Sunteți pe pagina 1din 117

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 2013

Investete n oameni!
Axa prioritar 1: Educaia i formarea n sprijinul creterii economice i dezvoltrii societii bazate pe cunoatere
Domeniul major de intervenie 1.2: Calitate n nvmntul superior
Titlul proiectului: Aplicarea metodologiilor de cercetare stiintifica in domeniul stiintelor medicale si promovarea culturii antreprenoriale pentru
facilitarea insertiei pe piata muncii a studentilor medicinisti din ciclul de studii universitare de licenta.
Numrul de identificare al contractului: POSDRU/156/1.2/G/141745
Beneficiar: Universitatea de Medicin i Farmacie Carol Davila din Bucureti

Metode si tehnici de biologie celulara si


moleculara utilizate in cercetarea
biomedicala
Curs 2

Dr. Florin Iordache

Cuprins
Culturi de celule
Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a
apoptozei
Citometrie in flux
Analiza ciclului celular
Metode de dozarea a proteinelor
Electroforeza, ELISA, Western blot
Tehnici de imunohistochimie simpla si dubla
Tehnica PCR si Real-Time PCR
Variante si aplicatii ale tehnicii PCR: MS-PCR, SNP-PCR, PCRRFLP,
Microarray
Secventiere genica
Transfectie si clonare

Western blot (imunoblot)


Metoda ce imbina tehnicile de electroforeza cu cele imunologice
pentru identificarea si cuantificarea proteinelor dintr-un amestec
Etape
1. Prepararea probelor
2. Electroforeza probelor
3. Transferul proteinelor pe membrana de nitroceluloza
4. Incubarea proteinelor cu Anticorpi specifici

Western blot (imunoblot)


1. Prepararea probelor
Liza celulara
- culturi de celule: RIPA (25mM TrisHCl pH 7.6, 150mM NaCl, 1%
NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS), mecanic in azot
lichid, sonicare
- Tesuturi: mecanic, sonicare, apoi chimic
Determinarea concentratiei proteinelor (BCA, Bradford, Lowry)
- Pe gel se va incarca o cantitate egala de proteina
- Inainte de incarcarea probelor in gel acestea se amesteca cu
loading buffer ce contine SDS (5-10 min, 95-100oC)
- 2x Laemnli buffer: 4% SDS, 10% -mercaptoetanol, 20% glicerol,
bromfenol blue, 0.125%M Tris-HCl

Western blot
2. Electroforeza (SDS-PAGE)
2 geluri: gel de concentrare si gel de separare
Gelul de separare
-30% acrilamida/bisacrilamida
-1,5M Tris pH 8,8
-10% SDS
-10% APS (amonium persulfat)
-TEMED
-se pasa la polimerizat 20-30 min
Gelul de concentrate
- 30% acrilamida/bisacrilamida
-1 M Tris pH 6,8
-10% SDS
-10% APS (amonium persulfat)
-TEMED

Western blot
- Se incarca ~ 30-100l/godeu (50mg proteina)
- Migrare la 100V, 1-2,5 ore
-Dupa transfer, gelul se poate colora (Coomassie Blue) pentru a
vedea daca proteinele au migrat

Western blot
3. Transferul proteinelor pe membra de nitroceluloza
Transferul se face in 2 moduri: umed sau semiuscat (15V, 20-30 minute)
Membrane: nitroceluloza, florura de poliviniliden (PVDF) sau Nylon
Membranele leaga proteinele prin interactii hidrofobe (nitroceluloza) sau
interactii hidrofobe si ionice (Nylon incarcat pozitiv)
Marimea porilor membranei este intre 0,05 m si 0,45 m. Cu cat porii sunt
mai mici cu atat capacitatea de legare este mai mare.

Western blot
3. Transferul proteinelor pe membra de nitroceluloza
-

Colorare cu Ponceau S pt a vedea daca s-a realizat transferul

https://www.youtube.com/watch?v=krFKPwhiHJE

Western blot
4. Incubarea cu Anticorpi specifici
- Blocare 30-60 min - lapte 5% in PBS cu Tween 0.05% (albumina)
- Incubare cu Anticorp primar peste noapte la 4oC
- Spalare 3x, 15min cu PBS+Tween 0.05%
- Incubare cu Anticorp secundar 1 ora la To cam
- Spalare 3x, 15min cu PBS+Tween 0.05%
- Spalare 1x, 15min cu PBS
- Developare: se adauga ECL peste membrana 2-3 min, citire la
aparatul de chemiluminiscenta
- ECL: luminol si HRP

Western blot

Imunohistochimie
Reprezinta combinatia dintre 2 stiinte: imunologia si
histochimia, avind ca scop evidentierea proprietatilor
antigenice ale unor substante intr-un tesut, utilizind anticorpi
monoclonali sau seruri polireactive. Vizualizarea substantelor
antigenice se poate face atit la nivel tisular, cit si la nivel
celular si subcelular, pe preparate la gheata sau parafina.
Se lucreaza cu anticorpi monoclonali, de care sunt legate
una sau mai multe molecule enzimatice, ce catalizeaza
transformarea unui substrat incolor intr-un produs de
reactie colorat. Enzima este cuplata covalent cu portiunea
Fc a anticorpului

Imunohistochimie
Enzimele utilizate sunt:
- Peroxidaza (HRP)
- fosfataza alcalina (PA)
Substratele folosite sunt:
- DAB (Di-amino-benzidina brun) sau AEC (3-Amino-9-ethylcarbazole
rosu) pentru peroxidaza
- pNPP (p-nitrophenylphosphate galben) si BCIP/NBT (5-bromo- 4-chloro3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium violet) pentru fosfataza

Imunohistochimie
Metoda ABC (dupa Hsu et al.,
1981, modificata de G. Bussolatti & P.
Gugliotta, 1983)
In prima etapa, Ac primar se
cupleaza cu Ag dorit; in a doua etapa
de Ac primar se leaga un Ac secundar,
marcat cu biotina.
In a treia etapa, se introduce un
reactiv cu mai multe molecule de
avidina marcata cu peroxidaza.
La locusul antigenic se leaga un
complex cu multe molecule de
peroxidaza,
intensitatea
reactiei
cromogene va fi accentuata si
sensibilitatea metodei mare.

Imunohistochimie
Metoda dextranului (DAKO
EnVisionTM Systems, 1996)
Permite cuplarea unui mare
numar de molecule enzimatice pe un
schelet
polimeric
de
dextran
hidrosolubil; cu acest complex se pot
cupla Ac secundari
Se obtine astfel un reactiv care
poate fi utilizat in cadrul unei tehnici
in 2 timpi, care aduce o mare
cantitate de enzime la locul reactiei si
va creste foarte mult sensibilitatea
detectarii Ag dorit.

Imunohistochimie
Metoda Tiramida

Protocol de lucru
1. Fixarea pieselor se face in formol neutru maximum 24h. Dimensiunea pieselor prelevate
nu depasesc 8-10x8-10x4-5 mm. Pentru biopsiile mici un timp de fixare de 6h este suficient.
2. Sectiuni de 3-4 microni, perfect intinse fara pliuri in apa distilata de 37oC etalate pe lame
silanizate sau tratate cu gelatina cromica (folosim numai in cazuri exceptionale). Sectiunile sunt
uscate la 37oC in termostat sau la temperatura camerei timp de 24h.
3. Deparafinarea: Xilen 3x10 min.
4. Rehidratarea: etanol 3x3 min., apa distilata 1x5 min.
5. Demascatia antigenica a sectiunilor se face prin fierbere, 3x5 min. intr-un vas cu solutie
Histols citrat tampon 0,01 M cu pH 6 (cat.30010) intr-un cuptor cu microunde la o putere de 750
W. Nivelul solutiei de tampon este verificat dupa fiecare 5 minute, iar cantitatea evaporata se
completeaza cu solutie tampon citrat de sodiu (aceeasi solutie pe care o folosim si la fierbere).
6. Racirea sectiunilor in apa distilata la temperatura camerei timp de 5 min.
7. Blocarea peroxidazei endogene timp de 10 min. (90 ml apa distilata+5 ml perhidrol
conc.)
8. Spalare cu apa distilata 5 min.
9. Spalare cu solutie tampon PBS (pH 7,2 - 7,6) 3-5 min.
Incepand de la punctul 10 se lucreaza in camera umeda.
10. Blocarea nespecifica pentru reducerea zgomotului de fond cu BBPS Histols 10 min.
(in loc de BSA sau lapte de praf 3% cum se facea inainte) BBPS Histols backround blocking
protein solution cat. 30012.

11. Aplicarea anticorpului primar folosim dilutiile indicate de firma producatoare intr-o
cantitate de 80 microlitri. In cazul sectiunilor obtinute prin tehnica TMA cantitatea serului aplicat
este semnificativ mai mica. Diluarea anticorpului primar se face cu Large Volume UltraAB Diluent
(LabVision cat. TA-125-UD). Aplicarea anticorpului se face prin simpla aplicare intr-o cantitate
suficienta care sa ajunga limitele marcate cu Histo Pen (dupa prima rehidratare cu solutie tampon
sectiunile vor fi incercuite, demarcate cu Histo Pen cat. 30020 Tissue Marker Hydrophobic Pen).
12. Incubare la temperatura camerei timp de 60 min.
13. Spalarea cu solutia tampon PBS 3x5 min.
14. Aplicarea polimerului insemnat Histols-MR (cat. 3001150) anti soarece si iepure timp de
30 min).
15. Spalare cu solutie tampon PBS 3x5 min.
16. Aplicarea Histols-DAB cat 30014, solutia de lucru (o picatura 40 microlitri DAB+1ml
substrat) se prepara extemporaneu si poate fi folosita la temperatura camerei timp de 6 ore.
Intensitatea coloratiei se verifica sub microscop timp de 3-10 min. si este oprit dupa obtinerea
intensitatii dorite prin punctul 17.
17. Spalare cu apa distilata 10-15 min.
18. Supracolorare cu Hematoxilina: un timp mai scurt de coloratie obisnuita (aproximativ
jumatate din timpul coloratiei de rutina).
19. Deshidratare: alcool 96o .1x30 sec. alcool absolut 1x30 sec. si acetona 1x30 sec.
20. Clarifiere: xilen 3x3 min.
21. Montare: balsam de Canada, care se poate utiliza si in cazul cromogenului Histols
restistant AEC

IHC detection of CD3 antigen in serial sections of paraffin-embedded


human tonsil

Rabbit anti-CD3 1:400, biotinylated anti-rabbit,


ABC, with DAB chromogenic detection.

TSA biotin: rabbit anti-CD3 1:400, biotinylated antirabbit, SA-HRP, biotinyl tyramide, ABC, with DAB
chromogenic detection.

Tehnica PCR si Real-Time PCR


EXTRACTIA ADN
PRENATAL
1.
2.
3.
4.

POSTNATAL

Vilozitati coriale
1.
Lichid amniotic (amniocite) 2.
Sange fetal
3.
Tesut (biopsie): piele
4.

Sange periferic (venos)


Secretii nazale, oculare, vaginale, uretrale
Raclaj al mucoaselor: bucala, cervicala, uretrala
Diverse tipuri de tesut (biopsie)

POSTMORNEM
1.
2.

Produs de conceptie
Sange, tesut, etc

Viloziti coriale

Lichid amniotic

Produs de concepie

Recoltarea probelor biologice

Sange periferic (venos):


ADN intracelular - se proceseaza celulele sangelui:

exemple: in vederea identificarii unei mutatii in structura unor gene


specifice: gena DMD

ADN extracelular - se proceseaza plasma

exemple: in vederea identificarii unor virusuri ADN (HBV) si ARN (HCV,


HIV)
exemple: in vederea detectiei si analizei ADN fetal liber circulant in sangele
mamei

Extractia ADN - etapele de lucru


Spargerea membranelor:
Detergenti neionici (nonidet (NP40), triton X) si ionici: SDS
- degradeaza lipidele membranare
Enzime: proteinaza K, proteaza - realizeaza digestia proteinelor
membranare
Tiocianat de guanidina - degradeaza proteinele si distruge DNazele si
RNazele
Precipitarea proteinelor: Clorura de sodium/potasiu, Acetat de sodium
Chloroform:alcool izoamilic, Fenol:cloroform
Precipitarea si spalarea ADN: izopropanol si etanol
Elutia ADN: apa, solutie TRIS:EDTA

Categorii metodologice
A. metode manuale

Metoda organica

Metoda bazata pe utilizarea coloanelor


cu membrane de dioxid de siliciu

Metoda bazata pe utilizarea particulelor


paramagnetice sau dioxid de siliciu (silica)

Automata

CUANTIFICAREA ADN - determina concentratia


(cantitatea) ADN

Metoda: masurarea spectrofotometrica


ADN: absorbanta maxima la lungimea de unda 260 nm
A260=1 50 ng ADN d.c./ml
A260=1 33 ng ADN m.c./ml
A260=1 40 ng ARN m.c./ml
A260=1 20 ng oligonucleotide d.c./ml

DETERMINAREA PURITATII (calitatea) ADN


Metoda: masurarea spetrofotometrica
ADN: absorbanta maxima la lungimea de unda 260 nm
Proteinele: absorbanta maxima la lungimea de unda 280 nm

Raportul A260 / A280:


interval optim 1.8 - 2.0
< 1.7 - contaminare cu proteine
> 2.0 - contaminare cu ARN

REACTIA PCR
Polymerase
Chain
Reaction

Polimerizare
Lant
Reactia

Definitie: PCR este o tehnica de biologie moleculara prin


care una sau mai multe secvente ADN sunt amplificate
(multiplicate) enzimatic; reactia este exponentiala - initiata
de la cateva copii, generand in final cateva mii pana la
cateva milioane de copii.

Scopul: acestei metode este de a face accesibila analiza


unei secvente ADN

Componentele reactiei PCR


ADN tinta obtinut prin extractia ADN
Primeri (Amorse)
ADN polimeraza
Nucleotide
Cationi
Tampon de reactie

Primeri (Amorse)
2 fragmente mici de ADN
monocatenar (fragmente
oligonucleotidice 15-30
perechi baze)
complementare celor doua
capete 3 ale seventei tinta

Functie:
recunosc secventa de interes si se ataseaza de capetele acesteia la o
temperatura specifica = temperatura de atasare a primerilor (se
calculeaza in functie de Tm)
initiaza reactia de polimerizare

ADN polimeraza
enzima termostabila
realizeaza sinteza unei noi secvente ADN identice cu secventa tinta
se ataseaza de primeri
incorporeaza nucleotide pe baza de complementaritate cu
secventa tinta;
Exemple comerciale: Taq polimeraza, Go Taq Flexi polimeraza,
AmpliTaq Gold polimeraza, HotStart Taq polimeraza

Nucleotide: sunt livrate fie separat, sub form de soluie stoc de dATP,
dCTP, dGTPi dTTP, fie sub form de soluie amestec a celor patru
nucleotide. Concentraiile optime depind de lungimea fragmentului ce
trebuie amplificat i de numrul de cicluri de amplificare.

Cationi - elemente chimice cu rol in mentinerea activitatii optime a enzimei;


Cationi bivalenti de magneziu si mangan

Cationi monovalenti de potasiu

Tampon de reactie - este o solutie ce confera un mediu optim pentru activitatea si


stabilitatea enzimei. ConineTRIS, HCl, KCli are pH 8,3.

Aparate PCR

Etapele reactiei PCR


Denaturarea initiala
Amplificarea ADN in trei pasi ce se repeta ciclic
Denaturarea ADN
Atasarea primerilorADN
Elongatia ADN

Elongatia finala

VARIANTE PCR - clasificare in functie de:


Numarul de secvente tinta:
Monoplex PCR
Multiplex PCR
Metoda de evidentiere a produsilor PCR (ampliconi):
PCR + electroforeza
Real-time PCR (PCR in timp real)
Matrita tinta:
ADN
ARN - RT PCR (reverstranscriere PCR)
Scopul urmarit:
Calitative
Cantitative
Semicantitative

PCR monoplex
se amplifica o singura
secventa tinta
exista un singur set de
primeri

PCR multiplex
se amplifica mai
multe secvente
tinta
exista mai multe
seturi de primeri
(cel putin 2)

In functie de modul de detectie


La sfarsitul reactiei PCR = End-Point PCR prin
electroforeza:
Plana in gel de agaroza
Verticala in gel de poliacrilamida
Capilara

In timpul reactiei PCR = Real-Time PCR

Touchdown PCR

Endonucleazele de restricie sunt enzime care recunosc secvene de


ADN specifice, scurte, se leaga de ele apoi le de cliveaza, fie la situsul
de recunoastere, fie la o distan oarecare de acesta, n funcie de tipul
de enzim.
EcoRI recunoate o secvena hexanucleotidic:
5-G-A-A-T-T-C-3
5-G-3
5-A-A-T-T-C-3
3-C-T-T-A-A-G-5
3-C-T-T-A-A-5
3-G-5

Real Time PCR - PCR in timp real


Metode de detectie a ampliconilor in timp real:
1.Coloranti fluorescenti care se leaga nespecific de molecula ADN
dublu catenara: SYBR Green I,
2. Sonde ADN specifice alcatuite din secvente oligonucleotidice
marcate fluorescent

Frster resonance energy transfer (FRET)

Real-Time PCR
Syber Green

vs

Taq-Man

- Monitorizeaza amplificarea oricarei

- Hibridizare foarte spcifica intre sonde si tinta

secvente ADNdc

- Sondele pot fi marcate cu fluorocromi diferiti

-Costuri scazute

-Datorita specificitatii si sensibilitatii ridicate nu este

-Dezavantaje: reactii fals pozitive,

necesara o - procesare ulterioara a datelor

legari nespecifice

- Dezavantaje: sinteza diverselor probe marcate si costurile

- SYBR Green II
- SYBR Gold
- YO (Oxazole Yellow)
- TO (Thiazole Orange)
-PG (PicoGreen)
-Eva Green
-BEBO, BOXTO, SYTO9

https://www.youtube.com/watch?v=nKrJnc1xWb0

Proiectarea unui experiment cu determinare


calitativa

Controale:
Pozitiv
Negativ
Control intern:
- Secventa din genom: globina, actina
- Secventa ADN externa
Blanc non-template:
- din extractie
- din PCR
Probe

Aplicaiile reaciei de real-time PCR

Cuantificarea expresiei genice


Verificarea datelor de microarray
Monitorizarea eficienei terapiilor
Cuantificare viral (detectarea numrului de particule virale)
Identificarea agenilor patogeni
Studiul ADN mitocondrial
Imunoprecipitarea cromatinei
Determinarea instabilitii microsateliilor
Determinarea nivelului de metilare a ADN
Detecia inactivrii cromozomului X
Monitorizarea post-transplant a grefelor de esut sau de organe
Diagnosticul cancerului
Cuantificarea ADN n medicina legal
Discriminare alelic i calcularea frecvenei alelelor n populaii

ELECTROFOREZA
1937 Arne Tiselius- aparat sofisticat care sa permita separarea
diferitelor particule in prezenta unui camp electric

1948 Tiselius- Premiul Nobel pentru Chimie (separarea


coloizilor prin metode electroforetice)

1960 Vin Thorne - electroforeza acizilor nucleici

ELECTROFOREZA
Denumirea: gr. Electron= electric, lat. Phore = purttor,
evideniindu-se astfel rolul esential al campului electric

reprezint o metod de analiz i separare bazat pe


migrarea particulelor solide incarcate electric dispersate
ntr-un lichid sub aciunea unui cmp electric
Moleculele de ADN sunt incarcate negativ si vor migra
spre polul pozitiv

ELECTROFOREZA
Fortele care determina mobilitatea electroforetica depind de: voltajul
aplicat (65-75 V), sarcina neta a moleculelor, masa moleculara si
coeficientul de frictiune
- teoretic: 5 v/cm

ELECTROFOREZA

Cuva (tanc) de electroforeza


2 electrozi conectati la o sursa de curent
Gel de electroforeza (pentru o migrarea mai buna a moleculelor)
un lichid (tampon de electroforeza)

Gelul de electroforeza
- Gel de agaroza (polizaharid, D-galactoza and 3,6-anhidro-Lgalactopiranoza, extras din alge)
- Gelurile de agaroza au o concentratie de 1-5%, in functie de
dimensiunea fragmentelor ce trebuie separate
- Gelurile de agaroza permit separarea acizilor nucleici cu
dimensiuni intre 100-1500 pb

Gel de poliacrilamida: permit separarea acizilor nucleici cu dimensiuni


intre 60-450 pb si a proteinelor
- dezavantaje: neurotoxic si cancerigen
Gelurile de agaroza se formeaza prin incalzirea agarozei la cuptorul cu
microunde timp de 3-4 minute. Aceste geluri polimerizeaza formand o
retea cu ochiuri de dimensiuni variabile in functie de concentratia gelului
Gelurile de poliacrilamida polimerizeaza la temperatura camerei in
prezenta unor agenti de polimerizare
Gelurile cu concentratie mica (< 3%) separarea moleculelor cu MM
mare
Gelurile cu concentratie mare (> 3%) separarea moleculelor cu MM
mica

ELECTROFOREZA
-

260
250

260, 250

200

200

+
Gel de agaroza

Gel de poliacrilamida

Gel de agaroza

ELECTROFOREZA
Tamponul de electroforeza
- TAE: Tris, acid acetic, EDTA
- TBE: Tris, acid boric, EDTA
- Acid citric
- Glicina
- Acid fosforic
TRIS = tris(hidroximetil)aminometan
Pentru vizualizarea fragmentelor de acizi nucleici :
- colorarea gelului: bromura de etidiu, Syber Green, EvaGreen,
GelGreen, GelRed sau
- Colorarea tamponului: bromura de etidiu

ELECTROFOREZA

Tipuri de electroforeza
In functie de suportul folosit:
1. Electroforeza in solutie libera = electroforeza capilara
2. Electroforeza pe diferite suporturi: hartie, film, geluri
In functie de planul de electroforeza:
1. Electroforeza orizontala acizi nucleici
2. Electroforeza verticala - proteine

Tipuri de electroforeza
Electroforeza pentru acizi nucleici
1. In gel de agaroza
2. DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis): electroforeza in gel in
gradient denaturant
3. TGGE: (temperature gradient gel electrophoresis): electroforeza in gel in
gradient de temperatura
- Ambele metode sunt folosite in domeniul biomedical (mutatii) si ecologie
microbiana
4. PFGE (pulse field gel electophoresis): electroforeza in camp pulsatoriu
- Gel de agaroza, dar voltajul este schimbat in 3 directii (1 catre centru
gelului, 2 care actioneaza intr-un unghi de 60o)
- Pentru genotipare, epidemiologie moleculara

Tipuri de electroforeza
DGGE

Tipuri de electroforeza
Electroforeza pentru separarea proteinelor
1. PAGE: in gel de poliacrilamida
2. SDS-PAGE: electroforeza in conditii denaturante
- Agenti de denaturare: SDS, uree si formamida
1. IEF (focusare izoelectrica): se realizeaza intr-un gradient de pH, fiecare
proteina migrand pana atinge punctul unde pH = pI
2. 2DGE (Two-dimensional gel electrophoresis): IEF si SDS-PAGE (pH
izoelectric si MM)

Tipuri de electroforeza

Tipuri de electroforeza

Electroforeza biochimie clinica


Electroforeaza proteinelor serice: albumina, 1 globuline,
2 globuline, 1 globuline, 2 globuline, globuline
- malnutritie, malabsorbtie, sindrom nefrotic, neoplazii,
hepatita, boli autoimune
Electroforeza hemoglobinei anemie
Electroforeza lipoproteinelor boli cardiovasculare

TEHNICA MICROARRAY

DNA MICROARRAY PRINCIPII GENERALE

Tehnica MICROARRAY reprezinta o tehnologie multiplex utilizata in studii de


biologie moleculara si medicina.
Principiul de baza al tehnicii este similar principiului se bazeaza pe
complementaritatea scventelor genice de a se recunoaste intre ele si de a
detecta prezenta sau absenta ADN/ARN-ului de interes.
Spoturile pot fi fragmente scurte de gene SONDE utilizate la hibridizarea
ADNc tinta, in conditii foarte bine definite

Complexele SONDA-TINTA pot fi vizualizate si cuantificate pe baza detectiei in


fluorescenta a unui fluorofor marker fluorescent atasat tintei in vederea
cuantificarii relative a abundentei acizilor nucleici existenti in proba tinta

DNA MICROARRAY PRINCIPII GENERALE


Prin tehnologia microarray pot fi furnizate informatii asupra expresiei simultane a mii de
gene sau chiar a intregului genom.

A permis identificarea unor seturi de gene supra- si sub- exprimate in diferite patologii:
cancer de san, de prostata, pulmonar, precum si in dereglarea anumitor procese
fiziologice: inducerea apoptozei sau raspunsul la terapie.
Utilizata pentru detectia SNP-urilor (single nucleotide polymorphism), a aberatiilor de
metilare, detectia splicing-ului alternativ, detectia de patogeni, amplificare genica, detectia
genelor de fuziune.
Principiul.
Microarray-ul este o matrice solida miniaturizata pe care sunt depozitate intr-o ordine bine
stabilita mii de fragmente specifice de acizi nucleici.
ADNc sintetizat prin reactia de revers transcriere de pe ARNm-ul extras din proba de
interes, este marcat fluorescent si hibridizat pe suprafata array-ului.
Cuantificarea nivelelor de expresie se bazeaza pe faptul ca intensitatea semnalului
fluorescent al fiecarui spot este direct proportionala cu cantitatea de ARN/ADN prezenta in
proba analizata, care a hibridizat spotul respectiv.
Tehnica microarray compara nivelurile de expresie a unei gene in doua conditii diferite (ex.
Cancer vs. normal).

Tipuri de sonde
Suporturile array pot contine fie ADNc fie oligonucleotide.
Un sistem ADNc microarray cuprinde o colectie de mii de sonde, apartinand unor banci
de ADNc. Primul pas: selectarea secventelor de interes din bazele de date
internationale, ce urmeaza a fi apoi amplificate prin PCR folosind primeri specifici,
purificate si apoi depozitate (sub forma de spoturi) in pozitii bine determinate pe
suprafata array-ului (20.000 spoturi/cm2). Avantaj: pot fi depozitate structuri clonate
care nu au fost inca secventiate, noi gene. Dezavantaj: dificultatea mentinerii si utilizarii
unor colectii voluminoase de clone de ADNc.
Oligonucleotide microarray realizata prin sinteza in situ. In loc de a fi sintetizate in
prealabil, oligonucleotidele sunt produse baza cu baza, direct pe suprafata array-ului.
Avantaj: eliminarea necesitatii unei colectii de clone ADNc; sensibilitate de hibridizare
ridicata; Dezavantaj: pot fi sintetizate doar secvente cunoscute
Tehnologiile two-color permit hibridizarea pe acelasi array a 2 probe marcate cu
fluorocromi diferiti (ex: Cy3 si Cy5). Probele marcate vor hibrida competitiv, rezultatul
fiind exprimat ca raport, punand in evidenta diferentele de expresie intre cele 2 probe.

Schema experiment microarray two color


Etapa de hibridizare se realizeaza cu 2 probe
de ADNc care urmeaza a fi comparate (probe
de tesut bolnav / tesut sanatos; celule tratate /
celule netratate) marcate cu doi fluorofori
diferiti
Markeri fluorescenti : Cy3, cu lungime de unda
de emisie 570 nm (corespunzator spectrului
cu lumina verde), si Cy5 cu lungime de unda
de emisie 670 nm (corespunzator spectrului
cu lumina rosie)
Cele doua tipuri de probe sunt amestecate si
hibridizate pe acelasi cip microarray care va fi
scanat pentru a analiza intensitatea
semnalului fluorescent a celor doi fluorocromi
Intensitatile relative ale semnalului fluorescent
a celor doi markeri pot fi analizate ca raport in
vederea identificarii genelor cu expresie
stimulata sau inhibata - up-regulated or downregulated

1.

Fabricarea cip-ului microarray (cele 2 metode)

2.

Purificarea si revers-transcrierea. Trebuie realizata


intr-un timp cat mai scurt (ARN-ul are stabilitate
redusa, fiind tinta degradarii enzimatice). De pe
ARNm extras este sintetizat fie ADNc, fie ARNc.
De asemenea, ARNc poate fi obtinut si din ADNc
dublu catenar.

3.

Marcarea fluorescenta a probelor. Se realizeaza


prin incorporarea unor nucleotide analoage
conjugate cu un fluorocrom, in timpul procesului
de revers-transcriptie.

4.

Hibridizarea pe lama. Etapa in care sondele


imobilizate pe suprafata lamelor vor forma heteroduplicati cu ARN/ADNc marcat fluorescent.
Hibridizarea: 12-24 h, 45-65 grade C. Apoi lamele
sunt spalate.

Etapele unui experiment microarray

5.

Achizitia de imagini (scanarea) si cuantificarea


expresiei genice

6.

Crearea unei baze de date, filtrarea si normalizarea

7.

Bioinformatica: analize statistice, analiza legaturilor


dintre date, data mining (Pattern-uri similare a
expresiei genice in diferite experimente

Procesul de productie microarray


Construirea chip-ului:
Cantitati masive de
produsi PCR (cADN)
sau OLIGO

PURIFICARE si
PREPARARE

PREPARARE SLIDE-URI

PRINTARE

Preparare ARN:

POST PROCESARE

CELULE/TESUT

HIBRIDIZAREA

IZOLARE ARN
ANALIZA DATELOR

OBTINEREA cADN

MARCAREA
PROBELOR

Tipuri de suporturi microarray


Pentru fabricarea suporturilor microarray sunt folosite mai multe metode:
- "depozitarea": probele (oligo, cDNA) sunt inainte sintetizate, apoi depozitate (spotted)
pe suprafata unui suport de sticla
- "printarea": secventele ce reprezinta o anumita gena sunt sintetizate direct pe
suprafata sticlei , oligonucleotida cu oligonucleotida
- fotolitografia pe substrat de siliciu, unde sunt adaugate nucleotidele una cate una
- electrochimic, pe anumiti microelectrozi
Miniaturizate: densitate foarte mare (1.300.000 oligonucleotide/cm2)

Microarray cu mii de
oligonucleotide "printate" pe
o lama de sticla, nylon,
plastic, etc.

Spotted glass slide


microarrays

Affymetrix GeneChip system


(printing microarray)

Avantaje
Pret scazut per array
Selectarea specifica a genelor (custom)
Orice specie poate fi analizata
Hibridizare competitiva
Sistem deschis al arhitecturii aparatului

Avantaje
Productia de linie
Un numar mare de gene
Numeroase specii

Dezavantaje
Management-ul clonelor (numeroase)
Controlul calitatii
-Datele obtinute pot fi variabile
-Uneori se pot desprinde nucleotide,
daca nu sunt bine aderate

Dezavantaje
Costul sistemului de analiza
Costul chip-ului
Limitarea particularizarii/ajustarii

Construirea chip-ului microarray

Arrayed Library
(96 or 384-well plates of
bacterial glycerol stocks)

Spot as microarray
on glass slides

PCR amplification
Directly from colonies with
SP6-T7 primers in 96-well
plates

Consolidate into
384-well plates

Camera de hibridizare
3XSSC
HYB CHAMBER
ARRAY
LIFTERSLIP
SLIDE
LABEL

SLIDE LABEL

Umiditate
Temperatura
Formamida (scade
temperatura de melting)

cDNA microarrays
cDNA B
Cy3 labeled

cDNA A
Cy5 labeled

Laser 1

Hybridization

Laser 2

Scanning

Analysis

Image Capture

Analiza imaginilor obtinute

Analiza datelor microarray

Analiza: Scatter plots, significance analysis, clustering, pathway analysis


Stabilirea intensitatii fluorescentei in probe experimentale vs. normal;

Normal vs. Normal

Normal vs. Tumor

De ce am analiza atat de multe gene?


Deoarece simpla secventirere a unui genom nu este de ajuns. Exista mii de gene cunoscute,
dar despre care nu stim absolut nimic, carora nu li s-a asociat o anumita functie in celula.
De asemenea, deseori un cluster de gene poate detine mai multa informatie in ce priveste
functionalitatea celulei, per total, decat analiza unei singure gene in particular

Bioinformatica
-

Este un domeniu in sine de analiza


Trebuie realizata de catre oameni specializati
Presupune o cunoastere aprofundata a genelor, a cailor biochimice, a notarii
genelor, cailor de semnalizare, a traficului intracelular, etc
Se folosesc software-uri speciale, precum Spotfire, Genesifter, Genespring

Aplicatii ale Microarray

Identificarea de noi gene implicate in progresia bolilor si in raspunsul la


tratament

Identifiarea efectelor secundare si a profilului de reactie la diferite


medicamente

Extragerea de informatii prognostice (ex. Clasificarea tumorilor in functie


de sute de parametri, comparativ cu doar 2 sau 3 parametri in prezent)

Identificarea de noi tinte terapeutice si accelerarea descoperirii si testarii


de noi medicamente

Genotipare

Atribuirea de functii anumitor gene (pt. 90% din genele noastre nu le-a
fost atribuita nici o functie)

Stratificarea pacientilor (farmacogenomica)

Identificare microbiana

Medicina personalizata

Medicina de precizie (discurs Barak Obama 2015)

Secventierea ADN

Secventierea ADN este o aplicatie ce utilizeaza un


cumul de metode si tehnologii de biologie moleculara
cu scopul de a determina succesiunea de nucleotide
intr-o secventa ADN.

Secventierea Sanger
1975 Frederick Sanger si Alan Coulson propun secventierea
enzimatica

Secventierea Maxam-Gilbert
19761977 Walter Gilbert si Allan Maxam au dezvoltat
secventierea prin degradare chimica

Secventierea Maxam-Gilbert
19761977 Allan Maxam si Walter Gilbert au dezvoltat secventierea
prin degradare chimica ce implica:

- marcarea radioactiva a ADN monocatenar


- 32P
- modificarea chimica a bazelor azotate
- dimetil sulfat G
- dimetil sulfat in acid formic A+G
- hidrazina C+T
- hidrazina in 2mM NaCl C
- clivajul chimic specific al bazelor azotate
- piperidina
- electroforeza in gel de poliacrilamida
- autoradiografie

Cathode (-)

Anode (+)

Secventierea Sanger - sinteza enzimatica


1975 Frederick Sanger si Alan Coulson
Etape de lucru:
1.
Amplificarea secventei ADN pentru care dorim sa aflam succesiunea de
nucleotide
1.

Purificarea ampliconilor

2.

Reactia PCR de secventiere

3.

Purificarea fragmentelor ADN obtinute

4.

Electroforeza capilara a fragmentelor ADN

5.

Interpretarea electroforegramelor

Secventierea Sanger (dideoxy, dye-terminator)


Reactia PCR de secventiere prezinta urmatoarele
componente:
ADN tinta regiune pentru care vrem sa cunoastem seventa de
nucleotide

1 singur primer
enzima de polimerizare - ADN polimeraza
dNTP deoxinucleotide
ddNTP marcate radioactiv/fluorescent - dideoxinucleotideactioneaza ca terminatori de catena
tampon de reactie si cationi

ddNTP:
- NU prezinta gruparea OH in pozitia 3 a pentozei si de aceea nu se mai
poate atasa un alt nucleotid

3130 Genetic Analzyer (Applied Biosystems)

Sistem automat de
umplere cu polimer
Sistem de capilare

Recipient cu polimer

Anod

Fereastra de detectie

Dispozitiv incarcare
probe, catod

Cuptor

Pirosecventierea
Este o tehnica de secventiere propusa in anul 2000
Nu include reactia PCR ciclica si nu necesita
electroforeza
Componentele reactiei:

ADN tinta
1 Primer
Tampon de reactie
4 Enzime

Enzime:
ADN polimeraza
catalizeaza incorporarea
nucleotidelor
ATP sulfurilaza
converteste pirofosfatul in
ATP in prezenta APS
(adenozin 5 fosfosulfat)
Luciferaza oxideaza
luciferina in prezenta ATP
si genereaza lumina
Apiraza degradeaza
nucleotidele neincorporate
si excesul de ATP

https://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGF
e0aA

Cromatograma = electroforegrama

Interpretarea secventelor ADN


- bioinformatica NCBI - National Center for Biotechnology Information
include:
baze de date:
Nucleotide
Gene
Proteine

motoare de cautare BLAST

UCSC (University of California Santa Cruz) motor de cautare


BioEdit

Secventiere de noua generatie (NGS)


next-generation sequencing

VA MULTUMESC PENTRU ATENTIE!