Sunteți pe pagina 1din 233

CUPRINS

Prefaţă
INTRODUCERE ………………………………………….........……………………………………...……...10

CAPITOLUL 1. CARACTERIZAREA PRINCIPALELOR ŢINTE ALE ACŢIUNII ANTIBIOTICELOR DIN


STRUCTURA CELULEI BACTERIENE
1.1. Peretele celular... .................................................................................................................. .......11
1.2. Spaţiul periplasmic.......................................................................................................................15
1.3. Membrana citoplasmatică............................................................................................ ...............15
1.4. Nucleoidul......................................................................................................................................20
1.5. Ribosomii ......................................................................................................................................23
1.6. Sporul bacterian.......................................................................................................................... .24
1.7. Glicocalixul ...................................................................................................................................26
1.8. Flagelul ..........................................................................................................................................28
1.9. Fimbriile ........................................................................................................................................29
1.10. Pilii ...............................................................................................................................................30
Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 2. ANTISEPTICE SI DEZINFECTANTE


2.1. Substanţe antibacteriene active prin inducerea unor modificări de permeabilitate...............39
2.2. Substanţe care acţionează prin denaturarea proteinelor ........................................ .................40
2.3. Substanţe care acţionează prin interferenţă cu grupările active ale proteinelor-enzime ......42
2.4. Coloranţi antiseptici .....................................................................................................................45
2.5. Agenţi sterilizanţi în fază de vapori ............................................................................................46
2.6. Rezistenţa microorganismelor la acţiunea antisepticelor si dezinfectantelor..........................46
2.7. Evaluarea potenţialului antibacterian al agenţilor chimici ......................................................47
Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 3. AGENŢI CHIMIOTERAPEUTICI DE SINTEZĂ ..........................................................49


3.1. Agenţi chimioterapeutici activi prin inhibiţie competitivă .......................................................53
3.2. Agenţi chimioterapeutici activi prin inhibiţia replicării ADN: quinolone...............................53
3.3. Alţi agenţi chimioterapeutici de sinteză .....................................................................................56
Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 4. ANTIBIOTICELE- CARACTERIZARE GENERALĂ..............................................… 60


4.1. Antibioticele – metaboliţi secundari ....................................................................................... ...61
4.2. Biosinteza antibioticelor ........................................................................................................ .....64
4.3. Clasificarea antibioticelor în funcţie de structura chimică ......................................................72
4.4. Clasificarea antibioticelor în funcţie de mecanismele de acţiune ............................................73
4.5. Determinismul genetic al rezistenţei microorganismelor la antibiotice...................................85
4.6. Mecanismele moleculare ale rezistenţei microoganismelor la antibiotice...............................93
4.7. Sisteme de eflux multiplu dependente de forta proton-motrice ...............................................95
Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 5. CARACTERIZAREA PRICIPALELOR CLASE DE ANTIBIOTICE ........................102


5.1. Aminoglicozidele ………………………………………………………………………….........102
5.2. Tetraciclinele ...............................................................................................................................110
5.3. Macrolidele, Lincosamidele şi Streptograminele (MLS)..........................................................118
5.4. Antibioticele β-lactamice ............................................................................................................121
5.5. Antibioticele polipeptidice...........................................................................................................129
5.6. Antibioticele glicopeptidice şi lipoglicopeptidice.......................................................................132
5.7. Antibiotice polichetidice ..............................................................................................................136
5.8. Cloramfenicolul ............................................................................................................................139
5.9. Novobiocina ................................................................................................... ............................141
5.10. Rifamicinele.................................................................................................................................142
5.11. Acidul fusidic ...............................................................................................................................143
Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 6. DETERMINAREA SPECTRULUI DE SENSIBILITATE LA ANTIBIOTICE A SPECIILOR


MICROBIENE. ANTIBIOGRAMA …...............................................................….………............................145
6.1. Metode calitative de determinare a spectrului de sensibilitate la antibiotice ………........………145
6.2. Metode cantitative de determinare a valorii C.M.I. ………………………………………...……..146

1
6.3. Controlul de calitate în testarea sesibiltăţii la antibiotice .............................................................147
6.4. Aplicaţii practice ale citirii interpretative în evidenţierea fenotipică a diferitelor mecanisme
de rezistenţă la principalele specii microbiene de interes clinic .........................................................151
6.5. Metode fenotipice calitative şi cantitative de evideniere a beta-lactamazelor ............................160
6.6. Fenotipuri de rezistenţă la alte antibiotice la bacterii de importanţă clinică..............................174
Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 7. INTERACŢIUNILE FARMACOLOGICE ALE ANTIBIOTICELOR ......................175


7.1. Sinergismul ........................................................................................................................................175
7.2. Blocarea secvenţială a căilor de sinteză ..........................................................................................176
7.3. Efectele defavorabile ale administrării antibioticelor ...................................................................177
7.4. Pătrunderea a antibioticelor în ţesuturi..........................................................................................178
Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 8. SUBSTANŢE NATURALE CU ACTIVITATE IMUNOSPURESOARE .................184


8.1. Ciclosporina .....................................................................................................................................184
8.2. Tacrolimus (FK506) .........................................................................................................................186
8.3. Rapamicina .......................................................................................................................................187
8.4. Micofenolat-mofetil (MMF) ............................................................................................................188
Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 9. BACTERIOCINELE .........................................................................................................191


9.1. Clasificarea bacteriocinelor ……………………………………………………………………...192
9.2. Sinteza bacteriocinelor …………………………………………………………………………....193
9.3. Imunitatea bacteriilor faţă de bacteriocinele endogene ………………………………………...194
9.4. Mecanisme de acţiune a bacteriocinelor ……………………..…………………………………..195
Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 10. AGENŢI TERAPEUTICI AI INFECŢIILOR FUNGICE ..........................................198


10.1. Tipuri de infecţii fungice ................................................................................................................198
10.2. Medicamentele antifungice ............................................................................................................199
10.3. Rezistenţa fungilor la medicamente ..............................................................................................207
Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 11. AGENŢI TERAPEUTICI AI INFECŢIILOR PRODUSE DE PROTOZOARE .....209


11.1. Agenţi terapeutici ai giardiozei.......................................................................................................209
11.2. Agenţi terapeutici ai infecţiilor produse de Trichomonas vaginalis …………………………...212
11.3. Agenţi terapeutici antimalarici ......................................................................................................214
Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 12. AGENŢI TERAPEUTICI AI INFECŢIILOR VIRALE .............................................219


12.1. Analogii nucleozidelor ................................................................................................................ ...219
12.2. Amine ciclice.....................................................................................................................................223
12.3. Inhibitori ai sintezei proteinelor virale: methisazone ..................................................................224
12.4. Foscarnet ........................................................................................................................................225
12.5. Terapia infecţiei cu HIV .................................................................................................................225
12.6. Imunizarea pacienţilor SIDA .........................................................................................................228
12.7. Rolul mutaţiilor în variabilitatea ribovirusurilor. Fenomenul de rezistenţă ............................229
Bibliografie selectivă........................................................................................................................................

2
PREFAŢĂ

Sinteza monografică Antibiotice şi substanţe chimioterapeutice antimicrobiene răspunde unei cerinţe


de informare şi cunoaştere a unor aspecte de ordin teoretic şi practic, cu privire la organismele producătoare
de antibiotice, mecanismele celulare şi moleculare ale actiunii antibioticelor, precum şi riscurile imediate sau
potenţiale pentru sănătatea organismului uman pe care le implică administrarea nejustificată a
medicamentelor din clasa antibioticelor şi agenţilor chimioterapeutici. În acest sens, lucrarea propusă spre
publicare este prima încercare din literatura ştiinţifică biologică din România, de a reuni într-un ansamblu
conceptual unitar, prezentarea unui grup de substanţe foarte heterogene care au în comun efectul inhibitor
asupra creşterii microorganismelor si multiplicarii virusurilor.
Cartea, bogat ilustrată, reuneşte problemele multiple ale domeniului, referitoare la structura chimică
a diferiţilor agenţi antimicrobieni de biosinteză şi de chimiosinteză, a mecanismelor de acţiune asupra
microorganismelor patogene, dar şi a mecanismelor de rezistenţă pe care microorganismele o dobândesc
consecutiv contactului prelungit cu agentul terapeutic, prin selecţia tulpinilor care au devenit rezistente prin
evenimente mutaţionale unice sau multiple sau consecutiv dobândirii unei gene de rezistenţă.
Elaborarea acestei monografii este o reflectare a interesului major al unui număr important de
specialişti faţă de fenomenul antibiozei în general, dar şi al interesului public, în special faţă de problemele
concrete ale administrării antibioticelor şi consecinţele, adeseori nefaste, opuse celor aşteptate. Cunoaşterea
principiilor generale ale acţiunii antibioticelor şi substanţelor chimioterapeutice antimicrobiene este
oportună pentru oricare biolog modern – indiferent de domeniul său de specialitate – ca şi pentru biochimist,
genetician, medic uman sau veterinar, agronom, cercetător în industria de biosinteză etc.
Monografia Antibiotice şi substanţe chimioterapeutice antimicrobiene nu oferă reţete pentru
tratamentul infecţiilor produse de microorganisme. Acest fapt nu este posibil, deoarece, în pofida practicii
cvasigeneralizate de a lua antibiotice, administrarea lor trebuie să fie precedată în mod obligatoriu de
izolarea agentului infecţios şi de evaluarea gradului de sensibilitate/rezistenţă la principalele antibiotice de
uz farmaceutic ! Pentru aceasta există acum ghiduri de utilizare a antibioticelor! Numai astfel va fi posibil
refluxul mării de antibiotice în care trăim şi va fi posibilă reducerea presiunii selective asupra
microorganismelor rezistente, a căror proporţie a crescut constant şi a atins un nivel îngrijorător!
Această lucrare este rodul unei bogate experienţe profesionale acumulată de autori, cadre didactice
ale Universităţii din Bucureşti, coordonate de prof. dr. Gr. Mihăescu. Apreciem că lucrarea, prin conţinutul
său ştiinţific modern, prin prezentarea ştiinţifică accesibilă şi atrăgătoare, va stârni interesul nu numai al
specialiştilor de profil (biologi şi medici), ci şi al celor care doresc să înţeleagă secretele acţiunii pastilei
magice, al cărei concept elaborat de P. Ehrlich (1904), s-a situat în centrul atenţiei timp de mai bine de un
secol şi va rămâne o preocupare de interes major mult timp de acum înainte, dar, în egală măsură, cartea
propusă de noi va contribui la înţelegerea cauzelor nereuşitei frecvente a tratamentului.

Autorii

3
INTRODUCERE

Antibioticele (anti + bios = cu efecte nefavorabile) sunt un grup heterogen de substanţe chimice,
produse de microorganisme prin procese de biosinteză, care omoară sau inhibă creşterea altor specii de
microorganisme. Definiţia iniţială s-a completat ulterior, în prezent antibioticele fiind definite ca substanţe
chimice obţinute prin biosinteză, semisinteză sau prin sinteză chimică, care, în concentraţie mică inhibă
multiplicarea sau omoară microorganismele.
Antibioticele au fost esenţiale în lupta cu maladiile infecţioase şi au avut o contribuţie importantă la
creşterea speranţei de viaţă în secolul XX, fiind considerate una dintre marile descoperiri ale lumii moderne,
alături de anestezia generală, maşina cu aburi, folosirea energiei atomice şi ieşirea omului în spaţiul
extraterestru. După introducerea penicilinei în clinica generală (1944), infecţiile foarte grave (de exemplu,
faringita streptococică) cu indici mari de mortalitate, au devenit vindecabile. In prezent, dependenţa omului de
antibiotice este totală. Din cele peste 500 substanţe cu proprietăţi antibiotice identificate, pentru terapia
infecţiilor umane şi animale se foloseşte un număr restrâns (circa l00), produse de reprezentanţii a 5 genuri de
microorganisme din grupurile actinomicete, bacili Gram pozitivi şi fungi filamentoşi microscopici, ca de
exemplu, Bacillus, Streptomyces, Micromonospora, Penicillium, Cephalosporium. Celelalte substanţe cu
proprietăţi antibiotice sunt toxice ori au efecte defavorabile asupra organismului, ori sunt lipsite de
selectivitate.
Se spune, şi nu fără temei, că lumea este o mare de antibiotice. Numai în SUA, în 1998, pentru uzul
uman s-au folosit circa 12,5 tone de antibiotice. Dacă se adaugă cele administrate în hrana animalelor şi în
agricultură, se apreciază că în ultimii 50 de ani s-au produs şi s-au utilizat peste un milion de tone de
antibiotice. Administrarea lor, adeseori nejustificată, creează o presiune selectivă considerabilă asupra
microorganismelor infecţioase, al cărei rezultat este selecţia tulpinilor multirezistente. Rezistenţa multiplă la
antibiotice şi la agenţii de sinteză chimică este o provocare majoră a clinicii infecţioase, ceea ce impune
găsirea unor noi antibiotice sau obţinerea prin procedee de semisinteză, a unor noi derivaţi chimici eficienţi.
Alcătuirea acestei cărţi a izvorât din necesitatea prezentării unitare a stadiului actual al cunoaşterii
structurii chimice, dar în special a mecanismelor de acţiune şi de rezistenţă a microorganismelor la
principalele clase de antibiotice folosite în clinică. Structura chimică a diferitelor antibiotice a fost determinată
curând după descoperirea lor, dar mecanismele acţiunii şi rezistenţei microorganismelor sunt achiziţii mai
recente.
Prezentarea propriu-zisă a diferitelor substanţe antimicrobiene utilizate în clinică pentru tratamentul
infecţiilor produse de microorganisme, este precedată de un capitol de anatomie şi fiziologie bacteriană, cu
scopul de a înţelege substratul anatomic structural al ţintei acţiunii diferitelor substanţe antimicrobiene şi de
un capitol referitor la acţiunea substanţelor din categoria antisepticelor şi dezinfectanţilor.
Antisepticele sunt substanţe chimice care, aplicate pe ţesuturile vii, împiedică creşterea şi
multiplicarea microorganismelor existente. Sunt relativ netoxice şi pot fi aplicate pe ţesuturi umane şi
animale.Termenul de dezinfectant este restrâns la substanţele cu efect microbicid rapid, exercitat la
concentraţii mici, care se aplică pe obiecte neanimate, în scopul distrugerii microorganismelor contaminante.
Cele mai multe substanţe dezinfectante sunt toxice şi nu pot fi administrate la om şi la animale. Antisepticele
şi dezinfectantele cuprind o largă varietate de agenţi chimici şi poartă denumirea generică de biocide.
Agenţii chimioterapeutici sunt substanţe de sinteză chimică, utilizate în tratamentul infecţiilor produse
de diferite microorganisme (bacterii, fungi microscopici şi protozoare). Conceptul chimioterapiei a fost
formulat de P. Ehrlich (l904). Principiul fundamental al chimioterapiei antiinfecţioase constă în utilizarea unor
substanţe cu toxicitate selectivă care să inhibe creşterea şi multiplicarea agentului patogen infecţios, dar să nu
altereze funcţionalitatea celulelor organismului uman şi animal. Agenţii chimioterapeutici interacţionează
selectiv cu sistemele metabolice active ale microorganismelor, dar nu cu acelea ale celulelor organismului
gazdă.

4
Capitolul 1
CARACTERIZAREA PRINCIPALELOR ŢINTE ALE ACŢIUNII ANTIBIOTICELOR DIN
STRUCTURA CELULEI BACTERIENE

Cunoaşterea structurii interne a celulei bacteriene este rezultatul utilizării tehnicilor de citochimie şi
de microscopie electronică. Structura şi arhitectura moleculară a componentelor celulare a fost demonstrată cu
ajutorul tehnicilor de citochimie, care presupun utilizarea unor metode de colorare selectivă, adică a
coloranţilor cu afinitate pentru o anumită structură celulară. Prin arhitectură moleculară se înţelege
modalitatea de aranjare ordonată a subunităţilor constitutive ale unei structuri. Structura reper a celulei
bacteriene este peretele celular. In raport cu peretele se disting structurile intraparietale (care alcătuiesc
protoplastul bacterian) şi structurile extraparietale (Zarnea, 1983).
Structurile intraparietale sunt reprezentate de: spaţiul periplasmic, membrana plasmatică, mezosomul,
nucleoidul, citoplasma, ribosomii, incluziile, vacuolele, sporul, aparatul fotosintetic, rhapidosomii (rhapidos =
baston) – incluzii ribonucleoproteice în formă de baston, magnetosomii – incluzii intracelulare delimitate de
membrană, cu structură cristalină formate din magnetită (Fe 3O4). Magnetosomii conferă dipol magnetic
permanent celulei, permiţându-i să se alinieze pasiv la câmpul geomagnetic. Bacteriile care produc
magnetosomi manifestă magnetotaxie, adică procesul de orientare şi migrare de-a lungul liniilor câmpului
magnetic. Structurile extraparietale sunt reprezentate de: glicocalix cu variantele sale structurale (capsula şi
glicocalixul comportamental), flageli, fimbrii şi pili, spini – structuri pericelulare groase la bază şi ascuţite la
vârf. Unele structuri (membrana, citoplasma, nucleoidul, ribosomii) sunt esenţiale (obligatorii) şi se găsesc la
toate celulele bacteriene. Altele sunt facultative (spor, aparat fotosintetic, capsulă, flageli), fiind prezente
numai la anumite grupe de bacterii.

1.1. Peretele celular

Peretele celular este o structură rigidă de înveliş, care delimitează celula bacteriană. La cele mobile,
peretele este străbătut de flageli. Structura parietală lipseşte la bacteriile din grupul Mycoplasma, precum şi la
cele halofile extreme (cele care trăiesc în medii saline foarte concentrate, unde structura protectoare faţă de
şocul osmotic nu este necesară). La microscopul optic, peretele celular se evidenţiază după colorare selectivă,
cu coloranţi de mare afinitate faţă de componentele sale chimice. La microscopul electronic, peretele se
evidenţiază fie direct, fie după utilizarea unor artificii de tehnică, ce constau în inducerea de leziuni mecanice
ale structurii parietale cu ajutorul perlelor de sticlă sau prin ultrasonicare. Conţinutul celular se pierde si
peretele rămâne ca un sac gol şi rigid, care păstrează forma originală a celulei, ceea ce sugerează rolul esenţial
al peretelui în determinarea formei bacteriene. Grosimea peretelui este cuprinsă între l5 şi 30 nm (uneori până
la 80 nm).
În ciuda stării incerte a taxonomiei bacteriene, un criteriu empiric care a avut o valoare practică
deosebită pentru clasificarea şi identificarea procariotelor este comportamentul la coloraţia Gram (C. Gram,
1884) (Beveridge şi Davies, 1983). Caracterul Gram pozitiv sau Gram negativ reflectă deosebiri structurale
majore ale peretelui, cu excepţia Archaea, cocilor rezistenţi la radiaţiile ionizante şi a micoplasmelor. Relaţia
dintre structura peretelui celular şi coloraţia Gram este următoarea: tehnica implică tratamentul succesiv al
celulelor cu cristal - violet (un colorant bazic), urmat de tratamentul cu soluţie de iod şi ulterior, extracţia cu
un solvent organic polar (alcool sau acetonă). În interiorul celulei, cristalul violet şi iodul formează un
complex insolubil. Celulele Gram pozitive, care rezistă etapei de decolorare şi reţin complexul insolubil
(cristal violet - iod) sunt colorate în albastru închis, iar cele care nu reţin colorantul sunt Gram negative şi pot
fi diferenţiate de cele Gram pozitive prin recolorare cu un colorant de contrast, fiind colorate în roşu. Reacţia
Gram nu se corelează direct cu compoziţia chimică a peretelui, ci depinde de structura sa fizică, de starea
fiziologică a celulei şi de integritatea ei structurală. Astfel, levurile, care au perete celular gros, dar cu o
compoziţie chimică diferită de a mureinei, se colorează Gram pozitiv.
În funcţie de particularităţile structurale ale peretelui, bacteriile se împart în 4 categorii:
l. Firmacutes (firmus = tare; cutis = înveliş) sunt bacteriile Gram pozitive, cu perete celular gros şi
rigid, la care mureina reprezintă până la 80% din greutatea uscată a acestei structuri şi bacteriile acido-
alcoolo-rezistente.
2. Gracilicutes (gracilis = subţire, fin) sunt bacteriile Gram negative cu perete subţire, la care
mureina reprezintă circa l0% din greutatea uscată a peretelui.
3. Mollicutes sau Tenericutes (mollis, tener = moale) cuprinde bacteriile din grupul Mycoplasma,
lipsite de perete. Periferia celulei este acoperită de o membrană ce conţine steroli, cu rol protector faţă
de liza osmotică. Sunt cele mai mici bacterii cunoscute, cu capacitatea de a creşte pe medii inerte. Se

6
dezvoltă ca saprobionte în cavităţile organismului uman şi animal sau sunt patogene pentru om,
animale şi plante.
4. Mendosicutes (mendosus =o structură cu defecte). Noţiunea desemnează organismele domeniului
Archaea, care au perete celular din care lipseşte mureina.
Marea majoritate a bacteriilor cunoscute aparţin grupului Gram pozitive sau Gram negative.

Structura moleculară a peretelui la bacteriile Gram pozitive

La bacteriile Gram pozitive, peretele celular este gros, rezistent şi rigid. Componenta esenţială este
mureina, denumită şi peptidoglican, glicopeptid, mucopeptid sau glucozaminopeptid. Mureina formează un
strat rigid, adiacent membranei plasmatice şi sub aspectul compoziţiei chimice este unitară la toate
eubacteriile (Gram pozitive şi Gram negative). Mureina este alcătuită dintr-o componentă peptidică şi una
glucidică. Componenta glucidică de bază este un dizaharid format din N-acetil-D- glucozamină şi acid N-
acetilmuramic, legate  l-4 (fig. 1). Acidul N-acetilmuramic rezultă prin stabilirea unei legaturi dr tip esteric
între N-acetil-D-glucozamină şi acidul lactic. Componenta peptidică este un tetrapeptid, a cărui compoziţie în
aminoacizi este variabilă în funcţie de specie, dar conţine L-ala, acid D-glutamic, acid diaminopimelic
(derivat al lizinei) sau lizina şi D-ala şi se leagă de acidul N-acetilmuramic. Acidul N-acetil muramic şi D-
aminoacizii sunt markeri biochimici ai eubacteriilor.

Figura 1. Structura glicanului tetrapeptidic, una dintre unitaţile repetitive ale peptidoglicanului structurilor parietale.
Aceasta structura chimica se gaseşte la E. coli, dar bacteriile conţin si alţi aminoacizi (dupa Brock, 2005).

Rigiditatea peptidoglicanului este conferită de punţi peptidice transversale. Cu cât numărul de


legături peptidice este mai mare, cu atât creşte rigiditatea peretelui celular. La bacteriile Gram negative,
punţile transversale reunesc gruparea NH 2 a acidului diaminopimelic, cu gruparea COOH a D-ala terminale a
altei grupări peptidice. La bacteriile Gram pozitive, legarea transversală a două peptide învecinate se face
printr-o punte peptidică, care, de exemplu, la Staphylococcus aureus este formată din 5 resturi de glicină (fig.
2).

7
Figura 2. Tetrapeptidele conectate la acidul N-acetilmuramic sunt interconectate prin punţi formate din cateva
resturi de aminoacizi. La S. aureus tetrapeptidele sunt conectate prin punţi de pentaglicină (dupa Brock, 1988).

Se formează astfel o structură covalentă perfect continuă în jurul celulei, o moleculă mureinică
gigantă, un adevărat sac mureinic, cu structură tridimensională dinamică (fig. 3) (Ghuysen si Hackenbeck,
1994). La nivelul sacului mureinic sunt localizate enzimele care modelează creşterea sa: murein-hidrolazele
care atacă legăturile chimice ale mureinei şi murein-sintetazele care inseră noi unităţi de construcţie.
Peptidoglicanii diferitelor specii diferă prin aminoacizii 2 şi 3 ai tetrapeptidului şi prin frecvenţa punţilor
transversale de pentaglicină. Speciile patogene au o frecvenţă superioară a punţilor transversale, ceea ce se
corelează cu o rezistenţă mai mare a mureinei la acţiunea factorilor litici din umorile organismului (lizozimul
etc.).

Figura 3. Reprezentarea structurii generale a peptidoglicanului (G = N-acetilglucozamina ; M = acid N-


acetilmuramic). La resturile de acid N-acetil-muranic sunt conectate tetrapeptidele, iar aceastea sunt reunite prin legaturi
peptidice transversale (dupa Brock, 2000).

8
Importanţa mureinei, ca o componentă structurală esenţială a peretelui celular al bacteriilor Gram
pozitive a reieşit din studiul acţiunii a doi agenţi antibacterieni, lizozimul şi penicilina, asupra peretului
celular. Lizozimul clivează legăturile glicozidice  l - 4 şi hidrolizează mureina celulelor aflate în faza
staţionară (fig. 4), în timp ce penicilina inhibă cresterea celulelor bacteriene Gram pozitive aflate în faza de
creştere, deoarece inhibă treapta finală a sintezei mureinei, reacţia de transpeptidare, adică formarea
legăturilor peptidice transversale între catenele de glican adiacente.

Figura 4. Imaginea electrono-optică a celulelor de Bacillus subtilis. a. In regiunea centrală s-a initiat formarea
septului de diviziune. b. Un stadiu intermediar al degradarii peretelui sub acţiuna lizozimului şi retracţia protoplastului. c.
Protoplastul (original).

La bacteriile Gram pozitive, puntea peptidica transversală reuneste acidul diaminopimelic al unui
peptid şi D-ala a peptidului adiacent (Ghuysen şi Hackenbeck, 1994). Inhibiţia reactiei de transpeptidare (de
formare a puntilor peptidice transversale) sub acţiunea penicilinei duce la formarea unui peptidoglican subţire.
În celulele care cresc, autolizinele continuă să degradeze legaturile chimice ale mureinei, fără a se mai forma
alte punţi peptidice. Astfel, peretele mureinic se dezagregă progresiv si elibereaza protoplastul, care este o
celulă neviabilă, iar în mediul neprotejat osmotic suferă liză. De aceea, penicilina este activă numai asupra
celulelor care cresc. In celulele care nu cresc, autolizinele nu sunt active şi peptidoglicanul nu este degradat.
Mureina formează o matrice în care se găsesc şi alţi polimeri: polizaharide, acizi teichoici. Acizii
teichoici sunt polimeri de l-3-poliglicerol-fosfat sau de poli-ribitol-fosfat, legaţi fosfo-diesteric.

Poliglicerol – fosfat

Poliribitol fosfat

9
Polimerii formează axul central al moleculei. Grupările –OH libere ale glicerolului şi gruparea –OH
de la C3 a ribitolului sunt ocupate de D-alanină, D-glucoză sau de N-acetilglucozamină. Bacteriile Gram
pozitive au două categorii de acizi teichoici: acizi lipoteichoici sau membranari, care traversează
peptidoglicanul şi cu o extremitate se leagă de glicolipidele din membrană, iar celălalt capăt este liber la
suprafaţa celulei şi acizi teichoici parietali, ataşaţi de resturile de acid N-acetilmuramic ale mureinei.
Acizii teichoici sunt molecule lungi şi flexibile, filamentoase, care conferă un plus de rigiditate
peretelui celular al bacteriilor Gram pozitive. Pentru bacteriile patogene, acizii teichoici sunt un factor de
virulenţă, deoarece au proprietăţi chimiotactic negative faţă de fagocite. Sunt implicaţi în transportul ionilor
în/şi din celulă. Pot avea rolul de receptori de fagi. Uneori bacteriile secretă cantităţi mari de acizi teichoici
solubili.

Peretele celular la bacteriile Gram negative

La bacteriile Gram negative, mureina reprezintă numai 2,5 - l0% din greutatea uscată a peretelui.
Peretele lor este mai complex, datorită unei structuri caracteristice denumită membrana externă a peretelui
celular, o replică structurală a membranei plasmatice, care poate fi astfel considerată ca membrană internă. La
microscopul electronic, peretele celular apare pluristratificat, datorită structurii trilaminare a membranei
externe a peretelui (fig. 5).

Figura 5. Pe imaginile electrono-optice, învelişul celulelor bacteriene Gram negative este multilaminar, caracter
conferit de cele două membrane: membrana externă şi membrana citoplasmatică. Structura mezosomală are conexiune
directă cu membrana citoplasmatică şi pare asociată cu nucleoidul, iar structura sa este trilaminară (original).

Membrana externă a peretelui conţine fosfolipide (35% din greutate), proteine (l5%) şi
lipopolizaharide (50%). Analiza filogeniei organismelor procariote pe baza secvenţierii proteinelor a dus la
concluzia existenţei unor diferenţe filogenetice majore între organismele cu înveliş dublu membranar
(didermice) şi cele cu membrană simplă (monodermice) (Costerton şi colab., 1974).
Mureina este localizată în stratul cel mai intern al peretelui (fig. 6). După un tratament adecvat,
membrana externă se poate îndepărta şi se obţine sacul mureinic pur, extrem de fin care păstrează forma
originală a celulei şi care sugerează că mureina ar putea fi o reţea bidimensională (un monostrat molecular), în
timp ce la bacteriile Gram pozitive cantitatea de peptidoglican corespunde la 20 de straturi moleculare sau mai
mult.

10
Figura 6. Reprezentarea schematică a componentelor peretelui celular la bacteriile Gram negative ( după
Brock, 2005).

Proteinele membranei externe se numesc porine, deoarece reglează permeabilitatea şi constituie


canalele membranare de transport celular. Iniţial s-au descris trei tipuri de porine trimerice: OmpF, OmpC şi
PhoE. Analiza prin metoda cristalografiei cu raze X relevă că porinele sunt proteine transmembranare a căror
configuraţie secundară este cea de β-pliere. O celulă de Escherichia (E.) coli produce circa 105 molecule
porine, cu rolul de bariere selective de permeabilitate. În mediul hiperosmotic, numărul porinelor scade. La E.
coli, porinele sunt proteine trimere, subunităţile delimitând un por cu diametrul de 1 nm.
Lipoproteinele leagă ferm membrana externă prin intermediul peptidoglicanului profund.
Lipopolizaharidele (LPS) sunt inclavate în membrana externă. Ele sunt de fapt endotoxinele bacteriilor Gram
negative (Salmonella, Shigella, Escherichia). Se numesc endotoxine, deoarece se eliberează numai după
pierderea integrităţii celulei. Datorită poziţiei lor externe, LPS se pot extrage din celule, cu fenol 45 - 60%.
Din punct de vedere chimic, LPS sunt molecule complexe, fiind alcătuite dintr-o regiune polizaharidică
externă (polizaharidul O), care determină specificitatea antigenică a celulei bacteriene, o regiune
oligozaharidică intermediară (regiunea R) şi o regiune internă hidrofobă, denumită lipidul A, prin care LPS se
ancorează în membrana externă, printre moleculele fosfolipidice (fig. 7). Regiunile intermediară şi internă ale
moleculei LPS au compoziţie chimică relativ constantă la diferite specii de bacterii Gram negative.
Polizaharidul regiunii externe are o structură şi o compoziţie chimică foarte variabile şi constituie antigenul
somatic O, cu specificitate antigenică foarte înaltă, pe baza căruia numeroasele tulpini ale unei specii aparţin
unui mare număr de serotipuri.

Figura 7. Reprezentarea schematică a structurii moleculei de lipopolizaharid (LPS) original).

Lipidul A este legat covalent de oligozaharidul regiunii intermediare. La Salmonella, lipidul A este
alcătuit din dizaharide de D-glucozamină, legate  l’- 6. Perechile de D-glucozamină sunt interconectate l - 4’,
prin punţi pirofosfat. Grupările –OH din poziţiile 3, 4 şi 6’ ale fiecărui dizaharid sunt substituite de acizi
graşi (lauric, palmitic, miristoximiristic, hidroximiristic).Grupul –OH din poziţia 3 se leagă de componenta
polizaharidică (acidul 2-ceto, 3-deoxioctanoic) (KDO). Grupările –NH2 ale glucozaminei sunt substituite de
acidul D-3-hidroximiristic (fig. 8). Lipidul A are proprietăţi endotoxice, evidenţiate la mutantele R (Rough =
rugos) care sintetizează LPS incomplet, căruia îi lipseşte polizaharidul O şi unele componente ale
oligozaharidului regiunii intermediare R.

11
Figura 8. Structura lipidului A al lipopolizaharidului de Salmonella, cu trizaharidul KDO şi cu resturile de acizi graşi
(dupa Rietschel si colab., 1977).

In mediile naturale, cele mai multe bacterii sintetizează polizaharidul O şi formează colonii S (Smooth
= neted). Cele care nu au polizaharidul O formează colonii R. Polizaharidul O nu este factorul determinant al
patogenităţii, deoarece formele coloniale R ale Bordetella (B.) pertusis, Neisseria (N.) gonorrhoeae sunt
patogene (Seifert şi colab., 1988; Jawetz şi colab., 1989).
Permeabilitatea membranei externe. Membrana externă, ca şi celelalte membrane biologice, este
alcătuită din stratul lipidic dublu, puţin permeabil pentru moleculele hidrofile. Porinele din membrana
externă formează canale de difuzie nespecifică pentru influxul nutrienţilor şi pentru eliminarea produselor de
catabolism. Porinele s-au găsit la toate bacteriile Gram negative şi chiar la un grup de bacterii Gram pozitive:
Corynebacterium - Nocardia - Mycobacterium, care produc un perete celular bogat în lipide, asemănător
dublului strat. Porinele clasice OmpF şi OmpC transportă preferenţial cationi, iar PhoE, transportă anioni.
Porinele reglează permeabilitatea membranei externe în funcţie de condiţiile mediului: în mediile cu
osmolaritate mică (cele naturale), porinele sunt mai permeabile, iar la bacteriile patogene, în organismul
gazdă, porinele au permeabilitate mai mică.
Moleculele de LPS formează baza structurală a integrităţii membranei externe. LPS este polianionică
datorită sarcinilor negative ale lipidului A şi leagă cationi. Moleculele adiacente polianionice de LPS sunt
aparent legate electrostatic, una de alta, prin cationi bivalenţi (Ca 2+, Mg2+) şi formează o structură compactă ca
un acoperiş de ţiglă, pe suprafaţa membranei externe. Situsurile LPS care leagă cationii sunt esenţiale pentru
integritatea membranei externe, dar în acelaşi timp ele reprezintă călcâiul lui Ahile al acestei structuri.
Antibioticele policationice din grupul polimixinei se complexează avid cu LPS şi dezorganizează membrana
externă, mărind permeabilitatea pentru agenţii cu acţiune asupra membranei sau componentelor
citoplasmatice. Toţi agenţii policationici se leagă de LPS anionice, cu o afinitate variabilă. Bacteriile Gram
negative sunt rezistente la detergenţii anionici şi neutri, dar sunt sensibile la detergenţii monocationici. Agenţii
chelatori ai ionilor de Ca2+ şi Mg2+ dezorganizează şi permeabilizează membrana externă. Cel puţin la
enterobacterii, dublul strat fosfolipidic al membranei externe este asimetric, stratul extern conţinând aproape
exclusiv LPS, în timp ce stratul intern conţine aproape exclusiv fosfolipide. Structura porinelor trimere s-a
analizat prin difracţie cu electroni şi cristalografie cu raze X. Monomerii porinei traversează dublul strat şi au
configuraţie β-pliată. Aproape invariabil, secvenţele porinelor la capătul C-terminal au fenil-alanina. Rareori,
restul C-terminal este triptofanul.

12
Peretele celular la Archaea

La Archaea, peretele celular prezintă diferenţe structurale majore, comparativ cu ale eubacteriilor.
Diferitele specii de Archaea se colorează Gram pozitiv sau Gram negativ. Peretele lor nu conţine acid
muramic sau D-aminoacizi, markeri biochimici ai mureinei (Rogers, 1983). Din punct de vedere chimic,
peretele la Archaea este heterogen. La Methanobacterium (producătoare de metan), peretele conţine o
pseudomureină alcătuită din unităţi repetitive formate din două zaharuri aminate (N-acetilglucozamină şi
acidul N-acetiltalosaminuronic, markerul biochimic al domeniului Archaea), legate  l-3. Resturile acidului N
–acetiltalosaminuronic sunt legate prin punţi peptidice (ca şi la mureină), iar aminoacizii sunt numai izomeri
L. Legăturile  l-3 ale pseudomureinei sunt rezistente la acţiunea lizozimului.

Peretele celular acido-alcoolo-rezistent al micobacteriilor

Unele genuri ale micobacteriilor (Mycobacterium (M.) tuberculosis, Corynebacterium (C.) diphteriae,
Nocardia (N.) asteroides) conţin lipide complexe, care nu se găsesc în structura parietală a altor bacterii. Ele
se colorează slab după protocolul coloraţiei Gram, dar se colorează la cald cu fuxină bazică concentrată şi sunt
rezistente la decolorare succesivă cu acid sulfuric diluat şi alcool etilic 96%. Aceste organisme se numesc
acido-alcoolo-rezistente (Rogers, 1983). Rezistenţa la decolorare se datorează compoziţiei chimice a peretelui
celular. Peptidoglicanul micobacteriilor conţine acid diaminopimelic ca acid diaminic major, iar acidul
muramic este N-glicozilat (şi nu N-acetilat). Un alt compus major parietal al micobacteriilor este
polizaharidul cu gr. mol. mare – arabinogalactanul – de care se leagă acizi graşi cu catenă lungă – acizii
micolici – cu 70 - 90 atomi de C. La Corynebacterium şi Nocardia, acizii graşi au catenă mai scurtă (40 - 60
de atomi de C). O altă categorie de lipide, cele libere, sunt lipooligozaharide ce conţin trehaloză şi
lipoarabinomanani.

Figura 9. Reprezentarea schematică a componentelor peretelui celular acido-rezistent la grupul Mycobacterium –


Nocardia. Regiunea externă a învelişului conţine unitaţi lungi de acid micolic legat de arabinogalactan (dupa Holt, 1998).

Funcţiile peretelui celular


Peretele celular este o structură cu rol esenţial în arhitectura celulară, pentru că determină forma
celulei şi menţinerea ei. După pierderea conţinutului celular, sacul mureinic păstrează forma iniţială a celulei.
Mureina conferă celulei elasticitate şi plasticitate (capacitatea de a suferi deformări la presiune, fără alterarea
structurii celulare), permiţând mărirea volumului ei prin creştere.
Peretele celular constituie o barieră suplimentară de permeabilitate, alături de membrana
citoplasmatică. La bacteriile Gram pozitive, peretele are o porozitate de 1,1 nm, permiţând trecerea
moleculelor mai mici de l200 Da (1 Dalton = masa atomului de H, adică l,672649 x l0 -24g. l kDa = l 000 Da).
La bacteriile Gram pozitive, peretele participă la formarea septului de diviziune, ce separă cele două
celule surori şi la procesele de creştere. Creşterea volumului celular este rezultatul creşterii peretelui.
Membrana externă are rolul unei site moleculare şi permite difuzia moleculelor mici, dar reţine pe
cele mari (enzime). Membrana externă este o barieră selectivă, fiind impermeabilă pentru macromolecule, dar
permite difuzia limitată a substanţelor hidrofobe, deoarece lama externă nu conţine glicerofosfolipide.
Suprafaţa este acoperită cu LPS, care formează o structură quasicristalină. Din această cauză, lama externă nu

13
prezintă o difuzie laterală marcată a moleculelor, tipică membranelor care conţin glicerofosfolipide (Wright şi
Tipper, 1978).
Membrana externă conţine proteine cu funcţii de transport molecular. Ele au rolul de receptori de
vitamine, glucide, aminoacizi, de transferine (leagă Fe şi îl transferă în celulă). În membrana externă a
bacteriilor patogene se găsesc proteine de virulenţă, din categoria adezinelor, cu rol de fixare a bacteriei la
suprafaţa celulelor sensibile. LPS are proprietăţi chimiotactic negative faţă de fagocite, mărind nivelul
virulenţei bacteriene şi conferă individualitate biochimică şi serologică diferitelor tulpini. LPS sunt antigene şi
induc sinteza anticorpilor specifici cu rol protector (Seifert şi colab, 1988).
In concluzie, peretele celular este o structură esenţială a celulei bacteriene, îndeplinind funcţii
multiple, cea mai importantă fiind protecţia faţă de liza osmotică în mediile hipotonice.
Singurele procariote care nu au o structură parietală sunt micoplasmele. Ele se pot izola din
organismul uman, de la animale, plante, insecte, fungi, sol, ape menajere. Sunt saprobionte, trăind pe materia
organică în mediile naturale (ape menajere, sol) sau comensale la om şi animale pe mucoasele bucofaringiană
şi genitourinară, incapabile să se dezvolte în mediul extern ca saprobionte. Unele dintre cele comensale sunt
potenţial patogene. Faptul că supravieţuiesc, deşi nu au perete celular, se explică prin aceea că au o membrană
citoplasmatică rigidă (care conţine steroli) şi pentru că trăiesc în medii protejate osmotic, aşa cum este
organismul animal şi uman.

1.2. Spaţiul periplasmic

Spaţiul periplasmic este un compartiment celular al bacteriilor Gram negative, delimitat de membrana
externă a peretelui celular şi de membrana internă (citoplasmatică). Este singurul compartiment al celulei
procariote şi conţine un volum apos semnificativ în care se găsesc proteine şi oligozaharide. Proteinele sunt
reprezentate de enzime degradative (DN-aza, RN-aza, proteaze, fosfataze, penicilinaza etc.) şi proteine de
legare specifice pentru diferite molecule, cu rol în transport şi chimiotaxie (Costerton şi colab., 1974; Wright
şi Tipper, 1978).
Oligozaharidele se găsesc în concentraţii variabile şi au rolul de a regla presiunea osmotică a celulei.
Când presiunea osmotică a mediului creşte, oligozaharidele trec în citoplasmă, iar când scade, oligozaharidele
revin în spaţiul periplasmic.
Spaţiul periplasmic îndeplineşte o funcţie esenţială ce constă în acumularea nutrienţilor moleculari din
mediu, înainte de a pătrunde în celulă. Spaţiul periplasmic funcţionează ca un compartiment adaptativ, a cărui
funcţie de depozit este foarte importantă, deoarece bacteriile Gram negative trăiesc, de cele mai multe ori, în
mediile oligotrofe (mediile aquatice). În spaţiul periplasmic, nutrienţii sunt scindaţi parţial sub acţiunea
enzimelor degradative şi de aici sunt preluaţi de proteinele de transport din membrana internă şi transferaţi în
celulă. Proteinele periplasmice pot fi eliberate prin conversia celulelor la protoplaşti, după tratamentul cu
cloroform sau prin şoc osmotic (tratamentul celulelor cu EDTA în mediu hipertonic şi transferul lor în mediu
hipotonic).

1.3. Membrana citoplasmatică

Membrana plasmatică înconjoară celula bacteriană şi este bariera separatoare a citoplasmei de mediul
extern. Consecinţa imediată a lezării membranei este pierderea componentelor citoplasmatice. Grosimea
membranei este de 7 - 10 nm. La microscopul electronic are o structură trilaminară, după modelul unitar al
membranelor celulare (unit membrane), al lui Robertson. Pe baza structurii fine s-a considerat (eronat) că
membrana plasmatică este alcătuită din două straturi de proteine, între care se găseşte unul lipidic. In realitate,
membrana este un dublu strat fosfolipidic şi glicolipidic, la care se asociază proteinele membranare.
Ansamblul molecular al membranei este asemănat cu un ocean fosfolipidic, în care sunt incluse ca nişte
iceberguri, proteinele externe (periferice) şi integrate, dar spre deosebire de membrana celulei eucariote nu
conţine steroli. Singer şi Nicolson au propus modelul mozaicului fluid de organizare a membranelor biologice,
în acord cu care membranele sunt structuri bidimensionale de proteine globulare şi lipide, cu distribuţie
orientată, stabilizate de moleculele de apă. Acestea sunt legate prin punţi intermoleculare de H, formând o
structură în reţea. Dizolvarea unei molecule în apă are semnificaţia stabilirii unei continuităţi între structurile
chimice ale moleculei dizolvate şi structura de reţea a apei. Pentru a se integra în structura de reţea a apei,
molecula trebuie să formeze o legătură de H cu apa sau să accepte o legătură a acesteia.
Proteinele sunt componentele care conferă membranelor multe dintre proprietăţile funcţionale
specifice (de exemplu, menţinerea şi utilizarea gradientului transmembranar de H + pentru sinteza ATP). În
raport cu dispunerea lor în structura membranei, proteinele sunt periferice şi integrate. Proteinele periferice
sunt asociate cu membrana, dar nu au nici o secvenţă inclusă în structura ei. Structura lor este analogă

14
proteinelor hidrosolubile. Proteinele membranare integrate au cel puţin un domeniu al moleculei situat în
regiunea hidrofobă a stratului lipidic. Secvenţa de aminoacizi a domeniului inclus în stratul lipidic este
hidrofobă, are configuraţia -helix şi cuprinde l9 - 23 aminoacizi. Ele pot fi dislocate din structura membranei
numai în prezenţa detergenţilor ce solubilizează lipidele. Proteinele integrate difuzează liber în planul lateral
al matricei lipidice, dar nu trec liber dintr-un strat în altul şi de aceea asimetria funcţională a membranei se
păstrează pentru perioade lungi. În categoria proteinelor integrate sunt incluse proteinele transmembranare
care au o mare parte a masei lor inclusă în dublul strat fosfolipidic, dar expun domenii semnificativ diferite pe
ambele feţe ale membranei, ceea ce conferă asimetria funcţională a acesteia şi proteinele membranare
ancorate care au cel putin un domeniu ce penetrează dublul strat lipidic, dar nu traversează complet
membrana. Proteinele membranare anocorate sunt legate covalent de lipidele membranare. Domeniile
extralipidice ale proteinelor membranare integrate sunt hidrofile, ceea ce conferă asimetria structurală şi
funcţională a membranei. Aşa se explică permeabilitatea superioară a feţei interne în raport cu faţa externă.

Figura 10. Modelul mozaicului fluid al structurii membranei. Fosfolipidele formează un strat dublu, cu
componentele hidrofobe orientate spre interior, iar capetele hidrofile constituie suprafaţa internă şi externa a membranei.
In marea lipidică proteinele plutesc ca niste iceberg-uri. Unele se extind în toata grosimea dublului strat lipidic, iar altele
sunt ancorate pe faţa internă sau externă. Membrana micoplasmelor şi eucariotelor conţine colesterol.

15
Figura 11. Reprezentarea schematică a moleculei fosfolipidice, componenta structurală a membranei. Fosfolipidele
sunt molecule polare. „Cozile” de acizi graşi sunt foarte hidrofobe (nu formează legături cu apa) şi constituie o barieră de
permeabilitate faţă de moleculele hidrosolubile. „Capul” moleculei este format din gruparea fosfat, legată de o grupare
care conţine N şi din glicerol si este foarte hidrofil (formează legături cu moleculele de apă) (dupa Lehninger, 1987).

Asimetria structurală a proteinelor integrate se evidenţiază pe imagini eletrono-optice ale membranei


criofracturate. Tehnica criofracturării presupune îngheţarea rapidă a membranei la temperatura azotului lichid
şi fracturarea membranei cu un cuţit special. Membrana se clivează de-a lungul regiunii hidrofobe a acizilor
graşi şi rezultă două jumătăţi, cu un grad accentuat de asimetrie, conferită de proteinele transmembranare
(Rogers, 1983).
Structura membranei plasmatice este stabilizată prin legături de H şi interacţiuni moleculare
hidrofobe. Ionii de Mg şi Ca realizează legături ionice cu sarcinile negative ale fosfolipidelor şi stabilizează
structura membranei.
Lipidele conţin acizi graşi, predominant cu l4 - l6 atomi de C, saturaţi sau nesaturaţi. În raport cu
capacitatea lor de a interacţiona cu structura apei, lipidele membranelor biologice conţin două categorii de
structuri chimice (sunt amfipatice): glicerolul intră în structura de reţea a apei, fiind hidrofil, iar restul
moleculei (acizii graşi) formează componenta hidrofobă a moleculei. Într-o soluţie apoasă, lipidele se agregă
şi formează spontan structuri în dublu strat: acizii graşi la interior, în mediul hidrofob, iar moleculele de
glicerol rămân expuse în mediul apos.
Funcţiile membranei, dar în special ale lipidelor membranare, s-au studiat folosind ca model,
veziculele membranare artificiale sau naturale, ce se formează spontan după spargerea celulelor. S-a
demonstrat astfel că procariotele îşi reglează fluiditatea membranei, prin modificarea proporţiei acizilor graşi
saturaţi/nesaturaţi. Cultivarea la temperaturi scăzute măreşte proporţia acizilor graşi nesaturaţi şi sporeşte
gradul de fluiditate a membranei. Prin răcire, faza de cristal lichid a lipidelor membranare trece spre o stare
solidă de gel, situaţie în care grosimea dublului strat creşte datorită extensiei catenelor de C ale lipidelor.
Dublul strat lipidic este o structură ordonată. Catenele de carbon ale acizilor graşi sunt constrânse la o
aşezare paralelă şi datorită caracterului hidrofob, nu se deplasează uşor în afara membranei. Moleculele
fosfolipidice sunt foarte mobile şi se deplasează în plan lateral (bidimensional), în acelaşi strat, cu o frecvenţă
foarte mare, dar mişcările flip-flop, dintr-un strat în celălalt (tridimensionale) sunt foarte rare (una la câteva
ore). Stratul lipidic este suportul proteinelor şi are rolul unei bariere de permeabilitate. Permeabilitatea

16
diferenţiată a celor două feţe ale membranei se explică atât prin asimetria proteinelor, cât şi prin compoziţia
chimică diferită a lipidelor în cele două straturi ale membranei.
Cu excepţia micoplasmelor şi a Archaea (bacteriile metanotrofe), membrana procariotelor se
deosebeşte de cea a eucariotelor prin absenţa sterolilor. Sterolii sunt molecule plane, rigide, iar acizii graşi
sunt flexibili. Sterolii conferă un grad superior de rigiditate membranei plasmatice. Rigiditatea membranei
este necesară celulelor lipsite de perete. La eucariote, rigiditatea ar fi necesară pentru a suporta forţele fizice
care se exercită asupra membranei. Antibioticele polienice (nistatinul, candicidina) reacţionează cu sterolii şi
destabilizează membrana. De aceea, ele sunt active faţă de celulele eucariote şi nu influenţează celulele
procariote. Micoplasmele încorporează sterolul în structura membranei, disponibil în mediul de creştere şi
sunt sensibile la antibioticele polienice.
La unele bacterii, în structura membranei se găsesc molecule asemănătoare structural cu colesterolul
şi pot avea acelaşi rol de creştere a rigidităţii: hopanoidele. Un compus larg distribuit este diploptenul, cu 30
de atomi de C.

Mecanismele fiziologice ale permeabilităţii membranei

Creşterea şi multiplicarea microorganismelor sunt condiţionate de disponibilitatea nutrienţilor care


trebuie să străbată învelişurile celulare şi de eliminarea produselor de catabolism. Caracterul hidrofob al
membranei îi conferă acesteia proprietatea de barieră de permeabilitate: trec prin difuzie liberă unele molecule
hidrofobe mici, molecule lineare şi cele solubile în mediul lipidic al membranei (antibioticele cu molecula
polară). Apa difuzează liber printre fosfolipidele membranei pentru că molecula este mică şi lipsită de sarcină.
Membrana exclude moleculele mai mari decât glicerolul, dacă nu sunt transportate de sisteme membranare
sau dacă nu se dizolvă în lipide. În acelaşi timp, barierele celulare asigură transportul substanţelor nutritive şi
reţin în interiorul celulei substanţele necesare, funcţionând ca adevărate porţi moleculare, ce controlează
intrarea şi ieşirea diferitelor molecule. Datorită structurilor de suprafaţă, celula bacteriană nu este niciodată în
stare de echilibru cu mediul înconjurător, în privinţa concentraţiei diferitelor molecule de o parte şi de alta a
membranei citoplasmatice (Brock, 2005). În funcţie de mecanismele fizico-chimice care stau la baza lor,
transportul moleculelor (electroliţi şi neelectroliţi) prin membrană se face prin două categorii de procese
fiziologice: difuzia pasivă şi mecanismele de transfer cu moleculă purtător.

Difuzia pasivă
Difuzia pasivă este cea mai simplă modalitate de pătrundere a moleculelor în celulă şi se defineşte
prin trecerea liberă a substanţelor prin membrana plasmatică în ambele sensuri. Procesul difuziei pasive are
următoarele particularităţi: trecerea moleculelor se face fără consum de energie; forţa motrice a trecerii este
gradientul de concentraţie, ceea ce înseamnă că transportul substanţelor se face din zona cu concentraţie mai
mare, spre zona cu concentraţie mai mică a moleculelor; transferul durează până în momentul în care
moleculele substanţei care se transferă ajung la aceeaşi concentraţie pe ambele feţe ale membranei
plasmatice; dacă de o parte a membranei se găsesc mai multe tipuri de substanţe, difuzia pasivă se face
individual pentru fiecare tip de moleculă în parte, până la echilibrul osmotic al fiecărei categorii; difuzia
pasivă se realizează lent şi nespecific. Factorul determinant al difuziei pasive este dimensiunea moleculei.
Prin difuzia pasivă trec moleculele de apă, O 2, CO2 (molecule mai mici de 0,8 nm), precum şi
moleculele liposolubile (care se dizolvă în lipidele membranei celulare, ca de exemplu, tetraciclina).
Membrana este permeabilă pentru apă şi pentru moleculele organice fără sarcină, până la dimensiunile
glicerolului. Fluxul molecular în oricare direcţie este proporţional cu concentraţia moleculei pe faţa de intrare,
astfel încât rata netă de transfer este proporţională cu diferenţa de concentraţie între cele două compartimente,
dar depinde şi de alţi factori: sarcina moleculei transportate, gradul ei de potrivire conformaţională cu
discontinuităţile membranare ce formează calea de transport.
Moleculele mai mari decât glicerolul necesită sisteme specifice de transport.

Sisteme de transport cu molecule purtător


Moleculele purtător sunt proteine integrate ale membranei plasmatice, care au proprietatea de a lega
substanţele dizolvate de o parte a membranei şi de a le transporta pe cealaltă parte, unde le eliberează.
Denumirea lor generică este aceea de sisteme de transport, transportori, purtători sau permeaze.
Sunt cel puţin trei clase de sisteme de transport membranar :
- sisteme formate dintr-o componentă ce traversează membrana;
- sisteme formate dintr-o componentă ce traversează membrana şi o proteină periplasmică de legare;

17
- sisteme formate din proteine multiple ce cooperează pentru a media transportul.
Sistemele de transport cu molecule purtător îndeplinesc mai multe funcţii: permit intrarea nutrienţilor
în celulă; reglează concentraţia metaboliţilor, catalizând excreţia produselor finale ale căilor metabolice;
mediază eliminarea activă a antibioticelor şi a substanţelor toxice, favorizând supravieţuirea celulei; reglează
echilibrul ionic, ce trebuie menţinut la concentraţii ce diferă mult de concentraţia din mediul extern; participă
la secreţia proteinelor, polizaharidelor şi lipidelor; permit transferul acizilor nucleici prin membrană, uşurând
schimburile genetice între celule; elimină molecule (antibiotice, toxine) care permit celulei să desfăşoare
competiţia biologică, conferindu-i un avantaj selectiv pentru supravieţuire.
Se cunosc trei modalităţi de transport prin intermediul moleculelor purtător: difuzia facilitată,
translocaţia de grup şi transportul activ.
Sistemele de transfer cu molecule purtător prezintă următoarele caracteristici: prin intermediul lor se
realizează o trecere mai rapidă a moleculelor de pe o faţă pe cealaltă a membranei plasmatice; asigură
trecerea simultană a mai multor tipuri de molecule, fără să existe fenomene de interferenţă; transferă în celule
diferite molecule, chiar contra gradientului de concentraţie şi prin aceasta permit acumularea moleculelor în
celulă la concentraţii ce pot depăşi de l00-l0000 de ori concentraţia lor în mediu (cu semnificaţie deosebită
pentru bacteriile care trăiesc în apele oligotrofe, sărace în substanţe nutritive).

Difuzia facilitată
Difuzia facilitată se aseamănă ca mecanism, cu difuzia pasivă, deoarece forţa de propulsie a
transportului este diferenţa de concentraţie a substanţei dizolvate, pe cele două feţe ale membranei plasmatice.
Procesul nu este cuplat cu consumul de energie metabolică şi nu generează procese concentrative. Transferul
moleculelor se face în sensul gradientului de concentraţie, din zona cu concentraţie mai mare, spre zona cu
concentraţie mai mică. In final, concentraţia substanţei în celulă este egală cu concentraţia sa în mediu. Nu se
produce acumularea (concentrarea) moleculelor pentru că nu se consumă energie. Deosebirea faţă de difuzia
pasivă constă în aceea că intervin molecule membranare care uşurează difuzia moleculelor transportate.
Moleculele membranare sunt proteine integrate, cu domenii extramembranare, atât citoplasmatice cât şi la
suprafaţa externă.
Există două modalităţi de transport facilitat: de tip canal (sau por) şi de tip purtător (carrier). In
difuzia facilitată de tip canal, substanţa dizolvată trece de pe o latură pe cealaltă a membranei, printr-un canal
sau por. Canalele sau porii sunt proteine oligomerice (în special trimere) de membrană care au rolul de a
transfera diferite molecule (fig. 12). Pereţii canalului sunt delimitaţi de secvenţe hidrofile, hidrofobe sau
amfipatice de aminoacizi, în funcţie de proprietăţile substratului care difuzează şi favorizează trecerea
moleculelor, spre deosebire de interiorul hidrofob al stratului lipidic.

Figura 12. Ilustrarea schematică a mecanismului difuziei facilitate de tip canal. Moleculele membranare din
categoria porinelor, sunt proteine integrate formate din cateva subunităţi. Prin modificări conformaţionale, porinele
realizează transportul moleculelor din mediul extracelular, în mediul citoplasmatic, dar numai în sensul gradientului de
concentraţie (de la concentraţie mare, la concentraţie mică). Procesul nu necesită consum de energie (după Black, 1996).

Moleculele purtător pot fi proteine monomerice sau dimerice, au specificitate stereospecifică de


substrat şi rata de transport este de câteva ori mai mică decât a difuziei de tip canal. Se presupune că molecula
purtătoare trece prin membrană împreună cu substratul şi isi schimbă conformaţia spaţială, ceea ce îi permite
să se prezinte cu suprafaţa activă, alternativ, spre faţa externă sau spre faţa internă a membranei. Fiecare tip de
proteină purtător are unul sau mai multe situsuri de legare pentru molecula specifică.

18
Mecanismul de transport al difuziei facilitate funcţionează în celulele adaptate la concentraţii mari de
glucide în mediu (de exemplu, levuri, eritrocite). La bacterii, care trebuie sa preia substanţele nutritive din
soluţii diluate, nu s-au evidenţiat astfel de sisteme de transport.

Translocaţia de grup
Particularitatea fundamentală a acestei modalităţi de transport constă în faptul că, pentru a fi
transportată prin membrana plasmatică, molecula este modificată chimic. Orice proces de transport în timpul
căruia substratul este modificat chimic, se numeşte translocaţie de grup. Moleculele din mediu nu vor apărea
în celulă în aceeaşi formă chimică, ci sub forma unui produs modificat (Alberts, 1994). Astfel sunt
transportate glucidele (glucoza, fructoza, manoza, lactoza, N-acetilglucozamina), bazele purinice şi
pirimidinice, acizii graşi etc.
Moleculele sunt fosforilate prin sistemul fosfotransferazei, cu un rest de acid fosforic. Sistemul
enzimatic al fosfotransferazei este alcătuit dintr-o reţea de proteine citoplasmatice şi membranare, care se
fosforilează în cascadă. Prima proteină a reţelei (HPr) are localizare citoplasmatică şi se fosforilează din
fosfoenol-piruvat, rezultând HPr-P, cu eliberarea piruvatului. La nivelul membranei, ultima componentă a
catenei de transport, o proteină integrată, fosforilează glucoza prin transferul grupării fosfat. Glucoza este
transferată în celulă sub forma esterului glucozo-6-P. La E. coli, sistemul fosfotransferazei este alcătuit din 24
de proteine, iar la transportul unui monozaharid participă cel puţin 4 componente.
Proteinele membranare care se fosforilează în cascadă au rolul de permeaze şi formează unul dintre
sistemele de transport prin membrana citoplasmatică. Permeazele sunt proteine de transport foarte eficiente.
Ele măresc viteza de transport de câteva ori în raport cu difuzia facilitată şi sunt factorii determinanţi ai ratei
excepţionale a metabolismului bacterian. Mutantele bacteriene identificate ca fiind lipsite de permeaze, devin
dependente de pătrunderea nutrienţilor prin difuzie şi necesită o concentraţie externă a moleculelor nutritive
de l000 de ori mai mare în raport cu tulpina parentală.
Din categoria permeazelor fac parte:
- sistemele de transport pentru glucide, cu specificitate moderată, deoarece pot fi destinate transportului unei
anumite molecule de zahăr sau unui grup de molecule glucidice. S-au identificat sisteme de transport pentru
monozaharide, pentru dizaharide şi chiar pentru oligozaharide (de exemplu, sistemul de transport al maltozei
poate transporta maltodextrine);
- sistemele de transport pentru aminoacizi au afinitate mai înaltă pentru substratul specific (comparativ cu
cele ce transportă glucide), fapt care se corelează cu concentraţia diferită a celor două categorii de molecule
în mediu şi cu rata lor diferită de metabolizare;
- sistemele de transport pentru oligopeptide au o specificitate mai mică de legare. La E. coli s-au identificat
trei sisteme de transport ale oligopeptidelor: unul care leagă nespecific orice dipeptid, unul pentru tripeptide şi
altul care leagă orice peptid mai mic de 6 resturi.
Relativa lipsă de specificitate a permeazelor face posibilă pătrunderea unor molecule pentru care
membrana nu este permeabilă, prin cuplarea lor cu peptidele. Astfel pătrund agenţii chimici antibacterieni,
care se leagă de peptide prin legături labile şi se eliberează intracelular, după hidroliza peptidelor.
Transportul membranar prin translocaţie de grup se realizează cu consum de energie. Este o
modalitate de a economisi energia, deoarece cea cheltuită prin fosforilare este folosită atât pentru realizarea
transportului, cât şi pentru prima treaptă a metabolizării glucidului. Translocaţia de grup realizează
acumularea moleculei transportate în celulă, la o concentraţie net superioară celei din mediu.

Transportul activ
Transportul activ este modalitatea de transfer intracelular al nutrienţilor contra gradientului de
concentraţie, prin care substanţele pot fi concentrate de l000 de ori în interiorul celulei, faţă de mediul extern.
Procesul este totdeauna energizat de o sursă primară de energie şi se evidenţiază prin incubarea celulelor în
prezenţa unui compus marcat radioactiv. Sursa de energie a transportului activ are trei origini: transportorii
cuplaţi leagă transportul contra gradientului de concentraţie al unei molecule cu transportul în sensul
gradientului al alteia; pompele dependente de ATP cuplează transportul contra gradientului de concentratie cu
hidroliza ATP; pompele dependente de lumină cuplează transportul cu aportul de energie luminoasă (de
exemplu, bacteriorodopsina de halofilelor).

19
Figura 13. Ilustrarea schematică a mecanismului transportului activ. Ca şi în cazul difuziei facilitate, moleculele
transportoare sunt proteine membranare integrate, dar spre deosebire de difuzia facilitată, procesul de transport activ are
loc contra gradientului de concentraţie şi de cele mai multe ori, consumă energie stocată în ATP (dupa Black, 1996).

Pentru a fi atribuită transportului activ, substanţa trebuie să se acumuleze în aceeaşi formă chimică (şi
nu sub forma unui derivat al său). Pentru aminoacizi, dovada transportului activ se obţine mai uşor, deoarece
între momentul pătrunderii lor în celulă, până la încorporarea lor în proteine există un interval de timp
suficient pentru evidenţierea lor, însă zaharurile sunt metabolizate rapid şi de aceea este necesar blocajul
metabolic (prin utilizarea mutantelor bacteriene care si-au pierdut capacitatea de a le metaboliza sau prin
utilizarea unui analog nemetabolizabil).
Transportul activ se realizează prin intermediul proteinelor membranare de transport (fig. 13).
Existenţa proteinelor membranare de transport a fost dedusă din creşterea peak-ului electroforetic al
proteinelor marcate în prezenţa moleculei transportate şi din dispariţia lor în celulele mutante pentru sistemul
respectiv de transport. Prima proteină purtător, identificată printre proteinele membranare solubilizate este
proteina sistemului lac la E. coli. Este o proteină inductibilă, iar în celulele bacteriene crescute pe mediu cu
lactoză, ea reprezintă 4% din totalul proteinelor membranare.
Proteinele de transport sunt proteine transmembranare (integrate) şi au domenii expuse atât spre
citoplasmă cât şi spre mediul extern. Structural, moleculele transportoare formează circa 12 helice care se
pliază pentru a forma un canal transportor. Transportul implică o schimbare conformaţională a proteinei, după
legarea substratului specific. Uneori transportul activ este foarte specific, adică pentru fiecare tip de moleculă
transportată există o anumită moleculă purtător, care o preia de pe o faţă a membranei şi o transferă pe
cealaltă. Acestea sunt sisteme uniport. Alte sisteme transportă simultan, în acelaşi sens o substanţă, împreună
cu o alta necesară pentru transport (sisteme simport). O altă categorie realizează concomitent transportul a
două tipuri de molecule, în direcţii opuse (sisteme antiport) (Alberts, 1994). Transportul activ al multor
glucide şi aminoacizi în celula bacteriană este dependent de gradientul electrochimic de H + prin membrana
plasmatică. Substanţa care este transportată se leagă specific cu o proteină membranară purtător, după care
molecula transportată este eliberată nemodificată chimic, în interiorul celulei. Specificitatea proteinelor
membranare de transport s-a demonstrat prin experimente de mutageneză care au arătat că o singură mutaţie
genică anulează capacitatea bacteriei de a transporta glucide specifice prin membrană. Substanţele transportate
activ sunt unele glucide, aminoacizii, acizii organici, ionii anorganici (K +, Mg2+, SO42- , PO43-). Glucoza este
luată prin procese active la unele bacterii, iar la altele, prin sistemul fosfotransferazei.
Transportul activ necesită consum de energie, deoarece transportorii funcţionează pe principiul pompelor
concentrative. La bacterii, energia necesară activării pompelor este rezultatul separării ionilor de H +, de
electroni, în grosimea membranei, ceea ce constituie forţa proton-motrice. Se creează un gradient de
concentraţie a protonilor între exteriorul şi interiorul celulei. Protonii sunt expulzati de pompe specifice
dependente de ATP si se concentrează la exteriorul celulei, iar în interior se concentrează OH -. Potenţialul
electrochimic are rol esenţial pentru transportul activ.
La bacteriile Gram negative, transportul moleculelor în celulă este rezultatul acţiunii a două
mecanisme, ambele consumatoare de energie. Moleculele sunt transportate în spaţiul periplasmic prin

20
intermediul porinelor. În spaţiul periplasmic, molecula transportată se leagă specific cu o proteină
periplasmică, care facilitează transportul în citoplasmă, pe calea unei proteine purtătoare specifice din
membrana celulei, energia necesară transportului fiind furnizată prin hidroliza ATP. Această clasă de
transportori s-a denumit sisteme ABC (ATP- Binding Cassette). Un alt mecanism de transport este reprezentat
de sistemul fosfotransferazei.
Adeseori, celulele bacteriene posedă două tipuri de sisteme de transport: sisteme constitutive, relativ
nespecifice, în condiţiile unei relative abundente a nutrienţilor şi sisteme inductibile, cu specificitate înaltă,
active în condiţii de stress, provocat de deficitul substanţelor nutritive sau indus de substanţe toxice.

Sisteme celulare de transport ionic

Pentru o moleculă fără sarcină, gradientul de concentraţie determină transportul pasiv şi sensul lui.
Dublul strat lipidic este foarte impermeabil pentru moleculele încărcate electric, mici sau mari. Sarcina şi
gradul de hidratare le împiedică să pătrundă în dublul strat lipidic. Transportul lor este influenţat atât de
gradientul de concentraţie, cât şi de diferenţa de potenţial electric a membranei, adică de potenţialul
membranar. Gradientul de concentraţie şi gradientul electric, adică gradientul electrochimic, determină forţa
netă de transport pentru fiecare tip de moleculă. Diferenţa de potenţial a membranei (negativ pe faţa internă)
favorizează intrarea cationilor, dar se opune accesului anionilor.
Membrana citoplasmatică are rol de barieră osmotică, prin permeabilitatea foarte selectivă, permiţând
trecerea (ieşirea) unor anioni, dar reţine cationii esenţiali care au acces în şi din celulă, numai pe calea unor
unor sisteme specifice de transport. Ionii de K +, Mg2+, SO42-, PO43- sunt transferaţi activ în celulă, prin
intermediul unor molecule purtătoare cu specificitate înaltă, denumite pompe ionice.
Sistemele de transport pentru ionii cu importanţă nutritrivă sunt sisteme de influx, iar cele pentru
transportul ionilor toxici sunt sisteme de eflux şi reprezintă substratul molecular al mecanismelor de rezistenţă.
Aceste pompe au o importanţă excepţională pentru sistemele biologice, deoarece realizează şi menţin pH,
gradientele ionice şi potenţialul de membrană. Sistemele de transport pentru Na +, Ca2+, H+ şi Cl- sunt sisteme
de eflux şi au rolul de a menţine concentraţii intracelulare scăzute şi de a realiza gradiente ionice
transmembranare. Sistemele de eflux pentru cationi consumă energie furnizată prin hidroliza ATP. Unii ioni
(Cu2+, Zn2+) au rolul de micronutrienţi, fiind utili la concentraţii mici şi sunt concentraţi prin sistemele de
influx, dar sunt toxici la concentraţii mari, fiind eliminaţi prin sistemele de eflux. Pentru aceşti cationi,
sistemele de influx şi de eflux sunt separate. Sistemele de eflux pentru cationii toxici sunt fie consumatoare de
ATP ori sunt cuplate cu un sistem antiport de înglobare a altui cation (H +, Na+, Ca2+).

1.4. Nucleoidul bacterian

Spre deosebire de celulele eucariote care au un nucleu cu structură bine definită, delimitat de o
membrană şi conţinând un număr definit de cromosomi, “nucleul” bacterian reprezintă o formă primitivă de
organizare, lipsită de membrană, inclavată direct în citoplasmă. Particularitatea structurii nucleare – lipsa
membranei delimitante – este fundamentală pentru organizarea celulară de tip procariot, căruia îi aparţin
bacteriile. Datorită caracterelor structurale particulare, “nucleul” bacterian a primit diferite denumiri:
nucleoid, material nuclear, nucleoplasmă, echivalent nuclear sau chiar nucleu, prin analogie cu nucleul
celulei eucariote, lineom sau genofor.
Aparatul genetic bacterian este reprezentat de două tipuri de structuri: nucleoidul, care din punct de
vedere structural şi funcţional corespunde cromosomului, iar cea de a doua categorie de structuri o reprezintă
plasmidele. Corespunzător celor două tipuri de structuri, determinanţii genetici sunt de două categorii: gene
esenţiale (eucromosomale), localizate în structura cromosomului şi genele accesorii, cu localizare plasmidială
sau în structura elementelor genetice transpozabile şi a unor fagi.
Cromosomul bacterian, ca structură genetică esenţială poartă informaţia genetică ce asigură
desfăşurarea funcţiilor esenţiale pentru existenţa celulei, adică setul de determinanţi minim necesari pentru a
codifica arhitectura celulei şi pentru a asigura metabolismul energetic şi de biosinteză, creşterea, diviziunea şi
reglarea diferitelor activităţi celulare. Structurile genetice extracromosomale (plasmidele) poartă informaţia
genetică accesorie, “de confort”, care permite celulei o mai bună adaptare la condiţii de mediu, noi sau
modificate. Genomul E. coli K12 este alcătuit din circa 4400 de gene. Pentru creşterea în laborator ar fi
necesare numai câteva sute. Genomul este rezultatul acţiunii forţelor selective pentru eficienţă metabolică şi
adaptabilitate.
Fiind foarte bogată în ARN, citoplasma celulei bacteriene este intens bazofilă, fapt ce nu a permis
diferenţierea materialului nuclear, la fel de bazofil, după colorarea cu coloranţi bazici de anilină. De aceea, s-a

21
considerat că nucleul bacterian lipseşte sau dimpotrivă, că bacteriile ar avea un nucleu imens care ocupă
întreaga celulă. Datorită bazofiliei citoplasmei, evidenţierea materialului nuclear la microscopul optic este
posibilă după utilizarea tehnicilor de colorare selectivă, ce constau în îndepărtarea ARN prin hidroliză acidă
(tehnica Robinow şi Feulgen) sau enzimatică (cu ribonuclează) şi utilizarea coloranţilor de anilină. După
hidroliza ARN, materialul nuclear apare sub diferite forme: sferică, ovalară, de halteră, de bastonaş,
reprezentând 5 - l6% din volumul celulei. După tratamentul celulelor cu DN-ază, zona corespunzătoare
materialului nuclear apare golită de conţinut.
Pe micrografiile electrono-optice, materialul nuclear este localizat, în mod obişnuit, în partea centrală
a celulei şi se distinge de citoplasma înconjurătoare, prin densitatea sa mai mică la fluxul de electroni, în
contrast cu celula eucariotă, la care nucleul este mai electronodens, comparativ cu citoplasma (fig. 14).

Figura 14. Imaginea electrono-optică a nucleoidului bacterian la Bacillus subtilis, x 100 000 (original).

Celula procariotă are un contrast invers al structurilor sale, în raport cu celula eucariotă, care se
datorează atât faptului că molecula de ADN nu este asociată cu proteine, cât şi densităţii foarte mari a
citoplasmei bacteriene.
Pe secţiuni ultrafine, zona materialului nuclear este ocupată de fibrile fine, cu diametrul de 2,5 nm,
uneori aranjate în şiruri ondulate, paralele, asemănătoare cu o jurubiţă de aţă şi sunt sensibile la hidroliza cu
DN-ază.

Organizarea fizică a cromosomului

Materialul nuclear poate fi izolat din celulă sub forma unui corpuscul dens şi compact. După
tratatamentul cu RN-ază, din corpusculul dens se eliberează cromosomul circular, format dintr-o singură
moleculă de ADN, circulară, închisă covalent, cu o lungime de l400 µm şi diametrul de 2,5 nm, corespunzător
diametrului moleculei de ADN dublu catenar. Circularitatea este o condiţie a existenţei sale. Sub această
formă, molecula de ADN este rezistentă la acţiunea exonucleazelor citoplasmatice, active asupra moleculelor
lineare de ADN. Cromosomul bacterian este cea mai mare moleculă biologică. Prin lungimea sa (1400 µm),
molecula de ADN cromosomal depăşeşte de circa l000 de ori lungimea celulei bacteriene.Corpusculul dens
corespunde stării “împachetate” a cromosomului. După tratamentul moderat cu RN-ază şi proteaze, din
structura compactă se izolează ADN (60%), ARNm, ARNt (30%) şi ARN-polimeraza (l0%). Raportată la
dimensiunile mici ale unei bacterii, molecula de ADN este supusă constrângerilor topologice de
supraspiralizare (suprarăsucire), prin care este “împachetată” pentru a forma un corp compact de l500 de ori
mai mic. Pentru a ocupa un volum atât de mic, molecula de ADN se împachetează după norme foarte
riguroase, astfel încât, în orice moment, din cele 3000-5000 de gene pe care le conţine, oricare să fie
accesibilă sistemelor celulare de transcriere şi traducere. Moleculele de ARN au un rol esenţial în menţinerea
stării compacte a ADN. S-au propus mai multe modele de împachetare a moleculei de ADN. Cel mai acceptat
este acela propus de Pettijohn si Hecht (l974) (citat de Zarnea, 1983), în acord cu care, împachetarea se face
printr-un proces de pliere şi supraspiralizare (formare de suprahelice) (fig. 15). Se formează astfel o structură
condensată, menţinută prin acţiunea asociată a proteinelor din nucleoid. Modelul de împachetare prin pliere şi
supraspiralizare încearcă să explice mecanismul molecular al drumului invers, de la structura circulară
relaxată a macromoleculei de ADN, la arhitectura corpusculului dens existent în celulă. Pentru împachetare se
consideră că molecula dublu catenară, circulară, iniţial se pliază, în 40-60 de domenii egale. Punctele de pliere
sunt determinate de molecule de ARN nascente, legate cu una dintre extremităţi de ARN-polimerază.

22
Moleculele de ARNr şi ARNt, împreună cu ARN-polimeraza participă la formarea şi menţinerea domeniilor
de pliere.

Figura 15. Diferite stări fizice (de impachetare) ale cromosomului bacterian. a. Bucle multiple de ADN dintr-o
celulă spartă prin şoc hipotonic, răspândite pe suportul reprezentat de o proteină bazică. b. Diagrama ADN
supraspiralizat. În stânga sunt reprezentate 7 domenii (numărul real este de circa 50) supraspiralizate, menţinute astfel de
un set de proteine, care stabilizează capetele unui domeniu. Buclele mici ale fiecărui domeniu pot fi spiralizate în jurul
unui set de proteine nucleosomale, reducând tensiunea în dublul helix, creată prin supraspiralizare. În dreapta, două
domenii au fost incizate la nivelul unei catene, permiţând rotaţia helixului şi relaxarea supraspiralei (dupa Pettijohn şi
Sinden, 1985).

Prin pliere, diametrul cromosomului scade la circa 30 µm. In interiorul fiecărui domeniu de pliere are
loc un proces de supraspiralizare. Supraspiralizarea este o stare fizică în care molecula de ADN se pliază prin
răsucire în jurul propriei axe. Intr-o etapă ulterioară, domeniile suprahelicale se pliază din nou unul faţă de
altul, superior şi inferior faţă de un plan orizontal. Astfel, rezultă masa compactă a nucleoidului, aşa cum se
evidenţiază la microscopul optic şi se poate izola din celulă.
Rolul topoizomerazelor în menţinerea configuraţiei supraspiralizate a moleculei de ADN
Spiralizarea ADN are sens pozitiv şi negativ. Spiralizarea primară a dublului helix are sens pozitiv (de
dreapta), cu 10,4 pb/tur. Anumite secvenţe de ADN, mai ales cele care conţin resturi alternante de G şi C, tind
să formeze un helix răsucit spre stânga (forma Z) a moleculei de ADN, denumită astfel deoarece axa glucid-
fosfat are o structură în zig-zag. Spiralizarea secundară (supraspiralizarea) are sens negativ (de stânga), adică
se produce prin răsucirea moleculei de ADN în sens opus spiralizării primare (pozitive) a dublului helix.
Molecula de ADN bacterian este, în mod normal, supraspiralizată negativ, cu o spirală negativă la fiecare
circa 200 pb. Cromosomul bacterian constă dintr-un număr mare de bucle supraspiralizate, aranjate pe o
regiune centrală, rezultând o structură compactă şi organizată - nucleoidul. Prin supraspiralizarea negativă,
între capetele domeniului pliat, se creează o tensiune de torsiune, direct proporţională cu gradul de spiralizare,
care se menţine atâta timp cât molecula este închisă covalent. Tensiunea este anulată prin incizia unei catene
şi formarea buclelor de ADN. Catena incizată se roteşte liber în jurul axei moleculei, se relaxează, ia forma
circulară deschisă, fără superhelice. Formarea unei bucle elimină un tur al suprahelicei şi reduce tensiunea
generală a suprahelicei. Formarea suprahelicei şi relaxarea ei este condiţionată de activitatea unui set de
enzime, denumite ADN-topoizomeraze. Topoizomerazele sunt enzime care schimbă configuraţia spaţială a
ADN prin ruperea şi reunirea catenelor. Unele topoizomeraze sunt helicaze sau giraze (produc spiralizarea
moleculei de ADN), iar altele sunt derulaze (produc despiralizarea prin incizia unei catene şi bucla se
relaxează). O topoizomerază este o nuclează reversibilă, care se leagă covalent la o grupare fosfat a ADN şi
rupe legătura fosfodiesterică. Deoarece legătura covalentă care uneşte topoizomeraza la o grupare fosfat a
ADN reţine energia legăturii fosfodiesterice pe care o rupe, reacţia este reversibilă, adică incizia este urmată
de legarea celor două capete. Legarea este rapidă şi nu necesită un aport suplimentar de energie.

23
Topoizomerazele de tip 1 acţionează prin recunoaşterea unui segment de ADN, parţial despiralizat,
prin incizia unei catene, ceea ce permite celor două părţi ale helicei de ADN, de o parte şi de alta a inciziei, să
se rotească liber una faţă de alta, în sensul care reduce tensiunea de supraspiralizare. Aceasta înseamnă că
replicarea ADN se face numai cu rotaţia unei mici părţi a helicei, adică a celei situată în aval de bifurcaţie.
Topoizomeraza I, prin clivarea unei catene, elimină tensiunea de torsiune şi formează bucle externe distribuite
pe toată suprafaţa nucleoidului. Buclele sunt secvenţele de ADN care conţin genele transcrise la un moment
dat. Ele sunt invizibile, extinse în citoplasmă şi în această topografie sunt mai uşor accesibile ADN-
polimerazei şi ARN-polimerazei. Pe secţiuni subţiri, anticorpii marcaţi cu aur, specifici faţă de ADN
monocatenar colorează numai periferia nucleoidului, iar anticorpii specifici faţă de ADN dublu catenar
colorează partea centrală (condensată) a nucleoidului.
Topoizomerazele de tip II se leagă covalent, simultan, de cele două catene ale dublei helice şi produc
o rupere bicatenară tranzitorie. Aceste enzime se activează la situsurile cromosomale la nivelul cărora se
întrepătrund două duble helice. După fixarea topoizomerazei la un astfel de situs, are loc clivarea uneia din
cele două helice duble şi trecerea celei de a II-a catene, prin breşa creată, urmată de repararea discontinuităţii
înainte de a se disocia de ADN. ADN-polimeraza de tip II poate astfel să separe cele două molecule de ADN
catenate.
ADN-giraza (sau topoizomeraza II) modifică configuraţia spaţială a moleculei de ADN, prin
catalizarea suprarăsucirii negative ale ADN cromosomal şi plasmidial, uşurând împachetarea cromosomului
bacterian în spaţiul restrâns al celulei. Este o proteină heterotetramerică formată din două subunităţi A (gyr A)
şi două subunităţi B (gyr B) (la E. coli proteinele gyr au 97 kDa). Subunităţile A şi B ale topoizomerazei II
sunt codificate de genele gyr A şi gyr B. După purificarea ADN-girazei de E. coli, structura acestei enzime a
fost investigată pentru numeroase alte specii bacteriene, evidenţiidu-se un grad înalt de omologie între
subunitaţile A, pe de o parte, şi a subunitaţilor B, pe de altă parte. Cu toate acestea, secvenţa situsurilor
catalitice din proteinele gyr A şi aceea a situsului de hidroliză a ATP în proteinele gyr B sunt foarte
conservate. ADN-giraza purificată introduce răsuciri suprahelicale negative ale moleculei de ADN circulară
închisă şi separă reversibil moleculele circulare catenate. Aceste activităţi sunt dependente de energia eliberată
prin hidroliza ATP şi constau în clivarea ambelor catene ale moleculei de ADN, trecerea altui duplex de ADN
(sau alt segment al aceluiaşi duplex) şi reunirea catenelor. Activitatea ADN-girazei este inhibată de quinolone
Subunitatea A a fost desemnată ca ţinta preferenţială a acţiunii quinolonelor. Subunitatea B este ţinta altor
antibiotice: cumermicina şi novobiocina.
ADN-giraza este singura enzimă care influenţează gradul de spiralizare al ADN, prin catalizarea
suprarăsucirilor negative ale ADN cromosomal şi plasmidial, fiind esenţială pentru menţinerea stării
suprahelicale a cromosomului bacterian. Inhibiţia activităţii acestei enzime de către fluoroquinolone este
asociată cu moartea rapidă a celulei bacteriene. Proteina se leagă de ADN ca un tetramer, în care cele două
subunităţi A şi două subunităţi B împachetează ADN prin supraspiralizare negativă. ADN giraza elimină
răsucirile suprahelicale pozitive care se acumulează înaintea bifurcaţiei de replicare. Aceste activităţi sunt
rezultatul secţionării coordonate a ambelor catene ale ADN, trecerea celuilalt segment de ADN prin nişă şi
restabilirea continuităţii catenei. Mecanismul de acţiune este caracteristic topoizomerazei II. Situsul catalitic al
ADN-girazei este situat la tirozina din poziţia 122 a subunitaţii A. Subunitatea B cuprinde situsul de hidroliză
a ATP, hidroliză care furnizează energia necesară activităţii enzimatice. ADN-giraza este esenţială pentru mai
multe procese vitale: iniţierea şi progresia bifurcaţiei de replicare, terminarea replicării, transcrierea unor
operoni, repararea ADN, recombinarea şi transpoziţia.
Topoizomeraza IV a fost descrisă recent, iar funcţia sa principală este decatenarea, adică separarea
copiilor ADN circular dublu catenar după replicarea cromosomului bacterian şi a plasmidelor. Topoizomeraza
IV este omologă structural cu ADN giraza. Este o enzimă de separare a catenanilor (a moleculelor surori
catenate de ADN), rezultaţi dintr-un rund de replicare bidirecţională şi permite segregarea lor în celulele
surori. ADN-giraza şi topoizomeraza IV acţionează asupra dublei catene, dar efectele sunt diferite: giraza
împachetează ADN prin inducerea supraspiralizării, iar topoizomeraza IV separă moleculele reunite prin
legături intermoleculare. Topoizomeraza IV este formată la fel ca ADN-giraza din două subunităţi denumite
Par C şi două subunităţi Par E, cu aceeaşi repartiţie funcţională ca şi a subunităţilor ADN-girazei. Proteinele
Par C şi Par E sunt foarte asemănătoare prin structura lor primară cu proteinele Gyr A şi Gyr B (40% din
secvenţa aminoacizilor este identică) şi sunt codificate de genele parC şi parE. Topoizomeraza IV modifică
într-o măsură mult mai mică topologia ADN dublu catenar: rolul său este important pentru separarea catenelor
de ADN după terminarea replicării. Rolul topoizomerazei IV, ca ţintă specifică a quinolonelor a fost recent
demonstrat la E. coli, S. aureus şi N. gonorrhaeae.
Ryter şi Chang (l975) consideră că nucleoidul evidenţiat la microscopul electronic ca o structură netă
ar reprezenta fracţia de ADN condensat, genetic inactivă, care din punct de vedere topologic reprezintă ADN
supraspiralizat. Proporţia între ADN supraspiralizat şi ADN relaxat este menţinută prin echilibrul dintre ADN-

24
giraza (topoizomeraza II), enzima care produce supraspiralizarea şi topoizomeraza I, enzima care produce
relaxarea.
Domeniile cromosomului bacterian sunt topografic independente, ceea ce permite rotaţia lor liberă şi
relaxarea individuală a fiecărei supraspirale, care trece reversibil în starea de buclă, configuraţie în care se
replică, este transcrisă sau reparată. ADN bacterian, ca şi la eucariote este asociat cu proteine. În celula
eucariotă, corpii proteici în jurul cărora se spiralizează dubla catenă de ADN se numesc nucleosomi. La
bacterii, organizarea moleculară a nucleosomilor este puţin cunoscută. Se pare că ei conţin două proteine de
legare pentru ADN: proteina HU (Helix Unwinding) şi proteina I. Ele se găsesc în structura nucleosomului, în
proporţia de o moleculă la l50-200 perechi de baze.

1.5. Ribosomii

Ribosomii sunt organite ribonucleoproteice, localizate în citoplasmă, care la microscopul electronic au


formă sferică, cu diametrul de aproximativ 20 nm. Pe baza constantei de sedimentare (S) se disting
următoarele categorii de ribosomi: a) ribosomi 80 S, în citoplasma celulelor eucariote; b) ribosomi
mitocondriali şi cloroplastici, între 55 S la mamifere şi 75 S la plantele superioare; c) ribosomii Archaea, de
70 S, asemănători din punct de vedere funcţional cu ribosomii 80 S ai eucariotelor, datorită absenţei
sensibilităţii la streptomicină şi cloramfenicol şi prin sensiblitatea la toxina difterică; d) ribosomii
eubacteriilor, de 70 S.
Numărul ribosomilor în celula bacteriană este corelat cu activitatea ei fiziologică: este mic în celulele
în repaus, dar creşte foarte mult în celulele fiziologic active (în medie 20000 ribosomi/celulă, cu variaţii între
l5-l00 000).
Ribosomii sunt structuri dinamice, calitate ce se reflectă în capacitatea lor de a se disocia în două
subunităţi, de 30 S şi 50 S şi de a se reasocia. Disocierea şi reasocierea sunt corelate cu variaţia concentraţiei
ionilor de Mg2+: creşterea concentraţiei ionilor favorizează asocierea, iar scăderea concentraţiei lor produce
disocierea. Circa l0% din numărul total de ribosomi sunt asamblaţi, liberi în citoplasmă. Ei sintetizează
proteinele structurale. Alţi l0% se găsesc sub forma subunităţilor disociate, iar restul de 80% sunt polisomi.
Ribosomii au două localizări: liberi în citoplasmă sau ataşaţi feţei interne a membranei citoplasmatice.
La nivelul celor ataşaţi se sintetizează proteinele de export. Studiul ribosomilor a beneficiat de tehnici din
domeniul fizicii (metoda dispersiei neutronilor), care, în asociaţie cu tehnicile de chimie au permis înţelegerea
structurii şi funcţiei ribosomilor. La microscopul electronic, s-a demonstrat că ribosomii au formă complexă,
cea sferică percepută în mod obişnuit fiind rezultatul examinării cu sisteme optice cu putere redusă de
rezoluţie. Subunitatea 50S are o formă asemănătoare cu aceea a unui fotoliu, iar subunitatea 30S se aseamănă
cu o halteră asimetrică, aşezată orizontal pe braţele şi spătarul fotoliului. Între cele două subunităţi rămâne un
spaţiu prin care trece ARNm.
Din punct de vedere biochimic, ribosomii bacterieni conţin circa 55 de tipuri de molecule proteice şi
trei tipuri de molecule de ARNr. Studiile privind structura funcţională a ribosomilor s-au făcut cu două
metode foarte sensibile: difracţia cu neutroni şi imunoelectronomicroscopia.
Subunitatea mică 30 S cuprinde 2l tipuri de molecule proteice (S 1 - S21), în ordinea descreşterii
mărimii, cu greutatea moleculară între 60 000 Da şi 8 000 Da şi o moleculă de ARNr l6S, alcătuită din circa
l6000 nucleotide.
Subunitatea mare, 50S conţine 34 tipuri de molecule proteice (L l - L34, L= Large), cu greutatea
moleculară cuprinsă între 9 - 28,5 kDa şi două molecule de ARNr, de 23 S şi respectiv 5 S. Cele două tipuri de
molecule de ARN provin prin clivarea unui precursor comun, de 30 S. Cele 55 de tipuri de proteine
ribosomale se găsesc într-un singur exemplar (o singură moleculă din fiecare tip). Unele au rol structural,
fiind esenţiale pentru asamblarea ribosomului, altele au rol funcţional, permiţând legarea ARNm în procesul
traducerii şi sintezei lanţului proteic. La E. coli, în fiecare subunitate ribosomală, raportul ARN-proteine este
2/l, iar la alte bacterii, raportul este 2/3. Moleculele componente au o distribuţie fixă, riguroasă în structura
ribosomului. Molecula de ARNr este pliată într-o structură tridimensională ce formează regiunea centrală a
ribosomului şi determină aspectul său. Proteinele care se leagă de ARNr 16 S sunt mai profunde şi sunt cele
mai protejate de acţiunea agenţilor externi. Proteinele sunt localizate în general la suprafaţa ribosomului, în
depresiunile pe care le creează ARN pliat. Unele proteine conţin domenii globulare, localizate la suprafaţă, ce
trimit extensii în regiunea centrală a ribosomului. Interacţiunile fixe ale componentelor condiţionează
procesele de autoasamblare a ribosomilor.
Asamblarea ribosomilor. In condiţii experimentale, componentele ribosomale se dispersează şi se
autoasamblează după restabilirea condiţiilor de mediu, pentru a produce ribosomi activi. S-a reconstituit
subunitatea 30 S, dar reasamblarea subunităţii 50 S este mai complexă deoarece este dependentă de
temperatură (60o C) şi proteinele se denaturează la această temperatură. În studiile experimentale s-au utilizat

25
ribosomi de Bacillus stearothermophilus, ale căror proteine sunt termostabile, rezistente la 60 o C. Ulterior s-a
reasamblat subunitatea 50 S de la E. coli. Reasamblarea ribosomilor urmează o cale specifică: anumite
proteine se leagă de ARN şi complexul este recunoscut succesiv de alte proteine, până ce structura devine
completă. Ribosomii reconstituiţi sunt funcţionali (fac sinteză proteică). Rolul proteinelor pare a fi de
stabilizare a ARN, dar ele permit schimbarea configuraţiei ARNr, necesare catalizei sintezei proteinelor.
Ribosomii reprezintă componenta esenţială a sistemului de traducere a informaţiei genetice. Ei sunt
adevăratele fabrici de proteine ale celulei. Ribosomii au rolul de a menţine atât molecula de ARNm, cât şi
complexul aminoacil-ARNt, într-o orientare corespunzătoare pentru a permite atât citirea mesajului, cât şi
formarea legăturilor peptidice. Ribosomii se asociază în polisomi (poliribosomi), adică grupări funcţionale
formate din 4 - 50 unităţi ribosomale. Dimensiunile polisomilor variază în funcţie de lungimea ARNm.
Polisomii sintetizează concomitent mai multe molecule proteice pe aceeaşi moleculă de ARNm.

1.6. Sporul bacterian

Sporul este o forma primitivă de diferenţiere celulară, care constă în reorganizarea structurală şi
funcţională a celulei vegetative şi formarea unui nou tip de celulă, cu proprietăţi noi. Sporii se formează la
bacteriile cilindrice: totdeauna la bacilii anaerobi din genul Clostridium, facultativ la cei aerobi din genul
Bacillus, excepţional la coci (Sporosarcina) şi la actinomicete. Toate bacteriile sporulate sunt Gram pozitive.
Sporularea este condiţionată de existenţa unui perete mureinic gros şi de formarea septului de diviziune.
Există circa l0 tipuri de spori, ce se deosebesc prin modul de formare, prin structură şi prin rezistenţă la
factorii de mediu. Cel mai caracteristic este endosporul, denumit astfel deoarece se formează în interiorul unei
celule vegetative. La actinomicete se formează câteva tipuri de spori: artrospori (prin segmentare), oidiospori
(prin fragmentare), aleuriospori (se formează apical sau lateral pe sporofori scurţi), zoospori (spori mobili), iar
aplanosporii se formează prin septarea hifelor şi sunt menţinuţi în interiorul unui înveliş. La Azotobacter se
formează chişti.
Endosporul sau sporul endogen a fost considerat ca unic tip sporal bacterian, până la descrierea
celorlalte tipuri. Are formă sferică sau ovalară. Cei ovalari au dimensiuni cuprinse între 0,5 – 1 µm, pentru
axul scurt şi 1,2 – 2 µm pentru axul lung. Endosporul are o refringenţă deosebită şi pe preparatul proaspăt
apare strălucitor. Este foarte greu colorabil datorită învelişurilor sporale groase, greu penetrabile pentru
coloranţi (în special cortexul) şi datorită conţinutului lor chimic particular. Se colorează prin tehnici speciale.
Poziţia sporului în celulă poate fi terminală, subterminală sau centrală. În funcţie de dimensiunile faţă
de diametrul celulei vegetative, sporii sunt deformanţi (diametrul lor este mai mare decât al celulei) şi
nedeformanţi (diametrul lor este mai mic decât al celulei).
Intr-o celulă bacteriană sporulantă, sporii sunt unici, cu rare excepţii: în sol apar bacterii bisporulate,
iar în intestinul unor vertebrate acvatice, bacterii polisporulate. Semnificaţia sporilor multipli nu este clară. Se
pare că ei apar ca rezultat al perturbării mecanismului de separare a celulelor după diviziune. Sporii multipli
apar în celulele în care materialul nuclear s-a replicat, dar nu s-a format septul de diviziune.
Sporogeneza este declanşată în mod obişnuit de lipsa unui nutrient esenţial în mediu, sursa de azot sau
de carbon. Procesul este foarte complex din punct de vedere genetic, biochimic, structural şi funcţional.
Sporularea implică activarea unui număr mare de gene sporale (peste 50) inactive în celula vegetativă, în timp
ce sunt represate genele active în celula vegetativă. Sub aspect biochimic, sporularea este însoţită de
modificări majore ale componentelor moleculare şi structurale. Se sintetizează proteazele care măresc
turnover-ul proteic, furnizând aminoacizii necesari sintezei proteinelor noi. Din punct de vedere funcţional,
celula sporală dobândeşte o rezistenţă deosebită la factorii fizici şi chimici. Din punct de vedere structural, la
nivel electrono-optic, sporularea la B. subtilis parcurge 7 stadii, în cursul cărora celula sporală se formează şi
se eliberează. Sporularea este precedată de replicarea materialului nuclear. Ulterior, cei doi cromosomi
fuzionează, formând o structură axială alungită unică. Nucleoidul axial diploid segregă în două structuri
cromosomale: una migrează spre polul sporal şi va deveni nucleoidul sporului, iar cealaltă rămâne în celula
vegetativă. Formarea septului sporal este iniţiată prin apariţia a două mici protuberanţe simetrice ale peretelui,
spre interiorul celulei. Membrana citoplasmatică îmbracă aceste excrescenţe, se invaginează şi formează
membrana presporului. Cele două intruzii ale membranei se închid ca o diafragmă, de la exterior spre interior.
Membrana presporului este dublă şi delimitează componentele celulare ale viitorului spor. Formarea sa este
completă la 5 ore după iniţiere. În stadiile ulterioare, din materialul care se depune între cele două membrane
ale presporului se definitivează morfogeneza cortexului, format din trei lamele: lama internă (profundă), care
va deveni peretele sporului, iar după germinare, peretele viitoarei celule; lama intermediară sau cortexul
propriu-zis, cu grosime variabila şi lama externă. S-au izolat mutante bacteriene care blochează sporogeneza
în diferite etape.

26
Structura internă a endosporului
La diferite grupe de bacterii există variaţii importante ale structurii sporului, în special în privinţa
învelişurilor, care diferă prin numărul şi grosimea lor. Există de asemenea variaţii cu privire la relaţia sporului
cu celula vegetativă în care s-a format: sporul rămâne inclus în celulă sau se eliberează curând după formare,
prin liza acesteia.
Sporul este alcătuit din protoplastul sporal, care conţine sporoplasma şi materialul nuclear. Protoplastul
sporal este acoperit de următoarele structuri:
- un perete intern subţire, originar din membrana internă a presporului. După germinare, acesta va
forma peretele celulei vegetative;
- cortexul sporal, cu grosime variabilă, electronodens. Este o structură multilaminară ce se formează
pe feţele adiacente ale celor două membrane ale presporului;
- stratul extern al cortexului, derivat din membrana externă a presporului;
- învelişul sporal intern (intina), un strat dens, de natură proteică;
- învelişul sporal extern (exina). Uneori, aceste două învelişuri sunt pluristratificate;
- exosporul, un rest al celulei vegetative, uneori adiacent de celelalte învelişuri sporale, prin
intermediul filamentelor “suspensoare” (fig. 16).

Figura 16. Imagine electrono-optică a secţiunii transversale prin sporul în curs de formare la B.
megatherium. Componenta structurală electronodensă, delimitantă a protoplastului, este cortexul sporal (x
120000, original).

La unele categorii de spori se găsesc structuri suplimentare denumite apendice sporale. Semnificaţia
lor funcţionala nu este certă, dar ar putea fi implicate în dispersarea sporilor în natură sau ar facilita absorbţia
substanţelor nutritive în perioada premergatoare germinării sporului.
Particularităţile biochimice ale sporului
Schimbarea specificităţii ARN-polimerazei este foarte importantă pentru controlul sporulării la B.
subtilis. Când începe sporularea, multe gene active în celula vegetativă sunt represate şi sunt activate genele
specifice. Fiecare stadiu al sporulării este marcat de schimbarea expresiei unor gene, mediată de factorul
sigma, care schimbă specificitatea legării ARN-polimerazei de promotor. Protoplastul sporal conţine toate
categoriile de molecule necesare reluării creşterii: materialul nuclear şi cantităţi mici ale fiecărui component al
aparatului de sinteză proteică (ribosomi, ARNt, enzime). Lipsesc componentele celulare instabile (ARNm şi
nucleozid-trifosfaţii), dar există precursorii lor mai stabili (nucleozid mono- şi difosfaţi). Aminoacizii şi
enzimele lor de biosinteză sunt virtual absente, dar la germinare, ambele tipuri vor fi generate prin hidroliza
proteinelor de depozit, solubile, cu moleculă mică. Puţine enzime sporale derivă din enzimele celulei
vegetative prin clivare. Majoritatea enzimelor sporale sunt noi. Sinteza lor este codificată de gene activate în
timpul sporulării. Toate enzimele sporale sunt termorezistente, fapt explicabil prin dimensiunile lor mici, fiind
reprezentate numai de situsul activ al moleculei respective. Lipsesc enzimele fundamentale ale
metabolismului celular, ca şi sistemele transportoare de electroni.
La cele mai multe bacterii, ionii de Ca 2+ lipsesc. In stadiile timpurii ale sporulării apar sistemele de
transport activ pentru Ca. Ionii de Ca sunt legaţi cu o cantitate echivalentă de acid dipicolinic (se formează din

27
acidul diaminopimelic – un precursor al peptidoglicanului) şi formează dipicolinatul, care poate constitui circa
l5% din greutatea uscată a sporului.
S-a considerat că sporul este rezultatul unui proces de deshidratare profundă. Cercetările ulterioare au
evidenţiat că deosebirile dintre spor şi celula vegetativă nu sunt de ordin cantitativ, ci de ordin calitativ şi se
datorează stării apei (Gould, 1969). In celula vegetativă, apa liberă reprezintă 70% din cantitatea totală, iar în
spor oscilează între 3 - l0%, restul de 90 - 97% fiind apa legată. Din această cauză, sporul este lipsit de
metabolism, sau are un metabolism de intensitate foarte mică, nedecelabilă. Celula sporală este vie, dar
procesele vieţii sunt latente. Fenomenul se numeşte criptobioză (viaţă ascunsă).
Consecinţa particularităţilor de compoziţie chimică, la care se adaugă învelişurile groase multiple şi
pluristratificate, este rezistenţa deosebită a sporului la caldură, la acţiunea substanţelor chimice (antiseptice,
dezinfectante) şi a radiaţiilor. Rezistenţa termică este conferită de dipicolinatul de Ca. Mutaţiile care reduc
cantitatea de dipicolinat scade rezistenţa sporului la agentul termic. Rezistenţa termică a sporului impune o
metodologie costisitoare de sterilizare, la temperaturi foarte ridicate. Uneori, sporii rezistă la temperatura de
l800 C, de la câteva minute, la câteva ore. De aceea s-a renunţat la metoda sterilizării obiectelor prin fierbere,
deoarece tratamentul omoară numai formele vegetative, iar sporii rămân viabili.
Germinarea este procesul de conversie a sporului în celulă vegetativă şi decurge în trei stadii:
- activarea sporului prin deshidratare, asociată cu mărirea volumului;
- germinarea, adică modificarea localizată prin gelificare a învelişurilor sporale;
- emergenţa celulei vegetative din învelişuri, delimitată de un perete derivat din peretele sporal intern.
Intr-un mediu nutritiv optim, germinarea este rapidă: de la iniţiere până la diviziunea celulară,
procesul durează 90 de minute. In medii favorabile, majoritatea sporilor germinează, dar o proporţie mică
rămân în stare dormindă. Pentru iniţierea germinării, sporii necesită un factor suplimentar: factorul termic, un
compus cu grupări –SH, pH acid. După circa o oră de la începutul activării începe sinteza ADN.

1.7. Glicocalixul

Glicocalixul este reprezentat de totalitatea structurilor polizaharidice extraparietale: capsula, cu


diferite grade de dezvoltare şi glicocalixul comportamental.
Capsula este o structură accesorie, cu o consistenţă gelatinoasă, vâscoasă, care acoperă complet celula
bacteriană. În funcţie de gradul de dezvoltare la diferite specii bacteriene se disting următoarele structuri
capsulare:
- microcapsula, reprezrentată de o peliculă fină de material polizaharidic, în jurul peretelui celular
(până la 0,2 m grosime). La microscopul optic se evidenţiază numai prin metoda imunofluorescenţei,
dar este vizibilă la microscopul electronic;
- macrocapsula, o structură omogenă, aderentă de celulă, mai groasă de 0,2 m, vizibilă la
microscopul optic prin tehnici speciale de colorare negativă, dacă este o capsulă suficient de compactă
şi rigidă, pentru a exclude tuşul de India şi nigrozina. Dacă are o structură laxă şi flexibilă, coloranţii o
penetrează. Aderenţa macrocapsulei de celulă este fermă şi prin centrifugare se depune concomitent
cu celulele;
- stratul mucos este o structură capsulară cu o grosime neuniformă şi distribuţie dezordonată în jurul
celulei. Consistenţa este mai fluidă, prin centrifugare, celulele se desprind şi se depun, iar materialul
polizaharidic ramâne în suspensie;
- zoogleea, o masă de material polizaharidic, în care sunt cuprinse un numar mare de celule
bacteriene.
Materialul capsular se găseşte la bacteriile Gram pozitive şi Gram negative (fig. 17) din sol, ape (dulci
şi sărate), rumen, la bacteriile patogene ce produc infecţii ale vezicii urinare şi pulmonare.

28
Figura 17. Macrocapsula la bacili Gram negativi (imagine la microscopul optic, x 1000, original).

Natura chimică a materialului capsular


Materialul capsular este de natură polizaharidică. De cele mai multe ori, în alcătuirea sa se găsesc D-
glucoza, D-fructoza, D-galactoza. Mai rare sunt manoza, fucoza, pentozele. Unele polizaharide extracelulare
se aseamănă cu acizii teichoici deoarece conţin glicerol-fosfat sau ribitol-fosfat.
Materialul capsular poate fi un homopolizaharid sau un heteropolizaharid. Cele mai cunoscute
homopolizaharide sunt dextranii si levanii. Dextranii formează o clasă mare de polizaharide, alcătuiţi din
unităţi de D-glucopiranozil, legate l-6, cu punţi de ramificare în pozitiile 2, 3 sau 4. Lungimea lanţului este
cuprinsă între 40 - 500 resturi de glucoză. Dextranii sunt produşi de Peptococcus (Leuconostoc)
mesenteroides, din sucroză. Sinteza lor este abundentă în melasa de la fabricile de zahăr, unde o cantitate
semnificativă de zahăr este convertită la dextran, aducând prejudicii economice importante. In stare purificată,
dextranul se foloseşte în practica transfuziilor, ca înlocuitor al plasmei, fiind solubil în apă. Sephadexul este
un dextran folosit în tehnicile cromatografice bazate pe principiul sitei moleculare şi cromatografia de schimb
ionic. Levanii sunt poli-D-fructani (fructozizi), sintetizaţi de unele bacterii patogene pentru plante
(Pseudomonas, Xanthomonas), de Streptococcus (Str.) salivarius, de Bacillus. Au greutăţi moleculare de l000
kDa sau mai mult (Black, 1996).
Heteropolizaharidele sunt alcătuite dintr-un număr variat de unităţi diferite: glucoză, fructoză,
galactoză, manoză, acid galacturonic, derivaţi aminaţi şi acetilaţi ai acestora. Structura biochimică a
heteropolizaharidelor este foarte diferită nu numai în funcţie de compoziţia chimică globală, ci şi de secvenţa
diferiţilor monomeri în catena polizaharidică (de exemplu, pentru xantan, structura repetitivă este un
pentazaharid). Diversitatea monomerilor glucidici conferă heteropolizaharidelor o anumită heterogenitate a
structurii chimice şi în consecinţă, o anumită specificitate antigenică. De exemplu, la Str. pneumoniae există
peste 80 de tipuri chimice diferite de material capsular, care corespund nu numai unor diferenţe de compoziţie
chimică, cât şi de secvenţă a monomerilor. Varianta antigenică a polizaharidului capsular imprimă
specificitatea anticorpilor în reacţiile de apărare faţă de bacteriile patogene.
Capsula este o structură inertă, accesorie ce nu face parte integrantă din celula bacteriană. Cel mai
adesea nu îndeplineşte o funcţie esenţială pentru celulă. Bacteriile patogene capsulate sunt virulente, deoarece
capsula este un material chimiotactic negativ pentru fagocite. Pe mediul solidificat, ele produc colonii netede
(S, Smooth). Mutantele lor necapsulate care produc colonii rugoase (R, Rough) sunt mult mai puţin virulente.
Materialul capsular este higroscopic (reţine apa) şi astfel protejează celula de efectul dăunător al uscăciunii.
Materialul capsular ar putea avea rolul de depozit al unor nutrienţi din mediu.

Glicocalixul comportamental
La anumite bacterii structurile superficiale sunt acoperite de un glicocalix adevărat, constituit dintr-o
reţea de filamente polizaharidice şi glicoproteice, legate de lipopolizaharidele membranei externe la bacteriile
Gram negative sau de mureina bacteriilor Gram pozitive. Filamentele formează o structură pericelulară
dezordonată, ca o pâslă, prin intermediul căreia celula se ancorează fie pe alte celule, fie pe suporturi inerte.
Glicocalixul se găseste numai la bacteriile care trăiesc în mediile naturale, având un caracter adaptativ, adică
există numai în condiţiile în care prezenţa ei conferă celulei un avantaj selectiv. După cultivare în medii
artificiale (bulion, geloza), glicocalixul dispare şi din această cauză s-a evidentiat târziu. Deoarece nu persistă
la celulele cultivate în mediile artificiale, s-a propus denumirea de glicocalix comportamental.

29
Glicocalixul a fost studiat la celulele bacteriene din placa dentară. Placa dentară este un depozit de
culoare alb-gălbuie, vizibil cu o lupă, ce se formează pe suprafaţa smalţului dentar, iniţiată de Streptococcus
mutans. Celulele sale sintetizează un polizaharid glucanic, prin intermediul căruia aderă foarte strâns de
suprafaţa smalţului, formând iniţial o microcolonie, iar ulterior, o colonie. Celulele aderă între ele, dar şi de
smalţul dentar, prin glicocalix. După impregnare cu săruri şi glicoproteine salivare se creează un micromediu
anaerob, în care bacteriile elimină produsele de catabolism. Micromediul coloniei se acidifică şi se creează
condiţiile favorabile degradării smalţului. Astfel se initiază formarea cariei.
În mediile naturale, celulele bacteriene lipsite de structura capsulară se ancorează de suport prin
intermediul glicocalixului. Legarea celulelor de suport este prima etapă a procesului de colonizare. Astfel se
iniţiază formarea coloniei bacteriene, glicocalixul fiind structura care mediază asocierile bacteriene
polispecifice. Astfel s-a demonstrat că în rumen, asocierile coloniale conţin celule ce aparţin unor specii
diferite (colonii polibacteriene). Intre ele se stabilesc relaţii metabolice sinergice, prin care bacteriile
realizează activităţi metabolice, pe care speciile separate nu le pot desfăşura. De exemplu, în rumen se
produce CH4: unele bacterii produc H2, altele CO2, iar bacteriile metanogene reduc CO2, utilizând H2 ca sursă
reducătoare.
Majoritatea microorganismelor din mediile acvatice nu se găsesc ca organisme libere plutitoare, ci
trăiesc ataşate de suprafeţe, inclusiv la suprafaţa apei, unde formează un biofilm. Asociaţiile naturale de
bacterii, în matricea unui biofilm funcţionează ca un consorţiu cooperant. Biofilmele reprezintă sisteme
biologice cu un nivel înalt de organizare, în care comunităţile de bacterii sunt coordonate funcţional.
Capacitatea lor de a persista în întreaga biosferă se datorează versatilităţii lor metabolice şi plasticităţii
fenotipice. Un element esenţial al adaptabilităţii este capacitatea lor de a-şi alege poziţia într-o nişă în care se
propagă. Cel mai comun mecanism de poziţionare este mobilitatea flagelară şi diferitele modalităţi de
translocaţie pe suprafeţe: răsucire, alunecare, înclinare, roire. Unele specii îşi modifică poziţia prin sinteza
polizaharidelor, formând o peliculă ce plasează celulele la interfaţa aer-apă. Un alt mecanism de alegere a
poziţiei este agregarea sau ataşarea, prin intermediul căreia se amplifică interacţiunile celulare. Prin ataşare,
bacteriile nu numai că îşi fixează poziţia pe o suprafaţă, dar formează comunităţi şi dobândesc avantajul
versatilităţii fenotipice. Biofilmele au rol în epurarea apelor uzate, în epurarea apelor de suprafaţă contaminate
cu produse petroliere. Biofilmele se formează chiar în condiţii extreme, ca de exemplu în apele acide (pH = 0)
de drenaj al minelor, unde contribuie la circuitul sulfului. Cianobacteriile formează biofilme în izvoarele
termale şi pe suprafaţa gheţii din Antarctica. Alt tip de comunitate în biofilm este ansamblul bacteriilor
asociate cu particulele suspendate, de materie organică sau anorganică. Aceste particule macroscopice
formează zăpada marină şi sunt bogate în biomasa microbiană şi nutrienţi, având rol în în circuitul carbonului
organic particulat în mediul pelagic (pelagos = mare, zona de larg a apelor marine).
Pentru bacteriile patogene, glicocalixul este structura prin care celulele se ancorează de celulele
mucoaselor şi iniţiază procesul infecţios. De exemplu, Neisseria gonorrhoeae se leagă de celulele uretrale şi
vaginale prin filamentele glicocalixului. Uneori, legarea mediată de glicocalix are caracter de specificitate
pentru un anumit tip de celule (bacteriile care iniţiază procese patologice intestinale se leagă uneori exclusiv
de epiteliul intestinal). Glicocalixul capsular şi cel comportamental sunt structuri foarte variabile din punct de
vedere fenotipic, având grade foarte diferite de dezvoltare la aceiaşi tulpină bacteriană, în diferite condiţii de
mediu. Deşi sinteza reprezintă o cheltuială semnificativă de energie, rolul lor funcţional în mediile naturale
justifică existenţa structurilor polizaharidice. Glicocalixul dispare la celulele cultivate în medii artificiale. Pe
medii nutritive bogate, existenţa acestor structuri nu mai este necesară, dar reapar prin transferul celulelor în
medii naturale nefavorabile.
Reunirea tuturor structurilor polizaharidice extraparietale, indiferent de gradul de dezvoltare sub
denumirea de glicocalix a fost propusă de Costerton (l974). Capsula este cea mai importantă dintre ele, ca
grad de dezvoltare, dar toate structurile polizaharidice îndeplinesc aceiaşi funcţie esenţială – aderenţa celulei
de substrat. Gradul diferit de dezvoltare, de la glicocalix la macrocapsulă, implică o diversificare
corespunzătoare a funcţiilor acestor structuri. Prin gradul foarte diferit de dezvoltare în raport cu condiţiile de
mediu, structurile polizaharidice extraparietale sunt expresia autentică a plasticităţii fenotipice structurale a
bacteriilor. Teoria plasticităţii fenotipice consideră că, bacteriile răspund modificărilor mediului de viaţă, prin
schimbări structurale şi funcţionale (metabolice) profunde, în contextul activităţii aceluiaşi set de gene.
Plasticitatea fenotipică a bacteriilor permite adaptarea rapidă la schimbări majore ale mediului. Bacteriile
sunt primele organisme care se adaptează la condiţiile noi de mediu, în timp ce organismele superioare se
adaptează mult mai lent, prin selecţia mutantelor. Bacteriile colonizează ecosistemele noi şi prin mecanismul
genetic al selecţiei mutantelor. Această dublă capacitate adaptativă – prin plasticitate fenotipică şi prin selecţia
mutantelor – explică uriaşul succes al bacteriilor de a popula chiar cele mai ostile medii.

30
1.8. Flagelul

Flagelul (flagellum = bici) este organitul extracelular al mobilităţii celulei procariote. Organitul
omolog de mobilitate al celulei eucariote este cilul. Flagelii se mai numesc şi undulipode (undula = undă
mică; pus, podos = picior). Flagelul se prezintă ca un filament extracelular, filiform, ondulat, cu grosimea
uniformă pe toată lungimea sa. Lungimea este variabilă, de la 4 - 5 m până la 70 m, iar diametrul este de 20
nm. Flagelii nu se observă prin examinarea directă a celulelor la microscopul optic. Existenţa lor se deduce
indirect, din mobilitatea celulelor bacteriene. Celulele fără flageli se numesc atrihe.
După numărul şi modul de aşezare a flagelilor, bacteriile sunt:
- monotrihe (cu un singur flagel);
- amfitrihe (cu doi flageli asezaţi la cei doi poli ai unui bacil);
- lofotrihe (au numeroşi flageli grupaţi într-un smoc);
- peritrihe (celule cu numeroşi flageli, distribuiţi pe toată circumferinţa celulei).
Poziţia flagelului (sau flagelilor) poate fi polară, subpolară sau ecuatorială.
Comparativ cu cilul celulei eucariote, flagelul are o structură simplă. Flagelul îşi are originea în
structurile de înveliş ale celulei şi este alcătuit din următoarele elemente (fig. 18):
- corpusculul bazal, localizat în învelişurile celulare;
- cârligul;
- filamentul extern (flagelul propriu-zis).
Corpusculul bazal formează o structură rotativă unică, atât ca alcătuire cât şi ca funcţionalitate în
sistemele biologice, asemănătoare, în general, cu un buton de cămaşă. La bacteriile Gram negative, structura
sa este mai complexă, deoarece discurile componente sunt duble, alcătuite din proteine diferite şi îndeplinesc
funcţii diferite. Se disting următoarele discuri:
- discul M (mobil, se roteşte cu viteză mare) şi este ancorat în structura membranei citoplasmatice;
- discul S (stator) este legat de peptidoglican;
- discul P este localizat în spaţiul periplasmic;
- discul L este legat de lipopolizaharidele membranei externe a peretelui.
Aceste discuri sunt aşezate pe o structură axială subţire.
Cârligul are rolul de articulaţie flexibilă între corpusculul bazal şi filamentul extern. Prin axul său
central, cârligul se leagă de corpusculul bazal.
Mişcarea de rotaţie a discului M (3000-4000 r/min) este transmisă cârligului şi filamentului extern.

Figura 18. Reprezentarea schematică a structurii flagelului (după Todar, 2004).

În alcătuirea flagelului intră cel puţin 11 tipuri de molecule proteice: câte unul în filamentul extern şi
cârlig şi cel puţin 9 tipuri de proteine în corpusculul bazal. Cea mai cunoscută este proteina filamentului
extern, denumită flagelină şi are gr. mol. de 40 kDa. Moleculele sale sunt aşezate după o simetrie helicală,
formând o structură tubulară, canaliculară. Moleculele de flagelină au proprietatea de autoasamblare: dacă
moleculele de flagelină sunt dispersate, în condiţii adecvate, ele se reasamblează spontan. Flagelina se
sintetizează sub forma monomerilor, în interiorul celulei. Moleculele străbat axul central al structurii bazale şi
se aşează după o simetrie helicală pentru a forma filamentul extern. Flagelul bacterian creşte prin regiunea sa
apicală.
Cârligul este format din subunităţi proteice identice. Funcţia sa nu este cunoscută.

31
Corpusculul bazal are o structură moleculară mult mai complexă. Cele 9 proteine diferite sunt
organizate în discurile care înconjură un ax subţire, ce se inseră în membrana citoplasmatică.
1.9. Fimbriile
Fimbriile sunt structuri de tipul unor apendice filamentoase, rigide şi neuniforme ca lungime, care se
extind de la suprafaţa celulei bacteriene. Termenul de fimbrii a fost introdus de Duguid (1955) (citat de
Zarnea, 1983) (fimbria - latin fibra, franjuri), iar în 1959 Brinton (citat de Zarnea 1983, 1995) a folosit
termenul de pil (latin, pilus = păr). Apoi s-a sugerat ca termenul de pil să fie folosit pentru structurile
filamentoase codificate de plasmidele conjugative, cu rol în procesul de conjugare ce constă în transferul unui
fragment de ADN de la o celulă donor la o celulă receptoare. Adeseori, cei doi termeni se folosesc pentru a
descrie aceiaşi stuctură. Fac excepţie structurile fimbriale de la Neisseria, pentru care literatura foloseşte
termenul de pil.
Fimbriile sunt alcătuite din molecule proteice de fimbrilină, cu gr. mol. de 15 - 30 kDa, aşezate
totdeauna după o simetrie helicală. Numărul lor este de până la l000/celulă. Daca sunt numeroase, au o
dispoziţie pericelulară. Dacă sunt puţine, au localizare polară sau bipolară. Lungimea lor este foarte variabilă
(l-20 µm), ceea ce sugerează că au vârste diferite.
Fimbriile se observă la microscopul electronic, după coloraţia negativă a celulelor întregi sau se
evidenţiază indirect prin capacitatea lor de a aglutina hematiile diferitelor specii de animale şi pot fi împărţite
în 3 categorii structurale:
- fimbrii rigide, cu diam. de 5 - 10 nm, cu un lumen de circa 2 nm (la enterobacterii). Regiunea
hidrofobă este la capătul COOH al fimbrilinei;
- fimbrii flexibile, cu diam. de de 5 - 6 nm. Se mai numesc fimbrii N-metil-fenilalanină, deoarece la
capătul N-terminal al fimbrilinei au un rest de fenilalanină metilată. Se găsesc la Ps. aeruginosa, N.
gonorrhoeae, N. meningitidis. Regiunea N-terminală este hidrofobă;
- fimbrii subţiri spiralate, cu diametru de 4 nm sau mai puţin, fără lumen (K 88, K99, la E. coli).
Unele fimbrii au atât o regiune rigidă, cât şi una flexibilă.
Fimbriile sunt comune la bacteriile Gram negative şi mai rare la bacteriile Gram pozitive
(Corynebacterium, Actinomyces), dar sunt diferite structural.
O bacterie posedă câteva tipuri de fimbrii, în funcţie de grosime, lungime, specificitatea antigenică
(determinată de secvenţa aminoacizilor în molecula de fimbrilină) şi de specificitatea receptorilor glicoproteici
ai celulelor epiteliale de care aderă.
Fimbriile sunt structuri din categoria adezinelor, adică mediază interacţiunea celulă-suport. În ceea ce
priveşte capacitatea de legare, cele mai multe adezine fac parte din familia lectinelor. Lectinele sunt
glicoproteine obţinute din plante care se leagă nespecific cu oligozaharide de pe suprafaţa celulelor şi produc
aglutinarea acestora. Ele precipită polizaharidele şi glicoproteinele sau aglutinează celulele. Activitatea
aglutinantă şi precipitantă poate fi inhibată de haptene (monozaharide şi oligozaharide).
Cea mai importantă funcţie care li se atribuie ar fi aceea de punţi de aderenţă intercelulară sau
aderenţă de suportul inert. La bacteriile din mediile acvatice, fimbriile favorizează asocierile dintre celule şi
astfel se formează pelicule fine (filme) de neuston la suprafaţa apei, cu rol adaptativ, ce asigură condiţii bune
de aerare pentru bacteriile aerobe şi de luminozitate pentru cele fotosintetizante.
Pentru bacteriile patogene, prezenţa fimbriilor (tulpinile fim+) le conferă un grad superior de virulenţă,
deoarece fimbriile aderă ferm de receptorii suprafeţei celulelor epiteliale ale mucoaselor şi ai hematiilor.
Receptorii majori pentru fimbriile bacteriene, pe suprafaţa celule eucariote sunt glicoproteinele cu manoză.
Proteina de aderenţă localizată pe fimbrii se leagă de resturile de manoză ale glicoproteinelor. În funcţie de
comportamentul în prezenţa manozei s-au identificat fimbrii manozo-sensibile şi manozo-rezistente. La E. coli
s-au evidenţiat fimbrii manozo-sensibile (manoza inhibă hemaglutinarea prin competiţia cu receptorii
suprafeţei hematiilor). Fimbriile manozo-rezistente aglutinează numai eritrocitele tanate. Celulele bacteriene
cu astfel de fimbrii aderă de celulele endoteliale, de celulele epiteliale ale tractului respirator, urogenital, de
membrana bazală a tubilor renali, a capsulei Bowmann. O celulă bacteriană exprimă simultan, fimbrii cu
specificităţi diferite de legare de suportul celular. Astfel se explică selectivitatea bacteriilor patogene şi
comensale pentru anumite gazde şi ţesuturi. Elaborarea conceptului adezinelor şi a specificităţii lor de legare,
explică tropismul tisular selectiv al bacteriilor infecţioase. Caracterul progresiv ascendent al infecţiei urinare,
de la vezică spre rinichi, împotriva fluxului urinar, se explică prin fenomenul de aderenţă, mediat de fimbrii cu
diferite specificităţi de legare, de celulele epiteliale. Exprimarea fimbriilor pe suprafaţa celulei este
adaptativă. Ele favorizează aderenţa celulei bacteriene de substraturi celulare diferite.
Fimbrilina este codificată de gene cromosomale, ceea ce denotă că fimbriile au o importanţă ecologică
deosebită, prezenţa lor favorizând competiţia celulei pentru substrat. După sinteză, fimbrilina este transferată

32
extracelular şi depusă la baza fimbriei. Orice linie bacteriană poate să existe alternativ în varianta fim+ sau fim-
şi să poarte simultan mai multe tipuri de fimbrii. Rata de mutaţie a genelor care codifică sinteza fimbriilor este
foarte mare, astfel încât celulele fim+ trec în varianta fim- şi invers, prin retromutaţie.
Uneori fimbriile suferă fenomenul variaţiei de fază şi al variaţiei antigenice. Variaţia de fază
înseamnă că o structură dată este sau nu este produsă. Variaţia antigenică semnifică faptul că aceiaşi structură
se produce în variante biochimice diferite. Variaţia antigenică a fimbriilor bacteriene este rezultatul acţiunii
mai multor mecanisme. Cel mai simplu este acumularea lentă a mutaţiilor punctiforme în gena codificatoare.
Fenomenul se numeşte drift antigenic şi are loc atât la bacteriile patogene cât şi la cele nepatogene.

1.10. Pilii

Pilii sunt apendice filamentoase neflagelare, a căror sinteză este codificată de gene localizate în
structura unor plasmide denumite conjugoni sau plasmide sex. Celulele purtătoare de pili au capacitatea
potenţială de a dona material genetic (sunt celule mascul). Numărul pililor pentru o celulă este cuprins între 1
şi l0, iar lungimea este de circa 20 µm. Diametrul extern este de 6 - l5 nm, iar cel intern de 2,5 nm. Pilii sunt
alcătuiţi din molecule identice de pilină, o fosfoglicoproteină de l2 - l5 kDa. Se sintetizează în celulă, de unde
este transferată în lumenul piliar şi este asamblată după o simetrie helicală, la extremitatea liberă a acestuia.
Pilii pot fi îndepărtaţi mecanic, prin agitare şi se resintetizează. Prin încălzire sau tratament acid, pilii se
dezagregă în moleculele componente (pilina). Restabilirea neutralităţii şi a nivelului termic permite
autoasamblarea şi formarea unei structuri identice cu pilul original (Davis şi colab., 1990).
Prezenţa pililor este asociată totdeauna cu procesul de conjugare bacteriană (fig. 19). Pilii ar putea fi
structuri esenţiale de transfer al materialului genetic de la celula donor la celula receptor. Molecula de ADN ar
trece prin lumenul pilului. După alţi autori, pilii ar avea numai rolul de a “agăţa” celula receptoare de material
genetic, iar prin retracţia sa ulterioară, cele două celule s-ar apropia.

Figura 19. Structurile piliare par să medieze conjugarea bacteriană (x 150 000, dupa Todar, 2004).

Rolul pililor în conjugare este argumentat de faptul că depilierea (prin agitare cu perle de sticlă) este
însoţită de pierderea capacităţii de conjugare şi de restabilire a ei odată cu resinteza pililor. Capacitatea de
sinteză a pilinei se pierde odată cu pierderea plasmidei de sex şi este redobândită odată cu recâştigarea
plasmidei.
Pilii poartă receptori de fagi. Pe suprafaţa pililor se găsesc receptori pentru fagii ARN masculi. Se
numesc fagi masculi deoarece infectează numai celulele cu potenţialitate de donor de material genetic.
Marcajul cu fagii ARN mascul este modalitatea de a-i distinge de alte structuri filamentoase. La extremitatea
liberă a pililor se găsesc receptori pentru fagii filamentoşi. Celulele purtătoare de pili au capacitatea potenţială
de a dona material genetic (sunt celule mascul). Numărul pililor pentru o celulă este cuprins între 1 şi l0, iar
lungimea este de circa 20 µm. Diametrul extern este de 6 - l5 nm, iar cel intern de 2,5 nm.

33
Bibliografie selectivă

1. Alberts B., Bray D., Lewis J., Molecular biology of the cell, 3rdEdition, Garland Publishing. 1994.
2. Beveridge T.J., Davies J.A., Cellular responses of Bacillus subtilis and Escherichia coli to the Gram
stain - Journal of Bacteriology, 1983, p. 156.
3. Black J. G., Microbiology - Principles and Applications, 3rd Edition, Prentice Hall, Upper Sadle
River, 1996.
4. Brock, T., Milestones in Microbiology: 1546 to 1940. Washington, DC: American Society for
Microbiology, 1998
5. Brock T., Biology of microorganisms, 9th Ed. Madigan M. T., Martinko J. M (eds) Prentice Hall,
Englewood Cliffs, New Jersey, 2000.
6. Brock T., Biology of microorganisms, 11th Ed. Madigan M. T., Martinko J. M (eds) Prentice Hall,
Englewood Cliffs, New Jersey, 2005.
7. Costerton J.W., Ingram J.M., Cheng K.J., Structure and function of the cell envelope of gram-
negative bacteria- Bacteriology Reviews, 1974, p.38 - 87.
8. Davis B., Dulbecco R., Eissen H., Microbiology , 4th Edition, New York Lippincott, 1990.
9. Ghuysen J-M., Hakenbeck R., Bacterial cell wall , Elsevier, 1994.
10. Gould G.W., Hurst A. (eds) , The Bacterial Spore , Academic Press, San Diego, 1969.
11. Lehninger A. L. , Biochimie - vol. 1, traducere din limba engleza editia a doua, Editura Tehnica,
Bucuresti, 1987.
12. Jawetz E., Melnick J.L., Adelberg E.A., Medical Microbiology , Appleton & Lange, East Norwalk,
CT. 1989.
13. Pettijohn DE, Hecht R. RNA molecules bound to the folded bacterial genome stabilize DNA folds and
segregate domains of supercoiling. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1974; 38:31–41
14. Pettijohn, D. E., and R. R. Sinden. Structure of the isolated nucleoid, p. 199–227. In N. Nanninga
(ed.), Molecular cytology of Escherichia coli. Academic Press, London, England. 1985
15. Ryter A, Chang A. Localization of transcribing genes in the bacterial cell by means of high
resolution autoradiography. J Mol Biol. 1975 Nov 15; 98 (4): 797–810.
16. Rogers H.J. - Bacterial Cell Structure - American Society for Microbiology, Washington, D.C.,
1983.
17. Seifert H.S., So M. - Genetic mechanisms of bacterial antigenic variation - Microbiological Reviews,
1988, p. 52.
18. Todar's Online Textbook of Bacteriology, Kenneth Todar, University of Wisconsin,
http://www.textbookofbacteriology.net/
19. Wright A., Tipper D.J. - The outer membrane of gram-negative bacteria, In Sokatch JR, Ornston LN
(eds): The bacteria. Vol. 7. Academic Press, San Diego. 1979, p:427.
20. Rietschel, E., S. Hase, Ming-Tzan King, John Redmond and Volker Lehman, 1977 – Chemical
Structure of Lipid A - Microbiology, 1977, Ed. D. Schlessinger
21. Zarnea G. - Tratat de Microbiologie generala - volumele I, II, III, V. 1983-1994.

34
Capitolul 2
ANTISEPTICE SI DEZINFECTANTE

Substanţele chimice din compoziţia unui mediu de creştere a microorganismelor pot exercita, în
funcţie de natura şi concentraţia lor, trei tipuri de efecte asupra acestora:
- un efect favorizant asupra dezvoltării şi multiplicării celulare, prin aportul substanţelor nutritive şi
realizarea echilibrelor fizico-chimice necesare;
- un efect microbiostatic, prin blocarea potenţial reversibilă a proceselor de multiplicare celulară,
determinând inhibiţia procesului de multiplicare, dar bacteriile rămân viabile şi îşi reiau creşterea şi
multiplicarea după ce sunt transferate pe medii adecvate;
- un efect microbicid, prin alterarea profundă şi ireversibilă a unor procese metabolice esenţiale.
Particularităţile fiziologice ale microorganismelor influenţează acţiunea substanţelor chimice. De
exemplu, CO2 şi H2S sunt toxice pentru majoritatea microorganismelor aerobe, al căror metabolism respirator
îl inhibă, dar pentru unele specii bacteriene aceste substanţe reprezintă o sursă de energie. Una şi aceeaşi
substanţă poate acţiona în moduri diametral opuse, în funcţie de concentraţia ei: în concentraţie de 1%,
zaharoza este o bună sursă de carbon şi energie, iar la concentraţia de 40% are efect bacteriostatic. Substanţele
folosite în metabolismul microorganismelor au rolul de surse de carbon, de azot şi de energie sau acţionează
ca factori de creştere. La concentraţii foarte mici ale unei substanţe nutritive în mediu, creşterea bacteriană
este foarte slabă, dar se intensifică odată cu creşterea concentraţiei substanţei nutritive, până când aceasta
atinge un nivel prag, după care, rata de creştere a populaţiei celulare devine constantă, independentă de
concentraţia substanţei nutritive. Când concentraţia substanţei atinge limita de toleranţă pentru celulă, se
produce inhibiţia creşterii celulare, iar dincolo de această limită, substanţa nutritivă poate avea un efect
bactericid. Unele substanţe exercită efecte de chimiotaxie sau chimiotropism pozitiv, fiind atractante pentru
microorganisme, în timp ce altele exercită un chimiotactism negativ asupra celulelor, efectul lor fiind repelent.
Efectele dăunătoare ale unor compuşi chimici pot fi de tip microbiostatic, alteori, compuşii chimici au
efect microbicid, adică determină moartea microorganismelor expuse. Împărţirea substanţelor chimice în
microbiostatice şi microbicide este arbitrară, deoarece o substanţă poate fi microbiostatică la concentraţie
mică sau când acţiunea ei este de scurtă durată, dar poate fi microbicidă la concentraţie mare sau după
acţiunea prelungită a unei concentraţii mici.
Caracterul bacteriostatic sau bactericid este dependent de concentraţia la care se manifestă un anumit
efect şi timpul de acţiune pentru producerea efectului.
O substanţă este microbicidă (bactericidă, fungicidă) dacă efectul ei se produce într-un interval scurt
de timp şi se manifestă la concentraţii foarte mici şi este microbiostatică, dacă efectul ei rămâne ca atare şi la
concentraţii relativ mari de substanţă activă, iar rata efectului microbicid este foarte scăzută, astfel încât cel
puţin o parte din celule pot supravieţui timp foarte îndelungat. În practică, în afara celor doi termeni se
folosesc denumirile de antiseptice (AS) şi dezinfectante (DF) (Redish, 1959).
Antisepticele sunt substanţe chimice care, aplicate pe ţesuturile vii impiedică creşterea şi multiplicarea
microorganismelor existente. Sunt relativ netoxice şi pot fi aplicate pe ţesuturi umane şi animale. Termenul de
dezinfectant este restrâns la substanţele cu efect microbicid rapid, la concentraţii mici. Ele se aplică pe obiecte
neanimate, în scopul distrugerii microorganismelor contaminante. Cele mai multe substanţe dezinfectante sunt
toxice şi nu pot fi administrate la om şi la animale.
Antisepticele şi dezinfectantele cuprind o largă varietate de agenţi chimici (tabelul 1) şi poartă
denumirea generică de biocide. Biocidele, în general, au un spectru mai larg de acţiune decât antibioticele şi
spre deosebire de acestea, care au ţinte intracelulare specifice, biocidele au ţinte multiple. Majoritatea
substanţelor dezinfectante acţionează fie prin dizolvarea lipidelor din membrana citoplasmatică (detergenţi,
solvenţi lipidici), fie prin modificări ale proteinelor, acizilor nucleici etc. Unele biocide se folosesc pentru
conservarea unor produse biologice (farmaceutice, alimentare). Conservarea semnifică prevenirea
multiplicării microorganismelor. Altele se folosesc pentru curăţire, care semnifică îndepărtarea unui material
străin de pe o suprafaţă.

36
Tabelul 1.
Structurile chimice şi utilizările biocidelor antiseptice şi dezinfectante (după Topley şi Wilson’s,
1998).
Compuşi Reprezentanţi Formula chimică Acţiune
chimici
Alcooli Etanol CH3 – CH2OH Antiseptic

Izopropanol Dezinfectant,
agent de
conservare
Aldehide Glutaraldehida Dezinfectant
O=C - CH2CH2CH2 – C=O
Formaldehida H2C O Agent de
sterilizare,
agent de
conservare
Anilide Structura generală C6H5-NH-COR Antiseptic
Triclorcarban

Biguanide Clorhexidina Antiseptic

Alexidina Dezinfectant,
Biguanide agent de
polimerice conservare,
agent antiplacă

Bifenoli Antiseptic,
Triclosan agent antiplacă

Hexaclorofen Odorizant,
agent de
conservare

Diamidine Propamidina Antiseptic


Dibromo- Agent de
propamidina conservare

Compuşi Compuşi cu Cl OCl-, HOCl, Cl2 Dezinfectant


halogenaţi Antiseptic
Compuşi cu I I2 Agent de
curăţire
Halofenoli Cloroxilenol Antiseptic,
(PCMX) agent de
conservare

36
Compuşi Compuşi cu Ag Ag Agent
metalici antiseptic de
conservare
Compuşi cu Hg Hg Dezinfectant
Peroxizi Peroxid de H H2 O2 Dezinfectant

Ozon O3 Agent de
sterilizare

Acid peracetic CH3COOOH Agent de


sterilizare

Fenoli şi Fenol Dezinfectant


crezoli

Cresol Agent de
conservare

Săruri Structura generală +


Dezinfectant
cuaternare Antiseptic
de amoniu R1 R3
N X-
2 4
R R

Cetrimid Agent de
Clorura de conservare,
benzalkonium agent de
curăţire

Faza de Etilenoxid Agent de


O
vapori sterilizare
H2C CH2
Formaldehida H2CO Dezinfectant

Peroxidul de H H2 O2 Dezinfectant

Metodele de studiu privind mecanismele de acţiune ale AS şi DF sunt:


- studiul dinamicii înglobării;
- determinarea efectelor litice sau de pierdere a constituienţilor celulari;
- studiul efectelor asupra modelului membranar;
- detectarea inhibiţiei activităţii enzimelor;
- studiul efectelor asupra proceselor de biosinteză macromoleculară;
- examinarea microscopică a celulelor expuse acţiunii biocidelor.
Efectele nocive ale substanţelor antibacteriene se exercită pe mai multe căi:
- prin modificări de permeabilitate la nivelul peretelui celular şi membranei citoplasmatice;
- prin denaturarea unor constituenţi celulari esenţiali (proteinele);
- prin blocarea grupărilor funcţionale active ale enzimelor şi interferenţa cu metabolismul producător
de energie;
- inhibiţia competitivă prin analogie sterică, a reacţiilor de biosinteză.
Uneori, aceiaşi substanţă îşi poate exercita acţiunea, pe una sau pe mai multe căi, dar una dintre
acestea reprezintă calea principală de acţiune. Oricare ar fi tipul de celulă microbiană, acţiunea substanţelor

37
antimicrobiene se desfăşoară după o secvenţă comună de evenimente. Interacţiunea cu suprafaţa celulei poate
modifica semnificativ viabilitatea (de exemplu, glutaraldehida), dar cei mai mulţi agenţi antimicrobieni sunt
activi după ce pătrund în celulă. Mecanismele acţiunii AS şi DF asupra protozoarelor nu au fost investigate,
datorită dificultăţii cultivării unor protozoare în condiţii de laborator (de exemplu, Criptosporidium).
Diferitele stadii ale ciclului de dezvoltare (de exemplu, trofozoiţii şi chiştii) ilustrează modul în care
schimbările fiziologice şi citologice influenţează răspunsul la antiseptice şi dezinfectanţi. AS şi DF se folosesc
pe scară largă în spitale şi în alte locaţii, pentru aplicaţii locale şi pentru dezinfectarea suprafeţelor expuse. Ele
constituie o parte esenţială a practicilor de control al infecţiilor şi contribuie la prevenirea infecţiilor
nosocomiale.

2.1. Substanţe antibacteriene active prin modificări de permeabilitate


Substanţele din această categorie (săpunurile, detergenţii) produc modificări fizico-chimice, care duc
la pierderea permeabilităţii selective a membranelor celulare, astfel încât membrana citoplasmatică nu mai
reţine în interiorul celulei, moleculele utile (aminoacizi, nucleotide, coenzime, ioni) şi nici nu poate opri
pătrunderea din exterior a unor substanţe nocive.
Săpunurile îşi datoresc efectul antimicrobian, acţiunii acizilor graşi nesaturaţi (oleic, linoleic,
linolenic) din compoziţia lor. Acţiunea lor se exercită asupra constituienţilor lipidici ai membranelor celulare,
care astfel devin mai permeabile (Jungerman, 1996). Datorită capacităţii lor emulsionante, săpunurile
determină, prin spălare, o reducere masivă a numărului microorganismelor pe suprafaţa tegumentului.
Detergenţii sunt compuşi organici tensioactivi, obţinuţi prin sinteză chimică, din materii prime
derivate din petrol. Molecula lor este asemănătoare aceleia a săpunurilor, dar au proprietăţi fizice şi chimice
superioare (Paulson, 1997).
Molecula agenţilor tensioactivi este asimetrică: conţine o regiune hidrofilă şi una hidrofobă (lipofilă
sau liposolubilă). Molecula detergenţilor se leagă atât de apă, cât şi de moleculele organice nepolare.
Molecula amfipatică a detergenţilor se orientează cu capătul hidrofob, spre materialul organic, iar cu capătul
hidrofil, spre apă. Efectul detergenţilor este udarea, desorbţia, emulsionarea, suspensionarea şi stabilizarea
particulelor dizlocate de pe o suprafaţă (fig. 20). Rezultatul este detergenţa (sau curăţirea). La contactul cu o
suprafaţă lipidică sau cu interfaţa ulei-apă, moleculele detergentului se adsorb pe această suprafaţă, prin
grupările lor hidrofobe, iar cele hidrofile rămân în apă.

Figura 20. Molecula de detergent se orientează cu gruparea hidrofobă spre materialul organic (original).

Astfel orientate, moleculele detergentului formează un strat (o soluţie) de continuitate între cele două
medii insolubile (lipide-apă), ceea ce determină efectul de “udare”, ca rezultat al scăderii tensiunii
superficiale.
Pe baza sarcinii sau absenţei ionizării grupării hidrofile, detergenţii sunt de patru tipuri: cationici,
anionici, neionici şi amfoterici. Cei neionici nu au calităţi dezinfectante, iar uneori pot chiar să favorizeze
creşterea bacteriilor şi fungilor.

38
Monoglicerida acidului stearic Lauratul de sodiu
(detergent neionic) (detergent anionic)

Detergenţii anionici sunt săruri de Na şi K ale acizilor graşi superiori. Au efect bactericid scăzut,
deoarece prin disociere eliberează un anion organic, cu toxicitate redusă, respins de sarcina netă negativă a
suprafeţei bacteriene. Sunt mai eficienţi faţă de bacteriile Gram negative (Zneiden, 1998).
Detergenţii cationici (Cetavlon, Cetazol, Bromocet) sunt săruri quaternare de amoniu, care conţin
patru grupări organice legate de un atom de azot.

Structura moleculară a clorurii de cetilpiridinium (detergent cationic)

Prin disociere, detergenţii cationici eliberează un cation organic toxic. Compuşii amoniului quaternar
acţionează asupra structurii membranei, pe care o dezorganizează. Bacteriile îşi pierd sarcina electronegativă,
prin adsorbţia ionilor pozitivi. Substanţele lipidice din peretele celular şi cele din membrană sunt solubilizate.
Numeroşi constituienţi citoplasmatici părăsesc celula, iar substanţa activă pătrunde în interior şi denaturează
proteinele şi acizii nucleici.
Sărurile quaternare de amoniu lizează sferoplaştii şi protoplaştii aflaţi în suspensie în soluţie de
sucroză. Sunt sporostatici (inhibă dezvoltarea celulei vegetative din sporul germinat, dar nu procesul de
germinare propriu-zisă). Au efect micobacteriostatic, dar nu micobactericid. Compuşii amoniului quaternar se
folosesc pentru dezinfecţia preoperatorie a tegumentului intact, se aplică pe membranele mucoase.
Detergenţii cationici sunt bactericizi faţă de toate categoriile de bacterii, chiar şi faţă de M.
tuberculosis, deoarece dizolvă învelişul lipidic al suprafeţei lor. Eficienţa lor este diminuată de materialele
fibroase, de apă, de ionii de Ca 2+ şi Mg2+. Oxidează obiectele de metal, dacă nu se adaugă un agent antioxidant
(nitritul). Viabilitatea sporilor nu este afectată. Nu sunt toxici pentru organismul uman şi nu irită ţesuturile. Se
folosesc ca antiseptici tegumentari. Acţiunea lor este neutralizată de săpunuri şi fosfolipide.
Detergenţii neionici (polieteri şi esteri poliglicerici) nu au acţiune bactericidă. Adaugaţi în mediile
nutritive sunt chiar metabolizaţi de unele microorganisme. Unii dintre ei (Tween 80) sunt folosiţi ca agenţi de
dispersare ai celulelor bacteriene, pentru a favoriza creşterea şi multiplicarea lor. Concentraţiile mici de
polisorbat (Tween) modifică permeabilitatea membranei externe a bacteriilor Gram negative (Zneiden, 1998).

Structura moleculară a Tween 80

Agenţii amfoterici cumulează proprietăţile de detergent ale compuşilor anionici, cu proprietăţile


antimicrobiene ale compuşilor cationici. Activitatea lor rămâne constantă la o variaţie largă de pH. Din
această categorie fac parte compuşii din seria Tego.

36
2.2. Substanţe care acţionează prin denaturarea proteinelor
Substanţele din această categorie produc modificări fizico-chimice ale coloizilor citoplasmatici,
stopează activitatea enzimelor şi precipită sau coagulează proteinele celulare.

Acizii şi bazele
Cele mai multe bacterii pot fi cultivate în medii al căror pH este cuprins între 6 şi 9, diferenţa de
concentraţie a ionilor de H fiind echivalentă cu diferenţa de la l la 1000. Toleranţa la variaţia largă a pH se
datorează faptului că bacteriile sunt puţin permeabile pentru ionii de H + şi OH-, ceea ce le permite menţinerea
neutralităţii interne.
Aşa se explică faptul că, deseori, tocmai acizii slabi şi bazele slabe, care se disociază puţin, au un
efect antibacterian evident (McDonell, 1999). Efectul lor nu se datorează ionilor de H + sau OH-, ci este legat
de prezenţa unui număr mare de molecule nedisociate, acizi sau baze care pot pătrunde în celulă mai uşor
decât ionii corespunzători. De aceea, activitatea lor antimicrobiană este dependentă de pH-ul mediului. Aşa se
explică faptul că într-un mediu uşor acid, acidul acetic este toxic pentru bacterii, pe când HCl are un efect
antibacterian slab. La un pH relativ scăzut al mediului, acizii slabi, aflaţi sub forma nedisociată pot pătrunde
în celula bacteriană şi îi modifică pH, în timp ce acizii tari, intens disociaţi rămân în afara ei. In mediul neutru
sau uşor alcalin, moleculele de acid acetic sunt aproape complet ionizate (disociate), ceea ce le îngreuiază
accesul în celulă şi, ca urmare, toxicitatea lor este anulată. Acelaşi mod de comportare este caracteristic şi
bazelor slabe: NH3 este toxic în mediu slab alcalin şi inofensiv pentru bacterii, în mediu neutru sau slab acid.
Pentru acizii tari, eficienţa acţiunii antimicrobiene este proporţională cu concentraţia ionilor de H + în soluţie.
HCl este sporicid şi se foloseşte pentru dezinfectarea pieilor de animale, infectate cu B. anthracis. Unele
bacterii sunt acidotolerante şi chiar acidofile. Lactobacillus sp. se dezvoltă la pH 4, iar Thiobacillus
thiooxidans, chiar în prezenţa H2SO4, 0,1 M. Acţiunea antimicrobiană a acizilor este folosită în practică pentru
conservarea alimentelor cu acid acetic 5%, cu sărurile acidului propionic (CH 3- CH2 - COOH),
parahidrobenzoic, benzoic, sorbic sau cu esterii metil, etil, propil, butil, ori prin fermentaţie lactică naturală.
Micobacteriile sunt relativ rezistente la acţiunea acizilor şi alcolilor, practica obisnuită fiind lichefierea sputei
înainte de cultivare, prin expunere pentru 30 de minute, la NaOH 1N sau H 2SO4 1N. Acidul boric este un
antiseptic de valoare medie.
Activitatea antimicrobiană a alcalilor tari este dependentă de concentraţia ionului OH - în soluţie.
NaOH are proprietăţi alcaline puternice: la concentraţia de 5% omoară celulele vegetative, iar la concentraţii
mai mari omoară sporii de Bacillus anthracis. Ca(OH)2 rezultă din reacţia CaO + H 2O. Soluţia 20% de
Ca(OH)2 omoară majoritatea bacteriilor nesporulate.
Alcoolii sunt cei mai utilizaţi agenţi chimici pentru dezinfecţie. Ei sunt activi prin efectul denaturant
asupra proteinelor şi prin solubilizarea lipidelor. Produc ruperea membranelor şi inactivarea enzimelor.
Omoară bacteriile nesporulate, inclusiv pe cele acidorezistente. Inhibă sporularea şi germinarea sporilor, dar
efectul este reversibil. Efectul dezinfectant al alcoolilor creşte odată cu lungimea catenei (metilic, etilic,
izopropanol etc), până la 8 - l0 atomi de C, după care solubilitatea în apă scade progresiv. Cei mai folosiţi
alcooli sunt CH3OH (metanol), C2H5OH (etanol) şi CH3CHOHCH3 (izopropanol). Ultimul este un bactericid
mai eficace, la concentraţia de 99%. Etanolul se foloseşte în soluţii apoase. Cele mai eficiente sunt cele cu
concentraţia de 60 - 70%. Prezenţa apei este esenţială pentru activitatea antimicrobiană a etanolului.
Concentraţiile mai mari de 90% şi mai mici de 5% sunt relativ ineficiente ca agenţi dezinfectanţi. Acţiunea lor
dezinfectantă, ca şi efectul denaturant asupra proteinelor implică participarea apei. Eficienţa acţiunii lor scade
în prezenţa materiei organice. Expunerea timp de o oră este letală pentru formele vegetative, nu modifică
viabilitatea sporilor, dar inhibă sporularea şi germinarea lor. Contactul de scurtă durată nu are efect sterilizant,
ci numai reducerea populaţiei bacteriene. Alcoolii au activitate antibacteriană rapidă, cu spectru larg faţă de
formele vegetative (inclusiv micobacterii), antifungică, neutralizează infecţiozitatea virusurilor (Zneiden,
1998). Pentru că nu omoară sporii, alcoolii nu se folosesc pentru sterilizare, dar se folosesc pentru
dezinfectarea suprafeţelor şi ca antiseptice tegumentare. Alcoolul izopropilic este mai eficient faţă de bacterii,
iar alcoolul etilic este mai eficient faţă de virusuri (Mihăescu, 2000).
Fenil-etanolul este activ faţa de bacteriile Gram negative şi se foloseşte drept conservant al soluţiilor
de uz oftalmic.
Alţi solvenţi organici (eter, benzen, acetonă) omoară bacteriile dar nu sunt agenţi dezinfectanţi.
Adăugarea câtorva picături de toluen sau cloroform în soluţii apoase inhibă dezvoltarea fungilor şi bacteriilor.
Glicerolul este bacteriostatic la concentraţii de peste 50%. Este folosit pentru conservarea vaccinurilor,
deoarece nu este iritant pentru ţesuturi.

37
Fenolul (acidul carbolic) este cel mai vechi dezinfectant cunoscut, fiind utilizat de Lister încă din
l867. La concentraţii mici este bactericid, deoarece produce denaturarea şi chiar precipitarea proteinelor
celulare. Este iritant şi produce coagularea proteinelor tisulare. Aceleaşi efecte le produc şi derivaţii săi
(crezolul, crezil-acetatul). Agenţii antimicrobieni de tip fenolic s-au folosit pentru proprietăţile antiseptice,
dezinfectante sau conservative, în funcţie de compus. Adeseori s-au denumit “otrăvuri protoplasmatice
generale” (McDonnell, 1999), dar sunt activi şi faţă de membrană.
Fenolul induce pierderea progresivă a constituienţilor intracelulari, inclusiv eliberarea K +, indiciul
major al leziunii membranare. Se consideră că fenolul acţionează la punctul de separare a celulelor fiice
pereche. Celulele tinere sunt mai sensibile. Fenolii sunt antifungici şi antivirali. Acţiunea antifungică se
datorează lezării membranei plasmatice şi pierderii constituienţilor citoplasmatici (McDonell, 1999). Fenolul
şi crezolii au proprietăţi analgezice. Se folosesc sub formă de spray ca antiseptice şi analgezice pe
membranele mucoase (ale urechii, nasului, gâtului). Sunt foarte stabili la încălzire şi uscare şi îşi păstrează
activitatea în prezenţa materialului organic. Faţă de sporii bacterieni au o eficienţă moderată. În diluţie de
5%o, fenolul este folosit ca prezervant pentru diferite preparate biologice. Prin convenţie internaţională,
activitatea fenolului este considerată ca etalon, în raport cu care se apreciază activitatea antibacteriană a
diferitelor substanţe. Fenolii sunt mai activi în amestec cu săpunurile, care măresc solubilitatea lor şi
favorizează penetrarea în substrat. Adăugarea unui halogen (clor) sau a unui compus organic stimulează
activitatea microbicidă a fenolilor.
Difenolii sunt derivaţii hidroxi-halogenaţi a două grupări fenolice conectate prin diferite legături. Au
spectru larg de eficacitate, sunt sporostatici, dar au activitate scăzută faţă de Pseudomonas aeruginosa şi
fungi. Triclosanul şi hexaclorofenul sunt cele mai folosite biocide din acest grup: în săpunurile antiseptice şi
în soluţiile dezinfectante pentru mâini. Ambele au efecte cumulative şi persistente asupra tegumentului.
Triclosanul are activitate în special faţă de bacteriile Gram pozitive. Eficienţa faţă de bacteriile Gram
negative şi levuri poate să crească prin efectul de formulare: de exemplu, în asociaţie cu EDTA, determină
creşterea permeabilităţii membranei externe. Efectul primar se produce, probabil, asupra membranei
citoplasmatice, deoarece inhibă înglobarea nutrienţilor, iar concentraţiile mari bactericide produc creşterea
amplă a permeabilităţii şi eliberarea rapidă a componentelor celulare.
Hexaclorofenul (difenol-halogenat) este bacteriostatic la diluţii foarte mari. In combinaţie cu un săpun
este un dezinfectant eficace al pielii. Dacă este absorbit pe cale tegumentară este toxic. Nu are miros iritant,
este un bun deodorant, ceea ce explică utilizarea sa ca deodorant comercial şi pentru producerea săpunurilor,
înainte de a fi interzis, datorită neurotoxicităţii la copii. Mecanismul de acţiune constă în inhibiţia catenei
transportoare de electroni, al cărei sediu structural este membrana citoplasmatică, efectul fiind bactericid.
Clorhexidenul este probabil cel mai folosit biocid în scopul producerii antisepticelor utilizate pentru
curăţirea mâinilor, dar şi ca dezinfectant şi conservant. Este un înlocuitor eficient al hexaclorofenului. Are
eficienţă cu spectru larg. Activitatea antibacteriană este dependentă de pH şi este mult diminuată în prezenţa
materiei organice. Clorhexidenul este un agent bactericid, deoarece traversează peretele celular sau membrana
externă, prin difuzie pasivă şi acţionează asupra membranei citoplasmatice, perturbând-i permeabilitatea. Nu
este sporicid. Efectul asupra germinării este minim, dar inhibă creşterea. Micobacteriile sunt, în general, foarte
rezistente la clorhexiden.
Alexidina diferă chimic de clorhexiden, pentru că are grupări terminale etil-hexil. Are acţiune mai
rapid bactericidă, deoarece alterează mai rapid permeabilitatea.
Esterii alchilaţi ai acidului hidroxibenzoic sunt conservanţi ai alimentelor şi medicamentelor. Nu sunt
toxici, deoarece sunt hidrolizaţi rapid.

2.3. Substanţe care acţionează prin interferenţă cu grupările active ale proteinelor-enzime
Unele substanţe acţionează direct asupra unor grupări reactive (amino, carboxil, sulfhidril, amido,
indol) din structura enzimelor, combinându-se cu ele şi blocând astfel sau modificând activitatea enzimatică.
In funcţie de stabilitatea legăturii formate între aceste substanţe şi grupările reactive ale enzimelor, efectul este
microbiostatic sau microbicid, iar reacţia este reversibilă sau ireversibilă.
Formaldehida (HCHO) şi glutaraldehida (OCH(CH2)3CHO) omoară celulele prin denaturarea
nespecifică a proteinelor şi acizilor nucleici şi au spectru larg de acţiune antimicrobiană.
Formaldehida (CH2O) este o monoaldehidă, foarte reactivă, care interacţionează cu proteinele, cu
ADN şi cu ARN. Concentraţiile de 25 g/ml pot fi bactericide. Ele înlocuie atomii labili de H din grupările
-NH2, -OH, -COOH, -SH ale proteinelor şi formează punţi metilenice (R-CH 2-R), care leagă, în general
ireversibil, moleculele proteice şi le inactiveză. Reacţiile formaldehidei sunt, parţial, ireversibile. Se foloseşte
în soluţie apoasă (34 - 38%) sau 20% în alcool metilic 65 - 70% (pentru a întârzia polimerizarea) sau prin
vaporizare la cald, pentru dezinfectarea şi sterilizarea suprafeţelor uscate. Este bactericidă, fungicidă,

38
sporicidă şi inactivează virusurile. In concentraţie de 4% o este folosită ca prezervant pentru vaccinuri şi
preparate de diagnostic. Soluţiile de formaldehidă, apoase sau alcoolice sunt netoxice şi neiritante. Ele omoară
celulele vegetative în 5 minute, Mycobacterium tuberculosis – în l0 minute, sporii în 3 - l2 ore şi inactivează
virusurile în l0 minute (McDonell, 1999). O-ftalaldehida are acţiune bactericidă şi sporicidă. Este un compus
aromatic cu două grupări aldehidice.
Glutaraldehida are spectru larg de activitate faţă de bacterii, spori, fungi şi inactivează virusurile. Se
leagă de structurile de suprafaţă ale celulei, inhibă transportul membranar şi enzimele periplasmice, inhibă
sinteza macromoleculelor. Glutaraldehida interacţionează puternic cu lizina, dar şi cu alţi aminoacizi. Este mai
activă la pH alcalin. Pe măsură ce pH extracelular se modifică la valori alcaline, suprafaţa celulei expune mai
multe situsuri reactive şi efectul bactericid este mai rapid. Are efect letal asupra micobacteriilor. La
concentraţii mici inhibă germinarea sporului, iar la concentraţii mari (2%) este sporicidă.
Datorită efectului denaturant asupra proteinelor, glutaraldehida se foloseşte ca fixator în tehnica de
preparare a materialului biologic pentru examinarea la microscopul electronic.
Etilen-oxidul (CH2-O-CH2) este cel mai folosit gaz sterilizant. Molecula de etilen-oxid înlocuie H din
proteine, din acizii nucleici şi probabil din alte molecule. Legarea etilen-oxidului se numeşte alchilare şi
efectul este blocarea grupărilor reactive ale macromoleculelor. Este solubil în apă şi foarte exploziv. Este
folosit pentru sterilizarea gazoasă a obiectelor termosensibile: echipamente chirurgicale, lenjerie de spital. Are
acţiune toxică remanentă (este vezicant).
Ionii unor metale grele (Hg, Ag, Cu, Zn, Fe) sunt toxici pentru microorganisme datorită acţiunii lor
oligodinamice, adică sunt activi la concentraţii foarte mici. Cu, Zn, Fe intră în componenţa unor enzime şi au
rolul fiziologic de microelemente, dar la concentraţii supraoptimale, în compoziţia substanţelor
antimicrobiene, ionii metalelor grele acţionează prin precipitarea enzimelor sau a altor proteine esenţiale ale
celulei. Ionii metalici pot fi aşezaţi în serii cu activitate antimicrobiană descrescătoare: Hg, Ag, Zn, Cu. Sunt
activi la concentraţii foarte mici (o parte la un milion), datorită afinităţii lor pentru grupările SH.
Hg este utilizat sub forma sărurilor anorganice (HgCl 2, sublimat coroziv, cu CF = 827 şi oxicianura de
Hg) sau sub formă organică (mertiolat, mercurocrom). Acţiunea sărurilor de Hg se datorează formării de
mercaptide cu grupările –SH ale proteinelor. Iniţial, reacţia este reversibilă şi efectul este microbiostatic.
Efectul HgCl2 este neutralizat prin adăugarea în exces a compuşilor cu grupări –SH (glutation, tioglicolat).
Din această cauză, utilizarea ei este considerată a fi perimată. După contactul prelungit sau prin utilizarea unor
concentraţii mari de HgCl2, reacţia devine ireversibilă şi efectul este microbicid. HgCl 2 este folosită curent în
laborator, la concentraţii de 1/l000 până la 1/l0 000, care omoară toate microorganismele. La diluţii mari
(1/20000 sau mai mari), efectul este bacteriostatic. Compuşii organici cu Hg se folosesc pentru dezinfectarea
rănilor superficiale şi pentru conservarea serurilor şi vaccinurilor.
Argintul şi compuşii săi au fost folosiţi mult timp ca agenţi antimicrobieni. Ionii de Ag au efect
microbiostatic, la concentraţii foarte mici şi microbicid, la concentraţii mai mari. Se pare că unele proteine au
afinitate mare pentru ionii de Ag şi îi fixează chiar la concentraţii mici. Bacteriile omorâte sub acţiunea ionilor
de Ag conţin în medie l06 ioni/celulă, ceea ce corespunde aproximativ numărului de molecule de proteine-
enzime dintr-o celulă. Cel mai important compus este Ag - sulfadiazina (AgSD), dar se folosesc şi alţi
compuşi: acetatul şi nitratul de Ag. AgNO3, în soluţie de 1% (Argyrol) se foloseşte pentru a inhiba posibilele
infecţii gonococice ale ochiului la noul născut. Se instilează în ochi imediat după naştere, deoarece infecţia
nosocomială poate determina orbirea. În locul AgNO 3 s-a folosit penicilina, dar odată cu preponderenţa
bacteriilor rezistente la penicilină, AgNO 3 a fost reintrodus în uz. Ionii de Ag interacţionează cu grupările thiol
(-SH), dar probabil şi cu alte ţinte, iar la nivel membranar produce eliberarea ionilor de K +. Aminoacizii, ca
cisteina şi alţi compuşi (tioglicolatul de Na) care conţin grupări tiol, neutralizează activitatea AgNO 3 faţă de
Ps. aeruginosa. Aminoacizii care conţin legătura S-S (disulfid), aminoacizii fără S şi compuşii cu S ca acidul
cisteic, L-metionina, taurina, tiosulfatul de Na, nu neutralizează activitatea Ag +. Faptul sugerează că
interacţiunea Ag+ cu gruparea tiol a enzimelor şi proteinelor. Joacă rol esenţial în inactivarea bacteriilor, dar
pot fi implicate şi alte componente celulare. Sărurile de Ag şi ale altor metale grele (Cu) acţionează prin
legarea de grupările funcţionale ale enzimelor fungice. Ag + produce eliberarea ionilor de K+ din celula
microorganismelor. Membrana citoplasmatică, sediul activităţii multor enzime, este o ţintă importantă pentru
activitatea Ag. Ag+ este activ nu numai asupra enzimelor: produce inhibiţia marcată a creşterii la
Cryptococcus neoformans şi este depozitat în perete şi în vacuolă citoplasmatică. Ag + inhibă diviziunea
celulară şi lezează membrana externă la Ps. aeruginosa. Volumul celulei creşte semnificativ, iar
componentele sale exprimă anomalii structurale. Ag + interacţionează cu acizii nucleici, cel mai probabil cu
bazele.
Sulfadiazina este o combinaţie a doi agenţi antibacterieni: Ag + şi sulfadiazina (SD). Efectul
antibacterian este rezultatul unui singur compus sau este rezultatul interacţiunii sinergice. AgSD are un
spectru larg de activitate, dar spre deosebire de AgNO 3 induce formarea protuberanţelor membranare la

39
bacteriile sensibile (dar nu şi la cele rezistente). AgSD se leagă de macromoleculele celulare, inclusiv de acizii
nucleici.
Zincul se foloseşte sub forma unui amestec al sării (ZnCl 2), cu acizi graşi cu lanţ lung. Se foloseşte ca
pulbere antifungică sau ca unguent. ZnCl 2 este astringentă şi se utilizează în tratamentul leziunilor
superficiale. Pasta de ZnO se foloseşte pentru tratamentul infecţiilor fungice şi bacteriene.
Acţiunea substanţelor dezinfectante asupra microorganismelor se desfăşoară ca un proces treptat, în
cursul căruia, numărul bacteriilor viabile scade progresiv: în fiecare unitate de timp va fi distrus un procent
constant din numărul celulelor viabile (Todar, 2002). Efectul antimicrobian este dependent de sensibilitatea
microorganismului, de faza sa de creştere, de forma de existenţă (vegetativă sau spor), de natura şi
concentraţia substanţei bactericide, de durata acţiunii ei, de compoziţia chimică a mediului şi de pH. Prezenţa
unor substanţe organice supraadaugate, alcalinitatea şi temperaturile scăzute diminuă efectele toxice ale
substanţelor chimice.
Halogenii şi compuşii lor. Halogenii, clorul şi iodul, se folosesc ca dezinfectanţi sub formă organică şi
anorganică. Majoritatea compuşilor organici ai halogenilor au efect letal asupra celulelor, prin oxidarea
proteinelor, ruperea membranelor şi inactivarea enzimelor. Iodul este mai puţin reactiv decât clorul, dar are
efecte bactericide, fungicide, sporicide, tuberculocide şi inactivează virusurile. Tincturile (soluţiile) apoase şi
alcoolice se folosesc de peste 150 de ani ca antiseptice, sunt iritante şi colorante. În soluţie se găsesc mai
multe variante de iod, în echilibru cantitativ, dar activitatea antimicrobiană principală este produsă de iodul
molecular. Iodul se combină ireversibil cu proteinele, prin iodurarea tirozinei şi este un agent oxidant (Topley
şi Wilson, 1998). Tinctura de iod (2 - 7%), adică iodul metalic (I 2), dizolvat în soluţie alcoolică concentrată de
KI, este antiseptic şi se aplică pe suprafaţa pielii, înainte de procedeul chirurgical şi pe rănile mici. Soluţiile
apoase sunt instabile: în soluţie cel puţin 7 specii molecule de iod se găsesc în echilibru cu I 2. Cel mai activ
este iodul diatomic (I2), având efect microbicid rapid faţă de bacterii, levuri, microfungi, spori. Folosirea
iodului este limitată de toxicitate şi de culoare. Este iritant şi poate determina chiar reacţii alergice. De aceea
se utilizează iodofori –complexe alcătuite din iod şi un agent de solubilizare, cu rol de purtător al iodului, pe
care-l eliberează sub forma sa activă. Iodoforii sunt mai puţin activi faţă de fungi şi spori, comparativ cu
tincturile. Iodul pătrunde rapid în celulă şi reacţionează cu grupările esenţiale ale macromoleculelor: cu
aminoacizii cu S (cisteina şi metionina), cu nucleotidele, cu acizii graşi. Efectul este letal. Virusurile nude sunt
cele mai sensibile, iar cele învelite sunt mai rezistente. Ca şi în cazul bacteriilor, iodul denaturează proteinele
capsidei sau ale învelişului. Iodoforii acţionează ca rezervor de iod activ, liber. Iodul este solubilizat de agenţi
tensioactivi: detergenţi neionici cu proprietăţi dezinfectante şi polivinil pirolidona, cu proprietăţi antiseptice.
Iodul se leagă uşor cu aceşti compuşi organici, de unde este eliberat lent, fapt ce condiţionează o dezinfecţie
eficientă. Iodoforii sunt microbicizi la variaţii mari de pH şi îşi păstrează activitatea în prezenţa materiei
organice. Iodul se fixează de un grup important de proteine (în special cele care nu conţin aminoacizi cu S), de
nucleotide şi acizi graşi, producând moartea celulei. Clorul liber are culoare caracteristică (verde) şi miros
pătrunzător. În oricare din variatele sale forme, clorul este deodorant şi dezinfectant. Clorul este un agent
bactericid foarte puternic (CF = 200). Adăugat în apă, clorul formează acidul hipocloros, produs instabil care
degajă O2 în stare născândă, un oxidant foarte puternic, după reacţiile:

În soluţie apoasă (apa de clor), clorul este bactericid la concentraţia de 0,02%, după maxim 5 minute.
Se foloseşte pentru tratarea apei potabile (clorinare), la concentraţia de 1 - 3 mg/l. Clorul şi compuşii săi sunt
inactivaţi în prezenţa materiei organice şi a catalizatorilor metalici. Soluţiile de hipoclorit sunt folosite pentru
dezinfectare şi ca deodorante. Sunt inofensive pentru ţesuturile umane, uşor de manevrat, incolore, dar
decolorante. Se folosesc în spitale pentru dezinfectarea camerelor, a suprafeţelor, a instrumentelor
nechirurgicale.
Agenţii care eliberează clorul sunt cloraminele (derivaţi cloruraţi ai aminelor (R-NHCl), din care face
parte cloramina-T), hipocloritul de Na, dioxidul de clor. Sunt compuşi mult mai stabili decât hipocloriţii,
cristalini, solubili în apă, cu care dau prin hidroliză, hipoclorit de sodiu şi anionul hipocloros. Sunt active la
concentraţii de 0,5 - l,5%, exprimate în clor activ. Hipocloritul de Na se foloseşte ca înălbitor al ţesăturilor. In
apă, ionizează şi eliberează Na+ şi ionul hipoclorit (OCl-), care stabileşte un echilibru cu acidul hipocloros
(HOCl). La pH 4-7, clorul există predominant ca HClO, iar la pH peste 9, predomină OCl -. Se foloseşte pentru
dezinfecţia obiectelor contaminate cu sânge infectat cu HIV sa cu virusul hepatitei B (VHB). Agenţii care
eliberează Cl sunt oxidanţi foarte activi şi denaturează proteinele celulare. La pH scăzut, activitatea
compuşilor care eliberează Cl este maximă. În concentraţii mari, agenţii care eliberează Cl sunt sporicizi.

40
Acidul hipocloros perturbă fosforilarea oxidativă. Câţiva compuşi organici cloruraţi se folosesc pentru
dezinfectarea apei. Cel mai utilizat este compusul halazon sau acidul parasulfon-dicloraminobenzoic. La
concentraţia de 4 - 8 mg/l dezinfectează, în 30 de minute, apa ce conţine bacili tifici.
Succin-clorimidul, o clorură organică stabilă în formă de tabletă, devine activă în contact cu apa. Este
ineficientă faţă de chiştii de Entamoeba hystolitica.
Alţi agenţi oxidanţi. Permanganatul de potasiu (KMnO4), în concentraţie de 1:l0000 este un antiseptic
puternic, dar acţiunea sa este neutralizată de prezenţa substanţelor organice.
Peroxizii. Peroxidul de H, perhidrolul sau apa oxigenată (H2O2) este un antiseptic eficient şi netoxic.
Se foloseşte pentru dezinfecţie, sterilizare şi antisepsie. Este un lichid incolor, disponibil într-o varietate de
concentraţii, de la 3 la 90%. Molecula este instabilă şi se descompune repede în H 2O şi O2, după reacţia:

Deşi soluţiile pure sunt în general stabile, cele mai multe conţin stabilizatori care împiedică
descompunerea. H2O2 are un spectru larg de eficacitate faţă de bacterii, spori bacterieni, levuri şi inactivează
virusurile. Este mai activ faţă de bacteriile Gram pozitive, dar prezenţa catalazei sau altor peroxidaze poate să
le facă tolerante la concentraţiile mici de H 2O2. Pentru efectul sporicid sunt necesare concentraţii de 10 - 30%
şi timp mai îndelungat de contact. H 2O2 acţionează ca oxidant, producând radicalul OH. liber, reactiv faţă de
grupările cu S şi faţă de dublele legături ale macromoleculelor. În timpul generării O 2 se formează O2-
(radicalul superoxid), în prezenţa ionilor de metal din citoplasmă. Radicalul O 2- reacţionează cu grupările
încărcate negativ ale proteinelor şi inactivează enzimele. Concentraţia de 6-25% H 2O2 se foloseşte pentru
sterilizarea unor materiale (implante chirurgicale, lentile de contact). Nu are toxicitate remanentă.
Concentraţia de 0,1% H2O2 în lapte, la temperatura de 54o, diminuă numărul total de bacterii cu 99,99%. La
concentraţia de l0%, distruge sporii şi inactivează virusurile. Soluţia comercială de 3% se foloseşte pentru
dezinfecţia rănilor, deoarece bacteriile anaerobe sunt foarte sensibile la prezenţa O 2.
Peroxidul de sodiu (Na2O2), ca pastă, se foloseşte pentru tratamentul acneii.
Peroxidul de zinc (ZnO2) se foloseşte în suspensie cu ZnO şi Zn(OH) 2 pentru tratamentul infecţiilor
tegumentare cu bacterii microaerofile şi anaerobe.
Benzoil-peroxidul se foloseşte pentru tratamentul acneii şi se adaugă în soluţiile de curăţire a pielii.
Acidul peracetic (CH3 –CO–O–OH) este un agent oxidant puternic şi se foloseşte sub formă gazoasă
pentru sterilizarea la temperatură scăzută, a camerelor destinate creşterii animalelor germ-free, a aparaturii
medicale pentru hemodializă şi ca sterilizant al suprafeţelor. Este bactericid, fungicid şi inactivator al
virusurilor la concentraţii mai mici de 0,3%. Se descompune la acid acetic şi O 2, dar nu este sensibil la
acţiunea peroxidazei şi rămâne activ în prezenţa materiei organice. Acidul peracetic denaturează proteinele şi
enzimele, rupând legăturile SH şi S-S.

2.4. Coloranţii antiseptici

O categorie specială de coloranţi manifestă acţiune bacteriostatică: derivaţii acridinei şi coloranţii de


rozanilină.
Acriflavina este un amestec format din doi derivaţi ai acridinei. Are toxicitate scăzută şi nu
sensibilizează tegumentul. Are un spectru larg de acţiune şi se foloseşte pentru tratamentul infecţiilor tractului
urinar. Mecanismul de acţiune pare să conste în capacitatea acridinelor de a se insera între nucleotidele
moleculei de ADN.
Cristal-violetul este un derivat metilic al colorantului rosanilină. Este colorantul utilizat în reacţia
Gram, dar are şi efect bacteriostatic asupra bacteriilor Gram pozitive.

Structura moleculară a cristal-violetului (Violet de genţiana)

Cristal-violetul a fost folosit pentru tratamentul vaginitei cauzată de Trichomonas. Agentul etiologic al
candidozei vaginale, C. albicans este foarte sensibil la acţiunea colorantului. Mecanismul de acţiune a acestui

41
compus faţă de bacteriile Gram pozitive este foarte asemănător cu acela al penicilinei, ce constă în blocarea
treptei finale a sintezei peretelui celular.
Quinonele sunt coloranţi naturali, care conferă culoare multor forme de viaţă, plante şi animale. Unele
quinone sunt fungicide de importanţă agricolă: cloranil şi diclone.

2.5. Agenţi sterilizanţi în fază de vapori

Multe instrumente medicale termosensibile pot fi sterilizate prin acţiunea sterilizanţilor lichizi
(glutaraldehidă, acidul peracetic, H 2O2) sau a agenţilor sterilizanţi în faza de vapori. Cei mai folosiţi agenţi în
aceste sisteme reci sunt oxidul de etilenă, formaldehida, iar mai recent se folosesc H 2O2 şi acidul peracetic.
Etilen-oxidul şi formaldehida sunt agenţi alchilanţi cu spectru larg. Agenţii alchilanţi sunt substanţe
care adaugă gruparea alchil (ca de exemplu, -CH3), la alte molecule. Adăugând un grup alchil la o bază
azotată, îi modifică dimensiunile şi determină o eroare de împerechere. Agenţii alchilanţi acţionează asupra
ciclurilor purinice azotate, la nivelul O 6 al guaninei sau O4 din bazele pirimidinice, producând leziuni
mutagene, dar şi la nivelul legăturilor fosfodiesterice ale catenei de ADN. Activitatea lor este dependentă de
concentraţia activă, temperatură, durata expunerii, umiditatea relativă.
Agenţii alchilanţi se formează prin prepararea multor produse alimentare, în gazele de eşapament prin
combustia internă a N2 atmosferic, formâdu-se nitraţi şi nitriţi. Prin arderea tutunului, a produselor petroliere
şi prin prepararea alimentelor, din resturile de guanină se formează hidrocarburi policiclice aromatice, cu efect
alchilant asupra ADN (Zneiden, 1998; McDonell, 1999). Fiind agenţi alchilanţi, etilen-oxidul şi formaldehida
reacţionează cu proteinele, acizii nucleici, fiind foarte reactivi faţă de grupările sulfhidril (-SH) ale proteinelor.
Etilen-oxidul are dezavantajul că este exploziv şi mutagen. H 2O2 şi acidul peracetic în fază de vapori sunt
agenţi oxidanţi mai activi, la concentraţiile inferioare, decât cele în formă lichidă. Ambele au toxicitate
scăzută, acţiune rapidă la temperatură scăzută, dar au penetranţă scăzută.

2.6. Rezistenţa microorganismelor la acţiunea antisepticelor şi dezinfectantelor

Rezistenţa microorganismelor la acţiunea antisepticelor (AS) şi dezinfectantelor (DF) poate fi


naturală (intrinsecă) sau dobândită.
Rezistenţa intrinsecă sau naturală este proprie bacteriilor Gram negative, sporilor, micobacteriilor.
Este o proprietate controlată de gene cromosomale şi permite depăşirea acţiunii unui antiseptic sau
dezinfectant. Moleculele de antiseptic sau dezinfectant trebuie să străbată straturile externe pentru a atinge
ţinta celulară. Structura chimică a acestor straturi depinde de grupul de microorganisme şi poate constitui o
barieră eficientă de permeabilitate, limitând difuzia agentului chimic. Mult mai rar este posibil ca enzimele
sintetizate constitutiv să degradeze compusul antiseptic sau dezinfectant.
Sporii de Bacillus spp. şi Clostridium spp. sunt cei mai rezistenţi la antiseptice şi dezinfectante. Sporii
de Bacillus spp.(deşi, în general, nu sunt patogene), sunt folosiţi ca indicatori ai sterilizării eficiente. Sporii de
Clostridium sunt patogeni semnificativi: Cl. difficile este cauza comună a diareii de spital.
Multe biocide sunt bactericide sau bacteriostatice la concentraţii mici, pentru formele vegetative, dar
pentru efectul sporicid sunt necesare concentraţii mai mari (de exemplu, glutaraldehida şi agenţii care
eliberează clor). Alcoolii, fenolii, sărurile quaternare de amoniu şi clorhexidina nu au efect sporicid, decât la
temperaturi superioare (Tortora şi colab., 1995). Rezistenţa superioară a sporilor se datorează structurii
complexe a învelişurilor sporale multiple. Invelişurile sporale cuprind o fracţie majoră a sporului. Aceste
structuri sunt de natură proteică, cu o fracţie de polipeptide acide solubile în baze, în învelişul intern şi o
fracţie rezistentă la baze, datorată legăturilor S-S.
Sporularea ete procesul în care celula vegetativă se diferenţiază în spor şi implică 7 stadii. Celula
vegetativă (stadiul 0) suferă schimbări morfo-funcţionale, care culminează cu eliberarea sporului matur
(stadiul VII). Pentru dezvoltarea rezistenţei la biocide, stadiile IV (dezvoltarea cortexului) până la VII, sunt
cele mai importante pentru dezvoltarea rezistenţei la biocide. Studiul mecanismelor rezistenţei sporale se
studiază prin tehnica parcurgerii retrograde a treptelor sporulării, care constă în îndepărtarea secvenţială a
învelişului sporal. In acest scop se folosesc mutante de sporulare, care nu progresează dincolo de stadiile
determinate genetic ale sporului, ceea ce permite o sporulare cu un grad înalt de sincronizare. Se adaugă
antisepticul sau dezinfectantul la începutul sporulării şi se determină gradul de progresie a sporulării (Black,
1996).
Unele microorganisme au un grad intermediar de rezistenţă la AS şi DF, între cele sporulate şi
nesporulate. La micobacterii, rezistenţa se datorează peretelui celular complex, care constituie o barieră
eficientă faţă de pătrunderea agenţilor chimici: peptidoglicanul este legat covalent cu un copolimer
polizaharidic (arabinogalactan), alcătuit din arabinoză şi galactoză, esterificate cu acizi micolici. Antisepticele

42
şi dezinfectantele care au activitate asupra micobacteriilor sunt fenolul, acidul peracetic, H 2O2, alcoolul şi
glutaraldehida. Alţi agenţi bactericizi – clorhexidina, sărurile amoniului quaternar, sunt bacteriostatice faţă de
Mycobacterium spp., chiar la concentraţii mari. Biocidele hidrofile nu penetrează învelişul lipidic consistent
hidrofob al celulelor de Mycobacterium, la concentraţii suficient de mari, pentru a fi letale. Activitatea lor
poate să crească sub efectul diferitelor variantelor de formulare (Mihăescu, 2000).
Peretele Gram pozitiv al bacteriilor din g. Staphylococcus este format din peptidoglican şi acizi
teichoici. Nici unul dintre componente nu are rolul de barieră eficientă faţă de AS şi DF. Plasticitatea
structurii mureinei este bine cunoscută: grosimea şi numărul de legături transversale ale peptidoglicanului sunt
influenţate de condiţiile de mediu şi de starea fiziologică a celulei, ceea ce modifică gradul lor de sensibilitate
la antiseptice şi dezinfectante. De exemplu, S. aureus poare să existe în varianta mucoidă, celulele fiind
înconjurate de un strat mucos. Tulpinile nemucoide sunt mai sensibile decât cele mucoide, la acţiunea
agenţilor chimici. Bacteriile Gram negative, în general, sunt mai rezistente decât bacteriile Gram pozitive
nesporulate: concentraţia minimă inhibitorie a dezinfectanţilor şi antisepticelor este mai mare la bacteriile
Gram negative, deoarece membrana externă acţionează ca barieră limitantă a pătrunderii agenţilor
antibacterieni.
Fenotipul organismelor sesile în biofilme diferă semnificativ de al celulelor planctonice sau de cele
crescute pe medii artificiale, în laborator. În diferite zone ale biofilmului, bacteriile au disponibilităţi diferite
ale nutrienţilor, iar proprietăţile fiziologice sunt modificate. In profunzimea biofilmului, limitarea nutrienţilor
reduce rata de creştere a bacteriilor, ceea ce modifică sensibilitatea la acţiunea agenţilor antimicrobieni.
Bacteriile cu o rată mică de creştere sunt deosebit de rezistente. Sensibilitatea redusă a bacteriilor într-un
biofilm se datorează mai multor factori:
- accesul redus al dezinfectantului sau antibioticului la celulele din biofilm;
- interacţiunea chimică între DF şi biofilm;
- producerea enzimelor degradative şi/neutralizante ale substanţelor chimice;
- schimbul genetic dintre celule în biofilm.
Bacteriile din biofilm, recultivate în mediul lichid, redevin sensibile ca şi celulele planctonice ale
speciei respective.
Rezistenţa dobândită. Ca şi în cazul antibioticelor şi al altor agenţi chimici, rezistenţa dobândită la AS
şi DF poate să se producă prin mutaţie sau prin dobândirea unei plasmide sau a unui Tn (casetă transmisibilă
de ADN cromosomal sau plasmidial, cu proprietăţi de integrare). Cu excepţia Ag, a compuşilor
organomercurici, plasmidele induc niveluri semnificative de rezistenţă la AS şi DF (Todar, 2002). Compuşii
Hg nu se mai folosesc ca dezinfectanţi, dar sărurile fenil-mercurice şi tiomersalul se folosesc ca agenţi
conservanţi pentru unele produse farmaceutice. Rezistenţa la Hg este plasmidială, inductibilă şi poate fi
transferată prin conjugare sau transducţie. Izolatele clinice de S. aureus care sintetizează -lactamază sunt
rezistente la Hg2+ anorganic şi la agenţii organomercurici.

2.7. Evaluarea potenţialului antibacterian al agenţilor chimici

Potenţialul sau eficienţa unui agent chimic antimicrobian este influenţată de temperatură, pH,
concentraţie şi timpul de acţiune. Creşterea temperaturii cu l0 oC dublează rata reacţiilor chimice şi măreşte
potenţialul agentului chimic. La o valoare a pH-ului care măreşte gradul de ionizare a unui agent chimic creşte
şi capacitatea sa de a penetra în celulă. Valoarea pH poate altera chiar conţinutul celulei.
Concentraţia influenţează decisiv efectele agentului antibacterian. Concentraţiile mari pot fi
bactericide, iar cele mici pot fi bacteriostatice (Zneiden, 1998; McDonell, 1999). Alcoolul etilic şi izopropilic
sunt excepţii notabile de la regula concentraţiilor. Ei sunt mai activi la concentraţia de 70% decât la
concentraţii mai mari. Alcoolii acţionează prin coagularea (denaturare permanentă) a proteinelor, iar apa este
necesară reacţiei de coagulare. Amestecul alcool - apă în proporţia 70% penetrează mai profund decât alcoolul
pur, în materialul supus dezinfectării.

Coeficientul fenolic

Efectul dezinfectant al fenolului este unitatea etalon, cu care se compară alţi dezinfectanţi, în aceleaşi
condiţii de acţiune. Comparaţia se exprimă în coeficientul fenolic (CF) (Todar, 2002).
Microorganismele test pentru determinarea coeficientului fenolic sunt Salmonella typhi şi
Staphylococcus aureus. Un dezinfectant care are CF egal cu 1, are aceiaşi eficienţă antibacteriană ca şi
fenolul, iar un CF mai mic decât 1 semnifică o eficienţă mai scăzută.
Coeficientul fenolic se determină astfel:

43
- se prepară câteva diluţii ale agentului chimic şi se repartizează volume egale în tuburi test;
- se prepară un set identic de tuburi test cu diluţii de fenol;
- ambele seturi de tuburi se aduc la acelaşi nivel termic prin încălzire în baie de 20 o, timp de 5 minute;
- în fiecare tub din cele două seturi se transferă 0,5 ml din cultura unui microorganism test (S. typhi
sau S. aureus);
- după 5, l0, l5 minute se transferă, cu ansa calibrată, un volum din fiecare tub, într-un tub cu bulion
nutritiv. Tuburile se incubă;
- după 48 de ore se evaluează turbiditatea tuburilor inoculate şi se găseşte cea mai mică concentraţie
(cea mai mare diluţie a agentului care a omorât toate organismele în l0 minute, dar nu în 5 minute);
- se stabileşte raportul diluţiei agentului chimic, la diluţia fenolului ce are acelaşi efect. De exemplu,
dacă diluţia l/l0 a unui agent chimic are acelaşi efect ca şi diluţia l/l00 a fenolului, CF al agentului
chimic este l0.
Determinarea CF este o modalitate adecvată de a aprecia eficienţa agenţilor chimici derivaţi din fenol,
dar este mai puţin adecvată pentru alţi agenţi dezinfectanţi.
Evaluarea potenţialului antibacterian a unui agent chimic se poate face mai simplu, prin metoda
discurilor de hârtie de filtru:
- fiecare disc de hârtie este îmbibat cu soluţia unui agent chimic diferit;
- discurile se aşează pe suprafaţa unei plăci cu mediu agarizat, inoculat cu un microorganism test;
- fiecare organism test se însămânţează pe o placă diferită;
- după incubare, efectul inhibitor al unui agent chimic asupra organismului se identifică printr-o zonă
clară de inhibiţie a creşterii în jurul discului.
Diametrul zonei de inhibiţie a creşterii este proporţional cu potenţialul antibacterian al agentului
chimic.

Bibliografie selectivă

1. Black J.G., Microbiology. Principles and Applications. Third Edition. Prentice Hall. Upper Saddle
River, New Jersey. 1996, pp: 332-352.
2. Jungerman E., Antimicrobial and Deodorant Soaps: Impact of Regulatory Developments. Cosmetics
& Toiletries, Allured Publishing Corporation. 1996.
3. McDonell G, Russell A.D., Antiseptics and disinfectants: activity, action and resistance, Clinical
Microbiology Reviews. 1999, 12: 147-179.
4. Mihăescu Gr., Microbiologie generala si virologie. Editura Universitatii Bucuresti, 2000.
5. Paulson D., Developing Effective Topical Antimicrobials, Soap/Cosmetics/Chemical Specialties,
1997.
6. Reddish G.F., Antiseptics, Disinfectants, Fungicides and Chemical and Physical Sterilization. The
Quarterly Review of Biology. 1959, 34(4): 330-331.
7. Todar's Online Textbook of Bacteriology, The control of microbial growth, Kenneth Todar University
of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology, 2002.
8. Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, Vol. I , II, Ed. Lesslie Collier, A.
Balows, M. Sussman. 1998.
9. Tortora G.J., Funke B.R., Case C.L., Microbiology. An Introduction. Fifth Edition. The
Benjamin/Cummings Publishing, Co., Inc., Redwood City, CA. 1995, pp:167-188.
10. Zneiden A., The War Against Germs. Drug and Cosmetic Industry 162, Advanstar Communications,
1998.

44
Capitolul 3
AGENŢI CHIMIOTERAPEUTICI DE SINTEZĂ

Utilizarea substanţelor de sinteză chimică sau produse de diferite organisme, în scop terapeutic, este
veche. Indienii din Peru mestecau scoarţa arborelui de chinină pentru tratamentul malariei. în secolul 15, în
Europa se foloseau compuşii cu mercur pentru tratamentul sifilisului, iar chinezii utilizau cultura de fungi
microscopici crescută pe seminţele de soia, pentru tratamentul furunculelor. Conceptul chimioterapiei a fost
formulat de Ehrlich (l904) în Germania. El a presupus că este posibilă găsirea unor substanţe chimice cu
efecte toxice selective asupra paraziţilor, dar nu pentru celulele sau tesuturile organismului uman. Ideea a fost
denumită “pastila magică”, pentru care a fost distins cu premiul Nobel. Ehrlich a descoperit para-rosanilina,
cu efecte antitripanosomiale şi a sintetizat compusul arsenic arsfenamina (salvarsan) pentru tratamentul
sifilisului.

Structura moleculară a salvarsanului

Gelmo (1908) a sintetizat sulfanilamida pentru tratamentul pacienţilor infectaţi cu Treponema


pallidum, agentul sifilisului. Eisenberg (1913) a studiat proprietăţile bactericide ale azo-coloranţilor cu
grupări sulfonamidice, iar Gratia şi Dath (1924), studiind microorganismele din sol, au descoperit
actinomicetina, produsă de actinomicete (Todar, 2002). În 1935, Domagk, medic german, a remarcat
activitatea antimicrobiană in vitro a compusului prontosil, primul dintr-o serie lungă de substanţe sintetice
denumite sulfonamide. Prontosil a fost introdus în clinică în anii ”30 pentru tratamentul infecţiilor tractului
urinar, pneumoniei şi altor stări patologice. In vivo, prontosil este convertit la sulfanilamidă activă, analogul
acidului paraaminobenzoic (APAB). In 1939, el a demonstrat valoarea terapeutică a sulfonamidelor (gruparea
S a compuşilor) pentru tratamentul infecţiilor cu Streptococcus şi activitatea antimicrobiană cu spectru larg
(Todar, 2002). Multe sulfonamide au eficienţă inferioară antibioticelor naturale, dar se folosesc pe scară largă.
In 1945, farmacologii aveau la dispoziţie, pentru uzul clinic, 5488 derivaţi ai sulfanilamidei
(sulfonamidei).

3.1. Agenţi chimioterapeutici activi prin inhibiţie competitivă

Sulfonamidele sunt agenţi chimioterapeutici foarte importanţi din punct de vedere practic. Nu sunt
antibiotice, deoarece termenul de antibiotic este rezervat substanţelor sintetizate de organisme, de cele mai
multe ori, bacterii sau fungi, care în concentraţii foarte mici inhibă sau omoară microorganismele.
Descoperirea lor are caracter empiric şi pragmatic (tabelul 2). Domagk (cercetător şi medic german) a
descoperit că prontosilul (un colorant roşu), deşi in vitro nu are efecte inhibitorii, in vivo este foarte eficient
faţă de S. aureus. Explicaţia este următoarea: în organism, molecula de colorant a fost scindată enzimatic şi s-
a eliberat o moleculă mică – sulfanilamida – foarte activă faţă de S. aureus, dar inactivă în forma legată de
colorant.
Sulfonamidele reprezintă primul grup de substanţe microbiostatice introduse cu succes în clinică,
având ca prototip sulfanilamida (para-amino-benzen-sulfonamida).
Mecanismul acţiunii sulfonamidelor a fost clarificat când Woods a demonstrat că acidul para-
aminobenzoic (APAB) are o acţiune antagonistă faţă de aceste substanţe, în sensul că anihilează efectul lor
antimicrobian: dublarea concentraţiei de inhibitor adăugat în mediu necesită dublarea concentraţiei de APAB,
pentru a relua creşterea. Toxicitatea selectivă a sulfonamidelor derivă din faptul că organismul uman preia
acidul folic din surse externe, dar multe bacterii îşi sintetizează propriul acid folic.

Structura moleculară a acidului para-aminobenzoic (APAB).

49
Tabelul 2.
Agenţi chimioterapeutici care acţionează prin inhibiţie competitivă (adaptare după Topley şi
Wilson’s, 1998).
Clasa de agenţi Ţinta specifică Structura chimică
chimioterapeutici
Sulfonamide Inhibarea dihidropteroid
sintetazei (DHPS)
H2N SO2NH2

sulf onamide

Diaminopirimidina Inhibarea dihidrofolat NH2 OCH3


(Trimetoprim) reductazei
N

H2N CH2 OCH3

OCH3
trimetoprim

Nitroimidazoli Interferă cu biosinteza N


timinei (produc ruperi ale
moleculei de ADN)
O2N N CH3

CH2 CH2OH
metronidazol

Nitrofurani Interferă cu biosinteza O


(Nitrofurantoil) timinei (produc ruperi ale
moleculei de ADN). C
O2N CH N N NH
O
H2C C O
nitrof urantoil

Acţiunea antagonistă a APAB nu este directă, ci se exercită prin intermediul metabolismului bacterian.
APAB este un nutrient esenţial, fiind precursorul acidului folic, un factor de creştere pentru bacterii. Acidul
folic şi formele sale reduse – acidul dihidrofolic şi tetrahidrofolic – transferă fragmente cu 1C derivate din
serină, pentru sinteza metioninei, purinelor, timinei, tiaminei, pantotenatului (Black, 1996).
Datorită marii asemănări a structurii chimice a celor două substanţe(APAB şi sulfanilamida), între ele
are loc un fenomen de competiţie pentru intrarea în calea sintezei acidului folic (fig. 21).

Structura moleculară a acidului folic

Enzima bacteriană implicată în conversia APAB la acid folic (pteridin-sintetaza), adeseori “greşeşte”
şi se combină cu sulfanilamida, în loc de APAB. Astfel, sinteza acidului folic şi toată calea metabolică
dependentă de acidul folic este blocată. Sulfanilamida intră în competiţie cu APAB pentru situsul activ al
enzimei.

50
Acest tip de inhibiţie este reversibil: dacă sulfanilamida este îndepărtată, enzima funcţionează normal.
Cu cât raportul moleculelor de sulfanilamidă/APAB este mai mare, cu atât inhibiţia metabolismului bacterian
este mai amplă.

Figura 21. Ilustrarea schematică a competiţiei dintre molecula de sulfonamidă şi acidul para-aminobenzoic (APAB)
pentru substrat, datorită omologiei structurale (adaptare după Wistreich, 1996).

Sulfonamidele au afinitate mai mare decât APAB pentru pteridin-sintetază. Trimetoprimul (un analog
al acidului dihidrofolic) are afinitate foarte mare (de 10000-100000 de ori) pentru dihidrofolat-reductaza
(DHFR) bacteriană decât pentru cea mamaliană, enzima care catalizează conversia dihidrofolatului la acidul
tetrahidrofolic (fig. 22) (Wistreich, 1996). Astfel sunt blocate căile metabolice dependente de acidul folic.
Acidul folic acţionează ca purtător al grupărilor C1 şi este necesar pentru sinteza ADN, ARN, etc. Spre
deosebire de mamifere, bacteriile şi protozoarele parazite nu au sistem de transport care să preia acidul folic
preformat din mediul extern. Majoritatea acestor organisme trebuie să sintetizeze acidul folic, deşi unele pot
să folosească timidina exogenă, acoperind necesarul metabolic de acid folic.

51
Fig. 22. Ilustrarea mecanismului acţiunii agenţilor terapeutici prin inhibiţie competitivă: sulfonamidele blochează
competitiv conversia pteridinei şi APAB în acidul dihidrofolic, pe calea sintezei acidului folic (adaptare după Huang şi
colab., 2004).

Deoarece, în privinţa trăsăturilor sale esenţiale, metabolismul este acelaşi la toate bacteriile, rezultă că
toate speciile utilizează acidul folic, chiar dacă nu toate îl pot sintetiza. Sulfamidele sunt toxice pentru
bacteriile capabile să sintetizeze acidul folic, pornind de la molecule mai simple. Bacteriile care nu
sintetizează acidul folic, ci necesită aportul exogen al moleculelelor preformate, nu sunt sensibile la
sulfonamide. Efectul sulfonamidelor este antagonizat necompetitiv de un amestec de intermediari ai căii
acidului folic, adică efectul lor antagonic nu poate fi depăşit prin creşterea concentraţiei de sulfonamidă.
Sulfanilamida inhibă sinteza acidului folic prin inhibiţie competitivă cu sintetaza acidului
dihidropteroic. Enzima catalizează condensarea dihidropteridinei cu acidul para-aminobenzoic, în stadiul
timpuriu al sintezei acidului folic. Deoarece acidul folic îşi păstrează activitatea în celulele bacteriene, efectul
inhibitor al sulfonamidelor devine evident după câteva generaţii de celule, când cantitatea de acid folic s-a
diminuat sub un nivel critic, prin distribuţie în celulele fiice. Toxicitatea selectivă derivă din faptul că
bacteriile sensibile sintetizează acidul folic de novo, iar omul absoarbe cofactorul preformat.
Cele mai cunoscute sulfonamide sunt sulfadiazina şi sulfametoxazol (cotrimoxazol), bine absorbite
după administrare orală şi excretate în urină.

Structura moleculară a sulfametoxazolului (Cotrimoxazol)

Acţiunea derivaţilor sulfanilamidei este bacteriostatică faţă de bacteriile Gram pozitive şi Gram
negative. Se folosesc în tratamentul infecţiilor vezicii urinare, cauzate în marea lor majoritate de E. coli. Circa
5% dintre pacienţi suferă efecte secundare, mai ales reacţii alergice, cu febră şi eritem tegumentar.
Ca şi sulfamidele, acidul paraaminosalicilic (APAS) şi dapsone, obţinuţi prin sinteză chimică sunt
inhibitori competitivi ai metabolismului APAB şi inhibă sinteza acidului folic.

52
Structura moleculară a Dapsone Structura moleculară a APAS (acid paraaminosalicilic)

Rezistenţa bacteriană la sulfonamide este mediată de plasmide, dar şi de gene cromosomale, prin
hiperproducţia de acid p-aminobenzoic.
Familia derivaţilor diaminopirimidinici cuprinde trimetoprimul şi tetroxoprimul.
Trimetoprim este un analog al acidului dihidrofolic, component esenţial al sintezei aminoacizilor şi
nucleotidelor. Agentul chimic blochează metabolismul dependent de acidul folic, dar la alt nivel decât
sulfonamidele, a căror eficienţă o ridică foarte mult (Wistreich, 1996). Agentul inhibă competitiv
dihidrofolat-reductaza, enzima care converteşte dihidrofolatul la cofactorul activ – acidul tetrahidrofolic.
Trimetoprim blochează regenerarea acidului tetrahidrofolic, precursorul acidului folinic şi ulterior al purinelor
şi al sintezei ADN, fiind un inhibitor al creşterii bacteriilor mai eficient decât sulfonamida.

Structura moleculară a acidului tetrahidrofolic

Blocajul secvenţial al aceleiaşi căi de biosinteză, sub acţiunea sulfonamidelor şi trimetoprim,


determină un grad înalt de activitate sinergică faţă de un spectru larg de microorganisme.
Omul nu sintetizează acidul folic, dar necesită aportul exogen şi sinteza purinelor în celula umană nu
este influenţată semnificativ de trimetoprim. Are acţiune selectivă deoarece este de 50 000 – 100 000 de ori
mai activ faţă de dihidrofolat-reductaza bacteriană, comparativ cu cea umană.
Trimetoprim are spectru larg de acţiune: coci Gram pozitivi şi majoritatea bacililor Gram negativi, cu
excepţia Ps. aeruginosa şi Bacteroides.
Rezistenţa la trimetoprim poate fi mediată de gene cromosomale ori plasmidiale, mobile prin
intermediul Tn7, este consecinţa dobândirii unei gene a dihidrofolat-reductazei (DHFR), mult mai puţin
sensibilă la trimetoprim sau altor mecanisme: supraproducţia DHFR, mutaţii ale genei structurale a DHFR sau
dobândirea unei gene care codifică o enzimă rezistentă la DHFR. Genele ce codifică enzimele modificate se
găsesc frecvent pe plasmide autotransferabile. Enzimele modificate sunt produse în celule care produc
concomitent şi o dihidrofolat reductază de tip sălbatic, dar cantitatea enzimei alterate depăşeşte blocajul
sintezei acidului folic mediat de efectul trimetoprimului asupra enzimei de tip sălbatic. Rezistenţa la
sulfonamide se produce printr-un mecanism asemănător. Datorită rezistenţei la sulfonamide, trimetoprim a
fost introdus ca un potenţiator al sulfonamidelor, în asociaţie cu care s-a administrat mult timp, considerându-
se că are proprietăţi antibacteriene slabe. Acum se administrează pe scară largă, ca agent terapeutic unic.

53
3.2. Agenţi chimioterapeutici activi prin inhibiţia replicării ADN: quinolonele

Quinolonele (denumite şi 4-quinolone) sunt primele substanţe antimicrobiene obţinute pe cale


sintetică şi formează o familie de compuşi care se aseamănă prin existenţa nucleului quinolinic. Primul
compus din acest grup, folosit în terapie este acidul nalidixic.
Quinolonele, alături de β – lactamice şi macrolide, reprezintă una dintre cele trei familii principale de
agenţi antimicrobieni folosiţi în terapeutica umană (Wolfson & Hooper, 1989). Importanţa lor terapeutică este
în continuă creştere începând din 1968, data comercializării primei quinolone reprezentată de acidul nalidixic.
Acidul nalidixic este un produs intermediar de sinteză a quinolonelor. Ulterior quinolonele s-au diversificat
prin introducerea unui atom de fluor (F) în poziţia 6 şi a unui heterociclu în poziţia 7 (piperazine, pirolidina,
etc.) care au generat fluoroquinolonele. Aceste molecule posedă un spectru antibacterian foarte larg şi pot fi
divizate în molecule metabolizabile şi nemetabolizabile (grupele III şi IV).
Quinolonele se pot clasifica în două grupe :
- cele de primă generaţie, ca acidul nalidixic, active asupra bacililor Gram-negativi;
- fluoroquinolonele.

Acid nalidixic Norfloxacin Ciprofloxacin

Ofloxacin Pefloxacin Enoxacin

Amifloxacin Flerofloxacin Lomefloxacin

54
Temafloxacin Tosufloxacin PD 127, 391

Gama derivaţilor quinolonici s-a diversificat prin modificarea nucleului de bază, 4-quinolona. La
atomul C6 s-a adăugat unul de fluor, ceea ce a crescut semnificativ spectrul şi potenţialul lor antimicrobian.
Avand în vedere spectrul lor de activitate antibacteriană, limitat la bacterii Gram negative şi în principal la
enterobacterii, acidul nalidixic şi derivaţii săi au fost folosiţi pentru tratamentul infecţiilor urinare.
Modificările structurii au dat naştere la quinolone, denumite noile quinolone sau fluoroquinolone (norfloxacin,
pefloxacin, ofloxacin, ciprofloxacin etc.), al căror spectru de activitate antibacteriană se extinde la alte specii
Gram negative (de ex. Pseudomonas aeruginosa), dar şi la anumite specii Gram pozitive (S. aureus) şi
micobacterii. Totuşi, activitatea noilor quinolone faţă de alte specii, aşa cum sunt cele natural-sensibile la
acidul nalidixic, rămâne modestă, ceea ce corespunde unui anumit grad de rezistenţă intrinsecă a acestor
specii.
Mecanismul de acţiune a quinolonelor este foarte complex. Aceste molecule pătrund în celula
bacteriană prin difuzie pasivă şi acţionează asupra ţintelor specifice reprezentate de topoizomeraze: ADN–
giraza (topoizomeaza II) şi topoizomeraza IV. Acţiunea celor două enzime este inhibată. Quinolonele se leagă
şi stabilizează complexele girază-ADN (quinolona singură nu se asociază cu ADN), după clivarea lanţului,
împiedicând acţiunea catalitică a ADN-polimerazei la nivelul bifurcaţiei de replicare. Complexul generează o
rupere a moleculei de ADN, pe care celula nu o repară eficient. Fluoroquinolonele formează complexe stabile
cu topoizomeraza II, efectul fiind moartea celulei. S-a sugerat că quinolonele nu se leagă cu ADN-giraza
însăşi, ci probabil chiar la situsuri specifice pe ADN, create de ADN-girază.
Studiile comparative ale sensibilităţii la fluoroquinolone şi de dezvoltare a rezistenţei, au relevat că
ADN-giraza este ţinta primară a fluoroquinolonelor la bacteriile Gram negative, iar topoizomeraza IV este
ţinta primară la bacteriile Gram pozitive. Excepţia o constituie Streptococcus pneumoniae, la care fie giraza,
fie topoizomeraza pot fi ţinte primare, în funcţie de fluoroquinolona folosită.
Activitatea antibacteriană este dependentă într-o măsură semnificativă de atomul de fluor din poziţia 6
şi de nucleul piperazinic din poziţia 7. Configuraţia spaţială a quinolonei determină nivelul activităţii. Astfel,
enantiomerii stereochimici (care diferă unul de altul numai prin poziţia în spaţiu a unei grupări particulare), ce
implică grupul metil ataşat la inelul al III-lea de ofloxacin, au activităţi antibacteriene foarte diferite, care
diferă în proporţie de 1/10.
Quinolonele sunt agenţi bactericizi. Ele stopează rapid sinteza replicativă a ADN şi întrerup progresia
bifurcaţiei de replicare. Inhibiţia activităţii ADN-girazei sub acţiunea fluroquinolonelor induce moartea rapidă
a celulei bacteriene. Inhibiţia rapidă a sintezei ADN nu explică moartea celulei bacteriene. Pentru efectul letal
sunt necesare alte evenimente suplimentare: inhibiţia sintezei ARN şi a proteinelor. La concentraţiile de
quinolone care depăşesc un anumit prag, activitatea bactericidă diminuă, probabil pentru că este inhibată
numai sinteza ARN şi a proteinelor.
Tratamentul cu quinolone, probabil induce efecte pleiotrope, ce pot fi consecinţe secundare ale
inhibiţiei sintezei ADN-girazei: leziuni ale ADN bacterian, deoarece quinolonele sunt inductoare ale
sistemului reparator SOS, dependent de Rec A.
Noile quinolone au reprezentat un real progres terapeutic având în vedere caracteristicile acţiunii lor
antibacteriene (spectru larg, activitate bactericidă şi farmacocinetică). Aceasta explică spectaculoasa creştere a
utilizării lor în ultimii 10 ani. Dar utilizarea extensivă a noilor quinolone s-a tradus prin emergenţa
îngrijorătoare a tulpinilor rezistente a unor specii bacteriene de mare importanţă medicală (enterobacteriile,
Ps. aeruginosa, S. aureus, Mycobacterium tuberculosis, N. gonorrhoeae) şi a tulpinilor multirezistente la alte
antibiotice.

55
Mecanismele rezistenţei bacteriene la fluoroquinolone sunt de trei categorii:
- modificări ale enzimelor ţintă ale medicamentelor
- alterări care limitează accesul medicamentelor la ţintă
- activitatea pompelor de efux.
Rezistenţa la quinolone este, predominant, consecinţa modificărilor enzimei ţintă, la situsurile active
ale enzimei.
Rezistenţa speciilor Gram pozitive la quinolone se datorează în special mutaţiilor într-o regiune
specifică (quinolone resistance determining region - QRDR) a subunităţii A a ADN-girazei. QRDR este
regiunea N-terminală a proteinei, omologă cu regiunile GyrA şi ParC de la E. coli. Regiunea cuprinsă între
codonii 67 - 106 ai GyrA la E. coli, este determinantă pentru rezistenţa la quinolone. Mutaţiile genei gyrA
induc schimbări ale situsului de legare/sau ale sarcinii, care condiţionează interacţiunea ADN-girazei cu
quinolona. Quinolonele interacţionează în primul rând cu subunitatea A, dar s-au identificat mutaţii ale
subunităţii B care conferă rezistenţă la quinolone.
ADN giraza şi topoizomeraza IV sunt localizate în citoplasma bacteriană. Pentru a-şi atinge ţinta,
antibioticele fluoroquinolonice trebuie să traverseze învelişul celular. Modificările structurale ale membranei
externe a bacteriilor Gram negative asociate cu diminuarea înglobării sunt factori importanţi ai rezistenţei la
fluoroquinolone. Variantele Gram negative rezistente la quinolone care se selectează, se datorează modificării
porinelor din membrana externă, asociată cu scăderea permeabilităţii. Rezistenţa la quinolone nu este
transferabilă prin intermediul plasmidelor. La bacteriile Gram pozitive, scăderea ratei înglobării nu s-a
demonstrat a fi un mecanism al rezistenţei.
Atât bacteriile Gram pozitive, cât şi cele Gram negative pot dobandi un nivel scăzut al rezistenţei,
mediat de activitatea pompelor de eflux, cu rol de transportori multipli, a căror activitate este dependentă de
gradientul electrochimic (forţa proton motrice).
Nu s-au identificat enzime cu efect inactivator faţă de quinolone.
Ciprofloxacina are un potenţial antibacterian mult mai ridicat decât acidul nalidixic. Efectul bactericid
al ciprofloxacinului este rapid, cu o pierdere de 90% a viabilităţii, într-un interval de l9 minute.
Ciprofloxacina se foloseşte în tratamentul infecţiilor respiratorii, ale tractului urinar, gonoreii, pentru
tratamentul infecţiilor diareice cu tulpinile enterotoxigene de E. coli, Campylobacter jejuni, Shigella. Este
activă, de asemenea faţă de M. tuberculosis. Este parţial metabolizată de ficat şi excretată de rinichi.
Medicamentele antiacide (Maloox) blochează absorbţia ciprofloxacinei şi nu vor fi administrate concomitent.
Administrată împreună cu teofilina, ciprofloxacina poate duce la acumularea unor nivele sanguine înalte ale
teofilinei. Ionii de Ca2+, Cu2+, Fe2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+ pot să lege ciprofloxacina şi diminuă mult absorbţia
medicamentului.
Multe antibiotice, inclusiv ciprofloxacina, pot altera microbiota normală a colonului, favorizand
dezvoltarea bacteriilor care produc inflamaţia mucoasei (colita pseudomembranoasă) şi determină tulburări
diareice (Liebetrau şi colab., 2003). Colita pseudomembranoasă se datorează creşterii în exces a bacteriei
Clostridium difficile şi poate induce stări febrile, durere abdominală, tulburări ale tranzitului intestinal şi chiar
starea de şoc. Tratamentul cu ciprofloxacină poate să ducă la creşterea în exces a levurii Candida albicans, cu
localizare vaginală (vaginită) sau intestinală (disbioza).
Manifestarea efectelor secundare este prevenită prin administrarea probioticelor: Lactobacillus casei,
L. acidophilus, Bifidobacterium longum, Saccharomyces cerevisiae.
Derivaţii quinolonici se folosesc pentru tratamentul infecţiilor căilor urinare, unde, după administrare
orală, se acumulează în concentraţii inhibitorii. Fluoroquinolonele pătrund în ţesutul prostatic la concentraţii
care echivalează sau depăşesc de câteva ori pe cele din plasmă.
Cele mai sensibile la acţiunea quinolonelor sunt enterobacteriile, dar compuşii grupului sunt activi
faţă de chlamidii şi micobacterii.
Quinolonele au efect antimicrobian prelungit după administrare, ceea ce se reflectă în continuarea
supresiei creşterii bacteriene, după eliminarea agentului antimicrobian din organism. Dacă un medicament are
un efect persistent după administrare, înseamnă că poate fi eficient chiar în intervalele dintre doze, când
nivelul seric şi tisular au scăzut sub nivelul concentraţiei minime inhibitorii.
Quinolonele îşi păstrează activitatea faţă de multe bacterii rezistente la antibiotice, inclusiv faţă de
bacilii Gram negativi cu rezistenţă multiplă, faţă de S. aureus rezistent la meticilină, faţă de N. gonorrhoeae
rezistent la penicilină, faţă de Haemophilus influenzae producător de -lactamaze.
Ciprofloxacina, ofloxacina şi tosufloxacina sunt active faţă de Chlamydia trachomatis şi Mycoplasma
hominis. Quinolonele sunt de asemenea active faţă de Rickettsia spp.
Acidul nalidixic inhibă numai speciile de bacterii Gram negative aerobe. În molecula de
ciprofloxacină, fluorul conferă activitate faţă de bacteriile Gram pozitive. Grupul piperazinic creşte activitatea
56
faţă de enterobacterii, iar gruparea piperazină şi ciclopropil conferă activitate faţă de speciile de
Pseudomonas.

3.3. Alţi agenţi chimioterapeutici de sinteză

Hidrazida acidului nicotinic (izoniazida, INH), introdusă în clinică înainte de 1950, împreună cu
rifampina, formează baza chimioterapiei antituberculoase. Izoniazida este un derivat al nicotinamidei.
Mecanismul de acţiune al izoniazidei nu este cunoscut, dar influenţează sinteza lipidelor, acizilor nucleici şi
acidului micolic la M. tuberculosis.

Structura moleculară a izoniazidei Structura moleculară a piridoxinei (vitamina B 6)

Se presupune că izoniazida este activă prin competiţie cu piridoxina (vitamina B6) necesară creşterii
celulelor de M. tuberculosis, sau inhibă sinteza acizilor micolici (acizi graşi specifici acestor bacterii). Este
bactericidă faţă de celulele care cresc şi se divid şi are acţiune bacteriostatică faţă de celulele care nu se
multiplică. Toate cele trei (PASA, dapsone şi izoniazida) se folosesc pentru tratamentul infecţiilor cu
Mycobacterium.
Etambutolul, pirazinamida şi etionamida blochează reacţiile enzimatice în celula bacteriană, deoarece
sunt similare dar nu identice cu vitaminele bacteriene.
Etambutolul inhibă arabinozil-transferaza, enzimă implicată în biosinteza arabinogalactanului şi
lipoarabinomananului. Alte efecte atribuite acţiunii etambutolului sunt inhibiţia metabolismului ARN şi
sintezei fosfolipidelor, inhibiţia transferului acizilor micolici la arabinogalactanul legat de peretele celular
mureinic, sinteza spermidinei şi inhibiţia unei trepte timpurii a conversiei glucozei în monozaharidele utilizate
pentru sinteza polizaharidelor parietale (arabinogalactan, arabinomanan) şi a peptidoglicanului. Este un
medicament foarte specific şi eficient, utilizat în asociaţie cu izoniazida, pentru tratamentul tuberculozei. Are
efect bacteriostatic. Nu se cunoaşte mecanismul care determină rezistenţa la etambutol (Musser, 1995).

Structura moleculară a etambutolului

Pirazinamida este un derivat sintetic al nicotinamidei. Nu se cunoaşte mecanismul de acţiune, nici


baza moleculară a rezistenţei. Unele tulpini sensibile la pirazinamidă au o enzimă specifică (pirazinamidaza),
ce metabolizează pirazinamida la acidul pirazinoic, intermediarul activ antibacterian. Tulpinile rezistente la
pirazinamidă au pierdut activitatea pirazinamidazică. S-au identificat şi tulpini foarte rezistente la
pirazinamidă, care au şi activitate pirazinamidazică. Aceasta sugerează că, în plus faţă de pierderea capacităţii
de sinteză a pirazinamidazei, există şi alte mecanisme de rezistenţă.

Structura moleculară a pirazinamidei

57
Etionamida, derivată a acidului izonicotinic, este activă faţă de M. tuberculosis şi alte micobacterii. In
vitro, celulele de M. tuberculosis îşi pierd acidorezistenţa. Se crede că mecanismul său de acţiune implică
inhibiţia sintezei acizilor micolici.

Structura moleculară a etionamidei

Nu se cunosc mecanismele rezistenţei la etionamidă şi la izoniazidă.


Metronidazolul a fost introdus în clinică în 1959 pentru tratamentul infecţiei cu Trichomonas
vaginalis. Ulterior s-a demonstrat eficienţa sa faţă de infecţiile cu bacterii anaerobe şi faţă de alte infecţii
parazitare. Difuzează bine în ţesuturi, inclusiv în sistemul nervos. Are cea mai bună activitate bactericidă,
dintre toate medicamentele active faţă de bacteriile anaerobe.
Acţiunea sa constă în activarea reductivă a grupăriii nitro. Metronidazolul acţionează ca acceptor
preferenţial de electroni(e-), fiind redus de proteinele transportoare de e - cu potenţial redox scăzut. Reducerea
scade concentraţia sa, ceea ce menţine un gradient ce favorizează încorporarea medicamentului în celulă şi
generarea produselor intermediare ale reducerii, cu efecte toxice pentru celulă.
Toxicitatea se datorează compuşilor intermediari sau radicalilor liberi ce interacţionează cu ADN şi
probabil cu alte molecule, producând leziuni. Intermediarii citotoxici se descompun în produse finale netoxice
şi inactive: acetamida şi acidul 2-hidroxietil oxamic. Efectul asupra microbiotei intestinale este minim,
deoarece medicamentul este redus în condiţii anaerobe.
Methenamina este produsul ciclic de condensare a formaldehidei şi amoniului. Are activitate
antibacteriană slabă, dar la pH acid, fiecare moleculă hidrolizată generează 4 molecule de amoniu şi 6
molecule de formaldehidă:

Methenamina este excretată în urina acidă, unde este hidrolizată şi formaldehida eliberată este
bactericidă. Este disponibilă ca sare a acidului mandelic sau hipuric pentru acidifierea urinii. Nu s-a descris
rezistenţa la formaldehidă, dar tulpinile de Proteus, care produc frecvente infecţii urinare sunt rezistente,
deoarece ureaza lor clivează ureea la CO 2 şi NH3 şi alcalinizează urina.
Derivaţii nitrofuranului (furazolidon, nitrofurantoina, nitrofuratel, nitrofurazon) au efect bacteriostatic
faţă de bacteriile Gram pozitive şi Gram negative. Cel mai utilizat este nitrofurantoina. Derivaţii
nitrofuranului se folosesc pentru terapia infecţiilor tractului urinar, deoarece realizează concentraţii suficient
de mari în urină. Nu au acţiune sistemică. Un intermediar redus al nitrofuranilor produce ruperea catenei de
ADN, ceea ce explică efectele mutagene ale acestor compuşi in vitro. Sunt activate mecanismele de reparare a
ADN. Metaboliţii reactivi reduşi ai nitrofurantoinei interferă nu numai cu ADN, ci par a fi capabili să se lege
cu proteinele ribosomale şi inhibă sinteza proteinelor. Inhibă respiraţia bacteriană şi metabolismul piruvatului.
Nitroimidazolii au spectru larg de acţiune (bacterii, fungi, protozoare, helminţi). Cei cu activitate
antibacteriană sunt 5-nitroimidazolii: 2-metronidazolul, furazolidonul şi tinidazolul.
Furazolidonul este unul din numărul foarte mare de compuşi (de ordinul miilor) de nitrofuran,
introduşi în clinică după descoperirea acestei clase de compuşi în anii ’40. Este activ faţă de Klebsiella, E.
coli, Campylobacter spp., S. aureus, Giardia intestinalis. Efectul lor antibacterian este dependent de reducerea
grupării nitro în condiţii anaerobe. Compuşii captează e- din feredoxina redusă, generată în reacţia de
decarboxilare a piruvatului. Produsul reducerii are efect letal, probabil prin ruperea catenei de ADN. Unele
bacterii microaerofile sunt deosebit de sensibile, dar mecanismul morţii lor nu se cunoaşte. Aceste substanţe
au spectru antibacterian redus, limitat la bacterii anaerobe, cu doar două excepţii: Helicobacter pylori şi
Gardnerella vaginalis, bacterii microaerofile sensibile la nitroimidazol. Condiţia esenţială pentru ca
nitroimidazolii să acţioneze, este reducerea parţială a grupării nitrat prin sistemul intracitoplasmatic
transportor de electroni. Bacteriile aerobe sunt incapabile să realizeze această reducere, ceea ce explică
rezistenţa lor naturală.
Nitrofuranii sunt agenţi antibacterieni a căror structură şi mod de acţiune sunt similare cu cele ale
nitroimidazolilor. Activitatea lor este legată de reducerea grupării NH 2. Întreaga cantitate administrată, pe cale
orală sau parenterală rămâne disponibilă acţiunii antimicrobiene. Perioada de înjumătăţire permite
58
administrarea a două doze/zi. Datorită mecanismului unic de acţiune, nu există fenomene de rezistenţă
încrucişată. Bacilii Gram negativi posedă rezistenţă intrinsecă pentru că au pompe de eflux eficiente faţă de
Linezolid.
Oxazolidinonele reprezintă o clasă unică de agenţi antimicrobieni sintetici. Utilizarea lor în clinică a
fost impusă de necesitatea tratării infecţiilor produse de stafilococii rezistenţi la meticilină, de pneumococii
rezistenţi la penicilină, de enterococii rezistenţi la vancomicină. Aceşti agenţi au un mecanism unic de acţiune,
ceea ce elimină riscul rezistenţei încrucişate cu agenţii antimicrobieni disponibili. Deoarece nu sunt molecule
naturale, genele de rezistenţă specifică nu preexistă în genofondul natural. Oxazolidinonele au fost iniţial
utilizate în terapie ca inhibitori ai monoamin-oxidazei, pentru tratamentul depresiei, dar ulterior s-a descoperit
că au şi activitate antimicrobiană. Primul agent al acestei clase a fost produs de compania DuPont de
Nemours, la sfârşitul anilor ’70 pentru controlul bolilor foliare bacteriene şi fungice la diferite plante, inclusiv
la tomate. Modificarea chimică a oxazolidinonei a dus la descoperirea a doi agenţi, eperezolid şi linezolid, cu
activitate in vitro şi toxicitate diminuată.
Linezolid are activitate in vitro, faţă de N. gonorrhoeae şi N. meningitidis şi are o eficienţă bună faţă
de multe bacterii Gram pozitive anaerobe (grupul Bacteroides fragilis). Bacteriile Gram negative sunt
probabil intrinsec rezistente, deoarece posedă pompe de eflux, eficiente faţă de linezolid. In vitro, linezolid are
o eficienţă relativ bună faţă de M. tuberculosis şi foarte bună faţă de Nocardia.

Structura moleculară a linezolidului

Concentraţiile subinhibitorii de linezolid diminuă producerea hemolizinei şi coagulazei la S. aureus şi


inhibă sinteza streptolizinei O şi DN-azei la streptococi.
Mecanismul de acţiune şi rezistenţă. Oxazolidinonele sunt inhibitorii sintezei proteinelor ribosomale
la bacterii, dar spre deosebire de alţi agenţi antimicrobieni cu acţiune asupra ribosomilor, oxazolidinonele au
un mecanism unic de acţiune deoarece blochează prima treaptă a asamblării ribosomilor din subunităţile
disociate. Oxazolidinonele se leagă de un situs al subunităţii 50S, la interfaţa sa cu subunitatea 30S şi previn
formarea complexului de iniţiere 70S, care cuprinde ARN-fMet, ARNm şi cele două subunităţi ribosomale.
Linezolid se leagă de subunitatea 50S, la sau lângă situsul care leagă cloramfenicolul şi lincomicina,
deoarece cele 3 molecule intră în competiţie pentru situsurile de legare din domeniul V al ARN 23S al
subunităţii 50S. Domeniul V este centrul peptidil-transferazei, care catalizează formarea legăturii peptidice.
Spre deosebire de cloramfenicol şi lincomicină, linezolid nu inhibă formarea legăturilor peptidice şi între ele
nu există rezistenţă încrucişată. Asemănător majorităţii inhibitorilor sintezei proteinelor ribosomale,
activitatea linezolidului faţă de bacterii in vitro este considerată bacteriostatică, deoarece bacteriile sunt
omorâte mai încet decat de agenţii bactericizi. Linezolid este metabolizat prin oxidarea inelului morfolino şi
se formează doi metaboliţi: acidul aminoetoxiacetic şi hidroxietil glicina. Linezolid este un agent
antimicrobian cu spectru larg de activitate, virtual faţă de toate bacteriile Gram pozitive. Întreaga cantitate
administrată, pe cale orală sau parenterală rămâne disponibilă acţiunii antimicrobiene. Perioada de
înjumătăţire permite administrarea a două doze/zi.
Un parametru esenţial al unui agent chimioterapeutic este indicele terapeutic, adică raportul dintre
doza toxică minimă şi doza cu eficienţă maximă. Valoarea mare a acestui raport este caracteristică agenţilor
chimioterapeutici foarte eficienţi.

Bibliografie selectivă

1. Black J.G., Microbiology. Principles and Applications. Third Edition. Prentice Hall. Upper Saddle
River, New Jersey. 1996, p: 332-352.
2. Huang H.W., Chen F-Y., Lee M-T., Molecular Mechanism of Peptide-Induced Pores in Membranes,
Physical Review Letters. 2004, 92: 198-304.
59
3. Liebetrau A., Rodloff A.C., Behra-Miellet J., Dubreuil L., In Vitro Activities of a New Des-Fluoro(6)
Quinolone, Garenoxacin, against Clinical Anaerobic Bacteria, Antimicrobial Agents and
Chemotherapy 2003, 47(11): 3667-3671.
4. Mihăescu G., Microbiologie generală si virologie. Editura Universitatii Bucuresti. 2000.
5. Musser J.M., Antimicrobial agents resistance in mycobacteria: molecular genetic insights, Clinical
Microbiology Reviews. 1995, 8: 496-514.
6. Todar's Online Textbook of Bacteriology, The control of microbial growth, Kenneth Todar University
of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology, 2002.
7. Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, Vol. I , II, Ed. Lesslie Collier, A.
Balows, M. Sussman. 1998.
8. Tortora G.J., Funke B.R., Case C.L., Microbiology. An Introduction. Fifth Edition. The
Benjamin/Cummings Publishing, Co., Inc., Redwood City, CA, 1995, p: 167-188.
9. Wistreich A.G., Microbiology Laboratory Fundamentals and Applications (Hardcover), 1996.
10. Wolfson W.S., Hooper D.C., Fluoroquinolone antimicrobial agents, Clinical Microbiological
Reviews, 1989, 2, (4): 378-424.

60
Capitolul 4
ANTIBIOTICELE. CARACTERIZAE GENERALĂ

Definiţia iniţială a antibioticelor ca substanţe chimice cu greutate moleculară mică, produse de


microorganisme prin procese de biosinteză, s-a completat ulterior, deoarece antibioticele sunt substanţe
chimice obţinute prin biosinteză, semisinteză sau prin sinteză chimică, care în concentraţie mică inhibă
multiplicarea sau omoară microorganismele. Definitorie pentru noţiunea de antibiotic, rămâne capacitatea de a
fi produs prin biosinteză de către microorganisme. Producerea antibioticelor a evoluat ca un mecanism
ecologic de inhibiţie a creşterii altor microorganisme, cu care intră în competiţie pentru resursele energetice.
Fenomenul se numeşte antibioză (descris de Pasteur, l877) şi are o semnificaţie funcţională opusă simbiozei.
Dar, microorganismele producătoare de antibiotice reprezintă o proporţie foarte mică din totalul
microorganismelor din sol. Faptul că antibioticele se sintetizează la sfârşitul fazei de creştere, pare să nu le
confere un avantaj competitiv real. Gratia şi Dath (1924) au studiat microorganismele din sol şi în filtratul
acelular al culturii de actinomicete au evidenţiat efectul inhibitor al unei substanţe pe care au denumit-o
actinomicetină. Fleming (l928), în căutarea unor compuşi cu potenţial antibacterian, a observat inhibiţia
creşterii coloniilor de Staphylococcus aureus în vecinătatea coloniilor fungice de Penicillium notatum. Apoi a
arătat că mediul lichid al culturii de P. notatum, diluat de 800 de ori, a inhibat creşterea culturii de
Staphylococcus. A descoperit „medicamentul miracol” – pe care l-a denumit penicilina, dar n-a izolat-o,
pentru care a fost distins cu premiul Nobel. Calităţile ei de medicament „miraculos” au fost evidenţiate de
către Ernst Chain şi Howard Florey (1939), care au izolat-o şi au folosit-o în tratamentul infecţiilor bacteriene
în timpul celui de al II-lea război mondial. Producţia industrială a început în l943. Noul medicament a fost
introdus în circuitul clinic general în 1944 şi a avut un impact uriaş asupra stării de sănătate a populaţiei
umane. R. Dubos (1939) a izolat gramicidina şi tirocidina din Bacillus brevis, active faţă de bacteriile Gram
pozitive. S. Waksman (1944 - 1945) a izolat streptomicina din Str. griseus, un microorganism izolat din sol,
pentru care a primit premiul Nobel. Streptomicina este activă faţă de unele bacterii Gram pozitive şi faţă de
Mycobacterium tuberculosis. El a propus denumirea de antibiotic, cu sensul de compus chimic produs de un
microorganism, care la concentraţie mică, inhibă sau omoară alte microorganisme.
Antibioticele au fost esenţiale în lupta cu maladiile infecţioase şi au contribuit esenţial la creşterea
speranţei de viaţă în secolul XX. După introducerea penicilinei în clinica generală (1944), infecţiile grave
(faringita streptococică) până atunci, au devenit vindecabile. Azi, dependenţa omului de antibiotice este totală.
Numai în SUA, în 1998, pentru uzul uman s-au folosit circa 12,5 tone de antibiotice. Dacă se adaugă cele
administrate în hrana animalelor şi în agricultură, se apreciază că în ultimii 50 de ani s-au produs şi s-au
utilizat peste un milion de tone.
Antibioticele sunt produse de trei grupe de microorganisme: actinomicete, bacili Gram pozitivi şi
fungi filamentoşi microscopici. Actinomicetele sunt cele mai bune producătoare de antibiotice şi alţi
metaboliţi secundari cu activitate biologică. Genul cel mai reprezentativ, Streptomyces, a fost izolat din tubul
digestiv al unui pui de găină. Cephalosporium a fost izolat din apa mării, lângă un canal de deversare a apelor
menajere, iar Bacillus, dintr-o rană tegumentară a unei fetiţe (Tracy) şi de aici s-a dat denumirea antibioticului
bacitracina.
Estimările numărului de substanţe antibiotice variază: unii au inventariat circa 5.000 antibiotice
identificate, iar alţii evaluează cifre net superioare de ordinul a 10 000. Actinomicetele produc peste 2/3 din
totalul antibioticelor, iar speciile g. Streptomyces produc 70-80% dintre metaboliţii secundari. Pentru terapia
infecţiilor umane şi animale se foloseşte un număr restrâns (circa l00), produse de reprezentanţii a 5 genuri de
microorganisme: Bacillus, Streptomyces, Micromonospora, Penicillium, Cephalosporium. Celelalte sunt
toxice ori au efecte defavorabile asupra organismului sau sunt lipsite de selectivitate.
Izolarea microorganismelor producătoare de antibiotice este foarte laborioasă, de exemplu din l34.700
tulpini bacteriene izolate din circa 5.000 de probe diferite de sol, o singură tulpină a prezentat interes practic.
În perioada descoperirii celor mai multe antibiotice (anii 1950 - 1960) s-au identificat tetraciclina,
eritromicina şi kanamicina, agenţii antifungici candicidina şi nistatinul, precum şi substanţe cu efect
antineoplazic (adriamicina). Marea majoritate a antibioticelor se obţine în procese industriale, pe cale
microbiologică. În prezent, numai porţiunea majoră a moleculei de antibiotic este sintetizată de
microorganisme, iar restul moleculei este sintetizată pe cale chimică. Se obţin astfel antibiotice de semisinteză
sau prin metode de bioconversie. În unele cazuri (de exemplu, cloramfenicolul), întreaga moleculă se
sintetizează pe cale chimică, datorită structurii sale moleculare simple.
Convenţional, în categoria antibioticelor sunt incluse şi substanţele de semisinteză sau cele sintetizate
artificial, dar pe care microorganismele le pot sintetiza total sau parţial. Această menţiune (că
60
microorganismele le pot sintetiza total sau parţial) este necesară, pentru ca din categoria antibioticelor să se
excludă compuşii cu efect antibacterian sintetizaţi numai pe cale chimică (sulfamidele) sau cei produşi în
organismele superioare (lizozimul).
Structurile moleculare complexe ale antibioticelor combină derivaţi a două sau mai multe grupe de
metaboliţi: aminoacizi, glucide, bazele acizilor nucleici, intermediari ai sintezei lipidelor. Acetil-CoA şi
propionil-CoA formează catene lungi (ca în sinteza acizilor graşi) şi rezultă poli- cetone (RCO –CH2–CO–
CH2-), care se condensează pentru a forma inelele macrolidelor, polienelor, tetraciclinelor sau porţiuni ale
moleculei altor antibiotice.

4.1. Antibioticele – metaboliţi secundari

Substanţele biogene preluate de celulă sub o formă simplă, sunt folosite de celulă în următoarele
direcţii esenţiale:
- pentru sinteza metaboliţilor primari (aminoacizi, baze purinice şi pirimidinice, enzime, acizi graşi),
necesari biosintezei constituienţilor structurali, rezultatul fiind creşterea celulei. Aceşti compuşi se
sintetizează faza de creştere primară, denumită şi trofofază;
- pentru producerea energiei, în metabolismul energetic şi a produselor metabolismului energetic
(produşi de fermentaţie alcoolică, lactică, butirică, propionică, acidă etc.);
- pentru producerea (uneori) a metaboliţilor secundari (antibiotice, alcaloizi, ergotina, giberelina).
Metaboliţii secundari se sintetizează în faza de creştere secundară, idiofază, după epuizarea unui
nutrient major (sursa de C sau de N), fiind denumiţi şi idioliţi nu sunt esenţiali pentru creşterea celulei şi
sinteza lor este expresia procesului de diferenţiere biochimică. Metaboliţii secundari au structuri chimice
particulare, nu sunt esenţiali pentru creşterea organismului producător, dar probabil au rol în asigurarea
supravieţuirii în mediile naturale. Diversitatea chimică şi structurile neobişnuite ale metaboliţilor secundari
sunt ilustrate de numărul mare de clase cărora le aparţin: aminozaharuri, quinone, cumarine, epoxizi, alcaloizi
ergot, glicozide, derivaţi indolici, lactone, macrolide, naftalene, nucleozide, peptide, poliacetilene, poliene,
piroli, terpenoide, tetracicline etc. Metaboliţii secundari conţin legături chimice neobişnuite: inele -lactamice,
peptide ciclice alcătuite din aminoacizi normali şi modificaţi, legături nesaturate de poliacetilene şi poliene,
inelul macrolidelor. Multe produse naturale de importanţă medicală (antibiotice), alimentară, industrială sau
agricolă sunt metaboliţi secundari.
Metaboliţii secundari sunt produşi numai de unele specii ale unui gen, ca familii de compuşi strâns
înrudiţi: cel puţin 10 peniciline naturale, 10 bacitracine, 25 actinomicine etc. Proporţia diferitelor componente
în amestec depinde de factori genetici, de factorii de mediu şi se datorează relativei lipse de specificitate a
enzimelor implicate în metabolismul secundar. În contrast, procesele de biosinteză ale metaboliţilor primari
sunt totdeauna catalizate de enzime cu specificitate înaltă: enzima recunoaşte un singur substrat şi se
formează un singur produs. Specificitatea acţiunii enzimelor care catalizează sinteza metaboliţilor primari se
datorează faptului că erorile de biosinteză a componentelor celulare esenţiale sunt, în general, letale, iar erorile
care survin în metabolismul secundar nu au consecinţe semnificative pentru celula producătoare, deoarece
metabolitul secundar modificat îşi păstrează, de regulă, activitatea biologică. Metaboliţii secundari se
sintetizează pe o varietate mai mare de căi, decât cei primari. Deşi au structuri chimice foarte diversificate şi
se sintetizează pe căi variate, metaboliţii secundari se asamblează dintr-un număr limitat de metaboliţi
intermediari.
Antibioticele sunt metaboliţi secundari a căror sinteză începe târziu în timpul fazei de creştere, la
intrarea în faza staţionară. Experienţele de autoradiografie cu aminoacizi marcaţi au evidenţiat că în perioada
în care miceliul creşte cu o rată înaltă, aminoacizii se încorporează în proteinele celulare, dar nu se
sintetizează actinomicină. După ce microorganismul a încheiat faza de creştere, rata încorporării aminoacizilor
în proteine scade considerabil. Waksman (1961) a intuit că proprietatea anumitor microorganisme de a
sintetiza antibiotice nu este corelată cu nici un mecanism esenţial al nutriţiei şi creşterii celulei. În general,
sinteza metaboliţilor secundari din categoria antibioticelor este supresată în timp ce celulele se găsesc în faza
de multiplicare activă şi este cea mai rapidă după ce cultura intră în faza staţionară. Comparativ cu metaboliţii
primari, antibioticele au specificitate redusă de biosinteză, deoarece acelaşi organism sintetizează, de multe
ori, un grup de molecule înrudite.
Cele două faze, trofofaza şi idiofaza, sunt bine separate la o cultură bacteriană producătoare de
antibiotic, dar nu sunt clar delimitate pentru microorganismele filamentoase (actinomicete şi fungi). Criteriul
evaluării creşterii masei celulare este determinarea greutăţii uscate. În numeroase procese de biosinteză
industrială cu microorganisme filamentoase, greutatea uscată continuă să crească semnificativ în idiofază, dar
cu o rată mai mică decât în trofofază. Determinarea greutăţii uscate nu este un criteriu optim pentru evaluarea
61
creşterii. Masa celulară constă din totalitatea structurilor necesare diviziunii celulare (organitele celulare) şi
din materialele de rezervă (polioli, lipide, polifosfaţi şi glucide nestructurale), care pot să reprezinte 50 - 60%
din greutatea uscată a celulei la sfârşitul procesului de biosinteză. Creşterea greutăţii uscate în idiofază este
rezultatul acumulării substanţelor de rezervă, o creştere cu caracter nereplicativ (nu este asociată cu diviziunea
celulară),. De aceea, parametrul optim pentru măsurarea creşterii masei replicative a celulei, este
determinarea cantitativă a ADN. În acest caz, creşterea celulei poate fi disociată de producerea de antibiotic.
Sfârşitul fazei de creştere replicativă este marcat de alţi parametrii: scăderea ratei activităţii respiratorii şi
scăderea ratei sintezei ARN.
Cele două faze sunt bine delimitate în cazul fermentaţiei antibioticelor (cloramfenicol, colistin,
penicilina, bacitracina) în mediile organice complexe, care favorizează creşterea rapidă a culturii discontinue
asincrone, dar se suprapun într-un grad semnificativ, în mediile chimic definite (sintetice), care favorizează
creşterea lentă.
Factorul care controlează declanşarea biosintezei antibioticelor este deficienţa unuia sau mai multor
componente nutriţionale care limitează creşterea. Epuizarea unui astfel de factor opreşte creşterea şi iniţiază
biosinteza idioliţilor. În mediile definite chimic, favorizante ale creşterii lente, unul sau mai mulţi factori
nutriţionali pot fi limitanţi ai creşterii chiar de la începutul cultivării, dar favorabili sintezei antibioticelor.
Momentul sintezei produsului nu este un criteriu totdeauna valid pentru a defini metabolitul secundar.
Microorganismele par a fi programate să producă antibiotice numai când rata specifică de creştere
scade sub un anumit nivel. Fenomenul s-a stabilizat în evoluţie, ca răspuns la presiunile competitive. În
mediile bogate în substanţe nutritive, ca de exemplu intestinul mamiferelor, producerea antibioticelor nu este
necesară, deoarece resursele satisfac necesităţile metabolice ale întregii asociaţii. În mediile naturale majore
(sol, apă), nutrienţii sunt totdeauna limitanţi pentru creşterea diferitelor asociaţii de microorganisme
heterotrofe şi sinteza antibioticelor devine avantajoasă pentru supravieţuire.
Microorganismele evită efectul letal al antibioticelor pe care le produc (sinuciderea) prin modificarea
şi detoxificarea antibioticelor de către enzime sintetizate de organismele producătoare; alterarea ţintei
antibioticului în celula producătoare; scăderea permeabilităţii pe faţa externă a membranei, după ce
antibioticul a fost excretat.
Unele antibiotice au rol în dinamica proceselor de sporulare (de exemplu, polimixina, produsă de
Bacillus polymyxa). Altele sunt produse secundare, rezultate din degradarea peretelui celular, corelată cu
sporularea, deoarece peretele conţine D-aminoacizi şi glucide care se regăsesc în compoziţia chimică a unor
antibiotice.
Condiţiile de mediu necesare sporulării şi secreţiei metaboliţilor secundari sunt adeseori asemănătoare
şi chiar mai stringente decât acelea necesare creşterii vegetative. S-a crezut că sinteza metaboliţilor este
obligatorie pentru sporulare, dar unele tulpini fungice sporulează chiar în absenţa producerii metaboliţilor
secundari.
Cei mai mulţi metaboliţi secundari sunt sintetizaţi de organisme cu creştere filamentoasă şi cu
morfologie relativ complexă.
Sinteza metaboliţilor secundari, la microorganisme, este asociată cu procesele de sporulare. Se disting
4 categorii de metaboliţi secundari a căror sinteză este declanşată de procesul de sporulare:
- metaboliţi care activează sporularea (acidul linoleic, la Asp. nidulans);
- pigmenţii structurilor de sporulare (melaninele necesare formării sau integrităţii sporilor sexuaţi şi
asexuaţi). Melaninele sunt pigmenţi de culoare închisă care se formează prin polimerizarea oxidativă a
compuşilor fenolici, se sintetizează în timpul sporulării şi sunt depozitaţi în peretele celular, având rol
protector faţă de radiaţiile UV, dar sunt şi factori de virulenţă;
- metaboliţi toxici secretaţi la timpul sporulării (micotoxinele);
- antibiotice.
Metaboliţii secundari sunt substanţe neesenţiale pentru organismul producător, cărora li se atribuie
următoarele activităţi biologice:
- inhibiţia creşterii sau chiar efectul letal asupra altor organisme din mediu;
- efecte toxice faţă de organismele multicelulare (nevertebrate, plante);
- stimulează diferenţierea microorganismelor;
- au rol în transportul ionilor metalici.
Metaboliţii secundari au semnificaţie adaptativă pentru microorganismele producătoare, deoarece
sinteza lor este determinată genetic, iar pe de altă parte, multe clase de compuşi prezintă o adaptare
remarcabilă de a interacţiona cu ţintele lor. Unii metaboliţi au activitate biologică chiar la concentraţiile mici
produse în mediile naturale.

62
Antibioticele produse de Streptomyces se sintetizează în cantităţi mici, în faza de tranziţie, când
creşterea miceliului vegetativ încetineşte, ca rezultat al epuizării nutrienţilor şi miceliul aerian este gata să se
dezvolte pe seama nutrienţilor eliberaţi prin degradarea hifelor vegetative. Astfel de antibiotice ar avea rolul
de a proteja organismul producător, de alte microorganisme care tind să consume resursele nutritive din
mediu. Uneori, antibioticele produse de diferitele specii ale unui grup au acţiune sinergică: de exemplu,
antibioticele -lactamice şi acidul clavulanic (produs de Str. clavuligerus). Acidul clavulanic este un inhibitor
natural al -lactamazelor, care conferă rezistenţă la -lactamice. Antibioticele -lactamice şi ale inhibitorilor
-lactamazei sunt eficiente faţă de bacteriile rezistente la -lactami. Efectul sinergic al asociaţiei este reflectat
de denumirea dată combinaţiei acidului clavulanic cu meticilina: augmentin. Coproducerea cefamicinei (un
antibiotic -lactamic) şi acidului clavulanic este constantă: nu există prodcători cunoscuţi de acid clavulanic,
care să nu producă cefamicine (Challis, Hopwood, 2003). Multe specii de Streptomyces produc două sau mai
multe antibiotice, cu acţiune sinergică faţă de un organism competitiv care domină numeric asociaţia naturală
(Majundar şi Kutyner, 1962). Astfel, Str. avermitilis sintetizează doi compuşi antifungici cu structuri diferite:
oligomicina şi un macrolid polienic. Cele două antibiotice au ţinte moleculare distincte: oligomicina inhibă o
sintază mitocondrială, iar macrolidul polienic se leagă ireversibil de membrana celulelor fungice, alterând
permeabilitatea lor. Oligomicina şi macrolidele polienice pot acţiona sinergic faţă de fungi. Probabil că un
competitor fungic al lui Str. avermitilis, l-a selectat pe ultimul pentru sinteza acestor antibiotice.

Structura moleculară a oligomicinei

Creşterea fungică şi sinteza antibioticului sunt rezultatul interacţiunii dintre miceliul fungic, substrat şi
condiţiile de mediu. Sinteza este influenţată de condiţiile mediului de creştere a fungilor. Multe antibiotice
sunt metaboliţi secundari, produşi în condiţii suboptimale de creştere sau în prezenţa unor cantităţi limitante
de nutrienţi. Temperatura, umiditatea, aeraţia, pH-ul, rata de creştere influenţează masa fungică şi sinteza
antibioticelor.

Sinteza neribosomală a proteinelor


Cele două categorii de proteine celulare şi antibiotice polipeptidice se sintetizează după mecanisme
diferite. Dovezile experimentale au fost aduse utilizând inhibitori metabolici. De exemplu, cloramfenicolul şi
puromicina, inhibitori ai sintezei proteinelor celulare, stimulează încorporarea aminoacizilor în actinomicină.
În absenţa sintezei proteinelor celulare, rezerva de aminoacizi poate fi folosită exclusiv pentru sinteza
antibioticelor. Nu toate proteinele se sintetizează pe ribosomi. Sinteza neribosomală a peptidelor are loc la
procariote şi la eucariotele inferioare şi se bazează pe principiul matriţei cu S (thiotemplate), catalizată de
complexe enzimatice mari multifuncţionale, denumite peptid-sintetaze, care sunt organizate în module (un
modul de iniţiere a sintezei şi mai multe module de alungire a catenei peptidice) (Lengyel şi Soll, 1969).
Fiecare modul este alcătuit din mai multe domenii, care determină alungirea catenei polipeptidice prin
adăugarea succesivă a aminoacizilor.
Unele polipeptide, cu mai puţin de 50 de aminoacizi, pot fi asamblate de peptid-sintetaze, ca şi alţi
compuşi, ca de exemplu acizii graşi, a căror sinteză este catalizată de alte sintetaze. Produsele peptidice de
sinteză neribosomală includ ciclosporina (cu acţiune imunosupresoare) şi antibiotice ca gramicidina S,

63
tirocidina A şi surfactinele. Structura modulară a peptid-sintetazelor determină alungirea secvenţială a catenei
peptidice, prin adausul de aminoacizi specifici.
Modulele au un model comun de organizare care le permite activarea aminoacidului fixat şi realizarea
unei legături peptidice, ca şi modificarea aminoacidului fixat prin reacţii de epimerizare sau N-metilare.
S-a demonstrat experimental că un modul de alungire trebuie să posede cel puţin 4 domenii:
- un domeniu de adenilare (A) cu activitate de peptid-sintetază care fixează aminoacidul şi îl activează
printr-o reacţie de adenilare;
- un domeniu de tioesterificare (T sau PCP- peptidyl carrier protein) care menţine peptidul nascent
asociat cu sintetaza, pe întreaga durată a sintezei prin intermediul unei legături tioesterice;
- un domeniu de condensare (C) prin care sintetaza catalizează formarea legăturilor peptidice;
- un domeniu specific (Te) cu activitate de tioesterază care permite eliberarea peptidului de complexul
sintetazei, după terminarea sintezei.
Spre deosebire de calea de sinteză proteică clasică (ribosomală) care utilizează doar 21 de aminoacizi (20
de aminoacizi esenţiali şi selenocisteina), sinteza non-ribosomală poate utiliza peste 300 de aminoacizi (de
exemplu, D-aminoacizi, aminoacizi N-metilaţi etc.), însă peptidele sintetizate nu pot depăşi o secventa de 48
de aminoacizi. Peptid-sintetazele, ca şi alte complexe enzimatice (de exemplu, poliketid-sintetazele) sunt
interesante datorită posibilităţii utilizării lor în biosinteza produselor nenaturale (Gotlieb, 1967). Majoritatea
peptidelor sintetizate pe cale neribosomală de microorganisme sunt clasificate ca metaboliţi secundari, adică
rareori au rol în metabolismul primar, în creştere sau în reproducere, dar sinteza lor a evoluat cu un oarecare
beneficiu pentru organismul producător.

4.2. Biosinteza antibioticelor

Producerea industrială a antibioticelor presupune, în primul rând, transferul inoculului din laborator în
instalaţia industrială, în condiţii de sterilitate. Procesul creşterii microorganismului producător şi al biosintezei
antibioticului durează între 3 şi 10 zile. În etapa a doua, mediul este supus prelucrării pentru îndepărtarea
celulelor, iar supernatantul este supus procedeelor specifice pentru purificarea antibioticului şi determinarea
proprietăţilor antimicrobiene prin metoda difuziei în mediul nutritiv agarizat, repartizat în plăci Petri. Pe
mediul din plăci se însămânţează microorganismul test şi se aplică rondelele de hârtie de filtru îmbibate în
soluţia de antibiotic. În funcţie de diametrul zonei de inhibiţie, se stabilesc proprietăţile antimicrobiene ale
antibioticului, în comparaţie cu aceea a unei soluţii standard de antibiotic. Puterea antimicrobiană se exprimă
în unităţi de activitate/mg de produs. Unitatea de activitate este g. Pentru penicilină, o unitate de activitate
(UA) este 0,6 g. Antibioticele sunt sintezate într-o serie de reacţii, supraadăugate reacţiilor metabolice
esenţiale. Antibioticele sunt metaboliţi secundari şi multe dintre ele se sintetizează când fosfatul devine factor
limitant al creşterii. Căile sintezei metaboliţilor primari (aminoacizi, enzime, vitamine) sunt interconectate cu
căile sintezei metaboliţilor secundari. Procesele prin care metaboliţii primari sunt transformaţi în metaboliţi
secundari sunt căi de biosinteză.
Factori reglatori ai sintezei antibioticelor. Căile de biosinteză a unor antibiotice sunt ramificate. Ele
au un trunchi comun, care ulterior se ramifică şi duc la sinteza unui metabolit primar şi a unui metabolit
secundar (Martin şi colab., 1980; 2000). În unele cazuri, metabolitul primar inhibă prin feed-back, trunchiul
comun al căii şi astfel inhibă sinteza antibioticului. Astfel, lizina, un precursor al penicilinei, inhibă sinteza
penicilinei şi cefalosporinei de către P. chrysogenum. Lizina este factorul reglator major al sintezei
antibioticelor -lactamice: calea biosintezei penicilinei se ramifică din calea lizinei în stadiul acidului -
aminoadipic. Lizina acţionează asupra homocitrat-sintazei, prima enzimă în calea sintezei penicilinei.
Fiecare microorganism producător, ca şi fiecare antibiotic, au caracteristici proprii şi, în consecinţă,
tehnica producerii industriale este adaptată acestor particularităţi.
Glucoza, cea mai bună sursă de C pentru creşterea bacteriană, interferă cu biosinteza multor
antibiotice. Polizaharidele şi oligozaharidele sunt adeseori surse mai bune de C decât glucoza, pentru sinteza
antibioticelor. Intr-un mediu care conţine glucoză şi un alt glucid cu o rată mai mică de metabolizare, curba de
creştere a culturii reflectă o creştere diauxică: într-o primă etapă este folosită glucoza, fără producerea
antibioticului. După ce glucoza este epuizată, pentru biosinteza antibioticului este metabolizată cea de-a doua
sursă de C. Glucoza, datorită ratei crescute cu care este metabolizată, favorizează creşterea rapidă a masei
celulare, dar inhibă sinteza multor antibiotice prin efectul supresor asupra unor enime:
- represează biosinteza kanamicinei, datorită represiei N-acetil-kanamicin-aminohidrolazei, probabil
ultima enzimă a căii de biosinteză a kanamicinei;
- represează (dar nu inhibă) încorporarea valinei C 14 în penicilină;
- interferă cu biosinteza streptomicinei prin represia ultimei enzime a căii de biosinteză.
64
Amoniul sau orice sursă de N uşor asimilabilă represează enzimele implicate în utilizarea altor surse
de N: nitrit-reductaza, nitrat-reductaza asimilatorie, arginaza, ornitin-transaminaza, proteazele extracelulare,
enzimele degradative ale purinelor, transportul ureii şi enzimele care o încorporează în compuşii organici ai
celulei.
Fosforul este un factor limitant foarte important al creşterii pentru multe specii de microorganisme
care produc antibiotice: Str. griseus (produce candicidina), Str. aureofaciens, înainte de sinteza tetraciclinei.
Fosforul reglează sinteza unor antibiotice: peptidice, macrolide, poliene, tetraciclina. Producerea industrială a
acestor antibiotice se desfăşoară la concentraţii mici de P anorganic, limitante ale creşterii. Concentraţiile
mari, de până la 300 mM favorizează creşterea masei celulare a microorganismelor producătoare, iar cele sub
10 mM sunt favorabile sintezei antibioticelor. Adăugarea P anorganic nu numai că interferă cu sinteza
antibioticelor, dar după câteva ore determină reversia celulelor producătoare de antibiotice, la starea de
creştere.
Celulele unui microorganism producător sintetizează antibioticul pe toată durata viabilităţii. Celulele
rămân viabile atâta timp cât sursa energetică este disponibilă. Cauzele încetării biosintezei sunt următoarele:
- declinul ireversibil al uneia sau mai multor enzime ale căii de biosinteză a antibioticului. Activitatea
sintetazelor antibioticelor peptidice scade rapid în câteva ore după declanşarea sintezei antibioticului;
- efectul de feedback al antibioticului acumulat. Câteva antibiotice inhibă propria lor biosinteză:
cloramfenicolul, cicloheximida, puromicina etc.
- epuizarea precursorilor intermediari ai antibioticului.
Biosinteza penicilinei
Structura de bază a tuturor tipurilor de peniciline este acidul 6-aminopenicilanic, ce constă dintr-un
inel tiazolidinic şi un inel -lactamic. La acidul 6-aminopenicilanic, în poziţia 6, este ataşată o catenă variabilă
(Arnstein şi Margreter, 1958; Fawcett şi colab., 1976; Muller şi colab., 1991). Microorganismul producător
este o tulpină de Penicillium chrysogenum, înalt producătoare, selecţionată prin mutageneză.
Faza iniţială (“de fermentaţie”) este cea în care se asigură cultivarea şi creşterea în condiţii optime a
microorganismului producător. Cultivarea se face în tancuri de mare capacitate, prevăzute cu dispozitive de
aerare cu aer steril, de agitare şi de reglare a temperaturii. Sinteza optimă a antibioticelor -lactamice produse
de fungi este în mare măsură dependentă de sursele de C disponibile.
Mediul de cultivare conţine lactoză (ca sursă de C), făină de rapiţă (sursă de azot), săruri minerale
(sulfat de sodiu, sulfat de amoniu, carbonat de calciu, monofosfat de potasiu etc.). La nevoie se adaugă, în
condiţii de sterilitate, o substanţă tensioactivă, care stimulează dezvoltarea miceliului fungic prin dispersarea
culturii şi mărirea gradului de aerare şi un agent antispumant, care opreşte formarea spumei datorită agitării,
aerării şi agentului tensioactiv.
Compuşii hidrofili ai cefalosporinelor sunt sintetizaţi de fungi, bacterii Gram pozitive şi Gram
negative, iar penicilinele hidrofobe sunt produse numai de fungii filamentoşi.
Fazele sintezei au fost identificate prin utilizarea atomilor marcaţi (C 14 şi C12, H3 şi N15). Primele două
trepte ale biosintezei penicilinei şi cefalosporinei sunt comune (Trip şi colab., 2004). Penicilinele şi
cefalosporinele naturale sunt formate din aceiaşi aminoacizi: acidul L--aminoadipic, L-cisteina, L-valina.
Acidul L--aminoadipic este un aminoacid neproteic şi este sintetizat pe calea aminoadipatului
specifică fungilor, care duce la formarea L-lizinei (Brakhage, 1998; Qeener, 1990).
În prima reacţie, cei 3 aminoacizi precursori sunt condensaţi pe cale neribosomală în tripeptidul  (L-
- aminoadipil)- L- cisteinil- D- valina (ACV). Condensarea neribosomală a tripeptidului limitează calea
sintezei. Toate reacţiile necesare formării tripeptidului sunt catalizate de o singură enzimă multifuncţională,
denumită ACV-sintetază. Originea acidului -aminoadipic este diferită la fungi şi la actinobacterii. La fungi,
produsul este un intermediar al căii lizinei, iar la actinobacterii, acidul -aminoadipic este produsul de
catabolism al lizinei.
În treapta a doua, închiderea inelului oxidativ al tripeptidului linear duce la formarea unei structuri
inelare biciclice – acidul aminopenicilanic, adică inelul -lactamic cu 4 atomi, fuzionat cu inelul tiazolidinic
format din 5 atomi. Nucleul comun biciclic este comun pentru toate penicilinele. Reacţia este catalizată de
izopenicilin-N-sintaza. Rezultă izopenicilina N, a cărei activitate de antibiotic este slabă.
În treapta a treia a biosintezei, lanţul lateral al acidului L--aminoadipic al izopenicilinei N este
schimbat cu un grup acil hidrofob. Schimbul este catalizat acil CoA-izopenicilin N-acil-transferază.
Tripeptidul ACV se formează pe calea mecanismului sintezei neribosomale a matriţei cu S, din aminoacizii
precursori. Sistemul multienzimatic al ACV-sintetazei este alcătuit din monomeri cu mase moleculare de circa
420 kDa şi manifestă activităţi catalitice diverse: 1) recunoaşterea specifică a celor 3 aminoacizi şi activarea
65
lor; 2) formarea punţii peptidice; 3) izomerizarea L-valinei la forma D şi eliberarea peptidului. Ca şi în
biosinteza ribosomală a peptidelor, funcţia –COOH a aminoacidului este activată prin formarea unei anhidride
cu -fosfatul din ATP şi eliberarea pirofosfatului (P-Pi). După activarea unui aminoacid, aminoacil-adenilatul
este clivat sub acţiunea unei enzime thiol. Se formează o legătură tioesterică între enzima thiol şi aminoacid,
cu eliberarea AMP. Aminoacizii tioesterificaţi joacă acelaşi rol ca şi aminoacizii legaţi de ARNt în biosinteza
peptidelor ribosomale. Ei sunt intermediari cu energie înaltă, care devin ţintele atacului nucleofilic al grupării
NH2 al unui al doilea aminoacid. Astfel se formează legătura peptidică. Ca şi în sinteza ribosomală, peptidul
nascent creşte de la capătul NH 2, spre capătul COOH, iar peptidele intermediare rămîn legate de enzimă, ca
tioesteri. Specificitatea de substrat este mai puţin strictă decît în sinteza proteinelor.
Microorganismul producător sintetizează, în mod obişnuit, mai multe tipuri de penicilină, cu aceeaşi
structură de bază, dar care diferă după natura catenei laterale ataşată nucleului biciclic prin intermediul unei
funcţii amidice. Dacă procesul de biosinteză se desfăşoară fără adăugarea catenei laterale, sunt produse
penicilinele naturale (penicilina G sau benzil-penicilina). Dintre penicilinele naturale, numai penicilina G
(benzil-penicilina) este utilizabilă în clinică. Pentru penicilina G, molecula precursoare a catenei laterale este
acidul fenil-acetic (C6H5CH2) sau unul din derivaţii săi (fenilacetatul de Na sau fenilacetamida). Acidul fenil-
acetic rezultă şi prin transformarea fenil-etilenaminei din extractul de porumb, în acidul fenilacetic.
Biosinteza industrială a penicilinei cu P. chrysogenum s-a realizat utilizând lactoza ca sursă de C,
deoarece furnizează cel mai înalt titru al penicilinei. Glucoza în exces determină reducerea amplă a titrului
penicilinei.
Deoarece separarea penicilinelor prin purificare este un proces dificil, în mediul de creştere se adaugă
molecule precursoare ale catenei laterale, care asigură sinteza unui anumit tip de penicilină, inhibând sinteza
celorlalte tipuri. Cea mai utilă penicilină, cea cu activitate faţă de bacteriile Gram negative, este rezultatul unui
proces de biosinteză, combinat cu o cale chimică, prin adăugarea precursorilor specifici în timpul fermentaţiei.
Se obţin astfel peniciline de semisinteză (ampicilina, amoxicilina, meticilina). În acest caz, benzil-penicilina
produsă în mod natural de miceliul fungic, este clivată chimic sau enzimatic şi rezultă acidul 6-
aminopenicilenic, supus modificării chimice prin adăugarea unei catene laterale. Penicilinele de semisinteză
au avantajele unui spectru mai larg de activitate şi ale administrării orale.
Compoziţia mediului de cultură este diferită de la un producător la altul. Sursa de carbon a mediului
este glucoza şi lactoza, iar sursa de aminoacizi şi de factori de creştere este hidrolizatul de porumb (corn
steep), un ingredient major al mediului. Glucoza poate fi folosită ca unică sursă de carbon, dar are
dezavantajul metabolizării rapide şi al efectului de represie prin catabolit, de aceea, trebuie să aibă o
concentraţie mai mică şi să se adauge treptat. Sunt mai favorabile metodele de cultivare continuă. În culturile
discontinue se folosesc ambele surse de carbon.
Lactoza se metabolizează lent şi nu produce fenomenul represiei prin catabolit. Uleiul de floarea
soarelui are rol de sursă de carbon, dar este în primul rând agentul antispumant. CaCO 3 se adaugă pentru
stabilitatea pH. Mediul conţine microelemente şi obligatoriu, un precursor care să furnizeze precursorii catenei
laterale a antibioticului, orientând sinteza spre un anumit tip de penicilină.
Prin adăugarea moleculelor precursoare adecvate, sinteza poate fi orientată în sensul producerii
sintezei penicilinei specifice. Acidul fenilacetic (C6H5-CH2COOH) este precursorul sintezei penicilinei G.
Pentru sinteza penicilinei V, ca precursor se foloseşte acidul fenoxiacetic (C6H5-O-CH2-COOH).
Penicilinele sunt sintetizate într-un proces de cultivare submersă, în fermentatoare de 40.000–200.000
litri. Este un proces strict aerob şi necesită aerare energică. Penicilina este un metabolit secundar tipic.
Faza “fermentativă” durează circa 120 de ore la 25 o şi cuprinde trei etape: a) etapa iniţială, în care are
loc creşterea microorganismului producător, pe seama metabolizării glucozei. Producerea de antibiotic este
nesemnificativă; b) etapa de maturaţie, după epuizarea sursei de carbon, cu sinteza masivă de antibiotic; c)
etapa de declin sau de îmbătrânire, în cursul căreia producerea de antibiotic este nulă şi survine chiar scăderea
cantităţii sale prin degradare.
Procesul producţiei de antibiotic, strict aerob este urmărit prin controlul modificărilor biochimice
(pH, concentraţia lactozei şi a NH 3), caracteristicile microbiologice (aspectul şi gradul de dezvoltare a
miceliului) şi a concentraţiei de antibiotic în mediul de cultură. Procesul este submers, necesită o aerare
eficientă şi este oprit în momentul în care întreaga cantitate de lactoză din mediu a fost metabolizată. În
absenţa sursei de carbon, creşterea miceliului încetează şi survine autoliza. NH 3 alcalinizează mediul şi la pH
alcalin, penicilina este instabilă. Penicilina se eliberează în mediu. Sub 1% rămâne asociată cu miceliul
fungic. Miceliul se îndepărtează prin filtrare.
Tulpina de Penicillium notatum utilizată iniţial pentru biosinteza penicilinei, a produs 6 mg/l. În 1941,
în SUA au început studiile pentru ameliorarea randamentului de producţie al tulpinii de P. notatum şi pentru

66
identificarea unor noi tulpini producătoare de penicilină. S-a identificat astfel o nouă specie, P. chrysogenum,
cu un randament de producţie mult mai bun, de 60 mg/l.
Studiile de selecţie s-au făcut prin mutageneză cu raze X şi UV, cu azotiperită. S-au urmărit două
aspecte: obţinerea unor tulpini lipsite de pigmentul galben – chrisogenina – care îngreunează operaţiile de
purificare a antibioticului; obţinerea tulpinilor înalt producătoare de penicilină, peste 20 g/l. Cele mai multe
tulpini obţinute în programele de dezvoltare sunt mutante reglatoare. Obţinerea lor se bazează pe conceptul că
mecanismele de control ale sintezei antibioticelor pot fi depăşite prin procese mutaţionale. Producţia
industrială a penicilinelor şi cefalosporinelor se realizează cu mutante înalt producătoare de Penicillium şi
respectiv Cephalosporium acremonium. Cefamicinele sunt produse de specii de Streptomyces.
S-au obţinut mutante de Penicillium şi Cephalosporium care cresc în profunzime, în condiţii de
aerare, cu randament de producţie de 4500 UI/ml benzil-penicilină, ceea ce echivalează cu 30 g/l, în
bioreactoare cu volume de 250-400 m3.
De obicei, mutantele sunt genetic instabile şi necesită măsuri de menţinere a potenţialului de
biosinteză şi de conservare. Cele mai adecvate metode de conservare sunt păstrarea celulelor vii în azot lichid
(minus 196o) sau liofilizarea sporilor.

Reglarea biosintezei penicilinei


Sinteza penicilinei este supusă mecanismului reglării feed-back al sintezei metaboliţilor primari. Deşi
penicilina este un metabolit secundar, sinteza sa este influenţată de metaboliţii primari, deoarece aceştia sunt
precursorii metaboliţilor secundari. Astfel, mecanismele reglatoare ale sintezei metaboliţilor primari
influenţează producerea antibioticului.
Unul dintre cei trei aminoacizi care participă la sinteza nucleului comun al penicilinei este L-valina.
Biosinteza valinei este reglată printr-un mecanism feed-back: valina exercită o acţiune inhibitorie a activităţii
primei enzime a lanţului de biosinteză. Dacă prima enzimă este inactivată, biosinteza valinei este inhibată şi
astfel este inhibată biosinteza penicilinei. Dacă în mediu se adaugă lizina, biosinteza penicilinei scade foarte
mult. La fungi, lizina se sintetizează pe calea acidului -aminoadipic. Lizina exercită o inhibiţie feed-back a
activităţii primei enzime a lanţului de biosinteză, enzimă implicată în sinteza acidului -aminoadipic.

Extracţia antibioticului
Lichidul obţinut la sfârşitul primei faze este vâscos, cu miros puternic şi conţine substanţe toxice,
compuşi piretogeni şi numeroase impurităţi, care depăşesc de sute de ori cantitatea de antibiotic. Extracţia
antibioticului din mediu se face cu solvenţi organici (pentru penicilină, cu acetat de amil sau acetat de butil la
pH = 2,5). Cele insolubile (tetraciclina) se separă şi se solubilizează în solvenţi speciali sau separarea unora
(streptomicina, neomicina) se face cu ajutorul răşinilor schimbătoare de ioni.
Antibioticul separat din supernatantul de creştere este supus unui proces de purificare, sterilizare,
spălare, cristalizare şi uscare în vid. Dacă după controalele finale, chimice, microbiologice şi toxicologice
(pentru absenţa toxicităţii şi a substanţelor piretogene) îndeplineşte condiţiile de utilizare, antibioticul este
standardizat în raport cu o unitate de activitate stabilită prin convenţie internaţională şi este trecut în faza
ultimă, cea de condiţionare (repartizare în fiole, flacoane etc.) sub formă de pulberi cristaline (prin sublimarea
în vid a soluţiilor) sau încorporat în diferite substanţe. Penicilina se prezintă ca o pulbere albă, microcristalină,
hidrosolubilă şi netoxică pentru om, chiar în doze mult mai mari decât cele active faţă de microorganisme.
S-au produs peste l00 de peniciline de biosinteză. Pentru obţinerea celor mai utile peniciline se
foloseşte procedeul combinat, fermentativ şi chimic, prin care rezultă peniciline semisintetice.
Cefalosporinele (nocardicina, acidul clavulanic şi tienamicina) sunt antibiotice -lactamice care
conţin inelul dihidrotiazină, în loc de tiazolidină. Au fost descoperite ca fiind produse de Cephalosporium
acremonium, dar sunt sintetizate şi de alţi fungi, ca şi de unele procariote. C. acremonium produce 4 tipuri
morfologice de celule, care reprezintă stadii ale ciclului de creştere: hife, artrospori, conidii, gemule.
Diferenţierea morfologică a lui C. acremonium pare a fi legată de sinteza cefalosporinei C. Rata maximă a
sintezei cefalosporinei C coincide cu conversia fragmentelor hifale la artrospori.
Sinteza cefalosporinei C este influenţată de metionină. Adăugarea metioninei în mediul de fermentaţie
măreşte semnificativ producţia de antibiotic. Metionina are rol de donor de S pentru sinteza antibioticului şi
este un inductor al anumitor enzime implicate în sinteză (-(L--aminoadipil-L-cisteinil-D-valin) sintetaza,
izopenicilin N sintetaza = ciclaza), dar are şi o funcţie reglatoare şi stimulează formarea artrosporilor.
Sinteza cefalosporinei C de către C. acremonium pare a fi însoţită de creşterea cantităţii de acid
linoleic.

67
Acidul clavulanic are o importanţă clinică deosebită, pentru că deşi nu este un antibiotic foarte
eficient, se administrează în asociaţie cu -lactamicele, deoarece este cel mai bun inhibitor al sintezei -
lactamazelor.

Semisinteza
Utilizarea penicilinei G (de biosinteză) prezintă câteva dezavantaje importante: este sensibilă la
penicilinaze, enzimele care o inactivează prin acţiune asupra ciclului -lactamic; este instabilă în mediul acid
al stomacului şi de aceea se administrează numai prin injectare; se elimină foarte repede din circulaţie, prin
rinichi. Pentru a menţine o concentraţie activă, se injectează la intervale scurte; este activă numai asupra
bacteriilor Gram pozitive.
Obţinerea antibioticelor de semisinteză se bazează principiul utilizării moleculei native, de la care se
obţin diferite derivate mai active, prin metode de sinteză. Moleculele rezultate sunt asemănătoare celor
naturale, cu valoare terapeutică superioară sau fără valoare. Numai benzil-penicilina, penicilina V şi acidul
clavulanic sunt molecule naturale. Celelalte peniciline, toate cefalosporinele şi cefamicinele sunt derivate ale
moleculelor obţinute prin biosinteză.
Atomii moleculei de penicilină sunt reactivi şi permit un spectru larg de modificări. Practic, fiecare
atom din structura penicilinei şi cefalosporinei naturale, cu excepţia celui de N din ciclul -lactamic, a
constituit sediul unei modificări chimice (Diaconu, Nechifor, 1988). Multe antibiotice sunt rezultatul unei
singure modificări, iar altele rezultă după două sau chiar mai multe transformări succesive.
Cele mai importante modificări chimice ale moleculei native sunt:
- dezacilarea penicilinelor şi cefalosporinelor naturale în scopul obţinerii acidului 6-aminopenicilenic
(A6AP), respectiv acidului 7 aminocefalosporinic (A7AC);
- acilarea grupării 6(7) NH2 din A6AP, respectiv A7AC şi obţinerea penicilinelor şi cefalosporinelor
semisintetice;
- transformarea penicilinei în cefalosporine prin extensia ciclului;
- modificarea poziţiei 3-acetoxi din cefalosporinei;
- esterificarea grupei 3-carboxil a penicilinei.
Cele mai importante antibiotice de semisinteză sunt ampicilina, oxacilina, meticilina. Jumătate din
moleculă se obţine prin biosinteză, iar cealaltă jumătate prin sinteză chimică. Penicilinele de semisinteză sunt
diferite de cele de biosinteză, prin catenele laterale. Fungii din g. Penicillium nu sintetizează acidul 6-
aminopenicilanic. Penicilinele de semisinteză se obţin din penicilina G, supusă acţiunii unei enzime,
penicilin-acilaza, extrasă din E. coli. Enzima scindează catena laterală (radicalul benzil) şi eliberează acidul 6-
aminopenicilanic. Ulterior, pe calea sintezei chimice, gruparea aminică este acilată cu diferiţi radicali şi
rezultă diferite peniciline de semisinteză.

Sinteza chimică

Cercetările privind posibilitatea sintezei chimice a antibioticelor -lactamice au fost stimulate în


special de dificultatea metodelor de separare-purificare. Creşterea randamentului de biosinteză, odată cu
utilizarea tulpinilor înalt productive (de 100 de ori mai productive decât tulpina de origine izolată de
Fleming), a făcut ca metoda sintezei chimice să rămână numai de interes ştiinţific.Sinteza chimică are ca scop
obţinerea unor molecule analoge celor naturale, cu activitate antimicrobiană superioară, mai ieftine, fără
efecte secundare asupra macroorganismului. Pe cale sintetică s-au obţinut peniciline, cefalosporine peneme,
carbapeneme şi monobactame.
Biosinteza streptomicinei
Tulpinile înalt producătoare de streptomicină s-au obţinut prin selecţia tulpinilor mutante sub acţiunea
radiaţiilor UV şi x. Mediile adecvate pentru obţinerea streptomicinei de către S. griseus s-au dezvoltat
empiric. S-au utilizat medii definite chimic (sintetice) şi medii organice complexe. În scop industrial se
folosesc mediile complexe (Eshman şi colab., 1994). Sursa de C pentru sinteza streptomicinei este D-glucoza,
dar pot fi folosite şi alte monozaharide sau dizaharide din familia hexozelor (fructoza, galactoza, maltoza,
lactoza), cu excepţia zaharozei. Xiloza şi manitolul sunt eficiente, iar amidonul are un randament inferior al
producerii antibioticului.
Sursa de N este complexă: hidrolizatul cu tripsină al caseinei, făina de soia, hidrolizatul de porumb
(corn steep), levura uscată, extractul de carne.

68
Concentraţia fosfatului anorganic este esenţială pentru sinteza antibioticului. Absenţa fosfatului
interferă cu creşterea şi cu sinteza antibioticului. Odată cu creşterea concentraţiei P anorganic, rata dezvoltării
miceliului şi a sintezei streptomicinei cresc. Peste un nivel critic al P, sinteza streptomicinei scade accentuat.
Sinteza maximă a streptomicinei de către o tulpină de S. griseus necesită surse adecvate de C şi N,
oxigenare abundentă şi concentraţii relativ scăzute de P anorganic (Distler şi colab., 1957; Malmberg şi
colab., 1993). În dinamica procesului se sintetizează cele trei componente fosforilate. Trizaharidul se
formează prin condensarea celor componente, formându-se streptomicina şi P anorganic. Deoarece D-glucoza
este precursorul celor 3 componente, asigurarea condiţiilor care duc la creşterea cantităţii de glucoză şi
intermediari fosforilaţi, măresc nivelul sintezei streptomicinei.
Sursa de azot este o sare de NH 4+ sau nitratul, pentru limitarea creşterii miceliului. Concentraţia de
fosfat anorganic este foarte mică, deoarece are efect inhibitor asupra sintezei unei enzime – streptomicin-
fosfataza. Unul dintre intermediarii biosintezei streptomicinei este streptomicin-fosfatul. Temperatura de
creştere este de 27 - 29o, la pH 7 - 8, cu aerare eficientă.
Procesul de biosinteză parcurge două faze:
- în prima fază, alături de streptomicină, se formează streptomicina B (manozido-streptomicina), care
conţine un rest de manoză legată de C4 al N-metil-L-glucozaminei, prin legătură -glicozidică.
Procesul de biosinteză trebuie dirijat în sensul formării manozido-streptomicinei, mai puţin activă
decât streptomicina;
- în faza a II-a, streptomicina B este hidrolizată sub acţiunea manozidazei, la streptomicină, după
eliberarea manozei.
Acţiunea manozidazei este influenţată de concentraţia glucozei din mediu. Enzima se activează numai
după ce glucoza a fost epuizată, la 32o, pH 8.
Dihidrostreptomicina este un antibiotic de semisinteză. Se obţine pe cale chimică, prin hidrogenarea
catalitică a streptomicinei, în cursul căreia gruparea aldehidică a streptozei se transformă în grupare alcoolică.
S-au identificat tulpini de Streptomyces, care sintetizează dihidrostreptomicina.
Hidroxistreptomicina rezultă prin oxidarea grupării metilice a streptozei. Este sintetizată de Str.
griseocarnus.
Sinteza antibioticelor polipeptidice
Polimixinele sunt produse de diferite tulpini de B. polymyxa. B. colistinus produce colistina. Fiecare
tulpină produce un singur polipeptid. Tulpinile producătoare de antibiotice sunt frecvent mucoide şi
sporogene. Compoziţia mediului de cultivare, în special natura surselor de C şi N, influenţează profund
cantitatea de antibiotic sintetizat. Mediile care favorizează creşterea optimă nu sunt cele mai bune pentru
sinteza antibioticului. Polimixina A este sintetizată pe mediu reprezentat de bulionul nutritiv, suplimentat cu
glucoză sau sucroză şi urme de ioni de Mn. Maltoza, lactoza, rafinoza stimulează sinteza polimixinei, la fel ca
şi glucoza, dar sucroza este mai puţin eficientă. B. polymyxa produce cantităţi mari de polizaharid extracelular,
o piedică importantă în calea izolării antibioticului. Sinteza polizaharidului este supresată prin adăugarea unor
concentraţii mai mari de sulfat de amoniu (4,2%) la mediul sintetic, dar randamentul sintezei de polimixină
scade cu 50%. Producţia optimă de polimixină este optimă în mediul cu 0,5% extract de levuri şi sulfatul de
amoniu (2%), ca sursă de azot. Sinteza polimixinei începe după ce creşterea miceliului fungic este aproape
completă şi continuă în faza staţionară până când se produce sporularea sau liza culturii. În timpul creşterii,
pH-ul mediului scade, dar când creşterea este completă, valoarea pH creşte. Sinteza antibioticului începe în
momentul începerii creşterii pH. Sinteza polimixinei este strâns dependentă funcţional de capacitatea de
sporulare a tulpinii bacteriene. Mutantele care nu sporulează nu sintetizează antibioticul.

Sinteza poliketidelor
Aproximativ 2/3 dintre poliketidele bioactive ca produse naturale sunt sintetizate de actinobacterii. Alte
organisme producătoare de poliketide sunt mixobacteriile şi fungii filamentoşi. Sinteza este catalizată de un
aparat enzimatic complex, prin reacţii de condensare repetată, ce leagă precursori carbonaţi cu moleculă mică
(grupări acil de 2 - 3 atomi de C derivaţi din tioesterii CoA) (Pffeifer şi Koshla, 2001; Peiru, 2005). Procesul
se aseamănă în multe privinţe cu sinteza acizilor graşi bacterieni şi mamalieni. Catena de C este asamblată din
unităţi cu doi atomi de C, care sunt adăugaţi în moleculă sub forma malonil-CoA sau a analogilor săi. Acizii
graşi se sintetizează după acelaşi mecanism, ceea ce a condus la presupunerea că biosinteza poliketidelor este
o variantă a căii de biosinteză a acizilor graşi. Concluzia este că aparatul enzimatic catalizator al sintezei
poliketidelor a evoluat din sintazele acizilor graşi. Poliketid-sintetazele se clasifică în categoria celor de tip I
sau de tip II, în funcţie de asemănarea cu sintetazele acizilor graşi de tip I de la vertebrate sau de tip II, ale

69
bacteriilor şi plantelor. Dar, spre deosebire de acizii graşi, structurile poliketidelor sunt mult mai diversificate
datorită variaţiilor structurale ale acizilor graşi şi modificărilor ulterioare prin glicozilare.
Biosinteza acizilor graşi este catalizată de un sistem enzimatic cunoscut sub denumirea de sintaza
acizilor graşi. Rolul de starter al sintezei îl are unitatea acetil, care este transferată de o acetil-transferază din
acetil-CoA, la grupul thiol al unei proteine purtătoare de acil (PPA) şi apoi pe grupul thiol al ketoacil-sintazei.
Unitatea de alungire a catenei este malonatul, care este transferat de la malonil-CoA, pe gruparea thiol a
proteinei purtătoare de acil. Ketoacil-sintaza catalizează condensarea celor două resturi acide, cu eliminarea
CO2, pentru a rezulta un rest ketoacil pe gruparea thiol a PPA.
Mecanismul sintezei acizilor graşi şi al poliketidelor a fost studiat utilizând diferiţi precursori marcaţi
cu izotopul C13, la un organism producător de antracicline. Casey (1978) şi ulterior Kitamura (1981) au
detectat pe cale autoradiografică, încorporarea izotopului C 13 în atomii specifici ai agliconului antraciclinelor.
Ketoreductaza reduce gruparea keto la gruparea OH. O dehidratază scoate apa şi produce o dublă
legătură, redusă ulterior de o enzimă cu NADPH la un lanţ de C saturat. După ce grupul acil alungit cu doi
atomi de C este transferat pe grupul thiol al ketoacil-sintazei, ciclul se repetă, începând cu reacţia de transfer a
grupului acil.
Când catena acidului gras a atins lungimea predeterminată, este detaşată de complexul keto-acil-
sintazei, de o tioesterază. Astfel rezultă acidul gras liber.
Asemănător sistemului enzimatic care catalizează sinteza acizilor graşi, biosinteza poliketidelor este
catalizată poliketid-sintază.
Poliketidele complexe, de exemplu macrolidele, au poliketid-sintaze specifice pentru fiecare
subunitate poliketidică a moleculei. Poliketid-sintazele sunt polipeptide multifuncţionale, analoge sintazelor
acizilor graşi de tip I. Secvenţa aminoacizilor şi a nucleotidelor ADN codificator al diferitelor enzime
esenţiale sunt bine conservate la diferite specii. Poliketid-sintazele sunt sisteme multienzimatice citosolice,
care nu necesită nici un organit pentru menţinerea activităţii in vitro. Ele utilizează un spectru larg de
substraturi: acetil-CoA, propionil-CoA, izobutiril-CoA, izovaleril-CoA, malonil-CoA, metilmalonil-CoA,
etilmalonil-CoA, propionilmalonil-CoA şi hidroximalonil-CoA. Când substraturile sunt chirale (chiralitatea
este proprietatea a două corpuri de a se comporta ca un obiect şi imaginea sa în oglindă, adică cele două
corpuri nu sunt direct superpozabile prin translaţie în acelaşi plan, ci numai după o rotaţie cu 180 o) (ca
metilmalonil-CoA), acil-transferazele corespunzătoare au stereospecificitate strictă. Substraturile -
carboxilate (de exemplu, malonil-CoA şi metilmalonil-CoA) sunt surse de unităţi de extensie, iar substraturile
neutre ca acetil-CoA sunt surse de unităţi primer pentru sinteza lanţului poliketidic.
Intermediarul a cărui sinteză este rezultatul acţiunii poliketid-sintetazelor, pentru a furniza produsul
final natural, necesită activitatea unor enzime care-l modifică: ciclaze, transferaze (N-metil-transferaze,
glicozil-transferaze, acil-transferaze), oxidoreductaze dependente de NADP(H) sau FAD(H) şi citocromi.
Deşi sinteza poliketidelor are loc după un mecanism foarte asemănător cu acela al acizilor graşi,
primele prezintă o variaţie structurală accentuată a moleculelor, care survine la diferitele trepte ale sintezei:
a) Unitatea ’’starter’’ a biosintezei catenei poliketidelor este variabilă. În biosinteza acizilor graşi, unitatea
de start a sintezei este acetil-CoA. În cazul poliketidelor, sinteza poate fi iniţiată de propionil-CoA.
b) Variaţia unităţii de extindere. În biosinteza acizilor graşi, catena de C este totdeauna extinsă cu unităţi
derivate din malonil-CoA, iar la poliketide extinderea catenei se face prin încorporarea unităţilor propionat
din metil malonil-CoA şi a unităţilor butiril din etil malonil-CoA. Ultimele dau naştere catenelor laterale de
metil şi respectiv etil ale catenei şi introduc un centru de chiralitate.
c) Variaţia numărului unităţilor de ketide ale catenei. De obicei, lungimea catenei la acizii graşi variază
între 6 - 12 unităţi acetil (acizii graşi au 12 - 24 atomi de C). La poliketide, numărul obişnuit de unităţi
ketidice este cuprins între 3 şi 10, dar poate ajunge la 25.
d) Variaţiile reacţiilor care produc alungirea catenei. În biosinteza acizilor graşi, fiecare reacţie de adăugare
a unei unităţi acetat este urmată de reducerea grupării carbonil la hidroxil, deshidratare în urma căreia se
formează o legătură dublă -C=C-, iar în final o a doua reacţie de reducere pentru a rezulta unitatea saturată C 2.
La poliketide, oricare dintre cele trei reacţii, dar şi cele care urmează, pot fi omise, rezultând o grupare
funcţională carbonil, hidroxil sau enoil a catenei de C.
e) Variaţia reacţiilor care urmează biosintezei catenei de C. Acizii graşi sunt cuplaţi cu derivaţii glicerolului
şi sfingozinei pentru a produce diferite lipide. În sinteza poliketidelor, soarta catenei de C este mai variată:
poate fi ciclizată şi formează compuşi aromatici, ca de exemplu antraciclinele şi tetraciclina sau poate fi
lactonizată pentru a forma macrolide. Lactonele sunt esteri intramoleculari, care au gruparea carbonil (C=O)
şi se formează prin eliminarea unei molecule de H 2O între gruparea –OH şi –COOH a hidroxiacizilor.
Noile grupări funcţionale (carbonil, hidroxil sau enoil) pot fi introduse de enzime specifice (de

70
exemplu gruparea OH 1 şi 11 a antraciclinelor). La unele poliketide, grupările OH sunt glicozilate, ceea ce
amplifică diversitatea structurală a poliketidelor.

Metodele de ameliorare a producţiei de antibiotice


Producţia de antibiotice se găseşte în impas, datorită fenomenelor de rezistenţă multiplă, întâlnite
frecvent la bacterii. Din această cauză se preconizează obţinerea unor antibiotice noi prin tehnica fuziunii de
protoplaşti bacterieni sau fungici. Cele două tulpini celulare (bacteriene, respectiv fungice) supuse
procedeului fuziunii, trebuie să facă sinteza a două antibiotice diferite, din aceiaşi familie. Prin cuplarea
artificială a celor două căi de biosinteză poate să rezulte un nou antibiotic (un antibiotic hibrid).
Fuziunea protoplaştilor se poate utiliza în scopul creşterii randamentului producţiei de antibiotice. Se
procedează la fuziunea protoplaştilor unei tulpini bacteriene înalt producătoare, care creşte încet sau este
pretenţioasă la condiţiile de creştere, cu o linie bacteriană care face sinteza antibioticelor cu o rată inferioară,
dar se dezvoltă repede şi nu are exigenţe nutritive deosebite. Prin fuziune rezultă organisme care cumulează
proprietăţi noi, convenabile atât în ceea ce priveşte producţia de antibiotice, cât şi exigenţele nutritive.
O altă modalitate de creştere a ratei de sinteză a antibioticelor este amplificarea genică. Genele
codificatoare ale sintezei antibioticelor sunt cromosomale şi extracromosomale (plasmidiale) (Recchia şi Hall,
1995). Numărul plasmidelor per celulă este variabil în funcţie de tipul de control pe care celula îl exercită: un
control riguros are ca efect existenţa unui număr mic de plasmide în celula (1- 5 copii); un control relaxat
permite creşterea numărului de copii plasmidiale per celulă (50-l00). În aceste condiţii, dacă genele
codificatoare ale sintezei antibioticului sunt plasmidiale, randamentul sintezei creşte foarte mult.
Transferul genelor codificatoare ale sintezei unui antibiotic, prin tehnologia ADN recombinant, pare a
nu fi realizabil, deoarece genele sunt dispersate. De aceea, s-a recurs la un artificiu: se încearcă mărirea
producţiei de antibiotic prin grefarea unor gene promotor foarte eficiente, care să grăbească intrarea în acţiune
a operonului codificator.
O altă cale pentru ameliorarea producerii de antibiotice este biosinteza mutaţională sau mutasinteza.
Principiul metodologic este următorul: sinteza unui antibiotic se desfăşoară pornind de la un produs iniţial,
prin etape intermediare, până la sinteza produsului final. În această tehnologie se folosesc microorganisme
mutante, cu incapacitatea de a face sinteza unui produs, aproape de capătul lanţului de sinteză. Dacă în mediul
de creştere se adaugă compusul natural, microorganismul produce antibioticul natural. Dacă în mediul de
creştere se adaugă un alt compus, nenatural (de sinteza chimică), celulele încorporează acest produs chimic
nou şi sinteza este orientată în funcţie de natura produsului care a fost furnizat. Această tehnică s-a denumit
biosinteza mutaţională.
Pentru producerea antibioticelor noi, industria de biosinteză a utilizat două căi majore:
- prin procedee de mutageneză s-a urmărit selecţia unor tulpini înalt producătoare. Pe această cale,
randamentul biosintezei de antibiotice s-a ameliorat permanent. Procedeul este foarte laborios,
deoarece mutageneza este o metoda oarbă, ce presupune testarea a mii şi mii de tulpini celulare, după
iradiere cu raze UV, X sau după tratamentul cu substanţe chimice mutagene (azotiperita). Această
metodă este tipică pentru producerea penicilinei, cu tulpini mutante de P. Chrysogenum (Eishmahan,
1991). Randamentul tulpinilor actuale, obţinute prin mutageneză cu radiaţii gamma (Co 6o) este de mii
de ori superior faţă de al tulpinii originale;
- producerea de antibiotice cu un oarecare grad de modificare chimică, prin procedeul semisintezei.
Metoda constă în grefarea unui radical chimic, pe o moleculă de antibiotic, produsă pe o cale naturală.

4.3. Clasificarea antibioticelor în funcţie de structura chimică

Din punct de vedere chimic, antibioticele sunt un grup de substanţe foarte heterogene (Bayarski,
2006). Se disting următoarele categorii:
Antibioticele -lactamice constituie unul dintre cele mai mari şi importante grupe de antibiotice.
Toate cuprind în structura lor, inelul β-lactamic şi sunt foarte diverse: penicilinele, cefalosporinele şi
cefamicinele.
Molecula nativă (benzil-peniclina sau peniclina G) este alcătuită din inelul β-lactamic şi inelul
tiazolidinic. La C6 este ataşat grupul fenil-acetamido (tabelul 3).
La cefalosporine, inelul tiazolidinic are un atom de C suplimentar, cu o legătură nesaturată între C 3 şi
C4 şi rezultă o structură denumită cefem.
Cefamicinele sunt similare ca structură chimică, dar inelul β-lactamic conţine un grup metoxi, care îi
conferă stabilitate la multe enzime β-lactamazice.
71
Alte variante structurale ale compuşilor β-lactamici utilizaţi în clinică sunt: carbapenem (Imipenem,
Meropenem), carbacefem, oxacefem, clavam (acid clavulanic), sulfone, monobactam.
Penicilinele semisintetice se obţin din acidul 6-aminopenicilanic, care se condensează cu orice acid
carboxilic. Rezultă astfel un număr mare de peniciline: oxacilina şi derivaţii săi, meticilina, ampicilina,
amoxicilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilina, ticarcilina.
Acidul 6-aminopenicilanic, pentru penicilinele semisintetice, se obţine prin tratamentul penicilinei cu
o amidază sau prin cultivarea organismului producător, într-un mediu fără donorul grupării acil.
Acidul 6-aminopenicilanic este un dipeptid ciclic, format prin condensarea L-cisteinei şi D-valinei şi
de aceea penicilinele, cefalosporina şi cloramfenicolul aparţin grupului antibioticelor oligopeptidice.
Cloramfenicolul este un antibiotic simplu, sintetizat de Streptomyces, dar în cea mai mare parte se
obţine prin sinteză chimică. Are un spectru larg de acţiune: bacteriile Gram pozitive şi Gram negative, dar şi
bacteriile parazite obligat intracelulare (chlamidii, rickettsii).
Cloramfenicolul conţine o grupare nitro şi un grup diclor-acetil. El se leagă de subunitatea ribosomală
mare şi blochează transferul peptidil, la ribosomii care alungesc catena.
Antibiotice polipeptidice: bacitracina (produsă de B. subtilis), gramicidina (sintetizată de B. brevis),
cicloserina (produsă de Streptomyces), actinomicina, polimixina (sintetizată de B. polymyxa).
Bacitracina este un peptid ciclic (tabelul 3) ce împiedică defosforilarea purtătorului lipidic ce
transferă noul peptidoglican, prin membrana celulei, în timpul sintezei peretelui celular. Bacitracina derivă
dintr-o proteină a celulei vegetative, care este degradată parţial în timpul sporulării. Este toxică pentru a fi
aplicată sistemic, dar se găseşte sub forma unor preparate pentru aplicaţii locale.
Polimixinele sunt o familie de antibiotice produse de specii de Bacillus. O parte a polipeptidului are o
configuraţie ciclică, cu o “coadă” hidrofobă de acid octanoic (tabelul 4). În clinică se folosesc polimixina B şi
polimixina E (colistina), precum şi derivaţii lor sulfometilaţi. Polimixinele sulfometilate au activitate
antibacteriană redusă, dar se clivează spontan şi rezultă compuşi mai activi.
Tyrocidina şi gramicidina S sunt polipeptide ciclice (tabelul 4). Ele produc dezorganizarea
membranei, rezultatul fiind pierderea moleculelor mici şi liza protoplaştilor. Nu se folosesc pentru
administrare sistemică, deoarece sunt toxice.
Antibioticele aminoglicozidice a căror denumire se termină cu “mycin” sunt produse de sinteză ale
unor specii ale genului Streptomyces, iar cele care se termină cu “micin” sunt sintetizate de tulpini de
Micromonospora. Toate aminoglicozidele au un inel format din 6 unităţi, cu grupări amino şi de aici derivă
denumirea de aminociclitol. Molecula lor polară, policationică, conţine un aminociclitol (tabelul 5), de care se
leagă două sau mai multe glucide, dintre care cel puţin unul este aminat. La streptomicină, aminociclitolul este
diguanidin-inozitolul (streptidina). Majoritatea aminoglicozidelor au grupul aminociclitol reprezentat de
deoxistreptamină. Ele se împart în derivaţi ai neomicinei, kanamicinei şi gentamicinei.
Aminoglicozidele sunt active faţă de numeroase bacterii patogene Gram pozitive şi Gram negative,
dar şi faţă de M. tuberculosis. Legarea unei singure molecule este suficientă pentru inactivarea ribosomului
bacterian. Aceste antibiotice nu traversează uşor membranele celulare. Se absorb cu dificultate din intestin,
dar pentru modificarea microbiotei intestinale, administrarea orală este calea optimă. Sunt ineficiente faţă de
bacteriile cu localizare intracelulară. Anaerobia şi prezenţa cationilor bivalenţi diminuează eficienţa
aminoglicozidelor. Se administrează numai în cazul infecţiilor severe (tuberculoza, bruceloza, tularemie, plaga
bubonică). Sunt sinergice cu antibioticele β-lactamice şi se folosesc în septicemiile cu bacterii Gram negative.
Pentru a-şi exercita efectul bactericid, aminoglicozidele necesită sinteza proteică.
Antibioticele poliketide (acetogenine) sunt substanţe naturale derivate din acizi poli-β-cetonici, care
la rândul lor se formează din acetil-CoA şi mai multe molecule de malonil-CoA, după decarboxilare:
griseofulvina (produsă de Penicillium patulum), tetraciclina (sintetizată de Streptomyces).
Tetraciclinele sunt un grup de substanţe naturale sau de semisinteză, a căror formulă cuprinde un
nucleu tetraciclic linear fuzionat (tabelul 5), de care se ataşează o varietate de grupări funcţionale: clor-
tetraciclina (produsă de Streptomyces aureofaciens), oxitetraciclina (produsă de S. rimosus).
Sunt cel mai important grup de antibiotice, datorită spectrului antibacterian foarte larg. Sunt active
faţă de bacteriile Gram pozitive şi Gram negative, faţă de protozoarele parazite (Entamoeba), faţă de
chlamidii, micoplasme şi ricketsii. Acţionează prin inhibiţia sintezei proteinelor, deoarece inhibă ataşarea
aminoacil-ARNt la situsul acceptor ribosomal. Sunt larg utilizate în terapia antiinfecţioasă umană şi animală,
deoarece nu produc colaterale majore. Se adaugă ca supliment în furaje în doze subterapeutice, pentru
stimularea creşterii.
Antibioticele macrolide. Denumirea de “macrolid” desemnează o structură chimică caracterizată prin
prezenţa unui ciclu lactonic cu complexitate variabilă, la care se ataşează componenta glucidică (tabelul 5).
Ciclul lactonic rezultă prin închiderea unui lanţ lung de acizi graşi hidroxilaţi. Antibioticele macrolide sunt
72
foarte diverse, datorită atât variaţiei inelului macrolidic, cât şi a complexului glucidic. Cele mai cunoscute
sunt eritromicina şi oleandomicina.
Antibioticele steroidice au o structură chimică asemănătoare colesterolului. Acidul fusidic (fusidina)
este produs de fungii filamentoşi din g. Fusarium. Este activ prin legarea de factorul de elongaţie G (EFG).
Antibioticele polienice se caracterizează prin prezenţa, în molecula lor, a unui anumit număr de
legături duble: nistatina, amfotericina B, candicidina (produse de membri ai g. Streptomyces), iar fumigalina
este sintetizată de Aspergillus fumigatus.
Antibiotice glicopeptidice. În clinică se folosesc două glicopeptide: vancomicina şi teicoplanina.
Vancomicina este o moleculă mare, complexă, produsă de Streptomyces orientalis (tabelul 3). Utilizarea ei
este limitată, datorită toxicităţii asupra rinichiului. Vancomicina este un heptapeptid rezultat din aminoacizi
aromatici modificaţi şi condensaţi într-o structură triciclică, de care se ataşează un dizaharid. Activitatea sa
antimicrobiană se datorează legării la catenele laterale de D-alanil-D-alanil ale peptidoglicanului, blocând
formarea legăturilor încrucişate ale catenei polipeptidice şi este limitată, în esenţă, la bacteriile Gram pozitive,
deoarece, la bacteriile Gram negative mureina acoperită de membrana externă, nu este accesibilă antibioticelor
glicopeptidice.

4.4. Clasificarea antibioticelor în funcţie de mecanismele de acţiune

Antibioticele au acţiune selectivă: ele nu produc leziuni asupra celulelor organismelor superioare, dar
inhibă creşterea sau omoară agentul infecţios. Selectivitatea acţiunii este o condiţie ideală, pentru că, de
exemplu, penicilina produce o stare alergică, independentă de acţiunea antibacteriană şi implică o altă parte a
moleculei decât cea efectoare a acţiunii antibacteriene. Unele antibiotice produc efecte toxice nete la om şi
animale şi folosirea lor este limitată pentru tratamentul infecţiilor la care riscul administrării este mai mic
decât consecinţele procesului infecţios. Antibioticele îşi datorează acţiunea selectivă, reactivităţii lor chimice
mai înalte sau exclusive faţă de unele componente ale celulei bacteriene sau fungice, în raport cu celulele
umane şi animale. Sensibilitatea diferitelor organisme la antibiotice, ca şi la agenţii chimioterapeutici, variază
în limite largi. De obicei, bacteriile Gram pozitive sunt mai sensibile, deoarece peretele mureinic este o barieră
mai permeabilă pentru moleculele de antibiotic şi în plus, sinteza mureinei este o ţintă importantă pentru
acţiunea unor antibiotice. Bacteriile Gram negative sunt mai puţin sensibile, deoarece membrana externă este
hidrofobă, iar moleculele de LPS stabilizate de ionii bivalenţi formează o structură densă, greu permeabilă.
Antibioticele se clasifică în funcţie de spectrul de activitate, adică de diversitatea microorganismelor
asupra cărora acţionează:
- antibiotice cu spectru restrâns de activitate, faţă de bacteriile Gram negative: de exemplu, penicilina
G este activă faţă de cocii Gram pozitivi;
- antibiotice cu spectru intermediar de activitate: sunt active faţă de bacteriile Gram pozitive, dar şi
faţă de unele bacterii Gram negative: streptomicina, neomicina, gentamicina, kanamicina,
cefalosporina;
- antibiotice cu spectru larg, active faţă de bacteriile Gram pozitive şi Gram negative: tetraciclina,
cloramfenicolul;
- antibiotice antifungice, active faţă de infecţiile fungice superficiale (de exemplu, griseofulvina) sau
faţă de infecţiile profunde (amfotericina). Nistatinul (stamicin) este activ faţă de infecţiile
tegumentului şi ale epiteliilor mucoaselor digestive şi vaginale, produse de Candida.
Antibioticele active asupra bacteriilor Gram pozitive şi Gram negative sunt de spectru larg. Acestea
au o utilitate clinică mai largă decât cele active faţă de un singur grup de microorganisme, denumite
antibiotice cu spectru îngust. Ultimele se folosesc pentru controlul infecţiilor care nu răspund la alte
antibiotice. De exemplu, vancomicina (un glicopeptid) este activă faţă de bacteriile din g. Staphylococcus,
Bacillus şi Clostridium. În unele cazuri, antibioticele interacţionează cu molecule caracteristice
microorganismelor şi de aceea indexul lor terapeutic este foarte înalt. De exemplu, penicilina este activă faţă
de sinteza mureinei, componenta specifică a peretelui bacterian. Penicilina reacţionează şi cu moleculele
proprii organismului uman şi animal, la concentraţii de câteva mii de ori mai mari decât cele necesare pentru a
omorî bacteriile.
Majoritatea antibioticelor sunt bacteriostatice sau bactericide. Efectul bacteriostatic semnifică
inhibiţia reversibilă a creşterii, iar cel bactericid are semnificaţia unei acţiuni letale ireversibile. Excepţie fac
griseofulvina şi antibioticele polienice, care sunt antifungice.
Mecanismele de acţiune a antibioticelor sunt diferite, consecinţă a diversităţii structurii lor
moleculare (fig. 22). Cele mai multe sunt molecule complexe, cu regiuni hidrofobe, ce uşurează difuzia în
celule. Cea mai simplă modalitate de a le clasifica, este în funcţie de situsul de acţiune în celula bacteriană:
73
- antibiotice ce acţionează asupra sintezei componentelor chimice ale peretelui celular (penicilina,
cefalosporina, bacitracina, cicloserina, fosfomicina);
- antibiotice active asupra sintezei proteinelor bacteriene (aminoglicozide, cloramfenicol, tetraciclina,
macrolide, streptogramina);
- antibiotice active asupra sintezei acizilor nucleici (rifamicina, novobiocina);
- antibiotice active asupra membranei celulare (polimixina, gramicidina, tirocidina, valinomicina,
monensina – ultimele două nefolosite în clinica umană).
În celulă, inhibiţia unui proces poate duce la inhibiţia sau la stimularea indirectă a altor procese, prin
alterarea sistemelor feed-back sau a altor mecanisme de control. De aceea, nu se pot trage concluzii ferme din
studiul efectelor unui antibiotic asupra unui singur proces celular.

Figura 22. Ilustrarea schematică a situsurilor majore ale acţiunii antibioticelor (dupa Dale, 1998).

Antibiotice care inhibă sinteza peretelui celular

Peretele acoperă membrana citoplasmatică, conferă forma specifică şi rigiditate celulei bacteriene,
asigură menţinerea integrităţii structurale. Structura chimică unică a peretelui bacterian condiţionează
sensibilitatea lui la câteva grupe de antibiotice, care includ -lactamii (peniciline, cefalosporine, carbapenemi
şi monobactami), acidul clavulanic (un inhibitor al -lactamazelor), antibioticele glicopeptidice (vancomicina,
teicoplanina şi avoparcina – stimulator al creşterii animalelor). Sunt de asemenea active asupra peretelui,
fosfomicina şi cicloserina, deşi acestea sunt active asupra căii metabolice a sintezei monomerilor peretelui
celular.
La bacteriile Gram-negative stratul peptidoglicanic este foarte subţire şi este acoperit de membrana
externă, care reprezintă o barieră importantă de permeabilitate, în special faţă de pătrunderea antibioticelor
(fig. 23).

74
Figura 23. Reprezentarea schematică a membranei externe a bacteriilor Gram negative (E. coli) (dupa Davis, 1990).

Sinteza peretelui celular este inhibată de antibioticele -lactamice (peniciline, cefalosporine),


inhibitoare ale polimerizării peptidoglicanului şi de vancomicină (tabelul 3).

Tabelul 3.
Antibiotice inhibitoare ale sintezei peretelui bacterian (adaptare după Topley si Wilson’s, 1998).

Clasa de Ţinta specifică Structura chimică


antibiotice
-Lactaminele PLP/PBP HO O H
(Peniciline, (Penicilin Binding CH3
S
Cefalosporine Protein); C ON R1 C N
, Transglicozilaze; H3C
S CH3 N
Carbapenem) Transpeptidaze; O R2
NH
Carboxidaze.
O -
COO COOH

carbapenem cef alosporina

Bacitracina Lipidul
transportor al
precursorilor
nucleotidici
Cicloserina Inhibarea
dipeptid-
sintetazei
Fosfomicina Inhibarea PEP ??- H H
sintetazei
C C
H3C O PO3H2
fosfomicina

75
Vancomicina Dipeptidul HO OH
terminal D-Ala-D- HO
Ala

CO2-
AA1 O AA3 O NH
R1 O
NH NH NH
R2 N+ NH NH O

R3 O O X1
HO OS1
X2

O O
vancomicina
X3 OS2

Familia antibioticelor β-lactamice cuprinde un număr mare de molecule, reprezentantul cel mai vechi
fiind penicilina G; ele se pot clasifica în patru grupe:
- peniciline
- cefalosporine
- carbapeneme
- monobactami.
Antibioticele β-lactamice inhibă ultima etapă a sintezei peptidoglicanului, adică formarea punţilor
interpeptidice. Aceşti compuşi prezintă o analogie structurală cu dipeptidul terminal D - ala - D - ala, care face
parte din pentapeptidul mureinic.
Problema funcţiei fiecărei proteine care leagă penicilina (PBP – Penicillin Binding Proteine) a fost
studiată în detaliu E. coli. La această specie s-au identificat patru PBP cu greutate moleculară mare (PBP 1a,
1b, 2 şi 3), cu rol de enzime bifuncţionale: catalizează transpeptidarea şi transglicozilarea peptidoglicanilor.
Antibioticele β-lactamice interferă cu reacţia finală de transpeptidare, ce formează legăturile
transversale între catenele adiacente de peptidoglican, cele care conferă rigiditatea structurii parietale.
Antibioticele β-lactamice sunt bactericide, dar mecanismul acţiunii lor este diferit, asupra bacteriilor
Gram pozitive şi Gram negative.
Bacteriile produc 4 tipuri de proteine care leagă penicilina (PBP), asemănătoare serin-proteazelor.
Unele catalizează reacţiile de transpeptidare (formarea legăturilor încrucişate în peptidoglican) şi de
carboxipeptidare (modificarea peptidoglicanului) ale asamblării peretelui celular. PBP, după legarea
penicilinei, transmit un semnal transmembranar pentru inducerea sintezei β-lactamazelor.
Beta-lactamazele sunt PBP ce catalizează hidroliza inelului β-lactamic şi inactivarea antibioticului.
PBP sunt proteine legate de membrană (1% din totalul proteinelor de membrană), esenţiale pentru
viabilitatea celulei, cu excepţia β-lactamazelor care pot fi legate de membrană sau secretate. Antibioticele β-
lactamice se leagă covalent cu PBP prin acilarea restului de serină din situsul activ. La bacteriile Gram
pozitive, antibioticele β-lactamice difuzează liber spre PBP. La bacteriile Gram negative, porinele membranei
externe limitează pătrunderea antibioticelor în celulă, care se acumulează în spaţiul periplasmic. Când
concentraţia devine eficientă, antibioticele sunt legate de PBP de pe suprafaţa externă a membranei celulare.
Rezistenţa se manifestă atunci când concentraţia antibioticului în periplasmă este mai mică decât cea
necesară pentru legarea şi inhibiţia activităţii PBP.
În absenţa sintezei mureinei, celulele lipsite de perete celular suferă fenomenul lizei osmotice. La
cocii Gram pozitivi, antibioticele β-lactamice determină pierderea acizilor lipoteichoici parietali. Absenţa lor
elimină controlul procesului autocatalitic, care în mod normal este limitat şi dezagregă peptidoglicanul la
situsuri strict localizate.
Antibioticele -lactamice sunt active numai asupra celulelor bacteriene tinere, aflate în faza de
creştere. Penicilina poate fi administrată în doze mari faţă de cele terapeutice, singurul risc fiind manifestările
alergice. Administrată oral, este degradată în cea mai mare parte, de HCl din stomac. De aceea se injectează
intramuscular sau intravenos. Se absoarbe rapid în sânge şi este excretată rapid. Din acest motiv se asociază cu
procaina, care diminuă excreţia şi îi prelungeşte acţiunea.
Penicilina G se foloseşte pentru tratamentul infecţiilor cu streptococi, meningococi, pneumococi,
spirochete, bacili aerobi Gram pozitivi, Clostridium. Işi păstrează activitatea în urină şi se foloseşte pentru
tratamentul infecţiilor tractului urinar.
Carbapenemii reprezintă un grup de antibiotice cu efect bactericid, ce conţin un antibiotic β-lactamic
şi un compus ce împiedică degradarea medicamentului în rinichi.

76
Bacitracina (un peptid ciclic) împiedică defosforilarea moleculei lipidice purtătoare, ce transferă
molecula de peptidoglican nou sintetizată, prin membrana celulei, în timpul sintezei peretelui celular. Este
toxică pentru rinichi şi de aceea nu se administrează sistemic, dar se aplică local pentru tratamentul leziunilor
tegumentare şi ale membranelor mucoase.
Mecanismul acţiunii vancomicinei constă în blocarea creşterii celulei, deoarece formează un complex
cu D-ala-D-ala din peptidul mureinic. Este activă numai faţă de multe bacterii Gram pozitive, pentru că la
Gram negative, peptidoglicanul nu este accesibil antibioticului. Nu selecţionează mutante rezistente. Cocii
Gram pozitivi (Leuconostoc) şi Lactobacillus sunt rezistente pentru că lanţul lateral al peptidoglicanului
constă din D-alanil-D-lactat, care are afinitate mai mică pentru antibioticele glicopeptidice.
Cicloserina inhibă competitiv formarea D-ala din L-ala şi astfel stopează sinteza dipeptidului D-ala-
D-ala. Este relativ toxică şi se foloseşte pentru tratamentul infecţiilor cu M. tuberculosis, rezistent la alte
medicamente.
Fosfomicina este un inhibitor al piruvil-transferazei şi astfel blochează sinteza acidului N-acetil-
muramic.
Cicloserina şi fosfomicina se comportă ca analogi ai precursorilor peptidoglicanului. Sunt molecule
foarte hidrofile şi pătrund în citoplasmă pe calea sistemelor de transport pentru metaboliţii înrudiţi:
fosfomicina este anologă structural cu fosfo-enol-piruvatul, iar cicloserina este analogă D-alaninei:

Structura moleculară a fosfo-enol-piruvatului

Structura moleculară a D-Cicloserinei Structura moleculară a D-Alaninei

Alanina este un compus major al peptidoglicanului şi al acizilor teichoici din peretele celulelor
bacteriene Gram pozitive. O parte a alaninei parietale se găseşte ca izomer D. Prezenţa D-aminoacizilor (D-
ala, acidul D-glutamic) în peretele bacteriilor infecţioase este considerată ca un mecanism protector faţă de
mediul intern al organismului gazdă. Compuşii analogi ai D-aminoacizilor au activitate antibacteriană.
Antagoniştii D-alaninei (D-cicloserina şi O-carbamil-D-serina) inhibă selectiv încorporarea D-alaninei în
peptidoglican. D-alanina rezultă din L-alanină sub acţiunea racemazei. Incorporarea D-alaninei este catalizată
de D-ala-D-ala ligază. Creşterea E. coli în prezenţa D-cicloserinei şi a sucrozei 0,32 M duce la formarea
sferoplaştilor, iar în celulă se acumulează precursorii parietali. Sinteza proteinelor celulare nu este modificată.
Adăugarea D-alaninei în mediul de creştere reversează efectele inhibitorii ale D-cicloserinei.
D-cicloserina are două grupări ionizabile. Este un antibiotic cu spectru larg de activitate, dar este mai
eficient faţă de bacteriile Gram pozitive decât faţă de cele Gram negative. Este foarte important că D-
cicloserina inhibă creşterea M. tuberculosis.
O-carbamil-D-serina izolată dintr-o tulpină de Streptomyces are acelaşi mecanism de acţiune:
activitatea antibacteriană este reversată de D-alanină.

Antibiotice antiribosomale (inhibitoare ale sintezei proteinelor)

Sinteza proteinelor implică 3 procese de recunoaştere macromoleculară: selecţia ARNt iniţiator;


selecţia codonului iniţiator pe ARNm; interacţia ARNm şi ARNt iniţiator cu ribosomul neangajat în sinteza
proteinelor.
Primul eveniment al iniţierii este legarea subunităţii 30S de codonul iniţiator al ARNm şi formarea
complexului de iniţiere. La procariote, iniţierea sintzei proteinelor se face prin legarea N-formil-metionil-ARNt.
După legarea în polipeptid, N-f-Met este clivată sub acţiunea peptidazelor. f-Met-ARNt iniţiator ocupă situsul
ribosomal peptidil (P). Al doillea complex aa-ARNt, ca şi toate cele care urmează, se leagă la nivelul situsului

77
acceptor (A), unde are loc interacţiunea dintre codonul ce specifică aminoacidul următor şi anticodonul din
secvenţa ARNt.
Formarea legăturii peptidice între gruparea COOH a f-Met-ARNt legat la situsul P şi gruparea NH 2
liberă a aminoacidului din situsul A, este catalizată de enzima peptidil-transferază, componentă a subunităţii
50S. Se formează un dipeptid legat la situsul A, în timp ce ARNt din situsul P este descărcat de aminoacidul
corespunzător (fig. 24). Creşterea polipeptidului cu un aminoacid se face prin clivarea acestuia de la ARNt
situat în situsul P şi legarea la aminoacidul din situsul A. Reacţia de clivare-reunire (adică de formare a
legăturii peptidice) consumă energie eliberată prin hidroliza GTP. La sfarşitul reacţiei, situsul A poartă ARNt
al celui de al doilea aminoacid, de care este legat un dipeptid (f-Met şi al doilea aminoacid legat - o moleculă
de peptidil-ARNt).

Figura 24. Ilustrarea schematica a mecanismului sintezei proteinelor. Amănunte în text. (după Dale, 1998).

Situsul P, foarte apropiat de situsul A, acceptă complexul ARNt-peptidil (ARNt legat cu lanţul
polipeptidic în curs de biosinteză). Translocaţia ARNt la situsul P este însoţită de deplasarea coordonată a
ribosomului de-a lungul secvenţei de ARNm, cu distanţa egală cu un codon. Astfel, un alt codon este plasat în
situsul A, care leagă un alt aminoacil-ARNt, pe baza relaţiei specifice codon-anticodon.

78
Figura 25. Situsurile de acţiune a antibioticelor inhibitoare ale sintezei proteinelor. Quinolonele inhibă replicarea
ADN. Rifampicina inhibă transcrierea. Tetraciclinele inhibă traducerea prin blocarea formării complexului de iniţiere.
Aminoglicozidele ocupă situsul acceptor al ribosomului şi induc erori de citire a ARNm. Cloramfenicolul interacţionează
cu ARNr 23S al subunităţii ribosomale 50S şi inhibă formarea legăturii peptidice. Eritromicina şi clindamicina se leagă
la subunitatea 50S şi interferă cu procesul de translocaţie a peptidului nascent, de la situsul acceptor (A), la situsul
peptidil (P) (după Dale, 1998).

Unele antibiotice acţionează selectiv asupra ribosomilor celulei procariote. Altele (de exemplu,
cicloheximida) sunt active faţă de ribosomii celulelor eucariote, iar o altă categorie sunt active faţă de ambele
tipuri de ribosomi. Unele sunt active asupra ribosomilor polisomali (puromicina, cloramfenicolul), iar altele
blochează numai ribosomii liberi, de iniţiere a catenei polipeptidice, pentru că situsurile lor de legare sunt
restrictive şi nu se pot asocia cu ribosomii polisomali (de exemplu, eritromicina). Unele antibiotice se leagă de
subunitatea ribosomală mică, iar altele se asociază cu subunitatea ribosomală mare (fig. 25).
Antibioticele cu acţiune asupra ribosomilor sunt molecule complexe, adeseori având cicluri şi grupări
cationice, care favorizează interacţiunile ionice cu ARNr. Spre deosebire de antibioticele care blochează
sinteza mureinei la nivelul suprafeţei externe a membranei citoplasmatice, cele care acţionează la nivelul
ribosomilor trebuie să pătrundă în citoplasmă.
Din punct de vedere chimic, majoritatea sunt aminoglicozide policationice, cu molecule polare. Ele au
o regiune hidrofobă mare, care uşurează difuzia prin stratul lipidic al membranei.
Aminoglicozidele (streptomicina şi kanamicina) au activitate bactericidă dependentă de concentraţie.
Sunt foarte solubile în apă şi insolubile în solvenţii organici şi de aceea au o capacitate limitată de a traversa
membranele lipidice. Aminoglicozidele cationice interacţionează chimic cu antibioticele β-lactamice.
Rezultatul este deschiderea inelului β-lactamic şi acilarea grupului amino al aminoglicozidei, cu pierderea
reciprocă a activităţii antibacteriene. Aminoglicozidele interacţionează ionic cu suprafaţa externă a celulei şi
sunt transportate în celulă. Sursa energiei este gradientul electrochimic al protonilor generaţi în procesul
respiraţiei. Cele cationice se leagă de resturile încărcate negativ ale LPS şi de proteinele anionice ale
membranei externe şi înlocuiesc competitiv Mg 2+ şi Ca2+ care consolidează LPS adiacente. Ele modifică
conformaţia subunităţii 30S a ribosomului polisomal, astfel încât creşte rata erorilor de împerechere a
codonilor cu anticodonii. Mesajul este tradus greşit şi se sintetizează proteine nefuncţionale. Aminoglicozidele
sunt active şi faţă de ribosomii liberi: asocierea antibioticului cu ribosomul liber blochează interacţiunea
acestuia cu ARNm (se blochează astfel formarea complexului de iniţiere). Sensibilitatea la Str este dependentă
de subunitatea 30 S, pentru că ribosomii hibrizi formaţi din subunităţi 30 S de la o tulpină Str rezistentă şi
subunităţi 50 S de la o tulpină Str sensibilă, sunt Str rezistenţi. Sensibilitatea la streptomicină este determinată
de proteina S12. Streptomicina face ca ribosomul să citească greşit ARNm şi să insere greşit aminoacidul.
79
Ribosomul normal încorporează fenil-alanina, ca răspuns la mesajul sintetic poli-U, dar streptomicina
stimulează intens încorporarea izoleucinei, a serinei şi leucinei ca răspuns la mesajul poli-U. Schimbarea
mutaţională a unui singur aminoacid într-o proteină a subunităţii ribosomale 30S determină rezistenţa celulei
la streptomicină, dar nu şi la antibioticele care conţin deoxistreptamina ca grup lateral ataşat heterociclului
complex, deoarece ele se asociază cu ambele subunităţi ribosomale.
Macrolidele (eritromicina, lincomicina şi clindamicina) penetrează greu în celula Gram negativă. Se
asociază cu ribosomii liberi, dar nu cu ribosomii polisomali. Se leagă cu subunitatea 50 S şi interferă cu
procesul de translocaţie a polipeptidului nascent, producând disocierea peptidil-ARNt de ribosom. Deşi unele
antibiotice care interacţionează cu ribosomii liberi blochează complexul de iniţiere, eritromicina stopează
sinteza proteică numai după ce s-a sintetizat un polipeptid scurt.
Unele antibiotice policiclice mari se leagă cu subunitatea mare a ribosomului şi blochează legarea
factorilor de elongaţie EFTu (Elongation Factor Thermo unstable) şi EFG (Elongation Factor G, implicat în
translocaţia peptidului nascent).
Acidul fusidic este bacteriostatic, dar la concentraţii mari poate fi bactericid. Are o structură
moleculară de tip steroidic. Spre deosebire de alţi inhibitori ai sintezei proteice, nu se leagă direct de ribosomi,
ci formează un complex stabil cu guanozin-trifosfatul şi cu factorul de elongaţie G. Sinteza proteică bacteriană
depinde de translocaţia peptidil-ARNt de la situsul acceptor ribosomal, la situsul peptidil. Translocaţia
necesită factorul G de alungire proteică şi hidroliza GTP. Acidul fusidic are capacitatea de a stabiliza
complexul ribosom-factorul G de alungire – GTP – fosfat anorganic, inhibând hidroliza GTP şi blocând
alungirea catenei polipeptidice nascente.
Puromicina a fost izolată din filtratele de Streptomyces alboniger. Antibioticul este un aminoglicozid
substituit, alcătuit din 3 componente :

- 6-dimetil-aminopurina
- 3-deoxi-3-amino-D-riboza
- p-metoxi-L-fenilalanina.
Legătura glicozidică, în configuraţie  ca şi în nucleozidele naturale, este clivată de acizi tari (HCl
1N, la 100o, timp de 10 min), condiţii în care legătura amidică a aminoacizilor este stabilă. Comparativ cu
multe alte antibiotice, puromicina are un spectru deosebit de larg al activităţii, ce constă în inhibiţia creşterii.
Puromicina este un inhibitor al sintezei proteinelor şi inhibă creşterea tuturor organismelor : bacterii, plante,
protozoare, animale. Principalul mecanism de acţiune al puromicinei, ca agent inhibitor al sintezei proteinelor
a fost definit ca rezultat al investigaţiei mecanismului biosintezei proteinelor.
Datorită analogiei structurale cu aminoacil-ARNt, un intermediar al sintezei proteinelor, puromicina
produce terminarea prematură a creşterii catenei polipeptidice. Puromicina eliberează polipeptidul în creştere
din complexul ribosom-ARNm, producând o rupere a legăturii ester între gruparea COOH a polipeptidului şi
gruparea OH a adenozinei din ARNt. Clivarea se datorează faptului că peptidul este transferat de la ARNt la
puromicină.
Datorită stopării sintezei proteinelor, efectul puromicinei constă în oprirea creşterii celulei. Efectul
este predominant bacteriostatic. Sinteza ADN şi ARN continuă pentru un timp la o rată normală sau aproape
normală, dar sinteza proteinelor este inhibată imediat. În celulele mamaliene, inhibiţia sintezei proteinelor este
reversată rapid după îndepărtarea puromicinei.
Deoarece puromicina este un analog al adenozinei, este posibil ca regiunea aminonucleozidică a
moleculei să interfere direct cu metabolismul nucleotidelor. Puromicina are toxicitate crescută asupra
organismelor superioare: nefrotoxicitate, stare de rău general etc.
Bacteriile Gram pozitive sunt mai sensibile decât cele Gram negative. Diferenţele de sensibilitate se
pot datora înglobării reduse a puromicinei. Ionii de Mg 2+ măresc sensibilitatea la puromicină. Nu se foloseşte
în terapia antiinfecţioasă, dar este utilă în studiul experimental al mecanismului sintezei proteinelor, deoarece
interferă cu sinteza proteică, producând eliberarea prematură a polipeptidului nascent din asociaţia sa cu
ribosomul.

80
Structura moleculară a puromicinei

Cloramfenicolul se leagă reversibil cu subunitatea ribosomală 50 S şi blochează alungirea peptidului


nascent pe ribosom. Ribosomii 80 S nu sunt afectaţi, dar probabil ribosomii 70 S mitocondriali sunt sensibili
la cloramfenicol.

Antibiotice care modifică permeabilitatea membranei plasmatice

Interacţiunea unor antibiotice (gramicidina, polimixina, nistatina, amfotericina B) cu membrana


plasmatică a celulei bacteriene produce creşterea permeabilităţii şi pierderea proprietăţilor de membrană
selectivă. Rezultatul este moartea celulei prin liză osmotică.
Polimixina actionează asupra membranei citoplasmatice ca un detergent cationic, având afinitate
pentru grupările sale cationice. Este singurul antibiotic cu acţiune bactericidă asupra celulelor aflate în faza
staţionară, după ce au depăşit faza de creştere. Acţionează asupra membranei externe, pe care o fragmentează,
ceea ce explică acţiunea sa bactericidă şi selectivitatea faţă de bacteriile Gram negative (tabelul 4).
Sensibilitatea diferitelor specii variază foarte mult, ceea ce denotă specificitatea interacţiunii dintre
antibiotic şi microorganism.
Antibioticele polienice (nistatin, amfotericina B) formează complexe cu sterolii din structura
membranei plasmatice. Nu sunt active faţă de bacterii, deoarece membrana lor nu conţine steroli, dar inhibă
creşterea micoplasmelor, deoarece conţin steroli. Rezultatul interacţiunii cu membranele celulelor sensibile
este pierderea permeabilităţii selective, pierderea ionilor de K + şi Mg2+ şi diminuarea ratei sintezei proteinelor
şi a ARN.
Toate tipurile de celule sensibile la acţiunea antibioticelor polienice conţin steroli. Sterolii sunt
componente comune multor grupe de organisme: alge, protozoare, levuri, viermi, mamifere etc. Datorită
efectului lor asupra permeabilităţii membranei, antibioticele polienice măresc eficienţa altor antibiotice.
Antibioticele polienice se utilizează în tratamentul micozelor. Infecţiile produse de fungi sunt mai rare
decât cele bacteriene, rareori pun în pericol viaţa şi adeseori sunt lipsite de importanţă clinică. Tratamentul
micozelor cu agenţi chimici este limitat, datorită absenţei specificităţii acţiunii lor. Cei mai importanţi agenţi
antifungici sunt cei ce acţionează asupra membranelor celulare, iar dintre aceştia, nistatinul şi amfotericina B.

81
Tabelul 4.
Antibiotice active asupra membranei bacteriene (adaptare dupa Topley si Wilson’s, 1998)

Clasa de Ţinta specifică Structura chimică


antibiotice
Polipepdide ciclice LPS membranei
(Polimixina B, externe
Polimixina E) Fosfolipidele
membranei
externe/interne

Gramicidinele Fosfolipide

Gramicidina
Tirocidina Fosfolipid

Amfotericina B este produsă de Streptomyces nodosus. Mecanismul acţiunii sale constă în legarea de
ergosterolul din membrana plasmatică a celulei fungice, a unor alge şi a unor protozoare, dar şi de celulele
umane. Efectul este creşterea permeabilităţii membranei, astfel încât glucoza, K + şi alte molecule esenţiale ies
din celulă. Amfotericina B se absoarbe puţin din tubul digestiv şi de aceea se administrează prin injectare
intravenoasă. Rezistenţa fungică la acest antibiotic nu este cunoscută, dar efectele secundare sunt foarte
frecvente şi uneori severe.
Nistatinul (Micostatin) este produs de Streptomyces noursei. Mecanismul de acţiune este acelaşi ca şi
al amfotericinei B. Se administrează local pentru tratamentul infecţiilor cu Candida. Nu se absoarbe din
intestin şi se administrează oral, numai pentru tratamentul suprainfecţiilor intestinale, care adeseori sunt
consecutive tratamentului cu antibiotice.

Antibiotice care interferă cu funcţiile acizilor nucleici

Rifamicina B este sintetizată natural, iar rifampicina este derivatul semisintetic cu cea mai largă
utilizare clinică (Tabelul 5). Rifampicina este alcătuită dintr-o grupare cromoforă aromatică, inclusă într-o
catenă alifatică. Ea se asociază cu subunitatea B a ARN-polimerazei dependentă de ADN şi probabil chiar cu
ADN în complexul de iniţiere, blocând astfel iniţierea transcrierii şi sinteza ARN. Antibioticul se foloseşte în
terapia combinată a tuberculozei. Mutantele rezistente, cu subunitatea B a ARN-polimerazei modificată se
selecţionează repede.

82
Structura moleculară a rifamicinei B

Actinomicina D (Dactinomicina) este formată dintr-o grupare cromoforă aromatică şi un ciclu


peptidic (Tabelul 5). Ea interacţionează cu ADN şi inhibă replicarea şi transcrierea. Gruparea aromatică se
intercalează în dublul helix al ADN, la perechile GC, iar peptidul ciclic rămâne la suprafaţă.

Structura moleculară a actinomicinei D


Novobiocina interferă cu sinteza ARN, deoarece inhibă ARN-polimeraza dependentă de ADN, iar
griseofulvina inhibă replicarea ADN, consecutiv interferenţei cu polimerizarea nucleotidelor purinice (tabelul
5). Cercetări recente sugerează că novobiocina acţionează asupra subunităţii B a ADN-girazei (topoizomeraza
II) care produce şi menţine starea supraspiralizată a ADN.
Griseofulvina sintetizată de Penicillium griseofulvum a fost izolată ca un factor care produce
dezvoltarea anormală (răsucirea) a hifelor fungice. Se foloseşte pentru tratamentul infecţiilor fungice
superficiale. Inhibă creşterea fungilor micelieni, dar nu este activă faţă de bacterii sau levuri. Nu influenţează
creşterea fungilor cu pereţi celulozici, dar inhibă creşterea fungilor care conţin chitină. Griseofulvina
influenţează celulele fungice prin contact direct: creşterea hifelor aeriene nu este modificată. Concentraţiile
mici produc răsucirea hifelor, ramificarea extensivă, micşorarea distanţei dintre pereţii transversali, creşterea
diametrului. La concentraţii mari de antibiotic, modificările de creştere se amplifică şi hifele se rup.
Injectarea intravenoasă a griseofulvinei la şobolan determină oprirea mitozei în metafază, produce
mitoze multipolare şi nuclei anormali. În miceliile tratate cu griseofulvină scade conţinutul de proteine, de
acizi nucleici. Antibioticul interferă cu creşterea fungică, probabil împiedicând incomplet formarea aparatului
mitotic de diviziune (tabelul 5).

Structura moleculară a griseofulvinei


83
Antibioticele care interacţionează cu ADN produc efecte nediscriminatorii asupra ADN bacterian,
viral sau al celulei eucariote.

Tabelul 5.
Antibiotice care interferă cu funcţiile acizilor nucleici (dupa Topley si Wilson’s, 1998):
Clasa de Etapa de Ţinta specifică Structura chimică
antibiotice biosinteză
Novobiocina Replicare ADN-giraza CH3
CH3
O O
OH3C OO OH
CH3

HN CO CH CH3
CH2 C
NH2COO OH OH CH3

novobiocina
Rifampicinele Transcriere ARN-
polimeraza
dependentă da HC N N N CH3
ADN

rifampicina
Aminoglicozide Traducere Subunitatea 30S NH2 O
H2C
(Streptomicina, ribosomală NH2
kanamicina, (perturbarea HO OH O NH2
tobramicina) citirii ARNm) HO
HO CH2OH
O
OH

kanamicina NH2
HO

HOH2C
O
HO
HO
H3CHN
O OH

H CH3
HN C NH2 H CHO
O
H
NH
HO O

H2N C HN OH
HO
NH
streptomicina
Cloramfenicol Traducere Factor de O
elongare EG-F
Inhibiţia fixării C CHCl2
aminoacilat- H NH
ARNt.
O2N C C CH2OH
Inhibiţia
peptidil- OH H
transferazei. cloramfenicol

84
Tretracicline Traducere Factor de N(CH2)
H3C OH
elongare EG-F
OH
Inhibiţia fixării
aminoacilat-
ARNt
CONH2
Inhibiţia OH
OH O OH O
peptidil-
transferazei. tetraciclina
Acid fusidic Traducere Factor de CH3
elongare EG-F CH2
H C
CH2 CH CH3
HO
C

CH3

O CO CH3
H CH3

HO

CH3
acid fusidic
Macrolide Traducere Situsul CH3 H C OH
3
aminoacil (A) H3C OCH3
de pe N O O
subunitatea CH3
H3C
ribosomală 50S HO O O
(perturbarea
translocaţiei) H3C CH3
OH
H3C CH3
OH O O

OH
O CH2CH3
CH3
CH3

eritromicina
Lincosamide Traducere Inhibiţia fixării CH3
aminoacilat-
ARNt N CH3
Inhibiţia
peptidil- HO C H
transferazei CO NH C H
H7C3
HO O
OH

lincomicina S CH3
OH

4.5.Determinismul genetic al rezistenţei microorganismelor la antibiotice

Utilizarea antibioticelor a reprezentat cea mai importantă modalitate de control a maladiilor


infecţioase în secolul 20. Multe maladii infecţioase au fost ţinute sub control prin administrarea antibioticelor,
dar totuşi, infecţiile răman cauza principală a morţii în lume. Mai mult, infecţii care anterior fuseseră
controlate, devin tot mai comune la pacienţii cu disfuncţii imunitare (SIDA). Microorganismele care produc
aceste infecţii sunt adeseori rezistente la antibiotice. Rezistenţa este capacitatea unui organism de a creşte în
prezenţa unui nivel ridicat al unui agent antimicrobian. Rezistenţa bacteriană la antibiotice a fost recunoscută
imediat ce antibioticele au fost introduse în clinică. Genele codificatoare ale factorilor de rezistenţă au
preexistat momentului introducerii antibioticelor în clinică deoarece au fost recunoscute în colecţiile
bacteriene alcătuite înainte de utilizarea antibioticelor. În anii ’50, Watanabe şi colab. au observat că Sh.
disenteriae a devenit rezistentă nu numai la sulfonamide, dar şi la tetraciclină şi cloramfenicol (Watanabe şi

85
colab., 1961). Rezistenţa s-a datorat nu numai mutaţiilor unor gene cromosomale, ci prezenţei ADN
extracromosomal, transmisibil, adică este o rezistenţă mediată de plasmide.
Capacitatea agenţilor patogeni de a creşte în prezenţa antibioticelor, prin dezvoltarea rezistenţei, a
făcut ca victimele să fie la fel de vulnerabile ca în era premergătoare utilizării antibioticelor. Rezistenţa la
toate grupele de antibiotice şi la agenţii chimioterapeutici a apărut paralel cu folosirea pe scară largă a
antibioticelor în clinică şi în creşterea animalelor, ceea ce a făcut ca multe dintre ele să fie ineficiente: de
exemplu, tuberculoza şi alte maladii infecţioase constituie o problemă importantă de sănătate publică, datorită
selecţiei în timp, a tulpinilor rezistente (Rosen şi Barkin, 1992). Bacteriile au evidenţiat o capacitate
remarcabilă de a dezvolta rezistenţa la fiecare antibiotic introdus în clinică, adeseori prin mecanisme
surprinzătoare, care au devenit funcţionale foarte repede. Bacteriile rezistente la un antibiotic pot să
supravieţuiacă şi chiar să se multiplice în prezenţa concentraţiilor terapeutice de antibiotic. Dezvoltarea
rezistenţei este inevitabilă după introducerea în clinică a unui antibiotic nou. Rata apariţiei tulpinilor
bacteriene rezistente la medicamentele noi este de ordinul a 1%. Dar după 8-12 ani de utilizare intensivă a
antibioticelor (în clinica umană şi în zootehnie), tulpinile bacteriene cu rezistenţă multiplă au devenit foarte
frecvente.
Rezistenţa poate fi naturală (intrinsecă) sau dobândită prin intermediul genelor de rezistenţă pe cale
mutaţională sau prin dobândirea genelor exogene.

Rezistenţa naturală

Rezistenţa intrinsecă se referă la bacteriile insensibile la un antibiotic, în stare naturală, fără să


dobândească factori de rezistenţă.Ţinta acţiunii antibioticului este inaccesibilă. Structurile de înveliş ale
celulei bacteriene formează bariere fizice de permeabilitate, care limitează sever difuzia liberă a moleculelor.
Absenţa ţintei celulare de acţiune a antibioticului este o cauză a rezistenţei naturale. Bacteriile din g.
Chlamydia (C. trachomatis produce o uretrită nespecifică, cauză majoră a infertilităţii umane şi produce cele
mai multe cazuri de orbire, comparativ cu oricare alt agent infecţios), nu sunt sensibile la acţiunea inhibitorilor
sintezei peretelui celular (peniciline), deoarece nu au peptidoglican, deşi au enzimele care leagă penicilina
(PBP) necesare sintezei peptidoglicanului.
Impermeabilitatea învelişurilor semnifică faptul că antibioticul nu pătrunde în celulă. Multe bacterii
posedă mecanisme naturale de excludere a moleculelor mici. La bacteriile Gram pozitive, peretele
peptidoglicanic gros şi relativ rigid, nu conferă protecţie faţă de antibiotice. Prin peretele mureinic cu o
porozitate de 1,1 nm, difuzează liber antibioticele cu moleculă mai mică de 1200 Da. Pentru că cele mai multe
antibiotice sunt cel puţin parţial hidrofobe, pot să difuzeze liber prin membrană.
La bacteriile Gram negative, membrana externă este o barieră protectoare eficientă faţă de moleculele
mici, aşa cum sunt antibioticele. Prin difuzia pasivă trec moleculele de apă, O 2, CO2 (molecule mai mici de 0,8
nm), moleculele liposolubile (care se dizolvă în lipidele membranei celulare, ca de exemplu, tetraciclina),
precum şi moleculele organice fără sarcină, până la dimensiunile glicerolului.
Penicilina G a fost primul antibiotic introdus în clinică, dar utilizarea sa este limitată deoarece catena
laterală nu permite trecerea prin membrana externă a bacteriilor enterice Gram negative ( E. coli). Asemănător,
antibioticele macrolide (eritromicina) nu penetrează membrana externă, deşi în sistemele acelulare de E. coli,
eritromicina inhibă la fel de eficient sinteza proteinelor ca şi în sistemele acelulare ale bacteriilor Gram
pozitive.
Inaccesibilitatea ţintei datorită impermeabilităţii unor structuri, aşa cum este membrana externă a
bacteriilor Gram negative, este o rezistenţă pasivă. Dar inaccesibilitatea ţintei poate fi un proces activ: de
exemplu, activitatea pompelor de eflux, dependente de energie, care elimină medicamentul contra unui
gradient de concentraţie.
În vivo, în majoritatea ţesuturilor se realizează concentraţii mici de antibiotice, care diminuă eficienţa
antimicrobiană. Astfel, Haemophilus influenzae se deplasează în interstiţiile tisulare ale gazdei, unde
antibioticele hidrofile mari (gentamicina) nu realizează concentraţii mari.
Un alt aspect interesant al rezistenţei naturale este reprezentat de rezistenţa microorganismelor faţă de
antibioticele pe care le sintetizează. De exemplu, streptomicetele manifestă o rezistenţă intrinsecă faţă de
antibioticele pe care le produc, ca un mecanism de autoprotecţie.
Rezistenţa dobândită
Dobandirea rezistenţei la antibiotice este un proces stadial. Rezistenţa completă nu este conferită
totdeauna de o schimbare imediată a genomului bacterian. Primul stadiu este toleranţa sau capacitatea

86
bacteriei de a supravieţui în prezenţa antibioticului, fără să continue creşterea şi diviziunea. Rezistenţa se
instalează atunci cand bacteriile nu numai că supravieţuiesc, dar se şi multiplică în mediul cu antibiotic.
Toleranţa favorizează dezvoltarea rezistenţei. În condiţiile presiunii selective, tulpinile tolerante, adeseori
devin rezistente.
Rezistenţa la antibiotice are totdeauna un substrat genetic. Bacteriile pot dobândi rezistenţa la un
antibiotic, ca rezultat al mutaţiei unei gene cromosomale care modifică ţinta sau al expresiei unei gene
cromosomale latente. În populaţiile bacteriene, patogene şi saprobionte, se găseşte o rezervă importantă de
gene de rezistenţă. Originea genelor de rezistenţă la antibiotice, ale bacteriilor patogene nu este clară.
Perioada de la începutul tratamentului cu antibiotice (50 - 60 de ani în urmă), până la emergenţa bacteriilor
care exprimă mecanisme eficiente de rezistenţă, este prea scurtă pentru a explica dezvoltarea factorilor de
rezistenţă din proteine celulare, prin mutaţie spontană. Dacă un mecanism de rezistenţă necesită acţiunea
cooperantă a câtorva proteine (de exemplu, rezistenţa la vancomicină), generarea de novo a unui mecanism
complex de rezistenţă a unei bacterii patogene este puţin probabilă.
Majoritatea medicamentelor antimicrobiene sunt derivate din metaboliţii organismelor din sol, în
special fungi şi actinomicete. Toate mecanismele de rezistenţă cunoscute la bacteriile patogene (ARN-
metilaze, transportori de tip ABC = ATP binding cassette, aminoglicozid-fosfotransferaze şi -lactamaze),
deja există la producătorii de antibiotice. Pentru genele care codifică factorii de rezistenţă la antibiotice se
acceptă două origini:
- prin mutaţiile unor gene cu rol în biosinteză, ca de exemplu cele care fosforilează glucidele (kinaze)
şi acetil-transferazele, care au evoluat prin schimbarea substratului asupra căruia acţionează,
modificand şi inactivand antibioticele;
- din genele de rezistenţă existente în mod natural, care probabil au evoluat în mii de milioane de ani
în populaţiile bacteriene din sol, ca modalităţi de protecţie faţă de antibioticele produse de ele însele.

Rezistenţa dobândită prin mutaţii


Cele mai multe studii referitoare la rezistenţa bacteriană s-au concentrat asupra evenimentelor
mutaţionale ale genelor cromosomale. Mutaţia este un proces genetic important prin care este dobandită
rezistenţa la antibiotice. Modificările genetice microevolutive (mutaţiile punctiforme) pot modifica
sensibilitatea organismelor la antibiotice prin modificarea structurală a ţintei. De exemplu, unele
microorganisme îşi modifică enzima β-lactamază prin mutaţie punctiformă şi astfel spectrul de activitate al
enzimei se extinde. Rezistenţa la sulfonamide este consecinţa schimbării unui singur aminoacid în secvenţa
enzimei pteridin-sintetază, care face ca sulfonamidele să se lege mai puţin eficient decât APAB. Asemănător,
o mutaţie punctiformă modifică o proteină ribosomală, ce conferă rezistenţă la streptomicină.
Schimbările genetice macroevolutive implică rearanjarea unor segmente mari de ADN prin
transpoziţie. Dacă schimbările implică deplasarea genelor de rezistenţă şi trecerea lor sub controlul unui nou
promotor, organismul poate deveni rezistent.
În timpul stresului, bacteriile saprobionte şi cele patogene îşi sporesc net rata mutaţiilor, adică devin
hipermutabile. Ele exprimă şi îşi duplică informaţia de supravieţuire, printre care şi genele de rezistenţă la
medicamente, localizate pe plasmide, transpozoni şi integroni. Pe de altă parte, bacteriile au o mare capacitate
de a-şi păstra materialul genetic care le conferă avantaj selectiv-evolutiv şi conservă mutaţiile avantajoase
chiar în prezenţa acţiunii mecanismelor de reparare a ADN, care au tendinţa să le corecteze.
Iniţial s-a presupus că rezistenţa a fost dobândită prin mutaţie spontană. Rezistenţa mutaţională se
numeşte rezistenţă primară. Erorile sintetzei replicative a ADN şi incapacitatea sistemelor de reparare a ADN,
duc la o frecvenţă a mutaţiei spontane de o pereche de baze/107- 1010 celule, ceea ce înseamnă că pentru
fiecare 107- 1010 celule, o singură bază suferă modificare. Dar rata mutaţiei spontane generatoare a rezistenţei
este mai mică, deoarece pentru apariţia rezistenţei primare trebuie să se producă mutaţii multiple. Din această
cauză, s-a considerat că apariţia tulpinilor rezistente la antibiotice prin procese mutaţionale, în timpul terapiei,
este improbabilă. Deşi mutaţia este un eveniment rar, rata foarte rapidă de creştere a bacteriilor, favorizează
exprimarea rezistenţei, relativ repede într-o populaţie celulară. Odată ce gena de rezistenţă prin mutaţie a fost
stabilizată, poate fi transferată direct la toate celulele descendente (fluxul genelor pe verticală).

Rezistenţa plasmidială
Adeseori, izolatele bacteriene au rezistenţă multiplă la antibiotice şi la agenţii chimioterapeutici.
Genele codificatoare ale rezistenţei multiple sunt localizate pe plasmidele de rezistenţă şi pe integroni (tabelul
6).

87
Plasmidele R (de rezistenţă transmisibilă, cu caracter infecţios), descrise de Watanabe (l961), sunt
elemente genetice extracromosomale care conferă celulei purtătoare, rezistenţă simultană la mai multe
antibiotice, la sulfamide, la cationii metalelor grele. El a demonstrat rezistenţa simultană a celulelor de
Shigella (agentul dizenteriei, bacterie Gram negativă, enterică) la mai multe antibiotice, iar rezistenţa s-a
dovedit a fi transmisibilă la celulele tulpinilor sensibile. Plasmidele de rezistenţă s-au identificat la toate
grupele de bacterii şi sunt larg distribuite în natură. Transmiterea rezistenţei multiple la antibiotice, de la o
celulă la alta, este atribuită plasmidei R. Acestea sunt molecule de ADN circulare, dublu catenare, care se
autoreplică fizic independent de cromosom.

Tabelul 6.
Mecanismele moleculare ale rezistenţei mediată de gene plasmidiale sau cromosomale, la diferite
antibiotice (după Brock, 2003)
Antibiotic Mecanismul de acţiune Organisme
Penicilina, ampicilina, carbenicilina, Hidroliza mediată de ß-lactamază Stafilococi, enterococi (rareori),
etc. Enterobacteriacee, pseudomonade,
Bacteroides sp.
Oxacilcina, meticilina, etc. Hidroliză prin ß-lactamaze Enterobacterii, pseudomonade
Cefalosporine ß-lactamază Stafilococi, enterobacterii,
pseudomonade, Bacteroides
Tetracicline Blocarea permeabilităţii Stafilococi, enterococi, streptococi,
enterobacterii, pseudomonade,
Bacteroides
Aminoglicozide : Stafilococi, enterococi,
Streptomicina Acetilare enterobacterii, pseudomonade
Neomicina Fosforilare
Kanamicina Adenilare
Tobramicina
Amikacin
Macrolide- Lincinoide : Alterarea ARN 23S Stafilococi, enterococi, streptococi,
Eritromicina Bacteroides
Clindamicina
Trimetoprim Alterarea DFHR (Dihidrofolat Stafilococi, enterobacteriacee
reductaza)
Sulfonamide Alterarea Tetrahidropteroic-sintetaza Stafilococi, enterococi, streptococi,
enterobacterii, pseudomonade,
Fosfomicina ? Stafilococi, enterobacterii,
Vancomicina Sinteza unei poteine noi Enterococi

Plasmidele R conţin informaţia genetică ce conferă rezistenţă la mai multe antibiotice, la sulfamide
(produşi de sinteză chimică, derivaţi ai acidului paraaminobenzoic) şi la diferiţi agenţi chimici.
Datorită înrudirii chimice dintre diferite familii de antibiotice, o plasmidă conferă rezistenţă simltană,
la un număr mare de antibiotice. Astfel, celula bacteriană devine suprarezistentă, atât calitativ cat şi cantitativ.
Datorită rezistenţei plasmidiale, bacteriile patogene produc infecţii foarte greu de controlat prin mijloacele
terapeutice obişnuite. Plasmidele R au fost evidenţiate la E. coli, Proteus, Salmonella, Pseudomonas, Erwinia,
Yersinia, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium etc, dar sunt foarte importante pentru stafilococi şi alte
bacterii Gram pozitive, la care determină rezistenţa la medicamente.
Plasmidele R au o structură genetică complexă şi sunt alcătuite din următoarele categorii de
determinanţi genetici:
- genele care conferă rezistenţă la antibiotice (genele “r ”);
- genele care conferă plasmidei R, funcţia de conjugon (transferon). Ele sunt grupate într-un
transpozon, formând factorul de transfer al rezistenţei (FTR). Se numesc gene tra şi codifică sinteza
proteinelor necesare transferului plasmidei prin conjugare;
- secvenţe de inserţie;
- secvenţa de iniţiere a procesului de replicare (“ori”);
- genele ce asigură replicarea fizic autonomă, a plasmidei.
Genele “r ” fac parte din structura unor transpozoni (fiind delimitate de secvenţe de inserţie) şi au o
mobilitate foarte accentuată, adică se deplasează dintr-un situs în altul în structura plasmidei sau între
plasmidă şi cromosom. Numărul genelor de rezistenţă într-o plasmidă este variabil. Spre deosebire de
plasmidele F, plasmidele R nu se integrează în cromosomul bacterian.
88
Cele două categorii de determinanţi genetici, de rezistenţă şi de transfer, pot să existe în stare
recombinată sau se găsesc disociaţi în celula bacteriană, ca unităţi de sine stătătoare:
- factorul de transfer al rezistenţei (FTR) ce poartă gene reglatoare ale replicării, genele de transfer şi uneori
gena de rezistenţă la tetraciclina (tet), cu gr.mol. de 11 x l06 Da;
- celălalt component, care conţine genele de rezistenţă la antibiotice şi are dimensiuni foarte diferite, între
câteva milioane - l00 milioane Da.
Cele două plasmide mici se replică autonom.
În celulele de E. coli, cele două plasmide se recombină şi formează o plasmidă mare, care poartă atât
genele de rezistenţă, cat şi pe cele de transfer. În această stare, plasmida R se transmite prin conjugare cu o
frecvenţă foarte mare: l00% dintre celulele sensibile ale unei populaţii celulare ce formează cupluri de
conjugare, primesc o copie a plasmidei R şi devin rezistente (aşa numita rezistenţă infecţioasă sau
transmisibilă). Frecvenţa transmiterii conjugative scade treptat, datorită sintezei unui represor care blochează
activitatea genelor tra şi astfel este inhibată sinteza pilinei şi implicit asamblarea pililor.
Dacă plasmida R nu conţine determinanţii genetici tra (FTR), transferul său se face prin transducţie
mediată de un fag de dimensiuni mari, sau prin conjugare iniţiată de alte plasmide conjugative.
O categorie specială de plasmide sunt cele care răspund la feromoni şi par a fi limitate la enterococi.
Feromonii sunt peptide hidrofobe de 7-8 aminoacizi. Plasmidele sensibile la feromoni codifică rezistenţa la
antibiotice, bacteriocine şi hemolizină. În acest sistem de transfer conjugativ, celulele receptoare secretă o
familie de feromoni peptidici. Celulele unei populaţii bacteriene care poartă o plasmidă particulară, reactivă la
prezenţa feromonilor, răspund prin sinteza unei adezine care facilitează formarea agregatelor de împerechere.
Celulele donoare, purtătoare ale plasmidei, exprimă molecule de suprafaţă cu rol de agregare (adezine), iar pe
suprafaţa celulelor receptoare se găsesc substanţe de legare (Gander, 1998). Celulele care se împerechează,
realizează contacte prin coliziuni aleatorii. Feromonii măresc de 5 - 6 ori rata de transfer a unei plasmide.
După ce celula receptoare a primit o copie a plasmidei, sinteza feromonului corespunzător este
stopată, dar continuă sinteza şi secreţia feromonilor specifici pentru alte plasmide.

Rezistenţa mediată de elementele genetice transpozabile


Secvenţele de inserţie (SI) sunt cele mai simple elemente transpozabile. Ele poartă gena pentru
transpozază, flancată la extremităţi de secvenţele repetate invers (SRI).
Deoarece nu poartă nici o genă care să codifice un caracter detectabil, se pot identifica numai prin
capacitatea lor de a produce mutaţii. Lungimea lor este mai mică de 1000 pb.
Integronii sunt secvenţe de ADN ce conţin determinanţi genetici ai unui sistem de recombinare cu
specificitate de situs. Ei recunosc, înglobează şi astfel mediază deplasarea unor scurte secvenţe mobile de
ADN, denumite casete genice (Recchia şi Hall, l995). Cele mai multe casete genice cuprind o singură genă de
rezistenţă la antibiotice.
Un integron conţine o secvenţă ce codifică integraza şi o secvenţă adiacentă de recombinare(att), care
recunoaşte situsul specific de recombinare. Un integron grupează şi integrează casete genice multiple.
S-au descris 4 clase de integroni (Livermore, 1995):
- integronii clasei I, cei mai comuni, conţin gena de rezistenţă la sulfonamidă (sul I) ;
- integronii clasei a II sunt asociaţi cu Tn7. Celelalte două clase de integroni au o distribuţie foarte limitată.
Frecvent, integronii fac parte din structura unor transpozoni.
O casetă genică poate exista în două forme:
- ca o secvenţă lineară într-un integron;
- ca o moleculă circulară de ADN, dublu catenară, ce poartă l - 2 gene de rezistenţă şi un situs de
recombinare (att) de 59 de nucleotide, cu rolul de a integra caseta genică la situsul specific al
unui replicon.
Secvenţele 5’ şi 3’ care flanchează caseta genică lineară, sunt bine conservate. Regiunea 5’ conţine
gena int, codificatoare a integrazei, o enzimă de recombinare la situs specific, iar la capătul 3’ se găseşte gena
de rezistenţă la un antibiotic.
Integrarea unei casete genice într-un replicon este reversibilă. Caseta excizată se integrează în alt
replicon. Prin intermediul casetelor genice, complementul genelor de rezistenţă poate fi mereu rearanjat şi
deplasat de pe un replicon pe altul.
Integronii sunt sisteme de diseminare a genelor bacteriene, distincte de plasmide şi de EGT.
Integronii se găsesc aproape exclusiv la bacteriile Gram negative şi mediază rezistenţa multiplă la
antibiotice (MDR): aminoglicozide, peniciline, cefalosporine, trimetoprim, tetraciclină, eritromicină,
cloramfenicol.

89
Cei mai comuni sunt integronii asociaţi cu gena de rezistenţă la sulfonamidă (sul I), care poartă cel
puţin 60 de casete genice ce conferă rezistenţă la antibiotice şi cei asociaţi cu Tn7.
Rezistenţa multiplă la antibiotice şi la agenţii chimioterapeutici poate fi datorată diminuării sintezei
porinelor, diminuării permeabilităţii sau expresiei pompelor de eflux, care au specificitate relativ largă de
substrat.
Transpozonii sunt segmente de ADN mobile (cu potenţial de transpoziţie), care includ în alcătuirea
lor, o serie de gene structurale, delimitate la extremităţi de SI, totdeauna repetate în ordine inversată. Mărimea
lor variază între 2.l00 – 9.300 pb.
Primii transpozoni, determinanţi ai instabilităţii genetice a culorii seminţelor de porumb, au fost
descoperiţi de către Barbara McClintock, prin experienţe din anii ’40, înainte de elucidarea structurii ADN. În
anii ’60 a devenit evident că sistemele genetice bacteriene, ca şi cele eucariote, au un grad înalt de
instabilitate. Emergenţa şi răspândirea fenomenului de rezistenţă la antibiotice a amplificat studiul substratului
său genetic.
Din punctul de vedere al structurii genetice, Tn simpli sunt asemănători cu SI, dar se deosebesc de
acestea prin faptul că în secvenţa centrală, poartă gene a căror expresie fenotipică este decelabilă şi conferă
proprietăţi noi celulei purtătoare (de exemplu, gene de rezistenţă la Km, Cm, Tc etc.). Genele structurale sunt
flancate de secvenţe repetate lungi (l-2 kb), cel mai adesea în ordine inversată. Secvenţele inversate conferă o
stabilitate superioară structurii Tn.
Transpozonii complecşi – grupaţi în familia Tn1, au până la 20 kbp, dar au fost descrişi alţii mult mai
mari (80 kb). Se disting de transpozonii simpli prin aceea că atât secvenţele de transpoziţie cat şi secvenţele
specifice sunt flancate de SRI scurte (40 pb), ca şi IS.
Majoritatea transpozonilor sunt rezidenţi în ADN plasmidial sau în ADN fagic. Mai puţini
transpozoni sunt rezidenţi în cromosomul bacterian.
Transpozonii sunt secvenţe genetice mobile: se deplasează între plasmide şi cromosom, trec de pe o
plasmidă pe alta sau transpozează între diferite situsuri ale aceleiaşi plasmide. Interesul pentru studiul
transpozonilor s-a amplificat odată cu descoperirea faptului că genele de rezistenţă la antibiotice pot să treacă
de la un replicon la altul. De exemplu, gena pentru β-lactamază este foarte mobilă, trecând cu uşurinţă de pe o
plasmidă pe alta, ceea ce explică răspândirea largă a rezistenţei bacteriene la antibioticele β-lactamice.
Relocarea Tn duce la instabilitate genetică, asociată cu modificări fenotipice, dacă transpoziţia are ca
rezultat inserţia unui element Tn într-o genă structurală. Dacă transpoziţia are loc într-o genă reglatoare, o
genă care în mod normal este represată, poate fi exprimată constitutiv şi la un nivel superior celui obişnuit.
Unele elemente transpozabile poartă secvenţe promotoare mai puternice şi pot influenţa expresia genelor din
aval de situsul de inserţie, producând mutaţii polare.
Unele gene de rezistenţă (TEM-β-lactamaza) s-au găsit atât pe plasmide cât şi pe cromosom, la o
largă varietate de bacterii. Datorită capacităţii de transpoziţie şi inserţie, transpozonii sunt factori majori ai
reorganizării informaţiei genetice şi în consecinţă, pentru aglomerarea câtorva gene de rezistenţă într-o
singură plasmidă. Structura genetică şi mobilitatea fac ca rezistenţa multiplă la antibiotice să fie foarte
probabilă. Transpoziţia este o cale uşoară şi eficientă pentru transferul concomitent al rezistenţei la câteva
antibiotice.
Pentru ca un element transpozabil să transpozeze ca o entitate de sine stătătoare, este necesar ca
transpozaza (o endonuclează) să recunoască extremităţile sale, caracterizate prin prezenţa secvenţelor repetate
invers (SRI).
Astfel, dacă un transpozon are la o extremitate secvenţa
5’AAAACCCGGT3’
3’TT TTGGGCCA5’,
la celălalt capăt va avea secvenţa 5’ACCGGGTT TT 3’
3’TGGCCCAAAA5’.
Secvenţele repetate invers au rolul de situsuri de recunoaştere pentru transpozază, enzima ce
catalizează procesul de transpoziţie.
ADN cromosomal şi plasmidial bacterian posedă un mare rezervor de gene de rezistenţă, ce codifică
diferite mecanisme de rezistenţă la medicamente: pompe de eflux, enzime inactivatoare ale antibioticelor,
modificarea ţintei acţiunii antibioticului.
Rezistenţa dobândită prin transferul orizontal al genelor

90
Dezvoltarea largă a rezistenţei multiple la multe specii de bacterii, a condus la presupunerea că există
şi alte mecanisme pentru dobandirea rezistenţei (Kruse si colab., 1994). Evaluarea ratei de apariţie a
mutantelor rezistente la antibiotice trebuie să ţină seama de doi factori: 
- fluxul genetic la bacterii este mult mai amplu decât la celelalte organisme şi rata transferului pe
orizontală este net superioară ratei de apariţie şi selecţie a mutantei. Bacteriile fac schimb de
informaţie genetică, depăşind barierele de specie, ceea ce permite ca o genă de rezistenţă existentă în
populaţia bacteriană să se transmită cu o rată înaltă de la o celulă la alta;
- antibioticele se folosesc pe scară largă şi expunerea bacteriilor este multiplă (repetată). Lumea vie
trăieşte într-o adevărată “mare de antibiotice”, ceea ce conferă bacteriilor un avantaj selectiv continuu.
În 1991 s-au folosit peste 50 de peniciline, 70 cefalosporine, 12 teracicline, 8 aminoglicozide, 1
monobactam, 3 carbapenemi, 9 macrolide, 2 noi streptogramine şi 3 inhibitori ai dihidrofolat-
reductazei.
Una dintre căile majore prin care bacteriile devin rezistente este dobândirea ADN exogen pe
orizontală. Schimbul genetic pe orizontală semnifică transferul informaţiei genetice între celulele bacteriene,
pe alte căi decât prin diviziune. ADN exogen poate fi dobândit prin transferul genelor prin conjugare între
speciile bacteriene diferite, pe calea plasmidelor care de obicei poartă gene multiple de rezistenţă la
antibiotice. Unele bacterii sunt în mod natural competente pentru a prelua ADN nud din mediul extern şi pot
să dobandească gene de rezistenţă pe calea mecanismului transformării genetice. Alteori, genele de rezistenţă
sunt transferate de fagi prin mecanismul transducţiei (fig. 26).

Figura 26. Reprezentarea schematică a mecanismelor de transfer al informaţiei genetice între celulele bacteriene
(original).

Fluxul genic pe verticală semnifică transmiterea informaţiei genetice în generaţiile succesive de


celule, odată cu diviziunea. Schimbul pe orizontală semnifică transferul informaţiei genetice între celulele
bacteriene, pe alte căi decât prin diviziune. Schimbul genetic orizontal reprezintă mecanismul primar al
evoluţiei rezistenţei la antibiotice şi se realizează prin conjugare, transformare sau transducţie.
Conjugarea este transferul ADN de la o celulă donoare la cea receptoare, prin contact celular direct,
mediat de un complex multiproteic specializat, denumit aparat de conjugare. La bacteriile Gram negative,
contactul fizic este realizat prin intermediul unor structuri filamentoase extracelulare, denumite pili.
S-au descris două tipuri de structuri genetice conjugative: plasmide conjugative şi elemente
conjugative cromosomale denumite transpozoni conjugativi.
Transpozonii conjugativi sunt molecule mobile de ADN, care codifică toate funcţiile necesare pentru
transpoziţia intracelulară, dar şi pentru conjugare intercelulară. Se găsesc la o largă varietate de bacterii Gram
pozitive (Tn 916, la Enterococcus faecalis) şi Gram negative (Tn 455, cu gena de rezistenţă la tetraciclină, la
Bacteroides) şi sunt importanţi pentru diseminarea genelor de rezistenţă la antibiotice. Frecvenţa de transfer a
transpozonilor conjugativi este între 10-4 - 10-9.
Transpozonii conjugativi au un situs de origine a transferului conjugativ – ori T, la care ADN este
incizat, pentru a iniţia transferul unei molecule de ADN monocatenar.
Ca mecanism general al transferului conjugativ mediat de transpozoni sau de plasmide, ADN
transferabil (plasmidial sau al unui transpozon cojugativ) al celulei donoare, care poate să conţină gena R, este
91
incizat monocatenar. Catena incizată este transferată sub formă monocatenară în celula receptoare, pe măsură
ce este copiată în celula donoare după mecanismul cercului rotativ. În celula receptoare, catena transferată este
copiată într-o catenă complementară şi se formează o moleculă dublu catenară lineară. Capetele moleculei
lineare sunt ligaturate şi se formează o moleculă circulară, închisă covalent.
Transferul genelor prin conjugare este supus unor restricţii, care au avut rol important în evoluţia
rezistenţei. Prima barieră este constituită de structurile de suprafaţă ale celor două celule, a doua restricţie
derivă din faptul că ADN-ul exogen este sensibil la enzimele de restricţie, iar a treia din faptul că plasmida
transferată poate fi incapabilă să se replice în noua gazdă.
La majoritatea bacteriilor Gram pozitive nu s-au identificat căile de realizare a contactului intercelular
şi de transfer conjugativ al ADN.
Problema centrală a conjugării bacteriene este înţelegerea modalităţii în care ADN traversează
învelişurile celor două celule. Modelul acceptat presupune existenţa a două complexe proteice codificate de
gene plasmidiale şi cromosomale (Grohmann, 2003):
- un complex proteic – relaxosomul, se asociază cu originea de transfer a plasmidei (ori T), incizează
una dintre cele două catene, consecinţa directă şi imediată fiind despiralizarea ADN (relaxarea);
- complexul proteic de cuplare condiţionează formarea perechilor celulare donor-receptor (complexul
mpf = mating pair formation), codificat de plasmidă şi implicat în transferul catenei de ADN de la
donor la receptor.
Relaxazele ADN sunt enzime esenţiale pentru iniţierea transferului conjugativ şi acţionează prin
cataliza clivării unei legături fosfodiester la situsul nic (nicking = clivare) localizat la originea de transfer
(ori T).
Transferul conjugativ al genelor de rezistenţă la bacteriile Gram pozitive
Diferenţele majore dintre conjugarea bacteriilor Gram negative şi Gram pozitive constau în
mecanismele prin care se stabileşte contactul intercelular, o etapă preliminară obligatorie pentru iniţierea
transferului conjugativ.
Proteinele esenţiale pentru realizarea transferului conjugativ al plasmidelor sunt relaxazele ADN. La
toate sistemele cojugative studiate, se acceptă că din celula donor se transferă în celula receptor, o singură
catenă de ADN. Generarea unui intermediar plasmidial monocatenar transferabil este consecinţa acţiunii
ADN-relaxazei, care clivează legătura fosfodiesterică a unui dinucleotid specific la situsul nic.
Plasmidele cu spectru larg de gazdă, identificate la streptococi şi enterococi, se transferă prin
conjugare cu o frecvenţă variabilă de 1/10 3 - 106 (un eveniment de conjugare la 10 3 - 106 celule), în funcţie de
plasmidă şi de genotipul celor două celule ale cuplului. Ele conferă rezistenţa la macrolide, lincosamide şi
streptogramina B.
Plasmidele identificate la stafilococi au spectru îngust de gazdă (par a fi limitate numai la stafilococi).
Formarea perechilor de conjugare necesită cocultivarea celulelor donor şi receptor pe o suprafaţă solidă.
Ambele grupe de plasmide conjugative conferă rezistenţă la un spectru larg de antibiotice
Din punct de vedere funcţional, aparatul de transfer conjugativ, alături de sistemele de secreţie ale
câtorva patogeni, de sistemele de transformare naturală şi de sistemul de secreţie a fagilor filamentoşi,
alcătuiesc sistemul de secreţie de tip IV.
Proteinele de cuplare (mpf = mating pair formation) formează familia proteinelor de transfer (Tra) şi
probabil au rol de orientare a moleculei prin canalul de transfer.
Conjugarea are un rol major în răspândirea rezistenţei bacteriilor la antibiotice. Procesul implică
contactul celular direct al celor două celule bacteriene şi transferul ulterior al ADN. Conjugarea are un
caracter pronunţat de promiscuitate, deoarece poate să se producă între specii neînrudite şi chiar între genuri
diferite. Din această cauză, rezerva genică disponibilă pentru schimb, este foarte mare.
Rezistenţa la antibiotice se transmite mai uşor dacă genele sunt transferate la celule sensibile, iar
ADN exogen este mai stabil în noua gazdă, dacă conţine mai puţine situsuri de restricţie.
Conjugarea este cea mai comună cale de transmitere a genelor de rezistenţă.
Transformarea genetică constă în preluarea de către celula bacteriană, a unui fragment de ADN
exogen. ADN trebuie să străbată învelişurile celulei şi să fie integrat în cromosomul celulei gazdă, prin
recombinare omologă. În procesul recombinării omologe, o parte a cromosomului este înlocuită de ADN
omolog. Ca şi în conjugare, enzimele de restricţie-modificare au rol important în transformare. Pentru că ele
generează fragmente mai mici, pot să crească şansa recombinării fragmentelor încorporate.
Recombinarea intragenică. Fragmentele mici de ADN încorporate din mediul extern favorizează
recombinarea intragenică şi astfel rezultă gene mozaic. Genele mozaic conţin ADN din alela originală, dar şi

92
ADN din alte gene sau chiar din alte organisme. Majoritatea genelor mozaic se pierd, dar unele pot să
exprime un fenotip ce favorizează supravieţuirea organismului, deoarece codifică proteine cu proprietăţi noi:
de exemplu, gena care codifică o PBP alterată, cu afinitate mică pentru antibioticele β-lactamice. O astfel de
genă favorizează toleranţa faţă de antibioticul din mediu şi celula purtătoare este favorizată de selecţie.
Rezistenţa încrucişată semnifică fenomenul prin care dobândirea unui singur mecanism de rezistenţă,
conferă rezistenţă la o clasă întreagă de antibiotice. De exemplu, rezistenţa S. aureus la meticilină, conferă
rezistenţă la toate antibioticele β-lactamice şi cefalosporine. Dar rezistenţa încrucişată nu este totdeauna o
regulă: P. aeruginosa rezistentă la kanamicină rămâne sensibilă la antibiotice asemănătoare (gentamicina).
Dacă mecanismul rezistenţei este nespecific, aşa cum sunt pompele de eflux, poate conferi rezistenţă
încrucişată la o varietate largă de medicamente.
Co-rezistenţa semnifică activitatea simultană a câtorva mecanisme de rezistenţă, la acelaşi organism
(Ballows, 1991). Co-selecţia se referă la selecţia genelor multiple de rezistenţă la antibiotice şi apare când
genele de rezistenţă sunt componente ale aceluiaşi operon şi deci sub controlul aceluiaşi promotor.
Cunoaşterea mecanismelor moleculare de rezistenţă la antibiotice este necesară pentru a lupta cu succes
împotriva bacteriilor rezistente sau multirezistente.
Rezistenţa naturală are ca suport genetic cromosomul bacterian. Evenimentele genetice implicate în
rezistenţa dobândită pot fi mutaţiile, afectând gene prezente pe cromosomul bacterian.

Originea genelor de rezistenţă

Bacteriile pot dobândi rezistenţa la un antibiotic, ca rezultat al mutaţiei unei gene cromosomale sau al
expresiei unei gene cromosomale latente.
Unele gene de rezistenţă au apărut prin mutaţii întâmplătoare care au furnizat un avantaj selectiv
celulelor purtătoare (Dixon, 2000). În populaţiile bacteriene, patogene şi saprobionte, se găseşte o rezervă
importantă de gene de rezistenţă, care au două origini:
- prin mutaţiile unor gene, ca de exemplu cele care fosforilează glucidele (kinaze) şi acetil-
transferazele, care au evoluat prin schimbarea substratului acţiunii, modificând şi inactivând
antibioticele ;
- genele de rezistenţă existente în mod natural, care probabil au evoluat în mii de milioane de ani în
populaţiile bacteriene din sol şi ape, ca modalităţi de protecţie faţă de antibioticele produse de ele
însele. În aceste medii bacteriile trebuie să intre în competiţie cu microorganisme producătoare de
antibiotic: fungi, actinomicete (actinobacterii). Ele trebuie să aibă un anumit nivel de rezistenţă,
pentru a supravieţui în mediul natural.
Genele de rezistenţă la antibioticele β-lactamice s-au descoperit înainte de descoperirea antibioticelor
însăşi. De exemplu, s-a descoperit că o tulpină de S. aureus izolată înainte de descoperirea antibioticelor şi
păstrată în colecţie, sintetizează β-lactamaza. Se consideră că lizozimul din secreţia nazală a exercitat o
presiune selectivă care a favorizat selecţia celulelor rezistente la antibiotice (Brock şi colab., 1998). S-a
presupus că bacteriile care formează microbiota normală a tractului digestiv, pot avea rol de rezervor de gene
de rezistenţă, ce pot fi transferate la bacterii ca Enterococcus faecalis, component al microbiotei normale a
colonului, dar şi la S. aureus şi Streptococcus ce colonizează orofaringele. Gena tetO s-a identificat la unele
tulpini de Lactobacillus ce colonizează tractul vaginal. Acestea sunt argumentele în favoarea ipotezei
transferului orizontal între membrii microbiotei normale şi bacteriile patogene, ce poate avea loc în anumite
micronişe ale organismului. Bacteriile care sintetizează tetracicline, trebuie să se protejeze de antibioticul pe
care-l produc. Genele de rezistenţă la antibiotice sunt frecvent localizate în acelaşi fragment de restricţie cu de
genele pentru producerea antibioticului.

4.6. Mecanismele moleculare ale rezistenţei microoganismelor la antibiotice

Efectul antibioticelor şi al agenţilor chimici antimicrobieni poate fi contracarat prin mai multe
mecanisme, unele mecanisme sunt intrinsece bacteriei; alte mecanisme rezultă din mutaţiile genelor ce
codifică pentru structurile ţintă sau din dobândirea genelor ce modifică sau hidrolizează antibioticele (fig. 27).

93
Figura 27. Ilustrarea schematică a principalelor mecanisme care determină rezistenţa la antibiotice. Genele
plasmidiale de rezistenţă codifică sinteza proteinelor de eflux, enzimele care degradează antibioticul sau enzimele care
modifică structura antibioticului (după Yim, 2006).

Inactivarea enzimatică a antibioticelor

Inactivarea enzimatică a medicamentului este cel mai comun mecanism prin care se naşte rezistenţa la
o varietate largă de tipuri structurale de antibiotice. Genele codificatoare ale enzimelor ce inactivează
diferitele antibiotice se găsesc în rezerva naturală de gene de rezistenţă: bacteriile din sol care trăiesc în
proximitatea organismului producător de antibiotic, pot să producă enzime inactivatoare ale antibioticului.
Genele ce codifică sinteza enzimelor inactivatoare pot fi transferate prin conjugare mediată de plasmide, ceea
ce explică frecvenţa înaltă la tulpinile bacteriene supuse presiunii selective a antibioticelor. Antibioticele pot fi
inactivate prin clivaj enzimatic sau prin modificare chimică, astfel încât ele nu mai sunt transportate în celulă
sau nu mai interacţionează cu ţinta specifică.
Modificarea chimică poate conferi rezistenţă clinică la aminoglicozide, cloramfenicol, peniciline,
cefalosporine. β-lactamazele catalizează hidroliza ciclului β-lactamic (Bachmann şi colab., 1998), iar acetil-
transferazele transferă un grup acetil de la un donor la un grup funcţional al antibioticului, convertindu-l la
forma sa inactivă. Unele bacterii patogene Gram pozitive (stafilococi, enterococi) posedă o enzimă
bifuncţională, care inactivează aminoglicozidele: enzima are activitate acetil- şi fosfotransferază. Cele două
gene au fost dobândite din surse diferite. Ulterior, cele două gene au fuzionat şi au generat o genă hibridă, cu
distribuţie largă la stafilococi şi enterococi.
Efluxul activ al antibioticelor
ADN cromosomal şi plasmidial bacterian posedă un mare rezervor de gene de rezistenţă, ce codifică
diferite mecanisme de rezistenţă la medicamente: pompe de eflux, enzime inactivatoare ale antibioticelor,
modificarea ţintei acţiunii antibioticului.
Celulele bacteriene şi eucariote au o varietate de sisteme de transport membranar, care îndeplinesc
funcţii vitale: înglobarea nutrienţilor esenţiali, eliminarea compuşilor toxici, menţinerea homeostaziei
celulare. Identificarea sistemelor de transport, al căror număr este într-o continuă creştere, se datorează
utilizării tehnicilor de clonare genică şi secvenţiere (Paulsen, 1996). S-au identificat numeroase proteine de
transport membranar (de ordinul sutelor), care au funcţii fiziologice importante, dar funcţionează şi pentru
eliminarea substanţelor toxice din celulă.
Efluxul transmembranar al antibioticelor este un mecanism foarte eficient al rezistenţei. De exemplu,
în celulele neoplazice umane, rezistenţa la agenţii chimioterapeutici antitumorali este mediată în mod obişnuit
de pompa de eflux reprezentată de glicoproteina P, iar la bacteriile patogene, rezistenţa la antibiotice şi
antiseptice se datorează frecvent, eliminării medicamentului. Sistemele de rezistenţă prin flux sunt dependente
de energie şi pot fi sisteme de transport activ primare sau secundare. Pompele de eflux pot fi specifice pentru
un anumit medicament (de exemplu, transportorul TetB la E. coli, elimină tetraciclina şi un spectru îngust de
analogi structurali) sau transportă o largă varietate structurală de medicamente şi de aceea s-au numit pompe
94
cu funcţie transportoare multiplă. Specificitatea de acţiune a transportorilor de eflux este variabilă: majoritatea
transportorilor, inclusiv determinanţii efluxului de tetraciclină, au un spectru îngust de acţiune, iar pompele de
tip MDR (rezistenţă multiplă = multi drug resistance) exportă compuşi chimici cu structură chimică
heterogenă.
Sistemele de eflux multiplu au o semnificaţie clinică majoră: dobndirea unui astfel de sistem scade
sensibilitatea la un spectru larg de agenţi chimioterapeutici. Cea mai bine caracterizată pompă de eflux
multiplu este glicoproteina P, care conferă rezistenţa la un spectru larg de medicamente citotoxice prin
exportul dependent de ATP. Bacteriile exprimă şi îşi duplică informaţia de supravieţuire, printre care şi
genele de rezistenţă la medicamente, localizate pe plasmide, transpozoni şi integroni. Rezistenţa mediată de
pompele membranare de eflux a fost evidenţiată iniţial, la o tulpină de E. coli, rezistentă la tetraciclină.
Transportorii membranari, cu rol de pompe de eflux, pot fi transportori primari de tipul ABC (ATP-
binding cassete) şi utilizează energia rezultată din hidroliza ATP, iar transportorii secundari folosesc ca sursă
de energie, gradientul chimic transmembranar (forţa proton-motrice) (fig. 28).

Figura 28. Reprezentarea schematică a transportorilor primari multipli de tip ABC (A) care utilizează ATP ca sursă
de energie şi a celor de tip secundar (B) care expulzează antibiotice cu structuri chimice diverse. Efluxul este cuplat cu
schimbul de protoni sau ioni de Na (după Putman si colab., 2000).

Toate proteinele de eflux dependente de ATP aparţin suprafamiliei ABC, cunoscute şi sub denumirea
de ATP-aze de trafic. În general, transportorii de tip ABC au o structură moleculară alcătuită din 4 domenii:
- două domenii membranare foarte hidrofobe, care formează 6 helixuri transmembranare
- două domenii care leagă nucleotidele (NBD = nucleotid binding domains).
Cei mai mulţi transportori de medicamente de tip ABC mediază exportul specific al antibioticelor.
Primul transportor bacterian din clasa ABC s-a identificat la Lactococcus lactis: este o proteină membranară
de 590 aminoacizi, cu domeniul hidrofob la capătul N-terminal şi domeniul hidrofil la capătul C-terminal,
care conţine caseta ce leagă ATP (fig. 29).

95
Figura 29. Reprezentarea schematică a transportorilor multipli de medicamente (multidrug) din suprafamilia ABC
(după Putman si colab., 2000).

Primele proteine identificate ca transportoare ale medicamentelor au fost pompele de eflux pentru
tetraciclină, care conferă rezistenţa bacteriilor Gram pozitive şi Gram negative.
Glicoproteina P aparţine familiei de transportori de tip ABC (ATP Binding Cassette).

4.7. Sisteme de eflux multiplu dependente de forţa proton-motrice

Ulterior s-a identificat un număr mare de proteine de transport, care conferă rezistenţă multiplă la
medicamente (MDR = Multidrug Resistance), implicate în exportul unei mari diversităţi de compuşi chimici
antimicrobieni, neînrudiţi din punct de vedere structural.
Determinanţii MDR pot să contribuie la emergenţa microorganismelor rezistente prin două
mecanisme:
- conferă protecţie celulei la o concentraţie scăzută a agentului antimicrobian, favorizând
supravieţuirea acesteia ;
- conferă protecţie faţă de concentraţii mari ale multor compuşi antimicrobieni.
Pompele de tip MDR exportă nu numai substanţe antimicrobiene cu moleculă mică, dar şi substanţe
bactericide produse de organismul gazdă, ca de exemplu peptidele cationice antimicrobiene.
Pompele membranare de eflux din membrana celulelor bacteriene au un corespondent structural şi
fiziologic în celula eucariotă, reprezentat de glicoproteina P, care poate conferi rezistenţă la concentraţii mari
de agenţi chimici antitumorali.
Transportorii multipli conferă rezistenţă multiplă şi utilizează gradientul electrochimic
transmembranar al protonilor, sau uneori al ionilor de Na+, pentru a elimina medicamentul. Acestea sunt
exprimate la organismele saprobionte şi patogene de tip sălbatic, care nu au venit în contact cu antibioticele
(înainte ca efluxul semnificativ al agentului antimicrobian să se producă), dar funcţionează la un nivel
semnificatv mai înalt la organismele rezistente (Westbrock, 1999). Existenţa sistemelor de eflux, atât la
bacteriile patogene cât şi la cele saprobionte, sugerează că genele de rezistenţă sunt colectate cu aceiaşi rată.
Pompele de eflux conferă avantaj celulei, ceea ce explică conservarea genelor şi diseminarea largă în
populaţiile bacteriene (fig. 30).

96
Transportorii multipli secundari sunt sensibili la agenţii care perturbă forţa proton-motrice, ceea ce
sugerează faptul că ele mediază eliminarea compuşilor toxici din celulă, în schimbul protonilor.

Figura 30. Extruzia antibioticelor hidrofobe în spaţiul extracelular prin intermediul transportorilor multipli (multidrug)
(după Putman si colab., 2000).

Pe baza dimensiunilor, asemănărilor şi structurii primare şi secundare, transportorii secundari care


conferă rezistenţă multiplă la medicamente pot fi împărţiţi în familii distincte:
- familia moleculelor mari (MF = Major Facilitator)
- familia moleculelor mici (SMR = Small Multidrug Resistance)
- familia moleculelor de Rezistenţă-Nodulare-Diviziune celulară (RND)
- familia moleculelor de rezistenţă multiplă şi de eliminare a compuşilor toxici (MATE).
Moleculele acestor familii au rolul nu numai de a exporta medicamentele, ci sunt implicate şi în alte
procese fiziologice de transport, dependente de forţa proton-motrice.
Familia proteinelor mari de transport (MF) este reprezentată de peste 300 de proteine membranare,
fiecare cu specificitate pentru o clasă de compuşi: glucide, anioni organici şi anorganici. Ele se găsesc atât în
membrana bacteriilor, cât şi la eucariotele superioare. Sunt molecule alcătuite dintr-un singur polipeptid, care
transportă numai molecule mici ca răspuns la gradienţii chemoosmotici. Sunt molecule care îndeplinesc
funcţii fiziologice importante: uniport, simport şi antiport pentru monozaharide, oligozaharide, pentru
intermediarii ciclului Krebs, esteri ai fosfaţilor şi pentru antibiotice (fig. 31, 32).
Proteinele de eflux care conferă rezistenţă sunt molecule mari care pot fi divizate în familii distincte:
cu 12 şi respectiv cu 14 domenii transmembranare (Putman, 2000).

Figura 31. Reprezentarea schematică a transportorilor multipli din familia MFS- model structural cu 14 domenii
segmente transmembranare (TMS) (după Putman si colab., 2000).

97
Figura 32. Reprezentarea schematică a transportorilor multipli din familia MSF- model strucutural cu 12 segmente
transmembranare (după Putman si colab., 2000).

Cel mai cunoscut transportor MDR cu 14 segmente transmembranare este proteina Qac de la
Staphylococcus aureus, funcţională ca sistem uniport, simport sau antiport a unei varietăţi mari de substanţe,
prin membrană (Fig. 16).
Transportorii MDR cu 12 domenii transmembranare sunt ilustraţi de proteina Nor A la St. aureus,
descoperită la o tulpină rezistentă la quinolone şi la meticilină (Fig. 17). Nor A este o proteină membranară de
388 aminoacizi ce conferă rezistenţa la compuşii hidrofili şi rezistenţă scăzută sau absenţa rezistenţei la
medicamentele hidrofobe. Nor A este un transportor multiplu adevărat, deoarece mediază rezistenţa la o
varietate de medicamente diferite structural.
Familia moleculelor mici de rezistenţă (SMR – Small Molecule Rezistence) multiplă la medicamente
cuprinde cele mai mici proteine cunoscute de eflux secundar: au circa 105-107 resturi de aminoacizi (Putman
şi colab., 2000).Catena polipeptidică formează numai 4 segmente transmembranare. Se crede că aceste
pompe mici de eflux multiplu funcţionează ca homooligomeri, alcătuiţi probabil din 3 monomeri (fig. 33).

Figura 33. Reprezentarea schematică a transportorilor multipli din familia SMR (după Putman şi colab., 2000).

Familia moleculelor mici de eflux constă din două subfamilii filogenetice:


- cele care conferă MDR pe calea unui mecanism antiport medicament : protoni (H+), ca şi proteinele
de rezistenţă ale familiei MF;
- cele care nu conţin permeaze cu specificitate de medicament, ci numai pompe de eflux de tip MDR:
de exemplu, QacC ce conferă rezistenţa la compusul quaternar de amoniu la Staphylococcus (Paulsen,
1996).
Moleculele familiei de rezistenţă-nodulare-diviziune celulară (RND), din punct de vedere funcţional,
aparţin la 3 subfamilii specific-bacteriene (fig. 34):
- unele catalizează transportul antiport medicament : H+ , sau pot fi specifice pentru ionii bivalenţi ai
metalelor grele;
- altele au specificitate pentru lipooligozaharide
98
- cele din grupul al III-lea catalizează efluxul medicamentelor multiple.

Figura 34. Reprezentarea schematică a transportorilor multipli din familia RND (după Putman si colab., 2000).

Deoarece transportorii de eflux pompează substanţele prin membrana citoplasmatică şi prin spaţiul
periplasmic al bacteriilor Gram negative, o punte proteică reprezentată de o proteină de fuziune membranară,
traversează acest spaţiu şi transferă moleculele porinelor membranei externe, care le elimină în spaţiul
extracelular. Proteinele de eflux din familia RND au 12 domenii transmembranare.
Sistemele de eflux multiplu din familia RND au o specificitate de substrat mult mai largă decât
proteinele de eflux multiplu de tipul sistemului facilitator (MFS) sau al moleculelor mici (SMR).
Familia proteinelor de eliminare a medicamentelor şi a compuşilor toxici (MATE) s-a descris la
Vibrio parahaemolyticus pentru efluxul norfloxacinei (Nor M). Nor M este dependent de energie şi mediază
rezistenţa la coloranţi, fluoroquinolone hidrofile şi aminoglicozide. Toate cele 4 familii de molecule de
transport secundar (MFS, SMR, RND şi MATE) sunt dependente de gradientul electrochimic transmembranar
al protonilor - forţa proton motrice - sau posibil, al ionilor de Na.
Transportul e- la O2, aparent produce H2O, dar de fapt, prin disocierea H2O, produce H+ şi OH- care se
concentrează pe cele două feţe ale membranei.
Diferenţa de pH şi de potenţial electrochimic de pe cele două feţe determină o stare energizată a
membranei, asemenea unei baterii, care se măsoară în volţi şi se exprimă ca forţă proton motrice.
Forţa proton-motrice rezultă dintr-un gradient chimic transmembranar de protoni, acid pe faţa externă
a membranei, alcalin pe faţa internă şi un potenţial electric, pozitiv pe faţa externă şi negativ pe faţa internă a
membranei.
Transportorii primari de rezistenţă multiplă dependenţi de ATP sunt proteine din categoria ATP-
azelor de trafic. Cei mai mulţi transportori din această categorie mediază exportul specific al antibioticelor.
Atât transportorii primari (cei care leagă ATP), cât şi cei secundari elimină din celulă o mare varietate
de compuşi toxici. Substraturile pe care le leagă sunt heterogene din punct de vedere structural, dar au
caracteristici fizice comune: sunt molecule hidrofobe, amfifile şi au sarcină pozitivă sau sunt neutre. Aceste
caracteristici permit substraturilor transportate să se intercaleze în membrană, ceea ce a dus la ipoteza că
transportorii multipli preiau şi transportă moleculele din dublul strat lipidic şi nu din faza apoasă a
citoplasmei.
Pompele de eflux care conferă rezistenţă multiplă la antibiotice creează dificultăţi mari în tratamentul
maladiilor infecţioase. Rolul nativ al sistemelor de eflux este apărarea celulei de compuşii toxici exogeni.
99
Alteori, sistemele de eflux multiplu par să îndeplinească funcţii primare, nelegate de rezistenţa la
medicamente. Ele transportă medicamente multiple numai în situaţii speciale.

Rezistenţa prin impermeabilitatea porinelor

Antibioticele policationice din grupul polimixinei se complexează avid cu LPS şi dezorganizează


membrana externă, mărind permeabilitatea pentru agenţii cu acţiune asupra membranei sau componentelor
citoplasmatice. Toţi agenţii policationici se leagă de LPS anionice, cu o afinitate variabilă (Bryan, 1984).
Bacteriile Gram negative sunt rezistente la detergenţii anionici şi neutri, dar sunt sensibile la detergenţii
monocationici. Agenţii chelatori ai ionilor de Ca 2+ şi Mg2+ dezorganizează şi permeabilizează membrana
externă. În general, barierele fizice de permeabilitate produc rareori fenomene de rezistenţă semnificativă,
deoarece nici cele mai eficiente bariere nu pot stopa complet difuzia liberă a moleculelor mici. Scăderea ratei
influxului, ca mecanism posibil al emergenţei rezistenţei, a fost argumentat de concentraţia intracelulară mică
a cloramfenicolului.
Bacteriile Gram negative pot dobândi rezistenţă înaltă ca rezultat al mutaţiilor care modifică porinele
şi astfel rata difuziei pasive a medicamentului scade foarte mult. Influxul mediat de porine este contracarat de
efluxul activ. Structura moleculară, dar în special datele experimentale, sugerează că antibioticele mici ( β-
lactamice, tetraciclina, cloramfenicolul, fluoroquinolonele) pătrund în celulă în special pe calea porinelor, cel
puţin la enterobacterii, care posedă porine cu permeabilitate înaltă. Spre deosebire de acestea, antibioticele cu
molecule mari, lipofile (macrolide, rifamicinele, novobiocina, acidul fusidic) difuzează cu dificultate prin
porii canalelor. Pentru ele, difuzia lentă prin stratul lipidic este o cale semnificativă de pătrundere în celulă.
Pentru agenţii antibacterieni care traversează membrana externă prin canalele formate de porine,
scăderea permeabilităţii porinelor poate să mărească nivelul rezistenţei. Pierderea mutaţională a porinelor
creşte rezistenţa la antibioticele hidrofile, deoarece aceste molecule sunt mai mari decât nutrienţii şi trec greu
prin canalele de transport ale acestora.
Modificarea mutaţională a ţintei antibioticului
Multe antibiotice inactivează o enzimă specifică sau ribosomii. Un număr mare de tulpini rezistente
apar printr-un proces mutaţional: sintetizează o proteină ţintă care devine incapabilă să lege antibioticul sau
mai rar, ţinta îşi păstrează funcţia chiar după legarea antibioticului. Adeseori, diferenţa dintre proteina de tip
sălbatic şi cea mutantă constă în substituţia unui singur aminoacid în catena proteică. Ribosomii stafilococului
pot deveni rezistenţi la eritromicină după modificarea ARNr, iar rezistenţa la rifampină poate să rezulte din
schimbarea unui singur aminoacid în subunitatea b a ARN-polimerazei.
Rezistenţa la unele antibiotice apare prin dobândirea unei gene care codifică o enzimă ţintă cu
afinitate mult mai mică decât enzima de tip sălbatic: PBP2a (Penicillin Binding Protein)este codificată de o
genă care conferă rezistenţă şi care s-a răspândit la speciile de stafilococi (Pinho, 2001).
Utilizarea unei căi metabolice rezistente (de ocolire a căii metabolice inhibate)

Dacă un medicament este activ prin inhibarea unei enzime esenţiale a unei căi metabolice, celulele care
produc o cantitate mai mare de enzimă pot supravieţui în prezenţa medicamentului. De exemplu, rezistenţa la
trimetoprim poate fi datorată supraproducţiei dihidrofolat reductazei (DHFR), mutaţiei genei structurale a DHFR
sau dobândirii unei gene care codifică o enzimă rezistentă la DHFR, sau streptomicetele care necesită timidină, dar
nu sunt inhibate de trimetoprim şi de sulfonamide deoarece produc concentraţii adecvate de timidină pe o cale
alternativă.
Rareori, mediamentul trebuie să fie convertit de bacterii, la forma sa activă. Mutantele care nu pot
metaboliza medicamentul devin rezistente: de exemplu, Bacteroides fragilis nu metabolizează metronidazolul
şi este rezistentă.
Rezistenţa multiplă la medicamente poate să apară prin următoarele mecanisme:
- mutaţiile genelor codificatoare ale sintezei moleculelor membranare transportoare cu rol fiziologic,
urmată de amplificarea lor şi schimbarea nivelului de activitate;
- mutaţiile genelor reglatoare, care amplifică expresia transportorilor multipli;
- transferul intercelular al genelor de rezistenţă, prin intermediul transpozonilor sau al plasmidelor.
Localizarea membranară a pompelor de eflux a îngreunat eforturile de a defini mecanismele
moleculare care guvernează activitatea acestor proteine. Progresul cunoaşterii a fost mult mai rapid în ceea ce
priveşte reglarea activităţii pompelor de eflux. Supraproducţia constitutivă a proteinelor de eflux, în absenţa
agentului chimic, creează un dezavantaj sever în competiţia cu cele care exprimă adaptativ proteinele de eflux.
100
Proteinele transportoare de eflux nu sunt sintetizate în exces, situaţie reflectată în faptul că aceste
proteine sunt foarte greu de produs în cantităţi adecvate scopului purificării. Sinteza unora dintre ele nu
necesită mecanisme reglatoare, datorită nivelului natural scăzut al expresiei, dar sinteza celor mai multe este
supusă reglării la nivelul transcrierii şi traducerii. Existenţa celor două trepte de control reflectă măsurile de
siguranţă ale celulei faţă de efectele defavorabile ale supraproducţiei transportorului. Genele codificatoare ale
proteinelor inductibile de eflux posedă mecanisme proprii de control al transcrierii şi traducerii. Este însă la
fel de important ca proteinele de eflux să fie disponibile în condiţiile în care sinteza lor este necesară (Moir şi
colab., 1999). Astfel, expresia celor mai multe proteine de eflux al medicamentelor este inductibilă.

Bibliografie selectivă

1. Arnstein H.R., Margreiter H., The biosynthesis of penicillin. 7. Further experiments on the utilization
of l- and d-valine and the effect of cystine and valine analogues on penicillin synthesis, Biochemestry
Journal. 1958, 68(2): 339-348.
2. Bachmann B.O., Li R., Townsend C.A., .β-Lactam synthetase: A new biosynthetic enzyme,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1998, 95(16):
9082-9086.
3. Balows A., (ed) Manual of Clinical Microbiology, 5th ed., Washington D.C, American Society for
Microbiology, 1991.
4. Bayarski Y., Antibiotics Classification And Side Effects. EzineArticles. 2006.
5. Brakhage A.A., Molecular Regulation of β-Lactam Biosynthesis În Filamentous Fungi, Microbiology
and Molecular Biology Reviews. 1998, 62(3): 547-585.
6. Brock T.D., Medigan M.T., Martinco J.M., Parker J., Biology of Microorganisms Tenth Ed. , New
Jersey, Prentice Hall Intern. Inc., 2003, p: 727-804, 846-875, 965-994.
7. Brock Th. Biology of microorganisms, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1988.
8. Brock Th., Biology of microorganisms, 11th Ed. Madigan M. T., Martinko J. M (eds) Prentice Hall,
Englewood Cliffs, New Jersey. 2005
9. Bryan L.E., O'Hara K., Wong S., Lipopolysaccharide changes În impermeability-type aminoglycoside
resistance În Pseudomonas aeruginosa, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1984, 26(2): 250-
255.
10. Casey M.L., Paulick R.C. and Whitlock H.W. Carbon-13 nuclear magnetic resonance study of the
biosynthesis of daunomycin and islandicin. J Org Chem. 1978, 43:1627-1634
11. Challis G.L., Hopwood D.A., Synergy and contingency as driving forces for the evolution of multiple
secondary metabolite production by Streptomyces species, Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America. 2003, 100(Suppl 2): 14555-14561.
12. Dale J., Molecular Genetics of Bacteria, 3rd edition, J. Willy & sons Ltd. 1998.
13. Davis M. J. Fastidious bacteria. Methods in Phytobacteriology. Z. Klement, K. Rudolph and D.
Sands. Budapest, Hungary, Akademiai Kiado. 1990, 75-85.
14. Distler J., Ebert A., Mansouri K., Pissowotzki K., Stockmann M., Piepersberg W., Gene cluster for
streptomycin biosynthesis În Streptomyces griseus: nucleotide sequence of three genes and analysis
of transcriptional activity, Nucleic Acids Research. 1987, 15(19): 8041-8056.
15. Dixon B., Changing pictures of patogenicity and virulence. ASM News. 2000, 66:122-127.
16. Esmahan C., Alvarez E., Montenegro E., Martin J.F., Catabolism of lysine În Penicillium
chrysogenum leads to formation of 2-aminoadipic acid, a precursor of penicillin biosynthesis,
Applied and Environemental Microbiology. 1994, 60(6): 1705-1710.
17. Fawcett P.A., Usher J.J., Huddleston J.A., Bleaney R.C., Nisbet J.J., Abraham E.P., Synthesis of
delta-(alpha-aminoadipyl) cysteinylvaline and its role În penicillin biosynthesis, Biochemestry
Journal. 1976, 157(3): 651-660.
18. Gander S., Bacterial biofilms: resistance to antimicrobial agents. Journal Antimicrobiology and
Chemotherapy. 1996, 37: 1047-1050.
19. Gottlieb D., Shaw P. D., Antibiotics, vol. I; Structure, vol. II, Biosynthesis, Springer-Verlag, Berlin
Heidelberg, New York. 1967.
20. Grohmann E., Muth G., Espinosa M., Conjugative Plasmid Transfer În Gram-Positive Bacteria,
Microbiol Mol Biol Rev. 2003, 67(2): 277-301.
21. Kitamura I., Tobe H., Yoshimoto A., Oki T., Naganawa H., Takeuchi T., Umezawa H. Biosynthesis
of aklavinone and aclacinomycins. J Antibiot. 1981, 34: 1498-1500

101
22. Kruse H., Sorum H., Transfer of Multiple Drug Resistence Plasmids between Bacteria of Diverse
Origins În Natural Microenvironments. Appled and Environemental Microbiology. 1994, 60: 4015-
4021.
23. Lengyel P., Söll D., Mechanism of protein biosynthesis, Bacteriology Reviews. 1969, 33(2): 264-
24. Livermore D.M., beta-Lactamases În laboratory and clinical resistance, Clinical Microbiology
Reviews. 1995, 8(4): 557-584.
25. Majumdar S.K., Kutzner H.J., Studies on the Biosynthesis of Streptomycin, Applied Microbiology.
1962, 10(2): 157-168.
26. Malmberg L.H., Hu W.S, Sherman D., Precursor Flux Control through Targeted Chromosomal
Insertion of the Lysine ε-Aminotransferase (lat) Gene În Cephamycine C Biosynthesis, Journal of
Bacteriology. 1993, 175(21): 6916-6924.
27. Martin J.F., Demain A.L., Control of Antibiotic Biosynthesis, Microbiological Reviews. 1980, 44(2):
230-251.
28. Martín J.F., Molecular Control of Expression of Penicillin Biosynthesis Genes În Fungi: Regulatory
Proteins Interact with a Bidirectional Promoter Region, Journal of Bacteriology. 2000, 182(9): 2355-
2362.
29. Moir D.T., Shaw K.J., Hare R.S., Vovis G.F., Genomics and Antimicrobial Drug Discovery,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1999, 43(3): 439-446.
30. Müller W.H., van der Krift T.P., Krouwer A.J., Wösten H.A., van der Voort L.H., Smaal E.B.,
Verkleij A.J., Localization of the pathway of the penicillin biosynthesis În Penicillium chrysogenum,
The EMBO Journal. 1991, 10(2): 489-495.
31. Paulsen I.T., Brown M.H., Littlejohn T.G., Mitchell B.A., Skurray R.A., Multidrug resistance
proteins QacA and QacB from Staphylococcus aureus: membrane topology and identification of
residues involved În substrate specificity, Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America.1996, 93(8): 3630-3635.
32. Paulsen T. J., Proton-dependent Multidrug efflux Systems, Microbiology Reviews. 1996, 60(4): 575-
608.
33. Peirú S., Menzella H.G., Rodríguez E., Carney J. and Gramajo H., Production of the Potent
Antibacterial Polyketide Erythromycin C În Escherichia coli, Applied and Environemental
Microbiology. 2005, 71(5): 2539–2547.
34. Pfeifer B.A., Khosla C., Biosynthesis of polyketides În heterologous host, Microbiology and
Molecular Biology Reviews. 2001, 65(1): 106-118.
35. Pinho M. G., de Lencastre H., Tomasz A. An acquired and a native penicillin-binding protein
cooperate in building the cell wall of drug-resistant staphylococci. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001,
98: 10886-10891
36. Putman M., van Veen H.W., Konings W.N., Molecular Properties of Bacterial Multidrug
Transporters, Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2000, 64(4): 672-693.
37. Queener S.W., Molecular biology of penicillin and cephalosporin biosynthesis, Antimicrobial Agents
and Chemotherapy. 1990, 34(6): 943-948.
38. Recchia G.D., Hall R.M., Plasmid evolution by acquisition of mobile gene cassettes: plasmid pIE723
contains the aadB gene cassette precisely inserted at a secondary site În the IncQ plasmid RSF1010,
Molecular Microbiology. 1995, 15:179-187.
39. Recchia G.D., Hall R.M.,. Gene cassettes: a new class of mobile element, Microbiology. 1995, 141:
3015-3027.
40. Rosen P., Barkin R.M., eds. Emergency Medicine: Concepts and Clinical Practice, Mosby-Year
Book. 1992.
41. Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, Vol. I , II, Ed. Lesslie Collier, A.
Balows, M. Sussman. 1998.
42. Trip H., Evers M.E., Kiel J.A., Driessen A.J., Uptake of the β-Lactam Precursor α-Aminoadipic Acid
În Penicillium chrysogenum Is Mediated by the Acidic and the General Amino Acid Permease,
Applied and Environemental Microbiology.. 2004, 70(8): 4775-4783.
43. Waksman S., The role of antibiotics in nature. Perspectives in Biology and Medicine. 1961; 4(3):
271-272.
44. Waksman S.A. The Actinomycetes. Vol. II. Bailliere, Tindall and Cox, London, 1961
45. Watanabe T., Fukasawa T. Episome-mediated transfer of drug resistance in enterobacteriaceae i. :
transfer of resistance factors by conjugation. J Bacteriol. 1961, 81(5):669–678

102
46. Watanabe T., Fukasawa, T. Episome-mediated transfer of drug resistance in enterobacteriaceae i. :
transfer of resistance factors by conjugation. J Bacteriol. 1961 May;81(5):669–678.
47. Westbrock-Wadman S., Sherman D.R., Hickey M.J., Coulter S.N., Zhu Y.Q., Warrener P., Nguyen
L.Y., Shawar R.M., Folger K.R., Stover C.K., Characterization of a Pseudomonas aeruginosa Efflux
Pump Contributing to Aminoglycoside Impermeability, Antimicrobial Agents and Chemotherapy.
1999, 43(12): 2975-2983.
48. Yim Grace, Attack of the superbugs: antibiotic resistance, The Science Creative Qurterly. 2006

103
Capitolul 5
CARACTERIZAREA PRICIPALELOR CLASE DE ANTIBIOTICE

5.1. Aminoglicozidele

Aminoglicozidele sunt zaharuri complexe, conectate prin legături glicozidice. Ele diferă atât prin
nucleul molecular care poate fi streptidina sau 2-deoxistreptidina, cât şi prin aminohexozele legate de nucleu
(Vakulenko, 2003). Pentru activitatea antimicrobiană, esenţiale sunt grupările NH 2 şi OH libere, prin
intermediul cărora aminoglicozidele se leagă de proteinele ribosomale.
Primul antibiotic aminoglicozidic – streptomicina sintetizată de Streptomyces griseus – a fost introdus
în clinică de către Schatz şi colaboratorii (1944), fiind activă pentru tratamentul tuberculozei, proprietate care
s-a păstrat şi rămâne medicamentul de elecţie pentru chimioterapia combinată a tuberculozei rezistente la
medicamente. A fost un instrument util pentru elucidarea sintezei proteinelor, dar este rareori folosită în
clinică, cu excepţia tratamentului tuberculozei, iar modul său de acţiune diferă într-o oarecare măsură de al
altor aminoglicozide utilizate în clinică. Valoarea terapeutică a celorlalte aminoglicozide s-a ameliorat prin
cercetări chimiofarmaceutice, care au generat noi variante semisintetice pornind de la moleculele parentale.
Ele şi-au păstrat rezistenţa la acţiunea enzimelor degradative ori au un spectru mai larg de activitate.
Streptomicina are structura unui trizaharid, fiind alcătuită din 3 subunităţi reunite prin legături
glicozidice: streptidina, streptoza şi N-metil-glucozamina. Streptidina este un inozitol substituit cu două
grupări guanido, iar streptoza şi N-metil-glucozamina formează dizaharidul streptobiosamină, cu o grupare
metilamino. Legăturile glicozidice dintre componente sunt în configuraţie . Activitatea antibacteriană este
anihilată prin clivajul acid al legăturii glicozidice dintre streptidină şi streptobiosamină, prin înlocuirea
grupărilor guanido cu grupele amino sau prin carbobenziloxilarea aminei secundare. Prin clivajul acid rezultă
streptidina şi dizaharidul streptobiosamina.

Structura moleculară a streptomicinei

Compuşii strâns înrudiţi cu streptomicina se formează prin modificări structurale ale streptozei şi
streptidinei.

102
Clasificarea aminoglicozidelor

Principalele grupe de antibiotice aminoglicozidice sunt cele din grupa II care conţine streptomicina şi
derivaţii săi şi cele grupa V care este subdivizată în 4 subgrupe.

Structura moleculară a streptograminei A Structura moleculară a streptograminei B

Subgrupa V A conţine kanamicina, tobramicina şi derivaţi semisintetici (amikacina, dibekacina,


habekacina). Subgrupa V B conţine complexul gentamicina şi isepamicina, iar subgrupa C cuprinde
antibiotice fără semnificaţie clinică. Subgrupa V D conţine sisomicina si netilmicina.

103
Aminoglicozidele – gentamicina, tobramicina, amikacina şi streptomicina sunt folosite în mod curent
pentru tratamentul infecţiilor cu bacterii Gram pozitive şi Gram negative.

Structura moleculară a gentamicinei Structura moleculară a streptomicin-sulfatului

Structura moleculară a gentamicin-sulfatului Structura moleculară a clindamicinei

Spectrul de activitate a aminoglicozidelor


Antibioticele aminoglicozidice au un spectru larg de activitate faţă de bacilii Gram negativi ( E. coli,
Salmonella spp, Shigella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Acinetobacter spp., Proteus spp.,
Klebsiella spp., Serratia spp., Morganella spp. şi Pseudomonas spp., precum şi S. aureus şi unii streptococi.
În vitro, aminoglicozidele nu sunt active faţă de Bacteroides spp. şi alte bacterii anaerobe, Str. pneumoniae,
N. gonorrhoeae, iar activitatea faţă de enterococi este evidentă numai în asociaţie sinergică cu antibioticele
antiparietale (-laclami şi vancomicina).
Spectrul de activitate al diferitelor antibiotice aminoglicozidice este diferit. Streptomicina este
bactericidă pentru o largă varietate de specii bacteriene Gram pozitive şi Gram negative. Celulele animale sunt
relativ insensibile la streptomicină, deşi apar fenomene de otitoxicitate, nefrotoxicitate şi hipersensibilitate.
Datorită sarcinii sale electrice, streptomicina interacţionează cu multe componente anionice celulare. În vitro,
precipită ADN. În general, aminoglicozidele mai noi (gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina,
isepamicina, dibekacina şi arbekacina) au un spectru mai larg decât cele vechi (streptomicina, kanamicina).
104
Deşi manifestă nefrotoxicitate şi otitoxicitate, iar apariţia tulpinilor rezistente este relativ frecventă,
aminoglicozidele rămân foarte importante pentru tratamentul unor infecţii în situaţii speciale.
Aminoglicozidele au câteva particularităţi ale acţiunii antimicrobiene:
activitatea bactericidă este dependentă de concentraţie;
- manifestă efectul postantibiotic;
- au o farmacocinetică relativ predictibilă;
- manifestă efectul sinergic cu antibioticele antiparietale.
Activitatea batericidă a aminoglicozidelor depinde în primul rând de concentraţia lor, decât de durata
expunerii bacteriilor la concentraţiile inhibitorii ale antibioticului şi este mai puţin dependentă de dimensiunile
populaţiei bacteriene. Potenţialul bactericid, dependent de concentraţie, creşte odată cu creşterea concentraţiei
antibioticului. Aminoglicozidele manifestă efectul postantibiotic, adică continuă să fie bactericide chiar după
stoparea administrării antibioticului. Activitatea bactericidă dependentă de concentraţie şi efectul
postantibiotic, asociat cu riscul atenuat de nefrotoxicitate şi ototoxicitate, fac posibilă administrarea unei
singure doze/zi, la pacienţii cu funcţie renală normală.
Sinergismul cu antibioticele antiparietale este probabil, rezultatul înglobării aminoglicozidelor la o
concentraţie superioară, cauzată de permeabilitatea crescută a celulelor bacteriene, după incubarea cu
inhibitorii sintezei peretelui celular. Efectul sinergic al aminoglicozidelor şi -lactamilor este foarte evident
faţă de enterococi.
Antibioticele aminoglicozidice sunt folosite pentru tratamentul pacienţilor neutropenici febrili şi a
celor cu infecţii grave produse de microorganisme Gram negative (enterobacterii, Ps. aeruginosa). Pentru
infecţiile tractului urinar, terapia cu aminoglicozide este eficientă, deoarece antibioticele administrate
intravenos sunt excretate exclusiv pe cale renală.

Inglobarea aminoglicozidelor

Aminoglicozidele sunt molecule cationice cu greutate moleculară mică, dar foarte hidrofile.
Acumularea lor în celula sensibilă are loc în trei faze. Prima fază constă în interacţiunea ionică cu
componentele peretelui celular, urmată de difuzia antibioticului prin pereţii bacteriilor Gram pozitive, sau de
trecerea prin membrana externă la bacteriile Gram-negative.
Datorită caracterului policationic, aminoglicozidele deplasează ionii de Mg care asigură legătura între
grupările fosfat ale lipidelor membranare, auto-amorsându-şi în acest fel trecerea prin dezorganizarea
membranei externe. Simpla difuzie la nivelul porinelor, al căror diametru este la limita excluderii
aminoglicozidelor, nu ar putea realiza concentraţii intracelulare crescute de antibiotic (Hancock, 1991).
Perturbarea integrităţii lipopolizaharidelor în sine, a fost considerată ca o componentă a efectului bactericid
independent de evenimentele declanşate la nivelul ribosomului.
Aminoglicozidele se acumulează în celulă numai printr-un proces de transport dependent de energie.
Acumularea lor în celula bacteriană parcurge două faze: faza I este lentă şi depinde de gradientul
transmembranar al potenţialului electric şi deci al fenomenului membranar oxidativ; faza a II-a este rapidă şi
se traduce printr-o acumulare intracelulară importantă. Concentraţiile intracelulare sunt de circa 100 ori mai
ridicate decât cele din mediul extern. Acumularea lentă a antibioticului determină un efect bacteriostatic, iar
acumularea rapidă produce efectul bactericid. Rata acumulării este condiţionată de mărimea componentei
electrice (Δψ), a forţei proton-motrice care la rândul ei depinde de funcţionarea catenei de respiraţie şi de
ATP-aza membranară. Astfel se explică de ce microorganismele cu sisteme transportoare deficiente, cum sunt
cele anaerobe, sunt intrinsec rezistente la aminoglicozide. Din acelaşi motiv, enterococii şi alţi anaerobi
facultativi sunt rezistenţi la concentraţiile mici de aminoglicozide.
Un rol important în acumularea intracelulară a aminoglicozidelor îl au proteinele periplasmatice a
căror sinteză este indusă de antibiotic.

Mecanismul de acţiune a aminoglicozidelor

Aminoglicozidele se leagă de ribosomii bacterieni şi inhibă sinteza proteinelor. Ribosomul este o


structură complexă, în alcătuirea căruia intră 3 molecule de ARN şi peste 50 de tipuri de proteine. Subunitatea
mare a ribosomului cuprinde două molecule de ARN 5S şi 23S şi 33 proteine, iar subunitatea mică conţine o
singură moleculă de ARN 16S şi 20 - 21 proteine. Aminoglicozidele se leagă de subunitatea 30S, care are rol
esenţial în traducerea cu mare fidelitate a mesajului genetic (fig. 35).

105
Ribosomul are 3 situsuri de legare a ARNt, desemnate A (Aminoacil), P (Peptidil) şi E (Exit). În
timpul sintezei proteinelor, ribosomii decodifică informaţia din ARNm şi catalizează formarea legăturilor
peptidice. Acumularea rapidă a aminoglicozidelor saturează toţi ribosomii, producând moartea celulei.

Figura. 35. Ilustrarea schematică a mecanismului de acţiune al aminoglicozidelor: inhibiţia formării


complexului ribosom 30S – ARNm (Neu şi colab., 1988).

Aminoglicozidele induc fenomenul de pleiotropism (modifică expresia unui număr mare de gene) şi


interacţionează cu mecanismul sintezei proteice. Pentru că interacţionează cu ribosomii, aminoglicozidele
induc erori de citire a ARNm. Secvenţa de baze a ARNm este citită greşit şi se sintetizează proteine
nefuncţionale sau sinteza proteinelor este stopată. Streptomicina a devenit un instrument pentru studiul
fidelităţii traducerii informaţiei genetice.
Alte antibiotice aminoglicozidice (bluensomicina, kanamicina, neomicina şi paromomicina (toate sunt
sintetizate de specii de Streptomyces), induc erori de citire a mesajului În vitro, în sisteme acelulare.
Aminoglicozidele sunt antibiotice cu efect rapid şi cu spectru larg de acţiune: sunt sensibile bacteriile
strict sau facultativ aerobe Gram pozitive sau negative. Acestea sunt zaharuri sau pseudo-zaharuri aminate, cu
caracter policationic, care explică câteva aspecte legate de modul lor de acţiune. Toate aminoglicozidele
utilizate în terapeutică, streptomicina şi streptinomicina conţin un ciclu deoxistreptomicină bisubstituit în
poziţia 4 şi 6.
Spre deosebire de alte familii de antibiotice, în special β-lactamice şi fluoroquinolone,
aminoglicozidele folosite în prezent conţin mai puţine variante moleculare.
Legându-se la ribosom, aminoglicozidele, pe de o parte perturbă procesul de traducere introducând
erori de citire, iar pe de altă parte antrenează stoparea totală a traducerii, interferând cu etapele de iniţiere,
alungire şi terminare. Efectul primar al aminoglicozidelor ar fi ocuparea situsului acceptor (A) al
ribosomului.
Streptomicina este un glicozid aminociclitol, larg folosit în terapia tuberculozei. La micobacterii,
streptomicina inhibă sinteza proteinelor după 5-15 min., iar sinteza acizilor nucleici continuă pentru o lungă
perioadă de timp. Mecanismul acţiunii sale la M. tuberculosis n-a fost studiat, dar la E. coli, streptomicina se
leagă iniţial la ARNr 16S al subunităţii ribosomale 30S, la nivelul nucleotidelor 15, 530, 915 şi 1400/1500
(Allen, 1989 citat de Pinard, 1991). Regiunea 1400/1500 este considerată ca un component al situsului de
fixare dezoxistreptaminelor (Moazed, 1986). Efectele legării aminoglicozidelor la subunitatea ribosomală
mică se extind la subunitatea mare, nucleotidul 2660 a ARN 23S. Astfel, interferă cu treapta traducerii,
inhibând iniţierea şi perturbând sinteza proteinelor (Fig. 35). Deoarece inhibă sinteza proteinelor, efectul
aminoglicozidelor este bactericid. Streptomicina se leagă de proteina S12 din subunitatea 30S şi face ca
ribosomul să citească greşit codul genetic. Alte aminoglicozide se leagă nu numai de proteina S12, ci şi de
proteina L6 a subunităţii 50S. Acest ultim situs de legare este important pentru rezistenţa bacteriilor la
106
aminoglicozide. Componenta chimică ce determină citirea greşită este streptamina sau deoxistreptamina, din
moleculele de streptomicină, kanamicină, neomicină, paroromicină, gentamicină, bluensomicină etc.
Spectinomicina este un antibiotic aminociclitol, înrudit cu aminoglicozidele şi are acţiune
bacteriostatică. Acţiunea sa antibacteriană constă în legarea cu o altă proteină ribosomală. Este astfel blocată
interacţiunea ARNm-ribosom, fără să produca citirea greşită. Se foloseşte pentru tratamentul gonoreii (N.
gonorrhoeae) rezistentă la penicilină. În scopul tratamentului infecţiilor intracelulare, aminoglicozidele au
fost încapsulate în liposomi. Încapsularea în liposomi poate să crească indexul terapeutic al medicamentului
prin diminuarea nivelului medicamentului eliberat la situsurile unde este toxic faţă de nivelul eficienţei
terapeutice.
Aminoglicozidele sunt eliminate prin filtrare glomerulară şi parţial sunt reabsorbite de celulele
tubulare proximale printr-un mecanism de pinocitoză în vezicule mici, care fuzionează cu lizosomii, unde se
acumulează. Ele induc o fosfolipidoză lizosomală caracterizată prin inhibiţia activităţii sfingomielinazei şi
fosfolipazei A1 şi prin acumularea fosfolipidelor în lizosomi. Fosfolipidoza este însoţită de necroză celulară şi
regenerare postnecrotică.
Diferiţi compuşi sau medicamente administrate concomitent cu aminoglicozidele pot să mărească
nivelul toxicităţii (vancomicina, cisplatinum şi hidrocortizonul) sau pot să-l diminueze (ticarcilina,
carbenicilina, cefalotina, acidul poli-L-aspartic). Toxicitatea aminoglicozidelor nu este influenţată de modul
de administrare (singure sau în asociaţie), dar unele medicamente diminuă nivelul renal al acumulării în
celulele tubulare.
Rezistenţa la antibioticele aminoglicozidice este larg răspândită şi se produce prin următoarele
mecanisme (fig. 36):
- înglobarea scăzută a antibioticului
- modificarea ţintei ribosomale
- efluxul antibioticului
- modificarea enzimatică a aminoglicozidelor.
Înglobarea aminoglicozidelor necesită funcţionarea catenei de respiraţie celulară, care generează un
potenţial electric prin membrana citoplasmatică. Un nivel scăzut al potenţialului transmembranar sau absenţa
sa, determină rezistenţa intrinsecă a bacteriilor anaerobe şi scăderea sensibilităţii bacteriilor facultativ
anaerobe (enterococi) la aminoglicozide.

Figura 36. Ilustrarea schematică a mecanismelor de rezistenţă la antibioticele aminoglicozidice (Neu si colab., 1988).

Modificarea chimică a aminoglicozidelor este principalul mecanism de rezistenţă bacteriană. Alte


mecanisme mai rare de rezistenţă la aminoglicozide sunt sistemele de eflux şi mutaţiile situsului ribosomal de
legare la ARNr ) (Leclerc şi colab., 1991)
Modificarea enzimatică a aminoglicozidelor este mecanismul major de rezistenţă la aminoglicozide al
izolatelor clinice Gram pozitive şi Gram negative. Modificarea chimică are loc la nivelul grupelor amino sau

107
hidroxil. S-au identificat peste 50 de enzime care modifică aminoglicozidele. Majoritatea genelor
codificatoare ale enzimelor se găsesc la bacteriile Gram negative. În funcţie de tipul modificării chimice pe
care o catalizează, enzimele care modifică aminoglicozidele se clasifică în trei familii:
- aminoglicozid-acetil-transferaze (AAC)
- aminoglicozid-adenilil-transferaze (ANT)
- aminoglicozid-fosfotransferaze (APH).
Aminoglicozid O-fosfo-transferaza (APH) şi aminoglicozid O-adenil sau nucleotidil-transferaza
(AAD sau ANT), catalizează fosforilarea şi respectiv nucleotidilarea grupării hidroxil, iar aminoglicozid- N-
acetiltransferaza (AAC) catalizează acetilarea grupărilor amino. APH şi ANT folosesc ATP şi ACA (acetil-
coenzima A).
Fiecare dintre cele familii de enzime este împărţită în clase, desemnate prin situsul pe care-l modifică.
Aminoglicozid-fosfotransferazele - APH - (7 clase) sunt kinaze şi utilizează ATP ca substrat secundar
şi fosforilează grupările specifice OH, la toate clasele de antibiotice aminoglicozidice.

Fosforilarea kanamicinei A catalizată de o aminoglicozid-fosfotransferază (APH), reacţie energizată de ATP.

Aminoglicozid-acetiltransferazele – AAC - (4 clase de enzime) utilizează acetil-CoA ca donor al


grupării acetil pentru modificarea aminoglicozidelor la gruparea amino din poziţiile 1 şi 3 ale inelului
deoxistreptaminei şi la poziţiile 2’ şi 6’ ale inelului 6-aminohexozei. Aminoglicozid 6’-acetiltransferazele au
spectru larg şi pot modifica majoritatea aminoglicozidelor cu importanţă clinică.

Acetilarea kanamicinei A, catalizată de aminoglicozid-N-acetiltransferază (AAC), reacţie energizată de coenzima A


(AcCoA)

Aminoglicozid-nucleotidiltransferazele – ANT - (5 clase) utilizează ATP ca substrat secundar şi


modifică antibioticele aminoglicozidice prin transferul AMP la gruparea OH la poziţiile 2’’, 3’’, 4’ şi
respectiv 9.

108
Adenilarea kanamicinei A cu AMP, catalizată de aminoglicozid-nucleotidiltransferază, cu consum de ATP.

Aminoglicozidele modificate la grupările amino sau la grupul OH sub acţiunea celor trei categorii de
enzime, se leagă slab sau pierd capacitatea de a se lega de ribosomi şi nu declanşează faza a II-a a înglobării –
dependentă de energie. Efectul inhibitor asupra sintezei proteinelor celulare nu se mai produce şi bacteriile
supravieţuiesc în prezenţa medicamentului. Inactivarea enzimatică a aminoglicozidelor este mecanismul
principal de rezistenţă a stafilococilor. Din punct de vedere biochimic, acest mecanism de rezistenţă este de
departe cel mai important, fiind implicat în totalitatea cazurilor de rezistenţă observate la enterobacterii (>
95%), la Acynetobacter (95%) şi la bacteriile Gram pozitive şi jumătate din cazurile de rezistenţă observate la
Pseudomonas.
Selecţia microorganismelor ce produc enzime sub acţiunea cărora modifică aminoglicozidele, depinde
de cantitatea de antibiotice folosită.
Mecanismele neenzimatice de rezistenţă la antibioticele aminoglicozidice sunt:
- sistemele de eflux
- mutaţiile ARNr
Rezistenţa datorată modificării ţintei macromoleculare este o modalitate majoră de dezvoltare a
rezistenţei. Modificările ţintei care determină rezistenţa la aminoglicozide includ schimbările mutaţionale ale
proteinelor ribosomale sau ale ARN 16S şi metilarea enzimatică a ARNr. Schimbările mutaţionale produc
rezistenţa în special la streptomicină. Studiile de RMN (rezonanţă magnetică nucleară) asupra nucleotidelor ce
cuprind situsul A (acceptor) al ARN 16S, complexat cu paromomicina, precum şi asupra subunităţii 30S
complexată cu acelaşi antibiotic, relevă că medicamentul se leagă în depresiunea majoră a situsului A.
Metilarea N7 a resturilor de guanină ale ARN 16S produce rezistenţa la concentraţiile mari de aminoglicozide
la microorganismele producătoare de aminoglicozide, dar acest tip de rezistenţă n-a fost raportat la bacteriile
cu importanţă clinică. Sinteza proteinelor necesită ca anticodonii aminoacil-ARNt şi codonii ARNm să se
recunoască specific. Evenimentul recunoaşterii are loc la nivelul subunităţii 30S. Fidelitatea recunoaşterii este
garantată de o secvenţă ARNr înalt conservată, care constituie situsul interacţiunii dintre codon şi anticodon
(situsul A). Această secvenţă este situsul preferat de legare al aminoglicozidelor (kanamicina şi
streptomicina), care pot să interfere cu sinteza proteinelor prin inducerea citirii greşite a codonilor şi
terminarea prematură a traducerii.
La enterococi, s-au identificat două tipuri de rezistenţă la streptomicină:
- rezistenţa la nivele moderate de antibiotic, datorată permeabilităţii scăzute a membranei, ce poate
fi depăşită cu administrarea concomitentă a penicilinei, care creşte permeabilitatea pentru
aminoglicozide;
- rezistenţa la doze mari, mediată ribosomal sau datorată producerii enzimelor inactivatoare ale
streptomicinei.
Rezistenţa la gentamicină se datorează prezenţei enzimei inactivatoare 2- fosfotransferază- 6-
acetiltransferază. Enzima conferă rezistenţă la gentamicină, tobramicină, metilmicină, amikacină şi
kanamicină. Rezistenţa la gentamicină este un indicator al rezistenţei bacteriene la alte aminoglicozide, cu
excepţia streptomicinei.
La M. tuberculosis nu s-au descris enzime care să modifice aminoglicozidul streptomicină, dar
rezistenţa este determinată de modificarea mutaţională a ţintei ribosomale.
În principiu, dacă mecanismele de rezistenţă la antibiotice ar fi inhibate, sensibilitatea bacteriilor la
aminoglicozide ar putea fi restabilită. Acest concept este inspirat de asocierea cu succes a primului inhibitor al

109
-lactamazelor – acidul clavulanic – cu amoxicilina (o penicilină). Nu s-au identificat inhibitori ai sintezei
enzimelor care modifică aminoglicozidele (Vakulenko, 2003).
Streptomicina produce efecte secundare: este afectat nervul acustic şi apar deficienţe de auz, care pot
dispărea după întreruperea tratamentului sau pot să persiste.

5.2. Tetraciclinele

Tetraciclinele sunt un grup de antibiotice naturale cu activitate antibacteriană faţă de un spectru larg
de microorganisme patogene, caracterizate printr-un nivel foarte scăzut de toxicitate pentru gazdele
mamaliene ale bacteriilor patogene. Tetraciclinele sunt prototipul antibioticelor cu spectru larg de acţiune,
deoarece inhibă creşterea unei varietăţi largi de microorganisme. Sunt bine absorbite şi sunt active după
administrare orală. Din aceste motive, tetraciclinele au cea mai largă utilizare în clinica umană.
Structural, tetraciclinele sunt unice, deoarece nu au nici o înrudire evidentă cu alţi metaboliţi
cunoscuţi. Structura de bază a tetraciclinelor constă dintr-un schelet comun de octahidronaftacenic (patru
cicluri de carbon hexagonale fuzionate, lineare, A, B, C, D), substituit în poziţiile 5, 6, 7, cu diferiţi radicali
din care se formează diferite tipuri de tetracicline.

Structura moleculară a tetraciclinei

Structura inelului de bază poate fi substituită la câteva poziţii, pentru a forma noi analogi ai
tetraciclinei: clortetraciclina (aureomicina) are un atom de Cl, iar oxitetraciclina (kanamicina) are un grup
OH în plus, dar nu are clor. Toate cele 3 antibiotice sunt produse pe cale microbiologică, dar sunt şi
tetracicline de semisinteză, la care diferiţi constituienţi sunt inseraţi în inelul de naftacen.

Clasificarea tetraciclinelor

Primul antibiotic al acestei familii, clortetraciclina, a fost descris în 1948, urmată de oxitetraciclină,
produse de Streptomyces aureofaciens şi respectiv, Streptomyces rimosus.
Tetraciclina propriu-zisă a fost descoperită mai târziu. Este sintetizată de Streptomyces aureofaciens,
în anumite condiţii de mediu: concentraţia ionului de Cl - nu trebuie să depăşească 17 părţi/milion. Ionul de Cl
este îndepărtat cu răşini schimbătoare de ioni sau prin precipitare sub formă de AgCl sau HgCl.
Demetilclortetraciclina este sintetizată de mutante ale Str. aureofaciens, defective pentru metilarea în
poziţia 6 a ciclului naftacenic. Este un antibiotic important, deoarece acţiunea sa este mai prelungită şi este
activă faţă de bacteriile rezistente la celelalte tetracicline. Este molecula de la care se sintetizează tetraciclinele
de semisinteză: metaciclina, minociclina.
Sursa de C a organismelor producătoare de tetracicline este reprezentată de glucide, glicerol, iar cea
de azot este amoniul. Tetraciclinele clorurate necesită sursa de Cl. Scheletul naftacenic de C al tetraciclinelor
este sintetizat din acetat, prin intervenţia catalitică a CO 2, biotinei, coenzimei A. Atomii de C ai inelelor
structurale derivă alternativ din C carboxilic şi respectiv C metilic a 9 molecule de acetat.
Compuşii cloruraţi (clortetraciclina) sunt mai activi decât oxitetraciclina şi tetraciclina faţă de
stafilococi, streptococi şi pneumococi. În clinică se folosesc clortetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina,
demetiltetraciclina (clortetraciclina demetilată).

110
Grupe de tetracicline

Tetraciclinele formează o familie de antibiotice inhibitoare ale sintezei proteinelor prin mecanismul
blocării ataşării complexului aminoacil-ARNt de situsul acceptor al ribosomului (situsul A). Efectul
bacteriostatic al acestor antibiotice are un spectru larg de acţiune, fiind active faţă de bacterii Gram pozitive şi
Gram negative, faţă de chlamidii, micoplasme, ricketsii şi protozoare.
Tetraciclinele sunt agenţi chelatori puternici (leagă diferiţi ioni metalici) şi proprietăţile lor
farmacologice sunt influenţate de prezenţa ionilor metalici. Fiecare dintre inelele nucleului linear tetraciclic
trebuie să conţină numai atomi de C, pentru ca antibioticul să-şi păstreze activitatea antibacteriană. Excepţia
este 6-tiotetraciclina, care deşi posedă un atom de S la poziţia 6 a inelului C, are activitate antibacteriană.
Tetraciclinele atipice (tiotetraciclina şi alţi analogi ai tetraciclinelor) perturbă structura membranei
citoplasmatice şi efectul este bactericid, ceea ce contrastează cu efectul bacteriostatic reversibil al
tetraciclinelor inhibitoare ale sintezei proteinelor. Efectul tetraciclinelor atipice de dezorganizare a membranei
este probabil consecinţa caracterului lipofil al moleculei, rezultată din planaritatea inelelor B, C şi D.
Tetraciclinele atipice sunt probabil încorporate în mediul hidrofob al membranei. Din cauza efectelor
secundare, derivate din interacţiunea lor nespecifică cu membranele celulelor procariote şi eucariote,
tetraciclinele atipice nu prezintă interes terapeutic.
În mod obişnuit, se utilizează tetraciclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, dar şi cele noi, de
semisinteză: minociclina şi doxiciclina. Toate sunt bacteriostatice, se absorb uşor din tubul digestiv şi se
distribuie larg în ţesuturi şi fluide, cu excepţia lichidului cefalorahidian.
Tetraciclinele au un spectru foarte larg de acţiune: sunt active faţă de multe bacterii Gram pozitive şi
Gram negative, faţă de rickettsii, chlamidii, micoplasme şi faţă de unii fungi, dar distrug şi microbiota
normală a intestinului şi produc tulburări gastro-intestinale. Tetraciclinele pot produce efecte toxice asupra
ţesutului hepaticşi renal. Administrarea tetraciclinei în timpul sarcinii sau în primii 5 ani de viaţă are ca
rezultat colorarea dinţilor, atât deciduali cât şi permanenţi, doarece mugurii ambelor dentiţii se formează
înainte de naştere. Tetraciclina administrată în timpul sarcinii poate duce la deformarea oaselor cutiei craniene
a fătului. Efectele tetraciclinelor asupra dinţilor şi oaselor se datorează capacităţii lor de a lega ioni de Ca 2+.

Mecanismul de acţiune a tetraciclinelor

Tetraciclinele difuzează liber (pasiv) prin porii hidrofili ai membranei externe a bacteriilor Gram
negative, dar necesită un sistem de transport dependent de energie pentru a traversa membrana citoplasmatică.
La bacteriile Gram pozitive (nu au membrană externă), aceste antibiotice nu difuzează liber în celulă.
Tetraciclinele traversează membrana externă a bacteriilor Gram negative enterice prin canalele porinelor din
membrana externă (OmpF şi OmpC), sub forma complexelor cu ionii bivalenţi, în special de Mg 2+. Complexul
se acumulează în spaţiul periplasmic, unde probabil se disociază şi moleculele lipofile de antibiotic difuzează
prin stratul lipidic al membranei citoplasmatice. În citoplasmă formează complexe cationice cu Mg 2+, datorită
activităţii lor chelatoare. Complexul molecular format din tetraciclină şi Mg se asociază cu subunitatea
ribosomală 30S. Consecinţa este inhibiţia sintezei proteinelor, prin blocarea asocierii aminoacil-ARNt la
situsul A al ribosomului bacterian. Tetraciclina inhibă faza de elongare a catenei polipeptidice în timpul
traducerii, exercitând un efect bacteriostatic.
O secvenţă foarte conservată a ARNr 16S pare a fi parte a situsului de legare, ceea ce explică spectrul
larg de activitate al tetraciclinei. În alcătuirea situsului de legare pare să intre şi proteina ribosomală 7S.
Efectul direct al legării tetraciclinei la ribosomi este blocarea accesului aminoacil-ARNt la situsul A
(acceptor) al ribosomului. Interferenţa cu legarea aminoacil-ARNt la situsul A poate să inducă un răspuns
stringent şi declanşează numeroase efecte secundare, care modifică stabilitatea ARNt, sinteza ARNr,
metabolismul aminoacizilor.

111
Câţiva derivaţi ai tetraciclinei acţionează pe altă cale: chelocardina şi tiotetraciclina sunt active faţă de
E. coli şi B. subtilis, dar sunt inhibitori ineficienţi ai sintezei proteinelor, pentru că nu se leagă stabil de
ribosomi. Spre deosebire de alte tetracicline, ele pot inhiba sinteza ADN, ARN şi a proteinelor (Speer, 1992).
Cele două tetracicline ar putea avea efecte asupra membranei citoplasmatice.
Olivera şi Chopra (citaţi de Speer, 1992), pe baza modului de acţiune, au împărţit tetraciclinele în
două categorii :
- cele care inhibă sinteza proteinelor (teraciclina, clortetraciclina, minociclina);
-cele care interacţionează cu membrana citoplasmatică (chelocardina, tiotetraciclina,
anhidrotetraciclina).
Legarea tetraciclinelor cu proteinele ribosomului este tranzitorie, ceea ce explică efectul
bacteriostatic al acestor antibiotice. Sunt inhibitoare faţă de o varietate largă de bacterii Gram pozitive şi
Gram negative, chlamidii şi micoplasme. Celulele mamiferelor nu concentrează tetraciclina (aşa cum fac
bacteriile) şi de aceea ribosomii lor sunt rezistenţi, cu posibila excepţie a ribosomilor 70S mitocondriali. Se
administrează oral, dar formează complexe neabsorbabile cu ionii bivalenţi.Tetraciclina şi derivaţii săi au o
utilizare clinică limitată, datorită frecvenţei crescute a tulpinilor rezistente. De exemplu, în anii ’80,
tetraciclina era folosită pentru tratamentul infecţiilor cu transmitere sexuală, dar după apariţia tulpinilor
rezistente de N. gonorrhoeae, n-a mai fost utilizată ca antibiotic de primă importanţă terapeutică.
Oxitetraciclina şi tetraciclina sunt încă folosite în tratamentul uretritei nongonococice şi a infecţiilor
chlamidiale.
Rezistenţa la tetraciclină este larg răspândită la cocii Gram pozitivi şi se manifestă şi la Mycoplasma.
De aceea, tetraciclina nu se foloseşte pentru tratamentul primar al infecţiilor tractului respirator inferior.
Deşi acţiunea sa principală este antibacteriană, tetraciclina este activă faţă de protozoarele parazite:
inhibă Giardia intestinalis, Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica, Plasmodium falciparum. Eficienţa
derivaţilor tetraciclinei faţă de protozoarele parazite este corelată cu gradul de pătrundere în celulă. Cei mai
eficienţi sunt derivaţii lipofili, care străbat repede membrana citoplasmatică (tiotetraciclina).

Mecanismele rezistenţei la tetracicline

Numeroase specii bacteriene au dobândit rezistenţă la acţiunea bacteriostatică a tetraciclinelor. S-au


identificat cel puţin 24 de gene codificatoare ale rezistenţei la tetraciclină şi trei determinanţi de rezistenţă la
oxitetraciclină, mai întâi la Streptomyces, care produce oxitetraciclina şi la Mycobacterium sp.
Rezistenţa determinată genetic (Taylor, 1996) este mediată de 3 mecanisme diferite:
- activitatea pompelor de eflux, dependente de energie, care elimină tetraciclina din celulă;
- protecţia ribosomilor prin intermediul proteinelor solubile;
- inactivarea enzimatică (degradarea oxidativă)a antibioticelor.
Cele mai multe gene de rezistenţă codifică pentru unul dintre cele două mecanisme importante ale
rezistenţei: efluxul sau protecţia ribosomilor. Aceste două mecanisme de rezistenţă la tetracicline sunt cele
mai răspândite şi nu degradează compusul chimic. Proteinele de eflux schimbă un proton pentru un complex
tetraciclină-cation şi sunt sisteme antiport.
Rezistenţa la tetraciclină poate fi consecinţa sintezei unor proteine ce interacţionează cu ribosomul.
Proteinele protejează ribosomii de interacţiunea cu antibioticul, astfel încât sinteza proteinelor rămâne
neafectată în prezenţa antibioticului. Protecţia ribosomilor celulari este mediată de cel puţin 6 clase de
proteine: TetM, TetO, TetP, TetQ, TetS, OtrA, la care s-au adăugat ulterior TetT şi TetW. Protecţia ribosomilor
de acţiunea tetraciclinei, ca mecanism de rezistenţă, s-a descoperit la Streptococcus. Proteinele protectoare ale
ribosomilor conferă rezistenţă la tetraciclină, doxiciclină şi minociclină. Ele se aseamănă cu EF-G, proteina
care catalizează reacţia de translocaţie, etapa următoare treptei inhibată de legarea tetraciclinei.
Proteina TetM, descoperită iniţial la Streptococcus, unde este codificată de transpozoni conjugativi ca
Tn916 şi Tn1545, dar şi la numeroase bacterii Gram negative (Neisseria, Haemophilus, Bacteroides), dar şi la
Mycoplasma, Ureaplasma, Streptococcus, Staphylococcus. Proteina TetM s-a purificat (72 kDa) şi s-a arătat
că În vitro se asciază cu ribosomii. În prezenţa TetM, legarea teraciclinei la ribosom nu este alterată, dar
legarea nu modifică funcţionalitatea ribosomului. Are efect protector În vitro, faţă de acţiunea tetraciclinei.
Explicaţia efectului protector este că proteina se asociază cu ribosomii, făcându-i insensibili la acţiunea
tetraciclinei. TetO este o proteină codificată de o plasmidă la Campylobacter coli, Campylobacter jejuni şi la
bacteriile Gram pozitive, unde pare a fi codificată de o genă cromosomală. TetQ s-a identificat la Bacteroides
sp. TetS, la Listeria monocytogenes, este codificată de o genă plasmidială, iar la Enterococcus faecalis, gena
codificatoare pare a fi localizată pe cromosom. TetP este codificată de o plasmidă la Clostridium perfringens.
OtrA, de la Streptomyces rimosus, producător de oxitetraciclină, este codificată de o genă crmosomală. Toate
112
proteinele care conferă protecţia ribosomilor sunt polipeptide de dimensiuni uniforme: TetO are 639
aminoacizi, iar OtrA, 661. Gradul de omologie şi de identitate a aminoacizilor diferitelor proteine atinge 75%
şi respectiv 37 %.
Genele codificatoare ale proteinelor de protecţie ribosomală sunt larg distribuite la bacterii, ceea ce a
sugerat ideea mobilităţii determinanţilor genetici de la organismele producătoare de antibiotic la cele de
interes clinic.

Mecanismul de acţiune a proteinelor de protecţie ribosomală

Protecţia ribosomală este rezultatul sintezei unor proteine codificate de genele de rezistenţă, care se
asociază cu ribosomii şi interferă cu legarea tetraciclinei. Tetraciclinele inhibă sinteza proteinelor prin legarea
cu afinitate înaltă, de un singur situs localizat pe subunitatea ribosomală 30S, probabil de proteinele S 7, S14 şi
S19. Legarea tetraciclinei în acest situs blochează legarea aminoacil-ARNt sintetazei la situsul ribosomal A
(acceptor). Treapta sintezei proteice inhibată de tetraciclină este cea catalizată de EF-Tu ( elongation factor
thermo-unstable).
Activitatea pompelor de eflux este o modalitate de a limita accesul tetraciclinei la ribosomi şi are ca
rezultat creşterea capacităţii celulei de a elimina antibioticul la o rată egală cu rata înglobării. Este cel mai
comun mecanism de rezistenţă, mediat de produsele de sinteză ale genelor de rezistenţă: acestea sunt proteine
ale membranei citoplasmatice care funcţionează ca transportori ai tetraciclinei, dependenţi de energie. Deşi
efluxul împiedică acumularea tetraciclinei chiar în celulele rezistente, nivelul intracelular al antibioticului
depăşeşte nivelul inhibitor al sintezei proteinelor (Speer, 1992). Explicaţia se bazează pe capacitatea
tetraciclinei de a exista în mai multe forme ionice. Este posibil ca o anumită formă ionică să se lege mai uşor
de ribosomi, comparativ cu altele. La tulpinile rezistente, este eliminată forma activă a antibioticului, iar în
celulă rămâne o concentraţie mare de tetraciclină inactivă sau mai puţin activă, compatibilă cu sinteza
proteinelor. Genele tet, codificatoare ale proteinelor de eflux, sunt asociate cu plasmide conjugative, ceea ce
explică distribuţia largă a rezistenţei. Proteinele de eflux sunt molecule membranare, care funcţionează ca
pompe de export dependente de energie. Sunt sisteme antiport, care schimbă un proton pentru un complex
tetraciclină-cation. Rezultatul activităţii pompelor de eflux este scăderea concentraţiei intracelulare a
antibioticului şi protecţia ribosomilor. Majoritatea genelor tet codificatoare ale proteinelor de eflux ale
bacteriilor Gram negative (tetA, tetB, tetC, tetD, tetE, tetG şi tetH) au organizare genetică comună, diferită de
a genelor bacteriilor Gram pozitive. Ele conferă rezistenţă la tetraciclină, dar nu la minociclină sau la
glicilcicline şi cele mai multe sunt localizate în structura unor plasmide mari, conjugative, în care se găsesc
gene de rezistenţă la alte antibiotice, gene de rezistenţă la metale grele şi de sinteză a unor factori de virulenţă
aşa cum sunt toxinele. Proteinele de eflux sunt proteine membranare de circa 46 kDa.
Impermeabilitatea structurilor de suprafaţă ale celulei constituie o cauză importantă a rezistenţei la
tetracicline. Pentru a inhiba sinteza proteinelor, tetraciclinele trebuie să pătrundă în celula bacteriană şi să se
lege de ribosomi. Tetraciclina poate exista în două forme: o formă protonată (TH 2) şi o formă legată de Mg2+
(THMg). Proporţia THMg2+ creşte la pH mai mare. Tetraciclina este acumulată în celulă ca THMg 2+, deoarece
pH intern este mai mare decât cel extern. Forma protonată a tetraciclinei difuzează prin membrana
citoplasmatică. Difuzia simplă nu explică faptul că bacteriile sensibile acumulează tetraciclină în citoplasmă.
În afara difuziei, tetraciclina este înglobată printr-un mecanism dependent de energie, care nu implică o
proteină de transport, ci diferenţa de pH între mediul celular şi extracelular. Alterarea porinelor, cu limitarea
difuziei tetrciclinelor în spaţiul periplasmic este un mecanism posibil de rezistenţă la bacteriile Gram negative.
Cele 2 mecanisme de rezistenţă la tetracicline (proteinele protectoare ale ribosomilor şi proteinele de
eflux) nu inactivează antibioticul. Rareori, antibioticul este inactivat sau modificat pe cale chimică.
Inactivarea enzimatică a tetraciclinelor nu are semnificaţie ca mecanism de rezistenţă, dar s-a
evidenţiat la Bacteroides. Câteva specii de Bacteroides (bacterie anaerobă) degradează oxidativ molecula de
antibiotic. Gena care codifică acest tip de rezistenţă este localizată pe 2 transpozoni înrudiţi, ce poartă de
asemenea o genă de rezistenţă la eritromicină. Gena codificatoare a enzimei care degradează tetraciclina s-a
identificat iniţial, prin capacitatea ei de a conferi rezistenţă pentru E. coli crescută în condiţii aerobe, dar a fost
inactivă faţă de celulele de E. coli crescute în anaerobie sau de Bacteroides.

113
Gliciltetraciclinele sunt reprezentate de tigeciclină, utilizată pentru tratamentul infecţiilor cutanate şi
intraabdominale. Caracteristica structurală a tigeciclinei constă în substituţia în poziţia 9 a tetraciclinei, cu un
rest de glicină. Este un antibiotic cu spectru larg de acţiune faţă de bacterii Gram pozitive, Gram negative,
aerobe şi anaerobe, dar şi faţă de bacterii patogene rezistente la alte antibiotice: enterococi rezistenţi la
vancomicină, S. aureus meticilino-rezistent (MRSA), Str. pneumoniae rezistent la penicilină. Este activă faţă
de patogenii Gram negativi: enterobacterii, H. influenzae, N.gonorrhoeae, Legionella pneumophila,
micobacterii netuberculoase cu creştere rapidă.

Structura moleculară a tigeciclinei

Dactilociclinele sunt derivaţi ai tetraciclinei, produşi de Dactylosporangium. Ele diferă de alţi derivaţi
prin aceea că sunt tetracicline glicozidice. Utilizarea clinică ete limitată, deoarece par să fie active numai faţă
de tulpinile bacteriene care poartă gene de rezistenţă la tetraciclină, din clasa K. Unele izolate bacteriene
sensibile la tetraciclină, nu sunt inhibate de dactilocicline. Incapacitatea lor de a inhiba bacteriile Gram
pozitive şi negative, se datorează probabil impermeabilităţii structurilor de suprafaţă faţă de dactilocicline
(Speer şi colab., 1992).
Tetraciclinele se administrează oral, dar unele sunt disponibile ca produse pentru administrare
parenterală. După administrare orală, tetraciclinele sunt absorbite în stomac şi în intestinul subţire. Absorbţia
este influenţată de conţinutul alimentar şi de cationii bivalenţi. Cu ionii de Ca 2+, tetraciclinele formează
complexe neabsorbabile. Ele pătrund moderat în fluidele organismului şi în ţesuturi şi sunt excretate prin
urină.
Tetraciclinele sunt antibiotice cu spectru larg, fiind utilizate în clinica umană pentru tratamentul
infecţiilor cu bacterii Gram pozitive şi Gram negative. Sunt de asemenea active faţă de agentul malariei şi se
folosesc pentru profilaxia tulpinilor de Plasmodium falciparum rezistente la agenţii chimioterapeutici
specifici.

5.3. Macrolidele, Lincosamidele şi Streptograminele

Macrolidele, lincosamidele şi streptograminele (MLS) au o structură chimică diferită, dar acţionează


într-o manieră asemănătoare asupra unei game variate de bacterii (Gram pozitive, coci Gram negativi,
Chlamydia, micoplasme, Legionella). Absenţa efectului asupra bacililor Gram negativi se explică prin

114
incapacitatea de a difuza prin membrana externă, datorită caracterului hidrofob al moleculei lor. Macrolidele
şi lincosamidele au proprietăţi antibacteriene, cel mai adesea bacteriostatice.
Mecanismele de acţiune ale antibioticelor grupului MLS
MLS acţionează asupra ribosomilor şi împiedică ribosomul bacterian să traducă ARN în două moduri
diferite. Situsul acţiunii macrolidelor este subunitatea mare a ribosomilor bacterieni.
a) Macrolidele inhibă sinteza proteică dependentă de ARN, la treapta alungirii catenei, producând
inhibiţia translocării peptidil-ARNt de la situsul acceptor(A), la situsul peptidil donor (P). Ele se leagă de
subunitatea ribosomală 50S şi interferă cu procesul de translocaţie a polipeptidului nascent, deoarece
stimulează disocierea complexului peptidil-ARNt de ribosomi, în timpul sintezei. Centrul peptidil-transferazei
(din subunitatea 50S) este situsul interacţiunii antibioticelor MLS, al cloramfenicolului şi puromicinei şi pare
a fi format în întregime de structura secundară a ARN 23S, ce formează 6 domenii. Aceasta sugerează că
legăturile peptidice sunt catalizate de ARNr. Macrolidele şi ketolidele interacţionează cu nucleotidele ARNr
23S (A2058, A2059 şi G2505) din bucla centrală a domeniului V, componente ale centrului peptidil-
transferazei şi blochează interacţiunea lor cu reactivii fiziologici. Consecinţa este terminarea prematură a
catenei şi oprirea reversibilă a sintezei proteinelor. Pentru eritromicină este suficientă legarea unei singure
molecule cu subunitatea mare a ribosomului. Eritromicina interacţionează cu ARNr, la nivelul unei bucle a
unor domenii îndepărtate în structura primară a ARN, dar care prin pliere sunt aduse în juxtapoziţie:
domeniile II şi V ale ARNr 23S. Macrolidele probabil se leagă la situsul peptidil donor (P) al ribosomului şi
prin competiţie interferă cu translocaţia peptidului de la situsul acceptor la situsul donor. Eritromicina poate să
producă disocierea peptidil-ARNt de ribosom. La E. coli, eritromicina inhibă formarea subunităţii ribosomale
50S.
b) Al doilea mecanism de acţiune constă în inhibarea treptelor iniţiale ale asamblării subunităţii
ribosomale 50S. Macrolidele şi ketolidele interacţionează cu subunitatea 50S parţial asamblată, blocând
procesul asamblării. Componentele neasamblate sunt supuse degradării nucleolitice. În celulele tratate cu
eritromicină se acumulează un precursor al subunităţii 50S. Eritromicina se leagă de subunitatea incompletă
formată din ARNr 23S, 5S, dar conţine numai 18 dintre cele 34 proteine ribosomale ale subunităţii mari.
Situsul de legare la subunitatea ribosomală 50S este comun pentru eritromicină, pentru macrolidele
noi, pentru lincosamidă şi streptogramina B.
Pentru eritromicină şi claritromicină s-a identificat un nou mecanism de acţiune: ele inhibă sinteza
ARNm pentru producerea endotelinei-1, la concentraţii terapeutice, necitotoxice. Endotelina-1 este un
polipeptid cu potenţial vasoconstrictor cunoscut şi are efecte bronhoconstrictoare. Stimulează secreţia de
mucus şi produce edemul mucoasei, având rol de mediator al inflamaţiei căilor aeriene. Procesul inflamator
este multifactorial şi macrolidele acţionează pe mai multe căi: cele derivate din eritromicină inhibă sinteza
citochinelor proinflamatorii (TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12 şi IFN-).

Macrolidele

Denumirea de macrolide desemnează un grup de antibiotice înrudite structural, produse de specii ale
g. Streptomyces.
Grupul macrolidelor cuprinde numai compuşi nepolienici (de exemplu, eritromicina). Compuşii care
conţin un sistem format din mai mult de două legături duble de C conjugate, sunt clasificaţi ca poliene. Din
punct de vedere structural, macrolidele sunt caracterizate printr-un inel lactonic multiunitar, cu puţine legături
duble, fără atomi de N, la care se ataşează, prin legături glicozidice, 1-3 componente glucidice. Macrolidele
pot fi glucide aminate sau glucide fără N (neutre). Sunt poliketide naturale, produse ale metabolismului
secundar la multe specii ale g. Streptomyces.
Macrolidele prezintă diferenţe structurale, dar posedă un schelet de C comun. După numărul de atomi
de C ai inelului lactonic (de obicei par), se disting compuşi cu 12, 14, 15 sau 16, cu substituienţi variaţi
(grupări metil, hidroxil). Prezenţa grupărilor determină asimetria centrilor inelului lactonic. Componentele
glucidice ataşate prin legături glicozidice de inelul lactonic sau legate una de alta, sunt totdeauna 6-
deoxihexoze. Glucidele poartă grupări N-, O- sau metil. La unele macrolide, glucidele sunt esterificate de un
acil: grupul acetil sau izovaleril. Inelul lactonic al antibioticelor macrolide este sintetizat din unităţi acetat,
care sunt adăugate gradat. Inelul lactonic al spiramicinei are duble legături care pot lega aceste macrolide cu
macrolidele polienice.
Fiecare compus are caracteristici chimice cât şi biologice, proprii:
- majoritatea celor care au cicluri formate din 14 atomi de C sunt substanţe naturale (eritromicina,
oleandomicina) sau derivaţi semisintetici (roxitromicina, diritromicina, claritromicina);
- un singur compus cu 15 atomi (azitromicina);
115
- compuşi naturali cu 16 atomi (josamicina, spiramicina, kitasamicina, midecamicina şi tilosina) sau
derivaţi semisintetici(rokitamicina, miocamicina, tilmicosina).

Structura moleculară a eritromicinei A (R=H) şi Structura moleculară a ABT-773


claritromicinei (R=CH3)

Structura moleculară a tilosinei

Macrolidele importante din punct de vedere clinic


Eritromicina A, primul antibiotic macrolid utilizat în clinică, posedă un inel cu 14 atomi. Tilosina, un
macrolid cu 16 atomi, este utilizată în zootehnie atât ca agent terapeutic cât  şi ca stimulator de creştere.
Claritromicina este derivatul 16-metoxi al eritromicinei şi acum se foloseşte pentru eradicarea infecţiei cu H.
pylori.

Structura moleculară a claritromicinei

116
Eritromicina, cel mai important antibiotic macrolid, este produsă de Streptomyces erythreus, izolată
dintr-un sol din Filipine. A fost primul antibiotic macrolid introdus în terapie în 1952 şi este reprezentativ
pentru clasa macrolidelor. Structura sa constă dintr-un inel lactonic macrociclic, de care se ataşează două
resturi de zahăr.

Structura moleculară a eritromicinei

Este puţin solubilă în apă şi este rapid inactivată de sucul gastric. Ca şi alte macrolide, eritromicina
penetrează greu peretele bacteriilor Gram negative. Eritromicina este un antibiotic cu spectru larg: este activă
faţă de bacteriile Gram pozitive şi Gram negative, faţă de actinomicete, Mycobacterium, T. pallidum,
Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia, Rickettsia. În funcţie de concentraţie, de specie, de faza de creştere sau
de densitatea inoculului, eritromicina poate fi bacteriostatică sau bactericidă. Eritromicina este un înlocuitor al
penicilinei, la persoanele alergice pentru ciclul β-lactamic.
Cele mai multe antibiotice macrolide sunt substanţe bazice, dar unele sunt neutre. Unele sunt solubile
în apă, iar altele, insolubile în apă, dar solubile în etanol. Cele folosite în clinică constau dintr-un inel lactonic
cu 14, 15 sau 16 atomi de C, substituit cu două sau mai multe glucide neutre sau aminate la C3 şi C5.
Macrolidele inhibă creşterea bacteriilor, dar nu sunt active faţă de fungi, iar lactonele polienice inhibă
fungii, dar nu influenţează creşterea bacteriilor.
Spectrul de activitate al macrolidelor include bacteriile Gram pozitive (Staphylococcus şi
Streptococcus) şi pe cele anaerobe (Clostridium). Bacteriile Gram negative (H. pylori, Haemophilus spp.
Pasteurella spp. şi Legionella spp.) sunt de asemenea sensibile. Microorganismele enterice (E. coli şi
Salmonella) sunt intrinsec rezistente, prin excluderea macrolidelor din citoplasmă datorită arhitecturii
membranei externe.
Moleculele noi, ca azitromicina şi claritromicina au activitate antibacteriană superioară eritromicinei,
deoarece au coeficienţi superiori de penetrare intracelulară şi tisulară, sunt mai stabile, mai uşor absorbite, iar
efectele secundare gastrointestinale au o incidenţă mai scăzută. Azitromicina este activă faţă de bacteriile
enterice. Mycoplasma spp. şi Chlamydia spp. sunt de asemenea sensibile la macrolide. Claritromicina are
activitate antibacteriană semnificativă, În vitro, faţă de micobacteriile netuberculoase.
Macrolidele sunt antibiotice bacteriostatice, utilizate pentru tratamentul unui spectru larg de infecţii
bacteriene ale tractului respirator cu Legionella, Chlamydia, Haemophilus, unele specii de Mycobacterium
(M. intracellulare, M. avium, dar nu M. tuberculosis), ulcerului gastric asociat cu H. pylori şi infecţii ale
ţesuturilor moi.

Streptograminele

Streptograminele sunt reprezentate de doi compuşi (A şi B) cu acţiune sinergică. Ca şi macrolidele şi


lincosamidele şi compuşii A şi B ai streptograminelor se fixează la subunitatea 50S a ribosomilor, la nivelul
ARNr 23S.

117
Lincomicina şi clindamicina

Aceste doua antibiotice nu sunt macrolide, dar multe dintre proprietăţile lor biologice sunt
asemănătoare cu ale eritromicinei. Sunt formate dintr-un aminoacid legat cu un zahăr aminat. Lincomicina
este sintetizată de Streptomyces lincolnensis (izolată din solul din Lincoln, Nebraska).

Structura moleculară a lincomicinei

Trăsăturile structurale specifice ale lincomicinei sunt reprezentate de prezenţa grupărilor –N-CH 3 şi S-
CH3. Originea multor grupări metil, legate de O, N şi C este în compuşii C 1. Grupele metil sunt transferae prin
transmetilare din sistemele donoare C1.
Lincomicina este activă faţă de o largă varietate de bacterii, în primul rând Gram pozitive. Ele au
aceleaşi situsuri de legare la subunitatea 50S, ca şi macrolidele şi cloramfenicolul şi pot intra în competiţie
pentru legare. Deşi sunt foarte diferite ca structură chimică, eritromicina şi clindamicina se leagă de
subunitatea ribosomală 50S. Inhibă sinteza proteinelor prin interferenţă cu reacţia de transpeptidare, probabil
prin blocarea situsului P (peptidil-donor). Astfel este blocată alungirea catenei peptidice. Efectul este
bacteriostatic.
Macrolidele şi lincomicina sunt bacteriostatice: inhibă numai iniţierea noilor catene peptidice.
Utilizarea terapeutică a macrolidelor a fost sever compromisă de emergenţa tulpinilor rezistente ale
multor specii de bacterii patogene. Fenomenul de rezistenţă a apărut curând după introducerea eritromicinei în
terapie în anii ’50. S-a observat că tulpinile rezistente la eritromicină, au devenit rezistente nu numai la toate
celelalte macrolide, dar şi la lincosamidă şi streptogramină B, antibiotice neînrudite chimic cu macrolidele. De
aceea, fenomenul s-a denumit ’’rezistenţa fenotipică la macrolide-lincosamidă-streptogramină B’’(MLS B).

Mecanismele rezistenţei la antibioticele MLS

Rezistenţa la antibioticele MLS (macrolide, lincosamida şi streptogramina B) este indusă prin mai
multe mecanisme:
- scăderea permeabilităţii peretelui celular la medicament;
- efluxul activ al medicamentului din celulă. Pompele prin care celula elimină agenţii antimicrobieni
aparţin suprafamiliei MSF (Major Superfamily Facilitator) sau RND (Resistance, Nodulation and
cell Division). Ambele folosesc forţa proton-motrice pentru energizarea efluxului. Supraproducţia
constitutivă a proteinelor de eflux, în absenţa agentului chimic, creează un dezavantaj sever în
competiţia cu cele la care proteinele de eflux sunt exprimate adaptativ;
- modificarea mutaţională a unei singure proteine a subunităţii 50S;
- modificarea ARNr 23S al subunităţii 50S prin metilare. Metilazele sunt codificate de genele erm
(erithromycin ribosome methylation);
- inactivarea enzimatică a antibioticelor: enzimele care hidrolizează inelul lactonic al nucleului
macrolid şi fosfotransferazele care inactivează macrolidele prin fosforilarea grupării 2’-OH a
glucidului aminat.
Rezistenţa la macrolide este cel mai adesea rezultatul modificării ţintei antibioticului şi constă în
modificarea posttranscriere a ARNr 23S sub acţiunea adenin-N 6-metiltransferazei. Unele metilaze conferă
rezistenţă numai la unul sau la două antibiotice ale clasei MLS B. Enzimele de metilare adaugă una sau două
118
grupe metil la un rest de adenină situat într-o poziţie fixă (A2058 la E. coli) a ARNr 23S. Metilarea are ca
rezultat schimbarea conformaţională a ribosomilor, ducând la scăderea afinităţii pentru toate antibioticele
MLS. Metilaza ribosomală conferă rezistenţă încrucişată la antibioticele MLSB, deoarece situsurile de legare
ale acestor antibiotice se suprapun.
La diferite tulpini bacteriene patogene s-au evidenţiat zeci de gene codificatoare ale metil-
transferazei. Genele s-au denumit erm (erythromycin ribosome methylation - A, B, C, D, E, F, G, H, L, N, O,
Q, R, S, T, U, V, W, X, Y) şi s-au izolat de la o largă varietate de bacterii Gram pozitive şi Gram negative.
Multe metil-transferaze sunt exprimate constitutiv. Toate enzimele Erm ale unei clase metilează ţinta
ribosomală a macrolidelor, adenozina 2058.
Expresia rezistenţei la MLSB poate fi constitutivă sau inductibilă. Tipul de rezistenţă depinde de
secvenţa reglatoare de gena structurală a metilazei. Dacă expresia rezistenţei este inductibilă, tulpinile sunt
rezistente numai la macrolidele cu 14 şi 15 atomi de C, iar macrolidele cu 16 atomi de C, lincosamida şi
streptogramina rămân active. La tulpinile de S. aureus, rezistenţa la MLSB poate fi indusă prin expunerea
culturii la concentraţii mici de eritromicină, care induce expresia enzimei metil-transferază (Erm-C). Metil-
transferaza metilează specific ARN 23S la poziţia N-6 a adenozinei din poziţia 2058 (A2058) la E. coli, un
nucleotid esenţial pentru legarea antibioticelor MLS B.
Tulpinile bacteriene cu ARNr-metilaze inductibile au predominat în anii ’60-’70. Astăzi, în multe arii
geografice se izolează tulpini care sintetizează constitutiv ARNr-metilaze, fără preexpunere la antibiotic.
Expresia constitutivă a genei erm se datorează alterărilor structurale ale atenuatorului traducerii erm, datorate
deleţiilor, duplicaţiilor sau mutaţiilor punctiforme.
Multe gene erm fac parte din structura unor transpozoni conjugativi sau neconjugativi, localizaţi pe
cromosom, deşi unele gene erm s-au găsit în structura genetică a plasmidelor. În general, genele erm sunt
asociate cu gene de rezistenţă la alte antibiotice, în special cu cele de rezistenţă la tetraciclină. Transpozonii
conjugativi pot avea un spectru larg de gazdă. Astfel se explică distribuţia largă a genelor erm la un număr
mare de specii bacteriene. Genele erm au un conţinut G+C scăzut (31-34%). Conţinutul G+C cromosomal al
bacteriilor Gram negative este mai mare sau egal cu 50%, iar al bacteriilor Gram pozitive este de circa 35%.
Alte gene de metilare sunt tlr, car, myr, smr şi toate conferă rezistenţă la macrolidele cu un inel de 16 atomi.
Numeroase cazuri de rezistenţă a tulpinilor bacteriene patogene la macrolide, pot fi datorate alterării
mutaţionale a nucleotidelor specifice în secvenţa ARNr 23S din subunitatea ribosomală mare, 50S. Adenina
2058 sau adenina adiacentă situsului de legare a peptidil-transferazei (A2057 sau A2059)este schimbată cu alt
nucleotid prin mutaţie şi conferă cel mai înalt grad de rezistenţă la anumite macrolide. Mutaţiile perturbă, într-
o măsură mai mare sau mică, structura situsului de legare, de unde rezultă scăderea capacităţii antibioticelor
macrolide de a interacţiona cu ribosomii şi de a inhiba activitatea lor.
Toate mutaţiile care perturbă structura situsului de legare a antibioticului la ARN 23S, reduc
capacitatea medicamentelor de a interacţiona şi de a inhiba activitatea ribosomilor. Metilarea ARNr la
A2058 sub acţiunea metil-transferazei conferă rezistenţă prin acelaşi mecanism. Un nivel mai scăzut al
rezistenţei este produs prin mutaţiile la poziţiile 2057, 2452 şi 2611, situate în afara centrului de interacţiune
al moleculei ARNr cu macrolidele. Mutaţiile ARNr s-au identificat prin tehnicile bazate pe PCR: regiunea
genei ARN 23S a H. pylori codificatoare a secvenţei adiacente nucleotidei A2058 a fost amplificată şi
analizată pentru tabloul acţiunii enzimelor de restricţie şi prin hibridare cu probele de oligonucleotide.
Mutaţiile proteinelor ribosomale L4 şi L22 ale subunităţii 50S induc rezistenţa la macrolide la Str.
pneumoniae, datorită alterării conformaţiei situsului care leagă medicamentul. Cele două proteine sunt în
contact direct cu A2058 şi A752 din regiunea peptidil-transferazei.
Mutaţii ale ARNr care conferă rezistenţă la macrolide. Mecanismul rezistenţei mutaţionale a fost
studiat la Helicobacter pylori. Agentul infecţios colonizează stomacul la circa 30% dintre indivizii umani
adulţi. Majoritatea infecţiilor sunt asimptomatice, dar H. pylori este principalul agent etiologic al celor mai
multe ulcere duodenale şi multor ulcere gastrice. Este asociat cu dezvoltarea unor tipuri de neoplazie gastrică.
Tratamentul preferat pentru infecţiile agresive este o combinaţie de medicamente care include un derivat al
eritromicinei - claritromicina care ameliorează stabilitatea mediului acid şi un inhibitor al pompei de protoni.
Rezistenţa la claritromicină apare în timpul terapiei şi s-a atribuit mutaţiilor la poziţiile A2058 sau A2059 în
ARNr 23S. La H. pylori nu s-au identificat gene de metilare a ARNr şi nici sisteme de eflux ale macrolidelor.
Mecanismele rezistenţei par a fi limitate la apariţia mutaţiilor ARNr 23S.
Dată fiind secvenţa foarte stabilă a ARNr la diferite specii de bacterii, este de presupus că mutaţiile
identice vor produce acelaşi fenotip la diferite specii bacteriene. Au fost identificate situsurile mutaţiei ARNr
care conferă rezistenţa bacteriilor patogene la macrolide:

119
- apariţia mutaţiilor la poziţia A2057 este limitată la un grup de propionibacterii rezistente la
eritromicină şi la o tulpină dublu mutantă de H. pylori, cu o mutaţie la poziţia 2032, suplimentară faţă
de substituţia 2057;
- adenozina 2058 este nucleotidul esenţial pentru interacţiunea macrolidelor cu ribosomul. Mutaţia
A2058 la G a fost prima mutaţie identificată a ARNr, care că conferă rezistenţă la eritromicină;
- mutaţiile A2059 la C sau G s-au identificat la Mycobacterium, Propionibacterium, H. pylori şi
Streptococcus pneumoniae. În experimentele in vitro, mutantele A2059 la H. pylori au niveluri
inferioare de rezistenţă la claritromicină, comparativ cu mutantele A2058.
După expunerea la antibioticele macrolide, tipurile de mutaţii menţionate ale ARNr pot să devină
dominante în scurt timp în populaţiile de celule care posedă numai 1sau 2 operoni rrn (genele transcrise în
ARNr). Cu cât celula posedă mai puţini operoni rrn, cu atât creşte probabilitatea apariţiei rezistenţei la
macrolide prin mutaţiile ARNr. Mutaţiile spontane ale ARNr apar constant cu frecvenţă mică în populaţiile
bacteriene, iar medicamentele exercită presiune selectivă, favorizând supravieţuirea şi proliferarea mutantelor.
La bacteriile cu operoni rrn multipli, efectul benefic al mutaţiei într-un operon nu oferă avantaj fenotipic
semnificativ. Dar amplificarea genei alele mutante, astfel încât să se extindă la majoritatea operonilor rrn ai
celulei, poate conferi un fenotip rezistent. Mutaţia ARNr 23S are un potenţial foarte mare de emergenţă a
mutantelor rezistente la macrolide. În general, la bacteriile cu operoni rrn multipli, rezistenţa este mediată de o
metil-transferază codificată de gena erm, cea care are capacitatea potenţială de a modifica toţi ribosomii.
Rezistenţa prin sistemul de eflux. Unele gene de rezistenţă codifică proteine de transport, cu rol în
efluxul proteinelor. Acestea nu modifică antibioticul şi nici ţinta antibioticului, ci au rol de pompe de
eliminare a antibioticului din citoplasmă sau din situsurile membranare de legare, menţinând astfel
concentraţia intracelulară scăzută. Multe dintre proteinele de eflux, codificate mef (macrolide efflux) sunt
omologe structural cu celelalte proteine de eflux. La S. aureus funcţionează un sistem membranar al pompelor
de eflux pentru macrolide.
A fost descrisă existenţa enzimelor care hidrolizează streptogramina B sau modifică antibioticul prin
adăugarea unui grup acetil (acetil-transferaze) la streptogramina A. Degradarea prin hidroliza inelului lactonic
al macrolidelor sub acţiunea unei esteraze şi modificarea prin fosforilarea macrolidelor şi nucleotidilarea
lincosamidei sunt mecanisme puţin importante pentru rezistenţa la MLS B. Un număr mic de tulpini bacteriene
poartă gene pentru sinteza enzimelor inactivatoare.
În general, eficienţa terapeutică a antibioticelor se evaluează prin inhibiţia creşterii bacteriene În vivo,
când concentraţia antibioticului măsurată de obicei în ser, depăşeşte concentraţia minimă inhibitorie (CMI)
evaluată in vitro. Macrolidele administrate în scop terapeutic, adeseori ating o concentraţie serică mai mică
decât valoarea CMI. Concentraţiile serice ale macrolidelor mai mici decât valoarea CMI sunt inhibitorii prin :
- modificarea expresiei unor factori de virulenţă: adezine, toxine, exoenzime, motilitatea flagelară;
- inducerea unor modificări structurale detectabile la microscopul electronic;
- creşterea sensibilităţii la factorii serici litici.
Toţi aceşti factori diminuă capacitatea agentului patogen de a produce manifestările patologice
specifice.
Eficienţa terapeutică a concentraţiilor unor antibiotice, inclusiv ale macrolidelor, mai mici decât CMI
se poate datora altor factori: macrolidele se concentrează în leucocite şi pot fi astfel transportate la situsul
infecţiei, unde sunt parţial eliberate. Macrolidele interferă cu răspunsul inflamator declanşat de agentul
infecţios: leucocitele (neutrofile, monocite, macrofage) concentrează în lizosomi, macrolidele din mediul
extracelular neimplicat (ţesuturi, vase) şi le transportă în situsul infecţios prin răspunsul chimiotactic,
eliberând antibioticul în stare activă.
Dozele subinhibitorii ale macrolidelor induc modificări structurale fine ale membranei externe şi
modifică sensibilitatea la factorii serici antibacterieni (proteinele ce leagă Fe, proteinele de fază acută,
complementul, anticorpi naturali).
Emergenţa tulpinilor rezistente la antibiotice a stimulat căutarea unor noi agenţi antimicrobieni.
Telitromicina este primul antibiotic cu inel de 14 atomi de C, din grupul ketolidelor, introdus în clinică.
Ketolidele sunt derivaţi semisintetici ai eritromicinei A, cu proprietăţi biologice noi.
Ketolidele reprezintă o nouă entitate chimică, caracterizată prin înlocuirea L-cladinozei din inelul A al
eritronolidei, cu o funcţie 3-ceto şi un carbamat la C11- C12. Restul 3-OH rămas după înlăturarea L-
cladinozei (un glucid neutru) a fost oxidat la grupul 3-ceto. Denumirea clasei derivă de la gruparea 3-ceto şi
de la inelul lactonic (Ackermann, 2003). Telitromicina şi ABT 773 reprezintă cea mai recentă generaţie de
medicamente, caracterizate prin grupul 3-cetonic ce substituie restul de zahăr 3-cladinoză din eritromicină şi
claritromicină.

120
Ambele ketolide au gruparea carbamat C11-C12, care la telitromicină se extinde cu un grup alkil-aril. Această
extensie permite telitromicinei să interacţioneze cu domeniul al II-lea al ARNr 23S (Vester, 2001).

Structura moleculară a telitromicinei:


Grupul metoxi (a) la C6 favorizează stabilitatea în mediul acid şi împiedică hemiacetalizarea internă; funcţia ceto (b)
elimină inducerea rezistenţei încrucişate cu MLS şi favorizează legarea de ribosom; lanţul lateral carbamat (c) ataşat la
C11/C12 măreşte afinitatea pentru ribosomi şi ameliorează interacţiunea cu ribosomii rezistenţi la MLS B
(după Tran, 2004).

S-a considerat că L-cladinoza este esenţială pentru activitatea antimicrobiană a macrolidelor cu inel de
14 atomi de C, deoarece scoaterea ei din claritromicină, azitromicină şi roxitromicină duce la pierderea
activităţii antimicrobiene. Dar modificarea altor poziţii ale inelului, compensează pierderea cladinozei.
Această nouă clasă de compuşi antimicrobieni a fost produsă pentru a depăşi rezistenţa prin mecanismele
obişnuite a cocilor Gram pozitivi, faţă de eritromicina A.
Telitromicina se leagă de ribosomi cu afinitate de până la 10 ori mai mare decât eritromicina, dar
legarea la situsul critic A 2058 este considerabil redusă. Telitromicina are o activitate antimicrobiană În vitro,
faţă de bacteriile aerobe Gram pozitive, mai bună decât a macrolidelor. Este foarte activă faţă de patogenii
respiratori atipici (Bordetella sp, Legionella sp., Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae). Este
activă faţă de câteva bacterii Gram pozitive şi negative: Clostridium sp., Peptostreptococcus sp. şi
Bacteroides sp. Este inactivă faţă de enterobacterii, faţă de Acinetobacter baumanii (bacil Gram negativ). Se
acumulează în celulele PMN şi în macrofage, unde atinge concentraţii de 130 şi respectiv de 71 de ori mai
mari decât în compartimentul extracelular. Din aceste celule, antibioticul este eliberat lent, ceea ce sugerează
că ele acţionează ca vehicule de transport spre focarul infecţios. Telitromicina este metabolizată în ficat.
Metabolitul major (un alcool) este de 4-16 ori mai puţin activ decât telitromicina şi este eliminat în proporţie
de 80% pe cale digestivă. Excreţia telitromicinei este aproape completă din urină, după 24 de ore, iar în fecale,
după 72 de ore.

5.4. Antibioticele β-lacamice

Descoperirea antibioticelor -lactamice este una dintre cele mai importante din istoria farmacologiei
terapeutice. La sfarşitul anilor ’40, Brotzu a izolat din apa mării (la Cagliari) organismul fungic producător de
penicilină, Cephalosporium chrysogenum (Acremonium chrysogenum). În culturile în mediul lichid s-a
descoperit alt antibiotic, derivat al compuşilor -lactamici, denumit cefalosporină.

Structura moleculară a acidului 6-aminopenicilanic

Antibioticele -lactamice conţin în molecula lor, un inel tetraatomic, în care o grupare carbonil şi un
atom de N formează o legătură amidică (o -lactamină). Prezenţa nucleului -lactamic conferă acestor

121
substanţe, proprietăţi fizico-chimice şi biologice specifice (tabelul 7). La peniciline, cel de-al II-lea nucleu al
structurii chimice a penicilinelor este inelul tiazolidinic. Penicilinele sunt derivate ale acidului 6-
aminopenicilanic. Cele două nuclee (-lactamic şi tiazolidinic) nu sunt coplanare, iar atomul de N iese în
afara planului. Atomii de H legaţi la C5 şi C6 au poziţie cis. C3 purtător al grupării –COOH este plasat în partea
opusă grupării amidice ataşată de C6. Prezenţa celor 3 atomi de C asimetrici (C3, C5, C6), determină activitatea
optică a moleculei de penicilină.
Structura penicilinei poate fi fragmentată în componentele din care se sintetizează: resturi de acid acetic
monosubstituit, L-cisteină şi D-valină.

Clasificarea antibioticelor β-lactamice

Familia antibioticelor β-lactamice cuprinde un număr mare de variante moleculare, primul


reprezentant fiind penicilina, care se pot clasifica în patru grupe:
- peniciline
- cefalosporine
- carbapeneme
- monobactami.
După modul de obţinere se disting :
- peniciline de biosinteză: penicilina G, penicilina V, penicilina N;
- peniciline de semisinteză: meticilina, oxacilina, ampicilina, carbenicilina, amoxicilina, azlocilina,
piperacilina;
- peniciline de sinteză chimică: peneme, monobactame, carbapeneme.
Componentele moleculare susceptibile de modificare chimică, cu implicaţii practice majore pentru
diversificarea antibioticelor -lactamice sunt: legătura C-N din inelul -lactamic, gruparea amino legată de C6,
gruparea –COOH legată de C3, atomul de S şi atomul de H ataşat de C 6. Legătura C-N din ciclul -lactamic
este mai reactivă decât cea din amidele obişnuite.

Tabelul 7.
Structura antibioticelor -lactamice şi organismele producătoare (după Chopra, 2001)

Clase de antibiotice Reprezentanţi Microorganisme producătoare


-lactamice naturale Fungi Bacterii
Gram pozitive Gram negative
Penam Peniciline Penicillium Streptomyces
chrysogenum clavuligerus
Aspergillus nidulans Nocardia lactamdurans

Ceph-3-em Cefalosporine Cephalosporium Str. clavuligerus Flavobacterium


Cefamicine chrysogenum sp.
Cefabicine Paecilomyces Lysobacter
Chitinovorine persicinus lactamgenus

Clavam Acid clavulanic Str. clavuligerus


Str. olivaceus

122
Carbapenem Tienamicine Nocardia uniformis Erwinia
Acid olivunic subsp. tsuyamanensis carotovora
Epitienamicine Seratia sp.

Monobactam Nocardicine Agrobacterium


Monobactami radiobacter
Pseudomonas
acidophila

Succesul antibioticelor -lactamice în tratamentul maladiilor infecţioase se datorează specificităţii şi


toxicităţii scăzute. În ciuda numărului mare de antibiotice şi a incidenţei crescute a izolatelor rezistente la
peniciline, antibioticele -lactamice sunt cele mai utilizate.
Deoarece enzimele de sinteză sunt adeseori instabile şi se găsesc în cantităţi mici, purificarea fiind
dificilă, căile biosintezei penicilinei (penam) şi a cefalosporinei (cefem) s-au elucidat la sfârşitul anilor ‘70.
Pe baza structurii chimice, -lactamii pot fi clasificaţi în 5 grupe. Toţi au în comun inelul -lactamic
cu 4 atomi. Cu excepţia monobactamilor care au un singur inel, antibioticele -lactamice constau dintr-un inel
biciclic.
Cefalosporinele sunt derivate N-acil ale acidului 7-aminocefalosporanic. Ele conţin ciclul -lactamic,
dar diferă structural de peniciline pentru că au un ciclu hexagonal de dihidrotiazină, în locul celui pentagonal
de tiazolidină. Prin condensarea celor două inele rezultă nucleul cefem. Cele două inele nu sunt aşezate în
acelaşi plan, iar atomii şi grupările ataşate lor pot ocupa poziţii foarte diferite.

Structura moleculară a acidului 7-aminocefalosporanic

Molecula de cefalosporină poate fi fragmentată în resturile din care este sintetizată: acid D--
aminoadipic, L-cisteină, --dehidrovalină şi de acid acetic. Nucleul cefem este mai stabil decât nucleul
penam, ceea ce explică numărul mare de cefalosporine semisintetice şi analogi sintetici. Cele două cicluri sunt
asemănătoare structural. În plus, penicilina N şi cefalosporina C au aceiaşi catenă laterală, ceea ce sugerează
asemănarea căilor de biosinteză. Cele două antibiotice -lactamice pot fi produse în condiţii care favorizează
numai o creştere lentă a micliului, în medii organice complexe sau definite chimic, în suspensii bine aerate.
Acţiunea antibacteriană s-a păstrat după modificările importante ale legăturilor atomilor din inelul
cefem, deoarece conservă o anumită configuraţie sterică. Mecanismul lor de acţiune este acelaşi cu al
penicilinelor: se leagă ireversibil de PBP şi împiedică formarea legăturilor transversale ale peptidoglicanului.
Cefalosporinele cu importanţă clinică majoră sunt semisintetice, cu spectru mai larg de activitate decât
penicilinele şi sunt, în general, mai rezistente la acţiunea β-lactamazelor.
Nucleul clavam are structura biciclică -lactamică. În poziţia C2 are o grupare -hidroxietiliden, iar
gruparea carboxil C3 şi atomul C5 au aceiaşi configuraţie că şi în molecula de penicilină. Acidul clavulanic
potenţează acţiunea antibacteriană a unor antibiotice -lactamice cu spectru larg. Acţionează ca inhibitor al
lactamazelor, enzime ce inactivează inelul -lactamic. Acidul clavulanic asociat cu un antibiotic -lactamic cu
spectru larg, sensibil la efectul hidrolitic al -lactamazelor, interacţionează cu enzima şi formează un complex
123
inactiv enzimă-acid clavulanic. Antibioticul -lactamic cu spectru larg este protejat şi rămâne în forma sa
activă.
Acidul clavulanic inhibă TEM -lactamazele, precum şi -lactamazele produse de S. aureus. Se
cunosc două asociaţii cu efect terapeutic optim: augmentin (amoxicilină - acid clavulanic) şi timentin
(ticarcilină - acid clavulanic).
Un număr relativ mare de antibiotice naturale acţionează asupra enzimelor implicate în biosinteza
peptidoglicanului şi stabilizării peretelui celular.
În funcţie de spectrul antibacterian, cefalosporinele se clasifică în patru grupe notate I, II, III şi IV.
Cefalosporinele din grupa I şi II, se disting în funcţie de stabilitatea lor la hidroliza cu β-lactamazele
cu spectru larg (TEM-1/2 şi SHV-1). În grupul II sunt incluse cefalosporinele (grup II B) şi cefamicinele
(grupul II A). Grupele III şi IV conţin antibiotice cu un spectru larg de acţiune. Grupa III e foarte importantă
calitativ şi cantitativ în practica medicală. Reprezentanţii grupei III sunt: cefotaxima, ceftriaxona şi
ceftazidina. În grupa IV sunt reunite C-3’ produse ca săruri cuaternare de amoniu (cefperoma, cefepima).
Aceste molecule posedă aceeaşi activitate În vitro ca cefotaxima asupra bacililor Gram negativi dar se
diferenţiază printr-o bună activitate În vitro asupra enterobacteriilor producătoare de cefalosporinaze şi asupra
tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa multirezistente.
Carbapenemele se deosebesc de peniciline, prin absenţa atomului de S, dar apare dubla legătură la C 2-
C3 în inelul tiazolidinic. Prezenţa dublei legături în inelul carbapenem conferă acestei structuri o reactivitate
chimică superioară, comparativ cu inelul penam al penicilinei. Mecanismul de acţiune este comun cu al
celorlalte antibiotice -lactamice.
Antibioticele -lactamice monociclice sunt reprezentate de nocardicine şi monobactami. Nocardicina
A are acţiune antibacteriană moderată faţă de câteva specii Gram negative (inclusiv Pseudomonas). Celelalte
variante moleculare nu au acţiune antibacteriană semnificativă. Nici unul dintre membrii grupului nu se
utilizează în clinică. Antibioticele a căror moleculă cuprinde ciclul monobactam, datorită simplităţii
structurale au fost sintetizate pe cale chimică în condiţii economice.
Genele pentru sinteza -lactamilor au fost identificate atît la bacterii cît şi la fungi. Secvenţa
nucleotidelor genelor celor două grupe de microorganisme are un grad ridicat de omologie (60% dintre
nucleotide sunt identice). S-a emis ipoteza unui transfer orizontal al genelor ce codifică biosinteza
antibioticelor -lactamice, de la bacterii la fungi. Atît la bacterii cît şi la fungi, genele -lactamilor sunt
grupate (cluster)într-un singur bloc. Genele pentru biosinteza cefalosporinei la Acremonium chrysogenum sunt
organizate în două aglomerări localizate pe cromosomi diferiţi. S-a presupus că genele pentru biosinteza -
lactamilor, în cursul evoluţiei, s-au transferat ca o singură grupare, de la un procariot ancestral, la un organism
precursor al fungilor care sintetizează antibiotice -lactamice. La organismul eucariot, precursor al fungilor,
genele codificatoare ale biosintezei antibioticelor -lactamice s-au distribuit între cei doi cromosomi.

Mecanismul de acţiune a antibioticelor -lactamice

Celula bacteriană trebuie să aibă un perete cu o structură închisă, legată covalent, care să permită
adăugarea noilor unităţi pentru creştere. Noile straturi de mureină sunt adăugate secvenţial pe faţa externă a
membranei citoplasmatice, în proximitatea ei, chiar sub stratul mureinic anterior. Pe măsură ce noile straturi
de mureină sunt adăugate, cele vechi sunt deplasate spre exterior şi sunt supuse unor forţe de întindere tot mai
mari, până la limita elasticităţii lor. În acest punct, autolizinele sunt extruzate din celulă şi hidrolizează stratul
cel mai tensionat. Fragmentele mureinice sunt eliberate şi uneori chiar reutilizate.
Sinteza mureinei are loc în 3 stadii. În primul stadiu , în citoplasmă, se sintetizează precursorii
solubili cu gr.mol. mică - UDP-GlcAc şi UDP-MurNAc-L-Ala-D-Glu-mezoDap-D-Ala-D-Ala. Unii agenţi
antibacterieni interferă cu treptele timpurii ale sintezei peretelui. Iniţial, la UDP-MurNAc este adăugat un
tripeptid, la care va fi legat dipeptidul D-Ala-D-Ala, sintetizat de o enzimă specifică. D-Ala este produsă din
L-Ala sub acţiunea alanin-racemazei.
Stadiul al doilea al sintezei peretelui celular este catalizat de enzime legate de membrană. Regiunea
non-nucleotidică a moleculei precursoare sintetizată anterior (intermediarul N-acetil glucozamina şi acidul N-
acetil muramic-tetrapeptid) este ataşată la un purtător lipidic (undecaprenol-pirofosfat, denumit bactoprenol),
generând lipidul I. Acesta este integrat în membrană, modificat ulterior prin adăugarea GlcNac şi
pentaglicinei. Se formează undecaprenol pirofosfat-MurNac(-L-Ala-D-Gln-(NH 2-(Gly5)L-Lys-D-Ala-D-Ala)-
(1-4)-GlcNac (lipidul II) şi este translocat prin membrana plasmatică. Lipidul II are rol de substrat pentru
reacţia de transglicozilare, polimerizând catenele glican ale peretelui celular bacterian. Rezultă astfel
dizaharidul repetitiv (MurNac-GlcNac)n. Purtătorul lipidic are rol de punct de ataşare de membrană pentru
124
precursori şi permite transportul subunităţilor prin interiorul hidrofob al membranei citoplasmatice, la
suprafaţa celulei.
În stadiul al treilea al sintezei, subunităţile peptidoglicanice sunt polimerizate prin inserţia în peretele
celular existent. Polimerizarea se face prin transferul peptidoglicanului nou, de la purtătorul său localizat în
membrană, la peptidoglicanul parietal preexistent, printr-o reacţie de transpeptidare ce implică lanţurile
peptidice ale ambilor polimeri, dintre care una trebuie să posede resturi D-ala-D-ala terminale. Reacţia este
catalizată de un complex de enzime, astfel încât să elimine riscul spargerii celulei sub acţiunea presiunii de
turgor (hidrostatice) din celulă. Enzimele sunt secretate prin membrană. Ele sunt autolizine, transglicozilaze şi
transpeptidaze, toate cu acţiune degradativă strict controlată asupra peretelui celular, permiţând creşterea şi
diviziunea celulei.
Polimerizarea glucidului şi legarea încrucişată a catenelor tetrapeptidice, denumită reacţia de
transpeptidare, este catalizată de proteine-enzime care leagă penicilina (penicillin binding proteins - PBP),
localizate la nivelul membranei citoplasmatice şi în spaţiul periplasmic.
Dizaharid-pentamuropeptidul extruzat prin membrana citoplasmatică, este inserat în reţeaua
mureinică în creştere. Peptidul se leagă de un alt peptid ce aparţine altui lanţ. Legarea celor două dizaharid-
pentamuropeptide prin secvenţele terminale se face cu consum de energie furnizată de reacţia de
transpeptidare şi pierderea D-Ala terminală a uneia dintre cele două muropeptide. Rezultă astfel un
nonamuropeptid (penta-tetrapeptid) (fig. 37). Restul D-ala al celuilalt muropeptid este adeseori hidrolizat şi
rezultă un octa- sau chiar un heptamuropeptid.

Figura 37. Componentele moleculare ale mureinei (adaptare după Koch, 2003). Explicaţii în text.

Antibioticele β-lactamice sunt inhibitoare ale sintezei peretelui celular. Diferitele enzime ţintă ale
antibioticelor sunt denumite generic PLP (francez - protein liant les penicillines) sau PBP (englez -penicillin
binding protein). Funcţia enzimatică a fiecărei PBP a fost studiată în detaliu la E. coli. La această specie
există patru PBP cu gm mare (PBP 1a, 1b, 2 şi 3). Toate sunt enzime bifuncţionale: catalizează
125
transpeptidarea şi transglicozilarea peptidoglicanilor. Rolul PBP ca enzime implicate în procesul final al
formării peretelui mureinic a fost descoperit prin marcare cu penicilină G radioactivă.
PBP sunt enzime care catalizează reacţiile de legare încrucişată între polimerii peptidoglicanului, una
dintre treptele finale în procesul asamblării peretelui celular. La Staphylococcus aureus, PBP au funcţii
fiziologice de transpeptidaze, endopeptidaze şi carboxipeptidaze. Unele PBP sunt esenţiale pentru
supravieţuirea şi creşterea celulei. Existenţa PBP esenţiale este argumentată de mutantele care nu sintetizează
PBP şi sunt condiţionat letale. Transpeptidazele (transamidaze) acţionează asupra mureinei prin clivarea unor
legături peptidice critice şi reformarea legăturii cu alt partener peptidic: legătura D-ala-D-ala este clivată şi
tetramuropeptidul rămâne legat de enzimă, până când alt muropeptid furnizează un grup amino al unui rest de
acid diaminopimelic. Autolizinele (hidrolaze) leagă apa în locul grupării amino şi în reacţia de hidroliză a
mureinei eliberează D-ala. Acţiunea lor împiedică formarea legăturilor transversale locale şi distruge mureina
numai într-o zonă strict limitată a peretelui.
Baza acţiunii antibioticelor β-lactamice constă în aceea că substratul transpeptidării – capătul
carboxil al D-alaninei din structura intermediarului dizaharid-tetrapeptid - are omologie structurală strânsă
cu inelul β-lactamic. Antibioticele -lactamice inhibă ultima etapă a sintezei peptidoglicanilor, adică formarea
punţilor interpeptidice. Aceşti compuşi prezintă analogie structurală cu dipeptidul terminal D-ala-D-ala, care
face parte din pentapeptidul mureinic.
Antibioticele acţionează ca pseudosubstraturi şi acilează situsurile active ale transpeptidazelor PBP,
care devin astfel incapabile să catalizeze reacţiile de polimerizare ale subunităţilor mureinice. Reacţia de
acilare a PBP este foarte lent reversibilă. Enzimele PBP deacilate devin incapabile să catalizeze reacţiile de
legare încrucişată a peptidelor. Complexul antibiotic-PBP stimulează eliberarea autolizinelor, cu efect
degradativ asupra peretelui celular. Presiunea osmotică din celulă, superioară celei din mediul extern, lizează
celula.
Transpeptidazele (PBP) sunt diferite la bacteriile Gram pozitive, Gram negative şi respectiv anaerobe,
ceea ce explică într-o oarecare măsură diferenţele activităţii antibacteriene a antibioticelor -lactamice.
Legarea unui antibiotic -lactamic la PBP determină modificări morfologice ale celulei bacteriene: de
exemplu, unele antibiotice se leagă de PBP implicată în formarea septului de diviziune. Consecinţa este că
celulele continuă să crească sub forma filamentelor lungi. Legarea de altă PBP duce la liza rapidă a bacteriei,
deoarece peretele proemină şi celula se sparge. Mecilinam (amidino-penicilina) nu se leagă de PBP ale
bacteriilor Gram pozitive şi nu influenţează creşterea lor, iar aztreonam se leagă numai de PBP ale bacteriilor
Gram negative şi nu inhibă creşterea celor Gram pozitive sau anaerobe.
Rezistenţa la antibioticele β-lactamice este conferită pe următoarele căi:
- sinteza β-lactamazelor;
- mutaţiile PBP, al căror efect este reducerea afinităţii de legare cu antibioticele β-lactamice;
- înglobarea diminuată a antibioticelor datorată schimbărilor în structura peretelui sau activităţii
pompelor de eflux.
Cel mai important mecanism de rezistenţă la antibioticele β-lactamice constă în sinteza enzimelor cu
efect hidrolizant asupra antibioticelor. Unul dintre primele rapoarte cu privire la rezistenţa antibioticelor a fost
referitor la o tulpină bacteriană producătoare de –lactamază, o enzimă ce hidrolizează legătura -lactamică a
acestei clase de antibiotice. Această legătură este esenţială pentru activitatea antibioticelor -lactamice,
deoarece are rolul de analog al legăturii peptidice ce leagă D-Ala terminală a peptidului de monomerul
peptidoglicanic. -lactamazele sunt enzime foarte eficiente : o singură moleculă poate hidroliza peste 100 000
de molecule -lactamice. β-lactamazele sunt o familie mare de enzime cu structură unitară, toate clivează
ciclul -lactamic şi inactivează antibioticul, dar diferă prin secvenţa aminoacizilor. Spectrul lor de activitate
este restrâns. -lactamazele s-au diversificat prin mecanismul mutaţiilor punctiforme ce se acumulează gradat
în genele codificatoare.
Clasificarea -lactamazelor. -lactamazele s-au clasificat în funcţie de substratul pe care-l
hidrolizează, de sensibilitatea la inhibitori, de modul de producere (constitutiv sau inductibil) şi de
localizarea cromosomală sau plasmidială a genelor codificatoare.
-lactamazele sunt considerate penicilinaze (cele care acţionează asupra penicilinelor),
cefalosporinaze (hidrolizează cefalosporinele). Unele au spectru larg de acţiune (cele care hidrolizează
penicilinele şi cefalosporinele).
-lactamazele produse de S. aureus şi S. epidermidis sunt exoenzime, pe care celula le elimină în
mediul extracelular, în cantităţi mari. -lactamazele produse de bacteriile Gram negative sunt endoenzime, pe
care celula le sintetizează şi le concentrează în spaţiul periplasmic. Enzimele hidrolitice sunt polipeptide, al
căror punct izoelectric este 8,9.
126
Clasificarea pe baza secvenţei de nucleotide a genelor codificatoare recunoaşte 4 clase de -
lactamaze: A, B, C, D. Această clasificare este stabilă şi reflectă raporturile fundamentale ce nu pot fi
modificate de mutaţii.

Figura 38. Situsurile de acţiune a -lactamazelor (indicate de săgeţi).

Enzimele din clasele A, C şi D au serină la situsul activ, iar cele din clasa B au 4 atomi de Zn.
β-lactamazele claselor A şi B sunt foarte active faţă de benzil-penicilină şi respectiv, peniciline şi
cefalosporine. Enzimele clasei C sunt în general inductibile, dar mutaţiile genelor codificatoare pot duce la
supraexpresie. Enzimele clasei D sunt de tip OXA, deoarece hidrolizează oxacilina.
O altă clasificare împarte β-lactamazele în următoarele grupe:
- metalo-β-lactamazele folosesc ionii de Zn la situsul activ, pentru a rupe inelul –lactamic. Acest
mecanism de acţiune este specific -lactamazelor clasei B;
- β-lactamazele cu spectru larg de acţiune, sunt active prin mecanismul serin-esteric. Enzima se
asociază necovalent cu antibioticul, pentru a forma un complex necovalent. Inelul -lactamic este
atacat de hidroxilul liber de pe lanţul lateral al unui rest de serină de la situsul activ al enzimei,
rezultând un acil-ester covalent. Hidroliza esterului eliberează enzima activă şi antibioticul inactiv,
hidrolizat. Acest mecanism este comun –lactamazelor claselor A, C şi D.
-lactamazele produse de bacteriile Gram negative (Enterobacter sp., Ps. aeruginosa, Citrobacter sp.,
Serratia sp., Proteus vulgaris, Klebsiella) au următoarele caracteristici :
- unele hidrolizează preferenţial cefalosporinele, cu o rată mult mai înaltă decât penicilinele
- nu sunt inhibate de acidul clavulanic sau de sulbactam
- sinteza lor este indusă
- cele care hidrolizează preferenţial penicilinele sunt constitutive
- cele cu spectru larg hidrolizează cu rate comparabile penicilinele şi cefalosporinele : TEM-1, TEM-
2, SHV-1, HMS. Sunt inhibate de acidul clavulanic.
Mult timp după descoperirea antibioticelor -lactamice, s-a crezut că acestea sunt produse numai de
speciile de Penicillium. Ulterior s-au identificat tulpini bacteriene care sintetizează -lactami, dar
mecanismele prin care anihilează efectele toxice ale antibioticelor pe care le produc nu sunt clare. O explicaţie
plauzibilă este că -lactamii şi -lactamazele au coexistat chiar la organismul ancestral, conform principiului
că o celulă producătoare de toxină, trebuie să posede căile prin care să se protejeze de propria-i toxină.
Koch (2003) consideră că -lactamazele au derivat din transpeptidaze, enzimele active în procesul de
creştere a sacului mureinic, cu câteva schimbări. Astfel, o PBP funcţională în procesul creşterii, s-a duplicat: o
copie s-a transformat dintr-o endotranspeptidază, într-o -lactamază, prin schimbări care permit intrarea apei
la situsul activ. Omologia secvenţei de aminoacizi este dovada că toate -lactamazele derivă din PBP şi nu au
avut o apariţie independentă. PBP şi lactamazele ce hidrolizează penicilina au câteva secvenţe de aminoacizi
foarte conservate.
Proteinele care leagă penicilina (PBP), de asemenea pot reacţiona cu -lactamii, formând serin-esteri,
dar spre deosebire de esterii formaţi de -lactamaze, nu pot hidroliza uşor.
Enzimele -lactamazice sunt detectate prin metode sensibile, la toate bacteriile. Sinteza lor precede
era antibioticelor. Lor li se atribuie un posibil rol în asamblarea peptidoglicanului sau au evoluat ca un
mecanism protector faţă de -lactamii produşi de bacteriile şi de fungii din mediu.
127
Unele -lactamaze sunt codificate de gene cromosomale şi sinteza lor este constitutivă sau inductibilă.
-lactamazele codificate de plasmide transmisibile care se pot disemina cu mare uşurinţă. Astfel de
plasmide s-au identificat la Staphylococcus, H. influenzae, Enterobacter, N. gonorrhoeae. Stafilococii sunt
singurii patogeni comuni Gram pozitivi, la care -lactamazele au creat probleme majore de rezistenţă,
deoarece genele s-au răspândit prin transferul pe orizontală al plasmidei de rezistenţă şi s-au selectat tulpinile
rezistente, al căror procent a atins 80-90% dintre izolate, atât la S. aureus, cât şi la tulpinile coagulazo-
negative.

Rezistenţa naturală prin scăderea afinităţii între ţinta bacteriană şi antibiotic

Micoplasmele, bacterii lipsite de perete celular, sunt natural rezistente la actiunea antibioticelor cu
ţinte de actiune la acest nivel (enzimele PLP). La alte specii bacteriene, PBP manifestă afinitate naturală slabă
pentru antibioticele β-lactamice. Este cazul aztreonamului, inactiv asupra bacteriilor Gram pozitive şi
anaerobe stricte (Georgopapadakou, 1982), cefsulodinului inactiv faţă de enterobacterii (Barry, 1981) şi
cefalosporinelor şi penicilinei M inactive faţă de enterococci.

Rezistenţa bacteriilor Gram pozitive la β-lactamice

Utilizarea în clinică pe scară largă a -lactamilor, constituie factorul major selectiv care influenţează
sinteza -lactamazelor de către agenţii patogeni.
S. aureus este de obicei rezistent la benzil-penicilină, deoarece majoritatea tulpinilor izolate (80-95%)
produc penicilinază.
Rezistenţa tulpinilor de S. aureus la meticilină se datorează legării antibioticului de către PBP, cu rol
în sinteza peretelui celular. După legarea antibioticului, PBP se inactivează şi sinteza peretelui celular este
inhibată. Rezistenţa la concentraţiile mari de β-lactamice este totdeauna dependentă de sinteza unei noi
variante biochimice de PBP (PBP2), codificată de o genă cromosomală. Expresia genei este constitutivă sau
inductibilă de către unele antibiotice β-lactamice. Rezistenţa la concentraţiile mici de meticilină se datorează
producerii β-lactamazei, creşterii nivelului PBP sau diminuării afinităţii de legare a antibioticului de proteinele
implicate în sinteza peretelui celular (PBP). Rezistenţa la concentraţiile mari este totdeauna dependentă de
sinteza unei noi variante biochimice a PBP (PBP 2), codificată de gena mecA, cu localizare cromosomală.
Proteina PBP2 are o afinitate mică pentru cele mai multe antibiotice β-lactamice. Expresia genei mecA este
constitutivă sau inductibilă în prezenţa unor antibiotice β-lactamice. Rezistenţa la meticilină a tulpinilor de S.
aureus (MRSA) este mai mare la 30o C decât la 37o C şi se datorează producerii PBP2, care nu este sensibilă la
acţiunea meticilinei. În unele cazuri, singurele medicamente eficiente pentru tratamentul infecţiilor cu S.
aureus rezistente la meticilină sunt antibioticele glicopeptidice ca vancomicina.
Rezistenţa tulpinilor de Str. pneumoniae la penicilină se datorează prezenţei PBP modificate, în
special PBP2, care au o afinitate redusă pentru penicilină. La Str. pneumoniae, β-lactamazele nu au fost
niciodată detectate, dar diferitele tulpini codifică 6 variante biochimice de PBP : PBP 1a, 1b, 2a, 2b, 2x şi
PBP3.
Antibioticele cu structură -lactamică formează un grup larg, utilizate în clinică pentru terapia
infecţiilor bacteriene, dar sunt deosebiri foarte mari în ceea ce priveşte spectrul şi intensitatea acţiunii
antibacteriene. Diferenţele se datorează afinităţii diferite de legare cu transpeptidazele bacteriene, enzime
implicate în sinteza peretelui celular sau cu enzimele care inactivează antibioticul (-lactamaze).

Rezistenţa naturală la β–lactamice mediata de β-lactamaze la bacilii Gram negativi

La Klebsiella, rezistenţa este legată de sinteza unei β-lactamaze cromosomale cu spectru larg care
antrenează rezistenţa la peniciline, anulată prin administrarea de inhibitori enzimatici ca acidul clavulanic,
sulfbactam sau tazobactam.
La Enterobacter sp., Serratia sp., Morganella sp., Providencia sp., Ps. aeruginosa, rezistenţa este
determinată de producerea unei β-lactamaze cromosomale de tipul cefalosporinazei (Bush, 1995). Terapia
infecţiilor cu Ps. aeruginosa se realizează cu aminoglicozide şi cu -lactamice. Rezistenţa celulelor de Ps.
aeruginosa se datorează permeabilităţii scăzute a peretelui, precum şi sintezei de -lactamaze.
Serratia marcescens produce în mod natural o enzimă codificată de o gena cromosomală capabilă să
inactiveze kanamicina, tobramicina, netilmicina şi amikacina, iar Providencia stuartii produce o enzimă
capabilă să inactiveze neomicina, gentamicina, tobramicina şi netilmicina.

128
Speciile anaerobe aparţinînd genului Bacteroides şi care fac parte din microbiota tubului digestiv al
omului, sunt natural rezistente la aminopeniciline şi la numeroase cefalosporine prin producerea de β-
lactamaze codificate de gene cromosomale cu spectru larg, care sunt inhibate de acidul clavulanic.

Rezistenţa dobândită la antibioticele β-lactamice

Rezistenţa dobândită la cefalosporinele de generaţia III, la aztreonam şi la penicilinele cu spectru larg


este foarte frecventă la 10-30% din tulpinile aparţinând speciilor natural producătoare de cefalosporinaze
cromosomale inductibile: Enterobacter cloaceae, E. aerogens, Citrobacter freundii, Serratia marcescens si
Ps. aeruginosa. Mecanismul de rezistenţă dobândită constă în sintaza intensă a cefalosporinazelor naturale
(Sanders, 1982; Then, 1986).
β-lactamazele codificate de gene plasmidiale care joacă un rol important în patologia
infecţioasă pot fi grupate în patru categorii:
- penicilinaze cu efect strict, ce nu inactivează decât penicilinele şi care sunt responsabile de rezistenţa
dobandită la penicilina G şi A a tulpinilor de S. aureus.
- β-lactamaze cu spectru larg, care inactiveaza penicilinele si În parte cefalosporinele, În afara de
cefamicina si cefalosporinele de generatia III. Aceste enzime sunt responsabile, de exemplu, de
rezistenţa dobândită la penicilină, la enterobacterii şi Pseudomonas aeruginosa şi de aceea denumirea
curentă este aceea de penicilinaze. Exemplul tip este TEM-1, identificat acum 30 ani la Escheria coli.
- β-lactamaze cu spectru larg (BLSE), derivate prin mutatiile punctiforme ale enzimelor precedente si
care inactiveaza de asemenea În parte cefalosporinazele de generaţia III şi aztreonamul.
- β-lactamaze numite TEM rezistente la inhibitori (TRI sau IRT) derivate prin mutaţiile punctiforme
ale β-lactamazelor TEM-1 sau 2 care sunt responsabile de rezistenţa la peniciline.
Aceste enzime, deja numeroase, au fost identificate dupa câţiva ani la tulpinile de E. coli rezistente la
asociaţia amoxicilină-acid clavulanic (Henquell, 1995). La aceste patru categorii de enzime se adaugă câteva
enzime plasmidiale mai puţin studiate: cefalosporinazele plasmidiale înrudite cu cefalosporinazele
cromosomale naturale ale enterobacteriilor (MIR-1) şi identificate la Klebsiella; imipenemaze identificate la
E. cloaceae (HMC-1) la Serratia, Ps. aeruginosa sau β-lactamazele cu spectru larg de la Ps. aeruginosa
(PER-1)

5.5. Antibioticele polipeptidice

Clasificarea antibioticelor polipeptidice

Polimixinele sunt antibiotice polipeptidice (octapeptide cu gm mare), cu caracteristici chimice şi


proprietăţi biologice identice. Sunt recunoscute 5 polimixine majore, distincte chimic, desemnate polimixina
A, B, C, D, E. Cele mai reprezentative sunt polimixina B şi polimixina E sau colistina. Toate sunt sintetizate
de Bacillus polymyxa şi au acelaşi spectru antibacterian. Sunt active în concentraţii asemănătoare, dar produc
efecte secundare semnificative. Polimixinele A şi D sunt nefrotoxice şi nu au fost niciodată folosite în clinică,
iar polimixinele B şi E au cel mai scăzut nivel de toxicitate. Aceste antibiotice sunt active faţă de bacteriile
Gram negative, deoarece membrana externă conţine lipide cu sarcină negativă (Aerobcter, Brucella,
Escherichia, Hemophillus, Klebsiella, Yersinia, Salmonella, Shigella, Vibrio), la concentraţii de până la 5,0
g/ml. Nu sunt active faţă de bacteriile Gram pozitive, cocii Gram negativi şi micobacterii. Trichomonas
vaginalis este sensibil la concentraţia de 125-250 g/ml.

129
Componentele moleculare ale polimixinei şi modalitatea interacţiei lor

Polimixinele nu sunt absorbite după administrare orală sau tegumentară, nu difuzează semnificativ în
ţesuturi. De aceea nu sunt eficiente faţă de infecţiile sistemice difuze sau ale organelor parenhimatoase
profunde. Se folosesc în tratamentul infecţiilor localizate : răni, arsuri, mucoase ale tractului intestinal,
cavitatea pleurală, spaţiul dural, grefe. Se folosesc cu mare eficienţă în tratamentul infecţiilor meningeale,
pulmonare şi ale tractului urinar. Polimixinele se asociază frecvent cu alte antibiotice, pentru a extinde
spectrul antimicrobian şi se folosesc pentru sterilizarea tractului digestiv.

Situsul celular al acţiunii polimixinelor

Ţinta polimixinelor este membrana lipidică, adică membrana externă şi citoplasmatică a bacteriilor
Gram negative. Fixarea polimixinelor de membrane duce la dezorganizarea acestora şi la liza celulei.
Membranele biologice sunt alcătuite dintr-o matrice lipidică, în care sunt distribuite aleatoriu,
proteinele globulare ce penetrează stratul lipidic. Membrana citoplasmatică acţionează ca barieră de
permeabilitate selectivă pentru ioni, nutrienţi şi este sediul structural al sistemelor de transport. Agenţii
antimicrobieni pot să dezorganizeze membranele: pot fi cationici, anionici sau neutri. Efectul polimixinelor
este asemănător cu al detergenţilor cationici. Molecula lor conţine grupări hidrofile şi hidrofobe. La pH neutru
sunt încărcate pozitiv şi pot fi considerate ca nişte compuşi cationici, cu activitate faţă de membrana externă
polianionică a bacteriilor Gram negative, sarcină conferită de lipopolizaharide.
Activitatea polimixinelor este antagonizată de compuşii anionici, de Mg 2+ şi de Ca2+, deoarece
neutralizează sarcinile negative ale grupărilor fosfat din membrana lipidică. Polimixinele dezorganizează
structura membranelor şi modifică profund permeabilitatea. Nu se folosesc pentru tratamentul sistemic,
deoarece se leagă de diferiţi liganzi tisulari şi sunt toxice pentru rinichi şi pentru sistemul nervos.
Fixarea antibioticelor în structura membranei depinde de concentraţia cationilor bivalenţi din mediu:
carenţa sau excesul acestora inhibă acţiunea polimixinelor. Compoziţia în LPS, fosfolipide şi proteine a
membranelor bacteriene influenţează de asemenea fixarea şi gradul de sensibilitate sau de rezistenţă al
diferitelor specii bacteriene la acţiunea polimixinelor. Polimixina şi alte molecule policationice se leagă de
lipidul A al LPS, într-un raport stoichiometric şi se inseră în structura membranei. Un astfel de mozaic
molecular dezorganizează straturile lipidice, iar membrana nu mai funcţionează normal ca barieră osmotică
eficientă. Datorită alterărilor structurale ale membranei externe şi interne, echilibrul osmotic este perturbat
prin pierderea ionilor de K +. Modificările permeabilităţii sunt asociate cu pierderea constituienţilor celulari
solubili şi a viabilităţii. Mecanismul este acelaşi cu cel propus pentru hemoliză sub acţiunea detergenţilor
ionici. Efectul hemolitic se datorează dezorganizării complexului colesterol-fosfolipide-lipoproteine din
membrana eritrocitului.
Concentraţiile minime inhibitorii ale polimixinelor opresc temporar creşterea bacteriilor sensibile, iar
concentraţiile de 2-4 ori mai mari au efect bactericid rapid. Sensibilitatea nu depinde de faza de creştere a
celulelor bacteriene. Bacteriile sensibile leagă cu afinitate înaltă polimixinele. Specifcitatea înaltă a legării stă
la originea unei metode eficiente pentru îndepărtarea endotoxinei din plasma pacienţilor septici: plasma este
perfuzată printr-o coloană la care este legată polimixina.
Rezistenţa se datorează incapacităţii antibioticului de a penetra membrana externă.

Bacitracina

Bacitracina s-a izolat în 1945, dintr-o tulpină de Bacillus licheniformis şi a fost folosită pentru
tratamentul infecţiilor stafilococice severe, până în 1960. Produsul comercial conţine un compus principal –
bacitracina A şi cel puţin 9 polipeptide strâns înrudite. În soluţie neutră sau uşor alcalină, activitatea
antibacteriană scade foarte mult. Antibioticul este bine tolerat în aplicaţiile locale şi prin instilare directă în
spaţiile articulare, în cavităţile pleurale, în rănile chirurgicale, pe membranele mucoase, urechi, ochi, ţesutul
cerebral. După administrare intramusculară, bacitracina este excretată pe cale urinară şi uneori produce
hematurie şi proteinurie, datorită alterării ireversibile a proprietăţilor de filtru ale endoteliului glomerulului
vascular.
Bacitracina se sintetizează după încheierea fazei de creştere logaritmică şi necesită adăugarea
nivelelor crescute de Mn2+. În celula producătoare, antibioticul îndeplineşte mai multe funcţii:
- inhibă dezvoltarea altor microorganisme în mediu. Antibioticele, ca metaboliţi secundari au ca
funcţie primară, inhibiţia creşterii altor microorganisme, deoarece alţi metaboliţi secundari nu au

130
proprietăţi antibiotice. Sinteza antibioticelor conferă avantaj selectiv organismelor producătoare, dar
pentru bacitracină nu există dovada că în mediile naturale ar avea rol de antibiotic;
- alterează membranele celulelor producătoare, uşurând eliberarea produselor metabolismului
secundar: bacitracina produce spargerea protoplaştilor celulelor care o produc;
- represează creşterea vegetativă sau iniţiază sporularea;
- are rol de unitate structurală a învelişului sporal. Compoziţia în aminoacizi a hidrolizatelor de
bacitracină şi de înveliş sporal este foarte asemănătoare.

Componentele moleculare ale bacitracinei

Majoritatea compuşilor antimicrobieni de origine naturală sau sintetică posedă unul sau mai multe
situsuri moleculare la care pot să lege ionii metalici. Bacitracina formează complexe cu ionii metalici.
Complexele bacitracinei cu Zn2+, Ni2+, Mn2+ şi Co2+, ca şi cu ZnO şi CdO sunt mai stabile la variaţiile de
temperatură comparativ cu antibioticul nativ. Pentru sinteza bacitracinei sunt necesari numai ionii de Mn 2+.
Datorită toxicităţii sale şi disponibilităţii altor antibiotice, utilizarea sa s-a limitat în special la aplicare
locală. Mecanismele de actiune a bacitracinei sunt multiple: dezorganizează membrana externă a bacteriilor
Gram negative, inhibă sinteza proteinelor şi a peretelui celular. Ultimele două efecte sunt considerate
consecinţe ale interferenţei cu funcţiile de permeabilitate ale membranei.
Rezistenţa este datorată incapacităţii antibioticului de a penetra membrana externă.
Gramicidinele şi tirocidina sunt sintetizate de tulpini de Bacillus brevis. Structural fac parte din
grupul antibioticelor polipeptidice. Aceste antibiotice sunt active asupra membranei şi par să acţioneze prin
producerea porilor membranari. Se folosesc numai cu aplicare locală.

Actinomicina

Actinomicina, produsă de diferite specii de Streptomyces, este primul antibiotic care s-a obţinut în
stare cristalină, o substanţă pigmentată roşu, foarte activă faţă de bacteriile Gram negative, mai puţin activă
faţă de bacteriile Gram pozitive şi lipsită de activitate faţă de fungi. Antibioticul are un nivel înalt de toxicitate
faţă de animalele de experienţă şi nu a fost folosită ca agent chimioterapeutic.
Actinomicinele formează o familie de antibiotice cromopeptidice, care diferă numai în regiunea
peptidică a moleculei. Gruparea cromoforă, denumită actinocin, este comună pentru toate variantele chimice
de actinomicine. Gruparea cromoforă este ataşată de două catene pentapeptidice, care pot fi identice sau diferă
în compoziţia aminoacizilor. Peptidele sunt structuri ciclice, deoarece grupul COOH al aminoacidului
terminal – N-metil-L-valina, este esterificat cu gruparea OH a primului aminoacid – treonina, pentru a forma
un inel lactonic.

131
Structura moleculară a actinomicinei D.

Toate variantele de de actinomicină sintetizate de Streptomyces conţin gruparea cromoforă


fenoxazinona (1 mol), L-treonina (2 moli), sarcozina (2 moli) şi N-metil-L-valina (2 moli)/moleculă de
antibiotic. Gruparea cromoforă (fenoxazinona) se sintetizează din triptofan.
Un organism producător al actinomicinei, de obicei sintetizează simultan, mai multe actinomicine,
care diferă numai printr-un singur aminoacid al peptidului.
Actinomicina produsă de Str. antibioticus este sintetizată pe o varietate de medii definite chimic şi pe
medii organice complexe. Randamentul sintezei este mai bun pe medii organice complexe. Sursa de N este
acidul glutamic, dar şi alţi aminoacizi sau compuşii azotaţi anorganici. Cea mai bună sursă de C pentru sinteza
antibioticului este galactoza. Glucoza este o sursă optimă pentru creşterea miceliului, dar este metabolizată
prea rapid şi se sintetizează o cantitate prea mică de actinomicină. Sinteza antibioticului este stimulată în
condiţii de agitare a culturii.

5.6. Antibioticele glicopeptidice şi lipoglicopeptidice

Antibioticele peptidice sunt diferite structural de peptidele clasice pentru ca sunt molecule ciclice,
conţinând lanţuri esterice şi D - aminoacizi, acizi graşi saturaţi sau nesaturaţi, heterocicluri, glucide aminate
sau neaminate. Peptidele sunt clasificate în 6 grupe

Clasificarea antibioticelor peptidice

Vancomicina şi teicoplanina

Sunt antibiotice glicopeptidice de interes clinic, componente esenţiale ale terapiei antiinfecţioase,
fiind active faţă de agenţii infecţioşi comuni: Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus. Sunt active
exclusiv faţă de bacteriile Gram pozitive, formând complexe stabile şi specifice, necovalente, cu D-Ala-D-Ala
terminale ale peptidoglicanului. Astfel este inhibată formarea punţilor peptidice şi creşterea peretelui celular.
Antibioticele glicopeptidice încorporează o structură heptapeptidică centrală, iar diversitatea stru
turală suplimentară derivă prin modificări variate sub acţiunea halogenazelor şi transferazelor. Pe
lângă aminoacidul comun Tir, teicoplanina încorporează aminoacizi neproteici: 4 hidroxifenil-glicina (HPG),
132
3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG) şi -hidroxitirozina (-OHTir). Clorinarea Tir, HPG şi -OHT la poziţiile 2,
5 şi 6, se produce, probabil, după asamblarea peptidului.

Structura moleculară a teicoplaninei

Vancomicina, un antibiotic glicopeptidic, a fost izolată dintr-o tulpină de Streptomyces orientalis,


denumită astfel deoarece s-a cultivat din probe de sol din Borneo şi India. Antibioticul a fost introdus în
clinică în 1958, pentru tratamentul infecţiilor cu bacterii Gram pozitive.

Structura moleculară a vancomicinei

Vancomicina este o moleculă amfoterică complexă, ce conţine azot şi glucide, foarte uşor solubilă în
apă, rezistentă la acţiunea diferitelor enzime hidrolitice. Spectrul de activitate este îngust, fiind activă faţă de
bacteriile Gram pozitive şi faţă de unele spirochete.
Utilizarea sa a înregistrat o dinamică ascendentă în ultimele două decenii, datorită creşterii ponderii
stafilococilor coagulazo-negativi şia tulpinilor de S. aureus rezistente la meticilină. Rezistenţa la meticilină a
unor tulpini de Staphylococcus s-a atribuit unor cantităţi mai mici de acizi teichoici, ceea ce determină o
sarcină mai puţin negativă decât la tulpinile sensibile.
Datele statistice arătau în anul 2000 că circa 75% dintre stafilococii coagulazo-negativi şi 47% dintre
izolatele de S. aureus din unităţile de tratament intensiv erau rezistente la meticilină. Pentru tratamentul
infecţiilor produse de tulpinile stafilococice meticilino-rezistente, vancomicina rămâne antibioticul de elecţie,
deoarece tulpinile rezistente apar cu o fecvenţă mai mică decât faţă de alte antibiotice.
Vancomicina se absoarbe greu din tractul digestiv, iar injecţia intramusculară produce durere
moderată. Administrarea este limitată la calea intravenoasă.

133
Mecanismul de acţiune
Vancomicina inhibă sinteza ARN, sinteza peretelui celular şi lezează componentele membranei
producând moartea celulei. Activitatea sa la situsuri multiple poate să explice absenţa dezvoltării rezistenţei la
acest antibiotic.
Vancomicina întrerupe sinteza peretelui celular, formând un complex cu resturile de D-Ala
carboxiterminale ale precursorilor peptidoglicanului. Formarea complexului la suprafaţa externă a membranei
citoplasmatice, împiedică transferul precursorilor de la purtătorul lipidic, la peretele peptidoglicanic.
Vancomicina inhibă reacţiile biochimice parietale, catalizate de transpeptidaze.
Antibioticele glicopeptidice au, ca şi cele β-lactamice, activitate bactericidă asupra tulpinilor
sensibile. În condiţii normale ale sintezei peptidoglicanului, la enterococi, două molecule de D-alanină sunt
legate de o ligază pentru a forma D-ala-D-ala, adăugată ulterior la UDP-N-acetil-muramil-pentapeptid. UDP-
N-acetil-muramil-pentapeptidul, după ce este încorporat în peptidoglicanul nascent prin reacţia de
transglicozilare permite legarea punţilor transversale (transpeptidare) şi contribuie la rezistenţa stratului de
peptidoglican. Vancomicina acţionează asupra ultimei etape a sintezei peptidoglicanului, formând legături de
hidrogen, ireversibile, cu extremitatea D-ala-D-ala terminală a tetrapeptidului precursorilor dizaharidici,
blocând adăugarea lor la catena polipeptidică în creştere şi împiedică formarea legăturilor transversale.
Glicopeptidele, mascând extremitatea D-ala-D-ala a tetrapeptidului, împiedică acţiunea transpeptidazelor şi
formarea legăturilor transversale ale macromoleculei peptidoglicanice.
Activitatea antimicrobiană a antibioticelor glicopeptidice este limitată la bacteriile Gram pozitive.
Cele mai multe bacterii Gram pozitive sunt sensibile. Moleculele glicopeptidice sunt mari (vancomicina –
1448 Da, teicoplamina – 1900 Da) şi nu pot pătrunde prin membrana externă a bacteriilor Gram negative. Prin
localizarea sa în spaţiul periplasmic, peptidoglicanul nu este accesibil acţiunii antibioticelor glicopeptidice.
Cele mai multe bacterii Gram negative sunt rezistente.

Rezistenţa la vancomicină
Rezistenţa poate să fie intrinsecă (naturală). Rezistenţa streptococilor a fost indusă În vitro, chiar
înainte de utilizarea sa în clinică. Molecula de vancomicină nu traversează membrana externă a bacteriilor
Gram negative, datorită dimensiunilor mari. Rezistenţa a apărut după 20 de ani de administrare în clinică, la
stafilococi, la Leuconostoc sp., cât şi la bacilii Gram pozitivi (Lactobacillus). La Lactobacillus, rezistenţa se
datorează faptului că alanina terminală din gruparea laterală a moleculei de peptidoglican este înlocuită cu
lactat (D-alanil-D-lactat), care are o afinitate mai mică pentru antibioticele glicopeptidice. Pentapeptidul
modificat înlocuie legătura amidică cu o legătură esterică. Vancomicina se leagă mai puţin stabil cu
pentapeptidul modificat decât cu pentapeptidul normal. Pierderea unei legături de H diminuă semnificativ
afinitatea vancomicinei pentru peptidul modificat. Deoarece vancomicina se complexează mai puţin frecvent
şi mai puţin stabil cu componentele peretelui celular, efectul inhibitor este mult diminuat. Pentru ca rezistenţa
celulelor să fie completă, întregul perete trebuie să fie sintetizat cu pentapeptidul modificat.
S. aureus are o sensibilitate uniformă la vancomicină În vitro, dar insuccesele la tratament apar cel
mai adesea în cazul endocarditei. Cauza nereuşitei ar putea fi toleranţa. Toleranţa este un fenomen care se
manifestă prin faptul că concentraţiile mici de antibiotic sunt inhibitoare ale creşterii (efect bacteriostatic), iar
efectul bactericid se produce numai la concentraţii relativ mari.
Antibioticele glicopeptidice sunt folosite pentru tratamentul pacienţilor cu intoleranţă la cele uzuale,
mai ales la -lactamice. Vancomicina prezintă inconvenientul administrării, deoarece necesită infuzie
intravenoasă lentă. Este nefrotoxică şi ototoxică, mai ales prin administrarea asociată cu aminoglicozide.
Glicopeptidele sunt antibiotice relativ scumpe. Din aceste cauze, administrarea lor este limitată la
situaţiile care sugerează rezistenţa sau alergia faţă de -lactamice. Utilizarea lor timp de câteva decenii, rareori
a indus rezistenţa stafilococilor şi enterococilor.
Viomicina, produsă de Streptomyces floridae, Str. paniceus şi Str. vinaceus, este un polipeptid cu caracter
intens bazic. Antibioticul diferă de cele mai multe antibiotice prin aceea că este mai activ faţă de micobacterii,
comparativ cu alte bacterii. În vitro nu are activitate faţă de fungii patogeni pentru om, animale şi plante.
Produce efecte benefice în infecţiile tuberculoase, dacă este administrată în doze relativ mari. Micobacteriile
dezvoltă rezistenţă la viomicină mult mai lent decât la streptomicină.

134
Structura moleculară a viomicinei

Dacă este administrată pentru perioade scurte, toxicitatea este relativ mică, dar tratamentul de durată
produce efecte colaterale ample.

Mupirocina (acidul pseudomonic A)

Mupirocina este cel mai eficient agent local utilizat pentru eradicarea stării de purtător nazal de S.
aureus rezistent la meticilină (MRSA).
Mecanismul de acţiune. Mupirocina este analogul structural al izoleucinei şi se leagă
competitiv de izoleucil-ARNt sintetază, blocând astfel sinteza proteinelor.

Structura moleculară a mupirocinei

Rezistenţa la mupirocină se datorează, probabil, mutaţiilor genei IRS(izoleucil ARNt-sintetază).


Rezistenţa la mupirocină cuprinde două grupe fiziologice de microorganisme:
cele rezistente la un nivel scăzut de antibiotic, cu concentraţia minimă inhibitorie (CMI) cuprinsă între 4-256
µg/ml; cele rezistente la nivele mari de antibiotic, pentru care concentraţia minimă inhibitorie este egală sau
mai mare de 512 µg/ml. S-au evidenţiat fenomene de rezistenţă atât la nivelul scăzut, cât şi la cel ridicat de
antibiotic. Rezistenţa la nivelul scăzut de mupirocină se poate datora mutaţiilor izoleucil-ARNt sintetazei, iar
izolatele rezistente la concentraţii mari de mupirocină conţin o variantă de izoleucin-ARNt sintetază, distinctă
imunochimic de enzima tulpinilor bacteriene sensibile. Cele două variante ale izoleucil-ARNt sintetazei au
omologie de numai 30% a aminoacizilor. Varianta mutantă a enzimei este rezistentă la acţiunea mupirocinei.
Gena mup A, care codifică varianta rezistentă a izoleucil-ARNt sintetazei este localizată pe plasmide
transferabile.
Mupirocina este unul dintre cei mai eficienţi agenţi cu aplicare locală pentru limitarea stării de
purtător a tulpinilor de S. aureus meticilin-rezistente. Tulpinile de S. aureus rezistente la nivele înalte de
mupirocină sunt rezistente şi la meticilină (tulpini MRSA). Eliminarea tulpinilor rezistente de S. aureus din
cavităţile nazale este o strategie importantă în controlul infecţiei. Cel mai eficient agent cu aplicare locală,
pentru limitarea stării de purtător nazal este mupirocina. Aplicarea locală a antibioticului este improbabil că va
eradica agentul patogen. De aceea, este importantă detectarea rapidă a tulpinilor de S. aureus rezistente la
concentraţii mari de mupirocină. În acest scop se foloseşte metoda amplificării secvenţei de 456 bp, a genei
mupA.

135
5.7. Antibiotice poliketidice
Poliketidele formează o familie mare de produse naturale şi cuprind printre cele mai complexe
molecule de antibiotice din categoria largă a metaboliţilor secundari (tabelul 8). Donadio (1993) a împărţit
poliketidele în două clase: aromatice şi complexe.
Structura generală a antraciclinelor
Antraciclinele sunt polichetide aromatice ce formează un grup de substanţe din care fac parte unele
dintre cele mai utile citostatice folosite în prezent. Ele au structura 7,8,9,10-tetrahidrotetracen-5,12-quinonă şi
sunt metaboliţi secundari ai actinomicetelor, în primul rând din g. Streptomyces, sau sunt derivaţii lor
semisintetici.

Mai jos sunt redaţi unii substituienţi (R) din antraciclinele naturale de tip aclavinonă. Prin
combinaţiile posibile ale acestor substituienţi rezultă 1344 agliconi diferiţi.

R1: H, OH;
R2: H, OH
R4: OH, OCH3
R6: H, OH
R7: H, OH, glicozid
R9: CH3, CH2CH3, COCH3, COCH2OH,
CHOHCH3, CHOHCH2OH, CH2COCH3
R10: H, OH, COOCH3, glicozid
R11: H, OH

Poliketidele sunt produse ca metaboliţi secundari, adică se sintetizează după stadiul creşterii vegetative
(tabelul 8).

Tabelul 8.
Antibiotice poliketidice şi organismele producătoare (după Pfeiffer, 2001).
Exemple de poliketide Tipul de activitate Organismul producător
Eritromicina A Antibiotic Streptomyces coelicolor
Doxorubicina Agent antitumoral Str. peucetius
Eritromicina A Antibiotic Str. erithraeus
Epothilone A Agent antitumoral Sorangium cellulosum
Acid 6-metil salicilic Precursor al antibioticelor Penicillium patulum
Lovastatin Agent hipocolesterolemic Aspergillus terreus

Caţiva compuşi poliketidici au fost utilizaţi în clinica infecţioasă, în tratamentul neoplaziilor, al


maladiilor cardiovasculare şi al inflamaţiilor (tabelul 9).

136
Tabelul 9.
Structura şi modul de acţiune a antibioticelor poliketidice (după Pfeiffer, 2001).
Poliketide naturale Mod de acţiune Organism gazdă
Actinorodina Antibiotic Streptomyces
coelicolor

Doxorubicina Agent anti-tumoral Streptomyces peucetius

Eritromicina A Antibiotic Sacharopolyspora


erythraea

Epotilona A Agent anti-tumoral Sorangium cellulosum

Acid 6-metil salicilic Precursor antibiotic Penicillium patulum

137
Lovastatin Agent Aspergillus terreus
hipocolesterolemiant

Primele antracicline au fost descoperite în 1950 (Brokmann şi Bauer), iar folosirea lor ca agenţi
antitumorali a început odată cu descoperirea daunorubicinei. Antraciclinele sunt antibiotice cu activitate
antimicrobiană semnificativă. Bacteriile Gram pozitive şi fungii au un grad relativ înalt de sensibilitate, iar
cele Gram negative sunt, în general, rezistente, dar au un grad prea înalt de toxicitate pentru a fi folosite în
acest scop.
Efectele biologice ale antraciclinelor sunt următoarele:
- inhibiţia fosforilărilor oxidative în mitocondrii
- inhibiţia ADN-polimerazelor
- inhibiţia ARN-polimerazelor
- inhibiţia enzimelor de reparare a ADN
- inhibiţia sintezei metalotioneinei
- inhibiţia topoizomerazei I
- inhibiţia topoizomerazei II
- inhibiţia helicazelor
- producerea radicalilor liberi
- clivajul endonucleolitic.
Doxorubicina (adriamicina) este un antibiotic citotoxic, a cărei parte agliconică este adriamicinona,
sintetizată din unităţi de acetat. Molecula are un ciclu antraciclinic, izolat de la Streptomyces peucetius var.
caesius. Din punct de vedere chimic, constă dintr-un nucleu naftacenchinonic, legat printr-o punte glicozidică
a atomului 7 al inelului, de un glucid aminat, daunosamina.

Structura moleculară a doxorubicinei Structura moleculară a daunorubicinei

138
Precursorul doxorubicinei pare a fi o unitate starter propionat, la care sunt adăugate succesiv 9 unităţi
de acetat. Catena de C precursoare a poliketidelor este ciclizată pentru a produce nucleul tetraciclic al
antraciclinei. Primul intermediar ciclic cunoscut al celor mai multe antracicline este acidul aclanonic, un
intermediar triciclic. Acidul aclanonic este metilat cu un grup metil din 5-adenozilmetionină şi rezultă esterul
metilic al acidului aclanonic, după care cel de al IV-lea inel este închis şi rezultă aclavicetona. Aclavinona este
precursorul celor mai multe antracicline, ceea ce înseamnă că organismele producătoare de antracicline conţin
enzime ce acţionează secvenţial şi modifică aclavinona pentru a produce alte antracicline.

Structura moleculară a aclavinonei

Cele mai comune modificări ale biosintezei antraciclinelor sunt glicozilările. Agliconul neglicozilat
este de obicei inactiv. Glicozidele antraciclinelor naturale sunt de 3 tipuri: rodosamina, daunosamina şi
glicozide neutre. Glucidele aminate se găsesc aproape exclusiv la poziţia 1. Glicozidele neutre sunt produse de
organismele mutante defective în sinteza aminoglicozidelor.
Daunorubicina este un antibiotic de fermentaţie derivat din antraciclină, folosită în clinică pentru
tratamentul leucemiilor umane. Se găseşte rareori ca produs final al fermentaţiilor microbiene, dar este
prezentă sub forma derivaţilor glicozidici, care prin hidroliză acidă furnizează medicamentul. Un produs
major al fermentaţiei daunorubicinei este rodomicina, înrudită structural cu antraciclinona.

Mecanismul de acţiune a antraciclinelor

Nu se cunoaşte mecanismul primar sau mecanismele prin care antraciclinele produc efectul toxic. Cea
mai probabilă ţintă pare a fi topoizomeraza II. Pentru inhibarea acestei enzime, o condiţie necesară, dar nu şi
suficientă este interacţiunea antraciclinelor cu molecula de ADN. Topoizomeraza II produce o rupere dublu
catenară în ADN, pe care o repară ulterior. Unele antracicline blochează relegarea ADN şi astfel produc o
rupere dublu catenară şi fragmentarea ADN. Alte antracicline, ca de exemplu aclacinomicina A inhibă
activitatea topoizomerazei II şi astfel este inhibată clivarea dublei catene, urmată de blocarea replicării,
transcrierii şi reparării ADN.
Doxorubicina se leagă de acizii nucleici, probabil prin intercalarea specifică a nucleului planar al
antraciclinei în dublul helix al moleculei de ADN. Molecula antibioticului este amfifilă: inelul antraciclinei
este lipofil, iar capătul saturat al ciclului conţine grupări OH numeroase, asociate glucidului aminat, rezultând
un centru hidrofil. Molecula este amfoterică, deoarece conţine funcţii acide în grupările fenolice ale ciclului şi
funcţie bazică în grupul amino al glucidului. Doxorubicina se leagă de membrana celulară, dar şi de proteinele
plasmatice. Cel mai important efect secundar al doxorubicinei şi daunorubicinei este cardiotoxicitatea de tip
cumulativ. Se presupune că fenomenul cardiotoxicităţii se datorează producerii radicalilor liberi ai
antraciclinei şi formării radicalului OH . liber, care reduce Cu 2+ şi Fe3+, la nivel celular. Producerea şi
stabilitatea radicalilor este asociată cu numărul grupărilor OH ai moleculei aromatice. Datorită efectului său
citotoxic, doxorubicina se administrează pentru tratamentul neoplaziilor. Efectul citotoxic asupra celulelor
maligne, precum şi efectele sale toxice faţă de celulele diferitelor organe, se crede că se datorează intercalării
antibioticului între bazele ADN şi afinităţii sale de legare cu lipidele membranare. Intercalarea inhibă legarea
ADN- şi ARN-polimerazei, inhibând procesele de replicare şi transcriere a ADN. Doxorubicina pare să
interacţioneze cu topoizomeraza II, formând complexe care clivează molecula de ADN. Legarea
doxorubicinei de membrana celulei, perturbă o varietate de funcţii celulare. Reducerea enzimatică a
doxorubicinei, prin acceptarea unui electron, sub acţiunea diferitelor oxidaze, reductaze şi dehidrogenaze,
generează variante moleculare foarte reactive, inclusiv radicalul OH . liber.
Doxorubicina este activă faţă de un spectru larg de tumori experimentale, este imunosupresivă şi are
proprietăţi carcinogenice la rozătoare. Induce diferite efecte toxice, inclusiv toxicitate cardiacă întârziată şi
progresivă, mielosupresie (scăderea numărului de leucocite polimorfonucleare circulante) la toate speciile
analizate. La şobolan şi câine produce atrofia testiculară. Doxorubicina se administrează numai intravenos.

139
Dacă în timpul administrării, medicamentul este extravazat, produce necroză tisulară severă. De aceea, nu se
administrează intramuscular sau subcutan.Toxicitatea miocardică manifestată în formă severă prin insuficienţă
cardiacă congestivă potenţial fatală, poate să se producă în timpul terapiei sau după luni ori ani de la
terminarea terapiei. Riscul insuficienţei cardiace congestive creşte odată cu doza totală, prin efect cumulativ,
ce depăşeşte 450 mg/m2. Efectele toxice pot să se manifeste chiar la doze cumulative mai mici, la pacienţii cu
afecţiuni cardiace. Doxorubicina potenţează toxicitatea la pacienţii supuşi altor terapii antineoplazice:
iradierea mediastinală, administrarea ciclofosfamidei.
Doxorubicina se metabolizează în ficat şi se excretă pe cale hepatobiliară. Din această cauză,
toxicitatea este mai mare la pacienţii cu insuficienţă hepatică.
Administrate ca citostatice, antraciclinele induc selecţia unor subpopulaţii de celule tumorale
rezistente, care nu mai răspund la tratament. Cel mai comun mecanism al rezistenţei la antracicline este acela
care conferă rezistenţă multiplă la medicamente (MDR). Mecanismul implică o glicoproteină membranară
complexă care funcţionează ca o pompă de export, ce transportă activ antibioticele antraciclinice din celulă.

5.8. Cloramfenicolul

A fost izolat şi cristalizat în acelaşi timp, în 3 laboratoare, din culturi de Streptomyces venezuelae şi
Str. phleochromogenes. Este primul antibiotic cu spectru larg, introdus în clinică. Este primul antibiotic
sintetizat complet prin metodele chimiei organice şi este singurul antibiotic produs pe cale industrială prin
sinteză chimică. Cloramfenicolul produce un efect specific asupra sintezei proteinelor. De aceea, este un
instrument important în biologia experimentală, folosit în scopul blocării specifice a sintezei proteinelor,
pentru a investiga alte procese celulare, ca de exemplu, controlul sintezei ADN.
Molecula de cloramfenicol conţine un inel aril, cu o catenă laterală de 3 atomi de C, care poate fi
derivată din fenilalanină sau tirozină. Acidul p-aminobenzoic poate să furnizeze jumătatea nitro-aril şi catena
laterală. Particularitatea neobişnuită a moleculei de cloramfenicol este N aromatic şi halogenul organic. Sunt
foarte puţini compuşi de origine biologică, cu grupare nitro: acidul -nitropropionic, 2-nitro-imidazolul.

Structura moleculară a cloramfenicolului

Organismul crescut în solul nesteril, nu produce cantităţi detectabile de cloramfenicol. Numai în solul
sterilizat, cloramfenicolul este produs în cantităţi semnificative. Acest fapt sugerează că cloramfenicolul nu
este un antibiotic în sensul convenţional – adică o substanţă elaborată de un organism ca răspuns la competiţia
sa cu alte organisme, pentru a supravieţui într-un mediu ecologic complex.
Biosinteza cloramfenicolului progresează rapid în medii organice complexe. În mediile definite
chimic, sinteza este mai puţin eficientă. Glucoza este sursa optimă de C pentru creşterea miceliului, dar
randamentul sintezei antibioticului este inferior, deoarece este metabolizată cu o rată înaltă. Glicerolul
satisface atât cerinţa creşterii miceliului, cât şi a unui bun randament al biosintezei cloramfenicolului. Ionul de
amoniu stimulează numai creşterea miceliului, iar nitratul favorizează sinteza cloramfenicolului. Procesul de
creştre necesită o sursă de fosfat şi de sulf. Magneziul, fierul, zincul sunt necesare pentru creştere, la
concentraţii mici.
Cloramfenicolul este un antibiotic cu spectru larg, inhibitor pentru creşterea celor mai multe bacterii
Gram pozitive şi Gram negative, la concentraţia de 0,5 g/ml, inclusiv Rickettsia. Clostridium şi
Pseudomonas sunt de obicei rezistente, ca şi celulele mamaliene în cultură. În general are acţiune
bacteriostatică, dar este bactericid faţă de agenţii etiologici ai meningitei: Haemophilus influenzae,
pneumococi, meningococi. Cloramfenicolul inhibă sinteza proteinelor: molecula se fixează pe subunitatea
ribosomală 50 S, interacţionează cu ARN r-23S şi inhibă formarea legăturii peptidice în catena în curs de
140
sinteză, prin legarea de enzima peptidil-transferază pe subunitatea 50S. Cloramfenicolul este un agent
bacteriostatic, inhibitor al creşterii bacteriilor Gram pozitive şi Gram negative.
Rezistenţa la cloramfenicol se datorează, de cele mai multe ori, inactivării antibioticului sub acţiunea
enzimelor inactivatoare: cloramfenicol-acetiltransferaza (CAT). Genele cat ale bacteriilor Gram pozitive şi
Gram negative au un grad redus de omologie şi codifică o mare diversitate de enzime. Cel mai adesea, gena se
găseşte localizată pe plasmide de rezistenţă.

Uneori, rezistenţa la cloramfenicol se datorează permeabilităţii scăzute a membranei externe şi


implicit reducerii ratei de transport intracelular al antibioticului, precum şi acţiunii pompelor de eflux, descrise
la bacteriile Gram negative. Rezistenţa se poate datora capacităţii bacteriilor rezistente de a degrada
antibioticul.
Cloramfenicolul are utilizări clinice restrânse: se foloseşte în tratamentul infecţiilor severe.

5.9. Novobiocina

Structural, molecula constă din glucidul norioză (inelul A), o componentă cumarinică (inelul B) şi un
acid benzoic substituit (inelul C), legate printr-o legătură glicozidică şi o legătură amidică.

Structura moleculară a novobiocinei

Novobiocina este considerată o cumarină substituită: este prima cumarină izolată ca metabolit
microbian şi prima identificată ca având N în structura ei. Cumarinele sunt larg distribuite la diferite familii de
plante. Câteva cumarine complexe sunt produse ca metaboliţi ai bacteriilor şi fungilor. Alte cumarine includ
aflatoxinele.
Cumarina este o lactonă ce rezultă prin hidroliza enzimatică a unor glicozide, care se găsesc în
frunzele şi tulpinile mai multor plante: Lavandula (levănţică), Melilotus, Trifolium, Levisticum (leuştean),
căpşuni, caise, cireşe, scorţişoară etc. Cel mai cunoscut precursor al cumarinei este melilotozidul din Melilotus
altissimus, M. arvensis. Melilotozida conţine un eter şi cumarina (fig. 39). Cumarina este un fitoestrogen şi se
găseşte în concentraţii mici în mulţi agenţi naturali care se adaugă alimentelor ca amelioratori de gust.
Datorită asemănării chimice cu estrogenii, se leagă de receptorul estrogenic uman.

141
Melilotozid Cumarina

Figura 39. Ilustrarea schematică a hidrolizei melilotozidului la cumarină

Novobiocina are două grupări acide, un fenol uşor acid şi un enol mai acid, pe inelul cumarinic.
Formează săruri insolubile cu o varietate de cationi bi- şi trivalenţi: Zn, Al, Mn, Fe. Sarea de sodiu este foarte
solubilă în apă. Novobiocina este activă în primul rând faţă de bacteriile Gram pozitive, dar acţionează şi
asupra unor tulpini de bacterii Gram negative (Klebsiella, Proteus). Este mai puţin activă faţă de micobacterii
şi corinebacterii, iar activitatea antifungică este neglijabilă. Novobiocina determină apariţia formelor
filamentoase ale bacililor Gram negativi, iar activitatea inhibitorie faţă de bacteriile Gram pozitive este
reversată uşor de ionii de Mg2+. Ca şi penicilina, novobiocina induce acumularea uridin-nucleotid-
mucopeptidelor în celulele de S. aureus. Concluzia este ca efectul său constă în inhibiţia sintezei peretelui
celular, dar structura parietală nu este ţinta primară a acţiunii antibioticului, pentru că creşterea protoplaştilor
şi a micoplasmelor este puternic inhibată. Novobiocina inhibă creşterea bacteriilor datorită unor efecte
multiple: unul dintre ele este efectul chelator faţă de ionii de Mg. Antibioticul formează complexe specifice cu
diferite metale, nu numai cu Mg2+, săruri insolubile, dar Mg2+ este un microelement esenţial, având rol
structural şi funcţional pentru activitatea unei largi varietăţi de enzime celulare. Cele mai multe enzime care
catalizează reacţii ce implică grupările fosfat, necesită ioni de Mg: sintetazele acizilor nucleici (ADN- şi
ARN-polimeraza), enzimele activatoare ale aminoacizilor, enzimele care catalizează sinteza acizilor teichoici,
enzimele glicolitice, fosfolipazele.
Ionii de Mg au rol structural: prin legarea moleculelor fosfolipidice conferă stabilitate membranelor
celulare. Au rol în stabilizarea dublei helice ADN şi în menţinerea subunităţilor ribosomale 30S şi 50S în
formă asociată, funcţională de 70S. Deficienţa cantitativă a ionilor de Mg are implicaţii profunde asupra
funcţionării celulei. Dar nu toate procesele celulare dependente de Mg 2+ necesită cantităţi echivalente de
cationi. Deficienţa de Mg2+ influenţează în grade diferite procesele celulare. Unele organisme au nevoi mai
mari de Mg2+ decât altele şi de aceea sunt mai sensibile, iar creşterea lor este influenţată mai mult.
Novobiocina inhibă creşterea bacteriilor, proporţional cu necesarul lor de Mg. Astfel se explică gradul diferit
de sensibilitate al bacteriilor: cele Gram pozitive sunt mai sensibile decât cele Gram negative, deşi Proteus şi
Klebsiella au sensibilitate relativ înaltă. Novobiocina este un inhibitor eficient al sintezei acizilor nucleici la
E. coli.
Activitatea novobiocinei este amplificată de concentraţiile subinhibitorii de azidă de sodiu. Unele
funcţii celulare sunt inhibate atât de azidă cât şi de novobiocină: respiraţia, transportul electronilor pe catena
respiratorie a bacteriilor aerobe, transportul membranar al aminoacizilor, fosforilarea oxidativă.

5.10. Rifamicinele

Rifamicinele sunt o clasă de antibiotice, inhibitorii ale ARN-polimerazei dependentă de ADN. ARN-
polimeraza se ataşează de un factor ce conferă specificitate pentru recunoaşterea situsurilor promotor ce
iniţiază transcrierea ADN. Rifamicina se leagă necovalent, dar ferm, de o subunitate a ARN-polimerazei şi
interferă specific cu procesul de iniţiere, dar nu are efect după ce polimerizarea a început.
Rifampicina aparţine familiei ansamicilinelor şi este un derivat semisintetic al unei molecule naturale,
rifamicina B – forma hidrofobă, constituită dintr-un lanţ lung alifatic în formă de ansă (de unde şi numele
familiei), legând două nuclee aromatice. Caracterul hidrofob al moleculei explică dificultăţile sale de a
traversa membrana externă a bacililor Gram-negativi.

142
Structura moleculară a rifampicinei

Acţiunea bacteriostatică a rifampicinei se explică printr-o inhibiţie a transcrierii ADN în ARN,


reacţie catalizată de ARN polimeraza dependentă de ADN. Rifampicina acţionează, în esenţă, asupra etapei
iniţierii transcrierii, dar nu împiedică alungirea lanţului de ARNm. Absenţa activităţii rifampicinei asupra
ARN polimerazelor celulelor eucariote explică toxicitatea sa selectivă faţă de bacterii. Rifampicina este un
component important al tratamentului pe termen scurt al infecţiilor cu micobacterii cu rezistenţă multiplă.
Mecanismul acţiunii antibacteriene al rifamicinelor implică inhibiţia unei singure ţinte enzimatice,
adică subunitatea β a ARN-polimerazei dependentă de ADN. La E. coli, această enzimă este un oligomer
complex alcătuit din 4 subunităţi diferite: , , ’ şi , codificate de genele corespunzătoare. Enzima poate să
existe sub forma regiunii centrale a enzimei alcătuită din 4 subunităţi (2  ’) sau sub forma holoenzimei
(2’ + ). Rifampicina se leagă la subunitatea  a ARN-polimerazei de E. coli şi produce inhibiţia
transcrierii. Formarea complexului medicament - enzimă, inhibă iniţierea formării lanţului în procesul sintezei
ARN.
Nu s-a raportat existenţa enzimelor inactivatoare ale rifamicinei, iar mecanismul rezistenţei la
antibiotic se bazează pe mutageneza ţintei unice. Din această cauză, tulpinile rezistente au apărut mai repede
decât pentru alte familii de antibiotice. Micobacteriile pot dezvolta rezistenţa la rifampicină, atât În vivo cât şi
În vitro. Apariţia rezistenţei este un proces ce constă într-o singură treaptă. Tuberculoza cauzată de tulpini
rezistente la rifampicină s-a identificat chiar la pacienţii care nu au fost supuşi chimioterapiei.
Mutaţiile produse de rifamicină sunt inserţii şi deleţii ale ARN-polimerazei bacteriene şi apar în cele 3
regiuni scurte înalt conservate ale subunităţii β, ce formează aria „fierbinte”, cuprinsă între resturile 505-534
(la E. coli), la distanţă de situsul activ al enzimei. La micobacterii, peste 90% dintre mutaţii se datorează
schimbării unei singure nucleotide a genei codificatoare a subunităţii β.

5.11. Acidul fusidic

Este un agent antibacterian de natura sterolică. Molecula este hidrofobă, ceea ce explica efectul redus
asupra bacililor Gram negativi, fiind utilizat mai ales ca antibiotic antistafilococic. Mecanismele prin care
inhiba sinteza proteinelor nu sunt încă suficient de bine cunoscute.

143
Structura moleculară a acidului fusidic

Bibliografie selectivă

1. Ackerman G, Rodloff AC. Drugs of the 21 st century: telithromycin (HMR 3647)—the first
ketolide. J Antimicrob Chemother. 2003, 51:497-511.
2. Ackermann, G., Tang Y. J., Kueper R., Heisig P., Rodloff A. C., Silva J. Jr., and Cohen S. H., .
Resistance to moxifloxacin În toxigenic Clostridium difficile isolates is associated with
mutations În gyrA, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45:2348-2353.
3. Barry A.L., Jones R.N., Thornsberry C., Cefsulodin: antibacterial activity and tentative
interpretive zone standards for the disk susceptibility test, Antimicrobial Agents and
Chemotherapy. 1981, 20(4): 525-529.
4. Brokmann H., Bauer K., Rhodomycin., Ein rotes Antibioticum aus Actinomyceten,
Naturwissenschaften. 1950, 37: 492-493
5. Bush K., Jacoby G. A., Medeiros A. A. A functional classification scheme for -lactamases and
its correlation with molecular structure. 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39:1211-1233
6. Chopra I., Roberts M., Tetracycline Antibiotics: Mode of Action, Applications, Molecular
Biology, and Epidemiology of Bacterial Resistance. Microbiology and Molecular Biology
Reviews. 2001, 65(2): 232-260.
7. Donadio S., McAlpine J.B., Sheldon P.J., Jackson M., Katz L., An erythromycin analog
produced by reprogramming of polyketide synthesis, Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America. 1993, 90(15): 7119-7123.
8. Georgopapadakou N.H., Smith S.A., Sykes R.B., .Mode of action of azthreonam, Antimicrobial
Agents and Chemotherapy. 1982, 21(6): 950-956.
9. Hancock R.E.W. Bacterial outer membranes: Evolving Concepts. ASM News. 1991, 57:175-
182.
10. Henquell C., Chanal C., Sirot D., Labia R., Sirot J., Molecular characterization of nine different
types of mutants among 107 inhibitor-resistant TEM beta-lactamases from clinical isolates of
Escherichia coli, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1995, 39(2): 427-430.
11. Koch A.L., Bacterial Wall as Target for Attack: Past, Present, and Future Research, Clinical
Microbiology Reviews. 2003, 16(4): 673-687.
12. Leclerc D., Melançon P., Brakier-Gingras L., Mutations in the 915 region of Escherichia coli
16S ribosomal RNA reduce the binding of streptomycin to the ribosome, Nucleic Acids
Research. 1991, 19(14): 3973-3977.
13. Moazed D, Noller HF., Transfer RNA shields specific nucleotides in 16S ribosomal RNA from
attack by chemical probes. Cell. 1986, 47 (6): 985–994
14. Neu H.C., Chin N.X., Novelli A., În vitro activity of E-1040, a novel cephalosporin with potent
activity against Pseudomonas aeruginosa, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1988,
32(11): 1666-1675.
15. Pfeiffer B.A., Khosla C., Biosynthesis of polyketides in heterologous host, Microbiology and
Molecular Biology Reviews. 2001, 65(1): 106-118

144
16. Pinard R., Côté M., Payant C., Brakier-Gingras L., Positions 13 and 914 În Escherichia coli
16S ribosomal RNA are involved În the control of translational accuracy, Nucleic Acids
Research.. 1994, 22(4): 619-624.
17. Sanders CC, Sanders WE Jr, Goering RV. In vitro antagonism of beta-lactam antibiotics by
cefoxitin. Antimicrob Agents Chemother. 1982, 21 (6): 968–975
18. Schatz A., Bugie E., Waksman, S. Streptomycin: A Substance Exhibiting Antibiotic Activity
Against Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria. Proceedings of the Society for
Experimental and Biological Medicine.1944, 55 (1944): 66-69.
19. Speer B.S., Shoemaker N.B., Salyers A.A., Bacterial resistance to tetracycline: mechanisms,
transfer, and clinical significance, Clinical Microbiology Reviews. 1992, 5(4): 387-399.
20. Taylor D.E., Courvalin P., .Mechanisms of antibiotic resistance in Campylobacter species,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1988, 32(8): 1107-1112.
21. Then R.L., Angehrn P., Multiply resistant mutants of Enterobacter cloacae selected by beta-
lactam antibiotics, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1986, 30(5): 684-688.
22. Tran M.P., Telithromycin: a novel agent for the treatment of community-acquired upper
respiratory infections, Baylor University Medical Center Proceedings. 2004, 17(4): 475-479.
23. Vakulenko S.B., Donabedian S.M., Voskresenskiy A.M., Zervos M.J., Lerner S.A.,Chow
J.W., .Multiplex PCR for Detection of Aminoglycoside Resistance Genes in Enterococci,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2003, 47(4): 1423-1426.
24. Vakulenko S.B., Mobashery S., Versatility of Aminoglycosides and Prospects for Their Future,
Clinical Microbiology Reviews. 2003, 16(3): 430-450.
25. Vester B., Douthwaite S., Macrolide Resistance Conferred by Base Substitutions in 23S rRNA,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45(1): 1-12.

145
Capitolul 6
DETERMINAREA SPECTRULUI DE SENSIBILITATE LA ANTIBIOTICE A SPECIILOR
MICROBIENE. ANTIBIOGRAMĂ

Datorita specificităţii lor de acţiune, antibioticele manifestă eficienţă diferită faţă de diferite specii
microbiene; totalitatea speciilor microbiene sensibile la un anumit antibiotic defineşte spectrul de activitate al
antibioticului respectiv. În funcţie de numărul şi diversitatea speciilor microbiene afectate, spectrul de
activitate al antibioticelor poate fi :
- larg (de exemplu, spectrul de acţiune al tetraciclinei este reprezentat de bacterii Gram-negative, inclusiv
chlamidii şi rickettsii şi specii Gram-pozitive; penicilinele sunt active în special faţă de specii Gram-
pozitive, dar şi Gram-negative, inclusiv chlamidii; nitrofuranii, rifampicina, sulfamidele sunt active pe un
număr mare de specii bacteriene Gram-pozitive şi Gram-negative şi pe bacteriile acido-alcoolo-rezistente);
- îngust (novobiocina este activă pe bacteriile Gram-pozitive, mai ales stafilococi, dar şi pe coci şi bacili
Gram-negativi, cum ar fi hemofilii şi pasteurelele; glicopeptidele, bacitracina, pe bacterii Gram –pozitive);
- limitat (nitroimidazolii sunt activi doar pe microorganismele anaerobe).
Chiar în cadrul aceleiaşi specii microbiene, pot exista diferenţe mari de sensibilitate a diferitelor
tulpini faţă de un anumit antibiotic, astfel că stabilirea tratamentului cu antibiotice în clinică necesită izolarea
tulpinii microbiene care reprezintă agentul etiologic al infecţiei respective (mai ales dacă acesta aparţine unor
genuri şi specii supuse fenomenului de dobândire a rezistenţei clinice) şi determinarea spectrului său de
sensibilitate la antibiotice.
Evaluarea in vitro a eficienţei unui antibiotic se realizează prin măsurarea a trei parametri, care
variază în funcţie de concentraţia antibioticului şi de timpul său de acţiune:
- concentraţia minima activă (= C.M.A.) - este concentraţia la care antibioticul poate induce anumite
perturbări în activitatea metabolică a microorganismelor, fără a afecta capacitatea de multiplicare şi
viabilitatea microorganismelor;
- concentraţie minima inhibitorie (= C.M.I.) - este concentraţia la care un antibiotic inhibă
multiplicarea microorganismelor (efect bacteriostatic);
- concentraţie minima bactericida (= C.M.B.) - este concentraţia la care un antibiotic are acţiune letală
asupra microorganismelor (efect bactericid).
Cunoaşterea acestor parametri prezintă o importanţă clinică deosebită, deoarece, pentru unele
antibiotice, concentraţia bactericida este foarte greu de atins in vivo. Din acest motiv, unele antibiotice ca
tetraciclina, cloramfenicolul, rifampicina sunt considerate antibiotice bacteriostatice.
Pe lângă valoarea C.M.I. determinată in vitro, în alegerea tratamentului cu un anumit antibiotic, trebuie să se
ţină cont şi de calităţile farmacologice ale antibioticului respectiv (de exemplu, posibilitatea realizarii
concentraţiei active la nivelul focarului de infecţie), de eventualele efecte secundare şi de starea fiziologică a
bolnavului.
Tehnica de evidenţiere a sensibilitaţii la antibiotice a unei tulpini microbiene se numeşte
antibiograma. Antibiograma trebuie practicată în mod obligatoriu în cazul microorganismelor patogene,
supuse fenomenului de dobândire a rezistenţei, înaintea începerii oricărui tratament cu antibiotice.
După determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice prin tehnici calitative (în care tulpina
microbiană de testat este pusă în contact cu diferite antibiotice aflate într-o anumită concentraţie), se pot
practica teste cantitative pentru determinarea valorii C.M.I. (în care tulpina microbiană este pusă în contact cu
concentraţii crescătoare ale aceluiaşi antibiotic).

6.1. Metode calitative de determinare a spectrului de sensibilitate la antibiotice

Metoda difuzimetrică (Kirby-Bauer)

Este o metodă foarte simplă şi rapidă, care permite determinarea concomitentă a spectrului de
sensibilitate a microorganismului şi a valorii C.M.I. în vederea calculării dozelor terapeutice de antibiotice.
Metoda are mai multe variante, în practică folosindu-se curent tehnica discurilor impregnate cu antibiotice,
standardizată, recomandată de NCCLS / CLSI (National Committee for Clinical Laboratory Standardisation /
Clinical Laboratorz Standards Institute).
O serie de factori, ca de exemplu, tulpina microbiană studiată (densitatea inoculului, specia, vârsta
culturii), mediul de cultură (compoziţia mediului, pH-ul, densitatea şi grosimea stratului de mediu), tehnica
folosită şi criteriile de interpretare a rezultatelor obţinute, pot influenţa rezultatele unei antibiograme. Din

147
acest motiv, tehnica trebuie efectuată în condiţii standardizate, reproductibile, conform indicaţiilor forurilor
internaţionale în domeniu.
Pe suprafaţa unui mediu agarizat însămânţat “în pânză” cu un inocul standardizat, obţinut din tulpina de
testat, se plasează la distanţe egale discuri impregnate cu soluţii de antibiotice de o anumită concentraţie care
vor difuza în mediu, realizând un gradient de concentraţie invers proporţional cu diametrul zonei de difuzie,
deci cu distanţa faţă de disc. Dacă tulpina este sensibilă la un anumit antibiotic, creşterea microbiană va fi
inhibată pe o anumită suprafaţă în jurul discului impregnat cu antibioticul respectiv, suprafaţă denumită zonă
de inhibiţie a creşterii.
Citirea rezultatelor se realizează prin masurarea diametrelor zonelor de inhibiţie a creşterii determinate de
diferite antibiotice, cu ajutorul unei rigle gradate. În cazuri de urgenţă clinică se poate realiza o primă citire la
6-8 h de la incubare. Interpretarea rezultatelor se face în funcţie de dimensiunea zonelor de inhibiţie a
creşterii, exprimând rezultatul cu termenii de tulpină sensibilă (S), rezistentă (R) sau intermediar sensibilă (I),
conform tabelelor cu puncte critice standardizate şi corespunzătoare metodei de lucru: tabelele NCCLS pentru
metoda difuzimetrică recomandată de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, USA),
in prezent CLSI (Clinical laboratory and Standards Institute).
Termenii S, I, R definesc de fapt şi categoriile de antibiotice, în funcţie de efectul lor clinic, după cum
urmează:
- categoria S, înseamnă că există o mare probabilitate ca antibioticul, administrat în doze obişnuite, să
elimine infecţia determinată de tulpina testată (C.M.I. are valori net inferioare celor ale concentraţiilor
umorale obţinute în urma administrării unei doze obişnuite);
- categoria I, semnifica probabilitatea ca antibioticul să fie eficient in vivo prin administrare locală sau prin
realizarea în mod fiziologic a concentraţiilor mari in organe sau ţesuturi (rinichi, ficat, cai biliare), la nivelul
cărora este localizat procesul infecţios;
- categoria R înseamnă că, cel mai probabil, administrarea antibioticului nu va determina eliminarea din
organism a agentului infecţios, a cărui sensibilitate a fost testată sau rezultatul tratamentului este
imprevizibil.
La citirea şi interpretarea rezultatelor se iau în considerare diametrele zonelor de inhibiţie, lipsite
complet de colonii vizibile cu ochiul liber.
Apariţia coloniilor la marginea sau în interiorul zonei de inhibiţie se poate datora urmatorilor factori:
cultura este mixtă sau suprainfectată; cultura este pură, dar prezintă celule heterorezistente; apariţia mutantelor
rezistente; dezvoltarea tardivă a unor celule, de fapt sensibile, şi apariţia coloniilor după ce antibioticul s-a
diluat prin difuzie în mediu.

6.2. Metode cantitative de determinare a valorii C.M.I.

Metoda diluţiilor în mediul lichid sau în agar

Principiul metodei: un inocul standardizat al tulpinii testate este însămânţat într-un gradient
discontinuu de concentraţii ale antibioticului, fie în plăci cu mediu agarizat, fie în tuburi cu bulion nutritiv.
După incubarea adecvată, se citeste valoarea C.M.I. prin observarea macroscopică a tuburilor: în primele
tuburi, cu concentraţii mari de antibiotic, creşterea culturii nu este vizibilă, microorganismele fiind omorâte
sau inhibate în prezenţa antibioticului. Concentraţia de antibiotic corespunzătoare tubului cu cea mai mică
concentraţie, care inhibă creşterea vizibilă a culturii microbiene, reprezintă valorea C.M.I. (mcg/ml) pentru
antibioticul respectiv. În tuburile următoare, inclusiv tubul martor de creştere, mediul se tulbură ca urmare a
creşterii microbiene. În tubul martor de sterilitate, obligatoriu mediul trebuie să rămână steril (limpede), iar pe
placile cu mediu agarizat, coloniile lipsesc. Determinarea C.M.I. se utilizeză pentru stabilirea dozei
terapeutice şi a căii de administrare în cazul infecţiilor severe, supravegherea evoluţiei rezistenţei bacteriilor la
antibiotice, cuantificarea activitaţii bactericide a substantelor antimicrobiene. Această metodă permite şi
aflarea valorii C.M.B. (concentraţia minimă bactericidă) pentru antibioticul testat. Pentru aceasta, se
prelevează 0.01 ml sau 0.1 ml din tuburile utilizate pentru tehnica diluţiilor în mediu lichid (din tubul la care
s-a stabilit valoarea C.M.I. şi din tuburile anterioare care prezintă concentraţii superioare de antibiotic) şi se
însămânţează pe suprafaţa unor plăci cu mediu solid nesuplimentat cu antibioticul testat. După incubare, se va
observa dezvoltarea microorganismelor la diluţia corespunzătoare C.M.I. Valoarea C.M.B. este dată de cea
mai mică concentraţie de antibiotic care reduce numărul coloniilor pană la 99.9%.

148
Metoda E-test

La ora actuală, există variante ale metodei difuzimetrice pentru determinarea valorii C.M.I.. O astfel
de varianta este E-testul (Epsilometer test), ce utilizează benzi impregnate cu diferite antibiotice ale căror
concentraţii variază exponenţial şi sunt înscrise pe banda respectivă. Zona de inhibiţie a creşterii
microorganismului testat are aspect de elipsă, al cărei diametru variază direct proporţional cu gradientul de
concentraţie a antibioticului difuzat în mediu, diminuându-se odată cu scăderea concentraţiei astfel că, la o
anumită valoare, zona de inhibiţie a creşterii va intersecta banda, concentraţia înscrisă pe bandă la acest nivel
indicând valorea C.M.I.

6.3. Controlul de calitate în testarea sesibiltăţii la antibiotice

Controlul de calitate are drept scop să asigure precizia şi fiabilitatea tehnicii de testare a sensibilităţii,
performanţa reactivilor utilizaţi şi performanţa personalului care efectuează testele (Codiţă, 2007). Pentru a
răspunde acestor deziderate, laboratoarele care realizează antibiograma trebuie să dispună de tulpini de
referinţă pentru realizarea antibiogramei, şi anume: Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC
35219, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 43300, Staphylococcus aureus
ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Haemophilus
influenzae ATCC 49766, Neisseria gonorrhoae ATTC 49226, Neisseria gonorrhoae ATTC 49226,
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619.
Controlul de calitate trebuie să fie realizat pentru fiecare lot nou de mediu Mueller Hinton şi / sau
antibiotic, utilizând tulpinile de referinţă care vor fi testate în aceleaşi conditii ca şi cele bacteriene a caror
rezistenta se evaluează. Antibiogramele vor fi efectuate zilnic pentru fiecare dintre tulpinile de referinţă.
Daca rezultatele nu sunt satisfăcătoare, vor fi controlaţi următorii parametri:
1. citirea şi interpretarea diametrelor zonelor de inhibitie
- citirea antibiogramei trebuie realizată cu ajutorul unei rigle precise şi să se evite la maximum erorile,
menţinându-se instrumentul de măsură perpendicular pe axa optică;
- trebuie verificat daca interpretările (S, I, R) corespund diametrelor masurate;
- trebuie evitate erorile prin confuzia diferitelor tabele de citire.
2. mediul de cultură
pH-ul trebuie să fie 7,2 - 7,4, deoarece variaţiile de pH influentează activitatea aminozidelor,
macrolidelor şi fenicolilor.
Umiditatea:
- plăcile cu mediu trebuie să fie uscate îinainte de inoculare
Concentraţia în timidină sau timină:
- o concentraţie prea crescută de timidină determină o reducere a diametrelor zonelor de inhibiţie in jurul
discurilor de sulfamide şi trimetoprim
- pentru aceasta trebuie testat mediul MH cu o tulpină de referinţă Enterococcus faecalis ATCC 29212;
diametrul de inhibiţie în jurul discului de cotrimoxazol trebuie să fie > / = 20 mm.
Concentraţia în cationi divalenţi:
- o concentraţie prea crescută în ioni bivalenţi (în principal de Ca 2+ şi Mg2+) determină o reducere a
diametrelor zonelor de inhibiţie în jurul discurilor de aminozide (testate pentru P. aeruginosa), în timp ce
concentraţii mai mici favorizează apariţia unor zone de inhibiţie prea mari
- ionii de Zn influenţează activitatea carbapenemelor
- concentraţiile optime trebuie să fie : Ca2+ = 50 – 100 mg şi Mg2+ = 20 - 35 m
3. inoculul
- etalonul 0,5 Mc Farland - se poate obtine astfel:
0,5ml Mg Cl2 sol 1% (10 g/l) +
95,5 ml H2SO4 1% (10 ml/ l);
etalonul astfel preparat trebuie să prezinte o densitate optică (D.O.) de 0,08 - 0,1 la 625 nm.
- se repartizează această soluţie în volume de 10 ml, în tuburi identice cu acelea care vor servi la prepararea
inoculului
- tuburile se inchid ermetic pentru a evita evaporarea (parafilm, adeziv etc.)
- se marchează nivelul lichidului cu un marker şi se controlează periodic măsurându-i densitatea optică
- se conservă tuburile la temperatură ambiantă, ferit de lumină (hârtie de aluminiu)
- tubul etalon se agita înainte de utilizar, iar inoculul şi etalonul trebuie să aibă aceeaşi turbiditate

149
4. discurile de antibiotice
- înainte de utilizare, cartuşul de antibiotic trebuie verificat pentru data valabilităţii, mai ales pentru -
lactamine, şi pentru încarcătura discului;
- stocul de cartuşe de antibiotice trebuie să fie pastrat la -20 oC; aplicatorul încărcat cu antibiotice trebuie
păstrat la + 4 oC;
- discurile umede sau în contact direct cu gheaţa, sau care au fost conservate la temperatura ambiantă nu
trebuie utilizate;
- cartuşele trebuie scoase din frigider sau congelator cu 1-2 h înainte de utilizare.
5. tulpinile de referinţă
- de la primirea lor, tulpinile de referinţă vor fi izolate pe un mediu adecvat; plecând de la această cultură se
fac 12 subculturi care se repartizează în 12 tuburi si se conservă prin congelare la - 70 oC. În fiecare lună se va
scoate un tub congelat cu tulpina / tulpinile care vor fi testate; se refac 12 tuburi cu culturi pentru congelare,
pentru anul viitor, pornind de la al 12-lea tub consevat

150
Staphylococcus Streptococcus spp Streptococcus Enterococcus spp Escherichia coli, P. aeruginosa Vibrio Haemophilus
aureus (alte specii decat pneumoniae Salmonella, Acinetobacter influenzae**
S. pneumoniae) Klebsiella spp.
ampicilină/
Lista standard Lista standard Lista standard Lista standard amoxicilina/ ticarcilina ampicilina amoxicilină
penicilină* penicilina G penicilina G ampicilina ampicilina piperacilina cotrimoxazol cefalotin
eritromicină ampicilina sau ampicilina sau gentamicina gentamicina/ ceftazidim acid nalidixic gentamicină
lincomicină amoxicilina amoxicilina nitrofurani tobramicina imipenem tetraciclina cloramfenicol
pristinamicină oxacilina oxacilina ftazidim/ amikacina pristinamicină
kanamicină tetraciclina cefotaxim sau Antibiotice cefotaxim/ gentamicina eritromicină
tobramicină eritromicina ceftriaxon opţionale ceftriaxon tobramicina tetraciclină
gentamicină lincomicina sau tetraciclina oxacilina* ofloxacin/ ofloxacin pefloxacină
cloramfenicol clindamicina eritromicina streptomicina ciprofloxacin sulfametoxazol
tetraciclină pristinamicna lincomicina sau kaanamicina cotrimoxazol rifampicină
cotrimoxazol clindamicina clindamicina cloramfenicol Acid nalidixic
acid fusidic pristinamicina tetraciclina **
Rezistenţă
rifampicină Antibiotice eritromicina naturală: la
opţionale Antibiotice lincomicina* sau aminopeniciline,
*
- se testează pe rifampicina opţionale clindamicina* carboxipeniciline
geloză Mueller cefotaxim imipenem) pristinamicina (E. ,
Hinton cu 4% NaCl cefepim streptomicina faecium) ureidopeniciline-
şi 6 g/ml oxacilină streptomicina kanamicina linezolid -lactamază
kanamicina gentamicina cotrimoxazol sensibilă la
Rezistenţă gentamicina cloramfenicol rifampicina inhibitori,
dobândită: cloramfenicol telitromicina fluorochinolone frecvent asociată
rezistenţă la spiramicina linezolid vancomicina cu
penicilină G; telitromicina cotrimoxazol* (teicoplamina) multirezistenţă;
fenotip MLSb linezolid fluorochinolone la
inductibil la cotrimoxazol* fosfomicina * - ajuta la aminopeniciline,
eritromicină; ofloxacin vancomicina identificarea cefalosporine
fenotip KT. vancomicina teicoplamina E. faecalis generaţia I –
teicoplamina (rezistenta naturala) nonenzimatică,
sensibilitatea nu
* - se testeaza pe * - se testeaza pe este restabilită în
geloza Mueller geloza Mueller prezenţa
Hinton cu 5% Hinton cu 5% inhibitorilor de
sange de cal sange de cal beta-lactamaze.
hemolizat hemolizat

Rezistenţă Rezistenţă
naturală: naturală:
- nivel scazut la -de nivel scazut la
aminozide; aminozide, acid
polimixine, acid fusidic, polimixină,
fusidic, acid acid nalidixic,
nalidixic; - puţin sensibil la
sensibilitate pefloxacină şi
moderată la norfloxacină
fluoroquinolone; (sensibil la
sensibilitate scăzută sparfloxacină),
la acid fusidic. bacitracină
NB: Activitatea
SXT inhibitată de
prezenţa timidinei
în mediu (geloză
Mueller Hinton cu
adaos de 5% sange
de cal).
Rezistenţă
dobândită:
la toate clasele de
antibiotice cu
excepţia
glicopeptidelor.
Rezistenţa la
penicilină decelată
cu ajutorului
discului de
Oxacilină (5/ 1 µg),
încrucişată cu toate
beta-lactaminele,
dar de niveluri
diferite (se
calculează C.M.I.).
Tabelul nr. 10.
Antibiotice de testat pentru cocii Gram-pozitivi, Enterobacteriaceae şi bacili Gram negativi nonfermentativi

145
Antibiograma difuzimetrică poate permite determinarea pattern-urilor de rezistenţă constitutivă,
intrinsecă, nativă, precum şi detectarea fenotipică a unor mecanisme de rezistenţă dobândită.
Plasarea antibioticelor pe placă într-o anumită ordine permite citirea interpretativă a testelor de
sensibilitate la antibiotice (concept introdus de Patrick Courvalin (1986) şi detectarea fenotipică a unor
mecanisme de rezistenţă la antibiotice (Lambert si colab., 1993).

6.4. Aplicaţii practice ale citirii interpretative în evidenţierea fenotipică a diferitelor mecanisme de
rezistenţă la principalele specii microbiene de interes clinic

Rezistenta S. aureus la β-lactamice


Pentru S. aureus, s-au evidenţiat mai multe mecanisme de rezistenţă la β-lactamice (tabelul 11, 12).
Tabelul 11.
Mecanismele de rezistenta la agenti antimicrobieni la S. aureus (dupa Lowy, 2003).

Antibiotice Genele rezistente Produsele genelor Mecanismele de rezistenta

ß-lactame blaZ ß-lactamaza 1) Hidroliza enzimatică a nucleului


mecA PBA2a ß-lactamic (fig. 24)
2) Reduce afinitatea pentru PBP
Glicopeptide VISA 1)Peptidoglican alterat 1) Legarea vancomicinei în peretele
- 2)D-Ala-D-Lac celular
2) Sinteza dipeptidelor cu reducerea
afinităţii pentru vancomicină
Quinolone 1) parC 1)Componentul par C al 1, 2) Mutaţii care au loc în regiunea
2) gyrA sau gyrB topoizomerazei IV QRDR reduc afinitatea complexului
2)Componentele Gyr A sau ADN-enzimă pentru quinolone
GyrB ale girazei
Trimethoprim- 1) Sulfonamide: 1)Dhidropteroat sintaza 1) Supraproducţia de acid amino-
sulfamethoxazol sal A 2)Dhidrofolat reductaza benzoic de către enzime
2)TMP:dfrB 2) Reducerea afinităţii pentru DHFR
Quinopristin- 1)Q:ermA 1) Metilaze ribosomale 1) Reduce legarea la subunitatea
dalfopristin ermB 2) Acetiltransferaze ribosomală 23S
(Q-D) ermC 2) Modificarea enzimatică a
2)D:vat, vatB dalfopristinului

Tabelul 12.
Mecanismele de rezistenta la ß -lactamice la S. aureus (dupa Lowy, 2003).
Penicilina G Antibiotic + Penicilina M Cefalosporine
Mecanism Penicilina A inhibitor de β- Carbapeneme
Carboxipenicilina lactamaze
Ureidopenicilina
Sălbatic S S S S
Penicilinază R S S S
Modificarea PLP, R R R R
gena mecA
BORSA R S/R R S
MODSA S S R S
BORSA = S. aureus borderline; MODSA = S. aureus modificat.

Rezistenta la meticilină (respectiv oxacilină) (fig. 40) este considerată un marker al polirezistenţei
incluzând: cefalosporinele, eritromicina şi clindamicina, iar izbucnirile intraspitalicesti cu acest tip de tulpini
au creat probleme deosebite terapeutice, antiepidemice si de cost al spitalizarii (Codita, 1993). Producerea de
beta-lactamază se poate evidenţia prin testul treflei, utilizat şi pentru detectarea producerii de beta-lactamaze
de către tulpinile de N.gonorroeae si Haemophilus sp. Se însămantează o tulpină de S.aureus ATCC 25923 pe
o geloză Muller-Hinton (sau M-H cu sange Chocolat pentru N.gonorroeae si Haemophilus sp.); Se aplică un
disc de peniciclină G în centrul plăcii (sau de ampicilină în cazul Haemophilus); Se însămânţează în striuri
radiale (din centrul plăcii spre periferie) tulpina de testat, o tulpină S. aureus ATCC 25923 (sensibilă la
penicilina G), o tulpină de S. aureus ATCC 43300 (rezistentă la penicilina G). Se incubează placa 18 h la
152
35°C în atmosferă normală (sau 24 h în atmosfera îmbogăţită cu CO 2 pentru Haemophilus sp. şi N.
gonorrhoeae). Se suspectează existenţa β- lactamazei dacă se observă o diferenţă între diametrul de inhibiţie a
creşterii produsă de antibioticul de testat între tulpina sensibilă şi cea de testat, chiar dacă cele 2 diametre se
înscriu în categoria sensibilă a valorilor critice admise pentru tulpina testată.
La ora ctuală există teste rapide, cromogenice, care utilizează un mediu specific ( CHROMagar MRSA), care
diferenţiază cu mare specificitate tulpinile de S. aureus rezistente le meticilină, pe baza culorii coloniilor (Fig.
41).

Figura 40. Mecanismul inducerii sintezei ß-lactamazei stafilococice in prezenta penicilinei. BlaI se leagă de regiunea
operator, astfel încât se represează transcrierea ARN atât pentru blaZ, cât şi pentru blaR1-blaI; II Legarea penicilinei la
BlaR1 stimulează activarea autocatalitică a BlaR1; III-IV BlaR1 clivează BlaI în fragmente inactive permiţând
transcrierea blaZ şi blaR1-BlaI; V-VIII ß-lactamaza, enzimă extracelulară codificată de blaZ (V) hidrolizează ciclul ß-
lactamic al penicilinei (VI), în consecinţă produce inactivarea (VII) (Kernodle si colab., 1990); Schema operonului care
codifică rezistenţa la meticilină a S. aureus. Expunerea MecR1 la un antibiotic ß-lactamic induce sinteza MecR1; MecR1
inactivează MecI, permiţând sinteza lui PBP2a (dupa Kernodle si colab., 1997).

Figura 41. Aspectul coloniilor de S. aureus meticilinorezistent pe mediu CHROMagar MRSA (www2.m-
techmicro.com/.../chromagar/mrsa/mrsa.jpg)

Rezistenţa la meticilină în cazul stafilococului auriu este de multe ori asociată cu mecanisme de
rezistenţă care determină inactivarea altor familii de antibiotice. S. aureus rezistent la meticilină prin
modificarea PLP este adesea rezistent la aminozide (amikacina şi tobramicina şi în peste peste 90% din cazuri
153
la gentamicină), la fluoroquinolone, macrolide, lincosamide şi ketolide, la fosfomicină şi uneori la
rifampicină. Ca regulă generală, rămân active pe stafilococ glicopeptidele, acidul fusidic, streptograminele,
rifampicina şi oxazolidinonele.

Rezistenţa enterococilor la β-lactamice


La enterococi, rezistenţa la β-lactamice se realizează prin producerea β-lactamazei şi prin modificarea
ţintei (ce conferă rezistenţă naturală la cefalosporine, oxaciline si monobactami şi sensibilitate diminuată la
peniciline).

Rezistenţa Streptococcus pneumoniae la β-lactamice


Streptococcus pneumoniae prezintă rezistenţă dobândită la penicilină prin producerea de -lactamaze,
evidenţiată fenotipic prin testarea sensibilităţii la oxacilină, utilizând discuri de oxacilina de 5µg . Rezistenta la
penicilină este incrucişată pentru toate β-lactamicele, dar prezinta diferite niveluri de expresie in funcţie de
antibiotic. Activitatea amoxicilinei şi cefalosporinelor din generaţia a treia (cefotaxim, ceftriaxon) este mai
puţin modificată decât cea a penicilinei G. In ceea ce priveste piperacilina, cefalosporinele din prima şi a
doua generaţie şi cele orale, indiferent de generatie, cu excepţia cefpodoximului, ele sunt mai puţin active
decat penicilina G.
Rezistenţa la β-lactamice este asociată în proporţie de peste 50% cu rezistenţa la alte antibiotice ca:
tetraciclinele, macrolidele, cloramfenicolul sau trimetoprim-sulfametoxazolul (fig. 38). Unele eşecuri
terapeutice ar putea fi date de fenomenul de toleranţă la penicilină, datorat modificărilor controlului
activităţii autolitice, ducând in vivo la selectarea mutantelor peni-R (raportul CMB/CMI > 32).
Pentru toate tulpinile cu diametrul de inhibitie <26 mm la oxacilină, trebuie testat CMI pentru
penicilină, amoxicilină, cefotaxim şi toate antibioticele utilizate în tratament.

Figura 42. Tulpini de Streptococcus pneumoniae multi-rezistente la antibiotice


(<gold.aecom.yu.edu/id/micro/pneumococcus.htm>)
C
AMX CXM MNO
CTX AMX PIP CTX XA
amoxicilina cefuroxim minociclina
cefotaxim
C
SXT
CPD CEC S
trimetroprim- GM KAN GEN
cefpodoxi cefaclor SXT
sulfametoxazol
m
OXA D CFM RA F
RA VA TEC
oxacilina TM cefixime rifampicina FOS
K
C
C AN PT
RO
cloranfenicol kanamicin pristinamicina
cefpiroma
a forte

Tulpinile de Streptococcus pneumoniae sunt foarte sensibile la optochin, testul la optochin constituind
unul dintre testele simple de identificare sau de confirmare a speciei şi de diferenţiere faţă de ceilalţi
streptococi α – hemolitici (testul Lund, 1959). La concentraţii de 1 / 500.000 – 1 / 1.000.000, optochinul are
acţiune bactericidă pentru pneumococi, în timp ce pentru ceilalţi streptococi este nevoie de doze mult mai

154
mari de 1 / 5.000. Se însămânţează tulpina de testat pe o placă cu geloza sânge conţinând optochin 0.05% în
paralel cu însăamânţarea pe o placă de control fără optochin. În jurul pulberii de optochin apare o zonă de
inhibiţie a creşterii, cu un diametru de peste 20 mm (fig. 43).

Figura 43. Pneumococ α-hemolitic sensibil la optochin


(<gold.aecom.yu.edu/id/micro/pneumococcus.htm>).

În ceea ce priveşte rezistenta la β-lactamice la alte specii de streptococi, se pare ca doar un număr redus de
specii (streptococi orali; S. oralis, S. sanguis, S. mitis) prezintă sensibilitate diminuată la penicilina G (după
CLSI).
Evidenţierea fenotipică a rezistenţei la -lactamice a enterobacteriilor
După sensibilitatea lor naturală la antibioticele β-lactamice, enterobacteriile sunt clasificate în 4
grupe. Clasificarea are la bază comportamentul faţă de următoarele antibiotice β-lactamice: aminopeniciline,
aminopeniciline + inhibitori ai β-lactamazelor (IBL), carboxipeniciline, ureidopeniciline, cefalosporine din
prima generaţie (CIG), cefalosporine din a II a generaţie (CIIG), cefalosporine din a III a generaţie (CIIIG),
cefalosporine din a IV a generatie CIVG (cu spectru larg), CIIIG + IBL, carbapeneme, cefamicine.
Grupa I
În această grupă sunt clasate tulpinile de Escherichia coli, Proteus mirabilis, Salmonella ssp. şi
Shigella spp. (tabelul 13). Această grupă prezintă 4 fenotipuri mai frecvente:
Fenotipul 1: tulpini sensibile la toate β-lactamicele (60% dintre tulpinile izolate);
Fenotipul 2: tulpini producătoare de cefalosporinaze cromosomale de nivel scăzut (5% dintre tulpinile
izolate).
Fenotipul 3: tulpini producătoare de penicilinaze. Această enzimă este în general transferabilă (30%
din tulpini).
Fenotipul 4: tulpini producătoare de penicilinaze rezistente la inhibitori.
Grupa II
Această grupă este reprezentată de tulpinile de Klebsiella spp., Citrobacter koseri, C. amalonaticus,
E. hermannii (tabelul 14).
Fenotipul 1: tulpini rezistente la concentraţii scăzute de amoxicilină şi de ticarcilină.
Fenotipul 2: tulpini producătoare de penicilinaze plasmidiale. Nivelul de producere al acestor
penicilinaze este variabil, dar în general scăzut.
Fenotipul 3: tulpini producătoare de β-lactamaze de spectru larg (BLSE). Aceste tulpini sunt
rezistente la o concentraţie relativ scăzută de CIIIG (15% dintre tulpinile de Klebsiella spp. izolate).
Grupa III
Este reprezentată de tulpini de Enterobacter spp., Serratia spp., Proteus spp. indol (+) şi Morganella
spp., Providencia spp., Citrobacter freundii (tabelul 15).
Fenotipul 1: tulpini cu rezistenţă naturală la amoxicilină şi la cefalotin, ca urmare a exprimării de
cefalosporinaze cromosomale;
Fenotipul 2: tulpini rezistente la amoxicilina, cefalotina şi la ticarcilină, prin producerea unei
penicilinaze plasmidiale;
Fenotipul 3: tulpini rezistente la CIIIG;

155
Fenotipul 4: tulpini de Proteus vulgaris producătoare de cefalosporinaze sensibile la acid clavulanic
(cefuroximaze).
Grupa IV
Grupează tulpini de Yersinia spp. rezistente la amoxicilină, ticarcilină, cefalotin şi cefoxitin, dar
sensibile la pipercilină (tabelul 16).
Tabelele următoare exprimă diferitele fenotipuri de rezistenţă (ca şi fenotipurile sălbatice) stabilind
manifestarea fenotipică a producţiei de β-lactamaze în fiecare grup. Câteva fenotipuri particulare pot fi
datorate altor mecanisme. Producerea unei enzime de către o bacterie nu răspunde la legea tot sau nimic, ci
există niveluri intermediare de exprimare ce pot fi detectate fenotipic prin citire interpretativă foarte utile în
intelegerea dinamicii fenomenului de antibiorezistenţă.

Tabelul 13.
Fenotipuri de rezistenţă la antibioticele β-lactamice la enterobacteriile din grupa I . E. coli, P.
mirabilis, Salmonella spp., Shigella spp. (după Jehl şi colab., 2004 )
Antibiotic Fenotip Penicilinaza Penicilinaza Cefalospori TRI 3 BLSE4 CHN5
2
salbatic nivel scazut nivel ridicat naza
Aminopeniciline S R R R R R R
Aminopeniciline + IBL S S I/R R R R R
Carboxipeniciline S R R S R R R
Ureidopeniciline S I/R I/R S R R R
CIG S I I/R R S R R
CIIG S S S/R S S R R
CIIIG S S S S S R R
CIIIG + IBL S S S S S S R
Cefamicine S S S S/R S S R
CIVG (1) S S S S S R S
Carbapeneme S S S

R = rezistent, S = sensibil, I = intermediar, (1) cefalosporine cu spectru larg : cefepim şi cefpiromă, 2 E.coli si
Shigella, 3-TEM rezistent la inhibitori, 4-β-lactamaza cu spectru extins, 5-cefalosporinază de nivel ridicat

Tabelul 14.
Fenotipuri de rezistenţă la antibioticele β-lactamice la enterobacteriile din grupa a II a : Klebsiella
spp.,Citrobacter koseri, C. amalonaticus, E. hermannii (după Jehl şi colab., 2004 )

Antibiotic Fenotip Penicilinaza BLSE CHN


salbatic (1) nivel ridicat

Aminopeniciline R R R R
Aminopeniciline +IBL S R R R
Carboxipeniciline R R R R
Ureidopeniciline I R R R
CIG S R R R
CIIG S I/R R R
CIIIG S S R R
CIIIG + IBL S S S R
Cefamicine S S S R
CIVG S S R S
Carbapeneme S S S S

156
(1) penicilinază de nivel scăzut

Tabelul 15.
Fenotipuri de rezistenţă la antibioticele beta-lactamice la enterobacteriile din grupa a III a :
Enterobacter spp., Serratia spp., Providencia spp., Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, P. penneri,
Morganella spp. (după Jehl şi colab., 2004 )
Antibiotic Fenotip Penicilinaza BLSE CHN
sălbatic (1) de nivel
ridicat
Aminopeniciline R R R R
Aminopeniciline + IBL R (2) R R R
Carboxipeniciline S R R R
Ureidopeniciline S R R R
CIG R R R R
CIIG S/R R R R
CIIIC S S R R
CIIIG + IBL S S S R
Cefamicine S/R S/R S/R R
CIVG S S R S/I
Carbapeneme S S S S
(1) cefalosporinaza inductibilă, (2) cefalosporinaza inductibilă numai pentru P. vulgaris şi P. penneri
Sinergismul dintre augmentin şi cefotaxim şi/sau aztreonam şi/sau cefepim şi/sau cefpirom, permite detecţia
anumitor BLSE. Cefepimul sau cefpiromul sunt utile în detecţia unei BLSE în prezenta unei CHN.

Tabelul 16.
Fenotipuri de rezistenţă la antibioticele -lactamice a enterobacteriilor din grupa a IV a: Yersinia
enterocolitica . (după Jehl şi colab., 2004 )
Antibiotic Fenotip sălbatic BLSE
Aminopenicilina R R
Aminopeniciline + IBL R R
Carbeniciline R R
Ureidopeniciline I/R R
CIG R R
CIIG S R
CIIIG S R
CIIIG + IBL S S
Cefamicine S S
CIVG S R
Carbapeneme S S

Unele tulpini de K.oxytoca, P.vulgaris, P. penneri si Citrobacter koseri sunt hiperproducatoare de


<aztreonamaza>, o penicilinaza cromosomală (tabelul 17).

Tabelul 17.
Fenotipuri de rezistenta la -lactamice a tulpinilor producătoare de “aztreonamaza” (după Jehl şi colab.,
2004)
Antibiotic Fenotip
Aminopeniciline R
Aminopeniciline + IBL R
Carboxipeniciline R
Ureidopeniciline R
CIG R
CIIG R
Ceftriaxon R
Cefotaxim S/R
Ceftazidim S
AZTREONAM R
Cefamicina S
Carbapeneme S
157
Rezistenţa la carbapeneme apare prin urmatoarele mecanisme:
- impermeabilitate ( P. mirabilis, E.aerogenes)
- impermeabilitate şi producere de cefalosporinază de nivel ridicat (E. cloacae, E. aerogenes, P.
rettgeri)
- carbapenemaze : de tip penicilinază, inactivă asupra CIIIG (E. cloacae); de tip metalo-enzimă,
care hidrolizează CIIIG şi carbapenemele.

Rezistenta P. aeruginosa la β-lactamice


La P. aeruginosa, rezistenţa naturală este indusă prin mecanisme de impermeabilitate, eflux,
producerea enzimelor inactivatoare şi modificarea tintelor.
Fenotipul sălbatic este legat de producerea unei cefalosporinaze inductibile în prezenţa
aminopenicilinelor şi cefalosporinelor din prima şi a doua generaţie, cuplată cu o impermeabilitate mai mult
sau mai puţin marcată şi de un sistem de eflux constitutiv, care determină apariţia unui fenotip rezistent la
aminopeniciline, ca atare sau asociate cu inhibitori ai β-lactamazelor şi la CIG şi CIIG, cu conservarea
sensibilităţii la carboxipeniciline, ureidopeniciline, la anumite CIIIG, la monobactami şi carbapeneme.
Rezistenţa dobandită apare în urma manifestării mecanismelor enzimatice (penicilinaze, cefalosporinaze,
BLSE, metalo-enzime) sau neenzimatice (impermeabilitate, eflux şi modificarea ţintelor) (tabelul 18).
Rezistenţa dobândită enzimatică este mediată de:
a) penicilinaze plasmidiale transferabile cum ar fi: PSE, TEM, OXA (nivel scăzut sau ridicat) care
se materializează prin rezistenţa la carboxipeniciline, ureidopeniciline, cefoperazona şi sensibilitate la:
ceftazidim, cefepim, imipenem şi inhibitori de β-lactamaze.
b) BLSE:
- tip penicilinază (TEM, SHV, PER, VEB) care conferă rezistenţă la toate beta-lactamicele, cu excepţia
imipenemului, carboxipenicilinelor+ IBL şi ureidopenicilinelor+ IBL
- tip oxacilinaza (OXA-2, OXA-10) care conferă rezistenţă la toate beta-lactamicele, cu excepţia
imipenemului
c) cefalosporinaze cromosomale derepresate:
- hiperproduse care conferă rezistenţă la toate β-lactamicele,cu excepţia cefepimului şi imipenemului
- hiperproduse cu nivel înalt, tulpinile conservandu-şi sensibilitatea doar la imipenem
d) carbapenemaze care dau sensibilitate doar la aztreonam
Rezistenţa dobândită neenzimatică este indusă prin:
a) trei sisteme de eflux: MexA, MexB şi OprM, constitutiv, conferă rezistenţă naturală la
carboxipeniciline şi aztreonam; MexC, MexD si OprJ, conferă rezistenţă la cefepim şi cefpirom; MexE, MexF
şi OprN, cuplată adesea cu D2, conferă rezistenţa la imipenem.
b) deficit de porine - se referă la pierderea porinelor - care dau rezistenţă variabilă la carbapeneme
(uneori asociată cu o cefalosporinază derepresată)
c) modificarea LPS-ului duce la permeabilitate diminuată pentru toate β-lactamicele, cu excepţia
imipenemului.
d) modificarea PLP-urilor 2 şi 4 care confera rezistenţă la imipenem şi 3 care generează rezistenţă la
toate β-lactamicele, cu excepţia imipenemului

Tabelul 18.
Evidentierea fenotipurilor de rezistenta la betalactamice pe baza citirii interpretative la
Pseudomonas aeruginosa (după Jehl şi colab., 2004)

Antibiotic Fenotip salbatic Penicillinaza(1) CHN(2)


Aminopeniciline R R R
Aminopeniciline +IBL R R R
Carboxipeniciline S R R
Ureidopeniciline S R R
Cefalosporine 1a generatie R R R
Cefalosporine 2a generatie R R R
Cefalosporine 3a generatie Cefoperazona S R R
Ceftazidim S S R
Cefsulodin S S R
(4)
Cefalosporine de spectru larg S S Cefepim S/R
Aztreonam S S R
158
Carbapeneme S S S
(1) Ticarcilina +acid clavulanic: S ; Piperacilina+tazobactam : S, (2) Cefalosporinaza de nivel înalt, (3) IBL : inhibitor de
beta-lactamază, (4) in funcţie de nivelul de producere

Tabelul 19.
Fenotipuri de rezistenta la β-lactamice la Stenotrophomonas maltophilia (după Jehl şi colab., 2004)

Fenotip Hiper- sensibil Imipenem-S Altele


Sensibil
CAZ-S/CAZ-R
Amoxicilina R R R R R
Amoxicilina-AC R R R S R
Ticarcilina S R R R R
Ticarcilina-AC S S S S V
Ceftazidim S S R S R
Aztreonam S R R R R
Imipenem R R R S R
Frecventa (%) 5-10 20-30 ; 40-50 <1 5-20
Activitatea şi expresia β-lactamazelor
L1 (rezistenta la AC) + + + - V
L2(sensibilitate la AC) +/- + ++ + V
S = sensibil; R = rezistent; I = intermediar; V = variabil; AC= acid clavulanic; CAZ = ceftazidim

Rezistenţa la β-lactamice la Acinetobacter spp.


Rezistenţa naturală se manifestă aproape fără excepţie la aminopeniciline, CIG şi CIIG.
Rezistenţa dobândită (tabelul 20) este indusă prin mai multe mecanisme :
 producerea de β-lactamaze de tipul penicilinazelor plasmidiale TEM (1 şi 2), CARB5
 oxacilinaze: OXA21
 cefalosporinaze cromosomiale ACE 1 – ACE 4 care hidrolizează toate cefalosporinele
 combinarea mecanismelor de tipul: impermeabilitate, modificarea PLP-urilor, producerea de
enzime (induc rezistenţa la imipenem)

Tabelul 20.
Fenotipuri de rezistenţă la β-lactamice la Acinetobacter spp. (după Jehl şi colab., 2004)

Fenotip I II III IV V
Mecanism - Penicilinaza Cefalosporinaza Penicilinaza+ Acumulare de
cefalosporinaza mecanisme

Carboxi si S R S R R
ureidopeniciline
Cefalosporine din S S R R R
gen. a III a
Aztreonam S S R R R
Carbapeneme S S S S R
Frecventa 5% 4% 35% - -
Rezistenţa la β-lactamice la Haemophilus influenzae
Se datorează mai multor mecanisme, cel mai frecvent fiind producerea de β-lactamaze, care a aparut
la 30% dintre tulpinile izolate din infecţii bronho-pulmonare la adulţi. Aceste β-lactamaze sunt plasmidiale de
tip TEM, mai rar ROB care inactivează aminopenicilinele, carboxi- şi ureidopenicilinele. In general rămân
active asociaţia amoxicilina-acid clavulanic şi CIIIG. Producerea β-lactamazelor este uşor de evidenţiat prin
teste cromogenice (nitrocefin). Un alt mecanism de rezistenţă destul de frecvent este modificarea ţintei. De
obicei sunt tulpini necapsulate, rezistenţa datorându-se alterării uneia sau mai multor PLP-uri şi conferă
rezistenţă de nivel scazut la toate antibioticele din această clasă. Rezistenţa la imipenem se pare că s-ar datora
diminuării permeabilităţii membranei externe printr-un mecanism încă neelucidat. Există în acest sens printre
tulpinile sensibile la ampicilină, un număr de tulpini rezistente la imipenem.

6.5. Metode fenotipice calitative şi cantitative de evidenţiere a beta-lactamazelor


159
Identificarea definitivă a acesor enzime este posibilă numai prin tehnici de secvenţiere a proteinelor şi
genelor, tehnici care sunt totuşi mult prea costisitoare pentru a fi utilizate în clinică şi diagnostic. Totuşi,
metode mai simple de evidenţiere şi caracterizare a β – lactamazelor sunt disponibile pentru laboratoarele
clinice.

A.1.Teste fenotipice bazate pe antibiograma difuzimetrică


Antibiograma difuzimetrică calitativă clasică (metoda Kirby – Bauer)
BLSE pot fi sintetizate în cea mai mare parte de către enterobacterii şi sunt reproduse cel mai adesea
în antibiogramă prin imaginea uni sinergism (dop de şampanie) între un disc de cefalosporină de generaţia a
III-a şi /sau monobactam şi un disc de amoxicilină + acid clavulanic.
Dar aceasta imagine poate fi discretă sau atipică. Secreţia de BLSE va fi suspectată mai întâi, de
micşorarea tuturor diametrelor de inhibiţie la toate CIIIG : CTX ≤ 27 mm, CAZ ≤ 22mm, CRO ≤ 25mm,
ATM ≤ 27mm (tabelul 21, fig. 44). O tulpină de referinţă trebuie testată în aceleaşi condiţii în scopul
verificării validităţii discurilor de antibiotice. Prezenţa unei BLSE indică faptul că tulpina este rezistentă la
toate β lactamicele, cu excepţia imipenemului şi cefamicinei (fig. 44).

Tabelul 21.
Diferenţierea ESBL tip TEM de ESBL tip SHV prin metoda difuzimetrică (după Jehl şi colab., 2004)

Antibiotic ESBL tip TEM ESBL tip SHV


Amoxicilină / Ampicilină R R
Amoxicilină + acid clavulanic S S
Piperacilină R R
Cefoxitină S S
Cefuroximă S R
Cefotaximă S S/I/R
Ceftazidimă S R
Aztreonam S R
Cefepimă S S/I/R
Imipenem S S

Figura 44. Aspectul antibiogramei la tulpini de E. coli producatoare de ß-lactamaze de spectru larg:
stg. – aspecte de sinergism (<www.microbes-edu.org/.../bla/generalites.html>).

Antibiograma difuzimetrică cantitativă prin metoda E-test.


Principiu: Această metodă se bazazează pe proprietatea ESBL de a fi sensibile la inhibitori de β-lactamaze
(acidul clavulanic). Există şi excepţii de la această regulă – enzimele de tip IRT (Inhibitor Rezistant TEM β–
lactamase).
Benzile E-test conţin un gradient de Cefotaxim la un capăt şi un gradient de Cefotaxim şi acid
clavulanic la celălat capăt. Concentraţia de Cefotaxim este mai mică în cazul în care acesta este asociat cu
acidul clavulanic conform tabelului 22:

160
Tabelul 22.
Concentraţiile de antibiotic pe striurile E-test
Cefotaxim (mg/L) Cefotaxim (mg/L) + aA. clavulanic
0,50 0,125
0,75 0,19
1 0,25
1,5 0,38
2 0,5
3 0,75
4 1
6 1,5
8 2
12 3
16 4
24 6
32 8

Benzile similare conţinând gradiente de ceftazidim / ceftazidim + clavulanat (TZ / TZL) sunt
deasemenea disponibile şi sunt mai potrivite pentru detectarea tipului enzimatic CTX-M.
Dacă raportul dintre concentraţia minimă inhibitorie (CMI) de Cefotaxim şi CMI de Cefotaxim +
clavulanat este mai mare de 8 rezultă că tulpina respectivă este producătoare de BLSE (Fig. 48-49).
Alternativ, se pot înregistra următoarele aspecte ale plăcii în urma incubării:
 Creşterea bacteriană de-a lungul întregii benzi (lipsa elipsei de inhibiţie) indică faptul că
valoarea respectivă de CMI este mai mare decât cea mai mare valoare din scală (fig. 45).

Figura 45. Valori CMI mai mari


decât concentraţiile scalate;
Rezultatul este nedeterminat
(Strachounski si colab, 2003).

 O elipsă de inhibiţie în afara gradientului arată o valoare a CMI mai mică decât cea mai mică
valoare din scală. Apariţia unei “zone fantomă” plasată sub gradientul CT, deşi o zonă de
inhibiţie clară în jurul capătului CT nu s-a evidenţiat, indică producerea de ESBL (fig. 46).

Figura 46. O zonă de inhibiţie „fantomă”,


circulară, în jurul CT semnifică prezenţa
ESBL-urilor
(Strachounski si colab, 2003).

 Apariţia unei elipse de inhibiţie deformate înspre capătul impregnat indică producerea de
ESBL, datorită sinergismului dintre cefotaxim (CT) si acidul clavulanic difuzat dinspre
regiunea CTL (fig. 47).

Figura 47. Deformarea elipsei


de inhibiţie TZ indică prezenţa
ESBL-urilor
(Strachounski si colab, 2003).

161
Figura 48. Aspectul E-Test
la o tulpină de E.coli J53
(SHV-2) producătoare de
ESBL
(după  Stratchounski şi
colab., 2003)
CMIAMC 12 mg/L
CMIPTZ 1,5 mg/L
CMICPS1 mg/L

Figura 49. Aspectul E-


Test la o tulpina de
K.pneumoniae
producătoare de ESBL
(după Stratchounski şi
colab., 2003)
(SHV-2 + SHV-1 +
TEM-1)
CMIAMC 48 mg/L
CMIPTZ 64 mg/L
CMICPS 4 mg/L

Metoda discurilor duble


Aceasta metodă presupune compararea diametrelor zonelor de inhibiţie date de un disc impregnate
cu o cefalosporină de spectru larg singură cu un alt disc impregnat cu acelaşi antibiotic asociat cu un inhibitor
de β–lactamaze (acidul clavulanic). Dacă tulpina testată produce o enzimă de tip ESBL, diametrul zonei este
mai mare pentru discul ce conţine antibiotic + inhibitor. NCCLS recomandă compararea diametrelor zonelor
de inhibiţie date de către cefotaxim 30 µg/disc cu cele ale cefotaximului + acid clavulanic 30 +10 µg/disc,
precum şi ceftazidim 30 µg/disc cu cele ale ceftazidimului + acid clavulanic 30 + 10 µg/disc. M’zali şi colab.,
2000 au evaluat discuri cu antibiotice şi inhibitori tip MAST DD, folosind metode conform indicaţiilor
NCCLS, şi au obţinut o sensibilitate de 93% a acestei metode pentru tulpini bacteriene control, producătoare
de ESBL–uri, în timp ce perechile de ceftazidim şi cefotaxim s-au dovedit a avea o sensibilitate mai scăzută:
86% şi respectiv 66%.
O variantă a metodei discurilor duble cu antibiotice (produse de OXOID) se bazează pe compararea
diametrelor zonelor de inhibiţie produse de cefpodoxim 10 µg/disc şi cefpodoxim + clavulanat 10 + 1 µg/disc.
Producerea de ESBL-uri este confirmată dacă diametrul zonei de inhibiţie dată de discul ce conţine şi
clavulanat este cu 5 mm mai mare decât diametrul zonei discului fără inhibitor.

Testul dublei difuzii pentru detectarea ESBL

Pe o placă cu mediu Mueller Hinton inoculată cu tulpina de testat (cultură de 24 h, însămânţare pe


placă prin tehnica tamponului) se aplică discuri cu amoxicilină / clavulanat (AMC) şi ceftazidim (CAZ) la 25
-30 mm distanţă (Jarlier şi colab., 1988). De cealaltă parte a discului AMC se plasează un disc conţinând o
altă cefalosporină, de preferat cefotaxim (CT ). Se incubează peste noapte la 37 oC.
Producerea de ESBL este certificată dacă diametrul zonei de inhibiţie este extins din cauza clavulanatului
( inhibitorul de β-lactamaze) (fig. 50-51).

162
Avantajul acestei metode simple este costul scăzut; dezavantajul este acela că separarea optimă a
discurilor poate varia cu fiecare tulpina. Izolatele cu ESBL-uri de tip TEM şi SHV dau rezultate pozitive, în
schimb cele cu enzime de tip CTX-M dau un rezultat pozitiv numai atunci când cefotaximul sau cefpodoximul
înlocuiesc ceftazidimul, ca indicator de cefalosporine.
Tulpinile producătoare de AmpC şi majoritatea tulpinilor hiperproducătoare de enzime K1, dau
rezultate negative, cu toate cele trei cefalosporine.

Figura 50. Detectarea producerii de beta-lactamaze prin testul dublei difuzii.


Discuri cu antibiotice: stânga: IMP, centru: AMC, dreapta: PIP, sus AM, jos: CAZ (după Shah si colab., 2003).

Figura 51. Detectarea ESBL prin testul dublei difuzii: AMC-amoxicilina şi acid clavulanic în centru; CAZ-Ceftazidim;
ATM-Aztreonam; CTX-Cefotaxim; CRO-Ceftriaxone (după Shah si colab., 2003).

Se recomandă utilizarea discurilor de cloxacilină pentru detectarea penicilinazelor (acest antibiotic


inhibă cefalosporinazele);
N.B. – inoculul dens poate masca hiperproducţia de beta-lactamaze;
N.B.- când sinergismul nu este vizibil din cauza fuzionării zonelor de inhibiţie, se îndepărtează
discurile (30 mm) sau se taie discurile de antibiotic în patru.
N.B.- existenţa unor discrepanţe mari între diametrul zonelor de inhibiţie la CAZ şi CTX se datorează
prezenţei unei alte enzime pe lângă ESBL (de exemplu, β-lactamaze AmpC la Enterobacter cloacae).

Teste pentru confirmarea prezenţei β-lactamazelor cromosomale inductibile (β-lactamaze tip AmpC)
Cefalosporinele de generaţia I (ampicilina şi amoxicilina) induc exprimarea enzimelor tip AmpC şi
sunt distruse de către acestea, la majoritatea speciilor de Enterobacteriaceae. Consecutiv, tulpinile bacteriene
producătoare de β-lactamaze inductibile tip AmpC devin rezistente constitutiv. Speciile producătoare de β-
lactamaze inductibile tip AmpC segregă mutante derepresate care produc enzime AmpC fără inducţie

163
(derepresie stabilă). Aceste mutante sunt rezistente la aproape toate penicilinele şi cefalosporinele (Livermore
şi colab, 2001) şi sunt de asemeni frecvente în izolatele clnice.
Speciile producătoare de β-lactamaze tip AmpC pot fi recunoscute prin teste de antagonism între
cefoxitim şi cefotaxim (Sanders şi colab. 1986). Pentru efectuarea acestui test se inoculează plăci, conform
protocolului din metoda antibiogramei, şi se plasează discuri cu ceftazidim şi cefoxitim, pe acceaşi placă, la o
distanţă de 25 mm. Inducţia de β-lactamaze este evidenţiată prin aplatizarea zonei de inhibiţie a ceftazidimului
în dreptul discului de cefoxitim. Astfel, cefoxitimul a determinat producerea de β-lactamaze iductibile care au
hidrolizat ceftazidimul (fig. 48).
Acidul clavulanic este un inductor al β-lactamazelor tip AmpC şi de aceea apariţia unor mici colonii
în interiorul zonei de inhibiţie a discului AMC (amoxicilină - acid clavulanic) poate fi un indicator util pentru
detectarea prezenţei enzimelor AmpC.

Figura 52. Detectarea β-lactamazelor inductibile tip AmpC. Discul cu diamterul mare al zonei de inhibiţie este ceftazidim
(CAZ), iar cel cu diametrul foarte mic este cefoxitim (FOX) (<www.seimc.org/protocolos/microbiologia/cap12.htm>).

Au fost concepute numeroase teste directe de detectare a activitaţii β-lactamazice, dar numai o parte
dintre ele se pot folosi ca analize de rutină (James şi colab., 1977). Majoritatea folosesc cefalosporine
cromogene, sau corelează hidroliza penicilinei cu o schimbare a culorii mediului de reacţie, mediată de iod
sau detectată cu un indicator de pH.
Cefalosporinele cromogene sunt foarte specifice, în timp ce acidifierea mediului şi reducerea iodului
se poate datora şi altor cauze decât acţiunii β-lactamazelor, generând rezultate fals pozitive. Datorită slabei
specificităţi a testului iodometric ar trebui realizate în paralel controlale pozitive si negative pentru toate
testele.

Testul la nitrocefin
Nitrocefinul este o cefalosporină care poate funcţiona ca substrat cromogen pentru β-lactmaze şi işi
schimbă culoarea de la galben la roşu atunci când este hidrolizat. Acesta reprezintă testul cel mai sensibil
pentru majoritatea β–lactamazelor, exceptând penicilinazele stafilococice. Avantajul folosirii acestui antibiotic
în testele de evidenţiere constă în faptul că el este hidrolizat de toate β – lactamazele cunoscute, indiferent de
specificitatea acestora.
Nitrocefinul este disponibil sub formă de pudră purificată de la Becton Dickinson (Oxford, UK) sau
discuri îmbibate cu antibiotic (OXOID).
Coloniile bacteriene sunt raclate de pe mediul nutritiv solid şi resuspendate în tampon fosfat
obţinându-se o suspensie densă, peste care se adaugă soluţie nitrocefin. Activitatea β-lactamazică este
evidenţiată prin apariţia culorii roşii în 1 - 2 minute. În cazul enzimelor cu activitate mai mică răspunsul poate
întârzia, însă rezultatele pozitive apărute la mai mult de 10 minute trebuie tratate cu scepticism întrucât ele pot
fi cauzate de o activitate β–lactamazică secundară a proteinelor care leagă penicilina (penicillin binding
protein - PBP) care formează complexe acil instabile (O’Callaghan şi colab., 1972).
Avantajul acestei metode constă în rapiditatea cu care se pot obţine rezultate despre prezenţa β-
lactamazelor.

Testul iodometric

164
Hidroliza penicilinei determină formarea acidului peniciloic, care reduce iodul, decolorând complexul
iod–amidon. Această proprietate poate fi exploatată pentru a detecta activitatea β–lactamazică în tuburi sau pe
hârtie. Aceste teste sunt sensibile pentru penicilinazele stafilococice, dar sunt mai puţin sensibile decât
nitrocefinul pentru majoritatea β–lactamazelor provenite de la bacterii Gram negative.
 Metoda în tub: Se poate efectua în cantităţi mici atât în tuburi, cât şi în plăci cu godeuri. Se
distribuie benzilpenicilină (penicilină G) în tampon fosfat, în godeurile unei plăci. În această soluţie se
suspendă cultură bacteriană, solidă (de pe agar) şi se păstrază la temperatura camerei pentru
aproximativ 30 – 60 minute. Se adaugă amidon solubil în apă distilată şi ulterior iod în soluţie de
iodură de potasiu. Activitatea β – lactamazică este demonstrată prin decolorarea iodului în maxim 5
minute (Catlin şi colab., 1975). Sunt necesare teste de control pozitive şi negative deoarece alte
proteine pot de asemenea reduce iodul, iar un inocul concentrat poate da rezultate fals pozitive.
 Metoda pe benzi de hârtie: Se foloseşte hârtie de filtru Whatman nr.3, îmbibată în soluţie
de amidon dizolvat în apă distilată la fierbere, la care s-a adăugat benzil – penicilină la răcire. Când
benzile de hârtie iodometrică s-au uscat (aproximativ 2 ore), acestea sunt înmuiate în soluţie de iod în
iodură de potasiu. Pe acestea se aplică colonii dintr-o cultură de 24 de ore. Decolorarea apare în 5
minute şi indică activitate β – lactamazică (Jorgensen şi colab., 1977).

Testul acidimetric
Hidroliza nucleului β-lactamic generează o grupare carboxil care acidifică un mediu netamponat.
Acidifierea rezultată poate fi detectată în tuburi sau pe hârtie de filtru.
 Metoda în tub: Se foloseşte soluţie de roşu fenol la care s-a adăugat benzilpenicilină, cu pH 8,5.
Soluţia de culoare violet este distribuită în godeuri şi inoculată cu bacterii din cultură solidă pentru a forma o
suspensie densă. Activitatea β-lactamazică este indicată de virajul culorii de la roşu la galben în maxim 5
minute (Duma & Kinz, 1968).
 Metoda pe benzi de hârtie: benzile mici, de hârtie de filtru Whatman sunt îmbibate într-o soluţie
proaspăt preparată de benzilpenicilină, bromo-crezol şi NaOH. Benzile se usucă şi se păstrează pentru mai
multe luni. Înainte de folosire ele trebuiesc rehidratate în apă distilată şi apoi se aplică cultură bacteriană de pe
agar solid. Apariţia culorii galbene în maxim 5 minute indică activitate β-lactamazică (Livermore, 1995).

A.3. Metode de identificare a diferitelor tipuri de β-lactamaze prin cinetică enzimatică


Obţinerea extractului proteic:
Tulpinile bacteriene care expimă constitutiv β-lactamaze se cultivă în bulion Mueller-Hinton peste
noapte la 37oC, din care se recoltează celulele prin centrifugare. Suspensia celulară obţinută din fiecare
preparat se supune sonicării urmată de ultracentrifugare. Supernatantul este dializat şi concentrat dacă este
nevoie.
Purificarea β-lactamazelor:
Într-o primă etapă, β-lactamazele se purifică prin focusare isoelectrică orizontală (IEFO), într-un
gradient de pH cuprins între 6.5 şi 10.5 obţinut prin metoda amfoliţilor.
După migrare, gelul este împărţit în 30 de segmente egale în care se testează activitatea β–lactamazică
cu nitrocefin sau benzilpenicilină (O’Callaghan şi colab., 1972). Fracţiile din gel care prezintă activitate β –
lactamaizică se încarcă pe o coloană cromatografică de carboxi – metil Sephadex şi se eluează cu tampon
fosfat conform protocolului descris de Iaconis şi colab. (1990). Fracţiile care au prezentat activitate β –
lactamazică se concentrează prin ultrafiltrare şi au fost trecute în continuare pe o coloană schimbătoare de
ioni.
Hidroliza antibioticelor β-lactamice este examinată prin spectrofotometrie UV (Beckman DU-7). Se
folosesc cuve de cuartz, de 1cm, la lungimea de undă maximă de absorbţie a inelului β-lactam, pentru fiecare
antibiotic în parte, iar densitatea optică se măsoara la intervale de 10 secunde, timp de 5 minute.
Maximul de absorbţie pentru pricipalele antibiotice folosite sunt:
 cefalotin (265 nm)
 cefuroxim (274 nm)
 cefotaxim (254 nm)
 ceftazidim (254 nm)
 imipenem (299 nm)
 cloxacilin (260 nm)
 aztreonam (292 nm)
 nitrocefin (489 nm)
165
Rata de hidroliză a benzilpenicilinei este măsurată la 233 nm. Soluţiile de antibiotic sunt preparate în
tampon 0,1M, pH 7.0. Pentru stabilirea profilelor substratelor, toate antibioticele se examinează la o
concentraţie de 100 uM, mai puţin benzilpenicilina care este testată pentru 500 uM. O unitate de activitate β-
lactamazică, este definită ca fiind cantitatea de enzimă care hidrolizează un nmol de substrat / min în etapa
liniară a reacţiei la 37 oC în tampon fosfat 0,1M, ph 7.0. Constanta Michaelis (K m) şi rata maximă de hidroliză
(vm) se determină cu ajutorul transformării Lineweaver-Burk a vitezei iniţiale (v) pentru şase concentraţii
diferite ale substratului. Susceptibilitatea β-lactamazelor de a fi inhibate de clavulanatul de potasiu şi
cloxacilina este măsurată cantitativ prin preincubarea enzimei cu concentraţii diferite de inhibitor pentru 10
minute. Pentru măsurarea activităţii enzimatice reziduale se adaugă ulterior ca substrat benzilpenicilină (500
uM) sau imipenem (100 uM).
Concentraţia de inhibitor necesară pentru a inhiba 50% din activitatea enzimatică se determină prin
teste statisitice de certitudine.

Evidenţierea fenotipică a rezistenţei cocilor Gram-pozitivi la aminozide


La S. aureus rezistenţa la aceste antibiotice este enzimatică fiind evidenţiate mai multe fenotipuri (tabelul 23).

Tabelul 23.
Rezistenţa S. aureus la aminozide (după Jehl şi colab., 2004)
Fenotip Enzime Kanamicina Tobramicina Gentamicina
Amikacina Netilmicina
Isepamicina
Salbatic - S S S
K APH3’-III R S S
KT ANT-4’-4’’ R R S
KTG APH 2”-AAC6’ R R R
APH = aminozid-fosfotransferaza; ANT = aminozid nucleotidiltransferaza; AAC = aminozid acetiltransferaza

Rezistenţa enterococilor la aminoglicozide


Rezistenţa naturală de nivel scazut (intrinsecă) se datorează unui transport ineficient al acestora prin
membrana citoplasmatică, însă activitatea lor este sinergică cu β-lactaminele şi glicopeptidele. Specia E.
faecium produce în mod natural o acetiltransferază cromosomală AAC(6’) care inactivează aminozidele
gentamicina rămâne activă).
Un număr din ce în ce mai mare de tulpini de enterococi manifestă rezistenţă de nivel înalt la
aminoglicozide (HLR) - definită ca CMI ≥2 mg/mg şi, concomitent, rezistenţă la sinergismul cu beta-
lactamicele (Tabelul 24). Mecanismul de rezistenţă preponderent este modificarea enzimatică a
aminoglicozidelor, ca urmare a achiziţionării uneia sau mai multor gene. Enzimele codificate de aceste gene
sunt sintetizate constitutiv şi au localizare citoplasmatică. Modificarea enzimatică a antibioticului este asociată
cu o diminuare a afinităţtii sale pentru proteinele ribosomale şi cu alterarea transportului antibioticului.

Tabelul 24.
Principalele fenotipuri de rezistenţă ale enterococilor la aminozide (după Jehl şi colab., 2004)

Enzime Kanamicina Gentamicina Netilmicina Tobramicina Amikacina


- S S S S S
APH3’ R S S S R
ANT-4’ R R S R S/R
APH2”-AAC6’ R R R R R
APH = aminozid fosfotransferaza; ANT = aminozid nucleotidiltransferaza; AAC = aminozid acetiltransferaza

Enterobacteriile cu exceptia speciei Providencia stuartii, sunt în mod natural sensibile la


aminoglicozide. Cele patru aminozide utilizate în terapia infecţiilor cu enterobacterii sunt: gentamicina (GM),
tobramicina (TM), netilmicina (NET) şi amikacina (AN).
P. stuartii are o rezistenţă cromosomală la gentamicină, netilmicină şi tobramicină. Rezistenţa dobândită la
aceste antibiotice este puţin frecventă (tabelul 25). Anumite fenotipuri de rezistenţă sunt generate în funcţie
de prezenţa anumitor enzime care modifică aminozidele:
Fenotipul 1: tulpini rezistente la gentamicină (GM), asociate cu prezenţa unei 3-aminoacil-
acetiltrensferazei AAC;

166
Fenotipul 2: tulpini rezistente la gentamicină (GM) şi la netilmicină (NET) asociate cu o 2-
nucleotidiltransferază ANT;
Fenotipul 3: tulpini rezistente la tobramicină (TM), netilmicină (NET), şi la amikacină (AN) asociate
cu o 6-aminoacilacetiltransferază AAC.

Tabelul 25.
Fenotipurile de rezistenţă dobândită ale enterobacteriilor la aminozide (după Jehl şi colab., 2004)

Fenotip Enzime Gm(G) To(T) Nt Ak(A) Is(I) Specii implicate


G AAC(3)-I R S S S S E.coli, P.mirabilis,
K.pneumoniae,
E. cloacae
A APH(3)-VI S S S R R E. cloacae
GT AAC(3)-VI R R S S S E.coli
TA ANT(4’)-II S R S R R TOATE
GTNt AAC(2’)-I R R R S S P.stuartii
AAC(3)-IV R R R S S E.coli
KTG ANT(2’’)-I R R S S TOATE
KTANt AAC(6’)-I S R R R S S.marcescens
E.coli, E.cloacae
K. pneumoniae
E. aerogenes
KTGNt AAC(3)-II R R R S S TOATE
KTGANt Impermeabilitate R R R R R TOATE
Asociaţie de enzime R R R R R TOATE
Gm = gentamicina, To = tobramicina, Nt = netilmicina, Ak =amikacina, Is =isepamicina, AAC = aminozid
acetiltransferaze, ANT = aminozid nucleotidiltransferaza, APH = aminozid fosfotransferaze In fiecare clasă,
enzimele sunt desemnate prin tipul lor de activitate, numărul carbonului purtând gruparea modificată (cifre arabe de
la 1 la 6) şi ciclul afectat de modificare (primar, secundar sau nemodificat). Cifra romană care urmează indică
spectrul de substrat al enzimei (adică ansamblul de molecule hidrolizate).

Evidenţierea fenotipurilor de rezistenţă a pseudomonadaceaelor la aminoglicozide

Fenotipul salbatic este sensibil la toate aminozidele. Fenotipurile de rezistenţă dobândită se datorează
mai multor mecanisme: impermeabilitate, eflux, inactivare enzimatică, mutante respiratorii, combinaţii ale
acestor mecanisme (tabelul 26, 27). La P. aeruginosa cel mai întâlnit mecanism este cel de impermeabilitate
(tabelul 26).
Tabelul 26.
Principalele fenotipuri de rezistenţă ale P. aeruginosa la la aminozide (după Jehl şi colab., 2004)

Fenotip Enzima G T Nt A I
G AAC(3)-I R S S S S
GNt AAC(3) R S R S S
GT ANT(2”)-I R R S S S
GNtT AAC(6)-II R R R S S
AAC(3)-II,IV,V
TntA AAC(6 )-I S R R R ?
GTNtA AAC(6)+ANT(2”)-I R R R R ?
Eflux(30-40%) R S R R R
G = gentamicina ; T= tobramicina ; Nt =netilmicina ; A =amikacina ; I = isepamicina; AAC = amioacid-
acetiltransferaza ; ANT = aminoacid- nucleotidiltransferaza.

167
Tabelul 27.
Fenotipuri de rezistenţă la aminozide la Acinetobacter spp
Fenotip de rezistenţă Enzime Prevalenţa ( %)
G AAC(3)-I 29,5 – 40
GN AAC(3)-? 61- 67
GTN AAC(3)- II 0-8,3
AAC(3)- V 0 -11
TNA AAC(6’)-I 28-35
GTN AAC(6’)- II 0-5
GT ANT(2 )-I 27-29,5
- APH(3’)-I 34 -40
AI APH(3’)-VI 48- 48,5
G = gentamicina; N = netilmicina; T = tobramicina; A = amikacina; I = isepamicina; APH = aminozidfosfotransferaza;
ANT = aminozidnucleotidiltransferaza; AAC = aminozidacetiltransferaza.

Evidenţierea fenotipurilor de rezistenţă la quinolone

Stafilococii sunt natural rezistenţi la quinolone de prima generaţie, în schimb sunt sensibili la
fluorochinolone.
Sunt descrise 2 mecanisme de rezistenţă:
- afinitate scăzută prin modificarea ţintei, ADN giraza. Dobândirea rezistenţei este legată de
apariţia mutaţiilor cromosomale în genele gyrA şi parC care provoacă o diminuare a legării
quinolonelor la ţintele lor intracelulare, complexele ADN giraza şi ADN topoizomeraza 4.
- eflux
Pneumococii prezintă rezistenţă naturală la quinolonele din prima generaţie şi au sensibilitate redusă
la pefloxacin, ofloxacin şi ciprofloxacin. Foarte active pe pneumococ sunt levofloxacina şi moxifloxacina.
Mecanismele rezistentei dobândite sunt: efluxul activ şi mutaţiile topoizomerazei IV (gena parC) şi
girazei (gena gyrA)
Toate enterobacteriile prezintă rezistenţă incrucişată la toate chinolonele, dar nivelul de exprimare
variază pentru fiecare substanţă antimicrobiană în funcţie de bacterie. Pentru a pune în evidenţă diferite
fenotipuri se testează acidul nalidixic (NAL) şi două florochinolone: de exemplu: pefloxacină (PEF) sau
ofloxacină (OFX) şi ciprofloxacină (CIP) sau norfloxacină (NOR) (tabelul 28).
Au fost identificate următoarele fenotipuri de rezistenţă la chinolone la enterobacterii:
Fenotipul 1: tulpini sensibile la toate chinolonele;
Fenotipul 2: tulpini rezistente la acid nalidixic, dar sensibile la fluorchinolone;
Fenotipul 3: tulpini cu sensibilitate diminuată la pefloxacină şi la ofloxacină, dar sensibile la
ciprofloxacină.
Fenotipul 4: tulpini rezistente la toate chinolonele.

Tabelul 28.
Fenotipuri de rezistenţă a enterobacteriilor la chinolone (după Jehl şi colab., 2004)

Fenotipuri Acid nalidixic Norfloxacin Pefloxacin Ofloxacin Ciprofloxacin


(1)
I S S S S S
II R S S S S
III R I/R I/R S S
IV R R R R R
Rar eflux (E. coli) S R S S S
(1) Acid nalidixic şi toate chinolonele clasice (prima genetaţie).

Fenotipurile de rezistenţă la chinolone la P. aeruginosa


Fenotipul salbatic este sensibil la toate fluorochinolonele deşi în terapie cel mai utilizat este
ciprofloxacinul (tabelul 29). Rezistenţa dobândită se datorează următoarelor mecanisme: impermeabilitate
(porine şi LPS); modificarea afinităţii ţintei (subunităţile A şi B ale ADN-girazei şi Cşsi D ale topoizomerazei
IV; Eflux activ (OprM, OprJ, OprN conferă rezistenţă de nivel scăzut)

168
Tabelul 29.
Principalele fenotipuri de rezistenţă ale P. aeruginosa la chinolone (după Jehl şi colab., 2004)

Fenotip Nofloxacin Pefloxacin Ofloxacin Ciprofloxacin


Levofloxacin
I (salbatic) S S S S
II I I I S
III R R R S
IV R R R R
Eflux R S S R

Se consideră că aproape 70% din tulpinile de A. baumanii au dobândit rezistenţă încrucişată la


fluoroquinolone, prin mutaţii la nivelul ţintei.

Evidenţierea fenotipurilor de rezistenţă la glicopeptide. Rezistenţa stafilococilor

Cazuri de rezistenţă sporadică la glicopeptide au fost descrise la stafilococii coagulazo-negativi încă


din 1981. In primele cazuri rezistenţa la vancomicină şi teicoplanină a fost de nivel scăzut (CMI 8-16 mg/ml).
Tulpinile raportate ulterior aveau CMI între 16 şi 64 mg/ml la teicoplanină şi o sensibilitate menţinută la
vancomicină. Fenotipul de rezistenţă a fost asociat cu prezenţa unei proteine membranare de 35 000-39 000da
la S.epidermidis şi S.haemolyticus. Câteva tulpini sunt intermediare la vancomicină (tulpini GISA) şi au o
rezistenţă crescută la teicoplanină. Acestea au fost izolate de la pacienţi care au urmat multiple tratamente cu
vancomicină. Aceste tulpini GISA nu au genotipul VanA, VanB, VanC, mecanismul de rezistenţă fiind încă
necunoscut. Articole recente raporteaza tulpini de S.aureus cu sensibilitate redusă la teicoplanină (creşterea
CMI de 8 ori) şi la vancomicină (CMI dublu), tulpini care sintetizează o noua proteină de 39 000da (fig. 53).
In schimb, tulpini de S.aureus sensibile la vancomicină şi cu sensibilitate redusa la teicoplanină
posedă o proteină membranară de 35 000da şi prezintă o creştere a exprimării PLP 2-1 şi PLP 2-2.
Rezistenţa la glicopeptide este uneori greu de depistat prin antibiograma difuzimetrică. Comitetul de
Antibiogramă al Societatii Franceze de Microbiologie (CA-SFM) recomandă determinarea CMI pentru toate
tulpinile al căror diametru de inhibiţie este mai mic de 17 mm. Detectarea rezistenţei pare sa dea rezultate mai
bune pe mediu semi-gelozat.

Rezistenţa enterococilor la vancomicină

Rezistenţa enterococilor la vancomicină a început să fie semnalată din anul 1988 (Leclercq si al., 1988
& 1989). Supravegherea clinică, biochimică şi genetică a rezistenţei la glicopeptide în cadrul genului
Euterococcus a evidenţiat o mare heterogenitate fenotipică şi genotipică. Cele trei fenotipuri (VanA. VanB &
VanC) sunt definite prin nivelul de rezistenţă la vancomicină şi sensibilitate sau rezistenţă la
teicoplanină (Tabel 30).
Rezistenta intrinsecă (naturală) la glicopeptide numită VanC se caracterizează prin rezistenţă de nivel
scăzut la vancomicină şi sensibilitate la teicoplanină întalnită la speciile: E. gallinarum, E. casseliflavus şi E.
flavescens. Gena VanC codifică o ligază care substituie –D-Ala-D-Ser în locul D-Ala-D-Ala ca precursor al
peptidoglicanului.
Mecanismul rezistenţei dobândite este legat de producerea unui nou precursor al peptidoglicanului în
care dipeptidul terminal ( D-Ala-D-Ala) este înlocuit de D-Ala- D-Lac, a cărui afinitate pentru glicopeptide
este redusă. Sunt descrise şase fenotipuri de rezistenţă dobândită: VanA, VanB, VanD, VanE,VanG, Van E
(la E. faecalis şi E. faecium).

169
Tabelul 30.
Distribuţia fenotipurilor de rezistenţă ale enterococilor la chinolone

Fenotip VanA (HLR) VanB (MLR) VanC VanD VanG VanE


CMI Va(mg/l) 64->1024 4-1000 4 64 16 16
CMI Tec(mg/l) 16-512 0,5- 1 4 4 16 0,5
Expresie Inductibila Inductibila Constitutiva Constitutiva Inductibila Inductibila
Suport genetic Plasmidial Cromosomal Cromosomal Cromosomal Cromosomal Cromosomal
transpozon Tn1546
Transferabil prin + + - - - -
conjugare
Specii bacteriene E. faecium E. E.faecalis E. vanC1 - E. E. faecium E.faecium E. faecalis
faecalis E. faecium gallinarum, E. faecalis
gallinarum E. vanC-2 - E.
flavescens E.avium casseliflavus,
E. durans E. and vanC-3 -
hirae E. flavescens

Transpozonul Tn1546 codifică 9 proteine:


- două necesare transpoziţiei (ORF1 si ORF2)
- două implicate în reglarea expresiei inductibile a rezistenţei ( VanR siVanS)
- cinci implicate în rezistenţă (VanH-dehidrogenaza, VanA-ligaza, VanX-peptidaza, majore şi
VanY şi VanZ, considerate minore).
A fost descrisă o tulpină de S. bovis rezistentă la vancomicină care posedă gena vanB.
Cea de-a doua formă a rezistenţei la vancomicină a rezultat probabil din transferul conjugativ al
operonului vanA de la Enterococcus faecalis vancomicin-rezistent (fig. 54). Showsh şi colaboratorii au
demonstrat că plasmida de la Enterococcus faecalis care conţine vanA codifică de asemenea un feromon de
sex care este sintetizat şi de către S. aureus, sugerând posibilitatea transferului conjugal. Aceste izolate VRSA
au rezistenţa de nivel înalt la vancomicină, cu CMI de 128 µg/ml. Rezistenţa la aceste izolate este cauzată de
alterarea peptidului terminal la D- Ala-D-Lac în loc de D-Ala-D-Ala (fig. 54). Sinteza D-Ala-D-Lac se
produce doar prin expunerea la concentraţii mici de vancomicină.

Figura 53. Mecanismele de rezistenţă la vancomicină a tulpinilor VISA. Acestea sintetizează în exces peptidoglican,
având ca rezultat creşterea numărului de resturi D-Ala-D-Ala care leagă vancomicina (după Walsh şi Howe, 2002).
170
Figura 54. Mecanismul de rezistenţă la vancomicină a tulpinilor VRSA (după Hiramatsu şi colab., 1997).

Evidenţierea rezistenţei la macrolide, streptogramine, lincosamide (MLSb)

Rezistenţa la aceste tipuri de antibiotice este rezultatul activarii a 3 mecanisme:


Modificarea ţintei ribosomale (sub-unitatea 50S)
Tulpinile rezistente produc o metilază responsabilă de o dimetilare specifică a adeninei din ARNr
23S. Aceasta provoacă o schimbare de conformaţie a ARN, care reduce afinitatea MLS pentru ribosomi.
Metilarea se produce la toate macrolidele şi lincosamidele. Această rezistenţă depinde de diferiţi determinanţi
genetici. La stafilococ găsim genele ermA, ermB, ermC. Aceste gene sunt purtate de transpozoni (ermA) sau
plasmide (erm). Exprimarea fenotipică a rezistenţei poate fi inductibilă (rezistenţă crescută pentru toate
macrolidele cu 14 şi 15 atomi de carbon şi sensibilitate la macrolidele cu 16 atomi de carbon), sau constitutivă
(rezistenţă crescută la toate macrolidele cu 14-16 atomi de carbon, lincozamidele şi streptograminele B –
rezistenţă de tip MLSB) (tabelul 31). Rezistenţa compusului B nu modifică sinergia a doi compuşi ai
streptograminelor.

Tabelul 31.
Fenotipuri de rezistenţă la MLS dobândite de către stafilococi (după Jehl şi colab., 2004)

14C1
Mecanism Genotip Fenotip 16C3 LIN CLIN PRIB PRIA PRIi5
15C2
erm
MLSB R S S S S S S
inductibil
Modificarea
erm
ţintei
constituti MLSB R R R R S S S
v
linA L S S R S4 S S S
Inactivare Vat/vatB (L)SA S S S S S R ?
vgb SB S S S S R S ?
vga (L)SA S S S/I/R R/I/S S R S/R
Eflux
msrA Erm R S S S S S S
(1) 14C: eritromicina, roxitromicina, claritromicina, diritromicina
(2) 15C: azitromicina
(3) 16C: spiramicina, josamicina, midecamicina, tilosina
(4): antibiotic a carui activitate bacteriostatica sau bactericida este diminuata
(5) Pri : pristinamicina

171
Inactivarea antibioticului
StreptograminaA acetiltransferaza conferă rezistenţă la factorul A astfel încât streptogramin B
hidrolaza, codificată de către gena vgb, inactivează factorul B. Cel puţin 2 gene vat şi vatB sunt responsabile
pentru acetilarea streptograminelor A. Rezistenţa izolată la lincosamide, exceptionala la S.aureus dar detectată
la stafilococii coagulazo-negativi (S. sciurii, S. cohnii, S. xylosus), este datorată achiziţionării unei enzime care
modifică prin adenilare lincomicina şi clindamicina. Fenotipul LS A poate fi confundat cu fenotipul L, ambele
rare la S.aureus. Lincosamidele sunt inactivate de către nucleotid-transferaze codificate de 2 gene plasmidiale
foarte apropiate, linA şi linA’.

Efluxul activ al moleculelor de antibiotic


Exprimarea acestei rezistenţe depinde de gena msrA, care codifică pentru proteina MsrA responsabilă
de eliminarea crescută a eritromicinei intrabacteriene. Au fost izolaţi stafilococi rezistenţi doar la
streptogramina A. Rezistenţa dependentă de gena vga este datorată unei diminuări a incorporarii intracelulare
a antibioticului.
La enterococi, rezistenţa naturală se manifestă la lincosamide şi la compusul A al streptograminelor
(la toate speciile cu excepţia E. faecium şi E. durans, astfel că acest tip de rezistenţă poate fi utilizat ca test de
orientare pentru identificare).
Rezistenţa dobândită se manifestă prin două mecanisme: modificarea ţintei şi inactivarea
antibioticului.
Modificarea ţintei (subunitatea 50S ribosomală) este mecanismul principal care explică rezistenţa
incrucişată la MLSK. La enterococi gena ermB este responsabilă de această rezistenţă.
Inactivarea antibioticului se manifestă la E. faecalis prin acţiunea unei lincomicin-nucleotidil-
transferaze (codificate de gene linA) care conferă rezistenţă la streptograminele A.
Rezistenţa dobandită a Str. pneumoniae la macrolide este MLSB, datorită metilării ARNr 23S, care
diminuează afinitatea macrolidelor pentru ţintă. Această rezistenţă este încrucişată pentru toate macrolidele,
lincosamidele şi streptograminele B şi poate fi de tip inductibil sau constitutiv:
- Tulpinile care au gena erm imductibilă sunt sensibile la ketolide la fel ca cele rezistente prin
mecanismul de eflux .
- Alte tulpini, care posedă gena mefE, codifică o rezistenţă prin mecanism de eflux ele fiind
rezistente la eritromicină, dar sensibile la clindamiciăa, quinupristină şi la ketolide. Genele erm şi
mefE sunt rareori asociate.
- Al treilea fenotip de rezistenţă a fost descris la un grup de 10 tulpini care nu au genele erm sau
mefE dar sunt ery-R constitutiv şi clinda-R.
La S. pyogenes mai puţin de 10% dintre tulpini sunt rezistente la eritromicină, cu o mare
heterogenitate
de la o zona la alta (18,3% în Asia, 10,6% în Europa de Est, 9,8% în Europa de Vest).
Doua mecanisme sunt responsabile de aceasta rezistenţă: modificarea ţintei, care dă fenotipul MLS B
constitutiv, codificat de gena ermB şi un mecanism de efux care dă fenotipul M codificat de gena mefA.
Telitromicina are o activitate intrinsecă superioară celei a macrolidelor.

Evidenţierea fenotipurilor de rezistenţă la tetracicline


Sunt descrise 2 mecanisme de rezistenţă la tetracicline:
 primul este legat de o insuficientă concentrare intracelulară a antibioticului datorită unui eflux excesiv al
antibioticului prin membrana citoplasmatică, sub acţiunea unei proteine membranare TET. Acest
mecanism conferă o rezistenţă la tetraciclină, dar nu şi la minociclină.
 al doilea mecanism este datorat unei modificări a ţintei ribosomale a acestor antibiotice. In acest caz,
există o rezistenţă crescută la toate tetraciclinele.
La streptococi şi enterococi au fost evidenţiate 3 gene de rezistenţă la tetraciclină, şi anume: tetM, tetO
(Zilhao şi colab., 1988) şi tetL (Chopra şi colab., 1986).

Rezistenţa la trimetoprim-sulfometoxazol
Rezistenţa stafilococului la acesti 2 compuşi se realizează prin mai multe mecanisme:
- modificarea enzimelor ţintă (DHFR si THFR)
- supraproducerea acestor enzime.

172
Rezistenţa la fosfomicină
Rezistenţa stafilococului la fosfomicină este rezultatul unor mutaţii foarte frecvente ce ţintesc
transportul antibioticului. A fost raportata o rezistenta plasmidială la tulpini de stafilococ coagulazo-negativi
şi la S.aureus (gena fosB la S. aureus). Mecanismul, prin analogie cu cel descris la bacilii Gram negativi, ar
putea fi inactivarea antibioticului prin conjugare cu glutation. Specia saprophyticus este natural rezistentă la
fosfomicină.

Rezistenţa la acid fusidic


Rezistenta stafilococului la acidul fusidic este datorata unor mutaţii care au loc cu frecvenţă mare, fapt
pentru care în clinică acest antibiotic se utilizează numai în asociere cu alte antibiotice.

Rezistenţa la rifampicină
Se disting două niveluri de rezistenţă:
- de nivel înalt cu CMI > 32mg/l
- sensibilitate diminuată (CMI 1- 4mg/l), tulpini izolate rareori
Mecanismele de rezistenţă la S. aureus nu sunt încă cunoscute.
La pneumococ, rezistenţa la rifampicină, este legată de o mutaţie a lanţului β al ARN polimerazei
care impiedică fixarea antibioticului pe ţinta sa.

Rezistenţa la cloramfenicol
Este predominant plasmidială şi se datorează prezenţei la enterococi a unor gene cat omologe cu cele
de origine stafilococică catpC221, catpC194 şi catpSCS7 (Trieu-Cuot et al., 1991; 1993). CatpC221, este o
genă, cu expresie inductibilă cu secvenţă cunoscută (Shaw si colab., 1985), identificată pe plasmida pC221 de
la S. aureus. Plasmida conjugativa pIP501 (30,2 kbp), cu spectru larg de gazdă, a fost izolat pentru prima dată
din tulpina B96 de S. agalactiae (Horodniceanu şi colab., 1976). Prezenţa sa conferă tulpinii gazdă fenotip
Cmr-Emr. Studii bazate pe hibridizări ADN-ADN au evidenţiat diseminarea determinantului catpIP501 pe
plasmide izolate din enterococi (Pepper şi colab., 1986; 1987; 1988).
Spre deosebire de stafilococi şi enterococi unde este codificata plasmidial, la pneumococi cloramfenicol
acetil transferaza este de natura cromosomală.

Rezistenţa la oxazolidinone
La stafilococi, până în prezent nu a fost evidenţiată rezistenţă încrucişată între linezolid şi alte
antibiotice inhibitoare ale sintezei proteice, mai mult oxazolidinonele rămân active asupra tulpinilor de
MRSA.
Oxazolidinonele s-au dovedit a fi active asupra tulpinilor de E. faecalis şi E. faecium fie că sunt
sensibile fie că nu la glicopeptide. In vitro s-au obţinut mutante rezistente cu o frecvenţă de 10 -9- 10-11 ( mutaţii
la nivelul subunitatii 23S ribosomale).
La penumococi nu s-a semnalat până în prezent nici o tulpină rezitentă indiferent de sensibilitatea la
penicilina G şi macrolide.

6.6. Fenotipuri de rezistenţă la alte antibiotice la microorganisme de interes clinic

B. cepacia este rezistentă, de asemenea, la aminozide, fosfomicina şi polimixine, dar sensibilă la


fluoroquinolone şi cotrimoxazol şi, într-un anumit procent, la carbapeneme în special la meropenem.
Fenomenul de eflux inactivează asupra cloramfenicolul, trimetoprimul şi ciprofloxacinul.
H. influenzae este rezistent la lincosamide şi moderat sensibil la macrolide şi ketolide. La aminozide
sensibilitatea este variabilă iar faţă de cloramfenicol, tetracicline, rifampicină, quinolone şi cotrimoxazol se
manifestă o rezistenţă de nivel scazut.
Biologul sau medicul de laborator care execută antibiograma are obligaţia de a prezenta clinicianului
rezultatul sub forma unui document uşor de citit şi de inţeles, care trebuie să urmeze logic rezultatului
examenului microscopic direct şi al culturii.
Menţiunile obligatorii din buletinul de analiză al antibiogramei sunt: metoda utilizată, lista
antibioticelor conform DCI-urilor (denumire comună internaţională), răspunsul interpretat ca sensibil,
intermediar, rezistent, CMI –uri în anumite cazuri (în special pentru microorganismele izolate din infectii
severe), menţionarea anumitor fenotipuri de rezistenţă şi consecinţele lor terapeutice. În anumite cazuri este
mai avantajos ca biologul sau medicul de laborator să prezinte clinicianului doar rezultatele pentru anumite
173
antibiotice, pentru a evita selectarea şi emergenţa unor fenotipuri de rezistenţă în mediul spitalicesc (tabelul
33).
Antibiograma este inutilă de fiecare dată când tulpina izolată nu poate fi considerată responsabilă de
infecţia care a determinat prelevarea (ex. -microorganism comensal sau contaminant, cum este cazul
streptococilor orali sau Haemophilus parainfluenzae în expectoraţii, Bacillus într-o singură hemocultură);
când numarul de UFC/ml este inferior pragului semnificativ (urina şi expectoraţi); dacă tulpina izolată poate fi
considerată ca patogenă, dar face parte dintre speciile sensibile în mod obişnuit la tratamentul de referinţă şi
când nu există nici o corelaţie in vitro-in vivo (ex. Legionella); în infecţiile cutanate pentru care tratamentul
este local sau chirurgical.
Antibiograma trebuie practicată în acord cu clinicianul:
- daca o bacterie comensală este izolată de la un pacient imunodeprimat;
- în prelevatele plurimicrobiene care conţin specii aerobe/anaerobe (tabelul 32);

Tabelul 32.
Criterii de decizie pentru realizarea unei antibiograme în funcţie de natura prelevatului (după Jehl şi colab., 2004)

Prelevat Necesitatea antibiogramei Fără antibiogramă Observaţii


Hemocultura Pentru toate speciile izolate cu Dacă sunt contaminanţi
exceptia contaminanţilor normali (Bacillus,
corineformi), iar o singură
hemocultură este pozitivă.
LCR Toate speciile considerate ca Daca sunt contaminanţi S. pneumoniae/N.
responsabile de meningite normali (Bacillus, meningitidis: investigarea
comunitare sau nosocomiale. corineformi) sistematică a rezistenţei la
SCN penicilina G
Daca examenul citochimic H. influenzae: investigarea
este normal. producerii de β lactamaze
Efectuare de CMI la
antibioticele utilizate
pentru tratament.
Cateter Dacă numărul de colonii este ≥ Dacă numărul de colonii este
1000 UFC/ml (metoda Brun < 1000 UFC/ml
Buisson) sau ( Brun Buisson) sau
15 colonii (metoda Maki) 15 colonii ( Maki)
Urocultura Leucocituria ≥ 10000 UFC/ml şi Dacă leucocituria = 10000 Se realizează la:
bacteriuria ≥ 100000 UFC/ml. UFC/ml şi bacteriuria ≤ 1000 -pacienţii imunodeprimaţi,
UFC/ml dializaţi, diabetici,
vârstnici, gravide, sau
pacienţi cu antecedente
endoscopice sau
chirurgicale pe căile
urinare şi leucociturie <
10000 şi bacteriurie
≥ 100000 UFC/ml

Daca sunt mai mult de 3 specii -la pacienţii simptomatici


bacteriene diferite. şi izolare de specii
uropatogene sau pacienţii
cu antecedente de
intervenţii endoscopice si
chirurgicale pe căile
urinare sau nefropatii
subiacente şi leucociturie ≥
10000/ml şi bacteriurie ≥
1000 şi < 100000 UFC/ml.
Secreţii naso-faringiene Investigare de SAMR,
Streptococ A la pacient alergic
la penicilină.
Puroi din otite şi sinuzite S. pneumoniae, Haemophilus Prelevate din otite externe, S.pneumoniae investigarea
influenzae, S. aureus, puroi recoltat prin paracenteză rezistenţei la penicilină
Enterobacterii, Pseudomonas SCN
174
Expectoraţii ≥10000000 UFC/ml Specii comensale sau patogene
nr. leucocite >25/câmp <10000000 UFC/ml Idem
numar celule bucale < 10/câmp
(10x).
Secreţii bronşice specii patogene ≥1000 UFC /ml <1000 UFC /ml H. influenzae
(β – lactamază)
Lichid bronho-alveolar specii patogene ≥10000 UFC /ml <10000 UFC /ml Idem
Aspirate traheo-bronşice specii patogene ≥10000 UFC /ml <10000 UFC /ml Idem
Coprocultura Speciile responsabile de Speciile comensale Interes epidemiologic în
gastroenterite. special

Toate speciile izolate ≥1000


Coprocultura cantitativă UFC /ml.
la pacienţi neutropenici
Prelevate cutanate Biopsie cutanată, arşi, Escare profunde, prelevare
(panariţii, arsuri, ulcere dermatomiozite. chirurgicală
varicoase, escare)
Prelevate osteoarticulare Sistematic dacă prelevarea este Fara antibiograma la orificii şi Conservarea tulpinilor
realizata chirurgical sau din fistule. timp de 1an
situsuri profunde.
Lichide de punctie In functie de examenul Speciile comensale (SCN, Se determină CMI
(ascite, pleural) microscopic si de numarul UFC corinebacterii). Pentru antibioticele R
Colecţii inchise Cu prioritate pe speciile
(abcese craniene şi predominante.
pulmonare)
Prelevate genitale N. gonorrhoeae sistematic Gardnerella
-in functie de examenul
microscopic numarul UFC
pentru alte specii.
Sperme UFC >1000 /ml
Prelevate oculare Ulcere corneene, conjunctivite, Speciile comensale
endoftalmii.

Tabelul 33.
Agenţi antimicrobieni de prima alegere pentru tratamentul infecţiilor cu bacterii patogene antibiorezistente
(după Jehl şi colab., 2004)

Bacterii patogene Antibioticul indicat pentru organismul susceptibil Antibiotice alternative dacă organismul este
rezistent la medicamentul indicat
Staphylococcus aureus Cloxacilina sau meticilina Vancomicina
Streptococcus pneumoniae Penicilina Cefotaxima, ceftriaxon sau vancomicina *
Haemophilus influenzae† Ampicilina Cefalosporine de generatia III, eritromicina,
TMP/SMX‡, Cefaclor§, Amoxicilina/clavulanat,
Claritromicina
Enterococcus fecalis Ampicilina si gentamicina Vancomicina
Moraxella catarrhalis Ampicilina La fel ca si pentru H. influenzae
Mycobacterium tuberculosis Izoniazida (în combinatie cu rifamfin şi alte medicamente) O combinatie de 3-6 medicamente la care
organismul este susceptibil
Specii de Shigella Ampicilina sau TMP/SMX Cefixim, ceftriaxon, cefotaxim, ciprofloxacin¶
Specii de Salmonella Ampicilina TMP/SMX, cloramfenicol, ceftriaxon
Pseudomonas aeruginosa Ticarcilin si tobramicina Ceftazidim, cefoperazon, quinolone¶, imipenem
*
Alegerea este determinata de localizarea infectiei si de rezultatele antibiogramei;

terapie orale;

Trimetoprim/sulfametoxazol (TMP/SMX);
§
Sau altă cefalosporină orală de a doua sau a treia generaţie; ¶A nu se folosi in cazul copiilor

175
Bibliografie selectivă

1. Catlin, B. W., lodometric detection of Haemophilus influenzae beta-lactamase: rapid presumptive test
for ampicillin esistance, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1975, 7:265-270.
2. Chopra I., Linton A., The antibacterial effects of low concentrations of antibiotics, Advances in
Microbial Physiology. 1986, 28:211–259.
3. Codiţă I., The genus Staphylococcus, Bacteriology, Virusology, Parazitology and Epidemiology. 1993,
38(3-4):5-33.
4. Codiţă I., (coordonator), Mazilu M., Mihai., Israil A.M., Ungureanu V., Tatu Chitoiu D., Petrescu A.M.,
Popa M., Balotescu C., Chersulik E., Lixandru B., Pană M., Ghitţă M., 2007, Ghid national pentru
aplicarea procedurii de testare a sensibilitatii la antibiotice conform standardului CLSI/NCCLS,
Editura Universitara “Carol Davila”, Bucuresti (ISBN:978-973-708-210-7)
5. Courvalin P., Jarlier C., Transposable multiple antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae,
Molecular and General Genetics. 1986, 205(2):291–297.
6. Duma R. J., Kunz L. J.,. Penicillinase production n the evaluation of disk sensitivity testing of
staphylococci to penicillin, American Journal of Clinical Pathology. 1970, 53:865-870.
7. Lowy F.D., Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus, The Journal of Clinical
Investigation. 2003, 111:1265-1273.
8. Hiramatsu K., Aritaka N., Hanaki H., Kawasaki S., Hosoda Y., Hori S., Fukuchi Y., Kobayashi I.,
Dissemination in Japanese hospitals of strains of Staphylococcus aureus heterogeneously resistant to
vancomycin. The Lancet Infectious Diseases. 1997, 350:1670-1673.
9. Horodniceanu T., Bouanchaud D.H.., Bieth G., Chabbert Y.A., R Plasmids in Streptococcus agalactiae
(Group B), Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1976, 10(5):795–801.
10. Iaconis JP, Sanders CC. Purification and characterization of inducible beta-lactamases in Aeromonas
spp. Antimicrob Agents Chemother. 1990, 34 (1):44–51
11. James H., Jorgensen J., Lee C., Gary A. A., Rapid Penicillinase Paper Strip Test for Detection of Beta-
Lactamase-Producing Haemophilus influenzae and Neisseria gonorrhoeae, Antimicrobial Agents and
Chemotherapy. 1977, 11(6): 1087–1088.
12. Jarlier V., Nicolas M.H., Fournier G., Philippon A., Extended broad-spectrum beta-lactamases
conferring transferable resistance to newer beta-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital
prevalence and susceptibility patterns, Reviews of Infectious Diseases. 1988, 10(4):867–878.
13. Jehl, F., Chomarat M. Weber M., Alain, G. De l'antibiogramme à la prescription. BIOMÉRIEUX,
2004
14. Jorgensen J., Lee J.C. Alexander G.A., Rapid Penicillinase Paper Strip Test for Detection of Beta-
Lactamase-Producing Haemophilus influenzae and Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents
Chemother. 1977, 11(6): 1087-1088
15. Kernodle D.S., Zygmunt D.J., McGraw P.A., Chipley J.R., Purification of Staphylococcus aureus beta-
lactamases by using sequential cation-exchange and affinity chromatography, Antimicrobial Agents
and Chemotherapy. 1990, 34(11):2177–2183.
16. Kernodle S.J., Improving Health Care with Clinical Practice Guidelines and Critical Pathways:
Implications for Pharmacists in Ambulatory Practice, Pharmacy Practice Management Quarterly. 1997;
17(3): 76-89.
17. Lambert T., Gerbaud G., Galimand M., Courvalin P., Characterization of Acinetobacter haemolyticus
aac(6')-Ig gene encoding an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase which modifies amikacin,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993, 37(10): 2093-2100.
18. Lambert T., Gerbaud G., Galimand M., Courvalin P., Characterization of Acinetobacter haemolyticus
aac(6~-1g gene encoding an aminoglycoside 6'- N-acetyltransf e rase wich modifies amikacin,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993, 37: 2093-2100.
19. Leclercq B., Genetic selection of meat-type chickens for high or low abdominal fat content, In : B.
Leclercq and C.C. Whitehead (eds), Leanness in domestic birds, 1993, p:25-40. Butterworth, London.
20. Leclercq B.,. Possibilités d'obtention et des génotypes maigres en aviculture. INRA Productionm
Animal. 1989, 2 : 275-286.
21. Leclercq R., Dutka-Malen S., Duval J., Courvalin P., The vancomycin resistance gene vanC is specific
of Enterococcus gallinarum. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1992, 36 : 2005-2008.
22. Livermore D.M., Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clinical Microbiology
Reviews. 1995, 8: 557-584.

176
23. M'Zali, F. H., Chanawong A., Kerr K. G., Birkenhead D., Hawkey P. M., Detection of extended-
spectrum β-lactamases in members of the family Enterobacteriaceae: comparison of the MAST DD test,
the double disc and the Etest ESBL. J. Antimicrob. Chemother. 2000, 45: 881-885
24. National Committee for Clinical Laboratory Standards Methods for determining bactericidal activity of
antimicrobial agents. Document M 26-A. NCCLS, Wayne PA. 1998.
25. National Committee for Clinical Laboratory Standards: Methods for dilution antimicrobial susceptibility
test for bacteria that grow aerobically. Document M7-A5. NCCLS, Wayne, PA, 2000.
26. National Committee for Clinical Laboratory Standards: Performance standards for antimicrobial disk
susceptibility tests. Document M2-A/. NCCLS, Wayne, PA, 2000.
27. O' Callaghan C. H., Morris A., Kirby S. M., Shingler A. H., Novel method for detection of P-lactamase
by using a chromogenic cephalosporin substrate. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1972,
1:283-288.
28. Pepper K., de Cespédès G., Horaud T., Heterogeneity of chromosomal genes encoding chloramphenicol
resistance in streptococci, Plasmid. 1988, 19(1):71–74.
29. Pepper K., Horaud T., Le Bouguénec C., de Cespédès G., Location of antibiotic resistance markers in
clinical isolates of Enterococcus faecalis with similar antibiotypes. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy. 1987, 31(9):1394–1402.
30. Pepper K., Le Bouguénec C., de Cespédès G., Horaud T., Dispersal of a plasmid-borne
chloramphenicol resistance gene in streptococcal and enterococcal plasmids, Plasmid. 1986, 6(3):195–
203.
31. Sanders, C. C., Sanders, W. E. Jr.. Type I beta-lactamases of gram-negative bacteria: interactions with
beta-lactam antibiotics. J Infect. Dis. 1986, 154 :792-800
32. Shah P.M., Isaacs R.D., Ertapenem, the first of a new group of carbapenems. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy. 2003, 52: 538-542
33. Strachounski L. S., Andreeva I. V.,. Ratchina S. A, Galkin D. V., Petrotchenkova N. A., Demin A. A.,
Kuzin V. B., Kusnetsova S. T., Likhatcheva R. Y., Nedogoda S. V., Ortenberg E. A., Belikov A. S.,
Toropova I. A., The Inventory of Antibiotics in Russian Home Medicine Cabinets, Clinical Infectious
Diseases. 2003, 37: 498–505
34. Trieu-Cuot P., G. de Cespédès, Bentorcha F., Delbos F., Gaspar E., Horaud T., Study of heterogeneity
of chloramphenicol acetyltransferase (CAT) genes in streptococci and enterococci by polymerase chain
reaction: characterization of a new CAT determinant, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993,
37(12): 2593–2598.
35. Trieu-Cout P., Carlier C., Poyart-Salmeron C., Courvalin P., Shuttle vectors containing a multiple
cloning site and a lacZ gene for conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to gram-positive
bacteria, Gene 1991, 02:99-104.
36. Walsh T. R., Howe R. A., The prevalence and mechanisms of vancomycin resistance in Staphylococcus
aureus. Annual Review of Microbiology. 2002, 56:657-675.
37. Zilhao R., Papadopoulou B., Courvalin P., Occurrence of the Campylobacter resistance gene tetO in
Enterococcus and Streptococcus spp., Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1988, 32(12):1793–
1796.
38. www.gold.aecom.yu.edu/id/micro/pneumococcus.htm
39. www.microbes-edu.org/.../bla/generalites.html
40. www.seimc.org/protocolos/microbiologia/cap12.htm

177
Capitolul 7
INTERACŢIUNILE FARMACOLOGICE ALE ANTIBIOTICELOR

Interacţiunile antibioticelor pot fi împărţite în două categorii:


- interacţiuni fizico-chimice care se produc în afara organismului, înainte de de administrare;
- interacţiuni care au loc in vivo.
Din prima categorie sunt cunoscute interacţiunile meticilină + kanamicină sau ampicilină +
gentamicină. In 2 ore, ampicilina pierde 50% din activitate, în amestecul cu gentamicina.
Utilizarea unor antibiotice asociate este o practică obişnuită în clinică, în special pentru tratamentul
infecţiilor grave. Asociaţia a fost empirică sau s-a bazat pe acţiunea lor complementară. Diseminarea
determinanţilor de rezistenţă face necesară înţelegerea bazelor moleculare ale administrării asociate a
antibioticelor în vederea alegerii optime a asocierilor cu acţiune sinergică şi în egală măsură, pentru evitarea
antagonismului.
Asociaţiile de antibiotice se folosesc frecvent în clinică, pentru următoarele scopuri:
- în majoritatea cazurilor, asociaţia se administrează pentru a obţine un spectru mai larg de activitate
sau în scopul întârzierii emergenţei subpopulaţiilor rezistente la medicament;
- administrarea unor antibiotice cu spectru larg de activitate este obligatorie pentru terapia pacienţilor
în pericol (pacienţii neutropenici febrili infectaţi cu bacili Gram negativi), sau când se suspectează o
infecţie combinată, polimicrobiană, cu bacterii aerobe sau anaerobe;
- pentru creşterea activităţii antibacteriene (sinergism);
- pentru utilizarea unor doze mai mici ale unor antibiotice toxice.
Tratamentul combinat se impune, pentru tratamentul infecţiilor al căror agent declanşator nu se
cunoaşte. Folosirea a două sau mai multe medicamente pentru prevenirea emergenţei rezistenţei este eficientă
pentru tratamentul tuberculozei şi pentru terapia unor infecţii cronice. Utilizarea asocierilor sinergice este mai
complexă. Sinergia se produce atunci când asocierea a două medicamente produce inhibiţia sau moartea
agentului infecţios, la concentraţii de 4 ori mai mici decât în cazul administrării separate a fiecărui
medicament.

7.1. Sinergismul

Uneori, antibioticele produse de diferitele specii ale unui grup au acţiune sinergică: de
exemplu, streptograminele sunt perechi de antibiotice neînrudite structural, care inhibă sinteza proteinelor
ribosomale la treapta transferului peptidil. Streptograminele de tip A se sintetizează pe calea poliketidelor
(peptide neribosomale), iar streptograminele de tip B sunt depsipeptide sintetizate neribosomal, care conţin
câţiva aminoacizi neproteici. Depsipeptidele sunt compuşi naturali sau sintetici cu secvenţe de aminoacizi ( -
NH2) şi hidroxicarboxilici (-OH), care de obicei alternează, însă nu în succesiune regulată:

Totdeauna organismele producătoare sintetizează ambele streptogramine. Streptograminele A sau B,


singure, sunt bacteriostatice, în timp ce asocierea lor este bactericidă. Creşterea eficienţei antibacteriene se
datorează legării sinergice a streptograminelor A şi B, la situsuri distincte pe ribosom. Legarea
streptograminei A la ribosom, măreşte afinitatea de legare pe ribosom a streptograminei B, de circa 40 de ori,
făcând ca legarea ambelor antibiotice să fie ireversibilă. Legarea antibioticului de tip A, probabil schimbă
conformaţia spaţială a ARNr, determinând expunerea unui situs de legare de înaltă afinitate pentru antibioticul
de tip B. Efectul sinergic al streptograminelor a fost exploatat clinic, sub forma unei combinaţii de derivaţi
semisintetici - pristinamicină IA şi IIA – cunoscuţi sub denumirea de synercid, utilizat pentru tratamentul
infecţiilor clinice cu rezistenţă multiplă la medicamente (Challis, Hopwood, 2003).
Studiile in vitro au arătat că în prezenţa penicilinei, înglobarea intracelulară a streptomicinei C 14 de
către Streptococcus faecalis, a crescut semnificativ, faţă de nivelul înglobării în absenţa -lactamilor
(Korzeniowski şi colab., 1978). Alte antibiotice active faţă de perete (vancomicina, bacitracina, cicloserina),
care acţionează la diferite trepte asupra sintezei peretelui celular bacterian şi care au produs efectul sinergic
optim (letal) în asociaţie cu streptomicina, au ridicat nivelul de încorporare al aminoglicozidului.
Administrarea asociată a antibioticelor prezintă un interes clinic major. Un exemplu tipic în acest sens
este administrarea asociată a inhibitorilor -lactamazei, cu alte antibiotice (Bush, 1988). Antibioticul care
178
leagă enzima acţionează ca inhibitor al enzimei. Sinteza -lactamazei constituie un mecanism major al
rezistenţei faţă de antibioticele -lactamice la bacteriile Gram pozitive şi Gram negative. Incercările s-au făcut
în sensul dezvoltării de noi antibiotice -lactamice, cu rezistenţă mai mare la hidroliza mediată de -
lactamaze. Sinergismul prin combinaţia ampicilină-cloxacilină s-a demonstrat şi s-a folosit în tratamentul
infecţiilor tractului urinar cauzate de organisme producătoare de -lactamaze.
Altă abordare a fost administrarea asociată a unui -lactamic hidrolizabil, activ, un alt -lactamic cu
afinitate mai mare pentru enzimă, cel de al doilea având rolul de inhibitor al enzimei. Inhibitori puternici ai
diferitelor -lactamaze produse de bacteriile Gram pozitive şi Gram negative s-au dovedit a fi două antibiotice
naturale: acidul clavulanic (produs de Str. clavuligerus) şi sulbactamul. Administrate separat, cele două
antibiotice au activitate antimicrobiană limitată. Aceşti compuşi acţionează ca inactivatori ai enzimelor
bacteriene: atât enzima cât şi antibioticul, după ce interacţionează, se inactivează reciproc. Asociaţia
clavulanatului de K cu amoxicilina, extinde spectrul acesteia faţă de microorganismele producătoare de -
lactamaze: S. aureus, H. influenzae, Bacteroides fragilis, K. pneumoniae şi alte enterobacterii.
Asocierea antibioticelor -lactamice şi a inhibitorilor de -lactamază este eficientă faţă de bacteriile
rezistente la -lactami (Siami şi colab., 2001). Efectul sinergic al asociaţiei este reflectat de denumirea dată
combinaţiei acidului clavulanic cu meticilina: augmentin.
Sulbactamul extinde spectrul ampicilinei, prin acelaşi mecanism ca şi acidul clavulanic. Ampicilina şi
sulbactamul au fost legate chimic (sultamicilin) sub forma unui compus absorbit pe cale orală. Asocierea
sintezei celor două tipuri de antibiotice caracterizează unele microorganisme în mediile naturale: producerea
cefamicinei (un antibiotic -lactamic) şi acidului clavulanic este constantă. Nu există producători cunoscuţi de
acid clavulanic, care să nu producă cefamicine.
Asociaţia cloramfenicolului la concentraţie mică, cu -lactamii, este sinergică faţă de 20% dintre
tulpinile Gram negative rezistente la -lactami prin hidroliza -lactamazei.

7.2. Blocarea secvenţială a căilor de sinteză

Asociaţia trimetoprimului cu sulfametoxazolul exemplifică sinergismul care rezultă din blocarea


treptelor secvenţiale ale unei căi metabolice esenţiale.
Inhibiţia dihidropteroat-sintetazei şi dihidrofolat-reductazei, trepte în sinteza acidului folic, are ca
rezultat sinergismul cu efect bactericid faţă de multe tulpini bacteriene, a căror creştere este inbibată de cei doi
compuşi chimici. Asociaţia trimetoprim-sulfametoxazol poate fi o alternativă la vancomicină.
Trimetoprim-sulfametoxazol, în asociaţie cu rifampina au fost folosite pentru eradicarea stării de
purtător nazal de Staphylococcus, rezistent, în epidemiile nosocomiale. Rifampina singură nu este folosită în
acest scop, datorită emergenţei tulpinilor rezistente.
Sinergismul cu efect bactericid al asociaţiei -lactamilor (inhibitori ai treptelor tardive ale sintezei
peptidoglicanului), cu fosfomicina (inhibitoare a unei trepte timpurii a sintezei peretelui celular) se explică
prin blocajul succesiv al treptelor multiple ale unei căi metabolice.
Antibioticele -lactamice au afinităţi preferenţiale pentru ţinte specifice, reprezentate de proteinele
care leagă penicilina (PBP), localizate în membrana citoplasmatică. Demonstrarea interacţiunii specifice cu
PBP a dus la conceptul că asocierea antibioticelor cu afinităţi complementare înalte poate produce efecte
sinergice. Astfel, concentraţiile bacteriostatice ale aztreonamului au devenit litice prin asocierea amidocilinei.
Asociaţiile -lactamice pot să producă efecte antagoniste. Antagonismul unor -lactami este frecvent
semnalat: de exemplu, antagonismul între azlocilină şi cefazolină se manifestă faţă de 16% dintre bacilii Gram
negativi testaţi (Eliopoulos, 1988).
Frecvenţa antagonismului variază mult în funcţie de metodele folosite in vitro, de combinaţia de
antibiotice şi de speciile examinate.
Spre deosebire de asociaţiile -lactami-aminoglicozide (streptomicina), al căror antagonism este bine
cunoscut şi semnalat în clinică, asociaţia poate avea efect sinergic şi bactericid pentru unele tulpini rezistente.
Rezistenţa la aminoglicozide se produce în special, după administrarea aminoglicozidelor ca agenţi terapeutici
unici, dar poate să apară chiar după administrarea lor în asociaţie cu -lactamicele.

7.3. Efectele defavorabile ale administrării antibioticelor

179
Cel mai direct şi cel mai evident efect al administrării prelungite pe cale orală a antibioticelor este
disbioza intestinală. Microbiota intestinală îndeplineşte mai multe funcţii, având un rol esenţial în stimularea
dezvoltării structurilor limfoide asociate tractului digestiv. La fel de importantă pentru organismul uman este
sinteza vitaminei K. Vitaminele K există sub două forme naturale: vitamina K 1 (filokinona), în ţesuturile
vegetale şi vitamina K2 (menaquinona), sintetizată de bacteriile intestinale. Celor două forme naturale se
adaugă menadiona sintetică (vitamina K3).

Structura moleculară a vitaminei K2


Funcţia majoră a vitaminei K în organismul uman este menţinerea nivelului normal al proteinelor de
coagulare sanguină: factorii II, VII, IX, X şi proteinele C şi S, sintetizate în ficat ca proteine precursoare
inactive. Vitamina K se absoarbe la nivel intestinal numai în prezenţa sărurilor biliare şi a altor lipide, prin
interacţiunea cu chilomicronii. In consecinţă, maladiile de malabsorbţie a lipidelor pot să aibă ca rezultat
deficienţa vitaminei K. Forma sintetică K3 este hidrosolubilă şi se absoarbe independent de prezenţa lipidelor
intestinale şi a bilei. Deficienţa K 2 este rară, deoarece este sintetizată de bacterii. Tratamentul îndelungat cu
antibiotice poate duce la deficienţe ale vitaminei K la adulţi. Intestinul nou-născuţilor este steril, astfel încât
este posibilă o deficienţă a vitaminei K, dacă lipseşte din dietă. Simptomul primar al deficienţei vitaminei K la
copii este sindromul hemoragic.
Agenţii antimicrobieni pot avea efecte toxice directe, pot să interacţioneze cu alte medicamente şi să-
şi mărească toxicitatea sau produc tulburări ale echilibrului microbiotei tractului digestiv şi favorizează
infecţiile cu organisme care în mod normal sunt saprobionte şi inofensive. Aproape toate antibioticele produc
creşterea numerică a celulelor de Cl. difficile, care secretă o toxină ce determină tulburări diareice şi chiar
colită pseudomembranară. Alterarea echilibrului intestinal de către antibiotice, poate să ducă la creşterea
populaţiei de C. albicans în cavitatea bucală, vagin, tractul gastrointestinal.
Unele antibiotice şi agenţi chimioterapeutici se metabolizează în ficat şi produc leziuni ale acestuia,
de exemplu, izoniazida, administrată pentru tratamentul tuberculozei, în timp ce aminoglicozidele pot să
lezeze rinichiul. Toxicitatea neurologică este rară, dar aminoglicozidele pot produce tulburări funcţionale ale
aparatului auditiv sau vestibular, dacă dozajul nu este monitorizat. Reacţiile hematologice au un spectru larg
de manifestări clinice.
Agenţii farmacologici, administraţi în scop terapeutic sau diagnostic, pot cauza o varietate de
dezordini imunitare, deoarece acţionează ca haptene care se cuplează cu diferite proteine tisulare, conferindu-
le imunogenitate. Legarea covalentă a unui medicament ori a unui metabolit reactiv derivat prin metabolizarea
lui, de o macromoleculă, creează un conjugat haptenă-macromoleculă, inductoare a unui răaspuns imun
specific. Legarea covalentă a celor două molecule se numeşte haptenare.
Se descriu două tipuri de haptenare:
- haptenarea directă a celulelor (a moleculelor membranare) şi a moleculelor extracelulare, sub acţiunea
compuşilor chimici cu reactivitate nativă (intrinsecă). De exemplu, penicilinele de semisinteză (benzil-
penicilina, cefalosporinele), dar şi alte medicamente se cuplează cu diferite proteine serice, formând
conjugate cu funcţie de alergene. Circa 10% din moleculele de penicilină injectată, se leagă covalent
prin gruparea –NH2, de proteine plasmatice sau membranare. Celula poate lega mii de haptene beta-
lactamice, în câteva minute după tratament.
- haptenarea indirectă a moleculelor membranare sau libere, cu derivaţii rezultaţi din catabolizarea
parţială a unor molecule, care în stare nativă sunt puţin reactive sau areactive.
Metabolizarea are loc în hepatocite, cheratinocite (şi în alte celule) şi poate crea intermediari reactivi
ce formează legături covalente cu molecule carrier.
Uneori, catabolismul medicamentelor este concomitent cu sinteza proteică. Se produce haptenarea
moleculelor în cursul sintezei (haptenare internă) şi pot fi expuse ca antigene pe suprafaţa celulei. Metaboliţii
reactivi pot fi secretaţi în spaţiul extracelular şi se leagă cu proteine extracelulare.
Unii indivizi sunt predispuşi la reacţiile alergice faţă de diverse medicamente, în special
antiinfecţioase. Dacă un individ manifestă fenomene alergice faţă de un compus farmacologic, riscul alergiei
180
faţă de o altă clasă de compuşi farmacologici creşte de 9 ori. Circa 10% dintre adulţi sunt alergici faţă de o
clasă de compuşi şi intră în categoria celor cu risc crescut faţă de alţi compuşi farmacologici.
Reacţiile de hipersensibilitate imediată de tip 1, induse de medicamente, se manifestă variat:
anafilaxie, urticarie, angioedem. Unele substanţe pot produce mai mult de un tip de reacţie, la un organism
sensibil. De exemplu, penicilina poate cauza o reacţie anafilactică de tip I, o anemie hemolitică datorată
reacţiei citotoxice de tip II, dezordini funcţionale de tip III cu complexe imune sau o reacţie de
hipersensibilitate întârziată. Reacţiile de hipersensibilitate de tip I apar, de cele mai multe ori, în ţesuturile
bogate în mastocite: tegument, mucoase, mucoasa linguală, plămân, tractul gastrointestinal.
Antibioticele β-lactamice au proprietăţi de haptene şi, la doze mari, penicilina sau gruparea peniciloil
rezultată după ruperea spontană a inelului β-lactamic, formează legături covalente cu proteinele. Gruparea
peniciloil are reactivitate chimică crescută. Proteinele tisulare care leagă moleculele β-lactamice se modifică.
Conjugatul antibiotic-proteină este inductor al sintezei IgM şi IgG şi rezultatul este hemoliza.
Alte medicamente care generează reacţii imunitare, în absenţa sintezei Ac sunt sulfonamidele.
Metaboliţii lor se leagă preferenţial cu enzimele care au citocromul P 450. Proteina alterată generează un peptid
care se asociază cu complexul CMH al celulei, recunoscut de limfocitele T.
Medicamentele se pot complexa cu proteine plasmatice şi formează conjugate haptenă-proteine,
inductoare ale sintezei Ac specifici. Se formează CI, care se adsorb pe hematii şi ulterior se produce liza.
Un anumit medicament poate produce o varietate de fenomene patologice, la diferiţi pacienţi: hemoliza,
trombocitopenia, neutropenia sau combinaţii ale acestor fenomene.

7.4. Pătrunderea antibioticelor în ţesuturi

Antibioticele administrate pe cale orală sau parenterală, părăsesc patul vascular şi intră în lichidul
interstiţial pe calea difuziei pasive prin spaţiile dintre celulele endoteliului vascular. Din lichidul interstiţial,
antibioticele pătrund în ţesuturi în grade diferite. Gradul de pătrundere tisulară condiţionează eficienţa clinică
şi potenţialul toxic al agenţilor antiinfecţioşi. Raportul concentraţiei ţesut/ser a aminoglicozidelor şi a -
lactamilor este subunitar pentru cele mai multe situsuri, cu excepţia organelor excretoare.
Bacteriile care cauzează infecţii tisulare sunt expuse la concentraţii mai mici de antibiotice decât cele
care se găsesc în acelaşi timp în sânge. Este recunoscut că lichidul cefalorahidian şi infecţiile cavitare
beneficiază de concentraţii mai mici decât cele din sânge. Astfel se explică utilizarea dozelor mai mari de
antibiotice pentru tratamentul infecţiilor tisulare. Raportul subunitar al concentraţiei antibioticului în
compartimentele tisular şi seric se datorează penetrării extravasculare scăzute ca rezultat al legării
medicamentului de proteinele sanguine. Faptul impune obligativitatea ca antibioticele cu afinitate înaltă de
legare de proteinele plasmatice să fie folosite în doze superioare pentru a fi la fel de eficiente ca acelea care au
un nivel scăzut de legare cu proteinele serice.
Unele antibiotice au capacitatea de a se concentra la anumite situsuri tisulare din organism, ceea ce
face ca ele să fie eficiente la doze inferioare. Concentraţiile tisulare mari realizate la situsurile de concentrare
pot determina efecte toxice: de exemplu, raportul mare al concentraţiei prelungite ţesut/ser de aminoglicozide
produce toxicitate renală. Concentraţiile locale mari de aminoglicozide nu sunt totdeauna toxice, dar creşte
eficienţa terapeutică faţă de pielonefrită.
Dată fiind corelaţia în general pozitivă între concentraţia tisulară şi eficienţa terapeutică, în clinică s-a
acceptat creşterea dozajului -lactamilor, iar pentru amioglicozide, dozele au fost limitate de toxicitate.
Eficienţa scăzută a aminoglicozidelor faţă de infecţiile tisulare are alte explicaţii: legarea de leucocite şi de
resturile necrotice la situs, antagonismul prin anaerobioza relativă şi antagonismul cationilor metalici din
urină.
Cele mai multe infecţii bacteriene se produc în spaţiul extracelular sau interstiţial. Bacteriile aderă la
suprafaţa celulelor gazdă sau de orice suprafaţă artificială pe care sunt disponibili nutrienţii. Infecţia produce
leziuni ale ţesuturilor gazdă prin intermediul metaboliţilor, toxinelor sau a enzimelor bacteriene sau prin
produsele reacţiei inflamatorii ale gazdei, cum sunt enzimele lizosomale şi factorul de necroză tisulară (TNF).
Pentru a fi eficiente în tratamentul infecţiei, antibioticele trebuie să fie prezente în lichidul interstiţial.
Concentraţia tisulară eficientă este corelată direct cu concentraţia sanguină: s-a evidenţiat că concentraţia
minimă eficientă de penicilină, necesară pentru tratamentul infecţiei cu S. aureus este aceiaşi cu concentraţia
minimă bactericidă in vitro. Penicilina rămâne în spaţiul extracelular şi este eficientă pentru tratamentul
infecţiilor bacteriene cu localizare extracelulară.
Antibioticele care pătrund în celule sunt potenţial utilizabile pentru tratatamentul infecţiilor produse
de microorganisme cu localizare intracelulară: Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis,
Listeria monocytogenes, S. aureus. Antibioticul trebuie să pătrundă în celulă (în fagocite) şi să-şi păstreze
181
activitatea antibacteriană în interiorul celulei (Labro, 2002). Clindamicina, eritromicina, rifampina şi
fluoroquinolonele pătrund în leucocitele polimorfonucleare. Eficienţa lor antibacteriană este diferită, datorită
diferenţelor de legare a antibioticelor de componentele structurale ale celulei. Antibioticul poate fi legat de
membrană, în citoplasmă, de componentele nucleare sau este încorporat în lizosomi. Măsurarea concentraţiei
intracelulare a antibioticului se bazează pe evaluarea cantităţii de medicament asociat celulei. Asocierea unei
cantităţi mari de antibiotic cu celula nu implică în mod obligatoriu prezenţa sa la situsul rezidenţei agentului
infecţios intracelular. Legarea extensivă a antibioticului de componentele celulei, diminuă activitatea sa
antiinfecţioasă. Pe de altă parte, condiţiile intracelulare nefavorabile (pH acid), pot modifica profilul activităţii
antibioticului în raport cu concentraţia: aminoglicozidele, quinolonele şi macrolidele sunt mai puţin active la
pH acid, iar la pH mic lizosomal sunt cel puţin parţial inactivate (Nix şi colab., 1991).
Pentru determinarea gradului în care antibioticele pătrund în ţesuturi s-au folosit mai multe metode.
Un parametru esenţial al evaluării nivelului în care antibioticul pătrunde în ţesuturi este specificitatea tisulară,
deoarece antibioticele nu se distribuie uniform în organism: de exemplu, un medicament se poate distribui
într-o concentraţie apropiată de cea serică în ţesutul muscular striat, dar concentraţia sa în nevrax, plămân sau
prostată poate fi mult sub nivelul concentraţiei serice. Unele ţesuturi sau fluide se echilibrează repede cu
spaţiul vascular, iar altele se echilibrează lent şi pot acţiona ca situsuri de depozit pentru antibiotice: de
exemplu, rinichiul pentru aminoglicozide şi ţesutul osos pentru tetraciclină.Ţesuturile cu echilibrare lentă în
raport cu sistemul vascular menţin concentraţii mari, mult timp după ce concentraţia sanguină a antibioticului
scade spre valoarea 0. Alte situsuri cu rol de depozit sunt lichidul ascitic pentru cefalosporine şi lichidul
interstiţial pentru aminoglicozide.
Concentraţia de antibiotic determinată într-un ţesut depinde de metoda de măsurare. Evaluările sunt
influenţate de cantitatea de sânge în proba tisulară, de gradul de desicare a probei, de gradul de descompunere
chimică a antibioticului în timpul prelucrării etc. Proba trebuie recoltată dintr-un singur tip de ţesut şi nu prin
secţionarea transversală a diferitelor straturi tisulare.Ţesutul va fi excizat după încheierea fazei de distribuţie a
medicamentului (la 1-2 ore după administrarea dozei) şi după ce a fost atinsă faza de echilibru dintre spaţiul
vascular şi cel tisular. Condiţiile tisulare măresc sau scad rata înglobării antibioticului: reacţia inflamatorie
modifică mediul fizico-chimic. In prostatita cronică, scăderea pH local diminuă penetrarea antibioticului.
Modificările permeabilităţii vasculare influenţează penetrarea şi capacitatea antibioticului de a atinge
situsurile infecţiei. In cazul meningitei acute, creşterea permeabilităţii capilare determină creşterea
concentraţiei unor antibiotice (de exemplu, -lactami), în lichidul cefalorahidian (Darouiche şi Hamill, 1994).
Metoda veche folosită pentru determinarea penetrării tisulare a unui medicament, presupune
omogenizarea probei de ţesut şi măsurarea concentraţiei de antibiotic. Recuperarea medicamentului în
supernatant este influenţată din cauza legării sale de resturile celulare sau de pierderea medicamentului în
timpul prelucrării probei. Antibioticele sunt transportate în grade variate în diferite tipuri de celule ale unui
ţesut şi se leagă cu afinităţi diferite de componentele celulare. Metoda omogenizării probei de ţesut sparge
membranele celulare şi rezultă o suspensie care conţine lichidul intracelular, extracelular şi compentele
particulate ale celulei. Sângele din vasele ţesuturilor reprezintă 3-6% din greutatea majorităţii probelor şi este
încorporat în omogenatul tisular. De aceea, trebuie estimată concentraţia de antibiotic asociată eritrocitelor.
Prezenţa sângelui în proba tisulară nu determină erori importante în estimarea cantitativă a -lactamilor,
tetraciclinei sau aminoglicozidelor (Roberts şi colab., 1979). Dintre medicamentele folosite în mod curent,
sulfonamidele, iar dintre cele noi, ribavirina, se concentrează în eritrocite. Contaminarea cu sânge
influenţează semnificativ rezultatele analizei medicamentelor care au afinitate mare pentru eritrocite. Pentru
medicamentele care se distribuie în mod egal în plasmă, celulele tisulare şi eritrocite (tetraciclina,
cloramfenicolul, unii -lactami), contaminarea cu sânge nu este o sursă importantă de erori.
Concentraţia tisulară a antibioticului se exprimă îm g/gram de ţesut.
Aminoglicozidele, -lactamii şi quinolonele au fost studiate în ceea ce priveşte gradul de pătrundere
tisulară, prin metoda omogenizării tisulare. Beta-lactamii sunt excluşi din cele mai multe tipuri de celule. Ele
pătrund în celule numai prin intermediul unui sistem membranar de transport: de exemplu, cefalosporina este
transportată în ţesutul renal. Concentraţia acestor antibiotice se echilibrează în tot lichidul interstiţial. După o
singură doză, aminoglicozidele se aseamănă cu -lactamii: nu pătrund în celule, iar în lichidul interstiţial
concentraţia este asemănătoare cu cea plasmatică. După doze multiple, aminoglicozidele se acumulează lent în
interiorul celulei. Transportul intracelular al acestor antibiotice este un proces lent, datorită permeabilităţii
scăzute a membranei şi este unidirecţional, datorită legăturii cu afinitate înaltă care se formează cu
mitocondriile şi cu lizosomii. Aminoglicozidele translocate în celule sunt legate ferm şi devin inactive faţă de
agenţii infecţioşi. Ele sunt în mică măsură utile pentru tratamentul agenţilor patogeni cu localizare
intracelulară. In ţesuturi (muşchi, ficat), raportul concentraţiei aminoglicozidelor tisulare/serice este 2, dar se
concentrează în rinichi, în proporţie de 200/1. Mecanismul înglobării în celulele renale probabil este acelaşi ca
182
şi în celelalte organe, dar rata înglobării în ţesutul renal este mult mai înaltă. Concentraţiile intracelulare mari
duc la concluzia că antibioticele reacţionează cu fosfolipidele, rezultatul fiind nefrotoxicitatea, factorul major
al limitării dozelor.
Quinolonele se acumulează în interiorul celulei, în concentraţii mai mari decât cele serice şi rezultă
concentraţii relativ înalte în omogenatele tisulare. Cel puţin 60% din doza de quinolone este legată în
interiorul celulelor. Legarea intracelulară a quinolonelor are aviditate mai mare şi se concentrează la un nivel
superior, dar este uşor reversibilă şi din această cauză au un timp de înjumătăţire de 10 ori mai scurt )Wolfson
şi Hooper, 1989). Distribuţia intracelulară a quinolonelor este avantajoasă pentru tratamentul infecţiilor
intracelulare, deoarece aminoglicozidele şi -lactamii sunt excluse din situsurile de infecţie intracelulară.
Quinolonele sechestrate în celule constituie un rezervor prin care se prelungeşte expunerea bacteriilor în
compartimentul extracelular.
Vancomicina şi teicoplanina pătrund în cele mai multe tipuri de celule şi se concentrează în rinichi.
Raportul normal al concentraţiei tisulare/serică este aproximativ 1. Ambele, dar în special teicoplanina, se
leagă de ţesuturi şi se acumulează prin dozare multiplă, asemănător aminoglicozidelor (Tuazon şi Miller,
1984). Vancomicina şi teicoplanina sunt molecule mari şi se elimină numai prin filtrare glomerulară.
Cloramfenicolul, rifampina şi macrolidele, ca eritromicina şi azitromicina se comportă asemănător
quinolonelor. Ele pătrund reversibil în celule, dar spre deosebire de quinolone, sunt metabolizate într-o
proporţie importantă.
Colistina, polimixina şi amfotericina manifestă o cinetică a legării tisulare şi o toxicologie
asemănătoare aminoglicozidelor. Ele intră lent în celule, dar afinitatea înaltă de legare intracelulară face ca
intervalul de înjumătăţire să fie mai mare.
Unele bacterii sunt fagocitate şi persistă în macrofage sau în leucocite, dar de cele mai multe ori
infecţiile tisulare rezidă în special în spaţiul tisular extracelular.
-lactamii şi aminoglicozidele sunt excluse din celulele intacte şi rămân în sânge şi în lichidul
interstiţial.
In unele situsuri, concentraţia antibioticului nu se supune principiului difuziei libere: urina, secreţia
biliară. Concentraţia antibioticelor este determinată de transportul activ. Alte situsuri – umoarea apoasă sau
lichidul cefalorahidian, au bariere de permeabilitate. In general, cele 3 clase de antibiotice (-lactami,
aminoglicozide, quinolone) se acumulează în urină şi toate sunt eliminate prin filtrare glomerulară şi/ sau
secreţie tubulară renală. Unele antibiotice -lactamice sunt concentrate în secreţia biliară.
S-au demonstrat corelaţii directe între concentraţiile serice ale antibioticelor (aminoglicozide, -
lactami şi quinolone) şi eficienţa faţă de infecţiile tisulare. La unele antibiotice, raportul este independent de
gradul de legare de proteinele serice. Efectele primare ale legării de proteine sunt încetinirea excreţiei şi
reducerea volumului de distribuţie tisulară.
Legarea antibioticelor de proteinele serice este un parametru important care condiţionează activitatea
lor antiinfecţioasă. Concentraţia serică a antibioticelor este rezultatul net al legării atât de proteinele serice, cât
şi de ţesuturi. Principalul suport molecular al legării antibioticelor este albumina sanguină şi extravasculară.
Deşi aminoglicozidele sunt legate în proporţie neglijabilă de proteinele serice, legarea poate fi
întreruptă de concentraţiile mari de cationi bivalenţi. Cationii bivalenţi au efect antagonic faţă de activitatea
lor antibacteriană.
Quinolonele se leagă în proporţie de până la 40% de proteinele serice, iar pentru antibioticele -
lactamice, legarea de proteinele serice este foarte semnificativă.
Biofilmul este o populaţie de celule care creşte pe o suprafaţă şi sunt incluse într-o matrice
polizaharidică (Costerton, 1999). Infecţiile organizate în biofilme sunt greu de eradicat şi sunt sursa infecţiilor
rezistente. Biofilmele se formează in vivo, ca rezultat al aderenţei microorganismelor de un substrat anatomic
şi sunt specifice infecţiilor bacteriene şi cu Candida albicans.
Biofilmele sunt cu greu eradicate prin acţiunea bactericidă a substanţelor antimicrobiene. Substanţele
antimicrobiene difuzează în biofilm şi inhibă creşterea sa. Majoritatea celulelor sunt supuse acţiunii ‘‘cide’’ a
agenţilor antimicrobieni, dar o mică proporţie rămân viabile (Donlan şi Costerton, 2002).
Cauzele rezistenţei biofilmelor. Factorii determinanţi ai rezistenţei biofilmelor sunt : penetrarea
limitată a substanţelor antimicrobiene în biofilm, rata scăzută de creştere a populaţiei bacteriene şi posibila
expresie a genelor de rezistenţă.
Penetrarea antibioticelor în biofilm este limitată, deoarece celulele sunt incluse într-o matrice
exopolizaharidică, ce poate să limiteze difuzia substanţelor şi chiar să le lege. Bariera de difuzie este eficientă
faţă de moleculele proteice mari, aşa cum sunt lizozimul şi proteinele complementului, sau faţă de peptidele
antimicrobiene din categoria defensinelor. Exopolizaharidele încărcate cu o sarcină electrică negativă sunt
foarte eficiente ca barieră protectoare faţă de antibioticele aminoglicozidice încărcate pozitiv.
183
Difuzia restrictivă poate limita penetrarea unui agent antimicrobian degradabil sub acţiunea unor
enzime hidrolitice de tipul -lactamazelor. Efectul sinergic al difuziei lente şi al inactivării enzimatice oferă
rezistenţă eficientă biofilmelor cu Ps. aeruginosa.
Inactivarea sau modificarea antibioticului (acetilarea aminoglicozidelor), asociată cu bariera de
difuzie în biofilm creează condiţii de protecţie a bacteriilor biofilmului: bariera polizaharidică de difuzie
protejează celulele biofilmului de acţiunea H 2O2. Astfel, celulele planctonice de Ps. aeruginosa sunt mult mai
sensibile decât cele din biofilm, deşi acestea produc cantităţi mai mici de catalază, iar rezistenţa biofilmului la
cloramfenicol se datorează atât unei rate de difuzie lentă cât şi inactivării enzimatice sub acţiunea
cloramfenicol acetil-transferazei (CAT).
Experimental, s-a demonstrat că în cele mai multe cazuri care implică molecule antimicrobiene mici,
bariera polizaharidică nu oferă o protecţie efectivă, ci doar întârzie moartea celulei. Cele mai eficiente sunt
fluoroquinolonele, deoarece difuzează uşor în biofilm şi stopează creşterea celulelor (Rediske şi colab., 1999).
Bariera biofilmului şi inactivarea enzimatică nu creează condiţiile creşterii celulelor, ci doar ale
supravieţuirii.
Rata scăzută de creştere a celulelor bacteriene este un factor favorizant al supravieţuirii celulelor în
biofilm, după tratamentul cu antibiotice. Unele antibiotice îşi exercită efectul letal numai asupra celulelor care
cresc. Penicilina şi ampicilina nu sunt active faţă de celulele care nu cresc. Cefalosporina, aminoglicozidele şi
fluoroquinolonele pot omorî celulele care nu cresc, dar au un efect letal faţă de celulele care se divid.
Creşterea lentă este un factor major pentru creşterea rezistenţei celulelor planctonice staţionare.
Majoritatea celulelor dintr-un biofilm nu manifestă o rezistenţă superioară celulelor planctonice şi
mor repede sub acţiunea unui antibiotic bactericid. Acţiunea substanţelor antimicrobiene bactericide asupra
celulelor planctonice şi din biofilm, este bifazică. Intr-o primă etapă se produce moartea majorităţii celulelor.
Populaţia de celule persistente, restrânsă numeric, este rezistentă la doza iniţială, dar este sensibilă la o doză
superioară. Biofilmul produce mai multe celule persistente decât o populaţie planctonică. Antibioticele
inhibitoare ale creşterii favorizează supravieţuirea şi persistenţa celulelor planctonice şi din biofilm. Scăderea
amplă a numărului de celule, planctonice sau din biofilm, are efecte benefice: celulele persistente devin ţinta
efectorilor imunitari şi infecţia este eradicată.
Persistenţa celulelor bacteriene creează probleme clinice ample în cazul în care funcţia imunitară nu
cooperează cu acţiunea antibioticelor (fig. 55). De exemplu, Str. pneumoniae produce meningita rezistentă
datorită inaccesibilităţii componentelor sistemului imunitar la lichidul cefalorahidian.

Figura 55. Ilustrarea schematică a mecanismului persistenţei biofilmelor. Antibioticele sunt active asupra celulelor
bacteriene planctonice (cercuri negre şi albe) şi ale biofilmului. In biofilm, celulele persistente (cercuri albe) sunt
inaccesibile efectorilor imunitari şi refac populaţia biofilmului (original).

Compartimentul gastric este de asemenea, lipsit de factori imunitari şi infecţiile cu Helicobacter


pylori, care produc ulcere peptice (ulcere care nu se datorează mediului acid), sunt foarte rezistente. Mediul
gastric necesită sterilizare completă pentru a împiedica recidiva.
Infecţiile cu biofilme sunt, din punctul de vedere al inaccesibilităţii efectorilor imunitari,
asemănătoare cu infecţiile produse de celulele libere, în absenţa efectorilor imunitari, deoarece exopolimerul
biofilmului protejează fizic celulele de accesul factorilor protectori. După prima doză a unui antibiotic
bactericid, este eliminată cea mai mare parte a populaţiei celulare. O proporţie foarte mică a celulelor
infecţioase sunt persistente. Dacă simptomele dispar odată cu eradicarea celulelor libere (planctonice) şi
terapia este oprită, celulele persistente vor reface populaţia biofilmului, din care se vor desprinde noi celule

184
planctonice. Această dinamică explică natura recurentă (recidivantă) a infecţiei sub forma biofilmului şi
necesitatea unei terapii îndelungate cu antibiotice.
Infecţiile sub forma biofilmelor reprezintă peste 60% din totalul infecţiilor bacteriene, deoarece
infecţiile comune ale tractului urinar (cauzate de E. coli şi de alţi patogeni), infecţiile de cateter (produse de S.
aureus şi alţi patogeni Gram pozitivi), infecţiile urechii medii la copii (produse de H. influenzae), formarea
plăcii dentare şi gingivita, toate cauzate de biofilme, sunt greu de tratat şi adeseori recurente. Alte infecţii de
biofilm produc morbiditate şi mortalitate: endocardita cauzată de S. aureus, infecţiile implantelor permanente
(protezele articulare şi valvele cardiace, produse de S. aureus) şi infecţiile pacienţilor cu fibroză chistică,
produse de Ps. aeruginosa).
Incidenţa celulelor persistente după acţiunea antibioticelor este de circa 10 -6. Bigger (1944) citat de
Olson şi colab., 2002) a explicat persistenţa bacteriană prin două ipoteze: a) celulele persistente au o rezistenţă
mai mare la antibiotic; b) celulele persistente au acelaşi grad de sensibilitate ca şi masa celulară a biofilmului,
dar se găsesc într-o stare fiziologică în care efectul bactericid al antibioticului nu se produce. După reluarea
creşterii, celulele persistente refac populaţia, care nu se distinge de cea originală în ceea ce priveşte
sensibilitatea la antibiotic. Factorii care favorizează persistenţa nu se cunosc, dar sunt celule importante,
deoarece au rol esenţial în supravieţuirea populaţiei celulare. Celulele persistente nu sunt mutante, ci sunt
celule comune ale biofilmului, care, prin mecanisme necunoscute, depăşesc faza critică a efectului bactericid.
O explicaţie nouă a persistenţei este derivată din studiile referitoare la moartea programată a celulei
eucariote. Celulele bacteriene care suferă efecte grave ale acţiunii factorilor bactericizi, ar activa programul
morţii celulare. Raţionamentul este acelaşi cu cel formulat pentru moartea celulelor eucariote. De cele mai
multe ori, moartea celulară este rezultatul apoptozei, indusă de leziunile provocate de factori toxici.
Antibioticele bactericide nu ar produce moartea celulară, ci numai leziuni declanşatoare ale sinuciderii.
Comunitatea biofilmului se aseamănă cu un organism multicelular, deoarece manifestă unele trăsături
funcţionale care sugerează un grad redus de integrare funcţională. Biofilmul ar beneficia din moartea
apoptotică a celulelor lezate, asemenea unui organism pluricelular. Antibioticul difuzează uniform în masa
biofilmului şi tinde să lezeze toate celulele, riscul fiind dispariţia asociaţiei. Celulele persistente ar fi acelea
care nu activează programul morţii şi supravieţuiesc după ce antibioticul atinge întreaga populaţie celulară.
Pentru eradicarea biofilmelor, asocierea rifampicinei şi minociclinei este foarte eficientă şi reduce
probabilitatea colonizării bacteriene. Încorporarea profilactică a antibioticului în materialul cateterelor va
împiedica bacteriile rezistente să colonizeze cateterele impregnate. Metoda se poate aplica pentru cateterele pe
termen scurt, dar nu poate fi la fel de eficientă pentru articulaţiile artificiale sau pentru valvele cardiace.

Bibliografie selectivă

1. Bush K., Beta-lactamase inhibitors from laboratory to clinic, Clinical Microbiology Reviews. 1988,
1(1): 109-123.
2. Challis G.L., Hopwood D.A., Synergy and contingency as driving forces for the evolution of multiple
secondary metabolite production by Streptomyces species, Proc Natl Acad Sci U S A, 2003,
100:14555–14561 Suppl 2
3. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P., Bacterial biofilms: a common cause of persistent
infections, Science. 1999, 284:318–322.
4. Darouiche R.O., Hamill R.J., Antibiotic penetration of and bactericidal activity within endothelial cells,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1994, 38(5): 1059-1064.
5. Donlan R.M., Costerton J.W., Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant
Microorganisms.Clinical Microbiology Reviews. 2002, 15(2): 167-193.
6. Eliopoulos G.M., Eliopoulos C.T., Antibiotic combinations: should they be tested?, Clinical
Microbiology Reviews. 1988, 1(2): 139-156.
7. Eliopoulos G.M., Wennersten C., Zighelboim-Daum S., Reiszner E., Goldmann D., Moellering R.C. Jr.,
High-level resistance to gentamicin in clinical isolates of Streptococcus (Enterococcus) faecium,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1988, 32(10): 1528-1532.
8. Korzeniowski O.M., Wennersten C., Moellering R.C. Jr., Sande M.A., Penicillin-netilmicin synergism
against Streptococcus faecalis, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1978, 13(3): 430-434.
9. Labro M.T., Interference of Antibacterial Agents with Phagocyte Functions: Immunomodulation or
“Immuno-Fairy Tales”?, Clinical Microbiology Reviews. 2000, 13(4): 615-650.
10. Nix D., Goodwin D., Peloquin C.A., Rotella D.L., Schentag J.J., Antibiotic tissue penetration and its
relevance: model of tissue penetration and their meaning, Antimicrobial Agents and Chemotherapy.
1991, 35(10): 1947-1952.
185
11. Olson M.E., Ceri H., Morck D.W., Buret A.G., Read R.R.., Biofilm bacteria: formation and
comparative susceptibility to antibiotics, Canadian Journal of Veterinary Research. 2002, 66(2): 86-
92.
12. Rediske A.M., Roeder B.L., Brown M.K., Nelson J.L., Robison R.L., Draper D.O., Schaalje G.B.,
Robison R.A., Pitt W.G., Ultrasonic Enhancement of Antibiotic Action on Escherichia coli Biofilms: an
In Vivo Model, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1999, 43(5): 1211-1214.
13. Roberts T.L. 3rd, Futrell J.W., Sande M.A., Antibiotic penetration into normal and inflamed tissues as
reflected by peripheral lymph, Annals of Surgery. 1979, 189(4): 395-403.
14. Siami G., Christou N., Eiseman I., Tack K.J., the Clinafloxacin Severe Skin And Soft Tissue Infections
Study Group, Clinafloxacin versus Piperacillin-Tazobactam in Treatment of Patients with Severe Skin
and Soft Tissue Infections, Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2001, 45(2): 525-531.
15. Tuazon C.U., Miller H., Comparative in vitro activities of teichomycin and vancomycin alone and in
combination with rifampin and aminoglycosides against staphylococci and enterococci, Antimicrobial
Agents and Chemotherapy. 1984, 25(4): 411-412.
16. Wolfson J.S., Hooper D.C., Fluoroquinolone antimicrobial agents, Clinical Microbiology Reviews.
1989, (4): 378-424.

186
Capitolul 8
SUBSTANŢE NATURALE CU ACTIVITATE IMUNOSUPRESOARE

In perioada timpurie a transplantării, imunosupresia s-a limitat la tratamentul combinat cu azatioprină


şi corticosteroizi. Eficienţa lor este limitată, neselectivă şi produc numeroase efecte secundare.
Progresele biologiei celulare cu privire la mecanismele propagării semnalelor intracelulare, precum şi
studiul chimiei unor compuşi naturali a evidenţiat faptul că multe produse sintetizate de diferite organisme au
afinitate înaltă pentru proteinele celulare care au funcţia de transductori ai semnalului. Un grup de compuşi
naturali care interferă cu semnalizarea intracelulară sunt agenţii cu efect imunosupresor: ciclosporina A,
FK506 (tacrolimus) şi rapamicina (sirolimus). Cei 3 compuşi suprimă răspunsul imun, deoarece blochează
activarea limfocitelor T şi de aceea sunt folosite în clinică pentru a preveni respingerea grefelor de organe.

8.1. Ciclosporina

Ciclosporina A este un antibiotic descoperit în 1971, sintetizată de fungii filamentoşi Tolypocladium


inflatum, în cultură submersă, de unde se extrage cu solvenţi organici. Este bogată în aminoacizi hidrofobi,
neutri, insolubilă în n-hexan şi apă, dar foarte solubilă în toţi ceilalţi solvenţi organici.Iniţial, antibioticul a fost
investigat pentru proprietăţile antifungice, dar spectrul activităţii sale este foarte îngust, ceea ce a determinat
renunţarea la utilizarea în clinică. Acţiunea sa inhibitorie, in vitro, s-a demonstrat pentru Neurospora crassa,
Rhodotorula rubra. Ciclosporina este un peptid ciclic lipofil, rezultat prin condensarea a 11 aminoacizi.

Mecanismul de acţiune
Mecanismul acţiunii antifungice se datorează inhibiţiei sintezei peretelui celular, în special blocării
sintezei chitinei. Un alt antibiotic blocant al sintezei chitinei – polioxina – are un spectru de acţiune la fel de
îngust. Ciclosporina inhibă selectiv proliferarea limfocitelor, dar, spre deosebire de alte citostatice, nu
modifică rata diviziunii altor celule somatice (Fruman şi colab., 1992). In vitro, ciclosporina este de 300 de ori
mai activă ca inhibitor al celulelor limfoide splenice, decât al celulelor mastocitoma (nelimfoide). Dozele
mari, administrate experimental timp de 13 săptămâni la şobolan, produc toxicitate renală şi hepatică.
Nefrotoxicitatea este asociată cu depozite mucoide în arteriole, fibroză focală stimulată de vasoconstricţie.

Structura moleculară a ciclosporinei

Ciclosporina a fost primul medicament imunosupresor, care a permis imunomodularea selectivă a


celulelor T, în condiţiile unui grad moderat de toxicitate şi a schimbat perspectiva transplantului de organe: a
scăzut morbiditatea şi a permis transplantul de rutină. În prezent, se foloseşte pentru prevenirea respingerii
grefelor de rinichi, ficat, cord, plămân şi a transplantului combinat cord-plămân. Majoritatea pacienţilor cu
transplant necesită tratamentul pe termen lung, cu doze mari de imunosupresor, care cresc sensibilitatea la
infecţii şi malignităţi, permiţând însă supravieţuirea pacienţilor transplantaţi, timp de ani de zile. Ciclosporina
acţionează specific asupra limfocitelor, inhibând transcrierea genică pe o cale dependentă de Ca 2+, adică
blochează progresia ciclului celular de la G 0 la G1, prin legarea cu mare afinitate de o ciclofilină, proteină
celulară ubicvitară. Complexul ciclosporină-ciclofilină leagă şi blochează funcţia enzimatică a calcineurinei, o
fosfatază, care are rolul de a defosforila un component citoplasmatic al factorului nuclear al celulelor T
187
activate (NF-ATc) (June şi colab., 1987; Marchetti şi colab., 2000). Factorul nuclear al limfocitelor B activate
este un mesager activator comun al transcrierii în celulele eucariote, denumit NF-kB, fiind descris (în 1986) ca
un factor nuclear necesar transcrierii catenei k a imunoglobulinelor în limfocitele B şi de aici denumirea de
nuclear factor k al celulelor B. In celulele B mature, NF-kB este localizat în nucleu, unde se leagă de o
secvenţă de 10 pb a genei codificatoare a catenei k şi activează transcrierea. NF-kB preexistă în citoplasmă
într-o formă inactivă, legată de un inhibitor (IkB). După primirea unui semnal, factorul NF-kB este eliberat
din asociaţia cu IkB şi transferat spre nucleu, unde activează transcrierea genei specifice. Deoarece se
activează numai ca răspuns la un stimul, are statutul funcţional de factor inductibil. Pentru activarea sa, nu
necesită sinteză proteică şi permite transmiterea rapidă a semnalului. NF-kB realizează comunicarea între
citoplasmă şi nucleu şi transmite mesajul direct la gena ţintă. Toate genele care răspund la NF-kB au în
comun faptul că amplifică răspunsul imun.Nf-kB este mediatorul care semnalează activarea celulelor limfoide
ca răspuns la numeroase citochine produse de celulele imunitare : IL-2, IL-1, IL-6, IL-8, TNF, interferoni etc.
Consecinţa inactivării calcineurinei este menţinerea stării fosforilate al NF-ATc. Astfel, transferul în nucleu al
componentei citoplasmatice a factorului NF-ATc este blocat şi factorul nuclear (NF-ATn) nu se mai formează
(fig. 56).
Ciclosporina A şi FK506 blochează căile de semnalizare ale altor sisteme celulare, cum ar fi:
degranularea dependentă de Ca2+ a mastocitelor; în condiţii fiziologice, complexul NF-ATc-NF-ATn se leagă
de promotorul genei IL-2 şi este factorul stimulator în special al transcrierii ARNm IL-2, necesară activării
celulelor T. Complexul NF-ATc-NF-ATn stimulează transcrierea ARNm al altor citochine (IFN ), cu rol
esenţial în activarea macrofagelor. Sub acţiunea ciclosporinei, celulele T nu mai sintetizează IL-2 sau IFN .
Ciclosporina este un agent imunosupresor selectiv, deoarece acţionează asupra celulelor Th1, dar este
mai puţin eficientă faţă de subpopulaţiile de limfocite Th2 care produc IL-4, IL-5, IL-7, sau faţă de
limfocitele B, granulocite sau macrofage (Loertscher şi colab., 1992; Morikawa şi colab., 1994).
Imunosupresia cu ciclosporină este o modalitate imunofarmacologică, datorită acţiunii sale selective faţă de
celulele imunocompetente. Deoarece nu inhibă semnificativ limfocitele B, ciclosporina este mai puţin
eficientă ca blocant al sintezei anticorpilor. Anticorpii specifici faţă de antigenele donorului sunt implicaţi în
nefropatia cronică a receptorului de grefă. Ciclosporina stimulează sinteza TGF- (Transforming Growth
Factor), inductor al fibrozării rinichiului transplantat (Stepkowski, 2000). Inhibitorii metabolici au acţiune
selectivă asupra celulelor T proliferante: inhibă maturarea limfocitelor T din precursori imaturi şi omoară
celulele T mature proliferante, stimulate de aloantigene.

Figura 56. Ilustrarea schematică a mecanismelor de acţiune a ciclosporinei şi FK506 (tacrolimus). Ciclosporina formează
un complex stabil cu ciclofilina şi o inactivează. In absenţa ciclofilinei libere, calcineurina nu defosforilează componenta
citoplasmatică a factorului activator al limfocitelor T, care rămâne în citoplasmă. Nu se mai asamblează factorul activ
nuclear (NF-Atn) al limfocitelor T. FK506 are un mecanism de acţiune asemănător: formează un complex stabil cu o
proteină (FKBP) şi blochează activitatea de defosforilază a calcineurinei;CsA – ciclosporina; CaN – calcineurina; CpN =
ciclofilina; NF-ATc - factorul nuclear de activare a celulelor T (componenta citoplasmatică); NF-ATn factorul nuclear
de activare a celulelor T (componenta nucleară); IL-2 - Interleukina 2; FK506 – Tacrolimus; FKBP – proteina de legare
a FK506 (după Stepkowski, 2000).

188
In ultimii ani s-au identificat câţiva compuşi chimici naturali, izolaţi ca şi ciclosporina, din culturi de
microorganisme: tacrolimus, rapamicina, mizoribina şi spergualin (Bierer şi colab., 1992). Primii doi sunt
înrudiţi structural, ambii fiind lactone macrociclice, dar mecanismele de acţiune sunt diferite.

8.2. Tacrolimus (FK506)

Tacrolimus este o lactonă macrociclică lipofilă, produsă de Streptomyces tsukabaensis, cu mecanism


de acţiune asemănător cu al ciclosporinei, dar de circa 100 de ori mai puternică. Face parte din clasa
macrolidelor şi este înrudit cu unele antibiotice. Tacrolimus este un agent imunosupresor tot mai utilizat în
clinica de transplantare, ca o alternativă la ciclosoporină, în special în cazurile de respingere refractare la
ciclosporină (Banerji şi colab., 1991). Absorbţia digestivă şi farmacocinetica prezintă o mare variabilitate
intra- şi interindividuală. Efectele secundare sunt asemănătoare celor produse de ciclosporină, dar
neurotoxicitatea şi diabetogeneza sunt mai frecvente.

Structura moleculară a tacrolimus

Mecanismul de acţiune
Tacrolimus este lipofil şi traversează membrana celulelor sistemului imunitar. Deşi are o structură
chimic diferită, mecanismul de acţiune este asemănător cu acela al ciclosporinei (Pahl şi colab., 1992). Ambii
aparţin categoriei imunosupresorilor cunoscuţi ca inhibitori ai calcineurinei. Ambii compuşi se leagă cu
proteine citoplasmatice receptoare specifice din categoria imunofilinelor: ciclofilina, respeciv FK-BP (binding
protein). Imunofilinele sunt molecule care au rol de receptori pentru o familie de agenţi imunosupresori, care
includ ciclosporina, tacrolimus (FK506) şi rapamicina. Complexul FK-BP leagă calcineurina. Din acest
punct, mecanismul său de acţiune este comun cu acela al ciclosporinei. Efectul net este inhibiţia propagării
semnalului celular declanşat de IL-2 şi inhibiţia expansiunii clonale a celulelor T citotoxice şi a altor celule
implicate în respingerea acută a grefei (Dubois şi colab., 2003).
Atât ciclosporina cât şi tacrolimus sunt metabolizaţi în ficat şi se consideră că interacţionează într-un
mod asemănător cu alte medicamente care interferă cu calea lor de metabolizare. Deoarece mecanismul
acţiunii ciclosporinei A şi tacrolimus este acelaşi, cei doi compuşi nu se pot administra simultan (Sho şi
colab., 2002). Toxicitatea celor două antibiotice este asemănătoare, dar tacrolimus produce hiperglicemie şi
neurotoxicitate mai accentuate. Tacrolimus produce mai puţin hirsutism, hipertrofie gingivală şi ginecomastie.
Ciclosporina şi tacrolimus nu rezolvă problema transplantului. Obstacolul principal în calea grefelor
este respingerea cronică, ce se caracterizează prin fibroză, deoarece ambii agenţi stimulează sinteza TGF-,
care, la rândul său, stimulează dezvoltarea unei fibroze interstiţiale (Hultsch şi colab., 1992). Consecinţa este
pierderea structurii normale a organului grefat, într-o perioadă de ordinul anilor. Fibroza a rămas cauza majoră
a pierderii alogrefei, pe măsură ce controlul respingerii acute s-a ameliorat. Frecvent se produce ocluzia
arterială a grefei, ca rezultat al proliferării celulelor musculare netede ale intimei. Este procesul de
arterioscleroză a grefei, detectabil în alogrefele cardiace sau renale, în intervalul de 6 – 12 luni după grefare.
Majoritatea pacienţilor cu transplant necesită tratamentul pe termen lung, cu doze mari de imunosupresoare,
care măresc sensibilitatea la infecţie şi malignitate (Todo şi colab, 1994; Steinbach şi colab., 2004).
Ciclosporina permite supravieţuirea pacienţilor transplantaţi timp de ani de zile.

189
8.3. Rapamicina

Rapamicina (cunoscută sub denumirea de sirolimus), un antibiotic macrolid produs de Streptomyces


hygroscopicus, a fost introdusă în clinica transplantării în 1999. Din punct de vedere chimic, rapamicina este o
lactonă macrociclică. Iniţial, a fost descrisă ca un agent antifungic (Calvo şi colab., 1992). Sirolimus este un
agent imunosupresor, de 10-100 de ori mai activ decât ciclosporina A în prevenirea respingerii alogrefelor
vascularizate. Efectul său principal constă în inhibiţia proliferării celulelor T, prin blocarea trecerii de la faza
G1 la faza S.

Structura moleculară a rapamicinei (Sirolimus)

Sirolimus se leagă, ca şi tacrolimus, cu aceiaşi proteină citoplasmatică (FK-BP) (binding protein), dar
efectul său este diferit: inhibă diferite căi de transmitere a semnalelor mediate de legarea antigenului sau de
citochine.Ţinta sa este o fosfatidilinozitol 3-kinază, al cărei rol este activarea unei kinaze a proteinei
ribosomale S6 (S = small). Sirolimus inhibă progresia celulelor T din faza G 1 în faza S a ciclului celular
(Brown şi colab., 2003). Este un inhibitor mult mai eficient al sintezei anticorpilor decât ciclosporina şi
tacrolimus. Sirolimus are acţiune sinergică în asociaţie cu ciclosporina şi prednisonul şi reduce net
incidenţa respingerii acute.
Efectele secundare majore constau în mielosupresie şi hipertrigliceridemie, sugerând un posibil rol în
inhibiţia activităţii lipoprotein-lipazei şi în scăderea numărului de plachete şi mai puţin semnificativă, a
numărului de leucocite.

8.4. Micofenolat-mofetil (MMF)

Micofenolat-mofetil, esterul 2-morfolinoetil al acidului micofenolic, este cel mai nou şi cel mai
folosit medicament din această clasă. Este sintetizat de tulpini ale g. Penicillium şi a fost introdus în clinica
transplantării în 1995.

Structura moleculară a micofenolat-mofetilului (MMF)


190
In ficat, micofenolat-mofetil este metabolizat prin hidroliză, la metabolitul activ, acidul micofenolic.
O parte importantă este conjugat în ficat cu gluconatul şi este secretat în bilă şi revine în ficat prin circuitul
enterohepatic.
Mecanismul de acţiune al MMF este mai selectiv, deoarece inhibă calea sintezei purinelor, dar calea
secundară (’’de salvare’’) rămâne funcţională. Este un inhibitor necompetitiv al unei izoforme specifice pentru
limfocite, a inozin-monofosfat-dehidrogenazei (IMPDH), necesară sintezei de novo a nucleotidelor cu guanină
în faza S a ciclului celular. Limfocitele sintetizează nucleotide de novo, prin conversia 5-fosforibozil-1
fosfatului, la inozin monofosfat (IMP). IMP este convertit la guanozin-monofosfat (GMP), pe calea IMPDH
(Sollinger şi colab., 1992). Pe calea secundară (calea ‘‘de salvare’’), guanina este convertită la GMP, de către
enzima HGPRT (Hipoxantin-Guanozin-Fosfo-Ribozil-Transferază). MMF diminuă concentraţia deoxi-
guanozin-trifosfatului şi inhibă sinteza ADN, inhibă proliferarea limfocitelor, fibroblastelor, celulelor
endoteliale şi a celulelor musculare netede din peretele arterelor.
Efectele secundare se manifestă, uneori, la nivelul tractului digestiv şi sunt dependente de doză:
diaree, stare de rău general, vomă. Deşi acţiunea sa este relativ specifică asupra limfocitelor, leucopenia,
anemia şi trombocitopenia pot să însoţească administrarea dozelor mari.
Ciclosporina, tacrolimus şi sirolimus fac parte din cea de a doua generaţie de inhibitori selectivi ai
limfocitelor T. Ciclosporina şi tacrolimus sunt nefrotoxice, iar sirolimus induce hipertrigliceridemie.
Cea de a III-a generaţie de agenţi imunosupresori au acţiune foarte selectivă, nu sunt toxici şi nu
produc alte efecte colaterale: sunt imunospresorii anti-sens, oligonucleotide scurte de 16-22 nucleotide
antisens, cu secvenţă complementară ARNm ţintă. Legarea oligonucleotidului de ARNm inhibă sinteza
proteinei şi blochează funcţia celulei.
Imunosupresorul ideal va media inducerea toleranţei, în special în transplant, adică va permite
sistemului imunitar să adopte ca self, moleculele CMH specifice ţesutului grefat.

Bibliografie selectivă

1. Banerji SS, Parsons JN, Tocci MJ.The immunosuppressant FK-506 specifically inhibits mitogen-
induced activation of the interleukin-2 promoter and the isolated enhancer elements NFIL-2A and
NF-AT1.Molecular Cell Biology. 1991, 11(8): 4074-4087.
2. Bierer B.E., Mattila P.S., Standaert R.F., Herzenberg L.A., Burakoff S.J., Crabtree G., Schreiber S.L.,
Two distinct signal transmission pathways in T lymphocytes are inhibited by complexes formed
between an immunophilin and either FK506 or rapamycin, Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America. 1990, 87(23): 9231-9235.
3. Brown V.I., Fang J., Alcorn K., Barr R., Kim J.M., Wasserman R., Grupp S.A., Rapamycin is active
against B-precursor leukemia in vitro and in vivo, an effect that is modulated by IL-7-mediated
signaling, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America..2003,
100(25): 15113-15118.
4. Calvo V., Crews C.M., Vik T.A., Bierer B.E.., Interleukin 2 stimulation of p70 S6 kinase activity is
inhibited by the immunosuppressant rapamycin, Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America. 1992, 89(16): 7571-7575.
5. Dubois S., Shou W., Haneline L.S., Fleischer S., Waldmann T.A., Müller J.R., Distinct pathways
involving the FK506-binding proteins 12 and 12.6 underlie IL-2-versus IL-15-mediated proliferation
of T cells, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003,
100(24): 14169–14174.
6. Fruman D.A., Klee C.B., Bierer B.E., Burakoff S.J., Calcineurin phosphatase activity in T
lymphocytes is inhibited by FK 506 and cyclosporin A Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America. 1992, 89(9): 3686-3690.
7. Hultsch T., Martin R., Hohman R.J.,The effect of the immunophilin ligands rapamycin and FK506 on
proliferation of mast cells and other hematopoietic cell lines, Molecular Cell Biology. 1992, 3(9):
981-987.
8. June C.H., Ledbetter J.A., Gillespie M.M., Lindsten .T, Thompson C.B., T-cell proliferation
involving the CD28 pathway is associated with cyclosporine-resistant interleukin 2 gene expression,
Molecular Cell Biology. 1987, 7(12): 4472-4481.
9. Loertscher R., Blier L., Steinmetz O., Nohr C., The utility of cyclosporine weaning in renal
transplantation, Annals of Surgery. 1992, 215(4): 368-376.
191
10. Marchetti O., Entenza J.M., Sanglard D., Bille J., Glauser M.P., Moreillon P., Fluconazole plus
Cyclosporine: a Fungicidal Combination Effective against Experimental Endocarditis Due to
Candida albicans, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2000, 44(11): 2932-2938.
11. Morikava K., Oseko F., Morikawa S., Iwamoto K., Immunomodulatory effects of three macrolides,
midecamycin acetate, josamycin, and clarithromycin, on human T-lymphocyte function in vitro,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1994, 38(11): 2643-2647.
12. Pahl A., Keller U., FK-506-binding proteins from streptomycetes producing immunosuppressive
macrolactones of the FK-506 type, Journal of Bacteriology. 1992, 174(18): 5888-5894.
13. Sho M., Sandner S.E., Najafian N., Salama A.D., Dong V., Yamada A., Kishimoto K., Harada H.,
Schmitt I., Sayegh M.H., New Insights Into the Interactions Between T-Cell Costimulatory Blockade
and Conventional Immunosuppressive Drugs, Annals of Surgery. 2002, 236(5): 667-675.
14. Sollinger H.W., Belzer F.O., Deierhoi M.H., Diethelm A.G., Gonwa T.A., Kauffman R.S., Klintmalm
G.B., McDiarmid S.V., Roberts J., Rosenthal J.T., RS-61443 (mycophenolate mofetil). A multicenter
study for refractory kidney transplant rejection, Annals of Surgery. 1992, 216(4): 513-519
15. Stepkowski, Stanislaw M. Molecular targets for existing and novel immunosuppressive drugs, Expert
reviews in molecular medicine. 2000.
16. Steinbach W.J., Schell W.A., Blankenship J.R., Onyewu C., Heitman J., Perfect J.R., In Vitro
Interactions between Antifungals and Immunosuppressants against Aspergillus fumigatus,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2004, 48(5): 1664-1669.
17. Todo S., Fung J.J., Starzl T.E., Tzakis A., Doyle H., Abu-Elmagd K., Jain A., Selby R., Bronsther O.,
Marsh W., Single-center experience with primary orthotopic liver transplantation with FK 506
immunosuppression, Annals of Surgery. 1994, 220(3): 297-309.

192
Capitolul 9
BACTERIOCINE

Bacteriocinele sunt proteine antibacteriene cu specificitate înaltă de acţiune, produse de anumite


tulpini bacteriene. Activitatea lor este limitată la unele tulpini ale aceleiaşi specii. Spectrul de activitate
restrâns al bacteriocinelor le exclude din categoria antibioticelor clasice. Totuşi, sunt agenţi antibacterieni
foarte eficienţi şi deşi nu au valoare terapeutică, faptul că sunt sintetizate de numeroase specii şi produc efecte
foarte specifice, a determinat interesul cercetătorilor. Bacteriocinogeneza este un fenomen la fel de frecvent în
natură ca şi lizogenia. Cele două procese au câteva trăsături comune :
- identificarea tulpinilor bacteriocinogene se face prin cultivarea mixtă a unui număr mic de bacterii
presupuse a fi producătoare de bacteriocine (B +), cu un exces de celule ale tulpinilor indicatoare
sensibile;
- prin acoperirea coloniilor B+ crescute pe plăci, cu o tulpină indicatoare.
In ambele cazuri, după incubarea pentru 24 de ore, coloniile B + sunt înconjurate de zone clare de
inhibiţie. Sinteza bacteriocinelor este codificată de elemente genetice extracromosomale, denumite plasmide
"col’’. Denumirea veche a bacteriocinelor este aceea de colicine, atribuită unor substanţe cu proprietăţi
antibiotice produse de o tulpină virulentă de E. coli, care au efect letal asupra celulelor producătoare, precum
şi a unor tulpini strâns înrudite cu cea producătoare. Fenomenul de colicinogeneză a fost descoperit de Gratia
(l925) (Zarnea, 1990). Producerea colicinelor nu este limitată la E. coli, ci este un fenomen mult mai răspândit
în lumea bacteriilor şi din acest motiv, Jacob (l953) a dat denumirile de bacteriocine, bacteriocinogeneză şi
factori bacteriocionogeni, pentru a desemna substanţele, fenomenul şi respectiv plasmidele care controlează
producerea lor. Denumirile diferitelor bacteriocine provin de la numele genului sau al speciei bacteriei
producătoare, la care se adaugă sufixul “cină”: de exemplu, lactocine (produse de Lactobacillus), vibriocine
(produse de Vibrio), respectiv pesticine (produse de Yersinia pestis), megacine (produse de B. megatherium),
subtilicine (produse de B. subtilis) etc. Plasmidele (factorii “Col”) au aceleaşi particularităţi, comune altor
plasmide: sunt molecule de ADN, circulare, dublu catenare închise, suprahelicale. La E. coli, în mod obişnuit
se găsesc 5-25 de copii/celulă. Unele plasmide “Col” (de exemplu, Col E1) au funcţie de conjugon, deoarece
poartă în structura lor genetică, determinanţii genetici de transfer. Ele se pot transfera la tulpinile col-, prin
conjugare. Plasmidele Col tra- se transferă prin transformare genetică, transducţie fagică sau prin conjugare
iniţiată de alte plasmide cu funcţie de conjugoni. De cele mai multe ori, bacteriocinele sunt proteine pure. La
bacteriile Gram negative, bacteriocinele sunt asociate cu lipopolizaharide de origine parietală, dar activitatea
de bacteriocină este asociată totdeauna cu componenta proteică, cu o gr. mol. de l8-90 kDa.
Bacteriocinele produse de bacteriile Gram negative au câteva proprietăţi generale:
- au un spectru de acţiune foarte îngust, limitat la tulpina producătoare şi la altele strâns înrudite;
- acţiunea lor este bactericidă. O singură moleculă poate fi suficientă pentru a produce liza celulei
sensibile;
- se leagă de celulele sensibile prin intermediul unor receptori celulari cu specificitate înaltă, ceea ce
explică spectrul lor foarte restrâns de acţiune;
- biosinteza bacteriocinelor nu are efect letal asupra celulei producătoare.
Receptorii parietali sunt analogi receptorilor fagici. Pierderea unui receptor conferă rezistenţă celulei
la bacteriocina corespunzătoare.
Bacteriocinele produse de bacteriile Gram pozitive au un spectru de acţiune foarte larg. Ele sunt active
asupra celulelor producătoare, dar şi asupra unor specii mai îndepărtate şi chiar asupra bacteriilor Gram
negative. Din punct de vedere chimic, sunt proteine pure.
O categorie specială de bacteriocine, o constituie cele sintetizate de Ps. aeruginosa (bacilul piocianic),
denumite piocine. Ele se evidenţiază în lizatele culturilor, după inducţia sintezei cu UV, sub forma unor
bastonaşe perechi, asemănătoare cozilor contractile ale fagilor din seria T-par, infecţioşi pentru E. coli, cu
lungimea de 90-l25 nm şi grosimea de 20 nm. Uneori, perechile de bastonaşe apar contractate, mai scurte şi
groase, iar între cele două structuri electrono-dense se evidenţiază zona centrală (“ core”), echivalentul
structural al cilindrului axial al cozii fagului.
Dacă antibioticele sunt definite ca substanţe produse de unele organisme (pro- sau eucariote) care au
efect inhibitor la concentraţii scăzute, asupra altor microorganisme (pro- sau eucariote) (Van Damme, 1984,
citat de de Vuyst, 1996), definiţia bacteriocinelor este mult mai restrictivă. Bacteriocinele sunt substanţe
proteice sau complexe proteice (agregate proteice, glicoproteine, glicolipoproteine) cu efect bactericid asupra
altor specii, majoritatea strâns înrudite cu specia producătoare (de Vuyst şi Van Damme,1996).

193
9.1. Clasificarea bacteriocinelor

Bacteriocinele formează un grup heterogen de molecule care, în funcţie de structura primară, masa
moleculară, stabilitate termică, prezenţa aminoacizilor modificaţi, sunt grupate în patru clase (Klaenhammer,
1993; Nes şi colab., 1996). Aceasta clasificare este frecvent revizuită, pe măsură ce sunt descoperite şi
caracterizate noi tipuri de bacteriocine şi noi asemănări între cele deja existente (tabelul 34).
Cls. I: Lantibiotice: molecule mici (< 5 kDa) subdivizate în două clase:
Clasa Ia – include peptide hidrofobe, cationice (lantionina, nisina, -metillantionona), al căror
mod de acţiune constă în formarea porilor în membrana celulei ţintă;
Clasa Ib – include molecule proteice cu o structură globulară mult mai rigidă, fără sarcină
electrică negativă. Modul lor de acţiune constă în inhibiţia sintezei peptidoglicanului în celula ţintă
(mersacidina, actagardina).

Cls. II: Non-lantibiotice: peptide mici, stabile termic, care acţionează asupra peretelui celular şi
produc creşterea permeabilităţii membranei plasmatice a celulelor bacteriene sensibile. Sunt subdivizate în:
Clasa IIa - include peptide pediocin-like cu activitate anti-Listeria, care conţin în structura lor
o secvenţă conservată (Tyr-Gly-Asn-Gly-Val) şi două resturi de cisteină care formează o punte
disulfurică între jumatăţile N-terminale ale moleculei (pediocine PA-I, sakacin A şi P, leucocina A,
carnobacteriocine) (Dieuleveux, 1998).
Clasa IIb - include o categorie aparte de bacteriocine reprezentate de un sistem format din
două componente peptidice diferite, dar care, prin interacţiune, constituie molecula activă (complex de
formare a porilor) (lactococcina G şi F, lactacina F, plantaricina EF şi JK).

Cls. III: bacteriocine termolabile de dimensiuni mari (> 30 kDa), mai puţin cunoscute şi studiate
(helveticin J şi V-1829, acidophillucin A, lactacin A si B);

Cls. IV: amestec nedefinit de proteine, lipide, glucide.

Tabelul 34.
Principalele tipuri de bacteriocine, tulpini producătoare şi spectrul inhibitor (adaptare după De Vuyst şi Van
Damme, 1994).
Clase de bacteriocine Microorganism producător Spectru de activitate
Cls I: LANTIBIOTICE
Nisina A Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454, 6F3 Bacterii Gram pozitive
Nisina Z Lactococcus lactis subsp. lactis NIZO 22186
Lacticina 481 Lactococcus lactis subsp. Lactis CNRZ 481 Bacterii lactice,
Chlostridium thyrobutyricum,
Satphylococcus carnosus
Lactocina S Lactobacillus sake L45 Carnobacterii, lactobacili,
pediococi, lactococi
Carnocina U149 Carnobacterium piscicola Carnobacterii, lactobacili,
pediococi, lactococi
Cls II: NON-LANTIBIOTICE TERMOSTABILE
Diplococcina Lactococcus lactis subsp. Cremoris 346 Lactococi
Lactococcina A Lactococcus lactis subsp. Cremoris LMG 2130 Lactococi
Lactocina 27 Lactobacillus helveticus LP 27 Lactobacili
Lactacina B Lactobacillus acidophilus N2 Lactobacili
Lactacina F Lactobacillus acidophilus 11088 Lactobacili,
Enterococcus faecalis
Sakacina A Lactobacillus sake Lb 706 Lactobacili, enterococi,
carnobacterii,
Listeria monocytogenes
Curvacina A Lactobacillus curvatus LTH 1174 Lactobacili, carnobacterii
Enterococcus faecalis,
Brochothrix thermosphacta
Listeria monocytogenes
Sakcina P Lactobacillus sake LTH673 Lactobacili, carnobacterii
Enterococcus faecalis,
Brochothrix thermosphacta
194
Listeria monocytogenes
Carnobacteriocina A şi B Carnobacterium piscicola LV 17 Carnobacterii, lactobacili,
pediococi
Enterococcus sp.
Listeria monocytogenes
Pediocina AcH Pediococcus acidilactici E, F, H, M Lactobacili, pediococi,
stafilococi,
Bacillus sp.,
Leuconostoc sp.,
Enterococcus sp..,
Brochothrix thermosphacta
Listeria monocytogenes
Pediocina PA-1 Pediococcus acidilactici PAC-1.0 Lactobacili, pediococi,
Leuconostoc sp.,
Listeria monocytogenes
Leucocina A UAL-187 Leuconostoc gelidum UAL 187 Bacterii lactice,
Listeria
monocytogenes
Enterocina 1146 Enterococcus faecium DPC 1146 Lactobacillus
sake
Listeria ssp.
Cls III: BACTERIOCINE TERMOLABILE
Helveticina J Lactobacillus helveticus 481 lactobacili
Caseicina 80 Lactobacillus casei B80 Lactobacillus casei B 109

9.2. Sinteza bacteriocinelor

Genele codificatoare pentru bacteriocinele active sunt dispuse în operoni aglomeraţi ( clusteri). Cei
mai studiaţi operoni sunt cei ai bacteriocinelor aparţinând clasei Ia din care fac parte lantionina şi nisina. In
anul 2000, Altena şi colab. au elucidat structura cluster-ului de gene codificatoare pentru clasa Ib de
bacteriocine (mersacidina), majoritatea genelor codificând proteine asemănătoare cu cele ale clasei Ia.
Localizarea genelor codificatoare poate fi cromosomală (Diep, 1996), plasmidială sau la nivelul unor
transposoni (Engelke şi colab., 1992; 1994). Majoritatea bacteriilor producătoare de bacteriocine posedă, în
acelaşi cluster, gene codificatoare ale unor proteine structurale, proteine implicate în transformarea formei
inactive în forma activă a bacteriocinelor şi proteine implicate în transportul acestora prin membrane, cât şi
proteine care conferă imunitate celulei producătoare (Cleveland şi colab., 2001).
Organizarea genetică a operonilor ce codifică clasa a II-a de bacteriocine (non-lantibiotice) este
asemănătoare cu cea a clasei I, genele pentru sistemul plantaricină (plantaricină, pediocină, sakacină)
codificând o serie de bacteriocine care utilizează acelaşi tip de sistem de transport şi sistem reglator. In
schimb, fiecare categorie de bacteriocine posedă propriul sistem imunitar care protejează celula bacteriană
producâtoare, de acţiunea propriei molecule proteice.
Sinteza tuturor claselor de bacteriocine se realizează prin traducere la nivel ribosomal, singurele care
suferă modificări post-translaţionale pentru a deveni forme active fiind bacteriocinele aparţinând clasei I
(Eijsink şi colab., 1998). Genele codificatore ale enzimelor implicate în acest proces sunt situate în vecinătatea
genelor structurale. Caracteristic pentru sinteza lantibioticelor este prezenţa la capătul N-terminal al moleculei
precursoare a unei secvenţe (peptid) leader care are rolul de situs de recunoaştere pentru enzimele implicate în
modificările post-transcriere.
Tehnicile moleculare permit manipularea genetică a acestora în vederea studierii din punct de vedere
structural şi funcţional.

195
9.3. Imunitatea bacteriilor faţă de bacteriocinele endogene

Imunitatea celulelor producătoare faţă de bacteriocinele endogene este un fenomen care, de asemenea,
diferenţiază bacteriocinele de antibiotice. Genele codificatoare pentru proteinele ce conferă imunitate sunt
situate în acelaşi operon, în apropierea genelor pentru bacteriocine şi a genelor implicate în prelucrarea post-
translaţională (Nes şi colab., 1996). Iniţial s-a considerat că, în cazul lantibioticelor, imunitatea este asigurată
de o singură genă, gena nisI pentru nisină, respectiv spaI pentru subtilizină, codificatoare ale proteinelor
protectoare NisI şi respectiv SpaI (Klein şi Entian, 1994). Ulterior s-a demonstrat că imunitatea faţă de aceste
bacteriocine este asigurată de un complex de proteine deoarece, prin deleţia altor gene, celulele producătoare
şi-au pierdut imunitatea. Astfel, Duan şi colab. (1996) au utilizat o tulpina de Lactococcus lactis,
neproducătoare de nisină, dar rezistentă la acţiunea nisinei. Tulpina nu prezintă gena codificatoare a proteinei
NisI, dar are secvenţe asemănătoare genelor nisF, nisE şi nisG, care conferă rezistenţă la acţiunea nisinei.
Deleţia genei nisG determină scăderea acestei rezistenţe.
Rezistenţa la bacteriocinele celei de a II-a clase (non-lantibiotice) implică o singura genă codificatoare
pentru proteinele imunitare. Structural, aceste proteine au o particularitate unică, având o secvenţă de 50-150
de aminoacizi ataşată membranei celulare, de unde poate fi eliberată. Deşi proteina care conferă imunitate faţă
de lactococcină A (LcnI) a fost intens studiată, mecanismul molecular ce stă la baza fenomenului imunitar, nu
este cunoscut (Cleveland, 2001).

9.4. Mecanisme de acţiune a bacteriocinelor

Bacteriocinele produse de celulele Gram negative acţionează prin mecanisme specifice asupra unor
“ţinte” situate în membrană sau în citoplasmă. Spectrul foarte limitat de acţiune a bacteriocinelor produse de
celulele Gram negative, sugerează existenţa unor receptori prin care acestea îşi dobândesc accesul la
structurile sensibile. De fapt, moleculele care funcţionează ca receptori nu sunt specializate în acest sens, ci
îndeplinesc diferite activităţi, în special de transport celular al unor substanţe nutritive. Mecanismele de
acţiune s-au studiat pentru colicine (produse de E. coli). După fixarea ireversibilă la nivelul receptorilor
membranei externe, colicinele îşi exercită efectul bactericid prin unul din următoarele mecanisme:
- inhibarea fosforilării oxidative, stopând astfel procesele energetice celulare. Consecutiv se produce
alterarea permeabilităţii membranei plasmatice, blocarea sintezei macromoleculare (ADN, ARN,
proteine), ca şi a transportului activ al substanţelor nutritive;
- unele colicine se fixează specific pe molecula de ADN şi determină apariţia inciziilor monocatenare,
ceea ce deschide calea acţiunii nucleazelor celulare şi a degradării ADN;
- altele inactivează subunităţile ribosomale 30 S, prin clivarea ARNr l6 S.
In concluzie, bacteriocinele au efect bactericid asupra celulelor sensibile. Ceea ce le deosebeşte
fundamental de alte antibiotice este faptul ca au efect letal asupra celulelor în care s-au sintetizat şi din această
cauză, proprietatea de bacteriocinogeneză nu se poate perpetua într-o celulă, decât în starea ei potenţială.
Periodic, sinteza bacteriocinelor este indusă şi celula producătoare se lizează, eliberând moleculele cu efect
litic în mediu. Efectul litic al bacteriocinelor se manifestă numai asupra celulelor aceleiaşi specii, care nu o pot
codifica, fiind lipsite de factorul Col. Celulele care poartă factorul Col sunt rezistente la acţiunea colicinei
omologe, elaborată de celule purtătoare ale aceluiaşi factor, ca şi cum ar fi imune la acţiunea lor.
Lantibioticele conţin în structura lor aminoacizi neproteici, care nu sunt încoporaţi prin mecanismul
genetic clasic(pentru care nu există codoni), ceea ce confirmă modificarea enzimatică posttranslaţională a
produsului primar. Asfel de aminoacizi prezenţi în forma activă a moleculei sunt: lantionina (de la care
provine denumirea de lantibiotice), -metillantionona, dehidroalanina, dehidrobutirina. Cel mai important
membru al acestei clase de bacteriocine este peptidul nisina, produsă de Lactococcus lactis subsp. lactis.
Mecanismul efectului letal asupra bacteriilor Gram pozitive exercitat de aceste molecule şi dovedit
experimental nu este cunoscut. Se pare că o cauză a morţii celulelor sensibile ar fi distrugerea membranei
celulare prin proprietatea de detergent-like a peptidului nisină. Mai recent s-a demonstrat că efectul distructiv
se datorează formării unor canale în membrana celulară prin încorporarea moleculei de nisină, datorită
propietăţilor sale fizice: nisina este un peptid cationic cu caracter uşor hidrofob. Efectul constă în perturbarea
echilibrului ionic prin efluxul de ioni şi molecule mici, ceea ce duce la alterarea potenţialului membranar.
Studiile cu membrane artificiale (liposomi) au demonstrat că formarea canalului transmembranar este un
proces dependent de diferenţa de sarcină a celor două feţe ale membranei, proces în care nisina perturbă atât
potenţialul membranar cât şi pH-ul liposomilor. S-a evidenţiat că activitatea nisinei este influenţată de
compoziţia în fosfolipide, ceea ce poate explica diferenţele de sensibilitate între diferite specii bacteriene (De
Vuyst şi Van Damme, 1996). Activitatea bactericidă a lantibioticelor se manifestă cu preponderenţă faţă de
196
bacteriile Gram pozitive. Ineficienţa faţă de bacteriile Gram negative se datorează dimensiunilor relativ mari
ale moleculelor (aproximativ 1800-4600 Da) care împiedică penetrarea membranei externe a peretelui celular
al bacteriilor Gram negative.
In privinţa modului de acţiune al lantibioticelor, s-a relevat importanţa unor molecule de ancorare
numite generic lipidul II, din membrana celulelor ţintă, molecule care sunt precursori ai peptidoglicanilor şi
care facilitează activitatea antibacteriană a nisinei şi a mersacidinei. Mersacidina (bacteriocină aparţinând
clasei Ib) inhibă sinteza peptidoglicanului prin blocarea transglicozilării (Brotz şi colab., 1998). Pentru nisină
şi epidermină, lipidul II are rolul de moleculă de ancorare şi facilitează din punct de vedere energetic,
formarea porilor (Brotz si Sahl, 2000). Acelaşi situs de ancorare la membrane este utilizat şi de vancomicina
dar mecanismul de interacţie este specific.
Bacteriocinele sunt adeseori confundate în literatura de specialitate, cu antibioticele, ceea ce limitează
din punct de vedere legal, utilizarea lor în industria alimentară (Hansen, 1994). Diferenţele între cele două
categorii de substanţe cu potenţial microbicid, se bazează atât pe modalitatea de sinteză cât şi pe modul de
acţiune, spectru antimicrobian, toxicitate şi mecanisme de rezistenţă (tabelul 35). Ca o recunoastere a
diferenţelor nete dintre bacteriocine şi antibiotice, a fost propus, pentru bacteriocine, termenul de “prezervanţi
biologici alimentari”, deoarece nu sunt utilizate în scop medical.

Tabelul 35.
Comparaţie între bacteriocine şi antibiotice (după Cleveland şi colab., 2001).
CARACTERISTICI BACTERIOCINE ANTIBIOTICE

Aplicaţii Industria alimentară Clinice


Sinteza Ribosomală Metabolit secundar
Activitate Spectru îngust Spectru variat
Imunitate a celulei gazdă Da Nu
Mecanisme de rezistenţă sau Modificarea compoziţiei Efectul este transferabil genetic
toleranţă a celulei ţintă membranei celulei ţintă (prin plasmide) şi se exercită la
diferite situsuri, în funcţie de
modul de acţiune
Interacţii necesare Cu ţintă specifică ceea ce explică Cu ţintă specifică
spectrul foarte îngust de activitate
al bacteriocinelor produse de
bacteriile Gram negative, restrâns
la tulpinile strâns înrudite cu cea
producătoare sau ţinta este
nespecifică pentru bacteriocinele
sintetizate de bacteriile Gram
pozitive, iar spectrul acţiunii lor
este foarte larg.
Mod de acţiune Formarea porilor sau blocarea Membrana celulara, blocarea
biosintezei peretelui celular sintezei mureinei sau ţinte
intracelulare
Toxicitate şi efecte secundare Necunoscute Da

197
Bibliografie selectivă

1. Altena K., Guder A., Cramer C., Bierbaum, G., Biosynthesis of the lantibiotic mersacidin:
organization of a type B lantibiotic gene cluster. Appl Environ Microbiol., 2000, 66, 2565–2571.
2. Brotz H., Sahl H.G., New insights into the mechanism of action of lantibiotics-diverse biological
effects by binding to the same molecular target, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2000, 46: 1-
6.
3. Cleveland G., Montville J., Nes I.F., Chikindas M.L.,. Bacteriocins: safe, natural antimicrobian for
food preservation, International Journal of Food Microbiology.2001,71: 1-20.
4. De Vuyst L., Van Damme E.J., Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria, Blackie Academy &
Professional. 1996.
5. Diep D. B., Havarstein L. S., Nes, I. F., Characterization of the locus responsible for the bacteriocin
production in Lactobacillus plantarum C11. J Bacteriol. 1996, 178, 4472–4483.
6. Dieuleveux V., Van Der Pyl D., Chataud J., Gueguen M., Purification and caracterization of anti-
Listeria compounds produced by Geotrichum candidum, Applied and Environemental Microbiology.
1998, 64: 800-803.
7. Duan K., Harvey M.L., Liu C.Q., Duun N.W., Identification and characterization of mobilizing
plasmid, pND300, in Lactococcus lactis M198 and its encoded nisin resistence determinant. Journal
of Applied Bacteriology. 1996, 81: 493-500.
8. Eijsink V.C.H., Skeie M., Middelhoven H.P., Brurberg M.B., Nes I.F., Comparative studies of class
IIa bacteriocins of lactic acid bacteria, Applied and Environemental Microbiology. 1998, 64: 3275-
3281.
9. Engelke et al., Biosynthesis of the lantiobiotic nisin: genomic organization and membrane
localization of the NisB protein. Appl. Environ. Microbiol. 1992, 58(11)3730-3743
10. Engelke et al., Regulation of nisin biosynthesis and immunity in Lactococcus lactis 6F3. Appl.
Environ. Microbiol., 1994.60(3):814-825
11. Gratia A.,  Sur un remarquable exemple d'antagonisme entre deux souches de colibacille. C. R. Soc.
Biol. 1925, 93:1040-1042
12. Hansen, N. Nisin as a model food preservative. Crit Rev Food Sci Nutr., 1994. 34(1):69-93.
13. Jacob F,, Lwoff A,, Siminovitch A,, Wollman E., Définition de quelques termes relatifs a la
lysogénie. Ann Inst Pasteur (Paris). 1953, Jan; 84(1):222–224
14. Klaenhammer T.R., Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria, FEMS Microbiology
Reviews. 1993. 12: 39-85.
15. Klein C., Entian K.D., Genes involved in self-protection against the lantibiotic subtilin produced by
Bacillus subtilis ATCC 6633, Applied and Environemental Microbiology. 1994, 60: 2793-2801.
16. Nes I.F., Diep D.B., Havarstein L.S., Brurberg M.B. Holo H., Biosynthesis of bacteriocins in lactic
acid bacteria, Antonie van Leeuwenhoek. 1996, 70: 113-128.
17. Zarnea G. Tratat de Microbiologie Generala. Editura Academiei Romane, 1990.

198
Capitolul 10
AGENŢI TERAPEUTICI AI INFECŢIILOR FUNGICE

Circa 50 de specii de fungi sunt patogene pentru om şi animale. Majoritatea fungilor patogeni sunt
agenţi infecţiosi oportunişti, care invadează ţesuturile organismelor cu rezistenţă scăzută la infecţie.Fungii au
fost recunoscuţi ca agenţi patogeni, cu mult înaintea bacteriilor. In 1665 s-a înregistrat o infecţie fatală,
consecutivă unei infecţii orale cu Candida ( Fromtling, 1988). Infecţia fungică a ţesuturilor umane şi animale
se produce pe fondul unor condiţii locale favorizante (Zarnea, 1970). Din această cauză, transmiterea infecţiei
de la un organism la altul este rară. In general, maladiile fungice nu sunt contagioase.

10.1. Tipuri de infecţii fungice

Infecţiile produse de deuteromicete se numesc micoze şi pot fi împărţite în două categorii mari:
- infecţii sistemice sau profunde, în care agentul patogen este larg diseminat în organism şi creşte în
diferite organe şi ţesuturi, care în mod normal sunt sterile. Pacienţii neutropenici au cel mai mare
risc pentru micoze profunde;
- micoze superficiale, care includ infecţii ale pielii, părului, unghiilor. Unii fungi produc numai un
tip de infecţie, iar altele pe amândouă.
Infecţiile sistemice sunt de origine endogenă şi exogenă. Inserţia cateterelor predispune pacienţii
neutropenici la infecţii fungice de origine endogenă. Micozele sistemice de origine exogenă au caracter
endemic: histoplasmoza, blastomicoza, paracoccidioidomicoza, coccidioidomicoza şi penicilioza. La pacienţii
imunodeficitari se remarcă tendinţa de transformare a micozelor endemice, în infecţii oportuniste.
Pentru majoritatea fungilor patogeni nu se cunosc stadii de înmulţire sexuată şi de aceea poziţia lor
sistematică este incertă. Unele micoze sistemice sunt produse de levuri. Altele sunt cauzate de fungi dimorfici,
care cresc ca levuri in vivo (la 37o) şi ca miceliu la temperatură mai mică, in vitro pe medii artificiale.Fungii
patogeni trăiesc în sol şi pătrund în organism pe cale respiratorie, fiind inhalaţi odată cu aerul. De la poarta de
intrare, agentul infecţios se diseminează în organism şi se instituie o infecţie cronică, cu simptome foarte
variate. Infecţiile fungice fatale sunt rare.
Infecţiile fungice apar frecvent, ca o consecinţă a eliminării microbiotei normale, prin terapie orală cu
antibiotice. Câţiva fungi (Cryptococcus neoformans, Coccidioides imitis, Histoplasma capsulatum,
Blastomyces dermatitides) produc infecţii pulmonare foarte asemănătoare prin manifestările clinice, cu
tuberculoza. Fungii care produc infecţii superficiale se numesc dermatofiţi. Dermatofiţii sunt un grup de fungi
strâns înrudiţi, care au capacitatea de a invada ţesutul cheratinizat (piele, păr, unghii) la om şi la animale. In
general, infecţia este cutanată şi restrânsă la straturile celulare cheratinizate, datorită incapacităţii fungilor de a
penetra ţesuturile mai profunde sau organele gazdelor imunocompetente (Wistreich şi Lechtman, 1984).
Micozele superficiale sunt cauzate, în primul rând, de fungi micelieni (Microsporum, Trichophyton,
Epidermophyton). Ele au afinitate pentru ţesuturile care conţin cheratina şi produc enzima necesară degradării
acestei proteine. Unele cresc pe suprafaţa firului de păr, iar altele la interior. Vârsta este un factor important
care condiţionează sensibilitatea la infecţie: impetigo al pielii capului este frecventă la copii şi rară la adulţi,
iar infecţia interdigitală este frecventă la adulţi şi rară la copii. Acizii graşi nesaturaţi din screţia glandelor
sebacee ale adultului, au acţiune antifungică, ceea ce explică rezistenţa mai mare a adultului la infecţiile
fungice superficiale. Una dintre substanţele antifungice, acidul undecilenic, se adaugă în compoziţia multor
unguente, folosite în controlul infecţiilor fungice ale pielii. Infecţia interdigitală este favorizată de umiditatea
locală crescută şi este produsă de fungi din g. Epidermophyton. Majoritatea infecţiilor cu fungii dermatofitici
se pot trata eficient cu griseofulvina, un antibiotic antifungic produs de Penicillium griseofulvum.
Griseofulvina se concentrează în celulele epidermice, la valori inhibitoare pentru creşterea dermatofitului.
Micozele intermediare sunt considerate acelea care produc leziuni epidermice, subcutanate, ale
mucoaselor, plămânului. Infecţia se poate extinde şi în alte ţesuturi, la diferite profunzimi. Infecţia este
realizată de inhalarea sporilor, prin contaminarea rănilor sau prin ingestie. Cele mai tipice infecţii intermediare
sunt candidoza şi aspergiloza.
Candidoza este produsă de variate specii de Candida, în special C. albicans, din grupul fungilor
imperfecti. In procesul infecţios se prezintă sub formă unei levuri, dar formează şi structuri miceliene
(Wistreich şi Lechtman, 1984). Infecţia se localizează, în primul rând, la nivelul membranelor mucoase, dar şi
în piele sau plămân. Infecţiile mucoasei bucale a noului născut sunt comune, iar la adult produce infecţii
bucale, tonsilare, vaginale.
Aspergiloza, cauzată de Aspergillus fumigatus este frecventă la puii de găină, în primele zile după
ecloziune, la care produce infecţii de amploarea unei epidemii. Miceliul se dezvoltă abundent în plămân şi
199
respiraţia devine imposibilă. Produce avortul la vacă, oaie etc. Omul prezintă rezistenţă naturală la infecţia cu
A. fumigatus. Cazurile de îmbolnăvire sunt rare.

Structura moleculară a colesterolului Structura moleculară a ergosterolului

10.2. Medicamentele antifungice

Agenţii antifungici disponibili pentru tratamentul infecţiilor micotice sistemice sunt limitate ca număr
şi eficienţă, deoarece fungii sunt organisme eucariote şi din punct de vedere biochimic se aseamănă cu
organismul gazdă. Asemănarea face ca dezvoltarea unui medicament eficient faţă de agentul invadator, dar
sigur pentru gazdă, să necesite un studiu de durată în cercetarea de bază şi în clinică. Cercetarea
premergătoare introducerii în clinică a unui agent antifungic, necesită studii interdisciplinare de chimie,
biochimie, microbiologie, endocrinologie, enzimologie etc. După ce agentul chimic este propus, cercetarea
vizează siguranţa, biodisponibilitatea, formularea.
Primul agent cu activitate antifungică (griseofulvina) a fost izolat în 1939, iar primul agent polienic
antifungic, nistatinul, a fost descoperit în 1949.
Antibioticele polienice (nistatinul şi amfotericina B) se sintetizează pe o cale metabolică
asemănătoare cu aceea a antibioticelor macrolide (eritromicina). Structural, macrolidele se caracterizează prin
inele lactonice multiunitare, care poartă numeroşi substituienţi: grupări metil, hidroxil, glucide specifice şi
celpuţin un grup carbonil. Subgrupul polienelor conţine o serie de legături duble (între 4 şi 7) conjugate. Din
punctul de vedere al precursorilor, polienele sunt alcătuite din unităţi de acetat şi propionat. Grupările metil îşi
au originea în unităţile de propionat.

Structura moleculară a nistatinului

Compuşii azolici s-au introdus în clinica antifungică în 1944, iar în 1960 s-a folosit amfotericina. Cei
mai importanţi sunt compuşi azolici şi amfotericina B din clasa polienelor, medicamentul optim pentru
tratamentul micozelor sistemice.
Majoritatea medicamentelor antifungice au ca ţintă molecula de ergosterol, sterolul major al
membranei plasmatice a fungilor, analogul structural al colesterolului din celula mamiferelor (Hector, 1993).
Ergosterolul din membrana fungică contribuie la o varietate de funcţii celulare: este sediul chitin-sintetazei,
200
importantă pentru creşterea şi diviziunea celulei, este important pentru fluiditatea şi integritatea membranei
(tabelul 36).

Polienele

Structural, toate antibioticele polienice se caracterizează printr-un inel macrolid lactonic de


dimensiuni mari. Se presupune că atât inelul lactonic cât şi legăturile duble conjugate multiple (4, 5, 6 sau 7)
sunt necesare pentru activitatea biologică. Prezenţa regiunilor foarte polare şi a celor nepolare în moleculele
polienice le conferă caracterul amfipatic, ceea ce explică solubilitatea şi mecanismul de acţiune. Majoritatea
polienelor sunt molecule amfoterice. Aciditatea se datorează grupării carboxil, iar caracterul bazic este
conferit de micozamină, un glucid aminat izolat din nistatin şi amfotericina B.
Mecanismul de acţiune. Medicamentele din clasa polienelor, în special amfotericina B, au fost
considerate cele mai eficiente dintre toţi agenţii antifungici cu administrare sistemică. Polienele sunt o clasă
de medicamente cu acţiune selectivă numai asupra membranelor ce conţin ergosterol: de aceea sunt inhibitorii
pentru fungi, dar nu sunt active faţă de bacterii. Acţiunea diferenţiată a permis relevarea unor diferenţe
biochimice importante între bacterii şi fungi.
Aceste medicamente, care includ amfotericina B şi nistatinul acţionează asemănător altor agenţi litici:
vitamina A, detergenţii ionici, saponine. Vitamina A (un compus polienic) este agent hemolitic (Johnson şi
colab., 2004). Liza se poate datora oxidării vitaminei A în interiorul membranei celulare. Acţiunea vitaminei
A poate fi prevenită de anumiţi antioxidanţi. Antibioticele polienice şi saponina acţionează prin mecanisme
identice: interacţionează cu sterolii membranari, penetrează membrana şi produc alterări ale permeabilităţii
organismelor sensibile, ducând la pierderea constituienţilor citoplasmatici esenţiali, rezultatul fiind moartea
celulei. Moleculele polienice sunt amfipatice, având grupări hidrofobe şi hidrofile. Membrana celulară este
situsul acţiunii antibioticelor polienice şi ca rezultat al legării polienelor îşi pierde funcţia de barieră selectivă
de permeabilitate. Medicamentele se intercalează în membrane şi formează un canal, prin care componentele
celulare, în special ionii de K, părăsesc citoplasma şi alterează gradientul protonic al membranei. Oligomerii
se formează prin asocierea monomerilor în conexiune cap-coadă, formându-se complexe suficient de lungi
pentru a străpunge membrana şi să inducă efectele lezionale.
Deşi ergosterolul este sterolul structural predominant al celulei fungice, alţi câţiva steroli pot să
contracareze efectul inhibitor al polienelor: colesterolul, sitosterolul, stigmasterolul şi într-o măsură mai mică,
lanosterolul. Sterolii sunt cei mai eficienţi în anularea activităţii polienelor, având cel mai puternic efect
asupra spectrului de acţiune al polienelor.
Sensibilitatea la poliene se manifestă şi la alte grupe de organisme: alge, protozoare ( Leishmania
donovani). Antibioticele polienice sunt relativ toxice pentru eritrocitele mamiferelor.

Structura moleculară a amfotericinei B

Amfotericina este mai activă faţă de celulele fungice, decât faţă de cele mamaliene, datorită tipului de
sterol încorporat în membrană. Amfotericina induce peroxidarea lipidelor din structura membranei, rezultatul
fiind modificarea permeabilităţii. Amfotericina B este insolubilă în apă, iar pentru a deveni activă biologic,
trebuie solubilizată în mediul apos. Medicamentul nu interacţionează cu colesterolul, ceea ce explică efectele
toxice selective ale concentraţiilor mici de amfotericină B, la care medicamentul este monomeric, asupra
membranelor cu ergosterol. Amfotericina monomerică s-ar asocia cu ergosterolul în grosimea membranei şi ar
duce la formarea canalelor transmembranare. Specificitatea medicamentelor pentru membranele cu ergosterol
se crede că se datorează interacţiunii canalului format de amfotericina B, cu ergosterolul în membrană.

201
Formarea canalelor oligomerice este condiţionată de o concentraţie prag a amfotericinei (Fig. 57). Oligomerii
se formează prin asocierea cap-coadă a moleculei, ceea ce duce la formarea complexelor suficient de mari
pentru a străpunge membrana şi a produce efectele toxice.

Figura 57. Reprezentarea schematică a mecanismului de acţiune a amfotericinei B asupra celulei fungice (a) şi
mamaliene (b) (după Brajtburg şi colab., 1996).

Specificitatea amfotericinei B pentru membranele care conţin colesterol poate fi de asemenea asociată
cu fosfolipidele şi cu raportul sterolului faţă de fosfolipide. Medicamentul interacţionează mai puţin probabil
cu membranele care conţin colesterol. S-a sugerat că amfotericina B produce leziuni oxidative ale membranei
plasmatice fungice. Se pare însă, că amfotericina B are efect antioxidant in vivo, protejând celulele fungice de
atacul oxidativ al gazdei.
Macrofagele pot avea rol de rezervor de amfotericina B, atât pentru acţiunea faţă de paraziţii
intracelulari, cât şi extracelulari. După ce amfotericina B se asociază cu lipidele membranare, este preluată de
macrofage şi monocite şi inhibă paraziţii fungici deja prezenţi în interiorul acestor celule sau se disociază de
lipidele membranare şi acţionează asupra paraziţilor extracelulari. In general, polienele sunt fungicide la
concentraţiile care inhibă complet creşterea microorganismului sensibil.
Amfotericina B este fungicidă atât in vivo cât şi in vitro. Este activă faţă de Candida spp.,
Blastomyces, Histoplasma, Cryptococcus neoformans (C. neoformans este inhalat din mediu, creşte în ţesutul
pulmonar, se diseminează în organism, creşte în creier şi persistă în prostată. C. neoformans persistă în toate
fluidele bogate în fosfolipide, acizi graşi şi compuşi icozanoidici), faţă de fungii filamentoşi Aspergillus,
Zygomyces şi fungii dimorfici (de exemplu C. albicans), cresc atât sub formă tipică de levură, cât şi sub formă
de micelii. Candida formează proiecţii hifale, lungi şi subţiri, asociate cu patogenitatea.
Polienele sunt active faţă de micoplasme. Micoplasmele nu au perete celular, fiind asemănătoare
protoplaştilor. Deosebirea constă în faptul că micoplasmele necesită steroli pentru creştere.
Amfotericina B s-a folosit în terapia infecţiilor fungice mai mult de 40 de ani. Deşi s-au descoperit
alte medicamente antifungice, amfotericina B rămâne medicamentul de elecţie pentru tratamentul infecţiilor
202
fungice sistemice severe şi este alternativa pentru tratamentul leishmaniozei viscerale. Amfotericina B şi
nistatinul s-au folosit pentru tratamentul anumitor infecţii cu protozoare. Amfotericina B se administrează
intravenos, pentru tratamentul infecţiilor sistemice (Van Etten şi colab., 1991). Toxicitatea, în special faţă de
rinichi, dar şi riscul producerii anemiei a limitat folosirea acestui medicament. Anemia poate să nu se datoreze
acţiunii toxice asupra eritrocitelor, ci supresiei măduvei osoase. Nistatinul este mai puţin eficient şi se
foloseşte pentru aplicare locală sau se administrează oral în cazul implicării intestinului. Rezistenţa apare
rareori şi constituie un obstacol major în utilizarea terapeutică a polienelor.

Inhibitorii biosintezei ergosterolului


Compuşii azolici. Alilaminele, tiocarbamaţii, compuşii azolici şi morfolinici se folosesc în tratamentul
micozelor ca inhibitori ai căii de biosinteză a ergosterolului. Toate aceste medicamente interacţionează cu
enzimele implicate în sinteza ergosterolului din squalen, care este produs din acetat prin acetil-CoA,
hidroximetilglutaril-CoA şi mevalonat.
Squalenul este un compus poliprenil cu 30 atomi de C, care conţine 6 unităţi prenil (C5H8). Prenilul
este de asemenea cunoscut sub denumirea de izopren sau izoprenoid. Structura de bază a tuturor steroizilor
este formată prin condensarea a 6 grupări prenil.

Structura moleculară a grupului prenil

Ergosterolul este important pentru fungi, deoarece este sterolul dominant în membrana plasmatică a
acestor organisme. Cantităţi foarte mici de ergosterol sunt necesare pentru ca celulele să progreseze în ciclul
celular.
In 1969, doi compuşi propuşi de două laboratoare diferite au fost introduşi în clinică pentru
tratamentul infecţiilor fungice: clotrimazol şi miconazol. A urmat econazolul (1974). Aceşti 3 compuşi azolici
rămân cei mai importanţi pentru terapia multor dermatofitoze.
Agenţii azolici antifungici inhibă sinteza ergosterolului, un compus major al membranei plasmatice a
fungilor, prin inhibiţia lanosterol-demetilazei, enzimă dependentă de citocromul P 450, denumită şi 14-sterol-
demetilază (P-450DM). Aceiaşi enzimă are rol important în sinteza colesterolului în celulele mamiferelor.
Administrarea compuşilor azolici în concentraţii terapeutice îşi datorează eficienţa, afinităţii lor mai mari
pentru P-450DM fungică, decât pentru enzima mamiferelor. Expunerea fungilor la un compus azolic produce
epuizarea ergosterolului şi acumularea sterolilor metilaţi 14. Ergosterolul, pentru celula fungică, are funcţii
multiple, una dintre ele fiind asemănătoare celei hormonale, deoarece stimulează creşterea şi diviziunea.
Efectele medicamentelor se manifestă când pierderea ergosterolului este aproape completă. Este perturbată
atât structura membranei celulei fungice, cât şi funcţiile sale esenţiale: permeabilitatea selectivă şi transportul
nutrienţilor, sinteza chitinei (Hector, 1993). Rezultatul net este inhibiţia creşterii fungice. Agenţii azolici
antifungici utilizaţi în clinică, conţin 2 sau 3 atomi de N în inelul azolic şi sunt clasificaţi ca imidazoli (de
exemplu, ketoconazol, miconazol, clotrimazol) sau ca triazoli (de exemplu, itraconazol şi fluconazol). Cu
excepţia ketoconazolului, folosirea imidazolilor şi triazolilor este limitată la tratamentul micozelor
superficiale.
Clotrimazolul este activ, in vitro, faţă de dermatofite, levuri patogene, fungi filamentoşi şi dimorfici,
dar şi faţă de unele bacterii Gram pozitive. In clinică se foloseşte pentru tratamentul infecţiilor dermatofite,
infecţiilor fungice superficiale (tinea versicolor, infecţii orale şi vaginale cu Candida). Activitatea
clotrimazolului, in vitro, este comparabilă cu a amfotericinei B. Este mai activ decât griseofulvina şi
nistatinul. Acţionează asupra membranei celulei fungice, a cărei permerabilitate o perturbă.

Structura moleculară a clotrimazolului

203
Miconazolul este un derivat fenetil-imidazol. Are toxicitate suficient de mică, astfel încât se
administrează intravenos, pentru terapia infecţiilor fungice sistemice. Este eficace pentru tratamentul
infecţiilor fungice superficiale: dermatofite, candidoză cutanată şi vaginală.

Structura moleculară a miconazolului

Econazolul este un derivat antifungic imidazolic, cu o structură identică cu a miconazolului,


deosebirea constând în absenţa unui atom de Cl pe un inel benzenic. Activitatea antifungică in vitro a
econazolului este comparabilă cu a miconazolului: are spectru larg de activitate faţă de dermatofite, Candida
spp., alte levuri patogene, fungi filamentoşi şi unele bacterii Gram pozitive (Georgopapadakou şi Walsh,
1996). S-a folosit pentru terapia locală a dermatofitelor, micozelor superficiale (tinea versicolor, candidoză
cutanată). Nu este adecvat pentru administrare sistemică, deoarece se leagă stabil de proteinele serice.

Structura moleculară a econazolului

Denumirile generice şi comerciale, structurile chimice, formulările şi indicaţiile privind imidazolii


antifungici şi a terconazolului, un derivat triazolic, utilizabili în clinică sunt prezentate în tabelul 36.

Tabelul 36.
Principalii agenţi terapeutici utilizaţi in infecţiile fungice (după Topley şi Wilson’s, 1998).
Denumire Denumire Formulă chimică Compoziţie Indicaţii
comercială terapeutice
Clotrimazol Canesten Tablete Infectii fungice
Mycelex vaginale 100, superficiale,
Mycelex – G 200, 500 mg dermatomicoze,
Lotrimin Tablete orale Tinea versicolor,
Gyne-Lotrimin 10 mg Candidoze vaginale
Fungoid Creme si loţiuni
2%

Miconazol Minostat Soluţie sterila Infectii fungice


Minostat-Derm parenterala 10 sistemice,
Minostat i.v. mg coccidioidomicoze,
Supozitoare Candidoze,
vaginale 20 mg criptococcoze,
Creme si loţiuni paracoccidioido-
2% micoze,
pseudoallescherioze
Candidoze cronice
mucocutanee

204
Econazol Spectazol Creme topice, Infectii fungice
Pevaryl vaginale, spray, superficiale,
pudre dermatomicoze,
Tinea versicolor,
Candidoze vaginale

Ketonazol Nizoral Tablete orale Infectii fungice


Fungarol 200 mg sistemice,
Fungarest Cremă si blastomicoze,
Orifungal soluţie 1% anumite forme de
coccidioidomicoze
si histoplasmoze,
Candidoze
mucocutanee
cronice,
paracoccidioido-
micoze, si
pseudoallescherioze
Infectii fungice
superficiale,
dermatomicoze,
Tinea versicolor,
Nu sunt
recomandate in
meningite fungice

Bifonazol Mycospor Cremă si Infectii fungice


Mycosporan soluţie 2% superficiale,
dermatomicoze,
Tinea versicolor,
Candidoze cutanate

Butaconazol Femstat Cremă vaginală Candidoze vaginale


1%
Ovule vaginale
100 mg

Croconazol Pilzein Cremă/gel 1% Infectii fungice


superficiale,
dermatomicoze,
Tinea versicolor,
Candidoze cutanate

205
Fenticonazol Lomexin Creme vaginale Infectii fungice
si topice 2% superficiale,
dermatomicoze,
Tinea versicolor,
Candidoze vaginale
si cutanate

Isoconazol Travogen Creme vaginale Infectii fungice


Gyn-Travogen si topice 2% superficiale,
dermatomicoze,
Tinea versicolor,
Candidoze vaginale
si cutanate

Oxiconazol Oceral Creme, spray- Infectii fungice


Myfungar uri, pudre 1% superficiale,
Gyno-Myfungar dermatomicoze,
Okinazol Tinea versicolor,
Derimin Candidoze vaginale
si cutanate

Sulconazol Exelderm Creme 1% Infectii fungice


Sulcosyn superficiale,
dermatomicoze,
Tinea versicolor,
Candidoze vaginale
si cutanate

Tioconazol Trosyd Creme, pudre, Infectii fungice


Gyn-Trosyd loţiuni, spray superficiale,
1% dermatomicoze,
Tinea versicolor,
Candidoze vaginale
si cutanate

Terconazol Terazol Creme vaginale Candidoze vaginale


(trionazol) Gyn-Terazol 0.8%
Fungistat Ovule vaginale
40, 80 mg

Itraconazol Sporanox Capsule orale Infectii fungice


206
100 mg superficiale si
Solutie orala sistemice inclusiv
10mg/ml tinea versicolor,
dermatomicoze,
Tinea versicolor,
Candidoze vaginale
cutanate si
sistemice,
aspergiloze
sistemice,
sporotrichoze,
chromomicoze
Fluconazol Diflucan Tablete orale Infectii fungice
50, 10, 150, superficiale si
200 mg sistemice inclusiv
Suspensie orală tinea versicolor,
10, 40 mg/ml dermatomicoze,
Soluţie sterilă Tinea versicolor,
i.v. Candidoze vaginale
2 mg/ml cutanate si
sistemice.
Indicate special in
meningite fungice

Mecanismul de acţiune nu este clar: peretele celular la C. albicans pare a fi evident deformat după
tratament, iar membrana plasmatică şi cea mitocondrială apar alterate. Mitocondriile par a fi cele mai
sensibile.
Compuşii azolici, care includ imidazolii (ketoconazol şi miconazol) şi triazolii (fluconazoli,
itraconazol) au acţiune specifică faţă de lanosterol-demetilază, enzimă a căii de sinteză a ergosterolului.
Această enzimă este un citocrom P450 care conţine hem la situsul activ. La concentraţii mari, compuşii azolici
pot să interacţioneze direct cu lipidele membranare.
Ketoconazolul este un derivat imidazolic antifungic, activ pe cale orală. Este indicat pentru tratamntul
blastomicozei, histoplasmozei diseminate. Acţiunea sa este fungistatică şi eliminarea infecţiei necesită o
activitate normală a funcţiei imunitare. Este eficient pentru tratamentul infecţiilor fungice superficiale.
Studiile dublu-orb (placebo şi medicament) eu evidenţiat eficienţa medicamentului în tratamentul tinea
versicolor. Reacţiile adverse, limitante ale dozei, sunt starea de rău general şi voma.
Fluconazolul este activ faţă de C. albicans in vitro şi in vivo şi s-a folosit pentru tratamentul
candidozei cutanate şi orofaringiene. Deoarece administrarea orală este avantajoasă, utilizarea s-a extins
pentru tratamentul altor infecţii fungice: criptococoza, histoplasmoza, coccidioidomicoza şi a infecţiilor cu
fungi dimorfici (Van Etten şi colab., 1991).
5-fluocitozina este încorporată în celulă de o citozin-permează şi dezaminată în 5-fluorouracil, de o
citozin-dezaminază. 5-fluocitozina are acţiune specific antifungică, deoarece celulele mamiferelor nu conţin
citozin-dezaminază.
Mecanismul primar de acţiune al compuşilor azolici constă în inhibiţia biosintezei ergosterolului,
componentă esenţială a membranei citoplasmatice a fungilor, rezultatul fiind acumularea lanosterolului sau a
altor intermediari sterolici.
Membrana fungică, spre deosebire de cea bacteriană, conţine steroli. Antibioticele polienice, care par
să acţioneze prin legarea de sterolii membranari, conţin un centru hidrofob rigid şi o regiune hidrofilă
flexibilă. Structural, polienele sunt molecule lungi, menţinute în extensie rigidă de regiunea polienică. Ele
interacţionează cu celula fungică pentru a produce un complex steroli membranari-polienă, ce alterează
permeabilitatea membranei (Van Etten şi colab., 1991). Este de fapt un por (canal) membranar, ce alterează
profund permeabilitatea membranei: conţinutul celulei (ionii de K + şi glucoza) difuzează în mediul
extracelular. Celulele procariote nu leagă şi nu sunt inhibate de poliene. Deşi au fost izolate numeroase
antibiotice polienice, numai amfotericina B se foloseşte pentru administrare sistemică. Nistatinul se foloseşte
pentru administrare locală, iar primaricina, ca preparat cu uz oftalmic.
Unii dintre derivaţii azolici antifungici sunt activi faţă de citocromul P 450, implicat în demetilarea
lanosterolului. Inhibiţia biosintezei ergosterolului duce la dezorganizarea structurală a membranei plasmatice
fungice şi la alterarea permeabilităţii şi funcţiei de transport. Leziunile membranare duc la dezechilibru
metabolic, rezultând inhibiţia creşterii celulei fungice sau moartea celulei.
207
Activitatea antifungică primară de inhibiţie a biosintezei ergosterolului membranar tinde să fie o
acţiune fungistatică şi nu fungicidă. De aceea, derivaţii azolici antifungici necesită activitatea funcţiei
imunitare pentru a elimina fungii invadatori.
Derivaţii azolici antifungici pot să afecteze respiraţia fungică.
Se sugerează existenţa a cel puţin două mecanisme distincte de acţiune a dervaţilor antifungici:
- mecanismul fizico-chimic, dependent de faza de creştere a miceliului, necesită concentraţii mari de
medicament, efectul fiind fungicid; mecanismul nu este comun tuturor derivaţilor azolici;
- mecanismul metabolic, se produce la concentraţii mici de medicament, este un eveniment
fungistatic, comun tuturor derivaţilor azolici.
Clinic, majoritatea derivaţilor azolici antifungici produc efecte fungistatice. Efectele fungicide au fost
raportate de studiile in vitro.
Flucitozina (5-fluorocitozina) este un agent antifungic inhibitor pentru speciile de levuri. Este
convertită în celula fungică la 5-fluorouracil, care inhibă timidilat-sintetaza, producând un deficit al timinei şi
al sintezei ADN

10.3. Rezistenţa fungilor la medicamente

In anii ’90, rezistenţa fungică a devenit o problemă importantă la pacienţii cu infecţii cronice cu HIV,
M. tuberculosis şi cu alte bacterii. S-a înregistrat o creştere dramatică a incidenţei infecţiilor fungice, în
special datorită alterării stării imunitare asociată cu SIDA, chimioterapie antineoplazică sau imunosupresia
asociată cu transplantul. La pacienţii HIV, rezistenţa infecţiei orofaringiene cu Candida este o problemă
importantă.
Căile prin care fungii previn acţiunea medicamentelor, substanţelor chimice antiseptice sau
dezinfectante sunt puţin cunoscute. Rezistenţa antifungică poate fi împărţită în două categorii: rezistenţa
clinică şi rezistenţa in vitro. Infecţia fungică refractară la tratamentul cu un medicament antifungic este
definită ca rezistenţă clinică. Una dintre cauzele comune ale rezistenţei este infecţia cu o tulpină fungică
pentru care concentraţia minimă inhibitorie (CMI) este mai mare decât valoarea medie. Rezistenţa in vitro
poate să fie primară şi secundară. Rezistenţa primară poate fi intrinsecă (înăscută) şi se datorează rezistenţei
naturale la agentul antifungic: peretele celular este o barieră mecanică ce diminuă sau chiar exclude
pătrunderea agentului antimicrobian. Rezistenţa secundară sau dobândită semnifică câştigarea rezistenţei de
către o tulpină la agentul terapeutic antifungic. Această formă de rezistenţă, rară acum câteva decenii, este cea
mai frecventă la pacienţii SIDA, care suferă de candidoză orofaringiană sau esofagiană recurentă, rezistentă la
compuşii azolici (Sheehan şi colab., 1999).
Cauzele rezistenţei sunt multiple. Tulpinile rezistente pot fi saprobionte la un individ sănătos. Ele
devin patogene la persoanele imunocompromise. Tulpinile rezistente de C. albicans pot să apară prin
înlocuirea celor sensibile. Analiza RFLP (restriction fragment length polymorfism) a evidenţiat modificări
genetice, în absenţa modificărilor fenotipice. O tulpină poate să devină rezistentă prin expunerea la acţiunea
medicamentului, pentru perioade lungi. Medicamentul nu produce rezistenţa, dar selectează tulpinile cu un
nivel iniţial redus de rezistenţă. In intervalul acţiunii medicamentului, celula se adaptează la concentraţii
progresiv crescânde de medicament. Tulpinile de Candida pot deveni tranzitoriu rezistente la medicamente,
fenomen denumit rezistenţă epigenetică. Fenotipul rezistent poate reversa la un fenotip sensibil, odată cu
întreruperea administră