ACADEMIA DE TIINE A MOLDOVEI

INSTITUTUL DE FIZIOLOGIE I SANOCREATOLOGIE

Cu titlu de manuscris
C.Z.U.: 591.963.12:589.6(478)(043.2)


BALAN ION


TEORIA I PRACTICA CRIOCONSERVRII SPERMEI DE
COCO N TEHNOLOGIA REPRODUCERII
DESCENDENILOR SNTOI

03.00.13 FIZIOLOGIA OMULUI I ANIMALELOR
Tez de doctor habilitat n biologie




Consultant tiinific _________________________ Teodor FURDUI,
doctor habilitat n biologie,
profesor universitar,
academician AM


Autor __________________________


CHIINU, 2013
2
















Balan Ion, 2012
3
CUPRINS
ADNOTARE (n romn, rus i englez) ......................................................................... 5
LISTA ABREVIERILOR .................................................................................................... 8
INTRODUCERE ................................................................................................................... 9
1. CRIOCONSERVAREA SPERMEI, REALIZRI I PERSPECTIVE
1.1. Starea actual a studiului mecanismelor de criodistrucie i crioprotecie a
materialului seminal .............................................................................................................. 17
1.2. Rolul lipidelor i proteinelor la derularea procesului de crioconservare a spermei ....... 26
1.3. Analiza tehnologiei de meninere i stabilizare a indicilor vitali ai spermatozoizilor
de coco n procesul de conservare ........................................................................................ 29
1.4. Factorii care influeneaz calitatea materialului seminal ................................................ 38
1.5. Evoluia i perspectiva cercetrilor n domeniul conservrii, pstrrii
i utilizrii spermei de coco .................................................................................................. 48
1.6. Concluzii la capitolul 1 .................................................................................................... 51
2. CARACTERISTICA MATERIALULUI EXPERIMENTAL I A METODELOR
DE INVESTIGAIE
2.1. Aspecte metodice generale ............................................................................................. 53
2.2. Metode de cercetare a membranelor plasmatice ............................................................ 53
2.3. Metode de cercetare a proteinelor .................................................................................. 55
2.4. Metode de cercetare a lipidelor ...................................................................................... 57
2.5. Metode de cercetare a spermatozoizilor i de crioconservare a spermei ....................... 60
2.6. Micrometoda de determinare a fosforului dup Vasilicovschii ..................................... 66
2.7. Determinarea coninutului ionilor prin metoda fotometriei n flacr ........................... 66
2.8. Metoda folosirii preparatelor coordinative pentru meninerea i
fortificarea spermatogenezei la coco ................................................................................... 67
2.9. Metoda de efectuare a experienei tiinifico-practice de nsmnare a ginilor 67
2.10. Prelucrarea statistic a materialului cifrologic ............................................................. 68
2.11. Concluzii la capitolul 2 ................................................................................................. 69
3. SPECIFICUL MODIFICRILOR MORFO-FUNCIONALE I BIOCHIMICE
ALE MATERIALULUI SEMINAL DE COCO LA CRIOCONSERVARE
3.1. Starea morfo-funcional a spermatozoizilor de coco la crioconservare ....................... 70
3.2. Modificarea biochimic a componenilor membranelor plasmatice, spermatozoizilor
i plasmei spermei de coco sub influena factorilor de crioconservare................................. 88
3.3. Concluzii la capitolul 3 ................................................................................................... 125
4
4. MENINEREA STRII MORFO-FUNCIONALE A COMPONENILOR
STRUCTURALI DE BAZ I STABILIZAREA STATUSULUI MORFO-FUNCIONAL
AI SPERMIILOR DE COCO N PROCESUL DE CONSERVARE.
4.1. Influena componenilor structurali principali asupra spermei de coco n
procesul de crioconservare a ei .............................................................................................. 128
4.2. Impactul aciunii antioxidanilor asupra strii morfo-funcionale a spermei de
coco la aciunea temperaturilor joase i ultrajoase ............................................................... 138
4.3. Specificul modificrii componenei spermei de coco la congelare-decongelare
sub influena regimelor termice tehnologice .......................................................................... 155
4.4. Stabilizarea funciei de barier a spermei de coco la crioconservare ............................. 159
4.5. Influena substanelor coordinative la stabilizarea i fortificarea spermatogenezei
la coco ................................................................................................................................... 162
4.6. Concluzii la capitolul 4 .................................................................................................... 169
5. ELABORAREA TEHNOLOGIILOR DE CONSERVARE, PSTRARE, UTILIZARE
A SPERMEI DE COCO I IMPLEMNTAREA REZULTATELOR OBINUTE.
5.1. Elaborarea principiilor de creare a mediilor sintetice crioprotectoare ............................ 171
5.2. Elaborarea metodelor de stabilizare i fortificare a spermatogenezei la coco ............... 173
5.3. Explorarea mediilor pentru diluarea i conservarea hipotermal n scopul
meninerii integritii morfo-funcionale a spermei de coco ................................................. 175
5.4. Aciunea mediilor integrate pentru diluarea i crioconservarea spermei de coco .......... 183
5.5. Experimentarea i implementarea rezultatelor cercetrilor n condiii practice
de ntreinere a ginilor i de producere intensiv a psrilor ................................................. 188
5.6. Concluzii la capitolul 5 ..................................................................................................... 196
CONCLUZII GENERALE I RECOMANDRI .............................................................. 197
BIBLIOGRAFIE .................................................................................................................... 201
ANEXE ................................................................................................................................... 221
Anexa 1. Brevete de invenie ................................................................................................... 231
Anexa 2. Acte de implementare a rezultatelor tiinifico-practice .......................................... 241
Anexa 3. Materiale expoziionale ............................................................................................ 245
DECLARAIA PRIVIND ASUMAREA RSPUNDERII ................................................ 251
CV-ul AUTORULUI .............................................................................................................. 252
5
ADNOTARE
Balan Ion, Teoria i practica crioconservrii spermei de coco i tehnologiei
reproducerii descendenilor sntoi. Tez de doctor habilitat n biologie, Chiinu, 2013.
Structura tezei: introducere, 5 capitole, concluzii generale i recomandri, bibliografia din 424
surse, 200 pagini de text de baz, 9 figuri, 88 tabele. Rezultatele obinute sunt publicate n 189
lucrri tiinifice. Cuvinte cheie: coco, spermatozoid, acrozom, membran, lipide, proteine,
antioxidani, medii, crioconservare, reproducere. Domeniul de studiu al tezei: fiziologia,
biotehnologia, criobiologia i sanocreatologia reproducerii. Scopul i obiectivele tezei:
evidenierea i dezvoltarea bazelor teoretice i practice ale conservrii spermei de coco n
tehnologia reproducerii descendenilor sntoi, optimizarea mediilor sintetice, regimelor de
conservare i criotehnologiilor. Metodologia cercetrii tiinifice: evaluarea fiziologic,
microscopic, spectrofotometric, preparativ, biochimic, cromatografic, statistic. Noutatea
i originalitatea tiinific: n procesul crioconservrii spermei de coco are loc: modificarea
structural-morfologic i biochimic la diverse nivele de organizare a spermatozoizilor;
stabilizarea strii structural funcionale a spermatozoizilor la etapele criotehnologice prin
folosirea substanelor biologice active, electroliilor, neelectroliilor, aminoacizilor i tehnologiei
treptate de congelare. Rezultatele principial noi ale soluionrii problemei tiinifice:
dezvoltarea specificului reacionrii diferitor componente membranare la influena factorilor de
crioconservare i stabilirea coraportului lor, estimarea posibilitilor planificat-direcionate a
principiilor de creare a mediilor crioprotectoare i elaborarea metodei de stimulare a
spermatogenezei la coco. Semnificaia teoretic: stabilitatea morfo-funcional a spermei de
coco este predeterminat de procesele biochimice ale plasmei i membranelor spermiilor,
inclusiv spectrul proteic i lipidic, raportul proteine/lipide, nivelul de peroxidare a lipidelor,
permeabilitatea membranelor pentru ionii de Na
+
, K
+
, Li
+
, Ca
2+
, Mg
2+
, pH-ul plasmei, gradientul
osmotic, iar meninerea integritii structurale i proprietilor funcionale ale spermei n
procesul de crioconservare poate fi realizat prin utilizarea substanelor cu proprieti
crioprotectoare i prin alimentaia cocoilor cu preparate, care favorizeaz spermatogeneza
sanogen. Valoarea aplicativ a lucrrii: elaborarea metodei de stimulare a spermatogenezei la
coco prin folosirea preparatelor coordinative; elaborarea principiilor de baz de creare a
mediilor crioprotectoare; determinarea componenei optimale a mediilor sintetice; elaborarea
mediilor i metodelor de stabilizare i meninere a indicilor care caracterizeaz starea funcional
a spermatozoizilor. Implementarea rezultatelor tiinifice: cercetrile instituionale ale
Institutului de Fiziologie i Sanocreatologie al AM, procesul didactic al Universitii Agrare de
Stat din Moldova i practica reproducerii n domeniul aviculturii.
6

..,
.
, , 2013. : -
, 5 , , 424 , 200
, 9 , 88 .
189 . : , , , ,
, , , , , .
: , , -
. :
.
: , , ,
, , .
: :
- -
; - ,
, ,
, , . -
:

,

. : -
,
, /,
, Na
+
, K
+
, Li
+
, Ca
2+
, Mg
2+
,
, ,

, .
:
; -
. :
,
.
7
ANNOTATION
Balan Ion, The theory and practice of rooster sperm cryoconservation and the
reproduction technology of healthy descendants. Postdoctoral thesis in biology, Chisinau
2013. Structure of dissertation: introduction, 5 chapters, conclusions and recomandations,
bibliography with 424 titles, 200 pages of main text, 9 figures, 88 tables. The obtained results are
published in 189 scientific papers. Key words: cock, spermatozoon, acrosome, membrane,
lipids, proteins, antioxidants, medium, cryoconservation, reproduction. Domain of study: physi-
ology, biotechnology, cryobiology and reproduction sanocreatology. The aim and objectives of
the study: to emphasize and develop the theoretical and practical basis of the rooster sperm
conser-vation in the reproduction technology of healthy descendants, optimization of the
synthetic medium conservation regimens and cryotechnology. Methodology of the scientific
research: physiological, microscopic, spectrophotometric, preparational, biochemical,
chromatographic evaluation, statistics. Novelty and scientific originality: in cryoconservation
process of the rooster sperm occurs: the structural-morphological and biochemical modification
at different levels of organization of the spermatozoon; stabilization of the functional structural
state of the spermatozoon at the level of cryotechnology through the use of the biological active
substance, electrolytes, non-electrolyte, aminoacids and gradual freezing technology. Essentially
new results in the solution of a scientific problem are: disclosure of specificity of reaction of
various membrane components in reply to influence of factors of a cryopreservation and to
establishment of interrelation between them, development of principles of purposeful creation of
cryoprotection environments and a stimulation method of the spermatogenesis at the cocks.
Theoretical value: the morpho-functional stability of the rooster sperm is predetermined by
biochemical processes of the plasma and sperm membranes including protein and lipid spectrum,
the ratio of proteins to lipids, the level of lipid peroxidation, membranes permeability for the ions
Na
+
, K
+
, Li
+
, Ca
2+
, Mg
2+
, plasma pH, osmotic gradient, but to maintain the integrity and functio-
nal properties of the sperm during the cryoconservation process can be achieved by using
substances with crioprotective properties and by feeding the rooster with products that favor the
sanogenic spermatogenesis. Practical value: elaboration of the spermatogenesis stimulation
method by using coordinative products; the elaboration of the principle of creating cryoprotec-
tive mediums; determination of the optimal composition of the synthetic mediums; elaboration
of the mediums and methods of stabilizing and maintaining the indices that characterize the
spermatozoa functional state. Implementation of scientific results: the institutional research of
the Institute of Physiology and Sanocreatology of ASM, the teaching process of the State
Agrarian University of Moldova and reproduction in poultry farming practice.
8
LISTA ABREVIERILOR
DMSO dimetilsulfoxida
DMF dimetilformamida
DMA dimetilacetamida
ADN acidul dezoxiribonucleic
ARN acidul ribonucleic
SM sfingomielina
FEA fosfatidiletanolamina
FS fosfatidilserina
FI fosfatidilinozitolul
FC fosfatidilcolina
FL fosfolipide
POL peroxidarea lipidelor
CL cardiolipina
AF acidul fosfatidic
SL sfingolipidele
CS colesterina
LFC lizofosfatidilcolina
SOD superoxid dismutaza
GSH-Px glutation peroxidaza
ROS reacii de oxidare specific
ADH alcooldehidrogenaza
AC anhidraza carbonic
AMP adenozinmonofosfatul
NAD-aza nicotinamiddinucleotidaza
DAM diadehida malonic
IAS indicele absolut de supravieuire
EG etilenglicol
1,2-BD 1,2-butandiol
AO antioxidant
Mn-SOD forma mitocondrial a superoxid dismutazei
Cu,Zn-SOD forma citoplasmatic a superoxid dismutazei
AA aminoacizi
9
INTRODUCERE
Actualitatea cercetrilor. Avicultura este o ramur a agriculturii, care se dezvolt cel mai
dinamic. Astfel, n anul 2006 producerea global a crnii de pasre a atins 80 mln tone i a
oulor - 66 mln tone, dintre care 67% de carne i 50% de ou se produc pe calea industrial
intensiv. Totodat, se prevede sporirea pn n anul 2030 cu 2,5% anual a crnii de pasre n
alimentaia populaiei [213-217].
Dintre rasele psrilor domestice, 30% se afl pe calea de dispariie, iar 9% deja au disprut,
proporia dintre rase i riscul dispariiei fiind cea mai mare la gini. n legtur cu aceasta n anul
2007 n oraul Interlaken (Elveia) cu participarea a 109 ri a fost elaborat programa global de
conservare a resurselor genetice ale psrilor [246, 247]. Aceast program reprezint un
eveniment important n dezvoltarea aviculturii i include aciuni strategice pentru elaborarea
cadrului internaional coerent de gestionare a biodiversitii avicole. Totodat, n programele de
ocrotire ale naturii sunt incluse 195 de rase de psri (77% gini, 9% rae, 9% gte i 3% curci).
S-a estimat c pentru a restabili o rasa sunt necesare peste 600 de doze de sperm congelat
[376] prin retroncruciri repetate ntr-un interval de timp de pn la apte generaii [174, 243].
n acelai timp, selecia puilor broiler, direcionat sporirii masei corporale a dus la scderea
continu a fertilitii prin mperechere natural.
Instituiile tiinifice continu s activeze n domeniul meninerii sanogenitii funcionrii
sistemului reproductiv i stoprii degradrii precoce funcionale i morfologice a acestuia. [122,
128] i elaborrii metodelor performante de pstrare i conservare a resurselor genetice a
psrilor [18, 50, 78, 171, 274]. Meninerea intensitii spermatogenezei ca proces morfo-
fiziologic, care cuprinde totalitatea transformrilor prin care trec spermatogoniile i asigurarea
sanogenitii spermei, reprezint una dintre sarcinile prioritare ale sanocreatologiei [124, 136]. n
ultimele decenii au fost elaborate i implementate tehnologii originale de conservare a spermei
de taur, vier, berbec, ap, iepure [264, 280, 16, 29, 47, 58, 65, 72, 91, 97, 323, 387], de
crioconservare a spermei de coco [17, 24, 31, 81, 116, 369, 409].
Eficiena de conservare depinde de progresele tehnologiilor de congelare i decongelare.
Dei elaborarea mediilor de crioconservare a spermatozoizilor de pasre s-a aflat n vizorul
comunitii tiinifice peste 100 de ani, rezultatele obinute, tehnologiile de crioconservare a
spermei nu permit pe deplin, folosirea eficient a materialului genetic n practica de ameliorare i
selecie, deoarece dup crioconservare numai 50-60% de spermatozoizi i pstreaz integritatea
funcional.
10
n prezent metoda cea mai fezabil pentru gestionarea ex-situ a resurselor genetice ale
psrilor este crioconservarea materialului seminal, dar nu crioconservarea embrionilor,
ovocitelor [171, 303] sau a celulelor blastodermice i germinale primordiale [405], sau a altor
metode insuficient de eficace, care sunt prea costisitoare pentru programele de conservare
genetic [340].
Prin urmare, crioconservarea materialului seminal aviar, este singura metod eficient i
disponibil de management ex-situ pentru toate speciile de psri.
Eficiena redus a criotehnologiilor spermei de coco este determinat, att de complicitatea
mecanismelor modificrii morfologice, metabolice i funcionale n procesul congelrii-
decongelrii, ct i de reactivitatea sporit i tolerana sczut a materialului seminal ctre
temperaturi ultrajoase. Reieind din cele menionate, succesul crioconservrii i conservrii
hipotermale a materialului seminal de coco, n mare msur, depinde de reuita studierii
mecanismelor meninerii homeostaziei structural-biochimice, legitilor apariiei criodeteriorrii
celulelor reproductive i de elaborarea condiiilor i tehnologiilor adecvate de conservare. De
aceea aceste probleme au constituit scopul principal al prezentei lucrri.
Descrierea tiinific n domeniul de cercetare i identificarea problemelor de
cercetare.
n pofida faptului, c conservarea spermei de coco a stat la baza crioconservrii spermei ca
atare, primele publicaii de amploare a utilizrii cu succes a materialului seminal crioconservat
de coco au fost realizate n anul 1978 de ctre Lake i Stewart i n anul 1980 de ctre Sexton,
adic dup mai mult de treizeci de ani de la raportul lui Shaffner et al. [370]. Lake si Stewart au
utilizat metode de rcire, congelare i decongelare n rate, glicerina ca agent crioprotector intern
i flacoane de sticl pentru mpachetarea materialului seminal. Sexton [368], de asemenea, a
utilizat tehnologia de refrigerare lent a probelor spermatice, dar n calitate de crioprotector
intern a folosit DMSO i paie pentru ambalare. Ambele metode au fost optimizate mai trziu de
ctre Seigneurin i Blesbois [366]. Sunt publicaii n care se descriu metodele de rcire rapid,
congelarea i decongelarea materialului seminal [ 50, 81, 90, 109, 365, 400], care includ n
calitate de crioprotectori interni dimetilformamid (DMF), dimetilacetamida (DMA), glicerina i
al. Compararea crioprotectorilor i a metodelor de crioconservare a spermei, folosite n condiii
standardizate industriale obinute de la cocoii broiler, a artat c cele mai mari rate de fertilitate,
dup nsmnarea artificial a ginilor cu material seminal crioconservat au fost obinute n
cazul folosirii n calitate de crioprotector a glicerinei la ambalarea spermei n paiete. Rezultate
analogice au fost obinute i la congelarea-decongelarea spermei de coco prin utilizarea DMA
11
ca crioprotector si a paietelor pentru ambalare [400]. Ultima metod de congelare-decongelare,
dup o perfecionare prin folosirea n calitate de crioprotector a DMA, dup optimizarea ei, n
combinaie cu ambalarea n paiete (n scopuri optime de identificare i siguran) a fost aleas ca
standard i de referin pentru sistemul bancar de sperm al raselor locale de psri din Olanda
[413]. n acelai timp, n Frana, metoda cu glicerin este considerat a fi de referin n
activitatea spermobncilor, deoarece aceasta s-a dovedit a fi mai eficient n procesul de
fecundare [173, 174]. Prin aceast metod, rata fertilitii medii, obinut cu materialul seminal
crioconservat, provenit din populaii mici de psri, pe cale de dispariie, din linii mai mult sau
mai puin subfertile i/sau consangvine variaz n limitele 7-68% [174]. Prin folosirea spermei
decongelate, obinute de la cocoii din liniile mai puin fertile, cu femele de tip comercial
(intensiv) fertilitatea a crescut de la 7% pn la 43%. Glicerina se consider, cel mai bun
crioprotector pentru spermatozoizii de coco, dar n acelai timp, este necesar s fie eliminat din
material seminal dup decongelarea lui. Acest lucru se propune prin centrifugarea succesiv,
diluare sau dializ [289]. De aceea, metoda de crioconservare a materialului seminal cu utilizarea
glicerinei este considerat mai dificil, comparativ cu tehnica metodei prin folosirea DMA. ns,
din cauza complicitii acestora i costului nalt al echipamentelor tehnologice, ele nu sunt
utilizate n reproducerea industrial a ginilor. Adic, explorarea noilor criprotectori cu eficien
nalt este o problem a crioconservrii spermei de coco.
O alt problem a pstrrii hipotermale a spermei de coco reprezint meninerea calitii
materialului seminal proaspt recoltat. Deteriorrile ce apar la crioconservarea spermiilor duc la
scderea eficacitii fecunditii, comparativ cu sperma proaspt [2, 248, 390]. Diminuarea
sporit a calitii materialului seminal dup decongelare, n mare msur, este predeterminat de
persistena devierilor deja prezente n materialul seminal proaspt nainte de congelare.
Practica multianual a Institutului de Fiziologie i Sanocreatologie de cercetare a spermei de
coco relev despre existena dificultilor n obinerea materialului seminal cu o calitate nalt,
care pot fi rezolvate, n mare msur, prin modificarea raiei alimentare a reproductorilor [70].
n contextul problemelor expuse i lund n consideraie importana economic i ecologic
a lor a fost realizat un studiu aprofundat i multilateral al proceselor de criodeteriorare i pstrare
a proprietilor funcionale i biochimice dup decongelarea spermei de coco.
Scopul lucrrii: Identificarea bazelor teoretice i practice ale conservrii spermei de coco
n tehnologia reproducerii descendenilor sntoi.
Obiectivele lucrrii:
1) Evidenierea stabilitii funcionale a spermatozoizilor la influena factorilor termici i a
12
raportului componenilor structurali principali ai spermei de coco;
2) Determinarea specificului intensitii metabolismului proteic la aciunea factorilor termici
i a componenei aminoacizilor n membrane, spermatozoizi i plasma seminal;
3) Elucidarea particularitilor spectrului lipidic al spermatozoizilor de coco, membranelor
plasmatice ale lor i plasmei seminale;
4) Elaborarea i experimentarea in vivo a remediilor coordinative stimulatoare ale
spermatogenezei la coco;
5) Elaborarea mediilor sintetice pentru pstrarea hipotermal i crioconservarea spermei de
coco, precum i a tehnologiei performante de pstrare i utilizare a ei;
6) Testarea n condiii industriale de cretere a psrilor a tehnologiei elaborate.
Metodologia cercetrii tiinifice se bazeaz pe conceptele privind:
a) sporirea sanogenitii spermei prin suplinirea direcionat a raiei alimentare a
reproductorilor [2, 6, 13, 41, 43];
b) conservarea spermei prin utilizarea temperaturilor ultrajoase [3, 14, 34, 37, 40];
c) eficientizarea fortificrii procesului de congelare-decongelare a spermei prin utilizarea
crioprotectorilor i substanelor membranotrope [7, 12, 17, 33, 35];
d) rolul reaciilor generale i specifice de specie n declanarea dereglrilor morfo-
funcionale i biochimice n procesul de crioconservare [19, 21, 22, 32, 36];
e) diminuarea intensitii stresului termic i osmotic excesiv la etapele tehnologice ale
crioconservrii spermei [10, 23, 24, 29].
Noutatea i originalitatea tiinific se refer la faptul, c n premier:
S-a stabilit specificul modificrilor morfo-funcionale ale spermei de coco;
S-a constatat c modificrile integritii acrozomale i deteriorrile membranelor
spermatozoizilor de coco n procesul de crioconservare, n mare msur, sunt determinate de
schimbrile raportului proteine/lipide i permeabilitatea selectiv a membranelor plasmatice
pentru ionii de Na
+
, K
+
, Li
2+
i Ca
2+
, predeterminat de forele determinante ale gradientului
osmotic, dependent de coninutul i concentraia ionilor;
S-a demonstrat c cele mai sensibile componente ale membranelor plasmatice ale
spermatozoizilor de coco la crioconservare sunt fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina,
cerebrozidele fraciile 3 i 5, trigliceridele i colesterina;
S-au stabilit n sperma de coco la crioconservare modificri ale dialdehidei malonice;
S-a elucidat stabilitatea indicelui Fisher prin modificri, destul de moderate, ale
echilibrului aminoacidic al membranelor plasmatice ale spermatozoizilor i plasmei seminale,
precum i al intensitii metabolismului proteinelor spermatice;
13
S-a stabilit interrelaia dintre stabilitatea ADN-lui i 5
1
-nucleotidazei, scderea activitii
g
+2
(Na
+
+
+
)-ATP-azei n membranele plasmatice i criorezistena nucleului, capului i
flagelului spermatozoizilor;
S-a determinat efectul stimulator asupra spermatogenezei a preparatelor coordinative,
obinute prin sintez LAZ (Zn(CCl
3
COO)
2
4H
2
O) i TAS (Zn(HSeO
3
)
2
4H
2
O);
S-a constatat c la influena factorilor crioconservrii, proteinele reacioneaz prin
reaciile compensatoare, lipidele - prin reaciile de oxidoreducere, iar glucidele - prin
modificarea arhitectonicii structurilor extramembranare.
Rezultatele principial noi ale soluionrii problemei tiinifice constau n dezvoltarea
specificului reacionrii diferitor componente membranare la influena factorilor de
crioconservare i stabilirea coraportului lor, estimarea posibilitilor planificat-direcionate a
principiilor de creare a mediilor crioprotectoare i elaborarea metodei de stimulare a
spermatogenezei la coco.
Semnificaia teoretic a lucrrii const n elaborarea unui concept nou, conform crui,
stabilitatea morfo-funcional a spermei de coco este predeterminat att de procesele
biochimice ale plasmei, ct i ale membranelor spermiilor, inclusiv spectrul proteic i lipidic,
raportul proteine/lipide, nivelul de peroxidare a lipidelor, permeabilitatea membranelor pentru
ionii de Na
+
, K
+
, Li
+
, Ca
2+
, Mg
2+
, pH-ul plasmei, gradientul osmotic, iar meninerea integritii
structurale i proprietilor funcionale ale spermei n procesul de crioconservare poate fi
realizat prin selectarea direcionat i utilizarea substanelor cu proprieti de a menine
procesele biochimice n plasm i spermatozoizi la nivelul strii native i prin alimentaia
cocoilor cu preparate, care favorizeaz spermatogeneza sanogen. La dezvoltarea teoriei
criobiologiei celulelor reproductive de coco contribuie, de asemenea, stabilirea legitilor
transformrii spectrului aminoacizilor, proteinelor, lipidelor i raportului lor, specificul strii
morfo-funcionale, funciilor bariere, aciunii antioxidanilor, regimelor termice, influenei
substanelor coordinative i aciunii mediilor integrate pentru diluarea i conservarea spermei.
Valoarea aplicativ a lucrrii s-a realizat prin determinarea proprietilor protectoare
eficiente ale glucidelor i poliglucidelor la crioconservare, electroliilor i neelectroliilor n
componena mediilor sintetice pentru sperma de coco; determinarea concentraiei optimale a
componenei mediilor sintetice; studierea regimurilor criotehnologice; elaborarea mediilor pentru
diluarea, pstrarea i conservarea spermei de coco; extracia tetraoxidului cu proprieti
antioxidative; elaborarea metodei de stimulare a spermatogenezei la coco; elaborarea
principiilor de baz de creare a mediilor crioprotectoare, care reduc la minimum incidena
cercetrilor empirice.
14
Rezultatele tiinifice principale naintate spre susinere:
Modificarea proprietilor morfo-fiziologice i fizico-chimice ale spermei de coco sub
influena factorilor criotehnologici;
Modificarea spectrului proteic al aminoacizilor i lipidelor membranelor plasmatice,
spermatozoizilor i plasmei seminale n procesul de crioconservare;
Sporirea eficienei conservrii spermei de coco prin utilizarea mediilor sintetice
elaborate;
Stimularea spermatogenezei la coco prin administrarea preparatelor coordinative;
Principiile de baz de elaborare ale mediilor sintetice pentru crioconservarea materialului
seminal;
Schema de organizare a reproducerii artificiale a ginilor prin utilizarea spermei
conservate de coco;
Conceptul tiinific cu privire la stabilitatea i meninerea integritii structurale i
proprietilor funcionale ale spermei n procesul de crioconservare.
Implementarea rezultatelor tiinifice a fost realizat n cadrul cercetrilor instituionale
ale Institutului de Fiziologie i Sanocreatologie al AM, n procesul didactic al Universitii
Agrare de Stat din Moldova i n practica reproducerii n domeniul aviculturii.
Aprobarea rezultatelor tiinifice. Rezultatele cercetrilor tiinifice au fost comunicate i
discutate la edinele Consiliului tiinific al Institutului de Fiziologie i Sanocreatologie pe
parcursul anilor 1992-2012, edina Laboratorului Sanocreatologia sistemului reproductiv i
Criobiologie V. Nauc al Institutului de Fiziologie i Sanocreatologie al AM, (11.05.2012),
Seminarul tiinific de profil Fiziologia omului i animalelor pe lng Institutul de Fiziologie i
Sanocreatologie al AM, (25.05.2012), Seminarul tiinific de profil Fiziologia omului i
animalelor pe lng Universitatea Agrar de Stat din Moldova, (02.11.2012) i la peste 60 de
foruri tiinifice de specialitate la nivel naional i internaional: Congresul VII al fiziologilor din
Republica Moldova, Chiinu, 2012; Congresul III al fiziologilor rilor CSI, Moscova-Ialta,
Rusia-Ucraina, 2011; Congresul IX Naional al Geneticienilor i Amelioratorilor, Chiinu,
2010; A Magyar Buiatricus Tarsasag. 19
th
International Congress of the Hungarian, Debrecen,
2009; Congresul II al fiziologilor rilor CSI, Moscova-Chiinu, 2008; XXV Jubilee World
Buiatrices Congress, Budapest, Hungary, 2008; XXXVII national session of scientific
communications of the faculty of animal science, Bucureti, Romnia, 2008; Conferina
internaional Problemele actuale ale proteciei i valorificrii durabile a diversitii lumii
animale, Chiinu 2007; Simpozionul tiinific Perspective n creterea animalelor,
Maximovca, 2006; Conferina tiin.-practic interna. Problemele actuale ale intensificrii
15
producerii produselor de origine animal, Jodino, Belarus, 2005; Congresul V i VI al
fiziologilor din Republica Moldova, Chiinu, 1999, 2005; Conferina tiinifico-practic
internaional Scopul i importana metodei de nsmnare artificial a animalelor n procesul
de cretere a animalelor n secolele XX-XXI, Dubrovi, Federaia Rus, 2004; Simpozion
tiinific internaional 70 ani ai UASM, Chiinu, 2003; Sesiunea anual de comunicri
tiinifice Problemele actuale i de perspectiv n zootehnie, Iai, Romnia, 1999, 2002;
Conferina a VI- tiinific internaional Progresul tehnico-tiinific, biotica si medicina.
Probleme de existen umana Chiinu, 2001; Conferina corpului didactic-studenesc "Bilanul
activitii tiinifice a USM pe anii 1998-1999", Chiinu, 2000; Conferina jubiliar a
Academiei veterinare din Moscova, Moscova, Federaia Rus, 1999; 10th European poultry
conference. Ierusalim, Izrael, 1998; Sesiunea anual de comunicri tiinifice Present interests
in animal pathology Cluj-Napoca, Romnia, 1997; Congress Programs ICAR, Sidney,
Australia, 1996; XX Worlds Poultry Congress, New Deihl, India, 1996; International scientific
symposium of husbandry, Iasi, Romnia, 1996; Conferina ucrainean a avicultorilor, Harkov,
Ucraina, 1996; Reuniunea a XIV de conservare a resurselor genetice, Pucino, Federaia Rus,
1996; Simpozionul Reproducerea animalelor dedicat semicentenarului Universitii de tiine
agricole a Banatului din Timioara, Romnia, 1995; Symposium 125 years of higher agronomic
education at Cluj-Napoca, Romnia, 1994; Congresul XVIII al Academiei Romno-Americane
de tiin i art, Ciinu, 1993; Congresul societii medico-biologice din Moldova, Chiinu,
1993; Prima reuniune naional de tiine fiziologice Iai-Chiinu, 1993; Congresul IV al
geneticienilor i selecionerilor din Moldova, Chiinu, 1992 i al.
Publicaii la tema tezei. Materialele de baz ale tezei au fost publicate n 189 lucrri
tiinifice, inclusiv 4 monografii, un manual, 4 articole de sintez, 5 articole n reviste de
circulaie internaional, 4 articole n culegeri internaionale, 40 de articole n culegeri naionale,
75 materiale ale comunicrilor tiinifice, 44 de teze ale comunicrilor tiinifice, 7 brevete de
invenie, 15 publicaii sunt fr coautori (11 articole, 4 materiale tiinifice), 5 - alte lucrri
tiinifice.
Volumul i structura tezei. Teza este expus pe 200 pagini de text de baz, procesate la
calculator, fiind constituit din: adnotri n limbile romn, rus i englez, lista abrevierilor,
introducere, 5 capitole, concluzii generale, recomandri practice, bibliografie din 424 de titluri i
3 anexe. Materialul iconografic include 88 de tabele i 9 figuri.
Cuvinte-cheie: coco, spermatozoid, acrozom, membran, lipide, proteine, antioxidani,
medii, crioconservare, reproducere.
Sumarul compartimentelor tezei.
16
Capitolul 1 conine reviul literaturii bazat pe surse bibliografice. n acest capitol sunt
prezentate datele din literatura tiinific modern cu privire la starea actual a cercetrilor n
domeniul crioconservrii materialului seminal al psrilor (modificrile morfo-fiziologice n
procesul crioconservrii, desfurarea proceselor fizico-chimice i biochimice n sistemele
biologice), reglri n domeniul crioconservrii resurselor genetice, posibilitilor cunoscute de
stabilizare a indicilor vitali ai spermatozoizilor de coco n procesul de crioconservare, care
influeneaz calitatea materialului seminal.
n capitolul 2 sunt descrise materialele i metodele moderne de cercetare utilizate n studiul
prezent (fiziologice, microscopice, spectrofotometrice, preparative, biochimice i
cromatografice), ct i n logaritmul investigaiilor efectuate.
n capitolul 3 sunt prezentate i analizate modificrile evidente ale materialului seminal de
coco: starea morfologic i termorezistena spermei de coco; funciile bariere ale membranei
plasmatice a spermatozoizilor; modificrile biochimice ale componenilor membranari, n
particular, a proteinelor, lipidelor i activitii enzimelor membranodependente.
n capitolul 4 sunt prezentate i analizate rezultatele cercetrilor cu privire la stabilizarea i
meninerea strii morfo-funcionale i biochimice a indicilor vitali ai spermatozoizilor de coco
n procesul de crioconservare prin folosirea concentraiilor optimale ale aminoacizilor, lipidelor,
glucidelor, antioxidanilor, crioprotectorilor i combinaiilor lor, regimelor tehnologice adaptate
la componena mediilor; precum i a electroliilor i neelectroliilor la diluarea i pstrarea
hipotermal a materialului seminal.
n capitolul 5 sunt prezentate rezultatele elaborrii tehnologiilor i mediilor pentru diluarea,
crioconservarea i pstrarea hipotermal a materialului seminal; experimentrii i implementrii
rezultatelor cercetrilor n condiii practice de ntreinere a psrilor, ct i, de reproducere
intensiv a lor.

17
1. CRIOCONSERVAREA SPERMEI, REALIZRI I PERSPECTIVE
1.1. Starea actual a studiului mecanismelor de criodistrucie i crioprotecie a materialului
seminal.
1.1.1. Starea actual n crioconservarea materialului seminal al psrilor.
Crioconservarea materialului seminal al diverselor specii de animale domestice este o
biotehnologie performant de reproducere, care se utilizeaz pentru dezvoltarea progresului
genetic, meninerea i conservarea biodiversitii potenialului genetic i pentru ameliorarea
proceselor nsmnrilor artificiale.
Dezvoltarea crioconservrii gameilor de pasre s-a aflat n vizorul ateniei comunitii
tiinifice peste 100 de ani. n monografia lor clasic Luyet i Gehenio [293] au elucidat toate
observaiile aciunilor temperaturilor biologice sczute cunoscute ntre anii 1736 - 1936, inclusiv
i cele citate de ctre Atkins (1909) i de ctre Moran (1925), cu privire la congelarea i efectele
temperaturilor sczute asupra oulor de gin. Dup puin timp Shaffner et al. [370] n rezultatul
numeroaselor cercetri ale celulelor sexuale aviare au demonstrat c este posibil obinerea
oulor fecundate de la ginile nsmnate cu material seminal congelat de coco, dei nu au
obinut pui vii dup incubaie [171, 182].
Ulterior, Polge et al. [343] au raportat c glicerolul posed proprieti protectoare contra
efectelor temperaturilor sczute asupra spermatozoizilor. Ei au descoperit c spermatozoizi
aviari, suspendai n soluia Ringher, care coninea 20% de glicerin i congelai la temperatura
de pn la 79 C i apoi decongelai s-au pstrat mobilitatea, care nu devia semnificativ de la
aceeai valoare a spermiilor din lotul martor, care nu au fost supui congelrii.
Din anul 1949, dup congelarea cu succes a spermei de coco, au fost efectuate multiple
studii pentru mbuntirea i standardizarea metodelor de conservare pe termen lung a
spermatozoizilor de diferite specii de animale. Acestea au inclus i spermatozoizii de psri
domestice [198, 274, 303, 411]. ns, n pofida investiiilor relativ intense ale comunitii
tiinifice din domeniul cercetrii privind crioconservarea materialului seminal, aceste metode au
fost utilizate neintensiv n creterea psrilor de curte. Unul dintre motive este faptul c
nsmnarea artificial nu era utilizat pe scar larg cu numeroase specii de psri domestice.
Dei, nsmnrile cu material seminal proaspt sunt intens folosite n reproducerea unor specii
de psri, atunci succesul procedurilor de congelare, care se aplic psrilor de curte este foarte
variabil i depinde de speciile concrete i liniile specifice de psri.
Indiferent de constrngerile menionate mai sus, ratificarea acordului internaional asupra
biodiversitii de la Rio de Janeiro, Brazilia n 1992, a provocat noi interese n dezvoltarea
18
metodelor de congelare a materialului seminal al psrilor domestice. Cercetrile n
crioconservarea celulelor aviare, inclusiv a spermatozoizilor, au cptat o atenie renovant, care
au fost direcionate asupra urmtoarelor proprieti: 1) conservarea spermei raselor rare; 2)
meninerea acceptibil a variabilitilor genetice n linii parentale; 3) disponibilitatea utilizrii pe
termen lung a potenialului genetic de la indivizii excepionali.
Progresele recente nregistrate n crioconservarea materialului seminal aviar, n particular,
de coco, au predeterminat activizarea gestionrii bncilor de gene din Europa i America de
Nord [169, 225, 413] n realitatea mediului natural asupra condiiilor de cretere intensiv a
anumitor specii de psri. Aceast activitate este foarte important pentru speciile de psri
domestice, care includ un numr foarte mare de crosuri rare i linii. De exemplu, n Frana exist
n jur de 154 de linii i crosuri rare din specia Gallus gallus [396], reprezentnd o mare
diversitate de populaii gestionate de ctre amatori, instituii de cercetare i cresctorii
comerciale. Aceste linii i crosuri sunt foarte rare n toate rile i sunt expuse unor riscuri de
epidemii (ex: Gripa aviar). La fel sunt expuse la eecul de gestionare i de consangvinizare
duntoare populaiile mici de psri. Aceste resurse ar putea fi salvate numai prin programe de
conservare care, n mod ideal ar combina managementul in-situ i ex-situ.
Metoda cea mai fezabil pentru gestionarea ex-situ a resurselor genetice ale psrilor este
crioconservarea materialului seminal, dar nu crioconservarea embrionilor ovocitelor [174, 303]
sau a celulelor blastodermice i germinale primordiale [405], sau a altor metode insuficient de
eficace, care sunt prea costisitoare pentru programele de conservare genetic [339].
Prin urmare, crioconservarea materialului seminal aviar, este singura metod eficient i
disponibil de management ex-situ pentru toate speciile de psri.
Crioconservarea este o metoda nonfiziologic, care implica un nivel ridicat de adaptare a
celulelor biologice la ocurile osmotice i termice la congelare i decongelare [164].
Spermatozoizii de pasre conin foarte puin citoplasma i, n mod proporional, o suprafa
foarte mare de membranele plasmatice [212, 273]. Acestea, de asemenea, conin un numr
variabil de mitocondrii (20-60), iar nucleul lor este constituit din cromatin foarte condensat.
n consecin, multe studii au fost efectuate pentru a se gsi cel mai bun agent crioprotector,
cele mai bune metode de congelare-decongelare, cele mai optime temperaturi i materiale
(ambalaje), care vin n contact cu materialul seminal [303]. Prin prisma acestor constrngeri,
rezultatele obinute de ctre diferii cercettori au elucidat diverse proceduri, n funcie de
varietile de specie iar, uneori, i la anumite rase din aceeai specie.
19
n ciuda faptului, c conservarea cu succes a spermei de coco a stat la baza crioconservrii
spermei ca atare, primele publicaii de amploare a utilizrii cu succes a materialului seminal
crioconservat de coco au fost realizate de ctre Lake i Stewart [273] i Sexton [369], adic
dup mai mult de treizeci de ani de la raportul lui Shaffner et al. [370]. Lake si Stewart au utilizat
metode de rcire, congelare i decongelare n rate, glicerina ca agent crioprotector intern i
flacoane de sticl pentru mpachetarea materialului seminal. Sexton, de asemenea, a utilizat
tehnologia de refrigerare lent a probelor spermatice, dar n calitate de crioprotector intern a
folosit DMSO i paie pentru ambalare. Ambele metode au fost optimizate mai trziu de ctre
Seigneurin i Blesbois [366]. Alte metode i proceduri, utilizate pentru rcirea rapid, congelarea
i decongelarea materialului seminal au fost elaborate de [50, 116, 365, 400]. n calitate de
crioprotectori interni a fost folosit DMF, DMA, glicerina i al. Compararea crioprotectorilor i a
metodelor de crioconservare a spermei, folosite n condiii standardizate industriale, obinute de
la cocoii broiler a artat c cele mai mari rate de fertilitate (mai mult de 90%), dup
nsmnarea artificial a ginelor cu material seminal crioconservat au fost obinute dup
congelarea-decongelarea lui, la folosirea n calitate de crioprotector glicerinei i la ambalarea
spermei n paiete. Aceleai rezultate au fost obinute i la congelarea-decongelarea spermei de
coco prin utilizarea DMA ca crioprotector si a paietelor pentru ambalare [400]. O adaptare a
ultimei metode de congelare-decongelare, la folosirea n calitate de crioprotector a DMA dup
optimizarea ei n combinaie cu ambalarea n paiete (n scopuri optime de identificare i
siguran) a fost aleas ca standard i metod de referin pentru sistemul bancar de sperm al
raselor locale de psri din Olanda [413]. n Frana, metoda cu glicerin este considerat a fi de
referin n activitatea spermobancurilor, deoarece aceasta s-a dovedit a fi mai eficient n
procesul de fecundare [173, 182]. Prin aceast metod, rata fertilitii medii, obinut cu
materialul seminal crioconservat, provenit din populaii mici de psri, pe cale de dispariie, din
linii mai mult sau mai puin subfertile i/sau consangvine variaz n limitele 7 - 68% [171]. Prin
folosirea spermei decongelate, obinute de la cocoii din liniile mai puin fertile, cu femele de tip
comercial (intensiv) fertilitatea a crescut de la 7% pn la 43%. La acest capitol, glicerina este,
probabil, cel mai bun crioprotector pentru spermatozoizii de coco, dar n acelai timp, este
necesar s fie eliminat din material seminal dup decongelarea lui. Acest lucru poate fi realizat
prin centrifugarea succesiv, diluare sau dializ [289].
n general este acceptat faptul, c un criteriu important n caracteristica capacitilor de
rezisten a spermei la congelare-decongelare este calitatea materialului seminal proaspt
recoltat. Deteriorrile aprute la crioconservarea spermei duc la scderea rezultatelor sistematice
20
ale calitii comparativ cu sperma proaspt [248, 390]. Diminuarea sporit a calitii
materialului seminal dup decongelare, de asemenea, este predeterminat de persistena
devierilor deja prezente n materialul seminal proaspt nainte de congelare.
Concomitent cu existena factorilor generali, sunt prezeni factorii specifici biologici i
biofizici, care asigur proprietatea spermei de a preveni posibilele dereglri cauzate de procesul
de crioconservare. Aceti factori, n general, includ permeabilitatea, compoziia lipidelor i
fluiditatea membranelor. Aceste deteriorri membranice provoac consecine nefaste asupra
mobilitii i diversitii proceselor metabolice, inclusiv i asupra concentraiei ATP n
spermatozoizi [170, 172, 290, 366]. Dintre toi aceti factori, fluiditatea membranar n
materialul seminal proaspt recoltat s-a dovedit a fi proporional cu raportul
colesterin/fosfolipidele al spermei i servete ca un indicator al particularitilor de specie.
Cercetrile experimentale contemporane au artat, c fluiditatea membranar este, n acelai
timp, un bun indicator anticipat al proprietilor materialului seminal pentru crioconservare,
obinut de la diveri masculi din aceeai specie [173].
Corelaia dintre fluiditatea membranar, compoziia lipidelor i proprietile de congelare
ale materialului seminal, de asemenea, prezint interes pentru faptul, c compoziia lipidelor
spermatice pot fi modificate i de factorii de mediu, cum ar fi dieta [171], care produce
modificri ulterioare asupra fluiditii membranelor. Ca consecin, n viitor, dieta ar putea servi
ca factor etalon de sporire a capacitilor de congelare a spermei aviare.
1.1.2. Modificri morfo-fiziologice n procesul de crioconservare.
Studiul morfologic al spermiilor a fost posibil datorit coloraiilor vitale, tehnicilor
biochimice i, n deosebi, microscopiei electronice.
Sub aspect morfologic spermiul este format din: cap, gt, piesa intermediar, piesa
principal i piesa terminal. Cele trei piese (intermediar, principal i terminal) alctuiesc la
un loc flagelul sau coada spermiului [15].
Capul spermiului, din punct de vedere al structurilor chimice, este format, n special, din
nucleoproteide i cantiti mici de proteine libere, lipide i sruri. Nucleoproteidele conin acid
dezoxiribonucleic (ADN) i o protein simpl, care, n cazul psrilor este o protamin.
Histonele sunt reprezentate de circa 18 aminoacizi (AA), dintre care arginina constituie
aproximativ 25%. ADN-ul reprezint circa 55% din substana uscat a capului spermiului, iar
mpreun cu histonele 80-83%. n afar de nucleoproteide capul spermiului conine i
lipoproteine (17-20%), care sunt concentrate n special n acrozom.
21
n componena capului intr mai multe formaiuni: nucleul, acrozomul, perforatorul,
capionul sau furoul postnuclear, protuberanele bazale, fosa de implantaie i membrana
celular.
n procesul derulrii etapelor tehnologice de crioconservare a spermei are loc deteriorarea
structurilor celulare, n rezultatul creia se produc schimbri calitative i cantitative ale
substanelor vitale, care provoac diminuarea indicilor specifici fiziologici ai gameilor.
Este stabilit corelarea pozitiv dintre concentraie i mobilitate, concentraie i volum.
Mobilitatea, la rndul ei, coreleaz pozitiv cu starea morfologic a spermatozoizilor de coco, dar
nu coreleaz cu integritatea membranelor. S-a dovedit, c mobilitatea, concentraia, integritatea
membranelor i starea morfologic depinde i de rasa cocoilor.
Mobilitatea i hemotaxisul sunt funcii obligatorii ale spermatozoizilor, n absena cror este
imposibila fecunditatea [252, 263, 325, 354]. Reglarea mobilitii poate fi realizat i prin
intermediul ionilor de Ca
+2
[236, 287, 318, 385, 395]. Suplinirea ionilor de Ca
+2
sporete viteza
micrii spermatozoizilor [329].
Adaosul proteinelor din ovulele Xenopus prelungete mobilitatea spermatozoizilor i
aceste proteine pot servi ca stimulatori ai spermatozoizilor. Este cunoscut, c n ovul exist trei
varieti de substane hemoatractive, stimulatori ai mobilitii i participani la reacia
acrozomal [342, 403]. Aceste substane sunt Ca
+2
-dependente n diapazonul mili molar [385].
Proprietile mecanice ale mediului influeneaz viteza micrii spermatozoizilor. Aceste
proprieti includ viscozitatea, care este predeterminat de interaciunea spermatozoizilor cu
complexul proteoglicanelor [286].
Procesul de crioconservare a celulelor i esuturilor prezint un factor de risc pe tot fluxul
frigorific. Pierderea celulelor are loc n cazul crioconservrii, incomplectitii perioadei de
precongelare, decongelrii ntmpltoare sau contaminrii cu microorganisme. Concomitent,
identificarea factorilor de risc, invers sporete eficiena utilizrii obiectelor crioconservate [306].
Unul dintre componentele celulei, care deseori se deterioreaz la crioconservare este
citoscheletul. Stabilizarea lui poate influena benefic rezultatele crioconservrii. n acest scop se
propune folosirea componentelor citoschelet-stabilizatoare - cetohalazina sau colhicina, dar
aceste preparate, la rndul su, pot provoca depolimerizarea actinei, ce poate fi periculos pentru
dezvoltarea embrionilor [75, 294, 393, 399].
Membranele celulare sunt foarte sensibile i, deseori, se deterioreaz n procesul
crioconservrii [5, 262]. n membranele plasmatice este prezent colesterina (CS), coraportul
22
creia cu fosfolipidele (FL), n mare msur, determin fluiditatea i sensibilitatea membranelor
[249].
La studierea spermei cocoilor de rasa Neagr Castelian [359], dup colorarea ei cu anilin
albastr, s-a difereniat clar coninutul celulelor cu morfologie normal sau anormal, practic,
analogic cu metoda fluoriscent [380]. Numrul acrozomelor intacte variaz n limitele 90-99%
n sperma nativ i valoarea acestui indice este independent de anotimp, ceea ce poate fi
explicat prin stabilitatea eriditar a cromatinei mpachetate n histoni [170, 210].
Pentru aprecierea calitii spermei se folosesc indicii: coninutul spermatozoizilor n
ejaculat, concentraia spermatozoizilor, mobilitatea, dereglrile morfologice, pH-ul materialului
seminal i altele. Indicii enumerai adecvat determin starea spermei, dar nu includ integritatea
structural a genomului spermatic [102, 145].
Totodat, pentru continuarea vieii este necesar translarea informaiei determinante de la o
generaie la alta. Aceast informaie face posibil translarea prin eriditate a proprietilor i
particularitilor, care asigur supravieuirea organismelor. Pstrarea i realizarea acestei
informaii trebuie efectuat la nivel molecular. S-a dovedit, c aceste molecule sunt prezentate de
ADN. Important este i ARN-ul, care contribuie la translarea informaiei genetice i acioneaz
ca translator al textului genetic, transferndul n succesiunea specific a AA. Coninutul
cantitativ al ADN-lui semnificativ reflect proprietatea fecundativ a spermatozoizilor.
Cercetrile privind determinarea coninutul ARN n sperma de coco sunt prezentate n foarte
puine lucrri, iar n unele dintre ele, sunt i contradictorii [377, 391].
Anumite deteriorri ale ADN pot provoca dereglarea procesului de reproducere. Tipurile de
dezorganizare ale ADN includ aderaiile cromosomale, modificaiile epigenetice ale histonilor i
ADN, mutaiile i fragmentaiile. Fragmentarea ADN este o cauz, deseori ntlnit, n
spermatozoizii infertili. Coninutul ADN fragmentat al spermatozoizilor, coreleaz negativ cu
calitatea spermei [377, 391].
Conform teoriei apoptozei, fragmentarea ADN este iniiat de activarea endonucleazelor,
conform crei, defectarea fenomenului menionat este determinat de substituirea histonilor cu
protamine n procesul spermatogenezei, ce provoac condensarea cromatinei i ADN-lui [391].
1.1.3. Desfurarea proceselor fizico-chimice i bio-chimice n sistemele biologice.
Cercetrile proceselor fizico-chimice n diverse sisteme biologice la temperaturile
hipotermale sunt descrise n numeroase lucrri tiinifice fundamentale [1, 32, 92, 146, 353].
Refrigerarea pn la temperaturi joase este urmat de schimbri semnificative ale condiiilor
fizico-chimice ale mediului de amplasare a obiectelor biologice. Scderea temperaturii,
23
cristalizarea apei, sporirea potenialului ionizant i osmotic al soluiilor, modificarea pH-lui i
altele sunt factorii fizico-chimici eseniali, care acioneaz asupra celulei la congelare-
decongelare i sub influena cror se produce modificarea macromoleculelor i a complexelor
supramoleculare ale proteinelor, cromatinei, lipoproteidelor i membranelor [2, 289, 305, 359,
380].
Eventuala posibilitate de elucidare a mecanismelor de criodestrucie este cercetarea
corelaiei dintre transformrile fizico-chimice la crioconservare i indicii pstrrii integritii
proprietilor biologice ale materialului deconservat [5, 61].
Conceptul actual al criodeteriorrii i apariiei defectelor n membrane nu este predeterminat
de modificarea aciunelor asupra ei a soluiilor concentrate, dar de deteriorrile mecanice aprute
n rezultatul producerii gradienilor osmotici. Prin urmare, suprapresiunea hidrostatic provoac
defecte ireversibile n membran, care, n esenial, servesc ca cauz de baz n lezarea celulei. n
acelai timp, nu se ia n consideraie specificaiile agentului hipertonic i de aceea prioritate n
procesele de distrugere a celulei la congelare-decongelare i revene presiunii osmotice. O
importan semnificativ n acest proces revine volumului i configuraiei celulelor, care suport
schimbri n rezultatul aciunii temperaturilor joase i a factorilor osmotici [61].
Concomitent, n perioada crioconservrii, spermatozoizii de coco sunt supui influenei
factorilor mecanici i hipoosmotici [171, 298]. n rezultat se observ o delatare, motivat de
ptrunderea apei prin membrana plasmatic n celul [380]. Aceti factori pot diminua
considerabil rezultatele nsmnrii ginelor [289].
Permeabilitatea membranelor plasmatice pentru moleculele apei i a crioprotectorilor este o
caracteristic criobiologic a celulelor, care determin procesele osmotice la congelarea-
decongelarea obiectelor [132].
Permeabilitatea membranelor celulare pentru moleculele crioprotectorilor scade n
diapazonul temperaturilor 35-5
o
C. Totodat, valoarea energiei de activare a procesului de
transportare a moleculelor EG, 1,2-BD i DMSO este aproximativ de 3 ori mai mare dect
valoarea energiei de activare a transportului prin membran a glicerolului [134].
Transportarea substanelor n celul depinde de structura lor, parametrii geometrici ai
moleculelor i organizarea structural a biomembranelor, care este determinat de specificul
speciilor i esuturilor [3, 74, 81, 133, 134].
Sporirea brusc a permeabilitii membranelor pentru ionii de Ca
+2
, ca rspuns la influena
diferitor factori, poate provoca nu numai adenozinmonofosfatul (AMP) din contul fosforilrii
anumitor structuri ale Ca
+2
-canalului, dar i hidroliza lipidelor membranare [185, 362].
24
Studierea permiabilitii membranelor face posibil obinerea informaiei despre
masotransportarea prin porii lor a diverselor substane [74]. n legtur cu aceasta, modelarea
torentului transmembranar al substanelor foarte frecvent se folosete n criobiologie [254].
O deosebit atenie se acord existenei fenomenelor de formare a clasterilor n procesul de
cristalizare. Producerea lor provoac reducerea brusc a dimensiunii cristalelor [335].
La congelarea soluiilor cu glicerin, n limitele 58-62% nu se formeaz cristale de ghea,
dar are loc cristalizarea intensiv a apei n procesul decongelrii n limitele temperaturilor -100-
60
o
C. Acest fenomen poate fi lmurit de pe poziia cristalizrii clasterice, deoarece limitele de
temperatur i concentraii studiate sunt caracteristice pentru microfazele lichide n bioobiectele
crioconservate la momentul producerii n ele a nano-cristalelor [362].
Este demonstrat c gheaa extracelular influeneaz celulele indiferent de natura esuturilor
[362]. Procesele termodinamice pot fi studiate prin modularea proceselor termodinamice [349] i
modele matematice de comportare termodinamic a cristalelor de ap [255, 257].
n acelai timp, celulele tuturor esuturilor i sistemelor se caracterizeaz prin existena
gradientului electrochimic al ionilor i cationilor. n ultimii ani, sunt stabilite proprieti ale
ionilor, direcionate spre modificarea mpachetrii proteinelor i acizilor nucleici i prin
interaciuni cu centrele ionizate ale macromoleculelor, contribuind la stabilizarea lor n anumite
conformaii [61].
Surplusul sau neajunsul coninutului de cationi, provoac unele modificri i n structura
proteinelor membranare. Acestui proces este supus structura proteinelor ale membranelor
eritrocitare, pentru care deosebit de periculos este sporirea concentraiei Ca
+2
intracelular, care
provoac agregarea ireversibil a eritrocitelor [ 355].
Cunoaterea mecanismelor de criodeteriorare ale sistemelor vii capt o semnificaie
deosebit n consecutivitatea proceselor biologice integre. Studierii mecanismelor criodeteriorrii
sistemelor biologice sunt dedicate numeroase cercetri [3, 32, 39, 42, 54, 95, 130, 174, 183, 191,
205, 218, 325, 346, 373, 409, 422].
Totalitatea cercetrilor experimentale acumulate pn n prezent au elucidat determinarea
factorilor principali, care influeneaz asupra obiectelor biologice la temperaturile hipo- i
superhipotermale, precum i posibilitatea de a formula ipoteze i teorii separate, care explic
multilateral mecanismele criodeteriorrii obiectelor biologice. Aceste ipoteze i teorii au fost
expuse multilateral de ctre cercettorii: Maximov N. [85], Smith A. [379], Lozina-Lozinschii L.
[84], Farrant J. i al. [218], Meryman H. [316], Saragusty J. i al. [361], Lovelock T. [291],
25
Pucari N. [103], Vinevschii V. [56], Milovanov V. [88], Nauc V. [92], Ostaco F. [97],
Boronciuc Gh. [47], Levitt J. [283], Mazur P. [307], Belous A., Bondarenco V. [42].
Ipotezele existente acord o semnificaie deosebit deteriorrilor mecanice i osmotice,
legate de modificarea moleculelor proteice i lipidice, cristalizarea apei i mpachetarea
moleculelor n microfaze solide [219, 307, 308]. n acelai timp, ele nu argumenteaz rolul
modificrilor proprii ale membranelor n iniierea criodeteriorrii celulelor. Dintre totalitatea
proceselor fizico-chimice, care se desfoar n celul i n membranele plasmatice la congelare
i decongelare exist un factor principal, care influeneaz intensitatea modificrilor criogenice.
Autorii [42] consider, c acest factor este apariia, dezvoltarea i evoluia defectelor
transmembranice n membranele plasmatice, derularea crora, depinde de nivelul modificrii
scheletului proteic i schimbarea proprietilor fizoco-chimice ale lipidelor i proteinelor
membranice la diferite etape nainte de congelare. n rezultatul analizei proceselor, care au loc n
membranele plasmatice autorii au elaborat conceptul moleculo-celular susmenionat.
O semnificaie deosebit acord cercetrile, direcionate la studierea mechanismelor
deteriorrii membranelor i componentelor ei. n rezultatul influenei temperaturilor joase se
observ o succesiune determinat de dezvoltarea criodeteriorrilor. Aceasta reprezint
diminuarea interaciunii hidrofobe i transferarea fazic a lipidelor, modificarea indicilor fizico-
chimici (pH, cocentraia electroliilor, presiunea osmotic, modificri biochimice), activarea
POL, oxidarea SH-grupelor, activarea fosfolipazelor, dereglarea respiraiei i fosforilrii [33, 89,
150].
Pe baza cercetrilor fundamentale i analizei bibliografice speciale V. Nauc [91, 92, 93, 94]
a formulat conceptul, conform crui criodeteriorrile specifice ale gameilor animalelor agricole
sunt determinate, n primul rnd de dereglarea membranelor biologice n rezultatul diversitii
coninutului, coraportului, labilitii i stabilitii componentelor i complexelor, care fac parte
din componena lor.
Ulterior, studiul fiziologo-biochimic i morfologic complex al materialului seminal de la
diferite specii de animale la diverse niveluri de organizare structural n condiiile
crioconservrii, efectuat de ctre profesorul Gh. Boronciuc, a permis de a stabili, c n cadrul
prelucrrii tehnologice dereglrile criogenice se declaneaz att din contul reaciilor generale, ct
i a celor particulare de specie [47].
Unul dintre mecanismele de criodeteriorare la decongelarea materialului este formarea
veziculelor de aer n obiectul biologic la eliminarea din substratul lichifiat a aerului n procesul
transformrilor fazice. n acelai timp, degazarea parial a obiectului pregtit pentru
26
crioconservare, practic, exclude formarea veziculelor de aer la deconservare, care provoac
apariia deteriorrii morfologice i modificrilor biochimice n obiect. S-a demonstrat c
vacumarea suspensiilor de celule pn la crioconservare, garanteaz vivacitatea lor la 80% n
comparaie cu 60% n varianta martor [143].
Conform cercetrilor proprii i analizei factorilor, care provoac deteriorarea celulelor,
autorul a elaborat un concept nou, conform cruia modelarea teoretic a mecanismului ocului
termic este completat cu aciunea forelor deterioratoare a bombardrii rezonante a undelor
hidrodinamice, care apar n rezultatul schimbrii brute a vitezei micrii apei n spaiul limitat
al celulei i cu modificarea brusc a tensiunii membranei citoplasmatice pn la nivele critice cu
pierderea elasticitii sale [98].
Ipotezele menionate reflect laturile importante ale mecanismului unic de criodeteriorare a
obiectelor biologice. n acelai timp, diversitatea modificrilor endo- i exocelulare, specificul
lor, face imposibil analiza lor n conformitate cu prevederile unilaterale ale ipotezelor
menionate. Acest fapt agraveaz armonizarea unificat a criodeteriorrilor, iar concomitent,
stabilete principii de performan i stimuleaz efectuarea cercetrilor de cutare a legitilor
generale, care stau la baza criorezistenei i criodeteriorrii celulelor.
n acest context, este necesar aprofundarea cercetrilor i generalizarea datelor
experimentale prin folosirea metodelor matematice de modelare i planificare polifactorial, care
ar simplifica determinarea cilor i posibilitilor de stabilizare a membranelor biologice.
1.2. Rolul lipidelor i proteinelor la derularea procesului de crioconservare a spermei.
Este cunoscut faptul, c lipidele formeaz nu numai baza structural a membranelor
celulare, determinnd gradul de viscozitate, difuzia lateral i asimetria bilateral, dar sunt i
substane biologice active, care ndeplinesc funcia compuilor ai sistemului de transducie a
semnalelor, ai modulatorilor activitii enzimatice i ai proprietilor de recepie [142]. Lipidele
n componena membranelor biologice sunt clasificate n 3 clase: lipide neutre, FL i
sfingolipide.
S-a demonstrat, c gradul de nesaturare a lipidelor determin desfurarea semnificativ a
fenomenului fiziologic n membrane - adaptarea homeoviscozitar, rolul crei const n
compensarea proceselor membrano-conjugate, cu implicarea fluiditii membranelor. Prin
urmare, se propune selectarea substanelor crioprotectore active, n dependen de varietatea FL;
de temperatura tranzaciei fazice i, n deosebi, de temperatura tranzaciei gel-cristal-lichid [278].
Repartizarea FL n membran este asimetric [57]. Fosfatidilcolina (FC) i sfingomielina
(SM) se localizeaz, prioritar, n monostratul extern al membranei, iar aminofosfolipidele -
27
fosfatidiletanolamina (FEA) i fosfatidilserina (FS), precum i fosfatidilinozitolul (FI), care nu
conine azot, sunt amplasate pe partea intern a stratului.
Rolul principal n pstrarea organizrii bistratare a membranelor biologice aparine FC i
SM [76]. FC este principalul component structural al membranelor majoritii celulelor. FC este
localizat, prioritar, pe partea extern, iar FEA i FS pe partea intern a membranei plasmatice.
FEA face parte din lipidele nesturate i nu este zwiterion, dar este foarte masiv. FC, invers,
este zwitterion, cu sarcini electrice echilibrate i reprezint un FL, la fel, masiv.
Astfel, localizarea deversat determin i funciile principale ale diferitor FL. De exemplu,
FC membranelor plasmatice ale spermiilor are proprieti protectoare la ocul termic i
nemijlocit particip la inhibarea procesului de peroxidare a lipidelor (POL).
Concomitent cu FL neutre, n componena lipidelor membranare sunt incluse i fraciile
anione (acide) ale lor FS, FI, cardiolipina (CL) i acidul fosfatidic (AF), care regleaz
activitatea Ca
+2
i Na
+
,K
+
-ATP-azelor, necesare pentru meninerea echilibrului ionilor n celul.
Un rol important n reglarea proceselor metabolice aparine FI, care se menine n cantiti
minore, iar produsele descompunerii FI particip n numeroase procese celulare secundare [57].
Acumularea n membrane a FI sporete posibilitatea controlului asupra transportrii i
translrii informaiei, n mod de semnale hormonale, n spaiul intracelular. FI influeneaz
proprietile fizico-chimice ale membranelor viscozitatea i aptitudinea de legtur a ionilor de
Ca
+2
, care la rndul lor, determin modificarea funciei membranelor [287, 362, 385].
Se presupune, c sfingolipidele (SL) i CS sunt localizate, prioritar, pe suprafaa extern a
membranei plasmatice, n insulie structurate (rafte). Conform modelului raftelor, interaciunea
CS cu FL se faciliteaz prin coninutul de terminaii ale acizilor grai saturai, care pot
interaciona cu ciclul sterolic al CS. Totodat, este posibil formarea legturilor hidrogene dintre
grupa hidroxil a CS i ceramida sfingolipidelor. Paralel, s-a propus i alt model, care presupune
c FL i CS sunt repartizate n membran reglementat, iar moleculele CS se situiaz pe stratul
extern al membranei, complementar moleculelor FEA. Dup prerea autorilor, anume acest
model mai bine corespunde interaciunilor dintre FEA cu CS [57].
CS n membranele biologice, este unul dintre cei mai importani reglatori ai organizrii
lipidelor. Existena n structura CS a grupei hidroxile, determin un ir de proprieti fizico-
chimice ale acestei substane. Ca i unele FL, CS aparine lipidelor nestratificate, care sunt apte
de a modifica topologia sistemelor membranare [142]. Funcia principal a CS, este aptitudinea
de a modula proprietile fizico-chimice ale membranelor.
28
Gradul nalt de structurare a FL n membrane provoac sporirea densitii i diminuarea
permeabilitii membranelor, mrete microviscozitatea lor [142]. CS sporete gradul de
ordonare i diminueaz mobilitatea lanurilor carbohidrate ale FL i limiteaz posibilitile
conformaionale ale lanurilor FC [139, 142]. La prezena n membran a CS, sporirea i
scderea temperaturii nu amenin structurarea i mobilitatea lanurilor acizilor grai [73].
Colesterina i LFC particip n procesul de reorganizare a structurilor membranare, iar
variaiile coninutului LFC pot provoca modificarea topologiei sistemelor membranare i duc la
apariia porilor. Surplusul produselor hidrolizei FL, a acizilor grai liberi i a lizoformelor FL
contribuie la modificarea bistratului lipidic i a proteinelor integrale ale membranei. Efectul
citologic al LFC, nsoit de sporirea permeabilitii membranelor pentru moleculele organice i
ioni, este determinat de combinarea aciunilor substanelor active i ionofore, care provoac
reorganizarea structural a componenei proteice a membranei [142, 288]. n acest caz, efectul
maximal citolitic al LFC se produce la extinderea mobilitii ei dup limitele stratului FL al
membranei [142].
Activarea proceselor lipolitice, care provoac destabilizarea membranelor, se examineaz n
calitate de cauz principal a nbtrnirii celulelor [142].
Modificarea valorilor rapoartelor varietilor FL are un rol semnificativ n funcionarea
membranelor celulare [112].
Pe baza datelor obinute T. Linnic i al. [82] demonstreaz, c un aport esenial n efectul
citotoxic al crioprotectorilor asupra spermatozoizilor de coco constituie aptitudinea lor de a
influena activ asupra interaciunilor hidrofobe cu membranele, de a modifica legturile i
formaiunile structurale din care fac parte lipidele. Intensitatea influenei substanelor asupra
interaciunii lipid-lipidice se afl n corelaie direct cu proprietile lor membranotrope, care
sunt determinate de echilibrul hidrofil-hidrofob al moleculelor lor. Datele obinute, de asemenea,
reprezint o informaie important despre mecanismele permeabilitii membranelor biologice,
indirect demonstrnd cile prioritare ale difuziei substanelor prin membrane, innd cont de
complexitatea i divergena structural. [38, 82].
Reactivitatea nalt a membranelor biologice la influena condiiilor hipotermale este
determinat, n primul rnd, de modificarea componenilor structurali de baz. Modificrile
eseniale ale organizrii moleculare a spermatozoizilor n procesul crioconservrii provoac
dereglarea sistemului energetic de transportare a electronilor i sporirea proceselor de oxidare a
lipidelor. La aplicarea strii lanului respirator, n procesul de crioconservare-deconservare a
spermei de coco s-a demonstrat, c includerea succinatului n componena mediului de incubare
29
nu provoac intensificarea respiraiei la spermatozoizii intaci, iar la prezena 2,4-dinitrofenolului
se stimuleaz respiraia la spermatozoizii de vier de 2,5-3 ori; de taur i coco - de 2 i mai multe
ori. Stimularea respiraiei spermatozoizilor congelai n mediu cu dinitrofenol i dibazol permite
de a menine respiraia lor, practic, la nivelul spermei native. Reglarea dirijat a respiraiei
celulelor reproductive poate fi folosit la elaborarea mediilor i procedeelor de crioconservare a
spermei de coco [138].
1.3. Analiza tehnologiei de meninere i stabilizare a indicilor vitali ai spermatozoizilor de
coco n procesul de conservare.
Continuarea dezvoltrii metodei de conservare a spermei este determinat de cercetrile
mediilor protectoare, regimurilor tehnologice i posibilitii de sporire a calitii iniiale a
materialului seminal. Impactul principal n elaborarea mediilor pentru diluarea i conservarea
spermei de coco aparine realizrilor performante [32, 76, 90].
1.3.1. Mediile pentru diluarea i conservarea spermei de coco.
Utilizarea mediilor protectoare pentru diluarea spermei are ca scop: I. De a repartiza
uniform spermatozoizii astfel, nct s se obin o concentraie suficient de spermatozoizi pentru
nsmnare; II. Meninerea viabilitii spermatozoizilor la etapa pregtirii pentru congelare i
toat perioada pstrrii hipotermice; III. Prentmpinarea sau diminuarea maximal a aciunilor
negative ale temperaturilor sczute i suprasczute (cristalizarea i recristalizarea, sporirea
concentraiei substanelor osmotice active i al.); IV. Stabilizarea proceselor fiziologice,
biochimice i morfologice pe tot parcursul ciclului de congelare i decongelare a obiectelor
biologice; V. Meninerea condiiilor favorabile pentru realizarea proceselor de fecundare.
Coninutul mediilor crioprotectoare este diferit, n dependen de obiectivele trasate pentru
realizare. De exemplu, pentru asigurarea viabilitii spermatozoizilor la etapa pregtirii pentru
congelare este necesar de a include componente, care menin echilibrul osmotic, volumul de
tampon, aprovizionarea energetic pentru susinerea proceselor metabolice la un nivel optim,
precum i a antioxidanilor (AO), pentru diminuarea stresrii oxidative, care apare, att dup
ejuculare, ct i n timpul pstrrii celulelor n condiii fiziologice normale sau hipotermice.
Diluarea spermei cu folosirea mediilor crioprotectoare, reprezint una dintre etapele
principale ale biotehnologiei crioconservrii. Componena i proprietile fizico-chimice ale
mediilor sintetice servesc ca factori eseniali la pregtirea spermei pentru congelare i determin
eficiena crioconservrii. n literatur este publicat un numr mare de medii pentru diluarea i
congelarea spermei de psri [17, 32, 78, 83, 116, 226, 273, 368, 409].
O deosebit valoare capt cercetarea gradului de diluare a materialului seminal. Este
cunoscut, c celulele conin structuri intracelulare osmotic neactive. Concentraia real a
30
crioprotectorilor n suspensia celulelor sporete la creterea coninutului de celule ntr-un anumit
volum. Temperatura de cristalizare a suspensiei de celule este determinat de concentraia real a
crioprotectorului. De aceea, temperatura cristalizrii scade la creterea concentraiei de celule,
care conin substane osmotic neactive, din contul creterii concentraiei reale a crioprotectorului.
Aici, este necesar de menionat, c spermatozoizii conin o cantitate nalt de substane osmotic
neactive, iar n condiii experimentale, s-a demonstrat c dac concentraia spermatozoizilor
constituie 05-08; 5-8; 11-16 mlrd/ml, atunci temperatura de cristalizare a suspensiei scade,
corespunztor, pn la -4,73; -5,75 i -7,16
o
C. Adic, se observ o dependen invers
proporional ntre indicii studiai [67].
Pentru aceasta, se propun diferite modaliti de creare a mediilor protectoare, dar, n
esenial, au confirmat eficiena i se folosesc pe larg dou: elaborarea mediilor, maximal posibil,
apropiate de componena plasmei spermatice [83, 273, 368] i elaborarea mediilor din
componeni, care ntrunesc anumite funcii, dintre care compensarea sau prevenirea
modificrilor n spermatozoizi, existente la diverse etape ale crioconservrii. [78, 83, 412].
n rezultatul cercetrii i analizei datelor bibliografice din domeniul crioconservrii spermei
de coco s-a stabilit, c compuii principali ai mediilor protectoare sunt neelectoliii, electroliii,
crioprotectorii, sistemele de tampon, substanele stimulatoare ale fecunditii oulor i apa.
n componena mediilor policomponente pentru crioconservarea spermei de pasre sunt
experimentate peste 10 varieti de glucide, mono-, di- i trizaharide. S-a stabilit, c dup gradul
influenei benefice asupra vivacitii spermatozoizilor crioconservai de coco, glucidele
formeaz succesiunea: fructoza>glucoza>lactoza>zaharoza>maltoza>trialoza>rafinoza. Dup
congelare-decongelare, monoglucidele i glicozidele steroide restabilesc pn la 45-50% din
totalitatea spermiilor i menin activitatea lor o perioad mai ndelungat, pstrnd integritatea
acrozomilor. Dizaharidele, prioritar, influeneaz pozitiv integritatea capului spermatozoizilor, n
comparaie cu monoglucidele [6, 34, 83].
Diglucidul trigaloza posed efect protector la congelare lent, la vitrificare i sublimare.
Unul dintre mecanismele de aciune a trigalozei, predetermin interaciunea dintre celulele
sistemului ghea n cazul congelrii lente [250, 350, 352].
Sorbitolul i trigaloza sporesc mobilitatea spermei dup liofilizarea ei [352].
Cercetrile ultramicroscopice demonstreaz stabilizarea structurilor celulare, scderea
intensitii proceselor de peroxidare i sporirea mobilitii spermatozoizilor congelai, dup
diluarea materialului seminal cu mediul, care coninea trigaloz [149].
31
Un component obligatoriu al mediilor pentru crioconservarea spermei este glbenuul de ou
de gin, care posed i unele unele neajunsuri, adic nu este posibil sterilizarea mediului i
standartizarea componenei lipidice a glbenuului. Folosirea lipidelor purificate, n mod separat,
(de exemplu, a FC) are efect pozitiv, dar economic neeficient. Numeroase experiene au dovedit,
c nlocuirea n componena mediilor sintetice a glbenuului nu are aciune benefic [273, 380,
109] Paralel, ine de menionat diminuarea fenomenului citotoxicitii al DMF la temperaturile
pozitive n prezena adausului proteic. Dintre adausurile proteice, mai eficiente sau dovedit a fi
mucoproteinele i albuminele n diverse concentraii [83].
n componena mediilor sunt experimentate numeroase sruri cu diverse funcii [49, 78, 88,
368]. Principalele dintre ele sunt: meninerea echilibrului osmotic, proprietatea de tampon i
pstrarea coraportului fiziologic al ionilor de potasiu i sodiu. Datele demonstreaz, c utilizarea
srurilor organice este preferabil pentru sperma de coco, deoarece asigur proprietile de
tampon ale mediului [116, 276]. La fel, este cunoscut c n limitele pH 6-8, fecunditatea spermei
psrilor se pstreaz la nivel nalt [411]. Din componena mediilor face parte i glutamatul de
sodiu, ca un component considerabil al spermei de psri. Prezena glutamatului n concentraie
optimal este evident pentru participarea lui n numeroase procese metabolice i, n special, n
ciclul energetic [78, 273].
Spermatozoizii, n procesele de pregtire, rcire, congelare, decongelare i nsmnre se
supun oscilrii ionice i presiunii osmotice ale mediului ambiant [14]. Supravieuirea lor depinde
de proprietile de adaptare la condiiile conservrii. Osmolaritatea mediilor existente pentru
crioconservarea spermei de psri este unul dintre indicii principali ai caracteristicilor fizico-
chimice ale mediilor i variaz de la 290 pn la 450 m
Osmol
[78, 83, 88, 273, 276, 368]. S-a
constatat, c fertilitatea spermei in vitro, n condiii hipotermale, la folosirea mediilor n
diapazonul 250-400 m
Osmol
, ncepe s scad dup 24 ore de pstrare.
Pentru prevenirea consecinelor transformrilor fazice, apa-gheaa la congelarea-
decongelarea suspensiilor de celule, n componena mediilor este necesar de a include
crioprotectori cu activitate nalt de protecie [40, 82, 104]. Preferabil, ca crioprotectorii s fie
multifuncionali. Eficiena folosirii crioprotectorilor depinde de proprietile termo-fazice ale lor,
care asigur cantitatea de cldur necesar pentru transferarea de la/la obiectul crioconservat prin
schimbarea temperaturii lui. Temperatura i componena obiectului influeneaz asupra
capacitii de cldur a lui, care este mai pronunat n momentul cristalizrii i topirii, cnd
capacitatea de cldur brusc sporete. Pentru dirijarea proceselor, care se produc n perioada
32
congelrii-decongelrii este necesar de a avea n vedere interdependena capacitii de cldur a
soluiilor congelate, dependent de temperatura i concentraia lor [118].
Congelarea spermei psrilor, diluat cu mediul, care conine DMA, permite de a obine
numai 25% de nsmnri rezultative. Comparativ cu tehnologia de congelare lent, metoda
accelerat (60
o
C/min) s-a dovedit a fi mai efectiv n pstrarea structurilor morfologice i a
fertilitii [268].
Dimetilsulfoxida (DMSO) i etilenglicolul (EG) n procesul crioconservri menin, dar nu
blocheaz dehidratarea celulelor [ 348].
Pentru crioconservarea spermei de coco sunt elaborate diferite metode alternative, care se
bazeaz pe folosirea diferitor crioprotectori, dintre care glicerina, EG, DMF, DMA, DMSO i
altele [82], fiecare n parte posednd anumite neajunsuri. n particular, toxicitatea
crioprotectorilor, care, n primul rnd, acioneaz la nivelul membranelor celulare ale
spermatozoizilor de coco.
Toxicitatea crioprotectorilor reprezint un factor, care limiteaz crioconservarea reuit a
sistemelor biologice. Ea poate fi micorat prin perfecionarea mediilor. De exemplu, amidele
pot bloca toxicitatea DMSO, dar acest fapt nu s-a confirmat experimental. Informaie
convingtoare despre detoxicarea crioprotectorilor lipsete [234].
Bazele moleculare ale influenei crioprotectorilor asupra membranelor biologice rmn pn
n prezent neelucidate, cu toate c crioprotectorii pot modifica interaciunile lipid-lipidice i
lipid-proteice, schimb potenialul membranar i influeneaz activitatea enzimelor membranare
[1, 35, 82, 116].
n literatura contemporan s-a acumulat un volum enorm de informaie despre proteinele
antifrize, care pot servi ca componente ale mediilor crioprotectoare. Interesul studiului lor este
determinat prin faptul, c aceste proteine protejeaz celulele de factorii deterioratori, care
reprezint un risc enorm la cristalizarea lichidului din obiectele biologice n procesul scderii
temperaturii. Proteinele antifrize formeaz o grup special de proteine, pentru care este
caracteristic aptitudinea de scdere a temperaturii de congelare; de modificare sau stopare a
formrii cristalelor de ap; de inhibiie a recristalizrii i, probabil, de protecie a membranelor
celulare de deteriorare. Reieind din cele menionate, A. Gulevschii i L. Relina [61] au clasificat
aceste proteine, n dependen de proveniena lor, dup urmtoarele principii: I - Proteinele i
glicoproteidele petilor; II - Proteinele insectelor; III - Proteinele rematodelor; IV - Proteinele
vegetale; V - Proteinele micotice; VI - Proteinele bacteriene. ns, puine clariti exist n
mecanismele de aciune a lor [62, 63].
33
Exist patru ipoteze, care elucideaz activitatea proteinelor antifrize: Prima ipotez se
bazeaz pe rezultatele radiografiei, modulrii computerizate i altor metode fizice, care, probabil,
predetermin rolul principal al complementrii atomilor de oxigen n ghea, cu structurile
moleculare n proteine, formnd legturi de hidrogen; A doua ipotez se bazeaz pe mutageneza
direcionat i modelarea computerizat; conform acestei ipoteze, partea hidrofob a spiralei
amfifile a proteinelor antifrize se afl n starea limitei ghea-ap; A treia ipotez, la fel, se
bazeaz pe mutageneza direcionat i modularea computerizat; se presupune c proteinele
antifrize, care se afl la limita suprafeei ghea-ap, influeneaz asupra planului cristalelor, cu
care ele interacioneaz.
Prevederile primelor dou ipoteze servesc, ca indicatoare asupra faptului, c proteinele se
acumuleaz pe suprafaa cristalului, iar conform ipotezei a treia, proteinele determin locurile de
conexiune [296]. Proteinele antifrize, conform proprietilor criobiologice se clasific n 3 clase:
I. Proteine nucleare iniiaz cristalizarea, fiind matricea de formare a gheii i blocheaz
suprarcirea; II. Proteine antinucleare inhibeaz formarea cristalelor; III. Proteine antifrize
micoreaz temperatura congelrii, modific sau stopeaz formarea cristalelor de ghea, inhib
procesul de recristalizare i protejeaz celulele de deteriorare [61].
Proteinele antifrize au un rol deosebit i n desfurarea adaptrii la temperaturile sczute
[295, 372]. Ele pot demonstra att aciuni protectoare, ct i citotoxice, care sunt condiionate n
raport cu programa congelrii, doza, tipul proteinelor antifrize, componena mediilor de
conservare i tipul biomaterialului. [408].
Avnd n vedere aceste proprieti, proteinele antifrize pot fi folosite pentru stabilizarea
membranelor la pstrarea frigorific. Eficacitatea utilizrii proteinelor antifrize depinde i de
componena lipidic a membranelor, n legtur cu ce glicoproteidele pot servi ca componente
eficiente ale mediilor pentru crioconservare [63, 179].
n literatura special persist anumite informaii despre componena i proprietile
secretului tractului genital al ginilor. S-a demonstrat, c coninutul de potasiu n acest lichid este
de 4 ori mai mare, dect n plasma seminal. Este depistat o cantitate mare de inozitol. Se
nregistreaz sporirea coninutului ionilor de Zn
+2
i altele [78].
Dup caracterul de aciune, substanele biologice active pot fi clasificate n dou grupe: 1)
substanele care nemijlocit influeneaz capacitile funcionale ale spermatozoizilor - AO,
stabilizanii echilibrului energetic, substanele care micoreaz i sporesc permeabilitatea
membranelor pentru molecule de ap, ioni, neelectrolii i ali reglatori ai metabolismului; 2)
substanele care influeneaz organismul femelelor prin stimularea motoricii tractului
34
reproductiv, contribuind la ptrunderea spermatozoizilor i fecundarea ovulelor (enzimele,
hormonii i al.) [88, 270].
Calitatea sczut a spermei este legat de producia excesiv a reaciilor de oxidare specific
(ROS), ca urmare a POL n materialul seminal [147, 228]. n funcie de tipul, concentraia, locul
i timpul de producere, ROS pot avea efecte benefice sau nocive [148].
Fiind cea mai rspndit substan n natur, apa este cel mai important component al
organismelor vii, reprezint mediul principal i dizolvant universal, care determin realizarea
metabolismului hidrosalin. Progresul tiinifico-tehnic i biotehnologiile avansate realizeaz
cercetri avansate n aceast direcie i, n special, asupra posibilitilor modificrilor dirijate a
proprietilor ei. S-a demonstrat, c prelucrarea electromagnetic a apei deplaseaz diapazonul
cristalizrii n direcia temperaturilor sczute, ns aceste proprieti nu se refer i la apa
distilat, iar pstrarea izotonic a mediului influeneaz formarea cristalelor de ap i are o
deosebit perspectiv [258].
Este studiat influena concentraiei naturale a izotopilor grei din coninutul apei asupra
cineticii reaciei generatoare a apei n mitohondriile izolate, n prezena acidului succilic, care
sevete n calitate de substrat. S-a demonstrat, c izotopii grei n componena apei naturale,
veridic inhib reacia studiat. Diminuarea coninutului izotopilor grei n ap provoac
deinhibarea i accelerarea veridic a reaciei studiate [100].
Pentru prevenirea consecinelor transformrilor fazice, apa-ghea la congelarea-
decongelarea suspensiilor de celule, n componena mediilor este necesar de a include
crioprotectori multifuncionali cu activitate nalt de protecie [83].
1.3.2. Regimuri i metote de congelare i decongelare a spermei de coco.
Din actualele meniuni bibliografice rezult, c exist o gam de regimuri, care asigur
posibiliti de congelare-decongelare i pstrare a spermei de coco [18, 274, 365, 369, 409].
Congelarea spermei prin diverse viteze liniare pn la multiple valori variate ale temperaturii
a stabilit, c la rcirea lent cu viteza de 2 C/min criodeteriorarea celulelor se produce n
diapazonul temperaturilor de pn la -30 C. n acest interval scade semnificativ mobilitatea
spermatozoizilor la -20-30 C i are loc deteriorarea acrozomilor la -15-30 C. Congelarea
accelerat cu viteza de 40 C/min provoac deteriorri critice principale ale mobilitii,
integritii membranelor celulare i acrozomului. Aceste deteriorri se declaneaz,
corespunztor, n diapazoanele de temperatur de -60-70; -30-40; -10-15 C. De asemenea, are
loc deteriorarea precoce a acrozomilor, i anume n jur de 50%, dintre aceste organele se
deterioreaz deja la -5C [109, 116]. Conform rezultatelor cercetrilor, la rcirea lent a
35
suspensiilor spermatice, ca factor deteriorator se presupune a fi efectul soluiei, iar la cea
accelerat cristalizarea intracelular a compuilor gameilor.
Congelarea spermei de coco de la 0 C pn la 10 C cu vitez lent, face posibil scderea
considerabil a deteriorrii spermatozoizilor n acest interval al temperaturilor negative i,
parial, produce diminuarea dehidratrii celulelor. Importana derulrii proceselor menionate
const n admiterea posibilitii de sporire ulterioar a vitezei de rcire n scopul minimalizrii
influenei efectului soluiei i a evitrii consecinelor cristalizrii intracelulare n spermii.
Avnd n vedere rezultatele acestor constatri, s-a elaborat regimul optimal, prin multiple etape
de congelare a spermei de coco i ambalarea ei n fiole plastice. Tehnologia include urmtorii
parametri: intervalul perioadei de cristalizare (de la nceputul cristalizrii pn la -8 C) constituie
2,0-2,5 min; viteza rcirii n intervalul de temperatur -8-20 C este de 25-30 C/min, n
intervalul -20-85 C este de 50-70 C/min i n intervalul -85-196 C este de 30-50 C/min.
Decongelarea spermei a fost realizat n baia cu ap la 40 C.
La congelarea spermei de coco ambalat n fiole sau paiete plastice T. P. Linic [81]
propune urmtorul regim de congelare i decongelare a spermei: viteza de rcire de la 4 pn la -
8 C constituie 1-3 C/min, expunerea la platoul cristalizrii 1-2-min, rcirea pn la 25 C cu
viteza de 25-30 C/min, pn la -80 C cu viteza de 65-70 C/min, ulterior sperma ambalat se
introduce n azot lichid.
n cazul congelrii spermei n form de granule, temperatura suprafeei metalice
hidrofobizat cu preparatul cremneorganic GKT-94, depinde de proprietile crioprotectorului
utilizat. n particular, pentru DMA i DMF trebuie s fie n limitele de -140 C, la folosirea
metilacetamidei, EG, 1,2-propandiolului sau combinrile lor temperatura suprafeei de congelare
urmeaz s constituie -50 C. Pentru decongelarea spermei indiferent de varietile metodelor de
ambalare se utilizeaz temperatura de -40 C.
Este necesar de menionat i regimurilede congelare i decongelare ale spermei de coco,
ambalate n flacoane de sticl, au fost propuse de ctre L. E. Narubina [90]. Aceast tehnologie
prevede cteva etape dup cum urmeaz: flacoanele cu sperm diluat se ermetizeaz, se
instaleaz n platouri i se expun la 2-4 C timp de 40-60 min, ulterior se introduc crioprotectorii
la rcire continu n camera criostatului i rotaia flacoanelor timp de 4 min cu frecvena de 12-
13 rot./min pn la temperatura de -80 C. Congelarea spermei se produce prin introducerea
flacoanelor n azotul lichid.
Decongelarea spermei, la fel, include cteva etape: iniial dup extragerea flacoanelor cu
sperm din azot, ele se pstreaz timp de 30-40 sec la temperatura camerei (18-20 C) pentru
36
evaporarea azotului lichid. Dup ce, flacoanele se transfer n baia cu ap la 60-70 C, unde se
pstreaz pn la nceputul alunecrii spermei de pe suprafaa sticlei, timp de 7-10 sec.
O alt tehnologie este crioconservarea spermei n form de granule prin metoda picurrii
directe n azotul lichid [90]. Sperma dup recoltare se dilueaz n raport de 1:1 cu mediul LKS-1
cu urmtoarea componen (%): glutamat de sodiu 1,657; protaminsulfat 0,028; acetat de
potasiu (dehidratat) 0,432; D-fructoz 0,691; polivinilpirolidon (10000 - 12000) 0,259 i
restul ap. Ulterior sperma se expune timp de 40 min la 2-4 C sau 15-30 min la -7-12 C i se
adaug 8% de DMA, nemijlocit nainte de congelare. Temperatura se coboar pn la 0-12 C i
sperma se picur, prin picturi ct mai mici, direct n azotul lichid cu seringa prealabil rcit.
Pentru decongelare granulele se extrag din azot, se transfer n conusul metalic special, nclzit
pn la 40-50 C. Sperma decongelat se colecteaz n eprubete i se fololosete pentru
nsmnarea ginelor.
n tehnologia crioconservrii spermei de coco n granule, recoltarea spermei se realizeaz
conform [233] sau prin alte metode, care nu streseaz cocoii. Nu se admite poluarea spermei.
Dup recoltare, sperma se dilueaz ct mai rapid cu mediul de urmtoarea componen (g/100 ml
ap): glutamat de sodiu (monohidrat) 1,103-1,192; acetat de magniu (tetrahidrat) 0,004-0,08;
acetat de potasiu (anhidrat) 0,051-0,50; pirolidon polivinilclorid (MM 10,000) 0,03-0,30;
glucoz 0,044-0,80 i DMA (lichid - 99%), care se adaug n sperma diluat n concentraie de
6% (V/V) nemijlocit nainte de congelare.
Congelarea spermei: 1) sperma (1-2 ml) n flacon de polisterol se transfer n lada cu ghea
timp de 10 min, dup ce se adaug n acelai volum mediu lui Lake la temperatura, aproximativ,
5
o
C, unde rmne pentru echilibrare timp de 20-30 min; 2) n alt lad se toarn azot lichid la
nivel nu mai mic de 10 cm i se rcete 10 min; 3) la agitare permanent n sperma diluat se
adaug, cu pictura DMA, pn la concentraia final de 6% (V/V) i se echilibreaz timp de 1
min; 4) cu pipeta automat de 1 ml sperma se picur direct n azot. Picturile cu volumul 0,05
ml, iniial plutesc la suprafaa azotului, pe urm se afund; 5) crioeprubetele pentru ambalare se
afund n azot; 6) n fiecare eprubet se ambaleaz cte 6 granule i eprubetele se nchid cu
capac; 7) ulterior eprubetele se transfer pentru pstrare n vasul cu azot lichid.
Decongelarea spermei decurge n urmtoarele etape: 1) crioeprubetele cu granule se extrag
din azot i se deschid; 2) pn la evaporarea azotului din flacon granulele se transfer n alt
flacon de polisterol; 3) flacoanele se plaseaz n baia cu ap, la temperatura de 60
o
C. n acest
moment, flaconul permanent se agit pn la lichefierea granulelor, dup care imediat se extrage
din baie i sperm poate fi folosit pentru nsmnarea ginilor [233].
37
Eficiena deosebit a nsmnrii artificiale a psrilor a determinat necesitatea crerii
mediilor pentru pstrarea de scurt durat i ndelungat (prin congelare) a materialului seminal
[226, 378]. Posibilitatea dilurii i pstrrii spermei de coco simplific munca avicultorilor i
creeaz posibiliti de transportare a spermei cocoilor de prsil la diferite distane. Cele mai
rspndite procedee pentru pstrarea nendelungat a spermei, de la cteva ore pn la cteva zile
(n condiiile frigiderului) trebuie s includ diluani, care ar asigura meninerea indicilor vitali ai
celulelor reproductive. Aceti diluanii trebuie s dispun de proprieti pentru aprovizionarea
spermatozoizilor cu energie, meninerea pH-lui i osmocitii la nivelul spermei native [297,
389].
Experimental a fost studiat eficiena diferitor diluani pentru pstrarea spermei la
temperatura de 4
o
C. Componena mediilor este prezentat n tabelul 1.1 [378].
Tabelul 1.1. Componena diluanilor pentru pstrarea spermei de coco la 4
o
C timp de 24 ore
Diluantul Nr.
ctr.
Denumirea
componentelor, g Lake Lucaszewies Tellutin
1. Glutamat de sodiu 1,35 1,4 1,92
2. Citrat de potasiu XH
2
O 0,128 0,14
3. Acetat de potasiu 0,5
4. Acetat de sodiu 0,51
5. Acetat de magneziu X
4
H
2
O 0,08
6. Glucoz 0,8 0,7
7. Fructoz 0,2 0,8
8. Inozitol 0,7
9. Polivinilpirolidon 0,1 0,3
10. Protamin sulfat 0,02 0,32
11. Sodiu hidrogen fosfat anhidrat 0,98
12. Sodiu dihidrogen fosfat anhidrat 0,21
13. pH 7,2 7,3 7,05
14. Presiunea osmotic (mOsmol/kg) 310 390 320
15. Apa bidistilat 100 100 100
Componentele principale ale mediilor pentru pstrarea spermei de psri sunt glutamatele,
citratele i acetatele. Glutamatele, posibil, nu sunt foarte importante ca substrat oxidativ pentru
spermatozoizii de coco la temperaturile nalte (5
o
C) i pot fi toxice [223, 224]. Acetatele sunt
benefice pentru sperma de curcan [199]. Sperma cocoilor i curcanilor pe parcursul pstrrii n
condiii aerobe la 5
o
C timp de 48 ore pierd FL n rezultatul hidrolizei acestora [412].
38
Pstrarea spermei psrilor in vitro, n condiiile de hipotermie (0-5
o
C) reprezint un
obiectiv aparte, deoarece, anume aceast metod se folosete pe larg n domeniul seleciei i
creterii psrilor [224].
n contextul celor expuse, regimurile existente de congelare i decongelare ale spermei de
coco, relativ pot fi divizate n dou grupe: 1) conservarea lent dup anumite programe
concrete; 2) congelarea accelerat - nemijlocit n azotul lichid sau vaporii lui.
Astfel, reieind din faptul nestabilitii regimurilor existente de crioconservare a spermei de
coco i impedimentele tehnologice de utilizare a spermei n condiiile practice de cretere a
psrilor, este evident i rmne pe viitor actual perfecionarea regimurilor i metodelor de
congelare-decongelare a materialului seminal.
1.4. Factorii care influeneaz calitatea materialului seminal.
Fertilitatea reprezint un proces de prima necesitate i este cea mai important n creterea
psrilor. Numrul de ou fertile, produse pentru incubaie, elucideaz rentabilitatea final a
ginilor de prsil. Fertilitatea sczut n reproducia psrilor este considerat, n mare msur,
o problem a efectivului masculin. Exista mai multe cauze factoriale de fertilitate sczut, care
au un efect negativ asupra succesului de reproducere al cocoilor [284].
n ultimele decenii, cercetrile efectuate n domeniul optimizrii raiilor psrilor, paralel cu
complementarea anorganic a lor, s-a evideniat biodisponibilitatea i activitatea biologic
sporit a compuilor organici. Efectele lor benefice au fost nregistrate n biotehnologiile de
reproducie a psrilor agricole i, n special, asupra proceselor de derulare a spermatogenezei i
de ameliorare a proprietilor vitale ale spermatozoizilor. Unele dintre mineralele organice de
mare importan pentru nutriia psrilor de prsil sunt seleniul (Se) i zincul (Zn) [ 25, 27, 101,
119, 155, 386, 418].
n acelai timp, este cunoscut, c dezechilibrele dintre concentraia pro- i AO au impact
negativ asupra calitii spermei [72, 375]. Aceasta duce la creterea POL, scderea mobilitii i
viabilitii spermei i, n cele din urm, la infertilitate.
Antioxidanii biologici bine cunoscui sunt enzimelesuperoxid dismutaza (SOD) si
glutation-peroxidaza (GSH-Px), care au fost bine documentate n literatura de specialitate [204,
284]. n categoria AO chimici att a produselor naturale, ct i a celor sintetice, s-a atras o atenie
deosebit asupra utilizrii lor n procesul de reproducere i n gestionarea fertilitii [147]. S-a
accentuat, asupra faptului, c AO naturali (vitamina E, acidul ascorbic) i enzimele (SOD i
GSH-Px), creeaz n materialul seminal un sistem integral de protecie contra ROS i produselor
toxice ale metabolismului [91, 204, 284, 198, 223].
39
Conform relatrilor academicianului T.Furdui [122], echilibrul fiziologic optimal al
fenomenelor biologice ale sistemului reproductiv i intensitii degradrii funcionale i
morfologice a lui, precum i echilibrul dintre producia ROS i AO protectori sunt considerate,
ca factori ai calitii materialului seminal i, n special, ai capacitii de fertilizare [47, 286].
Paralel, este cunoscut, c matricea structural al spermatogenezei, care este condiionat de
integritatea organogenezei a sistemului reproductiv, se afl n corelaie, att cu factorii genetici,
ct i cu cei epigenetici [122]. Ultimii includ i influene ale mediului ca factori determinani ai
spermatogenezei (aciuni teratogenice, remediile farmaceutice, dereglri alimentare etc).
Organismul continuu este supus aciunilor schimbtoare ale mediului, ceea ce poate determina
sporirea frecvenei de formare a gameilor anormali [125].
Relaiile dintre ROS i statutul AO n sperma aviar, dintre morfologia i funcionalitatea
spermatozoizilor, precum i posibilitile de modelare ale lor prin diverse mijloace [21, 32],
inclusiv i cele nutriionale au o importan considerabil [386]. AO, n general, pot fi mprii
n dou grupe, i anume, enzimatici i nonenzimatici, iar rolul lor n materialul seminal aviar este
elucidat mai jos [31, 147].
Formarea spermatozoizilor implic o serie de modificri moleculare si morfologice n
celulele germinale masculine, care sunt reprezentate prin celule stem diploide, spermatogoniile,
al caror stoc este intreinut prin mitoze, n deosebi, n fazele iniiale ale spermatogenezei [20,
124]. Meninerea intensitii spermatogenezei, ca proces fiziologic, care cuprinde totalitatea
transformrilor prin care trec spermatogoniile, reprezint una dintre sarcinile prioritare ale
sanocreatologiei i se realizeaz prin formarea dirijat i reglementarea statusului fiziologic,
inclusiv i al cordului n condiiile variabile ale mediului [135].
Pentru depirea problemelor de fertilitate din cauza performanei slabe a efectivului
masculin, mai multe studii au artat, c anume influenarea proceselor de spermatogenez prin
intermediul factorilor eseniali, participani n spermoproducie, ar putea reglementa creterea
proprietilor biologice ale spermatozoizilor [122, 124, 125].
Eficiena activitii de reproducere a cocoilor se reduce semnificativ la deficiene de
micronutrieni (Se sau Zn), care apar prin medierea dezvoltrii testiculelor i prin scderea
calitii materialului seminal [26, 51, 161387].
O importan major n acest sens i revine Se. Unul dintre efectele biologice ale Se const
n faptul, c este componentul unei proteine, formate din patru subuniti identice, fiecare
subunitate incluznd un atom de Se, sub form de selenocistein. Aceast protein, care conine
Se, intr n compoziia enzimei GSH-Px, care este enzima principal de lupt contra excesului
producerii radicalilor liberi. Meritul acestei descoperiri i revine lui Rotruck [358].
40
Selenocisteina este un AA ce deriv din aminoacizi cisteina, n care Se a substituit sulful. De
asemenea Se este un element esenial, care are un rol important n reproducerea psrilor [159,
195, 386].
Neve J. [332], studiind funciile biologice ale Se, a constatat c agresiunile, care se produc
n timpul proceselor metabolice normale sau n timpul unui numr mare de circumstane
patologice (maladii degenerative, dereglarea spermatogenezei etc.), sunt legate de radicalii liberi
i de pericolele pe care, acetia le cauzeaz. Un deficit de Se, chiar nensemnat, afecteaz
activitatea GSH-Px i conduce la peroxidarea membranelor celulare i intracelulare [204, 387].
n rezultat, permeabilitatea celular este afectat, inclusiv i numeroase structuri ale
biomoleculelor, n timp ce, de exemplu ADN i ARN continu s funcioneze, ns din cauza
acestor anomalii, deja codul genetic al lor produce anumite devieri [232, 277, 317, 364, 391,
407]. Anumite deteriorri ale ADN, pot provoca dereglarea procesului de reproducere.
Deteriorarea ADN i a proteinelor de legare, de asemenea, poate perturba calitatea materialului
seminal. Spermatozoidul cu ADN disfuncionabil nu este n apt pentru a participa la fecundarea
ovulei. Prin urmare, rata de fertilizare scade concomitent cu deteriorarea ADN-lui [371].
La fel i, fragmentarea ADN-ului este o cauz deseori ntlnit n spermatozoizii infertili.
Coninutul ADN-ului fragmentat al spermatozoizilor coreleaz negativ cu calitatea spermei [377,
391]. Conform teoriei apoptozei, fragmentarea ADN este iniiat de activarea endonucleazelor
[272, 300, 337]. Totodat, conform acestei teorii, defectarea fenomenului menionat este
determinat de substituirea histonilor cu protamine n procesul spermatogenezei, ce provoac
condensarea cromatinei i ADN-lui [232, 277, 301, 317, 364, 408].
n calitate de micronutrient, Se are o deosebit importan n nutriia psrilor. Sub forma
organic, Se este legat chimic de un agent chelant, sau ligant, reprezentat de AA sau peptide. De
aici provine i denumirea de minerale sau oligoelemente proteinate [165, 235].
Seleniul organic, ca i majoritatea mineralelor organice, are o biodisponibilitate i activitate
biologic mult mai mare, comparativ cu cea a Se anorganic [26, 264]. Seleniul poate determina
modificri fiziologice n esuturi, inclusiv i n testicule, ceea ce are o influen direct asupra
calitii produselor, care vor fi destinate consumului uman [11] i calitii materialului seminal
[281]. Integrarea Se organic n lanul alimentar favorizeaz un transfer mai mare al Se ntr-o
form ce poate fi asimilat la maximum de ctre organism [165].
Seleniul interacioneaz cu un numr mare de minerale, potenial toxice. La niveluri
micronutriionale, Se este capabil de a preveni manifestrile toxice ale acestor substane,
probabil, prin formarea derivailor mai puin toxici sau inactivi. Ca rezultat, Se modeleaz
41
toxicitatea metalelor grele, avnd ca unul dintre efectele benefice asupra organismului,
diminuarea pericolelor gonadice [155, 157, 203, 418].
Funcia esenial pe care o are Se n organism, este cea de component al GSH-Px, enzima
plasmatic i cito-plasmatic, care interacioneaz radicalii liberi cu efecte negative asupra strii
de sntate a organismului i reduce excesul producerii lor [311, 336]. De asemenea, Se este
implicat i n reglarea mai multor sisteme enzimatice, care particip, inclusiv i n desfurarea
metabolismului energetic al spermatozoizilor [223].
O alt funcie important a Se n organism este condiionat de rolul antioxidativ al lui, care
poate fi explicat prin faptul c acesta este parte component a enzimei antioxidante GSH-Px
[204, 386]. Exist diferite tipuri de selenoproteine, care particip la reglementarea funciilor
fiziologice, inclusiv la protecia AO i stabilizatoare a membranei celulare a spermiului. Recent a
fost stabilit, c o parte a GSH-Px din form enzimatic convertibil, trece n parte structural a
spermei. Importana Se reiese din faptul, c Se adugat n sperm, sporete caracteristicile de
pstrare i mobilitate a spermei i micoreaz eliberarea totalului de lipide i FL din
spermatozoizi n plasma seminala n timpul pstrrii [195]. Aciunea AO este predeterminat i
de interaciunile existente ntre Se i a vitamina E, prin potenarea mecanismelor de protecie
contra peroxidrii FL membranice [204, 240, 386]. Seleniul, component al GSH-Px, acioneaz
printr-un mecanism secundar de aprare, ca urmare a incapacitii vitaminei E de a distruge total
peroxizii metabolismului [387]. n calitate de component intracelular al GSH-Px, Se acioneaz
mpreun cu vitamina E i considerabil reduce stresul celular [198, 374]. Concomitent, exist
legturi strnse ntre consumul Se i vitaminei E i calitatea produselor de pasre [11]. Ca urmare
a proprietilor sale, prezena suplimentar a Se n alimentaie are influene benefice asupra
ameliorrii funcionale a sistemului reproductiv i a altor sisteme vitale ale organismului [165,
235].
S-a constatat, c aportul suplimentar al Se organic n organism este vindecarea infertilitii
masculine i dublarea capacitilor imune ale celulelor implicate n rspunsul imun [25, 26].
Prezint importan declanarea mecanismelor metabolice, prin intermediul crora Se manifest
proprieti amelioratoare i biologice benefice [203, 282, 328].
n acelai timp, la deficitul de Se la cocoi, scade semnificativ numrul de celule Sertoli si
Leydig, care sunt necesare, respectiv, pentru spermatogenez i producia de testosteron [203].
Cercetrile anterioare au demonstrat, c deficitul de Se provoac scderea fertilitii i
afecteaz funcia de reproducere la cocoi [159]. Selenoproteinile contribuie la stabilizarea
spermatozoizilor i, prin urmare, la apariia deficienei de Se scade calitatea spermei. Surai i al.
42
[386] au raportat c GSH-Px este enzim dependent de Se, care reprezint un component
esenial al sistemului AO al spermei de pasre. Barber i al. [159] au demonstrat, c adugarea
Se n materialul seminal de broiler n doze foarte mari (7896 micrograme/l) este nociv i
diminueaz indicii calitii spermei.
Este cunoscut, c deficitul de Se negativ influeneaz mecanismele de aprare antioxidativ
a spermei de coco [386]. Edens i Sefton [203] au demonstrat c, atunci cnd cocoii au fost
hrnii prin suplimentare de Se cu 0,2 ppm la raia de baz, care coninea Se 0,28 ppm, procentul
de spermatozoizi normali a crescut, iar anomaliile spermiilor semnificativ au sczut.
Prezena Se organic n alimentaia omului cu amintite produse are influene benefice asupra
reducerii multor maladii, iar n raiile alimentare ale psrilor duce la sporirea semnificativ a
productivitii i ameliorarea funciilor de reproducie [157]. Concomitent, conform avantajelor
sanocreatologiei, n scopul prevenirii posibilelor aciuni nocive ale factorilor epigenetici asupra
spermatogenezei este necesar de asigurat o alimentaie integr i de exclus aciunea factorilor
stresogeni din activitatea vital masculin [121, 124].
n contextul interesului crescnd pentru efectele benefice ale alimentelor asupra sntii
umane, crerii i meninerii dirijate a statusului fizic, fiziologic, morfologic i psihic al omului
[136], rezultatele succesului nregistrat n urma consumului produselor bogate n Se au
predeterminat direct proporional beneficiile aduse sntii, decizia cumprtorului i
intensitatea de profil a productorului. O preocupare major n Europa, reprezint nivelul Se-ului
n snge la populaia uman. Consumul redus de Se din ultimii 20 de ani poate avea influene
asupra creterii incidenei infertilitii i apariiei altor devieri ale organismului. Prin
administrarea de Se organic n raiile pentru ginile outoare, necesitatea zilnic (20-100mcg),
recomandat pentru om, se poate asigura prin consumul de dou ou pe zi [282].
Suplimentarea hranei cu Se organic, nu numai mbuntete starea de sntate i
productivitatea psrilor, dar poate servi i, ca o surs natural de alimente, care au o importan
vital pentru procesele fiziologice ale organismului, respectiv i pentru producia de ou i carne
de pasre mbogit cu Se [281]. Este important, n practic, de a se evita prescrierea
administrrii unui singur element n doze mari, dar este binevenit administrarea
micronutrienilor ntr-o manier multielementar i ntr-un bun interechilibru [27, 115], care
asigur, n acelai timp, i o derulare optim a proceselor de digestie a nutrienilor n tractul
digestiv [140].
Un rol, nu mai puin important, n funcionarea sistemelor i organelor organismului l are
Zn. Ca element de baz, care se conine n peste 200 de enzime, acest element coordoneaz i
particip n reglarea unui numr multiplu de procese biologice i metabolice, care decurg n
43
organism. n particular, Zn este implicat n procesele metabolice i balana electrolitic, formarea
structural a scheletului, creterea i dezvoltarea organismului, tonusul muscular i activitatea
sistemului enzimatic, fortificarea sistemului imun, transferul energetic i metabolismul
carbohidrailor, balana acido-bazic i altele. n acelai timp, Zn particip n sinteza proteinelor
i meninerea compoziiei AA eseniali, asigurnd funcia de reproducere i a strii generale
echitabile a organismului [168].
Zincul are roluri importante n diverse activiti biologice, fiind urmate de o gam larg de
relatri tiinifice, inclusiv i de informaii disponibile, cu privire la funciile sale n
spermatogenez. Cercetrile actuale au relevat faptul, c Zn se acumuleaz n celulele germinale,
n special, n mitocondriile spermatogoniilor i spermatozoizilor [162, 383, 416].
Zincul prin proprietile sale biologice, mpiedic atrofierea prematur a timusului,
stimuleaz digestia, asimilarea i are un rol important n activitatea organelor reproductive i
metabolismului tractului digestiv [161, 251].
Zincul este bine cunoscut, ca un element esenial n activiti biologice ale organismului. n
sistemele biologice, Zn este prezent n form de proteine i ioni, joac un rol important n
medierea funciei i structurii proteinelor, precum i n meninerea echilibrului fiziologic [208].
Zn se acumuleaz n testicule la nivel identic cu concentraia lui din ficat i rinichi [209].
Din motivul lipsei constituirii unei rezerve constante de Zn, pentru asigurarea optimal a
acestui mineral, organismul se afl n dependen direct de asimilarea necesarului de Zn din
alimente. Concomitent i ali autori au demonstrat, c Zn se acumuleaz n testicule n
concentaii ridicate, care, la fel, sunt comparabile cu cele din ficat i rinichi [162]. Peste 300 de
enzime cu funcii vitale n organism depind de aportul Zn n funcionarea fiziologic a lor. Unele
dintre aceste metaloenzime, au ca component structural principal ionul de Zn [351]. Printre
acestea, ce au importan vital esenial n organism sunt anhidraza carbonic (AC), care
produce excreia CO
2
; fosfataza alcalin, care elibereaz fosfaii anorganici ai metabolismului
oaselor; SOD, care protejeaz celulele contra radicalelor liberi; alcool-dehidrogenaza (ADH),
care asigur detoxicarea ficatului de alcool; carboxipeptidaza, implicat n digestia proteinelor
alimentare i al. Mai mult, meioza celular fiziologic nu poate avea loc n lipsa unei cantiti
optime de Zn, necesar pentru sinteza ADN-ului, ARN-ului i a proteinelor. Zn este o
component structural de legtur a proteinelor ADN-lui i protejeaz membrana celular
contra lizrii ei [26].
n studiile contemporane, inhibarea spermatogenezei si anomaliilor spermei au fost
observate n patologiile, care induc deficit de Zn [209, 345]. Deficitul de Zn poate provoca
leziuni severe ale testiculelor, cum ar fi, atrofia la nivelul tubilor testiculari i inhibarea
44
spermatidelor [345]. n acelai timp, exist unele relatri, care denot, c prezena Zn poate
atenua deteriorarea testiculelor, provocat de ctre metalele grele, fluoruri i de ctre cldur
[177]. Aceste constatri sugereaz faptul, c testiculele ar putea adposti un sistem ncorporat de
Zn i, c Zn poate exercita un efect protector contra leziunilor testiculare, precum i joac un rol
esenial n meninerea funciilor reproductive. Cu toate acestea, nu exist nici o dovada de
aciune direct a Zn asupra spermatogenezei.
n comparaie cu spermatogeneza, eficiena Zn asupra mobilitii spermatozoizilor a fost
examinat la diferite vertebrate si nevertebrate [247]. La om, scade mobilitatea spermei, n
asociere cu creterea concentraiei Zn n plasma seminal [241]. Morisawa i Yoshida, de
asemenea, au relatat, c Zn n plasma seminal suprim mobilitatea spermei, iar nlturarea lui
amelioreaz mobilitatea [177]. Aceste rezultate sugereaz asupra faptului, c Zn extracelular
afecteaz mobilitatea spermatozoizilor. n plus, s-a raportat c Zn este prezent n mitocondrii i
flagelul spermatozoizilor [324, 383], dar nu exist date, cu privire la rolul Zn intracelular n
funciile vitale ale spermei.
Concomitent, sunt clarificate unele mecanisme de reglementare, care stau la baza evoluiei
spermatogenezei [321, 322]. Paralel cu investigaiile de distribuire a concentraiei de Zn, au fost
artate efectele inhibatoare ale plumbului, molibdenului, rubidiului i arseniului asupra
spermatogenezei [416].
Unele studii au relatat, concentraii mari de Zn n testicule la diferite nivele, iar un deficit de
Zn inhib spermatogeneza i produce anomalii ale spermei [315]. n prezent exist unele relatri,
care vizeaz, n detalii, funcia Zn n procesul spermatogenezei. Sorensen i cooautorii au
demonstrat, c Zn este prezent n spermatogoniile i spermatocitele primare [381]. S-a
demonstrat, de asemenea, c Zn se acumuleaz n testicule n timpul spermatogenezei precoce i
poate juca un rol-cheie n reglementarea proliferrii spermatogoniilor i n meioza celulelor
germinale [208, 322].
Experimental s-a stabilit acumularea Zn n mitocondrii, spermatogonii, spermatide i
spermatozoizi. Costello i al. [191] au artat, c Zn este importat n mitocondrii de prostat i
celulele hepatice, n forma unui complex de Zn-ligande. Exist numeroase dovezi ale prezenei
sistemului de transport pentru Zn [189]. Zn, la rndul su, ar putea avea un rol important n
funciile mitocondriale i celulele germinale [245]. n plus, Zn a fost depistat i n alte zone ale
citoplasmei. Zn se acumuleaz n citoplasm, ct i n spermatogonii, spermatocite [381]. Acest
lucru denot c Zn este un element esenial pentru meninerea celulelor germinale. Prin sondaj
fluorescent s-a constatat, c Zn se acumuleaz n mitocondriile celulelor germinale i acest lucru
poate spori protecia acestor celule de la apoptoza [244, 398]. Unele studii au demonstrat
45
corelaia dintre Zn i apoptoz i art c Zn ar putea funciona ca un AO n celule [398]. Studii
suplimentare vor fi necesare pentru stabilirea rolului Zn-ului n integritatea celulelor germinale.
Unele cercetri au demonstrat, c sub influena Zn-ului se intensific spermatogeneza, se
noiesc spermatogoniile, sporete meioza i concentraia celulelor germinale [321, 322, 334].
Rezultatele cercetrilor au artat, de asemenea, c Zn are un rol important n sinteza ADN-ului
prin proliferarea celulelor i meiozei. n plus, receptori hormonilor steroizi ai progesteronului,
androgenilor, estrogenilor si cei ai Zn reciproc interacioneaz n ansamblul structurilor lor, care
nemijlocit sunt implicate n procesul spermatogenezei [222]. Aceste constatri sugereaz, c n
timpul sintezei ADN-ului hormonii steroizi i celulele embrionare pot ncorpora Zn pentru a
activa o serie de enzime specifice i proteine. Prin urmare, analize de perspectiv vor fi necesare
pentru clarificarea rolului Zn, cu privire la ndeplinirea funciilor de receptori ai hormonilor
steroizi i de factori ai tranzaciilor n timpul spermatogenezei.
O importan deosebit n mobilitatea spermei i revine Zn intracelular, care preponderent se
acumuleaz n mitocondrii spermatici [381] i este important pentru mobilitatea spermei. ATP
sintetizat de ctre mitocondrii, cu participarea Zn este necesar pentru mobilitatea
spermatozoizilor [402]. Paralel, n mobilitatea spermatozoizilor particip i AC, care se menine
n membranele spermatice. AC catalizeaz hidratarea reversibil a carbonului i regleaz pH-ul
n lichidele celulare, care influeneaz mobilitatea spermatozoizilor. AC este o protein Zn-
obligatorie, iar activitatea sa este dependent de concentraia Zn-ului [321].
O atenie deosebit s-a atribuit AO dietetic, vitaminei E. A fost demonstrat, c 88% a
vitaminei E din sperma de coco se gsete n spermatozoizi. n funcie de diet, concentraia
vitaminei E n materialul seminal de coco variaz ntre 0,46 micrograme/ml (fr suplimentarea
raiei cu vitamina E) pn la 1,04 micrograme/ml (cu suplimentarea raiei cu vitamina E la
nivelul de 200 mg/kg) [386].
Vitamina C (acidul ascorbic) este un AO solubil n ap i, n mod natural, se sintetizeaz de
ctre organism. A fost recomandat n hrana psrilor ca supliment pentru a atenua stresul,
deoarece n timpul stresului cerinele organismului n vitamina C pot depi capacitatea de
sintez a ei [206, 231]. Stresul fiziologic, cum ar fi, cldura, bolile sau suprapopularea poate
spori necesitatea organismului n acid ascorbic. Vitamina C este implicat n metabilismul AA,
metabolismul mineral i particip n sinteza testosteronului [311], care este esenial n funciile
de reproducere a cocoilor. Nowaczewski i Kontecka [208] au documentat faptul, c acidul
ascorbic asigur potenialul antioxidativ al plasmei seminale n mrime de 65%.
Carnitina, reprezint un vitamino-aminoacid, sintetizat de metionin i lizin, care
acioneaz ca receptor intercelular pentru activarea acizilor grai [2]. Carnitina posed proprieti
46
AO, care protejeaz membrana spermatozoizilor mpotriva toxinelor ROS [145 331, 384, 363].
Concentraii mari de carnitin sunt prezente, att n plasma seminala, ct i n spermatozoizi, care
reduc POL prin transportul acizilor grai polinesaturai n mitocondrii pentru -oxidare i pentru
producerea energiei necesare mobilitii spermatozoizilor [331, 424]. Carnitina poate proteja ali
AO mpotriva potenialelor deteriorri peroxidative, de exemplu, funcioneaz concomitent cu
SOD n protecia membranei lipidice a spermatozoizilor i joac un rol esenial n reducerea
POL, protejnd celulele de deteriorri peroxidative [224, 384].
Suplimentarea raiei cocoilor cu L-carnitin a nregistrat mbuntiri ale indicilor
materialului seminal i ai parametrilor de fertilitate prin inhibarea POL din membranele
spermatozoizilor de coco [2, 145, 331, 363]. Includerea n raia dietetic a L-carnitinei n doz
de 250-500 mg/kg a stabilit o sporire semnificativ a numrului de spermatozoizi normali i
ameliorarea calitii spermei de coco [145, 331, 363].
Glutathion peroxidaza, este o enzim important, care joac un rol-cheie n detoxicarea
peroxidelor lipidice n sperma de coco [223, 386]. GSH-Px este un AO deosebit, datorit rolului
su de conversie a peroxidului de hidrogen n componente mai puin toxice [204, 284]. Aceast
enzim este considerat calitativ superioar catalazei, deoarece menine sczut aciunea celular
a H
2
O
2
[156]. GSH-Px i vitamina E sunt considerate componentele principale ale sistemului AO
i aceste dou componente acioneaz ca sinergiste n procesul de protecie a spermei de coco
mpotriva stresului oxidativ [204]. GSH-Px acioneaz n concordan cu alte enzime, de
exemplu, catalaz i poate modifica statusul unor componente structurale [284].
SOD este un component important al plasmei seminale i joac un rol esenial n echilibrul
dintre generarea ROS i degradarea puritii anionului de superoxid [204, 284]. SOD modific
anionul de superoxid n peroxid de hidrogen, care este, n cele din urm, transformat n ap,
enzimele catalazei i GSH-Px. Scderea concentraiei de SOD a coincis cu mobilitatea anormal
a spermatozoizilor [284].
Materialul seminal aviar ntrunete dou varieti de SOD, forma mitocondrial (Mn-SOD)
i forma citoplasmatic (Cu,Zn-SOD). Exist particulariti de specie n activitatea i distribuia
SOD n material seminal al psrilor. De exemplu, Mn-SOD este principala varietate a acestei
enzime n spermatozoizi aviari, variind de la 57% (la coco) pn la 69% (la alte specii) din
totalul SOD [386]. Mn-SOD, prioritar, este prezent n spermatozoizi, n timp ce Cu,Zn-SOD se
afl n plasma seminala [386].
SOD este sintetizat i reglementat endogen i funcioneaz n cooperare cu alte enzime,
cum ar fi GHS-Px [284]. O cantitate semnificativ de SOD este secretat de epididium.
47
Aceast enzim purific anionul de superoxid extra- i intracelular, precum i inhib
peroxizii lipidelor din membranele spermatice [204, 284]. De asemenea, acioneaz mpotriva
peroxidului de hidrogen prin conjugarea sa cu catalaza sau GSH-Px [259, 284]. SOD
prentmpin hiperactivaia i capacitaia prematur, cauzate de radicalii de superoxid, nainte de
ejaculare. Pe baza studiilor in vitro, Froman [223] a constatat o cantitate minor de SOD n
modelele probelor de material seminal de curcan, examinarea crora, paralel, a stabilit o
sensibilitate mai nalt la stresul oxidativ, comparativ cu sperma de coco.
Unul dintre componenii minerali ai raiei este calciul. Reglarea aciunii celulelor, ca
rspuns la influena factorilor intra- sau extracelulari se realizeaz la diferite niveluri sub
controlul proprietilor genelor. Reglarea accelerat a activitii se realizeaz prin modificarea
funciei proteinelor, care poate avea loc sub influena hormonilor sau factorilor de cretere. Unul
dintre aceste mecanisme este modificarea concentraiei calciului (Ca
+2
) intracelular [362]. n
particular n nucleu [201, 227], n aparatul Goldji [164, 320], n liposome [185, 266] i alte
organe [190]. Mitocondriile pot acumula Ca
+2
n spaiul matricei lor, datorit existenei sarcinii
negative a membranei mitocondriale.
n condiiile cnd coninutul ionilor de Ca
+2
este sczut, are loc activitatea dehidrogenazelor
tricarbonice ale ciclului Krebs [237]. Acumularea Ca
+2
mitocondrial, n cantitate excesiv, poate
provoca activarea permeabilitii porilor, care iniiaz necrotizarea celulelor [187, 197]. n
condiii fiziologice, mitocondriile ndeplinesc un rol important n meninerea nivelului ionilor de
Ca
+2
n celul [167, 355]. Concomitent, este stabilit existena organelelor spermatice, unde se
depoziteaz ionii de Ca
+2
[362]. Calciul este un element, care particip activ n procesul de
fecundare. Procesele fiziologice, care decurg n zona pelucid i aciunea nucleotidelor ciclice
sunt determinate de starea canalelor Ca
+2
-conductibile [194].
n momentul fecundrii naturale, rolul principal al spermatozoizilor const n transportarea
materialului genetic i contopirea lor cu ovula. Ionii de Ca
+2
ndeplinete un rol important n
capacitaie, hemotaxis i ptrunderea spermatozoidului n ovul. Spermatozoizii sunt api pentru
fecundarea ovulei numai dup sfrirea procesului de capacitaie. Procesul de maturizare al
spermatozoidului se ncheie n tractul reproductiv al femelei. Capacitaia este nsoit de
modificri celulare, inclusiv hiperpolarizarea membranei, modificarea lipidelor membranare,
sporirea pH-ului intracelular, creterea coninutului tirozinei i a nivelului de fosforilare,
majorarea concentraiei Ca
+2
i AMP-c [194].
48
Ovula este nconjurat de zona pelucid, unde se localizeaz glicoproteinele, care sporesc
concentraia ionilor de Ca
+2
n sperm, iniiaz modificri ale mobilitii spermatozoizilor i
contribuie la reacia acrozomal [194].
Att n celulele somatice, ct i n spermatozoizi esuturile depozitelor de Ca
+2
regleaz
ptrunderea sau eliminarea lui n spaiu intra- sau extracelular [163, 347]. La dereglarea
permeabilitii canalelor Ca
+2
-conductoare are loc pierderea proprietilor de fertilizare ale
materialului seminal [194].
O influen semnificativ asupra calitii materialului seminal are i anotimpul. Astfel, n
decembrie, la longevitatea vizibil a zilei de 8 ore i temperatura de pn la 4
o
C, volumul
ejaculatului, concentraia spermatozoizilor i mobilitatea lor constituie, corespunztor, numai
0,05 ml; 2010
6
sp/ml i 5,0 baluri. Valori maximale ale indiciilor studiai s-au nregistrat n
februarie, concentraia spermatozoizilor a fost de 250010
6
sp/ml i mobilitatea 8,0 baluri.
Volumul ejaculatului nregistreaz valori maxime (>0,3 ml) n luna iunie i constituie 0,3 ml.
Valorile indicilor studiai sunt interdependente de rasele de cocoi, ceea ce se va avea n vedere
la crearea bancurilor genetice i realizarea tehnologiilor reproductive [174, 359].
1.5. Evoluia i perspectiva cercetrilor n domeniul conservrii, pstrrii i utilizrii
spermei de coco.
Cercetrile n domeniul crioconservrii spermei de coco au nceput de la comunicarea lui
Polge [343], despre obinerea descendenilor dup nsmnarea ginilor cu sperma decongelat.
Acest fapt a fost confirmat de numeroi savani [274]. Rezultatele limitate n domeniul
crioconservrii i tehnologiile complicate au diminuat valoarea aplicativ a acestor cercetri
fundamentale. ntre timp, s-a dovedit c diferite rase i linii de gini dispar cu viteze
ngrozitoare, din cauza lipsei surselor financiare pentru meninerea infrastructurii de existen a
lor. Concomitent, a sporit nivelul bolilor (invaziilor) virotice. Aceast situaie a contribuit la
organizarea Simpozionului extraordinar [374] i adoptarea Programului strategic de aciuni
pentru pstrarea surselor genetice de psri. n aa fel, a fost contientizat importana dezvoltrii
programelor de conservare a spermei de coco i, n particular, crearea bncurilor de sperm n
SUA [169], Frana [173], Niderlanda [413], Federaia Rus [90] i Ucraina [81].
Metodele contemporane de crioconservare a spermei animalelor agricole i a psrilor, n
linii generale, asigur satisfctor obinerea descendenilor, dar totui, nu asigur pe deplin
folosirea efectiv a materialului genetic al reproductorilor preioi n practica de selecie i
prsil, deoarece dup congelarea-decongelarea spermei tuturor speciilor, practic, se reuete de
a obine nu mai mult de 50% de celule funcional active [47, 81, 92, 410, 412].
49
Pn n prezent, cu toate, c exist rezultate convingtoare [174, 297], folosirea spermei
crioconservate de coco este limitat din cauza mobilitii i vivacitii sczute a materialului
seminal [256, 297]. Conform literaturii de specialitate, sperma de coco are volum mic i
concentraie mare de spermatozoizi, n legtur cu ce, este necesar diluarea ei. Pentru
crioconservarea reuit a spermei se realizeaz multilateral selectarea mediilor de diluare,
selectarea crioprotectorilor i folosirea tehnologiilor eficiente pentru congelarea-decongelarea
spermei, care determin reducerea deteriorrii membranelor [200, 297, 378]. Prin utilizarea
mediilor cu dimetilsulfoxod [297] a fost congelat sperma diferitor rase de coco. S-a
demonstrat, c sperma de coco congelat n paiete este criolabil i poate fi pstrat nu mai mult
de 60 min [239, 297]. Totodat, s-a observat dependena calitii spermei decongelate de rasa
cocoilor [297, 389], n schimb ali autori nu stabilesc aceast dependen [297].
Actualmente, metodele criobiologice includ unele pri negative, care micoreaz
posibilitile reale de soluionare a problemelor de crioconservare a spermei de coco. n
particular, se face imposibil pstrarea la 100% a viabilitii celulelor n procesul de
crioconservare, care este urmat de perderea unei pri a genofondului i prezena efectelor
nocive. Paralel cu investigaiile efectelor existente nedorite sunt necesare cercetri suplimentare
n studierea influenei crioconservrii asupra coninutului ADN-ului [59].
O atenie deosebit se acord noilor modaliti de perspectiv n elaborarea mediilor pentru
sperma de coco. n anumite perioade ale anilor precedeni, a fost observat i constatat
fenomenul de supravieuire a spermatozoizilor n cile sexuale ale femelelor, aa numita
conservarea fiziologic, durata creia variaz n limitele de la 48 ore la om pn la 15 ani la
furnici [52, 86, 92]. Pentru gini aceast perioad dureaz circa 25 zile. La psrile domestice
locul pentru supravieuirea spermatozoizilor sunt glandele uretro-vaginale, care pot fi numite i
spermodepozitare. n ultimele, spermatozoizii se afl n stare de inhibiie i intensitatea
proceselor metabolice a lor, este semnificativ redus. Reieind din cele menionate, este firesc i
rezonabil de a presupune, c mediile optimale pentru pstrarea spermei de coco n condiiile
hipotermice sau crioconservrii, pot servi mediile, apropiate dup componen i proprieti, de
secretul spermodepozitar, adic de condiiile mediului glandelor tubulare din oviductul
ginilor. n acest caz, este necesar de a include n componena mediilor menionate a
activatorilor metabolismului, care ar favoriza procesul de crioconservare, ns nu este clar
perioada de includere a lor n etapele tehnologice ale proceselor de diluare, congelare,
decongelare, nsmnare [83].
50
Accelerarea reproducerii animalelor agricole, sporirea reprezentabilitii animalelor este
posibil i prin elaborarea i implementarea tehnologiilor de transplantare a embrionilor [113].
Problema crioconservrii embrionilor atrage atenia mai multor cercettori [144, 152, 160,
166, 184, 202, 242, 285, 304, 356, 357, 388, 395]. Crioconservarea embrionilor de psri rmne
de perspectiv, deoarece embrionii lor au un volum, comparativ, mare, conin o cantitate mare de
glbenu i, cel puin 3 straturi de membrane. Cu ct este mai mic volumul, cu att este mai mare
probabilitatea vitrificrii [419]. Micorarea volumului este posibil prin utilizarea plasei de la
microscopia electronic, picturilor mici, criotopului, minipaietelor, suprafeei dure, plasei de
neilon, diferitor fibre etc. [153, 271, 275, 327, 340, 344, 417, 419, 420].
n acelai timp, vitrificarea poate fi realizat i cu o vitez de rcire, destul de mic i o
concentraie redus de crioprotectori [367]. La congelarea lent are loc cristalizarea apei
extracelulare n rezultatul gradientului osmotic, care extrage apa din celul, ce provoac
vitrificarea intracelular. Condiiile congelrii i decongelrii determin procesele, care au loc la
congelarea lent, iar condiiile de rcire i nclzire, determin procedeele, care au loc la
vitrificare. Ambele procese decurg sub egida crioconservrii. Spre deosebire de metoda de
congelare, cnd are loc dirijarea vitezei de rcire i folosirea utilajului complicat, metoda de
vitrificare poate fi realizat cu mai puine surse financiare, este mai simpl i mai avantajoas la
crioconservarea spermei i embrionilor de psre [367]. Materialul biologic crioconservat prin
vitrificare nu pierde proprietile funcionale, chiar i dup 20 de ani de pstrare.
Actualmente sunt acumulate multe date n favoarea ideei, c inhibarea exogen sau
endogen a metabolismului celulelar n condiiile de stres poate avea un rol protector [87, 121].
Realizarea acestei relatri considerabile i, evident, benefice nu se reuete din cauza lipsei
cunotinelor suficiente despre procesele metabolice n ciclul vitalitii spermatozoizilor.
Intensitatea reaciilor hetero- i endotermice este determinat de factorii ecologici, care
conin sistemele antioxidative i asigur derularea proceselor de adaptare la temperaturile joase.
Aceste temperaturi provoac producerea energiei i, ca consecin, modific concentraia
formelor active ale oxigenului. n rezultat se poate iniia stresul oxidativ cu dereglarea
homeostaziei celulare i a sistemului antioxidativ. Sistemele AO, reacionnd la stresul termic
acut, provoac epuizarea echivalentelor de oxido-reducere. La rndul su, aciunea temperaturilor
sczute determin adaptarea sistemului antioxidativ i a coninutului aminoacidic, reglarea crora
nu este complet elucidat prin mecanisme stabilite i rmne a fi o problem pentru cercetrile
viitorului [12, 183, 299, 312, 314, 326].
51
Pstrarea izotonic (volumul permanent) este alternativa metodelor tradiionale de
crioconservare, reprezentnd o metod, care reduce concentraia crioprotectorilor i este simpl
n realizare. S-a demonstrat, c pstrarea izohor influeneaz formarea cristalelor de ap i are o
perspectiv deosebit [258]. De perspectiv sunt i cercetrile referitoare la folosirea liposomilor
[48, 278, 279] i a lipoproteidelor antifrize la conservarea spermei de coco [239].
Pentru rezolvarea problemei de pstrare a resurselor genetice ale cocoilor, este oportun
cercetarea concomitent n urmtoarele direcii: 1) cercetrii fundamentale asupra depistrii
mecanismelor de criodeteriorare i aplicrii metodelor de crioprotecie a celulelor; 2) elaborarea
noilor metode de sporire a numrului celulelor cu supravieuire sporit i cu genomul
nedeteriorat; 3) elaborarea noilor metode de conservare a celulelor, care minimalizeaz factorul
economic pentru ntreinerea criobncilor [59].
1.6. Concluzii la capitolul 1.
Ameliorarea fertilitii masculine a fost n centrul cercetrilor majore din domeniul
conservrii spermei de coco din ultimele decenii. O mai bun nelegere a mecanismelor de
derulare a spermatogenezei a predeterminat studierea diverilor factori, ca produi de remediere
a fertilitii sczute. Datele actuale demonstreaz proprieti foarte benefice ale factorilor
epigenetici, ns concluzii definitive din studiile existente nu pot fi fcute numai n derularea
spermatogenezei, deoarece nu este singura cauz a infertilitii cocoilor. Dozele i durata de
aplicare a factorilor sunt critice i specifice, mai cu seam, c cercettorii nu au stabilit nivele
necesare ale aciunilor factoriale concrete, n scopuri fiziologice normale ale spermatogenezei.
Unele studii au artat, de asemenea, lipsa de eficien a folosirii factorilor eseniali asupra
parametrilor spermei. Pe de alt parte, doze de niveluri ridicate au demonstrat, fie nici un efect
asupra calitii materialului seminal sau efecte negative. Indiferent de cele menionate, exist
dovezi ample n avantajele utilizrii factorilor sus menionai pentru a mbunti calitatea
materialului seminal, care a putut fi afectat la expunerea carenelor sau a nivelurilor ridicate a
lor n procesul de meninere, reglare, protecie, stimulare la diverse etape evolutive ale
spermatogenezei la coco. Drept soluie ar servi stabilirea optim a tipurilor, dozelor i duratelor
de aciune a factorilor, care ar putea fi utilizate n derularea parametrilor studiai pentru a spori
proprietile biologice ale materialului seminal. n plus, numeroase cercetri multicentrice i un
numr mai mare de probe studiate pe eptele vaste de cocoi sunt unele necesiti prioritare
pentru a obine o imagine ampl n avantajele de perspectiv ale acestei probleme eseniale.
n acelai timp, urmare a analizei i generalizrii informaiei bibliografice prezentate n
acest capitol, succint, putem meniona, c actualmente sunt obinute succese considerabile n
52
domeniul crioconservrii spermei de coco i succese deosebit de avansate n tehnologia
nsmnrii artificiale a ginilor.
Eventualele relatri ale literaturii de specialitate de profil ofer posibilitatea de a
considera, c crioconservarea spermei de coco a devenit real datorit cercetrilor fundamentale
ale particularitilor specifice ale fiziologiei i criobiologiei spermei animalelor domestice.
Rezultatele diversitii cercetrilor morfologice, biochimice, fizico-chimice i funcionale ale
spermatozoizilor n procesul crioconservrii spermei de coco au permis cercettorilor de a
stabili (determina) metode difereniale pentru elaborarea mediilor protectoare i procedeelor
tehnologice de prelucrare ale spermei. n acelai timp, procedeele propuse n prezent pentru
crioconservarea spermei de coco sunt departe de eventualitate i nu fac posibil, n msura
ampl, folosirea potenialul genetic al psrilor. Aceasta se confirm prin faptul, c valorile
rezultatelor nsmnrii artificiale a ginilor cu sperma congelat-decongelat variaz n limite
mari, iar tehnologiile recomandate pentru congelarea i decongelarea spermei de coco sunt
destul de dificile i complicate n realizare.
Datele susmenionate, concomitent cu succesele obinute la elaborarea proceselor de
crioconservare a spermei de coco, relev i necesitatea continurii cercetrilor tiinifice
fundamentale n acest domeniu. Valoarea problemelor actuale de sporire a indicilor vitali ai
spermatozoizilor dup decongelare a determinat realizarea cercetrilor prezente, direcionate spre
aprofundarea studierii teoriei i practicii conservrii spermei de coco prin prisma
sanocreatologiei avansate.
n aceeai msur, o deosebit importan provoac cercetrile direcionate spre
perfecionarea i elaborarea metodelor performante de pstrare a spermei de coco n condiii
hipotermale.
Astfel, sporirea continu a eficacitii reproduciei animalelor domestice, n mare msur,
este condiionat de elaborarea mediilor sintetice nalt eficiente, procedeelor optimale de
prelucrare tehnologic i utilizare a spermei n combinare cu folosirea reproductorilor - donori
ai materialului seminal integru i cu rezistena nalt la influena factorilor biotehnologici de
conservare a celulelor reproductive ale cocoilor.

53
2. CARACTERISTICA MATERIALULUI EXPERIMENTAL I A METODELOR DE
INVESTIGAIE
2.1. Aspecte metodice generale.
Cercetrile experimentale au fost realizate n Laboratorul Sanocreatologia sistemului
reproductiv i Criobiologie V. Nauc al Institutului de Fiziologie i Sanocreatologie al AM;
Centrul de Automatizare i Metrologie al AM; Laboratorul Metabolismului lipidelor al
Institutului de Biochimie al Academiei de tiine a Uzbechistanului; Laboratorul Biologia
Reproducerii psrilor i ntreprinderea experimental ale Institutului de Avicultur al
Academiei Naionale Agrare a Ucrainei; Vivariul Institutului de Fiziologie i Sanocreatologie;
Asociaia de cercetri i producie Avicola, ntreprinderea avicol Orhidea Nani i Vivariul
Facultii de Zootehnie i Biotehnologii a UASM.
n calitate de material experimental a fost folosit sperma cocoilor de diverse rase, inclusiv
i rase comune. Prelevarea spermei a constat n provocarea artificial a ejaculrii, fr a avea loc
actul sexual ntre mascul i femel. Sperma de coco a fost recoltat prin folosirea spermo-
rezervorului din sticl n corespundere cu cerinele Instruciunii pentru nsmnare artificial a
psrilor, fr s prejudicieze sntatea masculilor. Ejaculatele recoltate au fost apreciate prin
folosirea metodelor general acceptate pentru determinarea volumului, concentraiei, mobilitii
i supravieuirii spermatozoizilor.
Pentru reproducere artificial au fost folosite ginile raselor din colecia de prsil sau care
reprezentau obiectul de producie al unitilor menionate mai sus.
Cercetrile au fost efectuate n majoritatea cazurilor cu respectarea identitii condiiilor
pentru toate psrile i condiii analogice pentru toate variantele martor i experimentale. Sperma
a fost diluat cu diferite medii sintetice n corespundere cu regulile general acceptate, la diferite
temperaturi i tehnologii de conservare n dependen de scopul prioritar al anumitor cercetri.
nsmnarea artificial a ginilor cu sperma decongelat s-a petrecut o dat la trei zile (4, 5,
6 i 7 zile). Prima i a doua nsmnare a fost realizat cu intervalul de 24 ore. Colectarea oulor
ncepea peste 24 ore dup nsmnarea a doua. Rezultatul nsmnrii ginilor a fost determinat
de totalizarea incubrii oulor.
2.2. Metodele de cercetare a membranelor plasmatice.
Obinerea membranelor plasmatice ale spermatozoizilor a fost realizat conform etapelor
schemei 2.1.
Aceast schem include etapele: a) divizarea; b) separarea i c) aprecierea gradului de
purificare a membranelor.
2.2.1. Divizarea membranelor.
54
Pentru separarea membranelor plasmatice ale gameilor a fost folosit metoda propus de
savanii bulgari N. Ivanov i Y. Profirov [253] n modificarea autorilor V. Nauc, Gh. Boronciuc
[93]. Principiul metodei este predeterminat de proprietile mediului hipotonic, care n calitate de
dizolvant organic conine EDTA n concentraie de 2 mMol/l. n rezultatul aciunii i diferenei
de presiune osmotic a mediului i spermatozoizilor are loc diluarea celulelor i desprinderea
membranelor plasmatice ale lor.



















Fig. 2.1. Schema de extracie a membranelor plasmatice ale spermatozoizilor.
2.2.2. Separarea membranelor.
Pentru separarea membranelor spermatozoizilor a fost folosit sistemul polimer bifazic pe
baza dextranului cu masa molecular 500000 D i polietilenglicolului-6000 D; producia firmei
Fluka, A.G.Busch (Elveia). Componentele sistemului polimeric au fost dizolvate n 0,1Mol/l de
tampon fosfatic cu pH 6,5. Suspensia membranelor i spermatozoizilor a fost transferat n plnia
gradat, unde n decurs de 12 ore s-a produs separarea membranelor la limitele devierii fazelor
lichide. Toate operaiunile au fost realizate la temperatura 4
o
C.
Agitarea precipitatului de spermatozoizi n soluiile
Centrifugarea suspensiei de spermatozoizi
Precipitat Supernatant
nlturare Centrifugare
Precipitat Supernatant
Depunere
Separarea membranelor
Resuspendarea membranelor
Determinarea gradului de purificare a
memranelor
Folosirea membranelor n diferite
scopuri
Resuspendare n sistem nlturare
55
Spre deosebire de metoda propus iniial [253], membranele au fost separate cu ajutorul
coloanei probelor cu construirea i realizarea curbei de calibrare. Soluia de albumin s-a
preparat prin utilizarea tris-HCl (sau EDTA la determinarea coninutului proteinelor). Astfel de
modificare a metodei permite centrifugarea soluiilor n eprubetele plastice. Procedura utilizat
exclude necesitatea n vesel de sticl, sporete sigurana metodei i diminueaz pierderile
coninutului de membrane. Corecia intensitii colorrii probelor cu evidena aciunii asupra ei a
componenilor mediului de omogenizare i resuspendare, face posibil sporirea exactitii
indicilor determinai.
2.2.3. Aprecierea gradului de purificare a membranelor.
Gradul de purificare a membranelor plasmatice separate a fost determinat prin cercetarea
activitii Mg
+2
(Na
+
+K
+
)+ATP-azei (EC 3.6.1.3), 5
1
-nucleotidazei (EC 3.1.3.5) i a fosfatazei
alcaline (EC 3.1.1.1.) dup N.Ivanov, Y.Profirov [253]. Conform acestei metode a fost
determinat i activitatea Mg
+2
(Na
+
+K
+
)ATP-azei i 5
1
-nuclotidazei. Mediu de incubaie la
determinarea activitii Mg
+2
(Na
+
+K
+
)ATP-azei a inclus ntr-un ml: 50 mMol tris-HCl, 5 mM
MgCl
2
, 100 mMol NaCl, 20 mMol KCl i 5 mMol sare de natriu al ATP cu pH 7,4. Pentru 5
1
-
nucreotidaz - 50 mMol tris-HCl, 10 mMol MgCl
2
i 5 mMol sare de natriu al AMP cu pH 7,4.
Activitatea fosfatazei a fost studiat conform metodei lui Bodanschii, descris de A.Pocrovschii
[100]. n perioada incubrii s-a folosit mediul alcalin, care coninea -glicerofostat.
Determinarea fosforului organic a fost realizat dup Chen et al. [188] prin metoda
spectrofotometric la lungimea de und - 820 nm. Conform comunicrii autorilor i bazndu-ne
pe rezultatele cercetrilor noastre metoda folosit permite de a atinge un grad de purificare a
membranelor n jur de 70%.
2.3. Metode de cercetare a proteinelor.
2.3.1. Determinarea coninutului general de proteine n membranele plasmatice.
Determinarea cantitativ a proteinelor n membranele plasmatice separate s-a efectuat prin
folosirea metodei Lowry i al. [292]. La baza acestei metode se afl capacitatea complexului
proteinelor cu cupru de a reduce soluia Folin, cu formarea ulterioar a produselor colorate ale
reaciei.
Coninutul proteinelor a fost determinat prin metoda spectrofotometric cu folosirea
spectrofotometrului SF-26 i SF-46 la lungimea de und - 750 nm cu recalcularea ulterioar a
rezultatelor obinute conform curbei de calibrare determinat anterior.
Cantitatea proteinelor membranelor plasmatice, n micrograme la 1 ml de sperm a fost
calculat conform formulei:
56
X=AxBx5, (2.1)
unde: X - cantitatea proteinelor n 1 ml de sperm;
A - valoarea densitii optice conform diapazonului msurrilor la SF-26 i SF-46 n
varianta experimental;
B - datele obinute conform curbei de calibrare;
5 - coeficientul recalculrii coninutului proteinelor din membranele plasmatice n
micrograme la 1 ml de sperm.
2.3.2. Determinarea coninutului aminoacizilor liberi i legai.
Determinarea coninutului AA membranelor plasmatice ale spermatozoizilor animalelor
agricole a fost realizat n Centru de Automatizare i Metrologie al AM cu folosirea
aminoanalizatorului AAA-339. Aparatul a fost reglat conform parametrilor: nlimea coloanei
de extincie 35 cm, temperatura de start a analizei (T
1
) 45-52
o
C, temperatura de finisare a
analizei (T
2
) 65
o
C. n calitate de material al trasabilitii ionice a fost folosit smoala de marca
stion AGWB. Probele au fost transferate n coloana pentru schimbarea ionilor i au fost
supuse extraciei prin tampoane cu urmtoarea succesiune:
I tampon - 0,3n Na
+
, pH=3,50;
II tampon - 0,4n Na
+
, pH=4,25;
III tampon - 0,45n Na
+
, pH=9,45.
Hidroliza acetic a proteinelor a fost realizat cu utilizarea HCl 6n, la temperatura 1102,0
o
C, timp de 24 ore. Hidrolizatul vaporizat s-a splat prin tamponul de sodiu cu pH 2,0. n
aceleai condiii, la determinarea AA liberi s-a folosit tamponul de litiu.
Identificarea picurilor cromatogramei a fost efectuat prin compararea lor cu cele analogice
ale standardelor AA corespunztori.
Ejaculatele recente ale spermei recoltate au fost divizate n dou pri. Una dintre ele a fost
centifugat la 10000 rot/min timp de 10 min. Plasma seminal separat a fost folosit pentru
determinarea coninutului AA liberi i legai.
n scopul determinrii coninutului AA legai n spermatozoizi, dup centrifugarea spermei
precipitatul s-a supus resuspendrii de 2 ori n soluie fiziologic cu precipitarea ulterioar a lui.
Ulterior precipetatele au fost supuse deshidratrii n decurs de 4 ore la temperatura 105
o
C, n
decurs de 24 ore i expuse n exicator, dup ce s-au hidrolizat i s-au aplicat procedurile necesare
pentru analiza cromatografic a proteinelor prin intermediul analizatorului sus-menionat.
A doua jumtate a spermei se supune congelrii n vaporii azotului lichid fr diluare cu
medii crioprotectoare. n continuare sperma se supune investigaiilor ca i volumul primei
jumti a spermei.
57
2.3.3. Metodele de determinare a coninutului fraciilor proteice n plasma seminal.
Principiul metodei se bazeaz pe proprietile soluiilor fosfatice de diferit concentraie de
a sedimenta proteinele. Valoarea densitii optice a soluiilor diferitor fracii de proteine a fost
determinat prin folosirea metodelor spectrofotometrice. n acest scop s-a utilizat
spectrofotometrul SF-26 i SF-46. Intensitatea culoraiilor soluiilor s-a determinat la lungimea
de und de 720 nm.
Pentru aceasta a fost pregtit soluia de baza care conine 226,8 g KHrPO
4
, 33,5 de NaOH
n 500 ml de soluie preparat cu ap bidistilat. Soluia 1. Conine 92,6 de soluie de baz
dizolvat cu ap distilat pn la 100 ml. Soluia 2. Se prepar prin adugarea la 75 ml de soluie
de baz a apei pn la 100 ml. Soluia 3. La 58,8 ml de soluie de baz se adaug ap pn la 100
ml. Soluia 4. Conine 48,7 ml soluie de baz dizolvat n ap distilat pn la 100 ml.
Pentru determinarea coninutului fraciilor de proteine se utilizeaz 6 eprubete cu volumul
de 10-15 ml, care se numeroteaz respectiv 0, 1, 2, 3, 4, 5. n eprubeta 0 se toarn 10 ml de ap
distilat. n eprubeta 2, 3 i 4 se introduce cte 5 ml de soluie dizolvant (soluiile 1-4). n
eprubeta 5 se toarn 0,5 ml de plasm seminal, 0,75 ml ap distilat i 3,75 ml soluie de
baz. Coninutul eprubetei 5 se omogenizeaz bine, iar plasma din coninutul acestei eprubete
se toarn cte 0,5 ml n eprubetele 1, 2, 3 i 4. n eprubeta 0 se adaug 1,0 ml de
plasm. Coninutul fiecrei eprubete se agit, evutnd formarea bulelor de aer.
Peste 15 min se determin densitatea optic a soluiilor din eprubeta 1, 2, 3 i 4 cu
folosirea spectrofotometrului SF-26 i SF-46 la lungimea de und 720 nm. n calitate de martor
servete soluia din eprubeta 0. Dup determinarea densitii optice a coninutului eprubetelor
1, 2, 3 i 4, se efectueaz calculele respective. Din indicele densitii optice a soluiei
eprubetei 1 se scade acelai indice a eprubetei 2. Diferena demonstreaz densitatea optic a
albuminelor. Apoi din densitatea optic a albuminelor eprubetei 2 se scade acelai indice al
eprubetei 3. Diferena constituie densitatea optic a -globulinelor. Analogic din densitatea
optic a eprubetei 3 se scade densitatea optic a eprubetei 4. Diferena corespunde densitii
optice a -globulinelor, iar densitatea optic a coninutului eprubetei 4 este egal coninutului
-globulinelor. Apoi toi indicii diferenei densitii optice a eprubetelor 1, 2, 3 i 4 se
adun i suma obinut se egaleaz cu 100. Dup aceea se calculeaz coninutul fraciilor
proteice n procente. Coninutul fraciilor separate se calculeaz n gram-procente.
2.4. Metode de cercetare a lipidelor.
2.4.1. Metoda de determinare a lipidelor generale ale membranelor plasmatice.
Extracia lipidelor generale s-a realizat conform metodei lui Bligh, Dijer [175].
58
Principiul metodei const n distrugerea legturilor lipo-proteice cu folosirea dizolvantului
polar (metanolul), care contribuie la extragerea ulterioar a lipidelor cu folosirea dizolvantului
nepolar (cloroformul). n acest caz dizolvanii polari i nepolari se combin ntr-un amestec
cloroform-metanol-ap bidistilat n coraport 1:2:0,8. Dup finisarea extragerii dizolvantul a fost
evaporat la evaporatorul rotator.
Coninutul lipidelor generale n extract a fost studiat conform metodei Bragdon descris de
V.Scorohod i M.Stefanic [111]. Principiul metodei const n aptitudinea bicromatului de potasiu
(K
2
Cl
2
O
7
) de a se reduce la interaciunea cu lipidele. n rezultatul reaciei culoarea soluiei se
modific, ceea ce face posibil realizarea colorimetriei acidului cromatic redus. Indicii densitii
optice au fost determinai la spectrofotometru SF-26 i SF-46 la lungimea de und 590 nm,
concomitent cu soluia standard a lipidelor (1 mg de lipide la 1 ml de soluie).
Coninutul lipidelor generale a membranelor plasmatice recalculat la 1 ml de sperm a fost
calculat conform formulei:
L=A/Bx1000, (2.2)
unde: L - coninutului lipidelor generale g/ml sperm;
A - indicele densitii optice la SF-26 i SF-46 n varianta experimental;
B - indicele densitii optice la SF-26 i SF-46 soluia standard;
1000-coninutul lipidelor n soluia standard, g/ml.
2.4.2. Metoda microanalitic de cercetare a lipidelor prin intermediul cromatografiei n
straturi subiri.
Selectarea acestei metode de cercetare a fraciilor lipidice din spermatozoizi n procesul
crioconservrii spermei animalelor agricole este legat de faptul, c aceast metod semnificativ
depete metoda cromatografic n coloane, dup viteza divizrii i proprietile admisibile ale
ei. n acelai timp, la selectarea corect a diluanilor cu ajutorul cromatografiei n straturi subiri
practic se identific toate fraciile de lipide, iar reactivele speciale utilizate au proprietatea de a
localiza i identifica aceste clase de lipide.
Pentru diferenierea lipidelor au fost folosite plcue cu dimensiuni 13x18, la suprafaa cror
s-a aplicat amestec din silicogel i gips medical n raport 16:1. Ulterior plcuele au fost uscate la
temperatura camerei i activate nainte de folosire timp de 30 min. la temperatura de 110 C.
Extracia i divizarea lipidelor s-a realizat innd cont de proporia - 30mlrd. de gamei n
sistemul cloroform-metanol-ap. Dup divizarea fazelor pe parcursul a 24 de ore mostrele au fost
centrifugate la 2000 rotaii pe minut timp de 30 min. n faza cloroformic au fost determinate
FL i lipidele neutre, iar n faza ap i metanol s-au determinat cerebrozidele.
59
2.4.3. Determinarea fosfolipidelor.
Mostrele din faza cloroformic au fost evaporate la evaporatorul rotativ. Dup care,
precipitatul a fost splat cu aceton pn la culoarea strvezie a soluiei. cu eliminarea
consecutiv a ei. Precipitatul s-a splat cu cloroform n proporie suficient pentru aplicarea pe
suprafaa plcuei. Conglomeratul obinut de lipide s-a folosit pentru cromatografie, iar divizarea
lor a fost efectuat n sistemul cloroform/metanol/acid acetic/ap (65/43/1/4). Plcuele cu
coninut lipidic s-au colorat n exicator n vapori de iod cristalic. Apoi cromatogramele au fost
fotografiate pe plcue foto i supuse densitometriei la densitometrul autografic NF-4.
2.4.4. Determinarea gliceridelor.
Mostrele din faza cloroformic, incluznd spermatozoizi n proporie de dou miliarde s-au
supus evaporrii. Precipitatul de lipide, la fel, a fost splat cu cloroform n proporie suficient
pentru aplicarea pe suprafaa plcuei. Celelalte proceduri s-au efectuat ca i pentru FL, cu
excluderea sistemului de divizare. Divizarea lor s-a petrecut prin sistemul eter/hexan/acid acetic
n raport 20/80/1,5. Cromatogramele obinute au fost fotografiate, supuse densitometriei i
utilizate ca i n metoda precedent.
2.4.5. Determinarea cerebrozidelor.
Mostrele din faza ap-metanol, care includeau spermatozoizi n proporie de dou miliarde
au fost supuse evaporrii n termostat la temperatura de 60 C. Precipitatul de lipide s-a splat cu
amestec de cloroform i metanol (1:1). n acelai timp, volumul amestecului a fost proporional
cu cantitatea necesar pentru aplicare la suprafaa plcuei. Dup uscarea plcilor, lipidele au fost
separate prin intermediul sistemului cloroform/metanol/amoniac (80/20/0,4) cu prelucrarea
ulterioar ca i n metodele sus menionate.
2.4.6. Determinarea raportului proteine/lipide n membranele plasmatice.
Raportul proteine/lipide n membranele plasmatice a fost calculat prin mprirea
coninutului proteinelor n membranele spermatice, care se conin ntr-un ml (1 ml) de sperm la
cantitatea lipidelor generale din acelai volum de sperm.
2.4.7. Metoda de determinare a coninutului produilor finali ai POL n spermatozoizi.
Determinarea concentraiei dialdehidei malonice (DAM), ca indice a strii de stres a
obiectului de studiu, a fost efectuat dup metoda lui Iu.A. Vladimirov i A.I. Arciacov la
spectofotometru SF-26 i SF-46 (LOMO) [55]. Determinarea concentraiei DAM n variantele
cercetate s-a realizat prin metoda, bazat pe reacia dintre DAM i acidul tiobarbituric, care are
loc la temperatur nalt i la valoarea acid a pH-lui, cu formarea complexului trimetin colorat
i care conine o molecul de DAM i dou molecule de acid tiobarbituric. Absorbia maxim are
loc la lungimea de und 535 nm.
60
Metoda a fost folosit pentru determinarea proceselor de POL n sisteme izolate, cum sunt
spermatozoizii. Pentru realizarea ei s-a procedat n felul urmtor:
1. Amestecul, care conine 50 ml de TRIS-HCl i 1 ml suspensie de spermatozoizi, s-a
incubat n baia de ap (t =37 C).
2. n timpul incubrii periodic amestecul se agit.
3. Probele n volum de 1,9 ml s-au transferat n eprubete pentru centrifugare.
4. Dup incubare reacia s-a blocat prin adugarea a 0,1 ml soluie de 100% acid
tricloracetic.
5. n fiecare eprubet s-au adugat cte 2,0 ml de acid tricloracetic de 30%, acid clorhidric
0,2 ml cu concentraia de 5 N i 2,0 ml de acid tiobarbituric cu concentraia de 0,75%.
6. Amestecul din eprubete s-a nclzit n baia de ap timp de 15 min.
7. Coninutul eprubetelor s-a centrifugat.
8. Densitatea optic s-a determinat la lungimea de und 535 nm.
Coninutul DAM n celule este prezentat n unitile de extincie (u.e.).
2.4.8. Metoda de determinare a conjugatelor dienice.
Pe parcursul POL la nivelul de formare a radicalilor liberi n moleculele acizilor grai
polinesaturai apare sistemul legturilor duble conjugate, care se nsoete de apariia a unui nou
maximum n spectrul de absorbie la 233 nm. Coninutul conjugatelor dienice au fost determinate
conform I.D. Stalinaia [114] i a fost calculat reieind din valorile coeficientului molar al
extinciei, egal cu 2,2x10,5 cm
-1
x M
-1
.
2.4.9. Determinarea hidroperoxizilor din lipide.
Principiul metodei se determin prin aceea, c n soluiile apoase peroxizii de hidrogen ai
lipidelor oxideaz Fe
+2
pn la Fe
+3
.

Ultimul se determin cu ajutorul reaciei de colorare cu
tiocianat de amoniu la o lungime de und 480 nm. Despre nivelul relativ a hidroperoxizilor n
spermatozoizi s-a judecat conform densitii optice descrise de L.A. Romanova i I.D. Stalinaia
[105].
2.5. Metode de cercetare a spermatozoizilor i de crioconservare a spermei.
2.5.1. Metodele de determinare a indicilor fiziologici.
Metodele de apreciere a indicilor fiziologici aveau ca scop de a determina n materialul
seminal numrul de spermatozoizi ntr-o unitate de volum (indicele concentraiei celulelor),
numrul spermatozoizilor vii cu micare rectilinie (indicele mobilitii) i durata timpului de
supravieuire a lor la anumit temperatur (indicele longevitii) [15]. Indicii studiai au fost
determinai la temperatura de 35C.
Volumul (ml) materialului seminal a fost determinat, imediat dup recoltare, cu ajutorul
61
pipetelor gradate de 2 sau 5 ml, nclzite pn la temperatura prevzut de condiiile
experienelor sau direct n spermocolectorul gradat.
Concentraia spermatozoizilor s-a determinat aplicnd camera Goreaev. Pentru aceasta a
fost pregtit soluia de 3% de clorur de sodiu. Sub influena soluiei hipertonice a clorurii de
sodiu spermatozoizii se imobilizeaz, ceea ce simplific tehnica de numrare a lor. n cazul
determinrii concentraiei spermatozoizilor din sperma uman a fost folosit melangerul
leucocitar, iar n cazul spermei animale s-a utilizat melangerul eritrocitar. Stabilirea numrului
de spermatozoizi s-a realizat la mrirea cmpului studiat de 200 ori. Numrarea pe diagonal s-a
efectuat n 5 ptrate mari. n ptratele mici spermatozoizii s-au numrat n form de zigzag. S-au
luat n considerare numai spermatozoizii, al cror cap este situat n interiorul ptratului.
n cazul studierii spermei animalelor, indicele studiat s-a determinat dup formula:
C=400PD/NR100000, (2.3)
unde: C concentraia spermatozoizilor; P numrul celulelor evideniate; D gradul de
diluare; N numrul ptratelor mici; R adncimea camerei Goreaev; 400 coeficientul folosit
la recalculare pentru suprafaa ptratului mic.
n cazul studierii concentraiei spermei umane se utilizeaz aceeai formul ca i n cazul
spermei animalelor, deosebire fiind doar c concentraia spermatozoizilor se mparte la 1000000,
de aceea ea se exprim n milioane/ml.
Mobilitatea. Pentru determinarea mobilitii s-a apreciat numrul de spermatozoizi cu
micare rectilinie. Determinarea se efectueaz vizual dup scara de zece baluri. Atunci, cnd toi
spermatozoizii posed micare rectilinie, sperma se calific de zece baluri, balul acordat
depinznd de procentul spermatozoizilor din prob care posed micri rectilinii, de exemplu
90% corespunde la 9 baluri etc.
Mobilitatea (n baluri) s-a determinat cu ajutorul microscopului Ampleval, firma german
Carl Zeitz (Iena) la mrimea obiectivului 200 de ori (obiectivul 20 i ocularul 10 ori).
Mobilitatea spermatozoizilor s-a apreciat la temperatura confortogen. Temperatura a fost reglat
cu ajutorul termomsuei electrice a microscopului.
Longevitatea s-a apreciat, de asemenea, la temperatura confortogen, care a fost pstrat n
termostat special pe tot parcursul determinrii acestui indice. Sperma a fost determinat ca vie n
acel caz, cnd mobilitatea ei nu era mai mic de 0,5 baluri.
Indicele absolut de supravieuire (IAS) a fost calculat conform formulei:
IAS = at, (2.4)
unde: a mobilitatea spermatozoizilor; t durata (n ore) timpului dup demararea
experienei.
62
2.5.2. Metoda de congelare a spermei de coco.
Congelarea a fost efectuat prin dou metode. Conform primei metode sperma nativ era
refrigerat timp de 15-20 min pn la temperatura camerei i treptat era diluat cu mediu
protector 1:1 (glutamat de natriu 2,87; glucoz 0,5; inozit 0,25; acetat de magneziu x 4H
2
O
0,07; acetat de kaliu 0,5 i ap pn la 100 ml) [365] fr crioprotector, apoi a fost expus n
frigider la o temperatur de +4 C. Dup 30-40 min sperma s-a diluat cu acelai mediu n raport
de 1/2, coninnd 21% de DMF [116]. Dup 15-20 min de la administararea crioprotectorului
sperma diluat a fost ambalat n paiete cu volumul de 0,25 ml i congelat. n calitate de
frigider pentru ndeplinirea procedurilor preventive ale spermei pentru congelare a fost folosit
camera frigorific MK-25, ceea ce a permis de a menine condiii stabile de temperatur.
Crioconservarea spermei s-a efectuat cu ajutorul congelatorului programat pentru
bioobiecte. Meninerea temperaturii s-a realizat prin intermediul termoreglatorului conectat la
instalaia de autografiat H-306. Parametrii evideniai ai regimului de rcire au fost timpul de
platocristalizare a probei (t tp.) i viteza de congelare (C/min.). Concomitent, s-au respectat
regimele din camer: de la +4 pn la -6 C 3 C/min., de la -6 pn la -19 C - -40 C/min, de la
-19 pn la -80 C -70 C/min, i mai apoi au fost scufundate n azot lichid; regimul de
modelare 3 C/min pn la -3 C, t platocristalizaiei = 0,5
1
, 45 C/min pn la -19 C i 100
C/min pn la -80 C.
Decongelarea spermei congelate s-a efectuat pe baiea de ap la temperatura de +40 C.
Conform metodei nr. 2 sperma nativ fr diluarea ei cu medii crioprotectoare a fost
congelat n vaporii azotului lichid. Sperma a fost decongelat pe baia cu ap la temperatura de
+40 C, nemijlocit pn la folosirea ei pentru analizele ulterioare.
2.5.3. Determinarea calitii spermei decongelate de coco.
Indici, care au fost evideniai sunt mobilitatea spermatozoizilor (n baluri, dup scara de
zece puncte), numrul spermatozoizilor cu membrane i acrozome integre (n procente).
Mobilitatea spermatozoizilor a fost apreciat sub microscop (x450) n pictur pe masa
termic la temperatura 36 C.
Determinarea numrului spermatozoizilor cu membranele integre i deteriorate s-a realizat
conform metodei Halangk, Bohnensak [238], modificat pentru analiza spermei de coco la
fluorimetru [116], cu folosirea n experien a fluorohromei etidium bromid.
Pentru determinarea spermatozoizilor cu acrozomele integre i deteriorate a fost folosit
colorarea spermatozoizilor vii cu colorantul fluoriscent - tiazinul rou.
Pentru analiz s-au utilizat mediile, prevzute pentru diluarea spermei, care au fost
suplimentate cu fluorocromele - etadionbromida i tiozinul rou n concentraie, respectiv, 10
6
63
Mol i 5x10
4
- 5x10
5
Mol. Sperma de coco s-a diluat cu mediul, care coninea fluorocromi n
raport de 1/5. O pictur mic de sperm (1 l), amestecat cu colorani, a fost aplicat pe
suprafaa lamei i acoperit cu lamela n scopul obinerii stratului subire dintre lamele,
aproximativ de 0,5-1,0 mkl., pentru a limita mobilitatea spermatozoizilor i ameliorarea
condiiilor de vizualizare. Examinarea s-a realizat la microscopul luminiscent ML-3 n lumina
reflect sub imersie la mrirea 1350. Pentru provocarea luminiscenei s-a utilizat lumina filtrului
CC cu maximumul de transmisie de 400 nm. n calitate de filtru de blocare a fost folosit filtru
de lumin JS-18.
2.5.4. Determinarea rezistenei spermatozoizilor la ocul termic.
Metoda de determinare a rezistenei la ocul termic este bazat pe supravieuirea
spermatozoizilor dup rcirea rapid a lor de la temperatura camerei pn la 1-3 C.
Dou picturi de sperm nediluat, expus la temperatura camerei n decurs de 20 min cu
pipeta se introduc ntr-o eprubet cu coninut de 6% soluie de glucoz, preventiv rcit pn la
21 C. n alt eprubet cu aceeai soluie, nclzit pn la 37-40C, se introduc dou picturi de
sperm nediluat. Ambele eprubete se pstreaz n decurs de 5 min la temperaturile menionate
i se examineaz microscopic mobilitatea spermatozoizilor n baluri dup metoda acceptat. Prin
urmare, devierea rezultatelor obinute dintre dou determinri paralele nu trebuie s depeasc
mai mult de 10%.
Calitatea spermei se determin dup coeficientul de rezisten a spermatozoizilor la ocul
termic (K), care se calculeaz dup formula:
2
1
a
a
K = , (2.5)
unde:
1
a mobilitatea spermatozoizilor peste 5 min dup introducerea spermei n soluia de 6%
de glucoz la temperatura de 21 C, n baluri;
2
a - mobilitatea spermatozoizilor peste 5 min dup introducerea spermei n soluia de 6% de
glucoz la temperatura de 37-40 C, n baluri.
2.5.5. Determinarea rezistenei osmotice a spermatozoizilor.
Determinarea rezistenei osmotice (R
o
) se bazeaz pe stabilitatea spermatozoizilor n
condiiile soluiei hipotonice de clorur de sodiu. Rezistena osmotic a spermatozoizilor se
determin n sperma nativ, diluat, pstrat la temperaturile pozitive sau congelat-decongelat
pentru aprecierea proprietilor biologice ale ei sau proprietilor protectoare ale mediilor
sintetice. La determinarea R
o
a spermatozoizilor se respect regulile de prevenire a ocului
termic.
64
Pentru determinarea rezistenei termice se pregtesc 9 eprubete cu cte 1 ml soluie de
clorur de sodiu cu diferit concentraie: 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,5 i 0,6%. Toate
eprubetele se termostateaz la 30-37
o
C, timp de 10-15 min. n fiecare eprubet se adaug
sperm n proporia n care s fie diluat 1:100 (:200) ori. Eprubetele cu sperma diluat se
pstreaz la temperatura 18-22
o
C timp de 3 ore. Dup ce se determin mobilitatea
spermatozoizilor n pictura strivit cu folosirea microscopului cu contrast de faz.
Prin R
o
se marcheaz valoarea concentraiei de NaCl a acelei eprubete, unde spermatozoizii
au pstrat mobilitatea nu mai puin de 0,5 baluri. Cu ct concentraia soluiei este mai mic, cu
att este mai mare rezistena osmotic. Ultima maximal poate atinge 0,6. La moartea
spermatozoizilor n soluia 0,6 - R
o
= 0.
La determinarea calitii spermei prin R
o
se recomand utilizarea coeficientului de rezisten
(R
k
), care se calculeaz conform formulei:
o
k
R
R
1 , 0
= , (2.6)
unde: 0,1 coeficientul constant;

o
R rezistena osmotic.
Maxima valoare a R
k
=1.
2.5.6. Metoda de colorare a spermatozoizilor.
Pe marginea lamei microscopice curate, prelucrat cu un amestec de alcool i eter se aplic
o pictur de sperm. Ctre ea se aduce marginea sticluei protectoare, pe muchia creia se
rspndete pictura. Dup aceasta printr-o micare rapid sticlua protectoare este mpins de la
unghiul lamei microscopice sub un unghi de circa 45, opus direciei de micare pentru a nu
distruge spermatozoizii. Frotiul trebuie s fie att de subire ca s se usuce timp de 1-2 min.
Frotiul uscat se fixeaz n alcool de 96%. Se coloreaz cu soluie apoas de 5% eozin. Astfel de
prelucrare a probelor de material permite de a mbunti contrastul imaginii i de a o studia.
2.5.7. Analiza i clasificarea formelor patologice ale spermatozoizilor n ejaculat.
Prezena formelor patologice de spermatozoizi n sperm denot despre scderea activitii
funcionale a lor i determin importana practic a acestui indice. El poate fi apreciat cu ajutorul
microscopului luminiscent. Estimarea formelor patologice n sperm const n determinarea
numrului de spermatozoizi cu aspect anormal n rezultatul examenului morfologic al lor.
Valoarea acestui indice a fost studiat prin metoda microscopiei luminiscente. Pentru
determinarea procentului de forme patologice ale spermatozoizilor s-a utilizat microscopul
(x400-600 mrire). Pentru calcularea formelor anormale, pe un frotiu, au fost analizate cel puin
65
cte 300-500 de spermatozoizi. Aceast procedur a fost repetat de opt ori, dup ce s-a calculat
valoarea medie. Procentul formelor patologice a fost determinat dup formula:
N
n
x
100
= , (2.7)
unde: n numrul spermatozoizilor patologici;
N numrul total de spermatozoizi constani.
Claritatea viziunii a fost obinut prin folosirea coloranilor sau a invertorului special, dup
caz, care este component a complexului microscopului (adaptorului fazocontrast, condensorul
cu cmp ntunecat).
Formele anormale ale spermatozoizilor au fost determinate conform metodei descrise [19].
Pe baza raportului spermiilor normali i anormali s-a calculat indicele-B teratologic (B).
n cercetrile efectuate formele patologice ale spermatozoizilor au fost divizate n dou
grupuri:
I formele patologice primare, care se formeaz n procesul spermatogenezei. La ele se
refer spermatozoizii cu capul deformat (cu cap ngust, alungit, pariform .a.) i dimensiuni
modificate (mici, mari);
II - formele patologice secundare, care se formeaz n cile sexuale. La ele aparin
spermatozoizii, crora le lipsesc unele componente structurale (lipsa capului, cozii, deteriorarea
capului i cozii), precum i spermatozoizi ncovoiai n regiunea cozii, gtului, spermatozoizi
montri cu dou cozi, dou capuri i gamei imaturi.
2.5.8. Metoda de cercetare a aparatului acrozomal.
Schimbrile morfologice ale aparatului acrozomal al spermatozoizilor au fost studiate prin
microscopia luminiscent, utiliznd microscopul MBI-11 i adaptorul fazocontrast FK-4.
Microscopia a fost realizat sub imersie la mrirea de 1500 ori. Studierea schimbrilor
morfologice ale acrozomilor a fost efectuat dup fixarea gameilor prin diluarea spermei n
soluie de 1% de fluorid de sodiu. O astfel de fixare permite de a obine o deplin imobilizare a
spermatozoizilor n condiiile pstrrii structurilor lor submicroscopice.
Starea morfologic a acrozomului spermatozoizilor a fost studiat n dependen de regimul
de decongelare a spermei.
n fiecare mostr au fost numrai cte 300-500 de spermatozoizi i, n dependen de starea
morfologic a acrozomului celulele, au fost mprite n dou categorii:
1. spermatozoizi cu acrozomul integru, cnd marginea apical este normal i bine se
vizualizeaz;
66
2. spermatozoizi cu acrozomul distrus, structura cruia este granulat, tumefiat, deformat
s-au lipsete.
2.6. Micrometoda de determinare a fosforului dup Vasilicovschii.
Metoda de determinare a fosforului este bazat pe proprietile amoniului de molibden
acidic de a forma n mediul acid cu fosfatul neorganic a complexului fosformolibdenic, care
dup reducere formeaz produse colorate n albastru (albastru de molibden). Intensitatea
coloraiei obinute este proporional cu coninutul de fosfor n obiectul cercetat.
Dup evaporarea din mostra a soluiei cloroform-metanol la substana uscat s-a adugat
0,2 ml 72% HClO
4
i eprubetele au fost nclzite timp de 20 min n blocul de aluminiu la
temperatur de 180-200 C (pn la decolorare). Dup rcire n eprubete s-a introdus cte 4,8 ml
de soluie nr. 1. Soluia nr. 1 s-a preparat prin amestecul a 48 ml de soluie 1N de H
2
SO
4
cu 4 ml
de reactiv iniial i volumul amestecului a fost suplinit cu ap bidistilat pn la 100 ml. Pentru
pregtirea reactivului iniial s-au diluat 400 mg de hidrozin acido-cloric n 14 ml de soluie 4N
HCl. Soluia obinut a fost amestecat cu soluia 10 g (NH
4
)
2
Mo
2
O
7
n 60 ml soluie 4N HCl.
Conglomeratul obinut s-a supus nclzirii timp de 20 min n baia ferbnd cu ap, dup ce s-a
rcit i s-a adugat 14 ml de H
2
SO
4
concentrat cu majorarea consecutiv a volumului pn la 100
ml. Ulterior eprubetele au fost supuse prelucrrii termice n baia de ap la fierbere timp de 15
min. Dup rcirea eprubetelor cu ap curgtore din reeaua de apeduct coninutul eprubetelor a
fost supus calorimetriei la spectrofotometrul SF-26 i SF-46 cu o lungime de und 820 nm.
Coninutul fosforului a fost determinat conform curbei de calibrare n Laboratorul
metabolismului lipidelor al Institutului de Biochimie al Academiei de tiine din Uzbechistan.
2.7. Determinarea coninutului ionilor prin metoda fotometriei n flacr.
Fotometria n flacr (Flamfotometria) este varianta analizei spectrale de emisie (11).
Aceast metod este o variant simplificat a spectroscopiei de emisie n care sursa de excitare
este o flacr. Spectrul de emisie al unui atom se obine prin excitarea termic a acestuia, dup
aducerea n prealabil n stare de vapori, deci prin aducerea probei la o temperatur suficient de
ridicat nct moleculele acesteia s disocieze n atomi, care emit apoi spectre caracteristice.
Spectrele atomice ale elementelor sunt determinate de electronii de valen, fiind una dintre
proprietile periodice. Cu ajutorul unui pulverizator pneumatic soluia analizat este adus n
arztorul alimentat cu aer, unde arde cu o flacr - gaz combustibil natural. Radiaia emis, mai
exact spectrul emis, este monocromat cu ajutorul filtrului sau monocromatorului, care selecteaz
lungimea de und dorit. Curentul fotoelectric ce ia natere n fotomultiplicator este amplificat
de un amplificator i nregistrat. Determinarea coninutului cantitativ al Na
+
, K
+
, Li
+
i Ca
++
n
soluie a fost realizat cu folosirea fotometrului n flacr FPL-2.
67
Proporionalitatea direct dintre intensitatea liniilor spectrale i concentraia soluiei
analizate se observ numai la anumite concentraii: pentru Na
+
i K
+
limita minimal este 0,5
mg/l, pentru Ca
2+
- 0,5 mg/l. Limita maximal pentru toate elementele constituie 100 mg/l.
Pentru separarea liniilor spectrale ale elementului studiat se folosesc filtre de lumin
interfereniale cu urmtoarea lungime a undelor: pentru msurarea emisiei a natriului, potasiului,
litiului i calciului, corespunztor, 589,0; 766,5; 670,8 i 422,5 nm.
2.8. Metoda folosirii preparatelor coordinative pentru meninerea i fortificarea
spermatogenezei la coco.
Preparatele coordinative au fost cu amabilitate oferite de ctre catedra chimia anorganic a
USM. Condiiile de ntreinere i hrana a cocoilor implicai n experiment au corespuns
cerinelor zoo- i sanitare veterinare. Cocoii au fost selectai conform principiului de analogie i
divizai n patru grupe, dintre care o grup martor i trei grupe experimentale.
Compusele coordinative s-a administrat cocoilor n form lichid per os cte 1 ml zilnic
timp de 35 zile. Calitatea spermei a fost apreciat conform indicilor fiziologici (volumul
ejaculatului, longivitatea, concentraia i mobilitatea spermatozoizilor).
n grupa martor s-a administrat zilnic, dup schema descris, cte 1 ml de soluie fiziologic.
La cocoii din grupa experimental 1 preparatul LAZ Zn(CCl
3
COO)
2
4H
2
O.
La cocoii din grupa experimental 2 s-a administrat n acelai volum preparatul TAS
Zn(HSeO
3
)
2
4H
2
O.
La cocoii din grupa experimental 3 a fost administrat n aceiai cantitate preparatul
combinat LAZ - (Zn(CCl
3
COO)
2
4H
2
O) + TAS - (Zn(HSeO
3
)
2
4H
2
O).
2.9. Metoda de efectuare a experienelor tiinifico-practice de nsmnare a ginilor.
Pentru determinarea valorii biologice a spermei de coco au fost efectuate experiene
tiinifico-practice de nsmnare a ginelor cu sperm congelat-decongelat la ntreprinderea
experimental a Institutului de Avicultur al Academiei Naionale Agrare a Ucrainei, Vivariul
Institutului de Fiziologie i Sanocreatologie; Asociaia de cercetri i producie Avicola i
ntreprinderea avicol Orhidea Nani. Prelucrarea tehnologic a spermei a fost utilizat
conform metodei prezentate mai sus. Cercetrile au fost efectuate cu folosirea ginilor din rasele
colecionate de prsil sau care reprezentau obiectul de producie al unitilor menionate.
nsmnarea artificial a ginilor cu folosirea spermei diluate, conservate i decongelate s-a
produs n oviduct la profunzimea de 2-3 cm. Primele dou nsmnri s-au efectuat cu un
interval de 24 ore, ulterior odat la 3 zile. Doza de nsmnare a constituit de la 0,02-0,03 ml
pn la 0,11-0,12 ml de sperm. Colectarea oulor s-a nceput peste o zi dup a doua nsmnare.
68
Eficacitatea nsemnrii artificiale a ginilor s-a evaluat conform rezultatelor incubrii
oulor fertilitii oulor, eclozionrii oulor i obinerea puilor.
2.10. Prelucrarea statistic a materialului cifrologic.
Prelucrarea biometric a datelor obinute s-a efectuat n conformitate cu metodologia
general acceptat dup E.K. Mercureva (1964) i E.A Novicov [96].
La prelucrarea statistic a materialului cifrologic o atenie deosebit s-a acordat determinrii
veridicitii diferenei dintre valorile comparative, care s-a realizat dup schema urmtoare:
1. Crearea unei serii de variaii, care reprezint totalitatea cifrelor rezultate din calculul
anumitor valori;
2. Aranjarea succesiv repartizarea cifrelor variabile n ordine descrescnd sau crescnd;
3. Selecionarea variaiilor numrul variaiilor, care include numai parial de seciuni ale
tuturor posibilelor variante (x
1
, x
2
, x
3
, ... x
n
) din seria de variaii (cu excluderea celor mari
i celor mai complicate variante);
4. Determinarea indicilor de volum ai seriei numrul variantelor n serie. Numrul n
seriile comparate trebuie s fie identic;
5. Determinarea mediei aritmetice (M), care reprezint suma algebric a tuturor cifrelor ale
seriei, mprit la volumul seriei (n):
n
v v v v
M
n
...
3 2 1
+ + +
= . (2.8)
6. Determinarea mediei patratelor abaterilor valorilor fat de media lor aritmetic ()
variaia variantelor n jurul valorilor medii:
1
) (
2

=

n
M V
. (2.9)
7. Determinarea erorii medii aritmetice:
1
=
n
m

. (2.10)
8. Determinarea criteriului de veridicitate(t):
2
2
2
1
2 1
m m
M M
t
+

= . (2.11)
9. Determinarea gradului de mprtiere a valorilor (f):
2
2 1
+ = n n f . (2.12)
69
10. n tabelul Student pentru gradul de mprtiere determinat 2
2 1
+ = n n f i nivelul
selectat de probabilitate P se gsete valoarea t corespunztoare i se compar cu cea
calculat.
11. Dac t
calc.
> t
tabl.,
atunci diferena constatat dintre valorile comparate se consider
autentic cu nivelul de veridicitate selectat sau nu mai mic dect 0,95. i invers, dac t
calc.

< t
tabl.,
atunci diferena constatat dintre valorile comparate se consider neautentic cu
nivelul de veridicitate selectat. n acest caz este posibil de confirmat, c valorile
comparate
2 1
V V , iar diferena cifric formal este condiionat de variaiile statistice
ale parametrilor rezultatelor de msurare.
12. Concluziile principale n lucrare sunt bazate pe diferenele statistic autentice ntre loturile
martor i experimental. Rezultatele sunt exprimate ca medieeroare standard. Pragul de
semnificaie prezentat: P<0,001 - P<0,05.
2.11. Concluzii la capitolul 2.
Materialele de studiu utilizate n cercetare au permis de a obine rezultate originale, concrete
comparative conform scopului lucrrii.
Metodele aplicate n cercetrile prezentate n lucrare sunt performante i adecvate
obiectivelor cercetrilor tiinifice trasate.

70
3. SPECIFICUL MODIFICRILOR MORFO-FUNCIONALE I BIOCHIMICE
ALE MATERIALULUI SEMINAL DE COCO LA CRIOCONSERVARE
3.1. Starea morfo-funcional a spermatozoizilor de coco la crioconservare.
3.1.1. Transformri morfologice i funcionale ale spermatozoizilor de coco i aciunea
temperaturii i pH-lui asupra rezistenei spermei la crioconservare.
Actualitatea studierii strii morfo-funcionale a sistemului reproductiv i spermatogenezei
este determinat de faptul diminurii inopinate a spermogramei. Acest proces, conform
relatrilor academicianului T. Furdui [122, 123], denot despre fenomenul degradrii biologice a
organismului, n general, i nu n ultimul rnd, a sistemului reproductiv. Astfel de degradri
rmn neclarificate definitiv i pot fi determinate de o diversitate de factori, care separat sau n
combinaii influeneaz negativ spermatogeneza nu numai la intensitate excesiv, dar i la
expoziia de lung durat a lor [128]. n acelai timp, nu este definitiv cercetat gradul de
influiena a diferitor factori naturali i artificiali asupra statusului morfo-funcional al organelor
vitale. Factorii influieneaz nederijat, stihiinic starea organismului i, n rezultat, nu se asigur
un nivel corespunttor pentru garantarea realizrii potenialului genetic al organismului n
ansamblu [136] i, n particular, pentru meninerea adecvat a proprietilor fecundative ale
materialului spermatic.
n calitate de unitate biologic, capabil de a demonstra proprieti vitale este
spermatozoidul. Vivacitatea lui, n mare msur, este detrminat de structura, proprietile fizico-
chimice i starea funcional a membranelor biologice. Majoritatea celulelor posed structur
membranar dezvoltat. Aceast structur include membrana plasmatic i un set destul de
complicat al membranelor intracelulare [5, 32].
Modificrile compensatoare n spermatozoizi sunt direcionate asupra meninerii structurii
lichid-cristalice a lipidelor i a bistratului lipidic, proprietilor de barier i permeabilitii
membranelor [42, 57]. Stereotipicitatea reaciilor biochimice adaptive, la nivel structural, este,
probabil, una dintre posibilitile principale ale evoluiei obiectelor vii, care determin lipsa
modificrilor calitative ale reaciilor bioobiectului la influena factorilor externi, inclusiv a celor
principali, care provoac degradarea precoce a organismului [10,173]. Volumul i caracterul
interconexiunii dintre indicii coordonai pot fi diferite, att n dependen de natura i intensitatea
factorului extern, ct i de starea fizico-chimic iniial a sistemelor biologice [362]. Aceasta
determin diferenierea cantitativ i calitativ, care se observ, nu numai la diferite etape ale
congelrii, dar i n dependen de iniierea influenei factorului termoosmotic [164, 378].
n contextul celor expuse, n prezentele cercetri atenia principal a fost direcionat spre
studierea membranelor plasmatice, component al fiecrui spermatozoid i, n primul rnd, a
71
sistemului acrozomal al lui, precum i a dereglrilor morfologice, termo- i osmorezistenei
spermiilor, influenei pH-lui asupra indicilor funcionali ai spermei i modificrilor componenei
chimice a membranelor plasmatice ale gameilor de coco.
n morfologia spermatozoizilor cele mai sensibile structuri sunt membranele acrozomale, la
modificarea crora, accelerat se reface structura i componena lor [50].
Numrul acrozomilor intaci la spermatozoizii de coco variaz i valoarea acestui indice
este independent de anotimp, ceea ce poate fi explicat prin stabilitatea iriditar a cromatinei
mpachetate n histoni [170, 210].
La diluarea spermei cu mediile sintetice, deseori apar efecte nedorite, de la aglutinarea
spermatozoizilor pn la iniierea prematur a reaciei acrozomale. Se presupune, c producerea
acestor fenomene este cauzat de diminuarea concentraiei proteinelor cationice cu sarcin
pozitiv n plasma seminal, care absorbindu-se pe suprafaa negativ a membranelor
citoplasmatice manifest o funcie protectoare [141].
Avnd n vedere proprietile i fenomenele menionate n cercetrile iniiale paralele am
studiat starea morfologic a acrozomului la diferite etape ale crioconservrii spermei de coco.
Rezultatele experimentale sunt prezentate n tabelul 3.1.
Tabelul 3.1. Modificarea acrozomului spermatozoizilor de coco n procesul crioconservrii, %
Acrozomi normali, %, dup
Nr.
crt.
Specia
animalului Diluare Refrigerare
Congelare-
decongelare
1. Coco 75,1 3,06 72,6 3,16 16,2 2,60*
2. Taur 76,4 2,19 69,0 1,36* 53,6 1,92*
3. Berbec 76,4 2,72 57,0 0,71* 46,4 1,59*
4. Vier 73,4 1,50 62,4 1,00* 19,3 1,90*
Not: *Statistic autentic este diferena n comparaie cu sperma diluat.
Rezultatele obinute ale cercetrilor comparative demonstreaz, c n sperma diluat se
conin deja aproximativ 25% de spermatozoizi cu membranele acrozomale deteriorate. Procesul
de refrigerare la etap iniial nu influeneaz esenial asupra strii morfologice a acrozomului,
iar refrigerarea, congelarea i decongelarea materialului seminal de coco provoac deteriorarea
semnificativ a acrozomului.
Coninutul acrozomilor integri ai spermatozoizilor scade cu 58,9% i constitue numai
16,22,60% dup congelarea-decongelarea spermei (P<0,001). n dependen de specia
animalelor, criorezistena acrozomului variaz considerabil i rmne cea mai sczut la
spermatozoizii de coco.
72
Modificrile nregistrate pot fi explicate prin faptul, c procesul de crioconservare reprezint
un factor nefavorabil de risc pentru structura acrozomal, influena crui se evideniaz
considerabil dup decongelarea spermei i care diminueaz aportul acrozomului n evenimentul
iniial de fertilizare [280]. La acest etap producerea modificrilor poate fi predeterminat de
procesele cristalizrii i recristalizrii substanelor aflate n stare lichid, pentru care sunt
caracteristice limitele temperaturilor la decongelare ntre 60-100
o
C [64]. Acest fenomen poate fi
lmurit de pe poziia cristalizrii clasterice, deoarece limitele de temperatur i concentraii
studiate sunt caracteristice pentru microfazele lichide n bioobiectele crioconservate la momentul
producerii n ele a nano-cristalelor [64]. Procentul mic de acrozomi normali ai spermatozoizilor
de coco, n comparaie cu cel al altor specii de animale poate fi deteminat de specificul
biochimic al spermei i de suprafaa acrozomului, care este comparativ mare la coco [280, 323].
n aceste condiii acrozomul servete ca int i poate fi, comparativ, mai deteriorat de atacul
factorilor nefavorabili.
Astfel, n procesul crioconservrii cea mai vulnerabil etap este congelarea-decongelarea
spermei de coco, n care se produc majoritatea proceselor deterioratoare i n care mediile
crioprotectoare posed proprieti protectoare sczute fa de structurile acrozomale.
n scopul studierii comparative a fost supus cercetrilor i mobilitatea spermatozoizilor ale
speciilor menionate n tabelul 3.1. Rezultatele experienei se prezint n tabelul 3.2.
Tabelul 3.2. Aciunea etapelor tehnologice de crioconservare asupra mobilitatii
spermatozoizilor
Mobilitatea spermatozoizilor, baluri, dup:
Nr.
crt.
Specia
animalului Diluare Refrigerare
Congelare-
decongelare
1. Coco 8,7 0,21* 8,3 0,20* 4,8 0,20*,**
2. Taur 8,5 0,01 8,0 0,03 4,9 0,11**
3. Berbec 7,9 0,22 6,7 0,21 3,4 0,34**
4. Vier 7,9 0,14 7,1 0,13 3,4 0,24**
Not: *Diferenile sunt statistic autentice n comparaie cu sperma de berbec i vier.
**Modificrile criogenice sunt statistic veridice.
Datele tabelului 3.2 denot, c mobilitatea spermatozoizilor n procesul de crioconservare
suport schimbri criogenice. n particular, mobilitatea spermatozoizilor de coco scade
considerabil de la 8,70,21 pn la 4,80,20 baluri (P<0,001). Sunt stabilite i particulariti de
specie a mobilitii spermatozoizilor i modificri ale valorii ei dup congelarea-decongelarea
spermei de coco, taur, berbec i vier (P<0,001).
73
La soluionarea problemelor fiziologiei reproducerii animalelor o importan deosebit are
reducerea i evitarea formele patologice ale spermatozoizilor, condiionate de dereglrile
structurilor morfologice ale lor. n multiple ceretri realizate n ar i peste hotare s-a
demonstrat existena anomaliilor morfologice primare i secundare [8, 22, 106, 147]. Cele
primare sunt determinate de tulburarea spermiogenezei, avnd o localizare n tubii seminiferi,
pn la ajungerea n epididim i constau n alterarea morfologic i structural a capului
spermului. Anomaliile secundare se produc n epididim, datorit stagnrii prelungite la acest
nivel sau sunt efecte ale aciunii unor factori termici (ocul termic), chimici (ocul osmotic), sau
mecanici n timpul ejaculrii i manipulrii spermei, adic dup ce ei capt o valoare
funcional deplin. Numai spermatozoizii integral funcionali, notai, cu cel puin 6-8 baluri la
diferite specii de animale, pot fi admii pentru crioconservare [58, 95], n rezultatul crei se pot
produce anumite modificri n structurile morfologice ale spermilor. n acelai timp, indicii
morfologici ai materialului seminal pot servi ca criteriu esenial al strii funcionale a spermei,
iar intensitatea fecunditii ovulelor se afl n corelaie direct cu raportul spermatozoizilor
normali i patologici [50].
Aceste rezultate abordeaz ntrebri cu privire la caracteristicile specifice ale biologiei
spermei de coco, care se consider eseniale n tratamentul materialului seminal, iar fecunditatea
ovulelor se afl n corelaie direct cu raportul de spermatozoizi normali i patologici.
n contextul celor expuse i reieind din importana practic a acestui parametru,
urmtoarele experiene au fost de determinare a coninutului spermatozoizilor patologici n
materialul seminal nativ de coco i la etapele crioconservrii lui. Rezultatele experienilor
efectuate sunt prezentate n tabelul 3.3.
Tabelul 3.3. Anomalii ale spermatozoizilor de coco la etapele crioconservrii spermei
Starea spermatozoizilor
Nr.
crt.
Etapa
tehnologic
Numrul
spermiilor
examinai
Forme
patologice,
numrul
Forme
integre,
numrul
Spermatozoizi
patologici,
%

1. Sperma nativ 300 52 248 17,3 2,18
2. Sperma diluat 300 56 244 18,7 2,25
3. Sperma refrigerat 300 57 243 19,0 2,26
4.
Sperma congelat-
decongelat
300 72 228 24,0 2,27*
Not: *Statistic sunt veridice schimbrile criogenice.
Datele tabelului 3.3 denot, c prezena celulelor patologice n sperma nativ de coco
constituie 17,32,18%, iar procesele de crioconservare condiioneaz sporirea treptat a indicilor
74
examinai la toate etapele tehnologice de la 18,72,25% pn la 24,02,27%. Aceste schimbri
sunt statistic veridice numai la etapele decongelrii (P<0,05). Cauzele principale pot fi
consecinele aciunii stresului termic i a factorului osmotic la etapa menionat [4, 50]. La fel,
este cunoscut c mecanismele apariiei i dezvoltrii numeroaselor stri patologice sunt
determinate de dereglarea structurii i de proprietile membranelor biologice ale
spermatozoizilor [38, 57, 174].
Totodat, gametopatiile constatate au fost clasificate conform schemei menionate mai sus
n dou categorii: primare I, secundare - II. Clasificarea gametopatiilor permite de a determina
regiunea de localizare a dereglrilor [19], ceea ce simplific cercetrile substanelor
stabilizatoare ale structurilor morfologice din celulele reproductive. n prima grup au fost
incluse patologiile localizate n regiunea capului, iar n grupa a doua - patologiile din regiunea
flagelului. Rezultatele sunt prezentate n tabelul 3.4.
Tabelul 3.4. Coninutul spermatozoizilor patologici n sperma de coco n procesul
crioconservrii
Nr.
crt.
Forme patologice
Procentul
spermatozoizilor
Categoria
patologiilor
Sperma nativ
1. Spermatozoizi evideniai 300
2. Spermatozoizi normali 87,4 1,92
3. Spermatozoizi patologici 12,6 1,92
4. Anomalii de categoria I, total
8,0 1,57
(taur - 2,7 0,49)
I
I
5. Anomalii de categoria II, total
4,7 1,22
(taur 11,1 1,04)
II
II
Indicele teratologic al spermei constituie 0,14 u.c. (taur 0.11 u.c.)
Sperma decongelat
6. Spermatozoizi evideniai 300
7. Spermatozoizi normali 79,0 2,35
8. Spermatozoizi patologici 21,0 2,35*
9. Anomalii de categoria I, total 2,7 0,94 I
10. Anomalii de categoria II, total 18,3 2,22** II
Indicele teratologic al spermei constituie 0,26 u.c.
Not: Semnificaia criogenic a patologiilor spermatice este statistic autentic: *P<0,01;
**P<0,001.
Datele tabelului 3.4 arat, c chiar i n sperma nativ s-a nregistrat prezena
spermatozoizilor patologici, unde au prevalat gametopatologiile de categoria II, care au constituit
75
4,71,22%, comparativ cu anomaliile de categoria I 8,01,57%. n rezultatul congelrii-
decongelrii numrul patologiilor sporete cu 8,5% i, practic, s-a dublat valoarea indicelui-B
teratologic al spermei, de la 0,14 pn la 0,26 u.c.
Gametopatiile n procesul crioconservri sunt determinate de modificarile i deteriorrile
morfologice ale spermatozoizilor. Un impact decisiv al acestor fenomene au gametopatiile de
categoria II i, anume, flagele rsucite i deteriorate. Aceasta demonstreaz c morfologia
flagelului este mai labil dect cea a capului [23].
Astfel, n sperma nativ de coco au fost constatate, n proporii variabile, diverse anomalii
ale spermiilor. Dintre ele au fost preponderente gametopatiile de categoria I. Congelarea-
decongelarea spermei provoac sporirea autentic a gametopatiilor de categoria II. Aceste
anomalii ale spermiilor sunt direct proporionale cu starea funcional a spermatozoizilor.
Paralel cu estimarea formelor patologice ale spermatozoizilor de coco n procesul de
crioconservare a fost studiat rezistena spermei la ocul termic prin rcire pn la temperaturi
negative avansate i la ocul osmotic prin modificri fizico-chimice.
Crioconservarea este o metoda nonfiziologic, care implica un nivel ridicat de adaptare a
celulelor biologice la ocurile osmotice i termice la congelare i decongelare [164], i care,
concomitent, declaneaz modificri eseniale, care defavorizeaz calitatea spermei. S-a
demonstrat, c rezistena spermei la ocul termic este egal cu rezistena la congelare [107].
Spermatozoizii de psre sunt celulele, care conin foarte puin citoplasm i, n mod
proporional, o suprafa foarte mare de membranele plasmatice [212, 273]. De asemenea,
spermatozoizii conin un numr variabil de mitocondrii (20-60), iar nucleul lor este constituit din
cromatin foarte condensat.
Exist mai multe teorii i ipoteze referitor la producerea ocului termic, ns, nici una nu
elucideaz complet mecanismul apariiei acestuia. Se consider, c un rol important n acest sens
l au procesele de osmoz i difuzie din sperm. Cu ct aceste procese decurg mai lent, cu att
manifestrile ocului sunt mai atenuate.
Conform cercetrilor proprii i analizei factorilor, care provoac deteriorarea celulelor, s-a
elaborat un concept nou, conform cruia modelarea teoretic a mecanismului ocului termic este
completat cu aciunea forelor deterioratoare a bombardrii rezonante a undelor hidrodinamice,
care apar n rezultatul schimbrii brute a vitezei micrii apei n spaiul limitat al celulei i cu
modificarea brusc a tensiunii membranei citoplasmatice pn la nivele critice cu pierderea
elasticitii sale [98].
Unul dintre principalii factori, care deterioreaz obiectele biologice n procesul
crioconservrii este ocul osmotic [262], iar valoarea gradientului osmotic este direct
76
proporional cu sensibilitatea spermatozoizilor la ocul termic [98]. Conform ipotezelor de
criodeteriorare, acest fenomen poate fi provocat de modificri fizico-chimice, dintre care este i
osmolaritatea. Concomitent, n perioada crioconservrii, spermatozoizii de coco sunt supui
influenei factorilor hipoosmotici [171, 182, 298]. n acelai timp, nu se ia n consideraie
specificaiile agentului hipertonic i, de aceea, prioritate n procesele de destrugere a celulei la
congelare-decongelare i reveine presiunii osmotice. Prin urmare, n scopul seleciei ejaculatelor
complete, necesare pentru experiene am studiat rezistena termic i osmotic a
spermatozoizilor de coco n cercetrile ulterioare.
Experimentarea cu sperma de coco a permis de a stabili criorezistena ei. S-a dovedit, c
acest indice este egal cu 0,870,123. Rezultatele comparrii criorezistenei spermei de coco cu
cea de om i vier sunt prezentate n tabelul 3.5.
Tabelul 3.5. Diversitatea rezistenei spermei de coco
Nr.
crt.
Denumirea
bioobiectului
Rezistena,
coeficientul de rezisten
Rezistena la ocul termic
1. Sperma de coco 0,87 0,123*
2. Sperma de om 0,96 0,092
3. Sperme de vier 0,43 0,096
Rezistena osmotic
1. Sperma de coco 0,79 0,81
Not: *Diferenele sunt statistic autentice comparativ cu sperma de vier.
Datele tabelului 3.5 demonstreaz, c indicii criorezistenei spermei animalelor variaz n
limite autentice (P<0,05). Axarea comparativ a datelor prezentate cu rezultatele obinute de
ctre noi n alte serii de cercetri [4, 50], stabilete o corelare direct proporional a criteriilor de
congelabilitate a spermei de coco i criorezistena ei.
La compararea valorilor indicelui studiat n sperma de coco i om, se observ o cretere a
lui n favoarea rezistenei spermei de om. Aceasta tendin ne permite de a relata, c sperma
uman poate fi mai eficient crioconservat, comparativ cu cea de coco i a altor animale.
Rezistena osmotic a spermei de coco este major i constituie 0,790,81. Aici este
necesar de remarcat faptul, c deoarece gradul de deteriorare a celulelor, provocat de
desfurarea ocului termic este proporional cu gradientul osmotic, unul dintre posibilele
mecanisme de crioprotecie a sistemelor biologice la ocul termic i osmotic se poate obine prin
optimizarea compuilor mediilor crioprotectoare. Sperma de coco poate menine capacitatea de
fertilizare n limitele osmocitii de 250 - 460 mOsmol/kg, iar presiunea osmotic ideal
77
recomandat este de 325 - 350 mOsmol/kg [368]. Astfel, rezistena osmotic demonstreaz c
starea funcional a membranelor poate fi folosit ca indice valoros n determinarea calitii
materialului seminal.
Aadar, reieind din datele prezentate putem concluziona c, materialul spermatic de coco
dispune de coeficiente comparative de termo- i osmorezisten relativ nalte.
Conform datelor literaturii universale celulele sexuale i structurile competitive ale lor,
activitatea funcional a spermatozoizilor i a sistemului reproductiv, se afl sub influena major
a factorilor interni i ambientali, care provoac scderea indicilor morfologici, biochimici i
funcionali ai materialului seminal. Prin urmare, potrivit relatrilor academicianului T. Furdui i
al. [127] este evident elaborarea metodelor i principiilor de meninere a activitii funcionale a
sistemului reproductiv n limitele sanogene. Actualitatea lor se ncadreaz n conceptul
mecanismelor dirijate a sanogenitii sistemelor vitale, inclusiv reproductiv prin prisma
meninerii i fortificrii proprietilor fiziologice, somatice i psihice ale lor. [136]. Una dintre
aceste metode la realizarea strategiei reproductive n meninerea viabilitii i puterii sanogene
fecundative a spermatozoizilor un timp variabil n afara cilor genitale, n sectorul avicol,
servete nsmnarea artificial a psrilor.
nsmnarea artificial reprezint o biotehnic modern de imitaie a mperecherii
efectivului femel de psri. Aplicarea metodelor de conservare a materialului seminal face
posibil creterea numrului de gini nsmnate de un coco i, implicit sporirea productivitii
acestora. La psrile domestice aplicarea nsmnrii artificiale amelioreaz proprietile de
reproducie, urmate de scderea considerabil a cheltuielelor tehnologice [221]. n acelai timp,
pentru aprecierea calitii spermei se folosesc indicii principali: coninutul spermatozoizilor n
ejaculat, starea morfologic a spermatozoizilor, concentraia i mobilitatea lor, rezistena i pH-
ul materialului seminal i altele. Indicii enumerai adecvat determin starea spermei [102].
Spermatozoizii de psre sunt celule, care conin foarte puin citoplasma i, n mod
proporional, o suprafa foarte mare de membrane plasmatice [164, 212, 273]. n membranele
plasmatice sunt prezeni factorii specifici biologici i biofizici, care asigur permeabilitatea,
compoziia lipidelor i proteinelor, precum i fluiditatea membranelor. La deteriorri
membranice, aceste proprieti se deregleaz i apar consecine nefaste asupra mobilitii i
diversitii proceselor metabolice n spermatozoizi [147, 170, 172, 290, 366]. Aceste dereglri se
produc, n primul rnd, la nivelul membranelor plasmatice ale spermatozoizilor, care sunt
structurile iniiale ce se supun aciunii factorilor de mediu [36, 173].
n corespundere cu relatrile contemporane, membranele reprezint structuri mozaice i
lichid-cristalice, care sunt formate din stratul bimolecular al lipidelor, unde spaial sunt localizate
78
proteinele i componentele glucidice. Conform structurii lichid-mozaice, moleculele proteinelor
globulare sunt situate n matricele lipidic n modul, care stabilete contactarea cu mediul acvatic
a grupelor polare i ionizate [42]. Lipidele sunt printre componentele majore ale membranelor
spermatozoizilor, implicate ntr-o serie de procese, care influeneaz n cele din urm potenialul
lor de fertilizare [154]. La cocoi, lipidele sunt parte integral a membranei spermatozoizidului i
sunt implicate n diferite stadii ale reaciilor de maturizare, capacitaie i acrozomale, ntr-o serie
de modificri biochimice i funcionale, care se desfoar n procesul de pregtire sau producere
a fecundrii [269].
Este cunoscut, c stabilitatea proteinelor, n mare msur, depinde de puterea ionic i
permeabilitatea dielectric a soluiei. Conform opiniilor contemporane [108], stabilitatea
proteinelor este determinat de concentraia sumar a anionilor i cationilor n soluie, care se
afl ntr-un echilibrul dinamic ntre ei. Pe msura schimbrii valorii pH-ului se modific i
indicii funcionali ai spermatozoizilor. Acest fapt prezint un interes deosebit n procesul
elaborrii mediilor crioprotectoare cu scopul stabilizrii structurii i funciei spermatozoizilor n
condiiile criconsevrii.
n contextul celor expuse, investigaiile ntreprinse n lucrarea de fa i-au propus
cercetarea evidenierii unor eventuale influiene ale pH-lui mediului asupra calitii spermei de
coco i a coraportului proteine/lipide al membranelor plasmatice ale spermiilor de coco n
procesul de crioconservare.
Remediile corespunztoare pentru materialul seminal de cococ trebuie s asigure sursa
adecvat de energie pentru spermatozoizi i s menin pH-ul i osmocitatea identice, cu cele din
plasma seminal, mediu natural pentru sperm [378]. Asigurarea pH-ului spermei are o
importan major n susinerea viabilitii spermatozoizilor. Un material seminal cu pH-ul mai
mic de 6,4 nu este potrivit pentru crioconservare, deoarece aceasta poate provoca deteriorri ale
membranei plasmatice a celulelor spermatice [276]. Ali autori [198, 378], invers au artat c
sperma de coco poate tolera o gam larg a pH-ul de 6,0-8,0. La fel, este cunoscut c n limitele
pH 6,0-8,0 fecunditatea spermei psrilor se pstreaz la un nivel nalt [198].
Avnd n vedere importana pH-lui n meninerea proprietilor morfo-funcionale ale
spermatozoizilor i diversitatea variat a opiniilor cu privire la pH-ul mediului, prezentat n
actualele surse bibliografice, acest studiu a fost conceput pentru a investiga rezistena spermei de
coco la diverse valori ale pH-lui n procesul crioconservrii. Rezultatele obinute sunt redate n
tabelul 3.6.
Datele expuse n tabelul 3.6 denot despre faptul, c majoritatea rezultatelor restabilirii
mobilitii gameilor de coco s-au produs n cazul dilurii spermei cu pH-ul mediului, apropiat
79
de neutru. Devierea nivelului pH-lui din varianta optimal numai cu 0,5 n direcia acidulrii sau
alcalinizrii, iniiaz diminuarea brusc a mobilitii spermatozoizilor dup decongelare.
Tabelul 3.6. Aciunea pH-ului mediului asupra calitii spermei de coco dup congelare-
decongelare
Nr.
ctr.
Varianta
experimental
pH-ul
mediului
Mobilitatea spermiilor dup
decongelare, puncte
1. I 4,75 1,1 0,12
2. II 5,25 1,1 0,12
3. III 5,75 1,8 0,12
4. IV 6,25 2,5 0,02
5. V 6,50 3,1 0,12
6. VI 6,75 4,0 0,02*
7. VII 7,00 4,5 0,02*
8. VIII 7,25 4,0 0,02*
9. IX 7,50 3,1 0,12
10. X 7,75 2,7 0,12
Not: *Diferena este statistic veridic: P<0,05.
Rezultatele obinute coreleaz cu relatrile lui Peters i al. [338], care au constatat, de
asemenea, c pH-ul materialului seminal de coco trebuie s fie uor alcalin, cu o medie de
7,010,01, n timp ce Tuncer i al. [402] i Bah i al. [158] au nregistrat un pH cuprins,
corespunztor, n limitele de 7,540,04 i 7,800,03. Aceast variaie a pH-ului n materialul
seminal poate fi produs de multipli factori, inclusiv poate fi predeterminat de interaciunea
unor factori cu cei epigenetici [124].
Sperma n condiii fiziologice asigur condiii de tampon, necesare pentru prevenirea
modificrii pH-ului, care se produce n rezultatul derulrii metabolismului spermatozoizilor
[124, 394]. Actualmente, n componena mediilor pentru diluarea materialului seminal se
folosesc n calitate de tampoan substanele tris, citratul de sodium i fosfaii [50].
Schimbrile indicilor fiziologici ai materialului seminal dup deconservare, n dependen
de pH-ul mediului, pot fi argumentate reieind din relatarea R. Gennis [57], conform crei, n
cazul pH-ului, apropiat de punctul izoelectronic al proteinelor, n biocomplexe apar fore de
atracie, iar cnd valoarea pH-ului difer de punctul izoelectronic, cu o unitate i mai mult, apar
fore de respingere, care provoac deteriorarea biocomplexelor.
Generaliznd rezultatele studierii aciunii pH-ului asupra mobilitii spermatozoizilor de
coco dup decongelare i n conformitate cu datele literaturii referitor la prezena variabil a
intensitii legturilor chimice a proteinelor membranelor plasmatice ale spermiilor la mamifere
80
[47] putem conchide, c membranele plasmatice ale gameilor de coco se caracterizeaz prin
prezena proteinelor cu prevalarea legturilor slabe, care se rup la devierea pH-lui de la valoarea
neutr. Aceasta demonsteaz rezistena sczut a spermei de coco la modificarea pH-ului.
Valoarea pH-ului n limitele stabilite demonstreaz, c compoziia mediul pentru sperma de
coco, utilizat n cercetare, probabil, conform relatrilor [108], reprezint un dezechilibru
dinamic al concentraiei sumare a anionilor i cationilor n soluie.
ntruct literatura de specialitate nu ofer suficiente date despre eventualele corelaii
funcionale ntre pH-ul spermei de pasre i structura morfo-funcional a membranelor
plasmatice ale spermatozoizilor, n urmtoarea experien ne-am propus s investigm raportul
proteine/lipide al membranelor plasmatice, de asemenea, la crioconservare. Mai mult ca att,
membranele plasmatice ale spermatozoizilor sunt structurile iniiale, care se supun aciunii
factorilor de mediu i posed funcii unicale de reglare a principalelor procese, care decurg n
celul. n legtur cu aceasta, studierea modificrilor componenei chimice a membranelor
plasmatice ale spermiilor de coco are o importan semnificativ.
Membranele reprezint un fluid structural alctuit din bistrat lipidic penetrat total sau partial
de molecule proteice; ntre lipide i proteine exista, mai ales, legturi necovalente. Proteinele i
lipidele n membranele biologice interacionnd prin legturile hidrofobe, hidrofile, ionice i
hidrogene, precum i cu cele ale metalelor bivalente formeaz complexe lipoproteice [9, 83]. n
acest caz, rolul legturilor covalente este neesenial. Caracterul interaciunii proteinelor, lipidelor
i glucidelor, n mare msur, depinde de condiiile mediului. Astfel, proteinele localizate pe
ambele pri ale membranelor se leag cu stratul bilipidic, n general, din contul interaciunilor
electrostatice, dar aceste legturi sunt destul de labile [34, 83, 230].
Numeroase date demonstreaz c la crioconservarea spermei are loc modificarea lipidelor i
proteinelor din spermatozoizi. ns, analiznd criorezistena obiectelor biologice la nivel
molecular, diferite componente (lipidele, proteinele, glucidele i biocomplexele lor) reacioneaz
variat la scderea temperaturii: lipidele sunt mai labile, iar proteinele i glucidele sunt mai stabile
[6, 50, 92].
Astfel, criorezistena spermatozoizilor, n mare msur, este condiionat de componena
membranei plasmatice i proprietile fizico-chimice ale lor, iar cunotinele acumulate despre
proteine, lipide i ali componeni membranici sunt unicele surse accesibile numai pentru
evaluarea superficial a mecanismelor, de formare a biocomplexelor funcionale active [50].
In legtur cu cele expuse, n continuare problema de baz este cercetarea coninutului
raportului proteine/lipide din membrana plasmatic a spermatozoizilor nativi i crioconservai de
81
coco n comparaie cu rezultatele obinute de ctre noi n cercetrile anterioare pe mamifere.
Valorile rezultatelor obinute sunt prezentate n tabelul 3.7.
Tabelul 3.7. Raportul proteine/lipide al membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de coco
i vier la crioconservare
Nr.
crt.
Denumirea
bioobiectului
Raportul
Proteine/lipide
1. Membranele plasmatice ale spermatozoizilor nativi de
coco
0,3980,042
2. Membranele plasmatice ale spermatozoizilor
congelai-decongelai de coco
0,5220,041
3. Membranele plasmatice ale spermatozoizilor nativi de
vier
0,1790,009*
4. Membranele plasmatice ale spermatozoizilor
congelai-decongelai de vier
0,2010,004*
Not: *Diferenele sunt autentic veridice: (P<0,05).
Din rezultatele cercetrilor prezentate n tabelul 3.7, n primul rnd, rezult, c valoarea
raportului proteine/lipide depinde de originea membranelor plasmatice. Cel mai nalt raport
proteine/lipide s-a nregistrat n membranele plasmatice ale spermatozoizilor de coco
(0,3980,042), care, n acelai timp, reieind din datele obinute de ctre noi n cercetrile
anterioare, sunt i mai rezisteni la ocul tempic [31]. n membranele plasmatice ale
spermatozoizilor nativi de vier, pentru care, de asemenea, din rezultatele acelorai relatri, este
caracteristic sensibilitatea nalt la condiiile crioconservrii, acest raport a constituit numai
0,1790,009 [32]. Diferenele stabilite ntre valorile raportului proteine/lipide n membranele
plasmatice ale spermatozoizilor nativi de coco i vier sunt statistic veridice. Aceste rezultate
sunt n acord cu datele obinute de ali autori, n ceea ce privete existena corelaiei pozitive
ntre raportul proteine/lipide din membranele plasmatice i rezistena spermatozoizilor de taur la
aciunea temperaturilor hipotermale [47, 58]. Dup congelarea i decongelarea spermei, raportul
proteine/lipide al membranelor plasmatice n spermatozoizii de coco a sporit pn la
0,5220,041, iar n cei de vier - pn la 0,2010,004 (P<0,05).
Rezultatele acestor cecetri au permis de a evedenia interrelaiile dintre criorezistena
spermiilor i valorile raportului proteine/lipide din membranele plasmatice ale spermatozoizilor
speciilor implicate n cercetare. Mai semnificativ aceast interrelaie este accentuat dup
congelarea-decongelarea spermei de coco. Majorarea raportului, conform datelor literaturii [82]
cu referire la criolabilitatea sporit a lipidelor i divergena structural a membranelor plasmatice
ale spermatozoizilor de coco, produs sub influena interaciunilor lipid-lipidice, probabil, are
82
loc din cauza diminurii coninutului lipidic n procesul crioconservrii. n acest caz,
proprietile membranelor se determin nu de orice interaciune specific ntre componeni, dar,
preponderent, de proprietile fizice ale rezistenei structurii bistratare [71].
Astfel, rezultatele cecetrilor biochimice ale modificrilor produse n membranele
spermatozoizilor de coco i vier n condiii identice relev, c raportul principalelor componeni
structurali ai membranelor plasmatice n procesul congelrii i decongelrii spermei este
predeterminat de particularitatea de specie.
Concluzii:
1. Structurile acrozomale ale spermatozoizilor de coco, comparativ cu cele ale spermiilor
speciilor studiate de animale sunt supuse deteriorrilor morfologice autentice numai la etapa de
congelare-decongelare.
2. S-a stabilit c procesele general acceptate de prelucrare tehnologic a spermei de coco
produc modificri structural-morfologice autentice ale spermatozoizilor dup decongelarea lor,
inclusiv i o cretere semnificativ a indicelui-B teratologic al spermei.
3. Crioconservarea materialului seminal contribuie, practic, la dublarea coninutul formelor
patologice de spermatozoizi cu anomalii ale cozii i, ca consecin, se reduce considerabil
concentraia spermiilor cu proprieti de micri rectilinii.
4. n sporirea proprietilor biologice ale spermei de coco dup congelare-decongelare o
semnificaie major i revine rezistenei proprii a celulelor sexuale la influena temperaturilor
hipotermale i condiiilor variabile ale osmocitii.
5. Devierea bilateral acido-alcalin a pH-lui de la valoarea neutr cu mai mult de o unutate,
provoac diminuarea brusc a mobilitii spermatozoizilor de coco n procesul de congelare-
decongelare a spermei.
6. Variabilele experimentale pre- i postoptimale i pstrez valoarea autentic numai n
limitele slab acide i slab alcaline i, implicit ofer avantaje majore n meninerea proprietilor
sanogene ale materialului seminal de coco.
7. Din datele prezentate se constat o interrelaie direct proporional ntre valoarea
raportului proteine/lipide din membranele plasmatice ale spermatozoizilor i rezistena spermei
de coco la influiena temperaturilor sczute.
8. Elucidarea particularitii coninutului raportului proteine/lipide din membranele
plasmatice ale spermatozoizilor nativi i crioconservai de coco comparativ cu cei de vier,
condiioneaz cercetri de performan n vederea completrii opiniei tiinifice despre
organizarea structural a biomembranelor i specificaiei lor.
83
9. Perspectiva direcionat a cercetrilor n domeniul crioproteciei obiectelor biologice,
rmne optimizarea condiiilor de reglementare a raportului compuilor structurali de baz ai
membranelor n scopul sporirii rezistenei spermatozoizilor psrilor la aciunea factorilor
crioconservrii.
3.1.2. Funciile de barier ale membranei plasmatice a spermatozoizilor de coco n
procesul de crioconservare.
Clarificarea mecanismelor de modificare criogenic n sistemele biologice la diferite nivele
de organizare, reprezint una dintre problemele fundamentale ale criobilogiei contemporane.
Numeroase date ale literaturii de specialitate demonstreaz, c una dintre cele mai criolabile
structuri a celulelor este membrana biologic [50]. n acelai timp, modificarea funciei de
barier a lor provoac diferite modificri intra- i extracelulare [37, 44, 191, 220, 273]. Studierea
proprietilor bariere ale membranelor este predeterminat de valoarea teoretic i aplicativ a
problemei abordate.
n primul rnd, dereglarea transportrii metaboliilor poate fi unul dintre principalele
mecanisme ale blocri metabolismului celulelor. Actualitatea studierii desfurrii mecanismelor
acestui fenomen este determinat prin faptul, c n procesul crioconservtrii, nu numai se inhib
reversibil activitatea enzimelor i a complexelor enzimatice, dar are loc i blocarea funciilor
vitale ale celulei, cum sunt proliferarea, respiraia etc. [1, 50]. n al doilea rnd, studierea strii
funcionale a sistemelor membranare prezint interes ntruct reprezint o modalitate de apreciere
a caracterului i profunzimii modificrii membranelor, precum i a clarificrii mecanismelor
interaciunii lor cu crioprotectorii n procesul conservrii. Deosebit de valoroase aceste date sunt
pentru descifararea mecanismelor moleculare de crioprotecie ale membranelor biologice.
n al treilea rnd, modificarea proprietilor bariere ale membranelor capt o semnificaie
deosebit i n sensul aplicativ, deoarece prin rezultatele obinute putem concluziona c
concentraiile pragale ale crioprotectorilor nu provoac modificri eseniale a strii structural-
funcionale a celulelor [61]. Condiiile experimentale denot, c la etapele de crioconservare au
loc modificri membranare, caracterul i intensificaia cror, este determinat de componena
mediilor sintetice i regimurile de prelucrare tehnologic a bioobiectelor [48, 50, 92].
Una dintre finciile prioritare ale membranelor biologice este reglarea permiabilitii
selective pentru substanele, care sunt transportate, n procesul activitii vitale a celulelor din
mediul nconjurtor n celul i invers. Unele structuri complexe ale sistemelor vii, separate de
membrane, funcioneaz ca sisteme de sine stttoare deschise.
Moleculele substanelor transportate sau a ionilor metalelor pot fi transportate prin
membran, independent de prezena i transferul altor substane i astfel, se realizeaz importul
84
substanelor. Transportarea substanelor poate fi realizat unidirecionat i concomitent cu alte
substane n acest caz are loc simportul substanelor. n sfrit, transportul concomitent al
substanelor contra gradientului de transportare al altor substane reprezint antiportul. Astfel,
simportul i antiportul sunt varieti ale transportului substanelor, n rezultatul crora, viteza
sumar a proceselor se controleaz prin disponibilitatea i accesibilitatea pentru sistemul ambelor
componente ale procesului de transportare [61]. n acelai timp, de starea funciei de barier a
membranelor, care asigur transportul ionilor, depinde i translarea informaiei, care poate fi
realizat de ctre transportul ionilor prin canalele corespunztoare ale membranei [193] sau n
rezultatul deformrii structurii lichid-cristalice a ei [46].
Reieind din cele menionate mai sus, devine clar importana cercetrilor funciei de
barier a membranelor plasmatice ale spermatozoizilor, ceea ce s-a realizat de ctre noi ntr-o
serie de experiene separarte. Rezultatele cercetrilor concentraiei ionilor de Na
+
, K
+
, Li
+
i Ca
2+
n sperma de coco sunt prezentate n tabelul 3.8.
Tabelul 3.8. Concentraia de Na
+
i K
+
, Li
2+
i Ca
2+
n sperma nativ de coco, mg%
Concentraia ionilor de:
Nr.
ctr.
Denumirea
bioobiectului
Na
+
,
mg%
K
+
,
mg%
Li
+
,
mg%
Ca
2+
,
mg%
Raportul
Na
+
/ K
+

1. Sperma nativ 29,8 9,72 31,3 9,72 0,4 0,02 9,9 0,04 0,952
2.
Plasma spermatic
nativ
407,0
22,80*
35,7
2,52*
0,6 0,01*
12,0
0,49*
11,401
3.
Spermatozoizii
nativi
147,9
5,48
156,8
27,90
0,7 0,03 7,5 0,16 0,943
Not: *Diferena este statistic autentic dintre plasm i spermatozoizi.
Din tabelul 3.8 urmeaz, c concentraia tuturor ionilor studiai, precum i raportul Na/K
este variabil n plasma seminal i spermatozoizii nativi de coco. Concentraia ionilor de Na
+
i Ca
2+
este mai mare n plasma seminal comparativ cu spermatozoizii, iar concentraia ionilor
de K
+
i Li
+
, invers, este mai nalt n spermatozoizi i mai joas n plasma seminal. Diferenele
n ambele cazuri sunt statistic autentice (P<0,001, P<0,01).
Ionii prezeni n plasm i spermatozoizi particip ca componente importante n procesele
metabolice ale celulei. De exemplu, reglarea funciei proteinelor are loc prin intermediul ionilor
de Ca
2+
, care reprezint un element esenial pentru o serie de activiti vitale ale spermei,
inclusiv hiperactivaia, hemotaxisul i reacia acrozomal [346]. Carena de Ca
2+
n sperm este
asociata, n toate cazurile cu subfertilitatea sexului masculin [211, 414].
85
Concomitent ionilor de Ca
2+
i Na
+
, fiind componeni ai Ca
+2
i Na
+
,K
+
-ATP-azelor,
regleaz activitatea acestor fermeni, care sunt, n acelai timp, strict necesari pentru meninerea
echilibrului ionilor n celul [57].
n cea mai mare concentraie n sperma de coco se afl ionii monovaleni de K
+
i Na
+
, care
sunt cei mai rspndii n natur, asigur formarea asimetriilor ionice, sunt cationi de mobilitate
nalt, formeaz diverse sruri hidrosolubile, precum i complexe mobile cu ligandele. Formarea
asimetriei ionice a celulei se asigur prin transportarea activ a Na
+
, K
+
, Ca
+2
i H
+
. Acest proces
se realizeaz prin sisteme transportatoare specifice.
Gradientele concentraionale de Na
+
i K
+
, care se formeaz la transportarea activ, asigur
celulele cu potenialele osmotice i electrochimice. n acelai timp, aceti ioni se deosebesc prin
proprieti valoroase. Ambele elemente au potenial de ionizare sczut al electronului pe orbita
extern, iar ionul format are configuraia gazului inert, adic este sferic i slab polarizat [261].
n lichidele biologice sodiul i potasiul sunt prezentate, prioritar, n form ionic. n faza
acvatic aceste elemente se ionizeaz, iar ionul nou format uor se hidrateaz. Ionii de Na
+
i K
+

sunt repartizai n sistemele biologice neuniform. Sodiul n lichidul interstial, regleaz echilibrul
osmotic i coninutul apei n celul, de asemenea particip la meninera echilibrului acido-bazic
n sistemele biologice [46].
Potasiul, spre deosebire de sodiu, este element intracelular, unde ndeplinete rolul de
reglator al presiunii osmotice intracelulare i n spermatozoizii nativi de coco constituie
156,827,90 mg% contra 35,7 2,52 mg% n plasma spermatic (P<0,01). n general, potasiul
sporete viteza oxidrii aerobe i inhib oxidarea anaerob a glucidelor.
n legtur cu faptul, c n procesul crioconservrii se produc procese extremale, a aprut
anumite premise de a presupune producerea modificrii concentraiei ionilor studiai. Rezultatele
experienelor de cercetare a compoziiei ionice a spermei de coco n procesul crioconservrii
sunt prezentate n tabelul 3.9.
n rezultatul analizei comparative a datelor prezentate n tabelele 3,8 i 3,9 putem constata,
c procesul crioconservrii spermei de coco duce la diminuarea concentraiei ionilor de Na
+
, Li
+
i Ca
2+
i sporirea concentraiei ionilor de K
+
n plasma seminal (P<0,01). n spermatozoizi are
loc sporirea concentraiei ionilor de Na
+
i Ca
2+
i scderea concentraiei ionilor de K
+
i Li
+
(P<0,01 -P<0,05 ).
Datele tabelului denot c, la rerfigerare, concentraia ionilor Ca
2+
i Li
+
n spermatozoizi nu
suport modificri eseniale. n plasm concentraia ionilor de Na
+
i Ca
2+
sporete. n
spermatozoizi ionii de K
+
i Na
+
scad i sporesc, comparativ cu coninutul lor n cei nativi
86
156,827,90 i 147,95,48 mg% (P<0,05). Modificrile stabilite denot despre manifestarea
reaciilor adaptive i compensatoare la etapele tehnologice de crioconservare a spermei de coco.
Tabelul 3.9. Transformrile criogenice ale ionilor de Na
+
, K
+
, Li
+
, Ca
2+
n sperma de coco, mg%
Concentraia ionilor de:
Nr.
ctr.
Denumirea
bioobiectului
Na
+
,
mg%
K
+
,
mg%
Li
+
,
mg%
Ca
2+
,
mg%
Raportul
Na
+
/ K
+

Sperma diluat
1. Sperma
293,0
22,40
35,0 4,94 0,6 0,06 9,2 1,02 8,37
2.
Plasma
spermatic
249,0
11,80*
,
**
28,8
3,20**
0,5 0,01 7,5 0,33** 8,65
3. Spermatozoizii
196,1
13,73*
97,2 6,78* 0,5 0,05 11,9 1,14 2,01
Sperma refrigerat
1. Sperma 286,4 8,77 33,4 2,90 0,7 0,04 9,5 1,14 8,57
2.
Plasma
spermatic
304,5
15,68*,**
34,2
2,23**
0,6 0,02 8,8 0,28** 8,90
3. Spermatozoizii
227,3
16,80*
60,2 7,03* 0,6 0,13 12,5 0,59 3,77
Sperma decongelat
1. Sperma
259,3
19,30
35,9 4,03 0,6 0,07 7,9 0,25 7,22
2.
Plasma
spermatic
280,6
19,00*
,
**
47,8 4,97 0,3 0,07 7,7 0,74** 5,87
3. Spermatozoizii
182,6
5,32*
43,3 4,58* 0,2 0,04 3,2 0,36 4,21
Not: *Diferenele sunt statistic autentice n comparaie cu sperma nativ (Tabelul 3.8).
**Diferena este statistic autentic dintre plasm i spermatozoizi.
n rezultatul dereglrii asimetriei naturale a ionilor, suprafaa membranei plasmatice, se
hiperpolarizeaz, destul de puternic i diminueaz interaciunea intermolecular i proprietile
de barier, n primul rnd, pentru biocationul de Ca
2+
[382, 423]. Conform datelor existente, Ca
2+

posed un efect multifactorial, iar n aspectul criobiologic prezint interes faptul c la
criodeteriorrile osmotice i termice se creaz condiii de modificare a permiabilitii
membranelor. Drept urmare Ca
2+
din mediul nconjurtor poate ptrunde n citoplasm unde
provoac un ir de modificri structurale [302, 330, 397].
87
Scderea autentic treptat a coninutului de K
+
, consecutiv cu fiecare etap tehnologic,
demonstreaz despre trecerea lui din spermatozoizi n plasma seminal la crioconservare.
Sporirea concentraiei Na
+
n spermatozoizi pn la 182,65,32 mg% n sperma crioconservat i
diminuarea coninutului lui n plasma spermatic de la 407,022,80 mg% n plasma nativ pn
la 280,619,00 mg% n cea decongelat denot despre faptul elimenrii-ptrunderii reciproce a
lor dup gradientul concentraional.
n acelai timp, este necesar de menionat, c criodistrucia membranelor celulare, parial,
depinde de natura srurilor, anionilor i, ndeosebi, a cationilor. Foarte frecvent se ntlnesc
comunicri, dedicate aciunii nefavorabile a ionilor de Ca
+2
, inclusiv i n componena mediilor
pentru crioconservarea celulelor reproductive [156, 415].
Proprieti stabilizatoare putem ntlni la ionii monovaleni n mediul 1,2-propandiol-H
2
O-
MeCl, unde ei formeaz lanul coerent: Li
+
>Na
+
>K
+
. Astfel, influena difereniat a electroliilor
asupra reaciei bioobiectelor la temperaturi joase, concomitent cu aciunea lor asupra
parametrilor fizico-chimici ai soluiilor congelate, este determinat i de particularitile
interaciunii cationilor i anionilor cu proteinele i lipidele membranelor plasmatice [362].
Rezultatele obinute se afl n strns concordan cu datele literaturii contemporane [50,
261]. n particular, unul dintre indicii cu variabilitate sporit de dereglare a permiabilitii
membranelor plasmatice n procesul de crioconservare este schimbarea coninutului cationilor
intracelulari ai K
+
i Na
+
, despre ce relev faptul, c celulele dup congelare-decongelare
pstrndu-i semiconductibilitatea pierd K
+
intracelular i acumuleaz Na
+
extracelular. De
asemenea, se arat alt coinciden, conform creia, la pierderea de K
+
i Na
+
contribuie
gradientul osmotic, mbogirea celulelor cu Na
+
are loc la etapa decongelrii, iar elimenarea K
+
,
preponderent, se produce n momentul congelrii. Se presupune, c pierderea K
+
i a altor cationi
(Ca
2+
, Mg
2+
) este momentul iniial de reconstrucie structural a celulei, care deregleaz
permiabilitatea selectiv a membranei plasmatice [61].
Elucidarea n literatura de specialtate a rolului Li
+
n procesul crioconservrii spermei de
coco este relativ limitat.
Concomitent cu cele menionate, proteinele membranare se asociaz cu proteinele specifice
ale mediului nconjurtor sub influena componenilor chimici ai lui i supun modificrilor
corespunztoare componena molecular a membranei plasmatice. n acest caz, ionii de K
+
i P
5+

manifest proprieti stabilizatoare asupra proteinelor, iar ionii de Na
+
i Cl
-
- aciuni
destabilizatoare. n acelai timp, scderea temperaturii tehnologice duce la modificarea funciei
proteinelor membranare i provoac, la rndul su, dereglarea activitii pompei de Na
+
i K
+
,
inclusiv i pn la stoparea definitiv a activitii ei [46]. De asemenea, de ctre acest autor este
88
stabilit, c proteinele membranare n condiiile fiziologice normale sunt intercalate n zona
periferic a bistratului lipidic, sporind permiabilitatea membranelor pentru ioni i neelectrolii,
iar la scderea temperaturii, proteinele stabilizeaz bistratul, mai concret o parte imponant din
lipidele implicate n transferul fazic n rezultatul interaciunilor lipo-proteice.
Modificarea concentraiei ionilor de Na
+
n spermatozoizi duce la dereglarea glicolizei [98],
iar dereglarea echilibrului ionilor se reflect asupra funcionrii normale a spermetozoizilor [50].
De exemplu, este cunoscut c coninutul de Ca
2+
liber n citoplasm mai mult de norma
fiziologic provoac moartea celulei n rezultatul deteriorrii citoscheletului, cauzat de
disociaia turbulent a microtuburilor. Totodat, Ca
2+
activeaz fosfolipazele bistratului
membranic, care deterioreaz lipidele membranare [46].
Modificrile determinate ale componenei ionilor n plasma i spermatozoizii de coco pot fi
interpretate, din punct de vedere al viziunii contemporane despre arhitectonica membranelor
biologice, ca structur nalt mobil, care ndeplinesc diverse fincii vitale, iar la influena
temperaturilor joase pot forma canale suplimentare pentru transportul ionilor cercetai. Astfel,
reglarea strii de barier a membranelor spermatice poate fi realizat prin utilizarea preparatelor
membranotrope, care conin ioni de Ca
2+
, K
+
, Na
+
, P
5+
i Cl
-
, precum i a grupelor metilice ale
substanelor organice. De asemenea, la eleborarea i aplicarea metodelor de crioconservare a
obiectelor biologice este necesar s se ia n consideraie schimbarea proprieti de barier ale
membranelor sub influiena factorilor mediului nconjurtor.

3.2. Modificarea biochimic a componenilor membranelor plasmatice, spermatozoizilor i
plasmei spermei de coco sub influiena factorilor de crioconservare.
3.2.1. Componena lipidic a spermatozoizilor, membranelor i a plasmei spermatice.
n conformitate cu datele prezentate n reviul literaturii, baza biomembranelor constituie
structurile lichid-cristalice i mozaice ale stratului bimolecular al lipidelor, n care spaial sunt
localizate proteinele. Rolul lipidelor n funcionarea normal a biomembranelor se determin de
starea fizic a lor, permiabiltatea selectiv, recepia, interaciunile intercelulare, transportul
biologic, reglarea activitii fermenilor membranodependeni i alte procese importante.
Lipidele sunt componentele eseniale i integrale ale membranelor i ndeplinesc funcii
importante n viabilitatea obiectelor biologice. Rolul specific al lipidelor const n faptul, c ele
sunt principalele elemente structurale i funcionale ale membranelor biologice i servesc ca
surse energetice pentru spermatozoizi [421].
Este cunoscut, c lipidele formeaz nu numai baza structural a membranelor celulare,
determinnd gradul de viscozitate, defuzia lateral i asimetria bilateral, dar sunt i
89
suntsubstane biologice active, care ndeplinesc funcia compuilor ai sistemului de transducie a
semnalelor, ai modulatorilor activitii enzimatice i ai proprietilor de recepie [76, 142, 229].
La fel, este cunoscut, c mecanismele apariiei i dezvoltrii numeroaselor stri patologice
sunt determinate de dereglarea structurii i de proprietile membranelor biologice [57].
Rolul lipidelor intracelulare nu este studiat complet. Unii autori presupun c ele sunt nu
numai sursa energetic, dar ndeplinesc i alte funcii [421].
Structurile principale, care se supun criodeteriorrii sunt membranele biologice, iar lipidele
lichid-cristalice sunt apte de a restabili aceste deteriorri. n acest caz, nu numai tranzaciile
fazice ale lipidelor membranare pot proteja celulele de deteriorri la ocul termic, dar i lipidele
exogene, n dependen de comportarea lor termotrop, care este determinat de specificul
componenei chimice a lor. Lipidele sunt printre componentele majore ale membranelor
spermatozoizilor, implicate ntr-o serie de procese, care influeneaz n cele din urm potenialul
lor de fertilizare [154].
La coco, lipidele sunt parte integrant a membranei spermatozoizidului i sunt implicate n
diferite stadii ale reaciilor de maturizare, capacitaie i acrozomale, ntr-o serie de modificri
biochimice i funcionale, care se desfoar n procesul de pregtire sau producere a fecundrii
[269]. Un nivel ridicat de acizi grasi polinesaturati ai spermatozoizilor aviari provoac
vulnerabilitatea spermiilor la efectele nocive ale POL [412] i, care se afl n corelaie direct cu
fertilitatea masculin.
Numeroase date demonstreaz, c la crioconservarea spermei are loc modificarea lipidelor
i proteinelor din spermatozoizi. Dar, analiznd criorezistena obiectelor biologice la nivel
molecular, diferite componente (lipidele, proteinele, glucidele i biocomplexele lor) reacioneaz
variat la scderea temperaturii: lipidele sunt mai labile, iar proteinele i glucidele sunt mai stabile
[50, 92].
Astfel, criorezistena spermatozoizilor, n mare msur, este condiionat de componena
membranei plasmatice i de proprietile fizico-chimice ale lor [53]. n aceast ordine de idei,
ine de menionat, c pn n prezent lipsa metodelor eficiente de izolare i separare a
membranelor spermatozoizilor nu permite de a studia n ansamblu, multilateral componena
chimic i totalitatea proceselor care decurg n membrane.
Avnd n vedere c organizarea structural i activitatea funcional a biomembranelor, n
mare msur, se determin de particularitile componenilor structurali, exist necesitatea
cercetrilor caracteristicilor structural-funcionale ale lipidelor membranice, participante n
90
funciile vitale ale gameilor. n acest caz, prezint interes stabilitatea coninutului chimic al
membranelor plasmatice i schimbrile lui n procesul crioconservrii spermei de coco.
Reieind din cele expuse, cercetrile lipidelor din membranele gameilor prezint un interes
mare pentru clarificarea de mai departe a deteriorrii gameilor i constatarea condiiilor de
crioprotecie ale lor. n acelai timp, constatatarea de ctre noi a modificrii sensibilitii
spermatozoizilor presupune i schimbarea componenei chimice a membranelor biologice ale
gameilor. n legtur cu aceasta, scopul acestei serii de experiene a fost determinarea
coninutului de lipide a biomembranelor spermatozoizilor de coco n procesul de crioconserare.
Cercetrile au fost ndeplinite n colaborare cu cercettorii Laboratorului Metabolismul
Lipidelor al Institutului de Biochimie al Academiei de tiine din Uzbechistan. Rezultatele
obinute au permis de evedeniat i de determinat coninutul gliceridelor, FL, colesterinei i a
cerebrozidelor n membranele native i dup congelarea-decongelarea spermei de coco.
n particular, n tabelul 3.10 sunt prezentate rezultatele experienelor prin care s-a
determinat coninutul FL, digliceridului-2, colesterinei (CS) i trigliceridelor n spermatozoizii
nativi i congelai-decongelai de coco.
Tabelul 3.10. Coninutul fosolipidelor, gliceridelor i colesterinei n membranele
spermatozoizilor de coco la crioconservare
Coninutul lipidelor (%) n
Nr.
ctr.
Lipide
Membrane native
Membrane congelate-
decongelate
1. Fosfolipide 44,780,049 79,41 0,257*
2. Diglicerid-2 8,040,150 9,530,173*
3. Colesterin 36,510,290 11,060,246*
4. Trigliceride 10,600,150 urme
5. Colesterin:Fosfolipide 0,815 0,139
Not: *Diferinele sunt statistic autentice ntre indicii membranelor native i cele congelate-
decongelate.
Datele tabeluli 3.10 permit de a constata, c componena lipidic a membranelor
spermatozoizilor de coco este prezentat, preponderent, de FL, gliceride i CS, care sunt supuse
schimbrilor semnificative sub aciunea temperaturilor sczute. De exemplu, s-a nregistrat
diferen statistic autentic ntre coninutul de FL n membranele gameilor nativi i ale celor
congelai-decongelai. n rezultatul prelucrrii tehnologice a spermei de coco (diluare,
refrigerare, congelare i decongelare) n membranele plasmatice ale spermatozoizilor coninutul
FL se majoreaz, iar cel al colesterinei se micorarea dup congelarea i decongelarea spermei.
n acelai timp, la crioconservare autentic se majoreaz coninutul digliceridei-2 n membranele
91
spermatozoizilor (de la 8,040,150 pn la 9,530,173% - P<0,05) i considerabil scade
coninutul trigliceridelor. Din punct de vedere chimic, moleculele trigliceridelor sunt
asemntoare cu cele ale FL, iar deosebirile eseniale ale lor constau n faptul, c FL nu
reprezint surs energetic pentru organism, dar componeni structurali principali ai
membranelor celulare [110].
n faza lipidic a membranelor, ca component esenial persist CS, metabolismul creia n
celule are un caracter integrativ, datorit afinitii majorate a ei [69]. Datorit CS transformrile
fazice n membranele plasmatice ale celulelor mamiferelor lipsesc sau se produc foarte rar.
Concomitent, CS modific atraciile dintre lanurile carbohidrate ale lipidelor i particip n
procesul de reorganizare a structurilor membranare [73].
n acelai timp, este cunoscut c de coninutul CS depinde temperatura de trecere fazic a
lipidelor [39, 50, 92, 97]. Temperatura de trecere fazic a lipidelor depinde nu numai de
coninutul CS, dar i de valoarea raportului colesterin:fosfolipide. n acela timp, n literatura de
specialitate persisit date insuficiente despre interdependena dintre raportul
colesterin:fosfolipide i rezistena spermatozoizilor la ocul termic. Ipoteza ocului termic a fost
dezvoltat n numeroase cercetri [42, 50, 92], care au demonstrat, c procesul dependent de
temperatur, care deruleaz la nivelul membranelor celulare la congelare este tranzacia fazic a
lipidelor, fiind considerat ca etap iniial n mecanismul ocului termic. Prevederile ipotezei
bine concordeaz cu criodeteriorrile determinate de tranzacia fazic a lipidelor, dar nu reflect
modificarea altor componente ale sistemelor criobiologice.
Datele prezentate n tabel denot, c CS i FL membranelor spermatozoizilor de coco sunt
supuse transformrilor sub aciunea temperaturilor negative. n membranele spermatozoizilor
nativi fosfolipidele constitue 44,80,05%, iar colesterina 36,50,29% din coninutul total de
lipide. Prelucrarea criotehnologic a spermei duce la majorarea coninutului FL n membranele
biologice pn la 79,40,26% (P<0,001) i la diminuarea procentului de CS pn la 11,10,25%
(P<0,001).
Concomitent, coraportul CS cu FL n membranele plasmatice, n mare msur, determin
fluiditatea i sensibilitatea membranelor [345]. Termorezistena membranelor, stabilit anterior i
raportul colesterin:fosfolipide sunt legate reciproc ntre ele, despre ce demonstreaz datele
obinute (tabelul 3.10). Acest raport este supus unor transformri semnificative n condiiile
crioconservrii. Analiza comparativ (figura 3.1 i 3.2) denot, c valoarea indicelui menionat
scade considerabil de la 0,815 pn la congelare la 0,139 dup decogelarea spermatozoizilor de
coco.
92










Fig. 3.1. Raportul colesterin/fosfolipidele n membranele spermei de cuco la crioconservare.
Raportul colesterin:fosfolipide
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
Membranele
native
Membranele
decongelate

Fig. 3.2. Raportul colesterin/fosfolipidele n membranele spermei de vier la crioconservare.
Conform lui E. Blesbois [173] fluiditatea membranar n materialul seminal proaspt
recoltat s-a dovedit a fi proporional cu raportul colesterin/fosfolipide i astfel, scderea
coraportului menionat servete i ca un indicator al particularitilor crioconservrii.
Modificarea cantitativ evident a raportului colesterin/fosfolipide are un rol important
adaptiv la funcionarea membranelor celulare [112]. Totodat, sunt cunoscute mecanisme de
adaptare, care modific componena membranelor la scderea temperaturii, dintre care i
sporirea nesaturrii acizilor grai [76]. Avnd n vedere, c coninutul acestor legturi se afl n
corelaie direct cu coninutul CS, putem meniona, c factorii crioconservrii influeneaz mai
puternic dect lipidele, la care pot fi adaptate membranele i n rezultat are loc modificarea
structurilor membranare. n acelai timp, aceast descretere poate avea loc n cazul formrii
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
Raportul colesterin:fosfolipide
Fara diluare
Duliat cu mediul
VIJ
Duliat cu mediul
VIJ + stabilizator
al membranelor
93
biocomplexelor ntre elementele membranei plasmatice i componenei mediilor crioprotectoare,
adic n componena biocomplexelor noi pot fi implicate FL mediului sintetic.
n contextul celor expuse, experienele efectuate au permis de a evidenia i a descrie
coninutul FL, gliceridelor i CS membranelor spermatozoizilor de coco n procesul
crioconservrii. Astfel, experimental este marcat majorarea autentic n spermatozoizi, dup
congelarea i decongelarea lor, a coninutului FL i scderea coninutului digliceridei-2 i
trigliceridelor. De asemenea, s-a stabilit scderea semnificativ a valorii raportului
colesterin:fosfolipide n procesul congelrii i decongelrii spermei, influennd la deplasarea
trecerilor fazice ale lipidelor membranelor spermatozoizilor.
*
*
*
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Membranele native Membranele decongelate
Lipidele membranelor spermatozoizilor de cocoi
fosfolipide
diglicerid-2
colesterina
trigliceride

Fig. 3.3. Lipidele membranelor spermatozoizilor de coco la crioconservare.
Not: *Diferenele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native i cele congelate-
decongelate.
Analiza comparativ a densitogramelor lipidelor din biomembranele spermatozoizilor de
coco i vier (figura 3.3 i 3.4) demonstreaz, n principiu, despre proprietile deosebite ale
componenei lipidice. n rezultatul densitometriei fotoplastinelor prelucrate cu componeni
lpidici ai spermiilor de coco sunt stabilite limitele de naintare a FL, digliceridei-2 i CS, la vier
a FL, digliceridei-2 i trigliceridelor. Coninutul FL i digliceridei-2 semnificativ difer ntre
spermatozoizii speciilor cercetate (P<0,001 i P<0,01 corespunztor). O particularitate
caracteristic este absena digliceridei-1 i scderea semnificativ a coninutului trigliceridelor n
spermatozoizii de coco dup congelare i decongelare, iar n spermii de vier, n condiii
similare, respectiv diglicerida-1 i CS. Totodat, procesul de crioconservare a spermei de coco
este nsoit de scderea n sperma congelat-decongelat a raportului colesterin:fosfolipide.
Scderea raportului colesterin:fosfolipide, practic, corespunde cu fluiditatea membranar,
94
predeterminat de acest raport i servete ca un bun indicator anticipat al proprietilor
materialului seminal pentru crioconservare, obinut de la diveri masculi din aceiai specie [173].
*
*
*
*
*
*
0
10
20
30
40
50
60
70
Fara diluare Duliat cu mediul
VIJ
Duliat cu mediul
VIJ + stabilizator
al membranelor
Lipidele membranelor spermatozoizilor de vier
fosfolipide
diglicerid-1
diglicerid-2
colesterin
trigliceride

Fig. 3.4. Lipidele membranelor spermatozoizilor de vier la crioconservare.
Datele prezentate n tabelul 3.10 demonstreaz, c procesul de crioconservare provoac
modificarea fizico-chimic a componenei lipidice a membranelor i concomitent, aceste
modificri ale diversitii lipidelor n direcia micorrii sau sporirii coninutului lor n parte, pot
fi explicate prin intermediul concepiei interaciunii CS cu alte componente de natur lipidic sau
proteic [142]. n acest caz, sporirea coninutului FL poate fi determinat prin formarea
complexelor colesterin-fosfolipidice, care coincide cu rezultatele diminurii CS. Scderea
coninutului CS n procesul crioconservrii spermei de coco se demonstreaz prin micorarea
numrului legturilor duble [117], care pot fi deteriorate sub influena factorilor de congelare-
decongelare a obiectului studiat.
n corespundere cu teoriile cunoscute despre organizarea molecular a membranelor,
lipidele n structura lor sunt prezentate, n general, ca substane amfipatice: FL, glicolipide,
lipoproteide i cholesterolul. FL, de exemplu, constituie 60-70% din lipidele totale ale
membranelor i sunt destul de labile ca componeni structurali ai celulelor. n legtur cu
aceasta, studierea FL i fraciilor lor are o semnificaie deosebit la clarificarea mecanismelor de
crioprotejare i criodeteriorare ale spermatozoizilor. Proprietile funcionale ale lipidelor sunt
determinate de componena lor i caracteristica fizico-chimic.
n membranele biologice componena lipidic integrat n matricele funcional particip la
iniierea programei de reglare celular [181]. Membrana plasmatic posed funcii unicale de
reglare a principalelor procese, care decurg n celul. FL menin activitatea mecanismelor
metabolice. n particular, metabolismul mineral i de oxidare biologic, iar de starea fazic a
95
lipidelor membranice depinde activitatea enzimelor membrano-conjuctoare i reacia celulei la
influena diferitor factori [57, 139].
FL tradiional se consider factorii naturali ai fertilitii. Din punct de vedere chimic, ele
sunt asemntoare cu moleculele trigliceridelor, ns n FL un acid gras este nlocuit cu eterul
acidului fosforic i cu diferiii substitueni. Deosebirile eseniale ale lor de trigliceride constau n
faptul, c FL nu reprezint surs energetic pentru organism, dar componeni structurali
principali ai membranelor celulare. Una dintre cele mai reprezentabile este FC, care include o
grup de substane, care difer prin componena acizilor grai n molecula lor. FL sunt substane
biologice active i contribuie la meninerea integritii sistemelor membranare ale celulelor, a
proceselor de difereniere, proliferare i regenerare ale lor. Participarea FC, ct i a altor FL este
stabilit i la reglarea activitii receptorilor membranari i enzimelor, la reglarea proceselor
metabolice intra- i extracelulare. FL sunt i componente structurale ale lipoproteinelor [178,
179]. Activitatea biologic a lor depinde de structura chimic, iar prezena lor este obligatorie
pentru realizarea normal a mobilitii spermatozoizilor i a meninerii reaciei acrozomale.
Modificarea coninutului FL determin schimbarea proprietilor fizico-chimice ale lor i
manifestarea reaciilor reglatoare, n rezultatul crora, spermatozoizii se adapteaz la condiiile
nefavorabile ale crioconservrii [110, 142].
FL fiind elemente structurale a lipoproteinelor determin starea biocomplexelor [110, 178].
Aceste lipide menin activitatea mecanismelor metabolice, cum ar fi: metabolismul ionilor i
oxidarea biologic de la starea fazei lipidice a membranelor, care depind de activitatea enzimelor
membranodependente i reacia spermatozoizilor la influena factorilor mediului ambiant [61].
n literatura de specialitate exist date despre sensibilitatea spermatozoizilor la temperaturile
hipotermice, care sunt studiate insuficient i numai unilateral, iar sensibilitatea lor este
determinat de coninutul FL, deoarece diferite subclase ale lor influeneaz variat asupra
transferului fazic i este condiionat de influena POL asupra activitii enzimelor
membranoconjugate, ceea ce determin rezistena obiectelor biologice la influena factorilor
extremali ai mediului ambiant.
Cercetrile efectuate de noi pentru determinarea FL n spermatozoizii nativi i deconservai
de coco au permis de a constata i a identifica ase fracii de FL SM, FC, FS, FEA, CL i
acidul fosfatidic (AF) (tabelul 3.11).
Din datele tabelului 3.11 se observ, c FL membranelor spermiilor nativi de coco sunt
reprezentate n cantitate mare de acidul fosfatidic (48,020,354%), FC (13,400,312%) i CL
(12,110,323%). Cercetarea fraciilor FL dup congelarea i decongelarea spermei de coco a
constatat tendina de majorare a cantitii fraciilor FL, cu excepia acidului fosfatidic i FS,
96
coninutul crora semnificativ scade. Procesul de crioconservare duce practic la absena fraciei
de CL.
Tabelul 3.11. Coninutul FL n membranele spermatozoizilor de coco la crioconservare
Coninutul fosfolipidelor (%) n Nr.
ctr.
Varietatea
fosfolipidului Membranele native Membranele decongelate
1. Sfingomielin 6,65 0,154 7,25 0,180
2. Fosfatidilcolin 13,40 0,312 19,41 0,054*
3. Fosfatidilserin 9,56 1,304 7,72 0,199
4. Fosfatidiletanolamin 10,24 0,175 20,60 0,147*
5. Cardiolipin 12,11 0,323 urme
6. Acid fosfatidic 48,02 0,354 46,01 0,289*
Not: *Diferenele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native i cele congelate-
decongelate.
n aa fel, n rezultatul cercetrilor efectuate este stabilit coninutul FL al membranelor
spermatozoizilor de coco n procesul crioconservrii. n baza datelor obinute, odat cu sporirea
coninutul FEA (cel mai nesaturat FL), mai mult dect de dou ori, n sperma deconservat
(P<0,001), se presupune, c are loc i majorarea coninutului de acizi grai nesaturai, ca rspuns
la aciunea temperaturilor sczute asupra spermei de coco. Cantitatea mare a acizilor grai
nesturai ai FEA determin o oxidare mai pronunat a FEA [76]. Modificarea coninutului
acizilor grai n procesul crioconservrii relev despre derularea proceselor reparative n
membranele spermatozoizilor. FEA, ca component structural al membranelor, este i activator
specific al enzimelor membranare i asigur activitatea antioxidativ a lipidelor [173].
Fracia anion (acid) a FL - acidul fosfatidic, majoritar n membranele spermiilor nativi i
decongelai, la diferene autentice (P<0,01), regleaz activitatea Ca
+2
i Na
+
, K
+
-ATP-azelor
necesare pentru meninerea echilibrului ionilor n celul [57]. Modificarea coninutului AF are
loc sub influena fosfolipazei D i a factorilor crioconservrii. Rata major a FL acide i, n
deosebi, a AF, a fost determinat i n eritrocite, dup alimentarea animalelor, n starea stresului
acut, prin suplimentarea raiei cu membranostimulatori i substane biologice active [80].
n acelai timp, AF este cel mai simplu dintre toate glicerofosfolipidele i el, poate fi
examinat ca baz structural a tuturor glicerofosfolipidelor. Din punct de vedere biochimic AF
este predecesorul glicerofosfolipidelor naturale. AF dispune de sarcin negativ n atomul de
oxigen al terminaiilor acidului fosforic, pH-ul natural al lui este acid i posed o vitez sporit n
reaciile metabolice [76].
97
Variaiile semnificative (P<0,001) a coninutului FC n procesul crioconservrii se produc
din contul scderii brute a CL, fapt ce poate fi determinat de rolul principal al FC n pstrarea
organizrii bistratare a membranelor biologice [76]. FC este principalul component structural al
membranelor majoritii celulelor i este localizat, prioritar, pe partea extern a bistratului, cu
sarcini electrice echilibrate i, astfel i pstreaz integritatea. Prin urmare, FC membranelor
plasmatice ale spermiilor au proprieti protectoare la ocul termic i nemijlocit particip la
inhibarea procesului de POL. Fosfatidilcolina, avnd o activitate metabolic nalt, capt o
semnificaie majorat n permeabilitatea membranelor, influeneaz metabolismul CS i are un
rol deosebit n procesul de POL [73]. Paralel, s-a demonstrat c FC posed proprieti de
nlturare sau restabilire a modificrilor aprute la crioconservare n membranele biologice
[110].
Un alt component este CL, care suport modificri eseniale la congelarea-decongelarea
spermei, este concentrat n stratul extern al membranelor mitocondriale i avnd dou
extremiti polare cu sarcini negative, particip activ la funcionarea lanului respirator [55].
Datorit structurii unicale, CL contribuie la formarea structurilor nebistratare i mobile, antrenate
n diferite procese celulare, inclusiv n funcionarea proteinelor membranare i este parte
component a lipoproteidelor [76].
Neschimbat rmne coninutul FS fosfolipid, care conine sulf i este necesar pentru
funcionarea normal a majoritii isoformelor proteinchinazei Ca
+2
i Na
+
,K
+
-ATP-azei,
sfingomielinazei i altor enzime [406]. Activarea FS, concomitent cu cea de activare a ATP-
azelor membranoconjugate, contribuie la meninerea gradientului de concentraie a ionilor dintre
celul i mediu [406]. De asemenea, FS are un rol deosebit n procesul apoptozei diferitor celule.
Mecanismele moleculare ale acestui fenomen sunt insuficient studiate, dar s-a menionat, c
apoptoza este o modalitate de renoire a celulelor, care poate fi realizat prin dereglarea
permeabilitii membranelor i modificarea proprietilor lor fizico-chimice [142]. n acelai
timp, coninutul FS pozitiv coreleaz cu mobilitatea spermatozoizilor de coco.
O tendin de sporire s-a nregistrat n coninutul SM, care are o semnificaie major n
modificarea proprietilor structurale i funcionale ale membranelor, este un glicerosfingolipid
i conine, n majoritate, terminaii ale acizilor grai sturai. SM este cel mai sturat FL, lipid
neutru, zwiterion. Sporirea coninutului SM contribuie la majorarea microviscozitii lipidelor
membranice, care s-a confirmat la analiza viscozitii bistratului lipidic al membranelor prin
intermediul zondelor fluoriscente. SM pozitiv coreleaz cu mobilitatea spermatozoizilor [47, 91].
Corelaii clare dintre coninutul SM n structurile membranare i mobilitatea fazei lipidice este
98
demonstrat la incubarea celulelor cu detergentul X-100. Coraportul SM/FC determin rezistena
osmotic a celulelor [142].
*
*
*
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Membranele native Membranele congelate-
decongelate
Fosfolipidele membranelor spermatozoizilor
de cocoi
Sfingomielin
Fosfatidilholin
Fosfatidilserin
Fosfatidiletanola
min
Cardiolipin
Acid fosfatidic

Fig. 3.5. Fosfolipidele membranelor spermatozoizilor de coco la crioconservare.
Not: *Diferenele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native i cele congelate-
decongelate.
Analiza densitogramelor (figura 3.5 i 3.6) a artat, c n spermatozoizii de coco sunt
nregistrate 5 varieti de FL, iar n cei de vier 4. n spermii de vier lipsete FS. Cercetrile
comparative a mrimilor punctelor culminante ale FL spermiilor de coco i vier au demonstrat
anumite particulariti de specie dup coninutul fraciilor FL. n aa fel, diferena n coninutul
FC, FEA i AF a spermatozoizilor de coco i vier sau dovedit a fi autentice. Concomitent, n
procesul congelrii i decongelrii spermei de coco i vier este deteriorat fracia CL.
Compararea cromatogramelor obinute demonstreaz prezena particularitilor calitative i
cantitative a componenei FL din spermatozoizii ambelor specii implicate n cercetate. Dintre FL
spermiilor de coco i vier n cantitate mare se conin FC, FEA i AF, care n spermatozoizii de
vier au un coninut mai sporit. Concentraia nalt a AF n spermii de vier 54,850,360%, relev
despre derularea distruciilor mult mai semnificative a membranelor lor i, concomitent, denot
despre posibiltatea iniierii proceselor de restabilire n membranele spermiilor la crioconservare.
n acelai timp, componentul minor al FL este SM, coninutul crei, practic, este identic la
ambele specii.
Procesul de congelare-decongelare a spermei de vier diluat duce la schimbri senificative a
tuturor fraciilor de FL, inclusiv a coninutului FL principale ale membranelor FC i FEA.
Prin urmare, n rezultatul cercetrilor ndeplinite sunt evideniate particularitile de specie a
coninutului FL n membranele spermatozoizilor de coco i vier n procesul crioconservrii.
99
*
*
*
*
*
*
*
*
0
10
20
30
40
50
60
Fara diluare Duliat cu mediul
VIJ
Duliat cu mediul
VIJ + stabilizator
al membranelor
Fosfolipidele membranelor spermatozoizilor
de vier
Sfingomielin
Fosfatidilholin
Fosfatidilserin
Fosfatidiletanolamin
Acid fosfatidic

Fig. 3.6. Fosfolipidele membranelor spermatozoizilor de vier la crioconservare.
Este necesar de luat n consideraie, c stabilizarea fraciilor FL ale gameilor de vier mai
bine se realizeaz la folosirea pentru diluarea i congelarea spermei a mediului elaborat de ctre
Institutul Unional de Zootehnie cu stabilizator pentru membrane.
Rezultatele obinute se afl n concordare cu comunicrile [112] i demonstreaz
variabilitatea diferenelor reactive ale FL la influena factorilor de crioconservare.
Astfel, totalizarea datelor experimentale i ale analizei literaturii de specialitate
demonstreaz, c activitatea funcional a spermatozoizilor, n mare msur, se determin, att de
coninutul FL, ct i de coninutul i raportul fraciilor FL. Influena factorului hipotermic
provoac modificrii eseniale a tuturor parametrilor lipidici. Aceasta demonstreaz importana
biologic a reaciei lipidelor la influena factorilor de criconservare.
Alte componente lipidice ale biomembranelor sunt cerebrozidele. Aceste lipide se refer la
glicolipidele neutre, care sunt prezentate, n general, ca substane amfipatice i sunt unul dintre
componenii de baz ai membranelor plasmatice [32].
Prezena lor n toate celulele vii, activitatea metabolic, structura amfipatic (prezena n
structura moleculei a subunitilor polare i nepolare) i fiind ca elemente structurale i integrale
ale tuturor membranelor biologice, demonstreaz actualitatea cercetrii cerebrozidelor -
componente biochimice ale spermatozoizilor.
Reieind din cele menionate, n cercetrile ulterioare a fost determinat componena
cerebrozidelor membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de coco n procesul
crioconservrii. n rezultatul cercetrilor efectuate s-a stabilit c, cerebrozidele determinate n
membranele spermatozoizilor nativi i decongelai sunt reprezentate de 6 fracii. Rezultatele
cercetrilor se prezint n tabelul 3.12.
100
Tabelul 3.12. Coninutul cerebrozidelor membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de coco
la crioconservare
Coninutul cerebrozidelor (%) n Nr.
ctr.
Varietatea
cerebrozidelor Membranele native Membranele decongelate
1. Cerebrozide - fracia 1 31,270,740 28,800,099*
2. Cerebrozide - fracia 3 19,740,510 37,480,842*
3. Cerebrozide - fracia 5 13,870,430 6,920,092*
4. Cerebrozide - fracia 6 15,000,170 11,270,317*
5. Cerebrozide - fracia 7 7,820,198 7,710,260
6. Cerebrozide - fracia 8 12,280,357 7,810,190*
Not: *Diferenele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native i cele congelate-
decongelate.
Din datele tabelul 3.12 reiese, c printre cerebrozidele membranelor plasmatice ale
spermatozoizilor nativi i decongelai de coco, prevaleaz coninutul cerebrozidelor fraciilor 1,
2, i 6, constituind mai mult de 50% din cantitatea total a lor. n procesul congelrii i
decongelrii spermei de coco s-au produs schimbri eseniale n coninutul fraciilor
cerebrozidelor. n particular, coninutul cerebrozidelor fraciei 3 s-a majorat de la 19,740,510
pn la 37,480,842% (P<0,001), n defavoarea coninutul cerebrozidelor fraciilor 5 i 8, care s-
a micorat, corespunztor, de la 13,870,430 pn la 6,920,092% (P<0,001) i de la
12,280,357 pn la 7,810,190% (P<0,001). n membranele plasmatice ale spermiilor nativi i
crioconsevai de coco se conine o cantitate, practic, egal a cerebrozidelor din fracia 7.
*
*
*
*
*
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Membranele native Membranele congelate-
decongelate
Cerebrosidele membranelor
spermatozoizilor de coco
Cerebrosida-1
Cerebrosida-3
Cerebrosida-5
Cerebrosida-6
Cerebrosida-7
Cerebrosida-8

Fig. 3.7. Cerebrozidele membranelor spermatozoizilor de coco la crioconservare.
Not: *Diferenele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native i cele congelate-
decongelate.
101
Analiza comparativ a densitogramelor (figura 3.7 i 3.8) a permis de a stabili i determina
particulariti evideniate de specie. n membranele plasmatice ale spermatozoizilor de coco nu
au fost depistate fraciile 2 i 4 ale cerebrozidelor, comparativ cu prezena lor n cele de vier. Prin
urmare, aceste fracii ale cerebrozidelor sunt specifice numai speciei respective. Studiul
comparativ al componenei cerebrozidice al membranelor plasmatice a spermatozoizilor de
coco i vier n procesul crioconservrii a depistat valori variate ale coninutului cerebrozidelor
fraciilor 3, 5, 6, 7 i 8.
*
*
*
*
*
*
*
*
*
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Fara diluare Duliat cu mediul
VIJ
Duliat cu mediul
VIJ + stabilizator
al membranelor
Cerebrosidele membranelor spermatozoizilor
de vier
Cerebroside-1
Cerebroside-2
Cerebroside-3
Cerebroside-4
Cerebroside-5
Cerebroside-6
Cerebroside-7
Cerebroside-8

Fig. 3.8. Cerebrozidele membranelor spermatozoizilor de coco la crioconservare.
Not: *Diferenele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native i cele congelate-
decongelate.
Prin urmare, n rezultatul cercetrilor efectuate este descris spectru cerebrozidic al
membranelor plasmatice native i congelate-decongelate ale spermatozoizilor de coco.
Concomitent, sunt elucidate i aciunile mediului sintetic utilizat i a stabilizatorului
membranelor n componena mediului sintetic, asupra coninutului cerebrozidelor n membranele
plasmatice ale spermatozoizilor de vier n procesul crioconservrii. n particular, folosirea
mediului sintetic elaborat de ctre Institutului Unional de Zootehnie a determinat o stabilizare
mai bun a fraciilor cerebrozidice, n comparaie cu mediul, care coninea stabilizator al
membranelor.
n acelai timp, au fost depistate particularitile calitative i cantitative de specie n
coninutul fraciilor cerebrozidice. S-a stabilit, c n condiii analogice de efectuare a experienei
coninutul total al cerebrozidelor membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de coco este
mult mai majorat (de 6 ori) dect cel din membranele spermatozoizilor de vier.
102
Modificarea coninutului cerebrozidelor membranare (sporirea coninutului cerebrozdelor
fraciei 3 i deminuarea coninutului cerebrozidelor fraciilor 5, 6, i 8) este provocat de factorul
crioconservrii, dar aceste modificri se produc n diferite direcii neidentice. Direcionri
similare a modificrilor lipidelor sunt determinate n eritrocite n methemoglobinemia
experimental [32, 76]. n acest caz, modificarea coninutului cerebrozidelor tot este determinat
de proprietile fizico-cimice difereniate ale acestor lipide.
Lipidele sunt substane uor oxidabile, de aceea metabolismul lor, activitatea enzimelor
lipid-dependente, viteza proliferrii i permiabilitatea membranelor sunt determinate de nivelul
POL [264]. Lipidele asigur rezerva de energie, sinteza unor vitamine eseniale, termoreglarea
fizic i reglarea activitii enzimelor membranoconjugate. Concomitent, moleculele lipidelor
coninnd grupe hidrofobe nepolare i hidrofile pot interaciona cu diferii componeni i,
respectiv, pot participa la realizarea numeroaselor funcii ale membranelor [319, 384].
Ca consecin a peroxidrii extinse a lipidelor, reaciile de oxidare specific (ROS) n mod
constant produc produse, care influeniaz n detrimentul capacitii de fertilizare a spermei [148,
375, 387]. Anionii de superoxid, peroxidul de hidrogen i radicalii hidroxili sunt unele majore,
dintre cele prezente n plasma seminala la ROS. Avnd n vedere creterea produciei de ROS,
apare stresul oxidativ, care duce la dezechilibrul dintre pro-oxidani i anti-oxidani [148, 404].
n condiii fiziologice, organismul dispune, de obicei, de rezerve suficiente antioxidative pentru
neutralizarea produselor ROS [186]. Cu toate acestea, atunci cnd ROS depesc capacitatea
organismului de producie a AO se dezvolt stresul oxidativ. Stresul oxidativ reduce numrul de
spermatozoizi, scade mobilitatea spermiilor i sporete procentul de celule moarte [148, 151,
375, 387].
POL este o condiie necesar pentru funcionarea normal a celulelor. Meninerea POL la
nivelul constant se realizeaz de ctre sistemele fizico-chimice de reglare, existena crora este
demonstrat, att la nivel experimental, ct i celular. Parametrele acestui sistem de reglare la
toate nivelele de organizare a sistemului biologic sunt activitatea antioxidativ i componena
lipidelor, aptitudinea lor de a se oxida [142]. n condiii fiziologice, spermatozoizii produc o
cantitate mic de produse ale procesului de POL, cum ar fi anionul de superoxid, care are un rol
foarte important n reaciile de capacitaie i acrozomale [148].
Nivelul ridicat al acizilor grai polinesaturai n membrana plasmatic i citoplasma
spermatozoidului sporete vulnerabilitatea lui la atacul ROS [154]. Prin urmare, producerea
excesiv de ROS este una dintre cauzele de baz ale infertilitii [151, 371]. Reieind din cele
expuse, n experinele efectuate, intensitatea POL n sperma de coco a fost apreciat prin
103
coninutul produselor iniiale, intermediare i finale ale acestui proces. Rezultatele cercetrii sunt
prezentate n tabelul 3.13.
Tabelul 3.13. Coninutul produselor POL n sperma de coco la etapele crioconservrii
Produsele peroxidrii lipidelor Nr.
ctr.
Etapa
tehnologic a
crioconservrii
Conjugatele dienice,
u.e.
Hidroperoxizi,
u.e.
Dialdihida malonic,
nMol/mlrd
1. Diluare 3,8 0,39 0,26 0,20 38,6 7,82
2. Refrigerare 2,1 0,06 0,3 0,02 40,2 1,08
3. Decongelare 4,0 0,47 0,72 0,02 67,0 2,48*
Not: *Diferena este statistic autentic.
Din tabelul 3.13 reiese, c coninutul produselor POL variaz semnificativ. n sperma
diluat de coco majoritatea constituie DAM - 38,67,82 nMol/mlrd, urmat de conjugatele
dienice cu 3,80,39 u.e. i hidroperoxizii cu 0,260,20 u.e. Procesul de crioconservare a spermei
provoac majorarea autentic numai a coninutului DAM pn la 67,02,48 nMol/mlrd (P<0,01).
n acest caz putem constata c coninutul i modificarea produselor POL att n sperma diluat,
ct i cea deconservat, prioritar, sunt determinate de DAM.
Astfel, acest indice biochimic poate fi folosit ca marcher specific al intensitii procesului
POL i strii fizico-chimice a lipidelor i, implicit a spermatozoizilor. n acelai timp, Gomez i
al. [228] au raportat c cantitatea produselor POL n spermatozoizi este invers proporional cu
calitatea iniial a spermei. Peroxidul de hidrogen este cel mai major produs al POL n
spermatozoizi, care provoac imobilitatea spermiilor prin diminuarea intracelular a ATP i
ulterior a proteinelor axonemale [319]. Nivelul ridicat a peroxidului de hidrogen duce la POL i,
n cele din urm, la moartea celulelor.
3.2.2. Componena proteinelor i aminoacizilor spermatozoizilor, membranelor i ai
plasmei spermatice.
n corespundere cu relatrile contemporane, membranele celulare reprezint structuri
mozaice i lichid-cristalice, care sunt formate din stratul bimolecular al lipidelor, unde spaial
sunt localizate proteinele.
Conform structurii lichid-mozaice, moleculele proteinelor globulare sunt situate n matricea
lipidic n modul, care stabilesc contactarea cu mediul acvatic a grupelor polare i ionizate i
asigur interaciunea specific a FL cu proteinele membranare [61]. Acest model corespunde
construciei dinamice, dar nu staticii membranelor biologice, ceea ce nu infirm principiul de
baz al termodinamicii i, concomitent, evideniaz tipurile principale ale interaciunilor
hidrofobe i hidrofile ale componenilor.
104
O deosebit importan la studierea strii proteinelor i revine efectului hidrofob, care
determin coagularea proteinelor i are un rol deosebit n reglarea stabilizrii biomoleculelor.
Denaturarea termic la perderea rezistenei de ctre proteine la temperaturile joase, la fel, este
determinat de efectul hidrofob. n legtur cu aceasta, o atenie deosebit se acord studierii
termodinamicii proteinelor, efectului hidrofob i denaturrii proteinelor la nivelul atomilor [192].
Proteinele i lipidele n membranele biologice interacionnd prin legturile hidrofobe,
hidrofile, ionice i hidrogene, precum i cele ale metalelor bivalente, formeaz complexe
lipoproteice. n acest caz rolul legturilor covalente este neesenial. Caracterul interaciunii
proteinelor, lipidelor i glucidelor, n mare msur, depinde de condiiile mediului. Astfel,
proteinele localizate pe ambele pri ale membranelor se leag cu stratul bilipidic, n general, din
contul interaciunei electrostatice, dar aceste legturi sunt destul de labile [82].
Temperatura mediului ambiant manifest o aciune semnificativ asupra dinamicii
componenilor membranelor plasmatice ale celulei [42] i poate provoca modificri criogenice a
proteinelor. Avnd n vedere c componentele principale ale biomembranelor sunt proteinele i
lipidele, studierea modificrii criogenice a lor prezint un deosbit interes. Este cunoscut c,
proteinele citoscheletului, care se deterioreaz la crioconservare, se consider a fi punctul forte
central, care determin stabilitatea celulelor i, astfel stabiliznd citoscheletul se poate influena
benefic rezultatele crioconservrii [393].
Scderea temperaturii iniieaz trecerile fazice ale lipidelor anulare. n zona temperaturilor
joase majoritatea lipidelor trec n stare de gel i se schimb funciile de barier ale membranelor
[42]. ns, pn n prezent, reacia componenilor proteici la aciunea factorilor extremali ai
mediului este studiat insuficient, adic rmne neclar modalitatea schimbrii strii structurale a
membranei i a proteinelor membranice n aceste condiii.
Reieind din cele menionate n experienele ulterioare s-a supus cercetrilor spectrul proteic
al spermei de coco i posibilitile de stabizare a coninutului de proteine n sperm la
congelarea-decongelarea ei (tabelul 3.14).
Datele tabelului 3.14 arat, c dintre fraciile proteice determinate att n plasm, ct i n
spermatozoizi predomin albuminele respectiv, cu 47,8 i 54,3%. - i -globulinele s-au
depistat n cantiti minore. n sperma nativ de coco globulinele nu au fost depistate.
Procesul de crioconservare a spermei de coco provoac scderea coninutului de albumine.
Acest fenomen poate fi argumentat ca rezultat al deteriorrii proteinelor la etapele tehnologice
sau n procesul crioconservrii spermei i, n special, a albuminelor. De exemplu, la diluarea
spermei cu medii sintetice, deseori apar efecte nedorite, de la aglutinarea spermatozoizilor pn
la iniierea prematur a reaciei acrozomale. Se presupune, c cauza producerii acestor fenomene
105
este produs de diminuarea concentraiei proteinelor cationice cu sarcin pozitiv n plasma
seminal, care absorbindu-se pe suprafaa negativ a membranelor citoplasmatice manifest o
funcie protectoare [141].
Tabelul 3.14. Spectrul proteic al spermei de coco n condiiile criconservrii
Sperma
nativ
Sperma
crioconservat
Nr.
ctr.
Fraciile
proteice
mg/ml/mlrd % mg/ml/mlrd %
Plasm
1. Albumine 6,0 2,45 47,8 4,8 1,90 46,3
2. - globuline 2,8 0,88 22,1 1,5 0,21 14,5
3. - globuline 3,8 1,08 30,1 2,6 0,50 25,0
4. globuluine urme urme 1,5 0,23 14,2
5. Proteine totale 12,5 100 10,4 100
Spermatozoizi
1. Albumine 11,8 0,47 54,3 2,1 0,91* 9,6
2. - globuline 2,7 1,53 12,4 1,2 0,12 5,5
3. - globuline 1,9 0,85 9,0 0,6 0,08 2,8
4. globuluine 5,3 0,70 24,3 17,9 1,08* 82,1
5. Proteine totale 21,6 100 21,9 100
Total 34,2 22,2 -
Not: *Diferenele sunt statistic autentice comparativ cu sperma nativ: *P<0,001.
De asemenea, se presupune, c proteinele pot aciona asupra strii de agregare a FL
membranare i menin configuraia suprafeei lipidelor, prin care protejeaz membranele
citoplasmatice de deteriorare n procesul crioconservrii. [42, 61].
Apariia -globuluinelor n plasma spermei de coco decongelat, majorarea considerabil a
lor n spermatozoizi (P<0,001) i diminuarea brusc a albuminelor n gamei (P<0,001) permite
de a remarca, c temperaturile joase pot induce translocarea, agregarea i dezagregarea
proteinelor. La manifestarea concret a acestor dereglri contribuie micorarea viscozitii
bistratului lipidic, ceea ce duce la dereglarea proprietilor bariere ale membranei plasmatice n
procesul criconsevrii [61]. n acest context, unii autori propun suplimentarea mediilor sintetice
cu proteine, care prelungesc mobilitatea spermatozoizilor i pot servi ca stimulatori ai ei [403],
iar alii au demonstrat, c dintre adaosurile proteice n componena mediilor pentru
crioconservarea spermei de coco, mai eficiente sau dovedit a fi mucoproteinele i albuminele n
diverse concentraii [81].
106
Este cunoscut c proteinele membranelor biologice difer prin coninutul AA, enzimelor i
masa molecular [137, 313]. Studierea coninutului AA n spermatozoizii animalelor agricole
capt o importan major, ntruct AA pot forma molecule proteice specifice, participnd n
iniierea proceselor de fecundare. Este important de menionat, c AA i derivaii lor particip n
reglarea metabolismului, funciei organelor i esuturilor organismului. Funciile reglatoare ale
AA i derivailor lor sunt elucidate prin polifuncionalitatea lor chimic [137].
n legtur cu aceasta, cercetrile particularitilor specifice ale AA n membranele
plasmatice a spermatozoizilor nativi i congelai-decongelai de coco i vier prezint un interes
deosebit pentru depistarea mecanismelor de criodeteriorare a spermiilor i condiiilor de
stabilizare a componenilor structurali ai membranelor plasmatice n procesul de elaborare a
metodelor efeciente de crioconservare a spermei.
Scopul cercetrilor prezente stabilirea componenei AA a membranelor plasmatice, izolate
ale spermatozoizilor nativi i decongelai de coco i vier (tabelele 3.15 i 3.16). Analza
aminogramelor obinute au permis de a constata n membranele plasmatce ale spermatozoizilor
de coco 16 AA, precum i amoniac i uree (dervai ai AA).
Din datele tabelului 3.15 se constat, c n membranele plasmatice native ale
spermatozoizilor de coco mai mult se conin AA din grupa hidrofob, 33,550,171% i
34,530,241% n membranele decongelate (P<0,05). Dintre aceti AA, att pn la conservare,
ct i dup decongelare n concentraie major sunt valin i leucina, cantitatea crora scade,
corespunztor, de la 8,330,187 i 10,370,734% n membranele plasmatice ale
spermatozoizilor nativi pn la 7,570,095 (P<0,01) i 9,480,614% (P<0,05) n membranele
spermatozoizilor congelai-decongelai. Prin coninut minor este reprezentat tirozina 2,610,049
4,650,888%, corespunztor strii membranelor i metionina n form de urme.
Pe locul doi se afl coninutul AA din grupa neutr, care constituie 26,660,199 i
25,040,066%, corespunztor, n membranele spermatozoizilor nativi i decongelai. Este
necesar de accentuat, c coninutul tuturor AA din aceast grup, practic, se afl la acela nivel,
cu excepia prolinei, care constituie 1,660,380 i 1,980,156%.
AA grupelor acidice i bazice n membranele spermatozoizilor nativi sunt prezentai de
18,100,642 i 22,240,222%. n membranele plasmatice ale spermatozoizilor congelai-
decongelai s-a stabilit majorarea coninutului AA acidici i scderea celor bazici.
Astfel, cercetrile efectuate au permis de a descrie componena AA n membranele
plasmatice ale spermatozoizilor nativi i congelai-decongelai de coco. n acelai timp, s-a
dovedit, c dintre tot spectrul AA cea mai mare valoare a coninutului revine AA din grupa
107
hidrofob, ceea ce coreleaz cu datele literaturii referitoare la natura i efectul hidrofob al
proteinelor membranice [60, 82].
Tabelul 3.15. Coninutul AA n membranele plasmatice a spermatozoizilor de coco la
crioconservare
Coninutul aminoacizilor (%) n:
Nr.
ctr.

arieti (grupe) ale
aminoacizilor

Denumirea
aminoacidului
Membranele
native
Membranele
congelate-
decongelate
Lizin 7,32 0,375 6,95 0,268
Histidin 6,81 0,329 4,24 0,382
Arginin 8,11 0,441 8,38 0,251
1. Aminoacizi bazici
Total 22,24 0,222 19,57 0,177*
Asparigin 8,02 0,539 7,72 0,399
Glutamin 10,08 0,529 12,70 0,529
2. Aminoacizi acizi
Total 18,10 0,642 20,42 0,331*
Trionin 7,54 0,850 6,76 0,060
Serin 5,40 0,256 4,55 0,109
Prolin 1,66 0,380 1,98 0,156
Glicin 5,98 0,053 5,75 0,206
Alanin 6,08 0,240 6,00 0,167
3. Aminoacizi neutri
Total 26,66 0,199 25,04 0,066*
Metionin Urme Urme
Valin 8,33 0,187 7,57 0,095
Izoleucin 5,76 0,309 5,90 0,262
Leucin 10,37 0,734 9,48 0,614
Tirozin 2,61 0,049 4,65 0,888
Fenilalanin 6,48 0,246 6,93 0,459
4. Aminoacizi hidrofobi
Total 33,55 0,171 34,53 0,241*
5. Derivi ai aminoacizilor Amoniac 0,92 0,041 0,69 0,142
Uree Urme Urme
Total 100,47 0,146 100,25 0,132
Not: *Diferenele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native i cele decongelate.

Pentru analiza comparativ a AA din membranele plasmatice ale spermatozoizilor n tabelul
de mai jos se prezint componena AA determinai n membranele plasmatice ale
spermatozoizilor de vier la crioconservare (tabelul 3.16).
108
Tabelul 3.16. Coninutul AA n membranele plasmatice ale spermatozoizilor de vier la
crioconservare
Coninutul aminoacizilor (%) n:
Nr.
ctr.

Varieti (grupe) ale
aminoacizilor

Denumirea
aminoacidului
Membranele
native
Membranele
congelate-
decongelate
Lizin 6,90 1,591 5,89 0,670
Histidin 6,95 1,846 6,13 0,504
Arginin 33,24 0,812 30,76 5,895
1. Aminoacizi bazici
Total 47,09 0,847** 42,76 1,964
Asparigin 5,91 0,836 6,79 1,022
Glutamin 7,42 2,335 8,92 0,826
2. Aminoacizi acizi
Total 13,33 1,240** 15,71 0,657
Trionin 3,30 0,441 3,66 0,802
Serin 4,01 0,377 4,54 0,254
Prolin 3,21 0,152 3,29 0,583
Glicin 3,19 0,434 4,33 0,268
Alanin 3,23 0,161 3,16 0,581
3. Aminoacizi neutri
Total 16,94 0,151** 18,98 0,241*
Metionin 0,54 0,164 0,42 0,231
Valin 2,90 0,678 3,39 0,816
Izoleucin 2,51 0,929 3,31 0,798
Leucin 4,06 1,256 5,05 1,255
Tirozin 5,70 0,695 3,81 1,037
Fenilalanin 4,29 0,591 4,34 0,815
4. Aminoacizi hidrofobi
Total 20,00 0,095** 20,32 0,334
5 Derivate ale aminoacizilor Amoniac 2,64 0,410 2,21 0,348
Total 100,01 0,309 99,98 0,428
Not: *Diferenele sunt statistic veridice dintre indicii membranelor native i cele decongelate.
**Diferenele de specie sunt statistic autentice.
Din datele tabelului 3.16 se constat modificri semnificative ale coninutului grupelor de
AA dup crioconservarea spermei de vier.
La anliza comparativ s-a stabilit, c dintre AA membranelor plasmatice ale
spermatozoizilor de coco prevaleaz coninutul AA hidrofobi, iar n membranele plasmatice ale
spermatozoizilor de vier coninutul AA bazici. O particularitate deosebit constituie coninutul
nalt al argininei (33,240,812%) n membranele spermiilor de vier, comparativ cu cel din
membranele plasmatice ale spermatozoizilor de coco (8,110,441%). La ambele specii studiate
109
n minoritate sunt prezentate grupele AA acidici, care constituie 18,100,642% n membranele
plasmatice ale spermatozoizilor de coco i 13,331,240% n membranele plasmatice ale celor
de vier. AA neutri n membranele plasmatice ale spermatozoizilor de coco i vier sunt
prezentai, corespunztor, de 26,660,199 i 16,940,151%. Totodat, se constat i schimbri
cantitative criogenice a spectrului aminoacidic studiat.
Astfel, datele obinute n cercetrile de mai sus demonstreaz prezena particularitilor
specifice de specie a coninutului AA n membranele plasmatice ale spermatozoizilor de coco i
vier. n particular, coninutul AA hidrofobi i neutri n membranele plasmatice ale
spermatozoizilor de coco este cu 1,5 ori mai mic, ceea ce indic la prezena interaciunilor
hidrofobe mult mai slabe ntre proteinele i lpidele membranelor plasmatice ale spermatozoizilor
de vier.
Potrivit relatrilor literaturii de specialitate, menionate n capitolul 1, interesul cu privire la
cercetrile elementelor structurale ale proteinelor - AA este argumentat prin faptul, c prin
intermediul lor se realizeaz legturile lor cu alte substane. De exemplu, la existena particulelor
hidrofobe pe suprafaa proteinei poate avea loc formarea complexelor proteinlipidice ale
membranelor. Anume descompunarea complexului lipoproteic n procesul congelrii celulelor
este cauza principal a deteriorrilor n procesul congelrii-decongelrii celulelor. n special,
sistemele lipoproteice sunt legate cu mitocondrii i membranele plasmatice i la deteriorare se
modific activitatea enzimatic i proprietile de barier ale membranelor.
Reieind din cele expuse, cercetrile AA i proteinelor n spermatozoizii nativi i congelai-
decongelai reprezint un interes deosebit pentru determinarea mecanismelor de criodistrucie a
obiectelor biologice. n particular, studierea componenei AA spermatozoizilor de coco i vier,
att n sperma nativ, ct i dup congelare i decongelare permite de a stabili particularitile
criogenice i de specie.
Rezultatele cercetrilor AA structurali ai proteinelor spermatozoizilor de coco au stabilit
prezena a 16 aminoacizi (tabelul 3.17).
Datele tabelului 3.17 denot c n spermatozoizii nativi de coco cantitatea cea mai mare de
AA revine celor hidrofobi 30,880,296%, coninutul procentual al cror scade n spermatozoizii
decongelai pn la 22,830,040%. Dintre varietile acestei grupe, cel mai nalt coninut n
spermatozoizii nativi este ocupat de valin (7,951,720%) i izoleucin (10,33,096%), care
dup congelarea i decongelarea spermei se reduce pn la 4,900,096 (P<0,05) i 3,390,107%
(P<0,001) corespunztor. n minoritate sunt prezente metionina i leucina, coninutul crora se
modific, respectiv, n spermatozoizii nativi i decongelai de la 0,75 0,315 pn la
0,290,103% (P<0,05) i de la 2,45 0,223 pn la 6,40 0,157% (P<0,001).
110
Tabelul 3.17. Coninutul AA n spermatozoizii de coco la crioconservare
Coninutul aminoacizilor (%) n:
Nr.
ctr.

Varieti (grupe) ale
aminoacizilor

Denumirea
aminoacidului
Spermatozoizii
nativi
Spermatozoizii
congelati-
decongelai
Lizin 5,68 0,092 4,90 0,053
Histidin 0,56 0,054 2,36 0,032
Arginin 18,30 0,528 18,82 0,365
1. Aminoacizi bazici
Total 24,54 0,179 26,08 0,123*
Asparigin 6,26 0,433 8,48 0,163
Glutamin 11,28 0,389 16,95 0,207
2. Aminoacizi acizi
Total 17,54 0,291 25,43 0,132*
Trionin 5,31 0,419 5,05 0,493
Serin 6,36 0,786 5,52 0,530
Prolin 1,74 0,124 3,29 0,109
Glicin 7,75 0,169 6,27 0,302
Alanin 5,69 0,520 3,74 0,086
3. Aminoacizi neutri
Total 26,85 0,210 23,87 0,160*
Metionin 0,75 0,315 0,29 0,103
Valin 7,95 1,720 4,90 0,096
Izoleucin 10,33 0,096 3,39 0,107
Leucin 2,45 0,223 6,40 0,157
Tirozin 4,26 0,175 4,08 0,052
Fenilalanin 5,14 0,103 3,77 0,039
4. Aminoacizi hidrofobi
Total 30,88 0,296 22,83 0,040*
5. Derivai ai
aminoacizilor
Amoniac 0,63 0,017 1,80 0,076*
Total 100,44 0,094 100,01 0,057
Not: *Diferenele sunt statistic autentice dintre indicii gameilor nativi i a celor decongelai
Coninutul AA neutri n spermatozoizii nativi constituie 26,850,210%, care scade n
spermatozoizii congelai-decongelai pn la 23,870,160%. Aici, pe fonul scderii acestor AA
are loc mrirea coninutlui prolinei de la 1,740,124% pn la 3,290,109%. Procentul AA, care
fac parte din grupurile acidice i alcaline, n spermatozoizii nativi este, corespunztor, de
17,540,291% i 24,540,179%, ce suport respectiv modificri n celulele decongelae pn la
25,430,132% i 26,080,123%, corespunztor. Printre AA grupei alcaline este stabilit un
coninut nalt al argininei (18,30 0,528%) i o cantitate mic de histidin (0,560,054%).
111
Astfel, cercetrile efectuate au permis de a stabili componena AA din proteinele
spermatozoizilor de coco n procesul crioconservrii. Este demonstrat, c la congelarea-
decongelarea spermei are loc scderea AA neutri i hidrofobi i majorarea AA acidici i alcalini.
n scop comparativ, a fost studiat i coninutul AA n spermatozoizii de vier la
crioconservare (tabelul 3.18).
Tabelul 3.18. Coninutul AA n spermatozoizii de vier la crioconservare
Coninutul aminoacizilor (%) n:
Nr.
ctr.

Varieti (grupe) ale
aminoacizilor

Denumirea
aminoacidului
Spermatozoizii
nativi
Spermatozoizii
congelati-
decongelai
Lizin 2,82 0,197 6,29 0,007
Histidin 3,93 0,305 3,37 0,065
Arginin 18,70 3,389 15,41 0,558
1. Aminoacizi bazici
Total 25,45 1,136 25,07 0,187
Asparigin 8,91 0,175 8,78 0,225
Glutamin 12,79 0,613 11,86 0,092
2. Aminoacizi acizi
Total 21,70 0,319** 20,64 0,121*
Trionin 5,13 0,064 5,01 0,092
Serin 5,19 0,305 5,27 0,302
Prolin 7,08 0,537 5,31 0,180
Glicin 6,99 0,590 6,14 0,802
Alanin 4,79 0,614 4,41 0,044
3. Aminoacizi neutri
Total 29,18 0,210** 26,14 0,176*
Metionin 0,49 0,026 0,98 0,210
Valin 4,92 0,085 4,85 0,049
Izoleucin 4,48 0,234 11,59 0,253
Leucin 6,64 0,330 3,08 0,189
Tirozin 2,11 0,228 4,84 0,127
Fenilalanin 4,54 0,155 0,48 0,208
4. Aminoacizi hidrofobi
Total 23,18 0,082** 25,82 0,076*
5. Derivai ai aminoacizilor Amoniac 0,48 0,076 1,68 0,060*
Total 99,99 0,241 99,35 0,059
Not: *Diferenele sunt statistic autentice dintre indicii spermatozoizii nativi i decongelai.
**Diferenele de specie sunt statistic autentice.
Analiza comparativ a componenei AA din proteinele spermatozoizilor nativi i congelai-
decongelai de coco i vier (tabelele 3.17 i 3.18) a stabilit diferene cantitative ntre coninutul
de AA. n particular, n spermatozoizii nativi de coco cea mai mare cantitate de AA ocup AA
112
hidrofobi, iar n spermatozoizii de vier prevaleaz AA neutri. n acelai timp, att n
spermatozoizii de coco, ct i n cei de vier componentele minore ale proteinelor sunt AA aciz.
La analiza aminogramelor proteinelor gameilor de coco i vier s-a stabilit, c concentraia
AA n spermatozoizii de coco este mai mare, comparativ cu cea din spermii de vier, care
implicit denot rezistena mai nalt a spermatozoizilor de coco la temperaturile sczute.
n legtur cu faptul, c plasma spermatic este veriga de legtur, care asigur
spermatozoizii cu AA i transportul lor prin membranele plasmatice, ulterior a fost studiat
coninutul AA liberi ai plasmei seminale de coco i vier n procesul de congelare-decongelare.
Cercetrile consacrate studierii coninutului AA liberi din plasma spermei animalelor
agricole prezint un interes major, deoarece prin intermediul lor se realizeaz legtura
spermatozoizilor cu mediul extern. n acest context, scopul cercetrilor prezentate a fost
investigarea AA liberi din plasma spermei de coco la crioconservare i, concomitent, stabilirea
particularitilor de specie a coninutului AA liberi din plasma spermei de coco i vier la
crioconservare (tab. 3.19 i 3.20).
Rezultatele cercetrilor, prezentate n tabelul 3.19 denot, c plasma spermei de coco este
prezentat de 20 AA i 4 derivai ai lor. Dintre AA plasmei spermei n cantitate major sunt AA
acidici - 597,0255,638 mg/100 ml n plasma nativ i 709,1065,657 mg/100 ml n plasma
crioconservat. n ambele condiii, aceti AA sunt prezentai n majoritate de acidul glutamic,
care constituie n plasma nativ a spermei 88,871,749% i 86,7830,286% (tabelul 3.22). AA
grupelor alcaline, neutre i hidrofobe, att n plasma nativ, ct i n plasma spermei congelate-
decongelate sunt reprezentai de o cantitate minor.
Procesul congelrii i decongelrii spermei de coco este nsoit de majorarea concentraiei
AA alcalini, neutri i hidrofobi, corespunztor, de la 5,500,360, 19,900,169 i 5,020,081
mg/100 ml de plasm n plasma nativ pn la 7,370,548, 29,400,350 i 8,400,164 mg/100
ml de plasm n plasma congelat-decongelat. Dintre componenii acestor grupe, urmeaz de
evedeniat majorarea n plasma spermei decongelate a coninutului aminacizilor cu radicali
alifatici ramificai leucina i izoleucina. De asemenea, este necesar de menionat c coninutul
derivailor AA n procesul refrigerrii, congelrii i decongelrii spermei de coco nu suport
schimbri semnificative.
n procesul criconservrii spermei de coco are loc majorarea coninutului total de AA liberi
i derivailor lor n plasma seminal de la 644,6311,128 n cea nativ pn la 774,6713,133
mg/100 ml n plasma decongelat. Aceast majorare are loc, preponderent, din contul sporirii
coninutului acidului glutamic, fapt care poate fi explicat, n aceste condiii, prin trecerea lui din
spermatozoizi n plasma seminal.
113
Tabelul 3.19. Coninutul AA liberi ai plasmei spermei de coco la crioconservare
Coninutul aminoacizilor (mg/100 ml
plasm) n Nr.
ctr.

Varieti (grupe) ale
aminoacizilor

Denumirea
aminoacidului
plasma nativ
plasma cong.-
decongelat
Lizin 2,31 0,820 3,19 0,738
Histidin 1,26 0,462 1,15 0,181
Arginin 1,93 0,533 3,03 1,457
1. Aminoacizi bazici
Total 5,50 0,360 7,37 0,548
Asparigin 15,12 3,419 26,96 3,152
Glutamin 581,90 111,224 682,14 131,277
2. Aminoacizi acizi
Total 597,02 55,638 709,10 65,657
Cistein 1,47 0,509 3,01 1,006
Trionin 2,37 0,489 7,13 2,659
Serin 3,78 0,8I8 4,54 0,240
Prolin 2,21 0,460 3,19 1,127
Glicin 2,72 0,239 3,95 0,416
Alanin 3,09 0,435 3,99 0,330
- alanin 0,47 0,091 0,74 0,376
-aminobutiric urme urme
Cistein 3,79 0,437 2,85 0,367
3.

Aminoacizi neutri

Total 19,90 0,169 29,40 0,350*
Metionin urme urme
Valin 1,62 0,262 2,99 0,627
Izoleucin 0,60 0,100 0,36 0,247
Leucin 1,09 0,167 1,85 0,150
Tirozin 0,98 0,209 1,13 0,422
Fenilalanin 0,73 0,133 1,97 0,142
4. Aminoacizi hidrofobi
Total 5,02 0,081 8,40 0,164*
Amoniac 9,73 1,251 12,05 2,874
Uree urme urme
Taurin 3,28 0,880 5,16 0,246
Etanolamina 4,18 1,433 3,19 0,389

5.

Derivi ai
aminoacizilor
Total 17,19 0,691 20,40 0,970
Total 644,63 11,128 774,67 13,133*
Not: *Diferenele sunt statistic autentice ntre indicii plasmei native i decongelate.

114
Tabelul 3.20. Coninutul AA liberi ai plasmei spermei de vier la crioconservare
Coninutul aminoacizilor (mg/100
ml plasm) n
Nr.
ctr.

Varieti (grupe) ale
aminoacizilor

Denumirea
aminoacidului
plasma nativ
plasma
congelat-
decongelat
Lizin 0,24 0,079 0,17 0,600
Histidin 0,74 0,213 0,59 0,104
Arginin urme urme
1. Aminoacizi bazici
Total 0,98 0,114** 0,76 0,304
Asparigin 1,09 0,125 0,93 0,126
Glutamin 8,06 2,303 5,42 0,977
2. Aminoacizi acizi
Total 9,15 1,153** 6,35 0,493
Cistein 3,48 0,243 2,35 0,368
Trionin 2,08 0,471 2,54 0,672
Serin 1,31 0,084 0,91 0,184
Prolin 1,14 0,434 0,89 0,231
Glicin 4,52 0,303 3,07 0,469
Alanin 1,45 0,085 0,94 0,167
- alanin 0,16 0,030 0,11 0,026
Cistein 1,16 0,016 0,93 0,176
-aminobutiric 0,50 0,243 0,83 0,455
3.

Aminoacizi neutri

Total 15,80 0,088** 12,57 0,119*
Metionin 0,16 0,027 0,27 0,015
Valin 2,51 0,155 1,89 0,752
Izoleucin 0,74 0,194 0,77 0,152
Leucin 1,15 0,240 0,88 0,099
Tirozin 0,96 0,338 0,67 0,339
Fenilalanin 0,34 0,080 0,21 0,057

4.

Aminoacizi hidrofobi

Total 5,86 0,081** 4,69 0,130*
Amoniac 0,70 0,101 0,61 0,077
Uree mare mare
Taurin 9,87 1,144 9,21 1,126
Ornitin 0,17 0,072 0,14 0,028
Citrulin 4,31 0,206 2,74 0,590
Etanolamina 1,42 0,200 1,24 0,151
5.

Derivai ai
aminoacizilor
Total 16,47 0,237 13,94 0,256*
n total 48,26 0,237** 38,31 0,131*
Not: *Diferenele sunt statistic autentice ntre indicii plasmei native i decongelate.
**Diferenele de specie sunt statistic autentice.
115
Astfel, cercetrile efectuate au permis de a descrie componena i coninutul AA liberi din
plasma spermei de coco n procesul crioconservrii. n rezultatul cercetrilor s-a stabilit un
coninut nalt al acidului glutamic, care denot despre prezena lui n ejaculat prin intermediul
canalelor epididiumului, deoarece la psri lipsesc glandele sexuale anexe. Coninutul nalt al
acidului glutamic i, n general, a AA acidici influeneaz structura i funcia spermatozoizilor.
n acelai timp, n rezultatul acestor cercetri s-a demonstrat, c drept rspuns la aciunea
temperaturilor suprasczute are loc schimbarea coninutului AA neutri i hidrofobi, ceea ce
denot despre schimbrile interaciunilor componenilor structurali spermatici. Totodat,
experimental au fost determinai derivaii AA plasmei spermatice de coco, dintre care ureea
prezint numai urme.
Compararea aminogramelor obinute ale acizilor liberi i derivailor lor n sperma nativ de
coco i vier (tabelele 3.19 i 3.20) relev, c exist diverse particulariti cantitative i calitative
de specie. De exemplu, n plasma spermei de coco 92,090,966% sunt prezentate de AA
acidici, n care acidul glutamic constituie 88,871,749%, iar n plasma spermei de vier -
18,560,303% i, respectiv, 16,300,569%. Dintre AA liberi ai plasmei spermei de vier cel mai
mult se conin AA neutri (15,800,088 mg/100 ml plasm), care n plasma spermei de coco
constituie 19,900,169 mg/100 ml de plasm. Deosebiri semnificative sunt nregistrate ntre AA
alcalini, reprezentai n plasma spermei de coco de 5,500,360 mg/100ml plasm contra la
0,980,114 mg/100 ml plasm n plasma spermei de vier. n plasma spermei animalelor
experimentale, la fel, sunt stabilite deosebiri statistic autentice ntre AA hidrofobi.
Spre deosebire de plasma de vier, n care ntr-o cantitate mare se conine ureea i urme de
arginin, n plasma spermei de coco sunt depistate urme de metionin, acid aminobutiric i uree,
precum i prevalarea taurinei i a acidului glutamic.
Concomitent cu particularitile cantitative sunt stabilite i deosebiri calitative ale AA liberi
i derivailor lor. n particular, n plasma spermei de coco sunt depistai 24 de AA liberi i
derivaii acestora, iar n plasma spermei de vier - 26. n plasma spermei de coco nu sunt
depistai astfel de derivai ai AA, ca ornitina i citrulina, precum i acidul -aminobutiric, iar n
plasma spermei de vier, invers nu s-a depistat acidul -aminobutiric.
Astfel, n rezultatul analizei spectrului AA liberi i derivailor lor n plasma spermei de
coco i vier este stabilit un coninut nalt de acid glutamic n plasma spermei de coco, cruia i
aparine funcia principal n determinarea structurii moleculelor proteice, reglarea proprietilor
i meninerea vital a lor, ceea ce denot despre rolul important al lui n stabilizarea moleculelor
proteice n procesul crioconservrii. De asemenea, s-a constatat un coninutul sczut de arginin
116
(urme) n plasma spermei de vier, ceea ce demonstreaz despre apariia unei manifestri mai
slabe a proceselor adaptive n procesul crioconservrii spermei.
Coninutul AA legai din plasma spermatic de coco n procesul crioconservrii sunt
prezentai n tabelul 3.21.
Tabelul 3.21. Coninutul AA legai ai plasmei spermei de coco la crioconservare, %
Coninutul aminoacizilor (%) n
Nr.
ctr.

Varieti (grupe) ale
aminoacizilor

Denumirea
aminoacidul
plasm nativ
plasm
congelat-
decongelat
Lizin 8,05 0,192 7,34 0,106*
Histidin 3,47 0,41 2,82 0,104
Arginin 7,26 0,212 6,92 0,142
1. Aminoacizi bazici
Total 18,78 0,096 17,08 0,096*
Asparigin 8,89 0,230 11,89 0,353*
Glutamin 10,57 0,358 15,75 0,215*
2. Aminoacizi acizi
Total 23,96 0,212 27,59 0,207*
Trionin 6,67 0,329 5,09 0,137
Serin 5,63 0,061 5,06 0,291
Prolin 1,37 0,123 3,92 0,029*
Glicin 5,70 0,392 5,30 0,130
Alanin 5,87 0,302 6,00 0,018
3. Aminoacizi neutri
Total 25,04 0,434 25,37 0,069
Metionin 1,20 0,340 1,34 1,206
Valin 7,87 0,068 6,10 0,055*
Izoleucin 12,65 0,414 11,99 0,335
Leucin 2,56 0,243 2,61 0,231
Tirozin 6,82 0,287 5,79 0,239*
Fenilalanin 0,67 0,161 0,39 0,218
4. Aminoacizi hidrofobi
Total 31,77 0,112 28,22 0,062*
5. Derivai ai aminoacizilor Amoniac 0,45 0,053 1,22 0,062*
Not: *Diferenele sunt statistic autentice dintre indicii plasmei native i decongelate.
117
Datele tabelului 3.21 denot c procesul de crioconservare a spermei de cocos provoac
modificri eseniale ale tuturor grupelor de AA legai din plasma seminal.
n scopul realizrii investigaiilor ulterioare n tabelul 3.22 se prezint componena
procentual a AA liberi din plasma spermei de coco la crioconservare.
Tabelul 3.22. Coninutul AA liberi ai plasmei spermei de coco la crioconservare, %
Coninutul aminoacizilor (%) n
Nr.
ctr.

Varieti (grupe) ale
aminoacizilor

Denumirea
aminoacidul plasm nativ
plasm
congelat-
decongelat
Lizin 0,36 0,086 0,45 0,217
Histidin 0,20 0,057 0,16 0,033
Arginin 0,32 0,074 0,38 0,149
1. Aminoacizi bazici
Total 0,88 0,042 0,99 0,088
Asparigin 3,22 0,823 3,77 0,839
Glutamin 88,87 1,749 86,78 30,286
2. Aminoacizi acizi
Total 92,09 0,966 90,55 15,149
Cistein 0,25 0,057 0,43 0,107
Trionin 0,39 0,057 0,99 0,358
Serin 0,63 0,106 0,64 0,141
Prolin 0,35 0,037 0,38 0,104
Glicin 0,47 0,097 0,55 0,111
Alanin 0,53 0,106 0,55 0,111
- alanin 0,07 0,007 0,09 0,036
Cistein 0,63 0,305 0,39 0,065
3.

Aminoacizi neutri

Total 3,23 0,046 4,02 0,055*
Valin 0,27 0,048 0,39 0,068
Izoleucin 0,10 0,016 0,19 0,053
Leucin 0,19 0,050 0,26 0,039
Tirozin 0,16 0,039 0,18 0, 057
Fenilalanin 0,12 0,021 0,14 0,017
4.


Aminoacizi hidrofobi
Total 0,84 0,017 1,16 0,022*
Amoniac 1,63 0,233 1,69 0,489
Uree Urme Urme
Taurin 0,56 0,088 0,73 0,164
Etanolamina 1,12 0,310 0,47 0,165
5.

Derivai ai
aminoacizilor

Total 3,31 0,132 2,89 0,180
Not: *Diferenele sunt statistic autentice dintre indicii plasmei native i decongelate.
118

Datele literaturii contemporane (capitolul 1) relev, c o importan deosebit n reglarea
metabolismului celulelor au AA hidrofobi i nepolari. Ultimii includ AA cu radicali alifatici
hidrocarbonai i amnoacizii aromatici. Concentraia lor servete drept indici de baz la
calcularea indicelui Fischer, care reprezint raportul sumei concentraiei AA liberi cu lan
ramificat (valina, leucina i izoleucina) i acizii aromatici (tirozina i fenilalanina). Valoarea
indicelui Fischer se utilizeaz ca criteriu obiectiv a disbalansului AA [32]. n legtur cu aceasta,
a fost cercetat indicele Fischer n plasma spermei de coco i vier n procesul de crioconservare
(tabelul 3.23).
Tabelul 3.23. Indicele Fischer n plasma spermei de cuco i de vier la crioconservare
Nr.
ctr.
Obiectul de studiu Indicele Fischer
1.
2.
3.
4.
Plasma spermatic nativ de coco
Plasma spermatic congelat-decongelat de coco
Plasma spermatic nativ de vier
Plasma spermatic congelat-decongelat de vier
1,90 0,078
1,83 0,013
4,77 0,091**
2,12 0,027*
Not: *Diferenele sunt statistic autentice dintre indicii plasmei native i decongelate.
**Diferenele de specie sunt statistic autentice.
Din datele tabelului 3.23 se constat, c valoarea indicelui Fischer n plasma spermei de
coco constituie 1,900,078, care n procesul crioconservrii spermei nu sufer schimbri
semnificative i constituie 1,830,013. n plasma spermei de vier acest indice n procesul
refrigerrii, congelrii i decongelrii spermei sufer schimbri. De exemplu, n plasma nativ a
spermei indicele Fischer este 4,770,91, contra la 2,120,027 n plasma spermei decongelate
(diferenele sunt statistic autentice).
Analiza comparativ a valorilor indicelui Fischer n plasma spermei de coco i vier permite
de a determina particulariti specifice de specie. n particular, n plasma spermei native de vier
acest indice este mai nalt, dect n plasma spermei de coco. Prin urmare, ca rspuns la aciunea
temperaturilor sczute indicele Fischer din plasma spermei de coco, practic, nu se supune
schimbrilor, ceea ce demonstreaz c la crioconservarea spermei de coco, care este mai
criorezistent, valoarea acestui indice rmne stabil.
n plasma spermei de vier dup refrigerare, congelare i decongelare indicele Fischer scade
mai mult de dou ori n comparaie cu nivelul lui din sperma nativ. Modificrile prezente
denot despre un disbalans semnificativ al AA i, implicit, despre dereglrile metabolismului
proteinelor n plasma spermei de vier.
119
Rezumnd rezultatele cercetrii spectrului AA al spermei de coco putem meniona, c
plasma este veriga de legtur, care aprovizioneaz spermatozoizii cu AA i asigur
transportarea lor prin membranele plasmatice. AA liberi ai plasmei spermei de coco sunt
prezentai, preponderent, de AA acidici (acidul asparaginic i glutamic), cu prioritate
considerabil a acidului glutamic. AA hidrofobi sunt reprezentai n cantitate minor. Merit
atenie i faptul, c AA liberi ai spermei de coco se modific la crioconservare ntr-o msur
mai mic. Excepie constituie AA neutri i hidrofobi, coninutul cror sporete de 1,5 ori.
Dintre AA liberi i derivaii lor, ureea este prezentat prin cantiti foarte mici, unde au fost
depistate numai urme. Coninutul sczut de uree n plasma spermei de coco poate fi
predeterminat de criorezistena spermei, ntruct n concentraii mici ea acord efect antioxidativ
[92], care se observ nu numai la hiperoxie, dar i n toate cazurile pentru care este caracteristic
sporirea intensitii POL, modificarea proprietilor i funciei membranelor biologice.
Spre deosebire de AA liberi din plasma spermatic, cei legai sunt reprezentai, prioritar, de
cei hidrofobi i n minoritate de cei alcalini. Modificri criogenice ale coninutului sunt
nregistrate la toate grupele AA, cu excepia celor neutri.
n cazul congelrii-decongelrii spermei de coco n membranele plasmatice se observ
modificarea coninutului tuturor grupelor de AA (P<0,001). Modificri eseniale s-au constatat n
coninutul histidinei, acidului glutamic, serinei i valinei. AA legai ai membranelor plasmatice i
spermatozoizilor n cele mai mari cantiti sunt reprezentai de AA hidrofobi, iar n concentraii
mici de AA grupelor acidici.
Att n membranele plasmatice, ct i n spermatozoizi au loc schimbri cantitative a tuturor
grupelor, care includ majoritatea AA. Modificrile spontane ale AA sunt determinate de
condiiile drastice ale experimentrii, folosite n scopul obineri rezultatelor mai clare. La
folosirea mediilor protectoare, AA caracteristici pentru histone nu se modific, iar AA
componeni ai proteinelor plasmatice se deterioreaz esenial [88]. Conform relatrilor autorului,
rezistena nucleelor spermatozoizilor la deterioratorii externi, inclusiv i a celor criogenici se
bazeaz pe includerea n cromatin, pe parcursul spermatogenezei, a proteinelor bogate n
arginin, care formeaz cu ADN-ul o reea amorf, rezistent la aciunea factorilor externi.
Pentru ocul termic aciunea acestei reele nu este descris.
Analiza tuturor aminogramelor spermei de coco demonstreaz, c arginina este AA, care
nu se supune modificrilor criogene n toate componentele spermei i coninutul cel mai mare al
acestui AA este n spermatozoizi. Avnd n vedere, c arginina este AA cu influen adaptogen
[32] putem presupune, c procesele adaptive la scderea temperaturii cel mai intens decurg la
nivelul spermatozoizilor. Posibilitatea derulrii proceselor adaptive n plasm, inclusiv i n
120
membrana plasmatic este nesemnificativ, deoarece coninutul argininei n aceste structuri este
mai mic mai mult de dou ori dect n spermatozoizi.
De asemenea, merit atenie faptul, c numai coninutul AA hidrofobi se modific n toate
componentele spermei (P<0,05 - P<0,001). Aceste schimbri demonstreaz, c criodeteriorrile,
n general, sunt predeterminate de modificarea interaciunilor hidrofobe i, din aceasta reiese c
de crioprotecie au nevoie toate componentele structurale ale spermei.
n acelai timp, este cunoscut c acidului glutamic i asparaginic aparine rolul principal n
determinarea structurii proteice, reglarea proteinelor i longevitii acestora [77]. Astfel, n
legtur cu faptul, c AA legai, care sunt AA acidici, sunt supui preponderent modificrilor
criogenice, putem presupune c procesul de crioconservare a spermei este nsoit de
restructurarea moleculelor proteice n toate componentele structurale ale spermei de coco.

3.2.3. Activitatea enzimelor i starea acizilor nucleici n procesul conservrii materialului
seminal.
O importan aparte este atribuit cercetrii proteinelor integrale, n legtur cu faptul, c ele
particip n derularea celor mai importante procese transmembranice. Astfel de localizare a
proteinelor determin orientarea enzimelor membranice. De exemplu, dac din partea exterioar
a membranelor este amplasat acetilcolinesteraza, NAD-aza, apoi din partea intern -
(Na
+
+K
+
)ATP-aza, proteinchinaza, dehidrogenaza etc. Printre ele merit atenie fermenii
membranodependeni, care joac un rol important n pstrarea viabilitii spermiilor. De
asemenea, prezint interes i cercetarea gradului de dereglare a structurii moleculare i funciei
enzimelor obiectelor biologice la aciunea anumitor factori i scderea temperaturii. Dintre
factorii principali, care deterioreaz enzimele n procesul crioconservrii sunt: deshidratarea
macromoleculelor n rezultatul cristalizrii apei i concentraia nalt a srurilor acizilor
neorganici, care influeneaz componena structural a enzimelor. Concomitent cu existena
factorilor generali, sunt prezeni factorii specifici biologici i biofizici, care asigur proprietatea
spermei de a preveni posibilele dereglri, cauzate de procesul de crioconservare. Aceti factori,
n general, includ permeabilitatea, compoziia lipidelor i fluiditatea membranelor. Aceste
deteriorri membranice provoac consecine nefaste asupra mobilitii i diversitii proceselor
metabolice, inclusiv i asupra concentraiei ATP-azelor n spermatozoizi [170, 172, 290, 366].
n legtur cu aceasta, o mare importan prezint studierea particularitilor de specie a
activitii fermenilor i a fraciilor bogate din membranele plasmatice ale spermatozoizilor de
coco i vier la crioconservare.
121
Dintre enzimele cuplate cu membran plasmatic o importan deosebit aparine ATP-
azelor transportatoare. De exemplu, la congelarea accelerat a eritrocitelor pn la -196
o
C brusc
sporete activitatea Na
+
+K
+
-ATP-azelor, atunci cnd activitatea Mg
+2
-ATP-azei n diapazonul
temperaturelor de la 0 pn la -30
o
C nu se modific esenial.
Tripolifosfatazele n combinaie cu glucidele pot ameliora rezultatele crioconservrii
bioobiectelor [267] .
Cercetrile ndeplinite pentru claritatea activitii Mg
+2
(Na
+
+
+
)-ATP-azei, 5
1
-
nucleotidazei i fosfatazei alcaline n membranele plasmatice ale spermatozoizilor de coco n
comparaie cu rezultatele studierii activitii fermenilor membrano-dependeni de vier (tabelul
3.24) au demonstrat c diluarea, congelarea i decongelarea spermei acioneaz asupra
activitii lor specific.
Tabelul 3.24. Activitatea g
+2
(Na
+
+
+
)-ATP-azei, 5'-nucleotidazei i fosfatazei alcaline n
membranele plasmatice izolate ale spermatozoizilor la crioconservare (mcMol/o/mg protein)
Nr.
ctr.
Etapa prelucrrii
tehnologice
Activitatea
g
+2
(Na
+
+
+
)-ATP-
azei
Activitatea
5'-nucleotidazei
Activitatea
fosfatazei
alcaline
Coco
1. Diluare (martor) 16,23 12,20 8,09 0,86 1,19 0,08
2. Congelare-
decongelare
9,57 0,56* 7,39 0,59 1,17 0,06
Vier
1. Diluare (martor) 28,03 1,30 4,49 0,98 3,02 0,36
2. Congelare-
decongelare
18,85 1,43* 3,17 0,66 2,48 0,37
Not: *Diferenele sunt statistic autentice.
Datele obinute n rezultatul cercetrii activitii g
+2
(Na
+
+
+
)-ATP-azei n membranele
spermiilor proaspt diluate, ct i dup congelarea i decongelarea spermei de coco i vier
denot despre o distrucie semnificativ a membranelor plasmatice ale spermatozoizilor acestor
specii. n particular, n procesul crioconservrii spermei activitatea acestui ferment scade de la
16,2312,20 pn la 9,570,56 mcMoli/o/mg protein la coco i de la 28,031,30 pn la
18,851,43 mcMoli/o/mg protein la vier. Avnd n vedere, c acest sistem fermentativ
ndeplinete funcia de transport i rolul de transformator al energiei, acumulate n ATP pentru
transportul activ al Na
+
i
+
prin membran, constatarea schimbrii activitii g
+2
(Na
+
+
+
)-
ATP-azei denot despre o deenergizare semnificativ a membranelor plasmatice ale
spermatozoizilor de coco i vier. Analiza datelor obinute, de asemenea, demonstreaz c n
122
membranele spermiilor de vier la congelare-decongelare are loc o scdere mai semnificativ a
activitii g
+2
(Na
+
+
+
)-ATP-azei, care indic la legturi mult mai labile a acestui ferment n
membrana spermatozoizilor de vier.
Diminuarea nregistrat demonstreaz c are loc deteriorarea semnificativ a membranelor
plasmatice ale spermatozoizilor speciilor studiate i dezechilibrul transportrii ionilor, care a fost
stabilit i prezentat la elucidarea funciilor de barier ale membranei plasmatice a
spermatozoizilor de coco n procesul de crioconservare.
Modificarea activitii acestor enzime prezint reacia celulei la influena factorilor
defavorizani ai homeostaziei [80].
Activitatea 5
1
-nucleotidazei din fraciile bogate ale membranelor plasmatice izolate ale
spermatozoizilor nativi de coco este mai nalt, dect n spermatozoizii de vier, care constituie
8,090,86 contra 4,490,98 mcMol/o/mg protein, corespunztor. n procesul crioconservrii
spermei de coco i vier are loc o scdere nensemnat a activitii acestui ferment i, anume pn
la 7,390,59 la coco i pn la 3,170,66 mcMol/o/mg protein la vier. Din rezultatele
nregistrate urmeaz, c acest ferment nu sufer schimbri importante la crioconservarea spermei
acestor specii de animale, ceea ce se confirm prin rezistena nalt a elementelor nucleare la
influena factorilor mediului ambiant.
Reprezentantul fermenilor, legai cu membrana plasmatic, este fosfataza alcalin, care
particip activ n mecanismul realizrii aciunii fiziologice a AMP prin eliberarea ortofosfatului
din substratele proteice fosforilate [108]. Cercetrile noastre au stabilit schimbri
nesemnificative ale activitii acestui ferment n membranele plasmatice native i congelate-
decongelate ale spermatozoizilor de coco i vier. Activitatea fosfatazei alcaline constituie
1,190,08 i 1,170,06 mcMol/o/mg protein, corespunztor, n membranele gameilor nativi i
decongelai de coco. La vier activitatea acestui ferment scade de la 3,020,36 n membranele
plasmatice ale spermatozoizilor nativi pn la 2,480,38mcMol/o/mg protein n membranele
spermatozoizilor decongelai. Datele obinute vin n concordan direct cu rezultatele
cercetrilor indicilor funcionali ai spermatozoizilor dup congelarea i decongelarea spermei de
coco i vier. Rezultatele cercetrilor ne permit de a meniona, c schimbrile activitii
g
+2
(Na
+
+
+
)-ATP-azei, 5
1
-nucleotidazei i fosfatazei alcaline la crioconsevare sunt
predeterminate de modificarea organizaiei moleculare a membranelor plasmatice, restructurarea
crora, apare n procesul dilurii, refrigerrii, congelrii i decongelrii spermei .
Analiza comparativ a particularitilor de specie a activitii fermenilor spermatozoizilor
speciilor menionate a artat, c activitatea g
+2
(Na
+
+
+
)-ATP-azei i fosfatazei alcaline este
mai sporit n membranele plasmatice ale spermatozoizilor de vier. Activitatea acestor fermeni
123
variaz, corespunztor, n membranele spermatozoizilor nativi i decongelai de la 16 i 1 la
coco pn la 28 i 3 mcMol/o/mg protein la vier. Activitatea 5
1
-nucleotidazei, invers, este mai
mare n membranele gameilor de coco i variaz de la 4,5 i 3 la vier pn la 8 i 7
mcMol/o/mg protein la coco. Prin urmare, datele obinute demonstreaz despre faptul c
fermenii membrano-dependeni ai membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de coco i vier
posed particulariti de specie, ntruct sunt stabilite devieri statistic autentice ntre activitatea
lor. Astfel, pentru membranele plasmatice ale spermatozoizilor de vier sunt caracteristice, ca
particulariti g
+2
(Na
+
+
+
)-ATP-aza i fosfataza alcalin, iar pentru coco - 5
1
-nucleotidaza.
n contextul celor expuse, analiza n ansamblu a datelor cercetrilor activitii enzimelor
membranare [1] demonstreaz, ca la aciunea factorilor hipotermali are loc activarea unor enzime
i inactivarea altora. n acest caz, modificrile criogenice ale enzimelor membranare ale
spermatozoizilor, practic, sunt rezultatul rspunsului secundar la dereglarea stabilitii legturilor
n complexele lipoproteice. Modificarea activitii enzimelor la crioconservarea materialului
seminal, n mare msur, se reflect asupra proceselor metabolice n spermatozoizi prin
diminuarea fertilitii lor.
n conformitate cu relatrile academicianului T. Furdui [124], la baza formrii dirijate a
sntii se afl gametogeneza, n procesul crei se formeaz spermatozoizii, ca produs al
sistemului reproductiv. Proprietile organismului direct sau indirect depind de informaia
genetic, care este codificat n succesiunea bazelor n structura ADN-lui celulelor reproductive.
Coninutul cantitativ al ADN-lui semnificativ reflect proprietatea fecundativ a
spermatozoizilor [391]. Cercetrile privind determinarea coninutul ARN-lui n sperma de coco
sunt prezentate n foarte puine lucrri, iar n unele dintre ele, sunt i contradictorii [20, 277,
377]. Reieind din aceste considerente a fost studiat posibilitatea modificrii coninutului de
ADN i a altor indici, care caracterizeaz sanogenitatea materialului seminal [7]. La prima etap
a fost studiat eficiena administrrii Fosfosanului, preparat care conine o cantitate sporit de
fosfor i care poate influena asupra rezistenei bioobiectelor la factorii nefavorabili ai mediului
extern. Rezultatele cercetrilor sunt prezentate n tabelul 3.25.
Tabelul 3.25. Aciunea Fosfosanului administrat asupra indicilor spermei de coco
Nr.
ctr.
Varianta
Mobilitatea,
puncte
Concentraia,
mlrd/ml
IAS,
u.c.
ADN,
mg%
1. Preexperimental 7,2 0,52 1,44 0,59 90,1 26,54 4,4 0,76
2. Experimental 7,8 0,18 2,082 0,19 135,8 15,04 3,6 0,10
Not: *Diferena este statistic autentic dintre variantele experienei.
124
n rezultatul cercetrilor s-a demonstrat, c Fosfosanul administrat pe cale oral nu a
contribuit la modificarea indicilor studiai, nectnd la faptul c n varianta experimental se
observ tendina de sporire a IAS.
La continuarea cercetrilor influenei fosfosanului asupra calitii spermei de coco, n
urmtoarea experien preparatul studiat a fost administrat parenteral, n doze de 1 ml la coco.
Rezultatele sunt prezentate n tabelul 3.26.
Tabelul 3.26. Studierea aciunii Fosfosanului la administrarea parenteral asupra indicilor
spermei de coco
Nr.
ctr.
Varianta
Mobilitatea,
puncte
Concentraia,
mlrd/ml
IAS,
u.c.
ADN,
mg%
1.
Preexpe-
rimental
7,2 0,52 1,44 0,59 90,1 26,54 4,4 0,76
2.
Experimen-
tal
8,2 0,179 2,78 0,20* 253,75 8,88* 4,68 0,47
Not: *Diferena este statistic autentic dintre variantele experienei.
Datele prezentate n tabelul 3.26 arat c, administrarea parenteral a preparatului
experimentat face posibil majorarea volumului ejaculatelor cu 37%, IAS se majoreaz mai mult
de 2 ori, iar concentraia spermatozoizilor se modific neesenial. Coninutul ADN-ului n
varianta experimental, la fel, nu suport schimbri semnificative, dar anumite deteriorri ale
ADN pot provoca dereglarea procesului de reproducere. Tipurile de dezorganizare ale ADN-ului,
includ aderaiile cromozomale, modificaiile epigenetice ale histonilor i ADN-ului, mutaiile i
fragmentaiile. Fragmentarea ADN-ului este o cauz, care deseori se ntlnete, n spermatozoizii
infertili. Coninutul de ADN fragmentat al spermiilor, coreleaz negativ cu calitatea spermei
[377, 391]. Astfel, n rezultatul cercetrilor se presupune c fosforul administrat n organismul
cocoilor a contribuit la pstrarea energiei acumulate n legturile macroergice ale ATP.
Un alt ferment, nu mai puin important n metabolismul plasmatic este SOD. Dup cum este
documentat n literatura performant de specialitate (capitolul 1), SOD este un component
important al plasmei seminale i joac un rol esenial n echilibru dintre generarea ROS i
degradarea puritii anionului de superoxid [204, 284]. SOD modific anionul de superoxid n
peroxid de hidrogen, care este, n cele din urm, transformat n ap de ctre enzimele catalaza
i glutation-peroxidaza (GSH-Px) [284]. Materialul seminal aviar conine dou tipuri de SOD,
Mn-SOD i Cu,Zn-SOD. Aceste varieti sunt sintetizate i reglementate endogen i funcioneaz
n cooperare cu alte enzime, cum ar fi GHS-Px [284]. O cantitate semnificativ de SOD este
secretat de ctre epididim.
125
SOD purific anionul de superoxid extra- i intracelular, precum i inhib peroxizii lipidelor
din membranele spermatice [204, 284]. De asemenea, acioneaz mpotriva peroxidului de
hidrogen prin conjugarea sa cu catalaza sau GSH-Px [259, 284]. Reieind din cele expuse
cercetrile ulterioare au fost direcionate asupra studiului activitii SOD n procesul de
crioconservare a spermei de coco. Rezultatele cercetrilor sunt prezentate n tabelul 3.27. n
acest tabel se prezint i datele obinute anterior pe sperma de taur [47], n scopul analizei
comparative a activitii SOD.
Tabelul 3.27. Activitatea SOD la crioconservarea spermei de coco
Nr.
ctr.
Varianta experienei,
mg/100 ml mediu sintetic
Mobilitatea gameilor
decongelai, puncte
1. Sperma de coco (0,156) 4,3 0,21
2. Sperma de coco (Lotul martor) 4,1 0,21
3. Sperma de taur (0,156) 4,6 0,10*
4. Sperma de taur (Lotul martor) 3,9 0,19
Not: *Diferenele sunt statistic autentice.
Datele prezentate n tabelul 3.27 denot, c SOD nu manifest activiti antioxidative fa de
spermatozoizii de coco. Lipsa acestor proprieti poate fi explicat prin faptul c sperma de
coco nu conine varieti active de oxigen n form de radicali ai superoxidrii.
Astfel, cercetarea activitii enzimelor membrano-dependente a spermatozoizilor de coco i
vier reprezint un deosebit interes teoretic i practic. Rezultatele permit de a obine date despre
compoziia chimic a membranelor, de a determina integritatea interaciunilor celulare n
complexele substratelor enzimatice i de a stabili corelaii de compoziie i raport a
componenilor structurali ai membranelor i rezistena spermatozoizilor la temperaturi joase.
3.3. Concluzii la capitolul 3.
n contextul celor expuse i analizei literaturii de specialitate este posibil de a concluziona,
c structurile acrozomale ale spermatozoizilor de coco, comparativ cu cele ale spermiilor
speciilor studiate de animale sunt supuse deteriorrilor morfologice autentice numai la etapa de
congelare-decongelare. S-a stabilit c procesele general acceptate de prelucrare tehnologic a
spermei de coco produc modificri structural-morfologice autentice ale spermatozoizilor dup
decongelarea lor, inclusiv i o cretere semnificativ a indicelui-B teratologic al spermei.
Studiul strii morfo-funcionale a spermatozoizilor de coco la crioconservare
demonstreaz, c procesul de crioconservare a materialului seminal contribuie, practic, la
dublarea coninutul formelor patologice de spermatozoizi cu anomalii ale cozii i, ca consecin,
se reduce considerabil concentraia spermiilor cu proprieti de micri rectilinii. Concomitent, n
126
sporirea proprietilor biologice ale spermei de coco dup congelare-decongelare o semnificaie
major i revine rezistenei proprii a celulelor sexuale la influena temperaturilor hipotermale i
condiiilor variabile ale osmocitii.
S-a stabilit, c devierea bilateral acido-alcalin a pH-lui de la valoarea neutr cu mai mult
de o unitate provoac diminuarea brusc a mobilitii spermatozoizilor de coco n procesul de
congelare-decongelare a spermei, iar variabilele experimentale pre- i postoptimale i pstreaz
valoarea autentic numai n limitele slab acide i slab alcaline i, implicit ofer avantaje majore
n meninerea proprietilor sanogene ale materialului seminal de coco.
Cercetrile transformrilor morfologice i funcionale ale spermatozoizilor de coco
constat o interrelaie direct proporional ntre valoarea raportului proteine/lipide din
membranele plasmatice ale spermatozoizilor i rezistena spermei de coco la influena
temperaturilor sczute. n acest caz, elucidarea particularitii coninutului raportului
proteine/lipide din membranele plasmatice ale spermatozoizilor nativi i crioconservai de coco
comparativ cu cei de vier, condiioneaz cercetri de performan n vederea completrii opiniei
tiinifice despre organizarea structural a biomembranelor i specificaiei lor i, implicit
demonstreaz, c perspectiva direcionat a cercetrilor n domeniul crioproteciei obiectelor
biologice rmne optimizarea condiiilor de reglementare a raportului compuilor structurali de
baz ai membranelor, n scopul sporirii rezistenei spermatozoizilor psrilor la aciunea
factorilor crioconservrii.
Evaluarea funciilor de barier ale membranei plasmatice a spermatozoizilor de coco n
procesul de crioconservare a stabilit, c crioconservarea spermei de coco la diverse etape
tehnologice este nsoit de restribuirea concentraiei ionilor studiai ntre spermatozoizi i
mediul nconjurtor i, aceasta la rndul su, provoac echilibrarea gradienilor concentraionali
i duce la pierderea activitii funcionale a membranelor biologice. Prelungire servete
constatarea, c funcia de barier a membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de coco se
modific esenial i este condiionat de pierderea brusc a ionilor de K
+
n procesele tehnologice
ale crioconservrii i ptrunderea excesiv a ionilor de Na
+
n spermatozoizi, are loc sporirea
consecutiv a raportului lor, care constituie 2,01; 3,77 i 4,21, corespunztor, n spermatozoizii
nativi, refrigerai i decongelai. La cele relatate, la fel, s-a stabilit c mecanismul de deteriorare
a asimetriei naturale a concentraiei ionilor de Na
+
, K
+
, Li
+
i Ca
2+
din ambele pri ale
membranei plasmatice a spematozoidului de coco este predeterminat de forele determinante ale
gradientului osmotic, dependent de coninutul i concentraia ionilor.
O importan aparte i revine faptului c stabilizarea sistemului barier-transport al
membranelor biologice ale spermatozoizilor de coco este posibil prin includerea n
127
componena mediilor crioprotectoare a componenilor cu proprieti de sistematizare i
optimizare a interaciunilor ionice ntre mediu i spermatozoid, iar stabilizarea strii morfo-
funcionale a spermatozoizilor de coco n procesul crioconservrii este posibil prin reglarea
funciilor bariere ale membranelor plasmatice.
Rspunsul lipidelor, ca componeni principali i elemente eseniale integrale ale
membranelor, la influena factorilor de criconservare se manifest prin reaciile de compensare
direct i invers proporional a diminurii-sporirii coninutului lor, n timp ce, valoarea
coninutului produsului final al POL DAM n sperma de coco servete drept criteriu de
elucidare a modificrilor strii lipidelor, iar produii iniiali i intermediari (conjugatele dienice
i hidroperoxizii) nu posed astfel de valoare informaional.
La oscilaia brusc a temperaturii, modificri criogenice mai evideniate n sperm sunt
prezente n coninutul AA acidici i hidrofobi, iar la cei alcalini, caracteristici pentru proteinele
nucleare, s-au stabilit modificri destul de moderate.
Studierea componenei proteinelor a demonstrat c variabilitatea spectrului proteic n
sperma de coco poate fi predeterminat de tranzacia fazic a lui n procesul de modificare a
structurii i proprietilor proteinelor, structura albuminelor i a -globulinelor spermei de coco
la crioconservare, fiind condiionat labil, comparativ cu cea a - i -globulinelor, care
manifest stabilitate. Totodat, s-a stabilit c proteinele reacioneaz la influena factorilor de
crioconservare prin reacii transformatoare de sintez sau de disociere a compuilor structurali ai
lor. Aici, reaciile de adaptare n procesul crioconservrii se produc, preponderent, la nivelul
spermatozoizilor, iar plasma seminal i membrana plasmatic particip nesemnificativ la
derularea acestor procese.
Diminuarea coninutului AA n membrane i spermatozoizi la crioconservare i sporirea lor
n plasma seminal, demonstreaz migrarea proteinelor din spermatozoizi, n particular a celor
intercalate n structura membranelor, deoarece proteinele transmembranice sunt legate de
membrane prin interaciuni dure. La fel, s-a stabilit c coninutul AA hidrofobi sporete de 1,5
ori n toate componentele structurale ale spermei, ceea ce denot despre faptul c
criodeteriorrile sunt legate de modificarea interaciunii hidrofobe i, implicit confirm c
crioprotecia este necesar pentru toi componenii structurali ai spermei.
n acelai timp, s-a demonstrat c spermatozoizii de coco reacioneaz la influena
factorilor de crioconservare prin reacia de deenergizare a lor, care este predeterminat de
scderea activitii g
+2
(Na
+
+
+
)-ATP-azei, localizat n membrana mitocondrial i activitatea
creia, variaz concomitent cu deteriorarea flagelului spermatozoizilor n procesul
128
crioconservrii, n schimb, capul este mai criorezistent, despre ce demonstreaz stabilitatea
ADN-lui i 5
1
-nucleotidazei.
Introducerea n organismul cocoilor a fosfosanului stimuleaz spermatogeneza i provoac
sporirea semnificativ a volumului ejaculatului i a IAS.
Coninutul ADN-lui n procesul de crioconservare a spermei de coco nu suport modificri
i la diferite etape poate servi ca indice, care caracterizeaz sanogenitatea sistemului reproductiv.

4. MENINEREA STRII MORFO-FUNCIONALE A COMPONENILOR
STRUCTURALI DE BAZ I STABILIZAREA STATUSULUI MORFO-FUNCIONAL
AI SPERMIILOR DE COCO N PROCESUL DE CONSERVARE
4.1. Influena componenilor structurali principali asupra spermei de coco n procesul de
crioconservare a ei.
4.1.1. Rolul proteinelor n stabilizarea indicilor morfo-funcionali ai spermatozoizilor de
coco la crioconservare.
n prezent se pot conserva pe o durat mare n condiiile temperaturilor foarte sczute
diverse obiecte biologice, care formeaz suspensii (spermatozoizi, microorganisme, celule
sangvine etc). Metodele utilizate pentru crioconservarea la temperaturi joase, n mare msur,
sunt consecinele modalitilor empirice de abordare a problemei. Posibilitile ultimelor s-au
dovedit a fi foarte limitate i insuficiente pentru dezvoltarea ulterioar a teorii i practicii
criobiologice. Aa de exemplu, modalitile elaborate de abordare sunt destul de nentemeiate i
insuficiente pentru perfecionarea mediilor i procedeelor tehnologice n scopul majorrii
eficacitii crioconservrii materialului biologic. Problemele menionate, necesit declanarea
unor experimentri complexe, att fundamentale, ct i aplicative, care ar asigura obinerea i
prelucrarea informaiei necesare.
O sarcin primordial n domeniul cercetrilor fundamentale ale criobiologiei spermei
animalelor de ferm, const n dezvluirea mecanismelor de criodistrucie la diferite nivele de
organizare biologic i, pe aceast baz, elaborarea metodelor, care asigur pstrarea eficient a
meterialului biologic. Una dintre modelele eficiente de soluionare a acestei probleme este
studierea corelaiilor dintre transformrile fizico-chimice n procesul criconservrii la
temperaturi sczute i indicii pstrrii proprietilor biologice ale materialului deconservat.
n criobiologia spermei s-a acumulat mult material experimental despre starea celulelor la
diferite etape ale congelrii, ceea ce a permis de a evedenia cei mai nocivi factori, care particip
n decalanarea criodeteriorrii structurii spermatozoizilor. ns, mecanismele de deteriorare a
129
structurii i funciei spermatozoizilor condiioneaz studierea aprofundat, precizarea i
generalizarea lor.
Destul de superficial sunt studiate criodeteriorrile la nivel supramolecular. Prezint un
interes deosebit, studierea particularitilor de specie ale criodeteriorrii spermatozoizilor, ceea
ce permite evedenierea componenilor, cei mai vulnerabili i ai structurilor celulare de acest tip.
Prin urmare, elaborarea metodelor eficiente de crioconservare a spermatozoizilor animalelor de
ferm trebuie s se bazeze pe rezultatele studierii aprofundate a proceselor, care nsoesc
congelarea, decongelarea i alte etape ale criconservrii.
n conformitate cu punctul de vedere, anterior formulat, referitor la criodeteriorrile
spermatozoizilor animalelor de ferm, determinate de dereglarea, n primul rnd, a membranelor
biologice (plasmatic, acrozomal, mitocondrial), datorit declanrii proceselor fizico-chimice
(slbirea duritii legturilor proteo-lipidice i proteo-glucidice din complexele biologice,
trecerile fazice ale lipidelor i apei, stresul termic i osmotic etc), i biochimice (intensificarea
proceselor de POL, schimbarea activitii fermenilor membranici, metabolismului glucidic,
lipidic i proteic).
Dezvoltnd prezenta poziie, o atenie deosebit a fost acordat cercetrii interdependenei
dintre biocomplexele membranelor plasmatice i pstrarea integritii funcionale a
spermatozoizilor deconservai.
Despre labilitatea nalt a biomembranelor n condiiile crioconservrii demonstreaz datele
obinute de ctre noi anterior [32, 50]. Cu toate acestea, considerm c ntre componenii i
structura membranei exist o verig n form de biocomplexe. Din aceste considerente, o
importan deosebit se atribuie studierii interaciunii dintre molecule n condiiile
crioconservrii spermei. Bistratul lipidic n care sunt scufundate proteinele membranice integrale
nu este solvent inert al globulelor proteice. Interaciunile proteo-lipidice pot duce la schimbarea
conformaiei proteinelor [45, 46].
Cercetrile interaciunii dintre molecule permite de a obine informaie preioas despre
starea biocomplexelor.
Pentru aceasta, unul dintre modurile de abordare cu perspectiv, pare a fi, introducerea n
componena mediilor a unor componeni, care ar asigura formarea biocomplexelor noi dintre
componenii membranei i mediile sintetice.
Sub acest aspect, s-a studiat aciunea AA din diferite grupe i, n particular, integritatea
funcional a spermatozoizilor de coco dup congelarea spermei n mediile sintetice, care conin
AA alcalini (arginin), acidici (acidul asparaginic), hidrofobi (valin) i neutri (alanin). Datele
obinute sunt expuse n tabelul 4.1.
130
Tabelul 4.1. Influena aminoacizilor asupra calitii spermei de coco
Nr.
ctr.
Denumirea aminoacidului Mobilitatea spermatozoizilor decongelai, puncte
1. Alanin 3,80 0,136
2. Arginin 4,40 0,119*
3. Acid asparaginic 3,90 0,209
4. Valin 4,60 0,112*
5. Martor (mediul C-2) 3,90 0,111
Not: *Diferenele sunt statistic veridice n comparaie cu lotul martor.
Datele tabelului 4.1 arat c dup congelarea i decongelarea spermei de coco n mediile,
care conin AA testai, mobilitatea spermatozoizilor divizeaz ntre 3,8 i 4,6 puncte.
Este cunoscut c suprafaa gameilor poart ncrctur electropozitiv [88] i din aceast
cauz eficacitatea AA evaluai este mai uor de explicat prin clasificarea lor conform strii
resturilor AA ale lanului proteic. n acest caz, AA se diviaz n polari i nepolari. Arginina i
acidul asparaginic, conform acestei clasificaii, se refer la acizii polari. Ei sunt api de a forma
legturi hidrogenice, acionnd astfel asupra structurii apei n procesul crioconservrii. ns, n
intervalul fiziologic al pH-ului egal cu 6-8, arginina este ncrcat pozitiv, iar acidul asparaginic
negativ. Reieind din acestea, efectul pozitiv al argininei este condiionat de formarea
biocomplexelor cu componenii membranei, cu sarcin electropozitiv. Acidil asparaginic nu
poate forma astfel de biocomplexe din care cauz eficacitatea lui scade.
Alanin i valin sunt acizi nepolari. Eficacitatea diferit a acestor AA, poate fi explicat
prin faptul c valina are resturi nepolare, care sunt expuse n interiorul globulei, iar la alanin
lipsete tendina clar de localizare a acestor resturi n anumite sectoare ale globulei moleculare.
La cel din urm interaciunea hidrofobic trebuie s fie mai puin pronunat.
Unul dintre indicii meninerii integritii funcionale a spermatozoizilor deconservai este
raportul proteine/lipide din membrana plasmatic [50]. n legtur cu aceasta, ne-am propus
studierea aciunii AA de diferit polaritate asupra raportului proteine/lipide din membrana
plasmatic a spermatozoizilor de coco la crioconservare (tabelul 4.2).
Rezultatele experimentale, expuse n tabelul 4.2 denot, c includerea AA n componena
mediului crioprotector pentru crioconservarea spermei de coco dup schema similar, cu cea din
experiena precedent, stabilizeaz integritatea indicelui studiat.
Aceasta demonstreaz, c n urma utilizrii AA se iniiaz stabilizarea, att a componenilor
lipidici, ct i ai celor proteici ai membranei. De exemplu, arginina acioneaz asupra
metabolizmului lipidelor, manifestnd efect antioxidativ [360].
131

Tabelul 4.2. Influena aminoacizilor de diferit polaritate asupra raportului proteine/lipide din
membrana plasmatic a spermatozoizilor de coco n condiiile crioconservrii
Nr.
ctr.
Varianta
experimental
Componena mediului
crioprotector
Raportul proteine/lipide din
membranele plasmatice ale
spermatozoizilor
1. I C 2 + alanin 0,91 0,168
2. II C 2 + arginin 1,05 0,249
3. III C 2 + acid asparaginic 0,74 0,146
4. IV C 2 + valin 0,91 0,275
5. V C 2 (martor) 0,73 0,200
Astfel, studierea aciunii AA de divers polaritate asupra mobilitii spermatozoizilor de
coco permite de a meniona, c arginina i valina stabilizeaz indicele studiat, n timp ce alanina
i acidul asparaginic au efect mai slab. Introducerea AA n componena mediilor pentru
crioconservarea spermei de coco nu provoac schimbri eseniale ale raportului proteine/lipide
din membrana plasmatic.
Experimentrile ulterioare au urmrit scopul de a elucida posibiliti de reglare a
coninutului fraciilor proteice n condiiile congelrii i decongelrii spermei de coco.
Rezultatele cerecetrilor sunt prezentate n tabelul 4.3.
Tabelul 4.3. Influena mediilor crioprotectoare asupra spectrului proteic din sperma de coco n
condiiile crioconservrii
Martor Mediul C 2 Nr.
ctr.
Fraciile
proteice mg/ml/mlrd % mg/ml/mlrd %
Plasma
1. Albumine 7,5 2,46* 37,3 4,9 0,40 22,7
2. - globuline 5,8 2,48 28,8 6,6 2,40 30,6
3. - globuline 2,9 0,47 14,2 3,0 0,83 13,9
4. globuluine 4,0 2,18 19,7 7,1 3,25* 32,8
5. Proteine totale 20,2 100 21,7 100
Gamei
1. Albumine 3,2 1,53 11,7 1,1 0,30 4,1
2. - globuline 1,9 0,88 7,1 1,1 0,73 3,9
3. - globuline 1,1 0,29 4,0 0,9 0,52 3,2
4. globuluine 21,1 3,10* 77,2 24,0 4,47* 88,8
5. Proteine totale 27,3 100 27,0 100
Not: *Prevalarea proteinelor.
132
Datele tabelul 4.3 relev, c aplicarea mediilor n procesul crioconservrii spermei de coco
duce la sporirea coninutului globulinelor din plasma seminal. Intensitatea derulrii acestui
proces este identic cu cea a spermei de taur, n condiii similare [47, 65, 91]. Stabilizarea acestui
indice are importan, ntruct conform .. .. [88, 98] proteinele
plasmatice din sperm majoreaz mobilitatea i longevitatea spermatozoizilor decongelai.
Aadar, condiiile crioconservrii spermei animalelor de ferm nu provoac transformri
semnificative ale proteinelor generale, plasmatice i ale spermatozoizilor. Anologice concluzii
sunt prezentate i de ali cercettori, care au studiat spectrul lipidelor spermei animalelor
domesice [47] i a eritrocitelor [142]. Este necesar de menionat, c n spermatozoizii de coco
prevaleaz -globuluinele dup congelare-decongelare, iar n plasm - albuminele, ceea ce
demonstreaz c spermatozoizii dup crioconservare se afl n stare de stres termic.
Analiza coninutul fraciilor proteice n varianta experimental a stabilit, c n
spermatozoizi, cum i n varianta martor, prevaleaz -globulinele, iar n plasma seminal -
globulinele sunt majoritare numai n varianta experimental. n varianta-martor a plasmei
spermatice prevaleaz albumunele. Prin urmare, modificrile nregistrate n coninutul
proteinelor din varianta experimental demonstreaz despre producerea lor sub influiena
factorilor componeni ai mediului C-2.
Astfel, n contextul celor expuse n prezentul subcapitol putem concluziona, c folosirea
argininei n componena mediului C-2 stabilizeaz indicii fiziologici dup crioconservarea
spermei de coco, care poate fi explicat prin stabilizarea complexelor dintre elementele
structurale ale proteinelor, membranelor i ale mediului crioprotector. n acelai timp, proteinele
din componena mediilor provoac modificri evidente n structura proteinelor plasmei seminale
i duc la prevalarea -globulinelor pe fonul scderii albuminelor, manifestnd efecte protectoare.

4.1.2. Rolul lipidelor n procesul de crioconservare a materialului seminal de coco.
Particularitile specifice ale reaciei genomului animalelor la condiiile extremale ale
mediului extern, realizate anterior n Institutul de Fiziologie i sarcinile puse n lucrare au
condiionat continuarea experienilor similare cu sperma de coco.
n ultimii ani, n legtur cu studierea activ a mecanismelor moleculare de criodeteriorare
i crioprotecie a bioobiectelor la nivelul sistemelor membranare, brusc a sporit interesul ctre
rolul reglator al lipidelor asupra strii funcionale a lor. Lipidele membranelor biologice,
particularitile compoziiei structurale ale lor, au un rol deosebit n reaciile compensatoare la
echilibrarea condiiilor mediului, care permit de a influena asupra strii indicilor funcionali ai
spermatozoizilor.
133
Este cunoscut, c lipidele formeaz nu numai baza structural a membranelor celulare,
determinnd gradul de lichiditate, difuzia lateral i asimetria transmembranar, dar ele sunt i
substane biologice active. n membranele biologice, componena lipidic integrat n matrica
funcional, particip la iniierea programei de reglare celular [181]. Modificrile
compensatoare n spermatozoizi sunt direcionate asupra meninerii structurii lichid-cristalice a
lipidelor i a bistratului lipidic, proprietilor de barier i permeabilitii membranelor.
Stereotipicitatea reaciilor biochimice adaptive, la nivelul lipidelor, este, probabil, una dintre
posibilitile principale ale evoluiei obiectelor vii, care determin lipsa modificrilor calitative
ale reaciilor biobiectului la influena factorilor externi. n schimb, parametrii fizico-chimici ai
sistemului de reglare a POL au divers sensibilitate [147, 264]. Volumul i caracterul
interconexiunii dintre indicii coordonai pot fi diferite, nu numai n dependen de natura i
intensitatea factorului extern, dar i de starea fizico-chimic iniial a sistemelor biologice.
Aceasta determin diferenierea cantitativ, care se observ nu numai la diferite cercetri, dar i
n dependen de iniierea influenei factorului de referin.
n legtur cu aceasta, n experiene speciale a fost studiat influena lipidelor din
componena mediilor pentru crioconservare asupra patologiilor spermiilor de coco. Rezultatele
cercetriloe sunt expuse n tabelul 4.4.
Tabelul 4.4. Influena lipidelor exogene asupra spermatozoizilor de coco
Spermatozoizi cercetai, % Nr.
ctr.
Etapa prelucrrii tehnologice
a spermei Patologici Integri
1. Sperma nativ 11,4 0,94 89,59 0,94
2.
Sperma crioconservat n mediu
glucoz-glicerin
26,8 0,59* 73,17 0,59*
3.
Sperma crioconservat n mediu
glucoz-glicerin-extract de lipide
27,5 0,84 73,50 0,84
Not: *Diferena este statistic autentic n comparaie cu sperma nativ.
Datele tabelului ilustreaz sporirea coninutului de spermatozoizi patologici pn la
26,80,59% sau de 2 ori mai mare, n comparaie cu rezultatele obinute n cazul experimentrii
cu sperma nativ de coco. La acest capitol, glicerina este, probabil, cel mai bun crioprotector
pentru spermatozoizii de coco, dar n acelai timp, este necesar s fie eliminat din material
seminal dup decongelarea lui. Acest lucru poate fi realizat prin centrifugarea succesiv, diluare
sau dializ [289]. n acelai timp, fiecare molecul de glicerin oxietilat, are proprietatea de a
lega 48 molecule de ap, ceea ce predetermin participarea ei n procesul de vitrificare [207].
134
Perfecionarea remediului crioprotector, prin introducerea n componena acestuia a
componentului lipidic, nu modific esenial coninutul celulelor atipice. Avnd n vedere, c fr
participarea nemijlocit a compuilor lipidici nu se realizeaz nici un proces biologic n
organism, atunci reiese, c lipidele exogene din componena mediului nu sunt implicate
nemijlocit n metabolismul vital al spermatozoizilor .
Paralel cu studierea coninutului formelor patologice, au fost studiai i indicii fiziologici ai
spermei de coco dup crioconservare, de asemenea, sub influiena lipidelor exogene.
Rezultatele studiului sunt prezentate n tabelul 4.5.
Tabelul 4.5. Indicii fiziologici ai spermei decongelate de coco la folosirea lipidelor n
componena mediului crioprotector
Indicii fiziologici ai spermatozoizilor
Nr.
ctr.
Denumirea bioobiectului
i mediul sintetic
Mobilitatea,
puncte
Longivitatea,
ore
1. Sperma crioconservat n mediu
glucoz-glicerin (martor)
3,2 0,12 4,3 0,55
2. Sperma crioconservat n mediu
glucoz-glicerin-lipide (experimental)
3,5 0,22 6,8 0,61*
Not: *Diferena este statistic autentic.
Datele prezentate n tabelul 4.5 demonstreaz, c lipidele studiate au proprietate
stabilizatoare asupra strii fiziologice a spermei. n particular, are loc sporirea semnificativ a
longevitii spermatozoizilor de coco dup decongelare. Acest proces poate fi predeterminat de
reducerea coninutului produselor toxice a activitii vitale a spermatozoizilor de coco [92],
fiind produse biologice active.
Astfel, rezultatele cercetroilor relev, c lipidele exogene, folosite n varianta
experimental posed proprieti protectoare numai asupra longevitii spermatozoizilor
decongelai de coco, ceea ce poate fi condiionat prin proprietile lipidelor de a substitui i
economisi sursele energetice, necesare pentru prelungirea activitii vitale a lor.

4.1.3. Rolul glucidelor la stabilizarea strii morfofuncionale a spermei de coco n procesul
de crioconnservare.
Glucidele reprezint substratul energetic pentru spermatozoizi, ceea ce determin
necesitatea includerii lor n componena mediilor, att pentru pstrarea hipotermal, ct i
superhipotermal a spermiilor [50, 78, 82, 92, 411]. n plus, glucidele sunt reglatori puternici ai
osmozei mediului intra- i extracelular. Un interes deosebit reprezint aptitudinea glucidelor,
135
ndeosebi a dizaharidelor, de a menine activitatea spermiilor crioconservai, n lipsa
crioprotectoarelor stabilite [171]. Se presupune, c glucidele au o influen stabilizatoare asupra
membranelor celulare, formnd legturi de hidrogen puternice ntre grupele hidrofile ale
glucidelor i grupele polare ale FL. Adugtor se consider, c dizaharidele sunt mai eficiente
dect monoglucidele n activitatea protectoare a lor, datorit influenei asupra compuilor
membranei citoplasmatice. Efectul crioprotector al glucidelor asupra spermatozoizilor, se
observ i n cazul mediilor hipertonice (450-550 m
Osmol
) la viteze mari de rcire (100-300
o
C/min) [413]. Practic, toate glucidele au eutectic sczut, viscozitate nalt la temperaturile mai
joase de 0
o
C i influeneaz forma i dimensiunile canalelor n apa nengheat.
n acelai timp, glucidele asigur n mediul extern i intern presiunea osmotic
corespunztoare spermiilor i, totodat, servesc ca substrat energetic al celulelor, n condiiile
aerobe i anaerobe; stabilizeaz complexele proteo-lipidice ale membranelor celulare i structura
citoscheletului; manifest activitate protectoare asupra spermatozoizilor, complet sau parial
nlocuind crioprotectorii aceptai [81].
Reieind din cele expuse, au fost efectuate cercetri a influenei glucidelor asupra strii
morfo-funcionale a materialului seminal de coco. La etapa iniial a investigaiilor s-a studiat
aciunea hidrailor de carbon asupra structurilor morfologice ale spermatozoizilor (tabelul 4.6).
Tabelul 4.6. Influena glucidelor asupra gametopatiilor n sperma de coco
Spermatozoizi
integri
Spermatozoizi
patologici
Nr.
ctr.
Componena
mediilor sintetice
Sperma-
tozoizi
cercetai Buci % Buci %
1.
Glucoz-glicerin-
glbenu
300 221 73,7 1,27 79 26,3 1,27
2.
Lactoz-glicerin-
glbenu
300 170 36,7 1,43* 130 43,3 1,43*
3.
Rafinoz-glicerin-
glbenu
300 215 71,7 1,69 85 28,3 1,69
4.
Maltoz-glicerin-
glbenu
300 238 79,8 1,16* 62 22,2 1,16*
5. Total (media) 1200 844 70,3 1,32 356 29,7 1,32
Not: *Diferena este autentic n comparaie cu media la experien.
Datele prezente n tabelul 4.6 demonstreaz, c numrul grupelor glicozidice n molecula
hidrailor de carbon (glucoza, lactoza, rafinoza, maltoza), spre deosebire de materialul seminal
de taur n aceleai condiii [47, 92], nu manifest influen asupra coninutului de forme
patologice ale spermatozoizilor.
136
n acest caz, rata gametopatiilor, practic, este determinat nu de numrul grupelor
glicozidice n molecul, dar de proprietile fizico-chimice ale glucidului experimentat, ntruct
lactoza i maltoza sunt dizaharide. n mediul cu lactoz gametopatiile n materialul seminal de
coco constituie 43,31,43%, iar, n condiii similare, includerea maltozei n componena
mediilor, contribuie la majorarea spermatozoizilor integri pn la 79,81,16%. Una dintre
cauzele nregistrrii acestor devieri, poate fi faptul c monoglucidele se caracterizeaz n
exclusivitate prin legturi hidrogene conform tipului, geometriei i energiei, care le formeaz.
Mecanismul aciunii lor se realizeaz la stabilizarea apei prin modificarea strii componentelor
citoplasmatice ale celulei, sporind pstrarea ei dup influena factorilor de crioconservare, [47].
ntro-o msur mai mic posed astfel de proprieti i di- i trizaharidele, cum sunt lactoza,
maltoza i rafinoza.
Avnd n vedere c glucidele, paralel cu proteinele i lipidele, sunt componente principale
ale biomembranelor, un interes deosebit prezint informaia cu privire la apartenena
interaciunilor structurale ale lor. De exemplu, glucoza face parte din componena glicolipidelor
i glicoproteidelor, xiloza - proteoglicanelor i glicoproteidelor, manoza glicoproteidelor i
galactoza este compus al tuturor trei glicoconjugate [46]. n acest caz, proprietile membranelor,
preponderent, se determin nu de orice interaciune specific ntre componeni, dar de
proprietile fizice ale rezistenei structurii bistratare, viscozitatea regiunii glucidice i polaritatea
grupelor implicate [71]. Rezistena membranelor biologice, n mare msur, depinde de gradul
saturrii sau nesaturrii resturilor acizilor grai ai FL, care condiioneaz viscozitatea necesar a
componenei glucidice n componena stratului bilipidic n cazul influenei temperaturilor
hipotermice. Astfel, n baza mecanismelor de crioprotecie poate fi considerat aptitudinea
glucozei n stabilirea biocomplexelor de natur glicoproteid i glicolipid n membrane (sunt
obinute unele dintre cele mai bune rezultate la stabilizarea morfologiei spermatozoizilor de
coco). Glucoza este substana stabilizatoare a proteinelor i influeneaz structura
citoscheletului la aciunea factorilor deterioratori n procesul crioconservrii [82]. Confirmare a
acestui fenomen servete stabilizarea biocomplexelor glicoproteice la includerea n componena
mediului crioprotector a manozei [92], care diminueaz calitatea spermei decongelate.
Ameliorarea rezultativitii crioconservrii spermei este real n rezultatul perfecionrii
mediilor crioprotectoare prin utilizarea procedeelor tehnologice eficiente pe baza cercetrilor
experimentale, efectuate la diferite nivele de organizare a obiectelor biologice. Potrivit prioritii
rolului biocomplexelor n activitatea membranelor plasmatice, n experienele ulterioare s-a
studiat aciunea monozaharidelor, componeni principali ai derivailor glucidici ai membranelor
asupra indicilor fiziologici ai spermei de coco.
137
n particular, n experiene separate, a fost determinat eficacitatea neelectroliilor n
componena mediilor crioprotectoare pentru diluia i congelarea spermei de coco. Pentru
aceasta, n calitate de neelectrolii au fost utilizate soluii izotonice de glucoz, zaharoz, maltoz
i rafinoz. La prima etap sperma de coco s-a diluat cu soluiile enumerate i a fost determinat
eficacitatea glucidelor dup indicii fiziologici ai spermatozoizilor (mobilitatea, longevitatea,
IAS). Rezultatele experimentale sunt prezentate n tabelul 4.7.
Tabelul 4.7. Aciunea neelectroliilor asupra indicilor fiziologici ai spermatozoizilor de coco
Indicii fiziologici ai spermatozoizilor
Mobilitatea spermatozoizilor
nativi, baluri
Nr.
ctr.
Denumirea
neelectrolitului
Nativi Diluai
Longevitatea,
ore
IAS,
u. c.
1. Galactoza 8,3 0,22 7,0 0,09* 7,8 0,22 18,2 1,34
2. Lactoza 8,3 0,22 6,0 0,35* 5,0 0,35 8,6 1,44
3. Zaharoza 8,3 0,22 7,1 0,44* 7,4 0,27 15,8 1,20
4. Maltoza 8,3 0,22 7,8 0,22** 8,8 0,22** 29,1 2,48**
5. Rafinoza 8,3 0,22 6,7 0,22* 5,8 0,22 13,6 2,21
Not: *Diferenele sunt statistic autentice n comparaie cu sperma nativ, **- lactoza.
Datele prezentate n tabelul 4.7 relev, c utilizarea soluiilor izotonice de glucide pentru
diluia spermei de coco, contribuie la meninerea calitii spermei. De exemplu, micorarea
mobilitii spermatozoizilor diluai se produce la nivelul, la care se asigur viabilitatea nalt a
spermiilor. Excepie constituie soluia izotonic de maltoz, care a asigurat cel mai nalt indice al
mobilitii spermatozoizilor diluai. Longevitatea i IAS ale spermatozoizilor sunt cele mai
minore n varianta de utilizare a lactozei i cele mai majore la utilizarea maltozei.
n continuare neelectroliii au fost utilizai pentru crioconservarea spermei de coco. n
special, s-a cercetat aciunea lor asupra mobilitii spermatozoizilor (tabelul 4.8).
Tabelul 4.8. Influena neelectroliilor asupra mobilitii spermatozoizilor de coco la
crioconservare
Nr.
ctr.
Mediile crioprotectoare suplimentate
cu neelectrolii
Mobilitatea spermatozoizilor,
puncte
1. Pe baz de glucoz (martor) 4,9 0,187
2. Pe baz de lactoz 4,3 0,199*
3. Pe baz de zaharoz 4,5 0,223
4. Pe baz de maltoz 5,8 0,122*
5. Pe baz de rafinoz 4,6 0,244
Not: *Diferenele sunt statistic autentice.
138
Datele tabelului 4.8 denot, c folosirea soluiilor izotonice de neelectrolii pentru
crioconservarea spermei de coco permite de a menine mobilitatea gameilor n limitele
4,30,19 i 5,80,12 puncte. n cazul utilizrii maltozei n componena mediului crioprotector au
fost nregistrate cele mai nalte rezultate (5,80,122 baluri). Includerea lactozei n componena
mediului a dus la diminuarea mobilitii spermatozoizilor. La experimentarea celorlalte glucide,
au fost stabilite rezultate, practic, identice cu cele din varianta martor.
Influena pozitiv a di- i trizaharidelor poate fi argumentat prin faptul, c primele
interacionnd cu moleculele de ap, formeaz legturi puternice, care contribuie la structurarea
apei, iar dizaharidele, prioritar, influeneaz pozitiv integritatea capului spermatozoizilor n
comparaie cu monoglucidele [83]. Mai mult, di- i trizaharidele provoac o scdere mai mare a
punctului de cristalizare [103]. Printre ele se ntlnesc i zaharide reduse.
Analiza n ansamblu a cercetrilor [6] denot, c prezena glucidelor n componena
mediilor crioprotectoare pentru sperma de coco iniiaz inhibarea procesului de POL din
membrane i diminuarea acumulrii produselor toxice ale acestui proces. n rezultat se
amelioreaz calitatea spermei decongelate i selectiv se stabilizeaz indicii fiziologici ai
spermatozoizilor de coco.

4.2. Impactul aciunii antioxidanilor asupra strii morfo-funcionale a spermei de coco la
aciunea temperaturilor joase i ultrajoase.
4.2.1. Aciunea antioxidanilor steroizi asupra strii morfologice i funcionale a
spermatozoizilor de coco la crioconservare.
Glicozidele steroide reprezint o clas imens a substanelor naturale din grupul
saponinelor, care atrag atenia cercettorilor datorit spectrului larg de activitate biologic i
securitate ecologic. Ele pe larg se folosesc n medicina tradiional ca preparate
antiinflamatoare, funghicide, contraceptive, antibiotice i citotostatice. De asemenea, este
cunoscut c aceste substane diminueaz nivelul CS n snge i au proprietate de aciune
antioxidativ. Totodat, stimularea creterii i fitoimunitii de ctre glicozidele steroide, permite
de a prezenta aceste substane ca adaptogeni naturali [120].
Soluionarea problemei ce ine de crioconservarea spermei animalelor domestice este strns
legat de studierea componenilor structurali ai gameilor. n aceast vedere, o atenie deosebit
se acord lipidelor, ca elemente necesare, integrale i eseniale ale membranelor biologice.
Anume, compoziia lipidic a membranelor determin un ir de funcii eseniale ale celulei.
Fluiditatea membranelor, clasterizarea proteinelor receptoare, formarea i caracteristica
materialului supramembranic, toate acestea depind de componena i structura lipidelor [42, 92].
139
Paralel, metabolismul lipidelor, activitatea enzimelor lipiddependente, viteza proliferrii i
permeabilitatea membranei sunt determinate de nivelul de POL [264]. ns, dereglarea
intensitii acestui proces poate fi cauza, ntr-o msur oarecare, ca factor nsoitor al patologiilor
celulare. n legtur cu aceasta, s-a efectuat o serie de experiene cu scopul explorrii
posibilitilor de stabilizare a structurilor morfologice i proprietilor funcionale ale
spermatozoizilor, folosind AO n componena mediilor crioprotectoare. n calitate de asemenea
compui, au fost experimentate glicozidele steroide. Eficacitatea utilizrii lor pentru crioprotecia
materialului seminal de coco este prezentat n tabelele 4.9-4.15.
Tabelul 4.9. Dinamica gametopatiilor i mobilitatea spermatozoizilor crioconservai de coco n
funcie de utilizare a glicozidului steroid Asparagozid-B
Nr.
crt.
Varianta
experienei
Concentraia
antioxidanilor,
mg%
Au fost
cercetai
spermatozoizi
Coninutul
gametopatiilor,
%
Mobilitatea
spermatozoizilor
decongelai,
baluri
1. I 5 600 27,2 1,64 4,92 0,168
2. II 2,5 600 27,3 1,05 4,83 0,183
3. III 1,25 600 27,3 0,83 4,92 0,166
4. IV 0,624 600 26,5 1,40 5,08 0,091
5. V 0,312 600 26,8 1,63 5,25 0,234
6. VI 0,156 600 26,3 1,08 5,25 0,234
7. VII 0,078 600 27,2 0,87 5,17 0,183
8. VIII 0,039 600 26,7 1,12 5,17 0,183
9. IX - martor 0 - martor 600 27,5 0,84 5,17 0,231

Datele prezentate n tabelul 4.9 demonstreaz, c folosirea asparagozidei-B n componena
mediului pentru crioconservarea spermei de coco nu este eficient.
n experiena urmtoare a fost continuat studierea eficienei asparagozidei, dar de acum a
fraciei C. Rezultatele sunt prezentate n tabelul 4.10.
Datele tabelului 4.10 demonstreaz, c Asparagozida-C n concentraii de la 5 pn la 0,039
mg% n coponena mediilor crioprotectoare nu influeneaz calitatea spermei de coco dup
decongelarea ei.
Continund cercetrile eficienei asparagozidei, n urmtoarele experiene a fost studiat
aciunea asparagozidei-H asupra indicilor morfo-funcionali ai spermatozoizilor de coco la
crioconservare. Rezultatele cercetrilor sunt prezentate n tabelul 4.11.

140
Tabelul 4.10. Dinamica gametopatiilor i mobilitatea spermatozoizilor crioconservai de coco n
funcie de utilizare a glicozidului steroid Asparagozid-C
Nr.
crt.
Varianta
experienei
Concentraia
antioxidanilor,
mg%
Au fost
cercetai
spermatozoizi
Coninutul
gametopatiilor,
%
Mobilitatea
spermatozoizilor
decongelai,
baluri
1. I 5 600 29,7 1,41 3,75 0,122
2. II 2,5 600 29,2 1,42 3,92 0,168
3. III 1,25 600 29,2 2,27 4,17 0,115
4. IV 0,624 600 29,5 1,09 4,24 0,122
5. V 0,312 600 28,5 0,84 4,33 0,115
6. VI 0,156 600 28,8 0,87 4,58 0,168
7. VII 0,078 600 28,8 1,86 4,92 0,168
8. VIII 0,039 600 29,7 1,89 5,25 0,168
9. IX - martor 0 - martor 600 29,8 1,75 5,25 0,122

Tabelul 4.11. Dinamica gametopatiilor i mobilitatea spermatozoizilor crioconservai de coco n
funcie de utilizare a glicozidului steroid Asparagozid-H
Nr.
crt.
Varianta
experienei
Concentraia
antioxidanilor,
mg%
Au fost
cercetai
spermatozoizi
Coninutul
gametopatiilor,
%
Mobilitatea
spermatozoizilor
decongelai,
baluri
1. I 5 600 26,3 0,88 5,08 0,261
2. II 2,5 600 25,8 0,88 5,67 0,115
3. III 1,25 600 23,3 0,67 6,25 0,112*
4. IV 0,624 600 21,8 0,52* 6,67 0,183
5. V 0,312 600 22,5 0,68* 6,50 0,200*
6. VI 0,156 600 25,5 0,88 6,00 0,141*
7. VII 0,078 600 26,3 0,88 5,67 0,183
8. VIII 0,039 600 26,7 0,73 5,58 0,168
9. IX - martor 0 - martor 600 26,5 0,79 5,58 0,168
Not: *Diferenele sunt statistic autentice n comparaie cu lotul-martor.
Datele prezentate n tabelul 4.11 demonstreaz efectul stabilizator al Asparagozidei-H n
concentraii optimale.
n cercetrile ulterioare a fost studiat eficiena glicozidului steroid din grupa Lilia. Datele
obinute n urma cercetrilor se prezint n tabelul 4.12.
141
Tabelul 4.12. Dinamica gametopatiilor i mobilitatea spermatozoizilor crioconservai de coco n
funcie de utilizare a glicozidului steroid Lilia-H
Nr.
crt.
Varianta
experienei
Concentraia
antioxidanilor,
mg%
Au fost
cercetai
spermatozoizi
Coninutul
gametopatiilor,
%
Mobilitatea
spermatozoizilor
decongelai,
baluri
1. I 5 600 27,0 1,16 4,75 0,230
2. II 2,5 600 27,3 1,60 4,92 0,261
3. III 1,25 600 26,5 2,39 5,17 0,183
4. IV 0,624 600 24,7 1,06 5,58 0,165
5. V 0,312 600 23,2 0,72 6,08 0,168*
6. VI 0,156 600 23,8 1,04 5,92 0,168*
7. VII 0,078 600 25,5 1,09 5,58 0,166
8. VIII 0,039 600 26,7 1,05 5,33 0,115
9. IX - martor 0 - martor 600 26,7 0,69 5,17 0,115
Not: *Diferenele sunt statistic autentice n comparaie cu lotul-martor.
Datele tabelului 4.12 denot eficiena includerii preparatului Lilia-H asupra stabilizrii
mobilitii gameilor de coco dup decongelare. Concentraia optim a glicozidului steroid a
constituit 0,312 i 0,156 mg%.
Continuitatea cercetrilor influenei compuilor din seria Lilia s-a axat pe studiul aciunii
substanei Triozid-Lilia, rezultatele crui sunt prezentate n tabelul 4.13.
Tabelul 4.13. Dinamica gametopatiilor i mobilitatea spermatozoizilor crioconservai de coco n
funcie de utilizare a glicozidului steroid Triozid-Lilia
Nr.
crt.
Varianta
experienei
Concentraia
antioxidanilor,
mg%
Au fost
cercetai
spermatozoizi
Coninutul
gametopatiilor,
%
Mobilitatea
spermatozoizilor
decongelai,
baluri
1. I 5 600 18,3 0,46* 5,75 0,121
2. II 2,5 600 17,5 0,68* 6,25 0,234*
3. III 1,25 600 18,5 0,97* 6,08 0,216
4. IV 0,624 600 20,8 0,91 5,58 0,154
5. V 0,312 600 24,0 1,50 5,33 0,115
6. VI 0,156 600 25,8 1,04 5,25 0,112
7. VII 0,078 600 26,3 0,92 5,42 0,091
8. VIII 0,039 600 27,2 0,66 5,33 0,115
9. IX - martor 0 - martor 600 27,7 0,54 5,42 0,215
Not: *Diferenele sunt statistic autentice n comparaie cu lotul-martor.
142
Datele din tabelul 4.13 stabilesc rezultate benefice asupra strii morfologice i funcionale
ale spermatozoizilor de coco la influena Triozidei-Lilia.
n cercetrile dedicate studierii eficienei glicozidelor steroide de o alt provenien, a
Petumozidului-2, a fost studiat mobilitatea spermatozoizilor la diferite etape de crioconservare a
spermei de coco. Rezultatele obinute sunt prezentate n tabelul 4.14.
Tabelul 4.14. Eficacitatea glicozidei steroide Petumozidei-2

pentru crioconservarea spermei de
coco
Mobilitatea spermatozoizilor, puncte Nr.
ctr.
Concentraia
glicozidelor, g/100 ml Nativi Refrigerai Decongelai
1. 5,0 x 10
-4
8,7 0,21 8,3 0,20 3,3 0,21
2. 2,5 x 10
-4
8,7 0,21 8,3 0,20 3,7 0,20
3. 1,25 x 10
-4
8,7 0,21 8,3 0,20 4,5 0,36
4. 6,25 x 10
-5
8,7 0,21 8,3 0,20 5,2 0,54
5. 3,15 x 10
-5
8,7 0,21 8,3 0,20 5,8 0,21*
6. Mediul C
2
(martor) 8,7 0,21 8,3 0,20 4,8 0,20
Not: *Diferenele sunt statistic autentice.
Rezultatele experienelor expuse n tabelul 4.14 relev, c concentraia optim a
Petumozidului-2 este de 3,15x10
-5
g/100 ml mediu. Utilizarea acestui preparat permite de a
majora mobilitatea spermatozoizilor cu 24%, comparativ cu indicii analogici din grupul-martor,
unde AO nu a figurat.
Concomitent, s-a studiat i influena Petumozidului-3 asupra mobilitii spermatozoizilor
nativi i decongelai. Rezultatele aciunii acestei substane sunt prezentate n tabelul 4.15.
Tabelul 4.15. Eficacitatea gicozidei steroide Petumozidei-3 la crioconservarea spermei de coco
Nr.
ctr.
Mobilitatea spermatozoizilor,
puncte

Concentraia
glicozidelor,
g/100 ml Nativi Decongelai
1. 5,0 x 10
-4
8,7 0,21 4,2 0,20
2. 2,5 x 10
-4
8,7 0,21 4,0 0,35
3. 1,25 x 10
-4
8,7 0,21 4,0 0,35
4. 6,25 x 10
-5
8,7 0,21 4,7 0,21
5. 3,15 x 10
-5
8,7 0,21 4,7 0,35
6. Mediul C
2
(martor) 8,7 0,21 4,7 0,21
Datele cercetrilor au stabilit, c concentraia Petumozidului-3 mai mare de 6,25x10
-5
g/100
ml este toxic pentru mobilitatea spermatozoizilor, iar concentraiile egale cu cea menionat i
143
mai mici, sunt neutre pentru indicii studiai. Acest remediu posed proprieti antioxidative
neutre.
Din datele tabelelor 4.9-4.15 urmeaz, c folosirea triozidei Liliea-H i asparagozidei-H n
componena mediului crioprotector pentru materialul seminal de coco micoreaz gametopatiile
cu 3-10 la sut. ndeosebi, s-a dovedit a fi eficient triozidul. Este important de a meniona, c
experimentarea asparagozidei-C i asparagozidei-B nu manifest aciune asupra ratei de
gametopatii, ceea ce poate fi explicat prin specificul i proprietile fizico-chimice ale AO.
Din datele expuse n tabele reiese, c concentraia de 5 mg% a substanelor experimentate
este toxic pentru gameii de coco. ndeosebi, s-a evideniat aceast proprietate n experienele
cu asparagozida-C. Diminuarea concentraiei AO a contribuit la majorarea mobilitii
spermatozoizilor decongelai. Valoarea maxim antioxidativ s-a stabilit la experimentarea cu
asparagozida-H i fracia sumar Lilia-H. Utilizarea acestor preparate mpreun cu componenii
mediului crioprotector pentru coco permite de a majora indicele studiat cu 17,7% i 17,8%,
corespunztor. De asemenea, ine de menionat, c asparagozida-H contribuie la majorarea
mobilitii spermatozoizilor decongelai n limitele de concentraii 1,250,156 mg% i are
importan practic.
O activitate satisfctoare posed i triozida-Lilia (13,2%). n cazul folosirii asparagozidei-
C i -B indicii fiziologici ai spermatozoizilor de coco dup decongelare nu se amelioreaz.
Prin urmare, activitatea antioxidativ a glicozidelor steroide depinde nu numai de
componena chimic, dar i de particularitile obiectului supus crioconservrii.
Astfel, analiza studierii influenei glicozidelor steroide (tabelele 4.9-4.15) asupra strii
morfo-funcionale a spermei de coco permite de a concluziona, c dintre glicozidele steroide
studiate, cele mai eficiente la stabilizarea integritii morfologice i activitii funcionale ale
spermatozoizilor n procesul crioconservrii sau dovedit a fi Asparagozida-H i Treozida-Lilia,
care au redus considerabil dinamica patologiilor i au sporit mobilitatea rectilinie a
spermatozoizilor. n acelai timp, concentraia optimal a glicozidelor steroide, studiate n
componena mediilor pentru crioconservarea spermei de coco, difer semnificativ, ceea ce
determin variabilitatea activitii antioxidative a lor.

4.2.2. Eficiena influenei vitaminelor la diferite etape tehnologice de crioconservare a
spermei de coco.
Vitaminele sunt substane chimice organice, necesare n cantiti mici pentru procesele
vitale ale organismului. Ele influeneaz activitatea organismului i a sistemelor n ansamblu,
inclusiv i a sistemululi reproductiv. S-a accentuat asupra faptului, c AO naturali (vitamina E,
144
acidul ascorbic) creeaz n materialul seminal un sistem integral de protecie contra POL i
produselor toxice ale metabolismului [171, 198, 223, 284].
Echilibru dintre producia POL i a AO protectori este considerat, ca factor determinant
important al calitii materialului seminal, n special, a capacitii de fertilizare [375]. Relaiile
dintre POL i statutul AO n sperma aviar au o importan considerabil [386]. Antioxidanii, n
general, pot fi mprii n dou grupe, i anume, enzimatici i nonenzimatici, iar rolul lor n
materialul seminal aviar este elucidat mai jos [147].
Este cunoscut, c vitaminele au proprieti antioxidative [143, 333]. Procesele de peroxidare
n obiectele biologice sunt reglate de AO endogeni. ns, n condiii nefavorabile, procesele de
peroxidare pot fi dereglate [204]. n legtur cu aceasta, cercetrile noastre au avut ca scop
studierea influenei vitaminelor, drept AO, asupra sanogenitii spermatozoizilor.
O atenie deosebit s-a atribuit AO dietetic vitaminei E. A fost demonstrat, c 88% din
coninutul vitaminei E din sperma de coco se afl n spermatozoizi. n funcie de diet,
concentraia vitaminei E n materialul seminal de coco variaz ntre 0,46 micrograme/ml (fr
suplimentarea raiei cu vitamina E), pn la 1,04 micrograme/ml (cu suplimentarea raiei cu
vitamina E la nivelul de 200 mg/kg) [386].
Vitamina E este format din compui de tocoferoli i tocotrienoli importani, mai cu seam,
prin rolul lor n funciile antioxidative, rezistena la boli i interaciunile cu Se n integritatea
esutului. n plus, compuii bioactivi ai vitaminei E sunt, la fel, implicai n stabilizarea
membranelor, reducerea reaciilor oxidative, detoxificarea metalelor grele, sinteza
prostoglandinelor, sinteza si metabolismul unor vitamine i metabolismul AA. [204, 284, 422].
Concomitent, conform lui Lin i al. [284] fertilitatea i durata de fertilitate sunt nsuirile
economie, cele mai importante pentru cocoi, care pot fi influenate de factorii de mediu, cum ar
fi temperatura i iluminarea, precum i aportul alimentar al vitaminei E [204].
O alt posibilitate pentru inhibarea POL se face prin includerea vitaminei E n solvenii
spermei, eficiena creia a fost, mult mai joas, dect integrarea ei n raia alimentar [386, 387].
n cercetrile noastre, n calitate de vitamin a fost folosit vitamina E (-tocoferol acetat),
substan pe larg rspndit n lumea vegetal i animal. La deficitul tocoferolului n organism
au loc diferite schimbri patologice. Anume tocoferolul este o substan efectiv, care
prentmpin multe stri cu ar fi infertilitatea masculin, capacitatea imun a celulelor implicate
n rspunsul imun etc [25, 26], care pot aprea n celule n condiii nefavorabile.
n prima experien a fost determinat concentraia optimal a tocoferolului n componena
mediului pentru crioconservarea spermei de coco. Rezultatele sunt prezentate n tabelul 4.16.
145
Tabelul 4.16. Eficiena tocoferolului n componena mediului pentru crioconservarea spermei de
coco
Mobilitatea spermatozoizilor dup, puncte
Nr.
crt.
Specificare
Diluare Refrigerare Decongelare
1.
Mediul de baz +
Vitamina E 0,1 mg%
7,3 0,32 7,2 0,24 3,9 0,20
2. _ _ + 0,2 _ _ 7,4 0,28 7,2 0,24 4,0 0,31
3. _ _ + 0,3 _ _ 7,4 0,28 7,2 0,30 4,3 0,31
4. _ _ + 0,4 _ _ 7,4 0,32 7,2 0,30 4,5 0,28
5. _ _ + 0,5 _ _ 7,4 0,40 7,2 0,24 4,8 0,28*
6. _ _ + 0,6 _ _ 7,4 0,20 7,2 0,24 4,3 0,30
7. _ _ + 0,7 _ _ 7,4 0,28 7,2 0,30 4,1 0,30
8. _ _ + 0,8 _ _ 7,3 0,43 6,9 0,41 3,8 0,21
9. _ _ + 0,9 _ _ 7,3 0,43 6,8 0,40 3,7 0,40
10. _ _ + 1,0 _ _ 7,3 0,49 6,8 0,40 3,5 0,40
11. Mediul de baz 7,3 0,32 7,0 0,14 3,9 0,20
Not: *Diferena este statistic autentic.
Din tabelul 4.16 reiese, c tocoferolul acord efecte diverse n mediile pentru sperma de
coco, n intervalul de concentraii 0,1-1,0 mg%. Concentraia optimal a tocoferolului n mediul
pentru diluarea i congelarea spermei de coco este egal cu 0,5 mg%. Efectul preparatului este
mai evideniat dup decongelarea spermei de coco, cnd mobilitatea spermatozoizilor a sporit cu
23%, de la 3,90,20 n varianta-martor pn la 4,80,28 baluri n varianta experimental.
Evoluia procesului normal al spermatogenezei n organism are necesitatea de un anumit
coninut de vitamine. n particular, dintre ele o semnificaie deosebit au vitaminele E, C, A, PP
i B
1
. Suplimentarea raiei cu vitamina E pentru meninerea i ameliorarea productivitii pe larg
este utilizat n creterea intensiv a psrilor, iar rezultatele variaz n funcie de nivelul i
durata suplimentrii cu aceast vitamin, rezervele genetice i vrst [374].
Vitamina E (tocoferolul) stimuleaz structurile hipotalamo-hipofizare, care regleaz
funciile testiculelor, procesele fiziologice ale epiteliului spermatic i ale endocrinocitelor
interstiiale, acioneaz ca oxidant, care amelioreaz calitatea spermei prin reducerea radicalilor
toxici pentru spermatozoizi. n procesul crioconservrii activitatea acestei vitamine scade, ceea
ce a predeterminat includerea ei n componena mediilor crioprotectoare i studierea influenei
lui asupra strii morfologice a spermatozoizilor. Rezultatele sunt prezentate n tabelul 4.17.
146
Datele prezentate n tabelul 4.17 demonstreaz, c folosirea tocoferolului la diluare i
refrigerare influeneaz gametopatiile neesenial i, numai dup decongelare se observ scderea
gametopatiilor n varianta experimental, unde coninutul tocoferolului a constituit 0,4-0,5 mg%.
Tabelul 4.17. Influena vitaminei E asupra ratei celulelor seminale patologice n procesul
crioconservrii, (%)
Celule seminale patologice (%) apreciate dup: Nr.
ctr.
Specificare
Diluare Refrigerare Decongelare
1. Mediul martor 19,4 2,13 22,4 4,10 30,4 2,35
2.
Mediul martor +
Vitamina E 0,3 mg%
20,3 1,19 21,8 5,04 28,4 4,13
3. - - + 0,4 mg% 19,8 3,83 20,3 3,81 23,0 1,35*
4. - - + 0,5 mg% 19,0 1,80 19,8 4,13 21,3 2,14*
5. - - + 0,6 mg% 20,1 2,34 20,4 3,35 23,4 3,02
Not: *Diferena este statistic autentic.
Avnd n vedere, c vitamina E este considerat ca component principal al sistemului AO i
acioneaz ca sinergist cu GSH-Px n procesul de protecie a spermei de coco mpotriva
stresului oxidativ [204], modificrile nregistrate confirm etapa vulnerabil a crioconservrii.
Vitamina C (acidul ascorbic) particip la reglarea sintezei hormonilor steroizi, activeaz
regenerarea fiziologic i procesele de oxido-reducere, favorizeaz absorbia microelementelor
(zinc, cupru, magneziu, potasiu, calciu), necesare pentru vitalitatea i longevitatea
spermatozoizilor i, n mod fiziologic normal, se sintetizeaz de ctre psri. Astfel, a fost
recomandat n hrana psrilor ca supliment pentru a atenua stresul, deoarece n timpul stresului
cerinele pot depi capacitatea de sintez [196, 231].
Stresul fiziologic, cum ar fi, cldura, bolile sau suprapopularea poate spori necesitatea
organismului n acid ascorbic [121]. Vitamina C este necesar pentru AA i metabolismul
mineral, precum i pentru sinteza testosteronului [311], care este esenial n funciile de
reproducere a cocoilor. Nowaczewski i Kontecka [333] au documentat faptul, c acidul
ascorbic asigur 65% potenialul antioxidativ al plasmei seminale i au demonstrat, c
suplimentarea raiei cu vitamina C, n rata de 200 mg/kg, acioneaz benefic asupra proprietilor
de reproducere a cocoilor n condiii de stres termic.
Astfel, meninerea spermatogenezei intense la psri necesit includerea vitaminei C n raia
alimentar a lor. Din aceleai considerente, aceast vitamin a fost inclus n componena
mediilor sintetice pentru diluarea i conservarea spermei de coco n condiii hipotermale i
studiat influena ei asupra mobilitii i longevitii celulelor reproductive. Rezultatele sunt
prezentate n tabelul 4.18.
147
Tabelul 4.18. Studierea influenei vitaminei C asupra capacitilor funcionale ale spermei de
coco
Indicii spermei Nr.
ctr.
Specificare
Mobilitate, baluri Longevitate, ore
1. Soluie fiziologic 5,8 0,02 5,0 0,61
2.
Soluie fiziologic +
Vitamina C 0,1 mg%
5,8 0,02 4,2 0,74
3. - - + 0,2 - - 5,6 0,11 4,4 0,77
4. - - + 0,3 - - 5,4 0,11 3,1 0,84
5. - - + 0,4 - - 4,9 0,11 3,0 0,35
6. - - + 0,5 - - 2,0 0,53 2,2 0,42
7. - - + 0,6 - - 1,7 0,42 2,2 0,42
8. - - + 0,7 - - 1,5 0,40 1,6 0,30
9. - - + 0,8 - - 1,2 0,42 1,0 0,10
10. - - + 0,9 - - 1,2 0,84 0,2 0,22
Datele prezentate n tabelul 4.18 demonstreaz, c vitamina C n componena soluiei
fiziologice cu concentraia n limitele 0,10,9 mg% nu favorizeaz indicii spermatozoizilor.
Aceasta poate fi explicat prin faptul, c aciunea vitaminei C a fost studiat numai n condiiile
hipotermale ale mediului. La fel, se poate de lmurit i prin eficiena manifestat de ctre
vitaminele studiate la etapele de congelare-decongelare a spermei de coco, ceea ce rezult din
datele prezentate n tabelele 4.16 i 4.17.
Variabilitatea eficienei vitaminelor studiate poate fi elucidat prin diferite mecanisme de
aciune a lor asupra obiectelor biologice, ceea ce vine n concordan cu relatrile privind
stabilizarea indicilor sanogeni ai spermei prin folosirea vitaminelor [122, 129].
Astfel, din contextul celor expuse reiese c vitamina E (-tocoferol acetat) poate fi folosit
n componena mediilor sintetice ca un stabilizator al strii funcionale i structurilor morfologice
ale spermei de coco, chiar i n condiiile nefavorabile ale crioconservrii. Totodat, efectul
antioxidativ i membranotrop al vitaminelor cercetate poate fi realizat prin meninerea i
consolidarea statusului structural-funcional al membranelor biologice ale spermatozoizilor, n
rezultatul crora are loc sporirea mobilitii i diminuarea nivelului de spermatopatii.

4.2.3. Stabilizarea strii funcionale a spermatozoizilor decongelai de coco prin utilizarea
substanelor de divers origine.
Vicasolul, strofantina i glutationul au fost incluse n componena mediilor crioprotectoare
din considerentele, c vicasolul particip n procesele fermentative ale sistemului de generare a
148
ATP, strofantina inhib accesul n celul a Na
+
-ului i efluxul K
+
-ului, crend condiii favorabile
pentru metabolismul acestor substane, iar glutationul particip n reglarea activitii ATP-azelor
[131].
Studiind aciunea strofantinei, vicasolului i glutationului n sperma de coco, n
urmtoarele experiene a fost determinat eficacitatea lor pentru stabilizarea indicilor fiziologici
ai materialului cercetat. n particular, n continuarea studiului influenei glicozidelor steroide a
fost cercetat eficiena steroidei cardiace (strofantinei) la crioconservarea spermei de coco.
Rezultatele studierii mobilitii spermatozoizilor decongelai sunt prezentate n tabelul 4.19.
Tabelul 4.19. Aciunea strofantinei asupra calitii spermei congelate-decongelate de coco
Nr.
ctr.
Concentraia strofantinei,
mg%
Mobilitatea spermatozoizilor
decongelai, puncte
1. 12,500 4,25 0,131
2. 1,250 4,18 0,246
3. 0,125 4,21 0,192
4. 0,062 4,46 0,283
5. 0,031 4,68 0,314
6. 0,016 4,53 0,296
7. 0,008 4,32 0,187
8. 0,004 4,32 0,245
9. Martor ( mediul C-2) 4,24 0,197
Datele expuse n tabelul 4.19 denot, c concentraia optimal a strofantinei n componena
mediului criprotector pentru sperma de coco constituie 0,031 mg%. Mobilitatea gameilor
decongelai n acest caz constituie 4,70,31 puncte sau cu 0,4 puncte mai mult, comparativ cu
lotul-martor, unde strofantina nu s-a utilizat. n toate variantele experimentale valoarea indicilor
studiai nu s-a modificat la niveluri autentice, deoarece glicozida cardiac blochiaz Na
+
/K
+
-
ATP-aza transportatoare i n rezultat coninutul Na
+
n celule sporete ce provoac deschiderea
Ca
+2
-canalelor i ptrunderea ionilor de Ca
+2
n celule. n rezultat se produce inhibarea
interaciunilor dintre compuii structurali ai sistemelor intracelulare [236, 385].
Ulterior, n scopul prelungirii studierii eficacitii vitaminelor i reieind din faptul, c
Vitamina K manifest activitate, partcipnd n reaciile fermentative ale sistemelor de generare
ale ATP-zelor [131], s-a cercetat influena ei asupra indicilor funcionali ai spermei de coco la
crioconservare. Rezultatele sunt prezentate n tabelul 4.20.
Din datele tabelul 4.20 urmeaz c vicasolul n concentraie de la 1,6 pn la 100 mg% nu
este toxic pentru sperma de coco, ns, schimbri eseniale ale calitii spermei decongelate nu
se observ. Aceasta poate fi explicat prin faptul, c vicasolul este o vitamin liposolubil, funcia
149
principal a creia, fiind de participare n reaciile de coagulare a sngelui, asigurnd hemostaza
biologic, regenerarea esuturilor i formarea esutului osos, ns, pe lng aceasta nu posed
activiti antioxidative. n sperm, n schimb, se desfoar multilateral, numai procese anabolice
[176, 180, 309, 401].
Tabelul 4.20. Eficacitatea vicasolului n componena mediului pentru crioconservarea spermei
de coco
Nr.
ctr.
Concentraia vicasolului,
mg%
Mobilitatea spermatozoizilor
decongelai, puncte
1. 100 4,16 0,205
2. 50 4,00 0,354
3. 25 4,33 0,205
4. 12,5 4,00 0,354
5. 6,25 4,16 0,205
6. 3,125 4,33 0,205
7. 1,602 4,33 0,205
8. Martor (mediul C - 2) 4,00 0,354
n contextul studierii aciunii AO, a fost continuat cercetarea preparatelor cu proprieti
antioxidative. Una dintre substanele cu proprieti antioxidative a fost glutationul compus cu
structur chimic tripeptidic, care se sintetizeaz din cistein, acidul glutamic i glicin.
Este cunoscut, c adausul glutationului redus n mediu, modific gradul de fragmentare a
cisteinei [341]. Glutationul intr n componena GSH-Px, enzim, care joac un rol-cheie n
detoxicarea produselor oxidative ale lipidelor n sperma de coco [223, 387] i este un AO
deosebit, datorit rolului su de conversie a peroxidului de hidrogen n componente mai puin
nocive [204, 284]. Acestui produs s-a atras o atenie deosebit datorit efectului la utilizarea lui
n reproducere i n gestionarea fertilitii [147].
Proprietile glutationului au fost studiate la includerea lui n componena mediului pentru
crioconservarea spermei de coco. Rezultatele influenei asupra indicilor fiziologici ai spermei
de coco sunt prezentate n tabelul 4.21.
Analiza datelor din tabelul 4.21 arat, c glutationul n componena mediilor pentru
crioconservarea spermei de coco, n diapazonul concentraiilor de la 0,004 pn la 12,500 mg%,
nu posed proprieti stabilizatoare considerabile a indicilor de mobilitate ai spermatozoizilor.
Concomitent, se nregistreaz o tendin de sporire a mobilitii spermiilor decongelai, care
experimental a crescut cu 0,5 baluri sau 11% la o diferen neveridic. Eficiena neautentic a
glutationului se explic prin faptul c n experienele noastre sa utilizat forma oxidat a
glutationului, pe cnd proprieti membranotrope, posibil, are numai glutationul redus.
150
Tabelul 4.21. Activitatea glutationului asupra calitii spermei decongelate de coco
Nr.
ctr.
Concentraia glutationului,
mg%
Mobilitatea spermatozoizilor
decongelai, puncte
1 12,500 4,33 0,409
2 1,250 4,16 0,204
3 0,125 4,33 0,216
4 0,062 4,66 0,205
5 0,031 4,66 0,205
6 0,016 4,66 0,205
7 0,008 4,33 0,216
8 0,004 4,16 0,204
9 Martor (mediul C - 2) 4,16 0,204
Astfel, cercetarea empiric, care a fostutilizat de ctre noi la iniierea acestor experiene
este mai puin eficient dect cea planificat. La programarea utilizrii preparatelor
membranotrope i de alt natur, este necesar de a ine cont de proprietile prioritare ale
substanelor i posibilitile de manifestare ale acestor proprieti.

4.2.4. Indicii morfologici i biochimici ai membranelor plasmatice i acrozomale ale
spermatozoizilor de coco la aciunea antioxidanilor.
Pentru depirea problemelor de fertilitate din cauza performanei slabe a efectivului
masculin, mai multe studii au artat, c anume AO ar putea proteja membranele spermatozoizilor
i creterea viabilitii spermatozoizilor. Ameliorarea fertilitii masculine a fost n centrul
cercetrilor majore din domeniul conservrii spermei de coco din ultimele decenii [264].
Componena lipidic a membranelor plasmatice, n mare msur, determin activitatea
funcional a celulelor. Fluiditatea membranelor, clasterizarea proteinelor receptoare, formarea i
arhitectura matricelui exocelular depinde de componena i structura lipidelor. Concomitent,
metabolismul lipidelor, activitatea fermenilor lipid-dependeni, viteza proliferrii membranelor
depind de nivelul POL, care este un proces fiziologic normal. n acelai timp, ca consecin a
peroxidrii extinse a lipidelor, reaciile de POL n mod constant produc produse, care
influeneaz n detrimentul capacitii de fertilizare a spermei [148, 375, 387]. n condiii
fiziologice normale, exist un echilibru adecvat ntre ROS si AO [147].
Din aceste considerente, n urmtoarele experiene s-a apreciat eficacitatea includerii AO n
componena mediului crioprotector pentru sperma de coco. Includerea n componena mediilor
a substanelor biologice active, are un caracter secundar i se folosete la dereglrile pronunate
ale homeostaziei celulelor. De exemplu, AO se utilizeaz pentru prentmpinarea POL din
151
structurile membranare ale spermatozoizilor, n care enzimele, care regleaz POL au o activitate
sczut. n acest scop, se folosete n componena mediilor pentru crioconservarea spermei
psrilor inhibatorul fosfodiesterazei i a enzimei discompunerii c-adenozinmonofosfatului (c-
AMP). S-a demonstrat, c influena dirijat a c-AMP, ca una dintre principalele nucleotide, care
aprovizioneaz bioenergetica celulei n mobilitatea i supravieuirea spermatozoizilor, se reflect
pozitiv asupra rezultatelor crioconservrii materialului seminal [83].
Cercetrile ulterioare, destinate studierii mecanismelor de crioprotecie i criodeteriorare a
spermatozoizilor au fost consacrate studierii noilor AO, deoarece inducia POL atinge structura
i funcia membranelor.
n conformitate cu concepiile contemporane, POL decurge n cazul apariiei radicalilor
specifici n sistemul biologic. Formarea radicalilor liberi i a produselor POL, iniiaz schimbri
profunde de natur biochimic i fiziologo-structural n obiectele biologice, la diferite niveluri
de organizare a lor. Radicalii liberi, datorit electronilor necuplai, se includ n procesele
biochimice i provoac reacii nespecifice de extragere a hidrogenului din compuii chimici.
Intermediatorii iniierii i derulrii reaciilor de oxidare a radicalilor liberi, sunt radicalii, nu
numai a oxigenului dar i ai lipidelor. Prin urmare, inhibarea acestor reacii poate fi realizat
datorit interaciunii cu radicalii de ambele forme. n conformitate cu aceasta, sunt necesari AO
cu o eficacitate nalt, fapt ce a servit argumentare pentru studierea activitii antioxidative a
glicozidelor steroide pentru crioconservarea spermei de coco.
Un rol semnificativ n procesul fecundrii ovocitelor ndeplinete aparatul acrozomal al
spermatozoizilor,iar cele mai sensibile structuri ale acestuia sunt membranele acrozomale, care
accelerat modific structura i componena lor. n legtur cu aceasta, au fost efectuate
experiene, referitor la determinarea influenei glicozidelor steroide asupra pstrrii structurilor
morfologice la nivelul acrozomului. Rezultatele cercetrilor sunt expuse n tabelul 4.22.
Din datele tabelului 4.22 rezult, c cel mai bine s-a pstrat integritatea acrozomului
spermatozoizilor de coco, cnd n componena mediului au fost incluse Asparagozida-H i
Triozid-Lilia, n concentraii, corespunztoare de 0,624-0,312 i 2,5-1,25 mg%. Datele obinute
denot eficiena AO menionai la stabilizarea structurilor morfologice ale spermiilor de coco.
Unul dintre indicii importani, care caracterizeaz calitatea materialului biologic este
raportul componenilor principali din membrana plasmatic.
Conform datelor anterior obinute n laborator, procesul crioconservrii spermei animalelor
de ferm duce la diminuarea raportului proteine/lipide din membrana plasmatic a
spermatozoizilor. n experienele efectuate a fost studiat posibilitatea comparativ a reglrii
acestui raport, incluznd n componena mediilor crioprotectoare preparate noi din grupa
152
glicozidelor steroide. Din aceast grup s-a cercetat glucozdul steroid - petumozida. Rezultatele
sunt expuse n tabelul 4.23.
Tabelul 4.22. Aciunea glicozidelor steroide asupra integritii acrozomului spermatozoizilor
decongelai de coco
Nr.
ctr.
Denumirea
antioxidantului
Concentraia
antioxidantului,
mg%
Integritatea
acrozomului
spermatozoizilor, %
1. Asparagozida - C 0,078 40,5 0,84
0,039 40,2 0,84
0 - martor 41,1 0,72
2. Asparagozida - B 0,312 41,0 0,63
0,156 40,7 0,97
0 - m 42,7 0,97
3. Lilia - H 0,312 45,3 1,16
0,156 45,7 1,01
0 - martor 44,7 0,46
4. Treozid - Lilia 2,5 50,8 1,03*
1,25 49,5 1,14*
0 - m 45,1 0,34
5. Asparagozida - H 0,624 47,5 0,55*
0,312 47,2 0,33*
0 - martor 44,5 0,61
Not: *Diferena este statistic autentic n comparaie cu lotul-martor.
Datele tabelului 4.23 denot, c n membrana plasmatic a spermatozoizilor diferitor specii
de animale indicele studiat variaz de la 0,210,09 la vier, pn la 0,400,02 la taur, ce se
coincide cu gradul de criorezisten a spermei animalelor experimentate [92]. Utilizarea AO FH
2
i FH
3
pentru crioconservarea spermei de taur, vier i coco nu influeneaz esenial raportul
proteine/lipide din membrana plasmatic a spermatozoizilor.
Analiza rezultatelor expuse permite de a remarca, c AO n componena mediilor
crioprotectoare inhib peroxidarea radicalilor liberi din sperm. Lipidele biocomplexelor
membranice snt implicate n procesul peroxidrii ntr-o msur mai mic, datorit prezenei
legturilor puternice ntre componenii structurali ai biocomplexelor. La POL din sperm, pot fi
prezeni radicalii liberi sau lipide intercalate n biocomplexe, prin intermediul legturilor slabe.
n acest fel, probabil, se produce peroxidarea preponderent a lipidelor i, prin urmare,
peroxidarea la acest nivel este inactivat de ctre AO.

153
Tabelul 4.23. Studierea influenei antioxidative a Petumozida-2 (FH
2
) i Petumozida-3 (FH
3
)

asupra raportului proteine/lipide din membranele plasmatice ale spermatozoizilor de coco i ale
altor specii
Nr.
ctr.
Varianta
experimental
Raportul
proteine/lipide
Sperma de coco
1.
1. Sperma congelat n mediu fr
antioxidant
0,22 0,06
2. 2. Sperma congelat n mediu cu FH
2
0,20 0,07
3. 3. Sperma congelat n mediu FH
3
0,23 0,09
Sperma de vier
1.
1. Sperma congelat n mediu fr
antioxidant
0,21 0,09
2. 2. Sperma congelat n mediu cu FH
2
0,20 0,04
3. 3. Sperma congelat n mediu FH
3
0,18 0,07
Sperma de taur
1.
1. Sperma congelat n mediu fr
antioxidant
0,40 0,021
2. 2. Sperma congelat n mediu cu FH
2
0,35 0,030
Astfel, rezultatele obinute permit de a meniona, c substanele membranotrope, inclusiv
AO cercetai, sunt preparate eficiente pentru crioconservarea spermei. Includerea acestora n
componena mediilor crioprotectoare pentru sperma animalelor permite de a majora indicii
fiziologici i morfologici ai materialului deconservat. Aciunea temperaturilor sczute iniiaz
intensificarea semnificativ a reaciei de POL, care este predeterminat, n primul rnd, de
sporirea activitii fosfolipazelor.
Calitatea spermei decongelate de coco, paralel cu indicii funcionali i morfologici, este
caracterizat i prin indicii biochimici. Importana proprietilor biochimice a determinat
iniierea ulterioarelor experiene, cu privire la studierea influenei glicozidelor steroide asupra
coninutului produselor primare, intermediare i finale ale procesului POL la diferite etape a
tehnologiei de crioconservare a spermei de coco. Concomitent i, la toate nivelele de organizare
a sistemelor biologice, la baza crora se afl sistemul fizico-chimic de reglare a POL prin
intraconexie cu principalele proprieti ale membranelor (permeabilitatea, viscozitatea i starea
fazic) [284].
Pe parcursul derulrii reaciilor de POL, la etapa formrii radicalilor liberi, n moleculele
acizilor grai polinesaturai, cele mai labile componente ale lipidelor membranice [76], apare
154
sistemul legturilor duble neconjugate, care este nsoit de apariia maximelor n spectrul
fotometric la lungimea undelor de 233 nm. Modificarea coninutului acizilor grai, activai prin
receptorii intercelulari n procesul crioconservrii, relev despre derularea procesele reparative n
membranele spermatozoizilor [2]. Hidroperoxizii i DAM se determin prin reacia cu
tiocinamida amoniului i acidul tiobarbituric, corespunztor. Experienele au fost efectuate cu
folosirea n componena mediului sintetic a petumozidului, melangozidei i rusticozidei.
Rezultatele sunt prezentate n tabelul 4.24.
Din datele tabelului 4.24 reiese, c substanele studiate n calitate de AO nu influeneaz
asupra coninutului conjugatelor dienice nici la o etap tehnologic de crioconservare a spermei
de coco. n acelai timp, este necesar de menionat, c nici procesul de congelare-decongelare
nu influeneaz asupra indicelui studiat. Rezultate analogice sunt obinute i la studierea
coninutului produselor intermediare ale POL hidroperoxizilor.
Glicozidele steroide cercetate au manifestat proprieti stabilizatoare asupra coninutului
produselor finale ale POL DAM, care semnificativ s-a redus sub influena tuturor preparatelor
studiate. Prin urmare, calitatea spermei este determinat, n primul rnd, de coninutul DAM, care
poate fi reglat prin folosirea glicozidelor steroide.
Tabelul 4.24. Coninutul produselor peroxidrii lipidelor la diferite etape ale crioconservrii
spermei de coco n dependen de folosirea glicozidelor steroide
Produsele peroxidrii lipidelor
Nr.
ctr.
Etapa
tehnologic a
crioconservrii
Denumirea
preparatului
Conjugatele
dienice, u.e.
Hidroperoxizii,
u.e.
Dialdehida
malonic,
nMol/mlrd.
1. Diluarea spermei
Petumozid-2
Melangozid
Rusticozid
Lotul martor
2,7 0,28
3,8 0,01
3,8 0,26
3,8 0,39
0,20 0,03
0,22 0,011
0,23 0,04
0,26 0,02
32,1 8,01
34,1 6,03
35,0 6,07
38,6 7,82
2.
Refrigerarea
spermei
Petumozid-2
Melangozid
Rusticozid
Lotul martor
2,2 0,08
2,1 0,12
2,0 0,11
2,1 0,06
0,21 0,05
0,29 0,07
0,25 0,03
0,30 0,02
35,2 2,12
35,1 1,31
37,9 1,76
40,2 1,08
3.
Decongelarea
spermei
Petumozid-2
Melangozid
Rusticozid
Lotul martor
3,1 0,36
3,4 0,21
3,2 0,33
4,0 0,47
0,53 0,06
0,67 0,06
0,66 0,04
0,72 0,02
46,1 3,61*
52,3 3,74*
49,4 0,63*
67,0 2,48
Not: *Diferenele sunt statistic autentice n comparaie cu mediul fr AO.
155
Variaia activitii diferitor glicozide steroide poate fi clarificat, reieind din faptul, c
activitatea biologic a glicozidelor este determinat de interaciunea direct a lor cu sterinele
libere sau membrano-dependente, care se ncadreaz n limitele ipotezei sterine. Conform
cercetrilor contemporane, n membranele biologice se formeaz biocomplexele glicozidelor cu
CS membranar, n particular se formeaz complexe intercolesterin i partea aglican a
moleculei glicozidelor. Astfel de complexe i sistemul enzimatic asigur protecie contra
peroxizilor lipidici din membranele celulelor spermatice prin blocarea progresiv a lanului de
POL i neutralizarea peroxidului de hidrogen, ca iniiator n POL [204, 284].
n acelai timp, un rol decisiv n formarea biocomplexelor are dimensiunea lanului
hidrocarbonic al moleculei glicozidelor i, evident, moleculele glicozidelor steroide au diferite
dimensiuni, respectiv i diverse proprieti, ceea ce a fost confirmat prin rezultatele cercetrilor
noastre. Alt latur, se explic prin faptul, c interaciunea glicozidelor cu membrana biologic,
localizarea i orientarea moleculelor n membrane este determinat de particularitatea structural
a aglicanului, formarea lanurilor hidrocarbonice, numrul lor i locul de alipire la aglicanul
respectiv [120].
Astfel, analiznd rezultatele aciunii glicozidelor steroide la stabilizarea strii funcionale a
spermatozoizilor de coco putem concluziona, c AO, ca substane biologice active, n procesul
crioconservrii manifest proprieti selective, referitoare la stabilizarea indicilor morfo-
funcionali i biochimici ai spermatozoizilor de coco la diferite nivele de organizare a lor.
Activitatea antioxidant depinde de tipul, doza i durata de aciune a AO. Cea mai pronunat
activitate a AO se nregistreaz dup congelarea-decongelarea materialului sminal de coco. De
asemenea, datele actuale demonstreaz c n procesul de crioconservare a spermei de coco,
bariera fiziologic a AO poate fi dereglat, ceea ce predetermin folosirea suplimentar a AO n
componena mediilor sintetice.

4.3. Specificul modificrii componenei spermei de coco la congelare-decongelare sub
influena regimelor termice tehnologice.
Perfecionarea remediilor crioprotectoare este unul dintre momentele principale, ce
influeneaz asupra strii morfologice a spermatozoizilor n stare congelat. O condiie, nu mai
puin important, este alegerea parametrilor optimali de refrigerare, congelare i decongelare,
capabili de a manifesta la maximum efectul protector al componenilor remediului. Pentru o mai
bun eficien, n procesul soluionrii problemelor de crioconservare a materialului biologic,
este necesar de a se lua n calcul ambele momente menionate, deoarece ele sunt elementele
principale ale tehnologiei crioconservrii i minimalizrii criodeteriorrilor.
156
n procesul de crioconservare are loc polarizarea electric a matricelui, care este nsoit de
iradierea electromagnetic. Un rol important n mecanismele criodeteriorrii, aparine gradului
de dezechilibrare termic a materialului congelat, n special, vitezei de scdere a temperaturii.
Fenomenul polarizrii electrice este determinat de trei procese relaxante: relaxarea termic a
formaiunilor cristalice; relaxarea, determinat de transformarea lichidului n starea amorf i
deschiderea matricei amorfe. Aportul fiecrui dintre aceste procese, depinde de corelaia fazelor
cristalice i amorfe n matricea congelat. Aceasta demonstreaz, c macromoleculele biologice
sau celulele, care se afl n zona tensiunii termice, sufer de deteriorri mecanice, provocate de
cmpurile electrice. Astfel, n cazurile cnd crioconservarea este rezultativ i celulele sunt
transformate complet n starea amorf, tensiunea termo-mecanic provoac deteriorri n bio-
obiectul congelat. Aceste efecte pot fi motivul principal al deteriorrii materialului genetic [68].
n acelai timp, procesul de pregtire i realizare a tehnologiilor de crioconservare a spermei
de coco, n calitate de element obligatoriu, include scderea temperaturii optimale de meninere
a indicilor vitali ai gameilor pn la temperatura gazelor lichifiate [273, 274].
Reieind din cele expuse, a fost studiat influena regimurilor moderate i accelerate de
crioconservare asupra coninutului formelor patologice ale spermatozoizilor de coco. Viteze
nalte ale congelrii au fost realizate prin picurarea direct a spermei refrigerate n azotul lichid.
Vitezele moderate de congelare s-au realizat prin picurarea materialului refrigerat pe suprafaa
plcii de fluoroplast la temperatura de 110-120C, cu expoziie timp de dou minute. Rezultatele
cercetrilor sunt prezentate n tabelul 4.25.
Tabelul 4.25. Influena regimurilor de crioconservare asupra gametopatiilor la coco
Spermatozoizi decongelai, % Nr.
ctr.
Regimele de congelare
Patologici Integri
1. Sperma brut (martor) 12,0 1,45 88,0 1,45
2. Regime moderate 26,2 1,97* 73,8 1,97*
3. Regime accelerate 41,6 1,76*
,
** 58,4 1,86*
,
**
Not: *Diferena este statistic autentic n comparaie cu varianta-martor. ** Diferena este
statistic autentic ntre regimele aplicate.
Datele tabelului 4.25 demonstreaz, c folosirea regimului moderat de congelare, cnd
viteza scderii temperaturii era de 60 C/min creeaz posibilitate de a obine spermatozoizi
intaci n mrime de 73,81,97%. Regimul accelerat (4196 C timp de 10 sec. = 1600 C/min.)
provoac o scdere a coninutului spermatozoizilor integri cu 15,4% n comparaie cu regimul
moderat. Aceast diferen denot, c scderea brusc a temperaturii poate condiiona formarea
rapid a cristalelor de ap, care conform legitilor fizice sunt consecina scderii numrului de
157
spermatozoizi cu structur normal. Prin urmare, reducerea formrii cristalelor este posibil prin
modularea proceselor termodinamice a cristalelor de ap [255, 257, 349].
Indicii termodinamici ai sistemelor criobiologice pot fi folosii pentru interpretarea
rezultatelor obinute. n acest sens, se elaboreaz conceptul despre diferite poteniale ale apei i
substanelor dizolvate i despre influena formei cristalelor asupra potenialului lor [308].
Concomitent cu studierea coninutului gametopatiilor i a spermatozoizilor normali a fost
studiat i starea fiziologic a spermatozoizilor de coco. Datele sunt prezentate n tabelul 4.26.
Tabelul 4.26. Aciunea regimurilor termice asupra calitii spermei crioconservate de coco
Indicii fiziologici ai spermatozoizilor Nr.
ctr.
Regimele
congelrii Mobilitatea, baluri Longivitatea, ore
1. Regimuri moderate 3,2 0,12 4,3 0,55
2. Regimuri accelerate 0,5 0,16* 1,61 0,24*
Not: *Diferena este autentic n comparaie cu regimul moderat.
Analiza datelor prezentate n tabelul 4.26 demonstereaz, c folosirea regimului moderat de
congelare permite de a obine mobilitatea spermatozoizilor decongelai de coco la nivel de
3,20,12 baluri. Valoarea acestui indice la regimul accelerat de congelare a constituit numai
0,50,16 baluri, adic s-a micorat de 6 ori. n condiiile experimentale aplicate longevitatea
celulelor decongelate a atins o durat de 4,30,55 ore la temperatura camerei, comparativ cu
1,610,24 ore n varianta de congelare accelerat i reprezint 37,2%.
Astfel, scderea nivelului gametopatiilor n procesul crioconservrii spermei de coco i
sporirea indicilor fiziologici este posibil prin folosirea vitezelor optimale de refrigerare i
congelare, precum i, implicit, sunt caracteristice speciei de animale, mediilor sintetice i
modalitii de preambalare a materialului seminal.
n componena mediilor sintetice pentru diluarea i crioconservarea spermei sunt incluse
substane criofilactice, n legtur cu ce, este necesar de a ine cont, c chiar i componenii
nalteficieni, paralel cu proprietile lor protectoare, pot produce i efecte toxice [83]. Aceste
efecte nocive pot influena asupra morfologiei i indicilor funcionali ai spermatozoizilor. n
aceast ordine de idei, o parte component foarte important n tehnologia crioconservrii, este
determinarea parametrilor optimali de refrigerare a materialului spermatic (tabelul 4.27).
Datele tabelul 4.27 arat, c cele mai bune rezultate referitoare la restabilirea mobilitii
spermatozoizilor pot fi obinute n cazul cnd sperma se rcete pe parcursul a 15 min pn la
temperatura de 4 C. Este necesar de accentuat, c aceast perioad de refrigerare, esenial
difer de cea similar n procesul crioconservrii spermei de taur, unde durata refrigerrii
158
spermei, la congelarea ei n form de granule constituie 4 ore [32], fapt ce demonstreaz
particulariti semnificative ale spermei speciilor menionate.
Tabelul 4.27. Aciunea duratei de refrigerare i congelare a spermei asupra restabilirii mobilitii
spermatozoizilor de coco
Nr.
crt.
Durata,
min.
Mobilitatea spermatozoizilor
decongelai, puncte
Refrigerarea spermei
1. 5 4,1 0,209*
2. 10 4,8 0,285*
3. 15 5,1 0,274*
4. 20 4,9 0,326*
5. 25 4,5 0,177*
6. 30 4,1 0,209*
7. 35 3,8 0,332*
8. 40 3,4 0,209
9. 45 3,2 0,137
10. 60 2,7 0,317
Congelarea spermei
1. 1,0 2,4 0,209
2. 1,5 3,4 0,112
3. 2,0 5,3 0,285*
4. 2,5 4,8 0,224*
5. 3,0 4,4 0,274
6. 4,0 4,0 0,177
7. 5,0 3,7 0,224
Not: *Diferena este statistic autentic n comparaie cu varianta experimental maximal.
Referitor la durata congelrii spermei de coco n vaporii de azot lichid putem remarca, c
acest indice constituie 2 minute. Prin urmare, n aceast perioad, posibil, are loc nghearea apei
libere, ceea ce duce la distrucii semnificative ale spermatozoizilor. Din aceste considerente,
parametrul tehnologic studiat are necesitate de respectare strict.
Astfel, n baza rezultatelor cercetrilor expuse n acest subcapitol putem concluziona, c la
crearea mediilor sintetice noi pentru crioconservarea spermei de coco, n scopul obinerii
efectelor performante, este obligatoriu de a determina condiiile optimale preponderente de
manifestare a proprietilor protectoare ale lor. Sperma de coco manifest o sensibilitate sporit
la influena factorilor mediului nconjurtor, ceea ce este necesar de a se avea n vedere la toate
etapele de manipulare a ei.
159
4.4. Stabilizarea funciei de barier a spermei de coco la crioconservare.
Dereglarea proprietilor de barier ale membranelor plasmatice, n mare msur, pot
determina modificrile proceselor care au loc n celul. Sub acest aspect, un interes deosebit
prezint studierea strii funcionale a membranelor plasmatice, care asigur unul din elementele
principale a homeostaziei celulare repartizarea asimetric a substanelor extra- i intracelulare.
Valoarea cercetrilor membranelor plasmatice pentru criobiologie se manifest prin faptul, c
influena numeroilor factori fizico-chimici n procesul croconservrii: modificarea componenei
membranei, pH-lui, forelor ionice i osmotice, scderea temperaturii, deshidratarea i,
concomitent, formarea gradienilor termici n limitele de divizare a mediilor extra- i
intracelulare, provoac continuu deteriorri ale membranelor plasmatice, inclusiv permiabilitatea
lor, n diverse intensiti, comparativ cu celelalte membrane celulare [61]. Factorul iniial al
criodeteriorrii celulelor n rezultatul dereglrii funciilor de barier ale membranelor plasmatice
este estimarea deshidratrii [42, 89].
Reieind din cele expuse, n cercetrile efectuate am studiat concentraia optimal a
preparatelor, care ar putea stabiliza starea barier a membranelor plasmatice a spermatozoizilor
de coco n procesul de crioconservare.
n conformitate cu importana major a ionilor de Na
+
i K
+
pentru meninerea potenialelor
electrochimice i osmotice din celul, a ionilor de Li
+
i Ca
2+
pentru inducerera transformrilor
conformaionale ale biopolimerilor i a activitii multor fermeni [46, 61, 66, 108], n continuare
am studiat concentraia ionilor de Na
+
, K
+
, Li
+,
Ca
2+
n sperma de coco decongelat, n
dependen de componena mediilor sintetice, n componena crora au fost incluse vicasolul,
strofantina i glutationul. Ionii de K
+
, Na
+
i Li
+
pot avea interaciuni specifice i cu FL.
Aceste remedii au fost incluse n componena mediilor crioprotectoare, dup cum s-a
menionat mai sus, din considerentele, c vicasolul particip n numeroase reaciile fermentative
ale sistemului de generare al ATP-ului, strofantina produce inhibarea accesului n celul al Na
+
i
efluxul K
+
-ului, crend condiii favorabile pentru metabolismul acestor substane, iar glutationul
particip n reglarea activitii ATP-azelor [131, 141]. Rezultatele cercetrilor sunt prezentate n
tabelul 4.28.
Din tabelul 4.28 urmeaz, c coninutul de Na
+
n spermatozoizii decongelai variaz n
variantele experimentale n limitele 189,712,28 i 201,210,52 mg%, corespunztor, preparatul
utilizat. Cea mai mare concentraie de K
+
s-a nregistrat la folosirea glutationului. Avnd n
vedere, c n condiiile crioconsevrii spermei de coco are loc transportul K
+
-ului din celul,
atunci rezultatul obinut n cazul folosirii glutationului prezint interes n sensul posibilitilor de
reglare a concentraiei de K
+
n spermatozoizi la crioconservarea lor.
160

Tabelul 4.28. Influena strofantinei, vicasolului i a glutationului asupra concentraiei ionilor de
Na
+
, K
+
, Li
+
, Ca
2+
n procesul de crioconservare a spermei de coco
Concentraia ionilor, (mg%)
Nr.
ctr.
Varianta
experimen-
tal
Na
+
K
+
Li
+
Ca
2+

Raport
ul
Na
+
/K
+

Sperma decongelat
1. Sperma 259,3 19,30 35,9 4,03 0,60 0,07 7,90 0,25 7,22
2. Plasma 280,6 19,00 47,8 4,97 0,30 0,07 7,66 0,74 5,86
3. Spermatozoizi 182,6 5,32 43,3 4,58 0,17 0,04 3,16 0,36 4,21
Vicasol
1. Sperma 272,2 9,11 47,0 5,99 0,40 0,07 7,50 0,71 5,79
2. Plasma 283,4 11,7 58,8 8,67 0,33 0,04 6,50 0,35 4,82
3. Spermatozoizi 189,7 12,28 51,56 3,57 0,17 0,04 3,16 0,54 3,68
Strofantin
1. Sperma 250,0 21,29 45,6 11,16 0,63 0,08 8,00 1,54 5,48
2. Plasma 266,6 35,96 44,6 13,05 0,47 0,17 7,50 1,50 5,98
3. Spermatozoizi 201,2 10,52 59,6 3,90 0,17 0,04 2,33 0,54 3,38
Glutation
1. Sperma 272,2 9,10 44,5 5,84 0,60 0,07 9,33 0,74 6,12
2. Plasma 297,8 9,52 51,6 3,57 0,47 0,04 8,17 0,98 5,77
3. Spermatozoizi 191,3 5,32 63,3 1,47* 0,13 0,04 2,67 0,41 3,03
Not: *Diferenele sunt statistic autentice n comparaie cu folosirea vicasolului.
Faptul posibilitilor de stabilizare a coninutului ionilor de K
+
capt o valoare
semnificativ, ntruct K
+
pe parcursul etapelor crioconservrii continuu scade n spermatozoizi.
Diminuarea lui demonstreaz, c membranele plasmatice pstrnd conductibilitatea, pierd ionii
de K
+
intracelular. Aceasta se explic prin faptul, c 20-30% din totalul ionilor de K
+
intracelular
se afl n stare combinat i numai o cantitate mic a lui este n starea disociat, care i determin
proprietile lui osmotice. Derularea acestor procese pot avea un deosebit interes pentru starea
osmo-coloidal a proteinelor i starea morfo-funcional a membranelor plasmatice. n
particular, este cunoscut c scderea concentraiei ionilor de K
+
,

n mediu, mai mult dect 20-30
mmol/l, provoac dezacordarea interaciunilor proteo-proteice i lipo-proteice n biomembranele,
care sunt nsoite de pierderea proprietilor bariere [33, 61].
De asemenea, la folosirea glutationului s-a nregistrat o tendin de cretere a coninutului
de Ca
+
n sperm i n plasma seminal, care ndeplinete funcii importante de reglare. Reglarea
funciei proteinelor prin coninutul Ca
+2
are o semnificaie deosebit pentru funcionarea spermei
161
i, n particular, hiperactivarea ei, hemotaxisul i reacia acrozomal [347]. Infertilitatea spermei
poate fi explicat i prin diminuarea concentraiei ionilor de Ca
+2
[211], coninutul crora n toate
variantele experienei este cel mai mic n spermatozoizi. Prezena lor poate fi predeterminat de
existena organelor spermatice, unde se depoziteaz Ca
+2
[362]. n spermii esuturile depozitelor
de Ca
+2
regleaz ptrunderea sau eliminarea lor n spaiu intra- sau extracelular [163, 356].
Modificarea coninutului ionilor de Ca
+2
n celul, poate avea loc prin transportul lor din
citoplasm, unde concentraia este de zeci de mii de ori mai mare. Acest transport se produce
prin canalele membranare (Ca
+2
). Existena canalelor pentru Ca
+2
este bine studiat. La
dereglarea permeabilitii canalelor Ca
+2
-conductoare are loc pierderea proprietilor de
fertilizare ale materialului seminal [260].
n conformitate cu rezultatele experienelor efectuate, n continuare a fost studiat
posibilitatea stabilirii interdependenei dintre mobilitatea gameilor decongelai, vivacitatea lor,
IAS, concentraia ionilor de Na
+
, K
+
, raportul proteine/lipide i raportul Na
+
/K
+
, la fel, sub
influena strofantinei, vicasolului i glutationului (tabelul 4.29).
Tabelul 4.29. Aciunea strofantinei, vicasolului i glutationului n procesul de crioconservare a
spermei de coco asupra indicilor morfo-funcionali
Indicii fiziologici ai
spermatozoizilor
Nr.
ctr.
Denumirea
substane-
lor
Mobili-
tatea,
puncte
Durata
vieii,
ore
IAS,
u.c.
Concen-
traia
Na
+
,
mg%
Concen-
traia
K
+
,
mg%
Rapor-
tul
proteine
/
lipide
Rapor-
tul
Na
+
/K
+
1. Strofantin
4,4
0,11*
6,0
0,35
13,2
0,06
201,2
10,52
59,6
3,90
0,45
0,09
3,38
2. Vicasol
4,25
0,17*
5,75
1,09
11,5
2,0
189,7
19,28
51,56
3,57
0,47
0,03
3,68
3. Glutation
4,8
0,14
6,6
0,47
13,75
1,78
191,3
5,32
63,3
1,47
0,35
0,13
3,03
Not: *Diferenele sunt statistic autentice n comparaie cu glutationul.
Datele prezentate n tabelul 4.29 demonstreaz despre existena interdependenei directe
dintre indicii fiziologici ai spermatozoizilor i coninutul ionilor de K
+
n spermii decongelai. O
interdependena invers s-a stabilit ntre mobilitatea spermatozoizilor i coninutul ionilor de
Na
+
, raportul protein/lipide i Na
+
/K
+
.
Astfel, n sperma decongelat de coco concentraia ionilor de Na
+
prevaleaz asupra celor
de K
+
i acest raport nu suport modificri n procesul de crioconservare, nici la folosirea n
componena mediilor a substanelor biologice active.
162
Datele prezentate n subcapitolul prezent ne permit de a concluziona c:
1. Stabilizarea funciei bariere a membranei plasmatice i echilibrului ionilor dintre mediul
ambiant i spermatozoizii de coco n procesul crioconservrii lor, poate fi realizat prin
includerea n componena mediilor sintetice a substanelor biologice active cu proprieti de
blocare a activitii radicalilor liberi.
2. S-a constatat o dependen direct dintre indicii caracteristici pentru starea funcional a
spermatozoizilor de coco i coninutul ionilor de K
+
i o interdependen invers, cu privire la
ionii de Na
+
, raportul proteine/lipide i Na
+
/K
+
.
3. n spermatozoizii de coco prevaleaz coninutul ionilor de Na
+
asupra celor de K
+
i
acest raport nu suport modificri n procesul de crioconservare, nici la folosirea n componena
mediilor a substanelor biologice active.

4.5. Influena substanelor coordinative la stabilizarea i fortificarea spermatogenezei la
coco.
Este cunoscut, c matricea structural a spermatogenezei, care este condiionat de
integritatea organogenezei a sistemului reproductiv, se afl n corelaie att cu factorii genetici,
ct i cu cei epigenetici [122]. Ultimii includ i influene ale mediului, ca factori determinani ai
spermatogenezei (aciuni teratogenice, remediile farmaceutice, dereglri alimentare etc).
Spermatozoizii se formeaz n procesul spermatogenezei, care dureaz la cocoi 21-27 zile
i include 3 perioade: dezvoltarea celulelor sexuale primare, prespermatogeneza sau
spermiogeneza i spermatogeneza. Ultima include trei stadii: spermatogonial, meiotic i
spermatid. Durata spermatogenezei este determinat genetic i nu se supune schimbrilor
eseniale.
n acelai timp, factorii mediului intern i extern influeneaz spermatogeneza, derularea
creia este reglat de sistemul neuroendocrin. La animalele domestice, inclusiv i cocoi se
deosebesc trei grupe de spermatozoizi, care difer prin proprietile fiziologice: testiculare,
epididimale i ejaculare [50, 92]. n perioada transportrii celulelor productive prin canalele
sistemului reproductiv, are loc modificarea fiziologic i ultrastructural a celulelor, care sunt
determinate de maturizarea lor i obinerea proprietilor fecundative [30].
Meninerea intensitii spermatogenezei ca proces fiziologic, care cuprinde totalitatea
transformrilor prin care trec spermatogoniile, reprezint una dintre sarcinile prioritare ale
sanocreatologiei i se realizeaz prin formarea dirijat i reglementarea statusului fiziologic,
inclusiv i al cordului n condiiile variabile ale mediului [135].
163
Membrana celular, care are un caracter glicolipidic, condiioneaz rezistena i
supravieuirea spermatozoizilor n epididium, unde ei se pstreaz dup maturizare. ns,
depozitarea ndelungat provoac deteriorarea i moartea celulelor. Totodat, ejacularea activ,
care are loc la exploatarea intens a reproductorilor, diminueaz calitatea materialului seminal,
ntruct aceasta duce la formarea celulelor nematurizate i reducerea fertilitii masculine [88].
Pentru depirea problemelor de fertilitate din cauza performanei slabe a efectivului
masculin, mai multe studii au artat, c anume influenarea proceselor de spermatogenez prin
intermediul factorilor eseniali, participani n spermoproducie ar putea reglementa creterea
proprietilor biologice ale spermatozoizilor [122, 124, 125].
Reieind din cele expuse reiese, c derularea spermatogenezei poate fi dirijat. n legtur
cu aceasta, n cercetrile efectuate am studiat influena preparatelor coordinative asupra
spermatogenezei la coco. Aceste obiective vin n concordan cu principiile dezvoltrii
tiinifice ale sanocreatologiei, care prevd elaborarea teoriei i practicii dirijate n formarea i
meninerea sntii, nu numai a organismului integru, dar i a tuturor structurilor morfo-
funcionale, inclusiv i a sistemului reproductiv [126, 136].
Remediile coordinative au fost sintetizate n acest scop, la catedra de chimie anorganic a
USM. Rezultatele cercetrilor sunt prezentate n tabelul 4.30.
Tabelul 4.30. Modificarea volumului spermei pe parcursul evoluiei spetrmatogenezei la coco
(ml)
Frecvena recoltrii spermei de la coco Varianta
experi
enei
Prepara-
tul 13.05.09 20.05.09 27.05.09 03.06.09 10.06.09 17.06.09 26.06.09
I.
(martor)
-
0,27
0,038
0,30
0,001
0,30
0,149
0,30
0,001
0,33
0,027
0,37
0,027
0,33
0,027
II. LAZ
0,20
0,001
0,27
0,038
0,23
0,027
0,27
0,028
0,30
0,001
0,30
0,001
0,27
0,038
III. TAS
0,23
0,027
0,23
0,027
0,30
0,149
0,30
0,001
0,33
0,027
0,33
0,027
0,33
0,027
IV.
LAZ +
TAS
0,27
0,038
0,30
0,001
0,37
0,027
0,43
0,027
0,57
0,027*
0,50
0,001*
0,53
0.027*
Not: *Diferenele sunt statistic autentice.
164
Datele tabelului 4.30 demonstreaz, c n perioada preexperimental volumul ejaculatului n
toate grupele a constituit de la 0,20,001 pn la 0,270,38 ml. Aceast asociere este statistic
neautentic. Peste 21 zile dup iniierea experienei volumul ejaculatului s-a mrit de la
0,270,38 pn la 0,430,027 ml n varianta IV a experienei. O majorare analogic se
nregistreaz i n varianta postexperimental timp de o sptmn. Majorarea volumului n
varianta IV poate fi determinat prin intensificarea spermatogenezei la aceti cocoi.
Mobilitatea spermatozoizilor este un indice, general acceptat, care caracterizeaz amplu
starea funcional a lor i este o funcie obligatorie a spermatozoizilor, n absena crora este
imposibila fecunditatea [252, 325, 354]. Reglarea mobilitii poate fi realizat prin intermediul
unei varieti largi de factori att cu aciune endogen, ct i exogen [287, 385, 392]. n acest
context, la urmtoarea etap de cercetri a fost studiat anume mobilitatea spermatozoizilor.
Rezultatele se prezint n tabelul 4.31.
Tabelul 4.31. Indicii mobilitii spermatozoizilor n perioada spermatogenezei la coco (baluri)
Frecvena recoltrii spermei de la coco Varianta
experi
enei
Prepa-
ratul 13.05.09 20.05.09 27.05.09 03.06.09 10.06.09 17.06.09 26.06.09
I.
Martor
-
7,2
0,04
7,8
0,01
7,7
0,01
7,5
0,01
7,8
0,16
7,7
0,13
7,5
0,23
II. LAZ
7,7
0,27
7,7
0,27
7,7
0,27
7,7
0,27
8,7
0,14
8,2
0,36
8,0
0,01
III. TAS
7,3
0,20
7,7
0,26
8,0
0,47
8,8
0,25*
8,7
0,27*
8,7
0,27*
8,3
0,27*
IV.
LAZ +
TAS
8,0
0,47
8,3
0,27
7,5
0,24
8,2
0,14
9,3
0,14
8,3
0,14
8,0
0,01
Not: *Diferenele sunt statistic autentice.
Din rezultatele prezentate n tabelul 4.31 reiese, c mobilitatea spermatozoizilor pe
parcursul experienei este reprezentat de la 7,20,04 pn la 8,80,25 baluri, care se determin
n varianta trei, la administrarea preparatului TAS. Preparatul a fost suplimentat cu Se, ca
element esenial, care are un rol important n reproducerea psrilor [159, 195]. Seleniul organic,
ca de altfel toate mineralele organice, are o biodisponibilitate i activitate biologic mult mai
mare, comparativ cu cea a Se anorganic.
165
La includerea Se organic n raia alimentar a cocoilor crete, n mod semnificativ,
concentraia GSH-Px n testicule, spermatozoizi i plasma seminal, iar efectul AO al Se, a fost
explicat prin rolul su, ca parte component a enzimei antioxidante GSH-Px [204, 284, 387].
Rezultatele demonstreaz, c administrarea acestui preparat, favorizeaz intensitatea
indicelui studiat. Aceasta se datoreaz faptului, c preparatul experimentat, posed proprieti
mai eficiente i particip la reglarea reaciilor de oxidoreducere, care determin aprovizionarea
celulelor cu energia necesar pentru dinamica micrii celulelor. Un efect analogic, se
nregistreaz i n varianta IV a experienei.
Aadar, mobilitatea spermatozoizilor determin starea funcional a lor, iar n conformitate
cu datele literaturii de specialitate fecunditatea spermatozoizilor, n mai mare msur depinde i
de longevitatea lor [50, 92]. n acelai timp, este cunoscut, c nu toate celulele mobile pstreaz
longevitatea spermatozoizilor dup congelarea-decongelarea spermei de coco (tabelul 4.32).
Tabelul 4.32. Longevitatea spermatozoizilor n perioada spermatogenezei la coco (ore)
Frecvena recoltrii spermei de la coco Varianta
experi
enei
Prepa-
ratul 13.05.09 20.05.09 27.05.09 03.06.09 10.06.09 17.06.09 26.06.09
I.
Martor
-
17,0
0,47
17,3
0,27
17,7
0,27
17,3
0,54
18,0
0,01
17,7
0,27
17,3
0,27
II. LAZ
19,0
0,47
20,3
1,09
20,3
0,72
20,3
0,66
22,7
0,27*
22,7
0,27*
22,0
0,01*
III. TAS
18,7
0,54
18,7
0,72
20,0
0,94
18,7
0,72
18,7
0,54
22,3
1,87
21,3
0,96
IV.
LAZ +
TAS
19,7
1,32
18,7
1,31
19,7
1,36
18,0
0,47
21,4
1,19
23,0
0,01
21,0
0,47
Not: *Diferenele sunt statistic autentice.
Datele tabelului 4.32 demonstreaz, c valoarea indicelui studiat la temperatura camerei
variaz de la 7,00,45 pn la 23,00,01 ore. Cele mai nalte rezultate au fost obinute n varianta
II a experienei, unde longevitatea spermatozoizilor a crescut, fa de varianta-martor, deja n
decurs de dou sptmni de la nceputul administrrii cocoilor a preparatului LAZ. Sporirea
acestui indice s-a pstrat i n perioada postexperimental timp de o sptmn. Efectul
nregistrat poate fi explicat prin faptul, c Zn asimilat, participnd n reaciile enzimatice i alte
166
procese, a creat condiii econome de folosire a energiei de ctre spermatozoizi. n particular,
unele cercetri au demonstrat, c sub influena Zn-ului se intensific spermatogeneza, se nnoiesc
spermatogoniile, sporete meioza i concentraia celulelor germinale [197, 209].
Rezultate cercetrilor au artat, de asemenea, c Zn are un rol important n sinteza ADN-
ului prin proliferarea celulelor i meiozei, iar ATP sintetizat de ctre mitocondrii, cu participarea
Zn, este necesar pentru activitatea spermatozoizilor. Concomitent, s-a demonstrat, c
concentraia de Zn n testicule crete n timpul spermatogenezei i, n general, Zn se acumuleaz
n celulele germinale, dar nu i n celulele interstiiale Sertoli [322].
Totodat, unele studii au artat c o concentraie mare de Zn este prezent n testicule, iar un
deficit de Zn inhib spermatogeneza i produce anomalii ale spermei [315]. n prezent exist
unele relatri, care vizeaz, n detalii, funcia Zn-ului n procesul spermatogenezei. Sorensen i
al. [381] au demonstrat, c Zn-ul este prezent n spermatogoniile i spermatocitele primare. S-a
demonstrat, c Zn se acumuleaz n testicule n timpul spermatogenezei precoce i poate juca un
rol-cheie n reglementarea proliferrii spermatogoniilor i n meioza celulelor germinale [208,
322].
n cercetrile efectuate s-a urmrit ca scop, de a interveni i a stimula anume aceast
perioad de formare i dezvoltare a spermatozoizilor. Rezultatele influenei substanelor
coordinative asupra concentraiei celulelor reproductive de coco sunt prezentate n tabelul 4.33.
Tabelul 4.33. Concentraia spermatozoizilor pe parcursul spermatogenezei la coco (mlrd/ml)
Frecvena recoltrii spermei de la coco Varianta
experi
enei
Prepa-
ratul 13.05.09 20.05.09 27.05.09 03.06.09 10.06.09 17.06.09 26.06.09
I.
Martor
-
2,02
0,082
2,05
0,117
3,17
0,297
2,09
0,145
2,27
0,130
2,20
0,295
2,21
0,204
II. LAZ
2,27
0,185
2,10
0,120
2,56
0,200
3,21
0,056
3,09
0,074
3,12
0,122
3,13
0,072
III. TAS
2,22
0,121
2,77
0,113*
3,27
0,200
3,76
0,078*
3,66
0,173*
3,62
0,137*
3,61
0,092*
IV.
LAZ +
TAS
2,11
0,049
2,86
0,028*
3,27
0,052
4,18
0,107*
4,83
0,059*
5,75
0,071*
5,23
0,059*

Not: *Diferenele sunt statistic autentice.
167
Din datele tabelului 4.33 reiese, c includerea suplimentar a preparatelor coordinative n
raia cocoilor benefic influeneaz spermatogeneza la coco. Aceasta se manifest prin sporirea
concentraiei spermatozoizilor n ejaculat. Cea mai reprezentativ sporire s-a nregistrat n
varianta IV a experienei, unde valoarea indicelui studiat a sporit de la 2,110,49 pn la
5,750,07 mlrd/ml. S-a demonstrat, c nu numai Zn i Se separat administrate influeneaz
spermatogeneza, dar i combinarea acestor elemente n complexele coordinative.
Efectele lor benefice au fost nregistrate, n special, n biotehnologiile de cretere a psrilor
agricole. Unele dintre mineralele organice de mare importan pentru nutriia psrilor sunt: Se i
Zn [25, 155, 386]. Influena preparatelor depinde i de natura lor. Prin urmare, putem
concluziona c aciunea preparatelor utilizate asupra concentraiei spermatozoizilor n variantele
experimentale este sinergist.
Pentru biotehnologia reproduceri animalelor agricole, o importan major are
spermoproductivitatea reproductorilor, indice, care determin nu numai calitatea, dar i
cantitatea materialului seminal, fiind rezultatul nmulirii unui indice cu altul. Rezultatele
cercetrii influenei preparatelor coordinative asupra spermoproductivitii cocoilor sunt
prezentate n tabelul 4.34.
Tabelul 4.34. Influena preparatelor coordinative asupra spermoproductivitii cocoilor
Frecvena recoltrii spermei de la coco Varianta
experi
enei
Prepa-
ratul 13.05.09 20.05.09 27.05.09 03.06.09 10.06.09 17.06.09 26.06.09
I.
Martor
-
0,54
0,120
0,61
0,118
0,93
0,446
0,63
0,146
0,75
0,157
0,81
0,322
0,73
0,231
II. LAZ
0,45
0,186
0,57
0,158
0,59
0,227
0,87
0,084
0,93
0,075
0,94
0,123
0,84
0,110
III. TAS
0,51
0,148
0,64
0,140
0,98
0,349
1,13
0,079*
1,21
0,200
1,19
0,164
1,19
0,119
IV.
LAZ +
TAS
0,57
0,087
0,86
0,029
1,20
0,079
1,39
0,134*
1,75
0,186*
1,87
0,078*
1,77
0,086*
Not: *Diferenele sunt statistic autentice.
Datele tabelului 4.34 demonstreaz, c spermoproductivitatea cocoilor, inclui n
experien variaz n limitele 0,450,186 pn la 1,870,078 mlrd/ejaculat. Acest indice sporete
168
semnificativ numai n varianta IV. La compararea datele din tabelele 4.30 i 4.34 se constat, c
spermoproductivitatea n varianta IV este determinat att de volumul spermei, care crete pe
parcursul perioadei experimentale, ct i de concentraia sporit a spermatozoizilor. Prin urmare,
n varianta IV a experienei, preparatele utilizate, favorizeaz nu numai cantitatea
spermatozoizilor, dar i cantitatea plasmei seminale, care contribuie la realizarea activitii
funcionale a spermatozoizilor.
n acelai timp, spre deosebire de valorile indicilor din varianta IV, n cea de a II-a i a III-a,
concentraia spermatozoizilor, la fel, sporete, iar volumul nu sufer modificri eseniale. Aceste
constatri demonstreaz, c mecanismul aciunii preparatelor coordinative studiate asupra
spermatogenezei la coco difer multilateral, ceea ce condiioneaz necesitatea cercetrilor
suplimentare de perspectiv.
Efectul preparatelor coordinatrive poate fi determinat din urmtoarele considerente. Zincul
este un element important n procesele de derulare a spermatogenezei. Rolul fiziologic al Zn-ului
este determinat de participarea lui n procesele fermentative, fiind component al circa 200 de
fermeni intracelulari, care particip la replicarea i transcripia ADN i ARN i, totodat, el
asigur majorarea nivelului de hormoni reglatori ai spermatogenezei. Coninutul de Zn n hran
deseori este insuficient, de aceea se include suplimentar n raia alimentar att sub form de
substane neorganice, ct i organice. Problema const n eficiena asimilrii Zn-ului, care la
psri are loc n intestinul subire, care reprezint mediu acid. Zn neorganic formeaz n acest
mediu compui insolubili, care nu se asimileaz. Un moment foarte important este, c sursele
organice, ce conin Zn disociaz n mediul acid cu un pH de la 2,0 pn la 5,0 i asimilarea Zn
din sursele organice, este efectiv superioar celei din sursele neorganice. Un interes deosebit
reprezint formele organice ale Zn-ului n componena adausurilor biologice active, utilizate n
creterea intensiv a psrilor, ns aceste preparate sunt dificile i costisitoare.
Este necesar de menionat i rolul biologic al Se. Seleniul, microelement cu valori biologice
antioxidative, care particip n diverse reacii de oxidoreducere n organismul animalelor
homeoterme. Una dintre cele mai importante funcii ale Se-ului n organism const, dup cum s-
a subliniat deja anterior, n rolul su de AO. Aciunea sa antioxidativ este potenat de
interrelaiile existente ntre Se i vitamina E, vitamin liposolubil existent n membranele
celulare, cu rol de aprare n mecanismele celulare contra peroxidrii FL membranice. Seleniul,
component al GSH-Px, acioneaz printr-un mecanism secundar de aprare, ca urmare a
incapacitii vitaminei E de a distruge toi peroxizii metabolismului. Tot n calitate de component
intracelular al GSH-Px, Se acioneaz mpreun cu vitamina E pentru reducerea stresului celular.
Ca urmare a aciunii sale de AO, prezena Se-ului suplimentar n alimentaie are influene
169
benefice asupra ameliorrii funcionale a sistemului reproductiv i asupra altor sisteme vitale ale
organismului [164, 203, 204].
Eficiena Se-ului se datoreaz, n mare msur, sinergiei masive dintre Se i vitamina E care
nu funcioneaz n lipsa Se-ului. Astfel, s-a constatat c un aport suplimentar al Se-ului organic
n organism este cel de participare n procesul de vindecare a infertilitii masculine i a altor
dereglri [25, 26]. De exemplu, Se particip n eritropoez, contribuie la meninerea i
longevitatea activitii sexuale. Circa jumtate din volumul Se se conine n canalele seminifere
i se elimin din organismul masculilor prin ejaculate. Prin urmare, recuperarea deficitului de Se
are o importan major pentru organismul cocoilor, intensiv implicai n procesul de
reproducie.
n acelai timp, n acest scop, este cunoscut utilizarea extractului tulpinei cianobacteriilor
Spirulina platensis, pentru optimizarea spermatogenezei la tauri reproductori [13]. ns aceast
metod nu poate fi folosit pentru cocoi, deoarece aciunea specific a preparatelor asupra
activitii spermatogenezei este condiionat selectiv la diferite animale domestice.
Astfel, analiznd rezultatele cercetrilor prezentate n prezentul subcapitol putem
concluziona, c preparatele coordinative sintetizate direconat pentru sporirea asimilrii Zn i Se,
posed proprieti spermatogenezostimulatoare. Preparatele LAZ i TAS au proprieti
sinergiste, care se manifest prin influena lor asupra spermatogenezei la coco. Preparatul LAZ,
fiind administrat n organism stimuleaz concentraia i longevitatea spermatozoizilor de coco.
4.6. Concluzii la capitolul 4.
Din datele prezentate n acest capitol este posibil de a concluziona, c la studierea rolului
proteinelor n stabilizarea indicilor morfo-funcionali ai gameilor de coco la crioconservare,
folosirea argininei n componena mediului C-2 influeneaz indicii fiziologici dup
crioconservarea spermei de coco, care poate fi explicat prin stabilizarea complexelor dintre
elementele structurale ale proteinelor, membranelor i ale mediului crioprotector. n acelai timp,
proteinele din componena mediilor de crioconservare provoac modificri evidente n structura
proteinelor plasmei seminale i duc la prevalarea -globulinelor pe fonul scderii albuminelor,
manifestnd efecte protectoare.
Lipidele exogene, folosite n procesul de crioconservare a materialului seminal de coco,
posed proprieti protectoare numai asupra longevitii spermatozoizilor decongelai, ceea ce
poate fi condiionat prin proprietile lipidelor de a substitui i economisi sursele energetice,
necesare pentru prelungirea activitii vitale a lor.
n procesul de crioconservare, prezena glucidelor n componena mediilor pentru sperma de
coco iniiaz inhibarea procesului de POL din membrane i diminuarea acumulrii produselor
170
toxice ale acestui proces. n rezultat se amelioreaz calitatea materialului seminal decongelat i,
selectiv, se stabilizeaz indicii fiziologici ai spermatozoizilor de coco.
La cercetarea activitii antioxidative a produselor steroide s-a stabilit, c dintre glicozidele
steroide studiate, cele mai eficiente la stabilizarea integritii morfologice i activitii
funcionale ale spermatozoizilor n procesul crioconservrii spermei de coco sau dovedit a fi
Asparagozida-H i Treozida-Lilia, care au redus considerabil dinamica patologiilor i au sporit
mobilitatea rectilinie a spermatozoizilor. n acelai timp, concentraia optimal a glicozidelor
steroide studiate n componena mediilor pentru crioconservarea spermei de coco difer
semnificativ, ceea ce determin variabilitatea activitii antioxidative a lor.
Variabilitatea eficienei vitaminelor studiate este elucidat prin mecanisme de aciune a
vitaminei E (-tocoferol acetat), care poate fi folosit n componena mediilor sintetice, ca un
stabilizator al strii funcionale i structurilor morfologice ale spermei de coco, chiar i n
condiiile nefavorabile ale crioconservrii. Totodat, efectul antioxidativ i membranotrop al
vitaminelor cercetate poate fi realizat prin meninerea i consolidarea statusului structural-
funcional al membranelor biologice ale spermatozoizilor, n rezultatul cruia are loc sporirea
mobilitii i diminuarea nivelului de spermatopatii.
Cercetarea empiric, care s-a utilizat de ctre noi la iniierea experienelor de stabilizare a
strii funcionale a spermatozoizilor decongelai de coco prin utilizarea substanelor de divers
origine, este mai puin eficient dect cea planificat. La programarea utilizrii preparatelor
membranotrope i de alt natur, este necesar de a ine cont de proprietile prioritare ale
substanelor i posibilitile de manifestare ale acestor proprieti.
Analiznd rezultatele aciunii glicozidelor steroide la stabilizarea strii funcionale a
spermatozoizilor de coco putem meniona, c AO ca substane biologice active, n procesul
crioconservrii manifest proprieti selective, referitore la stabilizarea indicilor morfo-
funcionali i biochimici ai spermatozoizilor de coco la diferite nivele de organizare a lor.
Activitatea antioxidativ depinde de tipul, doza i durata de aciune a AO. Cea mai pronunat
activitate a AO se nregistreaz dup congelarea-decongelarea materialului seminal de coco. De
asemenea, datele actuale demonstreaz, c n procesul de crioconservare a spermei de coco,
bariera fiziologic a AO poate fi dereglat, ceea ce predetermin folosirea suplimentar a AO n
componena mediilor sintetice.
ine de menionat, c la elaborarea mediilor noi pentru crioconservarea spermei de coco n
scopul obinerii efectelor performante este obligatoriu de a determina condiiile optimale
preponderente de manifestare a proprietilor protectoare ale lor. Sperma de coco manifest o
171
sensibilitate sporit la influena factorilor mediului ambiant, ceea ce este necesar de a avea n
vedere la manipularea ei.
Datele prezentate n prezentul capitol ne permit de a conchide, c stabilizarea funciei
bariere a membranelor plasmatice ale spermatozoizilor i echilibrului ionilor dintre mediul
ambiant i spermatozoizii de coco n procesul crioconservrii lor poate fi realizat prin
includerea n componena mediilor sintetice a substanelor biologice active, cu proprieti de
blocare a activitii radicalilor liberi.
S-a constatat o dependen direct dintre indicii caracteristici pentru starea funcional a
spermatozoizilor de coco i coninutul ionilor de K
+
i o interdependen invers, cu privire la
ionii de Na
+
, raportul proteine/lipide i Na
+
/K
+
. n spermatozoizii de coco prevaleaz coninutul
ionilor de Na
+
asupra celor de K
+
i, acest raport, nu suport modificri n procesul de
crioconservare, chiar nici la folosirea n componena mediilor a substanelor biologice active.
La cercetarea influenei substanelor coordinative asupra stabilizrii i fortificrii
spermatogenezei la coco s-a demonstrat, c preparatele coordinative sintetizate direconat
pentru sporirea asimilrii Zn i Se, posed proprieti spermatogenezostimulatoare. Preparatele
LAZ i TAS au proprieti sinergiste, care se manifest prin influena lor asupra spermatogenezei
la cocoi. Preparatul LAZ, fiind administrat n organism stimuleaz concentraia i mobilitatea
spermatozoizilor de coco.

5. ELABORAREA TEHNOLOGIILOR DE CONSERVARE, PSTRARE, UTILIZARE A
SPERMEI DE COCO I IMPLEMNTAREA REZULTATELOR OBINUTE
5.1. Elaborarea principiilor de creare a mediilor sintetice crioprotectoare.
n baza cercetrilor proprii i analizei factorilor, care provoac criodeteriorarea celulelor
a fost elaborat un concept nou, conform cruia, stabilitatea morfo-funcional a spermei de coco
este predeterminat att de procesele biochimice ale plasmei, ct i ale membranelor spermiilor,
inclusiv spectrul proteic i lipidic, raportul proteine/lipide, nivelul de POL, permeabilitatea
membranelor pentru ionii de Na
+
, K
+
, Li
+
, Ca
2+
, Mg
2+
, pH-ul plasmei, gradientul osmotic, iar
meninerea integritii structurale i capacitilor funcionale ale spermei n procesul de
crioconservare poate fi realizat prin selectarea direcionat i utilizarea substanelor cu
proprieti de a menine procesele biochimice n plasm i spermii la nivelul strii native i prin
alimentarea cocoilor cu preparate, care favorizeaz spermatogeneza sanogen.
Una dintre problemele principale ale cercetrilor fundamentale i aplicative n domeniul
criobiologiei materialului seminal al animalelor domestice este determinarea psibilitii
stabilizrii activitii funcionale a spermatozoizilor dup prelucrarea lor tehnologic. Rezolvarea
172
acestei probleme este posibil prin intermediul nivelului de cunoatere a mecanismelor de
criodeteriorare i elaborarea, n baza lui, a procedeelor de prevenire a criodeteriorrilor.
O alt posibilitate de soluionare a acestei probleme, este studierea interdependenei
corelative dintre modificrile morfologice, biochimice, fizico-chimice ale spermatozoizilor n
dependen de factorii mediului ambiant i indicii pstrrii proprietilor funcionale ale spermei.
Este necasar de menionat, c stabilizarea activitii funcionale a spermatozoizilor dup
decongelare, n mare msur, este determinat de proprietile protectoare ale componentelor
mediilor sintetice.
n conformitate cu practica laboratorului i comunicrile literaturii de specialitate [3, 32, 78,
81, 109, 174] la crioconservarea spermei de cocoi (i altor obiecte biologice) este necesar, n
primul rnd, de a determina modificrile criogenice i numai, dup care, este posibil selectarea
optimal a componentelor necesare ale mediilor. Reieind din aceste considerente au fost
elaborate principiile de creare a mediilor crioprotectoare, care sunt prezentate n tabelul 5.1.
Tabelul 5.1. Principiile de baz ale elaborrii mediilor sintetice crioprotectoare
Numrul
principiului
Denumirea
principiului
Prevederile principiului Posibilitatea de realizare
prin folosirea
Meninerea:
1. Osmolaritii Srurilor organice,
neorganice, glucidelor
2. Tamponrii Sistemelor de tamponare
I Stabilizator
3. pH-ul mediului

Substanelor organice i
neorganice
Blocarea:
1. Formrii cristalelor Metodei vitrificrii
2. Evoluiei microorganizmelor Preparatelor antimicrobiene
3. Formrii radicalilor liberi Preparatelor antioxidative
4. Formrii substanelor toxice Antidoilor
II Inhibitor
5. Proceselor metabolice Diminurii gazelor organice
i a altor antimetabolii
Dirijarea:
1. Activitii fermenilor Inhibitorilor revesibili ai
srurilor metalice bivalente
III Reglator
2. Permiabilitatea membranelor Protonoforilor
IV Combinator Utilizarea:
173
1. Crioprotectorilor

Alcoolilor, amidelor,
sulfoxidelor
2. Cristaloprotectoarelor

Combinrii componenilor
mediului cu diferite
mecanisme de aciune
3. Substanelor cu aciune
endocelular
Substanelor cu masa
molecular mic
4. Substanelor cu aciune
exocelular.
Substanelor polimerice

5. Substanelor biologic active Fermenii, vitaminele
6. Componenilor mediului
biologic
Electroliilor,
neelectroliilor, substanellor
biologice active
Schimbarea:
1. Structurii cristalelor de
ghea
Polimerilor sintetici
V Modificator
2. Limitele eutectice Agenilor crioprotectori
Stimularea:
1. Fortificrii de energie

Glucidelor, inhibitorilor
reaciilor fermentative
2. Formrii biocomplexelor
dintre mediul i membranelor
plasmatice
Proteinelor, lipidelor

3. Formrii structurilor
criorezistente
Antifrizelor

VI Stimulator
4. Activitii funcionale a
spermatozoizilor dup
deconservarea lor
Activatorilor sistemelor
fermentative, substanelor
macromoleculare
Principiile elaborate pot orienta cercettorii spre posibilitatea corectrii dereglrilor concrete
n structura i funia celulelor, pot simplifica investigaiile direcionate, ns nu ofer rspuns la
ntrebarea despre posibilitatea utilizrii fixe a anumitor substane la crioconservarea
bioobiectelor concrete, ceea ce este imposibil. Determinarea varietilor de aplicare rmne de
perspectiv n limitele creatoare ale cercettorilor.

5.2. Elaborarea metodelor de stabilizare i fortificare a spermatogenezei la coco.
Rezolvarea cu succes a problemelor de crioconservare i pstrare hipotermal a spermei de
coco, n mare msur, depinde de calitatea iniial a materialului seminal, care este determinat,
174
preponderent, de derularea spermatogenezei [122, 124, 125, 324].
Reieind din cele expuse mai sus, scopul cercetrilor ulterioare a fost cercetarea
posibilitilor de influen dirijat asupra procesului de spermatogenez.
n calitate de factor, care determin calitatea spermei a fost selectat factorul alimentar. n
legtur cu aceasta, n componena raiei alimentare, general acceptate, a fost inclus substana
coordinativ, cu coninut de Zn i de acid tricloracetic (LAZ). Acest remediu a fost sintetezat
direcionat la catedra de chimie anorganic a USM (eful catedrei, academician al AM A.
Gulea) i cu amabilitate oferit pentru a fi utilizat n experiene. Rezultatele aciunii acestui
preparat sunt prezentate n tabelul 5.2.
Tabelul 5.2. Influena preparatului coordinativ LAZ asupra spermatogenezei la coco
Variantele experienei Nr.
ctr.
Indicii studiai ai spermei
Martor Experimental
1. Volumul spermei, ml. 0,37 0,027 0,30 0,001
2. Concentraia spermatozoizilor, mlrd/ml. 2,20 0,295 3,12 0,122*
3. Mobilitatea spermatozoizilor, baluri. 7,7 0,13 8,2 0,36
4. Longevitatea spermatozoizilor, ore 17,7 0,27 22,7 0,27*
5. Spermoproductivitatea, mlrd/ejaculat 0,814 0,161 0,937 0,061
Not: *Diferena este statistic autentic.
Rezultatele prezentate n tabelul 5.2 denot, c folosirea substanei coordinative n
componena raiei cocoilor n cantitate de 1 ml/coco, timp de 35 de zile influeneaz benefic
spermatograma cocoilor i, ndeosebi, concentraia i longevitatea spermatozoizilor.
Efectul stimulator al preparatului coordinativ LAZ la spermatogeneza cocoilor este
condiionat prin asimilarea efectiv a Zn-ului. Aceasta provoac sporirea indicilor cantitativi i
calitativi ai produciei spermatice, comparativ cu varianta-martor. n particular, concentraia
spermatozoizilor n ejaculat prevaleaz cu 41% (3,1 fa de 2,2mlrd/ml), spermoproductivitatea
sporete cu 15% (0,937 fa de 0,814 mlrd), mobilitatea spermatozoizilor se majoreaz cu 6%
(8,2 fa de 7,7 baluri), iar longevitatea cu 28% (22,7 fa de 17,7 ore).
Eficiena obinut este predeterminat prin faptul, c preparatul studiat influeneaz prin
intermediul mecanismelor de stimulare a epiteliului germinativ i sinteza ADN-ului, precum i
prin reglarea aciunii enzimelor zincdependente [208, 345, 351]. Zincul se acumuleaz n
celulele germinative, n special, n mitocondriile spermatogoniilor i spermatozoizilor [416],
particip n reglementarea proliferrii spermatogoniilor i n meioza germinal [322].
Astfel, spermatogeneza poate fi stimulat prin perfecionarea raiei alimentare a cocoilor,
folosind Zn-ul organic n forme uor asimilabile de ctre organism.
175
5.3. Explorarea mediilor pentru diluarea i conservarea hipotermal n scopul meninerii
integritii morfo-funcionale a spermei de coco.
5.3.1. Elaborarea mediilor sintetice n baza neelectroliilor pentru diluarea i conservarea
spermei de coco.
Situaiile create n ultimii ani, legate de riscul rspndirii gripei aviare i altor maladii
infecioase, reducerea importurilor de ou pentru incubaie i pui de o zi, au reorientat cresctorii
de psri din R. Moldova la creterea tineretului avicol autohton [28].
Un rol important n aceast privin l ocup reproducerea intensiv a psrilor, bazat pe
realizrile biotehnologiilor moderne. n acest context, nsmnarea artificial a psrilor cu
sperm diluat i conservat, poate contribui la ameliorarea substanial a sectorului avicol.
Reieind din condiiile general acceptate, n elaborarea unor noi reete de medii diluante i
conservante, un rol important l prezint unele caracteristici biofizice ale mediilor respective. n
legtur cu aceasta, au fost efectuate experiene conform schemei prezentate n tabelul 5.3.
Tabelul 5.3. Schema experienelor pentru determinarea aciunii substanelor incluse n
componena mediilor sintetice pentru diluarea i pstrarea hipotermal a spermei de coco asupra
indicilor fiziologici ai spermatozoizilor
Nr.
crt.
Varianta
experienei
Substanele incluse n mediul sintetic
pentru diluarea spermei de coco
Tehnica pregtirii
soluiilor
1. I Soluie izotonic de lactoz 0,6 g +5 ml Bi H
2
O
2. II Soluie izotonic de glucoz 0,3 g + 5 ml Bi H
2
O
3. III Soluie izotonic de fructoz 0,3 g + 5 ml Bi H
2
O
4. IV-martor Sperma nativ -
5. V Soluie izotonic de zaharoz 0,3 g + 5 ml Bi H
2
O
6. VI Soluie izotonic de sorbit 0,3 g + 5 ml Bi H
2
O
Pentru determinarea aciunii unor substane n componena mediilor sintetice pentru diluarea
i conservarea spermei de coco asupra calitii spermei s-au utilizat metode de laborator
macroscopice, microscopice i fizice. n acest scop, au fost cercetate soluiile izotonice de
glucoz anhidrat, lactoz, fructoz, zaharoz i sorbit.
Rezultatele obinute (tabelul 5.4) au constatat sporirea indicilor funcionali ai spermiilor de
coco n condiiile dilurii i pstrrii lor n mediile sintetice pe baz de diverse glucide.
Datele tabelului denot, c supravieuirea i IAS al spermatozoizilor n sperma brut
constituie, respectiv, 2,40,273 ore i 2,70,379 u.c., care comparativ cu valorile acestora n
sperma diluat este de la dou, pn la zeci de ori mai mic. Aceasta se explic prin urmtoarele.
n primul rnd, plasma seminal nu servete n calitate de mediu ideal pentru pstrarea spermiilor
n afara cilor genitale ale organismului. n al doilea rnd, mobilitatea i meninerea viabilitii
176
spermiior este nsoit de distrugerea tegumentului lipoproteic al spermatozoizilor sub aciunea
radicalilor liberi, care se activeaz n condiiile aerobe de pstrare a spermei [50, 92].
Tabelul 5.4. Indici fiziologici ai spermatozoizilor diluai i conservai n diverse medii sintetice
pe baza neelectroliilor
Indicii spermatozoizilor
Mobilitatea, baluri:
Nr.
crt.
Varianta
experienei
Dup recoltare Dup diluare
Supravieuirea,
ore
IAS,
u.c.
1. I 8,3 0,136 6,0 0,612 1,0 0,612 5,5 1,262
2. II 8,3 0,136 7,2 0,379 11,4 0,273* 30,0 2,795*
3. III 8,3 0,136 6,9 0,447 7,0 0,790* 14,5 2,121*
4. IV-martor 8,3 0,136 - 2,4 0,273 2,7 0,379
5. V 8,3 0,136 7,0 0,136* 7,0 1,274* 15,8 3,923*
6. VI 8,3 0,136 7,0 0,136* 7,4 0,447* 17,5 1,802*
Not: *Diferena este statistic autentic n comparaie cu sperma brut.
Rezultatele dilurii i conservrii spermei de coco n mediile, care includ glucide de
divers structur i greutate molecular au determinat o valoare sporit a indicilor fiziologici ai
spermatozoizilor. n particular, n cazul conservrii spermei n mediul diluant cu soluie
izotonic de glucoz, respectnd valoarea pH-lui de 6,8-6,9 mobilitatea spermatozoizilor, practic,
este la nivelul spermei brute, iar supravieuirea i IAS constituie, respectiv, 11,40,273 ore i
30,02,795 u.c. n varianta-martor valoarea acestor indici este autentic mai mic.
De asemenea, semnificaii spermatice satisfctoare sunt constatate la diluarea i
conservarea spermei n mediul cu soluie izotonoc de sorbit, unde valorile indicilor studiai au
constituit 7,00,136 baluri, 7,40,447 ore i 17,51,802 u.c., corespunztor, pentru mobilitate,
supravieuire i IAS, n timp ce, n varianta-martor aceti indici au constituit numai 2,40,273
ore i 2,70,379 u.c.
Astfel, adaosul de glucoz i a altor glucide n componena mediului pentru sperma de coco
reprezint substratul energetic pentru metabolismul anaerob al celulelor spermatice. Ele,
concomitent cu ingredientele componente, benefic acioneaz asupra indicilor fiziologici,
asigurnd favorabilitatea prin prelungirea semnificativ a duratei de via a spermatozoizilor.
n acelai timp, a fost studiat nivelul de gametopatii n unele soluii de neelectrolii, n
variantele experienelor, rezultatele crora sunt prezentate n tabelul 5.5.
Din datele tabelului reiese, c cele mai multe gametopatii s-au constatat la folosirea soluiei
izotonice de lactoz i zaharoz, ns numrul de spermatozoizi patologici este mai mic la diluare
i conservare n soluiile izotonice ale sorbitului.

177
Tabelul 5.5. Formele patologice ale spermatozoizilor nativi i crioconservai n mediul sintetic pe
baz de neelectrolii
Starea spermatozoizilor
Anomalii ale spermatozoizilor
Nr.
crt.
Varianta
experienei
Spermatozoizi
cercetai Categoria I Categoria II
Spermatozoizi
patologici, %
1. I 1000 22,4 1,32* 22,4 1,32* 44,8 1,31*
2. II 1000 13,4 1,07* 21,4 1,29* 34,8 1,18*
3. III 1000 14,8 1,12* 19,0 1,24* 33,8 0,18*
4. IV-martor 1000 6,0 0,75 11,6 1,01 17,6 1,20
5. V 1000 20,2 1,26* 22,2 1,30* 42,4 1,28*
6. VI 1000 13,4 1,07* 12,6 1,05* 26,0 1,06*
Not: *Diferena este statistic autentic n comparaie cu sperma brut.
Scopul cercetrilor ulterioare a fost studierea aciunii gumiarabicului asupra mobilitii,
longevitii i IAS a spermatozoizilor la temperatur hipotermal. Rezultatele acestor cercetri
sunt prezentate n tabelul 5.6.
Tabelul 5.6. Studierea influenei gumiarabicului n componena mediului de conservare
hipotermal a spermei de coco
Indici studiai ai spermatozoizilor
Mobilitatea, baluri
Nr.
crt.
Experi-
ena
Gumiara-
bic 1%,
ml nativi diluai
Longevitatea,
ore
IAS,
u.c.
1. I 1,0 8,0 0,10 3,6 1,55 0,2 0,18 4,1 1,95
2. II 0,8 8,0 0,10 4,2 1,37 0,7 0,52 5,10 1,78
3. III 0,6 8,0 0,10 4,8 1,14 3,2 1,32 11,4 2,70
4. IV 0,4 8,0 0,10 6,3 0,61 7,0 0,40 22,7 2,26
5. V 0,2 8,0 0,10 7,7 0,22 8,7 0,46 35,4 1,53
6. VI 0,1 8,0 0,10 8,0 0,10 10,2 0,18* 30,0 2,795*
7. VII m. 0,0 8,0 0,10 8,0 0,10 8,0 0,28 31,1 2,78
Not: *Diferena statistic autentic n comparaie cu varianta VII.
Datele prezentate n tabelul 5.6 demonstreaz, c includerea gumuarabicului, n concentraie
de 0,1% permite de a majora esenial longevitatea i IAS a spermei de coco n condiiile
temperaturii hipotermale.
n cercetrile ulterioare a fost realizat experiena consacrat studierii eficienei amidonului
la conservarea hipotermal a spermei de coco.
Experiena a fost efectuat cu folosirea spermei de cocoi, ntreinui n condiiile de vivariu
al Institutului. n calitate de mediu de baz (martor) a fost folosit soluia izotonic de glucoz.
178
Pentru sporirea eficienei acestui mediu n componena lui a fost introdus amidon n concentraie
de la 0,1% pn la 1%. Rezultatul acestei experiene este prezentat n tabelul 5.7.
Tabelul 5.7. Studierea influenei amidonului n componena mediului de conservare hipotermal
a spermei de coco.
Indicii studiai
Nr.
ctr.
Varianta
experien-
ei
Mediul de
baz cu
coninut de
amidon, %
Mobilitatea
spermei native,
baluri
Mobilitatea
spermei diluate,
baluri
Longevitatea
spermatozoizil
or, ore
1. I 1,0 8,0 0,23 4,5 0,38 7,5 0,63
2. II 0,8 8,0 0,23 5,5 0,32 9,0 0,56
3. III 0,6 8,0 0,23 6,0 0,30 8,5 0,42
4. IV 0,4 8,0 0,23 6,5 0,35 10,2 1,58
5. V 0,2 8,0 0,23 6,5 0,53 12,0 1,63
6. VI 0,1 8,0 0,23 7,0 0,23 13,3 1,25
Datele tabelului 5.7 demonstreaz, c cea mai nalt calitate a spermei a fost obinut n
varianta experimental, unde se conine 0,1% de amidon, anume n varianta, unde a fost cea mai
mic concentraie a poliglucidului. Aceasta demonstreaz, c amidonul influeneaz indicii
sanogeni ai spermei de coco la temperatura camerei, ns exist necesitatea cercetri de mai
departe, n scopul determinrii concentraiei optimale de amidon.
n urmtoarea experien a fost continuat cercetarea amidonului n componena mediului
de diluare i pstrarea n condiii hipotermice a spermei de coco. Rezultatele sunt prezentate n
tabelul 5.8.
Tabelul 5.8. Studierea influenei amidonului n componena mediului de conservare hipotermal
a spermei de coco
Indicii sanogeni
Nr.
ctr.
Concentraia
amidonului,
%
Mobilitatea
spermei
native,
baluri
Mobilitatea
spermei
diluate,
baluri
Longevita-
tea, ore
I.A.S.,
u.c.
Supravieui-
rea, (%)
1. 0,05 7,6 0,2 7,0 0 8,0 0,35 79,3 7,66 113,35
2. 0,1 7,6 0,2 7,6 0,28 9,2 0,22* 122,8 4,39* 206,73*
3. 0,2 7,6 0,2 7,0 0,10 7,4 0,27 80,8 10,71 138
4. 0,3 7,6 0,2 7,2 0,23 6,8 0,42 61,0 9,72 102,69
5.
Glucoza-
glbenu
(GG) mart.
7,6 0,2 7,2 0,23 6,8 0,22 59,4 4,46 100
Not: *Diferena este statistic autentic n comparaie cu martorul.
179
Din datele tabelului 5.8 putem meniona, c folosirea amidonului n componena mediului
pe baza neelectroliilor face posibil sporirea indicilor, care caracterizeaz sanogenitatea spermei
de coco dup conservarea ei n condiii hipotermale. Sporirea longevitii i I.A.S. n varianta
experimental poate fi detereminat prin sporirea viscozitii mediului elaborat.
Efectul folosirii neelectroliilor, ca componente a mediilor pentru diluarea i pstrarea
spermei de coco, poate fi lmurit prin faptul, c neelectroliii contribuie la diminuarea
electroconductibilitii i stabilizarea presiunii osmotice [92].
Astfel, poliglucidele i gumiarabicul n componena mediilor pentru conservarea spermei de
coco stabilizeaz longevitatea spermatozoizilor i, respectiv, au o semnificaie deosebit la
organizarea reproducerii psrilor prin metoda de nsmnare artificial. Totodat, s-a stabilit, c
la includerea n componena mediilor sintetice a electroliiilor i neelectroliiilor indicii
funcionali ai spermei de coco nu suport modificri semnificative.

5.3.2 Elaborarea mediilor sintetice n baza electroliilor pentru diluarea i conservarea
spermei de coco.
Printre metodele biotehnice i biotehnologice de mare actualitate i de perspectiv n
optimizarea i dirijarea procesului de reproducie la animale, concomitent cu accelerarea ritmului
de ameliorare a acestora se afl i nsmnrile artificiale.
n prezent, n practica reproduciei animalelor i, concret a suinelor, ovinelor i psrilor s-a
creat o situaie, cnd nsmnarea lor artificial cu sperma congelat pn la -196 C nu creeaz
posibiliti de a obine rezultatele dorite. n prezent, pentru sporirea eficienei nsmnrii
artificiale, intensiv se elaboreaz metode de conservare a spermei la temperaturile hipotermale
(18-20 C).
Experienele efectuate au demonstrat, c pentru conservarea hipotermal este necesar de
inclus n componena mediilor pentru sperma de coco substane electrolitice i combinaiile lor.
Rezultatele cercetrilor sunt prezentate n tabelul 5.9.
Datele tabelului 5.9 relev, c aciunea unor combinaii de electrolii asupra indicilor
sanogeni ai spermei de coco (soluiile izotonice de hiposulfit de sodiu i clorur de potasiu) s-a
studiat n ordinea combinrii cantitii izotonice conform sistemului stabilit al biocomponenilor
mediilor sintetice (de la 0,1 pn la 1,0 i invers).
Rezultatul dilurii i conservrii spermei de coco n mediile respective au demonstrat o
influen benefic asupra mobilitii spermatozoizilor conservai. Valoarea mobilitii maximale
a atins nivelul de 7,80,48 baluri. n acest caz, longevitatea spermatozoizilor a constituit 12,3
ore. Intensitatea indicilor menionai n celelalte variante experimentale treptat a diminuat.
180
Tabelul 5.9. Eficiena combinrii electroliilor la pstrarea hipotermal a spermei de coco
Volumul soluiei izotonice (ml) de:
Varianta
experienei
Hiposulfit de
natriu
Clorur de caliu
Mobilitatea
gameilor
(baluri)
Longevitatea
gameilor (ore)
1. 0,1 0,9 6,3 0,41 8,3 0,50*
2. 0,2 0,8 6,5 0,53 8,3 0,26*
3. 0,3 0,7 7,0 0,38 9,0 0,38*
4. 0,4 0,6 7,1 0,61 9,3 0,40*
5. 0,5 0,5 7,0 0,50 10,5 0,53*
6. 0,6 0,4 7,6 0,39* 10,8 0,41*
7. 0,7 0,3 7,8 0,48* 12,3 0,36*
8. 0,8 0,2 7,4 0,46* 11,5 0,25*
9. 0,9 0,1 6,2 0,37 8,6 0,30*
10. 1,0 mator - 5,5 , 051 6,5 0,27
Not: *Diferena este statistic autentic comparativ cu varianta-martor.
n scop bine determinat, a fost studiat i eficiena Se-ului din componena preparatului
selen normolaizer la pstrarea hipotermic a spermei de coco (tabelul 5.10).
Tabelul 5.10. Studierea influenei seleniului organic n componena mediului pentru conservarea
hipotermic a spermei de coco
Indicii spermatozoizilor
Nr.
ctr.
Gluco
-za,
ml
Sele-
niu,
ml
Concen
-traia
Se, mg
Mobilita-
tea, baluri
I.A.S.,
u.c.
Longevita-
tea, ore
Supravieu-
irea, %
1. 1 0 0 m. 7,4 0,25 46,3 2,059 10,8 0,58 100
2. 0,8 0,2 0,001 7,4 0,025 40,1 3,25 10,2 0,20 86,6
3. 0,6 0,4 0,002 7,0 0,32 32,1 6,71 7,4 1,44* 69,33
4. 0,4 0,6 0,003 6,6 0,32 25,5 5,64 6,4 1,44* 55,08
5. 0,2 0,8 0,004 6,0 0,01* 15,5 3,46* 4,4 1,12* 33,48
6. 0 1 0,005 5,0 0,32* 12,7 2,01* 4,0 1,01* 27,43
Not: *Diferena este statistic autentic n comparaie cu varianta-martor.
Rezultatele cercetrilor prezentate n tabelul 5.10 demonstreaz, c Se din componena
preparatului normolaizer, n concentraii minimale egale cu 0,001 mg/% manifest proprieti
toxice pentru sperma de coco. Rezultatul negativ al eficienei Se-ului poate fi explicat prin
multicomponena substanial a preparatului, care include elemente de divers origine.
181
n concordan cu posibilitatea utilizrii glucidelor compoziionale n metabolismul
spermatozoizilor i potrivit rezultatelor obinute n urma multiplelor cercetri pe mediile sintetice
s-a convenit la realizarea altor experiene direcionate. n particular, s-au efectuat cercetri cu
mediile, n componena crora, au fost incluse substane, cu divers polaritate i cu proprieti de
electrolii, precum i a substanelor biologice active. n acest scop, au fost folosite clorura de
sodiu, calciu i kaliu, hiposulfitul de natriu i combinaii ale lor conform schemei prezentate n
tabelul 5.11.
Tabelul 5.11. Schema de determinare a aciunii substanelor, electrolite i combinrii lor n
componena mediilor sintetice pentru diluarea spermei de coco
Nr.
crt.
Varianta
experienei
Substanele incluse n mediul sintetic
pentru diluarea spermei de coco
Tehnica pregtirii
soluiilor
1. I Soluie izotonic de clorid de kaliu 0,08 g + 5 ml Bi H
2
O
2. II Soluie izotonic de hiposulfit de natriu 0,1 g + 5 ml Bi H
2
O
3. III Soluie izotonic de clorur de natriu 0,045 g + 5 ml Bi H
2
O
4. IV
Soluie izotonic de clorid de kaliu +
Soluie izotonic de clorur de natriu
Raport 1:1
5. V
Soluie izotonic de clorur de natriu +
clorid de calciu
Raport 1:0,1 (0,6 g + 5 ml Bi
H
2
O)
6. VI martor Sperma nativ -
Rezultatele cercetrilor influenei electroliilor i combinarea lor asupra indicilor funcionali
ai spermei de coco sunt prezentate n tabelul 5.12.
Tabelul 5.12. Aciunea mediilor sintetice cu electrolii asupra indicilor spermatozoizilor de coco
Indici ai gameilor
Mobilitatea (baluri) dup:
Nr.
ctr.
Experi-
ena
Recoltare Diluare
Longevitatea
(ore)
IAS,
(u.c.)
1. I 8,7 0,136 6,5 0,279* 6,6 0,273* 11,90 0,647*
2. II 8,7 0,136 7,0 0,306* 11,0 0,500* 30,30 2,133*
3. III 8,7 0,136 8,4 0,111 18,6 0,447* 68,50 2,113*
4. IV 8,7 0,136 6,7 0,335* 7,2 0,223* 16,00 0,750*
5. V 8,7 0,136 6,6 0,273* 6,4 0,273* 13,80 0,977*
6. VI-m. 8,7 0,136 8,7 0,136 2,4 0,273 3,40 0,539*
Not: *Diferenele sunt statistic autentice n comparaie cu datele variantei martor.
Rezultatele prezentate n tabelul 5.12 demonstreaz, c dintre electrolii experimentai, cel
mai favorabil influeneaz soluia de clorur de natriu, n cazul crei mobilitatea, supravieuirea
i IAS constituie, corespunztor, 8,40,11 baluri, 18,60,45 ore i 68,52,11 u.c. O eficien
mai sczut s-a nregistrat n variantele 1 i 5.
182
Lipsa unor corelaii ntre caracteristicile produciei spermatice diluate i conservate i indicii
de fecunditate i eclozionare denot, c pentru aprecierea obiectiv a unor reete de medii
sintetice sunt necesare i teste in vivo, n condiii de teren.
n continuare a fost studiat nivelul de gametopatii la utilizarea soluiilor de electrolii i
combinaiilor lor n variantele experienelor, care sunt prezentate n tabelul 5.13.
Tabelul 5.13. Determinarea formelor patologice ale spermatozoizilor din sperma de coco nativ
i diluat n medii cu electrolii
Starea spermatozoizilor
Anomalii ale spermatozoizilor, %
Nr.
crt.
Experi-
ena
Numrai
total
Categoria I Categoria II
Spermatozoizi
patologici,
%
1. I 1000 18,2 1,22 21,9 1,30 40,1 1,54
2. II 1000 17,9 1,21 23,6 1,34 41,5 1,57
3. III 1000 11,7 1,01* 13,1 1,06* 24,8 1,36*
4. IV 1000 17,3 1,19 21,4 1,29 38,7 1,54
5. V 1000 21,8 0,30** 26,3 1,39** 48,1 1,58**
6. VI-m. 1000 7,2 0,81 11,5 1,01 18,7 1,23
Not: *Diferenele sunt statistic autentice dintre datele variantei-martor i valoarea indicelui
minimal. ** Diferenele sunt statistic autentice dintre datele variantei-martor i valoarea indicelui
maximal.
Datele prezentate n tabelul 5.13 demonstreaz, c diluarea spermei prin folosirea mediilor
pentru pstrarea ei hipotermal, provoac sporirea coninutului spermatozoizilor patologici. Cel
mai favorabil mediul este cel, pe baza soluiei de clorur de natriu, cnd spermopatiile ating
numai 24,81,36%, atunci cnd n varianta V, spermopatiile constituie 48,11,58%. Diferena
este statistic autentic.
Aceast diferen poate fi determinat, dintr-o parte, prin stabilizarea presiuni osmotice de
ctre componena soluiei de clorur de natriu i, din alt parte, de formarea canalelor Ca
+2
independente, care sporesc permeabilitatea membranelor [287, 385].
Conform concepiilor recunoscute, permeabilitatea sporit a membranelor n condiiile
hipotermale, depinde de influena lor liotrop asupra lipidelor i lipoprodeidelor membranare, ce
duce la solubilizarea parial a CS i FL, care provoac dereglarea integritii bistratului lipidic
[61, 291].
Pe baza cercetrilor prezentate n ultimele dou subcapitole a fost elaborat un mediu nou
pentru diluarea i pstrarea hipotermal a spermei de coco cu urmtoarea compoziie, la
183
recalcularea raportului de volum la masa substanelor: clorur de natriu 1 g; amidon
hidrosolubil 0,1 g; ap distilat pn la 100 ml.
Acest mediu a fost folosit pentru diluarea spermei n raport de 1:1, ceea ce a predeterminat
ndeplinirea urmtoarei experiene, n care s-a studiat influena gradului de diluare asupra
indicilor fiziologici ai spermei. Rezultatele sunt prezentate n tabelul 5.14.
Tabelul 5.14. Gradul optimal de diluare a spermei de coco
Nr.
ctr.
Gradul
de diluare
Mobilitatea spermatozoizilor,
baluri
Longevitatea
spermatozoizilor, ore
1. 1:1 8,2 0,30 19,5 1,15
2. 1:2 8,0 0,26 23,3 1,20
3. 1:4 8,0 0,31 26,4 1,13
4. 1:8 7,5 0,26 24,3 2,16
5. 1:10 7,0 0,42 21,0 2,50
6. Sperma nativ 8,5 0,62 2,9 0,36
Datele prezentate n tabelul 5.14 demonstreaz faptul posibilitii dilurii spermei de coco
cu mediul propus, fr diminuarea calitii ei pn la 1:4. Devierea de la acest raport, provoac
scderea indicilor studiai, care se produce prin sporirea coninutului produselor activitii vitale
sau a activitii metabolice.
Astfel, combinarea soluiilor hiposulfitului de natriu i clorurei de caliu influeneaz pozitiv
asupra mobilitii i longevitii spermatozoizilor de coco, iar Se organic, ca component al
preparatului Selen normalaizer, la conservarea hipotermic a spermei de coco nu favorizeaz
indicii fiziologici a ei. n acelai timp, diluarea spermei de coco prin utilizarea mediilor
optimale pe baza electroliilor, precum i combinrii lor cu cele pe baz de neelectrolii, sporete
variabil indicii caracteristici ai strii funcionale a spermatozoizilor.

5.4. Aciunea mediilor integrate pentru diluarea i crioconservarea spermei de coco.
nsmnarea artificial n avicultur cu sperma conservat, ofer posibilitatea de a lrgi
posibilitile crerii raselor i liniilor de psri, de a obine un numr maximal de descendeni de
la reproductorii preioi, n aspect de prsil. Aceasta permite de a prelungi termenul de pstrare
a produselor sexuale, a majora numrul de gini nsmnate i de a micora efectivul de cocoi
la ntreprinderile de prsil.
n scopul folosirii raionale a cocoilor pentru nsmnarea artificial a ginilor, o
importan deosebit are elaborarea mediilor crioprotectoare.
Cu toate succesele obinute n domeniul crioconservrii spermei de coco [78, 109],
problema elucidrii unor crioprotectori, mai efectivi, rmne nerezolvat din cauza toxicitii
184
amidelor n componena mediului i necesitii purificrii lor permanente. Adugtor, n
componena majoritii mediilor figureaz componeni deficitari, cum sunt, glutamatul de natriu
(producie Ungaria), sulfatul de natriu protaminic i polivinilpirolidina. Aceste circumstane rein
aplicarea larg a metodei de crioconservare a materialului seminal de coco n procesul
reproducerii psrilor.
S-a demonstrat, c folosirea soluiilor izotonice de neelectrolii pentru crioconservarea
spermei de coco permite de a obine indici nali ai mobilitii spermatozoizilor dup
decongelare. n cazul includerii n componena mediului a dizaharidului maltoza, au fost
obinute cele mai nalte rezultate, comparativ cu alte variante experimentale.
Folosirea lactozei n scopuri analogice, diminueaz calitatea materialului deconservat.
Aceste date au permis de a concluziona, c calitatea materialului seminal de coco dup
decongelare depinde nu numai de cantitatea resturilor glucozidice n molecula glucidului, dar i
de natura lui chimic.
n acelai timp, a fost demonstrat, c majorarea mobilitii spermei de coco dup
decongelare este posibil datorit utilizrii n componena mediului crioprotector a glicozidului
steroid -Petumozida, ca reprezentat al AO.
Pe baza datelor obinute a fost elaborat o nou variant de mediu crioprotector pentru
sperma de coco (tabelul 5.15).
Tabelul 5.15. Mediul crioprotector pentru sperma de coco
Nr.
ctr.
Denumirea substanei folosite Cantitatea
1. Maltoz 11,5 g
2. Petumozid 0,05 mg%
3. Glicerin 7 ml
4. Ap distilat Pn la 100 ml
Not: pH-ul mediului (6,8 - 6,9) sa reglat cu soluie izotonic de arginin.
Folosind mediul prezentat n tabelul 5.15, n continuare a fost determinat influena
optimal a nivelului de diluare a materialului seminal asupra calitii spermei de coco dup
decongelarea ei (tabelul 5.16).
Din datele tabelul 5.16 urmeaz, c cele mai bune rezultate referitor la restabilirea
mobilitii spermatozoizilor dup decongelare sunt obinute n varianta a III-a experimental, n
cazul dilurii n raport de 1/3 cu mediul nou elaborat. Majorarea raportului mai sus de 1/5 este
nsoit de diminuarea treptat a mobilitii gameilor, ceea ce poate fi lmurit prin transformrile
proprietilor de bufer ale mediului n procesul de formare a cristalelor de ghea.
185
Tabelul 5.16. Aciunea nivelului de diluare asupra restabilirii mobilitii spermatozoizilor de
coco dup decongelare
Nr.
ctr.
Varianta
experimental
Raportul de diluare
Mobilitatea spermatozoizilor
decongelai, puncte
1. I 1 : 1 4,3 0,137
2. II 1 : 2 4,1 0,209
3. III 1 : 3 4,6 0,112
4. IV 1 : 4 4,4 0,112
5. V 1 : 5 4,3 0,137
6. VI 1 : 6 4,1 0,106
7. VII 1 : 7 4,0 0,177
8. VIII 1 : 8 3,2 0,137
9. IX 1 : 9 3,0 0,177
10. X 1 : 10 3,0 0,177
Din datele tabelul 5.16 urmeaz, c cele mai bune rezultate referitor la restabilirea
mobilitii spermatozoizilor dup decongelare sunt obinute n varianta a III-a experimental, n
cazul dilurii n raport de 1/3 cu mediul nou elaborat. Majorarea raportului mai sus de 1/5 este
nsoit de diminuarea treptat a mobilitii gameilor, ceea ce poate fi lmurit prin transformrile
proprietilor de bufer ale mediului n procesul de formare a cristalelor de ghea.
Folosind varianta optimal a mediului de refrigerare, diluare i congelare a fost efectuat o
experien comparativ de evaluare a calitii spermei congelate (tabelul 5.17).
Tabelul 5.17. Influena petumozidei-2 n componena mediilor crioprotectoare asupra indicilor
fiziologici ai spermatozoizilor de coco
Nr.
ctr.
Varianta
experienei
Mediul crioprotector
Mobilitatea
spermatozoizilor
decongelai, puncte
1. I Mediul Watanabe-Teroda (martor) 6,1 0,11
2. II Maltoz-arginin-glicerin 6,3 0,13
3. III Maltoz-arginin-glicerin-petumozida-2 6,8 0,14*
4. IV Mediul C-2 (martor-IUCGAA) 6,1 0,11
5. V Mediul C-2 -petumozida-2 6,6 0,11*
Not: *Diferenele sunt statistic autentice n comparaie cu lotul-martor.
Datele prezentate n tabelul 5.17 relev, c folosirea petumozidei-2 sporete esenial
mobilitatea spermatozoizilor dup crioconservarea lor.
n urmtoarea experien a fost studiat eficiena petumozidei, fracia 3 n componena
mediilor de crioconservare. Rezultatele cercetrilor sunt prezentate n tabelul 5.18.
186

Tabelul 5.18. Influena petumozidei-3 n componena mediilor crioprotectoare asupra indicilor
fiziologici ai gameilor de coco
Nr.
ctr.
Varianta
experienei
Mediul crioprotector
Mobilitatea
spermatozoizilor
decongelai, puncte
1. I Mediul Watanabe-Teroda (martor) 6,2 0,13
2. II Maltoz-arginin-glicerin 6,3 0,13
3. III Maltoz-arginin-glicerin-petumozida-3 6,6 0,11*
4. IV Mediul C-2 (martor-IUGAA) 6,2 0,13
5. V Mediul C-2 petumozida-3 6,4 0,21
Not: *Diferenele sunt statistic autentice n comparaie cu mediile-martor.
Rezultate demonstreaz sporirea mobilitii spermei decongelate pn la 6,60,13 baluri la
folosirea petumozidei-3. n celelalte variante experimentale, astfel de sporire nu s-a nregistrat.
Rezultatele experienelor prezentate n tabelul 5.17 i 5.18 demonstreaz activitatea antioxidativ
a pentumozidei, care mai evideniat este prezent la pentumozida-2.
Concomitent cu indicii fiziologici au fost estimai selectiv i indicii pstrrii structurilor
acrozomice n procesul crioconservrii spermei de coco, n diferite medii (tabelul 5.19).
Tabelul 5.19. Integritatea acrozomului spermatozoizilor de coco crioconservai n diferite medii
Starea acrozomului Nr.
ctr.
Mediul crioprotector
Total capuri
integre Deteriorat, % Integru, %
1.
1. Mediul Watanabe-Teroda
(martor)
54,4 2,01 24,0 1,96 30,4 1,03
2.
2. Maltoz-arginin-glicerin-
petumozida-3
55,4 3,52 20,2 1,66 35,2 1,64
3.
3. Maltoz-arginin-glicerin-
petumozida-2
55,8 2,21 16,8 1,55 39,0 0,93*
Not: *Diferena este statistic autentic n comparaie cu lotul-martor.
Datele tabelului 5.19 indic, c n condiiile crioconservrii spermei cu medii sintetice
elaborate se poate de obinut rezultate mai nalte, referitor la integritatea acrozomului,
comparativ cu mediul Watanabe-Teroda. Astfel, pstrarea acrozomului spermatozoizilor n
condiiile criconservrii n mediile experimentale 2 i 3 este mai mare de 1,18 i 1,28 ori, fa de
lotul-martor. Diferenele dintre indicii grupelor-martor i experimentale sunt statistic autentice.
187
Valoarea biologic a spermatozoizilor dup conservarea i deconservarea spermei
animalelor agricole, n multe aspecte, se determin de coninutul i proprietile mediilor
crioprotectoare, dar i, ntr-o msur semnificativ, de specia animalelor.
Prin urmare, folosirea AO n componena mediului sintetic a favorizat mbuntirea
mobilitii spermei de coco dup congelare-decongelare. n legtur cu aceasta, la a doua etap,
de ctre noi, n colaborare cu cercettorii Institutului de Avicultur al Academiei Naionale
Agrare a Ucrainei au fost efectuate cercetri privind aciunea AO (glutation, asparagozida-H,
baclanozida) n componena mediului sintetic pentru crioconservarea spermei de coco, cu
urmtorul coninut: glutamat de natriu 2,87 g, glucoz 0,5 g, inozit 0,25 g, acetat de
magneziu 4H
2
O 0,07 g, acetat de kaliu 0,5 g i ap pn la 100 ml [365], coninnd 21% de
DMF [116]. n experienele efectuate, spermatozoizii cu membranele intacte i deteriorate au
fost determinate dup metoda W. Halangk i R. Bohnensock [238], modificat pentru analiza
spermei cocoului la fluorometru [116], prin folosirea fluorocromei etidium bromid. Pentru
determinarea spermatozoizilor cu membranele acrozomale deteriorate i intacte, au fost colorai
spermatozoizii vii cu vopsea fluoriscent rou de tiozin (tabelul 5.20).
Tabelul 5.20. Aciunea antioxidanilor asupra indicilor morfofuncionali ai spermei de coco la
congelarea-decongelarea ei
Spermatozoizi cu capuri intacte, %
Nr.
ctr.
Expe-
riena
Mediul
crioprotector
Mobilitatea dup
decongelare,
baluri
Total
Acrozom
deteriorat
Acrozom
intact
1. I
Mediul Watanabe
Teroda (martor)
4,1 0,36 40,5 3,17 27,5 3,90 12,2 2,80
2. II
Madiul Schramm
+ glutation
5,2 0,21 42,3 3,33 26,5 2,5 15,8 2,05
3. III
Madiul Schramm
+ asparagozida-H
5,4 0,38* 56,1 5,26 35,1 4,4
21,1
3,90
4. IV
Mediul Schramm
+ baclanozid
4,2 0,42 45,8 3,71 38,8 3,6 13,0 1,38
Not: *Diferena este statistic autentic.
Datele tabelului 5.20 indic, c mobilitatea spermatozoizilor de coco dup refrigerare,
congelare i decongelate n mediul sintetic, care conine AO, este mai nalt la folosirea n
componena ei a asparagozidei-H. Acest indice constituie 5,40,38 baluri. n cazul folosirii n
componena mediului a glutationului i baclanozidului, mobilitatea spermatozoizilor congelai-
decongelai constituie, corespunztor, 5,20,21 i 4,20,42 baluri. Dup crioconservarea spermei
n varianta mediului, la folosirea n componena lui a asparagozidei-H, se conin spermatozoizi
188
cu capuri intacte, n mrime de 56,15,26%. n cazul folosirii glutationului i baclanozidului,
coninutul capurilor integre se afla, practic, la acelai nivel (42,33,3 i 45,83,7%,
corespunztor). Totodat, coninutul acrozomilor deteriorai i integri n varianta II constituie,
corespunztor, 26,52,50 i 15,82,05%. Spermatozoizii cu capuri i membrane acrozomale
intacte, constituie la folosirea n componena mediului a asparagozidei-H 21,13,9%, iar la
folosirea baclanozidului i glutationului - 13,01,38 i 15,82,05%, corespunztor.
Astfel, n rezultatul cercetrilor efectuate este stabilit concentraia optimal a AO
glutationului, asparagozidei-H i baclanozidei. De asemenea, s-a dovedit, c dintre AO folosii n
componena mediilor sintetice pentru diluarea i congelarea spermei de coco, cele mai bune
rezultate sunt obinute n rezultatul folosirii asparagozidei-H. De exemplu, mobilitatea
spermatozoizilor congelai-decongelai la folosirea mediului Schramm, Hubner, [365],
suplimentat cu asparagozida-H este mai nalt cu 22,8 i 3,7%, n comparaie cu variantele
experienei 2 i 4. Adugtor, n aceste condiii mai mult se conin spermatozoizi cu capuri i
membrane acrozomale intacte.
n acelai timp, datele prezentate n acest subcapitol demonstreaz, c sporirea indicilor
morfo-funcionali ai spermatozoizilor de cocoi este posibil prin elaborarea mediilor noi, care
includ n calitate de glucide maltoza, iar n calitate de AO concentraiile optimale ale
glicozidelor steroide. Drept model servete mediul, componena cruia este prezentat n tabelul
5.15. Acest mediul poate fi folosit prin procedeele, care includ urmtoarele etape:
a) Diluarea componenilor mediului n ap distilat la temperatura 40 C;
b) Diluarea spermei de coco n raport de 1:1 1:3;
c) Refrigerarea materialului seminal, etapa:
1. de la 18-20 C la +2-4 C, timp de 10 minute cu viteza rcirii de - 1,6 C/min.
2. de la 2-4 C pn la -110 C,

timp de 3 minute cu viteza rcirii 35 C/min.
d) Congelarea final n form de pastile, la scufundarea lor n azotul lichid;
e) Fasonarea i ambalarea n tuburi de aluminiu cu marcarea necesar.

5.5. Experimentarea i implementarea rezultatelor cercetrilor n condiii practice de
ntreinere a ginior i de cretere intensiv a psrilor.
5.5.1. Organizarea i implementarea nsmnrii artificiale a efectivului de gini cu
sperm conservat n condiii hipotermale.
Cercetrile cu privire la organizarea i implementarea nsmnrii artificiale a ginilor s-au
desfurat n condiii de producie intensiv a psrilor la ntreprinderea avicol Orhidea-Nani
I din com. Chetrosu, r-l Criuleni n perioada februarie-mai 2007.
189
ntreprinderea de psri este situat la o distan de 2 km de la traseul Chiinu-Criuleni.
Teritoriul fermei pe tot perimetrul este ngrdit. n teritoriul ntreprinderii sunt amplasate 6 hale
pentru psri (cretere, ntreinere i obinere producie), incubatorul, blocul de pstrare i
preparare a hranei pentru psri, abatorul cu frigorifer, blocul tehnic, blocul administrativ i alte
spaii, ncperi auxiliare necesare procesului de producie.
Iniial, ca obiect de studiu au servit condiiile de ntreinere i alimentare a psrilor
destinate reproduciei -11000 de gini de rasa Hay-Line, care erau ntreinute ntr-o singur
hal, n baterei piramidale pe 3 nivele pentru ou de consum (tip BP-3).
Ulterior prin achiziie, s-a completat septelul de psri cu cocoi B-Ross-308, pentru
ntreinerea crora, au fost create condiii comfortogene pe nivelul superior al batareilor
piramidale, n aceiai hal cu ginile destinate nsmnrii artificiale.
n sistemul msurilor de organizare a nsmnrilor artificiale ale ginilor i de pregtire a
cocoilor au fost parcurse urmtoarele etape:
I. Organizarea i instruirea corespunztoare a grupului de specialiti, angajai pentru
pregtirea cocoilor i a ginilor, pentru recoltarea spermei i nsmnarea artificial a ginilor.
II. Pregtirea cocoilor. Pentru obinerea unui material de calitate, dup acomodarea i
adaptarea cocoilor, s-a efectuat tualeta special a regiunii precloacale a lor prin zmulgerea
penelor, tunderea pufului i igienizarea esutului cutanat i a perinajului adiacent.
Cocoii s-au supus manipulaiilor corespunztoare pentru obinuirea deprinderii actului
copulativ i a reflexului de ejaculare n condiiile inexistente ale aparatului genital femel.
Obinuirea propriu-zis s-a produs prin executarea masajului abdominal i prin presiuni ritmice
pe pereii cloacii pentru formarea reflexului de ejaculare de 3 ori pe sptmn.
Efectivul de cocoi n perioada de pregtire a fost supus aplicrii msurilor sanitare
veterinare corespunztoare, inclusiv parenteral cocoii au fost injectai de dou ori, cu intervalul
de 10 zile, cu soluie standard de trivitamin i Sel-E-Vit n doze prevzute. Raia zilnic
general acceptat a cocoilor, a fost suplimentat, n esenial, cu protein nativ prin includerea
oulor cu defecte externe ale nveliului dur, rebutate din comercializare (~5%). Raia cocoilor,
concomitent, a fost completat cu gru ncolit n proporie de 40 g/coco.
n perioada respectiv s-au ntreprins msurile multilaterale de determinare a proceselor de
ejaculare/neejaculare a cocoilor, ejaculare insuficient, cu resturi sanguine, seroase, impuriti
etc. Ejaculatele obinute au fost examinate macro- i microscopic i au fost supuse investigaiilor
morfo-bio-fizico-chimice, n vederea determinrii indicilor cantitativi i calitativi ai materialului
seminal, precum i a selectrii i includerii cocoilor, n grupul efectivului pentru reproducie
biotehnologic. Este necesar de menionat, c dintre cei 350 de cocoi achiziionai, nu toi au
190
devenit api pentru includerea n grupul de reproducie din diverse cauze. n particular, au fost
exclui cocoii, care au nregistrat diverse abateri: imposibilitatea recoltrii spermei, volumul
mic al ejaculatului (sub 0,1 ml), mobilitatea redus a spermiilor (sub 6 baluri) i alte cauze
absolute i relative. Drept cauz principal, a devierilor constatate, credem, i este firesc, c a
fost vrsta foarte mic a cocoilor, numai de 120 zile la achiziie. De asemenea, este necesar de
menionat, c practic, ejaculatele fiecrui coco n parte au fost examinate macro- i microscopic,
n vederea aprecierii calitii spermei.
III. Recoltarea spermei. Recoltarea spermei de la cocoi s-a realizat n felul urmtor: n
poziia aezat pe un taburet/scunel, operatorul fixeaz cocoul n decubit sterno-abdominal pe
coapsa stng, cu mna dreapt, innd fluierile cocoului pe faa median a coapsei stngi. Prin
trecerea piciorului stng al operatorului peste piciorul drept se stabilete poziia n foarfec, sau
prin apropierea maxim a picioarelor i genunchilor, fiecrui operator dup comoditate, care
imobilizeaz picioarele cocoului i fixeaz cocoul ntr-o poziie comod. n acest fel/metod
minele operatorului rmn libere. Masajul cu ambele mini se efectueaz n felul urmtor: cu
mna stng se masajeaz uor regiunea sacral n sus cranio-caudal, iar mna dreapt masajeaz
regiunea abdominal n direcia de la apendicele xifoid spre apofizele pubiene. Momentul
ejaculrii se remarc/stabilete prin deschiderea orificiului cloacal i evidenierea pliului
cupulator, timp n care, operatorul cu mna stng preseaz rapid/accelerat zona precloacal. n
acest timp, masajul abdominal nceteaz. Cu mna dreapt materialul seminal se recolteaz n
paharul/flaconul colector de sticl sau de sterol. Manipulaiile descrise se repet de 2-3 ori,
pentru obinerea unei cantiti maxime de sperm. n unul i acelai flacon s-a recoltat sperma
mai multor cocoi. La finisarea perioadei de pregtire a cocoilor volumul mediu al unui ejaculat
a constituit 0,2-0,3 ml/coco.
IV. Organizarea, amenajarea i aprovizionarea laboratorului specializat pentru manipularea
i investigarea produsului seminal destinat nsmnrii artificiale.
n ncperile antreului halei de ntreinere a psrilor prevzute pentru desfurarea
nsmnrii artificiale s-a organizat i amenajat un laborator, care s-a dotat cu termostat, mas de
laborator, termometre, microscop cu dispozitivele luminescente, lame i lamele, sterilizator,
vesel de laborator pentru recoltarea i diluarea spermei, precum i cu vesel de msurare i
dozare fix, instrumentar necesar pentru dozarea i inocularea spermei, ap bidistilat, medii
sintetice pentru diluarea spermei, alcool etilic, soluii antiseptice, dezinfectante, detergente etc.
Not: Perioada de pregtire a fost de lung durat din motivul, c la momentul achiziionrii
cocoilor, ei aveau vrsta mic i de necesitate s-au aplicat unele msuri amelioratoare medicale
veterinare, s-a suplinit considerabil raia cocoilor i argumentat s-a temporizat nceputul ciclului
191
biotehnologic de reproducie a psrilor prin nsmnri artificiale, pn la vrsta cocoilor,
apropiat de ceea a maturitii sexuale i fiziologice.
V. Realizarea tehnicii de nsmnare artificial a ginilor. Pentru aplicarea tehnicii
inoculrii materialului seminal la gini, este necesar intervenia a doi operatori: unul pentru
contenie, iar cellalt pentru nsmnarea propriu-zis. Gina este prins de ctre operator cu
mna dreapt de fluiere, n poziie de contenie obinuit i fixat la nivelul celulei de ntreinere
a batareii piramidale. Gina se fixeaz cu partea posterioar n afara celulei sau la marginea
batereei. Cu mna stng se rsfrnge coada pe spate, n felul, n care se asigur deschiderea
cloacei. Concomitent, cu mna dreapt se apas din partea stng a ginii abdomenul. Cu degetele
minii stngi se faciliteaz evidenierea deschiderii oviductului, care apare n partea stng a
cloacei. Imediat, dup evidenierea deschiderii oviductului, operatorul nsmntor introduce
pipeta de nsmnare, adoptat la seringa de nsmnare, pe o adncime de aproximativ 3-4 cm
i inoculeaz ntreaga doz de material spermiatic. n acelai timp, presiunea asupra
abdomenului nu se mai exercit, pentru ca sperma inoculat s nu fie expulzat n exterior.
Timpul optim de nsmnare a ginilor, este a doua jumtate a zilei (dup orele 14.00). n
aceast perioad n oveducte la majoritatea ginilor lipsesc oule cu coaj tare, care pot constitui
obstacole n drumul spermatozoizilor spre infundibil.
n scopul dilurii i conservrii hipotermale, meninerea valorilor biologice i sporirea
proprietilor fecundative sanogene ale spermei cocoilor-reproductori s-a utilizat mediul pentru
conservare cu urmtoarea componen: clorur de sodiu (1,0 g); amidon hidrosolubil (0,1 g); ap
distilat (100 ml).
Cantitatea de material seminal diluat i conservat, care se inoculeaz este, n mediu, de 0,02-
0,03 ml la o gin, cu o concentraie de aproximativ 150 mln de spermatozoizi, cu o mobilitate
nu mai puin de 7 baluri. Diluarea i conservarea spermei, cu mediu sintetic s-a efectuat n raport
de 1:1, 1:2, 1:3 i mai mult, n dependen de concentraia spermei.
Sperma de la cocoii-reproductori s-a recoltat de cinci ori pe sptmn.
Efectivul de gini s-a divizat n 4 grupe. Primele dou zile ale nceputului ciclului de
reproducie biotehnologic a psrilor, ginile au fost nsmnate zilnic n scopul saturaiei
cilor sexuale ale lor cu spermatozoizi viabili. Ulterior, ginile primelor 3 grupuri s-au
nsmnat la ziua a 4, 5 i 6 cu doze de sperm de 0,03 ml. Ginile grupului 4 s-au nsmnat la
ziua a 7 cu doze de sperm de 0,05 ml. Smbt i duminica au rmas zile libere.
Pe parcursul realizrii nsmnrii artificiale au fost respectate urmtoarele cerine: 1.
Pentru realizarea nsmnrii artificiale a ginilor au fost organizate condiii satisfctoare
zooigienice de ntreinere i alimentaie a psrilor, implicate n reproducie, care, ntocmai, au
192
asigurat bunstarea lor; 2. Continuu s-au respectat condiiile optime de recoltare a spermei de la
cocoi i de nsmnare artificial a ginilor; 3. ntocmai au fost ndeplinite exigenele sanitare
veterinare de reproducie a psrilor n flux tehnologic intensiv; 4. S-a meninut nentrerupt
schema de nsmnare a ginilor pe toat perioada de reproducie; 5. Fluxul biotehnologic de
nsmnare artificial a ginilor, permanent a fost aprovizionat cu cantitatea necesar a mediului
sintetic pentru diluarea spermei de coco i conservarea ei; 6. n scopul dozrii fixe a
materialului spermatic mascul i inoculrii lui n aparatul genital femel, n condiii
biotehnologice aproximate de actul sexual fiziologic, a fost multilateral experimentat i
modernizat, ulterior selectat cea mai optim varietate a instrumentarului pentru nsmnarea
artificial a ginilor n condiiile tehnologice intensive de reproducie.
Rezultatele generalizate ale testrii n condiii industriale a nsmnrii artificiale a ginilor
cu sperm supus conservrii hipotermale se prezint n tabelul 5.21. Pentru stabilirea eficienei
aplicrii biotehnologiei i excluderii erorii la evidenierea rezultatelor incubrii oulor s-au
realizat investigaii timp de cinci zile pe cte un numr standard de ou zilnic.
Tabelul 5.21. Rezultatele incubrii oulor la aplicarea nsmnrii artificiale a ginilor cu
sperm supus conservrii hipotermale
Ou recoltate i incubate
Fecundate Nefecundate
Eclozionarea
puilor
Pui
neeclozionai
Nr.
Ctr.
Zilele
experi-
enei
Total,
buci Buci % Buci % Capuri % Capuri %
1. I 5000 4733 94,7 267 5,3 4331 86,6 669 13,4
2. II 5000 4786 95,7 214 4,3 4327 86,5 673 13,5
3. III 5000 4790 95,8 210 4,2 4347 86,9 653 13.1
4. IV 5000 4943 98,9 57 1,1 4366 87,3 634 12,7
5. V 5000 4698 94,0 302 6,0 4304 86,1 696 13,9
Total 25000 23950
95,8
0,13
1050
4,2
0,13
21675
86,7

0,21
3325
13,1

0,21
Datele tabelului 5.21 denot, c fecunditatea oulor variaz n limitele 94,0-98,9% i
constituie 95,80,13%. La eclozionarea puilor s-a stabilit variabilitate zilnic i valoare medie de
86,70,21%.

5.5.2. Implementarea nsmnrii artificiale a ginilor cu sperm crioconservat n condiii
practice.
La urmtoarea etap de cercetri a aciunii AO n componena mediului sintetic pentru
diluarea i congelarea spermei de coco, a fost efectuat o experien tiinifico-practic pentru
193
determinarea calitii spermei congelate-decongelate de coco n mediul sintetic, care conine
glutation, asparagozida-H i baclanozid. Experiena a fost efectuat pe gini de rase
colecionate, care se ntreineau n ntreprinderea experimental a Institutului de Avicultur al
Academiei Naionale Agrare a Ucrainei. Pentru aceasta au fost formate trei grupe de gini, care
s-au nsmnat cu sperm congelat-decongelat n mediul, care coninea AO cercetai. Prima i
a doua nsmnare a ginilor s-a petrecut cu interval de 24 ore, iar urmtoarele nsmnri o
dat la trei zile, pe parcursul a dou sptmni. Colectarea oulor s-a nceput peste o zi de la a
doua nsmnare. Rezultatele nsmnrii ginilor au fost determinate dup totalizrile incubrii
oulor, cu evidena ouatului, fecunditii i a eclozionrii oulor (tabelele 5.22 i 5.23).
Tabelul 5.22. Aciunea mediilor crioprotectoare, care conin antioxidani asupra capacitilor
fecundative ale spermatozoizilor de coco congelai-decongelai
Ou incubate
Nefecundate Fecundate
Nr.
ctr.
Varianta
experienei
Total,
buci Buci % Buci %
1.
Mediul Schramm +
glutation
195 103 62,8 3,46 92 47,2 3,57
2.
Mediul Schramm +
asparagozida-H
191 85 44,5 3,59 106 55,5 3,59
3.
Mediul Schramm +
baclanozid
136 71 52,8 4,28 65 47,8 4,28

Din datele tabelului 5.22 se vede, c dintre indicii grupelor experimentale, sunt primite
rezultate, mult mai nalte, la nsmnarea ginilor cu sperm congelat-decongelat, n mediul cu
asparagozida-H. De exemplu, fecunditatea oulor constituie 55,53,59%, contra la 47% n
ambele grupe de nsmnare a ginilor cu sperm deconservat, la folosirea glutationului i
baclanozidului. Concomitent, coninutul procentual de ou nefecundate, n cazul folosirii n
componena mediului crioprotector a asparagozidei-H este mai mic i constituie 44,53,59%, n
comparaie cu 62,83,46 i 52,84,28% la folosirea, corespunztor, a glutationului i
baclanozidului.
n cercetrile ulterioare s-au continuat experienele n condiii de producere, rezultatele
crora sunt prezentate n tabelul 5.23.
Analiza datelor tabelei 5.23 demonstreaz, c valoarea indicelui ouatului n rezultatul
folosirii glutationului i asparagozidei-H la crioconservarea spermei de coco, practic, se afl la
acelai nivel. n varianta 2, cnd s-a folosit baclanozida, valoarea acestui indice a fost mai nalt
cu 2,5 i 3,2%, comparativ cu nivelul nregistrat n prima i a doua variant.
194

Tabelul 5.23. Rezultatele experienei efectuate n condiii practice, obinute n rezultatul
nsmnrii ginilor cu sperm congelat-decongelat
Indicii eclozionrii
Nr.
ctr.
Varianta
experienei
Ou
fecundate,
buci
Pui
eclozinai,
capuri
Ciocnirea
oulor, %
Eclozionarea
puilor, %
1.
Mediul Schramm +
glutation
92 77
83,7 2,64

39,5 3,50
2.
Mediul Schramm +
asparagozida-H
106 88 83,0 2,71 46,1 3,60
3.
Mediul Schramm +
baclanozid
65 56 86,2 2,95 41,24 4,22
n acelai timp, s-a stabilit, c eclozionarea puilor, n cazul nsmnii ginilor cu sperm
congelat-decongelat n mediul cu adaos de asparagozid-H este mai majorat cu 7,5%, n
comparaie cu varianta folosirii glutationului i cu 5% - la folosirea glucozidului steroid
baclanozida-H.
Astfel, n rezultatul experienei de producere, pentru nsmnarea ginilor cu sperm
congelat-decongelat n mediul Schramm, Hubner [365] s-a stabilit, c dintre oxidanii cercetai
cele mai bune rezultate dup indicii investigai sunt obinute la folosirea n componena mediului
crioprotector a asparagozidei-H. n acelai timp, n rezultatul cercetrilor efectuate a fost
dovedit interaciunea pozitiv ntre indicii morfo-funcionali ai spermatozoizilor deconservai
de coco i rezultatele nsmnrii ginilor cu sperm congelat-decongelat.
n urmtoarele experiene, a fost studiat capacitatea de fertilitate a spermei congelate de
coco la folosirea mediului elaborat, pe baza maltozei, argininei, glicerinei i petamozidei-2.
Datele obinute sunt expuse n tabelul 5.24.
Datele tabelului 5.24 demonstreaz c crioconservarea spermei de coco n paiete cu
utilizarea att n varianta-martor, ct i n cea experimental a mediilor experimentate, duce la
diminuarea brusc a fecunditii oulor. Totodat, se observ tendina de ameliorare a
fecunditii oulor, n cazul includerii n componena mediului a AO petumozida-2.
Mediul maltozic elaborat, a fost evaluat i ntr-o experien de producere pentru
nsmnarea ginilor cu sperm de coco, congelat n granule (tabelul 5.25).
Din datele tabelului 5.25 se vede, c utilizarea mediului maltoz-arginin-glicerin cu
petumozida-2 permite de a obine o fecunditate a oulor egal cu 70,866,56%. n varianta-
martor, indicele evaluat este cu 23% mai sczut. Analogic ca i n experienele, rezultatele cror
sunt expuse n tabelul 5.24, s-a stabilit, c aplicarea AO majoreaz fecunditatea oulor.
195
Concomitent, este necesar de menionat c efectul pozitiv al petumozidei-2 este observat n
ambele variante ale mediilor.
Tabelul 5.24. Rezultatul incubrii oulor obinute de la ginile nsmnate artificial cu sperma
congelat-decongelat de coco
Ou incubate
Ciocnirea
oulor
Fecundate Nefecundate
Nr.
ctr.
Mediul
crioprotector Total,
buc. Buc. % Buc. %
Buci %
Eclozi-
onarea
oulor,
%
1.
Mediul
Watanabe
Terode (martor)
24 6
25,0
8,84
18
75,0
8,84
6
25,0
8,84
100,0
0,00
2.
Maltoz
arginin
glicerin
24 5
20,8
8,28
19
79,2
8,28
4
16,7
7,61
80,0
8,16
3.
Maltoz
arginin
glicerin
petumozida-2
24 9
37,5
9,88
15
62,5
9,88
8
33,3
9,62
88,9
6,41

Tabelul 5.25. Rezultatele incubrii oulor, obinute de la ginile nsmnate artificial cu sperma
congelat-decongelat de coco n granule
Ou incubate
Fecundate
Nr.
ctr.
Varianta mediului
crioprotector
Total,
buci Buci %
Pui vii,
capete
Eclozi-
onarea
oulor, %
Ieirea
puilor,
%
1.
Maltoz arginin
glicerin
48 19
39,6
7,06
19
100,0
0,00
39,6
7,06
2.
Maltoz arginin
glicerin cu
petumozida-2
48 34
70,8
6,56*
33
97,1
2,42
68,8
0,69*
3.
C2 (IUCGAA)
(martor)
48 23
47,9
7,21
20
87,0
4,85
41,7
7,12
4.
C2 (IUCGAA) cu
petumozida-2
48 31
64,6
6,90
31
100,0
0,00
64,6
6,90
Not: *Diferenele sunt statistic autentice.
Reieind din eficiena petamozidei-2, n continuare au fost studiate proprietile glicozidelor
steroide de origine organic (tabelul 5.26).
196
Tabelul 5.26. Rezultatele nsmnrii artificiale a ginilor cu sperm crioconservat la
includerea n componena mediilor a Triozidei Lilia i Asparogozidei-H
Fecundarea
oulor
Ciocnirea
oulor
Eclozionarea
oulor
Varianta
experimental,
AO - concentraia
Ou
incubate,
buc. buc. % buc. % buc. %
I - (Maltoza- Triozid
Lilia) - 2,5 mg%
150 132
88,0
2,65
132
99,0
0,145
116
88,0
2,65
II - (Maltoza-
Asparogozida-H) -
0,625 mg%
150 137
91,3
2,30
134
97,8
1,22
120
89,3
2,52
III - Martor
(Maltoza-arginin-
glicerin-
petumozida-2)
150 130
86,7
2,77
128
98,5
0,99
108
84,6
2,95
Not: *Diferenele sunt statistic autentice.
Datele tabelului 5.26 demonstreaz, c glicozizii steroizi studiai, posed o capacitate
antioxidativ mai eficient dect petamozida-2, manifestnd efecte pozitive asupra fecunditii,
ciocnirii, eclozionrii i ieirii puilor vii.
Efectul mediului elaborat poate fi determinat prin faptul c include maltoza n calitate de
glucid, care particip la reglarea tensiunii osmotice [81] i poate exercita funcia de crioprotector
[92], precum i arginina cu proprieti de a forma biocomplexe cu componentele membranare
[50] i AO, care blocheaz POL [55].
Este cunoscut [18], c fertilitatea reprezint un proces de prima necesitate i este cea mai
important n creterea psrilor. Numrul de ou fertile, produse pentru incubaie, elucideaz
rentabilitatea final a ginilor de prsil. n acelai timp, rezultatele cercetrilor prezentate
demonstreaz insuficiena acestor cerine, deoarece la fecunditatea nalt a oulor, n realitate,
putem obine descendeni mai puini, comparativ cu cele fecundate. Concomitent, nici
descendenii nu rspund la ntrebarea, sunt sntoi sau nu!
5.4. Concluzii la capitolul 5
Reieind din rezultatele expuse i n conformitate cu relatrile menionate n reviul
literaturii, indiscutabil este eficacitatea folosirii n componena mediilor crioprotectoare pentru
diluarea i conservarea spermei de coco a substanelor, care posed proprieti AO.
Concomitent cu aceasta, avnd n vedere instabilitatea mediilor existente pentru conservarea
spermei de coco la temperaturi sczute i dificultile tehnologice de utilizare a spermei n
condiii practice, rmne n continuare o necesitate vdit perfecionarea lor prin prisma
197
sanocreatologiei avansate. Mai mult ca att, nsmnarea artificial devine biotehnologia de baz
a lucrului de selecie n domeniul aviculturii i metoda principal n ameliorarea calitilor de
prsil, precum i n realizarea nsuirilor biologice reproductive ale psrilor.

CONCLUZII GENERALE I RECOMANDRI
CONCLUZII GENERALE
1. Specificul modificrilor morfo-funcionale i structurilor acrozomale ale spermatozoizilor
de coco, comparativ cu cele ale spermatozoizilor de taur, berbec i vier n procesul de diluare,
refrigerare, congelare i decongelare se exprim prin predominarea deteriorrilor morfo-
funcionale la etapa de congelare-decongelare, manifestarea mai sporit a rezistenei la factorii
tehnologici dect cele de vier i mai sczut dect cele de om i prin expresarea mobilitii la
nivelul celor de taur, fiind mult mai exprimat dect cele de berbec i vier, urmate de modificri
structural-morfologice semnificative ale spermatozoizilor, inclusiv de creterea semnificativ a
indicelui-B teratologic al spermei.
2. Funcionalitatea spermei de coco depinde de valoarea pH-lui mediului de diluare, fiind
mai optimal n limitele slab acide i slab alcaline ale mediului, scznd n condiiile de deviere
ca rezultat a ruperii legturilor slabe prevalente n proteinele membranare ale spermatozoizilor
de coco, ceea ce mrturisete despre necesitatea de utilizare la crioconservare a mediilor cu pH-
ul 6,0-8,0.
3. Modificrile integritii membranelor spermatozoizilor de coco n procesul de
crioconservare, n mare msur, sunt determinate de schimbrile raportului proteine/lipide, n
defavoarea lipidelor i colesterin/fosfolipide, de condiiile variabile ale osmolaritii i
permeabilitatea selectiv a membranelor pentru ionii de Na
+
, K
+
, Li
+
i Ca
2+
, n special, n
perioada de congelare-decongelare, precum i de micorarea coninutului colesterinei,
trigliceridelor i sporirea concentraiei fosolipidelor i digliceridelor n ele.
4. Cele mai sensibile componente structurale ale membranelor plasmatice ale spermatozoizi-
lor de coco n procesul de crioconservare sunt fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, cerebrozi-
dele fraciile 3 i 5, trigliceridele i colesterina, modificrile crora se manifest prin reaciile de
compensare direct i invers proporional coninutului lor i prin reacii de oxidoreducere.
5. n procesul de diluare, refrigerare i congelare-decongelare dintre produsele peroxidrii
lipidelor n sperma de coco cele mai eseniale modificri suport dialdehida malonic, care
servete ca marker specific al intensitii procesului de peroxidare a lipidelor.
6. Pool-ul grupelor de AA n membranele plasmatice i spermatozoizii nativi de coco n
procesul criocoservrii i modificrile lui, n mare msur, depinde de particularitile de specie:
198
n membranele plasmatice native de coco, comparativ cu cele de vier predomin AA acidici,
neutri i hidrofobi, n spermatozoizi un coninut mai mare revine AA hidrofobi, iar mic celor
neutri, acidici i bazici; n procesul de croiconservare specificul modificrilor de specie a
coninutului de aminoacizi la coco se manifest prin sporirea aminoacizilor hidrofobi n
membranele native, iar n spermatozoizi att a celor hidrofobi, ct i a celor acidici i bazici.
7. n plasma seminal de coco aminoacizii liberi prin coninutul sporit al grupelor bazice,
acidice, n special, a glutaminei i grupei neutre difer considerabil de cel de vier, n particular, a
aminiacizilor acidici, iar n procesul de congelare-decongelare coninutul tuturor grupelor de
aminoacizi n plasma seminal de coco sporete, pe cnd n grupele similare de aminoacizi ai
plasmei de vier se micoreaz; dintre aminoacizii legai n plasma nativ preponderent se
depisteaz grupa hidrofob, iar n condiiile de crioconservare coninutul grupelor hidrofobe,
neutre i acidice, n mare msur, se egaleaz, pe cnd cea bazic se manifest la un nivel
sczut.
8. Influena dilurii, congelrii i decongelrii spermei, n cea mai mare msur, se reflect
asupra membranelor plasmatice comparativ cu nucleul spermatozoizilor, despre ce denot
nivelul de modificri al activitii g
+2
(Na
+
+
+
)-ATP-azei, 5
1
-nucleotidazei, fosfatazei alcaline
i a coninutului ADN-lui n membranele plasmatice izolate i nucleele, att ale spermei de
coco, ct i de vier, precum i asupra plasmei seminale i spermatozoizilor prin modificrile
albuminelor, -, - i -globulinelor spermei, produse de reaciile de adaptare i labilizare ale
proceselor compensatoare, preponderent, la nivelul spermatozoizilor.
9. Fortificarea activitii fiziologice a spermei supuse crioconservrii poate fi asigurat din
contul includerii n mediul crioprotector a argininei, maltozei i a unor fracii de lipide.
10. Fortificarea integritii morfologice i stabilizarea funcional a spermei de coco n
condiii de crioconservare poate fi obinut prin utilizarea n calitate de crioprotector a
glicozidelor steroide - Asparagozid-H, Lilia-H i Triozid-Lilia.
11. Algoritmul tehnologiei de crioconservare a spermei de coco prevede de rnd cu
regimurile optimale de prelucrare tehnologic i utilizarea mediului perfecionat de diluare i
congelare cu crioprotectori (Petumozid, Asparagozid-H, Lilia-H, Triozid-Lilia) i alimentaia
cocoilor pe parcursul perioadei ciclului de spermatogenez cu raie bogat i suplimentat cu
substane coordinative (LAZ, TAS) i fosfosan.
12. Administrarea glucidelor n componena mediilor crioprotectoare pentru sperma de
coco previne epuizarea rezervelor energetice proprii ale spermiilor i constituie substratul
energetic pentru metabolismul anaerob al celulelor spermatice contribuind la inhibarea
procesului de peroxidatre a lipidelor din membranele spermatozoizilor prin diminuarea
199
acumulrii produselor toxice ale acestui proces, la meninerea arhitectonicii structurilor
extramembranare i la stabilizarea indicilor fiziologici ai spermatozoizilor decongelai, asigurnd
o sanogenitate favorabil a prolongrii semnificative a longevitii spermatozoizilor.
13. Cercetrile de perspectiv vor avea succes n cazul axrii lor spre descifrarea
mecanismelor, ce stabilizeaz starea morfo-funcional a spermei de coco, care este
predeterminat att de procesele biochimice ale plasmei, ct i ale membranelor spermiilor,
inclusiv spectrul proteic i lipidic, raportul proteine/lipide, nivelul de peroxidare a lipidelor,
permeabilitatea membranelor pentru ionii de Na
+
, K
+
, Li
+
, Ca
2+
, Mg
2+
, pH-ul plasmei, gradientul
osmotic i meninerea integritii structurale i capacitilor funcionale ale spermei n procesul
de crioconservare, care poate fi realizat prin selectarea i utilizarea substanelor cu proprieti
de a stabiliza procesele biochimice n plasm i spermii la nivelul strii native, precum i prin
alimentarea cocoilor cu preparate, care favorizeaz spermatogeneza sanogen.
14. Mediile crioprotectoare pentru sperma de coco, elaborate prin includerea substanelor
compoziionale cu variabilitate de provenien organic i anorganic; metodele, regimele i
principiile propuse pentru conservarea materialului spermatic i nsmnarea artificial a
ginilor au asigurat obinerea rezultatelor semnificative n condiii de producere a fecunditii
oulor, eclozionrii i obinerii puilor sntoi.

RECOMANDRI PRACTICE
1. n scopul majorrii eficienei reproducerii i realizrii seleciei genotipice n avicultur se
propune de a folosi pentru smnarea artificial a ginilor, sperma de coco criocoservat prin
utilizarea mediului crioprotector n urmtoarea componen: maltoz - 11,5 g; glicerin 7 ml;
petumozid - 0,05 mg%; arginina - pn la pH-ul mediului 6,8 -6,9; ap distilat - pn la 100 ml.
Mediul elaborat poate fi aplicat n criotehnologii la congelarea materialului seminal n
form de granule Mediul crioprotector pentru sperma de coco, Brevet de invenie. 639 G2,
Int. Cl.
6
: A 61 D 19\02 (BOPI, nr. 12/96).
2. Pentru reglarea procesului de peroxidare a lipidelor membranare ale spermatozoizilor, n
componena mediului pentru diluarea i criconservarea spermei de coco, se recomand de a
include steroidul glicozidic Triozida (25R)-spirost-5-en-3,27-diol-27-O-(3-hidroxi-3-
metilglutaroil) ce posed proprietate antioxidant, Brevet de invenie. 1156 G2, Int. Cl.
6
: C 07
H 3/06; C 07 J 71/00 (BOPI, nr. 2/99).
3. n scopul dilurii i conservrii hipotermale, meninerea valorii biologice i sporirea
proprietilor fecundative sanogene ale spermei cocoilor-reproductori se propune mediul
200
pentru conservare cu urmtoarea componen: soluie izotonic de clorur de sodiu - 1,0 g;
amidon hidrosolubil - 0,1 g; ap distilat - pn la 100 ml.
4. La elaborarea mediilor sintetice pentru crioconservarea spermei de aplicat urmtoarele
principii: stabilizator, inhibitor, reglator, combinator, modificator i stimulator, care,
corespunztor, prevd meninerea fiziologic a proprietilor bio-fizico-chimice, blocarea
derulrii proceselor bio-fizico-chimice nocive, dirijarea activitii compuilor structurali i
permiabilitii membranelor, utilizarea substanelor de divers origine cu aciune exo- i
endocelular, schimbarea structurilor cristalice i limitelor eutectice i stimularea proceselor
meninerii energiei, formrii biocomplexelor, structurilor criorezistente i activitii funcionale a
spermatozoizilor dup deconservarea lor.
5. Pentru sporirea eficienei activitii ntreprinderilor de prsil, se propune de a aplica
schema de organizare a reproducerii artificiale ale ginilor cu sperm conservat de coco, care
include urmtoarele elemente:
a) Organizarea i instruirea grupului de specialiti angajai pentru pregtirea cocoilor i
ginilor, recoltarea spermei i nsmnarea artificial a ginilor;
b) Pregtirea cocoilor pentru obinerea unui material de calitate dup acomodarea i
adaptarea lor;
c) Organizarea, amenajarea i aprovizionarea laboratorului specializat pentru manipularea i
investigarea produsului seminal destinat insmnrii artificiale;
d) Recoltarea spermei de la cocoi prin masajarea uoar a regiunii sacrale n sus cranio-
caudal i masajarea regiunii abdominale n direcia de la apendicele xifoid spre apofizele
pubiene;
e) Prepararea mediilor, diluarea i conservarea spermei de coco dup recoltare cu mediile
specifice preparate n acest scop;
f) Realizarea tehnicii de nsmnare artificial a ginilor i eviden ei conform schemei
aplicrii la ziua a 4, 5, 6 i 7 sau la ziua a 7, cu smbt i duminica - zile libere;
j) Recoltarea i incubarea oulor.
6. Metoda de meninere i fortificare a spermatogenezei la cocoi prin administrarea n
componena raiei alimentare a substanelor coordinative care contribuie la sporirea indicilor
spermatogenezei. Brevet de invenie. 4166 B1 MD, A01K 67/00; A23K 1/16; C01G 9/00; A61P
15/08, BOPI nr. 5/2012 i Brevet de invenie. 4193 B1 MD, A61D 19/00; A01K 67/00; A61P
15/08; C01G 9/00; C01B 19/00, BOPI nr. 1/2013.


201
BIBLIOGRAFIE
1. Balan I. Crioactivitatea enzimelor membranodependente i starea acidului dezoxiribonucleic
n procesul spermatogenezei. n: Revista Romn de Medicin Veterinar, 2012, Serie nou,
vol. 22, nr. 3, p. 39-48.
2. Balan I. Coerena factorilor de mediu, structur i calitate a materialului seminal de coco la
crioconservare. n: Mediul ambiant, 2012, nr. 4, p. 34-38.
3. Balan I. Actualiti n modificrile moleculare si morfologice dirijate ale celulelor spermatice
n progresia spermatogenezei. n: Buletinul AM. tiinele vieii, 2012, nr. 1, p. 65-82.
4. Balan I. Criolabilitatea strii morfo-fiziologice i diversitatea rezistenei spermei de coco.
n: Buletinul AM. tiinele vieii, 2012, nr. 2, p. 37-47.
5. Balan I. Aspecte membrano-structurale n pstrarea biodiversitii prin crioconservare. n:
Studia Universitatis, tiine ale naturii, 2012, nr. 1, p. 101-105.
6. Balan I. Rolul glucidelor n stabilizarea strii morfo-funcionale a spermei de coco n
procesul de crioconnservare. n: Studia Universitatis, tiine ale naturii, 2012, nr. 1, p. 96-100.
7. Balan I., Boronciuc Gh., Roca N. Unele caracteristici sanogene ale materialului seminal n
corelaie cu statusul homeostazic al organismului. n: Medicina tradiional i
sanocreatologic, Buletinul Asociaiei MT RM, Chiinu, 2006, vol. 9, p. 33-36.
8. Boronciuc Gh., Balan I., Roca N. i al. Modificri de conformaie ale gameilor de coco
sub influiena factorilor stresogeni. n: Lucrri tiinifice, Medicin veterinar, Chiinu, 2008,
vol. 19, p. 137-140.
9. Boronciuc Gh., Balan I., Roca N. Interaciunea lipoproteic i posibilitatea stabilizrii ei n
procesul crioconservrii spermei animalelor agricole. n: Materialele Congresului al IX-lea
Naional cu participare internaional al Geneticienilor i Amelioratorilor. Chiinu, 2010, p.
154.
10. Ciochin V., Furdui V. Dezvoltarea fiziologiei i sanocreatolgiei. Rezultate i perspective.
n: Buletinul Academiei de tiine a Moldovei, 2006, nr. 1, p. 12-18.
11. Ciofu C. Nutritie si alimentaie. In: Pediatrie, ed. I, 2001, p. 90-92.
12. Crivoi A., Bacalov Iu., Cojocari L. i al. Aspectul bioetic al stimulrii rezervelor funcionale
ale proceselor adaptative. n: Materialele Conferinei a XV-a tiinifice internaionale: bioetica,
filosofia, economia i medicina n strategia de asigurare a securitii umane. Chiinu, 2010, p.
28-33.
13. Darie G., Rudic V. i al. Procedeu de optimizare a spermatogenezei taurilor reproductori.
Brevet de invenie Nr. 3226 / 2007. 01. 31.
202
14. Darie Gr, Marandici Elena. Biotehnologia nsmnrii artificiale a taurilor: (recomandri).
Ch.: S. n., Tipogr. Print - Caro, 2011. 59 p.
15. Gudumac V., Niguleanu V., Rvneac V. i al. Examenul lichidului spermatic (ghid practic).
Chiinu, 2010. 50 p.
16. Marandici E. Dinamica modificrii cantitii i calitii spermei n funcie de vrst, mediu
ambient i impactul preparatelor microbiene la vieri. Autoref. tez. de dr. t. biologice.
Chiinu, 2008. 26 p.
17. Miclea V., Ladosi D., Ladosi I., Zahan M. The influence of inducing early reproductive
activity in young hens and roosters of egg-laying type breed. In: Journal of Central European
Agriculture, 2002, vol. 3, no. 4, p. 353-362.
18. Miclea V., Zahan M., Miclea Ileana. Reproducia animalelor de ferm. Cluj-Napoca: Accent,
2010. 334 p.
19. Pcal N. i al. ndrumtor lucrri practice de Biologia reproducerii animalelor. Timioara:
Eurobit, 2002. 46 p.
20. Raicu Florina i al. Rolul proteinelor de legare la ARN n spermatogenez i infertilitatea
masculin. n: Progrese n Biotehnologie. Editura Ars Docendi, 2002, vol. 2, p. 133-141.
21. Roca N. Modificrile morfofuncionale ale gameilor de tauri i cocoi n dependen de
modalitatea stresrii animalelor. Autoref. tezei de dr. t. biologice. Chiinu, 2000. 22 p.
22. Roca N. et al. Morfopatiile spermei de taur la influiena factorilor stresogeni de
crioconservare. n: Simpozion tiinific intrnaional 35 ani de nvmnt superior medical
veterinar din Republica Moldova, Chiinu: Centrul Ed. al UASM, 2009, p. 182-185.
23. Roca N. i al. Morfologia i activitatea funcional a spermatozoizilor de taur i coco sub
influiena diferitor factori. n: Lucrri tiinifice, UASM, Zootehnie i biotehnologii, Chiinu,
2010, vol. 26, p. 323-328.
24. Roca N. i al. Spectrul proteic n procesul criconservrii sprmei de tauri i cocoi. n:
materialele Congresului al IX-lea Naional cu participare internaional al Geneticienilor i
Amelioratorilor, Chiinu, 2010, p. 165.
25. ara A. et al. Efectele utilizrii mineralelor organice n nutriia animalelor. n: Buletinul
USAMVCN, 2004, vol. 60, p. 100-103.
26. ara A., Antonina Odagiu. Disponibilitatea probioticelor i mineralelor n creterea
ecologic a animalelor. n: ProEnvironment, 2008, vol. 2, p. 89-93.
27. umanschii A., Bularga I. Nutriia i alimentaia animalelor domestice. Chiinu, 2009. 326
p.
203
28. umanschii A. Studiul dezvoltrii sectorului avicol la nivel naional i internaional. n:
Realizri i perspective n zootehnie i biotehnologii. Simpozion tiinific internaional,
UASM. Chiinu, 2010, p. 122-126.
29. Zamfirescu S. i al. Rezultate privind pretabilitatea la congelare a spermei de ap i
fecunditatea obinut dup inseminarea artificial a caprelor. n: Lucrri tiinifice, Ed.
Universitii Lucian Blaga, Sibiu, 2007, vol. 5, p. 127-132.
30. Zamfirescu S., Anghel A. Researches regarding the ultrastructural modifications of sperm
cells before and after freezing in different media. n: Lucrri tiinifice, Seria Zootehnie, 2010,
vol. 53, no. 15, p. 67-74.
31. ..
. n: Materialele congresului VI al fiziologilor din Moldova cu participare
internaional. Chiinu, 2005, p. 115-116.
32. .., .. . .: . .. . , 2003.
336 c.
33. .. -
. n: Studia universitatis, tiine ale naturii, 2012, nr. 1, p.
106-118.
34. .., ..
. n: Problemele actuale ale geneticii, biotehnologiei i
ameliorrii. Chiinu, 2005, p. 221-225.
35. .., .. -
. n: Studia universitatis, tiine
ale naturii, 2005, p. 93-97.
36. .., .. -
. n: Studia
universitas, tiine ale naturii, 2007, nr. 1, p. 29-31.
37. .., .., . . -
. B: . . . .
. . . .-. ., , 2005, c. 45-46.
38. .., .. .
. n: Realizri i perspective n creterea animalelor. Mat. simp.
t. cu participare internaional, Maximovca, 2006, p. 302-306.
204
39. .., .., ..
. n: Analele tiinifice ale USM, tiine chimico-
biologice, Chiinu, 2006, p. 103-114.
40. .., .. . . n: Problemele
actuale ale proteciei i valorificrii durabile a diversitii lumii animale. Mat. conf. intern.,
Chiinu, 2007, p. 151-153.
41. .. . . n:
Diversitatea, valorificarea raional i protecia lumii animale, I.E.-P. tiina, Chiinu, 2009,
p. 13-16.
42. .., .. C
. : , 1982. 256 c.
43. . ., . . . : , 1994. 432 c.
44. .., .. .
: , 1983. 265 c.
45. .. . : , 1975, 183 c.
46. .. . : , 1990, 209 c.
47. ..

: . . . . . . ., 1998, 32 c.
48. .., ..
.
n: Analele tiinifice ale Universitii de Stat din Moldova. Seria "tiine chimico-biologice".
Chiinu, 2006, p. 115-120.
49. .., ..
. n: Studia universitatis. tiine
ale naturii, 2007, nr. 1, p. 32-35.
50. .., .. -
. hiinu: Tipografia AM, 2008. 633 c.
51. .., .. .
. n: Lucrri tiinifice, UASM, Zootehnie i biotehnologii,
Chiinu, 2008, vol. 18, p. 177-180.
52. .. . . B:
II- , -, 2008, c, 167.
205
53. .. . -
. Diversitatea, valorificarea
raional i protecia lumii animale, Chiinu: I.E.-P. tiina, 2009, p. 19- 22.
54. .. . K -
. n: Lucrri tiinifice, UASM,
Zootehnie i biotehnologii, Chiinu, 2010, vol. 26, p. 254-257.
55. .., ..
. : , 1972. 348 c.
56. ..
. :
. , , 1977, c. 11-12.
57. . , . : , 1997. 622 c.
58. .. /
-
-, , . . .
. . . , 1989. 18 c.
59. .. .
. : , 2006, . 8, . 88-92.
60. .. . . :
., 1988. 208 .
61. .., .. . I.
. : , 2009, . 19, 1, . 18-24.
62. .., .. . II.
. : , 2009, . 19, 2, . 121-136.
63. .., .. . III. ,
, . : , 2009, . 19,
3, . 273-282.
64. .., ..
. : , 2011, . 21, 2, . 200.
65. .. .
. . - . , , 1993. 30 .
66. .. . T
. : , 1990. 136 .
206
67. .. . ,
. : . . .
, , 2004, . 787-788.
68. .. .
. : . . . ,
, 2004, . 796-797.
69. .. : . : -
, 2005. 318 .
70. .. : . . .
. . , 2007. 21 .
71. .., .. . :
, 1982. 224 .
72. ..
, . .
. . . . , 1992. 18 .
73. .., .. , . : ,
, 1995, c. 304.
74. .. .
. : , 2009, . 19, 1, . 25-31.
75. .., .. ,

. : . . . . . , , 2004, .803.
76. .. . : , 1981. 340 .
77. .. .
: , 2001, 2, . 45-48.
78. .. . .
: , 1988. 256 .
79. .. . : , 1980. 296 .
80. ..
(Halocynthia aurantium),
. . . . . , 2006. 16 .
81. .. -
: . . . . .
, 2003. 36 .
207
82. .. .
. : . , 2010, . 20, 1, . 34-46.
83. .., ..
. : . ., 2010, . 20, 1, . 109-122.
84. ... . : , 1972. 289 .
85. .. . :
, 1913, . 25, . 300-330.
86. .., .. .
, 1989. 120 .
87. ..
. : , 1983, . 44, 3, . 386-397.
88. .. .
: , 1962. 696 .
89. .. -
. - . : , 1988, . 7-65.
90. ..
: . - - . -, 1998. 40 .
91. .. -
:
. . - . . , 1987. 32 .
92. ..
. : , 1991. 200 .
93. .., ..
. . . . . , 1993,
1, . 50-53.
94. .. .
. : - , 1989, 2, . 15-22.
95. .. . . :
. , 1991, . 35-81.
96. .. .
: , 1995, 1, . 20-22.
97. ..
. : , 1978. 255 .
208
98. .., ..
. : M. . . ,
, 2004, . 831-832.
99. .., ..
. :
, 2011, . 21, 2, . 199.
100. ..
( ). . .: ,
1969, . 159-160 / 93 c.
101. . . . , ,
. , 2009. 655 c.
102. .. .
. : M. . . ,
, 2004, c. 844-845.
103. .. . . : . , 1978. 204 c.
104. .., ..
. :
, 2009, . 19, 3, . 312-323.
105. ., ..
. : , .: , 1977, . 64-
66.
106. .. . C
. : III ... -,
2011, . 275.
107. ..
: . . . - . -, 1982. 22 .
108. .., .. . :
, 1988. 312 .
109. .. . . . - . . ,
1990. 32 .
110. .. . :
, 2003, 1, . 84-91.
111. .., ..
. , 1983. 23 .
209
112. .., .. -
. : , 2007. 182 .
113. .. . : .
. . , , 2004, . 859.
114. ..
. : . .: , 1977, . 63-64.
115. . . . Chiinu:
Tipografia A..M, 2006. 408 .
116. ..
: . . . . . , 1988. 16 .
117. .., ..
. B: .
. , 2006, 11, . 521-524.
118. .. . . II
, . B: ,
2010, . 20, 3, . 266-281.
119. .. . - . , 2003. 375 .
120. .. . allium
cyrillii (alliaceae). B: . . . . . . . ,
, , 2011, . 24, (63), 2, . 390-395.
121. ..
-. : , 1986. 240 .
122. ..
. . . B:
. hiinu: Tipografia AM, 2005, . 16-35.
123. .., .., ..
: c, , .
: , 1999, . 44-51.
124. .., .., .. .
. n: Buletinul Academiei de tiine a Moldovei, 2002, nr.
2, p. 30-39.
125. .., .., .. .
. n: Buletinul
Academiei de tiine a Moldovei, 2002, nr. 2, p. 40-45.
210
126. .., .., ..
. n: Buletinul Academiei de tiine a Moldovei, 2008, nr. 1, p. 4-14.
127. .., .
. n: Buletinul AM. tiinele vieii. 2005, nr. 1, p. 4-14.
128. .., .., ..
,
. n: Buletinul AM. tiinele vieii, 2011, nr. 2, p. 4-
15.
129. .., .., .. .
. II.
. n: Buletinul AM, tiinele vieii, 2011, nr. 1, p. 4-14.
130. .. . . B: .
. . , , 2004. p. 879.
131. .. . .
: , 1986. 736 c.
132. .. .
1,2- . B: , 2009, .
19, 2, . 137-142.
133. .. .
. B:
, 2010, . 20, 2, . 153158.
134. .. .
. B: , 2011, . 21, 1, . 46-
51.
135. .. . n: Buletinul
Academiei de tiine a Moldovei, 2002, nr. 4, p. 45-60.
136. o .. . B:
. h.: Tipografia AM, 2005, p. 234-242.
137. .. . ,
. n: Buletinul AM, tiinele
vieii, 2011, nr. 3, p. 15-35.
138. .. . -
. B: . . . , , 2004,
c. 883-884.
211
139. .. . . : , 1987. 248 c.
140. ..

. n: Bulet. Acad. de tiine a Moldovei, 2003, nr. 2, p. 54-69.
141. .. . :
, 1967. 232 c.
142. .., ..
. : , 2010, . 130, 6, . 587-602.
143. .. .
. B: . . . ,
, 2004, . 887-888.
144. Abe Y. et al. Cryopreservation of canine embryos. In: Biology of Reproduction, 2011, vol.
84, no. 2, p. 363-368.
145. Adabi S.G. et al. L.carnitine effects on quantity and quality of African black neck ostrich
sperm. In: Journal of Veterinary and Animal Advance, 2008, vol. 7, no. 1, p. 51-55.
146. Adam Z. et al. Curve fitting approach for measurement of cellular osmotic properties by
the electrical sensing zone method. In: Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 2, p. 117-128.
147. Agarwal A. and Prakaran S.A. Oxidative stress and antioxidants in male fertility: a difficult
balance. In: Iranian Journal of Reproductive Medicine, 2005, vol. 3, no. 1, p. 1-8.
148. Agarwal A. and Saleh R.A. Role of oxidants in male infertility: rationale, significance, and
treatment. In: Urologic Clinics of North America, 2002, vol. 29, no. 4, p. 817-827.
149. Aisen E. et. al. Ultramicroscopic and biochemical changes in ram spermatozoa
cryopreserved with trehalose-based hypertonic extenders. In: Cryobiology, 2005, vol. 50, no. 3,
p. 239-249.
150. Aitken R. J. et al. Generation of reactive oxygen species, lipid peroxidation and human
sperm function. In: Biol. Reprod., 1989, vol. 40, no. 1, p. 183-197.
151. Alkan, I. et. al. Reactive oxygen species production by the spermatozoa of patients with
idiopathic infertility: relationship to seminal plasma antioxidations. In: Journal of Urology,
1997, vol. 157, no. 1, p. 140-143.
152. Allen W. R. Sex, science and satisfaction: aheadybrew. In: Animal Reproduction Science.
2010, vol. 121, no. 1, p. 262278.
153. Almodin CG. et al. Embryo development and gestation using fresh and vitried oocytes.
In: Human Reproduction, 2010, vol. 25, no. 5, p. 1192-1198.
212
154. Alvarez J.G. and Storey B.T. Differential incorporation of fatty acids into and peroxidative
loss of fatty acids from phospholipids of human spermatozoa. In: Molecular Reproduction and
Development, 1995, vol. 42, no. 3, p. 334-346.
155. Anciuti M.A. et al. Effect of dietary inorganic by organic selenium ( Sel-plex) on
performance of broilers. In: Nutritional Biotechnology in the Feed and Food Industry.
Proceedings of the 20th Annual Symposium, Lexington, Kentucky, USA, 2004, p. 14.
156. Ardon F. et al. Mitochondrial inhibitors activate influx of external Ca2+ in sea urchin
sperm. In: Biochimica et Biophysica Acta, 2009, vol. 1787, no. 1, p. 15-24.
157. Arruda J.S. et al. Influence of replacing dietary inorganic selenium (Sel-plex) on
performance of broilers. In: Proceedings of the 20th Annual Altech Symposium Re-immaging
the Feed Industry, Kentucky, USA, suppl., 2004, vol. 11, p. 13.
158. Bah G.S. et al. Semen characteristics of local breeder cocks in the Sahel region of
Nigeria. In: Revue Elev. Med. Vet. Pays. Trop., 2001, vol. 54, no. 2, p. 153-158.
159. Barber S.J. et. al. Broiler breeder semen quality as affected by trace minerals in vitro. In:
Poultry Science, 2005, vol. 84, no. 1, p. 100-105.
160. Barcelo-Fimbres M , et al. Effects of phenazine ethosulfate during culture of bovine
embryos on pregnancy rate, prenatal and postnatal development. In: Theriogenology, 2009,
vol. 71, no. 2, p. 355-368.
161. Bartsevich V.V. et al. Engineered zinc finger proteins for controlling stem cell fate. In:
Stem Cells, 2003, vol. 21, no. 6, p. 632-637.
162. Bedwal R.S., Bahuguna A. Zinc, copper, and selenium in reproduction. In: Cell Mol Life
Sci., 1994, vol. 50, p. 624-640.
163. Benoff S. et al. Voltage-dependent calcium channels in mammalian spermatozoa revisited.
In: Front Biosci, 2007, vol. 12, p. 1420-1449.
164. Benson E. et al. Life in the Frozen State. In: Ed: Taylor and Francis Group, London (GBR),
2004, Chap. 12, p. 371-392.
165. Berdanier C.D. Advanced Nutrition and Human Metabolism. In: Ed. III, Belmont,
California, Wadsworth, Thomson Learning, 1999, p. 87-105.
166. Berlinguer F. In vitro oocyte maturation, fertilization and culture after ovum pick-up in an
endangered gazelle. Meiotic spindle recovery is faster in vitrication of humanoocytes
(Gazella dama mhorr). In: Theriogenology, 2008, vol. 69, no. 3, p. 349359.
167. Bianchi K. et al. Calcium and mitochondria: mechanisms and functions of a
traubledrelationship. In: Biochimica et Biophyzica Acta, 2004, vol. 1742, p. 119-131.
213
168. Black M.M. Zinc dificiency and child development. In: Am J Clin, Nutr., 2000, vol. 68, p.
4645-4695.
169. Blackburn H. D. The national animal germplasm program: challenges and opportunities for
poultry genetic resources. In: Poultry Science, 2006, vol. 85, no. 2, p. 210-215.
170. Blanco J. M. et al. Osmotic tolerance of avian spermatozoa: Influence of time, temperature,
cryoprotectant and membrane ion pump function on sperm viability. In: Cryobiology, 2008,
vol. 56, no. 1, p. 8-14.
171. Blesbois E. Current status in avian semen cryopreservation. In: Worlds Poultry Science
Journal, 2007, vol. 63, no. 2, p. 213-222.
172. Blesbois E. et al. Membrane fluidity and the ability to survive cryopreservation in domestic
bird spermatozoa. In: Reproduction, 2005, vol. 129, no. 3, p. 371378.
173. Blesbois E. et al. Cryopreservation of avian spermatozoa and predictors of ability to
freezing. In: Les actes du BRG, 2006, vol. 6, p. 415-431.
174. Blesbois, E., et al. Semen cryopreservation for ex-situ management of genetic diversity in
chickens; creation of the French Avian Cryobank. In: Poultry Science, 2007, vol. 86, no. 3, p.
555564.
175. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification. In: Can. J.
Biochem. Phisiol., 1959, vol. 37, no. 8, p. 911-917.
176. Booth S.L, A.l Rajabi A. Determinants of vitamin K status in humans. In: Vitam. Horm.,
2008, vol. 78, p. 1-22.
177. Boran C., Ozkan K.U. The effect of zinc therapy on damaged testis in prepubertal rats. In:
Pediatr Surg Int., 2004, vol. 20, no. 6, p. 444448.
178. Boronciuc Gh. Status of lipoproteins complexes in process of cryopreservation of a seed of
a bull. In: A Magyar Buiatricus Tarsasag. 20th Jubileumi International Congressof the
Hungarian, Eger, 2010, p. 186.
179. Boronchuk Gh. et al. The state of glicoproteic biocomplexes criopreservation of
reproductive cells of ram animals. In: The 37 international session of scientific
communications of the faculty of animal science. Bucureti, 2008, p. 222-224.
180. Bugel S. Vitamin K and bone health in adult humans. In: Vitam Horm., 2008, vol. 78, p.
393-416.
181. Burlacova E. et. al. Membrane Lipid Oxidation. In: CRC Press, Boston, 1991, vol. 3, p.
209-237.
182. Buss E. G. Cryopreservation of rooster sperm. In: Poultry Science, 1993, vol.72, no. 5, p.
944-954.
214
183. Buzan V. The role of phospholipids in activity of animal reproduction and there
modifications under hypothermal stress of the bulls seed material. In: Folia Veterinaria 53,1
Supplementum, LIII 10th Jubilee Middle European Buiatrics Congress; The scien. Jour. of
the Univ. of Vet. Med. in Kosice - The Slovak Republic, 2009, vol. 2, p. 118-121.
184. Cabrita E. et al. Preliminary studies on thecryopreservationof gilthead seabream (Sparus
aurata) embryos. In: Aquaculture, 2006, vol. 251, no. 2-4, p. 245-255.
185. Calcraft P.J. et al. NAADP mobilizes calcium from acidic organelles through two pore
channels. In: Nature, 2009, vol. 459, no. 7246, p. 596-600.
186. Castillo C. et. al. Importancia del estrs oxidativo en ganado vacuno: en relacin con el
estado fisiolgico (preez y parto) y la nutricin. In: Archivos de medicina veterinaria, 2001,
vol. 33, no. 1, p. 5-20.
187. Chen S-U & Yang Y-S. Slow freezing or vitrication of oocytes: their effects on survival
and meiotic spindles, and the time schedule for clinical practice. In: Journal of Obstetrics &
Gynecology, 2009, vol. 48, no. 1, p. 15-22.
188. Chen P.S. et. al. Microdetermination of phosphorus. In: Analyt. Chem., 1956, vol. 28, no.
11, p. 1756-1758.
189. Chi Z.H. et al. ZNT7 and Zn2+ are present in different cell populations in the mouse testis.
In: Histol Histopathol., 2009, vol. 24, p. 2530.
190. Churchill G.C. et al. NAADP mobilizes Ca2C from reserve granules, lysosome related
organelles, in sea urchin eggs. In: Cell, 2002, vol. 111, p. 703-708.
191. Costello S. et. al. Calcium stores in sperm: their identities and functions. In: Reproduction,
2009, vol. 138, no. 3, p. 425-437.
192. Cristiano L. Dias et al. The hydrophobic effect and its role in cold denaturation. In:
Thermodynamic aspects of Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 1, p. 91-99.
193. Darszon A. et al. Sperm channel diversity and functional multiplicity. In: Reproduction,
2006, vol. 131, no. 6, p. 977-988.
194. Dejian Ren and Jingsheng Xia. Calcium Signaling Through CatSper Channels. In:
Mammalian Fertilization Physiology, 2010, vol. 25, no. 3, p. 165-175.
195. Dimitrove S.G. et.al. Effect of organic selenium on turkey semen quality during liquid
storage. In: Animal Reproduction Science, 2007, vol. 100, no. 3, p. 311-317.
196. Dobrescu O. Vitamin C addition to breeder diets increase turkey semen production. In:
Feedstuffs, 1987, vol. 59, p. 18.
197. Dong Z. et al. Calcium in cell innjury and death. In: Annual Review of patology, 2006, nr.
1, p. 405- 434.
215
198. Donoghue A. M. and Wishart, G. J. Storage of poultry semen. In: Animal Reproduction
Science, 2000, vol. 62, p. 313232.
199. Douard V. et al. Impact of changes in composition of storage medium on lipid content and
quality of turkey spermatozoa. In: Theriogenology, 2004, vol. 61, no.1, p. 1-13.
200. Dumpala, P.R. et al. The effect of semen storage temperature and diluent type on the
sperm quality index of broiler breeder semen. In: Poult. Sci., 2006, vol. 5, no. 9, p. 838-845.
201. Echevarria D. et al.Neuroepithelial secondary organizers andcell fate specication in the
developing brain. In: Brain Research Reviews, 2003, vol. 43, no. 2, p. 179-191.
202. Edashige K. et al.Japanese ounder (Paralichthys olivaceus) embryos are difcult to
cryopreserve by vitrication. In: Cryobiology, 2006, vol. 53, no. 1, p. 96-106.
203. Edens F.W. et al. Influence of selenium yest (Sel-plex) on performance and carcass yeld of
broiler males grown in e cage environment. In: Proceedings of the 20th Annual Alltech
Symposium Re-immaging the Feed Industry, 2004, vol. 11, p. 31.
204. Eid Y. et. al. Vitamin E supplementation reduces dexamethasone-induced oxidative stress
in chicken semen. In: British Poultry Science, 2006, vol. 47, no. 3, p. 350-356.
205. Eisenbach M., and Giojalas L. 2006. Sperm guidance in mammals - an unpaved road to the
egg. In: Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2006, vol. 7, no. 4, p. 276-285.
206. Elansary E. et al. Effect of ascorbic acid on semen characteristics of Alexandria cockerels
under hot ambient temperatures. In: Abstr. Poul. Scien. Assoc., 1999, vol. 78, p. 35.
207. Elena N. Physical states of aqueous solutions of oxyethylated glycerol with polymerization
degree of N=30 at temperatures lower than 283 K. In: CryoLetters, 2007, vol. 28, no. 4, p. 261-
270.
208. Elgazar V. et al. Zinc-regulating proteins, ZnT-1, and Metallothionein I/II are present in
different cell populations in the mouse testis. In: J. Histochem Cytochem., 2005, vol. 53, no. 7,
p. 905-912.
209. El-Tawil A.M. Zinc deficiency in men with Crohn's disease may contribute to poor sperm
function and male infertility. In: Andrologia. 2003, vol. 35, no. 6, p. 337341.
210. Erenpreiss, J. et al. Sperm chromatin structure and male fertility: Biological and clinical
aspects. In: Asian J. Androl., 2006, vol. 8, no. 1, p. 11-29.
211. Espino J. Reduced levels of intracellular calcium releasing in spermatozoa from
asthenozoospermic patients. In: Reprod. Biol. and Endocrin., 2009, vol. 7, no. 1, p.11.
212. Etches R. J. Reproduction in Poultry. In: Britich Poult. Sci., 1996, vol. 19, p. 187-194.
216
213. FAO. Classication and characterization of world livestock production systems. Update of
the 1994 livestock production systems dataset with recent data, by J. Groenewold. Unpublished
report. Rome, 2004.
214. FAO. World agriculture: towards 2030/2050. Interim report. Rome, 2006. 78 p.
215. FAO. Global Plan of Action for Animal Genetic Resources and the Interlaken Declaration.
Rome, 2007. 48 p.
216. FAO. The State of Food and Agriculture. Livestock in the balance. Rome, 2009. 180 p.
217. FAO. The State of Food Insecurity in the World 2010. Addressing food insecurity in
protracted crises. Rome, 2010. 62 p.
218. Farrant J. et al. Use of two-step cooling procedures to examine factors influencing cell
survival following freezing and thawing. In: Cryobiology, 1977, vol. 14, no. 3, p. 273-286.
219. Farrant J. General observations on cell preservation. In: Low Temperature Preservation in
Medicine and Biology. Pitman Medical, Tonbridge Wells, UK, 1980, p. 1-18.
220. Felix R. Molecular physiology and pathology of Ca2+-conducting channels in the plasma
membrane of mammalian sperm. In: Reproduction, 2005, vol. 129, no. 3, p. 251-262.
221. Figueiuredo E. A. P. et al. Effects of composition of diluents, dilutions and storage time of
heavy broiler breeder semen on fertility, hatchability and chick production.In: Revista
Brusileria de Zootecnia, 1999, vol. 25, p. 1239-1244.
222. Freedman L.P. Anatomy of the steroid receptor zinc finger region. In: Endocrine Rev.,
1992, vol. 13, no. 2, p. 129-145.
223. Froman D.P. Dediction of a model for sperm storage in the oviduct of the domestic fowl
(Gallus domesticus). In: Biology of Reproduction, 2003, vol. 69, no. 1, p. 248-253.
224. Froman D.P., and Kirby J.D. Sperm mobility: phenotype in rosters (Gallus domesticus)
determined by mitochondrial function. In: Biol. Reprod., 2005, vol. 72, no. 3, p. 562-567.
225. Fulton J. E. Avian Genetic stock preservation: an industry perspective. In: Poultry Science,
2006, vol. 85, no. 2, p. 227231.
226. Gee G. F. et al. Reproduction in non-domestic birds: phisyology, semen collection,
artificial insemination and cryiopreservation. In: Avian Poult. Biol. Rev., 2004, vol. 15, p. 47-
101.
227. Gerasimenko JV. et al. NAADP mobilizes Ca2C from a thapsigargin-sensitive store in the
nuclear envelope by activating ryanodine receptors. In: Journal of Cell Biology, 2003, vol.
163, no. 2, p. 271-282.
217
228. Gomez E. et. al. Evaluation of a spectrophotometric assay for the measurement of
malondialdehyde and 4-hydroxyalkenals in human spermatozoa: relationships with semen
quality and sperm function. In: Int. Jour. of Androl., 1998, vol. 21, no. 2, p. 81-94.
229. Goni F.M. et. al. Molecular and acell Biology of Lipids. In: Biochim. Biofiz. Acta., 2008,
vol. 1781, no. 11-12, p. 665-684.
230. Gordienko O.I. et al. Mechanisms of cryoprotectant permeation via erythrocytes
membranes. In: Problems of Cryobiology, 2002, no. 4, p. 9-16.
231. Gous R.M. and Morris T.R. Nutritional interventions in alleviating the effects of high
temperatures in broiler production. In: World's Poultry Sci. J., 2005, vol. 61, no. 3, p.463-475.
232. Govin J. et al. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian
spermiogenesis. In: Eur. J. Biochem., 2004, vol. 271, no. 17, p. 3459-3469.
233. Graham L.A., Marshall C.B., Lin F.H. et al. Hyperactive antifreeze protein from fish
contains multiple ice-binding sites. In: Biochemistry, 2008, vol. 47, no. 7, p. 20512063.
234. Gregory M. Fahy. Cryoprotectant toxicity neutralization. In: Cryobiology, 2010, vol. 60, p.
45-53.
235. Gropper S.S. et al. Advanced Nutrition and Human Metabolism. In: 4th ed., Wadsworth,
Belmont, 2005, p. 205-206.
236. Guerrero A., et al. Tuning sperm chemotaxis by calcium burst timing. In: Dev. Biol., 2010,
vol. 344, p. 5265.
237. Gunter TE. et al. Calcium and mitochondria. In: FEBS Letters, 2004, vol. 567, p. 96-102.
238. Halangk W., Bohnensack R. A quick test for the simultaneous determination of
intactnessand concentrations of spermatozoa. In: Acta. biol. med. Germ., 1982, vol. 41, no. 10,
p. 899-905.
239. Hans R. et al. Antifreeze glycoproteins from the antarctic fish Dissostichus mawsoni
studied by differential scanning calorimetry (DSC) in combination with nanolitre osmometry.
In: Cryoletters, 2005, vol. 26, no. 2, p. 73-84.
240. Hemingway R.G. The influences of dietary intakes and supplementation with selenium and
vitamin E on reproduction diseases and reproductive efficiency in cattle and sheep. In: Vet.
Res. Comm., 2003, vol. 27, no. 2, p. 159-174.
241. Henkel R. et al. Molecular aspects of declining sperm motility in older man. In: Fert Ster.,
2005, vol. 84, no. 5, p. 1430-1437.
242. Hermes R. et al. Ovarian superstimulation, transrectal ultrasound-guided oocyte recovery,
and in rhinoceros. In: Theriogenology, 2009, vol. 72, p. 959968.
218
243. Hiemstra S.J. The potential of cryoconservation and reproductive technologies for animal
genetic resources conservation strategies. In: The role of biotechnology in exploring and
protecting agricultural genetic resources. Rome: FAO, 2006. 187 p.
244. Hirano T. et al.Improvement and biological applications of fluorescent probes for zinc,
ZnAFs. In: J. Am Chem Soc., 2002, vol. 124, p. 65556562.
245. Ho L.H. et al. Labile zinc and zinc transporter ZnT4 in mast cell granules: Role in
regulation of caspase activation and NF-B translocation. In: J. Immunol. 2004, vol. 172, p.
77507760.
246. Hoffmann I. Research and investment in poultry genetic resources challenges and options
for sustainable use. In: World's Poultry Science Journal, 2005, vol. 61, p.57-70.
247. Hoffmann I. The global plan of action for animal genetic resources and the conservation of
poultry genetic resources. In: World's Poultry Science Journal, 2009, vol. 65, p. 286-297.
248. Holt W. V. Basic aspects of frozen storage in semen. In: Animal Reproductive Science,
2000, vol. 62, p. 322.
249. Horvath G & Seidel GE. Vitrification of bovine oocytes after treatment with cholesterol-
loaded methyl-beta-cyclodextrin. In: Theriogenology, 2006, vol.66, p.1026-1033
250. Hubel et. al. Cell partitioning during the directional solidification of trehalose solutions. In:
Cryobiology, 2007, vol. 55, p. 182-188.
251. Hudson B.P. et al. Live performance and immune responses of straight-run broilers:
influences of zinc sourcein broiler breeder hen and progeny diets and ambient temperature
during the broiler production period. In: J. of Appl. Poult. Res., 2004, vol. 13, p. 291-301.
252. Ishikawa M., et al. Strategies for sperm chemotaxis in the siphonophores and ascidians: a
numerical simulation study. In: Biol. Bull., 2004, vol. 206, no. 2, p. 95-102.
253. Ivanov N., Profirov J. Isolation of plasma membranes from ram spermatozoa by a two-
phase polymer System. In: Reprod. Fert., 1981, vol. 63, p. 25-29.
254. James D. et al. Melting point equations for the ternary system water/sodium
chloride/ethylene glycol revisited. In: Cryobiology, 2010, vol. 61, no. 3, p. 352-356.
255. Janet AW Elliott. Introduction to the special issue: Thermodynamic aspects of cryobiology.
In: Cryobiology, 2010, vol 60, no. 1, p. 1-3.
256. Jennen D.G.J. et. al. M.A.M., Confirmation of quantitative trait loci affecting fatness in
chickens. In: Genet. Sel. Evol., 2005, vol. 37, p. 215-228.
257. Jens OM Karlsson. Effects of solution composition on the theoretical prediction of ice
nucleation kinetics and thermodynamics. In: Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 1, p. 43-51.
219
258. Jessica A. Preciado et. al. Isochoric preservation: A novel characterization method. In:
Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 1, p. 23-29.
259. Jeulin C. et. al. Catalase activity in human spermatozoa and seminal plasma. In: Gamete
Research 1989, vol. 24, p. 185-196.
260. Jimenez-Gonzalez C. et al. Calcium signalling in human spermatozoa: a specialized
toolkit of channels, transporters and stores. In: Hum Reprod Update, 2005, vol. 12, no. 3, p.
253-267.
261. John G. Day and Glyn N. Stacey. Methods in Molecular Biology. In: Cryopreservation
and Freeze-Drying Protocols, sec. ed., 2007, vol. 368, p. 141-151
262. Joseph S. and Amir A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow
freezing and vitrification. In: Reproduction, 2011, vol. 141, no. 1, p. 1-19.
263. Kaupp, U. B. et al. Mechanisms of sperm chemotaxis. In: Annu. Rev. Physiol., 2008, vol.
70, p. 93117.
264. Khan R.U. Antioxidants and poultry semen quality. In: World,s Poultry Science Journal,
2011, vol. 67, p. 297-308.
265. Kidd M.T. Vitamins, Minerals and Micronutrients. In: Biology of breeding poultry. Poultry
science symposium series, 2009, vol. 29, p. 361-373.
266. Kinnear NP. et al. Lysosome-sacroplasmic reticulum junctions. A triggerzone for calcium
signaling by nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate and endothelin-1. In: Journal of
Biological Chemistry, 2004, vol. 279, no. 52, p. 54319-54326.
267. Kiyoshi Kawai and Toru Suzuki. Effect of tetrasodium tripolyphosphate on the freeze-
concentrated glass-like transtion temperature of sugar aqueous solutions. In: CryoLetters,
2006, vol. 27, no. 2, p. 107-114.
268. Kowalczyk Artur. The effect of cryopreservation process on morphology and fertilising
ability of japanese quail ( coturnix japonica ) spermatozoa. In: CryoLetters, 2008, vol. 29, no.
3, p. 199-208.
269. Koyanagi F. et. al. Acrosome reaction of cock spermatozoa incubated with the perivitelline
layer of the hen's ovum. In: Poultry Science, 1988, vol. 67, p. 1770-1774.
270. Krug P.J. et al. Endogenous signaling pathways and chemical communication between
sperm and egg. In: J. Exp. Biol., 2009, vol. 212, no. 8, p. 1092-1100.
271. Kuwayama M. et al. Comparison of open and closed methods for vitrication of potential
contamination. In: Reproductive Biomedicine Online, 2005, vol. 11, p. 608-614.
272. Lachaud . et al. Apoptosis and necrosis in human ejaculated spermatozoa. In: Hum
Reprod., 2004, vol. 19, no. 3, p. 607-610.
220
273. Lake P. E. The male in reproduction. In: Physiology and Biochemistry o the Domestic
Fowl (ed. Freeman, B.M.). In: Academic Press, London, 1984, vol. 5. p. 381405.
274. Lake P.E. The history and future of the cryopreservation of avian germ plasm. In: Poultry
Sci., 1986, vol. 65, p. 115.
275. Larman MG. et al. Calcium-free vitrication reduces cryoprotectant-induced zona
pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. In: Reproduction, 2006,
vol. 131, p. 53-61.
276. Latif A. et. al. Effect of osmotic pressure and pH on the short-term storage and fertility of
broiler breeder sperm. In: Vet. J., Pakistan, 2005, vol. 25, no. 4, p. 179-182.
277. Leduc F. et al. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating
spermatids of mice. In: Biol Reprod., 2008, vol. 78, no. 2, p. 324-32.
278. Lee Fong Siow et. al. Cryo-responses of two types of large unilamellar vesicles in the
presence of non-permeable or permeable cryoprotecting agents. In: Cryobiology, 2008, vol. 57,
no. 3, p. 276-285.
279. Lee .. Radioprotective potential of ginseng. Mutagenesis. In: Cryobiology, 2005, vol.
20, no. 4, p. 237-243.
280. Lemoine M. et al. Abilitz of chichen spermatozoa to undergo acrosome reaction after liquid
storage or cryopreservation. In: Theriogenology, 2011, vol. 75, no. 1, p. 122-130.
281. Leng R. et al. Comparative metabolic and immune responses of chickens fed diets
contining inorganic selenium and Sel-plex M organinic selenium. In: Nutritional
Biotechnology in the Feed and Food Industries, Lyons, T.P. and Jaques K.A. Eds, 2003, p.
131-145.
282. Levis Sheena E.M. Is sperm evaluation useful in predicting human fertilyty? In:
Reproduction, 2007, vol. 134, no. 1, p. 31-40.
283. Levitt J. A sulphydryl-disulphyde hypothesis of frest injury and resistance in plants. In: J.
Theoret. Biol., 1962, vol. 3, no. 2, p. 355-391.
284. Lin Y.F. et al. Effects of supplemental vitamin E during the mature period on the
reproduction performance of Taiwan native chicken cockerels. In: British Poultry Science
2005, vol. 46, no. 3, p. 366-373.
285. Lindeberg H. Surgical recoveryandsuccessful surgical transferof conventionally frozen
thawed embryos in the farmed European polecat (Mustela putorius). In: Theriogenology, 2003,
vol. 60, no. 8, p. 1515-1525.
221
286. Lindsay L. L., et al. Cross-fertilization and structural comparison of egg extracellular
matrix glycoproteins from Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. In: Comp. Biochem.
Physiol. A Mol. Integr. Physiol., 2003, vol. 136, no. 2, p. 343352.
287. Lishko P. V. et al. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. In:
Nature, 2011, vol. 471, no. 7338, p. 387391.
288. Livera G. Et al. Inactivation of the mouse adenylyl cyclase 3 gene disrupts male fertility
and spermatozoon function. In: Mol. Endocrinol, 2005, vol. 19, no. 5, p. 1277-1290.
289. Long J. A. and Kulkarni G. An effective method for improving the fertility of glycerol-
exposed poultry semen. In: Poultry Science, 2004, vol. 83, p. 15941601.
290. Long J. A. Avian semen cryopreservation: what are the biological challenges? In: Poultry
Science, 2006, vol. 85, p. 232236.
291. Lovelock T.E. Denaturation of lipid-protein complexes as a cause of damage by freezing.
In: Proc. Roy. Soc. London B., 1957, vol. 47, no. 3, p. 427-433.
292. Lowry O.H. et al. Protein measurements with the Folin phenol reagent. In: J. Biol. Chem.,
1951, vol. 193, no. 1, p. 265-275.
293. Luyet B. J. and Gehenio P. M. Life and Death at Low Temperatures. In: Biodynamic
Normandy, MO, USA, 1940, p. 341.
294. Luz M. R. et. al. Survival rate and in vitro development of in vivo-produced and
cryopreserved dog embryos. In: Reprod., Fertil. and Develop, 2009, vol. 22, p. 208209.
295. Maddalena Bayer-Giraldi et al. Characterization of an antifreeze protein from the polar
diatom Fragilariopsis cylindrus and its relevance in sea ice. In: Cryobiology, 2011, vol. 63, p.
210-219.
296. Madura J.D., et al. Molecular recognition and binding of thermal hysteresis proteins to ice.
In: J. Mol. Recognition, 2000, vol. 13, no. 2, p. 101-113.
297. Makhafola . . Et al. The effect of breed on the survivability and motility rate of
cryopreserved cock semen. In: South African J. of Animal Sci., 2009, vol. 39, p. 242-245.
298. Malecki I. A. et al. Hypo-osmotic swelling test for measuring integrity of the emu sperm
membrane. In: Avian Poult. Biol. Rev., 2005, vol. 16, p. 175-197.
299. Malo C. et al. Anti-oxidant supplementation improves boar sperm characteristics and
fertility after cryopreservation: Comparison between cysteine and rosemary (Rosmarinus
officinalis). In: Cryobiology, 2010, vol. 61, no. 1, p. 142-147.
300. Marchiani S. et al. Characterization of M540 bodies in human semen: evidence that they
are apoptotic bodies. In: Mol. Hum. Reprod., 2007, vol. 13, no. 9, p. 621-31.
222
301. Marcon L, Boissonneault G. Transient DNA strand breaks during mouse and human
spermiogenesis new insights in stage specificity and link to chromatin remodeling. In: Biol
Reprod, 2004, vol. 70, no. 4, p. 910-918.
302. Marquez B. et al. Contributions of extracellular and intracellular Ca2C to regulation of
sperm motility: release of intracellular stores can hyperactivate CatSper1 and CatSper2 null
sperm. In: Developmental Biology, 2007, vol. 303, p. 214-221.
303. Massip A. et al. Cryobiology and the breeding of domestic animals. In: Life in the Frozen
State; Benson, E.; Fuller, B.; Lane, N. ed. Taylor and Francis Group, London (GBR), 2004,
vol. 12, p. 371392.
304. Mastromonaco GF & King WA. Cloning in companion animal, non- domestic and
endangered species: can the technology become a practical reality? In: Reproduction, Fertility,
and Development, 2007, vol. 19, no. 6, p. 748-761.
305. Matejtschuk P. Lyophilization of Biological Standards. In: CryoLetters, 2005, vol. 26, no.
4, p. 223-230.
306. Mathew Tomlinson. RISK management in cryopreservation associated with assisted
reproduction. In: CryoLetters, 2008, vol. 29, no. 2, p. 165-174.
307. Mazur P., Cole K.W. Influence of cell concentration on the contribution of un frozen
fraction and salt concentration to the survival of slowly frozen human erythrocytes. In:
Cryobiology, 1985, vol. 22, no. 6, p. 509-536.
308. Mazur Peter. A biologist's view of the relevance of thermodynamics and physical
chemistry to cryobiology. In: Thermodyn. Asp. of Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 1, p. 4-10.
309. McCormick RK. Osteoporosis: integrating biomarkers and other diagnostic correlates into
the management of bone fragility. In: Altern. Med. Rev. 2007, vol. 12, no. 2, p. 113-145.
310. McDaniel. An attempt to alleviate heat stress infertility in male broiler breeder chicken
with dietary ascorbic acid. In: Intern. J. of Poult. Sci., 2004, vol. 3, p. 593-602.
311. McDowel L. R. Minerals in Animal and Human Nutrition. In: Academic Press, Inc., San
Diego, 1992, 524 p.
312. Mereuta I. et al. Determination of nitrogen-containing substances in sperm: the metod of
ion exehange liquid chromatography. In: XXV Jubilee World Buiatrices Congress, Budapest,
2008, p. 211-212.
313. Mereu I. et al. Plasma amino acids of semenof bulls. In: A Magyar Buiatricus Tarsasag.
19th International Congressof the Hungarian, Debrecen, 2009, p. 198.
223
314. Mereutsa I. et al. The impact of stress on the temperature range of free amino acides bull
semen. In: The 37 international session of scientific communications of the faculty of animal
science, Bucureti, 2008, p. 196-199.
315. Merker H.J., Gnther T. Testis damage induced by zinc deficiency in rat. In: J. Trace
Element, 1997, vol. 11, no. 1, p. 1922.
316. Meryman H.T. Osmotic stress as a mechanism of freezing of glycerol. In: Cryobiology,
1981, vol. 18, no. 3, p. 221-228.
317. Meyer-Ficca M L. et al. Poly(ADP-ribose) polymerases PARP1 and PARP2 modulate
topoisomerase II beta (TOP2B) function during chromatin condensation in mouse
spermiogenesis. In: Biol Reprod, 2011, vol. 84, p. 900-909
318. Michelangeli F. et al. Aplethoraof interacting organellar Ca2C stores. In: Current Opinion
in Cell Biology, 2005, vol. 17, p. 135-140.
319. Misro M..M. et. al. Use of hydrogen peroxide to assess the sperm susceptibility to
oxidative stress in subjects presenting a normal semen profile. In: International Journal
Andrology, 2004, vol. 27, p. 82-87.
320. Missiaen L. et al. Calcium release from the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum
in HeLa cells stably expressing targeted aequorin to these compartments. In: Cell Calcium,
2004, vol. 36, p. 479-487.
321. Miura T. et al. Comparative studies between in vivo and in vitro spermatogenesis of
Japanese eel (Anguilla japonica). In: Zool Sci., 2002, vol. 19, p. 321329.
322. Miura T. et al. Progestin is an essential factor for the initiation of the meiosis in
spermatogenic cell of the eel. In: Proc Natl Acad Sci USA., 2006, vol. 103, p. 73337338.
323. Moc E. et al. Cryoprotectant and freezing-process alter the ability of chicken sperm to
acrosome react. In: Animal Reproduction Science, 2010, vol. 122, p. 359-366.
324. Morisawa M., Yoshida M. Activation of motility and chemotaxis in the spermatozoa: From
invertebrates to humans. In: Reprod Med Biol., 2005, vol. 4, p. 101114.
325. Morita M. et. al. Regulation of sperm flagellar motility activation and chemotaxis caused
by egg-derived substance(s) in sea cucumber. In: Cell Motil. Cytoskelet, 2009, vol. 66, p. 202-
214.
326. Mustafa N. et al. Effects of antioxidants on post-thawed bovine sperm and oxidative stress
parameters: Antioxidants protect DNA integrity against cryodamage. In: Cryobiology, 2010,
vol. 61, no. 3, p. 248-253.
327. Muthukumar K. et al. Blastocyst cryopreservation: vitrication or slow freeze. In: Fertility
and Sterility, 2008, vol. 90, p. 426-427.
224
328. Narahari D. et al. Sel-plex spares vitamin E in egg yolk of commercial layers, Proceedings
of the 20th. In: Annual Altech Symposium Re-immaging the Feed Industry, Kentucky, USA.,
2004, vol. 11, p. 18.
329. Nathan Tholl. et al. Swimming of Xenopus laevis Sperm Exhibits Multiple Gears and Its
Duration Is Extended by Egg Jelly Constituents. In: Biol. Bull., 2011, vol. 220, no. 3, p. 174-
185.
330. Navarro B. et al. Ion channels that control fertility in mammalian spermatozoa. In:
International Journal of Developmental Biology, 2008, vol. 52, no. 5-6, p. 607-613.
331. Neuman S.L. et al. The effect of dietary carnitine on semen trait of white leghorn roosters.
In: Poultry Science, 2002, vol. 81, no. 4, p. 495-503.
332. Neve J. et al. Selenium supplementation in healthy Belgian adults: response in platelet
glutathione peroxidase activity and other blood indices. In: Am J. Clin Nutr, 1988, vol. 48, no.
1, p. 139-143.
333. Nowaczewski S. and Kontecka, H. Effect of dietary vitamin C supplement on reproductive
performance of aviary pheasants. In: Czech Journal of Animal Science, 2005, vol. 50, no. 5, p.
208-212.
334. Olesen C. et al. Tesmin transcription is regulated differently during male and female
meiosis. In: Mol Reprod Dev., 2004, vol. 67, no. 1, p. 116126.
335. Osetsky .I. Thermodynamic aspects of cluster crystallization in cryoprotective solutions.
In: CryoLetters, 2011, vol. 32, no. 3, p. 216-224.
336. Pappas A.C. et al. Maternal organo-selenium compounds and polyunsaturated fatty acids
affect progeny performance and levels of selenium and docosahexaenoic acid in the chick
tissues. In: Poultry Science, 2006, vol. 85, p. 16101620.
337. Perdichizzi A. et al. Effects of tumour necrosis factor-alpha on human sperm motility and
apoptosis. In: J. Clin Immunol, 2007, vol. 27, no. 2, p. 152-162.
338. Peters S.O. et al. Semen quality traits of seven strain of chickens raised in humid tropics
Int. In: J. Poult. Sci., 2008, vol. 7, no. 10, p. 949-953.
339. Petite J. N. Avian germplasm preservation: embryonic stem cells or primordial germ cell?
In: Poultry Science, 2006, vol. 85, no. 2, p. 237242.
340. Petyim S. et al. The successful pregnancy and birth of a healthy baby after human
blastocyst vitrication using Cryo-E, rst case in Siriraj Hospital. In: Journal of the Medical
Association of Thailand, 2009, vol. 92, no. 8, p. 1116-1121.
341. Pingsheng Tian et. al. Cryosolvent interaction with cellular actin using 3T3-LI cells as a
model system. In: Cryobiology, 2010, vol. 61, no. 3 , p. 2010, 357-359.
225
342. Pizzari T. et. al. Sperm competition dynamics: ejaculate fertilising efnciency changes
differentially with time. In: BMC Evolutionary Biology, 2008, vol. 8, p. 332-338.
343. Polge C. and Parkes A. S. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low
temperatures. In: Nature, 1949, vol. 164, no. 4172, p. 666-668.
344. Portmann M. et. al. Evaluation of blastocyst survival following vitrication/warming using
two different closed carrier systems. In: Human Reproduction, 2010, vol. 25, p. 261.
345. Prasad A. Zinc deficiency. In: British Med. J., 2008, vol. 326, p. 409410.
346. Prieto M. T. et al. Relationship among fluctuating asymmetry, morphological traits, and
sperm quality in layers. In: Poult. Sci., 2011, vol. 90, p. 2845-2854.
347. Publicover S. et al. [Ca2+]i signaling in sperm: making the most of what you've got. In:
Nat Cell Biol, 2007, vol. 9, p. 235-242.
348. Ralf Spindler et. al. Dimethyl sulfoxide and ethylene glycol promote membrane phase
change during cryopreservation. In: CryoLetters, 2011, vol. 32, no. 2, p. 148-157.
349. Ram V. Devireddy. Statistical thermodynamics of biomembranes. In: Cryobiology, 2010,
vol. 60, no. 1, p. 80-90.
350. Ramon Risco et. al. Thermal performance of quartz capillaries for vitrification. In:
Cryobiology, 2007, vol. 55, no. 3, p. 222-229.
351. Rana U. et al. Zinc binding ligands and cellular zinc trafficking: Apo- metallothionein,
glutathione, TPEN, proteomic zinc, and Zn-sp1. In: J. Inorg Biochem., 2008, vol. 102, no. 3, p.
489499.
352. Ranjan Sitaula et al. A study of the effect of sorbitol on osmotic tolerance during partial
desiccation of bovine sperm. In: Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 3, p. 331-336.
353. Richelle C. Prickett et al. Application of the osmotic virial equation in cryobiology. In:
Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 1, p. 30-42.
354. Riffell J. A., et al. The ecological and evolutionary consequences of sperm
chemoattraction. In: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2004, vol. 101, p. 45014506.
355. Rimessi A. et al. The versatility ofmitochondrial calcium signals: from stimulation of cell
metabolism to induction of cell death. In: Biochimica et Biophysica Acta, 2008, vol. 1777, no-
7-8, p. 808-816.
356. Robles V. et al. Vitrication of turbot embryos: preliminary assays. In: Cryobiology, 2003,
vol. 47, no. 1, p. 3039.
357. Rodrigues BA & Rodrigues JL Responses of canine oocytes to in vitro maturation and in
vitro fertilization outcome. In: Theriogenology, 2006, no. 6-7, p. 1667-1672.
226
358. Rotruck I. I. Descovery of the role of selenium in glutathione peroxidase. In: Selen in
biology and medicine. Spallholz I., Martin I., Ganther H. (eds.), 1981, p. 10-15.
359. Santiago-Moreno et al. Use of the hypo-osmotic swelling test and aniline blue staining to
improve the evaluation of seasonal sperm variation in native Spanish free-range poultry. In:
Poultri Sciens, 2009, vol. 88, no. 12, p. 2661-2669.
360. Satish Ingale and Shrivastava. S.K. Amino Acid Profile of Some New Vartieties of Oil
Seeds. In: Advance Journal of Food Science and Technology, 2011, vol. 3, no. 2, p. 111-115.
361. Saragusty J. et al. Do physical forces contribute to cryodamage? In: Biotechnology and
Bioengineering, 2009, vol. 104, no. 4, p.719-728.
362. Sarah Costello, et al. Ca2+-stores in sperm: their identities and functions. In: Society for
Reproduction and Fertility, 2009, vol. 138, p. 425-427.
363. Sarica S. et. al. The effect of dietary L.carnitine supplementation on semen trait,
reproductive parameter and testicular histology of Japanese quail breeders. In: Journal of
Applied Poultry Research, 2007, vol. 16, no. 2, p. 178-186.
364. Schlegel P.N., Paduch D.A. Yet another test of sperm chromatin structure. In: Fertil Steril.,
2005, vol. 84, no. 4, p. 854-859.
365. Schramm G. P., Hubner R. Konservierung Von Gefugelsperma. In: Arch. Tiery., 1989, vol.
32. no. 1, p. 51-61.
366. Seigneurin F. and Blesbois E. The first method of cryopreservation of guinea fowl semen.
In: World Poultry Science Association, 2006, vol. 23, p. 1-2.
367. Seki S & Mazur P. The dominance ofwarming rateover cooling rate in survival of mouse
oocytes subjected to a vitrication procedure. In: Cryobiology, 2009, vol. 59, no. 1, p. 75-82.
368. Sexton T. J. et al. A new poultry semen extender: 2. Effect of the extender components on
the fertilizing capacity of chicken semen stored at 5 C. In: Poult. Sci., 1978, vol. 57, no. 1, p.
277-284.
369. Sexton T. J. et al. A new poultrysemen extender. 4. Effects of antibacterial in the control of
bacterial contamination in chicken semen. In: Poultry Sci., 1980, vol. 59, no. 1, p. 274-281.
370. Shaffner C. S., et al. Viability of spermatozoa of the chicken under various environmental
conditions. In: Poultry Science, 1941, vol. 20, p. 259265.
371. Sharma R.K. and Agarwal A. Role of reactive oxygen species in male infertility. In:
Journal of Urology, 1996, vol. 48, no. 6, p. 835-850.
372. Sherry Y. et al. A re-evaluation of the role of type IV antifreeze protein. In: Cryobiology,
2008, vol. 57, no. 3, p. 292-296.
227
373. Shiba K., et al. Ca2+ bursts occur around a local minimal concentration of attractant and
trigger sperm chemotactic response. In: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2008, vol. 105, no. 49, p.
1931219317.
374. Siegel P.B. et al. Performance of pureline broiler breeders fed two levels of vitamin E. In:
Poultry Science, 2001, vol. 80, no. 9, p. 1258-1262.
375. Sikka, S.C. Relative impact of oxidative stress on male reproductive function. In: Current
Medicinal Chemistry, 2001, vol. 8, no.7, p. 851-862.
376. Simianer, H. and Weigend, S. Konzept fr die Planung von Manahmen zur Erhaltung der
genetischen. In: Genetische Ressourcen. Unpublished report, 2007. 60 p.
377. Simon L. et al. Sperm DNA damage measured by the alkaline Comet assay as an
independent predictor of male infertility and in vitro fertilization success. In: Fertil Steril.,
2011, vol. 95, no. 2, p. 652-657.
378. Siudzinska A. and Lukaszewicz E. Effect of Semen Extenders and Storage Time on Sperm
Morphology of Four Chicken Breeds. In: J. Appl. Poult. Res. Spring, 2008, vol. 17, no. 1, p.
101-108.
379. Smith A.U. Same in vitro studies on rabbit corneal tissue. In: Exp. Eye Res., 1963, vol. 2,
p. 71-87.
380. Soler A. J. et al. Characteristics of Iberian red deer (Cervus elaphus hispanicus)
spermatozoa cryopreserved alter storage at 5C in the epididymis for several days. In:
Theriogenology, 2005, vol. 64, p. 1503-1517.
381. Srensen M.B. et al. Chelation of intracellular zinc ions affects human sperm cell motility.
In: Mol. Human Reprod., 1999, vol. 5, no. 4, p. 338341.
382. Stamboulian S. et al. Biophysical and pharmacological characterization of spermatogenic
T-type calcium current in mice lacking the Ca V 3.1 (1G) calcium channel: Ca V 3.2 (1H) is
the main functional calcim channel in wild-type spermatogenic cellsu. In: Journal of Cellular
Physiology, 2004, vol. 200, p. 116-124.
383. Stoltenberg M., et al. Autometallographic demonstration of zinc ion in rat sperm cell. In:
Mol. Hum Reprod., 1997, vol. 3, no. 9, p. 763767.
384. Stradaioli G. et. al. Zellieffect of L.carnitine administration on the seminal characteristics
of oligoasthenospermic stallions. In: Theriogenology, 2004, vol. 62, p. 761-777.
385. Strnker T. et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in
human sperm. In: Nature, 2011, vol. 471, no. 7338, p. 382386.
228
386. Surai P.F. et al. Selenium distribution in the eggs of ISA Brown commercial layers. In:
Proceedings of the 20th Annual Alltech. Symposium Reimmaging the Feed Industry,
Kentucky, USA, 2004, vol. 11, p. 17.
387. Surai P.F. Mineral and anti-oxidants. In: Redefining Mineral Nutrition. Nottingham
University Press, Nottingham, UK, 2005, p. 147-177.
388. Suzuki H. et al. Successful deliveryof pups from cryopreserved canine embryos. In:
Biology of Reproduction, 2009, vol. 81, p. 619-627.
389. Tabatabaci S. et al.Comparison of semen quality in indigenous and Ross broiler breeder
roosters. In: J. Anim. Vet. Adv., 2009, vol. 8, no. 1, p. 90-93.
390. Tajima A. Production of germ-line chimeras and their application in domestic chicken. In:
Avian and Poultry Biology Review, 2002, vol. 13, p. 1530.
391. Tamburrino Lara et al. Mechanisms and clinical correlates of sperm DNA damage. In:
Asian Journal of Andrology, 2012, vol. 14, no. 1, p. 24-31.
392. Teves M. E., et al. Molecular mechanism for human sperm chemotaxis mediated by
progesterone. In: PLoS One, 2009, vol. 4, no. 2, p. 8211.
393. Tharasanit T, Colenbrander B & Stout TAE Effect of cryopreservation on the cellular
integrity of equine embryos. In: Reproduction, 2005, vol. 129, p. 789798.
394. Thatohatsi Madaniel Bernice Mosenene. Characterization and cryopreservation of semen of
four south african chicken breeds. In: Bloemfontein, 2009, 114 p.
395. Thibier M. Data Retrieval Committee statistics of embryo transfer year 2008. The
worldwide statistics of embryo transfers in farm animals. In: International Embryo Transfer
Society Newsletter, 2009, vol. 27, p. 13-19.
396. Tixier-Bichard M. et al. Biodiversity of domestic birds. In: British Poultry Science, 2001,
vol. 42, p. S2931.
397. Trevino C. L. et al. Expression and differential cell distribution of low-threshold Ca2+
channels in mammalian male germ cells and sperm. In: FEBS Letters, 2004, vol. 563, no. 1-3,
p. 87-92.
398. Truong-Tran A.Q. et al. The role of zinc in caspase activation and apoptotic cell death. In:
Biometals, 2001, vol. 14, no. 3-4, p. 315330.
399. Tsang WH & Chow KL. Mouse embryo cryopreservation utilizing a novel high-capacity
vitrication spatula. In: BioTechniques, 2009, vol. 46, no. 7, p. 550-552.
400. Tselutin K., et al. Comparison of cryoprotectants and methods of cryopreservation of fowl
spermatozoa. In: Poultry Science, 1999, vol. 78, no. 4, p. 586590.
229
401. Tucker K.L. Osteoporosis prevention and nutrition. In: Curr Osteoporos Rep., 2009, vol. 7,
no. 4, p. 111-117.
402. Tuncer P.B. et al. Evaluation of some spermatological characteristics in Gerze cocks. In:
Univ. Vet. Fak. Derg., Ankara, 2008, vol. 55, p. 99-102.
403. Ueda Y. et al. Characterization of the acrosome reaction-inducing substance in Xenopus
(ARISX) secreted from the oviductal pars recta onto the vitelline envelope. In: Dev. Biol.,
2003, vol. 64, p. 289298.
404. Urso M. and Clarkson, P.M. Oxidative stress, exercise, and antioxidant supplementation.
In: Toxicology, 2003, vol. 189, no. 1-2, p. 41-54.
405. Van de Lavoir M. C. et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ
cells. In: Nature, 2006, vol. 441, no. 7094, p. 766769.
406. Vance J.E., Steenbergen R. Metabolism and functions of phosphatidylserine. In: Progress
in Lipid Research., 2005, vol. 44, no. 7, p. 207-234.
407. Vilfan I.D. et al. Formation of native-like mammalian sperm cell chromatin with folded
bull protamine. In: J. Biol Chem., 2004, vol. 279, no. 9, p. 20088-20095.
408. Wang H. et al. The novel, single-transmembrane protein CATSPERG is associated with
mouse CATSPER1 channel protein. In: Bio Reprod., 2009, vol. 81, no. 3, p. 539-544.
409. Watanabe T., et al. Identification of the sperm motility-initiating substance in the newt,
Cynops pyrrhogaster, and its possible relationship with the acrosome reaction during internal
fertilization. In: J. Dev. Biol., 2010, vol. 54, p. 591597.
410. Watson P.F., Holt W.V. Cryobanking the genetic resource. In: Wildlife conservation for
the future?. London, New York, 2001, p. 423.
411. Wishart, G.J. Cryopreservation of avian spermatozoa. In: Methods in Molecular Biology
Humana Press, 1995, vol. 38, p. 167177.
412. Wishart, G.J. Liquid semen storage: current status and where do we go from here?
Proceedings of the 22nd. In: Worlds Poultry Congress, Istanbul, Turkey, 2004, p. 1801.
413. Woelders H., et al. Animal genetic resources conservation in the Netherlands and Europe:
poultry perspective. In: Poultry Science, 2006, vol. 85, no. 2, p. 216222.
414. Wood C. D. Et al. Real-time analysis of the role of Ca2+ in flagellar movement and
motility in single sea urchin sperm. In: J. Cell Biol., 2005, vol. 169, no. 5, p. 725-731.
415. Xia J. & Ren D. Egg coat proteins activate calcium entry into mouse sperm via CATSPER
channels. In: Biology of Reproduction, 2009, vol. 80, no. 6, p. 1092-1098.
416. Yamaguchi S. et al. Zinc is an essential trace element for spermatogenesis. In: Proc. Natl.
Acad. Sci. U S A., 2009, vol. 106, no. 26, p. 10859-10864.
230
417. Yan J. et al. Cryo-survival, fertilization and early embryonic development of vitried
oocytes derived from mice of different reproductive age. In: Journal of Assisted Reproduction
Genetics, 2010, vol. 27, no. 11, p. 605-611.
418. Yaroshenko F.O. et al. Selenium-enriched chicken production in Ukraine, Proceedings of
the 20th. In: Annual Alltech Symposium Re-immaging the Feed Industry, Kentucky, USA,
suppl., 2004, vol. 11, p. 131.
419. Yavin S. & Arav A. Measurement of essential physical properties of vitrication solutions.
In: Theriogenology, 2007, vol. 67, no. 1, p. 81-89.
420. Ying Son et al. The future potential of cryopreservation for assisted reproduction. In:
Cryobiology, 2010, vol. 60, no. 3, p. 60-65.
421. Yoneda A. et al. Effects of delipidation and oxygen concentration on in vitro development
of porcine porcine embryos. In: Journal of Reproduction and Development, 2004, vol. 50, no.
3, p. 287-295.
422. Zaniboni L. et. al. Combined effect of DHA and a-tocopherol enrichment on sperm quality
and fertility in the turkey. In: Theriogenology, 2006, vol. 65, no. 9, p. 1813-1827.
423. Zarelli V.E. et al. PTB1B dephosphorylates NSF elicits SNARE complex disassembly
during human sperm exocytosis. In: J. of Biol. Chemistry, 2009, vol. 284, p. 10491-10503.
424. Zhai W. et. al. The effect of dietary L-carnitine on semen traits of White Leghorns. In:
Poultry Science, 2007, vol. 86, no. 10, p. 2228-2235.











231












ANEXE




Anexa 1.
Brevete de invenie
232



233

234

235



236




237


238
239
240
241














Anexa 2.
Acte de implementare a rezultatelor tiinifico-practice
242
243
244
245














Anexa 3.
Materiale expoziionale
246

247
248

249

250

251


DECLARAIA PRIVIND ASUMAREA RSPUNDERII

Subsemnatul, Balan Ion, declar pe rspundere personal c materialele prezentate n teza de
doctorat sunt rezultatul propriilor cercetri i realizri tiinifice. Contientizez c, n caz contrar,
urmeaz s suport consecinele n conformitate cu legislaia n vigoare.


Balan Ion


Semntura


Data
252
CV-ul AUTORULUI




Numele de familie i prenumele: Balan Ion
Data i locul naterii: 29 septembrie 1964, satul Slobozia, raionul tefan Vod, R. Moldova.
Cetenia: Republica Moldova
STUDII:
1983 1988 - Universitatea Agrar de Stat din Moldova, Facultatea de Medicin Veterinar.
(Specialitatea medicin veterinar).
1988 1991 - Aspirantura, Academia de tiine a Moldovei.
(Specialitatea fiziologia omului i animalelor).
2009 2011 Postdoctornatura, Academia de tiine a Moldovei.
(Specialitatea fiziologia omului i animalelor).

DOMENIILE DE INTERES TIINIFIC:
Fiziologia, sanocreatologia, criobiologia, reproducia animalelor agricole, criochirurgia,
membranologia, citologia.
ACTIVITATEA PROFESIONAL:
1988 1991 - aspirant, Academia de tiine a Moldovei;
1991 1993 - cercettor tiinific, Institutul de Fiziologie al AM;
1993 1999 - cercettor tiinific superior, Institutul de Fiziologie al AM;
1999 2010 - cercettor tiinific superior, Institutul de Fiziologie i Sanocreatologie al AM;
2011 prezent - cercettor tiinific coordonator, Institutul de Fiziologie i Sanocreatologie al
AM;

PARTICIPRI N PROIECTE TIINIFICE NAIONALE I INTERNAIONALE:
2001 2005 - proiectul instituional Evaluarea rolului diferitor factori n geneza spermei
sanogene i patogene n perioada postnatal.
2006 - 2010 proiectul instituional Dezvoltarea bazelor tiinifice ale meninerii sntii
organismului uman prin consolidarea funciilor unor organe i sisteme n limite
sanogene.
2011 - prezent proiectul instituional Elaborarea metodelor fiziologice de fortificare i
meninere a sntii somatice i psihice.

PARTICIPRI LA FORURI TIINIFICE (naionale i internaionale):
2012 - Congresul VII al fiziologilor din Moldova cu participare internaional. Chiinu,
R.Moldova.
2011 - European exhibition of creativity and innovation Euroinvent, Iai, Romnia.
- Salaon international des inventions, Geneve, Switzerland.
253
- Expoziia Internaional Specializat Euroinvent, Chiinu, R.Moldova.
- The belgian and international trade fair for technological innovation Brussels Eureka,
Belgium.
- III ..., -, .
- Simpozionul tiinific cu participare internaional, Maximovca, R.Moldova.
2010 - Congresul al IX-lea Naional cu participare internaional al Geneticienilor i
Amelioratorilor, Chiinu, R.Moldova.
- A Magyar Buiatricus Tarsasag. 20
th
Jubileumi International Congressof the Hungarian,
Eger, Hungary.
- Conferina tiinific, Zootehnie i biotehnologii, Chiinu, R.Moldova.
2009 - Simpozion tiinific intrnaional 35 ani de nvmnt superior medical veterinar din
Republica Moldova, Chiinu, R.Moldova.
- A Magyar Buiatricus Tarsasag. 19
th
International Congressof the Hungarian, Debrecen,
Hungary.
- Conferina internaional Diversitatea, valorificarea raional i protecia lumii
animale, Chiinu, R.Moldova.
2008 - II , -, .
- XXV Jubilee World Buiatrices Congress, Budapest, Hungary.
- The 37 international session of scientific communications of the faculty of animal
science, Bucureti, Romnia.
- Conferina tiinific, Zootehnie i biotehnologii, Chiinu, R.Moldova.
- Conferina tiinific, Medicin veterinar, Chiinu, R.Moldova.

LUCRRI TIINIFICE I TIINIFICO-METODICE PUBLICATE:

Peste 200 de lucrri tiinifice, inclusiv 4 monografii tiinifice, 7 brevete de invenii i un
manual.
PREMII, MENIUNI, DISTINCII, TITLURI ONORIFICE ETC:
1. Silver medal - European exhibition of creativity and innovation Euroinvent, Iai,
2011.
2. Medaille de bronze - Salaon international des inventions, Geneve, 2011.
3. Medalia de bronz - Expoziia Internaional Specializat Euroinvent, Chiinu, 2011.
4. Bronze medal - The belgian and international trade fair for technological innovation
Brussels Eureka, Brussels, 2011.
5. Silver medal - European exhibition of creativity and innovation Euroinvent, Iai,
2012.
APARTENENA LA SOCIETI/ASOCIAII TIINIFICE NAIONALE,
INTERNAIONALE:
1. Membru al societilii fiziologilor din Moldova i rile CSI.
2. Membru al societii geneticienilor i amelioratorilor din Moldova.
3. Membru al societii Internaionale Conservarea resurselor genetice.
4. Member of the Worlds Poultry Science Association (WPSA).
5. Membru al asociaiei medicilor veterinari din Republica Moldova.

CUNOATEREA LIMBILOR :
Romna, rusa fluent; engleza, franceza - cu dicionarul.

DATE DE CONTACT:
MD 2028, Chiinu, str. Academiei, 1, tel. 069124702, tel. serv. 022737138,
e-mail: balanion@rambler.ru