CITOGENETICA MOLECULARA - TEHNICA FISH

(FLUORESCENT IN SITU HYBRIDISATION) Prin aceasta se realizeaza marcajul cromosomilor cu ajutorul unor coloranti fluorescenti, au inceput sa fie utilizate si diversificate incepand cu anii 80. Aceasta categorie de tehnici, cuprinde si tehnici de marcaj a unor molecule de ARN si/sau proteine pe langa marcajul aplicat unor molecule de ADN. In principiu, daca ne referim la ADN, este vorba despre modalitati prin care, un cromosom in intregime sau fragmente de cromosom pot fi marcate si detectate cu ajutorul unor coloranti fluorescenti denumiti fluorofori sau fluorocromi.

Principiul tehnicii FISH

Consta in hibridizarea ADN-ului in situ, adica pe lama de microscopie cu fragmente de ADN (sau ARN) artificial obtinute, denumite sonde, si care sunt marcate cu un fluorofor, pe baza de complementaritate a secventei intre zona de ADN tinta si secventa sondei de ADN. Prin urmare: daca fragmentul tinta se regaseste in genom, in acel loc, apare un semnal fluorescent dupa hibridizare, ce va fi detectat in lumina ultravioleta (UV); absenta fragmentului, duce la absenta hibridizarii si deci, la absenta semnalului fluorescent pe lama (exp. deletii cromosomiale). Marcarea sondelor se poate face: direct - cu un fluorofor atasat, sau indirect - prin atasarea unor haptene (molecule ce pot fi ulterior detectate printr-o reactie specifica cu un anticorp monoclonal marcat, dupa modelul unei reactii antigen-anticorp) - tehnica presupune etape suplimentare pentru detectia fragmentului de ADN hibridizat in situ.

Etapele principale ale tehnicii FISH

1. Prelevarea probei biologice; 2. Realizarea: - preparatului cromosomial pe lama (asemanator unui cariotip clasic) sau - etalarea directa a celulelor recoltate de la pacient (marcajul unor regiuni din molecula de ADN nu impune neaparat ca acesta sa fie condensat sub forma de cromosom metafazic); 3. Denaturarea termica a moleculelor de ADN = separarea celor doua catene; 4. Hibridizarea ADN-ului tinta cu sondele marcate - peste noapte, 37C, in atmosfera umeda; 5. Eliminarea sondelor in exces, nehibridizate, de pe lama - prin spalarea acesteia cu solutii tampon specifice; 6. Detectia semnalelor fluorescente pe lama cu un microscop dotat cu unitate de fluorescenta (lumina UV); 7. Interpretarea si elaborarea unui diagnostic. 8.

Stadiile ciclului celular in care se poate marca ADN-ul prin tehnica FISH
Prin metodele clasice evidentierea cromosomilor si implicit analiza unor fragmente cromosomiale se poate face, in general, doar in metafaza. Tehnica FISH nu necesita obligatoriu prezenta ADN sub forma condensata (cromosom). Pot fi marcati: cromosomi in metafaza - presupune parcurgerea etapelor tehnicilor de cariotipare clasica, pentru obtinerea unor preparate cromosomiale pe lama de microscopie; cromosomi elongati, in prometafaza; fibra de cromatina; in interfaza.

 Aplicatiile tehnicilor FISH

Tehnicile FISH sunt aplicate astazi atat in diagnostic cat si in cercetare, datorita posibilitatii lor de a evidentia unele anomalii ale structurii moleculelor de ADN cu mare precizie si specificitate, astfel pot fi efectuate:

determinari cantitative la nivelul ADN (CGH); detectia unor deletii si duplicatii de dimensiuni foarte mici (exemplu microdeletiile); localizarea unor fragmente de ADN in genom; punerea in evidenta a unor fragmente de ADN exogen; marcarea si detectia unor cromosomi in intregime sau a unor fragmente de cromosom; diagnosticul extrem de precis al unor anomalii cromosomiale (deletii, duplicatii, translocatii) si mai ales a unor anomalii cromosomiale complexe (multiple); diagnosticul unor rearanjari intracromosomiale (in interiorul aceluiasi cromosom); detectia precisa a perechilor de cromosomi (tehnicile M-FISH); diagnosticul unor aneuploidii de tipul trisomiilor sau monosomiei X (cu ajutorul sondelor centromerice); diagnosticul sexului genetic (cu aplicatii mai ales in diagnosticul prenatal).

Avantajele tehnicilor FISH:

rapide in comparatie cu tehnicile clasice de analiza a cariotipului prin bandare (utilitate deosebita mai ales in cazul diagnosticului prenatal al unor anomalii cromosomiale precum sindromul Down); permit un diagnostic precis si specific datorita principiului de hibridizare pe baza de complementaritate a secventelor intre ADN tinta si sondele marcate; posibilitatea diagnosticului unor anomalii cromosomiale complexe, permitand identificarea precisa a punctelor de ruptura si a fragmentelor cromosomiale implicate; permit diagnosticul de preimplantare al anomaliilor cromosomiale in cazul embrionilor obtinuti prin procedee de fertilizare in vitro (reproducere umana asistata). Costurile destul de ridicate (inca) ale sondelor de ADN marcate (costurile pot fi reduse in cazul in care laboratorul are posibilitatea de a-si prepara singur sondele utilizate in tehnica FISH); Necesita aparatura si software de analiza si interpretare a rezultatelor (costisitoare); Lamele trebuie citite rapid fiind vorba de tehnici de fluorescenta; Nu se poate aplica de rutina (datorita tuturor considerentelor enuntate anterior). tehnica FISH se aplica doar in situatii bine determinate, de obicei atunci cand se stie exact ce fragment se doreste a fi marcat: fie dupa determinarea cariotipului prin metode standard cu bandare G sau R, pentru clarificarea diagnosticului; fie de prima intentie in diagnosticul cromosomial (mai ales prenatal) datorita faptului ca se poate determina rapid (fara cultivarea celulelor) numarul unor cromosomi dintr-o anumita pereche (ex. cromosomul 21) prin utilizarea sondelor centromerice. ofera informatii limitate la fragmentul/fragmentele sau cromosomul/cromosomii marcati si nu ofera informatii asupra intregului set cromosomial (cu exceptia cazului in care se marcheaza toate perechile de cromosomi in intregime) poate constitui un dezavantaj atunci cand nu se cunoaste anomalia cromosomiala posibila intr-un anume caz.

Dezavantajele tehnicilor FISH:

De retinut:

In concluzie, la ora actuala, tehnicile FISH constituie tehnici foarte utile, sensibile si specifice de diagnostic al unor anomalii, insa in acelasi timp reprezinta mai degraba tehnici complementare tehnicilor de citogenetica clasica cu marcaj in benzi al cromosomilor umani.

REACTIA PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

O data la cateva zeci de ani, stiinta ofera cate o descoperire revolutionara; o asemenea revolutie s-a produs cu descoperirea si punerea la punct a reactiei PCR, fara de care genetica moleculara moderna nu ar putea exista. Reactia PCR, sau amplificarea in vitro a fragmentelor ADN, a fost pusa la punct de catre Mullis, in 1983, motiv pentru care a fost laureat al premiului Nobel in chimie in anul 1993. Reactia PCR se bazeaza pe obtinerea intr-un timp scurt a catorva miliarde de copii ale unui fragment ADN, indiferent ce origine ar avea acesta (eucariot nuclear, mitocondrial, bacterian, plasmidic, viral etc).
Ingredientele necesare oricarei reactii PCR sunt urmatoarele: - matrita ADN (sau template), care reprezinta proba de ADN obtinuta prin extractie din diverse surse - o pereche de primeri (forward si reverse sau sens si antisens), secvente oligonucleotidice (in medie 15-20 nucleotide) care flancheaza regiunea ADN care se doreste a fi amplificata. Designul acestor primeri tine de principiul complementaritatii, deoarece fiecare primer trebuie sa fie perfect complementar cu secventa corespunzatoare de pe catenele matritei. Astfel, primerul forward trebuie sa fie complementar si capabil sa hibridizeze cu catena 3-5, iar primerul reverse trebuie sa fie complementar si capabil sa hibridizeze cu catena 5-3 - o ADN-polimeraza rezistenta la temperaturi inalte, de peste 90C. - MgCl - dideoxinucleotide trifosforilate, notate dNTPs, caramizile catenelor ADN nascente, pe care Taqpolimeraza le va adauga exclusiv in directia 5-3 (singura directie termodinamic favorabila) - de obicei, se adauga si un agent care leaga inhibitorii reactiei PCR, care poti fi foarte diversi (cel mai frecvent proteine, metale grele - altele decat Mg si talcul). In acest sens, cel mai frecvent se foloseste albumina serica bovina - matrita ADN
2 2+

Reactia PCR presupune mai multe etape: 1. Denaturarea initiala, timp de cateva minute, la 94-96C, etapa esentiala, deoarece in acest moment se desfac cele 2 catene ale moleculei matrita de ADN, prin distrugerea puntilor de H dintre bazele azotate ale celor de catene (2 punti de H intre fiecare cuplu A-T si respectiv 3 punti de H intre fiecare cuplu G-C). Aceasta etapa are o durata de cateva minute, pentru a permite denaturarea eficienta a celor 2 catene ADN pe toata lungimea moleculei matrita, care poate fi considerabila (milioane miliarde de perechi de baze). 2. Ciclurile propriu-zise de amplificare, fiecare ciclu fiind format din: a) denaturare timp de cateva zeci de secunde, de obicei, la 94-96C b) hibridizarea primerilor (annealing), timp de cateva zeci de secunde, de obicei, la 50-65C, temperatura de annealing fiind specifica fiecarei perechi de primeri. Este un pas crucial, deoarece daca primerii nu hibridizeaza in conditii optime, amplificarea fie nu se va mai produce, fie va fi mai slaba decat ar fi necesar c) extensie (elongare), timp de cateva zeci de secunde, de obicei, la 72C (temperatura la care activitatea enzimatica a Taq-polimerazei este maxima), etapa in care Taq-polimeraza adauga nucleotidele in directia 5-3, pe baza informatiei de pe catenele matritei In general, 30-35 de cicluri sunt suficiente pentru obtinerea unui numar suficient de copii ale fragmentului ADN tinta. 3. Extensia (elongarea) finala, timp de cateva minute, la 72C Presupunand ca s-ar dori amplificarea unui anumit fragment ADN, dupa 30 de cicluri ar trebui sa rezulte 2 copii din fragmentul respectiv; in realitate insa, randamentul reactiei PCR este in

+ + 30

cel mai bun caz de aproximativ 1.8 , pierderile fiind mai ales pe seama primelor cicluri de amplificare, cand o parte din catenele nou formate nu au exact aceeasi lungime cu a fragmentului tinta.
30