NTRODUCERE ............................................................................. 6 CAPITOLUL 1. ............................................................................... 7 Prezentarea principiilor metodei de clonare i exprimare a genelor n sistem procariot ........................................................................... 7 1.1. Amplificarea genei de interes. .............................................. 8 1.2. Enzime de restricie ................................................................ 14 1.3. Ligarea fragmentelor de ADN ................................................ 16 1.4. Vectori de clonare ................................................................... 17 1.5. Introducerea moleculelor recombinate n celule gazd .......... 22 1.6. Electroforeza acizilor nucleici ................................................ 24 1.7. Exprimarea genelor n sistem procariot .................................. 30 1.8. Purificarea proteinelor recombinate ....................................... 32 1.9. Utilizarea clonrii de gene i exprimrii de proteine recombinate n studii interdisciplinare .......................................... 34 CAPITOLUL 2. ............................................................................. 37 Tehnici moleculare utilizate in selecia asistat de markeri genetici ....................................................................................................... 37 2.1. TEHNICA PCR ..................................................................... 37 2.2. VARIANTE ALE TEHNICII PCR ........................................ 41 2.2.1. Tehnica RFLP ...................................................................... 41 2.2.2. Tehnica AFLP...................................................................... 44 2.2.3. Tehnicile MAAP.................................................................. 48 2.2.3.1. Tehnica RAPD .................................................................. 49 3
2.2.3.2. Tehnica DAF .................................................................... 52 2.2.3.3. Tehnica AP PCR ............................................................ 52 2.2.4. Tehnica RT PCR ............................................................... 53 2.2.5. Tehnica microsateliilor - SSR ............................................ 54 2.2.6. Tehnica EST ........................................................................ 55 2.2.7. Tehnica SCAR ..................................................................... 56 2.2.8. Tehnica SNP ........................................................................ 56 2.2.9. Tehnica STS ........................................................................ 57 2.2.10. Tehnica ARMS PCR ....................................................... 58 2.3. TEHNICA SSCP ................................................................... 59 2.4. TEHNICI BAZATE PE SECVENIERE .............................. 60 CAPITOLUL 3. ............................................................................. 64 Aplicaii ale tehnicilor de biologie molecular n studii interdisciplinare ............................................................................. 64 3.1. Clonarea genelor pentru aminoacid dehidrogenaze ................ 64 3.2. Producerea de proteine recombinate ....................................... 66 3.3. Msurarea activitii enzimatice a enzimelor ......................... 67 3.4. Sinteza de aminoacizi marcai cu 15 N ..................................... 69 3.5. Purificarea aminoacizilor sintetizai ....................................... 70 3.6. Analiza aminoacizilor sintetizai prin spectrometrie de mas 71 3.7. Sinteza de aminoacizi marcai ................................................ 72 3.8. Tendine actuale n aplicarea bionanotehnologiilor................ 75 3.9. Aplicaii ale bionanotehnologiilor .......................................... 75 3.10. Diagnostic ............................................................................. 76 CAPITOLUL 4. CULTURI CELULARE ..................................... 81 4
4.1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale ..................... 81 4.2. Culturi primare ....................................................................... 83 4.3. Culturi secundare .................................................................... 83 4.4. Culturi de celule imortalizate ................................................. 84 4.5. Prezentarea informaiilor care se pot obine pe diferite sisteme de studiu ......................................................................................... 84 4.6. Anticorpii monoclonali ........................................................... 85 4.7. Celule stem ............................................................................. 88 CAPITOLUL 5. ............................................................................. 92 Aparatajul disponibil i stabilirea parametrilor optimi de funcionare pentru diverse tipuri de experimente .......................... 92 5.1. Echiparea laboratorului de culturi celulare ............................. 92 5.2. Strategii de lucru ..................................................................... 95 5.3. Instruirea personalului ............................................................ 97 5.4. Asigurarea asepsiei i antisepsiei ........................................... 98 5.5. Cultivarea celulelor ................................................................. 99 5.6. Separarea prin centrifugare a celulelor din mediul de cultur i stabilirea viabilitii acestora ....................................................... 100 5.7. nghearea i dezghearea celuluor ....................................... 101 5.8. Subclonarea i tripsinizarea .................................................. 103 CAPITOLUL 6. Producerea i izolarea proteinelor recombinate din celule mamifere ........................................................................... 104 6.1. Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizai ................. 105 6.2. Recomandri pentru abordarea de noi tipuri de experimente i metodologii a culturilor celulare. ................................................. 111 CAPITOLUL 7. ........................................................................... 119 5
Cromatografia i cromatofocalizarea. Principii i metode .......... 119 7.1. Cromatografia de schimb ionic............................................. 119 7.2. Filtrare pe gel sau gel filtrarea. ............................................. 121 7.3. Interaciunea hidrofob ......................................................... 124 BIBLIOGRAFIA ......................................................................... 126
6
NTRODUCERE Clonarea genelor a devenit o tehnic indispensabil n laboratoarele de biologie molecular. Tehnica PCR sau reacia n lan a polimerazei, dezvoltat la mijlocul anilor 80, a revoluionat genetica molecular, fcnd posibil studierea i analiza genelor prin metode mult mai accesibile i uneori foarte simple. Una dintre aplicaiile clonrii genelor, importante nu numai pentru biologie, dar i pentru studii interdisciplinare, este utilizarea clonrii n scopul obinerii de proteine recombinate. Astfel, clonarea genelor i exprimarea lor n celule gazd reprezint o surs foarte preioas de proteine. Ulterior, aceste proteine recombinate pot fi purificate prin metode cromatografice, unde biomoleculele sunt etalonate folosind tehnici cromatografice care le separ potrivit diferenelor n proprietile lor biochimice specifice. Se disting cateva variaiuni ale tehnicilor cromatografice ca gel filtrarea, interaciunea hidrofob, afinitatea cromatografic si faza cromatografic revers. In aceasta ediie, in paralel cu biosinteza proteinelor la procariote, prezentm producerea si izolarea proteinelor recombinate din celule eucariote, cum ar fi culturile celulare primare, secundare, producerea anticorpilor monoclonali si policlonali, utilizarea celulelor stem in propagarea ADN-ului manipulat genetic. In final, tendinele actuale n aplicarea bionanotehnologiilor sunt prezentate, prin aplicaii in diagnosticul molecular, implicaii in medcina legala, genetica umana, markerii genetici, si diverse aspecte practice ale geneticii moleculare interdisciplinare. Aceasta ediie are ca auditoriu-inta tineri specialiti in biologia molecular si genetica aplicat cu aspiraii nalte spre realizri de performana n domeniul ales. 7
CAPITOLUL 1. Prezentarea principiilor metodei de clonare i exprimare a genelor n sistem procariot ADN n sine are doar dou funcii importante i anume pstrarea informaiei genetice i furnizarea acesteia pentru biosinteza de proteine. Pstrarea include transmiterea materialului genetic nemodificat de la o generaie la alta. Acest fapt este realizat prin replicarea ADN-ului i mprirea egal a celor dou copii n timpul diviziunii celulare. A doua funcie este legat de descifrarea informaiei pentru biosinteza de proteine. Mesagerul informaiei ntre ADN i proteine este ARN-ul, care este sintetizat n procesul de transcriere a ADN de ctre o enzim numit ARN polimeraza. ARNm rezultat servete ca matri n procesul de traducere a ADN-ului, prin biosinteza proteinelor, care are loc n ribozomi. Practic ARN-ul este purtatorul informaiei din nucleu n citoplasm unde are loc biosinteza proteinelor. Dogma central a biologiei moleculare presupune transmiterea unidirecional a informaiei de la ADN la proteine, prin intermediul ARN. Informaia genetic nu poate fi transmis invers, de la proteine la ADN. Uneori, informaia genetic poate fi transmis de la ARN la ADN n cazul retrovirusurilor la care materialul genetic este ARN. Nu exist cazuri de transmitere a informaiei de la ADN direct la proteine [2]. Clonarea genelor const n izolarea unei gene dintr-un genom i introducerea ei n alte celule gazd pentru multiplicare i n unele cazuri pentru exprimare. Prin multiplicarea celulelor cu genele clonate se pot 8
obine milioane de copii ale unei singure gene. Sumar, procesul clonrii const din urmtoarele etape: amplificarea genei de interes introducerea genei de interes ntr-un vector de clonare introducerea moleculelor recombinate n celule gazd selecia celulelor transformate (purttoare ale moleculei recombinate) verificarea moleculelor recombinate 1.1.Amplificarea genei de interes. O gen este considerat orice fragment de ADN care se transcrie ntr-o molecul de ARN. Moleculele de ARN rezultate n urma transcrierii pot fi mprite n 2 categorii: ARN funcional si ARN informaional. ARN funcional este ARN care nu se traduce, ndeplinete anumite funcii n celul (n cea mai mare parte particip la procesul de traducere) i ocup cea mai mare parte din ARN total din celul: ARN ribosomal (ARNr) i ARN de transport (ARNt). Pentru asamblare in ribosomi maturi ARNr are nevoie de proteine ribosomale structurale si de ARN chaperoni [18]. ARN informaional este ARN mesager (ARNm) care codific un polipeptid i servete ca matri n procesul de traducere (biosintez a proteinelor). De cele mai multe ori genele de interes care sunt scopul clonrii codific un polipeptid. n alte cazuri scopul clonrii nu este obligatoriu o gen, ci un fragment de ADN care nu poate fi separat dintr-un amestec heterogen de molecule apropiate ca mrime. Din 9
aceast cauz n continuare se va utiliza doar termenul fragment ADN de interes pentru a evita confuziile [2]. Deoarece fragmentul ADN de interes sau int se afl ntr-un genom este necesar extragerea acestuia. Exist dou modaliti de a obine fragmentul dorit, fie prin tierea acestuia din genom, fie prin copierea acestuia. Tierea fragmentului din genom este mai dificil deoarece necesit prezena unor situsuri (secvene specifice) la capetele fragmentului, care necesit apoi o izolare din amestecul de fragmente generate, iar numrul moleculelor deci i cantitatea de ADN este mic. A doua opiune de copiere a fragmentului din genom este cea mai des utilizat. n acest scop se utilizeaz tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction) [44]. Aceast tehnic poate fi considerat un adevrat copiator de gene. Tehnica este pe larg utilizat, este rapid i sensibil deoarece necesit cantiti foarte mici de ADN matri. O condiie obligatorie pentru o amplificare reuit este cunoaterea secvenei int, n special la capetele acesteia. Dac secvena este necunoscut, atunci se vor analiza cel puin secvene ADN omoloage de la alte specii sau secvena de aminoacizi a proteinei dac este vorba despre o gen. Principiul tehnicii PCR este o imitaie a procesului de replicare a ADN care are loc n celule. Dac n celule pentru replicare se folosete o ntreag serie de proteine, aici rolul unora dintre ele este preluat de unii factori fizici, cum ar fi spre exemplu denaturarea ADN [2]. Denaturarea ADN presupune separarea celor dou catene. Procesul este reversibil, catenele complementare formnd molecula 10
dublu catenar dup nlturarea agentului de denaturare. Reacia de amplificare este una ciclic, fiecare ciclu fiind alctuit din 3 etape: denaturarea ADN alinierea amorselor sinteza catenei complementare de ctre ADN polimeraza. Denaturarea ADN este necesar pentru separarea celor 2 catene. Ca agent denaturant se utilizeaz temperaturi nalte de 94-98C. Denaturarea din primul ciclu dureaz cteva minute (2-6) deoarece pentru denaturarea moleculelor de ADN genomic, care sunt foarte mari, e nevoie de mai mult timp. Etapele de denaturare dup primul ciclu sunt mai scurte, doar de 30-45 sec. Amorsele (termenul englez este primer), denumite i oligonucleotide, sunt secvene scurte de ADN monocatenar. Aceste amorse sunt complementare cu extremitile secvenei int i formeaz cu acestea poriuni scurte dublu catenare. Pentru alinierea amorselor la secvenele complementare, temperatura este cobort la 40-60C timp de cteva zeci de secunde. Aceast etap este numit de aliniere sau hibridizare. Temperatura de aliniere se stabilete la cteva grade (2-5C) mai puin dect temperatura de topire (Tm) a amorsei. Temperatura de topire se calculeaz n dependen de lungimea amorsei i de compoziia ei. Exist mai multe formule de calcul, cea mai simpl formul de calcul pentru o amors de pn n 25 de nucleotide este: Tm=4(G+C)+2(A+T), unde G, C, A i T sunt numrul de nucleotide ce conin aceste baze azotate. Numrul de G i C se nmulete dublu fa de A i T deoarece 11
ntre acestea exist trei legturi de hidrogen, n consecin moleculele bogate n G i C au o temperatur mai mare de topire [2]. Exist cteva reguli pentru construirea amorselor i anume: numrul de nucleotide este de 15-35, temperatura de topire a amorselor trebuie s fie ntre 40 C i 70C, coninutul de G i C nu trebuie s depeasc 50-55%, la captul 3' al amorsei este de dorit s fie o G sau C, deoarece ofer o stabilitate mai mare, amorsele nu trebuie s prezinte complementaritate intern, n caz contrar amorsa poate forma secvene interne dublu ca-tenare care au aspect de stem sau bucl, cele dou amorse sens (forward) i antisens (reverse) nu tre-buie sa fie complementare ntre ele, altfel se vor forma pori-uni dublu catenare sau dimeri de amorse, iar ca rezultat se vor amplifica poriunile scurte rmase monocatenare. De la aceste poriuni dublu catenare formate ntre catena matri i amorsa ADN, polimeraza poate iniia sinteza catenei complementare. ADN polimeraza catalizeaz sinteza catenei complementare n direcia 5'3' (Figura 1.1). Amorsele servesc n primul rnd la delimitarea fragmentului amplificat, dar i ca punct start pentru ADN polimeraz, care nu poate porni sinteza de la zero i are nevoie de un capt liber 3'. Iniial la originea tehnicii PCR se folosea ADN polimeraza izolat din bacteria Escherichia coli, care are activitatea optim de sintez la 37C. Cel mai mare dezavantaj al utilizrii acestei enzime era inactivarea termic n timpul denaturrii ADN. n acest fel tuburile de 12
reacie trebuiau schimbate de la o temperatur la alta i dup fiecare ciclu era nevoie de un surplus de ADN polimeraz. Astfel, amplificarea fragmentelor de ADN era una foarte costisitoare. Salvarea acestei metode a venit dup descoperirea i descrierea ADN polimerazelor de la bacteriile termofile. Enzima revoluionar n acest sens, pe larg utilizat i astzi este Taq polimeraza. Aceast enzim este o ADN polimeraz, izolat din o bacterie termofil Thermococcus aquaticus (de unde i denumirea ei), care sintetizeaz polimerizarea nucleotidelor trifosfat ntr-un lan polinucleotidic n direcia 53. Taq polimeraza are activitatea optim la 72C i nu se denatureaz la temperaturi ridicate de peste 90C foarte repede, astfel dup cteva ore la 95C pierderea de activitate este nesemnificativ. Viteza de polimerizare a Taq polimerazei este de aproximativ 1000 de nucleotide per minut. Durata elongrii necesare sinte-zei va fi n dependen de mrimea fragmentului int. Pentru un fragment de 500 de nucleotide vor fi suficiente 30 sec, iar pentru un fragment de 2000 de nucleotide dou minute [2]. Prin implementarea tehnicilor de mai sus este posibil de generat mutaii in ADN-ul genomic i plasmidic, deleii ale genelor eseniale si caracterizarea mutanilor funcionali in gene eseniale pentru viabilitatea prokariotelor [16]. 13
Figura 1.1. Reprezentarea schematic a primelor cicluri de PCR.
Un tip special de PCR este RT-PCR sau PCR de transcriere invers. Acest tip este asemntor PCR obinuit, doar c folosete o matri de ARN pentru a sintetiza ADN. Enzima responsabil de aceast sintez este transcriptaza invers, care este de fapt o ADN polimeraz ARN-dependent. Taq polimeraza este o ADN polimeraz deoarece sintetizeaz ADN i este ADN dependent deoarece utilizeaz o matri ADN pentru sintez. Transcriptaza invers a fost izolat de la virusurile care au material genetic ARN i n momentul intrrii n celul necesit sinteza unei copii a materialului su genetic. RT-PCR se utilizeaz pentru obinerea copiilor de gene eucariote care nu conin introni i analiza exprimrii de gene. n ambele cazuri se pornete de la ARNm, fiind ARN informaional care codific proteine. 14
1.2. Enzime de restricie Enzimele de restricie sau restrictazele sunt enzime care taie molecule monocatenare sau dublu catenare de ADN la anumite situsuri specifice. Ele pot fi numite cu alte cuvinte adevrate foarfece de ADN. Restrictazele recunosc doar anumite secvene scurte numite situsuri specifice de recunoatere, se fixeaz de acestea i taie legturile fosfoesterice ntre nucleotide. Aceste enzime au fost descoperite la bacterii i se presupune c funcia lor este de aprare contra bacteriofagilor (virusuri ale bacteriilor). n momentul intrrii ADN fagic n bacterii, enzimele de restricie diger aceste molecule. ADN bacterian propriu este protejat contra enzimelor de restricie prin metilarea unor baze azotate, enzimele de restricie, n general, nu taie ADN metilat. Pn acum au fost descrise 4000 de enzime de restricie de la cteva sute de specii bacteriene. Toate aceste enzime se mpart n 3 clase: I, II i III. Aceast clasificare este n dependen de cofactorul utilizat i de secvena de recunoatere. Enzimele cele mai utilizate n tehnicile moleculare sunt cele de tip II, care au secvena de recunoatere un palindrom i utilizeaz ioni de Mg 2+ ca i cofactor. Secvena palindrom este alctuit din 4-6 nucleotide i citit pe ambele catene n direcia 53 este identic. Nomenclatura enzimelor de restricie pornete de la denumirea bacteriei de la care a fost izolat. Astfel, HindIII este izolat de Heamophilus influenzae tulpina Rd, iar EcoRI de la Escherichia coli tulpina RY13 [2]. 15
Capetele libere dup tierea de ctre enzimele de restricie pot fi de 2 tipuri: coezive sau drepte. Enzima BamHI i EcoRI genereaz capete coezive dup tiere, iar enzimele SmaI i EcoRV genereaz capete drepte sau netede (Figura 1.2).
Figura 1.2. Secvenele de recunoatere pentru enzimele EcoRI (A) i SmaI (B) i capetele libere dup tiere. Locurile de restricie sunt indicate cu sgei [2].
Cu ajutorul unor programe specializate se pot alctui hri de restricie care reprezint situsurile de recunoatere pentru diferite restrictaze ntr-o secven (Figura 1.3). 16
Figura 1.3. Harta de restricie a unei gene de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. Cu cifre n parantezesunt indicate situsurile enzimelor de restricie [2]. 1.3. Ligarea fragmentelor de ADN Dei moleculele de ADN pot fi asemnate cu nite fire, acestea nu pot fi legate prin creare de noduri sau nu exist nici un lipici special. Pentru legarea fragmentelor de ADN se utilizeaz o enzim numit ADN ligaza. Aceast enzim reface legturile fosfoesterice ntre gruparea hidroxil a unui nucleotid (captul 3) i gruparea fosfat de la nucleotidul altui fragment (captul 5) (Figura 1.4). Funcia ligazei n celule vii este legarea fragmentelor n timpul replicrii, recombinrii i dup repararea ADN. Cea mai des utilizat este ADN ligaza T4 izolat din bacteriofagul T4. In aciune, ADN ligaza T4 utilizeaz ATP-ul ca i cofactor.
17
Figura 1.4. Reprezentarea schematic de legare de ctre ADN ligaz a dou fragmente ADN care au capete netede [2].
1.4. Vectori de clonare Prin vectori de clonare subnelegem molecule de ADN transportatoare ale fragmentului de ADN strin n celulele gazd. Vectorii sunt de mai multe tipuri: cosmide, bacteriofagi, plasmide i vectori artificiali. Aceti vectori sunt utilizai n dependen de scopul clonrii. Cele mai pe larg utilizate sunt plasmidele. Un plasmid este o molecul dublu catenar de ADN, care este circular, nchis i capabil de replicare autonom n celule gazd. Plasmidele comerciale utilizate pe larg sunt plasmide naturale izolate de la bacterii care au fost modificate. Plasmidele au nite secvene specifice necesare replicrii, clonrii, seleciei i uneori exprimrii genelor. Pentru replicarea autonom n celule gazd plasmidele conin secvena ori, care este originea de replicare. Nici o molecul de ADN nu poate fi replicat fr o origine de replicare. Originea de replicare este o regiune a moleculei de ADN de unde poate ncepe replicarea i care este recunoscut de anumite proteine care iniiaz replicarea. 18
O regiune foarte important ntr-un vector de clonare este Situsul Multiplu de Clonare (termenul englezesc este Multiple Cloning Site). n aceast regiune se introduce fragmentul int de ADN cu ajutorul enzimelor de restricie i a ligazei. Att vectorul ct i fragmentul ADN sunt tiate cu aceleai enzime de restricie i legate mpreun cu ajutorul ligazei. SMC conine secvenele de recunoatere pentru mai multe enzime de restricie care nu se conin n alt regiune a vectorului [2]. O alt component foarte important a plasmidelor sunt markerii de selecie care sunt de obicei nite gene, a cror produs (enzim) fac posibil selectarea celulelor cu plasmid de cele fr plasmid care sunt mai numeroase. Cei mai frecveni markeri utilizai sunt genele ce confer rezisten la antibiotice, mai corect spus produsul genei confer rezisten. Spre exemplu, -lactamaza confer rezisten la ampicilin. Plasmidele care conin gena pentru aceast enzim vor proteja celulele bacteriene de efectul antibioticului. Astfel dac un amestec de celule transformate cu plasmide care vor conine att celule cu, ct i fr plasmid, se nsmneaz pe un mediu cu ampicilin, vor supravieui doar celulele care conin plasmidul. Un alt fel de selecie este selecia celulelor transformate cu plasmid recombinat adic cu insert de cele cu plasmid fr insert. Insert se refer la fragmentul de ADN int clonat. n acest scop situsul multiplu de clonare se afl ntr-o gen ce codific o enzim. Dac n SMC nu a fost introdus niciun fragment ADN atunci gena este intact, produsul ei este o protein activ. Dac n SMC a fost introdus un 19
fragment ADN atunci gena este modificat i produsul ei este inactiv. Spre exemplu dac SMC se afl n gena lacZ care codific subunitatea a enzimei -galactozidaz, atunci produsul acestei gene mpreun cu subunitile codificate din genomul celulei gazd bacteriene vor forma o enzim activ capabil s metabolizeze un derivat al galactozei numit X-Gal (bromo-cloro-indolil galactopiranozid) care este adugat n mediu i este incolor. Dac -galactozidaza este activ atunci va metaboliza acest substrat, iar produsul format n urma reaciei va avea o culoare albastr. n acest fel coloniile rezultate dup transformare care conin vectorul fr insert vor fi albastre, iar cele ce conin vector recombinat vor fi albe, deoarece ele nu produc enzim activ capabil de metabolizarea substratului X-Gal. Un alt tip de selecie utilizeaz o enzim toxic pentru celulele bacteriene. Astfel, celulele cu plasmid fr insert au gena funcional care va provoca moartea celulelor. Celulele bacteriene care au plasmidul cu insert vor avea gena nefuncional i vor supraveui [2]. Vectorii de clonare au de obicei mrime mic, doar de cteva mii de pb i n care pot fi inserate fragmente de ADN de la 100 pb pn la 2000-5000 pb (Figura 1.5). O caracteristic important pentru plasmide este numrul de copii per celul. Vectorii de clonare mai mici au de obicei un numr mai mare de copii per celul. Acest fapt permite obinerea unei cantiti mari de ADN plasmidic dintr-o cultur mic de bacterii (din 3-5 ml de cultur se pot obine cteva g de ADN plasmidic). Pentru vectorii mai mari numrul copiilor per celul este 20
mai mic, n consecin i pentru a obine o cantitate mai mare de ADN este necesar o cantitate mai mare de cultur. Vectorii de exprimare sunt de asemenea vectori de clonare dar care ofer n plus posibilitatea exprimrii genei clonate. Plasmidele de exprimare trebuie s mai conin cteva elemente n plus fa de vectorii de clonare. Aceste elemente sunt cele care se gsesc n genom i fac parte dintr-o gen: promotorul, situsul de legare al ribosomilor, codonii START i STOP care delimiteaz cadrul deschis de citire (termenul englez este Open Reading Frame). Promotorul este o secven care se afl n amonte de gen i este recunoscut de factorii de transcriere, care se fixeaz la nivelul promotorului i iniiaz transcrierea. Numai n prezena promotorului exprimarea va fi foarte sczut, de aceea situsul de legare al ribozomilor (termenul englez este Ribosome Binding Site) este o secven care se transcrie dar care nu se traduce i care este recunoscut de ribosomi. Ribosomii se leag la acest situs i se deplaseaz de-a lungul ARNm pn ntlnesc primul codon START de unde ncepe traducerea. Codonul START la procariote este n cele mai dese cazuri AUG, urmat de codonul +2, care este necesar sa nu fie cu frecvena de decodare rara, pentru a nu ncetini miscarea in vivo a ribosomilor pe mARN [17]. Aceti doi codoni sunt de obicei inclui n situsul multiplu de clonare, sau se pot introduce n fragmentul int cu ajutorul amorselor. In contrast, codonul STOP (UAA, UGA) este inclus de obicei n situsul de clonare. Unerori UGA poate fi recodat in selenocisteina [75]. n unele cazuri UAA este prezent dup regiuni care codific anumite aa-zisele etichete. Acestea din urm faciliteaz 21
purificarea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. Cele mai des utilizate sunt eticheta de 6 histidine (His-tag), Glutation S- transferaza (GST) i proteina de legare a maltozei (Maltose Binding Protein, MBP este termenul n englez). Aceste etichete vor fi parte integrant a proteinelor la captul ei C-terminal sau N-terminal dac secvena ce codific eticheta este prezent dup sau nainte de situsul de clonare respectiv. Etichetele vor conferi proteinelor recombinate afinitate fa de anumite rini cromatografice [2].
Figura.1.5 Reprezentarea a plasmidei pTN48 [9].
22
1.5. Introducerea moleculelor recombinate n celule gazd Introducerea plasmidelor recombinate n celule gazd se numete transformare dac sunt utilizate celule bacteriene sau transfecie dac sunt utilizate celule eucariote. n continuare se va detalia doar transformarea celulelor procariote, acestea avnd cea mai mare aplicabilitate i simplitate n scopul obinerii clonelor i proteinelor recombinate. Exist dou tipuri de transformare a celulelor bacteriene pe larg utilizate n laboratoarele de biologie molecular: transformarea chimic transformare sub influena cmpului electric. Ambele tipuri de transformare necesit inducerea unei competene de transformare, deoarece E. coli nu are proprieti de transformare natural. Aceast competen n cazul transformrii chimice este indus cu CaCl 2 . n acest scop se realizeaz o cultur de E. coli i prin tratarea celulelor cu clorur de calciu la rece se poate induce transformarea celulelor bacteriene (Figura 1.6A). Apoi celulele sunt ocate termic foarte scurt, timp de maxim dou minute, la 42C. Acest timp este suficient pentru intrarea moleculelor recombinate n celulele bacteriene. Transformarea n cmp electric este mai eficient dect transformarea chimic. Prepararea celulelor competente presupune doar creterea lor pn n faza logaritmic (D 600nm =0,6 - 0,8) i nlturarea prin splri repetate a mediului de cultur. Aceste splri repetate vor asigura eliminarea ionilor care pot afecta transformarea. Pentru acest tip de transformare este necesar un aparat numit electroporator, care va 23
crea cmpul electric ntre doi electrozi. Amestecul de celule competente i plasmide recombinate vor fi depuse ntr-o cuv special de electroporare, ai crei perei laterali sunt electrozii. Transformarea are loc la o tensiune de 1800 sau 2500 V timp de cteva msec (Figura 1.6B). Dup transformare celulele ocate sunt preluate n mediu de cultur i apoi nsmnate pe mediu selectiv cu antibiotice [2]. Doar unele celule bacteriene sunt transformate, cea mai mare parte dintre ele fiind netransformate, adic fr plasmid. Eficiena de transformare a celulelor se poate msura efectund o transformare cu o cantitate de 1 ng de ADN plasmidic i apoi numrnd coloniile rezultate. Numrul de colonii va corespunde numrului de celulele transformate deoarece fiecare colonie ia natere dintr-o singur celul. Numrul obinut de la transformarea a 1 ng de ADN plasmidic se raporteaz la 1 g de ADN (nmulind valoarea la 1000). O eficien bun de transformare este 10 6 , ceea ce nseamn ca la transformarea unui g de plasmid s-ar obine 1 milion de colonii, o valoare foarte mare innd cont de faptul c avem nevoie de o singur colonie sau de cteva cnd avem un amestec eterogen de molecule int. Desigur n amestecul de ligare numrul de molecule recombinate este mic i din aceas-t cauz este recomandat o eficien ct mai mare a celulelor competente. Fiecare dintre cele dou metode de transformare prezint avantaje i dezavantaje legate de eficiena de transformare i de costuri. Transformarea chimic este mai puin eficient dect electroporarea, dar mai ieftin deoarece nu necesit aparataj i cuve costisitoare. 24
Figura 1.6. Transformarea celulelor bacteriene cu ADN plasmidic [2]. A transformarea chimic cu CaCl 2 ; B electroporarea celulelor bacteriene.
1.6. Electroforeza acizilor nucleici Electroforeza este procesul de migrare a moleculelor cu sarcin ntr-un cmp electric. Migrarea moleculelor se realizeaz printr-o matrice specific. Metoda este aplicat pentru analiza proteinelor i a acizilor nucleici. Pentru proteine se aplic cel mai des electroforeza proteinelor n condiii denaturante n gel de poliacrilamid (termenul englezesc SDS-PAGE). Poliacrilamida se poate utiliza ca matrice i pentru electroforeza acizilor nucleici care ofer o rezoluie foarte bun a separrii fragmentelor de ADN, mai ales n cazul fragmentelor mici. Aceast matrice este folosit mai rar n laboratoarele de analize genetice, deoarece este mai laborioas. Primul loc n utilizarea vizualizrii acizilor nucleici aparine electroforezei n gel de agaroz. 25
Dei metoda ofer o rezoluie inferioar celei din poliacrilamid, ea este utilizat cu succes deoarece este mai simpl. Moleculele de acizi nucleici sunt ncrcate negativ datorit gruprilor fosfat. Aceast sarcin face posibil migrarea moleculelor de ADN i ARN ntr-un cmp electric de la catod la anod. Amestecul de molecule nu se va deplasa n cmp electric cu aceeai vitez. Moleculele mici se vor deplasa mai repede prin porii matricei, iar cele mai mari vor avansa mai lent. Astfel separarea moleculelor va fi n dependen de masa lor molecular. Pentru estimarea aproximativ a mrimii fragmentelor n acelai gel, dar n godeu separat se va migra un amestec de molecule cu mase moleculare diferite dar cunoscute. Acest amestec de molecule se numete marker molecular ADN. Agaroza este un poliglucid extras din alge marine roii. Gelurile de agaroz se realizeaz prin nclzirea agarozei ntr-un tampon specific. Concentraia agarozei n gel poate fi ntre 1% i 3% n dependen de scopul urmrit. Cu ct concentraia agarozei este mai mare, cu att mrimea porilor va fi mai mic. La concentraii mai mici de agaroz, porii vor fi mai mari i migrarea moleculelor mai rapid. n concluzie concentraii mai mici se folosesc pentru fragmente mari (cteva mii de pb), iar concentraii mari pentru fragmente mici. Gelurile de agaroz de 1% sunt cel mai des utilizate, oferind separarea moleculelor ntre 0,1 i 10 kpb. Gelurile de agaroz sunt plasate ntre cei doi electrozi n cuve speciale care conin tampon de migrare. Acest tampon este acelai folosit i pentru realizarea gelului. Cele mai folosite tampoane sunt TAE (Tris/Acetat/EDTA) i TBE (Tris/Borat/EDTA). 26
Deoarece ADN nu poate fi vizualizat cu ochiul liber este necesar utilizarea unui colorant. Cel mai des folosit n acest scop este bromura de etidiu, care fixat de ADN n lumin ultraviolet devine fluorescent i are o culoare portocalie (Figura 1.7). Bromura de etidiu se intercaleaz ntre bazele azotate din molecula dublu catenar de ADN. Lungimea de und a luminii ultraviolete la care este expus gelul trebuie s fie cuprins ntre 260 i 300 nm.
Figura 1.7. Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei n gel de agaroz. Electroforeza n gel de agaroz este utilizat pentru vizualizarea i purificarea ADN. Vizualizarea ne ofer informaii despre integritatea ADN (ADN genomic, ADN plasmidic etc), rezultatul digestiilor enzimatice, estimarea cantitii de ADN obinut n reaciile PCR sau de extracie. ADN poate fi purificat din gel de agaroz dup migrare prin 27
excizarea fragmentului int i purificarea din gel cu kituri special predestinate acestui tip de purificri [2].
Verificarea moleculelor recombinate Rezultatul ligrii i transformrii se poate vedea doar dup 12- 18 ore de la transformare cnd apar coloniile de E. coli pe mediu selectiv. Apariia coloniilor nu indic neaprat i o reuit deplin a clonrii, deoarece acestea pot conine un amestec de colonii pozitive i colonii cu plasmid fr insert. Chiar dac se folosete un sistem alb- albastru de selecie a coloniilor pozitive, acestea necesit totui o dovad n plus a prezenei plasmidului recombinat. n acest scop se va efectua o cultur lichid de 3-5 ml de mediu cu antibiotic care se va nsmna cu o singur colonie. Cultura se va incuba peste noapte cu agitare la 37C. Ziua urmtoare din bacteriile rezultate se va purifica ADN plasmidic cu ajutorul unor metode clasice sau cu ajutorul unor kituri speciale. ADN plasmidic urmeaz a fi analizat iniial prin digestie enzimatic i apoi prin secvenializare. Digestia ADN plasmidic se va realiza cu enzimele de restricie cu care acesta a fost introdus n vector sau care se afl la extremele situsului multiplu de clonare. Aceast digestie va confirma prezena insertului n plasmid i aproximativ mrimea acestuia, dar nu va furniza nicio informaie despre secvena fragmentului clonat. Secvenierea fragmentului int este verificarea definitiv a clonrii. Aceast verificare este necesar deoarece ADN polimeraza utilizat pentru amplificarea insertului prin PCR poate introduce erori 28
de sintez. Pentru a evita erorile n produii PCR se poate utiliza o ADN polimeraz care are proprietatea de a corecta erorile introduse. Astfel de ADN polimeraze sunt Vent polimeraza, Pfu polimeraza, Tli polimeraza . a. Taq polimeraza nu are activitate de corectare a erorilor, dar asigur de obicei randamente de sintez mai mari. n unele cazuri se utilizeaz un amestec de 2 polimeraze (3 pri de Taq polimeraz i o parte Pfu polimeraz) pentru a combina un randament mai mare cu o fidelitate crescut [2]. Analizatoarele genetice din seria ABI Prism, produse de Applied Biosystems (SUA), au laser cu detecie pentru 5 fluorocromi, i n actiunea sa utilizeaz principiul Sanger de secveniere. Acest principiu presupune utilizarea unei variante de PCR pentru secveniere. Matria ADN ce urmeaz a fi secveniat este denaturat, apoi la unul din capetele sale are loc ataarea unei amorse de la care ADN polimeraza va porni sinteza catenei complementare. Amestecul PCR conine dezoxiribonucleozide trifosfat (dNTP) dar i di-dezoxiribonucleozide trifosfat (ddNTP) care nu conin gruparea OH n poziia 3' a dezoxiribozei. Lipsa acestei grupri va face imposibil continuarea sintezei ADN, deoarece ADN polimeraza nu poate aduga urmtorul nucleotid. Rezultatul acestui PCR vor fi fragmente monocatenare (deoarece se folosete o singur amors) de diferite mrimi. Numrul de cicluri este de 40, ceea ce permite sinteza tuturor fragmentelor care se opresc n toate punctele matriei de ADN. Pentru detecia fragmentelor, fiecare ddNTP este marcat cu un fluorocrom. Amestecul de fragmente rezultate sunt separate cu ajutorul electroforezei capilare, care 29
presupune utilizarea unui capilar cu un diametru de ordinul micrometrilor. O cantitate de civa microlitri vor fi separai n gelul din capilar. Migrarea fragmentelor n gel este n dependen de mrimea lor, cele mai mici vor fi primele, iar la final cele mai mari. n ultima parte a capilarului exist o fereastr transparent prin care un fascicol laser va excita fluorocromii, iar fluorescena emis va fi captat i prezentat sub forma unei electroforegrame (Figura 1.8). Electroforegramele sunt apoi analizate i comparate cu secvena existent n bazele de date. Mrimea fragmentelor de ADN care pot fi secvenializate variaz ntre 600 i 800 pb. Pentru fragmente mai mari sau pentru matrie dificile (cu secvene repetitive) este necesar utilzarea unor kituri speciale [2].
Figura 1.8. Electroforegrama unei secvene obinut cu ajutorul analizorului ABI Prism 310. 30
1.7. Exprimarea genelor n sistem procariot Clonarea genelor vizeaz n principal dou obiective posibile: multiplicarea unui fragment ADN sau exprimarea genei clonate. Clonarea n scopul multiplicrii fragmentului este utilizat atunci cnd ADN supus analizei este de fapt un amestec de fragmente care nu pot fi separate cu ajutorul electroforezei i la care se urmrete cunoaterea secvenei. n acest scop amestecul de fragmente se cloneaz ntr-un vector de clonare, iar clonele pozitive sunt apoi secvenializate. Celulele de E. coli sunt utilizate pe larg n obinerea de proteine recombinate. Ele pot fi numite adevrate fabrici de proteine la comand, care ns cteodat refuz s sintetizeze proteinele comandate i de ce cele mai dese ori strine celulei bacteriene. Clonarea n scopul exprimrii genei i obinerii de protein recombinat include cteva aspecte care sunt importante pentru exprimare. Gena codificatoare poate fi clonat direct n vectorul de exprimare. Plasmidele de exprimare conin neaprat un promotor recunoscut de ARN polimeraza celulei gazd, un situs de legare a ribosomilor (rbs), un codon START (AUG) i unul STOP la capetele situsului multiplu de clonare. Foarte important n acest caz este pstrarea cadrului deschis de citire, adic mprirea exact pe codoni a genei de la primul codon tradus pn la ultimul. Promotorii din aceste tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Cel mai des utilizat inductor este IPTG (isopropyl--D-thiogalactopyranosid), care este un analog al galactozei. Spre exemplu, vectorii de tip pET de la Novagen asigur de obicei o supraexprimare a genelor clonate. Plasmidul pET21 conine promotorul de la fagul T7, situsul de 31
recunoatere a ribosomilor, codonul START n situsul multiplu de clonare i codonul STOP dup o etichet de 6 histidine. Dac se opteaz pentru prezena unei etichete 6His la captul C-terminal a proteinei pentru facilitarea purificrii, atunci din gen se va nltura codonul STOP. Dac aceast etichet nu este necesar, atunci n gen se va pstra codonul STOP i traducerea se va opri nainte de etichet. Promotorul T7 nu este recunoscut de ctre ARN polimeraza de la E. coli i simpla prezen a plasmidului n celulele bacteriene nu va sigura o exprimare a genei. Vectorii pET necesit tulpini de E. coli care conin gena pentru ARN polimeraz de la fagul T7. Aceast gen se afl sub controlul promotorului lac UV5 i a operatorului lac. Operatorul lac este o secven recunoscut de ctre o protein numit represorul lac. Atunci cnd n mediu nu exist lactoz (sau analogi ai lactozei) represorul lac se fixeaz la operatorul lac i mpiedic transcrierea genei pe care o regleaz, care n acest caz este gena pentru T7 ARN polimeraz. n absena T7 ARN polimerazei nu va exista nici transcrierea genei int din plasmid. Represorul lac este codificat de gena lacI care se afl att n genomul bacteriei gazd ct i n plasmidul de exprimare. Agentul care induce exprimarea este un analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixeaz de represorul lac i cauzeaz disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care va transcrie gena pentru T7 ARN polimeraz. Aceasta din urm va recunoate promotorul T7 din plamsid i va transcrie gena int. Acest sistem de exprimare este unul foarte puternic i care poate asigura o 32
producie de protein care va alctui pn la 50% din proteinele totale bacteriene. Operatorul lac este o secven recunoscut de ctre o protein numit represorul lac. Atunci cnd n mediu nu exist lactoz (sau analogi ai lactozei) represorul lac se fixeaz la operatorul lac i mpiedic transcrierea genei pe care o regleaz, care n acest caz este gena pentru T7 ARN polimeraz. n absena T7 ARN polimerazei nu va exista nici transcrierea genei int din plasmid. Represorul lac este codificat de gena lacI care se afl att n genomul bacteriei gazd ct i n plasmidul de exprimare. Agentul care induce exprimarea este un analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixeaz de represorul lac i cauzeaz disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care va transcrie gena pentru T7 ARN polimeraz. Aceasta din urm va recunoate promotorul T7 din plamsid i va transcrie gena int. Acest sistem de exprimare este unul foarte puternic i care poate asigura o producie de protein care va alctui pn la 50% din proteinele totale bacteriene [2]. 1.8. Purificarea proteinelor recombinate Proteinele recombinate pot fi purificate prin metode cromatografice. Pentru o purificare ct mai bun din amestecul total de proteine este necesar purificarea n cel puin dou etape prin metode cromatografice diferite. Ataarea unor etichete la proteinele recombinate asigur purificarea proteinelor ntr-o singur etap, ceea ce reduce timpul 33
necesar i asigur randamente de purificare mai mari (Figura 1.9). Dac eticheta deranjeaz n analiza ulterioar a proteinei, atunci se poate recurge la nlturarea acesteia prin digestie cu peptidaze. n acest scop pentru clonare i exprimare se va alege un plasmid care conine situsul pentru peptidaz, cum este spre exemplu situsul pentru trombin n cazul plasmidului pET28 [2].
Figura 1.9. Reprezentarea schematic a purificrii de proteine recombinate prin cromatografie de afinitate.
34
1.9. Utilizarea clonrii de gene i exprimrii de proteine recombinate n studii interdisciplinare Clonarea genelor n ultimii ani a devenit o tehnic indispensabil n laboratoarele de biologie molecular. Una dintre aplicaiile acestei tehnici, importante nu numai pentru biologie, dar i pentru studii interdisciplinare este utilizarea ei n scopul obinerii de proteine recombinate. Clonarea genelor i exprimarea lor n celule gazd reprezint o surs foarte preioas de proteine. n cele mai multe cazuri purificarea unei proteine din celulele n care aceasta se exprim n mod firesc natural prezint mai multe dificulti: cantitatea de proteine n esuturi este foarte mic, spre exemplu pentru purificarea unei proteine din bacterii este necesar o cantitate de zeci de litri de cultur bacterian, iar rezultatul purificrilor n cteva etape pot fi sub 100 mg de protein; obinerea unei cantiti mari de esut pentru purificare este aproape imposibil, spre exemplu cum este cazul unor bacterii pe care nu putem s le cultivm n condiii de laborator; obinerea materialului pentru purificare implic probleme etice, cum ar fi spre exemplu cazul unor proteine umane, obinerea de proteine din celule umane ar fi imposibil; purificarea se face n mai multe etape care necesit timp, consumabile i are randamente mai mici. Aceste dezavantaje ale purificrii direct din material biologic sunt eliminate n cazul exprimrii genelor n celule gazd. Un mare avantaj al acestei metode este posibilitatea introducerii de mutaii care pot dezvlui rolul unor domenii sau aminoacizi particulari n activitatea 35
proteinei. Prin intermediul tehnicilor de mutagenez pot fi introduse mai multe tipuri de mutaii: mutaii missens care schimb un aminoacid cu altul; deleii n care poriuni ntregi din lanul polipeptidic pot fi nlturate; inserii care constau n introducerea de fragmente noi n gena codificatoare i respectiv n proteina recombinat; fuzionrii, se pot fuziona proteine ntre ele sau regiuni ale unei proteine cu regiuni ale altei proteine, spre exemplu regiunea N-terminal a unei proteine de la o specie se poate fuziona cu captul C-terminal al aceleiai proteine de la o specie nrudit; proteinele recombinate pot fi marcate. Proteinele pot fi marcate cu anumite molecule care sunt introduse n proteine n procesul lor de sintez sau pot fi fuziuni. Un exemplu n acest sens este marcarea proteinelor cu izotopi stabili sau radioactivi, n mod specific sau randomizat. Un alt exemplu este marcarea proteinelor prin fuziunea lor cu proteine fluorescente, care apoi faciliteaz detecia lor. Clonarea genelor i exprimarea lor n sistem procariot este tehnica la care se apeleaz cel mai des, deoarece este mai rapid i mai puin costisitoare. Proteinele sunt structuri cu mai multe nivele de organizare, astfel o protein are structur: primar, secundar, teriar i cuaternar. Exprimarea genelor i sinteza proteinelor n celulele procariote asigur doar structura primar exact a polipeptidului sintetizat. n unele cazuri proteinele adopt structura secundar independent dup sintez, n alte cazuri este nevoie de condiii speciale 36
i alte proteine care contribuie la adoptarea conformaiei proteinei active. Unele proteine att de la eucariote ct i de la procariote sintetizate n celule gazd de E. coli nu reuesc s adopte o structur secundar corect, iar ca rezultat polipeptidele acumulate n citoplasm formeaz corpi de incluziune. Exist cazuri cnd acumularea proteinei sub forma corpilor de incluziune este un avantaj. Corpii de incluziune ofer posibilitatea unei purificri printr-o singur etap n condiii denaturante. Proteinele denaturate purificate n acest mod pot fi utilizate pentru imunizarea de animale n scopul producerii de anticorpi. Cel mai important aspect pentru imunizare este secvena de aminoacizi a proteinei i nu structura ei secundar sau teriar. Exprimarea proteinelor sub forma corpilor de incluziune nu poate fi prezis pe baza apartenenei genei sau pe baza analizei structurii primare. O alt problem care poate aprea este neexprimarea genei. Cauzele neexprimrii pot fi toxicitatea proteinei asupra celulelor gazd. Un alt dezavantaj (dei n unele cazuri este un avantaj) este lipsa modificrilor post-traducere a polipeptidelor sintetizate n celule bacteriene. Majoritatea proteinelor de la eucariote necesit nu numai adaptri conformaionale dar i modificri post-traducere cum ar fi fosforilri, glicozilri . a. Dac prezena acestor modificri este absolut necesar, atunci se va recurge la clonarea genei n sistem procariot i exprimarea ei n celule gazd eucariote. Lipsa modificrilor post-traducere este un avantaj atunci cnd este cunoscut funcia proteinei active i se dorete s se cunoasc rolul gruprilor care sunt adugate dup sintez. n acest 37
fel proteina recombinat nu va fi modificat i se va putea deduce rolul acestor grupri n activitatea proteinei [2]. CAPITOLUL 2. Tehnici moleculare utilizate in selecia asistat de markeri genetici 2.1. TEHNICA PCR Tehnica PCR sau reacia n lan a polimerazei, dezvoltat la mijlocul anilor 80, a revoluionat genetica molecular, fcnd posibil studierea i analizarea genelor prin metode mult mai accesibile i foarte simple. Aceast tehnic a fost descoperit de Kary Mullis n anul 1983, plecnd de la caracteristicile replicrii ADN i anume, cu ajutorul enzimei ADN polimeraza care utilizeaz o caten a ADN ca matri pentru sinteza unei noi catene complementare. Prin aceast tehnic se produc un numr enorm de copii a unor secvene de ADN (gene) fr a se apela la clonare [44]. Tehnica PCR exploateaz unele caracteristici ale replicrii ADN, unde pentru amplificarea secvenei de ADN dorite se utilizeaz o secven de oligonucleotide numit primer sau amors. Primerii sunt secvene scurte de 15 35 nucleotide, complementare capetelor 3 ale secvenei de ADN ce se dorete a fi amplificat; ei sunt specifici fiecrei gene i sunt sintetizai cu ajutorul unor sintetizatoare automate de ADN. Pentru amplificarea secvenelor specifice de ADN, prin tehnica PCR, se folosete o soluie tampon (PCR buffer) n care se introduce ADN ce conine gena de interes, primerii 38
sintetizai, Taq polimeraza i cele patru tipuri de deoxinucleotid- trifosfai (dATP, dGTP, dCTP i dTTP). Tehnica PCR presupune parcurgerea a trei etape principale, ntr-un aparat n care realizarea ciclurilor termice este controlat automat de Termocycler: - Denaturarea ADN, presupune nclzirea soluiei n care se afl ADN la 940 C timp de 5 minute, efectul fiind ruperea legturilor de hidrogen i separarea celor dou catene. - Ataarea primerilor se realizeaz prin rcirea pn la 40C 60
C a soluiei n care se afl secvena de amplificat.
Primerii se leag la capetele 3a celor dou catene de ADN ale genei pe care dorim s o amplificm. De obicei, este nevoie de doi primeri numii sens i antisens, dar amplificarea se poate realiza i cu un singur primer, n cazul tehnicii PCR ancorat. - Elongaia se produce la temperatura de circa 72C, temperatur la care Taq-polimeraza funcioneaz optim, n faza de extensie, iar ciclul se repet de 25 40 ori. Amplificarea este aproximativ exponenial, realizndu- se dup 3 cicluri 2 copii, dup 10 cicluri 256 copii, iar dup 32 cicluri 1,73 miliarde copii ale secvenei supuse amplificrii [2]. Dup amplificare, gena de interes se vizualizeaz n lumin ultraviolet, la nivelul gelului de agaroz n care fragmentele au fost colorate cu bromur de 39
etidiu. Dac amplificarea s-a produs, n gel se vor observa una sau mai multe benzi, corespunztoare secvenei specifice de ADN. n tehnica PCR, alegerea primerilor este primordial i putnd fi utilizai dou tipuri de primeri: - primeri specifici - sunt dirijai spre un situs foarte precis al ADN, reprezentat de genele sau fragmentele de gene cunoscute. Prin primer specific se nelege o secven cunoscut de ADN utilizat pentru nceperea sintezei unei anumite gene, cu structur cel puin parial cunoscut. Primeri specifici pot fi dirijai i spre regiunile situate n amonte sau aval de secvenele unice, la nivelul secvenelor minisatelit sau microsatelit. Secvenele de tip satelit, specifice fiecrui individ sunt astfel amplificate. Evidenierea acestor polimorfisme se utilizeaz n momentul de fa n medicina criminalistic pentru identificarea suspecilor, pornind de la diferite mostre de esut (snge, sperm, bulbi de pr etc.), pentru marcarea crnii, sau altfel spus, urmrirea ei pe parcursul filierei de distribuie i consum. - primeri aleatori - sunt de dimensiuni reduse (n medie 10 20 nucleotide ). Alegerea secvenelor care constituie aceti primeri este complet arbitrar. n cursul reaciei PCR aceti primeri se vor hibrida de fiecare dat cnd n ADN se vor gsi secvene care le sunt complementare i de orientare opus.
40
Tehnica PCR i-a gsit aplicare n cele mai diverse domenii: - n selecia animalelor: prin stabilirea genotipurilor la locii care codific sinteza cazeinei, -lactoglobulinei, leptinei, factorului de transcripie pituitar (Pit1) care este responsabil pentru expresia hormonului de cretere la mamifere, este posibil aplicarea seleciei timpurii, reinnd la reproducie numai animalele a cror genotip se asociaz cu producii cantitative i calitative mai ridicate. - n alimentaie: se poate folosi pentru alegerea tulpinilor de levuri sau mucegaiuri ce vor putea fi utilizate ca probiotice (aditivi furajeri) n hrana animalelor. - n reproducie: se folosete pentru identificarea sexului nc din faza de embrion. Utiliznd primeri specifici pentru amplificarea unor secvene de ADN de pe heterozomul Y, se poate stabili sexul. Dac embrionul este de sex mascul (XY) se va produce amplificarea secvenei specifice de pe cromozomul Y i va putea fi vizualizat n gelul de agaroz. Dac embrionul este de sex femel (XX) nu se va produce amplificarea secvenei respective, n gelul de agaroz lipsind banda caracteristic. - n medicin: se folosete pentru identificarea unor gene mutante (oncogene), care conduc la apariia unor tumori maligne, n monitorizarea evoluiei i terapiei cancerului, n detectarea infeciilor bacteriene i virale. 41
- n institutele medico - legale: se folosete pentru determinarea paternitii, sau pentru identificarea persoanelor care s-au fcut vinovate de delicte penale: crim, viol etc [38].
2.2. VARIANTE ALE TEHNICII PCR 2.2.1. Tehnica RFLP Aceast tehnic se bazeaz pe proprietile de hibridare care exist ntre dou fragmente de ADN, prezentnd un grad nalt de omologie (RFLP- bazat pe hibridare) i tehnica PCR denumit PCR- RFLP, n care se evideniaz polimorfismele existente la nivelul situsurilor enzimelor de restricie. a) Tehnica RFLP bazat pe hibridare cu o sond, implic parcurgerea urmtoarelor etape: - extracia ADN din organismele ce urmeaz s fie analizate; - digestia ADN cu ajutorul enzimelor de restricie; - separarea fragmentelor obinute n urma digestiei, n funcie de mrimea lor, prin electroforez n gel de agaroz; - transferul ADN sub form denaturat pe o membran de nylon (Southern blotting) n care poziia relativ a diferitelor fragmente de ADN din gel se pstreaz pe parcursul transferului; - hibridarea ADN cu sonda marcat prealabil, n regiunile n care prezint omologie; 42
- vizualizarea regiunilor hibridate cu ajutorul unui film sensibil la radiaii (autoradiografie) sau cu ajutorul unei reacii enzimatice, care d o coloraie specific. n tehnica RFLP pot fi utilizate diferite tipuri de sonde, care permit evidenierea unor tipuri diferite de polimorfism. Sondele mono- sau oligogenice pun n eviden unul sau mai muli loci; ele dau un profil simplu care include cteva benzi. Utilizarea acestui tip de sonde permite vizualizarea polimorfismelor de secven, localizate la nivelul situsurilor de restricie, precum i a polimorfismelor de inserie/deleie, situate ntre situsurile de restricie. Acest tip de sond a fost utilizat pentru a alctui hri genetice la om, pentru a identifica unele varieti de mr i pentru a pune la punct un test de depistare a anemiei falciforme. Sondele poligenice sau multilocus pot fi dirijate spre zonele care prezint ariabilitate foarte mare, cum sunt secvenele de tip micro i minisatelit, alctuite de 2 pn la 16 perechi de baze, repetate n tandem. Cu ajutorul sondelor multilocus, se observ, n general un grad ridicat de polimorfism ntre genotipurile nrudite. Acest tip de sond a fost utilizat pentru prima dat de Jeffreys i colaboratorii in 1985 [33] la hibridarea cu ADN genomic uman digerat i amprentizarea genetic a fiecrui individ. Ulterior, au fost descoperite alte secvene satelit i la alte mamifere, la insecte i plante. Sondele multilocus permit evidenierea polimorfismului de secven la nivelul situsurilor de restricie, polimorfismului de inserie/deleie precum i polimorfismului determinat de numrul unitilor repetitive, pentru fiecare individ n parte [33]. 43
b) Tehnica RFLP, bazat pe PCR, utilizeaz o enzim de restricie pentru digerarea unui produs de amplificare, obinut cu primeri specifici, iar n gelul de agaroz se vor obine benzi de dimensiuni diferite, corespunztoare celor trei genotipuri (homozigoi pe una din cele dou alele i heterozigoi).
Markerii RFLP sunt markeri cu polimorfism limitat ce identific variaiile secvenei de ADN la nivelul unui situs de restricie, prin analiza RFLP. O surs abundent de markeri genetici, utilizai n tehnicile de cartare a genomului animal au la baz modificrile unor secvene de ADN care se produc la nivelul situsurilor de restricie De regul aceste variaii sunt cauzate de mutaii punctiforme (substituia unei nucleotidecu o alta), inserii sau deleii, n interiorul situsului de restricie i astfel, enzima de restricie, nu mai recunoate situsul respectiv i nu mai taie. Aceasta va determina obinerea unor fragmente de restricie de lungimi diferite (polimorfice) care pot fi uor vizualizate i identificate n gelul de agaroz datorit lungimii lor diferite. Din aceast cauz ele se vor separa n gelul de electroforez sub forma unor benzi situate n diferite regiuni. Greutatea molecular se apreciaz cu ajutorul unui ADN standard de etalonare - ladder. n practic, mrimea unui fragment ce se detecteaz prin Southern blotting este de 300 pb 15 kb cu diferene detectabile mai mici de 50 pb. 44
Prin tehnica PCR se detecteaz produi ntre 60 pb-2kb, cu diferene chiar de cteva baze. Indivizii diferii genetic pentru un anumit locus, vor prezenta fragmente de restricie de lungimi diferite, ntr-un numr diferit pentru un anumit cuplu format din sonda molecular enzim de restricie. n acest context, fiecare sistem format din ADN genomic enzim de restricie, poate defini un locus polimorf care are cel mult dou alele diferite [38]. Cu ajutorul RFLP se pot identifica variaiile genetice dintre indivizi doar la nivelul situsurilor de recunoatere a enzimelor de restricie, respectiv dintre indivizii care posed unul din cele trei genotipuri existente n locusul de interes (AA, Aa, aa) i nu se pot detecta variaiile la nivelul ntregului genom, care la mamifere este de ordinul 3x 10 9 pb. 2.2.2. Tehnica AFLP Tehnicile moleculare care permit obinerea amprentelor genetice i vizualizarea polimorfismelor, a diferenelor dintre eantioane la nivel de ADN, se bazeaz pe dou principii: hibridare cu sonde sau amplificare prin reacia PCR. Polimorfismul bazat pe numrul de repetiii n tandem, a motivelor de tip satelit, este azi cel mai utilizat n studiul diversitii genetice a raselor de animale i a soiurilor de plante. AFLP este o tehnic bazat pe punerea n eviden a polimorfismelor tot la nivelul situsurilor de restricie. Aceast tehnic a fost descris de Vos i colaboratorii n anul 1995 i se bazeaz pe amplificarea selectiv, cu ajutorul PCR, a unei categorii de fragmente obinute 45
printr-o restricie particular, care utilizeaz 2 enzime de restricie i adaptori, marele avantaj al metodei este acela c nu necesit informaii preliminare despre genom. Tehnica AFLP se bazeaz pe amplificarea selectiv a fragmentelor de restricie, obinute din ADN genomic total digerat i ea parcurge trei etape: - restricia ADN genomic i legarea adaptorilor oligonucleotidici; - amplificarea selectiv a seturilor de fragmente de restricie; - analiza fragmentelor amplificate, n gel de poliacrilamid. Pentru prepararea unei matrie AFLP, ADN genomic este izolat i digerat simultan cu 2 enzime de restricie, de exemplu: EcoRI i MseI. EcoRI are un situs de recunoatere de 6 pb (taie rar) iar, MseI are un situs de recunoatere de 4 pb (taie frecvent). Fragmentele obinute prin restricie pot fi grupate n 3 clase: - marea majoritate (90%) prezint dou situsuri MseI la extremitile lor; - aproximativ 10% prezint un situs EcoRI i un situs MseI; - cteva fragmente prezint 2 situsuri EcoRI. Procedeul AFLP se bazeaz pe detecia predominant a fragmentelor EcoRI - MseI care au o extremitate tiat cu o enzim care taie rar i o extremitate tiat de o enzim care taie des. Succesul tehnicii AFLP depinde de digestia complet a ADN genomic. Pentru aceasta trebuie acordat o importan sporit izolrii ADN de nalt calitate, intact i fr contaminri cu nucleaze sau inhibitori [39]. 46
Legarea adaptorilor, dup inactivarea prin cldur a endonucleazelor de restricie, de tip Eco RI i MseI, dublu catenari, se face la extremitile fragmentelor de ADN. Structura adaptorilor este urmtoarea: - secven nou, care va servi ca situs int pentru ataarea primerilor PCR n etapa urmtoare a AFLP; - o secven care permite restaurarea situsului de restricie; Sunt utilizate dou tipuri de adaptori: cei care restaureaz situsul EcoRI i cei care restaureaz situsul MseI. Primerii care sunt utilizai n reacia PCR nu se fixeaz pe ADN genomic, dar se vor fixa pe adaptori. Dup digestia ADN genomic i legarea adaptorilor, fragmentele de restricie vor fi amplificate prin PCR. n structura primerilor PCR vom regsi de o parte secvena adaptorilor i un situs de restricie (este acela la nivelul cruia se vor fixa primerii PCR n urmtoarea reacie PCR), iar de cealalt parte o nucleotid selectiv, adugat la extremitatea 3 a primerilor PCR. Numrul nucleotidelor selective poate varia de la 0 la 3 pe primer. Fixarea nucleotidelor specifice determin ca un singur subansamblu de fragmente de restricie s fie recunoscut i amplificat. Condiiile de reacie sunt alese de aa natur ca singurele fragmente de ADN care corespund perfect cu primerul s fie amplificate. Dac se lucreaz cu genoame complexe, cum sunt cele de la plante sau animale, PCR-ul este realizat n dou etape consecutive. n prima reacie, numit preamplificare, ADN genomic este amplificat cu doi primeri AFLP, avnd cte o singur nucleotid selectiv i produsul PCR al 47
preamplificrii este diluat i utilizat ca matri pentru a 2-a amplificare selectiv, iar n al doilea PCR se vor utiliza primeri AFLP, ce conin cte trei nucleotide selective. Aceast strategie, de amplificare n dou etape, permite obinerea unei amprente genetice foarte clare, care poate fi analizat pentru detectarea polimorfismelor i ntre indivizii strns nrudii. Unul din marile avantaje ale tehnicii AFLP este permisivitatea modulrii numrului de profiluri genetice. Este posibil creterea sau reducerea complexitii profilului, adaptnd diferii parametrii, iar factorul cel mai important pentru determinarea numrului de fragmente, amplificate ntr-o reacie simpl AFLP, este numrul de nucleotide selective din primerii selectivi. Numrul de fragmente detectate n gel, pentru o amprent genetic, scade cnd numrul nucleotidelor selective crete. Alegerea numrului de nucleotide selective este strns legat de mrimea genomului, cu ct mrimea genomului este mai redus cu att numrul fragmentelor amplificate este mai restrns i amprenta genetic mai simpl. Pentru organismele cu genoame mari (5x10 8 - 5x10 9 pb) se utilizeaz primeri selectivi cu cte trei nucleotide, astfel nct s se amplifice n medie 50 fragmente pe prob i pe perechea de primeri selectivi, acest numr poate varia ns ntre 10 i 100, n funcie de secvena nucleotidic i complexitatea genomului. Al doilea factor, ce determin numrul de fragmente amplificate, este compoziia n baze G i C a nucleotidelor selective din primeri. n general, se amplific mai puine fragmente cnd nucleotidele selective sunt G i C. 48
Tehnicile amprentelor genetice sunt multiple, fiecare are caracteristici particulare de specificitate de locus, nivel de polimorfism, tehnicitate. Alegerea unei metode trebuie ntotdeauna s fie luat n considerare n funcie de obiectivul cercetrii: - pentru studii de diversitate ca i pentru msurarea variaiilor inter sau intrapopulaionale, distanei genetice, pentru clasificarea n sistematic a populaiilor distincte genetic. - pentru clonarea poziional ca i pentru obinerea unei densiti mari de markeri moleculari, ntr-o regiune precis din genom (hipervariabil), din vecintatea unei gene care urmeaz s fie clonat; - pentru stabilirea hrilor genetice la speciile puin studiate sau acolo unde sondele i primerii PCR nu au fost nc dezvoltai. Marele avantaj al tehnicii AFLP este sensibilitatea n detectarea polimorfismului la nivelul genomului total. Cu toate acestea, tehnica AFLP a devenit un standard molecular pentru clasificarea n sistematic a populaiilor distincte genetic. Polimorfismele identificate n ADN sunt transmise mendelian i utilizate apoi pentru genotipizare, identificarea markerilor moleculari i cartografierea genelor [2].
2.2.3. Tehnicile MAAP Din categoria tehnicilor MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling) face parte tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic 49
DNA), alturi de tehnicile DAF (Amplification Fingerprinting ) i AP- PCR (Arbitrary Primed PCR).
2.2.3.1. Tehnica RAPD Tehnica RAPD se bazeaz pe determinarea polimorfismului la nivel alelic n ceea ce privete producerea unor produi de amplificare sau lipsa lor, n urma utilizrii unui primer oligonucleotidic, arbitrar, ntr-o poziie care s-i permit realizarea amplificrii. Aceast variant a tehnicii PCR nu necesit clonarea sau secvenierea ADN i poate detecta mai muli loci simultan. Principiul tehnicii este simplu: ADN izolat de la un individ este supus unei reacii PCR utiliznd primeri oligonucleotidici, de secven arbitrar, care vor hibrida la secvenele sale complementare, n cazul n care acestea exist. Dac din ntmplare, doi primeri consecutivi, aflai n vecintate, se ataeaz la matri n sensuri opuse, fiecare pe una din cele dou catene, la o distan nu prea mare unul de cellalt, fragmentul delimitat de ele va fi amplificat, iar dac unul din cele dou situsuri este absent la unul din indivizi, la acesta amplificarea nu va avea loc, evideniindu-se un polimorfism de prezen/absen. Secvenele de primeri scuri, mperecheai aleator (8 12 perechi de baze) sunt folosii la amplificarea ADN de tip RAPD, de obicei rezultnd un polimorfism de prezen/absen, n gel. O astfel de situaie, care permite amplificarea randomizat, n mai multe puncte, poate fi realizat la nivelul ntregului genom. 50
Deoarece RAPD este o tehnic bazat pe PCR, vom prezenta cteva din particularitile definitorii ale acesteia. Modificarea unei singure baze n genom este suficient pentru a mpiedica ataarea primerului n acel loc i a mpiedica amplificarea fragmentului delimitat de acel primer. Analiza RAPD poate detecta modificarea unei singure baze n ADN genomic, n anumite condiii [39].
Polimorfismul detectat de RAPD poate rezulta din cteva tipuri de modificri: - inseria unei secvene mari de ADN, ntre secvenele de ataare a primerilor, care fac fragmentul delimitat de aceste secvene prea mare pentru a fi amplificat; - deleia unui fragment de ADN ce conine unul din situsurile de ataare a primerilor duce de asemenea la lipsa amplificrii segmentului; - substituia unui nucleotid poate afecta hibridarea primerului la un anumit situs de ataare, putnd evidenia sau nu un polimorfism (dispariia unei benzi); - inseria sau deleia unui mic fragment de ADN poate duce la modificarea mrimii unui fragment amplificat i a poziiei benzii n gel. Modificrile de mrime se observ rar, dar cel mai adesea polimorfismul se manifest prin aceea c un fragment amplificat poate fi prezent sau absent. Polimorfismul detectat prin RAPD este folosit ca i marker molecular. Markerii RAPD se comport ca markeri dominani 51
cnd sunt urmrii n descenden. Acest comportament rezult din faptul c un fragment amplificat este prezent n gel (ca o alel dominant A) sau absent (ca alel recesiv a). n analiza descendenilor, un fragment este observat n stare homozigot (analog cu AA), fiind amplificat att ADN de la un printe, ct i de la cellalt, sau n stare heterozigot (analog cu Aa), cnd este amplificat numai ADN provenit de la unul din prini, cellalt prezentnd un polimorfism reperezentat prin absena fragmentului. n stare heterozigot, absena fragmentului de la unul din prini este mascat de prezena benzii datorat fragmentului amplificat de la cellalt printe. Prin urmare, analiza RAPD nu poate discerne ntre starea homozigot (AA) i cea heterozigot (Aa). n cazul markerilor codominani ns (n care fiecare printe posed o band distinct, pe care cellalt nu o posed), starea heterozigot (AB) n descenden (prezena ambelor benzi n hibridul din F1) poate fi deosebit de strile homozigote (AA) i (BB). In anii `90 s-a artat c 95% din fragmentele RAPD se comport ca markeri dominani (un singur fragment amplificat distinctiv la unul sau ambii prini i descendeni) i sub 5% se comport ca markeri codominani. Calculul numrului de fragmente care poate fi ateptat teoretic la folosirea unui primer care hibrideaz 100% cu matria, poate fi calculat din lungimea primerului i din complexitatea genomului int, presupunnd c nucleotidele sunt prezente n proporii egale. Produii de amplificare se separ prin electroforez n gel de agaroz i se evideniaz dup colorare n bromur de etidiu . 52
2.2.3.2. Tehnica DAF In 1991, Caetano-Anolles i colaboratorii [13], au introdus o metod numit DNA Amplification Fingerprinting (DAF). Ei au folosit primeri scuri, cel mai adesea de lungime ntre 5 8 nucleotide. De asemenea, ei au modificat anumii parametrii PCR, folosind pai att de joas ct i de nalt stringen, precum i un program al ciclurilor cu numai dou temperaturi n loc de standardul cu trei. Produii de amplificare au fost separai prin electroforez n gel de poliacrilamid i vizualizai prin colorare cu argint. Nivelul complexitii profilului benzilor poate fi predeterminat prin manipularea condiiilor de reacie. Ca urmare a apariiei mai multor variante de amprentare a ntregului genom, bazate pe PCR cu primeri arbitrari, Caetano-Anolles i colab., au propus n (1994), denumirea acestor metode nrudite cu numele generic de Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (MAAP) [13]. Totui, datorit simplitii i utilitii, numele i metoda original RAPD, cunoate cea mai larg rspndire. Aceast tehnic permite amplificarea unui numr mai mare de fragmente de dimensiuni foarte mici, care ulterior vor fi separate ntr-un gel de poliacrilamid.
2.2.3.3. Tehnica AP PCR Lungimea primerului utilizat, este un criteriu principal de distincie ntre cele trei tehnici descrise anterior; astfel c pentru RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) sunt primerii decameri (9-10 pb), pentru DAF (DNA Amplification Fingerprint) 53
primerii au 5-15 pb, iar pentru AP-PCR (Arbitrary Primed PCR) primerii au lungimea de18-32 pb. Tehnicile AP-PCR i DAF pot releva numeroase benzi (pn la 100) n timp ce RAPD-ul produce un numr mic de benzi, pn la zece [56] . Avantajele tehnicilor Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (MAAP) rezid din: simplitate, rapiditate, costuri sczute, i faptul c nu necesit cunotine anterioare despre genom, nu necesit digestie sau transfer pe o membran, marcare radioactiv sau fluorescent, cu ajutorul lor fiind generai markeri moleculari utiliznd markerii deja disponibili [52] . Tehnica RAPD fiind rapid, poate fi utilizat n hibridri interspecifice, introgresia genelor, identificarea clonelor, descoperirea markerilor sex-linkai, msurarea distanelor genetice la plante, animale i om. Dezavantajele tehnicii constau n reproductibilitatea sczut, iar schimbrile de scurt durat a condiiilor de reacie pot cauza benzi nereproductibile. O singur procedur cuprinde trei etape importante. Tehnica AP-PCR utilizeaz primeri de 18 pb i a fost dezvoltat i utilizat ca metod reprezentativ [32].
2.2.4. Tehnica RT PCR Aceast tehnic este tot o variant a tehnicii PCR, n care amplificarea pornete de la ARN mesager (ARNm). n prezena enzimei revers transcriptaza, ARNm devine matri pentru sinteza ADN complementar (ADNc), dup care procesul de amplificare decurge n mod normal. Cuantificarea expresiei genice se bazeaz pe 54
presupunerea c se pstreaz o anumit proporionalitate ntre cantitatea de ADN de la nceputul reaciei i cantitatea produsului de amplificare [56]. Trebuie subliniat faptul c aplicarea reaciei PCR la moleculele de ARN necesit o modificarea a reaciei PCR n prima etap. Pentru c molecula de ARN nu poate fi copiat n prezena Taq polimerazei, aceast etap este catalizat de revers transcriptaz, enzim n prezena creia este sintetizat molecula de ADN de pe matria de ARN. Copia de ADN este apoi amplificat n prezena Taq polimerazei. Descoperirea enzimelor termostabile (ex. ADN-polimeraza - obinut din bacteria Thermus thermophilus) cu ajutorul crora pot fi obinute copii termostabile de ADN att de pe matrie de ADN ct i de pe matrie de ARN face posibil aplicarea RT PCR n condiiile n care va fi necesar o singur reacie n prezena unei singure enzime [11]. Aceast tehnic ofer o informaie mai detaliat referitoare la detectarea cu sensibilitate ridicat a unor gene exprimate n cantiti reduse, ntr-o anumit celul.
2.2.5. Tehnica microsateliilor - SSR La organismele procariote i eucariote o parte din ADN genomic este reprezentat de secvene de ADN nalt repetitive, de complexitate mic i considerate noninformaionale. Microsateliii sau SSR (Simple Sequence Repeats) sunt secvene nalt repetate, care conin motive de 2 5 perechi de baze, repetate n tandem i care 55
flancheaz o secven unic de ADN. Se pare c acetia sunt rezultatul crossing-overului inegal. Tehnica PCR este aceea care va fi utilizat pentru relevarea profilurilor individuale, furniznd markeri specifici de locus ce se transmit codominant. Un microsatelit nu este specific la un locus particular, dar regiunile flancatoare sunt specifice [19]. Aceti markeri bazai pe PCR necesit investiii considerabile pentru a putea fi generai, dar sunt nalt polimorfici pentru folosirea lor n aplicaiile MAS (selecia asistat de markeri moleculari). Polimorfismul este determinat de diferenele existente n lungimea produilor de amplificare. Acest polimorfism va duce la evidenierea mai multor alele la acest locus. Fiind o regiune nalt polimorfic se pot distinge foarte multe alele, dar care pot determina diferenele chiar i ntre indivizi nrudii. Motivele repetate n tandem pot fi utilizate i ca sonde, dirijate ctre ADN genomic, unde s-i gseasc regiunile complementare.
2.2.6. Tehnica EST Aceast reacie bazat pe PCR necesit att clonare ct i informaii despre secven, utiliznd informaiile proiectului de secveniere a genelor, cnd sunt generate clone de ADNc. Aceast secven este folosit pentru designul unor primeri de 18 20 pb cu care se vor amplifica secvene nvecinate. Markerul EST este de obicei detectat dup mrime n produsul de amplificare i este un marker codominant. Crearea acestor primeri se realizeaz cu costuri foarte mari, dar acetia sunt foarte utili prin 56
diversele aplicaii n cartare, descoperirea genelor asociate cu locii caracterelor cantitative - QTL (Quantitative Traits Loci) i ar trebui s contribuie considerabil la nelegerea mecanismelor la aceti loci [11].
2.2.7. Tehnica SCAR n cadrul acestei tehnici, fragmentele de ADN amplificate prin tehnica PCR-RAPD, sunt clonate i pe baza lor se construiesc primeri specifici care vor avea lungime mai mare dect primerii RAPD. Prin utilizarea primerilor SCAR n PCR, nu se rezolv problema reproductibilitii reduse, deseori ntmpinat de markerii RAPD. Obinerea unui marker codominant poate deveni un avantaj n plus, n convertirea markerilor RAPD n markeri SCAR [11]. Totui, markerii SCAR pot manifesta dominan complet cnd unul sau ambii primeri coincid parial cu variaia din secvena unui anumit locus. Markerii SCAR dominani pot fi fcui deseori codominani, prin digestia produsului PCR cu diferite enzime de restricie.
2.2.8. Tehnica SNP Aceast tehnic se caracterizeaz prin detectarea mutaiilor punctiforme la un locus particular, mutaii determinate de substituia unei singure nucleotide cu alta. Prin aceast tehnic pot fi evideniate diferenele de secven existente ntre alele, cum ar fi substituia A n T 57
de exemplu AAGGCTAA n ATGGCTAA [23]. Pentru ca o variaie de secven s fie considerat SNP ea trebuie s apar cu o frecven de pn n 1% n populaie, ceea ce n populaia uman va detemina mai mult de 90% din ntreaga variaie genetic [23]. Aceasta nseamn apariia mutaiei la fiecare 100 pn la 300 perechi de baze din totalul de 3 miliarde. Dou din trei polimorfisme SNP sunt determinate de nlocuirea citozinei cu timina, ce apar att n regiunile codificatoare ct i necodificatoare, polimorfisme de tip citozin timin au fost descrise i de Schenkel F.S. i colaboratorii n anul 2005 [63].
2.2.9. Tehnica STS Aceast tehnic bazat pe PCR, detecteaz o secven unic ntr- un punct definit din genom. Pe baza acestei tehnici pot fi convertii markerii genetici RAPD n markeri STS, pentru acelai locus. Tehnica nu necesit clonare dac exist informaii anterioare despre secven, pentru definirea primerilor. Designul primerilor de 18 20 pb, poate fi conceput dup secvena fragmentelor RAPD excizate din gel, pentru a amplifica ulterior fragmente de ADN unice (de exemplu poate fi secvena unui produs PCR - RAPD sau a sondelor RFLP). Polimorfismul este n general detectat ca o diferen de mrime n produsul de amplificare STS fa de produsul RAPD, de la acelai locus. Dac nu exist nici o diferen de mrime, se apeleaz la restricia enzimatic pentru a tia produii de amplificare i pentru identificarea polimorfismului lor. Poate fi 58
astfel detectat un polimorfism de cteva nucleotide. Din moment ce primerii STS sunt mai lungi dect primerii RAPD i bazai pe o secven specific, aceast metod detecteaz polimorfismul de la acelai locus, fiind potrivit pentru studii de cartare genic. Dezavantajul metodei este c proiectarea i crearea primerilor poate implica o investiie important [11].
2.2.10. Tehnica ARMS PCR O modificare a metodei PCR, care permite detecia mutaiilor punctiforme cunoscute, prin amplificare cu primeri specifici de alel, este metoda ARMS-PCR. Aceasta este o metod care nu implic utilizarea izotopilor radioactivi, iar genotipizarea este posibil prin simpla examinare a migrrii produsului PCR prin elecroforez n gel de agaroz. Tehnica este cunoscut ca detectarea mutaiilor prin amplificare refractar, descris pentru prima dat de Newton C.R. i colab., 1989. Metoda const n utilizarea a doi primeri care prezint aceeai secven de nucleotide cu excepia nucleotidei terminale 3 unul complementar cu alela normal, iar cellat cu alela mutant. Pentru amplificarea enzimatic se folosete Taq-polimeraza, enzim care nu are activitate exonucleazic 3-5, ceea ce implic necesitatea unei perfecte complementariti a primerului cu capatul 3 al matriei ADN. Rezultatul se obine n urma electroforezei n gel de agaroz prin prezena sau absena produsului de amplificare respectiv. 59
Specificitatea este obinut dac primerul oligonucleotidic este complementar cu secvena alelei dorite, dar nu este complementar cu cealalt alel la captul 3, sau n imediata vecintate a captului 3' al primerului specific de alel. Neamplificarea este rezultatul nepotrivirii dintre ADN matri i oligonucleotidul din primer. Pentru c Taq-polimeraza nu are activitate exonucleoazic n direcia 3'-5', aceast nepotrivire mpiedic eficient elongarea la capatul 3' cu ajutorul Taq polimerazei. Metoda este aplicabil, n general, n detecia mutaiilor punctiforme cunoscute, mici deleii i inserii, polimorfisme i alte variaii n secvena ADN. De aceea, o mutaie (sau un polimorfism) poate fi detectat prin utilizarea unui construct oligonucleotidic adecvat, care permite o elongare eficient, n cazul unui cromozom mutant i o elongare ineficient, n cazul unui cromozom normal [11].
2.3. TEHNICA SSCP Aceast tehnic este util n detectarea polimorfismului determinat de cel puin o nucleotid. Evidenierea polimorfismului se face n timpul electroforezei n gel de poliacrilamid. Acest polimorfism se bazeaz pe diferenele de conformaie ale unei singure catene (mutant) ce difer de cealalt ntr-un singur punct, datorit unei substituii, deleii sau inserii [6]. n anumite condiii, acizii nucleici dintr-o caten de ADN formeaz n soluie o structur secundar. Structura secundar depinde de compoziia n baze, structur care poate fi alterat i de substituia unei singure 60
nucleotide. Aceast diferen va determina o mobilitate electroforetic diferit n condiiile unui gel nedenaturat (gel de poliacrilamid nedenaturat). Vizualizarea fragmentelor ce urmeaz a fi detectate se face dup o prealabil colorare cu argint sau dup marcarea radioactiv [1].
2.4. TEHNICI BAZATE PE SECVENIERE Prima secven descifrat a fost ARNt-ul purtator de alanina publicat de ctre Robert Holley i colegii si de la Universitatea Cornell in 1964 [26]. Acetia au utilizat enzime specifice care au rupt molecula de ARNt n segmente mici pn cnd s-a reuit secvenierea direct prin metode de degradare enzimatic. Abia n 1976 a fost descifrat secvena complet a ARN monocatenar de la fagul MS2, de ctre Walter Fiers n laboratorul su din Ghent. S-a stabilit atunci structura complet a genomului viral i organizarea acestuia, corespondena dintre codoni i cele trei proteine codificate de genele fagului MS2 i c un codon stop cauzeaz terminarea transcripiei [58]. Secvenierea ADN poate fi fcut prin procedee chimice - metoda Maxam i Gilbert sau cu ajutorul terminatorilor de lan - metoda dideoxi sau Sanger, aceasta din urma fiind astzi utilizat mai mult. Prima metod a fost pus la punct de ctre Maxam si Gilbert n 1977 i este de fapt o clivare chimic [40]. Cea de-a doua, metoda dideoxi sau Sanger, a fost pus la punct n acelai an de ctre Sanger i 61
se bazeaz pe ntreruperea controlat a sintezei enzimatice a ADN, amplificat prin PCR [62]. n ambele cazuri, fragmentele obinute sunt supuse marcrii radioactive (cu 32 P, de exemplu) naintea separrii pe baza greutii moleculare ntr-un gel de poliacrilamid. Vizualizarea i analizarea produilor rezultai se face prin autoradiografie. O metod mult mai convenabil i mai precis este marcarea fluorescent a fragmentelor i secvenierea automat. Fragmentele de ADN sunt migrate ntr-un gel de poliacrilamid iar aparatul (secveniatorul), prevzut cu un fascicul laser, excit fiecare molecul marcat fluorescent i transform valorile fluorescente n secvena n nucleotidice a fragmentului analizat. Un astfel de aparat (ALFexpress Auto Read) poate detecta 200 pb pe or. Fiecrei secvene de acizi nucleici i corespunde o diagram a succesiunii de baze numit electroforegram. n aceast diagram fiecrei baze i corespunde un vrf i o coloraie caracteristic. O alt tehnic este secvenierea automat, n cazul creia, catena de ADN care va intra n reacia de secveniere depinde de primerul utilizat, putnd fi supus secvenierii att catena sens ct i cea antisens. n studiile de secveniere a genelor, pentru precizia rezultatelor obinute sau atunci cnd sunt cutate mutaii punctiforme, se recomand secvenierea ambelor catene i compararea rezultatelor obinute. n acest caz, este necesar cunoaterea ambilor primeri, care s iniieze sinteza genei ce urmeaz s fie descifrat. 62
n cazul n care se dorete descifrarea structurii unui fragment de ADN, sau a unei gene, de la specii a cror genom nu este saturat n hri genetice, pentru amplificare se utilizeaz primeri universali, cum este cel de la fagul M13 [72]. Pentru fragmente de dimensiuni diferite se aleg vectori corespunztori pentru clonare, de exemplu: plasmide (0,1-10 kb), fagi (8-20 kb), cosmide (35-50 kb), BAC (cromozom artificial bacterian 75-300 kb) i YAC (cromozom artificial de drojdie 100-1000 kb) la care genomul este complet descifrat i sunt ntocmite hrile de restricie. Etapele secvenierii: 1. Izolarea ADN genomic sau a fragmentului (genei) de interes ce urmeaz s fi clonat sau secveniat; 2. Purificarea ADN izolat; 3. Amplificarea prin PCR a fragmentului de analizat cu ajutorul primerilor specifici sau a primerilor universali, n prezena celor patru dNTP marcai florescent, fiecare cu alt culoare - (adenina n verde, timina n rou, guanina n negru i citozina n albastru) i a polimerazei ; 4. Vizualizarea produilor de amplificare prin migrarea n gel de agaroz (procedeu care face posibil att identificarea produilor de amplificare, determinarea lungimii fragmentelor amplificate i a calitii produsului de amplificare; 5. Purificarea produilor de amplificare; pentru ca produii de amplificare s poat fi utilizai n reacii de secveniere trebuie s 63
aib un grad nalt de puritate (evitndu-se contaminarea cu inhibitori i prezena rezultatelor eronate) ; 6. Secvenierea automat; 7. Citirea secvenelor pe catena analizat; 8. Alinierea secvenelor de pe cele dou catene sens i antisens; Reacia de secveniere ncepe ntotdeauna dup ce ADN supus secvenierii a fost iniial amplificat prin PCR, purificat i cuantificat [2].
64
CAPITOLUL 3. Aplicaii ale tehnicilor de biologie molecular n studii interdisciplinare
3.1. Clonarea genelor pentru aminoacid dehidrogenaze Genele ce codific leucin dehidrogenaza de la Bacillus sterothermophilus, alanin dehidrogenaza de la Bacillus subtilis, glucoz dehidrogenaza de la Bacillus subtilis i aspartaza de la Escherichia coli au fost amplificate prin metoda PCR utiliznd amorse specifice. n secvena amorselor au fost incluse situsurile pentru enzime de restricie necesare inserrii genei n vectorul de exprimare. Pentru clonarea genelor ce codific leucin dehidrogenaza, alanin dehidrogenaza i aspartaza s-a utilizat vectorul de exprimare pET21b (Novagen). Acest vector ofer posibilitatea exprimrii genelor la inducere cu IPTG. Produii PCR au fost purificai din gel i digerai cu enzimele de restricie corespunztoare (Tabel 3.1). Vectorii de exprimare au fost digerai cu aceleai enzime de restricie. Produii de digestie (produii PCR i vectorii) au fost separai cu ajutorul electroforezei n gel de agaroz.
65
Tabelul 3.1. Amorsele utilizate pentru amplificarea prin PCR a genelor. Enzima Amorsele utilizate Organism surs Enzime de restricie Vector utilizat
Fragmentele ADN au fost purificate din gelul de agaroz. Pentru inserea genelor n vectori s-a utilizat ADN ligaza, care are proprietatea de a 66
reface legturile fosfoesterice. Moleculele recombinate rezultate dup ligare (vector +gena) au fost introduse prin transformare n tulpina de Escherchia coli DH5. Secvenele genelor clonate au fost verificate prin secvenializare cu un aparat ABI Prism 310 Genetic Analyzer utiliznd kitul de secvenializare BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). 3.2. Producerea de proteine recombinate Pentru exprimarea genelor, moleculele corect recombinate au fost introduse prin transformare n tulpina de Escherichia coli BL21(DE3). Pentru obinerea de proteine recombinate s-au realizat culturi mai mari (0,5-1L). Dup ce densitatea optic (DO) la 600 nm a atins valorile de ~1, s-a indus exprimarea genelor cu izopropil- D- tiogalactopiranozid (IPTG) 1 mM [2]. Dup cteva ore de la inducere (3-5 ore) bacteriile au fost centrifugate i pstrate la -80C pn la utilizare. Sintezele enzimatice au fost realizate cu extracte celulare bacteriene. O purificare a proteinelor recombinate ar implica costuri i timp suplimentar, iar orice proces biotehnologic este cu att mai valoros cu ct implic mai puine costuri. Celulele bacteriene au fost preluate n tampon Tris HCl pH=8,0 50 mM. Pereii celulelor bacteriene au fost distruse prin sonicare. Dup sonicare extractul bacterian a fost centrifugat (20 min la 21 000g la 4C), iar supernatantul cu proteinele solubile a fost utilizat pentru msurarea activitii enzimatice. Analiza exprimrii genelor i sintezei de proteine recombinate n celulele de E. coli a fost urmrit cu ajutorul electroforezei n gel de poliacrilamid n condiii denaturante n prezen de SDS (Figura 3.1). 67
Figura 3.1. Sinteza de proteine recombinate n celulele gazd de E. coli. Cu cifre sunt indicate masele moleculare ale proteinelor din markerul molecular, preum i masele moleculare ale proteinelor recombinate. Se poate observa cantitatea mare de proteine recombinate raportat la cantitatea de proteine totale din celulele bacteriene [2].
3.3. Msurarea activitii enzimatice a enzimelor Msurtorile de activitate enzimatic a dehidrogenazelor s-au efectuat la 30C cu un spectrofotometru urmrindu-se scderea absorbanei NADH (reacia de aminare a cetoacizilor) sau formarea acestuia (reacia de dezaminare a aminoacizilor) la 340nm. La aceast lungime de und NADH prezint maximul de absorban i are un coeficient molar de extincie de 6,22 103 M -1 cm -1 . Activitatea enzimatic s-a calculat dup formula: A=[(DO/min)/6,22]*(Vr/Vp) *FD *103 U/l DO/min variaia densitii optice pe minut la 340 nm Vr volumul reaciei Vp volumul probei FD factorul de diluie O unitate enzimatic (1U) corespunde formrii unui mol de produs ntr-un minut. Mediile de reacie pentru enzime au fost urmtoarele: Ala DH LeuDH AAL 68
a) LeuDH (leucin dehidrogenaza): cetoacid 10 mM, NADH 0,15 mM, NH 4 Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 n reacia de aminare; L-leucin 10 mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 n reacia de dezaminare b) AlaDH (alanin dehidrogenaza): piruvat 10 mM, NADH 0,15 mM, NH 4 Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 n reacia de aminare; L- alanin 10 mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 n reacia de dezaminare c) GDH (glucozo dehidrogenaza): glucoz 10 mM, NAD 2 mM, Tris HCl 50 mM pH 8,0 d) GalM (galacto mutarotaza): glucoz 10 mM, NAD 2 mM, Tris HCl 50 mM pH 8,0, GDH 1 U e) LDH (lactat dehidrogenaza): piruvat 1 mM, NADH 0,15 mM, Tris HCl 50 mM pH 8,0 f) AAL (aspartat amoniuliaza): acid L-aspartic 100 mM, Tris HCl 50 mM pH8,5, MgCl 2 6 mM Pentru msurarea activitii enzimatice a aspartzei s-a urmrit formarea acidului fumaric la 240 nm, care are un coeficient molar de extincie la aceas lungime de und egal cu 2,54 103 M -1 cm -1 . Pentru msurarea activitii enzimatice s-au folosit civa l de enzim purificat sau extract brut bacterian, astfel nct valorile DO/min s fie cuprinse ntre 0,05 i 0,3. S-a ales poriunea dreptei cu activitatea cea mai mare.
69
3.4. Sinteza de aminoacizi marcai cu 15 N Mediul de reacie pentru sintezele de aminoacizi marcai cu 15 N a coninut: cetoacid 100 mM
15 NH 4 Cl 100 mM NADH 1 mM glucoz 670 mM Amestecul de sintez a fost ajustat la pH 8,0 cu NaOH. Reacia s-a declanat prin adugarea enzimelor. Sintezele de aminoacizi marcai au fost efectuate la 30C cu urmrirea pH-lui i agitare. Pe parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH 4 Cl prin metoda Berthelot. Aceast metod const n formarea unui compus de culoare, la interaciunea ionului de amoniu, a fenolnitroprusiatului i a cloraminei. Probele s-au preparat dup urmtoarea procedur: 10 l de prob diluat de 20 ori, 200 l de fenolnitroprusiat, 200 l de hipoclorit de sodiu i 590 l ap. Developarea culorii s-a fcut prin incubarea probelor timp de 2-3 min la 100C. S-a msurat absorbana la 623 nm. nainte de declanarea sintezelor s-a preluat o prob care a servit la alctuirea unei curbe etalon. Ca martor a servit amestecul de sintez fr clorur de amoniu (din care cauz se aduga la sfrit). n Figura 3.2 este prezentat curba etalon de la sinteza de [ 15 N]-L-metionin. Pe baza curbelor etalon s-a calculat cantitatea de ion de amoniu rmas n mediul de sintez. Sintezele au fost oprite prin denaturarea termic a enzimelor, timp de 15 min la 85C. 70
Figura 3.2. Curba etalon de la sinteza [ 15 N] L-Metionin [2].
3.5. Purificarea aminoacizilor sintetizai Aminoacizii sintetizai au fost purificai pe o coloan cu rin schimbtoare de ioni Dowex 50W x 8, n forma H + . Activarea umpluturii s-a fcut prin tratare cu HCl 2 N, dup care s-a splat pn la un pH neutru. Amestecul de sintez filtrat s-a ncrcat pe coloan i apoi s-a splat cu ap (10 volume). Aminoacidul s-a eluat cu NH 4 OH 1M. Controlul elurii s-a fcut cu ninhidrin pentru aminoacizi. Fraciunea cu aminoacid s-a concentrat pe baia de ap, dup care s-a precipitat cu etanol absolut. Precipitarea s-a lsat peste noapte, iar precipitatul obinut s-a filtrat i uscat. n continuare, aminoacizii astfel obinui au fost supui determinrii structurii, puritii i concentraiei izotopice. 71
3.6. Analiza aminoacizilor sintetizai prin spectrometrie de mas Pentru analiza calitativ prin metoda spectrometriei de mas a aminoacizilor este necesar o derivatizare a produsului de reacie. Derivatizarea, care trebuie facut la ambele funciuni polare ale moleculei de aminoacid, la carboxil i amin, s-a facut prin sililare, utiliznd metoda Das Neves i Vasconcelos, care introduce la fiecare funciune polar din molecul cte o grupare ter-butil-dimetilsilil (TBDMS). Acest tip de derivatizare are avantajul c, datorit substituentului ter-butil voluminos, la amin se introduce o singur grupare silil, i nu una sau dou n mod statistic, cum se ntmpl n cazul derivatizrii cu grupri trimetilsilil. Derivatizarea s-a fcut utiliznd ca reactiv N-metil-N-(ter-butil-dimetilsilil) triflouroacetamida (MTBSTFA) n calitate de donor al gruprii silil, reactivul avnd i un coninut de 1% ter-butil-dimetil-clorsilan, n calitate de catalizator. Derivatizarea s-a fcut pe cantitai de prob de ordinul 0.5-1 mg de prob, cu 150 l de acetonitril ca solvent i 50 l reactiv MTBSTFA, la 120C timp de 20 minute. Separarea gaz-cromatografic a produilor de sintez sub form de TBDMS-derivai s-a fcut pe o coloan capilar cu faz staionar DB5 de 30 m lungime, cu hidrogen ca i gaz purttor i cu temperatur programat ntre 55 i 250C. La ionizarea cu impact de electroni, aminoacizii sub form de TBDMS-derivai se produc n cea mai mare parte sub form de ioni prin fragmentarea moleculelor. Masele ionilor fragment fiind caracteristice fiecrui aminoacid. Prin ruperea n diferite poziii din gruparea tert-butil-dimetilsilil se formeaz ioni cu masele M- 72
43, M-57 i M-85, iar prin ruperea legturii dintre carboxil i atomul de carbon alfa, adiacent, ia natere un fragment cu masa M-159. Pentru analize s-a utilizat un cromatograf de gaze Hewlett Packard 5840 A, iar spectrele s-au nregistrat cu un spectrometru de mas cuadrupolar HP 5985.
3.7. Sinteza de aminoacizi marcai Marcarea aminoacizilor cu izotopi stabili se poate realiza prin sinteze chimice i enzimatice. n primele etape de marcare a acizilor aminai cu izotopi stabili s-au folosit metode de sintez chimic. Aceste metode prezint un ir ntreg de dezavantaje, cum ar fi consumul unei cantiti mari de amoniac, randamente sczute datorit mai multor etape de sintez, obinerea racemicului. Folosirea enzimelor n sinteze de aminoacizi marcai cu izotopi stabili prezint mai multe avantaje fa de metodele chimice, datorit faptului c decurg stereoselectiv i au randamente superioare. O metod relativ simpl i mai utilizat pentru obinerea de aminoacizi marcai cu 15 N este sinteza enzimatic pornind de la cetoacizi i sruri de amoniu ( 15 N). Reaciile de sintez sunt cuplate cu reacii de regenerare a cofactorilor costisitori. Majoritatea enzimelor utilizate n sinteza diverilor compui necesit coenzime (NADH sau NADP). Din cauza preului mare a acestora utilizarea lor n cantiti stoichiometrice nu este eficient. Pentru a evita acest fenomen exist cteva ci de regenerare continu a coenzimelor pe parcursul sintezelor: 73
regenerarea n vivo, cu utilizare de celule n cretere. Aceast metod prezint dezavantajul manipulrii laborioase a celulelor i caracterul enantioselectiv sczut al reaciei; regenerarea enzimatic n vitro, cele mai utilizate enzime pentru regenerarea coenzimelor n sinteze fiind alcool dehidrogenaza i formiat dehidrogenaza [27]; regenerarea electrochimic, care const n oxidarea unui mediator i transferul electronului la NAD(P) + . Un dezavantaj al metodei l prezint specificitatea i viteza de regenerare reduse. Modalitatea cea mai eficient pentru regenerarea coenzimelor rmne metoda enzimatic. Sursele enzimelor utilizate n regenerarea coenzimelor sunt destul de variate, marea majoritate provenind de la bacterii. Piridin nucleotid transhidrogenaza de la Pseudomonas fluorescens a fost utilizat n regenerarea att a NAD ct i a NADP pentru producerea de hidromorfon [10]. Schema de sintez a aminocizilor marcai cu 15 N utilizat n prezenta lucrare este reprezentat n Figura 3.3.
74
Figura 3.3. Schema de sintez a acizilor aminai cu 15N. AADH aminoacid dehidrogenz
Aminoacid dehidrogenazele catalizeaz reacia de formare a aminoacizilor pornind de la 15 NH 4 Cl i cetoacizii corespunztori. Sinteza de aminoacizi a fost cuplat cu reacia catalizat de glucozo- dehidrogenaza (GlucDH) de la B. subtilis. GlucDH a servit la regenerarea NADH, utiliznd ca sub-strat glucoza cu formare de acid gluconic. n unele sinteze s-a folosit galac-tozo-mutarotaza pentru transformarea -glucozei n -glucoz. Enzimele utilizate n sintezele de aminoacizi marcai nu au fost purificate. Enzimele recombinate, exprimate n celule de E. coli, reprezint aproximativ 50% din proteinele totale existente n lizatul bacterian. Purificarea acestora este o etap suplimentar care, n general, nu conduce la mrirea randamentului reaciei. Honorat i colaboratorii [24] au testat sinteza de
L-alanin i L-valin cu enzime (alanin dehidrogenaz i valin dehidrogenaz) purificate i n lizat bacterian. Acest fapt nu a influenat randamentul sintezelor.
3.8. Tendine actuale n aplicarea bionanotehnologiilor Bionanotehnologiile moderne se inspir din organizarea celular a lumii vii. Astfel, structurile nano la fel ca i structurile vii, sunt alctuite din componente de natur organic i anorganic. Aceste structuri sunt sperana pentru tratarea a numeroase cancere, existnd n prezent deja aplicaii ale nanoparticulelor n tratamentul unor cancere. Nanoparticulele sunt o speran nu numai pentru tratamentul numeroaselor boli, dar i pentru stabilirea unor diagnostice. Utilizarea nanoparticulelor n medicin este axa prioritar n aplicarea bionanotehnologiilor. Limitrile bionanotehnologiilor sunt: incapacitatea de a sintetiza particule de aceleai dimensiuni cu aceeai suprafa, controlul organizrii lor. esuturile tari, cum ar fi esutul osos, cochiliile la molute, conin una sau mai multe componente organice de natur proteic care controleaz organizarea structural .
3.9. Aplicaii ale bionanotehnologiilor Nanoparticulele de aur (NP-Au) sunt o adevrat speran n diagnosticul i tratamentul cancerelor. 76
Au a fost utilzat timp de cteva decenii n diverse aplicaii n medicin (implanturi dentare) datorit caractersticilor sale neutre. Nanoparticulele de Au au nceput s fie din ce n ce mai des utilizate n depistarea i chiar tratamentul unor celule canceroase datorit faptului c acestea sunt inerte, non-toxice, au stabilitate mare, dimensiuni mici i capacitate de legare mare. NP-Au sunt capabile de a aciona asupra unor anumite tipuri de celule chiar n absena oricror grupe funcionalizate. NP-Au induc moartea celular liniei de celule de carcinom pulmonar A549 de la om, dar nu au nici un efect asupra altor linii de celule HepG2 (carcinom hepatic hepatocelular uman) i BHK21 (celule juvenile din rinichi de hamster) [57].
3.10. Diagnostic Diagnosticul nanomolecular al cancerului poate asigura depistarea celulelor canceroase n faze incipiente ale bolii. Nanoparticule de aur derivatizate cu nucleotide tiolate au fost utilizate pentru depistarea celulelor canceroase [15]. NP-Au la care s-au ataat oligonucleotide de ADN au fost utilizate pentru diagnosticul timpuriu al leucemiilor mieloide acute. Oligonucleotidele ADN utilizate n acest scop reprezentau un fragment din jonciunea care rezult n urma translocaiiei t(9;22)(q34;q11). Un fragment dintr-un cromozom este translocat la un alt cromozom, n acest caz fragmentul de la cromozomul 9 este transferat pe cromozomul 22, cromozomul find cunoscut sub denumirea de cromozom Philadelphia. Aceast 77
translocaie este cauza leucemiilor mieloide cronice i care sunt cauzate de fuziunea a 2 gene BCR(22)-Abl(9) (Figura 3.14).
Figura 3.14. Formarea cromozomului Philadelphia translocaia reciproc ntre cromozomul 9 i 22.
Produsul acestei gene este o protein himer cu activitate tirozin-kinazic. Metoda de detecie cu ajutorul nanoparticulelor se bazeaz pe formarea de poriuni hibride ADN:ARN (ADN sonda: ARNm din celulele canceroase) dublu catenare, care vor mpiedica agregarea nanoparticulelor de Au odat cu creterea concentraiei de sruri. Metoda nanosondelor pentru diagnosticul acestui tip particular de cancer ofer avantaje fa de metodele utilizate actual n diagnostic BCR Translocaie reciproc Abi Comozomul 9 Comozomul 22 Comozomul 9 Comozomul Philadelphia Abi BCR
78
(FISH, transcrierea invers a ARNm i amplificarea prin PCR) prin faptul c este mai ieftin i mai rapid (~30 min) i necesit cantiti mici de ARNm (10 ng/l). Diagnosticul timpuriu n asemenea cazuri este foarte important, n fazele ulterioare celulele canceroase devenind rezistente la chemoterapice. Nanoparticulele de argint (NP-Ag) au devenit atractive n domeniul bionanotehnologic dup descoperirea efectului lor antibactericid [66]. Acest efect este unul de importan major datorit faptului c bacteriile capt din ce n ce mai mult rezisten la antibiotice. Nanoparticulele de argint par a avea o influen nu numai asupra bacteriilor, dar i asupra virusurilor. Astfel NP-Ag la concentraii non-toxice pentru celule inhib replicarea viral (sinteza materialului genetic ai virusului) atunci cnd nanoparticulele sunt administrate nainte de infectare sau ime-diat dup (2-4 ore) aceasta [67]. Unele substane chimice s-au dovedit a avea un efect inhibitor asupra proliferrii celulare, angiogenezei i rol antiinflamator. Un astfel de exem-plu este colorantul DCPIP (2,6-diclorofenol-indofenol) care induce apoptoza (moartea celular) n celule umane de melanom A375 i G361 [12]. DCPIP s-a dovedit a avea aciune antiangiogenez i antiinflamatoare asupra celulelor canceroase umane de colon HCT116. Efectul acestuia este mai intens dac este ncapsulat n particule de polia-cizi (lactic i glicolic). Concentraiile de 6 g/ml de colorant (DCPIP) induc moartea celular prin apoptoz [41]. 79
Nanobiotehnologiile urmresc nu numai crearea de nano- vehicule pen-tru transportarea diferitor substane, dar i crearea i manipularea unor adevrate nano-motoare, utile n nanomanipulare celular. F1-ATP-aza este un veritabil nano-motor rotativ, a crei micri pot fi controlate cu ajutorul unor stimuli optici i chimici [60]. Sisteme particulare capabile de transport intit i eficient a diferitor substane, cu puine efecte adverse, se datoreaz probabil endocitozei transportorilor. Nanoparticule cationice formate din lipide cationice i polielectrolii s-au dovedit a fi crui exceleni pentru transportul amfotericinei B un antifungicid pentru Candida albicans [71]. Nanodiscurile de HDL (High Density Lipoprotein) sunt un strat bifosfolipidic cu aspect de disc (ND-HDL). Este cunoscut faptul c HDL este numit colesterolul bun deoarece este implicat n transportul molecu-lelor hidrofobe (colesterol) n fluxul sangvin care este un mediu hidrofil. Structura HDL (liporoteine cu densitate mare) este una simpl, fiind alctu-it din fosfolipide i apolipoprotein (apo). Cea mai abundent form de lipoprotein din plasma sanguin uman este apoA- I, care este alctuit din 243 de aminoacizi, este bine caracterizat i la incubarea cu vezicule de fosfolipide n vitro formeaz HDL revers, capabil de transportul molecule-lor hidrofobe [61]. Fosfolipidele cele mai frecvent utilizate pentru asamblarea veziculelor sunt DMPC (dimirisstoil-fosfatidil colina) i DMPG (dimirisstoil-fosfatidil glicerol). Incubarea acestor vezicule cu apoA-I se autoasambleaz ND-HDL. Aceste nano-discuri se pot autoasambla chiar dac nu este utilizat 80
enzima integral, ci numai fragmente de apolipoproteine [73]. ND-HDL reprezint astfel un mediu favorabil pentru studierea proteinelor transmembranare, transportul unor substane hidrofobe. Stratul bilipidic este un mediu natural pentru proteinele transmembranare care i pstreaz proprietile sale conformaionale i activitatea. Suprafaa unui nanodisc cu diametrul de 20nm este de ~300 nm 2 , o suprafa suficient pentru integrarea ctorva molecule proteice. Avantajul utilizrii acestor structuri comparativ cu miceliile de detergeni, este c asigur un mediu natural apropiat, fr prezena detergenilor care pot schimba conformaiile proteinelor. ND-HDL au fost utilizate n studierea a numeroase proteine transmembranare cum ar fi bacteriorodopsina [7,8], citoromul p450 3A4 [3], toxina antraxului [35], hidrogenaze enzime de membran produse de Pyrococcus furiosus care pot sintetiza H 2 [5]. ND-HDL au fost testate n utilizarea lor pentru transportul diferitor substane hidrofobe, care sunt insolubile n mediu sangvin hidrofil. Un exemplu n acest sens este transportul de ctre ND- HDL a amfotericinei B un potenial antifungicid care inhib creterea Saccharomyces cerevisiae i a altor fungi patogene, care administrat sub aceast form nu mai este toxic la anumite concentraii [51]. ND- HDL ce conineau cucurmin (un polifenol hidrofob natural obinut din Curcuma longa) au inhibat creterea liniei celulare hepatice HepG2 comparativ cu administrarea curcuminei libere [22]. O alt aplicaie a nanodiscurilor de HDL a fost ncorporarea de lipide cu ioni bivaleni de Ni 2+ , care au capacitatea de a fixa proteinele cu etichet de 6-His (histidine). Proteina din nveliul virusului West Nile [28]. 81
CAPITOLUL 4. CULTURI CELULARE 4.1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale Multe dintre tehnicile introduse la un moment dat n diferite tiine au revoluionat felul n care acea tiin a fost perceput ulterior. Culturile celulare sunt un asemenea exemplu n biologie. Introducerea acestei tehnici n urm cu aproximativ 100 de ani a permis practic importul naturii n laborator, ceea ce a dus la standardizarea tehnicilor i generalizarea strategiilor de studiu ntre cercettorii din diverse instituii, urmat de o explozie informaional n lumea biologic. Avansarea cunoaterii biomedicale din ultimele decenii nu ar fi fost posibil fr dezvoltarea printre altele a metodelor de lucru cu celulele. Cercetarea biomedical actual folosete tehnicile de lucru cu celulele pentru investigarea unor probleme din domenii ca: biofizica, biochimie, biologie celular i molecular, genetica, biologia dezvoltrii organismelor, evolutionism, medici-na molecular, farmacologia, bionano-tehnologia, inteligent drug design etc. Este practic de neimaginat desfurarea activitii ntr-un centru de cercetare biomedical lipsit de laboratorul de culturi celulare. Aplicaii curente sunt legate de: folosirea culturilor celulare pentru elaborarea vaccinurilor, producia glicoproteinelor recombinante (cytokine, hormoni, anticorpi monoclonali folosii n cercetare i clinica medical, interferoni, eritropoietina), testarea agenilor anticanceroi, studii de genomic, metabolism, apoptoz. ntr-un sens mai larg, cultura celular poate cuprinde cultura esuturilor i organelor. Pe de alt parte, celulele pot fi folosite ca i model pentru studiul rspunsurilor fiziologice la 82
diferii factori de stres din mediu. Avansarea cercetrii din domeniul celulelor stem i lucrul cu celulele embrionare face posibil, deocamdat teoretic, cultivarea organelor i esuturilor cu aplicaii n bolile cronice degenerative, cancere i altele. Din punct de vedere al tipului de cultur se poate vorbi despre: - cultura de organe - presupune prelevarea i cultivarea unui organ n totalitate. Aceasta include i cultivarea unor embrioni ntregi; - cultura de esuturi - presupune prelevarea unor fragmente de esuturi i cultivarea lor; - cultura de celule - presupune prelevarea unor esuturi i digestia lor pentru obinerea unei suspensii unicelulare care este apoi cultivat mai departe. Dac ne referim la cultura de celule, exist trei tipuri de celule animale care sunt cultivate n laborator: primare, secundare i imortalizate (tabel 4.1). Proprieti primare secundare imortale/canceroase Inhibiia de contact 1
Da Da Unele/nu Fenotipul fa de situaia in vivo Identic Asemntor Asemntor/ rotunde Genotipul fa de situaia in vivo Identic Identic Asemntor/ diferit Necesarul factorilor de cretere Crescut Crescut Crescut/limitat Difereniate Da Da Da/nedifereniate Numr de diviziuni 2-3 <100 Nelimitat Timp necesar cultivrii Crescut Sczut Sczut Reproductibilitatea rezultatelor Sczut crescut crescut 83
Tabel 4.1. Caracteristicile celulelor primare, secundare i imortale/canceroase [2]. 1 n mod normal, celulele cresc n vasul de cultur pn cnd stabilesc contact cu vecinele lor, moment n care i opresc creterea. Celulele canceroase pierd aceast caracteristic fenotipic i dup ce ajung s fie confluente ncep s creasc una peste cealalt formnd ghemuri de celule uor de distins la microscopul optic.
4.2. Culturi primare Majoritatea celulelor din culturile primare necesit ancoraj. Cultivarea celulelor provenite din piele (keratinocite, fibroblaste) se face prin biopsierea esutului i formarea unei suspensii unicelulare. Aceste celule vor crete aderente de suprafaa vasului de cultur. Pentru a le separa de acesta i pentru separarea celulelor unele de altele se folosesc de obicei enzime proteolitice (tripsina). Pe de alt parte, cultivarea celulelor prelevate din sngele periferic se face ntr-o manier care nu necesit ancorarea acestora de pereii vasului de cultur. Este posibil ca celulele s formeze aderene ntre ele dar de obicei acestea sunt de o mic intensitate. Diferite substane (factori de cretere ai diferitelor populaii leucocitare i/sau mitogeni substane care stimuleaz mitoza) pot fi utilizate pentru diferenierea i nmulirea celulelor n cultur [2].
4.3. Culturi secundare Prin subcultivarea celulelor dintr-o cultur primar se pot obine aa-numitele culturi secundare. Celulele dintr-o cultur secundar pot parcurge pn la 100 de diviziuni nainte de a-i pierde potenialul 84
proliferativ. Dei nu prezint alterri ale setului de cromozomi (karyotipului), aceste celule acumuleaz anumite caracteristici fenotipice care le fac s devin o linie celular distinct. Pe lng derivarea culturilor secundare, subcultura are ca scop meninerea celulelor n faza logaritmic de cretere, evitarea confluenei care poate avea ca rezultat inhibarea creterii, ndeprtarea celulelor moarte i a produilor de metabolism celular i adugarea substanelor nutritive [2].
4.4. Culturi de celule imortalizate Este posibil ca unele celule din culturile secundare s sufere anumite transformri care le confer caracterul de imortalitate adic posibilitatea de a se divide la nesfrit. Aceste celule pot aprea ca urmare a unor modificri (transformri) la nivelul cromozomului prin factori chimici, fizici (radiaii) sau biologici (virusurile oncogene). Unele dintre aceste celule imortale (transformate) pot avea caracter oncogenic; cu alte cuvinte transplantarea lor la animalele de laborator este urmat de apariia tumorilor la acestea. Dup cum se poate observa din tabelul 4.1, celulele canceroase au unele proprieti care le difereniaz de celelalte celule imortale necancreoase: nu mai prezint inhibiia de contact; pot crete cu mai puini nutrieni etc [2].
4.5. Prezentarea informaiilor care se pot obine pe diferite sisteme de studiu Aplicaiile culturilor celulare i gsesc utilitatea n producerea: vaccinurilor (antirubeolic, antiparotidita epidemic, antivaricela, 85
antirabic); hormonilor i factorilor de cretere (insulina, eritropoietina), factorilor de coagulare, enzimelor, anticorpilor monoclonali i altor substane imunomodulatoare (interferoni, interleukine), agenilor anticanceroi etc. Mai mult, dezvoltarea n ultimii ani a cunotinelor i tehnologiei de lucru cu celulele stem constituie una dintre temele cele mai actuale n domeniul biomedical. Este de ateptat ca acest domeniu s revoluioneze tratamentul diferitelor afeciuni. n plus, celulele animale sunt deosebit de utile n testarea citotoxicitii diferitelor substane incluznd noile terapii anticanceroase. Nu n ultimul rnd, prin folosirea tehnologiei AND-ului recombinat este posibil crearea celulelor transgene care constituie per se un model de studiu pentru investigarea metabolismului energetic, traficului de membran, ciclului celular, diferenierii, mbtrnirii i apoptozei [2].
4.6. Anticorpii monoclonali Una dintre aplicatiile culturilor celulare cu cel mai mare impact pentru societate la ora actual este reprezentat de tehnologia de obinere a anticorpilor monoclonali prin folosirea hibridoamelor. Aceast tehnologie a fost inventat de ctre Milstein i Koehler n urma cu aproape patru decenii. n 1975 cei doi cercettori au publicat rezultatele prin care pot fi obtinui anticorpii monoclonali. Pe scurt tehnica presupune imunizarea unui animal de experien cu un antigen i recoltarea celulelor B (cele care produc anticorpii) la un anumit interval de timp dup imunizare (figura 4.3). Aceste celule sunt 86
fuzionate apoi n prezena polietilenglicolului (PEG) cu o linie celular canceroas de mielom (cancer al plasmocitelor). n urma acestei fuziuni, se formeaz celule hibrid (de unde i numele de hibridoame) dintre care unele produc anticorpii cu specificitatea dorit (caracter dobndit de la celula B a animalului imunizat) ntr-o manier continu (dobndind caracterul imortal de la celulele de mielom). Prin diferite metode de screening se pot gsi aceste celule care sunt ulterior subclonate dnd natere astfel unor linii celulare pure i stabile are produc anticorpii monoclonali. Datorit specificitii deosebit de mari (se consider c un anticorp poate distinge antigenul pereche ntre 10 8 molecule), anticorpii monoclonali i-au gsit foarte rapid aplicaii n domenii variate cum ar fi: diagnosticul i trata mentul clinic, cercetare fundamental [59] i cea aplicat prin metode de izolare a diferitelor substane recunoscute, anticorpi catalizatori ai reaciilor chimice (abzymes). Folosirea terapeutic a anticorpilor monoclonali n diferite afeciuni umane urmeaz dou direcii: markeri diagnostici care pot identifica diferite tipuri de antigene din populaii celulare in vivo i terapia intit a diferite-lor afeciuni n care anticorpului monoclonal i sunt ataate substane chimice toxice sau radioactive [2].
87
Figura 4.3. Producerea anticorpilor monoclonali [2]. Splina este izolat la cteva saptmni (timp necesar pentru mbogi-rea repertoriului de celule B specifice) dup imunizarea animalului cu anti-genul fa de care se dorete producerea anticorpilor monoclonali. Celulele B sunt izolate i combinate cu mieloamele (partea stng) n prezena PEG care mediaz fuziunea celulelor. Celulele hibrid sunt singurele care vor supravieui n mediul suplimentat cu Hypoxanthine Aminopterin Thymidine (HAT). Screeningul face posibil identificarea coloniilor care produc anticorpi fa de antigenul dorit. Urmeaz apoi subclonarea realizat prin diluarea
Screening Subclonare Linie celular productoare de anticorpi monoclonali
PEG HAT Antigen 88
celulelor din coloniile productoare n aa fel nct fiecare recipient s conin teoretic o singur celul. Se obin n acest fel colonii n care toate celule provin dintr-o singur celul mam i deci vor produce acelai anticorp ca i aceasta. Aceast abordare a permis medicilor oncologi s obin rezultate spectaculoase n diferite forme de cancere. Se poate vorbi la ora actual de cancere tratate cu anticorpi monoclonali n care pacienii supravieuiesc fr recidiv la 30 de ani de la administrarea terapiei. Dei nu sunt toxici, anticorpii monoclonali produi n oarece prezint neajunsul de a fi strini organismului uman. Ajuni n organism aceti anticorpi ca orice alt substan strin iniiaz un rspuns imun din partea gazdei care se poate manifesta prin secreia de anticorpi umani anti-anticorpi monoclonali de oarece. Cu timpul anticorpii umani pot neutraliza i distruge anticorpii monoclonali injectai anulndu-le efectele terapeutice. Din acest motiv, n ultimii ani, anticorpii de oarece au fost umanizai. Tehnologia ADN-ului recombinat a fcut posibil ataarea prii specifice (cea care recunoate antigenul) derivat de la oarece cu un bra constant (care constituie cea mai mare parte) de la om. Exist la ora actual i peste 30 de anticorpi monoclonali folosii ca i ageni terapeutici n diferite afeciuni umane; numrul celor aflai n diferite stadii de testare depete 100. 4.7. Celule stem Urmtorul pas n revoluia din domeniul biomedical a fost reprezentat de posibilitatea cultivrii celulelor stem n laborator. Prin 89
definiie celulele stem sunt acele celule care prin diviziune dau natere unei celule fiic identic i unei alte celule care poate fi diferit. Dup sursa de provenien exist dou tipuri de celule stem: celule stem embrionare i celule stem adulte. Dup numrul de precursori ai liniilor difereniate pe care le poate produce, celule stem pot fi clasificate n: totipotente, pluripotente, multipotente, oligopotente. Dup cum implic numele, celulele totipotente sunt capabile s formeze un organism n totalitate. Aceste celule sunt reprezentate de ctre ovulul fertilizat i celulele obinute din primele diviziuni ale acestuia. O schi a diferenierii celulare se gsete n figura 4.4. Cele mai bine studiate celule stem sunt cele derivate din mduva osoas i care constituie precursorii tuturor celulelor din snge. Interesul major pentru biologia celulelor stem este explicat de potenialul de difereniere al acestora n orice tip de esuturi i organele dintr-un organism. Dei cercetarea n acest domeniu este relativ la nceput, cercettorii au reuit s izoleze i cultive cu succes anumite celule stem din diferite surse unele dintre ele fiind apoi difereniate n numeroase celule finale. Pe lng potenialul terapeutic enorm, celulele stem prezint i aplicaii diagnostice. Este posibil ca una dintre cele opt celule ale embrionului rezultat n urma fertilizrii in vitro a unui ovul s fie ndeprtat i analizat din punct de vedere genetic (celula este dispensabil deoarece restul celulelor rmase refac embrionul). n urma analizelor care pot s depisteze diferite defecte genetice se poate decide neimplantarea embrionului n uterul viitoarei mame. 90
Folosirea acestor celule face posibil i obinerea animalelor modificate genetic prin introducerea unor gene n embrionul tnr. Se pot produce astfel animale chimera care exprim genele implantate n diferite organe. Dac aceste organe sunt chiar gonadele, atunci urmaii unei mperecheri dintre doi astfel de oareci chimera pot produce un knock-out/knock-in pentru acea gen. Dei deosebit de atractiv, tehnologia cultivrii celulelor stem embrionare este puternic ngrdit de normele actuale ale eticii cercetrii.
Figura 4.4 Celulele stem pot da nastere unui numar mare de celule diferentiate final [2].
Disputele asupra aspectelor etice ale lucrului cu celule stem embrionare au ncurajat dezvoltarea tehnicilor de lucru cu celulele stem 91
adulte. Rmne de vzut dac potenialul unor astfel de celule stem adulte este la fel de nelimitat ca i al celor embrionare. Recent au fost descrise i celule stem canceroase. Aceast nou descoperire pune sub semnul ntrebrii principiile actuale care stau la baza tratamentului cancerului. Existena acestor celule canceroase stem poate explica apariia recidivelor prin participarea unui numr redus de celule care nu pot fi distinse/distruse prin tehnicile actuale. Experimental s-a dovedit c un numr de doar 200 de celule considerate ca fiind celule stem canceroase este suficient pentru a transfera cancerul de la un animal la un altul n timp ce un numr de cteva sute de ori mai mare de celule canceroase care nu prezint caracteristicile celulelor stem sunt incapabile s transfere boala. Succesul n lucrul cu celule depinde de factori variai cum ar fi: utilarea laboratorului, calitatea celulelor i a reactivilor, tehnica asepteic (prezentate n cele ce urmeaz) i experiena personal a operatorului care contribuie decisiv la primele trei [2].
92
CAPITOLUL 5. Aparatajul disponibil i stabilirea parametrilor optimi de funcionare pentru diverse tipuri de experimente
5.1. Echiparea laboratorului de culturi celulare Organizarea general a laboratorului de culturi celulare include urmtoarele echipamente de baz: a. Hota cu flux laminar Servete lucrului efectiv cu celulele; aranjarea spaiului de lucru este descris n figura 4; este prevazut n mod obligatoriu cu o lamp de UV care va fi pornit 5-10 minute nainte de nceperea lucrului i repornit pentru 5-10 minute dup ncheierea lucrului; tipul de hot folosit pe scar larg n cultura celulelor animale este hota cu flux de aer vertical care ofer o protecie bun att pentru celule ct i pentru operator. b. Incubator cu sursa de CO 2
creterea celulelor; n funcie de tipul de celulp, concentraia de CO2 este n general ajustat ntre 5% i 7% pentru a obine un sistem tampon optimal n combinaie cu substanele din mediul de cultur; responsabil pentru meninerea unei atmosfere sterile (filtre HEPA - high efficiency particulate air), umede i cu temperatura constant. c. Microscop optic inversat cu contrast de faz (opional aparat foto) servete la observarea celulelor; 93
deoarece n cultura de celule animale, celulele sunt n general situate pe suprafaa bazei recipientului se folosete microscopul inversat; contrastul de faz mbuntete vizualizarea specimenelor transpa- rente (celulelor). d. Centrifuga de mas cu rcire centrifugarea suspensiilor de celule n diverse scopuri. e. Recipient cu azot lichid stocarea celulelor pe termen lung; de obicei se gsete ntr-o incint anexat; o precauie deosebit trebuie acordat faptului c recipientul este extrem de rece (-196 grade Celsisus) i azotul poate produce arsuri n urma contactului cu pielea sau mucoasele; de aceea este necesar utilizarea echipamentului de protecie (ochelari/masc facial, manui, halat). f. Frigider/congelator stocarea reactivilor (medii cultur, stocuri de antibiotice, L-glutamina etc.) g. Alte componente Baie de ap pstrarea mediilor i altor reactivi la temperatura de 37C; o alternativ este nlocuirea apei cu perle metalice care prezint urmtoarele avantaje: reducerea contaminrii reactivilor cu care vin n contact, igienizare uoar, economisirea consumului de energie, stabilitate n timp. Autoclav i sterilzor cu aer uscat 94
Folosite pentru sterilizarea diferitelor soluii i recipiente folosite. Pompa de vid i sisteme de sterilfiltrare pentru lichidele instabile la autoclavare (de ex. DMSO) se poate folosi i ca sistem de aspirare a mediilor folosite. h. Consumabile pipete serologice, pot fi din plastic (de unic folosin) sau din sticl (refolosibile dup sterilizare); vase de cultur - codate n funcie de aria util de cultivare i de vo- lumul maxim de mediu care poate fi coninut; medii de cultur (multe celule pot fi cultivate n DMEM/RPMI+10%FBS la care se adaug diferite concentraii de L- glutamina i antibiotice). Cronologic se poate vorbi de existena a dou categorii de medii; cele na-turale care includ serul sanguin i alte secreii de origine animal i medii sintetice n care componentele de baz sunt produse separat i apoi amestecate de obicei de ctre firme specializate. Chiar dac este vorba de un mediu sintetic, cu unele excepii serul este considerat un component de baz. La ora actual, serul provine de la animale mari, n gene-ral de la vac - de unde i numele de fetal bovine serum (FBS). Mediile de cultur sunt soluii saline tamponate. Compoziia mediilor de cultur este complex incluznd: aminoacizi, acizi grai, carbohidrai, sruri, microelemente, vitamine, hormoni, factori de cretere i alte componente. Cele mai multe medii conin i phenol red, un indicator al pH-ului care trebuie s rmn ntre 7 i 7,4. 95
Dac acesta vireaz spre galben indicnd un mediu acid este cazul ca mediul s fie schimbat. suplimente pentru mediile de cultur: antibiotice uzual se folosete un amestec de penicilin/streptomicin, L-glutamin, Na-piruvat, bicarbonat, glucoz i altele n funcie de particularitile experimentului [2].
5.2. Strategii de lucru Din punct de vedere tehnic, exist cteva principii de baz ale lucrului cu celulele: culturile celulare vor fi fcute ntr-o camer dedicat acestui scop. Este de dorit ca aceast ncpere s fie oarecum izolat fa de restul laboratoarelor pentru a limita riscul de contaminare. Tot din acest motiv, accesul personalului n aceast camer va fi restricionat pe ct posibil; de aceea se va permite doar accesul celor care sunt direct implicai n procesul de lucru cu celulele; personalul care urmeaz s lucreze cu celulele va fi instruit corespunztor (vezi mai jos); acele ncperi care sunt dedicate lucrului cu celule prezint risc infecios pentru cei implicai; de aceea ncperile vor fi semnalizate corespunztor; toate mediile i suplimentele care urmeaz a fi folosite n cultura celular trebuie s fie certificate pentru lucrul pe culturi de celule (indicaia cell culture certified/approved trebuie s apar pe 96
ambalaj/descrierea produsului); toate acestea trebuie adaptate liniilor celulare cu care urmeaz a se lucra n laborator; spre deosebire de celulele vegetale i bacterii, celulele animale sunt pretenioase n ceea ce privete condiiile n care pot sa creasc; exist riscul contaminrii cu diferite microorganisme care datorit ratei de cretere mult superioar celulelor animale vor deveni majoritare n scurt timp; n plus factori ca spre exemplu temperatura (37 o C pentru celule mamifere), pH-ul, osmolaritatea (290-310mOsm), i o concentraie a CO2 ntre 5 i 7% condiioneaz cultura celulelor animale (sistemul de tampon cel mai frecvent utilizat este cel cu bicarbonat de sodiu sau potasiu din mediul de cultur + CO2 din incubatorul folosit); celulele animale sunt limitate n ceea ce privete numrul de generaii pe care le produc. Chiar i n condiii optime, celulele animale se vor opri din cretere dup un numr de generaii care depinde de sursa primar a celulelor; creterea celulelor animale urmeaz o curb cu trei faze: o faza de echilibrare (primele 24h) n care celulele se acomodeaz cu noul mediu n care sunt introduse; o faza de cretere exponenial care dureaz n jur de 7-10 zile; o faza de inhibare a creterii datorit inhibiiei de contact, creterii densitii peste un nivel critic, scderii potenialului de metabolizare a mediului; substanele pot fi prenclzite fie la 22, fie la 37 grade Celsius (10-20 min e suficient; se poate porni un cronometru pentru a evita uitarea 97
mediilor pentru un timp ndelungat i degradarea lor (L-glutamina, tripsina).; lucrul bine organizat i desfurat fr grab este esenial pentru o eficien maxim: o micrile vor fi msurate i sigure; o imediat dup adugarea suplimentelor n mediile de cultur se noteaz acest fapt pe recipientul respectiv; o nimic din ceea ce vine n contact direct cu celulele nu se deschide n afara hotei sterile; nainte de scoaterea din hot se verific etaneitatea nchiderii [2].
5.3. Instruirea personalului Cultivarea celulelor este un lucru care se poate nva repede. Cu alte cuvinte, oricine poate nva s menin culturile de celule dup doar cteva zile petrecute n laborator dac respect protocoalele i are la dispoziie echipamentul necesar. Singurul lucru care este i mai uor i nici mcar nu necesit nvare este s contaminezi celulele. De aceea desfurarea activitii n linite este esenial n laboratorul de culturi celulare. Odat aprut, contaminarea se poate propaga din aproape n aproape i duce n final la compromiterea nu doar a celulelor la care contaminarea a fost iniial semnalat ci a ntregului stoc de celule. Pe lng considerentele financiare, contaminarea recipientelor cu coninut original (celule produse n laborator i care nu pot fi achiziionate de la companiile specializate sau transferate de 98
la ali investigatori) reprezint cel mai neplcut aspect care poate afecta un laborator de culturi celulare. Toi cei care urmeaz s lucreze cu celule vor fi n prealabil instruii teoretic nainte de a ptrunde pentru prima dat n laborator. Practic, ei vor ncepe prin a observa manoperele de lucru i a le discuta cu un coleg familiarizat deja cu tehnicile. Doar dup aceast perioad este permis lucrul direct, mai nti sub supravegherea direct a celor familiarizai i mai apoi n mod independent. Chiar i dup ctigarea in-dependenei n lucru, cel proaspt iniiat va fi supravegheat din umbr de ctre un coleg cu experien care ar putea observa anumite manopere executate neconform cu normele curente [2].
5.4. Asigurarea asepsiei i antisepsiei Exist anumite msuri care asigur igiena n lucrul cu celulele: Utilizarea echipamentului de protecie - pentru evitarea contaminrii celulelor i operatorului: halat cu mneci lungi pantofi nchii mnui de unic folosin Splatul pe mini nainte i dup lucrul cu celulele; O soluie antimicrobian de etanol 70% trebuie s fie n permanen la ndemn; Instrumentele de lucru trebuie igienizate la intervale regulate. Orice obiect (pipeta, recipient etc.) care urmeaz s fie introdus n hota pentru lucrul steril trebuie dezinfectat nainte sau imediat dup introducere; 99
Orice pipet trebuie folosit o singur dat; nu este permis pstrarea pipetei n mediu sau folosirea unei pipete pentru a transfera mediu de la un recipient la altul; Orice mediu sau obiect contaminat din greeal va fi aruncat; Orice lichid care ajunge n contact cu suprafaa de lucru steril va fi ndeprtat imediat cu ajutorul unui prosop de hrtie mbibat n etanol 70%; Este necesar investigarea strii de sntate a celulelor n fiecare zi. Se pot astfel observa caracteristicile normale sau abateri de la acestea. Se pot de asemenea observa contaminri cu alte celule sau microorganisme. Se pot lua probe care sunt analizate pentru stabilirea prin diferite tehnici a gradului de puritate/contaminare [2].
5.5. Cultivarea celulelor dup felul n care cresc n flacoanele de cultur, celulele eucariote pot fi mprite n dou mari categorii: cele care cresc aderent pe vasul de cultur i cele care cresc n suspensie. Modul de lucru este asemntor pentru toate celulele dar exist anumite particulariti de care trebuie inut cont n cazul fiecrei grupe; evaluarea celulelor se face n mod normal n fiecare zi prin vizualizarea lor sub microscopul optic; celulele care cresc aderent trebuie s apar distribuite pe suprafaa de contact cu vasul n care cresc i de cele mai multe ori capt o form poligonal, iar celulele care cresc n suspensie rmn rotunde i uneori (n funcie de linia cultivat) 100
pot forma aglomerri de celule (asemntor cu o ciorchin de struguri); starea de sntate a celulelor este confirmat i de creterea numrului de la o zi la alta; o evaluare de prim instan a celulelor se realizeaz prin vizualizarea macroscopic a culorii mediului din sticlele de cultur; culoarea standard a mediilor este rou-orange; o culoare care virea z spre galben indic necesitatea schimbrii mediului; subcultivarea celulelor: deoarece aglomerarea celular poate influena negativ vitalitatea celulelor (a se vedea mai sus), se recomand ca celulele s fie subcultivate; aceast procedur care se aplic n faza logaritmic de cretere a celulelor permite obinerea unor cantiti crescute de celule prin mprirea/transferul acestora dintr-un recipient de cultur n mai multe recipiente fiecare reprezentnd o nou surs de celule; exist anumite formule de calcul care permit aflarea cu precizie a combinaiilor optime; de asemenea se pot planifica n acest fel anumite experimente pentru anumite date; n anumite situaii este nevoie de utilizarea unor soluii de tripsina/EDTA pentru crearea suspensiilor unicelulare (vezi Tripsinizarea) [2]. 5.6. Separarea prin centrifugare a celulelor din mediul de cultur i stabilirea viabilitii acestora Pentru a subcultiva celulele/folosi celulele ntr-un anumit protocol este nevoie de stabilirea numrului de celule pe unitatea de volum. Mediul de cultur coninnd celulele este transferat unor tuburi n care se centrifugheaz (centrifuga trebuie echilibrat n prealabil - dac avem un singur tub cu celule va trebui s folosim un al doilea tub 101
cu aceeai greutate care poate s conin ap distilat sau orice alt lichid cu densitate asemntoare). Pentru o separare bun este nevoie de 10 minute la 200-250g/min (ntr-o centrifug de mas cu rotor standard 1000rpm). Dup centrifugare celulele se resuspend n mediu proaspt i apoi 10 microlitri sunt combinai cu 10 microlitri de soluie Trypan blue 0,5% i pipetate n camera de numrat. Sub microscopul optic, leucocitele apar ca i celule glbui/transparente cu o membran brun. Soluia de trypan blue va ptrunde n celulele moarte care apar albastre. n funcie de tipul camerei de numrat, exist formule de calcul dup care putem s aflm numrul total de celule. O viabilitate de peste 90- 95% este n general acceptat pentru toate manipulrile ulterioare [2]. 5.7. nghearea i dezghearea celuluor Doi pai critici ai lucrului cu celulele sunt constituii de ctre nghearea i dezghearea celulelor. nghearea este indispensabil din urmtoarele considerente: Celulele sunt supuse n permanen variaiilor n compoziia cromozomilor. De aceea cea mai sigur metod de prezervare a liniilor celulare este cryoprezervarea care oprete procesele metabolice nelsnd astfel loc modificrilor genotipului. n plus, cryoconservarea este o metod practic din punct de vedere economic: este mult mai simplu s pstrezi un tub cu celule ngheate care nu au nevoie dect de o completare periodic a rezervei de azot dect s cultivi n mod repetat celulele n laborator; de 102
asemenea transportul ntre laboratoare este mai uor dac celulele sunt ngheate. Nu n ultimul rnd, metoda face posibil revenirea la celule cu un numr mai mic de pasaje. Este esenial ca nainte de nceperea procedurii respective s notm urmtoarele detalii pe fiecare tub: tipul de celul, numrul de celule, numrul de pasaj i data la care a fost creat stocul. nghearea va fi lent i constant pentru a minimaliza efectele adverse asupra viabilitii celulelor. Mediul de ngheare cel mai frecvent folosit conine mediul de cultur recomandat pentru linia celular + 20% FCS + 5-10% cryoprotector -Dimethyl sulfoxid (DMSO) sau 10-15% glicerol care are rolul de a scdea temperatura de nghe permind apei s ias din celul i mpiedicnd astfel formarea cristalelor de ghea care ar putea distruge membrana. Dup centrifugarea i verificarea vitalitii (se recomand folosirea celulelor vitale n proporie de >90-95% la colorarea cu trypan blue), celulele vor fi resuspendate direct n mediul de ngheare rcit n prealabil la 4 grade la o concentraie de 1x10 6 -1x10 7 /ml 6 i transferate imediat la -20 o C pentru 1-2 ore. Urmeaz apoi transferul peste noapte la -80 o C i apoi stocarea de lung durat n azot lichid. Dezghearea celulelor trebuie fcut extrem de rapid (ideal n mai puin de un minut) prin transferul acestora din recipientul cu azot, pe gheaa uscat, direct n baia de ap la 37 de grade Celsius. Odat ce 103
dezghearea permite pipetarea suspensiei (>75% dezgheat) aceasta se transfer ntr-un tub de 15ml peste care se adaug pictur cu pictur8 o cantitate de mediu prenclzit echivalent cu de dou-trei ori cantitatea suspensiei, dup care se poate aduga mai rapid mediu pn la 10ml. Se centrifugheaz n general la 200rpm timp de 2-5 min pentru a elimina urmele mediului de ngheare. Se resuspend n 10 ml de mediu i se transfera n sticlele de cultur etichetate. Prin micri fine se distribuie celulele. Dup cteva ore (cel trziu a doua zi dimineaa) se verific starea celulelor prin vizualizarea la microscop. Mediul va fi schimbat pentru a nltura celulele moarte i resturile de cryoprotector (DMSO sterilfiltrat sau glycelor - autoclavat). 5.8. Subclonarea i tripsinizarea Celulele formeaz aderene ntre ele i suprafaa vasului de cultur (celule aderente) i/sau ntre ele (celulele aderente, unele celule care cresc n suspensie). Pentru cele mai multe protocoale/manopere este necesar obinerea unei suspensii unicelulare. Cea mai frecvent combinaie folosit n acest scop este tripsina/EDTA. Dac este vorba de celule aderente protocolul de lucru presupune ndeprtarea mediului, splarea cu o soluie salin tampon fr calciu i magneziu i adugarea unei cantiti de trispin/EDTA care s acopere stratul de celule. Celulele nu trebuie lsate neacoperite timp ndelungat. Pentru a ajuta separarea este posibil uoara btaie a sticlei de podul palmei. Urmrind sub microscop separarea celulelor (dureaz cteva minute) se poate evita efectul nociv al unei incubri 104
prea ndelungate. Celulele devin rotunde odat ce pierd aderenele. Imediat, aciunea trispinei este antagonizat prin adugarea de ser urmat de transferul ntr-un tub adecvat i centrifugarea. Dup centrifugare celulele sunt resuspendate n mediu pentru a obine o suspensie unicelular i apoi numrate/investigate la microscop prin colorarea cu trypan blue (proporia celulelor moarte). Dac tripsinizarea s-a fcut n cadrul protocolului de subcultivare, celulele sunt apoi transferate vaselor noi de cultur i incubate pn a doua zi. A doua zi se recomand schimbarea mediului care permite nlturarea celulelor moarte i a resturilor de tripsin/EDTA. Dac manopera s-a fcut n alt scop, se urmeaz paii din protocolul respectiv. La celulele neaderente nu se face tripsinizarea; celule pot fi direct numrate iar densitatea lor este ajustat prin adugarea mediului proaspt. La fiecare 2-4 sptmni se centrifugheaz i resuspend celulele neaderente n mediu proaspt [2].
CAPITOLUL 6. Producerea i izolarea proteinelor recombinate din celule mamifere Tehnica de baz pentru producerea acestor proteine implic mai multe etape care sunt menionate n tabelul 3. Dup ntocmirea strategiei de lucru, fragmentele de interes sunt amplificate prin tehnica PCR. Pe scurt, esutul care conine antigenul int este prelevat de la sursa de interes dup care ARN-ul mesager obinut n urma extraciei este folosit ca i matri pentru sinteza ADN-ului complementar [2]. Cu 105
ajutorul amorselor specifice, folosind acest ADN complementar pot fi amplificate secvenele de interes prin reacia de PCR. Dup clonarea acestor fragmente n celule, urmeaz exprimarea proteinelor codate i purificarea acestora [2]. Apoi n funcie de aplicaia dorit, acestea vor fi utilizate fie la imunizarea pentru modelul activ de boal fie pentru cel pasiv. 6.1. Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizai Terapia biologic cu ajutorul anticorpilor este considerat la ora actual ca fiind cea mai activ bran a industriei biotehnologice [57]. Din punct de vedere istoric, prevenia/terapia cu ajutorul anticorpilor este o procedur folosit de cteva mii de ani. Chinezii i indienii sunt cei crora li se atribuie folosirea terapeutic a serurilor (fraciunea sngelui n care se gsesc anticorpii alturi de alte proteine) nc naintea erei noastre. n urm cu cteva secole, este semnalat folosirea serurilor pentru protejarea persoanelor n Turcia i apoi odat cu experimentele doctorului Edward J enner de la sfritul secolului al XVIII i n Anglia. Totusi folosirea pe scar mai larg a anticorpilor n scop terapeutic a nceput s fie practicat ncepnd cu secolul XX. n ciuda efectelor terapeutice extraordinare, folosirea anticorpilor a fost ns limitat de anumite aspecte dintre care cele mai neconvenabile au fost: lipsa unei surse constante de anticorpi omogeni; anumite aspecte adverse (apriia unui rspuns imun fa de nsui anticorpii) datorit utilizrii anticorpilor de la alte specii; 106
dificultilor tehnice n izolarea/producerea lor i necunoaterea posibilelor inte terapeutice eseniale pentru diferite afeciuni. Descoperirea antibioticelor n anii 30-40 ai secolului trecut alturi de celelalte inconveniente amintite au dus la intrarea anticorpilor ntr-un con de umbr. ncepnd cu 1975 situaia avea ns s se schimbe. ntr-o lucrare de referin pentru literatura biomedical, doi cercettori anun n revista Nature o metod prin care se pot obine cantiti teoretic nelimitate de anticorpi cu specificitatea dorit. Diferena ntre anticorpii policlonali (cei care erau la acea or n uz medical) i noii anticorpi (numii monoclonali) poate fi comparat, chiar i numai pentru a face lucrurile mai uor de neles, cu diferena dintre dou persoane, prima purtnd haine de diferite mrimi, forme i culori i a doua purtnd haine personalizate de ctre un croi-tor profesionist, ncepnd de la lenjerie i pn la ultimul nasture al paltonului. Chiar dac uor exagerat i poate nu cea mai potrivit din punct de vedere biomedical, folosirea acesteia are un substrat uor de neles i anume n literatura de specialitate de limba englez termenii tailor made antibodies sunt folosii pentru a descrie producerea de anticorpi monoclonali specifici pentru diferite situaii [57]. Dezvoltarea acestei noi tehnici, a dus la nlturarea primului din cele dou mari dezavantaje ale folosirii anticorpilor policlonali, i anume lipsa unei surse constante de anticorpi cu caracteristici omogene; de asemenea, cu timpul, noua tehnologie a permis obinerea lor prin tehnici relativ 107
simple i cu costuri substanial diminuate nlturnd astfel cel de-al treilea dintre dezavantajele amintite anterior. Anticorpii monoclonali produi iniial au pstrat neajunsul de a fi produi n alte specii ducnd la declanarea unui rspuns imun masiv din partea primitorului (cel de- al doilea neajuns). Cel mai probabil din acest motiv, lumea biomedical i industria farmaceutic a fost n prima instan rezervat la posibila utilizare a acestora pe scar larg. Aceast temere a fost dublat i de avansarea tehnicilor industriale de producere a molecule-lor cu mas molecular mic care preau s fi rezolvat n sfrit problema inexistenei unor medicamente perfecte. n ciuda acestor piedici, entuziatii au continuat ns lucrul la producerea anticorpilor monoclonali ducnd la aprobarea utilizrii primului anticorp produs n acest fel nu ns mai repede de un deceniu de la publicarea metodologiei de ctre Koehler i Milstein [37]. Totui n anii care au urmat, potenialul imens al noii tehnologii a incitat att curiozitatea comunitii tiinifice (interesat n definirea noilor aplicaii pentru care anticorpii monoclonali reprezentau unealta mult-cutat, cel de-al patrulea neajuns amintit mai sus) ct i de ctre pragmatismul industriei farmaceutice (care gsea o nou min de aur n comercializarea noilor gloane magice aa cum le numea Paul Ehrlich, printele hematologiei i chemoterapiei, acesta din urm fiind un termen pe care l-a introdus chiar el, cu mai bine de un secol n urm [69]. Dup unii, dezvoltarea tehnologiei producerii anticorpilor monoclonali reprezint inovaia secolului trecut n ceea ce priveste importana terapeutic, diagnostic i preventiv a mbolnvirilor 108
umane. Dac n anul 2000, n topul primelor zece produse folosite n tratamentul diverselor afeciuni existau, cu o singur excepie, doar substane cu greutate molecular mic, se estimeaz c cinci din cele zece substane vor fi reprezentate de anticorpi n viitor [57, 66]. Desigur aceast turnur a fost posibil prin mbuntirea permanent a protocoalelor de lucru i obinerea unor anticorpi modificai prin tehnologia ADN recombinat, tehnici care au cunoscut o dezvoltare extraordinar n ultimele dou trei decenii. La ora actual, anticorpii sunt n aproape toate situaiile luai n calcul la stabilirea strategiei terapeutice alternative sau cteodat constituie chiar terapia de prim alegere. Dintre cei peste 25 de anticorpi monoclonali aflai la ora actual pe lista medicamentelor aprobate pentru tratamentul afeciunilor umane, majoritatea sunt destinai tratrii cancerelor. De asemenea dintr- un total de 1500 de studii clinice n care sunt testai noi anticorpi monoclonali peste75% sunt axate pe folosirea acestora n tratarea cancerelor. Majoritatea sunt folosii ca atare (neconjugati), urmai de cei conjugai cu material radioactiv i o mic proporie sunt reprezentai de cei conjugai cu toxine. Aceste date au menirea de a sublinia interesul major al comunitii biomedicale i al guvernelor statelor industrializate (din moment ce majoritatea studiilor sunt finanate din bani publici) pentru gsirea unor strategii terapeutice specifice pentru tratarea acestei maladii. Dup cum aminteam anterior la 11 ani de la publicarea lucrrii lui Koehler i Milstein [37], n 1986 este aprobat utilizarea primului anticorp monoclonal pentru prevenirea rejetului de transplant. Folosirea 109
pe scar larg a Orthoclone OKT3 (muronomab CD3) a fost ns limitat de faptul c acest anticorp de origine murin (produs n celule de oarece care difer suficient de celulele umane) induce un rspuns imun amplu n organismul uman [68]. Mai mult, administrarea acestui anticorp a dus la apariia sindromului eliberrii sistemice de cytokine datorit interaciunii OKT3 cu receptorii pentru poriunea Fc a IgG. Datorit eecului relativ al utilizrii acestui medicament i datorit timpului ndelungat necesar dezvoltrii unui nou medicament, timpul scurs pn la aprobarea celui de-al doilea anticorp monoclonal a fost de nc opt ani de la aprobarea OKT3. n 1997, rituxan (rituximab), un anticorp monoclonal mpotriva CD20 de pe celulele B devine cel de-al treilea medicament admis pe piaa din SUA pentru tumori ale celulelor B. ntre timp acest medicament este folosit i n tratamentul unor boli autoimune cum ar fi artrita reumatoid, bolile buloase (pemfigusul, pemfigoidul), diabetul zaharat de tip I, anemia hemolitic autoimun, vasculita autoimun etc. Acest anticorp chimer (combinaie ntre uman i murin) are multiple mecanisme de aciune dintre care merit amintite: inducerea toxicitii celulare indus de anticorpi (ADCC) i citotoxicitatea mediat de complement (CDC), alturi de un mecanism de inducere a apoptozei celulelor care exprim CD20 pe suprafa. n general, anticorpii sunt substane care interacioneaz cu structuri extracelulare sau de pe suprafaa celulelor. Mare parte dintre eforturile actuale au menirea de a crete penetrana acestor glicoproteine pentru inte din interiorul celulelor. n plus dac anticorpii iniiali aparineau clasei IgG1, investigaii actuale sunt concentrate asupra diversificrii 110
activitii prin schimbarea clasei i deci a paletei de efecte posibile. Mai mult, exist cteva direcii prin care se urmrete creterea posibilelor interaciuni terapeutice. Dintre acestea amintim: - o modificarea poriunii Fc a anticorpilor pentru: - mbuntirea interaciunii cu receptorii Fc sau Fc de tip neonatal (FcRn) de pe celulele efectoare; - mbuntirea proprietilor efectoare prin optimizarea in- teraciunii cu sistemul complement; o prelungirea duratei de injumtire cu efecte favorabile datorate reducerii dozajului fie prin PEG-ylarea fragmentelor (scFv, Fab) fie prin fuzionarea lor pe domenii de Ig; o multispecificitatea, adic adugarea unei alte specificiti n zona de recunoatere a Fab. Pe scurt, anticorpul pstreaz specificitatea pentru care a fost creat pe unul dintre fragmentele Fab cu care se va lega de inta dorit urmnd ca pe celalalt fragment Fab s lege un receptor de pe o celul efectoare (spre exemplu CD3 de pe celula T) care are proprietatea de a distruge celula recunoscut specific. 111
6.2. Recomandri pentru abordarea de noi tipuri de experimente i metodologii a culturilor celulare. Una dintre direciile de cercetare care vor fi abordate n viitor se va concentra pe producerea de fragmente recombinate ale diferitelor protei-ne autoantigen cu ajutorul culturilor celulare eucariote. Atenia va fi concentrat pe producerea acelor autoantigene a cror patogenitate este nc incomplet elucidat, contribuind astfel ntr-un mod inovativ la definirea naturii autoimune a diferitelor entiti clinice. Un exemplu n acest sens l constituie clonarea fragmentelor de integrine. Integrinele sunt o clas heterogen de proteine implicate n diverse procese de la asigurarea contac-telor dintre celule i mediul nconjurtor, la funcii de recrutare i transducerea semnalului. Un interes primar pentru preocuprile noastre l constituie producerea fragmentelor recombinate ale proteinelor care asigu-r adeziunea keratinocitelor de stratul dermal. Defecte ale acestor integrine sunt considerate a fi implicate n patogeneza bolilor autoimune. Nu este deocamdat clar n ce fel i n ce msur autoanticorpii fa de aceste mole-cule sunt implicai n patogeneza autoimun. De aceea, odat produse aceste fragmente ar putea fi folosite n diferite combinaii pentru a reproduce caracteristicile bolii umane n animalele de experien. Ca i metodologie de lucru, producerea unui model de boal i modularea acestuia n scop preventiv/terapeutic implic mai multe etape (Tabelul 6.1).
112
Tabelul 6.1. Etape recomandate pentru modelare n scop preventiv/terapeutic a unei boli autoimune n animalele de experien Denumire etap activiti Obinerea fragmentelor recombinate ale autoantigenului Stabilirea planului de clonare Designul i producerea de amorse specifice Izolarea ARN-ului mesager RT-PCR Clonarea produilor obinui prin PCR Exprimarea proteinelor recombinate Producerea modelului activ de boal Imunizarea animalelor de experien cu diferite combinaii de proteine recombinate Evaluarea clinic i paraclinic a inducerii bolii Dezvoltarea unor strategii de prevenie, diagnostic i tratament a bolii induse: - folosirea diverselor ci de administrare, adjuvani, cantiti variabile de autoanitgen, folosirea autoantigilor modificai - folosirea anticorpilor monoclonali cruzi sau funcionalizai cu nanosfere - folosirea nanosferelor direcionate specific mpotriva celulelor imune autoreactive
Producerea modelului pasiv de boal Imunizarea unor animale intermediare cu diferite combinaii de proteine recombinate i izolarea anticorpilor specifici produi Transferul pasiv al acestor anticorpi n oarecii de 113
laborator Dezvoltarea strategiilor de prevenie, diagnostic i tratament: - folosirea anticorpilor din diferite surse i evaluarea mecanismelor patogenetice specifice fiecruia (sistem complement, granulocite prin FcR etc.) - izolarea claselor i subclaselor din sursa de anticorpi policlonali i investigarea meca- nismelor efectoare prin care acetia produc boala - modificarea anticorpilor prin tehnica ADN-ului recombinat (se urmrete n acest fel modularea interaciunii cu diferite mecanisme efectoare prin modificarea spre exemplu a poriunii Fc a anticorpului)
n ultimii ani, un accent deosebit a fost pus pe studierea interaciunilor dintre poriunea Fc a anticorpilor i alte proteine efectoare din sistemul imun (receptorii pentru Fc de la nivelul celulelor imuniti nnscute, sistemul complement). Cercetri recente au artat c exist diferene eseniale ntre aciunea diverilor anticorpi care la prima vedere sunt identici. Explicaia propus a fost c diferena este datorat unor modificri postranslaionale aprute n poriunea Fc a anticorpilor. Este vorba despre adugarea diferitelor lanuri glucidice care fac anticorpii entiti glicoproteice. Dei acest lucru era cunoscut 114
de mai mult vreme, semnifica-ia funcional a acestui detaliu structural a rmas un mister pn de cu-rnd. S-a dovedit recent c o scdere a syalilarii lanului glucidic din aceas-t poriune duce la creterea activrii celulelor efectoare cu receptror Fcgamma. De asemenea structura primar a lanului polipeptidic care formeaz poriunea Fc a anticorpilor este implicat n reactivitile diferite observate la folosirea diverselor preparaii de anticorpi. De altfel interesul tot mai mare n explicarea la nivel molecular a susceptibilitii la anumite afeciuni a dus din ce n ce mai frecvent la obinerea secvenelor de nucleotide care codeaz pentru anticorpi. S-a dovedit astfel existena unei concordane ntre aceste secvene i capacitatea lanurilor codate de a activa anumite mecanisme efectoare. Tendina actual este de a grupa aceste polimorfisme de la nivelul ADN n funcie de capacitatea anticorpilor de a activa/inhiba o anumit clas de celule efectoare cu implicare n terapia afeciunilor autoimune i cancerelor. Astfel, interesul extraordinar n gsirea combinaiilor optime de anticorpi care s identifice celulele tumorale int i n acelai timp s angajeze un rspuns prin modificare celui de-al doilea fragment Fab a nceput s fie balansat de interesul pentru modifica-rea poriunii Fc n vederea creterii efectivitii. Ideea de baz este c un sistem imun acordat perfect reuete s distrug celulele nedorite prin implicarea la timpul i momentul potrivit a potenialului uria pe care celu-lele imunitii il posed. Se vorbete n acest sens despre anticorpi trispecifici/multispecifici n care pe lng specificitatea poriunii Fab pen-tru inta dorit, cea de-a doua poriune Fab poart specificitatea 115
agentului terapeutic (nanosfera radioactiv sau toxina; specificitate pentru un alt re-ceptor de pe o celul citotoxic spre exemplu), iar o a treia, patra etc. speci-ficitate este adus de ctremodificarea/modificrile din poriunea Fc astfel nct acestea s poat activa cu succes diverse mecanisme imune (Figura 6.1). Figura 6.1. Mecanisme de aciune ale anticorpilor multispecifici. Pe lng specificitatea pentru celula tumoral int i cea pentru nanoparticule, anticorpii multispecifici posed i alte specificiti care s le creasc capacitatea funcional benefic. Spre exemplu, prin modificarea poriunii Fc pe partea stng a figurii, anticorpul capt 116
proprieti sporite de activare a sistemului complement care fie direct (2) fie indirect (3) duce la distrugerea celulei canceroase/autoimune. n plus, folosirea unei duble specificiti a poriunii variabile a fragmentului Fab face posibil recrutarea n vecintatea tumorii a celulelor T citotoxice (4). De asemenea, prin personalizarea interaciunii fragmentului Fc cu celulele care poart receptori pentru acesta (partea dreapta jos) sunt transduse semnale puternice care pot avea ca rezultat o activare crescut a acestor celule cu producerea speciilor reactive de oxigen i eliberarea proteazelor efectoare (5,6). n prezent se urmrete lrgirea paletei de experimente i metodologii care pot fi oferite la nivelul laboratorului. Numeroi membri ai acestuia se afl n prezent n diverse laboratoare partenere unde deprind metode i tehnici noi pe care dorim s le implementm odat cu reintegrarea acestora n laboratorul de origine. Dintre avantajele folosirii anticorpilor ca i ageni biologici n tratamentul cancerului amintim: - timpul de njumtire crescut fa de moleculele cu greutate molecular mic ceea ce face posibil scderea dozei utilizate - specificitatea i afinitatea mare - multiple mecanisme de aciune care pot fi combinate (vezi anticorpi multispecifici pentru ADCC i CDC) - posibilitatea folosirii acestora ca i terapie complementar/alternativ oricrei forme de terapie anti-canceroas tradiional 117
- utilizarea lor ca i vehicul specific pentru transportul diverselor substane anticanceroase spre diverse destinaii (vezi anticorpi bispecifici) - utilizarea lor ca i markeri de diagnostic/prognostic pentru diferite afeciuni. - n anumite cazuri anticorpii pot per se s controleze creterea tumorii prin interferarea cu cile de semnalizare celular, fie prin inducerea apoptozei fie prin antagonizarea efectelor factorilor de cretere [49]. Tabelul 6.2. Diferite mecanisme de aciune ale anticorpilor monoclonali Mecanism de aciune propus Reprezentant ADCC Anti-CD20 CDC Anti-CD20 Inducerea apoptozei Anti-CD20 Blocarea interaciunii factorilor de cretere cu receptorii specifici Anti-EGFR Blocarea fizic a dimerizrii receptorilor pentru factorii de cretere Anti-EGFR Anti-Her2/neu Inhibarea neoformrii vaselor sangvine Anti-VEGF-A Anti-EGFR Blocarea factorilor de cretere n forma solubil Anti-EGFR Funcionalizarea/conjugarea cu radioizo-topi, toxine, enzime sau cytokine Diveri
118
Majoritatea anticorpilor monoclonali utilizai acioneaz asupra intelor specifice prin acest mecanism; legarea concomitent a Fv (partea a Fab) de antigenul int i a Fc de o celul cum ar fi macrofagul sau celula NK care posed receptori pentru aceast poriune duce la activarea celulei imune urmat de distrugerea celulei intit specific. Cercetri recente au artat c ADCC este mai eficient la acei indivizi care prezint anumite polimorfisme n poriunea Fc (respondeni cu grad nalt)
119
CAPITOLUL 7. Cromatografia i cromatofocalizarea. Principii i metode Biomoleculele sunt purificate folosind tehnici cromatografice care le separ potrivit diferenelor n proprietile lor specifice, astfel cum se arat n figura 7.1. 7.1. Cromatografia de schimb ionic (Ion exchange chromatography - IEX) separ biomolecule in funcie de variaia suprafeei moleculare (figura 7.1.).
Gel filtrare Interaciune hidrofob Schimb de ioni Afinitate Faza revers
Figura 7.1. Principii de separare n purificarea cromatografic IEX pentru separarea biomoleculelor a fost introdus n 1960 i continu s joace un rol important n separarea i purificare. Astzi, IEX este una dint tehnicile cele mai frecvent utilizate pentru purificarea de proteine, peptide, acizi nucleici i alte biomolecule, oferind o nalt rezoluie de separare de grup i cu ncrcri de mare capacitate. Tehnica 120
este capabil de a separa specii moleculare, care au cele mai minore diferene de sarcin, de exemplu dou proteine care difer prin un aminoacid. Aceste caracteristici fac IEX bine potrivit pentru captarea, purificare intermediar ntr-un protocol de purificare tehnic i este utilizat la purificarea microcantitilor i purificarea pentru analize a cantitilor de ordinul kilogramelor de produs. IEX separa moleculele pe baza diferenelor de sarcin pe suprafa. Molecule variaz considerabil n proprietile lor de ncrcare i expun diferite grade de interaciune cu faza fix a cromatografiei n funcie de diferenele n sarcina lor, densitatea i distribuia sarcinii pe suprafa. Grupurile intramoleculare care posed diferite valori pKa, n funcie de structura acestora i micromediul chimic. Deoarece toate moleculele cu grupri ionizabile poate fi titrate, sarcina lor extern depinde de pH. n cazul proteinelor, care sunt construite din mai muli aminoacizi coninnd grupri acide i bazice slabe. Fiecare protein are propria sa ncrcare unic fa de relaia pH care poate fi vizualizat ca o curb de titrare. Aceast curb reflect modul de ncrcare general al modificrilor de proteine n funcie de pH-ul mediului. Figura 7.2 ilustreaz mai multe curbe teoretice titrare proteice (aceste curbe pot fi generate folosind o combinaie de focalizarea izoelectric i electroforeza). Cromatografia IEX are un avantaj deoarece relaia dintre pH i sarcina molecular extern este specific fiecrei substane [48].
121
Figura 7.2. Curba ipotetic de titrare a proteinelor, care arat modul n care sarcina superficial a moleculei variaz n funcie de pH.
7.2. Filtrare pe gel sau gel filtrarea. Filtrarea pe gel, mentionat ca cromatografia de excluziune steric SEC, separ moleculele conform diferene n dimensiune ca acestea trec printr-un mediu de filtrare n gel ambalat n o coloan. Spre deosebire de schimbtori de ioni sau cromatografie de afinitate, moleculele nu se leag de mediul pentru cromatografie. Prin urmare, un avantaj semnificativ de filtrare pe gel este c condiiile pot fi variate pentru a se potrivi tipului de prob sau cerinele pentru purificare ulterioar, analiz sau de depozitare fr a modifica separarea. Filtrarea pe gel este un procedeu foarte potrivit pentru biomolecule care pot fi sensibile la modificarea pH-ului, concentraia ionilor metalici sau co-factori i condiiile dure de mediu. Separarea Sarcina superfi cial 122
poate fi realizat n prezena ionilor eseniali sau cofactori, detergeni, uree, guanidina clorhidrat, la tria ionic ridicat sau sczut, la 37C sau n camera frigorific conform cerinelor experimentului. Proteine purificate pot fi colectate n orice soluie tampon. Acest capitol ofer sfaturi generale aplicabile pentru orice separare filtrare gel. Un pas cheie fa de separarea de succes este selectarea mediului corect. Pentru a realiza o separare, filtrare pe gel, mediul este ambalat ntr-o coloan, pentru a forma un strat tasat. Mediul este o matrice poroas de particule sferice cu stabilitatea chimic i fizic i Inert (lipsit de reactivitate i proprieti de adsorbie). Stratul tasat este echilibrat cu tampon care umple porii matricei i spaiul dintre particule. Lichide n interiorul porilor, sau faza staionar, este n echilibru cu lichidul din afara particulei, sau faz mobil. Eantioanele sunt eluai izocratic deci nu este nevoie de a utiliza diferite tampoane n timpul separare. Cu toate acestea, un pas de splare folosind tampon de rulare este, de obicei, la sfritul unei separare a elimina molecule care poate au fost pstrate la coloan i a pregti coloan pentru o nou centrare. Filtrare pe gel poate fi folosit direct dup schimbul de ioni, cromatofocalizare, interaciune hidrofob, sau afinitate, deoarece compoziia tampon nu va afecta n general, separarea final. Figura 7.3 ilustreaz procedeul de separare de filtrare pe gel [47]. 123
Figura 7.3. Procesul de gel filtrare. (A) Schema unui irag de mrgele, cu o extindere de microscopie electronic. (B) Schema desen de molecule de prob difuzarea n porii irag de mrgele. (C) descrierea grafic a separrii I. Proba este aplicat pe coloan, II. Cea mai mic molecul (galben) este mai ntrziat dect cea mai mare molecula (rou). III. Cea mai mare molecula este eluat prima din coloan. Banda lrgit produce diluarea semnificativ a 124
zonelor de proteine n timpul cromatografie. (D) cromatogram schematic. 7.3. Interaciunea hidrofob Apa este un bun solvent pentru substanele polare, i un solvent slab pentru substanele nepolare. n ap lichid o majoritate a moleculelor de ap apar in grupuri datorit legturi de hidrogen ntre ele nsele (Figura 7.4). Dei timpul de semidezintegrare al clusterilor aquatici este foarte scurt, efectul net este o coeziune foarte puternic ntre moleculele de ap, reflectat, de exemplu, printr-un punct de fierbere ridicat.
Figura 7.4. Proprietile de solubilizare ale apei aprute n capacitatea sa de a interaciona cu dipoli i pentru a forma legturi de hidrogen. La o interfa aer-apa, moleculele de apa se vor aranja ntr-o structur foarte ordonat. Aici, posibilitatea de a forma legturi de hidrogen nu mai este n echilibru, dar este dominat de partea lichid a interfeei. Acest lucru d natere la o structur ordonat, care se manifest ca o tensiune de suprafa puternic. Orice lucru care influeneaz stabilitatea apei afecteaz i tensiunea superficial. Atunci cnd o substan hidrofob, cum ar fi o protein sau un ligand hidrofob este scufundat n ap se ntmpl ceva analog 125
fenomenului de tensiune superficial. Moleculele de ap nu pot umezi suprafaa substanei hidrofobe. n schimb, se formeaza un nveli foarte ordonat n jurul substanei, din cauza incapacitii lor de a forma legturi de hidrogen n toate direciile (figura 7.5).
Figura 7.5. Ap structurat nconjoar suprafeele hidrofobe de liganzi i proteine. Substane hidrofobe sunt forate s fuzioneze pentru a minimiza suprafaa total a acestor structuri (maximizarea entropiei). Srurile sporesc interaciunea hidrofob. B) echilibru de interaciune hidrofob este controlat n special de concentraia de sare.
Per ansamblu, toate tehnicile cromatografice prezentate mai sus sunt o modalitate foarte eficient de a separa molecule anorganice, ct si macromoleculele organice de interes cercetatorilor preocupai de genetica molecular, n studii biomedicale, aplicaii biotehnologice si nanotehnologiile viitorului. Aceasta editie are ca auditoriu-inta tineri specialiti n biologia molecular si genetica aplicat cu aspiraii inalte spre realizri de performanta n domeniul ales.
126
BIBLIOGRAFIA 1. Abba M.C., Gmez M.A., Golijow C.D., (2001). HLA-DQA1 allele typing by nonisotopic PCR-LIS-SSCP. Braz. J . Med. Biol. Res. J ul;34(7):867-9. 2. Alua M., Simon S., (2012). Metode experimentale avansate pentru studiul si analiza bio-nano-sistemelor. Cluj-Napoca: Casa Crii de tiin, ISBN 978-606-17-0115-5. 3. Baas B. J ., Denisov I. G., Sligar S. G., (2004). Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 n a nanoscale native bilayer environment, Archives of Biochemistry and Biophysics, 430(2), 218-28. 4. Baker S. E., Hopkins R. C., Blanchette C. D., Walsworth V. L., Sumbad R., Fischer N. O., Kuhn E. A., Coleman M., Chromy B. A., Letant S. E., Hoeprich P. D., Adams M. W., Henderson P. T., (2009). Hydrogen production by a hyperthermophilic membrane-bound hydrogenase n water-soluble nanolipoprotein particles. J ournal of the American Chemical Society, 131(22), 7508-7509. 5. Baker P., Sawa Y., Shibata H., Sedelnikova S., Rice D., (1998). Analysis of the structure and substrate binding of Phormidium lapideum alanine dehydrogenase. Nature Structural Biology, 5, 561- 67. 6. Barroso A, Dunner S, Can J ., (1998). Technical note: Detection of bovine kappa-casein variants A, B, C, and E by means of polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR- SSCP). J . Anim. Sci. J un;76(6):1535-8. 7. Bayburt T. H., Grinkova Y. V., Sligar S. G., (2006). Assembly of single bacteriorhodopsin trimers n bilayer nanodiscs, Archives of Biochemistry and Biophysics, 450(2), 215-22. 8. Blanchette C. D., Cappuccio J . A., Kuhn E. A., Segelke B. W., Benner W. H., Chromy B. A., Coleman M. A., Bench G., Hoeprich P. D., Sulchek T. A., (2008). Atomic force microscopy differentiates discrete size distributions between membrane protein containing and empty nanolipoprotein particles, Biochimica et Biophysica Acta, 1788(3), 724-31. 9. Billard-Pomares T, Tenaillon O, Le Nagard H, Rouy Z, Cruveiller S, Mdigue C, Arlet G, Denamur E, Branger C., (2011). Complete 127
nucleotide sequence of plasmid pTN48, encoding the CTX-M-14 extended-spectrum -lactamase from an Escherichia coli O102- ST405 strain. Antimicrob. Agents Chemother.;55:1270-1273. 10. Boonstra B., Rathborne D. A., French C. E., Walker E. H., Bruce N. C., (2000). Cofactor regeneration by a soluble pyridine nucleotide transhydrogenase for biological production of hydromorphone. Applied Enviromental Microbiology, 66, 5161-66. 11. Brown T.A., (2002). Genomes. 2nd edition. Oxford: Wiley-Liss. 12. Cabello C. M., Warner B. Bair W. B., Bause A. S., Wondrak G. T., (2009). Antimelanoma activity of the redox dye DCPIP (2,6- Dichlorophenolindophenol) is antagonized by NQO1, Biochemical Pharmacology, 78(4), 344-54. 13. Caetano-Anolls G, Bassam BJ , Gresshoff PM., (1991). DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers. Biotechnology (NY). 1991 J un; 9(6):553-7. 14. Chibata I., Tosa T., Sato T., (1976). Production of L-aspartic acid by microbial cells entrapped n polyacrylamide gels. Methods n Enzymology, 44, 739-746. 15. Conde J ., de la Fuente J . M., Baptista P. V., (2010). RNA quantification using gold nanoprobes - application to cancer diagnostics. J ournal of Nanobiotechnology, 8:5. 16. Croitoru V., Bucheli-Witschel M., Hgg P., Abdulkarim F., Isaksson L.A., (2004). Generation and characterization of functional mutants in the translation initiation factor IF1 of Escherichia coli. Eur. J . Biochem. Feb;271(3):534-44. 17. Croitoru V., Bucheli-Witschel M., Isaksson L.A., (2005). In vivo involvement of mutated initiation factor IF1 in gene expression control at the translational level. FEBS Lett. Feb 14;579(5):995-1000. 18. Croitoru V., Semrad K., Prenninger S., Rajkowitsch L., Vejen M., Laursen B.S., Sperling-Petersen H.U., Isaksson L.A., (2006). RNA chaperone activity of translation initiation factor IF1. Biochimie. Dec;88(12):1875-82 19. Dakin E.E., Avise J .C., (2004). Microsatellite null alleles in parentage analysis. Heredity (Edinb). Nov;93(5):504-9. 20. Deconttignies-Le Marchal P., Calderon-Seguin R., Vandecasteele J .,P., Azerad R., (1979). Synthesis of L-tryptophan by immobilized 128
Escherichia coli cells. European J ournal of Applied Microbiology and Biotechnology, 7, 33-44. 21. Delforge D., Devreese B., Dieu M., Delaivre E., Beeumen J ., Remacle J ., (1997). Identification of lysine 74 n pyruvate bineding of alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis. J ournal of Biological Chemistry, 272, 2276-84. 22. Ghosh M., Singh A. T., Xu W., Sulchek T., Gordon L. I., Ryan R. O., (2010). Curcumin nanodisks: formulation and characterization, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 23. Heaton MP, Harhay GP, Bennett GL, Stone RT, Grosse WM, Casas E, Keele J W, Smith TP, Chitko-McKown CG, Laegreid WW. (2002) Selection and use of SNP markers for animal identification and paternity analysis in U.S. beef cattle. Mamm. Genome. May;13(5):272-81. 24. Honorat A., Monot F., Ballerini D., (1990). Synthesis of L-alanine and L-valine by enzyme system from Bacillus megaterium. Enzyme and Microbial Technology, 12, 515-20. 25. Honorat-Pascal A., Monot F., Ballerini D., (1990). Coparative stady of the enzymatic synthesis of L-valine by purified enzymes, crude extract or permeabilized cells from Bacillus megaterium. Applied Microbiology and Biotechnology, 34, 236-41. 26. Holley R.W., Everett G.A., Madison J .T, Zamir A., (1965). Nucleotide Sequences In The Yeast Alanine Transfer Ribonucleic Acid. J . Biol. Chem. 240 (5): 21228. 27. Hummel W., Kula M-R., (1989). Dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds. European J ournal of Biochemistry, 184, 1-13. 28. Fischer N.O., Infante E., Ishikawa T., Blanchette C.D., Bourne N., Hoeprich P.D., Mason P.W., (2010). Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis, Bioconjugate Chemistry, 21(6), 1018-22. 29. Fukui S., Ikeda S., Fujimura M., Yamada H., Kumagai H., (1974). Production of L-tryptophan, L-tyrosine and their analogues by immobilized tryptophanase and immobilized -tyrosinase. European J ournal of Applied Microbiology, 1, 25-39. 129
30. Fusee M., Swann W., Calton G., (1981). Immobilization of Escherichia coli cells containing aspartase activity with polyurethane and its application for L-aspartic acid production. Applied Enviromental Microbiology, 42, 672-76. 31. Fusee M., Weber J ., (1984). Immobilization by polyurethane of Pseudomonas dacunhae cells containing L-aspartat -decarboxylase activity and application to L-alanine production. Applied Enviromental Microbiology, 48, 694-98. 32. Iacobazzi V, Castegna A, Infantino V, Andria G.(2013). Mitochondrial DNA methylation as a next-generation biomarker and diagnostic tool. Mol. Genet. Metab. Sep-Oct;110(1-2):25-34. 33. J effreys A.J ., Royle N.J ., Patel I., Armour J .A., MacLeod A., Collick A., Gray I.C., Neumann R., Gibbs M., Crosier M., (1991). Principles and recent advances in human DNA fingerprinting. EXS.;58:1-19 34. Karsten W.E., Viola R.E., (1991). Kinetic studies of L-aspartase from Escherichia coli: pH-dependent activity changes. Archives of Biochemistry and Biophysics, 287, 60-67. 35. Katayama H., Wang J ., Tama F., Chollet L., Gogol E. P., Collier R. J ., Fisher M. T., (2010). Three-dimensional structure of the anthrax toxin pore inserted into lipid nanodiscs and lipid vesicles, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 107(8), 3453-57 36. Katoh R., Nagata S., Ozawa A., Ohshima T., Kamekura M., Misono H., (2003). Purification and characterization of leucine dehydrogenase from an alkaliphilic halophile, Natronobacterium magadii MS-3. J ournal of Molecular Catalysis, 23, 231-38. 37. Khler G, Milstein C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. Aug 7;256(5517):495-7. 38. Landegren U., (1996). The challengers to PCR: a proliferation of chain reactions. Curr Opin Biotechnol. 1996 Feb;7(1):95-7. 39. Liu Q., Liu A., Gao F., Weng S., Zhong G., Liu J ., Lin X., Lin J .H., Chen X., (2011) Coupling technique of random amplified polymorphic DNA and nanoelectrochemical sensor for mapping pancreatic cancer genetic fingerprint. Int. J . Nanomedicine.;6:2933-9. 130
40. Maxam A.M, Gilbert W., (1992). A new method for sequencing DNA. 1977. Biotechnology.; 24:99-103. 41. Mondalek F. G., Ponnurangam S., Govind J ., Houchen C., Anant S., Pantazis P., Rama P Ramanujam R. P., (2010). Inhibition of angiogenesis- and inflammation-inducing factors n human colon cancer cells in vitro and in ovo by free and nanoparticle-encapsulated redox dye, DCPIP, J ournal of Nanobiotechnology, 8:17, 1-9. 42. Monot F., Benoit Y., Lemal J ., Honorat A., Ballerini D., (1988). Simultaneous production of amino acid dehydrogenase and glucose dehydrogenase by Bacillus megaterium and their utilization for L- valine synthesis with NADH regeneration. Biocatalysis, 2, 161-74. 43. Mueller U.G, Wolfenbarger L.L. (1999). AFLP genotyping and fingerprinting. Trends Ecol. Evol. Oct;14(10):389-394. 44. Mullis K.B., (1990). Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann. Biol. Clin. (Paris).;48(8):579-82. 45. Nagata S., Misono H., Nagasaki S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989). Thermostable alanine dehydrogenase of Bacillus sp.DSM730: gene cloning, purification, and characterization. Biochemistry, 71, 559-63. 46. Nagata S., Tanizawa K., Esaki N., Sakamoto Y., Ohshima T., Tanaka H., Soda K., (1988). Gene cloning and sequence determination of leucine dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus and structural comparison with other NAD(P)+-dependent dehydrogenases. Biochemistry, 27, 9056-62. 47. Nagore L.I., Nadeau R.J ., Guo Q., J adhav Y.L., J arrett H.W., Haskins W.E. (2013). Purification and characterization of transcription factors. Mass Spectrom. Rev. Sep;32(5):386-98 48. Nakatani N., Kozaki D., Mori M., Tanaka K. (2012). Recent progress and applications of ion-exclusion/ion-exchange chromatography for simultaneous determination of inorganic anions and cations. Anal. Sci.;28(9):845-52 49. Nakamura T., Mizuno S. (2010). The discovery of hepatocyte growth factor (HGF) and its significance for cell biology, life sciences and clinical medicine. Proc. J pn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci.;86(6):588- 610 131
50. Norbert M., Brunhuber W., Blanchard J .S., (1994). The biochemistry and enzymology of amino acids dehydrogenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 29, 415-67. 51. Oda M. N., Hargreaves P. L., Beckstead J . A., Redmond K. A., van Antwerpen R., Ryan R. O., (2006). Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B, J ournal of Lipid Research, 47(2), 260-67. 52. Ohshima T., Nishida N., Bakthavatsalam S., Kataoka K., Takada H., Yoshimura T., Esaki N., Soda K., (1994). The purification, characterization, cloning and sequencing of the gene for a halostable and thermostable leucine dehydrogenase from Thermoactinomyces intermedius. European J ournal of Biochemistry, 222, 305-12. 53. Ohshima T., Wandrey C., Conrad D., (1988). Continous production of 3-fluoro-L-alanine with alanine dehydrogenase. Biotechnology and Bioengineering, 34, 394-97. 54. Ohshima T., Wandrey C., Kula M-R., Soda K., (1985). Impovement for L-leucine production n a continously operated enzyme membrane reactor. Biotechnology and Bioengineering, 26, 1616-18. 55. Oka M., Yang Y.S., Nagata S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989). Overproduction of thermostable leucine dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus and its one-step purification from recombinant cells of Escherichia coli. Biotchnology and Applied Biochemestry, 11, 307-11. 56. Park D.J ., (2004). 3' RACE LaNe: a simple and rapid fully nested PCR method to determine 3'-terminal cDNA sequence. Biotechniques. Apr;36(4):586-8, 590. 57. Patra H.K., Banerjee S., Chaudhuri U., Lahiri P., Dasgupta A., (2007). Cell selective response to gold nanoparticles, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 3, 11119 58. Pierrel J . (2012). An RNA Phage Lab: MS2 in Walter Fiers' laboratory of molecular biology in Ghent, from genetic code to gene and genome, 1963-1976. J . Hist. Biol.;45(1):109-38 59. Rasmussen L.C., J ensen J .M., Croitoru V., Sperling-Petersen H.U., Mortensen K.K., (2007). Production and epitope characterization of mAbs specific for translation factor IF1. Biochem. Biophys. Res. Commun. Dec 7;364(1):72-8. 132
60. Ristic Z., Vitali M., Duci A., Goetze C., Kemnitz K., Zuschratter W., LillH., Bald D., (2009). Two-stimuli manipulation of a biological motor, J ournal of Nanobiotechnology, 7:3. 61. Ryan R. O., (2010). Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein, J ournal of Nanobiotechnology, 8:28. 62. Sanger F., Nicklen S., Coulson AR., (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Dec;74(12):5463-7. 63. Schenkel F.S., Miller S.P., Ye X., Moore S.S., Nkrumah J .D., Li C., Yu J ., Mandell I.B., Wilton J .W., Williams J .L., (2005). Association of single nucleotide polymorphisms in the leptin gene with carcass and meat quality traits of beef cattle. J . Anim. Sci. Sep;83(9):2009-20. 64. Schtte H., Flossdorf J ., Sahm H., Kul, M. R., (1976). Purification and properties of formaldehyde dehydrogenase and fromate dehydrogenase from Candida boidinii. European J ournal of Biochemistry, 62, 151. 65. Siranosian J .K., Ireton, K., Grossamn D.A., (1993). Alanine dehydrogenase (ald) is required for normal sporulation in Bacillus subtilis. J ournal of Bacteriology. 175, 6789-96. 66. Sondi I., and Salopek-Sondi B., (2004). Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram- negative bacteria, J ournal of Colloid and Interface Science, 275, 177 82. 67. Speshock J . L., Murdock R. C., Braydich-Stolle L. K., Schrand A. M., Hussain S. M., (2010). Interaction of silver nanoparticles with Tacaribe virus, J ournal of Nanobiotechnology, 8:19. 68. Starzl T.E., Fung J .J ., (1986). ORTHOCLONE OKT3 in Treatment of Allografts Rejected Under Cyclosporine-Steroid Therapy. Transplant Proc. Aug;18(4):937-941. 69. Strebhardt K, Ullrich A. (2008) Paul Ehrlich's magic bullet concept: 100 years of progress. Nat. Rev. Cancer. J un;8(6):473-80. 70. Tosa T., Sato T., Mori T., Chibata I., (1974). Basic studies for continous production of L-aspartic acid by immobilized Escherichia coli Cells. Applied Microbiology, 27, 886-89. 133
71. Vieira D. B., Carmona-Ribeiro A. M., (2008). Cationic nanoparticles for delivery of amphotericin B: preparation, characterization and activity in vitro, J ournal of Nanobiotechnology, 6:6. 72. Vieira J , Messing J . (1982). The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. Oct;19(3):259-68. 73. Weers P. M., Narayanaswami V., Ryan R. O., (2001). Modulation of the lipid binding properties of the N-terminal domain of human apolipoprotein E3, European J ournal of Biochemistry, 268, 3728-35. 74. Welsh J ., McClelland M., (1991). Genomic fingerprinting using arbitrarily primed PCR and a matrix of pairwise combinations of primers. Nucleic Acids Res. Oct 11;19(19):5275-9 75. Xu J ., Croitoru V., Rutishauser D., Cheng Q., Arnr E.S., (2013). Wobble decoding by the Escherichia coli selenocysteine insertion machinery. Nucleic Acids Res. 2013 Aug 27. [Epub ahead of print].