UNIVERSITATEA ALEXANDRU IOAN CUZA DIN IAI

FACULTATEA DE BIOLOGIE
SPECIALIZAREA BIOCHIMIE

LUCRARE DE LICEN

Coordonator tiinific:
Prof. univ. dr. habil. Hricu Lucian
Absolvent:
Butur Mihail

IAI 2017
1
 UNIVERSITATEA ALEXANDRU IOAN CUZA DIN IAI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

SPECIALIZAREA BIOCHIMIE

INFLUIENA EXTRACTULUI HIDROALCOOLIC DE

HYPERICUM PERFORATUM ASUPRA STATUSULUI OXIDATIV
DIN HIPOCAMPUL UNUI MODEL ANIMAL DE DEMEN

LUCRARE DE LICEN

Coordonator tiinific:

Prof. univ. dr. habil. Hricu Lucian

Absolvent:

Butur Mihail

IAI 2017
2
CUPRINS
Introducere ......................................................................................................... 5
Scopul cercetrilor ............................................................................................. 6
CAPITOLUL 1. DATE GENERALE PRIVIND MECANISMELE IMPLICATE
N PATOGENEZA MALADIEI ALZHEIMER................................................. 7
1.1. Generaliti.............................................................................................. 7
1.2. Mecanisme neurochimice ........................................................................ 9
1.3. Stresul oxidativ...................................................................................... 15
CAPITOLUL2. TAXONOMIA GENULUI Hypericum
APLICAII N MEDICINA TRADIIONAL .............................................. 25
CAPITOLUL 3. MATERIALE I METODE DE CERCETARE..................... 31
3.1. Materialul de cercetat ............................................................................ 31
3.2. Metode de cercetare............................................................................... 31
3.2.1. Administrarea substanelor chimice ................................................ 31
3.2.2. Recoltarea probelor......................................................................... 32
3.2.3. Determinarea activitii SOD.......................................................... 33
3.2.4. Determinarea activitii GPX.......................................................... 33
3.2.5. Determinarea activitii AChE........................................................ 34
3.2.6. Determinarea coninutului total de GSH redus................................ 34
3.2.7. Determinarea nivelului proteinelor carbonilate ............................... 35
3.2.8. Determinarea nivelului MDA ......................................................... 35
3.2.9. Determinarea concentraiei proteinelor ......................................... 36
3.3. Calculul statistic al datelor experimentale.............................................. 36
CAPITOLUL 4. REZULTATE I DISCUII .................................................. 38
4.1. REZULTATE........................................................................................ 38
4.1.1. Evidenierea efectelor uleiului de Hypericum perforatum asupra

3
activitilor specifice ale SOD, GPX i AChE .......................................... 38
4.1.2. Evidenierea efectelor uleiului de Hypericum perforatum asupra
coninutului total de GSH redus i a nivelului proteinelor carbonilate i
MDA ........................................................................................................ 41
4.2. DISCUII.............................................................................................. 44
CONCLUZII .................................................................................................... 46
Bibliografie ...................................................................................................... 47

4
 Introducere

Boala Alzheimer este o afeciune degenerativ progresiv a creierului care

apare mai ales la persoane de vrst naintat, producnd deteriorarea din ce n ce mai
accentuat a funciilor de cunoatere ale creierului, cu pierderea capacitilor
intelectuale ale individului i a valorii sociale a personalitii sale, asociat cu tulburri
de comportament, prin acumularea progresiv a perechilor de filamente helicale
conducnd la formarea ghemurilor neurofibrilare i prin formarea plcilor senile,
ceea ce realizeaz starea cunoscut sub numele de demen.
Se estimeaz c aproximativ 24 de milioane de oameni din ntreaga lume
prezint o demen de tip Alzheimer, i c 11.2% sunt persoane de 60 ani sau chiar mai
n vrst.
Cauzele bolii nu sunt pe deplin cunoscute, o sum de factori influenai de o
perioad lung de timp conduc la apariia afeciunii. Stresul oxidativ joac un rol
important n apariia bolii Alzheimer, avand un nivel crescut datorit dezechilibrului
dintre producia de oxigen reactiv i capacitatea organismului de a-l neutraliza
printr-un sistem biologic de detoxifiere rapid.
Pentru realizarea acestui studiu am utilizat articole de specialitate cu privire la
apariia bolii Alzheimer, influena beta amiloidului i a stresului oxidativ la apariia
acestei afectiuni. Deasemenea am utilizat cari de specialitate pentru a putea evidenia
i ncadra efectele plantei Hypericum perforatum asupra organismului.
Ne propunem ca acest studiu s evidenieze utilitatea folosirii extractului
hidroalcoolic de Hypericum perforatum n tratarea sau ncetinirea evoluiei unei
forme de demen. Aceast abordare naturist va evidenia importana folosirii
suntoarei n multe alte afeciuni.
5
 Scopul cercetrii

Aceast lucrare va arta influena extractului hidroalcoolic de Hypericum

perforatum n tratarea bolii Alzhaimer pe un model animal. Cunoscand modul de
aciune a stresului oxidativ n apariia acestei forme de demen, precum i modul de
formare a plcilor amiloid, am ales aceast plant datorit efectului antioxidant, pentru
a vedea dac influeneaz boala, ducnd la agravarea sau la stagnarea ei.
Folosind suntoarea am ncercat s evideniem rolul puternic antioxidant,
precum i aducerea de ct mai multe informaii care s ne ajute s depistm
substanele ce i confer acest rol.

Rezultatul cercetrii a fost pozitiv, el evideniind succesul utilizrii suntoarei n

tratarea acestei forme de demen.

6
CAPITOLUL 1

DATE GENERALE PRIVIND MECANISMELE

IMPLICATE N PATOGENEZA MALADIEI ALZHEIMER

1.1. Generaliti

Boala Alzheimer, care reprezint ntre 50% i 80% din toate cazurile de
demen, distruge celulele creierului, provoac pierderea memoriei i confuzia i se
agraveaz n timp, pn cnd pacienii i pierd n cele din urm capacitatea de a
munci, de a merge i de a comunica. La majoritatea persoanelor cu Alzheimer,
simptomele apar mai nti dup vrsta de 60 de ani. (Stutton, 2011)
Numit dup neurologul german Alois Alzheimer, care a raportat pentru prima
dat n 1906, boala Alzheimer a fost puin mai mult dect o not de subsol n
majoritatea manualelor medicale. Boala Alzheimer, mpreun cu alte demene, este
acum recunoscut ca o preocupare major pentru sntatea public i a devenit int a
planurilor de aciune la toate nivelurile de guvernare.
Rspunsul la ntrebarea frecvent adresat "Care este diferena dintre boala
Alzheimer i demena?" Este c nu exist nici o diferen - boala Alzheimer este una
dintre multele tipuri diferite de demen.(Draper, 2004)
La nivel cognitiv, declinul memoriei este un semn distinctiv al bolii Alzheimer ,
iar acest declin implic mai multe sisteme de memorie, inclusiv cele implicate n
memoria autobiografic. Scderea memoriei autobiografice n Alzheimer duce la
pierderea cunotinelor despre evenimente i fapte care au definit viaa pacienilor i,
prin urmare, degradarea cunoaterii i a identitii lor.

7
 ntr-un timp foarte scurt, au fost identificate trei gene care sunt implicate n
formele genetice motenite ale bolii (boala Alzheimer familial, FAD). Mai mult
dect att, sisteme simple de culturi de esuturi sunt acum disponibile pentru a analiza
efectele moleculare ale mutaiilor n aceste gene pe generarea de peptide de tip -
amiloid (A). Acelai sistem de cultur este, de asemenea, utilizat pentru a identifica
medicamente care pot fi capabile s inhibe producerea peptidei A neurotoxice.
(Haass, 2005)

Figura 1. Micorarea hipocampului la pacienii bolnavi de Alzheimer

comparativ cu cei sntoi.
https://www.google.ro/boala+alzheimer

Psihiatrul german, Alois Alzheimer, i-a stabilit descrierea iniial a bolii care i
poart numele pe un pacient de 51 de ani, a crui prezentare clinic a nceput cu o
tulburare paranoid delirant de debut trziu, progresnd rapid pn la deteriorarea
cognitiv sever i moartea 41/2 ani mai trziu.
Examinarea postmortem a creierului ei a artat atrofie generalizat fr leziuni
macroscopice. Folosind o metoda de colorare argintie dezvoltata de Bielschowsky,
Alzheimer a descoperit "leziuni militare multiple" (plci) extracelulare i n mai mult
de un sfert din neuronii corticali, structuri fibrilare n form de flacr (ncurcri
8
neurofibrilare). De asemenea, el a raportat o pierdere neuronal sever, n special n
straturile exterioare ale neocortexului. (Alzheimer, 1907)

1.2. Mecanisme neurochimice

Eficacitatea excitativ a aminoacizilor acizi grai glutamat i aspartat n diferite

regiuni ale sistemului nervos central (SNC) a fost recunoscut nc din anii 1960.
Astzi, L-glutamatul este acceptat ca neurotransmitorul excitator rapid predominant
n creierul vertebratelor. n paralel cu studiile privind rolul fiziologic al acestor
aminoacizi, s-a constatat din anii 1950 c glutamatul poate exercita efecte toxice
asupra sistemului nervos n anumite condiii. n urma aplicrii sistemice a
glutamatului la oareci, au fost descrise efectele toxice asupra neuronilor retinieni.
Astfel, L-glutamatul este transmitorul excitativ primar n SNC-ul
mamiferului, dar este citotoxic n anumite condiii. Aceast relaie ntre funcia
fiziologic ca aminoacid excitator (EAA) i efectul patologic este reflectat de
termenul "excitotoxicitate" introdus n anii 1970 de ctre Olney i colab.

Beta amiloid

Beta-amiloidul este un peptid ce rezult dintr-o protein precursoare, Amyloid-

Precursor-Protein (APP), inserat pe membrana celular. Beta-amiloidul, n form
oligomeric insolubil, este citotoxic i altereaz homeostazia ionilor de calciu,
inducnd astfel procesul de apoptoz (moarte celular programat). Este de notat c
ApoE4, factorul genetic de risc major pentru apariia bolii Alzheimer familiale,
favorizeaz producia n exces de beta-amiloid, nainte de apariia primelor simptome
de boal.

9
 Boala Alzheimer, cea mai frecvent cauz de demen la vrstnici, se
caracterizeaz prin cteva tipuri diferite de anomalii care afecteaz regiunile selectiv
vulnerabile ale telencefalului. Anomaliile majore includ depunerea de protein
amiloidic n spaiul extracelular, pierderea masiv a neuronilor corticali i
acumularea de filamente helicoidale.(Masters, 1985)
Numeroase proteine sau fragmente de proteine incluznd amiloidul seric A,
lanuri uoare de imunoglobulin, peptid amiloid din insulin pancreatic, calcitonin,
2-microglobulin, apolipoprotein Al, protein prionic i protein amiloid sunt
capabili s formeze depozite de amiloid in vivo. (Glenner, 1983)

Figura 2. Aciunea beta amiloidului la nivelul creierului

https://www.google.ro/beta-amiloid

Depozitarea amiloidului subpial se gsete att n creierul bolnavului de

Alzheimer, ct i n cel normal din punct de vedere mental. Fibrele amiloide apar ca
nite fascicule mici ntre procesele astrogliale, dar uneori este dificil s se detecteze
fibrile amiloide n zona A-pozitiv (Yamaguchi, 1991).

10
 n neocortexul pacientilor cu Alzheimer, se gsesc numeroase depuneri mici de
stelat A-imunoreactiv ntre plcile senile. Se regsesc, de asemenea, cantiti
considerabile de plci senile la subieci normali mental. ntr-un studiu imuno-EM, s-a
evideniat c aceast mic zon A-pozitiv coninea mici fascicule de fibril amiloid
sau o substan amorf ntre procesele celulare, iar membrana plasmatic a proceselor
adiacente era A-pozitiv (Shoji, 1990).
Patologia Alzheimarului este complex. ntrebarea central a fost dac
depunerea amiloidelor declaneaz patologia complex observat n Alzheimer sau
este un produs final al acestei patologii. Formele genetice ale Alzheimarului au fost
utile n rezolvarea acestei probleme. Dac depunerea amiloidelor declaneaz
dezvoltarea patologiei , atunci defectele genetice care produc Alzhaimer trebuie s fie
legate de depunerea amiloidului.
Persoanele cu sindrom Down (trisomia 21), care au peste 40 de ani, dezvolt
invariabil o patologie a sistemului nervos central care este n esen identic cu cea
observat n AD. Aceast observaie este semnificativ, deoarece indic faptul c doza
crescut a unuia sau mai multor loci de pe cromozomul 21 este suficient pentru a
provoca AD. ( Mann, 1986)
Constatarea c gena APP este localizat pe cromozomul 21 imediat indic faptul
c gena APP este probabil s fie locusul (sau cel puin unul dintre locusurile) care este
responsabil pentru patologia AD care se dezvolt n DS. Acest lucru este susinut de
observaia c, n creierul DS, depozitele etichetate cu antiseruri la A sunt observate
nainte ca alte aspecte ale patologiei AD s se dezvolte. (Mann,1986)
Pe baza acestei dovezi genetice, este rezonabil s se propun, ca ipotez de
lucru, c AD este o tulburare eterogen n care mecanismele multiple de iniiere
modific procesarea APP ntr-un mod care duce la depunerea amiloidului, care la
rndul su produce patologia care caracterizeaz aceast tulburare. Recent, mutaiile
de pe cromozomul 14 au fost legate de AD i s-a artat c alela ApoE, care este

11
localizat pe cromozomul 19, substanial crete riscul ca AD s se dezvolte.(Mullan,
1992)
Aceste mutaii nu sunt evident legate de gena APP, dar genele afectate pot
codifica bine proteine (de exemplu, proteaze sau inhibitori de proteaz) care modific
procesarea APP ntr-un mod care este amiloidogen. Identificarea acestor gene i a
altor gene mutante care sunt legate de FAD i determinarea faptului dac ele modific
procesarea APP ntr-un mod care este amiloidogen este, prin urmare, o modalitate
important de a continua s testeze ipoteza c depunerea amiloidelor joac un rol
central n dezvoltarea AD.

Figura 3. Apariia plcilor amiloid

https://www.google.ro/beta-amiloid

12
 Proteina tau

Proteina Tau este o protein asociat cu microtubulii, fiind implicat n

specificaia spaial i temporal a acestora i a fost gsit n trompele neurofibrilare
ale bolii Alzheimer. Determinarea structurii proteinei tau a relevat trei secvene
repetate de 18 aminoacizi, aceasta ducand la ipoteza c sunt situsuri de legare a
tubulinei. (Lee,1989)
Tau este o component major a ncurcrilor neurofibrilare (NFT) care
reprezint un semn distinctiv patologic al bolii Alzheimer (AD). Dei n general este
considerat o protein axonal, Tau se gsete n compartimentul somato-dendritic al
neuronilor degenerai i aceast redistribuie se consider a fi un declanator al
neurodegenerrii n AD.( Kobayashi,2017)
Din 2009, s-au acumulat dovezi care sugereaz c agregatele Tau se formeaz
mai nti ntr-un numr mic de celule n creier, de unde se propag n alte regiuni,
ducnd la neurodegenerare i boli. Propagarea agregatelor Tau este deseori numit
prion-like, care se refer la capacitatea unei proteine asamblate de a induce aceeai
conformaie anormal ntr-o protein de acelai tip, iniiind o cascad auto-
amplificatoare. n plus, prion-like cuprinde eliberarea de agregate de proteine din
celulele creierului i absorbia lor de ctre celulele nvecinate.(Goedert, 2017)

13
 Figura 4. Proteina tau n formarea microtubulilor sau a plcilor amiloid
https://www.google.ro/proteina+tau

Implicarea unei componente citoscheletale n AD i prezena unei legturi

potenial directe ntre formarea de ghemuri neurofibrilare i neurodegenerare a
determinat numeroase studii asupra rolului tau n AD. Cu toate acestea, n ciuda unui
numr din ce n ce mai mare de date privind numeroasele schimbri pe care le sufer
n cazul bolii, rolul su n ceea ce privete procesele fundamentale ale bolii este nc
neclar. (Brandt, 1995)
De exemplu, dovezile directe pentru rolul primar al modificrii tau n formarea
de ghemuri neurofibrilare sau moarte celular nc lipsesc. n plus, funcia tau n
timpul dezvoltrii normale a creierului rmne nesoluionat, ceea ce complic o
nelegere a tau ntr-o boal care se dezvolt pe o scal de timp de zeci de ani i poate

14
implica schimbri brute n comportamentul unei varieti de proteine i ali factori.
(Drechsel, 1997)

1.3. Stresul oxidativ

Stresul oxidativ este definit ca un dezechilibru ntre oxidani i antioxidani n

favoarea oxidanilor, conducnd la o ntrerupere a semnalizrii i controlului redox i
a deteriorrii moleculare.

Sistemul nervos este deosebit de vulnerabil la efectele duntoare ale speciilor

reactive de oxigen deoarece creierul conine concentraii ridicate de acizi grai
polinesaturai care sunt foarte susceptibili la peroxidarea lipidelor. n plus, utilizeaz,
n comparaie cu alte esuturi, cea mai mare cantitate de oxigen pentru a produce
energie i, n final, creierul este relativ deficitar n sistemele antioxidante cu activitate
sczut a peroxidazei glutation i a catalazei comparativ cu alte organe. (Migliore,
2005)

n condiii normale exist un echilibru ntre producia de diferite specii reactive

de oxigen (ROS) i aprarea antioxidant. Cnd acest echilibru este dereglat apare
stresul oxidativ. ntr-adevr, ROS particip direct la aprarea mpotriva infeciilor.

ntr-o situaie normal, microgliile, care sunt macrofagele reziduale ale

creierului, lupt mpotriva infeciilor cu ROS. ROS sunt bine recunoscute pentru rolul
dual, avnd att efecte duntoare, ct i benefice, care n majoritatea cazurilor depind
de concentraie. La concentraii mari de ROS exist efecte duntoare, iar ntr-o
concentraie moderat ROS sunt implicai n roluri fiziologice n rspunsul celular la
stimulii nocivi. (Maher, 2001)

15
 O dat cu mbtrnirea, atunci cnd aceste ci se deterioreaz, acumularea de
concentraii mai mari de ROS are loc n cantiti dincolo de capacitatea antioxidanilor
de a face fa. Aceast deteriorare are ca rezultat tulburrile neurodegenerative asociate
cu vrsta, cum ar fi accidentul vascular cerebral i traumatismul sistemului nervos
central, precum i boala Parkinson i Alzheimer. (Halliwell, 2006)

Este probabil ca stresul oxidativ s apar mai devreme, deoarece mecanismele

antioxidante sunt supuse cel puin unei creteri compensatorii tranzitorii care este
aparent insuficient datorit deteriorrii oxidative continue n timpul progresiei bolii.
Este bine documentat faptul c distrugerea oxidativ a radicalilor liberi, n special a
lipidelor neuronale, a proteinelor, a acizilor nucleici i a zaharurilor, este extins n
creierul pacienilor cu AD. (Mariani, 2005)

Dovezile arat c n faza iniial a dezvoltrii AD, depunerea A i formarea de

inflexiuni neurofibrilare de ctre tau hiperfosforilat sunt consecine ale stresului
oxidativ i pot funciona ca "scuturi" pentru a se asigura c celulele neuronale nu
sufer leziuni oxidative. Cu toate acestea, n timpul progresiei bolii, activitatea
antioxidant a ambilor ageni evolueaz n pro-oxidant, reprezentnd o transformare
tipic a ctigului de funcie. Aceast transformare se datoreaz unei creteri a speciilor
reactive i unei scderi a mecanismelor de eliberare. Mediului poate provoca schimbri
metabolice care fie duc la creterea produciei de ROS, fie la scderea produciei de
antioxidani. (Moreira, 2005)

O caracteristic comun a multor boli neurodegenerative este acumularea de

proteine aberante sau greite, formarea protofibrilului, stresul oxidativ i nitrosativ,
leziunile mitocondriale, insuficiena sinaptic, modificarea homeostaziei metalelor i
eecul transportului axonal i dendritic reprezint evenimente ce duc la aparitia
tulburrilor neurodegenerative progresive (Bossy-Wetzel, 2004).

16
 Utilizarea proteomicii pentru a identifica n mod specific proteine modificate
oxidativ n creierul AD (permite determinarea proteinelor care sunt mai afectate de
oxidare n AD) oferind perspective asupra potenialelor mecanisme de
neurodegenerare. Studiile proteomice au indicat mai multe astfel de proteine care se
ocup cu metabolismul energetic, recaptarea glutamatului i reciclarea proteinelor
deteriorate sau agregate prin proteazom, cum ar fi Ubiquitin Carboxyl L-1 (UCH L-1).

Aceast enzim este modificat n mod specific prin oxidare n AD conducnd

la pierderea activitii proteazomului i acumularea de proteine deteriorate sau
agregate. Alte astfel de proteine sunt implicate n meninerea structurii i funciei
membranei i n direcionarea dendritelor ctre neuronii adiaceni. Toate aceste funcii
sunt compromise n AD, iar utilizarea proteomic a identificat proteine ale cror funcii
sczute sunt n concordan cu fiziopatologia AD.( Butterfield,2004)

Iradierea intens , cum ar fi iradierea gamma i razele X, cauzeaz daune

oxidative, dar contribuie foarte puin la stresul oxidativ global, cu excepia anumitor
tratamente medicale sau n medii cu nivele naturale ridicate de radioactivitate.

17
 Figura 5. Efectele stresului oxidativ la nivel celular

https://www.google.ro/stresul+oxidativ

Temperatura i stresul oxidative

ocul de cldur afecteaz negativ transportul fotosintetic i oxidativ al

electronilor i modific integrarea moleculelor enzimatice i antioxidante i conduce
astfel la formarea ROS. Animalele mai tinere sunt capabile sa reziste mai bine
stresului de cldur dect animalele cele batrane, probabil datorit faptului c
capacitatea antioxidant diminueaz cu vrsta. (Proteinele heatshock induse de
schimbrile brute ale temperaturii n toate organismele nu sunt direct asociate cu

18
stresul oxidativ, dar sunt proteine chaperonin care ajut la plierea i organizarea
macromolecular la temperaturi extreme). (Ando, 1997)

Tolerana la rece se realizeaz adesea prin ncetinirea metabolismului pn la

starea de hibernare. Stresul oxidativ este o consecin nu a frigului, ci a creterii rapide
a metabolismului oxidativ atunci cnd temperaturile revin la normal. Rezistena la rece
la animale utilizeaz ci similare cu tolerana la ischemie. (Storey, 1996)

Nutrienii i stresul oxidativ

Stresul nutritiv poate include deficiene specifice n nutrienii necesari, cum ar fi

aminoacizii eseniali, vitaminele i metalele. Aceste deficiene pot duce la stres
oxidativ, mai ales dac lipsesc vitaminele antioxidante. Urmtoarele metale sunt
eseniale pentru activitile enzimelor cum ar fi superoxid dismutaza (Mn, Cu i / sau
Zn), catalaz (fier heme) si peroxidaza de glutation (Se), dar deficienele care
determin leziuni oxidative sunt rare. Deficiena de seleniu apare n China, cnd
aportul foarte sczut de seleniu este nsoit de o infecie viral (boala Keshan). Spre
deosebire de deficienele nutritive specifice, restricia caloric prelungete durata de
via cel puin parial prin minimizarea acumulrii de daune oxidative n funcie de
vrst. (Finkel i Holbrook, 2000)

n studiile la om exist o relaie slab ntre nivelurile ridicate de sare dietetic

(NaCl) i tensiunea arterial crescut aparent din cauza disfunciei endoteliale. Studiile
pe animale sugereaz c hipertensiunea indus de sare este o consecin a creterii
produciei de superoxid, care reacioneaz rapid cu NO, fcndu-l indisponibil ca
vasoregulator. (Dobrian, 2003)

19
 Modificarea oxidant a ARN-ului citoplasmatic n neuronii vulnerabili este o
trstur important, binecunoscut a patofiziologiei AD. Se pare c ARNr furnizeaz
un situs de legare pentru fierul activ redox i servete ca centru redox n citoplasma
neuronilor vulnerabili n AD, nainte de apariia modificrilor morfologice care indic
neurodegenerarea. (Honda, 2005)

ntr-adevr, n zonele corticale multiple ale subiecilor AD, exist o afectare

semnificativ a funciei ribozomului care nu este observat n cerebelul acelorai
subieci. Insuficiena funciei ribozomului este asociat cu o scdere a ratei i
capacitii de sintez a proteinelor, scderea nivelului de ARN ribozomal i ARNt i
creterea oxidrii ARN. Ipoteza c deficienele n sinteza proteinelor pot fi una dintre
cele mai vechi modificri neurochimice din AD sugereaz un rol al modificrilor n
sinteza proteinelor, indirect induse de stresul oxidativ, ca un nou contributor la debutul
i dezvoltarea AD. (Ding, 2005)

Ipoteza c metalele pot fi considerate printre factorii de mediu implicai n

declanarea acestor boli complexe este recurent deoarece formarea de radicali liberi
(de exemplu, Fenton, metal (fier, cupru, crom, cobalt, vanadiu, cadmiu, arsenic, nichel)
Chimia) poate contribui la o stare de stres oxidativ. Dei o relaie direct ntre aluminiu
i AD nu a fost clar demonstrat, o baz mecanic detaliat pentru ipoteza c Al poate
exacerba evenimentele asociate cu AD apare n mod clar. (Campbell, 2002)

Datele recente din esuturile cerebrale ale obolanilor n vrst tratai cu

aluminiu indic faptul c SNC mbtrnit este deosebit de sensibil la efectele toxice ale
Al (III) care pot crete sarcina celular a stresului oxidativ i pot contribui, ca factor
agravant, la dezvoltarea neurodegenerativ Evenimente observate n AD (Fattoretti,
2003).

Mai multe studii arat niveluri crescute de zinc (Zn) n creierul AD. Modificrile
uneia dintre principalele proteine responsabile pentru meninerea homeostaziei Zn la
20
nceputul progresiei AD au fost gsite sugernd c modificrile echilibrului Zn ar putea
fi implicate n patogeneza degenerrii neuronului i depunerea amiloidului n AD.
(Lovell, 2005)

Mitocondriile i stresul oxidativ

Dovezile recente au artat c acumularea de mutaii ADN mitocondriale

accelereaz mbtrnirea normal, duneaz oxidrii ADN-ului nuclear i afecteaz
transcripia genei. Prin eliberarea unor niveluri ridicate de peroxid de hidrogen,
mitocondriile disfuncionale propag o serie de interaciuni ntre metalele redox active
i elementele de rspuns oxidativ (Moreira, 2005).

Producia de adenozin trifosfat defectuos (ATP) i radicalii de oxigen crescui

pot induce moartea celular dependent de mitocondrie, deoarece mitocondriile
deteriorate nu sunt n msur s menin cerinele energetice ale celulei. A fost descris
un rol esenial al insuficienei mitocondriilor induse de hipoperfuzie vascular n
patogeneza AD. n plus, supraexprimarea catalazei enzimei antioxidante n mitocondrii
mrete durata de via a murinilor. Exist dovezi puternice din genetica i modelele de
oareci transgenici c disfuncia mitocondrial are ca rezultat neurodegenerarea i
poate contribui la patogeneza AD. (Zhu, 2004)

21
 Figura 6. Efectele bolii Alzheimer la nivel mitochondrial

https://www.google.ro/boala+alzheimer+la+nivel+mitocondrial

amiloidul i stresul oxidaiv

Peptidele amiloid i caspazele activate se acumuleaz n cortexul frontal i in

hipocampul bolnavilor de AD, iar studiile recente sugereaz c cele dou semne clasice
ale AD, plachetelor amiloide i ghemurile neurofibrilare nu sunt independente unul cu
cellalt, dar mprtesc o cale comun la activarea caspazei. n acest model, peptidele
-amiloid activeaz caspazele, iar caspazele activate scindeaz tau, iniind sau
accelernd formarea de ghemuri neurofibrilare. n plus, nivelele crescute ale p53 au
fost observate n esuturile post mortem ale pacienilor cu AD i sa propus recent c
22
peptidele -amiloid pot activa apoptoza printr-o manier dependent de p53. (Ohyagi,
2005)

Oxidarea AND

Dovezi recente indic rolul ADN-ului oxidant n declanarea PCD-ului neuronal

asemntor apoptotic: deteriorarea oxidativ a ADN-ului a demonstrat recent c induce
activitatea polimerazei-1 (PARP-1) poli-ADP-riboz, translocarea ulterioar
dependent de PARP-1 a AIF de la mitocondrii la nucleul care conduce la moartea
celular independent de caspaz. Pe baza studiilor efectuate la pacienii cu AD i la
cei sntoi, au aprut dovezi c, n anumite condiii, neuronii difereniai postmitotic
n creierul adult uman sunt capabili s reintre n ciclul de diviziune celular. (Nagy,
1998)

Totui, se pare c i n subiecii de control ciclul celular nu progreseaz dincolo

de faza G1, iar celulele sunt capabile s se redefineasc n neuroni. Prin contrast, la
pacienii cu AD, ciclul celular progreseaz pn la faza G2, dar fr nici o dovad a
replicrii ADN. Stoparea ciclului celular n aceast etap nu permite rediferenierea, ci
este un preludiu al leziunilor celulare ireversibile sau apoptozei. (Nagy, 1998)

Mai mult, o expresie crescut a ciclinelor i a kinazelor dependente de ciclin

implicate att n tranziiile G1-S, ct i n cele G2-M ale ciclului celular au fost
observate n neuronii degenerativi ai creierului AD. Cu toate acestea, aceste inducii nu
indic diviziunea celular neuronal, dar ele sunt probabil faza incipient a unei mori
celulare programate. Reintroducerea ciclului celular n neuroni a fost observat i la
indivizii sntoi i ar putea fi un mecanism fiziologic necesar pentru repararea
leziunilor ADN oxidative din neuroni. (Dragovich, 1998)

23
 Producerea de stres oxidativ endogen contribuie la boli cronice, inclusiv boli
cardiovasculare, boli neurodegenerative cum ar fi boala Alzheimer i boala Parkinson
i o gam larg de cancere. Dei stresul oxidativ nu este cauza ultim a oricreia dintre
aceste boli, el contribuie la dezvoltarea i la apariia simptomelor acestora.

24
CAPITOLUL 2.

TAXONOMIA GENULUI HYPERICUM

APLICAII N MEDICINA TRADIIONAL

Hypericum este un gen de plante lemnoase i ierboase din familia hipericacee,

care cuprinde 490 de specii rspndite n regiunile temperate (dar puine n Australia)
i tropicale montane. Sunt cunoscute n popor sub denumirea pojarni sau iarba Sf.
Ion.

Speciile din genul Hypericum cele mai cunoscute sunt: Hypericum perforatum,
Hypericum maculatum, Hypericum hirsutum L., Hypericum montanum L., Hypericum
montanum Fr.

ncadrare taxonomic a speciei Hypericum perforatum:

Regnul: Plantae

ncrengtura: Magnoliophyta

Clasa: Mangnoliopsida

Ordinul: Theales

Familia: Hyperaceae

Genul: Hypericum

Specia: Hypericum perforatum

25
 Hypericum perforatum

Are tulpina dreapt, ramificat n partea superioar, usor luminoas n partea de

jos, prevazut n tot lungul ei cu dou muchii i nalt pn la 1 m. Frunzele, dispuse
opus sunt sesile, oval-eliptice i conin multe pungi secretoare, din care cauz dau
impresia c prezint puncte translucide cnd sunt examinate prin transparen de unde
i denumirea de ,,perforatum ce se d acestei specii.

Fgura 7. Hypericum perforatum

https://www.google.ro/genul+hypericum

26
 Florile sunt grupate n vrful tulpinii i ramurilor; sunt hermafrodite, regulate,
periantul este format din 5 sepale i 5 petale de culoare galben-aurie prevzut fiecare
pe margini cu mici glande negre, iar androceul din stamine numeroase, grupate in 3
fascicule: fructul este o capsul oval.

Este o plant erbacee, peren, ce crete prin fnee, pe marginea drumurilor i a

pdurilor, pe locuri necultivate i n tieturi de pdure. Altitudinal se ntinde din zona
de campie pn n zona subalpin, mai abundent n zonele deluroase. nflorete din
luna iunie pn n septembrie.

Compoziie chimc
Ulei eteric (0,1% n herba i 0,4 - 0,6% n flori), cu miros de conifere, localizat
n punctele transparente ale frunzelor. n ulei predomin hidrocarburile
sesquiterpenice;
Glicozide flavonice (hiperina, rutina, quercetrina);
Hipericina - o substant colorat n rou;
Hiperforina, hiperozida, rudozida;
Taninuri catehnice (8 -12%), saponine emoliente;
Rezine, coine, carotenoizi;
Acizi organici (fenolic, valerianic, nicotinic, cafeinic, clorogenic, ascorbic);
Vitamine ( A, C, K, P, PP);
Sruri minerale.

Aciune i intrebuinri
Sub form de infuzie, produsul vegetal are aciune coleretic i colagoga
(flavonoide, acizi fenolici) i antidiareice ( taninuri), fiind indicat n tulburri
dispeptice, afeciuni hepatobiliare, colecistopatii, diaree.
27
 Un macerat uleios de suntoare (partea aerian ) n ulei de floarea soarelui sau
de masline are proprieti cicatrizante i antiinflamatore, fiind indicat n tratamentul
mialgiilor, arsurilor de gradul I, al plgilor si contuziilor.

Totodat, hiperforina cu o structur apropiat de cea a ceto-enoilor bactericizi

din conurile de hamei prezint o activitate antimicrobian bun fa de o serie de
bacterii gram pazitive i gram negative. Aciunea antimicrobian a suntoarei este
imprimat, de fapt i de taninuri, hipericin i uleiul volatil.

Figura 8. Hypericum - schi

https://www.google.ro/genul+hypericum

Indicaia terapeutic principal i de mare actualitate a suntoarei se bazeaz

ns pe proprietile antidepresive ale acesteia. n acest scop se folosesc preparate care

28
conin extracte standardizate n componentele antidepresiv- active din produsul
vegetal.

Numeroase studii clinice realzate cu astfel de preparate pe pacieni cu tulburri

depresive uoare i moderate au evideniat o mbuntire semnificativ a starii
generale a acestora sau chiar atenuarea pn la dispariie a simptomelor caracteristice:
anxietate, pierderea interesului, sentimentul de inutilitate, tulburrile de somn, de
concentrare sau tulburri somatice. Iniial s-a crezut c efectul antidepresiv al
suntoarei se datoreaz hipericinei, acum ns se tie c acest efect trebuie atribuit
fitocomplexului.

Deoarece n urm cu cteva decenii se constatase ca n organismul depresivilor

exist un deficit de melatonin ( datorat, de fapt, lipsei de expunere la lumin i la
soare a pacienilor n cauz), cnd a devenit evident faptul ca preparate obinute din
suntoare acioneaz antidepresiv, aciunea acestora a fost atribuit prezenei n extract
a hipericinelor, substane fotodinamice, care , conform teoriei lansate atunci, ar fi
participat n organism la formarea unor porfirine endogene, antidepresive.

Astzi se tie c hipericina nu dezvolt aciune anti-monoaminoxidazei dect

dac se afl n prezena procianidinelor din extractele speciale de Hypericum care cresc
solubilitatea n ap i deci, biodisponibilitatea diantronei.

Actualmente se consider c substana cu aciunea cea mai puternic

antidepresiv din fitocomplexul extractelor de Hypericum este hiperforina. Dac
antidepresivele de sintez inhib competitiv neurotransmitorul prin fixarea pe situsul
specific din proteinele de transport ale acestuia, hiperforina se pare c acioneaz
necompetitiv prin creterea concentraiei intracelulare de Na+. Acest mod de aciune
explic de ce hiperforina poate inhiba procese de transport neuronale diferite,
reducerea gradientului de Na determinnd o limitare a activitii proteinelor de
transport.
29
 Hiperforina este un inhibitor nespecific al replerurii simptosomale a
serotoninei, noradrenalinei, dopaminei, GABA si L-glutamatului.

Mecanismul de aciune al extractelor standardizate de Hypericum este unul

extrem de complex, fiecare dintre componentele sale acionnd pe o alt filier,
efectele cumulndu-se, potentndu-se i completndu-se. n plus, cercetri recente au
demonstrat c extractul de Hypericum determin eliberarea de ctre monocite a unor
citikine (IL-6), fapt care sugereaz posibilitatea ca efectul antidepresiv s se datoreze,
cel puin n parte, i unei interaciuni ntre sistemul imunitar i sistemul nervos central.

Avantajul acestor aciuni combinate l constituie o activitate antioxidant

complex, simptomatologia depresiei fiind influienat din perspectiva majoritii
sistemelor imlicate n declanarea sa. n plus, rspunsul global nefiind dat de un singur
tip de aciune, incidena efectelor adverse este mult mai mic dect cea observat n
cazul antidepresivelor convenionale.

Ca urmare, preparatele de suntoare se recomand n depresii uoare i medii.

Depresia sever cu simptome de suicid, tulburri psihotice sau melancolie accentuat
nu se trateaz cu preparate din suntoare.

Totodat suntoarea este contraindicat n sarcin (prezint activitate

uterotonic la animalele de experien) i n alptare (inhib secreia pituitar de
prolactin).

30
CAPITOLUL 3

MATERIAL I METODE DE CERCETARE

3.1. Materialul de cercetat

Experimentele din prezentul studiu s-au realizat pe 20 de obolani albi, masculi,

rasa Wistar, care cntreau 250 g - 300 g la nceputul experimentului.

Animalele au fost meninute la o temperatur de 22C, umiditate de 50% i au

avut acces liber la ap ad libitum i la hran. obolanii au fost tratai n concordan cu
normele instituionale de bioetic privind efectuarea studiilor experimentale pe animale
de laborator i toate procedurile experimentale sunt n conformitate cu Directiva
Consiliului European din 22 septembrie 2010 (2010/63/EU).

n vederea realizrii studiului propus privind influena extractului hidroalcoolic

de Hypericum perforatum asupra statusului oxidativ din hipocampul unui model
animal de demen au fost utilizate metode standardizate pentru animalele de laborator.

3.2. Metode de cercetare

3.2.1. Administrarea substanelor chimice

Animalele din prezentul studiu au fost mprite n 4 loturi (5 animale/lot):

31
 (1) Control - care a fost tratat cu ser fiziologic;

(2) A (25-35) control negativ;

(3) A (25-35) - care a fost tratat cu tratat cu extract hidroalcoolic de Hypericum

perforatum 50 mg/kg (A (25-35)+HE 50 mg/kg);

(4) A (25-35) - care a fost tratat cu tratat cu extract hidroalcoolic de Hypericum

perforatum 100 mg/kg (A (25-35)+HE 100 mg/kg);

Extractul hidroalcoolic de Hypericum perforatum (50 mg/kg i 100 mg/kg) a

fost injectat pe o perioad de 21 zile consecutive.

Modelul de demen a fost indus experimental prin injectarea

intracerebroventricular a 4 L de suspensie de A (25-35). Iniial, animalele de
laborator au fost anesteziate prin injectarea i.p. a unei soluii de nembutal (50 mg/kg
g.c., Sigma-Aldrich, Germania), acestea fiind ulterior fixate pe aparatul stereotaxic. A
(25-35) s-a administrat unilateral-dreapta utilizndu-se o microsering Hamilton (10
L) pe o durat de 4 minute, acest volum fiind eliberat gradual (1 l/min). Ulterior,
microseringa Hamilton a fost meninut n aceeai poziie pentru o perioad de 5
minute, fiind apoi extras cu atenie. Coordonatele utilizate au fost: 1,5 mm lateral de
linia median i 7,4 mm ventral de suprafa cortexului (Hricu et al., 2015). La
animalele de control s-a administrat soluie salin urmndu-se acelai protocol.

3.2.2. Recoltarea probelor

Animalele au fost eutanasiate i s-a colectat hipocampul de la fiecare animal.

Fiecare prob de esut nervos a fost cntrit i omogenizat (1:10) cu ghea, 0,1 M

32
tampon fosfat de potasiu (pH 7,4) i 1,15% KCl. Omogenatele obinute au fost
centrifugate (15 minute la 960 x g) iar din supernatantul obinut s-au determinat
activitile specifice ale superoxid-dismutazei (SOD), glutation-peroxidazei (GPX) i
acetilcolinesterazei (AChE), precum i nivelul glutationului redus (GSH), al
proteinelor carbonilate i al malondialdehidei (MDA).

3.2.3. Determinarea activitii SOD

Activitatea superoxid dismutazei (SOD, EC 1.15.1.1) a fost determinat prin

monitorizarea capacitii sale de a inhiba reducerea fotochimic a NBT. Fiecare reacie
de amestec de 1,5 ml, conine Tris 100 mM / HCl (pH 7.8), NBT 75 mM, riboflavina
2M , EDTA 6 mM , i 200 l de supernatant. Monitorizarea creterii absorbiei la 560
nm, este urmat de producerea albastrului formazan. O unitate de SOD este definit ca
fiind cantitatea necesar pentru a inhiba rata de NBT prin reducere de 50%
(Winterbourn et al., 1975). Activitatea enzimei este exprimat n uniti/mg protein.

3.2.4. Determinarea activitii GPX

Activitatea glutation peroxidazei (GPX), a fost analizat printr-un test de

spectrofotometrie. Reacia de amestec const dintr-un 1 ml de tampon fosfat 0,4 M (pH
7,0) care conine EDTA 0,4 mM, 1 ml de NaN3 5 mM, 1 ml de GSH 4 mM i 200 l
de supernatant care a fost incubat la 37C, timp de 5 minute.

Apoi, se adaug 1 ml de 4 mM H2O2 i se incubeaz la 37C timp de 5 minute.

Excesul de GSH a fost cuantificat prin metoda DTNB descris de ctre Sharma i
33
Gupta (2002). O unitate de GPX este definit ca fiind cantitatea de enzim necesar
pentru a oxida 1nmol GSH / min. Activitatea enzimei este exprimat n uniti/mg
protein.

3.2.5. Determinarea activitii AChE

Activitatea acetilcolinesterazei (AChE) din hipocampul de obolan a fost

determinat dup metoda lui Ellman et al. (1961) utiliznd acetiltiocolina (ATC) ca
substrat artificial (Srikumar et al., 2004). Amestecul de reacie (600 l volumul final)
conine 0,26 M tampon fosfat cu pH 7,4, 1 mM acid 5,5'-ditio-bis-2-nitrobenzoic
(DTNB) i 5 mM ATC. Determinarea s-a realizat prin adugarea n mixul de reacie a
supernatantului pn la apariia culorii galbene (10 minute la temperatura camerei).
Citirile s-au realizat la spectofotometru cu lungimea de und de 412 nm. Activitatea
enzimea a fost exprimat n nmoli ACT/min/mg de protein.

3.2.6. Determinarea coninutului total de GSH redus

Glutationul (GSH) s-a determinat pe baza metodei descris de Fukuzawa i

Tokumura (1976). Astfel, s-au amestecat 200 l supernatant cu 1,1 ml tampon fosfat
de sodiu 0,25 M (pH 7,4) i 130 l DNTB 0,04%. n final, amestecul a fost adus la un
volum de 1,5 ml cu ap distilat iar absorbana s-a citit la spectofotometru la 412 nm.
Coninutul total de GSH redus a fost exprimat n g GSH/g protein.

34
 3.2.7. Determinarea nivelului proteinelor carbonilate

Gradul de oxidare al proteinelor din hipocamp a fost evaluat prin determinarea

nivelului de grupri carbonil pe baza metodelor descrise de Oliver et al. (1987) i Luo
and Wehr (2009). Supernatantul a fost mprit n dou probe care conin fiecare
aproximativ 2 mg de protein. n ambele probe s-a produs precipitarea proteinelor prin
adugare de acid tricloracetic 10% (w/v, concentraia final). Una din probe a fost
tratat cu HCl 2N iar cealalt prob cu DNPH 0,2% (w/v) n HCl 2N. ambele probe au
fost incubate la 25C i agitate la intervale de 5 minute. Probele au fost precipitate din
nou cu acid tricloracetic 10% (w/v, concentraia final) i extrase cu etanol-acetat de
etil (1:1, v/v) i apoi precipitate cu acid tricloracetic 10%. Ulterior au fost dizolvate n
uree 8M cu tampon fosfat de sodiu 20 mM, pH 6,5. Resturile celulare insolubile au fost
ndeprtate prin centrifugare la 13000 x g la 4C. Absorbana s-a citit la
spectofotometru la 370 nm comparnd problele tratate cu DNPH cu cele cu HCl
(control). Rezultatele sunt exprimate n nmoli DNPH/mg protein.

3.2.8. Determinarea nivelului MDA

Malondialdehida (MDA) este un indicator al peroxidrii lipidelor i a fost

msurat spectrofotometric cu ajutorul testului de acid tiobarbituric (Okhawa et al.
1979). Se adaug 200 l de supernatant care se amestec cu 1 ml de acid tricloracetic
50% n HCl 0,1M i 1ml de acid tiobarbituric 26 mM. Dup vortexare, probele au fost
meninute la 95C timp de 20 de minute.

Ulterior, probele au fost centrifugate la 960 x g, timp de 10 minute iar

supernatanii au fost citii la 532 nm. S-a construit apoi curba de etalonare i rezultatele
au fost exprimate n nmol/mg protein.
35
 3.2.9. Determinarea concentraiei proteinelor

S-a utilizat metoda acidului bicinconinic (BCA) descris de Smith et al. (1985).

3.3. Calculul statistic al datelor experimentale

Aplicnd metodele statisticii matematice se poate calcula o valoare ct mai

apropiat de cea real i se poate estima i gradul de certitudine al respectivelor
rezultate, deoarece este greu ca n practic s se fac un numr foarte mare de
determinri .

Utilizarea statisticii matematice n investigaiile experimentale este

indispensabil, deoarece compararea gradului de corelare i estimare a fenomenelor
necesit etaloane precise.

Pentru prelucrarea statistic a datelor am aplicat testul t al lui Student. Au fost

calculate:

-media aritmetic (M)

-eroarea standard a mediei (E.S.M.)

Media aritmetic

Reprezint raportul dintre suma tuturor valorilor individuale i numrul total al

valorilor individuale (n) ale probelor.

36
 n

xi
M i 1

n
unde:

xi valorile individuale,

n numrul total al valorilor individuale.

Eroarea standard

Deoarece media aritmetic nu scoate n eviden dispersia valorilor individuale n jurul

valorii medii, precum i graniele de variaie a irului statistic, se impune calcularea
acestui indice de dispersie, care este eroarea standard (Es).

Es
n

unde reprezint abaterea standard i se calculeaz dup formula standard:

d 1
2

n 1

unde:

d21 reprezint ptratul diferenelor dintre media aritmetic i valorile individuale;

n = numrul de determinri

37
CAPITOLUL 4

REZULTATE I DISCUII

4.1. REZULTATE

4.1.1. Evidenierea efectelor extractului hidroalcoolic de Hypericum

perforatum asupra activitilor specifice ale SOD, GPX i AChE

Analizele biochimice au evideniat c administrarea extractului hidroalcoolic de

Hypericum perforatum (50 mg/kg i 100 mg/kg) a determinat creterea semnificativ a
activitilor specifice a SOD (p<0,001) (Figura 9) i GPX (p<0,001) (Figura 10),
precum i scderea semnificativ a activitii specifice a AChE (p<0,001) (Figura 11),
n loturile tratate cu A (25-35) comparativ cu loturile tratate numai cu A (25-35).
n contrast, A (25-35) manifest efecte prooxidante puternice, cuantificate prin
scderea semnificativ a activitilor specifice ale SOD i GPX precum i prin
creterea semnificativ a activitii specifice a AChE, n omogenatele obinute din
hipocampul obolanilor de laborator.

38
 0 .0 4
p < 0 ,0 0 1

S O D ( U /m g p r o t e in )
0 .0 3 p < 0 ,0 1

0 .0 2

0 .0 1

0 .0 0

)
)
)
l

g
g
5
o

/k
/k
-3
tr

g
g
5
n

m
m
(2
o
C

0
A

(5

(1
E

E
H

H
)+

)+
5

5
-3

-3
5

5
(2

(2

Figura 9. Variaiile activitii specifice a SOD n urma administrrii

extractului hidroalcoolic de Hypericum perforatum (50 mg/kg i 100 mg/kg) la
loturile tratate cu A (25-35). Valorile sunt medii ESM, n=5 animale/lot.

39
 p < 0 ,0 0 1
0 .0 6

G P X ( U /m g p r o t e in )
p < 0 ,0 1

0 .0 4

0 .0 2

0 .0 0

)
)
)
l

g
g
5
o

/k
/k
-3
tr

g
g
5
n

m
m
(2
o
C

0
0

0
(5
A

(1
E

E
H

H
)+

)+
5

5
-3

-3
5

5
(2

(2

Figura 10. Variaiile activitii specifice a GPX n urma administrrii

extractului hidroalcoolic de Hypericum perforatum (50 mg/kg i 100 mg/kg) la
loturile tratate cu A (25-35). Valorile sunt medii ESM, n=5 animale/lot.

40
 p < 0 ,0 0 1

p < 0 ,0 0 1
100

( n m o l/m in /m g p r o te in )
80

60
A ChE

40

20

)
)
)
l

g
g
5
o

/k
/k
-3
tr

g
g
5
n

m
m
(2
o
C

0
0
A

0
(5

(1
E

E
H

H
)+

)+
5

5
-3

-3
5

5
(2

(2

Figura 11. Variaiile activitii specifice a AChE n urma administrrii

extractului hidroalcoolic de Hypericum perforatum (50 mg/kg i 100 mg/kg) la
loturile tratate cu A (25-35). Valorile sunt medii ESM, n=5 animale/lot.

4.1.2. Evidenierea efectelor extractului hidroalcoolic de Hypericum

perforatum asupra coninutului total de GSH redus i a nivelului
proteinelor carbonilate i MDA

Analizele biochimice au evideniat c administrarea extractului hidroalcoolic de

Hypericum perforatum (50 mg/kg i 100 mg/kg) a determinat creterea semnificativ a

41
coninutului total de GSH redus (p<0,0001) (Figura 12), precum i scderea
semnificativ a nivelului de proteine carbonilate (p<0,0001) (Figura 13) i a nivelului
MDA (p<0,00001) (Figura 14), n loturile tratate cu A (25-35) comparativ cu loturile
tratate numai cu A (25-35).

n contrast, A (25-35) manifest efecte prooxidante puternice, cuantificate prin

scderea semnificativ a coninutului total de GSH redus i prin creterea semnificativ
a nivelului proteinelor carbonilate i a MDA n omogenatele hipocampilor obolanilor
de laborator.

p < 0 ,0 0 0 1
20
g G S H / g p r o t e in

15 p < 0 ,0 0 1

10

0
)
)
)
l

g
g
5
o

/k
/k
-3
tr

g
g
5
n

m
m
(2
o
C

0
0

0
(5
A

(1
E

E
H

H
)+

)+
5

5
-3

-3
5

5
(2

(2

Figura 12. Variaiile coninutului total de GSH redus n urma administrrii

extractului hidroalcoolic de Hypericum perforatum (50 mg/kg i 100 mg/kg) la
loturile tratate cu A (25-35). Valorile sunt medii ESM, n=5 animale/lot.

42
 p < 0 ,0 0 0 1

p < 0 ,0 0 0 1

20

P r o te in e c a r b o n ila te
( n m o l/m g p r o te in )
15

10

)
)
)
l

g
g
5
o

/k
/k
-3
tr

g
g
5
n

m
m
(2
o
C

0
0

0
(5
A

(1
E

E
H

H
)+

)+
5

5
-3

-3
5

5
(2

(2

Figura 13. Variaiile nivelului de proteine carbonilate n urma administrrii

extractului hidroalcoolic de Hypericum perforatum (50 mg/kg i 100 mg/kg) la
loturile tratate cu A (25-35). Valorile sunt medii ESM, n=5 animale/lot.

43
 p < 0 ,0 0 0 0 1

0 .8 p < 0 ,0 0 0 1

M D A (n m o l/m g p r o te in )
0 .6

0 .4

0 .2

0 .0

)
)
)
l

g
g
5
o

/k
/k
-3
tr

g
g
5
n

m
m
(2
o
C

0
0

0
(5
A

(1
E

E
H

H
)+

)+
5

5
-3

-3
5

5
(2

(2

Figura 14. Variaiile nivelului de malondialdehid (MDA) n urma

administrrii extractului hidroalcoolic de Hypericum perforatum (50 mg/kg i
100 mg/kg) la loturile tratate cu A (25-35). Valorile sunt medii ESM, n=5
animale/lot.

4.2. DISCUII

Prezentul studiu s-a realizat n vederea evalurii efectelor neuroprotective ale

extractului hidroalcoolic de Hypericum perforatum (50 mg/kg i 100 mg/kg) mpotriva
A (25-35) care a indus stres oxidativ n hipocampul obolanilor de laborator.

Hypericum perforatum L. aparine familiei Hypericaceae, fiind frecvent

utilizat, nc din antichitate, pentru a trata diverse afeciuni. Numeroase studii atest
44
proprietile antiinflamatorii, antivirale i antibacteriene, neuroprotective, antidepresive
i antioxidante ale acestei plante (Kenneth M. Klemow et al., 2011). Principalii
compui caracteristici speciei Hypericum perforatum L. sunt derivaii de antrachinon
(hipericina), derivai ai floroglucinolului (hiperforina), flavonoide (quercitina,
kampferol, luteolina), acizi fenolici (acidul cafeic, acidul cumaric), biflavonoide,
taninuri (Hritcu and Cioanca, 2016). Studii recente menioneaz efectele
antiinflamatorii ale hipericinei precum i capacitatea acesteia de a ameliora deficitele
cognitive (Zhang et al., 2016). Hiperflorina are capacitatea de a stimula eliberarea
acetilcolinei hipocampice, aspect evideniat de Kiewert C. et al. n anul 2004. Pentru
flavonoida quercitin au fost evideniate efectele neuroprotective (Pu et al., 2007), iar
luteolina are capacitatea de a stimula memoria de scurt durat.

Acetilcolinesteraza este un marker al degradrii extensive a neuronilor

colinergici din creier (Sohanaki et al., 2016). Numeroase date experimentale au indicat
c disfuncia colinergic mpreun cu intensificarea stresului oxidativ este implicat n
neurotoxicitatea indus de A (Wang et al., 2013). n prezentul studiu, administrarea
A (2535) intensific semnificativ activitatea AChE, sugerndu-se astfel degradarea
sistemului colinergic. Administrarea extractului hidroalcoolic a diminuat toxicitatea
indus de A (2535) prin diminuarea activitii AChE.

De asemenea, administrarea A (2535) a determinat eliberarea speciilor

reactive de oxigen determinnd peroxidarea lipidic i oxidarea proteinelor,
concomitent cu diminuarea activitii sistemului enzimatic antioxidant. Administrarea
extractului hidroalcoolic de Hypericum perforatum (50 mg/kg i 100 mg/kg) previne
acumularea MDA i a proteinelor carbonilate, concomitent cu intensificarea activitii
SAD i GPX n hipocampul animalelor tratate cu A (2535) ca un mecanism
compensatoriu pentru a preveni intensificarea producerii speciilor reactive de oxigen
(Casado et al., 2008; Prediger et al., 2007).

45
 CONCLUZII

Avnd n vedere rezultatele acestui studiu n concluzie afirmm c:

1. Administrarea extractului hidroalcoolic de Hypericum perforatum la

animalele tratate cu A (2535) a determinat creterea semnificativ a
activitilor specifice a SOD i GPX i scderea semnificativ a AChE din
omogenatele de hipocamp.

2. Administrarea extractului hidroalcoolic de Hypericum perforatum la

animalele tratate cu A (2535) a determinat creterea semnificativ a
coninutului total de glutation redus din omogenatele de hipocamp.

3. Administrarea extractului hidroalcoolic de Hypericum perforatum la

animalele tratate cu A (2535) a determinat scderea semnificativ a
nivelului proteinelor carbonilate i MDA din omogenatele de hipocamp.

4. Administrarea extractului hidroalcoolic de Hypericum perforatum poate

reface statusul antioxidant al creierului i poate induce efecte
neuroprotective prin diminuarea stresului oxidativ indus de A (2535).

46
 Bibliografie

1. Alzheimer, A., Allg. Z.(1907) Psychiatrie.Psychisch-Gerichtliche Med. 64,

146-148.
2. Bossy-Wetzel E, Schwarzenbacher R, Lipton SA.(2004) Molecular
pathways to neurodegeneration. Nat Med. 10 (Suppl.): S2-S9.
3. Brandt, R., Lee, G. (1994) Orientation, assembly, and stability of
microtubule bundles induced by a fragment of tau protein. Cell Motil.
Cytoskel., 28, 143154.
4. Butterfield DA. (2005) Proteomics: a new approach to investigate
oxidative stress in Alzheimers disease brain. Brain Res. 1000: 17.
5. Campbell A.(2002) The potential role of aluminium in Alzheimers disease.
Nephrol Dial Transplant. 2: 1720.
6. Casado A, Castellanos A, Lpez-Fernndez ME, Ruz R, Aroca CG,
Noriega F., Relationship between oxidative and occupational stress and
aging in nurses of an intensive care unit. Age (Dordr). 30(4):229-36.
7. Ding Q, Markesbery WR, Chen Q, Li F, Keller JN. (2005) Ribosome
dysfunction is an early event in Alzheimers disease. J Neurosci. 25: 9171
9175.
8. Drechsel, D.N. (1997) Using video microscopy to study taus effects on the
dynamic instability of microtubule assembly. In Brain microtubule
associated proteins: Modifications in disease. J. Avila, R. Brandt, and K.S.
Kosik, editors. Harwood, Amsterdam, 275292.
9. Ellman, G., Courtney, K., Andres, V. J., Feather-Stone, R. A new and
rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem
Pharmacol. 1961,7:88-95.

47
10. Fattoretti P, Bertoni-Freddari C, Balietti M, Mocchegiani E, Scancar J,
Zambenedetti P, Zatta P. (2003) The effect of chronic aluminium (III)
administration on the nervous system of aged rats: clues to understand its
suggested role in Alzheimers disease. J Alzheimers Dis. 5: 437444.
11. Fukuzawa K, Tokumura A (1976) Glutathione peroxidase activity in
tissues of vitamin E-deficient mice. J Nutr Sci Vitaminol 22:405-407.
12. Gloria Lee, Rachael L. Neve, Kenneth S. Kosik, The microtubule binding
domain of tau protein . Volume 2, p16151624.
13. Halliwell B. Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now?
JNeurochem. 2006;97:1634. 58.
14. Honda K, Smith MA, Zhu X, Baus D, Merrick WC, Tartakoff AM,
Hattier T, Harris PL, Siedlak SL, Fujioka H, Liu Q, Moreira PI, Miller
FP, Nunomura A, Shimohama S, Perry G. (2005) Ribosomal RNA in
Alzheimer disease is oxidized by bound redox-active iron. J Biol Chem. 280:
2097820986.
15. Hricu L., O. Cioanc, (2016). Herbal Medicine in Depression:
Prevalence of Use of Herbal Medicines and Complementary and Alternative
Medicine in Europe, Ed. Springer, 139-143.
16. Hricu L., J. A. Noumedem, O. Cioanc, M. Hancianu, P. Postu, M.
Mihan, (2015). Anxiolytic and antidepressant profile of the methanolic
extract of Piper nigrum fruits in beta-amyloid (142) rat model of
Alzheimers disease, Behavioral and Brain Functions, 11:13.
17. Kenneth K. M., A. Bartlow, J. Crawford, N. Kocher, J. Shah, M.
Ritsick, (2011). Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects. 2nd
edition.: Medical Attributes of St. John's-Wort (Hypericum perforatum),
CRC Press/Taylor & Francis.

48
18. Kiewerta C., M. L. Buchholzerb, J. Hartmanna, S. S. Chatterjeec, J.
Klein, (2004). Stimulation of hippocampal acetylcholine release by
hyperforin, a constituent of St. Johns Wort, Neuroscience Letters, 364:195.
19. Kobayashi S, Tanaka T, Soeda Y, Almeida OFX, Takashima A. (2017)
Local Somatodendritic Translation and Hyperphosphorylation of Tau
Protein Triggered by AMPA and NMDA Receptor Stimulation.
EBioMedicine. 30;10(1):18.
20. Lovell MA, Smith JL, Xiong S, Markesbery WR. (2005) Alterations in
zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild
cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimers disease. Neurotox
Res. 7: 265271.
21. Luo S, Wehr NB (2009) Protein carbonylation: avoiding pitfalls in the 2,4-
dinitrophenylhydrazine assay. Redox Rep 14 (4):159-166.
22. Mann, D.M., Yates, P.O., Marcyniuk, B. Ravindra, C.R. (1986)
Neuropathol. Appl. Neurobiol. 12, 447-457.
23. Maher P. How protein kinase C activation protects nerve cells from
oxidative stress induced cell death. J Neurosci. 2001;21:2929 38.
24. Mariani E, Polidori MC, Cherubini A, Mecocci P.(2005) Oxidative stress
in brain aging, neurodegenerative and vascular diseases: an overview. J
Chromatogr B 827: 6575.
25. Masters CL, Simms G, Weinman NA, Multhaup G, McDonald BL,
Beyreuther K .(1985) Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease
and Down syndrome .USA 82:4245-4249.
26. Migliore L, Fontana I, Colognato R, Copped F, Siciliano G, Murri L.
(2005) Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative
stress in Alzheimers disease and in other neurodegenerative diseases.
Neurobiol Aging 26: 587595.
49
27. Moreira PI, Honda K, Liu Q, Santos MS, Oliveira CR, Aliev G,
Nunomura A, Zhu X, Smith MA, Perry G. (2005). Oxidative stress: the
old enemy in Alzheimers disease pathophysiology. Curr Alzheimer Res. 2:
403408.
28. Moreira PI, Smith MA, Zhu X, Honda K, Lee HG, Aliev G, Perry G.
(2005) Oxidative damage and Alzheimers disease: are antioxidant
therapies useful? Drug News Perspect. 18: 1319.
29. Mullan, M., Houlden, H., Windelspecht, M., Fidani, L., Lombardi, C.,
Diaz, P., Rossor, M., Crook, R., Hardy, J., Duff, K. Crawford, F. (1992)
Nature Genet. 2, 340-342.
30. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Assay for lipid peroxides in animal
tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 1979,95:351-8.
31. Ohyagi Y, Asahara H, Chui DH, Tsuruta Y, Sakae N, Miyoshi K,
Yamada T, Kikuchi H, Taniwaki T, Murai H, Ikezoe K, Furuya H,
Kawarabayashi T, Shoji M, Checler F, Iwaki T, Makifuchi T, Takeda
K, Kira J, Tabira T. (2005) Intracellular Abeta42 activates p53 promoter:
a pathway to neurodegeneration in Alzheimers disease. FASEB J. 19(2):
255257.
32. Oliver CN, Ahn BW, Moerman EJ, Goldstein S, Stadtman ER (1987)
Age-related changes in oxidized proteins. J Biol Chem 262 (12):5488-5491.
33. Pu F., K. Mishima, K. Irie, K. Motohashi, Y. Tanaka, K. Orito, T.
Egawa, Y. Kitamura, N. Egashira, K. Iwasaki, M. Fujiwara, (2007).
Neuroprotective effects of quercetin and rutin on spatial memory impairment
in an 8-arm radial maze task and neuronal death induced by repeated
cerebral ischemia in rats, Journal of Pharmacological Sciences, 104:329.
34. Prediger RD, Franco JL, Pandolfo P, Medeiros R, Duarte FS, Di Giunta
G, Figueiredo CP, Farina M, Calixto JB, Takahashi RN, Dafre AL.,
50
 (2007), Differential susceptibility following beta-amyloid peptide-(1-40)
administration in C57BL/6 and Swiss albino mice: Evidence for a
dissociation between cognitive deficits and the glutathione system response.
Behav Brain Res.;177(2):205-13.
35. Robu T., Milica C., (2004) Plante medicinale autohtone. Ed. Institutul
European, 128-131.
36. Sharma M., Gupta Y.K., Chronic treatment with trans resveratrol prevents
intracerebroventricular streptozotocin induced cognitive impairment and
oxidative stress in rats, Life Sci., 2002, 71, 2489-2498.
37. Shoji, M., Hirai, S., Harigaya, Y., Kawarabayashi, T., and Yamaguchi,
H., (1990), The amyloid beta-protein precursor is localized in smooth
muscle cells of leptomeningeal vessels. 530: 113-116.
38. Sohanaki H, Baluchnejadmojarad T, Nikbakht F, Roghani M., (2016),
Pelargonidin improves memory deficit in amyloid 25-35 rat model of
Alzheimer's disease by inhibition of glial activation, cholinesterase, and
oxidative stress. Biomed Pharmacother;83:85-91.
39. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH,
Provenzano MD, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC (1985)
Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150:76-85.
40. Srikumar, B., Ramkumar, K., Raju, T., Shankaranarayana Rao, B.
Assay of acetylcholinesterase activity in the brain. In: Raju T, Kutty B,
Sathyaprabha T, Shanakranarayana Rao B, eds. Brain and Behavior.
Bangalore, India: National Institute of Mental Health and Neurosciences;
2004. p. 142-4.
41. Srnescu U., Miron A., Hancianu M., Aprotosoaie C. (2004) Plante
medicinale de la A la Z. Vol. 1, Ed. UMF Iai, 297-305

51
42. Wang Y, Feng Y, Fu Q, Li L (2013) Panax notoginsenoside Rb1
ameliorates Alzheimer's disease by upregulating brain-derived neurotrophic
factor and downregulating tau protein expression. Exp Ther Med 6:826
830.
43. Winterbourne C.C., How Kins R.E., Brain M., Carrell R.W. (1975) The
estimation of red cell superoxide dismutase activity, J. Lab. Clin. Med., 85,
327-341.
44. Yamaguchi, H., Nakazato, Y., Yamazaki, T., Shoji, M., Kawarabayashi,
T., and Hirai, S. (1991) Subpial /A4 amyloid deposition occurs between
astroglial processes in Alzheimer-type dementia. Neurosci. Lett., 123, 217
220.
45. Zhang M., Y. Wang, F. Qian, P. Li, X. Xu, (2016). Hypericin inhibits
oligomeric amyloid 42-induced inflammation response in microglia and
ameliorates cognitive deficits in an amyloid injection mouse model of
Alzheimer's disease by suppressing MKL1, Biochemical and Biophysical
Research Communications, 481:71.
46. Zhu X, Smith MA, Perry G, Aliev G. (2004) Mitochondrial failures in
Alzheimers disease. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 19: 345352.

Referine WEB:
https://www.google.ro/stresul+oxidativ
https://www.google.ro/hypericum+perforatum
https://www.google.ro/boala+alzheimer
https://www.google.ro/beta-amiloid
https://www.google.ro/proteina+tau
https://www.google.ro/boala+alzheimer+la+nivel+mitocondrial

52