UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

DIN CRAIOVA
ȘCOALA DOCTORALĂ

TEZĂ DE DOCTORAT

CONDUCĂTOR DE DOCTORAT
PROF. UNIV. DR. JOHNY NEAMȚU

STUDENT-DOCTORAND
FLORIAN GEORGE APOSTOLESCU

Craiova
2023
 UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE
DIN CRAIOVA
ȘCOALA DOCTORALĂ

TEZĂ DE DOCTORAT
SUBSTANŢE ANTIOXIDANTE ŞI
ANTIMICROBIENE DIN GENUL STACHYS L.
(LAMIACEAE)

CONDUCĂTOR DE DOCTORAT
PROF. UNIV. DR. JOHNY NEAMȚU

STUDENT-DOCTORAND
FLORIAN GEORGE APOSTOLESCU

Craiova
2023
 Motto sau dedicație

„Nu urma un drum bătătorit, crează-ți propria cale și lasă o potecă în urma ta!”

Ralph Waldo Emerson

 LISTA DE PUBLICAȚII
Articole publicate in extenso ca rezultat al cercetării doctorale

1. Stegăruș DI, Lengyel E, Apostolescu FG, Botoran OR, Tănase C.

Phytochemical analysis and biological activity of three Stachys species
(Lamiaceae) from Romania. Plants. 2021; 10(12):2710; IF: 4.658; ISI
(https://www.mdpi.com/2223-7747/10/12/2710).
2. Apostolescu FG, Biță A, Bejenaru LE, Bejenaru C, Radu A, Mogoşanu
GD, Neamţu J. Preliminary chromatographic investigation of four Stachys
spp.(Lamiaceae) from Oltenia flora. Annals of the University of Craiova-
Agriculture, Montanology, Cadastre Series. 2022; 52(1):13-8; BDI
(https://anale.agro-craiova.ro/index.php/aamc/article/view/1308).
3. Apostolescu FG, Stegăruș DI, Botoran OR, Sandru D, Șuțan NA.
Chemical and antioxidant profile of extracts of Stachys officinalis L.,
Stachys palustris L., Stachys sylvatica L. from Romania. Acta Chimica
Slovenica. 2023; 26:231-9. IF: 1.524; ISI (https://acsi-
journal.eu/index.php/ACSi/article/view/8046).
4. Apostolescu FG, Bejenaru LE, Biţă A, Pisoschi CG, Mogoşanu GD,
Bejenaru C, Neamţu J. Polyphenol content and antioxidant activity of some
Stachys spp. (Lamiaceae) from Romania flora. In press Current Health
Sciences Journal. BDI
 MULȚUMIRI

Prezenta teză reprezintă rezultatul unei cercetări ce s-a desfășurat pe

parcursul perioadei 2019–2023, în cadrul Universității de Farmacie și Medicină
din Craiova, Facultatea de Farmacie. În perioada 2022–2023 studiile au fost
finanțate din proiectul: POCU/993/6/13/153178, “Performanţă în cercetare”
cofinanțat de Fondul Social European în cadrul Programului Operațional
Sectorial Capital Uman 2014–2020.

Sunt profund recunoscător ajutorului primit din partea coordonatorului

meu științific, domnul decan, profesor universitar dr. Johny Neamțu. Gratitudinea
mea se îndreaptă către toată echipa care m-a ajutat și sprijinit în timpul cercetării
și redactării prezentei teze: domnul conferențiar universitar dr. Ludovic-Everard
Bejenaru, domnul conferențiar universitar dr. George-Dan Mogoșanu, domnul
șef lucrări dr. Andrei Biță, doamna profesor universitar dr. Catalina-Gabriela
Pisoschi, doamna conferențiar universitar dr. Cornelia Bejenaru, doamna șef
lucrări dr. Ecaterina Lengyel, cercetător științific dr. Diana Ionela Popescu,
doamna conferențiar universitar dr. Nicoleta Anca Şuţan și domnului secretar
doctorate Geani Popescu.

Un gând pios se îndreaptă și către familie, ce m-a susținut în acest demers.

 SURSE DE FINANȚARE

Studiile au fost finanțate din proiectul:

POCU/993/6/13/153178, “Performanţă în cercetare” cofinanțat de Fondul
Social European în cadrul Programului Operațional Sectorial Capital Uman
2014–2020.
 CUPRINS
1. INTRODUCERE ....................................................................................... 10
2. STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII ................................................ 13
2.1. Descrierea botanică a speciilor de Stachys ......................................... 13
2.2. Compoziția chimică a speciilor de Stachys ........................................ 16
2.3. Acțiunea farmacologică a speciilor de Stachys .................................. 20
2.3.1. Acțiunea antioxidantă .................................................................. 21
2.3.2. Acțiunea antimicrobiană ............................................................. 24
2.3.3. Acțiunea neuroprotectoare .......................................................... 28
2.3.4. Acțiunea antiinflamatoare și tratamentul sindromului ovarului
polichistic .................................................................................................. 29
2.3.5. Acțiunea hepatoprotectoare ......................................................... 32
2.3.6. Acțiunea anti-hiperglicemiantă ................................................... 32
2.3.7. Acțiunea citotoxică și antiproliferativă ....................................... 33
2.3.8. Justificarea utilizării speciilor de Stachys în medicina tradițională
37
3. CONTRIBUȚIA PERSONALĂ ................................................................ 39
3.1. Ipoteza de lucru şi obiectivele generale .............................................. 39
3.2. Metodologia cercetării ........................................................................ 39
3.2.1. Abordarea Temei ......................................................................... 41
3.2.2. Material și Metodă ...................................................................... 42
Probe de Stachys, medii de cultură și tulpini bacteriene ....................... 42
Produse chimice și reactivi .................................................................... 42
Determinarea cantitativă a uleiului volatil din Stachys sp. ................... 43
Extracţie ................................................................................................ 44
Determinarea conținutului total de fenoli.............................................. 44
Determinarea conținutului total de flavonoide ...................................... 45
Determinarea conținutului total de antociani ........................................ 45
Determinarea conținutului total de tanin ............................................... 46
Analiza HPTLC preliminară ................................................................. 46
Test calitativ DPPH in situ .................................................................... 47
 Determinarea acizilor fenolici prin metoda UHPLC/MS ...................... 47
Determinarea acizilor fenolici prin metoda HPLC/DAD ...................... 48
Analiza uleiului volatil prin GC–MS a speciilor S. germanica, S. recta şi
S. sylvatica ............................................................................................ 48
Analiza uleiului volatil prin GC–MS a speciilor S. byzantina, S.
officinalis, S. sylvatica .......................................................................... 50
Determinarea activității antioxidante cu DPPH .................................... 50
Determinarea activității antioxidante cu ABTS .................................... 51
Determinarea potențialului reducător (FRAP) ...................................... 51
Determinarea activității antimicrobiene ................................................ 52
Analize statistice ................................................................................... 53
3.3. Rezultate ............................................................................................. 53
Conținutul fenolic total și activitatea antioxidantă ................................ 53
Determinarea conținutului total de flavonoide ...................................... 54
Determinarea conținutului total de antociani ........................................ 55
Determinarea conținutului total de tanin ............................................... 55
Determinarea potențialului reducător (FRAP) ...................................... 56
Analiza HPTLC preliminară ................................................................. 57
Determinarea acizilor fenolici prin metoda UHPLC/MS ...................... 62
Determinarea acizilor fenolici prin metoda HPLC/DAD ...................... 66
Analiza uleiului volatil prin GC–MS a speciilor S. germanica, S. recta şi
S. sylvatica ............................................................................................ 67
Analiza uleiului volatil prin GC–MS a speciilor S. byzantina, S.
officinalis, S. sylvatica .......................................................................... 71
Activitate antibacteriană ........................................................................ 73
4. DISCUȚII .................................................................................................. 76
5. CONCLUZII .............................................................................................. 83
6. BIBLIOGRAFIE ........................................................................................ 86
7. ANEXE .................................................................................................... 108
 ABREVIERI UTILIZATE ÎN TEXT

5-LOX 5-lipoxigenaza
ABTS 2,2'-azino- bis (acid 3-etilbenzotiazolin-6-sulfonic)
AChE acetilcolinesterază
ATCC American Type Culture Collection
BChE butirilcolinesterază
COV compuși organici volatili
CUPRAC capacitatea antioxidantă de reducere a cuprului
DAD detecție cu sistem de diode
DPPH 2,2-Difenil-1-picrilhidrazil
EI ionizăre electronică
EU extract uscat
FRAP puterea antioxidantă de reducere a fierului
GABA acid gamaaminobutiric
GALAE galantamine echivalent
GC-FID cromatografie de gaze cuplată cu ionizare în flacără
GC-MS cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă
HPLC cromatografie de lichide de înaltă performanță
HPTLC cromatografie pe strat subțire de înaltă performanță
IC50 concentrația inhibitorului necesară pentru a inhiba 50%
dintr-o activitate biologică
MBC concentrația bactericidă minimă
MFC concentrația fungicidă minimă
MIC concentrația minima inhibitorie
NIST National Institute of Standards and Technology
SIR înregistrare selectivă a ionilor
SOP sindromul ovarului polichistic
StG Stachys germanica
StO Stachys officinalis
StR Stachys recta
StS Stachys sylvatica
TFC total conținut flavonoide
TPC total conținut polifenoli
 1. INTRODUCERE

Plantele medicinale au constituit din cele mai vechi timpuri o preocupare

majoră pentru om, calitățile acestora fiind utile în tratarea diferitelor afecțiuni.
Componentele biologic active ale acestora pot fi identificate și cuantificate prin
metode moderne, astfel încât utilizarea lor să cuprindă un spectru cât mai larg în
medicina alternativă. Numeroase plante sunt cunoscute pentru efectele benefice
în tratarea unor boli, dar se descoperă tot mai multe, în prezent existând o revenire
tot mai accentuată la natură și la ceea ce oferă ea. Tehnologii avansate sau clasice
de extracție ale componentelor valoroase conduc la completarea informațiilor din
acest domeniu, rezultatele fiind vizibile atât în zona științifică cât și cea
comercială. Din familia Lamiaceae există un număr mare de genuri și specii
regăsit în fitoterapia tradițională, majoritatea prezentând însușiri curative de
excepție. Genul Stachys este reprezentată de peste 400 de specii acceptate, native
sau aclimatizate, naturale sau ornamentale, importanța și compoziția lor chimică
complexă fiind validată de cercetările tot mai variate care se realizează și de
posibilitatea de valorificare superioară a potențialului lor bioactiv. În țara noastră
au fost identificate în flora spontană 12 specii de Stachys (Stachys alpina L.,
Stachys angustifolia Bieb., Stachys annua L., Stachys atherocalyx C. Koch,
Stachys byzantina C. Koch, Stachys germanica L., Stachys maritima Gouan.,
Stachys obliqua W. et K., Stachys officinalis (L.) Trev., Stachys palustris L.,
Stachys recta L., Stachys sylvatica L.) acestea fiind prezente pe pajiștile umede
sau uscate din depresiuni sau lunci, parte din ele cu sinonime acceptate de
comunitatea științifică (1).
Plantele din familia Lamiaceae se remarcă prin prezența uleiurilor
esențiale, bogate în compuși aromatici, polifenoli, terpene și acizi fenolici (2–8),
cu aplicații atât în medicină, cât și în gastronomie (9,10). Speciile de Stachys au
fost folosite în mod tradițional în scopuri terapeutice dar și în bucătăria multor

10
popoare din zona mediteraneeană ca parte a aportului lor nutrițional (11). Diverse
specii de Stachys se disting printr-o concentrație mare de taninuri, extractele fiind
astringente sau amare dar cu potențial major în tratamentul diferitelor boli biliare,
diaree, gută sau varice, și cu proprietăți antimicrobiene specifice (12,13). Se
remarcă faptul că plantele din genul Stachys pot constitui o sursă bogată de
fitochimice cu aplicații terapeutice și economice. Având în vedere cererea tot mai
mare de produse naturale, multe specii de Stachys pot fi cultivate în vederea
utilizării în medicina tradițională, pe piața alimentară, în industria cosmetică și
din motive ornamentale (14,15). Chiar dacă aceste specii se utilizează pe scară
largă nu există totuși o evaluare specifică pentru cele care cresc în țara noastră,
care să includă toate informațiile într-o bază de date ale genului specific și care
să ateste concret contribuția acestora în medicină.
Din literatura de specialitate internațională s-a constatat că aceste plante
prezintă un potențial valoros de compuși bioactivi, se utilizează pe scară largă în
domeniile de profil, astfel încât se impune și o evaluare actualizată asupra
speciilor existente la noi în țară.
Prezenta teză de doctorat are în vedere caracterizarea fizico-chimică și
microbiologică a șase specii de Stachys (S. byzantina, S. germanica, S. officinalis,
S. palustris, S. sylvatica, S. recta) provenite din flora României, identificarea și
cuantificarea unor compuși biologic activi valoroși și stabilirea acțiunii acestora
asupra diverselor afecțiuni.
Scopul propus în cadrul cercetării științifice se poate materializa prin
abordarea și rezolvarea obiectivelor științifice de mai jos:
-realizarea de extracte și uleiuri esențiale din cele șase specii de Stachys (S.
byzantina, S. germanica, S. officinalis, S. palustris, S. sylvatica, S. recta)
selectate;
-caracterizarea fizico-chimică a celor șase specii de Stachys (S. byzantina,
S. germanica, S. officinalis, S. palustris, S. sylvatica, S. recta) selectate prin

11
identificarea și cuantificarea de compuși polifenolici, compuși aromatici și a
metaboliților secundari;
-stabilirea activității antioxidante și antimicrobiene a celor patru specii
selectate;
-evidențierea de acțiuni biologice cu largă aplicabilitate în practica
farmaceutică, pentru unele specii de Stachys provenite din flora spontană a
României.
În vederea realizării obiectivelor propuse au fost supuse studiului șase
specii de Stachys (S. byzantina, S. germanica, S. officinalis, S. palustris, S.
sylvatica, S. recta) provenite din flora spontană a României. Extractele și uleiurile
esențiale obținute au fost analizate prin metode spectrofotometrice (polifenoli,
activitate antioxidantă), HPLC (compuși fenolici) și GC-MS (compuși aromatici)
în vederea identificării și cuantificării de elemente biologic active. Activitatea
antimicrobiană a fost pusă în evidență prin metoda Kirby-Bauer, și s-a stabilit
concentrația minima inhibitorie (MIC).
Tema abordată în prezenta teză de doctorat a condus la rezultate
semnificative în ceea ce privește calitatea fitochimică, antioxidantă și
antibacteriană a extractelor și uleiurilor esențiale studiate. Polifenolii s-au regăsit
în cuantumuri ce pot fi comparate cu literatura de specialitate, o gamă variată de
compuși fenolici și de aromă a fost pusă în evidență prin metodele moderne
utilizate, iar activitatea antimicrobiană s-a materializat în special asupra
bacteriilor. Extractele s-au remarcat printr-o activitate antioxidantă semnificativă,
lucru care le recomandă în vederea utilizării în scopuri medicale.
Plantele selectate prezintă un potențial biologic activ valoros, în consecință
pot fi recomandate atât în zona medicală cât și cea comercială. Studiile pot fi
extinse și asupra altor specii de Stachys astfel încât să se poate realiza o bază de
date completă pentru zona României.

12
 2. STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII

2.1. Descrierea botanică a speciilor de Stachys

În cadrul tezei de doctorat, am luat în studiu un număr de șase specii din
genul Stachys: S. byzantina C. Koch. (S. lanata Jack. non Cr.), S. germanica L.,
S. officinalis (L.) Trev. (Betonica officinalis L.), S. palustris L., S. recta L., S.
sylvatica L.
Stachys officinalis (numită popular crețișor sau vindecea) este o plantă
erbacee perenă, cu o înălțime cuprinsă între 30–100 cm. Prezintă un rizom scurt,
de la care pleacă rădăcinile adventive. Tulpina aeriană este tetramuchiată, subțire,
erectă, neramificată sau spre vârf cu o pereche de ramuri. Frunzele bazale sunt
lats au alungit lanceolate, dispuse în rozetă, evident reticulat nervate, cu ambele
fețe dispers și alungit păroase. Frunzele bazale sunt mai lungi și mai mari decât
frunzele tulpinale, acestea din urmă fiind scurt pețiolate, iar frunzele florale sunt
sesile. Florile sunt grupate în inflorescențe spiciforme cilindrice fromate din
verticile multiflore dispuse compact. Caliciul este tubulos campanulat, având
partea superioară aproape violet, cu dinții cam de aceeași lungime cu tubul.
Corola este de culoare portocalie și are tubul mai lung decât caliciul. Labiul
superior al corolei este ovat sau alungit, cu marginea cel mai adesea întreagă, iar
labiul inferior este trilobat, lobul median fiind lat, iar lobii laterali alungit ovați.
Înflorește din iunie până în august. Crește frecvent pe pajiști, lângă tufișuri,
margini de pădure, margini de drumuri și livezi, de la câmpie până la altitudini
medii și chiar mai mari, în zona pădurilor de molid (16,17).
Stachys germanica (cunoscută cu denumirea popurală de jaleș) este o
plantă perenă sau bienală, care poate atinge înălțimea de 100 (120) cm. Tulpinile
sunt erecte, ramificate sau simple, alb-lanate. Frunzele au lungimea de 3-10 cm,
fiind groase și rugoase. Pe fața superioară a frunzelor se găsesc peri tectori lungi,
iar fața inferioară este alb lanată. În funcție de poziția frunzelor pe tulpină forma

13
acestora diferă: cele inferioare sunt alungit-ovate, iar cele superioare ovat-
alungite. Florile de culoare roz-violet sau purpuriu deschis sunt dispuse într-o
inflorescență formată din 5-10 verticile care este formată din 15-30 sau chiar 40
de flori. Specia este comună în întreaga țară, fiind prezentă prin tufărișuri, fânețe
și pășuni, pe marginea drumurilor sau prin păduri luminoase (16–18).
Stachys sylvatica (bălbisă) este o specie perenă cu rizom repent. Plantele
ajunge la o înălțime cuprinsă între 30 și 120 cm. Tulpinile sunt simple sau
ramificate, erecte, având partea superioară glandulos păroasă. Frunzele sunt ovat
cordate, lung pețiolate, cu marginea crenat serată și cu lungimea cuprinsă între 4
și 12 cm. Pe ambele fețe sunt prezenți peri tectori lungi. Frunzele din partea
superioară a tulpinii, situate la baza verticilelor florale, sunt de culoare violacee,
au peri glandulari pe suprafața lor și marginea întreagă. Florile sunt dispuse câte
2-6 (8) în verticile mai apropiate către vârful plantei. Caliciul este tubular
campanulat, cu 10 nervuri și culoare violet, cu dinții aproximativ egali și ascuțiți,
cu suprafața glandulos păroasă. Corola este de culoare roșie și are o lungime de
1,5 ori mai mare decât a caliciului. Tubul corolei este glabru la exterior, dar cu
un inel de peri în partea interioară. Labiul superior este ușor boltit și mai scurt
decât cel inferior. Labiul inferior al corolei are lobul median reniform sau lat-
ovat, și cu pete brun purpurii pe față. Staminele sunt puțin exerte, cu conectivul
prelungit într-un vârf scurt. Specie frecventă în întreaga țară, prezentă prin locuri
umbroase, prin păduri și tufărișuri (16–18).
Stachys recta (jaleș de câmp) este o specie cu plante perenă, care pot ajunge
până la 100 cm înălțime. Tulpina este ramificată sau simplă, erectă sau
ascendentă, fiind acoperită cu peri sau glabrescentă. Frunzele au lungimea
cuprinsă între 2-6 cm, putând ajunge chiar și la 8 cm, pe ambele fețe fiind hirsute,
mai rar glabrescente. Frunzele inferioare sunt alungit-eliptice sau lanceolate,
pețiolate și au marginea crenată, iar cele superioare sunt aproape întregi, subsesile
și liniare sau îngust-lanceolate. Frunzele florale din partea inferioară sunt mai
lungi decât verticilele, iar cele situate în partea superioară au formă ovat-
14
lanceolată și lungimea egală cu cea a verticilelor. Florile sunt de culoare galben-
portocalie până la albă-gălbuie, dispuse în verticile distanțate către bază și mai
strânse către vârf. În fiecare verticil se găsesc un număr de 6-12 flori, uneori până
la 18. Caliciul este tubulos campanulat, cu dinții egali sau mai scurți decât tubul.
Corola are tubul de lungimea caliciului, cu labiul superior mai scurt decât cel
inferior. Labiul superior este boltit sau emarginat, iar labiul inferior are lobul
median lat ovat și cu desene brune. Staminele sunt îndoite spre exterior și au lojile
divergente (16–18).
Stachys byzantina (urechea iepurelui) este cultivată ornamental în țara
noastră, fiind uneori și sălbăticită. Originară din zona de sud a Peninsulei
Balcanice, din Crimeea, Caucaz, Asia Mică, plantele sunt cultivate în Europa.
Specie ierboasă perenă cu tulpinile erecte, simple, alb tomentoase, ce pot ajunge
la 80 cm înălțime, este prezentă mai ales ca plantă decorativă. Frunzele, groase
și alb lanate pe ambele fețe, au marginea aproape întreagă sau foarte slab crenată.
Frunzele au formă diferită: cele inferioare sunt spatulate, cu baza îngustată și
pețiol semiaplexicaul, iar cele superioare eliptice și sesile. Florile sunt grupate
într-o inflorescență formată din numeroase verticile (fiecare cu câte 25-30 flori),
cele inferioare distanțate, iar cele superioare foarte apropiate, având aspectul unui
spic compact. Caliciul este tubulos și alb lanat, iar corola este de culoare roz și
are tubul de lungimea caliciului. Labiul superior al corolei este aproximativ egal
cu cel inferior. Staminele sunt numai cu puțin mai lungi decât corola. Înflorește
în perioada iunie-septembrie (16–18).
Stachys palustris (bălbisă) este plantă ierboasă, perenă, cu rizom repent și
îngroșat spre vârf. Tulpinile sunt erecte, simple, cu înălțimea cuprinsă între 30 și
120 cm. Mai ales în partea superioară, tulpinile au peri reflecți, iar pe muchii sunt
prezenți și peri rigizi, patenți. Frunze sunt sesile sau aplexicaule, de formă liniar-
lanceolată până la alungit lanceolată. Baza frunzei este rotujită sau cordată, iar
marginea este fin crenulată. Cele două fețe ale frunzelor prezintă peri, mai deși
pe cea inferioară sau chiar lanat, rareori fiind aproape glabrescente. Frunzele
15
florale sunt asemănătoare cu cele tulpinale, în cazul celor situate în partea
inferioară a tulpinii, sau mai mici, cu marginea întreagă și mai scurte decât
verticilele, în cazul celor situate în partea superioară. Florile sunt grupate în
vericile distanțate către bază și apropiate către vârf. Fiecare verticil grupează un
număr de 6 până la 10, sau chiar 14, flori de culoare liliachie sau purpuriu-
liliachie. Caliciul este hirsut sau des glandulos și de culoare violet, cu dinții
inegali, triunghiulari, divergenți, cu aristă și cel mult de lungimea tubului. Corola
este glandulos păroasă în partea externă. Tubul corolei este de lungimea
caliciului, iar labiul superior este ușor boltit și mai scurt decât cel inferior. Labiul
inferior are desene purpurii închis pe un fond deschis și lobul median reniform.
Staminele, cu filamente păroase, sunt închise în labiul superior. Plantele cresc în
toate regiunile țării prin tufărișuri umede, în jurul lacurilor, prin fânețe umede, pe
marginea pâraielor și a râurilor, prin locuri cultivate (16–18).

2.2. Compoziția chimică a speciilor de Stachys

Genul Stachys cu multiplele specii a constituit o temă de studiu pentru
numeroși cercetători, compoziția chimică demonstrată fiind bogată în polifenoli
(flavonoide, acizi fenolici, stilbeni și lignani), compuși terpenici
(monoterpenoide, diterpenoide, triterpenoide), compuși volatili, vitamine,
polizaharide, steroli (19–23). Profilul chimic și activitatea biologică a extractului
metanolic de Stachys spreitzenhoferi Heldr. (părți aeriene), de exemplu a
evidențiat treizeci și șase de compuși – flavonoide, heterozide feniletanoide,
iridoide, derivați ai acidului chinic, compuși alifatici, heterozide alcoolice și
oligozaharide. Alți compuși importanți au fost identificați în cuantum substanțial
(iridoid-melitozide, compuși flavonoidici precum 4’-O-metilisoscutelarina
mono-acetil-diglicozid/crisoeriolul, mono-acetil-diglicozida, trimetoxiflavone și
tetrametoxiflavone), compuși care contribuie la caracterele antioxidante ale
plantei, la o scădere a radicalilor DPPH, ABTS și H2O2 (20).

16
 Importanța majoră a plantelor utilizate în medicina alternativă constă în
multitudinea de compuși biologic activi și de efectele benefice asupra diverselor
afecțiuni. Polifenolii sunt structurați în patru grupe mari și anume: flavonoide,
acizi fenolici, stilbeni și lignani, acestea regăsindu-se în speciile Stachys în
cuantumuri favorabile.
Polifenolii din diverse părți ale plantelor din genul Stachys au fost puse în
evidență de mulți autori (6,24–34), valorile cele mai semnificative fiind
identificate în flori și frunze, mai puțin în rădăcină sau tulpină.
Printre speciile studiate amintim Stachys ionica, Stachys lanata, Stachys
cretica, Stachys spinosa, Stachys swainsonii, Stachys recta, Stachys
lavandulifolia, Stachys officinalis ș.a. care au prezentat acumulări de polifenoli
variate și în funcție de metodele de extracție sau de tipul de solvent utilizat,
probele provenind din Europa, Asia, China.
Polifenolii din extractele metanolice a nouă specii de Stachys: Stachys
persica, Stachys fruticulosa, Stachys laxa, Stachys inflata, Stachys turcomanica,
Stachys subaphylla, Stachys setifera, Stachys byzantina și Stachys trinervis au
fost cuantificate de Khanavi et al. (25), valorile fiind cuprinse între 3294.96 mg
acid galic/100 g s.u. și 4450.36 mg acid galic/100 g s.u. Namvar et al. (26)
identifică în Stachys turcomanica valori ale polifenolilor cuprinse între 1299.0 ±
1.7 mg acid galic/100 g s.u. și 4197.8 ± 3.5 mg acid galic/100 g s.u. în funcție de
solventul de extracție utilizat.
Mai mult de 60 de flavone au fost identificate în genul Stachys, cu
subgenurile și speciile sale. Astfel apigenolul a fost identificat și cuantificat în
speciile Stachys aegiptiaca (35), Stachys cretica (34), Stachys ionica (36),
Stachys iva (37), Stachys lavandulifolia (38), Stachys ocimastrum (39), Stachys
officinalis (36), Stachys swansoinii (29), Stachys thirkei (40), Stachys tmolea (41)
valorile ajungând până la 92.38 µg/g extract.
Un alt grup de flavone întâlnit frecvent în compoziția chimică a plantelor
din genul Stachys este și luteolul și derivații acestuia (luteol 7-O-glucuronida,
17
luteol 7-O-β-D-glucozida, luteol 6-C-glucozida, luteol-7-O-[6’’’-O-acetil]-
alosil]-(1→2)-β-D-glucozida, 6,8 di-C-β-D-glucopiranozil luteol, 3’,4’-dimetil-
luteol-7-O-β-D-glucozida) care au fost identificate în specii de Stachys precum:
Stachys aegyptiaca, Stachys annua (neglecta), Stachys swainsonii, Stachys
plumose, Stachys alopecuros, Stachys officinalis, Stachys scardica (28,29,35).
crisoeriol ul și compușii săi (crisoeriol 7-O-β-D-glucozida, stachyspinozida,
crisoeriol 7-O-[6’’-O-acetil-alosil]-(1→2)-glucozida, crisoeriol 7-(3’’-E-p-
coumaroil)-β-D-glucopiranozida, crisoeriol 7-(6’’-E-p-cumaroil)-β-D-
glucopiranozida) și compușii glicozidici și piranozidici de hipolaetin au fost
identificați și cuantificați în următoarele specii de Stachys: Stachys aegyptiaca,
Stachys schtschegleevii, Stachys candida, Stachys chrysantha, Stachys iva,
Stachys lanata susp. germanica, Stachys annua, Stachys recta, Stachys spinosa,
Stachys swainsonii, Stachys lavandulifolia (28,29,35,37,38,42–46).
Flavonolii precum cvercetol-3-O-rutinozida, isorhamnetol-3-O-
rutinozida, isorhamnetolul, kaempferolul sunt parte componentă a următoarelor
specii de Stachys: S. cretica, S. tetragona, S. swainsonii, S. palustris, conform
studiilor efectuate de Afouxenidi et al., Kotsos et al., Bahadori et al., Marin et al.
(28,47–49). Studiile de mai sus au menționat existența flavonolilor în speciile de
Stachys în principal la cele din arealul grecesc. Afouxenidi et al. (47) au izolat
kaempferolul din reziduul rezultat în urma extracției cu n-butanol din părțile
aeriene ale speciei S. tetragona, și tot acest flavonol s-a regăsit și în părțile aeriene
specie S. cretica subsp. smyrnaea (34).
Stilbenii fac parte tot din grupa polifenolilor, existența lor în speciile de
Stachys fiind limitată. Khoigani et al. (32) identifică în specia Stachys
lavandulifolia doi stilbeni: pterostilbenul și cis-resveratrol-3-O-glucozida,
compuși care își aduc aportul în conferirea unei activități antioxidante
semnificative extractelor.
O gamă largă de compuși terpenici fac parte din compoziția chimică a
plantelor, aceștia fiind clasificați în funcție de numărul de unități de izopren din
18
moleculă. În speciile de Stachys au fost identificate încă din anii ‘70 o serie de
compuși terpenici, în special monoterpenoide, diterpenoide, triterpenoide. Din
grupa monoterpenoidelor o importanță majoră o reprezintă iridoidele, care apar
în general sub formă glicozidică fiind intermediari în biosinteza alcaloizilor.
Lazarević et al. (50) au studiat mai multe specii de Stachys precum Stachys
germanica, Stachys iva, Stachys plumosa, Stachys scardica din punct de vedere
al compoziției chimice obținând următoarele rezultate: monoterpenoide
oxigenate 0.1%-0.4%, sescviterpenoide oxigenate 0.1%-22.5%, diterpene 2.4%-
40.8%, triterpene 0.2%-2.2%, diferențele fiind motivate prin utilizarea de
solvenți de extracție diferiți și de natura plantei.
Mai multe specii de Stachys au constituit baza unor studii (51–55) privind
existența de compuși volatili valoroși, metodele utilizate fiind de microextracție
în fază solidă (SPME) cuplată cu detector de ionizare cu flacără (GC-FID) și
cromatografie în gaz cu spectrometrie de masă (GC-MS). In speciile Stachys
macrantha, Stachys sylvatica și Stachys annua ssp. annua var. annua au fost
identificate între 33 și 39 de compuși volatili. Principalii constituenți volatili din
cele trei specii de Stachys investigate au fost: α-pinen (11.2%), p-cimen (18.2%)
și carvacrol (28.8%) în S. macrantha, γ-muurolen (10.2%), α-cedrol (11.2%) și
limonen (37.0%) în S. sylvatica și α-pinen (11.4%), β-pinen (23.1%) și (Z)-β-
ocimen (24.8%) în S. annua ssp. annua var. annua. Ca și profil chimic compușii
volatili au fost din segmentul monoterpenoidelor hidrocarbonate,
monoterpenoidelor oxogenate, sescviterpenoidelor hidrocarbonate,
sescviterpenoidelor oxigenate, aldehide, esteri, alcooli superiori. Stachys tmolea
a fost investigată de Demiray et al. (55), rezultatele demonstrând existența
alcanilor (20.1%), a alcoolilor alifatici (26.7%), a alchil-aldehidelor (12.3%), a
fenilpropanelor (11.7%), a acizilor carboxilici (8.7%). Sub 1% au fost decelate
aldehide alifatice, dicetone alifatice, cetone, tetralactone și furani.

19
 2.3. Acțiunea farmacologică a speciilor de Stachys
În general, plantele reprezintă o sursă bine-cunoscută de molecule naturale
bioactive în medicina alternativă și complementară și servesc ca o resursă
excelentă pentru multe medicamente contemporane care sunt produse din resurse
naturale (56). S-a demonstrat că diverse variabile intrinseci și extrinseci au un
impact asupra creșterii și dezvoltării plantelor; în special plantele medicinale sunt
puternic afectate în ceea ce privesc funcțiile biochimice și fiziologice ale
uleiurilor volatile ale acestora (57). Mai mult, în timp ce studiul plantelor a fost
o preocupare încă din cele mai vechi timpuri în domeniul medicinei tradiționale,
interesul pentru acest domeniu devine din ce în ce mai intens datorită
dezvoltărilor avansate ale tehnologiilor potrivite pentru investigarea efectelor lor
terapeutice. Una dintre cele mai importante proprietăți ale plantelor este acțiunea
asupra corpului uman (28,58–61). Aceste aspecte sunt evidențiate în special prin
studiul cuantumurilor și tipurilor de compuși bioactivi pe care îi conțin (32,35,62)
și/sau asupra activității lor biologice (28,43,63). În literatura internațională,
speciile Stachys au fost studiate pe larg prin mai multe investigații fitochimice și
farmacologice, justificându-și utilizările etnofarmacologice. De interes
farmacologic deosebit sunt considerate activitatea citotoxică, antiinflamatoare,
antioxidantă, analgezică, renoprotectoare, anxiolitică, antidepresivă și
antimicrobiană. Gama proprietăților terapeutice atribuite acestor specii a fost
asociată cu conținutul lor fitochimic. Prin urmare, genul Stachys a primit multă
atenție pentru screening-ul metaboliților săi secundari bioactivi din diferite părți
ale plantei. În general, din acest gen au fost izolați peste 200 de compuși,
aparținând următoarelor grupe chimice importante: terpene (de exemplu,
triterpene, diterpene, iridoide), polifenoli (de exemplu, derivați de flavone,
heterozide feniletanoide, lignani), acizi fenolici și uleiuri esențiale. Serbetçi et al.
(59) prezintă un studiu efectuat pe uleiuri extrase din Stachys cretica subspecia
lesbiaca și subspecia trapezuntica identificându-se 63 de compuși cu activitate
farmacologică valoroase prin capacitatea lor de a inhiba creșterea liniilor de
20
celule tumorale umane HL-60 și Ishikawa. Valorile IC50 au fost 100 μg / ml pentru
linia celulară HL-60 și 200 μg / ml pentru linia celulară Ishikawa.

2.3.1. Acțiunea antioxidantă

După cum se observă din compoziția chimică prezentată anterior, aceste
plante au capacitatea de a dezvolta o acțiune antioxidantă puternică. Studii
efectuate asupra diverselor extracte (etanolice, metanolice, apoase sau cu alți
solvenți) și a uleiurilor esențiale de Stachys conduc la stabilirea capacității
antioxidante a acestora. Studii precedente au demonstrat că acest gen este o sursă
excelentă de antioxidanți naturali, care pot avea aplicații diverse în medicină
(64,65).
Gad et al. (65) au investigat trei specii din Uzbekistan (Stachys byzantina,
Stachys hissarica și Stachys betoniciflora) care au prezentat potențial antioxidant
în funcție de testul utilizat. În cazul testelor DPPH, ABTS și FRAP, efectuate pe
uleiuri de Stachys hissarica, acestea au prezentat o activitate de 13.04 ± 0.97 mg
TE/g, 226.48 ± 1.75 și respectiv 109.55 ± 3.24 mg TE/g, urmate de Stachys
betoniciflora cu valori ale ABTS și FRAP de peste 120 mg și respectiv peste 56
mg TE/g. Stachys betoniciflora a prezentat cea mai puternică activitate în
celelalte teste (174.94 ± 0.20 mg TE/g pentru CUPRAC, 60.11 ± 0.36 mg
EDTAE/g pentru chelare și 28.24 ± 1.00 mmol TE/g pentru PBD), urmat de
Stachys hissarica (162.62 ± 1.15 mg TE/g pentru CUPRAC, 24.30 ± 1.50 mg
EDTAE/g ulei pentru chelare și 5.69 ± 0.21 mmol TE/g ulei pentru PBD. S-a
observat că Stachys byzantina a prezentat cea mai scăzută activitate antioxidantă
în toate experimentele aplicate. Ahmadvand et al. (66) a efectuat o serie de
determinări asupra speciei Stachys inflata (frunze) și a stabilit o capacitate
antioxidantă de 4.30 ± 0.17/ 3.63 ± 0.23 mg echivalenți de acid ascorbic/g în
extractele etanolice și metanolice.
Frunzele sunt o sursă ușor accesibilă de antioxidanți naturali, utilizarea lor
fiind recomandată în medicină și alimentație. Unele proprietăți biochimice și
21
antioxidante au reliefat și Bursal et al. (67), Alpay et al. (68) în studiile efectuate
asupra speciei Stachys annua, utilizând extracte metanolice. Capacitatea
antioxidantă a fost determinată de Bursal et al. (67), prin șase metode diferite in
vitro, trei metode antioxidante reducătoare și trei metode antioxidante de
eliminare a radicalilor liberi. Valorile IC50 ale extractelor și standardelor pentru
eliminarea radicalilor DPPH au fost pentru MESA de 7.8 ± 0.2 μg/mL, pentru
WESA de 8.9 μg/mL, pentru Trolox și BHA în jur de 10 μg/mL, 11.0 µg/mL
pentru BHT și 15.4 µg/mL pentru α-tocoferol. Și alte specii de Stachys au intrat
în atenția oamenilor de știință, capacitatea lor antioxidantă fiind bine stabilită.
Amintim aici extractele metanolice și cu acetonă din specia Stachys officinalis L.
care au prezentat valori ale testelor DPPH și ABTS de 714 ± 83 µM /558 ± 33
µM echivalent Trolox/gram extract uscat (69) sau cele de Stachys lavandulifolia
studiate de Tundis et al. (70) și Bingol et al. (71). Au fost evaluate cinci extracte
din această specie (părți aeriene) de către Tundis et al. (70) aplicând teste ABTS,
DPPH, FRAP. Rezultatele au demonstrat o putere antioxidantă cu valori IC50 de
19.9 µg/mL / 22.8 µg/mL (radicalul ABTS) în cazul extractelor etanolice de 70%
și metanolice. Valori ale IC50 de 25.0 µg/mL au rezultat în cazul extractelor
metanolice Soxhlet utilizând metoda DPPH, iar testele de decolorare a β-
carotenului au validat valori ale IC50 de 29.3 µg/mL / 33.0 µg/mL pentru
extractele etanolice și metanolice la o incubare de 30 de minute și de 60.3 µg/mL
/ 34.6 µg/mL, la o incubare de 60 de minute. În schimb, Bingol et al. (71) au
utilizat cinci metode de a studia capacitatea antioxidantă a acestei specii și
anume: ABTS, DPPH, FRAP, CUPRAC și metoda cu tiocianatul de fier.
Rezultatele au condus la concluzia că extractele etanolice prezintă capacități
antioxidante mai ridicate decât cele apoase, iar o concentrație mare de fenoli
conduce la o valorificare a acestui potențial. Prin studiul lor, Ertas et al. (40) pun
în evidență capacitățile antioxidante ale speciei Stachys thirkei, extractele fiind
obținute cu ajutorul a patru solvenți și anume: eter de petrol, acetonă, metanol și
apă. Metodele aplicate (decolorare β-caroten, DPPH, ABTS) au condus la
22
rezultatele cele mai semnificative în cazul extractelor metanolice unde prin
metoda cu β-caroten a rezultat o valoare IC50 de 47.79 µg/mL, iar prin metoda
DPPH, IC50 a prezentat o valoare de 49.31 µg/mL. Grigorakis et al. (72) au studiat
extractele de Stachys mucronata ajungând la concluzia că o concentrație mare de
polifenoli conduce la o activitate antioxidantă puternică. Alte specii studiate au
fost Stachys cretica și Stachys mialhesii. Kirkan (73) a efectuat o serie de teste
pe Stachys cretica, rezultatele obținute variind în funcție de metoda antioxantă
aplicată cât și de modul de extracție utilizat. Laggoune et al. (74)au stabilit o
valoare a IC50 de 0.047 mg/mL în testul DPPH, pe extractele de Stachys mialhesii,
iar Ferhat et al. (62) au studiat activitatea a trei extracte Stachys guyoniana prin
mai multe metode. Prin intermediul acidului β -caroten-linoleic extractele cu
cloroform au prezentat un IC50 = 2.3 µg/mL, iar prin metoda ABTS, IC50 a fost
de 7.29 µg/mL. Extractul de n-butanol a prezentat cea mai bună capacitate
antioxidantă în testul DPPH unde IC50 a fost de 2.91µg/mL. Ebrahimabadi et al.
(75) pun în evidență capacitatea antioxidantă a speciei Stachys inflata, valorile
IC50 obținute prin metoda DPPH fiind de în jur de 90 µg/mL.
Rezultate multiple au fost obținute din evaluarea activității de captare a
radicalilor și din alte specii de Stachys. Extractele metanolice din șapte taxoni
Stachys din Croația au prezentat o activitate considerabilă de captare a radicalilor
DPPH cu valori IC50 cuprinse între 1.96 și 16.10 µg/mL, în timp ce extractele lor
cu diclormetan au fost substanțial mai slabe (76). De asemenea, au fost raportate
activități anti-DPPH ridicate pentru unii taxoni Stachys din Serbia (77) și Stachys
byzantina din Turcia (78). Prin studiul efectuat de Stegăruș et al. (79) s-au
raportat valori ale IC50 de 12.7± 0.01 µg/mL, 11.2 ± 0.01 µg/mL și de 14.5 µg/mL
în cazul a trei specii de Stachys (Stachys bizantina, Stachys officinalis și Stachys
sylvatica) provenite din România, metoda utilizată fiind DPPH.
Napolitano et al. (20) stabilesc în studiul efectuat asupra extractului
metanolic de Stachys spreitzenhoferi o acțiune antioxidantă promițătoare. Astfel
valorile de IC50 / DPPH s-au situat la 0.17 mg/mL, IC50/ H2O2 la 0.125 mg/mL,
23
iar IC50/ ABTS la 0.18 mg/mL. Shakeri et al. (80) pun în evidență calitățile
antioxidante ale speciei Stachys parviflora, unde extractele metanolice indică
pentru DPPH o valoare a IC50 de 76.87 ± 0.57 µg/mL, iar pentru BCB o valoare
a IC50 de 188.47 ± 0.76 µg/mL.
Și alte specii de Stachys au constituit o temă majoră de cercetare. Șen et al.
(81) au studiat extracte ale speciei Stachys subnuda raportând o activitate
antioxidantă față de DPPH și ABTL cu valori ale IC50 de 2.35 µg/mL, respectiv
1.98 µg/mL pentru 4’-O-metilizoscutelarin-7-O-2’’-O-(6-O-acetil-β-D-
alopiranozil)-β-D-glucopiranozida și un IC50 de 13.94 µg/mL, respectiv 12.76
µg/mL pentru isoscutelarin-7-O-2’’-O-(6-O-acetil-p-D-alopiranozil)-p-D-
glucopiranozida. Cei doi compuși au inhibat activitatea 5-lipoxigenazei (5-LOX)
cu valori IC50 de 47.23 µg/mL și, respectiv, de 41.60 µg/mL. Jaradat et al. (82)
realizează un amplu studiu asupra speciei Stachys viticina, uleiul volatil fiind
studiat din punct de vedere al compoziției chimice. Au fost identificate 52 de
componente, dintre care endo-borneolul a fost componenta majoră, urmat de
eucaliptol și epizonarene. Acțiunea antioxidantă s-a situat la o valoare IC50 de
19.95 ± 2.08 µg/mL.
2.3.2. Acțiunea antimicrobiană
Studiile efectuate asupra mai multor specii de Stachys au demonstrat faptul
că aceste plante prezintă o acțiune antibacteriană și antifungică importantă.
Acțiunea antibacteriană
Extractele cu diferiți solvenți, ex. n-butanol din Stachys guyoniana, au
prezentat o acțiune puternică (MIC = 32 ± 0.90 µg/mL/ MIC = 32 ± 0.70 µg/mL)
împotriva bacteriilor Staphylococcus aureus și Enterobacter aerogenes (62), sau
cele din Stachys parviflora, cu acetat de etil, au inhibat tulpinile de Escherichia
coli unde valoarea MIC a fost de 64 ± 0.60 µg/mL. Extractele metanolice de
Stachys parviflora, au prezentat acțiune antibacteriană pe tulpini de Bacillus
cereus, obținându-se valori ale MIC-ului de 0.125 mg/mL (80). Abichandani et
al. (83) au efectuat o serie de studii asupra speciei Stachys schtschegleevii din
24
Iran, o acțiune antibacteriană bună fiind obținută asupra Escherichia coli
rezistentă la ampicilină și Staphylococcus aureus. Extractele metanolice au
prezentat o valoare MIC cuprinsă între 1.56 mg/mL și 6.25 mg/mL, valorile cele
mai semnificative fiind obținute împotriva tulpinilor de Escherichia coli
rezistentă la ampicilină. Alpay et al. (68) au studiat efectul extractelor metanolice
și etanolice ale speciei Stachys annua asupra unor specii bacteriene
intraspitalicești și anume Staphylococcus caprae, Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus pettenkoferi, Staphylococcus captis, Acinetobacter baumanii,
Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Serratia marcescens cu rezultate
pozitive, semnificativ mai ridicate în cazul extractelor etanolice. Zonele de
inhibiție s-au situat la valori cuprinse între 8 mm și 18 mm pentru o concentrație
a extractului etanolic de 75 μL. În schimb, pe aceeași specie, Dulger și Gonuz
(84) au investigat acțiunea antimicrobiană a extractelor asupra unor tulpini de
bacterii de referință: Bacillus cereus ATCC 706, Escherichia coli ATCC 11230,
Klebsiella pneumoniae UC 57, Listeria monocytogenes ATCC 15313,
Mycobacterium smegmatis CCM 2067, Micrococcus luteus CCM 169,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus vulgaris ATCC 8427,
Stapylococcus aureus ATCC 6538P, rezultatele obținute fiind moderate, dar cu
acțiune asupra tuturor tulpinilor monitorizate. Stachys pseudopinardii a constituit
o temă de cercetare pentru Dulger et al. (85), planta prezentând certe proprietăți
antibacteriene în special asupra tulpinilor de Escherichia coli, Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Proteus
vulgaris, Salmonella typhimurium. Extractele de Stachys pseudopinardii au
prezentat o acțiune antibacteriană puternică, în special asupra tulpinii de Bacillus
cereus, unde zona de inhibiție a atins 25.0 mm, cu o concentrație inhibitoare
minimă (MIC) de 16 μg/mL și o concentrație bactericidă minimă (MBC) de 32
μg/mL. Stachys pseudopinardii a prezentat calități antibacteriene certe asupra
unor tulpini ce produc infecții urinare, și anume: Enterococcus feacalis,
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus
25
mirabilis (86). Rezultatele cele mai semnificative au fost obținute pe tulpinile de
Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, unde zona de inhibiție a fost
17mm/18mm. Studii importante au fost realizate și pe alte specii de Stachys care
au condus la evaluarea diametrelor de inhibiție și la stabilirea valorilor MIC,
precum Stachys thirkei, Stachys bizantina, Stachys officinalis, Stachys sylvatica
(40,87,88). Napolitano et al. (88) stabilesc în studiul efectuat asupra extractului
metanolic de Stachys spreitzenhoferi o acțiune antimicrobiană asupra tulpinilor
patogene Gram-pozitive și Gram-negative. Extractul nu a prezentat acțiune
asupra bacteriilor Gram-negative testate, dar a avut o bună acțiune
antimicrobiană dependentă de doză față de tulpini Gram-pozitive,
Staphylococcus aureus (unde MIC-ul a fost de 1.0 mg/mL) și Listeria
monocytogenes (unde MIC-ul a fost de 1.0 mg/mL). Jaradat et al. (82)
monitorizează acțiunea antibacteriană a speciei Stachys viticina cu rezultate
semnificative în special asupra tulpinilor de Staphylococcus aureus rezistent la
meticilină (MRSA), Escherichia coli și Epidermophyton floccosum, cu valori
MIC de 0.039 mg/mL, 0.078 mg/mL și respectiv, 0.78 mg/mL.
Acțiunea antifungică
Cele mai multe studii care s-au efectuat asupra extractelor obținute din
plantele speciilor de Stachys s-au axat pe tulpinile întâlnite frecvent în patologia
umană, în special pe cele din genul Candida. Extracte etanolice sau metanolice
au fost utilizate pentru a monitoriza acțiunea antifungică a speciei Stachys annua
asupra unor tulpini de drojdii (Candida albicans, Candida guilliermondii,
Candida glabrata Candida tropicalis) de către Alpay et al. (68), acțiunea lor
inhibitorie fiind cuprinsă între 9–11 mm. Asupra speciei Stachys annua s-au
efectuat studii și de către Cüce et al. în 2017 (89) pe Candida albicans și Candida
parapsilosis. Valorile MIC determinate au condus la concluzia că toate extractele
prezintă o acțiune antifungică eficientă. Dulger et al. (84) a folosit extracte de
Stachys annua pe Rhodotorula rubra, Candida albicans și Kluyveromyces
fragilis cu rezultate modice. Aceiași autori (85) au monitorizat acțiunea speciei
26
Stachys pseudopinardii asupra următoarelor tulpini fungice: Candida albicans,
Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces fragilis și Rhodotorula rubra. Cele mai
eficiente rezultate au fost identificate în cazul tulpinii de Debaryomyces hansenii
cu o zonă de inhibare de 17.0 mm, concentrație minimă inhibitorie MIC de 32
μg/mL și concentrație minimă fungicidă (MFC) de 32 μg/ml. Stachys
pseudopinardii a prezentat o acțiune antifungică bună față de tulpina Candida
albicans izolată din tractul urinar, valorile determinate de Dulger et al. (86)
ajungând la 64.0 μg/mL pentru MIC și la 128.0 μg/mL pentru MFC. O altă specie
studiată a fost Stachys citrina (90) care a demonstrat capacități antifungice
substanțiale, în special asupra tulpinilor de Candida albicans, Candida utilis,
Candida tropicalis, Candida krusei Candida parapsilosis și Candida glabrata,
valorile MIC fiind cuprinse între 0.625mg/mL și 0.078 mg/mL. Stachys
germanica, Stachys iva, Stachys plumose, Stachys scardica, au prezentat acțiune
antifungică asupra unor tulpini de Aspergillus niger și Candida albicans (50),
diametrele de inhibiție fiind cuprinse între 23 mm și 28 mm. Acțiune antifungică
puternică a fost identificată și în cazul extractelor din Stachys parviflora de către
Shakeri et al.. (80) unde MFC-ul a fost stabilit pentru specia fungică Candida
albicans la 0.28 μg/ml.
Cele mai bune acțiuni antimicrobiene ale uleiului extras din Stachys
officinalis au fost obținute împotriva mucegaiului Aspergillus niger (MIC de 2.5
mg/mL) și fungicide minime (MFC de 5.0 mg/mL) și a drojdiei Candida albicans
(MIC de 5.9 mg/mL și MFC de 5.0 mg/ml) de către (63).
Stachys germanica, Stachys iva, Stachys plumose și Stachys scardica au
fost investigate sub aspectul acțiunilor lor antifungice de către Ristic et al. (91),
valorile determinate asupra tulpinilor de Aspergillus niger și Candida albicans
fiind exprimate în mm diametru de inhibiție, acestea fiind cuprinse între 18–21
mm și respectiv 16–22 mm. Aspergillus niger și Candida albicans au constituit
tulpinile investigate de Saedi et al.. (92), din punct de vedere al răspunsului față
de acțiunea unor extracte de Stachys, și anume Stachys bizantina, Stachys inflata,
27
Stachys lavandulifolia, Stachys laxa, rezultatele obținute fiind nule. Opt specii de
Stachys provenite din Grecia (Stachys alopecuros, Stachys scardica, Stachys
cretica, Stachys germanica, Stachys recta, Stachys spinulosa, Stachys euboica și
Stachys menthifolia) au fost investigate din punct de vedere al activității lor
antifungice. Tulpinile luate în lucru au fost Aspergillus niger (ATCC 6275),
Penicillium ochrochloron (ATCC 9112), Trichophyton mentagrophytes,
Epidermophyton floccosum și Candida albicans, rezultatele obținute fiind mai
puțin semnificative în comparație cu cele obținute asupra unor tulpini bacteriene.
Uleiul volatil obținut din specia Stachys scardica a prezentat cele mai
recomandate rezultate antifungice (13).
2.3.3. Acțiunea neuroprotectoare
Atât extractele cât și uleiurile extrase din diferite specii de Stachys au
prezentat calități în ceea ce privește potențialul neuroprotector, fiind utile în
tratarea bolii Alzheimer. Bahadori et al.. (93)stabilesc în studiul lor că uleiul
volatil al speciei Stachys inflata poate să inhibe enzimele colinesteraze
cuantificând valori de până la 7.8 mg echivalent galantamină/g. Gad et al. (65)
constată acțiunea inhibitorie a uleiului volatil din Stachys byzantina asupra
enzimelor neurodistructive, valorile determinate ajungând la 5.64 ± 0.04 mg
galantamine echivalent (GALAE)/g ulei. Bahadori et al.. (34) evaluează Stachys
cretica subsp. smyrnaea și Stachys cretica subsp. Mersinaea, obținând valori de
inhibare a AChE exprimată în (µg GALAE/g dp) de 343.78 ± 10.79, respectiv de
2.03 ± 0.15 mg GALAEs/g extract. Tundis et al. (70) stabilesc că extractele de
Stachys lavandulifolia au capacitatea de a inhiba enzimele responsabile de acestă
boală, procentele de inhibare fiind cuprinse între 23% și 50% în funcție de
solventul de extracție utilizat. Sarikurkcu et al. (94) demonstrează în studiul lor
asupra tulpinilor de Stachys byzantina și Stachys iberica subsp. iberica var.
densipilosa calitățile anti-Alzheimer ale extractelor cu acetat de etil obținând
rezultate valoroase precum: inhibarea AChE în jur de 2 mg GALAE/g extract și
inhibarea BChE în jur de 4 mg GALAEs/g extract. Stachys sieboldii, Stachys
28
guyoniana și Stachys thirkei au constituit subiectul de studiu a lui Harada et al.
(95), Ferhat et al. (62) și Ertas et al. (40), extractele acestor plante demonstrând
potențialul lor neuroprotector și îmbunătățind memoria celor afectați de leziuni
cerebrale, o bună activitate împotriva AChE și BChE cu un procent de inhibare
de peste 50%.
2.3.4. Acțiunea antiinflamatoare și tratamentul sindromului ovarului
polichistic
Una din problemele cu care se confruntă femeile este sindromul ovarului
polichistic (SOP) care este o afecțiune medicală frecventă, caracterizată atât prin
tulburări metabolice, cât și de reproducere. Există în prezent tratamente
farmaceutice pentru SOP, dar cu nelipsitele efectele secundare, mai ales pe
termen lung. Eficacitatea lor poate fi amplificată cu ajutorul tratamentelor
complementare și alternative, cu ajutorul plantelor medicinale, care au fost
folosite de mult timp în rezolvarea problemelor ginecologice și de infertilitate ale
bolnavilor de SOP. Literatura de specialitate prezintă efectele benefice ale multor
plante în patologia SOP, printre acestea fiind studiate și cele ale genului Stachys.
Jalilian et al. (96) fac un studiu pe un segment de 66 de femei cu vârste cuprinse
între 15 și 45 de ani privind eficiența părților aeriene ale speciei Stachys
lavandulifolia în comparație cu acetatul de medroxiprogesteron (MPA) în
gestionarea sângerării uterine anormale (AUB) din cauza SOP. Participanții au
fost repartizați aleatoriu cu doze de 10 mg BD MPA ciclic timp de trei cicluri, fie
de 5 g ABW TDS timp de trei luni. Rata de prevalență ajustată în funcție de vârstă
a diferitelor modele de AUB, a scăzut de la 2.7 la 1.1 pentru pacienții care iau
MPA și de la 2.5 la 0.7. Scăderea ratei de prevalență a fost similară în cele două
ramuri ale studiului. Efectele adverse au fost observate mai rar (24.2%) în rândul
participanților la MPA decât în rândul celor la AWB (45.5%). Cota ajustată pe
mai multe variabile pentru dezvoltarea reacției adverse a MPA a fost de 0.40.
ajungând la concluzia, că AWB poate fi utilizat ca alternativă pentru MPA în
tratamentul AUB cauzată de SOP.
29
 Pahlevani et al. (97) realizează un studiu privind acțiunea extractelor
alcoolice de Stachys lavandulifolia în sindromul policistic ovarian.
Experimentele s-au efectuat pe un lot de 36 de exemplare (femele) de cobai
Sprague-Dawley. SOP a fost indus printr-o singură injecție intramusculară de 4
mg valerat de estradiol. Cobaii au fost împărțiți în șase grupuri; grupul de control
fără tratament, grupul SOP primind solvent, trei grupuri SOP tratate cu doze
multiple (225, 450, 900 mg/kg) de extract de Stachys lvandulifolia și grupul SOP
care primește citrat de clomifen (1.5 mg/kg). Extractele au fost injectate
intraperitoneal pentru o perioadă de 4 cicluri (16 zile). Biopsiile endometriale au
fost colorate cu hematoxilină-eozină și apoi au fost examinate numărul de glande,
înălțimea celulelor glandulare endometriale, diametrul intern al glandelor,
înălțimea celulelor epiteliale și înălțimea endometrului și modificările patologice.
Rezultatele au arătat că înălțimea epiteliului de suprafață și a epiteliului glandular
a crescut, iar grosimea endometrului și diametrul intern al glandelor au scăzut
nesemnificativ în grupul cu SOP în comparație cu martorul, în timp ce numărul
de glande a prezentat o scădere semnificativă. În plus, 40% dintre cobaii din
grupul SOP au prezentat hiperplazie endometrială. Tratamentul cu citrat de
clomifen și diferite concentrații de Stachys lavandulifolia au determinat înălțimea
epiteliului glandular, diametrul intern al glandelor, înălțimea epiteliului de
suprafață și a endometrului și numărul de glande să devină mai asemănătoare cu
grupul martor. Tratamentul cu citrat de clomifen și concentrații de 900 mg/kg de
Stachys lavandulifolia a redus hiperplazia la 35% și, respectiv, 33.3% dintre
cobai. Kolivand et al. (98) și Moini Jazani et al. (99) publică un review care
abordează o serie de practici utilizate în soluționarea și managementul
sindromului polichistic ovarian. Lucrările subliniază efectul benefic și
antiinflamator al ceaiurilor din Stachys lavandulifolia, pe lângă alte plante,
rezultatele fiind materializate prin corectarea anomaliilor clinice ale raportului
LH/FSH. Totodată, autorii realizează o revizie interesantă în privința utilității
tratamentelor pe bază de plante și rezolvarea problemelor ginecologice și de
30
infertilitate ale bolnavilor de SOP. Studii recente abordează această temă,
Alizadeh et al. (100) evaluând extractul hidroalcoolic al speciei Stachys sylvatica
pe cobai, pentru SOP. S-a observat că extractul în doza de 500 mg/kg a crescut
gonadotropinele FSH la 5.95 ± 0.02 mUI/mL și LH la 6.48 ± 0.09 mUI/mL) și au
redus nivelul de estrogen la 0.9 ± 0.07 mUI/mL) comparativ cu grupul SOP ceea
ce face ca raportul LH/FSH să fie aproape de 1:1 (6.48/5.59). Conform literaturii
de specialitate, acest raport LH/FSH este de aproape 1:1 în cazuri normale, în
timp ce în cazul femeilor cu sindromul ovarului polichistic este mai mare, de
exemplu, 2:1 sau 3:1. Aceste rezultate ar putea fi corelate cu conținutul de
flavonoide ale plantei. Studiile anterioare au arătat că flavonoidele ar putea
scădea nivelul de estrogen și ar putea acționa pe receptorii GABA, reglând
gonadotropinele. Femeile cu sindromul ovarului polichistic prezintă în general o
serie de inflamații astfel că s-a ajuns la concluzia că flavonoidele și iridoizii din
extractele de Stachys sylvatica au demonstrat proprietăți antioxidante și
antiinflamatorii. Tot calități antiinflamatoare prezintă și o altă specie de Stachys
(Stachys schtschegleevii SSC), care se axează pe calitățile acestei plante în
patologia artritei reumatoide la femei. Prin acest studiu se urmărește investigarea
efectelor ceaiului SSC asupra scorului de activitate a bolii (DAS), biomarkerilor
inflamatorii serici și metaloproteinazelor matriceale (MMP-1 și MMP-3) în
rândul femeilor cu artrită reumatoidă (AR). Intervenția SSC a arătat o eficacitate
clinică adecvată pentru pacienții de sex feminin cu RA, însoțind reduceri
remarcabile ale numărului de articulații sensibile și umflate, DAS28 și nivelurile
serice de MMP-3. Intervenția SSC a determinat reduceri semnificative ale
numărului și procentelor de modificări ale articulațiilor sensibile. Spre deosebire
de intervenția din grupul SSC care a arătat reduceri semnificative ale nivelurilor
serice medii ale hs-CRP, IL-1β și MMP-3, SSC a cauzat reduceri semnificative
ale MMP-3. Acest lucru poate oferi informații suplimentare pentru studiile
intervenționale care controlează rezultatele patologice și inflamatorii legate de
RA.
31
 2.3.5. Acțiunea hepatoprotectoare
Una din speciile de Stachys (Stachys pilifera) a fost studiată din punct de
vedere al calităților hepatoprotectoare de Kokhdan et al. (101), ulterior de
Mansourian et al. (102). Proprietatea hepatoprotectoare a extractului etanolic de
Stachys pilifera a fost studiată și validată în tetraclorura de carbon (CCl4),
inducându-se hepatotoxicitate la cobai. Rezultatele au indicat faptul că această
proprietate ar putea fi legată de compoziția chimică și activitatea antioxidantă a
speciei. Mansourian et al.. (102) au studiat activitatea hepatoprotectoare și
antioxidantă a extractului hidroalcoolic de Stachys pilifera asupra
hepatotoxicității induse de acetaminofen (APAP) tot pe cobai. Rezultatele au
demonstrat că extractul a redus hepatotoxicitatea prin scăderea
markerilor/enzimelor funcției hepatice, aspartat aminotransferaza (AST) și
alanina aminotransferaza (ALT) și proteina carbonil (PCO) comparativ cu grupul
APAP. De asemenea, a diminuat stresul oxidativ prin inhibarea proteinei
oxidative și inducerea activității enzimei glutation peroxidază (GPX).
2.3.6. Acțiunea anti-hiperglicemiantă
Diabetul este în prezent una din bolile care afectează un procent ridicat al
populației, cauzele fiind multiple. Cercetătorii caută noi modalități de a
contracara acestă boală prin explorarea efectelor benefice ale extractelor din
diverse plante, numeroase studii axându-se pe specii din familia Lamiaceae.
Bahadori et al. (34) au evaluat acțiunea anti-hiperglicemiantă a extractelor de
Stachys cretica subsp. smyrnaea demonstrând că extractele metanolice inhibă α-
amilaza și α-glucozidaza, rezultând valori de 61.4 mg ACE/g s.u., respectiv de
47.8 mg ACE/g s.u., datorate compoziției chimice, în special în valorile ridicate
de compuși fenolici. Sarikurkcu et al.. (94) stabilesc o acțiune inhibitorie asupra
α-amilazei de 0.31 ± 0.01 mmol ACE/g extract și asupra α-glucozidazei de 1.95
± 0.20 mmol ACE/g extract prin studiul efectuat asupra extractelor obținute din
specia Stachys bizantina, iar Bahadori et al. (34) raportează valori de inhibare a
α-amilazei de 396.50 mg ACE/g, și a α-glucozidazei de 734 mg ACE/g ale
32
extractelor de Stachys cretica subsp. mersinaea. Calitățile anti-diabetice ale
speciilor de Stachys iberica var. densipilosa, Stachys iva, Stachys cretica subsp.
vacillans au constituit temă de cercetare și pentru Sarikurkcu et al. (94), Pritsas
et al. (37), Kirkan et al. (73) care au stabilit valori semnificative de inhibare a
extractelor asupra α-amilazei de 0.34 ± 0.02 mmol ACE/g extract, asupra α-
glucozidazei de 6.17 ± 0.51 mmol ACE/g extract, respectiv asupra α-amilazei de
433.99 ± 5.10 mg ACE/g extract. Bahadori et al. (93) realizează un studiu
comparativ complex prin care trei specii de Stachys sunt analizate și anume:
Stachys inflata, Stachys lavandulifolia și Stachys byzantina din mai multe puncte
de vedere. Toate speciile au prezentat un efect anti-hiperglicemiant puternic
asupra α-glucozidazei, valorile fiind cuprinse între 4.47 mmol ACE/g ulei și 4.62
mmol ACE/g ulei. Gad et al. (65) pun în valoare prin studiul lor calitățile anti-
diabetice a trei specii de Stachys, și anume: Stachys byzantina, Stachys hissarica
și Stachys betoniciflora. Acțiunea de inhibare asupra α-amilazei a prezentat
următoarele valori: 0.59± 0.01 mmol ACAE/g ulei, 0.68 ± 0.02 mmol ACAE/g
ulei, 0.76 ± 0.02 mmol ACAE/g ulei, iar cea asupra α-glucozidazei respectiv
valori de 24.11 ± 0.06 mmol ACAE/g ulei, 24.56 ± 0.10 mmol ACAE/g ulei,
24.89 ± 0.03 mmol ACAE/g ulei.
2.3.7. Acțiunea citotoxică și antiproliferativă
Flavonoidele sunt cunoscute în lumea științifică prin proprietățile lor
citotoxice, astfel încât extractele de Stachys, bogate în astfel de compuși,
constituie o bază de plecare în studiile medicale. Activitatea citotoxică a
extractelor și flavonoidelor izolate din părțile aeriene ale speciei Stachys
lavandulifolia au fost studiate de Delnavazi et al. (38) folosind testul MTT.
Extractul de Stachys lavandulifolia cu diclormetan a prezentat cea mai mare
activitate citotoxică la creveții de saramură prin testul de letalitate (BSLT)
(LD50 = 121.8 ± 5.6 g/mL), în timp ce ca martor pozitiv a fost folosită
podofilotoxina (LD50 = 3.1 ± 0.6 g/mL). Ulterior, au explorat acțiunea citotoxică
a flavonoidelor izolate în trei linii de celule canceroase (MDA-MB-231, HT-29
33
și MRC-5), folosind ca și compus de referință tamoxifenul. Toate cele nouă
flavonoidele izolate au moderat citotoxicitatea activată pe liniile celulare
studiate. În acest studiu s-a constat că crisosplenetina a fost compusul cel mai
activ în primele două linii celulare. În linia celulară MRC-5, apigenina a prezentat
cea mai mare activitate. Este remarcabil de subliniat că specificul studiului a
menționat și acțiunea selectivă împotriva celulelor canceroase, de către
crisosplenetina, kumatakenina și viscozina, care au prezentat o toxicitate
selectivă mai mare față de linia de celule MDA-MB-231 versus tamoxifen. Se
poate afirma că acțiunea citotoxică intensă a acestor compuși este atribuită
substituțiilor lor cu grupări (poli)-metilate care măresc acest efect. Evaluarea
citotoxicității in vitro împotriva a trei linii celulare, și anume carcinomul ovarian
uman (A2780), carcinomul de colon uman (HCT) și linia celulară de melanom
de șoarece (B16F10), a arătat o acțiune anti-proliferativă a uleiului volatil obținut
din Stachys parviflora IC50 variind de la valoarea 30.95 μg/ml până la 16.55
μg/ml. Rezultatele acestui studiu au demonstrat o citotoxicitate promițătoare
(80). Extractul de Stachys spreitzenhoferi a determinat o scădere a ROS (la
concentrația de 200 μg/mL) și o creștere a activității enzimelor antioxidante SOD,
CAT și GPX în PMN-urile stimulate de OZ. Mai mult, a prezentat acțiune
antiproliferativă împotriva leucemiei mieloide acute (celula U937), proCOVând
50% din moartea celulelor la 0.75 mg/mL (Napolitano et al. 2022) (88). Acțiune
citotoxică împotriva celulelor canceroase HeLa (adenocarcinom cervical) și
Colo-205 (colon), linii cu procente de inhibiție de 95% și 90%, pentru
concentrații de EO de 1.25 și 0.5 mg/mL, prezintă și uleiul volatil de Stachys
viticina (82).
Extractul metanolic al speciei Stachys ehrenbergii, recoltate din Liban, a
fost supus cercetării de către Abi-Rizk et al. (103) pentru proprietățile sale
antioxidante și acțiunea citotoxică. Citotoxicitatea a fost examinată prin test MTT
în cazul în care extractul de metanol a prezentat cea mai mare citotoxicitate
(IC50= 420± 104 g/mL) la o concentrație de 3000 mg/mL. Un alt studiu (101) a
34
evaluat extracte metanolice ale speciei Stachys pilifera, alcaloizi și fracțiuni
terpenoide și activitatea lor citotoxică și antiproliferativă in vitro (linia celulară
HT-29). S-a constatat că fracția terpenoidă are cea mai bună activitate citotoxică
în comparație cu celelalte fracții, ca și compus de referinţă fiind folosită
cisplatina. Mai mult, au investigat activitatea antiproliferativă, studiind efectele
asupra activității caspase-8 și caspase-9, factorul nuclear-B (NF-kB) și oxid nitric
(NO), raportând că extractul/fracțiile au crescut activitatea caspasei-8/-9 și a
scăzut NF-kB și ulterior nivelul de NO. Rezultatele obținute au fost comparate
cu date anterioare privind activitatea citotoxică in vitro a altor specii de Stachys,
cum ar fi Stachys acerosa, Stachys benthamiana, Stachys floridana, Stachys
lavandulifolia, Stachys obtusicrena, Stachys persica, Stachys pubescens și
Stachis spectabilis (104–106). Mohamed et al. (107) au izolat trei compuși din
extractele părților aeriene de Stachys aegyptiaca care au fost investigate pentru
acțiunea citotoxică în linia celulară HepG2, folosind testul MTT cu valori
rezultate LD50 ale stachaegyptin D de 94.7 µM, stachysolon monoacetat de 63.4
µM și stachysolon diacetat de 59.5 µM. s-a constatat că diacetatul de stachizolon
a fost cel mai activ. Activitatea genotoxică a extractelor din patru plante diferite
(Gratiola officinalis, Vincetoxicum hirundinaria, Betonica officinalis,
Vincetoxicum luteum) a fost investigată de Slapšyte et al. (108) care au raportat
că toate extractele de plante au indus deteriorarea ADN-ului, folosind testul
cometei, în timp ce extractul de Stachys officinalis a indus creșterea valorii
schimbului de cromatide. Nasrollahi et al. (109) au evaluat activitatea anti-
cancerigenă și gradul de letalitate a extractelor de Stachys schtschegleevii pe
creveții de saramură unde IC50 a fost cuprins între 100 μg/mL și 700 μg/mL
ajungând la concluzia că o activitate antioxidantă puternică conduce la rezultate
favorabile. Efectele citotoxice ale speciilor de Stachys (Stachys koelzii, Stachys
obtusicrena, Stachys betoniciflora) au fost investigate și de Ramak et al. (110),
Amirghofran et al. (111), Mamadalieva et al. (112), Uritu și colab (113), cu
rezultate semnificative.
35
 Mladenova et al. (114)au investigat activitatea citotoxică a speciei Betonica
bulgarica, rezultatele cercetării demonstrând că extractul are un potențial
inhibitor semnificativ împotriva celulelor HeLa (valoarea medie IC50 119.2
μg/mL). Proba a indus selectiv moartea apoptotică în celulele tumorale. Efectele
citotoxice asupra liniilor celulare de șoarece au fost detectate în urma
tratamentului cu concentrații mari de extract de Betonica bulgarica (200 și 250
μg/mL). Incubarea ex vivo timp de douăzeci și patru de ore a leucocitelor din
sângele periferic în mediu de creștere care conține extract de plantă a indus efecte
semnificative în populații distincte de celule imune. Acestea au inclus niveluri
crescute de limfocite ale celulelor T CD25+ și CD56+, în special celulele
CD4+CD25+ și CD8+CD56+.
Na et al. publică în anul 2020 (115) un studiu care drept obiectiv
investigarea efectului antiproliferativ al extractelor de Stachys sieboldii MIQ. pe
linii de celule canceroase. Toate extractele și fracțiile din Stachys sieboldii MIQ.
au condus la scăderea numărului de celule AGS, iar efectul a fost dependent de
concentrație. Toate fracțiile au inhibat proliferarea liniilor de celule canceroase
HT-29 (p < 0.05), prezentând o inhibare >50% la o concentrație de 0.25 mg/mL,
inclusiv au inhibat creșterea celulelor canceroase HT-1080 cu 60% la o
concentrație de 0.25 mg/mL.
Kokhdan et al. (101)au studiat efectele citotoxice și mecanismele de moarte
celulară ale extractului metanolic de Stachys pilifera și fracțiile sale alcaloide și
terpenoide pe linia celulară colorectală HT-29. Celulele HT-29 au fost cultivate
și apoi incubate în extractul metanolic de Stachys pilifera și fracțiile sale la
diferite concentrații timp de o zi. Viabilitatea celulară a fost măsurată prin testul
MTT (bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu). Morfologia
celulelor a fost evaluată prin microscopie de contrast. În plus, efectele extractului
și fracțiilor testate au fost testate asupra unor regulatori ai lizei și proliferării
celulare, cum ar fi caspaza-8, caspaza-9, factorul nuclear-kB (NF-kB) și oxidul
nitric (NO). Cisplatina a fost utilizată ca martor pozitiv. Valorile estimate ale IC50
36
ale extractului metanolic, fracțiilor de alcaloid și terpenoid și cisplatină împotriva
celulei HT29 după 24 de ore au fost stabilite la valori descrescătoare până la 4.02
μg/mL. Modificări morfologice, cum ar fi sângerarea membranei plasmatice,
reducerea dimensiunii celulelor și corpurile apoptotice au fost observate în
celulele care se confruntă cu extractul și fracțiile.
Extractul de Stachys pilifera și fracțiile sale au indus apoptoza prin
inhibarea NF-kB, NO și activarea caspazei-8 și a caspazei-9. Datele au arătat
efecte citotoxice și antiproliferative considerabile ale specie asupra liniei celulare
colorectale prin inducerea apoptozei, cu perspective în tratamentul cancerului de
colon (101).
2.3.8. Justificarea utilizării speciilor de Stachys în medicina
tradițională
Studiile efectuate până în prezent au demonstrat faptul că majoritatea
extractelor, uleiurilor volatile sau a ceaiurilor obținute din plantele genului
Stachys se pretează pentru utilizarea lor în medicină, ca și aport complementar
sau de sine stătător. Venditti et al. (116) și Lee et al. (117) recomandă specia
Stahys affinis în tratarea unor infecții, în demență, ca și antioxidant puternic sau
în probleme gastrointestinale. Stachys annua și Stachys arvensis își găsesc
utilitate în remedierea unor probleme oculare sau febrile (46), iar Stachys
byzantina poate fi utilizată ca și agent antiinflamator, dezinfectant (118), în
atenuarea problemelor digestive, ca antivomitiv, neurologice sau ca și antispastic.
Specia Stachys fructiculosa (119) este menționată pentru proprietățile
antiinflamatoare. Stachys germanica se recomandă în stări de discomfort
menstrual, calmant, tonic (120). Ca și antipiretic se poate utiliza specia Stachys
iberica sau Stachys lavandulifolia (121). Tot Stachys lavandulifolia a prezentat
calități sedative, anxiolitice, antiinflamatoare, de creștere fetală sau calmante
(122–126). Utilizarea extractelor de Stachys mucronata și-au dovedit eficiența în
tratarea problemelor reumatice și a ulcerelor, ca și purgative sau ca și antiseptice
(127). Stachys officinalis este recomandat ca și antibacterial, calmant și regulator
37
în probleme menstruale sau de menopauză, anxietate, dezinfectant (128–130).
Stachys palustris, Stachys parviflora și Stachys pilifera sunt utilizate frecvent în
medicina tradițională pentru calitățile antiseptice, analgezice, dezinfectante pe
care le dețin (122,131–133). Piozzi et al. (7), respectiv Kepekçi et al. (134)
stabilesc proprietăți antibacteriale, antispasmodice, diuretice, sedative pentru
specia Stachys pumila, specie utilizată în probleme stomacale și bronhice.
Proprietăți anxiolitice și depurative prezintă ceaiurile și decocturile obținute din
Stachys recta, preparate utilizate și în tratamentul durerii (129,130,135).
Lotfipour et al. (119), Maleki et al. (136) stabilesc prin studiile lor posibilitatea
de fi utilizate extracte de Stachys schtscheglevii în tratarea inflamațiilor,
infecțiilor din tractul respirator, sinuzite, astm și afecțiuni reumatologice, ca
alternative medicale naturale. Probleme cardiace, digestive, inflamații sa spasme
pot fi tratate prin utilizarea de infuzii de Stachys sylvatica (100,137). Compoziția
bogată în compuși fenolici, terpenici, volatili, caracterele puternic antioxidante,
antimicrobiene, conduc la posibilități multiple de utilizare a plantelor din genul
Stachys în medicina alternativă, înlocuind cu succes o serie de medicamente
sintetice sau tratamente cu efecte secundare multiple.

38
 3. CONTRIBUȚIA PERSONALĂ
3.1. Ipoteza de lucru şi obiectivele generale
Din literatura de specialitate internațională s-a constatat că aceste plante
prezintă un potențial valoros de compuși bioactivi, se utilizează pe scară largă în
domeniile de profil, astfel încât se impune și o evaluare actualizată asupra
speciilor existente la noi în țară.
Prezenta teză de doctorat are în vedere caracterizarea fizico-chimică,
antioxidantă și microbiologică a șase specii de Stachys (S. byzantine, S.
germanica, S. officinalis, S. palustris, S. sylvatica, S. recta) provenite din flora
spontană a României, identificarea și cuantificarea unor compuși biologic activi
valoroși și stabilirea acțiunii acestora asupra diverselor afecțiuni.
Scopul propus în cadrul cercetării ştiinţifice se poate materializa prin
abordarea și rezolvarea obiectivelor științifice de mai jos:
-realizarea de extracte și uleiuri esențiale din cele șase specii de Stachys (S.
byzantine, S. germanica, S. officinalis, S. palustris, S. sylvatica, S. recta)
selectate;
-caracterizarea fizico-chimică a celor șase specii de Stachys (S. byzantine,
S. germanica, S. officinalis, S. palustris, S. sylvatica, S. recta) selectate prin
identificarea și cuantificarea de compuși polifenolici, compuși de aromă și a
metaboliților secundari;
-stabilirea activității antioxidante și antimicrobiene a celor șase specii
selectate;
-evidenţierea de acţiuni biologice cu largă aplicabilitate în practica
farmaceutică, pentru unele specii de Stachys provenite din flora spontană a
României.
3.2. Metodologia cercetării
În vederea realizării obiectivelor propuse au fost supuse studiului șase
specii de Stachys (S. byzantina, S. germanica, S. officinalis, S. palustris, S.

39
sylvatica, S. recta) provenite din flora României. Extractele și uleiurile esențiale
obținute au fost analizate prin metode spectrofotometrice (polifenoli, activitate
antioxidantă), HPLC (compuși fenolici) și GC-MS (compuși aromatici) în
vederea identificării și cuantificării de elemente biologic active. Activitatea
antimicrobiană a fost pusă în evidență prin metoda Kirby-Bauer, și s-a stabilit
concentrația minima inhibitorie (MIC).
În lucrările de specialitate există puţine menţiuni cu privire la compoziţia
chimică a uleiului volatil provenit de la specii de Stachys din flora României. O
cercetare recentă menţionează, pentru uleiul volatil din speciile S. byzantina, S.
officinalis şi S. sylvatica, recoltate din zona centrală a României, următoarele
componente principale: germacren D, β-gurjunen, β-cubeben, β-cariofilen, β-
pinen, limonen, nerolidol, α-terpinen, linalool, cariofilen-oxid, β-mircen, α-
humulen, β-bourbonen, β-farnesen (79).
În toate lucrările de specialitate se menţionează faptul că, pentru uleiul
volatil din Stachys sp., determinarea cantitativă şi identificarea componentelor
au fost efectuate prin metoda NeoClevenger (după hidrodistilarea materialului
vegetal şi extracţia uleiului volatil în n-hexan) şi, respectiv, cu ajutorul gaz-
cromatografiei cuplată cu spectrometria de masă (GC–MS).
Gaz-cromatografia (GC) reprezintă cea mai utilizată metodă de separare şi
identificare a componentelor din uleiurile volatile, datorită simplităţii, eficienţei
şi costurilor mai reduse comparativ cu metodele lichid/lichid sau lichid/solid. Un
alt argument important îl constituie simplitatea constructivă a liniilor de transfer
GC–MS, de cele mai multe ori ieşirea coloanei capilare fiind cuplată direct la
spectrometrul de masă, fără un dispozitiv special de îndepărtare a fazei mobile.
Dezavantajul important al GC îl reprezintă imposibilitatea analizei compuşilor
cu volatilitate scăzută sau termolabili. Asemănarea pronunţată a spectrelor de
masă ale componentelor unui ulei volatil face dificilă analiza calitativă a acestuia.
Din acest motiv, spectrele de masă nu pot constitui dovada identificării unor
compuşi ai uleiurilor volatile decât în unele cazuri izolate (e.g., unii derivaţi
40
aromatici mono- sau policiclici, oxizi, alcooli etc., care nu reprezintă mai mult de
10% din totalul componentelor unui ulei volatil).
Eficienţa separării GC este legată, în primul rând, de condiţiile de analiză
programate pentru gaz-cromatograf. Rezultate bune se obţin folosind debite ale
gazului purtător între 1–1.5 ml/min., pentru coloane de 30 m, cu polaritate medie
sau mare (DB–5, DB–WAX), eventual coloane chirale în cazul separărilor de
compuşi optic activi, programe de temperatură lente, cu temperatură iniţială de
minimum 40ºC, temperatură finală de peste 250ºC şi o rată de creştere a
temperaturii de 2–5ºC/min. Calitatea separării se poate verifica folosind peak-
urile limonenului şi eucaliptolului, foarte apropiate ca timp de retenţie, pentru o
coloană de tip DB-WAX (138).
3.2.1. Abordarea Temei
Speciile Stachys sunt o sursă abundentă de substanțe fitochimice cu
potențiale utilizări medicinale și comerciale într-o varietate de domenii. Mai
multe soiuri Stachys au fost produse pentru utilizare în medicina convențională,
industria alimentară și farmaceutică și chiar ca plante ornamentale, ca urmare a
cererii tot mai mari de produse naturale (63). Prezentul studiu a fost conceput
ținând cont de faptul că speciile de Stachys sunt utilizate pe scară largă și că au
existat un număr mare de lucrări de cercetare asupra lor; nu a existat totuși o
evaluare recentă originară din România.
În acest context, cercetarea a urmat două căi: determinarea conținutului
total de polifenoli și substanțe chimice volatile a șase specii din genul Stachys (S.
byzantine, S. germanica, S. officinalis, S. palustris, S. sylvatica, S. recta) și
evaluarea activității lor antioxidante și antibacteriene respective. Utilizând
analiza statistică multivariată, amprentele chimice ale compușilor fenolici (TPC)
și ale compușilor organici volatili au fost comparate pentru a defini diferențele și
a descoperi posibile caracteristici distinctive ale celor trei specii Stachys. Au fost
de asemenea explorate potențialele caracteristici compoziționale legate de
activitatea antioxidantă și antibacteriană.
41
 3.2.2. Material și Metodă
Probe de Stachys, medii de cultură și tulpini bacteriene
Speciile selectate din genul Stachys (S. byzantina, S. officinalis, S.
sylvatica) au fost colectate aleatoriu, în vara anului 2021 (iunie și iulie), în
perioada de înflorire, din zona centrală a României; au fost identificate și
conservate în Centrul de Cercetare în Biotehnologie și Ingineria Alimentelor
Sibiu. Produsele vegetale au fost uscate la 35°C timp de câteva zile și apoi
mărunțite.
Stachys officinalis, Stachys palustris și Stachys sylvatica catalogate și
înregistrate în cadrul CCBIA din L. Blaga University, Sibiu, Romania sub nr.
314/1-314/3, plante culese în luna iulie a anului 2022, în perioada de
inflorescență maximă.
Din Regiunea Oltenia, Sud-Vestul României, în perioada mai-iunie 2022,
la înflorire, a fost recoltată partea aeriană de la patru specii spontane de Stachys
(S. germanica, S. officinalis, S. recta și S. sylvatica). Studiul nostru nu a implicat
specii de plante pe cale de dispariție sau protejate. Exemplarele (StG-
20220602/1, StO-20220623/1, StR-20220524/1, respectiv StS-20220607/1) au
fost depuse în Herbarul Departamentului de Botanică Farmaceutică, Facultatea
de Farmacie, Universitatea de Medicină și Farmacia Craiova.
Tulpinile bacteriene utilizate în acest studiu au fost Staphylococcus aureus
(ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Bacillus cereus
(ATCC 9372), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Escherichia coli (ATCC
87349), Escherichia coli (ATCC 87349) Enterobacter cloacae (ATCC 43560) și
Proteus mirabilis (ATCC 29906). Mediile de cultură utilizate au fost Mueller
Hinton, bulion Mueller Hinton și agar Cereus selectiv pentru Bacillus cereus.
Produse chimice și reactivi
Toate substanțele chimice și reactivii implicați în procesele de extracție,
conținutul total de polifenoli, experimentele cu activitate antioxidantă și
standardele chimice (1-hexanol, 2-tuionă, 3-octanonă, 5-amino-1-etilprazol,
42
alilbenzen, camphene, caryophyllene oxid, acid decanoic, docosan, germacren D,
hexadecan, acid hexadecanoic, lavandulol, limonen, linalool, acetat de linalool,
nerol, nerolidol, ninanal, acid tetradecanoic, tricozan, α-copaen, α-humulenă, α-
terpinen, β-caryophyllen, β-copaen, β-cubenen, β-farsen, β-gurjunen, β-myrcen,
β-pinen) utilizați la identificarea compușilor fenolici și aromatici din extracte au
fost achiziționați de la Sigma Aldrich (St. Louis, MO, SUA).
NaNO2 5%, AlCl3⋅6H2O 10%, NaOH 1M, cvercetol, clorură de potasiu
0.025 M, acetat de sodiu 0.4 M, HCl, cianidin-3-glucozidă, reactiv Folin-
Ciocâlteu, carbonat de sodiu 20%, acid tanic, cazeină, 0.5% formic acid în H2O,
MeOH, ferric-tripyridyltriazine, Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-
2-carboxylic acid) de la Fluka (Germany) și Sigma-Aldrich (Germany). Acid
cafeic, acid clorogenic, acid p-cumaric, acid ferulic, acid m-cumaric, acid
sinapic, acid trans-cinamic, acid benzoic, acid elagic, acid galic, p-
hidroxibenzoic, acid rozmarinic, acid siringic, acid vanillic.
Acidul protocatehic, cafeic, p-cumaric și ferulic au fost achiziționați de la
Merck (Darmstadt, Germania), acidul clorogenic a fost obținut de la Alfa Aesar
(Kandel, Germania), acidul rosmarinic, rutozida și cvercetolul au fost
achiziționate de la Sigma Aldrich (Taufkirchen , Germania), luteolul a fost
achiziționată de la Carl Roth (Karlsruhe, Germania), în timp ce izocvercitrozida
a fost obținută de la HWI Analytik (Rülzheim , Germania). Toți solvenții cu grad
de gradient HPLC (LiChrosolv®) (acetonitril, metanol, apă) au fost achiziționați
de la Merck. 2,2-Difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) a fost achiziționat de la Sigma
Aldrich, 2,2'-azino- bis (acid 3-etilbenzotiazolin-6-sulfonic) (ABTS) de la Roche
Diagnostics (Basel, Elveția), clorura de aluminiu de la Fluka (Dorset,
Gillingham, Marea Britanie), reactivul Folin-Ciocîlteu, acetatul de sodiu și
persulfatul de potasiu de la Merck.
Determinarea cantitativă a uleiului volatil din Stachys sp.
Uleiul volatil a fost obţinut prin hidrodistilare, în n-hexan, cu ajutorul
metodei NeoClevenger, conform F.R. X (139,140). Au fost supuse hidrodistilării
43
50 g din fiecare produs vegetal, uscat şi pulverizat la sita V, timp de trei ore,
volumul de apă adăugat iniţial şi recirculat în instalaţie fiind de 1000 ml.
Încălzirea s-a efectuat cu ajutorul unei mantale electrice, luând toate precauţiile
necesare pentru evitarea supraîncălzirii vasului de distilare: adăugarea de piatră
ponce şi reglarea temperaturii până la fierbere uniformă în toată masa lichidului.
Durata hidrodistilării reprezintă un element important, care influenţează direct
randamentul de extracţie.
În toate cazurile, epuizarea produsului vegetal a avut loc după două ore dar,
pentru antrenarea şi a eventualelor componente cu volatilitate medie sau redusă,
durata hidrodistilării a fost prelungită la trei ore.
Extracţie
Cincizeci de grame de material vegetal au fost lăsate la macerat timp de 7
zile în 500 ml de alcool etilic 96%. După macerare, pașii următori au fost
filtrarea, centrifugarea și concentrarea extractului pe baia de apă la 70°C,
rezultând un extract uscat (EU). Materialul uscat a fost resuspendat în 50 ml de
apă distilată (141). Toate determinările ulterioare au fost efectuate în trei
exemplare pentru a obține rezultate cât mai concludente.
Florile, tulpinile și frunzele au fost uscate separat la o temperatură de 40°C,
până la masă constantă. Câte 50 g de material uscat și mărunțit a fost macerat în
500 mL soluție apoasă de metanol 80% timp de 3 zile la o temperatură de 18°C
în recipiente acoperite pentru a evita evaporarea. Probele au fost decantate,
filtrate cu o pompă de vid Buchner (hârtie de filtru Whatman No. 1001 090),
concentrate în evaporatorul rotativ. Extractele uscate au fost resuspendate în apă
distilată la o concentrație de 1:1.
Determinarea conținutului total de fenoli
Conținutul total de polifenoli a fost măsurat spectrofotometric
(spectrofotometru UV-1900 SHI-MADZU, Shimadzu Corporation, Kyoto,
Japonia) utilizând tehnica Folin-Ciocâlteu modificată și adaptată (142) folosind

44
acid galic ca standard intern. Metoda presupune omogenizarea a 0.20 mL de
suspensie de probă (extract dizolvat anterior în apă distilată) cu 0.80 mL de
reactiv Folin-Ciocâlteu 10% (v/v) și 1 mL de carbonat de sodiu (7.5% (m / v).
După o reacție perioadă de 1 oră la temperatura camerei (23°C), absorbanța a fost
citită la o lungime de undă de 750 nm.
Calculul polifenolilor totali sa realizat folosind formula:
C = c × V/m
unde: c-concentrația acidului galic determinată din curba de calibrare în
mg/mL; V-volumul extractului în ml; m-masa extractului de plante în g.
Rezultatele sunt exprimate în miligrame de echivalent acid galic per gram
de extract uscat (mg GAE/g).
Determinarea conținutului total de flavonoide
Flavonoidele au fost determinate spectrophotometric prin metoda descrisă
de Popescu et al. (143) prin care extractele apoase (5 mL) au fost omogenizate
cu soluție de NaNO2 5% (0.3 mL) și incubate timp de 5 minute. Ulterior s-a
adăugat soluție de AlCl3⋅6H2O 10% (0.5 mL) și s-a lăsat amestecul să reacționeze
la întuneric. După 15 minute de reacție s-a adăugat soluție de NaOH 1M (2 mL)
și s-a adus la un volum de 10 mL cu apă distilată. Citirea probelor s-a efectuat la
spectrofotometru (UV-1900 SHIMADZU spectrophotometer, Shimadzu
Corporation, Kyoto, Japan) la lungimea de undă de 510 nm. Conținutul total de
flavonoide se exprimă în mg echivalent quercetină/gram extract.
Determinarea conținutului total de antociani
Metoda (AOAC) se bazează pe diferența de absorbție (UV-1900
SHIMADZU spectrophotometer, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) a
pigmenților monomerici de antociani la o modificare a pH-ului, (pH 1 și pH 4.5)
la o lungime de undă de 520 nm, respective 700 nm în funcție de concentrația
acestora. Rezultatele obținute în mg/L cianidin-3-glucozidă (144) se transformă
în mg/g, în funcție de concentrația extractului.

45
 Determinarea conținutului total de tanin
Metoda presupune cuantificarea polifenolilor totali (metoda Folin-
Ciocâlteu) exprimați în µg echivalent acid tanic/ml și cuantificarea polifenolilor
reziduali prin complexare cu cazeină. Diferența între nivelul total de polifenoli și
a polifenolilor reziduali necomplexați reprezintă conținutul total de tanin
exprimat în mg TAE/g extract (145).
Analiza HPTLC preliminară
Pornind de la părțile aeriene a patru specii de Stachys (Stachydis herba),
analiza preliminară HPTLC– densitometrică a polifenolilor a fost efectuată pe
sistemul CAMAG (Muttenz , Elveția), conform unor condiții experimentale
specifice (146–148): fază staționară: silicagel HPTLC 60 F 254 (Merck,
Darmstadt, Germania) plăci de sticlă preacoperite de 20×10 cm; fază mobilă:
acetat de etil–acid formic–metanol–apă (15:1:0,1:1, în volume); s-au adăugat 10
ml de fază mobilă în camera dublă de dezvoltare (CAMAG) și apoi s-a
suprasaturat timp de 20 de minute; probe: cinci extracte metanolice 20% de
Stachydis herba; compuși de referință (Merck): 0,1% soluții metanolice de acid
cafeic, acid clorogenic și rutozidă; distanța de migrare: 62 mm (linia de aplicare
a probei 8 mm, frontul solventului 70 mm); aplicarea probei (2 μL) și a soluțiilor
de referință (2 μL , 3 μl , 4 μL): sistem semi-automat CAMAG Linomat 5 –
pulverizare de azot gazos, volum de seringă 100 μL, viteza de dozare 150 nL/s,
volum pre-dozare 0.2 μL , lungimea benzilor de 8 mm; uscare placă: 5 minute, la
25ºC (uscător cu aer rece); documnetare pe placă: lumină ultravioletă (UV) (254
nm și 365 nm); detectare: Fotodensitometru CAMAG TLC Scanner 3, pentru
densitogramă și spectre de lumină UV in situ (280 nm), fără derivatizare, lampă
deuteriu-tungsten, viteză de scanare 20 mm/s, rezoluție datelor 100 μm /pas,
absorbanță mod de măsurare; visionCATS ver. Pachetul software 3.1 (CAMAG).
În cabinetul de pulverizare CAMAG TLC 2, plăcile HPTLC au fost
pulverizate cu soluție metanolică 0.5 mM de 2,2-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH);
apoi, plăcile au fost uscate la temperatura camerei, în întuneric, timp de 90 de
46
secunde, încălzite la 60°C, într-un cuptor, timp de 30 de secunde, și analizate în
lumină albă (149).
Test calitativ DPPH in situ
În cabinetul de pulverizare CAMAG TLC 2, plăcile HPTLC au fost
pulverizate cu soluție metanolică 0.5 mM de 2,2-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH);
apoi, plăcile au fost uscate la temperatura camerei, în întuneric, timp de 90 de
secunde, încălzite la 60°C, într-un cuptor, timp de 30 de secunde, și analizate în
lumină albă (149).
Determinarea acizilor fenolici prin metoda UHPLC/MS
Separarea a fost efectuată pe sistemul UHPLC/MS ACQUITY Arc echipat
cu un detector ACQUITY QDa (Waters, Milford, MA, SUA). Software-ul
Empower 3 (Waters) a fost utilizat pentru achiziția și procesarea datelor.
Separarea UHPLC a fost realizată folosind o coloană CORTECS C18, cu
următoarele caracteristici: lungime de 50 mm, diametru interior de 4.6 mm și
dimensiuni ale particulelor de 2.7 μm. Debitul a fost de 0.5 ml/min, cu o fază
mobilă în gradient compusă din solvent A (formiat de amoniu 10 mM) și solvent
B (acetonitril). Gradientul de fază mobilă a început cu 8% solvent B, urmat de
20% solvent B după 8 minute, 27% solvent B la 16 minute atingând 60% solvent
B atât la 19 minute cât și la 20 de minute, revenind constant la condițiile originale.
de 8% solvent B la 21 minute (150). Volumul de injectare a probei a fost de 5 μL.
Procesul de separare a fost operat la o temperatură a coloanei de 25°C, în timp ce
probele au fost păstrate la 20°C. Analiza MS a fost efectuată utilizând modul de
ioni negativ de ionizare electrospray (ESI), după cum urmează: tensiune capilară
0.8 kV, tensiune conică 20 V, temperatura sursei 120°C, temperatura de
desolvatare 400°C. Spectrele de masă au fost detectate utilizând modul de
înregistrare selectivă a ionilor (SIR), cu o rată de eșantionare de 20
puncte/secundă, la următorul m/z : 153, 163, 179, 193, 285, 301, 353, 359, 463,
609.

47
 Determinarea acizilor fenolici prin metoda HPLC/DAD
Acizii fenolici au fost cuantificați prin metoda HPLC (151) ușor modificată
care presupune utilizarea unei coloane cromatografice C18 (Zorbax SB-Aq: 250
mm × 4.6 mm i.d., 5.0 μm p.s.) și un ciclu de 15 de minute de extracție a acestora.
Sistemul Smartline, KNAUER GmbH Germany este dotat cu o pompă
cuaternară, detector DAD, system de injecție automat. Pentru faza mobilă
eluentul A s-a utilizat o soluție compusă din H2O deionizată și acid fosforic (pH
3.5), iar pentru eluentul B acetonitrile (pH 3.5). În coloana cromatografică s-a
injectat un volum de 2 µL extract, debitul fiind de 1 mL/minut. Rezultatele se
exprimă în µg/g extract.
Analiza uleiului volatil prin GC–MS a speciilor S. germanica, S. recta şi
S. sylvatica
Pentru analiza GC–MS, uleiurile volatile au fost obţinute prin
hidrodistilare, în n-hexan, din părţile aeriene înflorite de la cele trei specii de
Stachys, conform F.R. X (metoda Neoclevenger) (139,140).
Analiza gaz-cromatografică s-a realizat pentru separarea componentelor
din uleiurile volatile de Stachys sp. prin compararea spectrelor de masă cu
spectrele de referinţă (Biblioteca NIST), utilizând un gaz-cromatograf Thermo
Scientific Focus cuplat cu un detector de masă DSQ II, echipat cu o coloană
TraceGOLD, TG-5SilMS (lungimea 60 m × diametrul 0.25 mm × mărimea
particulelor 0.25 μm). Volumul injecţiei, la un debit de 1.5 ml/min şi un raport de
splitare de 1:10, a fost de 2 μL, utilizând heliul drept gaz purtător. Temperatura
iniţială a cuptorului (40°C), crescută la 110°C, a fost menţinută izoterm timp de
două minute şi ulterior modificată, prin creştere în trei trepte, cu un gradient de
3℃/min, menţinută de asemenea izoterm, după cum urmează: la 120°C (timp de
trei minute), la 140°C (timp de trei minute) şi în final la 230°C (timp de şapte
minute). Temperatura liniei de transfer a spectrometrului de masă a fost de 250°C,
iar temperatura sursei de ioni de 230°C. Ionizarea cu impact de electroni (EI) s-
a realizat la o energie de 70 eV. Spectrele de masă au fost examinate în modul de
48
scanare completă, în intervalul m/z 35–350, cu înregistrarea timpilor de retenţie
pentru toţi compuşii.
Metoda de ionizare recomandată pentru punerea în evidenţă a peak-urilor
moleculare cuprinde diverse variante, printre care ionizarea la energie mică (5–
10 eV) şi ionizarea chimică, folosind metan, amoniac, butan etc. Aplicarea
ionizării electronice (EI – 70 eV) conduce, în cazul compuşilor cu stabilitate
redusă a ionului molecular, la peak-uri moleculare cu intensitate extrem de
scăzută sau chiar zero, imposibilitatea stabilirii exacte a masei moleculare creând
probleme serioase atribuirilor structurale. Fenomenul de saturaţie a trapei ionice
apare în cazul injectării unor cantităţi mari de probă, manifestându-se prin
observarea unor spectre de masă diferite la parcurgerea unui peak cromatografic
presupus complet separat. Ca urmare, rezultatele comparării spectrelor respective
cu cele din bibliotecile digitale pot fi eronate [Adams, 1989].
În cazul problemelor de acest gen, se recomandă verificarea spectrului de
masă pentru fiecare peak din gaz-cromatogramă, pentru a pune în evidenţă
cazurile de saturaţie. De asemenea, se va avea în vedere faptul că în cazul peak-
urilor de intensitate mică este improbabilă interferenţa saturării trapei cu
fenomenul de suprapunere a două peak-uri, ca urmare a rezoluţiei slabe, în acest
caz preluarea spectrelor de masă făcându-se numai de la începutul sau coada
peak-ului. Desigur, pentru peak-urile mici din gaz-cromatogramă, spectrul de
masă se va prelua de la vârful acestora. La folosirea detectorului cu trapă ionică,
se recomandă ajustarea adecvată a volumului de injecţie în gaz-cromatograf şi a
ratei de splitare, precum şi operarea spectrometrului de masă în domeniul unor
sensibilităţi mari. În cazul ionizării chimice este extrem de importantă reducerea
concentraţiei compuşilor de analizat, pentru evitarea supraîncărcării trapei, prin
faptul că metoda în sine determină creşterea numărului de ioni, a randamentului
de ionizare şi, implicit, a sensibilităţii (138).

49
 Analiza uleiului volatil prin GC–MS a speciilor S. byzantina, S.
officinalis, S. sylvatica
Analiza principalilor compuși organici volatili (COV) prezenți în extracte
a fost efectuată folosind cromatografie gazoasă (GC) Varian 450-GC, echipată cu
un detector de ionizare în flacără (FID) și o coloană capilară TG-WAXMS (60 m
× 0.32 mm ID × 0.25 µm grosimea filmului). Extractele obținute folosind
procedurile de extracție menționate mai sus au fost filtrate utilizând un filtru de
politetrafluoretilenă microporos de 0.5 m și apoi s-a injectat direct 1 µL din
extractul filtrat, cu un raport de împărțire de 1:10. Au fost efectuate trei injecții
pentru fiecare dintre cele trei variante. Heliul (He) a fost utilizat ca gaz purtător,
cu un debit de 0.8 ml/min. Programul de temperatură a coloanei utilizat pentru
separarea compușilor volatili a crescut de la 50°C (menținut timp de 1 min) la
110°C cu o rată de 7.5°C pe minut, apoi până la 160°C (menținut timp de 4 min)
cu un 14°C pe minut, și în final până la 230°C (menținut timp de 8 min).
Temperaturile injectorului și detectorului au fost stabilite la 260°C și, respectiv,
290°C. Identificarea compușilor țintă a fost realizată prin compararea timpilor de
retenție ai compușilor individuali într-o cromatogramă înregistrată pe o soluție
standard cu timpii de retenție a acelorași compuși în cromatogramele înregistrate
pentru probele extrase, ceea ce s-a realizat prin utilizarea retenției. timpii
compușilor individuali din soluția standard. A fost necesar să se dilueze probele
și standardele înainte de a le injecta. A fost necesar să se dilueze cu grijă probele
și standardele înainte de a le injecta. În urma finalizării acestei investigații, au
fost strânse date calitative și cantitative. Procentul fiecărui compus a fost calculat
pe baza cantității fiecărui compus determinată conform metodei standard externe.
Determinarea activității antioxidante cu DPPH
Metoda DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) este o metodă
spectrofotometrică de cuantificare a antioxidanților din sistemele biologice
complexe utilizate în mod obișnuit pentru a testa capacitatea compușilor de a
elimina radicalii liberi sau capacitatea lor de a dona hidrogen. Metoda utilizată a
50
fost cea descrisă de Alexandre et al. (142) modificată și adaptată. Soluția stoc a
fost preparată prin dizolvarea în 100 mL de metanol a unei cantități de 24 mg de
DPPH, urmată de depozitare la întuneric la -20°C (concentrația soluției = 600
pM). Proba de lucru a fost obținută prin omogenizarea extractului uscat în apă
distilată (1:1); apoi s-a preparat soluția de lucru, constând dintr-un amestec de 90
mL de metanol și 10 mL de soluție stoc (concentrația soluției = 60 µM). Douăzeci
și cinci ui din probă au fost lăsați să reacționeze timp de 30 de minute la
temperatura camerei (23°C) în întuneric cu 175 µL amestec DPPH. Absorbanța
a fost citită la o lungime de undă de 515 nm (spectrofotometru UV-1900
SHIMADZU). Ca probă martor a fost folosită apă distilată, fără extract, urmând
aceeași procedură de lucru. Curba de calibrare a fost realizată cu Trolox.
Procentul de inhibiție (I) a fost calculat conform ecuației:
I (%) = [(Abs A0 − Abs eșantion): Abs A0] × 100
unde Abs A0 reprezintă absorbanța de control, iar testul Abs reprezintă
absorbanța de reacție a probei și a radicalilor.
Determinarea activității antioxidante cu ABTS
Activitatea de captare a cationilor radicalilor din extractele speciilor de
Stachys au fost evaluate spectrofotometric (152). Un amestec de soluție ABTS•+
și probe au fost incubate la întuneric, la 37°C, timp de 15 minute; apoi absorbanța
a fost măsurată la 734 nm. Formula [(A 0 –A 1)/A 0)× 100] a fost utilizată pentru a
calcula procentul de inhibiție ABTS•+,A0 fiind absorbanța controlului, iar A1
absorbanța măsurată în prezența probei. Rezultatele au fost exprimate ca IC50
calculat din ecuațiile de regresie liniară ale procentului de inhibiţie ABTS•+. Toate
probele au fost analizate în trei exemplare.
Determinarea potențialului reducător (FRAP)
Potențialul reducător se bazează pe reducerea complexului ferric (Fe3+-
TPTZ) în Fe2+-TPTZ de către compușii antioxidanți din probe. FRAP a fost
monitorizat utilizând metoda spectrofotometrică descrisă de Lachowicz-

51
Wisniewska et al. (153) prin care extractele apoase de Stachys (1 mL) au fost
omogenizate cu 3 mL complex ferric (ferric-tripyridyltriazine), absorbanța fiind
citită la o lungime de undă de 593 nm (spectrofotometru UV-1900 SHIMADZU,
Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) după 10 minute de incubare. Rezultatele
se exprimă în mg echivalent trolox/g substanță uscată.
Determinarea activității antimicrobiene
Metoda Kirby-Bauer (difuzimetrică) a fost utilizată pentru a determina
activitatea antibacteriană a extractelor. Această abordare implică răspândirea
unui strat subțire de cultură bacteriană pe un mediu de cultură solid (cu o
concentrație de aproximativ 0.5 pe scara MacFarland) pentru a determina
activitatea antibacteriană a extractelor. Tulpinile liofilizate au fost hidratate
conform protocolului propriu, cu lichid hidratant. 1 mL de inocul de
Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (ATCC
12228), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Escherichia coli (ATCC 8739),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC) sau Enterobacteracae ATCC 43560) a fost
depus și răspândit pe vase Petri care conțin mediu de cultură solid Mueller Hinton
(Merck KGaA, Darmstadt, Germania) și inocul care conține Bacillus cereus
(ATCC 9372) a fost plasat pe mediu de cultură solid cu agar Cereus selectiv
(Merck, Germania). Concentrația soluțiilor din probele de plante a fost stabilită
la 50 µg/mL. După ce cultura a fost ștearsă, s-au aplicat discuri sterile cu 10 µL,
15 µL, 20 µL de extract de plantă. După o incubare de 24 de ore la 37°C, aria de
inhibare a extractului a fost măsurată cu o riglă, incluzând diametrul de 6 mm al
discului. Interpretarea s-a făcut prin comparație și/sau în mm. Gentamicina și
ampicilina în concentrații conform recomandărilor CLSI (Clinical and
Laboratory Standard Institute) au fost selectate ca teste de control pentru
activitatea antibacteriană pe tulpini Gram-pozitive și Gram-negative, permițând
stabilirea unor metode și proceduri standard în acest sens.

52
 Analize statistice
Principala abordare a analizei statistice multivariate s-a bazat pe analiza
componentelor principale (PCA) pentru a explica asocierile semnificative dintre
parametrii de calitate, conținutul de compuși fenolici totali și datele COV.
Corelațiile lui Pearson (p < 0,05 și p < 0,01) au fost utilizate pentru a identifica
corelațiile dintre toate variabilele incluse în setul de date. Toate analizele
statistice au fost efectuate folosind versiunea software XLSTAT Addinsoft
2014.5.03 (Addinsoft Inc., New York, NY, SUA).

3.3. Rezultate
Conținutul fenolic total și activitatea antioxidantă
Polifenolii pot fi extrași prin diverse metode, iar eficiența acestor procese
poate fi corelată cu materialul vegetal și cu structura compușilor fenolici.
Compușii fenolici sunt prezenți din abundență în mediul natural; în special,
țesuturile plantelor produc o proporție mare din aceste molecule. Se crede că au
capacități antioxidante deoarece includ grupări hidroxil în structura lor; ca
urmare, este esențial să cunoaștem cantitatea lor totală în mostrele de plante,
deoarece acest lucru indică potențialul lor pentru utilizare terapeutică. Extractele
Stachys au fost obținute prin aplicarea unei extracție cu etanol, datorită
randamentului superior în comparație cu alți solvenți, conform literaturii de
specialitate (154). Rezultatele obținute pot fi comparate cu curba standard (R2 =
0.9772). S. officinalis a avut un conținut fenolic total mai mare decât extractele
raportate anterior din această specie. Pe baza acestei evaluări, s-ar putea sugera
că infuziile de S. officinalis posedă o concentrație mai mare de compuși bioactivi
decât alte extracte. Alte rezultate obținute aici sunt comparabile cu cele ale mai
multor specii diferite de Stachys.
Pentru stabilirea activității antioxidante, probele au fost prelucrate conform
metodei DPPH. Rezultatele obținute pot fi comparate cu curba standard (R2 =
0.994). În ceea ce privește capacitatea de a inhiba radicalii prin metoda DPPH, s-
53
a constatat că valorile concentrației maxime efective (EC50) au variat între 11.2
μg/mL pentru S. officinalis și 14.5 μg/mL pentru S. sylvatica. Activitatea
antioxidantă a fost de 556 ± 62 mM Trolox/g pentru S. byzantina, 602 ± 75 mM
Trolox/g pentru S. officinalis și 444 ± 58 mM trolox/g pentru S. sylvatica (Tabelul
1).
Tabel 1. Cantitatea totală de compuși fenolici și activitatea de captare a
radicalilor la S. byzantina, S. officinalis și S. sylvatica.
TPC
Plant sample DPPH scavenging DPPH (EC50) TE (mM/g dry
(mg GAE/g) ±
extract activity (%) ± SD* μg/mL ± SD* extract) ± SD*
SD*
Stachys byzantina 222±0.34 63.8±0.3 12.7±0.01 556±62
Stachys officinalis 232±0.43 65.2±0.5 11.2±0.01 602±75
Stachts sylvatica 197±0.27 53.1±0.2 14.5 ±0.01 444±58
*TPC - total polyphenol content; GAE - gallic acid equivalent; DPPH - 2,2-diphenyl-1-
picrylhydrazyl; TE - Trolox equivalent; SD - standard deviation

Tabel 2. Cantitatea totală de compuși fenolici și activitatea de captare a

radicalilor la S. germanica, S. officinalis, S. recta și S. sylvatica.
IC50 values
Analyzed sample
DPPH assay [μg AAE/mL] ABTS assay [μg/mL]
StG 20.14± 29.41±
StO 17.83± 25.05±
StR 14.13± 17.66±
StS 18.58± 25.75±

Determinarea conținutului total de flavonoide

Flavonoidele joacă un rol important în compoziția chimică a extractelor din
specia Stachys, remarcându-se faptul că practic în toate părțile luate în lucru ele
au fost identificate. După cum se remarcă în tabelul 3 în extractele din flori de
Stachys sylvatica s-au identificat valori de 39.48 mgQE/g extract, valorile fiind
în creștere pentru Stachys officinalis la 45.36 mgQE/g extract, iar pentru Stachys
palustris la 51.66 mgQE/g extract. În extractele obținute din tulpini valorile
determinate s-au situat între 19.78 mgQE/g extract (Stachys palustris) și 39.45
mgQE/g extract (Stachys officinalis), iar în cele din frunze între 31.22 mgQE/g
54
extract (Stachys officinalis) și 32.67 mgQE/g extract (Stachys palustris).
Sarikurkcu et al. (94) determină cuantumuri de flavonoide exprimate în
echivalent rutin, în specii de Stachys la valori cuprinse între 39.24 mgRe/g extract
și 47.70 mgRe/g extract, iar Ahmadvand et al. (66) de 17.09 mgQE/g extract și
31.18 mgQE/g extract.
Determinarea conținutului total de antociani
Antocianii sunt acei compuși care se reflectă în culoarea roșie a petalelor
care formează florile din speciile luate în studiu. Astfel s-au identificat valori de
32.61 mg/g extract în florile de Stachys officinalis, 19.88 mg/g extract în florile
de Stachys palustris și 27.72 mg/g extract în florile de Stachys sylvatica. În
tabelul 2 se remarcă lipsa acestora în extractele provenite din tulpini și frunze.
Antociani au decelat și Lachowicz-Wisniewska et al. (153) în specia Stachys
palustris la un cuantum mediu de 20 mg/100 g d.m. sau Bursal et al. (155) de
34.3 (μg/g) în specia Stachys annua, dar și alți autori care au pus în valoare
calitățile lor antioxidante și antiinflamatoare (156).
Determinarea conținutului total de tanin
Taninurile sunt prezente în extractele de Stachys ele fiind o componentă
indispensabilă în plante. În tabelul 3 se remarcă faptul că taninurile variază în
extractele obținute din flori de la 75.54 mgTAE/g extract la 101.33 mgTAE/g
extract, valoarea cea mai semnificativă fiind atribuită speciei Stachys sylvatica.
Atât în tulpină cât și în frunze taninurile sunt prezente cu valori cuprinse între
44.97 mgTAE/g extract și 84.27 mgTAE/g extract, valorile cele mai scăzute fiind
identificate în cazul speciei Stachys palustris, extracte din tulpină, iar cele mai
semnificative fiind atribuite speciei Stachys officinalis, extracte din frunze.
Lachowicz-Wisniewska et al. (153) stabilește în lucrarea sa din 2022 un număr
de 36 de taninuri hidrolizabile în extracte de flori de Stachys palustris, 32 în
extracte din tulpini și 31 în extracte din frunze, valorile determinate depășind
7000 mg/100g d.m.

55
 Taninuri au fost identificate în plantele din genul Stachys și de Vundac et
al. (76) și Bączek et al. (151) valorile decelate fiind de 1.36%, respectiv 1.86 %
sau la cuantumuri cuprinse între 2 mg/g și 3.9 mg/g.

Tabel 3. Flavonoide, antociani, taninuri și activitate antioxidantă rezultate în cele

trei specii de Stachys (Stachys officinalis, Stachys palustris, Stachys sylvatica).
Flavonoide Antociani Taninuri FRAP
Partea
Specia (mg QE/g (mg/g (mg TAE/g (mg TE/g
plantei
extract) extract) extract) extract)
Flori 45.36 32.61 87.55 71.34
Stachys Tulpini 39.45 n.d. 77.39 56.38
officinalis Frunze 31.22 n.d. 84.27 83.22
Total 116.03 32.61 249.21 210.94
Flori 51.66 19.88 75.54 93.76
Stachys Tulpini 19.78 n.d. 44.97 66.09
palustris Frunze 32.67 n.d. 71.76 76.21
Total 104.11 19.88 192.27 236.06
Flori 39.48 27.72 101.33 87.54
Stachys Tulpini 29.07 n.d. 56.39 63.27
sylvatica Frunze 31.63 n.d. 51.15 75.77
Total 100.18 27.72 208.87 226.58

Determinarea potențialului reducător (FRAP)

Potențialul reducător al extractelor din florile, tulpinile și frunzele de
Stachys se observă în tabelul 3. Valorile obținute sunt cuprinse între 71.34
mgTE/g extract flori (Stachys officinalis) și 93.76 mgTE/g extract flori (Stachys
palustris), 56.38 mgTE/g extract tulpină (Stachys officinalis) și 66.09 mgTE/g
extract tulpină. Se remarcă faptul că această activitate este mai semnificativă în
cazul speciei Stachys palustris, urmată de specia Stachys sylvatica, apoi de
Stachys officinalis. În cazul extractelor din frunze se observă o activitate mai
pronunțată în cazul speciei Stachys officinalis (83.22 mgTE/g extract), urmată de
Stachys palustris (76.21 mgTE/g extract) și Stachys sylvatica (75.77 mgTE/g
extract). Valori semnificative au obținut și Bursal et al. (155), Carev et al. (157)
pe extracte de Stachys cretica (127.20 mgTE/g extract) sau Gülsoy-Toplan et al.
(158) pe extracte de Stachys thirkei cuantumurile fiind cuprinse între 0.038

56
mMFe2+/mg extract și 0.459 mMFe2+/mg extract în funcție de solventul utilizat.
Studiile efectuate de Khanavi et al. (25) pe nouă specii de Stachys conduc la
valori ale activității antioxidante cuprinse între 9.1092 mmol of FeSO4/100 g
echivalent de plantă uscată in S. trinervis și 62.0945 mmol of FeSO4/100 g plantă
uscată în S. fruticulosa, iar Cüce et al. (89) stabilesc pentru S. annua valori ale
FRAP cuprinse între 334.5 mgTE/g extract și 1409.5 mgTE/g extract. Namvar et
al. (26) studiază efectul solvenților asupra capacității antioxidante a S.
turcomanica cu rezultate ale FRAP cuprinse între 680 mMFe2+/g extract -1240
mMFe2+/g extract, în funcție de concentrația de metanol utilizat.
Analiza HPTLC preliminară
Rezultatele experimentale privind analiza HPTLC preliminară a
polifenolilor din părțile aeriene a patru specii de Stachys (Stachydis herba) au
fost evidențiate în figurile 1–8.
Prin modul de regresie liniară, cu abatere de 5% interval, 1,68% coeficient
de variație (CV) și 0,9961 coeficient de corelație (R), curba de calibrare pentru
-9
acid clorogenic a fost utilizată pentru analiza cantitativă: y = 3,571×10 x+
4,636×10 -3.
În extractele metanolice 20% de Stachydis herba, cea mai mare cantitate
de acid clorogenic (R f 0.22) a fost cuantificată în S. recta (59.88 mg%), urmat de
S. sylvatica (32.90 mg%), S. officinalis (31.34 mg%) și S. germanica (25.16 mg
%) părți aeriene, respectiv.
După separarea cromatografică, utilizând testul HPTLC-DPPH, pentru
Stachydis extracte metanolice de herba, screening-ul activității antioxidante a
fost efectuat in situ. Pentru benzile HPTLC, intensitatea culorii galbene este
direct proporțională cu concentrația de polifenoli (acid clorogenic) din probele
examinate (Figura 3).
Pornind de la conținutul de polifenolici din Stachys spp., rezultatele noastre
concordă cu cercetările de specialitate din domeniul chimiei produselor naturale
(25,50,79,159).
57
 Figura 1. Cromatograma HPTLC a polifenolilor din Stachydis herba 20%
extracte metanolice: UV 254 nm, fără derivatizare. B: Gol; Benzile 1–3: Acid
cafeic, Rf 0,76 ; Benzile 4–6: Acid clorogenic, Rf 0,22 ; Benzile 7–9: Rutin , R f
0,08; Benzile 10–13: Probele (S. germanica , S. officinalis , S. recta și respectiv
S. sylvatica).

Figura 2. Cromatograma HPTLC a polifenolilor din Stachydis herba 20%

extracte metanolice: UV 365 nm, fără derivatizare. B: Gol; Benzile 1–3: Acid
cafeic, Rf 0,76 ; Benzile 4–6: Acid clorogenic, Rf 0,22 ; Benzile 7–9: Rutin ,
nevisualizat; Benzile 10–13: Probele (S. germanica , S. officinalis , S. recta și
respectiv S. sylvatica).

58
 Figura 3. Cromatograma HPTLC a polifenolilor din Stachydis herba 20%
extracte metanolice: iluminare cu lumină albă, derivatizare cu DPPH. B: Gol;
Benzile 1–3: Acid cafeic, Rf 0,76 ; Benzile 4–6: Acid clorogenic, Rf 0,22 ; Benzile
7–9: Rutin , R f 0,08; Benzile 10–13: Probele (S. germanica , S. officinalis , S.
recta și respectiv S. sylvatica).

Figura 4. Densitograma acidului clorogenic (UV 280 nm, fără derivatizare)

separată din părțile aeriene de Stachys germanica 20% extract metanolic.

59
Figura 5. Densitograma acidului clorogenic (UV 280 nm, fără derivatizare)
separată din părțile aeriene de Stachys officinalis 20% extract metanolic.

Figura 6. Densitograma acidului clorogenic (UV 280 nm, fără derivatizare)

separată din părțile aeriene Stachys recta 20% extract metanolic.

60
 Figura 7. Densitograma acidului clorogenic (UV 280 nm, fără derivatizare)
separată din părțile aeriene de Stachys sylvatica 20% extract metanolic.

Figura 8. Spectre UV in situ (280 nm) ale acidului clorogenic de referință (a) și
compus separat din probele analizate (b).

61
 Determinarea acizilor fenolici prin metoda UHPLC/MS
Timpii de retenție pentru fiecare compus de referință și profilul UHPLC al
acizilor polifenolici și flavonoidelor separați din extractele din speciile de
Stachys au fost evidențiate în tabelele 4 și 5.
Tabel 4. Timpi de retenție pentru fiecare compus de referință.
Compus de referință Timp de retenție [min]
Protocatechuic acid 2.2
Chlorogenic acid 3.2
Caffeic acid 4.6
p-Coumaric acid 6.7
Ferulic acid 7.7
Rutin 8.1
Isoquercitrin 8.5
Rosmarinic acid 9.9
Luteolin 14.6
Quercetin 14.8
Kaempferol 18.7

Tabel 5. Cantitățile de polifenoli în speciile de Stachys.

Cantitatea de polifenoli [μg/g p.u.] din speciile de Stachys
Compuși
StG StO StR StS
Protocatechuic acid 3.204 17.652 F F
Chlorogenic acid 876.65 445.564 977.374 760.01
Caffeic acid F F F F
p-Coumaric acid 0.42± 1.498 2.814 F
Ferulic acid F F F M
Rutin F 0.084 F F
Isoquercitrin 4.694 2.22 1.964 2.698
Rosmarinic acid F 121.202 F F
Luteolin F 1.476 1.786 F
Quercetin F F M F
Kaempferol F F F F

62
Figura 9. Cromatograma UHPLC pentru extractul metanolic de S. germanica.

Figura 10. Cromatograma UHPLC pentru extractul metanolic de S. officinalis.

63
Figura 11. Cromatograma UHPLC pentru extractul metanolic de S. recta.

64
 Figura 12. Cromatograma UHPLC pentru extractul metanolic de S. sylvatica.

Din acizii polifenolici analizați, s-au găsit acizi cafeic și ferulic, dar nu au
fost cuantificabili în probele Stachys. În plus, acidul ferulic lipsește din proba
StS. Acidul protocatehic și acidul p -cumaric au fost găsite în toate probele
Stachys, dar cuantificate în cantități mici numai pentru StG și StO și, respectiv,
pentru StG , StO și StR. S-au găsit cantități mari de acid clorogenic în StR , StG
și StS , în timp ce StO a prezentat o concentrație mai mică. O cantitate moderată
de acid rosmarinic a fost cuantificată numai pentru proba StO. Au fost
determinate cantități mici de rutină și luteolină pentru StO și, respectiv, pentru
probele StO și StR. Isoquercitrina a fost găsită în toate probele Stachys în ordine
descrescătoare StG > StS > StO > StR.
Cromatogramele UHPLC din analiza extractelor metanolice de Stachys
spp. sunt prezentate în figurile 9–12.

65
 Determinarea acizilor fenolici prin metoda HPLC/DAD
Acizii fenolici reprezintă un segment important în structura plantelor, rolul
lor în scop medicinal fiind evidențiat prin acțiunea lor anticancerigenă,
antiinflamatoare, antibacteriană (34,73,157,158,160), sau cu efecte pozitive în
tratarea unor boli precum Alzheimer (34). Șapte acizi hidroxibenzoici și opt acizi
hidroxicinamici au fost identificați în extractele din flori de Stachys, cu valori
foarte reduse (0.01 µg/g acid trans-cinamic) sau generoase (27970.53 µg/g acid
benzoic).

Tabel 5. Acizii fenolici identificați și cuantificați în cele trei specii de Stachys

(Stachys officinalis, Stachys palustris, Stachys sylvatica).
Stachys officinalis L Stachys palustris L Stachys sylvatica L
Acizi (µg/g) (µg/g) (µg/g)
fenolici
Fl T Fr Fl T Fr Fl T Fr
benzoic 12464. 1270. 4564. 27970. 282. 2225. 19071. 347. 3447.
34 16 43 53 28 44 32 79 22
elagic 24.25 4.56 12.34 18.02 1.27 2.97 32.01 6.96 21.12
galic 7.33 n.d. 0.27 2.48 n.d. 0.22 9.34 n.d. n.d.
p- 25.39 2.11 73.43 49.27 8.54 57.14 83.15 n.d. 4.04
hidroxiben
zoic
salicilic 5.23 0.96 0.35 9.42 0.27 0.22 1.22 0.29 0.77
siringic 389.41 34.12 22.44 569.78 11.2 9.29 487.76 126. 111.1
4 32 1
vanilic 266.78 n.d. n.d. 343.21 n.d. n.d. 312.22 n.d. n.d.
cafeic 102.56 n.d. 0.01 176.53 0.02 0.15 149.28 0.04 0.11
clorogenic 1011.7 125.3 452.6 7132.2 234. 217.0 2119.6 333. 113.3
8 7 5 9 23 2 9 25 8
p-cumaric 35.66 10.21 12.92 46.22 9.22 16.78 55.19 22.3 24.21
3
ferulic 821.32 247.7 293.9 916.16 196. 241.3 441.02 133. 188.0
7 9 78 9 44 7
m-cumaric 5.66 1.21 2.92 4.22 n.d. n.d. 5.19 2.33 4.21
rosmarinic 9.56 n.d. n.d. 4.93 n.d. n.d. 4.55 n.d. n.d.
sinapic 7.99 n.d. n.d. 3.23 n.d. 0.03 7.13 n.d. 0.05
trans- 0.01 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
cinamic
Total 15177. 1696. 5435. 37246. 743. 2770. 22779. 972. 3914.
27 47 75 29 85 65 07 75 29
Fl - flori, T - tulpini, Fr - frunze, n.d. - nedetectabil

66
 Analiza uleiului volatil prin GC–MS a speciilor S. germanica, S. recta şi
S. sylvatica
Prin hidrodistilare cu ajutorul metodei NeoClevenger, conform F.R. X, în
n-hexan s-au obţinut trei uleiuri volatile de culoare gălbuie, cu miros caracteristic.
Rezultatele determinării cantitative a uleiului volatil din părţile aeriene înflorite
ale celor trei specii de Stachys reprezintă media aritmetică a trei probe analizate
pentru fiecare produs vegetal, după cum urmează: S. germanica – 1.15%, S. recta
– 1.05% şi S. sylvatica – 0.95%.
Rezultatele analizei GC–MS pentru uleiul volatil din partea aeriană a celor
trei specii de Stachys sunt redate în Tabelul 6 şi în Fig. 13–18, după cum
urmează.
Tabel 6. Analiza GC–MS a compoziţiei uleiului volatil provenit de la trei
specii de Stachys
[%] în uleiul volatil
Nr. T.R.
Componenta identificată S.
crt. [min.] S. recta S. sylvatica
germanica
1 Camfen 13.61 0.197 0.319 0.240
2 Mircen 14.61 3.928* 3.396** 4.077***
3 α-Felandren 15.51 5.933* 25.716** 32.509***
4 (+)-3-Caren 15.85 0.526 0.541 0.482
5 4-Izopropil-toluen 16.94 1.197 1.149 1.262
6 3,7-Dimetil-1,3,6-octatrienă 17.37 0.032 1.666 0.058
7 Eucaliptol 17.59 0.799 0.125 0.103
8 Linalool 22.23 3.196* 4.240** 4.310***
9 (-)-Izopulegol 25.62 1.704 1.748 1.684
10 Camfora 26.69 0.273 0.330 0.546
11 Izoborneol 26.81 0.852 0.963 1.156
12 D,L-mentol 27.58 1.186 1.271 1.228
13 Nerol 30.13 2.917* 2.910** 2.967***
14 Acetat de geranil 36.83 3.080* 2.328 2.180
15 Cariofilen 39.06 32.976* 2.125 6.336***
16 Valencen 41.90 29.208* 2.868 12.476***
17 cis-Nerolidol 44.06 2.769 2.711 2.787
18 (-)-Cariofilen-oxid 48.50 1.269 1.562 2.138
19 Cedrol 48.96 1.131 2.995** 1.212
20 (-)-α-Bisabolol 51.08 5.511* 3.114** 3.121***

67
 *: Componente majoritare în uleiul volatil de S. germanica; **:
Componente majoritare în uleiul volatil de S. recta; ***: Componente majoritare
în uleiul volatil de S. sylvatica; T.R.: Timpul de retenţie.

Figura 13. Gaz-cromatograma uleiului volatil obţinut din partea aeriană

înflorită de S. germanica.

Figura 14. Gaz-cromatograma uleiului volatil obţinut din partea aeriană

înflorită de S. recta.

68
 Figura 15. Gaz-cromatograma uleiului volatil obţinut din partea aeriană
înflorită de S. sylvatica.

Figura 16. Peak-ul din gaz-cromatogramă, spectrul de masă şi curba de

calibrare pentru standardul de cariofilen, componentă principală din uleiul
volatil de S. germanica.

69
 Figura 17. Peak-ul din gaz-cromatogramă, spectrul de masă şi curba de
calibrare pentru standardul de valencen, componentă principală din uleiul
volatil de S. germanica.

Figura 18. Peak-ul din gaz-cromatogramă, spectrul de masă şi curba de

calibrare pentru standardul de α-felandren, componentă principală din uleiurile
volatile de S. germanica şi de S. sylvatica.

Din analiza datelor experimentale, se constată că în uleiurile volatile de la

cele trei specii de Stachys au fost identificate, prin GC–MS, un număr total de 20
de componente; din punctul de vedere al importanţei, respectiv în ordinea
descrescătoare a concentraţiei în uleiul volatil, acestea sunt repartizate după cum
urmează:
▪ opt componente principale în uleiul volatil de S. germanica: cariofilen,
valencen, α-felandren, (-)-α-bisabolol, mircen, linalool, acetat de geranil, nerol;
▪ şase componente principale în uleiul volatil de S. recta: α-felandren,
linalool, mircen, (-)-α-bisabolol, cedrol, nerol;
▪ şapte componente principale în uleiul volatil de S. sylvatica: α-felandren,
valencen, cariofilen, linalool, mircen, (-)-α-bisabolol, nerol.
În uleiul volatil de S. germanica, două componente au concentraţia cea mai
mare: cariofilen (32.976%) şi valencen (29.208%). Uleiurile volatile de S. recta

70
şi S. sylvatica prezintă un singur component cu concentraţia cea mai mare: α-
felandren (25.716% şi, respectiv, 32.509%).
Analiza uleiului volatil prin GC–MS a speciilor S. byzantina, S.
officinalis, S. sylvatica
Conținutul chimic a trei specii de Stachys întâlnite în mod obișnuit în
România, și anume S. sylvatica, S. officinalis și S. byzantina, au fost determinate
și investigate în acest studiu. masa 2prezintă constituenții aromatici extrași,
fiecare probă prezentând o compoziție complexă. Printre acestea, terpenoidele
cuprind clasa majoră de compuși naturali din toate extractele studiate.
Hidrocarburile sescviterpenice au fost clasa cea mai abundentă de constituenți
găsite în toți taxonii, urmate de hidrocarburile monoterpenoidice ca al doilea tip
ca abundență. Aceste probe au inclus 29, 30 și 31 de compuși volatili, care au
reprezentat 98.4%, 95.8% și, respectiv, 97.5% din totalul compozițiilor, conform
rezultatelor analizei GC-MS. S. sylvatica și S. officinalis extractele aveau
profiluri chimice similare. Cele mai abundente grupe de compuși au fost
hidrocarburile sescviterpenoidice (SH) (42.8 și 41.6%), hidrocarburile
monoterpenoidice (MH) (36.8 și 31.2 %) și monoterpenoidele oxigenate (OM)
(10.5 și 9.5 %). Probele de S. sylvatica provenind din Bulgaria, Italia, Kosovo,
Croația și Ungaria au fost investigate anterior de diferite grupuri, care au raportat
că lactonele sescviterpenoidice erau, ca și în cazul nostru, grupul major de
substanțe (161). S. byzantina a prezentat cea mai mare concentrație de SH și cea
mai scăzută în ceea ce privește conținutul de MH, aceste proporții fiind observate
anterior în studiul realizat de Lashgargahi și Shafaghat (162).
Tabel 7. Profilul compușilor volatili din cele trei specii de Stachys: S. byzantina,
S. officinalis, S. sylvatica.

S. byzantina S. officinalis S. sylvatica Compound

Compound name
(%) (%) (%) classification
Docosane 0.7 0.4 0.9 FAD1
Hexadecanoic acid 0.2 1.1 0.1 FAD2

71
Tetradecanoic acid 0.1 0.3 0.1 FAD3
Tricosane 0.2 0 0 FAD4
Hexadecan-1-ol 0.2 0.1 0.1 FAD5
1-hexanol 0 0.1 0.2 GL1
Decanoic acid 0.2 1 0.8 GL2
3-octanone 0.2 0.1 1.2 O1
5-Amino-1-ethylprazole 0.5 0.1 0.4 O2
Allylbenzene 0.4 1.5 1.3 O3
Ninanal 0.3 0 0.4 O4
2-Thujene 0.2 0.1 0 MH1
Camphene 0.6 1.1 0.8 MH2
Limonene 10.8 15.7 19.5 MH3
α-Terpinene 2.1 2.1 2.2 MH4
Β-Myrcene 0.5 1.7 0 MH5
Β-Pinene 15.2 10.5 14.3 MH6
Lavandulol 0.5 0.1 0.7 OM1
Linalool 3.2 5.4 2.5 OM2
Linalool acetate 0.3 0.5 0.8 OM3
Nerol 0.8 0.7 1.8 OM4
Nerolidol 2.7 2.8 4.7 OM5
Caryophyllene oxide 1.9 5.7 1.8 OS1
Germacrene D 24.6 25.2 21.9 SH1
α-Copaene 0.9 0.1 0.2 SH2
α-Humulene 2.7 1.4 1.1 SH3
β-Bourbonene 0.1 1.2 2 SH4
β-Caryophyllene 8.9 9.9 13.3 SH5
β-Copaene 1.9 2.4 1.6 SH6
β-Cubenene 10.1 0.1 0.1 SH7
β-Farnesene 0.2 1 0.5 SH8
β-Gurjunene 1.3 0.3 1.1 SH9
TOTAL (%) 97.5 95.8 98.4
MH 29.4 31.2 36.8
OM 7.5 9.5 10.5
SH 50.7 41.6 41.8
OS 1.9 5.7 1.8

72
 FAD - fatty acids and fatty acid-derived compounds; GL - green leaf volatiles; MH -
monoterpenoide hydrocarbons; OM - oxygenated monoterpenoides; SH - sesquiterpene
hydrocarbons; OS - oxygenated sesquiterpenes; O - others

Activitate antibacteriană
Plantele cu potențial antibacterian atrag în prezent atenția oamenilor de
știință, datorită faptului că numeroase studii relevă asimilarea ușoară a
compușilor naturali valoroși de către organism în comparație cu medicamentele
obținute pe cale sintetică (163). Activitatea antibacteriană a celor trei specii de
Stachys selectate este deosebit de remarcabilă. După cum se poate vedea în
Figura 13, zonele măsurate de inhibiție au fost între 3 și 10 mm pentru bacteriile
Gram-pozitive și până la 7 mm pentru bacteriile Gram-negative. Tulpina de
Staphylococcus aureus (ATCC 25923) a prezentat o inhibiție mai pronunțată de
către extractul de S. officinalis, unde valorile medii au fost de 7 mm, în timp ce
Staphylococcus epidermidistulpina (ATCC 12228) a arătat o zonă de inhibiție
mult mai semnificativă de până la 10 mm în cazul extractelor de S. byzantina.
Aceste valori sunt mai mari decât cele înregistrate la martori (ampicilină sau
gentamicina). În plus, din spectrul bacteriilor Gram-pozitive se poate afirma că
tulpinile de Bacillus cereus (ATCC 9372) și Enterococcus faecalis (ATCC
19433) au experimentat efecte antibacteriene cu o zonă de inhibiție măsurată într-
un interval de 3–6 mm pentru toate cele trei extrase luate în studiu. Aceste valori
sunt mai mici decât cele înregistrate pentru martori (ampicilină sau gentamicina).

73
 Figura 19. Activitatea antibacteriană a extractelor de Stachys byzantina,
S. officinalis și S. sylvatica pe SA: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), SE:
Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), BC: Bacillus cereus (ATCC 9372:
Enterococcus), (ATCC 93722), BC: ATCC 19433), EC: Escherichia coli
(ATCC 8739), PA: Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), En.C.:
Enterobacter cloacae (ATCC 43560), PM: Proteus mirabilis (ATCC 29906).

În ceea ce privește acțiunea antibacteriană a celor trei extracte de Stachys

(S. byzantina, S. officinalis, S. sylvatica) asupra bacteriilor Gram-negative, s-a
constatat că acestea prezintă valori diferite de inhibiție. Valorile înregistrate
pentru cele trei extracte au fost mai mici în comparație cu cele înregistrate pentru
martori (ampicilină și gentamicina). Excepție au fost valorile observate pentru P.
aeruginosa, unde acestea au fost aproximativ egale cu cele ale martorilor
(ampicilină și gentamicina). Astfel, efectul antibacterian a fost minor asupra
tulpinii de Escherichia coli (ATCC 8739), cu valori cuprinse între 2 mm în cazul
extractului de S. byzantina. În cazul tulpinii Proteus mirabilis (ATCC 29906),
cele mai semnificative valori ale efectului antibacterian au fost observate in cazul
extractelor de S. byzantina și S. sylvatica unde aria de inhibiție măsurată a depășit
74
7 mm. Atât extractul de S. officinalis, cât și S. sylvatica au avut un efect inhibitor
asupra tulpinii Enterobacter cloacae (ATCC 43560) de peste 4 mm, în timp ce
extractul de S. byzantina a avut un efect de aproximativ 3 mm. Reacția extractelor
de Stachys la culturile bacteriene variază, fiind în mare parte influențată de
profilul chimic, structura moleculară a componentelor majore, proprietățile
structurale și cantitățile (164). De asemenea, activitatea antibacteriană este
determinată de formarea complexă și interacțiunile dintre componentele COV
majore și minore. Având în vedere screening-urile anterioare concentrate pe
activitatea antimicrobiană a plantelor medicinale, rezultatele noastre sunt de
acord prezentând o activitate antibacteriană mai puternică împotriva tulpinilor
Gram-pozitive și moderată față de tulpinile Gram-negative (165).
În studiul actual, prezența fenolilor și a terpenelor oxigenate poate explica
inhibarea bacteriilor, deoarece terpenele precum linaloolul, neronidolul și oxidul
de cariofilen sunt mai active decât terpenoidele precum β-pinenul și
hidrocarburile β-cariofilenul. Datorită solubilității lor limitate în apă, derivații de
hidrocarburi au activitate antibacteriană redusă, limitând dispersia lor prin
substrat. Această inactivitate este strâns legată de capacitatea redusă de legare a
hidrogenului și solubilitatea în apă, în timp ce moleculele oxigenate au o
capacitate de legare mai puternică (165). Rezistența generalizată a bacteriilor
Gram-negative, cum ar fi Proteus mirabilis este atribuită existenței unei
membrane exterioare hidrofile care conține un lanț polizaharidic hidrofil care
funcționează ca o barieră hidrofobă împotriva uleiurilor esențiale extracelulare
(166). Influența compușilor fenolici naturali produși de plante asupra creșterii
biofilmului bacteriilor Gram-negative a fost recent demonstrată (167), dar nu a
fost efectuat niciun studiu sistematic privind corelația dintre limitarea microbiană
și conținutul total de fenolici al plantelor și ierburilor aromatice.

75
 4. DISCUȚII

Din rezultatele obținute se observă că acidul benzoic se acumulează în

concentrațiile cele mai semnificative (12464.34 µg/g-27970.53 µg/g) în special
în flori (Stachys palustris) și frunze (2225.44 µg/g – 4564.43 µg/g), valorile
maxime fiind identificate în specia Stachys officinalis. Tulpinile au prezentat
acumulări de acid benzoic, valorile rezultate fiind cuprinse între 282.28 µg/g
pentru Stachys palustris și 1270.16 µg/g pentru Stachys officinalis. Acidul elagic
s-a identificat în extractele din flori la cuantumuri cuprinse între 18.02 µg/g
pentru Stachys palustris și 32.01 µg/g pentru Stachys sylvatica, valorile din
tulpini fiind sub 7 µg/g, iar cele din frunze atingând un maxim de 21.12 µg/g în
specia Stachys sylvatica. Acidul galic s-a regăsit în cantități neuniforme (sub 10
µg/g) în extractele din flori studiate, în tulpini nefiind decelată. Acidul p-
hidroxibenzoic s-a identificat la valori semnificative în extractele din florile de
Stachys sylvatica, (83.15 µg/g) și din frunzele de Stachys officinalis (73.43 µg/g).
În extractele provenite din tulpinile de Stachys sylvatica nu s-a identificat acest
acid. Acidul salicilic s-a regăsit la cuantumuri cuprinse între 1.22 µg/g – 9.42
µg/g în extractele din flori de Stachys, în frunze și tulpini valorile fiind subunitare
(0.27 µg/g – 0.96 µg/g). Acidul siringic a fost cuantificat în toate extractele luate
în studiu, în flori oscilând între 389.41 µg/g (Stachys officinalis) și 569.78 µg/g
(Stachys palustris), în tulpini între 11.24 µg/g (Stachys palustris) și 126.32 µg/g
(Stachys sylvatica), iar în frunze între 9.29 µg/g (Stachys palustris) și 111.11 µg/g
(Stachys sylvatica). Acidul vanilic nu a fost decelat în tulpinile și frunzele de
Stachys, el fiind present doar în flori la valori cuprinse între 266.78 µg/g (Stachys
officinalis) și 343.21 µg/g (Stachys palustris). Dintre acizii hidroxicinamici
identificați, cele mai semnificative cuantumuri s-au regăsit în cazul acidului
clorogenic cu valori cuprinse în extractele din flori între 1011.78 µg/g (Stachys
officinalis) și 7132.29 µg/g (Stachys palustris). Acidul clorogenic a fost prezent

76
și în tulpini (125.37 µg/g -333.25 µg/g) dar și în frunze (113.48 µg/g – 452.65
µg/g) în toate trei speciile de Stachys. Acidul cafeic a fosr identificat în flori la
valori de peste 100 µg/g, în frunze și tulpini doar la valori subunitare, sau
nedetectate în tulpinile de Stachys officinalis. Acidul p-cumaric a fost decelat în
toate extractele de Stachys, valorile fiind mai semnificative în extractele din flori
(35.66 µg/g- 55.19 µg/g), mai reduse în tulpini și frunze (9.22 µg/g – 24.21 µg/g).
În toate extractele de Stachys se observă o acumulare semnificativă de acid
ferulic. Valorile determinate din extractele de flori au fost cuprinse între 441.02
µg/g și 916.16 µg/g (Stachys sylvatica, Stachys palustris), din tulpină până la un
maxim de 247.77 µg/g și din frunze de 293.99 µg/g (Stachys officinalis). În
extractele din flori s-au mai decelat acizii m-cumaric (4.22 µg/g – 5.66 µg/g),
acid rosmarinic (4.55 µg/g – 9.56 µg/g), acid sinapic (3.23 µg/g – 7.29 µg/g),
acidul trans-cinamic (0.01 µg/g pentru Stachys officinalis, iar pentru Stachys
palustris, Stachys sylvatica nedetectabil). În tulpinile și frunzele de Stachys
officinalis și Stachys sylvatica s-a identificat acidul m-cumaric, acesta fiind
nedetectat în extractele de Stachys palustris, iar acidul sinapic nu s-a decelat în
extractele din tulpinile celor trei specii fiind present în cantități reduse în frunze
(maxim 0.05 µg/g Stachys sylvatica). Și alți autori au analizat compușii fenolici,
respectiv acizii fenolici din diverse extracte de Stachys (73), rezultatele fiind
remarcate în cazul speciilor Stachys officinalis (69,151,168), Stachys palustris
(153,168), Stachys sylvatica (116,168), Stachys cretica ssp. anatolica (157),
Stachys lavandulifolia (33), Stachys tmolea (169).
Rezultatele obţinute pentru analiza uleiului volatil din cele trei specii de
Stachys (S. germanica, S. recta şi S. sylvatica) din flora României, zona Olteniei,
concordă cu informaţiile din lucrările de specialitate. Pentru cele trei specii sus-
menţionate, diferenţele privind compoziţia uleiului volatil apar ca urmare a
provenienței geografice şi a condiţiilor pedoclimatice.
Cercetările efectuate pe material vegetal provenit de la S. germanica din
Câmpia Panonică şi din Peninsula Balcanică au evidenţiat, pentru uleiul volatil,
77
următoarele componente principale: germacren D, epi-cubebol, α- şi γ-muurolen,
ocimen, β-felandren, γ-terpinen, linalool, trans- şi cis-pinocamfonă, β-cariofilen,
δ-cadinen, α-cadinol (161); borneol, biciclogermacren, β-farnesen, spathulenol
(170); cariofilen-oxid, spathulenol, nuciferil izobutirat, hexahidroxi-farnesil-
acetonă, viridiflorol, β-bourbonen, valeranonă (50). Uleiul volatil provenit de la
S. germanica din flora Italiei conţine, în principal, germacren D, limonen, β-
pinen, fitol, nerolidol, β-bourbonen, β-ylangen (171), iar cel provenit din Turcia
acetat de linalil, α-terpineol, germacren D, β-mircen, α-pinen, linalool, cariofilen-
oxid, β-cariofilen, spathulenol (53,172).
Uleiul volatil obţinut prin hidrodistilare din partea aeriană înflorită a speciei
S. recta recoltată din flora Turciei şi din flora Serbiei, conţine, în principal,
germacren D, β-mircen, cariofilen-oxid, β-cariofilen, acetat de linalil, α-pinen,
linalool, α-terpineol, spathulenol (172).
În cazul speciei S. sylvatica provenită din flora Ungariei, din flora Kosovo
şi a Italiei, cercetările au evidenţiat următoarele componente principale în uleiul
volatil: germacren D, β-felandren, α- şi γ-muurolen, β-cariofilen, epi-cubebol,
ocimen, γ-terpinen, linalool, trans- şi cis-pinocamfonă, δ-cadinen, α-cadinol
[Radnai et al., 2003]; α-pinen, β-pinen, germacren D (173); germacren D, (E)-β-
farnesen, n-tetracosan, mintsulfură (174).
Constituentul major al speciei Stachys s-a dovedit a fi germacrenul D (174–
176). La specia Stachys studiată valorile germacrenului D au fost cuprinse între
25.2% (S. officinalis) și 21.9% (S. sylvatica). Cu toate acestea, a fost identificată
și prezența altor substanțe active precum limonen, β-pinen, β-cuben, β-cariofilen
și linalool.
β-cariofilen este un compus identificat în cantități remarcabile la toate cele
trei specii studiate, rezultatele fiind între 8.9% (S. byzantina) și 13.3% (S.
sylvatica). S-a descoperit că uleiul esențial dintr-o populație de S. officinalis
originară din Serbia nu conținea β-cariofilen (170), care anterior s-a dovedit a fi
un constituent dominant într-un ulei esențial dintr-o comunitate de S. officinalis
78
originară din Muntenegru (177). În schimb, germacrenul D a fost compusul
predominant în uleiul esențial dintr-o populație de S. officinalis din Serbia.
Conform constatărilor unui alt studiu efectuat în Serbia (63), hidrocarburile
sescviterpenoidice au fost fracțiunile predominante, cu germacren D, β-cariofilen
și α-humulen fiind componentele majore. Constituenții primari ai S. officinalis,
conform unei investigații efectuate pe probe originare din Croația, au fost
germacrenul D și β-cariofilenul (178). Este interesant de observat că germacrenul
D a fost detectat în concentrații semnificative în probele din Italia și Serbia
(170,174), în timp ce fracția de monoterpenoide a prezentat concentrații scăzute
în toate aceste probe investigate. În contrast cu această constatare, S. sylvatica
originare din Croația au prezentat o concentrație similară de germacren D și
hidrocarburi monoterpenice, α-pinenul și β-pinenul fiind componentele cele mai
răspândite ale acestei fracțiuni, precum și în studiul nostru. Rezultatele unei
investigații privind S. sylvatica originară din Kosovo au fost, de asemenea, în
concordanță cu constatările prezente (173), constituenții principali fiind
reprezentați de α-pinen, β-pinen și germacren D. În ciuda prezenței unor
concentrații semnificative de germacren D, α-pinen și β-cariofilen în S. sylvatica
colectate în Turcia, ingredientul β-pinen nu a fost identificat (172). În ceea ce
privește hidrocarburile monoterpenoidice, al doilea cel mai abundent constituent
din uleiul esențial din S. sylvatica, s-au observat rezultate comparative pentru
probele originare din Turcia, cei mai abundenți compuși fiind limonenul și α-
cedrenul (10).
β-pinenul a fost cuantificat la procente care ajung la 15.2% (S. byzantina).
Specific pentru S. byzantina a fost nivelul ridicat de β-cubenen de 10.1%
identificat, comparativ cu celelalte două specii de Stachys unde acest compus nu
depășește 0.1%. Un alt compus important a fost găsit la toate cele trei specii și
anume limonenul, cu niveluri de 10.8% la S. byzantina, 15.7% la S. officinalis și
19.5% la S. sylvatica. S-a observat că acest compus este prezent aproape de două
ori mai mult la S. sylvatica comparativ cu S. byzantina. La specia S. byzantina nu
79
a fost identificat compusul 1-hexanol, la S. officinalis tricozanul nu a fost
identificat, în timp ce pentru S. sylvatica 2-tuiona, tricozan și β-mircen nu au fost
identificați. Într-un studiu efectuat pe frunze de S. byzantina colectate din
provincia Azarbaijan de Vest, Iran, s-a observat că monoterpenoidele erau
fracțiunile predominante, cei mai abundenți compuși fiind linaloolul și 1,8
cineolul (162). Aceste rezultate sunt diferite de cele obținute în studiul de față și
în cel realizat de Lashgargahi și Shafaghat (162), unde constituenții principali au
fost reprezentați de hidrocarburile sescviterpenice, cu germacren D și β-
cubenenul ca fiind cei mai abundenți compuși.
Linaloolul a fost identificat și cuantificat la valori între 2.5% (S sylvatica)
și 5.4% (S. officinalis), iar nerolidolul variază de la 2.7% (S. byzantina) la 4.7%
pentru (S sylvatica), procente diferite față de alte studii. (0.3–0.8% (178), 0.8%
(179). La toate cele trei specii studiate s-a identificat α-humulenă, valorile
constatate fiind între 2.7% (S. byzantina) și 1.1% pentru (S. sylvatica) și acetatul
de linalool a fost între 0.3% și 0.8% Compușii volatili identificați au specificitate
pentru fiecare extract, rezultatele obținute fiind un etalon pentru zona lor de
origine.
Analiza multivariată a speciilor Stachys
COV-urile extractelor de specii Stachys preparate în studiul de față au fost
comparate folosind PCA. Analiza statistică multivariată aplicată a ajutat la
evaluarea potențialului importanță ecologică a datelor volatile, precum și în
interpretarea acestora; constatările au fost susținute statistic ca rezultat al analizei.
Pentru a investiga potențialul COV de a discrimina între eșantioanele Stachys,
precum și pentru a identifica orice corelații importante între COV, a fost aplicat
PCA datelor GC-MS. Figura 14 prezintă o proiecție a scorului și a valorilor de
încărcare, oferind o reprezentare vizuală a tiparelor inter-varietale de asemănare
sau diferență, ca între probele Stachys studiate, în funcție de caracteristicile
investigate. Rezultatele acestui studiu au indicat că există o variație semnificativă
între soiurile native ale speciilor Stachys.
80
 Figura 20. Graficul analizei componentelor principale 2D a COV la cele
trei specii de Stachys. FAD - acizi grași și compuși derivați de acizi grași; GL-
volatile din frunze verzi; MH - hidrocarburi monoterpenoidice; OM-
monoterpenoide oxigenate; SH-hidrocarburi sescviterpenoidice; OS -
sescviterpene oxigenate; O-alții.

Cele două componente principale au explicat 100% din variația setului de

date, PC1 reprezentând 51.33% și PC2 48.67% din variație. Cele trei probe de
Stachys au fost clar dispersate de-a lungul PC-urilor din parcela PCA. S.
byzantina și S. sylvatica, în special, prezintă scoruri PC1 negative (dar scoruri
PC2 negative și pozitive, ceea ce indică faptul că aceste probe sunt oarecum
distincte) și au fost poziționate în partea stângă a figurii, în timp ce S. officinalis
a fost reprezentat grafic pe cealaltă parte. Scorurile absolute de încărcare (LV ≥

81
0.8) au fost atribuite ca limită pentru a explica varianța maximă de-a lungul PC-
urilor (180), permițând selectarea a 14 încărcări ca componente cele mai
diferențiate pe PC1 (FAD1, FAD2, FAD3, O2, O4, MH2, MH5, MH6, OM1,
OM2, OS1, SH6, SH8 și SH9) și 13 încărcări cu corelația de-a lungul PC2
(FAD4, FAD5, GL1, MH1, MH3 (Tabel 6 , Figura 14). În cadrul celor mai
diferențiate componente pe PC1, MH6, OM1 și SH9 terpenoidele au fost
detectate în S. byzantina și în concentrații mari; în timp ce eșantionul de S.
officinalis a fost caracterizat prin cantități relativ mari de MH1, SH3 și SH7.
Prezența altor COV s-a dovedit a fi similară în toate probele Stachys (Tabelul 6).
Dacă sunt luate în considerare variabilele care au separat probele în jurul F1,
rezultatele PCA pot susține ipoteza lui Lazarevic et al. (2), sugerând că proporția
din compoziția totală a anumitor molecule, cum ar fi terpenele oxigenate precum
oxidul de cariofilen sau compușii oxigenați din originea terpenoidă, este
influențată de factori eco-geografici (2). Pe baza concluziilor lor, factorii
ecologici din Peninsula Balcanică pot influența cantitatea de oxigenare a
terpenoidelor din probele de plante S. officinalis, de exemplu, prin exprimarea
genelor enzimelor implicate.

82
 5. CONCLUZII

Compușii bioactivi din trei extracte de Stachys au prezentat valori

semnificative în ceea ce privește capacitatea antioxidantă. Activitatea
antioxidantă duce la posibilitatea utilizării lor în industria farmaceutică și
agroalimentară. Prin analizele GC-MS efectuate au fost identificați peste 39 de
compuși volatili, specifici tuturor speciilor. Cel mai important grup de compuși
volatili face parte din grupul sescviterpenoidelor oxigenate și hidrogenate,
urmate de monoterpenoide și alți compuși neterpenoidici. Acest studiu a
demonstrat, de asemenea, potențialul utilizării profilurilor COV ale țesuturilor
vegetale pentru a discrimina între diferite specii de Stachys, cu un total de 31 de
COV fiind identificate din toate cele trei specii. Deși au existat asemănări
puternice între profilurile de COV ale celor trei specii, distincțiile pot fi încercate
folosind analiza chimiometrică. Rezultatele acestui studiu oferă o metodă
fezabilă și utilă de clasificare rapidă a plantelor Stachys, indicând o mare
similitudine în ceea ce privește profilul compușilor volatili în rândul S. officinalis
din Europa de Sud-Est, chiar dacă constituenții uleiurilor esențiale diferă
considerabil în funcție de mutabilitatea genetică individuală, diferitele porțiuni
ale plantei și perioadele de creștere. Conținutul și distribuția acestor componente
au variat între speciile studiate, datorită mai multor factori extrinseci care
afectează compoziția metaboliților secundari. Prin urmare, pentru a obține un
nivel ridicat de descoperiri științifice și experimentale și pentru a verifica
eficacitatea și siguranța autentică a produselor vegetale care au fost utilizate de
oameni de milenii, sunt necesare investigații suplimentare bine concepute (180).
Testele antimicrobiene efectuate au arătat că extractele de S. byzantina, S.
officinalis și S. sylvatica prezentat activitate antibacteriană în special împotriva
microorganismelor Gram-pozitive, efectul fiind mai mic la cele Gram-negative.
Cele mai relevante rezultate au fost obţinute la speciile S. byzantina şi S. sylvatica

83
împotriva S. epidermidis şi P. mirabilis. Utilizarea tradițională a speciilor Stachys
derivă din efectele medicinale cunoscute, astfel încât identificarea și
cuantificarea compușilor bioactivi conduc la posibilități multiple de exploatare a
acestor calități pentru sănătate și ca remedii naturale. Pe lângă creșterea
înțelegerii consumatorilor cu privire la beneficiile pentru sănătate ale acestor
specii de Stachys, această investigație oferă un mijloc de a proteja o moștenire
genetică și culturală valoroasă.
Analiza cromatografică preliminară a polifenolilor din părțile aeriene a
patru specii de Stachys din flora Olteniei a fost realizată prin HPTLC cuplat cu
fotodensitometrie. Identificată și cuantificată în extractele metanolice 20% de
Stachydis herba, cantitatea de acid clorogenic a fost fluctuantă (mg %): S. recta
(59.88) > S. sylvatica (32.90) > S. officinalis (31.34) > S. germanica (25.16).
Extractele din plantele de Stachys prezintă o compoziție chimică bogată în
compuși fenolici benefici în tratamente medicale diverse. Florile sunt mai bogate
în acești compuși comparativ cu tulpinile sau frunzele, dar împreună creionează
un profil bogat și divers. Elemente valoroase precum acizi hidroxibenzoici sau
hidroxicinamici conduc la posibilitatea utilizării lor în domenii medicale,
alimentare sau cosmetic. Flavonoidele se regăsesc la valorile cele mai
semnificative în Stachys officinalis, urmată de Stachys palustris și Stachys
sylvatica, iar acumularea este mai ridicată în flori comparativ cu extractele din
tulpini sau frunze. Antocianii sunt specifici extractelor din flori, valorile decelate
fiind maxime în cazul speciei Stachys officinalis, iar taninurile se acumulează în
cuantumuri care se regăsesc și în literatura de specialitate, valorile mai
semnificative fiind specifice speciei Stachys officinalis. Din rezultatele obținute
se remarcă faptul că cele trei specii studiate prezintă o încărcătură bogată în
antioxidanți naturali, cu valori ale FRAP care le situează în lista recomandată în
utilizarea lor ulterioară atât în medicină/farmacie cât și pentru obținerea de
alimente funcționale sau cu aplicabilitate în industria cosmetică.

84
 Pentru prima dată a fost cercetat uleiul volatil obţinut din părţile aeriene
provenite de la trei specii de Stachys (S. germanica, S. recta şi S. sylvatica) din
flora României, zona de sud-vest (Oltenia).
Determinarea cantitativă a uleiului volatil s-a efectuat cu ajutorul metodei
NeoClevenger, conform F.R. X (S. germanica – 1.15%, S. recta – 1.05% şi
S. sylvatica – 0.95%).
Identificarea şi determinarea cantitativă pentru cele 20 de componente
principale din uleiurile volatile s-au realizat prin metoda GC–MS.
În uleiul volatil de S. germanica, două componente au concentraţia cea mai
mare: cariofilen şi valencen.
Uleiurile volatile de S. recta şi S. sylvatica prezintă un singur component
cu concentraţia cea mai mare: α-felandren.
Constituentul major al speciei Stachys s-a dovedit a fi germacrenul D. La
specia Stachys studiată valorile germacrenului D au fost cuprinse între 25.2% (S.
officinalis) și 21.9% (S. sylvatica). Cu toate acestea, a fost identificată și prezența
altor substanțe active precum limonen, β-pinen, β-cuben, β-cariofilen și linalool.
Linaloolul a fost identificat și cuantificat la valori între 2.5% (S sylvatica)
și 5.4% (S. officinalis), iar nerolidolul variază de la 2.7% (S. byzantina) la 4.7%
pentru (S sylvatica), procente diferite față de alte studii. (0.3–0.8%, 0.8%. La
toate cele trei specii studiate s-a identificat α-humulenă, valorile constatate fiind
între 2.7% (S. byzantina) și 1.1% pentru (S. sylvatica) și acetatul de linalool a fost
între 0.3% și 0.8% Compușii volatili identificați au specificitate pentru fiecare
extract, rezultatele obținute fiind un etalon pentru zona lor de origine.

85
 6. BIBLIOGRAFIE

1. Ciocârlan V. Flora ilustrată a României. Pteridophyta et Spermatophyta.

Editura Ceres, București, 2009.
2. Lazarević JS, Ðorđević AS, Kitić D V, Zlatković BK, Stojanović GS.
Chemical Composition and Antimicrobial Activity of the Essential Oil of
Stachys officinalis (L.) TREVIS. Lamiaceae) Chem Biodivers. 10:1335–
1349.
3. Bilušić Vundać V. Taxonomical and phytochemical characterisation of
10 Stachys taxa recorded in the Balkan Peninsula flora: A review. Plants.
8(2):32.
4. Kiliç Ö, Özdemir FA, Yildirimli Ş. Essential oils and fatty acids of
Stachys L. taxa, a chemotaxonomic approach. Prog Nutr. 19:49–59.
5. Vundac VB, Pfeifhofer HW, Brantner AH, Males Z, Plazibat M.
Essential oils of seven Stachys taxa from Croatia. Biochem Syst Ecol.
34(12):875–881.
6. Meremeti A, Karioti A, Skaltsa H, Heilmann J, Sticher O. Secondary
metabolites from Stachys ionica. Biochem Syst Ecol. 32:139–151.
7. Piozzi F, Bruno M. Diterpenoids from Roots and Aerial Parts of the
Genus Stachys. Nat Prod. 2011;5:1–11.
8. Tübitak U. Use of Stachys Species (Mountain Tea) as Herbal Tea and
Food. Rec Nat Prod. 8:71–82.
9. Murata T, Endo Y, Miyase T, Yoshizaki F. Iridoid glycoside constituents
of Stachys lanata. J Nat Prod. 71:1768–1770.
10. Renda G, Bektaş Y, Nurdan, Korkmaz B, Çelik T, Gonca, et al. Volatile
constituents of three Stachys L. Species from Turkey. Marmara Pharm J.
21(2):278–285,.
11. Eryiğit T, Tunctürk M, Tunctürk R. Determination of nutritive value and

86
 analysis of mineral elements for wild edible Stachys lavandulifolia Vahl.
var. lavandulifolia Growing in Eastern Anatolia. Int J Agric Environ
Food Sci. 3:6–9.
12. Saeedi M, Morteza-Semnani K, Mahdavi MR, Rahimi F. Antimicrobial
studies on extracts of four species of Stachys. Indian J Pharm Sci.
70:403–406.
13. Skaltsa HD, Demetzos C, Lazari D, Sokovic M. Essential oil analysis
and antimicrobial activity of eight Stachys species from Greece.
Phytochemistry. 2003 Oct;64(3):743–52.
14. Jahani R, Khaledyan D, Jahani A, Jamshidi E, Kamalinejad M,
Khoramjouy M, et al. Evaluation and comparison of the antidepressant-
like activity of Artemisia dracunculus and Stachys lavandulifolia
ethanolic extracts: an in vivo study. Res Pharm Sci.
15. Sadeghi H, Mansourian M, Panahi kokhdan E, Salehpour Z, Sadati I,
Abbaszadeh‐Goudarzi K, et al. Antioxidant and protective effect of
Stachys pilifera Benth against nephrotoxicity induced by cisplatin in rats.
J Food Biochem. 2020 May 10;44(5).
16. *** Flora RPR. vol VIII, Ed.Academiei RPR, București, 1960.
17. Bilušić Vundać V. Taxonomical and Phytochemical Characterisation of
10 Stachys Taxa Recorded in the Balkan Peninsula Flora: A Review.
Plants. 2019 Jan 29;8(2):32.
18. Tutin TG, Burges NA, Chater AO, Edmondson JR, Heywood VH,
Moore DM, Valentine DH, Walters SM, Webb DA, eds. Flora Europea.
vol III, Diapensaceae to Myoporaceae, Cambridge at the University
Press, 1972.
19. Mohammadi M, Kharazian N. Untargeted metabolomics study and
identification of potential biomarkers in the six sections of the genus
Stachys L. (Lamiaceae) using HPLC‐MQ‐API‐MS/MS. Phytochem
Anal. 2022 Aug 7;33(6):915–42.
87
20. A. N, M. N, G. C, N. B, A. C, M. B, et al. The chemical composition of
the aerial parts of Stachys spreitzenhoferi (Lamiaceae) growing in
Kythira Island (Greece), and their antioxidant, antimicrobial, and
antiproliferative properties. Phytochemistry,Volume. 203.
21. Nasrollahi S, Ghoreishi SM, Ebrahimabadi AH, Khoobi A. Gas
chromatography-mass spectrometry analysis and antimicrobial,
antioxidant and anti-cancer activities of essential oils and extracts of
Stachys schtschegleevii plant as biological macromolecules. Int J Biol
Macromol. 128:718–723.
22. Pirbalouti AG, Mohammadi M. Phytochemical composition of the
essential oil of different populations of Stachys lavandulifolia Vahl.
Asian Pac J Trop Biomed. 3(2):123–128.
23. Ramak P, Talei GR. Chemical composition, cytotoxic effect and
antimicrobial activity of Stachys koelzii Rech.f. essential oil against
periodontal pathogen Prevotella intermedia. Microb Pathog. 124:272–
278.
24. Tomás-Barberán FA, Gil MI, Ferreres F, Tomás-Lorente F. Flavonoid p-
coumaroylglucosides and 8-hydroxyflavone allosylglucosides in some
Labiatae. Phytochemistry. 31:3097–3102.
25. Khanavi M, Hadjiakhoondi A, Oveisi MR. Comparison of the
antioxidant activity and total phenolic contents in some Stachys species.
Artic AFRICAN J Biotechnol. 2009;
26. Namvar K, Mohammadi A, Ataei Salehi E, Feyzi P. Evaluation of
Solvent Effect (Methanol: Water Mixture) on the Phenolic Content and
Antioxidant Activities of Stachys turcomanica Trautv. Pharm Sci. 2017
Sep 30;23(3):244–8.
27. El-Ansari MA, Nawwar MA, Saleh NAM. Stachysetin, a diapigenin-7-
glucoside-p,p′-dihydroxy-truxinate from Stachys aegyptiaca.
Phytochemistry. 1995 Nov;40(5):1543–8.
88
28. Marin PD, Grayer RJ, Grujic-Jovanovic S, Kite GC, Veitch NC.
Glycosides of tricetin methyl ethers as chemosystematic markers in
Stachys subgenus Betonica. Phytochemistry. 2004 May;65(9):1247–53.
29. Skaltsa H, Georgakopoulos P, Lazari D, Karioti A, Heilmann J, Sticher
O, et al. Flavonoids as chemotaxonomic markers in the polymorphic
Stachys swainsonii (Lamiaceae). Biochem Syst Ecol. 2007
May;35(5):317–20.
30. Kotsos MP, Aligiannis N, Mitakou S. A new flavonoid diglycoside and
triterpenoids from Stachys spinosa L. (Lamiaceae). Biochem Syst Ecol.
2007 Jun;35(6):381–5.
31. Murata T, Endo Y, Miyase T, Yoshizaki F. Iridoid Glycoside
Constituents of Stachys lanata. J Nat Prod. 2008 Oct 24;71(10):1768–70.
32. S RK, A R, SA G. Evaluation of antioxidant activity, total phenolics,
total flavonoids and LC-MS/MS characterisation of phenolic constituents
in Stachys lavandulifolia.
33. Bingol MN, Bursal E. LC-MS/MS Analysis of Phenolic Compounds and
In Vitro Antioxidant Potential of Stachys lavandulifolia Vahl. var.
brachydon Boiss. Int Lett Nat Sci. 2018 Nov;72:28–36.
34. Bahadori MB, Kirkan B, Sarikurkcu C. Phenolic ingredients and
therapeutic potential of Stachys cretica subsp. smyrnaea for the
management of oxidative stress, Alzheimer’s disease, hyperglycemia,
and melasma. Ind Crops Prod. 2019 Jan;127:82–7.
35. El-Ansari MA, Abdalla MF, Saleh NAM, Barron D, Le Quéré JL.
Flavonoid constituents of Stachys aegyptiaca. Phytochemistry. 1991
Jan;30(4):1169–73.
36. Meremeti A, Karioti A, Skaltsa H, Heilmann J, Sticher O. Secondary
metabolites from Stachys ionica. Biochem Syst Ecol. 2004
Feb;32(2):139–51.
37. Pritsas A, Tomou E-M, Tsitsigianni E, Papaemmanouil CD, Diamantis
89
 DA, Chatzopoulou P, et al. Valorisation of stachysetin from cultivated
Stachys iva Griseb. as anti-diabetic agent: a multi-spectroscopic and
molecular docking approach. J Biomol Struct Dyn. 2021 Nov
22;39(17):6452–66.
38. Delnavazi M-R, Saiyarsarai P, Jafari-Nodooshan S, Khanavi M, Tavakoli
S, Hadavinia H, et al. Cytotoxic Flavonoids from the Aerial Parts of
Stachys lavandulifolia Vahl. Pharm Sci. 2018 Dec 30;24(4):332–9.
39. Lakhal H, Boudiar T, Kabouche A, Laggoune S, Kabouche Z, Topcu G.
Antioxidant activity and flavonoids of Stachys ocymastrum. Chem Nat
Compd. 46(6):964–965.
40. Ertas A, Yener I. A comprehensive study on chemical and biological
profiles of three herbal teas in Anatolia; rosmarinic and chlorogenic
acids. South African J Bot. 2020 May;130:274–81.
41. Elfalleh W, Kirkan B, Sarikurkcu C. Antioxidant potential and phenolic
composition of extracts from Stachys tmolea: An endemic plant from
Turkey. Ind Crop Prod. 127:212–216.
42. Nazemiyeh H, Shoeb M, Movahhedin N, Kumarasamy Y, Talebpour A-
H, Delazar A, et al. Phenolic compounds and their glycosides from
Stachys schtschegleevii (Lamiaceae). Biochem Syst Ecol. 2006
Sep;34(9):721–3.
43. Kotsos M, Aligiannis N, Mitaku S, Skaltsounis A-L, Charvala C.
Chemistry of Plants from Crete: Stachyspinoside, a New Flavonoid
Glycoside And iridoids from Stachys spinosa. Nat Prod Lett. 2001
Dec;15(6):377–86.
44. Lenherr A, Meier B, Sticher O. Modern HPLC as a Tool for
Chemotaxonomical Investigations: Iridoid Glucosides and Acetylated
Flavonoids in the Group of Stachys recta 1. Planta Med. 1984 Oct
26;50(05):403–9.
45. Karioti A, Bolognesi L, Vincieri FF, Bilia AR. Analysis of the
90
 constituents of aqueous preparations of Stachys recta by HPLC–DAD
and HPLC–ESI-MS. J Pharm Biomed Anal. 2010 Sep;53(1):15–23.
46. Venditti A, Bianco A, Quassinti L, Bramucci M, Lupidi G, Damiano S,
et al. Phytochemical Analysis, Biological Activity, and Secretory
Structures of Stachys annua (L.) L. subsp. annua (Lamiaceae) from
Central Italy. Chem Biodivers. 2015 Aug;12(8):1172–83.
47. Afouxenidi A, Milošević-Ifantis T, Skaltsa H. Secondary metabolites
from Stachys tetragona Boiss. &amp; Heldr. ex Boiss. and their
chemotaxonomic significance. Biochem Syst Ecol. 2018 Dec;81:83–5.
48. Kotsos MP, Aligiannis N, Mitakou S. A new flavonoid diglycoside and
triterpenoids from Stachys spinosa L. Lamiaceae) Biochem Syst Ecol.
35:381–385,.
49. Bahadori MB, Zengin G, Dinparast L, Eskandani M. The health benefits
of three Hedgenettle herbal teas (Stachys byzantina, Stachys inflata, and
Stachys lavandulifolia)-profiling phenolic and antioxidant activities. Eur
J Integr Med. 36:101134.
50. Lazarevic J, Palic R, Radulovic N, Ristic N, Stojanovic G. Chemical
composition and screening of the antimicrobial and anti-oxidative
activity of extracts of Stachys species. J Serbian Chem Soc.
2010;75(10):1347–59.
51. Renda G, Yazıcı Bektaş N, Korkmaz B, Çelik G, Sevgi S, Yaylı N.
Türkiye’den Üç Stachys L. Türünün Uçucu Bileşenleri. Marmara Pharm
J. 2017 Apr 1;21(2):278–278.
52. Háznagy-Radnai E, Czigle S, Máthé I. TLC and GC analysis of the
essential oils of Stachys species. J Planar Chromatogr – Mod TLC. 2007
Jun;20(3):189–96.
53. Goren AC, Piozzi F, Akcicek E, Kılıç T, Çarıkçı S, Mozioğlu E, et al.
Essential oil composition of twenty-two Stachys species (mountain tea)
and their biological activities. Phytochem Lett. 2011 Dec;4(4):448–53.
91
54. §can GI, Demirci B, Demirci F, Bülent Y, Can KKH, §er BA.
ANTIMICROBIAL EVALUATION OF STACHYS CITRINA SUBSP.
CITRINA ESSENTIAL OIL. Turk J Pharm Sci. 2012;9(2).
55. Demiray H, Tabanca N, Estep AS, Becnel JJ, Demirci B. Chemical
composition of the essential oil and n-hexane extract of Stachys tmolea
subsp. Tmolea Boiss., an endemic species of Turkey, and their
mosquitocidal activity against dengue vector Aesdes aegypti. Saudi
Pharm J.
56. Atanasov AG, Waltenberger B, Pferschy-Wenzig E-M, Linder T,
Wawrosch C, Uhrin P, et al. Discovery and resupply of
pharmacologically active plant-derived natural products: A review.
Biotechnol Adv. 2015 Dec;33(8):1582–614.
57. Perrino E V., Valerio F, Gannouchi A, Trani A, Mezzapesa G.
Ecological and Plant Community Implication on Essential Oils
Composition in Useful Wild Officinal Species: A Pilot Case Study in
Apulia (Italy). Plants. 2021 Mar 18;10(3):574.
58. Sarvi Moghanlou K, Nasr Isfahani E, Dorafshan S, Tukmechi A, Aramli
MS. Effects of dietary supplementation with Stachys lavandulifolia Vahl
extract on growth performance, hemato-biochemical and innate
immunity parameters of rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss ). Anim
Feed Sci Technol. 2018 Mar;237:98–105.
59. Serbetçi T, Demirci B, Güzel CB, Kültür S, Ergüven M, Başer KHC.
Essential oil composition, antimicrobial and cytotoxic activities of two
endemic Stachys cretica subspecies (Lamiaceae) from Turkey. Nat Prod
Commun. 2010 Sep;5(9):1369–74.
60. Conforti F, Menichini F, Formisano C, Rigano D, Senatore F, Arnold
NA, et al. Comparative chemical composition, free radical-scavenging
and cytotoxic properties of essential oils of six Stachys species from
different regions of the Mediterranean Area. Food Chem. 2009 Oct
92
 15;116(4):898–905.
61. Kartsev VG, Stepanichenko NN, Auelbekov SA. Chemical composition
and pharmacological properties of plants of the genusStachys. Chem Nat
Compd. 1994 Nov 1;30(6):645–54.
62. Ferhat M, Erol E, Beladjila KA, Çetintaş Y, Duru ME, Öztürk M, et al.
Antioxidant, anticholinesterase and antibacterial activities of Stachys
guyoniana and Mentha aquatica. Pharm Biol. 2017 Jan 1;55(1):324–9.
63. Lazarević JS, Ðorđević AS, Kitić D V., Zlatković BK, Stojanović GS.
Chemical Composition and Antimicrobial Activity of the Essential Oil of
Stachys officinalis (L.) Trevis . (Lamiaceae). Chem Biodivers. 2013
Jul;10(7):1335–49.
64. Tomou E-M, Barda C, Skaltsa H. Genus Stachys: A Review of
Traditional Uses, Phytochemistry and Bioactivity. Medicines. 2020 Sep
29;7(10):63.
65. Gad HA, Mukhammadiev EA, Zengen G, Musayeib NM Al, Hussain H,
Bin Ware I, et al. Chemometric Analysis Based on GC-MS Chemical
Profiles of Three Stachys Species from Uzbekistan and Their Biological
Activity. Plants. 2022 Apr 29;11(9):1215.
66. Ahmadvand H, * SF, Amiri H, Amiri A. The Antioxidant Properties and
Chemical Composition of Stachys inflata Benth Leaves Grown Wild in
Lorestan Province. Herb Med J (Herb Med J). 2017 Dec 29;2(3):97–104.
67. Bursal E, Taslimi P, A.C. G, Gülçin I. Assessments of anticholinergic,
antidiabetic, antioxidant activities and phenolic content of Stachys annua.
Biocatal Agric Biotechnol. 28:101711.
68. Alpay M, Dulger G, Karabacak E. ANTIOXIDANT, ANTIMICROBIAL
AND ANTITUMORAL EFFECTS OF STACHYS ANNUA (L.) L.
SUBSP. ANNUA VAR. ANNUA IN COMPARATIVE CANCER
PROFILES. Open Access J Indian J Med Res Pharm Sci. 2017;4(12).
69. Šliumpaitė I, Venskutonis PR, Murkovic M, Ragažinskienė O.
93
 Antioxidant properties and phenolic composition of wood betony
(Betonica officinalis L., syn. Stachys officinalis L.). Ind Crops Prod.
2013 Oct;50:715–22.
70. Tundis R, Bonesi M, Pugliese A, Nadjafi F, Menichini F, Loizzo MR.
Tyrosinase, Acetyl-and Butyryl-Cholinesterase Inhibitory Activity of
Stachys lavandulifolia Vahl (Lamiaceae) and Its Major Constituents. Nat
Prod. 2015;9:81–93.
71. N. BM, E B. LC-MS/MS Analysis of Phenolic Compounds and In Vitro
Antioxidant potential of Stachys lavandulifolia Vahl. In: var brachydon
Boiss, International Letters of Natural Sciences 2018. p. 28–36.
72. Grigorakis S, Makris D. Characterisation of Polyphenol-Containing
Extracts from Stachys mucronata and Evaluation of Their Antiradical
Activity. Medicines. 2018 Jan 27;5(1):14.
73. Kirkan B. Antioxidant potential, enzyme inhibition activity, and phenolic
profile of extracts from Stachys cretica subsp. vacillans. Ind Crops Prod.
2019 Nov;140:111639.
74. Laggoune S, Zeghib A, Kabouche A, Kabouche Z, Maklad YA, Leon F,
et al. Components and antioxidant, anti-inflammatory, anti-ulcer and
antinociceptive activities of the endemic species Stachys mialhesi de
Noé. Arab J Chem. 2016 Sep;9:S191–7.
75. A. EH, Ebrahimabadi EH, Djafari-Bidgoli Z, Kashi FJ, Mazoochi A,
Batooli H. Composition and antioxidant and antimicrobial activity of the
essential oil and extracts of Stachys inflata Benth from Iran. Food Chem.
119(ue 2).
76. Bilušić Vundać V, Brantner AH, Plazibat M. Content of polyphenolic
constituents and antioxidant activity of some Stachys taxa. Food Chem.
2007 Jan;104(3):1277–81.
77. Kukić J, Petrović S, Niketić M. Antioxidant Activity of Four Endemic
Stachys Taxa. Biol Pharm Bull. 2006;29(4):725–9.
94
78. Erdemoglu N, Turan NN, Cakõcõ I, Sener B, Aydõn A. Antioxidant
activities of some Lamiaceae plant extracts. Phyther Res. 2006
Jan;20(1):9–13.
79. Stegăruș DI, Lengyel E, Apostolescu GF, Botoran OR, Tanase C.
Phytochemical Analysis and Biological Activity of Three Stachys
Species (Lamiaceae) from Romania. Plants. 2021 Dec 9;10(12):2710.
80. Shakeri A, D’Urso G, Taghizadeh SF, Piacente S, Norouzi S, Soheili V,
et al. LC-ESI/LTQOrbitrap/MS/MS and GC–MS profiling of Stachys
parviflora L. and evaluation of its biological activities. J Pharm Biomed
Anal. 2019 May;168:209–16.
81. Şen A, Göğer F, Dogan A, Bitis L. Two Acylated Isoscutellarein
Glucosides with Anti-Inflammatory and Antioxidant Activities Isolated
from Endemic Stachys Subnuda Montbret &amp; Aucher ex Benth. Acta
Chim Slov. 2019 Dec 18;831–8.
82. Jaradat N, Al-Maharik N. Fingerprinting, Antimicrobial, Antioxidant,
Anticancer, Cyclooxygenase and Metabolic Enzymes Inhibitory
Characteristic Evaluations of Stachys viticina Boiss. Essential Oil.
Molecules. 2019 Oct 28;24(21):3880.
83. Abichandani M, Nahar L, Singh P, Chitnis R, Nazemiyeh H, Delazar A,
et al. Antibacterial and free-radical-scavenging properties of Stachys
schtschegleevii (Lamiaceae). Arch Biol Sci. 2010;62(4):941–5.
84. Dulger B, Gonuz A. Antimicrobial Activity of Some Endemic
Verbascum , Salvia , and Stachys Species. Pharm Biol. 2004 Jan
29;42(4–5):301–4.
85. Dulger G, Aki C. Antimicrobial Activity of the Leaves of Endemic
Stachys pseudopinardii in Turkey. Trop J Pharm Res. 2009 Aug 20;8(4).
86. Dulger G, Dulger B. Antimicrobial Potential of the Leaves of Stachys
pseudopinardii on Microorganisms Isolated from Urinary Tract
Infections. J Adv Med Med Res. 7(10):821–826.
95
87. Stegăruș DI, Lengyel E, Apostolescu GF, Botoran OR, Tanase C.
Phytochemical Analysis and Biological Activity of Three Stachys
Species (Lamiaceae) from Romania. Plants. 10(12).
88. Napolitano A, Di Napoli M, Castagliuolo G, Badalamenti N, Cicio A,
Bruno M, et al. The chemical composition of the aerial parts of Stachys
spreitzenhoferi (Lamiaceae) growing in Kythira Island (Greece), and
their antioxidant, antimicrobial, and antiproliferative properties.
Phytochemistry. 2022 Nov;203:113373.
89. Cüce M, Bekircan T, Laghari AH, Sökmen M, Sökmen A, Önay Uçar E,
et al. Antioxidant phenolic constituents, antimicrobial and cytotoxic
properties of Stachys annua L. from both natural resources and
micropropagated plantlets. Indian J Tradit Knowl. 2017;16(3):407–16.
90. İşcan G, Köse YB, Demİrcİ B. Chemical Composition and Antimicrobial
Effects of Stachys Rupestris Essential Oil. Anadolu Univ J Sci Technol
Life Sci Biotechnol. 4:41–47.
91. Ristic N, Lazarevic J, Radulovic N, Palic R. Antimicrobial Activity of
the Essential Oils of Selected Stachys Species. Chem Nat Compd. 2008
Jul 30;44(4):522–5.
92. Morteza-Semnani K, Mahdavi M, Rahimi F, Saeedi M. Antimicrobial
studies on extracts of four species of Stachys. Indian J Pharm Sci.
2008;70(3):403.
93. Bahadori MB, Zengin G, Dinparast L, Eskandani M. The health benefits
of three Hedgenettle herbal teas (Stachys byzantina, Stachys inflata, and
Stachys lavandulifolia) - profiling phenolic and antioxidant activities.
Eur J Integr Med. 2020 Jun;36:101134.
94. Sarikurkcu C, Kocak MS, Uren MC, Calapoglu M, Sihoglu Tepe A.
Potential sources for the management global health problems and
oxidative stress: Stachys byzantina and S. iberica subsp. iberica var.
densipilosa. Eur J Integr Med. 2016 Oct;8(5):631–7.
96
95. HARADA S, TSUJITA T, ONO A, MIYAGI K, MORI T,
TOKUYAMA S. Stachys sieboldii (Labiatae, Chorogi) Protects against
Learning and Memory Dysfunction Associated with Ischemic Brain
Injury. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 2015;61(2):167–74.
96. Jalilian N, Modarresi M, Rezaie M, Ghaderi L, Bozorgmanesh M.
Phytotherapeutic Management of Polycystic Ovary Syndrome: Role of
Aerial Parts of Wood Betony ( Stachys lavandulifolia ). Phyther Res.
2013 Nov;27(11):1708–13.
97. Pahlevani P, Mosavi S, Rastgoo Haghi A, Lahotian H, Esna Ashari F,
Alizadeh Z, et al. Study of the Effects of Stachys Lvandulifolia
Alcoholic Extract on Histomorphometry of Endometrium in Polycystic
Ovarian Syndrome Rat Model. Avicenna J Clin Med. 23(1).
98. Kolivand M, Keramat A, Khosravi A. The Effect of Herbal Teas on
Management of Polycystic Ovary Syndrome: A Systematic Review. J
Midwifery Reprod Heal. 5(4):1098–1106.
99. Moini Jazani A, Nasimi Doost Azgomi H, Nasimi Doost Azgomi A. A
comprehensive review of clinical studies with herbal medicine on
polycystic ovary syndrome (PCOS. DARU J Pharm Sci. 27:863–877.
100. Alizadeh F, Ramezani M, Piravar Z. Effects of Stachys sylvatica
hydroalcoholic extract on the ovary and hypophysis-gonadal axis in a rat
with polycystic ovary syndrome. Middle East Fertil Soc J. 2020 Dec
30;25(1):4.
101. Kokhdan E, Sadeghi H, Ghafoori H, Sadeghi H, Danaei N, Javadian H,
et al. Cytotoxic effect of methanolic extract, alkaloid and terpenoid
fractions of Stachys pilifera against HT-29 cell line. Res Pharm Sci.
2018;13(5):404.
102. Mansourian M, Mirzaei A, Azarmehr N, Vakilpour H, Kokhdan EP,
Doustimotlagh AH. Hepatoprotective and antioxidant activity of
hydroalcoholic extract of Stachys pilifera. Benth on acetaminophen-
97
 induced liver toxicity in male rats. Heliyon. 2019 Dec;5(12):e03029.
103. Abi-Rizk A, Rayess Y El, Iriti M, Tabet E, Mezher R, Beyrouthy M El.
Chemical composition, antitumor and antioxidant effects of four
lebanese plants extracts on human pulmonary adenocarcinoma. Nat Prod
Res. 2021 Nov 17;35(22):4861–4.
104. Jassbi AR, Miri R, Asadollahi M, Javanmardi N, Firuzi O. Cytotoxic,
antioxidant and antimicrobial effects of nine species of woundwort (
Stachys ) plants. Pharm Biol. 2014 Jan 12;52(1):62–7.
105. Ma L, Qin C, Wang M, Gan D, Cao L, Ye H, et al. Preparation,
preliminary characterization and inhibitory effect on human colon cancer
HT-29 cells of an acidic polysaccharide fraction from Stachys floridana
Schuttl. ex Benth. Food Chem Toxicol. 2013 Oct;60:269–76.
106. Háznagy-Radnai E, Réthy B, Czigle S, Zupkó I, Wéber E, Martinek T, et
al. Cytotoxic activities of Stachys species. Fitoterapia. 2008 Dec;79(7–
8):595–7.
107. Mohamed TA, Elshamy AI, Hamed AR, Shams KA, Hegazy M-EF.
Cytotoxic neo-clerodane diterpenes from Stachys aegyptiaca. Phytochem
Lett. 2018 Dec;28:32–6.
108. Slapšytė G, Dedonytė V, Adomėnienė A, Lazutka JR, Kazlauskaitė J,
Ragažinskienė O, et al. Genotoxic properties of Betonica officinalis,
Gratiola officinalis, Vincetoxicum luteum and Vincetoxicum
hirundinaria extracts. Food Chem Toxicol. 2019 Dec;134:110815.
109. Nasrollahi S, Ghoreishi SM, Ebrahimabadi AH, Khoobi A. Gas
chromatography-mass spectrometry analysis and antimicrobial,
antioxidant and anti-cancer activities of essential oils and extracts of
Stachys schtschegleevii plant as biological macromolecules. Int J Biol
Macromol. 2019 May;128:718–23.
110. Ramak P, Talei GR. Chemical composition, cytotoxic effect and
antimicrobial activity of Stachys koelzii Rech.f. essential oil against
98
 periodontal pathogen Prevotella intermedia. Microb Pathog. 2018
Nov;124:272–8.
111. Amirghofran Z, Bahmani M, Azadmehr A, Javidnia K. Anticancer
effects of various Iranian native medicinal plants on human tumor cell
lines. Neoplasma. 2006;53(5):428–33.
112. Mamadalieva NZ, Mamedov NA, Craker LE, Tiezzi A.
ETHNOBOTANICAL USES AND CYTOTOXIC ACTIVITIES OF
NATIVE PLANTS FROM THE LAMIACEAE FAMILY IN
UZBEKISTAN. Acta Hortic. 2014 Apr;(1030):61–70.
113. Uritu CM, Mihai CT, Stanciu G-D, Dodi G, Alexa-Stratulat T, Luca A,
et al. Medicinal Plants of the Family Lamiaceae in Pain Therapy: A
Review. Pain Res Manag. 2018 May 8;2018:1–44.
114. Mladenova T, Batsalova T, Dzhambazov B, Mladenov R, Teneva I,
Stoyanov P, et al. Antitumor and Immunomodulatory Properties of the
Bulgarian Endemic Plant Betonica bulgarica Degen et Neič.
(Lamiaceae). Plants. 2022 Jun 26;11(13):1689.
115. Na E, Lee JW, Winkler S, Lim SY. Antiproliferative Properties of
Extracts from Stachys sieboldii MIQ. Curr Bioact Compd. 2020 Jun
10;16(3):342–7.
116. Venditti A, Frezza C, Celona D, Bianco A, Serafini M, Cianfaglione K,
et al. Polar constituents, protection against reactive oxygen species, and
nutritional value of Chinese artichoke (Stachys affinis Bunge). Food
Chem. 2017 Apr;221:473–81.
117. Lee JK, Lee J, Kim Y-K, Lee Y, Ha J-H. Stachys sieboldii Miq. root
attenuates weight gain and dyslipidemia in rats on a high-fat and high-
cholesterol diet. Nutrients. 12.
118. Aminfar P, Abtahi M, Parastar H. Gas chromatographic fingerprint
analysis of secondary metabolites of Stachys lanata (Stachys byzantine
C. Koch) combined with antioxidant activity modelling using
99
 multivariate chemometric methods. J Chromatogr A. 2019
Sep;1602:432–40.
119. Lotfipour F, Nazemiyeh H, Fathi-Azad F, Garaei N, Arami S, Talat S, et
al. Evaluation of Antibacterial Activities of Some Medicinal Plants from
North-West Iran. Iran J Basic Med Sci. 2008 Apr 1;11(2):80–5.
120. Mulas M. Traditional uses of labiatae in the mediterranean area. Acta
Hortic. 723:25–32.
121. Altundag E, Ozturk M. Ethnomedicinal studies on the plant resources of
east Anatolia, Turkey. Procedia - Soc Behav Sci. 2011;19:756–77.
122. Asghari G, Akbari M, Asadi-Samani M. Phytochemical analysis of some
plants from Lamiaceae family frequently used in folk medicine in
Aligudarz region of Lorestan province. Marmara Pharm J. 2017 May
11;21(3):506–506.
123. Rabbani M, Sajjadi SE, Zarei HR. Anxiolytic effects of Stachys
lavandulifolia Vahl on the elevated plus-maze model of anxiety in mice.
J Ethnopharmacol. 2003 Dec;89(2–3):271–6.
124. Rabbani M, Sajjadi S-E, Karimi-Firozjai M, Ghannadian M. Bioactivity
guided isolation of apigenin from Stachys lavandulifolia Vahl. in mice
with anxiolytic effects. J Herbmed Pharmacol. 2018 Apr 1;7(2):74–8.
125. Hajhashemi V, Ghannadi A, Sedighifar S. Analgesic and anti-
inflammatory properties of the hydroalcoholic, polyphenolic and boiled
extracts of Stachys lavandulifolia. Res Pharm Sci. 2007 Oct 11;1(2):92–
8.
126. Jafarzadeh L, Asgari A. Teratogenic effects of hydroalcoholic extract of
Stachys lavandulifolia Vahl on the skeletal system and fetal growth in
Balb mice. J Shahrekord Univ Med Sci. 14(4):21–29.
127. Fazio C, Passannanti S, Paternostro M, Arnold N. Diterpenoids from
Stachys mucronata. Planta Med. 1994 Oct 4;60(05):499–499.
128. Gören AC. Use of Stachys Species (Mountain Tea) as Herbal Tea and
100
 Food. Nat Prod. 2014;8(2):71–82.
129. Lucchetti L, Zitti S, Taffetani F. Ethnobotanical uses in the Ancona
district (Marche region, Central Italy). J Ethnobiol Ethnomed. 2019 Dec
5;15(1):9.
130. Cornara L, La Rocca A, Terrizzano L, Dente F, Mariotti MG.
Ethnobotanical and phytomedical knowledge in the North-Western
Ligurian Alps. J Ethnopharmacol. 2014 Aug;155(1):463–84.
131. Gruenwald J, Brendleer T, Jaenicke T. PDR for Herbal Medicines.
Montvale, NJ, USA: Medical Economics Company; 832 p.
132. Rustaiyan A, Masoudi S, Ameri N, Samiee K, Monfared A. Volatile
Constituents of Ballota aucheri Boiss., Stachys benthamiana Boiss. and
Perovskia abrotanoides Karel. Growing Wild in Iran. J Essent Oil Res.
2006 Mar;18(2):218–21.
133. Ahmad VU, Arshad S, Bader S, Iqbal S, Khan A, Khan SS, et al. New
terpenoids from Stachys parviflora Benth. Magn Reson Chem. 2008
Oct;46(10):986–9.
134. Aysun Kepekçi R, Polat S, Çoşkun G, Çelik A, Bozkurt AS, Yumrutaş
Ö, et al. Preliminary Characterization of Phenolic Acid Composition and
Hepatoprotective Effect of Stachys pumila. J Food Biochem. 2017
Apr;41(2):e12286.
135. Cornara L, La Rocca A, Marsili S, Mariotti MG. Traditional uses of
plants in the Eastern Riviera (Liguria, Italy). J Ethnopharmacol. 2009
Aug;125(1):16–30.
136. Maleki F, Valilou MMS. Poulk Plant (Stachys schtschegleevii) and Its
Antibacterial Specifications. 2020 Nov 2;
137. Polat R, Cakilcioglu U, Kaltalioğlu K, Ulusan MD, Türkmen Z. An
ethnobotanical study on medicinal plants in Espiye and its surrounding
(Giresun-Turkey). J Ethnopharmacol. 2015 Apr;163:1–11.
138. Adams R. Identification of essential oils by ion trap mass spectrometry.
101
 New York: Academic Press; 1989. 17–280 p.
139. Oniga I, Benedec D, Hanganu D. Analiza produselor naturale
medicinale. Cluj-Napoca: Ed. Medicală Universitară ,,Iuliu Haţieganu”;
2003. 9–23 p.
140. ***. Farmacopeea Română ediţia a X-a. Bucureşti: Ed. Medicală; 1993.
1064–1065 p.
141. Bussmann RW, Sharon D. Traditional medicinal plant use in Northern
Peru: tracking two thousand years of healing culture. J Ethnobiol
Ethnomed. 2006 Dec 7;2(1):47.
142. Alexandre EMC, Silva S, Santos SAO, Silvestre AJD, Duarte MF,
Saraiva JA, et al. Antimicrobial activity of pomegranate peel extracts
performed by high pressure and enzymatic assisted extraction. FOOD
Res Int. 2019 Jan;115:167–76.
143. Popescu DI (Stegarus), Lengyel E, Apostolescu FG, Soare LC, Botoran
OR, Șuțan NA. Volatile Compounds and Antioxidant and Antifungal
Activity of Bud and Needle Extracts from Three Populations of Pinus
mugo Turra Growing in Romania. Horticulturae. 2022 Oct 14;8(10):952.
144. Lee J, Durst RW, Wrolstad RE, Eisele T, Giusti MM, Hach� J, et al.
Determination of Total Monomeric Anthocyanin Pigment Content of
Fruit Juices, Beverages, Natural Colorants, and Wines by the pH
Differential Method: Collaborative Study. J AOAC Int. 2005 Sep
1;88(5):1269–78.
145. GOMES CL, SILVA CCAR, MELO CG DE, FERREIRA MRA,
SOARES LAL, DA SILVA RMF, et al. Development of an analytical
method for determination of polyphenols and total tannins from leaves of
Syzygium cumini L. Skeels. An Acad Bras Cienc. 2021;93(2).
146. Altemimi A, Watson DG, Kinsel M, Lightfoot DA. Simultaneous
extraction, optimization, and analysis of flavonoids and polyphenols
from peach and pumpkin extracts using a TLC-densitometric method.
102
 Chem Cent J. 2015 Dec 20;9(1):39.
147. Bojić M, Simon Haas V, Šarić D, Maleš Ž. Determination of Flavonoids,
Phenolic Acids, and Xanthines in Mate Tea ( Ilex paraguariensis St.-
Hil.). J Anal Methods Chem. 2013;2013:1–6.
148. Jug U, Glavnik V, Kranjc E, Vovk I. High-performance thin-layer
chromatography and high-performance thin-layer chromatography–mass
spectrometry methods for the analysis of phenolic acids. JPC - J Planar
Chromatogr - Mod TLC. 2018 Feb;31(1):13–22.
149. Pozharitskaya ON, Ivanova SA, Shikov AN, Makarov VG. Separation
and free radical-scavenging activity of major curcuminoids ofCurcuma
longa using HPTLC-DPPH method. Phytochem Anal. 2008
May;19(3):236–43.
150. Nováková L, Vildová A, Mateus JP, Gonçalves T, Solich P.
Development and application of UHPLC–MS/MS method for the
determination of phenolic compounds in Chamomile flowers and
Chamomile tea extracts. Talanta. 2010 Sep 15;82(4):1271–80.
151. Bączek K, Kosakowska O, Przybył JL, Węglarz Z. Accumulation of
phenolic compounds in the purple betony herb ( Stachys officinalis L.)
originated from cultivation. Herba Pol. 2016 Jun 1;62(2):7–16.
152. Andonova T, Muhovski Y, Vrancheva R, Slavov I, Apostolova E,
Naimov S, et al. Antioxidant and DNA-Protective Potentials, Main
Phenolic Compounds, and Microscopic Features of Koelreuteria
paniculata Aerial Parts. Antioxidants. 2022 Jun 13;11(6):1154.
153. Lachowicz-Wiśniewska S, Pratap-Singh A, Kapusta I, Kruszyńska A,
Rapak A, Ochmian I, et al. Flowers and Leaves Extracts of Stachys
palustris L. Exhibit Stronger Anti-Proliferative, Antioxidant, Anti-
Diabetic, and Anti-Obesity Potencies than Stems and Roots Due to More
Phenolic Compounds as Revealed by UPLC-PDA-ESI-TQD-MS/MS.
Pharmaceuticals. 2022 Jun 23;15(7):785.
103
154. Matkowski A, Piotrowska M. Antioxidant and free radical scavenging
activities of some medicinal plants from the Lamiaceae. Fitoterapia.
2006 Jul;77(5):346–53.
155. Bursal E, Taslimi P, Gören AC, Gülçin İ. Assessments of
anticholinergic, antidiabetic, antioxidant activities and phenolic content
of Stachys annua. Biocatal Agric Biotechnol. 2020 Sep;28:101711.
156. Paun G, Neagu E, Moroeanu V, Albu C, Ursu T-M, Zanfirescu A, et al.
Anti-inflammatory and antioxidant activities of the Impatiens noli-
tangere and Stachys officinalis polyphenolic-rich extracts. Rev Bras
Farmacogn. 2018 Jan;28(1):57–64.
157. Carev I, Sarikurkcu C. LC-MS/MS Profiles and In Vitro Biological
Activities of Extracts of an Endemic Species from Turkey: Stachys
cretica ssp. anatolica. Plants. 2021 May 25;10(6):1054.
158. Gülsoy Toplan G, Taşkın T, Mataracı Kara E, Ecevit Genç G.
Antioxidant and antimicrobial activities of various extracts from Stachys
cretica subsp. bulgarica Rech.f., Stachys byzantina K. Koch and Stachys
thirkei K. Koch. İstanbul J Pharm. 2021 Dec 30;51(3):341–7.
159. Tomou E-M, Barda C, Skaltsa H. Genus Stachys: A Review of
Traditional Uses, Phytochemistry and Bioactivity. Medicines. 2020 Sep
29;7(10):63.
160. Amalan V, Vijayakumar N, Indumathi D, Ramakrishnan A. Antidiabetic
and antihyperlipidemic activity of p-coumaric acid in diabetic rats, role
of pancreatic GLUT 2: In vivo approach. Biomed Pharmacother. 2016
Dec;84:230–6.
161. Radnai E, Dobos A, Veres K, Toth I, Mathe I, Janicsak G, et al. Essential
oils in some Stachys species growing in Hungary. In: Szoke E, Mathe I,
Blunden G, Kery A, editors. PROCEEDINGS OF THE
INTERNATIONAL CONFERENCE ON MEDICINAL AND
AROMATIC PLANTS, PT II: (FOLLOW UP OF ACTA
104
 HORTICULTURAE 576). 2003. p. 137–42. (Acta Horticulturae).
162. Lashgargahi Z, Shafaghat A. Volatile Constituents of Essential Oils
Isolated from Fresh and Dried Stachys lavandulifolia Vahl. and Stachys
byzantina C. Koch. Two Lamiaceae from North-West Iran. J Essent Oil
Bear Plants. 2017 Sep 3;20(5):1302–9.
163. Anand U, Jacobo-Herrera N, Altemimi A, Lakhssassi N. A
Comprehensive Review on Medicinal Plants as Antimicrobial
Therapeutics: Potential Avenues of Biocompatible Drug Discovery.
Metabolites. 2019 Nov 1;9(11):258.
164. Ed-Dra A, Filali FR, Lo Presti V, Zekkori B, Nalbone L, Bouymajane A,
et al. Chemical composition, antioxidant capacity and antibacterial action
of five Moroccan essential oils against Listeria monocytogenes and
different serotypes of Salmonella enterica. Microb Pathog. 2020
Dec;149.
165. Sokovic M, Glamoclija J, Marin PD, Brkic D, van Griensven LJLD.
Antibacterial Effects of the Essential Oils of Commonly Consumed
Medicinal Herbs Using an In Vitro Model. MOLECULES. 2010
Nov;15(11):7532–46.
166. Mulyaningsih S, Sporer F, Zimmermann S, Reichling J, Wink M.
Synergistic properties of the terpenoids aromadendrene and 1,8-cineole
from the essential oil of Eucalyptus globulus against antibiotic-
susceptible and antibiotic-resistant pathogens. PHYTOMEDICINE. 2010
Nov;17(13):1061–6.
167. Jagani S, Chelikani R, Kim D-S. Effects of phenol and natural phenolic
compounds on biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.
Biofouling. 2009;25(4):321–4.
168. Bilusic Vundac V. Taxonomical and Phytochemical Characterisation of
10 Stachys Taxa Recorded in the Balkan Peninsula Flora: A Review.
PLANTS-BASEL. 2019 Feb;8(2).
105
169. Elfalleh W, Kirkan B, Sarikurkcu C. Antioxidant potential and phenolic
composition of extracts from Stachys tmolea: An endemic plant from
Turkey. Ind Crops Prod. 2019 Jan;127:212–6.
170. Grujic-Jovanovic S, Skaltsa HD, Marin P, Sokovic M. Composition and
antibacterial activity of the essential oil of sixStachys species from
Serbia. Flavour Fragr J. 2004 Mar;19(2):139–44.
171. Giuliani C, Pellegrino RM, Tirillini B, Bini LM. Composition of
essential oils from leaves and flowers of Stachys germanica subsp.
salviifolia (Ten.) gams (Labiatae) and related secretory structures. Nat
Prod Commun. 2009 Jun;4(6):831–4.
172. Kiliç Ö, Özdemir FA, Yildirimli S. Essential oils and fatty acids of
Stachys L. taxa, a chemotaxonomic approach. Prog Nutr. 2017 Oct
23;19(1-S):49–59.
173. Hajdari A, Novak J, Mustafa B, Franz C. Essential oil composition and
antioxidant activity of Stachys sylvatica L. (Lamiaceae) from different
wild populations in Kosovo. Nat Prod Res. 2012;26(18):1676–81.
174. Tirillini B, Pellegrino R, Bini LM. Essential oil composition of Stachys
sylvatica L. from Italy. FLAVOUR Fragr J. 2004;19(4):330–2.
175. Bahadori MB, Maggi F, Zengin G, Asghari B, Eskandani M. Essential
oils of hedgenettles (Stachys inflata, S. lavandulifolia, and S. byzantina)
have antioxidant, anti-Alzheimer, antidiabetic, and anti-obesity potential:
A comparative study. Ind Crops Prod. 2020 Mar;145.
176. Cavar S, Maksimovic M, Vidic D, Solic ME. Chemical composition of
the essential oil of Stachys menthifolia Vis. Pharm Biol. 2010
Feb;48(2):170–6.
177. Chalchat JC, Petrovic SD, Maksimovic ZA, Gorunovic MS. Essential oil
of Stachys officinalis (L.) Trevis., Lamiaceae from Montenegro. J Essent
OIL Res. 2001;13(4):286–7.
178. Vundac VB, Pfeifhofer HW, Brantner AH, Males Z, Plazibat M.
106
 Essential oils of seven Stachys taxa from Croatia. Biochem Syst Ecol.
2006 Dec;34(12):875–81.
179. Khanavi M, Hadjiakhoondi A, Amin G, Amanzadeh Y, Rustaiyan A,
Shafiee A. Comparison of the volatile composition of Stachys persica
Gmel. and Stachys byzantina C. Koch. Oils obtained by hydrodistillation
and steam distillation. ZEITSCHRIFT FUR Naturforsch Sect C-A J
Biosci. 2004;59(7–8):463–7.
180. Cozzolino R, De Giulio B, Petriccione M, Martignetti A, Malorni L,
Zampella L, et al. Comparative analysis of volatile metabolites, quality
and sensory attributes of Actinidia chinensis fruit. FOOD Chem. 2020
Jun;316.

107
7. ANEXE

108
 plants
Article
Phytochemical Analysis and Biological Activity of Three
Stachys Species (Lamiaceae) from Romania
Diana Ionela Stegărus, 1 , Ecaterina Lengyel 2 , George Florian Apostolescu 3 , Oana Romina Botoran 1, *
and Corneliu Tanase 4, *


Citation: Stegărus, , D.I.; Lengyel, E.;
Apostolescu, G.F.; Botoran, O.R.;
Tanase, C. Phytochemical Analysis
and Biological Activity of Three
Stachys Species (Lamiaceae) from
Romania. Plants 2021, 10, 2710.
https://doi.org/10.3390/
plants10122710
Academic Editors:
Pedro Diaz-Vivancos and
Gregorio Barba-Espín
Received: 17 November 2021
Accepted: 7 December 2021
Published: 9 December 2021
Publisher’s Note: MDPI stays neutral
with regard to jurisdictional claims in
published maps and institutional affil-
iations.
Copyright: © 2021 by the authors.
Licensee MDPI, Basel, Switzerland.
This article is an open access article
distributed under the terms and
conditions of the Creative Commons
Attribution (CC BY) license (https://
creativecommons.org/licenses/by/
4.0/).
Plants 2021, 10, 2710. https://doi.org/10.3390/plants10122710
1 National Research and Development Institute for Cryogenics and Isotopic Technologies—ICSI Ramnicu
Valcea, 4th Uzinei Street, 240050 Ramnicu Valcea, Romania; diana.stegarus@icsi.ro
2 Department of Agricultural Sciences and Food Engineering, Lucian Blaga University of Sibiu,
Doctor Ion Rat, iu 7, 550012 Sibiu, Romania; ecaterina.lengyel@ulbsibiu.ro
3 Department of Pharmacognosy & Phytotherapy, Faculty of Pharmacy, University of Medicine and
Pharmacy of Craiova, 2 Petru Rareş Street, 200349 Craiova, Romania; apostolescugeorge@yahoo.com
4 Department of Pharmaceutical Botany, “George Emil Palade” University of Medicine, Pharmacy,
Sciences and Technology of Târgu Mures, , 38 Gheorghe Marinescu Street, Târgu Mures, ,
540139 Mures, , Romania
* Correspondence: oana.dinca@icsi.ro (O.R.B.); corneliu.tanase@umfst.ro (C.T.)
Abstract: Three species of Stachys genus (S. byzantina, S. officinalis, S. sylvatica) were investigated in the
present study in terms of aromatic profile and total polyphenol content, as well as antibacterial activity
and antioxidant capacity. Gas chromatography coupled with flame ionization detection (GC/FID)
was used for exploration of the herbal alcoholic extracts. Using statistical analysis, volatile organic
compounds (VOCs) and total phenolic chemical fingerprints were compared in order to describe
differences and identify putative signature traits of the three Stachys species. The results showed
that the analyzed Stachys extracts have a total polyphenol content being between 197 ± 0.27 mg
GAE/g for S. sylvatica and 232 ± 43 mg GAE/g for S. officinalis. The antioxidant activity was between
444 ± 58 mM Trolox/g (S. sylvatica) and 602 ± 75 mM Trolox/g (S. officinalis). The volatile compounds
identified were mostly sesquiterpenes, followed by monoterpenes and secondary compounds. The
most abundant in all three species was germacrene D (21.9% 28–25.2%). The multivariate analysis
demonstrated the potential of using plant tissue VOC profiles to discriminate between different Stachy
species, with a total of 31 VOCs being identified from all three species. Although there were strong
similarities among the three species’ VOC profiles, distinctions can be made using chemometric
analysis. The microbiological results showed an antimicrobial capacity of all three extracts, especially
on Gram-positive bacteria. In addition to increasing consumers’ understanding regarding the health
benefits of these Stachy species, this investigation contributes to defining and preserving a precious
genetic and cultural-historical biodiversity.
Keywords: antibacterial activity; antioxidant activity; S. byzantina; S. officinalis; S. sylvatica;
polyphenols; volatile compounds
1. Introduction
In horticulture, quality may be defined as the degree of excellence provided by the
combination of various characteristics and traits that provide each plant’s relative value for
the intended purpose [1]. Visual appearance, capability to resist different post-harvest pro-
cessing activities, chemical and nutritional composition, as well as aroma profile, represent
principal factors that may be included in this holistic approach [2]. Horticultural breeding
has advanced to the point where it is now possible to find fruits and vegetables that have
attributes that producers and vendors require, such as high yield, better resistance to pest
threats and disease, aesthetic design, and the ability to withstand a wide range of collection
and storage operations, among other characteristics. Although several of these agricultural
https://www.mdpi.com/journal/plants
Plants 2021, 10, 2710 2 of 13

products achieve superior nutritional and flavor attributes, for many products this is very
rare [3]. It is still difficult to improve the aroma profile of horticultural plants through
breeding techniques, due to the large number of factors that influence the synthesis of
volatile and nonvolatile compounds responsible for flavor attributes, including climate
and cultural practices [4], agriculture (organic vs. conventional), and pre- and post-harvest
processing operations. In general, plants represent a well-known source of natural bioactive
molecules in alternative and complementary medicine, and serve as a great resource for
many contemporary medications that are produced from natural resources [5]. Various
intrinsic and extrinsic variables have been shown to have an impact on plant growth and
development; in particular, medicinal plants are strongly affected, as regards the biochem-
ical and physiological functions of their essential oils [6]. Moreover, while the study of
plants has been a concern since ancient times in the field of traditional medicine, interest in
this field is becoming more intense, due to advanced developments in technology suited to
investigating their therapeutic effects. One of the most important properties of plants is
their action on the human body [7–10]. These aspects are highlighted especially through
study of the levels and types of bioactive compounds they contain [11–14] and/or on their
biological activity [15–18].
The biodiversity existing in the temperate and/or Mediterranean area is currently
insufficiently studied, in terms of pharmacological potential. In recent years, plant extracts
rich in polyphenols have provided a solid basis for the production of alternative pharma-
ceutical products [19,20]. Plant extracts have been able to offer a lot of opportunities to
mankind through their chemical diversity, since they have in their constitution a series of
valuable bioactive compounds, including phenolics, flavonoids, iridoids and diterpenoids,
that can exhibit significant antifungal, antimicrobial, anti-inflammatory, antioxidant and
cytotoxic properties [21–23].
The Lamiaceae family is well known for its essential oils, rich in aromatic compounds,
with both medical and gastronomic applications [23,24]. Stachys species have tradition-
ally been used for therapeutic purposes but also in the cuisine of many peoples in the
Mediterranean area as part of their nutritional intake, with tubers rich in protein and
carbohydrates [22]. Various Stachys species are distinguished by a high concentration of
tannins, the extracts being astringent and bitter but with major potential in the treatment
of various biliary diseases, diarrhea, gout or varicose veins, and with certain antimicrobial
properties [25,26].
In Romania, 14 species of Stachys have been identified so far, in spontaneous flora,
according to the literature [27]. The Stachys genus comprises herbaceous plants with simple
or branched stems, with opposite leaves, narrow or broad-lanceolate, with corollary flowers
grouped (2 to 20) [27]. Active principles identified in the Stachys species from Romania
include tannins, bitter substances, choline, stachydrins or betaines, which have been recom-
mended for lung diseases and treatments, asthma, diarrhea, gout, varicose ulcers and other
conditions [28]. High-performance methods have been used to identify a variety of volatile
and non-volatile compounds, flavonoids, monoterpenoids, phenolic acids (caffeic, chloro-
genic, p-coumaric), fatty acids and essential oils, choline and betaine [11,25,29], as well as
secondary metabolites, among other compounds. Given the fact that the phytochemical
composition of these species is responsible for a wide variety of medicinal benefits, the
Stachys genus has attracted a great deal of interest for the evaluation of its biologically
active compounds from various plant parts, including the leaves and fruits. Over 200 chem-
icals have been identified from this genus, with the majority of them belonging to the key
chemical categories of essential oils, polyphenols (e.g., flavonoid derivatives), terpenes and
phenolic acids [18,30–35].
Stachys species are an abundant source of phytochemicals with potential medicinal
and commercial uses in a variety of fields. Several Stachys cultivars have been produced
for use in conventional medicine, the food and pharmaceutical industries and even as
ornamental plants as a result of the increasing demand for natural products [18]. The
present study was designed taking into account that Stachys species are widely used and
Plants 2021, 10, 2710 3 of 13

that there have been a large number of research papers on them; there has been no recent
evaluation originating in Romania, however.
In this context, the research followed two paths: to determine the total polyphenol
and volatile chemical content of three species of the Stachys genus (S. byzantina, S. officinalis,
and S. sylvatica), and to assess their respective antioxidant and antibacterial activity. Using
multivariate statistical analysis, the chemical fingerprints of the phenolic compounds (TPCs)
and volatile organic compounds were compared in order to define differences and discover
possible distinctive characteristics of the three Stachys species. Potential compositional
characteristics related to antioxidant and antibacterial activity were also explored.

2. Materials and Methods

2.1. Stachy Samples, Culture Media and Bacterial Strains
The selected species of Stachys genus (S. byzantina, S. officinalis, S. sylvatica) were
collected randomly, in the summer of 2021 (June and July), during the flowering stage,
from the central area of Romania; they were identified and preserved in the Research
Center in Biotechnology and Food Engineering Sibiu. The herbs were dried at 35 ◦ C for
several days and then shredded.
The bacterial strains used in this study were Staphylococcus aureus (ATCC 25923),
Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Bacillus cereus (ATCC 9372), Enterococcus faecalis
(ATCC 19433), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), Enter-
obacter cloacae (ATCC 43560) and Proteus mirabilis (ATCC 29906). The culture media used
were Mueller Hinton, Mueller Hinton broth and Cereus selective agar for Bacillus cereus.

2.2. Chemicals and Reagents

All the chemicals and reagents involved in the extraction processes, total polyphe-
nolic content, antioxidant activity experiments and the chemical standards (1-hexanol,
2-Thujene, 3-octanone, 5-Amino-1-ethylprazole, Allylbenzene, Camphene, Caryophyl-
lene oxide, Decanoic acid, Docosane, Germacrene D, Hexadecane, Hexadecanoic acid,
Lavandulol, Limonene, Linalool, Linalool acetate, Nerol, Nerolidol, Ninanal, Tetradecanoic
acid, Tricosane, α-Copaene, α-Humulene, α-Ter-pinene, β-Bourbonene, β-Caryophyllene,
β-Copaene, β-Cubenene, β-Farnesene, β-Gurjunene, β-Myrcene, β-Pinene) used in the
identification of phenolic and aromatic compounds from the extracts were acquired from
Sigma Aldrich Company (St. Louis, MO, USA).

2.3. Extraction
Fifty grams of plant material was left to soak for 7 days in 500 mL of 96% ethyl alcohol.
After maceration, next steps were to filter, centrifuge and concentrate the extract on the
water bath at 70 ◦ C, resulting in a dry extract (EU). The dry material was resuspended in
50 mL of distilled water [36]. All subsequent determinations were performed in triplicate
in order to obtain the most conclusive results.

2.4. Determination of Total Phenolics Content

The total polyphenolic content was measured spectrophotometrically (UV-1900 SHI-
MADZU spectrophotometer, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) using the modified
and adapted Folin–Ciocalteu technique [37] using gallic acid as an internal standard. The
method involves homogenizing 0.20 mL of sample suspension (extract previously dissolved
in distilled water) with 0.80 mL of Folin–Ciocalteu reagent 10% (v/v) and 1 mL of sodium
carbonate (7.5% (m/v). After a reaction period of 1 h at room temperature (23 ◦ C), the
absorbance was read at a wavelength of 750 nm.
The calculation of total polyphenols was done using the formula:

C = c × V/m (1)

where: c—gallic acid concentration determined from the calibration curve in mg/mL;
V—volume of extract in mL; m—mass of plant extract in g.
Plants 2021, 10, 2710 4 of 13

The results are expressed in milligrams of gallic acid equivalent per gram of dry
extract (mg GAE/g).

2.5. Determination of Volatile Compounds

Analysis of the principal volatile compounds (VOCs) present in the extracts was
carried out using gas chromatography (GC) Varian 450-GC, equipped with a flame ioniza-
tion detector (FID) and a TG-WAXMS capillary column (60 m × 0.32 mm ID × 0.25 μm
film thickness). The extracts obtained using the above-mentioned extraction procedures
were filtered using a 0.5 m microporous polytetrafluoroethylene filter, and then 1 μL of
the filtered extract was directly injected, with a split ratio of 1:10. Three injections were
performed for each of the three variants. Helium (He) was used as the carrier gas, with a
flow rate of 0.8 mL/min. The column temperature program used for the volatile compound
separation increased from 50 ◦ C (held for 1 min) to 110 ◦ C with a rate of 7.5 ◦ C per minute,
then up to 160 ◦ C (held for 4 min) with a 14 ◦ C per minute rate, and finally up to 230 ◦ C
(held for 8 min). The injector and detector temperatures were set at 260 ◦ C and 290 ◦ C,
respectively. The identification of the target compounds was carried out by comparing the
retention times of the individual compounds in a chromatogram recorded on a standard
solution with the retention times of the same compounds in the chromatograms recorded
for the extracted samples, which was done by using the retention times of the individual
compounds in the standard solution. It was necessary to dilute the samples and standards
before injecting them. It was necessary to carefully dilute the samples and standards before
injecting them. Following the completion of this investigation, qualitative and quantitative
data were gathered [38]. The percentage of each compound was calculated based on the
quantity of each compound determined according to the external standard method.

2.6. Determination of Antioxidant Activity

The DPPH (1,1,-diphenyl-2-picrylhydrazyl) method is a spectrophotometric method
to quantify antioxidants in complex biological systems commonly used to test the ability of
compounds to scavenge free radicals or their ability to donate hydrogen. The method used
was as described by Alexandre et al., 2019 [37], amended and adapted. The stock solution
was prepared by dissolving in 100 mL of methanol an amount of 24 mg of DPPH, followed
by storage in the dark at −20 ◦ C (solution concentration = 600 μM). The working sample
was obtained by homogenizing the dry extract in distilled water (1:1); then the working
solution was prepared, consisting of a mixture of 90 mL of methanol and 10 mL of stock
solution (solution concentration = 60 μM). Twenty-five μL from the sample was allowed to
react for 30 min at room temperature (23 ◦ C) in the dark with 175 μL DPPH mixture. The
absorbance was read at a wavelength of 515 nm (UV-1900 SHIMADZU spectrophotometer).
Distilled water, without extract, was used as a control sample, following the same working
procedure. The calibration curve was performed with Trolox, the results being expressed
as milligrams of Trolox equivalent per gram of dry extract (mg TE/g EU).
The inhibition percentage (I) was calculated according to the equation:

I (%) = [(Abs A0 − Abs sample): Abs A0] × 100 (2)

where Abs A0 represents the control absorbance, and Abs test represent sample and
radicals’ reaction absorbance.

2.7. Determination of Antimicrobial Activity

The Kirby–Bauer method (diffusimetric) was used to determine the antibacterial
activity of the extracts [39]. This approach involves spreading a thin layer of bacterial
culture on a solid culture medium (with a concentration of about 0.5 on the MacFarland
scale) to determine the antibacterial activity of the extracts. The lyophilized strains were
hydrated according to their own protocol, with hydrating liquid. 1 mL of Staphylococcus
aureus inoculum (ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Enterococcus
faecalis (ATCC 19433), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145),
Plants 2021, 10, 2710 5 of 13

or Enterobacter cloacae (ATCC 43560) was deposited and spread on Petri dishes containing
Mueller Hinton solid culture medium (Merck KGaA, Darmstadt, Germany), and the
inoculum containing Bacillus cereus (ATCC 9372) was placed on Cereus selective agar
solid culture medium (Merck, Germany). The concentration of the solutions in the plant
samples was set at 50 μg/mL. After the culture was wiped, sterile discs with 10 μL,
15 μL, 20 μL of plant extract were applied. After a 24 h incubation at 37 ◦ C, the area
of inhibition of the extract was measured with a ruler, including the 6 mm diameter
of the disc. The interpretation was made by comparison and/or in mm. Gentamicin
and ampicillin in concentrations according to CLSI (Clinical and Laboratory Standard
Institute) recommendations were selected as control tests for antibacterial activity on Gram-
positive and Gram-negative strains, allowing the establishment of standard methods and
procedures in this regard.

2.8. Statistical Analysis

The main multivariate statistical analysis approach was based on principal component
analysis (PCA) to explain significant associations among quality parameters, content of
total phenolic compounds, and VOCs data. Pearson’s correlations (p < 0.05 and p < 0.01)
were used to identify correlations between all of the variables included in the dataset. All
the statistical analyses were carried out using the XLSTAT Addinsoft 2014.5.03 software
version (Addinsoft Inc., New York, NY, USA).

3. Results and Discussions

3.1. Total Phenolic Content and Antioxidant Activity
Polyphenols can be extracted by various methods and the efficiency of these processes
can be correlated with the plant material and with the structure of the phenolic compounds.
Phenolic compounds are present in abundance in the natural environment; specifically,
plants tissues produce a high proportion of these molecules. They are thought to have
antioxidant capabilities because they include hydroxyl groups in their structure; as a
result, it is critical to know their overall quantity in plant samples since this indicates
their potential for therapeutic use. The Stachys extracts were obtained by applying an
ethanol extraction, due to the superior yield compared with other solvents, according
to the literature [40,41]. The results obtained can be compared with the standard curve
(R2 = 0.9772). S. officinalis had a greater total phenolic content than the previously reported
extracts of this species [40]. Based on this evaluation, it could be suggested that infusions
of S. officinalis possess a higher concentration of bioactive compounds than other extracts.
Other results achieved here are comparable to those of several different Stachys species.
In order to establish the antioxidant activity, the samples were processed according
to the DPPH method. The results obtained can be compared with the standard curve
(R2 = 0.994). Regarding the ability to inhibit radicals by the DPPH method, it was found
that half maximal effective concentration (EC50) values ranged between 11.2 μg/mL for
S. officinalis and 14.5 μg/mL for S. sylvatica. The antioxidant activity was 556 ± 62 mM
Trolox/g for S. byzantina, 602 ± 75 mM Trolox/g for S. officinalis and 444 ± 58 mM trolox/g
for S. sylvatica (Table 1).

3.2. Determination of Volatile Compounds

Chemical contents of three commonly Stachys species found in Romania, namely
S. sylvatica, S. officinalis, and S. byzantina, were determined and investigated in this study.
Table 2 presents the extracted aromatic constituents, each sample presenting a complex
composition. Among them, terpenoids comprise the major class of naturally occurring
compounds of all the studied extracts. Sesquiterpene hydrocarbons were the most abun-
dant class of constituents found in all taxa, followed by monoterpene hydrocarbons as the
second most abundant type. These samples included 29, 30, and 31 volatile compounds,
which represented 98.4%, 95.8%, and 97.5% of the total compositions, respectively, ac-
cording to the results of the GC-MS analysis. S. sylvatica and S. officinalis extracts had
Plants 2021, 10, 2710 6 of 13

similar chemical profiles. The most abundant groups of compounds were sesquiterpene
hydrocarbons (SH) (42.8 and 41.6%), monoterpene hydrocarbons (MH) (36.8 and 31.2 %),
and oxygenated monoterpenes (OM) (10.5 and 9.5 %). S. sylvatica samples originating from
Bulgaria, Italy, Kosovo, Croatia and Hungary were previously investigated by different
groups, which reported that sesquiterpene lactones were, as in our case, the major group of
substances [42,43]. S. byzantina presented the highest concentration of SH and the lowest
regarding the content of MH, these proportions having being observed previously in the
study conducted by Lashgargahi and Shafaghat [44].

Table 1. Total amount of phenolic compounds and radical scavenging activity in S. byzantina, S. officinalis and S. sylvatica.

DPPH Scavenging Activity

Plant Sample Extract TPC (mg GAE/g) ± SD * DPPH (EC50) μg/mL ± SD * TE (mM/g Dry Extract) ± SD *
(%) ± SD *
Stachys byzantina 222 ± 0.34 63.8 ± 0.3 12.7 ± 0.01 556 ± 62
Stachys officinalis 232 ± 0.43 65.2 ± 0.5 11.2 ± 0.01 602 ± 75
Stachts sylvatica 197 ± 0.27 53.1 ± 0.2 14.5 ±0.01 444 ± 58

* TPC—total polyphenol content; GAE—gallic acid equivalent; DPPH—2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl; TE—Trolox equivalent; SD—
standard deviation.

Table 2. The profile of volatile compounds from the three Stachys species: S. byzantina, S. officinalis, S. sylvatica.

Compound Name S. byzantine (%) S. officinalis (%) S. sylvatica (%) Compound Classification
Docosane 0.7 0.4 0.9 FAD1
Hexadecanoic acid 0.2 1.1 0.1 FAD2
Tetradecanoic acid 0.1 0.3 0.1 FAD3
Tricosane 0.2 0 0 FAD4
Hexadecan-1-ol 0.2 0.1 0.1 FAD5
1-hexanol 0 0.1 0.2 GL1
Decanoic acid 0.2 1 0.8 GL2
3-octanone 0.2 0.1 1.2 O1
5-Amino-1-ethylprazole 0.5 0.1 0.4 O2
Allylbenzene 0.4 1.5 1.3 O3
Ninanal 0.3 0 0.4 O4
2-Thujene 0.2 0.1 0 MH1
Camphene 0.6 1.1 0.8 MH2
Limonene 10.8 15.7 19.5 MH3
α-Terpinene 2.1 2.1 2.2 MH4
B-Myrcene 0.5 1.7 0 MH5
B-Pinene 15.2 10.5 14.3 MH6
Lavandulol 0.5 0.1 0.7 OM1
Linalool 3.2 5.4 2.5 OM2
Linalool acetate 0.3 0.5 0.8 OM3
Nerol 0.8 0.7 1.8 OM4
Nerolidol 2.7 2.8 4.7 OM5
Caryophyllene oxide 1.9 5.7 1.8 OS1
Germacrene D 24.6 25.2 21.9 SH1
α-Copaene 0.9 0.1 0.2 SH2
α-Humulene 2.7 1.4 1.1 SH3
β-Bourbonene 0.1 1.2 2 SH4
β-Caryophyllene 8.9 9.9 13.3 SH5
β-Copaene 1.9 2.4 1.6 SH6
β-Cubenene 10.1 0.1 0.1 SH7
β-Farnesene 0.2 1 0.5 SH8
β-Gurjunene 1.3 0.3 1.1 SH9
TOTAL (%) 97.5 95.8 98.4
MH 29.4 31.2 36.8
OM 7.5 9.5 10.5
SH 50.7 41.6 41.8
OS 1.9 5.7 1.8

FAD—fatty acids and fatty acid-derived compounds; GL—green leaf volatiles; MH—monoterpene hydrocarbons; OM—oxygenated
monoterpenes; SH—sesquiterpene hydrocarbons; OS—oxygenated sesquiterpenes; O—others.

The major constituent of the Stachy species was found to be germacrene D [45–47]. In
the studied Stachys species the values of germacrene D were between 25.2% (S. officinalis)
and 21.9% (S. sylvatica). Nevertheless, the presence of other active substances such as
limonene, β-pinene, β-cubene, β-caryophyllene and linalool was also identified.
β-caryophyllene is a compound identified in remarkable quantities in all three studied
species, the results being between 8.9% (S. byzantina) and 13.3% (S. sylvatica). It was discov-
ered that the essential oil from a population of S. officinalis originating from Serbia contained
no β-caryophyllene [16], which was previously found to be a dominant constituent in an
Plants 2021, 10, 2710 7 of 13

essential oil from a community of S. officinalis originating from Montenegro [48]. Instead,
germacrene D was the predominant compound in the essential oil from a population
of S. officinalis in Serbia. According to the findings of another study carried out in Ser-
bia [18], sesquiterpene hydrocarbons were the predominant fractions, with germacrene D,
β-caryophyllene, and α-humulene being the major components. The primary constituents
of S. officinalis, according to a research investigation performed on samples originating
in Croatia, were germacrene D and €-caryophyllene [32]. It is interesting to observe that
germacrene D was detected in significant concentrations in the samples from Italy and
Serbia [16,45], while the monoterpene fraction presented low concentrations in all of these
investigated samples. In contrast with this finding, S. sylvatica originating from Croatia
presented a similar concentration of germacrene D and monoterpene hydrocarbons, with
α-pinene and β-pinene being the most prevalent components of this fraction as well as in
our study. The results of an investigation regarding S. sylvatica originating in Kosovo were
also consistent with the present findings [49], with the main constituents being represented
by α-pinene, β-pinene, and germacrene D. Despite the presence of significant concentra-
tions of germacrene D, αpinene, and β-caryophyllene in S. sylvatica collected in Turkey, the
ingredient β-pinene was not seen [31]. Regarding monoterpene hydrocarbons, the second
most abundant constituents in the essential oil from S. sylvatica, comparative results were
observed for samples originating from Turkey, with the most abundant compounds being
limonene and α-cedrene [24].
β-pinene was quantified at percentages reaching 15.2% (S. byzantina). Specific for
S. byzantina was the high level of β-cubenene of 10.1% identified, compared to the other
two species of Stachys where this compound does not exceed 0.1%. Another important com-
pound was found in all three species, namely limonene, with levels of 10.8% in S. byzantina,
15.7% in S. officinalis and 19.5% in S. sylvatica. It was observed that this compound is present
almost twice as much in S. sylvatica compared to S. byzantina. In the S. byzantina species
1-hexanol compound was not identified, in S. officinalis ninanal and tricosane were not
identified, while for the S. sylvatica 2-thujene, tricosane and β-myrcene were not identi-
fied. In a study performed on leaves of S. byzantina collected from Western Azarbaijan
province, Iran, it was observed that monoterpenes were the predominant fractions, with the
most abundant compounds being linalool and 1,8 cineole [44]. These results are different
from those obtained in the present study and in the one performed by Lashgargahi and
Shafaghat [44], where the principal constituents were represented by the sesquiterpene
hydrocarbons, with germacrene D and β-cubenene as most abundant compounds.
Linalool has been identified and quantified at values between 2.5% (S sylvatica) and
5.4% (S. officinalis), and nerolidol ranges from 2.7% (S. byzantina) to 4.7% for (S sylvatica),
different percentages compared to other studies (0.3–0.8% [32], 0.8% [50]. α- humulene
was identified in all three species under study, the values found being between 2.7%
(S. byzantina) and 1.1% for (S. sylvatica), and linalool acetate was between 0.3% and 0.8%.
The identified volatile compounds have specificity for each extract, the results obtained
being a benchmark for their area of origin.

3.3. Multivariate Analysis of the Stachy Species

The VOCs of the extracts of Stachy species prepared in the present study were com-
pared using PCA. The applied multivariate statistical analysis helped assess the potential
ecological importance of the volatiles data as well as in their interpretation; the findings
were statistically supported as a result of the analysis. In order to investigate the po-
tential of VOCs to discriminate among the Stachys samples, as well as to identify any
important correlations between VOCs, PCA was applied to the GC–MS data. Figure 1
presents a projection of the score and loading values, providing a visual representation
of the inter-varietal patterns of similarity or difference, as between the studied Stachys
samples, depending on the investigated features. The results of this study indicated that
there is a significant variance among native varieties of Stachys species.
Plants 2021, 10, 2710 8 of 13

Figure 1. 2D-principal component analysis plot of the VOCs in the three Stachys species. FAD—fatty
acids and fatty acid-derived compounds; GL—green leaf volatiles; MH—monoterpene hydrocarbons;
OM—oxygenated monoterpenes; SH—sesquiterpene hydrocarbons; OS—oxygenated sesquiterpenes;
O—others.

The two principal components explained 100% of the variation in the dataset, PC1
accounting for 51.33% and PC2 48.67% of the variance. The three Stachys samples were
clearly dispersed along the PCs in the PCA plot. S. byzantina and S. sylvatica, in particular,
exhibit negative PC1 scores (but negative and positive PC2 scores, indicating that these
samples are somehow distinct), and were positioned on the left side of the figure, whilst
S. officinalis was plotted on the other side. The absolute loading scores (LV ≥ 0.8) were
assigned as cut-off in order to explain the maximum variance along the PCs [51], allowing
14 loadings to be selected as the most differentiating components on PC1 (FAD1, FAD2,
FAD3, O2, O4, MH2, MH5, MH6, OM1, OM2, OS1, SH6, SH8, and SH9) and 13 loadings
with high correlation along PC2 (FAD4, FAD5, GL1, MH1, MH3 (Table 2, Figure 1). Within
the most differentiating components on PC1, MH6, OM1 and SH9 terpenoids were detected
in S. byzantina and S. sylvatica in high concentrations; while the S. officinalis sample was
characterized by relative high amounts of MH1, SH3 and SH7. The presence of other
VOCs was found to be similar in all the Stachys samples (Table 2). If the variables that
separated the samples around F1 are taken into account, the PCA results may support
the hypothesis of Lazarevic et al., suggesting that the proportion of total composition of
certain molecules, such as oxygenated terpenes like caryophyllene oxide, or oxygenated
compounds of terpenoid origin, is influenced by eco-geographic factors [18]. Based on
Plants 2021, 10, 2710 9 of 13

their conclusions, ecological factors on the Balkan Peninsula may influence the amount
of terpenoid oxygenation in samples of S. officinalis plants, for example, by expressing the
genes of the enzymes involved.

3.4. Antibacterial Activity

Plants with antibacterial potential are currently attracting the attention of scientists,
due to the fact that many studies reveal the easy assimilation of valuable natural com-
pounds by the body compared to drugs obtained synthetically [52]. The antibacterial
activity of the three selected Stachys species is particularly noticeable. As can be seen in
Figure 2, the measured zones of inhibition were between 3 and 10 mm for Gram-positive
bacteria and up to 7 mm for Gram-negative bacteria. The Staphylococcus aureus strain
(ATCC 25923) showed more pronounced inhibition by S. officinalis extract, where the mean
values were 7 mm, while the Staphylococcus epidermidis strain (ATCC 12228) showed a much
more significant area of inhibition of up to 10 mm in the case of extracts of S. byzantine.
These values are higher than those recorded for the controls (ampicillin or gentamicin). In
addition, from the spectrum of Gram-positive bacteria it can be stated that the strains of
Bacillus cereus (ATCC 9372) and Enterococcus faecalis (ATCC 19433) experienced antibacterial
effects with a zone of inhibition measured in a range of 3–6 mm for all three extracts
taken in the study. These values are lower than those recorded for the controls (ampicillin
or gentamicin).

Figure 2. Antibacterial activity of Stachys byzantina, S. officinalis and S. sylvatica extracts on

S.A.: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), S.E.: Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), B.C.: Bacil-
lus cereus (ATCC 9372), E.F.: Enterococcus faecalis (ATCC 19433), E.C.: Escherichia coli (ATCC 8739),
P.A.: Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), En.C.: Enterobacter cloacae (ATCC 43560), P.M.: Proteus
mirabilis (ATCC 29906).

Regarding the antibacterial action of the three Stachys extracts (S. byzantina, S. officinalis,
S. sylvatica) on Gram-negative bacteria, it was found that they present different inhibition
values. The values recorded for the three extracts were lower compared to those recorded
for the controls (ampicillin and gentamicin). The exception was the values observed for
P. aeruginosa, where these were approximately equal to those of the controls (ampicillin
and gentamicin). Thus, the antibacterial effect was minor on the Escherichia coli strain
(ATCC 8739), with values between 2 mm in the case of S. byzantina extract. In the case of
the Proteus mirabilis strain (ATCC 29906), the most significant values of the antibacterial
Plants 2021, 10, 2710 10 of 13

effect were noticed in the case of S. byzantina and S. sylvatica extracts where the measured
inhibition area exceeded 7 mm. Both S. officinalis and S. sylvatica extract had an inhibitory
effect on the Enterobacter cloacae strain (ATCC 43560) of over 4 mm, while S. byzantina
extract had an effect of around 3 mm. The reaction of Stachy extracts regarding bacterial
cultures varies, being mostly influenced by the chemical profile, molecular structure of
the major components, structural properties and quantities [53]. Also, the antibacterial
activity is determined by the complex formation and interactions between major and minor
VOC components. Considering previous screenings focused on antimicrobial activity of
medicinal plants, our results are in agreement presenting a stronger antibacterial activity
against Gram-positive strains and moderate against Gram-negative strains [54].
In the current study, the presence of phenols and oxygenated terpenes may explain the
inhibition of bacteria, as terpenes such as linalool, neronidol and caryophyllene oxide are
more active than terpenoids such as β-pinene and β-caryophyllene hydrocarbons. Due to
their limited water solubility, hydrocarbon derivatives have reduced antibacterial activity,
limiting their dispersion through the substrate. This inactivity is strongly related to their
reduced hydrogen binding capacity and water solubility, whereas oxygenated molecules
have a stronger bonding capability [54]. Generalized resistance of Gram-negative bacteria
such as Proteus mirabilis is attributed to the existence of a hydrophilic outer membrane con-
taining a hydrophilic polysaccharide chain that functions as a hydrophobic barrier against
extracellular essential oils [55]. The influence of natural phenolic compounds produced
by plants on Gram-negative bacteria biofilm growth has recently been demonstrated [56],
but no systematic study regarding the correlation between microbial limitation and total
phenolic content of aromatic plants and herbs has been conducted.

4. Conclusions
The bioactive compounds from three Stachys extracts presented significant values with
regard to antioxidant capacity. The antioxidant activity leads to the possibility of their use in
the pharmaceutical and agri-food industry. Through the GC-MS analyses performed, over
39 volatile compounds were identified, specific to all species. The most important group of
volatile compounds is part of the group of oxygenated and hydrogenated sesquiterpenes,
followed by monoterpenes and other non-terpenoid compounds. This study also demon-
strated the potential of using plant tissue VOC profiles to discriminate between different
Stachys species, with a total of 31 VOCs being identified from all three species. Although
there were strong similarities among the three species’ VOC profiles, distinctions can be
attempted using chemometric analysis. Results from this study provide a feasible and
useful method to rapidly classify Stachys plants, indicating a great similarity regarding
the profile of volatile compounds among S. officinalis from South East Europe, even if
essential oil constituents differ noticeably according to the individual genetic mutability,
different portions of the herb and growth periods. The content and distribution of these
components varied among the studied species, owing to several extrinsic factors affecting
secondary metabolite composition. Therefore, in order to obtain a high level of scientific
and experimental findings and verify the genuine efficacy and safety of plant products
that have been used by humans for millennia, additional well-designed investigations are
needed [51]. The antimicrobial tests performed showed that the extracts of S. byzantine,
S. officinalis and S. sylvatica showed antibacterial activity especially against Gram-positive
microorganisms, with the effect being lower in Gram-negative ones. The most relevant
results were obtained in the species S. byzantina and S. sylvatica against S. epidermidis and
P. mirabilis. The traditional use of Stachys species derives from known medicinal effects, so
the identification and quantification of bioactive compounds lead to multiple possibilities
of exploiting these qualities for health and as natural remedies. In addition to increas-
ing consumers’ understanding regarding the health benefits of these Stachys species, this
investigation provides a means to protect a valuable genetic and cultural heritage.
Plants 2021, 10, 2710 11 of 13

Author Contributions: Conceptualization, D.I.S., E.L., O.R.B. and C.T.; methodology, D.I.S., E.L. and
O.R.B.; investigation, D.I.S., E.L., O.R.B., G.F.A. and C.T.; resources, O.R.B.; data curation, D.I.S., E.L.
and O.R.B.; writing—original draft preparation, D.I.S., O.R.B. and C.T.; writing—review and editing,
E.L., O.R.B., G.F.A. and C.T.; visualization, C.T.; project administration, O.R.B.; funding acquisition,
O.R.B. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.
Funding: This work was carried out through the Core Program, carried out with the support
of Ministry of Research, Innovation and Digitization, project no. PN 19110302 “Research on the
variation trends specific to stable isotopes in different tree species: deepening the fractionation
mechanisms and the chemical processes interconnected on the soil-water-plant chain” and project
number PN-III-P1-1,1-PD-2019-0325, within PNCDI III.
Institutional Review Board Statement: Not applicable.
Informed Consent Statement: Not applicable.
Data Availability Statement: Data is contained within the article.
Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.

References
1. Kyriacou, M.C.; Rouphael, Y. Towards a new definition of quality for fresh fruits and vegetables. Sci. Hortic. 2017, 234, 463–469.
[CrossRef]
2. Klee, H.J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytol. 2010, 187, 44–56.
[CrossRef]
3. Silva Dias, J.; Ryder, E.J. World Vegetable Industry: Production, Breeding, Trends. Hortic. Rev. Am. Soc. Hortic. Sci. 2011, 38,
299–356. [CrossRef]
4. Vilela, A. Introductory Chapter: Generation of Aromas and Flavours. In Generation of Aromas and Flavours; InTech Open: Rijeka,
Croatia, 2018. [CrossRef]
5. Atanasov, A.G.; Waltenberger, B.; Pferschy-Wenzig, E.M.; Linder, T.; Wawrosch, C.; Uhrin, P.; Temml, V.; Wang, L.; Schwaiger, S.;
Heiss, E.H.; et al. Discovery and resupply of pharmacologically active plant-derived natural products: A review. Biotechnol. Adv.
2015, 33, 1582–1614. [CrossRef]
6. Perrino, E.V.; Valerio, F.; Gannouchi, A.; Trani, A.; Mezzapesa, G. Ecological and Plant Community Implication on Essential Oils
Composition in Useful Wild Officinal Species: A Pilot Case Study in Apulia (Italy). Plants 2021, 10, 574. [CrossRef]
7. Marin, P.D.; Grayer, R.J.; Grujic-Jovanovic, S.; Kite, G.C.; Veitch, N.C. Glycosides of of tricetin methyl ethers as chemosystematic
markers in Stachys subgenus Betonica. Phytochemistry 2004, 65, 1247–1253. [CrossRef]
8. Sarvi Moghanlou, K.; Nasr Isfahani, E.; Dorafshan, S.; Tukmechi, A.; Aramli, M.S. Effects of dietary supplementation with
Stachys lavandulifolia Vahl extract on growth performance, hemato-biochemical and innate immunity parameters of rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss). Anim. Feed Sci. Technol. 2018, 237, 98–105. [CrossRef]
9. Serbetçi, T.; Demirci, B.; Güzel, C.B.; Kültür, S.; Ergüven, M.; Başer, K.H. Essential oil composition, antimicrobial and cytotoxic
activities of two endemic Stachys cretica subspecies (Lamiaceae) from Turkey. Nat. Prod. Commun. 2010, 5, 1369–1374. [CrossRef]
10. Conforti, F.; Menichini, F.; Formisano, C.; Rigano, D.; Senatore, F.; Arnold, N.A.; Piozzi, F. Comparative chemical composition,
free radical-scavenging and cytotoxic properties of essential oils of six Stachys species from different regions of the Mediterranean
Area. Food Chem. 2009, 116, 898–905. [CrossRef]
11. El-Ansari, M.A.; Barron, D.; Abdalla, M.F.; Saleh, N.A.M.; Le Quéré, J.L. Flavonoid constituents of Stachys aegyptiaca. Phytochem-
istry 1991, 30, 1169–1173. [CrossRef]
12. Ferhat, M.; Erol, E.; Beladjila, K.A.; Çetintaş, Y.; Duru, M.E.; Öztürk, M.; Kabouche, A.; Kabouche, Z. Antioxidant, anti-
cholinesterase and antibacterial activities of Stachys guyoniana and Mentha aquatica. Pharm. Biol. 2016, 55, 324–329. [CrossRef]
13. Frezza, C.; Venditti, A.; Maggi, F.; Cianfaglione, K.; Nagy, D.U.; Serafini, M.; Bianco, A.; Armandodoriano, B. Secondary
metabolites from Stachys palustris L. In Proceedings of the CIPAM 2016, 6th International Congress of Aromatic and Medicinal
Plants, Coimbra, Portugal, 29 May–1 June 2016.
14. Rahimi Khoigani, S.; Rajaei, A.; Goli, S.A. Evaluation of antioxidant activity, total phenolics, total flavonoids and LC-MS/MS
characterisation of phenolic constituents in Stachys lavandulifolia. Nat. Prod. Res. 2017, 31, 355–358. [CrossRef] [PubMed]
15. Nadeem, M.; Abdullah, S. Screening of local medicinal plant extracts against multi drugs resistance bacteria. Int. J. Bioassays 2016,
5, 4986. [CrossRef]
16. Grujic-Jovanovic, S.; Skaltsa, H.D.; Marin, P.; Sokovic, M. Composition and antibacterial activity of the essential oil of six Stachys
species from Serbia. Flavour Fragr. J. 2004, 19, 139–144. [CrossRef]
17. Kotsos, M.; Aligiannis, N.; Mitaku, S.; Skaltsounis, A.L.; Charvala, C. Chemistry of Plants from Crete: Stachyspinoside, a New
Flavonoid Glycoside And iridoids from Stachys spinosa. Nat. Prod. Lett. 2001, 15, 377–386. [CrossRef]
18. Lazarević, J.S.; Ðord̄ević, A.S.; Kitić, D.V.; Zlatković, B.K.; Stojanović, G.S. Chemical composition and antimicrobial activity of the
essential oil of Stachys officinalis (L.) Trevis. (Lamiaceae). Chem. Biodivers. 2013, 10, 1335–1349. [CrossRef]
Plants 2021, 10, 2710 12 of 13

19. Venditti, A.; Bianco, A.; Quassinti, L.; Bramucci, M.; Lupidi, G.; Damiano, S.; Papa, F.; Vittori, S.; Maleci Bini, L.; Giuliani, C.; et al.
Phytochemical Analysis, Biological Activity, and Secretory Structures of Stachys annua (L.) L. subsp. annua (Lamiaceae) from
Central Italy. Chem. Biodivers. 2015, 12, 1172–1183. [CrossRef] [PubMed]
20. Tundis, R.; Peruzzi, L.; Menichini, F. Phytochemical and biological studies of Stachys species in relation to chemotaxonomy: A
review. Phytochemistry 2014, 102, 7–39. [CrossRef] [PubMed]
21. Uritu, C.M.; Mihai, C.T.; Stanciu, G.D.; Dodi, G.; Alexa-Stratulat, T.; Luca, A.; Leon-Constantin, M.M.; Stefanescu, R.; Bild, V.;
Melnic, S.; et al. Medicinal plants of the family Lamiaceae in pain therapy: A review. Pain Res. Manag. 2018. [CrossRef]
22. Eryiğit, T.; Tunctürk, M.; Tunctürk, R. Determination of nutritive value and analysis of mineral elements for wild edible Stachys
lavandulifolia Vahl. var. lavandulifolia Growing in Eastern Anatolia. Int. J. Agric. Environ. Food Sci. 2019, 3, 6–9. [CrossRef]
23. Murata, T.; Endo, Y.; Miyase, T.; Yoshizaki, F. Iridoid glycoside constituents of Stachys lanata. J. Nat. Prod. 2008, 71, 1768–1770.
[CrossRef]
24. Renda, G.; Bektas, N.; Korkmaz, B.; Celik, G.; Sevgi, S.; Yayli, N. Volatile constituents of three Stachys L. Species from Turkey.
Marmara Pharm. J. 2017, 21, 278–285. [CrossRef]
25. Saeedi, M.; Morteza-Semnani, K.; Mahdavi, M.R.; Rahimi, F. Antimicrobial studies on extracts of four species of Stachys. Indian J.
Pharm. Sci. 2008, 70, 403–406. [CrossRef]
26. Skaltsa, H.D.; Demetzos, C.; Lazari, D.; Sokovic, M. Essential oil analysis and antimicrobial activity of eight Stachys species from
Greece. Phytochemistry 2003, 64, 743–752. [CrossRef]
27. Sârbu, I.; S, tefan, N.; Oprea, A. Vascular Plants from Romania—Illustrated Determinant of Land; Victor B Victor: Bucures, ti, Romania, 2013.
28. Imbrea, I.; Butnariu, M.; Nicolin, A.; Imbrea, F.; Prodan, M. Valorising the species Stachys officinalis (L.) Trevis. from South-Western
Romania. Res. J. Agric. Sci. 2011, 43, 198–203.
29. Sajjadi, S.E.; Ghanadian, S.M.; Rabbani, M.; Tahmasbi, F. Isolation and Identification of Secondary Metabolites from the Aerial
Parts of Stachys lavandulifolia Vahl. Iran. J. Pharm. Res. 2017, 16, 58–63. [PubMed]
30. Vundać, V.B. Taxonomical and phytochemical characterisation of 10 Stachys taxa recorded in the Balkan peninsula flora: A review.
Plants 2019, 8, 32. [CrossRef]
31. Kiliç, Ö.; Özdemir, F.A.; Yildirimli, Ş. Essential oils and fatty acids of Stachys L. taxa, a chemotaxonomic approach. Prog. Nutr.
2017, 19, 49–59. [CrossRef]
32. Vundac, V.B.; Pfeifhofer, H.W.; Brantner, A.H.; Males, Z.; Plazibat, M. Essential oils of seven Stachys taxa from Croatia. Biochem.
Syst. Ecol. 2006, 34, 875–881. [CrossRef]
33. Meremeti, A.; Karioti, A.; Skaltsa, H.; Heilmann, J.; Sticher, O. Secondary metabolites from Stachys ionica. Biochem. Syst. Ecol. 2004,
32, 139–151. [CrossRef]
34. Piozzi, F.; Bruno, M. Diterpenoids from Roots and Aerial Parts of the Genus Stachys. Nat. Prod. 2011, 5, 1–11.
35. Tübitak, U. Use of Stachys Species (Mountain Tea) as Herbal Tea and Food. Rec. Nat. Prod. 2014, 8, 71–82.
36. Bussmann, R.W.; Sharon, D. Traditional medicinal plant use in Northern Peru: Tracking two thousand years of healing culture.
J. Ethnobiol. Ethnomed. 2006, 2, 47. [CrossRef]
37. Alexandre, E.M.; Silva, S.; Santos, S.A.; Silvestre, A.J.; Duarte, M.F.; Saraiva, J.A. Pintado, M Antimicrobial activity of pomegranate
peel extracts performed by high pressure and enzymatic assisted extraction. Food Res. Int. 2019, 115, 167–176. [CrossRef]
[PubMed]
38. Nisca, A.; S, tefănescu, R.; Stegărus, , D.I.; Mare, A.D.; Farczadi, L.; Tanase, C. Comparative Study Regarding the Chemical
Composition and Biological Activity of Pine (Pinus nigra and P. sylvestris) Bark Extracts. Antioxidants 2021, 10, 327. [CrossRef]
39. Iancu, I.; Cătana, D.; Pascu, C.; Herman, N. Evaluation of antimicrobial resistance in strains of E. coli isolated from broiler carcasses.
Rev. Rom. Med. Vet. 2018, 28, 35–38.
40. Dušek, K.; Dušková, E.; Smékalová, K. Variability of morphological characteristic and content of active substances in Betonica
officinalis L. in the Czech Republic. Agriculture 2009, 55, 102–110.
41. Matkowski, A.; Piotrowska, M. Antioxidant and free radical scavenging activities of some medicinal plants from the Lamiaceae.
Fitoterapia 2006, 77, 346–353. [CrossRef]
42. Radnai, E.; Dobos, A.; Veres, K.; Tóth, L.; Máthé, I.; Janicsak, G.; Blunden, G. Essential oils in some Stachys species growing in
Hungary. Acta Hortic. 2004, 597, 137–142. [CrossRef]
43. Dimitrova-Dyulgerova, I.; Merdzhanov, P.; Todorov, K.; Seymenska, D.; Stoyanov, P.; Mladenov, R.; Stoyanova, A. Essential oils
composition of Betonica officinalis L. and Stachys sylvatica L. (Lamiaceae) from Bulgaria. C. R. L’acad. Bulg. Sci. 2015, 68, 991–998.
44. Lashgargahi, Z.; Shafaghat, A. Volatile Constituents of Essential Oils Isolated from Fresh and Dried Stachys lavandulifolia Vahl.
and Stachys byzantina C. Koch. Two Lamiaceae from North-West Iran. J. Essent. Oil Bear. Plants 2017, 20, 1302–1309. [CrossRef]
45. Tirillini, B.; Pellegrino, R.; Bini, L.M. Essential oil composition of Stachys sylvatica L. from Italy. Flavour Fragr. J. 2004, 19, 330–332.
[CrossRef]
46. Bahadori, M.B.; Maggi, F.; Zengin, G.; Asghari, B.; Eskandani, M. Essential oils of hedgenettles (Stachys inflata, S. lavandulifolia,
and S. byzantina) have antioxidant, anti-Alzheimer, antidiabetic, and anti-obesity potential: A comparative study. Ind. Crops Prod.
2020, 145, 112089. [CrossRef]
47. Avar, S.; Maksimović, M.; Vidic, D.; Šolić, M.E. Chemical composition of the essential oil of Stachys menthifolia Vis. Pharm. Biol.
2010, 48, 170–176. [CrossRef]
Plants 2021, 10, 2710 13 of 13

48. Chalchat, J.C.; Petrovic, S.D.; Maksimovic, Z.A.; Gorunovic, M.S. Essential oil of Stachys officinalis (L.) Trevis., Lamiaceae from
Montenegro. J. Essent. Oil Res. 2001, 13, 286–287. [CrossRef]
49. Hajdari, A.; Novak, J.; Mustafa, B.; Franz, C. Essential oil composition and antioxidant activity of Stachys sylvatica L. (Lamiaceae)
from different wild populations in Kosovo. Nat. Prod. Res. 2012, 26, 1676–1681. [CrossRef]
50. Khanavi, M.; Hadjiakhoondi, A.; Amin, G.; Amanzadeh, Y.; Rustaiyan, A.; Shafiee, A. Comparison of the volatile composition of
Stachys persica Gmel. and Stachys byzantina C. Koch. Oils obtained by hydrodistillation and steam distillation. Z. Naturforsch. C
2004, 59, 463–467. [CrossRef] [PubMed]
51. Cozzolino, R.; De Giulio, B.; Petriccione, M.; Martignetti, A.; Malorni, L.; Zampella, L.; Laurino, C.; Pellicano, M.P. Comparative
analysis of volatile metabolites, quality and sensory attributes of Actinidia chinensis fruit. Food Chem. 2020, 316, 126340. [CrossRef]
52. Anand, U.; Jacobo-Herrera, N.; Altemimi, A.; Lakhssassi, N. A Comprehensive Review on Medicinal Plants as Antimicrobial
Therapeutics: Potential Avenues of Biocompatible Drug Discovery. Metabolites 2019, 9, 258. [CrossRef]
53. Ed-Dra, A.; Filali, F.R.; Lo Presti, V.; Zekkori, B.; Nalbone, L.; Bouymajane, A.; Trabelsi, N.; Lamberta, F.; Bentayeb, A.;
Giuffrida, A.; et al. Chemical composition, antioxidant capacity and antibacterial action of five Moroccan essential oils against
Listeria monocytogenes and different serotypes of Salmonella enterica. Microb. Pathog. 2020, 149, 104510. [CrossRef] [PubMed]
54. Soković, M.; Glamočlija, J.; Marin, P.D.; Brkić, D.; Van Griensven, L.J.L.D. Antibacterial effects of the essential oils of commonly
consumed medicinal herbs using an in vitro model. Molecules 2010, 15, 7532–7546. [CrossRef] [PubMed]
55. Mulyaningsih, S.; Sporer, F.; Zimmermann, S.; Reichling, J.; Wink, M. Synergistic properties of the terpenoids aromadendrene
and 1,8-cineole from the essential oil of Eucalyptus globulus against antibiotic-susceptible and antibiotic-resistant pathogens.
Phytomedicine 2010, 17, 1061–1066. [CrossRef] [PubMed]
56. Jagani, S.; Chelikani, R.; Kim, D.S. Effects of phenol and natural phenolic compounds on biofilm formation by Pseudomonas
aeruginosa. Biofouling 2009, 25, 321–324. [CrossRef] [PubMed]
Analele Universităţii din Craiova, seria Agricultură – Montanologie – Cadastru (Annals of the University of Craiova - Agriculture,
Montanology, Cadastre Series)Vol. 52/1/2022
Mo

PRELIMINARY CHROMATOGRAPHIC INVESTIGATION OF FOUR

STACHYS SPP. (LAMIACEAE) FROM OLTENIA FLORA

Florian George APOSTOLESCU1, Andrei BIŢĂ2, Ludovic Everard BEJENARU2*,

Cornelia BEJENARU3, Antonia RADU3, George Dan MOGOŞANU2, Johny NEAMŢU1,4

(1) Doctoral School, University of Medicine and Pharmacy of Craiova, 2 Petru Rareş Street,
200349 Craiova, Romania; E-mail: apostolescugeorge@yahoo.com
(2) Department of Pharmacognosy & Phytotherapy, Faculty of Pharmacy, University of Medicine
and Pharmacy of Craiova, 2 Petru Rareş Street, 200349 Craiova, Romania;
E-mail: ludovic.bejenaru@umfcv.ro, andrei.bita@umfcv.ro, george.mogosanu@umfcv.ro
(3) Department of Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmacy, University of Medicine and
Pharmacy of Craiova, 2 Petru Rareş Street, 200349 Craiova, Romania;
E-mail: cornelia.bejenaru@umfcv.ro, antonia.radu@umfcv.ro
(4) Department of Physics, Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy of Craiova,
2 Petru Rareş Street, 200349 Craiova, Romania; E-mail: johny.neamtu@umfcv.ro

Corresponding author email: ludovic.bejenaru@umfcv.ro

Abstract
Concerning four Stachys spp. (Lamiaceae) from the Oltenia flora, the paper highlights the
polyphenolic content of aerial parts through high-performance thin-layer chromatography coupled
with photodensitometry. Chlorogenic acid (CA) was identified and quantified in all 20% methanolic
extracts of Stachydis herba. The highest CA amount was determined in S. recta (59.88 mg%),
followed by S. sylvatica (32.90 mg%), S. officinalis (31.34 mg%), and S. germanica (25.16 mg%),
respectively.
Key words: high-performance thin-layer chromatography, Lamiaceae, photodensitometry, polyphenols,
Stachys spp.

INTRODUCTION flavonoids (apigenin, luteolin, chrysoeriol,

Commonly known as hedge nettle, Stachys
genus, Lamiaceae family, contains more
than 300 different annual or perennial
species (herbs or small shrubs) originating
from Mediterranean region, Asia, Americas,
and southern Africa. In the Romanian flora,
12 Stachys spp. are also found (Ciocârlan,
2009; Imbrea et al., 2011).
The flowering aerial part of Stachys spp.
contains important active principles, such
as: essential oil (germacrene D, limonene,
β-caryophyllene, β-pinene, nerolidol, linalyl
acetate, linalool, caryophyllene oxide,
spathulenol, α-cadinene, α-pinene, β-
myrcene, α-terpineol, β-bourbonene, β-
ylangene); iridoids (ajugoside, aucubin,
harpagide, acetyl-harpagide, harpagoside);
isoscutellarein, kaempferol, quercetin,
isorhamnetin, naringenin and their
glycosides); diterpenes with labdane, neo-
clerodane, rosane and ent-kaurene type
(deoxyandalusol, stachaegyptins, roseo-
stachone, stachyrosanes); triterpenes
(ursolic acid and oleanolic acid derivatives);
phytosterols; phenylethanoid glycosides
(acteoside, verbascoside, martynoside,
leucosceptoside A, lavandulifoliosides);
phenylpropanoid glycosides (coniferin,
syringin); lignans (sesamin, paulownin,
urolignoside); phenolic acids (chlorogenic
acid, caffeic acid); fatty acids (linoleic,
oleic and palmitic acids): oligosaccharides
(Giuliani et al., 2009; Goren et al., 2011;
Hajdari et al., 2012; Háznagy-Radnai et

13
Analele Universităţii din Craiova, seria Agricultură – Montanologie – Cadastru (Annals of the University of Craiova - Agriculture,
Montanology, Cadastre Series)Vol. 52/1/2022
Mo
al., 2006 & 2012; Khanavi et al., 2009;
Kiliç et al., 2017; Lazarević et al., 2013;
Sarikurkcu et al., 2021; Stegăruş et al.,
2021; Tomou et al., 2020; Tundis et al.,
2014; Venditti et al., 2013).
In Turkey, Stachys spp. are used as wild
(mountain) tea mainly against stomatitis,
diabetes, rheumatism, cough and cold, or
as functional foods for a healthy diet
(Carović-Stanko et al., 2016; Gören, 2014;
Satıl & Açar, 2020; Tomou et al., 2020).
Stachys spp. exhibited significant
pharmacological actions, such as:
antimicrobial (against Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Klebsiella
pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa
and Candida albicans), antioxidant, anti-
inflammatory (useful for polycystic ovary
syndrome), hepatoprotective, anti-diabetes,
wound healing, antiviral, cytotoxic and
antiproliferative, enzyme inhibitory (Alizadeh
et al., 2020; Goren et al., 2011; Hajdari et
al., 2012; Háznagy-Radnai et al., 2012;
Khanavi et al., 2009 & 2012; Lazarević et
al., 2010 & 2013; Paun et al., 2018;
Sarikurkcu et al., 2021; Tomou et al.,
2020; Tundis et al., 2014).
The purpose of our research was the
preliminary analysis of polyphenols in the
aerial parts of four Stachys spp. from
Oltenia flora, by high-performance thin-layer
chromatography (HPTLC)–densitometry.
MATERIALS AND METHODS
Plant material
The plant material was harvested during
the flowering period, in May–June 2022,
from the Oltenia Region, South-West of
Romania. It was represented by the aerial
parts of four Stachys spp. (S. germanica
L., S. officinalis (L.) Trevis. sin. Betonica
officinalis L., S. recta L., and S. sylvatica L.)
Our study did not involve endangered or
protected herbal species. The voucher
14
specimens (StG-20220602/1, StO-
20220623/1, StR-20220524/1, and StS-
20220607/1, respectively) were deposited
in the Herbarium of the Department of
Pharmaceutical Botany, Faculty of
Pharmacy, University of Medicine and
Pharmacy of Craiova.
HPTLC analysis
Starting from the aerial parts of four Stachys
spp. (Stachydis herba), preliminary HPTLC–
densitometric analysis of polyphenols was
made on CAMAG (Muttenz, Switzerland)
system, according with some specific
experimental conditions (Altemimi et al.,
2015; Bojić et al., 2013; Gîrd et al., 2014;
Jug et al., 2018): stationary phase: HPTLC
silica gel 60 F254 (Merck, Darmstadt,
Germany) 20×10 cm precoated glass
plates; mobile phase: ethyl acetate–formic
acid–methanol–water (15:1:0.1:1, in
volumes); 10 mL of mobile phase were
added in the developing twin-chamber
(CAMAG) and then oversaturated for 20
minutes; sample: five 20% methanolic
extracts of Stachydis herba; reference
compounds (Merck): 0.1% methanolic
solutions of caffeic acid, chlorogenic acid
and rutin; migration distance: 62 mm
(sample application line 8 mm, solvent
front 70 mm); application of sample (2 μL)
and reference solutions (2 μL, 3 μl, 4 μL):
CAMAG Linomat 5 semi-automatic system
– spraying gas nitrogen, syringe volume
100 μL, dosage speed 150 nL/s, pre-
dosage volume 0.2 μL, bands length of
8 mm; plate drying: 5 minutes, at 25ºC
(cold air dryer); plate shooting: ultraviolet
(UV) light (254 nm and 365 nm); detection:
CAMAG TLC Scanner 3 photodensitometer,
for densitogram and in situ UV light (280 nm)
spectra, without derivatization, deuterium–
tungsten lamp, scanning speed 20 mm/s,
data resolution 100 μm/step, measurement
Analele Universităţii din Craiova, seria Agricultură – Montanologie – Cadastru (Annals of the University of Craiova - Agriculture,
Montanology, Cadastre Series)Vol. 52/1/2022
Mo

mode absorbance; visionCATS ver. 3.1 Lazarević et al., 2010; Stegăruş et al.,
software package (CAMAG). 2021; Tomou et al., 2020).

DPPH in situ qualitative assay

In the CAMAG TLC Spray Cabinet 2, the
HPTLC plates were sprayed with 0.5 mM
methanolic solution of 2,2-diphenyl-1-
picrylhydrazyl (DPPH); then, the plates were
dried at room temperature, in the dark, for
90 seconds, heated at 60°C, in an oven, for
30 seconds, and analyzed in white light Figure 1. HPTLC chromatogram of polyphenols
illumination (Pozharitskaya et al., 2008). from Stachydis herba 20% methanolic extracts:
UV 254 nm, without derivatization. B: Blank;
Lanes 1–3: Caffeic acid, Rf 0.76; Lanes 4–6:
RESULTS AND DISCUSSIONS
Chlorogenic acid, Rf 0.22; Lanes 7–9: Rutin,
The experimental results on the preliminary Rf 0.08; Lanes 10–13: Samples (S. germanica,
HPTLC analysis of polyphenols from the S. officinalis, S. recta, and S. sylvatica,
aerial parts of four Stachys spp. (Stachydis respectively).
herba) were highlighted in Figures 1–9.
Through linear regression mode, with 5%
range deviation, 1.68% coefficient of
variation (CV), and 0.9961 correlation
coefficient (R), the calibration curve for
chlorogenic acid (Figure 9) was used for
quantitative analysis: y = 3.571×10-9x +
4.636×10-3.
In the 20% methanolic extracts of Stachydis Figure 2. HPTLC chromatogram of polyphenols from
herba, the highest amount of chlorogenic Stachydis herba 20% methanolic extracts:
UV 365 nm, without derivatization. B: Blank;
acid (Rf 0.22) was quantified in S. recta
Lanes 1–3: Caffeic acid, Rf 0.76; Lanes 4–6:
(59.88 mg%), followed by S. sylvatica Chlorogenic acid, Rf 0.22; Lanes 7–9: Rutin, not
(32.90 mg%), S. officinalis (31.34 mg%), visualized; Lanes 10–13: Samples (S. germanica, S.
and S. germanica (25.16 mg%) aerial parts, officinalis, S. recta, and S. sylvatica, respectively).

respectively.
After the chromatographic separation, using
HPTLC–DPPH assay, for Stachydis herba
methanolic extracts, the screening of the
antioxidant activity was performed in situ.
For the HPTLC bands, the intensity of the
yellow color is directly proportional with the
concentration of polyphenols (chlorogenic Figure 3. HPTLC chromatogram of polyphenols
acid) in the examined samples (Figure 3). from Stachydis herba 20% methanolic extracts:
white light illumination, derivatization with DPPH.
Starting from the polyphenolic content of
B: Blank; Lanes 1–3: Caffeic acid, Rf 0.76; Lanes
Stachys spp., our results agree with the 4–6: Chlorogenic acid, Rf 0.22; Lanes 7–9: Rutin,
specialized research in the field of natural Rf 0.08; Lanes 10–13: Samples (S. germanica,
products chemistry (Khanavi et al., 2009; S. officinalis, S. recta, and S. sylvatica,
respectively).

15
Analele Universităţii din Craiova, seria Agricultură – Montanologie – Cadastru (Annals of the University of Craiova - Agriculture,
Montanology, Cadastre Series)Vol. 52/1/2022
Mo
Figure 4. Densitogram of chlorogenic acid
(UV 280 nm, without derivatization) separated
from the Stachys germanica aerial parts
20% methanolic extract.
Figure 5. Densitogram of chlorogenic acid
(UV 280 nm, without derivatization) separated
from the Stachys officinalis aerial parts
20% methanolic extract.
Figure 6. Densitogram of chlorogenic acid
(UV 280 nm, without derivatization) separated
from the Stachys recta aerial parts
20% methanolic extract.
16
Figure 7. Densitogram of chlorogenic acid
(UV 280 nm, without derivatization) separated
from the Stachys sylvatica aerial parts
20% methanolic extract.
Figure 8. In situ UV spectra (280 nm) of
chlorogenic acid reference (a) and compound
separated from the analyzed samples (b).
Figure 9. Chlorogenic acid reference calibration
curve.
CONCLUSIONS
Preliminary chromatographic analysis of
the polyphenols in the aerial parts of four
Stachys spp. from the Oltenia flora was
achieved by HPTLC coupled with photo-
densitometry. Identified and quantified in
Analele Universităţii din Craiova, seria Agricultură – Montanologie – Cadastru (Annals of the University of Craiova - Agriculture,
Montanology, Cadastre Series)Vol. 52/1/2022
Mo
the 20% methanolic extracts of Stachydis
herba, the amount of chlorogenic acid was
fluctuating (mg%): S. recta (59.88) > S.
sylvatica (32.90) > S. officinalis (31.34) >
S. germanica (25.16).
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by the grant
POCU/993/6/13/153178, “Performanţă în
cercetare” – “Research performance” co-
financed by the European Social Fund
within the Sectorial Operational Program
Human Capital 2014–2020.
REFERENCES
Alizadeh, F., Ramezani, M., Piravar, Z.,
(2020). Effects of Stachys sylvatica
hydroalcoholic extract on the ovary and
hypophysis–gonadal axis in a rat with
polycystic ovary syndrome. Middle East
Fertility Society Journal, 25(1), 4.
Altemimi, A., Watson, D.G., Kinsel, M.,
Lightfoot, D.A., (2015). Simultaneous
extraction, optimization, and analysis of
flavonoids and polyphenols from peach
and pumpkin extracts using a TLC–
densitometric method. Chemistry Central
Journal, 9, 39.
Bojić, M., Simon Haas, V., Sarić, D., Maleš,
Z., (2013). Determination of flavonoids,
phenolic acids, and xanthines in mate tea
(Ilex paraguariensis St.-Hil.). Journal of
Analytical Methods in Chemistry, 2013,
658596.
Carović-Stanko, K., Petek, M., Grdiša, M.,
Pintar, J., Bedeković, D., Ćustić, M.H.,
Satovic, Z., (2016). Medicinal plants of
the family Lamiaceae as functional
foods – a review. Czech Journal of
Food Sciences, 34(5), 377–390.
Ciocârlan V., (2009). Flora ilustrată a
României. Pteridophyta et Spermatophyta.
3rd edition, Bucharest, RO: Ceres
Publishing House, 654–656.
17
Giuliani, C., Pellegrino, R.M., Tirillini, B.,
Maleci Bini, L., (2009). Composition of
essential oils from leaves and flowers of
Stachys germanica subsp. salviifolia
(Ten.) Gams (Labiatae) and related
secretory structures. Natural Product
Communications, 4(6), 831–834.
Gîrd, C.E., Nencu, I., Costea, T., Duţu, L.E.,
Popescu, M.L., Ciupitu, N., (2014).
Quantitative analysis of phenolic
compounds from Salvia officinalis L.
leaves. Farmacia, 62(4), 649–657.
Goren, A.C., Piozzi, F., Akcicek, E., Kılıç, T.,
Çarıkçı, S., Mozioğlu, E., Setzer, W.N.,
(2011). Essential oil composition of
twenty-two Stachys species (mountain
tea) and their biological activities.
Phytochemistry Letters, 4(4), 448–453.
Gören, A., (2014). Use of Stachys species
(mountain tea) as herbal tea and food.
Records of Natural Products, 8(2), 71–82.
Hajdari, A., Novak, J., Mustafa, B., Franz,
C., (2012). Essential oil composition
and antioxidant activity of Stachys
sylvatica L. (Lamiaceae) from different
wild populations in Kosovo. Natural
Product Research, 26(18), 1676–1681.
Háznagy-Radnai, E., Balogh, Á., Czigle, S.,
Máthé, I., Hohmann, J., Blazsó, G.,
(2012). Anti-inflammatory activities of
Hungarian Stachys species and their
iridoids. Phytotherapy Research, 26(4),
505–509.
Háznagy-Radnai, E., Czigle, S., Janicsák,
G., Máthé, I., (2006). Iridoids of Stachys
species growing in Hungary. Journal of
Planar Chromatography – Modern TLC,
19(109), 187–190.
Imbrea, I., Butnariu, M., Nicolin, A., Imbrea,
F., Prodan, M., (2011). Valorising the
species Stachys officinalis (L.) Trevis.
from south-western Romania. Research
Journal of Agricultural Science, 43(2),
198–203.
Analele Universităţii din Craiova, seria Agricultură – Montanologie – Cadastru (Annals of the University of Craiova - Agriculture,
Montanology, Cadastre Series)Vol. 52/1/2022
Mo
Jug, U., Glavnik, V., Kranjc, E., Vovk, I.,
(2018). High-performance thin-layer
chromatography and high-performance
thin-layer chromatography–mass
spectrometry methods for the analysis
of phenolic acids. Journal of Planar
Chromatography, 31(1), 13–22.
Khanavi, M., Hajimahmoodi, M., Cheraghi-
Niroomand, M., Kargar, Z., Ajani, Y.,
Hadjiakhoondi, A., Oveisi, M.R., (2009).
Comparison of the antioxidant activity
and total phenolic contents in some
Stachys species. African Journal of
Biotechnology, 8(6), 1143–1147.
Khanavi, M., Manayi, A., Lotfi, M., Abbasi,
R., Majdzadeh, M., Ostad, S.N., (2012).
Investigation of cytotoxic activity in four
Stachys species from Iran. Iranian Journal
of Pharmaceutical Research, 11(2), 589–
593.
Kiliç, Ö., Özdemir, F.A., Yildirimli, Ş., (2017).
Essential oils and fatty acids of Stachys
L. taxa, a chemotaxonomic approach.
Progress in Nutrition, 19(Suppl 1), 49–59.
Lazarević, J.S., Đorđević, A.S., Kitić, D.V.,
Zlatković, B.K., Stojanović, G.S., (2013).
Chemical composition and antimicrobial
activity of the essential oil of Stachys
officinalis (L.) Trevis. (Lamiaceae).
Chemistry & Biodiversity, 10(7), 1335–
1349.
Lazarević, J.S., Palić, R.M., Radulović, N.S.,
Ristić, N.R., Stojanović, G.S., (2010).
Chemical composition and screening of
the antimicrobial and antioxidative activity
of extracts of Stachys species. Journal of
the Serbian Chemical Society, 75(10),
1347–1359.
Paun, G., Neagu, E., Moroeanu, V., Albu, C.,
Ursu, T.M., Zanfirescu, A., Negres, S.,
Chirita, C., Radu, G.L., (2018). Anti-
inflammatory and antioxidant activities of
the Impatiens noli-tangere and Stachys
18
officinalis polyphenolic-rich extracts.
Revista Brasileira de Farmacognosia,
28(1), 57–64.
Pozharitskaya, O.N., Ivanova, S.A., Shikov,
A.N., Makarov, V.G., (2008). Separation
and free radical-scavenging activity of
major curcuminoids of Curcuma longa
using HPTLC–DPPH method.
Phytochemical Analysis, 19(3), 236–
243.
Sarikurkcu, C., Ceylan, O., Benabdallah, A.,
Tepe, B., (2021). Stachys germanica
subsp. heldreichii (Boiss.) Hayek:
phytochemical analysis, antioxidant and
enzyme inhibitory activities. South African
Journal of Botany, 143, 291–300.
Satıl, F., Açar, M., (2020). Ethnobotanical
use of Stachys L. (Lamiaceae) taxa in
Turkey. International Journal of Nature
and Life Sciences, 4(2), 66–86.
Stegăruş, D.I., Lengyel, E., Apostolescu,
G.F., Botoran, O.R., Tanase, C., (2021).
Phytochemical analysis and biological
activity of three Stachys species
(Lamiaceae) from Romania. Plants,
10(12), 2710.
Tomou, E.M., Barda, C., Skaltsa, H., (2020)
Genus Stachys: a review of traditional
uses, phytochemistry and bioactivity.
Medicines (Basel), 7(10), 63.
Tundis, R., Peruzzi, L., Menichini, F., (2014).
Phytochemical and biological studies of
Stachys species in relation to chemo-
taxonomy: a review. Phytochemistry, 102,
7–39.
Venditti, A., Serrilli, A.M., Di Cecco, M.,
Ciaschetti, G., Andrisano, T., Bianco, A.,
(2013). Phytochemical composition of
polar fraction of Stachys germanica L.
subsp. salviifolia (Ten.) Gams, a typical
plant of Majella National Park. Natural
Product Research, 27(2), 190–193.
DOI: 10.17344/acsi.2023.8046 Acta Chim. Slov. 2023, 70, 231–239 231
Scientific paper

Chemical and Antioxidant Profile of Hydroalcoholic

Extracts of Stachys Officinalis L., Stachys Palustris L.,
Stachys Sylvatica L. from Romania
George Florian Apostolescu1, Diana Ionela (Stegarus) Popescu2, Oana Botoran2,
Daniela Sandru3, Nicoleta Anca Şuţan4,* and Johny Neamtu5
1 Doctoral school, Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy of Craiova, 2 Petru Rareş Street,
200349 Craiova, Romania
2 National Research and Development Institute for Cryogenics and Isotopic Technologies–ICSI Ramnicu Valcea,
4th Uzinei Street, 240050 Ramnicu Valcea, Romania
3 Department of Agricultural Sciences and Food Engineering, Lucian Blaga University of Sibiu, Doctor Ion Rațiu 7,
550012 Sibiu, Romania
4 Department of Natural Sciences, University of Pitesti, Targul din Vale 1, 110040 Pitesti, Romania
5 Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy of Craiova, 2-4 Petru Rares Str., 200349 Craiova, Romania

* Corresponding author: E-mail: anca.sutan@upit.ro

Tel.: +40 348 453 260

Received: 02-04-2023

Abstract
Stachys officinalis L., Stachys palustris L., Stachys sylvatica L. (Lamiaceae) are widely used as herbal remedies. In this study,
comparative assessment of the phenolic acids, flavonoids, anthocyanin, and tannins content, together with antioxidant
activity of the extracts obtained from flowers, leaves and stems was performed. Phenolic acids determined by the HPLC
method reached highest values in flower extract of S. palustris, stem extract of S. officinalis, and leaf extracts of S. sylvati-
ca. Flavonoids were found at values exceeding 100 mg quercetin equivalents (QE)/g dry weights in all three species, based
on the spectrophotometric method. Anthocyanins were detectable only in extracts from flowers. S. officinalis stood out
for the highest content of anthocyanins and tannins. Antioxidant activity was present in all three species studied, with S.
palustris standing out for the most intense ferric reducing antioxidant power. The results obtained lead to the validation
of applicability of these plants for curative and food purposes, given their variety and richness in bioactive compounds
and antioxidants.

Keywords: Stachys; Phenolic Compounds; Flavonoids; Anthocyanin; Tannins; Antioxidant

1. Introduction wide, most of them presenting exceptional curative prop-

Many plants are known for their therapeutical effects
in the treatment of certain diseases, but more and more are
being discovered, and nowadays there is an ever-increas-
ing return to nature and what it has to offer. Advanced or
classical extraction technologies of valuable components
lead to the completion of information in this field, the re-
sults being visible both in the scientific and commercial
areas.
One of the often refferened families in folk medicine
is Lamiaceae, with genera and species identified world-
erties. The genus Stachys is represented by 300–400 spe-
cies, native or acclimatized, natural or ornamental, their
importance and complex chemical composition being val-
idated by the increasingly varied research that is being car-
ried out and the possibility of superior exploitation of their
bioactive potential.1,2
Recent studies revealed antioxidant, enzyme inhibi-
tion, antidiabetic, anti-cholinesterase and anti-tyrosinase
properties of Stachys cretica subsp. mersinaea (Boiss.)
Rech.f., cytotoxic and antifungal activities of Stachys parv-

Apostolescu et al.: Chemical and Antioxidant Profile of Hydroalcoholic ...

232 Acta Chim. Slov. 2023, 70, 231–239
iflora L., Stachys cretica subsp. bulgarica Rech.f. (SC),
Stachys byzantina K. Koch (SB), Stachys thirkei K. Koch,
antibacterial activity against Gram-positive microorgan-
isms of Stachys byzantina K.Koch, S. officinalis and S. syl-
vatica, nephroprotective, anti-inflammatory, hepatopro-
tective and anticancer properties of Stachys pilifera Benth,
antiphlogistic effects of S. alpina, S. germanica, S. officinalis
and S. recta antidepressant activity and apoptotic effect of
Stachys pilifera Benth.3–11 Antioxidant activities were men-
tioned for all the above species. Nutritional value was also
showed by a number of studies for species such as Stachys
affinis Bunge, Stachys lavandulifolia Vahl. var. lavandulifo-
lia, Stachys sieboldii Miq. 12–14
The chemical composition of the extracts differs de-
pending on the species,6,9 on the solvent, on the different
parts of plants used for extraction15 and the geographical
area that the plants grow, 16,17 and so are the antioxidant
and antimicrobial properties.16,18
In the central area of Romania (Sibiu County), seven
species of Stachys genus have been identified so far: Stachys
alpina L., present on the valleys and slopes of the Cibin
and Făgăraș mountains; Stachys annua L. found on the
montan hills at altitudes between 300 m and 700 m; Sta-
chys germanica L. found on hills and montan hills at altitu-
des of 320–550 m; Stachys officinalis L. identified in hi-
lly-mountain areas at altitudes between 330–1250 m;
Stachys palustris L. growing sporadically at high altitudes
between 300 m and 900 m; Stachys recta L. present in the
hilly-mountainous area at altitudes between 260–800 m;
Stachys sylvatica L. present frequent on mountain hills at
high altitudes comprised 340–1470 m.19
Considering the therapeutic and nutritional potenti-
al of the species of the genus Stachys, this study provides a
comprehensive and comparative evaluation of polyphe-
nols and antioxidant profile of extracts obtained from
flowers, leaves and stems of the three species grown in the
central area of Romania (Sibiu County): S. officinalis, S. pa-
lustris and S. sylvatica. Although other reports include
chemical profile of Stachys sp., this is the first study that
shows the chemical and antioxidant profile differentiated
according to the aerial part of the plant and provide im-
portant clues regarding the optimal exploitation of plants,
through the use of plant organs with abundant bioactive
compounds.
2. Experimental
2. 1. Plant Samples and Description of the
Area of Interest
Plant samples: Stachys officinalis L. (hemicrypto-
phyte, Eurasia), Stachys palustris L. (hemicryptophyte, cir-
cumpolar), and Stachys sylvatica L. (hemicryptophyte,
Eurasia) were collected in July 2022, in the maximum
flowering period from depression Mărginimii groups. The
Apostolescu et al.: Chemical and Antioxidant Profile of Hydroalcoholic ...
area that was studied is located between coordinates:
45°45'23"N 23°55'28"E and 45°45'58"N 23°54'29"E, at an
altitude between 560 m and 610 m that covers the media
between villages Fântânele (Cacova) and Sibiel from
Mărginimea Sibiului.
Depression Mărginimii groups is located at the foot-
hills of Mountains Cindrel and is formed by two depres-
sions, one of Sibiu and the other of Săliște, separated by
Măgura Beleuța with an altitude of 630 m. Depression is
characterized by gradually hill Miocene aged at the foot-
hills of mountains, meadows, and terraces, attributes that
frame it in the contact area. The climate is distinguished
according to the landscape, with the depression area show-
ing warm sides, rich in precipitation, and more significant
in winter. The solar radiation exceeds 115 kcal/cm2 /year
overall. Air temperature oscillates depending on the land-
scape, depression area presenting an annual average tem-
perature of 9 °C and northwest winds. Rainfall totals over
600 mm, with summer showers. Woody and herbaceous
species are specific to the foothill area. The xerophiles
meadows from the Depression Mărginimii (of Săliște)
stand out through boreal plant diversity, dominated by
plants original from Eurasia, followed by those Europeans
and Central-European. Floristic species from this area
were botanically researched with results that led to a very
thorough and complete inventor.19
Plant samples of S. officinalis, S. palustris, and S. syl-
vatica were recorded within the CCBIA from L. Blaga Uni-
versity, Sibiu, Romania under no. 314/1, 314/2, and 314/3
respectively.
2. 2. Chemicals and Reagents
The chemicals and reagents used in the process were
sodium nitrite (NaNO2) 5%, aluminum chloride hexa-hy-
drate (AlCl3 . 6H2O) 10%, sodium hydroxide (NaOH) 1M,
quercetin, potassium chloride (KCl) 0.025M, sodium ace-
tate (CH3COONa) 0.4M, hydrochloric acid (HCl), cyani-
din-3-glucoside, reagent Folin-Ciocâlteu, sodium car-
bonate (Na2CO3) 20%, tannic acid, casein, 0.5% formic
acid in H2O, methanol (CH3OH), ferric-tripyridyltriazine
(Fe3+-TPTZ), Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchro-
man-2-carboxylic acid) from Fluka (Germany) and Sig-
ma-Aldrich (Germany). The HPLC standards were caffeic
acid, chlorogenic acid, p-coumaric acid, ferulic acid,
m-coumaric acid, sinapic acid, trans-cinnamic acid, ben-
zoic acid, ellagic acid, gallic acid, p- hydroxybenzoic acid,
rosemarinic acid, syringic acid, and vanillic acid from Sig-
ma-Aldrich (Germany).
2. 3. Preparation of Stachys sp. Extracts
Flowers, stems, and leaves of S. officinalis, S. palus-
tris, and S. sylvatica were dried separately at a temperature
of 40 °C until the constant mass. Each 50 g of shredded
dried material was soaked in a 500 mL solution of aqueous
 Acta Chim. Slov. 2023, 70, 231–239
80% methanol for 3 days at a temperature of 18 °C in a
covered container. The samples were decanted, filtered
with a Buchner vacuum pump (Whatman filter paper No.
1001 090), and concentrated in a rotary evaporator. The
dry extracts were resuspended in distilled water to a con-
centration of 1:1 mg/ml.
2. 4. Determination of Phenolic Acids (PAs)
PAs were quantified through the HPLC method pro-
posed by Baczek et al.20 slightly modified, and by consult-
ing other methods that were already applied on plant ex-
tracts.21,22 Phenolic acids were identified following the
HPLC system Smartline, KNAUER GmbH (Berlin, Ger-
many), equipped with a quaternary pump, automatic in-
jection and DAD detector, set to the following λ wave-
lengths: 280 nm, 320 nm, 360 nm. Briefly, C18 columns
(Zorbax SB – Aq: 250 mm × 4.6 mm i.d., 5.0 μm p.s) were
used. For the mobile phase, a solution of deionized H2O
and phosphoric acid (pH 3.5) was used as eluent A, and
acetonitrile (pH 3.5) as eluent B, with the follows ratio:
0.00 min – 20% B; 0.45 min – 20% B; 5.50 min – 30% B;
5.55 min – 90% B; 6.50 min – 95% B; 6.51 min – 20% B;
15.00 min – STOP. A volume of 2 μL extract was injected
into the column for chromatographic analysis, and the
flow rate was 1 mL/min, at the temperature of 35 °C and 15
min total time of analysis. The identification and quantifi-
cation of phenolic acids was achieved by comparison with
selected standards, using calibration curves for each indi-
vidual compound. The experiments were performed in
triplicate and the results were expressed in μg/g extract.24
2. 5. Determination of Total Flavonoid
Content (TFC)
Flavonoids were determined based on the spectro-
photometric method described by Popescu et al.23 The
aqueous extracts (5 mL) were homogenized with 5% Na-
NO2 solution (0.3 mL) and incubated for 5 minutes. Later
a solution of AlCl3 . 6H2O 10% (0.5 mL) was added and the
mixture was left to react in darkness. After 15 minutes of
reaction 2 mL of 1M NaOH solution was added and made
up to 10 mL with distilled water. The samples were read
with UV-1900 SHIMADZU spectrophotometer (Shimad-
zu Corporation, Kyoto, Japan) at a wavelength of 510 nm.
The TFC was expressed in mg quercetin equivalents /gram
of dry weight (mg QE/g DW).
2. 6. Determination of Total Monomeric
Anthocyanin Pigment Content
The colorimetric method based on the difference of
absorbance of anthocyanins at a change in pH (pH 1 and
pH 4.5) was applied for determination of total monomeric
anthocyanin pigment (MAPC) content.24 Depending on
their concentration, the difference in the absorbance of
Apostolescu et al.: Chemical and Antioxidant Profile of Hydroalcoholic ...
233
MAPC was read at a wavelength of 520 nm, respectively
700 nm, using UV-1900 SHIMADZU spectrophotometer
(Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). Results obtained
in mg/L cyanidin-3-glucoside were converted into mg/g.24
2. 7. Determination of Total Tannin Content
(TTC)
For the assessment of TTC, comparative quantifica-
tion of total polyphenols determined through Folin-Ci-
ocâlteu method and express the results in μg tannic acid
equivalents/ml (μg TAE/ml) and polyphenols residuals in
casein was applied. The difference between the total level
of polyphenols and polyphenols residuals represents the
TTC expressed in mg tannic acid equivalents /g dry weight
(mg TAE/g DW).25,26
2. 8. Determination of Ferric Reducing
Antioxidant Power (FRAP)
Antioxidant properties of the extracts were evaluat-
ed based on the reduction of Fe3+ -TPTZ in Fe2+-TPTZ by
antioxidants ingredients from the samples. FRAP was
monitored using the spectrophotometric method de-
scribed by Lachowicz-Wisniewska et al.27 Briefly, 1 mL of
each aqueous extracts was homogenized with 3 mL Fe3+
-TPTZ, absorbance being read at a wavelength of 593 nm
with UV-1900 SHIMADZU spectrophotometer (Shimad-
zu Corporation, Kyoto, Japan), after 10 minutes of incuba-
tion. The results are expressed in mg Trolox equivalents/g
of dry weight (mg TE/g DW).
2. 9. Multivariate Analysis
In order to explain the significant correlations be-
tween quality parameters (phenolic acids data), principal
component analysis (PCA) was the main approach of mul-
tivariate statistical analysis. In order to display data as sin-
gle point for each variable and to reveal the correspond-
ence between the principal component and the direction
of maximum variance, the data were mean-centered. Pear-
son correlations (p < 0.05 and p < 0.01) were used to iden-
tify correlations between all variables included in the data-
set. All statistical analyzes were performed using Addinsoft
XLSTAT software, version 2014.5.03 (Addinsoft Inc., New
York, NY, USA).
3. Results and Discussions
3. 1. Phenolic Acids in Stachys Extracts
Through their anti-cancer, anti-inflammatory and
antimicrobial action5,28–31 or through their positive effects
on curing neurodegenerative diseases such as Alzhei-
mer’s,3 phenolic acids represent bioactive plants secondary
metabolites with important preventive and curative acti-
234 Acta Chim. Slov. 2023, 70, 231–239

ons. Seven hydroxybenzoic acids and eight hydroxycinna-
mic acids were identified in Stachys flower extracts, with
very low (0.01 μg/g trans-cinnamic acid) or generous val-
ues (27970.53 μg/g benzoic acid).
The results presented in Table 1 indicate that benzoic
acid accumulates significantly especially in flower of S. syl-
vatica (19071.32 μg/g) and S. palustris (27970.53 μg/g) and
leaves of S. officinalis (4564.43 μg/g). The lowest values of
benzoic acid were observed in extracts of stems, varying
between a minimum of 282.28 μg/g in S. palustris and a
maximum of 1270.16 μg/g in S. officinalis. At a significant-
ly lower detected concentration (3080 μg/g extract), ben-
zoic acid was indicated as one of the most abundant phe-
nolic compound of S. cretica subsp. Mersinaea.3
The ellagic acid has been identified in the flowers ex-
tracts in quantities between 18.02 μg/g for S. palustris and
32.01 μg/g for S. sylvatica, the obtained values for the stems
extracts being below 7 μg/g, and those for the leaves ex-
tracts reaching a maximum of 21.12 μg/g in S. sylvatica.
Uneven amounts of gallic acid were found in the studied
extracts. Gallic acid was found in values below 10 μg/g in
flower extracts and it was undetected in stems. In compar-
ison, higher content of 16.59 mg gallic acid equiv./g dry
matter in Stachys lavandulifolia Vahl.32 or 900.61±0.06 mg
gallic acid equivalent /100 g in dried herb in Stachys aleur-
ites Boiss. & Heldr. was reported.33 The p-hydroxybenzoic
acid was identified at significant values in the flower ex-
tracts of S. sylvatica (83.15 μg/g) and in the leaves extracts
of S. officinalis (73.43 μg/g). Salicylic acid was found in
trace, with amounts between 0.22μg/g – 9.42 μg/g in flow-
ers extracts, and with subunit values in extracts of stems
and leaves (0.27 μg/g – 0.96 μg/g), irrespectively of the spe-
cies. Significantly lower amount of p-hydroxybenzoic acid
(0.006 mg g−1 DW) and significantly higher amount of sa-
licylic acid (0.168 mg g−1 DW) were found in methanol
extracts of leaves of S. byzantina, in comparison with
leaves and flower extracts in our study.34 These results sug-
gest a species-specific phenolic acid pattern.
Syringic acid was fluctuated in flower extracts between
389.41 μg/g in S. officinalis and 569.78 μg/g in S. palustris, in
stems extracts between 11.24 μg/g in S. palustris and 126.32
μg/g in S. sylvatica, and in leaf extracts between 9.29 μg/g in
S. palustris and 111.11 μg/g in S. sylvatica. A syringic acid
derivative was found in ethanol extract of dried roots of
Stachys geobombycis C.Y.Wu.35 Vanillic acid was not detected
in the stems and leaves of studied extracts, and was identified
only in the flower extracts at values between 266.78 μg/g (S.
officinalis) and 343.21 μg/g (S. palustris).
Among the hydroxycinnamic acids identified, the
most significant amounts were found in the case of chloro-
genic acid with values varying in the flower extracts be-
tween 1011.78 μg/g (S. officinalis) and 7132.29 μg/g (S.
palustris). Chlorogenic acid was also identified in stems
(125.37 μg/g – 333.25 μg/g) and in leaves (113.48 μg/g –
452.65 μg/g) in all three species. Chlorogenic acid and
vanillic acid were predominant in aerial parts extracts of
Stachys cretica L. subsp. vacillans Rech. Fil.30 Syringic acid
and vanillic acid were identified in Stachys sp. aff. Schim-
peri whole plant extract.36
Caffeic acid was identified in the flower extracts at
values over 100 μg/g, but in leaf and stems extracts the val-
ues were only subunit, or undetectable in the stems ex-
tracts of S. officinalis. Caffeic acid was found as major phe-
nolic compound for Stachys tmolea Boiss.37 The p-coumaric
acid was detected in all Stachys extracts, values being sig-
nificantly identified in the flower extracts (35.66 μg/g –

Table 1. Phenolic acids identified and quantified in extracts obtained from flowers, stems and leaves of S. officinalis, S. palustris, S. sylvatica

Phenolic acid S. officinalis (μg/g) S. palustris (μg/g) S. sylvatica (μg/g)

Flowers Stems Leaves Flowers Stems Leaves Flowers Stems Leaves
Hydroxybenzoic acid
Benzoic acid 12464.34 1270.16 4564.43 27970.53 282.28 2225.44 19071.32 347.79 3447.22
Ellagic acid 24.25 4.56 12.34 18.02 1.27 2.97 32.01 6.96 21.12
Gallic acid 7.33 n.d 0.27 2.48 n.d 0.22 9.34 n.d n.d
P-hydroxybenzoic acid 25.39 2.11 73.43 49.27 8.54 57.14 83.15 n.d 4.04
Salicylic acid 5.23 0.96 0.35 9.42 0.27 0.22 1.22 0.29 0.77
Syringic acid 389.41 34.12 22.44 569.78 11.24 9.29 487.76 126.32 111.11
Vanillic acid 266.78 n.d n.d 343.21 n.d n.d 312.22 n.d n.d
Hydroxycinamic acid
Caffeic acid 102.56 n.d 0.01 176.53 0.02 0.15 149.28 0.04 0.11
Chlorogenic acid 1011.78 125.37 452.65 7132.29 234.23 217.02 2119.69 333.25 113.38
P- coumaric acid 35.66 10.21 12.92 46.22 9.22 16.78 55.19 22.33 24.21
Ferulic acid 821.32 247.77 293.99 916.16 196.78 241.39 441.02 133.44 188.07
M-coumaric acid 5.66 1.21 2.92 4.22 n.d n.d 5.19 2.33 4.21
Rosmarinic acid 9.56 n.d n.d 4.93 n.d n.d 4.55 n.d n.d
Sinapic acid 7.99 n.d n.d 3.23 n.d 0.03 7.13 n.d 0.05
Trans-cinnamic acid 0.01 n.d n.d n.d n.d n.d n.d n.d n.d
Total 15177.27 1696.47 5435.75 37246.29 743.85 2770.65 22779.07 972.75 3914.29
Values are expressed as mean (n = 3), n.d = not detected

Apostolescu et al.: Chemical and Antioxidant Profile of Hydroalcoholic ...

 Acta Chim. Slov. 2023, 70, 231–239 235

55.19 μg/g), and lower in stems and leaves (9.22 μg/g – Table 2. Flavonoids, anthocyanins, tannins and antioxidant activity
24.21 μg/g). In all assessed extracts a significant amount of of S. officinalis, S. palustris, S. sylvatica
ferulic acid were quantified. The values determined in the
Species Aerial Total Antho- Total FRAP
flower extracts varied between 441.02 μg/g and 916.16
part flavonoids cyanins tannins
μg/g, and in the stem extracts up to a maximum of 247.77
(mgQE/g (mg/g (mg TAE/ (mg TE/
μg/g. Ferulic acid were identified in other species, such as DW) DW) g DW) g DW)
Stachys germanica L.,38 Stachys pumila Banks & Sol.,39 S.
byzantine34 and in Stachys thirkei K. Koch was found as S. officinalis Flowers 45.36 32.61 87.55 71.34
major phenolic compounds along with chlorogenic acid, Stems 39.45 n.d 77.39 56.38
Leaves 31.22 n.d 84.27 83.22
caffeic acid and rosmarinic acid.37
Total 38.67 10.87 83.07 70.31
In the extracts obtained from flowers have been de-
S. palustris Flowers 51.66 19.88 75.54 93.76
tected m-coumaric acids (4.22 μg/g – 5.66 μg/g), ros- Stems 19.78 n.d 44.97 66.09
marinic acid (4.55 μg/g – 9.56 μg/g), sinapic acid (3.23 Leaves 32.67 n.d 71.76 76.21
μg/g – 7.29 μg/g), trans-cinnamic acid (0.01 μg/g for Total 34.70 19.88 64.09 78.68
Stachys Officinalis L). Other authors analyzed phenolics S. sylvatica Flowers 39.48 27.72 101.33 87.54
compounds, respectively PAs from various Stachys ex- Stems 29.07 n.d 56.39 63.27
tracts, results being noted in the case of species S. officina- Leaves 31.63 n.d 51.15 75.77
lis, 20,40,41,42 S. palustris,12,41 S. sylvatica,12,38 Stachys cretica Total 34.70 27.72 69.62 75.52
ssp. anatolica Rech. Fil.,31 Stachys lavandulifolia Vahl.,43
Stachys tmolea Boiss.44
3. 4. Determination of Total Tannin Content
3. 2. Total Flavonoid Content in Flower, Stem
Tannins are phenolic compounds produced as sec-
and Leaf Extracts ondary metabolites by terrestrial and aquatic plants.49 Ta-
Flavonoids are important bioactive compounds ble 2 stands out the fact that tannins vary in the flower
identified in all extracts, irrespective of plant species or or- extracts from 75.54 mg TAE/g DW to 101.33 mg TAE/g
gan used. As noted in table 2, the highest value of 51.66 mg DW, the significantly higher value being attributed to S.
QE/g DW were identified in flower extract of S. palustris, sylvatica. In the extracts derived from stems, TTC was
followed by flower extracts of S. officinalis (45.36 mg QE/g quantified to a value of 44.97 mg TAE/g DW and 77.39 mg
DW) and S. sylvatica (39.48 mg QE/g DW). TFC was lower TAE/g DW, the lowest value being defining for the species
in the extracts obtained from the stems and leaves regard- S. palustris. Lachowicz-Wisniewska et al. identified 36 hy-
less of the species. Similar or lower TFC was identified by drolysable tannins in S. palustris flower extracts, 32 in
other authors in Stachys species. Sarikurkcu et al. reported stem extracts and 31 in leaf extracts.27 TTC varied between
a TFC between 39.24 mg Re/g extract (routine equiva- the level of 1.72% and 2.91% pyrogallol equivalent in S.
lents) and 47.70 mg Re/g for S. byzantina extract,45 and officinalis, depending of the vegetative stage of plant devel-
Ahmadvand et al. referenced a TFC of 17.09 mg QE/g ex- opment.20
tract and 31.18 mg QE/g for Stachys inflata Benth extract.46
3. 5. Principal Component Analysis of
3. 3. Anthocyanins Content in Flower, Stem Flowers, Stems and Leaves Sample of S.
and Leaf Extracts Officinalis, S. Palustris and S. Sylvatica
Anthocyanins are water-soluble, colored and bioac- The results obtained through HPLC method were
tive compounds, associated with the red color of the flower analyzed and interpreted to explain and to identify the re-
petals of the three studied species. In this study, anthocya- lationships and the patterns of chemical compounds char-
nins were identified at an average value of 32.61 mg/g ex- acteristic of S. officinalis, S. palustris and S. sylvatica flow-
tract in Stachys officinalis flowers, 19.88 mg/g extract in ers, leaves and stems. The first principal component (PC1)
Stachys palustris flowers and 27.72 mg/g extract in Stachys corresponds to 68% of the total variation, while the second
sylvatica flowers. Table 2 shows the lack of anthocyanins in principal component (PC2) explains only approximately
the extracts from stems and leaves. Anthocyanins were al- 11% (Figure 1). The analysis of the PCA from flowers,
so detected by Lachowicz-Wisniewska et al.27 in the flowers leaves and stems showed a separation of the samples de-
of the species Stachys palustris at an average amount of 20 pending on their chemical composition, leaves and stems
mg/100 g d.m. or by Bursal et al.47 in the extracts of Stachys of S. sylvatica, stems of S. officinalis being located on the
annua at an average value of 34.3 μg/g, but also by other negative semiaxes. The location of the S. officinalis flower
authors who highlighted their antioxidant and anti-in- sample in quadrant II, away from the other samples, sug-
flammatory qualities.48 gests the highest content of anthocyanins, flavonoids, ros-
marinic acid, M-coumaric acid, etc. A similar content of

Apostolescu et al.: Chemical and Antioxidant Profile of Hydroalcoholic ...

236 Acta Chim. Slov. 2023, 70, 231–239

PAs are indicated by the close location of samples from
flowers of S. palustris and S. sylavtica in the first quadrant,
on the one hand, and samples from leaves of S. palustris
and S. officinalis in the IV quadrant, on the other side (Fig-
ure 1a). The main components of positive side of PC1 were
p-coumaric acid, flavonoids, ellagic acid, rosmarinic acid,
anthocyanin, salicylic acid, syringic acid, sinapic acid and
trans-cinnamic acid, while the positive side of the PC2 is
identified with vanillic acid, tannins, caffeic acid, ferulic
acid, p-hydroxybenzoic acid (Figure 1b).
The results are confirmed by the Pearson correlation
coefficient. In the heatmap presented in Figure 2, a signifi-
cant positive correlation can be observed between the
chemical variables identified in the analyzed samples, very
rarely being identified a weak negative correlation between
the chemical components, such as between trans-cinnam-
ic acid and P-hydroxybenzoic acid or FRAP.
nua L. that FRAP values varied between 334.5 mg TE/g
extract and 1409.5 mg TE/g extract.50 Other studies re-
vealed that FRAP values of Stachys thirkei K. Koch. and
Stachys turcomanica Trautv. extracts varied depending on
the solvent type and on the concentration of the solvent
used for extraction, respectively.5, 51
4. Conclusions
Extracts obtained from flowers, leaves and stems of
S. officinalis, S. palustris, S. sylvatica have a chemical com-
position rich in phenolic compounds. The comparative
analysis has completed the literature data with new and
comprehensive information about the phenolic and anti-
oxidant profile. Compared to stems and leaves, these bio-
active compounds are more abundant in flowers, but to-

(a) (b)

Figure 1. Differentiation of flowers, leaves and stems sources based on the compositional profile; (a) PCA score plot illustrating differentiation of
flowers, leaves and stems sources based on the compositional profile. Colored symbols correspond to the flowers, leaves and stems of the three spe-
cies addressed in this study (So – S. officinalis, Sp – S. plustris and Ss – S. sylvatica). The first two principal axes explained approximately 79% of the
variance; (b) PCA loading plot showing the multivariate variation among the flowers, leaves and stems of the three species in terms of chemical
compositional variables

3. 6. FRAP of Flower, Stem and Leaves
Extracts
In the flower, stem and leaf extracts of S. officinalis, S.
palustris, S. sylvatica, FRAP values varied between 56.38
mg TE/g DW and 93.76 mg TE/g DW (Table 2). It is noted
that this activity is more significant for flower extracts ob-
tained from S. palustris, followed by S. sylvatica, and then
by S. officinalis. Regarding the leaf extracts, a more pro-
nounced activity is on S. officinalis (83.22 mg TE/g ex-
tract), followed by S. palustris (76.21 mg TE/g extract) and
S. sylvatica (75.77 mg TE/g extract). Significant values
were also obtained on Stachys cretica L. extract (12.98±0.11
mg TE/g extract, 236.44±2.96 mg TE/g extract, 254.40±8.58
mg TE/g extract, 127.20 mg TE/g extract).3,29,30,31,47 Cüce
et al. established for micropropagated plants of Stachys an-
gether they create a generous profile. Flavonoids, ant-
hocyanins and tannins are found in the most significant
amounts in S. officinalis, followed by S. palustris and S. syl-
vatica. The PCA analysis revealed significant differences in
chemical composition of flowers, leaves and stems. Valua-
ble elements such as hydroxybenzoic or hydroxycinnamic
acids, the plenteous load of natural antioxidants in the as-
sessed extracts, place them in the recommended list for
their further use in pharmaceutical, cosmetic and food
industries.
Funding
This work was supported by the grant POCU/993/6/13
-153178, co-financed by the European Social Fund within

Apostolescu et al.: Chemical and Antioxidant Profile of Hydroalcoholic ...

 Acta Chim. Slov. 2023, 70, 231–239 237

Figure 2. Heatmap of Pearson correlation coefficient obtained from chemical compositional variables analyzed from flowers, leaves and stems of S.
officinalis, S. palustris and S. sylvatica

the Sectorial Operational Program Human Capital 2014 –
2020, PN 23150301 (The implementation of integrated is-
otopic-chemical-nuclear analytical method-ologies for the
authentication of traditional Romanian food product-
s).N.A.Ș. gratefully acknowledges the support obtained
through project number PN-III-P4-ID-PCE-2020-0620,
within PNCDI III, a grant from the Romanian Ministry of
of Education and Research, CNCS–UEFISCDI.
5. References
1. M.S. Kocak, M.C. Uren, M. Calapoglu, A. Sihoglu Tepe, A.
Mocan, K.R.R. Rengasamy, C. Sarikurkcu, S. Afr. J. Bot. 2017,
113, 128–1321. DOI:10.1016/j.sajb.2017.08.005
2. E.M.Tomou, C. Barda, H. Skaltsa, Medicines 2020, 7, 63.
DOI:10.3390/medicines7100063
3. M.B. Bahadori, B. Kirkan, C.Sarikurkcu, Ind. Crop Prod.
2019, 127, 82–87. DOI:10.1016/j.indcrop.2018.10.066
4. A.Shakeri, G. D’Urso, S.F. Taghizadeh, S. Piacente, S.Norouzi,
V.Soheili, J.Asili, D. Salarbashi, J. Pharm. Biomed. Anal. 2019,
168, 209–216.
DOI:10.1016/j.jpba.2019.02.018
5. G. Gülsoy Toplan, T. Tașkın, E. Mataracı Kara, G.E. Genç.,
Istanbul J. Pharm. 2021, 51, 341–347.
DOI:10.26650/IstanbulJPharm.2021.974035
6. D.I. Stegăruș, E. Lengyel, G.F. Apostolescu, O.R. Botoran, C.
Tanase, Plants 2021, 10, 2710.
DOI:10.3390/plants10122710
7. H. Sadeghi, D. Rostamzadeh, E. Panahi Kokhdan, A. As-
faram, A.H. Doustimotlagh, N. Hamidi, S. Hossein, Evid.
Based Complement. Alternat. Med. 2022, 7621599.
DOI:10.1155/2022/7621599
8. H. Sadeghi, M. Mansourian, E.P. Kokhdan, Z. Salehpour, I.
Sadati, K. Abbaszadeh-Goudarzi, A. Asfaram, AH. Dousti-
motlagh, J. Food Biochem. 2020, 44, e13190.
DOI:10.1111/jfbc.13190
9. E. Háznagy-Radnai, Á. Balogh, S. Czigle, I. Máthé, J. Hoh-
mann, G. Blazsó, Phytother. Res. 2012, 26, 505–509.
DOI:10.1002/ptr.3582
10. R. Jahani, D. Khaledyan, A. Jahani, E. Jamshidi, M. Kamali-
nejad, M. Khoramjouy, M. Faizi, Res. Pharm. Sci. 2019, 14,
544–553. DOI:10.4103/1735-5362.272563
11. E. Panahi Kokhdan, H. Sadeghi, H. Ghafoori, H. Sadeghi, N.
Danaei, S. Salaminia, M.R. Aghamaali, Armaghane Danesh
2019, 24, 17–30.

Apostolescu et al.: Chemical and Antioxidant Profile of Hydroalcoholic ...

238 Acta Chim. Slov. 2023, 70, 231–239
12. A. Venditti, C. Frezza, D. Celona, A. Bianco, M. Serafini, K.
Cianfaglione, D. Fiorini, S. Ferraro, F. Maggi, A.R. Lizzi, G.
Celenza, 2017, Food Chem. 221, 473–481.
DOI:10.1016/j.foodchem.2016.10.096
13. M. Tuncturk, R. Tuncturk, U. Karik, T. Eryigit, Int. J. Agric.
Environ. Food Sci. 2019, 3, 5–8.
DOI:10.31015/jaefs.2019.1.2
14. J.K. Lee, J.-J. Lee, Y.-K. Kim, Y. Lee, J.-H. Ha, Nutrients 2020,
12, 2063. DOI:10.3390/nu12072063
15. K. Namvar, E.A. Salehi, N. Mokhtarian, Bioscience Journal
2018, 34, 1349–1356.
DOI:10.14393/BJ-v34n5a2018-41517
16. C.Georgescu, A. Frum, L.I. Virchea, A. Sumacheva, M.
Shamtsyan, F.G. Gligor, N.K. Olah, E. Mathe, M. Mironescu,
Molecules 2022, 27, 4986.
DOI:10.3390/molecules27154986
17. V.B. Vundać, A.H. Brantner, M. Plazibat, Food Chem. 2007,
104,1277–1281. DOI:10.1016/j.foodchem.2007.01.036
18. C. Popescu, C. Popescu, B. Popescu, D. Daas, C. Morgovan,
N.K. Olah, Farmacia 2014, 62, 743–752.
DOI:10.1016/j.foodchem.2007.01.036
19. C. Drăgulescu (Ed.), „Lucian Blaga” University Sibiu, 2010,
pp.450–452.
20. K. Bączek, O. Kosakowska, J.L. Przybył, Z. Węglar, Herba Pol.
2016, 62, 7–16. DOI:10.1515/hepo-2016-0007
21. F.G. Gligor, A. Frum, L.G. Vicas, M. Totan, C. Roman-Filip,
C.M. Dobrea, Anal. Lett. 2020, 53, 1391–1406.
DOI:10.1080/00032719.2019.1708373
22. V.I. Craciun, F.G. Gligor, A.M. Juncan, A.A. Chis, L.L. Rus,
Rev. Chim. 2019, 70, 3202–3205.
DOI:10.37358/RC.19.9.7516
23. D.I. Popescu, E. Lengyel, F.G. Apostolescu, L.C. Sun, O.R. Bo-
toran, N.A. Șuțan, Horticulturae 2022, 8, 952.
DOI:10.3390/horticulturae8100952
24. J. Lee, R.W. Durst, R.E. Wrolstad, J. AOAC Int. 2005, 88,
1269–1278. DOI:10.1093/jaoac/88.5.1269
25. E.L.C. Amorim, J.E. Nascimento, J.M. Monteiro, T.J.S.P. So-
brinho, T.A.S. Araujo, U.P. Albuquerque, Functional Ecosys-
tems and Communities 2008, 88–94.
26. C.L. Gomes, C.C.A.R. Silva, C.G. De Melo, M.R.A. Ferreira,
L.A.L. Soares, R.M.F. Da Silva, L.A. Rolim, P.J. Rolim Neto,
An. Acad. Bras. Cienc. 2021, 93, e20190373.
DOI:10.1590/0001-3765202120190373
27. S. Lachowicz-Wisniewska, A. Pratap-Singh, I. Kapusta,
A. Kruszynska, A. Rapak, I. Ochmian, T. Cebulak, W. Zu-
kiewicz-Sobczak, P. Rubinski, Pharmaceuticals 2022, 15, 785.
DOI:10.3390/ph15070785
28. V. Amalan, V. Natesan, I. Dhananjayan, R. Arumugam, Bio-
med. Pharmacother. 2016, 84, 230–236.
DOI:10.1016/j.biopha.2016.09.039
29. M.B. Bahadori, B. Kirkan, C. Sarikurkcu, O. Ceylan, Ind. Crops
Prod. 2019, 131, 85–89. DOI:10.1016/j.indcrop.2019.01.038
30. B. Kirkan, C. Sarikurkcu, O. Ceylan, Ind. Crop and Prod.
2019, 131, 85–89. DOI:10.1016/j.indcrop.2019.01.038
31. I. Carev, C. Sarikurkcu, Plants 2021, 10, 1054.
DOI:10.3390/plants10061054
Apostolescu et al.: Chemical and Antioxidant Profile of Hydroalcoholic ...
32. S. Rahimi Khoigani, A. Rajaei, S.A.Goli, Nat Prod. Res. 2017,
31, 355–358. DOI:10.1080/14786419.2016.1233410
33. G. Ozkan, R.S. Gokturk, O. Unal, S. Celik, Chem. Nat. Comp.
2006, 42, 172–174. DOI:10.1007/s10600-006-0070-1
34. O. Sytar, I. Hemmerich, M. Zivcak, C. Rauh, M. Brestic, Saudi
J Biol. 2018, 25(4), 631–641. DOI:10.1016/j.sjbs.2016.01.036
35. X. Zhou, S. Huang, P. Wang, Q. Luo, X. Huang, Q. Xu, X. Qin,
J. Qin, C. Liang, X. Chen, Nat. Prod. Res. 2017, 1–6.
DOI:10.1080/14786419.2017.1405413
36. M. Abdel-Mogib, H.S.M. Al-Zahrani, JKAU: Sci. 2005, 17,
77–82. DOI:10.4197/Sci.17-1.8
37. T. Askun, E.M. Tekwu, F. Satil, S. Modanlioglu, H. Aydeniz,
BMC Complement. Altern. Med. 2013, 13, 365.
DOI:10.1186/1472-6882-13-365
38. S.S. Mitic, M. Stojkovic, J.L. Pavlović, M. Mitić, B.T. Stojano-
vić, Oxid. Commun. 2012, 35, 1011–1021.
39. R.A. Kepekçi, S. Polat, G. Çoșkun, A. Çelik, A.S. Bozkurt, Ö.
Yumrutaș, M. Pehlivan, J. Food Biochem. 2017, 41, 12286.
DOI:10.1111/jfbc.12286
40. I. Šliumpaite, P. Venskutonis, M. Murkovic, O. Ragažinskie-
ne, Ind. Crop Prod. 2013, 50, 715–722.
DOI:10.1016/j.indcrop.2013.08.024
41. V. B. Vundać, 2019, Plants (Basel), 8, 32.
DOI:10.3390/plants8020032
42. J.S. Lazarević, A.S. Ðorđević, D.V. Kitić, B.K. Zlatković, G.S.
Stojanović, Chem. Biodivers. 2013, 10, 1335–1349.
DOI:10.1002/cbdv.201200332
43. M.N. Bingol, E. Bursal, Int. Lett. Nat. Sci. 2018, 72, 28–36.
DOI:10.18052/www.scipress.com/ILNS.72.28
44. W. Elfalleh, B. Kirkan, C. Sarikurkcu, Ind. Crop Prod. 2019,
127, 212–216. DOI:10.1016/j.indcrop.2018.10.078
45. C. Sarikurkcu, M.S. Kocak, M.C. Uren, M. Calapoglu, A.S.
Tepe, Eur. J. Integr. Med. 2016, 8, 631–637.
DOI:10.1016/j.eujim.2016.04.010
46. H. Ahmadvand, S. Farajollahi, H. Amiri, A. Amiri,
Herb. Med. J. 2017, 2, 97–104. DOI: 10.22087/hmj.v0i0.623
47. S.E. Bursal, P. Taslimi, A.C. Gören, I. Gülçin, Biocatal. Agric.
Biotechnol. 2020, 28, 101711.
DOI:10.1016/j.bcab.2020.101711
48. G. Paun, E. Neagu, V. Moroeanu, C. Albu, T.-M. Ursu, A.
Zanfirescu, S. Negres, C. Chirita, G.L. Radu, Rev. Bras. Far-
macogn. 2018, 28, 57–64. DOI:10.1016/j.bjp.2017.10.008
49. M. Fraga-Corral, P. Otero, J. Echave, P. Garcia-Oliveira, M.
Carpena, A. Jarboui, B. Nuñez-Estevez, J. Simal-Gandara,
M.A. Prieto, Foods 2021, 10, 137.
DOI:10.3390/foods10010137
50. M. Khanavi, M. Hajimahmoodi, M. Cheraghi-Niroomand,
Z. Kargar, Y. Ajani, A. Hadjiakhoondi, M. R. Oveisi, Afr. J.
Biotechnol. 2009, 8, 1143–1147.
DOI:10.5897/AJB2009.000-9182
51. M. Cüce, T. Bekircan, A.H. Laghari, M. Sökmen, A. Sökmen,
E.Ö. Uçar, A.O. Kılıç, Indian J. Tradit. Knowl. 2017, 16, 407–
416.
52. K. Namvar, A. Mohammadi, E.A. Salehi, P. Feyzi, Pharm. Sci.
2017, 23, 244–248. DOI:10.15171/PS.2017.36
 Acta Chim. Slov. 2023, 70, 231–239 239

Povzetek
Stachys officinalis L., Stachys palustris L., Stachys sylvatica L. (Lamiaceae) se pogosto uporabljajo kot zdravila rastlinskega
izvora. V tej raziskavi je bila opravljena primerjalna ocena vsebnosti fenolnih kislin, flavonoidov, antocianinov in taninov
ter antioksidativne aktivnosti izvlečkov, pridobljenih iz cvetov, listov in stebel. Fenolne kisline, določene z metodo HPLC,
so dosegle najvišje vrednosti v izvlečku cvetov S. palustris, izvlečku stebla S. officinalis in izvlečku listov S. sylvatica. Na
podlagi spektrofotometrične metode so bile pri vseh treh vrstah ugotovljene vrednosti flavonoidov, ki so presegale 100
mg ekvivalentov kvercetina (QE)/g suhe snovi. Antocianini so bili zaznani le v izvlečkih iz cvetov. S. officinalis se je od-
likoval z najvišjo vsebnostjo antocianinov in taninov. Antioksidativna aktivnost je bila prisotna pri vseh treh proučevanih
vrstah, pri čemer se je vrsta S. palustris odlikovala z najintenzivnejšo antioksidativno sposobnostjo reduciranja železovih
ionov. Dobljeni rezultati so zaradi raznolikosti in bogastva bioaktivnih spojin in antioksidantov pripeljali do potrditve
uporabnosti teh rastlin v zdravilne in prehrambene namene.

Except when otherwise noted, articles in this journal are published under the terms and conditions of the
Creative Commons Attribution 4.0 International License

Apostolescu et al.: Chemical and Antioxidant Profile of Hydroalcoholic ...

Polyphenol content and antioxidant activity of some Stachys spp. (Lamiaceae) from Romania flora

Florian George Apostolescu1, Ludovic Everard Bejenaru2, $QGUHL%LĠă2*, &ăWăOLQD*DEULHOD3LVRVFKL1,3,

*HRUJH'DQ0RJRúDQX2, Cornelia Bejenaru4, and -RKQ\1HDPĠX1,5
1
'RFWRUDO6FKRRO8QLYHUVLW\RI0HGLFLQHDQG3KDUPDF\RI&UDLRYD3HWUX5DUHú6WUHHW&UDLRYD5RPDQLD
E-mail: apostolescugeorge@yahoo.com
2
Department of Pharmacognosy & Phytotherapy, Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy of
&UDLRYD3HWUX5DUHú6WUHHW&UDLRYD5RPDQLD(-mail: andrei.bita@umfcv.ro, ludovic.bejenaru@umfcv.ro

Department of Pharmaceutical Biochemistry, Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy of Craiova,
3HWUX5DUHú6WUHHW&UDLRYD5RPDQLD(-mail: catalina.pisoschi@umfcv.ro

Department of Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy of Craiova,
3HWUX5DUHú6WUHHW&UDLRYD5RPDQLD(-mail: cornelia.bejenaru@umfcv.ro
5
'HSDUWPHQWRI3K\VLFV)DFXOW\RI3KDUPDF\8QLYHUVLW\RI0HGLFLQHDQG3KDUPDF\RI&UDLRYD3HWUX5DUHú6WUHHW
&UDLRYD5RPDQLD(-mail: johny.neamtu@umfcv.ro

Running title:
Stachys VSSSRO\SKHQROFRQWHQWDQGDQWLR[LGDQWDFWLYLW\

Corresponding author:
$QGUHL%LĠă/HFWXUHU3KDUP3K''HSDUWPHQWRI3KDUPDFRJQRV\ 3K\WRWKHUDS\)DFXOW\RI3KDUPDF\8QLYHUVLW\RI
0HGLFLQH DQG 3KDUPDF\ RI &UDLRYD  3HWUX 5DUHú 6WUHHW  &UDLRYD 5RPDQLD 3KRQH –  )D[
–426 688, e-PDLODQGUHLELWD#XPIFYUR

ORCID #:
)ORULDQ*HRUJH$SRVWROHVFX---$QGUHL%LĠă---
&ăWăOLQD*DEULHOD3LVRVFKL---*HRUJH'DQ0RJRúDQX--6338-
-RKQ\1HDPĠX---.
Abstract
Introduction: 6WDUWLQJ IURP WKHLU GLYHUVLILHG SK\WRFKHPLFDO FRPSRVLWLRQ PRGHUQ UHVHDUFK UHYHDOHG LPSRUWDQW
SKDUPDFRORJLFDODFWLRQV IRUStachys spp.: DQWLPLFURELDOF\WRWR[LFDQGDQWLSUROLIHUDWLYHDQWLR[LGDQWDQWL-LQIODPPDWRU\
DQ[LRO\WLFKHSDWRSURWHFWLYHZRXQGKHDOLQJDQWL-GLDEHWHVDQWLYLUDOHQ]\PHLQKLELWRU\. Moreover, Stachys spp. are used
LQWKHHWKQRSKDUPDFRORJ\RIWKH0HGLWHUUDQHDQDUHDDVZLOG PRXQWDLQ WHDDJDLQVWFRXJKDQGFROGGLDEHWHVUKHXPDWLVP
VWRPDWLWLVDQGDOVRDVIXQFWLRQDOIRRGVIRUKHDOWK\GLHW0HWKRGV,QWKLVVWXG\IRXUStachys spp. S. germanica L., S.
officinalis / 7UHYLVVLQBetonica officinalis L., S. recta L., and S. sylvatica / FROOHFWHGIURPWKH5RPDQLDQIORUDZHUH
DQDO\]HGIURPWKHSRLQWRIYLHZ RI8+3/&SRO\SKHQROILQJHUSULQWWRWDOSRO\pKHQRO FRQWHQW 73& and total IODYRQRLG
content 7)& . ,Q DGGLWLRQ WKHLU UDGLFDO VFDYHQJLQJ DFWLYLW\ ZDV HYDOXDWHG E\ '33+ DQG $%76 DVVD\V 5HVXOWV
&KORURJHQLF DFLG DQG LVRTXHUFLWULQ ZHUH IRXQG LQ DOO DQDO\]HG VDPSOHV$ PRGHUDWH DPRXQW RI URVPDULQLF DFLG ZDV
TXDQWLILHGRQO\IRUS. officinalis7KHKLJKHVW73&DQG7)&ZHUHHVWDEOLVKHGIRUS. recta VDPSOe. 7KHKLJKHVWDQWLR[LGDQW
FDSDFLW\ZDVGHWHUPLQHGIRUS. germanica. Conclusion: 7KHDHULDOSDUWVRIStachys VSSIURPWKH5RPDQLDQIORUDFRXOG
EHDQDWXUDOVRXUFHRISRO\SKHQROVZLWKDQWLR[LGDQWSURSHUWLHV.

Keywords: Stachys VSSSRO\SKHQROVDQWLR[LGDQW8+3/&06'33+$%76.

Introduction
0RUHWKDQGLIIHUHQWDQQXDORUSHUHQQLDOStachys VSSFRPPRQO\NQRZQDVKHGJHQHWWOH Lamiaceae IDPLO\ , are KHUEV
RUVPDOOVKUXEVRULJLQDWLQJIURP0HGLWHUUDQHDQUHJLRQ$VLD$PHULFDVDQGVRXWKHUQ$IULFD7ZHOYHStachys spp. are also
IRXQGLQWKH5RPDQLDQIORUD 1–3 
6RPHLPSRUWDQWDFWLYHSULQFLSOHVZHUHKLJKOLJKWHGIRUWKHIORZHULQJDHULDOSDUWVRIStachys spSDVIROORZVHVVHQWLDORLO
ULFK LQ JHUPDFUHQH ' OLPRQHQH ȕ-FDU\RSK\OOHQH ȕ-SLQHQH QHUROLGRO OLQDO\O DFHWDWH OLQDORRO FDU\RSK\OOHQH R[LGH
VSDWKXOHQRO Į-cadinene, Į-pinene, ȕ-P\UFHQH Į-terpineol, ȕ-ERXUERQHQH ȕ-\ODQJHQH  –  LULGRLGV – ajugoside,
DXFXELQKDUSDJLGHDFHW\O-KDUSDJLGHKDUSDJRVLGH , 8 IODYRQRLGV– DSLJHQLQOXWHROLQFKU\VRHULROLVRVFXWHOODUHLQ
NDHPSIHUROTXHUFHWLQLVRUKDPQHWLQQDULQJHQLQDQGWKHLUJO\FRVLGHV  GLWHUSHQHVZLWKODEGDQHneo-clerodane,
rosane and ent-NDXUHQHW\SH– GHR[\DQGDOXVROVWDFKDHJ\SWLQVURVHRVWDFKRQHVWDFK\URVDQHV  WULWHUSHQHV– ursolic
DFLG DQG ROHDQROLF DFLG GHULYDWLYHV    SK\WRVWHUROV    SKHQ\OHWKDQRLG JO\FRVLGHV – DFWHRVLGH YHUEDVFRVLGH
PDUW\QRVLGH OHXFRVFHSWRVLGH$ ODYDQGXOLIROLRVLGHV    SKHQ\OSURSDQRLG JO\FRVLGHV – FRQLIHULQ V\ULQJLQ   
lignans – VHVDPLQSDXORZQLQXUROLJQRVLGH  SKHQROLFDFLGV– FKORURJHQLFDFLGFDIIHLFDFLG  IDWW\DFLGV–
PDLQO\OLQROHLFROHLFDQGSDOPLWLFDFLGV , 6 ROLJRVDFFKDULGHV  
,QWKHHWKQRSKDUPDFRORJ\RIWKH0HGLWHUUDQHDQDUHDStachys VSSDUHUHFRPPHQGHGDVZLOG PRXQWDLQ WHDDJDLQVWFRXJK
DQG FROG GLDEHWHV UKHXPDWLVP VWRPDWLWLV     DQG DOVR DV IXQFWLRQDO IRRGVGLHWDU\ VXSSOHPHQWV IRU KHDOWK\
QXWULWLRQ  
5HFHQW UHVHDUFK HYLGHQFHG VLJQLILFDQW SKDUPDFRORJLFDO DFWLRQV IRU Stachys VSS KHUEDO H[WUDFWV DQWLEDFWHULDO DJDLQVW
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus  DQG DQWLIXQJDO DJDLQVW
Candida albicans        F\WRWR[LF DQG DQWLSUROLIHUDWLYH     DQWLR[LGDQW   , 16   DQWL-
LQIODPPDWRU\, e.g., S. sylvatica K\GURDOFRKROLFH[WUDFWRQWKHRYDU\DQGK\SRSK\VLV–JRQDGDOD[LVLQDUDWZLWKSRO\F\VWic
RYDU\V\QGURPH   DQ[LRO\WLF  KHSDWRSURWHFWLYHZRXQGKHDOLQJ  anti-GLDEHWHV  , antiviral
, 5 HQ]\PHLQKLELWRU\ 16 

Aim
7KHDLPRIRXUUHVHDUFKZDVWKHultra-KLJKSHUIRUPDQFHOLTXLGFKURPDWRJUDSK\PDVVVSHFWURPHWU\ 8+3/&06 DQDO\VLV
RISRO\SKHQROVDQGWKHDVVHVVPHQWRIDQWLR[LGDQWDFWLYLW\ '33+DQG$%76DVVD\V IRUWKHK\GURDOFRKROLFH[WUDFWVRIWKH
IORZHULQJDHULDOSDUWVRIIRXUStachys VSSKDUYHVWHGIURP5RPDQLDQIORUD

Materials and Methods

Chemicals and solvents
3URWRFDWHFKXLFFDIIHLFp-FRXPDULFDQGIHUXOLFDFLGVZHUHSXUFKDVHGIURP0HUFN 'DUPVWDGW*HUPDQ\ FKORURJHQLF
DFLGZDVREWDLQHGIURP$OID$HVDU Kandel*HUPDQ\ URVPDULQLFDFLGUXWLQDQGTXHUFHWLQZHUHDFTXLUHGIURP6LJPD
$OGULFK 7DXINLUFKHQ*HUPDQ\ OXWHROLQZDVSXUFKDVHGIURPCarl 5RWK .DUOVUXKH*HUPDQ\ ZKLOHLVRTXHUFLWULQZDV
REWDLQHGIURP+:,$QDO\WLN 5O]KHLP*HUPDQ\ .
$OO+3/& /L&KURVROY® JUDGLHQWJUDGHVROYHQWV DFHWRQLWULOHPHWKDQROZDWHU ZHUHSXUFKDVHGIURP0HUFN
2,2-'LSKHQ\O-1-SLFU\OK\GUD]\O '33+  ZDV SXUFKDVHG IURP 6LJPD $OGULFK ¶-D]LQR-bis -HWK\OEHQ]RWKLD]ROLQH-6-
VXOIRQLFDFLG  $%76 IURP5RFKH'LDJQRVWLFV %DVHO6ZLW]HUODQG DOXPLQXPFKORULGHIURP)OXND 'RUVHW*LOOLQJKDP
8. , Folin–Ciocîlteu reagent, VRGLXPDFHWDWHDQGSRWDVVLXPSHUVXOSKDWHIURP0HUFN

Plant material
7KHSODQWPDWHULDO, collected GXULQJWKHIORZHULQJSHULRGLQ0D\–-XQHIURPWKH6RXWK-:HVWRI5RPDQLD Oltenia
5HJLRQ ZDVUHSUHVHQWHGE\WKHDHULDOSDUWVRIIRXUStachys spp.: S. germanica L., S. officinalis / 7UHYLVVLQBetonica
officinalis L., S. recta L., and S. sylvatica L. 7KH UHVHDUFKdid not involve endangered or protected plant VSHFLHV7KH
YRXFKHU VSHFLPHQV 6W*-2 6W2-2 6W5-2 DQG 6W6-2 UHVSHFWLYHO\  ZHUH
GHSRVLWHGLQWKH+HUEDULXPRIWKH'HSDUWPHQWRI3KDUPDFHXWLFDO%RWDQ\)DFXOW\RI3KDUPDF\ 8QLYHUVLW\RI0HGLFLQH
DQG3KDUPDF\RI&UDLRYD5RPDQLD.

Preparation of sample solutions

7KHZRUNLQJVDPSOHVIRU8+3/&06DQDO\VLVZHUHREWDLQHGE\H[WUDFWLQJJRISODQWPDWHULDOZLWKP/VROYHQW 
PHWKDQRO $OOVDPSOHVZHUHILOWHUHGWKURXJK ȝPV\ULQJHILOWHUV $FURGLVF066\ULQJH)LOWHUV::37)(0HPEUDQH
– )LVKHU6FLHQWLILF*|WHERUJ6ZHGHQ SULRUWRLQMHFWLRQ
For tRWDO SRO\SKHQRO FRQWHQW 73&  WRWDO IODYRQRLG FRQWHQW 7)&  '33+ DQG$%76 DVVD\V, sDPSOHV RI DFFXUDWHO\
ZHLJKHGair-GULHGDQGSRZGHUHG SODQWPDWHULDOVZHUH PDFHUDWHGIRUGD\VZLWKGLOXWHG DOFRKRO HWKDQRO DWURRP
WHPSHUDWXUHDFFRUGLQJWRWKH 5RPDQLDQ3KDUPDFRSRHLD;WKedition 21 . Stachys spp. K\GURDOFRKROLFH[WUDFWs ZHUH
ILOWHUHGDQGWKHQ VWRUHGLQGDUNERWWOHVLQWKHUHIULJHUDWRUXQWLOXVH

UHPLC/MS analysis
7KHVHSDUDWLRQZDVSHUIRUPHGRQWKH8+3/&06$&48,7<$UF6\VWHPHTXLSSHGZLWKDQ$&48,7<4'D'HWHFWRU
:DWHUV0LOIRUG0$86$ (PSRZHU6RIWZDUH :DWHUV ZDVXVHGIRUGDWDDFTXLVLWLRQDQGSURFHVVLQJ
7KH8+3/&VHSDUDWLRQZDVDFKLHYHGXVLQJD&257(&6&18 FROXPQZLWKWKHIROORZLQJFKDUDFWHULVWLFVOHQJWKRI PP
LQQHUGLDPHWHURI PPDQGSDUWLFOHVL]HVRIȝP7KHIORZUDWHZDVP/PLQ, ZLWKDJUDGLHQWPRELOHSKDVH
FRPSRVHGRIVROYHQW$ P0DPPRQLXPIRUPDWH DQGVROYHQW% DFHWRQLWULOH 7KHPRELOHSKDVHJUDGLHQWVWDUWHGZLWK
RIVROYHQW%IROORZHGE\RIVROYHQW%DIWHUPLQXWHVRIVROYHQW%DWPLQXWHVUHDFKLQJRIVROYHQW
B DWERWKPLQXWHVDQGPLQXWHVVWHDGLO\UHWXUQLQJWRRULJLQDOFRQGLWLRQVRIVROYHQW%DWPLQXWHV 22 .
7KHYROXPH LQMHFWLRQRIWKHVDPSOHZDVȝL7KHVHSDUDWLRQSURFHVVZDVRSHUDWHGDWDFROXPQWHPSHUDWXUHRIƒ&
ZKLOHWKHVDPSOHVZHUHNHSWDWƒ&
7KH06 DQDO\VLVZDVFDUULHGRXWXVLQJHOHFWURVSUD\LRQL]DWLRQ (6, QHJDWLYHLRQPRGHDVIROORZVFDSLOODU\YROWDJH
 N9FRQHYROWDJH9VRXUFHWHPSHUDWXUHƒ&GHVROYDWLRQWHPSHUDWXUHƒ&0DVVVSHFWUDZHUHGHWHFWHGXVLQJ
selectivHLRQUHFRUGLQJ 6,5 PRGHZLWKDVDPSOHUDWHRISRLQWVVHFRQGDWWKHIROORZLQJm/z: 
.

Total polyphenol content

73&ZDVassessed XVLQJDPRGLILHG)ROLQ–&LRFkOWHXPHWKRG DQGDFDOLEUDWLRQFXUYHRIJDOOLF acid, DQGWKHUHVXOWVZHUH
H[SUHVVHGLQPJJDOOLFDFLGHTXLYDOHQWV *$( P/DQGPJ*$(JGU\ZHLJKW GZ UHVSHFWLYHO\ 21, 23 . All H[WUDFWV
ZHUHDQDO\]HGLQWULSOLFDWH

Total flavonoid content

4XDQWLILFDWLRQRI7)& ZDVPDGHZLWKDOXPLQXPFKORULGHLQWKHSUHVHQFHRIVRGLXPDFHWDWHZKHQWKH\IRUPD\HOORZ
SURGXFWZLWKDPD[LPXPDEVRUSWLRQDWQP. 7KHUHVXOWVZHUHH[SUHVVHGLQPJTXHUFHWLQHTXLYDOHQWV 4( P/DQG
PJ4(JGZ 21, 23 . $OOVDPSOHVZHUHDQDO\]HGLQ triplicate.

DPPH assay
'33+UDGLFDOVFDYHQJLQJDFWLYLW\RIStachys VSSH[WUDFWVZDVVSHFWURSKRWRPHWULFDOO\DVVHVVHG 23, 24 $IWHULQFXEDWLQJ
WKHDVVD\PL[WXUHIRUPLQXWHVLQWKHGDUNDWURRPWHPSHUDWXUHWKHDEVRUEDQFHZDVPHDVXUHGDWQP RQD'8
899,66SHFWURPHWHU %HFNPDQ&RXOWHUBrea, CA86$ . 7KHIROORZLQJIRUPXODZDVXVHGWRFDOFXODWHWKHSHUFHQWDJH
RI'33+LQKLELWLRQ> $–A1 $ î@$ EHLQJWKHDEVRUEDQFHRIWKHFRQWURODQG$1 WKHDEVRUEDQFHPHDVXUHGLQWKH
SUHVHQFHRIWKHVDPSOH7KHUHVXOWVZHUHH[SUHVVHGDVFRQFHQWUDWLRQUHTXLUHGWRREWDLQDQWLR[LGDQWHIIHFWYDOXH ,&
– KDOIPD[LPDOLQKLELWRU\FRQFHQWUDWLRQ E\GHWHUPLQDWLRQRIDVFRUELFDFLGHTXLYDOHQWV $$(  ȝJ$$(P/ ,& ZDV
FDOFXODWHG IURP WKH OLQHDU UHJUHVVLRQ HTXDWLRQV RI WKH SHUFHQWDJH RI '33+ LQKLELWLRQ$OO H[WUDFWV ZHUH DQDO\]HG in
triplicate.

ABTS assay
$%76• UDGLFDO FDWLRQ VFDYHQJLQJ DFWLYLW\ RI Stachys VSS H[WUDFWV ZDV VSHFWURSKRWRPHWULFDOO\ assessed 25 . $IWHU
LQFXEDWLQJWKHDVVD\PL[WXUHRI$%76• VROXWLRQDQGVDPSOHVIRUPLQXWHVDWºC, LQWKHGDUNWKHDEVRUEDQFHZDV
PHDVXUHG DW  QP 7KH IROORZLQJ IRUPXOD > $–A1 $ î@ ZDV XVHG WR FDOFXODWH WKH SHUFHQWDJH RI $%76•
LQKLELWLRQ$ EHLQJWKHDEVRUEDQFHRIWKHFRQWURODQG$1 WKHDEVRUEDQFHPHDVXUHGLQWKHSUHVHQFHRIWKHVDPSOH7KH
UHVXOWVZHUHH[SUHVVHGDV,& FDOFXODWHGIURPWKHOLQHDUUHJUHVVLRQHTXDWLRQVRIWKHSHUFHQWDJHRI$%76• LQKLELWLRQ$OO
VDPSOHVZHUHDQDO\]Hd in triplicate.

Statistical analysis
7KHH[SHULPHQWDOYDOXHVDUHWKHDYHUDJHRIWKUHHPHDVXUHPHQWV“VWDQGDUGGHYLDWLRQ 6' . One-ZD\DQDO\VLVRIYDULDQFH
$129$ WHVWZDVXVHGWRGHWHUPLQHWKHVLJQLILFDWLRQEHWZHHQGLIIHUHQWPHDVXUHPHQWVXVLQJ*UDSK3DG3ULVPVRIWZDUH
p-YDOXH”ZDV considered VWDWLVWLFDOO\VLJQLILFDQW

Results
UHPLC/MS analysis
7KH UHWHQWLRQ WLPHV IRU HDFK UHIHUHQFH FRPSRXQG DQG WKH 8+3/& SURILOH RI WKH SRO\SKHQROLF DFLGV DQG IODYRQRLGV
VHSDUDWHGIURPWKHStachys spp. H[WUDFWVZHUHKLJKOLJKWHG LQ7DEOHs 1 and 2.

Table 15HWHQWLRQWLPHIRUHDFKUHIHUHQFHFRPSRXQG
Reference compound Retention time [min]
3URWRFDWHFKXLFDFLG 2.2
&KORURJHQLFDFLG 3.2
&DIIHLFDFLG 4.6
p-&RXPDULFDFLG 
Ferulic acid 
5XWLQ 8.1
,VRTXHUFLWULQ 8.5
5RVPDULQLFDFLG 
Luteolin 14.6
Quercetin 14.8
.DHPSIHURO 
Table 23RO\SKHQRODPRXQWs RIStachys spp.
Polyphenol amounts [ȝg/g d.w.] of Stachys spp.
Polyphenol compound
StG StO StR StS
3URWRFDWHFKXLFDFLG “ “ F F
&KORURJHQLFDFLG “ 445.564“ “ “
&DIIHLFDFLG F F F F
p-&RXPDULFDFLG “ “ 2.814“ F
Ferulic acid F F F M
5XWLQ F “ F F
,VRTXHUFLWULQ “ 2.22“ “ “
5RVPDULQLFDFLG F “ F F
Luteolin F “ “ F
Quercetin F F M F
.DHPSIHURO F F F F
GZ 'U\ ZHLJKW F, )RXQG EXW QRW TXDQWLILDEOH 0, 0LVVLQJ IURP VDPSOH 6tG, Stachys germanica 6tO, Stachys
officinalis6t5, Stachys recta6t6, Stachys sylvatica.

)URPWKHIRXUDQDO\]HGSRO\SKHQROLFDFLGVFDIIHLFDQGIHUXOLFDFLGVZHUHIRXQGEXWZHUHQRWTXDQWLILDEOHLQStachys
VDPSOHV,QDGGLWLRQIHUXOLFDFLGLVPLVVLQJIURP6W6VDPSOH3URWRFDWHFKXLFDFLGDQGp-FRXPDULFDFLGZHUHIRXQGLQDOO
Stachys VDPSOHVEXWTXDQWLILHGLQVPDOODPRXQWVRQO\IRU 6W*DQG6W2DQGIRU6W*6W2DQG6W5VDPSOHVUHVSHFWLYHO\
/DUJHDPRXQWVRI FKORURJHQLFDFLGZHUHIRXQGLQ6W56W*DQG6W6ZKLOH6W2H[KLELWHGORZHUFRQFHQWUDWLRQ$Poderate
DPRXQWRIURVPDULQLFDFLGZDVTXDQWLILHGRQO\IRU6W2VDPSOH6PDOODPRXQWVRIUXWLQDQGOXWHROLQZHUHGHWHUPLQHGIRU
6W2DQGIRU6W2DQG6W5VDPSOHVUHVSHFWLYHO\,VRTXHUFLWULQZDVIRXQGLQDOOStachys VDPSOHV 6W*!6W6!6W2!6W5 
8+3/&FKURPDWRJUDPVIURPWKHDQDO\VLVRIPHWKDQROLFH[WUDFWVRI6WDFK\VVSSare presented in Figures 1–4.

Figure 1. 8+3/&FKURPDWRJUDPIRUWKHPHWKDQROLFH[WUDFW RI S. germanica.

Figure 2. 8+3/&FKURPDWRJUDPIRUWKHPHWKDQROLFH[WUDFWRIS. officinalis.

Figure 3. 8+3/&FKURPDWRJUDPIRUWKHPHWKDQROLFH[WUDFWRIS. recta.

Figure 4. 8+3/&FKURPDWRJUDPIRUWKHPHWKDQROLFH[WUDFWRIS. sylvatica.

TPC and TFC assays

7KHUHVXOWVREWDLQHGIRU73&DQG7)&DQDO\VLVIRUStachys VSSK\GURDOFRKROLFH[WUDFWVDQGSODQWPDWHULDODUHSUHVHQWHG
LQ7DEOH

Table 37RWDOSRO\SKHQRODQGIODYRQRLGFRQWHQWRI Stachys spp. K\GURDOFRKROLFH[WUDFWV DQGSODQWPDWHULDO

TPC TFC
Analyzed sample
mg/mL mg GAE/g d.w. mg/mL mg QE/g d.w.
6W* “ “ “ “
6W2 “ “ “ “
6W5 “ “ “ “
6W6 “ “ “ “
GZ 'U\ ZHLJKW *$( *DOOLF DFLG HTXLYDOHQWV 4( 4XHUFHWLQ HTXLYDOHQWV 6W* Stachys germanica 6W2 Stachys
officinalis6W5Stachys recta6W6Stachys sylvatica7)&7RWDOIODYRQRLGFRQWHQW73&7RWDOSRO\SKHQROFRQWHQW.

$PRQJWKHDQDO\]HGVDPSOHVWKHKLJKHVW73&ZDVKLJKOLJKWHGIRU6W5DQGWKHORZHVWZDVGHWHUPLQHGIRU6W*6LPLODUO\
6W5 K\GURDOFRKROLF H[WUDFW H[KLELWHG WKH KLJKHVW 7)& )RU WKH RWKHU WKUHH DQDO\]HG H[WUDFWV 6W* 6W2 DQG 6W6
UHVSHFWLYHO\ 7)&VKRZHGYHU\FORVHYDOXHV

DPPH and ABTS assays

7KHUHVXOWVRIWKH'33+DQG$%76DQWLR[LGDQWDVVD\VIRUStachys VSSK\GURDOFRKROLFH[WUDFWVDUHVKRZQLQ7DEOH

Table 4. IC values RIStachys spp. K\GURDOFRKROLFH[WUDFWVLQWKH'33+DQG$%76DVVD\V

IC50 values
Analyzed sample
DPPH assay [ȝg AAE/mL] ABTS assay [ȝg/mL]
6WG “ “
6WO “ “
6W5 14.13“ “
6W6 18.58“ “
$%76 ¶-$]LQR-bis -HWK\OEHQ]RWKLD]ROLQH-6-VXOIRQLFDFLG $$($VFRUELFDFLGHTXLYDOHQWV'33+ 2,2-'LSKHQ\O-1-
SLFU\OK\GUD]\O IC +DOI PD[LPDO LQKLELWRU\ FRQFHQWUDWLRQ 6W* Stachys germanica 6W2 Stachys officinalis 6W5
Stachys recta6W6Stachys sylvatica.
,QWKH'33+DQG$%76DVVD\VWKHKLJKHVWDQWLR[LGDQWFDSDFLW\ZDVGHWHUPLQHGIRU6W*VDPSOHIROORZHGLQWKLVRUGHU
E\6W66W2DQG6W5VDPSOHV

Discussion
&RQVLGHULQJWKHJHRJUDSKLFDODUHDRIRULJLQWKHSHGRFOLPDWLFFRQGLWLRQVDQGWKHLQWHUVSHFLHVYDULDELOLW\RXUUHVXOWVDJUHH
ZLWKWKHVSHFLDOL]HGSDSHUVFRQFHUQLQJWKHSRO\SKHQROFRQWHQWDQGDQWLR[LGDQWDFWLYLW\RIStachys spp.
,QDVWXG\RQDFFXPXODWLRQRISKHQROLFFRPSRXQGVLQWKHS. officinalis RULJLQDWHGIURPFXOWLYDWLRQLQ3RODQGWKHKLJKHVW
FRQWHQWRIWDQQLQVZDVIRXQGLQWKHKHUEFROOHFWHGDWWKHYHJHWDWLYHVWDJHRISODQWGHYHORSPHQW LQWKHVHFRQGDQG
 LQ WKH WKLUG \HDU  )RXU SKHQROLF DFLGV FKORURJHQLF IHUXOLF FDIIHLF DQG URVPDULQLF DFLGV  DQG ILYH IODYRQRLG
FRPSRXQGV RULHQWLQOXWHROLQ--glucoside, apigenin--glucoside, apigenin-3-gOXFRVLGHDSLJHQLQ ZHUHLGHQWLILHGLQWKH
REWDLQHGUDZPDWHULDOV7KHGRPLQDQWFRPSRXQGVZHUHFDIIHLFDFLGDQGDSLJHQLQ7KHKLJKHVWFRQWHQWRIFDIIHLFDFLGZDV
IRXQGDWWKHEHJLQQLQJRISODQWYHJHWDWLRQZKHUHDVDSLJHQLQ– DWWKHVWDJHRIIXOOEORRPLQJDQGVHHGVHWWLQJ  
6HYHUDOFRPSRXQGVZHUHLVRODWHGDQGLGHQWLILHGIURPWKHSRODUIUDFWLRQRIS. germanica /VXEVSsalviifolia 7HQ *DPV
FROOHFWHG LQ WKH SURWHFWHG DUHD RI 0DMHOOD 1DWLRQDO 3DUN $EUX]]R UHJLRQ ,WDO\  SDUWLFXODUO\KDUSDJLGH -ȕ-K\GUR[\-
KDUSDJLGHDMXJRO-DOORV\OR[\-DXFXELQYHUEDVFRVLGHDQGDUEXWLQ  
7KHVLPXOWDQHRXVGHWHUPLQDWLRQRISKHQROLFFRPSRXQGV LQWKUHHDTXHRXVSUHSDUDWLRQV GHFRFWLRQVDQGLQIXVLRQ RIS.
recta ZDVPDGHXVLQJ+3/&ZLWKGLRGHDUUD\GHWHFWLRQ '$' FRXSOHGWRDQ(6,LQWHUIDFH7KLUW\FRQVWLWXHQWVZHUH
GHWHFWHGDQGLGHQWLILHGEHORQJLQJPDLQO\WRWKUHHFODVVHVRIFRPSRXQGVFDIIHR\OTXLQLFDFLGVSKHQ\OHWKDQROJO\FRVLGHV
DQGIODYRQRLGV)LIWHHQRIWKHPZHUHTXDQWLILHGKDYLQJDORZHUOLPLWQRWOHVVWKDQRIWKHO\RSKLOL]HGH[WUDFWV2QO\
VHYHQRIWKHPZHUHSUHYLRXVO\UHSRUWHGLQWKLVVSHFLHVZKLOHZHUHLGHQWLILHGIRUWKHILUVWWLPHDVFRQVWLWXHQWVRIS.
recta$PRQJWKHLQYHVWLJDWHGSUHSDUDWLRQVWKHLQIXVLRQVHHPVWREHWKHEHVWPHWKRGWRH[WUDFWWKHQDWLYHFRQVWLWXHQWVRI
WKHSODQWZKLOHGHFRFWLRQLVDPRUHDJJUHVVLYHWUHDWPHQWDQGFDXVHVSDUWLDOGHJUDGDWLRQRIVRPHDF\ODWHGIODYRQRLGV 28,
 
7ZHQW\-WKUHH NQRZQ FRPSRXQGV ZHUH LVRODWHG IURP WKH FKORURIRUP FKORURIRUP–PHWKDQRO  v/v  DQG PHWKDQRO
H[WUDFWVRIS. sylvatica DHULDOSDUWVFROOHFWHGLQ7XVFDQ-(PLOLDQ$SHQQLQH ,WDO\ SKHQROLFGHULYDWLYHV FKORURJHQLFDFLG
cDIIHLF DFLG p-FRXPDULF DFLG PHWK\O HVWHU QLGXORLF DFLG K\GUR[\W\URVRO W\URVRO  RQH JO\FRV\ODWHG DOLSKDWLF DOFRKRO
HEUDFWHDWRVLGH %  VL[ JO\FRV\ODWHG SKHQ\OSURSDQRLGV GHFDIIHR\O YHUEDVFRVLGH ODYDQGXOLIROLRVLGH EHWDQ\RVLGH )
YHUEDVFRVLGH LVRDFWHRVLGH F\VWDQRVLGH '  IRXU IODYRQRLGV VWDFK\VSLQRVLGH FKU\VRHULRO -O-ȕ-D-JOXFRS\UDQRVLGH
QDULQJHQLQ -O- ¶¶-p-FRXPDUR\O -ȕ-D-JOXFRS\UDQRVLGH DSLJHQLQ -O- ¶¶-p-FRXPDUR\O -ȕ-D-JOXFRS\UDQRVLGH  WKUHH
OLJQDQV V\ULQJDUHVLQRO ¶-O-ȕ-D-JOXFRS\UDQRVLGH pinoresinol 4-O-ȕ-D-JOXFRS\UDQRVLGH -HSLVHVDPLQRO -O-ȕ-D-
JOXFRS\UDQRVLGH  DQG WKUHH LRQRQHV OROLROLGH YRPLIROLRO -WHWUDK\GUR[\--PHJDVWLJPHQH  2QH SKHQROLF
GHULYDWLYH HWK\O FDIIHDWH  DQG IRXU FDUER[\OLF DFLGV D]HODLF DFLG WULK\GUR[\RFWDGHFadienoic acid,
WULK\GUR[\RFWDGHFHQRLFDFLGDQGGLK\GUR[\GRGHFDGLHQRLFDFLG KDYHEHHQWHQWDWLYHO\LGHQWLILHGE\8+3/&FRXSOHGWR
DQ(6,VRXUFHKLJK-UHVROXWLRQRUELWUDS06  
$QWLR[LGDQW SURSHUWLHV DQG SKHQROLF DFWLYH FRQVWLWXHQWV FKORURJHQLF DFLG SKHQ\OHWKDQRLG JO\FRVLGHV DQG
K\GUR[\FLQQDPLFDFLGGHULYDWLYH RIS. officinalis H[WUDFWVVXFFHVVLYHO\LVRODWHGZLWKDFHWRQHDQGPHWKDQROZHUHVWXGLHG
E\ WKH EDWFK DQG WKH RQ-OLQH UDGLFDO VFDYHQJLQJ DVVD\V73& ZDV KLJKHU LQ DFHWRQH H[WUDFW E\  WKDQ LQ PHWKDQRO
H[WUDFW KRZHYHU WKH ODWWHU H[WUDFW ZDVVWURQJHUUDGLFDOVFDYHQJHU LQ '33+UDGLFDOGRWDQG$%76UDGLFDO GRW DVVD\V
“ȝM vs. “ȝ07UROR[HTXLYDOHQWVJRIGU\H[WUDFW 31 
,QDUHFHQWVWXG\RQS. germanica VXEVSheldreichii %RLVV +D\HN, WKHDPRXQWRISKHQROLFVZDVKLJKHULQDOO PHWKDQRO
ZDWHUHWK\ODFHWDWH H[WUDFWVWKDQIODYRQRLGV0HWKDQROH[WUDFWZDVWKHULFKHVWRQHLQSKHQROLFVDQGIODYRQRLGV7KHPDMRU
FRPSRXQGVRIWKHH[WUDFWVZHUHFKORURJHQLFDFLGDQGYHUEDVFRVLGH$QWLR[LGDQW DFWLYLW\RIYDULRXVH[WUDFWVZDVDQDO\]HG
E\SKRVSKRPRO\EGHQXPUDGLFDOVFDYHQJLQJ '33+DQG$%76 UHGXFLQJSRZHU>FXSULF-UHGXFLQJDQWLR[LGDQWFDSDFLW\
&835$& DQGIHUULFUHGXFLQJDQWLR[LGDQWSRZHU )5$3 @DQG)H FKHODWLQJDVVD\V5HODWLYHDQWLR[LGDQW FDSDFLW\LQGH[
5$&, DQDO\VLVVKRZHGWKDWWKHUDQNLQJRIWKHH[WUDFWVZDVPHWKDQRO!ZDWHU!HWK\ODFHWDWH,Q$%76UDGLFDOVFDYHQJLQJ
PJP/ SKRVSKRPRO\EGHQXP PJP/ &835$& PJP/ DQG)5$3WHVWV PJP/ WKHPHWKDQRO
H[WUDFW VKRZHG WKH KLJKHVW DFWLYLW\7KH ZDWHU H[WUDFW H[KLELWHG WKH KLJKHVW DFWLYLW\ LQ '33+ UDGLFDO VFDYHQJLQJ DQG
IHUURXVLRQFKHODWLQJWHVWV  .
73&7)&+3/&SURILOHDQGDQWLR[LGDQWDFWLYLW\ZHUHGHWHUPLQHGIRUWKHDHULDOSDUWVRIS. germanica KDUYHVWHGIURPWKH
PRXQWDLQUDQJH6YUOMLVNH3ODQLQH VRXWK-HDVW6HUELD 73&DQG7)&RIPHWKDQROH[WUDFWVUDQJHGIURP EORVVRP WR
 OHDYHV  PJ *$(J GZ DQG EHWZHHQ  EORVVRP  WR  OHDYHV  PJ FDWHFKLQ HTXLYDOHQWV &( J GZ
UHVSHFWLYHO\3KHQROLFDFLGV IHUXOLFp-FRXPDULFDQGFDIIHLFDFLG DQGIODYRQRLGV FDWHFKLQKHVSHUHWLQDQGUXWLQ ZHUH
LGHQWLILHG DQG TXDQWLILHG E\ +3/&–'$' DQDO\VLV S. germanica PHWKDQRO H[WUDFWV ZHUH IRXQG WR KDYH VLJQLILFDQW
DQWLR[LGDQWDFWLYLWLHVDVHYDOXDWHGE\IRXUGLIIHUHQWDVVD\V'33+$%76)H to Fe UHGXFWLRQDQG)5$3 32 
7KUHHStachys spp. S. byzantina, S. officinalis and S. sylvatica IURP5RPDQLDQIORUDZHUHLQYHVWLJDWHGLQWHUPVRI73&
DQGDQWLR[LGDQWFDSDFLW\73&RIStachys H[WUDFWVZDVEHWZHHQ“PJ*$(JIRUS. sylvatica DQG“PJ
*$(J IRU S. officinalis7KH DQWLR[LGDQW FDSDFLW\ ZDV EHWZHHQ“P07UROR[J S. sylvatica  DQG“P0
7UROR[J S. officinalis  33 
/D]DUHYLü HW DO   evidenced WKH DQWLR[LGDQW DFWLYLW\ RI WKH DHULDO SDUWV RI IRXU Stachys VSS HQGHPLF LQ %DONDQ
peninsula: S. germanica VXEVSheldreichii %RLVV +D\HNS. iva *ULVHES. plumosa *ULVHEDQGS. scardica *ULVHE For
S. plumosaVLJQLILFDQWDQWLR[LGDQWDFWLYLW\ '33+DVVD\ ZDVDWWULEXWHGWRWKHODUJHDPRXQWRIWRWDOSKHQROLFVLQWKH
PHWKDQROH[WUDFW  
7KHDQWLR[LGDQWDFWLYLW\ ,& 2.5 ȝJP/ RIS. officinalis SRO\SKHQROLF-ULFKH[WUDFWREWDLQHGE\QDQRILOWUDWLRQSURFHVVFDQ
EHDWOHDVWSDUWO\DVVLJQHGWRWKHSUHVHQFHRIXUVROLFDFLGFDIIHLFDFLGURVPDULQLFDFLGTXHUFHWLQDQGDOVRDQWKRF\DQLGLQV
JHQLVWLQ  5HVXOWV VKRZHG WKH JUHDW SRWHQWLDO DQG HIILFLHQF\ RI WKH QDQRILOWUDWLRQ SURFHVV WR FRQFHQWUDWH WKH KHUEDO
H[WUDFW¶VPDLQSRO\SKHQROLFFRPSRXQGV RYHUSKHQROLFDFLGVDQGIODYRQRLGVUHWHQWLRQ   
/HDYHVDQGLQIORUHVFHQFHVRIS. sylvatica ZHUHFROOHFWHGIURPWKUHHGLIIHUHQWZLOGSRSXODWLRQVLQ.RVRYRWRVWXG\WKHWRWDO
IODYRQRLGVWRWDOSKHQROLFVDQGWKHDQWLR[LGDQWDFWLYLW\ 7RWDOSKHQROLFVUDQJHGIURPWRPJJGZZKHUHDVWRWDO
IODYRQRLG FRQWHQW UDQJHG IURP  WR  PJJ GZ 7KH DQWLR[LGDQW DFWLYLW\ DV PHDVXUHG E\ WKH '33+ DVVD\
H[KLELWHGDUDWKHUKLJKGHJUHHRIDFWLYLW\UDQJLQJIURPWRZKHUHDVWKH)5$3DQWLR[LGDQWDFWLYLW\VKRZHGD
ORZHUYDULDELOLW\DQGUDQJHGIURPWRPJJGZ 34 

Conclusion
7KLVVWXG\FRQFOXGHGWKDWWKHDHULDOSDUWVRIVRPHStachys VSSIURPWKH5RPDQLDQIORUDUHSUHVHQWDQDWXUDOVRXUFHRI
SRO\SKHQROVZLWKDQWLR[LGDQWSURSHUWLHV&KORURJHQLFDFLGDQGLVRTXHUFLWULQZHUHIRXQGLQDOODQDO\]HGVDPSOHV,QWKH
'33+DQG$%76DVVD\VWKHKLJKHVWDQWLR[LGDQWFDSDFLW\ZDVGHWHUPLQHGIRUS. germanica.

Authors’ contribution
)*$$%DQG*'0FRQFHLYHGWKHUHVHDUFKLGHD/(%$%&*3DQG&%SHUIRUPHGWKHH[SHULPHQWVDQDO\]HGWKHGDWD
DQGGUDIWHGWKHPDQXVFULSW*'0DQG-1VXSHUYLVHGWKHHQWLUHSURMHFW$OODXWKRUVUHYLHZHGWKHGUDIWPDQXVFULSt and
DSSURYHGWKHILQDOYHUVLRQIRUSXEOLFDWLRQ

Conflict of interests
7KHDXWKRUVGHFODUHWKDWWKHUHLVQRFRQIOLFWRILQWHUHVWV

Data availability
$OOGDWDLVLQFOXGHGLQWKLVPDQXVFULSWKRZHYHUDGGLWLRQDOLQIRUPDWLRQPD\EHREWDLQHGIURPWKHDXWKRUVXSRQUHTXHVW

Acknowledgments
7KLVZRUNZDVVXSSRUWHGE\WKHJUDQW32&8³3HUIRUPDQĠăvQFHUFHWDUH´– ³5HVHDUFKSHUIRUPDQFH´
co-ILQDQFHGE\WKH(XURSHDQ6RFLDO)XQGZLWKLQWKH6HFWRULDO2SHUDWLRQDO3URJUDP+XPDQ&DSLWDO–

References
1. 7RPRX (0 %DUGD & 6NDOWVD + *HQXV Stachys D UHYLHZ RI WUDGLWLRQDO XVHV SK\WRFKHPLVWU\ DQG ELRDFWLYLW\
0HGLFLQHV %DVHO   GRLPHGLFLQHV
2. ,PEUHD,%XWQDULX01LFROLQ$,PEUHD)3URGDQ09DORULVLQJWKHVSHFLHVStachys officinalis / 7UHYLVIURP
VRXWK-ZHVWHUQ5RPDQLD5HV-$JULF6FL  –KWWSVUMDVURSDSHUBGHWDLO
3. &LRFkUODQ9)ORUDLOXVWUDWăD5RPkQLHLPteridophyta et Spermatophyta. 3rd HGLWLRQ%XFKDUHVW&HUHV3XEOLVKLQJ
+RXVHSS– LQ5RPDQLDQ 
4. 7XQGLV 5 3HUX]]L / 0HQLFKLQL ) 3K\WRFKHPLFDO DQG ELRORJLFDO VWXGLHV RI Stachys species in relation to
FKHPRWD[RQRP\DUHYLHZ3K\WRFKHPLVWU\–GRLMSK\WRFKHP
5. *RUHQ$&3LR]]L)$NFLFHN(.ÕOÕo7dDUÕNoÕ60R]LR÷OXHWDO(VVHQWLDORLOFRPSRVLWLRQRIWZHQW\-WZRStachys
VSHFLHV PRXQWDLQ WHD  DQG WKHLU ELRORJLFDO DFWLYLWLHV 3K\WRFKHP /HWW   –53. doi:
1MSK\WRO
6. .LOLogg]GHPLU)$<LOGLULPOLù(VVHQWLDORLOVDQGIDWW\DFLGVRIStachys /WD[DDFKHPRWD[RQRPLFDSSURDFK
3URJU1XWU 6XSSO –GRLSQYL-6
 /D]DUHYLü -6 ĈRUÿHYLü$6 .LWLü '9 =ODWNRYLü %. 6WRMDQRYLü *6 &KHPLFDO FRPSRVLWLRQ DQG DQWLPLFURELDO
DFWLYLW\RIWKHHVVHQWLDORLORIStachys officinalis / 7UHYLV Lamiaceae &KHP%LRGLYHUV  –
GRLFEGY
8. +i]QDJ\-5DGQDL(%DORJKÈ&]LJOH60iWKp,+RKPDQQ- %OD]Vy*$QWL-LQIODPPDWRU\DFWLYLWLHVRI+XQJDULDQ
Stachys VSHFLHVDQGWKHLULULGRLGV3K\WRWKHU5HV  –GRLSWU
 .KDQDYL0+DMLPDKPRRGL0&KHUDJKL-1LURRPDQG0.DUJDU=$MDQL<+DGMLDNKRRQGL$HWDO&RPSDULVRQRI
WKHDQWLR[LGDQWDFWLYLW\DQGWRWDOSKHQROLFFRQWHQWVLQVRPHStachys VSHFLHV$IU-%LRWHFKQRO  –
KWWSVZZZDMROLQIRLQGH[SKSDMEDUWLFOHYLHZ
 *|UHQ $ 8VH RI Stachys VSHFLHV PRXQWDLQ WHD  DV KHUEDO WHD DQG IRRG 5HF 1DW 3URG   –82.
KWWSVDFJSXEVRUJDUWLFOHUHFRUGV-RI-natural-SURGXFWV-april-MXQHXVH-RI-VWDFK\V-species-PRXQWDLQ-tea-as-
KHUEDO-tea-and-IRRG
11. 6DWÕO)$oDU0(WKQRERWDQLFDOXVHRIStachys / Lamiaceae WD[DLQ7XUNH\,QW-1DW/LIH6FL  –86.
GRLLMQOV
12. &DURYLü-6WDQNR.3HWHN0*UGLãD03LQWDU-%HGHNRYLü'ûXVWLü0+HWDO0HGLFLQDOSODQWVRIWKHIDPLO\
Lamiaceae DVIXQFWLRQDOIRRGV– DUHYLHZ&]HFK-)RRG6FL  –GRL-&-)6
13. /D]DUHYLü -6 3DOLü 50 5DGXORYLü 16 5LVWLü 15 6WRMDQRYLü *6 &KHPLFDO FRPSRVLWLRQ DQG VFUHHQLQJ RI WKH
DQWLPLFURELDO DQG DQWLR[LGDWLYH DFWLYLW\ RI H[WUDFWV RI Stachys VSHFLHV - 6HUE &KHP 6RF   –
KWWSVZZZVKGRUJUV-6&69RO1RBBSGI
14. 0RJKLP+7DJKLSRRU66KDKLQIDUG1.KHLUL6+H\GDUL=5DILHLDQ6$QWLIXQJDOHIIHFWVRIAllium ascalonicum,
 Matricaria chamomilla and Stachys lavandulifolia H[WUDFWV RQ Candida albicans - +HUEPHG 3KDUPDFRO
  –14. KWWSZZZKHUEPHGSKDUPDFROFRP$UWLFOH-+3B
15. .KDQDYL 0 0DQD\L$ /RWIL 0$EEDVL 5 0DMG]DGHK 0 2VWDG 61 ,QYHVWLJDWLRQ RI F\WRWR[LF DFWLYLW\ LQ IRXU
Stachys VSHFLHV IURP ,UDQ ,UDQ - 3KDUP 5HV   –
KWWSVZZZQFELQOPQLKJRYSPFDUWLFOHV30&
16. 6DULNXUNFX & &H\ODQ 2 %HQDEGDOODK $ 7HSH % Stachys germanica VXEVS heldreichii %RLVV  +D\HN
SK\WRFKHPLFDO DQDO\VLV DQWLR[LGDQW DQG HQ]\PH LQKLELWRU\ DFWLYLWLHV 6 $IU - %RW – GRL
MVDME
 3DXQ*1HDJX(0RURHDQX9$OEX&8UVX70=DQILUHVFX$HWDO$QWL-LQIODPPDWRU\DQGDQWLR[LGDQWDFWLYities
RI WKH Impatiens noli-tangere and Stachys officinalis SRO\SKHQROLF-ULFK H[WUDFWV 5HY %UDV )DUPDFRJQ
  –GRLMEMS
18. $OL]DGHK ) 5DPH]DQL 0 3LUDYDU = (IIHFWV RI Stachys sylvatica K\GURDOFRKROLF H[WUDFW RQ WKH RYDU\ and
K\SRSK\VLV–JRQDGDO D[LV LQ D UDW ZLWK SRO\F\VWLF RYDU\ V\QGURPH 0LGGOH (DVW )HUWLO 6RF -    GRL
V---
 5DEEDQL06DMMDGL6(.DULPL-)LUR]MDL0*KDQQDGLDQ0%LRDFWLYLW\JXLGHGLVRODWLRQRIDSLJHQLQIURPStachys
lavandulifolia 9DKO LQ PLFH ZLWK DQ[LRO\WLF HIIHFWV - +HUEPHG 3KDUPDFRO  2 – GRL
MKS
 3DXQ*1HDJX($OEX&0RURHDQX95DGX*/$QWLR[LGDQWDFWLYLW\DQGLQKLELWRU\HIIHFWRISRO\SKHQROLF-ULFK
H[WUDFWIURPBetonica officinalis and Impatiens noli-tangere KHUEVRQNH\HQ]\PHOLQNHGWRW\SHGLDEHWHV-7DLZDQ
,QVW&KHP(QJ–GRLMMWLFH
21. 1DWLRQDO $JHQF\ IRU 0HGLFLQHV DQG 0HGLFDO 'HYLFHV RI 5RPDQLD 5RPDQLDQ 3KDUPDFRSRHLD ;WK (GLWLRQ
%XFKDUHVW0HGLFDO3XEOLVKLQJ+RXVHSS LQ5RPDQLDQ 
22. 1RYiNRYi / 9LOGRYi$ 0DWHXV -3 *RQoDOYHV 7 6ROLFK 3 'HYHORSPHQW DQG DSSOLFDWLRQ RI 8+3/&–0606
PHWKRGIRUWKHGHWHUPLQDWLRQRISKHQROLFFRPSRXQGVLQ&KDPRPLOHIORZHUVDQG&KDPRPLOHWHDH[WUDFWV7DODQWD
  –GRLMWDODQWD
23. +DQJDQX ' 2ODK 1. 3RS &( 9ODVH / 2QLJD , &LRFDUODQ 1 HW DO (YDOXDWLRQ RI SRO\SKHQROLF SURILOH DQG
DQWLR[LGDQWDFWLYLW\IRUVRPHSalvia VSHFLHV)DUPDFLD  –GRLIDUPDFLD
24. $QGUHLFXĠ$'3kUYX$(0RĠ$&3kUYX0)LVFKHU-)RGRU()HOGULKDQ9HWDO$QWL-LQIODPPDWRU\DQGDQWLR[LGDQW
HIIHFWV RI Mahonia aquifolium OHDYHV DQG EDUN H[WUDFWV )DUPDFLD   –58.
KWWSVIDUPDFLDMRXUQDOFRPLVVXH-DUWLFOHVDQWL-LQIODPPDWRU\-and-DQWLR[LGDQW-HIIHFWV-RI-PDKRQLD-DTXLIROLXP-
leaves-and-EDUN-H[WUDFWV
25. $QGRQRYD70XKRYVNL<9UDQFKHYD56ODYRY,$SRVWRORYD(1DLPRY6HWDO$QWLR[LGDQWDQG'1$-protective
poteQWLDOV PDLQ SKHQROLF FRPSRXQGV DQG PLFURVFRSLF IHDWXUHV RI Koelreuteria paniculata aerial parts.
$QWLR[LGDQWV  GRLDQWLR[
26. %ąF]HN..RVDNRZVND23U]\E\á-/:ĊJODU]=$FFXPXODWLRQRISKHQROLFFRPSRXQGVLQWKHSXUSOHEHWRQ\KHUE
Stachys officinalis / RULJLQDWHGIURPFXOWLYDWLRQ+HUED3RO  –GRLKHSR--
 9HQGLWWL$6HUULOOL$0'L&HFFR0&LDVFKHWWL*$QGULVDQR7%LDQFR$3K\WRFKHPLFDOFRPSRVLWLRQRISRODU
IUDFWLRQRIStachys germanica /VXEVSsalviifolia 7HQ *DPVDW\SLFDOSODQWRI0DMHOOD1DWLRQDO3DUN1DW3URG
5HV  –GRL
28. .DULRWL$%RORJQHVL/9LQFLHUL))%LOLD$5$QDO\VLVRIWKHFRQVWLWXHQWVRIDTXHRXVSUHSDUDWLRQVRIStachys recta
E\+3/&–'$'DQG+3/&–(6,–06-3KDUP%LRPHG$QDO  –GRLMMSED
 .DULRWL$.XNLü-0DUNRYLü-%LOLD$51LNHWLü03HWURYLü6&KHPLFDOSURILOLQJRIVL[Stachys WD[DIURP%DONDQ
3HQLQVXOD%LRFKHP6\VW(FROGRLMEVH
 'L6WDVL0'ROFL'3HUX]]L/%UDFD$'H/HR03K\WRFKHPLFDOVWXG\RIStachys sylvatica Lamiaceae DHULDO
SDUWV3ODQW%LRV\VWLQSUHVV RQOLQHYHUVLRQ GRL
31. âOLXPSDLWơ,9HQVNXWRQLV350XUNRYLF05DJDåLQVNLHQơ2$QWLR[LGDQWSURSHUWLHVDQGSKHQROLFFRPSRVLWLRQRI
ZRRG EHWRQ\ Betonica officinalis / V\Q Stachys officinalis /  ,QG &URSV 3URG –22. doi:
MLQGFURS
32. 0LWLF666WRMNRYLF0%3DYORYLF-/0LWLF016WRMDQRYLF%7$QWLR[LGDQWDFWLYLW\SKHQROLFDQGPLQHUDOFRQWHQW
RI Stachys germanica / Lamiaceae  2[LG &RPPXQ   –
KWWSVVFLEXOFRPQHWHQDUWLFOH:[8%YMD2)])+&\;
33. 6WHJăUXú',/HQJ\HO($SRVWROHVFX*)%RWRUDQ257DQDVH&3K\WRFKHPLFDODQDO\VLVDQGELRORJLFDODFWLYLW\RI
WKUHHStachys VSHFLHV Lamiaceae IURP5RPDQLD3ODQWV  GRLSODQWV
34. +DMGDUL$1RYDN-0XVWDID%)UDQ]&(VVHQWLDORLOFRPSRVLWLRQDQGDQWLR[LGDQWDFWLYLW\RIStachys sylvatica L.
Lamiaceae  IURP GLIIHUHQW ZLOG SRSXODWLRQV LQ .RVRYR 1DW 3URG 5HV   –81. doi:
MEVH