Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Investete n oameni!
Axa prioritar 1: Educaia i formarea n sprijinul creterii economice i dezvoltrii societii bazate pe cunoatere
Domeniul major de intervenie 1.2: Calitate n nvmntul superior
Titlul proiectului: Aplicarea metodologiilor de cercetare stiintifica in domeniul stiintelor medicale si promovarea culturii antreprenoriale pentru
facilitarea insertiei pe piata muncii a studentilor medicinisti din ciclul de studii universitare de licenta.
Numrul de identificare al contractului: POSDRU/156/1.2/G/141745
Beneficiar: Universitatea de Medicin i Farmacie Carol Davila din Bucureti
Cuprins
Culturi de celule
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a
apoptozei
Citometrie in flux
Analiza ciclului celular
Metode de dozarea a proteinelor
Electroforeza, ELISA, Western blot
Tehnici de imunohistochimie simpla si dubla
Tehnica PCR si Real-Time PCR
Variante si aplicatii ale tehnicii PCR: MS-PCR, SNP-PCR, PCRRFLP,
Microarray
Secventiere genica
Transfectie si clonare
Western blot
2. Electroforeza (SDS-PAGE)
2 geluri: gel de concentrare si gel de separare
Gelul de separare
-30% acrilamida/bisacrilamida
-1,5M Tris pH 8,8
-10% SDS
-10% APS (amonium persulfat)
-TEMED
-se pasa la polimerizat 20-30 min
Gelul de concentrate
- 30% acrilamida/bisacrilamida
-1 M Tris pH 6,8
-10% SDS
-10% APS (amonium persulfat)
-TEMED
Western blot
- Se incarca ~ 30-100l/godeu (50mg proteina)
- Migrare la 100V, 1-2,5 ore
-Dupa transfer, gelul se poate colora (Coomassie Blue) pentru a
vedea daca proteinele au migrat
Western blot
3. Transferul proteinelor pe membra de nitroceluloza
Transferul se face in 2 moduri: umed sau semiuscat (15V, 20-30 minute)
Membrane: nitroceluloza, florura de poliviniliden (PVDF) sau Nylon
Membranele leaga proteinele prin interactii hidrofobe (nitroceluloza) sau
interactii hidrofobe si ionice (Nylon incarcat pozitiv)
Marimea porilor membranei este intre 0,05 m si 0,45 m. Cu cat porii sunt
mai mici cu atat capacitatea de legare este mai mare.
Western blot
3. Transferul proteinelor pe membra de nitroceluloza
-
https://www.youtube.com/watch?v=krFKPwhiHJE
Western blot
4. Incubarea cu Anticorpi specifici
- Blocare 30-60 min - lapte 5% in PBS cu Tween 0.05% (albumina)
- Incubare cu Anticorp primar peste noapte la 4oC
- Spalare 3x, 15min cu PBS+Tween 0.05%
- Incubare cu Anticorp secundar 1 ora la To cam
- Spalare 3x, 15min cu PBS+Tween 0.05%
- Spalare 1x, 15min cu PBS
- Developare: se adauga ECL peste membrana 2-3 min, citire la
aparatul de chemiluminiscenta
- ECL: luminol si HRP
Western blot
Imunohistochimie
Reprezinta combinatia dintre 2 stiinte: imunologia si
histochimia, avind ca scop evidentierea proprietatilor
antigenice ale unor substante intr-un tesut, utilizind anticorpi
monoclonali sau seruri polireactive. Vizualizarea substantelor
antigenice se poate face atit la nivel tisular, cit si la nivel
celular si subcelular, pe preparate la gheata sau parafina.
Se lucreaza cu anticorpi monoclonali, de care sunt legate
una sau mai multe molecule enzimatice, ce catalizeaza
transformarea unui substrat incolor intr-un produs de
reactie colorat. Enzima este cuplata covalent cu portiunea
Fc a anticorpului
Imunohistochimie
Enzimele utilizate sunt:
- Peroxidaza (HRP)
- fosfataza alcalina (PA)
Substratele folosite sunt:
- DAB (Di-amino-benzidina brun) sau AEC (3-Amino-9-ethylcarbazole
rosu) pentru peroxidaza
- pNPP (p-nitrophenylphosphate galben) si BCIP/NBT (5-bromo- 4-chloro3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium violet) pentru fosfataza
Imunohistochimie
Metoda ABC (dupa Hsu et al.,
1981, modificata de G. Bussolatti & P.
Gugliotta, 1983)
In prima etapa, Ac primar se
cupleaza cu Ag dorit; in a doua etapa
de Ac primar se leaga un Ac secundar,
marcat cu biotina.
In a treia etapa, se introduce un
reactiv cu mai multe molecule de
avidina marcata cu peroxidaza.
La locusul antigenic se leaga un
complex cu multe molecule de
peroxidaza,
intensitatea
reactiei
cromogene va fi accentuata si
sensibilitatea metodei mare.
Imunohistochimie
Metoda dextranului (DAKO
EnVisionTM Systems, 1996)
Permite cuplarea unui mare
numar de molecule enzimatice pe un
schelet
polimeric
de
dextran
hidrosolubil; cu acest complex se pot
cupla Ac secundari
Se obtine astfel un reactiv care
poate fi utilizat in cadrul unei tehnici
in 2 timpi, care aduce o mare
cantitate de enzime la locul reactiei si
va creste foarte mult sensibilitatea
detectarii Ag dorit.
Imunohistochimie
Metoda Tiramida
Protocol de lucru
1. Fixarea pieselor se face in formol neutru maximum 24h. Dimensiunea pieselor prelevate
nu depasesc 8-10x8-10x4-5 mm. Pentru biopsiile mici un timp de fixare de 6h este suficient.
2. Sectiuni de 3-4 microni, perfect intinse fara pliuri in apa distilata de 37oC etalate pe lame
silanizate sau tratate cu gelatina cromica (folosim numai in cazuri exceptionale). Sectiunile sunt
uscate la 37oC in termostat sau la temperatura camerei timp de 24h.
3. Deparafinarea: Xilen 3x10 min.
4. Rehidratarea: etanol 3x3 min., apa distilata 1x5 min.
5. Demascatia antigenica a sectiunilor se face prin fierbere, 3x5 min. intr-un vas cu solutie
Histols citrat tampon 0,01 M cu pH 6 (cat.30010) intr-un cuptor cu microunde la o putere de 750
W. Nivelul solutiei de tampon este verificat dupa fiecare 5 minute, iar cantitatea evaporata se
completeaza cu solutie tampon citrat de sodiu (aceeasi solutie pe care o folosim si la fierbere).
6. Racirea sectiunilor in apa distilata la temperatura camerei timp de 5 min.
7. Blocarea peroxidazei endogene timp de 10 min. (90 ml apa distilata+5 ml perhidrol
conc.)
8. Spalare cu apa distilata 5 min.
9. Spalare cu solutie tampon PBS (pH 7,2 - 7,6) 3-5 min.
Incepand de la punctul 10 se lucreaza in camera umeda.
10. Blocarea nespecifica pentru reducerea zgomotului de fond cu BBPS Histols 10 min.
(in loc de BSA sau lapte de praf 3% cum se facea inainte) BBPS Histols backround blocking
protein solution cat. 30012.
11. Aplicarea anticorpului primar folosim dilutiile indicate de firma producatoare intr-o
cantitate de 80 microlitri. In cazul sectiunilor obtinute prin tehnica TMA cantitatea serului aplicat
este semnificativ mai mica. Diluarea anticorpului primar se face cu Large Volume UltraAB Diluent
(LabVision cat. TA-125-UD). Aplicarea anticorpului se face prin simpla aplicare intr-o cantitate
suficienta care sa ajunga limitele marcate cu Histo Pen (dupa prima rehidratare cu solutie tampon
sectiunile vor fi incercuite, demarcate cu Histo Pen cat. 30020 Tissue Marker Hydrophobic Pen).
12. Incubare la temperatura camerei timp de 60 min.
13. Spalarea cu solutia tampon PBS 3x5 min.
14. Aplicarea polimerului insemnat Histols-MR (cat. 3001150) anti soarece si iepure timp de
30 min).
15. Spalare cu solutie tampon PBS 3x5 min.
16. Aplicarea Histols-DAB cat 30014, solutia de lucru (o picatura 40 microlitri DAB+1ml
substrat) se prepara extemporaneu si poate fi folosita la temperatura camerei timp de 6 ore.
Intensitatea coloratiei se verifica sub microscop timp de 3-10 min. si este oprit dupa obtinerea
intensitatii dorite prin punctul 17.
17. Spalare cu apa distilata 10-15 min.
18. Supracolorare cu Hematoxilina: un timp mai scurt de coloratie obisnuita (aproximativ
jumatate din timpul coloratiei de rutina).
19. Deshidratare: alcool 96o .1x30 sec. alcool absolut 1x30 sec. si acetona 1x30 sec.
20. Clarifiere: xilen 3x3 min.
21. Montare: balsam de Canada, care se poate utiliza si in cazul cromogenului Histols
restistant AEC
TSA biotin: rabbit anti-CD3 1:400, biotinylated antirabbit, SA-HRP, biotinyl tyramide, ABC, with DAB
chromogenic detection.
POSTNATAL
Vilozitati coriale
1.
Lichid amniotic (amniocite) 2.
Sange fetal
3.
Tesut (biopsie): piele
4.
POSTMORNEM
1.
2.
Produs de conceptie
Sange, tesut, etc
Viloziti coriale
Lichid amniotic
Produs de concepie
Categorii metodologice
A. metode manuale
Metoda organica
Automata
REACTIA PCR
Polymerase
Chain
Reaction
Polimerizare
Lant
Reactia
Primeri (Amorse)
2 fragmente mici de ADN
monocatenar (fragmente
oligonucleotidice 15-30
perechi baze)
complementare celor doua
capete 3 ale seventei tinta
Functie:
recunosc secventa de interes si se ataseaza de capetele acesteia la o
temperatura specifica = temperatura de atasare a primerilor (se
calculeaza in functie de Tm)
initiaza reactia de polimerizare
ADN polimeraza
enzima termostabila
realizeaza sinteza unei noi secvente ADN identice cu secventa tinta
se ataseaza de primeri
incorporeaza nucleotide pe baza de complementaritate cu
secventa tinta;
Exemple comerciale: Taq polimeraza, Go Taq Flexi polimeraza,
AmpliTaq Gold polimeraza, HotStart Taq polimeraza
Nucleotide: sunt livrate fie separat, sub form de soluie stoc de dATP,
dCTP, dGTPi dTTP, fie sub form de soluie amestec a celor patru
nucleotide. Concentraiile optime depind de lungimea fragmentului ce
trebuie amplificat i de numrul de cicluri de amplificare.
Aparate PCR
Elongatia finala
PCR monoplex
se amplifica o singura
secventa tinta
exista un singur set de
primeri
PCR multiplex
se amplifica mai
multe secvente
tinta
exista mai multe
seturi de primeri
(cel putin 2)
Touchdown PCR
Real-Time PCR
Syber Green
vs
Taq-Man
secvente ADNdc
-Costuri scazute
legari nespecifice
- SYBR Green II
- SYBR Gold
- YO (Oxazole Yellow)
- TO (Thiazole Orange)
-PG (PicoGreen)
-Eva Green
-BEBO, BOXTO, SYTO9
https://www.youtube.com/watch?v=nKrJnc1xWb0
Controale:
Pozitiv
Negativ
Control intern:
- Secventa din genom: globina, actina
- Secventa ADN externa
Blanc non-template:
- din extractie
- din PCR
Probe
ELECTROFOREZA
1937 Arne Tiselius- aparat sofisticat care sa permita separarea
diferitelor particule in prezenta unui camp electric
ELECTROFOREZA
Denumirea: gr. Electron= electric, lat. Phore = purttor,
evideniindu-se astfel rolul esential al campului electric
ELECTROFOREZA
Fortele care determina mobilitatea electroforetica depind de: voltajul
aplicat (65-75 V), sarcina neta a moleculelor, masa moleculara si
coeficientul de frictiune
- teoretic: 5 v/cm
ELECTROFOREZA
Gelul de electroforeza
- Gel de agaroza (polizaharid, D-galactoza and 3,6-anhidro-Lgalactopiranoza, extras din alge)
- Gelurile de agaroza au o concentratie de 1-5%, in functie de
dimensiunea fragmentelor ce trebuie separate
- Gelurile de agaroza permit separarea acizilor nucleici cu
dimensiuni intre 100-1500 pb
ELECTROFOREZA
-
260
250
260, 250
200
200
+
Gel de agaroza
Gel de poliacrilamida
Gel de agaroza
ELECTROFOREZA
Tamponul de electroforeza
- TAE: Tris, acid acetic, EDTA
- TBE: Tris, acid boric, EDTA
- Acid citric
- Glicina
- Acid fosforic
TRIS = tris(hidroximetil)aminometan
Pentru vizualizarea fragmentelor de acizi nucleici :
- colorarea gelului: bromura de etidiu, Syber Green, EvaGreen,
GelGreen, GelRed sau
- Colorarea tamponului: bromura de etidiu
ELECTROFOREZA
Tipuri de electroforeza
In functie de suportul folosit:
1. Electroforeza in solutie libera = electroforeza capilara
2. Electroforeza pe diferite suporturi: hartie, film, geluri
In functie de planul de electroforeza:
1. Electroforeza orizontala acizi nucleici
2. Electroforeza verticala - proteine
Tipuri de electroforeza
Electroforeza pentru acizi nucleici
1. In gel de agaroza
2. DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis): electroforeza in gel in
gradient denaturant
3. TGGE: (temperature gradient gel electrophoresis): electroforeza in gel in
gradient de temperatura
- Ambele metode sunt folosite in domeniul biomedical (mutatii) si ecologie
microbiana
4. PFGE (pulse field gel electophoresis): electroforeza in camp pulsatoriu
- Gel de agaroza, dar voltajul este schimbat in 3 directii (1 catre centru
gelului, 2 care actioneaza intr-un unghi de 60o)
- Pentru genotipare, epidemiologie moleculara
Tipuri de electroforeza
DGGE
Tipuri de electroforeza
Electroforeza pentru separarea proteinelor
1. PAGE: in gel de poliacrilamida
2. SDS-PAGE: electroforeza in conditii denaturante
- Agenti de denaturare: SDS, uree si formamida
1. IEF (focusare izoelectrica): se realizeaza intr-un gradient de pH, fiecare
proteina migrand pana atinge punctul unde pH = pI
2. 2DGE (Two-dimensional gel electrophoresis): IEF si SDS-PAGE (pH
izoelectric si MM)
Tipuri de electroforeza
Tipuri de electroforeza
TEHNICA MICROARRAY
A permis identificarea unor seturi de gene supra- si sub- exprimate in diferite patologii:
cancer de san, de prostata, pulmonar, precum si in dereglarea anumitor procese
fiziologice: inducerea apoptozei sau raspunsul la terapie.
Utilizata pentru detectia SNP-urilor (single nucleotide polymorphism), a aberatiilor de
metilare, detectia splicing-ului alternativ, detectia de patogeni, amplificare genica, detectia
genelor de fuziune.
Principiul.
Microarray-ul este o matrice solida miniaturizata pe care sunt depozitate intr-o ordine bine
stabilita mii de fragmente specifice de acizi nucleici.
ADNc sintetizat prin reactia de revers transcriere de pe ARNm-ul extras din proba de
interes, este marcat fluorescent si hibridizat pe suprafata array-ului.
Cuantificarea nivelelor de expresie se bazeaza pe faptul ca intensitatea semnalului
fluorescent al fiecarui spot este direct proportionala cu cantitatea de ARN/ADN prezenta in
proba analizata, care a hibridizat spotul respectiv.
Tehnica microarray compara nivelurile de expresie a unei gene in doua conditii diferite (ex.
Cancer vs. normal).
Tipuri de sonde
Suporturile array pot contine fie ADNc fie oligonucleotide.
Un sistem ADNc microarray cuprinde o colectie de mii de sonde, apartinand unor banci
de ADNc. Primul pas: selectarea secventelor de interes din bazele de date
internationale, ce urmeaza a fi apoi amplificate prin PCR folosind primeri specifici,
purificate si apoi depozitate (sub forma de spoturi) in pozitii bine determinate pe
suprafata array-ului (20.000 spoturi/cm2). Avantaj: pot fi depozitate structuri clonate
care nu au fost inca secventiate, noi gene. Dezavantaj: dificultatea mentinerii si utilizarii
unor colectii voluminoase de clone de ADNc.
Oligonucleotide microarray realizata prin sinteza in situ. In loc de a fi sintetizate in
prealabil, oligonucleotidele sunt produse baza cu baza, direct pe suprafata array-ului.
Avantaj: eliminarea necesitatii unei colectii de clone ADNc; sensibilitate de hibridizare
ridicata; Dezavantaj: pot fi sintetizate doar secvente cunoscute
Tehnologiile two-color permit hibridizarea pe acelasi array a 2 probe marcate cu
fluorocromi diferiti (ex: Cy3 si Cy5). Probele marcate vor hibrida competitiv, rezultatul
fiind exprimat ca raport, punand in evidenta diferentele de expresie intre cele 2 probe.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
PURIFICARE si
PREPARARE
PREPARARE SLIDE-URI
PRINTARE
Preparare ARN:
POST PROCESARE
CELULE/TESUT
HIBRIDIZAREA
IZOLARE ARN
ANALIZA DATELOR
OBTINEREA cADN
MARCAREA
PROBELOR
Microarray cu mii de
oligonucleotide "printate" pe
o lama de sticla, nylon,
plastic, etc.
Avantaje
Pret scazut per array
Selectarea specifica a genelor (custom)
Orice specie poate fi analizata
Hibridizare competitiva
Sistem deschis al arhitecturii aparatului
Avantaje
Productia de linie
Un numar mare de gene
Numeroase specii
Dezavantaje
Management-ul clonelor (numeroase)
Controlul calitatii
-Datele obtinute pot fi variabile
-Uneori se pot desprinde nucleotide,
daca nu sunt bine aderate
Dezavantaje
Costul sistemului de analiza
Costul chip-ului
Limitarea particularizarii/ajustarii
Arrayed Library
(96 or 384-well plates of
bacterial glycerol stocks)
Spot as microarray
on glass slides
PCR amplification
Directly from colonies with
SP6-T7 primers in 96-well
plates
Consolidate into
384-well plates
Camera de hibridizare
3XSSC
HYB CHAMBER
ARRAY
LIFTERSLIP
SLIDE
LABEL
SLIDE LABEL
Umiditate
Temperatura
Formamida (scade
temperatura de melting)
cDNA microarrays
cDNA B
Cy3 labeled
cDNA A
Cy5 labeled
Laser 1
Hybridization
Laser 2
Scanning
Analysis
Image Capture
Bioinformatica
-
Genotipare
Atribuirea de functii anumitor gene (pt. 90% din genele noastre nu le-a
fost atribuita nici o functie)
Identificare microbiana
Medicina personalizata
Secventierea ADN
Secventierea Sanger
1975 Frederick Sanger si Alan Coulson propun secventierea
enzimatica
Secventierea Maxam-Gilbert
19761977 Walter Gilbert si Allan Maxam au dezvoltat
secventierea prin degradare chimica
Secventierea Maxam-Gilbert
19761977 Allan Maxam si Walter Gilbert au dezvoltat secventierea
prin degradare chimica ce implica:
Cathode (-)
Anode (+)
Purificarea ampliconilor
2.
3.
4.
5.
Interpretarea electroforegramelor
1 singur primer
enzima de polimerizare - ADN polimeraza
dNTP deoxinucleotide
ddNTP marcate radioactiv/fluorescent - dideoxinucleotideactioneaza ca terminatori de catena
tampon de reactie si cationi
ddNTP:
- NU prezinta gruparea OH in pozitia 3 a pentozei si de aceea nu se mai
poate atasa un alt nucleotid
Sistem automat de
umplere cu polimer
Sistem de capilare
Recipient cu polimer
Anod
Fereastra de detectie
Dispozitiv incarcare
probe, catod
Cuptor
Pirosecventierea
Este o tehnica de secventiere propusa in anul 2000
Nu include reactia PCR ciclica si nu necesita
electroforeza
Componentele reactiei:
ADN tinta
1 Primer
Tampon de reactie
4 Enzime
Enzime:
ADN polimeraza
catalizeaza incorporarea
nucleotidelor
ATP sulfurilaza
converteste pirofosfatul in
ATP in prezenta APS
(adenozin 5 fosfosulfat)
Luciferaza oxideaza
luciferina in prezenta ATP
si genereaza lumina
Apiraza degradeaza
nucleotidele neincorporate
si excesul de ATP
https://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGF
e0aA
Cromatograma = electroforegrama