Rezumat Teza de Doctorat Mihai FEDORCA

Investeşte în oameni!
FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013
Axa prioritară 1 „Educaţie şi formare profesională în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii bazate pe cunoaştere”
Domeniul major de intervenţie 1.5. „Programe doctorale şi post-doctorale în sprijinul cercetării”
Titlul proiectului: Burse doctorale si postdoctorale pentru cercetare de excelenta
Numărul de identificare al contractului: POSDRU/159/1.5/S/134378
Beneficiar: Universitatea Transilvania din Braşov
Partener:
Universitatea Transilvania din Brasov

Scoala Doctorala Interdisciplinara
Facultatea de Silvicultură și Exploatări Forestiere
Ing. Mihai Bogdan FEDORCA
TEZĂ DE DOCTORAT
Rezumatul tezei de doctorat

Summary of the Phd thesis
Conducător ştiinţific
Prof.dr.ing. Neculae ȘOFLETEA
BRASOV, 2017
Evaluări genetice cu markeri ADN în populația de cocoș de munte (Tetrao urogallus) din
România
MINISTERUL EDUCATIEI NATIONALE

UNIVERSITATEA TRANSILVANIA DIN BRASOV
BRASOV, B-DUL EROILOR NR. 29, 500036, TEL. 0040-268-413000, FAX 0040-268-410525
RECTORAT
D-lui (D-nei) ........................................................................................
COMPONENTA
Comisiei de doctorat
Numita prin ordinul Rectorului Universitatii „Transilvania” din Brasov
Nr. 8661 din
17/07/2017
PRESEDINTE: Prof.univ.dr.ing. Ovidiu IONESCU

PRODECAN: Facultatea de Silvicultura și Exploatari Forestiere,
Universitatea Transilvania din Brașov
CONDUCATOR STIINTIFIC: Prof.univ.dr.ing. Neculae ȘOFLETEA
REFERENTI: Prof.dr.ing. Aurel VLAIC
Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară
Cluj-Napoca
Conf.dr.ing. Antonia Cristina Maria ODAGIU
Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară
Cluj-Napoca
Prof.dr.ing. Alexandru Lucian CURTU
Data, ora si locul sustinerii publice a tezei de doctorat:..........., ..............., sala SP4,
Facultatea de Silvicultura și Exploatari Forestiere
Eventualele aprecieri sau observatii asupra continutului lucrarii va rugam sa le transmiteti
în timp util, pe adresa Facultatea de Silvicultura și Exploatari Forestiere, Brașov, Șirul Beethoven,
nr. 1, 500123, la numarul de fax: 0268.475705 sau la adresa de e-mail
mihai.fedorca@yahoo.com.
Totodata va invitam sa luati parte la sedinta publica de sustinere a tezei de doctorat.
Va multumim.
2
România
CUPRINS
MULȚUMIRI .......................................................................................................................................... 7
INTRODUCERE ..................................................................................................................................... 9
Capitolul I. Stadiul actual al cunoștințelor ......................................................................................... 10
1.1. Sistematica și istoricul speciei. Încadrarea taxonomică ..............................................................................10
1.2. Arealul cocoșului de munte .........................................................................................................................11
1.2.1. Situația cocoșului de munte la nivel mondial ......................................................................................11
1.2.2 Situația cocoșului de munte în România ...............................................................................................12
1.3. Morfologia, ecologia și etologia speciei......................................................................................................13
1.3.1. Morfologie............................................................................................................................................13
1.3.2. Habitat și dietă ......................................................................................................................................14
1.3.3. Locuri de rotit și alegerea partenerului.................................................................................................15
1.3.4. Reproducerea........................................................................................................................................15
1.4. Istoricul cercetărilor genetice ......................................................................................................................16
1.4.1. Studii efectuate pe probe provenite din România.................................................................................16
1.4.2. Studii efectuate în Europa ....................................................................................................................16
1.4.3. Evoluția studiilor genetice ....................................................................................................................16
1.5. Statutul de conservare al speciei .................................................................................................................17
1.6. Presiuni și amenințări asupra speciei...........................................................................................................17
CAPITOLUL II. SCOPUL, OBIECTIVELE CERCETĂRILOR ȘI METODELE DE LUCRU 19
2.1 Scopul și obiectivele cercetărilor ................................................................................................................19
2.2 Material și metode de cercetare ...................................................................................................................20
2.2.1 Localizarea studiului .............................................................................................................................20
2.2.2 Materialul și metodele de cercetare ......................................................................................................20
2.2.2.1. Materialul și metodele de lucru utilizate pentru obiectivul 1 ..................................................21
3
România
2.2.2.2 Materialul și metodele de cercetare pentru obiectivele 2 și 3 ..................................................23
CAPITOLUL III. REZULTATE ȘI DISCUȚII................................................................................. 27
3.1 Determinarea și analiza habitatului favorabil pentru cocoșul de munte în România ...................................27
3.2 Evaluarea genetică a populației de cocoș de munte din România la nivelul ADN-ului nuclear ..................35
3.2.1 Testarea și optimizarea metodelor de izolare și analiză a ADN-ului ....................................................35
3.2.2 Testarea echilibrului Hardy-Weinberg, a dezechilibrului linkage și identificarea alelelor nule ...........38
3.2.3 Structura alelică .....................................................................................................................................40
3.2.4 Indicii genetici de caracterizare a populației de cocoș de munte din România .....................................46
3.2.4.1 Indicii genetici pe ansamblul populației .........................................................................................46
3.2.4.2. Indicii genetici pe regiuni geografice ............................................................................................49
3.2.5 Structura genetică spațială a cocoșului de munte în România...............................................................50
3.2.6 Testarea multiplicității genotipurilor multilocus ...................................................................................52
3.2.6.1 Testarea multiplicității genotipurilor multilocus pentru întreaga populație ...................................52
3.2.6.2 Testarea multiplicității genotipurilor multilocus între indivizii proveniți din masive muntoase
diferite ........................................................................................................................................................57
3.2.6.3 Analiza autocorelației spațiale........................................................................................................59
3.2.6.4 Analiza existenței efectului de „gât de sticlăˮ (eng. Bottleneck) în arealul autohton al cocoșului
de munte .....................................................................................................................................................61
CAPITOLUL IV. CONCLUZII FINALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE. DISEMINAREA

REZULTATELOR. DIRECȚII VIITOARE DE CERCETARE ..................................................... 62
4.1 Concluzii finale ............................................................................................................................................62
4.2 Contribuţii originale .....................................................................................................................................64
4.3. Diseminarea rezultatelor..........................................................................................................................65
4.4. Direcții viitoare de cercetare .......................................................................................................................66
Bibliografie............................................................................................................................................. 68
4
România
TABLE OF CONTENTS
Foreword .................................................................................................................................................. 7
INTRODUCTION ................................................................................................................................... 9
Chapter I. State of the art..................................................................................................................... 10
1.1. Systematic and historic of the species .........................................................................................................10
1.2. Capercaillie distribution ............................................................................................................................111
1.2.1. Capercaillie worldwide status............................................................................................................111
1.2.2 Capercaillie status in Romania ..........................................................................................................122
1.3. Species morphology, ecology and ethology ..............................................................................................133
1.3.1. Morphology ........................................................................................................................................133
1.3.2. Habitat and diet ..................................................................................................................................144
1.3.3. Leks and mate choice .........................................................................................................................155
1.3.4. Reproduction ......................................................................................................................................155
1.4. History of genetic studies ..........................................................................................................................165
1.4.1. Studies of samples from Romania ........................................................................................................15
1.4.2. Studies conducted in Europe ................................................................................................................16
1.4.3. Genetic studies evolution .....................................................................................................................16
1.5. Conservation status of the species ...............................................................................................................16
1.6. Threats and presures ....................................................................................................................................17
CHAPTER II. AIM, RESEARCH OBJECTIVES AND RESEARCH METHODS ...................... 18
2.1 Aim and research objectives........................................................................................................................18
2.2 Research material and methods ...................................................................................................................19
2.2.1 Study area ..............................................................................................................................................19
2.2.2 Research material and methods ............................................................................................................19
5
România
2.2.2.1. Research material and methods for objective 1........................................................................20
2.2.2.2 Research material and methods for objectives 2 and 3............................................................22
CHAPTER III. RESULTS AND DISCUSSIONS ............................................................................. 26
3.1 Suitable habitat for capercaillie in Romania ...............................................................................................26
3.2 Genetic evaluation of capercaillie from Romania ....................................................................................3533
3.2.1 Testing and optimizing DNA extraction using non-invasive methods..................................................33
3.2.2 Testing the Hardy-Weinberg equilibrium, linkage disequilibrium and identifying the null allels ........35
3.2.3 Allelic structure .....................................................................................................................................38
3.2.4 Genetic indices for capercaillie population in Romania........................................................................44
3.2.4.1 Genetic indices of the population ...................................................................................................44
3.2.4.2. Genetic indices on geographical regions .......................................................................................47
3.2.5 Spatial genetic structure of capercaillie in Romania .............................................................................48
3.2.6 Testing the multilocus genotipes ...........................................................................................................50
3.2.6.1 Testing the multilocus genotipes of the population ........................................................................50
3.2.6.2 T Testing the multilocus genotipes among geographical regions ..................................................55
3.2.6.3 Spatial autocorrelation analyses .....................................................................................................57
3.2.6.4 Testing the bottleneck effect ..........................................................................................................59
CAPITOLUL IV. FINAL CONCLUSIONS. ORIGINAL CONTRIBUTIONS.

DISSEMINATION OF RESULTS. FUTURE RESEARCH DIRECTIONS .................................. 60
4.1 Final conclusions ..........................................................................................................................................60
4.2 Original contributions...................................................................................................................................62
4.3. Dissemination of results ..............................................................................................................................63
4.4. Future research directions ...........................................................................................................................64
References .............................................................................................................................................. 66
6
România
MULȚUMIRI
“Daca nu iti construiesti singur visul, cineva o sa te angajeje sa il construiesti pe al lui“
“If you don't build your dream someone will hire you to help build theirs.” Tony A. Gaskins Jr.
Întreaga activitate de cercetare din perioada doctoratului nu ar fi putut fi posibilă fără

sprijinul multor colaboratori, colegi, prieteni, dar și al familiei. Cred că aici și acum am prilejul și
momentul să le fiu recunoscător pentru întregul lor suport moral și material.
În primul rând, vreau să mulțumesc conducătorului științific al acestei teze de doctorat, prof.
dr. ing. Neculae Șofletea, pentru încredere, pentru profesionalism și pentru calitatea știintifică
oferită, dar mai ales pentru răbdarea și înțelegerea de care a dat dovadă de-a lungul acestei perioade.
Doresc să le mulțumesc tuturor profesorilor care de-a lungul timpului mi-au însoțit și
călăuzit pașii, dar și prin faptul că mi-au insuflat dorința de a cunoaște și de a cerceta. În mod special
doresc să adresez mulțumirile mele domnului Rector prof.dr.ing. Ioan Vasile Abrudan pentru
sprijinul moral și material acordat, domnului conf.dr.ing. Tudor Stăncioiu pentru facilitarea legăturii
cu Universitatea din Freiburg, unde am reușit să îmi finalizez cercetările, dar și pentru suportul
moral și științific în realizarea acestei cercetări. O bună parte din această teză nu ar fi fost posibilă
fără ajutorul domnului conf.dr.ing. Mihai Daniel Niță, care a reușit să mă învețe o parte din tainele
GIS-ului, dar și multe alte lecții de viață.
Pe această cale doresc să le mulțumesc colegilor din cadrul Regiei Naționale a Pădurilor, dar
mai ales domnului ing. Petre Gărgărea, fără de care această lucrare nu ar fi putut fi realizată, ei fiind
cei care m-au sprijint atât cu colectarea probelor biologice, cât și în procesul de identificare și
cartare a locurilor de rotit.
Tot pe această cale doresc să le mulțumesc colegilor și prietenilor din cadrul Institutului
Național de Cercetare în Silvicultură "Marin Drăcea", dar mai ales celor de la Secția Cinegetică,
pentru ajutorul de care au dat dovadă ori de câte ori i-am solicitat. De asemenea, mulțumesc celor de
la Fundația Carpați, alături de care mi-am petrecut multe zile frumoase.
Un deosebit respect și mulțumiri adresez familiei Ionescu, care ori de câte ori a fost nevoie
mi-au oferit sfaturile lor bune, dar și ajutor necondiționat. Mai mult decât atât, prin încrederea și
încurajarea care mi-au fost oferite am reușit să cresc atât pe plan profesional, cât mai ales ca om.
Prețuirea și mulțumirea pe care le-o port nu pot fi măsurate în câteva cuvinte.
De asemenea, țin să le mulțumesc tuturor prietenilor care mi-au fost alături necondiționat, ori
de câte ori a fost nevoie, atât în momentele de bucurie, cât mai ales în cele mai puțin fericite. O
7
România
deosebită mulțumire o adresez Liei Ciocîrlan, care și-a sacrificat multe zile pentru a mă ajuta cu
analizele de laborator și nu numai.
Țin să le mulțumesc atât socrilor mei Bogdan și Elena Cotovelea, cât și cumnaților mei Gabi
și Narcisa Cotovelea.
Mulțumesc persoanei care m-a sprijinit și a fost alături de mine ori de câte ori a fost nevoie,
mai ales în momentele în care reușita analizelor genetice părea un lucru imposibil de atins. Mai mult
decât atât, sfaturile și exemplele despre cum să lupți pentru a-ți îndeplinii obiectivul sau visul, nu au
încetat să mă uimească și să mă inspire. Această persoană minunată este Ancuța, soția mea, dar mai
ales prietena mea cea mai bună.
O prețuire nespusă o am pentru părinții mei, care întotdeauna m-au încurajat și m-au sprijinit
cu tot ce le-a stat în putință să îmi urmez și realizez visele. Au fost lângă mine ori de câte ori am
avut nevoie, oferindu-mi atât sprijin material, cât mai ales moral. Nu pot în cuvinte să mulțumesc
pentru cât au făcut pentru mine, atât în timpul doctoratului, cât mai ales de-a lungul vieții mele de
până acum. Din păcate tatăl meu nu mai este prezent printre noi, dar cu siguranță mă privește, este
mândru și se bucură de undeva de acolo de sus pentru mine.
Parintilor mei ....
8
România
INTRODUCERE
Fragmentarea habitatelor afectează structura genetică a populației (Giles 1997). Pe lângă

reducerea habitatului, scăderea diversității genetice, dar și creșterea gradului de consangvinizare,
pot duce la dispariția populațiilor izolate și de mici dimensiuni. Dacă populațiile rămân conectate cu
ajutorul dispersiei unor indivizi, atunci se poate păstra o mare parte din diversitatea genetică
(Segelbacher & Storch 2002). În Europa Centrală și nu numai, cocoșul de munte este considerat de o
foarte mare importanță în ceea ce privește conservarea ecosistemelor forestiere montane (Storch
1993a). Declinul populațional este un proces în derulare în majoritatea zonelor geografice, dar este
accentuat mai ales în zonele în care fragmentarea habitatului este mare, favorizând în unele zone
dispariția acestei specii (Segelbacher & Piertney 2007). Pe lângă pierderea habitatului, și degradarea
acestuia prin pășunat, prin schimbarea practicilor silviculturale din ultima perioadă, sau prin
favorizarea creșterii mărimii unor populații de faună sălbatică (de ex. mistreț) poate duce la un
declin al acestei specii (Baines et al. 2004).
Cocoșul de munte este o specie cu o largă răspândire arealistică în europa, mai ales în țările
nordice, dar și în rusia. În românia, habitatul, dar și mărimea populației sunt unele dintre cele mai
mari din europa centrală și de est. Deși au fost efectuate cercetări multiple la această specie,
informațiile legate de populația din țara noastră aproape că lipsesc. Deși mărimea habitatului pare să
fie favorabilă existenței speciei, presiunile provenite din turismul dezorganizat, exploatării
forestiere, dar și din urbanizarea necontrolată pot pune în viitor probleme acestei specii (Thiel et al.
2008). Având în vedere faptul că cercetările genetice din ultima perioadă, au stabilit că specia se află
într-un declin, dar și că indivizii localizați în masive muntoase diferite sunt izolați, fapt ce nu poate
fi determinat cu exactitate dacă este din cauza izolării recente prin reducerea habitatului sau din
cauza izolării de secole, impune studii amănunțite care să evalueze situația din țara noastră. Mai
mult decât atât, studiile genetice trebuie sa fie combinate cu cele de determinare a mărimii și
fragmentării habitatului, astfel încât, managementul asupra acestei specii pe termen lung să asigure,
pe lângă o mărime minimă a populației și o conectivitate între indivizii localizați în masive
muntoase diferite.
9
România
CAPITOLUL I. STADIUL ACTUAL AL CUNOȘTINȚELOR
1.1. Sistematica și istoricul speciei. Încadrarea taxonomică

Cocoșul de munte (Tetrao urogallus) face parte din ordinul Galliformes, familia
Phasianidae, subfamilia Tetraoninae, (Linaeus 1758) (Gutierrez et al. 2000; Dimcheff et al. 2002;
Drovetski 2002), sau după cum consideră alți autori, din familia Tetraonidae, încadrată la ordinul
Galliformes, alături de Phasianidae (Duriez et al. 2007).
Cocoșul de munte ( Tetrao urogallus) prezintă 12 subspecii (Tabelul 1), iar cea din țara
noastră și care face obiectul cercetărilor de față este subspecia Tetrao urogallus rudolfi
(Dombrowski 1912; Bajc et al. 2011; Simon 2010).
Tabelul 1. Subspecii de cocoș de munte și localizarea acestora (Bajc et al. 2011)
The list of Western Capercaillie (Tetrao urogallus) subspecies and their distribution ranges (Bajc et
al. 2011)
Nr.Crt. Subspecii Localizare
Tetrao urogallus aquitanus; Pirinei (Spania, Franța, Andora)
1
Ingram, 1915
Tetrao urogallus
2 cantabricus; Castroviejo, Munții Cantabrici (nord-vestul Spaniei)
1967
Tetrao urogallus karelicus; Finlanda și Rusia (Karelia)
3
Lonnberg, 1924
Tetrao urogallus lonnbergi; Peninsula Kola (Finlanda, Norvegia și nord-vestul Rusiei)
4
Snigirevski, 1957
Europa Centrală din Germania și Alpi până la sud-vestul statelor
baltice, vestul Belarusului, Carpații de Vest și nordul Macedoniei
Tetrao urogallus major; C. (Germania, Austria, Italia, Elveția, Lichtenstein, Franța, Slovenia,
5
L. Brehm, 1831 Croația, Bosnia și Herțegovina, Serbia, Montenegru, Kosovo,
Albania, Republica Cehă, Slovacia, Polonia, Belarus, Lituania,
posibil și Ucraina și Estonia)
Tetrao urogallus obsoletus;
6 Nordul Rusiei și Siberia
Snigirevski, 1937
Tetrao urogallus pleskei; Belarus, nordul Ucrainei, majoritatea Rusiei europene
7
Stegmann, 1926
Tetrao urogallus rudolfi; Munții Carpați și Rodopi (România, Bulgaria, Grecia, Ucraina)
8
Dombrowski, 1912
Tetrao urogallus
Centrul Siberiei, la sud de Altai și nord-vestul Mongoliei (Rusia,
9 taczanowskii; Stejneger,
Kazakhstan, China, Mongolia)
1885
Tetrao urogallus uralensis;
10 Uralii de sud și sud-vestul Siberiei (Rusia, Kazakhstan)
Menzbier, 1887
Tetrao urogallus urogallus; Fenno-Scandia (Finlanda, Suedia, Norvegia), Scoția (reintrodus)
11
Linnaeus, 1758
10
România
Nr.Crt. Subspecii Localizare

Tetrao urogallus volgensis;
12
Buturlin, 1907 Rusiacentralașidesud-est
1.2. Arealul cocoșului de munte
1.2.1. Situația cocoșului de munte la nivel mondial
Tetraonidele acoperă diverse nișe ecologice. Astfel, ele apar de pe vârful munților, în diverse
tipuri de pădure, până în zonele joase de tundră (Sachot 2002). Arealul acestei specii se întinde din
partea de vest a Europei, până în Scandinavia și estul Siberiei (figura 1). Deși în prezent această
specie ocupă o mare parte a arealului său inițial, schimbări majore au fost raportate de-a lungul
timpului, mai ales din cauza pierderii, deteriorării sau fragmentării habitatului, inclusiv din cauza
impactului uman (Storch 1994).
Această specie este nativă în următoarele țări: Albania, Andora, Austria, Belarus, Bosnia și
Herzegovina, Bulgaria, China, Croația, Republica Cehă, Estonia, Finlanda, Franța, Germania,
Grecia, Italia, Kazakhstan, Letonia, Liechtenstein, Lituania, Macedonia, fosta Republică Iugoslavia,
Mongolia, Muntenegru Norvegia, Polonia, România, Rusia, Serbia, Slovacia, Slovenia, Spania,
Suedia, Elveția și Ucraina, fiind introdusă în Regatul Unit al Marii Britaniei și apare ocazional și în
Danemarca (www.iucnredlist.org).
Figura 1. Distribuția speciei la nivel mondial (conform IUCN)

World distribution of capercaillie
11
România
(http://maps.iucnredlist.org/map.html?id=22679487)
1.2.2 Situația cocoșului de munte în România
În România se întâlnesc 3 dintre speciile de tetraonide și anume cocoșul de mesteacăn

(Tetrao tetrix), ierunca (Tetrastes bonasia rupestris) și cocoșul de munte (Tetrao urogallus) (Cotta
et al. 2008). În țara noastră, cocoșul de munte are o distribuție continuă, fiind întâlnit în întregul lanț
carpatic (figura 2).
Figura 2. Harta distribuției cocoșului de munte pe fonduri cinegetice (original)

Distribution map of capercaillie on hunting units
După cum se poate vedea în figura 3, populaţia de cocoş de munte (Tetrao urogallus) din
România are o creştere continuă, începând cu anul 2001. Din datele estimărilor la nivelul ţării, în
anul 2001 populaţia era de apoximativ 5600 exemplare și are o creștere continuă până în anul 2010,
când populaţia era de aproximativ 7200 exemplare (Fedorca 2016). Din datele statistice existente nu
rezultă care este raportul între sexe, aspect care ar fi fost util pentru interpretarea datelor genetice din
studiul de față.
12
România
Figura 3. Determinarea dinamicii populației de cocoș de munte în perioada 2001-2010

Capercaillie population trend from 2001 to 2010
1.3. Morfologia, ecologia și etologia speciei
1.3.1. Morfologie
Cocoșul de munte este cel mai mare reprezentant al tetraonidelor autohtone, cu un pronunțat
dimorfism sexual. Masculii au lungimea de 92,5-108 cm și femelele de 64,5-69 cm (Linția 1955).
Anvergura aripilor este de 87-133 cm și greutatea de 2400-4180 g (în medie 3472 g) la masculi și
1500-2030 g (în medie 1755 g) la femele (Klemm și Kohl 1988). Valori maxime de anvergură (133
cm) și de greutate (5020 g) au fost măsurate pe același mascul de E. v. Czynk în 20.04.1879, în
Munții Bucegi (Salmen 1980).
Masculul prezintă un penaj negru-cenușiu întunecat pe piept, cu luciu verzui și cu aripi brun
întunecate, subspecia T.u rudolfi fiind cea mai închisă la culoare dintre toate subspeciile. Ventral, la
baza aripilor și pe rectrice pot apărea, în special la indivizii mai bătrâni, zone albe de formă
variabilă. Ciocul este alb, iar deasupra ochilor apare o zonă golașă, roșie și sub cioc o bărbiță neagră.
Femela prezintă numeroase pete și benzi întunecate, pe un fond brun-ruginiu deschis. Se deosebește
13
România
de femela cocoșului de mesteacăn prin pieptul ruginiu și coada neemarginată (figura 4) (Simon
2010).
Figura 4. Mascul, femelă și pui de cocoș de munte

Male, female and chick of capecaillie http://www.planetofbirds.com/galliformes-
phasianidae-capercaillie-tetrao-urogallus
1.3.2. Habitat și dietă
Cocoșul de munte este o specie tipică a pădurilor de tip boreal. În cadrul limitei sale de
distribuție prezintă o mare plasticitate, utilizând diferite tipuri de habitate. Habitatul său predominant
este în pădurile bătrâne de limită altitudinală, mărginite de către zone cu pădure tânără. Habitatul
cocoșului de munte este în general caracterizat de către pădurile de rășinoase (Miettinen et al. 2010),
în special molidul, cu structuri deschise sau cu consistență medie spre redusă, dar cu o bună
acoperire a solului (figura 6), mai ales de către arbuști, mai ales de afin (Vaccinium myrtillus) și/sau
alte specii de ericacee (Storch 1995; Sachot 2002; Regnaut 2004; Jacquin et al. 2005).
În ceea ce privește dieta, plasticitatea acestei specii o ajută să supraviețuiască în cele mai
aspre codiții și să se adapteze în funcție de anotimp, schimbându-și comportamentul în funcție de
acesta. Astfel, în general, în timpul iernii exemplarele de cocoș de munte sunt arboricole și au o
dietă bazată în principal pe ace de rășinoase, în timp ce în sezonul de vară au o dietă bazată pe
muguri, frunze, flori și fructele unor plante ierbacee și arbuști, iar activitatea lor este preponderent la
14
România
nivelul solului (Storch 1993b; Blanco-Fontao et al. 2009). Supraviețuirea pe timpul iernii este
înlesnită de către tractul lor intestinal, care este adaptat la digerarea greoaie a acelor de rășinoase
(Sachot 2002).
1.3.3. Locuri de rotit și alegerea partenerului
În timpul primăverii, masculii se adună la locurile de rotit. Fiind o specie poligamă, femelele
au oportunitatea de a-și alege partenerul dorit, de obicei fiind aleși masculii dominanți (Fiske et al
1998), astfel cauzând un dezechilibru în proporția de masculi care participă la împerechere, fapt
întâlnit chiar și la speciile de mamifere (cerb carpatin, cerb lopătar ș.a). Pentru a atrage femelele,
masculii execută un dans de curtare, dar și un cântec de atragere a acestora, denumit tocat și tocilat.
Masculii, care în timpul anului nu sunt teritoriali, în perioada de împerechere se adună în aceste
locuri de rotit și devin foarte teritoriali unii față de alții. Adunarea de la locurile de rotit, pe lângă
ritualurile de curtare, cântece, determină și o expunere a ornamentelor sexuale secundare (Pagel
2002).
1.3.4. Reproducerea
Ponta poate fi în general între 6 și 16 ouă, care au circa 6 cm lungime, sunt de culoare alb-
gălbuie, cu câteva dungi roșietice-maronii. Ponta este depusă pe sol, unde este foarte sensibilă la
prădare, mai ales de către vulpilor, mistreților și jderilor (Summers et al. 2013). Perioada de
incubație durează în general între 24 și 29 de zile, iar eclozarea are loc în perioada mai-iunie.
Puii sunt nidifugi , iar după o perioadă de 3 luni în care sunt îngrijiți de către femelă, ating
dimensiunea maximă, urmând apoi a deveni independenți. Puii se hrănesc cu nevertebrate timp de 3-
4 săptămâni de la eclozare. În timpul acestei perioade supraviețuirea lor depinde de condițiile
meteorologice (Baines et al. 2016), care reglează abundența larvelor de lepidoptere (Picozzi et al.
1999), dar și de existența fructelor de pădure și a prădătorilor (Baines et al. 2004). În țara noastră,
perioada de împerechere are loc în lunile aprilie-mai (Cota 1982; Simon 2010).
15
România
1.4. Istoricul cercetărilor genetice
1.4.1. Studii efectuate pe probe provenite din România
Cocoșul de munte este cea mai cercetată specie de tetraonide din lume, fiind și cea mai
răspândită și, totodată, considerată de către unii specialiști ca fiind o specie umbrelă, specie prin a
cărei conservare se asigură protecție pentru un număr mare de specii care se găsesc în mod natural
în același habitat cu aceasta (Suter et al. 2002; Pakkala et al. 2003; Bollmann et al. 2004; Roberge
& Angelstam 2004). Cercetările genetice asupra populației de cocoș de munte efectuate până în
prezent au utilizat un număr redus de probe, din acest motiv, cercetările de față prezintă un interes
aparte, deoarece se vor finaliza cu date care vor permite caracterizarea genetică a populației
autohtone prin analize multilocus de ADN nuclear.
1.4.2. Studii efectuate în Europa
Alte studii pe această specie au vizat o multitudine de aspecte legate atât de ecologia (Wegge
și Rolstad 1986), biologia, cât și de habitatul acesteia (Braunisch și Suchant 2007, González et al.
2012, Quevedo et al. 2006, Storch 1993a, 1993b). Cele mai multe studii au fost realizate în Europa
Centrală (Germania, Franța, Italia), dar și în Scandinavia, Rusia și nu în ultimul rând în Spania.
1.4.3. Evoluția studiilor genetice
Deși există studii recente bazate pe microsateliți care au sugerat o diferențiere genetică între
subpopulații (Segelbacher et al. 2003, Segelbacher și Piertney 2007), nu se poate stabili cu precizie
dacă această diferențiere poate fi pusă pe seama izolării istorice, sau pe seama fragmentării relativ
recente a habitatului.
Pentru cocoșul de munte, fiind considerat o specie umbrelă și, de asemenea, datorită faptului
că efectivele au început să scadă în multe țări europene, metodele de cercetare folosite au constat în
mare parte din probe colectate non-invaziv (pene și fecale) (Jacob et al. 2010, Segelbacher et al.
2003). Principala problemă a acestor probe, mai ales a fecalelor, este metoda de păstrare: dacă
penele pot fi păstrate uscate la temperatura camerei (Morin et al. 1994, Taberlet și Bouvet 1994,
Taberlet și Luikart 1999), păstrarea fecalelor impune reale probleme.
După metoda de păstrare, o altă problemă pentru probele colectate non-invaziv este legată de
metoda de izolare a ADN-ului. În ultimii ani au apărut kit-urile de extracție, rezultatele acestora
16
România
fiind foarte bune, utilizarea lor fiind mult mai ușor de realizat (Wasser et al. 1997). De asemenea, o
nouă tehnică de extracție a ADN-ului a început să fie utilizată. Astfel, cartușele de izolare oferă cea
mai rapidă metodă de izolare a ADN-ului, dar principala problemă a acestora este costul ridicat de
achiziționare (Cotovelea et al. 2012).
1.5. Statutul de conservare al speciei

În ceea ce privește statutul de conservare, în clasificările IUCN cocoșul de munte este
încadrat în categoria "eng. least concern" = fără amenințări, efectivul la nivel mondial fiind suficient
de mare (2,28-3 milioane de indivizi în Europa, iar la nivel mondial între 5-10 milioane de indivizi).
Astfel, ținând cont de mărimea efectivului total, specia nu poate fi pusă în pericol în viitorul apropiat
(http://www.iucnredlist.org/details/full/22679487/0).
În ceea ce privește Directiva Habitate și Păsări, această specie este inclusă în Anexa I,
datorită faptului că este amenințată ca urmare a deteriorării habitatului și a braconajului.
(http://ec.europa.eu/environment/nature/conservation/wildbirds/threatened/t/tetrao_urogallus_en.htm)
1.6. Presiuni și amenințări asupra speciei

Principalele amenințări și presiuni asupra speciei sunt în general datorate acțiunilor umane.
Agricultura și creșterea animalelor prin conversia habitatelor naturale, au condus la o pierdere
considerabilă în ceea ce privește conectivitatea, distribuția și suprafața habitatelor ocupate de către
această specie (Kurki & Linden 1995; Storch 2007; Fedorca 2016).
O altă problemă cu care se confruntă cocoșul de munte este pășunatul, atât prin deranjul pe
care îl fac animalele prin trecerea zilnică, cât mai ales prin faptul că modifică structura, înălțimea,
cât și compoziția vegetației, astfel degradând sau distrugând specii de plante care asigură protecția
împotriva prădătorilor, locurile de cuibărit sau cele de hrănire (Ludwig et al. 2009; Fedorca 2016).
Subvențiile acordate în ultimii ani în sectorul agricol, au determinat o creștere a numărului
de ovine și caprine și implicit a numărului de câini însoțitori, dar și a nevoilor de extindere a
pășunilor. Astfel, pe lângă prădarea directă efectuată de către câinii însoțitori, mai ales asupra
pontelor și a puilor, amenajarea și curățarea pășunilor au determinat o pierdere sau o deteriorare a
habitatului (Ovidiu Ionescu comunicare personală).
17
România
O presiune care exercită un efect negativ în ultimii ani se datorează în primul rând protecției
păsărilor de pradă și în al doilea rând scăderii cerinței pentru piața de blănuri, fapt ce a dus la o
creștere numerică a răpitorilor cu păr și cu pene, ceea ce a determinat o creștere a numărului de
exemplare de cocoș de munte prădate (Čas 2010).
18
România
CAPITOLUL II. SCOPUL, OBIECTIVELE CERCETĂRILOR ȘI
METODELE DE LUCRU
2.1 Scopul și obiectivele cercetărilor

Cercetările genetice desfășurate pe populația de cocoș de munte din România se rezumă
doar la puține studii realizate în afara țării, în contextul cercetării unor populații din Europa,
efectuându-se preponderant analize de ADN mitocondrial, urmărindu-se o evaluare filogeografică a
cocoșului de munte (Segelbacher & Piertney 2007; Duriez et al. 2007). Studiile cu markeri de tipul
microsateliților sunt relative puțineiar în arealul cercetat în această lucrare lipsesc cu desăvârșire.
În consecință, prin studiul de față s-a considerat oportună cercetarea populației de cocoș de
munte din România, una dintre cele mai reprezentative pentru această specie (peste 7000 de
exemplare). Cercetările vizează obținerea unor date relevante, mai întâi prin analiza arealului și a
habitatelor specifice cocoșului de munte în România, pentru ca apoi, pornind de la datele noi astfel
obținute să se asigure un eșantionaj corespunzător pentru recoltarea probelor biologice, în vederea
efectuarii cercetărilor genetice cu markeri moleculari. În baza acestor date, corelate cu necesitatea de
a efectua analize de ADN recoltat din probe prelevate prin metode non-invazive (specia fiind
ocrotită, recoltarea prin vânare fiind interzisă), a rezultat faptul că un studiu genetic prin genotiparea
a peste 100 de indivizi, utilizând mai mulți markeri polimorfici, ar fi acoperitor pentru caracterizarea
populației de cocoș de munte din România.
Ca atare, teza de doctorat are ca scop determinarea diversității genetice și prezentarea de date
noi, actualizate, privind răspândirea și preferințele de habitat ale speciei în România.
Pentru a atinge acest scop au fost stabilite următoarele obiective ale cercetării:
1. Determinarea habitatului favorabil al speciei în România și identificarea zonelor de

areal cu diferite niveluri de demografie, respectiv a discontinuităților de areal, în vederea
analizei influențelor acestora asupra genofondului speciei;
2. Testarea și optimizarea metodelor genetice de izolare și analiză a ADN-ului, în

primul rând prin izolarea din probe recoltate non-invaziv;
19
România
3. Determinarea indicilor de diversitate genetică pentru populația de cocoș de munte din

România la nivelul ADN-ului nuclear, cu markeri de tipul secvențelor simple repetitive
(SSRs) și analiza distribuției spațiale a structurilor genetice în arealul cercetat.
2.2 Material și metode de cercetare
2.2.1 Localizarea studiului
Prezentul studiu este localizat la nivel național, de-a lungul lanțului carpatic, acoperind o
suprafață de aproximativ 49.000 km2 (Fedorca et al. 2015) (figura 5).
Figura 5. Harta prelevării probelor biologice

Biological samples locations map
2.2.2 Materialul și metodele de cercetare
Deoarece această specie nu se mai vânează în țara noastră, utilizarea metodelor non-invazive
reprezintă singura posibilitate de obținere a materialului biologic pentru efectuarea analizelor
genetice (cel puțin la momentul actual). Penele reprezintă cea mai comună sursă utilizată pentru
extragerea ADN-ului în ceea ce privește specia cocoșul de munte (Segelbacher et al. 2008). Totuși,
deși penele sunt mai ușor de păstrat pe termen lung și permit inclusiv identificarea vizuală a
sexulului indivizilor, acestea se găsesc mai greu în teren. Excrementele sunt mult mai ușor de găsit
20
România
în toate anotimpurile, mai ales în locurile de rotit sau în cele de înnoptare (Pérez et al. 2011). Este
motivul pentru care acestea au fost alese pentru a fi utilizate în cadrul acestei cercetări. Principala
problemă privind aceste probe o reprezintă metoda de păstrare, deoarece cantitatea de ADN este
foarte redusă (AND-ul se regăsește în câteva celule epiteliale), iar pe de altă parte, există
posibilitatea alterării rapide a acestuia.
2.2.2.1. Materialul și metodele de lucru utilizate pentru obiectivul 1
Preferința pentru selectarea habitatului este influențată în primul rând de prezența pădurilor
de rășinoase dar și de următoarele elemente: caracteristicile solului, panta terenului, expoziția și nu
în ultimul rând unele caracteristici structurale ale arboretului (compoziție, consistență, vârstă)
(Bollmann et al. 2005; Graf et al. 2007), dar mai ales mărimea minimă a suprafeței împădurite, care
după unii autori trebuie să fie de 800-1.100 ha (Bollmann et al. 2011) sau după alții de minim 500
ha (Braunisch & Suchant 2008), pentru a putea fi favorabilă existenței speciei. Alte caracteristici
care influențează habitatul speciei sunt poziția topografică, temperatura medie a lunii iunie (Graf et
al. 2006) și zilele cu zăpadă pe sol (Braunisch & Suchant 2007).
Pentru derularea acestui obiectiv au fost folosite o serie de date și informații, care ulterior au
fost intercorelate constând în: hărțile fondurilor cinegetice de la nivelul întregii țări, datele furnizate
de către Ministerul Mediului Apelor și Pădurilor referitoare la efectivele speciei, dar și harta
habitatelor forestiere din cuprinsul țării, furnizată de către Institutul Național de Cercetare-
Dezvoltare în Silvicultură Marin Drăcea (ICAS 2008). O altă serie de elemente folosite a constat în
utilizarea hărții folosinței terenului Corine Land Cover 2012 (CLC), harta temperaturilor și
precipitațiilor la nivel de țară, cât și hărți generate din modelul digital de elevație. Produsul acestei
evaluări s-a concretizat în elaborarea hărții răspândirii și habitatelor cocoșului de munte în România,
hartă realizată cu ajutorul software-lui ArcGIS 10.4.
Pornind de la locația locurilor de rotit considerate ca și un centru al zonei utilizate de această
specie, s-a selectat un buffer (buffer = teritoriul potențial (ha) situat în jurul locului de rotit, folosit
de indivizi pe parcursul unui an pentru hrănire și ca loc de adăpost, de cuibărit etc.) de diferite
dimensiuni pentru a determina o arie variabilă de folosință a terenului, pentru a surprinde cât mai în
detaliu habitatul propice acestei specii. Astfel, pornind de la dimensiunile habitatului utilizat de către
21
România
această specie (Storch 1995), s-a generat o medie între habitatul maxim și minim necesar ambelor
sexe (587,5 ha) și astfel au rezultat dimensiunile zonelor de buffer de 10, 100, 500 și 1000 de
hectare, care reprezintă 1,7%, 17%, 85%, respectiv 170% din teritoriul mediu utilizat (figura 6).
Faptul că procentul utilizat nu este unul fix se datorează dimensiunilor celulelor de 250X250 m
(Graf et al. 2005) cu care s-a lucrat.
Figura 6. Reprezentarea diferitelor mărimi ale bufferelor folosite

Different buffer size representation
Fiecare zonă de buffer s-a suprapus peste hărțile generate în GIS. Astfel, au fost determinate:
folosința terenului, temperatura medie și precipitațiile medii din luna iunie (în această lună eclozează
puii (aceștia fiind dependenți în alimentație de prezența artropodelor și a larvelor de lepidoptere,
context în care atât temperatura, cât și cantitatea de precipitații influențează indirect rata de
supraviețuire - Moss et al. 2001), distanța până la cel mai apropiat drum de acces (acest parametru
influențează deranjul cauzat de către activitățile umane - Graf et al. 2005), distanța până la prima
zonă locuită, distanța până la terenul agricol, panta terenului, indicele de radiație solară (Kumar et
al. 1997) și Topographic Position Index (TPI) (Graf et al. 2005; Braunisch & Suchant 2007; De Reu
22
România
et al. 2013). Caracteristicile fiecărei zone de buffer folosite au fost introduse în Excel pentru a fi mai
bine gestionate și aranjate, apoi au fost transferate pentru a fi prelucrate în programul STATISTICA.
Astfel, aplicând media pe zona de buffer a fiecărui parametru utilizat, a fost determinată abaterea
standard, pentru a stabili intervalul de valori care influențează habitatul speciei și mai apoi pentru
realizarea hărților de distribuție.
2.2.2.2 Materialul și metodele de cercetare pentru obiectivele 2 și 3
Materialul de cercetare
Pentru derularea studiului genetic cu markeri ADN de tip SSRs, în perioada 2013-2015 s-au
colectat 138 de probe biologice, prin metode non-invazive, provenite de la exemplare de cocoș de
munte din masivele muntoase din țara noastră (figura 7).
Figura 7. Localizarea probelor biologice pentru analizele genetice

Biological samples locations used in genetic analyses
23
România
Metodele de cercetare pentru obiectivele 2 și 3
A. Izolarea ADN-ului
În cadrul acestei cercetări, pentru a reduce costurile a fost utilizată o metodă inovativă de
extragere a ADN-ului, utilizând extractorul automat Maxwell®16, - cartușele pentru izolare
Maxwell (Promega). Aparatul Maxwell®16 poate fi folosit pentru izolarea ADN-ului din diferite
tipuri de surse biologice: țesut, salivă, sânge, fecale, culturi de celule etc. (Cotovelea et al. 2012).
Paşii urmaţi au presupus:

1. Pregătirea probelor: a constat din agitarea în prealabil a probei, urmată de extragerea unei cantități
de 1ml de lichid din eprubeta care conține proba (metodă utilizată în cadrul acestui studiu);
2. Pregătirea cartuşului pentru izolare: introducerea probei în camera de lisare;
3. Introducerea pistonului în ultima cameră;
4. Pornirea aparatul Maxwell® 16;
5. Setarea parametrilor protocolului pentru celule;
6. Aşezarea cartuşelor de izolare pe placa aparatului;
7. Adăugarea a 300µl Elution Buffer în tuburile pentru eluţie;
8. Selectarea opţiunii RUN;
9. Așteptare timp de 47 de minute;
10. Pipetare lichid din tuburile pentru eluţie în tuburi noi de 2 ml.
B. Măsurarea cantității/calității AND-ului izolat
Măsurarea ADN-ului s-a realizat cu ajutorul spectrofotometrului NanoDrop8000, pentru a

determina reușita la extracție, urmărind valorile raportului 260/280 (valoare care oferă indicii
privind puritatea acestuia). Pentru a efectua măsurătorile s-a utilizat 1 µl de ADN, încărcându-se 8
probe distincte la fiecare măsurătoare.
C. Analizele de microsateliți (SSR)
Metoda de cercetare a constat în efectuarea analizelor de laborator pentru obținerea

genotipurilor și a secvențelor repetitive de ADN. Analizele de ADN nuclear s-au efectuat utilizând
13 markeri genetici (tabelul 2) identificați în studiile anterioare desfășurate pe populațiile de cocoș
24
România
de munte la nivel european (Piertney și Hoglund 2001, Segelbacher et al. 2000). Markerii BG15 și
BG18 au fost concepuți pentru a fi utilizați la cocoșul de mesteacăn (Piertney și Hoglund 2001), însă
pot fi folosiți cu succes și pentru alte specii, dacă distanța filogenetică dintre acestea este mică
(Galbusera et al. 2000), așa cum este cazul cocoșului de munte. Utilizarea acestui set de markeri
permite nu numai evaluarea genetică a populației autohtone de cocoș de munte, ci și compararea
datelor cu cele obținute în alte zone din arealul speciei.
Pentru o cât mai bună reușită și pentru a reduce costurile de amplificare și secvențiere,
markerii folosiți au fost grupați în două reacții (engl. multiplex) după cum urmează:
- multiplexul 1 (TUD4, TUT3, BG15, TUT2, TUT1, TUT4)
- multiplexul 2 (TUD3, TUD5, TUD6, BG18, TUD7, TUD1, TUD8)
D. Analiza fragmentelor de ADN: indicii de diversitate genetică determinați și

metodologia de analiză a structurilor genetice populaționale și spațiale
O primă analiză a bazei de date a constat în detectarea prezenței alelelor nule. Această
analiză a fost posibilă utilizând soft-ul MICROCHECKER (Van Oosterhout et al. 2004).
O a doua analiză a constat în determinarea indicilor diversității genetice: numărul mediu de
alele (Na), numărul efectiv de alele (Ne), heterozigoția observată (Ho), heterozigoția așteptată (He),
indicele de diferențiere genetică (Fst). Pentru calculul acestor indici s-a utilizat soft-ul GeneAlex 6.5
(Peakall & Smouse 2012). Pentru testarea echilibrului Hardy-Weinberg (Guo & Thompson 1992) s-
a utilizat soft-ul GENEPOP v 4.2.2 (Rousset 2008).
Pentru a examina dacă genotipurile sunt distribuite randomizat în zona de studiu sau dacă
acestea prezintă o structură genetică determinată de un nivel mai mare de înrudire decât media
specifică, s-au efectuat analize de autocorelație spațială, utilizând coeficientul de înrudire r (Smouse
et al. 2008) în programul GenAlex v 6.5 (Peakall & Smouse 2012).
In programele STRUCTURE v 2.3.4 (Pritchard et al. 2000; Evanno et al. 2005) și
GENELAND v 4.03 (pachetul R) (Guillot 2005; Guillot et al. 2012) a fost aplicat algoritmul
Bayesian utilizând Markov Chain Monte Carlo (MCMC), pentru a explora structura genetică
populațională și posibilele discontinuități genetice spațiale. Modelul stochastic pentru programul
STRUCTURE v 2.3.4 a constat în setarea numărului de iterații la 5, pentru fiecare număr de
25
România
subpopulații așteptat (K), cu K=1 până la K=10 și un număr de 500 de mii de repetiții MCMC, după
un număr de 1 milion de simulări. Pentru a estima probabilitatea posterioară de apariție a unui
anumit număr de subpopulații, s-a utilizat valoarea Ln(K) furnizată de către programul
STRUCTURE și a fost calculat ΔK (Evanno et al. 2005). În programul GENELAND (Guillot 2005;
Guillot et al. 2012) au fost efectuate100 de mii de iterații, cu o îngustare de 100 (1000 de iterații au
fost salvate), pentru K cu valori de la 1 la 10 subpopulații. Repetițiile au fost făcute ținând cont de
poziția geografică a tuturor probelor luate în analiză.
Tot pentru a testa structura genetică populațională a fost utilizat programul TESS (Chen et
al. 2007), utilizând valori pentru K de la 2 la 10; pentru fiecare subpopulație statistică constituită pe
criterii geografice au fost făcute un număr de 5 repetiții, utilizând 1200 de simulări cu 200 de
repetiții, pentru fiecare repetiție a numărului de subpopulații.
Atât indicele Fst utilizat pentru a evidenția nivelul general al divergenței genetice între
subpopulații (Hartl & Grant 1997; Rousset 1997), cât și indicele FIS, care relevă abaterea de la
echilibrul genetic Hardy-Weinberg determinată de regulă de un anumit nivel de consangvinizare, au
fost calculați utilizând programul FSTAT v 2.9.3.2 (Goudet 1995).
Pentru a testa dacă populația autohtonă de cocoș de munte, în ansamblul ei sau pe
subpopulații, a trecut recent printr-un gât de sticlă (eng. bottleneck), s-a folosit soft-ul
BOTTLENECK v 1.2.02 (Piry et al. 1999), utilizând testul Wilcoxon și modelele pentru
determinarea mutațiilor I.A.M. și S.M.M., folosind 9999 de iterații (Cornuet & Luikart 1996).
Subpopulațiile au fost delimitate la nivelul întregului areal din România pe zone de existență a
speciei, separate după criterii geomorfologice, îndeosebi în funcție de existența unor bariere care nu
au permis sau nu au fost favorabile pentru deplasarea indivizilor. Aceste subpopulații au fost apoi
analizate pe baza genotipurilor multilocus pentru a determina distanța genetică între ele, respectiv
indicele de diferențiere FST.
26
România
CAPITOLUL III. REZULTATE ȘI DISCUȚII
3.1 Determinarea și analiza habitatului favorabil pentru cocoșul de munte în România
Pentru îndeplinirea acestui obiectiv, s-au analizat 750 de locuri de rotit distribuite la nivel
național. Utilizând zone de buffer de diferite dimensiuni (10, 100, 500 și 1000 de hectare), s-a
determinat o suprafață de teren situată în jurul locului de rotit care este folosită pe tot parcursul
anului de către exemplarele de cocoș de munte, despre care se știe că rămân fidele zonei din jurul
locului de rotit folosit în primăvară, în timpul sezonului de împerechere. Deși deplasarea
exemplarelor nu este întotdeanuna una concentrică în jurul locului de rotit (Gernot Segelbacher -
comunicare personală), aceasta a fost determinată ca și un minim și un maxim, atât pentru femele,
cât și pentru masculi, utilizând datele de telemetrie ale unor exemplare pe care au fost montate
aparate GPS, în alte țări precum Germania (Storch 1995). Datele de telemetrie din țara noastră la
această specie lipsesc, așa încât nu putem decât să facem referire la cele din alte țări cu condiții de
relief asemănătoare. Distanțele de deplasare au fost calculate ca o medie a minimului și maximului
de deplasare a ambelor sexe. Așadar, au rezultat mai multe variante ale dimensiunii zonelor de
buffer care au fost analizate (Tabelul 3)(Graf et al. 2005; Braunisch & Suchant 2007).
Variabilele luate în calcul pentru determinarea habitatului favorabil acestei specii au fost
generate pentru fiecare parametru în parte, în fiecare zonă de buffer utilizată. Astfel, aceste rezultate
au fost introduse în programul STATISTICA pentru a determina minimul, maximul și media
fiecărui parametru pentru întreaga zonă avută în studiu (Tabelul 3).
Utilizând valorile rezultate pentru fiecare dintre variabilele folosite, s-au realizat modele de
caracterizare și determinare a habitatului favorabil acestei specii pentru fiecare zonă de buffer.
Astfel, au rezultat 4 modele de distribuție ale habitatului, fiecare cu un grad diferit de suportanță.
Fiecare model rezultat a fost validat utilizând locația locurilor de rotit luate în studiu, context în care
gradul de suportanță a celor 4 modele a fost diferit. După cum se poate observa în figura 8, utilizarea
suprafeței de buffer de 500 ha a furnizat rezultatele cele mai concludente în ceea ce privește
caracterizarea habitatului favorabil pentru specia cocoș de munte (91% grad de suportanță al
modelului).
27
România
Utilizarea zonelor de buffer de 100 ha a avut un grad de suportanță al modelului de 74%, iar
zonele de 10 ha, respectiv cele de 1000 ha au avut un grad de suportanță de 73%. Aceste rezultate
sunt diferite de cele din alte studii. Astfel, în studiul efectuat în Pădurea Neagră, suprafața care
explică cel mai bine aceste modele este cea de 10 ha (Braunisch & Suchant 2007). Rezultatul acesta
este influențat de zona restrânsă de habitat în care această specie se găsește în arealul respectiv din
Germania. În studiul efectuat în Alpii Elvețieni, suprafața care a explicat cel mai bine modelul de
habitat a fost cea de 256 ha (Graf et al. 2005), rezultat influențat cel mai probabil de condițiile de
relief din Alpi, de înălțimile mari (peste 300m) și de faptul că această specie se găsește până la
altitudinea de 2000 m (Graf et al. 2005), dar și de puternica fragmentare a teritoriului generată de
căile de acces și amenajările multiple cu infrastructură pentru practicarea sporturilor de iarnă. Din
această ultimă perspectivă, situația din România este mult diferită, influențând mărimea zonei de
buffer (500 ha) cu cel mai mare nivel de suportanță.
Figura 8. Validarea suprafețelor de buffer utilizate

Buffer zones size validation
În figura 26 este prezentată harta modelului rezultat pentru zona de buffer de 500 ha, model
cu care s-a lucrat mai departe pentru determinarea habitatului favorabil acestei specii în țara noastră.
În prima etapă, acestui model i-a fost aplicată o barieră de suprafață, pentru a elimina suprafețele de
teren mai mici de 1 ha. O a doua etapă a presupus o eliminare a zonelor care au ca și atribut pentru
28
România
fiecare celulă valori mai mici de 27 (valoare prag rezultată în urma stratificării tuturor factorilor luați
în analiză). O a treia și ultimă etapă a constat în utilizarea unor celule cu dimensiunea de 250x250
m, pentru a armoniza rezultatele obținute și pentru o dispunere grafică a rezultatelor. Rezultatele
finale în ceea ce privește determinarea habitatelor favorabile pentru specia cocoș de munte în
România utilizând programul ARCGis sunt prezentate în figura 9.
Figura 9. Distribuția habitatului favorabil pentru specia cocoș de munte

în România utilizând programul ARCMap
Map of suitable habitat distribution for capercaillie using ARCMap
O a doua metodă de determinare a habitatului favorabil acestei specii a constat în utilizarea

programului MAXENT (Elith et al. 2011). Coordonatele locurilor de rotit au fost utilizate ca puncte
de prezență. Această metodă poate fi folosită cu succes dacă punctele sunt distribuite oarecum
uniform (Brotos et al. 2004; Elith et al. 2006). Parametri folosiți la modelul anterior au fost utilizați
și în acest caz ca și descriptori ai habitatului. Programul MAXENT a testat fiecare parametru luat în
29
România
calcul și a determinat importanța acestuia (Phillips et al. 2006). Rezultatele din figura 10 arată care
dintre parametri au avut cele mai mari influențe în construirea modelului. Totodată, a rezultat că
altitudinea are cele mai mari influențe în ceea ce privește preferința de alegere a habitatului, cu
valori apropiate de 2,0. Parametrul care a avut cele mai mici influențe a fost distanța până la drum,
cu valori de 0,2.
Figura 10. Parametri utilizați pentru construirea modelului și gradul acestora de influență
Parameters used in model building and their degree of influence
Utilizând rezultatele primei testări, programul a determinat procentul de contribuție a

fiecăruia dintre parametri avuți în analiză. Astfel, din tabelul 2 putem observa faptul că cea mai mare
contribuție a avut-o distribuția molidului, cu un procent de contribuție de 70,2%, urmată de
distribuția altitudinii (26,5%). Distanța până la drum, până la terenul agricol și până la cea mai
apropiată zonă locuită nu au influențat modelul, ceea ce demonstrează faptul că habitatul acestei
specii nu este fragmentat de către acestea. Mai mult decât atât, așezările umane aproape că lipsesc la
altitudinile la care această specie trăiește, iar folosința terenului agricol este în general redusă, acesta
fiind utilizat preponderent ca pășuni temporare, doar pe timpul verii.
30
România
Tabelul 2 . Procentul de contribuție al parametrilor utilizați în construirea modelului

Contribution per cent of the parameters used in model building
Variabile Procent de contribuție
Distribuția molidului 70.2

Altitudinea 26.5
Temperatura medie a lunii iunie 1.9
Precipitații medii în luna iunie 0.6
Panta 0.6
Radiația solară la 30 martie 0.3
Distanța până la terenul agricol 0
Distanța până la zonele locuite 0
Distanța până la drum 0
A doua etapă în construirea modelului a constat în stabilirea gradului de suportanță al
acestuia. Astfel, analizând curba modelului (AUC - "area under de curve" = zona de sub curbă),
putem să observăm faptul că acesta are un grad de suportanță de 95,2 % (figura 29). Rezultatele
acestui model având un grad de suportanță de peste 90% (Norris 2014), au fost considerate ca și
finale, nemaifiind necesară construirea altui model și, în baza datelor respective s-a trecut la
generarea hărții habitatelor favorabile cocoșului de munte cu ajutorul programului ARCGis (figura
11).
Figura 11. Determinarea gradului de suportanță al modelului (AUC = zona de sub curbă)
Sensitivity of the model (AUC - area under curve)
31
România
Evaluând cele 2 modele de predicție a habitatului, putem observa faptul că modelul rezultat
utilizând programul MAXENT a avut cel mai mare grad de încredere (95,2%), față de modelul
rezultat utilizând programul ARCGis (91%). Mai mult decât atât, AUC-ul rezultat în acest studiu a
fost mult mai mare decât cel mai bun model găsit în studiile realizate în Pădurea Neagră (74,5%),
când au fost luați în calcul mai mulți parametri (Braunisch et al. 2013).
Figura 12. Distribuția habitatului favorabil pentru specia cocoș de munte

în România utilizând programul Maxent
Map of suitable habitat distribution for capercaillie using Maxent software
După ce a fost creat acest model, au rezultat valorile curbelor factorilor luați în analiză,
rezultatele fiind prezentate în figura 13. Acest model surprinde interdependența variabilelor folosite,
mai ales a celor două care au avut cel mai mare procent de contribuție în construcția acestuia
(distribuția molidului și altitudinea). În ceea ce privește altitudinea, această specie se regăsește în
România preponderent între 1000 m și 2000 m, fapt întâlnit și în studiile din Munții Alpi, dar și în
32
România
majoritatea zonelor din Europa Centrală, unde aceasta se întâlnește între 800 m și 1600/2200 m,
influențată mai ales de limita superioară a pădurii (Graf 2005).
Temperatura medie a lunii iunie a avut o infleunță mai mare decât a cantității medii de
precipitații, fapt care se poate răsfrânge asupra ratei de supraviețuire a puilor (Kortland 2006). Ca
urmare a distribuției curbei de valori pentru temperatura medie a lunii iunie, se poate observa un
minim necesar de 8oC pentru o rată mai mare de supraviețuire a puilor.
Valorile pantei au fost cuprinse între 15o și 550, observându-se o grupare a preferințelor
pentru cea de 330, fapt ce poate afecta indirect structura vegetației (Suchant 2002), dar mai ales
direct capacitatea exemplarelor de a evita prădătorii (Graf 2005).
33
România
a) b)
c) d)
e)
Figura 13. Curba valorilor pentru variabilele luate în studiu pentru specia cocoș de munte
în România utilizând programul Maxent : a) distribuția molidului; b) altitudinea; c) temperatura
medie a lunii iunie; d) precipitațiile medii din luna iunie; e) panta terenului
Response curves of the parameters considered for capercaillie in Romania: a) spruce distribution; b)
altitude; c) mean temperature in June; d) mean rain fall in June; e) slope
34
România
3.2 Evaluarea genetică a populației de cocoș de munte din România la nivelul ADN-ului
nuclear
3.2.1 Testarea și optimizarea metodelor de izolare și analiză a ADN-ului
În ceea ce privește testarea și optimizarea metodelor genetice de izolare a ADN-ului, s-a impus
derularea de cercetări specifice, deoarece a trebuit ca ADN-ul să fie extras prin metode non-
invazive, în condițiile în care, în România, este interzisă recoltarea prin împușcare.
Au fost testate două metode de extragere a ADN-ului din probe colectate non-invaziv, și
anume extragerea ADN-ului din pene cu ajutorul kit-urilor de extracție și respectiv a ADN-ului
existent în celule epiteliale intestinale eliminate în fecale. Având în vedere faptul că analizele
efectuate prin metode de recoltare non-invazive sunt consumatoare de timp și bani (Ball et al. 2007),
s-a încercat determinarea celei mai viabile metode, atât din punct de vederea economic, cât mai ales
a calității și cantității ADN-ului extras. ADN-ul extras prin cele două metode a fost testat cu ajutorul
spectrofotometrului NanoDrop8000, în vederea stabilirii cantității și calității acestuia.
Pentru extragerea ADN-ului din pene au fost folosite materiale provenite din părți diferite ale
corpului (pene de pe corp, din coadă și din aripă), de mărimi diferite, vizând mai ales extragerea
ADN-ului conservat în artera axială din interiorul penelor mari (Horváth et al. 2005; Fedorca et al.
2013). Pentru aceasta s-au utilizat kit-uri de extracție Macherry Nagel, specifice acestui tip de
material.
Pentru extragerea ADN-ului din excremente, probele au fost stocate în fiole de plastic umplute
în prealabil cu etanol, în care excrementele au fost introduse imediat după colectarea de pe sol.
Probele au fost recoltate în perioada 2013-2015. Pentru extragerea ADN-ului s-a folosit extractorul
automat și protocolul de izolare MaxWell16, conform specificațiilor producătorului.
După cum se poate observa din tabelul 3, au fost analizate 12 probe provenind din pene,
respectiv alte 12 din excremente. Valorile medii ale concentrațiilor ADN-ului extras din fecale (în
medie 60 ng/µl) au fost de circa 3 ori mai mari decât cele obținute din pene (19,95 ng/µl). De
asemenea, calitatea ADN-ului extras din fecale a înregistrat valori cuprinse între 2,1 și 2,6, în vreme
ce la pene, valorile au fost foarte mari (între 10,4 și 81,1). Conform instrucțiunilor de utilizare a
spectrofotometrului, valoarea calității este apreciată în funcție de raportul 260/280, la care valorile
optime se încadrează între 1,8 și 2, aceste valori determinând o reușită ridicată în cadrul proceselor
de amplificare și secvențiere (Cotovelea et al. 2012). Faptul că și în cazul ADN-ului extras din
35
România
excremente raportul 260/280 s-a situat sub nivelul considerat optim se datorează naturii materialului
biologic din care s-a realizat extracția, material total diferit față de probele biologice directe, clasice,
în care extracția se face din țesuturi, sânge etc. Pe de altă parte, în cazul ADN-ului extras din pene a
rezultat o concentrație mai mare atunci când extracția s-a făcut din artera (calamus) unei pene din
zona cozii (circa 37 ng/µl), însă puritatea a fost cea mai slabă din toate variantele de lucru utilizate.
Tabelul 3. Analiza concentrației și purității probelor

DNA quality and concentration of non-invasive samples
Nr. pobă Tip probă Concentrație ( ng/μl) Puritate (raport 260/280)
Valori medii probe ADN din pene
1 pană 22.3 20.1
2 pană 16.6 10.6
3 pană 12.3 38.6
4 pană 13.6 19.8
5 pană 36.2 50.6
6 pană 20.3 25.6
7 pană 20.3 10.4
8 pană 11.2 10.9
9 pană 12.4 34.5
10 pană 14.1 21.9
11 pană 38.9 81.1
12 pană 21.3 25.4
Valori medii probe ADN din excremente

13 excremente 52.4 2.3
36
România
Ca urmare a rezultatelor obținute din testarea reușitei metodei de izolare, s-a optat pentru
continuarea analizelor doar cu probe de excremente, atât calitatea, cât și cantitatea ADN-ului, dar
mai ales durata și complexitatea procesului de izolare, determinând acest fapt.
Protocolul standard de izolare cu cartușe MaxWell16 prevede utilizarea părții exterioare a

excrementului, ceea ce, în fapt, decurge din localizarea celulelor epiteliale antrenate în procesul
defecației. În acest studiu, îmbunătățirea protocolului a constat în utilizarea a 1ml de etanol din fiola
în care era stocată proba. Modificarea protocolului standard a determinat creșterea reușitei la
izolarea ADN-ului din excremente. Astfel, din 138 de probe introduse în analiză, după verificarea
calității și purității, 137 au fost utilizate în cadrul procesului de amplificare și analiză de fragmente
(Fedorca et. al. 2017 in review).
În alte studii metoda de păstare a probelor a influențat foarte mult reușita extracției (Roeder et
al. 2004), fiind amplificate cu succes 69% din probe după prima repetiție, iar după încă trei repetiții
rata de succes a fost de 99% (Regnaut et al. 2005). În studiul de față, rata de succes după prima
repetiție a fost foarte bună, de 99,3%, nemaifiind necesare alte repetiții. Optimizarea ratei de succes
s-a realizat prin introducerea probelor recoltate de pe sol în etanol 90?º, reușindu-se astfel extragerea
unor cantități ridicate de ADN și de o calitate corespunzătoare, fapt ce demonstrează eficiența
acestei metode. Mai mult decât atât, perioada de păstrare a probelor nu a influențat reușita de izolare
a ADN-ului, așa cum a fost întâlnit în cadrul altor studii (Lucchini et al. 2002; Murphy et al. 2002;
Piggott 2004). Este foarte important de subliniat faptul că s-a reușit extragerea ADN-ului și din
probe păstrate o perioadă de aproximativ 2 ani, la o temperatură de 4oC.
În afară de faptul că introducerea și depozitarea probelor de fecale în etanol asigură o bună
reușită a extracției ADN-ului, această metodă este, totodată, ușor aplicabilă în teren, nemaifiind
necesar ca operatorul să dispună de genți frigorifice, silica gel, etc. care să îngreuneze accesul în
teren, sau să fie condiționat de timpul de păstrare. Mai mult decât atât, perioada mare de păstrare a
probelor facilitează înființarea unei bănci de probe, care pot fi stocate pe termen lung.
37
România
3.2.2 Testarea echilibrului Hardy-Weinberg, a dezechilibrului linkage și identificarea

alelelor nule
Inițial, în analiză au fost testați toți cei 13 markeri genetici prezentați în capitolul 3, însă în
urma lecturării și interpretării electroforegramelor au fost eliminați 4 markeri (TUD4 TUT3 TUD5
TUD), deoarece aceștia nu au furnizat rezultate pentru mai mult de 80% din probe, asigurându-se
astfel o precizie sporită pentru determinările efectuate. Astfel, caracterizarea genetică a populației
autohtone de cocoș de munte a fost făcută cu următorii 9 markeri genetici: TUD7, TUT4, TUD8,
BG15, TUD3, TUT1, TUT2, BG18 și TUD6.
Pentru a testa posibilitatea existenței alelelor nule a fost utilizat programul MICRO-CHEKER
(Van Oosterhout et al. 2004), rezultatele acestuia reflectând faptul că la niciunul dintre cei 9 markeri
analizați nu a fost identificată prezența acestora. Așa cum se știe, o alelă nulă = alelă neamplificată
este o copie a unei gene mutante la un locus care este complet lipsit de funcția normala a genei.
Acest lucru poate fi rezultatul absenței complete a produsului genei (proteine, ARN) la nivel
molecular, sau se poate exprima printr-un produs de genă nefuncțională (de exemplu, poate genera
un efect de epistazie). La nivel fenotipic, o alelă nulă se confundă cu o deleție a întregului locus. De
aceea, existența unor astfel de alele poate denatura rezultatele unei analize de diversitate genetică,
ceea ce nu s-a întâmplat în cazul de față.
Pentru testarea echilibrului Hardy-Weinberg s-a optat pentru împărțirea indivizilor avuți în
analiză în 7 zone geografice, considerate subpopulații: Carpații Orientali (Suceava); Carpații
Orientali (Neamț); Carpații Orientali (Mureș); Carpații Orientali (Harghita); Carpații de Curbură;
Munții Făgăraș; Munții Retezat. S-a optat pentru această împărțire, deoarece zonele geografice din
care au fost prelevate probele sunt despărțite de văi adânci, având habitate improprii existenței
acestei specii, existând posibilitatea ca zonele astfel delimitate să fie relativ izolate unele de altele.
În urma testării echilibrului Hardy-Weinberg a rezultat faptul că, pentru markerii TUD7,
TUD8 și TUT2, diferențele sunt semnificative (p<0,05) pentru toate zonele geografice. Pentru
ceilalți markeri există zone geografice în care aceste diferențe sunt semnificative, dar și zone cu
diferențe nesemnnificative (tabelul 4). Subpopulațiile care au înregistrat pentru cei mai mulți
markeri (8) abateri de la echilibrul Hardy-Weinberg sunt cele din Carpații Orientali (Neamț) și
Munții Retezat, în vreme ce subpopulațiile din Carpații Orientali (Suceava) și Carpații Orientali
(Mureș) prezintă abateri pentru doar 3 markeri. Faptul că pentru unele zone geografice sau pentru
38
România
unii markeri au rezultat abateri de la echilibrul Hardy-Weinberg se poate datora selecției în favoarea
heterozigoților, fiind cel mai probabil o consecință a faptului că subpopulațiile astfel analizate nu
respectă criteriile unei “populații ideale” (lipsa mutațiilor, a fluxului de gene sau selecției, sau
încrucișare randomizată) (Curtu și Șofletea 2009). De asemenea, la nivelul întregii populații au fost
observate abateri semnificative de la echilibrul Hardy-Weinberg, pentru toți markerii analizați.
Acest fapt a fost observat și în studiile efectuate în populația de cocoș de munte din Spania (Alda et
al. 2011) și în cazul a jumătate din cele 18 populații de cocoș de munte din Alpi (Segelbacher &
Storch 2002). Cauzele acestei abateri nu au fost până în prezent bine documentate, mai ales pentru
faptul că acestea se datorează excesului de heterozigoți, care poate fi pus pe seama sistemului de
împerechere (Storz et al. 2001), pe mărimea mică a populației (Pudovkin et al. 1996; Rosewich et
al. 1999; Luijten et al. 2000) sau pe dispersia bazată pe sex (Prout 1981; Segelbacher & Storch
2002).
Tabelul 4. Testarea echilibrului Hardy – Weinberg
Testing the Hardy – Weinberg equilibrium
Locus TUD7 TUT4 TUD8 BG15 TUD3 TUT1 TUT2 BG18 TUD6
Suceava 0.025 0.789 0.025 0.136 0.172 0.528 0.025 0.079 0.475
Neamt 0.000 0.992 0.000 0.000 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000
Harghita 0.001 0.094 0.001 0.745 0.144 0.153 0.006 0.012 0.051
Mures 0.002 0.895 0.002 0.114 0.287 0.124 0.002 0.077 0.629
Curbura 0.014 0.532 0.014 0.025 0.372 0.303 0.008 0.072 0.116
Fagaras 0.000 0.572 0.000 0.000 0.219 0.001 0.000 0.030 0.010
Retezat 0.000 0.079 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.010
România 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Dezechilibrul linkage a fost testat pentru toți markerii folosiți în studiu, pentru cele 7 zone
geografice. Din totalul de 36 de cazuri posibile, utilizând programul GenePOP (Rousset 2008) au
fost identificate 7 situații (tabelul 5) pentru care există o probabilitate semnificativă (p<0,05) ca
acestea să se afle într-un dezechilibru linkage (sub 20% din cazuri). Existența celor mai multe
dezechilibre linkage se constată la nivelul markerilor TUT2 și TUD3.
39
România
Tabelul 5. Testarea dezechilibrului linkage

Testing the linkage disequilibrium
Nr. crt. Marker 1 Marker 2 Semnificație (p<0,05)
1 TUD7 TUD3 0.0229
2 TUT4 TUD3 0.0116
3 BG15 TUT1 0.0008
4 BG15 TUT2 0.0014
5 TUT1 TUT2 0.0263
6 TUT2 BG18 0.0395
7 TUD3 TUD6 0.0034
3.2.3 Structura alelică
Pentru a determina structura alelică a populației de cocoș de munte din România s-au analizat
rezultatele furnizate de programul GeneAlex (Peakall & Smouse 2012), datele structurându-se
pentru numărul de alele identificate, intervalul de variație al acestora și frecvența relativă pentru
fiecare marker în parte. Toți cei 9 markeri analizați au înregistrat polimorfism, în total fiind
identificate 44 de alele.
La nivelul întregii populații analizate, markerul cu cel mare număr de alele a fost TUD6,
acestea fiind în număr de 9, fapt întâlnit și în studiul efectuat pentru caracterizarea acestor markeri
(Segelbacher et al. 2000). Markerul cu cel mai mic număr de alele, două, a fost TUT2, fapt constatat
și în populațiile din Munții Jura (Regnaut et al. 2006a).
În ceea ce privește alte studii desfășurate în Europa, de exemplu în populația de cocoș de
munte din Polonia, numărul de alele a variat între 5 și 14 (Rutkowski et al. 2005), în vreme ce în alte
studii (Elveția și Franța), intervalul a variat între 3 și 17 alele per locus (Regnaut et al. 2006a), sau
între 2 și 12 alele per locus (Germania) (Rösner et al. 2014). Totuși, trebuie remarcat faptul că toate
aceste studii au utilizat un număr diferit de markeri.
Cea mai mare frecvență relativă (0,516) a fost înregistrată la markerul TUT1, pentru alela 220
pb, cea mai mică frecvență (0,004) fiind înregistrată la 4 markeri din totalul de 9 analizați (BG15 –
alela 140, TUT1 – alelele 206 pb, 214 pb, 216 pb și 224 pb, BG18 alela 203 pb și respectiv TUD6 –
alela 205 pb).
Pentru o analiză mai detaliată la nivelul arealului cercetat, pentru fiecare marker s-a determinat
frecvența alelelor pe zone geografice.
40
România
Din figura 14 se constată că în cazul markerului TUT4, în șase din cele șapte zone geografice
delimitate la nivelul României predominantă este alela 126 pb. Excepție face zona de nord a
Carpaților Orientali (Suceava), unde frecvența cea mai mare o deține alela 132 pb. Revenind la alela
126 pb, se constată frecvența ridicată a acesteia în zona de mijloc a Carpaților Orientali (Neamț,
Harghita și Mureș), pentru ca mai la sud, în zona Carpaților de Curbură, să se înregistreze cea mai
mică frecvență relativă a acestei alele. Această situație din Carpații de Curbură rezultă, de fapt, ca
urmare a frecvenței mai mari pe care le înregistrează, comparativ cu celelalte 6 zone geografice,
alele 124 pb, 130 pb și 134 pb.
Astfel, putem concluziona că pentru acest marker, subpopulațiile analizate se poziționează în
trei grupe: prima include zonele din Carpații Orientali (Neamț și Suceava), cea de a două se situează
tot în Carpații Orientali (Mureș și Harghita), iar cea de a treia în Carpații Meridionali, în Munții
Făgăraș și Retezat.
Figura 14. Frecvența relativă a alelelor pe zone geografice la markerul TUT4

Alleles frequencies/geographical zones for TUT4 marker
Prin comparație cu datele din cercetările de față, într-un studiu efectuat în patru populații din
Polonia (Rutkowki et al. 2005), la acest marker au fost identificate, ca și în cazul de față, între 3 și 5
alele/populație, însă prin adăugarea a două populații din Rusia, pe ansamblul arealului cercetat au
fost identificate 7 alele. Pe de altă parte, Regnaut (2004) a rencenzat în Munții Jura un total de 9
alele.
Pentru markerul TUD8, frecvențele alelelor 142 pb și 144 pb au ponderi egale (0,5) în toate
subpopulațiile analizate, cu excepția celei din zona Carpaților Orientali (Neamț), care înregistrează o
frecvență mai ridicată a alelei 144 pb (0,55). O situație aparte a fost identificată în subpopulația din
Munții Retezat, singura zonă unde a fost înregistrată alela 146 pb. Deși această alelă are o frecvență
41
România
relativă scăzută (0,021), nu este exclus ca ea să reprezinte o alelă privată pentru această zonă din
arealul cocoșului de munte în România (figura 15). Pentru a clarifica dacă într-adevăr aceasta este o
alelă privată pentru Munții Retezat, s-ar impune continuarea cerecetărilor pe un eșantion mai mare
de probe din zona respectivă, dar și în areale limitrofe acesteia.
Figura 15. Frecvența alelelor per zone geografice la markerul TUD8

Alleles frequencies/geographical zones for TUD8 marker
Analizând markerul BG15 (figura 16), observăm prezența alelelor 138 pb și 142 pb în toate
populațiile analizate, cu un maxim de frecvență pentru prima alelă în zona Carpaților Orientali
(Suceava) (0,6) și un maxim pentru cea de a doua alelă în zona Neamț (0,52). La fel ca și la
markerul TUD8, subpopulația din Munții Retezat se detașează de toate celelalte, deoarece este
singura care înregistrează prezența a încă două alele, 140 pb și 144 pb, dar frecvența redusă a
acestora (0,011) le încadrează în categoria celor rare. Totodată, o altă alelă rară care a fost recenzată
în Munții Retezat este cea de 146 pb (frecvența relativă de 0,022), care însă se întâlnește și în zonele
Carpaților Orientali (Harghita și Mureș), cu un maxim al frecvenței în ultima zonă (0,056).
Figura 16. Frecvența alelelor per zone geografice la markerul BG15

Alleles frequencies/geographical zones for BG15 marker
Pentru markerul TUD3 (figura 17), alelele 188 pb, 190 pb și 192 pb se regăsesc în toate
zonele analizate, frecvențele acestora variind în funcție de zonă: a treia alelă înregistrează frecvențe
42
România
ridicate în zona Carpaților Orientali (Suceava (0,5), Neamț (0,48) și Harghita (0,5)), cea de a doua,
are frecvențe cuprinse între 0,3 și 0,4 în toate zonele, iar prima înregistrează frecvență maximă în
zona Carpaților de Curbură (0,42). Alela 196 pb este comună subpopulațiilor din zona Carpaților
Orientali (Neamț) (0,05) și Munților Retezat (0,021), aceasta lipsind din celelalte zone analizate.
Subpopulațiile din zona Carpaților Orientali (Neamț) și a Munților Retezat prezintă cel mai mare
grad de polimorfism la acest locus marker, cu câte 5 alele, fiind urmate de cele din Carpații de
Curbură și Munții Făgăraș, cu câte 4 alele.
Frecvența alelelor/zone geografice la markerul TUD3

0.600
0.500
0.400 188
190
0.300
192
0.200 194
0.100 196
0.000
Suc e ava Ne amt Harghita Mure s Curbura Fagaras Re te zat

Analiza markerului TUT1(figura 18) scoate în evidență prezență alelelor rare și private
pentru zona Carpaților de Curbură și cea din Munții Retezat. Astfel, alela 224 pb este o alelă privată
pentru zona Carpaților de Curbură (frecvența acesteia este mai mare de 0,05), iar alelele 206 pb
(0,011), 214 pb (0,011) și 216 pb (0,011) fiind rare pentru zona Munților Retezat. Celelalte alele
identificate pentru acest marker, 208 pb, 212 pb și 220 pb, sunt comune tuturor zonelor analizate.
Frecvența alelelor/zone geografice la markerul TUT1
0.700
0.600
206
0.500
208
0.400 212
0.300 214
0.200 216
220
0.100
224
0.000
Suc e ava Ne amt Har ghita Mur e s Cur bur a Fagar as Re te zat
Figura 18. Frecvența alelelor per zone geografice la markerul TUT1

Alleles frequencies/geographical zones for TUT1 marker
43
România
La markerul BG18 s-a putut identifica alela rară 203 pb, aceasta fiind întâlnită doar în zona
Carpaților Orientali (Neamț) (0,015). Alela 201 pb este frecventă doar în zona Carpaților Orientali
(Neamț) și a Munților Retezat, pe când alela 197 pb este înregistrată în 4 zone: Carpații Orientali
(Neamț (0,106), Harghita (0,091)), Munții Făgăraș (0,048) și Munții Retezat (0,031). Celelalte 3
alele identificate la acest marker (193 pb, 195 pb și 201 pb) sunt comune tuturor subpopulațiilor
analizate, cu excepția alelei 195, care nu este prezentă în zona Carpaților Orientali (Harghita) (figura
19). Polimorfismul prezentat la acest locus marker este similar cu cel identificat în patru populații
din Polonia, între 3 și 5 alele/populație (Rutkowski et al. 2005).
Frecvența alelelor/zone geografice la markerul BG18
0.600
0.500
0.400 191
193
0.300
195
0.200 197
201
0.100
203
0.000
Suc e ava Ne amt Har ghita Mure s Cur bur a Fagaras Re te zat
Figura 19. Frecvența alelelor per zone geografice la markerul BG18

Alleles frequencies/geographical zones for BG18 marker
Markerul TUD6 (figura 20) a înregistrat cel mai mare număr de alele dintre toți cei 9
analizați. Alelele 213 pb (0,031) și 205 (0,016) au fost înregistrate doar în zona Carpaților Orientali
(Neamț), acestea fiind considerate rare pentru această subpopulație. Numărul cel mai mic de alele
(4) a fost înregistrat în zona Carpaților Orientali (Suceava) și a Carpaților de Curbura, pe când
numărul cel mai mare fiind înregistrat în zona Carpaților Orientali (Neamț), această subpopulație
prezentând toate cele 9 alele identificate pentru acest marker.
Frecvența alelelor/zone geografice la markerul TUD6
0.700
0.600
189
0.500
191
193
0.400
195
0.300 197
199
0.200 201
205
0.100 213
0.000
Suce ava Ne amt Harghita Mure s Cur bur a Fagar as Re te zat

44
România
Analiza pentru markerii TUT2 și TUD7 a indicat existența a doua alele pentru fiecare dintre
aceștia, în toate subpopulațiile analizate. Mai mult decât atât, frecvențele acestora au fost
aproximativ egale.
În privința polimorfismului pe ansamblul celor 9 loci marker analizați, polimorfismul cel mai
mare se regăsește în subpopulația din Munții Retezat, care deține 40 din totalul de 44 alele recenzate
pe teritoriul României. Cea mai scăzută diversitate alelică se înregistrează în zona de nord a
Carpaților Orientali (Suceava), cu numai 24 de alele (54,7%) din numărul total rencenzat (figura
21).
Figura 21. Numărul de alele identificate pentru fiecare subpopulație

Number of alleles identified for each subpopulation
Din datele experimentale rezultă că în arealul cercetat au fost identificate în total 10 alele rare,
reprezentând 22,7% din numărul total rencenzat (tabelul 6). Cele mai multe (6) au fost identificate în
subpopulația din Munții Retezat, iar alte trei sunt în Carpații Orientali, în zona Neamț. Un caz aparte
45
România
este cel al alelei 204 de la markerul TUT1, care apare numai în zona Carpaților de Curbură, iar
frecvența relativă a acesteia (8,3%) justifică încadrarea ei ca alelă privată.
Tabelul 6. Alele rare/private în Carpații României
Rare/private allels in Romania Carpathians

Pop Locus Allele Freq
BG18 203 0.015
Neamț TUD6 205 0.016
TUD6 213 0.031
Curbură TUT1 224 0.083
TUD8 146 0.022
BG15 140 0.011
Retezat BG15 144 0.011
TUT1 206 0.011
TUT1 214 0.011
TUT1 216 0.011
În alte studii desfășurate în Europa a fost identificat un număr de 4 alele private în populația de
cocoș de munte din Pădurea Neagră (Segelbacher et al. 2008) și un număr de 21 de alele private în
populația din Alpii Elveției (Jacob 2006), ambele populații fiind amenințate în trecut cu dispariția
din cauza deteriorării habitatului, înregistrând un număr scăzut de exemplare.
3.2.4 Indicii genetici de caracterizare a populației de cocoș de munte din România
3.2.4.1 Indicii genetici pe ansamblul populației
Populațiile unor specii pot avea de suferit ca urmare a reducerii diversității genetice, care
alături de prezența consangvinizării pot afecta procesul reproductiv, dar mai ales capacitatea
acestora de a răspunde la schimbările de mediu, fapt ce poate pe termen lung să ducă la creșterea
riscului de extincție (Keller & Waller 2002; Tallmon et al. 2004; Segelbacher et al. 2008).
În ceea ce privește numărul de alele/locus (tabelul 7), cea mai mare valoare a fost detectată
de la markerul TUD6 (Na=9). Valoarea medie pentru acest parametru, pentru cei 9 markeri analizați,
a fost Na=4,89, o medie mult mai mare față de Na=2,85 întâlnită la populația de cocoș de munte din
46
România
Spania (Rodríguez-Muñoz et al. 2007) și, de asemenea, mai mare cu 7,7% față de Na=4,54
determinată pe ansamblul arealului speciei în Europa (exceptând Spania) (Segelbacher et al. 2003).
Tabelul 7. indicii diversității genetice calculați pentru toate exemplarele analizate

Genetic parameters calculated for all the entire population
Locus AR Na Ne Ho He F
TUD7 2 2 2.000 0.970 0.500 -0.941
TUT4 3 5 2.137 0.484 0.532 0.091
TUD8 2 3 2.027 0.955 0.507 -0.884
BG15 2 5 2.080 0.913 0.519 -0.759
TUD3 3 5 3.153 0.908 0.683 -0.329
TUT1 3 7 2.655 0.946 0.623 -0.517
TUT2 2 2 2.000 0.985 0.500 -0.970
BG18 3 6 2.713 0.926 0.631 -0.466
TUD6 4 9 4.499 0.643 0.778 0.173
Media 2.667 4.889 2.585 0.859 0.586 -0.511
AR - bogăția alelică (allelic richness), Na - numărul de alele per locus, Ne - numărul efectiv de alele, Ho - heterozigoția
observată, He - heterozigoția așteptată, F - indice de fixare.
AR - allelic richness, Na - number of alleles per locus, Ne - effective number of alleles, Ho - observed heterozigosity, He
- expected heterozigosity, F - fixation index.
Heterozigoția observată (Ho=0,859) are valori mai mari decât cele obținute pentru alte
populații de cocoș de munte: Ho=0,66 pentru populațiile din Germania și Italia (Segelbacher et al.
2003); Ho=0,72/0,71 în Alpii de Nord, respectiv Alpii de Sud (Rodríguez-Muñoz et al. 2007); mult
mai mari decât cele obținute în Spania (Ho=0,44) (Alda et al. 2011). Cea mai mare heterozigoție
observată a fost determinată pentru markerul TUT2 (Ho=0,985), respectiv cea mai mică valoare a
fost determinată pentru markerul TUT4 (Ho=0,484). Faptul că heterozigoția observată este mare și
mai ales prin faptul că valorile lui F sunt negative, indică existența unei selecții în favoarea
heterozigoților. Mai mult decât atât, acest rezultat este diferit față de studiile anterioare, care au
arătat faptul că sistemul de împerechere al acestei specii, la care doar o mică parte dintre masculi își
transmit genele, poate determina o creștere a potențialului de consangvinizare (Segelbacher et al.
2007). Rezultatele identificate mai sus se pot datora extragerii exemplarelor mascule de-a lungul
timpului, în sezonul de împerechere, cu o selecție în favoarea exemplarelor dominante, ceea ce a
facilitat în timp șansa la imperechere a cât mai multor exemplare din această categorie genotipică,
47
România
asigurându-se astfel împrospătarea permanentă a schimbului de gene, fapt observat și în Pirinei,

unde în fiecare an s-a identificat o reorganizare a teritoriilor masculilor (Catusse 1993).
În ceea ce privește heterozigoția așteptată (He=0,58), au fost obținute valori apropiate de cele
din studiul efectuat de Segelbacher et al. (2003) în Alpii Bavarezi (He=0,59-0,66), însă diversitatea
genetică este mult mai mare față de valoarea comunicată de Rodríguez-Muñoz et al. (2007) pentru
unele cazuri din Munții Cantabrici (He=0,36), unde sunt populații mici și izolate în care se produce
efectul de consangvinizare (Alda et al. 2011).
Unii autori pun excesul de heterozigoți pe seama unui declin al mărimii populației (Cornuet
& Luikart 1996; Segelbacher 2002) și consideră că este necesar un număr minim de indivizi pentru a
menține diversitatea genetică (Soulé 1987), mai ales în cadrul unui habitat fragmentat, unde este
încă neclar cum percep animalele acest cadru și cum migrează între aceste petice (Cushman et al.
2006; Segelbacher et al. 2008), fapt ce nu poate fi luat în considerare în populația din țara noastră,
care este una continuă și care se găsește într-un habitat nefragmentat.
Bogăția alelică (AR=allelic richness) a fost determinată atât pentru întreaga populație de
cocoș de munte din România, cât și pentru cele 7 zone geografice distincte care au fost separate prin
analiza discontinuităților arealistice determinate geomorfologic-ecologic (tabelul 8). Cea mai mare
bogăție alelică pentru întreaga populație prezintă markerul TUD6 (4,44), iar cea mai mică se
înregistrează la markerii TUD7 și TUT2 (2,0). Bogăția alelică pentru zonele geografice selectate nu
a fost influențată de mărimea numărului de indivizi luați în calcul pentru fiecare zonă în parte.
Astfel, cea mai mare bogăție alelică a fost înregistrată la indivizii localizați în Carpații Orientali
(Neamț), la markerul TUD6 (5,07), iar cea mai mică valoare înregistrată a fost pentru indivizii din
aceeași zonă, la markerul TUT4 (1,54). Comparativ cu alte studii efectuate în Europa, în țara noastră
au fost înregistrate valori mult mai mici decât în studii efectuate în populația din Pădurea Neagră
(AR=4,35) (Segelbacher et al. 2008) și cea din Polonia (AR=4,075) (Rutkowski et al. 2005), valori
aproximativ egale cu cele din populația din Munții Jura (AR=2,78) (Regnaut et al. 2006a), însă mai
mari decât în populația din Munții Cantabrici (AR=2,45) (Rodríguez-Muñoz et al. 2007).
48
România
Tabelul 8. Bogăția alelică (AR) per populație/subpopulații și per locus

Alellic richness (AR) per population/subpopulation and per locus
Marker România Suceava Neamț Harghita Mureș Curbură Făgăraș Retezat
TUD7 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
TUT4 3.19 3.00 1.54 3.16 3.09 4.94 3.38 3.23
TUD8 2.03 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.21
BG15 2.19 2.00 2.00 2.45 2.56 2.00 2.00 2.32
TUD3 3.25 3.00 3.58 2.93 2.93 3.67 3.38 3.26
TUT1 3.08 3.00 2.82 2.85 2.95 3.82 2.91 3.21
TUT2 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
BG18 2.99 3.00 4.05 2.71 2.50 2.93 2.85 2.89
TUD6 4.44 4.00 5.07 4.92 4.09 4.00 4.73 4.28
Total 2.80 2.67 2.78 2.78 2.68 3.04 2.80 2.82
3.2.4.2. Indicii genetici pe regiuni geografice
Parametrii genetici au fost analizați și pentru fiecare regiune geografică în parte, pentru a
surprinde cât mai în detaliu particularitățile fiecărei subpopulații ipotetice, rezultatele fiind
prezentate în tabelul 9.
Tabelul 9. Parametrii genetici calculați pentru fiecare regiune geografică
Genetic parameters calculated for each geographic region
Număr Pop Na Ne Ho He F
exemplare
Carpații 6 Suceava 2.667 2.208 0.800 0.542 -0.507
Orientali 34 Neamț 3.778 2.555 0.836 0.543 -0.557
11 Harghita 3.111 2.437 0.802 0.561 -0.461
11 Mureș 3.000 2.347 0.878 0.559 -0.606
Media/Carpații 62 4.111 2.549 0.835 0.565 -0.506
Orientali
Carpații de 7 Curbură 3.111 2.650 0.911 0.595 -0.587
Curbură
Carpații 21 Făgăraș 3.444 2.564 0.886 0.585 -0.574
Meridionali 47 Retezat 4.444 2.545 0.868 0.589 -0.518
Media/Carpații 68 4.444 2.557 0.872 0.589 -0.531
Meridionali
România 137 4.889 2.585 0.859 0.586 -0.511
Subpopulația cu cel mai mare număr de alele a fost cea din Munții Retezat (Na=4,444), iar
subpopulația cu cel mai mic număr a fost cea din Carpații Orientali (Suceava) (Na=2,667).
49
România
Heterozigoția observată a înregistrat valorile cele mai mari în subpopulația din Carpații de Curbură
(Ho=0,911), valorile cele mai mici fiind observate în subpopulația din Carpații Orientali (Suceava)
(Ho=0,800). În ceea ce privește heterozigoția așteptată, valorile din subpopulațiile analizate sunt
apropiate, cea mai mică valoare fiind înregistrată în subpopulația din Carpații Orientali (Suceava)
(He=0,542), iar cea mai mare în subpopulația din Carpații de Curbură (He=0,595).
Comparând valorile rezultate pe masive muntoase cu valorile rezultate la nivelul întregii
populații analizate, s-a constatat faptul că sunt mai mari în Carpații de Curbură, scăzând atât în
Meridionali, cât și în Orientali, fapt ce poate sugera faptul că subpopulația din Carpații de Curbură,
acționează ca o punte de legătură în Carpați, între indivizii localizați în masive muntoase diferite
existând schimb de gene.
3.2.5 Structura genetică spațială a cocoșului de munte în România
Distanțele genetice Nei între subpopulațiile delimitate după criterii geografice
Distanța genetică Nei este strâns legată/inluențată de alelele private, prezente în

subpopulațiile delimitate. Această distanță are o valoare maximă când fiecare dintre subpopulații
este fixată pentru o altă alelă. Pentru a determina situația în cadrul acestei cercetări s-a analizat
distanța genetică Nei, cu soft-ul GenAlEx (tabelul 10).
Tabelul 10. Distanțe genetice Nei între subpopulații
Nei genetic distance calculated among subpopulations
Subpopulația Suceava Neamț Harghita Mureș Curbură Făgăraș Retezat
Suceava 0.000
Neamț 0.102 0.000
Harghita 0.089 0.044 0.000
Mureș 0.060 0.039 0.023 0.000
Curbură 0.095 0.114 0.121 0.094 0.000
Făgăraș 0.050 0.053 0.038 0.014 0.047 0.000
Retezat 0.045 0.044 0.041 0.016 0.045 0.007 0.000
Matricea distanțelor genetice Nei a indicat faptul că valoarea cea mai mare se regăsește între
indivizii situați în Munții Harghitei și cei din zona Carpaților de Curbură (0.121), urmată de zona
Neamț și zona de Curbură (0,102). Cele mai mici valori au fost înregistrate între zona Făgăraș și
zona Retezat (0,007). Aceste rezultate arată faptul că subpopulațiile sunt variabile, existând alele
diferite în fiecare dintre acestea, fapt sugerat și de prezența alelelor rare și/sau private. Prin
50
România
calcularea distanței genetice Nei între Carpații Meridionali și Carpații Orientali, a rezultat o
apropiere genetică foarte mare între aceștia (Nei = 0,015).
Pentru a evidenția dacă indivizii luați în analiză se constituie în structuri spațiale, cu ajutorul
programului GenAlEx a fost implementat testul Mantel. Nici după această testare, nu există niciun
semnal care să conducă la concluzia că aceștia sunt izolați prin distanță, p=0,509 fiind mult mai
mare decât valoarea prag a semnificației statistice de p=0,005.
Pentru a determina diferențele dintre subpopulații, valorile lui Fst au fost calculate cu ajutorul
programului GENEPop (Rousset 2008). Luând în considerare rezultatele din tabelul 11. valorile lui
Fst calculate pentru cele 7 subpopulații ipotetice analizate sunt mai mici de 0,05, fapt ce indică a
diferențiere genetică mică între acestea. Excepție face valoarea 0,0554 înregistrată între zona
Carpaților de Curbură și zona Neamț a Carpaților Orientali (mai mare față de valoarea prag de 0,05
(Rutkowski et al. 2005)), fapt ce sugerează o diferență moderată dintre aceste două zone (Hartl &
Grant 1997; Segelbacher 2002). Calculul lui Fst între Carpații Orientali și Carpații Meridionali
sugerează o diferențiere foarte mică între indivizii localizați în cele 2 zone (Fst = 0,0064).
Tabelul 11. Calculul valorilor Fst între subpopulațiile analizate

Fst values among subpopulation
Subpopulația Suceava Neamț Harghita Mureș Curbură Făgăraș
Neamț 0.0479
Harghita 0.021 0.0181
Mureș 0.0056 0.0138 -0.0098
Curbură 0.0126 0.0554 0.0388 0.0265
Făgăraș 0.0039 0.028 0.0077 -0.0092 0.002
Retezat 0.003 0.0238 0.0132 -0.0053 0.004 -0.0047
Valorile obținute în acest studiu pentru Fst indică o diferențiere mică între zonele luate în
studiu, arătând faptul că populația din România este una continuă și nefragmentată. Rezultatele
analizelor efectuate în populația din Polonia arată faptul că cea mai mică valoare înregistrată în
această țară între zona Carpaților și zona de est (Munții Sudeți) a fost 0,056 (Rutkowski et al. 2005),
valoare apropiată de cea mai mare valoare întâlnită în populația din țara noastră.
51
România
3.2.6 Testarea multiplicității genotipurilor multilocus
3.2.6.1 Testarea multiplicității genotipurilor multilocus pentru întreaga populație
Pentru a testa individualizarea eventualelor nuclee de cocoș de munte din România s-a rulat
analiza apartenenței genetice cu ajutorul programului STRUCTURE, setul de date pentru verificarea
statistică a rezultatelor introducându-se în programul STRUCTURE HARVESTER. Datele
introduse au cuprins valori ale lui K (numărul ipotetic de populații) de la 1 la 10, fiecare având câte
5 replicații. De aici a rezultat împărțirea populației de cocoș de munte la nivelul zonei analizate în
două nuclee populaționale (figura 22). Analiza dendrogramelor rezultate pentru împărțirea în două,
trei sau mai multe nuclee nu a conferit siguranța rezultatelor obținute. De asemenea, testele de
verificare statistică aplicate pentru rezultatele obținute nu au validat împărțirea în două subpopulații,
analizând cei cei doi parametri (Δk) (figura 23) și logaritmul distribuției valorilor (Ln) (figura 24),
rezultatele nefiind confirmate nici de analiza spațială.
Analiza bayesiană a presupus gruparea indivizilor pe baza genotipurilor multilocus astfel
încât să existe posibilitatea ca fiecare individ analizat să aparțină uneia dintre cele k populații care au
fost predefinite. Așa cum se poate observa din figura 22, aproximativ jumătate din indivizii analizați
au probabilitate de apartenență de peste 80% la clusterul de culoare verde, respectiv cealaltă
jumătate la cel de culoare roșie.
Figura 22. Histogramă utilizând modelul Bayesian pentru K=2, fără a utiliza opțiunea LOCPRIOR
Bayesian histogram for K=2, without LOCPRIOR
52
România
Figura 23. Valorile obținute pentru ΔK Figura 24. Valorile medii ale logaritmului
ΔK values probabilității de estimare a numărului
de subpopulații
Mean of estimated Ln probability of data
Pentru a stabili dacă genotipurile multilocus se distribuie/ localizează geografic după o

anumită legitate, în figura 25 s-a generat harta probabilității de apartenență a fiecărui individ avut în
analiză, utilizând locațiile probelor genetice și rezultatele obținute în urma analizei bayesiene pentru
K=2, cu ajutorul software-ului GIS. Totuși, exemplarele cu probabilitate de apartenență între 40-
60% la unul din cele două genotipuri multilocus sunt puține (circa 12%). Dintre genotipurile
multilocus cu probabilitate de apartenență de peste 60%, ponderea cea mai mare (51%) revine celor
desemnate în histogramă prin culoarea roșie, diferența (37%) revenind genotipului multilocus
desemnat prin culoarea verde. Aceste rezultate sunt concludente în ceea ce privește vizualizarea
apartenenței la subpopulațiile ipotetice de cocoș de munte.
53
România
Figura 25. Locațiile indivizilor cu valorile probabilității de apartenență pentru K=2

Distribution of genetic cluster for K=2
Această analiză a reliefat fapul că indivizii din populația de cocoș de munte din România nu
sunt izolați din punct de vedere genetic, existând flux de gene de-a lungul lanțului carpatic,
infirmând totodată și ipoteza conform căreia populația este divizată.
Pentru o cât mai bună reușită în determinarea numărului de subpopulații de cocoș de munte
din România, au fost efectuate testări și cu ajutorul programului TESS (figura 26), rezultatele
acestuia fiind asemănătoare cu cele generate de programul STRUCTURE, și anume faptul că
populația din România este omogenă (figura 27).
54
România
Figura 26. Probabilitatea de apartenență a indivizilor pentru K=2

utilizând programul TESS
Probability of individuals belonging for K=2 using TESS software
Figura 27. Histogramă obținută cu ajutorul programului TESS

Histogram resulted from TESS software
Analizând valorile pentru ΔK obținute cu ajutorul programului TESS (figura 28), putem
observa faptul că rezultatele sunt similare cu cele ale analizei valorilor ΔK, obținute prin programul
STRUCTURE, numărul de populații suportat de cele 2 modele fiind egal cu 1.
55
România
Figura 28. Valorile pentru ΔK obținute cu ajutorul programului TESS

ΔK resulted from TESS software
Totuși, utilizând programul GENELAND se poate observa faptul că acesta indică prezența a
4 subpopulații de cocoș de munte în România (figura 29 și figura 30). Aceste rezultate pot fi puse pe
seama utilizării în analiză a probelor genetice colectate din locurile de rotit, unde masculii nu
părăsesc aceste locuri; mai mult decât atât, aceștia sunt majoritatea înrudiți între ei (Regnaut et al.
2006a). Acest program sesizează mai degrabă înrudirea genetică dintre masculii din locurile de rotit
de unde au fost colectate probele, decât probabilitatea de existență a 4 subpopulații, sugerând
existența unor structuri familiale la nivelul locurilor de rotit (Segelbacher - comentarii personale).
Figura 29. Probabilitatea de apartenență a indivizilor la 4 sub-populații utilizând

programul GENELAND
Probability of individuals belonging to 4 subpopulations using GENELAND software
56
România
Figura 30. Valorile medii ale logaritmului probabilității de estimare

a numărului de subpopulații utilizând programul GENELAND
Mean of estimated logarithm of probability using GENELAND software
3.2.6.2 Testarea multiplicității genotipurilor multilocus între indivizii proveniți din masive
muntoase diferite
Având în vedere faptul că această specie are habitat favorabil în țara noastră în zonele
muntoase, dar și prin faptul că acestea sunt relativ fragmentate de văi largi cu habitat nefavorabil
speciei, s-a trecut la testarea analizei bayesiene între indivizii luați în studiu, care provin din masive
muntoase diferite.
Au fost analizate comparativ probele biologice provenind din următoarele variante:
- Munții Retezat + Munții Poiana Ruscă versus zona Curburii Carpaților ( Bucegi, Ciucaș și
Munții Întorsurii);
- Munții Retezat + Munții Poiana Ruscă versus Munții Făgăraș;
- Munții Făgăraș versus Munții Harghitei și Munții Gurghiului.
Pentru toate aceste trei situații, din analiza bayesiană nu a rezultat diferențierea de clustere diferite,
rezultând în fiecare caz analizat câte două modele de genotipuri multilocus cu pondere egală. Ca
atare, nu s-a confirmat existența unor diferențe genetice între zonele de areal analizate.
57
România
O altă analiză bayesiană s-a realizat între probele provenind din Carpații Orientali și cele din
Carpații Meridionali. Nici de data aceasta nu au rezultat clustere diferite (figurile 31, 32). În schimb,
cele două modele de genotipuri multilocus nu au mai rezultat în pondere egală, unul dintre ele (cel
marcat prin culoarea verde – vezi figura 31) fiind de departe preponderent, fiind cel specific
Carpaților Meridionali. Mai mult, pentru acesta au rezultat exemplare preponderente cu grad de
apartenență de peste 80%. Acesta este un indiciu pentru a presupune că, totuși, analiza comparativă
a genotipurilor multilocus din areale neînvecinate (Meridionali versus Orientali) prezintă o tendință
de diferențiere față de analiza comparativă a genotipurilor multilocus din areale învecinate (cum ar fi
Munții Făgăraș versus Munții Harghitei împreună cu Munții Gurghiului). Chiar dacă analiza s-a
realizat în ambele moduri (cu LOCPRIOR și fără LOCPRIOR; LOCPRIOR = utilizarea în analiză a
coordonatelor GPS a probelor), rezultatele la nivel diferențierii subpopulațiilor au fost similare.
Figura 31. Histogramă utilizând modelul Bayesian utilizând opțiunea LOCPRIOR

Bayesian histogram with LOCPRIOR Orientali vs. Meridionali
Figura 32. Histogramă utilizând modelul Bayesian fără a utiliza opțiunea LOCPRIOR
Bayesian histogram without LOCPRIOR Orientali vs. Meridionali
58
România
3.2.6.3 Analiza autocorelației spațiale
Migrația indivizilor (dispersia sau fluxul de gene) sunt strâns legate de modificarea
habitatului sub influența factorului antropic, cu consecințe directe asupra conservării populațiilor.
Pentru întelegerea acestora este nevoie să se compare informația genetică a indivizilor cu distanța
geografică la care aceștia se regăsesc (Peakall et al. 2003). În acest scop, s-a utilizat programul
GenALEX (Peakall & Smouse 2012) pentru a estima extinderea spațială și magnitudinea corelației
dintre genotipurile multilocus ale indivizilor în relație cu distanța dintre probe. Acest program
calculează coeficientul multilocus de autocorelație r între genotipurile indivizilor care se încadrează
între anumite clase de distanță, având valori între 1 și -1 și un interval de încredere de 95% (Neville
et al. 2006). Această modalitate de analiză permite identificarea gradului de panmixie în funcție de
distanța dintre locurile din care s-au recoltat probele; atunci când r depășește intervalul determinat
de U și L, rezultă faptul că panmixia a fost limitată, altfel spus gradul de înrudire dintre exemplare
este mai mare decât media gradului de înrudire existent în condiții de panmixie (Curtu și Șofletea
2009).
Rezultatele acestui test au fost vizualizate sub formă de corelograme, testarea fiind făcută în
două moduri. În cadrul primei testări s-a utilizat distanța dintre probe, începând cu o distanță minimă
de 50 km între acestea, până la distanța maximă de 319 km (figura 33). A doua testare s-a realizat
utilizând clase de distanță egale (60 km pentru fiecare interval), care spre deosebire de prima testare
efectuează o testare între 0 și prima valoare a intervalului determinat, pentru a surprinde diferențele
genetice datorate distanțelor geografice (figura 34).
În urma analizei rezultatelor se poate constata faptul că, în cazul în care a fost testată distanța
geografică dintre probe, până la o distanță de circa 110-120 km, r depășește limitele intervalului de
încredere dat de U și L, fapt ce sugerează că încrucișările nu se produc în condiții de panmixie.
Acest rezultat poate avea o explicație în etologia speciei, care determină participarea la împerechere
a exemplarelor mascule cu vârsta de peste 3 ani (Mäki-Petäys et al. 2007), dar și prin faptul că
femelele sunt cele care stabilesc alegerea partenerului, doar cei mai viguroși masculi participând
activ la transmiterea genelor (Saniga 2003). O altă influență în acest rezultat ar putea fi cauzată de
distanța de dispersie a acestei specii, unde a fost determinat un maxim de 70 km (Segelbacher 2002),
distanță ce se află apoximativ la jumătatea distanței în care acest efect se produce. În cazul în care s-
au utilizat distanțe egale între clase, r se află în limitele intervalului dat de către U și L. În urma
59
România
acestei testări nu s-a înregistrat depășirea intervalului de încredere, datorită faptului că distanța
intervalelor nu a depășit distanța maximă de dispersie a acestei specii, acest model explicând cel mai
bine structura spațială a acesteia. Aceste rezultate indică faptul că populația de cocoș de munte
analizată este panmictică (Kimura & Weiss 1964).
Figura 33. Testarea izolării prin distanță utilizând distanța geografică dintre probe (km), unde r -
coeficientul de corelație, U,L limitele de încredere ale intervalului (95%)
Testing the isolation by distance using geographic distances (km), r - correlation coefficient , U,L -
confidence interval
Figura 34. Testarea izolării prin distanță utilizând 5 intervale egale de distanță între probe, unde r -
coeficientul de corelație, U,L limitele de încredere ale intervalului (95%)
Testing the isolation by distance using 6 equal distance clasees, r - correlation coefficient , U,L -
confidence interval
60
România
3.2.6.4 Analiza existenței efectului de „gât de sticlăˮ (eng. Bottleneck) în arealul autohton al
cocoșului de munte
Pentru a testa dacă populația în ansamblul ei sau anumite subpoplații au trecut recent printr-
un gât de sticlă (eng. bottleneck), datele genetice experimentale au fost rulate utilizând programul
BOTTLENECK. Pentru întreaga populație rezultatele furnizate de acesta sunt prezentate în tabelul
12. Se constată că, pentru ansamblul populației valorile S.P.M. și Mode-Shift nu oferă indicii de
existență în trecut a unei congestionări? genetice determinate de reducerea drastică a efectivului
populației, care ar fi favorizat consangvinizarea.
Tabelul 12. Teste pentru identificarea efectului de gât de sticlă pentru întreaga populație
Bottleneck efect testing for the entire population
S.P.M. Mode-Shift
Probabilitate STANDARDIZED DIFFERENCES TEST 0.21771 0.068
WILCOXON TEST 0.32617
SIGN TEST 0.36339
Totuși, atunci când s-a trecut la analiza datelor pe subpopulații delimitate după criteriul
apartenenței la diferite zone geografice (tabelul 13) rezultatele au fost oarecum contradictorii.
Tabelul 13. Teste pentru identificarea efectului de gât de sticlă pentru subpopulații
Bottleneck efect testing for subpopulations
Suceava Neamț Harghita Mureș Curbură Făgăraș Retezat
Probabilitate STANDARDIZED 0.04475 0.12124 0.03951 0.04690 0.00626 0.01298 0.37123
DIFFERENCES TEST
WILCOXON TEST 0.93555 0.82031 0.97559 0.97559 0.99707 0.99023 0.45508
SIGN TEST 0.09809 0.59796 0.06093 0.05188 0.14459 0.35779 0.34623
Astfel, deși analiza testului Wilcoxon și a testului Sign indică faptul că niciuna dintre
subpopulațiile testate nu a trecut printr-un gât de sticlă, ipoteză sugerată și de cercetările desfășurate
pe populațiile din Europa (Segelbacher et al. 2003), totuși cel de-al treilea test indică contrariul
pentru 5 din cele 7 subpopulații. Rezultatele pot fi interpretate ca având cauze petrecute în trecut în
populația de cocoș de munte din țara noastră, datorită unei potențiale reduceri a numărului de
exemplare, fapt sesizat doar de testul de diferențiere standardizat (Duriez et al. 2007). Pe de altă
parte, ar fi plauzibilă și denaturarea rezultatelor ca urmare a numărului mai redus de probe ce revine
subpopulațiilor astfel delimitate.
61
România
CAPITOLUL IV. CONCLUZII FINALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE.
DISEMINAREA REZULTATELOR. DIRECȚII VIITOARE DE CERCETARE
4.1 Concluzii finale

Obiectivul 1. Determinarea habitatului favorabil al speciei în România și identificarea
zonelor de areal cu diferite niveluri de demografie, respectiv a discontinuităților de areal, în
vederea analizei influențelor acestora asupra genofondului speciei;
1. În ceea ce privește determinarea habitatului, cele două metode folosite au furnizat modele
de distribuție al acestuia cu un grad de suportanță mai mare pentru cel realizat cu ajutorul Maxent.
Mărimea suprafeței de buffer de 500 ha, folosită în cadrul primei variante de determinare a
habitatelor, a influențat cel mai mult gradul de suportanță al modelului.
2. Dintre variabilele utilizate pentru determinarea habitatului favorabil, cel mai mare procent
de contribuție l-a înregistrat distribuția molidului, urmat de către altitudine și de temperatura medie a
lunii iunie. Distanțele până la drum, zone locuite sau teren agricol nu au contribuit la construirea
modelului, sugerând faptul că habitatul acestei specii nu este fragmentat.
3. Suprafața habitatului favorabil acestei specii a fost calculată la 1.237.686 ha, utilizând
modelul creat cu ajutorul software-lui Maxent.
Obiectivul 2. Testarea și optimizarea metodelor genetice de izolare și analiză a ADN-

ului, în primul rând prin izolarea din probe recoltate non-invaziv;
1. Extragerea ADN-ului prin metode non-invazive, utilizând cartușele Maxwell, a furnizat

cele mai ridicate valori ale concentrației ADN-ului, mai mult decât atât calitatea acestuia a fost
ridicată. Foarte important de subliniat este faptul că vechimea probelor nu a influențat reușita la
izolare, acest rezultat având implicații directe asupra reducerii costurilor analizelor, facilitând
înființarea unei bănci de probe și stocarea acestora pe termen lung.
62
România
Obiectivul 3. Determinarea indicilor de diversitate genetică pentru populația de cocoș

de munte din România la nivelul ADN-ului nuclear, cu markeri de tipul secvențelor simple
repetitive (SSR) și analiza distribuției spațiale a structurilor genetice în arealul cercetat.
1. În urma analizelor, 4 markerii care nu au furnizat rezultate concludente au fost excluși, iar
testarea în ceea ce privește prezența alelelor nule a celor rămași în analiză a indicat absența
acestora. În consecință, rezultatele obținute prezintă un grad de încredere ridicat și nu sunt
denaturate din cauza prezenței acestor alele.
2. Testarea echilibrului Hardy-Weinberg a indicat o abatere semnificativă pentru 3 dintre

markerii analizați, populația analizată nerespectând criteriile unei populații ideale. Totuși acest
rezultat trebuie interpretat cu precauție, mai ales datorită faptului că nu există informații referitoare
la proporția femelelor și a masculilor avuți în analiză, acest lucru putând determina apariția erorilor
în ceea ce privește reprezentativitatea eșantionului, astfel încât nu s-a avut control asupra apariția
erorilor generate de dispersia diferențiată a sexelor.
3. În ceea ce privește structura alelică a subpopulațiilor analizate, s-a dovedit faptul că în

populația din Retezat se regăsesc cele mai multe alele. În opoziție cu aceasta, cel mai mic număr de
alele a înregistrat subpopulația din Carpații Orientali (Suceava).
4. Cele mai multe alele rare au fost identificate pentru subpopulația din Munții Retezat, în
vreme ce, în subpopulația din Carpații de Curbură, a fost înregistrată o alelă privată.
5. În ceea ce privește heterozigoția observată, valorile mari ale acesteia, sugerează influența
extragerii exemplarelor mascule de-a lungul timpului prin vânătoare, asigurând astfel șansa
participării la împerechere a mai multor indivizi maturi. Totodată aceste valori mari pot sugera și un
declin al populației în trecutul îndepărtat, însă datele prin care s-ar putea verifica această ipoteză
sunt inexistente, această ipoteză necesitând fundamentare inclusiv prin intermediul analizelor ADN-
ului mitocondrial.
6. În ceea ce privește bogăția alelică, populația din România înregistrează valori apropiate de
cele din Munții Jura, mai mici față de cele din Munții Pădurea Neagră și mai mari decât cele din
Munții Cantabrici, în toate aceste studii numărul de markeri nu a fost identic.
63
România
7. Analizând diversitatea genetică a subpopulaților, cea mai mare valoare au înregistrat-o

exemplarele care se regăsesc în Carpații de Curbură. În schimb cea mai mică diversitatea genetică a
prezentat-o populația din Carpații Orientali. De asemenea, exemplarele de cocoș de munte din
România nu sunt izolate datorită distanțelor geografice, rezultat susținut și de valorile mici ale lui Fst
înregistrate între subpopulațiile analizate.
8. Testarea structurii populaționale a scos în evidență faptul că populația de cocoș de munte

din România este omogenă, între indivizii localizați în masive muntoase diferite existând schimb de
informație genetică.
9. Rezultatele analizei autocorelației spațiale obținute prin utilizarea celor două abordări
(distanțe geografice dintre probe și clase de distanțe succesive) au indicat în primul rând că
populația de cocoș de munte analizată este panmictică, fapt care poate fi datorat considerării claselor
de distanțe mai mici decât distanța maximă de dispersie a speciei. Aceasta ipoteză nu a fost susținută
în totalitate de cel de al doilea test aplicat, în care distanța dintre probe a fost mult mai mare decât
distanța de dispersie a speciei, intervalul dat de către U și L fiind depășit doar în primii 110
kilometri.
10. Testarea prezenței efectului de gât de sticlă în populația de cocoș de munte din țara
noastră nu a fost confirmată. Rezultatele unui singur test din cele 3 aplicate pentru anumite
subpopulații (Carpații Orientali (Suceava, Harghita, Mureș), Munții Făgăraș și Carpații de Curbură)
au indicat existența unei potențiale reduceri în trecut a numărului de exemplare, fapt ce se poate
datora mărimii diferite a eșantioanelor utilizate.
4.2 Contribuţii originale

Primul studiu de estimare a diversității genetice nucleare, desfășurat exclusiv într-un
laborator de genetică din România pe specia cocoș de munte.
Primul studiu fundamentat pentru determinarea habitatului favorabil acestei specii în
România.
Primele analize genetice care au utilizat exclusiv metode non-invazive, desfășurat în
România.
64
România
4.3. Diseminarea rezultatelor
Lucrări ISI
1. Cotovelea Ancuța, O.Ionescu Genetic diversity in habituated and wild

N.Sofletea, G.Ionescu, R.Jurj, G. individuals of brown bear (Ursus arctos).
Sirbu, M.Fedorca, A.L. Curtu Annals of Forest Research. 2015. ANN.
FOR. RES. Volume 58, Issue 1. Doi:
10.15287/afr.2015.355
2. Fedorca Mihai, G. Ionescu, E. Different approach to extract DNA from
Ciocîrlan, N. Șofletea, A. Fedorca capercaillie, brown bear and wolf faeces
- the method of automatized DNA
extractor using tissue extraction
cartridges. Conservation Genetics
Resources. 2017. Lucrare trimisă spre
publicare.
Lucrări BDI
1. Mihai Fedorca, G. Ionescu, Iniţierea tehnicilor geneticii
O. Ionescu, A. Cotovelea, N. moleculare în analiza populaţiei de
Şofletea cocoş de munte (Tetrao urogallus) în
România. 2013. Revista de
Silvicultură și Cinegetică. Nr. 33
2. Mihai FEDORCA, G. Determinarea habitatului favorabil

IONESCU, O. IONESCU, A. pentru cocoșul de munte în România.
COTOVELEA, N. ŞOFLETEA, 2014. Revista de Silvicultură și
C. MARIȘ, T. STANCIOIU Cinegetică. Nr. 35.
65
România
3. Mihai FEDORCA Cocoșul de munte (Tetrao urogallus):

istoricul studiilor, statut de conservare,
presiuni și amenințări. 2016. Revista de
Silvicultură și Cinegetică. Nr. 38
Lucrări prezentate în cadrul unor conferințe/manifestări științifice

1. Mihai FEDORCA, A. Assessing the suitable forest habitats
Cotovelea, N. Șofletea, O. for capercaillie in Romania. Forest and
Ionescu, T. Stăncioiu Sustainable Development. Brașov 24-
25 Octombrie 2014. Prezentare
2. Mihai FEDORCA, O. Preferences of lek selection by

Ionescu, G. Ionescu, N. Șofletea, capercaillie in the Romanian
A. Fedorca Carpathians. Forest and Sustainable
Development. Brașov 7-8 Octombrie
2016. Prezentare
3. Mihai FEDORCA, O. Habitat suitability of capercaillie in the

Ionescu, G. Ionescu, N. Șofletea, Romanian Carpathians. Forum
A. Fedorca Carpathicum. București 28-29
Septembrie 2016. Poster.
4.4. Direcții viitoare de cercetare
În ceea ce privește habitatul cocoșului de munte în România, sunt necesare atât studii de
telemetrie prin care să se determine mărimea teritoriului utilizat de către ambele sexe și schimbările
sezoniere care apar în preferința de alegere al acestuia, dar și să valideze distribuția habitatului la
nivelul întregii țări. Mai mult decât atât, sunt necesare studii prin care să se evalueze și să se carteze
distribuția afinului în România, această specie fiind dependentă de prezența acestei componente în
dietă.
În ceea ce privește cercetările genetice, un eșantion mai mare de probe este necesar în
fundamentarea rezultatelor acestei cercetări, dar și elaborarea unui scheme de culegere a datelor care
să permită evaluarea structurilor spațiale care au loc la nivelul locurilor de rotit.
66
România
Totodată este necesar să se întocmească studii genetice diferențiate pe sexe, pentru a

surprinde cât mai exact eventualele diferențe care pot să apară între acestea și să se implementeze
analize de ADN mitocondrial.
Studiile de telemetrie, combinate cu cele genetice pot conduce la obținerea unor rezultate
fundamentate, care să fie utile pentru conservarea și managementul speciei pe termen lung. De
asemenea, desfășurarea unor cercetări simultane cu țările vecine, pot fundamenta măsurile necesare
pentru asigurarea viabilității populațiilor, prin identificarea nucleelor sursă care pot fi utilizate în
cadrul unor potențiale repopulări.
67
România
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Alda F, Sastre P, De La Cruz-Cardiel PJ, Doadrio I (2011) Population genetics of the

endangered Cantabrian capercaillie in northern Spain. Animal Conservation, 14, 249–260.
2. Baines D, Aebischer NJ, Macleod A (2016) Increased mammalian predators and climate
ch1ange predict declines in breeding success and density of Capercaillie tetrao urogallus, an old
stand specialist, in fragmented Scottish forests. Biodiversity and Conservation, 25, 2171–2186.
3. Baines D, Moss R, Dugan D (2004) Capercaillie breeding success in relation to forest habitat
and predator abundance. Journal of Applied Ecology, 41, 59–71.
4. Bajc M, Čas M, Ballian D et al. (2011) Genetic differentiation of the Western Capercaillie
highlights the importance of South-eastern Europe for understanding the species phylogeography.
PloS one, 6, 1–15.
5. Ball MC, Pither R, Manseau M et al. (2007) Characterization of target nuclear DNA from
faeces reduces technical issues associated with the assumptions of low-quality and quantity
template. Conservation Genetics, 8, 577–586.
6. Blanco-Fontao B, Fernández-Gil A, Obeso JR, Quevedo M (2009) Diet and habitat selection
in Cantabrian Capercaillie (Tetrao urogallus cantabricus): ecological differentiation of a rear-edge
population. Journal of Ornithology, 151, 269–277.
7. Bollmann K, Graf RF, Debrunner R, Suter W (2004) The capercaillie as indicator of high
species richness: potential and limitations of the umbrella species concept. In: Landscape ecology of
tree and forest, pp. 200–207.
8. Bollmann K, Graf RF, Suter W (2011) Quantitative predictions for patch occupancy of
capercaillie in fragmented habitats. Ecography, 34, 276–286.
9. Bollmann K, Weibel P, Graf RF (2005) An analysis of central Alpine capercaillie spring
habitat at the forest stand scale. Forest Ecology and Management, 215, 307–318.
10. Braunisch V, Coppes J, Arlettaz R et al. (2013) Selecting from correlated climate variables:
a major source of uncertainty for predicting species distributions under climate change. Ecography,
36, 971–983.
11. Braunisch V, Suchant R (2007) A Model for Evaluating the “Habitat Potential” of a
Landscape for Capercaillie Tetrao urogallus: A Tool for Conservation Planning. Wildlife Biology,
68
România
13, 21–33.
12. Braunisch V, Suchant R (2008) Using ecological forest site mapping for long-term habitat
suitability assessments in wildlife conservation-Demonstrated for capercaillie (Tetrao urogallus).
Forest Ecology and Management, 256, 1209–1221.
13. Brotos L, Thuiller W, Araujo MB, Hirzel AH (2004) Presence-absence versus presence-only
modelling methods for predicting bird habitat suitability. Ecography, 4, 437–448.
14. Čas M (2010) Disturbances and predation on capercaillie at leks in Alps and Dinaric
mountains. Sumarski List, 134, 487–495.
15. Catusse M (1993) Spatial and temporal plasticity of a capercaillie (Tetrao urogallus) arena in
the French Pyrenees. Ethology Ecology & Evolution, 5, 145–156.
16. Chen C, Durand E, Forbes F, François O (2007) Bayesian clustering algorithms ascertaining
spatial population structure: A new computer program and a comparison study. Molecular Ecology
Notes, 7, 747–756.
17. Cornuet JMa, Luikart G (1996) Description and Power Analysis of Two Tests for Detecting
Recent Population Bottlenecks From Allele Frequency Data. Genetics, 144, 2001–2014.
18. Cotovelea A, Sofletea N, Ionescu G, Jurj R, Ionescu O (2012) DNA ISOLATION AND
AMPLIFICATION IN ROMANIAN SPECIES OF WILD ANIMALS. Proceedings of the Biennial
International Symposium, Forest and Sustainable Development, Braş ov, Romania, 19-20th October
2012, 37–42.
19. Cushman SA, McKelvey KS, Hayden J, Schwartz MK (2006) Gene flow in complex
landscapes: testing multiple hypotheses with causal modeling. Wildlife Biology Faculty
Publications, 168, 486–499.
20. Dimcheff DE, Drovetski S V., Mindell DP (2002) Phylogeny of Tetraoninae and other
galliform birds using mitochondrial 12S and ND2 genes. Molecular Phylogenetics and Evolution,
24, 203–215.
21. v Dombrowski RR (1912) Ornis Romaniae. Staatsdr.
22. Drovetski S V (2002) Molecular phylogeny of grouse: individual and combined performance
of W-linked, autosomal, and mitochondrial loci. Systematic biology, 51, 930–945.
23. Duriez O, Sachet J-M, Ménoni E et al. (2007) Phylogeography of the capercaillie in Eurasia:
what is the conservation status in the Pyrenees and Cantabrian Mounts? Conservation Genetics, 8,
69
România
513–526.
24. Elith J, H. Graham C, P. Anderson R et al. (2006) Novel methods improve prediction of
species’ distributions from occurrence data. Ecography, 29, 129–151.
25. Elith J, Phillips SJ, Hastie T et al. (2011) A statistical explanation of MaxEnt for ecologists.
Diversity and Distributions, 17, 43–57.
26. Evanno G, Regnaut S, Goudet J (2005) Detecting the number of clusters of individuals using
the software STRUCTURE: A simulation study. Molecular Ecology, 14, 2611–2620.
27. Fedorca M (2016) COCOȘUL DE MUNTE (TETRAO UROGALLUS): ISTORICUL
STUDIILOR, STATUT DE CONSERVARE, PRESIUNI ȘI AMENINȚĂRI. Revista de
Silvicultura si Cinegetica, 77–80.
28. Fedorca M, Ionescu G, Ionescu O et al. (2015) Determinarea habitatului favorabil pentru
cocoșul de munte în România. Revista de Silvicultura si Cinegetica, 35, 152–154.
29. Fedorca M, Ionescu G, Ionescu O, Cotovelea A, Şofletea N (2013) Iniţierea tehnicilor
geneticii moleculare în analiza populaţiei de cocoş de munte ( Tetrao urogallus ) în România.
Revista de Silvicultura si Cinegetica, 126–128.
30. Fiske P, Rintamaki PT, Karvonen E (1998) Mating success in lekking males: a meta-
analysis. Behavioral Ecology, 9, 328–338.
31. Galbusera P, Dongen S Van, Matthysen E (2000) Cross-species amplification of
microsatellite primers in passerine birds. Conservation Genetics, 1, 163–168.
32. Giles BE (1997) A Case Study of Genetic Structure in a Plant Metapopulation-18.
33. González MA, Olea PP, Mateo-Tomás P et al. (2012) Habitat selection and diet of Western
Capercaillie Tetrao urogallus in an atypical biogeographical region. Ibis, 154, 260–272.
34. Goudet J (1995) FSTAT (Version 1.2): A Computer Program to Calculate F-Statistics.
Journal of Heredity, 86, 485–486.
35. Graf RF (2005) Analysis of Capercaillie Aerial Landscape Scale Using Photographs and
GIS.
36. Graf RF, Bollmann K, Bugmann H, Suter W (2007) Forest and Landscape Structure as
Predictors of Capercaillie Occurrence. Journal of Wildlife Management, 71, 356–365.
37. Graf R, Bollmann K, Sachot S, Suter W, Bugmann H (2006) On the generality of habitat
distribution models: A case study of capercaillie in three Swiss regions. Ecography, 29, 319–328.
70
România
38. Graf RF, Bollmann K, Suter W, Bugmann H (2005) The Importance of Spatial Scale in
Habitat Models: Capercaillie in the Swiss Alps. Landscape Ecology, 20, 703–717.
39. Guillot G (2005) G ENELAND : a computer package for landscape genetics. Molecular
Ecology Notes, 712–715.
40. Guillot G, Renaud S, Ledevin R, Michaux J, Claude J (2012) A Unifying Model for the
Analysis of Phenotypic , Genetic , and Geographic Data. Systematic biology, 61, 897–911.
41. Guo SW, Thompson EA (1992) Performing the Exact Test of Hardy-Weinberg Proportion
for Multiple Alleles. Biometrics, 48, 361–372.
42. Gutierrez R, Barrowclough GF, Groth JG (2000) A classification of the grouse (Aves:
Tetraonindae) based on mitochondrial DNA sequences. Wildlife Biology, 6, 205–211.
43. Hartl DL, Grant A (1997) Principles of Population Genetics.
44. Horváth MB, Martínez-Cruz B, Negro JJ, Kalmár L, Godoy J a. (2005) An overlooked DNA
source for non-invasive genetic analysis in birds. Journal of Avian Biology, 36, 84–88.
45. Jacob G (2006) Conservation Genetics of the Capercaillie (Tetrao urogallus L .) in the Swiss
Alps.
46. Jacob G, Debrunner R, Gugerli F, Schmid B, Bollmann K (2010) Field surveys of
capercaillie (Tetrao urogallus) in the Swiss Alps underestimated local abundance of the species as
revealed by genetic analyses of non-invasive samples. Conservation Genetics, 11, 33–44.
47. Jacquin A, Chéret V, Denux J-P et al. (2005) Habitat suitability modelling of Capercaillie
(Tetrao urogallus) using earth observation data. Journal for Nature Conservation, 13, 161–169.
48. Keller LF, Waller DM (2002) Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology and
Evolution, 17, 230–241.
49. Kimura M, Weiss G (1964) THE STEPPING STONE MODEL OF POPULATION
STRUCTURE AND THE DECREASE OF GENETIC CORRELATION WITH DISTANCE.
Genetics, 561–576.
50. Klemm, W.; Kohl, St (1988) Die Ornis Siebenburgens. Bd. 3, Ed. Bohlau, Koln, Wien.
51. Kortland K (2006) Forest Management for Capercaillie.
52. Kumar L, Skidmore AK, Knowles E (1997) Modelling topographic variation in solar
radiation in a GIS environment. International Journal of Geographical Information Science, 11,
475–497.
71
România
53. Kurki S, Linden H (1995) Forest fragmentation due to agriculture affects the reproductive
success of the ground-nesting black grouse Tetrao tetrix. Ecography, 18, 109–113.
54. Linția, D (1955) Păsările din R.P.R., vol. II. Editura Acad. R.P.R., București.
55. Lucchini V, Fabbri E, Marucco F et al. (2002) Noninvasive molecular tracking of colonizing
wolf (Canis lupus) packs in the western Italian Alps. Molecular Ecology, 11, 857–868.
56. Ludwig T, Storch I, Gärtner S (2009) Large-scale land use change may explain bird species
declines in semi-natural areas: the case of Black Grouse population collapse in Lower Saxony,
Germany. Journal of Ornithology, 150, 871–882.
57. Luijten SH, Dierick A, Gerard J et al. (2000) Society for Conservation Biology Population
Size , Genetic Variation , and Reproductive Success in a Rapidly Declining , Self-Incompatible
Perennial ( Arnica montana ) in the Netherlands Published by : Wiley for Society for Conservation
Biology Stable URL. , 14, 1776–1787.
58. Mäki-Petäys H, Corander J, Aalto J et al. (2007) No genetic evidence of sex-biased dispersal
in a lekking bird, the capercaillie (Tetrao urogallus). Journal of evolutionary biology, 20, 865–73.
59. Miettinen J, Helle P, Nikula A, Niemelä P (2010) Capercaillie (Tetrao urogallus) Habitat
Characteristics in North-Boreal Finland. Silva Fennica, 44, 235–254.
60. Morin P a, Moore JJ, Chakraborty R et al. (1994) Kin selection, social structure, gene flow,
and the evolution of chimpanzees. Science, 265, 1193–1201.
61. Moss R, Oswald J, Baines D (2001) Climate change and breeding success: decline of the
capacaillie in Scotland. Journal of Animal Ecology, 70, 47–61.
62. Murphy MAMA, Waits LPLP, Kendall KCKC et al. (2002) An evaluation of long-term
preservation methods for brown bear (Ursus arctos) faecal DNA samples. Conservation Genetics, 3,
435–440.
63. Neville HM, Isaak DJ, Dunham JB, Thurow RF, Rieman BE (2006) Fine-scale natal homing
and localized movement as shaped by sex and spawning habitat in Chinook salmon: Insights from
spatial autocorrelation analysis of individual genotypes. Molecular Ecology, 15, 4589–4602.
64. Norris D (2014) Model thresholds are more important than presence location type :
Understanding the distribution of lowland tapir ( Tapirus terrestris ) in a continuous Atlantic forest
of southeast Brazil. Tropical Conservation Science, 7, 529–547.
65. Van Oosterhout C, Hutchinson WF, Wills DPM, Shipley P (2004) MICRO-CHECKER:
72
România
Software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology
Notes, 4, 535–538.
66. Pagel MD (2002) Encyclopedia of evolution.
67. Pakkala T, Pellikka J, Lindén H (2003) Capercaillie Tetrao urogallus - A good candidate for
an umbrella species in taiga forests. Wildlife Biology, 9, 309–316.
68. Peakall R, Ruibal M, Lindenmayer DB (2003) Spatial autocorrelation analysis offers new
insights into gene flow in the Australian bush rat, Rattus fuscipes. Evolution; international journal
of organic evolution, 57, 1182–1195.
69. Peakall R, Smouse PE (2012) GenALEx 6.5: Genetic analysis in Excel. Population genetic
software for teaching and research-an update. Bioinformatics, 28, 2537–2539.
70. Pérez T, Vázquez JF, Quirós F, Domínguez A (2011) Improving non-invasive genotyping in
capercaillie (Tetrao urogallus): redesigning sexing and microsatellite primers to increase efficiency
on faeces samples. Conservation Genetics Resources, 3, 483–487.
71. Phillips SJ, Anderson RP, Schapire RE (2006) Maximum entropy modeling of species
geographic distributions. Ecological Modelling, 190, 231–259.
72. Picozzi N, Moss R, Kortland K (1999) Diet and survival of capercaillie Tetrao urogallus
chicks in Scotland. Wildlife Biology, 5, 11–23.
73. Piertney SB, Hoglund J (2001) Polymorphic microsatellite DNA markers in black grouse (
Tetrao tetrix ). Molecular Ecology Notes, 1, 303–304.
74. Piggott MP (2004) Effect of sample age and season of collection on the reliability of
microsatellite genotyping of faecal DNA. Wildlife Research, 31, 485.
75. Piry S, Luikart G, Cornuet JM (1999) Computer note. BOTTLE- NECK: a computer
program for detecting recent reductions in the effective size using allele frequency data. Journal of
Heredity, 90, 502–503.
76. Pritchard JK, Stephens M, Donnelly P (2000) Inference of population structure using
multilocus genotype data. Genetics, 155, 945–959.
77. Prout T (1981) A note on the island model with sex dependent migration. Theoretical and
Applied Genetics, 59, 327–332.
78. Pudovkin AI, Zaykin D V., Hedgecock D (1996) On the potential for estimating the effective
number of breeders from heterozygote-excess in progeny. Genetics, 144, 383–387.
73
România
79. Quevedo M, Bañuelos MJ, Sáez O, Obeso JR (2006) Habitat selection by Cantabrian
capercaillie Tetrao urogallus cantabricus at the edge of the species’ distribution. Wildlife Biology,
12, 267–276.
80. Regnaut S (2004) Population genetics of Capercaillie (Tetrao urogallus) in the Jura and the
Pyrenees : a non-invasive approach to avian conservation genetics.
81. Regnaut S, Christe P, Chapuisat M, Fumagalli L (2006a) Genotyping faeces reveals
facultative kin association on capercaillie’s leks. Conservation Genetics, 7, 665–674.
82. Regnaut S, Lucas FS, Fumagalli L (2006b) DNA degradation in avian faecal samples and
feasibility of non-invasive genetic studies of threatened capercaillie populations. Conservation
Genetics, 7, 449–453.
83. De Reu J, Bourgeois J, Bats M et al. (2013) Application of the topographic position index to
heterogeneous landscapes. Geomorphology, 186, 39–49.
84. Roberge J, Angelstam PER (2004) Usefulness of the Umbrella Species Concept.
Conservation Biology, 18, 76–85.
85. Rodríguez-Muñoz R, Mirol PM, Segelbacher G, Fernández A, Tregenza T (2007) Genetic
differentiation of an endangered capercaillie (Tetrao urogallus) population at the Southern edge of
the species range. Conservation Genetics, 8, 659–670.
86. Roeder AD, Archer FI, Poinar HN, Morin P a. (2004) A novel method for collection and
preservation of faeces for genetic studies. Molecular Ecology Notes, 4, 761–764.
87. Rosewich UL, Pettway RE, McDonald BA, Kistler HC (1999) High levels of gene flow and
heterozygote excess characterize Rhizoctonia solani AG-1 IA (Thanatephorus cucumeris) from
Texas. Fungal genetics and biology, 28, 148–59.
88. Rösner S, Brandl R, Segelbacher G, Lorenc T, Müller J (2014) Noninvasive genetic
sampling allows estimation of capercaillie numbers and population structure in the Bohemian
Forest. European Journal of Wildlife Research, 60, 789–801.
89. Rousset F (1997) Genetic Differentiation and Estimation of Gene Flow from FStatistics
Under Isolation by Distance. Genetics, 145, 1219–1228.
90. Rousset F (2008) GENEPOP’007: A complete re-implementation of the GENEPOP software
for Windows and Linux. Molecular Ecology Resources, 8, 103–106.
91. Rutkowski R, Niewęgłowski H, Dziedzic R, Kmieć M, Goździewski J (2005) Genetic
74
România
Variability of Polish Population of the Capercaillie Tetrao urogallus. Acta Ornithologica, 40, 27–34.
92. Sachot S (2002) Viability and management of an endangered capercaillie (Tetrao urogallus)
metapopulation. Universite de Lausanne.
93. Salmen H., (1980/82) Die Ornis Siebenburgens. Bd. 1, Ed. Bohlau, Koln, Wien.
94. Saniga M (2003) Ecology of the capercaillie ( Tetrao urogallus ) and forest management in
relation to its protection in the West Carpathians. Journal of Forest Science, 49, 229–239.
95. Segelbacher G (2002) Genetic structure of capercaillie populations : a non-invasive approach
at multiple spatial scales.
96. Segelbacher G, Hoglund J, Storch I (2003) From connectivity to isolation: genetic
consequences of population fragmentation in capercaillie across Europe. Molecular Ecology, 12,
1773–1780.
97. Segelbacher G, Manel S, Tomiuk J (2008) Temporal and spatial analyses disclose
consequences of habitat fragmentation on the genetic diversity in capercaillie (Tetrao urogallus).
Molecular ecology, 17, 2356–67.
98. Segelbacher G, Paxton R, Steinbrueck G, Trontelj P, Storch I (2000) Characterization of
microsatellites in capercaillie Tetrao urogallus. Molecular Ecology, 9, 1934–1935.
99. Segelbacher G, Piertney S (2007) Phylogeography of the European capercaillie (Tetrao
urogallus) and its implications for conservation. Journal of Ornithology, 148, 269–274.
100. Segelbacher G, Storch I (2002) Capercaillie in the Alps : genetic evidence of
metapopulation. Molecular Ecology, 11, 1669–1677.
101. Segelbacher G, Wegge P, Sivkov A V., Höglund J (2007) Kin groups in closely spaced
capercaillie leks. Journal of Ornithology, 148, 79–84.
102. Simon Dieter (2010) Păsările de interes cinegetic din România. Editura Universității
Transilvania din Brașov.
103. Smouse PE, Peakall R, Gonzales E (2008) A heterogeneity test for fine-scale genetic
structure. Molecular Ecology, 17, 3389–3400.
104. Soulé ME (1987) Viable populations for conservation. Cambridge university press.
105. Storch I (1993a) Habitat selection by capercaillie in summer and autumn: Is bilberry
important? Oecologia, 93, 257–265.
106. Storch I (1993b) Habitat selection by capercaillie in summer and autumn: Is bilberry
75
România
important? Oecologia, 95, 257–265.

107. Storch I (1993c) Patterns and strategies of winter habitat selection in alpine capercaillie.
Ecography, 16, 351–359.
108. Storch I (1994) Habitat and survival of capercaillie Tetrao urogallus nests and broods in the
Bavarian alps. Biological Conservation, 70, 237–243.
109. Storch I (1995) Annul home ranges and spacing patterns of capercaillie in central europe.
Journal of Wildlife Management, 52, 392–400.
110. Storch I (2007) Conservation Status of Grouse Worldwide: An Update. Wildlife Biology, 13,
5–12.
111. Storz JF, Bhat HR, Kunz TH (2001) Genetic consequences of polygyny and social structure
in an indian fruit bat, Cynopterus sphinx. I. Inbreeding, outbreeding, and population subdivision.
Evolution, 55, 1215–1223.
112. Suchant R (2002) Die Entwicklung eines mehrdimensionalen Habitatmodells für
Auerhuhnareale (Tetra urogallus L.) als Grundlage für die Integration von Diversität in die
Waldbaupraxis.
113. Summers RW, Green RE, Proctor R et al. (2013) An experimental study of the effects of
predation on the breeding productivity of capercaillie and black grouse. Journal of Applied Ecology,
41, 513–525.
114. Suter W, Graf RF, Hess R (2002) Capercaillie (Tetrao urogallus) and Avian Biodiversity:
Testing the Umbrella-Species Concept. Conservation Biology, 16, 778–788.
115. Taberlet P, Bouvet J (1994) Mitochondrial DNA polymorphism, phylogeography, and
conservation genetics of brown bear Ursus arctis in Europe. The Royal Society, 255, 195–200.
116. Taberlet P, Luikart G (1999) Non-invasive genetic sampling and individual identification.
Proceedings of the Royal Society of London, 68, 41–55.
117. Tallmon DA, Luikart G, Waples RS (2004) The alluring simplicity and complex reality of
genetic rescue. Trends in Ecology and Evolution, 19, 489–496.
118. Thiel D, Jenni-Eiermann S, Braunisch V, Palme R, Jenni L (2008) Ski tourism affects habitat
use and evokes a physiological stress response in capercaillie Tetrao urogallus: A new
methodological approach. Journal of Applied Ecology, 45, 845–853.
119. Wasser SK, Houston CS, Koehler GM, Cadd GG, Fain SR (1997) Techniques for application
76
România
of faecal DNA methods to field studies of Ursids. Molecular ecology, 6, 1091–7.

120. Wegge P, Rolstad J (1986) Size and spacing of capercaillie leks in relation to social behavior
and habitat. Behavioral Ecology and Sociobiology, 19, 401–408.
121. http://www.planetofbirds.com/galliformes-phasianidae-capercaillie-tetrao-urogallus
122. http://www.iucnredlist.org/details/full/22679487/0
123. http://ec.europa.eu/environment/nature/conservation/wildbirds/threatened/t/tetrao_urogallus_en.h
tm
77

Rezumat Teza de Doctorat Mihai FEDORCA

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Rezumat Teza de Doctorat Mihai FEDORCA

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Investeşte în oameni!

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Universitatea Transilvania din Brasov

Ing. Mihai Bogdan FEDORCA

Rezumatul tezei de doctorat

MINISTERUL EDUCATIEI NATIONALE

PRESEDINTE: Prof.univ.dr.ing. Ovidiu IONESCU

Capitolul I. Stadiul actual al cunoștințelor ......................................................................................... 10

1.1. Sistematica și istoricul speciei. Încadrarea taxonomică ..............................................................................10

1.2. Arealul cocoșului de munte .........................................................................................................................11

1.2.1. Situația cocoșului de munte la nivel mondial ......................................................................................11

1.2.2 Situația cocoșului de munte în România ...............................................................................................12

1.3. Morfologia, ecologia și etologia speciei......................................................................................................13

1.3.2. Habitat și dietă ......................................................................................................................................14

1.3.3. Locuri de rotit și alegerea partenerului.................................................................................................15

1.4. Istoricul cercetărilor genetice ......................................................................................................................16

1.4.1. Studii efectuate pe probe provenite din România.................................................................................16

1.4.2. Studii efectuate în Europa ....................................................................................................................16

1.4.3. Evoluția studiilor genetice ....................................................................................................................16

1.5. Statutul de conservare al speciei .................................................................................................................17

1.6. Presiuni și amenințări asupra speciei...........................................................................................................17

CAPITOLUL II. SCOPUL, OBIECTIVELE CERCETĂRILOR ȘI METODELE DE LUCRU 19

2.1 Scopul și obiectivele cercetărilor ................................................................................................................19

2.2 Material și metode de cercetare ...................................................................................................................20

2.2.1 Localizarea studiului .............................................................................................................................20

2.2.2 Materialul și metodele de cercetare ......................................................................................................20

2.2.2.1. Materialul și metodele de lucru utilizate pentru obiectivul 1 ..................................................21

2.2.2.2 Materialul și metodele de cercetare pentru obiectivele 2 și 3 ..................................................23

CAPITOLUL III. REZULTATE ȘI DISCUȚII................................................................................. 27

3.2.1 Testarea și optimizarea metodelor de izolare și analiză a ADN-ului ....................................................35

3.2.3 Structura alelică .....................................................................................................................................40

3.2.4.1 Indicii genetici pe ansamblul populației .........................................................................................46

3.2.4.2. Indicii genetici pe regiuni geografice ............................................................................................49

3.2.5 Structura genetică spațială a cocoșului de munte în România...............................................................50

3.2.6 Testarea multiplicității genotipurilor multilocus ...................................................................................52

3.2.6.1 Testarea multiplicității genotipurilor multilocus pentru întreaga populație ...................................52

3.2.6.3 Analiza autocorelației spațiale........................................................................................................59

CAPITOLUL IV. CONCLUZII FINALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE. DISEMINAREA

4.1 Concluzii finale ............................................................................................................................................62

4.2 Contribuţii originale .....................................................................................................................................64

4.3. Diseminarea rezultatelor..........................................................................................................................65

4.4. Direcții viitoare de cercetare .......................................................................................................................66

Chapter I. State of the art..................................................................................................................... 10

1.1. Systematic and historic of the species .........................................................................................................10

1.2. Capercaillie distribution ............................................................................................................................111

1.2.1. Capercaillie worldwide status............................................................................................................111

1.2.2 Capercaillie status in Romania ..........................................................................................................122

1.3. Species morphology, ecology and ethology ..............................................................................................133

1.3.1. Morphology ........................................................................................................................................133

1.3.2. Habitat and diet ..................................................................................................................................144

1.3.3. Leks and mate choice .........................................................................................................................155

1.3.4. Reproduction ......................................................................................................................................155

1.4. History of genetic studies ..........................................................................................................................165

1.4.1. Studies of samples from Romania ........................................................................................................15

1.4.2. Studies conducted in Europe ................................................................................................................16

1.4.3. Genetic studies evolution .....................................................................................................................16

1.5. Conservation status of the species ...............................................................................................................16

1.6. Threats and presures ....................................................................................................................................17

CHAPTER II. AIM, RESEARCH OBJECTIVES AND RESEARCH METHODS ...................... 18

2.1 Aim and research objectives........................................................................................................................18

2.2 Research material and methods ...................................................................................................................19

2.2.1 Study area ..............................................................................................................................................19

2.2.2 Research material and methods ............................................................................................................19