Imunologie Veterinara

CRISTINA HORHOGEA
UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ

VETERINARĂ ION IONESCU DE LA BRAD IAȘI
IMUNOLOGIE ȘI
IMUNOPATOLOGIE
ÎNDREPTAR DE LUCRĂRI PRACTICE
Editura Ion Ionescu de la Brad
Iași - 2015
Referenți științifici:
Prof. univ. dr. Mihai CARP-CĂRARE
Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Ion
Ionescu de la Brad Iași
Conf. univ. dr. Eleonora GUGUIANU
Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Ion
Ionescu de la Brad Iași
Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României

HORHOGEA, CRISTINA
Imunologie şi imunopatologie / Cristina Horhogea. - Iaşi : Editura
Ion Ionescu de la Brad, 2015
Bibliogr.
Index
ISBN 978-973-147-185-3
612.017
57.083.3
ISBN 978-973-147-185-3
© EDITURA ION IONESCU DE LA BRAD IAȘI
IMUNOLOGIE ŞI IMUNOPATOLOGIE
Indreptar de lucrări practice
CUPRINS
Introducere .................................................................................................................................................... 6
Elemente introductive........................................................................................................................... 7
Organizarea sistemului imun................................................................................................................. 7
Imunitatea naturală.................................................................................................................................... 10
Antigenele........................................................................................................................................................ 13
Imunitatea dobândită................................................................................................................................. 16
Factorii umorali ai imunității dobândite – Imunoglobulinele și alți factori umorali...... 17
Factorii celulari ai imunității dobândite............................................................................................ 20
Noțiuni generale despre diagnosticul imunologic......................................................................... 22
Metode de diagnostic imunologic.................................................................................................... 28
Specimene pentru diagnosticul imunologic..................................................................................... 28
Teste de evaluare a imunității umorale ...................................................................................... 33
Reacții de aglutinare. ............................................................................................................................. 34
Reacții de aglutinare rapidă................................................................................................................ 35
Reacția de seroaglutinare rapidă pe lamă......................................................................................... 35
Reacția de hemaglutinare rapidă pe lamă......................................................................................... 37
Reacția de seroaglutinare rapidă cu antigen brucelic colorat cu Roz Bengal.................... 39
Reacția de aglutinare rapidă cu latex.................................................................................................. 40
Reacția de microaglutinare liză............................................................................................................. 41
Reacții de aglutinare lentă.................................................................................................................... 43
Reacția de aglutinare lentă în tuburi................................................................................................... 43
Testul inelar al laptelui.............................................................................................................................. 46
Reacții de seroprecipitare (imunoprecipitare) ...................................................................... 48
Reacții de seroprecipitare în mediul lichid.................................................................................. 50
Reacția de precipitare sub formă de inel (disc) ............................................................................. 50
Reacția de serofloculare............................................................................................................................ 52
Reacții de seroprecipitare în mediul semisolid (imunodifuzia în gel de agaroză)..... 53
Imunodifuzia verticală simplă (Oudin) ............................................................................................. 54
Imunodifuzia verticală dublă ................................................................................................................. 55
3
Imunodifuzia orizontală simplă (radială Mancini) ....................................................................... 56

Imunodifuzia orizontală dublă (Outcherlony) .............................................................................. 57
Imunoelectroforeza.................................................................................................................................... 60
Tehnica Western Blot................................................................................................................................. 63
Reacția de hemaglutinare (RHA) și reacția de inhibare a hemaglutinării
66
(RIHA) în pseudopesta aviară............................................................................................................
Reacția de hemaglutinare ....................................................................................................................... 66
Reacția de inhibare a hemaglutinării.................................................................................................. 68
Reacții de liză mediate de complement........................................................................................ 72
Reacția de fixare a complementului.................................................................................................... 72
Metoda complementul hemolitic 50 (CH50) ................................................................................... 77
Reacții de seroneutralizare................................................................................................................ 78
Metoda calitativă.......................................................................................................................................... 79
Metoda cantitativă....................................................................................................................................... 81
Testul de seroneutralizare cu anticorpi marcați cu peroxidază.............................................. 81
Testul de neutralizare în placă............................................................................................................... 82
Testul de neutralizare a toxinelor......................................................................................................... 83
Reacții serologice cu anticorpi marcați ........................................................................................ 84
Reacție de imunofluorescență............................................................................................................ 84
IFD în rabie..................................................................................................................................................... 88
IFD în pesta porcină clasică..................................................................................................................... 92
IFI în coronaviroza felină......................................................................................................................... 95
IFS în coronaviroza felină......................................................................................................................... 97
Testul de polarizare a fluorescenței.................................................................................................... 97
ELISA................................................................................................................................................................. 99
Imunocromatografia în flux lateral...................................................................................................... 105
Chemiluminscența....................................................................................................................................... 107
Reacțiile radioimunologice...................................................................................................................... 108
Tehnici de imunohistochimie.............................................................................................................. 109
Metode de evaluare a imunității celulare................................................................................... 117
Tehnici de separare a celulelor imunocompetente....................................................................... 117
Tehnici de cuantificare a celulelor imunocompetente................................................................. 119
Tehnici de identificare a celulelor imunocompetente................................................................. 120
Tehnici de evaluare funcțională a celulelor imunocompetente............................................... 122
Testul de transformare limfoblastică.................................................................................................. 123
Tehnica ELISpot............................................................................................................................................ 123
4
Citometria în flux ......................................................................................................................................... 124

Cytometric bead array............................................................................................................................... 125
Indicele opsonocitofagic........................................................................................................................... 126
Metode de diagnostic imunopatologic.......................................................................................... 129
Teste utilizate în diagnosticul lupusului eritematos sistemic (LES) ..................................... 130
Identificarea anticorpilor antinucleari (ANA) ................................................................................ 130
Detectarea crioglobulinelor..................................................................................................................... 133
Evidențierea celulelor lupice.................................................................................................................. 136
Teste utilizate în diagnosticul poliartritei reumatoide (PR) .................................................... 139
Determinarea factorului reumatoid (FR) ......................................................................................... 139
Examenul imunocitologic al lichidului sinovial.............................................................................. 141
Evaluarea proteinei C reactive (PCR) ................................................................................................. 141
Teste utilizate în diagnosticul febrei reumatismale .................................................................... 142
Detectarea anticorpilor antistreptolizina O (ASLO) .................................................................... 142
Teste utilizate în diagnosticul anemiei hemolitice autoimune (AHAI) ................................ 143
Testul Coombs .............................................................................................................................................. 143
Teste cutanate utilizate în diagnosticarea stărilor de hipersensibilitate ........................... 146
Diagnosticul alergic al tuberculozei la bovine ................................................................................ 150
Testul de transformare celulară a limfocitelor .............................................................................. 153
Listă abrevieri ............................................................................................................................................... 155
Bibliografie ..................................................................................................................................................... 158
5
Introducere
După cum s-a putut observa de-a lungul timpului, organismele sunt
extrem de bine echipate din punct de vedere imunologic pentru a putea face
față asalturilor antigenice de diverse naturi. Totodată, această reactivitate,
tradusă prin activarea sau sinteza unor elemente specifice umorale și
celulare, ne permite să evaluăm, prin diferite metode, statusul imunitar al
unui individ.
Ca atare, putem stabili etiologia infecțioasă prin identificarea
antigenului (agentului patogen), a anticorpilor, autoanticorpilor specifici
sau a unor celule activate specific. De asemenea, pot fi evaluate o serie
întreagă de elemente umorale și celulare de neoformație.
Nu în ultimul rând, imunitatea naturală poate fi testată în scopul
stabilirii capacității de reactivitate în fața unor atacuri antigenice reale.
Trebuie avut în vedere faptul că organismele sunt permanent expuse unui
număr extreme de mare de antigene, marea lor majoritate fiind eliminate la
porțile de intrare tocmai prin abilitatea și buna funcționare a elementelor
imunității naturale. De aceea, orice deficit sau insuficiență în producerea,
maturarea și funcționalitatea acestora se va reflecta la nivelul stării de
sănătate a individului.
În concluzie, testele imunologice ne permit atât evaluarea
parametrilor umorali și celulari ai imunității naturale și dobândite, cât și
stabilirea diagnosticului în unele afecțiuni cu substrat imun.
La ora actuală, în laboratoarele de profil se utilizează o gamă foarte
largă de teste serologice şi imunologice, cu diferite grade de specificitate și
sensibilitate. Având în vedere faptul că acest îndreptar se adresează
viitorilor medici veterinari practicieni, am selectat doar metodele frecvent
utilizate în scop diagnostic şi pentru evaluarea statusului imun al
animalelor.
Autoarea
6
Imunologia este o ramură a științelor medicale care se ocupă cu

studiul sistemului imunitar normal și al patologiei acestuia. Pentru a
înțelege mai bine modul de desfășurare a reacțiilor serologice și a
metodelor de diagnostic utilizate în vederea evaluării statusului imun al
unui individ, este utilă cunoașterea câtorva elemente umorale și celulare
care asigură imunitatea naturală și dobândită.
ORGANIZAREA SISTEMULUI IMUN
Sistemul imun este un ansamblu extrem de complex, alcătuit din

elemente cu diferite grade de organizare (organe, țesuturi, celule,
molecule), prin a căror cooperare elementele străine (non-self) sunt
discriminate față de cele proprii (self) și neutralizate în scopul păstrării
homeostaziei.
Organele limfoide pot fi primare (centrale, OLP) și secundare
(periferice, OLS).
•sediul formării, maturării şi educării celulor implicate în

realizarea răspunsului imun, fără intervenția
antigenelor.
Organe limfoide •Ficatul embrionar

primare •Măduva roșie hematoformatoare
(OLP) •Timusul
•Bursa lui Fabricius
7
În etapele timpurii ale dezvoltării embriofetale, ficatul embrionar

este singurul furnizor de celule sușă pentru toate elementele figurate ale
sângelui, rol care va fi preluat după naștere de către măduva hematogenă.
Măduva roșie hematoformatoare (MOH) este locul genezei
celulei cap de serie (celula precursoare, celulă stem, sușă sau
pluripotentă) care se diferențiază spre una din seriile sangvine și se
autoreplică pentru menținerea constantă a numărului celulelor stem.
Timusul este responsabil, în prima perioadă a vieții, de maturarea
imunologică normală a limfocitelor T (LT), iar la organismele adulte, de
reaprovizionarea anatomică și funcțională a sistemul de apărare
celulară. LT capătă competență imună numai după ce au părăsit timusul.
Bursa lui Fabricius este un organ limfoepitelial al păsărilor,
implicat în formarea și educarea limfocitelor B (LB), în sensul
recunoaşterii non-selfului antigenic. Limfocitele B sunt responsabile de
producerea anticorpilor după stimulare antigenică și transformarea lor în
plasmocite, care reprezintă sistemul de apărare umoral. Organul
complementar de la mamifere este reprezentat de MOH.
Elementele celulare formate și educate, părăsesc OLP și vor
popula OLS în așa numitele zone timo-dependente sau burso-dependente,
constituind lotul sechestrat de limfocite, la care se adaugă lotul de
limfocite recirculante prezente în sânge și, uneori, în canale limfatice.
•populate de LT și LB, după maturare și instruire în OLP

•locul întâlnirii cu antigenele
•Limfonodurile
Organe limfoide •Splina
secundare •Țesuturile limfoide asociate mucoaselor
(OLS)
Limfonodurile sunt responsabile cu filtrarea și sechestrarea

elementelor străine (non self) vehiculate pe cale limfatică. In inflamații sau
8
infecții, limfonodurile regionale cresc mult în volum, datorită proliferării

limfocitelor.
Splina este organul limfoid periferic cel mai mare, responsabil de
filtrarea antigenelor vehiculate pe cale sangvină.
Țesuturile limfoide asociate mucoaselor (MALT) se găsesc sub
forma unor aglomerări locale sau colecții limfocitare cu rol important în
imunitatea locală:
GALT - țesut limfoid asociat mucoaselor tubului digestiv;
BALT - țesut limfoid asociat mucoaselor tractusului respirator
(trahee, bronhii);
NALT - țesut limfoid asociat mucoasei nazale;
VALT - țesut limfoid asociat mucoaselor vulvo-vaginale.
În sens general, imunitatea poate fi definită ca o stare de

rezistență, grație căreia, organismul este protejat total sau parțial de
acțiunea patogenă a microorgansimelor și a toxinelor, prin acțiunea
complexă a factorilor umorali și celulari.
Organismele cu un sistem imunitar competent și funcțional sunt
protejate prin cooperarea imunității naturale și a celei dobândite,
fiecare fiind caracterizată de anumite particularități.
Caracteristici Imunitatea naturală Imunitatea dobândită

de la cele mai simple
Apariția pe scara
viețuitoare până la la vertebrate
filogenetică
organismele superioare
Caracter de specie individual
Transmisibilitatea caracter genetic stabil și
netransmisibil ereditar
genetică transmisibil ereditar
structuri și funcții
structuri și funcții de
Efectorii normale ale
neoformație
organismului
Memoria imunologică nu da
Acțiune nespecifică specifică și diferențiată
Depinde de
nu da
pătrunderea atg în
9
organism
IMUNITATEA NATURALĂ este starea de rezistență a organismului,

transmisă ereditar și care prezintă caracteristicile speciei. Este prima care
intervine în apărarea antiinfecțioasă, întrucât efectorii caracteristici umorali
și celulari sunt elemente competente și active, cu acțiune nespecifică și
nediferențiată (interacționează cu orice non-self, chiar în absența unui
contact anterior).
Factorii implicați sunt reprezentați de:
Barierele naturale (pielea și mucoasele)
Factori i umorali: anticorpii naturali,

complementul, interferonii, lizozimul, PCR, β-lizinele
Factorii celulari: polimorfonuclearele neutrofile,

eozinofile, bazofile, macrofagele (fagocite), celulele
NK
Marea majoritate a microorganismelor sunt eliminate la nivelul

porților de intrare, prin mecanismele locale. La exterior, barierele naturale
(pielea și mucoasele) se opun pătrunderii germenilor patogeni în organism
printr-o protecție mecanică (integritate), funcțională (mișcare cili,
descuamarea epiteliilor), biologică (competiție eficientă a microbiotei
autohtone) și chimică (acidul clorhidric în stomac, acid undecilenic în piele,
acidul lactic la nivelul mucoasei vaginale).
Această activitate complexă este secondată de buna funcționare și
competență a efectorilor umorali și celulari.
Factorii umorali sunt extrem de polimorfi, iar modul lor de acțiune
se concretizează în efecte imunitare complexe.
Anticorpii naturali (opsonine nespecifice, imunoglobiline) sunt
proteine serice existente în serul indivizilor normali, transmise de la mamă
la nou - născut pe cale transplacentară/colostrală. Aceste elemente sunt
sintetizate ca urmare a resorbției intestinale a antigenelor florei bacteriene
10
normale sau a alimentelor ingerate (de origine vegetală în principal). Ca și

structură, aparțin clasei de IgM produse de plasmocite derivate din LB
purtătoare a markerului CD5.
Opsonizarea este fenomenul de învelire (sensibilizare) a unui
antigen (non-self) cu anticorpi naturali și complement, fiind astfel facilitată
fagocitarea și eliminarea structurilor străine din organism.
Sistemul complement seric este format din circa 26 de substanțe
proteice din plasmă (C1-C26), care se activează succesiv una pe cealaltă, într-o
ordine dată, în trei moduri: pe calea clasică, lectinică sau alternativă
(properdinică). Calea clasică este declanșată de complexele antigen-anticorp
formate, în timp ce calea alternativă este iniţiată de diferite polizaharide,
mai ales de origine microbiană (zimosan, inulină, lipopolizaharidele
bacteriilor Gram negative, acizii teichoici ai bacteriilor Gram pozitive), de
suprafaţa unor paraziţi, de molecule agregate de anticorpi. Calea lectinică
este activată prin legarea Mannose Bindindg Lectin la reziduurile de
manoză de pe suprafața unor agenți patogeni. Elementul central al acestei
reacții în cascadă este reprezentat de activarea și clivarea fracțiunii C3 în
fracțiunile C3a (anafilatoxina) și C3b (principala opsonină, cu rol în
imunoaderență și liză).
Fixarea complementului pe complexul antigen celular - anticorp se
soldează cu citoliză, prin formarea, în final, a complexului membranar de
atac (CMA C5-C9).
Interferonii alfa (leucocitari) și beta (fibroblastici) sunt proteine
cu activitate antivirală și imunomodulatoare (ajustează răspunsul imun în
sensul activării sau supresării).
Anumite molecule (polipeptidele bazice, beta-lizinele) produc liza
bacteriilor Gram+, în condiții de anaerobioză și aerobioză. Lizozimul
(muraminidaza) este un ferment glucidolitic prezent în lichidele organice ale
diverselor specii de animale.
Proteina C reactivă (PCR) o proteină inflamatorie de fază acută
este se atașează pe unele bacterii sau fungi și favorizează opsonizarea,
facilitând fagocitoza. Este prezentă în serul sanguin, lichidul de ascită,
pleural, articular și cefalorahidian de natură inflamatorie.
11
Factorii celulari (celulele imunocompetente) sunt reprezentați

de toate celulele din sistemul fagocitar mononuclear și polimorfonuclear:
polimorfonucleare (neutrofile, eozinofile, bazofile), microfage (monocite),
macrofagele mobile și fixe, care se găsesc răspândite în toate organele și
țesuturile, precum și celulele NK.
Una dintre funcțiile de bază ale acestui sistem celular este
reprezentată de fagocitoză (fig. 1), respectiv pinocitoză.
Fig. 1 – Procesarea materialului patologic în interiorul macrofagelor

http://www.harunyahya.com/books/science/blood_heart/images/macrophage3.jpg
Celulele seriei granulocitare (polimorfonuclearele) asigură

prima linie de apărare a organismului, reprezentând 50-70% din
leucocitele circulante.
Neutrofilele sunt implicate atât în procesele inflamatorii acute și
cronice, cât și în fagocitoză (completă) datorită unui echipament enzimatic
foarte activ.
Eozinofilele au capacitate fagocitară, prezintă receptori Fc care
intermediază fagocitarea complexelor antigen-anticorp și citotoxicitatea
anticorpo-dependentă mediată celular. Au rol important în infestațiile
parazitare și în stările de hipersensibilitate.
Bazofilele au rol important în imunitatea nespecifică, în stările de
hipersensibilitate de tip I, fiind celule cu receptori pentru IgE. Prin
12
intermediul acestora, complexele de tip IgE specifică - alergen, determină

degranularea celulară cu eliberarea unor mediatori activi.
Celulele liniei mielocitare sunt reprezentate de monocite (forma
circulantă) și macrofage (în țesuturi).
Macrofagele sunt celule esențiale pentru menținerea imunității, fiind
implicate în imunitatea naturală, ca și celule fagocitare, precum și în
imunitatea dobândită, ca și celule prezentatoare de antigen (CPA).
Acestea provin din monocite (forma circulantă), care migrează în
diverse țesuturi, fiind responsabile de fagocitoză şi secreție de substanțe
funcționale solubile. Unele sunt specializate numai ca CPA (celulele
Langerhans, celulele dendritice şi interdigitate), altele numai în fagocitoză
(celulele Kupffer) sau ambele.
Macrofagele pot realiza o fagocitoză parțială (cu purificarea
antigenelor și expunerea la suprafața celulei a epitopilor, în asociere cu
moleculele complexului major de histocompatibilitate) sau pot permite
persistența nealterată și multiplicarea în interior a unor microorganisme,
fără a le putea distruge (ex. bacilii tuberculozei).
Celulele NK (natural killer cells) recunosc modificări de suprafață
care apar la celulele infectate cu virusuri. Celulele NK sunt activate de IFN
produs de acele celule pe care le ucid printr-un mecanism de citotoxicitate
directă.
ANTIGENELE
Antigenele (atg) sunt substanțe cu structuri chimice variate, care

induc un răspuns imun umoral sau celular.
În general, o moleculă de antigen este alcătuită din epitopi
(număr variabil) și o grupare carrier (purtătoare) (fig. 2).
Gruparea carrier poate purta unul sau mai mulți epitopi (arii, situsuri
antigenice, grupări determinante) identici sau diferiți, fiecare având în
populația de celule limfoide (LB și LT) un corespondent reprezentat de un
grup restrâns (clonă) de limfocite care exprimă pe suprafața lor receptori
unici şi specifici epitopului.
13
Fig. 2 - Părțile componente ale unei molecule de antigen

http://www.as.miami.edu/chemistry/2086/Chp22/chap22.htm
http://classes.midlandstech.com/carterp/courses/bio225/chap18/Slide17.GIF
Antigenele trebuie să îndeplinească două calități definitorii:

imunogenitatea (capacitatea de a declanșa un răspuns imun) şi specificitatea
(capacitatea de interacțiune cu anticorpii specifici).
I. Imunogenitatea depinde de:
I.1. Dimensiunea moleculei ≥ 5000 Da cu mai mulți epitopi identici
sau diferiți, capabili să interacționeze cu mai mulți anticorpi diferiți.
Numărul de molecule de anticorpi cu care poate reacționa o moleculă
de atg. reprezintă valența antigenului.
Haptenele sunt molecule care, din cauza dimensiunilor foarte mici
nu întrunesc condiția de mărime, responsabilă de atribuirea proprietăților
imunogenice. Acestea devin antigenice numai după combinare cu
macromoleculele gazdei.
I.2. În funcție de locul de pătrundere, unele antigene sunt mai
imunogene administrate pe o anumită cale.
I.3. în cazul antigenelor vaccinale (celule bacteriene, particule virale,
toxoizi), asocierea cu un adjuvant produce o captare mai mare a
antigenelor de către macrofage şi eliberarea lor mai lentă, combinată cu
producerea unei reacții inflamatorii la locul injectării.
I.4. Structura chimică : proteinele sunt mai imunogene decât
polizaharide, care, la rândul lor, sunt mai imunogene decât lipidele. Acizii
nucleici (macromoleculele de ADN) sunt cele mai slab imunogene.
II. Specificitatea constă în capacitatea de identificarea unui antigen

de către anticorpii specifici. De fapt, recunoașterea antigenului este un
14
proces de interacțiune complementară între epitop (de pe molecula de

antigen) și paratop (situsul de recunoaștere de pe molecula de
imunoglobulină) (fig. 3). Există situații în care două sau mai multe antigene
diferite, cu epitopi similari sau identici, pot da naştere unor anticorpi
crossreactivi (care recunosc, în egală măsură, toate antigenele).
Fig. 3 – Specificitatea
http://www.mahalo.com/antigen/
Antigenele naturale pot fi de diferite tipuri: bacteriene, virale,

parazitare, de grup sangvin și Rh, de histocompatibilitate, sechestrate.
Antigenele bacteriene pot fi:
 somatice (O) – substanțe chimice din peretele celular (proteine,
glucide, complexe lipopolizaharidice și poliglucidice), imunogene,
asigurând specificitatea grup la bacteriile Gram negative şi Gram
pozitive;
 flagelare (H) – proteina din flageli (cili) – flagelina – are rol
important în tipizarea serologică a enterobacteriilor;
 fimbriale (F) – proteine cu importanță deosebită în mecanismul
patogenic al unor boli, favorizând fixarea microorganismelor la
suprafața mucoaselor;
 capsulare (K) – inhibă fagocitoza;
 de suprafață (Vi) - împiedică aglutinarea cu seruri anti-O
(inaglutinabilitate). Aceste antigene au fost descrise la unele specii
din genul Salmonella (S. tiphy, S. hirschfeldi, S. typhimurium), dar şi
la alte specii bacteriene (Citrobacter), fiind corelate cu virulența.
15
Sunt antigene termolabile, dar insensibile la alcool şi formol. Pentru

a elimina fenomenul de inaglutinabilitate, tulpinile testate se supun
încălzirii (se distruge atg Vi care maschează atg O).
Din celelalte categorii amintite, antigenele virale responsabile de
capacitate antigenică şi imunogenă sunt componentele proteice ale
capsidei şi pericapsidei virale.
Structura antigenică a paraziților este complexă, aceștia fiind
capabili să inducă sinteza de anticorpi de tip reagenic (IgE) şi să producă
stări de hipersensibilizare imediată.
O categorie aparte o reprezintă antigenele sechestrate sau
autoantigenele prin bariere anatomice (din tiroidă, creier, testicul, şi unele
componente oculare care, în condiţii fiziologice normale, nu sunt
vehiculate în organism) prin a căror eliberare (traumatică, infecțioasă) pot
declanșa maladii autoimune (uveita, orhita autoimună).
Răspunsul imun sau imunogeneza este o reacție prin care, în urma
pătrunderii unui antigen, organismul produce efectori imuni umorali
(imunoglobuline) sau celulari. Acest fenomen este determinat de acea
însuşire a unor sisteme morfofuncționale ale organismului numită
imunocompetență.
IMUNITATEA DOBÂNDITĂ (INDUCTIBILĂ) este starea de

rezistență a organismului față de factorii non-self antigenici, realizată prin
structuri și funcții de neoformație cu un înalt grad de specificitate pentru
antigen.
Acest tip de imunitate este realizată de o serie de factori umorali și
celulari.
Factorii umorali: imunoglobulinele (IgA, IgG, IgE,

IgD, IgM), citokinele
Factorii celulari: macrofagele (celule

prezentatoare de antigen), limfocitele (LT,
LB), celulele Killer (K)
16
Tipuri de imunitate dobândită:

Imunitatea activă:
antigenul pătrunde în organism:
pe căi naturale - infecție naturală;
pe căi artificiale - vaccinare;
se instalează în 6 - 10 zile;
este de lungă durată.
Imunitatea pasivă:
antigenul nu vine în contact cu organismul;
poate fi dobândită:
pe căi naturale - transplacentar și colostral;
pe căi artificiale – serumizare;
transfer de celule;
se instalează imediat;
este de scurtă durată (de la câteva zile la 2-3 săptămâni).
Imunitatea umorală – principalii efectori sunt imunoglobulinele;

Imunitatea celulară - starea de rezistență se datorează efectorilor
celulari.
Răspunsul imun (reacția imună a organismului) este rezultatul

interacțiunii dintre antigenele diferiților agenți patogeni (bacterii,
virusuri, miceți, paraziți, toxine, etc) și componentele sistemului
imunitar al organismul agresat.
FACTORII UMORALI AI IMUNITĂȚII DOBÂNDITE

IMUNOGLOBULINELE și alți factori umorali
Anticorpii specifici sunt efectori umorali elaborați ca răspuns în

urma pătrunderii în organism a antigenelor.
Anticorpii (imunoglobulinele) sunt molecule proteice complexe
bifuncționale (fig. 4):
17
 extremitatea aminoterminală (cu structură moleculară foarte

variabilă) serveşte pentru recunoaşterea şi captarea antigenelor;
 extremitatea carboxiterminală efectoare, cu structură constantă,
serveşte pentru ataşarea (imunoaderența) la celule cu receptori pentru acest
fragment și pentru activarea complementului prin calea clasică.
Fig. 4 - Schema unei molecule de imunoglobulină G

http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Antibody2.jpg
Imunoglobulinele (Ig) sunt formate din lanțuri lungi - grele (H -

Heavy) care definesc clasa imunoglobulinelor (α – IgA, δ – IgD, ε – IgE, γ –
IgG, µ - IgM) și lanțuri scurte -uşoare (L - Light) de tip kapa şi lambda.
Ig sunt elaborate de plasmocite, după stimularea antigenică a LB.
Clasele de imunoglobuline
IgG (monomerică):
traversează placenta și transmite imunitatea de la mamă la făt;
străbate barierele endoteliale;
mijlocește imunoaderența prin segmentul efector Fc şi, uneori,
activarea complementului.
IgM (macroglobulina, pentamerică):
sintetizată înaintea IgG în răspunsul imun primar;
18
nu poate părăsi uşor spațiul intravascular;

poate lega simultan, mai mulți corpi bacterieni (aglutinare);
activează complementul și produce liza bacteriilor.
IgA – IgA serică – prezentă în serul sangvin (dimerică);
IgA secretorie:
secretată în concentrație ridicată în salivă, lapte, lacrimi, spută sau
secreții digestive;
asigură protecția antibacteriană la nivelul suprafețelor mucoase care
vin în contact cu mediu extern.
IgE (reagină, monomerică):
produsă în titruri mari în cursul reacțiilor alergice;
asigură protecția suprafețelor mucoaselor externe.
IgD (monomerică) - exprimate pe suprafața LB (receptori pentru atg).
Modul de acțiune al anticorpilor în apărarea antiinfecțioasă este

foarte divers:
blocarea situsurilor de fixare a virusurilor pe celulele țintă;
opsonizarea microorganismelor, urmată de activarea sistemului
complement și facilitând ingerarea și digerarea acestora de către
neutrofile;
existența LB cu memorie (care păstrează informația legată de un
antigen) asigură sinteza promtă de anticorpi specifici la recontactul
cu același antigen.
În răspunsul imun primar, prima categorie de anticorpi specifici

sintetizată este din clasa IgM, cu tendință de epuizare rapidă. Ulterior, apar
IgG a căror creştere este lentă şi progresivă, cu tendință, deseori, de
descreştere.
În răspunsul imun secundar (reacția anamnestică), sinteza IgM este
neglijabilă şi se epuizează rapid, în timp ce titrurile de anticorpii de tip IgG
cresc rapid, atingând un nivel ridicat şi persistent, urmat de scăderea lentă
până la un anumit prag de protecție imună reziduală.
19
Diferențele între răspunsul imun primar şi cel secundar constau în

scurtarea timpului de apariție a efectorilor imuni şi titrul mult mai ridicat al
acestora, indiferent de doza de antigen reinoculată.
Alte molecule implicate în răspunsul imun sunt reprezentate de
neuroleukine (substanţe care permit examinarea noilor interacţiuni între
sistemul nervos şi reţeaua de citokine), factori de stimulare a coloniilor
celulare (GM -CSF - factorul stimulator al coloniilor de granulocite şi
macrofage, G-CSF - factorul stimulator al coloniilor de granulocite, M-CSF sau
CSF-1 - factorul stimulator al coloniilor de macrofage), factori de
transformare a creşterii (TGF)
Citokinele: monokine, limfokine, interleukine (IL1-IL36):
molecule secretate numai de celule activate, fie specific (în urma
contactului cu atg.), fie nespecific (de alte citokine);
nu sunt specifice (pot fi secretate de mai multe celule şi pot acționa
asupra mai multor celule);
acționează asupra celulelor-țintă .
Interferonul (IFN gama) - produs de LT cu activitate antivirală şi
antitumorală.
Factorii de necroză tumorală:
 Limfotoxina (TNF beta) - produsă de LT activate, cu efecte citolitice
asupra celulelor țintă (tumorale, străine sau alterate de agresiunea
antigenică).
 Factorul de necroză tumorală (TNFα, caşectina)- produsă de
macrofage.
FACTORII CELULARI AI IMUNITĂȚII DOBÂNDITE
Din categoria efectorilor celulari, celulele limfoide (LB și LT) sunt

principalii efectori ai imunității dobândite, atât pe linie umorală, cât și pe
linie celulară.
Limfocitele sunt celule (populații, clone) care recunosc și
reacționează cu non-selful prin intermediul receptorilor de membrană
20
pentru antigene (fiecare clonă are un singur tip de receptor pentru fiecare
epitop).
După maturare/educare în sensul recunoașterii selfului și
diferențiere în organele limfoide primare, celulele mature virgine (care nu au
venit în contact cu antigenul) se distribuie în zonele B, respectiv T-
dependente din organele limfoide periferice (homing), grație unor receptori
specifici de suprafață.
După întâlnirea cu antigenele, atât LB cât și LT suferă o serie de
transformări morfologice şi structurale cu formarea imunoblaştilor, care,
prin mitoză, vor genera o celulă efectoare a răspunsului imun (RI), și o
celulă cu memorie imunologică (celule care păstrează amintirea
contactului cu antigenele, activându-se mai rapid ca celulele virgine, la un
nou contact cu același antigen).
În cazul LB, celula efectoare este plasmocitul secretor de
imunoglobuline.
În cazul LT, pe lângă celulele cu memorie, se formează mai multe
subpopulații ce îndeplinesc funcții diferite:
celule cu funcții efectoare - LT citotoxice - LTc (CD8), implicate în
distrugerea celulelor infectate cu virusuri, a celulelor tumorale şi în
respingerea grefelor.
celule cu funcții de reglare:
LT helper sau auxiliare - LTh (CD4) - rol esențial în stimularea
apariției plasmocitelor şi activarea celulelor Tc şi Ts;
LT supresoare - LTs (CD8) - modulează răspunsul imun umoral
şi celular în sens limitativ;
Celulele K sunt responsabile de citotoxicitatea celulară dependentă
de anticorpi (ADCC - antibody dependent cell-mediated cytotoxicity), spre
deosebire de celulele NK care prezintă o activitate citolitică manifestată
împotriva celulelor tumorale sau infectate cu virusuri.
Toate aceste elemente umorale și celulare descrise mai sus sunt
absolut indispensabile pentru buna desfășurare a proceselor imune de
recunoaștere și îndepărtare a nonselfului prin mecanisme specifice sau
nespecifice.
21
NOȚIUNI GENERALE DESPRE DIAGNOSTICUL IMUNOLOGIC
Întrucât imunitatea naturală și dobândită trebuie asigurată de

structuri competente morfologic și funcțional, testele imunologice sunt
instrumentul ideale de testare a acestora.
Serologia – ca terminologie – este un termen mai vechi, utilizat în
perioada în care serul sangvin era principalul material biologic în care se
identificau anticorpii specifici produși ca urmare a pătrunderii unui
antigen. În prezent se utilizează termenul de reacții imunologice.
Seroconversia se traduce prin apariția anticorpilor specifici unui
agent infecțios, detectabili în serul sangvin.
Ca principiu, diagnosticului serologic și imunologic are la bază
interacțiunea dintre antigene (prin epitopi) și anticorpi (prin paratopi),
soldată cu formarea complexelor atg-atc (complexe imune) in vitro. Ca și
într-o ecuație cu o necunoscută, identificarea antigenelor devine posibilă
dacă dispunem de anticorpii specifici, iar aceștia din urmă, la rândul lor,
pot fi depistați și cuantificați cu ajutorul antigenelor cunoscute.
În concluzie, reacțiile imunologice pot fi utilizate pentru:
1. Detectarea și cuantificarea antigenelor cu ajutorul unor seruri
cu specificitate cunoscută (seruri de referință). Metoda este cunoscută
sub denumirea de serotipizare. Utilizând ca martor soluții standardizate
de antigen pur în concentrație cunoscută (soluții etalon), rezultatele
dozării imunologice pot fi exprimate în unități de masă (ex. mg/ml).
2. Identificarea și titrarea anticorpilor specifici pentru un antigen
– serodiagnosticul – necesită seturi de antigene cunoscute (antigene de
referință, tulpini standard).
Prin punerea în contact a mai multor diluții seriate dintr-un ser de
cercetat (cantități diferite de atc) cu o cantitate bine stabilită de antigen de
referință, se poate stabili titrul de anticorpi ca fiind ultima diluție a
serului (cantitatea minimă de atc) care mai produce o reacție pozitivă.
Cuantificarea celor 2 elemente se mai poate realiza și cu ajutorul
unor sisteme automate.
22
Identificarea anticorpilor specifici este privită ca diagnostic

indirect, iar punerea în evidență a antigenelor (agentul patogen)
reprezintă diagnosticul direct.
Reacțiile serologice pot fi calitative (pozitiv – negativ, prezent -
absent) și cantitative (stabilesc titrul).
Rolul testelor serologice în cadrul metodologiilor de diagnostic
poate fi diferit, în funcție de boală sau metoda de lucru aplicată.
În general, serologia joacă un rol foarte important în diagnosticul
bolilor infecțioase bacteriene (produse de bacterii cu localizare
extracelulară), în care imunitatea mediată umoral este bine conturată.
Utilitatea majoră a acestor teste s-a dovedit a fi în screeningul
unor boli. În același timp, reprezintă principalul și cel mai facil instrument
de diagnostic prin care se poate supraveghea starea de sănătate a
efectivelor.
Există și boli în care serologia poate furniza un diagnostic de
certitudine.
Diagnosticul de laborator imunologic și serologic prezintă mai
multe avantaje:
 unele teste sunt ușor de aplicat, nefiind necesară o aparatură de
laborator foarte complicată;
 poate furniza rezultate rapide, în timp util, mai ales în cazul bolilor
bacteriene, la care examenul microbiologic durează minim 24 ore;
 este relativ ieftin;
 în contextul dotării cu aparatură performantă și utilizării unor
metode standardizate, rezultatele pot fi precise.
În cazul utilizării unor teste cu specificitate și sensibilitate scăzute
există posibilitatea obținerii unor rezultate fals pozitive sau fals negative,
datorate unor interferențe. În toate aceste situații se apelează la teste de
referință pentru confirmarea sau infirmarea bolii.
Reacțiile serologice sunt reacții de tip antigen-anticorp,
materializate prin cuplarea specifică între epitopul antigenic (grupare
determinantă) și paratopul (situsul de combinare) moleculei de anticorp
23
(fig. 5). Rezultatul acestei interacțuni prezintă manifestări vizibile variate:

precipitare, aglutinare, reacții de culoare, fluorescență.
Fig. 5 – Cuplarea epitop-paratop

http://img.tfd.com/mk/D/X2604-D-25.png
http://bio1151b.nicerweb.net/Locked/media/ch43/43_07Epitopes.jpg
Reacția de tip antigen-anticorp se desfășoară în 2 etape:

1. Etapa I – reacția atg-atc are loc la nivel molecular, individual.
Complexele formate își păstrează în continuare solubilitatea
componentelor și nu determină reacții vizibile prin metode obișnuite, ci
numai prin teste deosebit de sensibile ca testul radio-imunologic.
Fig. 6 – Conglomerate atg-atc

http://www2.estrellamountain.edu/faculty/Farabee/BIOBK/antigenAB.gif
2. Etapa II – concentrația complexelor antigen – anticorp crește

considerabil până la formarea unor conglomerate (rețele) cu solubilitate
redusă și constantă de disociere mică (fig. 6). Se crează posibilitatea de
vizualizare sau de interpretare prin tehnici mai puțin sensibile, în funcție
de natura antigenului și a anticorpilor introduși în reacție.
Reacțiile antigen – anticorp prezintă o serie de caracteristici.

1. Specificitatea este proprietatea antigenelor de a interacționa
cu anticorpii specifici (fig. 7). Lipsa specificității poate duce la erori
24
serologice cunoscute sub denumirea de interferențe antigenice sau reacții

încrucișate (cross) (fig. 8).
Fig. 7 – Specificitatea Fig. 8 – Reacții încrucișate

http://cisncancer.org/research/images/antibody_specificity-rew.jpg http://www.microbiologybook.org/mayer/rx-4a.jpg
Existența acestor asemănări între grupările determinante ale unor

antigene conduc la obținerea unor seruri care reacționează cu ambele
antigene. Cu cât numărul grupărilor determinante similare este mai mare,
cu atât reacțiile încrucișate sunt mai bine exprimate și mai stabile.
Microorganismele, prin structura lor complexă, oferă numeroase exemple
de asemenea interferențe. La unii germeni gram-negativi, grupările
determinate conțin câteva zaharuri dispuse secvențial asemănător
(Brucella abortus cu Yersinia enterocolitica).
Animale real negative

Specificitatea =
Animale real negative + animale fals pozitive
2. Sensibilitatea este o însușire dependentă de tipul de reacție și

de categoria de imunoglobuline pe care o evidențiază, fiind dată de
capacitatea testelor de a detecta cantități cât mai mici de antigene sau
anticorpi prezente în proba de cercetat. În ordinea sensibilității se pot
enumera: RIA, ELISA, testul de imunofluorescență, RFC.
Animale real pozitive

Sensibilitatea =
Animale real pozitive + animale fals negative
25
3. Afinitatea exprimă capacitatea antigenelor de a se cupla cu

anticorpii specifici (forța de legare dintre un determinant antigenic și
situsul complementar de legare al unui anticorp specific). Anticorpii cu
afinitate slabă nu realizează etapa a 2-a a cuplării cu antigenul specific,
exprimarea serologică fiind slabă sau inexistentă (fig. 9). IgG din răspunsul
imun primar manifestă o afinitate mai slabă față de antigenul care l-a
generat, comparativ cu IgG produs în cadrul răspunsului imun secundar.
Fig. 9 – Afinitatea
http://www.microbiologybook.org/mayer/rx-2.jpg
4. Aviditatea exprimă intensitatea cuplării antigenului cu

anticorpii corespondenți, fiind dependentă de afinitatea dintre epitopi și
paratopi. Majoritatea antigenelor constituie mozaicuri de epitopi, în
general diferiți unul de celălalt. Când un antigen multivalent se combină cu
situsurile anticorpilor specifici, energia de legare este superioară celei a
fiecărui situs de combinare luată separat. IgM (pentamerică) manifestă o
afinitate puternică, considerată aviditate față de antigen, posedând mai
multe situsuri de combinare. Anticorpii formați precoce în cadrul
biosintezei au un grad de aviditate inferior comparativ cu anticorpii induși
în etapele ulterioare ale răspunsului imun. Deasemenea, anticorpii formați
în faza inițială nu au situsuri de combinare în totalitate corespondente cu
întreaga grupare a determinanților antigenici și, ca urmare, complexele
formate se disociază cu ușurință.
Aviditatea caracterizează energia medie a interacțiunii de legare a
unui antigen multivalent, cu anticorpii corespunzători.
Cuplarea celor 2 elemente este o reacție chimică de înaltă
specificitate condiționată de prezența a 4 tipuri de legături necovalente:
26
legături de hidrogen, forțe Van der Waals, forțe electrostatice (între

grupări ionice cu încărcătură diferită) și legături hidrofobe (datorate
aminoacizilor hidrofobi).
Reacția este reversibilă, cinetica fiind dependentă de constanta
vitezei de disociere într-un sens sau altul.
Cuplarea specifică atg-atc este condiționată de o serie de factori:

concentrația anticorpilor specifici, care, în general, trebuie să fie
ridicată, pentru a crește posibilitatea întâlnirii cu antigenul
corespunzător;
concentrația antigenului, materializată prin numărul acestora,
heterogenitate și acces liber la epitopi;
clasa și subclasa de imunoglobuline participante la reacție;
temperatura: de regulă, t=370C accelerează reacția, dar sunt situații
când o temperatură scăzută (+40C), asociată cu o incubație
prelungită, duce la un randament mai mare au cuplărilor specifice;
pH-ul optim pentru desfășurarea reacției este cuprins între 6 și 8,5
(valorile extreme inhibă reacția);
forța ionică: prezența electroliților (obișnuit ioni de Na și Cl)
contribuie la stabilizarea reacției prin influențarea interacțiunilor
electrostatice (permit apropierea celulelor unele de altele suficient
de mult pentru ca cele două situsuri de combinare ale moleculei de
anticorpi să lege doi determinanți antigenici situați pe 2 celule
diferite).
27
Diagnosticul imunologic este un instrument extrem de util care

permite confirmarea sau infirmarea unei suspiciuni de diagnostic,
evaluarea statusului imunitar al unui individ, precum și reactivitatea
celulară și umorală.
SPECIMENE PENTRU DIAGNOSTICUL IMUNOLOGIC
Pentru diagnosticul serologic și imunologic pot fi folosite diverse

materiale patologice recoltate de la animalele în viață sau de la cadavre. La
ora actuală se utilizează o gamă foarte mare de metode care permit
identificarea anticorpilor și a antigenelor de diferite naturi: bacteriene,
virale, parazitare, micotice, etc.
De la animalele în viață se pot recolta probe de secreții, excreții,
sânge, organe (biopsie). Pentru identificarea anticorpilor, cel mai frecvent
se utilizează serul sangvin care se obține prin recoltarea probelor de sânge
în tuburi fără anticoagulant (seci) sau cu activator de
coagulare.
1. Prelevarea probelor de sânge

Sângele integral:
se utilizează atât pentru detecție de anticorpi, cât
și pentru detecție de antigene.
Se recoltează sânge în tuburi cu anticoagulant
(citrat de sodiu – dop albastru, heparină – dop verde,
Fig. 10 - Vacutainere
EDTA – dop mov) (fig. 10).
De regulă, se utilizează sânge venos obținut prin puncție venoasă.
Metodele de contenție a animalelor şi selectarea vaselor sangvine din care
se face recoltarea se realizează în funcție de specie. Această metodă
28
permite recoltarea unor cantități relativ crescute de sânge, pe care se pot

face mai multe tipuri de analize, fiind posibilă testarea unui număr mai
mare de animale, întrucât probele recoltate vor fi transportate la laborator
pentru testarea ulterioară.
În anumite cazuri se poate utiliza și sângele capilar. În acest caz,
datorită cantității reduse de sânge (câteva picături), analiza trebuie
realizată pe loc. În aceste condiții, numărul animalelor testate scade
considerabil.
Serul sangvin este un lichid transparent, cu o culoare ce variază
de la galben-pai la galben-portocaliu, în funcție de specie.
se obține prin recoltarea probelor de sânge în tuburi fără
anticoagulant (seci) – dop roșu sau cu factor activator de coagulare – dop
galben;
după prelevare, probele sunt lăsate la temperatura camerei, până
când începe să se exprime serul; se decolează (desprinde) coagului de pe
pereții eprubetei cu o baghetă sterilă și se introduce la frigider până a
doua zi; serul exprimat (fig. 11), separat de coagul este decantat;
conservarea serului sangvin se face în microtuburi sau criotuburi,
în condiții de regrigerare (dacă este lucrat imediat) sau congelare (-200C
sau -800C);
toate manoperele vor fi executate în condiții de sterilitate;
probele de sânge pe coagul nu se congelează, pentru a se evita
hemoliza.
Fig. 11 – Obținerea serului sangvin

http://medimoon.com/wp-content/uploads/2012/07/serum1.jpeg
http://i01.i.aliimg.com/photo/v1/60060524497/Serum_separation_gel_for_blood_collection_tubes.jpg
29
Probele de ser care se pretează pentru analizele serologice nu

trebuie să prezinte hemoliză accentuată, corpi străini și semne de
contaminare microbiană (turbiditate).
Pentru toate probele se completează corect nota de însoțire ce
trebuie să cuprindă următoarele: specia, categoria de vârstă a animalului,
starea fiziologică, date clinice și epidemiologice, data recoltării probelor,
tratamente și imunizări efectuate și, eventual, un diagnostic prezumtiv.
Se recomandă transportarea la laborator a probelor de sânge în lăzi
frigorifice, la temperatura de 40C, iar intervalul de timp între prelevare și
prelucrare să nu depăşească 24 de ore.
2. Lichidul cefalorahidian - se prelevează în mod aseptic,
folosindu-se ace şi seringi sterile, prin puncția canalului rahidian.
3. Probele de lapte - se prelevează în tuburi sterile prevăzute cu
dop etanş. Anterior recoltării, mameloanele sunt spălate, şterse cu soluții
dezinfectate, iar primele jeturi de lapte se elimină, pentru a se reduce
riscul contaminării bacteriene masive.
Probele de lapte pot fi utilizate ca material patologic în examenele
serologice pentru diagnosticarea unor boli ca: febra aftoasă, leucoza
enzootică a bovinelor, rinotraheita infecțioasă sau diareea virală a
bovinelor sau altele cu etiologie virală.
4. Probele de secreții nazale – se prelevează în fazele acute de
boală, în scopul identificării agenților microbieni. Se utilizează tampoane
sterile din vată introduse într-un tub steril cu mediu de transport şi
menținute la 4oC, expediindu-se rapid către laborator.
Celulele descuamate de la suprafața mucoasei nazale pot fi etalate
ca atare pe lame de sticlă sau, în cazul folosirii unui mediu de transport,
frotiul este realizat din depozitul celular obținut în urma centrifugării.
După uscarea la aer şi fixarea în acetonă, aceste preparate pot fi utilizate în
vederea detecției de antigen prin imunofluorescență sau prin teste
imunocitoenzimatice.
5. Probele de secreții oculare - se prelevează din sacul
conjunctival, sub pleoapa superioară şi inferioară, cu ajutorul tampoanelor
30
sterile, după care se imersează în mediul de transport. Pentru detecția

directă de antigen, se execută frotiuri pe lame de sticlă.
6. Probele de secreții prepuțiale şi vaginale - se prelevează cu
ajutorul tampoanelor sterile introduse şi menținute scurt timp în cavitățile
respective şi imersate ulterior în mediul de transport.
Pentru detecție directă de antigen se poate recurge la raclajul
acestor mucoase şi la executarea de frotiuri pe lame de sticlă. Prelevarea
de probe din secrețiile prepuțiale se poate realiza prin lavajul cavității cu o
soluție salină sterilă, urmată de colectare.
7. Probele de secreții buco-faringo-esofagiene se prelevează ca
metodă alternativă recoltării probelor de epitelii şi lichide veziculare în
suspiciunile de boli veziculoase, atunci când animalele sunt într-o fază
avansată a bolii sau când evoluția este subclinică.
8. Probele de epitelii cutanate sau mucoase se utilizează
aproape în exclusivitate în diagnosticul bolilor veziculoase, fiind
reprezentate de: epiteliu al aftelor sparte recent, lichid din afte nedeschise,
extras cu seringa, însoțit de un lamboul epitelial al aftei respective, în
cantitate de cel puțin 1 - 2 g pentru fiecare probă. Prelevarea se face din
zonele predilect afectate.
Probele de epiteliu cutanat se realizează prin biopsie cutanată, sub
anestezia locală, prelevându-se o zonă de epiderm de formă eliptică ce va
cuprinde zona cu leziuni şi zona adiacentă nemodificată.
9. Probele de fecale servesc ca material patologic pentru detecția
de antigen în cazul enterovirusurilor, adenovirusurilor, parvovirusurilor,
coronavirusurilor, rotavirusurilor, în diagnosticul suspiciunilor de
influență aviară şi pentru alte boli.
Se prelevează fecale eliminate recent, fie în coprocultoare sterile, în
cantitate mai mare, fie cu ajutorul unor tampoane rectale sau cloacale, care
se introduc după prelevare, în tuburi sterile.
10. Lichidele din colecții cavitare se utilizează pentru
identificarea antigenelor și anticorpilor prin diferite tipuri de metode.
31
II. Prelevarea de probe de la cadavre de animale

Prelevarea de probe de la animale moarte sau tăiate în scop de
diagnostic se realizează consecutiv efectuării examenului necropsic
constând în recoltarea de fragmente de organe (fig. 12) parenchimatoase
sau cavitare, secreții, excreții, atât de la
animale tinere sau adulte cât şi de la avortoni.
Este necesară cunoaşterea patogenezei
bolilor suspicionate, deoarece organul afectat
lezional nu este întotdeauna locul predilect al
multiplicării sau replicării microbiene.
Fig. 12- Recoltare probe organe
Pentru stabilirea unui diagnostic etiologic cert, este necesară,

uneori, şi expedierea de probe corespunzătoare prelevate de la animale
tăiate în scop de diagnostic.
În cazul animalelor mici, mijlocii şi categoria tineret a speciilor de
animale de talie mare, se poate expedia la laborator cadavrul întreg. În
scimb, de la animalele mari, se trimit organe sau fragmente de organe,
prelevate cât mai aseptic posibil.
Prelevarea se realizează cu ajutorul unor instrumente adecvate şi
utilizate numai în acest scop precum bisturie, cuțite, foarfeci de diferite
dimensiuni, cleşti, dălți, fierăstraie.
În cazul expedierii la laborator a unor fragmente de organ, acestea
trebuie să fie reprezentative pentru tipul de leziune existent şi să conțină
zone de țesut normal şi zone afectate.
Prelevarea probelor trebuie realizată cât de repede posibil, înaintea
invadării cadavrului de către germenii saprofiți şi apariția unor modificări
autolitice ce ar interfera cu obținerea unor rezultate corecte la
investigațiile ulterioare.
Prosectorul, persoana ce prelevează probele şi ajutoarele acestuia
trebuie să fie echipați în mod corespunzător cu echipament de protecție.
Probele prelevate de la animale moarte sunt ambalate
corespunzător în recipiente etanşe sau în saci dubli de plastic, între care se
introduce vată sau rumeguş de lemn îmbibat cu substanțe dezinfectante.
32
După prelevare, probele se individualizează cu înscris vizibil ce nu

se şterge în cursul manipulărilor. În cursul transportului, este necesară
menținerea probelor la temperatura de refrigerare.
Toate probele sunt acompaniate de o notă de însoțire ce conține:
descrierea detaliată a originii materialelor patologice, elemente de
anamneză şi alte date de interes epidemiologic.
Absolut toate probele recepționate în laborator vor fi supuse
testelor imunologice, în funcție de solicitările de pe nota de însoțire.
TESTE DE EVALUARE A IMUNITĂȚII UMORALE
Aceste teste de diagnostic imunologic permit punerea în evidență a

anticorpilor produși în urma pătrunderii unui antigen de natură
bacteriană, virală, etc. În egală măsură, aceste teste ne permit să
identificăm și agentul etiologic, cu ajutorul serurilor de referință specifice.
Din punct de vedere a structurii antigenului, al modului de
vizualizare a reacției, de maniera de prelucrare a celor 2 elemente
esențiale (antigenul și anticorpul), testele (reacțiile serologice) pot fi
clasificate în mai multe categorii:
a. Reacții de aglutinare – antigenul corpuscular (aglutinogenul),
reprezentat de o suspensie de celule microbiene, hematii, sub acțiunea
anticorpilor aglutinanți specifici (aglutinine), este aglutinat treptat, cu
formarea unor conglomerate vizibile cu ochiul liber. Cele mai eficiente
aglutinine sunt cele din clasa IgM, având 10 situsuri de legare a
antigenelor.
Reacțiile pot fi rapide (pe lamă) sau lente (în tuburi), calitative sau
cantitative.
b. Reacții de precipitare – antigenul molecular (precipitinogen),
reprezentat de o soluție coloidală, sub acțiunea anticorpilor specifici
(precipitine), formează un precipitat vizibil, spontan (imunodifuzie
simplă) sau cu ajutorul curentului electric (imunoelecroforeză, Western
Blot).
33
Reacțiile se pot desfășura în mediul lichid (seroprecipitare sub

formă de inel/disc sau reacții de serofloculare/turbiditate – precipitare în
toată masa lichidului) sau în mediul semisolid (imunodifuzia în gel de
agaroză pe verticală simplă și dublă, pe orizontală simplă și dublă).
c. Reacții de hemaglutinare (RHA) și inhibare a hemaglutinării
(RIHA) – utilizate pentru a evalua capacitatea hemaglutinantă a unor
virusuri și titrul hemaglutinant al acestora, precum și pentru a identifica și
titra anticorpii antivirali.
d. Reacția de fixare a complementului (liză) - antigenul (celule
microbiene sau hematii), sub acțiunea anticorpilor specifici și în prezența
complementului (alexinei) este lizat (imunocitoliză, bacterioliză,
hemoliză);
e. Reacții de neutralizare (testul de neutralizare a toxinelor, testul
de neutralizare în placă) – antigenul poate fi reprezentat de o toxină
bacteriană sau o suspensie virală, acțiunea ei putând fi neutralizată sub
acțiunea anticorpilor (antitoxine sau anticorpi antivirali
seroneutralizanți)
f. Reacții serologice cu anticorpi marcați – anticorpii primari sau
secundari pot fi marcați cu enzime (teste imunoenzimatice: ELISA,
imunocromatografia în flux lateral), substanțe fluorocrome (reacții de
imunofluorescență, imunohistochimie), markeri radioactivi (teste
radioimunologice).
Reacțiile de aglutinare sunt de 2 tipuri: rapide și lente.
Reacțiile de aglutinare rapidă se bazează pe interacțiunea dintre

anticorpii aglutinanți (aglutinine) cu antigenul omolog (aglutinine),
concretizându-se prin formarea de agregate antigen-anticorp vizibile sub
forma unor conglomerate moleculare mici sau flocoane cu aspect albicios.
34
In funcție de tipul de reacție, anticorpii se găsesc în ser sau în

sângele integral, iar antigenul poate fi reprezentat de o suspensie celulară
(obținută în laborator sau standardizată) simplă, colorată sau înglobată în
latex.
Elementele necesare unei reacții de aglutinare sunt:

Antigenul:
suspensie de germeni care nu aglutinează spontan (colonii S);
culturi proaspete, de 24 de ore, iar suspensia microbiană
realizată în soluție cloruro-sodică să fie omogenă;
suspensii microbiene omorâte (prin formol, alcool, fenol, etc.) –
tilpini standardizate.
Anticorpii: se găsesc în serul sangvin (probe de ser de cercetat sau
seruri de referință) sau în sângele integral;
Electroliții:
Ioni de Cl- și Na+ din serul fiziologic în care se suspendă
antigenul;
În absența lor reacția nu se produce.
REACȚIA DE SEROAGLUTINARE RAPIDĂ PE LAMĂ
Se aplică în scopul determinării prezenței anticorpilor

aglutinanți într-un ser sanguin sau în scopul identificării (tipizării) unor
germeni microbieni izolați în cultură, folosind seruri aglutinante specifice
cunoscute.
Materiale necesare
- antigene pentru reacția de seroaglutinare rapidă pe lamă,
omologate (antigen Salmonella pullorum, antigen Mycoplasma, sp., antigen
Brucella, sp., etc.);
- seruri pozitive de referință, omologate (seruri aglutinante
specifice antigenului folosit);
- seruri negative de referință, omologate (seruri normale de
specie, fără anticorpii specifici antigenelor folosite în reacție);
35
- ser fiziologic cu pH 7-7,2.


- lame din sticlă simple sau cu godeu, pipete, lupă sau


aglutinoscop.
Materialul supus examinării

 Probe de ser sanguin fără urme de hemoliză şi fără hematii în
suspensie (0,5-1,0 ml);
 Culturi bacteriene de 24h obținute pe medii speciale, în vederea
identificării şi tipizării acestora.
Modul de lucru
1. Pentru decelarea anticorpilor - pe o lamă de microscop, bine
curățată și degresată, se pun în contact o picătură din suspensia de antigen
și o picătură din serul de examinat. Se omogenizează bine cele 2 picături
cu ajutorul unei baghete, până când amestecul ajunge să descrie un cerc cu
diametrul de aproximativ 1 – 1,5 cm. Se aşteaptă 3-5 minute (în funcție de
temperatura încăperii), după care se citeşte şi se interpretează reacția.
Pentru fiecare serie de probe se prepară martori de reacție
(martor ser pozitiv şi martor ser negativ), în acelaşi mod cu probele.
2. Pentru tipizarea culturilor bacteriene, pe o lamă de
microscop se depune o picătură din serul aglutinant specific. Cu ajutorul
ansei bacteriologice se recoltează o colonie microbiană şi se omogenizează
în picătura de ser. Se aşteaptă 1-2 minute apariția fenomenului de
aglutinare. Aglutinarea apărută după 2 minute este considerată
nespecifică.
În evaluarea şi interpretarea reacției se apreciază:
- prezența şi intensitatea aglutinării corpilor microbieni din
antigene de către aglutininele specifice din serul de examinat;
- prezența şi intensitatea aglutinării corpilor microbieni în
suspensie de către serul aglutinant specific cunoscut.
Citirea este uşurată de plasarea lamei pe un fond întunecat sau cu
ajutorul aglutinoscopului:
36
- reacție pozitivă: apariția unor conglomerate sub formă de

grunji albicioşi (antigene somatice O) sau de flocoane (antigene flagelare
H), de la periferia spre centrul picăturii (fig. 13)
Fig. 13 – Reacția de aglutinare rapidă pe lamă

http://academic.pgcc.edu/~kroberts/Lecture/Chapter%204/04-26_AgglutinationTst_L.jpg
- reacție negativă: păstrarea aspectului inițial al amestecului

antigen-ser (omogen);
- reacție nespecifică: apariția tardivă (mai mult de 2 minute) a
unor conglomerate sub forma unor grunji foarte mici sau a unor filamente,
în amestecul antigen-ser.
În cazul celulelor bacteriene s-au descris două tipuri de aglutinare:
De tip H (hauch - val) – realizată de antigenele flagelare
(termostabile și rezistente la acțiunea formolului 0,5%),
caracterizată prin formarea unor flocoane mari și laxe ce se produc
rapid, dar se disociază la fel de repede la agitare.
De tip O (ohne hauch – fără val) - realizată de antigenele somatice
(termostabile, rezistente la alcool și sensibile la formol),
caracterizată de formarea unor conglomerate celulare mici, dense,
compacte, greu disociabile prin agitare.
REACȚIA DE HEMAGLUTINARE RAPIDĂ PE LAMĂ
Este o variantă a reacției de aglutinare rapidă pe lamă, aplicată în

diagnosticul tifopulorozei şi al tuberculozei aviare, în care anticorpii
aglutinanți din sânge formează grunji cu aspect albicios, în contact cu
antigenul omolog.
37
Materiale necesare:
- antigene pentru reacția de aglutinare rapidă cu sânge integral
(antigen Salmonella pullorum, antigen Mycobacterium avium) omologate;
- ser pozitiv de referință, omologat (martor de reacție);
- ser negativ de referință, omologat (martor de reacție) sau ser

normal de specie fără anticorpi specifici antigenelor folosite în reacție;

- sânge integral obținut în picătură prin puncție venoasă sau prin

secționarea crestei sau bărbiței.


Modul de lucru:
Pe o lamă de microscop se pun în contact o picătură de sânge şi o
picătură din antigenul omolog. Se omogenizează cu ajutorul unei baghete
şi se aşteaptă 30-60 secunde, în funcție de temperatura încăperii, după
care se citeşte reacția.
Pentru fiecare serie de probe se prepară martori de reacție (ser
pozitiv şi ser negativ) în mod similar cu probele de examinat.
Evaluarea şi interpretarea reacției:

Se apreciază prin comparație cu aspectul probelor martor-pozitiv
şi negativ: prezența şi intensitatea aglutinării corpilor bacterieni
(antigene) de către aglutininele din sângele de examinat, exprimată prin
apariția grunjilor de culoare albicioasă şi prin proporția acestora în
preparat.
Rezultatul reacției se notează astfel:
-reacție pozitivă: apariția grunjilor albicioşi confluenți, de la
periferia spre centrul preparatului;
-reacție negativă: păstrarea aspectului inițial al amestecului
antigen-sânge
Martorii de reacție trebuie să prezinte următorul aspect:
- serul martor pozitiv să evidențieze o aglutinare puternică, cu
grunji albicioşi confluenți pe toată întinderea preparatului.
- serul martor negativ să păstreze aspectul inițial al amestecului
de sânge-antigen.
38
Pentru probele care prezintă o aglutinare cu grunji de dimensiuni

reduse, dificil de interpretat, va fi folosită lupa sau aglutinoscopul.
REACȚIA DE SEROAGLUTINARE RAPIDĂ PE LAMĂ

CU ANTIGEN BRUCELIC COLORAT CU ROZ-BENGAL
Se aplică în diagnosticul brucelozei la bovine, suine, ovine

(infecția cu Brucella melitensis), cabaline, leporine şi alte specii receptive.
Principiul metodei are la bază interacțiunea dintre anticorpii
aglutinanți din ser și antigenul colorat, urmată de formarea unor agregate
antigen-anticorp vizibile, cu aspectul unor grunji de culoare roz.
Materiale necesare:
- antigen brucelic colorat cu Roz-Bengal - suspensie 8% de
Brucella abortus 99-Weybridge, inactivată prin căldură şi fenol 0,5%,
colorată cu Roz-Bengal, soluție 1% în diluant tamponat şi acidifiat;
- ser pozitiv brucelic de referință, omologat (provenit de la iepuri
inoculați cu B. abortus tulpina 99-S Weybridge şi etalonat la un conținut de
100 UAI/ml.);
- ser negativ brucelic de referință, omologat (provenit de la
animale normale, fără anticorpi anti-Brucella);
- probe de ser sanguin fără urme de hemoliză şi fără eritrocite în
suspensie (0,5-1 ml).
Modul de lucru:
Pe lamă se depune o picătură (0,03 ml) de antigen și un volum
egal din serul de cercetat, se omogenizează cu ajutorul unei baghete şi se
aşteaptă timp de 4 minute, după care se citeşte şi se interpretează reacția.
Pentru fiecare serie de probe se prepară martori de reacție
(martor ser pozitiv şi martor ser negativ) în acelaşi mod cu probele.
Evaluarea şi interpretarea reacției (fig. 14):

aglutinarea minim vizibilă pe lamă indică prezența anticorpilor
anti-Brucella şi serul se încadrează ca pozitiv;
39
lipsa aglutinătii indică absența anticorpilor anti-Brucella şi serul se

încadrează ca negativ.
Fig. 14 – Reacția de aglutinare rapidă cu antigen brucelic colorat cu Roz Bengal

http://www.saudijhealthsci.org/articles/2013/2/2/images/SaudiJHealthSci_2013_2_2_130_117919_u1.jpg
Serurile cu rezultat pozitiv şi neconcludent vor fi retestate,

obligatoriu, prin reacția de fixare a complementului (RFC).
REACȚIA DE AGLUTINARE RAPIDĂ CU LATEX
Se aplică în diagnosticul rapid al multor boli infecțioase, pentru a

pune în evidență unii markeri de boală sau unele titruri patologice ale
unor proteine inflamatorii.
Materiale necesare:
- antigene înglobate în latex;
- ser pozitiv de referință, omologat (martor de reacție);
- ser negativ de referință, omologat (martor de reacție) sau ser

normal de specie fără anticorpi specifici antigenelor folosite în reacție;

- ser de cercetat.

Efectuarea testului parcurge următoarele etape:

 se depun în godeurile de pe lame câte 50μl de ser (martor pozitiv,
martor negativ și ser de cercetat);
 se adaugă câte 50μl antigen înglobat în latex, în fiecare din cele 3
godeuri;
 se omogenizează cu o baghetă specială;
 se păstrază placa pe o suprafață netedă timp de 1 minut, după care
se înclină la 450 timp de 1 minut, se lasă în repaos 1 minut şi apoi se
interpretează.
40
Interpretarea testului (fig. 15):
Fig. 15 – Reacția de aglutinare cu latex
reacția pozitivă este reprezentată de apariția depozitelor mici,

albe, sub forma unor aglutinări specifice pe fond negru, aspect identic ca şi
la godeul cu martorul pozitiv, în intervalul de 3 minute;
reacția negativă constă în păstrarea aspectului alb, omogen,
identic cu aspectul godeului martor negativ.
REACȚIA DE MICROAGLUTINARE-LIZĂ
Este o metodă utilizată pentru diagnosticul infecțiilor produse de

germeni din genul Leptospira.
Principiul reacției are la bază aglutinarea diferitelor specii de
leptospire de către anticorpii din serurile de cercetat.
Este o metodă calitativ-semicantitativă, permițând identificarea
anticorpilor antileptospirici, precum și evaluarea titrurilor serurice.
Materiale necesare:
antigene - culturi de leptospire cunoscute sau care trebuie
identificate;
seruri antileptospirice de referință;
seruri de analizat;
microscop cu câmp întunecat;
acid acetic – dezinfectant.
41
Tehnica de lucru:
pe o lamă de sticlă bine curățată şi degresată se pune o picătură din
suspensia de antigen (cultura de leptospire). Imaginea
microscopică a picăturii va prezenta un număr mare de leptospire
de formă spiralată cu mobilitate ridicată;
se adaugă o picătură din serul antileptospiric;
se omogenizează picăturile şi se lasă acoperite cu o placă Petri timp
de 10-15 minute la temperatura camerei. Examinarea reacției se
face la un microscop cu câmp întunecat.
În cazul reacției pozitive (atc antileptospirici corespund tulpinii
examinate) se produce aglutinarea, urmată, după câteva minute, de liza
germenilor. Aglutinarea este realizată de către IgM din serul de testat și se
manifestă prin constituirea unor aglomerări mari de leptospire, cu aspect
de ghem (stea), pe marginea cărora se găsesc, uneori, leptospire libere în
mişcare (fig. 16).
Fig. 16 – Reacție de microaglutinare-liză

https://d8wdz88hpuaz5.cloudfront.net/1899/Preview/1899-20308740.jpg
Fenomenul de liză se produce la câteva minute de la constituirea

ghemelor şi se manifestă prin imobolizarea germenilor a căror citiplasmă
devine granulară şi se lizează.
Notarea:
 L - în câmpul microscopic se produce liza totală a germenilor;
 ++++ - toate leptospirele sunt aglutinate în gheme mari cu aspect
de păianjen;
42
 +++ - marea majoritate a leptospirelor sunt aglutinate în gheme

mari, dar se observă şi leptospire libere, mobile la marginea
câmpului microscopic;
 ++ - aproximativ jumătate din leptospire sunt aglutinate (6-12
gheme leptospire) şi numeroase leptospire libere prezente în întreg
câmpul microscopic;
 + - numărul ghemelor este redus, majoritatea leptospirelor, libere;
 - toate leptospirele din câmpul microscopic sunt libere.
Aprecierile cantitative se fac utilizând seruri martor al căror titru
imunologic este cunoscut.
REACȚII DE AGLUTINARE LENTĂ
Aceste teste de diagnostic se pot realiza în tuburi (eprubete),

microtuburi sau microplăci cu 96 de godeuri și permit incubarea la
temperaturi diferite (între +40C și 370C). În toate cazurile interpretarea
reacției se poate face cu ochiul liber.
REACȚIA DE SEROAGLUTINARE LENTĂ ÎN TUBURI
Reacțiile de seroaglutinare lentă sunt teste semicantitative care

permit evaluarea titrului de anticorpi sau antigen. În patologia veterinară,
această metodă se utilizează pentru diagnosticarea infecțiilor produse de
reprezentanții genului Salmonella (metoda Widal) sau Brucella (tehnica
Wright).
Titrul aglutinant al unui ser este reprezentat de diluția maximă la
care se produce aglutinarea de 50% (++).
Principiul metodei are la bază contactul dintre antigenul brucelic
corpuscular şi anticorpii din serul sanguin, soldat cu formarea unor
agregate antigen-anticorp vizibile cu ochiul liber sub forma unui sediment
albicios franjurat depus la fundul tubului de reacție.
Materiale necesare reacției sunt reprezentate de:
43
 ser sanguin, fără eritrocite în suspensie, fără urme de hemoliză sau

de contaminare bacteriană sau fungică;
 antigen brucelic – suspensie bacteriană de culoare alb-lăptoasă;
 ser pozitiv brucelic;
 ser negativ pentru bruceloză (ser normal de specie fără anticorpi
anti-Brucella);
 ser fiziologic 0,85% fenolat 0,5%, pH 7-7,2 – SFF.
Modul de lucru:
1. Se prepară diluția de lucru pentru antigen (după
instrucțiunile producătorului și în raport cu numărul de probe de
examinat);
2. Se prepară diluții seriate ale serului de cercetat în 5 sau 10
tuburi. Se repartizează 0,8 ml SFF în primul tub şi câte 0,5 ml în
următoarele. În primul tub se adaugă 0,2 ml din serul de cercetat,
realizând diluția 1/5. Se omogenizează cu ajutorul pipetei, apoi se aspiră
în pipetă 0,5 ml şi se trece în cel de-al doilea tub, continuând operațiunea
până la ultimul tub, din care se îndepărtează 0,5 ml.
3. Se adaugă câte 0,5 ml suspensie de antigen în toate tuburile.
Omogenizarea se realizează prin agitarea stativului cu tuburi. Diluția
serului în primul tub este 1/10, urmată de diluții seriale cu rata 2. Reacția
poate fi efectuată inițial în primele tuburi şi continuată în diluții
superioare, după caz.
4. Pentru fiecare serie de probe se prepară martori de reacție
(pozitiv și negativ), asemănător probelor de examinat, până la titrul
indicat de producător (tabel 1).
Tabel 1 – Pregătirea scării etalon

Soluție Antigen diluat, Intensitatea Rezultatul
Nr. tub
fiziologică, ml ml transparenței reacției
1 1,00 0.00 4 pozitiv
2 0,75 0.25 3 pozitiv
3 0,50 0.50 2 dubios
4 0,25 0.75 1 dubios
5 0,00 1.00 0 negativ
44
5. Tuburile se incubează la 37C timp de 20 ore, după care se scot

şi se lasă 30 minute la temperatura laboratorului, înainte de citirea
reacției.
6. Interpetarea reacției se face la lumină naturală sau la
aglutinoscop. Rezultatele se compară cu martorii de turbiditate preparați
din soluția de lucru a antigenului, apreciind transparența lichidului
supernatant din tuburile de reacție și prezența depozitului (fig. 17).
Fig. 17 – Reacția de aglutinare lentă în tub
Se foloseşte următoarea notație:

4 () – aglutinare 100% - clarificarea totală a
supernatantului, prezența unui depozit cu aspect franjurat, persistent în
lichid la o uşoară agitare (tubul nr. 1 din scara de turbiditate);
3  - aglutinare 75% -clarificarea aproape totală a
supernatantului, prezența unui depozit cu aceleaşi caracteristici, puțin mai
redus (tubul nr. 2 din scara de turbiditate);
2  - aglutinare 50% - clarificarea redusă şi prezența unui
sediment redus (tubul nr. 3 din scara de turbiditate);
1  - aglutinare 25% - clarificare redusă şi prezența unui
sediment foarte redus, uşor omogenizabil la agitarea tubului (tubul nr.4
din scara de turbiditate);
0 (-) absența oricărei urme de aglutinare, turbiditatea
supernatantului asemănătoare cu cea a martorului negativ (tubul nr. 5 din
scara de turbiditate).
45
7. Pentru clarificarea reacțiilor nespecifice, toate probele cu

rezultat pozitiv şi/sau dubios vor fi reexaminate prin aceeaşi tehnică, după
inactivarea serurilor la baia de apă reglată la 56-59C, timp de 60 minute.
Rezultatul este reprezentat de titrul aglutinant (valoarea aglutinării)
obținut prin această ultimă tehnică.
Interpretarea rezultatelor:
Valoarea aglutinantă a unui ser sanguin se exprimă în unități
internaționale (UAI), astfel:
- la bovine, bubaline şi ecvine un ser sanguin pozitiv conține
100 UAI/ml, valoare ce corespunde titrului 1/80 (), iar un ser
sanguin dubios minimum 30 UAI/ml  titrul 1/20 ();
- la porcine, ovine, caprine, lagomorfe un ser sanguin pozitiv
conține min. 50 UAI/ml, valoare ce corespunde titrului 1/40 (), iar un
ser sanguin dubios min. 25 UAI/ml  titrul 1/20 ();
Tirurile echivalente cu 30 UAI /ml. şi cele cu valori mai ridicate nu
sunt acceptate de UE în schimburile de animale.
TESTUL INELAR AL LAPTELUI (RING TEST)
Este o metodă utilizată pentru diagnosticarea brucelozei la

taurine.
Principiul metodei presupune aglutinarea celulelor bacteriene
(antigenul) colorate prin tratare cu roz Bengal de către anticorpii din
laptele animalelor infectate, aderarea complexelor antigen-anticorp
formate la globulele de grăsime şi antrenarea la suprafață cu formarea
unui inel colorat.
Dacă laptele nu conține anticorpi, acesta capătă o colorație
uniformă, iar inelul de grăsime prezintă aspectul normal, nemodificat.
Materiale necesare:
antigen brucelic colorat cu roz Bengal sau alt produs similar
omologat.
46
ser pozitiv brucelic sau alt produs similar omologat.

Materiale supuse examinării:
Proba de lapte este recoltată individual sau comasată de la un
grup de maximum 16 animale (volume egale). Probele colective se
recoltează din bidon cu ajutorul sondei, după o uşoară omogenizare cu
ajutorul paletei metalice.
Când mulsul se face mecanic, testul inelar se efectuează prin
recoltarea probelor de la fiecare animal, iar comasarea acestor probe se
realizează în eprubete sau flacoane, individualizând animalele donatoare.
Pentru ca testul să fie efectuat în condiții optime, laptele se
recoltează la mulsul de dimineață și se examinează după menținerea timp
de 24 ore la temperatura de 4C. De asemenea, laptele trebuie să fie
nefiert, necongelat, nedegresat și nu trebuie supus unei agitări puternice.
Modul de lucru:
Din fiecare probă de lapte (individuală sau comasată), precum și
din martorul pozitiv se pune în contact câte 1ml cu 0,03 ml din antigenul
colorant cu roz Bengal. Se omogenizează uşor conținutul fiecărui tub, apoi
se incubează o oră la termostatul de 37C.
Interpretarea reacției (fig. 18) presupune aprecierea inelului de
smântână şi cel al coloanei de lapte, astfel:
Fig 18 – Testul inelar al laptelui
Reacție pozitivă: formarea unui inel intens colorat la supurafața

coloanei de lapte;
47
Reacție negativă: inelul de smântână rămâne alb, iar coloana de

lapte este colorată uniform.
Probele colective de lapte cu rezultate pozitive sau neconcludente

vor fi reexaminate individual. De asemenea, la animalele din efectiv cu
reacții pozitive la testul inelar este obligatorie confirmarea serologică pe
probe de sânge.
Vor fi excluse de la testare:
probele de lapte modificate organoleptic;
probele de lapte anormal (colostru, provenit de la animale cu
mastită);
probele de lapte fiert, pasteurizat, acidifiat.
Combinarea anticorpilor specifici (precipitine) cu antigene

coloidale (precipitinogen) în soluție sau gel de agaroză se materializează
prin formarea unor complexe imune vizibile sub formă de precipitat.
Precipitatul este mai greu în zona de echivalență, când antigenele și
anticorpii sunt cuplate în totalitate. În alte cazuri, interacțiunea optimă
între anticorpi și antigene poate fi vizualizată în reacția de floculare (test
cantitativ pentru titrarea toxinelor și antitoxinelor).
Precipitinele sunt anticorpi capabili să formeze un precipitat
după interacțiunea cu antigenele specifice (precipitinogene), în prezența
electroliților (NaCl 0,85%). Serurile precipitante specifice sunt obținute
prin imunizarea de durată a animalelor cu antigenele corespondente.
În 1897 R. Kraus a observat că un filtrat de cultură de Yersinia
pestis devine turbid când este amestecat cu ser specific, cu formarea
ulterioară a unui depozit floconos. A fost denumită reacție de
precipitare, iar anticorpii, precipitine.
48
Precipitinogenii, în timpul administrării parenterale, induc

formarea precipitinelor specifice în organism și combinarea lor.
Reacția se poate desfășura în mediul lichid sau solid, fiind calitativă
sau cantitativă. Aceste reacții sunt specifice, dar cu sensibilitate scăzută,
necesitând cantități importante de anticorpi. Precipitarea complexelor
moleculare rezultate din interacțiunea antigen–anticorp este determinată
de formarea unei rețele tridimensionale de antigene reunite prin anticorpi.
Precipitarea maximă corespunde cu zona de echivalență, unde anticorpii și
antigenele sunt în raport optimal de concentrație, ceea ce permite
precipitarea tuturor moleculelor de atc cu atg corespunzator. În zonele cu
exces de atg sau de atc precipitatul nu se formează (fig. 19).
Fig. 19 – Reacția de seroprecipitare

http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap18/figure_18_03_labeled.jpg
Elementele necesare reactiei sunt:

Antigenul (precipitinogenul) reprezentat de un extract
microbian, o toxină, o suspensie virală etc. (în general, un antigen
molecular), preparat prin metode:
Mecanice (filtrarea, centrifugarea, sonicarea);
fizice (încălzirea la 1000C, înghețări și dezghețări succesive);
chimice (hidroliza cu acizi - cel mai frecvent fiind folosit HCl).
Anticorpii (precipitinele);
Electroliții.
Reacțiile de seroprecipitare se pot clasifica în 2 mari categorii:

49
Reacții de seroprecipitare în mediu lichid:

a. Reacții de seroprecipitare sub formă de inel sau de disc;
b. Reacții de seroprecipitare în toată masa lichidului
(serofloculare);
Reacții de seroprecipitare în mediu solid – imunodifuzie în gel
de agaroză (pe orizontală și pe verticală, simple și duble)
Reacțiile de precipitare sunt utilizate pentru:

 diagnosticarea antraxului, tularemiei, în tipizarea și studiul
structurii antigenice a anumitor grupe bacteriene;
 stabilirea originii proteinelor sangvine și spermatice;
 identificarea speciilor de la care provine laptele, carnea.
Rezultatele testelor se obțin după 5-10 min, 1-2 ore sau 20-24 ore
în funcție de tipul de reacție.
REACȚIILE DE SEROPRECIPITARE ÎN MEDIU LICHID
Reacția de precipitare în mediul lichid a permis demonstrarea

naturii proteice a anticorpilor şi a sugerat multivalența atg şi atc. Dispersia
reactanților în mediul mediu lichid constă în vehicularea lor dintr-o zonă
în alta a fluidului, în urma mişcării întâmplătoare a moleculelor.
REACȚIILE DE PRECIPITARE SUB FORMĂ DE INEL (disc)
Cea mai cunoscută aplicație este reacția Ascoli utilizată pentru

detectarea antigenelor de Bacillus anthracis în extracte din organe, piele,
lână, păr provenite de la animale suspecte precum și pentru controlul
produselor fabricate din piei și blănuri: haine de blană, gulere, pămătufuri
pentru bărbierit, etc.
Reacția Ascoli la cald, mai este cunocută sub denumirea de
termoprecipitare, întrucât extractul supus investigației este inițial fiert,
apoi filtrat, pentru a obține o soluție transparentă.
50
Materiale şi reactivi:
1. Antigenul (Bacillus anthracis) - precipitinogenul
este o suspensie apoasă preparată din organe splahnice provenite
de la animale suspecte de antrax;
fragmentele de organe sunt tăiate mărunt și se suspendă în ser
fiziologic în proporție de 1/3;
suspensia de germeni, respectiv broiajul de organe, se supune apoi
extracției prin căldură - baie de apă (t = 1000C), timp de 10-15 minute;
se filtrează prin hârtie de filtru soluție limpede, de
culoare ușor gălbuie. În cazul în care filtratul prezintă un grad ușor de
turbiditate, filtrarea trebuie repetată.
2. Ser anticărbunos precipitant (precipitină) – preparat în biofabrici.
Tehnica de lucru:
Într-un tub Wassermann se introduc 1-2 ml din antigenul
molecular;
cu o pipetă Pasteur bine efilată se adaugă o cantitate aproximativ
egală de ser precipitant, având grijă ca adăugarea serului să se facă încet,
sprijinind vârful pipetei de fundul eprubetei, astfel încât cele două lichide
să nu se amestece.
Interpretarea reacției:
Fig. 20 – Reacția de seroprecipitate sub formă de inel (disc)

http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/micbio/classes_stud/en/med/lik/ptn/Microbiology,%20virology%20and%20immunology/2/07_The%20usage
%20of%20immunological%20reactions%20in%20diagnostics%20of%20infectious%20diseases.files/image107.jpg
51
Reacția pozitivă: în 2-3 minute de la efectuarea reacției, la zona de

separare dintre ser și antigen, apare un precipitat alb, sub forma unui inel
sau disc (fig. 20);
Reacția negativă: nu se formează inelul de precipitare.
Tehnica poate fi utilizată şi pentru identificarea antigenului
cărbunos în pielea neprelucrată prin sărare a animalelor suspecte de
boală. Pieile se taie în fragmente mici, se pun la macerat în ser fiziologic
fenolat timp de 24 ore. Suspensia rezultată în urma macerării se filtrează
şi se execută în acelaşi mod. Această tehnică poartă numele de reacția
Ascoli la rece.
Dezavantajele reacției de precipitare sunt instabilitatea
precipitatului (inelul) care dispare la cea mai mică agitare şi
imposibilitatea de a stabili numărul de antigene diferite participante la
formarea precipitatului.
REACȚIA DE SEROFLOCULARE
Este o metodă cantitativă care a permis titrarea serurilor

antitoxice.
Principiul reacției are la bază proporționalitatea directă dintre
viteza de producere a reacției și raportul dintre antigen și anticorp.
Reacția se produce cu atât mai repede cu cât cantitatea de anticorpi din ser
neutralizează perfect antigenul și cu cât acesta din urmă se găsește în
cantitate corespunzatoare celei de anticorpi din ser. Un exces, fie din
partea antigenului, fie din partea anticorpilor, provoacă întotdeauna o
întârziere a reacției, care este cu atât mai mare cu cât disproporția dintre
cele două elemente este mai accentuată. Pe baza acestui principiu se pot
titra serurile antitoxice, folosind ca antigen o toxină cu titrul cunoscut, fie
putem titra toxinele cu ajutorul serurilor antitoxice cunoscute.
Materiale necesare:
antigenul – o suspensie care conţine toxine microbiene purificate;
serul de cercetat în care se urmăreşte titrarea atc antitoxină;
seruri martor la care titrul de atc este cunoscut;
52
Tehnica de lucru:
Pentru titrarea unui ser antitoxic se combină diluții diferite de ser
cu aceeași cantitate de toxină cu titru cunoscut. Se lasă la incubat tuburile
la temperatura camerei și se urmărește apariția reacției pozitive
(turbiditate sau floculare). Serul antitoxic care se titrează conține, în
diluția unde a apărut mai întâi flocularea, un număr de unități antitoxice
corespunzător numărului de unități toxice din volumul de toxine care a
fost repartizat inițial în toate tuburile. Cu cât raportul dintre atg. și atc.
este mai aproape de valoarea 1, cu atât seroflocularea se produce mai
repede.
REACȚII DE SEROPRECIPITARE ÎN MEDIUL SEMISOLID

(IMUNODIFUZIA ÎN GEL DE AGAROZĂ)
Reacțiile de precipitare în mediu semisolid (gel de agaroză)

sunt utilizate pe scară largă în laboratoarele de imunologie/serologie
pentru confirmarea diagnosticului în diferite boli infecțioase (AIE, LEB,
Blue tongue, etc.), precum și pentru evaluarea cantitativă a
imunoglobulinelor. Totodată, este o reacție de cuplare specifică atg-atc, cu
o evoluție lentă.
Clasificarea tehnicilor de imunodifuzie:
După numărul de elemente

care difuzează:
difuziune simplă
difuziune dublă
verticală simplă
verticală dublă
orizontală simplă
otizontală dublă
După direcţia de difuziune:
difuziune verticală difuziune
orizontală
53
De regulă, reacțiile de imunodifuzie pe verticală se realizează în

tuburi, iar reacțiile de imunodifuzie pe orizontală, în plăci Petri sau lame
de microscop. În imunodifuzia simplă, în care difuzează un singur element
(atg sau atc), celălalt se regăsește încorporat în gelul de agaroză.
Elementele necesare desfășurării reacțiilor sunt:
Gelul de agaroză - preparat după rețetă cu agar Noble;
Antigenul – de identificat sau cunoscut (standardizat);
Serul - de identificat, cunoscut (de referință – martor pozitiv) sau
ser normal de specie fără atc specifici (martor negativ).
IMUNODIFUZIA VERTICALĂ SIMPLĂ
Ca și principiu – tehnica realizată de Oudin se mai numeşte

difuzia simplă unidimensională. În această metodă difuzează un singur
reactant, de regulă atg. La zona de echivalență apare un disc de precipitare
sau un număr de benzi de precipitat, egal cu numărul minim de
componente antigenice.
Materiale şi reactivi
suspensia de atg (de identificat sau standardizat);
serul cu atc corespunzători (de testat sau de referință);
gel de agaroză 1%.
Fig. 21 – Reacția de seroprecipitare pe verticală simplă

http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap18/figure_18_04_labeled.jpg
54
Tehnica de lucru - serul este încorporat în agaroza topită şi răcită

la 45-500C, iar apoi repartizat în tuburi de hemoliză, într-o coloană de 3
cm. După solidificare se adaugă suspensia de atg. După difuzarea
antigenului în coloana cu gel și interacția cu anticorpii precipitanți, în zonă
de echivalență a celor doi reactanți se va forma un disc de precipitare
(fig. 21). Cu cât discul de precipitare va fi mai apropiat de limita dintre gel
şi soluția de atg, cu atât concentrația atc este mai mare.
IMUNODIFUZIUNEA VERTICALĂ DUBLĂ
Această reacție are la bază o tehnică introdusă de Oakley şi

Fulthrope, numită şi difuzia dublă unidimensională. Modificarea constă
în interpunerea între atg şi serul de analizat a unui strat intermediar de
gel fără atg sau atc.
Serul este încorporat în agaroza topită şi răcită la 45-500C, iar apoi
repartizat în tuburi de hemoliză într-o coloană de 2-3 cm. Se adaugă un
strat intermediar de gel fără atc sau atg. Se adaugă suspensia de atg, iar cei
doi reactanți migrează unul către celălalt în stratul de gel liber de atg sau
atc şi la zona de echivalență se formează linii de precipitare (fig. 22).
Fig. 22 – Imunodifuzia verticală dublă

http://image.slidesharecdn.com/ag-abidwd-111209100131-phpapp01/95/ag-ab-i-dwd-23-728.jpg?cb=1323427358
55
IMUNODIFUZIA ORIZONTALĂ SIMPLĂ

(RADIALĂ MANCINI)
Imunodifuzia radială este o metodă relativ simplă care permite

evaluarea cantitativă a unor fracțiuni proteice din ser (IgG, IgA, IgM, C3,
etc.).
Ca și principiul presupune difuzia unui atg adăugat într-un godeu
realizat în gel de agaroză care conține ser cu atc omologi. În cazul reacției
pozitive, în jurul godeului, se formează un inel de precipitare. Pentru o
concentrație constantă şi uniformă de atc şi o grosime constantă a gelului,
diametrul inelului de precipitare este proporțional cu concentrația atg.
Materiale şi reactivi:
atg din probele de examinat;
seruri de referință standardizate cu concentrație proteică
cunoscută;
plăci pentru imunodifuzie cu anticorpi (antiser) gata preparate.
Tehnica de lucru – în godeuri se repartizează cîte 50µl din soluțiile
de atg de cercetat, precum şi din soluțiile standardizate.
După difuzia atg (24-48 ore), la zona de echivalență se formează
inele de precipitare (fig. 23). Diametrul inelului de precipitare este direct
proporțional cu concentrația atg care difuzează şi invers proporțional cu
concentrația atc din ser.
Fig. 23 – Imunodifuzia Mancini Fig. 24 – Cuantificare IgG prin

imunodifuzie radială
https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRBGiynnq5N0Y13_KDLeXCQgy0-V3KEzBC2BHCIw3u8UK5iVj1Baw
http://ednieuw.home.xs4all.nl/IgGsubclasses/Fig8.jpg
56
Utilizarea serurilor de referință este obligatorie pentru controlul

calității imunoplăcii, precum și pentru evaluarea cantitativă a elementelor
din proba de cercetat. Este proba martor care servește pentru comparație
şi la care se raportează valorile obținute pentru probele de cercetat.
Tehnica poate fi utilizată cu succes pentru determinarea
concentrației Ig (fig. 24) din serul sangvin sau din alte lichide biologice,
precum şi în cuantificarea componentelor sistemului complement.
În acest scop, se utilizează kituri specifice, în care plăcuțele conțin
gel de agaroză în care este încorporat ser cu anticorpi anti IgG/IgA/IgM.
În godeurile deja practicate se introduc probele de ser de testat și,
după finalizarea precipitării, se apreciază cantitatea de imunoglobuline în
funcție de diametrul inelului de precipitare, conform intrucțiunilor
producătorului.
IMUNODIFUZIA ORIZONTALĂ DUBLĂ (OUTCHTERLONY)
Această metodă este frecvent utilizată în laboratoarele de

diagnostic veterinar pentru depistarea animalelor cu anemie infecțioasă
ecvină (AIE), leucoză enzootică bovină (LEB), blue tongue, etc.
Anemia infecțioasă ecvină (AIE) este o boală specifică solipedelor,
caracterizată clinic prin febră recurentă sau intermitentă, anemie,
tulburări cardio-vasculare şi slăbire progresivă, iar anatomopatologic prin
diateză hemoragică şi hiperplazia țesutului reticulo-endotelial. Testul de
imunodifuzie urmărește identificarea anticorpilor în serul animalelor
bolnave.
Testul Coggins - principiul metodei

Se bazează pe capacitatea antigenelor și anticorpilor specifici de a
migra dacă sunt puși împreună în gel de agaroză (pH 8,6), pentru a forma,
la locul de întâlnire, un precipitat cu aspect caracteristic de linii de
precipitare.
57
Materiale necesare:
În funcție de furnizor, setul de diagnostic pentru anemia infecțioasă
ecvină este format din următoarele componente :
antigen AIE (liofilizat sau gata de lucru);
ser pozitiv AIE (liofilizat sau gata de lucru);
ser negativ AIE (liofilizat sau gata de lucru);
gelul de agar (agaroză) care se prepară din agar Noble Difco
pentru imunodifuzie pulbere, acid boric (H3BO3), hidroxid de
sodium, apă distilată;
probe de hemoser recoltat de la cabaline, cât mai aseptic şi fără
hemoliză, menținute la temperatura de 4°C;
plăci Petri din plastic cu diametrul de 100 mm, pipete, matrița
metalică pentru ștanțat godeurile.
Tehnica de lucru va ține cont și de instrucțiunile producătorului
setului de diagnostic.
Gelul de agar preparat se repartizează în plăci Petri de plastic (17
ml). Cu matrița 5,3/2,4 mm, se ștanțează 7 grupuri de godeuri, folosind
desenul șablon. Fiecare grup are câte 7 godeuri (1 central și 6 periferice).
Reagenții trebuie introduși fără bule de aer, până la apariția
meniscurilor. În godeul central se repartizează antigenul, în godeurile 1, 3,
5 serul martor pozitiv, iar în godeurile 2, 4, 6 serurile de cercetat.
Plăcile se acoperă cu capac, după care se introduc pentru incubare
în cutii din material plastic, în care s-a asigurat o atmosfera umedă, la
temperatura de 20 - 22oC (la temperatura camerei ).
Citirile se fac la 24, 48 și 72 de ore.
Interpretarea rezultatului
Citirea reacției se face așezând placa în fața unui fascicol îngust de
lumină. Primul lucru care se verifică este reactivitatea serurilor martor
pozitive cu antigenul (obligatoriu, fiecare grup de godeuri trebuie să aibă
cel puțin 3 linii de precipitare) (fig. 25).
Aspectele întâlnite în timpul stabilirii diagnosticului sunt
următoarele:
58
martori pozitivi
Fig. 25 – Validare martori pozitivi
antigen
1. Reacția negativă - serul de cercetat nu conține anticorpi

specifici antigenului din reacție. Între godeurile cu ser și cel cu antigen nu
apare nici o linie de precipitare.
2. Reacția pozitivă – apare o linie de precipitare clară, continuă,
situată la jumătatea distanței dintre godeul cu antigen şi cel cu serul de
cercetat, iar unul din capetele liniei se uneşte sub forma unui cot, cu linia
de precipitare a serului martor pozitiv alăturat (fig. 26 a, b, c).
a b c
Fig. 26 a, b, c – Reacții pozitive
3. Reacția slab pozitivă - linia de precipitare abia se distinge, mai

aproape de godeul ce conține serul de cercetat.
4. Reacția intens pozitivă – se formează o bandă mai lată de
precipitare, între godeurile cu ser şi cel cu antigen. Este mai greu de
concluzionat, deoarece, adesea dizolvă linia de precipitare a serului de
referință din partea sa, aceasta rămânănd la jumătate. Diagnosticul se
59
stabileşte după retestarea serurilor respective în diluții seriate (1/2; 1/4;

1/8 etc.) până când se obține o linie de precipitare distinctă.
5. Reacția nespecifică se produce în cazul unor reacții antigen -
anticorp de altă natură. Se ia în considerare atunci când serurile de
cercetat formează o linie slabă, difuză, alteori clară, dar care se suprapune
sau întretaie linia serului martor pozitiv (neidentitate totală – fig. 27 sau
parțială – fig. 28).
Fig. 27 – Reacție de neidentitate Fig. 28 – Reacție de identitate parțială

http://www.microbiologybook.org/mayer/Image46.gif
https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSuSfl62Ni10Db6PdxyHdRSmbog4XshGe-zVe6VLkR2LJltZzqS
Raportarea rezultatelor:
Rezultatul negativ - Imunoserologic / AGID
Rezultatul pozitiv - Imunoserologic / AGID
IMUNOELECTROFOREZA
Imunoelectroforeza (IEF), elaborată de Grabar şi Williams, este o

metodă de diagnostic imunologic care permite identificarea antigenelor
proteice dintr-o probă de analizat. Prin această metodă, proteinele (mixul
de antigene) sunt depuse într-un godeu realizat în gel de agaroză, apoi
separate prin electroforeză, după care sunt puse în contact cu un antiser
mono sau polivalent, care difuzează în gelul de agaroză. Rezultatele sunt
vizibile prin formarea unor arcuri de precipitare la nivelul zonei de
echivalență (fig. 29).
60
Fig. 29 - Imunoelectroforeza
http://www.microbiologybook.org/mayer/Image49.gif
În metodologia actuală de diagnostic, pe lângă imunoelectroforeza

clasică, sunt utilizate mai multe metode, printre care și
electroimunodifuzia, contraimunoelectroforeza, electroforeza cu
imunofixare (IFE) sau imunoprecipitarea proteinelor după electroforeza
capilară.
Ultima este cea mai folosită, proteinele fiind imunoprecipitate în
gel. Este o metodă mai ușor de interpretat și mai sensibilă decât metoda
clasică.
Electroimunodifuzia (electroimmunoassay-EIA, rocket sau Laurell

rocket) este o metodă modificată a imunodifuziunii radiale Mancini. Sub
influența curentului electric, migrarea
antigenului, depus într-un godeu realizat în
gel de agaroză (cu anticorpi încorporați),
se realizează într-un singur sens (cel impus
de curentul electric). Interacțiunea celor 2
elemente se materializează prin formarea
unei zone de precipitare sub formă de con Fig. 30 – Electroimunodifuzia
sau rachetă (fig. 30). https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR1AynlXNT3cgNN8EmZNXEnVjZcPbQfOtKUoQnYrWmrg9kESQBZxQ
Înălțimea arcului este proporțională cu concentrația atg din probă.

Pentru interpretare se folosește o curbă standard obținută cu cantități
cunoscute de antigen. Este un test cantitativ, mult mai rapid decât
61
imunodifuzia radială și este utilizat pentru cuantificarea unor proteine din

ser.
Contraimunoelectroforeza este o variantă a metodei

Outcherlony, în câmp electric. Poate fi folosită pentru identificarea unor
proteine (atg) a căror migrare se face către anod. La întâlnirea atg cu atc
corespunzători, care se deplasează prin electroendosmoză către catod, se
produce o linie de precipitare (fig. 31). Reacția se utilizează pentru
detectarea atg bacteriene sau a unor proteine serice patologice.
Fig. 31 – Contraimunoelectroforeza Fig. 32 – Electroforeza cu imunofixare

http://www.sebia-usa.com/images/IT-IFGraph2Bars.png
http://image.slidesharecdn.com/immunodiffusion-130121011208-phpapp01/95/immunodiffusion-principles-and-application-17-
638.jpg?cb=1359056050
Electroforeza cu imunofixare (fig. 32) este o metodă ce permite

detectarea şi identificarea gamopatiilor monoclonale pe probe de ser și
urină. Tehnica se desfășoară în 3 etape: separarea electroforetică a
proteinelor de interes din proba de cercetat, adăugarea antiserurilor
monospecifice pentru fixare și imunoprecipitare și colorarea benzilor.
În acest scop se folosesc sisteme de geluri care conțin 6 godeuri.
Primul este alocat proteinelor totale care se separă în urma migrării
electroforetice, celelalte sunt tratate cu antiseruri care se leagă specific de
imunoglobulinele de tip IgG, IgA, IgM – lanțuri grele, precum şi k, λ –
lanțuri uşoare.
Pentru interpretare se examinează gelurile obținute și colorate și se
compară poziția benzilor imunofixate cu banda de referință
62
corespunzătoare proteinelor totale, putând fi astfel identificată proteina

specifică.
Elementele monoclonale produc pe gel benzi distincte înguste –
tipic unei gamapatii monoclonale;
Imunoglobulinele policlonale formează o zonă difuză de
precipitare;
În cazul gamapatiilor oligoclonale se obțin cel puțin trei benzi
înguste (o bandă discretă, corespunzătoare unui lanț greu şi două benzi
corespunzătoare ambelor tipuri de lanțuri uşoare);
Electroforeza capilară este o metodă alternativă pentru

caracterizarea proteinelor monoclonale (imunotipizare) în probe de urină
și de ser.
Tehnica de lucru presupune utilizarea unui sistem automant în
cadrul căruia probele sunt puse în contact cu antiseruri specifice lanțurilor
grele gama (IgG), alfa (IgA) şi miu (IgM), respectiv lanțurilor uşoare kapa
(libere şi legate) şi lambda (libere şi legate). Moleculele proteice sunt
separate pe bază mobilității electroforetice proprii, într-o soluție tampon
alcalină. Proteinele, separate în capilare de cuarț sunt detectate direct,
prin absorbanță, la 200nm. Electroforegramele sunt evaluate vizual pentru
detectarea prezenței reacțiilor specifice cu presupusele proteine
monoclonale.
Identificarea unei proteine monoclonale în ser sau urină este
echivalentă, de obicei, cu prezența unui proces malign, însă trebuie avut în
vedere faptul că aceste componente monoclonale pot apare şi în afecțiuni
benigne sau chiar în absența unei modificări patologice.
Tehnica WESTERN BLOT (denumită și imunotransferul,

protein immunoblot) este o metodă analitică utilizată pentru depistarea
proteinelor într-o probă de omogenat sau extract tisular sau celular.
Reacția se desfășoară în mai multe etape:
Prelucrarea probelor (țesuturi sau culturi celulare) are drept scop
obținerea acestor omogenate sau extracte cu ajutorul unui blender,
63
omogenizator sau sonicator. Acest proces este completat de tratarea cu

substanțe cu efect litic asupra celulelor, în scopul solubilizării proteinelor;
Electroforeza în gel de agaroză sau de poliacrilamidă (SDS PAGE)
este realizată cu scopul separării proteinelor native după structura 3-D, a
proteinelor denaturate după lungimea lanțului polipetidic sau în funcție de
greutatea moleculară a fragmentelor (fig. 33). Timpul de migrare și
voltajul se setează în funcție de proteinele de interes (de ex. 1 oră, 160V);
Fig. 33 – Electroforeza în gel de agaroză sau SDS PAGE

http://lh3.ggpht.com/-DpUSdf8KPEA/UuPOdWnGZyI/AAAAAAAACj8/B4nCYenKUck/clip_image002%25255B7%25255D.jpg?imgmax=800
Transferul proteinelor, denumit și electroblotting se realizează pe o

membrană (nitroceluloză sau PVDF - polyvinylidene difluoride).
Fig. 34 – Transferul proteinelor de pe gel pe membrana

http://www.leinco.com/includes/templates/LeincoCustom/images/WesternBlotSetup.gif
64
În acest scop se realizează un dispozitiv tip sandwitch: 2 bureți,

bine îmbibați în soluție tampon, o hârtie de filtru, gelul, membrana de
nitroceluloză, altă hârtie de filtru, 3 bureți bine îmbibați în soluție tampon
(fig. 34). Timpul de transfer variază de la 2 la 8 ore, la o tensiune a
curentului electric cuprinsă între 30 și 70 volți.
Reacția imunologică propriu-zisă are loc între antigenele

proteice transferate și anticorpii specifici.
Se adaugă anticorpii primari specifici proteinei țintă (monoclonali

sau policlonali) peste membrana pe care s-au transferat proteinele țintă.
De regulă, incubația este de lungă durată, realizându-se peste noapte, la
+40C, pe agitator.
Dacă se utilizează anticorpi II cuplați cu o enzimă, revelarea se face
cu un substrat specific cromogen, la întuneric.
Evidențiarea cuplului proteină de interes – atc I se realizează cu
ajutorul anticorpilor secundari marcați (anticorpi anti Ig de specie
față de anticorpii primari), urmând o nouă incubare de 1 oră la
temperatura camerei, pe agitator.
Fig. 35 – Interpretare rezultate Westen Blot

http://proteomics.case.edu/proteomics/westernblot-sm.jpg
Anticorpii secundari pot fi cuplați cu:

biotina sau cu o enzimă reporter ca fosfataza alcalină sau
peroxidaza, care, în prezența unui substrat specific, produce o
reacție colorimetrică;
65
substanță fluorescentă, a cărei excitație produce un semnal

luminos ce permite detectarea precisă a proteinelor, la
examinarea în lumină UV;
marker radioactiv.
Interpretarea rezultatelor se face diferit, în funcție de substanța
folosită pentru marcare (colorimetric – evaluare prin densitometrie sau
spectrofotometrie, detecția radioactivității, fluorescență) (fig. 49).
Boala de Newcastle (pseudopesta aviară) este cea mai gravă boală

a păsărilor produsă de un paramyxovirus şi soldată cu pagube economice
importante prin morbiditate şi mortaliate ridicată, scăderea productivităţii
păsărilor şi prin cheltuielile mari necesare eradicării bolii.
REACȚIA DE HEMAGLUTINARE
Reacția de hemaglutinare nu este o reacție serologică propriu-

zisă, ci se bazează pe proprietatea virusurilor influenței aviare și a bolii de
Newcastle (pseudopestei aviare) de a aglutina globulele roşii de pasăre.
Este un test care se realizează pentru a verifica capacitatea
hemaglutinantă și titrul hemaglutinant al suspensiei virale (antigenului)
utilizat în reacția serologică propriu-zisă (RIHA), în vederea evaluării
anticorpilor antivirali din serurile testate.
Materiale necesare:
Antigen de testat: suspensie virală (antigene de referință sau
lichidul alantoidian obșinut după inocularea ouălor
embrionate);
Suspensie de eritrocite 1% și 10%;
66
Tampon fosfat salin (TFS) pH 7,1 - 7,2;

Plăci de microtitrare cu 96 de godeuri cu fundul în V;
Pentru prepararea suspensiei de eritrocite 1% și 10% (ambele

cu albumină 50mg/100ml) se recoltează sânge venos (din vena axilară) în
soluție Alsever în proporție de 1/1, de la de la minim 3 păsări SPF (sau
păsări libere de anticorpi pentru pseudopesta aviară).
Sângele se centrifughează în TFS 10 minute la 1000-1500 r.p.m.
Plasma se decantează şi se înlocuieşte cu o soluție fiziologică sterilă
executându-se 2-3 spălări, după care se prepară o suspensie de eritrocite
1% sau 10% în în TFS (pH 7,1-7,2). Eritrocitele se pot păstra la 4°C timp de
4-5 zile în soluție Alsever (dextroză 0,8 mg, acid citric 0,055 mg, NaCl 0,42
mg, apă distilată 100 ml – autoclavare sau filtrare sterilă prin filtru de
0,22μm).
Tehnica de lucru:
1. Se distribuie 0,025 ml TFS în fiecare godeu al plăcii de microtitrare;
2. Se repartizează 0,025 ml suspensie de virus (lichid amniotic infectat)
în primul godeu și se execută diluții seriate cu volum de 0,025 ml
suspensie de virus de la primul până la ultimul godeu;
3. Se distribuie 0,025 ml TFS în toate godeurile;
4. Se distribuie 0,025 ml suspense de eritrocite 1% în toate godeurile;
5. Se agită ușor placa și se lasă acoperită timp de 40 de minute la 200C sau
60 de minute la 40C dacă temperatura ambientală este prea ridicată.
Interpretarea rezultatelor (fig. 36)

Reacția pozitivă – virusul are capacitatea de aglutinare a
hematiilor, tradusă prin formarea unui depozit de eritrocite pe fundul
godeului.
Reacția negativă – virusul nu are capacitatea de aglutinare a
hematiilor, iar eritrocitele se depun sub formă de buton pe fundul
godeului.
67
Pentru a diferenția hemaglutinarea de buton se înclină placa pentru

a observa scurgerea eritrocitelor pe peretele godeului
Fig. 36 – Reacție de hemaglutinare
Această reacție este cantitativă și permite calcularea titrului

hemaglutinant al antigenului – cea emai mare diluție a suspensiei virale
care produce aglutinarea completă (fără curgerea eritrocitelor).
REACȚIA DE INHIBARE A HEMAGLUTINĂRII
Metoda se bazează pe proprietatea unor virusuri (virusul

influenței aviare, a bolii de Newcastle) de a aglutina globulele roşii de
pasăre. Inhibarea aglutinării indică prezența anticorpilor specifici.
Prezența anticorpilor specifici în serurile de analizat va determina
inhibarea hemaglutinării eritrocitelor de pasăre.
Materiale necesare:
Antigen: ND-test sau tulpină de vaccin viu La Sota; se recomandă

pentru folosire un standard antigenic, tulpina Ulster 2C;
În reacție se folosește atg cu concentrație de 4UHA/ml.
Ser de cercetat;
Seruri martor pozitiv și negativ;
Suspensie de eritrocite 1% și 10%
tampon fosfat salin (TFS) pH 7,1 - 7,2;
Plăci de microtitrare cu 96 de godeuri cu fundul în V;
68
Tehnica de lucru:
1. Repartizarea tamponului de diluție (TFS), câte 25µl, după schemă:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,025 ml TFS
A-G 1-12
B
H 2-12
C
SP – ser pozitiv
D SN – ser negativ
E CV – control virus
SP CE – control
SN eritrocite
CV CE
2. Repartizarea serurilor (de testat, martor pozitiv, martor negativ),

câte 25µl, după schemă:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
0,025 ml ser de testat B
A-E 1
C
0.025 ml ser pozitiv
D
0.025 ser negativ
E
SP
SN
CV CE
3. Realizarea diluțiilor seriate, cu câte 25µl, după schemă:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 Diluții seriate cu 0,025 ml
2 ser
A-E 1, SP, SN
3
4
5
SP
SN
CV CE
69
4. Adăugarea suspensiei de antigen, câte 25µl, după schemă:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0,025 ml suspensie de 1
virus/antigen cu 4UHA 2
în fiecare godeu 3
Incubare:
4
30 min. la t=250C
5
60 min. la t=40C
SP
SN
CV CE
5. Realizarea diluțiilor pentru CV (control virus), câte 25µl, după

schemă:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1
2 Diluții cu 0,025 CV
3 H 2-6
4 TFS 1x cu albumină 0,05%
5 în CV și CE
SP
SN
CV CE
6. Reapartizarea suspensiei de eritrocite, câte 25µl, după schemă:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0,025 ml suspensie de 1
eritrocite 1% în fiecare 2
godeu 3
Se agită ușor placa și 4
se lasă acoperită:
5
40 min. la t=200C
SP
60 min. la t=40C
SN
CV CE
70
Interpretarea rezultatelor (fig. 37)

Reacția pozitivă – anticorpii din serul de cercetat inhibă
capacitatea virusului de a aglutina hematiile. Ca atare, eritrocitele se
depun sub formă de buton pe fundul godeului.
Un ser poate fi considerat pozitiv la o diluție de cel puțin 1/16 față
de 4UHA de antigen.
Reacția negativă –capacitatea hemaglutinantă nu este inhibată –
se formează un depozit.
Fig. 37 – Reacția de inhibare a hemaglutinării

http://o.quizlet.com/GXTwooy7y0RGS42jZk4Dvw_m.jpg
Titrul inhibohemaglutinant este cea mai mare diluție la care se

produce o inhibare completă a 4 (8) unități virale.
Se calculează titrul inhibitor de hemaglutinare (TIH), ca fiind
diluția cea mai mare a serului capabilă să inhibe hemaglutinarea, înmulțită
cu numărul de unități virale hemaglutinante ale virusului.
Valorile titrurilor IHA obținute permit atât aprecierea imunizării
păsărilor în urma acțiunilor imunoprofilactice, cât şi prezența în efective a
păsărilor bolnave sau trecute prin boală.
71
Complementul reprezintă un sistem seric complex format din peste

20 fracțiuni proteice denumite componente care se activează succesiv una
pe cealaltă, într-o ordine dată (activare în cascadă).
REACȚIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI
Reacția de fixare a complementului este utilizată ca și test de

confirmare în diagnosticul bolilor infecțioase bacteriene sau parazitare, la
diferite specii de animale și la om. Micro-RFC-ul este o metodă care
permite utilizarea unor cantități mult mai mici de reactivi, comparativ cu
RFC-ul realizat în eprubete.
Principiul metodei se bazează pe proprietatea complementului
de a se fixa numai pe anticorpii sensibilizați din complexele de tip
antigen-anticorp. Complexele imune fixează ireversibil complementul.
Deoarece reacțiile pozitive (cuplarea antigenelor cu anticorpii specifici și,
ulterior, complementul) nu pot fi vizualizate direct, este necesară
utilizarea unui revelator sub forma unui sistem hemolitic preparat din
eritrocite de berbec şi ser hemolitic anti-oaie.
În concluzie, reacția presupune utilizarea a 2 complexe de tip
antigen anticorp (din care doar unul este sigur prezent) și complementul
(alexina) care se va fixa pe unul din cele două.
Materialele necesare:
Antigene preparate şi standardizate (în stare lichidă sau
liofilizate), care se diluează conform intrucțiunilor producătorului;
Ser de cercetat;
Complement de cobai (alexină) – liofilizat sau congelat la -400C;
o Din cauza labilității accentuate a complementului, acesta
trebuie titrat la fiecare utilizare în RFC.
Eritrocite de berbec diluate 2,5 % în tampon veronal;
72
Ser hemolitic – ser de iepure cu anticorpi anti-hematie de berbec

(hemolizină):
o se diluează în funcție de titru;
o în reacție se utilizează 2UH;
Ser control pozitiv omologat (cu titru cunoscut și etalonat);
Ser control negativ omologat;
Ser fiziologic (diluant) 0,85% clorură de sodiu, pH 7,0-7,2.
Reacția propriu - zisă:
1. Serurile de cercetat (suspecte), în care se suspicionează prezența unor
anticorpi specifici, precum și serurile martor se tratează termic, 30
minute la temperaturi cuprinse între 56-60°C, pentru inactivarea
complementului propriu;
2. serul de testat inactivat se pune în contact cu o suspensie de antigen
corespunzător anticorpilor suspicionați, după care se adaugă o
anumită cantitate de complement (ser de cobai);
3. se incubează la termostat sau pe baie de apă pentru a se forma
complexele antigen anticorp, care vor fixa complementul;
4. se adaugă sistemul indicator (revelator) al reacției - sistemul hemolitic
format din hematii de oaie (atg) și ser hemolitic anti- hematii de oaie
(atc);
5. se incubează la termostat sau pe baie de apă
6. se interpretează rezultatele.
În cazul în care în serul de cercetat există anticorpii specifici
suspectați (Reacție +), complementul se va fixa pe anticorpii sensibilizați
din complexele imune microbiene și nu va mai fi disponibil a se fixa de alte
complexe atg/ atc prezente în sistemul de reacție (sistemul hemolitic).
Fixarea complementului pe complexele imune este urmată de liza
celulelor bacteriene, în timp ce hematiile din sistemul hemolitic rămân
integre.
În concluzie, în reacția pozitivă, hemoliza este absentă (fig. 38).
73
Fig. 38 – RFC pozitiv

http://biosiva.50webs.org/compft2.jpg
În cazul în care în serul de cercetat nu există anticorpii specifici

suspectați (Reacție -), în prima etapă nu se formează complexe imune.
Complementul, adăugat tot în prima etapă, va rămâne liber și se va fixa pe
anticorpii sensibilizați din sistemul hemolitic.
Fixarea complementului pe aceste complexele imune este urmată
de liza hematiilor. În concluzie, în reacția negativă, hemoliza este
prezentă (fig. 39).
Fig. 39 – RFC negativ

http://biosiva.50webs.org/compft3.jpg
Pentru interpretarea rezultatelor, se evaluează gradul de hemoliză

produsă, cu ajutorul unei scări etalon (fig. 40), după cum urmează:
Fig. 40 – Grade de hemoliză la RFC

http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/micbio/classes_stud/en/med/lik/ptn/Microbiology,%20virology%20and%20immunology/2/07_The%20usage
%20of%20immunological%20reactions%20in%20diagnostics%20of%20infectious%20diseases.files/image112.jpg
74
Reacție pozitivă
4   lipsă completă a hemolizei
3  hemoliză (25%)
Reacție dubioasă
2  hemoliză (50%)
1  hemoliză (75%)
Reacție negativă
- hemoliza totală
Micro RFC în bruceloză
Metoda este aplicată în diagnosticul infecțiilor cu Brucella ovis și

Brucella canis.
Titrarea complementului se efectuează în tuburi cu fundul în U cu
volum de 4 ml (tabel 2).
Titrul complementului (unitatea exactă de complement) este
reprezentat de cea mai mică doză care produce hemoliză completă.
Tabel 2 – Titrarea complementului

Martori
Tuburi
hemoliză
Complement 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 H0 H100
1/100 (ml) 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 0,11 0,12 0,13 0,14 0,15 0,16 0 0,400
Tampon
0,36 0,35 0,34 0,33 0,32 0,31 0,30 0,29 0,28 0,27 0,26 0,25 0,24 0,400 0
veronal (ml)
Antigen
diluat (1 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
unitate) (ml)
Se agită tuburile și se incubează pe baie de apă la 37C, 30 minute
Sistem
0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40
hemolitic
Se agită tuburile și se incubează pe baie de apă la 37C, 30 minute
Prepararea sistemului hemolitic se realizează prin amestecul în

părți egale de hemolizină și suspensie 2,5% eritrocite de berbec.
Serurile de cercetat și serurile martor se diluează - diluția ¼ (50μl
ser de testat + 150 μl tampon veronal), apoi se inactivează (tabel 3).
Inactivarea serurilor de cercetat și a martorilor:
Nediluate – 30 minute la baie marină la 60±20C
75
Diluate - 50 minute la baie marină la 58±20C (sau în funcție

de specie)
Tabel 3 - Condițiile de inactivare a serurilor sanguine ale unor specii de animale

Specia Timpul (min.) Temperatura (C)
Taurine, iepure, cobai, porumbel 30 56
Ovine-caprine 60-75 60
Ecvine 30 62
Suine 30-45 60
Câine 30 (20) 60-65
Tampon veronal salin soluție stoc: HCl (42,5 grame), acid barbituric
(2,875 grame), dietil barbiturat de sodiu (1,875 grame), sulfat de
magneziu (1,018 grame) şi clorura de calciu (0,147 grame) la un litru de
apă distilată şi se diluează prin adaugarea a 4 volume de 0,04 % soluție de
gelatină.
Tabel 4 - Desfăşurarea reacției:

Diluția M M M
¼ 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 MC1 MC2 MC3 MC4
serului Ac SH Ag
Ser diluat
25 25 25 25 25 25 25 25 25 - - - - - -
(μl)
Antigen (μl) 25 25 25 25 25 25 25 25 - 25 25 25 25 - 25
Complement
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 - 25
(μl)
Tampon
- - - - - - - - 25 25 25 25 25 75 25
veronal (μl)
Se agită placa, se acoperă și se incubează peste noapte la 4C
SH (μl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Se agită placa, se acoperă și se incubează la 37C, 30 minute
Se centrifughează placa la 1600 rpm timp de 5 minute pentru

sedimentarea rapidă a hematiilor nelizate în timpul reacției şi
interpretarea gradului de hemoliză, comparativ cu scala etalon obținută cu
soluțiile standardizate și titrate (liză de la 0 la 100% ).
martor atg – hemoliză 100%;
martor SH – 0% hemoliză;
martor negativ - hemoliză 100%;
martor pozitiv – titru specificat de producător.
76
Tabel 5 - Interpretarea:
Gradul de reținere al hemolizei
Diluția de ser
25% (+) 50% (++) 75% (+++) 100% (++++)
½ 8,3 10 11,6 13,3
¼ 16,6 20 23,3 26,6
1/8 33,3 40 46,6 53,3
1/16 66,6 80 93,3 107
1/32 133 160 187 213
1/64 266 320 373 426
1/128 532 640 746 852
1/256 1065 1280 1492 1705
Un rezultat mai mare sau egal cu 20 este considerat pozitiv.

Reacţii fals-pozitive pot apare la testarea animalelor vaccinate cu B.
abortus tulpina S19. Femelele care au fost vaccinate la vârste cuprinse
între 3 şi 6 luni, sunt considerate pozitive dacă serurile dau o fixare
pozitivă la un titru de 30 UFC/ml, în condițiile în care testarea se face pe
animale de 18 luni sau mai mari.
METODA COMPLEMENTULUI HEMOLITIC 50%
Cele mai multe cunoştințe în privința naturii sistemului

complement s-au acumulat prin studii asupra eritrocitelor de berbec cu
anticorpi şi complement. In vitro, eritrocitele sensibilizate cu anticorpi
specifici sunt lizate de complementul activat prezent în ser. După același
principiu, in vivo, în unele stări patologice, are loc procesul de
imunohemoliză.
Dozarea complementului total se bazează pe însuşirea acestuia de a
se fixa pe complexele antigen anticorp formate (hematii – anticorpi anti-
hematii) și de produce hemoliza eritrocitelor de berbec sensibilizate cu ser
hemolitic.
Materiale necesare:
Suspensie de hematii de berbec – sânge integral recoltat pe
77
anticoagulant;
ser hemolitic anti Ig de oaie (hemolizină);
seruri de cercetat.
Tehnica de lucru:
Sistemul hemolitic se prepară din părți egale de suspensie
eritrocitară şi ser hemolitic, după care se lasă 30 de minute la temperatura
camerei.
Pentru efectuarea testului se numără mai întâi hematiile din
sistemul hemolitic (valoarea reprezintă martorul sau numărul de hematii
la t0)
Se pun apoi în contact 0,5 ml sistem hemolitic şi 0,5 ml ser de
cercetat, după care amestecul se incubează 30 minute la 37 0C, se numără
hematiile, obținând valoarea la tx.
Aplicând formula CH50% = nH(t0) - nH(tx), aflăm număul de
hematii lizate de complement.
Evaluarea cantitativă a complementului total se mai poate realiza
prin ELISA.
Testele de seroneutralizare pot avea diverse utilizări pentru studiul

toxinelor bacteriene sau pentru identificarea anticorpilor antivirali
postvaccinali sau postinfecție, folosind culturile celulare.
Pot fi utilizate 2 metode: una calitativă, care atestă prezența sau
absența anticorpilor sau cea cantitativă, care permite evaluarea titrului.
Principiul metodei:
Amestecul format din suspensia virală în concentrație constantă
(cunoscută) și una sau mai multe diluții de ser este incubat 1 oră la 37OC,
după care este inoculat pe linie celulară sensibilă la infecția cu virusul
incriminat. Anticorpii specifici prezenți în proba de examinat
neutralizează acțiunea virusului, materializată prin lipsa modificărilor
78
specifice produse în substratul celular (fig. 41). În cazul reacției negative

(lipsa anticorpilor), virusul se multiplică și produce un efect citopatic sau
citolitic observat în urma examinării la microscopul optic.
Fig 41 – Schemă reacția de seroneutralizare

http://www.swine-influenza.com/uploads/pics/HAHT_en.png
Pentru realizarea reacției, materiale necesare sunt reprezentate

de: o linie celulară, soluție de tripsină – EDTA (0,25%), tulpina virală,
medii complexe de creştere pentru cuturi celulare, ser fetal bovin,
microplăci pentru culturi celulare, precum și martorii de reacție (ser
pozitiv și negativ). Materialul supus examinării este reprezentat de probe
de ser sanguin, incubat pe baie de apă la 56OC, timp de 30 de minute,
pentru inactivarea complementului.
A. Testul de seroneutralizare – metoda calitativă

Probele de seruri nediluate sunt puse în contact cu suspensia virală,
iar microplaca este agitată şi introdusă în termostat la 37 OC, timp de 1 oră
(CO2 opțional);
79
Peste acest amestec se adaugă o suspensie de celule obținută dintr-o

cultură celulară în monostrat tratată cu soluție de tripsină – EDTA, după
care placa este acoperită şi introdusă la 37OC la termostat cu CO2 (sau
acoperită cu folie de plastic și incuată în termostat normal). Înainte de
introducerea în termostat placa este agitată uşor pentru a obține o
distribuție egală de celule/fundul godeurilor.
La fiecare set de probe testate este obligatorie utilizarea
următoarelor controale:
Control virus – pentru verificarea concentrației de virus folosită în
testul de seroneutralizare, aceasta este diluată (1:10, 1:100,
1:1000). Din fiecare diluție se introduc câte 50 l/godeu în câte 5
godeuri.
Control celule - în cel puțin două godeuri se introduce numai
suspensie celule şi mediu specific de creștere;
Control ser pozitiv - ser cu atc specifici atg titru cunoscut;
Control ser negativ – ser care nu conține atc specifici atg;
Controlul citotoxicității serului – se inoculează câte 3 godeuri
fără suspensia virală;
În urma examinării la microscopul ranversat (x 100) la 48 – 72 ore
de la inoculare, testul este validat dacă:
 Virusul de control are un titru speciicat în protocol;
 Monostratul din godeurile martor celulă este nemodificat;
 Titrul serului pozitiv de control este cel cunoscut sau cu
diferență de cel mult o diluție (plus sau minus);
 Nu apare efect citotoxic pe serul testat citotoxicitate.
Serurile de testat în urma citirii rezultatelor se pot încadra în

următoarele categorii:
rezultat negativ – apariția unei modificări a substratului celular în
toate godeurile;
80
rezultat pozitiv – absența unei modificări a substratului celular în

toate godeurile;
rezultat dubios – absența sau prezența unei modificări a
substratului celular în cel puțin un godeu.
Probele încadrate în categoria dubioase se retestează.

Acest teste de seroneutralizare pot detecta absența sau prezența
anticorpilor neutralizanți antivirali, dar nu pot diferenția anticorpii
postvaccinali de cei postinfecțioşi. Când se obțin rezultate pozitive pe un
număr mic de seruri dintr-un grup de animale, pentru confirmare, se pot
folosi tehnici cantitative de seroneutralizare sau ELISA.
B. Testul de seroneutralizare – tehnica cantitativă – are ca

principiu punerea în contact a unor diluții de ser cu o suspensie virală și
incubarea timp de 1 oră, la 37OC, urmată de adăugarea unei supensii de
celule (în care virusurile implicate au capacitate de replicare și producere
a unor modificări) și o nouă incubare timp de 1 oră, la 37OC.
Titrul neutralizant al serului este expresia numitorului celei mai
mari diluții care produce o neutralizare aproape completă a efectului
citopatogen indus de virus.
C. Testul de seroneutralizare cu anticorpi marcați cu peroxidază

se aplică în medicina veterinară în diagnosticul serologic al pestei porcine
clasice (PPC).
Testul se realizează în microplăci cu godeuri, sterile, pentru
culturi celulare, conform diagramei de lucru.
Metoda constă în inocularea pe culturi celulare a amestecului
format din suspensia virală și diferite diluții din serul de cercetat (inactivat
la 56C, timp de 30 minute, pe baie de apă).
Evidențierea virusului rămas liber (neneutralizat) şi replicat în
sistemul celular se face cu ajutorul unui ser hiperimun cu anticorpi
specifici antivirali. Cuplul antigen-anticorp format se identifică cu ajutorul
unui conjugat format din atc anti-IgG de specie cuplați cu o enzimă
81
(peroxidază). Developarea se realizează cu ajutorul unui substrat

cromogen specific enzimei (3-amino-9 ethylencarbazole). Stoparea
reacției de culoare se realizează prin adăugarea de soluție NaCl în toate
godeurile. Citirea se face la microscop ranversat în lumină normală.
Interpretarea rezultatelor
Absența anticorpilor în serul de testat determină multiplicarea
virusului în citoplasma celulelor, care apare colorată în roşu închis –
reacție pozitivă.
Prezența anticorpilor în serul de testat inhibă replicarea virusului,
iar citoplasma celulelor are o uşoară tentă roz deschis – reacție negativă.
De exemplu, în cazul PPC, prezența anticorpilor în serul de testat la
animalele nevaccinate reprezintă contaminare cu virusul pestei porcine
clasice, fiind necesare investigații virusologice pentru evidențierea
acestuia.
Pentru aprecierea imunității postvaccinale (titrul de anticorpi
antivirali specifici produși după vaccinare), se realizează diluții ale serului
(de la 1:16 la 1:256), fiecare dintre acestea fiind inoculată în câte două
godeuri.
Titrurile 1:32 – 1:64 UN100 (unități neutralizante) conferă un grad
minim de rezistență față de o infecție cu 106 DIP100 (doze infectante virus
patogen), iar titrurile mai mari de 1:64 indică un grad de imunitate bun
sau foarte bun.
Testul de neutralizare în placă (fig. 42) este utilizat pentru

evaluarea titrului anticorpilor antivirali neutralizanți.
Mixul format din diferite diluții ale serului de testat și suspensia
virală, incubat la o anumită temperatură, pentru o perioadă diferită de
timp, se toarnă peste un monostrat confluent de celule. La suprafața
acestui strat se adaugă un strat de agar sau carboximetil celuloză.
Concentrația, exprimată în unități formatoare de plăci (plaque forming
units - PFU) poate fi estimată prin numărul de plăci (regiuni cu celule
infectate) formate după câteva zile.
82
Fig. 42 – Testul de neutralizare în placă

http://www.omicsonline.org/ArchiveJAA/2009 /November/03/images/JAA1.36Figure4.gif
Revelarea se poate realiza prin utilizarea unor anticorpi antivirali

specifici, cuplați cu substanțe colorate sau fluoresceină. Interpretarea se
face prin observare la microscop.
Este o tehnică mult mai sensibilă decât hemaglutinarea sau ELISA,
fără a afecta specificitatea, însă rezultatele se obțin după o perioadă mai
lungă de timp.
Testul de neutralizare a toxinelor (TNT) se utilizează pentru

identificarea atc antitoxici bacterieni prezenți în serurile animalelor
suspecte. TNT se bazează pe proprietatea acestor act de a proteja celulele
vii dintr-o cultură (macrofage sau LB) de acțiunea toxinelor bacteriene. În
acest scop, celulele sunt puse în contact cu serurile de cercetat, după care
este adăugată toxina și se incubează (fig. 43).
Fig. 43 – Testul de neutralizare a toxinelor

http://aws.labome.com/figure/te-207-4.png
Evaluarea rezultatelor presupune aprecierea viabilității celulare.

Celulele vii pot fi identificate cu ajutorul bromurii de difeniltetrazoliu, care
83
va fi metabolizat de acestea și celulele vor prezenta cristale de formazan

purpur. Celulele moarte sunt incolore. Anticorpii antitoxici neutralizează
toxina și reduc efectul asupra celulei. Plăcile cu culturi de celule pot fi
analizate cu un cititor pentru a determina absorbanța în fiecare godeu,
precum și concentrația la care toxina omoară jumătate dintre celule.
Imunocolorarea (marcarea sau colorarea prin metode imunologice)

este un termen general aplicat tehnicilor care utilizează anticorpi cuplați cu
enzime sau substanțe fluorescente (fluorofori, fluorocromi) în scopul
identificării proteinelor sau antigenelor specifice dintr-o probă.
Aceste teste sunt utilizate pentru stabilirea diagnosticului în
diferite boli infecțioase, dar nu numai, prin identificarea antigenelor sau
anticorpilor cu ajutorul unor anticorpi primari (specifici atg) sau
secundari (atc anti Ig de specie) cuplați fie cu substanțe fluorocrome
(reacția de imunofluorescență), fie cu o enzimă (teste imunoenzimatice),
fie cu markeri radioactivi.
REACȚIA DE IMUNOFLUORESCENȚĂ (IF)
Reacția de imunofluorescență este o reacție complexă care

permite identificarea antigenelor sau a anticorpilor dintr-o probă de
cercetat cu ajutorul unor atc I sau II cuplați cu substanțe fluorocrome, care
pot fi vizualizate utilizând un microscop cu fluorescență, fluorometru,
scanner cu fluorescență sau citometru în flux.
În laboratoarele clinice testele cu anticorpi marcați sunt utilizate
penru depistarea infecțiilor bacteriene, virale, micotice sau parazitare.
84
Principiul reacției este cel caracteristic reacțiilor serologice

(antigen - anticorp), în care atg se identifică utilizând atc specifici, iar atc,
cu ajutorul atg cunoscute.
În urma contactului dintre un antigen cunoscut și un ser de cercetat
pozitiv (care conține atc specifici atg), se formează un complex atg-atc
nefluorescent. Identificarea acestuia se realizează cu ajutorul unui
conjugat format din atc anti-Ig de specie cuplați cu o substanță
fluorescentă, soldată cu formarea unui complex atg-atc-anti-atc
fluorescent.
De ex.: pentru identificarea unor atc antirabici la un câine (atc I,
specifici), se utilizează un atg rabic cunoscut și un conjugat format din atc
anti-IgG de câine cuplați cu FITC.
Complexele fluorescente pot fi formate din:
antigene de identificat și anticorpi specifici marcați;
antigene cunoscute - anticorpi de identificat și a anti-anticorpi
marcați.
Vizualizarea complexelor fluorescente se

face cu ajutorul unui microscop cu fluorescență
(fig. 44). Acesta este identic cu microscopul fotonic
obișnuit, dar folosește ca sursă de lumină un
fascicul de raze ultraviolete, emise de o lampă de
sticlă de cuarț cu vapori de mercur, de tip HBO.
Fig. 44 – Microscop cu fluorescență

Aceste microscoape dispun de un sistem de filtre primare (de
excitație), situate între sursa de lumină și preparat și filtre secundare (de
protecție) situate între preparat și cel care examinează.
Substanțele fluorescente (fluorocromii) absorb lumina incidentă de
diferite lungimi de undă şi emit o lumină vizibilă diferită în funcție de
fluorocromul utilizat: albastră, verde, galbenă, roşie sau albă.
Fluoroforii sunt stimulați de lumina emisă la o anumită lungime de
undă, eliberând lumină cu o lungime de undă mai mare.
85
Cele mai utilizate substanțe fluorescente (fluorocromi sau

fluorofori) sunt reprezentate de:
izotiocianatul de fluoresceină (FITC) – derivat de
fluoresceină solubil în apaă, cu spectrul de emisie situat în jurul ƛ=488-
520 nm și caracterizat de radiații vizibile de culoare galben-verzuie;
izotiocianat de tertrametil rodamină (TRITC) – utilizat
cu precădere pentru marcările duble, cu spectrul de emisie situat pe un
domeniu mai larg (ƛ=555-580 nm) și caracterizat de radiații vizibile de
culoare galben - roșu-oranj;
Fluoroforii obișnuiți (fluoresceina - FITC) emit lumină la λ=550 nm.
Fluorocromii care emit lumini de undă mai mari (rodamina) sunt mai utili,
întrucât marea majoritate a probelor biologice manifestă autofluorescență
(colorație verzuie la expunerea la UV).
Pentru reacția de imunofluorescență sunt necesare următoarele
materiale:
Suportul solid – lame de microscop (obișnuite sau lab tek), plăci
din polistiren cu 96 de godeuri cu fundul plat (tip ELISA) pentru culturi
celulare infectate;
Antigen de cercetat – suspensii bacteriene, culturi celulare
infectate cu virusuri sau diferite materiale patologice; după etalare sub
forma unui frotiu și uscare (în cazul utilizării lamelor), dar și în cazul
culturilor celulare este absolut necesară fixarea (pentru asigurarea
aderenței antigenelor la suportul solid) prin utilizarea unor substanțe
conforme și după un protocol bine stabilit;
Serul cu anticorpi primari (specifici atg):
Ser cu atc specifici atg de identificat;
Ser cu anticorpi specifici atg de identificat marcat cu o substanță
fluorescentă;
Serul cu anticorpi secundari fluorescenți (anti-anticorpi) – ser
cu anticorpi anti-Ig de specie pentru anticorpii primari;
Microscop UV.
86
Conjugatul fluorescent poate fi format din atc I sau atc II cuplați cu

fluorocromi.
Reacția de imunofluorescență poate fi directă, indirectă și
sandwich.
1. Reacția de imunofluorescență directă (IFD) (fig. 45) permite
identificarea atg specifice în probele de cercetat cu ajutorul conjugatului
fluorescent format din anticorpi specifici marcați. Se utilizează curent în
laborator pentru diagnosticarea sau confirmarea rabiei, PPC.
Fig. 45 – Reacția de imunofluorescență directă și indirectă

http://a.static-abcam.com/CmsMedia/Media/direct-vs-indirect-immunofluorescence.jpg
2. Reacția de imunofluorescență indirectă (IFI) (fig. 45) se

utilizează pentru identificarea anticorpilor specifici dintr-o probă, cu
ajutorul unui atg cunoscut și a unui conjugat fluorescent anti-atc. Serul
de cercetat (atc I) se pune în contact cu un substrat celular (tisular) ce
conține atg specific atc de identificat. Acest complex atg-atc nefluorescent
format se identifică prin adăugarea unui conjugat fluorescent format din
atc II marcați cu un fluorocrom.
3. Reacția de imunofluorescență sandwich (IFS) permite
identificarea antigenelor prin aplicarea unui ser cu atc specifici acestora
(atc I), urmată de adăugarea unui ser cu atc anti-Ig de specie (atc II)
marcat cu fluorocromi.
Markerii fluorescenți pot fi aplicați într-o gamă largă de teste (IF,
imunohistochimia, imunocitochimia, etc.) pentru detectarea unor proteine
specifice (markerii tumorali celulari sau tisulari) sau de interes.
Avantajul imunofluorescenței constă în timpul relativ scurt de
reacție (2 -3 ore), fiind posibilă vizualizarea rapidă a rezultatelor pozitive
87
în țesuturi, culturi celulare, lichide biologice. Dezavantajul reprezentat de

dispariția fluorescenței (photobleaching) este diminuat prin folosirea unor
noi tipuri de fluorofori (quan - tum dots, nanoparticule cu viață lungă -
long-lifetime nanoparticles).
IFD ÎN RABIE
Rabia sau turbarea este o boală infecțioasă virală a mamiferelor

domestice și sălbatice, provocată de virusul rabic, un virus neurotrop din
genul Lyssaviridae, familia Rhabdoviridae, care se elimină prin saliva
animalelor infectate și care se poate transmite cu ușurință la om.
Principiul metodei presupune detecția antigenului rabic în
țesuturile infectate, în urma cuplării specifice a acestuia cu un ser (cu atc
antirabici) conjugat cu FITC şi a vizualizări în lumină UV a complexelor
virus – anticorp fluorescente.
În baza acestui principiu se poate efectua detecția directă a
antigenului rabic pe amprente de creier sau culturi celulare infectate.
Tehnica de lucru parcurge etapele de bază ale realizării unui
frotiu, cu unele mici diferențe.
1. Etalarea - pe lame de microscop numerotate, se realizează 2
grupuri de amprente. În acest sens, se recoltează fragmente de creier din
zonele de elecție: corn Amon, cerebel, scoarță, trunchi cerebral. La bovine
zonele de elecție sunt cerebelul şi trunchiul cerebral. La şoareci se
recoltează creierul întreg.
2. Uscarea se realizează la temperatura camerei sub o hotă de
aspirație. Expunerea la UV timp de 15 minute este o etapă obligatorie
pentru inactivarea virusului (distanța lamelor față de sursele de 20-40 W
trebuie să fie aproximativ de 20 cm).
3. Lamele se fixează în acetonă precongelată timp de 30 minute
în congelator, după care se scot şi se usucă la temperatura camerei.
4. Colorarea lamelor (reacția serologică propiu-zisă) se
realizează prin adăugarea conjugatului rabic fluorescent care conține atc
antirabici cuplți cu FITC.
88
Prepararea conjugatului se face după recomandările

producătorului. Conjugatul liofilizat se hidratează într-un volum de apă
distilată şi se centrifughează, pentru clarificare, timp de 10 minute la
2500-3000 rot/minut. Supernatantul este folosit la colorarea amprentelor
supuse diagnosticului.
Conjugatul rabic activ se depune pe unul din grupurile de
amprente, iar pe cealaltă se depune serul fluorescent inactivat termic ce
serveşte ca martor negativ.
Preparatele se introduc în baie umedă, la termostat 30 minute la
37 C.
0
4. Lamele se spală timp de 10 – 20 minute într-o baie cu TFS, pH

7,2-7,4, pe agitator magnetic, după care se introduc 2 minute în apă
distilată pentru clarificare.
Lamele uscate la temperatura camerei sunt montate cu câte o
picătură de glicerină tamponată și acoperite cu lamele degresate, care se
presează uşor pentru îndepărtarea bulelor de aer. Se scutură lama pe cant
pentru îndepărtarea excesului de lichid de montare.
Evaluarea rezultatelor şi modul de exprimare al acestora
Lamele se examinează cu atenție (cu obiectivul 20), pornind
dinspre marginile țesutului spre porțiunea centrală a amprentei. Zonele ce
oferă aspecte discutabile se examinează cu obiectivul 40X.
Este obligatoriu ca în ambele amprente colorate să existe țesut
supus diagnosticului.
Testul urmăreşte detecția prin examinare UV a corpusculilor
fluorescenți specifici (fig. 46, 47) ce sunt formați dintr-un amestec cu
structură omogenă din antigen viral şi material citoplasmatic al celulelor
anterior infectate.
Aceşti corpusculi fluorescenți specifici prezintă câteva
caracteristici care facilitează identificarea lor prin microscopie UV, astfel:
forma este ovală sau rotundă, uneori cu aspect de virgulă sau
semne de exclamare;
dimensiunea variază de la punctiform, până la dimensiunea unui
bob de mazăre (cei mai mari la bovine, cei mai mici la pisică);
89
o sunt apreciați ca specifici corpusculii cu diametrul de 2 - 6

mm (ob. x40 şi oc. x10);
Fig. 46 - IFD pozitiv lup Fig. 47 - IFD pozitiv câine
culoarea trebuie să fie specifică conjugatului activ utilizat

(verde sau verde gălbui) şi trebuie să existe uniformitate de culoare
pentru toți corpusculii fluorescenți specifici existenți în preparatul colorat
cu conjugat activ, datorită structurii comune a acestora;
sunt dispuşi extracelular, în marea lor majoritate, rareori
găsindu-se şi formațiuni intracelulare dispuse perinuclear;
În amprentele prelucrate din probe prelevate de la animale

infectate, corpusculii fluorescenți specifici sunt identificați pe amprenta
colorată cu conjugat activ, fiind absenți pe amprentele colorate cu conjugat
inactivat.
Combaterea rabiei la animalele sălbatice (vulpe) se realizează prin

administrarea de momeli care conțin tulpină virală vaccinală și tetraciclină
(TC) utilizată ca marker. TC se depune în oase şi dinți, putând fi
evidențiată prin executarea de secțiuni de 50-70 µm şi examinare la
microscopul cu lampă UV cu lungimea de undă de 390 nm. Depozitele de
tetraciclină se vor observa sub forma unor zone circulare de culoare
galbenă, în secțiunile din oase/ dinți.
90
Măsuri de protecția muncii
Având în vedere riscul infectării cu virusul rabic, măsurile de

protecție a muncii trebuie riguros respectate. In cazul animalelor de talie
mare suspecte de rabie, la laborator se trimite capul, iar în cazul
animalelor de talie mică, cadavrul întreg. Este de preferat ca acestea să fie
refrigerate, înainte de a fi transportate, iar transportul să se facă într-un
recipient cu ghiață. Capul sau cadavrul se vor împacheta imediat într-un
ambalaj dublu (saci de plastic etanşi sau saci de plastic şi cutii de carton),
aşezați într-un recipient refrigerator (dacă este posibil), iar transportarea
se va face în cel mai scurt timp. Dacă nu există posibilitatea trimiterii
imediate şi probele se congelează, decongelarea lor în laborator se va face
într-un loc închis, la care să nu aibă acces persoane străine sau animalele.
Deschiderea capului în vederea prelevării creierului se va face
luându-se următoarele măsuri:
- operatorul va avea echipament de protecție format din cizme din
cauciuc, halat, şorț, bonetă, ochelari de protecție, mănuşi de cauciuc;
- tot instrumentarul necesar (cuțit, bisturiu, fierăstrău, dălți,
foarfece, pense, etc.) va fi în stare bună de funcționare şi aşezat într-o tavă;
- operațiunea de scoatere a creierului se va face în sala de
necropsie, preferabil pe o masă separată de alte cadavre. În cazul în care
animalul suspect mai rămâne o perioadă în sală, în vederea efectuării şi a
altor examene, acesta va fi etichetat cu Atenție rabie;
- după recoltarea probelor, capul sau cadavrul împreună cu
ambalajul se vor distruge la crematoriu;
- masa, instrumentarul mare, mănuşile şi şorțul de cauciuc vor
dezinfectante cu soluție de sodă caustică 2%, clorură de var 5% sau alte
dezinfectante aprobate, iar instrumentarul se va autoclava;
- recipienții în care s-au prelevat probe (borcane, plăci Petri) vor fi
identificate prin etichetare sau înscriere cu creion dermatograf cu
numărului probei şi inscripția Atenție rabie. Aceeaşi atenționare se va
face şi pe notele de însoțire care se trimit altor laboratoare, pentru
investigații.
91
La efectuarea amprentelor din SNC în vederea examenului

imunofluorescenței directe, vor fi luate aceleaşi măsuri pentru
împiedicarea infectării personalului. Este obligatorie purtarea aceluiaşi
echipament, cu excepția cizmelor de cauciuc. Este obligatorie inactivarea
virusului cu lampa de ultraviolete, pentru evitarea difuzării virusului rabic
şi a infectării. Se interzice de asemenea, efectuarea operațiunilor de
recoltare a probelor, de preparare a serului antirabic fluorescent, de către
persoane care nu au fost instruite pentru asemenea operații.
Contraprobele rămase după efectuarea amprentelor şi inocularea
pe şoareci, vor fi păstrate în congelator, încuiate.
În cazul în care, în timpul lucrului, una sau mai multe persoane s-au
rănit sau au venit în contact direct cu materialul patologic, va fi anunțat
imediat şeful laboratorului sau cel ierarhic superior, persoanele respective
fiind trimise pentru efectuarea tratamentului antirabic. Aceeaşi măsură se
va lua şi cu personalul care a lucrat fără precauțiile de rigoare cu cadavre,
la care ulterior s-a stabilit diagnosticul de rabie.
Plaga sau suprafața cutanată contaminată va fi badijonată cu soluție
de cloramină şi apoi spălată abundent cu apă şi săpun alcalin.
Atât în sala de necropsie, cât şi în laborator, va exista în
permanență soluție proaspătă de cloramină sau clorură mercurică.
IFD ÎN PESTA PORCINĂ CLASICĂ (PPC)
Pesta porcină clasică (PPC) este o boală virală, produsă de un virus

din familia Flaviviridae, genul Pestivirus, extrem de contagioasă, care
afectează deopotrivă porcii domestici şi pe cei sălbatici, fiind răspândită la
nivel global. Boala nu este transmisibilă la om, dar poate genera pierderi
economice de mari proporţii.
Principiul metodei are în vedere evidențierea, prin examen
microscopic în UV, a celulelor infectate cu virus al pestei porcine clasice, la
care s-au atașat prin legături specifice antigen-anticorp, elementele unui
conjugat fluorescent specific (atc anti virus PPC cuplat cu FITC), ce
92
acționează ca marker de vizualizare a antigenului în citoplasma acestor

celule.
Materialul supus examinării:

- platou sternal (sau numai primele trei sternebre), proaspăt,
refrigerat sau supus la cel mult 1-2 congelări şi decongelări, în procesul de
recoltare, transport şi eventuală conservare până în momentul prelucrării;
- frotiuri din măduvă sternală, realizate în laboratoare mai mici sau
chiar în unități crescătoare, fixate în acetonă, proaspete, refrigerate sau
anterior congelate un interval de timp ce poate depăşi 6 sau chiar 12 luni.
Modul de lucru:
Se secționează cu satîrul a doua sau a treia sternebră în plan
transversal, pe mijlocul acestora. Se izolează cu bisturiul porțiunea de
sternebră secționată de musculatura intercostală învecinată. Se presează
în cleştele patent secțiunea de sternebră obținută, pentru a exprima
măduva roşie cu aspect tipic (consistență păstoasă, culoare roşu-cenuşie).
1. Pentru etalare, se recoltează măduva sternală exprimată prin
presarea sternului şi se trag 2-4 frotiuri în sens longitudinal. Frotiurile
bine realizate au aspectul unor dungi fine paralele;
2. Uscarea se realizează 20-30 de minute la temperatura camerei
sau 10-15 minute cu un ventilator;
3. Pentru fixare, frotiurile uscate se introduc acetonă la
temperatura camerei, timp de 20 de minute (aceasta poate fi refolosită de
mai multe ori fără risc de alterare a rezultatelor). Frotiurile fixate pot fi
lucrate imediat sau pot fi conservate la –8 -200C pentru perioade ce pot
depăşi 12 luni;
4. Colorarea (reacția serologică propiu-zisă) se realizează cu 80-
100 µl conjugat diluat (atc anti virus PPC cuplați cu FITC) în TFS
(conform prescripțiilor producătorului) la care se adaugă câțiva microlitri
din soluția de Evans-Blau 1/20.000 în TFS de lucru, până se obține o
nuanță slabă de albastru a conjugatului. Acest amestec se aplică pe
marcajul fiecărui frotiu, inclusiv pe frotiurile martor, se acoperă şi se
incubează 30-40 de minute la 370C;
93
5. Spălarea se realizează într-o baie cu TFS pH 7,2-7,4, timp de 30

minute, pe agitator magnetic, apoi lamele se introduc 2 minute în apă
distilată pentru clarificare.
După spălare, pe fiecare marcaj se depune câte o picătură de
glicerină tamponată și o lamelă.
Examinarea se face inițial cu un obiectiv x20 pentru încadrarea
zonelor de interes din porțiunea de frotiu colorată, apoi cu obiective x40
sau x50 pentru examinare curentă.
Validarea testului se face prin examinarea frotiurilor martor, la
care trebuie să se producă reacție pozitivă (martor pozitiv) și reacție
negativă (martor negativ).
Reacția pozitivă (fig. 48, 49) se caracterizarea prin observarea de
celule mari, cu nucleu rotund ce ocupă aproximativ 80% din suprafața
celulei (celule blastice într-un număr neobişnuit de mare), cu fluorescență
citoplasmatică în nuanța specifică fluorocromului (în cazul FITC verde
crud sau verde gălbui) depusă ca un inel perinuclear. Intensitatea culorii
este dependentă de cantitatea de antigen viral existentă în fiecare celulă
infectată. Alături de aceste celule infectate, în preparat vor fi prezente
obligatoriu şi celule nefluorescente, asemănătoare celor observate pe
frotiuri martor negativ.
Fig 48 – Reacția pozitivă IFD PPC, Fig 49 – Reacția pozitivă martor IFD PPC
Frotiu măduvă sternală FITC, x400 Frotiu măduvă sternală FITC, Evans Blau, x400
94
În reacția negativă nu se observă celule blastice cu fluorescența

descrisă anterior, aspectul fiind identic cu frotiul martor negativ.
IFI ÎN CORONAVIROZA FELINĂ
Infecțiile (portajul) cu coronavirus sunt destul de frecvente la

animale, însă, în anumite condiții, coronavirusul enteric felin (FCoV) poate
suferi modificări într-o mutantă extrem de periculoasă (virusul peritonitei
infecțioase felune - VPIF), agentul etiologic al peritonitei infecțioase feline
(PIF), o boală infecțioasă letală.
Această metodă este utilizată pentru punerea în evidență și titrarea
anticorpilor anticoronavirali în diferite materiale patologice recoltate de la
pisici suspecte de PIF (peritonită infecțioasă felină).
Materialele patologice sunt reprezentate de probe de ser, lichid
ascitic (fig. 50) sau lichid pleural.
Pentru metoda calitativă se utilizează antigen coronaviral (probe
de țesuturi din organe pozitive pentru coronavirus) etalat, uscat și fixat
(cu acetonă sau metanol la -200C) pe o lamă de microscop (fig. 51). Se
adaugă proba de testat (în care se supicionează prezența atc
anticoronavirali), se incubează o oră la 370C, se spală și se adaugă
conjugatul fluorescent format din ser cu anticorpi anti-Ig de pisică și FITC.
Se incubează o oră la 370C, se spală, se montează cu o picătură de glicerină
și se examinează la microscopul cu fluorescență.
Fig. 50 – Recoltare probe lichid ascitic Fig. 51– Prelucrare probe
95
Reacția pozitivă se vizualizează sub forma unei fluorescențe

citoplasmatice de culoare galben verzuie. Dacă se utilizează ca substrat
celular o suspensie de macrofage infectate (VPIF capătă tropism pentru
acestea și are capacitate de multiplicare în interiorul lor), fluorescența
apare ca un inel de culoare verde, bine conturat, la suprafața acestora (fig.
52).
Fig. 52 – IFI pozitivă pe macrofage infectate

din lichidul de ascită, FITC, x 400
Metoda cantitativă este utilizată pentru detectarea și cuantificarea

anticorpilor anticoronavirali, utilizând plăci de plastic cu 96 de godeuri
sau Lab-Tek chamber slide system (Nalge Nunc International) ce conțin
culturi celulare (linia PK – celule renale de porc) infectate cu o soluție de
coronavirus 1%. Cultura celulară utilizată trebuie să conțină 1,5-2 x 105
celule/ml. Plăcile infectate și verificate sub raportul multiplicării
coronavirusurilor (modificări celulare specifice) sunt fixate cu etanol pur
și spălate.
Pentru a aprecia titrul de anticorpi anticoronavirali, se prepară
diluții din materialele patologice de cercetat (ser, lichid ascitic, lichid
pleural, etc): 1/25, 1/125, 1/625, 1/3125, 1/16000. Pentru aceasta se
repartizează în primul godeu 240µl ser fiziologic, iar în următoarele 4 câte
200µl. Se adaugă în primul godeu 10µl ser de testat, se omogenizează
(1/25) şi se realizează diluții seriate cu câte 50µl până la ultima diluție
(diluții din 5 în 5).
În plăcile cu culturi celulare infectate se repartizează câte 50µl din
fiecare diluție a serurilor de examinat, în prima şi a doua coloană
96
repartizându-se diluția 1/25. Se incubează 30 minute la termostat, se

spală de 4 ori cu apă fiziologică şi apoi se repartizează câte 50µl conjugat
format din atc anti- IgG pisică-FITC. Se incubează, din nou, 30 minute la
termostat, se spală de 4 ori cu apă fiziologică şi se examinează la
microscopul cu lumina UV.
Fig. 53 – IFI pozitivă pe linia PK infectată Fig. 54 – Martor negativ – lipsa

cu coronavirus – fluorescență fluorescenței, x400
intracitoplasmatică, FITC, x400
În reacția pozitivă, fluorescența se observă dispusă intracitoplasmatic

(fig. 53) la celulele infectate cu coronavirus. În cazul reacției negative, aspectul
celulelor rămâne nemodificat, similar martorului negativ (fig. 54).
IFS ÎN CORONAVIROZA FELINĂ
Metoda sandwich poate fi utilizată pentru identificarea atg coronavirale

în probele de cercetat. În acest sens, se etalează materialul patologic de testat
(în care se suspicionează prezența coronavirusului) și se pune în contact cu un
ser ce conține atc anticoronavirali (obținut de la pisici sau preparat pe o altă
specie). După incubare, complexul atg (coronavirus) – atc (atc anticoronavirali)
se pune în evidență cu ajutorul unui conjugat fluorescent format din atc anti-Ig
de pisică (sau altă specie) cuplat cu FITC. Lamele se examinează tot la
microscopul UV, intrepretarea fiind similară IFD.
Testul de polarizare a fluorescenței (Fluorescence

polarization immunoassay - FPIA)) se bazează pe capacitatea moleculelor
97
de fluoresceină de a emite lumină plan polarizată după excitare. Este o

metodă rapidă de screening prin care se pot identifica haptene (atg
incomplete) sau medicamente într-o probă de material biologic supusă
testării.
Antigenul din probă este incubat cu anticorpi specifici acestuia,
nemarcați, în exces. Peste acest mix este adăugat un conjugat cu anticorpi
specifici atg marcați cu fluoresceină și amestecul este supus acțiunii
luminii plan polarizate (490 nm), moleculele de fluoresceină emițând
lumină cu lungime de undă mai mare (520 nm). Complexele imune de
dimensiuni mari marcate cu FITC se rotesc mai încet, rămânând în emisia
de lumină, în timp ce cele mici se rotesc mai repede, fiind depolarizate.
Intensitatea fluorescenței este măsurată cu un fluorometru (analizor de
polarizare a fluorescenței), cantitatea antigenului din probă fiind evaluată
cu ajutorul unei scale etalon.
Mecanismul reacției are la bază comportamentul unei molecule în
soluție (se roteşte randomizat). Dacă o moleculă este marcată cu
fluorocrom, timpul de rotaţie la un un unghi de 68,50 se determină prin
măsurarea intensităţii luminii polarizate în planuri orizontale şi verticale.
Astfel, o moleculă mare este limitată să emită mai multă lumină într-un
singur plan (mai multă polarizare), comparativ cu o moleculă mică ce se
roteşte rapid şi emite mai multă lumină depolarizată.
În diagnosticul brucelozei, se utilizează un antigen (aprox. 22 kD)
de B. abortus marcat cu izocianat de fluoresceină, care, pus în contact cu
serul diluat sau cu sângele integral, permite evaluarea titrului de anticorpi
în aproximativ 2 minute, utilizând fluorometrul.
Reacția poate fi realizată în eprubete sau plăcuţe cu 96 de godeuri.
Serul de bovine se diluează 1/100 sau, dacă este sânge pe EDTA, se
utilizează diluția 1/50 în 0,1M TFS, pH 7,2, ce conţine 0,15 M clorură de
sodiu, 0,1% azidă de sodiu şi 0,05% dodecil sulfat de litiu (PBSAL).
Se realizează o citire iniţială pentru a evalua gradul de difuzare a
luminii, după omogenizare. După adăugarea unui antigen marcat și titrat
corespunzător, se omogenizează şi se realizeaă a doua citire, după două
minute. Rezultatele se exprimă în unităţi de minipolarizare, (mP). Testul
98
se calibrează cu seruri standard (de referință), la care se adaugă seruri

mortor puternic pozitive, slab pozitive şi negative, precum şi serul cu atc
anti tulpină vaccinală S19.
Sensibilitatea şi specificitatea de diagnostic a acestei metode pentru
bruceloza bovină similare celor pentru ELISA competitiv. Specificitatea de
diagnostic pentru bovinele recent vaccinate cu B. abortus S19 este în jur de
99 %.
ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)
Reacția imunoenzimatică este o metodă de diagnostic utilizată în

laboratorul de imunologie pentru a detecta prezența unor anticorpi sau
antigene dintr-o probă.
Este o reacție cantitativă foarte sensibilă, cu aplicații diverse.
Principiul reacției este reprezentat de interacțiunea dintre
antigene și anticorpi marcați cu o enzimă, în prezența substratului
enzimatic specific.
Materiale necesare:
Suportul solid pe care se realizează adsorbția antigenelor sau
anticorpilor (microplăci de polistiren cu 96 de godeuri fixe sau cu stripsuri
detaşabile, cu fundul în U sau plat);
Antigenul poate fi reprezentat de extracte polizaharidice sau
suspensii bacteriene ultrasonate, suspensii virale, antigene de diferite
origini purificate (în funcție de scopul utilizării testului);
Anticorpii pot fi de 2 tipuri:
anticorpi specifici față de antigenul folosit în reacție,
prezenți fie în serul animalelor bolnave (stabilirea diagnosticului prin
decelarea anticorpilor), fie în serul hiperimun al animalelor inoculate cu
antigenul respectiv (de referință) – anticorpi primar;
anti-anticorpii (antiimunoglobuline de specie) față de Ig
speciei pe care s-a preparat anticorpul specific față de antigenul de
identificat – anticorpi secundari;
Enzimele folosite mai frecvent drept markeri sunt:
99
fosfataza alcalină (obținută din mucoasa de vițel);

peroxidaza (obținută din hrean);
glucooxidaza;
beta galactozidaza (obținută din E. coli);
aceste enzime se cuplează cu imunoglobulinele prin
intermediul unui agent de cuplare (glutaraldehida);
Conjugatul enzimatic poate fi format din atc I sau atc II cuplați

cu enzime.
Substratul specific enzimei folosite:

fosfataza alcalină - para-nitrofosfat, 5 bromo-4 cloro-3
indolil fosfatul plus albastru de tetrazoliu;
peroxidaza - acid 5 aminosalicilic, diaminobenzina sau
ortofenilendiamina;
beta galacozidaza – orto-nitrofenil-galactopiranozida;
substraturile sunt cromogene și, în urma acțiunii enzimei
asupra acestora, se produce o modificare de culoare;
Soluția de spălare – concentrată (10x, 100x);
Soluția de stopare – acid sulfuric sau acid clorhidric
Spectofotometru (cititor ELISA)– la o anumită lungime de undă,
intensitatea culorii este tradusă în unități de densitate optică (OD sau
DO) (fig. 55).
Fig. 55 – Linia ELISA: cititor (spectofotometru), spălător automat, incubator

(termostat) cu agitatot
100
În funcție de elementul pe care dorim să îl identificăm (atg sau atc),

s-au descris mai multe tipuri de teste imunoenzimatice.
I. ELISA directă (fig. 56) se foloseşte pentru determinarea
concentrațiilor de antigene din probă.
Fig. 56 – Schema ELISA direct

http://thumbs.dreamstime.com/z/elisa-immuno-assay-reaction-scheme-vector-illustration-44287409.jpg
Metoda de lucru:
1. Se tapetează suportul solid cu anticorpi specifici atg de
identificat, cu titru cunoscut, utilizat pentru configurarea curbei standard,
pe baza căreia se poate calcula concentrația antigenelor din probă;
Anticorpii sunt fixați şi devin imobili în 18-20 ore la +40C sau 3
ore la 370C;
Sunt disponibile kituri comerciale în care plăcile sunt deja
tapetate cu anticorpi;
2. Se spală microplaca (numărul de spălări și cantitatea utilizată
diferă în funcție de producător);
3. Se repartizează proba se antigen de cercetat şi se incubează 1-
2 ore la temperatura de 370C, după care se spală microplaca;
4. Se adaugă conjugatul enzimatic format din anticorpi specifici
atg de identificat cuplați cu enzimă şi se lasă 30 minute la temperatura
de 370C;
5. După ultima spălare, se adaugă substratul enzimatic specific şi
se lasă la întuneric 30 minute la temperatura camerei;
101
6. Se adaugă soluția de stopare şi în cel mult 10 minute se face

citirea.
II. ELISA indirectă (fig. 57) se foloseşte pentru determinarea

concentrațiilor de anticorpi din ser.
1. Se tapetează suportul solid cu antigen (specific atc de
identificat) cu o concentrație cunoscută, utilizat pentru configurarea
curbei standard pe baza căreia se poate calcula concentrația anticorpilor
din probă;
Antigenul este fixat şi devine imobil în 18-20 ore la +40C sau 3
ore la 370C;
Sunt disponibile kituri comerciale în care plăcile sunt deja
tapetate cu antigen;
Fig. 57 – Schemă ELISA indirect

http://www.leinco.com/includes/templates/LeincoCustom/images/IndirectElisa.gif
2. Se adaugă proba de ser de cercetat (în care se suspicionează

prezența atc specifici) ca atare sau diluată (fig. 58a) şi se incubează 1-2 ore
la temperatura de 370C, după care se spală microplaca;
3. Se adaugă conjugatul enzimatic format din anticorpi anti-Ig de
specie cuplați cu enzimă şi se lasă 30 minute la temperatura de 370C;
4. După ultima spălare se adaugă substratul enzimatic specific
(fig. 58b) şi se lasă la întuneric 30 minute la temperatura camerei;
102
5. Se adaugă soluția de stopare (fig. 58c) şi în cel mult 10 minute

se face citirea.
a b c
Fig. 58 – Reacția ELISA etape: a – repartizarea serurilor de testat și a martorilor, b –

adăugarea conjugatului, c – adăugarea soluției de stopare
Enzima acționează ca un amplificator şi chiar în cantități mici

moleculele de enzimă vor produce multe molecule semnal.
III. ELISA Sandwich (fig. 59) se utilizează pentru detecția atg într-
o probă de testat.
1. Se utilizează un suport solid ce conține anticorpi de captare
specifici atg de identificat;
2. Se repartizează proba se antigen de cercetat şi se incubează 1-2
ore la temperatura de 370C, după care se spală microplaca;
Fig. 59 – ELISA sandwich

https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTYhf_YgZt9B3V8HUztOCzIkGIAP7hfZobBokWQShAN23qwqW1PHA
103
3. Se adăugă un ser cu anticorpi primari specifici nemarcați şi se

incubează 1 oră la temperatura de 370C, după care se spală microplaca;
4. Se adaugă conjugatul enzimatic format din anticorpi
secundari (atc anti-Ig de specie) cuplați cu enzimă şi se lasă 30 minute
la temperatura de 370C, după care se spală placa;
5. Se adaugă substratul enzimatic specific şi se lasă la întuneric
30 minute la temperatura camerei;
6. După adăugarea soluției de stopare, se face citirea în cel mult 10
minute.
IV. ELISA de competiție (fig. 60) este o metodă care permite atât
identificarea atc, cât și a atg. În cazul metodei de identificare și cuantificare
a atg:
1. Se tapetează placa cu antigene;
2. Se adaugă amestecul format din antigene din proba de testat și
anticorpi nemarcați și se incubează (cu cât este o cantitate mai mare
de antigene în proba de testat, se vor forma mai multe complexe atg-
atc și vor rămâne mai puțini anticorpi disponibili să se cupleze cu
antigenele din placă);
3. Plăcile se spală – complexele atg-atc nefixate sunt eliminate;
4. Se adaugă un conjugat format din anticorpi secundari (anti-Ig de
specie) cuplați cu o enzimă;
5. După spălare, se adaugă substratul specific care este transformat de
către enzimă şi se lasă la întuneric 30 minute la temperatura camerei.
Fig. 60 – Elisa de competiție

http://image.slidesharecdn.com/vishwanthautosaved-130304233213-phpapp02/95/elisa-ria-23-638.jpg?cb=1362440056
104
6. Se adaugă soluția de stopare şi în cel mult 10 minute se face citirea. În

acest caz, intensitatea culorii este invers proporțională cu cantitatea de
antigene din probă.
IMUNOCROMATOGRAFIA ÎN FLUX LATERAL
O aplicație a testelor imunoenzimatice este imunocromatografia în

flux lateral, o tehnică utilizată pentru a evalua prezența sau absența unuia
sau mai multor antigene într-o probă de cercetat, fără echipamente
sofisticate de identificare. Este o metodă calitativă mult mai scurtă decât
ELISA, utilizată pentru detecția rapidă a virusurilor, bacteriilor, paraziților,
miceților.
Tehnologia se bazează pe o serie de elemente (hârtie poroasă sau
polimeri de sinteză) cu capacitate de a transporta spontan fluide (urină,
sânge produse biologice). Validarea testului se face foarte ușor, prezența
martorului pozitiv ajutând la interpretarea reacției și la controlul calității
testului.
Anticorpii de captură sunt imobilizați la suprafața unei membrane
poroase (nitroceluloză, nylon, teflon), iar materialul absorbant plasat sub
membrană are rolul de a atrage reagenții lichizi din probă, permițând
separarea componentelor nereactive de complexele antigen anticorp
atașate.
Fig. 61 – Imunocromatografie
http://pubs.rsc.org/services/images/RSCpubs.ePlatform.Service.FreeContent.ImageService.svc/ImageService/Articleimage/2015/RA/c4ra15036h/
c4ra15036h-f2_hi-res.gif
105
Primul element (sample pad) acționează ca un burete și reține

excesul de fluid (fig. 61). Fluidul absorbit migrează spre al doilea element
(conjugate pad) în care este stocat conjugatul – anticorpi specifici atg de
identificat cuplați cu particule bioactive (latex sau particule metalice
coloidale). Proba de fluid absorbită dizolvă matricea, eliberând conjugatul,
iar în timpul transportului prin structura poroasă are loc reacție dintre
antigenul din probă și anticorpi. Al treilea element are ai multe zone
denumite linii (fig. 62a) sau buline (fig. 62b) în care sunt imobilizate alte
molecule de anticorpi.
Pe măsură ce complexele antigen (din probă) – conjugat ajung în
aceste zone, anticorpii de captură le recunosc și le fixează, producând
modificarea de culoare.
a b
Fig. 62 – Interpretare teste imunocromatografie
http://www.gobizkorea.com/att/cat/BIOFOCUS/tp_html/img/BIOFOCUS_cat_27_small_img_2.jpg
http://www.idexx.com.au/images/en_au/smallanimal/snap/png/triple-interpreting-results.png
În mod normal, pe aceste teste se disting 2 zone (fig. 62):

 C - de control - conține anticorpi care cuplează latex sau particule
de aur neconjugate pentru a confirma veridicitatea testului;
 T – testul – conține anticorpi de captură specifici antigenului de
identificat.
Marea majoritate a acestor teste sunt calitative.
Metoda Sandwich presupune interacția dintre antigenul din probă
și anticorpii specifici marcați cu subtanțe colorate (latex – albastru,
particule nanometrice de aur - roșu).
Metoda de competiție presupune competiția antigenului nemarcat
din probă și antigene marcate pentru situsurile de cuplare ale anticorpilor
specifici de captură fixați în membrană. Linia test conține anticorpi
106
specifici țintei. Antigenul nemarcat din probă va bloca situsurile de legare

de pe anticorpi, împiedicând fixarea paticulelor colorate. În acest caz,
reacția negativă se traduce prin apariția unei linii colorate.
Testele cantitative permit determinarea cantității antigenului din
probă prin evaluarea intensității culorii liniei cu ajutorul unor cititoare în
flux lateral (Detekt Biomedical L.L.C.) și a unor algoritmi de calcul.
Chemiluminiscența (CL) este, de asemenea, o metodă foarte

populară, bazată pe emisia de lumină produsă în urma descompunerii
unui substrat și trecerea de la starea de excitație la starea de masă. Spre
deosebire de imunofluorescență care utilizează radiația incidentă, în
chemiluminiscență, energia este generată de o reacție chimică, cel mai
frecvent de oxidare. Datorită autoreactivității scăzute a probelor biologice
(background), CL este mai sensibilă, cu limite de detecție de ordinul attomol
(10-18) sau zeptomole (10-21). Citirea reacției produsă în tuburi sau plăci de
mirotitrare se face direct, cu ajutorul unui luminometru sau indirect, prin
înregistrarea semnalului luminos pe un film fotografic.
Ca și principiu, chemiluminiscența poate utiliza marcarea directă sau
un compus chemiluminescent poate fi utilizat ca substrat pentru un
imunoreactant (atg sau atc) marcat cu o enzimă. Cei mai utilizați compuși
chemiluminescenți sunt esterii de acridinium și derivații de isoluminol.
Compușii de acridinium pot fi conjugați cu anticorpii sau cu
antigenele, fiind posibilă inducerea unei reacții chimice, soldată cu
producerea de lumină, prin adiția de hidroxid de sodiu sau peroxid de
hidrogen.
Metodele care utilizează isoluminol (fig. 63) sunt foarte sensibile,
reacția desfășurându-se prin adăugarea unui mix de peroxid de hidrogen și
un catalizator peste proba marcată cu isoluminol.
Atg de interes interacționează cu atc (nemarcați) specifici acestora
(atc I), iar complexul atg-atc nemarcat este recunoscut de către atc II marcați
cu peroxidază.
Complexul enzimatic format catalizează conversia substratului
chemiluminescent într-un reactiv sensibilizat, în vecinătatea molecule de
107
interes, care, la oxidarea ulterioară cu peroxid de hidrogen produce un

carbonil triplet care emite lumină, la descompunerea într-o singură
grupare carbonil.
Fig. 63 – Chemiluminiscența
https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSkBimJCyUlt0a1wZqp-zVjmEfER3i_Ocb52KN9IUTDL98FPudr7Q
CL a fost aplicată în medicina legală și criminalistică, fierul din

sânge comportându-se ca un catalizator care reacționează cu luminolul și
peroxidul de hidrogen, producând o luminiscență albastră timp de 30 de
secunde.
Reacțiile radioimunologice (Radioimmunoassay -

RIA) au la bază o tehnică in vitro foarte sensibilă pentru cuantificarea
antigenelor (utilizată în endocrinologie, diagnosticul alergiilor – RAST -
radioallergosorbent test) cu ajutorul anticorpilor, iar radiobinding assay
permite titrarea anticorpilor cu ajutorul antigenelor.
Tehnica a fost introdusă de Berson și Yalow, în 1960, pentru
dozarea insulinei plasmatice umane.
Radioizotopii cei mai utilizați sunt cei cu iod (I125, I131), tritiu (H3)
sau carbon (C14). Deși este foarte sensibilă și specific, marea majoritatea a
acestora emit radiații gama și beta, necesitând o aparatură specială de
identificare și cuantificare (gamma și beta counter).
Sunt 2 tipuri de metode:
1. Analiza prin competiție care are la bază competiția dintre un
antigen radiomarcat și un antigen de cercetat, pentru situsurile
108
anticorpilor specifici. În prima etapă, o cantitate cunoscută de anticorpi

specifici va fi incubată cu antigenul de identificat, urmată de adăugarea
unei cantități cunoscute de antigen marcat. Interpretarea reacției se
realizează prin măsurarea radioactivității antigenului marcat liber (free)
de cel marcat din complexele antigen-anticorp (bound).
Această reacție se poate desfășura în fază lichidă (metoda
radioimunologică), de regulă pentru dozarea antigenului sau în fază
solidă (RIST – radio-immuno-sorbent-test) utilizată pentru dozarea IgE
totale. Competiția are loc între IgE de dozat și IgE marcată, pentru a ocupa
situsurile de cuplare ale unui anticorp anti-IgE fixat pe un suport.
Aprecierea radioactivității complexelor marcate se realizează cu ajutorul
unei curbe etalon obținută din cuantificarea IgE în soluții cu concentrații
cunoscute.
2. Imunoradiometria, descrisă de Hales și Miles în 1968, are la
bază utilizarea anticorpilor marcați radioactiv, pe sistemul sandwich. Pe
scurt, prima etapă vizează interacțiunea dintre anticorpii de captură, fixați
pe un suport solid și antigenul plurivalent, cu formarea unor complexe
antigen – anticorp nemarcate Peste acest amestec se adaugă o soluție de
anticorpi specifici purificați marcați cu iod. Evaluarea cantității de antigen
se realizează prin determinarea radioactivității complexului anticorp-
antigen-anticorp marcat radioactiv, cu ajutorul unei curbe etalon.
TEHNICI DE IMUNOHISTOCHIMIE
Imunohistochimia (IHC) este o metodă de detectare a atg

(proteine) în celule din secțiuni tisulare pe principiul cuplării specifice a
atc cu antigenele din țesuturi biologice.
Termenul IHC provine de la imuno (atc utilizați), histo (țesut),
chimie (reacții chimice). Procedura a fost concepută și implementată de Dr.
Albert Coons în 1941.
Metoda imunohistochimică are utilizări multiple în diagnostic şi
cercetare.
109
Vizualizarea reacției antigen – anticorp poate fi realizată prin mai

multe metode:
Cu ajutorul anticorpilor conjugați cu enzime (peroxidaza, fosfataza
alcalină) - immunoperoxidase staining, metode imunoenzimatice,
caraterizate de modificarea colorimetrică a unui substrat în urma
acțiunii enzimelor;
Cu ajutorul anticorpilor cuplați cu o substanță fluorescentă
(fluoresceina sau rodamina) – imunofluorescența.
Imunohistochimia presupune parcurgerea mai multor etape:

Prelucrarea probelor de testat este foarte importantă, întrucât
trebuie conservată morfologia celulelor, arhitectura țesuturilor și
antigenitatea epitopilor țintă. De aceea, toate etapele parcurse de la
recoltare și până la colorare trebuie realizate cu cea mai mare atenție.
Fixarea imobilizează antigenele, cu menținerea structurii normale
a celulei. Substanțele utilizate depind de sensibilitatea epitopilor precum
şi a anticorpilor.
Paraformaldehida conservă structura celulară, dar poate reduce
antigenitatea unor componente. O altă opțiune este utilizarea solvenților
organici (metanol, etanol şi acetonă) care îndepărtează lipidele în timpul
deshidratării şi precipită proteinele din arhitectura celulară.
Se mai poate utiliza fixarea prin imersie cu formol tamponat neutru
(FTN) 10% timp de 18-24 ore sau perfuzie via sistem vascular (cord sau
aorta abdominală), în scopul obținerii organe de șobolan fixate cu
paraformaldehidă 4%.
Țesuturile pot fi utilizate ca atare sau secționate. Înainte de
secționare, țesuturile pot fi incluse în parafină sau un criomediu.
Secționarea se poate realiza cu ajutorul unui microtom sau
criotom la grosimea dorită (5-8 µm).
Etalarea secțiunilor se realizează pe lame de microscop, preferabil
tapetate cu APES (amino-propyl-tri-ethoxy-silane), fiind încărcate pozitiv.
Preparatele se usucă pentru îndepărtarea apei (temperatura camerei
peste noapte sau incubare la 60°C câteva ore). Secțiunile obținute la
110
criostat se introduc în glicerol metacrilat (GMA) care prezintă unele

aventaje: este miscibil cu apa (nu mai necesită etapele de deshidratare și
rehidratere), realizează o prezentare adecvată a antigenelor, permite
conservarea morfologiei celulare și obținerea unor secțiuni foarte fine (1-2
µm), fiind foarte utilă în biopsii.
În funcție de metoda de fixare și conservare a țesutului, pot fi
necesare etape suplimentare: deparafinarea, hidratarea, demascarea
epitopilor pentru facilitarea contactului cu anticorpii specifici care trebuie
să îi recunoască.
Deparafinarea și rehidratarea sunt obligatorii înainte de colorare,
prin tratare cu xilen și etanol în diferite concentrații și proporții.
Permeabilizarea este necesară pentru a facilita accesul
anticorpilor către epitopii intracelulari, transmembranari sau
citoplasmatici. În acest scop se pot utiliza: acetona şi metanolul (nu sunt
compatibile cu toți anticorpii), detergenții de tip Triton sau NP-40 (dizolvă
parțial membrana nucleară, dar pot distruge proteinele membranare).
Soluții de tipul Tween 20, Saponin, Digitonin și Leucoperm
(permeabilizatori membranari care crează pori suficient de mari pentru
pasajul anticorpilor, fără a dizolva membrana) se pretează atât pentru
antigenele citoplasmatice sau de pe partea citoplasmatică a membranei,
cât și pentru antigenele nucleare solubile.
Demascarea epitopilor este utilă în cazul fixării cu formol pentru
descoperirea situsurilor antigenice mascate de către punțile de metilen. Se
poate realiza prin căldură sau enzimatic (tripsină).
În funcție de tipul de țesut și de metoda de identificare a
antigenelor, enzimele și biotina endogenă trebuie blocate, înainte de
punerea în contact cu anticorpii specifici. Deși aceștia manifestă o aviditate
preferențială pentru epitopii specifici, se pot cupla parțial şi cu proteine
nespecifice (situsuri reactive), producând colorarea fundalului celular și
mascând detecția antigenului. Pentru a reduce acest aspect, în IHC,
imunocitochimie și alte metode asemănătoare, probele sunt incubate cu
soluții tampon care blochează situsurile reactive pe care s-ar fixa atc
primari și secundari: albumină serică bovină (BSA) sau gelatină.
111
În IHC se pot utiliza mai multe tipuri de anticorpi:

Anticorpii policlonali sunt mixuri heterogene de anticorpi care
recunosc mai mulți epitopi, spre deosebire de anticorpii monoclonali care
sunt specifici unui singur epitop.
Anticorpii primari sunt specifici unui antigen de interes și sunt
nemarcați (neconjugați), în timp ce anticorpii secundari sunt anti -
imunoglobuline de specie pe care au fost preparați anticorpii primari. Atc
II sunt, de regulă, conjugați de o moleculă linker (biotina), care apoi
recrutează molecule reporter sau sunt direct conjugați cu molecula
reporter.
Moleculele reporter, în funcție de metoda aleasă (cromogenică
sau IF), pot fi reprezentate de o enzimă sau un fluorofor.
În cazul reporterilor cromogenici, enzima reacționează cu un
substrat producând o modificare de culoare ce poate fi analizată cu
ajutorul microscopului. Fosfataza alcalină şi peroxidaza (horseradish
peroxidase - HRP) sunt enzimele cele mai folosite pentru marcarea
anticorpilor specifici, în vederea detecției proteinelor.
Substratele folosite sunt DAB (Diaminobenzidina) sau BCIP/NBT
(nitro-blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3’-indolyphosphate) ce produc
culoarea maro sau vișinie.
Reacția de culoare cu DAB poate fi accentuată cu ajutorul
nichelului, producând o colorare în vișiniu închis/negru.
Unele celule (eozinofile, eritrocite) sau țesuturi conțin peroxidaze
endogene, care vor reacționa cu soluția substrat (peroxid de hidrogen sau
DAB), producând rezultate fals pozitive. Acest inconvenient poate fi redus
prin pre-tratarea probei cu peroxid de hidrogen (diluat în metanol),
înainte de incubarea cu conjugat enzimatic (anticorpi – HRP). În cazul
existenței unor markeri proteici de suprafață foarte sensibili la
metanol/peroxid de hidrogen (scade afinitatea tinctorială a situsurilor
antigenice, în special pe secțiunile congelate), se recomandă diluarea în
TFS.
112
Reporterii fluorescenți sunt molecule organice mici de tipul FITC

(izotiocianat de fluoresceină), TRITC (tetrametil rodamina), AMCA (7-
aminocoumarina) sau produse comerciale Alexa Fluors and Dylight Fluors.
Pentru ambele metode, analiza densitometrică a semnalului poate
oferi date cantitative, existând o corelație între nivelul semnalului reporter
și gradul de exprimare sau localizare a proteinelor.
Amplificarea semnalului se utilizează pentru a adăuga mai multă
enzimă sau fluorofor la țesutul de interes și poate fi realizată prin
conjugarea atc II cu mai multe molecule de biotină, care pot recruta
complexe de avidin, streptavidin sau NeutrAvidin protein cuplate cu
enzime. Diferența între cele 3 constă în afinitatea individuală de legare la
țesuturile țintă endogene, soldate, uneori, cu legări nespecifice colorarea
nespecifică a fundalului celular.
Tehnica avidină - biotină utilizează afinitatea avidinei (proteină din
albușul de ou) pentru biotină (enzimă co-factor în reacțiile de carboxilare).
Avidina are patru situsuri de cuplare cu biotina, iar legăturile sunt
ireversibile. Atc primari recunosc și se cuplează cu proteina de interes
(atg). Complexul atg – atc I interacționează cu atc II biotinilați, după care
se adaugă un conjugat avidină - enzimă biotinilată. În consecință, pe
antigenul țintă se va fixa o cantitate mai mare de enzimă.
Există însă și țesuturi care dispun de biotină endogenă (rinichi,
ficat, creier, prostată, colon, intestin, testicole), producând colorarea
nespecifică a fundalului.
Tehnica streptavidină - biotină utilizează interacțiunea dintre
streptavidină (similar cu avidina) și biotină. Această substanță produce
mai puțină colorare nespecifică ca avidina, fiind ne-glicozilată și nu
interacționează cu lectine sau alți carbohidrați fixatori de proteine.
Primele 2 metode sunt surclasate de o tehnică ce utilizează un
conjugat format din atc II și un complex polimer-enzimă. Este, astfel,
eliminată o etapă şi este eliminată problema legată de biotina endogenă.
O metodă îmbunătățită (EXPOSE detection kits) utilizează molecule
mici de detecție (linker) care pot penetra țesuturile mai eficient decât
113
complexele mari utilizate în metoda clasică, fiind astfel o metodă mai

sensibilă.
Tyramide signal enhancing (TSE) este una dintre cele mai eficiente
metode de amplificare, în mod special, pentru detectarea antigenelor
relativ dispersate, dificil de detectat prin alte metode și este utilizată
pentru îmbunătățirea rezultatelor obținute cu anticorpii slab-performanți.
Metoda se bazează pe o reacție catalizată de peroxidază (pentru
atașarea covalentă a tiraminei din conjugatul tiramină-proteină într-o
zonă adiacentă proteinei de interest), după aplicarea atc I și a conjugatului
atc II -HRP. Pentru amplificarea semnalului se utilizează un conjugat de tip
atc – enzimă/fluorofor direcționat spre partea proteică a conjugatului
tiramină-proteină.
Dezavantajul constă în prețul crescut al kitului și durata mare de
timp pentru parcurgerea tuturor etapelor.
Substanțele de contrast se folosesc pentru a evidenția colorația
primară. Unele metode prezintă specificitate pentru anumite clase de
biomolecule, iar altele colorează toată celula: hematoxilina, DAPI
(colorează nucleul celular în albastru), colorația Hoechst (ADN se
colorează în albastru-verzui), nuclear fast red (colorantul Kernechtrot
colorează acizii nucleici în roșu).
După prelucrarea probelor după protocoale specifice, lamele se
montează și se examinează la microscop, urmărind identificarea
antigenelor de interes (fig. 64).
Fig. 64 – IHC, antigen distemper în epiteliul plexului coroid

http://vet.uga.edu/ivcvm/courses/VPAT5316/02_neuropath/02_cyto/images/F11761.jpg
114
Metoda directă este o metodă one-step ce utilizează anticorpi

specifici atg de identificat marcați (conjugat atc specifici –
fluorocrom/enzimă) care se leagă direct de antigenul țintă din secțiunile
de țesut. Deși este o metodă simplă și rapidă, sensibilitatea este scăzută,
datorită semnalului scăzut de amplificare. În cazul IF proba se examinează
la microcopul UV, iar în cazul utilizării unei enzime, obligatoriu trebuie
adăugat un substrat spcific acesteia.
Metoda indirectă (fig. 65) utilizează anticorpi primari (specifici
atg) nemarcați care interacționează specific cu antigen din țesut. După
prima incubare, se adaugă și atc secundari (atc anti IgG de specie pe care
au fost preparați atc I) marcați cu enzime sau fluorocromi. Aceștia
recunosc și interacționează cu complexele atg-atc specifici nemarcate. Este
o metodă mai sensibilă întrucât semnalul de amplificare datorat legării
mai multor atc II la fiecare atc I este mai mare.
Fig. 65 – IHC – metoda indirectă

http://www.leinco.com/includes/templates/LeincoCustom/images/immunohistochemistry.gif
IHC poate prezenta unele dezavantaje:

colorarea puternică a fundalului (datorită biotinei endigene, a
enzimelor reporter, a cross-reactivității);
colorarea slabă a antigenului țintă (activitate enzimatică sau
potență a anticorpilor slabă);
autofluorescența (datorită metodei de fixare).
115
În unele cazuri, se recurge la prelucrarea prin IHC a unui fragment

de țesut în totalitate (embrioni de găină, șoarece, pești), fără secționare
anterioară. Este o metodă utilizată în cazul cercetărilor pe celule stem sau
neurologie, fiind astfel posibilă colorarea întregului embrion în stadii
diferite de evoluție, pentru a observa expresia proteinelor țintă în cursul
dezvoltării animalului.
Este foarte asemănătoare cu imunocitochimia sau colorarea
criosecțiunilor. Diferența constă în faptul că proba de colorat este mult mai
mare și mai groasă decât o secțiune pe lamă. De aceea, etapele de incubare
în vederea fixării, blocării, interacțiunii cu anticorpii, spălării,
permeabilizării și developării vor fi mult mai mari.
Spre deosebire de imunofluorescență, IHC prezintă avantajul de a
vizualiza morfologia țesutului din jurul antigenului specific, prin colorație
de contrast. Rezultatele colorării markerilor prin IHC sunt reportate
semicantitativ și au implicații în diagnostic și prognostic, în special pentru
tumori cutanate, în detecția microorganismelor.
Metodele îmbunătățite folosesc anticorpi secundari multipli şi
enzime conjugate cu un schelet polimer, prezentând avantajul unei
specificități și sensibilități crescute. Colorația dublă pe o secțiune de țesut
poate fi obținută prin combinarea a 2 sisteme imunoenzimatice sau un
sistem imunoenzimatic și substrate diferite. Pentru a putea examina co-
distribuția a două (sau mai multe) antigene diferite în aceeași probă, se
poate realiza o dublă IF, simultan (în amestec) sau secvențial (fiecare atg
pe rând).
Pentru fiecare probă lucrată se foloseşte un control pozitiv şi unul
negativ. Martorul pozitiv este o probă de țesut care conține antigenul de
interes şi care este colorat la fel ca şi proba de testat. Martorul negativ este
reprezentat de proba tratată cu anticorpi nespecifici.
Se pot obține rezultate fals-negative, în cazul fixării, respectiv
prelucrării necorespunzătoare sau fals-pozitive, prin colorarea nespecifică
a fundalului (atașarea anticorpilor la elemente încărcate electric ale
țesutului conjunctiv, fibrelor de colagen).
116
Imunitatea celulară este un mecanism de apărare foarte important

al organismului, în special când sunt incriminate celule infectate sau
modificate patologic, dar nu numai. În imunitatea naturală, fagocitoza este
un proces atât de simplu, dar atât de complex în același timp, asigurând
captarea și neutralizarea nespecifică a antigenelor de diferite naturi. De
asemenea, celulele activate producătoare de anticorpi și molecule active
trebuie să îndeplinească condițiile de calitate și funcționalitate.
În laborator se pot folosi o multitudine de metode care presupun
separarea celulelor, cuantificarea și identificarea lor pe baza unor criterii
bine stabilite și, nu în ultimul rând, evaluarea capacității funcționale.
TEHNICI DE SEPARARE A CELULELOR IMUNOCOMPETENTE
Separarea celulelor cu funcții imunitare (limfocite, granulocite,

macrofage) se bazează pe centrifugare simplă sau în gradient de densitate
sau prin citometrie în flux.
Aceste metode au în vedere caracteristicile fizice (mărime,
densitate, raport nucleocitoplasmatic, refringența, conținutul în organite
citoplasmatice), chimice (aderența celulelor la suporturi solide sau
caractere enzimatice) și imunologice (prezența antigenelor
intracitoplasmatice sau de suprafață care pot fi identificate prin
intermediul anticorpilor mono sau policlonali) care definesc fenotipul unei
populații celulare.
Celulele pot fi izolate din sânge, măduvă osoasă hematogenă,
organe imunocompetente primare și secundare sau diferite materiale
patologice (lichid cefalo-rahidian, lavaj bronhoalveolar, peritoneal).
117
Recoltarea se realizază în tuburi cu anticoagulant (EDTA, heparină,

citrate de sodiu).
Tehnicile de separare celulară pot fi în gradient de densitate, prin
aderență sau citometrie în flux.
1. Metodele de separare în gradient de densitate pot fi realizate
prin centrifugare simplă sau cu medii de separare.
Centrifugarea simplă (800-1000 rpm, 10 minute) determină
formarea în eprubetă a trei straturi distincte: depozit de hematii, inel
leucocitar și supernatant (plasmă, trombocite).
De asemenea, pot fi utilizate o serie de medii de separare, pentru
obținerea unei categorii de celule de interes.
Pentru separarea cu ajutorul mediului Ficol (conține un glucid
ramificat artificial, cu densitatea de 1,077 la t=200C), sângele defibrinat
sau recoltat pe anticoagulant (5ml) este tratat cu această soluție (3ml)
astfel încât cele 2 componente să nu se amestece. Se centrifughează la
2500 rpm, 20 de minute, la +40C, observându-se separarea mai multor
straturi, ce conțin diferite tipuri celulare. Stratul de la fundul eprubetei
conține eritrocite aglutinate, iar cel de deasupra, în special, granulocite
(fig. 66). Datorită densității scăzute, limfocitele se separă la interfața
dintre plasmă și soluția utilizată, împreună cu alte celule (trombocite și
monocite). Limfocitele sunt apoi recuperate și spălate (2 centrifugări la
1500, respectiv 1000 rpm, 10-15 minute cu o soluție specială) pentru
îndepărtarea plachetelor și a plasmei.
Fig. 66 – Metoda de separare a limfocitelor pe baza gradientului

http://www.nature.com/nprot/journal/v9/n7/images/nprot.2014.104-F5.jpg
https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTDdx5eGpXEtPxbVMBse34O2ewNpdgFy44dwMz7-b9wg-Nd0pTF
118
Mediul cu dextran (Plasmagel, Plasmion, Gelofusine) se utilizează

pentru separarea granulocitelor. Sângele se adaugă peste dextran în așa fel
încât cele două medii să nu se amestece. După incubare la temperatura
camerei timp de 45 minute, se obține sedimentarea celulelor sangvine, mai
puțin granulocitele și trombocitele care rămân în supernatant. Prin
recoltarea și centrifugarea acestuia la 500 rpm, timp de 10 minute, se
obțin granulocitele în depozit și trombocitele suspendate în supernatant.
Mediul Percoll (mediu bifazic, ce permite realizarea unui gradient
de densitate discontinuu) se utilizează pentru separarea foarte riguroasă a
populațiilor celulare. Tehnica este similară mediului Ficoll (centrifugare
30 minute la 2000-2500 rpm). Benzile celulare se dispun în funcție de
densitatea soluției utilizate.
2. Tehnicile de separare prin aderență au la bază proprietatea
celulelor de a adera (selecția pozitivă) sau nu (selecția negativă) spontan
sau mediat la diferite substraturi.
Se poate utiliza o separare simplă, care are la bază proprietatea
unor populații de celule (monocite, macrofage, LB) de a adera la suporturi
de plastic (polistiren sau poliacrilamidă) după o incubare de 2 ore la 370C.
Metoda de separare prin aderență imună presupune utilizarea unor
substraturi tapetate cu anticorpi sau lectine. De asemenea, se mai poate
utiliza și tehnica de separare prin aderență la fibrele de naylon, care
permite separarea populațiilor celulare (monocite, LB) obținute în banda
specifică după centrifugarea pe mediul Ficoll, prin incubare 30 minute la
370C. După aderarea acestora, recuperarea se face prin spălări repetate și
dilatarea mecanică a fibrelor de nylon.
TEHNICI DE CUANTIFICARE A CELULELOR IMUNOCOMPETENTE
Evaluarea numărului de celule imunocompetente (formula

leucocitară) se poate realiza manual, cu ajutorul camerelor de numărare
sau automat, folosind diferite cititoare hematologice care furnizează datele
sub forma hemoleucogramei. Rezultatele obținute în urma acestui test
permit punerea în evidența a stărilor leucopenice sau, dimpotrivă, pe cele
119
de leucocitoză reacțională sau neoplazică, comparând valorile obținute cu

cele de referință din literatura de specialitate (tabel 6).
Tabel 6 - Formula leucocitară la animale

Câine Pisică Porc Oaie Capră Vacă Cal Iepure
Leucocite
5.9-16.6 3.8-19 7-20 4-12 8-12 4-12 8-11 7-13
(x1000)
Diff. (%)
Segmentate 51-84 34-84 28-50 20-40 35-40 20-40 50-60 20-60
Nesegmentate 0-4 0-1 0-10 0-2 0-1 0-4 0-2 0-1
Limfocite 8-38 7-60 40-60 40-70 50-55 40-70 30-40 40-80
Monocite 1-9 0-5 2-10 0-6 5 1-6 5-6 1-4
Eozinofile 0-9 0-12 0-10 0-10 2-5 0-4 2-5 0-4
Bazofile 0-1 0-2 0-2 0-3 0-1 0-2 0-1 1-7
Trombocite
160-525 160-660 120-720 100-800 300-600 50-750 72-183 125-270
(x1000)
TEHNICI DE IDENTIFICARE A CELULELOR IMUNOCOMPETENTE
Identificarea claselor și subseturilor de limfocite se poate realiza cu

ajutorul anticorpilor monoclonali, capabili să recunoscă și să
interacționeze cu markerii de suprafață (CD - Cluster Designation), care pot
fi specifici pentru:
o serie de celule (panantigene) (ex. CD2 pe LT; CD24 pe LB);
vârsta celulei (ex. CD1 pe LT imature din timus, iar CD3 pe LT adulte);
anumite subseturi funcționale (CD4 este markerul LT helper, iar CD8
este markerul LTc sau LTs);
receptorii pentru antigen, etc.
Limfocitele mai pot fi identificate prin metodele de rozetare.

LB exprimă pe suprafață receptori pentru fragmentul Fc al IgG şi
pentru C3b, atașând eritrocite învelite cu IgG (rozete EA - erytrocyt-antibody
– eritrocit - anticorp) sau în molecule de complement care au fost fixate prin
intermediul unor IgM care servesc ca piese de legătură (rozete EAC -
120
erytrocyte-antibody-complement/etitrocit-anticorp-complement). Astfel,
celulele EA+ şi EAC+ aparțin populației B (fig. 67).
Fig. 67 – Rozetare limfocite

http://www.spandidos-publications.com/article_images/ol/8/6/OL-08-06-2527-g03.jpg
Determinarea procentului de LT la bovine cu ajutorul

rozetelor de tip E (totale) se folosește pentru determinarea procentului
de LT la bovine sănătoase, leucemice sau cu imunodeficiență pentru
aprecierea profilului imun.
Testul E-rosetting (rozetare E) este utilizat pentru identificarea LT,
care prezintă la suprafață proteina CD2 capabilă să interacționeze cu
omologul LFA-3 de pe suprafața eritrocitelor de oaie.
Se utilizează limfocite de bovine separate pe mediul Ficoll Odiston
și eritrocite de oaie proaspăt recoltate sau păstrate în soluție Alsever,
centrifugate și spălate. Se realizează un amestec din suspensia de limfocite
(2 x 105 celule) și suspensia 1 % eritrocite de oaie (2 x 105 eritrocite), se
centrifughează, se incubează timp de 24 ore la 40C, se resuspendă cu TFS,
se adaugă albastru de toluidină 0,2% și se interpretează.
Se numără 250 limfocite, indiferent că au format sau nu rozete, în
camera Burker sau Burker Turk, după acoperirea rețelei cu o lamelă.
Rozeta se ia în considerație dacă de limfocit sunt alipite minimum 3
eritrocite.
Se aplică formula:
nr.de limfocite rozetate
% de LT formatoare de rozete = x 100
nr. de limfocite numărate
121
Citirea se poate face și după colorare pe lamă. Suspensia de

limfocite, incubată și resuspendată în TFS, se etalează pe o lamă de
microscop. Usucarea se face la ventilator, iar fixarea cu alcool metilic
absolut timp de 5 minute. Se colorează cu soluție Giemsa, timp de 15 - 20
minute și se citește la microscopul optic, la fel ca un frotiu, prin numărarea
a 250 limfocite, indiferent ca au rozetat sau nu.
În leucoza enzootică bovină valoarea LT poate scade până la 14%,
iar în leucoza sporadică înregistrează creșterea până la 97%.
TEHNICI DE EVALUARE FUNCȚIONALĂ A CELULELOR

IMUNOCOMPETENTE
Cuantificarea limfocitelor este adeseori însoțită și de evaluarea

funcției LT, măsurând abilitatea LT de a răspunde la diferiți stimuli
mitogeni (fitohemaglutinina PHA) și antigene (toxina tetanică toxoid,
candida). Răspunsul LT poate fi reprezentat de diviziunea LT în subclase
funcționale, proliferare policlonală sau producerea de substanțe active
(citokinele).
Evaluarea funcțională a limfocitelor se poate realiza in vitro,
prin stimulare cu activatori specifici sau nespecifici și urmată de
proliferare celulară sau diferențiere în celule efectoare.
Transformarea limfocitelor poate fi indusă de antigene specifice
(care stimulează limfocitele presensibilizate) sau agenți nespecifici
(determină stimularea policlonală a limfocitelor) reprezentați de lectine
(fitomitogene), anticorpi anti-limfocitari, diferite substanțe (papaina,
periodatul de sodiu, metale grele – Zn, Hg, Ni).
Cele mai importante lectine de origine vegetală sunt:
fitohemaglutinina (PHA) extrasă din semințe de Phaseola vulgaris (pentru
LT, LB), concanavalina A (Con A) pentru LT. Pentru stimularea LB se mai
poate utiliza mitogenul PWM (Pokeweed Mitogen) extras din germeni de
Phytolacca, o serie de compuși microbieni precum PPD (protein purified
derivative) extras din Mycobacterium tuberculosis sau SpA (proteina A)
extrasă din Staphylococcus aureus.
122
Testul de trasnformare limfoblastică urmărește modificările

morfologice suferite de celule. Suspensia de limfocite este cultivată timp
de 3-4 ore in vitro în prezența unei lectine cu efect mitogen (PHA). Din
suportul celular se realizează un frotiu care se colorează May-Grunwald-
Giemsa, în vederea examinării și stabilirii unui procent de celule cu
morfologie modificată.
Celulele transformate se caracterizează prin creșterea în
dimensiuni, a bazofiliei citoplasmatice, apariția vacuolelor clare și mărirea
numărului de lizozomi.
O funcție importantă o au și macrofagele prezente în substatul
celular care stimulează blastizarea limfocitelor prin secreția de IL-1.
Pentru interpretarea rezulatelor, se numără 100 de celule pe frotiu
și se exprimă procentual numărul de celule blastice și de limfocite
transformate.
Tehnica ELISpot (Enzyme-Linked ImmunoSpot) este o metodă

utilizată pentru monitorizarea răspunsului imun celular. Se bazează pe
principiul ELISA, dar cu suport celular, evaluând prezența celulelor
secretoare de anticorpi sau alte molecule active (citokine). Celulele
secretoare sunt îndepărtate (spălate), însă anticorpii sau citokinele pot fi
identificate cu ajutorul microscopului ca niște pete (spots), care pot fi
numărate (fig. 68).
Fig. 68 – Metoda ELISpot

http://zellnet.com/wp-content/uploads/2012/10/zellnet-elispot-reader-service-reader.jpg
123
http://www.abnova.com/newspaper/1021122/img/ELISpot-4.gif
Citometria în flux este o metodă utilizată pentru cuantificarea

celulelor sangvine, fenotipajul subpopulațiilor de limfocite și detectarea
unor biomarkeri (imunoglobuline de suprafață, receptori de membrană,
etc.). Principiul reacției constă în suspendarea celulelor într-un fluid și
trecerea lor printr-un aparat electronic de detecție.
Tehnologia a devenit posibilă cu ajutorul unui sistem automat
foarte complex, denumit citometru în flux capabil să analizeze câteva mii
de particule pe secundă, în timp real, să separe și să izoleze activ
particulele cu proprietăți specifice.
Aparatul este foarte complex, prezentând un sistem de măsurare a
impedanței (sau conductivității) și un sistem optic reprezentat de lămpi
(mercur, xenon), lasere de mare putere răcite cu apă (argon, krypton),
lasere de putere mică răcite cu aer, un sistem detector și convretor
analogic - digital care generează semnale luminoase care pot fi procesate
cu ajutorulunui soft, un sistem de amplificare -linear sau logaritmic și un
computer pentru analiza semnalelor.
Suspensia celulară de analizat este introdusă în aparat prin
injectare verticală. Fiecare celulă, la traversarea fascicolelor luminoase, va
reemite, pe de o parte, lumina incident dispersată (a cărei analiză
furnizează date legate de mărime, densitate optică, formă a celulei) și o
fluorescență specifică, în cazul marcajului cu fluorocromi.
Datele înregistrate de aparat sunt preluate și prelucrate cu ajutorul
unui soft. Sistemele moderne dețin mai multe lasere (max. 10) și
detectoare de fluorescență (max. 18), car prin utilizarea anticorpilor
marcați pot identifica cu precizie o populație celulară țintă prin markerii
fenotipici.
Datele culese pot fi utilizate pentru a obține o histograma (fig. 69).
Fig. 69 – Histograma
http://www.scq.ubc.ca/wp-content/cytometrygraph.gif
124
Fenotiparea prin fluorescență (Fluorescence-activated cell

sorting - FACS) este o metodă specială de citometrie în flux care utilizează
marcarea cu substanțe fluorescente a celulelor analizate. Această metodă
permite sortarea unui amestec celular heterogen, pe categorii de celule și
individual, pe baza difuziei luminoase specifice și a caracteristicilor
fluorescente ale fiecărei celule (fig. 70).
Fig. 70 – Fenotiparea prin fluorescență (FACS)

http://www.biotech.cornell.edu/sites/default/files/uploads/Images/facs3b.jpg
Markerii fluorescenți utilizați pot fi, de regulă, cuplați cu anticorpi

specifici unei structuri celulare țintă sau o substanță chimică cu afinitate
pentru membrana celulară sau altă componentă. Fiecare fluorofor are un
vârf caracteristic de excitație și o anumită lungime de undă de emise.
Utilizarea concomitentă a mai multor markeri depinde de lungimea de
undă a lămpii sau laserului și de sistemele de detectare. Numărul maxim
de markeri fluorescenți detectabili este de 17 sau 18, necesitând condiții și
aparatură specifică pentru a limita apariția artefactelor precum și un
sistem de algoritmi complecși care să separe spectrele suprapuse.
Pentru marcarea anticorpilor se mai pot utiliza izotopi de lantanidă,
dezavantajul fiind reprezentat de distrugerea celulelor analizate.
Cytometric bead array (CBA)

O dată cu identificarea celulelor țintă prin intermediul anticorpilor
fluorescenți, pot fi cuantificate și anumite molecule de sinteză (citokine,
proteine). Ca și metoda ELISA sandwich, CBA utilizează mai multe
populații celulare, diferențiate pe baza mărimii și a diferitelor grade de
125
intensitate a fluorescenței, în scopul identificării concomitente a mai

multor analiți. Cuantificarea analiților capturați se realizează cu ajutorul
anticorpilor specifici biotinilați, specifici unor epitopi proteici secundari,
urmat de tratare cu streptavidin-R-phycoerythrin. Intensitatea
fluorescenței R-phycoerythrin este evaluată cu un citometru în flux
echipat cu o sursă de excitare de 488 nm. Concentrațiile proteinelor din
probele de testat se evaluează comparând semnalele fluorescente ale
acestora cu cele generate de o curbă standard obținută cu diluții seriate ale
unei concentrații cunoscute ale analitului.
Aceste tehnici de citometrie în flux au permis fenotipajul
populațiilor
INDICELE OPSONO-CITOFAGIC
Pentru evaluarea imunității naturale se utilizează mai multe

metode care permit aprecierea activității celulare și umorale a sistemului
imun.
Indicele opsono-citofagic permite analizarea activității celulare,
fiind cunoscut faptul că în sânge se găsesc celule care au ca funcție
principală fagocitoza (polimorfonuclearele neutrofile, bazofile, eozinofile,
macrofage). Principiul acestei reacții este reprezentat de punerea în
contact a sângelui integral al unui individ cu o cultură bacteriană.
Materiale necesare:
sânge integral proaspăt recoltat pe anticoagulant;
cultură proaspătă de 24 de ore de Staphylococcus aureus tulpina
Cohan, pe agar nutritiv;
ser fiziologic, agar nutritiv, plăci Petri.
Reacția se desfășoară în 2 etape:

1. Etapa 1 – determinarea numărului total de germeni din cultura
de Staphylococcus aureus.
În acest sens, se utilizează o cultură proaspătăt de 24 de ore pe agar
nutritiv. Cultura se spală cu ser fiziologic, iar suspensia obținută se
126
centrifughează la 3000 rpm timp de 10 minute. Supernatantul obținut se

îndepărtează, iar din depozit (format din celule bacteriene) se pepară o
suspensie bacteriană cu o turbiditate corespunzătoare tubului nr. 9 din
scara Brown. Din această suspensie se efectuează NTG, conform metodei
studiate la Microbiologie – nB(T0)
2. Etapa 2 – se pun în contact 0,5 ml suspensie microbiană cu 0,5
ml sânge integral și se lasă în contact 30 de minute la 370C. După expirarea
timpului de incubare se realizează din nou NTG-ul – nB(Tx)
Teoretic, după contactul suspensiei microbiene cu leucocitele
responsabile de fagocitoză din sângele integral și cu unii efectori umorali,
numărul bacteriilor (NTG-ul la Tx) ar trebui să fie mult mai mic decât
numărul inițial (NTG la T0).
Se calculează indicele de activitate fagocitară pe baza formulei:
nB(T0) - nB(Tx)
IF = x 100
nB(T0)
IF - indicele de fagocitoză
nB(T0) – numărul inițial de bacterii din supernatant
nB(Tx) - numărul final de bacterii
Pentru testarea activității bactericide intracelulare se utilizează o

populație heterogenă de fagocite peritoneale care se pune în contact cu o
suspensie echivalentă de celule bacteriene. Se utilizează câte 2ml din
fiecare, la care se adaugă 0,4ml ser de cobai sau iepure (conține opsonine),
iar amestecul se incubează la 370C la o rotație ușoară (4 rpm). Stoparea
acțiunii fagocitelor se realizează cu ajutorul soluție Hanks rece.
Din supernatantul obținut în urma centrifugării (care conține
bacterii nefagocitate) se determină numărul de celule prin metoda
indirectă a numărării coloniilor pe mediu nutritiv solidificat (NTG).
Din depozit se realizează un frotiu care se colorează May-
Grunwald-Giemsa.
Puterea opsonizantă a unui ser se exprimă prin numărul de
germeni înglobați în fagocit.
127
Numărul de bacterii fagocitate/celulă se calculează aplicând

formula:
nB(T0) - nB(Tx)
n(fag) = x 100
n (celule)
n(fag) – numărul de bacterii fagocitate
n(celule) – numărul de celule
128
Sfera afecțiunilor imunopatologice la animale a devenit din ce în ce

mai extinsă. De aceea, este mai mult decât necesară stabilirea unui
diagnostic cât mai corect, în scopul instituirii unui tratament eficient.
Afecțiunile imunopatologice pot fi, de multe ori, greu de diagnosticat
datorită lipsei specificității unor simptome exprimate de animalele
bolnave sau a unor teste specifice pentru confirmare. În aceste condiții,
coroborarea rezultatelor obținute în urma examenului clinic, paraclinic și
a analizelor de laborator este cea mai bună metodă.
În categoria afecțiunilor imunopatologice pot fi încadrate bolile
autoimune, imunodeficiențele primare/secundare și, nu în ultimul rând
stările de hipersensibilitate de tip I-IV (alergiile) care sunt cel mai frecvent
întâlnite. Pentru fiecare dintre acestea se utilizează diverse teste de
diagnostic care permit evaluarea imunității umorale și celulare.
La animale evoluează mai frecvent câteva boli autoimune: lupusul
eritematos sistemic și discoid, poliartrita reumatoidă, vasculite diverse,
dermatomiozitele, tiroidita Hashimoto, febra reumatismală, Myastenia
gravis, anemia hemolitică autoimună.
Spre deosebire de alte categorii de afecțiuni, patologia autoimună
sistemică sau localizată este caracterizată de apariția autoanticorpilor
(anticorpi anti-self) circulanți elaborați împotriva unei game largi de
antigene celulare sau moleculare. Acești autoanticorpi pot fi caracteristici
(anticorpi anti receptori acetilcolină – Myastenia gravis), dar, de cele mai
multe ori, pot prezinta o specificitate limitată (factorul reumatoid -FR- nu
este prezent la toți pacienții cu poliartrită reumatoidă, dar poate fi
identificat în lupusul eritematos şi tiroidita autoimună).
De asemenea, complexele imune circulante sau conglomerate de tip
atg-atc-complement depuse în țesuturi induc apariția treptată a unor
leziuni cronice inflamatorii.
129
În continuare vom prezenta câteva teste utilizate în mod curent în

laboratarele de imunopatologie cu scopul de a identifica autoanticorpii
specifici sau nu, diferite proteine inflamatorii sau de interes, precum și
celule caracteristice cu semnificație patologică.
TESTE UTILIZATE ÎN DIAGNOSTICUL

LUPUSULUI ERITEMATOS SISTEMIC (LES)
Lupusul eritematos sistemic (LES) este o boală autoimună

sistemică, cu o simptomatologie diversă (afectare cutanată, articulară,
renală) și caracterizată atât de apariția unei game foarte largi de
autoanticorpi, precum și a celulelor specifice (celule lupice).
DENTIFICAREA ANTICORPILOR ANTINUCLEARI
Anticorpii antinucleari (ANA, factor antinuclear sau ANF) sunt

anticorpi care interacționează cu diferite componente ale nucleului celular
propriu.
Există mai multe subtipuri de ANA: anti-Ro, anti-La, anti-Sm, anti-
nRNP, anti-Scl-70, anti-dsDNA, anti-histone, anti-centromere şi anti-sp100,
fiecare interacționând cu diverse proteine sau complexe proteice din
nucleu.
Aceste molecule sunt produse frecvent în bolile autoimmune (LES,
poliartrita reumatoidă, tiroidita autoimună, sindrom Sjögren,
sclerodermie, etc.), dar și în boli tumorale sau infecțioase. De aceea,
diagnosticul nu se va baza strict pe identificarea acestora.
Depistarea ANA în serul sangvin se poate realiza prin aglutinare cu
latex, IFI (imunofluorescență indirectă) sau ELISA.
Titrul de autoanticorpi ≥ 1:160 este considerat semnificativ clinic.
Titrul de autoanticorpi ˂ 1:160 poate fi întâlnit la aproximativ 20%
din indivizii sănătoși, în special, în vârstă.
130
Screening-ul autoanticorpilor este util în diagnosticarea bolilor

autoimune, iar monitorizarea titrului în timp este util pentru aprecierea
evoluției bolii.
Testul de aglutinare cu latex este un test rapid bazat pe

aglutinarea moleculelor de ADN (extrase din timus fetal de vițel) înglobate
în particule de latex de către anticorpii antinucleari prezenți în serul
animalelor bolnave.
Este o reacție de aglutinare rapidă pe lamă, reacția pozitivă fiind
reprezintată de apariția depozitelor mici, albe, sub forma unor aglutinări
specifice pe fond negru (fig. 71), aspect identic godeului cu martorul
pozitiv, în intervalul de 3 minute.
Fig. 71 – Test aglutinare cu latex ANA
Dacă testul calitativ este pozitiv, se poate evalua și titrul de

autoanticorpi, prin diluții seriate ale serului de testat.
Reacția de imunofluorescență indirectă este o metodă care se

bazează pe punerea în contact a probelor de ser obținute de la animalele
suspecte cu antigenele nucleare ale unor celule (culturi celulare sau
fragmente tisulare de rozătoare, primate). Secțiunile din țesuturi animale
sunt obținute prin criotomie, etalate pe lame de microscop, uscate și fixate.
Identificarea complexelor antigen-anticorp formate se realizează cu
ajutorul unor anticorpi secundari (ser cu anticorpi anti-Ig de specie)
cuplați cu FITC, iar vizualizarea se face cu ajutorul microscopului UV.
Reacțiile pozitive sunt considerate cele în care apare fluorescența
nucleară specifică, cu mai multe aspecte (pattern): omogen, pătat,
nucleolar, nuclear şi citoplasmatic, periferic, anticentromere (fig. 72).
131
Aspectul fluorescenței este evocator pentru anumiți anticorpi, dar

identificarea trebuie confirmată cu ajutorul altor metode.
Fig. 72– Aspecte imunofluorescență ANA:A, B, – omogen; C – nucleolar; D – pătat;
Fig. 72 – Aspecte imunofluorescență ANA: E & F – rim-like pattern; G – centromere;

H – anti-Sp-100
http://krebsforschung.meduniwien.ac.at/fileadmin/krebsforschung/Research/Gadek/4-1-400x538.png
Interpretarea rezultatelor reacției de imunofluorescență

indirectă:
a. Testul pozitiv, în absența altor semne, nu este o dovadă a
evoluției lupusului, aspectul fiind întâlnit şi în alte maladii:
alte boli ale țesutului conjunctiv: sclerodermia, sindrom Sjogren,
poliartrita reumatoidă, boli tiroidiene, boli hepatice;
în urma unor tratamente cu: procainamidă, hidralazina, isoniazid,
132
clorpromazina;
boli virale: mononucleoza infecțioasă;
alte boli infecțioase cronice: hepatită, endocardită bacteriană
subacută, malarie;
alte boli autoimune: tiroidita, scleroza multiplă, etc.
b. Test slab pozitiv – apare la 20% dintre indivizii sănătoşi, care,
în timp, pot prezenta simptome de lupus;
c. Rezultate fals pozitive pot apare în cazul administrării
griseofulvinei, sulfonamidelor, tetraciclinei, procainamidei, hidralazinei.
d. Testul negativ – poate exclude lupusul, deşi sunt cazuri în care
LES este prezent fără anticorpi antinucleari detectabili;
e. Rezultate fals negative pot apare în cazul administrării de
corticosteroizi (doze mari), citostatice.
Detectarea anticorpilor antinucleari prin ELISA se practică în
microplăci cu godeuri tapetate cu ADN. După incubare cu serul suspect, se
adugă un conjugat enzimatic (anticorpi anti-Ig de specie cuplați cu o
enzimă), iar revelarea activității enzimatice se realizează cu un substrat
specific pentru enzimă. Se determină titrul de anticorpi prin citirea
densității optice cu un spectofotometru. Intensitatea culorii este direct
proporțională cu cantitatea de anticorpi din probă.
Testul este foarte sensibil dar nu este foarte specific (anticorpii
anti-ADNn fiind decelați și la pacienți care nu au LES).
DECELAREA CRIOGLOBULINELOR
Crioglobulinele sunt imunoglobuline care, in vitro, la temperaturi mai

mici de 370C precipită sau formează un gel, reversibil la reîncălzire. La
titruri mici, precipită numai în jurul temperaturii de +4oC, dar, cu cât
concentrația serică este mai mare, cu atât creşte temperatura de
precipitare.
Serul uman şi animal normal conțin cantități mici de crioglobuline
(30 mg/l), dar concentrații mai mari de 100 mg/l pot fi sau nu însoțite de
manifestări clinice.
133
Crioglobulinele pot apare în multe afecțiuni ca: boli

limfoproliferative, infecții virale, boli connective ale țesutului conjunctiv.
Simptomatologia poate include purpura, vasculitele cu implicare
multisistemică, glomerulonefrite, sinovite, etc
Crioglobulinele sunt testate în cazul simptomelor induse de frig
(purpura şi fenomenul Raynaud's la om) şi când sunt suspectate boli
mediate de complexe imune. Crioglobulinele, adesea confundate cu
aglutininele la rece sunt Ig anormale care precipită la diferite grade de
temperatură sub 37°C şi devin solubile după reîncălzire. Pericolul este
eprezentat de faptul că precipitatele formate pot bloca vasele de sânge cu
calibru mic.
Se recoltează 8-10 ml sânge într-o eprubetă de centrifugă și se
menține proba la 370C, 15-20 minute până la coagulare completă. Se
centrifughează într-o cuvă încălzită, se separă serul, care se păstrează la
+40C până a doua zi.
Se centrifugează la 37°C, la 2000 rpm timp de 5 min;
Se decantează imediat serul şi se introduce în tuburi de centrifugă;
Se centrifugează din nou la 37°C 2000 rpm, 5 min pentru
eliminarea completă a globlelor roşii şi a fibrinei;
Imediat după ultima centrifugare se transferă serul în tuburi de
centrifugă şi se introduce la +4°C;
Crioprecipitarea poate dura de la căteva ore până la cîteva zile, de
aceea se examinează probele zilnic.
Interpretarea ezultatelor
Dacă serul rămâne complet clar timp de 5 zile, rezultatul este
negativ.
Dacă în tub apare o uşoară turbiditate după 2-5 zile:
Se centrifughează tubul control la +4°C la 2000 rpm, 10 min. Dacă
precipitatul nu se formează rezultatul este negativ la 5 zile;
Dacă se formează un precipitat se plasează tubul la 37°C timp de 1-
18 ore;
Dacă precipitatul nu se dizolvă, rezultatul este negativ la 5 zile;
134
Dacă precipitatul se dizolvă, se reintroduce la 4°C, iar în cazul

reapariției precipitatului rezultatul este pozitiv;
Dacă proba prezintă un precipitat vizibil:

Se plasează tubul control la 370C, se verifică timp de 1-4 ore. Dacă
devine clar, se pasează din nou la 40C, iar în cazul reapariției precipitatului
rezultatul este pozitiv.
Dacă după 1-4 ore nu se clarifică se lasă peste noapte, se compară
cu tubul control de la +40C pentru a decide dacă a apărut o clarificare
parțială. În caz contrar se plasează tubul control din nou la +40C. După 5
zile se centrifughează proba la 40C. Dacă nu se formează nici un precipitat
rezultatul este negativ.
Dacă apare un precipitat, se introduce tubul la 370C peste noapte.
Dacă precipitatul nu se dizolvă rezultatul este negativ la 5 zile.
Dacă precipitatul se dizolvă, se reintroduce la 40C. Dacă precipitatul
nu apare rezultatul este negativ, ar în cazul reapariției precipitatului
rezultatul este pozitiv.
Unele crioglobuline trebuie încălzite la temperaturi mai mari de
370C pentru redizolvare. În acest caz se creşte treptat temperatura şi se
înregistrează temperatura la care s-a dizolvat (în mod obişnuit 40-45°C).
Niciodată nu trebuie depăşită limita de 630C timp de 3 minute.
Rareori va apare un precipitat parțial redizolvat când este plasat la
37°C (crioglobuline şi fibrină).
se centrifughează tubul control care a stat la 37°C peste noapte, la
37°C timp de 8 minute.
Cu atenție se decantează supernatantul şi se plasează într-un tub la
+4°C timp de 24-48 ore.
Se centrifughează la 2000 rpm la 40C, 8 minute.
Dacă apare un precipitat, rezultatul este pozitiv.
Dacă din anumite motive este discutabilă prezența crioglobulinelor
se realizează imunofixarea:
Dacă imunoglobulinele sunt prezente, iar albumina absentă în
precipitat testul este pozitiv.
135
Dacă imunoglobulinele nu sunt prezente, rezultatul este negativ.
Se poate determina şi dependența de complement.

Se centrifughează proba de la 4°C;
Se încălzeşte la 56°C timp de 30 minute pentru inactivarea
complementului, apoi se plasează la 4°C peste noapte, după care se
centrifughează la 2000 rpm, 4°C, 8 minute;
Dacă precipitatul reapare crioglobulinele nu sunt dependente de
complement.;
Dacă precipitatul nu apare crioglobulinele sunt dependente de
complement.
Pentru stabilirea tipului de imunoglobuline, care intră în
componența crioglobulinelor se recurge la imunoelectroforeză.
Valorile crioglobulinelor serice nu se corelează de obicei cu

severitatea şi prognosticul bolii.
Valorile foarte mici, deseori greu de cuantificat se pot asocia cu un
sindrom crioglobulinic sever, comparativ cu concentrațiile mari care pot fi
caracteristice bolilor oligosimptomatice sau asimptomatice.
Criglobulinele (complexe de imunoglobuline, complement şi
fibronectină care precipită reversibil la rece) sugerează afectarea severă,
în special renală. Crioglobulinemia este frecvent mixtă (IgG-IgM). Dacă
fenomenele Raynaud sunt prezente în LES, crioglobulinele se întâlnesc
frecvent, atingând valori mari în ser. Crioglobulinele conțin FR,
complement, ANA şi au importanță în producerea leziunilor.
EVIDENȚIEREA CELULELOR LUPICE
În centrul imunopatogenezei se situează fenomenul LE, ce constă în

formarea de celule de lupus eritematos, cunoscute sub numele de celule
LE (clonele Hargraves).
Formarea celulelor LE depinde de prezența unor anticorpi
antinucleari, capabili să reacționeze cu nucleoproteinele. Aceşti anticorpi
136
aparțin clasei IgG şi sunt anti-ADN şi antinucleoproteine (factorul LE).

Celulele lupice sunt considerate drept caracteristice pentru diagnosticul
pozitiv al LES, însă pot să apară inconstant şi în alte boli cu componentă
imună.
Caracteristic lupusului eritematos este proprietatea plasmei sau a
serului de la indivizii bolnavi de a determina nucleoliză. Aceste modificări
celulare sunt induse de prezența unui anticorp opsonizant şi lizant asupra
nucleului denumit factorul Haserick (anticorpi antinucleari). Fagocitoza
acestor nuclei este secundară şi defineşte celula caracteristică descrisă de
Hargraves. Nucleul fagocitat apare ca o vacuolă mare colorată roz uniform
care ocupă aproape toată citoplasma şi care împinge nucleul celulei
fagocitate la periferie, fiind mult subțiat (fig. 73).
Fenomenul celular LE poate fi reprodus in vitro, prin termostatarea
probei de sânge și centrifugare. Din stratul leucocitar se realizează frotiuri
colorate May-Grümwald Giemsa.
Pentru identificarea celulelor lupice se foloseşte testul direct şi
testul indirect.
1. Testul indirect - foloseşte serul suspect în amestec cu leucocite

normale.
Reactivi necesari:
Ser obținut prin recoltarea fără antiacoagulant de la
animalele suspecte;
Sânge normal, proaspăt defibrinat pe perle de sticlă: 10 ml
sânge normal izogrup se defribinează agitând perlele de
sticlă timp de 10 minute.
Tehnica de lucru: într-un tub de hemoliză (eprubetă) se introduce
un amestec de părți egale de ser suspect şi sânge normal defibrinat. Tubul
se lasă 2 ore la 370C în baie de apă, apoi se centrifughează 10 minute la
2500-3000 rpm şi se mai lasă astfel centrifugat încă 2 ore la 370C. După
incubare se îndepărtază supernatantul din tub. Cu ajutorul unei pipete
Pasteur se pipetează stratul celular superior, de culoare alb-roz care
137
conține leucocite. Din acest strat se întind frotiuri care apoi se colorează
MGG și se examinează la microscopul optic cu obiectiv de imersie.
Uneori se găsesc grămezi de leucocite în jurul unei celule cu nucleu
picnotic în curs de liză (corp în rozetă).
2. Testul direct: foloseşte sângele recoltat de la animalele suspecte,

coagulat sau defibrinat cu perle.
Sângele suspect, în amestec cu serul normal este incubat la 370C în
baie de apă, timp de 2 ore. Se îndepărtează serul, apoi cheagul este strivit
cu ajutorul unei baghete de sticlă pe o strecurătoare metalică cu ochiuri
fine de 1mm. Suspensia obținută este centrifugată la 3000 rpm, timp de 10
minute, după care este incubat încă 2 ore la 370C. Apoi se procedează ca la
testul indirect prin întinderea frotiului din stratul leucocitar.
Tehnica de colorare May-Grümwald Giemsa:

Se acoperă frotiul cu soluție May-Grümwald, timp de 5-7 minute,
apoi se varsă colorantul şi se introduce în soluție Giemsa timp de 30
minute. Soluția Giemsa se prepară extemporaneu (15 picături soluție
Giemsa în 10 ml apă distilată).
Frotiul este spălat la jet de apă sau se clăteşte în apă distilată, apoi
se usucă şi se examinează la microscopul ooptic, cu obiectiv de imersie.
Fig. 73– Celula lupică (LE)

http://www.pathologystudent.com/wp-content/uploads/2013/04/LE-cell.jpg
138
Un rezultat negativ al testului pentru celule LE nu exclude lupusul

eritematos sistemic, deoarece concentrația anticorpilor antinucleari
variază în decursul evoluției bolii (scade în faza de linişte a bolii sau în
timpul terapiei cu corticoizi).
În mod normal, celulele lupice sunt absente în sânge. În lupusul
eritematos diseminat evolutiv, proporția de celule lupice este de peste
80%.
Celulele lupice sunt cel mai frecvent întâlnite în lupusul eritematos
sistemic, însă mai pot fi identificate și în poliartrita reumatoidă (sub 10%
din cazuri), sclerodermia (sub 5%), intoxicația hidralazinică.

POLIARTRITEI REUMATOIDE
Poliartrita reumatoidă este o autoimunopatie caracterizată prin

febră, tumefacţii şi deformări progresive ale articulaţiilor. De asemenea,
sinteza excesivă a anticorpilor anti-IgG (factor reumatoid) se soldează cu
formarea de complexe imune circulante şi care, depuse intraarticular,
provoacă leziuni de tip inflamator, mediate de complement. Din acest
considerent boala este considerată o reacţie imună de tip III (Arthus).
DETERMINAREA FACTORULUI REUMATOID
Factorul reumatoid (FR) este un anticorp (IgM) elaborat

împotriva regiunii Fc a unei IgG denaturate şi se găseşte la circa 70%
dintre pacienții cu poliartrită reumatoidă. In vitro, FR precipită cu IgG
denaturată chimic sau termic.
In vivo, modificarea structurii IgG se produce după ce IgG
reacționează cu antigenul corespunzător, iar in vitro, după ce se fixează
nespecific pe un suport inert sau după denaturare termică.
Factorul reumatoid se sintetizează față de molecula IgG a cărei
conformație moleculară a fost modificată in vivo, cu expunerea
determinanților antigenici, inaccesibili pe molecula intactă. Sinteza FR se
139
realizează în plasmocitele din limfonoduri, dar şi în cele din țesutul de

granulație al membranei sinoviale (țesut conjunctiv reparator care se
formează în focarul reacției inflamatorii).
Pentru identificarea FR se utilizează teste de aglutinare cu latex.
Testul este de tip calitativ şi semicantitativ. Dat fiind că este o
metodă de screening, o testare corectă presupune şi efectuarea testului
Rose – Waaler.
Reumathoid factor kit conține particule de latex în care sunt
înglobate molecule de IgG. În urma contactului acestora cu serul care
conține factorul reumatoid într-o concentrație mai mare de 8.0 U.I./ml,
particulele de latex vor fi aglutinate (fig. 74).
Fig. 74 – FR – test aglutinare cu latex
Waaler- Rose kit – se bazează pe utilizarea reagentului Rose –

Waaler, o suspensie de globule roşii de oaie sensibilizate cu ser antiglobule
roşii de oaie, preparat pe iepure. Acest complex este aglutinat de către
factorul reumatoid, prezent în serul animalelor bolnave (fig. 75). Testul
are sensibilitate ajustată pentru determinarea unei cantități de minimum
6 U.I. factor reumatoid/ml.
Fig. 75 – FR – test Rose - Waaler
140
EXAMENUL IMUNOCITOLOGIC AL LICHIDULUI SINOVIAL
Citoanaliza se realizează pe probe de lichid sinovial recoltat pe

EDTA, diluat cu soluție salină izotonă (400 cel/ml) și centrifugat. Din
depozit sau direct din lichidul sinovial se realizează frotiuri care se
colorează prin metoda Jenner-Wright Giemsa. Printre celulele inflamatorii
se pot observa și ragocitele (fig. 76), celule din diferite linii celulare,
caracterizate de prezența granulațiilor retractile citoplasmatice, mult
mărite (incluzii intracitoplasmatice rotunjite, de culoare verzuie,
asemănătoare boabelor de strugure). Aceste incluzii pot fi resturi nucleare
sau complexe imune formate din histone sau ADN și anticorpi specifici
acestora.
Fig. 76 - Ragocite
http://www.eclinpath.com/wp-content/uploads/LE-ragocytes-150x150.jpg
DETECTAREA PROTEINEI C REACTIVE (PCR)
Proteina C reactivă (PCR) este o proteină serică produsă în ficat în

faza acută a inflamațiilor. Alături de complement, PCR are rol de mediator
între țesutul implicat în boală şi răspunsul sistemului imun.
Poate fi detectată atât în serul sanguin, cât şi în lichidul de ascită,
lichidul pleural, lichidul sinovial şi lichidul cefalorahidian de natură
inflamatorie.
În mod normal proteina C reactivă nu poate fi detectată în ser la
valori mai mici de 0,6 mg/dL. În schimb, prezintă importanță evoluția
titrului, evaluarea făcându-se în acelesși condiții de analiză. Valorile
141
crescute în timpul bolii (boli acute sau cronice care se acutizează: infecții,
reumatism articular, poliartrită reumatoidă, vasculite, etc.) se
normalizează după un tratament adecvat.
Pentru detectarea proteinei C reactive se poate folosi testul de
aglutinare cu latex, ELISA, imunoturbidimetria.
Proteina C-reactivă kit (RANDOX Laboratories United Kingdom)
este utilizat pentru detecția antigenelor proteinei C reactive din ser, prin
aglutinarea acestora cu anticorpii anti-CRP în latex. Reacția de aglutinare
caracteristică se produce la valori ale PCR mai mari de 6 mg /dl.

FEBREI REUMATISMALE
Numită și artrita reumatismală, boala este definită ca un proces

inflamator cu evoluție acută sau cronică, cu afectarea, în princial, a
țesuturilor articulare și periarticulare, dar și cu implicarea altor țesuturi,
mai frecvent cel cardiac. La animale boala poare a fi frecventă la miei,
câini, porci și taurine, deși cazuri de artrită generalizată sunt destul de
frecvent semnalate și la alte animale.
Este una dintre bolile autoimune la care s-a demonstrat etiologia
infecțiosă (streptococ beta hemolitic).
DETECTAREA ANTICORPILOR ANTISTREPTOLIZINA O (ASLO)
Identificarea acestor anticorpi (ASLO) poate fi utilă pentru

demonstrarea fenomenului de cros reactivitate antigenică streptococ –
miocard, evidențiat de Kaplan. Aceste asemănări între structura unor
componente ale streptococului și antigenele proprii prezente la nivelul
miocardului, aortei, articulațiilor se soldează cu atacul imun al
organismului și asupra selfului și a non-selfului.
Conform opiniei unor cercetători, reumatismul articular acut sau
febra reumatismală sunt fenomene cu care se confruntă în exclusivitate
specia umană. Streptococul este un microorganism care se distinge printr-
142
o compoziție imunogenă cu totul particulară. Majoritatea antigenelor

structurale streptococice sunt localizate la nivelul capsular, aici aflându-se
şi proteinele M, T, R, precum şi substanța C. Toxinele (streptolizina O,
toxina Dick, dezoxiribonucleaza, streptokinaza, hialuronidaza,
difosfopiridinnucleotidaza, precursorul proteinazei) sunt de asemenea
extrem de imunogene.
ASLO – kit – conține particule de latex în care este înglobată
streptolizina O. În urma contactului cu serul care conține atc
antistreptolizina O într-o concentrație mai mare de 200 U.I./ml,
particulele latex vor fi aglutinate, rezultatul fiind considerat pozitiv.

ANEMIEI HEMOLITICE AUTOIMUNE (AHAI)
Anemiile hemolitice autoimune (AHAI) reprezintă un grup de

afecţiuni cu substrat imunitar, în care se sintetizează anticorpi specifici
faţă de una sau mai multe componente ale membranei eritrocitare. În
prezența complementului, hemoliza este mediată de anticorpi
antieritrocitari din clasa IgG şi IgM.
Anemia hemolitică autoimună este cea mai comună reacţie de
hipersensibilitate de tip II produsă de anticorpi citotoxici, fiind, deseri,
asociată cu LES (mai ales la câini) sau maladii limforeticulare (cai şi pisici).
Sunt afectate mai frecvent rasele Basenji, West Highland, White Terrier,
English Springer Spaniel, Alaskan Malamute, Poodle şi Beagle care pot fi
predispuse congenital datorită deficitelor enzimatice (ca piruvat kinaza).
Diagnosticarea bolii se realizează cu ajutorul testului antiglobulinic.
TESTUL COOMBS (ANTIGLOBULINIC)
Reacția de hemaglutinare pasivă (testul Coombs) este utilizată

pentru a identificarea anticorpilor anti-eritrocitari, atunci când
concentrația acestora este prea mică pentru a produce autoaglutinare
spontană. Sunt 2 tipuri de teste: direct şi indirect.
143
Fig. 77 – Testul Coombs ditect

http://www.newhealthadvisor.com/images/1HT00404/Direct%20Antiglobulin%20Test.png
Testul direct (fig. 77) detectează anticorpii anti-eritrocitari ataşați

de eritrocite şi este cel mai util test de diagnosticare a AHAI.
Testul indirect (fig. 78) detectează anticorpii anti-eritrocitari
prezenți în serul pacientului.
Fig. 78 – Testul Coombs indirect

https://o.quizlet.com/lCgA2K5Gq.-XBEupqjVrsQ_m.jpg
Există două clase majore de anticorpi care reacționează cu

eritrocitele. Anticorpii compleți aglutinează eritrocitele suspendate în
soluție salină și sunt, de obicei, de tip IgM. In vivo, anticorpii IgM din
complexele eritrocite – atc, fixează complementul şi produc hemoliza
intravasculară mediată imun.
Anticorpii care nu reacționează vizibil în mediu salin şi produc
reacții de aglutinare, vizibile numai prin tehnici speciale, sunt numiți
aglutinine incomplete şi sunt, de obicei, de tip IgG.
Deoarece cei mai mulţi anticorpi anti-eritrocitari sunt ataşaţi de
eritrocite testul direct este mai sensibil şi furnizează în puţine cazuri
144
rezultate fals negative. Rezultatele testului direct sunt raportate ca

pozitive sau negative.
Principiul testului direct constă în incubarea suspensiei de
eritrocite spălate cu reactivul Coombs, fiind posibilă aglutinarea şi liza
eritrocitelor sensibilizate.
Reactivul Coobs poate fi monovalent (anticorpi anti-Ig specifică)
sau polivalent (anticorpi anti - IgG, IgM, şi C3b).
Sângele recoltat pe EDTA este centrifugat, supernatantul este
înlocuit cu TFS, iar după altă centrifugare, din eritrocitele spălate se obține
o suspensie de 2%..
Anticorpii antieritrociari prezenți pe eritrocitele din proba de
testat, interacționează cu reactivul Coombs și produc aglutinare
microscopică.
Tehnica de lucru pentru Canine Coombs Reagent (VMRD USA).
Reagentul Coombs este un antiser la IgG, IgM şi C3 preparat pe
capră. După obţinere acesta se inactivează la 560C timp de 30 minute,
reagentul nereacţionând cu eritrocitele normale de câine. Pentru testare
sângele poate fi recoltat pe acid etilendiamin tetraacetic (EDTA) sau
heparină. Ca mator negativ se utilizează eritrocite recoltate de la un câine
sănătos.
Prepararea suspensiei de eritrocite:
se centrifughează sângele (recoltat pe EDTA sau heparină) timp de
5 minute la temperatura camerei;
se îndepărtează 0,1 ml şi se adaugă 4,9 ml TFS se omogenizează, se
centrifughează, se îndepărtează supernatantul şi se adaugă 4,9 ml
PBS, repetând operaţiunea de 3 ori;
la sfârşitul ultimei spălări se îndepărtează supernatantul şi se
resuspendă în 4,9 ml TFS, obţinându-se o suspensie de eritrocite
2%.
Pentru test se prepară diluții seriate ale reactivului Coombs: se
numerotează 4 tuburi (12 x 75 mm) şi se adaugă câte 0,1 ml TFS; se
adaugă 0,1 ml reagent Coombs în tubul nr. 1 (diluţia 1:2), se omogenizează
şi se trec 0,1 ml în tubul nr. 2 (diluţia 1:4), apoi se omogenizează şi se trec
145
0,1 ml în tubul nr. 3 (diluţia 1:4). Din tubul nr. 3 se îndepărtează 0,1 ml.
Tubul nr. 4 va conţine doar TFS.
Peste toate diluțiile se adaugă câte 0,1 ml eritrocite spălate,
omogenizându-se uşor, după care se incubează 30 minute la 370C și se
centrifughează 1 minut. Din fiecare tub, se plasează o cantitate mică pe o
lamă şi se examinează la microscop (x100).
Interpretarea testului:
Rezultat negativ – eritrocite neaglutinate;
Rezultat pozitiv – agregate mari de eritrocite identice cu cele din
martorul pozitiv;
Rezultat fals pozitiv - poate apare datorită: transfuziilor cu sânge
incompatibil, adsorpţiei complementului în timpul stocării (evitat
prin folosirea sângelui recoltat pe EDTA);
Rezultat fals negativ - apare datorită concentraţiei prea scăzute de
anticorpi, după terapia cu corticosteroizi, din cauza eluţiei
anticorpilor de pe eritrocite în timpul spălării, datorită detaşării
anticorpilor de pe eritrocite o dată cu învechirea probei.
TESTELE CUTANATE UTILIZATE ÎN

DIAGNOSTICUL STĂRILOR DE HIPERSENSIBILITATE
Stările de hipersensibilitate (tipul I-IV) sau alergiile reprezintă

reacții anormale ale organismului la una sau mai multe substanțe alergene
care, în general sunt tolerate și inofensive la indivizii sănătoși. Alergenele
pot fi de natură alimentară, chimică, biologică sau fizică.
În funcție de tipul de alergie și de poarta de ntrare, reacțiile se pot
manifesta la nivel local sau general. În consecință este bine de cunoscut
care sunt substanțele la care un animal este alergic și care sunt
posibilitățile de diagnostic.
Cele mai frecvente tipuri de stări de hipersensibilitate care
evoluează la animalele de companie sunt: alergia la înțepătura de purici,
alergia alimentară și atopia.
146
Alergenii pot fi reprezentați de ierburi, proteine de insecte

(gândaci), mucegai, praf din casă, medicamente, produse cosmetice, etc.
Animalele pot dezvolta alergii la alergeni multipli, în același timp.
Testele alergologice pot fi împărțite în două categorii:

teste cutanate (prick, idr, patch);
teste sangvine.
Aceste metode sunt recomandate în scop de diagnostic și, în multe
cazuri, pe lângă măsurile nespecifice care se impun (evitarea expunerii la
alergen, deparazitarea) se utilizează și imunoterapia specifică cu alergeni
(desensibilizarea). De cele mai multe ori, alergiile pot fi relativ ușor
suspicionate, în special când dispar o dată cu îndepărtarea alergenului.
Testele cutanate se realizează prin aplicarea cutanată a alergenii

suspectați și urmărirea apariției unei reacții ulterioare la locul
administrării (in vivo).
Prick testul (scratch test sau testul percutan) constă în aplicarea,
pe pielea animalului, a câte unei picături din soluția de extract alergenic
standardizat care va patrunde în piele prin înțepătura nesângerandă
realizată cu o lanțetă foarte fină.
Pentru a verifica reactivitatea normală a pielii sunt utilizate două
substanțe marker:
Histamina (martorul pozitiv)– la majoritatea indivizilor provoacă
un răspuns (în cazul lipsei de răspuns individul nu va reacționa la
nici un alergen testat).
Glicerina sau soluția salină (martorul negativ) - la majoritatea
indivizilor nu provoacă nici un răspuns (în cazul răspunsului
pozitiv, se admite că individul este foarte sensibil și va produce
multe reacții fals pozitive).
Rezultatele se citesc în 15 minute. Apariția unei leziuni
asemănătoare cu o pișcătură de țânțar de dimensiuni diferite este
considerată pozitivă (fig. 79).
147
Fig. 79 – Prick test

https://myhealth.alberta.ca/health/_layouts/15/healthwise/media/medical/hw/h9991640_001.jpg
http://www.coughdoc.com/uploads/images/spt%20lancet_550.JPG
Patch test (fig. 80) este o metodă utilizată pentru testarea

sensibilității la anumite substanțe care pot produce reacții de
hipersensibilitate tardivă (dermatita de contact – iritația pielii). Una sau
mai multe alergene (20-30) sunt aplicate pe plasturi, care apoi sunt puse
în contact cu pielea, timp de 48-72 de ore. Apariția unei iritații sau chiar a
papulelor este considerată reacție pozitivă.
Fig. 80– Patch test

http://www.dermnet.com/wp-content/uploads/2011/10/patch-test.jpg
Intradermoreacția (idr) constă în injectarea intradermică a unei

picături de extract alergenic pe o zonă de piele tunsă foarte scurt (părțile
laterale ale corpului sau abdomen) (fig. 81). După 30 minute, locul
administrării este examinat și se apreciază răspunsul organismului (fig.
82).
148
În reacția negativă, aspectul pielii nu se modifică la locul aplicării

alergenului.
În reacția pozitivă, la locul aplicării, apare câte o papulă înconjurată
de eritem de dimensiuni diferite (fig. 82), în funcție de care se poate
aprecia severitatea sensibilizării alergice.
Fig. 81 – Intradermoreacția Fig. 82 – Intradermoreacția

administrarea alergenilor interpretarea
http://www.sacdermvet.com/yahoo_site_admin/assets/images/IDTsmall.143135743_std.jpg
http://atlantaskinvet.com/sites/site-2698/images/AVSAC%20img/Intradermal%20Allergy%20Test.JPG
Reacțiile pozitive, la oricare dintre teste semnifică o alergie la o

anumită substanță, dimensiunea leziunii fiind direct proporțională cu
gradul de sensibilitate. De asemenea, trebuie reținut faptul că testele
alergice nu sunt întotdeauna foarte exacte. Indivizi diferiți reacționează
diferit la acelaș alergen, existând posibilitatea apariției rezultatelor fals
pozitive și negative. Anumite medicamente (antihistaminice,
antidepresive) sau afecțiuni ale pielii (eczema) pot interfera cu testele
alergice. În aceste condiții, se recomandă testele sangvine.
Testele sanguine sunt utilizate în scopul identificării reaginelor

(anticorpi specifici din clasa IgE) produse ca urmare a sensibilizării
produse de alergenul incriminat în declanșarea reacției (in vitro). Sângele
recoltat se pune în contact cu alergenii suspicionați și se măsoară
cantitatea de IgE specifice alergenelor prin metodele ELISA, testul de
149
eliberare a histaminei de către bazofile sau radioallergosorbent test

(RAST).
Aceste teste in vitro sunt mai puțin sensibile și mai costisitoare
decât cele cutanate, fiind recomandate doar în cazul unei reactivități
crescute a pielii sau a evoluției unor boli cutanate.
Pe lângă acestea, pacienții suspectați de alergii alimentare sunt
supuși unor teste suplimentare, care constau în introducerea treptată a
alimentelor și urmărirea reacțiilor ce pot apare. Testele alergice pot
identifica alergenii specifici, responsabili de stările de hipersensibilitate şi
care pot sta la baza imunoterapiei.
DIAGNOSTICUL ALERGIC AL TUBERCULOZEI LA BOVINE
În acest test, alergenele folosite sunt tuberculina purificată PPD de

tip bovin (derivat proteic purificat extras din culturi de Mycobacterium.
bovis, tulpina interanțională AN5) și tuberculina purificată PPD de tip aviar
(derivat proteic purificat extras din culturi de Mycobacterium. avium,
tulpina interanțională D4ER).
Teste de diagnostic folosite sunt testul unic (TU), testul
comparativ simultan (TCS) și testul intravenos (TIV).
Testul unic (TU)

In treimea mijlocie a laturii stângi a gâtului se tunde un pătrat cu
latura de 5 cm pe o porțiune de derm integră. Se măsoară, cu ajutorul
cutimetrului, grosimea pliului vertical de piele din mijlocul ariei tunse. Se
inoculează strict intradermic (cu verificarea bulei de inoculare) cantitatea
de 0,1 ml PPD bovin, în centrul acestei arii.
Citirea reacției se face după 72 ore de la inoculare de către
aceiaşi persoană şi constă în:
- măsurarea şi înregistrarea grosimii pliului vertical de piele din
zona în care dimensiunea reacției este maximă ;
150
- aprecierea caracterelor reacției: consistență ( moale, păstos, dur),

aspect (margini delimitate sau difuze), formă (circumscris sau decliv),
mobilitate (aderent sau mobil) ;
- măsurarea diametrelor - orizontal şi vertical ale reacției.
Interpretarea reacției
Reacția pozitivă - îngroşare a pliului pielii de peste 3 mm.
Reacția dubioasă - îngroşare a pliului pielii ˂ 3 mm + edem moale
sau păstos sau îngroşare între 1-3 mm + edem sau nodul.
Reacția negativă - lipsa modificărilor la locul de inoculare sau
îngroşare ˂ 1 mm, fără edem moale sau păstos.
Testul comparativ simultan (TCS)

In treimea mijlocie a laturii stângi a gâtului, pe diagonala dreapta-
sus, stânga-jos a unui pătrat imaginar cu latura de 15 cm, se tund două
pătrate cu latura de 5 cm (se respectă direcția marginii anterioare a
spetei). După cutimetrie şi înregistrarea grosimii pliurilor de derm din
centrul celor două pătrate, se inoculează strict intra dermic 0,1 ml PPD
aviar în centrul pătratului supero-posterior şi 0,1 ml PPD bovin în centrul
pătratului infero-anterior.
Citirea reacției se face după 72 ore şi comportă aceiaşi apreciere
ca la TU, pentru fiecare alergen în parte.
Interpretarea reacției
Reacția pozitivă:
- reacția la PPD bovin cu edem moale sau păstos ˃ reacția la PPD
aviar cu peste 3 mm ;
- reacția la PPD bovin cu edem dur ˃ reacția la PPD aviar cu peste
4 mm.
Reacția recontrol se consideră:
- reacția la PPD bovin cu edem moale sau păstos ˃ reacția la PPD
aviar cu până la 3 mm ;
- reacția la PPD bovin cu edem moale sau păstos ≤ reacția la PPD
aviar cu edem dur sau nodul ;
151
- reacția la PPD bovin cu edem dur sau nodul ˃ reacția la PPD

aviar cu 1-4 mm.
Reacția negativă:
- reacțiile l ambele tuberculine sunt negative;
- reacția PPD bovin, indiferent de caracterul edemului ≤ reacția la
PPD aviar, însoțită de edem moale sau păstos, sau
- reacția la PPD bovin cu edem sau nodul ˃ reacția la PPD aviar cu
până la 1 mm.
Testul intravenos (TIV)

Se înregistrează temperatura corporală a fiecărui animal ce
urmează a fi testat. Se inoculează intravenos câte 4 ml PPD bovin.
Animalele inoculate se mențin în repaus total.
Reacția pozitivă se consideră când temperatura maximă
depăşeşte 40C, cu o diferență de cel puțin un grad față de temperatura
inițială
Reacție dubioasă se consideră când:
- temperatura maximă este cuprinsă între 39,5C şi 40C, cu o
diferență de cel puțin un grad față de temperatura inițială , sau
- când temperatura maximă depăşeşte 40C, fără se înregistreze
diferența de un grad față de temperatura inițială.
Reacția negativă se consideră când temperatura maximă nu
atinge 39,5C şi diferențele menționate.
Testele tuberculinice intradermice se pot repeta după un interval
de cel puțin 45 zile .
Testul intravenos se poate repeta după un interval de cel puțin 90
zile .
Intervalul de repaus după un test intravenos, pentru aplicarea
următorului TCS, este de 60 zile.
152
Testul de transformare celulară a limfocitelor (LTT)

este o altă metodă de diagnostic a stărilor de hipersensibilitate tip IV
(întârziate) la medicamente, metale, materiale dentare, alimente.
Principiul testului își are bazele în 1962 când s-a observat că
incubarea limfocitelor cu fitohemaglutinină (substanță mitogenă), conduce
la activarea și proliferarea celulară. De asemenea, limfocitele sensibilizate
anterior față de un anumit antigen (alergen) proliferează și se transformă
în celule blastice la o nouă reexpunere.
Pentru cuantificarea procesului de transformare limfoblastică, în
concordanță cu mecanismele biologice produse la nivel celular, se
utilizează metode fizice și chimice. Acestea includ măsurarea unor procese
metabolice cum ar fi biosinteza proteică, sinteza acidului ribonucleic
(ARN) sau a acidului dezoxiribonucleic (ADN). Testul care măsoară
replicarea ADN-ului este cel mai larg folosit.
Materiale și metodă:
Se utilizează limfocite izolate din sângele periferic prin centrifugare
în gradient de densitate Ficoll și resuspendate în mediu de cultură
(1,2×106 celule pe o placă de cultură sterilă);
Se adaugă alergene/antigene și se incubează culturile celulare la
37˚C, în atmosferă de 5% CO2;
Pentru creșterea specificității testului se adaugă α-interferon, ser
autolog și glutamină (intensifică proliferarea specifică indusă de antigen și
reduce proliferarea spontană nespecifică a limfocitelor;
în ziua 6 se va adăuga timidină marcată cu H3 (pentru un interval
de 8-12 ore, timp suficient pentru ca toate celulele să treacă printr-un ciclu
de diviziune cu sinteza ADN-ului în faza S); aceasta nucleozit marcat cu un
izotop radioactiv se va încorpora în celulele-fiice ale limfocitelor activate;
celulele sunt colectate în filtre din fibre de sticlă;
se cuantifică sinteza de ADN indusă de antigen prin masurarea într-
un contor beta a ratei încorporării H-timidinei.
Reacția pozitivă la LTT demonstrează existența limfocitelor
antigen-specifice (celule cu memorie) în proba de sânge testată.
153
Rata de încorporare a 3H-timidinei în ADN este direct proporțională

cu proliferarea limfocitară. Din rata de încorporare a timidinei (cpm=
counts per minute; numărul de ionizări pe minut) este calculat un index de
stimulare (SI):
SI = radioactivitatea încorporată în culturile cu antigen/
radioactivitatea încorporată în culturile fără antigen
SI este evaluat pentru fiecare antigen în parte.
Interpretarea rezultatelor
Rezultat negativ: SI < 2 (nu există sensibilizare de tip IV față de
alergenele testate);
Rezultat pozitiv: SI ≥ 2
Rezultat neconcludent (dubioase) sunt cele înregistrate în
condițiile în care nu s-au îndeplinit criteriile de validare ale controlului
pozitiv (limfocitele utilizate nu au activare policlonală a limfocitelor), fie
ale controlului negativ (proliferare spontană crescută).
Acest test realizează doar identificarea unei sensibilizări a
limfocitelor și predispoziția de dezvoltare a unor stări de
hipersensibilizare.
154
Listă cu abrevieri
µm Micrometru
antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (citotoxicitate celulară
ADCC
mediată de anticorpi)
ADN Acid dezoxiribonucleic
AGID Agar gel immunodiffusion (imunodifuzie în gel de agaroză)
AHAI Anemia hemolitică autoimună
AIE Anemia infecțioasă ecvină
AMCA 7-aminocoumarina
Anti-neutrophil cytoplasmic antibody (anticorpi anti citoplasmă
ANCA
neutrofile)
ANA Antinuclear antibody (anticorpi antinucleari)
Atc Anticorp
Atc I Anticorpi primari (anticorpi specifici antigenului)
Anticorpi secundari (anticorpi anti-imunoglobulină de specie față
Atc II de specia pe care s-au preparat sau de la care au provenit anticorpii
primari)
Atg Antigen
BCIP/NBT nitro-blue tetrazolium / 5-bromo-4-chloro-3’-indolyphosphate
BSA Albumină serică bovină
C1-30, C3b Fracțiuni ale complementului
CBA Cytometric bead array
CD Cluster designation (marker celulari de pe limfocite)
CH Complement hemolitic
CL Chemiluminiscență
CMA Complex membranar de atac
CPA Cellule prezentatoare de antigen
DAB Diaminobenzidina
DAPI 4′-6-diamidino2-phenylindole
DIP Doza infectantă patogenă
EDTA Acidul etilendiaminotetraacetic
155
EIA Electroimmunoassay (electroimunodifuzia)

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (testul imunoenzimatic)
Fc Fracțiunea cristalizabilă
FCoV Coronavirus felin
FITC Izotiocianat de fluoresceină
FR Factor reumatoid
FTN Formol tamponat neutru
HRP Horse radish peroxidase (peroxidaza)
ICC Imunocitochimie
IDR Intradermoreacția
IEF Imunoelectroforeza
IFD Imunofluorescența directă
IFI Imunofluorescența indirectă
IFN Interferon
IFS Imunofluorescența sandwich
Ig Imunoglobulină (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)
IHC Imunohistochimie
IL Interleukine
kDa Kilodalton
LB Limfocite B
LCR Lichid cefalorahidian
LEB Leucoza enzootică bovină
LES Lupus eritematos sitemic
LT Limfocite T
LTc Limfocite T citotoxice
LTh Limfocite T helper
LTs Limfocite T supresoare
MALT Țesuturi limfoide asociate mucoaselor
MOH Măduvă osoasă hematogenă
NK Natural Killer
nm Nanometru
NTG Număr total de germeni
OLP Organe limfoide primare
OLS Organe limfoide secundare
PBS/TFS Phosphate buffer saline / tampon fosfat salin
PCR Proteina C reactivă
156
PHA Fitohemaglutinina
PK Pork kidney (celule renale de porc)
PPC Pesta porcină clasică
PR Poliartrita reumatoidă
RFC Reacția de fixare a complementului
RHA Reacția de hemaglutinare
RI Răspunsul imun
RIA Reacții radioimunologice
RIHA Reacția de inhibare a hemaglutinării
rpm Rotații pe minut
sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (gel de
SDS-PAGE
electroforeză cu poliacrilamidă și sulfat dodecil de sodiu)
SF Ser fiziologic
SFF Ser fiziologic fenolat
SPF Specific pathogen free (libere de germeni patogeni specifici)
TIH Titri inhiboaglutinant
TNF Tumor necrosis factor
TRITC Tetrametil rodamina
UAI Unități aglutinante internaționale
UFC Unități fixatoare de complement
UH/UHA Unități hemaglutinante
UN Unități neutralizante
UV Ultraviolete
VPIF Virusul peritonitei infecțioase feline
WB Western Blot
λ Lambda (lungime de undă)
157
Bibliografie
1. Adina Bărănguţă, Cristina Horhogea, Aurelia Ionescu, Irina Homescu, T.

Perianu, 2009 - Aspects regarding serological and virusological
surveillance of the moving bovines and ovines flocks from TCE 3 BRAZI
Farm, Scientific Works C Series LV, Simpozionul Contributions of
scientific research to the progress of veterinary medicine 19 – 20
noiembrie 2009, UȘAMV București, pag. 756-759, Record Number
20103327971
2. Bain, B. and Pshyk, K. (1972) - Enhanced reactivity in mixed leukocyte
cultures after separation of mononuclear cell on Ficoll-Hypaque.
Transplantation Proceedings 4: 163–164.
3. Berceanu St., Păunescu E. (1981) –Biologia şi patologia imunităţii, Ed.
Academiei Române, Bucureşti.
4. Berg P. A. and E. W. Becker (1995).- The lymphocyte transformation
test – a debated method for the evaluation of drug allergic hepatic
injury. In J. Hepatol. 22, 115–118
5. Beunett D.- Synovial fluid cytology. Jornal of Small Animal Practice
28:9, 779-797, 1997
6. Bloch, Durt J. (1992)- Cryoglobulinemia and Hepatitis C Virus, New
England Journal of Medicine, Vol. 327, pp 1521-1522.
7. Borbil Septimiu (2004) – Imunopatatiile la câine: studiu epidemiologic,
aspecte anatomoclinice, metode de diagnostic şi tratament, Teză de
doctorat, Cluj-Napoca.
8. Břyum, A. (1964) - Separation of white blood cells.” Nature 204: 793–
794, 1964.
9. Břyum, A., (1968) - Isolation of mononuclear cells and granulocytes
from human blood.” Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 Suppl. 97 (Paper IV):
77–89.
10. Burnette WN. (1981) - Western blotting': electrophoretic transfer of
proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to
158
unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody

and radioiodinated protein A". Analytical Biochemistry 112 (2): 195–
203. doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5. ISSN 0003-2697.
PMID 6266278.
11. Camus MS1, Almy FS, Cienava EA (2010) - A ragtime joint. Immune-
mediated polyarthropathy in a dog, Vet Clin Pathol. 2010 Mar;39(1):4.
doi: 10.1111/j.1939-165X.2010.00222.x.
12. Carp - Cărare M., Timofte D. Solcan Gh, Solcan C. Pavel G. Rebegea
Cristina (2005)– Boli autoimune diagnosticate la câine, Rev. Rom. Med.
Vet., 15, 1., pag. 83-96.
13. Carp-Cărare M., Timofte D. (1998) - Imunologie şi imunopatologie,
manual practic, Ed Vasiliana, Iaşi;
14. Carp-Cărare M., Timofte D. (2002)- Imunologie şi imunopatologie, Ed
Venus, Iaşi.
15. Clements DN, Gear RN, Tattersall J, Carmichael S, Bennett D. (2004) -
Type I immune-mediated polyarthritis in dogs: 39 cases (1997-2002), J
Am Vet Med Assoc. 2004 Apr 15;224(8):1323-7.
16. Corley RB. (2005) -A Guide to Methods in the Biomedical Sciences.
Springer. p. 11. ISBN 978-0-387-22844-0.
17. Cristina Horhogea, Ivona Laiu, Sophie Le Poder, M. Carp-Cărare,
Cristina Rîmbu, C. Carp-Cărare , 2011- Identification of coronaviral
antibodies and coronavirus - specific antibody complexes in ascites
fluid of cats diagnosticated with feline infectious peritonitis, Cercetări
Agronomice în Moldova, Vol. XLIII , No. 2 (146), pag. 87-93 Record
Number 20113390193
18. Cristina Horhogea, M. Carp-Cărare, Cristina Rîmbu, C. Carp-Cărare,
2010 - Serological evaluation of canine coronavirus antibodies,
Cercetări Agronomice în Moldova, Vol. XLIII , No. 3 (143), pag. 75-79
Record Number 20103366725
19. Cytodiagnosis staining methods Merck, Millipore, 07/2014
20. Duca M.C. (1990) – Imunologie şi imunopatologie, Editura Didactică şi
Pedagocică.
159
21. Filip Valentin (1988) – Îndreptar de alergologie, ed. Medicală,

București.
22. Flow Cytometry ‐ A Basic Introduction – Wicki Version (Michael G.
Ormerod) http://flowbook‐wiki.denovosoftware.com/ Consolidated
Resource for Flow Cytometry Antibodies, Instrumentation, Software &
Suppliers: http://www.chromocyte.com
23. Frances Fischbach (2009) - Immunodiagnostic Studies. In A Manual of
Laboratory and Diagnostic Tests.Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8
ed.
24. Ghergariu S, Pop Al., Kadar L., Spînu M (2000) – Manual de laborator
clinic veterinar, Ed. All, Bucureşti.
25. Ghergariu S.(1984) - Bolile alergice şi autoimunopatiile la animale, Ed.
Ceres, Bucureşti.
26. Gîjâilă Gabriel (2002) - Imunologie analitică, aspecte fndamentale şi
metodologice, Editura Printech.
27. Harris, R. and Ukaejiofo, E.O. (1970) - Tissue typing using a routine
one-step lymphocyte separation technique.” Brit. J. Haematol. 18: 229–
235.
28. Hawiger D, Inaba K, Dorsett Y, Guo M,Mahnke K, Rivera M,et al (2001) -
Dendritic cells induce peripheral T cell unresponsiveness under steady
state conditions in vivo, J Exp Med,194:769 –79.
29. Heath WR, Carbone FR. (2001)- Cross-presentation, dendritic cells,
tolerance and immunity, Annual Rev. Immunol.;19:47 –64.
30. Imaging Systems for Westerns: Chemiluminescence vs. Infrared
Detection, 2009 - Methods in Molecular Biology, Protein Blotting and
Detection, vol. 536" (PDF). Humana Press. Retrieved 2010-02-26.
31. Koivunen Marja E., Richard L. Krogsrud (2006)- Principles of
Immunochemical Techniques Used in Clinical Laboratories,
Labmedicine, Volume 37, Number 8, DOI:
10.1309/MV9RM1FDLWAUWQ3F
32. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and
Interpretive Guide. Immunofixation (IFE), Serum and Protein
160
Electrophoresis, Serum. www.labcorp.com. 2015. Ref Type: Internet

Communication
33. Laboratory Manual for Medical Immunology, Fujian Medical University,
2011
34. Levinson, Stanley S (2009) – Immunoelectrophoresis, Published
online: September 2009, DOI: 10.1002/9780470015902. a0001136.
pub2
35. Lothar Thomas (1998) - Monoclonal Immunoglobulins. Clinical
Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory
Results.
36. Manolescu, N., N.Alexandru, N. Avram, H. Barza, V.Comisel, - Tratat de
hematologie animală (1999), vol.1, Ed. Fundaţiei "România de mâine",
Bucureşti.
37. Mihăescu Grigore (2001) – Imunologie și imunochimie, Editura
Universității din București, 456 p. Bibliogr. ISBN 973-575-556-4
38. Mihăiescu Grigore- Imunologie şi imunochimie, Bucureşti, 2003
39. Moga Mânzat Radu (2005) – Boli virotice şi prionice ale animalelor, Ed.
Brumar, Timişoara.
40. Neff, A. (2003) - Autoimmune hemolytic Anemias. In Wintrobe’s
Clinical Hematology. Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia,
11th Ed., 1158-1177.
41. Olinescu Andrei (1995)– Elemente de imunologie comparată, Ed.
Ceres.
42. Olinescu Andrei (1995) –Imunologie comparată, Ed. Didactică şi
Pedagogică Bucureşti.
43. Pastoret, P.P., Govaerts, A., Bazin, H. – Imunologie animale, Ed.
Medicine-Sciences, Paris, 1990.
44. Perianu Tudor (2011)– Tratat de boli infecțioase ale animalelor,
Bacterioze, vol. I, ed. Universitas.
45. Perianu Tudor (2012)– Tratat de boli infecțioase ale animalelor, Viroze
și boli prionice, vol. II, ed. Universitas.
161
46. Quesada-González, Daniel; Merkoçi, Arben (2015) - Nanoparticle-based

lateral flow biosensors". Biosensors & Bioelectronics 15 (special): 47–
63.doi:10.1016/j.bios.2015.05.050.
47. Răducănescu Helgomar (1999) – Compendiu de imunopatologie
veterinară , Ed. Fundaţia Română de mâine, Bucureşti.
48. Răpuntean Gheorghe (1996)- Imunologie şi imunopatologie, Ed
Genesis, Cluj Napoca.
49. Rebegea (Horhogea) Cristina Elena (2007)– Cercetări privind bolile
autoimune la câine și pisică, teză de doctorat, Iași
50. Rebegea Cristina, Carp – Cărare M., 2007 - Serological screening for
anti-felin coronavirus antibodies detection using indirect
immunofluorescence technics, Lucrări Ştiinţifice vol. 50(9), pag. 603-
606, Ed. Ion Ionescu de La Brad, Iaşi, ISSN 1457-7406. Record Number
20073190443
51. Rebegea Cristina, Carp Cărare Mihai (2007)– Serological screening for
anti-felin coronavirus antibodies detection using indirect
immunofluorescence technics, Lucrări ştiinţifice vol 50,pag.608-610,
Ed. Ion Ionescu de la Brad, Iaşi.
52. Rebegea Cristina, Carp-Cărare M, Solcan Ghe., 2007 – Researches
regarding some allergic diseases diagnosis in dogs and cats, Lucrări
Ştiinţifice vol. 50(9), pag. 606-610, Ed. Ion Ionescu De La Brad, Iaşi,
ISSN 1457-7406. Record Number 20073190434
53. Rebegea Cristina, Guguianu Eleonora, Carp–Cărare C.(2005) -
Investigaţii privind diagnosticul bolilor autoimune utilizând teste de
aglutinare cu latex, Lucrări ştiinţifice vol 48(7), pag.576-579, Ed. Ion
Ionescu de la Brad, Iaşi.
54. Ruginosu, E., Creangă , Ş., Plă vă nescu, A., Dască lu, L., Aniţă , D. Aniţă , A.,
Rebegea, C., Solcan, G., 2010 - Studies regarding the prevalence and
determinant factors of the main diseases in dairy cows, Lucrări
Ştiinţifice Vol. 53(12) Medicină Veterinară, 2010, ISSN 1454-7406, pag
841-848, Record Number 20103374912
162
55. Sieben S, Hertl M, Al Masaoudi T, Merk HF and Blomeke B (2001a)

Characterization of T cell responses to fragrances. In Toxicol Appl
Pharmacol 172:172-8 .
56. Simu G. (1978) – Imunitate și cancer, Ed. Medicală, București.
57. Skoog, W.A. and Beck, W.S. (1956), - Studies in the fibrinogen, dextran,
and phytohemagglutinin methods of isolating leukocytes. Blood 11:
436–454, 1956.
58. Solcan Ghe., Mitrea I.L., Miron L., Solcan C. (2003) – Dermatologia
animalelor de companie, Ed. Ion Ionescu de la Brad, Iaşi.
59. Ting, A. and Morris, P.J. (1971) - A technique for lymphocyte
preparation from stored heparinized blood.” Vox Sang 20: 561–563.
60. Tizard, IR: (2004)- Veterinary Immunology, An Introduction, 7th ed.
Philadelphia, W. B. Saunders Co., pp.405-408.
61. Tîrziu E. (2004) – Imunologie, Ed. Brumar, ISBN 973-602-076-3,
Timisoara.
62. Tîrziu E., Trif R., Vior C., Cumpănășoiu (2002) – Metode de diagnostic
imunologic, Ed. Walpress, ISBN 973-8453-06-2, Timișoara.
63. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. (1979) - Electrophoretic transfer of
proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure
and some applications". Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 76 (9): 4350–54. doi:10.1073/ pnas.76.9.4350. PMC
411572. PMID 388439.
64. Trif Radu, Vior Constantin (1996) – Patologia sistemului imunitar, Ed
Brumar, ISBN 973-978-03-6-9, Timisoara.
65. Vior C-tin, Răducănescu H., Manolescu, Trif R. (1980)- Imunitatea și
imunoprofilaxia la animale, Ed.Ceres, București.
66. Vior C-tin, Răducănescu H., Tîrziu E., Trif R. (2005)- Imunopatologie,
Ed.Brumar, ISBN 973-602-104-1,Timişoara.
67. Von Baehr V, W. Mayer, C. Liebenthal, R. Von Baehr, W. Bieger, HD Volk
(2001)- Improving the in vitro antigen specific T cell proliferation
assay: the use of interferon-alpha to elicit antigen-specific stimulation
and decrease bystander proliferation. In Journal of immunological
method, 251(1-2):63-71.
163
68. Wybran, J., Chantler, S. and Fudenberg, H.H., (1973) Response to

phytohemagglutinin.” J. Immunol. 110: 1157–1160.
69. Zare H, Shooshtari P, Gupta A, Brinkman RR (2010). - Data reduction
for spectral clustering to analyze high throughput flow cytometry
data". BMC Bioinformatics 11: 403. doi:10.1186/1471-2105-11-403.
PMC 2923634. PMID 20667133.
70. Zeana C. (1980) - Imunologie clinică, Ed. Medicală, Bucureşti.
164
Consilier editorial: Vasile VÎNTU

Tehnoredactor: Cristina HORHOGEA
Corectori: Cristina HORHOGEA, Eleonora GUGUIANU
Coperta: Cristina HORHOGEA
_________________________
Bun de tipar: octombrie 2015
Apărut: octombrie 2015
Editura: “Ion Ionescu de la Brad” Iaşi
Aleea M. Sadoveanu nr. 3
Tel.: +40 232 218300;
E-mail: editura@uaiasi.ro
__________________________
ISBN: ISBN 978-973-147-185-3
Tipărit la PIM Iași
165

Imunologie Veterinara

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Imunologie Veterinara

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

CRISTINA HORHOGEA

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ

Editura Ion Ionescu de la Brad

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României

Imunodifuzia orizontală simplă (radială Mancini) ....................................................................... 56

Citometria în flux ......................................................................................................................................... 124

Imunologia este o ramură a științelor medicale care se ocupă cu

ORGANIZAREA SISTEMULUI IMUN

Sistemul imun este un ansamblu extrem de complex, alcătuit din

•sediul formării, maturării şi educării celulor implicate în

Organe limfoide •Ficatul embrionar

În etapele timpurii ale dezvoltării embriofetale, ficatul embrionar

•populate de LT și LB, după maturare și instruire în OLP

Limfonodurile sunt responsabile cu filtrarea și sechestrarea

infecții, limfonodurile regionale cresc mult în volum, datorită proliferării

În sens general, imunitatea poate fi definită ca o stare de

Caracteristici Imunitatea naturală Imunitatea dobândită

IMUNITATEA NATURALĂ este starea de rezistență a organismului,

Barierele naturale (pielea și mucoasele)

Factori i umorali: anticorpii naturali,

Factorii celulari: polimorfonuclearele neutrofile,

Marea majoritate a microorganismelor sunt eliminate la nivelul

normale sau a alimentelor ingerate (de origine vegetală în principal). Ca și

Factorii celulari (celulele imunocompetente) sunt reprezentați

Fig. 1 – Procesarea materialului patologic în interiorul macrofagelor

Celulele seriei granulocitare (polimorfonuclearele) asigură

intermediul acestora, complexele de tip IgE specifică - alergen, determină

Antigenele (atg) sunt substanțe cu structuri chimice variate, care

Fig. 2 - Părțile componente ale unei molecule de antigen

Antigenele trebuie să îndeplinească două calități definitorii:

II. Specificitatea constă în capacitatea de identificarea unui antigen

proces de interacțiune complementară între epitop (de pe molecula de

Antigenele naturale pot fi de diferite tipuri: bacteriene, virale,

Sunt antigene termolabile, dar insensibile la alcool şi formol. Pentru

IMUNITATEA DOBÂNDITĂ (INDUCTIBILĂ) este starea de

Factorii umorali: imunoglobulinele (IgA, IgG, IgE,

Factorii celulari: macrofagele (celule

Tipuri de imunitate dobândită:

Imunitatea umorală – principalii efectori sunt imunoglobulinele;

Răspunsul imun (reacția imună a organismului) este rezultatul

FACTORII UMORALI AI IMUNITĂȚII DOBÂNDITE

Anticorpii specifici sunt efectori umorali elaborați ca răspuns în

 extremitatea aminoterminală (cu structură moleculară foarte

Fig. 4 - Schema unei molecule de imunoglobulină G

Imunoglobulinele (Ig) sunt formate din lanțuri lungi - grele (H -

nu poate părăsi uşor spațiul intravascular;

Modul de acțiune al anticorpilor în apărarea antiinfecțioasă este

În răspunsul imun primar, prima categorie de anticorpi specifici

Diferențele între răspunsul imun primar şi cel secundar constau în

FACTORII CELULARI AI IMUNITĂȚII DOBÂNDITE

Din categoria efectorilor celulari, celulele limfoide (LB și LT) sunt

NOȚIUNI GENERALE DESPRE DIAGNOSTICUL IMUNOLOGIC

Întrucât imunitatea naturală și dobândită trebuie asigurată de

Identificarea anticorpilor specifici este privită ca diagnostic

(fig. 5). Rezultatul acestei interacțuni prezintă manifestări vizibile variate:

Fig. 5 – Cuplarea epitop-paratop

Reacția de tip antigen-anticorp se desfășoară în 2 etape:

Fig. 6 – Conglomerate atg-atc

2. Etapa II – concentrația complexelor antigen – anticorp crește

Reacțiile antigen – anticorp prezintă o serie de caracteristici.

serologice cunoscute sub denumirea de interferențe antigenice sau reacții

Fig. 7 – Specificitatea Fig. 8 – Reacții încrucișate

Existența acestor asemănări între grupările determinante ale unor

Animale real negative