CUPRINS Prefa INTRODUCERE ...............10 CAPITOLUL 1.

CARACTERIZAREA PRINCIPALELOR INTE ALE ACIUNII ANTIBIOTICELOR DIN STRUCTURA CELULEI BACTERIENE 1.1. Peretele celular... .......................................... ........................................................................ ....... 11 1.2. Spaiul periplasmic............................................................................................ .......... .................1 5 1.3. Membrana citoplasmatic............................................................................................ ............. .. 15 1.4. Nucleoidul............................................................................................................................. .........20 1.5. Ribosomii ............................................................................................................................. .........23 1.6. Sporul bacterian........................................................................... .................... ........................... .24 1.7. Glicocalixul ............................................................................................................................. ......26 1.8. Flagelul ...................................... ................................. ............................................................... ....28 1.9. Fimbriile ............................................................................................................................. ........... 29 1.10. Pilii ............................................................................................................................. ..................3 0 Bibliografie selectiv CAPITOLUL 2. ANTISEPTICE SI DEZINFECTANTE 2.1. Substane antibacteriene active prin inducerea unor modificri de permeabilitate...............39 2.2. Substane care acioneaz prin denaturarea proteinelor ........................................ .................40 2.3. Substane care acioneaz prin interferen cu gruprile active ale proteinelor-enzime ......42 2.4. Colorani antiseptici .............. ................................................................................................ .......45 2.5. Ageni sterilizani n faz de vapori ............. ..................................................... ....................... ...46 2.6. Rezistena microorganismelor la aciunea antisepticelor si dezinfectantelor.......................... 46 2.7. Evaluarea potenialului antibacterian al agenilor chimici ................................................... ...47 Bibliografie selectiv CAPITOLUL 3. AGENI CHIMIOTERAPEUTICI DE SINTEZ ............... ..................... .............. ........49 3.1. Ageni chimioterapeutici activi prin inhibiie competitiv ........................ ............................... 53 3.2. Ageni chimioterapeutici activi prin inhibiia replicrii ADN: quinolone............................... 53 3.3. Ali ageni chimioterapeutici de sintez ..................................................................................... 56 Bibliografie selectiv CAPITOLUL 4. ANTIBIOTICELE- CARACTERIZARE GENERAL ........... .................................. . 60 4.1. Antibioticele metabolii secundari ............................................................. .......................... ...61 4.2. Biosinteza antibioticelor ........................................................................................................ .....64 4.3. Clasificarea antibioticelor n funcie de structura chimic ........................... ........................... 72 4.4. Clasificarea antibioticelor n funcie de mecanismele de aciune .................. .......................... 73 4.5. Determinismul genetic al rezistenei microorganismelor la antibiotice............................... ....85 4.6. Mecanismele moleculare ale rezistenei microoganismelor la antibiotice...............................93 4.7. Sisteme de eflux multiplu dependente de forta proton-motrice ............................................. ..95 Bibliografie selectiv CAPITOLUL 5. CARACTERIZAREA PRICIPALELOR CLASE DE ANTIBIOTICE ............... .........102 5.1. Aminoglicozidele ... ......102 5.2. Tetraciclinele ............................................................................................................................ ...110 5.3. Macrolidele, Lincosamidele i Streptograminele (MLS)......................... ......................... ........118 5.4. Antibioticele -lactamice ............................ ................................ ............................................. ...121 5.5. Antibioticele polipeptidice............................................................. .................. ............................129 5.6. Antibioticele glicopeptidice i lipoglicopeptidice.................................. ........................... .......... 132 5.7. Antibiotice polichetidice ................................................... ............ .............. ....................... ..........136 5.8. Cloramfenicolul .............................................................................................. ..................... .........139 5.9. Novobiocina ....................................... ............................................................ ..................... .......141 5.10. Rifamicinele.............................................................................................. ........................... ........142 5.11. Acidul fusidic ....................................................................................................................... ........143 Bibliografie selectiv CAPITOLUL 6. DETERMINAREA SPECTRULUI DE SENSIBILITATE LA ANTIBIOTICE A SPECI ILOR MICROBIENE. ANTIBIOGRAMA ............................................................... ............................. 145 6.1. Metode calitative de determinare a spectrului de sensibilitate la antibiotice ........145 6.2. Metode cantitative de determinare a valorii C.M.I. .....146

6.3. Controlul de calitate n testarea sesibiltii la antibiotice .............................................................1 47 6.4. Aplicaii practice ale citirii interpretative n evidenierea fenotipic a diferitelor mecanisme de rezisten la principalele specii microbiene de interes clinic ................................................ .........151 6.5. Metode fenotipice calitative i cantitative de evideniere a beta-lactamazelor ........................ ....160 6.6. Fenotipuri de rezisten la alte antibiotice la bacterii de importan clinic................. .............174 Bibliografie selectiv CAPITOLUL 7. INTERACIUNILE FARMACOLOGICE ALE ANTIBIOTICELOR ............ ..........175 7.1. Sinergismul .............................................. .................................................................................. ........175 7.2. Blocarea secvenial a cilor de sintez ..........................................................................................176 7.3. Efectele defavorabile ale administrrii antibioticelor ...................................................................177 7.4. Ptrunderea a antibioticelor n esuturi..........................................................................................178 Bibliografie selectiv CAPITOLUL 8. SUBSTANE NATURALE CU ACTIVITATE IMUNOSPURESOARE ................. 184 8.1. Ciclosporina ............................................................................................................................. ........184 8.2. Tacrolimus (FK506) ............................................................................................ .............................18 6 8.3. Rapamicina ........................................................................................... ............................................1 87 8.4. Micofenolat-mofetil (MMF) .................................................................................... ........................18 8 Bibliografie selectiv CAPITOLUL 9. BACTERIOCINELE ...................................... .............................. ....................... ..............191 9.1. Clasificarea bacteriocinelor .. .192 9.2. Sinteza bacteriocinelor ....193 9.3. Imunitatea bacteriilor fa de bacteriocinele endogene ...194 9.4. Mecanisme de aciune a bacteriocinelor ....195 Bibliografie selectiv CAPITOLUL 10. AGENI TERAPEUTICI AI INFECIILOR FUNGICE ................................ ..........198 10.1. Tipuri de infecii fungice ................................................................................................................ 198 10.2. Medicamentele antifungice ................................. ........................................................................... 199 10.3. Rezistena fungilor la medicamente ..............................................................................................2 07 Bibliografie selectiv CAPITOLUL 11. AGENI TERAPEUTICI AI INFECIILOR PRODUSE DE PROTOZOARE .....209 11.1. Ageni terapeutici ai giardiozei................................................................. ......................................209 11.2. Ageni terapeutici ai infeciilor produse de Trichomonas vaginalis ...212 11.3. Ageni terapeutici antimalarici ......................................................................................................2 14 Bibliografie selectiv CAPITOLUL 12. AGENI TERAPEUTICI AI INFECII LOR VIRALE ...................................... .......219 12.1. Analogii nucleozidelor ................................................................................................................ ... 219 12.2. Amine ciclice........................... ............................................................................ .............................. 223 12.3. Inhibitori ai sintezei proteinelor virale: methisazone ..................................... ............................ .224 12.4. Foscarnet ........................................................................................................ ....................... .........225 12.5. Terapia infeciei cu HIV ................................................................................... ..............................2 25 12.6. Imunizarea pacienilor SIDA ........................................................................... ..............................22 8 12.7. Rolul mutaiilor n variabilitatea ribovirusurilor. Fenomenul de rezisten ............................22 9 Bibliografie selectiv............................................................................................................................. ...........

PREFA
Sinteza monografic Antibiotice i substane chimioterapeutice antimicrobiene rspunde unei cerine de informare i cunoatere a unor aspecte de ordin teoretic i practic, cu privire la organismele productoare de antibiotice, mecanismele celulare i moleculare ale actiunii antibioticelor, precum i riscurile imediate sau poteniale pentru sntatea organismului uman pe care le implic administrarea nejustificat a medicamentelor din clasa antibioticelor i agenilor chimioterapeutici. n acest sens, lucrarea propus spre publicare este prima ncercare din literatura tiinific biologic din Romnia, de a reuni ntr-un ansamblu conceptual unitar, prezentarea unui grup de substane foarte heterogene care au n comun efectul inhibitor asupra creterii microorganismelor si multiplicarii virusurilor. Cartea, bogat ilustrat, reunete problemele multiple ale domeniului, referitoare la structura chimic a diferiilor ageni antimicrobieni de biosintez i de chimiosintez, a mecanismelor de aciune asupra microorganismelor patogene, dar i a mecanismelor de rezisten pe care microorganismele o dobndesc consecutiv contactului prelungit cu agentul terapeutic, prin selecia tulpinilor care au devenit rezistente prin evenimente mutaionale unice sau multiple sau consecutiv dobndirii unei gene de rezisten. Elaborarea acestei monografii este o reflectare a interesului major al unui numr important de specialiti fa de fenomenul antibiozei n general, dar i al interesului public, n special fa de problemele concrete ale administrrii antibioticelor i consecinele, adeseori nefaste, opuse celor ateptate. Cunoaterea principiilor generale ale aciunii antibioticelor i substanelor chimioterapeutice antimicrobiene este oportun pentru oricare biolog modern indiferent de domeniul su de specialitate ca i pentru biochimist, genetician, medic uman sau veterinar, agronom, cercettor n industria de biosintez etc. Monografia Antibiotice i substane chimioterapeutice antimicrobiene nu ofer reete pentru tratamentul infeciilor produse de microorganisme. Acest fapt nu este posibil, deoarece, n pofida practicii cvasigeneralizate de a lua antibiotice, administrarea lor trebuie s fie precedat n mod obligatoriu de izolarea agentului infecios i de evaluarea gradului de sensibilitate/rezisten la principalele antibiotice de uz farmaceutic ! Pentru aceasta exist acum ghiduri de utilizare a antibioticelor! Numai astfel va fi posibil refluxul mrii de antibiotice n care trim i va fi posibil reducerea presiunii selective asupra microorganismelor rezistente, a cror proporie a crescut constant i a atins un nivel ngrijortor! Aceast lucrare este rodul unei bogate experiene profesionale acumulat de autori, cadre didactice ale Universitii din Bucureti, coordonate de prof. dr. Gr. Mihescu. Apreciem c lucrarea, prin coninutul su tiinific modern, prin prezentarea tiinific accesibil i atrgtoare, va strni interesul nu numai al specialitilor de profil (biologi i medici), ci i al celor care doresc s neleag secretele aciunii pastilei magice, al crei concept elaborat de P. Ehrlich (1904), s-a situat n centrul ateniei timp de mai bine de un secol i va rmne o preocupare de interes major mult timp de acum nainte, dar, n egal msur, cartea propus de noi va contribui la nelegerea cauzelor nereuitei frecvente a tratamentului. Autorii

INTRODUCERE
Antibioticele (anti + bios = cu efecte nefavorabile) sunt un grup heterogen de substane chimice, produse de microorganisme prin procese de biosintez, care omoar sau inhib creterea altor specii de microorganisme. Definiia iniial s-a completat ulterior, n prezent antibioticele fiind definite ca substane chimice obinute prin biosintez, semisintez sau prin sintez chimic, care, n concentraie mic inhib multiplicarea sau omoar microorganismele. Antibioticele au fost eseniale n lupta cu maladiile infecioase i au avut o contribuie important la creterea speranei de via n secolul XX, fiind considerate una dintre marile descoperiri ale lumii moderne, alturi de anestezia general, maina cu aburi, folosirea energiei atomice i ieirea omului n spaiul extraterestru. Dup introducerea penicilinei n clinica general (1944), infeciile foarte grave (de exemplu, faringita streptococic) cu indici mari de mortalitate, au devenit vindecabile. In prezent, dependena omului de antibiotice este total. Din cele peste 500 substane cu proprieti antibiotice identificate, pentru terapia infeciilor umane i animale se folosete un numr restrns (circa l00), produse de reprezentanii a 5 genuri de microorganisme din grupurile actinomicete, bacili Gram pozitivi i fungi filamentoi microscopici, ca de exemplu, Bacillus, Streptomyces, Micromonospora, Penicillium, Cephalosporium. Celelalte substane cu proprieti antibiotice sunt toxice ori au efecte defavorabile asupra organismului, ori sunt lipsite de selectivitate. Se spune, i nu fr temei, c lumea este o mare de antibiotice. Numai n SUA, n 1998, pentru uzul uman s-au folosit circa 12,5 tone de antibiotice. Dac se adaug cele administrate n hrana animalelor i n agricultur, se apreciaz c n ultimii 50 de ani s-au produs i s-au utilizat peste un milion de tone de antibiotice. Administrarea lor, adeseori nejustificat, creeaz o presiune selectiv considerabil asupra microorganismelor infecioase, al crei rezultat este selecia tulpinilor multirezistente. Rezistena multipl la antibiotice i la agenii de sintez chimic este o provocare major a clinicii infecioase, ceea ce impune gsirea unor noi antibiotice sau obinerea prin procedee de semisintez, a unor noi derivai chimici eficieni. Alctuirea acestei cri a izvort din necesitatea prezentrii unitare a stadiului actual al cunoaterii structurii chimice, dar n special a mecanismelor de aciune i de rezisten a microorganismelor la principalele clase de antibiotice folosite n clinic. Structura chimic a diferitelor antibiotice a fost determinat curnd dup descoperirea lor, dar mecanismele aciunii i rezistenei microorgani smelor sunt achiziii mai recente. Prezentarea propriu-zis a diferitelor substane antimicrobiene utilizate n clinic pentru tratamentul infeciilor produse de microorganisme, este precedat de un capitol de anatomie i fiziologie bacterian, cu scopul de a nelege substratul anatomic structural al intei aciunii diferitelor substane antimicrobiene i de un capitol referitor la aciunea substanelor din categoria antisepticelor i dezinfectanilor. Antisepticele sunt substane chimice care, aplicate pe esuturile vii, mpiedic creterea i multiplicarea microorganismelor existente. Sunt relativ netoxice i pot fi aplicate pe esuturi umane i animale.Termenul de dezinfectant este restrns la substanele cu efect microbicid rapid, exercitat la concentraii mici, care se aplic pe obiecte neanimate, n scopul distrugerii microorganismelor contaminante. Cele mai multe substane dezinfectante sunt toxice i nu pot fi administrate la om i la animale. Antisepticele i dezinfectantele cuprind o larg varietate de ageni chimici i poart denumirea generic de biocide. Agenii chimioterapeutici sunt substane de sintez chimic, utilizate n tratamentul infeciilor produse de diferite microorganisme (bacterii, fungi microscopici i protozoare). Conceptul chimioterapiei a fost formulat de P. Ehrlich (l904). Principiul fundamental al chimioterapiei antiinfecioase const n utilizarea unor substane cu toxicitate selectiv care s inhibe creterea i multiplicarea agentului patogen infecios, dar s nu altereze funcionalitatea celulelor organismului uman i animal. Agenii chimioterapeutici interacioneaz selectiv cu sistemele metabolice active ale microorganismelor, dar nu cu acelea ale celulelor organismului gazd.

Capitolul 1 CARACTERIZAREA PRINCIPALELOR INTE ALE ACIUNII ANTIBIOTICELOR DIN STRUCTURA CELULEI BACTERIENE
Cunoaterea structurii interne a celulei bacteriene este rezultatul utilizrii tehnicilor de citochimie i de microscopie electronic. Structura i arhitectura molecular a componentelor celulare a fost demonstrat cu ajutorul tehnicilor de citochimie, care presupun utilizarea unor metode de colorare selectiv, adic a coloranilor cu afinitate pentru o anumit structur celular. Prin arhitectur molecular se nelege modalitatea de aranjare ordonat a subunitilor constitutive ale unei structuri. Structura reper a celulei bacteriene este peretele celular. In raport cu peretele se disting structurile intraparietale (care alctuiesc protoplastul bacterian) i structurile extraparietale (Zarnea, 1983). Structurile intraparietale sunt reprezentate de: spaiul periplasmic, membrana plasmatic, mezosomul, nucleoidul, citoplasma, ribosomii, incluziile, vacuolele, sporul, aparatul fotosintetic, rhapidosomii (rhapidos = baston) incluzii ribonucleoproteice n form de baston, magnetosomii incluzii intracelulare delimitate de membran, cu structur cristalin formate din magnetit (Fe3O4). Magnetosomii confer dipol magnetic permanent celulei, permindu-i s se alinieze pasiv la cmpul geomagnetic. Bacteriile care produc magnetosomi manifest magnetotaxie, adic procesul de orientare i migrare de-a lungul liniilor cmpului magnetic. Structurile extraparietale sunt reprezentate de: glicocalix cu variantele sale structurale (capsula i glicocalixul comportamental), flageli, fimbrii i pili, spini structuri pericelulare groase la baz i ascuite la vrf. Unele structuri (membrana, citoplasma, nucleoidul, ribosomii) sunt eseniale (obligatorii) i se gsesc la toate celulele bacteriene. Altele sunt facultative (spor, aparat fotosintetic, capsul, flageli), fiind prezente numai la anumite grupe de bacterii.

1.1. Peretele celular

Peretele celular este o structur rigid de nveli, care delimiteaz celula bacterian. La cele mobile, peretele este strbtut de flageli. Structura parietal lipsete la bacteriile din grupul Mycoplasma, precum i la cele halofile extreme (cele care triesc n medii saline foarte concentrate, unde structura protectoare fa de ocul osmotic nu este necesar). La microscopul optic, peretele celular se evideniaz dup colorare selectiv, cu colorani de mare afinitate fa de componentele sale chimice. La microscopul electronic, peretele se evideniaz fie direct, fie dup utilizarea unor artificii de tehnic, ce constau n inducerea de leziuni mecanice ale structurii parietale cu ajutorul perlelor de sticl sau prin ultrasonicare. Coninutul celular se pierde si peretele rmne ca un sac gol i rigid, care pstreaz forma original a celulei, ceea ce sugereaz rolul esenial al peretelui n determinarea formei bacteriene. Grosimea peretelui este cuprins ntre l5 i 30 nm (uneori pn la 80 nm). n ciuda strii incerte a taxonomiei bacteriene, un criteriu empiric care a avut o valoare practic deosebit pentru clasificarea i identificarea procariotelor este comportamentul la coloraia Gram (C. Gram, 1884) (Beveridge i Davies, 1983). Caracterul Gram pozitiv sau Gram negativ reflect deosebiri structurale majore ale peretelui, cu excepia Archaea, cocilor rezisteni la radiaiile ionizante i a micoplasmelor. Relaia dintre structura peretelui celular i coloraia Gram este urmtoarea: tehnica implic tratamentul succesiv al celulelor cu cristal - violet (un colorant bazic), urmat de tratamentul cu soluie de iod i ulterior, extracia cu un solvent organic polar (alcool sau aceton). n interiorul celulei, cristalul violet i iodul formeaz un complex insolubil. Celulele Gram pozitive, care rezist etapei de decolorare i rein complexul insolubil (cristal violet - iod) sunt colorate n albastru nchis, iar cele care nu rein colorantul sunt Gram negative i pot fi difereniate de cele Gram pozitive prin recolorare cu un colorant de contrast, fiind colorate n rou. Reacia Gram nu se coreleaz direct cu compoziia chimic a peretelui, ci depinde de structura sa fizic, de starea fiziologic a celulei i de integritatea ei structural. Astfel, levurile, care au perete celular gros, dar cu o compoziie chimic diferit de a mureinei, se coloreaz Gram pozitiv. n funcie de particularitile structurale ale peretelui, bacteriile se mpart n 4 categorii: l. Firmacutes (firmus = tare; cutis = nveli) sunt bacteriile Gram pozitive, cu perete celular gros i rigid, la care mureina reprezint pn la 80% din greutatea uscat a acestei structuri i bacteriile acidoalcoolo-rezistente. 2. Gracilicutes (gracilis = subire, fin) sunt bacteriile Gram negative cu perete subire, la care mureina reprezint circa l0% din greutatea uscat a peretelui. 3. Mollicutes sau Tenericutes (mollis, tener = moale) cuprinde bacteriile din grupul Mycoplasma, lipsite de perete. Periferia celulei este acoperit de o membran ce conine steroli, cu rol protector fa de liza osmotic. Sunt cele mai mici bacterii cunoscute, cu capacitatea de a crete pe medii inerte. Se

dezvolt ca saprobionte n cavitile organismului uman i animal sau sunt patogene pentru om, animale i plante. 4. Mendosicutes (mendosus =o structur cu defecte). Noiunea desemneaz organismele domeniului Archaea, care au perete celular din care lipsete mureina. Marea majoritate a bacteriilor cunoscute aparin grupului Gram pozitive sau Gram negative. Structura molecular a peretelui la bacteriile Gram pozitive La bacteriile Gram pozitive, peretele celular este gros, rezistent i rigid. Componenta esenial este mureina, denumit i peptidoglican, glicopeptid, mucopeptid sau glucozaminopeptid. Mureina formeaz un strat rigid, adiacent membranei plasmatice i sub aspectul compoziiei chimice este unitar la toate eubacteriile (Gram pozitive i Gram negative). Mureina este alctuit dintr-o component peptidic i una glucidic. Componenta glucidic de baz este un dizaharid format din N-acetil-D- glucozamin i acid Nacetilmuramic, legate F l-4 (fig. 1). Acidul N-acetilmuramic rezult prin stabilirea unei legaturi dr tip esteric ntre N-acetil-D-glucozamin i acidul lactic. Componenta peptidic este un tetrapeptid, a crui compoziie n aminoacizi este variabil n funcie de specie, dar conine L-ala, acid D-glutamic, acid diaminopimelic (derivat al lizinei) sau lizina i D-ala i se leag de acidul N-acetilmuramic. Acidul N-acetil muramic i Daminoacizii sunt markeri biochimici ai eubacteriilor.

Figura 1. Structura glicanului tetrapeptidic, una dintre unitaile repetitive ale peptidoglicanului structurilor parietale. Aceasta structura chimica se gasete la E. coli, dar bacteriile conin si ali aminoacizi (dupa Brock, 2005).

Rigiditatea peptidoglicanului este conferit de puni peptidice transversale. Cu ct numrul de legturi peptidice este mai mare, cu att crete rigiditatea peretelui celular. La bacteriile Gram negative, punile transversale reunesc gruparea NH2 a acidului diaminopimelic, cu gruparea COOH a D-ala terminale a altei grupri peptidice. La bacteriile Gram pozitive, legarea transversal a dou peptide nvecinate se face printr-o punte peptidic, care, de exemplu, la Staphylococcus aureus este format din 5 resturi de glicin (fig. 2).

Figura 2. Tetrapeptidele conectate la acidul N-acetilmuramic sunt interconectate prin puni formate din cateva resturi de aminoacizi. La S. aureus tetrapeptidele sunt conectate prin puni de pentaglicin (dupa Brock, 1988).

Se formeaz astfel o structur covalent perfect continu n jurul celulei, o molecul mure inic gigant, un adevrat sac mureinic, cu structur tridimensional dinamic (fig. 3) (Ghuysen si Hackenbeck, 1994). La nivelul sacului mureinic sunt localizate enzimele care modeleaz creterea sa: murein-hidrolazele care atac legturile chimice ale mureinei i murein-sintetazele care inser noi uniti de construcie. Peptidoglicanii diferitelor specii difer prin aminoacizii 2 i 3 ai tetrapeptidului i prin frecvena punilor transversale de pentaglicin. Speciile patogene au o frecven superioar a punilor transversale, ceea ce se coreleaz cu o rezisten mai mare a mureinei la aciunea factorilor litici din umorile organismului (lizozimul etc.).

Figura 3. Reprezentarea structurii generale a peptidoglicanului (G = N-acetilglucozamina ; M = acid Nacetilmuramic). La resturile de acid N-acetil-muranic sunt conectate tetrapeptidele, iar aceastea sunt reunite prin legaturi peptidice transversale (dupa Brock, 2000).

Importana mureinei, ca o component structural esenial a peretelui celular al bacteriilor Gram pozitive a reieit din studiul aciunii a doi ageni antibacterieni, lizozimul i penicilina, asupra peretului celular. Lizozimul cliveaz legturile glicozidice F l - 4 i hidrolizeaz mureina celulelor aflate n faza staionar (fig. 4), n timp ce penicilina inhib cresterea celulelor bacteriene Gram pozitive aflate n faza de cretere, deoarece inhib treapta final a sintezei mureinei, reacia de transpeptidare, adic formarea legturilor peptidice transversale ntre catenele de glican adiacente.

Figura 4. Imaginea electrono-optic a celulelor de Bacillus subtilis . a. In regiunea central s-a initiat formarea septului de diviziune. b. Un stadiu intermediar al degradarii peretelui sub aciuna lizozimului i ret racia protoplastului. c. Protoplastul (original).

La bacteriile Gram pozitive, puntea peptidica transversal reuneste acidul diaminopimelic al unui peptid i D-ala a peptidului adiacent (Ghuysen i Hackenbeck, 1994). Inhibiia reactiei de transpeptidare (de formare a puntilor peptidice transversale) sub aciunea penicilinei duce la formarea unui peptidoglican subire. n celulele care cresc, autolizinele continu s degradeze legaturile chimice ale mureinei, fr a se mai forma alte puni peptidice. Astfel, peretele mureinic se dezagreg progresiv si elibereaza protoplastul, care este o celul neviabil, iar n mediul neprotejat osmotic sufer liz. De aceea, penicilina este activ numai asupra celulelor care cresc. In celulele care nu cresc, autolizinele nu sunt active i peptidoglicanul nu este degradat. Mureina formeaz o matrice n care se gsesc i ali polimeri: polizaharide, acizi teichoici. Acizii teichoici sunt polimeri de l-3-poliglicerol-fosfat sau de poli-ribitol-fosfat, legai fosfo-diesteric.

Poliglicerol fosfat

Poliribitol fosfat

Polimerii formeaz axul central al moleculei. Gruprile OH libere ale glicerolului i gruparea OH de la C3 a ribitolului sunt ocupate de D-alanin, D-glucoz sau de N-acetilglucozamin. Bacteriile Gram pozitive au dou categorii de acizi teichoici: acizi lipoteichoici sau membranari, care traverseaz peptidoglicanul i cu o extremitate se leag de glicolipidele din membran, iar cellalt capt este liber la suprafaa celulei i acizi teichoici parietali, ataai de resturile de acid N-acetilmuramic ale mureinei. Acizii teichoici sunt molecule lungi i flexibile, filamentoase, care confer un plus de rigiditate peretelui celular al bacteriilor Gram pozitive. Pentru bacteriile patogene, acizii teichoici sunt un factor de virulen, deoarece au proprieti chimiotactic negative fa de fagocite. Sunt implicai n transportul ionilor n/i din celul. Pot avea rolul de receptori de fagi. Uneori bacteriile secret cantiti mari de acizi teichoici solubili. Peretele celular la bacteriile Gram negative La bacteriile Gram negative, mureina reprezint numai 2,5 - l0% din greutatea uscat a peretelui. Peretele lor este mai complex, datorit unei structuri caracteristice denumit membrana extern a peretelui celular, o replic structural a membranei plasmatice, care poate fi astfel considerat ca membran intern. La microscopul electronic, peretele celular apare pluristratificat, datorit structurii trilaminare a membranei externe a peretelui (fig. 5).

Figura 5. Pe imaginile electrono-optice, nveliul celulelor bacteriene Gram negative este multilaminar, caracter conferit de cele dou membrane: membrana extern i membrana citoplasmatic. Structura mezosomal are conexiune direct cu membrana citoplasmatic i pare asociat cu nucleoidul, iar structura sa este trilaminar (original).

Membrana extern a peretelui conine fosfolipide (35% din greutate), proteine (l5%) i lipopolizaharide (50%). Analiza filogeniei organismelor procariote pe baza secvenierii proteinelor a dus la concluzia existenei unor diferene filogenetice majore ntre organismele cu nveli dublu membranar (didermice) i cele cu membran simpl (monodermice) (Costerton i colab., 1974). Mureina este localizat n stratul cel mai intern al peretelui (fig. 6). Dup un tratament adecvat, membrana extern se poate ndeprta i se obine sacul mureinic pur, extrem de fin care pstreaz forma original a celulei i care sugereaz c mureina ar putea fi o reea bidimensional (un monostrat molecular), n timp ce la bacteriile Gram pozitive cantitatea de peptidoglican corespunde la 20 de straturi moleculare sau mai mult.

10

Figura 6. Reprezentarea schematic a componentelor peretelui celular la bacteriile Gram negative (dup Brock, 2005).

Proteinele membranei externe se numesc porine, deoarece regleaz permeabilitatea i constituie canalele membranare de transport celular. Iniial s-au descris trei tipuri de porine trimerice: OmpF, OmpC i PhoE. Analiza prin metoda cristalografiei cu raze X relev c porinele sunt proteine transmembranare a cror configuraie secundar este cea de -pliere. O celul de Escherichia (E.) coli produce circa 105 molecule porine, cu rolul de bariere selective de permeabilitate. n mediul hiperosmotic, numrul porinelor scade. La E. coli, porinele sunt proteine trimere, subunitile delimitnd un por cu diametrul de 1 nm. Lipoproteinele leag ferm membrana extern prin intermediul peptidoglicanului profund. Lipopolizaharidele (LPS) sunt inclavate n membrana extern. Ele sunt de fapt endotoxinele bacteriilor Gram negative (Salmonella, Shigella, Escherichia). Se numesc endotoxine, deoarece se elibereaz numai dup pierderea integritii celulei. Datorit poziiei lor externe, LPS se pot extrage din celule, cu fenol 45 - 60%. Din punct de vedere chimic, LPS sunt molecule complexe, fiind alctuite dintr -o regiune polizaharidic extern (polizaharidul O), care determin specificitatea antigenic a celulei bacteriene, o regiune oligozaharidic intermediar (regiunea R) i o regiune intern hidrofob, denumit lipidul A, prin care LPS se ancoreaz n membrana extern, printre moleculele fosfolipidice (fig. 7). Regiunile intermediar i intern ale moleculei LPS au compoziie chimic relativ constant la diferite specii de bacterii Gram negative. Polizaharidul regiunii externe are o structur i o compoziie chimic foarte variabile i constituie antigenul somatic O, cu specificitate antigenic foarte nalt, pe baza cruia numeroasele tulpini ale unei specii aparin unui mare numr de serotipuri.

Figura 7. Reprezentarea schematic a structurii moleculei de lipopolizaharid (LPS) original).

Lipidul A este legat covalent de oligozaharidul regiunii intermediare. La Salmonella, lipidul A este alctuit din dizaharide de D-glucozamin, legate F l- 6. Perechile de D-glucozamin sunt interconectate l - 4, prin puni pirofosfat. Gruprile OH din poziiile 3, 4 i 6 ale fiecrui dizaharid sunt substituite de acizi grai (lauric, palmitic, miristoximiristic, hidroximiristic).Grupul OH din poziia 3 se leag de componenta polizaharidic (acidul 2-ceto, 3-deoxioctanoic) (KDO). Gruprile NH2 ale glucozaminei sunt substituite de acidul D-3-hidroximiristic (fig. 8). Lipidul A are proprieti endotoxice, evideniate la mutantele R (Rough = rugos) care sintetizeaz LPS incomplet, cruia i lipsete polizaharidul O i unele componente ale oligozaharidului regiunii intermediare R.

11

Figura 8. Structura lipidului A al lipopolizaharidului de Salmonella, cu trizaharidul KDO i cu resturile de acizi grai (dupa Rietschel si colab., 1977).

In mediile naturale, cele mai multe bacterii sintetizeaz polizaharidul O i formeaz colonii S (Smooth = neted). Cele care nu au polizaharidul O formeaz colonii R. Polizaharidul O nu este factorul determinant al patogenitii, deoarece formele coloniale R ale Bordetella (B.) pertusis, Neisseria (N.) gonorrhoeae sunt patogene (Seifert i colab., 1988; Jawetz i colab., 1989). Permeabilitatea membranei externe. Membrana extern, ca i celelalte membrane biologice, este alctuit din stratul lipidic dublu, puin permeabil pentru moleculele hidrofile. Porinele din membrana extern formeaz canale de difuzie nespecific pentru influxul nutrienilor i pentru eliminarea produselor de catabolism. Porinele s-au gsit la toate bacteriile Gram negative i chiar la un grup de bacterii Gram pozitive: Corynebacterium - Nocardia - Mycobacterium, care produc un perete celular bogat n lipide, asemntor dublului strat. Porinele clasice OmpF i OmpC transport preferenial cationi, iar PhoE, transport anioni. Porinele regleaz permeabilitatea membranei externe n funcie de condiiile mediului: n mediile cu osmolaritate mic (cele naturale), porinele sunt mai permeabile, iar la bacteriile patogene, n organismul gazd, porinele au permeabilitate mai mic. Moleculele de LPS formeaz baza structural a integritii membranei externe. LPS este polianionic datorit sarcinilor negative ale lipidului A i leag cationi. Moleculele adiacente polianionice de LPS sunt aparent legate electrostatic, una de alta, prin cationi bivaleni (Ca2+, Mg2+) i formeaz o structur compact ca un acoperi de igl, pe suprafaa membranei externe. Situsurile LPS care leag cationii sunt eseniale pentru integritatea membranei externe, dar n acelai timp ele reprezint clciul lui Ahile al acestei structuri. Antibioticele policationice din grupul polimixinei se complexeaz avid cu LPS i dezorganizeaz membrana extern, mrind permeabilitatea pentru agenii cu aciune asupra membranei sau componentelor citoplasmatice. Toi agenii policationici se leag de LPS anionice, cu o afinitate variabil. Bacteriile Gram negative sunt rezistente la detergenii anionici i neutri, dar sunt sensibile la detergenii monocationici. Agenii chelatori ai ionilor de Ca2+ i Mg2+ dezorganizeaz i permeabilizeaz membrana extern. Cel puin la enterobacterii, dublul strat fosfolipidic al membranei externe este asimetric, stratul extern coninnd aproape exclusiv LPS, n timp ce stratul intern conine aproape exclusiv fosfolipide. Structura porinelor trimere s-a analizat prin difracie cu electroni i cristalografie cu raze X. Monomerii porinei traverseaz dublul strat i au configuraie -pliat. Aproape invariabil, secvenele porinelor la captul C-terminal au fenil-alanina. Rareori, restul C-terminal este triptofanul.

12

Peretele celular la Archaea La Archaea, peretele celular prezint diferene structurale majore, comparativ cu ale eubacteriilor. Diferitele specii de Archaea se coloreaz Gram pozitiv sau Gram negativ. Peretele lor nu conine acid muramic sau D-aminoacizi, markeri biochimici ai mureinei (Rogers, 1983). Din punct de vedere chimic, peretele la Archaea este heterogen. La Methanobacterium (productoare de metan), peretele conine o pseudomurein alctuit din uniti repetitive formate din dou zaharuri aminate (N-acetilglucozamin i acidul N-acetiltalosaminuronic, markerul biochimic al domeniului Archaea), legate F l-3. Resturile acidului N acetiltalosaminuronic sunt legate prin puni peptidice (ca i la murein), iar aminoacizii sunt numai izomeri L. Legturile F l-3 ale pseudomureinei sunt rezistente la aciunea lizozimului. Peretele celular acido-alcoolo-rezistent al micobacteriilor Unele genuri ale micobacteriilor (Mycobacterium (M.) tuberculosis, Corynebacterium (C.) diphteriae, Nocardia (N.) asteroides) conin lipide complexe, care nu se gsesc n structura parietal a altor bacterii. Ele se coloreaz slab dup protocolul coloraiei Gram, dar se coloreaz la cald cu fuxin bazic concentrat i sunt rezistente la decolorare succesiv cu acid sulfuric diluat i alcool etilic 96%. Aceste organisme se numesc acido-alcoolo-rezistente (Rogers, 1983). Rezistena la decolorare se datoreaz compoziiei chimice a peretelui celular. Peptidoglicanul micobacteriilor conine acid diaminopimelic ca acid diaminic major, iar acidul muramic este N-glicozilat (i nu N-acetilat). Un alt compus major parietal al micobacteriilor este polizaharidul cu gr. mol. mare arabinogalactanul de care se leag acizi grai cu caten lung acizii micolici cu 70 - 90 atomi de C. La Corynebacterium i Nocardia, acizii grai au caten mai scurt (40 - 60 de atomi de C). O alt categorie de lipide, cele libere, sunt lipooligozaharide ce conin trehaloz i lipoarabinomanani.

Figura 9. Reprezentarea schematic a componentelor peretelui celular acido-rezistent la grupul Mycobacterium Nocardia. Regiunea extern a nveliului conine unitai lungi de acid micolic legat de arabinogalactan (dupa Holt, 1998).

Funciile peretelui celular Peretele celular este o structur cu rol esenial n arhitectura celular, pentru c determin forma celulei i meninerea ei. Dup pierderea coninutului celular, sacul mureinic pstreaz forma iniial a celulei. Mureina confer celulei elasticitate i plasticitate (capacitatea de a suferi deformri la presiune, fr alterarea structurii celulare), permind mrirea volumului ei prin cretere. Peretele celular constituie o barier suplimentar de permeabilitate, alturi de membrana citoplasmatic. La bacteriile Gram pozitive, peretele are o porozitate de 1,1 nm, permind trecerea moleculelor mai mici de l200 Da (1 Dalton = masa atomului de H, adic l,672649 x l0-24 g. l kDa = l 000 Da). La bacteriile Gram pozitive, peretele particip la formarea septului de diviziune, ce separ cele dou celule surori i la procesele de cretere. Creterea volumului celular este rezultatul creterii peretelui. Membrana extern are rolul unei site moleculare i permite difuzia moleculelor mici, dar reine pe cele mari (enzime). Membrana extern este o barier selectiv, fiind impermeabil pentru macromolecule, dar permite difuzia limitat a substanelor hidrofobe, deoarece lama extern nu conine glicerofosfolipide. Suprafaa este acoperit cu LPS, care formeaz o structur quasicristalin. Din aceast cauz, lama extern nu

13

prezint o difuzie lateral marcat a moleculelor, tipic membranelor care conin glicerofosfolipide (Wright i Tipper, 1978). Membrana extern conine proteine cu funcii de transport molecular. Ele au rolul de receptori de vitamine, glucide, aminoacizi, de transferine (leag Fe i l transfer n celul). n membrana extern a bacteriilor patogene se gsesc proteine de virulen, din categoria adezinelor, cu rol de fixare a bacteriei la suprafaa celulelor sensibile. LPS are proprieti chimiotactic negative fa de fagocite, mrind nivelul virulenei bacteriene i confer individualitate biochimic i serologic diferitelor tulpini. LPS sunt antigene i induc sinteza anticorpilor specifici cu rol protector (Seifert i colab, 1988). In concluzie, peretele celular este o structur esenial a celulei bacteriene, ndeplinind funcii multiple, cea mai important fiind protecia fa de liza osmotic n mediile hipotonice. Singurele procariote care nu au o structur parietal sunt micoplasmele. Ele se pot izola din organismul uman, de la animale, plante, insecte, fungi, sol, ape menajere. Sunt saprobionte, trind pe materia organic n mediile naturale (ape menajere, sol) sau comensale la om i animale pe mucoasele bucofaringian i genitourinar, incapabile s se dezvolte n mediul extern ca saprobionte. Unele dintre cele comensale sunt potenial patogene. Faptul c supravieuiesc, dei nu au perete celular, se explic prin aceea c au o membran citoplasmatic rigid (care conine steroli) i pentru c triesc n medii protejate osmotic, aa cum este organismul animal i uman.

1.2. Spaiul periplasmic

Spaiul periplasmic este un compartiment celular al bacteriilor Gram negative, delimitat de membrana extern a peretelui celular i de membrana intern (citoplasmatic). Este singurul compartiment al celulei procariote i conine un volum apos semnificativ n care se gsesc proteine i oligozaharide. Proteinele sunt reprezentate de enzime degradative (DN-aza, RN-aza, proteaze, fosfataze, penicilinaza etc.) i proteine de legare specifice pentru diferite molecule, cu rol n transport i chimiotaxie (Costerton i colab., 1974; Wright i Tipper, 1978). Oligozaharidele se gsesc n concentraii variabile i au rolul de a regla presiunea osmotic a celulei. Cnd presiunea osmotic a mediului crete, oligozaharidele trec n citoplasm, iar cnd scade, oligozaharidele revin n spaiul periplasmic. Spaiul periplasmic ndeplinete o funcie esenial ce const n acumularea nutrienilor moleculari din mediu, nainte de a ptrunde n celul. Spaiul periplasmic funcioneaz ca un compartiment adaptativ, a crui funcie de depozit este foarte important, deoarece bacteriile Gram negative triesc, de cele mai multe ori, n mediile oligotrofe (mediile aquatice). n spaiul periplasmic, nutrienii sunt scindai parial sub aciunea enzimelor degradative i de aici sunt preluai de proteinele de transport din membrana intern i transferai n celul. Proteinele periplasmice pot fi eliberate prin conversia celulelor la protoplati, dup tratamentul cu cloroform sau prin oc osmotic (tratamentul celulelor cu EDTA n mediu hipertonic i transferul lor n mediu hipotonic).

1.3. Membrana citoplasmatic

Membrana plasmatic nconjoar celula bacterian i este bariera separatoare a citoplasmei de mediul extern. Consecina imediat a lezrii membranei este pierderea componentelor citoplasmatice. Grosimea membranei este de 7 - 10 nm. La microscopul electronic are o structur trilaminar, dup modelul unitar al membranelor celulare (unit membrane), al lui Robertson. Pe baza structurii fine s-a considerat (eronat) c membrana plasmatic este alctuit din dou straturi de proteine, ntre care se gsete unul lipidic. In realitate, membrana este un dublu strat fosfolipidic i glicolipidic, la care se asociaz proteinele membranare. Ansamblul molecular al membranei este asemnat cu un ocean fosfolipidic, n care sunt incluse ca nite iceberguri, proteinele externe (periferice) i integrate, dar spre deosebire de membrana celulei eucariote nu conine steroli. Singer i Nicolson au propus modelul mozaicului fluid de organizare a membranelor biologice, n acord cu care membranele sunt structuri bidimensionale de proteine globulare i lipide, cu distribuie orientat, stabilizate de moleculele de ap. Acestea sunt legate prin puni intermoleculare de H, formnd o structur n reea. Dizolvarea unei molecule n ap are semnificaia stabilirii unei continuiti ntre structurile chimice ale moleculei dizolvate i structura de reea a apei. Pentru a se integra n structura de reea a apei, molecula trebuie s formeze o legtur de H cu apa sau s accepte o legtur a acesteia. Proteinele sunt componentele care confer membranelor multe dintre proprietile funcionale specifice (de exemplu, meninerea i utilizarea gradientului transmembranar de H+ pentru sinteza ATP). n raport cu dispunerea lor n structura membranei, proteinele sunt periferice i integrate. Proteinele periferice sunt asociate cu membrana, dar nu au nici o secven inclus n structura ei. Structura lor este analog

14

proteinelor hidrosolubile. Proteinele membranare integrate au cel puin un domeniu al moleculei situat n regiunea hidrofob a stratului lipidic. Secvena de aminoacizi a domeniului inclus n stratul lipidic este hidrofob, are configuraia E-helix i cuprinde l9 - 23 aminoacizi. Ele pot fi dislocate din structura membranei numai n prezena detergenilor ce solubilizeaz lipidele. Proteinele integrate difuzeaz liber n planul lateral al matricei lipidice, dar nu trec liber dintr-un strat n altul i de aceea asimetria funcional a membranei se pstreaz pentru perioade lungi. n categoria proteinelor integrate sunt incluse proteinele transmembranare care au o mare parte a masei lor inclus n dublul strat fosfolipidic, dar expun domenii semnificativ diferite pe ambele fee ale membranei, ceea ce confer asimetria funcional a acesteia i proteinele membranare ancorate care au cel putin un domeniu ce penetreaz dublul strat lipidic, dar nu traverseaz complet membrana. Proteinele membranare anocorate sunt legate covalent de lipidele membranare. Domeniile extralipidice ale proteinelor membranare integrate sunt hidrofile, ceea ce confer asimetria structural i funcional a membranei. Aa se explic permeabilitatea superioar a feei interne n raport cu faa extern.

Figura 10. Modelul mozaicului fluid al structurii membranei. F osfolipidele formeaz un strat dublu, cu componentele hidrofobe orientate spre interior, iar capetele hidrofile constituie suprafaa intern i externa a membranei. In marea lipidic proteinele plutesc ca niste iceberg-uri. Unele se extind n toata grosimea dublului strat lipidic, iar altele sunt ancorate pe faa intern sau extern. Membrana micoplasmelor i eucariotelor conine colesterol.

15

Figura 11. Reprezentarea schematic a moleculei fosfolipidice, componenta structural a membranei. Fosfolipidele sunt molecule polare. Cozile de acizi grai sunt foarte hidrofobe (nu formeaz legturi cu apa) i constituie o barier de permeabilitate fa de moleculele hidrosolubile. Capul moleculei este format din gruparea fosfat, legat de o grupare care conine N i din glicerol si este foarte hidrofil (formeaz legturi cu moleculele de ap) (dupa Lehninger, 1987).

Asimetria structural a proteinelor integrate se evideniaz pe imagini eletrono-optice ale membranei criofracturate. Tehnica criofracturrii presupune nghearea rapid a membranei la temperatura azotului lichid i fracturarea membranei cu un cuit special. Membrana se cliveaz de-a lungul regiunii hidrofobe a acizilor grai i rezult dou jumti, cu un grad accentuat de asimetrie, conferit de proteinele transmembrana re (Rogers, 1983). Structura membranei plasmatice este stabilizat prin legturi de H i interaciuni moleculare hidrofobe. Ionii de Mg i Ca realizeaz legturi ionice cu sarcinile negative ale fosfolipidelor i stabilizeaz structura membranei. Lipidele conin acizi grai, predominant cu l4 - l6 atomi de C, saturai sau nesaturai. n raport cu capacitatea lor de a interaciona cu structura apei, lipidele membranelor biologice conin dou categorii de structuri chimice (sunt amfipatice): glicerolul intr n structura de reea a apei, fiind hidrofil, iar restul moleculei (acizii grai) formeaz componenta hidrofob a moleculei. ntr-o soluie apoas, lipidele se agreg i formeaz spontan structuri n dublu strat: acizii grai la interior, n mediul hidrofob, iar moleculele de glicerol rmn expuse n mediul apos. Funciile membranei, dar n special ale lipidelor membranare, s-au studiat folosind ca model, veziculele membranare artificiale sau naturale, ce se formeaz spontan dup spargerea celulelor. S-a demonstrat astfel c procariotele i regleaz fluiditatea membranei, prin modificarea proporiei acizilor grai saturai/nesaturai. Cultivarea la temperaturi sczute mrete proporia acizilor grai nesaturai i sporete gradul de fluiditate a membranei. Prin rcire, faza de cristal lichid a lipidelor membranare trece spre o stare solid de gel, situaie n care grosimea dublului strat crete datorit extensiei catenelor de C ale lipidelor. Dublul strat lipidic este o structur ordonat. Catenele de carbon ale acizilor grai sunt constrnse la o aezare paralel i datorit caracterului hidrofob, nu se deplaseaz uor n afara membranei. Moleculele fosfolipidice sunt foarte mobile i se deplaseaz n plan lateral (bidimensional), n acelai strat, cu o frecven foarte mare, dar micrile flip-flop, dintr-un strat n cellalt (tridimensionale) sunt foarte rare (una la cteva ore). Stratul lipidic este suportul proteinelor i are rolul unei bariere de permeabilitate. Permeabilitatea

16

difereniat a celor dou fee ale membranei se explic att prin asimetria proteinelor, ct i prin compoziia chimic diferit a lipidelor n cele dou straturi ale membranei. Cu excepia micoplasmelor i a Archaea (bacteriile metanotrofe), membrana procariotelor se deosebete de cea a eucariotelor prin absena sterolilor. Sterolii sunt molecule plane, rigide, iar acizii grai sunt flexibili. Sterolii confer un grad superior de rigiditate membranei plasmatice. Rigiditatea membranei este necesar celulelor lipsite de perete. La eucariote, rigiditatea ar fi necesar pentru a suporta forele fizice care se exercit asupra membranei. Antibioticele polienice (nistatinul, candicidina) reacioneaz cu sterolii i destabilizeaz membrana. De aceea, ele sunt active fa de celulele eucariote i nu influeneaz celulele procariote. Micoplasmele ncorporeaz sterolul n structura membranei, disponibil n mediul de cretere i sunt sensibile la antibioticele polienice. La unele bacterii, n structura membranei se gsesc molecule asemntoare structural cu colesterolul i pot avea acelai rol de cretere a rigiditii: hopanoidele. Un compus larg distribuit este diploptenul, cu 30 de atomi de C. Mecanismele fiziologice ale permeabilitii membranei Creterea i multiplicarea microorganismelor sunt condiionate de disponibilitatea nutrienilor care trebuie s strbat nveliurile celulare i de eliminarea produselor de catabolism. Caracterul hidrofob al membranei i confer acesteia proprietatea de barier de permeabilitate: trec prin difuzie liber unele molecule hidrofobe mici, molecule lineare i cele solubile n mediul lipidic al membranei (antibioticele cu molecula polar). Apa difuzeaz liber printre fosfolipidele membranei pentru c molecula este mic i lipsit de sarcin. Membrana exclude moleculele mai mari dect glicerolul, dac nu sunt transportate de sisteme membranare sau dac nu se dizolv n lipide. n acelai timp, barierele celulare asigur transportul substanelor nutritive i rein n interiorul celulei substanele necesare, funcionnd ca adevrate pori moleculare, ce controleaz intrarea i ieirea diferitelor molecule. Datorit structurilor de suprafa, celula bacterian nu este niciodat n stare de echilibru cu mediul nconjurtor, n privina concentraiei diferitelor molecule de o parte i de alta a membranei citoplasmatice (Brock, 2005). n funcie de mecanismele fizico-chimice care stau la baza lor, transportul moleculelor (electrolii i neelectrolii) prin membran se face prin dou categorii de procese fiziologice: difuzia pasiv i mecanismele de transfer cu molecul purttor. Difuzia pasiv Difuzia pasiv este cea mai simpl modalitate de ptrundere a moleculelor n celul i se definete prin trecerea liber a substanelor prin membrana plasmatic n ambele sensuri. Procesul difuziei pasive are urmtoarele particulariti: trecerea moleculelor se face fr consum de energie; fora motrice a trecerii este gradientul de concentraie, ceea ce nseamn c transportul substanelor se face din zona cu concentraie mai mare, spre zona cu concentraie mai mic a moleculelor; transferul dureaz pn n momentul n care moleculele substanei care se transfer ajung la aceeai concentraie pe ambele fee ale membranei plasmatice; dac de o parte a membranei se gsesc mai multe tipuri de substane, difuzia pasiv se face individual pentru fiecare tip de molecul n parte, pn la echilibrul osmotic al fiecrei categorii; difuzia pasiv se realizeaz lent i nespecific. Factorul determinant al difuziei pasive este dimensiunea moleculei. Prin difuzia pasiv trec moleculele de ap, O2 , CO2 (molecule mai mici de 0,8 nm), precum i moleculele liposolubile (care se dizolv n lipidele membranei celulare, ca de exemplu, tetraciclina). Membrana este permeabil pentru ap i pentru moleculele organice fr sarcin, pn la dimensiunile glicerolului. Fluxul molecular n oricare direcie este proporional cu concentraia moleculei pe faa de intrare, astfel nct rata net de transfer este proporional cu diferena de concentraie ntre cele dou compartimente, dar depinde i de ali factori: sarcina moleculei transportate, gradul ei de potrivire conformaional cu discontinuitile membranare ce formeaz calea de transport. Moleculele mai mari dect glicerolul necesit sisteme specifice de transport. Sisteme de transport cu molecule purttor Moleculele purttor sunt proteine integrate ale membranei plasmatice, care au proprietatea de a lega substanele dizolvate de o parte a membranei i de a le transporta pe cealalt parte, un de le elibereaz. Denumirea lor generic este aceea de sisteme de transport, transportori, purttori sau permeaze. Sunt cel puin trei clase de sisteme de transport membranar : - sisteme formate dintr-o component ce traverseaz membrana; - sisteme formate dintr-o component ce traverseaz membrana i o protein periplasmic de legare;

17

- sisteme formate din proteine multiple ce coopereaz pentru a media transportul. Sistemele de transport cu molecule purttor ndeplinesc mai multe funcii: permit intrarea nutrienilor n celul; regleaz concentraia metaboliilor, cataliznd excreia produselor finale ale cilor metabolice; mediaz eliminarea activ a antibioticelor i a substanelor toxice, favoriznd supravieuirea celulei; regleaz echilibrul ionic, ce trebuie meninut la concentraii ce difer mult de concentraia din mediul extern; particip la secreia proteinelor, polizaharidelor i lipidelor; permit transferul acizilor nucleici prin membran, uurnd schimburile genetice ntre celule; elimin molecule (antibiotice, toxine) care permit celulei s desfoare competiia biologic, conferindu-i un avantaj selectiv pentru supravieuire. Se cunosc trei modaliti de transport prin intermediul moleculelor purttor: difuzia facilitat, translocaia de grup i transportul activ. Sistemele de transfer cu molecule purttor prezint urmtoarele caracteristici: prin intermediul lor se realizeaz o trecere mai rapid a moleculelor de pe o fa pe cealalt a membranei plasmatice; asigur trecerea simultan a mai multor tipuri de molecule, fr s existe fenomene de interferen; transfer n celule diferite molecule, chiar contra gradientului de concentraie i prin aceasta permit acumularea moleculelor n celul la concentraii ce pot depi de l00-l0000 de ori concentraia lor n mediu (cu semnificaie deosebit pentru bacteriile care triesc n apele oligotrofe, srace n substane nutritive). Difuzia facilitat Difuzia facilitat se aseamn ca mecanism, cu difuzia pasiv, deoarece fora de propulsie a transportului este diferena de concentraie a substanei dizolvate, pe cele dou fee ale membranei plasmatice. Procesul nu este cuplat cu consumul de energie metabolic i nu genereaz procese concentrative. Transferul moleculelor se face n sensul gradientului de concentraie, din zona cu concentraie mai mare, spre zona cu concentraie mai mic. In final, concentraia substanei n celul este egal cu concentraia sa n mediu. Nu se produce acumularea (concentrarea) moleculelor pentru c nu se consum energie. Deosebirea fa de difuzia pasiv const n aceea c intervin molecule membranare care uureaz difuzia moleculelor transportate. Moleculele membranare sunt proteine integrate, cu domenii extramembranare, att citoplasmatic e ct i la suprafaa extern. Exist dou modaliti de transport facilitat: de tip canal (sau por) i de tip purttor (carrier). In difuzia facilitat de tip canal, substana dizolvat trece de pe o latur pe cealalt a membranei, printr-un canal sau por. Canalele sau porii sunt proteine oligomerice (n special trimere) de membran care au rolul de a transfera diferite molecule (fig. 12). Pereii canalului sunt delimitai de secvene hidrofile, hidrofobe sau amfipatice de aminoacizi, n funcie de proprietile substratului care difuzeaz i favorizeaz trecerea moleculelor, spre deosebire de interiorul hidrofob al stratului lipidic.

Figura 12. Ilustrarea schematic a mecanismului difuziei facilitate de tip canal. Moleculele membranare din categoria porinelor, sunt proteine integrate formate din cateva subuniti. Prin modificri conformaionale, porinele realizeaz transportul moleculelor din mediul extracelular, n mediul citoplasmatic, dar numai n sensul gradientului de concentraie (de la concentraie mare, la concentraie mic). Procesul nu necesit consum de energie (dup Black, 1996).

Moleculele purttor pot fi proteine monomerice sau dimerice, au specificitate stereospecific de substrat i rata de transport este de cteva ori mai mic dect a difuziei de tip canal. Se presupune c molecula purttoare trece prin membran mpreun cu substratul i isi schimb conformaia spaial, ceea ce i permite s se prezinte cu suprafaa activ, alternativ, spre faa extern sau spre faa intern a membranei. Fiecare tip de protein purttor are unul sau mai multe situsuri de legare pentru molecula specific.

18

Mecanismul de transport al difuziei facilitate funcioneaz n celulele adaptate la concentraii mari de glucide n mediu (de exemplu, levuri, eritrocite). La bacterii, care trebuie sa preia substanele nutritive din soluii diluate, nu s-au evideniat astfel de sisteme de transport. Translocaia de grup Particularitatea fundamental a acestei modaliti de transport const n faptul c, pentru a fi transportat prin membrana plasmatic, molecula este modificat chimic. Orice proces de transport n timpul cruia substratul este modificat chimic, se numete translocaie de grup. Moleculele din mediu nu vor aprea n celul n aceeai form chimic, ci sub forma unui produs modificat (Alberts, 1994). Astfel sunt transportate glucidele (glucoza, fructoza, manoza, lactoza, N-acetilglucozamina), bazele purinice i pirimidinice, acizii grai etc. Moleculele sunt fosforilate prin sistemul fosfotransferazei, cu un rest de acid fosforic. Sistemul enzimatic al fosfotransferazei este alctuit dintr-o reea de proteine citoplasmatice i membranare, care se fosforileaz n cascad. Prima protein a reelei (HPr) are localizare citoplasmatic i se fosforileaz din fosfoenol-piruvat, rezultnd HPr-P, cu eliberarea piruvatului. La nivelul membranei, ultima component a catenei de transport, o protein integrat, fosforileaz glucoza prin transferul gruprii fosfat. Glucoza este transferat n celul sub forma esterului glucozo-6-P. La E. coli, sistemul fosfotransferazei este alctuit din 24 de proteine, iar la transportul unui monozaharid particip cel puin 4 componente. Proteinele membranare care se fosforileaz n cascad au rolul de permeaze i formeaz unul dintre sistemele de transport prin membrana citoplasmatic. Permeazele sunt proteine de transport foarte eficiente. Ele mresc viteza de transport de cteva ori n raport cu difuzia facilitat i sunt factorii determinani ai ratei excepionale a metabolismului bacterian. Mutantele bacteriene identificate ca fiind lipsite de permeaze, devin dependente de ptrunderea nutrienilor prin difuzie i necesit o concentraie extern a moleculelor nutritive de l000 de ori mai mare n raport cu tulpina parental. Din categoria permeazelor fac parte: - sistemele de transport pentru glucide, cu specificitate moderat, deoarece pot fi destinate transportului unei anumite molecule de zahr sau unui grup de molecule glucidice. S-au identificat sisteme de transport pentru monozaharide, pentru dizaharide i chiar pentru oligozaharide (de exemplu, sistemul de transport al maltozei poate transporta maltodextrine); - sistemele de transport pentru aminoacizi au afinitate mai nalt pentru substratul specific (comparativ cu cele ce transport glucide), fapt care se coreleaz cu concentraia diferit a celor dou categorii de molecule n mediu i cu rata lor diferit de metabolizare; - sistemele de transport pentru oligopeptide au o specificitate mai mic de legare. La E. coli s-au identificat trei sisteme de transport ale oligopeptidelor: unul care leag nespecific orice dipeptid, unul pentru tripeptide i altul care leag orice peptid mai mic de 6 resturi. Relativa lips de specificitate a permeazelor face posibil ptrunderea unor molecule pentru care membrana nu este permeabil, prin cuplarea lor cu peptidele. Astfel ptrund agenii chimici antibacterieni, care se leag de peptide prin legturi labile i se elibereaz intracelular, dup hidroliza peptidelor. Transportul membranar prin translocaie de grup se realizeaz cu consum de energie. Este o modalitate de a economisi energia, deoarece cea cheltuit prin fosforilare este folosit att pentru realizarea transportului, ct i pentru prima treapt a metabolizrii glucidului. Translocaia de grup realizeaz acumularea moleculei transportate n celul, la o concentraie net superioar celei din mediu. Transportul activ Transportul activ este modalitatea de transfer intracelular al nutrienilor contra gradientului de concentraie, prin care substanele pot fi concentrate de l000 de ori n interiorul celulei, fa de mediul extern. Procesul este totdeauna energizat de o surs primar de energie i se evideniaz prin incubarea celulelor n prezena unui compus marcat radioactiv. Sursa de energie a transportului activ are trei origini: transportorii cuplai leag transportul contra gradientului de concentraie al unei molecule cu transportul n sensul gradientului al alteia; pompele dependente de ATP cupleaz transportul contra gradientului de concentratie cu hidroliza ATP; pompele dependente de lumin cupleaz transportul cu aportul de energie luminoas (de exemplu, bacteriorodopsina de halofilelor).

19

Figura 13. Ilustrarea schematic a mecanismului transportului activ. Ca i n cazul difuziei facilitate, moleculele transportoare sunt proteine membranare integrate, dar spre deosebire de difuzia facilitat, procesul de transport activ are loc contra gradientului de concentraie i de cele mai multe ori, consum energie stocat n ATP (dupa Black, 1996).

Pentru a fi atribuit transportului activ, substana trebuie s se acumuleze n aceeai form chimic (i nu sub forma unui derivat al su). Pentru aminoacizi, dovada transportului activ se obine mai uor, deoarece ntre momentul ptrunderii lor n celul, pn la ncorporarea lor n proteine exist un interval de timp suficient pentru evidenierea lor, ns zaharurile sunt metabolizate rapid i de aceea este necesar blocajul metabolic (prin utilizarea mutantelor bacteriene care si-au pierdut capacitatea de a le metaboliza sau prin utilizarea unui analog nemetabolizabil). Transportul activ se realizeaz prin intermediul proteinelor membranare de transport (fig. 13). Existena proteinelor membranare de transport a fost dedus din creterea peak-ului electroforetic al proteinelor marcate n prezena moleculei transportate i din dispariia lor n celulele mutante pentru sistemul respectiv de transport. Prima protein purttor, identificat printre proteinele membranare solubilizate este proteina sistemului lac la E. coli. Este o protein inductibil, iar n celulele bacteriene crescute pe mediu cu lactoz, ea reprezint 4% din totalul proteinelor membranare. Proteinele de transport sunt proteine transmembranare (integrate) i au domenii expuse att spre citoplasm ct i spre mediul extern. Structural, moleculele transportoare formeaz circa 12 helice care se pliaz pentru a forma un canal transportor. Transportul implic o schimbare conformaional a proteinei, dup legarea substratului specific. Uneori transportul activ este foarte specific, adic pentru fiecare tip de molecul transportat exist o anumit molecul purttor, care o preia de pe o fa a membranei i o transfer pe cealalt. Acestea sunt sisteme uniport. Alte sisteme transport simultan, n acelai sens o substan, mpreun cu o alta necesar pentru transport (sisteme simport). O alt categorie realizeaz concomitent transportul a dou tipuri de molecule, n direcii opuse (sisteme antiport) (Alberts, 1994). Transportul activ al multor glucide i aminoacizi n celula bacterian este dependent de gradientul electrochimic de H+ prin membrana plasmatic. Substana care este transportat se leag specific cu o protein membranar purttor, dup care molecula transportat este eliberat nemodificat chimic, n interiorul celulei. Specificitatea proteinelor membranare de transport s-a demonstrat prin experimente de mutagenez care au artat c o singur mutaie genic anuleaz capacitatea bacteriei de a transporta glucide specifice prin membran. Substanele transportate activ sunt unele glucide, aminoacizii, acizii organici, ionii anorganici (K+, Mg2+, SO42- , PO43-). Glucoza este luat prin procese active la unele bacterii, iar la altele, prin sistemul fosfotransferazei. Transportul activ necesit consum de energie, deoarece transportorii funcioneaz pe principiul pompelor concentrative. La bacterii, energia necesar activrii pompelor este rezultatul separrii ionilor de H+, de electroni, n grosimea membranei, ceea ce constituie fora proton-motrice. Se creeaz un gradient de concentraie a protonilor ntre exteriorul i interiorul celulei. Protonii sunt expulzati de pompe specifice dependente de ATP si se concentreaz la exteriorul celulei, iar n interior se concentreaz OH-. Potenialul electrochimic are rol esenial pentru transportul activ. La bacteriile Gram negative, transportul moleculelor n celul este rezultatul aciunii a dou mecanisme, ambele consumatoare de energie. Moleculele sunt transportate n spaiul periplasmic prin

20

intermediul porinelor. n spaiul periplasmic, molecula transportat se leag specific cu o protein periplasmic, care faciliteaz transportul n citoplasm, pe calea unei proteine purttoare specifice din membrana celulei, energia necesar transportului fiind furnizat prin hidroliza ATP. Aceast clas de transportori s-a denumit sisteme ABC (ATP- Binding Cassette). Un alt mecanism de transport este reprezentat de sistemul fosfotransferazei. Adeseori, celulele bacteriene posed dou tipuri de sisteme de transport: sisteme constitutive, relativ nespecifice, n condiiile unei relative abundente a nutrienilor i sisteme inductibile, cu specificitate nalt, active n condiii de stress, provocat de deficitul substanelor nutritive sau indus de substane toxice. Sisteme celulare de transport ionic Pentru o molecul fr sarcin, gradientul de concentraie determin transportul pasiv i sensul lui. Dublul strat lipidic este foarte impermeabil pentru moleculele ncrcate electric, mici sau mari. Sarcina i gradul de hidratare le mpiedic s ptrund n dublul strat lipidic. Transportul lor este influenat att de gradientul de concentraie, ct i de diferena de potenial electric a membranei, adic de potenialul membranar. Gradientul de concentraie i gradientul electric, adic gradientul electrochimic, determin fora net de transport pentru fiecare tip de molecul. Diferena de potenial a membranei (negativ pe faa intern) favorizeaz intrarea cationilor, dar se opune accesului anionilor. Membrana citoplasmatic are rol de barier osmotic, prin permeabilitatea foarte selectiv, permind trecerea (ieirea) unor anioni, dar reine cationii eseniali care au acces n i din celul, numai pe calea unor unor sisteme specifice de transport. Ionii de K+, Mg2+, SO42-, PO43- sunt transferai activ n celul, prin intermediul unor molecule purttoare cu specificitate nalt, denumite pompe ionice. Sistemele de transport pentru ionii cu importan nutritriv sunt sisteme de influx, iar cele pentru transportul ionilor toxici sunt sisteme de eflux i reprezint substratul molecular al mecanismelor de rezisten. Aceste pompe au o importan excepional pentru sistemele biologice, deoarece realizeaz i menin pH, gradientele ionice i potenialul de membran. Sistemele de transport pentru Na+, Ca2+, H+ i Cl- sunt sisteme de eflux i au rolul de a menine concentraii intracelulare sczute i de a realiza gradiente ionice transmembranare. Sistemele de eflux pentru cationi consum energie furnizat prin hidroliza ATP. Unii ioni (Cu2+, Zn2+) au rolul de micronutrieni, fiind utili la concentraii mici i sunt concentrai prin sistemele de influx, dar sunt toxici la concentraii mari, fiind eliminai prin sistemele de eflux. Pentru aceti cationi, sistemele de influx i de eflux sunt separate. Sistemele de eflux pentru cationii toxici sunt fie consumatoare de ATP ori sunt cuplate cu un sistem antiport de nglobare a altui cation (H+, Na+, Ca2+).

1.4. Nucleoidul bacterian

Spre deosebire de celulele eucariote care au un nucleu cu structur bine definit, delimitat de o membran i coninnd un numr definit de cromosomi, nucleul bacterian reprezint o form primitiv de organizare, lipsit de membran, inclavat direct n citoplasm. Particularitatea structurii nucleare lipsa membranei delimitante este fundamental pentru organizarea celular de tip procariot, cruia i aparin bacteriile. Datorit caracterelor structurale particulare, nucleul bacterian a primit diferite denumiri: nucleoid, material nuclear, nucleoplasm, echivalent nuclear sau chiar nucleu, prin analogie cu nucleul celulei eucariote, lineom sau genofor. Aparatul genetic bacterian este reprezentat de dou tipuri de structuri: nucleoidul, care din punct de vedere structural i funcional corespunde cromosomului, iar cea de a doua categorie de structuri o reprezint plasmidele. Corespunztor celor dou tipuri de structuri, determinanii genetici sunt de dou categorii: gene eseniale ( eucromosomale), localizate n structura cromosomului i genele accesorii, cu localizare plasmidial sau n structura elementelor genetice transpozabile i a unor fagi. Cromosomul bacterian, ca structur genetic esenial poart informaia genetic ce asigur desfurarea funciilor eseniale pentru existena celulei, adic setul de determinani minim necesari pentru a codifica arhitectura celulei i pentru a asigura metabolismul energetic i de biosintez, creterea, diviziunea i reglarea diferitelor activiti celulare. Structurile genetice extracromosomale (plasmidele) poart informaia genetic accesorie, de confort, care permite celulei o mai bun adaptare la condiii de mediu, noi sau modificate. Genomul E. coli K12 este alctuit din circa 4400 de gene. Pentru creterea n laborator ar fi necesare numai cteva sute. Genomul este rezultatul aciunii forelor selective pentru eficien metabolic i adaptabilitate. Fiind foarte bogat n ARN, citoplasma celulei bacteriene este intens bazofil, fapt ce nu a permis diferenierea materialului nuclear, la fel de bazofil, dup colorarea cu colorani bazici de anilin. De aceea, s-a

21

considerat c nucleul bacterian lipsete sau dimpotriv, c bacteriile ar avea un nucleu imens care ocup ntreaga celul. Datorit bazofiliei citoplasmei, evidenierea materialului nuclear la microscopul optic este posibil dup utilizarea tehnicilor de colorare selectiv, ce constau n ndeprtarea ARN prin hidroliz acid (tehnica Robinow i Feulgen) sau enzimatic (cu ribonucleaz) i utilizarea coloranilor de anilin. Dup hidroliza ARN, materialul nuclear apare sub diferite forme: sferic, ovalar, de halter, de bastona, reprezentnd 5 - l6% din volumul celulei. Dup tratamentul celulelor cu DN-az, zona corespunztoare materialului nuclear apare golit de coninut. Pe micrografiile electrono-optice, materialul nuclear este localizat, n mod obinuit, n partea central a celulei i se distinge de citoplasma nconjurtoare, prin densitatea sa mai mic la fluxul de electroni, n contrast cu celula eucariot, la care nucleul este mai electronodens, comparativ cu citoplasma (fig. 14).

Figura 14. Imaginea electrono-optic a nucleoidului bacterian la Bacillus subtilis, x 100 000 (original).

Celula procariot are un contrast invers al structurilor sale, n raport cu celula eucariot, care se datoreaz att faptului c molecula de ADN nu este asociat cu proteine, ct i densitii foarte mari a citoplasmei bacteriene. Pe seciuni ultrafine, zona materialului nuclear este ocupat de fibrile fine, cu diametrul de 2,5 nm, uneori aranjate n iruri ondulate, paralele, asemntoare cu o jurubi de a i sunt sensibile la hidroliza cu DN-az. Organizarea fizic a cromosomului Materialul nuclear poate fi izolat din celul sub forma unui corpuscul dens i compact. Dup tratatamentul cu RN-az, din corpusculul dens se elibereaz cromosomul circular, format dintr-o singur molecul de ADN, circular, nchis covalent, cu o lungime de l400 m i diametrul de 2,5 nm, corespunztor diametrului moleculei de ADN dublu catenar. Circularitatea este o condiie a existenei sale. Sub aceast form, molecula de ADN este rezistent la aciunea exonucleazelor citoplasmatice, active asupra moleculelor lineare de ADN. Cromosomul bacterian este cea mai mare molecul biologic. Prin lungimea sa (1400 m), molecula de ADN cromosomal depete de circa l000 de ori lungimea celulei bacteriene.Corpusculul dens corespunde strii mpachetate a cromosomului. Dup tratamentul moderat cu RN -az i proteaze, din structura compact se izoleaz ADN (60%), ARNm, ARNt (30%) i ARN-polimeraza (l0%). Raportat la dimensiunile mici ale unei bacterii, molecula de ADN este supus constrngerilor topologice de supraspiralizare (suprarsucire), prin care este mpachetat pentru a forma un corp compact de l500 de ori mai mic. Pentru a ocupa un volum att de mic, molecula de ADN se mpacheteaz dup norme foarte riguroase, astfel nct, n orice moment, din cele 3000-5000 de gene pe care le conine, oricare s fie accesibil sistemelor celulare de transcriere i traducere. Moleculele de ARN au un rol esenial n meninerea strii compacte a ADN. S-au propus mai multe modele de mpachetare a moleculei de ADN. Cel mai acceptat este acela propus de Pettijohn si Hecht (l974) (citat de Zarnea, 1983), n acord cu care, mpachetarea se face printr-un proces de pliere i supraspiralizare (formare de suprahelice) (fig. 15). Se formeaz astfel o structur condensat, meninut prin aciunea asociat a proteinelor din nucleoid. Modelul de mpachetare prin pliere i supraspiralizare ncearc s explice mecanismul molecular al drumului invers, de la structura circular relaxat a macromoleculei de ADN, la arhitectura corpusculului dens existent n celul. Pentru mpachetare se consider c molecula dublu catenar, circular, iniial se pliaz, n 40-60 de domenii egale. Punctele de pliere sunt determinate de molecule de ARN nascente, legate cu una dintre extremiti de ARN-polimeraz.

22

Moleculele de ARNr i ARNt, mpreun cu ARN-polimeraza particip la formarea i meninerea domeniilor de pliere.

Figura 15. Diferite stri fizice (de impachetare) ale cromosomului bacterian. a. Bucle multiple de ADN dintr -o celul spart prin oc hipotonic, rspndite pe suportul reprezentat de o protein bazic. b. Diagrama ADN supraspiralizat. n stnga sunt reprezentate 7 domenii (numrul real este de circa 50) supraspiralizate, meninute astfel de un set de proteine, care stabilizeaz capetele unui domeniu. Buclele mici ale fiecrui domeniu pot fi spiralizate n jurul unui set de proteine nucleosomale, reducnd tensiunea n dublul helix, creat prin supraspiralizare. n dreapta, dou domenii au fost incizate la nivelul unei catene, permind rotaia helixului i relaxarea supraspiralei (dupa Pettijohn i Sinden, 1985).

Prin pliere, diametrul cromosomului scade la circa 30 m. In interiorul fiecrui domeniu de pliere are loc un proces de supraspiralizare. Supraspiralizarea este o stare fizic n care molecula de ADN se pliaz prin rsucire n jurul propriei axe. Intr-o etap ulterioar, domeniile suprahelicale se pliaz din nou unul fa de altul, superior i inferior fa de un plan orizontal. Astfel, rezult masa compact a nucleoidului, aa cum se evideniaz la microscopul optic i se poate izola din celul. Rolul topoizomerazelor n meninerea configuraiei supraspiralizate a moleculei de ADN Spiralizarea ADN are sens pozitiv i negativ. Spiralizarea primar a dublului helix are sens pozitiv (de dreapta), cu 10,4 pb/tur. Anumite secvene de ADN, mai ales cele care conin resturi alternante de G i C, tind s formeze un helix rsucit spre stnga (forma Z) a moleculei de ADN, denumit astfel deoarece axa glucidfosfat are o structur n zig-zag. Spiralizarea secundar (supraspiralizarea) are sens negativ (de stnga), adic se produce prin rsucirea moleculei de ADN n sens opus spiralizrii primare (pozitive) a dublului helix. Molecula de ADN bacterian este, n mod normal, supraspiralizat negativ, cu o spiral negativ la fiecare circa 200 pb. Cromosomul bacterian const dintr-un numr mare de bucle supraspiralizate, aranjate pe o regiune central, rezultnd o structur compact i organizat - nucleoidul. Prin supraspiralizarea negativ, ntre capetele domeniului pliat, se creeaz o tensiune de torsiune, direct proporional cu gradul de spiralizare, care se menine atta timp ct molecula este nchis covalent. Tensiunea este anulat prin incizia unei catene i formarea buclelor de ADN. Catena incizat se rotete liber n jurul axei moleculei, se relaxeaz, ia forma circular deschis, fr superhelice. Formarea unei bucle elimin un tur al suprahelicei i reduce tensiunea general a suprahelicei. Formarea suprahelicei i relaxarea ei este condiionat de activitatea unui set de enzime, denumite ADN-topoizomeraze. Topoizomerazele sunt enzime care schimb configuraia spaial a ADN prin ruperea i reunirea catenelor. Unele topoizomeraze sunt helicaze sau giraze (produc spiralizarea moleculei de ADN), iar altele sunt derulaze (produc despiralizarea prin incizia unei catene i bucla se relaxeaz). O topoizomeraz este o nucleaz reversibil, care se leag covalent la o grupare fosfat a ADN i rupe legtura fosfodiesteric. Deoarece legtura covalent care unete topoizomeraza la o grupare fosfat a ADN reine energia legturii fosfodiesterice pe care o rupe, reacia este reversibil, adic incizia este urmat de legarea celor dou capete. Legarea este rapid i nu necesit un aport suplimentar de energie.

23

Topoizomerazele de tip 1 acioneaz prin recunoaterea unui segment de ADN, parial despiralizat, prin incizia unei catene, ceea ce permite celor dou pri ale helicei de ADN, de o parte i de alta a inciziei, s se roteasc liber una fa de alta, n sensul care reduce tensiunea de supraspiralizare. Aceasta nseamn c replicarea ADN se face numai cu rotaia unei mici pri a helicei, adic a celei situat n aval de bifurcaie. Topoizomeraza I, prin clivarea unei catene, elimin tensiunea de torsiune i formeaz bucle externe distribuite pe toat suprafaa nucleoidului. Buclele sunt secvenele de ADN care conin genele transcrise la un moment dat. Ele sunt invizibile, extinse n citoplasm i n aceast topografie sunt mai uor accesibile ADNpolimerazei i ARN-polimerazei. Pe seciuni subiri, anticorpii marcai cu aur, specifici fa de ADN monocatenar coloreaz numai periferia nucleoidului, iar anticorpii specifici fa de ADN dublu catenar coloreaz partea central (condensat) a nucleoidului. Topoizomerazele de tip II se leag covalent, simultan, de cele dou catene ale dublei helice i produc o rupere bicatenar tranzitorie. Aceste enzime se activeaz la situsurile cromosomale la nivelul crora se ntreptrund dou duble helice. Dup fixarea topoizomerazei la un astfel de situs, are loc clivarea uneia din cele dou helice duble i trecerea celei de a II-a catene, prin brea creat, urmat de repararea discontinuitii nainte de a se disocia de ADN. ADN-polimeraza de tip II poate astfel s separe cele dou molecule de ADN catenate. ADN-giraza (sau topoizomeraza II) modific configuraia spaial a moleculei de ADN, prin catalizarea suprarsucirii negative ale ADN cromosomal i plasmidial, uurnd mpachetarea cromosomului bacterian n spaiul restrns al celulei. Este o protein heterotetrameric format din dou subuniti A (gyr A) i dou subuniti B (gyr B) (la E. coli proteinele gyr au 97 kDa). Subunitile A i B ale topoizomerazei II sunt codificate de genele gyr A i gyr B. Dup purificarea ADN-girazei de E. coli, structura acestei enzime a fost investigat pentru numeroase alte specii bacteriene, evideniidu-se un grad nalt de omologie ntre subunitaile A, pe de o parte, i a subunitailor B, pe de alt parte. Cu toate acestea, secvena situsurilor catalitice din proteinele gyr A i aceea a situsului de hidroliz a ATP n proteinele gyr B sunt foarte conservate. ADN-giraza purificat introduce rsuciri suprahelicale negative ale moleculei de ADN circular nchis i separ reversibil moleculele circulare catenate. Aceste activiti sunt dependente de energia eliberat prin hidroliza ATP i constau n clivarea ambelor catene ale moleculei de ADN, trecerea altui duplex de ADN (sau alt segment al aceluiai duplex) i reunirea catenelor. Activitatea ADN-girazei este inhibat de quinolone Subunitatea A a fost desemnat ca inta preferenial a aciunii quinolonelor. Subunitatea B este inta altor antibiotice: cumermicina i novobiocina. ADN-giraza este singura enzim care influeneaz gradul de spiralizare al ADN, prin catalizarea suprarsucirilor negative ale ADN cromosomal i plasmidial, fiind esenial pentru meninerea strii suprahelicale a cromosomului bacterian. Inhibiia activitii acestei enzime de ctre fluoroquinolone este asociat cu moartea rapid a celulei bacteriene. Proteina se leag de ADN ca un tetramer, n care cele dou subuniti A i dou subuniti B mpacheteaz ADN prin supraspiralizare negativ. ADN giraza elimin rsucirile suprahelicale pozitive care se acumuleaz naintea bifurcaiei de replicare. Aceste activiti sunt rezultatul secionrii coordonate a ambelor catene ale ADN, trecerea celuilalt segment de ADN prin ni i restabilirea continuitii catenei. Mecanismul de aciune este caracteristic topoizomerazei II. Situsul catalitic al ADN-girazei este situat la tirozina din poziia 122 a subunitaii A. Subunitatea B cuprinde situsul de hidroliz a ATP, hidroliz care furnizeaz energia necesar activitii enzimatice. ADN-giraza este esenial pentru mai multe procese vitale: iniierea i progresia bifurcaiei de replicare, terminarea replicrii, transcrierea unor operoni, repararea ADN, recombinarea i transpoziia. Topoizomeraza IV a fost descris recent, iar funcia sa principal este decatenarea, adic separarea copiilor ADN circular dublu catenar dup replicarea cromosomului bacterian i a plasmidelor. Topoizomeraza IV este omolog structural cu ADN giraza. Este o enzim de separare a catenanilor (a moleculelor surori catenate de ADN), rezultai dintr-un rund de replicare bidirecional i permite segregarea lor n celulele surori. ADN-giraza i topoizomeraza IV acioneaz asupra dublei catene, dar efectele sunt diferite: giraza mpacheteaz ADN prin inducerea supraspiralizrii, iar topoizomeraza IV separ moleculele reunite prin legturi intermoleculare. Topoizomeraza IV este format la fel ca ADN-giraza din dou subuniti denumite Par C i dou subuniti Par E, cu aceeai repartiie funcional ca i a subunitilor ADN-girazei. Proteinele Par C i Par E sunt foarte asemntoare prin structura lor primar cu proteinele Gyr A i Gyr B (40% din secvena aminoacizilor este identic) i sunt codificate de genele parC i parE. Topoizomeraza IV modific ntr-o msur mult mai mic topologia ADN dublu catenar: rolul su este important pentru separarea catenelor de ADN dup terminarea replicrii. Rolul topoizomerazei IV, ca int specific a quinolonelor a fost recent demonstrat la E. coli, S. aureus i N. gonorrhaeae. Ryter i Chang (l975) consider c nucleoidul evideniat la microscopul electronic ca o structur net ar reprezenta fracia de ADN condensat, genetic inactiv, care din punct de vedere topologic reprezint ADN supraspiralizat. Proporia ntre ADN supraspiralizat i ADN relaxat este meninut prin echilibrul dintre ADN-

24

giraza (topoizomeraza II), enzima care produce supraspiralizarea i topoizomeraza I, enzima care produce relaxarea. Domeniile cromosomului bacterian sunt topografic independente, ceea ce permite rotaia lor liber i relaxarea individual a fiecrei supraspirale, care trece reversibil n starea de bucl, configuraie n care se replic, este transcris sau reparat. ADN bacterian, ca i la eucariote este asociat cu proteine. n celula eucariot, corpii proteici n jurul crora se spiralizeaz dubla caten de ADN se numesc nucleosomi. La bacterii, organizarea molecular a nucleosomilor este puin cunoscut. Se pare c ei conin dou proteine de legare pentru ADN: proteina HU (Helix Unwinding) i proteina I. Ele se gsesc n structura nucleosomului, n proporia de o molecul la l50-200 perechi de baze.

1.5. Ribosomii
Ribosomii sunt organite ribonucleoproteice, localizate n citoplasm, care la microscopul electronic au form sferic, cu diametrul de aproximativ 20 nm. Pe baza constantei de sedimentare (S) se disting urmtoarele categorii de ribosomi: a) ribosomi 80 S, n citoplasma celulelor eucariote; b) ribosomi mitocondriali i cloroplastici, ntre 55 S la mamifere i 75 S la plantele superioare; c) ribosomii Archaea, de 70 S, asemntori din punct de vedere funcional cu ribosomii 80 S ai eucariotelor, datorit absenei sensibilitii la streptomicin i cloramfenicol i prin sensiblitatea la toxina difteric; d) ribosomii eubacteriilor, de 70 S. Numrul ribosomilor n celula bacterian este corelat cu activitatea ei fiziologic: este mic n celulele n repaus, dar crete foarte mult n celulele fiziologic active (n medie 20000 ribosomi/celul, cu variaii ntre l5-l00 000). Ribosomii sunt structuri dinamice, calitate ce se reflect n capacitatea lor de a se disocia n dou subuniti, de 30 S i 50 S i de a se reasocia. Disocierea i reasocierea sunt corelate cu variaia concentraiei ionilor de Mg2+: creterea concentraiei ionilor favorizeaz asocierea, iar scderea concentraiei lor produce disocierea. Circa l0% din numrul total de ribosomi sunt asamblai, liberi n citoplasm . Ei sintetizeaz proteinele structurale. Ali l0% se gsesc sub forma subunitilor disociate, iar restul de 80% sunt polisomi. Ribosomii au dou localizri: liberi n citoplasm sau ataai feei interne a membranei citoplasmatice. La nivelul celor ataai se sintetizeaz proteinele de export. Studiul ribosomilor a beneficiat de tehnici din domeniul fizicii (metoda dispersiei neutronilor), care, n asociaie cu tehnicile de chimie au permis nelegerea structurii i funciei ribosomilor. La microscopul electronic, s-a demonstrat c ribosomii au form complex, cea sferic perceput n mod obinuit fiind rezultatul examinrii cu sisteme optice cu putere redus de rezoluie. Subunitatea 50S are o form asemntoare cu aceea a unui fotoliu, iar subunitatea 30S se aseamn cu o halter asimetric, aezat orizontal pe braele i sptarul fotoliului. ntre cele dou subuniti rmne un spaiu prin care trece ARNm. Din punct de vedere biochimic, ribosomii bacterieni conin circa 55 de tipuri de molecule proteice i trei tipuri de molecule de ARNr. Studiile privind structura funcional a ribosomilor s-au fcut cu dou metode foarte sensibile: difracia cu neutroni i imunoelectronomicroscopia. Subunitatea mic 30 S cuprinde 2l tipuri de molecule proteice (S1 - S21 ), n ordinea descreterii mrimii, cu greutatea molecular ntre 60 000 Da i 8 000 Da i o molecul de ARNr l6S , alctuit din circa l6000 nucleotide. Subunitatea mare, 50S conine 34 tipuri de molecule proteice (Ll - L34, L= Large), cu greutatea molecular cuprins ntre 9 - 28,5 kDa i dou molecule de ARNr, de 23 S i respectiv 5 S. Cele dou tipuri de molecule de ARN provin prin clivarea unui precursor comun, de 30 S. Cele 55 de tipuri de proteine ribosomale se gsesc ntr-un singur exemplar (o singur molecul din fiecare tip). Unele au rol structural, fiind eseniale pentru asamblarea ribosomului, altele au rol funcional, permind legarea ARNm n procesul traducerii i sintezei lanului proteic. La E. coli, n fiecare subunitate ribosomal, raportul ARN-proteine este 2/l, iar la alte bacterii, raportul este 2/3. Moleculele componente au o distribuie fix, riguroas n structura ribosomului. Molecula de ARNr este pliat ntr-o structur tridimensional ce formeaz regiunea central a ribosomului i determin aspectul su. Proteinele care se leag de ARNr 16 S sunt mai profunde i sunt cele mai protejate de aciunea agenilor externi. Proteinele sunt localizate n general la suprafaa ribosomului, n depresiunile pe care le creeaz ARN pliat. Unele proteine conin domenii globulare, localizate la suprafa, ce trimit extensii n regiunea central a ribosomului. Interaciunile fixe ale componentelor condiioneaz procesele de autoasamblare a ribosomilor. Asamblarea ribosomilor. In condiii experimentale, componentele ribosomale se disperseaz i se autoasambleaz dup restabilirea condiiilor de mediu, pentru a produce ribosomi activi. S -a reconstituit subunitatea 30 S, dar reasamblarea subunitii 50 S este mai complex deoarece este dependent de temperatur (60o C) i proteinele se denatureaz la aceast temperatur. n studiile experimentale s-au utilizat

25

ribosomi de Bacillus stearothermophilus, ale cror proteine sunt termostabile, rezistente la 60o C. Ulterior s-a reasamblat subunitatea 50 S de la E. coli. Reasamblarea ribosomilor urmeaz o cale specific: anumite proteine se leag de ARN i complexul este recunoscut succesiv de alte proteine, pn ce structura devine complet. Ribosomii reconstituii sunt funcionali (fac sintez proteic). Rolul proteinelor pare a fi de stabilizare a ARN, dar ele permit schimbarea configuraiei ARNr, necesare catalizei sintezei proteinelor. Ribosomii reprezint componenta esenial a sistemului de traducere a informaiei genetice. Ei sunt adevratele fabrici de proteine ale celulei. Ribosomii au rolul de a menine att molecula de ARNm, ct i complexul aminoacil-ARNt, ntr-o orientare corespunztoare pentru a permite att citirea mesajului, ct i formarea legturilor peptidice. Ribosomii se asociaz n polisomi (poliribosomi), adic grupri funcionale formate din 4 - 50 uniti ribosomale. Dimensiunile polisomilor variaz n funcie de lungimea ARNm. Polisomii sintetizeaz concomitent mai multe molecule proteice pe aceeai molecul de ARNm.

1.6. Sporul bacterian

Sporul este o forma primitiv de difereniere celular, care const n reorganizarea structural i funcional a celulei vegetative i formarea unui nou tip de celul, cu proprieti noi. Sporii se formeaz la bacteriile cilindrice: totdeauna la bacilii anaerobi din genul Clostridium, facultativ la cei aerobi din genul Bacillus, excepional la coci (Sporosarcina) i la actinomicete. Toate bacteriile sporulate sunt Gram pozitive. Sporularea este condiionat de existena unui perete mureinic gros i de formarea septului de diviziune. Exist circa l0 tipuri de spori, ce se deosebesc prin modul de formare, prin structur i prin rezisten la factorii de mediu. Cel mai caracteristic este endosporul, denumit astfel deoarece se formeaz n interiorul unei celule vegetative. La actinomicete se formeaz cteva tipuri de spori: artrospori (prin segmentare), oidiospori (prin fragmentare), aleuriospori (se formeaz apical sau lateral pe sporofori scuri), zoospori (spori mobili), iar aplanosporii se formeaz prin septarea hifelor i sunt meninui n interiorul unui nveli. La Azotobacter se formeaz chiti. Endosporul sau sporul endogen a fost considerat ca unic tip sporal bacterian, pn la descrierea celorlalte tipuri. Are form sferic sau ovalar. Cei ovalari au dimensiuni cuprinse ntre 0,5 1 m, pentru axul scurt i 1,2 2 m pentru axul lung. Endosporul are o refringen deosebit i pe preparatul proaspt apare strlucitor. Este foarte greu colorabil datorit nveliurilor sporale groase, greu penetr abile pentru colorani (n special cortexul) i datorit coninutului lor chimic particular. Se coloreaz prin tehnici speciale. Poziia sporului n celul poate fi terminal, subterminal sau central. n funcie de dimensiunile fa de diametrul celulei vegetative, sporii sunt deformani (diametrul lor este mai mare dect al celulei) i nedeformani (diametrul lor este mai mic dect al celulei). Intr-o celul bacterian sporulant, sporii sunt unici, cu rare excepii: n sol apar bacterii bisporulate, iar n intestinul unor vertebrate acvatice, bacterii polisporulate. Semnificaia sporilor multipli nu este clar. Se pare c ei apar ca rezultat al perturbrii mecanismului de separare a celulelor dup diviziune. Sporii multipli apar n celulele n care materialul nuclear s-a replicat, dar nu s-a format septul de diviziune. Sporogeneza este declanat n mod obinuit de lipsa unui nutrient esenial n mediu, sursa de azot sau de carbon. Procesul este foarte complex din punct de vedere genetic, biochimic, str uctural i funcional. Sporularea implic activarea unui numr mare de gene sporale (peste 50) inactive n celula vegetativ, n timp ce sunt represate genele active n celula vegetativ. Sub aspect biochimic, sporularea este nsoit de modificri majore ale componentelor moleculare i structurale. Se sintetizeaz proteazele care mresc turnover-ul proteic, furniznd aminoacizii necesari sintezei proteinelor noi. Din punct de vedere funcional, celula sporal dobndete o rezisten deosebit la factorii fizici i chimici. Din punct de vedere structural, la nivel electrono-optic, sporularea la B. subtilis parcurge 7 stadii, n cursul crora celula sporal se formeaz i se elibereaz. Sporularea este precedat de replicarea materialului nuclear. Ulterior, cei doi cromosomi fuzioneaz, formnd o structur axial alungit unic. Nucleoidul axial diploid segreg n dou structuri cromosomale: una migreaz spre polul sporal i va deveni nucleoidul sporului, iar cealalt rmne n celula vegetativ. Formarea septului sporal este iniiat prin apariia a dou mici protuberane simetrice ale peretelui, spre interiorul celulei. Membrana citoplasmatic mbrac aceste excrescene, se invagineaz i formeaz membrana presporului. Cele dou intruzii ale membranei se nchid ca o diafragm, de la exterior spre interior. Membrana presporului este dubl i delimiteaz componentele celulare ale viitorului spor. Formarea sa este complet la 5 ore dup iniiere. n stadiile ulterioare, din materialul care se depune ntre cele dou membrane ale presporului se definitiveaz morfogeneza cortexului, format din trei lamele: lama intern (profund), care va deveni peretele sporului, iar dup germinare, peretele viitoarei celule; lama intermediar sau cortexul propriu-zis, cu grosime variabila i lama extern. S-au izolat mutante bacteriene care blocheaz sporogeneza n diferite etape.

26

Structura intern a endosporului La diferite grupe de bacterii exist variaii importante ale structurii sporului, n special n privina nveliurilor, care difer prin numrul i grosimea lor. Exist de asemenea variaii cu privire la relaia sporului cu celula vegetativ n care s-a format: sporul rmne inclus n celul sau se elibereaz curnd dup formare, prin liza acesteia. Sporul este alctuit din protoplastul sporal, care conine sporoplasma i materialul nuclear. Protoplastul sporal este acoperit de urmtoarele structuri: - un perete intern subire, originar din membrana intern a presporului. Dup germinare, acesta va forma peretele celulei vegetative; - cortexul sporal, cu grosime variabil, electronodens. Este o structur multilaminar ce se formeaz pe feele adiacente ale celor dou membrane ale presporului; - stratul extern al cortexului, derivat din membrana extern a presporului; - nveliul sporal intern (intina), un strat dens, de natur proteic; - nveliul sporal extern (exina). Uneori, aceste dou nveliuri sunt pluristratificate; - exosporul, un rest al celulei vegetative, uneori adiacent de celelalte nveliuri sporale, prin intermediul filamentelor suspensoare (fig. 16).

Figura 16. Imagine electrono-optic a seciunii transversale prin sporul n curs de formare la B. megatherium. Componenta structural electronodens, delimitant a protoplastului, este cortexul sporal (x 120000, original).

La unele categorii de spori se gsesc structuri suplimentare denumite apendice sporale. Semnificaia lor funcionala nu este cert, dar ar putea fi implicate n dispersarea sporilor n natur sau ar facilita absorbia substanelor nutritive n perioada premergatoare germinrii sporului. Particularitile biochimice ale sporului Schimbarea specificitii ARN-polimerazei este foarte important pentru controlul sporulrii la B. subtilis. Cnd ncepe sporularea, multe gene active n celula vegetativ sunt represate i sunt activate genele specifice. Fiecare stadiu al sporulrii este marcat de schimbarea expresiei unor gene, mediat de factorul sigma, care schimb specificitatea legrii ARN-polimerazei de promotor. Protoplastul sporal conine toate categoriile de molecule necesare relurii creterii: materialul nuclear i cantiti mici ale fiecrui component al aparatului de sintez proteic (ribosomi, ARNt, enzime). Lipsesc componentele celulare instabile (ARNm i nucleozid-trifosfaii), dar exist precursorii lor mai stabili (nucleozid mono- i difosfai). Aminoacizii i enzimele lor de biosintez sunt virtual absente, dar la germinare, ambele tipuri vor fi generate prin hidroliza proteinelor de depozit, solubile, cu molecul mic. Puine enzime sporale deriv din enzimele celulei vegetative prin clivare. Majoritatea enzimelor sporale sunt noi. Sinteza lor este codificat de gene activate n timpul sporulrii. Toate enzimele sporale sunt termorezistente, fapt explicabil prin dimensiunile lor mici, fiind reprezentate numai de situsul activ al moleculei respective. Lipsesc enzimele fundamentale ale metabolismului celular, ca i sistemele transportoare de electroni. La cele mai multe bacterii, ionii de Ca2+ lipsesc. In stadiile timpurii ale sporulrii apar sistemele de transport activ pentru Ca. Ionii de Ca sunt legai cu o cantitate echivalent de acid dipicolinic (se formeaz din

27

acidul diaminopimelic un precursor al peptidoglicanului) i formeaz dipicolinatul, care poate constitui circa l5% din greutatea uscat a sporului. S-a considerat c sporul este rezultatul unui proces de deshidratare profund. Cercetrile ulterioare au evideniat c deosebirile dintre spor i celula vegetativ nu sunt de ordin cantitativ, ci de ordin calitativ i se datoreaz strii apei (Gould, 1969). In celula vegetativ, apa liber reprezint 70% din cantitatea total, iar n spor oscileaz ntre 3 - l0%, restul de 90 - 97% fiind apa legat. Din aceast cauz, sporul este lipsit de metabolism, sau are un metabolism de intensitate foarte mic, nedecelabil. Celula sporal este vie, dar procesele vieii sunt latente. Fenomenul se numete criptobioz (via ascuns). Consecina particularitilor de compoziie chimic, la care se adaug nveliurile groase multiple i pluristratificate, este rezistena deosebit a sporului la caldur, la aciunea substanelor chimice (antiseptice, dezinfectante) i a radiaiilor. Rezistena termic este conferit de dipicolinatul de Ca. Mutaiile care reduc cantitatea de dipicolinat scade rezistena sporului la agentul termic. Rezistena termic a sporului impune o metodologie costisitoare de sterilizare, la temperaturi foarte ridicate. Uneori, sporii rezist la temperatura de l800 C, de la cteva minute, la cteva ore. De aceea s-a renunat la metoda sterilizrii obiectelor prin fierbere, deoarece tratamentul omoar numai formele vegetative, iar sporii rmn viabili. Germinarea este procesul de conversie a sporului n celul vegetativ i decurge n trei stadii: - activarea sporului prin deshidratare, asociat cu mrirea volumului; - germinarea, adic modificarea localizat prin gelificare a nveliurilor sporale; - emergena celulei vegetative din nveliuri, delimitat de un perete derivat din peretele sporal intern. Intr-un mediu nutritiv optim, germinarea este rapid: de la iniiere pn la diviziunea celular, procesul dureaz 90 de minute. In medii favorabile, majoritatea sporilor germineaz, dar o proporie mic rmn n stare dormind. Pentru iniierea germinrii, sporii necesit un factor suplimentar: factorul termic, un compus cu grupri SH, pH acid. Dup circa o or de la nceputul activrii ncepe sinteza ADN.

1.7. Glicocalixul
Glicocalixul este reprezentat de totalitatea structurilor polizaharidice extraparietale: capsula, cu diferite grade de dezvoltare i glicocalixul comportamental. Capsula este o structur accesorie, cu o consisten gelatinoas, vscoas, care acoper complet celula bacterian. n funcie de gradul de dezvoltare la diferite specii bacteriene se disting urmtoarele structuri capsulare: - microcapsula, reprezrentat de o pelicul fin de material polizaharidic, n jurul peretelui celular (pn la 0,2 Q m grosime). La microscopul optic se evideniaz numai prin metoda imunofluorescenei, dar este vizibil la microscopul electronic; - macrocapsula, o structur omogen, aderent de celul, mai groas de 0,2 Q m, vizibil la microscopul optic prin tehnici speciale de colorare negativ, dac este o capsul suficient de compact i rigid, pentru a exclude tuul de India i nigrozina. Dac are o structur lax i flexibil, coloranii o penetreaz. Aderena macrocapsulei de celul este ferm i prin centrifugare se depune concomitent cu celulele; - stratul mucos este o structur capsular cu o grosime neuniform i distribuie dezordonat n jurul celulei. Consistena este mai fluid, prin centrifugare, celulele se desprind i se depun, iar materialul polizaharidic ramne n suspensie; - zoogleea, o mas de material polizaharidic, n care sunt cuprinse un numar mare de celule bacteriene. Materialul capsular se gsete la bacteriile Gram pozitive i Gram negative (fig. 17) din sol, ape (dulci i srate), rumen, la bacteriile patogene ce produc infecii ale vezicii urinare i pulmonare.

28

Figura 17. Macrocapsula la bacili Gram negativi (imagine la microscopul optic, x 1000, original).

Natura chimic a materialului capsular Materialul capsular este de natur polizaharidic. De cele mai multe ori, n alctuirea sa se gsesc Dglucoza, D-fructoza, D-galactoza. Mai rare sunt manoza, fucoza, pentozele. Unele polizaharide extracelulare se aseamn cu acizii teichoici deoarece conin glicerol-fosfat sau ribitol-fosfat. Materialul capsular poate fi un homopolizaharid sau un heteropolizaharid. Cele mai cunoscute homopolizaharide sunt dextranii si levanii. Dextranii formeaz o clas mare de polizaharide, alctuii din uniti de D-glucopiranozil, legate l-6, cu puni de ramificare n pozitiile 2, 3 sau 4. Lungimea lanului este cuprins ntre 40 - 500 resturi de glucoz. Dextranii sunt produi de Peptococcus (Leuconostoc) mesenteroides, din sucroz. Sinteza lor este abundent n melasa de la fabricile de zahr, unde o cantitate semnificativ de zahr este convertit la dextran, aducnd prejudicii economice importante. In stare purificat, dextranul se folosete n practica transfuziilor, ca nlocuitor al plasmei, fiind solubil n ap. Sephadexul este un dextran folosit n tehnicile cromatografice bazate pe principiul sitei moleculare i cromatografia de schimb ionic. Levanii sunt poli-D-fructani (fructozizi), sintetizai de unele bacterii patogene pentru plante (Pseudomonas, Xanthomonas), de Streptococcus (Str.) salivarius, de Bacillus. Au greuti moleculare de l000 kDa sau mai mult (Black, 1996). Heteropolizaharidele sunt alctuite dintr-un numr variat de uniti diferite: glucoz, fructoz, galactoz, manoz, acid galacturonic, derivai aminai i acetilai ai acestora. Structura biochimic a heteropolizaharidelor este foarte diferit nu numai n funcie de compoziia chimic global, ci i de secvena diferiilor monomeri n catena polizaharidic (de exemplu, pentru xantan, structura repetitiv este un pentazaharid). Diversitatea monomerilor glucidici confer heteropolizaharidelor o anumit heteroge nitate a structurii chimice i n consecin, o anumit specificitate antigenic. De exemplu, la Str. pneumoniae exist peste 80 de tipuri chimice diferite de material capsular, care corespund nu numai unor diferene de compoziie chimic, ct i de secven a monomerilor. Varianta antigenic a polizaharidului capsular imprim specificitatea anticorpilor n reaciile de aprare fa de bacteriile patogene. Capsula este o structur inert, accesorie ce nu face parte integrant din celula bacterian. Cel mai adesea nu ndeplinete o funcie esenial pentru celul. Bacteriile patogene capsulate sunt virulente, deoarece capsula este un material chimiotactic negativ pentru fagocite. Pe mediul solidificat, ele produc colonii netede (S, Smooth). Mutantele lor necapsulate care produc colonii rugoase (R, Rough) sunt mult mai puin virulente. Materialul capsular este higroscopic (reine apa) i astfel protejeaz celula de efectul duntor al uscciunii. Materialul capsular ar putea avea rolul de depozit al unor nutrieni din mediu. Glicocalixul comportamental La anumite bacterii structurile superficiale sunt acoperite de un glicocalix adevrat, constituit dintr-o reea de filamente polizaharidice i glicoproteice, legate de lipopolizaharidele membranei externe la bacteriile Gram negative sau de mureina bacteriilor Gram pozitive. Filamentele formeaz o structur pericelular dezordonat, ca o psl, prin intermediul creia celula se ancoreaz fie pe alte celule, fie pe suporturi inerte. Glicocalixul se gseste numai la bacteriile care triesc n mediile naturale, avnd un caracter adaptativ, adic exist numai n condiiile n care prezena ei confer celulei un avantaj selectiv. Dup cultivare n medii artificiale (bulion, geloza), glicocalixul dispare i din aceast cauz s-a evidentiat trziu. Deoarece nu persist la celulele cultivate n mediile artificiale, s-a propus denumirea de glicocalix comportamental.

29

Glicocalixul a fost studiat la celulele bacteriene din placa dentar. Placa dentar este un depozit de culoare alb-glbuie, vizibil cu o lup, ce se formeaz pe suprafaa smalului dentar, iniiat de Streptococcus mutans. Celulele sale sintetizeaz un polizaharid glucanic, prin intermediul cruia ader foarte strns de suprafaa smalului, formnd iniial o microcolonie, iar ulterior, o colonie. Celulele ader ntre ele, dar i de smalul dentar, prin glicocalix. Dup impregnare cu sruri i glicoproteine salivare se creeaz un micromediu anaerob, n care bacteriile elimin produsele de catabolism. Micromediul coloniei se acidific i se creeaz condiiile favorabile degradrii smalului. Astfel se initiaz formarea cariei. n mediile naturale, celulele bacteriene lipsite de structura capsular se ancoreaz de suport prin intermediul glicocalixului. Legarea celulelor de suport este prima etap a procesului de colonizare. Astfel se iniiaz formarea coloniei bacteriene, glicocalixul fiind structura care mediaz asocierile bacteriene polispecifice. Astfel s-a demonstrat c n rumen, asocierile coloniale conin celule ce aparin unor specii diferite (colonii polibacteriene). Intre ele se stabilesc relaii metabolice sinergice, prin care bacteriile realizeaz activiti metabolice, pe care speciile separate nu le pot desfura. De exemplu, n rumen se produce CH4: unele bacterii produc H2, altele CO2, iar bacteriile metanogene reduc CO2 , utiliznd H2 ca surs reductoare. Majoritatea microorganismelor din mediile acvatice nu se gsesc ca organisme libere plutitoare, ci triesc ataate de suprafee, inclusiv la suprafaa apei, unde formeaz un biofilm. Asociaiile naturale de bacterii, n matricea unui biofilm funcioneaz ca un consoriu cooperant. Biofilmele reprezint sisteme biologice cu un nivel nalt de organizare, n care comunitile de bacterii sunt coordonate funcional. Capacitatea lor de a persista n ntreaga biosfer se datoreaz versatilitii lor metabolice i plasticitii fenotipice. Un element esenial al adaptabilitii este capacitatea lor de a-i alege poziia ntr-o ni n care se propag. Cel mai comun mecanism de poziionare este mobilitatea flagelar i diferitele modaliti de translocaie pe suprafee: rsucire, alunecare, nclinare, roire. Unele specii i modific poziia prin sinteza polizaharidelor, formnd o pelicul ce plaseaz celulele la interfaa aer-ap. Un alt mecanism de alegere a poziiei este agregarea sau ataarea, prin intermediul creia se amplific interaciunile celulare. Prin ataare, bacteriile nu numai c i fixeaz poziia pe o suprafa, dar formeaz comuniti i dobndesc avantajul versatilitii fenotipice. Biofilmele au rol n epurarea apelor uzate, n epurarea apelor de suprafa contaminate cu produse petroliere. Biofilmele se formeaz chiar n condiii extreme, ca de exemplu n apele acide (pH = 0) de drenaj al minelor, unde contribuie la circuitul sulfului. Cianobacteriile formeaz biofilme n izvoarele termale i pe suprafaa gheii din Antarctica. Alt tip de comunitate n biofilm este ansamblul bacteriilor asociate cu particulele suspendate, de materie organic sau anorganic. Aceste particule macroscopice formeaz zpada marin i sunt bogate n biomasa microbian i nutrieni, avnd rol n n circuitul carbonului organic particulat n mediul pelagic (pelagos = mare, zona de larg a apelor marine). Pentru bacteriile patogene, glicocalixul este structura prin care celulele se ancoreaz de celulele mucoaselor i iniiaz procesul infecios. De exemplu, Neisseria gonorrhoeae se leag de celulele uretrale i vaginale prin filamentele glicocalixului. Uneori, legarea mediat de glicocalix are caracter de specificitate pentru un anumit tip de celule (bacteriile care iniiaz procese patologice intestinale se leag uneori exclusiv de epiteliul intestinal). Glicocalixul capsular i cel comportamental sunt structuri foarte variabile din punct de vedere fenotipic, avnd grade foarte diferite de dezvoltare la aceiai tulpin bacterian, n diferite condiii de mediu. Dei sinteza reprezint o cheltuial semnificativ de energie, rolul lor funcional n mediile naturale justific existena structurilor polizaharidice. Glicocalixul dispare la celulele cultivate n medii artificiale. Pe medii nutritive bogate, existena acestor structuri nu mai este necesar, dar reapar prin transferul celulelor n medii naturale nefavorabile. Reunirea tuturor structurilor polizaharidice extraparietale, indiferent de gradul de dezvoltare sub denumirea de glicocalix a fost propus de Costerton (l974). Capsula este cea mai important dintre ele, ca grad de dezvoltare, dar toate structurile polizaharidice ndeplinesc aceiai funcie esenial aderena celulei de substrat. Gradul diferit de dezvoltare, de la glicocalix la macrocapsul, implic o diversificare corespunztoare a funciilor acestor structuri. Prin gradul foarte diferit de dezvoltare n raport cu condiiile de mediu, structurile polizaharidice extraparietale sunt expresia autentic a plasticitii fenotipice structurale a bacteriilor. Teoria plasticitii fenotipice consider c, bacteriile rspund modificrilor mediului de via, prin schimbri structurale i funcionale (metabolice) profunde, n contextul activitii aceluiai set de gene. Plasticitatea fenotipic a bacteriilor permite adaptarea rapid la schimbri majore ale mediului. Bacteriile sunt primele organisme care se adapteaz la condiiile noi de mediu, n timp ce organismele superioare se adapteaz mult mai lent, prin selecia mutantelor. Bacteriile colonizeaz ecosistemele noi i prin mecanismul genetic al seleciei mutantelor. Aceast dubl capacitate adaptativ prin plasticitate fenotipic i prin selecia mutantelor explic uriaul succes al bacteriilor de a popula chiar cele mai ostile medii.

30

1.8. Flagelul
Flagelul (flagellum = bici) este organitul extracelular al mobilitii celulei procariote. Organitul omolog de mobilitate al celulei eucariote este cilul. Flagelii se mai numesc i undulipode (undula = und mic; pus, podos = picior). Flagelul se prezint ca un filament extracelular, filiform, ondulat, cu grosimea uniform pe toat lungimea sa. Lungimea este variabil, de la 4 - 5 Qm pn la 70 Q m, iar diametrul este de 20 nm. Flagelii nu se observ prin examinarea direct a celulelor la microscopul optic. Existena lor se deduce indirect, din mobilitatea celulelor bacteriene. Celulele fr flageli se numesc atrihe. Dup numrul i modul de aezare a flagelilor, bacteriile sunt: - monotrihe (cu un singur flagel); - amfitrihe (cu doi flageli asezai la cei doi poli ai unui bacil); - lofotrihe (au numeroi flageli grupai ntr-un smoc); - peritrihe (celule cu numeroi flageli, distribuii pe toat circumferina celulei). Poziia flagelului (sau flagelilor) poate fi polar, subpolar sau ecuatorial. Comparativ cu cilul celulei eucariote, flagelul are o structur simpl. Flagelul i are originea n structurile de nveli ale celulei i este alctuit din urmtoarele elemente (fig. 18): - corpusculul bazal, localizat n nveliurile celulare; - crligul; - filamentul extern (flagelul propriu-zis). Corpusculul bazal formeaz o structur rotativ unic, att ca alctuire ct i ca funcionalitate n sistemele biologice, asemntoare, n general, cu un buton de cma. La bacteriile Gram negative, structura sa este mai complex, deoarece discurile componente sunt duble, alctuite din proteine diferite i ndeplinesc funcii diferite. Se disting urmtoarele discuri: - discul M (mobil, se rotete cu vitez mare) i este ancorat n structura membranei citoplasmatice; - discul S (stator) este legat de peptidoglican; - discul P este localizat n spaiul periplasmic; - discul L este legat de lipopolizaharidele membranei externe a peretelui. Aceste discuri sunt aezate pe o structur axial subire. Crligul are rolul de articulaie flexibil ntre corpusculul bazal i filamentul extern. Prin axul su central, crligul se leag de corpusculul bazal. Micarea de rotaie a discului M (3000-4000 r/min) este transmis crligului i filamentului extern.

Figura 18. Reprezentarea schematic a structurii flagelului (dup Todar, 2004).

n alctuirea flagelului intr cel puin 11 tipuri de molecule proteice: cte unul n filamentul extern i crlig i cel puin 9 tipuri de proteine n corpusculul bazal. Cea mai cunoscut este proteina filamentului extern, denumit flagelin i are gr. mol. de 40 kDa. Moleculele sale sunt aezate dup o simetrie helical, formnd o structur tubular, canalicular. Moleculele de flagelin au proprietatea de autoasamblare: dac moleculele de flagelin sunt dispersate, n condiii adecvate, ele se reasambleaz spontan. Flagelina se sintetizeaz sub forma monomerilor, n interiorul celulei. Moleculele strbat axul central al structurii bazale i se aeaz dup o simetrie helical pentru a forma filamentul extern. Flagelul bacterian crete prin regiunea sa apical. Crligul este format din subuniti proteice identice. Funcia sa nu este cunoscut.

31

Corpusculul bazal are o structur molecular mult mai complex. Cele 9 proteine diferite sunt organizate n discurile care nconjur un ax subire, ce se inser n membrana citoplasmatic.

1.9. Fimbriile
Fimbriile sunt structuri de tipul unor apendice filamentoase, rigide i neuniforme ca lungime, care se extind de la suprafaa celulei bacteriene. Termenul de fimbrii a fost introdus de Duguid (1955) (citat de Zarnea, 1983) (fimbria - latin fibra, franjuri), iar n 1959 Brinton (citat de Zarnea 1983, 1995) a folosit termenul de pil (latin, pilus = pr). Apoi s-a sugerat ca termenul de pil s fie folosit pentru structurile filamentoase codificate de plasmidele conjugative, cu rol n procesul de conjugare ce const n transferul unui fragment de ADN de la o celul donor la o celul receptoare. Adeseori, cei doi termeni se folosesc pentru a descrie aceiai stuctur. Fac excepie structurile fimbriale de la Neisseria, pentru care literatura folosete termenul de pil. Fimbriile sunt alctuite din molecule proteice de fimbrilin, cu gr. mol. de 15 - 30 kDa, aezate totdeauna dup o simetrie helical. Numrul lor este de pn la l000/celul. Daca sunt numeroase, au o dispoziie pericelular. Dac sunt puine, au localizare polar sau bipolar. Lungimea lor este foarte variabil (l-20 m), ceea ce sugereaz c au vrste diferite. Fimbriile se observ la microscopul electronic, dup coloraia negativ a celulelor ntregi sau se evideniaz indirect prin capacitatea lor de a aglutina hematiile diferitelor specii de animale i pot fi mprite n 3 categorii structurale: - fimbrii rigide, cu diam. de 5 - 10 nm, cu un lumen de circa 2 nm (la enterobacterii). Regiunea hidrofob este la captul COOH al fimbrilinei; - fimbrii flexibile, cu diam. de de 5 - 6 nm. Se mai numesc fimbrii N-metil-fenilalanin, deoarece la captul N-terminal al fimbrilinei au un rest de fenilalanin metilat. Se gsesc la Ps. aeruginosa, N. gonorrhoeae, N. meningitidis. Regiunea N-terminal este hidrofob; - fimbrii subiri spiralate, cu diametru de 4 nm sau mai puin, fr lumen (K88 , K99, la E. coli). Unele fimbrii au att o regiune rigid, ct i una flexibil. Fimbriile sunt comune la bacteriile Gram negative i mai rare la bacteriile Gram pozitive (Corynebacterium, Actinomyces), dar sunt diferite structural. O bacterie posed cteva tipuri de fimbrii, n funcie de grosime, lungime, specificitatea antigenic (determinat de secvena aminoacizilor n molecula de fimbrilin) i de specificitatea receptorilor glicoproteici ai celulelor epiteliale de care ader. Fimbriile sunt structuri din categoria adezinelor, adic mediaz interaciunea celul-suport. n ceea ce privete capacitatea de legare, cele mai multe adezine fac parte din familia lectinelor. Lectinele sunt glicoproteine obinute din plante care se leag nespecific cu oligozaharide de pe suprafaa celulelor i produc aglutinarea acestora. Ele precipit polizaharidele i glicoproteinele sau aglutineaz celulele. Activitatea aglutinant i precipitant poate fi inhibat de haptene (monozaharide i oligozaharide). Cea mai important funcie care li se atribuie ar fi aceea de puni de aderen intercelular sau aderen de suportul inert. La bacteriile din mediile acvatice, fimbriile favorizeaz asocierile dintre celule i astfel se formeaz pelicule fine (filme) de neuston la suprafaa apei, cu rol adaptativ, ce asigur condiii bune de aerare pentru bacteriile aerobe i de luminozitate pentru cele fotosintetizante. Pentru bacteriile patogene, prezena fimbriilor (tulpinile fim+) le confer un grad superior de virulen, deoarece fimbriile ader ferm de receptorii suprafeei celulelor epiteliale ale mucoaselor i ai hematiilor. Receptorii majori pentru fimbriile bacteriene, pe suprafaa celule eucariote sunt glicoproteinele cu manoz. Proteina de aderen localizat pe fimbrii se leag de resturile de manoz ale glicoproteinelor. n funcie de comportamentul n prezena manozei s-au identificat fimbrii manozo-sensibile i manozo-rezistente. La E. coli s-au evideniat fimbrii manozo-sensibile (manoza inhib hemaglutinarea prin competiia cu receptorii suprafeei hematiilor). Fimbriile manozo-rezistente aglutineaz numai eritrocitele tanate. Celulele bacteriene cu astfel de fimbrii ader de celulele endoteliale, de celulele epiteliale ale tractului respirator, urogenital, de membrana bazal a tubilor renali, a capsulei Bowmann. O celul bacterian exprim simultan, fimbrii cu specificiti diferite de legare de suportul celular. Astfel se explic selectivitatea bacter iilor patogene i comensale pentru anumite gazde i esuturi. Elaborarea conceptului adezinelor i a specificitii lor de legare, explic tropismul tisular selectiv al bacteriilor infecioase. Caracterul progresiv ascendent al infeciei urinare, de la vezic spre rinichi, mpotriva fluxului urinar, se explic prin fenomenul de aderen, mediat de fimbrii cu diferite specificiti de legare, de celulele epiteliale. Exprimarea fimbriilor pe suprafaa celulei este adaptativ. Ele favorizeaz aderena celulei bacteriene de substraturi celulare diferite. Fimbrilina este codificat de gene cromosomale, ceea ce denot c fimbriile au o importan ecologic deosebit, prezena lor favoriznd competiia celulei pentru substrat. Dup sintez, fimbrilina este transferat

32

extracelular i depus la baza fimbriei. Orice linie bacterian poate s existe alternativ n varianta fim+ sau fimi s poarte simultan mai multe tipuri de fimbrii. Rata de mutaie a genelor care codific sinteza fimbriilor este foarte mare, astfel nct celulele fim+ trec n varianta fim- i invers, prin retromutaie. Uneori fimbriile sufer fenomenul variaiei de faz i al variaiei antigenice. Variaia de faz nseamn c o structur dat este sau nu este produs. Variaia antigenic semnific faptul c aceiai structur se produce n variante biochimice diferite. Variaia antigenic a fimbriilor bacteriene este rezultatul aciunii mai multor mecanisme. Cel mai simplu este acumularea lent a mutaiilor punctiforme n gena codificatoare. Fenomenul se numete drift antigenic i are loc att la bacteriile patogene ct i la cele nepatogene.

1.10. Pilii
Pilii sunt apendice filamentoase neflagelare, a cror sintez este codificat de gene localizate n structura unor plasmide denumite conjugoni sau plasmide sex. Celulele purttoare de pili au capacitatea potenial de a dona material genetic (sunt celule mascul). Numrul pililor pentru o celul este cuprins ntre 1 i l0, iar lungimea este de circa 20 m. Diametrul extern este de 6 - l5 nm, iar cel intern de 2,5 nm. Pilii sunt alctuii din molecule identice de pilin, o fosfoglicoprotein de l2 - l5 kDa. Se sintetizeaz n celul, de unde este transferat n lumenul piliar i este asamblat dup o simetrie helical, la extremitatea liber a acestuia. Pilii pot fi ndeprtai mecanic, prin agitare i se resintetizeaz. Prin nclzire sau tratament acid, pilii se dezagreg n moleculele componente (pilina). Restabilirea neutralitii i a nivelului termic permite autoasamblarea i formarea unei structuri identice cu pilul original (Davis i colab., 1990). Prezena pililor este asociat totdeauna cu procesul de conjugare bacterian (fig. 19). Pilii ar putea fi structuri eseniale de transfer al materialului genetic de la celula donor la celula receptor. Molecula de ADN ar trece prin lumenul pilului. Dup ali autori, pilii ar avea numai rolul de a aga celula receptoare de material genetic, iar prin retracia sa ulterioar, cele dou celule s-ar apropia.

Figura 19. Structurile piliare par s medieze conjugarea bacterian (x 150 000, dupa Todar, 2004).

Rolul pililor n conjugare este argumentat de faptul c depilierea (prin agitare cu perle de sticl) este nsoit de pierderea capacitii de conjugare i de restabilire a ei odat cu resinteza pililor. Capacitatea de sintez a pilinei se pierde odat cu pierderea plasmidei de sex i este redobndit odat cu rectigarea plasmidei. Pilii poart receptori de fagi. Pe suprafaa pililor se gsesc receptori pentru fagii ARN masculi. Se numesc fagi masculi deoarece infecteaz numai celulele cu potenialitate de donor de material genetic. Marcajul cu fagii ARN mascul este modalitatea de a-i distinge de alte structuri filamentoase. La extremitatea liber a pililor se gsesc receptori pentru fagii filamentoi. Celulele purttoare de pili au capacitatea potenial de a dona material genetic (sunt celule mascul). Numrul pililor pentru o celul este cuprins ntre 1 i l0, iar lungimea este de circa 20 m. Diametrul extern este de 6 - l5 nm, iar cel intern de 2,5 nm.

33

Bibliografie selectiv
1. Alberts B., Bray D., Lewis J., Molecular biology of the cell, 3rd Edition, Garland Publishing. 1994. 2. Beveridge T.J., Davies J.A., Cellular responses of Bacillus subtilis and Escherichia coli to the Gram stain - Journal of Bacteriology, 1983, p. 156. 3. Black J. G., Microbiology - Principles and Applications, 3rd Edition, Prentice Hall, Upper Sadle River, 1996. 4. Brock, T., Milestones in Microbiology: 1546 to 1940. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1998 5. Brock T., Biology of microorganisms, 9th Ed. Madigan M. T., Martinko J. M (eds) Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 2000. 6. Brock T., Biology of microorganisms, 11th Ed. Madigan M. T., Martinko J. M (eds) Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 2005. 7. Costerton J.W., Ingram J.M., Cheng K.J., Structure and function of the cell envelope of gram-negative bacteria- Bacteriology Reviews, 1974, p.38 - 87. 8. Davis B., Dulbecco R., Eissen H., Microbiology , 4th Edition, New York Lippincott, 1990. 9. Ghuysen J-M., Hakenbeck R., Bacterial cell wall , Elsevier, 1994. 10. Gould G.W., Hurst A. (eds) , The Bacterial Spore , Academic Press, San Diego, 1969. 11. Lehninger A. L. , Biochimie - vol. 1, traducere din limba engleza editia a doua, Editura Tehnica, Bucuresti, 1987. 12. Jawetz E., Melnick J.L., Adelberg E.A., Medical Microbiology , Appleton & Lange, East Norwalk, CT. 1989. 13. Pettijohn DE, Hecht R. RNA molecules bound to the folded bacterial genome stabilize DNA folds and segregate domains of supercoiling. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1974; 38:3141 14. Pettijohn, D. E., and R. R. Sinden. Structure of the isolated nucleoid, p. 199227. In N. Nanninga (ed.), Molecular cytology of Escherichia coli. Academic Press, London, England. 1985 15. Ryter A, Chang A. Localization of transcribing genes in the bacterial cell by means of high resolution autoradiography. J Mol Biol. 1975 Nov 15; 98 (4): 797810. 16. Rogers H.J. - Bacterial Cell Structure - American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1983. 17. Seifert H.S., So M. - Genetic mechanisms of bacterial antigenic variation - Microbiological Reviews, 1988, p. 52. 18. Todar's Online Textbook of Bacteriology, Kenneth Todar, University of Wisconsin, http://www.textbookofbacteriology.net/ 19. Wright A., Tipper D.J. - The outer membrane of gram-negative bacteria, In Sokatch JR, Ornston LN (eds): The bacteria. Vol. 7. Academic Press, San Diego. 1979, p:427. 20. Rietschel, E., S. Hase, Ming-Tzan King, John Redmond and Volker Lehman, 1977 Chemical Structure of Lipid A - Microbiology, 1977, Ed. D. Schlessinger 21. Zarnea G. - Tratat de Microbiologie generala - volumele I, II, III, V. 1983-1994.

34

Capitolul 2 ANTISEPTICE SI DEZINFECTANTE

Substanele chimice din compoziia unui mediu de cretere a microorganismelor pot exercita, n funcie de natura i concentraia lor, trei tipuri de efecte asupra acestora: - un efect favorizant asupra dezvoltrii i multiplicrii celulare, prin aportul substanelor nutritive i realizarea echilibrelor fizico-chimice necesare; - un efect microbiostatic, prin blocarea potenial reversibil a proceselor de multiplicare celular, determinnd inhibiia procesului de multiplicare, dar bacteriile rmn viabile i i reiau creterea i multiplicarea dup ce sunt transferate pe medii adecvate; - un efect microbicid, prin alterarea profund i ireversibil a unor procese metabolice eseniale. Particularitile fiziologice ale microorganismelor influeneaz aciunea substanelor chimice. De exemplu, CO2 i H2S sunt toxice pentru majoritatea microorganismelor aerobe, al cror metabolism respirator l inhib, dar pentru unele specii bacteriene aceste substane reprezint o surs de energie. Una i aceeai substan poate aciona n moduri diametral opuse, n funcie de concentraia ei: n concentraie de 1%, zaharoza este o bun surs de carbon i energie, iar la concentraia de 40% are efect bacteriostatic. Substanele folosite n metabolismul microorganismelor au rolul de surse de carbon, de azot i de energie sau acioneaz ca factori de cretere. La concentraii foarte mici ale unei substane nutritive n mediu, creterea bacterian este foarte slab, dar se intensific odat cu creterea concentraiei substanei nutr itive, pn cnd aceasta atinge un nivel prag, dup care, rata de cretere a populaiei celulare devine constant, independent de concentraia substanei nutritive. Cnd concentraia substanei atinge limita de toleran pentru celul, se produce inhibiia creterii celulare, iar dincolo de aceast limit, substana nutritiv poate avea un efect bactericid. Unele substane exercit efecte de chimiotaxie sau chimiotropism pozitiv, fiind atractante pentru microorganisme, n timp ce altele exercit un chimiotactism negativ asupra celulelor, efectul lor fiind repelent. Efectele duntoare ale unor compui chimici pot fi de tip microbiostatic, alteori, compuii chimici au efect microbicid, adic determin moartea microorganismelor expuse. mprirea substanelor chimice n microbiostatice i microbicide este arbitrar, deoarece o substan poate fi microbiostatic la concentraie mic sau cnd aciunea ei este de scurt durat, dar poate fi microbicid la concentraie mare sau dup aciunea prelungit a unei concentraii mici. Caracterul bacteriostatic sau bactericid este dependent de concentraia la care se manifest un anumit efect i timpul de aciune pentru producerea efectului. O substan este microbicid (bactericid, fungicid) dac efectul ei se produce ntr-un interval scurt de timp i se manifest la concentraii foarte mici i este microbiostatic, dac efectul ei rmne ca atare i la concentraii relativ mari de substan activ, iar rata efectului microbicid este foarte sczut, astfel nct cel puin o parte din celule pot supravieui timp foarte ndelungat. n practic, n afara celor doi termeni se folosesc denumirile de antiseptice (AS) i dezinfectante (DF) (Redish, 1959). Antisepticele sunt substane chimice care, aplicate pe esuturile vii impiedic creterea i multiplicarea microorganismelor existente. Sunt relativ netoxice i pot fi aplicate pe esuturi umane i animale. Termenul de dezinfectant este restrns la substanele cu efect microbicid rapid, la concentraii mici. Ele se aplic pe obiecte neanimate, n scopul distrugerii microorganismelor contaminante. Cele mai multe substane dezinfectante sunt toxice i nu pot fi administrate la om i la animale. Antisepticele i dezinfectantele cuprind o larg varietate de ageni chimici (tabelul 1 ) i poart denumirea generic de biocide. Biocidele, n general, au un spectru mai larg de aciune dect antibioticele i spre deosebire de acestea, care au inte intracelulare specifice, biocidele au inte multiple. Majoritatea substanelor dezinfectante acioneaz fie prin dizolvarea lipidelor din membrana citoplasmatic (detergeni, solveni lipidici), fie prin modificri ale proteinelor, acizilor nucleici etc. Unele biocide se folosesc pentru conservarea unor produse biologice (farmaceutice, alimentare). Conservarea semnific prevenirea multiplicrii microorganismelor. Altele se folosesc pentru curire, care semnific ndeprtarea unui material strin de pe o suprafa.

36

Compui chimici Alcooli

Tabelul 1. Structurile chimice i utilizrile biocidelor antiseptice i dezinfectante (dup Topley i Wilsons, 1998). Reprezentani Formula chimic Aciune Etanol Izopropanol CH3 CH2OH Antiseptic Dezinfectant, agent de conservare Dezinfectant O=C - CH2CH2CH2 C=O Formaldehida H2C O Agent de sterilizare, agent de conservare Antiseptic

Aldehide

Glutaraldehida

Anilide

Structura general Triclorcarban

C6H5 -NH-COR

Biguanide

Clorhexidina

Antiseptic

Alexidina Biguanide polimerice

Dezinfectant, agent de conservare, agent antiplac

Bifenoli

Triclosan

Antiseptic, agent antiplac

Hexaclorofen

Odorizant, agent de conservare

Diamidine

Propamidina Dibromopropamidina Compui cu Cl Compui cu I OCl-, HOCl, Cl 2 I2

Antiseptic Agent de conservare Dezinfectant Antiseptic Agent de curire Antiseptic, agent de conservare

Compui halogenai Halofenoli

Cloroxilenol (PCMX)

36

Compui metalici Peroxizi

Compui cu Ag Compui cu Hg Peroxid de H Ozon Acid peracetic

Ag Hg H2 O2 O3 CH3COOOH

Agent antiseptic de conservare Dezinfectant Dezinfectant Agent sterilizare Agent sterilizare de de

Fenoli crezoli

Fenol

Dezinfectant

Cresol

Agent de conservare

Sruri cuaternare de amoniu

Structura general
R1 N R
2

Dezinfectant Antiseptic

R3 XR
4

Cetrimid Clorura benzalkonium

de

Agent de conservare, agent de curire

Faza vapori

de

Etilenoxid
H2C

O CH2

Agent sterilizare H2CO H2 O2

de

Formaldehida Peroxidul de H

Dezinfectant Dezinfectant

Metodele de studiu privind mecanismele de aciune ale AS i DF sunt: - studiul dinamicii nglobrii; - determinarea efectelor litice sau de pierdere a constituienilor celulari; - studiul efectelor asupra modelului membranar; - detectarea inhibiiei activitii enzimelor; - studiul efectelor asupra proceselor de biosintez macromolecular; - examinarea microscopic a celulelor expuse aciunii biocidelor. Efectele nocive ale substanelor antibacteriene se exercit pe mai multe ci: - prin modificri de permeabilitate la nivelul peretelui celular i membranei citoplasmatice; - prin denaturarea unor constitueni celulari eseniali (proteinele); - prin blocarea gruprilor funcionale active ale enzimelor i interferena cu metabolismul productor de energie; - inhibiia competitiv prin analogie steric, a reaciilor de biosintez. Uneori, aceiai substan i poate exercita aciunea, pe una sau pe mai multe ci, dar una dintre acestea reprezint calea principal de aciune. Oricare ar fi tipul de celul microbian, aciunea substanelor

37

antimicrobiene se desfoar dup o secven comun de evenimente. Interaciunea cu suprafaa celulei poate modifica semnificativ viabilitatea (de exemplu, glutaraldehida), dar cei mai muli ageni antimicrobieni sunt activi dup ce ptrund n celul. Mecanismele aciunii AS i DF asupra protozoarelor nu au fost investigate, datorit dificultii cultivrii unor protozoare n condiii de laborator (de exemplu, Criptosporidium). Diferitele stadii ale ciclului de dezvoltare (de exemplu, trofozoiii i chitii) ilustreaz modul n care schimbrile fiziologice i citologice influeneaz rspunsul la antiseptice i dezinfectani. AS i DF se folosesc pe scar larg n spitale i n alte locaii, pentru aplicaii locale i pentru dezinfectarea suprafeelor expuse. Ele constituie o parte esenial a practicilor de control al infeciilor i contribuie la prevenirea infeciilor nosocomiale.

2.1. Substane antibacteriene active prin modificri de permeabilitate

Substanele din aceast categorie (spunurile, detergenii) produc modificri fizico-chimice, care duc la pierderea permeabilitii selective a membranelor celulare, astfel nct membrana citoplasmatic nu mai reine n interiorul celulei, moleculele utile (aminoacizi, nucleotide, coenzime, ioni) i nici nu poate opri ptrunderea din exterior a unor substane nocive. Spunurile i datoresc efectul antimicrobian, aciunii acizilor grai nesaturai (oleic, linoleic, linolenic) din compoziia lor. Aciunea lor se exercit asupra constituienilor lipidici ai membranelor celulare, care astfel devin mai permeabile (Jungerman, 1996). Datorit capacitii lor emulsionante, spunurile determin, prin splare, o reducere masiv a numrului microorganismelor pe suprafaa tegumentului. Detergenii sunt compui organici tensioactivi, obinui prin sintez chimic, din materii prime derivate din petrol. Molecula lor este asemntoare aceleia a spunurilor, dar au proprieti fizice i chimice superioare (Paulson, 1997). Molecula agenilor tensioactivi este asimetric: conine o regiune hidrofil i una hidrofob (lipofil sau liposolubil). Molecula detergenilor se leag att de ap, ct i de moleculele organice nepolare. Molecula amfipatic a detergenilor se orienteaz cu captul hidrofob, spre materialul organic, iar cu captul hidrofil, spre ap. Efectul detergenilor este udarea, desorbia, emulsionarea, suspensionarea i stabilizarea particulelor dizlocate de pe o suprafa (fig. 20). Rezultatul este detergena (sau curirea). La contactul cu o suprafa lipidic sau cu interfaa ulei-ap, moleculele detergentului se adsorb pe aceast suprafa, prin gruprile lor hidrofobe, iar cele hidrofile rmn n ap.

Figura 20. Molecula de detergent se orienteaz cu gruparea hidrofob spre materialul organic (original).

Astfel orientate, moleculele detergentului formeaz un strat (o soluie) de continuitate ntre cele dou medii insolubile (lipide-ap), ceea ce determin efectul de udare, ca rezultat al scderii tensiunii superficiale. Pe baza sarcinii sau absenei ionizrii gruprii hidrofile, detergenii sunt de patru tipuri: cationici, anionici, neionici i amfoterici. Cei neionici nu au caliti dezinfectante, iar uneori pot chiar s favorizeze creterea bacteriilor i fungilor.

38

Monoglicerida acidului stearic (detergent neionic)

Lauratul de sodiu (detergent anionic)

Detergenii anionici sunt sruri de Na i K ale acizilor grai superiori. Au efect bactericid sczut, deoarece prin disociere elibereaz un anion organic, cu toxicitate redus, respins de sarcina net negativ a suprafeei bacteriene. Sunt mai eficieni fa de bacteriile Gram negative (Zneiden, 1998). Detergenii cationici (Cetavlon, Cetazol, Bromocet) sunt sruri quaternare de amoniu, care conin patru grupri organice legate de un atom de azot.

Structura molecular a clorurii de cetilpiridinium (detergent cationic)

Prin disociere, detergenii cationici elibereaz un cation organic toxic. Compuii amoniului quaternar acioneaz asupra structurii membranei, pe care o dezorganizeaz. Bacteriile i pierd sarcina electronegativ, prin adsorbia ionilor pozitivi. Substanele lipidice din peretele celular i cele din membran sunt solubilizate. Numeroi constituieni citoplasmatici prsesc celula, iar substana activ ptrunde n interior i denatureaz proteinele i acizii nucleici. Srurile quaternare de amoniu lizeaz sferoplatii i protoplatii aflai n suspensie n soluie de sucroz. Sunt sporostatici (inhib dezvoltarea celulei vegetative din sporul germinat, dar nu procesul de germinare propriu-zis). Au efect micobacteriostatic, dar nu micobactericid. Compuii amoniului quaternar se folosesc pentru dezinfecia preoperatorie a tegumentului intact, se aplic pe membranele mucoase. Detergenii cationici sunt bactericizi fa de toate categoriile de bacterii, chiar i fa de M. tuberculosis, deoarece dizolv nveliul lipidic al suprafeei lor. Eficiena lor este diminuat de materialele fibroase, de ap, de ionii de Ca2+ i Mg2+. Oxideaz obiectele de metal, dac nu se adaug un agent antioxidant (nitritul). Viabilitatea sporilor nu este afectat. Nu sunt toxici pentru organismul uman i nu irit esuturile. Se folosesc ca antiseptici tegumentari. Aciunea lor este neutralizat de spunuri i fosfolipide. Detergenii neionici (polieteri i esteri poliglicerici) nu au aciune bactericid. Adaugai n mediile nutritive sunt chiar metabolizai de unele microorganisme. Unii dintre ei (Tween 80) sunt folosii ca ageni de dispersare ai celulelor bacteriene, pentru a favoriza creterea i multiplicarea lor. Concentraiile mici de polisorbat (Tween) modific permeabilitatea membranei externe a bacteriilor Gram negative (Zneiden, 1998).

Structura molecular a Tween 80

Agenii amfoterici cumuleaz proprietile de detergent ale compuilor anionici, cu proprietile antimicrobiene ale compuilor cationici. Activitatea lor rmne constant la o variaie larg de pH. Din aceast categorie fac parte compuii din seria Tego.

36

2.2. Substane care acioneaz prin denaturarea proteinelor

Substanele din aceast categorie produc modificri fizico-chimice ale coloizilor citoplasmatici, stopeaz activitatea enzimelor i precipit sau coaguleaz proteinele celulare. Acizii i bazele Cele mai multe bacterii pot fi cultivate n medii al cror pH este cuprins ntre 6 i 9, diferena de concentraie a ionilor de H fiind echivalent cu diferena de la l la 1000. Tolerana la variaia larg a pH se datoreaz faptului c bacteriile sunt puin permeabile pentru ionii de H+ i OH-, ceea ce le permite meninerea neutralitii interne. Aa se explic faptul c, deseori, tocmai acizii slabi i bazele slabe, care se disociaz puin, au un efect antibacterian evident (McDonell, 1999). Efectul lor nu se datoreaz ionilor de H+ sau OH-, ci este legat de prezena unui numr mare de molecule nedisociate, acizi sau baze care pot ptrunde n celul mai uor dect ionii corespunztori. De aceea, activitatea lor antimicrobian este dependent de pH-ul mediului. Aa se explic faptul c ntr-un mediu uor acid, acidul acetic este toxic pentru bacterii, pe cnd HCl are un efect antibacterian slab. La un pH relativ sczut al mediului, acizii slabi, aflai sub forma nedisociat pot ptrunde n celula bacterian i i modific pH, n timp ce acizii tari, intens disociai rmn n afara ei. In mediul neutru sau uor alcalin, moleculele de acid acetic sunt aproape complet ionizate (disociate), ceea ce le ngreuiaz accesul n celul i, ca urmare, toxicitatea lor este anulat. Acelai mod de comportare este caracteristic i bazelor slabe: NH3 este toxic n mediu slab alcalin i inofensiv pentru bacterii, n mediu neutru sau slab acid. Pentru acizii tari, eficiena aciunii antimicrobiene este proporional cu concentraia ionilor de H+ n soluie. HCl este sporicid i se folosete pentru dezinfectarea pieilor de animale, infectate cu B. anthracis. Unele bacterii sunt acidotolerante i chiar acidofile. Lactobacillus sp. se dezvolt la pH 4, iar Thiobacillus thiooxidans, chiar n prezena H2SO4, 0,1 M. Aciunea antimicrobian a acizilor este folosit n practic pentru conservarea alimentelor cu acid acetic 5%, cu srurile acidului propionic (CH3- CH2 - COOH), parahidrobenzoic, benzoic, sorbic sau cu esterii metil, etil, propil, butil, ori prin fermentaie lactic natural. Micobacteriile sunt relativ rezistente la aciunea acizilor i alcolilor, practica obisnuit fiind lichefierea sputei nainte de cultivare, prin expunere pentru 30 de minute, la NaOH 1N sau H2SO4 1N. Acidul boric este un antiseptic de valoare medie. Activitatea antimicrobian a alcalilor tari este dependent de concentraia ionului OH- n soluie. NaOH are proprieti alcaline puternice: la concentraia de 5% omoar celulele vegetative, iar la concentraii mai mari omoar sporii de Bacillus anthracis. Ca(OH)2 rezult din reacia CaO + H2O. Soluia 20% de Ca(OH)2 omoar majoritatea bacteriilor nesporulate. Alcoolii sunt cei mai utilizai ageni chimici pentru dezinfecie. Ei sunt activi prin efectul denaturant asupra proteinelor i prin solubilizarea lipidelor. Produc ruperea membranelor i inactivarea enzimelor. Omoar bacteriile nesporulate, inclusiv pe cele acidorezistente. Inhib sporularea i germinarea sporilor, dar efectul este reversibil. Efectul dezinfectant al alcoolilor crete odat cu lungimea catenei (metilic, et ilic, izopropanol etc), pn la 8 - l0 atomi de C, dup care solubilitatea n ap scade progresiv. Cei mai folosii alcooli sunt CH3OH (metanol), C2 H5OH (etanol) i CH3CHOHCH3 (izopropanol). Ultimul este un bactericid mai eficace, la concentraia de 99%. Etanolul se folosete n soluii apoase. Cele mai eficiente sunt cele cu concentraia de 60 - 70%. Prezena apei este esenial pentru activitatea antimicrobian a etanolului. Concentraiile mai mari de 90% i mai mici de 5% sunt relativ ineficiente ca ageni dezinfectani. Aciunea lor dezinfectant, ca i efectul denaturant asupra proteinelor implic participarea apei. Eficiena aciunii lor scade n prezena materiei organice. Expunerea timp de o or este letal pentru formele vegetative, nu modific viabilitatea sporilor, dar inhib sporularea i germinarea lor. Contactul de scurt durat nu are efect sterilizant, ci numai reducerea populaiei bacteriene. Alcoolii au activitate antibacterian rapid, cu spectru larg fa de formele vegetative (inclusiv micobacterii), antifungic, neutralizeaz infeciozitatea virusurilor (Zneiden, 1998). Pentru c nu omoar sporii, alcoolii nu se folosesc pentru sterilizare, dar se folosesc pentru dezinfectarea suprafeelor i ca antiseptice tegumentare. Alcoolul izopropilic este mai eficient fa de bacterii, iar alcoolul etilic este mai eficient fa de virusuri ( Mihescu, 2000). Fenil-etanolul este activ faa de bacteriile Gram negative i se folosete drept conservant al soluiilor de uz oftalmic. Ali solveni organici (eter, benzen, aceton) omoar bacteriile dar nu sunt ageni dezinfectani. Adugarea ctorva picturi de toluen sau cloroform n soluii apoase inhib dezvoltarea fungilor i bacteriilor. Glicerolul este bacteriostatic la concentraii de peste 50%. Este folosit pentru conservarea vaccinurilor, deoarece nu este iritant pentru esuturi.

37

Fenolul (acidul carbolic) este cel mai vechi dezinfectant cunoscut, fiind utilizat de Lister nc din l867. La concentraii mici este bactericid, deoarece produce denatura rea i chiar precipitarea proteinelor celulare. Este iritant i produce coagularea proteinelor tisulare. Aceleai efecte le produc i derivaii si (crezolul, crezil-acetatul). Agenii antimicrobieni de tip fenolic s-au folosit pentru proprietile antiseptice, dezinfectante sau conservative, n funcie de compus. Adeseori s-au denumit otrvuri protoplasmatice generale (McDonnell, 1999), dar sunt activi i fa de membran. Fenolul induce pierderea progresiv a constituienilor intracelulari, inclusiv eliberarea K+, indiciul major al leziunii membranare. Se consider c fenolul acioneaz la punctul de separare a celulelor fiice pereche. Celulele tinere sunt mai sensibile. Fenolii sunt antifungici i antivirali. Aciunea antifungic se datoreaz lezrii membranei plasmatice i pierderii constituienilor citoplasmatici (McDonell, 1999). Fenolul i crezolii au proprieti analgezice. Se folosesc sub form de spray ca antiseptice i analgezice pe membranele mucoase (ale urechii, nasului, gtului). Sunt foarte stabili la nclzire i uscare i i pstreaz activitatea n prezena materialului organic. Fa de sporii bacterieni au o eficien moderat. n diluie de 5%o, fenolul este folosit ca prezervant pentru diferite preparate biologice. Prin convenie internaional, activitatea fenolului este considerat ca etalon, n raport cu care se apreciaz activitatea antibacterian a diferitelor substane. Fenolii sunt mai activi n amestec cu spunurile, care mresc solubilitatea lor i favorizeaz penetrarea n substrat. Adugarea unui halogen (clor) sau a unui compus organic stimuleaz activitatea microbicid a fenolilor. Difenolii sunt derivaii hidroxi-halogenai a dou grupri fenolice conectate prin diferite legturi. Au spectru larg de eficacitate, sunt sporostatici, dar au activitate sczut fa de Pseudomonas aeruginosa i fungi. Triclosanul i hexaclorofenul sunt cele mai folosite biocide din acest grup: n spunurile antiseptice i n soluiile dezinfectante pentru mini. Ambele au efecte cumulative i persistente asupra tegumentului. Triclosanul are activitate n special fa de bacteriile Gram pozitive. Eficiena fa de bacteriile Gram negative i levuri poate s creasc prin efectul de formulare: de exemplu, n asociaie cu EDTA, determin creterea permeabilitii membranei externe. Efectul primar se produce, probabil, asupra membranei citoplasmatice, deoarece inhib nglobarea nutrienilor, iar concentraiile mari bactericide produc creterea ampl a permeabilitii i eliberarea rapid a componentelor celulare. Hexaclorofenul (difenol-halogenat) este bacteriostatic la diluii foarte mari. In combinaie cu un spun este un dezinfectant eficace al pielii. Dac este absorbit pe cale tegumentar este toxic. Nu are miros iritant, este un bun deodorant, ceea ce explic utilizarea sa ca deodorant comercial i pentru producerea spunurilor, nainte de a fi interzis, datorit neurotoxicitii la copii. Mecanismul de aciune const n inhibiia catenei transportoare de electroni, al crei sediu structural este membrana citoplasmatic, efectul fiind bactericid. Clorhexidenul este probabil cel mai folosit biocid n scopul producerii antisepticelor utilizate pentru curirea minilor, dar i ca dezinfectant i conservant. Este un nlocuitor eficient al hexaclorofenului. Are eficien cu spectru larg. Activitatea antibacterian este dependent de pH i este mult diminuat n prezena materiei organice. Clorhexidenul este un agent bactericid, deoarece traverseaz peretele celular sau membrana extern, prin difuzie pasiv i acioneaz asupra membranei citoplasmatice, perturbnd-i permeabilitatea. Nu este sporicid. Efectul asupra germinrii este minim, dar inhib creterea. Micobacteriile sunt, n general, foarte rezistente la clorhexiden. Alexidina difer chimic de clorhexiden, pentru c are grupri terminale etil-hexil. Are aciune mai rapid bactericid, deoarece altereaz mai rapid permeabilitatea. Esterii alchilai ai acidului hidroxibenzoic sunt conservani ai alimentelor i medicamentelor. Nu sunt toxici, deoarece sunt hidrolizai rapid.

2.3. Substane care acioneaz prin interferen cu gruprile active ale proteinelor-enzime
Unele substane acioneaz direct asupra unor grupri reactive (amino, carboxil, sulfhidril, amido, indol) din structura enzimelor, combinndu-se cu ele i blocnd astfel sau modificnd activitatea enzimatic. In funcie de stabilitatea legturii formate ntre aceste substane i gruprile reactive ale enzimelor, efectul este microbiostatic sau microbicid, iar reacia este reversibil sau ireversibil. Formaldehida (HCHO) i glutaraldehida (OCH(CH2)3CHO) omoar celulele prin denaturarea nespecific a proteinelor i acizilor nucleici i au spectru larg de aciune antimicrobian. Formaldehida (CH2O) este o monoaldehid, foarte reactiv, care interacioneaz cu proteinele, cu ADN i cu ARN. Concentraiile de 25 Qg/ml pot fi bactericide. Ele nlocuie atomii labili de H din gruprile NH2, -OH, -COOH, -SH ale proteinelor i formeaz puni metilenice (R-CH2-R), care leag, n general ireversibil, moleculele proteice i le inactivez. Reaciile formaldehidei sunt, parial, ireversibile. Se folosete n soluie apoas (34 - 38%) sau 20% n alcool metilic 65 - 70% (pentru a ntrzia polimerizarea) sau prin vaporizare la cald, pentru dezinfectarea i sterilizarea suprafeelor uscate. Este bactericid, fungicid,

38

sporicid i inactiveaz virusurile. In concentraie de 4%o este folosit ca prezervant pentru vaccinuri i preparate de diagnostic. Soluiile de formaldehid, apoase sau alcoolice sunt netoxice i neiritante. Ele omoar celulele vegetative n 5 minute, Mycobacterium tuberculosis n l0 minute, sporii n 3 - l2 ore i inactiveaz virusurile n l0 minute (McDonell, 1999). O-ftalaldehida are aciune bactericid i sporicid. Este un compus aromatic cu dou grupri aldehidice. Glutaraldehida are spectru larg de activitate fa de bacterii, spori, fungi i inactiveaz virusurile. Se leag de structurile de suprafa ale celulei, inhib transportul membranar i enzimele periplasmice, inhib sinteza macromoleculelor. Glutaraldehida interacioneaz puternic cu lizina, dar i cu ali aminoacizi. Este mai activ la pH alcalin. Pe msur ce pH extracelular se modific la valori alcaline, suprafaa celulei expune mai multe situsuri reactive i efectul bactericid este mai rapid. Are efect letal asupra micobacteriilor. La concentraii mici inhib germinarea sporului, iar la concentraii mari (2%) este sporicid. Datorit efectului denaturant asupra proteinelor, glutaraldehida se folosete ca fixator n tehnica de preparare a materialului biologic pentru examinarea la microscopul electronic. Etilen-oxidul (CH2-O-CH2) este cel mai folosit gaz sterilizant. Molecula de etilen-oxid nlocuie H din proteine, din acizii nucleici i probabil din alte molecule. Legarea etilen-oxidului se numete alchilare i efectul este blocarea gruprilor reactive ale macromoleculelor. Este solubil n ap i foarte exploziv. Este folosit pentru sterilizarea gazoas a obiectelor termosensibile: echipamente chirurgicale, lenjerie de spital. Are aciune toxic remanent (este vezicant). Ionii unor metale grele (Hg, Ag, Cu, Zn, Fe) sunt toxici pentru microorganisme datorit aciunii lor oligodinamice, adic sunt activi la concentraii foarte mici. Cu, Zn, Fe intr n componena unor enzime i au rolul fiziologic de microelemente, dar la concentraii supraoptimale, n compoziia substanelor antimicrobiene, ionii metalelor grele acioneaz prin precipitarea enzimelor sau a altor proteine eseniale ale celulei. Ionii metalici pot fi aezai n serii cu activitate antimicrobian descresctoare: Hg, Ag, Zn, Cu. Sunt activi la concentraii foarte mici (o parte la un milion), datorit afinitii lor pentru gruprile SH. Hg este utilizat sub forma srurilor anorganice (HgCl2, sublimat coroziv, cu CF = 827 i oxicianura de Hg) sau sub form organic (mertiolat, mercurocrom). Aciunea srurilor de Hg se datoreaz formrii de mercaptide cu gruprile SH ale proteinelor. Iniial, reacia este reversibil i efectul este microbiostatic. Efectul HgCl2 este neutralizat prin adugarea n exces a compuilor cu grupri SH (glutation, tioglicolat). Din aceast cauz, utilizarea ei este considerat a fi perimat. Dup contactul prelungit sau prin utilizarea unor concentraii mari de HgCl2, reacia devine ireversibil i efectul este microbicid. HgCl2 este folosit curent n laborator, la concentraii de 1/l000 pn la 1/l0 000, care omoar toate microorg anismele. La diluii mari (1/20000 sau mai mari), efectul este bacteriostatic. Compuii organici cu Hg se folosesc pentru dezinfectarea rnilor superficiale i pentru conservarea serurilor i vaccinurilor. Argintul i compuii si au fost folosii mult timp ca ageni antimicrobieni. Ionii de Ag au efect microbiostatic, la concentraii foarte mici i microbicid, la concentraii mai mari. Se pare c unele proteine au afinitate mare pentru ionii de Ag i i fixeaz chiar la concentraii mici. Bacteriile omorte sub aciunea ionilor de Ag conin n medie l06 ioni/celul, ceea ce corespunde aproximativ numrului de molecule de proteineenzime dintr-o celul. Cel mai important compus este Ag - sulfadiazina (AgSD), dar se folosesc i ali compui: acetatul i nitratul de Ag. AgNO3, n soluie de 1% (Argyrol) se folosete pentru a inhiba posibilele infecii gonococice ale ochiului la noul nscut. Se instileaz n ochi imediat dup natere, deoarece infecia nosocomial poate determina orbirea. n locul AgNO3 s-a folosit penicilina, dar odat cu preponderena bacteriilor rezistente la penicilin, AgNO3 a fost reintrodus n uz. Ionii de Ag interacioneaz cu gruprile thiol (-SH), dar probabil i cu alte inte, iar la nivel membranar produce eliberarea ionilor de K+. Aminoacizii, ca cisteina i ali compui (tioglicolatul de Na) care conin grupri tiol, neutralizeaz activitatea AgNO3 fa de Ps. aeruginosa. Aminoacizii care conin legtura S-S (disulfid), aminoacizii fr S i compuii cu S ca acidul cisteic, L-metionina, taurina, tiosulfatul de Na, nu neutralizeaz activitatea Ag+. Faptul sugereaz c interaciunea Ag+ cu gruparea tiol a enzimelor i proteinelor. Joac rol esenial n inactivarea bacteriilor, dar pot fi implicate i alte componente celulare. Srurile de Ag i ale altor metale grele (Cu) acioneaz prin legarea de gruprile funcionale ale enzimelor fungice. Ag+ produce eliberarea ionilor de K+ din celula microorganismelor. Membrana citoplasmatic, sediul activitii multor enzime, este o int important pentru activitatea Ag. Ag+ este activ nu numai asupra enzimelor: produce inhibiia marcat a creterii la Cryptococcus neoformans i este depozitat n perete i n vacuol citoplasmatic. Ag+ inhib diviziunea celular i lezeaz membrana extern la Ps. aeruginosa. Volumul celulei crete semnificativ, iar componentele sale exprim anomalii structurale. Ag+ interacioneaz cu acizii nucleici, cel mai probabil cu bazele. Sulfadiazina este o combinaie a doi ageni antibacterieni: Ag+ i sulfadiazina (SD). Efectul antibacterian este rezultatul unui singur compus sau este rezultatul interaciunii sinergice. AgSD ar e un spectru larg de activitate, dar spre deosebire de AgNO3 induce formarea protuberanelor membranare la

39

bacteriile sensibile (dar nu i la cele rezistente). AgSD se leag de macromoleculele celulare, inclusiv de acizii nucleici. Zincul se folosete sub forma unui amestec al srii (ZnCl2), cu acizi grai cu lan lung. Se folosete ca pulbere antifungic sau ca unguent. ZnCl2 este astringent i se utilizeaz n tratamentul leziunilor superficiale. Pasta de ZnO se folosete pentru tratamentul infeciilor fungice i bacteriene. Aciunea substanelor dezinfectante asupra microorganismelor se desfoar ca un proces treptat, n cursul cruia, numrul bacteriilor viabile scade progresiv: n fiecare unitate de timp va fi distrus un procent constant din numrul celulelor viabile (Todar, 2002). Efectul antimicrobian este dependent de sensibilitatea microorganismului, de faza sa de cretere, de forma de existen (vegetativ sau spor), de natura i concentraia substanei bactericide, de durata aciunii ei, de compoziia chimic a mediului i de pH. Prezena unor substane organice supraadaugate, alcalinitatea i temperaturile sczute diminu efectele toxice ale substanelor chimice. Halogenii i compuii lor. Halogenii, clorul i iodul, se folosesc ca dezinfectani sub form organic i anorganic. Majoritatea compuilor organici ai halogenilor au efect letal asupra celulelor, prin oxidarea proteinelor, ruperea membranelor i inactivarea enzimelor. Iodul este mai puin reactiv dect clorul, dar are efecte bactericide, fungicide, sporicide, tuberculocide i inactiveaz virusurile. Tincturile (soluiile) apoase i alcoolice se folosesc de peste 150 de ani ca antiseptice, sunt iritante i colorante. n soluie se gsesc mai multe variante de iod, n echilibru cantitativ, dar activitatea antimicrobian principal este produs de iodul molecular. Iodul se combin ireversibil cu proteinele, prin iodurarea tirozinei i este un agent oxidant (Topley i Wilson, 1998). Tinctura de iod (2 - 7%), adic iodul metalic (I2), dizolvat n soluie alcoolic concentrat de KI, este antiseptic i se aplic pe suprafaa pielii, nainte de procedeul chirurgical i pe rnile mici. Soluiile apoase sunt instabile: n soluie cel puin 7 specii molecule de iod se gsesc n echilibru cu I2. Cel mai activ este iodul diatomic (I2), avnd efect microbicid rapid fa de bacterii, levuri, microfungi, spori. Folosirea iodului este limitat de toxicitate i de culoare. Este iritant i poate determina chiar reacii alergice. De aceea se utilizeaz iodofori complexe alctuite din iod i un agent de solubilizare, cu rol de purttor al iodului, pe care-l elibereaz sub forma sa activ. Iodoforii sunt mai puin activi fa de fungi i spori, comparativ cu tincturile. Iodul ptrunde rapid n celul i reacioneaz cu gruprile eseniale ale macromoleculelor: cu aminoacizii cu S (cisteina i metionina), cu nucleotidele, cu acizii grai. Efectul este letal. Virusurile nude sunt cele mai sensibile, iar cele nvelite sunt mai rezistente. Ca i n cazul bacteriilor, iodul denatureaz proteinele capsidei sau ale nveliului. Iodoforii acioneaz ca rezervor de iod activ, liber. Iodul este solubilizat de ageni tensioactivi: detergeni neionici cu proprieti dezinfectante i polivinil pirolidona, cu proprieti antiseptice. Iodul se leag uor cu aceti compui organici, de unde este eliberat lent, fapt ce condiioneaz o dezinfecie eficient. Iodoforii sunt microbicizi la variaii mari de pH i i pstreaz activitatea n prezena materiei organice. Iodul se fixeaz de un grup important de proteine (n special cele care nu conin aminoacizi cu S), de nucleotide i acizi grai, producnd moartea celulei. Clorul liber are culoare caracteristic (verde) i miros ptrunztor. n oricare din variatele sale forme, clorul este deodorant i dezinfectant. Clorul este un agent bactericid foarte puternic (CF = 200). Adugat n ap, clorul formeaz acidul hipocloros, produs instabil care degaj O2 n stare nscnd, un oxidant foarte puternic, dup reaciile:

n soluie apoas (apa de clor), clorul este bactericid la concentraia de 0,02%, dup maxim 5 minute. Se folosete pentru tratarea apei potabile (clorinare), la concentraia de 1 - 3 mg/l. Clorul i compuii si sunt inactivai n prezena materiei organice i a catalizatorilor metalici. Soluiile de hipoclorit sunt folosite pentru dezinfectare i ca deodorante. Sunt inofensive pentru esuturile umane, uor de manevrat, incolore, dar decolorante. Se folosesc n spitale pentru dezinfectarea camerelor, a suprafeelor, a instrumentelor nechirurgicale. Agenii care elibereaz clorul sunt cloraminele (derivai clorurai ai aminelor (R-NHCl), din care face parte cloramina-T), hipocloritul de Na, dioxidul de clor. Sunt compui mult mai stabili dect hipocloriii, cristalini, solubili n ap, cu care dau prin hidroliz, hipoclorit de sodiu i anionul hipocloros. Sunt active la concentraii de 0,5 - l,5%, exprimate n clor activ. Hipocloritul de Na se folosete ca nlbitor al esturilor. In ap, ionizeaz i elibereaz Na+ i ionul hipoclorit (OCl-), care stabilete un echilibru cu acidul hipocloros (HOCl). La pH 4-7, clorul exist predominant ca HClO, iar la pH peste 9, predomin OCl-. Se folosete pentru dezinfecia obiectelor contaminate cu snge infectat cu HIV sa cu virusul hepatitei B (VHB). Agenii care elibereaz Cl sunt oxidani foarte activi i denatureaz proteinele celulare. La pH sczut, activitatea compuilor care elibereaz Cl este maxim. n concentraii mari, agenii care elibereaz Cl sunt sporicizi.

40

Acidul hipocloros perturb fosforilarea oxidativ. Civa compui organici clorurai se folosesc pentru dezinfectarea apei. Cel mai utilizat este compusul halazon sau acidul parasulfon-dicloraminobenzoic. La concentraia de 4 - 8 mg/l dezinfecteaz, n 30 de minute, apa ce conine bacili tifici. Succin-clorimidul, o clorur organic stabil n form de tablet, devine activ n contact cu apa. Este ineficient fa de chitii de Entamoeba hystolitica. Ali ageni oxidani. Permanganatul de potasiu (KMnO4), n concentraie de 1:l0000 este un antiseptic puternic, dar aciunea sa este neutralizat de prezena substanelor organice. Peroxizii. Peroxidul de H, perhidrolul sau apa oxigenat (H2O2) este un antiseptic eficient i netoxic. Se folosete pentru dezinfecie, sterilizare i antisepsie. Este un lichid incolor, disponibil ntr-o varietate de concentraii, de la 3 la 90%. Molecula este instabil i se descompune repede n H2O i O2, dup reacia:

Dei soluiile pure sunt n general stabile, cele mai multe conin stabilizatori care mpiedic descompunerea. H2 O2 are un spectru larg de eficacitate fa de bacterii, spori bacterieni, levuri i inactiveaz virusurile. Este mai activ fa de bacteriile Gram pozitive, dar prezena catalazei sau altor peroxidaze poate s le fac tolerante la concentraiile mici de H2O2. Pentru efectul sporicid sunt necesare concentraii de 10 - 30% i timp mai ndelungat de contact. H2O2 acioneaz ca oxidant, producnd radicalul OH. liber, reactiv fa de gruprile cu S i fa de dublele legturi ale macromoleculelor. n timpul generrii O2 se formeaz O2(radicalul superoxid), n prezena ionilor de metal din citoplasm. Radicalul O2 - reacioneaz cu gruprile ncrcate negativ ale proteinelor i inactiveaz enzimele. Concentraia de 6-25% H2O2 se folosete pentru sterilizarea unor materiale (implante chirurgicale, lentile de contact). Nu are toxicitate remanent. Concentraia de 0,1% H2O2 n lapte, la temperatura de 54o, diminu numrul total de bacterii cu 99,99%. La concentraia de l0%, distruge sporii i inactiveaz virusurile. Soluia comercial de 3% se folosete pentru dezinfecia rnilor, deoarece bacteriile anaerobe sunt foarte sensibile la prezena O2. Peroxidul de sodiu (Na2O2), ca past, se folosete pentru tratamentul acneii. Peroxidul de zinc (ZnO2) se folosete n suspensie cu ZnO i Zn(OH)2 pentru tratamentul infeciilor tegumentare cu bacterii microaerofile i anaerobe. Benzoil-peroxidul se folosete pentru tratamentul acneii i se adaug n soluiile de curire a pielii. Acidul peracetic (CH3 COOOH) este un agent oxidant puternic i se folosete sub form gazoas pentru sterilizarea la temperatur sczut, a camerelor destinate creterii animalelor germ-free, a aparaturii medicale pentru hemodializ i ca sterilizant al suprafeelor. Este bactericid, fungicid i inactivator al virusurilor la concentraii mai mici de 0,3%. Se descompune la acid acetic i O2, dar nu este sensibil la aciunea peroxidazei i rmne activ n prezena materiei organice. Acidul peracetic denatureaz proteinele i enzimele, rupnd legturile SH i S-S.

2.4. Coloranii antiseptici

O categorie special de colorani manifest aciune bacteriostatic: derivaii acridinei i coloranii de rozanilin. Acriflavina este un amestec format din doi derivai ai acridinei. Are toxicitate sczut i nu sensibilizeaz tegumentul. Are un spectru larg de aciune i se folosete pentru tratamentul infeciilor tractului urinar. Mecanismul de aciune pare s conste n capacitatea acridinelor de a se insera ntre nucl eotidele moleculei de ADN. Cristal-violetul este un derivat metilic al colorantului rosanilin. Este colorantul utilizat n reacia Gram, dar are i efect bacteriostatic asupra bacteriilor Gram pozitive.

Structura molecular a cristal-violetului (Violet de geniana)

Cristal-violetul a fost folosit pentru tratamentul vaginitei cauzat de Trichomonas. Agentul etiologic al candidozei vaginale, C. albicans este foarte sensibil la aciunea colorantului. Mecanismul de aciune a acestui

41

compus fa de bacteriile Gram pozitive este foarte asemntor cu acela al penicilinei, ce const n blocarea treptei finale a sintezei peretelui celular. Quinonele sunt colorani naturali, care confer culoare multor forme de via, plante i animale. Unele quinone sunt fungicide de importan agricol: cloranil i diclone.

2.5. Ageni sterilizani n faz de vapori

Multe instrumente medicale termosensibile pot fi sterilizate prin aciunea sterilizanilor lichizi (glutaraldehid, acidul peracetic, H2O2) sau a agenilor sterilizani n faza de vapori. Cei mai folosii ageni n aceste sisteme reci sunt oxidul de etilen, formaldehida, iar mai recent se folosesc H2 O2 i acidul peracetic. Etilen-oxidul i formaldehida sunt ageni alchilani cu spectru larg. Agenii alchilani sunt substane care adaug gruparea alchil (ca de exemplu, -CH3), la alte molecule. Adugnd un grup alchil la o baz azotat, i modific dimensiunile i determin o eroare de mperechere. Agenii alchilani acioneaz asupra ciclurilor purinice azotate, la nivelul O6 al guaninei sau O4 din bazele pirimidinice, producnd leziuni mutagene, dar i la nivelul legturilor fosfodiesterice ale catenei de ADN. Activitatea lor este dependent de concentraia activ, temperatur, durata expunerii, umiditatea relativ. Agenii alchilani se formeaz prin prepararea multor produse alimentare, n gazele de eapament prin combustia intern a N2 atmosferic, formdu-se nitrai i nitrii. Prin arderea tutunului, a produselor petroliere i prin prepararea alimentelor, din resturile de guanin se formeaz hidrocarburi policiclice aromatice, cu efect alchilant asupra ADN (Zneiden, 1998; McDonell, 1999). Fiind ageni alchilani, etilen-oxidul i formaldehida reacioneaz cu proteinele, acizii nucleici, fiind foarte reactivi fa de gruprile sulfhidril (-SH) ale proteinelor. Etilen-oxidul are dezavantajul c este exploziv i mutagen. H2O2 i acidul peracetic n faz de vapori sunt ageni oxidani mai activi, la concentraiile inferioare, dect cele n form lichid. Ambele au toxic itate sczut, aciune rapid la temperatur sczut, dar au penetran sczut.

2.6. Rezistena microorganismelor la aciunea antisepticelor i dezinfectantelor

Rezistena microorganismelor la aciunea antisepticelor (AS) i dezinfectantelor (DF) poate fi natural (intrinsec) sau dobndit. Rezistena intrinsec sau natural este proprie bacteriilor Gram negative, sporilor, micobacteriilor. Este o proprietate controlat de gene cromosomale i permite depirea aciunii unui antiseptic sau dezinfectant. Moleculele de antiseptic sau dezinfectant trebuie s strbat straturile externe pentru a atinge inta celular. Structura chimic a acestor straturi depinde de grupul de microorganisme i poate constitui o barier eficient de permeabilitate, limitnd difuzia agentului chimic. Mult mai rar este posibil ca enzimele sintetizate constitutiv s degradeze compusul antiseptic sau dezinfectant. Sporii de Bacillus spp. i Clostridium spp. sunt cei mai rezisteni la antiseptice i dezinfectante. Sporii de Bacillus spp.(dei, n general, nu sunt patogene), sunt folosii ca indicatori ai sterilizrii eficiente. Sporii de Clostridium sunt patogeni semnificativi: Cl. difficile este cauza comun a diareii de spital. Multe biocide sunt bactericide sau bacteriostatice la concentraii mici, pentru formele vegetative, dar pentru efectul sporicid sunt necesare concentraii mai mari (de exemplu, glutaraldehida i agenii care elibereaz clor). Alcoolii, fenolii, srurile quaternare de amoniu i clorhexidina nu au efect sporicid, dect la temperaturi superioare (Tortora i colab., 1995). Rezistena superioar a sporilor se datoreaz structurii complexe a nveliurilor sporale multiple. Inveliurile sporale cuprind o fracie major a sporului. Aceste structuri sunt de natur proteic, cu o fracie de polipeptide acide solubile n baze, n nveliul intern i o fracie rezistent la baze, datorat legturilor S-S. Sporularea ete procesul n care celula vegetativ se difereniaz n spor i implic 7 stadii. Celula vegetativ (stadiul 0) sufer schimbri morfo-funcionale, care culmineaz cu eliberarea sporului matur (stadiul VII). Pentru dezvoltarea rezistenei la biocide, stadiile IV (dezvoltarea cortexului) pn la VII, sunt cele mai importante pentru dezvoltarea rezistenei la biocide. Studiul mecanismelor rezistenei sporale se studiaz prin tehnica parcurgerii retrograde a treptelor sporulrii, care const n ndeprtarea sec venial a nveliului sporal. In acest scop se folosesc mutante de sporulare, care nu progreseaz dincolo de stadiile determinate genetic ale sporului, ceea ce permite o sporulare cu un grad nalt de sincronizare. Se adaug antisepticul sau dezinfectantul la nceputul sporulrii i se determin gradul de progresie a sporulrii (Black, 1996). Unele microorganisme au un grad intermediar de rezisten la AS i DF, ntre cele sporulate i nesporulate. La micobacterii, rezistena se datoreaz peretelui celular complex, care constituie o barier eficient fa de ptrunderea agenilor chimici: peptidoglicanul este legat covalent cu un copolimer polizaharidic (arabinogalactan), alctuit din arabinoz i galactoz, esterificate cu acizi micolici. Antisepticele

42

i dezinfectantele care au activitate asupra micobacteriilor sunt fenolul, acidul peracetic, H2O2, alcoolul i glutaraldehida. Ali ageni bactericizi clorhexidina, srurile amoniului quaternar, sunt bacteriostatice fa de Mycobacterium spp., chiar la concentraii mari. Biocidele hidrofile nu penetreaz nveliul lipidic consistent hidrofob al celulelor de Mycobacterium, la concentraii suficient de mari, pentru a fi letale. Activitatea lor poate s creasc sub efectul diferitelor variantelor de formulare (Mihescu, 2000). Peretele Gram pozitiv al bacteriilor din g. Staphylococcus este format din peptidoglican i acizi teichoici. Nici unul dintre componente nu are rolul de barier eficient fa de AS i DF. Plasticitatea structurii mureinei este bine cunoscut: grosimea i numrul de legturi transversale ale peptidoglicanului sunt influenate de condiiile de mediu i de starea fiziologic a celulei, ceea ce modific gradul lor de sensibilitate la antiseptice i dezinfectante. De exemplu, S. aureus poare s existe n varianta mucoid, celulele fiind nconjurate de un strat mucos. Tulpinile nemucoide sunt mai sensibile dect cele mucoide, la aciunea agenilor chimici. Bacteriile Gram negative, n general, sunt mai rezistente dect bacteriile Gram pozitive nesporulate: concentraia minim inhibitorie a dezinfectanilor i antisepticelor este mai mare la bacteriile Gram negative, deoarece membrana extern acioneaz ca barier limitant a ptrunderii agenilor antibacterieni. Fenotipul organismelor sesile n biofilme difer semnificativ de al celulelor planctonice sau de cele crescute pe medii artificiale, n laborator. n diferite zone ale biofilmului, bacteriile au disponibiliti diferite ale nutrienilor, iar proprietile fiziologice sunt modificate. In profunzimea biofilmului, limitarea nutrienilor reduce rata de cretere a bacteriilor, ceea ce modific sensibilitatea la aciunea agenilor antimicrobieni. Bacteriile cu o rat mic de cretere sunt deosebit de rezistente. Sensibilitatea redus a bacteriilor ntr-un biofilm se datoreaz mai multor factori: - accesul redus al dezinfectantului sau antibioticului la celulele din biofilm; - interaciunea chimic ntre DF i biofilm; - producerea enzimelor degradative i/neutralizante ale substanelor chimice; - schimbul genetic dintre celule n biofilm. Bacteriile din biofilm, recultivate n mediul lichid, redevin sensibile ca i celulele planctonice ale speciei respective. Rezistena dobndit. Ca i n cazul antibioticelor i al altor ageni chimici, rezistena dobndit la AS i DF poate s se produc prin mutaie sau prin dobndirea unei plasmide sau a unui Tn (caset transmisibil de ADN cromosomal sau plasmidial, cu proprieti de integrare). Cu excepia Ag, a compuilor organomercurici, plasmidele induc niveluri semnificative de rezisten la AS i DF (Todar, 2002). Compuii Hg nu se mai folosesc ca dezinfectani, dar srurile fenil-mercurice i tiomersalul se folosesc ca ageni conservani pentru unele produse farmaceutice. Rezistena la Hg este plasmidial, inductibil i poate fi transferat prin conjugare sau transducie. Izolatele clinice de S. aureus care sintetizeaz F -lactamaz sunt rezistente la Hg2+ anorganic i la agenii organomercurici.

2.7. Evaluarea potenialului antibacterian al agenilor chimici

Potenialul sau eficiena unui agent chimic antimicrobian este influenat de temperatur, pH, concentraie i timpul de aciune. Creterea temperaturii cu l0oC dubleaz rata reaciilor chimice i mrete potenialul agentului chimic. La o valoare a pH-ului care mrete gradul de ionizare a unui agent chimic crete i capacitatea sa de a penetra n celul. Valoarea pH poate altera chiar coninutul celulei. Concentraia influeneaz decisiv efectele agentului antibacterian. Concentraiile mari pot fi bactericide, iar cele mici pot fi bacteriostatice (Zneiden, 1998; McDonell, 1999). Alcoolul etilic i izopropilic sunt excepii notabile de la regula concentraiilor. Ei sunt mai activi la concentraia de 70% dect la concentraii mai mari. Alcoolii acioneaz prin coagularea (denaturare permanent) a proteinelor, iar apa este necesar reaciei de coagulare. Amestecul alcool - ap n proporia 70% penetreaz mai profund dect alcoolul pur, n materialul supus dezinfectrii. Coeficientul fenolic Efectul dezinfectant al fenolului este unitatea etalon, cu care se compar ali dezinfectani, n aceleai condiii de aciune. Comparaia se exprim n coeficientul fenolic (CF) (Todar, 2002). Microorganismele test pentru determinarea coeficientului fenolic sunt Salmonella typhi i Staphylococcus aureus. Un dezinfectant care are CF egal cu 1, are aceiai eficien antibacterian ca i fenolul, iar un CF mai mic dect 1 semnific o eficien mai sczut. Coeficientul fenolic se determin astfel:

43

- se prepar cteva diluii ale agentului chimic i se repartizeaz volume egale n tuburi test; - se prepar un set identic de tuburi test cu diluii de fenol; - ambele seturi de tuburi se aduc la acelai nivel termic prin nclzire n baie de 20o, timp de 5 minute; - n fiecare tub din cele dou seturi se transfer 0,5 ml din cultura unui microorganism test (S. typhi sau S. aureus); - dup 5, l0, l5 minute se transfer, cu ansa calibrat, un volum din fiecare tub, ntr-un tub cu bulion nutritiv. Tuburile se incub; - dup 48 de ore se evalueaz turbiditatea tuburilor inoculate i se gsete cea mai mic concentraie (cea mai mare diluie a agentului care a omort toate organismele n l0 minute, dar nu n 5 minute); - se stabilete raportul diluiei agentului chimic, la diluia fenolului ce are acelai efect. De exemplu, dac diluia l/l0 a unui agent chimic are acelai efect ca i diluia l/l00 a fenolului, CF al agentului chimic este l0. Determinarea CF este o modalitate adecvat de a aprecia eficiena agenilor chimici derivai din fenol, dar este mai puin adecvat pentru ali ageni dezinfectani. Evaluarea potenialului antibacterian a unui agent chimic se poate face mai simplu, prin metoda discurilor de hrtie de filtru: - fiecare disc de hrtie este mbibat cu soluia unui agent chimic diferit; - discurile se aeaz pe suprafaa unei plci cu mediu agarizat, inoculat cu un microorganism test; - fiecare organism test se nsmneaz pe o plac diferit; - dup incubare, efectul inhibitor al unui agent chimic asupra organismului se identific printr-o zon clar de inhibiie a creterii n jurul discului. Diametrul zonei de inhibiie a creterii este proporional cu potenialul antibacterian al agentului chimic.

Bibliografie selectiv
1. Black J.G., Microbiology. Principles and Applications. Third Edition. Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. 1996, pp: 332-352. 2. Jungerman E., Antimicrobial and Deodorant Soaps: Impact of Regulatory Developments. Cosmetics & Toiletries, Allured Publishing Corporation. 1996. 3. McDonell G, Russell A.D., Antiseptics and disinfectants: activity, action and resistance, Clinical Microbiology Reviews. 1999, 12: 147-179. 4. Mihescu Gr., Microbiologie generala si virologie. Editura Universitatii Bucuresti, 2000. 5. Paulson D., Developing Effective Topical Antimicrobials, Soap/Cosmetics/Chemical Specialties, 1997. 6. Reddish G.F., Antiseptics, Disinfectants, Fungicides and Chemical and Physical Sterilization. The Quarterly Review of Biology. 1959, 34(4): 330-331. 7. Todar's Online Textbook of Bacteriology, The control of microbial growth, Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology, 2002. 8. Topley and Wilsons Microbiology and Microbial Infections, Vol. I , II, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman. 1998. 9. Tortora G.J., Funke B.R., Case C.L., Microbiology. An Introduction. Fifth Edition. The Benjamin/Cummings Publishing, Co., Inc., Redwood City, CA. 1995, pp:167-188. 10. Zneiden A., The War Against Germs. Drug and Cosmetic Industry 162, Advanstar Communications, 1998.

44

Capitolul 3 AGENI CHIMIOTERAPEUTICI DE SINTEZ

Utilizarea substanelor de sintez chimic sau produse de diferite organisme, n scop terapeutic, este veche. Indienii din Peru mestecau scoara arborelui de chinin pentru tratamentul malariei. n secolul 15, n Europa se foloseau compuii cu mercur pentru tratamentul sifilisului, iar chinezii utilizau cultura de fungi microscopici crescut pe seminele de soia, pentru tratamentul furunculelor. Conceptul chimioterapiei a fost formulat de Ehrlich (l904) n Germania. El a presupus c este posibil gsirea unor substane chimice cu efecte toxice selective asupra paraziilor, dar nu pentru celulele sau tesuturile organismului uman. Ideea a fost denumit pastila magic, pentru care a fost distins cu premiul Nobel. Ehrlich a descoperit para-rosanilina, cu efecte antitripanosomiale i a sintetizat compusul arsenic arsfenamina (salvarsan) pentru tratamentul sifilisului.

Structura molecular a salvarsanului

Gelmo (1908) a sintetizat sulfanilamida pentru tratamentul pacienilor infectai cu Treponema pallidum, agentul sifilisului. Eisenberg (1913) a studiat proprietile bactericide ale azo-coloranilor cu grupri sulfonamidice, iar Gratia i Dath (1924), studiind microorganismele din sol, au descoperit actinomicetina, produs de actinomicete (Todar, 2002). n 1935, Domagk, medic german, a remarcat activitatea antimicrobian in vitro a compusului prontosil, primul dintr-o serie lung de substane sintetice denumite sulfonamide. Prontosil a fost introdus n clinic n anii 30 pentru tratamentul infeciilor tractului urinar, pneumoniei i altor stri patologice. In vivo, prontosil este convertit la sulfanilamid activ, analogul acidului paraaminobenzoic (APAB). In 1939, el a demonstrat valoarea terapeutic a sulfonamidelor (gruparea S a compuilor) pentru tratamentul infeciilor cu Streptococcus i activitatea antimicrobian cu spectru larg (Todar, 2002). Multe sulfonamide au eficien inferioar antibioticelor naturale, dar se folosesc pe scar larg. In 1945, farmacologii aveau la dispoziie, pentru uzul clinic, 5488 derivai ai sulfanilamidei (sulfonamidei).

3.1. Ageni chimioterapeutici activi prin inhibiie competitiv

Sulfonamidele sunt ageni chimioterapeutici foarte importani din punct de vedere practic. Nu sunt antibiotice, deoarece termenul de antibiotic este rezervat substanelor sintetizate de organisme, de cele mai multe ori, bacterii sau fungi, care n concentraii foarte mici inhib sau omoar microorganismele. Descoperirea lor are caracter empiric i pragmatic (tabelul 2). Domagk (cercettor i medic german) a descoperit c prontosilul (un colorant rou), dei in vitro nu are efecte inhibitorii, in vivo este foarte eficient fa de S. aureus. Explicaia este urmtoarea: n organism, molecula de colorant a fost scindat enzimatic i sa eliberat o molecul mic sulfanilamida foarte activ fa de S. aureus, dar inactiv n forma legat de colorant. Sulfonamidele reprezint primul grup de substane microbiostatice introduse cu succes n clinic, avnd ca prototip sulfanilamida (para-amino-benzen-sulfonamida). Mecanismul aciunii sulfonamidelor a fost clarificat cnd Woods a demonstrat c acidul paraaminobenzoic (APAB) are o aciune antagonist fa de aceste substane, n sensul c anihileaz efectul lor antimicrobian: dublarea concentraiei de inhibitor adugat n mediu necesit dublarea concentraiei de APAB, pentru a relua creterea. Toxicitatea selectiv a sulfonamidelor deriv din faptul c organismul uman preia acidul folic din surse externe, dar multe bacterii i sintetizeaz propriul acid folic.

Structura molecular a acidului para-aminobenzoic (APAB).

49

Tabelul 2. Ageni chimioterapeutici care acioneaz prin inhibiie competitiv (adaptare dup Topley i Wilsons, 1998). Clasa de ageni inta specific Structura chimic chimioterapeutici Sulfonamide Inhibarea dihidropteroid sintetazei (DHPS)
H2N SO 2NH2 s ulf onam ide

Diaminopirimidina (Trimetoprim)

Inhibarea dihidrofolat reductazei

H2N

NH2 N CH2 N trimetoprim

OCH3

OCH3

OCH3 N

Nitroimidazoli

Interfer cu biosinteza timinei (produc ruperi ale moleculei de ADN)

O2N N

CH3

CH2 CH2OH metronidazol

Nitrofurani (Nitrofurantoil)

Interfer cu biosinteza timinei (produc ruperi ale moleculei de ADN).

O2N O CH N N

O C NH C O

H2C nitrof urantoil

Aciunea antagonist a APAB nu este direct, ci se exercit prin intermediul metabolismului bacterian. APAB este un nutrient esenial, fiind precursorul acidului folic, un factor de cretere pentru bacterii. Acidul folic i formele sale reduse acidul dihidrofolic i tetrahidrofolic transfer fragmente cu 1C derivate din serin, pentru sinteza metioninei, purinelor, timinei, tiaminei, pantotenatului (Black, 1996). Datorit marii asemnri a structurii chimice a celor dou substane(APAB i sulfanilamida), ntre ele are loc un fenomen de competiie pentru intrarea n calea sintezei acidului folic (fig. 21).

Structura molecular a acidului folic

Enzima bacterian implicat n conversia APAB la acid folic (pteridin-sintetaza), adeseori greete i se combin cu sulfanilamida, n loc de APAB. Astfel, sinteza acidului folic i toat calea metabolic dependent de acidul folic este blocat. Sulfanilamida intr n competiie cu APAB pentru situsul activ al enzimei.

50

Acest tip de inhibiie este reversibil: dac sulfanilamida este ndeprtat, enzima funcioneaz normal. Cu ct raportul moleculelor de sulfanilamid/APAB este mai mare, cu att inhibiia metabolismului bacterian este mai ampl.

Figura 21. Ilustrarea schematic a competiiei dintre molecula de sulfonamid i acidul para -aminobenzoic (APAB) pentru substrat, datorit omologiei structurale (adaptare dup Wistreich, 1996).

Sulfonamidele au afinitate mai mare dect APAB pentru pteridin-sintetaz. Trimetoprimul (un analog al acidului dihidrofolic) are afinitate foarte mare (de 10000-100000 de ori) pentru dihidrofolat-reductaza (DHFR) bacterian dect pentru cea mamalian, enzima care catalizeaz conversia dihidrofolatului la acidul tetrahidrofolic (fig. 22) (Wistreich, 1996). Astfel sunt blocate cile metabolice dependente de acidul folic. Acidul folic acioneaz ca purttor al gruprilor C1 i este necesar pentru sinteza ADN, ARN, etc. Spre deosebire de mamifere, bacteriile i protozoarele parazite nu au sistem de transport care s preia acidul folic preformat din mediul extern. Majoritatea acestor organisme trebuie s sintetizeze acidul folic, dei unele pot s foloseasc timidina exogen, acoperind necesarul metabolic de acid folic.

51

Fig. 22. Ilustrarea mecanismului aciunii agenilor terapeutici prin inhibiie competitiv: sulfonamidele blocheaz competitiv conversia pteridinei i APAB n acidul dihidrofolic, pe calea sintezei acidului folic (adaptare dup Huang i colab., 2004).

Deoarece, n privina trsturilor sale eseniale, metabolismul este acelai la toate bacteriile, rezult c toate speciile utilizeaz acidul folic, chiar dac nu toate l pot sintetiza. Sulfamidele sunt toxice pentru bacteriile capabile s sintetizeze acidul folic, pornind de la molecule mai simple. Bacteriile care nu sintetizeaz acidul folic, ci necesit aportul exogen al moleculelelor preformate, nu sunt sensibile la sulfonamide. Efectul sulfonamidelor este antagonizat necompetitiv de un amestec de intermediari ai cii acidului folic, adic efectul lor antagonic nu poate fi depit prin creterea concentraiei de sulfonamid. Sulfanilamida inhib sinteza acidului folic prin inhibiie competitiv cu sintetaza acidului dihidropteroic. Enzima catalizeaz condensarea dihidropteridinei cu acidul para -aminobenzoic, n stadiul timpuriu al sintezei acidului folic. Deoarece acidul folic i pstreaz activitatea n celulele bacteriene, efectul inhibitor al sulfonamidelor devine evident dup cteva generaii de celule, cnd cantitatea de acid folic s-a diminuat sub un nivel critic, prin distribuie n celulele fiice. Toxicitatea selectiv deriv din faptul c bacteriile sensibile sintetizeaz acidul folic de novo, iar omul absoarbe cofactorul preformat. Cele mai cunoscute sulfonamide sunt sulfadiazina i sulfametoxazol (cotrimoxazol), bine absorbite dup administrare oral i excretate n urin.

Structura molecular a sulfametoxazolului (Cotrimoxazol)

Aciunea derivailor sulfanilamidei este bacteriostatic fa de bacteriile Gram pozitive i Gram negative. Se folosesc n tratamentul infeciilor vezicii urinare, cauzate n marea lor majoritate de E. coli. Circa 5% dintre pacieni sufer efecte secundare, mai ales reacii alergice, cu febr i eritem tegumentar. Ca i sulfamidele, acidul paraaminosalicilic (APAS) i dapsone, obinui prin sintez chimic sunt inhibitori competitivi ai metabolismului APAB i inhib sinteza acidului folic.

52

Structura molecular a Dapsone

Structura molecular a APAS (acid paraaminosalicilic)

Rezistena bacterian la sulfonamide este mediat de plasmide, dar i de gene cromosomale, prin hiperproducia de acid p-aminobenzoic. Familia derivailor diaminopirimidinici cuprinde trimetoprimul i tetroxoprimul. Trimetoprim este un analog al acidului dihidrofolic, component esenial al sintezei aminoacizilor i nucleotidelor. Agentul chimic blocheaz metabolismul dependent de acidul folic, dar la alt nivel dect sulfonamidele, a cror eficien o ridic foarte mult (Wistreich, 1996). Agentul inhib competitiv dihidrofolatreductaza, enzima care convertete dihidrofolatul la cofactorul activ acidul tetrahidrofolic. Trimetoprim blocheaz regenerarea acidului tetrahidrofolic, precursorul acidului folinic i ulterior al purinelor i al sintezei ADN, fiind un inhibitor al creterii bacteriilor mai eficient dect sulfonamida.

Structura molecular a acidului tetrahidrofolic

Blocajul secvenial al aceleiai ci de biosintez, sub aciunea sulfonamidelor i trimetoprim, determin un grad nalt de activitate sinergic fa de un spectru larg de microorganisme. Omul nu sintetizeaz acidul folic, dar necesit aportul exogen i sinteza purinelor n celula uman nu este influenat semnificativ de trimetoprim. Are aciune selectiv deoarece este de 50 000 100 000 de ori mai activ fa de dihidrofolat-reductaza bacterian, comparativ cu cea uman. Trimetoprim are spectru larg de aciune: coci Gram pozitivi i majoritatea bacililor Gram negativi, cu excepia Ps. aeruginosa i Bacteroides. Rezistena la trimetoprim poate fi mediat de gene cromosomale ori plasmidiale, mobile prin intermediul Tn7, este consecina dobndirii unei gene a dihidrofolat -reductazei (DHFR), mult mai puin sensibil la trimetoprim sau altor mecanisme: supraproducia DHFR, mutaii ale genei structurale a DHFR sau dobndirea unei gene care codific o enzim rezistent la DHFR. Genele ce codific enzimele modificate se gsesc frecvent pe plasmide autotransferabile. Enzimele modificate sunt produse n celule care produc concomitent i o dihidrofolat reductaz de tip slbatic, dar cantitatea enzimei alterate depete blocajul sintezei acidului folic mediat de efectul trimetoprimului asupra enzimei de tip slbatic. Rezistena la sulfonamide se produce printr-un mecanism asemntor. Datorit rezistenei la sulfonamide, trimetoprim a fost introdus ca un poteniator al sulfonamidelor, n asociaie cu care s-a administrat mult timp, considernduse c are proprieti antibacteriene slabe. Acum se administreaz pe scar larg, ca agent terapeutic unic.

53

3.2. Ageni chimioterapeutici activi prin inhibiia replicrii ADN: quinolonele

Quinolonele (denumite i 4-quinolone) sunt primele substane antimicrobiene obinute pe cale sintetic i formeaz o familie de compui care se aseamn prin existena nucleului quinolinic. Primul compus din acest grup, folosit n terapie este acidul nalidixic. Quinolonele, alturi de lactamice i macrolide, reprezint una dintre cele trei familii principale de ageni antimicrobieni folosii n terapeutica uman (Wolfson & Hooper, 1989). Importana lor terapeutic este n continu cretere ncepnd din 1968, data comercializrii primei quinolone reprezentat de acidul nalidixic. Acidul nalidixic este un produs intermediar de sintez a quinolonelor. Ulterior quinolonele s-au diversificat prin introducerea unui atom de fluor (F) n poziia 6 i a unui heterociclu n poziia 7 (piperazine, pirolidina, etc.) care au generat fluoroquinolonele. Aceste molecule posed un spectru antibacterian foarte larg i pot fi divizate n molecule metabolizabile i nemetabolizabile (grupele III i IV). Quinolonele se pot clasifica n dou grupe : - cele de prim generaie, ca acidul nalidixic, active asupra bacililor Gram-negativi; - fluoroquinolonele.

Acid nalidixic

Norfloxacin

Ciprofloxacin

Ofloxacin

Pefloxacin

E noxacin

Amifloxacin

Flerofloxacin

Lomefloxacin

54

Temafloxacin

Tosufloxacin

PD 127, 391

Gama derivailor quinolonici s-a diversificat prin modificarea nucleului de baz, 4-quinolona. La atomul C6 s-a adugat unul de fluor, ceea ce a crescut semnificativ spectrul i potenialul lor antimicrobian. Avand n vedere spectrul lor de activitate antibacterian, limitat la bacterii Gram negative i n principal la enterobacterii, acidul nalidixic i derivaii si au fost folosii pentru tratamentul infeciilor urinare. Modificrile structurii au dat natere la quinolone, denumite noile quinolone sau fluoroquinolone (norfloxacin, pefloxacin, ofloxacin, ciprofloxacin etc.), al cror spectru de activitate antibacterian se extinde la alte specii Gram negative (de ex. Pseudomonas aeruginosa), dar i la anumite specii Gram pozitive (S. aureus) i micobacterii. Totui, activitatea noilor quinolone fa de alte specii, aa cum sunt cele natural-sensibile la acidul nalidixic, rmne modest, ceea ce corespunde unui anumit grad de rezisten intrinsec a acestor specii. Mecanismul de aciune a quinolonelor este foarte complex. Aceste molecule ptrund n celula bacterian prin difuzie pasiv i acioneaz asupra intelor specifice reprezentate de topoizomeraze: ADN giraza (topoizomeaza II) i topoizomeraza IV. Aciunea celor dou enzime este inhibat. Quinolonele se leag i stabilizeaz complexele giraz-ADN (quinolona singur nu se asociaz cu ADN), dup clivarea lanului, mpiedicnd aciunea catalitic a ADN-polimerazei la nivelul bifurcaiei de replicare. Complexul genereaz o rupere a moleculei de ADN, pe care celula nu o repar eficient. Fluoroquinolonele formeaz complexe stabile cu topoizomeraza II, efectul fiind moartea celulei. S-a sugerat c quinolonele nu se leag cu ADN-giraza nsi, ci probabil chiar la situsuri specifice pe ADN, create de ADN-giraz. Studiile comparative ale sensibilitii la fluoroquinolone i de dezvoltare a rezistenei, au relevat c ADN-giraza este inta primar a fluoroquinolonelor la bacteriile Gram negative, iar topoizomeraza IV este inta primar la bacteriile Gram pozitive. Excepia o constituie Streptococcus pneumoniae, la care fie giraza, fie topoizomeraza pot fi inte primare, n funcie de fluoroquinolona folosit. Activitatea antibacterian este dependent ntr-o msur semnificativ de atomul de fluor din poziia 6 i de nucleul piperazinic din poziia 7. Configuraia spaial a quinolonei determin nivelul activitii. Astfel, enantiomerii stereochimici (care difer unul de altul numai prin poziia n spaiu a unei grupri particulare), ce implic grupul metil ataat la inelul al III-lea de ofloxacin, au activiti antibacteriene foarte diferite, care difer n proporie de 1/10. Quinolonele sunt ageni bactericizi. Ele stopeaz rapid sinteza replicativ a ADN i ntrerup progresia bifurcaiei de replicare. Inhibiia activitii ADN-girazei sub aciunea fluroquinolonelor induce moartea rapid a celulei bacteriene. Inhibiia rapid a sintezei ADN nu explic moartea celulei bacteriene. Pentru efectul letal sunt necesare alte evenimente suplimentare: inhibiia sintezei ARN i a proteinelor. La concentraiile de quinolone care depesc un anumit prag, activitatea bactericid diminu, probabil pentru c este inhibat numai sinteza ARN i a proteinelor. Tratamentul cu quinolone, probabil induce efecte pleiotrope, ce pot fi consecine secu ndare ale inhibiiei sintezei ADN-girazei: leziuni ale ADN bacterian, deoarece quinolonele sunt inductoare ale sistemului reparator SOS, dependent de Rec A. Noile quinolone au reprezentat un real progres terapeutic avnd n vedere caracteristicile aciun ii lor antibacteriene (spectru larg, activitate bactericid i farmacocinetic). Aceasta explic spectaculoasa cretere a utilizrii lor n ultimii 10 ani. Dar utilizarea extensiv a noilor quinolone s-a tradus prin emergena ngrijortoare a tulpinilor rezistente a unor specii bacteriene de mare importan medical (enterobacteriile, Ps. aeruginosa, S. aureus, Mycobacterium tuberculosis, N. gonorrhoeae) i a tulpinilor multirezistente la alte antibiotice.

55

Mecanismele rezistenei bacteriene la fluoroquinolone sunt de trei categorii: - modificri ale enzimelor int ale medicamentelor - alterri care limiteaz accesul medicamentelor la int - activitatea pompelor de efux. Rezistena la quinolone este, predominant, consecina modificrilor enzimei int, la situsurile active ale enzimei. Rezistena speciilor Gram pozitive la quinolone se datoreaz n special mutaiilor ntr -o regiune specific (quinolone resistance determining region - QRDR) a subunitii A a ADN-girazei. QRDR este regiunea N-terminal a proteinei, omolog cu regiunile GyrA i ParC de la E. coli. Regiunea cuprins ntre codonii 67 - 106 ai GyrA la E. coli, este determinant pentru rezistena la quinolone. Mutaiile genei gyrA induc schimbri ale situsului de legare/sau ale sarcinii, care condiioneaz interaciunea ADN-girazei cu quinolona. Quinolonele interacioneaz n primul rnd cu subunitatea A, dar s -au identificat mutaii ale subunitii B care confer rezisten la quinolone. ADN giraza i topoizomeraza IV sunt localizate n citoplasma bacterian. Pentru a-i atinge inta, antibioticele fluoroquinolonice trebuie s traverseze nveliul celular. Modificrile structurale ale membranei externe a bacteriilor Gram negative asociate cu diminuarea nglobrii sunt factori importani ai rezistenei la fluoroquinolone. Variantele Gram negative rezistente la quinolone care se selecteaz, se datoreaz modificrii porinelor din membrana extern, asociat cu scderea permeabilitii. Rezistena la quinolone nu este transferabil prin intermediul plasmidelor. La bacteriile Gram pozitive, scderea ratei nglobrii nu s-a demonstrat a fi un mecanism al rezistenei. Att bacteriile Gram pozitive, ct i cele Gram negative pot dobandi un nivel sczut al rezistenei, mediat de activitatea pompelor de eflux, cu rol de transportori multipli, a cror activitate este dependent de gradientul electrochimic (fora proton motrice). Nu s-au identificat enzime cu efect inactivator fa de quinolone. Ciprofloxacina are un potenial antibacterian mult mai ridicat dect acidul nalidixic. Efectul bactericid al ciprofloxacinului este rapid, cu o pierdere de 90% a viabilitii, ntr-un interval de l9 minute. Ciprofloxacina se folosete n tratamentul infeciilor respiratorii, ale tractului urinar, gonoreii, pentru tratamentul infeciilor diareice cu tulpinile enterotoxigene de E. coli, Campylobacter jejuni, Shigella. Este activ, de asemenea fa de M. tuberculosis. Este parial metabolizat de ficat i excretat de rinichi. Medicamentele antiacide (Maloox) blocheaz absorbia ciprofloxacinei i nu vor fi administrate concomitent. Administrat mpreun cu 2+ teofilina, ciprofloxacina poate duce la acumularea unor nivele sanguine nalte ale teofilinei. Ionii de Ca , 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ Cu , Fe , Mn , Mg , Zn pot s lege ciprofloxacina i diminu mult absorbia medicamentului. Multe antibiotice, inclusiv ciprofloxacina, pot altera microbiota normal a colonului, favorizand dezvoltarea bacteriilor care produc inflamaia mucoasei (colita pseudomembranoas) i determin tulburri diareice (Liebetrau i colab., 2003). Colita pseudomembranoas se datoreaz creterii n exces a bacteriei Clostridium difficile i poate induce stri febrile, durere abdominal, tulburri ale tranzitului intestinal i chiar starea de oc. Tratamentul cu ciprofloxacin poate s duc la creterea n exces a levurii Candida albicans, cu localizare vaginal (vaginit) sau intestinal (disbioza). Manifestarea efectelor secundare este prevenit prin administrarea probioticelor: Lactobacillus casei, L. acidophilus, Bifidobacterium longum, Saccharomyces cerevisiae. Derivaii quinolonici se folosesc pentru tratamentul infeciilor cilor urinare, unde, dup administrare oral, se acumuleaz n concentraii inhibitorii. Fluoroquinolonele ptrund n esutul prostatic la concentraii care echivaleaz sau depesc de cteva ori pe cele din plasm. Cele mai sensibile la aciunea quinolonelor sunt enterobacteriile, dar compuii grupului sunt activi fa de chlamidii i micobacterii. Quinolonele au efect antimicrobian prelungit dup administrare, ceea ce se reflect n continuarea supresiei creterii bacteriene, dup eliminarea agentului antimicrobian din organism. Dac un medicament are un efect persistent dup administrare, nseamn c poate fi eficient chiar n interva lele dintre doze, cnd nivelul seric i tisular au sczut sub nivelul concentraiei minime inhibitorii. Quinolonele i pstreaz activitatea fa de multe bacterii rezistente la antibiotice, inclusiv fa de bacilii Gram negativi cu rezisten multipl, fa de S. aureus rezistent la meticilin, fa de N. gonorrhoeae rezistent la penicilin, fa de Haemophilus influenzae productor de F-lactamaze. Ciprofloxacina, ofloxacina i tosufloxacina sunt active fa de Chlamydia trachomatis i Mycoplasma hominis. Quinolonele sunt de asemenea active fa de Rickettsia spp. Acidul nalidixic inhib numai speciile de bacterii Gram negative aerobe. n molecula de ciprofloxacin, fluorul confer activitate fa de bacteriile Gram pozitive. Grupul piperazinic crete activitatea

56

fa de enterobacterii, iar gruparea piperazin i ciclopropil confer activitate fa de speciile de Pseudomonas.

3.3. Ali ageni chimioterapeutici de sintez

Hidrazida acidului nicotinic (izoniazida, INH), introdus n clinic nainte de 1950, mpreun cu rifampina, formeaz baza chimioterapiei antituberculoase. Izoniazida este un derivat al nicotinamidei. Mecanismul de aciune al izoniazidei nu este cunoscut, dar influeneaz sinteza lipidelor, acizilor nucleici i acidului micolic la M. tuberculosis.

Structura molecular a izoniazidei

Structura molecular a piridoxinei (vitamina B 6)

Se presupune c izoniazida este activ prin competiie cu piridoxina (vitamina B6) necesar creterii celulelor de M. tuberculosis, sau inhib sinteza acizilor micolici (acizi grai specifici acestor bacterii). Este bactericid fa de celulele care cresc i se divid i are aciune bacteriostatic fa de celulele car e nu se multiplic. Toate cele trei (PASA, dapsone i izoniazida) se folosesc pentru tratamentul infeciilor cu Mycobacterium. Etambutolul, pirazinamida i etionamida blocheaz reaciile enzimatice n celula bacterian, deoarece sunt similare dar nu identice cu vitaminele bacteriene. Etambutolul inhib arabinozil-transferaza, enzim implicat n biosinteza arabinogalactanului i lipoarabinomananului. Alte efecte atribuite aciunii etambutolului sunt inhibiia metabolismului ARN i sintezei fosfolipidelor, inhibiia transferului acizilor micolici la arabinogalactanul legat de peretele celular mureinic, sinteza spermidinei i inhibiia unei trepte timpurii a conversiei glucozei n monozaharidele utilizate pentru sinteza polizaharidelor parietale (arabinogalactan, arabinomanan) i a peptidoglicanului. Este un medicament foarte specific i eficient, utilizat n asociaie cu izoniazida, pentru tratamentul tuberculozei. Are efect bacteriostatic. Nu se cunoate mecanismul care determin rezistena la etambutol (Musser, 1995).

Structura molecular a etambutolului

Pirazinamida este un derivat sintetic al nicotinamidei. Nu se cunoate mecanismul de aciune, nici baza molecular a rezistenei. Unele tulpini sensibile la pirazinamid au o enzim specific (pirazinamidaza), ce metabolizeaz pirazinamida la acidul pirazinoic, intermediarul activ antibacterian. Tulpinile rezistente la pirazinamid au pierdut activitatea pirazinamidazic. S-au identificat i tulpini foarte rezistente la pirazinamid, care au i activitate pirazinamidazic. Aceasta sugereaz c, n plus fa de pierderea capacitii de sintez a pirazinamidazei, exist i alte mecanisme de rezisten.

Structura molecular a pirazinamidei

57

Etionamida, derivat a acidului izonicotinic, este activ fa de M. tuberculosis i alte micobacterii. In vitro, celulele de M. tuberculosis i pierd acidorezistena. Se crede c mecanismul su de aciune implic inhibiia sintezei acizilor micolici.

Structura molecular a etionamidei

Nu se cunosc mecanismele rezistenei la etionamid i la izoniazid. Metronidazolul a fost introdus n clinic n 1959 pentru tratamentul infeciei cu Trichomonas vaginalis. Ulterior s-a demonstrat eficiena sa fa de infeciile cu bacterii anaerobe i fa de alte infecii parazitare. Difuzeaz bine n esuturi, inclusiv n sistemul nervos. Are cea mai bun activitate bactericid, dintre toate medicamentele active fa de bacteriile anaerobe. Aciunea sa const n activarea reductiv a grupriii nitro. Metronidazolul acioneaz ca acceptor preferenial de electroni(e-), fiind redus de proteinele transportoare de e- cu potenial redox sczut. Reducerea scade concentraia sa, ceea ce menine un gradient ce favorizeaz ncorporarea medicamentului n celul i generarea produselor intermediare ale reducerii, cu efecte toxice pentru celul. Toxicitatea se datoreaz compuilor intermediari sau radicalilor liberi ce interacioneaz cu ADN i probabil cu alte molecule, producnd leziuni. Intermediarii citotoxici se descompun n produse finale netoxice i inactive: acetamida i acidul 2-hidroxietil oxamic. Efectul asupra microbiotei intestinale este minim, deoarece medicamentul este redus n condiii anaerobe. Methenamina este produsul ciclic de condensare a formaldehidei i amoniului. Are activitate antibacterian slab, dar la pH acid, fiecare molecul hidrolizat genereaz 4 molecule de amoniu i 6 molecule de formaldehid:

Methenamina este excretat n urina acid, unde este hidrolizat i formaldehida eliberat este bactericid. Este disponibil ca sare a acidului mandelic sau hipuric pentru acidifierea urinii. Nu s-a descris rezistena la formaldehid, dar tulpinile de Proteus, care produc frecvente infecii urinare sunt rezistente, deoarece ureaza lor cliveaz ureea la CO2 i NH3 i alcalinizeaz urina. Derivaii nitrofuranului (furazolidon, nitrofurantoina, nitrofuratel, nitrofurazon) au efect bacteriostatic fa de bacteriile Gram pozitive i Gram negative. Cel mai utilizat este nitrofurantoina. Derivaii nitrofuranului se folosesc pentru terapia infeciilor tractului urinar, deoarece realizeaz concentraii suficient de mari n urin. Nu au aciune sistemic. Un intermediar redus al nitrofuranilor produce ruperea catenei de ADN, ceea ce explic efectele mutagene ale acestor compui in vitro. Sunt activate mecanismele de reparare a ADN. Metaboliii reactivi redui ai nitrofurantoinei interfer nu numai cu ADN, ci par a fi capabili s se lege cu proteinele ribosomale i inhib sinteza proteinelor. Inhib respiraia bacterian i metabolismul piruvatului. Nitroimidazolii au spectru larg de aciune (bacterii, fungi, protozoare, helmini). Cei cu activitate antibacterian sunt 5-nitroimidazolii: 2-metronidazolul, furazolidonul i tinidazolul. Furazolidonul este unul din numrul foarte mare de compui (de ordinul miilor) de nitrofuran, introdui n clinic dup descoperirea acestei clase de compui n anii 40. Este activ fa de Klebsiella, E. coli, Campylobacter spp., S. aureus, Giardia intestinalis. Efectul lor antibacterian este dependent de reducerea gruprii nitro n condiii anaerobe. Compuii capteaz e- din feredoxina redus, generat n reacia de decarboxilare a piruvatului. Produsul reducerii are efect letal, probabil prin ruperea catenei de ADN. Unele bacterii microaerofile sunt deosebit de sensibile, dar mecanismul morii lor nu se cunoate. Aceste substane au spectru antibacterian redus, limitat la bacterii anaerobe, cu doar dou excepii: Helicobacter pylori i Gardnerella vaginalis, bacterii microaerofile sensibile la nitroimidazol. Condiia esenial pentru ca nitroimidazolii s acioneze, este reducerea parial a gruprii nitrat prin sistemul intracitoplasmatic transportor de electroni. Bacteriile aerobe sunt incapabile s realizeze aceast reducere, ceea ce exp lic rezistena lor natural. Nitrofuranii sunt ageni antibacterieni a cror structur i mod de aciune sunt similare cu cele ale nitroimidazolilor. Activitatea lor este legat de reducerea gruprii NH2. ntreaga cantitate administrat, pe cale oral sau parenteral rmne disponibil aciunii antimicrobiene. Perioada de njumtire permite

58

administrarea a dou doze/zi. Datorit mecanismului unic de aciune, nu exist fenomene de rezisten ncruciat. Bacilii Gram negativi posed rezisten intrinsec pentru c au pompe de eflux eficiente fa de Linezolid. Oxazolidinonele reprezint o clas unic de ageni antimicrobieni sintetici. Utilizarea lor n clinic a fost impus de necesitatea tratrii infeciilor produse de stafilococii rezisteni la meticilin, de pneumococii rezisteni la penicilin, de enterococii rezisteni la vancomicin. Aceti ageni au un mecanism unic de aciune, ceea ce elimin riscul rezistenei ncruciate cu agenii antimicrobieni disponibili. Deoarece nu sunt molecule naturale, genele de rezisten specific nu preexist n genofondul natural. Oxazolidinonele au fost iniial utilizate n terapie ca inhibitori ai monoamin-oxidazei, pentru tratamentul depresiei, dar ulterior s-a descoperit c au i activitate antimicrobian. Primul agent al acestei clase a fost produs de compania DuPont de Nemours, la sfritul anilor 70 pentru controlul bolilor foliare bacteriene i fungice la diferite plante, inclusiv la tomate. Modificarea chimic a oxazolidinonei a dus la descoperirea a doi ageni, eperezolid i linezolid, cu activitate in vitro i toxicitate diminuat. Linezolid are activitate in vitro, fa de N. gonorrhoeae i N. meningitidis i are o eficien bun fa de multe bacterii Gram pozitive anaerobe (grupul Bacteroides fragilis). Bacteriile Gram negative sunt probabil intrinsec rezistente, deoarece posed pompe de eflux, eficiente fa de linezolid. In vitro, linezolid are o eficien relativ bun fa de M. tuberculosis i foarte bun fa de Nocardia.

Structura molecular a linezolidului

Concentraiile subinhibitorii de linezolid diminu producerea hemolizinei i coagulazei la S. aureus i inhib sinteza streptolizinei O i DN-azei la streptococi. Mecanismul de aciune i rezisten. Oxazolidinonele sunt inhibitorii sintezei proteinelor ribosomale la bacterii, dar spre deosebire de ali ageni antimicrobieni cu aciune asupra ribosomilor, oxazolidinonele au un mecanism unic de aciune deoarece blocheaz prima treapt a asamblrii ribosomilor din subunit ile disociate. Oxazolidinonele se leag de un situs al subunitii 50S, la interfaa sa cu subunitatea 30S i previn formarea complexului de iniiere 70S, care cuprinde ARN-fMet, ARNm i cele dou subuniti ribosomale. Linezolid se leag de subunitatea 50S, la sau lng situsul care leag cloramfenicolul i lincomicina, deoarece cele 3 molecule intr n competiie pentru situsurile de legare din domeniul V al ARN 23S al subunitii 50S. Domeniul V este centrul peptidil-transferazei, care catalizeaz formarea legturii peptidice. Spre deosebire de cloramfenicol i lincomicin, linezolid nu inhib formarea legturilor peptidice i ntre ele nu exist rezisten ncruciat. Asemntor majoritii inhibitorilor sintezei proteinelor ribosomale, activitatea linezolidului fa de bacterii in vitro este considerat bacteriostatic, deoarece bacteriile sunt omorte mai ncet decat de agenii bactericizi. Linezolid este metabolizat prin oxidarea inelului morfolino i se formeaz doi metabolii: acidul aminoetoxiacetic i hidroxietil glicina. Linezolid este un agent antimicrobian cu spectru larg de activitate, virtual fa de toate bacteriile Gram pozitive. ntreaga cantitate administrat, pe cale oral sau parenteral rmne disponibil aciunii antimicrobiene. Perioada de njumtire permite administrarea a dou doze/zi. Un parametru esenial al unui agent chimioterapeutic este indicele terapeutic, adic raportul dintre doza toxic minim i doza cu eficien maxim. Valoarea mare a acestui raport este caracteristic agenilor chimioterapeutici foarte eficieni.

Bibliografie selectiv
1. Black J.G., Microbiology. Principles and Applications. Third Edition. Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. 1996, p: 332-352. 2. Huang H.W., Chen F-Y., Lee M-T., Molecular Mechanism of Peptide-Induced Pores in Membranes, Physical Review Letters. 2004, 92: 198-304.

59

3. Liebetrau A., Rodloff A.C., Behra-Miellet J., Dubreuil L., In Vitro Activities of a New Des-Fluoro(6) Quinolone, Garenoxacin, against Clinical Anaerobic Bacteria, Antimicrobial Agents and hemothera y 200 , 47(11): 3667-3671. 4. Mihescu G., Microbiologie general si virologie. Editura Universitatii Bucuresti. 2000. 5. Musser J.M., Antimicrobial agents resistance in mycobacteria: molecular genetic insights, Clinical Microbiology Reviews. 1995, 8: 496-514. 6. Todar's Online Textbook of Bacteriology, The control of microbial growth, Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology, 2002. 7. Topley and Wilsons Microbiology and Microbial Infections, Vol. I , II, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman. 1998. 8. Tortora G.J., Funke B.R., Case C.L., Microbiology. An Introduction. Fifth Edition. The Benjamin/Cummings Publishing, Co., Inc., Redwood City, CA, 1995, p: 167-188. 9. Wistreich A.G., Microbiology Laboratory Fundamentals and Applications (Hardcover), 1996. 10. Wolfson W.S., Hooper D.C., Fluoroquinolone antimicrobial agents, Clinical Microbiological Reviews, 1989, 2, (4): 378-424.

60

Capitolul 4 ANTIBIOTICELE. CARACTERIZAE GENERAL

Definiia iniial a antibioticelor ca substane chimice cu greutate molecular mic, produse de microorganisme prin procese de biosintez, s-a completat ulterior, deoarece antibioticele sunt substane chimice obinute prin biosintez, semisintez sau prin sintez chimic, care n concentraie mic inhib multiplicarea sau omoar microorganismele. Definitorie pentru noiunea de antibiotic, rmne capacitatea de a fi produs prin biosintez de ctre microorganisme. Producerea antibioticelor a evoluat ca un mecanism ecologic de inhibiie a creterii altor microorganisme, cu care intr n competiie pentru resursele energetice. Fenomenul se numete antibioz (descris de Pasteur, l877) i are o semnificaie funcional opus simbiozei. Dar, microorganismele productoare de antibiotice reprezint o proporie foarte mic din totalul microorganismelor din sol. Faptul c antibioticele se sintetizeaz la sfritul fazei de cretere, pare s nu le confere un avantaj competitiv real. Gratia i Dath (1924) au studiat microorganismele din sol i n filtratul acelular al culturii de actinomicete au evideniat efectul inhibitor al unei substane pe care au denumit -o actinomicetin. Fleming (l928), n cutarea unor compui cu potenial antibacterian, a observat i nhibiia creterii coloniilor de Staphylococcus aureus n vecintatea coloniilor fungice de Penicillium notatum. Apoi a artat c mediul lichid al culturii de P. notatum, diluat de 800 de ori, a inhibat creterea culturii de Staphylococcus. A descoperit medicamentul miracol pe care l-a denumit penicilina, dar n-a izolat-o, pentru care a fost distins cu premiul Nobel. Calitile ei de medicament miraculos au fost evideniate de ctre Ernst Chain i Howard Florey (1939), care au izolat-o i au folosit-o n tratamentul infeciilor bacteriene n timpul celui de al II-lea rzboi mondial. Producia industrial a nceput n l943. Noul medicament a fost introdus n circuitul clinic general n 1944 i a avut un impact uria asupra strii de sntate a populai ei umane. R. Dubos (1939) a izolat gramicidina i tirocidina din Bacillus brevis, active fa de bacteriile Gram pozitive. S. Waksman (1944 - 1945) a izolat streptomicina din Str. griseus, un microorganism izolat din sol, pentru care a primit premiul Nobel. Streptomicina este activ fa de unele bacterii Gram pozitive i fa de Mycobacterium tuberculosis. El a propus denumirea de antibiotic, cu sensul de compus chimic produs de un microorganism, care la concentraie mic, inhib sau omoar alte microorganisme. Antibioticele au fost eseniale n lupta cu maladiile infecioase i au contribuit esenial la creterea speranei de via n secolul XX. Dup introducerea penicilinei n clinica general (1944), infeciile grave (faringita streptococic) pn atunci, au devenit vindecabile. Azi, dependena omului de antibiotice este total. Numai n SUA, n 1998, pentru uzul uman s-au folosit circa 12,5 tone de antibiotice. Dac se adaug cele administrate n hrana animalelor i n agricultur, se apreciaz c n ultimii 50 de ani s-au produs i s-au utilizat peste un milion de tone. Antibioticele sunt produse de trei grupe de microorganisme: actinomicete, bacili Gram pozitivi i fungi filamentoi microscopici. Actinomicetele sunt cele mai bune productoare de antibiotice i ali metabolii secundari cu activitate biologic. Genul cel mai reprezentativ, Streptomyces, a fost izolat din tubul digestiv al unui pui de gin. Cephalosporium a fost izolat din apa mrii, lng un canal de deversare a apelor menajere, iar Bacillus, dintr-o ran tegumentar a unei fetie (Tracy) i de aici s-a dat denumirea antibioticului bacitracina. Estimrile numrului de substane antibiotice variaz: unii au inventariat circa 5.000 antibiotice identificate, iar alii evalueaz cifre net superioare de ordinul a 10 000. Actinomicetele produc peste 2/3 din totalul antibioticelor, iar speciile g. Streptomyces produc 70-80% dintre metaboliii secundari. Pentru terapia infeciilor umane i animale se folosete un numr restrns (circa l00), produse de reprezentanii a 5 genuri de microorganisme: Bacillus, Streptomyces, Micromonospora, Penicillium, Cephalosporium. Celelalte sunt toxice ori au efecte defavorabile asupra organismului sau sunt lipsite de selectivitate. Izolarea microorganismelor productoare de antibiotice este foarte laborioas, de exemplu din l34.700 tulpini bacteriene izolate din circa 5.000 de probe diferite de sol, o singur tulpin a prezentat interes practic. n perioada descoperirii celor mai multe antibiotice (anii 1950 - 1960) s-au identificat tetraciclina, eritromicina i kanamicina, agenii antifungici candicidina i nistatinul, precum i substane cu efect antineoplazic (adriamicina). Marea majoritate a antibioticelor se obine n procese industriale, pe cale microbiologic. n prezent, numai poriunea major a moleculei de antibiotic este sintetizat de microorganisme, iar restul moleculei este sintetizat pe cale chimic. Se obin astfel antibiotice de semisintez sau prin metode de bioconversie. n unele cazuri (de exemplu, cloramfenicolul), ntreaga molecul se sintetizeaz pe cale chimic, datorit structurii sale moleculare simple. Convenional, n categoria antibioticelor sunt incluse i substanele de semisintez sau cele sintetizate artificial, dar pe care microorganismele le pot sintetiza total sau parial. Aceast meniune (c

60

microorganismele le pot sintetiza total sau parial) este necesar, pentru ca din categoria antibioticelor s se exclud compuii cu efect antibacterian sintetizai numai pe cale chimic (sulfamidele) sau cei produi n organismele superioare (lizozimul). Structurile moleculare complexe ale antibioticelor combin derivai a dou sau mai multe grupe de metabolii: aminoacizi, glucide, bazele acizilor nucleici, intermediari ai sintezei lipidelor. Acetil-CoA i propionil-CoA formeaz catene lungi (ca n sinteza acizilor grai) i rezult poli-F cetone (RCO CH2CO CH2-), care se condenseaz pentru a forma inelele macrolidelor, polienelor, tetraciclinelor sau poriuni ale moleculei altor antibiotice.

4.1. Antibioticele metabolii secundari

Substanele biogene preluate de celul sub o form simpl, sunt folosite de celul n urmtoarele direcii eseniale: - pentru sinteza metaboliilor primari (aminoacizi, baze purinice i pirimidinice, enzime, acizi grai), necesari biosintezei constituienilor structurali, rezultatul fiind creterea celulei. Aceti compui se sintetizeaz faza de cretere primar, denumit i trofofaz; - pentru producerea energiei, n metabolismul energetic i a produselor metabolismului energetic (produi de fermentaie alcoolic, lactic, butiric, propionic, acid etc.); - pentru producerea (uneori) a metaboliilor secundari (antibiotice, alcaloizi, ergotina, giberelina). Metaboliii secundari se sintetizeaz n faza de cretere secundar, idiofaz, dup epuizarea unui nutrient major (sursa de C sau de N), fiind denumii i idiolii nu sunt eseniali pentru creterea celulei i sinteza lor este expresia procesului de difereniere biochimic. Metaboliii secundari au structuri chimice particulare, nu sunt eseniali pentru creterea organismului productor, dar probabil au rol n asigurarea supravieuirii n mediile naturale. Diversitatea chimic i structurile neobinuite ale metaboliilor secundari sunt ilustrate de numrul mare de clase crora le aparin: aminozaharuri, quinone, cumarine, epoxizi, alcaloizi ergot, glicozide, derivai indolici, lactone, macrolide, naftalene, nucleozide, peptide, poliacetilene, poliene, piroli, terpenoide, tetracicline etc. Metaboliii secundari conin legturi chimice neobinuite: inele F-lactamice, peptide ciclice alctuite din aminoacizi normali i modificai, legturi nesaturate de poliacetilene i poliene, inelul macrolidelor. Multe produse naturale de importan medical (antibiotice), alimentar, industrial sau agricol sunt metabolii secundari. Metaboliii secundari sunt produi numai de unele specii ale unui gen, ca familii de compui strns nrudii: cel puin 10 peniciline naturale, 10 bacitracine, 25 actinomicine etc. Proporia diferitelor componente n amestec depinde de factori genetici, de factorii de mediu i se datoreaz relativei lipse de specificitate a enzimelor implicate n metabolismul secundar. n contrast, procesele de biosintez ale metaboliilor primari sunt totdeauna catalizate de enzime cu specificitate nalt: enzima recunoate un singur substrat i se formeaz un singur produs. Specificitatea aciunii enzimelor care catalizeaz sinteza metaboliilor primari se datoreaz faptului c erorile de biosintez a componentelor celulare eseniale sunt, n general, letale, iar erorile care survin n metabolismul secundar nu au consecine semnificative pentru celula productoare, deoarece metabolitul secundar modificat i pstreaz, de regul, activitatea biologic. Metaboliii secundari se sintetizeaz pe o varietate mai mare de ci, dect cei primari. Dei au structuri chimice foarte diversificate i se sintetizeaz pe ci variate, metaboliii secundari se asambleaz dintr-un numr limitat de metabolii intermediari. Antibioticele sunt metabolii secundari a cror sintez ncepe trziu n timpul fazei de cretere, la intrarea n faza staionar. Experienele de autoradiografie cu aminoacizi marcai au evideniat c n perioada n care miceliul crete cu o rat nalt, aminoacizii se ncorporeaz n proteinele celulare, dar nu se sintetizeaz actinomicin. Dup ce microorganismul a ncheiat faza de cretere, rata ncorporrii aminoacizilor n proteine scade considerabil. Waksman (1961) a intuit c proprietatea anumit or microorganisme de a sintetiza antibiotice nu este corelat cu nici un mecanism esenial al nutriiei i creterii celulei. n general, sinteza metaboliilor secundari din categoria antibioticelor este supresat n timp ce celulele se gsesc n faza de multiplicare activ i este cea mai rapid dup ce cultura intr n faza staionar. Comparativ cu metaboliii primari, antibioticele au specificitate redus de biosintez, deoarece acelai organism sintetizeaz, de multe ori, un grup de molecule nrudite. Cele dou faze, trofofaza i idiofaza, sunt bine separate la o cultur bacterian productoare de antibiotic, dar nu sunt clar delimitate pentru microorganismele filamentoase (actinomicete i fungi). Criteriul evalurii creterii masei celulare este determinarea greutii uscate. n numeroase procese de biosintez industrial cu microorganisme filamentoase, greutatea uscat continu s creasc semnificativ n idiofaz, dar cu o rat mai mic dect n trofofaz. Determinarea greutii uscate nu este un criteriu optim pentru evaluarea

61

creterii. Masa celular const din totalitatea structurilor necesare diviziunii celulare (organitele celulare) i din materialele de rezerv (polioli, lipide, polifosfai i glucide nestructurale), care pot s reprezinte 50 - 60% din greutatea uscat a celulei la sfritul procesului de biosintez. Creterea greutii uscate n idiofaz este rezultatul acumulrii substanelor de rezerv, o cretere cu caracter nereplicativ (nu este asociat cu diviziunea celular),. De aceea, parametrul optim pentru msurarea creterii masei replicative a celulei, este determinarea cantitativ a ADN. n acest caz, creterea celulei poate fi disociat de producerea de antibiotic. Sfritul fazei de cretere replicativ este marcat de ali parametrii: scderea ratei activitii respiratorii i scderea ratei sintezei ARN. Cele dou faze sunt bine delimitate n cazul fermentaiei antibioticelor (cloramfenicol, colistin, penicilina, bacitracina) n mediile organice complexe, care favorizeaz creterea rapid a culturii discontinue asincrone, dar se suprapun ntr-un grad semnificativ, n mediile chimic definite (sintetice), care favorizeaz creterea lent. Factorul care controleaz declanarea biosintezei antibioticelor este deficiena unuia sau mai multor componente nutriionale care limiteaz creterea. Epuizarea unui astfel de factor oprete creterea i iniiaz biosinteza idioliilor. n mediile definite chimic, favorizante ale creterii lente, unul sau mai muli factori nutriionali pot fi limitani ai creterii chiar de la nceputul cultivrii, dar favorabili sintezei antibioticelor. Momentul sintezei produsului nu este un criteriu totdeauna valid pentru a defini metabolitul secundar. Microorganismele par a fi programate s produc antibiotice numai cnd rata specific de cretere scade sub un anumit nivel. Fenomenul s-a stabilizat n evoluie, ca rspuns la presiunile competitive. n mediile bogate n substane nutritive, ca de exemplu intestinul mamiferelor, producerea antibioticelor nu este necesar, deoarece resursele satisfac necesitile metabolice ale ntregii asociaii. n mediile naturale majore (sol, ap), nutrienii sunt totdeauna limitani pentru creterea diferitelor asociaii de microorganisme heterotrofe i sinteza antibioticelor devine avantajoas pentru supravieuire. Microorganismele evit efectul letal al antibioticelor pe care le produc (sinuciderea) prin modificarea i detoxificarea antibioticelor de ctre enzime sintetizate de organismele productoare; alterarea intei antibioticului n celula productoare; scderea permeabilitii pe faa extern a membranei, dup ce antibioticul a fost excretat. Unele antibiotice au rol n dinamica proceselor de sporulare (de exemplu, polimixina, produs de Bacillus polymyxa). Altele sunt produse secundare, rezultate din degradarea peretelui celular, corelat cu sporularea, deoarece peretele conine D-aminoacizi i glucide care se regsesc n compoziia chimic a unor antibiotice. Condiiile de mediu necesare sporulrii i secreiei metaboliilor secundari sunt adeseori asemntoare i chiar mai stringente dect acelea necesare creterii vegetative. S-a crezut c sinteza metaboliilor este obligatorie pentru sporulare, dar unele tulpini fungice sporuleaz chiar n absena producerii metabo liilor secundari. Cei mai muli metabolii secundari sunt sintetizai de organisme cu cretere filamentoas i cu morfologie relativ complex. Sinteza metaboliilor secundari, la microorganisme, este asociat cu procesele de sporulare. Se disting 4 categorii de metabolii secundari a cror sintez este declanat de procesul de sporulare: - metabolii care activeaz sporularea (acidul linoleic, la Asp. nidulans); - pigmenii structurilor de sporulare (melaninele necesare formrii sau integritii sporilor sexuai i asexuai). Melaninele sunt pigmeni de culoare nchis care se formeaz prin polimerizarea oxidativ a compuilor fenolici, se sintetizeaz n timpul sporulrii i sunt depozitai n peretele celular, avnd rol protector fa de radiaiile UV, dar sunt i factori de virulen; - metabolii toxici secretai la timpul sporulrii (micotoxinele); - antibiotice. Metaboliii secundari sunt substane neeseniale pentru organismul productor, crora li se atribuie urmtoarele activiti biologice: - inhibiia creterii sau chiar efectul letal asupra altor organisme din mediu; - efecte toxice fa de organismele multicelulare (nevertebrate, plante); - stimuleaz diferenierea microorganismelor; - au rol n transportul ionilor metalici. Metaboliii secundari au semnificaie adaptativ pentru microorganismele productoare, deoarece sinteza lor este determinat genetic, iar pe de alt parte, multe clase de compui prezint o adaptare remarcabil de a interaciona cu intele lor. Unii metabolii au activitate biologic chiar la concentraiile mici produse n mediile naturale.

62

Antibioticele produse de Streptomyces se sintetizeaz n cantiti mici, n faza de tranziie, cnd creterea miceliului vegetativ ncetinete, ca rezultat al epuizrii nutrienilor i miceliul aerian este gata s se dezvolte pe seama nutrienilor eliberai prin degradarea hifelor vegetative. Astfel de antibiotice ar avea rolul de a proteja organismul productor, de alte microorganisme care tind s consume resursele nutritive din mediu. Uneori, antibioticele produse de diferitele specii ale unui grup au aciune sinergic: de exemplu, antibioticele F-lactamice i acidul clavulanic (produs de Str. clavuligerus). Acidul clavulanic este un inhibitor natural al F-lactamazelor, care confer rezisten la F-lactamice. Antibioticele F -lactamice i ale inhibitorilor F-lactamazei sunt eficiente fa de bacteriile rezistente la F -lactami. Efectul sinergic al asociaiei este reflectat de denumirea dat combinaiei acidului clavulanic cu meticilina: augmentin. Coproducerea cefamicinei (un antibiotic F-lactamic) i acidului clavulanic este constant: nu exist prodctori cunoscui de acid clavulanic, care s nu produc cefamicine (Challis, Hopwood, 2003). Multe specii de Streptomyces produc dou sau mai multe antibiotice, cu aciune sinergic fa de un organism competitiv care domin numeric asociaia natural (Majundar i Kutyner, 1962). Astfel, Str. avermitilis sintetizeaz doi compui antifungici cu structuri diferite: oligomicina i un macrolid polienic. Cele dou antibiotice au inte moleculare distincte: oligomicina inhib o sintaz mitocondrial, iar macrolidul polienic se leag ireversibil de membrana celulelor fungice, alternd permeabilitatea lor. Oligomicina i macrolidele polienice pot aciona sinergic fa de fungi. Probabil c un competitor fungic al lui Str. avermitilis, l-a selectat pe ultimul pentru sinteza acestor antibiotice.

Structura molecular a oligomicinei

Creterea fungic i sinteza antibioticului sunt rezultatul interaciunii dintre miceliul fungic, substrat i condiiile de mediu. Sinteza este influenat de condiiile mediului de cretere a fungilor. Multe antibiotice sunt metabolii secundari, produi n condiii suboptimale de cretere sau n prezena unor cantiti limitante de nutrieni. Temperatura, umiditatea, aeraia, pH-ul, rata de cretere influeneaz masa fungic i sinteza antibioticelor. Sinteza neribosomal a proteinelor Cele dou categorii de proteine celulare i antibiotice polipeptidice se sintetizeaz dup mecanisme diferite. Dovezile experimentale au fost aduse utiliznd inhibitori metabolici. De exemplu, cloramfenicolul i puromicina, inhibitori ai sintezei proteinelor celulare, stimuleaz ncorporarea aminoacizilor n actinomicin. n absena sintezei proteinelor celulare, rezerva de aminoacizi poate fi folosit exclusiv pentru sinteza antibioticelor. Nu toate proteinele se sintetizeaz pe ribosomi. Sinteza neribosomal a peptidelor are loc la procariote i la eucariotele inferioare i se bazeaz pe principiul matriei cu S (thiotemplate), catalizat de complexe enzimatice mari multifuncionale, denumite peptid-sintetaze, care sunt organizate n module (un modul de iniiere a sintezei i mai multe module de alungire a catenei peptidice) (Lengyel i Soll , 1969). Fiecare modul este alctuit din mai multe domenii, care determin alungirea catenei polipeptidice prin adugarea succesiv a aminoacizilor. Unele polipeptide, cu mai puin de 50 de aminoacizi, pot fi asamblate de peptid-sintetaze, ca i ali compui, ca de exemplu acizii grai, a cror sintez este catalizat de alte sintetaze. Produsele peptidice de sintez neribosomal includ ciclosporina (cu aciune imunosupresoare) i antibiotice ca gramicidina S,

63

tirocidina A i surfactinele. Structura modular a peptid-sintetazelor determin alungirea secvenial a catenei peptidice, prin adausul de aminoacizi specifici. Modulele au un model comun de organizare care le permite activarea aminoacidului fixat i realizarea unei legturi peptidice, ca i modificarea aminoacidului fixat prin reacii de epimerizare sau N-metilare. S-a demonstrat experimental c un modul de alungire trebuie s posede cel puin 4 domenii: - un domeniu de adenilare (A) cu activitate de peptid-sintetaz care fixeaz aminoacidul i l activeaz printr-o reacie de adenilare; - un domeniu de tioesterificare (T sau PCP- peptidyl carrier protein) care menine peptidul nascent asociat cu sintetaza, pe ntreaga durat a sintezei prin intermediul unei legturi tioesterice; - un domeniu de condensare (C) prin care sintetaza catalizeaz formarea legturilor peptidice; - un domeniu specific (Te) cu activitate de tioesteraz care permite eliberarea peptidului de complexul sintetazei, dup terminarea sintezei. Spre deosebire de calea de sintez proteic clasic (ribosomal) care utilizeaz doar 21 de aminoacizi (20 de aminoacizi eseniali i selenocisteina), sinteza non-ribosomal poate utiliza peste 300 de aminoacizi (de exemplu, D-aminoacizi, aminoacizi N-metilai etc.), ns peptidele sintetizate nu pot depi o secventa de 48 de aminoacizi. Peptid-sintetazele, ca i alte complexe enzimatice (de exemplu, poliketid-sintetazele) sunt interesante datorit posibilitii utilizrii lor n biosinteza produselor nenaturale (Gotlieb, 1967). Majoritatea peptidelor sintetizate pe cale neribosomal de microorganisme sunt clasificate ca metabolii secundari, adic rareori au rol n metabolismul primar, n cretere sau n reproducere, dar sinteza lor a evoluat cu un oarecare beneficiu pentru organismul productor.

4.2. Biosinteza antibioticelor

Producerea industrial a antibioticelor presupune, n primul rnd, transferul inoculului din laborator n instalaia industrial, n condiii de sterilitate. Procesul creterii microorganismului productor i al biosintezei antibioticului dureaz ntre 3 i 10 zile. n etapa a doua, mediul este supus prelucrrii pentru ndeprtarea celulelor, iar supernatantul este supus procedeelor specifice pentru purificarea antibioticului i determinarea proprietilor antimicrobiene prin metoda difuziei n mediul nutritiv agarizat, repartizat n plci Petri. Pe mediul din plci se nsmneaz microorganismul test i se aplic rondelele de hrtie de filtru mbibate n soluia de antibiotic. n funcie de diametrul zonei de inhibiie, se stabilesc proprietile antimicrobiene ale antibioticului, n comparaie cu aceea a unei soluii standard de antibiotic. Puterea antimicrobian se exprim n uniti de activitate/mg de produs. Unitatea de activitate este Q g. Pentru penicilin, o unitate de activitate (UA) este 0,6 Qg. Antibioticele sunt sintezate ntr-o serie de reacii, supraadugate reaciilor metabolice eseniale. Antibioticele sunt metabolii secundari i multe dintre ele se sintetizeaz cnd fosfatul devine factor limitant al creterii. Cile sintezei metaboliilor primari (aminoacizi, enzime, vitamine) sunt interconectate cu cile sintezei metaboliilor secundari. Procesele prin care metaboliii primari sunt transformai n metabolii secundari sunt ci de biosintez. Factori reglatori ai sintezei antibioticelor. Cile de biosintez a unor antibiotice sunt ramificate. Ele au un trunchi comun, care ulterior se ramific i duc la sinteza unui metabolit primar i a unui metabolit secundar (Martin i colab., 1980; 2000). n unele cazuri, metabolitul primar inhib prin feed-back, trunchiul comun al cii i astfel inhib sinteza antibioticului. Astfel, lizina, un precursor al penicilinei, inhib sinteza penicilinei i cefalosporinei de ctre P. chrysogenum. Lizina este factorul reglator major al sintezei antibioticelor F -lactamice: calea biosintezei penicilinei se ramific din calea lizinei n stadiul acidului Eaminoadipic. Lizina acioneaz asupra homocitrat-sintazei, prima enzim n calea sintezei penicilinei. Fiecare microorganism productor, ca i fiecare antibiotic, au caracteristici proprii i, n consecin, tehnica producerii industriale este adaptat acestor particulariti. Glucoza, cea mai bun surs de C pentru creterea bacterian, interfer cu biosinteza multor antibiotice. Polizaharidele i oligozaharidele sunt adeseori surse mai bune de C dect glucoza, pentru sinteza antibioticelor. Intr-un mediu care conine glucoz i un alt glucid cu o rat mai mic de metabolizare, curba de cretere a culturii reflect o cretere diauxic: ntr-o prim etap este folosit glucoza, fr producerea antibioticului. Dup ce glucoza este epuizat, pentru biosinteza antibioticului este metabolizat cea de-a doua surs de C. Glucoza, datorit ratei crescute cu care este metabolizat, favorizeaz creterea rapid a masei celulare, dar inhib sinteza multor antibiotice prin efectul supresor asupra unor enime: - represeaz biosinteza kanamicinei, datorit represiei N-acetil-kanamicin-aminohidrolazei, probabil ultima enzim a cii de biosintez a kanamicinei; - represeaz (dar nu inhib) ncorporarea valinei C14 n penicilin; - interfer cu biosinteza streptomicinei prin represia ultimei enzime a cii de biosintez.

64

Amoniul sau orice surs de N uor asimilabil represeaz enzimele implicate n utilizarea altor surse de N: nitrit-reductaza, nitrat-reductaza asimilatorie, arginaza, ornitin-transaminaza, proteazele extracelulare, enzimele degradative ale purinelor, transportul ureii i enzimele care o ncorporeaz n compuii organici ai celulei. Fosforul este un factor limitant foarte important al creterii pentru multe specii de microorganisme care produc antibiotice: Str. griseus (produce candicidina), Str. aureofaciens, nainte de sinteza tetraciclinei. Fosforul regleaz sinteza unor antibiotice: peptidice, macrolide, poliene, tetraciclina. Producerea industrial a acestor antibiotice se desfoar la concentraii mici de P anorganic, limitante ale creterii. Concentraiile mari, de pn la 300 mM favorizeaz creterea masei celulare a microorganismelor productoare, iar cele sub 10 mM sunt favorabile sintezei antibioticelor. Adugarea P anorganic nu numai c interfer cu sinteza antibioticelor, dar dup cteva ore determin reversia celulelor produc toare de antibiotice, la starea de cretere. Celulele unui microorganism productor sintetizeaz antibioticul pe toat durata viabilitii. Celulele rmn viabile atta timp ct sursa energetic este disponibil. Cauzele ncetrii biosintezei sunt urmtoarele: - declinul ireversibil al uneia sau mai multor enzime ale cii de biosintez a antibioticului. Activitatea sintetazelor antibioticelor peptidice scade rapid n cteva ore dup declanarea sintezei antibioticului; - efectul de feedback al antibioticului acumulat. Cteva antibiotice inhib propria lor biosintez: cloramfenicolul, cicloheximida, puromicina etc. - epuizarea precursorilor intermediari ai antibioticului. Biosinteza penicilinei Structura de baz a tuturor tipurilor de peniciline este acidul 6-aminopenicilanic, ce const dintr-un inel tiazolidinic i un inel F -lactamic. La acidul 6-aminopenicilanic, n poziia 6, este ataat o caten variabil (Arnstein i Margreter, 1958; Fawcett i colab., 1976; Muller i colab., 1991). Microorganismul productor este o tulpin de Penicillium chrysogenum, nalt productoare, selecionat prin mutagenez. Faza iniial (de fermentaie) este cea n care se asigur cultivarea i creterea n condiii optime a microorganismului productor. Cultivarea se face n tancuri de mare capacitate, prevzute cu dispozitive de aerare cu aer steril, de agitare i de reglare a temperaturii. Sinteza optim a antibioticelor F-lactamice produse de fungi este n mare msur dependent de sursele de C disponibile. Mediul de cultivare conine lactoz (ca surs de C), fin de rapi (surs de azot), sruri minerale (sulfat de sodiu, sulfat de amoniu, carbonat de calciu, monofosfat de potasiu etc.). La nevoie se adaug, n condiii de sterilitate, o substan tensioactiv, care stimuleaz dezvoltarea miceliului fungic prin dispersarea culturii i mrirea gradului de aerare i un agent antispumant, care oprete formarea spumei datorit agitrii, aerrii i agentului tensioactiv. Compuii hidrofili ai cefalosporinelor sunt sintetizai de fungi, bacterii Gram pozitive i Gram negative, iar penicilinele hidrofobe sunt produse numai de fungii filamentoi. Fazele sintezei au fost identificate prin utilizarea atomilor marcai (C14 i C 12, H3 i N15). Primele dou trepte ale biosintezei penicilinei i cefalosporinei sunt comune (Trip i colab., 2004). Penicilinele i cefalosporinele naturale sunt formate din aceiai aminoacizi: acidul L-E-aminoadipic, L-cisteina, L-valina. Acidul L-E-aminoadipic este un aminoacid neproteic i este sintetizat pe calea aminoadipatului specific fungilor, care duce la formarea L-lizinei (Brakhage, 1998; Qeener, 1990). n prima reacie, cei 3 aminoacizi precursori sunt condensai pe cale neribosomal n tripeptidul H (LE- aminoadipil)- L- cisteinil- D- valina (ACV). Condensarea neribosomal a tripeptidului limiteaz calea sintezei. Toate reaciile necesare formrii tripeptidului sunt catalizate de o singur enzim multifuncional, denumit ACV-sintetaz. Originea acidului E-aminoadipic este diferit la fungi i la actinobacterii. La fungi, produsul este un intermediar al cii lizinei, iar la actinobacterii, acidul E-aminoadipic este produsul de catabolism al lizinei. n treapta a doua, nchiderea inelului oxidativ al tripeptidului linear duce la formarea unei structuri inelare biciclice acidul aminopenicilanic, adic inelul F-lactamic cu 4 atomi, fuzionat cu inelul tiazolidinic format din 5 atomi. Nucleul comun biciclic este comun pentru toate penicilinele. Reacia este catalizat de izopenicilin-N-sintaza. Rezult izopenicilina N, a crei activitate de antibiotic este slab. n treapta a treia a biosintezei, lanul lateral al acidului L-E -aminoadipic al izopenicilinei N este schimbat cu un grup acil hidrofob. Schimbul este catalizat acil CoA-izopenicilin N-acil-transferaz. Tripeptidul ACV se formeaz pe calea mecanismului sintezei neribosomale a matriei cu S, din aminoacizii precursori. Sistemul multienzimatic al ACV-sintetazei este alctuit din monomeri cu mase moleculare de circa 420 kDa i manifest activiti catalitice diverse: 1) recunoaterea specific a celor 3 aminoacizi i activarea

65

lor; 2) formarea punii peptidice; 3) izomerizarea L-valinei la forma D i eliberarea peptidului. Ca i n biosinteza ribosomal a peptidelor, funcia COOH a aminoacidului este activat prin formarea unei anhidride cu E-fosfatul din ATP i eliberarea pirofosfatului (P-Pi). Dup activarea unui aminoacid, aminoacil-adenilatul este clivat sub aciunea unei enzime thiol. Se formeaz o legtur tioesteric ntre enzima thiol i aminoacid, cu eliberarea AMP. Aminoacizii tioesterificai joac acelai rol ca i aminoacizii legai de ARNt n biosinteza peptidelor ribosomale. Ei sunt intermediari cu energie nalt, care devin intele atacului nucleofilic al gruprii NH2 al unui al doilea aminoacid. Astfel se formeaz legtura peptidic. Ca i n sinteza ribosomal, peptidul nascent crete de la captul NH2, spre captul COOH, iar peptidele intermediare rmn legate de enzim, ca tioesteri. Specificitatea de substrat este mai puin strict dect n sinteza proteinelor. Microorganismul productor sintetizeaz, n mod obinuit, mai multe tipuri de penicilin, cu aceeai structur de baz, dar care difer dup natura catenei laterale ataat nucleului biciclic prin intermediul unei funcii amidice. Dac procesul de biosintez se desfoar fr adugarea catenei laterale, sunt produse penicilinele naturale (penicilina G sau benzil-penicilina). Dintre penicilinele naturale, numai penicilina G (benzil-penicilina) este utilizabil n clinic. Pentru penicilina G, molecula precursoare a catenei laterale este acidul fenil-acetic (C6 H5CH2) sau unul din derivaii si (fenilacetatul de Na sau fenilacetamida). Acidul fenilacetic rezult i prin transformarea fenil-etilenaminei din extractul de porumb, n acidul fenilacetic. Biosinteza industrial a penicilinei cu P. chrysogenum s-a realizat utiliznd lactoza ca surs de C, deoarece furnizeaz cel mai nalt titru al penicilinei. Glucoza n exces determin reducerea ampl a titrului penicilinei. Deoarece separarea penicilinelor prin purificare este un proces dificil, n mediul de cretere se adaug molecule precursoare ale catenei laterale, care asigur sinteza unui anumit tip de penicilin, inhibnd sinteza celorlalte tipuri. Cea mai util penicilin, cea cu activitate fa de bacteriile Gram negative, este rezultatul unui proces de biosintez, combinat cu o cale chimic, prin adugarea precursorilor specifici n timpul fermentaiei. Se obin astfel peniciline de semisintez (ampicilina, amoxicilina, meticilina). n acest caz, benzil-penicilina produs n mod natural de miceliul fungic, este clivat chimic sau enzimatic i rezult acidul 6aminopenicilenic, supus modificrii chimice prin adugarea unei catene laterale. Penicilinele de semisintez au avantajele unui spectru mai larg de activitate i ale administrrii orale. Compoziia mediului de cultur este diferit de la un productor la altul. Sursa de carbon a mediului este glucoza i lactoza, iar sursa de aminoacizi i de factori de cretere este hidrolizatul de porumb (corn steep), un ingredient major al mediului. Glucoza poate fi folosit ca unic surs de carbon, dar are dezavantajul metabolizrii rapide i al efectului de represie prin catabolit, de aceea, trebuie s aib o concentraie mai mic i s se adauge treptat. Sunt mai favorabile metodele de cultivare continu. n culturile discontinue se folosesc ambele surse de carbon. Lactoza se metabolizeaz lent i nu produce fenomenul represiei prin catabolit. Uleiul de floarea soarelui are rol de surs de carbon, dar este n primul rnd agentul antispumant. CaCO 3 se adaug pentru stabilitatea pH. Mediul conine microelemente i obligatoriu, un precursor care s furnizeze precursorii catenei laterale a antibioticului, orientnd sinteza spre un anumit tip de penicilin. Prin adugarea moleculelor precursoare adecvate, sinteza poate fi orientat n sensul producerii sintezei penicilinei specifice. Acidul fenilacetic (C6H5-CH2 COOH) este precursorul sintezei penicilinei G. Pentru sinteza penicilinei V, ca precursor se folosete acidul fenoxiacetic (C 6H5-O-CH2-COOH). Penicilinele sunt sintetizate ntr-un proces de cultivare submers, n fermentatoare de 40.000200.000 litri. Este un proces strict aerob i necesit aerare energic. Penicilina este un metabolit secundar tipic. Faza fermentativ dureaz circa 120 de ore la 25o i cuprinde trei etape: a) etapa iniial, n care are loc creterea microorganismului productor, pe seama metabolizrii glucozei. Producerea de antibiotic este nesemnificativ; b) etapa de maturaie, dup epuizarea sursei de carbon, cu sinteza masiv de antibiotic; c) etapa de declin sau de mbtrnire, n cursul creia producerea de antibiotic este nul i survine chiar scderea cantitii sale prin degradare. Procesul produciei de antibiotic, strict aerob este urmrit prin controlul modificrilor biochimice (pH, concentraia lactozei i a NH3), caracteristicile microbiologice (aspectul i gradul de dezvoltare a miceliului) i a concentraiei de antibiotic n mediul de cultur. Procesul este submers, necesit o aerare eficient i este oprit n momentul n care ntreaga cantitate de lactoz din mediu a fost metabolizat. n absena sursei de carbon, creterea miceliului nceteaz i survine autoliza. NH3 alcalinizeaz mediul i la pH alcalin, penicilina este instabil. Penicilina se elibereaz n mediu. Sub 1% rmne asociat cu miceliul fungic. Miceliul se ndeprteaz prin filtrare. Tulpina de Penicillium notatum utilizat iniial pentru biosinteza penicilinei, a produs 6 mg/l. n 1941, n SUA au nceput studiile pentru ameliorarea randamentului de producie al tulpinii de P. notatum i pentru

66

identificarea unor noi tulpini productoare de penicilin. S-a identificat astfel o nou specie, P. chrysogenum, cu un randament de producie mult mai bun, de 60 mg/l. Studiile de selecie s-au fcut prin mutagenez cu raze X i UV, cu azotiperit. S-au urmrit dou aspecte: obinerea unor tulpini lipsite de pigmentul galben chrisogenina care ngreuneaz operaiile de purificare a antibioticului; obinerea tulpinilor nalt productoare de penicilin, peste 20 g/l. Cele mai multe tulpini obinute n programele de dezvoltare sunt mutante reglatoare. Obinerea lor se bazeaz pe conceptul c mecanismele de control ale sintezei antibioticelor pot fi depite prin procese mutaionale. Producia industrial a penicilinelor i cefalosporinelor se realizeaz cu mutante nalt productoare de Penicillium i respectiv Cephalosporium acremonium. Cefamicinele sunt produse de specii de Streptomyces. S-au obinut mutante de Penicillium i Cephalosporium care cresc n profunzime, n condiii de aerare, cu randament de producie de 4500 UI/ml benzil-penicilin, ceea ce echivaleaz cu 30 g/l, n bioreactoare cu volume de 250-400 m3. De obicei, mutantele sunt genetic instabile i necesit msuri de meninere a potenialului de biosintez i de conservare. Cele mai adecvate metode de conservare sunt pstrarea celulelor vii n azot lichid (minus 196o) sau liofilizarea sporilor. Reglarea biosintezei penicilinei Sinteza penicilinei este supus mecanismului reglrii feed-back al sintezei metaboliilor primari. Dei penicilina este un metabolit secundar, sinteza sa este influenat de metaboliii primari, deoarece acetia sunt precursorii metaboliilor secundari. Astfel, mecanismele reglatoare ale sintezei metaboliilor primari influeneaz producerea antibioticului. Unul dintre cei trei aminoacizi care particip la sinteza nucleului comun al penicilinei este L-valina. Biosinteza valinei este reglat printr-un mecanism feed-back: valina exercit o aciune inhibitorie a activitii primei enzime a lanului de biosintez. Dac prima enzim este inactivat, biosinteza valinei este inhibat i astfel este inhibat biosinteza penicilinei. Dac n mediu se adaug lizina, biosinteza penicilinei scade foarte mult. La fungi, lizina se sintetizeaz pe calea acidului E-aminoadipic. Lizina exercit o inhibiie feed-back a activitii primei enzime a lanului de biosintez, enzim implicat n sinteza acidului E -aminoadipic. Extracia antibioticului Lichidul obinut la sfritul primei faze este vscos, cu miros puternic i conine substane toxice, compui piretogeni i numeroase impuriti, care depesc de sute de ori cantitatea de antibiotic. Extracia antibioticului din mediu se face cu solveni organici (pentru penicilin, cu acetat de amil sau acetat de butil la pH = 2,5). Cele insolubile (tetraciclina) se separ i se solubilizeaz n solveni speciali sau separarea unora (streptomicina, neomicina) se face cu ajutorul rinilor schimbtoare de ioni. Antibioticul separat din supernatantul de cretere este supus unui proces de purificare, sterilizare, splare, cristalizare i uscare n vid. Dac dup controalele finale, chimice, microbiologice i toxicologice (pentru absena toxicitii i a substanelor piretogene) ndeplinete condiiile de utilizare, antibioticul este standardizat n raport cu o unitate de activitate stabilit prin convenie internaional i este trecut n faza ultim, cea de condiionare (repartizare n fiole, flacoane etc.) sub form de pulberi cristaline (prin sublimarea n vid a soluiilor) sau ncorporat n diferite substane. Penicilina se prezint ca o pulbere alb, microcristalin, hidrosolubil i netoxic pentru om, chiar n doze mult mai mari dect cele active fa de microorganisme. S-au produs peste l00 de peniciline de biosintez. Pentru obinerea celor mai utile peniciline se folosete procedeul combinat, fermentativ i chimic, prin care rezult peniciline semisintetice. Cefalosporinele (nocardicina, acidul clavulanic i tienamicina) sunt antibiotice F -lactamice care conin inelul dihidrotiazin, n loc de tiazolidin. Au fost descoperite ca fiind produse de Cephalosporium acremonium, dar sunt sintetizate i de ali fungi, ca i de unele procariote. C. acremonium produce 4 tipuri morfologice de celule, care reprezint stadii ale ciclului de cretere: hife, artrospori, conidii, gemule. Diferenierea morfologic a lui C. acremonium pare a fi legat de sinteza cefalosporinei C. Rata maxim a sintezei cefalosporinei C coincide cu conversia fragmentelor hifale la artrospori. Sinteza cefalosporinei C este influenat de metionin. Adugarea metioninei n mediul de fermentaie mrete semnificativ producia de antibiotic. Metionina are rol de donor de S pentru sinteza antibioticului i este un inductor al anumitor enzime implicate n sintez (H-(L-E-aminoadipil-L-cisteinil-D-valin) sintetaza, izopenicilin N sintetaza = ciclaza), dar are i o funcie reglatoare i stimuleaz formarea artrosporilor. Sinteza cefalosporinei C de ctre C. acremonium pare a fi nsoit de creterea cantitii de acid linoleic.

67

Acidul clavulanic are o importan clinic deosebit, pentru c dei nu este un antibiotic foarte eficient, se administreaz n asociaie cu F -lactamicele, deoarece este cel mai bun inhibitor al sintezei Flactamazelor. Semisinteza Utilizarea penicilinei G (de biosintez) prezint cteva dezavantaje importante: este sensibil la penicilinaze, enzimele care o inactiveaz prin aciune asupra ciclului F-lactamic; este instabil n mediul acid al stomacului i de aceea se administreaz numai prin injectare; se elimin foarte repede din circulaie, prin rinichi. Pentru a menine o concentraie activ, se injecteaz la intervale scurte; este activ numai asupra bacteriilor Gram pozitive. Obinerea antibioticelor de semisintez se bazeaz principiul utilizrii moleculei native, de la care se obin diferite derivate mai active, prin metode de sintez. Moleculele rezultate sunt asemntoare celor naturale, cu valoare terapeutic superioar sau fr valoare. Numai benzil-penicilina, penicilina V i acidul clavulanic sunt molecule naturale. Celelalte peniciline, toate cefalosporinele i cefamicinele sunt derivate ale moleculelor obinute prin biosintez. Atomii moleculei de penicilin sunt reactivi i permit un spectru larg de modificri. Practic, fiecare atom din structura penicilinei i cefalosporinei naturale, cu excepia celui de N din ciclul F -lactamic, a constituit sediul unei modificri chimice (Diaconu, Nechifor, 1988). Multe antibiotice sunt rezultatul unei singure modificri, iar altele rezult dup dou sau chiar mai multe transformri succesive. Cele mai importante modificri chimice ale moleculei native sunt: - dezacilarea penicilinelor i cefalosporinelor naturale n scopul obinerii acidului 6 -aminopenicilenic (A6AP), respectiv acidului 7 aminocefalosporinic (A7AC); - acilarea gruprii 6(7) NH2 din A6AP, respectiv A7AC i obinerea penicilinelor i cefalosporinelor semisintetice; - transformarea penicilinei n cefalosporine prin extensia ciclului; - modificarea poziiei 3-acetoxi din cefalosporinei; - esterificarea grupei 3-carboxil a penicilinei. Cele mai importante antibiotice de semisintez sunt ampicilina, oxacilina, meticilina. Jumtate din molecul se obine prin biosintez, iar cealalt jumtate prin sintez chimic. Penicilinele de semisintez sunt diferite de cele de biosintez, prin catenele laterale. Fungii din g. Penicillium nu sintetizeaz acidul 6aminopenicilanic. Penicilinele de semisintez se obin din penicilina G, supus aciunii unei enzime, penicilinacilaza, extras din E. coli. Enzima scindeaz catena lateral (radicalul benzil) i elibereaz acidul 6aminopenicilanic. Ulterior, pe calea sintezei chimice, gruparea aminic este acilat cu diferii radicali i rezult diferite peniciline de semisintez. Sinteza chimic Cercetrile privind posibilitatea sintezei chimice a antibioticelor F -lactamice au fost stimulate n special de dificultatea metodelor de separare-purificare. Creterea randamentului de biosintez, odat cu utilizarea tulpinilor nalt productive (de 100 de ori mai productive dect tulpina de origine izolat de Fleming), a fcut ca metoda sintezei chimice s rmn numai de interes tiinific.Sinteza chimic are ca scop obinerea unor molecule analoge celor naturale, cu activitate antimicrobian superioar, mai ieftine, fr efecte secundare asupra macroorganismului. Pe cale sintetic s-au obinut peniciline, cefalosporine peneme, carbapeneme i monobactame. Biosinteza streptomicinei Tulpinile nalt productoare de streptomicin s-au obinut prin selecia tulpinilor mutante sub aciunea radiaiilor UV i x. Mediile adecvate pentru obinerea streptomicinei de ctre S. griseus s-au dezvoltat empiric. S-au utilizat medii definite chimic (sintetice) i medii organice complexe. n scop industrial se folosesc mediile complexe (Eshman i colab., 1994). Sursa de C pentru sinteza streptomicinei este D-glucoza, dar pot fi folosite i alte monozaharide sau dizaharide din familia hexozelor (fructoza, galactoza, maltoza, lactoza), cu excepia zaharozei. Xiloza i manitolul sunt eficiente, iar amidonul are un randament inferior al producerii antibioticului. Sursa de N este complex: hidrolizatul cu tripsin al caseinei, fina de soia, hidrolizatul de porumb (corn steep), levura uscat, extractul de carne.

68

Concentraia fosfatului anorganic este esenial pentru sinteza antibioticului. Absena fosfatului interfer cu creterea i cu sinteza antibioticului. Odat cu creterea concentraiei P anorganic, rata dezvoltrii miceliului i a sintezei streptomicinei cresc. Peste un nivel critic al P, sinteza streptomicinei scade accentuat. Sinteza maxim a streptomicinei de ctre o tulpin de S. griseus necesit surse adecvate de C i N, oxigenare abundent i concentraii relativ sczute de P anorganic (Distler i colab., 1957; Malmberg i colab., 1993). n dinamica procesului se sintetizeaz cele trei componente fosforilate. Trizaharidul se formeaz prin condensarea celor componente, formndu-se streptomicina i P anorganic. Deoarece D-glucoza este precursorul celor 3 componente, asigurarea condiiilor care duc la creterea cantitii de glucoz i intermediari fosforilai, mresc nivelul sintezei streptomicinei. Sursa de azot este o sare de NH4+ sau nitratul, pentru limitarea creterii miceliului. Concentraia de fosfat anorganic este foarte mic, deoarece are efect inhibitor asupra sintezei unei enzime streptomicinfosfataza. Unul dintre intermediarii biosintezei streptomicinei este streptomicin-fosfatul. Temperatura de cretere este de 27 - 29o, la pH 7 - 8, cu aerare eficient. Procesul de biosintez parcurge dou faze: - n prima faz, alturi de streptomicin, se formeaz streptomicina B (manozido-streptomicina), care conine un rest de manoz legat de C4 al N-metil-L-glucozaminei, prin legtur E-glicozidic. Procesul de biosintez trebuie dirijat n sensul formrii manozido-streptomicinei, mai puin activ dect streptomicina; - n faza a II-a, streptomicina B este hidrolizat sub aciunea manozidazei, la streptomicin, dup eliberarea manozei. Aciunea manozidazei este influenat de concentraia glucozei din mediu. Enzima se activeaz numai dup ce glucoza a fost epuizat, la 32o, pH 8. Dihidrostreptomicina este un antibiotic de semisintez. Se obine pe cale chimic, prin hidrogenarea catalitic a streptomicinei, n cursul creia gruparea aldehidic a streptozei se transform n grupare alcoolic. S-au identificat tulpini de Streptomyces, care sintetizeaz dihidrostreptomicina. Hidroxistreptomicina rezult prin oxidarea gruprii metilice a streptozei. Este sintetizat de Str. griseocarnus. Sinteza antibioticelor polipeptidice Polimixinele sunt produse de diferite tulpini de B. polymyxa. B. colistinus produce colistina. Fiecare tulpin produce un singur polipeptid. Tulpinile productoare de antibiotice sunt frecvent mucoide i sporogene. Compoziia mediului de cultivare, n special natura surselor de C i N, influeneaz profund cantitatea de antibiotic sintetizat. Mediile care favorizeaz creterea optim nu sunt cele mai bune pentru sinteza antibioticului. Polimixina A este sintetizat pe mediu reprezentat de bulionul nutritiv, suplimentat cu glucoz sau sucroz i urme de ioni de Mn. Maltoza, lactoza, rafinoza stimuleaz sinteza polimixinei, la fel ca i glucoza, dar sucroza este mai puin eficient. B. polymyxa produce cantiti mari de polizaharid extracelular, o piedic important n calea izolrii antibioticului. Sinteza polizaharidului este supresat prin adugarea unor concentraii mai mari de sulfat de amoniu (4,2%) la mediul sintetic, dar randamentul sintezei de polimixin scade cu 50%. Producia optim de polimixin este optim n mediul cu 0,5% extract de levuri i sulfatul de amoniu (2%), ca surs de azot. Sinteza polimixinei ncepe dup ce creterea miceliului fungic este aproape complet i continu n faza staionar pn cnd se produce sporularea sau liza culturii. n timpul creterii, pH-ul mediului scade, dar cnd creterea este complet, valoarea pH crete. Sinteza antibioticului ncepe n momentul nceperii creterii pH. Sinteza polimixinei este strns dependent funcional de capacitatea de sporulare a tulpinii bacteriene. Mutantele care nu sporuleaz nu sintetizeaz antibioticul. Sinteza poliketidelor Aproximativ 2/3 dintre poliketidele bioactive ca produse naturale sunt sintetizate de actinobacterii. Alte organisme productoare de poliketide sunt mixobacteriile i fungii filamentoi. Sinteza este catalizat de un aparat enzimatic complex, prin reacii de condensare repetat, ce leag precursori carbonai cu molecul mic (grupri acil de 2 - 3 atomi de C derivai din tioesterii CoA) (Pffeifer i Koshla, 2001; Peiru, 2005). Procesul se aseamn n multe privine cu sinteza acizilor grai bacterieni i mamalieni. Catena de C este asamblat din uniti cu doi atomi de C, care sunt adugai n molecul sub forma malonil-CoA sau a analogilor si. Acizii grai se sintetizeaz dup acelai mecanism, ceea ce a condus la presupunerea c biosinteza poliketidelor este o variant a cii de biosintez a acizilor grai. Concluzia este c aparatul enzimatic catalizator al sintezei poliketidelor a evoluat din sintazele acizilor grai. Poliketid-sintetazele se clasific n categoria celor de tip I sau de tip II, n funcie de asemnarea cu sintetazele acizilor grai de tip I de la vertebrate sau de tip II, ale

69

bacteriilor i plantelor. Dar, spre deosebire de acizii grai, structurile poliketidelor sunt mult mai diversificate datorit variaiilor structurale ale acizilor grai i modificrilor ulterioare prin glicozilare. Biosinteza acizilor grai este catalizat de un sistem enzimatic cunoscut sub denumirea de sintaza acizilor grai. Rolul de starter al sintezei l are unitatea acetil, care este transferat de o acetil-transferaz din acetil-CoA, la grupul thiol al unei proteine purttoare de acil (PPA) i apoi pe grupul thiol al ketoacil-sintazei. Unitatea de alungire a catenei este malonatul, care este transferat de la malonil-CoA, pe gruparea thiol a proteinei purttoare de acil. Ketoacil-sintaza catalizeaz condensarea celor dou resturi acide, cu eliminarea CO2, pentru a rezulta un rest ketoacil pe gruparea thiol a PPA. Mecanismul sintezei acizilor grai i al poliketidelor a fost studiat utiliznd diferii precursori marcai cu izotopul C13, la un organism productor de antracicline. Casey (1978) i ulterior Kitamura (1981) au detectat pe cale autoradiografic, ncorporarea izotopului C13 n atomii specifici ai agliconului antraciclinelor. Ketoreductaza reduce gruparea keto la gruparea OH. O dehidrataz scoate apa i produce o dubl legtur, redus ulterior de o enzim cu NADPH la un lan de C saturat. Dup ce grupul acil alungit cu doi atomi de C este transferat pe grupul thiol al ketoacil-sintazei, ciclul se repet, ncepnd cu reacia de transfer a grupului acil. Cnd catena acidului gras a atins lungimea predeterminat, este detaat de complexul keto -acilsintazei, de o tioesteraz. Astfel rezult acidul gras liber. Asemntor sistemului enzimatic care catalizeaz sinteza acizilor grai, biosinteza poliketidelor este catalizat poliketid-sintaz. Poliketidele complexe, de exemplu macrolidele, au poliketid-sintaze specifice pentru fiecare subunitate poliketidic a moleculei. Poliketid-sintazele sunt polipeptide multifuncionale, analoge sintazelor acizilor grai de tip I. Secvena aminoacizilor i a nucleotidelor ADN codificator al diferitelor enzime eseniale sunt bine conservate la diferite specii. Poliketid-sintazele sunt sisteme multienzimatice citosolice, care nu necesit nici un organit pentru meninerea activitii in vitro. Ele utilizeaz un spectru larg de substraturi: acetil-CoA, propionil-CoA, izobutiril-CoA, izovaleril-CoA, malonil-CoA, metilmalonil-CoA, etilmalonil-CoA, propionilmalonil-CoA i hidroximalonil-CoA. Cnd substraturile sunt chirale (chiralitatea este proprietatea a dou corpuri de a se comporta ca un obiect i imaginea sa n oglind, adic cele dou corpuri nu sunt direct superpozabile prin translaie n acelai plan, ci numai dup o rotaie cu 180o) (ca metilmalonil-CoA), acil-transferazele corespunztoare au stereospecificitate strict. Substraturile Ecarboxilate (de exemplu, malonil-CoA i metilmalonil-CoA) sunt surse de uniti de extensie, iar substraturile neutre ca acetil-CoA sunt surse de uniti primer pentru sinteza lanului poliketidic. Intermediarul a crui sintez este rezultatul aciunii poliketid-sintetazelor, pentru a furniza produsul final natural, necesit activitatea unor enzime care-l modific: ciclaze, transferaze (N-metil-transferaze, glicozil-transferaze, acil-transferaze), oxidoreductaze dependente de NADP(H) sau FAD(H) i citocromi. Dei sinteza poliketidelor are loc dup un mecanism foarte asemntor cu acela al acizilor grai, primele prezint o variaie structural accentuat a moleculelor, care survine la diferitele trepte ale sintezei: a) Unitatea starter a biosintezei catenei poliketidelor este variabil. n biosinteza acizilor grai, unitatea de start a sintezei este acetil-CoA. n cazul poliketidelor, sinteza poate fi iniiat de propionil-CoA. b) Variaia unitii de extindere. n biosinteza acizilor grai, catena de C este totdeauna extins cu uniti derivate din malonil-CoA, iar la poliketide extinderea catenei se face prin ncorporarea unitilor propionat din metil malonil-CoA i a unitilor butiril din etil malonil-CoA. Ultimele dau natere catenelor laterale de metil i respectiv etil ale catenei i introduc un centru de chiralitate. c) Variaia numrului unitilor de ketide ale catenei. De obicei, lungimea catenei la acizii grai variaz ntre 6 - 12 uniti acetil (acizii grai au 12 - 24 atomi de C). La poliketide, numrul obinuit de uniti ketidice este cuprins ntre 3 i 10, dar poate ajunge la 25. d) Variaiile reaciilor care produc alungirea catenei. n biosinteza acizilor grai, fiecare reacie de adugare a unei uniti acetat este urmat de reducerea gruprii carbonil la hidroxil, deshidratare n urma creia se formeaz o legtur dubl -C=C-, iar n final o a doua reacie de reducere pentru a rezulta unitatea saturat C2. La poliketide, oricare dintre cele trei reacii, dar i cele care urmeaz, pot fi omise, rezultnd o grupare funcional carbonil, hidroxil sau enoil a catenei de C. e) Variaia reaciilor care urmeaz biosintezei catenei de C. Acizii grai sunt cuplai cu derivaii glicerolului i sfingozinei pentru a produce diferite lipide. n sinteza poliketidelor, soarta catenei de C este mai variat: poate fi ciclizat i formeaz compui aromatici, ca de exemplu antraciclinele i tetraciclina sau poate fi lactonizat pentru a forma macrolide. Lactonele sunt esteri intramoleculari, care au gruparea carbonil (C=O) i se formeaz prin eliminarea unei molecule de H2 O ntre gruparea OH i COOH a hidroxiacizilor. Noile grupri funcionale (carbonil, hidroxil sau enoil) pot fi introduse de enzime specifice (de

70

exemplu gruparea OH 1 i 11 a antraciclinelor). La unele poliketide, gruprile OH sunt glicozilate, ceea ce amplific diversitatea structural a poliketidelor. Metodele de ameliorare a produciei de antibiotice Producia de antibiotice se gsete n impas, datorit fenomenelor de rezisten multipl, ntlnite frecvent la bacterii. Din aceast cauz se preconizeaz obinerea unor antibiotice noi prin tehnica fuziunii de protoplati bacterieni sau fungici. Cele dou tulpini celulare (bacteriene, respectiv fungice) supuse procedeului fuziunii, trebuie s fac sinteza a dou antibiotice diferite, din aceiai familie. Prin cuplarea artificial a celor dou ci de biosintez poate s rezulte un nou antibiotic (un antibiotic hibrid). Fuziunea protoplatilor se poate utiliza n scopul creterii randamentului produciei de antibiotice. Se procedeaz la fuziunea protoplatilor unei tulpini bacteriene nalt productoare, care crete ncet sau este pretenioas la condiiile de cretere, cu o linie bacterian care face sinteza antibioticelor cu o rat inferioar, dar se dezvolt repede i nu are exigene nutritive deosebite. Prin fuziune rezult organisme care cumuleaz proprieti noi, convenabile att n ceea ce privete producia de antibiotice, ct i exigenele nutritive. O alt modalitate de cretere a ratei de sintez a antibioticelor este amplificarea genic. Genele codificatoare ale sintezei antibioticelor sunt cromosomale i extracromosomale (plasmidiale) (Recchia i Hall, 1995). Numrul plasmidelor per celul este variabil n funcie de tipul de control pe care celula l exercit: un control riguros are ca efect existena unui numr mic de plasmide n celula (1- 5 copii); un control relaxat permite creterea numrului de copii plasmidiale per celul (50-l00). n aceste condiii, dac genele codificatoare ale sintezei antibioticului sunt plasmidiale, randamentul sintezei crete foarte mult. Transferul genelor codificatoare ale sintezei unui antibiotic, prin tehnologia ADN recombinant, pare a nu fi realizabil, deoarece genele sunt dispersate. De aceea, s-a recurs la un artificiu: se ncearc mrirea produciei de antibiotic prin grefarea unor gene promotor foarte eficiente, care s grbeasc intrarea n aciune a operonului codificator. O alt cale pentru ameliorarea producerii de antibiotice este biosinteza mutaional sau mutasinteza. Principiul metodologic este urmtorul: sinteza unui antibiotic se desfoar pornind de la un produs iniial, prin etape intermediare, pn la sinteza produsului final. n aceast tehnologie se folosesc microorganisme mutante, cu incapacitatea de a face sinteza unui produs, aproape de captul lanului de sintez. Dac n mediul de cretere se adaug compusul natural, microorganismul produce antibioticul natural. Dac n mediul de cretere se adaug un alt compus, nenatural (de sinteza chimic), celulele ncorporeaz acest produs chimic nou i sinteza este orientat n funcie de natura produsului care a fost furnizat. Aceast tehnic s-a denumit biosinteza mutaional. Pentru producerea antibioticelor noi, industria de biosintez a utilizat dou ci majore: - prin procedee de mutagenez s-a urmrit selecia unor tulpini nalt productoare. Pe aceast cale, randamentul biosintezei de antibiotice s-a ameliorat permanent. Procedeul este foarte laborios, deoarece mutageneza este o metoda oarb, ce presupune testarea a mii i mii de tulpini celulare, dup iradiere cu raze UV, X sau dup tratamentul cu substane chimice mutagene (azotiperita). Aceast metod este tipic pentru producerea penicilinei, cu tulpini mutante de P. Chrysogenum (Eishmahan, 1991). Randamentul tulpinilor actuale, obinute prin mutagenez cu radiaii gamma (Co6o) este de mii de ori superior fa de al tulpinii originale; - producerea de antibiotice cu un oarecare grad de modificare chimic, prin procedeul semisintezei. Metoda const n grefarea unui radical chimic, pe o molecul de antibiotic, produs pe o cale natural.

4.3. Clasificarea antibioticelor n funcie de structura chimic

Din punct de vedere chimic, antibioticele sunt un grup de substane foarte heterogene (Bayarski, 2006). Se disting urmtoarele categorii: Antibioticele F -lactamice constituie unul dintre cele mai mari i importante grupe de antibiotice. Toate cuprind n structura lor, inelul -lactamic i sunt foarte diverse: penicilinele, cefalosporinele i cefamicinele. Molecula nativ (benzil-peniclina sau peniclina G) este alctuit din inelul -lactamic i inelul tiazolidinic. La C6 este ataat grupul fenil-acetamido (tabelul 3). La cefalosporine, inelul tiazolidinic are un atom de C suplimentar, cu o legtur nesaturat ntre C3 i C4 i rezult o structur denumit cefem. Cefamicinele sunt similare ca structur chimic, dar inelul -lactamic conine un grup metoxi, care i confer stabilitate la multe enzime -lactamazice.

71

Alte variante structurale ale compuilor -lactamici utilizai n clinic sunt: carbapenem (Imipenem, Meropenem), carbacefem, oxacefem, clavam (acid clavulanic), sulfone, monobactam. Penicilinele semisintetice se obin din acidul 6-aminopenicilanic, care se condenseaz cu orice acid carboxilic. Rezult astfel un numr mare de peniciline: oxacilina i derivaii si, meticilina, ampicilina, amoxicilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilina, ticarcilina. Acidul 6-aminopenicilanic, pentru penicilinele semisintetice, se obine prin tratamentul penicilinei cu o amidaz sau prin cultivarea organismului productor, ntr-un mediu fr donorul gruprii acil. Acidul 6-aminopenicilanic este un dipeptid ciclic, format prin condensarea L-cisteinei i D-valinei i de aceea penicilinele, cefalosporina i cloramfenicolul aparin grupului antibioticelor oligopeptidice. Cloramfenicolul este un antibiotic simplu, sintetizat de Streptomyces, dar n cea mai mare parte se obine prin sintez chimic. Are un spectru larg de aciune: bacteriile Gram pozitive i Gram negative, dar i bacteriile parazite obligat intracelulare (chlamidii, rickettsii). Cloramfenicolul conine o grupare nitro i un grup diclor-acetil. El se leag de subunitatea ribosomal mare i blocheaz transferul peptidil, la ribosomii care alungesc catena. Antibiotice polipeptidice : bacitracina (produs de B. subtilis), gramicidina (sintetizat de B. brevis), cicloserina (produs de Streptomyces), actinomicina, polimixina (sintetizat de B. polymyxa). Bacitracina este un peptid ciclic (tabelul 3) ce mpiedic defosforilarea purttorului lipidic ce transfer noul peptidoglican, prin membrana celulei, n timpul sintezei peretelui celular. Bacitracina deriv dintr-o protein a celulei vegetative, care este degradat parial n timpul sporulrii. Este toxic pentru a fi aplicat sistemic, dar se gsete sub forma unor preparate pentru aplicaii locale. Polimixinele sunt o familie de antibiotice produse de specii de Bacillus. O parte a polipeptidului are o configuraie ciclic, cu o coad hidrofob de acid octanoic (tabelul 4). n clinic se folosesc polimixina B i polimixina E (colistina), precum i derivaii lor sulfometilai. Polimixinele sulfometilate au activitate antibacterian redus, dar se cliveaz spontan i rezult compui mai activi. Tyrocidina i gramicidina S sunt polipeptide ciclice (tabelul 4). Ele produc dezorganizarea membranei, rezultatul fiind pierderea moleculelor mici i liza protoplatilor. Nu se folosesc pentru administrare sistemic, deoarece sunt toxice. Antibioticele aminoglicozidice a cror denumire se termin cu mycin sunt produse de sintez ale unor specii ale genului Streptomyces, iar cele care se termin cu micin sunt sintetizate de tulpini de Micromonospora. Toate aminoglicozidele au un inel format din 6 uniti, cu grupri amino i de aici deriv denumirea de aminociclitol. Molecula lor polar, policationic, conine un aminociclitol (tabelul 5), de care se leag dou sau mai multe glucide, dintre care cel puin unul este aminat. La streptomicin, aminociclitolul este diguanidin-inozitolul (streptidina). Majoritatea aminoglicozidelor au grupul aminociclitol reprezentat de deoxistreptamin. Ele se mpart n derivai ai neomicinei, kanamicinei i gentamicinei. Aminoglicozidele sunt active fa de numeroase bacterii patogene Gram pozitive i Gram negative, dar i fa de M. tuberculosis. Legarea unei singure molecule este suficient pentru inactivarea ribosomului bacterian. Aceste antibiotice nu traverseaz uor membranele celulare. Se absorb cu dificultate din intest in, dar pentru modificarea microbiotei intestinale, administrarea oral este calea optim. Sunt ineficiente fa de bacteriile cu localizare intracelular. Anaerobia i prezena cationilor bivaleni diminueaz eficiena aminoglicozidelor. Se administreaz numai n cazul infeciilor severe (tuberculoza, bruceloza, tularemie, plaga bubonic). Sunt sinergice cu antibioticele -lactamice i se folosesc n septicemiile cu bacterii Gram negative. Pentru a-i exercita efectul bactericid, aminoglicozidele necesit sinteza proteic. Antibioticele poliketide (acetogenine) sunt substane naturale derivate din acizi poli--cetonici, care la rndul lor se formeaz din acetil-CoA i mai multe molecule de malonil-CoA, dup decarboxilare: griseofulvina (produs de Penicillium patulum), tetraciclina (sintetizat de Streptomyces). Tetraciclinele sunt un grup de substane naturale sau de semisintez, a cror formul cuprinde un nucleu tetraciclic linear fuzionat (tabelul 5), de care se ataeaz o varietate de grupri funcionale: clortetraciclina (produs de Streptomyces aureofaciens), oxitetraciclina (produs de S. rimosus). Sunt cel mai important grup de antibiotice, datorit spectrului antibacterian foarte larg. Sunt active fa de bacteriile Gram pozitive i Gram negative, fa de protozoarele parazite (Entamoeba), fa de chlamidii, micoplasme i ricketsii. Acioneaz prin inhibiia sintezei proteinelor, deoarece inhib ataarea aminoacil-ARNt la situsul acceptor ribosomal. Sunt larg utilizate n terapia antiinfecioas uman i animal, deoarece nu produc colaterale majore. Se adaug ca supliment n furaje n doze subterapeutice, pentru stimularea creterii. Antibioticele macrolide. Denumirea de macrolid desemneaz o structur chimic caracterizat prin prezena unui ciclu lactonic cu complexitate variabil, la care se ataeaz componenta glucidic ( tabelul 5). Ciclul lactonic rezult prin nchiderea unui lan lung de acizi grai hidroxilai. Antibioticele macrolide sunt

72

foarte diverse, datorit att variaiei inelului macrolidic, ct i a complexului glucidic. Cele mai cunoscute sunt eritromicina i oleandomicina. Antibioticele steroidice au o structur chimic asemntoare colesterolului. Acidul fusidic (fusidina) este produs de fungii filamentoi din g. Fusarium. Este activ prin legarea de factorul de elongaie G (EFG). Antibioticele polienice se caracterizeaz prin prezena, n molecula lor, a unui anumit numr de legturi duble: nistatina, amfotericina B, candicidina (produse de membri ai g. Streptomyces), iar fumigalina este sintetizat de Aspergillus fumigatus. Antibiotice glicopeptidice . n clinic se folosesc dou glicopeptide: vancomicina i teicoplanina. Vancomicina este o molecul mare, complex, produs de Streptomyces orientalis (tabelul 3). Utilizarea ei este limitat, datorit toxicitii asupra rinichiului. Vancomicina este un heptapeptid rezultat din aminoacizi aromatici modificai i condensai ntr-o structur triciclic, de care se ataeaz un dizaharid. Activitatea sa antimicrobian se datoreaz legrii la catenele laterale de D-alanil-D-alanil ale peptidoglicanului, blocnd formarea legturilor ncruciate ale catenei polipeptidice i este limitat, n esen, la bacteriile Gram pozitive, deoarece, la bacteriile Gram negative mureina acoperit de membrana extern, nu este accesibil antibioticelor glicopeptidice.

4.4. Clasificarea antibioticelor n funcie de mecanismele de aciune

Antibioticele au aciune selectiv: ele nu produc leziuni asupra celulelor organismelor superioare, dar inhib creterea sau omoar agentul infecios. Selectivitatea aciunii este o condiie ideal, pentru c, de exemplu, penicilina produce o stare alergic, independent de aciunea antibacterian i implic o alt parte a moleculei dect cea efectoare a aciunii antibacteriene. Unele antibiotice produc efecte toxice nete la om i animale i folosirea lor este limitat pentru tratamentul infeciilor la care riscul administrrii este mai mic dect consecinele procesului infecios. Antibioticele i datoreaz aciunea selectiv, reactivitii lor chimice mai nalte sau exclusive fa de unele componente ale celulei bacteriene sau fungice, n raport cu celulele umane i animale. Sensibilitatea diferitelor organisme la antibiotice, ca i la agenii chimioterapeutici, variaz n limite largi. De obicei, bacteriile Gram pozitive sunt mai sensibile, deoarece peretele mureinic este o barier mai permeabil pentru moleculele de antibiotic i n plus, sinteza mureinei este o int importan t pentru aciunea unor antibiotice. Bacteriile Gram negative sunt mai puin sensibile, deoarece membrana extern este hidrofob, iar moleculele de LPS stabilizate de ionii bivaleni formeaz o structur dens, greu permeabil. Antibioticele se clasific n funcie de spectrul de activitate, adic de diversitatea microorganismelor asupra crora acioneaz: - antibiotice cu spectru restrns de activitate, fa de bacteriile Gram negative: de exemplu, penicilina G este activ fa de cocii Gram pozitivi; - antibiotice cu spectru intermediar de activitate: sunt active fa de bacteriile Gram pozitive, dar i fa de unele bacterii Gram negative: streptomicina, neomicina, gentamicina, kanamicina, cefalosporina; - antibiotice cu spectru larg, active fa de bacteriile Gram pozitive i Gram negative: tetraciclina, cloramfenicolul; - antibiotice antifungice, active fa de infeciile fungice superficiale (de exemplu, griseofulvina) sau fa de infeciile profunde (amfotericina). Nistatinul (stamicin) este activ fa de infeciile tegumentului i ale epiteliilor mucoaselor digestive i vaginale, produse de Candida. Antibioticele active asupra bacteriilor Gram pozitive i Gram negative sunt de spectru larg. Acestea au o utilitate clinic mai larg dect cele active fa de un singur grup de microorganisme, denumite antibiotice cu spectru ngust. Ultimele se folosesc pentru controlul infeciilor care nu rspund la alte antibiotice. De exemplu, vancomicina (un glicopeptid) este activ fa de bacteriile din g. Staphylococcus, Bacillus i Clostridium. n unele cazuri, antibioticele interacioneaz cu molecule caracteristice microorganismelor i de aceea indexul lor terapeutic este foarte nalt. De exemplu, penicilina este activ fa de sinteza mureinei, componenta specific a peretelui bacterian. Penicilina reacioneaz i cu moleculele proprii organismului uman i animal, la concentraii de cteva mii de ori mai mari dect cele necesare pentru a omor bacteriile. Majoritatea antibioticelor sunt bacteriostatice sau bactericide. Efectul bacteriostatic semnific inhibiia reversibil a creterii, iar cel bactericid are semnificaia unei aciuni letale ireversibile. Excepie fac griseofulvina i antibioticele polienice, care sunt antifungice. Mecanismele de aciune a antibioticelor sunt diferite, consecin a diversitii structurii lor moleculare (fig. 22). Cele mai multe sunt molecule complexe, cu regiuni hidrofobe, ce uureaz difuzia n celule. Cea mai simpl modalitate de a le clasifica, este n funcie de situsul de aciune n celula bacterian:

73

- antibiotice ce acioneaz asupra sintezei componentelor chimice ale peretelui celular (penicilina, cefalosporina, bacitracina, cicloserina, fosfomicina); - antibiotice active asupra sintezei proteinelor bacteriene (aminoglicozide, cloramfenicol, tetraciclina, macrolide, streptogramina); - antibiotice active asupra sintezei acizilor nucleici (rifamicina, novobiocina); - antibiotice active asupra membranei celulare (polimixina, gramicidina, tirocidina, valinomicina, monensina ultimele dou nefolosite n clinica uman). n celul, inhibiia unui proces poate duce la inhibiia sau la stimularea indirect a altor procese, prin alterarea sistemelor feed-back sau a altor mecanisme de control. De aceea, nu se pot trage concluzii ferme din studiul efectelor unui antibiotic asupra unui singur proces celular.

Figura 22. Ilustrarea schematic a situsurilor majore ale aciunii antibioticelor (dupa Dale, 1998).

Antibiotice care inhib sinteza peretelui celular Peretele acoper membrana citoplasmatic, confer forma specific i rigiditate celulei bacteriene, asigur meninerea integritii structurale. Structura chimic unic a peretelui bacterian condiioneaz sensibilitatea lui la cteva grupe de antibiotice, care includ F-lactamii (peniciline, cefalosporine, carbapenemi i monobactami), acidul clavulanic (un inhibitor al F -lactamazelor), antibioticele glicopeptidice (vancomicina, teicoplanina i avoparcina stimulator al creterii animalelor). Sunt de asemenea active asupra peretelui, fosfomicina i cicloserina, dei acestea sunt active asupra cii metabolice a sintezei monomerilor peretelui celular. La bacteriile Gram-negative stratul peptidoglicanic este foarte subire i este acoperit de membrana extern, care reprezint o barier important de permeabilitate, n special fa de ptrunderea antibioticelor (fig. 23).

74

Figura 23. Reprezentarea schematic a membranei externe a bacteriilor Gram negative ( E. coli) (dupa Davis, 1990).

Sinteza peretelui celular este inhibat de antibioticele F-lactamice (peniciline, cefalosporine), inhibitoare ale polimerizrii peptidoglicanului i de vancomicin (tabelul 3). Tabelul 3. Antibiotice inhibitoare ale sintezei peretelui bacterian ( adaptare dup Topley si Wilsons, 1998).
Clasa de antibiotice F-Lactaminele (Peniciline, Cefalosporine, Carbapenem) inta specific PLP/PBP (Penicilin Binding Protein); Transglicozilaze; Transpeptidaze; Carboxidaze.
HO

Structura chimic
O R C H S N N O COOH c f l sp ri R2

CH3 C ON

H3C

NH O c r COO
-

CH3

Bacitracina

Cicloserina Fosfomicina

Lipidul transportor al precursorilor nucleotidici Inhibarea dipeptidsintetazei Inhibarea PEP ??sintetazei

H C H3 C O C

PO3H2 fsfici 

75

Vancomicina

Dipeptidul terminal D-Ala-DAla

AA 1 R1 R2 N+ R3 O HO NH NH O X2 O O OS 2 O AA 3 NH NH X1 O

HO HO

OH

CO 2NH O NH O OS 1

vancomici na

X3

Familia antibioticelor -lactamice cuprinde un numr mare de molecule, reprezentantul cel mai vechi fiind penicilina G; ele se pot clasifica n patru grupe: - peniciline - cefalosporine - carbapeneme - monobactami. Antibioticele -lactamice inhib ultima etap a sintezei peptidoglicanului, adic formarea punilor interpeptidice. Aceti compui prezint o analogie structural cu dipeptidul terminal D - ala - D - ala, care face parte din pentapeptidul mureinic. Problema funciei fiecrei proteine care leag penicilina (PBP Penicillin Binding Proteine) a fost studiat n detaliu E. coli. La aceast specie s-au identificat patru PBP cu greutate molecular mare (PBP 1a, 1b, 2 i 3), cu rol de enzime bifuncionale: catalizeaz transpeptidarea i transglicozilarea peptidoglicanilor. Antibioticele -lactamice interfer cu reacia final de transpeptidare, ce formeaz legturile transversale ntre catenele adiacente de peptidoglican, cele care confer rigiditatea structurii parietale. Antibioticele -lactamice sunt bactericide, dar mecanismul aciunii lor este diferit, asupra bacteriilor Gram pozitive i Gram negative. Bacteriile produc 4 tipuri de proteine care leag penicilina (PBP), asemntoare serin-proteazelor. Unele catalizeaz reaciile de transpeptidare (formarea legturilor ncruciate n peptidoglican) i de carboxipeptidare (modificarea peptidoglicanului) ale asamblrii peretelui celular. PBP, dup legarea penicilinei, transmit un semnal transmembranar pentru inducerea sintezei -lactamazelor. Beta-lactamazele sunt PBP ce catalizeaz hidroliza inelului -lactamic i inactivarea antibioticului. PBP sunt proteine legate de membran (1% din totalul proteinelor de membran), eseniale pentru viabilitatea celulei, cu excepia -lactamazelor care pot fi legate de membran sau secretate. Antibioticele lactamice se leag covalent cu PBP prin acilarea restului de serin din situsul activ. La bacteriile Gram pozitive, antibioticele -lactamice difuzeaz liber spre PBP. La bacteriile Gram negative, porinele membranei externe limiteaz ptrunderea antibioticelor n celul, care se acumuleaz n spaiul periplasmic. Cnd concentraia devine eficient, antibioticele sunt legate de PBP de pe suprafaa extern a membranei celulare. Rezistena se manifest atunci cnd concentraia antibioticului n periplasm este mai mic dect cea necesar pentru legarea i inhibiia activitii PBP. n absena sintezei mureinei, celulele lipsite de perete celular sufer fenomenul lizei osmotice. La cocii Gram pozitivi, antibioticele -lactamice determin pierderea acizilor lipoteichoici parietali. Absena lor elimin controlul procesului autocatalitic, care n mod normal este limitat i dezagreg peptidoglicanul la situsuri strict localizate. Antibioticele F -lactamice sunt active numai asupra celulelor bacteriene tinere, aflate n faza de cretere. Penicilina poate fi administrat n doze mari fa de cele terapeutice, singurul risc fiind manifestrile alergice. Administrat oral, este degradat n cea mai mare parte, de HCl din stomac. De aceea se injecteaz intramuscular sau intravenos. Se absoarbe rapid n snge i este excretat rapid. Din acest motiv se asociaz cu procaina, care diminu excreia i i prelungete aciunea. Penicilina G se folosete pentru tratamentul infeciilor cu streptococi, meningococi, pneumococi, spirochete, bacili aerobi Gram pozitivi, Clostridium. Ii pstreaz activitatea n urin i se folosete pentru tratamentul infeciilor tractului urinar. Carbapenemii reprezint un grup de antibiotice cu efect bactericid, ce conin un antibiotic -lactamic i un compus ce mpiedic degradarea medicamentului n rinichi.

76

Bacitracina (un peptid ciclic) mpiedic defosforilarea moleculei lipidice purttoare, ce transfer molecula de peptidoglican nou sintetizat, prin membrana celulei, n timpul sintezei peretelui celular. Este toxic pentru rinichi i de aceea nu se administreaz sistemic, dar se aplic local pentru tratamentul leziunilor tegumentare i ale membranelor mucoase. Mecanismul aciunii vancomicinei const n blocarea creterii celulei, deoarece formeaz un complex cu D-ala-D-ala din peptidul mureinic. Este activ numai fa de multe bacterii Gram pozitive, pentru c la Gram negative, peptidoglicanul nu este accesibil antibioticului. Nu selecioneaz mutante rezistente. Cocii Gram pozitivi (Leuconostoc) i Lactobacillus sunt rezistente pentru c lanul lateral al peptidoglicanului const din D-alanil-D-lactat, care are afinitate mai mic pentru antibioticele glicopeptidice. Cicloserina inhib competitiv formarea D-ala din L-ala i astfel stopeaz sinteza dipeptidului D-alaD-ala. Este relativ toxic i se folosete pentru tratamentul infeciilor cu M. tuberculosis, rezistent la alte medicamente. Fosfomicina este un inhibitor al piruvil-transferazei i astfel blocheaz sinteza acidului N-acetilmuramic. Cicloserina i fosfomicina se comport ca analogi ai precursorilor peptidoglicanului. Sunt molecule foarte hidrofile i ptrund n citoplasm pe calea sistemelor de transport pentru metaboliii nrudii: fosfomicina este anolog structural cu fosfo-enol-piruvatul, iar cicloserina este analog D-alaninei:

Structura molecular a fosfo-enol-piruvatului

Structura molecular a D-Cicloserinei

Structura molecular a D-Alaninei

Alanina este un compus major al peptidoglicanului i al acizilor teichoici din peretele celulelor bacteriene Gram pozitive. O parte a alaninei parietale se gsete ca izomer D. Prezena D-aminoacizilor (Dala, acidul D-glutamic) n peretele bacteriilor infecioase este considerat ca un mecanism protector fa de mediul intern al organismului gazd. Compuii analogi ai D-aminoacizilor au activitate antibacterian. Antagonitii D-alaninei (D-cicloserina i O-carbamil-D-serina) inhib selectiv ncorporarea D-alaninei n peptidoglican. D-alanina rezult din L-alanin sub aciunea racemazei. Incorporarea D-alaninei este catalizat de D-ala-D-ala ligaz. Creterea E. coli n prezena D-cicloserinei i a sucrozei 0,32 M duce la formarea sferoplatilor, iar n celul se acumuleaz precursorii parietali. Sinteza proteinelor celulare nu este modificat. Adugarea D-alaninei n mediul de cretere reverseaz efectele inhibitorii ale D-cicloserinei. D-cicloserina are dou grupri ionizabile. Este un antibiotic cu spectru larg de activitate, dar este mai eficient fa de bacteriile Gram pozitive dect fa de cele Gram negative. Este foarte important c Dcicloserina inhib creterea M. tuberculosis. O-carbamil-D-serina izolat dintr-o tulpin de Streptomyces are acelai mecanism de aciune: activitatea antibacterian este reversat de D-alanin. Antibiotice antiribosomale (inhibitoare ale sintezei proteinelor) Sinteza proteinelor implic 3 procese de recunoatere macromolecular: selecia ARNt iniiator; selecia codonului iniiator pe ARNm; interacia ARNm i ARNt iniiator cu ribosomul neangajat n sinteza proteinelor. Primul eveniment al iniierii este legarea subunitii 30S de codonul iniiator al ARNm i formarea complexului de iniiere. La procariote, iniierea sintzei proteinelor se face prin legarea N-formil-metionil-ARNt. Dup legarea n polipeptid, N-f-Met este clivat sub aciunea peptidazelor. f-Met-ARNt iniiator ocup situsul ribosomal peptidil (P). Al doillea complex aa-ARNt, ca i toate cele care urmeaz, se leag la nivelul situsului

77

acceptor (A), unde are loc interaciunea dintre codonul ce specific aminoacidul urmtor i anticodonul din secvena ARNt. Formarea legturii peptidice ntre gruparea COOH a f-Met-ARNt legat la situsul P i gruparea NH2 liber a aminoacidului din situsul A, este catalizat de enzima peptidil-transferaz, component a subunitii 50S. Se formeaz un dipeptid legat la situsul A, n timp ce ARNt din situsul P este descrcat de aminoacidul corespunztor (fig. 24). Creterea polipeptidului cu un aminoacid se face prin clivarea acestuia de la ARNt situat n situsul P i legarea la aminoacidul din situsul A. Reacia de clivare-reunire (adic de formare a legturii peptidice) consum energie eliberat prin hidroliza GTP. La sfaritul reaciei, situsul A poart ARNt al celui de al doilea aminoacid, de care este legat un dipeptid (f-Met i al doilea aminoacid legat - o molecul de peptidil-ARNt).

Figura 24. Ilustrarea schematica a mecanismului sintezei proteinelor. Amnunte n text. (dup Dale, 1998).

Situsul P, foarte apropiat de situsul A, accept complexul ARNt-peptidil (ARNt legat cu lanul polipeptidic n curs de biosintez). Translocaia ARNt la situsul P este nsoit de deplasarea coordonat a ribosomului de-a lungul secvenei de ARNm, cu distana egal cu un codon. Astfel, un alt codon este plasat n situsul A, care leag un alt aminoacil-ARNt, pe baza relaiei specifice codon-anticodon.

78

Figura 25. Situsurile de aciune a antibioticelor inhibitoare ale sintezei proteinelor. Quinolonele inhib replicarea ADN. Rifampicina inhib transcrierea. Tetraciclinele inhib traducerea prin blocarea formrii complexului de iniiere. Aminoglicozidele ocup situsul acceptor al ribosomului i induc erori de citire a ARNm. Cloramfenicolul interacioneaz cu ARNr 23S al subunitii ribosomale 50S i inhib formarea legturii peptidice. Eritromicina i clindamicina se leag la subunitatea 50S i interfer cu procesul de translocaie a peptidului nascent, de la situsul acceptor (A), la situsul peptidil (P) (dup Dale, 1998).

Unele antibiotice acioneaz selectiv asupra ribosomilor celulei procariote. Altele (de exemplu, cicloheximida) sunt active fa de ribosomii celulelor eucariote, iar o alt categorie sunt active fa de ambele tipuri de ribosomi. Unele sunt active asupra ribosomilor polisomali (puromicina, cloramfenicolul), iar altele blocheaz numai ribosomii liberi, de iniiere a catenei polipeptidice, pentru c situsurile lor de legare sunt restrictive i nu se pot asocia cu ribosomii polisomali (de exemplu, eritromicina). Unele antibiotice se leag de subunitatea ribosomal mic, iar altele se asociaz cu subunitatea ribosomal mare (fig. 25). Antibioticele cu aciune asupra ribosomilor sunt molecule complexe, adeseori avnd cicluri i grupri cationice, care favorizeaz interaciunile ionice cu ARNr. Spre deosebire de antibioticele care blocheaz sinteza mureinei la nivelul suprafeei externe a membranei citoplasmatice, cele care acioneaz la nivelul ribosomilor trebuie s ptrund n citoplasm. Din punct de vedere chimic, majoritatea sunt aminoglicozide policationice, cu molecule polare. Ele au o regiune hidrofob mare, care uureaz difuzia prin stratul lipidic al membranei. Aminoglicozidele (streptomicina i kanamicina) au activitate bactericid dependent de concentraie. Sunt foarte solubile n ap i insolubile n solvenii organici i de aceea au o capacitate limitat de a traversa membranele lipidice. Aminoglicozidele cationice interacioneaz chimic cu antibioticele -lactamice. Rezultatul este deschiderea inelului -lactamic i acilarea grupului amino al aminoglicozidei, cu pierderea reciproc a activitii antibacteriene. Aminoglicozidele interacioneaz ionic cu suprafaa extern a celulei i sunt transportate n celul. Sursa energiei este gradientul electrochimic al protonilor generai n procesul respiraiei. Cele cationice se leag de resturile ncrcate negativ ale LPS i de proteinele anionice ale membranei externe i nlocuiesc competitiv Mg2+ i Ca2+ care consolideaz LPS adiacente. Ele modific conformaia subunitii 30S a ribosomului polisomal, astfel nct crete rata erorilor de mperechere a codonilor cu anticodonii. Mesajul este tradus greit i se sintetizeaz proteine nefuncionale. Aminoglicozidele sunt active i fa de ribosomii liberi: asocierea antibioticului cu ribosomul liber blocheaz interaciunea acestuia cu ARNm (se blocheaz astfel formarea complexului de iniiere). Sensibilitatea la Str este dependent de subunitatea 30 S, pentru c ribosomii hibrizi formai din subuniti 30 S de la o tulpin Str rezistent i subuniti 50 S de la o tulpin Str sensibil, sunt Str rezisteni. Sensibilitatea la streptomicin este determinat de proteina S12. Streptomicina face ca ribosomul s citeasc greit ARNm i s insere greit aminoacidul.

79

Ribosomul normal ncorporeaz fenil-alanina, ca rspuns la mesajul sintetic poli-U, dar streptomicina stimuleaz intens ncorporarea izoleucinei, a serinei i leucinei ca rspuns la mesajul poli -U. Schimbarea mutaional a unui singur aminoacid ntr-o protein a subunitii ribosomale 30S determin rezistena celulei la streptomicin, dar nu i la antibioticele care conin deoxistreptamina ca grup lateral ataat heterociclului complex, deoarece ele se asociaz cu ambele subuniti ribosomale. Macrolidele (eritromicina, lincomicina i clindamicina) penetreaz greu n celula Gram negativ. Se asociaz cu ribosomii liberi, dar nu cu ribosomii polisomali. Se leag cu subunitatea 50 S i interfer cu procesul de translocaie a polipeptidului nascent, producnd disocierea peptidil-ARNt de ribosom. Dei unele antibiotice care interacioneaz cu ribosomii liberi blocheaz complexul de iniiere, eritromicina stopeaz sinteza proteic numai dup ce s-a sintetizat un polipeptid scurt. Unele antibiotice policiclice mari se leag cu subunitatea mare a ribosomului i blocheaz legarea factorilor de elongaie EFTu (Elongation Factor Thermo unstable) i EFG ( Elongation Factor G, implicat n translocaia peptidului nascent). Acidul fusidic este bacteriostatic, dar la concentraii mari poate fi bactericid. Are o structur molecular de tip steroidic. Spre deosebire de ali inhibitori ai sintezei proteice, nu se leag direct de ribosomi, ci formeaz un complex stabil cu guanozin-trifosfatul i cu factorul de elongaie G. Sinteza proteic bacterian depinde de translocaia peptidil-ARNt de la situsul acceptor ribosomal, la situsul peptidil. Translocaia necesit factorul G de alungire proteic i hidroliza GTP. Acidul fusidic are capacitatea de a stabiliza complexul ribosom-factorul G de alungire GTP fosfat anorganic, inhibnd hidroliza GTP i blocnd alungirea catenei polipeptidice nascente. Puromicina a fost izolat din filtratele de Streptomyces alboniger. Antibioticul este un aminoglicozid substituit, alctuit din 3 componente : - 6-dimetil-aminopurina - 3-deoxi-3-amino-D-riboza - p-metoxi-L-fenilalanina. Legtura glicozidic, n configuraie F ca i n nucleozidele naturale, este clivat de acizi tari (HCl 1N, la 100o, timp de 10 min), condiii n care legtura amidic a aminoacizilor este stabil. Comparativ cu multe alte antibiotice, puromicina are un spectru deosebit de larg al activitii, ce const n inhibiia creterii. Puromicina este un inhibitor al sintezei proteinelor i inhib creterea tuturor organismelor : bacterii, plante, protozoare, animale. Principalul mecanism de aciune al puromicinei, ca agent inhibitor al sintezei proteinelor a fost definit ca rezultat al investigaiei mecanismului biosintezei proteinelor. Datorit analogiei structurale cu aminoacil-ARNt, un intermediar al sintezei proteinelor, puromicina produce terminarea prematur a creterii catenei polipeptidice. Puromicina elibereaz polipeptidul n cretere din complexul ribosom-ARNm, producnd o rupere a legturii ester ntre gruparea COOH a polipeptidului i gruparea OH a adenozinei din ARNt. Clivarea se datoreaz faptului c peptidul este transferat de la ARNt la puromicin. Datorit stoprii sintezei proteinelor, efectul puromicinei const n oprirea creterii celulei. Efectul este predominant bacteriostatic. Sinteza ADN i ARN continu pentru un timp la o rat normal sau aproape normal, dar sinteza proteinelor este inhibat imediat. n celulele mamaliene, inhibiia sintezei proteinelor este reversat rapid dup ndeprtarea puromicinei. Deoarece puromicina este un analog al adenozinei, este posibil ca regiunea aminonucleozidic a moleculei s interfere direct cu metabolismul nucleotidelor. Puromicina are toxicitate crescut asupra organismelor superioare: nefrotoxicitate, stare de ru general etc. Bacteriile Gram pozitive sunt mai sensibile dect cele Gram negative. Diferenele de sensibilitate se pot datora nglobrii reduse a puromicinei. Ionii de Mg2+ mresc sensibilitatea la puromicin. Nu se folosete n terapia antiinfecioas, dar este util n studiul experimental al mecanismului sintezei proteinelor, deoarece interfer cu sinteza proteic, producnd eliberarea prematur a polipeptidului nascent d in asociaia sa cu ribosomul.

80

Structura molecular a puromicinei

Cloramfenicolul se leag reversibil cu subunitatea ribosomal 50 S i blocheaz alungirea peptidului nascent pe ribosom. Ribosomii 80 S nu sunt afectai, dar probabil ribosomii 70 S mitocondriali sunt sensibili la cloramfenicol. Antibiotice care modific permeabilitatea membranei plasmatice Interaciunea unor antibiotice (gramicidina, polimixina, nistatina, amfotericina B) cu membrana plasmatic a celulei bacteriene produce creterea permeabilitii i pierderea proprietilor de membran selectiv. Rezultatul este moartea celulei prin liz osmotic. Polimixina actioneaz asupra membranei citoplasmatice ca un detergent cationic, avnd afinitate pentru gruprile sale cationice. Este singurul antibiotic cu aciune bactericid asupra celulelor aflate n faza staionar, dup ce au depit faza de cretere. Acioneaz asupra membranei externe, pe care o fragmenteaz, ceea ce explic aciunea sa bactericid i selectivitatea fa de bacteriile Gram negative (tabelul 4). Sensibilitatea diferitelor specii variaz foarte mult, ceea ce denot specificitatea interaciunii dintre antibiotic i microorganism. Antibioticele polienice (nistatin, amfotericina B) formeaz complexe cu sterolii din structura membranei plasmatice. Nu sunt active fa de bacterii, deoarece membrana lor nu conine steroli, dar inhib creterea micoplasmelor, deoarece conin steroli. Rezultatul interaciunii cu membranele celulelor sensibile este pierderea permeabilitii selective, pierderea ionilor de K+ i Mg2+ i diminuarea ratei sintezei proteinelor i a ARN. Toate tipurile de celule sensibile la aciunea antibioticelor polienice conin steroli. Sterolii sunt componente comune multor grupe de organ isme: alge, protozoare, levuri, viermi, mamifere etc. Datorit efectului lor asupra permeabilitii membranei, antibioticele polienice mresc eficiena altor antibiotice. Antibioticele polienice se utilizeaz n tratamentul micozelor. Infeciile produse de fungi sunt mai rare dect cele bacteriene, rareori pun n pericol viaa i adeseori sunt lipsite de importan clinic. Tratamentul micozelor cu ageni chimici este limitat, datorit absenei specificitii aciunii lor. Cei mai importani ageni antifungici sunt cei ce acioneaz asupra membranelor celulare, iar dintre acetia, nistatinul i amfotericina B.

81

Tabelul 4. Antibiotice active asupra membranei bacteriene (adaptare dupa Topley si Wilsons, 1998)
Clasa de antibiotice Polipepdide ciclice (Polimixina B, Polimixina E)

inta specific
LPS membranei externe Fosfolipidele membranei externe/interne

Structura chimic

Gramicidinele

Fosfolipide

Gramicidina Tirocidina Fosfolipid

Amfotericina B este produs de Streptomyces nodosus. Mecanismul aciunii sale const n legarea de ergosterolul din membrana plasmatic a celulei fungice, a unor alge i a unor protozoare, dar i de celulele umane. Efectul este creterea permeabilitii membranei, astfel nct glucoza, K+ i alte molecule eseniale ies din celul. Amfotericina B se absoarbe puin din tubul digestiv i de aceea se administreaz prin injectare intravenoas. Rezistena fungic la acest antibiotic nu este cunoscut, dar efectele secundare sunt foarte frecvente i uneori severe. Nistatinul (Micostatin) este produs de Streptomyces noursei. Mecanismul de aciune este acelai ca i al amfotericinei B. Se administreaz local pentru tratamentul infeciilor cu Candida. Nu se absoarbe din intestin i se administreaz oral, numai pentru tratamentul suprainfeciilor intestinale, care adeseori sunt consecutive tratamentului cu antibiotice. Antibiotice care interfer cu funciile acizilor nucleici Rifamicina B este sintetizat natural, iar rifampicina este derivatul semisintetic cu cea mai larg utilizare clinic (Tabelul 5). Rifampicina este alctuit dintr-o grupare cromofor aromatic, inclus ntr-o caten alifatic. Ea se asociaz cu subunitatea B a ARN-polimerazei dependent de ADN i probabil chiar cu ADN n complexul de iniiere, blocnd astfel iniierea transcrierii i sinteza ARN. Antibioticul se folosete n terapia combinat a tuberculozei. Mutantele rezistente, cu subunitatea B a ARN-polimerazei modificat se selecioneaz repede.

82

Structura molecular a rifamicinei B

Actinomicina D (Dactinomicina) este format dintr-o grupare cromofor aromatic i un ciclu peptidic (Tabelul 5). Ea interacioneaz cu ADN i inhib replicarea i transcrierea. Gruparea aromatic se intercaleaz n dublul helix al ADN, la perechile GC, iar peptidul ciclic rmne la suprafa.

Structura molecular a actinomicinei D

Novobiocina interfer cu sinteza ARN, deoarece inhib ARN-polimeraza dependent de ADN, iar griseofulvina inhib replicarea ADN, consecutiv interferenei cu polimerizarea nucleotidelor purinice (tabelul 5). Cercetri recente sugereaz c novobiocina acioneaz asupra subunitii B a ADN-girazei (topoizomeraza II) care produce i menine starea supraspiralizat a ADN. Griseofulvina sintetizat de Penicillium griseofulvum a fost izolat ca un factor care produce dezvoltarea anormal (rsucirea) a hifelor fungice. Se folosete pentru tratamentul infeciilor fungice superficiale. Inhib creterea fungilor micelieni, dar nu este activ fa de bacterii sau levuri. Nu influeneaz creterea fungilor cu perei celulozici, dar inhib creterea fungilor care conin chitin. Griseofulvina influeneaz celulele fungice prin contact direct: creterea hifelor aeriene nu este modificat. Concentraiile mici produc rsucirea hifelor, ramificarea extensiv, micorarea distanei dintre pereii transversali, creterea diametrului. La concentraii mari de antibiotic, modificrile de cretere se amplific i hifele se rup. Injectarea intravenoas a griseofulvinei la obolan determin oprirea mitozei n metafaz, produce mitoze multipolare i nuclei anormali. n miceliile tratate cu griseofulvin scade coninutul de proteine, de acizi nucleici. Antibioticul interfer cu creterea fungic, probabil mpiedicnd incomplet formarea aparatului mitotic de diviziune (tabelul 5).

Structura molecular a griseofulvinei

83

Antibioticele care interacioneaz cu ADN produc efecte nediscriminatorii asupra ADN bacterian, viral sau al celulei eucariote.
Tabelul 5. Antibiotice care interfer cu funciile acizilor nucleici (dupa Topley si Wilsons, 1998): Etapa de inta specific Structura chimic biosintez Replicare ADN-giraza CH3
CH3 OH3C CH3 O O HN CO NH2COO OH OH CH2 O O OH CH C CH3 CH3

Clasa de antibiotice Novobiocina

vi ci 

Rifampicinele

Transcriere

ARNpolimeraza dependent ADN

da

HC

CH3

rifm ici !

Aminoglicozide (Streptomicina, kanamicina, tobramicina)

Traducere

Subunitatea 30S ribosomal (perturbarea citirii ARNm)

H2C HO HO

NH2 O OH O HO O

NH2 NH2 CH2OH OH HO NH2

kanamicina

HOH2C HO HO H3CHN

O H

OH CH3 H CHO O H

HN HO H2N C NH HN

C NH

NH2 O OH

HO

" $ str #t mici na

O C H NH C CH2OH CHCl2

Cloramfenicol

Traducere

Tretracicline

Traducere

Factor de elongare EG-F Inhibiia fixrii aminoacilatARNt. Inhibiia peptidiltransferazei. Factor de elongare EG-F Inhibiia fixrii aminoacilatARNt Inhibiia peptidiltransferazei.

O2N

OH H

cl%ramf&nic%l
H3C OH N(CH2) OH

OH OH O

CONH2 O

t traciclina

'

OH

84

Acid fusidic

Traducere

Factor de elongare EG-F

HO

CH3 H CH2 C CH3 O H HO CH3 CH3 CO CH3 CH2 CH C CH3

acid fusidic
CH3 H C 3 OH OCH3 N O HO H3C H3C O OH OH CH3 O OH O CH3 CH3 CH2CH3 O CH3 O CH3 O

Macrolide

Traducere

Situsul aminoacil (A) de pe subunitatea ribosomal 50S (perturbarea translocaiei)

H3C H3C

eritromicina

Lincosamide

Traducere

Inhibiia fixrii aminoacilatARNt Inhibiia peptidiltransferazei

C H3 N C H3 HO C H7C 3 H C O NH C H HO O OH S C H3 OH

lincomicina

4.5.Determinismul genetic al rezistenei microorganismelor la antibiotice

Utilizarea antibioticelor a reprezentat cea mai important modalitate de control a maladiilor infecioase n secolul 20. Multe maladii infecioase au fost inute sub control prin administrarea antibioticelor, dar totui, infeciile rman cauza principal a morii n lume. Mai mult, infecii care anterior fuseser controlate, devin tot mai comune la pacienii cu disfuncii imunitare (SIDA). Microorganismele care produc aceste infecii sunt adeseori rezistente la antibiotice. Rezistena este capacitatea unui organism de a crete n prezena unui nivel ridicat al unui agent antimicrobian. Rezistena bacterian la antibiotice a fost recunoscut imediat ce antibioticele au fost introduse n clinic. Genele codificatoare ale factorilor de reziste n au preexistat momentului introducerii antibioticelor n clinic deoarece au fost recunoscute n coleciile bacteriene alctuite nainte de utilizarea antibioticelor. n anii 50, Watanabe i colab. au observat c Sh. disenteriae a devenit rezistent nu numai la sulfonamide, dar i la tetraciclin i cloramfenicol (Watanabe i colab., 1961). Rezistena s-a datorat nu numai mutaiilor unor gene cromosomale, ci prezenei ADN extracromosomal, transmisibil, adic este o rezisten mediat de plasmide. Capacitatea agenilor patogeni de a crete n prezena antibioticelor, prin dezvoltarea rezistenei, a fcut ca victimele s fie la fel de vulnerabile ca n era premergtoare utilizrii antibioticelor. Rezistena la toate grupele de antibiotice i la agenii chimioterapeutici a aprut paralel cu folosirea pe scar larg a antibioticelor n clinic i n creterea animalelor, ceea ce a fcut ca multe dintre ele s fie ineficiente: de exemplu, tuberculoza i alte maladii infecioase constituie o problem important de sntate public, datorit seleciei n timp, a tulpinilor rezistente (Rosen i Barkin, 1992). Bacteriile au evideniat o capacitate

85

remarcabil de a dezvolta rezistena la fiecare antibiotic introdus n clinic, adeseori prin mecanisme surprinztoare, care au devenit funcionale foarte repede. Bacteriile rezistente la un antibiotic pot s supravieuiac i chiar s se multiplice n prezena concentraiilor terapeutice de antibiotic. Dezvoltarea rezistenei este inevitabil dup introducerea n clinic a unui antibiotic nou. Rata apariiei tulpinilor bacteriene rezistente la medicamentele noi este de ordinul a 1%. Dar dup 8-12 ani de utilizare intensiv a antibioticelor (n clinica uman i n zootehnie), tulpinile bacteriene cu rezisten multipl au devenit foarte frecvente. Rezistena poate fi natural (intrinsec) sau dobndit prin intermediul genelor de rezisten pe cale mutaional sau prin dobndirea genelor exogene.

Rezistena natural
Rezistena intrinsec se refer la bacteriile insensibile la un antibiotic, n stare natural, fr s dobndeasc factori de rezisten.inta aciunii antibioticului este inaccesibil. Structurile de nveli ale celulei bacteriene formeaz bariere fizice de permeabilitate, care limiteaz sever difuzia liber a moleculelor. Absena intei celulare de aciune a antibioticului este o cauz a rezistenei naturale. Bacteriile din g. Chlamydia (C. trachomatis produce o uretrit nespecific, cauz major a infertilitii umane i produce cele mai multe cazuri de orbire, comparativ cu oricare alt agent infecios), nu sunt sensibile la aciunea inhibitorilor sintezei peretelui celular (peniciline), deoarece nu au peptidoglican, dei au enzimele care leag penicilina (PBP) necesare sintezei peptidoglicanului. Impermeabilitatea nveliurilor semnific faptul c antibioticul nu ptrunde n celul. Multe bacterii posed mecanisme naturale de excludere a moleculelor mici. La bacteriile Gram pozitive, peretele peptidoglicanic gros i relativ rigid, nu confer protecie fa de antibiotice. Prin peretele mureinic cu o porozitate de 1,1 nm, difuzeaz liber antibioticele cu molecul mai mic de 1200 Da. Pentru c cele mai multe antibiotice sunt cel puin parial hidrofobe, pot s difuzeze liber prin membran. La bacteriile Gram negative, membrana extern este o barier protectoare eficient fa de moleculele mici, aa cum sunt antibioticele. Prin difuzia pasiv trec moleculele de ap, O2 , CO2 (molecule mai mici de 0,8 nm), moleculele liposolubile (care se dizolv n lipidele membranei celulare, ca de exemplu, tetraciclina), precum i moleculele organice fr sarcin, pn la dimensiunile glicerolului. Penicilina G a fost primul antibiotic introdus n clinic, dar utilizarea sa este limitat deoarece catena lateral nu permite trecerea prin membrana extern a bacteriilor enterice Gram negative (E. coli). Asemntor, antibioticele macrolide (eritromicina) nu penetreaz membrana extern, dei n sistemele acelulare de E. coli, eritromicina inhib la fel de eficient sinteza proteinelor ca i n sistemele acelulare ale bacteriilor Gram pozitive. Inaccesibilitatea intei datorit impermeabilitii unor structuri, aa cum este membrana extern a bacteriilor Gram negative, este o rezisten pasiv. Dar inaccesibilitatea intei poate fi un proces activ: de exemplu, activitatea pompelor de eflux, dependente de energie, care elimin medicamentul contra unui gradient de concentraie. n vivo, n majoritatea esuturilor se realizeaz concentraii mici de antibiotice, care diminu eficiena antimicrobian. Astfel, Haemophilus influenzae se deplaseaz n interstiiile tisulare ale gazdei, unde antibioticele hidrofile mari (gentamicina) nu realizeaz concentraii mari. Un alt aspect interesant al rezistenei naturale este reprezentat de rezistena microorganismelor fa de antibioticele pe care le sintetizeaz. De exemplu, streptomicetele manifest o rezisten intrinsec fa de antibioticele pe care le produc, ca un mecanism de autoprotecie.

Rezistena dobndit
Dobandirea rezistenei la antibiotice este un proces stadial. Rezistena complet nu este conferit totdeauna de o schimbare imediat a genomului bacterian. Primul stadiu este tolerana sau capacitatea bacteriei de a supravieui n prezena antibioticului, fr s continue creterea i diviziunea. Rezistena se instaleaz atunci cand bacteriile nu numai c supravieuiesc, dar se i multiplic n mediul cu antibiotic. Tolerana favorizeaz dezvoltarea rezistenei. n condiiile presiunii selective, tulpinile tolerante, adeseori devin rezistente. Rezistena la antibiotice are totdeauna un substrat genetic. Bacteriile pot dobndi rezistena la un antibiotic, ca rezultat al mutaiei unei gene cromosomale care modific inta sau al expresiei unei gene cromosomale latente. n populaiile bacteriene, patogene i saprobionte, se gsete o rezerv important de gene de rezisten. Originea genelor de rezisten la antibiotice, ale bacteriilor patogene nu este clar.

86

Perioada de la nceputul tratamentului cu antibiotice (50 - 60 de ani n urm), pn la emergena bacteriilor care exprim mecanisme eficiente de rezisten, este prea scurt pentru a explica dezvoltarea factorilor de rezisten din proteine celulare, prin mutaie spontan. Dac un mecanism de rezisten necesit aciunea cooperant a ctorva proteine (de exemplu, rezistena la vancomicin), generarea de novo a unui mecanism complex de rezisten a unei bacterii patogene este puin probabil. Majoritatea medicamentelor antimicrobiene sunt derivate din metaboliii organismelor din sol, n special fungi i actinomicete. Toate mecanismele de rezisten cunoscute la bacteriile patogene (ARNmetilaze, transportori de tip ABC = ATP binding cassette, aminoglicozid-fosfotransferaze i F -lactamaze), deja exist la productorii de antibiotice. Pentru genele care codific factorii de rezisten la antibiotice se accept dou origini: - prin mutaiile unor gene cu rol n biosintez, ca de exemplu cele care fosforileaz glucidele (kinaze) i acetil-transferazele, care au evoluat prin schimbarea substratului asupra cruia acioneaz, modificand i inactivand antibioticele; - din genele de rezisten existente n mod natural, care probabil au evoluat n mii de milioane de ani n populaiile bacteriene din sol, ca modaliti de protecie fa de antibioticele produse de ele nsele.

Rezistena dobndit prin mutaii

Cele mai multe studii referitoare la rezistena bacterian s-au concentrat asupra evenimentelor mutaionale ale genelor cromosomale. Mutaia este un proces genetic important prin care este dobandit rezistena la antibiotice. Modificrile genetice microevolutive (mutaiile punctiforme) pot modifica sensibilitatea organismelor la antibiotice prin modificarea structural a intei. De exemplu, unele microorganisme i modific enzima -lactamaz prin mutaie punctiform i astfel spectrul de activitate al enzimei se extinde. Rezistena la sulfonamide este consecina schimbrii unui singur aminoacid n secvena enzimei pteridin-sintetaz, care face ca sulfonamidele s se lege mai puin eficient dect APAB. Asemntor, o mutaie punctiform modific o protein ribosomal, ce confer rezisten la streptomicin. Schimbrile genetice macroevolutive implic rearanjarea unor segmente mari de ADN prin transpoziie. Dac schimbrile implic deplasarea genelor de rezisten i trecerea lor sub controlul unui nou promotor, organismul poate deveni rezistent. n timpul stresului, bacteriile saprobionte i cele patogene i sporesc net rata mutaiilor, adic devin hipermutabile. Ele exprim i i duplic informaia de supravieuire, printre care i genele de rezisten la medicamente, localizate pe plasmide, transpozoni i integroni. Pe de alt parte, bacteriile au o mare capacitate de a-i pstra materialul genetic care le confer avantaj selectiv-evolutiv i conserv mutaiile avantajoase chiar n prezena aciunii mecanismelor de reparare a ADN, care au tendina s le corecteze. Iniial s-a presupus c rezistena a fost dobndit prin mutaie spontan. Rezistena mutaional se numete rezisten primar. Erorile sintetzei replicative a ADN i incapacitatea sistemelor de reparare a ADN, duc la o frecven a mutaiei spontane de o pereche de baze/107- 1010 celule, ceea ce nseamn c pentru fiecare 107- 1010 celule, o singur baz sufer modificare. Dar rata mutaiei spontane generatoare a rezistenei este mai mic, deoarece pentru apariia rezistenei primare trebuie s se produc mutaii multiple. Din aceast cauz, s-a considerat c apariia tulpinilor rezistente la antibiotice prin procese mutaionale, n timpul terapiei, este improbabil. Dei mutaia este un eveniment rar, rata foarte rapid de cretere a bacteriilor, favorizeaz exprimarea rezistenei, relativ repede ntr-o populaie celular. Odat ce gena de rezisten prin mutaie a fost stabilizat, poate fi transferat direct la toate celulele descendente (fluxul genelor pe vertical). Rezistena plasmidial Adeseori, izolatele bacteriene au rezisten multipl la antibiotice i la agenii chimioterapeutici. Genele codificatoare ale rezistenei multiple sunt localizate pe plasmidele de rezisten i pe integroni (tabelul 6). Plasmidele R (de rezisten transmisibil, cu caracter infecios), descrise de Watanabe (l961), sunt elemente genetice extracromosomale care confer celulei purttoare, rezisten simultan la mai multe antibiotice, la sulfamide, la cationii metalelor grele. El a demonstrat rezistena simultan a celulelor de Shigella (agentul dizenteriei, bacterie Gram negativ, enteric) la mai multe antibiotice, iar rezistena s-a dovedit a fi transmisibil la celulele tulpinilor sensibile. Plasmidele de rezisten s-au identificat la toate grupele de bacterii i sunt larg distribuite n natur. Transmiterea rezistenei multiple la antibiotice, de la o celul la alta, este atribuit plasmidei R. Acestea sunt molecule de ADN circulare, dublu catenare, care se autoreplic fizic independent de cromosom.

87

Tabelul 6. Mecanismele moleculare ale rezistenei mediat de gene plasmidiale sau cromosomale, la diferite antibiotice (dup Brock, 2003) Antibiotic Mecanismul de aciune Organisme Penicilina, ampicilina, carbenicilina, Hidroliza mediat de -lactamaz Stafilococi, enterococi (rareori), etc. Enterobacteriacee, pseudomonade, Bacteroides sp. Oxacilcina, meticilina, etc. Hidroliz prin -lactamaze Enterobacterii, pseudomonade Cefalosporine -lactamaz Stafilococi, enterobacterii, pseudomonade, Bacteroides Tetracicline Blocarea permeabilitii Stafilococi, enterococi, streptococi, enterobacterii, pseudomonade, Bacteroides Aminoglicozide : Stafilococi, enterococi, Streptomicina Acetilare enterobacterii, pseudomonade Neomicina Fosforilare Kanamicina Adenilare Tobramicina Amikacin Macrolide- Lincinoide : Alterarea ARN 23S Stafilococi, enterococi, streptococi, Eritromicina Bacteroides Clindamicina Trimetoprim Alterarea DF HR (Dihidrofolat Stafilococi, enterobacteriacee reductaza) Sulfonamide Alterarea Tetrahidropteroic-sintetaza Stafilococi, enterococi, streptococi, enterobacterii, pseudomonade, Fosfomicina ? Stafilococi, enterobacterii, Vancomicina Sinteza unei poteine noi Enterococi

Plasmidele R conin informaia genetic ce confer rezisten la mai multe antibiotice, la sulfamide (produi de sintez chimic, derivai ai acidului paraaminobenzoic) i la diferii ageni chimici. Datorit nrudirii chimice dintre diferite familii de antibiotice, o plasmid confer rezisten simltan, la un numr mare de antibiotice. Astfel, celula bacterian devine suprarezistent, att calitativ cat i cantitativ. Datorit rezistenei plasmidiale, bacteriile patogene produc infecii foarte greu de controlat prin mijloacele terapeutice obinuite. Plasmidele R au fost evideniate la E. coli, Proteus, Salmonella, Pseudomonas, Erwinia, Yersinia, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium etc, dar sunt foarte importante pentru stafilococi i alte bacterii Gram pozitive, la care determin rezistena la medicamente. Plasmidele R au o structur genetic complex i sunt alctuite din urmtoarele categorii de determinani genetici: - genele care confer rezisten la antibiotice (genele r ); - genele care confer plasmidei R, funcia de conjugon (transferon). Ele sunt grupate ntr-un transpozon, formnd factorul de transfer al rezistenei (FTR). Se numesc gene tra i codific sinteza proteinelor necesare transferului plasmidei prin conjugare; - secvene de inserie; - secvena de iniiere a procesului de replicare (ori); - genele ce asigur replicarea fizic autonom, a plasmidei. Genele r fac parte din structura unor transpozoni (fiind delimitate de secvene de inserie) i au o mobilitate foarte accentuat, adic se deplaseaz dintr-un situs n altul n structura plasmidei sau ntre plasmid i cromosom. Numrul genelor de rezisten ntr-o plasmid este variabil. Spre deosebire de plasmidele F, plasmidele R nu se integreaz n cromosomul bacterian. Cele dou categorii de determinani genetici, de rezisten i de transfer, pot s existe n stare recombinat sau se gsesc disociai n celula bacterian, ca uniti de sine stttoare: - factorul de transfer al rezistenei (FTR) ce poart gene reglatoare ale replicrii, genele de transfer i uneori gena de rezisten la tetraciclina (tet), cu gr.mol. de 11 x l06 Da; - cellalt component, care conine genele de rezisten la antibiotice i are dimensiuni foarte diferite, ntre cteva milioane - l00 milioane Da. Cele dou plasmide mici se replic autonom.

88

n celulele de E. coli, cele dou plasmide se recombin i formeaz o plasmid mare, care poart att genele de rezisten, cat i pe cele de transfer. n aceast stare, plasmida R se transmite prin conjugare cu o frecven foarte mare: l00% dintre celulele sensibile ale unei populaii celulare ce formeaz cupluri de conjugare, primesc o copie a plasmidei R i devin rezistente (aa numita rezisten infecioas sau transmisibil). Frecvena transmiterii conjugative scade treptat, datorit sintezei unui represor care blocheaz activitatea genelor tra i astfel este inhibat sinteza pilinei i implicit asamblarea pililor. Dac plasmida R nu conine determinanii genetici tra (FTR), transferul su se face prin transducie mediat de un fag de dimensiuni mari, sau prin conjugare iniiat de alte plasmide conjugative. O categorie special de plasmide sunt cele care rspund la feromoni i par a fi limitate la enterococi. Feromonii sunt peptide hidrofobe de 7-8 aminoacizi. Plasmidele sensibile la feromoni codific rezistena la antibiotice, bacteriocine i hemolizin. n acest sistem de transfer conjugativ, celulele receptoare secret o familie de feromoni peptidici. Celulele unei populaii bacteriene care poart o plasmid particular, reactiv la prezena feromonilor, rspund prin sinteza unei adezine care faciliteaz formarea agregatelor de mperechere. Celulele donoare, purttoare ale plasmidei, exprim molecule de suprafa cu rol de agregare (adezine), iar pe suprafaa celulelor receptoare se gsesc substane de legare (Gander, 1998). Celulele care se mperecheaz, realizeaz contacte prin coliziuni aleatorii. Feromonii mresc de 5 - 6 ori rata de transfer a unei plasmide. Dup ce celula receptoare a primit o copie a plasmidei, sinteza feromonului corespunztor este stopat, dar continu sinteza i secreia feromonilor specifici pentru alte plasmide. Rezistena mediat de elementele genetice transpozabile Secvenele de inserie (SI) sunt cele mai simple elemente transpozabile. Ele poart gena pentru transpozaz, flancat la extremiti de secvenele repetate invers (SRI). Deoarece nu poart nici o gen care s codifice un caracter detectabil, se pot i dentifica numai prin capacitatea lor de a produce mutaii. Lungimea lor este mai mic de 1000 pb. Integronii sunt secvene de ADN ce conin determinani genetici ai unui sistem de recombinare cu specificitate de situs. Ei recunosc, nglobeaz i astfel mediaz deplasarea unor scurte secvene mobile de ADN, denumite casete genice (Recchia i Hall, l995). Cele mai multe casete genice cuprind o singur gen de rezisten la antibiotice. Un integron conine o secven ce codific integraza i o secven adiacent de recombinare(att), care recunoate situsul specific de recombinare. Un integron grupeaz i integreaz casete genice multiple. S-au descris 4 clase de integroni (Livermore, 1995): - integronii clasei I, cei mai comuni, conin gena de rezisten la sulfonamid (sul I) ; - integronii clasei a II sunt asociai cu Tn7. Celelalte dou clase de integroni au o distribuie foarte limitat. Frecvent, integronii fac parte din structura unor transpozoni. O caset genic poate exista n dou forme: - ca o secven linear ntr-un integron; - ca o molecul circular de ADN, dublu catenar, ce poart l - 2 gene de rezisten i un situs de recombinare (att) de 59 de nucleotide, cu rolul de a integra caseta genic la situsul specific al unui replicon. Secvenele 5 i 3 care flancheaz caseta genic linear, sunt bine conservate. Regiunea 5 conine gena int, codificatoare a integrazei, o enzim de recombinare la situs specific, iar la captul 3 se gsete gena de rezisten la un antibiotic. Integrarea unei casete genice ntr-un replicon este reversibil. Caseta excizat se integreaz n alt replicon. Prin intermediul casetelor genice, complementul genelor de rezisten poate fi mereu rearanjat i deplasat de pe un replicon pe altul. Integronii sunt sisteme de diseminare a genelor bacteriene, distincte de plasmide i de EGT. Integronii se gsesc aproape exclusiv la bacteriile Gram negative i mediaz rezistena multipl la antibiotice (MDR): aminoglicozide, peniciline, cefalosporine, trimetoprim, tetraciclin, eritromicin, cloramfenicol. Cei mai comuni sunt integronii asociai cu gena de rezisten la sulfonamid (sul I), care poart cel puin 60 de casete genice ce confer rezisten la antibiotice i cei asociai cu Tn7. Rezistena multipl la antibiotice i la agenii chimioterapeutici poate fi datorat diminurii sintezei porinelor, diminurii permeabilitii sau expresiei pompelor de eflux, care au specificitate relativ larg de substrat.

89

Transpozonii sunt segmente de ADN mobile (cu potenial de transpoziie), care includ n alctuirea lor, o serie de gene structurale, delimitate la extremiti de SI, totdeauna repetate n ordine inversat. Mrimea lor variaz ntre 2.l00 9.300 pb. Primii transpozoni, determinani ai instabilitii genetice a culorii seminelor de porumb, au fost descoperii de ctre Barbara McClintock, prin experiene din anii 40, nainte de elucidarea structurii ADN. n anii 60 a devenit evident c sistemele genetice bacteriene, ca i cele eucariote, au un grad nalt de instabilitate. Emergena i rspndirea fenomenului de rezisten la antibiotice a amplificat studiul substratului su genetic. Din punctul de vedere al structurii genetice, Tn simpli sunt asemntori cu SI, dar se deosebesc de acestea prin faptul c n secvena central, poart gene a cror expresie fenotipic este decelabil i confer proprieti noi celulei purttoare (de exemplu, gene de rezisten la Km, Cm, Tc etc.). Genele structurale sunt flancate de secvene repetate lungi (l-2 kb), cel mai adesea n ordine inversat. Secvenele inversate confer o stabilitate superioar structurii Tn. Transpozonii compleci grupai n familia Tn1, au pn la 20 kbp, dar au fost descrii alii mult mai mari (80 kb). Se disting de transpozonii simpli prin aceea c att secvenele de transpoziie cat i secvenele specifice sunt flancate de SRI scurte (40 pb), ca i IS. Majoritatea transpozonilor sunt rezideni n ADN plasmidial sau n ADN fagic. Mai puini transpozoni sunt rezideni n cromosomul bacterian. Transpozonii sunt secvene genetice mobile: se deplaseaz ntre plasmide i cromosom, trec de pe o plasmid pe alta sau transpozeaz ntre diferite situsuri ale aceleiai plasmide. Interesul pentr u studiul transpozonilor s-a amplificat odat cu descoperirea faptului c genele de rezisten la antibiotice pot s treac de la un replicon la altul. De exemplu, gena pentru -lactamaz este foarte mobil, trecnd cu uurin de pe o plasmid pe alta, ceea ce explic rspndirea larg a rezistenei bacteriene la antibioticele -lactamice. Relocarea Tn duce la instabilitate genetic, asociat cu modificri fenotipice, dac transpoziia are ca rezultat inseria unui element Tn ntr-o gen structural. Dac transpoziia are loc ntr-o gen reglatoare, o gen care n mod normal este represat, poate fi exprimat constitutiv i la un nivel superior celui obinuit. Unele elemente transpozabile poart secvene promotoare mai puternice i pot influena expresia genelor din aval de situsul de inserie, producnd mutaii polare. Unele gene de rezisten (TEM--lactamaza) s-au gsit att pe plasmide ct i pe cromosom, la o larg varietate de bacterii. Datorit capacitii de transpoziie i inserie, transpozonii sunt factori majori ai reorganizrii informaiei genetice i n consecin, pentru aglomerarea ctorva gene de rezisten ntr -o singur plasmid. Structura genetic i mobilitatea fac ca rezistena multipl la antibiotice s fie foarte probabil. Transpoziia este o cale uoar i eficient pentru transferul concomitent al rezistenei la cteva antibiotice. Pentru ca un element transpozabil s transpozeze ca o entitate de sine stttoare, este necesar ca transpozaza (o endonucleaz) s recunoasc extremitile sale, caracterizate prin prezena secvenelor repetate invers (SRI). Astfel, dac un transpozon are la o extremitate secvena 5AAAACCCGGT3 3TT TTGGGCCA5, la cellalt capt va avea secvena 5ACCGGGTT TT 3 3TGGCCCAAAA5. Secvenele repetate invers au rolul de situsuri de recunoatere pentru transpozaz, enzima ce catalizeaz procesul de transpoziie. ADN cromosomal i plasmidial bacterian posed un mare rezervor de gene de rezisten, ce codific diferite mecanisme de rezisten la medicamente: pompe de eflux, enzime inactivatoare ale antibioticelor, modificarea intei aciunii antibioticului. Rezistena dobndit prin transferul orizontal al genelor Dezvoltarea larg a rezistenei multiple la multe specii de bacterii, a condus la presupunerea c exist i alte mecanisme pentru dobandirea rezistenei (Kruse si colab., 1994). Evaluarea ratei de apariie a mutantelor rezistente la antibiotice trebuie s in seama de doi factori: - fluxul genetic la bacterii este mult mai amplu dect la celelalte organisme i rata transferului pe orizontal este net superioar ratei de apariie i selecie a mutantei. Bacteriile fac schimb de informaie genetic, depind barierele de specie, ceea ce permite ca o gen de rezisten existent n populaia bacterian s se transmit cu o rat nalt de la o celul la alta;

90

- antibioticele se folosesc pe scar larg i expunerea bacteriilor este multipl (repetat). Lumea vie triete ntr-o adevrat mare de antibiotice, ceea ce confer bacteriilor un avantaj selectiv continuu. n 1991 s-au folosit peste 50 de peniciline, 70 cefalosporine, 12 teracicline, 8 aminoglicozide, 1 monobactam, 3 carbapenemi, 9 macrolide, 2 noi streptogramine i 3 inhibitori ai dihidrofolatreductazei. Una dintre cile majore prin care bacteriile devin rezistente este dobndirea ADN exogen pe orizontal. Schimbul genetic pe orizontal semnific transferul informaiei genetice ntre celulele bacteriene, pe alte ci dect prin diviziune. ADN exogen poate fi dobndit prin transferul genelor prin conjugare ntre speciile bacteriene diferite, pe calea plasmidelor care de obicei poart gene multiple de rezisten la antibiotice. Unele bacterii sunt n mod natural competente pentru a prelua ADN nud din mediul extern i pot s dobandeasc gene de rezisten pe calea mecanismului transformrii genetice. Alteori, genele de rezisten sunt transferate de fagi prin mecanismul transduciei (fig. 26).

Figura 26. Reprezentarea schematic a mecanismelor de transfer al informaiei genetice ntre celulele bacteriene (original).

Fluxul genic pe vertical semnific transmiterea informaiei genetice n generaiile succesive de celule, odat cu diviziunea. Schimbul pe orizontal semnific transferul informaiei genetice ntre celulele bacteriene, pe alte ci dect prin diviziune. Schimbul genetic orizontal reprezint mecanismul primar al evoluiei rezistenei la antibiotice i se realizeaz prin conjugare, transformare sau transducie. Conjugarea este transferul ADN de la o celul donoare la cea receptoare, prin contact celular direct, mediat de un complex multiproteic specializat, denumit aparat de conjugare. La bacteriile Gram negative, contactul fizic este realizat prin intermediul unor structuri filamentoase extracelulare, denumite pili. S-au descris dou tipuri de structuri genetice conjugative: plasmide conjugative i elemente conjugative cromosomale denumite transpozoni conjugativi. Transpozonii conjugativi sunt molecule mobile de ADN, care codific toate funciile necesare pentru transpoziia intracelular, dar i pentru conjugare intercelular. Se gsesc la o larg varietate de bacterii Gram pozitive (Tn 916, la Enterococcus faecalis) i Gram negative (Tn 455, cu gena de rezisten la tetraciclin, la Bacteroides) i sunt importani pentru diseminarea genelor de rezisten la antibiotice. Frecvena de transfer a transpozonilor conjugativi este ntre 10-4 - 10-9. Transpozonii conjugativi au un situs de origine a transferului conjugativ ori T, la care ADN este incizat, pentru a iniia transferul unei molecule de ADN monocatenar. Ca mecanism general al transferului conjugativ mediat de transpozoni sau de plasmide, ADN transferabil (plasmidial sau al unui transpozon cojugativ) al celulei donoare, care poate s conin gena R, este incizat monocatenar. Catena incizat este transferat sub form monocatenar n celula receptoare, pe msur ce este copiat n celula donoare dup mecanismul cercului rotativ. n celula receptoare, catena transferat este copiat ntr-o caten complementar i se formeaz o molecul dublu catenar linear. Capetele moleculei lineare sunt ligaturate i se formeaz o molecul circular, nchis covalent. Transferul genelor prin conjugare este supus unor restricii, care au avut rol important n evoluia rezistenei. Prima barier este constituit de structurile de suprafa ale celor dou celule, a doua restricie

91

deriv din faptul c ADN-ul exogen este sensibil la enzimele de restricie, iar a treia din faptul c plasmida transferat poate fi incapabil s se replice n noua gazd. La majoritatea bacteriilor Gram pozitive nu s-au identificat cile de realizare a contactului intercelular i de transfer conjugativ al ADN. Problema central a conjugrii bacteriene este nelegerea modalitii n care ADN traverseaz nveliurile celor dou celule. Modelul acceptat presupune existena a dou complexe proteice codificate de gene plasmidiale i cromosomale (Grohmann, 2003): - un complex proteic relaxosomul, se asociaz cu originea de transfer a plasmidei (ori T), incizeaz una dintre cele dou catene, consecina direct i imediat fiind despiralizarea ADN (relaxarea); - complexul proteic de cuplare condiioneaz formarea perechilor celulare donor-receptor (complexul mpf = mating pair formation), codificat de plasmid i implicat n transferul catenei de ADN de la donor la receptor. Relaxazele ADN sunt enzime eseniale pentru iniierea transferului conjugativ i acioneaz prin cataliza clivrii unei legturi fosfodiester la situsul nic (nicking = clivare) localizat la originea de transfer (ori T). Transferul conjugativ al genelor de rezisten la bacteriile Gram pozitive Diferenele majore dintre conjugarea bacteriilor Gram negative i Gram pozitive constau n mecanismele prin care se stabilete contactul intercelular, o etap preliminar obligatorie pentru iniierea transferului conjugativ. Proteinele eseniale pentru realizarea transferului conjugativ al plasmidelor sunt relaxazele ADN. La toate sistemele cojugative studiate, se accept c din celula donor se transfer n celula receptor, o singur caten de ADN. Generarea unui intermediar plasmidial monocatenar transferabil este consecina aciunii ADN-relaxazei, care cliveaz legtura fosfodiesteric a unui dinucleotid specific la situsul nic. Plasmidele cu spectru larg de gazd, identificate la streptococi i enterococi, se transfer prin conjugare cu o frecven variabil de 1/103 - 106 (un eveniment de conjugare la 103 - 106 celule), n funcie de plasmid i de genotipul celor dou celule ale cuplului. Ele confer rezistena la macrolide, lincosamide i streptogramina B. Plasmidele identificate la stafilococi au spectru ngust de gazd (par a fi limitate numai la stafilococi). Formarea perechilor de conjugare necesit cocultivarea celulelor donor i receptor pe o suprafa solid. Ambele grupe de plasmide conjugative confer rezisten la un spectru larg de antibiotice Din punct de vedere funcional, aparatul de transfer conjugativ, alturi de sistemele de secreie ale ctorva patogeni, de sistemele de transformare natural i de sistemul de secreie a fagilor filamentoi, alctuiesc sistemul de secreie de tip IV. Proteinele de cuplare (mpf = mating pair formation) formeaz familia proteinelor de transfer (Tra) i probabil au rol de orientare a moleculei prin canalul de transfer. Conjugarea are un rol major n rspndirea rezistenei bacteriilor la antibiotice. Procesul implic contactul celular direct al celor dou celule bacteriene i transferul ulterior al ADN. Conjugarea are un caracter pronunat de promiscuitate, deoarece poate s se produc ntre specii nenrud ite i chiar ntre genuri diferite. Din aceast cauz, rezerva genic disponibil pentru schimb, este foarte mare. Rezistena la antibiotice se transmite mai uor dac genele sunt transferate la celule sensibile, iar ADN exogen este mai stabil n noua gazd, dac conine mai puine situsuri de restricie. Conjugarea este cea mai comun cale de transmitere a genelor de rezisten. Transformarea genetic const n preluarea de ctre celula bacterian, a unui fragment de ADN exogen. ADN trebuie s strbat nveliurile celulei i s fie integrat n cromosomul celulei gazd, prin recombinare omolog. n procesul recombinrii omologe, o parte a cromosomului este nlocuit de ADN omolog. Ca i n conjugare, enzimele de restricie-modificare au rol important n transformare. Pentru c ele genereaz fragmente mai mici, pot s creasc ansa recombinrii fragmentelor ncorporate. Recombinarea intragenic. Fragmentele mici de ADN ncorporate din mediul extern favorizeaz recombinarea intragenic i astfel rezult gene mozaic. Genele mozaic conin ADN din alela original, dar i ADN din alte gene sau chiar din alte organisme. Majoritatea genelor mozaic se pierd, dar unele pot s exprime un fenotip ce favorizeaz supravieuirea organismului, deoarece codific proteine cu proprieti noi: de exemplu, gena care codific o PBP alterat, cu afinitate mic pentru antibioticele -lactamice. O astfel de gen favorizeaz tolerana fa de antibioticul din mediu i celula purttoare este favorizat de selecie. Rezistena ncruciat semnific fenomenul prin care dobndirea unui singur mecanism de rezisten, confer rezisten la o clas ntreag de antibiotice. De exemplu, rezistena S. aureus la meticilin, confer

92

rezisten la toate antibioticele -lactamice i cefalosporine. Dar rezistena ncruciat nu este totdeauna o regul: P. aeruginosa rezistent la kanamicin rmne sensibil la antibiotice asemntoare (gentamicina). Dac mecanismul rezistenei este nespecific, aa cum sunt pompele de eflux, poate conferi rezisten ncruciat la o varietate larg de medicamente. Co-rezistena semnific activitatea simultan a ctorva mecanisme de rezisten, la acelai organism (Ballows, 1991). Co-selecia se refer la selecia genelor multiple de rezisten la antibiotice i apare cnd genele de rezisten sunt componente ale aceluiai operon i deci sub controlul aceluiai promotor. Cunoaterea mecanismelor moleculare de rezisten la antibiotice este necesar pentru a lupta cu succes mpotriva bacteriilor rezistente sau multirezistente. Rezistena natural are ca suport genetic cromosomul bacterian. Evenimentele genetice implicate n rezistena dobndit pot fi mutaiile, afectnd gene prezente pe cromosomul bacterian. Originea genelor de rezisten Bacteriile pot dobndi rezistena la un antibiotic, ca rezultat al mutaiei unei gene cromosomale sau al expresiei unei gene cromosomale latente. Unele gene de rezisten au aprut prin mutaii ntmpltoare care au furnizat un av antaj selectiv celulelor purttoare (Dixon, 2000). n populaiile bacteriene, patogene i saprobionte, se gsete o rezerv important de gene de rezisten, care au dou origini: - prin mutaiile unor gene, ca de exemplu cele care fosforileaz glucidele (kinaze) i acetiltransferazele, care au evoluat prin schimbarea substratului aciunii, modificnd i inactivnd antibioticele ; - genele de rezisten existente n mod natural, care probabil au evoluat n mii de milioane de ani n populaiile bacteriene din sol i ape, ca modaliti de protecie fa de antibioticele produse de ele nsele. n aceste medii bacteriile trebuie s intre n competiie cu microorganisme productoare de antibiotic: fungi, actinomicete (actinobacterii). Ele trebuie s aib un anumit nivel de rezisten, pentru a supravieui n mediul natural. Genele de rezisten la antibioticele -lactamice s-au descoperit nainte de descoperirea antibioticelor nsi. De exemplu, s-a descoperit c o tulpin de S. aureus izolat nainte de descoperirea antibioticelor i pstrat n colecie, sintetizeaz -lactamaza. Se consider c lizozimul din secreia nazal a exercitat o presiune selectiv care a favorizat selecia celulelor rezistente la antibiotice (Brock i colab., 1998). S-a presupus c bacteriile care formeaz microbiota normal a tractului digestiv, pot avea rol de rezervor de gene de rezisten, ce pot fi transferate la bacterii ca Enterococcus faecalis, component al microbiotei normale a colonului, dar i la S. aureus i Streptococcus ce colonizeaz orofaringele. Gena tetO s-a identificat la unele tulpini de Lactobacillus ce colonizeaz tractul vaginal. Acestea sunt argumentele n favoarea ipotezei transferului orizontal ntre membrii microbiotei normale i bacteriile patogene, ce poate avea loc n anumite micronie ale organismului. Bacteriile care sintetizeaz tetracicline, trebuie s se protejeze de antibioticul pe care-l produc. Genele de rezisten la antibiotice sunt frecvent localizate n acelai fragment de restricie cu de genele pentru producerea antibioticului.

4.6. Mecanismele moleculare ale rezistenei microoganismelor la antibiotice

Efectul antibioticelor i al agenilor chimici antimicrobieni poate fi contracarat prin mai multe mecanisme, unele mecanisme sunt intrinsece bacteriei; alte mecanisme rezult din mutaiile genelor ce codific pentru structurile int sau din dobndirea genelor ce modific sau hidrolizeaz antibioticele (fig. 27).

93

Figura 27. Ilustrarea schematic a principalelor mecanisme care determin rezistena la antibiotice. Genele plasmidiale de rezisten codific sinteza proteinelor de eflux, enzimele care degradeaz antibioticul sau enzimele care modific structura antibioticului (dup Yim, 2006).

Inactivarea enzimatic a antibioticelor Inactivarea enzimatic a medicamentului este cel mai comun mecanism prin care se nate rezistena la o varietate larg de tipuri structurale de antibiotice. Genele codificatoare ale enzimelor ce inactiveaz diferitele antibiotice se gsesc n rezerva natural de gene de rezisten: bacteriile din sol care triesc n proximitatea organismului productor de antibiotic, pot s produc enzime inactivatoare ale antibioticului. Genele ce codific sinteza enzimelor inactivatoare pot fi transferate prin conjugare mediat de plasmide, ceea ce explic frecvena nalt la tulpinile bacteriene supuse presiunii selective a antibioticelor. Antibioticele pot fi inactivate prin clivaj enzimatic sau prin modificare chimic, astfel nct ele nu mai sunt transportate n celul sau nu mai interacioneaz cu inta specific. Modificarea chimic poate conferi rezisten clinic la aminoglicozide, cloramfenicol, peniciline, cefalosporine. -lactamazele catalizeaz hidroliza ciclului -lactamic (Bachmann i colab., 1998), iar acetiltransferazele transfer un grup acetil de la un donor la un grup funcional al antibioticului, convertindu -l la forma sa inactiv. Unele bacterii patogene Gram pozitive (stafilococi, enterococi) posed o enzim bifuncional, care inactiveaz aminoglicozidele: enzima are activitate acetil- i fosfotransferaz. Cele dou gene au fost dobndite din surse diferite. Ulterior, cele dou gene au fuzionat i au generat o gen hibrid, cu distribuie larg la stafilococi i enterococi. Efluxul activ al antibioticelor ADN cromosomal i plasmidial bacterian posed un mare rezervor de gene de rezisten, ce codific diferite mecanisme de rezisten la medicamente: pompe de eflux, enzime inactivatoare ale antibioticelor, modificarea intei aciunii antibioticului. Celulele bacteriene i eucariote au o varietate de sisteme de transport membranar, care ndeplinesc funcii vitale: nglobarea nutrienilor eseniali, eliminarea compuilor toxici, meninerea homeostaziei celulare. Identificarea sistemelor de transport, al cror numr este ntr-o continu cretere, se datoreaz utilizrii tehnicilor de clonare genic i secveniere (Paulsen, 1996). S-au identificat numeroase proteine de transport membranar (de ordinul sutelor), care au funcii fiziologice importante, dar funcioneaz i pentru eliminarea substanelor toxice din celul. Efluxul transmembranar al antibioticelor este un mecanism foarte eficient al rezistenei. De exemplu, n celulele neoplazice umane, rezistena la agenii chimioterapeutici antitumorali este mediat n mod obinuit de pompa de eflux reprezentat de glicoproteina P, iar la bacteriile patogene, rezistena la antibiotice i antiseptice se datoreaz frecvent, eliminrii medicamentului. Sistemele de rezisten prin flux sunt dependente de energie i pot fi sisteme de transport activ primare sau secundare. Pompele de eflux pot fi specifice pentru un anumit medicament (de exemplu, transportorul TetB la E. coli, elimin tetraciclina i un spectru ngust de analogi structurali) sau transport o larg varietate structural de medicamente i de aceea s-au numit pompe

94

cu funcie transportoare multipl. Specificitatea de aciune a transportorilor de eflux este variabil: majoritatea transportorilor, inclusiv determinanii efluxului de tetraciclin, au un spectru ngust de aciune, iar pompele de tip MDR (rezisten multipl = multi drug resistance) export compui chimici cu structur chimic heterogen. Sistemele de eflux multiplu au o semnificaie clinic major: dob ndirea unui astfel de sistem scade sensibilitatea la un spectru larg de ageni chimioterapeutici. Cea mai bine caracterizat pomp de eflux multiplu este glicoproteina P, care confer rezistena la un spectru larg de medicamente citotoxice prin exportul dependent de ATP. Bacteriile exprim i i duplic informaia de supravieuire, printre care i genele de rezisten la medicamente, localizate pe plasmide, transpozoni i integroni. Rezistena mediat de pompele membranare de eflux a fost evideniat iniial, la o tulpin de E. coli, rezistent la tetraciclin. Transportorii membranari, cu rol de pompe de eflux, pot fi transportori primari de tipul ABC (ATPbinding cassete) i utilizeaz energia rezultat din hidroliza ATP, iar transportorii secundari folosesc ca surs de energie, gradientul chimic transmembranar (fora proton-motrice) (fig. 28).

Figura 28. Reprezentarea schematic a transportorilor primari multipli de tip ABC (A) care utilizeaz ATP ca surs de energie i a celor de tip secundar (B) care expulzeaz antibiotice cu structuri chimice diverse. Efluxul este cuplat cu schimbul de protoni sau ioni de Na (dup Putman si colab., 2000).

Toate proteinele de eflux dependente de ATP aparin suprafamiliei ABC, cunoscute i sub denumirea de ATP-aze de trafic. n general, transportorii de tip ABC au o structur molecular alctuit din 4 domenii: - dou domenii membranare foarte hidrofobe, care formeaz 6 helixuri transmembranare - dou domenii care leag nucleotidele (NBD = nucleotid binding d omains). Cei mai muli transportori de medicamente de tip ABC mediaz exportul specific al antibioticelor. Primul transportor bacterian din clasa ABC s-a identificat la Lactococcus lactis: este o protein membranar de 590 aminoacizi, cu domeniul hidrofob la captul N-terminal i domeniul hidrofil la captul C-terminal, care conine caseta ce leag ATP (fig. 29).

95

Figura 29. Reprezentarea schematic a transportorilor multipli de medicamente ( multidrug) din suprafamilia ABC (dup Putman si colab., 2000).

Primele proteine identificate ca transportoare ale medicamentelor au fost pompele de eflux pentru tetraciclin, care confer rezistena bacteriilor Gram pozitive i Gram negative. Glicoproteina P aparine familiei de transportori de tip ABC (ATP Binding Cassette).

4.7. Sisteme de eflux multiplu dependente de fora proton -motrice

Ulterior s-a identificat un numr mare de proteine de transport, care confer rezisten multipl la medicamente (MDR = Multidrug Resistance), implicate n exportul unei mari diversiti de compui chimici antimicrobieni, nenrudii din punct de vedere structural. Determinanii MDR pot s contribuie la emergena microorganismelor rezistente prin dou mecanisme: - confer protecie celulei la o concentraie sczut a agentului antimicrobian, favoriznd supravieuirea acesteia ; - confer protecie fa de concentraii mari ale multor compui antimicrobieni. Pompele de tip MDR export nu numai substane antimicrobiene cu molecul mic, dar i substane bactericide produse de organismul gazd, ca de exemplu peptidele cationice antimicrobiene. Pompele membranare de eflux din membrana celulelor bacteriene au un corespondent structural i fiziologic n celula eucariot, reprezentat de glicoproteina P, care poate conferi rezisten la concentraii mari de ageni chimici antitumorali. Transportorii multipli confer rezisten multipl i utilizeaz gradientul electrochimic transmembranar al protonilor, sau uneori al ionilor de Na+, pentru a elimina medicamentul. Acestea sunt exprimate la organismele saprobionte i patogene de tip slbatic, care nu au venit n contact cu antibioticele (nainte ca efluxul semnificativ al agentului antimicrobian s se produc), dar funcioneaz la un nivel semnificatv mai nalt la organismele rezistente (W estbrock, 1999). Existena sistemelor de eflux, att la bacteriile patogene ct i la cele saprobionte, sugereaz c genele de rezisten sunt colectate cu aceiai rat. Pompele de eflux confer avantaj celulei, ceea ce explic conservarea genelor i diseminarea larg n populaiile bacteriene (fig. 30).

96

Transportorii multipli secundari sunt sensibili la agenii care perturb fora proton-motrice, ceea ce sugereaz faptul c ele mediaz eliminarea compuilor toxici din celul, n schimbul protonilor.

Figura 30. Extruzia antibioticelor hidrofobe n spaiul extracelular prin intermediul transportorilor multipli (multidrug) (dup Putman si colab., 2000).

Pe baza dimensiunilor, asemnrilor i structurii primare i secundare, transportorii secundari care confer rezisten multipl la medicamente pot fi mprii n familii distincte: - familia moleculelor mari (MF = Major Facilitator) - familia moleculelor mici (SMR = Small Multidrug Resistance) - familia moleculelor de Rezisten-Nodulare-Diviziune celular (RND) - familia moleculelor de rezisten multipl i de eliminare a compuilor toxici (MATE). Moleculele acestor familii au rolul nu numai de a exporta medicamentele, ci sunt implicate i n alte procese fiziologice de transport, dependente de fora proton-motrice. Familia proteinelor mari de transport (MF) este reprezentat de peste 300 de proteine membranare, fiecare cu specificitate pentru o clas de compui: glucide, anioni organici i anorganici. Ele se gsesc att n membrana bacteriilor, ct i la eucariotele superioare. Sunt molecule alctuite dintr-un singur polipeptid, care transport numai molecule mici ca rspuns la gradienii chemoosmotici. Sunt molecule care ndeplinesc funcii fiziologice importante: uniport, simport i antiport pentru monozaharide, oligozaharide, pentru intermediarii ciclului Krebs, esteri ai fosfailor i pentru antibiotice (fig. 31, 32). Proteinele de eflux care confer rezisten sunt molecule mari care pot fi divizate n familii distincte: cu 12 i respectiv cu 14 domenii transmembranare (Putman, 2000).

Figura 31. Reprezentarea schematic a transportorilor multipli din familia MFS- model structural cu 14 domenii segmente transmembranare (TMS) (dup Putman si colab., 2000).

97

Figura 32. Reprezentarea schematic a transportorilor multipli din familia MSF - model strucutural cu 12 segmente transmembranare (dup Putman si colab., 2000).

Cel mai cunoscut transportor MDR cu 14 segmente transmembranare este proteina Qac de la Staphylococcus aureus, funcional ca sistem uniport, simport sau antiport a unei varieti mari de substane, prin membran (Fig. 16). Transportorii MDR cu 12 domenii transmembranare sunt ilustrai de proteina Nor A la St. aureus, descoperit la o tulpin rezistent la quinolone i la meticilin (Fig. 17). Nor A este o protein membranar de 388 aminoacizi ce confer rezistena la compuii hidrofili i rezisten sczut sau absena rezistenei la medicamentele hidrofobe. Nor A este un transportor multiplu adevrat, deoarece mediaz rezistena la o varietate de medicamente diferite structural. Familia moleculelor mici de rezisten (SMR Small Molecule Rezistence) multipl la medicamente cuprinde cele mai mici proteine cunoscute de eflux secundar: au circa 105-107 resturi de aminoacizi (Putman i colab., 2000).Catena polipeptidic formeaz numai 4 segmente transmembranare. Se crede c aceste pompe mici de eflux multiplu funcioneaz ca homooligomeri, alctuii probabil din 3 monomeri (fig. 33).

Figura 33. Reprezentarea schematic a transportorilor multipli din familia SMR (dup Putman i colab., 2000).

Familia moleculelor mici de eflux const din dou subfamilii filogenetice: - cele care confer MDR pe calea unui mecanism antiport medicament : protoni (H+), ca i proteinele de rezisten ale familiei MF; - cele care nu conin permeaze cu specificitate de medicament, ci numai pompe de eflux de tip MDR: de exemplu, QacC ce confer rezistena la compusul quaternar de amoniu la Staphylococcus (Paulsen, 1996). Moleculele familiei de rezisten-nodulare-diviziune celular (RND), din punct de vedere funcional, aparin la 3 subfamilii specific-bacteriene (fig. 34): - unele catalizeaz transportul antiport medicament : H+ , sau pot fi specifice pentru ionii bivaleni ai metalelor grele; - altele au specificitate pentru lipooligozaharide

98

- cele din grupul al III-lea catalizeaz efluxul medicamentelor multiple.

Figura 34. Reprezentarea schematic a transportorilor multipli din familia RND (dup Putman si colab., 2000).

Deoarece transportorii de eflux pompeaz substanele prin membrana citoplasmatic i prin spaiul periplasmic al bacteriilor Gram negative, o punte proteic reprezentat de o protein de fuziune membranar, traverseaz acest spaiu i transfer moleculele porinelor membranei externe, care le elimin n spaiul extracelular. Proteinele de eflux din familia RND au 12 domenii transmembranare. Sistemele de eflux multiplu din familia RND au o specificitate de substrat mult mai larg dect proteinele de eflux multiplu de tipul sistemului facilitator (MFS) sau al moleculelor mici (SMR). Familia proteinelor de eliminare a medicamentelor i a compuilor toxici (MATE) s-a descris la Vibrio parahaemolyticus pentru efluxul norfloxacinei (Nor M). Nor M este dependent de energie i mediaz rezistena la colorani, fluoroquinolone hidrofile i aminoglicozide. Toate cele 4 familii de molecule de transport secundar (MFS, SMR, RND i MATE) sunt dependente de gradientul electrochimic transmembranar al protonilor - fora proton motrice - sau posibil, al ionilor de Na. Transportul e- la O2 , aparent produce H2O, dar de fapt, prin disocierea H2O, produce H+ i OH- care se concentreaz pe cele dou fee ale membranei. Diferena de pH i de potenial electrochimic de pe cele dou fee determin o stare energizat a membranei, asemenea unei baterii, care se msoar n voli i se exprim ca for proton motrice. Fora proton-motrice rezult dintr-un gradient chimic transmembranar de protoni, acid pe faa extern a membranei, alcalin pe faa intern i un potenial electric, pozitiv pe faa extern i negativ pe faa intern a membranei. Transportorii primari de rezisten multipl dependeni de ATP sunt proteine din categoria ATPazelor de trafic. Cei mai muli transportori din aceast categorie mediaz exportul specific al antibioticelor. Att transportorii primari (cei care leag ATP), ct i cei secundari elimin din celul o mare varietate de compui toxici. Substraturile pe care le leag sunt heterogene din punct de vedere structural, dar au caracteristici fizice comune: sunt molecule hidrofobe, amfifile i au sarcin pozitiv sau sunt neutre. Aceste caracteristici permit substraturilor transportate s se intercaleze n membran, ceea ce a dus la ipoteza c transportorii multipli preiau i transport moleculele din dublul strat lipidic i nu din faza apoas a citoplasmei. Pompele de eflux care confer rezisten multipl la antibiotice creeaz dificulti mari n tratamentul maladiilor infecioase. Rolul nativ al sistemelor de eflux este aprarea celulei de compuii toxici exogeni.

99

Alteori, sistemele de eflux multiplu par s ndeplineasc funcii primare, nelegate de rezistena la medicamente. Ele transport medicamente multiple numai n situaii speciale. Rezistena prin impermeabilitatea porinelor Antibioticele policationice din grupul polimixinei se complexeaz avid cu LPS i dezorganizeaz membrana extern, mrind permeabilitatea pentru agenii cu aciune asupra membranei sau componentelor citoplasmatice. Toi agenii policationici se leag de LPS anionice, cu o afinitate variabil (Bryan, 1984). Bacteriile Gram negative sunt rezistente la detergenii anionici i neutri, dar sunt sensibile la detergenii monocationici. Agenii chelatori ai ionilor de Ca2+ i Mg2+ dezorganizeaz i permeabilizeaz membrana extern. n general, barierele fizice de permeabilitate produc rareori fenomene de rezisten semnifica tiv, deoarece nici cele mai eficiente bariere nu pot stopa complet difuzia liber a moleculelor mici. Scderea ratei influxului, ca mecanism posibil al emergenei rezistenei, a fost argumentat de concentraia intracelular mic a cloramfenicolului. Bacteriile Gram negative pot dobndi rezisten nalt ca rezultat al mutaiilor care modific porinele i astfel rata difuziei pasive a medicamentului scade foarte mult. Influxul mediat de porine este contracarat de efluxul activ. Structura molecular, dar n special datele experimentale, sugereaz c antibioticele mici (lactamice, tetraciclina, cloramfenicolul, fluoroquinolonele) ptrund n celul n special pe calea porinelor, cel puin la enterobacterii, care posed porine cu permeabilitate nalt. Spre deosebire de acestea, antibioticele cu molecule mari, lipofile (macrolide, rifamicinele, novobiocina, acidul fusidic) difuzeaz cu dificultate prin porii canalelor. Pentru ele, difuzia lent prin stratul lipidic este o cale semnificativ de ptrundere n celul. Pentru agenii antibacterieni care traverseaz membrana extern prin canalele formate de porine, scderea permeabilitii porinelor poate s mreasc nivelul rezistenei. Pierderea mutaional a porinelor crete rezistena la antibioticele hidrofile, deoarece aceste molecule sunt mai mari dect nutrienii i trec greu prin canalele de transport ale acestora. Modificarea mutaional a intei antibioticului Multe antibiotice inactiveaz o enzim specific sau ribosomii. Un numr mare de tulpini rezistente apar printr-un proces mutaional: sintetizeaz o protein int care devine incapabil s lege antibioticul sau mai rar, inta i pstreaz funcia chiar dup legarea antibioticului. Adeseori, diferena dintre proteina de tip slbatic i cea mutant const n substituia unui singur aminoacid n catena proteic. Ribosomii stafilococului pot deveni rezisteni la eritromicin dup modificarea ARNr, iar rezistena la rifampin poate s rezulte din schimbarea unui singur aminoacid n subunitatea b a ARN-polimerazei. Rezistena la unele antibiotice apare prin dobndirea unei gene care codific o enzim int cu afinitate mult mai mic dect enzima de tip slbatic: PBP2a (Penicillin Binding Protein)este codificat de o gen care confer rezisten i care s-a rspndit la speciile de stafilococi (Pinho, 2001). Utilizarea unei ci metabolice rezistente (de ocolire a cii metabolice inhibate)
Dac un medicament este activ prin inhibarea unei enzime eseniale a unei ci metabolice, celulele care produc o cantitate mai mare de enzim pot supravieui n prezena medicamentului. De exemplu, rezistena la trimetoprim poate fi datorat supraproduciei dihidrofolat reductazei (DHFR), mutaiei genei structurale a DHFR sau dobndirii unei gene care codific o enzim rezistent la DHFR, sau streptomicetele care necesit timidin, dar nu sunt inhibate de trimetoprim i de sulfonamide deoarece produc concentraii adecvate de timidin pe o cale alternativ. Rareori, mediamentul trebuie s fie convertit de bacterii, la forma sa activ. Mutantele care nu pot metaboliza medicamentul devin rezistente: de exemplu, Bacteroides fragilis nu metabolizeaz metronidazolul i este rezistent. Rezistena multipl la medicamente poate s apar prin urmtoarele mecanisme: - mutaiile genelor codificatoare ale sintezei moleculelor membranare transportoare cu rol fiziologic, urmat de amplificarea lor i schimbarea nivelului de activitate; - mutaiile genelor reglatoare, care amplific expresia transportorilor multipli; - transferul intercelular al genelor de rezisten, prin intermediul transpozonilor sau al plasmidelor. Localizarea membranar a pompelor de eflux a ngreunat eforturile de a defini mecanismele moleculare care guverneaz activitatea acestor proteine. Progresul cunoaterii a fost mult mai rapid n ceea ce privete reglarea activitii pompelor de eflux. Supraproducia constitutiv a proteinelor de eflux, n absena agentului chimic, creeaz un dezavantaj sever n competiia cu cele care exprim adaptativ proteinele de eflux.

100

Proteinele transportoare de eflux nu sunt sintetizate n exces, situaie reflectat n faptul c aceste proteine sunt foarte greu de produs n cantiti adecvate scopului purificrii. Sinteza unora dintre ele nu necesit mecanisme reglatoare, datorit nivelului natural sczut al expresiei, dar sinteza celor mai multe este supus reglrii la nivelul transcrierii i traducerii. Existena celor dou trepte de control reflect msurile de siguran ale celulei fa de efectele defavorabile ale supraproduciei transportorului. Genele codificatoare ale proteinelor inductibile de eflux posed mecanisme proprii de control al transcrierii i traducerii. Este ns la fel de important ca proteinele de eflux s fie disponibile n condiiile n care sinteza lor este necesar (Moir i colab., 1999). Astfel, expresia celor mai multe proteine de eflux al medicamentelor este inductibil.

Bibliografie selectiv
1. Arnstein H.R., Margreiter H., The biosynthesis of penicillin. 7. Further experiments on the utilization of l- and d-valine and the effect of cystine and valine analogues on penicillin synthesis, Biochemestry Journal. 1958, 68(2): 339-348. 2. Bachmann B.O., Li R., Townsend C.A., .-Lactam synthetase: A new biosynthetic enzyme, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1998, 95(16): 9082-9086. 3. Balows A., (ed) Manual of Clinical Microbiology, 5th ed., Washington D.C, American Society for Microbiology, 1991. 4. Bayarski Y., Antibiotics Classification And Side Effects. EzineArticles. 2006. 5. Brakhage A.A., Molecular Regulation of -Lactam Biosynthesis n Filamentous Fungi, Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998, 62(3): 547-585. 6. Brock T.D., Medigan M.T., Martinco J.M., Parker J., Biology of Microorganisms Tenth Ed. , New Jersey, Prentice Hall Intern. Inc., 2003, p: 727-804, 846-875, 965-994. 7. Brock Th. Biology of microorganisms, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1988. 8. Brock Th., Biology of microorganisms, 11th Ed. Madigan M. T., Martinko J. M (eds) Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey. 2005 9. Bryan L.E., O'Hara K., Wong S., Lipopolysaccharide changes n impermeability-type aminoglycoside resistance n Pseudomonas aeruginosa, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1984, 26(2): 250255. 10. Casey M.L., Paulick R.C. and Whitlock H.W. Carbon-13 nuclear magnetic resonance study of the biosynthesis of daunomycin and islandicin. J Org Chem. 1978, 43:1627-1634 11. Challis G.L., Hopwood D.A., Synergy and contingency as driving forces for the evolution of multiple secondary metabolite production by Streptomyces species, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003, 100(Suppl 2): 14555-14561. 12. Dale J., Molecular Genetics of Bacteria, 3rd edition, J. Willy & sons Ltd. 1998. 13. Davis M. J. Fastidious bacteria. Methods in Phytobacteriology. Z. Klement, K. Rudolph and D. Sands. Budapest, Hungary, Akademiai Kiado. 1990, 75-85. 14. Distler J., Ebert A., Mansouri K., Pissowotzki K., Stockmann M., Piepersberg W., Gene cluster for streptomycin biosynthesis n Streptomyces griseus: nucleotide sequence of three genes and analysis of transcriptional activity, Nucleic Acids Research. 1987, 15(19): 8041-8056. 15. Dixon B., Changing pictures of patogenicity and virulence. ASM News. 2000, 66:122-127. 16. Esmahan C., Alvarez E., Montenegro E., Martin J.F., Catabolism of lysine n Penicillium chrysogenum leads to formation of 2-aminoadipic acid, a precursor of penicillin biosynthesis, Applied and Environemental Microbiology. 1994, 60(6): 1705-1710. 17. Fawcett P.A., Usher J.J., Huddleston J.A., Bleaney R.C., Nisbet J.J., Abraham E.P., Synthesis of delta-(alpha-aminoadipyl) cysteinylvaline and its role n penicillin biosynthesis, Biochemestry Journal. 1976, 157(3): 651-660. 18. Gander S., Bacterial biofilms: resistance to antimicrobial agents. Journal Antimicrobiology and Chemotherapy. 1996, 37: 1047-1050. 19. Gottlieb D., Shaw P. D., Antibiotics, vol. I; Structure, vol. II, Biosynthesis, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, New York. 1967. 20. Grohmann E., Muth G., Espinosa M., Conjugative Plasmid Transfer n Gram-Positive Bacteria, Microbiol Mol Biol Rev. 2003, 67(2): 277-301. 21. Kitamura I., Tobe H., Yoshimoto A., Oki T., Naganawa H., Takeuchi T., Umezawa H. Biosynthesis of aklavinone and aclacinomycins. J Antibiot. 1981, 34: 1498-1500

101

22. Kruse H., Sorum H., Transfer of Multiple Drug Resistence Plasmids between Bacteria of Diverse Origins n Natural Microenvironments. Appled and Environemental Microbiology. 1994, 60: 40154021. 23. Lengyel P., Sll D., Mechanism of protein biosynthesis, Bacteriology Reviews. 1969, 33(2): 26424. Livermore D.M., beta-Lactamases n laboratory and clinical resistance, Clinical Microbiology Reviews. 1995, 8(4): 557-584. 25. Majumdar S.K., Kutzner H.J., Studies on the Biosynthesis of Streptomycin, Applied Microbiology. 1962, 10(2): 157-168. 26. Malmberg L.H., Hu W.S, Sherman D., Precursor Flux Control through Targeted Chromosomal Insertion of the Lysine -Aminotransferase (lat) Gene n Cephamycine C Biosynthesis, Journal of Bacteriology. 1993, 175(21): 6916-6924. 27. Martin J.F., Demain A.L., Control of Antibiotic Biosynthesis, Microbiological Reviews. 1980, 44(2): 230-251. 28. Martn J.F., Molecular Control of Expression of Penicillin Biosynthesis Genes n Fungi: Regulatory Proteins Interact with a Bidirectional Promoter Region, Journal of Bacteriology. 2000, 182(9): 23552362. 29. Moir D.T., Shaw K.J., Hare R.S., Vovis G.F., Genomics and Antimicrobial Drug Discovery, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1999, 43(3): 439-446. 30. Mller W.H., van der Krift T.P., Krouwer A.J., Wsten H.A., van der Voort L.H., Smaal E.B., Verkleij A.J., Localization of the pathway of the penicillin biosynthesis n Penicillium chrysogenum, The EMBO Journal. 1991, 10(2): 489-495. 31. Paulsen I.T., Brown M.H., Littlejohn T.G., Mitchell B.A., Skurray R.A., Multidrug resistance proteins QacA and QacB from Staphylococcus aureus: membrane topology and identification of residues involved n substrate specificity, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1996, 93(8): 3630-3635. 32. Paulsen T. J., Proton-dependent Multidrug efflux Systems, Microbiology Reviews. 1996, 60(4): 575608. 33. Peir S., Menzella H.G., Rodrguez E., Carney J. and Gramajo H., Production of the Potent Antibacterial Polyketide Erythromycin C n Escherichia coli, Applied and Environemental Microbiology. 2005, 71(5): 25392547. 34. Pfeifer B.A., Khosla C., Biosynthesis of polyketides n heterologous host, Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2001, 65(1): 106-118. 35. Pinho M. G., de Lencastre H., Tomasz A. An acquired and a native penicillin-binding protein cooperate in building the cell wall of drug-resistant staphylococci. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 98: 10886-10891 36. Putman M., van Veen H.W., Konings W.N., Molecular Properties of Bacterial Multidrug Transporters, Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2000, 64(4): 672-693. 37. Queener S.W., Molecular biology of penicillin and cephalosporin biosynthesis, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1990, 34(6): 943-948. 38. Recchia G.D., Hall R.M., Plasmid evolution by acquisition of mobile gene cassettes: plasmid pIE723 contains the aadB gene cassette precisely inserted at a secondary site n the IncQ plasmid RSF1010, Molecular Microbiology. 1995, 15:179-187. 39. Recchia G.D., Hall R.M.,. Gene cassettes: a new class of mobile element, Microbiology. 1995, 141: 3015-3027. 40. Rosen P., Barkin R.M., eds. Emergency Medicine: Concepts and Clinical Practice, Mosby-Year Book. 1992. 41. Topley and Wilsons Microbiology and Microbial Infections, Vol. I , II, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman. 1998. 42. Trip H., Evers M.E., Kiel J.A., Driessen A.J., Uptake of the -Lactam Precursor -Aminoadipic Acid n Penicillium chrysogenum Is Mediated by the Acidic and the General Amino Acid Permease , Applied and Environemental Microbiology.. 2004, 70(8): 4775-4783. 43. Waksman S., The role of antibiotics in nature. Perspectives in Biology and Medicine. 1961; 4(3): 271-272. 44. Waksman S.A. The Actinomycetes. Vol. II. Bailliere, Tindall and Cox, London, 1961 45. Watanabe T., Fukasawa T. Episome-mediated transfer of drug resistance in enterobacteriaceae i. : transfer of resistance factors by conjugation. J Bacteriol. 1961, 81(5):669678

102

46. Watanabe T., Fukasawa, T. Episome-mediated transfer of drug resistance in enterobacteriaceae i. : transfer of resistance factors by conjugation. J Bacteriol. 1961 May;81(5):669678. 47. Westbrock-Wadman S., Sherman D.R., Hickey M.J., Coulter S.N., Zhu Y.Q., Warrener P., Nguyen L.Y., Shawar R.M., Folger K.R., Stover C.K., Characterization of a Pseudomonas aeruginosa Efflux Pump Contributing to Aminoglycoside Impermeability, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1999, 43(12): 2975-2983. 48. Yim Grace, Attack of the superbugs: antibiotic resistance, The Science Creative Qurterly. 2006

103

Capitolul 5 CARACTERIZAREA PRICIPALELOR CLASE DE ANTIBIOTICE 5.1. Aminoglicozidele

Aminoglicozidele sunt zaharuri complexe, conectate prin legturi glicozidice. Ele difer att prin nucleul molecular care poate fi streptidina sau 2-deoxistreptidina, ct i prin aminohexozele legate de nucleu (Vakulenko, 2003). Pentru activitatea antimicrobian, eseniale sunt gruprile NH2 i OH libere, prin intermediul crora aminoglicozidele se leag de proteinele ribosomale. Primul antibiotic aminoglicozidic streptomicina sintetizat de Streptomyces griseus a fost introdus n clinic de ctre Schatz i colaboratorii (1944), fiind activ pentru tratamentul tuberculozei, proprietate care s-a pstrat i rmne medicamentul de elecie pentru chimioterapia combinat a tuberculozei rezistente la medicamente. A fost un instrument util pentru elucidarea sintezei proteinelor, dar este rareori folosit n clinic, cu excepia tratamentului tuberculozei, iar modul su de aciune difer ntr-o oarecare msur de al altor aminoglicozide utilizate n clinic. Valoarea terapeutic a celorlalte aminoglicozide s-a ameliorat prin cercetri chimiofarmaceutice, care au generat noi variante semisintetice pornind de la moleculele parentale. Ele i-au pstrat rezistena la aciunea enzimelor degradative ori au un spectru mai larg de activitate. Streptomicina are structura unui trizaharid, fiind alctuit din 3 subuniti reunite prin legturi glicozidice: streptidina, streptoza i N-metil-glucozamina. Streptidina este un inozitol substituit cu dou grupri guanido, iar streptoza i N-metil-glucozamina formeaz dizaharidul streptobiosamin, cu o grupare metilamino. Legturile glicozidice dintre componente sunt n configuraie E. Activitatea antibacterian este anihilat prin clivajul acid al legturii glicozidice dintre streptidin i streptobiosamin, prin nlocuirea gruprilor guanido cu grupele amino sau prin carbobenziloxilarea aminei secundare. Prin clivajul acid rezult streptidina i dizaharidul streptobiosamina.

Structura molecular a streptomicinei

Compuii strns nrudii cu streptomicina se formeaz prin modificri structurale ale streptozei i streptidinei.

102

Clasificarea aminoglicozidelor

Principalele grupe de antibiotice aminoglicozidice sunt cele din grupa II care conine streptomicina i derivaii si i cele grupa V care este subdivizat n 4 subgrupe.

Structura molecular a streptograminei A

Structura molecular a streptograminei B

Subgrupa V A conine kanamicina, tobramicina i derivai semisintetici (amikacina, dibekacina, habekacina). Subgrupa V B conine complexul gentamicina i isepamicina, iar subgrupa C cuprinde antibiotice fr semnificaie clinic. Subgrupa V D conine sisomicina si netilmicina.

103

Aminoglicozidele gentamicina, tobramicina, amikacina i streptomicina sunt folosite n mod curent pentru tratamentul infeciilor cu bacterii Gram pozitive i Gram negative.

Structura molecular a gentamicinei

Structura molecular a streptomicin-sulfatului

Structura molecular a gentamicin-sulfatului

Structura molecular a clindamicinei

Spectrul de activitate a aminoglicozidelor Antibioticele aminoglicozidice au un spectru larg de activitate fa de bacilii Gram negativi (E. coli, Salmonella spp, Shigella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Acinetobacter spp., Proteus spp., Klebsiella spp., Serratia spp., Morganella spp. i Pseudomonas spp., precum i S. aureus i unii streptococi. n vitro, aminoglicozidele nu sunt active fa de Bacteroides spp. i alte bacterii anaerobe, Str. pneumoniae, N. gonorrhoeae, iar activitatea fa de enterococi este evident numai n asociaie sinergic cu antibioticele antiparietale (F-laclami i vancomicina). Spectrul de activitate al diferitelor antibiotice aminoglicozidice este diferit. Streptomicina este bactericid pentru o larg varietate de specii bacteriene Gram pozitive i Gram negative. Celulele animale sunt relativ insensibile la streptomicin, dei apar fenomene de otitoxicitate, nefrotoxicitate i hipersensibilitate. Datorit sarcinii sale electrice, streptomicina interacioneaz cu multe componente anionice celulare. n vitro, precipit ADN. n general, aminoglicozidele mai noi (gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, isepamicina, dibekacina i arbekacina) au un spectru mai larg dect cele vechi (streptomicina, kanamicina).

104

Dei manifest nefrotoxicitate i otitoxicitate, iar apariia tulpinilor rezistente este relativ frecvent, aminoglicozidele rmn foarte importante pentru tratamentul unor infecii n situaii speciale. Aminoglicozidele au cteva particulariti ale aciunii antimicrobiene: activitatea bactericid este dependent de concentraie; - manifest efectul postantibiotic; - au o farmacocinetic relativ predictibil; - manifest efectul sinergic cu antibioticele antiparietale. Activitatea batericid a aminoglicozidelor depinde n primul rnd de concentraia lor, dect de durata expunerii bacteriilor la concentraiile inhibitorii ale antibioticului i este mai puin dependent de dimensiunile populaiei bacteriene. Potenialul bactericid, dependent de concentraie, crete odat cu creterea concentraiei antibioticului. Aminoglicozidele manifest efectul postantibiotic, adic continu s fie bactericide chiar dup stoparea administrrii antibioticului. Activitatea bactericid dependent de concentraie i efectul postantibiotic, asociat cu riscul atenuat de nefrotoxicitate i ototoxicitate, fac posibil administrarea unei singure doze/zi, la pacienii cu funcie renal normal. Sinergismul cu antibioticele antiparietale este probabil, rezultatul nglobrii aminoglicozidelor la o concentraie superioar, cauzat de permeabilitatea crescut a celulelor bacteriene, dup incubarea cu inhibitorii sintezei peretelui celular. Efectul sinergic al aminoglicozidelor i F-lactamilor este foarte evident fa de enterococi. Antibioticele aminoglicozidice sunt folosite pentru tratamentul pacienilor neutropenici febrili i a celor cu infecii grave produse de microorganisme Gram negative (enterobacterii, Ps. aeruginosa). Pentru infeciile tractului urinar, terapia cu aminoglicozide este eficient, deoarece antibioticele administrate intravenos sunt excretate exclusiv pe cale renal. Inglobarea aminoglicozidelor Aminoglicozidele sunt molecule cationice cu greutate molecular mic, dar foarte hidrofile. Acumularea lor n celula sensibil are loc n trei faze. Prima faz const n interaciunea ionic cu componentele peretelui celular, urmat de difuzia antibioticului prin pereii bacteriilor Gram pozitive, sau de trecerea prin membrana extern la bacteriile Gram-negative. Datorit caracterului policationic, aminoglicozidele deplaseaz ionii de Mg care asigur legtura ntre gruprile fosfat ale lipidelor membranare, auto-amorsndu-i n acest fel trecerea prin dezorganizarea membranei externe. Simpla difuzie la nivelul porinelor, al cror diametru este la limita excluderii aminoglicozidelor, nu ar putea realiza concentraii intracelulare crescute de antibiotic (Hancock, 1991). Perturbarea integritii lipopolizaharidelor n sine, a fost considerat ca o component a efectului bactericid independent de evenimentele declanate la nivelul ribosomului. Aminoglicozidele se acumuleaz n celul numai printr-un proces de transport dependent de energie. Acumularea lor n celula bacterian parcurge dou faze: faza I este lent i depinde de gradientul transmembranar al potenialului electric i deci al fenomenului membranar oxidativ; faza a II-a este rapid i se traduce printr-o acumulare intracelular important. Concentraiile intracelulare sunt de circa 100 ori mai ridicate dect cele din mediul extern. Acumularea lent a antibioticului determin un efect bacteriostatic, iar acumularea rapid produce efectul bactericid. Rata acumulrii este condiionat de mrimea componentei electrice (), a forei proton-motrice care la rndul ei depinde de funcionarea catenei de respiraie i de ATP-aza membranar. Astfel se explic de ce microorganismele cu sisteme transportoare deficiente, cum sunt cele anaerobe, sunt intrinsec rezistente la aminoglicozide. Din acelai motiv, enterococii i ali ana erobi facultativi sunt rezisteni la concentraiile mici de aminoglicozide. Un rol important n acumularea intracelular a aminoglicozidelor l au proteinele periplasmatice a cror sintez este indus de antibiotic. Mecanismul de aciune a aminoglicozidelor Aminoglicozidele se leag de ribosomii bacterieni i inhib sinteza proteinelor. Ribosomul este o structur complex, n alctuirea cruia intr 3 molecule de ARN i peste 50 de tipuri de proteine. Subunitatea mare a ribosomului cuprinde dou molecule de ARN 5S i 23S i 33 proteine, iar subunitatea mic conine o singur molecul de ARN 16S i 20 - 21 proteine. Aminoglicozidele se leag de subunitatea 30S, care are rol esenial n traducerea cu mare fidelitate a mesajului genetic (fig. 35).

105

Ribosomul are 3 situsuri de legare a ARNt, desemnate A (Aminoacil), P (Peptidil) i E (Exit). n timpul sintezei proteinelor, ribosomii decodific informaia din ARNm i catalizeaz formarea legturilor peptidice. Acumularea rapid a aminoglicozidelor satureaz toi ribosomii, producnd moartea celulei.

Figura. 35. Ilustrarea schematic a mecanismului de aciune al aminoglicozidelor: inhibiia formrii complexului ribosom 30S ARNm (Neu i colab., 1988). Aminoglicozidele induc fenomenul de pleiotropism (modific expresia unui numr mare de gene) i interacioneaz cu mecanismul sintezei proteice. Pentru c interacioneaz cu ribosomii, aminoglicozidele induc erori de citire a ARNm. Secvena de baze a ARNm este citit greit i se sintetizeaz proteine nefuncionale sau sinteza proteinelor este stopat. Streptomicina a devenit un instrument pentru studiul fidelitii traducerii informaiei genetice. Alte antibiotice aminoglicozidice (bluensomicina, kanamicina, neomicina i paromomicina (toate sunt sintetizate de specii de Streptomyces), induc erori de citire a mesajului n vitro, n sisteme acelulare. Aminoglicozidele sunt antibiotice cu efect rapid i cu spectru larg de aciune: sunt sensibile bacteriile strict sau facultativ aerobe Gram pozitive sau negative. Acestea sunt zaharuri sau pseudo-zaharuri aminate, cu caracter policationic, care explic cteva aspecte legate de modul lor de aciune. Toate aminoglicozidele utilizate n terapeutic, streptomicina i streptinomicina conin un ciclu deoxistreptomicin bisubstituit n poziia 4 i 6. Spre deosebire de alte familii de antibiotice, n special -lactamice i fluoroquinolone, aminoglicozidele folosite n prezent conin mai puine variante moleculare. Legndu-se la ribosom, aminoglicozidele, pe de o parte perturb procesul de traducere introducnd erori de citire, iar pe de alt parte antreneaz stoparea total a traducerii, interfernd cu etapele de iniiere, alungire i terminare. Efectul primar al aminoglicozidelor ar fi ocuparea situsului acceptor (A) al ribosomului. Streptomicina este un glicozid aminociclitol, larg folosit n terapia tuberculozei. La micobacterii, streptomicina inhib sinteza proteinelor dup 5-15 min., iar sinteza acizilor nucleici continu pentru o lung perioad de timp. Mecanismul aciunii sale la M. tuberculosis n-a fost studiat, dar la E. coli, streptomicina se leag iniial la ARNr 16S al subunitii ribosomale 30S, la nivelul nucleotidelor 15, 530, 915 i 1400/1500 (Allen, 1989 citat de Pinard, 1991). Regiunea 1400/1500 este considerat ca un component al situsului de fixare dezoxistreptaminelor (Moazed, 1986). Efectele legrii aminoglicozidelor la subunitatea ribosomal mic se extind la subunitatea mare, nucleotidul 2660 a ARN 23S. Astfel, interfer cu treapta traducerii, inhibnd iniierea i perturbnd sinteza proteinelor (Fig. 35). Deoarece inhib sinteza proteinelor, efectul aminoglicozidelor este bactericid. Streptomicina se leag de proteina S12 din subunitatea 30S i face ca ribosomul s citeasc greit codul genetic. Alte aminoglicozide se leag nu numai de proteina S12, ci i de proteina L6 a subunitii 50S. Acest ultim situs de legare este important pentru rezistena bacteriilor la

106

aminoglicozide. Componenta chimic ce determin citirea greit este streptamina sau deoxistreptamina, din moleculele de streptomicin, kanamicin, neomicin, paroromicin, gentamicin, bluensomicin etc. Spectinomicina este un antibiotic aminociclitol, nrudit cu aminoglicozidele i are aciune bacteriostatic. Aciunea sa antibacterian const n legarea cu o alt protein ribosomal. Este astfel blocat interaciunea ARNm-ribosom, fr s produca citirea greit. Se folosete pentru tratamentul gonoreii (N. gonorrhoeae) rezistent la penicilin. n scopul tratamentului infeciilor intracelulare, aminoglicozidele au fost ncapsulate n liposomi. ncapsularea n liposomi poate s creasc indexul terapeutic al medicamentului prin diminuarea nivelului medicamentului eliberat la situsurile unde este toxic fa de nivelul eficienei terapeutice. Aminoglicozidele sunt eliminate prin filtrare glomerular i parial sunt reabsorbite de celulele tubulare proximale printr-un mecanism de pinocitoz n vezicule mici, care fuzioneaz cu lizosomii, unde se acumuleaz. Ele induc o fosfolipidoz lizosomal caracterizat prin inhibiia activitii sfingomielinazei i fosfolipazei A1 i prin acumularea fosfolipidelor n lizosomi. Fosfolipidoza este nsoit de necroz celular i regenerare postnecrotic. Diferii compui sau medicamente administrate concomitent cu aminoglicozidele pot s mreasc nivelul toxicitii (vancomicina, cisplatinum i hidrocortizonul) sau pot s-l diminueze (ticarcilina, carbenicilina, cefalotina, acidul poli-L-aspartic). Toxicitatea aminoglicozidelor nu este influenat de modul de administrare (singure sau n asociaie), dar unele medicamente diminu nivelul renal al acumulrii n celulele tubulare. Rezistena la antibioticele aminoglicozidice este larg rspndit i se produce prin urmtoarele mecanisme (fig. 36): - nglobarea sczut a antibioticului - modificarea intei ribosomale - efluxul antibioticului - modificarea enzimatic a aminoglicozidelor. nglobarea aminoglicozidelor necesit funcionarea catenei de respiraie celular, care genereaz un potenial electric prin membrana citoplasmatic. Un nivel sczut al potenialului transmembranar sau absena sa, determin rezistena intrinsec a bacteriilor anaerobe i scderea sensibilitii bacteriilor facultativ anaerobe (enterococi) la aminoglicozide.

Figura 36. Ilustrarea schematic a mecanismelor de rezisten la antibioticele aminoglicozidice (Neu si colab., 1988).

Modificarea chimic a aminoglicozidelor este principalul mecanism de rezisten bacterian. Alte mecanisme mai rare de rezisten la aminoglicozide sunt sistemele de eflux i mutaiile situsului ribosomal de legare la ARNr ) (Leclerc i colab., 1991) Modificarea enzimatic a aminoglicozidelor este mecanismul major de rezisten la aminoglicozide al izolatelor clinice Gram pozitive i Gram negative. Modificarea chimic are loc la nivelul grupelor amino sau hidroxil. S-au identificat peste 50 de enzime care modific aminoglicozidele. Majoritatea genelor

107

codificatoare ale enzimelor se gsesc la bacteriile Gram negative. n funcie de tipul modificrii chimice pe care o catalizeaz, enzimele care modific aminoglicozidele se clasific n trei familii: - aminoglicozid-acetil-transferaze (AAC) - aminoglicozid-adenilil-transferaze (ANT) - aminoglicozid-fosfotransferaze (APH). Aminoglicozid O-fosfo-transferaza (APH) i aminoglicozid O-adenil sau nucleotidil-transferaza (AAD sau ANT), catalizeaz fosforilarea i respectiv nucleotidilarea gruprii hidroxil, iar aminoglicozid- Nacetiltransferaza (AAC) catalizeaz acetilarea gruprilor amino. APH i ANT folosesc ATP i ACA (acetilcoenzima A). Fiecare dintre cele familii de enzime este mprit n clase, desemnate prin situsul pe care-l modific. Aminoglicozid-fosfotransferazele - APH - (7 clase) sunt kinaze i utilizeaz ATP ca substrat secundar i fosforileaz gruprile specifice OH, la toate clasele de antibiotice aminoglicozidice.

Fosforilarea kanamicinei A catalizat de o aminoglicozid-fosfotransferaz (APH), reacie energizat de ATP.

Aminoglicozid-acetiltransferazele AAC - (4 clase de enzime) utilizeaz acetil-CoA ca donor al gruprii acetil pentru modificarea aminoglicozidelor la gruparea amino din poziiile 1 i 3 ale inelului deoxistreptaminei i la poziiile 2 i 6 ale inelului 6-aminohexozei. Aminoglicozid 6-acetiltransferazele au spectru larg i pot modifica majoritatea aminoglicozidelor cu importan clinic.

Acetilarea kanamicinei A, catalizat de aminoglicozid-N-acetiltransferaz (AAC), reacie energizat de coenzima A (AcCoA)

Aminoglicozid-nucleotidiltransferazele ANT - (5 clase) utilizeaz ATP ca substrat secundar i modific antibioticele aminoglicozidice prin transferul AMP la gruparea OH la poziiile 2, 3, 4 i respectiv 9.

108

Adenilarea kanamicinei A cu AMP, catalizat de aminoglicozid-nucleotidiltransferaz, cu consum de ATP.

Aminoglicozidele modificate la gruprile amino sau la grupul OH sub aciunea celor trei categorii de enzime, se leag slab sau pierd capacitatea de a se lega de ribosomi i nu declaneaz faza a II-a a nglobrii dependent de energie. Efectul inhibitor asupra sintezei proteinelor celulare nu se mai produce i bacteriile supravieuiesc n prezena medicamentului. Inactivarea enzimatic a aminoglicozidelor este mecanismul principal de rezisten a stafilococilor. Din punct de vedere biochimic, acest mecanism de rezisten este de departe cel mai important, fiind implicat n totalitatea cazurilor de rezisten observate la enterobacterii (> 95%), la Acynetobacter (95%) i la bacteriile Gram pozitive i jumtate din cazurile de rezisten observate la Pseudomonas. Selecia microorganismelor ce produc enzime sub aciunea crora modific aminoglicozidele, depinde de cantitatea de antibiotice folosit. Mecanismele neenzimatice de rezisten la antibioticele aminoglicozidice sunt: - sistemele de eflux - mutaiile ARNr Rezistena datorat modificrii intei macromoleculare este o modalitate major de dezvoltare a rezistenei. Modificrile intei care determin rezistena la aminoglicozide includ schimbrile mutaionale ale proteinelor ribosomale sau ale ARN 16S i metilarea enzimatic a ARNr. Schimbrile mutaionale produc rezistena n special la streptomicin. Studiile de RMN (rezonan magnetic nuclear) asupra nucleotidelor ce cuprind situsul A (acceptor) al ARN 16S, complexat cu paromomicina, precum i asupra subunitii 30S complexat cu acelai antibiotic, relev c medicamentul se leag n depresiunea major a situsului A. Metilarea N7 a resturilor de guanin ale ARN 16S produce rezistena la concentraiile mari de aminoglicozide la microorganismele productoare de aminoglicozide, dar acest tip de rezisten n-a fost raportat la bacteriile cu importan clinic. Sinteza proteinelor necesit ca anticodonii aminoacil-ARNt i codonii ARNm s se recunoasc specific. Evenimentul recunoaterii are loc la nivelul subunitii 30S. Fidelitatea recunoaterii este garantat de o secven ARNr nalt conservat, care constituie situsul interaciunii dintre codon i anticodon (situsul A). Aceast secven este situsul preferat de legare al aminoglicozidelor (kanamicina i streptomicina), care pot s interfere cu sinteza proteinelor prin inducerea citirii greite a codonilor i terminarea prematur a traducerii. La enterococi, s-au identificat dou tipuri de rezisten la streptomicin: - rezistena la nivele moderate de antibiotic, datorat permeabilitii sczute a membranei, ce poate fi depit cu administrarea concomitent a penicilinei, care crete permeabilitatea pentru aminoglicozide; - rezistena la doze mari, mediat ribosomal sau datorat producerii enzimelor inactivatoare ale streptomicinei. Rezistena la gentamicin se datoreaz prezenei enzimei inactivatoare 2- fosfotransferaz- 6acetiltransferaz. Enzima confer rezisten la gentamicin, tobramicin, metilmicin, amikacin i kanamicin. Rezistena la gentamicin este un indicator al rezistenei bacteriene la alte aminoglicozide, cu excepia streptomicinei. La M. tuberculosis nu s-au descris enzime care s modifice aminoglicozidul streptomicin, dar rezistena este determinat de modificarea mutaional a intei ribosomale. n principiu, dac mecanismele de rezisten la antibiotice ar fi inhibate, sensibilitatea bacteriilor la aminoglicozide ar putea fi restabilit. Acest concept este inspirat de asocierea cu succes a primului inhibitor al

109

F-lactamazelor acidul clavulanic cu amoxicilina (o penicilin). Nu s-au identificat inhibitori ai sintezei enzimelor care modific aminoglicozidele (Vakulenko, 2003). Streptomicina produce efecte secundare: este afectat nervul acustic i apar deficiene de auz, care pot disprea dup ntreruperea tratamentului sau pot s persiste.

5.2. Tetraciclinele
Tetraciclinele sunt un grup de antibiotice naturale cu activitate antibacterian fa de un spectru larg de microorganisme patogene, caracterizate printr-un nivel foarte sczut de toxicitate pentru gazdele mamaliene ale bacteriilor patogene. Tetraciclinele sunt prototipul antibioticelor cu spectru larg de aciune, deoarece inhib creterea unei varieti largi de microorganisme. Sunt bine absorbite i sunt active dup administrare oral. Din aceste motive, tetraciclinele au cea mai larg utilizare n clinica uman. Structural, tetraciclinele sunt unice, deoarece nu au nici o nrudire evident cu ali metabolii cunoscui. Structura de baz a tetraciclinelor const dintr-un schelet comun de octahidronaftacenic (patru cicluri de carbon hexagonale fuzionate, lineare, A, B, C, D), substituit n poziiile 5, 6, 7, cu diferii radicali din care se formeaz diferite tipuri de tetracicline.

Structura molecular a tetraciclinei

Structura inelului de baz poate fi substituit la cteva poziii, pentru a forma noi analogi ai tetraciclinei: clortetraciclina (aureomicina) are un atom de Cl, iar oxitetraciclina (kanamicina) are un grup OH n plus, dar nu are clor. Toate cele 3 antibiotice sunt produse pe cale microbiologic, dar sunt i tetracicline de semisintez, la care diferii constituieni sunt inserai n inelul de naftacen. Clasificarea tetraciclinelor Primul antibiotic al acestei familii, clortetraciclina, a fost descris n 1948, urmat de oxitetraciclin, produse de Streptomyces aureofaciens i respectiv, Streptomyces rimosus. Tetraciclina propriu-zis a fost descoperit mai trziu. Este sintetizat de Streptomyces aureofaciens, n anumite condiii de mediu: concentraia ionului de Cl- nu trebuie s depeasc 17 pri/milion. Ionul de Cl este ndeprtat cu rini schimbtoare de ioni sau prin precipitare sub form de AgCl sau HgCl. Demetilclortetraciclina este sintetizat de mutante ale Str. aureofaciens, defective pentru metilarea n poziia 6 a ciclului naftacenic. Este un antibiotic important, deoarece aciunea sa este mai prelungit i este activ fa de bacteriile rezistente la celelalte tetracicline. Este molecula de la care se sintetizeaz tetraciclinele de semisintez: metaciclina, minociclina. Sursa de C a organismelor productoare de tetracicline este reprezentat de glucide, glicerol, iar cea de azot este amoniul. Tetraciclinele clorurate necesit sursa de Cl. Scheletul naftacenic de C al tetraciclinelor este sintetizat din acetat, prin intervenia catalitic a CO2, biotinei, coenzimei A. Atomii de C ai inelelor structurale deriv alternativ din C carboxilic i respectiv C metilic a 9 molecule de acetat. Compuii clorurai (clortetraciclina) sunt mai activi dect oxitetraciclina i tetraciclina fa de stafilococi, streptococi i pneumococi. n clinic se folosesc clortetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina, demetiltetraciclina (clortetraciclina demetilat).

110

Grupe de tetracicline

Tetraciclinele formeaz o familie de antibiotice inhibitoare ale sintezei proteinelor prin mecanismul blocrii atarii complexului aminoacil-ARNt de situsul acceptor al ribosomului (situsul A). Efectul bacteriostatic al acestor antibiotice are un spectru larg de aciune, fiind active fa de bacterii Gram pozitive i Gram negative, fa de chlamidii, micoplasme, ricketsii i protozoare. Tetraciclinele sunt ageni chelatori puternici (leag diferii ioni metalici) i proprietile lor farmacologice sunt influenate de prezena ionilor metalici. Fiecare dintre inelele nucleului linear tetraciclic trebuie s conin numai atomi de C, pentru ca antibioticul s-i pstreze activitatea antibacterian. Excepia este 6-tiotetraciclina, care dei posed un atom de S la poziia 6 a inelului C, are activitate antibacterian. Tetraciclinele atipice (tiotetraciclina i ali analogi ai tetraciclinelor) perturb structura membranei citoplasmatice i efectul este bactericid, ceea ce contrasteaz cu efectul bacteriostatic reversibil al tetraciclinelor inhibitoare ale sintezei proteinelor. Efectul tetraciclinelor atipice de dezorganizare a membranei este probabil consecina caracterului lipofil al moleculei, rezultat din planaritatea inelelor B, C i D. Tetraciclinele atipice sunt probabil ncorporate n mediul hidrofob al membranei. Din cauza efectelor secundare, derivate din interaciunea lor nespecific cu membranele celulelor procariote i eucariote, tetraciclinele atipice nu prezint interes terapeutic. n mod obinuit, se utilizeaz tetraciclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, dar i cele noi, de semisintez: minociclina i doxiciclina. Toate sunt bacteriostatice, se absorb uor din tubul digestiv i se distribuie larg n esuturi i fluide, cu excepia lichidului cefalorahidian. Tetraciclinele au un spectru foarte larg de aciune: sunt active fa de multe bacterii Gram pozitive i Gram negative, fa de rickettsii, chlamidii, micoplasme i fa de unii fungi, dar distrug i microbiota normal a intestinului i produc tulburri gastro-intestinale. Tetraciclinele pot produce efecte toxice asupra esutului hepatici renal. Administrarea tetraciclinei n timpul sarcinii sau n primii 5 ani de via are ca rezultat colorarea dinilor, att deciduali ct i permaneni, doarece mugurii ambelor dentiii se formeaz nainte de natere. Tetraciclina administrat n timpul sarcinii poate duce la deformarea oaselor cutiei craniene a ftului. Efectele tetraciclinelor asupra dinilor i oaselor se datoreaz capacitii lor de a lega ioni de Ca2+. Mecanismul de aciune a tetraciclinelor Tetraciclinele difuzeaz liber (pasiv) prin porii hidrofili ai membranei externe a bacteriilor Gram negative, dar necesit un sistem de transport dependent de energie pentru a traversa membrana citoplasmatic. La bacteriile Gram pozitive (nu au membran extern), aceste antibiotice nu difuzeaz liber n celul. Tetraciclinele traverseaz membrana extern a bacteriilor Gram negative enterice prin canalele porinelor din membrana extern (OmpF i OmpC), sub forma complexelor cu ionii bivaleni, n special de Mg2+. Complexul se acumuleaz n spaiul periplasmic, unde probabil se disociaz i moleculele lipofile de antibiotic difuzeaz prin stratul lipidic al membranei citoplasmatice. n citoplasm formeaz complexe cationice cu Mg2+, datorit activitii lor chelatoare. Complexul molecular format din tetraciclin i Mg se asociaz cu subunitatea ribosomal 30S. Consecina este inhibiia sintezei proteinelor, prin blocarea asocierii aminoacil-ARNt la situsul A al ribosomului bacterian. Tetraciclina inhib faza de elongare a catenei polipeptidice n timpul traducerii, exercitnd un efect bacteriostatic. O secven foarte conservat a ARNr 16S pare a fi parte a situsului de legare, ceea ce explic spectrul larg de activitate al tetraciclinei. n alctuirea situsului de legare pare s intre i proteina ribosomal 7S. Efectul direct al legrii tetraciclinei la ribosomi este blocarea accesului aminoacil-ARNt la situsul A (acceptor) al ribosomului. Interferena cu legarea aminoacil-ARNt la situsul A poate s induc un rspuns stringent i declaneaz numeroase efecte secundare, care modific stabilitatea ARNt, sinteza ARNr, metabolismul aminoacizilor.

111

Civa derivai ai tetraciclinei acioneaz pe alt cale: chelocardina i tiotetraciclina sunt active fa de E. coli i B. subtilis, dar sunt inhibitori ineficieni ai sintezei proteinelor, pentru c nu se leag stabil de ribosomi. Spre deosebire de alte tetracicline, ele pot inhiba sinteza ADN, ARN i a proteinelor (Speer, 1992). Cele dou tetracicline ar putea avea efecte asupra membranei citoplasmatice. Olivera i Chopra (citai de Speer, 1992), pe baza modului de aciune, au mprit tetraciclinele n dou categorii : - cele care inhib sinteza proteinelor (teraciclina, clortetraciclina, minociclina); -cele care interacioneaz cu membrana citoplasmatic (chelocardina, tiotetraciclina, anhidrotetraciclina). Legarea tetraciclinelor cu proteinele ribosomului este tranzitorie, ceea ce explic efectul bacteriostatic al acestor antibiotice. Sunt inhibitoare fa de o varietate larg de bacterii Gram pozitive i Gram negative, chlamidii i micoplasme. Celulele mamiferelor nu concentreaz tetraciclina (aa cum fac bacteriile) i de aceea ribosomii lor sunt rezisteni, cu posibila excepie a ribosomilor 70S mitocondriali. Se administreaz oral, dar formeaz complexe neabsorbabile cu ionii bivaleni.Tetraciclina i derivaii si au o utilizare clinic limitat, datorit frecvenei crescute a tulpinilor rezistente. De exemplu, n anii 80, tetraciclina era folosit pentru tratamentul infeciilor cu transmitere sexual, dar dup apariia tulpinilor rezistente de N. gonorrhoeae, n-a mai fost utilizat ca antibiotic de prim importan terapeutic. Oxitetraciclina i tetraciclina sunt nc folosite n tratamentul uretritei nongonococice i a infeciilor chlamidiale. Rezistena la tetraciclin este larg rspndit la cocii Gram pozitivi i se manifest i la Mycoplasma. De aceea, tetraciclina nu se folosete pentru tratamentul primar al infeciilor tractului respirator inferior. Dei aciunea sa principal este antibacterian, tetraciclina este activ fa de protozoarele parazite: inhib Giardia intestinalis, Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica, Plasmodium falciparum. Eficiena derivailor tetraciclinei fa de protozoarele parazite este corelat cu gradul de ptrundere n celul. Cei mai eficieni sunt derivaii lipofili, care strbat repede membrana citoplasmatic (tiotetraciclina). Mecanismele rezistenei la tetracicline Numeroase specii bacteriene au dobndit rezisten la aciunea bacteriostatic a tetraciclinelor. S-au identificat cel puin 24 de gene codificatoare ale rezistenei la tetraciclin i trei determinani de rezisten la oxitetraciclin, mai nti la Streptomyces, care produce oxitetraciclina i la Mycobacterium sp. Rezistena determinat genetic (Taylor, 1996) este mediat de 3 mecanisme diferite: - activitatea pompelor de eflux, dependente de energie, care elimin tetraciclina din celul; - protecia ribosomilor prin intermediul proteinelor solubile; - inactivarea enzimatic (degradarea oxidativ)a antibioticelor. Cele mai multe gene de rezisten codific pentru unul dintre cele dou mecanisme importante ale rezistenei: efluxul sau protecia ribosomilor. Aceste dou mecanisme de rezisten la tetracicline sun t cele mai rspndite i nu degradeaz compusul chimic. Proteinele de eflux schimb un proton pentru un complex tetraciclin-cation i sunt sisteme antiport. Rezistena la tetraciclin poate fi consecina sintezei unor proteine ce interacioneaz cu ribosomul. Proteinele protejeaz ribosomii de interaciunea cu antibioticul, astfel nct sinteza proteinelor rmne neafectat n prezena antibioticului. Protecia ribosomilor celulari este mediat de cel puin 6 clase de proteine: TetM, TetO, TetP, TetQ, TetS, OtrA, la care s-au adugat ulterior TetT i TetW. Protecia ribosomilor de aciunea tetraciclinei, ca mecanism de rezisten, s-a descoperit la Streptococcus. Proteinele protectoare ale ribosomilor confer rezisten la tetraciclin, doxiciclin i minociclin. Ele se aseamn cu EF-G, proteina care catalizeaz reacia de translocaie, etapa urmtoare treptei inhibat de legarea tetraciclinei. Proteina TetM, descoperit iniial la Streptococcus, unde este codificat de transpozoni conjugativi ca Tn916 i Tn1545, dar i la numeroase bacterii Gram negative (Neisseria, Haemophilus, Bacteroides), dar i la Mycoplasma, Ureaplasma, Streptococcus, Staphylococcus. Proteina TetM s-a purificat (72 kDa) i s-a artat c n vitro se asciaz cu ribosomii. n prezena TetM, legarea teraciclinei la ribosom nu este alterat, dar legarea nu modific funcionalitatea ribosomului. Are efect protector n vitro, fa de aciunea tetraciclinei. Explicaia efectului protector este c proteina se asociaz cu ribosomii, fc ndu-i insensibili la aciunea tetraciclinei. TetO este o protein codificat de o plasmid la Campylobacter coli, Campylobacter jejuni i la bacteriile Gram pozitive, unde pare a fi codificat de o gen cromosomal. TetQ s-a identificat la Bacteroides sp. TetS, la Listeria monocytogenes, este codificat de o gen plasmidial, iar la Enterococcus faecalis, gena codificatoare pare a fi localizat pe cromosom. TetP este codificat de o plasmid la Clostridium perfringens. OtrA, de la Streptomyces rimosus, productor de oxitetraciclin, este codificat de o gen crmosomal. Toate proteinele care confer protecia ribosomilor sunt polipeptide de dimensiuni uniforme: TetO are 639

112

aminoacizi, iar OtrA, 661. Gradul de omologie i de identitate a aminoacizilor diferitelor proteine atinge 75% i respectiv 37 %. Genele codificatoare ale proteinelor de protecie ribosomal sunt larg distribuite la bacterii, ceea ce a sugerat ideea mobilitii determinanilor genetici de la organismele productoare de antibiotic l a cele de interes clinic. Mecanismul de aciune a proteinelor de protecie ribosomal Protecia ribosomal este rezultatul sintezei unor proteine codificate de genele de rezisten, care se asociaz cu ribosomii i interfer cu legarea tetraciclinei. Tetraciclinele inhib sinteza proteinelor prin legarea cu afinitate nalt, de un singur situs localizat pe subunitatea ribosomal 30S, probabil de proteinele S7 , S14 i S19. Legarea tetraciclinei n acest situs blocheaz legarea aminoacil-ARNt sintetazei la situsul ribosomal A (acceptor). Treapta sintezei proteice inhibat de tetraciclin este cea catalizat de EF-Tu (elongation factor thermo-u nstable). Activitatea pompelor de eflux este o modalitate de a limita accesul tetraciclinei la ribosomi i are ca rezultat creterea capacitii celulei de a elimina antibioticul la o rat egal cu rata nglobrii. Este cel mai comun mecanism de rezisten, mediat de produsele de sintez ale genelor de rezisten: acestea sunt proteine ale membranei citoplasmatice care funcioneaz ca transportori ai tetraciclinei, dependeni de energie. Dei efluxul mpiedic acumularea tetraciclinei chiar n celulele rezistente, nivelul intracelular al antibioticului depete nivelul inhibitor al sintezei proteinelor (Speer, 1992). Explicaia se bazeaz pe capacitatea tetraciclinei de a exista n mai multe forme ionice. Este posibil ca o anumit form ionic s se lege mai uor de ribosomi, comparativ cu altele. La tulpinile rezistente, este eliminat forma activ a antibioticului, iar n celul rmne o concentraie mare de tetraciclin inactiv sau mai puin activ, compatibil cu sinteza proteinelor. Genele tet, codificatoare ale proteinelor de eflux, sunt asociate cu plasmide conjugative, ceea ce explic distribuia larg a rezistenei. Proteinele de eflux sunt molecule membranare, care funcioneaz ca pompe de export dependente de energie. Sunt sisteme antiport, care schimb un proton pentru un complex tetraciclin-cation. Rezultatul activitii pompelor de eflux este scderea concentraiei intracelulare a antibioticului i protecia ribosomilor. Majoritatea genelor tet codificatoare ale proteinelor de eflux ale bacteriilor Gram negative (tetA, tetB, tetC, tetD, tetE, tetG i tetH) au organizare genetic comun, diferit de a genelor bacteriilor Gram pozitive. Ele confer rezisten la tetraciclin, dar nu la minociclin sau la glicilcicline i cele mai multe sunt localizate n structura unor plasmide mari, conjugative, n care se gsesc gene de rezisten la alte antibiotice, gene de rezisten la metale grele i de sintez a unor factori de virulen aa cum sunt toxinele. Proteinele de eflux sunt proteine membranare de circa 46 kDa. Impermeabilitatea structurilor de suprafa ale celulei constituie o cauz important a rezistenei la tetracicline. Pentru a inhiba sinteza proteinelor, tetraciclinele trebuie s ptrund n celula bacterian i s se lege de ribosomi. Tetraciclina poate exista n dou forme: o form protonat (TH2) i o form legat de Mg2+ (THMg). Proporia THMg2+ crete la pH mai mare. Tetraciclina este acumulat n celul ca THMg2+, deoarece pH intern este mai mare dect cel extern. Forma protonat a tetraciclinei difuzeaz prin membrana citoplasmatic. Difuzia simpl nu explic faptul c bacteriile sensibile acumuleaz tetraciclin n citoplasm. n afara difuziei, tetraciclina este nglobat printr-un mecanism dependent de energie, care nu implic o protein de transport, ci diferena de pH ntre mediul celular i extracelular. Alterarea porinelor, cu limitarea difuziei tetrciclinelor n spaiul periplasmic este un mecanism posibil de rezisten la bacteriile Gram negative. Cele 2 mecanisme de rezisten la tetracicline (proteinele protectoare ale ribosomilor i proteinele de eflux) nu inactiveaz antibioticul. Rareori, antibioticul este inactivat sau modificat pe cale chimic. Inactivarea enzimatic a tetraciclinelor nu are semnificaie ca mecanism de rezisten, dar s-a evideniat la Bacteroides. Cteva specii de Bacteroides (bacterie anaerob) degradeaz oxidativ molecula de antibiotic. Gena care codific acest tip de rezisten este localizat pe 2 transpozoni nrudii, ce poart de asemenea o gen de rezisten la eritromicin. Gena codificatoare a enzimei care degradeaz tetraciclina s -a identificat iniial, prin capacitatea ei de a conferi rezisten pentru E. coli crescut n condiii aerobe, dar a fost inactiv fa de celulele de E. coli crescute n anaerobie sau de Bacteroides.

113

Gliciltetraciclinele sunt reprezentate de tigeciclin, utilizat pentru tratamentul infeciilor cutanate i intraabdominale. Caracteristica structural a tigeciclinei const n substituia n poziia 9 a tetraciclinei, cu un rest de glicin. Este un antibiotic cu spectru larg de aciune fa de bacterii Gram pozitive, Gram negative, aerobe i anaerobe, dar i fa de bacterii patogene rezistente la alte antibiotice: enterococi rezisteni la vancomicin, S. aureus meticilino-rezistent (MRSA), Str. pneumoniae rezistent la penicilin. Este activ fa de patogenii Gram negativi: enterobacterii, H. influenzae, N.gonorrhoeae, Legionella pneumophila, micobacterii netuberculoase cu cretere rapid.

Structura molecular a tigeciclinei

Dactilociclinele sunt derivai ai tetraciclinei, produi de Dactylosporangium. Ele difer de ali derivai prin aceea c sunt tetracicline glicozidice. Utilizarea clinic ete limitat, deoarece par s fie active numai fa de tulpinile bacteriene care poart gene de rezisten la tetraciclin, din clasa K. Unele izolate bacter iene sensibile la tetraciclin, nu sunt inhibate de dactilocicline. Incapacitatea lor de a inhiba bacteriile Gram pozitive i negative, se datoreaz probabil impermeabilitii structurilor de suprafa fa de dactilocicline (Speer i colab., 1992). Tetraciclinele se administreaz oral, dar unele sunt disponibile ca produse pentru administrare parenteral. Dup administrare oral, tetraciclinele sunt absorbite n stomac i n intestinul subire. Absorbia este influenat de coninutul alimentar i de cationii bivaleni. Cu ionii de Ca2+, tetraciclinele formeaz complexe neabsorbabile. Ele ptrund moderat n fluidele organismului i n esuturi i sunt excretate prin urin. Tetraciclinele sunt antibiotice cu spectru larg, fiind utilizate n clinica uman pentru tratamentul infeciilor cu bacterii Gram pozitive i Gram negative. Sunt de asemenea active fa de agentul malariei i se folosesc pentru profilaxia tulpinilor de Plasmodium falciparum rezistente la agenii chimioterapeutici specifici.

5.3. Macrolidele, Lincosamidele i Streptograminele

Macrolidele, lincosamidele i streptograminele (MLS) au o structur chimic diferit, dar acioneaz ntr-o manier asemntoare asupra unei game variate de bacterii (Gram pozitive, coci Gram negativi, Chlamydia, micoplasme, Legionella). Absena efectului asupra bacililor Gram negativi se explic prin

114

incapacitatea de a difuza prin membrana extern, datorit caracterului hidrofob al moleculei lor. Macrolidele i lincosamidele au proprieti antibacteriene, cel mai adesea bacteriostatice. Mecanismele de aciune ale antibioticelor grupului MLS MLS acioneaz asupra ribosomilor i mpiedic ribosomul bacterian s traduc ARN n dou moduri diferite. Situsul aciunii macrolidelor este subunitatea mare a ribosomilor bacterieni. a) Macrolidele inhib sinteza proteic dependent de ARN, la treapta alungirii catenei, producnd inhibiia translocrii peptidil-ARNt de la situsul acceptor(A), la situsul peptidil donor (P). Ele se leag de subunitatea ribosomal 50S i interfer cu procesul de translocaie a polipeptidului nascent, deoarece stimuleaz disocierea complexului peptidil-ARNt de ribosomi, n timpul sintezei. Centrul peptidil-transferazei (din subunitatea 50S) este situsul interaciunii antibioticelor MLS, al cloramfenicolului i puromicinei i pare a fi format n ntregime de structura secundar a ARN 23S, ce formeaz 6 domenii. Aceasta sugereaz c legturile peptidice sunt catalizate de ARNr. Macrolidele i ketolidele interacioneaz cu nucleotidele ARNr 23S (A2058, A2059 i G2505) din bucla central a domeniului V, componente ale centrului peptidil transferazei i blocheaz interaciunea lor cu reactivii fiziologici. Consecina este terminarea prematur a catenei i oprirea reversibil a sintezei proteinelor. Pentru eritromicin este suficient legarea unei singure molecule cu subunitatea mare a ribosomului. Eritromicina interacioneaz cu ARNr, la nivelul unei bucle a unor domenii ndeprtate n structura primar a ARN, dar care prin pliere sunt aduse n juxtapoziie: domeniile II i V ale ARNr 23S. Macrolidele probabil se leag la situsul peptidil donor (P) al ribosomului i prin competiie interfer cu translocaia peptidului de la situsul acceptor la situsul donor. Eritromicina poate s produc disocierea peptidil-ARNt de ribosom. La E. coli, eritromicina inhib formarea subunitii ribosomale 50S. b) Al doilea mecanism de aciune const n inhibarea treptelor iniiale ale asamblrii subunitii ribosomale 50S. Macrolidele i ketolidele interacioneaz cu subunitatea 50S parial asamblat, blocnd procesul asamblrii. Componentele neasamblate sunt supuse degradrii nucleolitice. n celulele tratate cu eritromicin se acumuleaz un precursor al subunitii 50S. Eritromicina se leag de subunitatea incomplet format din ARNr 23S, 5S, dar conine numai 18 dintre cele 34 proteine ribosomale ale subunitii mari. Situsul de legare la subunitatea ribosomal 50S este comun pentru eritromicin, pentru macrolidele noi, pentru lincosamid i streptogramina B. Pentru eritromicin i claritromicin s-a identificat un nou mecanism de aciune: ele inhib sinteza ARNm pentru producerea endotelinei-1, la concentraii terapeutice, necitotoxice. Endotelina-1 este un polipeptid cu potenial vasoconstrictor cunoscut i are efecte bronhoconstrictoare. Stimuleaz secreia de mucus i produce edemul mucoasei, avnd rol de mediator al inflamaiei cilor aeriene. Procesul inflamator este multifactorial i macrolidele acioneaz pe mai multe ci: cele derivate din eritromicin inhib sinteza citochinelor proinflamatorii (TNF-, IL-6, IL-8, IL-12 i IFN-K). Macrolidele Denumirea de macrolide desemneaz un grup de antibiotice nrudite structural, produse de specii ale g. Streptomyces. Grupul macrolidelor cuprinde numai compui nepolienici (de exemplu, eritromicina). Compuii care conin un sistem format din mai mult de dou legturi duble de C conjugate, sunt clasificai ca poliene. Din punct de vedere structural, macrolidele sunt caracterizate printr-un inel lactonic multiunitar, cu puine legturi duble, fr atomi de N, la care se ataeaz, prin legturi glicozidice, 1-3 componente glucidice. Macrolidele pot fi glucide aminate sau glucide fr N (neutre). Sunt poliketide naturale, produse ale metabo lismului secundar la multe specii ale g. Streptomyces. Macrolidele prezint diferene structurale, dar posed un schelet de C comun. Dup numrul de atomi de C ai inelului lactonic (de obicei par), se disting compui cu 12, 14, 15 sau 16, cu substit uieni variai (grupri metil, hidroxil). Prezena gruprilor determin asimetria centrilor inelului lactonic. Componentele glucidice ataate prin legturi glicozidice de inelul lactonic sau legate una de alta, sunt totdeauna 6deoxihexoze. Glucidele poart grupri N-, O- sau metil. La unele macrolide, glucidele sunt esterificate de un acil: grupul acetil sau izovaleril. Inelul lactonic al antibioticelor macrolide este sintetizat din uniti acetat, care sunt adugate gradat. Inelul lactonic al spiramicinei are duble legturi care pot lega aceste macrolide cu macrolidele polienice. Fiecare compus are caracteristici chimice ct i biologice, proprii: - majoritatea celor care au cicluri formate din 14 atomi de C sunt substane naturale (eritromicina, oleandomicina) sau derivai semisintetici (roxitromicina, diritromicina, claritromicina); - un singur compus cu 15 atomi (azitromicina);

115

- compui naturali cu 16 atomi (josamicina, spiramicina, kitasamicina, midecamicina i tilosina) sau derivai semisintetici(rokitamicina, miocamicina, tilmicosina).

Structura molecular a eritromicinei A (R=H) i claritromicinei (R=CH3)

Structura molecular a ABT-773

Structura molecular a tilosinei

Macrolidele importante din punct de vedere clinic Eritromicina A, primul antibiotic macrolid utilizat n clinic, posed un inel cu 14 atomi. Tilosina, un macrolid cu 16 atomi, este utilizat n zootehnie att ca agent terapeutic ct i ca stimulator de cretere. Claritromicina este derivatul 16-metoxi al eritromicinei i acum se folosete pentru eradicarea infeciei cu H. pylori.

Structura molecular a claritromicinei

116

Eritromicina, cel mai important antibiotic macrolid, este produs de Streptomyces erythreus, izolat dintr-un sol din Filipine. A fost primul antibiotic macrolid introdus n terapie n 1952 i este reprezentativ pentru clasa macrolidelor. Structura sa const dintr-un inel lactonic macrociclic, de care se ataeaz dou resturi de zahr.

Structura molecular a eritromicinei

Este puin solubil n ap i este rapid inactivat de sucul gastric. Ca i alte macrolide, eritromicina penetreaz greu peretele bacteriilor Gram negative. Eritromicina este un antibiotic cu spectru larg: este activ fa de bacteriile Gram pozitive i Gram negative, fa de actinomicete, Mycobacterium, T. pallidum, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia, Rickettsia. n funcie de concentraie, de specie, de faza de cretere sau de densitatea inoculului, eritromicina poate fi bacteriostatic sau bactericid. Eritromicina este un nlocuitor al penicilinei, la persoanele alergice pentru ciclul -lactamic. Cele mai multe antibiotice macrolide sunt substane bazice, dar unele sunt neutre. Unele sunt solubile n ap, iar altele, insolubile n ap, dar solubile n etanol. Cele folosite n clinic constau dintr-un inel lactonic cu 14, 15 sau 16 atomi de C, substituit cu dou sau mai multe glucide neutre sau aminate la C3 i C5 . Macrolidele inhib creterea bacteriilor, dar nu sunt active fa de fungi, iar lactonele polienice inhib fungii, dar nu influeneaz creterea bacteriilor. Spectrul de activitate al macrolidelor include bacteriile Gram pozitive (Staphylococcus i Streptococcus) i pe cele anaerobe (Clostridium). Bacteriile Gram negative (H. pylori, Haemophilus spp. Pasteurella spp. i Legionella spp.) sunt de asemenea sensibile. Microorganismele enterice (E. coli i Salmonella) sunt intrinsec rezistente, prin excluderea macrolidelor din citoplasm datorit arhitecturii membranei externe. Moleculele noi, ca azitromicina i claritromicina au activitate antibacterian superioar eritromicinei, deoarece au coeficieni superiori de penetrare intracelular i tisular, sunt mai stabile, mai uor absorbite, iar efectele secundare gastrointestinale au o inciden mai sczut. Azitromicina este activ fa de bacteriile enterice. Mycoplasma spp. i Chlamydia spp. sunt de asemenea sensibile la macrolide. Claritromicina are activitate antibacterian semnificativ, n vitro, fa de micobacteriile netuberculoase. Macrolidele sunt antibiotice bacteriostatice, utilizate pentru tratamentul unui spectru larg de infecii bacteriene ale tractului respirator cu Legionella, Chlamydia, Haemophilus, unele specii de Mycobacterium (M. intracellulare, M. avium, dar nu M. tuberculosis), ulcerului gastric asociat cu H. pylori i infecii ale esuturilor moi. Streptograminele Streptograminele sunt reprezentate de doi compui (A i B) cu aciune sinergic. Ca i macrolidele i lincosamidele i compuii A i B ai streptograminelor se fixeaz la subunitatea 50S a ribosomilor, la nivelul ARNr 23S.

117

Lincomicina i clindamicina Aceste doua antibiotice nu sunt macrolide, dar multe dintre proprietile lor biologice sunt asemntoare cu ale eritromicinei. Sunt formate dintr-un aminoacid legat cu un zahr aminat. Lincomicina este sintetizat de Streptomyces lincolnensis (izolat din solul din Lincoln, Nebraska).

Structura molecular a lincomicinei

Trsturile structurale specifice ale lincomicinei sunt reprezentate de prezena gruprilor N-CH3 i SCH3. Originea multor grupri metil, legate de O, N i C este n compuii C1. Grupele metil sunt transferae prin transmetilare din sistemele donoare C1 . Lincomicina este activ fa de o larg varietate de bacterii, n primul rnd Gram pozitive. Ele au aceleai situsuri de legare la subunitatea 50S, ca i macrolidele i cloramfenicolul i pot intra n competiie pentru legare. Dei sunt foarte diferite ca structur chimic, eritromicina i clindamicina se leag de subunitatea ribosomal 50S. Inhib sinteza proteinelor prin interferen cu reacia de transpeptidare, probabil prin blocarea situsului P (peptidil-donor). Astfel este blocat alungirea catenei peptidice. Efectul este bacteriostatic. Macrolidele i lincomicina sunt bacteriostatice: inhib numai iniierea noilor catene peptidice. Utilizarea terapeutic a macrolidelor a fost sever compromis de emergena tulpinilor rezistente ale multor specii de bacterii patogene. Fenomenul de rezisten a aprut curnd dup introducerea eritromicinei n terapie n anii 50. S-a observat c tulpinile rezistente la eritromicin, au devenit rezistente nu numai la toate celelalte macrolide, dar i la lincosamid i streptogramin B, antibiotice nenrudite chimic cu macrolidele. De aceea, fenomenul s-a denumit rezistena fenotipic la macrolide-lincosamid-streptogramin B(MLSB). Mecanismele rezistenei la antibioticele MLS Rezistena la antibioticele MLS (macrolide, lincosamida i streptogramina B) este indus prin mai multe mecanisme: - scderea permeabilitii peretelui celular la medicament; - efluxul activ al medicamentului din celul. Pompele prin care celula elimin agenii antimicrobieni aparin suprafamiliei MSF (Major Superfamily Facilitator) sau RND (Resistance, Nodulation and cell Division). Ambele folosesc fora proton-motrice pentru energizarea efluxului. Supraproducia constitutiv a proteinelor de eflux, n absena agentului chimic, creeaz un dezavantaj sever n competiia cu cele la care proteinele de eflux sunt exprimate adaptativ; - modificarea mutaional a unei singure proteine a subunitii 50S; - modificarea ARNr 23S al subunitii 50S prin metilare. Metilazele sunt codificate de genele erm (erithromycin ribosome methylation); - inactivarea enzimatic a antibioticelor: enzimele care hidrolizeaz inelul lactonic al nucleului macrolid i fosfotransferazele care inactiveaz macrolidele prin fosforilarea gruprii 2-OH a glucidului aminat. Rezistena la macrolide este cel mai adesea rezultatul modificrii intei antibioticului i const n modificarea posttranscriere a ARNr 23S sub aciunea adenin-N6-metiltransferazei. Unele metilaze confer rezisten numai la unul sau la dou antibiotice ale clasei MLSB. Enzimele de metilare adaug una sau dou

118

grupe metil la un rest de adenin situat ntr-o poziie fix (A2058 la E. coli) a ARNr 23S. Metilarea are ca rezultat schimbarea conformaional a ribosomilor, ducnd la scderea afinitii pentru toate antibioticele MLS. Metilaza ribosomal confer rezisten ncruciat la antibioticele MLSB, deoarece situsurile de legare ale acestor antibiotice se suprapun. La diferite tulpini bacteriene patogene s-au evideniat zeci de gene codificatoare ale metiltransferazei. Genele s-au denumit erm (erythromycin ribosome methylation - A, B, C, D, E, F, G, H, L, N, O, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y) i s -au izolat de la o larg varietate de bacterii Gram pozitive i Gram negative. Multe metil-transferaze sunt exprimate constitutiv. Toate enzimele Erm ale unei clase metileaz inta ribosomal a macrolidelor, adenozina 2058. Expresia rezistenei la MLSB poate fi constitutiv sau inductibil. Tipul de rezisten depinde de secvena reglatoare de gena structural a metilazei. Dac expresia rezistenei este inductibil, tulpinile sunt rezistente numai la macrolidele cu 14 i 15 atomi de C, iar macrolidele cu 16 atomi de C, lincosamida i streptogramina rmn active. La tulpinile de S. aureus, rezistena la MLSB poate fi indus prin expunerea culturii la concentraii mici de eritromicin, care induce expresia enzimei metil-transferaz (Erm-C). Metiltransferaza metileaz specific ARN 23S la poziia N-6 a adenozinei din poziia 2058 (A2058) la E. coli, un nucleotid esenial pentru legarea antibioticelor MLSB. Tulpinile bacteriene cu ARNr-metilaze inductibile au predominat n anii 60-70. Astzi, n multe arii geografice se izoleaz tulpini care sintetizeaz constitutiv ARNr-metilaze, fr preexpunere la antibiotic. Expresia constitutiv a genei erm se datoreaz alterrilor structurale ale atenuatorului traducerii erm, datorate deleiilor, duplicaiilor sau mutaiilor punctiforme. Multe gene erm fac parte din structura unor transpozoni conjugativi sau neconjugativi, localizai pe cromosom, dei unele gene erm s-au gsit n structura genetic a plasmidelor. n general, genele erm sunt asociate cu gene de rezisten la alte antibiotice, n special cu cele de rezisten la tetraciclin. Transpozonii conjugativi pot avea un spectru larg de gazd. Astfel se explic distribuia larg a genelor erm la un numr mare de specii bacteriene. Genele erm au un coninut G+C sczut (31-34%). Coninutul G+C cromosomal al bacteriilor Gram negative este mai mare sau egal cu 50%, iar al bacteriilor Gram pozitive este de circa 35%. Alte gene de metilare sunt tlr, car, myr, smr i toate confer rezisten la macrolidele cu un inel de 16 atomi. Numeroase cazuri de rezisten a tulpinilor bacteriene patogene la macrolide, pot fi datorate alterrii mutaionale a nucleotidelor specifice n secvena ARNr 23S din subunitatea ribosomal mare, 50S. Adenina 2058 sau adenina adiacent situsului de legare a peptidil-transferazei (A2057 sau A2059)este schimbat cu alt nucleotid prin mutaie i confer cel mai nalt grad de rezisten la anumite macrolide. Mutaiile perturb, ntro msur mai mare sau mic, structura situsului de legare, de unde rezult scderea capacitii antibioticelor macrolide de a interaciona cu ribosomii i de a inhiba activitatea lor. Toate mutaiile care perturb structura situsului de legare a antibioticului la ARN 23S, reduc capacitatea medicamentelor de a interaciona i de a inhiba activitatea ribosomilor. Metilarea ARNr la A2058 sub aciunea metil-transferazei confer rezisten prin acelai mecanism. Un nivel mai sczut al rezistenei este produs prin mutaiile la poziiile 2057, 2452 i 2611, situate n afara centrului de interaciune al moleculei ARNr cu macrolidele. Mutaiile ARNr s-au identificat prin tehnicile bazate pe PCR: regiunea genei ARN 23S a H. pylori codificatoare a secvenei adiacente nucleotidei A2058 a fost amplificat i analizat pentru tabloul aciunii enzimelor de restricie i prin hibridare cu probele de oligonucleotide. Mutaiile proteinelor ribosomale L4 i L22 ale subunitii 50S induc rezistena la macrolide la Str. pneumoniae, datorit alterrii conformaiei situsului care leag medicamentul. Cele dou proteine sunt n contact direct cu A2058 i A752 din regiunea peptidil-transferazei. Mutaii ale ARNr care confer rezisten la macrolide. Mecanismul rezistenei mutaionale a fost studiat la Helicobacter pylori. Agentul infecios colonizeaz stomacul la circa 30% dintre indivizii umani aduli. Majoritatea infeciilor sunt asimptomatice, dar H. pylori este principalul agent etiologic al celor mai multe ulcere duodenale i multor ulcere gastrice. Este asociat cu dezvoltarea unor tipuri de neoplazie gastric. Tratamentul preferat pentru infeciile agresive este o combinaie de medicamente care include un derivat al eritromicinei - claritromicina care amelioreaz stabilitatea mediului acid i un inhibitor al pompei de protoni. Rezistena la claritromicin apare n timpul terapiei i s-a atribuit mutaiilor la poziiile A2058 sau A2059 n ARNr 23S. La H. pylori nu s-au identificat gene de metilare a ARNr i nici sisteme de eflux ale macrolidelor. Mecanismele rezistenei par a fi limitate la apariia mutaiilor ARNr 23S. Dat fiind secvena foarte stabil a ARNr la diferite specii de bacterii, este de presupus c mutaiile identice vor produce acelai fenotip la diferite specii bacteriene. Au fost identificate situsurile mutaiei ARNr care confer rezistena bacteriilor patogene la macrolide:

119

- apariia mutaiilor la poziia A2057 este limitat la un grup de propionibacterii rezistente la eritromicin i la o tulpin dublu mutant de H. pylori, cu o mutaie la poziia 2032, suplimentar fa de substituia 2057; - adenozina 2058 este nucleotidul esenial pentru interaciunea macrolidelor cu ribosomul. Mutaia A2058 la G a fost prima mutaie identificat a ARNr, care c confer rezisten la eritromicin; - mutaiile A2059 la C sau G s-au identificat la Mycobacterium, Propionibacterium, H. pylori i Streptococcus pneumoniae. n experimentele in vitro, mutantele A2059 la H. pylori au niveluri inferioare de rezisten la claritromicin, comparativ cu mutantele A2058. Dup expunerea la antibioticele macrolide, tipurile de mutaii menionate ale ARNr pot s devin dominante n scurt timp n populaiile de celule care posed numai 1sau 2 operoni rrn (genele transcrise n ARNr). Cu ct celula posed mai puini operoni rrn, cu att crete probabilitatea apariiei rezistenei la macrolide prin mutaiile ARNr. Mutaiile spontane ale ARNr apar constant cu frecven mic n populaiile bacteriene, iar medicamentele exercit presiune selectiv, favoriznd supravieuirea i proliferarea mutantelor. La bacteriile cu operoni rrn multipli, efectul benefic al mutaiei ntr-un operon nu ofer avantaj fenotipic semnificativ. Dar amplificarea genei alele mutante, astfel nct s se extind la majoritatea operonilor rrn ai celulei, poate conferi un fenotip rezistent. Mutaia ARNr 23S are un potenial foarte mare de emergen a mutantelor rezistente la macrolide. n general, la bacteriile cu operoni rrn multipli, rezistena este mediat de o metil-transferaz codificat de gena erm, cea care are capacitatea potenial de a modifica toi ribosomii. Rezistena prin sistemul de eflux. Unele gene de rezisten codific proteine de transport, cu rol n efluxul proteinelor. Acestea nu modific antibioticul i nici inta antibioticului, ci au rol de pompe de eliminare a antibioticului din citoplasm sau din situsurile membranare de legare, meninnd astfel concentraia intracelular sczut. Multe dintre proteinele de eflux, codificate mef (macrolide efflux) sunt omologe structural cu celelalte proteine de eflux. La S. aureus funcioneaz un sistem membranar al pompelor de eflux pentru macrolide. A fost descris existena enzimelor care hidrolizeaz streptogramina B sau modific antibioticul prin adugarea unui grup acetil (acetil-transferaze) la streptogramina A. Degradarea prin hidroliza inelului lactonic al macrolidelor sub aciunea unei esteraze i modificarea prin fosforilarea macrolidelor i nucleotidilarea lincosamidei sunt mecanisme puin importante pentru rezistena la MLSB. Un numr mic de tulpini bacteriene poart gene pentru sinteza enzimelor inactivatoare. n general, eficiena terapeutic a antibioticelor se evalueaz prin inhibiia creterii bacteriene n vivo, cnd concentraia antibioticului msurat de obicei n ser, depete concentraia minim inhibitorie (CMI) evaluat in vitro. Macrolidele administrate n scop terapeutic, adeseori ating o concentraie seric mai mic dect valoarea CMI. Concentraiile serice ale macrolidelor mai mici dect valoarea CMI sunt inhibitorii prin : - modificarea expresiei unor factori de virulen: adezine, toxine, exoenzime, motilitatea flagelar; - inducerea unor modificri structurale detectabile la microscopul electronic; - creterea sensibilitii la factorii serici litici. Toi aceti factori diminu capacitatea agentului patogen de a produce manifestrile patologice specifice. Eficiena terapeutic a concentraiilor unor antibiotice, inclusiv ale macrolidelor, mai mici dect CMI se poate datora altor factori: macrolidele se concentreaz n leucocite i pot fi astfel transportate la situsul infeciei, unde sunt parial eliberate. Macrolidele interfer cu rspunsul inflamator declanat de agentul infecios: leucocitele (neutrofile, monocite, macrofage) concentreaz n lizosomi, macrolidele din mediul extracelular neimplicat (esuturi, vase) i le transport n situsul infecios prin rspunsul chimiotactic, elibernd antibioticul n stare activ. Dozele subinhibitorii ale macrolidelor induc modificri structurale fine ale membranei externe i modific sensibilitatea la factorii serici antibacterieni (proteinele ce leag Fe, proteinele de faz acut, complementul, anticorpi naturali). Emergena tulpinilor rezistente la antibiotice a stimulat cutarea unor noi ageni antimicrobieni. Telitromicina este primul antibiotic cu inel de 14 atomi de C, din grupul ketolidelor, introdus n clinic. Ketolidele sunt derivai semisintetici ai eritromicinei A, cu proprieti biologice noi. Ketolidele reprezint o nou entitate chimic, caracterizat prin nlocuirea L-cladinozei din inelul A al eritronolidei, cu o funcie 3-ceto i un carbamat la C11- C12. Restul 3-OH rmas dup nlturarea Lcladinozei (un glucid neutru) a fost oxidat la grupul 3-ceto. Denumirea clasei deriv de la gruparea 3-ceto i de la inelul lactonic (Ackermann, 2003). Telitromicina i ABT 773 reprezint cea mai recent generaie de medicamente, caracterizate prin grupul 3-cetonic ce substituie restul de zahr 3-cladinoz din eritromicin i claritromicin.

120

Ambele ketolide au gruparea carbamat C11-C12, care la telitromicin se extinde cu un grup alkil-aril. Aceast extensie permite telitromicinei s interacioneze cu domeniul al II-lea al ARNr 23S (Vester, 2001).

Structura molecular a telitromicinei: Grupul metoxi (a) la C 6 favorizeaz stabilitatea n mediul acid i mpiedic hemiacetalizarea intern; funcia ceto (b) elimin inducerea rezistenei ncruciate cu MLS i favorizeaz legarea de ribosom; lanul lateral carbamat (c) ataat la C11/C12 mrete afinitatea pentru ribosomi i amelioreaz interaciunea cu ribosomii rezisteni la MLS B (dup Tran, 2004).

S-a considerat c L-cladinoza este esenial pentru activitatea antimicrobian a macrolidelor cu inel de 14 atomi de C, deoarece scoaterea ei din claritromicin, azitromicin i roxitromicin duce la pierderea activitii antimicrobiene. Dar modificarea altor poziii ale inelului, compenseaz pierderea cladinozei. Aceast nou clas de compui antimicrobieni a fost produs pentru a depi rezistena prin mecanismele obinuite a cocilor Gram pozitivi, fa de eritromicina A. Telitromicina se leag de ribosomi cu afinitate de pn la 10 ori mai mare dect eritromicina, dar legarea la situsul critic A 2058 este considerabil redus. Telitromicina are o activitate antimicrobian n vitro, fa de bacteriile aerobe Gram pozitive, mai bun dect a macrolidelor. Este foarte activ fa de patogenii respiratori atipici (Bordetella sp, Legionella sp., Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae). Este activ fa de cteva bacterii Gram pozitive i negative: Clostridium sp., Peptostreptococcus sp. i Bacteroides sp. Este inactiv fa de enterobacterii, fa de Acinetobacter baumanii (bacil Gram negativ). Se acumuleaz n celulele PMN i n macrofage, unde atinge concentraii de 130 i respectiv de 71 de ori mai mari dect n compartimentul extracelular. Din aceste celule, antibioticul este eliberat lent, ceea ce sugereaz c ele acioneaz ca vehicule de transport spre focarul infecios. Telitromicina este metabolizat n ficat. Metabolitul major (un alcool) este de 4-16 ori mai puin activ dect telitromicina i este eliminat n proporie de 80% pe cale digestiv. Excreia telitromicinei este aproape complet din urin, dup 24 de ore, iar n fecale, dup 72 de ore.

5.4. Antibioticele -lacamice

Descoperirea antibioticelor F -lactamice este una dintre cele mai importante din istoria farmacologiei terapeutice. La sfaritul anilor 40, Brotzu a izolat din apa mrii (la Cagliari) organismul fungic productor de penicilin, Cephalosporium chrysogenum (Acremonium chrysogenum). n culturile n mediul lichid s-a descoperit alt antibiotic, derivat al compuilor F-lactamici, denumit cefalosporin.

Structura molecular a acidului 6-aminopenicilanic

Antibioticele F-lactamice conin n molecula lor, un inel tetraatomic, n care o grupare carbonil i un atom de N formeaz o legtur amidic (o F -lactamin). Prezena nucleului F-lactamic confer acestor

121

substane, proprieti fizico-chimice i biologice specifice (tabelul 7). La peniciline, cel de-al II-lea nucleu al structurii chimice a penicilinelor este inelul tiazolidinic. Penicilinele sunt derivate ale acidului 6aminopenicilanic. Cele dou nuclee (F -lactamic i tiazolidinic) nu sunt coplanare, iar atomul de N iese n afara planului. Atomii de H legai la C5 i C6 au poziie cis. C3 purttor al gruprii COOH este plasat n partea opus gruprii amidice ataat de C6. Prezena celor 3 atomi de C asimetrici (C3, C 5, C 6), determin activitatea optic a moleculei de penicilin. Structura penicilinei poate fi fragmentat n componentele din care se sintetizeaz: resturi de acid acetic monosubstituit, L-cistein i D-valin. Clasificarea antibioticelor -lactamice Familia antibioticelor -lactamice cuprinde un numr mare de variante moleculare, primul reprezentant fiind penicilina, care se pot clasifica n patru grupe: - peniciline - cefalosporine - carbapeneme - monobactami. Dup modul de obinere se disting : - peniciline de biosintez: penicilina G, penicilina V, penicilina N; - peniciline de semisintez: meticilina, oxacilina, ampicilina, carbenicilina, amoxicilina, azlocilina, piperacilina; - peniciline de sintez chimic: peneme, monobactame, carbapeneme. Componentele moleculare susceptibile de modificare chimic, cu implicaii practice majore pentru diversificarea antibioticelor F-lactamice sunt: legtura C-N din inelul F -lactamic, gruparea amino legat de C6, gruparea COOH legat de C3, atomul de S i atomul de H ataat de C6. Legtura C-N din ciclul F-lactamic este mai reactiv dect cea din amidele obinuite.
Tabelul 7. Structura antibioticelor F-lactamice i organismele productoare (dup Chopra, 2001) Clase de antibiotice F-lactamice naturale Penam Reprezentani Peniciline Microorganisme productoare Bacterii Gram pozitive Penicillium Streptomyces clavuligerus chrysogenum Nocardia lactamdurans Aspergillus nidulans Fungi

Gram negative

Ceph-3-em

Cefalosporine Cefamicine Cefabicine Chitinovorine

Cephalosporium chrysogenum Paecilomyces persicinus

Str. clavuligerus

Flavobacterium sp. Lysobacter lactamgenus

Clavam

Acid clavulanic

Str. clavuligerus Str. olivaceus

122

Carbapenem

Tienamicine Acid olivunic Epitienamicine

Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis

Erwinia carotovora Seratia sp.

Monobactam

Nocardicine Monobactami

Agrobacterium radiobacter Pseudomonas acidophila

Succesul antibioticelor F-lactamice n tratamentul maladiilor infecioase se datoreaz specificitii i toxicitii sczute. n ciuda numrului mare de antibiotice i a incidenei crescute a izolatelor rezistente la peniciline, antibioticele F-lactamice sunt cele mai utilizate. Deoarece enzimele de sintez sunt adeseori instabile i se gsesc n cantiti mici, purificarea fiind dificil, cile biosintezei penicilinei (penam) i a cefalosporinei (cefem) s-au elucidat la sfritul anilor (70. Pe baza structurii chimice, F-lactamii pot fi clasificai n 5 grupe. Toi au n comun inelul F -lactamic cu 4 atomi. Cu excepia monobactamilor care au un singur inel, antibioticele F-lactamice constau dintr-un inel biciclic. Cefalosporinele sunt derivate N-acil ale acidului 7-aminocefalosporanic. Ele conin ciclul F-lactamic, dar difer structural de peniciline pentru c au un ciclu hexagonal de dihidrotiazin, n locul celui pentagonal de tiazolidin. Prin condensarea celor dou inele rezult nucleul cefem. Cele dou inele nu sunt aezate n acelai plan, iar atomii i gruprile ataate lor pot ocupa poziii foarte diferite.

Structura molecular a acidului 7-aminocefalosporanic

Molecula de cefalosporin poate fi fragmentat n resturile din care este sintetizat: acid D-E aminoadipic, L-cistein, E-F-dehidrovalin i de acid acetic. Nucleul cefem este mai stabil dect nucleul penam, ceea ce explic numrul mare de cefalosporine semisintetice i analogi sintetici. Cele dou cicluri sunt asemntoare structural. n plus, penicilina N i cefalosporina C au aceiai caten lateral, ceea ce sugereaz asemnarea cilor de biosintez. Cele dou antibiotice F-lactamice pot fi produse n condiii care favorizeaz numai o cretere lent a micliului, n medii organice complexe sau definite chimic, n suspensii bine aerate. Aciunea antibacterian s-a pstrat dup modificrile importante ale legturilor atomilor din inelul cefem, deoarece conserv o anumit configuraie steric. Mecanismul lor de aciune este acelai cu al penicilinelor: se leag ireversibil de PBP i mpiedic formarea legturilor transversale ale peptidoglicanului. Cefalosporinele cu importan clinic major sunt semisintetice, cu spectru mai larg de activitate dect penicilinele i sunt, n general, mai rezistente la aciunea -lactamazelor. Nucleul clavam are structura biciclic F -lactamic. n poziia C2 are o grupare F -hidroxietiliden, iar gruparea carboxil C3 i atomul C5 au aceiai configuraie c i n molecula de penicilin. Acidul clavulanic poteneaz aciunea antibacterian a unor antibiotice F-lactamice cu spectru larg. Acioneaz ca inhibitor al lactamazelor, enzime ce inactiveaz inelul F-lactamic. Acidul clavulanic asociat cu un antibiotic F -lactamic cu spectru larg, sensibil la efectul hidrolitic al F-lactamazelor, interacioneaz cu enzima i formeaz un complex

123

inactiv enzim-acid clavulanic. Antibioticul F -lactamic cu spectru larg este protejat i rmne n forma sa activ. Acidul clavulanic inhib TEM F -lactamazele, precum i F -lactamazele produse de S. aureus. Se cunosc dou asociaii cu efect terapeutic optim: augmentin (amoxicilin - acid clavulanic) i timentin (ticarcilin - acid clavulanic). Un numr relativ mare de antibiotice naturale acioneaz asupra enzimelor implicate n biosintez a peptidoglicanului i stabilizrii peretelui celular. n funcie de spectrul antibacterian, cefalosporinele se clasific n patru grupe notate I, II, III i IV. Cefalosporinele din grupa I i II, se disting n funcie de stabilitatea lor la hidroliza cu -lactamazele cu spectru larg (TEM-1/2 i SHV-1). n grupul II sunt incluse cefalosporinele (grup II B) i cefamicinele (grupul II A). Grupele III i IV conin antibiotice cu un spectru larg de aciune. Grupa III e foarte important calitativ i cantitativ n practica medical. Reprezentanii grupei III sunt: cefotaxima, ceftriaxona i ceftazidina. n grupa IV sunt reunite C-3 produse ca sruri cuaternare de amoniu (cefperoma, cefepima). Aceste molecule posed aceeai activitate n vitro ca cefotaxima asupra bacililor Gram negativi dar se difereniaz printr-o bun activitate n vitro asupra enterobacteriilor productoare de cefalosporinaze i asupra tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa multirezistente. Carbapenemele se deosebesc de peniciline, prin absena atomului de S, dar apare dubla legtur la C2C3 n inelul tiazolidinic. Prezena dublei legturi n inelul carbapenem confer acestei structuri o reactivitate chimic superioar, comparativ cu inelul penam al penicilinei. Mecanismul de aciune este comun cu al celorlalte antibiotice F-lactamice. Antibioticele F -lactamice monociclice sunt reprezentate de nocardicine i monobactami. Nocardicina A are aciune antibacterian moderat fa de cteva specii Gram negative (inclusiv Pseudomonas). Celelalte variante moleculare nu au aciune antibacterian semnificativ. Nici unul dintre membrii grupului nu se utilizeaz n clinic. Antibioticele a cror molecul cuprinde ciclul monobactam, datorit simplitii structurale au fost sintetizate pe cale chimic n condiii economice. Genele pentru sinteza F-lactamilor au fost identificate att la bacterii ct i la fungi. Secvena nucleotidelor genelor celor dou grupe de microorganisme are un grad ridicat de omologie (60% dintre nucleotide sunt identice). S-a emis ipoteza unui transfer orizontal al genelor ce codific biosinteza antibioticelor F -lactamice, de la bacterii la fungi. Att la bacterii ct i la fungi, genele F-lactamilor sunt grupate (cluster)ntr-un singur bloc. Genele pentru biosinteza cefalosporinei la Acremonium chrysogenum sunt organizate n dou aglomerri localizate pe cromosomi diferii. S-a presupus c genele pentru biosinteza Flactamilor, n cursul evoluiei, s-au transferat ca o singur grupare, de la un procariot ancestral, la un organism precursor al fungilor care sintetizeaz antibiotice F -lactamice. La organismul eucariot, precursor al fungilor, genele codificatoare ale biosintezei antibioticelor F -lactamice s-au distribuit ntre cei doi cromosomi. Mecanismul de aciune a antibioticelor F-lactamice Celula bacterian trebuie s aib un perete cu o structur nchis, legat covalent, care s permit adugarea noilor uniti pentru cretere. Noile straturi de murein sunt adugate secvenial pe faa extern a membranei citoplasmatice, n proximitatea ei, chiar sub stratul mureinic anterior. Pe msur ce noile straturi de murein sunt adugate, cele vechi sunt deplasate spre exterior i sunt supuse unor fore de ntindere tot mai mari, pn la limita elasticitii lor. n acest punct, autolizinele sunt extruzate din celul i hidrolizeaz stratul cel mai tensionat. Fragmentele mureinice sunt eliberate i uneori chiar reutilizate. Sinteza mureinei are loc n 3 stadii. n primul stadiu , n citoplasm, se sintetizeaz precursorii solubili cu gr.mol. mic - UDP-GlcAc i UDP-MurNAc-L-Ala-D-Glu-mezoDap-D-Ala-D-Ala. Unii ageni antibacterieni interfer cu treptele timpurii ale sintezei peretelui. Iniial, la UDP-MurNAc este adugat un tripeptid, la care va fi legat dipeptidul D-Ala-D-Ala, sintetizat de o enzim specific. D-Ala este produs din L-Ala sub aciunea alanin-racemazei. Stadiul al doilea al sintezei peretelui celular este catalizat de enzime legate de membran. Regiunea non-nucleotidic a moleculei precursoare sintetizat anterior (intermediarul N-acetil glucozamina i acidul Nacetil muramic-tetrapeptid) este ataat la un purttor lipidic (undecaprenol-pirofosfat, denumit bactoprenol), genernd lipidul I. Acesta este integrat n membran, modificat ulterior prin adugarea GlcNac i pentaglicinei. Se formeaz undecaprenol pirofosfat-MurNac(-L-Ala-D-Gln-(NH2-(Gly5 )L-Lys-D-Ala-D-Ala)(F 1-4)-GlcNac (lipidul II) i este translocat prin membrana plasmatic. Lipidul II are rol de substrat pentru reacia de transglicozilare, polimeriznd catenele glican ale peretelui celular bacterian. Rezult astfel dizaharidul repetitiv (MurNac-GlcNac)n. Purttorul lipidic are rol de punct de ataare de membran pentru

124

precursori i permite transportul subunitilor prin interiorul hidrofob al membranei citoplasmatice, la suprafaa celulei. n stadiul al treilea al sintezei, subunitile peptidoglicanice sunt polimerizate prin inseria n peretele celular existent. Polimerizarea se face prin transferul peptidoglicanului nou, de la purttorul su localizat n membran, la peptidoglicanul parietal preexistent, printr-o reacie de transpeptidare ce implic lanurile peptidice ale ambilor polimeri, dintre care una trebuie s posede resturi D-ala-D-ala terminale. Reacia este catalizat de un complex de enzime, astfel nct s elimine riscul spargerii celulei sub aciunea presiunii de turgor (hidrostatice) din celul. Enzimele sunt secretate prin membran. Ele sunt autolizine, transglicozilaze i transpeptidaze, toate cu aciune degradativ strict controlat asupra peretelui celular, permind creterea i diviziunea celulei. Polimerizarea glucidului i legarea ncruciat a catenelor tetrapeptidice, denumit reacia de transpeptidare, este catalizat de proteine-enzime care leag penicilina (penicillin binding proteins - PBP), localizate la nivelul membranei citoplasmatice i n spaiul periplasmic. Dizaharid-pentamuropeptidul extruzat prin membrana citoplasmatic, este inserat n reeaua mureinic n cretere. Peptidul se leag de un alt peptid ce aparine altui lan. Legarea celor dou dizaharidpentamuropeptide prin secvenele terminale se face cu consum de energie furnizat de reacia de transpeptidare i pierderea D-Ala terminal a uneia dintre cele dou muropeptide. Rezult astfel un nonamuropeptid (penta-tetrapeptid) (fig. 37). Restul D-ala al celuilalt muropeptid este adeseori hidrolizat i rezult un octa- sau chiar un heptamuropeptid.

Figura 37. Componentele moleculare ale mureinei (adaptare dup Koch, 2003). Explicaii n text.

Antibioticele -lactamice sunt inhibitoare ale sintezei peretelui celular. Diferitele enzime int ale antibioticelor sunt denumite generic PLP (francez - protein liant les penicillines) sau PBP (englez -penicillin binding protein). Funcia enzimatic a fiecrei PBP a fost studiat n detaliu la E. coli. La aceast specie exist patru PBP cu gm mare (PBP 1a, 1b, 2 i 3). Toate sunt enzime bifuncionale: catalizeaz

125

transpeptidarea i transglicozilarea peptidoglicanilor. Rolul PBP ca enzime implicate n procesul final al formrii peretelui mureinic a fost descoperit prin marcare cu penicilin G radioactiv. PBP sunt enzime care catalizeaz reaciile de legare ncruciat ntre polimerii peptidoglicanului, una dintre treptele finale n procesul asamblrii peretelui celular. La Staphylococcus aureus, PBP au funcii fiziologice de transpeptidaze, endopeptidaze i carboxipeptidaze. Unele PBP sunt eseniale pentru supravieuirea i creterea celulei. Existena PBP eseniale este argumentat de mutantele care nu sintetizeaz PBP i sunt condiionat letale. Transpeptidazele (transamidaze) acioneaz asupra mureinei prin clivarea unor legturi peptidice critice i reformarea legturii cu alt partener peptidic: legtura D-ala-D-ala este clivat i tetramuropeptidul rmne legat de enzim, pn cnd alt muropeptid furnizeaz un grup amino al unui rest de acid diaminopimelic. Autolizinele (hidrolaze) leag apa n locul gruprii amino i n reacia de hidroliz a mureinei elibereaz D-ala. Aciunea lor mpiedic formarea legturilor transversale locale i distruge mureina numai ntr-o zon strict limitat a peretelui. Baza aciunii antibioticelor -lactamice const n aceea c substratul transpeptidrii captul carboxil al D-alaninei din structura intermediarului dizaharid-tetrapeptid - are omologie structural strns cu inelul -lactamic. Antibioticele F-lactamice inhib ultima etap a sintezei peptidoglicanilor, adic formarea punilor interpeptidice. Aceti compui prezint analogie structural cu dipeptidul terminal D-ala-D-ala, care face parte din pentapeptidul mureinic. Antibioticele acioneaz ca pseudosubstraturi i acileaz situsurile active ale transpeptidazelor PBP, care devin astfel incapabile s catalizeze reaciile de polimerizare ale subunitilor mureinice. Reacia de acilare a PBP este foarte lent reversibil. Enzimele PBP deacilate devin incapabile s catalizeze reaciile de legare ncruciat a peptidelor. Complexul antibiotic-PBP stimuleaz eliberarea autolizinelor, cu efect degradativ asupra peretelui celular. Presiunea osmotic din celul, superioar celei din mediul extern, lizeaz celula. Transpeptidazele (PBP) sunt diferite la bacteriile Gram pozitive, Gram negative i respectiv anaerobe, ceea ce explic ntr-o oarecare msur diferenele activitii antibacteriene a antibioticelor F-lactamice. Legarea unui antibiotic F -lactamic la PBP determin modificri morfologice ale celulei bacteriene: de exemplu, unele antibiotice se leag de PBP implicat n formarea septului de diviziune. Consecina este c celulele continu s creasc sub forma filamentelor lungi. Legarea de alt PBP duce la liza rapid a bacteriei, deoarece peretele proemin i celula se sparge. Mecilinam (amidino-penicilina) nu se leag de PBP ale bacteriilor Gram pozitive i nu influeneaz creterea lor, iar aztreonam se leag numai de PBP ale bacteriilor Gram negative i nu inhib creterea celor Gram pozitive sau anaerobe. Rezistena la antibioticele -lactamice este conferit pe urmtoarele ci: - sinteza -lactamazelor; - mutaiile PBP, al cror efect este reducerea afinitii de legare cu antibioticele -lactamice; - nglobarea diminuat a antibioticelor datorat schimbrilor n structura peretelui sau activitii pompelor de eflux. Cel mai important mecanism de rezisten la antibioticele -lactamice const n sinteza enzimelor cu efect hidrolizant asupra antibioticelor. Unul dintre primele rapoarte cu privire la rezistena antibioticelor a fost referitor la o tulpin bacterian productoare de Flactamaz, o enzim ce hidrolizeaz legtura F -lactamic a acestei clase de antibiotice. Aceast legtur este esenial pentru activitatea antibioticelor F-lactamice, deoarece are rolul de analog al legturii peptidice ce leag D-Ala terminal a peptidului de monomerul peptidoglicanic. F-lactamazele sunt enzime foarte eficiente : o singur molecul poate hidroliza peste 100 000 de molecule F -lactamice. -lactamazele sunt o familie mare de enzime cu structur unitar, toate cliveaz ciclul F-lactamic i inactiveaz antibioticul, dar difer prin secvena aminoacizilor. Spectrul lor de activitate este restrns. F-lactamazele s-au diversificat prin mecanismul mutaiilor punctiforme ce se acumuleaz gradat n genele codificatoare. Clasificarea F -lactamazelor. F -lactamazele s-au clasificat n funcie de substratul pe care-l hidrolizeaz, de sensibilitatea la inhibitori, de modul de producere (constitutiv sau inductibil) i de localizarea cromosomal sau plasmidial a genelor codificatoare. F-lactamazele sunt considerate penicilinaze (cele care acioneaz asupra penicilinelor), cefalosporinaze (hidrolizeaz cefalosporinele). Unele au spectru larg de aciune (cele care hidrolizeaz penicilinele i cefalosporinele). F-lactamazele produse de S. aureus i S. epidermidis sunt exoenzime, pe care celula le elimin n mediul extracelular, n cantiti mari. F-lactamazele produse de bacteriile Gram negative sunt endoenzime, pe care celula le sintetizeaz i le concentreaz n spaiul periplasmic. Enzimele hidrolitice sunt polipeptide, al cror punct izoelectric este 8,9.

126

Clasificarea pe baza secvenei de nucleotide a genelor codificatoare recunoate 4 clase de Flactamaze: A, B, C, D. Aceast clasificare este stabil i reflect raporturile fundamentale ce nu pot fi modificate de mutaii.

Figura 38. Situsurile de aciune a F-lactamazelor (indicate de sgei).

Enzimele din clasele A, C i D au serin la situsul activ, iar cele din clasa B au 4 atomi de Zn. -lactamazele claselor A i B sunt foarte active fa de benzil-penicilin i respectiv, peniciline i cefalosporine. Enzimele clasei C sunt n general inductibile, dar mutaiile genelor codificatoare pot duce la supraexpresie. Enzimele clasei D sunt de tip OXA, deoarece hidrolizeaz oxacilina. O alt clasificare mparte -lactamazele n urmtoarele grupe: - metalo--lactamazele folosesc ionii de Zn la situsul activ, pentru a rupe inelul F lactamic. Acest mecanism de aciune este specific F -lactamazelor clasei B; - -lactamazele cu spectru larg de aciune, sunt active prin mecanismul serin-esteric. Enzima se asociaz necovalent cu antibioticul, pentru a forma un complex necovalent. Inelul F -lactamic este atacat de hidroxilul liber de pe lanul lateral al unui rest de serin de la situsul activ al enzimei, rezultnd un acil-ester covalent. Hidroliza esterului elibereaz enzima activ i antibioticul inactiv, hidrolizat. Acest mecanism este comun lactamazelor claselor A, C i D. F-lactamazele produse de bacteriile Gram negative (Enterobacter sp., Ps. aeruginosa, Citrobacter sp., Serratia sp., Proteus vulgaris, Klebsiella) au urmtoarele caracteristici : - unele hidrolizeaz preferenial cefalosporinele, cu o rat mult mai nalt dect penicilinele - nu sunt inhibate de acidul clavulanic sau de sulbactam - sinteza lor este indus - cele care hidrolizeaz preferenial penicilinele sunt constitutive - cele cu spectru larg hidrolizeaz cu rate comparabile penicilinele i cefalosporinele : TEM-1, TEM2, SHV-1, HMS. Sunt inhibate de acidul clavulanic. Mult timp dup descoperirea antibioticelor F -lactamice, s-a crezut c acestea sunt produse numai de speciile de Penicillium. Ulterior s-au identificat tulpini bacteriene care sintetizeaz F-lactami, dar mecanismele prin care anihileaz efectele toxice ale antibioticelor pe care le produc nu sunt clare. O explicaie plauzibil este c F-lactamii i F -lactamazele au coexistat chiar la organismul ancestral, conform principiului c o celul productoare de toxin, trebuie s posede cile prin care s se protejeze de propria-i toxin. Koch (2003) consider c F-lactamazele au derivat din transpeptidaze, enzimele active n procesul de cretere a sacului mureinic, cu cteva schimbri. Astfel, o PBP funcional n procesul creterii, s-a duplicat: o copie s-a transformat dintr-o endotranspeptidaz, ntr-o F -lactamaz, prin schimbri care permit intrarea apei la situsul activ. Omologia secvenei de aminoacizi este dovada c toate F-lactamazele deriv din PBP i nu au avut o apariie independent. PBP i lactamazele ce hidrolizeaz penicilina au cteva secvene de aminoacizi foarte conservate. Proteinele care leag penicilina (PBP), de asemenea pot reaciona cu F-lactamii, formnd serin-esteri, dar spre deosebire de esterii formai de F-lactamaze, nu pot hidroliza uor. Enzimele F-lactamazice sunt detectate prin metode sensibile, la toate bacteriile. Sinteza lor precede era antibioticelor. Lor li se atribuie un posibil rol n asamblarea peptidoglicanului sau au evoluat ca un mecanism protector fa de F-lactamii produi de bacteriile i de fungii din mediu.

127

Unele F-lactamaze sunt codificate de gene cromosomale i sinteza lor este constitutiv sau inductibil. F-lactamazele codificate de plasmide transmisibile care se pot disemina cu mare uurin. Astfel de plasmide s-au identificat la Staphylococcus, H. influenzae, Enterobacter, N. gonorrhoeae. Stafilococii sunt singurii patogeni comuni Gram pozitivi, la care F-lactamazele au creat probleme majore de rezisten, deoarece genele s-au rspndit prin transferul pe orizontal al plasmidei de rezisten i s-au selectat tulpinile rezistente, al cror procent a atins 80-90% dintre izolate, att la S. aureus, ct i la tulpinile coagulazonegative. Rezistena natural prin scderea afinitii ntre inta bacterian i antibiotic Micoplasmele, bacterii lipsite de perete celular, sunt natural rezistente la actiunea antibioticelor cu inte de actiune la acest nivel (enzimele PLP). La alte specii bacteriene, PBP manifest afinitate natural slab pentru antibioticele -lactamice. Este cazul aztreonamului, inactiv asupra bacteriilor Gram pozitive i anaerobe stricte (Georgopapadakou, 1982), cefsulodinului inactiv fa de enterobacterii (Barry, 1981) i cefalosporinelor i penicilinei M inactive fa de enterococci. Rezistena bacteriilor Gram pozitive la -lactamice Utilizarea n clinic pe scar larg a F-lactamilor, constituie factorul major selectiv care influeneaz sinteza F-lactamazelor de ctre agenii patogeni. S. aureus este de obicei rezistent la benzil-penicilin, deoarece majoritatea tulpinilor izolate (80-95%) produc penicilinaz. Rezistena tulpinilor de S. aureus la meticilin se datoreaz legrii antibioticului de ctre PBP, cu rol n sinteza peretelui celular. Dup legarea antibioticului, PBP se inactiveaz i sinteza peretelui celular este inhibat. Rezistena la concentraiile mari de -lactamice este totdeauna dependent de sinteza unei noi variante biochimice de PBP (PBP2), codificat de o gen cromosomal. Expresia genei este constitutiv sau inductibil de ctre unele antibiotice -lactamice. Rezistena la concentraiile mici de meticilin se datoreaz producerii -lactamazei, creterii nivelului PBP sau diminurii afinitii de legare a antibioticului de proteinele implicate n sinteza peretelui celular (PBP). Rezistena la concentraiile mari este totdeauna dependent de sinteza unei noi variante biochimice a PBP (PBP2), codificat de gena mecA, cu localizare cromosomal. Proteina PBP2 are o afinitate mic pentru cele mai multe antibiotice -lactamice. Expresia genei mecA este constitutiv sau inductibil n prezena unor antibiotice -lactamice. Rezistena la meticilin a tulpinilor de S. aureus (MRSA) este mai mare la 30o C dect la 37o C i se datoreaz producerii PBP2, care nu este sensibil la aciunea meticilinei. n unele cazuri, singurele medicamente eficiente pentru tratamentul infeciilor cu S. aureus rezistente la meticilin sunt antibioticele glicopeptidice ca vancomicina. Rezistena tulpinilor de Str. pneumoniae la penicilin se datoreaz prezenei PBP modificate, n special PBP2, care au o afinitate redus pentru penicilin. La Str. pneumoniae, -lactamazele nu au fost niciodat detectate, dar diferitele tulpini codific 6 variante biochimice de PBP : PBP 1a, 1b, 2a, 2b, 2x i PBP3. Antibioticele cu structur F -lactamic formeaz un grup larg, utilizate n clinic pentru terapia infeciilor bacteriene, dar sunt deosebiri foarte mari n ceea ce privete spectrul i intensitatea aciunii antibacteriene. Diferenele se datoreaz afinitii diferite de legare cu transpeptidazele bacteriene, enzime implicate n sinteza peretelui celular sau cu enzimele care inactiveaz antibioticul (F-lactamaze). Rezistena natural la lactamice mediata de -lactamaze la bacilii Gram negativi La Klebsiella, rezistena este legat de sinteza unei -lactamaze cromosomale cu spectru larg care antreneaz rezistena la peniciline, anulat prin administrarea de inhibitori enzimatici ca acidul clavulanic, sulfbactam sau tazobactam. La Enterobacter sp., Serratia sp., Morganella sp., Providencia sp., Ps. aeruginosa, rezistena este determinat de producerea unei -lactamaze cromosomale de tipul cefalosporinazei (Bush, 1995). Terapia infeciilor cu Ps. aeruginosa se realizeaz cu aminoglicozide i cu F -lactamice. Rezistena celulelor de Ps. aeruginosa se datoreaz permeabilitii sczute a peretelui, precum i sintezei de F-lactamaze. Serratia marcescens produce n mod natural o enzim codificat de o gena cromosomal capabil s inactiveze kanamicina, tobramicina, netilmicina i amikacina, iar Providencia stuartii produce o enzim capabil s inactiveze neomicina, gentamicina, tobramicina i netilmicina.

128

Speciile anaerobe aparinnd genului Bacteroides i care fac parte din microbiota tubului digestiv al omului, sunt natural rezistente la aminopeniciline i la numeroase cefalosporine prin producerea de lactamaze codificate de gene cromosomale cu spectru larg, care sunt inhibate de acidul clavulanic. Rezistena dobndit la antibioticele -lactamice Rezistena dobndit la cefalosporinele de generaia III, la aztreonam i la penicilinele cu spectru larg este foarte frecvent la 10-30% din tulpinile aparinnd speciilor natural productoare de cefalosporinaze cromosomale inductibile: Enterobacter cloaceae, E. aerogens, Citrobacter freundii, Serratia marcescens si Ps. aeruginosa. Mecanismul de rezisten dobndit const n sintaza intens a cefalos porinazelor naturale (Sanders, 1982; Then, 1986).

-lactamazele codificate de gene plasmidiale care joac un rol important n patologia infecioas pot fi grupate n patru categorii:
- penicilinaze cu efect strict, ce nu inactiveaz dect penicilinele i care sunt responsabile de rezistena dobandit la penicilina G i A a tulpinilor de S. aureus. - -lactamaze cu spectru larg, care inactiveaza penicilinele si n parte cefalosporinele, n afara de cefamicina si cefalosporinele de generatia III. Aceste enzime sunt responsabile, de exemplu, de rezistena dobndit la penicilin, la enterobacterii i Pseudomonas aeruginosa i de aceea denumirea curent este aceea de penicilinaze. Exemplul tip este TEM-1, identificat acum 30 ani la Escheria coli. - -lactamaze cu spectru larg (BLSE), derivate prin mutatiile punctiforme ale enzimelor precedente si care inactiveaza de asemenea n parte cefalosporinazele de generaia III i aztreonamul. - -lactamaze numite TEM rezistente la inhibitori (TRI sau IRT) derivate prin mutaiile punctiforme ale -lactamazelor TEM-1 sau 2 care sunt responsabile de rezistena la peniciline. Aceste enzime, deja numeroase, au fost identificate dupa civa ani la tulpinile de E. coli rezistente la asociaia amoxicilin-acid clavulanic (Henquell, 1995). La aceste patru categorii de enzime se adaug cteva enzime plasmidiale mai puin studiate: cefalosporinazele plasmidiale nrudite cu cefalosporinazele cromosomale naturale ale enterobacteriilor (MIR-1) i identificate la Klebsiella; imipenemaze identificate la E. cloaceae (HMC-1) la Serratia, Ps. aeruginosa sau -lactamazele cu spectru larg de la Ps. aeruginosa (PER-1)

5.5. Antibioticele polipeptidice

Clasificarea antibioticelor polipeptidice Polimixinele sunt antibiotice polipeptidice (octapeptide cu gm mare), cu caracteristici chimice i proprieti biologice identice. Sunt recunoscute 5 polimixine majore, distincte chimic, desemnate polimixina A, B, C, D, E. Cele mai reprezentative sunt polimixina B i polimixina E sau colistina. Toate sunt sintetizate de Bacillus polymyxa i au acelai spectru antibacterian. Sunt active n concentraii asemntoare, dar produc efecte secundare semnificative. Polimixinele A i D sunt nefrotoxice i nu au fost niciodat folosite n clinic, iar polimixinele B i E au cel mai sczut nivel de toxicitate. Aceste antibiotice sunt active fa de bacteriile Gram negative, deoarece membrana extern conine lipide cu sarcin negativ (Aerobcter, Brucella, Escherichia, Hemophillus, Klebsiella, Yersinia, Salmonella, Shigella, Vibrio), la concentraii de pn la 5,0 Qg/ml. Nu sunt active fa de bacteriile Gram pozitive, cocii Gram negativi i micobacterii. Trichomonas vaginalis este sensibil la concentraia de 125-250 Q g/ml.

129

Componentele moleculare ale polimixinei i modalitatea interaciei lor

Polimixinele nu sunt absorbite dup administrare oral sau tegumentar, nu difuzeaz semnificativ n esuturi. De aceea nu sunt eficiente fa de infeciile sistemice difuze sau ale organelor parenh imatoase profunde. Se folosesc n tratamentul infeciilor localizate : rni, arsuri, mucoase ale tractului intestinal, cavitatea pleural, spaiul dural, grefe. Se folosesc cu mare eficien n tratamentul infeciilor meningeale, pulmonare i ale tractului urinar. Polimixinele se asociaz frecvent cu alte antibiotice, pentru a extinde spectrul antimicrobian i se folosesc pentru sterilizarea tractului digestiv. Situsul celular al aciunii polimixinelor inta polimixinelor este membrana lipidic, adic membrana extern i citoplasmatic a bacteriilor Gram negative. Fixarea polimixinelor de membrane duce la dezorganizarea acestora i la liza celulei. Membranele biologice sunt alctuite dintr-o matrice lipidic, n care sunt distribuite aleatoriu, proteinele globulare ce penetreaz stratul lipidic. Membrana citoplasmatic acioneaz ca barier de permeabilitate selectiv pentru ioni, nutrieni i este sediul structural al sistemelor de transport. Agenii antimicrobieni pot s dezorganizeze membranele: pot fi cationici, anionici sau neutri. Efectul polimixinelor este asemntor cu al detergenilor cationici. Molecula lor conine grupri hidrofile i hidrofobe. La pH neutru sunt ncrcate pozitiv i pot fi considerate ca nite compui cationici, cu activitate fa de membrana extern polianionic a bacteriilor Gram negative, sarcin conferit de lipopolizaharide. Activitatea polimixinelor este antagonizat de compuii anionici, de Mg2+ i de Ca2+, deoarece neutralizeaz sarcinile negative ale gruprilor fosfat din membrana lipidic. Polimixinele dezorganizeaz structura membranelor i modific profund permeabilitatea. Nu se folosesc pentru tratamentul sistemic, deoarece se leag de diferii liganzi tisulari i sunt toxice pentru rinichi i pentru sistemul nervos. Fixarea antibioticelor n structura membranei depinde de concentraia cationilor bivaleni din mediu: carena sau excesul acestora inhib aciunea polimixinelor. Compoziia n LPS, fosfolipide i proteine a membranelor bacteriene influeneaz de asemenea fixarea i gradul de sensibilitate sau de rezisten al diferitelor specii bacteriene la aciunea polimixinelor. Polimixina i alte molecule policationice se leag de lipidul A al LPS, ntr-un raport stoichiometric i se inser n structura membranei. Un astfel de mozaic molecular dezorganizeaz straturile lipidice, iar membrana nu mai funcioneaz normal ca barier osmotic eficient. Datorit alterrilor structurale ale membranei externe i interne, echilibrul osmotic este perturbat prin pierderea ionilor de K+. Modificrile permeabilitii sunt asociate cu pierderea constituienilor celulari solubili i a viabilitii. Mecanismul este acelai cu cel propus pentru hemoliz sub aciunea detergenilor ionici. Efectul hemolitic se datoreaz dezorganizrii complexului colesterol-fosfolipide-lipoproteine din membrana eritrocitului. Concentraiile minime inhibitorii ale polimixinelor opresc temporar creterea bacteriilor sensibile, iar concentraiile de 2-4 ori mai mari au efect bactericid rapid. Sensibilitatea nu depinde de faza de cretere a celulelor bacteriene. Bacteriile sensibile leag cu afinitate nalt polimixinele. Specifcitatea nalt a legrii st la originea unei metode eficiente pentru ndeprtarea endotoxinei din plasma pacienilor septici: plasma este perfuzat printr-o coloan la care este legat polimixina. Rezistena se datoreaz incapacitii antibioticului de a penetra membrana extern. Bacitracina Bacitracina s-a izolat n 1945, dintr-o tulpin de Bacillus licheniformis i a fost folosit pentru tratamentul infeciilor stafilococice severe, pn n 1960. Produsul comercial conine un compus principal bacitracina A i cel puin 9 polipeptide strns nrudite. n soluie neutr sau uor alcalin, activitatea antibacterian scade foarte mult. Antibioticul este bine tolerat n aplicaiile locale i prin instilare direct n spaiile articulare, n cavitile pleurale, n rnile chirurgicale, pe membranele mucoase, urechi, ochi, esutul cerebral. Dup administrare intramuscular, bacitracina este excretat pe cale urinar i uneori produce hematurie i proteinurie, datorit alterrii ireversibile a proprietilor de filtru ale endoteliului glomerulului vascular. Bacitracina se sintetizeaz dup ncheierea fazei de cretere logaritmic i necesit adugarea nivelelor crescute de Mn2+. n celula productoare, antibioticul ndeplinete mai multe funcii: - inhib dezvoltarea altor microorganisme n mediu. Antibioticele, ca metabolii secundari au ca funcie primar, inhibiia creterii altor microorganisme, deoarece ali metabolii secundari nu au

130

proprieti antibiotice. Sinteza antibioticelor confer avantaj selectiv organismelor productoare, dar pentru bacitracin nu exist dovada c n mediile naturale ar avea rol de antibiotic; - altereaz membranele celulelor productoare, uurnd eliberarea produselor metabolismului secundar: bacitracina produce spargerea protoplatilor celulelor care o produc; - represeaz creterea vegetativ sau iniiaz sporularea; - are rol de unitate structural a nveliului sporal. Compoziia n aminoacizi a hidrolizatelor de bacitracin i de nveli sporal este foarte asemntoare.

Componentele moleculare ale bacitracinei

Majoritatea compuilor antimicrobieni de origine natural sau sintetic posed unul sau mai multe situsuri moleculare la care pot s lege ionii metalici. Bacitracina formeaz complexe cu ionii metalici. Complexele bacitracinei cu Zn2+, Ni2+, Mn2+ i Co2+, ca i cu ZnO i CdO sunt mai stabile la variaiile de 2+ temperatur comparativ cu antibioticul nativ. Pentru sinteza bacitracinei sunt necesari numai ionii de Mn . Datorit toxicitii sale i disponibilitii altor antibiotice, utilizarea sa s-a limitat n special la aplicare local. Mecanismele de actiune a bacitracinei sunt multiple: dezorganizeaz membrana extern a bacteriilor Gram negative, inhib sinteza proteinelor i a peretelui celular. Ultimele dou efecte sunt considerate consecine ale interferenei cu funciile de permeabilitate ale membranei. Rezistena este datorat incapacitii antibioticului de a penetra membrana extern. Gramicidinele i tirocidina sunt sintetizate de tulpini de Bacillus brevis. Structural fac parte din grupul antibioticelor polipeptidice. Aceste antibiotice sunt active asupra membranei i par s acioneze prin producerea porilor membranari. Se folosesc numai cu aplicare local. Actinomicina Actinomicina, produs de diferite specii de Streptomyces, este primul antibiotic care s-a obinut n stare cristalin, o substan pigmentat rou, foarte activ fa de bacteriile Gram negative, mai puin activ fa de bacteriile Gram pozitive i lipsit de activitate fa de fungi. Antibioticul are un nivel nalt de toxicitate fa de animalele de experien i nu a fost folosit ca agent chimioterapeutic. Actinomicinele formeaz o familie de antibiotice cromopeptidice, care difer numai n regiunea peptidic a moleculei. Gruparea cromofor, denumit actinocin, este comun pentru toate variantele chimice de actinomicine. Gruparea cromofor este ataat de dou catene pentapeptidice, care pot fi identice sau difer n compoziia aminoacizilor. Peptidele sunt structuri ciclice, deoarece grupul COOH al aminoacidului terminal N-metil-L-valina, este esterificat cu gruparea OH a primului aminoacid treonina, pentru a forma un inel lactonic.

131

Structura molecular a actinomicinei D.

Toate variantele de de actinomicin sintetizate de Streptomyces conin gruparea cromofor fenoxazinona (1 mol), L-treonina (2 moli), sarcozina (2 moli) i N-metil-L-valina (2 moli)/molecul de antibiotic. Gruparea cromofor (fenoxazinona) se sintetizeaz din triptofan. Un organism productor al actinomicinei, de obicei sintetizeaz simultan, mai multe actinomicine, care difer numai printr-un singur aminoacid al peptidului. Actinomicina produs de Str. antibioticus este sintetizat pe o varietate de medii definite chimic i pe medii organice complexe. Randamentul sintezei este mai bun pe medii organice complexe. Sursa de N este acidul glutamic, dar i ali aminoacizi sau compuii azotai anorganici. Cea mai bun surs de C pentru sinteza antibioticului este galactoza. Glucoza este o surs optim pentru creterea miceliului, dar este metabolizat prea rapid i se sintetizeaz o cantitate prea mic de actinomicin. Sinteza antibioticului este stimulat n condiii de agitare a culturii.

5.6. Antibioticele glicopeptidice i lipoglicopeptidice

Antibioticele peptidice sunt diferite structural de peptidele clasice pentru ca sunt molecule ciclice, coninnd lanuri esterice i D - aminoacizi, acizi grai saturai sau nesaturai, heterocicluri, glucide aminate sau neaminate. Peptidele sunt clasificate n 6 grupe

Clasificarea antibioticelor peptidice Vancomicina i teicoplanina Sunt antibiotice glicopeptidice de interes clinic, componente eseniale ale terapiei antiinfecioase, fiind active fa de agenii infecioi comuni: Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus. Sunt active exclusiv fa de bacteriile Gram pozitive, formnd complexe stabile i specifice, necovalente, cu D-Ala-D-Ala terminale ale peptidoglicanului. Astfel este inhibat formarea punilor peptidice i creterea peretelui celular. Antibioticele glicopeptidice ncorporeaz o structur heptapeptidic central, iar diversitatea stru tural suplimentar deriv prin modificri variate sub aciunea halogenazelor i transferazelor. Pe lng aminoacidul comun Tir, teicoplanina ncorporeaz aminoacizi neproteici: 4 hidroxifenil-glicina (HPG),

132

3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG) i F-hidroxitirozina (F -OHTir). Clorinarea Tir, HPG i F -OHT la poziiile 2, 5 i 6, se produce, probabil, dup asamblarea peptidului.

Structura molecular a teicoplaninei

Vancomicina, un antibiotic glicopeptidic, a fost izolat dintr-o tulpin de Streptomyces orientalis, denumit astfel deoarece s-a cultivat din probe de sol din Borneo i India. Antibioticul a fost introdus n clinic n 1958, pentru tratamentul infeciilor cu bacterii Gram pozitive.

Structura molecular a vancomicinei

Vancomicina este o molecul amfoteric complex, ce conine azot i glucide, foarte uor solubil n ap, rezistent la aciunea diferitelor enzime hidrolitice. Spectrul de activitate este ngust, fiind activ fa de bacteriile Gram pozitive i fa de unele spirochete. Utilizarea sa a nregistrat o dinamic ascendent n ultimele dou decenii, datorit creterii ponderii stafilococilor coagulazo-negativi ia tulpinilor de S. aureus rezistente la meticilin. Rezistena la meticilin a unor tulpini de Staphylococcus s-a atribuit unor cantiti mai mici de acizi teichoici, ceea ce determin o sarcin mai puin negativ dect la tulpinile sensibile. Datele statistice artau n anul 2000 c circa 75% dintre stafilococii coagulazo-negativi i 47% dintre izolatele de S. aureus din unitile de tratament intensiv erau rezistente la meticilin. Pentru tratamentul infeciilor produse de tulpinile stafilococice meticilino-rezistente, vancomicina rmne antibioticul de elecie, deoarece tulpinile rezistente apar cu o fecven mai mic dect fa de alte antibiotice. Vancomicina se absoarbe greu din tractul digestiv, iar injecia intramuscular produce durere moderat. Administrarea este limitat la calea intravenoas.

133

Mecanismul de aciune
Vancomicina inhib sinteza ARN, sinteza peretelui celular i lezeaz componentele membranei producnd moartea celulei. Activitatea sa la situsuri multiple poate s explice absena dezvoltrii rezistenei la acest antibiotic. Vancomicina ntrerupe sinteza peretelui celular, formnd un complex cu resturile de D-Ala carboxiterminale ale precursorilor peptidoglicanului. Formarea complexului la suprafaa extern a membranei citoplasmatice, mpiedic transferul precursorilor de la purttorul lipidic, la peretele peptidoglicanic. Vancomicina inhib reaciile biochimice parietale, catalizate de transpeptidaze. Antibioticele glicopeptidice au, ca i cele -lactamice, activitate bactericid asupra tulpinilor sensibile. n condiii normale ale sintezei peptidoglicanului, la enterococi, dou molecule de D-alanin sunt legate de o ligaz pentru a forma D-ala-D-ala, adugat ulterior la UDP-N-acetil-muramil-pentapeptid. UDPN-acetil-muramil-pentapeptidul, dup ce este ncorporat n peptidoglicanul nascent prin reacia de transglicozilare permite legarea punilor transversale (transpeptidare) i contribuie la rezistena stratului de peptidoglican. Vancomicina acioneaz asupra ultimei etape a sintezei peptidoglicanului, formnd legturi de hidrogen, ireversibile, cu extremitatea D-ala-D-ala terminal a tetrapeptidului precursorilor dizaharidici, blocnd adugarea lor la catena polipeptidic n cretere i mpiedic formarea legturilor transversale. Glicopeptidele, mascnd extremitatea D-ala-D-ala a tetrapeptidului, mpiedic aciunea transpeptidazelor i formarea legturilor transversale ale macromoleculei peptidoglicanice. Activitatea antimicrobian a antibioticelor glicopeptidice este limitat la bacteriile Gram pozitive. Cele mai multe bacterii Gram pozitive sunt sensibile. Moleculele glicopeptidice sunt mari (vancomicina 1448 Da, teicoplamina 1900 Da) i nu pot ptrunde prin membrana extern a bacteriilor Gram negative. Prin localizarea sa n spaiul periplasmic, peptidoglicanul nu este accesibil aciunii antibioticelor glicopeptidice. Cele mai multe bacterii Gram negative sunt rezistente. Rezistena la vancomicin Rezistena poate s fie intrinsec (natural). Rezistena streptococilor a fost indus n vitro, chiar nainte de utilizarea sa n clinic. Molecula de vancomicin nu traverseaz membrana extern a bacteriilor Gram negative, datorit dimensiunilor mari. Rezistena a aprut dup 20 de ani de administrare n clinic, la stafilococi, la Leuconostoc sp., ct i la bacilii Gram pozitivi (Lactobacillus). La Lactobacillus, rezistena se datoreaz faptului c alanina terminal din gruparea lateral a moleculei de peptidoglican este nlocuit cu lactat (D-alanil-D-lactat), care are o afinitate mai mic pentru antibioticele glicopeptidice. Pentapeptidul modificat nlocuie legtura amidic cu o legtur esteric. Vancomicina se leag mai puin stabil cu pentapeptidul modificat dect cu pentapeptidul normal. Pierderea unei legturi de H diminu semnif icativ afinitatea vancomicinei pentru peptidul modificat. Deoarece vancomicina se complexeaz mai puin frecvent i mai puin stabil cu componentele peretelui celular, efectul inhibitor este mult diminuat. Pentru ca rezistena celulelor s fie complet, ntregul perete trebuie s fie sintetizat cu pentapeptidul modificat. S. aureus are o sensibilitate uniform la vancomicin n vitro, dar insuccesele la tratament apar cel mai adesea n cazul endocarditei. Cauza nereuitei ar putea fi tolerana. Tolerana este un fenomen care se manifest prin faptul c concentraiile mici de antibiotic sunt inhibitoare ale creterii (efect bacteriostatic), iar efectul bactericid se produce numai la concentraii relativ mari. Antibioticele glicopeptidice sunt folosite pentru tratamentul pacienilor cu intoleran la cele uzuale, mai ales la F-lactamice. Vancomicina prezint inconvenientul administrrii, deoarece necesit infuzie intravenoas lent. Este nefrotoxic i ototoxic, mai ales prin administrarea asociat cu aminoglicozide. Glicopeptidele sunt antibiotice relativ scumpe. Din aceste cauze, administrarea lor este limitat la situaiile care sugereaz rezistena sau alergia fa de F -lactamice. Utilizarea lor timp de cteva decenii, rareori a indus rezistena stafilococilor i enterococilor. Viomicina, produs de Streptomyces floridae, Str. paniceus i Str. vinaceus, este un polipeptid cu caracter intens bazic. Antibioticul difer de cele mai multe antibiotice prin aceea c este mai activ fa de micobacterii, comparativ cu alte bacterii. n vitro nu are activitate fa de fungii patogeni pentru om, animale i plante. Produce efecte benefice n infeciile tuberculoase, dac este administrat n doze relativ mari. Micobacteriile dezvolt rezisten la viomicin mult mai lent dect la streptomicin.

134

Structura molecular a viomicinei

Dac este administrat pentru perioade scurte, toxicitatea este relativ mic, dar tratamentul de durat produce efecte colaterale ample. Mupirocina (acidul pseudomonic A) Mupirocina este cel mai eficient agent local utilizat pentru eradicarea strii de purttor nazal de S. aureus rezistent la meticilin (MRSA).

Mecanismul de aciune. Mupirocina este analogul structural al izoleucinei i se leag competitiv de izoleucil-ARNt sintetaz, blocnd astfel sinteza proteinelor.

Structura molecular a mupirocinei

Rezistena la mupirocin se datoreaz, probabil, mutaiilor genei IRS(izoleucil ARNt-sintetaz). Rezistena la mupirocin cuprinde dou grupe fiziologice de microorganisme: cele rezistente la un nivel sczut de antibiotic, cu concentraia minim inhibitorie (CMI) cuprins ntre 4-256 g/ml; cele rezistente la nivele mari de antibiotic, pentru care concentraia minim inhibitorie este egal sau mai mare de 512 g/ml. S-au evideniat fenomene de rezisten att la nivelul sczut, ct i la cel ridicat de antibiotic. Rezistena la nivelul sczut de mupirocin se poate datora mutaiilor izoleucil-ARNt sintetazei, iar izolatele rezistente la concentraii mari de mupirocin conin o variant de izoleucin-ARNt sintetaz, distinct imunochimic de enzima tulpinilor bacteriene sensibile. Cele dou variante ale izoleucil-ARNt sintetazei au omologie de numai 30% a aminoacizilor. Varianta mutant a enzimei este rezistent la aciunea mupirocinei. Gena mup A, care codific varianta rezistent a izoleucil-ARNt sintetazei este localizat pe plasmide transferabile. Mupirocina este unul dintre cei mai eficieni ageni cu aplicare local pentru limitarea strii de purttor a tulpinilor de S. aureus meticilin-rezistente. Tulpinile de S. aureus rezistente la nivele nalte de mupirocin sunt rezistente i la meticilin (tulpini MRSA). Eliminarea tulpinilor rezistente de S. aureus din cavitile nazale este o strategie important n controlul infeciei. Cel mai eficient agent cu aplicare local, pentru limitarea strii de purttor nazal este mupirocina. Aplicarea local a antibioticului este improbabil c va eradica agentul patogen. De aceea, este important detectarea rapid a tulpinilor de S. aureus rezistente la concentraii mari de mupirocin. n acest scop se folosete metoda amplificrii secvenei de 456 bp, a genei mupA.

135

5.7. Antibiotice poliketidice

Poliketidele formeaz o familie mare de produse naturale i cuprind printre cele mai complexe molecule de antibiotice din categoria larg a metaboliilor secundari (tabelul 8). Donadio (1993) a mprit poliketidele n dou clase: aromatice i complexe. Structura general a antraciclinelor Antraciclinele sunt polichetide aromatice ce formeaz un grup de substane din care fac parte unele dintre cele mai utile citostatice folosite n prezent. Ele au structura 7,8,9,10-tetrahidrotetracen-5,12-quinon i sunt metabolii secundari ai actinomicetelor, n primul rnd din g. Streptomyces, sau sunt derivaii lor semisintetici.

Mai jos sunt redai unii substituieni (R) din antraciclinele naturale de tip aclavinon. Prin combinaiile posibile ale acestor substituieni rezult 1344 agliconi diferii. R1: H, OH; R2: H, OH R4: OH, OCH3 R6: H, OH R7: H, OH, glicozid R9: CH3, CH2CH3, COCH3, COCH2OH, CHOHCH3, CHOHCH2OH, CH2COCH3 R10: H, OH, COOCH3, glicozid R11: H, OH Poliketidele sunt produse ca metabolii secundari, adic se sintetizeaz dup stadiul creterii vegetative (tabelul 8).
Tabelul 8. Antibiotice poliketidice i organismele productoare (dup Pfeiffer, 2001). Exemple de poliketide Tipul de activitate Organismul productor Eritromicina A Antibiotic Streptomyces coelicolor Doxorubicina Agent antitumoral Str. peucetius Eritromicina A Antibiotic Str. erithraeus Epothilone A Agent antitumoral Sorangium cellulosum Acid 6-metil salicilic Precursor al antibioticelor Penicillium patulum Lovastatin Agent hipocolesterolemic Aspergillus terreus

Caiva compui poliketidici au fost utilizai n clinica infecioas, n tratamentul neoplaziilor, al maladiilor cardiovasculare i al inflamaiilor (tabelul 9).

136

Tabelul 9. Structura i modul de aciune a antibioticelor poliketidice (dup Pfeiffer, 2001). Poliketide naturale Organism gazd Mod de aciune Actinorodina Antibiotic Streptomyces

coelicolor

Doxorubicina

Agent anti-tumoral

Streptomyces peucetius

Eritromicina A

Antibiotic

Sacharopolyspora erythraea

Epotilona A

Agent anti-tumoral

Sorangium cellulosum

Acid 6-metil salicilic

Precursor antibiotic

Penicillium patulum

137

Lovastatin

Agent hipocolesterolemiant

Aspergillus terreus

Primele antracicline au fost descoperite n 1950 (Brokmann i Bauer), iar folosirea lor ca ageni antitumorali a nceput odat cu descoperirea daunorubicinei. Antraciclinele sunt antibiotice cu activitate antimicrobian semnificativ. Bacteriile Gram pozitive i fungii au un grad relativ nalt de sensibilitate, iar cele Gram negative sunt, n general, rezistente, dar au un grad prea nalt de toxicitate pentru a fi folosite n acest scop. Efectele biologice ale antraciclinelor sunt urmtoarele: - inhibiia fosforilrilor oxidative n mitocondrii - inhibiia ADN-polimerazelor - inhibiia ARN-polimerazelor - inhibiia enzimelor de reparare a ADN - inhibiia sintezei metalotioneinei - inhibiia topoizomerazei I - inhibiia topoizomerazei II - inhibiia helicazelor - producerea radicalilor liberi - clivajul endonucleolitic. Doxorubicina (adriamicina) este un antibiotic citotoxic, a crei parte agliconic este adriamicinona, sintetizat din uniti de acetat. Molecula are un ciclu antraciclinic, izolat de la Streptomyces peucetius var. caesius. Din punct de vedere chimic, const dintr-un nucleu naftacenchinonic, legat printr-o punte glicozidic a atomului 7 al inelului, de un glucid aminat, daunosamina.

Structura molecular a doxorubicinei

Structura molecular a daunorubicinei

138

Precursorul doxorubicinei pare a fi o unitate starter propionat, la care sunt adugate succesiv 9 uniti de acetat. Catena de C precursoare a poliketidelor este ciclizat pentru a produce nucleul tetraciclic al antraciclinei. Primul intermediar ciclic cunoscut al celor mai multe antracicline este acidul aclanonic, un intermediar triciclic. Acidul aclanonic este metilat cu un grup metil din 5-adenozilmetionin i rezult esterul metilic al acidului aclanonic, dup care cel de al IV-lea inel este nchis i rezult aclavicetona. Aclavinona este precursorul celor mai multe antracicline, ceea ce nseamn c organismele productoare de antracicline conin enzime ce acioneaz secvenial i modific aclavinona pentru a produce alte antracicline.

Structura molecular a aclavinonei

Cele mai comune modificri ale biosintezei antraciclinelor sunt glicozilrile. Agliconul neglicozilat este de obicei inactiv. Glicozidele antraciclinelor naturale sunt de 3 tipuri: rodosamina, daunosamina i glicozide neutre. Glucidele aminate se gsesc aproape exclusiv la poziia 1. Glicozidele neutre sunt produse de organismele mutante defective n sinteza aminoglicozidelor. Daunorubicina este un antibiotic de fermentaie derivat din antraciclin, folosit n clinic pentru tratamentul leucemiilor umane. Se gsete rareori ca produs final al fermentaiilor microbiene, dar este prezent sub forma derivailor glicozidici, care prin hidroliz acid furnizeaz medicamentul. Un produs major al fermentaiei daunorubicinei este rodomicina, nrudit structural cu antraciclinona. Mecanismul de aciune a antraciclinelor Nu se cunoate mecanismul primar sau mecanismele prin care antraciclinele produc efectul toxic. Cea mai probabil int pare a fi topoizomeraza II. Pentru inhibarea acestei enzime, o condiie necesar, dar nu i suficient este interaciunea antraciclinelor cu molecula de ADN. Topoizomeraza II produce o rupere dublu catenar n ADN, pe care o repar ulterior. Unele antracicline blocheaz relegarea ADN i astfel produc o rupere dublu catenar i fragmentarea ADN. Alte antracicline, ca de exemplu aclacinomicina A inhib activitatea topoizomerazei II i astfel este inhibat clivarea dublei catene, urmat de blocarea replicrii, transcrierii i reparrii ADN. Doxorubicina se leag de acizii nucleici, probabil prin intercalarea specific a nucleului planar al antraciclinei n dublul helix al moleculei de ADN. Molecula antibioticului este amfifil : inelul antraciclinei este lipofil, iar captul saturat al ciclului conine grupri OH numeroase, asociate glucidului aminat, rezultnd un centru hidrofil. Molecula este amfoteric, deoarece conine funcii acide n gruprile fenolice ale ciclului i funcie bazic n grupul amino al glucidului. Doxorubicina se leag de membrana celular, dar i de proteinele plasmatice. Cel mai important efect secundar al doxorubicinei i daunorubicinei este cardiotoxicitatea de tip cumulativ. Se presupune c fenomenul cardiotoxicitii se datoreaz producerii radicalilor liberi ai antraciclinei i formrii radicalului OH. liber, care reduce Cu2+ i Fe3+, la nivel celular. Producerea i stabilitatea radicalilor este asociat cu numrul gruprilor OH ai moleculei aromatice. Datorit efectului su citotoxic, doxorubicina se administreaz pentru tratamentul neoplaziilor. Efectul citotoxic asupra cel ulelor maligne, precum i efectele sale toxice fa de celulele diferitelor organe, se crede c se datoreaz intercalrii antibioticului ntre bazele ADN i afinitii sale de legare cu lipidele membranare. Intercalarea inhib legarea ADN- i ARN-polimerazei, inhibnd procesele de replicare i transcriere a ADN. Doxorubicina pare s interacioneze cu topoizomeraza II, formnd complexe care cliveaz molecula de ADN. Legarea doxorubicinei de membrana celulei, perturb o varietate de funcii celulare. Reducerea enzimatic a doxorubicinei, prin acceptarea unui electron, sub aciunea diferitelor oxidaze, reductaze i dehidrogenaze, genereaz variante moleculare foarte reactive, inclusiv radicalul OH. liber. Doxorubicina este activ fa de un spectru larg de tumori experimentale, este imunosupresiv i are proprieti carcinogenice la roztoare. Induce diferite efecte toxice, inclusiv toxicitate cardiac ntrziat i progresiv, mielosupresie (scderea numrului de leucocite polimorfonucleare circulante) l a toate speciile analizate. La obolan i cine produce atrofia testicular. Doxorubicina se administreaz numai intravenos.

139

Dac n timpul administrrii, medicamentul este extravazat, produce necroz tisular sever. De aceea, nu se administreaz intramuscular sau subcutan.Toxicitatea miocardic manifestat n form sever prin insuficien cardiac congestiv potenial fatal, poate s se produc n timpul terapiei sau dup luni ori ani de la terminarea terapiei. Riscul insuficienei cardiace congestive crete odat cu doza total, prin efect cumulativ, ce depete 450 mg/m2. Efectele toxice pot s se manifeste chiar la doze cumulative mai mici, la pacienii cu afeciuni cardiace. Doxorubicina poteneaz toxicitatea la pacienii supui altor terapii antineoplazice: iradierea mediastinal, administrarea ciclofosfamidei. Doxorubicina se metabolizeaz n ficat i se excret pe cale hepatobiliar. Din aceast cauz, toxicitatea este mai mare la pacienii cu insuficien hepatic. Administrate ca citostatice, antraciclinele induc selecia unor subpopulaii de celule tumorale rezistente, care nu mai rspund la tratament. Cel mai comun mecanism al rezistenei la antracicline este acela care confer rezisten multipl la medicamente (MDR). Mecanismul implic o glicoprotein membranar complex care funcioneaz ca o pomp de export, ce transport activ antibioticele antraciclinice din celul.

5.8. Cloramfenicolul
A fost izolat i cristalizat n acelai timp, n 3 laboratoare, din culturi de Streptomyces venezuelae i Str. phleochromogenes. Este primul antibiotic cu spectru larg, introdus n clinic. Este primul antibiotic sintetizat complet prin metodele chimiei organice i este singurul antibiotic produs pe cale industrial prin sintez chimic. Cloramfenicolul produce un efect specific asupra sintezei proteinelor. De aceea, este un instrument important n biologia experimental, folosit n scopul blocrii specifice a sintezei proteinelor, pentru a investiga alte procese celulare, ca de exemplu, controlul sintezei ADN. Molecula de cloramfenicol conine un inel aril, cu o caten lateral de 3 atomi de C, care poate fi derivat din fenilalanin sau tirozin. Acidul p-aminobenzoic poate s furnizeze jumtatea nitro-aril i catena lateral. Particularitatea neobinuit a moleculei de cloramfenicol este N aromatic i halogenul organic. Sunt foarte puini compui de origine biologic, cu grupare nitro: acidul F-nitropropionic, 2-nitro-imidazolul.

Structura molecular a cloramfenicolului

Organismul crescut n solul nesteril, nu produce cantiti detectabile de cloramfenicol. Numai n solul sterilizat, cloramfenicolul este produs n cantiti semnificative. Acest fapt sugereaz c cloramfenicolul nu este un antibiotic n sensul convenional adic o substan elaborat de un organism ca rspuns la competiia sa cu alte organisme, pentru a supravieui ntr-un mediu ecologic complex. Biosinteza cloramfenicolului progreseaz rapid n medii organice complexe. n mediile definite chimic, sinteza este mai puin eficient. Glucoza este sursa optim de C pentru creterea miceliului, dar randamentul sintezei antibioticului este inferior, deoarece este metabolizat cu o rat nalt. Glicerolul satisface att cerina creterii miceliului, ct i a unui bun randament al biosintezei cloramfenicolului. Ionul de amoniu stimuleaz numai creterea miceliului, iar nitratul favorizeaz sinteza cloramfenicolului. Procesul de cretre necesit o surs de fosfat i de sulf. Magneziul, fierul, zincul sunt necesare pentru cretere, la concentraii mici. Cloramfenicolul este un antibiotic cu spectru larg, inhibitor pentru creterea celor mai multe bacterii Gram pozitive i Gram negative, la concentraia de 0,5 Q g/ml, inclusiv Rickettsia. Clostridium i Pseudomonas sunt de obicei rezistente, ca i celulele mamaliene n cultur. n general are aciune bacteriostatic, dar este bactericid fa de agenii etiologici ai meningitei: Haemophilus influenzae, pneumococi, meningococi. Cloramfenicolul inhib sinteza proteinelor: molecula se fixeaz pe subunitatea ribosomal 50 S, interacioneaz cu ARNr-23S i inhib formarea legturii peptidice n catena n curs de

140

sintez, prin legarea de enzima peptidil-transferaz pe subunitatea 50S. Cloramfenicolul este un agent bacteriostatic, inhibitor al creterii bacteriilor Gram pozitive i Gram negative. Rezistena la cloramfenicol se datoreaz, de cele mai multe ori, inactivrii antibioticului sub aciunea enzimelor inactivatoare: cloramfenicol-acetiltransferaza (CAT). Genele cat ale bacteriilor Gram pozitive i Gram negative au un grad redus de omologie i codific o mare diversitate de enzime. Cel mai adesea, gena se gsete localizat pe plasmide de rezisten.

Uneori, rezistena la cloramfenicol se datoreaz permeabilitii sczute a membranei externe i implicit reducerii ratei de transport intracelular al antibioticului, precum i aciunii pompelor de eflux, descrise la bacteriile Gram negative. Rezistena se poate datora capacitii bacteriilor rezistente de a degrada antibioticul. Cloramfenicolul are utilizri clinice restrnse: se folosete n tratamentul infeciilor severe.

5.9. Novobiocina
Structural, molecula const din glucidul norioz (inelul A), o component cumarinic (inelul B) i un acid benzoic substituit (inelul C), legate printr-o legtur glicozidic i o legtur amidic.

Structura molecular a novobiocinei

Novobiocina este considerat o cumarin substituit: este prima cumarin izolat ca metabolit microbian i prima identificat ca avnd N n structura ei. Cumarinele sunt larg distribuite la diferite familii de plante. Cteva cumarine complexe sunt produse ca metabolii ai bacteriilor i fungilor. Alte cumarine includ aflatoxinele. Cumarina este o lacton ce rezult prin hidroliza enzimatic a unor glicozide, care se gsesc n frunzele i tulpinile mai multor plante: Lavandula (levnic), Melilotus, Trifolium, Levisticum (leutean), cpuni, caise, ciree, scorioar etc. Cel mai cunoscut precursor al cumarinei este melilotozidul din Melilotus altissimus, M. arvensis. Melilotozida conine un eter i cumarina (fig. 39). Cumarina este un fitoestrogen i se gsete n concentraii mici n muli ageni naturali care se adaug alimentelor ca amelioratori de gust. Datorit asemnrii chimice cu estrogenii, se leag de receptorul estrogenic uman.

141

Melilotozid

Cumarina

Figura 39. Ilustrarea schematic a hidrolizei melilotozidului la cumarin

Novobiocina are dou grupri acide, un fenol uor acid i un enol mai acid, pe inelul cumarinic. Formeaz sruri insolubile cu o varietate de cationi bi- i trivaleni: Zn, Al, Mn, Fe. Sarea de sodiu este foarte solubil n ap. Novobiocina este activ n primul rnd fa de bacteriile Gram pozitive, dar acioneaz i asupra unor tulpini de bacterii Gram negative (Klebsiella, Proteus). Este mai puin activ fa de micobacterii i corinebacterii, iar activitatea antifungic este neglijabil. Novobiocina determin apariia formelor filamentoase ale bacililor Gram negativi, iar activitatea inhibitorie fa de bacteriile Gram pozitive este reversat uor de ionii de Mg2+. Ca i penicilina, novobiocina induce acumularea uridin-nucleotidmucopeptidelor n celulele de S. aureus. Concluzia este ca efectul su const n inhibiia sintezei peretelui celular, dar structura parietal nu este inta primar a aciunii antibioticului, pentru c creterea protoplatilor i a micoplasmelor este puternic inhibat. Novobiocina inhib creterea bacteriilor datorit unor efecte multiple: unul dintre ele este efectul chelator fa de ionii de Mg. Antibioticul formeaz complexe specifice cu diferite metale, nu numai cu Mg2+, sruri insolubile, dar Mg2+ este un microelement esenial, avnd rol structural i funcional pentru activitatea unei largi varieti de enzime celulare. Cele mai multe enzime care catalizeaz reacii ce implic gruprile fosfat, necesit ioni de Mg: sintetazele acizilor nucleici (ADN - i ARN-polimeraza), enzimele activatoare ale aminoacizilor, enzimele care catalizeaz sinteza acizilor teichoici, enzimele glicolitice, fosfolipazele. Ionii de Mg au rol structural: prin legarea moleculelor fosfolipidice confer stabilitate membranelor celulare. Au rol n stabilizarea dublei helice ADN i n meninerea subunitilor ribosomale 30S i 50S n form asociat, funcional de 70S. Deficiena cantitativ a ionilor de Mg are implicaii profunde asupra 2+ funcionrii celulei. Dar nu toate procesele celulare dependente de Mg necesit cantiti echivalente de 2+ cationi. Deficiena de Mg influeneaz n grade diferite procesele celulare. Unele organisme au nevoi mai mari de Mg2+ dect altele i de aceea sunt mai sensibile, iar creterea lor este influenat mai mult. Novobiocina inhib creterea bacteriilor, proporional cu necesarul lor de Mg. Astfel se explic gradul diferit de sensibilitate al bacteriilor: cele Gram pozitive sunt mai sensibile dect cele Gram negative, dei Proteus i Klebsiella au sensibilitate relativ nalt. Novobiocina este un inhibitor eficient al sintezei acizilor nucleici la E. coli. Activitatea novobiocinei este amplificat de concentraiile subinhibitorii de azid de sodiu. Unele funcii celulare sunt inhibate att de azid ct i de novobiocin: respiraia, transportul electronilor pe catena respiratorie a bacteriilor aerobe, transportul membranar al aminoacizilor, fosforilarea oxidativ.

5.10. Rifamicinele
Rifamicinele sunt o clas de antibiotice, inhibitorii ale ARN-polimerazei dependent de ADN. ARNpolimeraza se ataeaz de un factor ce confer specificitate pentru recunoaterea situsurilor promotor ce iniiaz transcrierea ADN. Rifamicina se leag necovalent, dar ferm, de o subunitate a ARN-polimerazei i interfer specific cu procesul de iniiere, dar nu are efect dup ce polimerizarea a nceput. Rifampicina aparine familiei ansamicilinelor i este un derivat semisintetic al unei molecule naturale, rifamicina B forma hidrofob, constituit dintr-un lan lung alifatic n form de ans (de unde i numele familiei), legnd dou nuclee aromatice. Caracterul hidrofob al moleculei explic dificultile sale de a traversa membrana extern a bacililor Gram-negativi.

142

Structura molecular a rifampicinei

Aciunea bacteriostatic a rifampicinei se explic printr-o inhibiie a transcrierii ADN n ARN, reacie catalizat de ARN polimeraza dependent de ADN. Rifampicina acioneaz, n esen, asupra etapei iniierii transcrierii, dar nu mpiedic alungirea lanului de ARNm. Absena activitii rifampicinei asupra ARN polimerazelor celulelor eucariote explic toxicitatea sa selectiv fa de bacterii. Rifampicina este un component important al tratamentului pe termen scurt al infeciilor cu micobacterii cu rezisten multipl. Mecanismul aciunii antibacteriene al rifamicinelor implic inhibiia unei singure inte enzimatice, adic subunitatea a ARN-polimerazei dependent de ADN. La E. coli, aceast enzim este un oligomer complex alctuit din 4 subuniti diferite: E , F , F i W, codificate de genele corespunztoare. Enzima poate s existe sub forma regiunii centrale a enzimei alctuit din 4 subuniti (E2 F F ) sau sub forma holoenzimei (E2FF + W). Rifampicina se leag la subunitatea F a ARN-polimerazei de E. coli i produce inhibiia transcrierii. Formarea complexului medicament - enzim, inhib iniierea formrii lanului n procesul sintezei ARN. Nu s-a raportat existena enzimelor inactivatoare ale rifamicinei, iar mecanismul rezistenei la antibiotic se bazeaz pe mutageneza intei unice. Din aceast cauz, tulpinile rezistente au aprut mai repede dect pentru alte familii de antibiotice. Micobacteriile pot dezvolta rezistena la rifampicin, att n vivo ct i n vitro. Apariia rezistenei este un proces ce const ntr-o singur treapt. Tuberculoza cauzat de tulpini rezistente la rifampicin s-a identificat chiar la pacienii care nu au fost supui chimioterapiei. Mutaiile produse de rifamicin sunt inserii i deleii ale ARN-polimerazei bacteriene i apar n cele 3 regiuni scurte nalt conservate ale subunitii , ce formeaz aria fierbinte, cuprins ntre resturile 505-534 (la E. coli), la distan de situsul activ al enzimei. La micobacterii, peste 90% dintre mutaii se datoreaz schimbrii unei singure nucleotide a genei codificatoare a subunitii .

5.11. Acidul fusidic

Este un agent antibacterian de natura sterolic. Molecula este hidrofob, ceea ce explica efectul redus asupra bacililor Gram negativi, fiind utilizat mai ales ca antibiotic antistafilococic. Mecanismele prin care inhiba sinteza proteinelor nu sunt nc suficient de bine cunoscute.

143

Structura molecular a acidului fusidic

Bibliografie selectiv
1. Ackerman G, Rodloff AC. Drugs of the 21 st century: telithromycin (HMR 3647)the first ketolide. J Antimicrob Chemother. 2003, 51:497-511. 2. Ackermann, G., Tang Y. J., Kueper R., Heisig P., Rodloff A. C., Silva J. Jr., and Cohen S. H., . Resistance to moxifloxacin n toxigenic Clostridium difficile isolates is associated with mutations n gyrA, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45:2348-2353. 3. Barry A.L., Jones R.N., Thornsberry C., Cefsulodin: antibacterial activity and tentative interpretive zone standards for the disk susceptibility test, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1981, 20(4): 525-529. 4. Brokmann H., Bauer K., Rhodomycin., Ein rotes Antibioticum aus Actinomyceten, Naturwissenschaften. 1950, 37: 492-493 5. Bush K., Jacoby G. A., Medeiros A. A. A functional classification scheme for -lactamases and its correlation with molecular structure. 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39:1211-1233 6. Chopra I., Roberts M., Tetracycline Antibiotics: Mode of Action, Applications, Molecular Biology, and Epidemiology of Bacterial Resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2001, 65(2): 232-260. 7. Donadio S., McAlpine J.B., Sheldon P.J., Jackson M., Katz L., An erythromycin analog produced by reprogramming of polyketide synthesis, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1993, 90(15): 7119-7123. 8. Georgopapadakou N.H., Smith S.A., Sykes R.B., . Mode of action of azthreonam, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1982, 21(6): 950-956. 9. Hancock R.E.W. Bacterial outer membranes: Evolving Concepts. ASM News. 1991, 57:175182. 10. Henquell C., Chanal C., Sirot D., Labia R., Sirot J., Molecular characterization of nine different types of mutants among 107 inhibitor-resistant TEM beta-lactamases from clinical isolates of Escherichia coli, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1995, 39(2): 427-430. 11. Koch A.L., Bacterial Wall as Target for Attack: Past, Present, and Future Research, Clinical Microbiology Reviews. 2003, 16(4): 673-687. 12. Leclerc D., Melanon P., Brakier-Gingras L., Mutations in the 915 region of Escherichia coli 16S ribosomal RNA reduce the binding of streptomycin to the ribosome, Nucleic Acids Research. 1991, 19(14): 3973-3977. 13. Moazed D, Noller HF., Transfer RNA shields specific nucleotides in 16S ribosomal RNA from attack by chemical probes. Cell. 1986, 47 (6): 985994 14. Neu H.C., Chin N.X., Novelli A., n vitro activity of E-1040, a novel cephalosporin with potent activity against Pseudomonas aeruginosa, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1988, 32(11): 1666-1675. 15. Pfeiffer B.A., Khosla C., Biosynthesis of polyketides in heterologous host, Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2001, 65(1): 106-118

144

16. Pinard R., Ct M., Payant C., Brakier-Gingras L., Positions 13 and 914 n Escherichia coli 16S ribosomal RNA are involved n the control of translational accuracy , Nucleic Acids Research.. 1994, 22(4): 619-624. 17. Sanders CC, Sanders WE Jr, Goering RV. In vitro antagonism of beta-lactam antibiotics by cefoxitin. Antimicrob Agents Chemother. 1982, 21 (6): 968975 18. Schatz A., Bugie E., Waksman, S. Streptomycin: A Substance Exhibiting Antibiotic Activity Against Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria. Proceedings of the Society for Experimental and Biological Medicine.1944, 55 (1944): 66-69. 19. Speer B.S., Shoemaker N.B., Salyers A.A., Bacterial resistance to tetracycline: mechanisms, transfer, and clinical significance, Clinical Microbiology Reviews. 1992, 5(4): 387-399. 20. Taylor D.E., Courvalin P., .Mechanisms of antibiotic resistance in Campylobacter species, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1988, 32(8): 1107-1112. 21. Then R.L., Angehrn P., Multiply resistant mutants of Enterobacter cloacae selected by betalactam antibiotics, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1986, 30(5): 684-688. 22. Tran M.P., Telithromycin: a novel agent for the treatment of community-acquired upper respiratory infections, Baylor University Medical Center Proceedings. 2004, 17(4): 475-479. 23. Vakulenko S.B., Donabedian S.M., Voskresenskiy A.M., Zervos M.J., Lerner S.A.,Chow J.W., .Multiplex PCR for Detection of Aminoglycoside Resistance Genes in Enterococci, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2003, 47(4): 1423-1426. 24. Vakulenko S.B., Mobashery S., Versatility of Aminoglycosides and Prospects for Their Future, Clinical Microbiology Reviews. 2003, 16(3): 430-450. 25. Vester B., Douthwaite S., Macrolide Resistance Conferred by Base Substitutions in 23S rRNA, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45(1): 1-12.

145

Capitolul 6 DETERMINAREA SPECTRULUI DE SENSIBILITATE LA ANTIBIOTICE A SPECIILOR MICROBIENE. ANTIBIOGRAM

Datorita specificitii lor de aciune, antibioticele manifest eficien diferit fa de diferite specii microbiene; totalitatea speciilor microbiene sensibile la un anumit antibiotic definete spectrul de activitate al antibioticului respectiv. n funcie de numrul i diversitatea speciilor microbiene afectate, spectrul de activitate al antibioticelor poate fi : - larg (de exemplu, spectrul de aciune al tetraciclinei este reprezentat de bacterii Gram-negative, inclusiv chlamidii i rickettsii i specii Gram-pozitive; penicilinele sunt active n special fa de specii Grampozitive, dar i Gram-negative, inclusiv chlamidii; nitrofuranii, rifampicina, sulfamidele sunt active pe un numr mare de specii bacteriene Gram-pozitive i Gram-negative i pe bacteriile acido-alcoolo-rezistente); - ngust (novobiocina este activ pe bacteriile Gram-pozitive, mai ales stafilococi, dar i pe coci i bacili Gram-negativi, cum ar fi hemofilii i pasteurelele; glicopeptidele, bacitracina, pe bacterii Gram pozitive); - limitat (nitroimidazolii sunt activi doar pe microorganismele anaerobe). Chiar n cadrul aceleiai specii microbiene, pot exista diferene mari de sensibilitate a diferitelor tulpini fa de un anumit antibiotic, astfel c stabilirea tratamentului cu antibiotice n clinic necesit izolarea tulpinii microbiene care reprezint agentul etiologic al infeciei respective (mai ales dac acesta aparine unor genuri i specii supuse fenomenului de dobndire a rezistenei clinice) i determinarea spectrului su de sensibilitate la antibiotice. Evaluarea in vitro a eficienei unui antibiotic se realizeaz prin msurarea a trei parametri, care variaz n funcie de concentraia antibioticului i de timpul su de aciune: - concentraia minima activ (= C.M.A.) - este concentraia la care antibioticul poate induce anumite perturbri n activitatea metabolic a microorganismelor, fr a afecta capacitatea de multiplicare i viabilitatea microorganismelor; - concentraie minima inhibitorie (= C.M.I.) - este concentraia la care un antibiotic inhib multiplicarea microorganismelor (efect bacteriostatic); - concentraie minima bactericida (= C.M.B.) - este concentraia la care un antibiotic are aciune letal asupra microorganismelor (efect bactericid). Cunoaterea acestor parametri prezint o importan clinic deosebit, deoarece, pentru unele antibiotice, concentraia bactericida este foarte greu de atins in vivo. Din acest motiv, unele antibiotice ca tetraciclina, cloramfenicolul, rifampicina sunt considerate antibiotice bacteriostatice. Pe lng valoarea C.M.I. determinat in vitro, n alegerea tratamentului cu un anumit antibiotic, trebuie s se in cont i de calitile farmacologice ale antibioticului respectiv (de exemplu, posibilitatea realizarii concentraiei active la nivelul focarului de infecie), de eventualele efecte secundare i de starea fiziologic a bolnavului. Tehnica de evideniere a sensibilitaii la antibiotice a unei tulpini microbiene se numete antibiograma. Antibiograma trebuie practicat n mod obligatoriu n cazul microorganismelor patogene, supuse fenomenului de dobndire a rezistenei, naintea nceperii oricrui tratament cu antibiotice. Dup determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice prin tehnici calitative (n care tulpina microbian de testat este pus n contact cu diferite antibiotice aflate ntr-o anumit concentraie), se pot practica teste cantitative pentru determinarea valorii C.M.I. (n care tulpina microbian este pus n contact cu concentraii cresctoare ale aceluiai antibiotic).

6.1. Metode calitative de determinare a spectrului de sensibilitate la antibiotice

Metoda difuzimetric (Kirby-Bauer) Este o metod foarte simpl i rapid, care permite determinarea concomitent a spectrului de sensibilitate a microorganismului i a valorii C.M.I. n vederea calculrii dozelor terapeutice de antibiotice. Metoda are mai multe variante, n practic folosindu-se curent tehnica discurilor impregnate cu antibiotice, standardizat, recomandat de NCCLS / CLSI (National Committee for Clinical Laboratory Standardisation / Clinical Laboratorz Standards Institute). O serie de factori, ca de exemplu, tulpina microbian studiat (densitatea inoculului, specia, vrsta culturii), mediul de cultur (compoziia mediului, pH-ul, densitatea i grosimea stratului de mediu), tehnica folosit i criteriile de interpretare a rezultatelor obinute, pot influena rezultatele unei antibiograme. Din

147

acest motiv, tehnica trebuie efectuat n condiii standardizate, reproductibile, conform indicaiilor forurilor internaionale n domeniu. Pe suprafaa unui mediu agarizat nsmnat n pnz cu un inocul standardizat, obinut din tulpina de testat, se plaseaz la distane egale discuri impregnate cu soluii de antibiotice de o anumit concentraie care vor difuza n mediu, realiznd un gradient de concentraie invers proporional cu diametrul zonei de difuzie, deci cu distana fa de disc. Dac tulpina este sensibil la un anumit antibiotic, creterea microbian va fi inhibat pe o anumit suprafa n jurul discului impregnat cu antibioticul respectiv, suprafa denumit zon de inhibiie a creterii. Citirea rezultatelor se realizeaz prin masurarea diametrelor zonelor de inhibiie a creterii determinate de diferite antibiotice, cu ajutorul unei rigle gradate. n cazuri de urgen clinic se poate realiza o prim citire la 6-8 h de la incubare. Interpretarea rezultatelor se face n funcie de dimensiunea zonelor de inhibiie a creterii, exprimnd rezultatul cu termenii de tulpin sensibil (S), rezistent (R) sau intermediar sensibil (I), conform tabelelor cu puncte critice standardizate i corespunztoare metodei de lucru: tabelele NCCLS pentru metoda difuzimetric recomandat de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, USA), in prezent CLSI (Clinical laboratory and Standards Institute). Termenii S, I, R definesc de fapt i categoriile de antibiotice, n funcie de efectul lor clinic, dup cum urmeaz: - categoria S, nseamn c exist o mare probabilitate ca antibioticul, administrat n doze obinuite, s elimine infecia determinat de tulpina testat (C.M.I. are valori net inferioare celor ale concentraiilor umorale obinute n urma administrrii unei doze obinuite); - categoria I, semnifica probabilitatea ca antibioticul s fie eficient in vivo prin administrare local sau prin realizarea n mod fiziologic a concentraiilor mari in organe sau esuturi (rinichi, ficat, cai biliare), la nivelul crora este localizat procesul infecios; - categoria R nseamn c, cel mai probabil, administrarea antibioticului nu va determina eliminarea din organism a agentului infecios, a crui sensibilitate a fost testat sau rezultatul tratamentului este imprevizibil. La citirea i interpretarea rezultatelor se iau n considerare diametrele zonelor de inhibiie, lipsite complet de colonii vizibile cu ochiul liber. Apariia coloniilor la marginea sau n interiorul zonei de inhibiie se poate datora urmatorilor factori: cultura este mixt sau suprainfectat; cultura este pur, dar prezint celule heterorezistente; apariia mutantelor rezistente; dezvoltarea tardiv a unor celule, de fapt sensibile, i apariia coloniilor dup ce antibioticul s-a diluat prin difuzie n mediu.

6.2. Metode cantitative de determinare a valorii C.M.I.

Metoda diluiilor n mediul lichid sau n agar Principiul metodei: un inocul standardizat al tulpinii testate este nsmnat ntr-un gradient discontinuu de concentraii ale antibioticului, fie n plci cu mediu agarizat, fie n tuburi cu bulion nutritiv. Dup incubarea adecvat, se citeste valoarea C.M.I. prin observarea macroscopic a tuburilor: n primele tuburi, cu concentraii mari de antibiotic, creterea culturii nu este vizibil, microorganismele fiind omorte sau inhibate n prezena antibioticului. Concentraia de antibiotic corespunztoare tubului cu cea mai mic concentraie, care inhib creterea vizibil a culturii microbiene, reprezint valorea C.M.I. (mcg/ml) pentru antibioticul respectiv. n tuburile urmtoare, inclusiv tubul martor de cretere, mediul se tulbur ca urmare a creterii microbiene. n tubul martor de sterilitate, obligatoriu mediul trebuie s rmn steril (limpede), iar pe placile cu mediu agarizat, coloniile lipsesc. Determinarea C.M.I. se utilizez pentru stabilirea dozei terapeutice i a cii de administrare n cazul infeciilor severe, supravegherea evoluiei rezistenei bacteriilor la antibiotice, cuantificarea activitaii bactericide a substantelor antimicrobiene. Aceast metod permite i aflarea valorii C.M.B. (concentraia minim bactericid) pentru antibioticul testat. Pentru aceasta, se preleveaz 0.01 ml sau 0.1 ml din tuburile utilizate pentru tehnica diluiilor n mediu lichid (din tubul la care s-a stabilit valoarea C.M.I. i din tuburile anterioare care prezint concentraii superioare de antibiotic) i se nsmneaz pe suprafaa unor plci cu mediu solid nesuplimentat cu antibioticul testat. Dup incubare, se va observa dezvoltarea microorganismelor la diluia corespunztoare C.M.I. Valoarea C.M.B. este dat de cea mai mic concentraie de antibiotic care reduce numrul coloniilor pan la 99.9%.

148

Metoda E-test La ora actual, exist variante ale metodei difuzimetrice pentru determinarea valorii C.M.I.. O astfel de varianta este E-testul (Epsilometer test), ce utilizeaz benzi impregnate cu diferite antibiotice ale cror concentraii variaz exponenial i sunt nscrise pe banda respectiv. Zona de inhibiie a creterii microorganismului testat are aspect de elips, al crei diametru variaz direct proporional cu gradientul de concentraie a antibioticului difuzat n mediu, diminundu-se odat cu scderea concentraiei astfel c, la o anumit valoare, zona de inhibiie a creterii va intersecta banda, concentraia nscris pe band la acest nivel indicnd valorea C.M.I.

6.3. Controlul de calitate n testarea sesibiltii la antibiotice

Controlul de calitate are drept scop s asigure precizia i fiabilitatea tehnicii de testare a sensibilitii, performana reactivilor utilizai i performana personalului care efectueaz testele (Codi, 2007). Pentru a rspunde acestor deziderate, laboratoarele care realizeaz antibiograma trebuie s dispun de tulpini de referin pentru realizarea antibiogramei, i anume: Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 35219, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 43300, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Haemophilus influenzae ATCC 49766, Neisseria gonorrhoae ATTC 49226, Neisseria gonorrhoae ATTC 49226, Streptococcus pneumoniae ATCC 49619. Controlul de calitate trebuie s fie realizat pentru fiecare lot nou de mediu Mueller Hinton i / sau antibiotic, utiliznd tulpinile de referin care vor fi testate n aceleai conditii ca i cele bacteriene a caror rezistenta se evalueaz. Antibiogramele vor fi efectuate zilnic pentru fiecare dintre tulpinile de referin. Daca rezultatele nu sunt satisfctoare, vor fi controlai urmtorii parametri: 1. citirea i interpretarea diametrelor zonelor de inhibitie - citirea antibiogramei trebuie realizat cu ajutorul unei rigle precise i s se evite la maximum erorile, meninndu-se instrumentul de msur perpendicular pe axa optic; - trebuie verificat daca interpretrile (S, I, R) corespund diametrelor masurate; - trebuie evitate erorile prin confuzia diferitelor tabele de citire. 2. mediul de cultur pH-ul trebuie s fie 7,2 - 7,4, deoarece variaiile de pH influenteaz activitatea aminozidelor, macrolidelor i fenicolilor. Umiditatea: - plcile cu mediu trebuie s fie uscate inainte de inoculare Concentraia n timidin sau timin : - o concentraie prea crescut de timidin determin o reducere a diametrelor zonelor de inhibiie in jurul discurilor de sulfamide i trimetoprim - pentru aceasta trebuie testat mediul MH cu o tulpin de referin Enterococcus faecalis ATCC 29212; diametrul de inhibiie n jurul discului de cotrimoxazol trebuie s fie > / = 20 mm. Concentraia n cationi divaleni: - o concentraie prea crescut n ioni bivaleni (n principal de Ca2+ i Mg2+) determin o reducere a diametrelor zonelor de inhibiie n jurul discurilor de aminozide (testate pentru P. aeruginosa), n timp ce concentraii mai mici favorizeaz apariia unor zone de inhibiie prea mari - ionii de Zn influeneaz activitatea carbapenemelor - concentraiile optime trebuie s fie : Ca 2+ = 50 100 mg i Mg2+ = 20 - 35 m 3. inoculul - etalonul 0,5 Mc Farland - se poate obtine astfel: 0,5ml Mg Cl2 sol 1% (10 g/l) + 95,5 ml H2SO4 1% (10 ml/ l); etalonul astfel preparat trebuie s prezinte o densitate optic (D.O.) de 0,08 - 0,1 la 625 nm. - se repartizeaz aceast soluie n volume de 10 ml, n tuburi identice cu acelea care vor servi la prepararea inoculului - tuburile se inchid ermetic pentru a evita evaporarea (parafilm, adeziv etc.) - se marcheaz nivelul lichidului cu un marker i se controleaz periodic msurndu-i densitatea optic - se conserv tuburile la temperatur ambiant, ferit de lumin (hrtie de aluminiu) - tubul etalon se agita nainte de utilizar, iar inoculul i etalonul trebuie s aib aceeai turbiditate

149

4. discurile de antibiotice - nainte de utilizare, cartuul de antibiotic trebuie verificat pentru data valabilitii, mai ales pentru Flactamine, i pentru ncarctura discului; - stocul de cartue de antibiotice trebuie s fie pastrat la -20 oC; aplicatorul ncrcat cu antibiotice trebuie pstrat la + 4 oC; - discurile umede sau n contact direct cu gheaa, sau care au fost conservate la temperatura ambiant nu trebuie utilizate; - cartuele trebuie scoase din frigider sau congelator cu 1-2 h nainte de utilizare. 5. tulpinile de referin - de la primirea lor, tulpinile de referin vor fi izolate pe un mediu adecvat; plecnd de la aceast cultur se fac 12 subculturi care se repartizeaz n 12 tuburi si se conserv prin congelare la - 70 oC. n fiecare lun se va scoate un tub congelat cu tulpina / tulpinile care vor fi testate; se refac 12 tuburi cu culturi pentru congelare, pentru anul viitor, pornind de la al 12-lea tub consevat

150

Tabelul nr. 10. Antibiotice de testat pentru cocii Gram-pozitivi, Enterobacteriaceae i bacili Gram negativi nonfermentativi

Staphylococcus aureus Lista standard penicilin * eritromicin lincomicin pristinamicin kanamicin tobramicin gentamicin cloramfenicol tetraciclin cotrimoxazol acid fusidic rifampicin
*

Streptococcus spp (alte specii decat S. pneumoniae ) Lista standard penicilina G ampicilina sau amoxicilina oxacilina tetraciclina eritromicina lincomicina sau clindamicina pristinamicna clindamicina Antibiotice opionale rifampicina cefotaxim cefepim streptomicina kanamicina gentamicina cloramfenicol spiramicina telitromicina linezolid cotrimoxazol* ofloxacin vancomicina teicoplamina * - se testeaza pe geloza Mueller Hinton cu 5% sange de cal hemolizat Rezisten natural: - nivel scazut la aminozide; polimixine, acid fusidic, acid nalidixic; sensibilitate moderat la fluoroquinolone; sensibilitate sczut la acid fusidi c. NB: Activitatea SXT inhibitat de prezena timidinei n mediu (geloz Mueller Hinton cu adaos de 5% sange de cal). Rezisten dobndit: la toate clasele de antibiotice cu excepia glicopeptidelor. Rezistena la penicilin decelat cu ajutorului discului de Oxacilin (5/ 1 g), ncruciat cu toate beta-lactaminele, dar de niveluri diferite (se calculeaz C.M.I.).

Streptococcus pneumoniae Lista standard penicilina G ampicilina sau amoxicilina oxacilina cefotaxim sau ceftriaxon tetraciclina eritromicina lincomicina sau clindamicina pristinamicina Antibiotice opionale imipenem) streptomicina kanamicina gentamicina cloramfenicol telitromicina linezolid cotrimoxazol* fluorochinolone fosfomicina vancomicina teicoplamina * - se testeaza pe geloza Mueller Hinton cu 5% sange de cal hemolizat Rezisten natural: -de nivel scazut la aminozide, acid fusidic, polimixin, acid nalidixic, - puin sensibil la pefloxacin i norfloxacin (sensibil la sparfloxacin), bacitracin

Enterococcus spp

Escherichia coli, Salmonella, Klebsiella amoxicilina/ ampicilina gentamicina/ tobramicina ftazidim/ cefotaxim/ ceftriaxon ofloxacin/ ciprofloxacin cotrimoxazol Acid nalidixic

P. aeruginosa Acinetobacter spp. ticarcilina piperacilina ceftazidim imipenem amikacina gentamicina tobramicina ofloxacin

Vibrio

Haemophilus influenzae ** ampicilin/ amoxicilin cefalotin gentamicin cloramfenicol pristinamicin eritromicin tetraciclin pefloxacin sulfametoxazol rifampicin Rezisten natural: la aminopeniciline, carboxipeniciline , ureidopeniciline F-lactamaz sensibil la inhibitori, frecvent asociat cu multirezisten; la aminopeniciline, cefalosporine generaia I nonenzimatic, sensibilitatea nu este restabilit n prezena inhibitorilor de beta-lactamaze.
**

Lista standard ampicilina gentamicina nitrofurani Antibiotice opionale oxacilina * streptomicina kaanamicina cloramfenicol tetraciclina eritromicina lincomicina * sau clindamicina* pristinamicina ( E. faecium) linezolid cotrimoxazol rifampicina fluorochinolone vancomicina (teicoplamina) * - ajuta la identificarea E. faecalis (rezistenta naturala)

ampicilina cotrimoxazol acid nalidixic tetraciclina

- se testeaz pe geloz Mueller Hinton cu 4% NaCl i 6 Qg/ml oxacilin Rezisten dobndit: rezisten la penicilin G; fenotip MLSb inductibil la eritromicin; fenotip KT.

145

Antibiograma difuzimetric poate permite determinarea pattern-urilor de rezisten constitutiv, intrinsec, nativ, precum i detectarea fenotipic a unor mecanisme de rezisten dobndit . Plasarea antibioticelor pe plac ntr-o anumit ordine permite citirea interpretativ a testelor de sensibilitate la antibiotice (concept introdus de Patrick Courvalin (1986) i detectarea fenotipic a unor mecanisme de rezisten la antibiotice (Lambert si colab., 1993).

6.4. Aplicaii practice ale citirii interpretative n evidenierea fenotipic a diferitelor mecanisme de rezisten la principalele specii microbiene de interes clinic Rezistenta S. aureus la -lactamice Pentru S. aureus, s-au evideniat mai multe mecanisme de rezisten la -lactamice (tabelul 11, 12).
Tabelul 11. Mecanismele de rezistenta la agenti antimicrobieni la S. aureus (dupa Lowy, 2003). Antibiotice -lactame Glicopeptide Genele blaZ mecA VISA 1) parC 2) gyrA sau gyrB 1) Sulfonamide: sal A 2)TMP:dfrB 1)Q:ermA ermB ermC 2)D:vat, vatB rezistente Produsele genelor -lactamaza PBA2a 1)Peptidoglican alterat 2)D-Ala-D-Lac 1)Componentul par C al topoizomerazei IV 2)Componentele Gyr A sau GyrB ale girazei 1)Dhidropteroat sintaza 2)Dhidrofolat reductaza 1) Metilaze ribosomale 2) Acetiltransferaze Mecanismele de rezistenta 1) Hidroliza enzimatic a nucleului -lactamic (fig. 24) 2) Reduce afinitatea pentru PBP 1) Legarea vancomicinei n peretele celular 2) Sinteza dipeptidelor cu reducerea afinitii pentru vancomicin 1, 2) Mutaii care au loc n regiunea QRDR reduc afinitatea complexului ADN-enzim pentru quinolone 1) Supraproducia de acid aminobenzoic de ctre enzime 2) Reducerea afinitii pentru DHFR 1) Reduce legarea la subunitatea ribosomal 23S 2) Modificarea enzimatic a dalfopristinului

Quinolone

Trimethoprimsulfamethoxazol Quinopristindalfopristin (Q-D)

Mecanism

Slbatic Penicilinaz Modificarea PLP, gena mecA BORSA R S/R MODSA S S BORSA = S. aureus borderline; MODSA = S. aureus modificat.

Tabelul 12. Mecanismele de rezistenta la -lactamice la S. aureus (dupa Lowy, 2003). Penicilina G Antibiotic + Penicilina M Cefalosporine Penicilina A inhibitor de Carbapeneme Carboxipenicilina lactamaze Ureidopenicilina S S S S R S S S R R R R R R S S

Rezistenta la meticilin (respectiv oxacilin) (fig. 40) este considerat un marker al polirezistenei incluznd: cefalosporinele, eritromicina i clindamicina, iar izbucnirile intraspitalicesti cu acest tip de tulpini au creat probleme deosebite terapeutice, antiepidemice si de cost al spitalizarii (Codita, 1993). Producerea de beta-lactamaz se poate evidenia prin testul treflei, utilizat i pentru detectarea producerii de beta-lactamaze de ctre tulpinile de N.gonorroeae si Haemophilus sp. Se nsmanteaz o tulpin de S.aureus ATCC 25923 pe o geloz Muller-Hinton (sau M-H cu sange Chocolat pentru N.gonorroeae si Haemophilus sp.); Se aplic un disc de peniciclin G n centrul plcii (sau de ampicilin n cazul Haemophilus); Se nsmneaz n striuri radiale (din centrul plcii spre periferie) tulpina de testat, o tulpin S. aureus ATCC 25923 (sensibil la penicilina G), o tulpin de S. aureus ATCC 43300 (rezistent la penicilina G). Se incubeaz placa 18 h la

152

35C n atmosfer normal (sau 24 h n atmosfera mbogit cu CO2 pentru Haemophilus sp. i N. gonorrhoeae). Se suspecteaz existena - lactamazei dac se observ o diferen ntre diametrul de inhibiie a creterii produs de antibioticul de testat ntre tulpina sensibil i cea de testat, chiar dac cele 2 diametre se nscriu n categoria sensibil a valorilor critice admise pentru tulpina testat. La ora ctual exist teste rapide, cromogenice, care utilizeaz un mediu specific (CHROMagar MRSA), care difereniaz cu mare specificitate tulpinile de S. aureus rezistente le meticilin, pe baza culorii coloniilor (Fig. 41).

Figura 40. Mecanismul inducerii sintezei -lactamazei stafilococice in prezenta penicilinei. BlaI se leag de regiunea operator, astfel nct se represeaz transcrierea ARN att pentru blaZ, ct i pentru blaR1-blaI; II Legarea penicilinei la BlaR1 stimuleaz activarea autocatalitic a BlaR1; III-IV BlaR1 cliveaz BlaI n fragmente inactive permind transcrierea blaZ i blaR1-BlaI; V-VIII -lactamaza, enzim extracelular codificat de blaZ (V) hidrolizeaz ciclul lactamic al penicilinei (VI), n consecin produce inactivarea (VII) (Kernodle si colab., 1990); Schema operonului care codific rezistena la meticilin a S. aureus. Expunerea MecR1 la un antibiotic -lactamic induce sinteza MecR1; MecR1 inactiveaz MecI, permind sinteza lui PBP2a (dupa Kernodle si colab., 1997).

Figura 41. Aspectul coloniilor de S. aureus meticilinorezistent pe mediu CHROMagar techmicro.com/.../chromagar/mrsa/mrsa.jpg)

MRSA (www2.m-

Rezistena la meticilin n cazul stafilococului auriu este de multe ori asociat cu mecanisme de rezisten care determin inactivarea altor familii de antibiotice. S. aureus rezistent la meticilin prin modificarea PLP este adesea rezistent la aminozide (amikacina i tobramicina i n peste peste 90% din cazuri

153

la gentamicin), la fluoroquinolone, macrolide, lincosamide i ketolide, la fosfomicin i uneori la rifampicin. Ca regul general, rmn active pe stafilococ glicopeptidele, acidul fusidic, streptograminele, rifampicina i oxazolidinonele. Rezistena enterococilor la -lactamice La enterococi, rezistena la -lactamice se realizeaz prin producerea -lactamazei i prin modificarea intei (ce confer rezisten natural la cefalosporine, oxaciline si monobactami i sensibilitate diminuat la peniciline). Rezistena Streptococcus pneumoniae la -lactamice Streptococcus pneumoniae prezint rezisten dobndit la penicilin prin producerea de F -lactamaze, evideniat fenotipic prin testarea sensibilitii la oxacilin, utiliznd discuri de oxacilina de 5g. Rezistenta la penicilin este incruciat pentru toate -lactamicele, dar prezinta diferite niveluri de expresie in funcie de antibiotic. Activitatea amoxicilinei i cefalosporinelor din generaia a treia (cefotaxim, ceftriaxon) este mai puin modificat dect cea a penicilinei G. In ceea ce priveste piperacilina, cefalosporinele din prima i a doua generaie i cele orale, indiferent de generatie, cu excepia cefpodoximului, ele sunt mai puin active decat penicilina G. Rezistena la -lactamice este asociat n proporie de peste 50% cu rezistena la alte antibiotice ca: tetraciclinele, macrolidele, cloramfenicolul sau trimetoprim-sulfametoxazolul (fig. 38). Unele eecuri terapeutice ar putea fi date de fenomenul de toleran la penicilin, datorat modificrilor controlului activitii autolitice, ducnd in vivo la selectarea mutantelor peni-R (raportul CMB/CMI > 32). Pentru toate tulpinile cu diametrul de inhibitie <26 mm la oxacilin, trebuie testat CMI pentru penicilin, amoxicilin, cefotaxim i toate antibioticele utilizate n tratament.

Figura 42. Tulpini de Streptococcus pneumoniae multi-rezistente la antibiotice (<gold.aecom.yu.edu/id/micro/pneumococcus.htm>)

C MNO CTX minociclina cefotaxim C SXT CEC CPD trimetroprimcefpodoxi cefaclor sulfametoxazol m OXA D CFM RA oxacilina TM cefixime rifampicina K C C PT AN RO cloranfenicol kanamicin pristinamicina cefpiroma a forte AMX CXM amoxicilina cefuroxim AMX PIP CTX XA S SXT F FOS

GM RA

KAN VA

GEN TEC

Tulpinile de Streptococcus pneumoniae sunt foarte sensibile la optochin, testul la optochin constituind unul dintre testele simple de identificare sau de confirmare a speciei i de difereniere fa de ceilali streptococi hemolitici (testul Lund, 1959). La concentraii de 1 / 500.000 1 / 1.000.000, optochinul are aciune bactericid pentru pneumococi, n timp ce pentru ceilali streptococi este nevoie de doze mult mai mari de 1 / 5.000. Se nsmneaz tulpina de testat pe o plac cu geloza snge coninnd optochin 0.05% n

154

paralel cu nsamnarea pe o plac de control fr optochin. n jurul pulberii de optochin apare o zon de inhibiie a creterii, cu un diametru de peste 20 mm (fig. 43).

Figura 43. Pneumococ -hemolitic sensibil la optochin (<gold.aecom.yu.edu/id/micro/pneumococcus.htm>).

n ceea ce privete rezistenta la -lactamice la alte specii de streptococi, se pare ca doar un numr redus de specii (streptococi orali; S. oralis, S. sanguis, S. mitis) prezint sensibilitate diminuat la penicilina G (dup CLSI). Evidenierea fenotipic a rezistenei la F -lactamice a enterobacteriilor Dup sensibilitatea lor natural la antibioticele -lactamice, enterobacteriile sunt clasificate n 4 grupe. Clasificarea are la baz comportamentul fa de urmtoarele antibiotice -lactamice: aminopeniciline, aminopeniciline + inhibitori ai -lactamazelor (IBL), carboxipeniciline, ureidopeniciline, cefalosporine din prima generaie (CIG), cefalosporine din a II a generaie (CIIG), cefalosporine din a III a generaie (CIIIG), cefalosporine din a IV a generatie CIVG (cu spectru larg), CIIIG + IBL, carbapeneme, cefamicine. Grupa I n aceast grup sunt clasate tulpinile de Escherichia coli, Proteus mirabilis, Salmonella ssp. i Shigella spp. (tabelul 13). Aceast grup prezint 4 fenotipuri mai frecvente: Fenotipul 1: tulpini sensibile la toate -lactamicele (60% dintre tulpinile izolate); Fenotipul 2: tulpini productoare de cefalosporinaze cromosomale de nivel sczut (5% dintre tulpinile izolate). Fenotipul 3: tulpini productoare de penicilinaze. Aceast enzim este n general transferabil (30% din tulpini). Fenotipul 4: tulpini productoare de penicilinaze rezistente la inhibitori. Grupa II Aceast grup este reprezentat de tulpinile de Klebsiella spp., Citrobacter koseri, C. amalonaticus, E. hermannii (tabelul 14). Fenotipul 1: tulpini rezistente la concentraii sczute de amoxicilin i de ticarcilin. Fenotipul 2: tulpini productoare de penicilinaze plasmidiale. Nivelul de producere al acestor penicilinaze este variabil, dar n general sczut. Fenotipul 3: tulpini productoare de -lactamaze de spectru larg (BLSE). Aceste tulpini sunt rezistente la o concentraie relativ sczut de CIIIG (15% dintre tulpinile de Klebsiella spp. izolate). Grupa III Este reprezentat de tulpini de Enterobacter spp., Serratia spp., Proteus spp. indol (+ ) i Morganella spp., Providencia spp., Citrobacter freundii (tabelul 15). Fenotipul 1: tulpini cu rezisten natural la amoxicilin i la cefalotin, ca urmare a exprimrii de cefalosporinaze cromosomale; Fenotipul 2: tulpini rezistente la amoxicilina, cefalotina i la ticarcilin, prin producerea unei penicilinaze plasmidiale; Fenotipul 3: tulpini rezistente la CIIIG; Fenotipul 4: tulpini de Proteus vulgaris productoare de cefalosporinaze sensibile la acid clavulanic (cefuroximaze).

155

Grupa IV Grupeaz tulpini de Yersinia spp. rezistente la amoxicilin, ticarcilin, cefalotin i cefoxitin, dar sensibile la pipercilin (tabelul 16). Tabelele urmtoare exprim diferitele fenotipuri de rezisten (ca i fenotipurile slbatice) stabilind manifestarea fenotipic a produciei de -lactamaze n fiecare grup. Cteva fenotipuri particulare pot fi datorate altor mecanisme. Producerea unei enzime de ctre o bacterie nu rspunde la legea tot sau nimic, ci exist niveluri intermediare de exprimare ce pot fi detectate fenotipic prin citire interpretativ foarte utile n intelegerea dinamicii fenomenului de antibiorezisten.

Tabelul 13. Fenotipuri de rezisten la antibioticele -lactamice la enterobacteriile din grupa I . E. coli, P. mirabilis, Salmonella spp., Shigella spp. (dup Jehl i colab., 2004 ) Antibiotic Aminopeniciline Aminopeniciline + IBL Carboxipeniciline Ureidopeniciline CIG CIIG CIIIG CIIIG + IBL Cefamicine CIVG (1) Carbapeneme Fenotip salbatic S S S S S S S S S S S Penicilinaza nivel scazut R S R I/R I S S S S S S Penicilinaza nivel ridicat R I/R R I/R I/R S/R S S S S S Cefalospori naza2 R R S S R S S S S/R S TRI 3 R R R R S S S S S S BLSE4 R R R R R R R S S R CHN5 R R R R R R R R R S

R = rezistent, S = sensibil, I = intermediar, (1) cefalosporine cu spectru larg : cefepim i cefpirom, 2 E.coli si Shigella, 3-TEM rezistent la inhibitori, 4--lactamaza cu spectru extins, 5-cefalosporinaz de nivel ridicat Tabelul 14. Fenotipuri de rezisten la antibioticele -lactamice la enterobacteriile din grupa a II a : Klebsiella spp.,Citrobacter koseri, C. amalonaticus, E. hermannii (dup Jehl i colab., 2004 ) Antibiotic Fenotip salbatic (1) Penicilinaza nivel ridicat BLSE CHN

Aminopeniciline Aminopeniciline +IBL Carboxipeniciline Ureidopeniciline CIG CIIG CIIIG CIIIG + IBL Cefamicine CIVG Carbapeneme (1) penicilinaz de nivel sczut

R S R I S S S S S S S

R R R R R I/R S S S S S

R R R R R R R S S R S

R R R R R R R R R S S

156

Tabelul 15. Fenotipuri de rezisten la antibioticele beta-lactamice la enterobacteriile din grupa a III a : Enterobacter spp., Serratia spp., Providencia spp., Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, P. penneri, Morganella spp. (dup Jehl i colab., 2004 ) Antibiotic Fenotip Penicilinaza BLSE CHN slbatic (1) de nivel ridicat Aminopeniciline R R R R Aminopeniciline + IBL R (2) R R R Carboxipeniciline S R R R Ureidopeniciline S R R R CIG R R R R CIIG S/R R R R CIIIC S S R R CIIIG + IBL S S S R Cefamicine S/R S/R S/R R CIVG S S R S/I Carbapeneme S S S S (1) cefalosporinaza inductibil, (2) cefalosporinaza inductibil numai pentru P. vulgaris i P. penneri Sinergismul dintre augmentin i cefotaxim i/sau aztreonam i/sau cefepim i/sau cefpirom, permite detecia anumitor BLSE. Cefepimul sau cefpiromul sunt utile n detecia unei BLSE n prezenta unei CHN. Tabelul 16. Fenotipuri de rezisten la antibioticele F-lactamice a enterobacteriilor din grupa a IV a: Yersinia enterocolitica . (dup Jehl i colab., 2004 )

Antibiotic Aminopenicilina Aminopeniciline + IBL Carbeniciline Ureidopeniciline CIG CIIG CIIIG CIIIG + IBL Cefamicine CIVG Carbapeneme

Fenotip slbatic
R R R I/R R S S S S S S

BLSE R R R R R R R S S R S

Unele tulpini de K.oxytoca, P.vulgaris, P. penneri si Citrobacter koseri sunt hiperproducatoare de <aztreonamaza>, o penicilinaza cromosomal (tabelul 17).
Tabelul 17. Fenotipuri de rezistenta la F-lactamice a tulpinilor productoare de aztreonamaza (dup Jehl i colab., 2004) Antibiotic Fenotip Aminopeniciline R Aminopeniciline + IBL R Carboxipeniciline R Ureidopeniciline R CIG R CIIG R Ceftriaxon R Cefotaxim S/R Ceftazidim S AZTREONAM R Cefamicina S Carbapeneme S

Rezistena la carbapeneme apare prin urmatoarele mecanisme:

157

impermeabilitate ( P. mirabilis, E.aerogenes) impermeabilitate i producere de cefalosporinaz de nivel ridicat (E. cloacae, E. aerogenes, P. rettgeri) carbapenemaze : de tip penicilinaz, inactiv asupra CIIIG (E. cloacae); de tip metalo-enzim, care hidrolizeaz CIIIG i carbapenemele.

Rezistenta P. aeruginosa la -lactamice La P. aeruginosa, rezistena natural este indus prin mecanisme de impermeabilitate, eflux, producerea enzimelor inactivatoare i modificarea tintelor. Fenotipul slbatic este legat de producerea unei cefalosporinaze inductibile n prezena aminopenicilinelor i cefalosporinelor din prima i a doua generaie, cuplat cu o impermeabilitate mai mult sau mai puin marcat i de un sistem de eflux constitutiv, care determin apariia unui fenotip rezis tent la aminopeniciline, ca atare sau asociate cu inhibitori ai -lactamazelor i la CIG i CIIG, cu conservarea sensibilitii la carboxipeniciline, ureidopeniciline, la anumite CIIIG, la monobactami i carbapeneme. Rezistena dobandit apare n urma manifestrii mecanismelor enzimatice (penicilinaze, cefalosporinaze, BLSE, metalo-enzime) sau neenzimatice (impermeabilitate, eflux i modificarea intelor) (tabelul 18). Rezistena dobndit enzimatic este mediat de: a) penicilinaze plasmidiale transferabile cum ar fi: PSE, TEM, OXA (nivel sczut sau ridicat) care se materializeaz prin rezistena la carboxipeniciline, ureidopeniciline, cefoperazona i sensibilitate la: ceftazidim, cefepim, imipenem i inhibitori de -lactamaze. b) BLSE: - tip penicilinaz (TEM, SHV, PER, VEB) care confer rezisten la toate beta-lactamicele, cu excepia imipenemului, carboxipenicilinelor+ IBL i ureidopenicilinelor+ IBL - tip oxacilinaza (OXA-2, OXA-10) care confer rezisten la toate beta-lactamicele, cu excepia imipenemului c) cefalosporinaze cromosomale derepresate: - hiperproduse care confer rezisten la toate -lactamicele,cu excepia cefepimului i imipenemului - hiperproduse cu nivel nalt, tulpinile conservandu-i sensibilitatea doar la imipenem d) carbapenemaze care dau sensibilitate doar la aztreonam Rezistena dobndit neenzimatic este indus prin: a) trei sisteme de eflux: MexA, MexB i OprM, constitutiv, confer rezisten natural la carboxipeniciline i aztreonam; MexC, MexD si OprJ, confer rezisten la cefepim i cefpirom; MexE, MexF i OprN, cuplat adesea cu D2, confer rezistena la imipenem. b) deficit de porine - se refer la pierderea porinelor - care dau rezisten variabil la carbapeneme (uneori asociat cu o cefalosporinaz derepresat) c) modificarea LPS-ului duce la permeabilitate diminuat pentru toate -lactamicele, cu excepia imipenemului. d) modificarea PLP-urilor 2 i 4 care confera rezisten la imipenem i 3 care genereaz rezisten la toate -lactamicele, cu excepia imipenemului
Tabelul 18. Evidentierea fenotipurilor de rezistenta la betalactamice pe baza citirii interpretative la Pseudomonas aeruginosa (dup Jehl i colab., 2004) Antibiotic Aminopeniciline Aminopeniciline +IBL Carboxipeniciline Ureidopeniciline Cefalosporine 1a generatie Cefalosporine 2a generatie Cefalosporine 3a generatie Cefsulodin Cefalosporine de spectru larg Aztreonam Carbapeneme Fenotip salbatic R R S S R R S S S S S S Penicillinaza(1) R R R R R R R S S S S S CHN(2) R R R R R R R R
(4)

Cefoperazona Ceftazidim

R Cefepim S/R R S

158

(1) Ticarcilina +acid clavulanic: S ; Piperacilina+tazobactam : S, (2) Cefalosporinaza de nivel nalt, (3) IBL : inhibitor de beta-lactamaz, (4) in funcie de nivelul de producere Tabelul 19. Fenotipuri de rezistenta la -lactamice la Stenotrophomonas maltophilia (dup Jehl i colab., 2004) Fenotip Hipersensibil Sensibil CAZ-S/CAZ-R R R R R R R S S S R R R R R 20-30 ; 40-50 Imipenem-S Altele

Amoxicilina R R R Amoxicilina-AC R S R Ticarcilina S R R Ticarcilina-AC S S V Ceftazidim S S R Aztreonam S R R Imipenem R S R Frecventa (%) 5-10 <1 5-20 Activitatea i expresia -lactamazelor L1 (rezistenta la AC) + + + V L2(sensibilitate la AC) +/+ ++ + V S = sensibil; R = rezistent; I = intermediar; V = variabil; AC= acid clavulanic; CAZ = ceftazidim

Rezistena la -lactamice la Acinetobacter spp. Rezistena natural se manifest aproape fr excepie la aminopeniciline, CIG i CIIG. Rezistena dobndit (tabelul 20) este indus prin mai multe mecanisme : y producerea de -lactamaze de tipul penicilinazelor plasmidiale TEM (1 i 2), CARB5 y oxacilinaze: OXA21 y cefalosporinaze cromosomiale ACE 1 ACE 4 care hidrolizeaz toate cefalosporinele y combinarea mecanismelor de tipul: impermeabilitate, modificarea PLP-urilor, producerea de enzime (induc rezistena la imipenem)
Tabelul 20. Fenotipuri de rezisten la -lactamice la Acinetobacter spp. (dup Jehl i colab., 2004) Fenotip Mecanism Carboxi si ureidopeniciline Cefalosporine din gen. a III a Aztreonam Carbapeneme Frecventa I S S S S 5% II Penicilinaza R S S S 4% III Cefalosporinaza S R R S 35% IV Penicilinaza+ cefalosporinaza R R R S V Acumulare de mecanisme R R R R -

Rezistena la -lactamice la Haemophilus influenzae Se datoreaz mai multor mecanisme, cel mai frecvent fiind producerea de -lactamaze, care a aparut la 30% dintre tulpinile izolate din infecii bronho-pulmonare la aduli. Aceste -lactamaze sunt plasmidiale de tip TEM, mai rar ROB care inactiveaz aminopenicilinele, carboxi- i ureidopenicilinele. In general rmn active asociaia amoxicilina-acid clavulanic i CIIIG. Producerea -lactamazelor este uor de evideniat prin teste cromogenice (nitrocefin). Un alt mecanism de rezisten destul de frecvent este modificarea intei. De obicei sunt tulpini necapsulate, rezistena datorndu-se alterrii uneia sau mai multor PLP-uri i confer rezisten de nivel scazut la toate antibioticele din aceast clas. Rezistena la imipenem se pare c s-ar datora diminurii permeabilitii membranei externe printr-un mecanism nc neelucidat. Exist n acest sens printre tulpinile sensibile la ampicilin, un numr de tulpini rezistente la imipenem. 6.5. Metode fenotipice calitative i cantitative de evideniere a beta-lactamazelor

159

Identificarea definitiv a acesor enzime este posibil numai prin tehnici de secveniere a proteinelor i genelor, tehnici care sunt totui mult prea costisitoare pentru a fi utilizate n clinic i diagnostic. Totui, metode mai simple de evideniere i caracterizare a lactamazelor sunt disponibile pentru laboratoarele clinice.

A.1.Teste fenotipice bazate pe antibiograma difuzimetric Antibiograma difuzimetric calitativ clasic (metoda Kirby Bauer) BLSE pot fi sintetizate n cea mai mare parte de ctre enterobacterii i sunt reproduse cel mai adesea n antibiogram prin imaginea uni sinergism (dop de ampanie) ntre un disc de cefalosporin de generaia a III-a i /sau monobactam i un disc de amoxicilin + acid clavulanic. Dar aceasta imagine poate fi discret sau atipic. Secreia de BLSE va fi suspectat mai nti, de micorarea tuturor diametrelor de inhibiie la toate CIIIG : CTX 27 mm, CAZ 22mm, CRO 25mm, ATM 27mm (tabelul 21, fig. 44). O tulpin de referin trebuie testat n aceleai condiii n scopul verificrii validitii discurilor de antibiotice. Prezena unei BLSE indic faptul c tulpina este rezistent la toate lactamicele, cu excepia imipenemului i cefamicinei (fig. 44).
Tabelul 21. Diferenierea ESBL tip TEM de ESBL tip SHV prin metoda difuzimetric (dup Jehl i colab., 2004) Antibiotic Amoxicilin / Ampicilin Amoxicilin + acid clavulanic Piperacilin Cefoxitin Cefuroxim Cefotaxim Ceftazidim Aztreonam Cefepim Imipenem ESBL tip TEM R S R S S S S S S S ESBL tip SHV R S R S R S/I/R R R S/I/R S

Figura 44. Aspectul antibiogramei la tulpini de E. coli producatoare de -lactamaze de spectru larg: stg. aspecte de sinergism (<www.microbes-edu.org/.../bla/generalites.html >).

Antibiograma difuzimetric cantitativ prin metoda E-test. Principiu: Aceast metod se bazazeaz pe proprietatea ESBL de a fi sensibile la inhibitori de -lactamaze (acidul clavulanic). Exist i excepii de la aceast regul enzimele de tip IRT (Inhibitor Rezistant TEM lactamase). Benzile E-test conin un gradient de Cefotaxim la un capt i un gradient de Cefotaxim i acid clavulanic la cellat capt. Concentraia de Cefotaxim este mai mic n cazul n care acesta este asociat cu acidul clavulanic conform tabelului 22:

160

Cefotaxim (mg/L) 0,50 0,75 1 1,5 2 3 4 6 8 12 16 24 32

Tabelul 22. Concentraiile de antibiotic pe striurile E-test Cefotaxim (mg/L) + aA. clavulanic 0,125 0,19 0,25 0,38 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 6 8

Benzile similare coninnd gradiente de ceftazidim / ceftazidim + clavulanat (TZ / TZL) sunt deasemenea disponibile i sunt mai potrivite pentru detectarea tipului enzimatic CTX-M. Dac raportul dintre concentraia minim inhibitorie (CMI) de Cefotaxim i CMI de Cefotaxim + clavulanat este mai mare de 8 rezult c tulpina respectiv este productoare de BLSE (Fig. 48-49). Alternativ, se pot nregistra urmtoarele aspecte ale plcii n urma incubrii: y Creterea bacterian de-a lungul ntregii benzi (lipsa elipsei de inhibiie) indic faptul c valoarea respectiv de CMI este mai mare dect cea mai mare valoare din scal (fig. 45).

Figura 45. Valori CMI mai mari dect concentraiile scalate; Rezultatul este nedeterminat (Strachounski si colab, 2003).

O elips de inhibiie n afara gradientului arat o valoare a CMI mai mic dect cea mai mic valoare din scal. Apariia unei zone fantom plasat sub gradientul CT, dei o zon de inhibiie clar n jurul captului CT nu s-a evideniat, indic producerea de ESBL (fig. 46).

Figura 46. O zon de inhibiie fantom, circular, n jurul CT semnific prezena ESBL-urilor (Strachounski si colab, 2003).

Apariia unei elipse de inhibiie deformate nspre captul impregnat indic producerea de ESBL, datorit sinergismului dintre cefotaxim (CT) si acidul clavulanic difuzat dinspre regiunea CTL (fig. 47).
Figura 47. Deformarea elipsei de inhibiie TZ indic prezena ESBL-urilor (Strachounski si colab, 2003).

161

Figura 48. Aspectul E-Test la o tulpin de E.coli J53 (SHV-2) productoare de ESBL (dup Stratchounski i colab., 2003) CMIAMC 12 mg/L CMIPTZ 1,5 mg/L CMICPS1 mg/L

Figura 49. Aspectul ETest la o tulpina de K.pneumoniae productoare de ESBL (dup Stratchounski i colab., 2003) (SHV-2 + SHV-1 + TEM-1) CMIAMC 48 mg/L CMIPTZ 64 mg/L CMICPS 4 mg/L

Metoda discurilor duble Aceasta metod presupune compararea diametrelor zonelor de inhibiie date de un disc impregnate cu o cefalosporin de spectru larg singur cu un alt disc impregnat cu acelai antibiotic asociat cu un inhibitor de lactamaze (acidul clavulanic). Dac tulpina testat produce o enzim de tip ESBL, diametrul zonei este mai mare pentru discul ce conine antibiotic + inhibitor. NCCLS recomand compararea diametrelor zonelor de inhibiie date de ctre cefotaxim 30 g/disc cu cele ale cefotaximului + acid clavulanic 30 +10 g/disc, precum i ceftazidim 30 g/disc cu cele ale ceftazidimului + acid clavulanic 30 + 10 g/disc. Mzali i colab., 2000 au evaluat discuri cu antibiotice i inhibitori tip MAST DD, folosind metode conform indicaiilor NCCLS, i au obinut o sensibilitate de 93% a acestei metode pentru tulpini bacteriene control, productoare de ESBLuri, n timp ce perechile de ceftazidim i cefotaxim s-au dovedit a avea o sensibilitate mai sczut: 86% i respectiv 66%. O variant a metodei discurilor duble cu antibiotice (produse de OXOID) se bazeaz pe compararea diametrelor zonelor de inhibiie produse de cefpodoxim 10 g/disc i cefpodoxim + clavulanat 10 + 1 g/disc. Producerea de ESBL-uri este confirmat dac diametrul zonei de inhibiie dat de discul ce conine i clavulanat este cu 5 mm mai mare dect diametrul zonei discului fr inhibitor.
Testul dublei difuzii pentru detectarea ESBL Pe o plac cu mediu Mueller Hinton inoculat cu tulpina de testat (cultur de 24 h, nsmnare pe plac prin tehnica tamponului) se aplic discuri cu amoxicilin / clavulanat (AMC) i ceftazidim (CAZ) la 25 -30 mm distan (Jarlier i colab., 1988). De cealalt parte a discului AMC se plaseaz un disc coninnd o alt cefalosporin, de preferat cefotaxim (CT ). Se incubeaz peste noapte la 37oC. Producerea de ESBL este certificat dac diametrul zonei de inhibiie este extins din cauza clavulanatului ( inhibitorul de -lactamaze) (fig. 50-51).

162

Avantajul acestei metode simple este costul sczut; dezavantajul este acela c separarea optim a discurilor poate varia cu fiecare tulpina. Izolatele cu ESBL-uri de tip TEM i SHV dau rezultate pozitive, n schimb cele cu enzime de tip CTX-M dau un rezultat pozitiv numai atunci cnd cefotaximul sau cefpodoximul nlocuiesc ceftazidimul, ca indicator de cefalosporine. Tulpinile productoare de AmpC i majoritatea tulpinilor hiperproductoare de enzime K1, dau rezultate negative, cu toate cele trei cefalosporine.

Figura 50. Detectarea producerii de beta-lactamaze prin testul dublei difuzii. Discuri cu antibiotice: stnga: IMP, centru: AMC, dreapta: PIP, sus AM, jos: CAZ (dup Shah si colab., 2003).

Figura 51. Detectarea ESBL prin testul dublei difuzii: AMC-amoxicilina i acid clavulanic n centru; CAZ -Ceftazidim; ATM-Aztreonam; CTX-Cefotaxim; CRO-Ceftriaxone (dup Shah si colab., 2003).

Se recomand utilizarea discurilor de cloxacilin pentru detectarea penicilinaze lor (acest antibiotic inhib cefalosporinazele); N.B. inoculul dens poate masca hiperproducia de beta-lactamaze; N.B.- cnd sinergismul nu este vizibil din cauza fuzionrii zonelor de inhibiie, se ndeprteaz discurile (30 mm) sau se taie discurile de antibiotic n patru. N.B.- existena unor discrepane mari ntre diametrul zonelor de inhibiie la CAZ i CTX se datoreaz prezenei unei alte enzime pe lng ESBL (de exemplu, -lactamaze AmpC la Enterobacter cloacae).

Teste pentru confirmarea prezenei -lactamazelor cromosomale inductibile (-lactamaze tip AmpC) Cefalosporinele de generaia I (ampicilina i amoxicilina) induc exprimarea enzimelor tip AmpC i sunt distruse de ctre acestea, la majoritatea speciilor de Enterobacteriaceae. Consecutiv, tulpinile bacteriene productoare de -lactamaze inductibile tip AmpC devin rezistente constitutiv. Speciile productoare de lactamaze inductibile tip AmpC segreg mutante derepresate care produc enzime AmpC fr inducie

163

(derepresie stabil). Aceste mutante sunt rezistente la aproape toate penicilinele i cefalosporinele (Livermore i colab, 2001) i sunt de asemeni frecvente n izolatele clnice. Speciile productoare de -lactamaze tip AmpC pot fi recunoscute prin teste de antagonism ntre cefoxitim i cefotaxim (Sanders i colab. 1986). Pentru efectuarea acestui test se inoculeaz plci, conform protocolului din metoda antibiogramei, i se plaseaz discuri cu ceftazidim i cefoxitim, pe acceai plac, la o distan de 25 mm. Inducia de -lactamaze este evideniat prin aplatizarea zonei de inhibiie a ceftazidimului n dreptul discului de cefoxitim. Astfel, cefoxitimul a determinat producerea de -lactamaze iductibile care au hidrolizat ceftazidimul (fig. 48). Acidul clavulanic este un inductor al -lactamazelor tip AmpC i de aceea apariia unor mici colonii n interiorul zonei de inhibiie a discului AMC (amoxicilin - acid clavulanic) poate fi un indicator util pentru detectarea prezenei enzimelor AmpC.

Figura 52. Detectarea -lactamazelor inductibile tip AmpC. Discul cu diamterul mare al zonei de inhibiie este ceftazidim (CAZ), iar cel cu diametrul foarte mic este cefoxitim (FOX) (< www.seimc.org/protocolos/microbiologia/cap12.htm>).

Au fost concepute numeroase teste directe de detectare a activitaii -lactamazice, dar numai o parte dintre ele se pot folosi ca analize de rutin (James i colab., 1977). Majoritatea folosesc cefalosporine cromogene, sau coreleaz hidroliza penicilinei cu o schimbare a culorii mediului de reacie, mediat de iod sau detectat cu un indicator de pH. Cefalosporinele cromogene sunt foarte specifice, n timp ce acidifierea mediului i reducerea iodului se poate datora i altor cauze dect aciunii -lactamazelor, genernd rezultate fals pozitive. Datorit slabei specificiti a testului iodometric ar trebui realizate n paralel controlale pozitive si negative pentru toate testele.

Testul la nitrocefin Nitrocefinul este o cefalosporin care poate funciona ca substrat cromogen pentru -lactmaze i ii schimb culoarea de la galben la rou atunci cnd este hidrolizat. Acesta reprezint testul cel mai sensibil pentru majoritatea lactamazelor, exceptnd penicilinazele stafilococice. Avantajul folosirii acestui antibiotic n testele de evideniere const n faptul c el este hidrolizat de toate lactamazele cunoscute, indiferent de specificitatea acestora. Nitrocefinul este disponibil sub form de pudr purificat de la Becton Dickinson (Oxford, UK) sau discuri mbibate cu antibiotic (OXOID). Coloniile bacteriene sunt raclate de pe mediul nutritiv solid i resuspendate n tampon fosfat obinndu-se o suspensie dens, peste care se adaug soluie nitrocefin. Activitatea -lactamazic este evideniat prin apariia culorii roii n 1 - 2 minute. n cazul enzimelor cu activitate mai mic rspunsul poate ntrzia, ns rezultatele pozitive aprute la mai mult de 10 minute trebuie tratate cu scepticism ntruct ele pot fi cauzate de o activitate lactamazic secundar a proteinelor care leag penicilina ( penicillin binding protein - PBP) care formeaz complexe acil instabile (OCallaghan i colab., 1972). Avantajul acestei metode const n rapiditatea cu care se pot obine rezultate despre prezena lactamazelor. Testul iodometric

164

Hidroliza penicilinei determin formarea acidului peniciloic, care reduce iodul, decolornd complexul iodamidon. Aceast proprietate poate fi exploatat pentru a detecta activitatea lactamazic n tuburi sau pe hrtie. Aceste teste sunt sensibile pentru penicilinazele stafilococice, dar sunt mai puin sensibile dect nitrocefinul pentru majoritatea lactamazelor provenite de la bacterii Gram negative.  Metoda n tub : Se poate efectua n cantiti mici att n tuburi, ct i n plci cu godeuri. Se distribuie benzilpenicilin (penicilin G) n tampon fosfat, n godeurile unei plci. n aceast soluie se suspend cultur bacterian, solid (de pe agar) i se pstraz la temperatura camerei pentru aproximativ 30 60 minute. Se adaug amidon solubil n ap distilat i ulterior iod n soluie de iodur de potasiu. Activitatea lactamazic este demonstrat prin decolorarea iodului n maxim 5 minute (Catlin i colab., 1975). Sunt necesare teste de control pozitive i negative deoarece alte proteine pot de asemenea reduce iodul, iar un inocul concentrat poate da rezultate fals pozitive.  Metoda pe benzi de hrtie : Se folosete hrtie de filtru Whatman nr.3, mbibat n soluie de amidon dizolvat n ap distilat la fierbere, la care s-a adugat benzil penicilin la rcire. Cnd benzile de hrtie iodometric s-au uscat (aproximativ 2 ore), acestea sunt nmuiate n soluie de iod n iodur de potasiu. Pe acestea se aplic colonii dintr-o cultur de 24 de ore. Decolorarea apare n 5 minute i indic activitate lactamazic (Jorgensen i colab., 1977).

Testul acidimetric Hidroliza nucleului -lactamic genereaz o grupare carboxil care acidific un mediu netamponat. Acidifierea rezultat poate fi detectat n tuburi sau pe hrtie de filtru.  Metoda n tub : Se folosete soluie de rou fenol la care s-a adugat benzilpenicilin, cu pH 8,5. Soluia de culoare violet este distribuit n godeuri i inoculat cu bacterii din cultur solid pentru a forma o suspensie dens. Activitatea -lactamazic este indicat de virajul culorii de la rou la galben n maxim 5 minute (Duma & Kinz, 1968).  Metoda pe benzi de hrtie : benzile mici, de hrtie de filtru W hatman sunt mbibate ntr-o soluie proaspt preparat de benzilpenicilin, bromo-crezol i NaOH. Benzile se usuc i se pstreaz pentru mai multe luni. nainte de folosire ele trebuiesc rehidratate n ap distilat i apoi se aplic cultur bacterian de pe agar solid. Apariia culorii galbene n maxim 5 minute indic activitate -lactamazic (Livermore, 1995).

A.3. Metode de identificare a diferitelor tipuri de -lactamaze prin cinetic enzimatic Obinerea extractului proteic: Tulpinile bacteriene care expim constitutiv -lactamaze se cultiv n bulion Mueller-Hinton peste noapte la 37oC, din care se recolteaz celulele prin centrifugare. Suspensia celular obinut din fiecare preparat se supune sonicrii urmat de ultracentrifugare. Supernatantul este dializat i concentrat dac este nevoie. Purificarea -lactamazelor: ntr-o prim etap, -lactamazele se purific prin focusare isoelectric orizontal (IEFO), ntr-un gradient de pH cuprins ntre 6.5 i 10.5 obinut prin metoda amfoliilor. Dup migrare, gelul este mprit n 30 de segmente egale n care se testeaz activitatea lactamazic cu nitrocefin sau benzilpenicilin (OCallaghan i colab., 1972). Fraciile din gel care prezint activitate lactamaizic se ncarc pe o coloan cromatografic de carboxi metil Sephadex i se elueaz cu tampon fosfat conform protocolului descris de Iaconis i colab. (1990). Fraciile care au prezentat activitate lactamazic se concentreaz prin ultrafiltrare i au fost trecute n continuare pe o coloan schimbtoare de ioni. Hidroliza antibioticelor -lactamice este examinat prin spectrofotometrie UV (Beckman DU-7). Se folosesc cuve de cuartz, de 1cm, la lungimea de und maxim de absorbie a inelului -lactam, pentru fiecare antibiotic n parte, iar densitatea optic se msoara la intervale de 10 secunde, timp de 5 minute. Maximul de absorbie pentru pricipalele antibiotice folosite sunt:  cefalotin (265 nm)  cefuroxim (274 nm)  cefotaxim (254 nm)  ceftazidim (254 nm)  imipenem (299 nm)  cloxacilin (260 nm)  aztreonam (292 nm)  nitrocefin (489 nm)

165

Rata de hidroliz a benzilpenicilinei este msurat la 233 nm. Soluiile de antibiotic sunt preparate n tampon 0,1M, pH 7.0. Pentru stabilirea profilelor substratelor, toate antibioticele se examineaz la o concentraie de 100 uM, mai puin benzilpenicilina care este testat pentru 500 uM. O unitate de activitate lactamazic, este definit ca fiind cantitatea de enzim care hidrolizeaz un nmol de substrat / min n etapa liniar a reaciei la 37oC n tampon fosfat 0,1M, ph 7.0. Constanta Michaelis (Km) i rata maxim de hidroliz (vm) se determin cu ajutorul transformrii Lineweaver-Burk a vitezei iniiale (v) pentru ase concentraii diferite ale substratului. Susceptibilitatea -lactamazelor de a fi inhibate de clavulanatul de potasiu i cloxacilina este msurat cantitativ prin preincubarea enzimei cu concentraii diferite de inhibitor pentru 10 minute. Pentru msurarea activitii enzimatice reziduale se adaug ulterior ca substrat benzilpenicilin (500 uM) sau imipenem (100 uM). Concentraia de inhibitor necesar pentru a inhiba 50% din activitatea enzimatic se determin prin teste statisitice de certitudine.

Evidenierea fenotipic a rezistenei cocilor Gram-pozitivi la aminozide La S. aureus rezistena la aceste antibiotice este enzimatic fiind evideniate mai multe fenotipuri (tabelul 23).
Tabelul 23. Rezistena S. aureus la aminozide (dup Jehl i colab., 2004) Fenotip Enzime Kanamicina Tobramicina Gentamicina Amikacina Netilmicina Isepamicina Salbatic S S S K APH3-III R S S KT ANT-4-4 R R S KTG APH 2-AAC6 R R R APH = aminozid-fosfotransferaza; ANT = aminozid nucleotidiltransferaza; AAC = aminozid acetiltransferaza

Rezistena enterococilor la aminoglicozide Rezistena natural de nivel scazut (intrinsec) se datoreaz unui transport ineficient al acestora prin membrana citoplasmatic, ns activitatea lor este sinergic cu -lactaminele i glicopeptidele. Specia E. faecium produce n mod natural o acetiltransferaz cromosomal AAC(6) care inactiveaz aminozidele gentamicina rmne activ). Un numr din ce n ce mai mare de tulpini de enterococi manifest rezisten de nivel nalt la aminoglicozide (HLR) - definit ca CMI 2 mg/mg i, concomitent, rezisten la sinergismul cu beta lactamicele (Tabelul 24). Mecanismul de rezisten preponderent este modificarea enzimatic a aminoglicozidelor, ca urmare a achiziionrii uneia sau mai multor gene. Enzimele codificate de aceste gene sunt sintetizate constitutiv i au localizare citoplasmatic. Modificarea enzimatic a antibioticului este asociat cu o diminuare a afinittii sale pentru proteinele ribosomale i cu alterarea transportului antibioticului.
Tabelul 24. Principalele fenotipuri de rezisten ale enterococilor la aminozide (dup Jehl i colab., 2004) Enzime Kanamicina Gentamicina Netilmicina Tobramicina Amikacina S S S S S APH3 R S S S R ANT-4 R R S R S/R APH2-AAC6 R R R R R APH = aminozid fosfotransferaza; ANT = aminozid nucleotidiltransferaza; AAC = aminozid acetiltransferaza

Enterobacteriile cu exceptia speciei Providencia stuartii, sunt n mod natural sensibile la aminoglicozide. Cele patru aminozide utilizate n terapia infeciilor cu enterobacterii sunt: gentamicina (GM), tobramicina (TM), netilmicina (NET) i amikacina (AN). P. stuartii are o rezisten cromosomal la gentamicin, netilmicin i tobramicin. Rezistena dobndit la aceste antibiotice este puin frecvent (tabelul 25). Anumite fenotipuri de rezisten sunt generate n funcie de prezena anumitor enzime care modific aminozidele: Fenotipul 1: tulpini rezistente la gentamicin (GM), asociate cu prezena unei 3-aminoacilacetiltrensferazei AAC;

166

Fenotipul 2: tulpini rezistente la gentamicin (GM) i la netilmicin (NET) asociate cu o 2nucleotidiltransferaz ANT; Fenotipul 3: tulpini rezistente la tobramicin (TM), netilmicin (NET), i la amikacin (AN) asociate cu o 6-aminoacilacetiltransferaz AAC.
Tabelul 25. Fenotipurile de rezisten dobndit ale enterobacteriilor la aminozide (dup Jehl i colab., 2004) Specii implicate E.coli, P.mirabilis, K.pneumoniae, E. cloacae A APH(3)-VI S S S R R E. cloacae GT AAC(3)-VI R R S S S E.coli TA ANT(4)-II S R S R R TOATE GTNt AAC(2)-I R R R S S P.stuartii AAC(3)-IV R R R S S E.coli KTG ANT(2)-I R R S S TOATE KTANt AAC(6)-I S R R R S S.marcescens E.coli, E.cloacae K. pneumoniae E. aerogenes KTGNt AAC(3)-II R R R S S TOATE KTGANt Impermeabilitate R R R R R TOATE Asociaie de enzime R R R R R TOATE Gm = gentamicina, To = tobramicina, Nt = netilmicina, Ak =amikacina, Is =isepamicina, AAC = aminozid acetiltransferaze, ANT = aminozid nucleotidiltransferaza, APH = aminozid fosfotransferaze In fiecare clas, enzimele sunt desemnate prin tipul lor de activitate, numrul carbonului purtnd gruparea modificat (cifre arabe de la 1 la 6) i ciclul afectat de modificare (primar, secundar sau nemodificat). Cifra roman care urmeaz indic spectrul de substrat al enzimei (adic ansamblul de molecule hidrolizate). Fenotip G Enzime AAC(3)-I Gm(G) R To(T) S Nt S Ak(A) S Is(I) S

Evidenierea fenotipurilor de rezisten a pseudomonadaceaelor la aminoglicozide

Fenotipul salbatic este sensibil la toate aminozidele. Fenotipurile de rezisten dobndit se datoreaz mai multor mecanisme: impermeabilitate, eflux, inactivare enzimatic, mutante respiratorii, combinaii ale acestor mecanisme (tabelul 26, 27). La P. aeruginosa cel mai ntlnit mecanism este cel de impermeabilitate (tabelul 26).
Tabelul 26. Principalele fenotipuri de rezisten ale P. aeruginosa la la aminozide (dup Jehl i colab., 2004) Fenotip G GNt GT GNtT Enzima AAC(3)-I AAC(3) ANT(2)-I AAC(6)-II AAC(3)-II,IV,V AAC(6 )-I AAC(6)+ANT(2)-I G R R R R T S S R R Nt S R S R A S S S S I S S S S

TntA S GTNtA R Eflux(30-40%) R G = gentamicina ; T= tobramicina ; Nt =netilmicina acetiltransferaza ; ANT = aminoacid- nucleotidiltransferaza.

R R R ? R R R ? S R R R ; A =amikacina ; I = isepamicina; AAC = amioacid-

167

Tabelul 27. Fenotipuri de rezisten la aminozide la Acinetobacter spp Fenotip de rezisten Enzime Prevalena ( %) G AAC(3)-I 29,5 40 GN AAC(3)-? 61- 67 GTN AAC(3)- II 0-8,3 AAC(3)- V 0 -11 TNA AAC(6)-I 28-35 GTN AAC(6)- II 0-5 GT ANT(2 )-I 27-29,5 APH(3)-I 34 -40 AI APH(3)-VI 48- 48,5 G = gentamicina; N = netilmicina; T = tobramicina; A = amikacina; I = isepamicina; APH = aminozidfosfotransferaza; ANT = aminozidnucleotidiltransferaza; AAC = aminozidacetiltransferaza.

Evidenierea fenotipurilor de rezisten la quinolone Stafilococii sunt natural rezisteni la quinolone de prima generaie, n schimb sunt sensibili la fluorochinolone. Sunt descrise 2 mecanisme de rezisten: - afinitate sczut prin modificarea intei, ADN giraza. Dobndirea rezistenei este legat de apariia mutaiilor cromosomale n genele gyrA i parC care provoac o diminuare a legrii quinolonelor la intele lor intracelulare, complexele ADN giraza i ADN topoizomeraza 4. - eflux Pneumococii prezint rezisten natural la quinolonele din prima generaie i au sensibilitate redus la pefloxacin, ofloxacin i ciprofloxacin. Foarte active pe pneumococ sunt levofloxacina i moxifloxacina. Mecanismele rezistentei dobndite sunt: efluxul activ i mutaiile topoizomerazei IV (gena parC) i girazei (gena gyrA) Toate enterobacteriile prezint rezisten incruciat la toate chinolonele, dar nivelul de exprimare variaz pentru fiecare substan antimicrobian n funcie de bacterie. Pentru a pune n eviden diferite fenotipuri se testeaz acidul nalidixic (NAL) i dou florochinolone: de exemplu: pefloxacin (PEF) sau ofloxacin (OFX) i ciprofloxacin (CIP) sau norfloxacin (NOR) (tabelul 28). Au fost identificate urmtoarele fenotipuri de rezisten la chinolone la enterobacterii: Fenotipul 1: tulpini sensibile la toate chinolonele; Fenotipul 2: tulpini rezistente la acid nalidixic, dar sensibile la fluorchinolone; Fenotipul 3: tulpini cu sensibilitate diminuat la pefloxacin i la ofloxacin, dar sensibile la ciprofloxacin. Fenotipul 4: tulpini rezistente la toate chinolonele.
Tabelul 28. Fenotipuri de rezisten a enterobacteriilor la chinolone (dup Jehl i colab., 2004) Fenotipuri Acid nalidixic Norfloxacin Pefloxacin (1) I S S S II R S S III R I/R I/R IV R R R Rar eflux (E. coli) S R S (1) Acid nalidixic i toate chinolonele clasice (prima genetaie). Ofloxacin S S S R S Ciprofloxacin S S S R S

Fenotipurile de rezisten la chinolone la P. aeruginosa Fenotipul salbatic este sensibil la toate fluorochinolonele dei n terapie cel mai utilizat este ciprofloxacinul (tabelul 29). Rezistena dobndit se datoreaz urmtoarelor mecanisme: impermeabilitate (porine i LPS); modificarea afinitii intei (subunitile A i B ale ADN-girazei i Csi D ale topoizomerazei IV; Eflux activ (OprM, OprJ, OprN confer rezisten de nivel sczut)

168

Tabelul 29. Principalele fenotipuri de rezisten ale P. aeruginosa la chinolone (dup Jehl i colab., 2004) Fenotip I (salbatic) II III IV Eflux Nofloxacin S I R R R Pefloxacin S I R R S Ofloxacin Levofloxacin S I R R S Ciprofloxacin S S S R R

Se consider c aproape 70% din tulpinile de A. baumanii au dobndit rezisten ncruciat la fluoroquinolone, prin mutaii la nivelul intei. Evidenierea fenotipurilor de rezisten la glicopeptide. Rezistena stafilococilor Cazuri de rezisten sporadic la glicopeptide au fost descrise la stafilococii coagulazo-negativi nc din 1981. In primele cazuri rezistena la vancomicin i teicoplanin a fost de nivel sczut (CMI 8-16 mg/ml). Tulpinile raportate ulterior aveau CMI ntre 16 i 64 mg/ml la teicoplanin i o sensibilitate meninut la vancomicin. Fenotipul de rezisten a fost asociat cu prezena unei proteine membranare de 35 000-39 000da la S.epidermidis i S.haemolyticus. Cteva tulpini sunt intermediare la vancomicin (tulpini GISA) i au o rezisten crescut la teicoplanin. Acestea au fost izolate de la pacieni care au urmat multiple tratamente cu vancomicin. Aceste tulpini GISA nu au genotipul VanA, VanB, VanC, mecanismul de rezisten fiind nc necunoscut. Articole recente raporteaza tulpini de S.aureus cu sensibilitate redus la teicoplanin (creterea CMI de 8 ori) i la vancomicin (CMI dublu), tulpini care sintetizeaz o noua protein de 39 000da (fig. 53). In schimb, tulpini de S.aureus sensibile la vancomicin i cu sensibilitate redusa la teicoplanin posed o protein membranar de 35 000da i prezint o cretere a exprimrii PLP 2-1 i PLP 2-2. Rezistena la glicopeptide este uneori greu de depistat prin antibiograma difuzimetric. Comitetul de Antibiogram al Societatii Franceze de Microbiologie (CA-SFM) recomand determinarea CMI pentru toate tulpinile al cror diametru de inhibiie este mai mic de 17 mm. Detectarea rezistenei pare sa dea rezultate mai bune pe mediu semi-gelozat.

Rezistena enterococilor la vancomicin

Rezistena enterococilor la vancomicin a nceput s fie semnalat din anul 1988 (Leclercq si al., 1988 & 1989). Supravegherea clinic, biochimic i genetic a rezistenei la glicopeptide n cadrul genului Euterococcus a evideniat o mare heterogenitate fenotipic i genotipic. Cele trei fenotipuri (VanA. VanB & VanC) sunt definite prin nivelul de rezisten la vancomicin i sensibilitate sau rezisten la teicoplanin (Tabel 30). Rezistenta intrinsec (natural) la glicopeptide numit VanC se caracterizeaz prin rezisten de nivel sczut la vancomicin i sensibilitate la teicoplanin ntalnit la speciile: E. gallinarum, E. casseliflavus i E. flavescens. Gena VanC codific o ligaz care substituie D-Ala-D-Ser n locul D-Ala-D-Ala ca precursor al peptidoglicanului. Mecanismul rezistenei dobndite este legat de producerea unui nou precursor al peptidoglicanului n care dipeptidul terminal ( D-Ala-D-Ala) este nlocuit de D-Ala- D-Lac, a crui afinitate pentru glicopeptide este redus. Sunt descrise ase fenotipuri de rezisten dobndit: VanA, VanB, VanD, VanE,VanG, Van E (la E. faecalis i E. faecium).

169

Tabelul 30. Distribuia fenotipurilor de rezisten ale enterococilor la chinolone Fenotip CMI Va(mg/l) CMI Tec(mg/l) Expresie Suport genetic Transferabil prin conjugare Specii bacteriene VanA (HLR) 64->1024 16-512 Inductibila Plasmidial transpozon Tn1546 + E. faecium E. faecalis E. gallinarum E. flavescens E.avium E. durans E. hirae VanB (MLR) 4-1000 0,5- 1 Inductibila Cromosomal + E.faecalis faecium E. VanC 4 4 Constitutiva Cromosomal vanC1 - E. gallinarum, vanC-2 - E. casseliflavus, and vanC-3 E. flavescens VanD 64 4 Constitutiva Cromosomal E. faecium VanG 16 16 Inductibila Cromosomal E.faecium E. faecalis VanE 16 0,5 Inductibila Cromosomal E. faecalis

Transpozonul Tn1546 codific 9 proteine: - dou necesare transpoziiei (ORF1 si ORF2) - dou implicate n reglarea expresiei inductibile a rezistenei ( VanR siVanS) - cinci implicate n rezisten (VanH-dehidrogenaza, VanA-ligaza, VanX-peptidaza, majore i VanY i VanZ, considerate minore). A fost descris o tulpin de S. bovis rezistent la vancomicin care posed gena vanB. Cea de-a doua form a rezistenei la vancomicin a rezultat probabil din transferul conjugativ al operonului vanA de la Enterococcus faecalis vancomicin-rezistent (fig. 54). Showsh i colaboratorii au demonstrat c plasmida de la Enterococcus faecalis care conine vanA codific de asemenea un feromon de sex care este sintetizat i de ctre S. aureus, sugernd posibilitatea transferului conjugal. Aceste izolate VRSA au rezistena de nivel nalt la vancomicin, cu CMI de 128 g/ml. Rezistena la aceste izolate este cauzat de alterarea peptidului terminal la D- Ala-D-Lac n loc de D-Ala-D-Ala (fig. 54). Sinteza D-Ala-D-Lac se produce doar prin expunerea la concentraii mici de vancomicin.

Figura 53. Mecanismele de rezisten la vancomicin a tulpinilor VISA. Acestea sintetizeaz n exces peptidoglican, avnd ca rezultat creterea numrului de resturi D-Ala-D-Ala care leag vancomicina (dup Walsh i Howe, 2002).

170

Figura 54. Mecanismul de rezisten la vancomicin a tulpinilor VRSA (dup Hiramatsu i colab., 1997).

Evidenierea rezistenei la macrolide, streptogramine, lincosamide (MLSb)

Rezistena la aceste tipuri de antibiotice este rezultatul activarii a 3 mecanisme: Modificarea intei ribosomale (sub-unitatea 50S) Tulpinile rezistente produc o metilaz responsabil de o dimetilare specific a adeninei din ARNr 23S. Aceasta provoac o schimbare de conformaie a ARN, care reduce afinitatea MLS pentru ribosomi. Metilarea se produce la toate macrolidele i lincosamidele. Aceast rezisten depinde de diferii determinani genetici. La stafilococ gsim genele ermA, ermB, ermC. Aceste gene sunt purtate de transpozoni (ermA) sau plasmide (erm). Exprimarea fenotipic a rezistenei poate fi inductibil (rezisten crescut pentru toate macrolidele cu 14 i 15 atomi de carbon i sensibilitate la macrolidele cu 16 atomi de carbon), sau constitutiv (rezisten crescut la toate macrolidele cu 14-16 atomi de carbon, lincozamidele i streptograminele B rezisten de tip MLSB) (tabelul 31). Rezistena compusului B nu modific sinergia a doi compui ai streptograminelor.
Tabelul 31. Fenotipuri de rezisten la MLS dobndite de ctre stafilococi (dup Jehl i colab., 2004) 14C1 15C2

Mecanism

Genotip

Fenotip

16C3

LIN

CLIN

PRIB

PRIA S S S R S R S

PRIi5 S S S ? ? S/R S

erm MLS B R S S S S inductibil Modificarea erm intei constituti MLS B R R R R S v linA L S S R S4 S Inactivare Vat/vatB (L)SA S S S S S vgb SB S S S S R vga (L)SA S S S/I/R R/I/S S Eflux msrA Erm R S S S S (1) 14C: eritromicina, roxitromicina, claritromicina, diritro micina (2) 15C: azitromicina (3) 16C: spiramicina, josamicina, midecamicina, tilosina (4): antibiotic a carui activitate bacteriostatica sau bactericida este diminuata (5) Pri : pristinamicina

171

Inactivarea antibioticului StreptograminaA acetiltransferaza confer rezisten la factorul A astfel nct streptogramin B hidrolaza, codificat de ctre gena vgb, inactiveaz factorul B. Cel puin 2 gene vat i vatB sunt responsabile pentru acetilarea streptograminelor A. Rezistena izolat la lincosamide, exceptionala la S.aureus dar detectat la stafilococii coagulazo-negativi (S. sciurii, S. cohnii, S. xylosus), este datorat achiziionrii unei enzime care modific prin adenilare lincomicina i clindamicina. Fenotipul LSA poate fi confundat cu fenotipul L, ambele rare la S.aureus. Lincosamidele sunt inactivate de ctre nucleotid-transferaze codificate de 2 gene plasmidiale foarte apropiate, linA i linA. Efluxul activ al moleculelor de antibiotic Exprimarea acestei rezistene depinde de gena msrA, care codific pentru proteina MsrA responsabil de eliminarea crescut a eritromicinei intrabacteriene. Au fost izolai stafilococi rezisteni doar la streptogramina A. Rezistena dependent de gena vga este datorat unei diminuri a incorporarii intracelulare a antibioticului. La enterococi, rezistena natural se manifest la lincosamide i la compusul A al streptograminelor (la toate speciile cu excepia E. faecium i E. durans, astfel c acest tip de rezisten poate fi utilizat ca test de orientare pentru identificare). Rezistena dobndit se manifest prin dou mecanisme: modificarea intei i inactivarea antibioticului. Modificarea intei (subunitatea 50S ribosomal) este mecanismul principal care explic rezistena incruciat la MLSK. La enterococi gena ermB este responsabil de aceast rezisten. Inactivarea antibioticului se manifest la E. faecalis prin aciunea unei lincomicin-nucleotidiltransferaze (codificate de gene linA) care confer rezisten la streptograminele A. Rezistena dobandit a Str. pneumoniae la macrolide este MLSB, datorit metilrii ARNr 23S, care diminueaz afinitatea macrolidelor pentru int. Aceast rezisten este ncruciat pentru toate macrolidele, lincosamidele i streptograminele B i poate fi de tip inductibil sau constitutiv: - Tulpinile care au gena erm imductibil sunt sensibile la ketolide la fel ca cele rezistente prin mecanismul de eflux . - Alte tulpini, care posed gena mefE, codific o rezisten prin mecanism de eflux ele fiind rezistente la eritromicin, dar sensibile la clindamicia, quinupristin i la ketolide. Genele erm i mefE sunt rareori asociate. - Al treilea fenotip de rezisten a fost descris la un grup de 10 tulpini care nu au genele erm sau mefE dar sunt ery-R constitutiv i clinda-R. La S. pyogenes mai puin de 10% dintre tulpini sunt rezistente la eritromicin, cu o mare heterogenitate de la o zona la alta (18,3% n Asia, 10,6% n Europa de Est, 9,8% n Europa de Vest). Doua mecanisme sunt responsabile de aceasta rezisten: modificarea intei, care d fenotipul MLSB constitutiv, codificat de gena ermB i un mecanism de efux care d fenotipul M codificat de gena mefA. Telitromicina are o activitate intrinsec superioar celei a macrolidelor.

Evidenierea fenotipurilor de rezisten la tetracicline Sunt descrise 2 mecanisme de rezisten la tetracicline: y primul este legat de o insuficient concentrare intracelular a antibioticului datorit unui eflux excesiv al antibioticului prin membrana citoplasmatic, sub aciunea unei proteine membranare TET. Acest mecanism confer o rezisten la tetraciclin, dar nu i la minociclin. y al doilea mecanism este datorat unei modificri a intei ribosomale a acestor antibiotice. In acest caz, exist o rezisten crescut la toate tetraciclinele. La streptococi i enterococi au fost evideniate 3 gene de rezisten la tetraciclin, i anume: tetM, tetO (Zilhao i colab., 1988) i tetL (Chopra i colab., 1986). Rezistena la trimetoprim-sulfometoxazol Rezistena stafilococului la acesti 2 compui se realizeaz prin mai multe mecanisme: - modificarea enzimelor int (DHFR si THFR) - supraproducerea acestor enzime.

172

Rezistena la fosfomicin Rezistena stafilococului la fosfomicin este rezultatul unor mutaii foarte frecvente ce intesc transportul antibioticului. A fost raportata o rezistenta plasmidial la tulpini de stafilococ coagulazo-negativi i la S.aureus (gena fosB la S. aureus). Mecanismul, prin analogie cu cel descris la bacilii Gram negativi, ar putea fi inactivarea antibioticului prin conjugare cu glutation. Specia saprophyticus este natural rezistent la fosfomicin. Rezistena la acid fusidic Rezistenta stafilococului la acidul fusidic este datorata unor mutaii care au loc cu frecven mare, fapt pentru care n clinic acest antibiotic se utilizeaz numai n asociere cu alte antibiotice. Rezistena la rifampicin Se disting dou niveluri de rezisten: - de nivel nalt cu CMI > 32mg/l - sensibilitate diminuat (CMI 1- 4mg/l), tulpini izolate rareori Mecanismele de rezisten la S. aureus nu sunt nc cunoscute. La pneumococ, rezistena la rifampicin, este legat de o mutaie a lanului al ARN polimerazei care impiedic fixarea antibioticului pe inta sa. Rezistena la cloramfenicol Este predominant plasmidial i se datoreaz prezenei la enterococi a unor gene cat omologe cu cele de origine stafilococic catpC221, catpC194 i catpSCS7 (Trieu-Cuot et al., 1991; 1993). CatpC221, este o gen, cu expresie inductibil cu secven cunoscut (Shaw si colab., 1985), identificat pe plasmida pC221 de la S. aureus. Plasmida conjugativa pIP501 (30,2 kbp), cu spectru larg de gazd, a fost izolat pentru prima dat din tulpina B96 de S. agalactiae (Horodniceanu i colab., 1976). Prezena sa confer tulpinii gazd fenotip Cmr-Emr. Studii bazate pe hibridizri ADN-ADN au evideniat diseminarea determinantului catpIP501 pe plasmide izolate din enterococi (Pepper i colab., 1986; 1987; 1988). Spre deosebire de stafilococi i enterococi unde este codificata plasmidial, la pneumococ i cloramfenicol acetil transferaza este de natura cromosomal. Rezistena la oxazolidinone La stafilococi, pn n prezent nu a fost evideniat rezisten ncruciat ntre linezolid i alte antibiotice inhibitoare ale sintezei proteice, mai mult oxazolidinonele rmn active asupra tulpinilor de MRSA. Oxazolidinonele s-au dovedit a fi active asupra tulpinilor de E. faecalis i E. faecium fie c sunt sensibile fie c nu la glicopeptide. In vitro s-au obinut mutante rezistente cu o frecven de 10-9- 10-11 ( mutaii la nivelul subunitatii 23S ribosomale). La penumococi nu s-a semnalat pn n prezent nici o tulpin rezitent indiferent de sensibilitatea la penicilina G i macrolide. 6.6. Fenotipuri de rezisten la alte antibiotice la microorganisme de interes clinic
B. cepacia este rezistent, de asemenea, la aminozide, fosfomicina i polimixine, dar sensibil la fluoroquinolone i cotrimoxazol i, ntr-un anumit procent, la carbapeneme n special la meropenem. Fenomenul de eflux inactiveaz asupra cloramfenicolul, trimetoprimul i ciprofloxacinul. H. influenzae este rezistent la lincosamide i moderat sensibil la macrolide i ketolide. La aminozide sensibilitatea este variabil iar fa de cloramfenicol, tetracicline, rifampicin, quinolone i cotrimoxazol se manifest o rezisten de nivel scazut. Biologul sau medicul de laborator care execut antibiograma are obligaia de a prezenta clinicianului rezultatul sub forma unui document uor de citit i de ineles, care trebuie s urmeze logic rezu ltatului examenului microscopic direct i al culturii. Meniunile obligatorii din buletinul de analiz al antibiogramei sunt: metoda utilizat, lista antibioticelor conform DCI-urilor (denumire comun internaional), rspunsul interpretat ca sensibil, intermediar, rezistent, CMI uri n anumite cazuri (n special pentru microorganismele izolate din infectii severe), menionarea anumitor fenotipuri de rezisten i consecinele lor terapeutice. n anumite cazuri este mai avantajos ca biologul sau medicul de laborator s prezinte clinicianului doar rezultatele pentru anumite

173

antibiotice, pentru a evita selectarea i emergena unor fenotipuri de rezisten n mediul spitalicesc (tabelul 33). Antibiograma este inutil de fiecare dat cnd tulpina izolat nu poate fi considerat responsabil de infecia care a determinat prelevarea (ex. -microorganism comensal sau contaminant, cum este cazul streptococilor orali sau Haemophilus parainfluenzae n expectoraii, Bacillus ntr-o singur hemocultur); cnd numarul de UFC/ml este inferior pragului semnificativ (urina i expectorai); dac tulpina izolat poate fi considerat ca patogen, dar face parte dintre speciile sensibile n mod obinuit la tratamentul de referin i cnd nu exist nici o corelaie in vitro-in vivo (ex. Legionella); n infeciile cutanate pentru care tratamentul este local sau chirurgical. Antibiograma trebuie practicat n acord cu clinicianul: - daca o bacterie comensal este izolat de la un pacient imunodeprimat; - n prelevatele plurimicrobiene care conin specii aerobe/anaerobe (tabelul 32);
Tabelul 32. Criterii de decizie pentru realizarea unei antibiograme n funcie de natura prelevatului (dup Jehl i colab., 2004) Prelevat Hemocultura Necesitatea antibiogramei Pentru toate speciile izolate cu exceptia contaminanilor Toate speciile considerate ca responsabile de meningite comunitare sau nosocomiale. Fr antibiogram Dac sunt contaminani normali (Bacillus, corineformi), iar o singur hemocultur este pozitiv. Daca sunt contaminani normali (Bacillus, corineformi) SCN Daca examenul citochimic este normal. Observaii

LCR

S. pneumoniae/N. meningitidis: investigarea sistematic a rezistenei la penicilina G H. influenzae: investigarea producerii de lactamaze Efectuare de CMI la antibioticele utilizate pentru tratament.

Cateter

Urocultura

Dac numrul de colonii este 1000 UFC/ml (metoda Brun Buisson) sau 15 colonii (metoda Maki) Leucocituria 10000 UFC/ml i bacteriuria 100000 UFC/ml.

Dac numrul de colonii este < 1000 UFC/ml ( Brun Buisson) sau 15 colonii ( Maki) Dac leucocituria = 10000 UFC/ml i bacteriuria 1000 UFC/ml

Se realizeaz la: -pacienii imunodeprimai, dializai, diabetici, vrstnici, gravide, sau pacieni cu antecedente endoscopice sau chirurgicale pe cile urinare i leucociturie < 10000 i bacteriurie 100000 UFC/ml -la pacienii simptomatici i izolare de specii uropatogene sau pacienii cu antecedente de intervenii endoscopice si chirurgicale pe cile urinare sau nefropatii subiacente i leucociturie 10000/ml i bacteriurie 1000 i < 100000 UFC/ml.

Daca sunt mai mult de 3 specii bacteriene diferite.

Secreii naso-faringiene Puroi din otite i sinuzite S. pneumoniae, Haemophilus influenzae, S. aureus, Enterobacterii, Pseudomonas

Investigare de SAMR, Streptococ A la pacient alergic la penicilin. Prelevate din otite externe, puroi recoltat prin paracentez SCN

S.pneumoniae investigarea rezistenei la penicilin

174

Expectoraii

Secreii bronice Lichid bronho-alveolar Aspirate traheo-bronice Coprocultura

10000000 UFC/ml nr. leucocite >25/cmp numar celule bucale < 10/cmp (10x). specii patogene 1000 UFC /ml specii patogene 10000 UFC /ml specii patogene 10000 UFC /ml Speciile responsabile de gastroenterite. Toate speciile izolate 1000 UFC /ml. Biopsie cutanat, ari, dermatomiozite. Sistematic dac prelevarea este realizata chirurgical sau din situsuri profunde. In functie de examenul microscopic si de numarul UFC Cu prioritate pe speciile predominante. N. gonorrhoeae sistematic -in functie de examenul microscopic numarul UFC pentru alte specii. UFC >1000 /ml Ulcere corneene, conjunctivite, endoftalmii.

Specii comensale sau patogene <10000000 UFC/ml <1000 UFC /ml <10000 UFC /ml <10000 UFC /ml Speciile comensale

Idem H. influenzae ( lactamaz) Idem Idem Interes epidemiologic n special

Coprocultura cantitativ la pacieni neutropenici Prelevate cutanate (panariii, arsuri, ulcere varicoase, escare) Prelevate osteoarticulare Lichide de punctie (ascite, pleural) Colecii inchise (abcese craniene pulmonare) Prelevate genitale

Escare profunde, chirurgical

prelevare Conservarea timp de 1an tulpinilor

Fara antibiograma la orificii i fistule. Speciile comensale corinebacterii). (SCN,

Se determin CMI Pentru antibioticele R

Gardnerella

Sperme Prelevate oculare

Speciile comensale

Tabelul 33. Ageni antimicrobieni de prima alegere pentru tratamentul infeciilor cu bacterii patogene antibiorezistente (dup Jehl i colab., 2004) Antibiotice alternative dac organismul este rezistent la medicamentul indicat Staphylococcus aureus Cloxacilina sau meticilina Vancomicina Streptococcus pneumoniae Penicilina Cefotaxima, ceftriaxon sau vancomicina * Haemophilus influenzae Ampicilina Cefalosporine de generatia III, eritromicina, TMP/SMX, Cefaclor , Amoxicilina/clavulanat, Claritromicina Enterococcus fecalis Ampicilina si gentamicina Vancomicina Moraxella catarrhalis Ampicilina La fel ca si pentru H. influenzae Mycobacterium tuberculosis Izoniazida (n combinatie cu rifamfin i alte medicamente) O combinatie de 3-6 medicamente la care organismul este susceptibil ) Specii de Shigella Ampicilina sau TMP/SMX Cefixim, ceftriaxon, cefotaxim, ciprofloxacin Specii de Salmonella Ampicilina TMP/SMX, cloramfenicol, ceftriaxon ) Pseudomonas aeruginosa Ticarcilin si tobramicina Ceftazidim, cefoperazon, quinolone , imipenem * Alegerea este determinata de localizarea infectiei si de rezul tatele antibiogramei; terapie orale; Trimetoprim/sulfametoxazol (TMP/SMX); ) Sau alt cefalosporin oral de a doua sau a treia generaie; A nu se folosi in cazul copiilor Bacterii patogene Antibioticul indicat pentru organismul susceptibil

175

Bibliografie selectiv
1. Catlin, B. W., lodometric detection of Haemophilus influenzae beta-lactamase: rapid presumptive test for ampicillin esistance, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1975, 7:265-270. 2. Chopra I., Linton A., The antibacterial effects of low concentrations of antibiotics, Advances in Microbial Physiology. 1986, 28:211259. 3. Codi I., The genus Staphylococcus, Bacteriology, Virusology, Parazitology and Epidemiology. 1993, 38(3-4):5-33. 4. Codi I., (coordonator), Mazilu M., Mihai., Israil A.M., Ungureanu V., Tatu Chitoiu D., Petrescu A.M., Popa M., Balotescu C., Chersulik E., Lixandru B., Pan M., Ghit M., 2007, Ghid national pentru aplicarea procedurii de testare a sensibilitatii la antibiotice conform standardului CLSI/NCCLS, Editura Universitara Carol Davila, Bucuresti (ISBN:978-973-708-210-7) 5. Courvalin P., Jarlier C., Transposable multiple antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae, Molecular and General Genetics. 1986, 205(2):291297. 6. Duma R. J., Kunz L. J.,. Penicillinase production n the evaluation of disk sensitivity testing of staphylococci to penicillin, American Journal of Clinical Pathology. 1970, 53:865-870. 7. Lowy F.D., Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus, The Journal of Clinical Investigation. 2003, 111:1265-1273. 8. Hiramatsu K., Aritaka N., Hanaki H., Kawasaki S., Hosoda Y., Hori S., Fukuchi Y., Kobayashi I., Dissemination in Japanese hospitals of strains of Staphylococcus aureus heterogeneously resistant to vancomycin. The Lancet Infectious Diseases. 1997, 350:1670-1673. 9. Horodniceanu T., Bouanchaud D.H.., Bieth G., Chabbert Y.A., R Plasmids in Streptococcus agalactiae (Group B), Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1976, 10(5):795801. 10. Iaconis JP, Sanders CC. Purification and characterization of inducible beta-lactamases in Aeromonas spp. Antimicrob Agents Chemother. 1990, 34 (1):4451 11. James H., Jorgensen J., Lee C., Gary A. A., Rapid Penicillinase Paper Strip Test for Detection of BetaLactamase-Producing Haemophilus influenzae and Neisseria gonorrhoeae, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1977, 11(6): 10871088. 12. Jarlier V., Nicolas M.H., Fournier G., Philippon A., Extended broad-spectrum beta-lactamases conferring transferable resistance to newer beta-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns, Reviews of Infectious Diseases. 1988, 10(4):867878. 13. Jehl, F., Chomarat M. Weber M., Alain, G. De l'antibiogramme la prescription. BIOMRIEUX, 2004 14. Jorgensen J., Lee J.C. Alexander G.A., Rapid Penicillinase Paper Strip Test for Detection of BetaLactamase-Producing Haemophilus influenzae and Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents Chemother. 1977, 11(6): 1087-1088 15. Kernodle D.S., Zygmunt D.J., McGraw P.A., Chipley J.R., Purification of Staphylococcus aureus betalactamases by using sequential cation-exchange and affinity chromatography , Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1990, 34(11):21772183. 16. Kernodle S.J., Improving Health Care with Clinical Practice Guidelines and Critical Pathways: Implications for Pharmacists in Ambulatory Practice, Pharmacy Practice Management Quarterly. 1997; 17(3): 76-89. 17. Lambert T., Gerbaud G., Galimand M., Courvalin P., Characterization of Acinetobacter haemolyticus aac(6')-Ig gene encoding an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase which modifies amikacin, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993, 37(10): 2093-2100. 18. Lambert T., Gerbaud G., Galimand M., Courvalin P., Characterization of Acinetobacter haemolyticus aac(6~-1g gene encoding an aminoglycoside 6'- N-acetyltransf e rase wich modifies amikacin, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993, 37: 2093-2100. 19. Leclercq B., Genetic selection of meat-type chickens for high or low abdominal fat content, In : B. Leclercq and C.C. Whitehead (eds), Leanness in domestic birds, 1993, p:25-40. Butterworth, London. 20. Leclercq B.,. Possibilits d'obtention et des gnotypes maigres en aviculture . INRA Productionm Animal. 1989, 2 : 275-286. 21. Leclercq R., Dutka-Malen S., Duval J., Courvalin P., The vancomycin resistance gene vanC is specific of Enterococcus gallinarum. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1992, 36 : 2005-2008. 22. Livermore D.M., Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clinical Microbiology Reviews. 1995, 8: 557-584.

176

23. M'Zali, F. H., Chanawong A., Kerr K. G., Birkenhead D., Hawkey P. M., Detection of extendedspectrum -lactamases in members of the family Enterobacteriaceae: comparison of the MAST DD test, the double disc and the Etest ESBL. J. Antimicrob. Chemother. 2000, 45: 881-885 24. National Committee for Clinical Laboratory Standards Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents. Document M 26-A. NCCLS, Wayne PA. 1998. 25. National Committee for Clinical Laboratory Standards: Methods for dilution antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically. Document M7-A5. NCCLS, Wayne, PA, 2000. 26. National Committee for Clinical Laboratory Standards: Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. Document M2-A/. NCCLS, Wayne, PA, 2000. 27. O' Callaghan C. H., Morris A., Kirby S. M., Shingler A. H., Novel method for detection of P-lactamase by using a chromogenic cephalosporin substrate . Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1972, 1:283-288. 28. Pepper K., de Cespds G., Horaud T., Heterogeneity of chromosomal genes encoding chloramphenicol resistance in streptococci, Plasmid. 1988, 19(1):7174. 29. Pepper K., Horaud T., Le Bougunec C., de Cespds G., Location of antibiotic resistance markers in clinical isolates of Enterococcus faecalis with similar antibiotypes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1987, 31(9):13941402. 30. Pepper K., Le Bougunec C., de Cespds G., Horaud T., Dispersal of a plasmid-borne chloramphenicol resistance gene in streptococcal and enterococcal plasmids , Plasmid. 1986, 6(3):195 203. 31. Sanders, C. C., Sanders, W. E. Jr.. Type I beta-lactamases of gram-negative bacteria: interactions with beta-lactam antibiotics. J Infect. Dis. 1986, 154 :792-800 32. Shah P.M., Isaacs R.D., Ertapenem, the first of a new group of carbapenems. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2003, 52: 538-542 33. Strachounski L. S., Andreeva I. V.,. Ratchina S. A, Galkin D. V., Petrotchenkova N. A., Demin A. A., Kuzin V. B., Kusnetsova S. T., Likhatcheva R. Y., Nedogoda S. V., Ortenberg E. A., Belikov A. S., Toropova I. A., The Inventory of Antibiotics in Russian Home Medicine Cabinets, Clinical Infectious Diseases. 2003, 37: 498505 34. Trieu-Cuot P., G. de Cespds, Bentorcha F., Delbos F., Gaspar E., Horaud T., Study of heterogeneity of chloramphenicol acetyltransferase (CAT) genes in streptococci and enterococci by polymerase chain reaction: characterization of a new CAT determinant, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993, 37(12): 25932598. 35. Trieu-Cout P., Carlier C., Poyart-Salmeron C., Courvalin P., Shuttle vectors containing a multiple cloning site and a lacZ gene for conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to gram-positive bacteria, Gene 1991, 02:99-104. 36. Walsh T. R., Howe R. A., The prevalence and mechanisms of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus. Annual Review of Microbiology. 2002, 56:657-675. 37. Zilhao R., Papadopoulou B., Courvalin P., Occurrence of the Campylobacter resistance gene tetO in Enterococcus and Streptococcus spp., Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1988, 32(12):1793 1796. 38. www.gold.aecom.yu.edu/id/micro/pneumococcus.htm 39. www.microbes-edu.org/.../bla/generalites.html 40. www.seimc.org/protocolos/microbiologia/cap12.htm

177

Capitolul 7 INTERACIUNILE FARMACOLOGICE ALE ANTIBIOTICELOR

Interaciunile antibioticelor pot fi mprite n dou categorii: - interaciuni fizico-chimice care se produc n afara organismului, nainte de de administrare; - interaciuni care au loc in vivo. Din prima categorie sunt cunoscute interaciunile meticilin + kanamicin sau ampicilin + gentamicin. In 2 ore, ampicilina pierde 50% din activitate, n amestecul cu gentamicina. Utilizarea unor antibiotice asociate este o practic obinuit n clinic, n special pentru tratamentul infeciilor grave. Asociaia a fost empiric sau s-a bazat pe aciunea lor complementar. Diseminarea determinanilor de rezisten face necesar nelegerea bazelor moleculare ale administrrii asociate a antibioticelor n vederea alegerii optime a asocierilor cu aciune sinergic i n egal msur, pentru evitarea antagonismului. Asociaiile de antibiotice se folosesc frecvent n clinic, pentru urmtoarele scopuri: - n majoritatea cazurilor, asociaia se administreaz pentru a obine un spectru mai larg de activitate sau n scopul ntrzierii emergenei subpopulaiilor rezistente la medicament; - administrarea unor antibiotice cu spectru larg de activitate este obligatorie pentru terapia pacienilor n pericol (pacienii neutropenici febrili infectai cu bacili Gram negativi), sau cnd se suspecteaz o infecie combinat, polimicrobian, cu bacterii aerobe sau anaerobe; - pentru creterea activitii antibacteriene (sinergism); - pentru utilizarea unor doze mai mici ale unor antibiotice toxice. Tratamentul combinat se impune, pentru tratamentul infeciilor al cror agent declanator nu se cunoate. Folosirea a dou sau mai multe medicamente pentru prevenirea emergenei rezistenei este eficient pentru tratamentul tuberculozei i pentru terapia unor infecii cronice. Utilizarea asocierilor sinergice este mai complex. Sinergia se produce atunci cnd asocierea a dou medicamente produce inhibiia sau moartea agentului infecios, la concentraii de 4 ori mai mici dect n cazul administrrii separate a fiecrui medicament.

7.1. Sinergismul
Uneori, antibioticele produse de diferitele specii ale unui grup au aciune sinergic: de exemplu, streptograminele sunt perechi de antibiotice nenrudite structural, care inhib sinteza proteinelor ribosomale la treapta transferului peptidil. Streptograminele de tip A se sintetizeaz pe calea poliketidelor (peptide neribosomale), iar streptograminele de tip B sunt depsipeptide sintetizate neribosomal, care conin civa aminoacizi neproteici. Depsipeptidele sunt compui naturali sau sintetici cu secvene de aminoacizi (ENH2) i hidroxicarboxilici (E-OH), care de obicei alterneaz, ns nu n succesiune regulat:

Totdeauna organismele productoare sintetizeaz ambele streptogramine. Streptograminele A sau B, singure, sunt bacteriostatice, n timp ce asocierea lor este bactericid. Creterea eficienei antibacteriene se datoreaz legrii sinergice a streptograminelor A i B, la situsuri distincte pe ribosom. Legarea streptograminei A la ribosom, mrete afinitatea de legare pe ribosom a streptograminei B, de circa 40 de ori, fcnd ca legarea ambelor antibiotice s fie ireversibil. Legarea antibioticului de tip A, probabil schimb conformaia spaial a ARNr, determinnd expunerea unui situs de legare de nalt afinitate pentru antibioticul de tip B. Efectul sinergic al streptograminelor a fost exploatat clinic, sub forma unei combinaii de derivai semisintetici - pristinamicin IA i IIA cunoscui sub denumirea de synercid, utilizat pentru tratamentul infeciilor clinice cu rezisten multipl la medicamente (Challis, Hopwood, 2003). Studiile in vitro au artat c n prezena penicilinei, nglobarea intracelular a streptomicinei C14 de ctre Streptococcus faecalis, a crescut semnificativ, fa de nivelul nglobrii n absena F-lactamilor (Korzeniowski i colab., 1978). Alte antibiotice active fa de perete (vancomicina, bacitracina, cicloserina), care acioneaz la diferite trepte asupra sintezei peretelui celular bacterian i care au produs efectul sinergic optim (letal) n asociaie cu streptomicina, au ridicat nivelul de ncorporare al aminoglicozidului.

178

Administrarea asociat a antibioticelor prezint un interes clinic major. Un exemplu tipic n acest sens este administrarea asociat a inhibitorilor F -lactamazei, cu alte antibiotice (Bush, 1988). Antibioticul care leag enzima acioneaz ca inhibitor al enzimei. Sinteza F -lactamazei constituie un mecanism major al rezistenei fa de antibioticele F-lactamice la bacteriile Gram pozitive i Gram negative. Incercrile s-au fcut n sensul dezvoltrii de noi antibiotice F-lactamice, cu rezisten mai mare la hidroliza mediat de Flactamaze. Sinergismul prin combinaia ampicilin-cloxacilin s-a demonstrat i s-a folosit n tratamentul infeciilor tractului urinar cauzate de organisme productoare de F-lactamaze. Alt abordare a fost administrarea asociat a unui F -lactamic hidrolizabil, activ, un alt F -lactamic cu afinitate mai mare pentru enzim, cel de al doilea avnd rolul de inhibitor al enzimei. Inhibitori puternici ai diferitelor F -lactamaze produse de bacteriile Gram pozitive i Gram negative s-au dovedit a fi dou antibiotice naturale: acidul clavulanic (produs de Str. clavuligerus) i sulbactamul. Administrate separat, cele dou antibiotice au activitate antimicrobian limitat. Aceti compui acioneaz ca inactivatori ai enzimelor bacteriene: att enzima ct i antibioticul, dup ce interacioneaz, se inactiveaz reciproc. Asociaia clavulanatului de K cu amoxicilina, extinde spectrul acesteia fa de microorganismele productoare de Flactamaze: S. aureus, H. influenzae, Bacteroides fragilis, K. pneumoniae i alte enterobacterii. Asocierea antibioticelor F-lactamice i a inhibitorilor de F-lactamaz este eficient fa de bacteriile rezistente la F-lactami (Siami i colab., 2001). Efectul sinergic al asociaiei este reflectat de denumirea dat combinaiei acidului clavulanic cu meticilina: augmentin. Sulbactamul extinde spectrul ampicilinei, prin acelai mecanism ca i acidul clavulanic. Ampicilina i sulbactamul au fost legate chimic (sultamicilin) sub forma unui compus absorbit pe cale oral. Asocierea sintezei celor dou tipuri de antibiotice caracterizeaz unele microorganisme n mediile naturale: producerea cefamicinei (un antibiotic F-lactamic) i acidului clavulanic este constant. Nu exist productori cunoscui de acid clavulanic, care s nu produc cefamicine. Asociaia cloramfenicolului la concentraie mic, cu F-lactamii, este sinergic fa de 20% dintre tulpinile Gram negative rezistente la F -lactami prin hidroliza F-lactamazei.

7.2. Blocarea secvenial a cilor de sintez

Asociaia trimetoprimului cu sulfametoxazolul exemplific sinergismul care rezult din blocarea treptelor secveniale ale unei ci metabolice eseniale. Inhibiia dihidropteroat-sintetazei i dihidrofolat-reductazei, trepte n sinteza acidului folic, are ca rezultat sinergismul cu efect bactericid fa de multe tulpini bacteriene, a cror cretere este inbibat de cei doi compui chimici. Asociaia trimetoprim-sulfametoxazol poate fi o alternativ la vancomicin. Trimetoprim-sulfametoxazol, n asociaie cu rifampina au fost folosite pentru eradicarea strii de purttor nazal de Staphylococcus, rezistent, n epidemiile nosocomiale. Rifampina singur nu este folosit n acest scop, datorit emergenei tulpinilor rezistente. Sinergismul cu efect bactericid al asociaiei F -lactamilor (inhibitori ai treptelor tardive ale sintezei peptidoglicanului), cu fosfomicina (inhibitoare a unei trepte timpurii a sintezei peretelui celular) se explic prin blocajul succesiv al treptelor multiple ale unei ci metabolice. Antibioticele F-lactamice au afiniti prefereniale pentru inte specifice, reprezentate de proteinele care leag penicilina (PBP), localizate n membrana citoplasmatic. Demonstrarea interaciunii specifice cu PBP a dus la conceptul c asocierea antibioticelor cu afiniti complementare nalte poate produce efec te sinergice. Astfel, concentraiile bacteriostatice ale aztreonamului au devenit litice prin asocierea amidocilinei. Asociaiile F -lactamice pot s produc efecte antagoniste. Antagonismul unor F-lactami este frecvent semnalat: de exemplu, antagonismul ntre azlocilin i cefazolin se manifest fa de 16% dintre bacilii Gram negativi testai (Eliopoulos, 1988). Frecvena antagonismului variaz mult n funcie de metodele folosite in vitro, de combinaia de antibiotice i de speciile examinate. Spre deosebire de asociaiile F -lactami-aminoglicozide (streptomicina), al cror antagonism este bine cunoscut i semnalat n clinic, asociaia poate avea efect sinergic i bactericid pentru unele tulpini rezistente. Rezistena la aminoglicozide se produce n special, dup administrarea aminoglicozidelor ca ageni terapeutici unici, dar poate s apar chiar dup administrarea lor n asociaie cu F-lactamicele.

179

7.3. Efectele defavorabile ale administrrii antibioticelor

Cel mai direct i cel mai evident efect al administrrii prelungite pe cale oral a antibioticelor este disbioza intestinal. Microbiota intestinal ndeplinete mai multe funcii, avnd un rol esenial n stimularea dezvoltrii structurilor limfoide asociate tractului digestiv. La fel de important pentru organismul uman este sinteza vitaminei K. Vitaminele K exist sub dou forme naturale: vitamina K1 (filokinona), n esuturile vegetale i vitamina K2 (menaquinona), sintetizat de bacteriile intestinale. Celor dou forme naturale se adaug menadiona sintetic (vitamina K3).

Structura molecular a vitaminei K 2

Funcia major a vitaminei K n organismul uman este meninerea nivelului normal al proteinelor de coagulare sanguin: factorii II, VII, IX, X i proteinele C i S, sintetizate n ficat ca proteine precursoare inactive. Vitamina K se absoarbe la nivel intestinal numai n prezena srurilor biliare i a altor lipide, prin interaciunea cu chilomicronii. In consecin, maladiile de malabsorbie a lipidelor pot s aib ca rezultat deficiena vitaminei K. Forma sintetic K3 este hidrosolubil i se absoarbe independent de prezena lipidelor intestinale i a bilei. Deficiena K2 este rar, deoarece este sintetizat de bacterii. Tratamentul ndelungat cu antibiotice poate duce la deficiene ale vitaminei K la aduli. Intestinul nou-nscuilor este steril, astfel nct este posibil o deficien a vitaminei K, dac lipsete din diet. Simptomul primar al deficienei vitaminei K la copii este sindromul hemoragic. Agenii antimicrobieni pot avea efecte toxice directe, pot s interacioneze cu alte medicamente i si mreasc toxicitatea sau produc tulburri ale echilibrului microbiotei tractului digestiv i favorizeaz infeciile cu organisme care n mod normal sunt saprobionte i inofensive. Aproape toate antibioticele produc creterea numeric a celulelor de Cl. difficile, care secret o toxin ce determin tulburri diareice i chiar colit pseudomembranar. Alterarea echilibrului intestinal de ctre antibiotice, poate s duc la creterea populaiei de C. albicans n cavitatea bucal, vagin, tractul gastrointestinal. Unele antibiotice i ageni chimioterapeutici se metabolizeaz n ficat i produc leziuni ale acestuia, de exemplu, izoniazida, administrat pentru tratamentul tuberculozei, n timp ce aminoglicozidele pot s lezeze rinichiul. Toxicitatea neurologic este rar, dar aminoglicozidele pot produce tulburri funcionale ale aparatului auditiv sau vestibular, dac dozajul nu este monitorizat. Reaciile hematologice au un spectru larg de manifestri clinice. Agenii farmacologici, administrai n scop terapeutic sau diagnostic, pot cauza o varietate de dezordini imunitare, deoarece acioneaz ca haptene care se cupleaz cu diferite prote ine tisulare, conferindule imunogenitate. Legarea covalent a unui medicament ori a unui metabolit reactiv derivat prin metabolizarea lui, de o macromolecul, creeaz un conjugat hapten-macromolecul, inductoare a unui raspuns imun specific. Legarea covalent a celor dou molecule se numete haptenare. Se descriu dou tipuri de haptenare: - haptenarea direct a celulelor (a moleculelor membranare) i a moleculelor extracelulare, sub aciunea compuilor chimici cu reactivitate nativ (intrinsec). De exemplu, penicilinele de semisintez (benzilpenicilina, cefalosporinele), dar i alte medicamente se cupleaz cu diferite proteine serice, formnd conjugate cu funcie de alergene. Circa 10% din moleculele de penicilin injectat, se leag covalent prin gruparea NH2, de proteine plasmatice sau membranare. Celula poate lega mii de haptene beta lactamice, n cteva minute dup tratament. - haptenarea indirect a moleculelor membranare sau libere, cu derivaii rezultai din catabolizarea parial a unor molecule, care n stare nativ sunt puin reactive sau areactive. Metabolizarea are loc n hepatocite, cheratinocite (i n alte celule) i poate crea intermediari reactivi ce formeaz legturi covalente cu molecule carrier.

180

Uneori, catabolismul medicamentelor este concomitent cu sinteza proteic. Se produce haptenarea moleculelor n cursul sintezei (haptenare intern) i pot fi expuse ca antigene pe suprafaa celulei. Metaboliii reactivi pot fi secretai n spaiul extracelular i se leag cu proteine extracelulare. Unii indivizi sunt predispui la reaciile alergice fa de diverse medicamente, n special antiinfecioase. Dac un individ manifest fenomene alergice fa de un compus farmacologic, riscul alergiei fa de o alt clas de compui farmacologici crete de 9 ori. Circa 10% dintre aduli sunt alergici fa de o clas de compui i intr n categoria celor cu risc crescut fa de ali compui farmacologici. Reaciile de hipersensibilitate imediat de tip 1, induse de medicamente, se manifest variat: anafilaxie, urticarie, angioedem. Unele substane pot produce mai mult de un tip de reacie, la un organism sensibil. De exemplu, penicilina poate cauza o reacie anafilactic de tip I, o anemie hemolitic datorat reaciei citotoxice de tip II, dezordini funcionale de tip III cu complexe imune sau o reacie de hipersensibilitate ntrziat. Reaciile de hipersensibilitate de tip I apar, de cele mai multe ori, n esuturile bogate n mastocite: tegument, mucoase, mucoasa lingual, plmn, tractul gastrointestinal. Antibioticele -lactamice au proprieti de haptene i, la doze mari, penicilina sau gruparea peniciloil rezultat dup ruperea spontan a inelului -lactamic, formeaz legturi covalente cu proteinele. Gruparea peniciloil are reactivitate chimic crescut. Proteinele tisulare care leag moleculele -lactamice se modific. Conjugatul antibiotic-protein este inductor al sintezei IgM i IgG i rezultatul este hemoliza. Alte medicamente care genereaz reacii imunitare, n absena sintezei Ac sunt sulfonamidele. Metaboliii lor se leag preferenial cu enzimele care au citocromul P450. Proteina alterat genereaz un peptid care se asociaz cu complexul CMH al celulei, recunoscut de limfocitele T. Medicamentele se pot complexa cu proteine plasmatice i formeaz conjugate hapten -proteine, inductoare ale sintezei Ac specifici. Se formeaz CI, care se adsorb pe hematii i ulterior se produce liza. Un anumit medicament poate produce o varietate de fenomene patologice, la diferii pacieni: hemoliza, trombocitopenia, neutropenia sau combinaii ale acestor fenomene.

7.4. Ptrunderea antibioticelor n esuturi

Antibioticele administrate pe cale oral sau parenteral, prsesc patul vascular i intr n lichidul interstiial pe calea difuziei pasive prin spaiile dintre celulele endoteliului vascular. Din lichidul interstiial, antibioticele ptrund n esuturi n grade diferite. Gradul de ptrundere tisular condiioneaz eficiena clinic i potenialul toxic al agenilor antiinfecioi. Raportul concentraiei esut/ser a aminoglicozidelor i a Flactamilor este subunitar pentru cele mai multe situsuri, cu excepia organelor excretoare. Bacteriile care cauzeaz infecii tisulare sunt expuse la concentraii mai mici de antibiotice dect cele care se gsesc n acelai timp n snge. Este recunoscut c lichidul cefalorahidian i infeciile cavitare beneficiaz de concentraii mai mici dect cele din snge. Astfel se explic utilizarea dozelor mai mari de antibiotice pentru tratamentul infeciilor tisulare. Raportul subunitar al concentraiei antibioticului n compartimentele tisular i seric se datoreaz penetrrii extravasculare sczute ca rezultat al legrii medicamentului de proteinele sanguine. Faptul impune obligativitatea ca antibioticele cu afinitate nalt de legare de proteinele plasmatice s fie folosite n doze superioare pentru a fi la fel de eficiente ca acelea care au un nivel sczut de legare cu proteinele serice. Unele antibiotice au capacitatea de a se concentra la anumite situsuri tisulare din organism, ceea ce face ca ele s fie eficiente la doze inferioare. Concentraiile tisulare mari realizate la situsurile de concentrare pot determina efecte toxice: de exemplu, raportul mare al concentraiei prelungite esut/ser de aminoglicozide produce toxicitate renal. Concentraiile locale mari de aminoglicozide nu sunt totdeauna toxice, dar crete eficiena terapeutic fa de pielonefrit. Dat fiind corelaia n general pozitiv ntre concentraia tisular i eficiena terapeutic, n clinic s-a acceptat creterea dozajului F-lactamilor, iar pentru amioglicozide, dozele au fost limitate de toxicitate. Eficiena sczut a aminoglicozidelor fa de infeciile tisulare are alte explicaii: legarea de leucocite i de resturile necrotice la situs, antagonismul prin anaerobioza relativ i antagonismul cationilor metalici din urin. Cele mai multe infecii bacteriene se produc n spaiul extracelular sau interstiial. Bacteriile ader la suprafaa celulelor gazd sau de orice suprafa artificial pe care sunt disponibili nutrienii. Infecia produce leziuni ale esuturilor gazd prin intermediul metaboliilor, toxinelor sau a enzimelor bacteriene sau prin produsele reaciei inflamatorii ale gazdei, cum sunt enzimele lizosomale i factorul de necroz tisular (TNF). Pentru a fi eficiente n tratamentul infeciei, antibioticele trebuie s fie prezente n lichidul interstiial. Concentraia tisular eficient este corelat direct cu concentraia sanguin: s-a evideniat c concentraia minim eficient de penicilin, necesar pentru tratamentul infeciei cu S. aureus este aceiai cu concentraia

181

minim bactericid in vitro. Penicilina rmne n spaiul extracelular i este eficient pentru tratamentul infeciilor bacteriene cu localizare extracelular. Antibioticele care ptrund n celule sunt potenial utilizabile pentru tratatamentul infeciilor produse de microorganisme cu localizare intracelular: Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocytogenes, S. aureus. Antibioticul trebuie s ptrund n celul (n fagocite) i s-i pstreze activitatea antibacterian n interiorul celulei (Labro, 2002). Clindamicina, eritromicina, rifampina i fluoroquinolonele ptrund n leucocitele polimorfonucleare. Eficiena lor antibacterian este diferit, datorit diferenelor de legare a antibioticelor de componentele structurale ale celulei. Antibioticul poate fi legat de membran, n citoplasm, de componentele nucleare sau este ncorporat n lizosomi. Msurarea concentraiei intracelulare a antibioticului se bazeaz pe evaluarea cantitii de medicament asociat celulei. Asocierea unei cantiti mari de antibiotic cu celula nu implic n mod obligatoriu prezena sa la situsul rezidenei agentului infecios intracelular. Legarea extensiv a antibioticului de componentele celulei, diminu activitatea sa antiinfecioas. Pe de alt parte, condiiile intracelulare nefavorabile (pH acid), pot modifica profilul activitii antibioticului n raport cu concentraia: aminoglicozidele, quinolonele i macrolidele sunt mai puin active la pH acid, iar la pH mic lizosomal sunt cel puin parial inactivate (Nix i colab., 1991). Pentru determinarea gradului n care antibioticele ptrund n esuturi s-au folosit mai multe metode. Un parametru esenial al evalurii nivelului n care antibioticul ptrunde n esuturi este specificitatea tisular, deoarece antibioticele nu se distribuie uniform n organism: de exemplu, un medicame nt se poate distribui ntr-o concentraie apropiat de cea seric n esutul muscular striat, dar concentraia sa n nevrax, plmn sau prostat poate fi mult sub nivelul concentraiei serice. Unele esuturi sau fluide se echilibreaz repede cu spaiul vascular, iar altele se echilibreaz lent i pot aciona ca situsuri de depozit pentru antibiotice: de exemplu, rinichiul pentru aminoglicozide i esutul osos pentru tetraciclin.esuturile cu echilibrare lent n raport cu sistemul vascular menin concentraii mari, mult timp dup ce concentraia sanguin a antibioticului scade spre valoarea 0. Alte situsuri cu rol de depozit sunt lichidul ascitic pentru cefalosporine i lichidul interstiial pentru aminoglicozide. Concentraia de antibiotic determinat ntr-un esut depinde de metoda de msurare. Evalurile sunt influenate de cantitatea de snge n proba tisular, de gradul de desicare a probei, de gradul de descompunere chimic a antibioticului n timpul prelucrrii etc. Proba trebuie recoltat dintr-un singur tip de esut i nu prin secionarea transversal a diferitelor straturi tisulare.esutul va fi excizat dup ncheierea fazei de distribuie a medicamentului (la 1-2 ore dup administrarea dozei) i dup ce a fost atins faza de echilibru dintre spaiul vascular i cel tisular. Condiiile tisulare mresc sau scad rata nglobrii antibioticului: reacia inflamatorie modific mediul fizico-chimic. In prostatita cronic, scderea pH local diminu penetrarea antibioticului. Modificrile permeabilitii vasculare influeneaz penetrarea i capacitatea antibioticului de a atinge situsurile infeciei. In cazul meningitei acute, creterea permeabilitii capilare determin creterea concentraiei unor antibiotice (de exemplu, F-lactami), n lichidul cefalorahidian (Darouiche i Hamill, 1994). Metoda veche folosit pentru determinarea penetrrii tisulare a unui medicament, presupune omogenizarea probei de esut i msurarea concentraiei de antibiotic. Recuperarea medicamentului n supernatant este influenat din cauza legrii sale de resturile celulare sau de pierderea medicamentului n timpul prelucrrii probei. Antibioticele sunt transportate n grade variate n diferite tipuri de celule ale unui esut i se leag cu afiniti diferite de componentele celulare. Metoda omogenizrii probei de esut sparge membranele celulare i rezult o suspensie care conine lichidul intracelular, extracelular i compentele particulate ale celulei. Sngele din vasele esuturilor reprezint 3-6% din greutatea majoritii probelor i este ncorporat n omogenatul tisular. De aceea, trebuie estimat concentraia de antibiotic asociat eritrocitelor. Prezena sngelui n proba tisular nu determin erori importante n estimarea cantitativ a F -lactamilor, tetraciclinei sau aminoglicozidelor (Roberts i colab., 1979). Dintre medicamentele folosite n mod curent, sulfonamidele, iar dintre cele noi, ribavirina, se concentreaz n eritrocite. Contaminarea cu snge influeneaz semnificativ rezultatele analizei medicamentelor care au afinitate mare pentru eritrocite. Pentru medicamentele care se distribuie n mod egal n plasm, celulele tisulare i eritrocite (tetraciclina, cloramfenicolul, unii F -lactami), contaminarea cu snge nu este o surs important de erori. Concentraia tisular a antibioticului se exprim m Qg/gram de esut. Aminoglicozidele, F -lactamii i quinolonele au fost studiate n ceea ce privete gradul de ptrundere tisular, prin metoda omogenizrii tisulare. Beta-lactamii sunt exclui din cele mai multe tipuri de celule. Ele ptrund n celule numai prin intermediul unui sistem membranar de transport: de exemplu, cefalosporina este transportat n esutul renal. Concentraia acestor antibiotice se echilibreaz n tot lichidul interstiial. Dup o singur doz, aminoglicozidele se aseamn cu F-lactamii: nu ptrund n celule, iar n lichidul interstiial concentraia este asemntoare cu cea plasmatic. Dup doze multiple, aminoglicozidele se acumuleaz lent n interiorul celulei. Transportul intracelular al acestor antibiotice este un proces lent, datorit permeabilitii

182

sczute a membranei i este unidirecional, datorit legturii cu afinitate nalt care se formeaz cu mitocondriile i cu lizosomii. Aminoglicozidele translocate n celule sunt legate ferm i devin inactive fa de agenii infecioi. Ele sunt n mic msur utile pentru tratamentul agenilor patogeni cu localizare intracelular. In esuturi (muchi, ficat), raportul concentraiei aminoglicozidelor tisulare/serice este 2, dar se concentreaz n rinichi, n proporie de 200/1. Mecanismul nglobrii n celulele renale probabil este acelai ca i n celelalte organe, dar rata nglobrii n esutul renal este mult mai nalt. Concentraiile intracelulare mari duc la concluzia c antibioticele reacioneaz cu fosfolipidele, rezultatul fiind nefrotoxicitatea, factorul major al limitrii dozelor. Quinolonele se acumuleaz n interiorul celulei, n concentraii mai mari dect cele serice i rezult concentraii relativ nalte n omogenatele tisulare. Cel puin 60% din doza de quinolone este legat n interiorul celulelor. Legarea intracelular a quinolonelor are aviditate mai mare i se concentreaz la un nivel superior, dar este uor reversibil i din aceast cauz au un timp de njumtire de 10 ori mai scurt )Wolfson i Hooper, 1989). Distribuia intracelular a quinolonelor este avantajoas pentru tratamentul infeciilor intracelulare, deoarece aminoglicozidele i F-lactamii sunt excluse din situsurile de infecie intracelular. Quinolonele sechestrate n celule constituie un rezervor prin care se prelungete expunerea bacteriilor n compartimentul extracelular. Vancomicina i teicoplanina ptrund n cele mai multe tipuri de celule i se concentreaz n rinichi. Raportul normal al concentraiei tisulare/seric este aproximativ 1. Ambele, dar n special teicoplanina, se leag de esuturi i se acumuleaz prin dozare multipl, asemntor aminoglicozidelor (Tuazon i Miller, 1984). Vancomicina i teicoplanina sunt molecule mari i se elimin numai prin filtrare glomerular. Cloramfenicolul, rifampina i macrolidele, ca eritromicina i azitromicina se comport asemntor quinolonelor. Ele ptrund reversibil n celule, dar spre deosebire de quinolone, sunt metabolizate nt r-o proporie important. Colistina, polimixina i amfotericina manifest o cinetic a legrii tisulare i o toxicologie asemntoare aminoglicozidelor. Ele intr lent n celule, dar afinitatea nalt de legare intracelular face ca intervalul de njumtire s fie mai mare. Unele bacterii sunt fagocitate i persist n macrofage sau n leucocite, dar de cele mai multe ori infeciile tisulare rezid n special n spaiul tisular extracelular. F-lactamii i aminoglicozidele sunt excluse din celulele intacte i rmn n snge i n lichidul interstiial. In unele situsuri, concentraia antibioticului nu se supune principiului difuziei libere: urina, secreia biliar. Concentraia antibioticelor este determinat de transportul activ. Alte situsuri umoarea apoas sau lichidul cefalorahidian, au bariere de permeabilitate. In general, cele 3 clase de antibiotice (F -lactami, aminoglicozide, quinolone) se acumuleaz n urin i toate sunt eliminate prin filtrare glomerular i/ sau secreie tubular renal. Unele antibiotice F-lactamice sunt concentrate n secreia biliar. S-au demonstrat corelaii directe ntre concentraiile serice ale antibioticelor (aminoglicozide, Flactami i quinolone) i eficiena fa de infeciile tisulare. La unele antibiotice, raportul este independent de gradul de legare de proteinele serice. Efectele primare ale legrii de proteine sunt ncetinirea excreiei i reducerea volumului de distribuie tisular. Legarea antibioticelor de proteinele serice este un parametru important care condiioneaz activitatea lor antiinfecioas. Concentraia seric a antibioticelor este rezultatul net al legrii att de proteinele serice, ct i de esuturi. Principalul suport molecular al legrii antibioticelor este albumina sanguin i extravascular. Dei aminoglicozidele sunt legate n proporie neglijabil de proteinele serice, legarea poate fi ntrerupt de concentraiile mari de cationi bivaleni. Cationii bivaleni au efect antagonic fa de activitatea lor antibacterian. Quinolonele se leag n proporie de pn la 40% de proteinele serice, iar pentru antibioticele Flactamice, legarea de proteinele serice este foarte semnificativ. Biofilmul este o populaie de celule care crete pe o suprafa i sunt incluse ntr-o matrice polizaharidic (Costerton, 1999). Infeciile organizate n biofilme sunt greu de eradicat i sunt sursa infeciilor rezistente. Biofilmele se formeaz in vivo, ca rezultat al aderenei microorganismelor de un substrat anatomic i sunt specifice infeciilor bacteriene i cu Candida albicans. Biofilmele sunt cu greu eradicate prin aciunea bactericid a substanelor antimicrobiene. Substanele antimicrobiene difuzeaz n biofilm i inhib creterea sa. Majoritatea celulelor sunt supuse aciunii 00cide a agenilor antimicrobieni, dar o mic proporie rmn viabile (Donlan i Costerton, 2002). Cauzele rezistenei biofilmelor. Factorii determinani ai rezistenei biofilmelor sunt : penetrarea limitat a substanelor antimicrobiene n biofilm, rata sczut de cretere a populaiei bacteriene i posibila expresie a genelor de rezisten.

183

Penetrarea antibioticelor n biofilm este limitat, deoarece celulele sunt incluse ntr-o matrice exopolizaharidic, ce poate s limiteze difuzia substanelor i chiar s le lege. Bariera de difuzie este eficient fa de moleculele proteice mari, aa cum sunt lizozimul i proteinele complementului, sau fa de peptidele antimicrobiene din categoria defensinelor. Exopolizaharidele ncrcate cu o sarcin electric negativ sunt foarte eficiente ca barier protectoare fa de antibioticele aminoglicozidice ncrcate pozitiv. Difuzia restrictiv poate limita penetrarea unui agent antimicrobian degradabil sub aciunea unor enzime hidrolitice de tipul F-lactamazelor. Efectul sinergic al difuziei lente i al inactivrii enzimatice ofer rezisten eficient biofilmelor cu Ps. aeruginosa. Inactivarea sau modificarea antibioticului (acetilarea aminoglicozidelor), asociat cu bariera de difuzie n biofilm creeaz condiii de protecie a bacteriilor biofilmului: bariera polizaharidic de difuzie protejeaz celulele biofilmului de aciunea H2O2. Astfel, celulele planctonice de Ps. aeruginosa sunt mult mai sensibile dect cele din biofilm, dei acestea produc cantiti mai mici de catalaz, iar rezistena biofilmului la cloramfenicol se datoreaz att unei rate de difuzie lent ct i inactivrii enzimatice sub aciunea cloramfenicol acetil-transferazei (CAT). Experimental, s-a demonstrat c n cele mai multe cazuri care implic molecule antimicrobiene mici, bariera polizaharidic nu ofer o protecie efectiv, ci doar ntrzie moartea celulei. Cele mai eficiente sunt fluoroquinolonele, deoarece difuzeaz uor n biofilm i stopeaz creterea celulelor (Rediske i colab., 1999). Bariera biofilmului i inactivarea enzimatic nu creeaz condiiile creterii celulelor, ci doar ale supravieuirii. Rata sczut de cretere a celulelor bacteriene este un factor favorizant al supravieuirii celulelor n biofilm, dup tratamentul cu antibiotice. Unele antibiotice i exercit efectul letal numai asupra celulelor care cresc. Penicilina i ampicilina nu sunt active fa de celulele care nu cresc. Cefalosporina, aminoglicozidele i fluoroquinolonele pot omor celulele care nu cresc, dar au un efect letal fa de celulele care se divid. Creterea lent este un factor major pentru creterea rezistenei celulelor planctonice staionare. Majoritatea celulelor dintr-un biofilm nu manifest o rezisten superioar celulelor planctonice i mor repede sub aciunea unui antibiotic bactericid. Aciunea substanelor antimicrobiene bactericide asupra celulelor planctonice i din biofilm, este bifazic. Intr-o prim etap se produce moartea majoritii celulelor. Populaia de celule persistente, restrns numeric, este rezistent la doza iniial, dar este sensibil la o doz superioar. Biofilmul produce mai multe celule persistente dect o populaie planctonic. Antibioticele inhibitoare ale creterii favorizeaz supravieuirea i persistena celulelor planctonice i din biofilm. Scderea ampl a numrului de celule, planctonice sau din biofilm, are efecte benefice: celulele persistente devin inta efectorilor imunitari i infecia este eradicat. Persistena celulelor bacteriene creeaz probleme clinice ample n cazul n care funcia imunitar nu coopereaz cu aciunea antibioticelor (fig. 55). De exemplu, Str. pneumoniae produce meningita rezistent datorit inaccesibilitii componentelor sistemului imunitar la lichidul cefalorahidian.

Figura 55. Ilustrarea schematic a mecanismului persistenei biofilmelor. Antibioticele sunt active asupra celulelor bacteriene planctonice (cercuri negre i albe) i ale biofilmului. In biofilm, celulele persistente (cercuri albe) sunt inaccesibile efectorilor imunitari i refac populaia biofilmului (original).

Compartimentul gastric este de asemenea, lipsit de factori imunitari i infeciile cu Helicobacter pylori, care produc ulcere peptice (ulcere care nu se datoreaz mediului acid), sunt foarte rezistente. Mediul gastric necesit sterilizare complet pentru a mpiedica recidiva.

184

Infeciile cu biofilme sunt, din punctul de vedere al inaccesibilitii efectorilor imunitari, asemntoare cu infeciile produse de celulele libere, n absena efectorilor imunitari, deoarece exopolimerul biofilmului protejeaz fizic celulele de accesul factorilor protectori. Dup prima doz a unui antibiotic bactericid, este eliminat cea mai mare parte a populaiei celulare. O proporie foarte mic a celulelor infecioase sunt persistente. Dac simptomele dispar odat cu eradicarea celulelor libere (planctonice) i terapia este oprit, celulele persistente vor reface populaia biofilmului, din care se vor desprinde noi celule planctonice. Aceast dinamic explic natura recurent (recidivant) a infeciei sub forma biofilmului i necesitatea unei terapii ndelungate cu antibiotice. Infeciile sub forma biofilmelor reprezint peste 60% din totalul infeciilor bacteriene, deoarece infeciile comune ale tractului urinar (cauzate de E. coli i de ali patogeni), infeciile de cateter (produse de S. aureus i ali patogeni Gram pozitivi), infeciile urechii medii la copii (produse de H. influenzae), formarea plcii dentare i gingivita, toate cauzate de biofilme, sunt greu de tratat i adeseori recurente. Alte infecii de biofilm produc morbiditate i mortalitate: endocardita cauzat de S. aureus, infeciile implantelor permanente (protezele articulare i valvele cardiace, produse de S. aureus) i infeciile pacienilor cu fibroz chistic, produse de Ps. aeruginosa). Incidena celulelor persistente dup aciunea antibioticelor este de circa 10-6. Bigger (1944) citat de Olson i colab., 2002) a explicat persistena bacterian prin dou ipoteze: a) celulele persistente au o rezisten mai mare la antibiotic; b) celulele persistente au acelai grad de sensibilitate ca i masa celular a biofilmului, dar se gsesc ntr-o stare fiziologic n care efectul bactericid al antibioticului nu se produce. Dup reluarea creterii, celulele persistente refac populaia, care nu se distinge de cea original n ceea ce privete sensibilitatea la antibiotic. Factorii care favorizeaz persistena nu se cunosc, dar sunt celule importante, deoarece au rol esenial n supravieuirea populaiei celulare. Celulele persistente nu sunt mutante, ci sunt celule comune ale biofilmului, care, prin mecanisme necunoscute, depesc faza critic a efectului bactericid. O explicaie nou a persistenei este derivat din studiile referitoare la moartea programat a celulei eucariote. Celulele bacteriene care sufer efecte grave ale aciunii factorilor bactericizi, ar activa programul morii celulare. Raionamentul este acelai cu cel formulat pentru moartea celulelor eucariote. De cele mai multe ori, moartea celular este rezultatul apoptozei, indus de leziunile provocate de factori toxici. Antibioticele bactericide nu ar produce moartea celular, ci numai leziuni d eclanatoare ale sinuciderii. Comunitatea biofilmului se aseamn cu un organism multicelular, deoarece manifest unele trsturi funcionale care sugereaz un grad redus de integrare funcional. Biofilmul ar beneficia din moartea apoptotic a celulelor lezate, asemenea unui organism pluricelular. Antibioticul difuzeaz uniform n masa biofilmului i tinde s lezeze toate celulele, riscul fiind dispariia asociaiei. Celulele persistente ar fi acelea care nu activeaz programul morii i supravieuiesc dup ce antibioticul atinge ntreaga populaie celular. Pentru eradicarea biofilmelor, asocierea rifampicinei i minociclinei este foarte eficient i reduce probabilitatea colonizrii bacteriene. ncorporarea profilactic a antibioticului n materialul cateterelor va mpiedica bacteriile rezistente s colonizeze cateterele impregnate. Metoda se poate aplica pentru cateterele pe termen scurt, dar nu poate fi la fel de eficient pentru articulaiile artificiale sau pentru valvele cardiace.

Bibliografie selectiv
1. Bush K., Beta-lactamase inhibitors from laboratory to clinic, Clinical Microbiology Reviews. 1988, 1(1): 109-123. 2. Challis G.L., Hopwood D.A., Synergy and contingency as driving forces for the evolution of multiple secondary metabolite production by Streptomyces species, Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100:1455514561 Suppl 2 3. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P., Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections, Science. 1999, 284:318322. 4. Darouiche R.O., Hamill R.J., Antibiotic penetration of and bactericidal activity within endothelial cells, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1994, 38(5): 1059-1064. 5. Donlan R.M., Costerton J.W., Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.Clinical Microbiology Reviews. 2002, 15(2): 167-193. 6. Eliopoulos G.M., Eliopoulos C.T., Antibiotic combinations: should they be tested?, Clinical Microbiology Reviews. 1988, 1(2): 139-156. 7. Eliopoulos G.M., Wennersten C., Zighelboim-Daum S., Reiszner E., Goldmann D., Moellering R.C. Jr., High-level resistance to gentamicin in clinical isolates of Streptococcus (Enterococcus) faecium, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1988, 32(10): 1528-1532.

185

8. Korzeniowski O.M., Wennersten C., Moellering R.C. Jr., Sande M.A., Penicillin-netilmicin synergism against Streptococcus faecalis, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1978, 13(3): 430-434. 9. Labro M.T., Interference of Antibacterial Agents with Phagocyte Functions: Immunomodulation or Immuno-Fairy Tales?, Clinical Microbiology Reviews. 2000, 13(4): 615-650. 10. Nix D., Goodwin D., Peloquin C.A., Rotella D.L., Schentag J.J., Antibiotic tissue penetration and its relevance: model of tissue penetration and their meaning, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1991, 35(10): 1947-1952. 11. Olson M.E., Ceri H., Morck D.W., Buret A.G., Read R.R.., Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics, Canadian Journal of Veterinary Research. 2002, 66(2): 8692. 12. Rediske A.M., Roeder B.L., Brown M.K., Nelson J.L., Robison R.L., Draper D.O., Schaalje G.B., Robison R.A., Pitt W.G., Ultrasonic Enhancement of Antibiotic Action on Escherichia coli Biofilms: an In Vivo Model, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1999, 43(5): 1211-1214. 13. Roberts T.L. 3rd, Futrell J.W., Sande M.A., Antibiotic penetration into normal and inflamed tissues as reflected by peripheral lymph, Annals of Surgery. 1979, 189(4): 395-403. 14. Siami G., Christou N., Eiseman I., Tack K.J., the Clinafloxacin Severe Skin And Soft Tissue Infections Study Group, Clinafloxacin versus Piperacillin-Tazobactam in Treatment of Patients with Severe Skin and Soft Tissue Infections, Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2001, 45(2): 525-531. 15. Tuazon C.U., Miller H., Comparative in vitro activities of teichomycin and vancomycin alone and in combination with rifampin and aminoglycosides against staphylococci and enterococci , Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1984, 25(4): 411-412. 16. Wolfson J.S., Hooper D.C., Fluoroquinolone antimicrobial agents, Clinical Microbiology Reviews. 1989, (4): 378-424.

186

Capitolul 8 SUBSTANE NATURALE CU ACTIVITATE IMUNOSUPRESOARE

In perioada timpurie a transplantrii, imunosupresia s-a limitat la tratamentul combinat cu azatioprin i corticosteroizi. Eficiena lor este limitat, neselectiv i produc numeroase efecte secundare. Progresele biologiei celulare cu privire la mecanismele propagrii semnalelor intracelulare, precum i studiul chimiei unor compui naturali a evideniat faptul c multe produse sintetizate de diferite organisme au afinitate nalt pentru proteinele celulare care au funcia de transductori ai semnalului. Un grup de compui naturali care interfer cu semnalizarea intracelular sunt agenii cu efect imunosupresor: ciclosporina A, FK506 (tacrolimus) i rapamicina (sirolimus). Cei 3 compui suprim rspunsul imun, deoarece blocheaz activarea limfocitelor T i de aceea sunt folosite n clinic pentru a preveni respingerea grefelor de organe.

8.1. Ciclosporina
Ciclosporina A este un antibiotic descoperit n 1971, sintetizat de fungii filamentoi Tolypocladium inflatum, n cultur submers, de unde se extrage cu solveni organici. Este bogat n aminoacizi hidrofobi, neutri, insolubil n n-hexan i ap, dar foarte solubil n toi ceilali solveni organici.Iniial, antibioticul a fost investigat pentru proprietile antifungice, dar spectrul activitii sale este foarte ngust, ceea ce a determinat renunarea la utilizarea n clinic. Aciunea sa inhibitorie, in vitro, s-a demonstrat pentru Neurospora crassa, Rhodotorula rubra. Ciclosporina este un peptid ciclic lipofil, rezultat prin condensarea a 11 aminoacizi.

Mecanismul de aciune Mecanismul aciunii antifungice se datoreaz inhibiiei sintezei peretelui celular, n special blocrii sintezei chitinei. Un alt antibiotic blocant al sintezei chitinei polioxina are un spectru de aciune la fel de ngust. Ciclosporina inhib selectiv proliferarea limfocitelor, dar, spre deosebire de alte citostatice, nu modific rata diviziunii altor celule somatice (Fruman i colab., 1992). In vitro, ciclosporina este de 300 de ori mai activ ca inhibitor al celulelor limfoide splenice, dect al celulelor mastocitoma (nelimfoide). Dozele mari, administrate experimental timp de 13 sptmni la obolan, produc toxicitate renal i hepatic. Nefrotoxicitatea este asociat cu depozite mucoide n arteriole, fibroz focal stimulat de vasoconstricie.

Structura molecular a ciclosporinei

Ciclosporina a fost primul medicament imunosupresor, care a permis imunomodularea selectiv a celulelor T, n condiiile unui grad moderat de toxicitate i a schimbat perspectiva transplantului de organe: a sczut morbiditatea i a permis transplantul de rutin. n prezent, se folosete pentru prevenirea respingerii grefelor de rinichi, ficat, cord, plmn i a transplantului combinat cord-plmn. Majoritatea pacienilor cu transplant necesit tratamentul pe termen lung, cu doze mari de imunosupresor, care cresc sensibilita tea la infecii i maligniti, permind ns supravieuirea pacienilor transplantai, timp de ani de zile. Ciclosporina 2+ acioneaz specific asupra limfocitelor, inhibnd transcrierea genic pe o cale dependent de Ca , adic blocheaz progresia ciclului celular de la G0 la G1 , prin legarea cu mare afinitate de o ciclofilin, protein celular ubicvitar. Complexul ciclosporin-ciclofilin leag i blocheaz funcia enzimatic a calcineurinei, o fosfataz, care are rolul de a defosforila un component citoplasmatic al factorului nuclear al celulelor T

187

activate (NF-ATc) (June i colab., 1987; Marchetti i colab., 2000). Factorul nuclear al limfocitelor B activate este un mesager activator comun al transcrierii n celulele eucariote, denumit NF-kB, fiind descris (n 1986) ca un factor nuclear necesar transcrierii catenei k a imunoglobulinelor n limfocitele B i de aici denumirea de nuclear factor k al celulelor B. In celulele B mature, NF-kB este localizat n nucleu, unde se leag de o secven de 10 pb a genei codificatoare a catenei k i activeaz transcrierea. NF-kB preexist n citoplasm ntr-o form inactiv, legat de un inhibitor (IkB). Dup primirea unui semnal, factorul NF-kB este eliberat din asociaia cu IkB i transferat spre nucleu, unde activeaz transcrierea genei specifice. Deoarece se activeaz numai ca rspuns la un stimul, are statutul funcional de factor inductibil. Pentru activarea sa, nu necesit sintez proteic i permite transmiterea rapid a semnalului. NF-kB realizeaz comunicarea ntre citoplasm i nucleu i transmite mesajul direct la gena int. Toate genele care rspund la NF-kB au n comun faptul c amplific rspunsul imun.Nf-kB este mediatorul care semnaleaz activarea celulelor limfoide ca rspuns la numeroase citochine produse de celulele imunitare : IL-2, IL-1, IL-6, IL-8, TNF, interferoni etc. Consecina inactivrii calcineurinei este meninerea strii fosforilate al NF-ATc. Astfel, transferul n nucleu al componentei citoplasmatice a factorului NF-ATc este blocat i factorul nuclear (NF-ATn) nu se mai formeaz (fig. 56). Ciclosporina A i FK506 blocheaz cile de semnalizare ale altor sisteme celulare, cum ar fi: degranularea dependent de Ca2+ a mastocitelor; n condiii fiziologice, complexul NF-ATc-NF-ATn se leag de promotorul genei IL-2 i este factorul stimulator n special al transcrierii ARNm IL-2, necesar activrii celulelor T. Complexul NF-ATc-NF-ATn stimuleaz transcrierea ARNm al altor citochine (IFN K), cu rol esenial n activarea macrofagelor. Sub aciunea ciclosporinei, celulele T nu mai sintetizeaz IL-2 sau IFN K. Ciclosporina este un agent imunosupresor selectiv, deoarece acioneaz asupra celulelor Th1, dar este mai puin eficient fa de subpopulaiile de limfocite Th2 care produc IL-4, IL-5, IL-7, sau fa de limfocitele B, granulocite sau macrofage (Loertscher i colab., 1992; Morikawa i colab., 1994). Imunosupresia cu ciclosporin este o modalitate imunofarmacologic, datorit aciunii sale selective fa de celulele imunocompetente. Deoarece nu inhib semnificativ limfocitele B, ciclosporina este mai puin eficient ca blocant al sintezei anticorpilor. Anticorpii specifici fa de antigenele donorului sunt implicai n nefropatia cronic a receptorului de gref. Ciclosporina stimuleaz sinteza TGF-F (Transforming Growth Factor), inductor al fibrozrii rinichiului transplantat (Stepkowski, 2000). Inhibitorii metabolici au aciune selectiv asupra celulelor T proliferante: inhib maturarea limfocitelor T din precursori imaturi i omoar celulele T mature proliferante, stimulate de aloantigene.

Figura 56. Ilustrarea schematic a mecanismelor de aciune a ciclosporinei i FK506 (tacrolimus). Ciclosporina formeaz un complex stabil cu ciclofilina i o inactiveaz. In absena ciclofilinei libere, calcineurina nu defosforileaz componenta citoplasmatic a factorului activator al limfocitelor T, care rmne n citoplasm. Nu se mai asambleaz factorul activ nuclear (NF -Atn) al limfocitelor T. FK506 are un mecanism de aciune asemntor: formeaz un complex stabil cu o protein (FKBP) i blocheaz activitatea de defosforilaz a calcineurinei;CsA ciclosporina; CaN calcineurina; CpN = ciclofilina; NF -ATc - factorul nuclear de activare a celulelor T (componenta citoplasmatic); NF-ATn factorul nuclear de activare a celulelor T (componenta nuclear); IL-2 - Interleukina 2; FK506 Tacrolimus; FKBP proteina de legare a FK506 (dup Stepkowski, 2000).

188

In ultimii ani s-au identificat civa compui chimici naturali, izolai ca i ciclosporina, din culturi de microorganisme: tacrolimus, rapamicina, mizoribina i spergualin (Bierer i colab., 1992). Primii doi sunt nrudii structural, ambii fiind lactone macrociclice, dar mecanismele de aciune sunt diferite.

8.2. Tacrolimus (FK506)

Tacrolimus este o lacton macrociclic lipofil, produs de Streptomyces tsukabaensis, cu mecanism de aciune asemntor cu al ciclosporinei, dar de circa 100 de ori mai puternic. Face parte din clasa macrolidelor i este nrudit cu unele antibiotice. Tacrolimus este un agent imunosupresor tot mai utilizat n clinica de transplantare, ca o alternativ la ciclosoporin, n special n cazurile de respingere refractare la ciclosporin (Banerji i colab., 1991). Absorbia digestiv i farmacocinetica prezint o mare variabilitate intra- i interindividual. Efectele secundare sunt asemntoare celor produse de ciclosporin, dar neurotoxicitatea i diabetogeneza sunt mai frecvente.

Structura molecular a tacrolimus

Mecanismul de aciune Tacrolimus este lipofil i traverseaz membrana celulelor sistemului imunitar. Dei are o structur chimic diferit, mecanismul de aciune este asemntor cu acela al ciclosporinei (Pahl i colab., 1992). Ambii aparin categoriei imunosupresorilor cunoscui ca inhibitori ai calcineurinei. Ambii compui se leag cu proteine citoplasmatice receptoare specifice din categoria imunofilinelor: ciclofilina, respeciv FK-BP (binding protein). Imunofilinele sunt molecule care au rol de receptori pentru o familie de ageni imunosupresori, care includ ciclosporina, tacrolimus (FK506) i rapamicina. Complexul FK-BP leag calcineurina. Din acest punct, mecanismul su de aciune este comun cu acela al ciclosporinei. Efectul net este inhibiia prop agrii semnalului celular declanat de IL-2 i inhibiia expansiunii clonale a celulelor T citotoxice i a altor celule implicate n respingerea acut a grefei (Dubois i colab., 2003). Att ciclosporina ct i tacrolimus sunt metabolizai n ficat i se consider c interacioneaz ntr-un mod asemntor cu alte medicamente care interfer cu calea lor de metabolizare. Deoarece mecanismul aciunii ciclosporinei A i tacrolimus este acelai, cei doi compui nu se pot administra simultan (Sho i colab., 2002). Toxicitatea celor dou antibiotice este asemntoare, dar tacrolimus produce hiperglicemie i neurotoxicitate mai accentuate. Tacrolimus produce mai puin hirsutism, hipertrofie gingival i ginecomastie. Ciclosporina i tacrolimus nu rezolv problema transplantului. Obstacolul principal n calea grefelor este respingerea cronic, ce se caracterizeaz prin fibroz, deoarece ambii ageni stimuleaz sinteza TGF-F , care, la rndul su, stimuleaz dezvoltarea unei fibroze interstiiale (Hultsch i colab., 1992). Consecina este pierderea structurii normale a organului grefat, ntr-o perioad de ordinul anilor. Fibroza a rmas cauza major a pierderii alogrefei, pe msur ce controlul respingerii acute s-a ameliorat. Frecvent se produce ocluzia arterial a grefei, ca rezultat al proliferrii celulelor musculare netede ale intimei. Este procesul de arterioscleroz a grefei, detectabil n alogrefele cardiace sau renale, n intervalul de 6 12 luni dup grefare. Majoritatea pacienilor cu transplant necesit tratamentul pe termen lung, cu doze mari de imunosupresoare, care mresc sensibilitatea la infecie i malignitate (Todo i colab, 1994; Steinbach i colab., 2004). Ciclosporina permite supravieuirea pacienilor transplantai timp de ani de zile.

189

8.3. Rapamicina
Rapamicina (cunoscut sub denumirea de sirolimus), un antibiotic macrolid produs de Streptomyces hygroscopicus, a fost introdus n clinica transplantrii n 1999. Din punct de vedere chimic, rapamicina este o lacton macrociclic. Iniial, a fost descris ca un agent antifungic (Calvo i colab., 1992). Sirolimus este un agent imunosupresor, de 10-100 de ori mai activ dect ciclosporina A n prevenirea respingerii alogrefelor vascularizate. Efectul su principal const n inhibiia proliferrii celulelor T, prin blocarea trecerii de la faza G1 la faza S.

Structura molecular a rapamicinei (Sirolimus)

Sirolimus se leag, ca i tacrolimus, cu aceiai protein citoplasmatic (FK-BP) (binding protein), dar efectul su este diferit: inhib diferite ci de transmitere a semnalelor mediate de legarea antigenului sau de citochine.inta sa este o fosfatidilinozitol 3-kinaz, al crei rol este activarea unei kinaze a proteinei ribosomale S6 (S = small). Sirolimus inhib progresia celulelor T din faza G1 n faza S a ciclului celular (Brown i colab., 2003). Este un inhibitor mult mai eficient al sintezei anticorpilor dect ciclosporina i tacrolimus. Sirolimus are aciune sinergic n asociaie cu ciclosporina i prednisonul i reduce net incidena respingerii acute. Efectele secundare majore constau n mielosupresie i hipertrigliceridemie, sugernd un posibil rol n inhibiia activitii lipoprotein-lipazei i n scderea numrului de plachete i mai puin semnificativ, a numrului de leucocite.

8.4. Micofenolat-mofetil (MMF) Micofenolat-mofetil, esterul 2-morfolinoetil al acidului micofenolic, este cel mai nou i cel mai folosit medicament din aceast clas. Este sintetizat de tulpini ale g. Penicillium i a fost introdus n clinica transplantrii n 1995.

Structura molecular a micofenolat-mofetilului (MMF)

190

In ficat, micofenolat-mofetil este metabolizat prin hidroliz, la metabolitul activ, acidul micofenolic. O parte important este conjugat n ficat cu gluconatul i este secretat n bil i revine n ficat prin circuitul enterohepatic. Mecanismul de aciune al MMF este mai selectiv, deoarece inhib calea sintezei purinelor, dar calea secundar (de salvare) rmne funcional. Este un inhibitor necompetitiv al unei izoforme specifice pentru limfocite, a inozin-monofosfat-dehidrogenazei (IMPDH), necesar sintezei de novo a nucleotidelor cu guanin n faza S a ciclului celular. Limfocitele sintetizeaz nucleotide de novo, prin conversia 5-fosforibozil-1 fosfatului, la inozin monofosfat (IMP). IMP este convertit la guanozin-monofosfat (GMP), pe calea IMPDH (Sollinger i colab., 1992). Pe calea secundar (calea 11de salvare), guanina este convertit la GMP, de ctre enzima HGPRT (Hipoxantin-Guanozin-Fosfo-Ribozil-Transferaz). MMF diminu concentraia deoxiguanozin-trifosfatului i inhib sinteza ADN, inhib proliferarea limfocitelor, fibroblastelor, celulelor endoteliale i a celulelor musculare netede din peretele arterelor. Efectele secundare se manifest, uneori, la nivelul tractului digestiv i sunt dependente de doz: diaree, stare de ru general, vom. Dei aciunea sa este relativ specific asupra limfocitelor, leucopenia, anemia i trombocitopenia pot s nsoeasc administrarea dozelor mari. Ciclosporina, tacrolimus i sirolimus fac parte din cea de a doua generaie de inhibitori selectivi ai limfocitelor T. Ciclosporina i tacrolimus sunt nefrotoxice, iar sirolimus induce hipertrigliceridemie. Cea de a III-a generaie de ageni imunosupresori au aciune foarte selectiv, nu sunt toxici i nu produc alte efecte colaterale: sunt imunospresorii anti-sens, oligonucleotide scurte de 16-22 nucleotide antisens, cu secven complementar ARNm int. Legarea oligonucleotidului de ARNm inhib sinteza proteinei i blocheaz funcia celulei. Imunosupresorul ideal va media inducerea toleranei, n special n transplant, adic va permite sistemului imunitar s adopte ca self, moleculele CMH specifice esutului grefat.

Bibliografie selectiv
1. Banerji SS, Parsons JN, Tocci MJ.The immunosuppressant FK-506 specifically inhibits mitogeninduced activation of the interleukin-2 promoter and the isolated enhancer elements NFIL-2A and NF-AT1.Molecular Cell Biology. 1991, 11(8): 4074-4087. 2. Bierer B.E., Mattila P.S., Standaert R.F., Herzenberg L.A., Burakoff S.J., Crabtree G., Schreiber S.L., Two distinct signal transmission pathways in T lymphocytes are inhibited by complexes formed between an immunophilin and either FK506 or rapamycin, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1990, 87(23): 9231-9235. 3. Brown V.I., Fang J., Alcorn K., Barr R., Kim J.M., Wasserman R., Grupp S.A., Rapamycin is active against B-precursor leukemia in vitro and in vivo, an effect that is modulated by IL -7-mediated signaling, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America..2003, 100(25): 15113-15118. 4. Calvo V., Crews C.M., Vik T.A., Bierer B.E.., Interleukin 2 stimulation of p70 S6 kinase activity is inhibited by the immunosuppressant rapamycin, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992, 89(16): 7571-7575. 5. Dubois S., Shou W., Haneline L.S., Fleischer S., Waldmann T.A., Mller J.R., Distinct pathways involving the FK506-binding proteins 12 and 12.6 underlie IL-2-versus IL-15-mediated proliferation of T cells, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003, 100(24): 1416914174. 6. Fruman D.A., Klee C.B., Bierer B.E., Burakoff S.J., Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK 506 and cyclosporin A Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992, 89(9): 3686-3690. 7. Hultsch T., Martin R., Hohman R.J.,The effect of the immunophilin ligands rapamycin and FK506 on proliferation of mast cells and other hematopoietic cell lines, Molecular Cell Biology. 1992, 3(9): 981-987. 8. June C.H., Ledbetter J.A., Gillespie M.M., Lindsten .T, Thompson C.B., T-cell proliferation involving the CD28 pathway is associated with cyclosporine-resistant interleukin 2 gene expression, Molecular Cell Biology. 1987, 7(12): 4472-4481. 9. Loertscher R., Blier L., Steinmetz O., Nohr C., The utility of cyclosporine weaning in renal transplantation, Annals of Surgery. 1992, 215(4): 368-376.

191

10. Marchetti O., Entenza J.M., Sanglard D., Bille J., Glauser M.P., Moreillon P., Fluconazole plus Cyclosporine: a Fungicidal Combination Effective against Experimental Endocarditis Due to Candida albicans, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2000, 44(11): 2932-2938. 11. Morikava K., Oseko F., Morikawa S., Iwamoto K., Immunomodulatory effects of three macrolides, midecamycin acetate, josamycin, and clarithromycin, on human T-lymphocyte function in vitro, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1994, 38(11): 2643-2647. 12. Pahl A., Keller U., FK-506-binding proteins from streptomycetes producing immunosuppressive macrolactones of the FK-506 type, Journal of Bacteriology. 1992, 174(18): 5888-5894. 13. Sho M., Sandner S.E., Najafian N., Salama A.D., Dong V., Yamada A., Kishimoto K., Harada H., Schmitt I., Sayegh M.H., New Insights Into the Interactions Between T-Cell Costimulatory Blockade and Conventional Immunosuppressive Drugs, Annals of Surgery. 2002, 236(5): 667-675. 14. Sollinger H.W., Belzer F.O., Deierhoi M.H., Diethelm A.G., Gonwa T.A., Kauffman R.S., Klintmalm G.B., McDiarmid S.V., Roberts J., Rosenthal J.T., RS-61443 (mycophenolate mofetil). A multicenter study for refractory kidney transplant rejection, Annals of Surgery. 1992, 216(4): 513-519 15. Stepkowski, Stanislaw M. Molecular targets for existing and novel immunosuppressive drugs, Expert reviews in molecular medicine. 2000. 16. Steinbach W.J., Schell W.A., Blankenship J.R., Onyewu C., Heitman J., Perfect J.R., In Vitro Interactions between Antifungals and Immunosuppressants against Aspergillus fumigatus, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2004, 48(5): 1664-1669. 17. Todo S., Fung J.J., Starzl T.E., Tzakis A., Doyle H., Abu-Elmagd K., Jain A., Selby R., Bronsther O., Marsh W., Single-center experience with primary orthotopic liver transplantation with FK 506 immunosuppression, Annals of Surgery. 1994, 220(3): 297-309.

192

Capitolul 9 BACTERIOCINE
Bacteriocinele sunt proteine antibacteriene cu specificitate nalt de aciune, produse de anumite tulpini bacteriene. Activitatea lor este limitat la unele tulpini ale aceleiai specii. Spectrul de activitate restrns al bacteriocinelor le exclude din categoria antibioticelor clasice. Totui, sunt ageni antibacterieni foarte eficieni i dei nu au valoare terapeutic, faptul c sunt sintetizate de numeroase specii i produc efecte foarte specifice, a determinat interesul cercettorilor. Bacteriocinogeneza este un fenomen la fel de frecvent n natur ca i lizogenia. Cele dou procese au cteva trsturi comune : - identificarea tulpinilor bacteriocinogene se face prin cultivarea mixt a unui numr mic de bacterii presupuse a fi productoare de bacteriocine (B+), cu un exces de celule ale tulpinilor indicatoare sensibile; - prin acoperirea coloniilor B+ crescute pe plci, cu o tulpin indicatoare. In ambele cazuri, dup incubarea pentru 24 de ore, coloniile B+ sunt nconjurate de zone clare de inhibiie. Sinteza bacteriocinelor este codificat de elemente genetice extracromosomale, denumite plasmide "col. Denumirea veche a bacteriocinelor este aceea de colicine, atribuit unor substane cu proprieti antibiotice produse de o tulpin virulent de E. coli, care au efect letal asupra celulelor productoare, precum i a unor tulpini strns nrudite cu cea productoare. Fenomenul de colicinogenez a fost descoperit de Gratia (l925) (Zarnea, 1990). Producerea colicinelor nu este limitat la E. coli, ci este un fenomen mult mai rspndit n lumea bacteriilor i din acest motiv, Jacob (l953) a dat denumirile de bacteriocine, bacteriocinogenez i factori bacteriocionogeni, pentru a desemna substanele, fenomenul i respectiv plasmidele care controleaz producerea lor. Denumirile diferitelor bacteriocine provin de la numele genului sau al speciei bacteriei productoare, la care se adaug sufixul cin: de exemplu, lactocine (produse de Lactobacillus), vibriocine (produse de Vibrio), respectiv pesticine (produse de Yersinia pestis), megacine (produse de B. megatherium), subtilicine (produse de B. subtilis) etc. Plasmidele (factorii Col) au aceleai particulariti, comune altor plasmide: sunt molecule de ADN, circulare, dublu catenare nchise, suprahelicale. La E. coli, n mod obinuit se gsesc 5-25 de copii/celul. Unele plasmide Col (de exemplu, Col E1) au funcie de conjugon, deoarece poart n structura lor genetic, determinanii genetici de transfer. Ele se pot transfera la tulpinile col-, prin conjugare. Plasmidele Col tra- se transfer prin transformare genetic, transducie fagic sau prin conjugare iniiat de alte plasmide cu funcie de conjugoni. De cele mai multe ori, bacteriocinele sunt proteine pure. La bacteriile Gram negative, bacteriocinele sunt asociate cu lipopolizaharide de origine parietal, dar activitatea de bacteriocin este asociat totdeauna cu componenta proteic, cu o gr. mol. de l8-90 kDa. Bacteriocinele produse de bacteriile Gram negative au cteva proprieti generale: - au un spectru de aciune foarte ngust, limitat la tulpina productoare i la altele strns nrudite; - aciunea lor este bactericid. O singur molecul poate fi suficient pentru a produce liza celulei sensibile; - se leag de celulele sensibile prin intermediul unor receptori celulari cu specificitate nalt, ceea ce explic spectrul lor foarte restrns de aciune; - biosinteza bacteriocinelor nu are efect letal asupra celulei productoare. Receptorii parietali sunt analogi receptorilor fagici. Pierderea unui receptor confer rezisten celulei la bacteriocina corespunztoare. Bacteriocinele produse de bacteriile Gram pozitive au un spectru de aciune foarte larg. Ele sunt active asupra celulelor productoare, dar i asupra unor specii mai ndeprtate i chiar asupra bacteriilor Gram negative. Din punct de vedere chimic, sunt proteine pure. O categorie special de bacteriocine, o constituie cele sintetizate de Ps. aeruginosa (bacilul piocianic), denumite piocine. Ele se evideniaz n lizatele culturilor, dup inducia sintezei cu UV, sub forma unor bastonae perechi, asemntoare cozilor contractile ale fagilor din seria T-par, infecioi pentru E. coli, cu lungimea de 90-l25 nm i grosimea de 20 nm. Uneori, perechile de bastonae apar contractate , mai scurte i groase, iar ntre cele dou structuri electrono-dense se evideniaz zona central (core), echivalentul structural al cilindrului axial al cozii fagului. Dac antibioticele sunt definite ca substane produse de unele organisme (pro- sau eucariote) care au efect inhibitor la concentraii sczute, asupra altor microorganisme (pro- sau eucariote) (Van Damme, 1984, citat de de Vuyst, 1996), definiia bacteriocinelor este mult mai restrictiv. Bacteriocinele sunt substane proteice sau complexe proteice (agregate proteice, glicoproteine, glicolipoproteine) cu efect bactericid asupra altor specii, majoritatea strns nrudite cu specia productoare (de Vuyst i Van Damme,1996).

193

9.1. Clasificarea bacteriocinelor

Bacteriocinele formeaz un grup heterogen de molecule care, n funcie de structura primar, masa molecular, stabilitate termic, prezena aminoacizilor modificai, sunt grupate n patru clase (Klaenhammer, 1993; Nes i colab., 1996). Aceasta clasificare este frecvent revizuit, pe msur ce sunt descoperite i caracterizate noi tipuri de bacteriocine i noi asemnri ntre cele deja existente (tabelul 34). Cls. I: Lantibiotice: molecule mici (< 5 kDa) subdivizate n dou clase: Clasa Ia include peptide hidrofobe, cationice (lantionina, nisina, F-metillantionona), al cror mod de aciune const n formarea porilor n membrana celulei int; Clasa Ib include molecule proteice cu o structur globular mult mai rigid, fr sarcin electric negativ. Modul lor de aciune const n inhibiia sintezei peptidoglicanului n celula int (mersacidina, actagardina). Cls. II: Non-lantibiotice: peptide mici, stabile termic, care acioneaz asupra peretelui celular i produc creterea permeabilitii membranei plasmatice a celulelor bacteriene sensibile. Sunt subdivizate n: Clasa IIa - include peptide pediocin-like cu activitate anti-Listeria, care conin n structura lor o secven conservat (Tyr-Gly-Asn-Gly-Val) i dou resturi de cistein care formeaz o punte disulfuric ntre jumatile N-terminale ale moleculei (pediocine PA-I, sakacin A i P, leucocina A, carnobacteriocine) (Dieuleveux, 1998). Clasa IIb - include o categorie aparte de bacteriocine reprezentate de un sistem format din dou componente peptidice diferite, dar care, prin interaciune, constituie molecula activ (complex de formare a porilor) (lactococcina G i F, lactacina F, plantaricina EF i JK). Cls. III: bacteriocine termolabile de dimensiuni mari (> 30 kDa), mai puin cunoscute i studiate (helveticin J i V-1829, acidophillucin A, lactacin A si B); Cls. IV: amestec nedefinit de proteine, lipide, glucide. Tabelul 34. Principalele tipuri de bacteriocine, tulpini productoare i spectrul inhibitor (adaptare dup De Vuyst i Van Damme, 1994).
Clase de bacteriocine Cls I: LANTIBIOTICE Nisina A Nisina Z Lacticina 481 Lactocina S Carnocina U149 Microorganism productor Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454, 6F3 Lactococcus lactis subsp. lactis NIZO 22186 Lactococcus lactis subsp. Lactis CNRZ 481 Lactobacillus sake L45 Carnobacterium piscicola Spectru de activitate Bacterii Gram pozitive Bacterii lactice, Chlostridium thyrobutyricum, Satphylococcus carnosus Carnobacterii, lactobacili, pediococi, lactococi Carnobacterii, lactobacili, pediococi, lactococi Lactococi Lactococi Lactobacili Lactobacili Lactobacili, Enterococcus faecalis Lactobacili, enterococi, carnobacterii, Listeria monocytogenes Lactobacili, carnobacterii Enterococcus faecalis, Brochothrix thermosphacta Listeria monocytogenes Lactobacili, carnobacterii Enterococcus faecalis, Brochothrix thermosphacta

Cls II: NON-LANTIBIOTICE TERMOSTABILE Diplococcina Lactococcus lactis subsp. Cremoris 346 Lactococcina A Lactococcus lactis subsp. Cremoris LMG 2130 Lactocina 27 Lactobacillus helveticus LP 27 Lactacina B Lactobacillus acidophilus N2 Lactacina F Lactobacillus acidophilus 11088 Sakacina A Curvacina A Lactobacillus sake Lb 706 Lactobacillus curvatus LTH 1174

Sakcina P

Lactobacillus sake LTH673

194

Carnobacteriocina A i B

Carnobacterium piscicola LV 17

Pediocina AcH

Pediococcus acidilactici E, F, H, M

Pediocina PA-1 Leucocina A UAL-187

Pediococcus acidilactici PAC-1.0 Leuconostoc gelidum UAL 187

Listeria monocytogenes Carnobacterii, lactobacili, pediococi Enterococcus sp. Listeria monocytogenes Lactobacili, pediococi, stafilococi, Bacillus sp., Leuconostoc sp., Enterococcus sp.., Brochothrix thermosphacta Listeria monocytogenes Lactobacili, pediococi, Leuconostoc sp., Listeria monocytogenes Bacterii lactice,

Enterocina 1146

Enterococcus faecium DPC 1146 Listeria ssp.

Listeria monocytogenes Lactobacillus sake

lactobacili Lactobacillus casei B 109

Cls III: BACTERIOCINE TERMOLABILE

Helveticina J Caseicina 80 Lactobacillus helveticus 481 Lactobacillus casei B80

9.2. Sinteza bacteriocinelor

Genele codificatoare pentru bacteriocinele active sunt dispuse n operoni aglomerai ( clusteri). Cei mai studiai operoni sunt cei ai bacteriocinelor aparinnd clasei Ia din care fac parte lantionina i nisina. In anul 2000, Altena i colab. au elucidat structura cluster-ului de gene codificatoare pentru clasa Ib de bacteriocine (mersacidina), majoritatea genelor codificnd proteine asemntoare cu cele ale clasei Ia. Localizarea genelor codificatoare poate fi cromosomal (Diep, 1996), plasmidial sau la nivelul unor transposoni (Engelke i colab., 1992; 1994). Majoritatea bacteriilor productoare de bacteriocine posed, n acelai cluster, gene codificatoare ale unor proteine structurale, proteine implicate n transformarea formei inactive n forma activ a bacteriocinelor i proteine implicate n transportul acestora prin membrane, ct i proteine care confer imunitate celulei productoare (Cleveland i colab., 2001). Organizarea genetic a operonilor ce codific clasa a II -a de bacteriocine (non-lantibiotice) este asemntoare cu cea a clasei I, genele pentru sistemul plantaricin (plantaricin, pediocin, sakacin) codificnd o serie de bacteriocine care utilizeaz acelai tip de sistem de transport i sistem reglator. In schimb, fiecare categorie de bacteriocine posed propriul sistem imunitar care protejeaz celula bacterian productoare, de aciunea propriei molecule proteice. Sinteza tuturor claselor de bacteriocine se realizeaz prin traducere la nivel ribosomal, singurele care sufer modificri post-translaionale pentru a deveni forme active fiind bacteriocinele aparinnd clasei I (Eijsink i colab., 1998). Genele codificatore ale enzimelor implicate n acest proces sunt situate n vecintatea genelor structurale. Caracteristic pentru sinteza lantibioticelor este prezena la captul N-terminal al moleculei precursoare a unei secvene (peptid) leader care are rolul de situs de recunoatere pentru enzimele implicate n modificrile post-transcriere. Tehnicile moleculare permit manipularea genetic a acestora n vederea studierii din punct de vedere structural i funcional.

195

9.3. Imunitatea bacteriilor fa de bacteriocinele endogene

Imunitatea celulelor productoare fa de bacteriocinele endogene este un fenomen care, de asemene a, difereniaz bacteriocinele de antibiotice. Genele codificatoare pentru proteinele ce confer imunitate sunt situate n acelai operon, n apropierea genelor pentru bacteriocine i a genelor implicate n prelucrarea post translaional (Nes i colab., 1996). Iniial s-a considerat c, n cazul lantibioticelor, imunitatea este asigurat de o singur gen, gena nisI pentru nisin, respectiv spaI pentru subtilizin, codificatoare ale proteinelor protectoare NisI i respectiv SpaI (Klein i Entian, 1994). Ulterior s-a demonstrat c imunitatea fa de aceste bacteriocine este asigurat de un complex de proteine deoarece, prin deleia altor gene, celulele productoare i-au pierdut imunitatea. Astfel, Duan i colab. (1996) au utilizat o tulpina de Lactococcus lactis, neproductoare de nisin, dar rezistent la aciunea nisinei. Tulpina nu prezint gena codificatoare a proteinei NisI, dar are secvene asemntoare genelor nisF, nisE i nisG, care confer rezisten la aciunea nisinei. Deleia genei nisG determin scderea acestei rezistene. Rezistena la bacteriocinele celei de a II-a clase (non-lantibiotice) implic o singura gen codificatoare pentru proteinele imunitare. Structural, aceste proteine au o particularitate unic, avnd o secven de 50-150 de aminoacizi ataat membranei celulare, de unde poate fi eliberat. Dei proteina care confer imunitate fa de lactococcin A (LcnI) a fost intens studiat, mecanismul molecular ce st la baza fenomenului imunitar, nu este cunoscut (Cleveland, 2001).

9.4. Mecanisme de aciune a bacteriocinelor

Bacteriocinele produse de celulele Gram negative acioneaz prin mecanisme specifice asupra unor inte situate n membran sau n citoplasm. Spectrul foarte limitat de aciune a bacteriocinelor produse de celulele Gram negative, sugereaz existena unor receptori prin care acestea i dobndesc accesul la structurile sensibile. De fapt, moleculele care funcioneaz ca receptori nu sunt specializate n acest sens, ci ndeplinesc diferite activiti, n special de transport celular al unor substane nutritive. Mecanismele de aciune s-au studiat pentru colicine (produse de E. coli). Dup fixarea ireversibil la nivelul receptorilor membranei externe, colicinele i exercit efectul bactericid prin unul din urmtoarele mecanisme: - inhibarea fosforilrii oxidative, stopnd astfel procesele energetice celulare. Consecutiv se produce alterarea permeabilitii membranei plasmatice, blocarea sintezei macromoleculare (ADN, ARN, proteine), ca i a transportului activ al substanelor nutritive; - unele colicine se fixeaz specific pe molecula de ADN i determin apariia inciziilor monocatenare, ceea ce deschide calea aciunii nucleazelor celulare i a degradrii ADN; - altele inactiveaz subunitile ribosomale 30 S, prin clivarea ARNr l6 S. In concluzie, bacteriocinele au efect bactericid asupra celulelor sensibile. Ceea ce le deosebete fundamental de alte antibiotice este faptul ca au efect letal asupra celulelor n care s-au sintetizat i din aceast cauz, proprietatea de bacteriocinogenez nu se poate perpetua ntr-o celul, dect n starea ei potenial. Periodic, sinteza bacteriocinelor este indus i celula productoare se lizeaz, elibernd moleculele cu efect litic n mediu. Efectul litic al bacteriocinelor se manifest numai asupra celulelor aceleiai specii, care nu o pot codifica, fiind lipsite de factorul Col. Celulele care poart factorul Col sunt rezistente la aciunea colicinei omologe, elaborat de celule purttoare ale aceluiai factor, ca i cum ar fi imune la aciunea lor. Lantibioticele conin n structura lor aminoacizi neproteici, care nu sunt ncoporai prin mecanismul genetic clasic(pentru care nu exist codoni), ceea ce confirm modificarea enzimatic posttranslaional a produsului primar. Asfel de aminoacizi prezeni n forma activ a moleculei sunt: lantionina (de la care provine denumirea de lantibiotice), F-metillantionona, dehidroalanina, dehidrobutirina. Cel mai important membru al acestei clase de bacteriocine este peptidul nisina, produs de Lactococcus lactis subsp. lactis. Mecanismul efectului letal asupra bacteriilor Gram pozitive exercitat de aceste molecule i dovedit experimental nu este cunoscut. Se pare c o cauz a morii celulelor sensibile ar fi distrugerea membranei celulare prin proprietatea de detergent-like a peptidului nisin. Mai recent s-a demonstrat c efectul distructiv se datoreaz formrii unor canale n membrana celular prin ncorporarea moleculei de nisin, datorit propietilor sale fizice: nisina este un peptid cationic cu caracter uor hidrofob. Efectul const n perturbarea echilibrului ionic prin efluxul de ioni i molecule mici, ceea ce duce la alterarea potenialului membranar. Studiile cu membrane artificiale (liposomi) au demonstrat c formarea canalului transmembranar este un proces dependent de diferena de sarcin a celor dou fee ale membranei, proces n care nisina perturb att potenialul membranar ct i pH-ul liposomilor. S-a evideniat c activitatea nisinei este influenat de compoziia n fosfolipide, ceea ce poate explica diferenele de sensibilitate ntre diferite specii bacteriene (De Vuyst i Van Damme, 1996). Activitatea bactericid a lantibioticelor se manifest cu preponderen fa de

196

bacteriile Gram pozitive. Ineficiena fa de bacteriile Gram negative se datoreaz dimensiunilor relativ mari ale moleculelor (aproximativ 1800-4600 Da) care mpiedic penetrarea membranei externe a peretelui celular al bacteriilor Gram negative. In privina modului de aciune al lantibioticelor, s-a relevat importana unor molecule de ancorare numite generic lipidul II, din membrana celulelor int, molecule care sunt precursori ai peptidoglicanilor i care faciliteaz activitatea antibacterian a nisinei i a mersacidinei. Mersacidina (bacteriocin aparinnd clasei Ib) inhib sinteza peptidoglicanului prin blocarea transglicozilrii (Brotz i colab., 1998). Pentru nisin i epidermin, lipidul II are rolul de molecul de ancorare i faciliteaz din punct de vedere energetic, formarea porilor (Brotz si Sahl, 2000). Acelai situs de ancorare la membrane este utilizat i de vancomicina dar mecanismul de interacie este specific. Bacteriocinele sunt adeseori confundate n literatura de specialitate, cu antibioticele, ceea ce limiteaz din punct de vedere legal, utilizarea lor n industria alimentar (Hansen, 1994). Diferenele ntre cele dou categorii de substane cu potenial microbicid, se bazeaz att pe modalitatea de sintez ct i pe modul de aciune, spectru antimicrobian, toxicitate i mecanisme de rezisten (tabelul 35). Ca o recunoastere a diferenelor nete dintre bacteriocine i antibiotice, a fost propus, pentru bacteriocine, termenul de prezervani biologici alimentari, deoarece nu sunt utilizate n scop medical.
Tabelul 35. Comparaie ntre bacteriocine i antibiotice (dup Cleveland i colab., 2001). CARACTERISTICI BACTERIOCINE ANTIBIOTICE Aplicaii Sinteza Activitate Imunitate a celulei gazd Mecanisme de rezisten sau toleran a celulei int Interacii necesare Industria alimentar Ribosomal Spectru ngust Da Modificarea compoziiei membranei celulei int Cu int specific ceea ce explic spectrul foarte ngust de activitate al bacteriocinelor produse de bacteriile Gram negative, restrns la tulpinile strns nrudite cu cea productoare sau inta este nespecific pentru bacteriocinele sintetizate de bacteriile Gram pozitive, iar spectrul aciunii lor este foarte larg. Formarea porilor sau blocarea biosintezei peretelui celular Necunoscute Clinice Metabolit secundar Spectru variat Nu Efectul este transferabil genetic (prin plasmide) i se exercit la diferite situsuri, n funcie de modul de aciune Cu int specific

Mod de aciune Toxicitate i efecte secundare

Membrana celulara, blocarea sintezei mureinei sau inte intracelulare Da

197

Bibliografie selectiv
1. Altena K., Guder A., Cramer C., Bierbaum, G., Biosynthesis of the lantibiotic mersacidin: organization of a type B lantibiotic gene cluster. Appl Environ Microbiol., 2000, 66, 25652571. 2. Brotz H., Sahl H.G., New insights into the mechanism of action of lantibiotics-diverse biological effects by binding to the same molecular target, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2000, 46: 16. 3. Cleveland G., Montville J., Nes I.F., Chikindas M.L.,. Bacteriocins: safe, natural antimicrobian for food preservation, International Journal of Food Microbiology.2001,71: 1-20. 4. De Vuyst L., Van Damme E.J., Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria, Blackie Academy & Professional. 1996. 5. Diep D. B., Havarstein L. S., Nes, I. F., Characterization of the locus responsible for the bacteriocin production in Lactobacillus plantarum C11. J Bacteriol. 1996, 178, 44724483. 6. Dieuleveux V., Van Der Pyl D., Chataud J., Gueguen M., Purification and caracterization of antiListeria compounds produced by Geotrichum candidum, Applied and Environemental Microbiology. 1998, 64: 800-803. 7. Duan K., Harvey M.L., Liu C.Q., Duun N.W., Identification and characterization of mobilizing plasmid, pND300, in Lactococcus lactis M198 and its encoded nisin resistence determinant. Journal of Applied Bacteriology. 1996, 81: 493-500. 8. Eijsink V.C.H., Skeie M., Middelhoven H.P., Brurberg M.B., Nes I.F., Comparative studies of class IIa bacteriocins of lactic acid bacteria, Applied and Environemental Microbiology. 1998, 64: 32753281. 9. Engelke et al., Biosynthesis of the lantiobiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB protein. Appl. Environ. Microbiol. 1992, 58(11)3730-3743 10. Engelke et al., Regulation of nisin biosynthesis and immunity in Lactococcus lactis 6F3. Appl. Environ. Microbiol., 1994.60(3):814-825 11. Gratia A., Sur un remarquable exemple d'antagonisme entre deux souches de colibacille. C. R. Soc. Biol. 1925, 93:1040-1042 12. Hansen, N. Nisin as a model food preservative. Crit Rev Food Sci Nutr., 1994. 34(1):69-93. 13. Jacob F,, Lwoff A,, Siminovitch A,, Wollman E., Dfinition de quelques termes relatifs a la lysognie. Ann Inst Pasteur (Paris). 1953, Jan; 84(1):222224 14. Klaenhammer T.R., Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria, FEMS Microbiology Reviews. 1993. 12: 39-85. 15. Klein C., Entian K.D., Genes involved in self-protection against the lantibiotic subtilin produced by Bacillus subtilis ATCC 6633 , Applied and Environemental Microbiology. 1994, 60: 2793-2801. 16. Nes I.F., Diep D.B., Havarstein L.S., Brurberg M.B. Holo H., Biosynthesis of bacteriocins in lactic acid bacteria, Antonie van Leeuwenhoek. 1996, 70: 113-128. 17. Zarnea G. Tratat de Microbiologie Generala. Editura Academiei Romane, 1990.

198

Capitolul 10 AGENI TERAPEUTICI AI INFECIILOR FUNGICE

Circa 50 de specii de fungi sunt patogene pentru om i animale. Majoritatea fungilor patogeni sunt ageni infeciosi oportuniti, care invadeaz esuturile organismelor cu rezisten sczut la infecie.Fungii au fost recunoscui ca ageni patogeni, cu mult naintea bacteriilor. In 1665 s-a nregistrat o infecie fatal, consecutiv unei infecii orale cu Candida ( Fromtling, 1988). Infecia fungic a esuturilor umane i animale se produce pe fondul unor condiii locale favorizante (Zarnea, 1970). Din aceast cauz, transmiterea infeciei de la un organism la altul este rar. In general, maladiile fungice nu sunt contagioase.

10.1. Tipuri de infecii fungice

Infeciile produse de deuteromicete se numesc micoze i pot fi mprite n dou categorii mari: - infecii sistemice sau profunde, n care agentul patogen este larg diseminat n organism i crete n diferite organe i esuturi, care n mod normal sunt sterile. Pacienii neutropenici au cel mai mare risc pentru micoze profunde; - micoze superficiale, care includ infecii ale pielii, prului, unghiilor. Unii fungi produc numai un tip de infecie, iar altele pe amndou. Infeciile sistemice sunt de origine endogen i exogen. Inseria cateterelor predispune pacienii neutropenici la infecii fungice de origine endogen. Micozele sistemice de origine exogen au caracter endemic: histoplasmoza, blastomicoza, paracoccidioidomicoza, coccidioidomicoza i penicilioza. La pacienii imunodeficitari se remarc tendina de transformare a micozelor endemice, n infecii oportuniste. Pentru majoritatea fungilor patogeni nu se cunosc stadii de nmulire sexuat i de aceea poziia lor sistematic este incert. Unele micoze sistemice sunt produse de levuri. Altele sunt cauzate de fungi dimorfici, care cresc ca levuri in vivo (la 37o) i ca miceliu la temperatur mai mic, in vitro pe medii artificiale.Fungii patogeni triesc n sol i ptrund n organism pe cale respiratorie, fiind inhalai odat cu aerul. De la poarta de intrare, agentul infecios se disemineaz n organism i se instituie o infecie cronic, cu simptome foarte variate. Infeciile fungice fatale sunt rare. Infeciile fungice apar frecvent, ca o consecin a eliminrii microbiotei normale, prin terapie oral cu antibiotice. Civa fungi (Cryptococcus neoformans, Coccidioides imitis, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitides) produc infecii pulmonare foarte asemntoare prin manifestrile clinice, cu tuberculoza. Fungii care produc infecii superficiale se numesc dermatofii. Dermatofiii sunt un grup de fungi strns nrudii, care au capacitatea de a invada esutul cheratinizat (piele, pr, unghii) la om i la animale. In general, infecia este cutanat i restrns la straturile celulare cheratinizate, datorit incapacitii fungilor de a penetra esuturile mai profunde sau organele gazdelor imunocompetente (Wistreich i Lechtman, 1984). Micozele superficiale sunt cauzate, n primul rnd, de fungi micelieni (Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton). Ele au afinitate pentru esuturile care conin cheratina i produc enzima necesar degradrii acestei proteine. Unele cresc pe suprafaa firului de pr, iar altele la interior. Vrsta este un factor important care condiioneaz sensibilitatea la infecie: impetigo al pielii capului este frecvent la copii i rar la aduli, iar infecia interdigital este frecvent la aduli i rar la copii. Acizii grai nesaturai din screia glandelor sebacee ale adultului, au aciune antifungic, ceea ce explic rezistena mai mare a adultului la infeciile fungice superficiale. Una dintre substanele antifungice, acidul undecilenic, se adaug n compoziia multor unguente, folosite n controlul infeciilor fungice ale pielii. Infecia interdigital este favorizat de umiditatea local crescut i este produs de fungi din g. Epidermophyton. Majoritatea infeciilor cu fungii dermatofitici se pot trata eficient cu griseofulvina, un antibiotic antifungic produs de Penicillium griseofulvum. Griseofulvina se concentreaz n celulele epidermice, la valori inhibitoare pentru creterea dermatofitului. Micozele intermediare sunt considerate acelea care produc leziuni epidermice, subcutanate, ale mucoaselor, plmnului. Infecia se poate extinde i n alte esuturi, la diferite profunzimi. Infecia este realizat de inhalarea sporilor, prin contaminarea rnilor sau prin ingestie. Cele mai tipice infecii intermediare sunt candidoza i aspergiloza. Candidoza este produs de variate specii de Candida, n special C. albicans, din grupul fungilor imperfecti. In procesul infecios se prezint sub form unei levuri, dar formeaz i structuri miceliene (Wistreich i Lechtman, 1984). Infecia se localizeaz, n primul rnd, la nivelul membranelor mucoase, dar i n piele sau plmn. Infeciile mucoasei bucale a noului nscut sunt comune, iar la adult produce infecii bucale, tonsilare, vaginale. Aspergiloza, cauzat de Aspergillus fumigatus este frecvent la puii de gin, n primele zile dup ecloziune, la care produce infecii de amploarea unei epidemii. Miceliul se dezvolt abundent n plmn i

199

respiraia devine imposibil. Produce avortul la vac, oaie etc. Omul prezint rezisten natural la infecia cu A. fumigatus. Cazurile de mbolnvire sunt rare.

Structura molecular a colesterolului

Structura molecular a ergosterolului

10.2. Medicamentele antifungice

Agenii antifungici disponibili pentru tratamentul infeciilor micotice sistemice sunt limitate ca numr i eficien, deoarece fungii sunt organisme eucariote i din punct de vedere biochimic se aseamn cu organismul gazd. Asemnarea face ca dezvoltarea unui medicament eficient fa de agentul invadator, dar sigur pentru gazd, s necesite un studiu de durat n cercetarea de baz i n clinic. Cercetarea premergtoare introducerii n clinic a unui agent antifungic, necesit studii interdisciplinare de chimie, biochimie, microbiologie, endocrinologie, enzimologie etc. Dup ce agentul chimic este propus, cercetarea vizeaz sigurana, biodisponibilitatea, formularea. Primul agent cu activitate antifungic (griseofulvina) a fost izolat n 1939, iar primul agent polienic antifungic, nistatinul, a fost descoperit n 1949. Antibioticele polienice (nistatinul i amfotericina B) se sintetizeaz pe o cale metabolic asemntoare cu aceea a antibioticelor macrolide (eritromicina). Structural, macrolidele se caracterizeaz prin inele lactonice multiunitare, care poart numeroi substituieni: grupri metil, hidroxil, glucide specifice i celpuin un grup carbonil. Subgrupul polienelor conine o serie de legturi duble (ntre 4 i 7) conjugate. Din punctul de vedere al precursorilor, polienele sunt alctuite din uniti de acetat i propionat. Gruprile metil i au originea n unitile de propionat.

Structura molecular a nistatinului

Compuii azolici s-au introdus n clinica antifungic n 1944, iar n 1960 s-a folosit amfotericina. Cei mai importani sunt compui azolici i amfotericina B din clasa polienelor, medicamentul optim pentru tratamentul micozelor sistemice. Majoritatea medicamentelor antifungice au ca int molecula de ergosterol, sterolul major al membranei plasmatice a fungilor, analogul structural al colesterolului din celula mamiferelor (Hector, 1993). Ergosterolul din membrana fungic contribuie la o varietate de funcii celulare: este sediul chitin-sintetazei,

200

important pentru creterea i diviziunea celulei, este important pentru fluiditatea i integritatea membranei (tabelul 36). Polienele Structural, toate antibioticele polienice se caracterizeaz printr-un inel macrolid lactonic de dimensiuni mari. Se presupune c att inelul lactonic ct i legturile duble conjugate multiple (4, 5, 6 sau 7) sunt necesare pentru activitatea biologic. Prezena regiunilor foarte polare i a celor nepolare n moleculele polienice le confer caracterul amfipatic, ceea ce explic solubilitatea i mecanismul de aciune. Majoritatea polienelor sunt molecule amfoterice. Aciditatea se datoreaz gruprii carboxil, iar caracterul bazic este conferit de micozamin, un glucid aminat izolat din nistatin i amfotericina B. Mecanismul de aciune. Medicamentele din clasa polienelor, n special amfotericina B, au fost considerate cele mai eficiente dintre toi agenii antifungici cu administrare sistemic. Polienele sunt o clas de medicamente cu aciune selectiv numai asupra membranelor ce conin ergosterol: de aceea sunt inhibitorii pentru fungi, dar nu sunt active fa de bacterii. Aciunea difereniat a permis relevarea unor diferene biochimice importante ntre bacterii i fungi. Aceste medicamente, care includ amfotericina B i nistatinul acioneaz asemntor altor ageni litici: vitamina A, detergenii ionici, saponine. Vitamina A (un compus polienic) este agent hemolitic (Johnson i colab., 2004). Liza se poate datora oxidrii vitaminei A n interiorul membranei celulare. Aciunea vitaminei A poate fi prevenit de anumii antioxidani. Antibioticele polienice i saponina acioneaz prin mecanisme identice: interacioneaz cu sterolii membranari, penetreaz membrana i produc alterri ale permeabilitii organismelor sensibile, ducnd la pierderea constituienilor citoplasmatici eseniali, rezultatul fiind moartea celulei. Moleculele polienice sunt amfipatice, avnd grupri hidrofobe i hidrofile. Membrana celular este situsul aciunii antibioticelor polienice i ca rezultat al legrii polienelor i pierde funcia de barier selectiv de permeabilitate. Medicamentele se intercaleaz n membrane i formeaz un canal, prin care componentele celulare, n special ionii de K, prsesc citoplasma i altereaz gradientul protonic al membranei. Oligomerii se formeaz prin asocierea monomerilor n conexiune cap-coad, formndu-se complexe suficient de lungi pentru a strpunge membrana i s induc efectele lezionale. Dei ergosterolul este sterolul structural predominant al celulei fungice, ali civa steroli pot s contracareze efectul inhibitor al polienelor: colesterolul, sitosterolul, stigmasterolul i ntr-o msur mai mic, lanosterolul. Sterolii sunt cei mai eficieni n anularea activitii polienelor, avnd cel mai puternic efect asupra spectrului de aciune al polienelor. Sensibilitatea la poliene se manifest i la alte grupe de organisme: alge, protozoare (Leishmania donovani). Antibioticele polienice sunt relativ toxice pentru eritrocitele mamiferelor.

Structura molecular a amfotericinei B

Amfotericina este mai activ fa de celulele fungice, dect fa de cele mamaliene, datorit tipului de sterol ncorporat n membran. Amfotericina induce peroxidarea lipidelor din structura membranei, rezultatul fiind modificarea permeabilitii. Amfotericina B este insolubil n ap, iar pentru a deveni activ biologic, trebuie solubilizat n mediul apos. Medicamentul nu interacioneaz cu colesterolul, ceea ce explic efectele toxice selective ale concentraiilor mici de amfotericin B, la care medicamentul este monomeric, asupra membranelor cu ergosterol. Amfotericina monomeric s-ar asocia cu ergosterolul n grosimea membranei i ar duce la formarea canalelor transmembranare. Specificitatea medicamentelor pentru membranele cu ergosterol se crede c se datoreaz interaciunii canalului format de amfotericina B, cu ergosterolul n membran.

201

Formarea canalelor oligomerice este condiionat de o concentraie prag a amfotericinei (Fig. 57). Oligomerii se formeaz prin asocierea cap-coad a moleculei, ceea ce duce la formarea complexelor suficient de mari pentru a strpunge membrana i a produce efectele toxice.

Figura 57. Reprezentarea schematic a mecanismului de aciune a amfotericinei B asupra celulei fungice (a) i mamaliene (b) (dup Brajtburg i colab., 1996).

Specificitatea amfotericinei B pentru membranele care conin colesterol poate fi de asemenea asociat cu fosfolipidele i cu raportul sterolului fa de fosfolipide. Medicamentul interacioneaz mai puin probabil cu membranele care conin colesterol. S-a sugerat c amfotericina B produce leziuni oxidative ale membranei plasmatice fungice. Se pare ns, c amfotericina B are efect antioxidant in vivo, protejnd celulele fungice de atacul oxidativ al gazdei. Macrofagele pot avea rol de rezervor de amfotericina B, att pentru aciunea fa de paraziii intracelulari, ct i extracelulari. Dup ce amfotericina B se asociaz cu lipidele membranare, este preluat de macrofage i monocite i inhib paraziii fungici deja prezeni n interiorul acestor celule sau se disociaz de lipidele membranare i acioneaz asupra paraziilor extracelulari. In general, polienele sunt fungicide la concentraiile care inhib complet creterea microorganismului sensibil. Amfotericina B este fungicid att in vivo ct i in vitro. Este activ fa de Candida spp., Blastomyces, Histoplasma, Cryptococcus neoformans (C. neoformans este inhalat din mediu, crete n esutul pulmonar, se disemineaz n organism, crete n creier i persist n prostat. C. neoformans persist n toate fluidele bogate n fosfolipide, acizi grai i compui icozanoidici), fa de fungii filame ntoi Aspergillus, Zygomyces i fungii dimorfici (de exemplu C. albicans), cresc att sub form tipic de levur, ct i sub form de micelii. Candida formeaz proiecii hifale, lungi i subiri, asociate cu patogenitatea. Polienele sunt active fa de micoplasme. Micoplasmele nu au perete celular, fiind asemntoare protoplatilor. Deosebirea const n faptul c micoplasmele necesit steroli pentru cretere. Amfotericina B s-a folosit n terapia infeciilor fungice mai mult de 40 de ani. Dei s-au descoperit alte medicamente antifungice, amfotericina B rmne medicamentul de elecie pentru tratamentul infeciilor

202

fungice sistemice severe i este alternativa pentru tratamentul leishmaniozei viscerale. Amfotericina B i nistatinul s-au folosit pentru tratamentul anumitor infecii cu protozoare. Amfotericina B se administreaz intravenos, pentru tratamentul infeciilor sistemice (Van Etten i colab., 1991). Toxicitatea, n special fa de rinichi, dar i riscul producerii anemiei a limitat folosirea acestui medicament. Anemia poate s nu se datoreze aciunii toxice asupra eritrocitelor, ci supresiei mduvei osoase. Nistatinul este mai puin eficient i se folosete pentru aplicare local sau se administreaz oral n cazul implicrii intestinului. Rezistena apare rareori i constituie un obstacol major n utilizarea terapeutic a polienelor. Inhibitorii biosintezei ergosterolului Compuii azolici. Alilaminele, tiocarbamaii, compuii azolici i morfolinici se folosesc n tratamentul micozelor ca inhibitori ai cii de biosintez a ergosterolului. Toate aceste medicamente interacioneaz cu enzimele implicate n sinteza ergosterolului din squalen, care este produs din acetat prin acetil-CoA, hidroximetilglutaril-CoA i mevalonat. Squalenul este un compus poliprenil cu 30 atomi de C, care conine 6 uniti prenil (C5H8). Prenilul este de asemenea cunoscut sub denumirea de izopren sau izoprenoid. Structura de baz a tuturor steroizilor este format prin condensarea a 6 grupri prenil.

Structura molecular a grupului prenil

Ergosterolul este important pentru fungi, deoarece este sterolul dominant n membrana plasmatic a acestor organisme. Cantiti foarte mici de ergosterol sunt necesare pentru ca celulele s progreseze n ciclul celular. In 1969, doi compui propui de dou laboratoare diferite au fost introdui n clinic pentru tratamentul infeciilor fungice: clotrimazol i miconazol. A urmat econazolul (1974). Aceti 3 compui azolici rmn cei mai importani pentru terapia multor dermatofitoze. Agenii azolici antifungici inhib sinteza ergosterolului, un compus major al membranei plasmatice a fungilor, prin inhibiia lanosterol-demetilazei, enzim dependent de citocromul P450, denumit i 14E-steroldemetilaz (P-450DM). Aceiai enzim are rol important n sinteza colesterolului n celulele mamiferelor. Administrarea compuilor azolici n concentraii terapeutice i datoreaz eficiena, afinitii lor mai mari pentru P-450DM fungic, dect pentru enzima mamiferelor. Expunerea fungilor la un compus azolic produce epuizarea ergosterolului i acumularea sterolilor metilai 14E. Ergosterolul, pentru celula fungic, are funcii multiple, una dintre ele fiind asemntoare celei hormonale, deoarece stimuleaz creterea i diviziunea. Efectele medicamentelor se manifest cnd pierderea ergosterolului este aproape complet. Este perturbat att structura membranei celulei fungice, ct i funciile sale eseniale: permeabilitatea selectiv i transportul nutrienilor, sinteza chitinei (Hector, 1993). Rezultatul net este inhibiia creterii fungice. Agenii azolici antifungici utilizai n clinic, conin 2 sau 3 atomi de N n inelul azolic i sunt clasificai ca imidazoli (de exemplu, ketoconazol, miconazol, clotrimazol) sau ca triazoli (de exemplu, itraconazol i fluconazol). Cu excepia ketoconazolului, folosirea imidazolilor i triazolilor este limitat la tratamentul micozelor superficiale. Clotrimazolul este activ, in vitro, fa de dermatofite, levuri patogene, fungi filamentoi i dimorfici, dar i fa de unele bacterii Gram pozitive. In clinic se folosete pentru tratamentul infeciilor dermatofite, infeciilor fungice superficiale (tinea versicolor, infecii orale i vaginale cu Candida). Activitatea clotrimazolului, in vitro, este comparabil cu a amfotericinei B. Este mai activ dect griseofulvina i nistatinul. Acioneaz asupra membranei celulei fungice, a crei permerabilitate o perturb.

Structura molecular a clotrimazolului

203

Miconazolul este un derivat fenetil-imidazol. Are toxicitate suficient de mic, astfel nct se administreaz intravenos, pentru terapia infeciilor fungice sistemice. Este eficace pentru tratamentul infeciilor fungice superficiale: dermatofite, candidoz cutanat i vaginal.

Structura molecular a miconazolului

Econazolul este un derivat antifungic imidazolic, cu o structur identic cu a miconazolului, deosebirea constnd n absena unui atom de Cl pe un inel benzenic. Activitatea antifungic in vitro a econazolului este comparabil cu a miconazolului: are spectru larg de activitate fa de dermatofite, Candida spp., alte levuri patogene, fungi filamentoi i unele bacterii Gram pozitive (Georgopapadakou i Walsh, 1996). S-a folosit pentru terapia local a dermatofitelor, micozelor superficiale (tinea versicolor, candidoz cutanat). Nu este adecvat pentru administrare sistemic, deoarece se leag stabil de proteinele serice.

Structura molecular a econazolului

Denumirile generice i comerciale, structurile chimice, formulrile i indicaiile privind imidazolii antifungici i a terconazolului, un derivat triazolic, utilizabili n clinic sunt prezentate n tabelul 36.
Tabelul 36. Principalii ageni terapeutici utilizai in infeciile fungice (dup Topley i Wilsons, 1998). Denumire Formul chimic Compoziie Indicaii comercial terapeutice Canesten Tablete Infectii fungice Mycelex vaginale 100, superficiale, Mycelex G 200, 500 mg dermatomicoze, Lotrimin Tablete orale Tinea versicolor, Gyne-Lotrimin 10 mg Candidoze vaginale Fungoid Creme si loiuni 2%

Denumire Clotrimazol

Miconazol

Minostat Minostat-Derm Minostat i.v.

Soluie sterila parenterala 10 mg Supozitoare vaginale 20 mg Creme si loiuni 2%

Infectii fungice sistemice, coccidioidomicoze, Candidoze, criptococcoze, paracoccidioidomicoze, pseudoallescherioze Candidoze cronice mucocutanee

204

Econazol

Spectazol Pevaryl

Creme topice, vaginale, spray, pudre

Infectii fungice superficiale, dermatomicoze, Tinea versicolor, Candidoze vaginale

Ketonazol

Nizoral Fungarol Fungarest Orifungal

Tablete orale 200 mg Crem si soluie 1%

Infectii fungice sistemice, blastomicoze, anumite forme de coccidioidomicoze si histoplasmoze, Candidoze mucocutanee cronice, paracoccidioidomicoze, si pseudoallescherioze Infectii fungice superficiale, dermatomicoze, Tinea versicolor, Nu sunt recomandate in meningite fungice Infectii fungice superficiale, dermatomicoze, Tinea versicolor, Candidoze cutanate Candidoze vaginale

Bifonazol

Mycospor Mycosporan

Crem soluie 2%

si

Butaconazol

Femstat

Crem vaginal 1% Ovule vaginale 100 mg

Croconazol

Pilzein

Crem/gel 1%

Infectii fungice superficiale, dermatomicoze, Tinea versicolor, Candidoze cutanate

205

Fenticonazol

Lomexin

Creme vaginale si topice 2%

Infectii fungice superficiale, dermatomicoze, Tinea versicolor, Candidoze vaginale si cutanate

Isoconazol

Travogen Gyn-Travogen

Creme vaginale si topice 2%

Infectii fungice superficiale, dermatomicoze, Tinea versicolor, Candidoze vaginale si cutanate

Oxiconazol

Oceral Myfungar Gyno-Myfungar Okinazol Derimin

Creme, sprayuri, pudre 1%

Infectii fungice superficiale, dermatomicoze, Tinea versicolor, Candidoze vaginale si cutanate

Sulconazol

Exelderm Sulcosyn

Creme 1%

Infectii fungice superficiale, dermatomicoze, Tinea versicolor, Candidoze vaginale si cutanate

Tioconazol

Trosyd Gyn-Trosyd

Creme, loiuni, 1%

pudre, spray

Infectii fungice superficiale, dermatomicoze, Tinea versicolor, Candidoze vaginale si cutanate

Terconazol (trionazol)

Terazol Gyn-Terazol Fungistat

Creme vaginale 0.8% Ovule vaginale 40, 80 mg

Candidoze vaginale

Itraconazol

Sporanox

Capsule orale

Infectii

fungice

206

100 mg Solutie orala 10mg/ml

Fluconazol

Diflucan

Tablete orale 50, 10, 150, 200 mg Suspensie oral 10, 40 mg/ml Soluie steril i.v. 2 mg/ml

superficiale si sistemice inclusiv tinea versicolor, dermatomicoze, Tinea versicolor, Candidoze vaginale cutanate si sistemice, aspergiloze sistemice, sporotrichoze, chromomicoze Infectii fungice superficiale si sistemice inclusiv tinea versicolor, dermatomicoze, Tinea versicolor, Candidoze vaginale cutanate si sistemice. Indicate special in meningite fungice

Mecanismul de aciune nu este clar: peretele celular la C. albicans pare a fi evident deformat dup tratament, iar membrana plasmatic i cea mitocondrial apar alterate. Mitocondriile par a fi cele mai sensibile. Compuii azolici, care includ imidazolii (ketoconazol i miconazol) i triazolii (fluconazoli, itraconazol) au aciune specific fa de lanosterol-demetilaz, enzim a cii de sintez a ergosterolului. Aceast enzim este un citocrom P450 care conine hem la situsul activ. La concentraii mari, compuii azolici pot s interacioneze direct cu lipidele membranare. Ketoconazolul este un derivat imidazolic antifungic, activ pe cale oral. Este indicat pentru tratamntul blastomicozei, histoplasmozei diseminate. Aciunea sa este fungistatic i eliminarea infeciei necesit o activitate normal a funciei imunitare. Este eficient pentru tratamentul infeciilor fungice superficiale. Studiile dublu-orb (placebo i medicament) eu evideniat eficiena medicamentului n tratamentul tinea versicolor. Reaciile adverse, limitante ale dozei, sunt starea de ru general i voma. Fluconazolul este activ fa de C. albicans in vitro i in vivo i s-a folosit pentru tratamentul candidozei cutanate i orofaringiene. Deoarece administrarea oral este avantajoas, utilizarea s -a extins pentru tratamentul altor infecii fungice: criptococoza, histoplasmoza, coccidioidomicoza i a infeciilor cu fungi dimorfici (Van Etten i colab., 1991). 5-fluocitozina este ncorporat n celul de o citozin-permeaz i dezaminat n 5-fluorouracil, de o citozin-dezaminaz. 5-fluocitozina are aciune specific antifungic, deoarece celulele mamiferelor nu conin citozin-dezaminaz. Mecanismul primar de aciune al compuilor azolici const n inhibiia biosintezei ergosterolului, component esenial a membranei citoplasmatice a fungilor, rezultatul fiind acumularea lanosterolului sau a altor intermediari sterolici. Membrana fungic, spre deosebire de cea bacterian, conine steroli. Antibioticele polienice, care par s acioneze prin legarea de sterolii membranari, conin un centru hidrofob rigid i o regiune hidro fil flexibil. Structural, polienele sunt molecule lungi, meninute n extensie rigid de regiunea polienic. Ele interacioneaz cu celula fungic pentru a produce un complex steroli membranari -polien, ce altereaz permeabilitatea membranei (Van Etten i colab., 1991). Este de fapt un por (canal) membranar, ce altereaz profund permeabilitatea membranei: coninutul celulei (ionii de K+ i glucoza) difuzeaz n mediul extracelular. Celulele procariote nu leag i nu sunt inhibate de poliene. Dei au fost izolate numeroase antibiotice polienice, numai amfotericina B se folosete pentru administrare sistemic. Nistatinul se folosete pentru administrare local, iar primaricina, ca preparat cu uz oftalmic. Unii dintre derivaii azolici antifungici sunt activi fa de citocromul P450, implicat n demetilarea lanosterolului. Inhibiia biosintezei ergosterolului duce la dezorganizarea structural a membranei plasmatice fungice i la alterarea permeabilitii i funciei de transport. Leziunile membranare duc la dezechilibru metabolic, rezultnd inhibiia creterii celulei fungice sau moartea celulei.

207

Activitatea antifungic primar de inhibiie a biosintezei ergosterolului membranar tinde s fie o aciune fungistatic i nu fungicid. De aceea, derivaii azolici antifungici necesit activitatea funciei imunitare pentru a elimina fungii invadatori. Derivaii azolici antifungici pot s afecteze respiraia fungic. Se sugereaz existena a cel puin dou mecanisme distincte de aciune a dervailor antifungici: - mecanismul fizico-chimic, dependent de faza de cretere a miceliului, necesit concentraii mari de medicament, efectul fiind fungicid; mecanismul nu este comun tuturor derivailor azolici; - mecanismul metabolic, se produce la concentraii mici de medicament, este un eveniment fungistatic, comun tuturor derivailor azolici. Clinic, majoritatea derivailor azolici antifungici produc efecte fungistatice. Efectele fungicide au fost raportate de studiile in vitro. Flucitozina (5-fluorocitozina) este un agent antifungic inhibitor pentru speciile de levuri. Este convertit n celula fungic la 5-fluorouracil, care inhib timidilat-sintetaza, producnd un deficit al timinei i al sintezei ADN

10.3. Rezistena fungilor la medicamente

In anii 90, rezistena fungic a devenit o problem important la pacienii cu infecii cronice cu HIV, M. tuberculosis i cu alte bacterii. S-a nregistrat o cretere dramatic a incidenei infeciilor fungice, n special datorit alterrii strii imunitare asociat cu SIDA, chimioterapie antineoplazic sau imunosupresia asociat cu transplantul. La pacienii HIV, rezistena infeciei orofaringiene cu Candida este o problem important. Cile prin care fungii previn aciunea medicamentelor, substanelor chimice antiseptice sau dezinfectante sunt puin cunoscute. Rezistena antifungic poate fi mprit n dou categorii: rezistena clinic i rezistena in vitro. Infecia fungic refractar la tratamentul cu un medicament antifungic este definit ca rezisten clinic. Una dintre cauzele comune ale rezistenei este infecia cu o tulpin fungic pentru care concentraia minim inhibitorie (CMI) este mai mare dect valoarea medie. Rezistena in vitro poate s fie primar i secundar. Rezistena primar poate fi intrinsec (nscut) i se datoreaz rezistenei naturale la agentul antifungic: peretele celular este o barier mecanic ce diminu sau chiar exclude ptrunderea agentului antimicrobian. Rezistena secundar sau dobndit semnific ctigarea rezistenei de ctre o tulpin la agentul terapeutic antifungic. Aceast form de rezisten, rar acum cteva decenii, este cea mai frecvent la pacienii SIDA, care sufer de candidoz orofaringian sau esofagian recurent, rezistent la compuii azolici (Sheehan i colab., 1999). Cauzele rezistenei sunt multiple. Tulpinile rezistente pot fi saprobionte la un individ sntos. Ele devin patogene la persoanele imunocompromise. Tulpinile rezistente de C. albicans pot s apar prin nlocuirea celor sensibile. Analiza RFLP (restriction fragment length p olymorfism) a evideniat modificri genetice, n absena modificrilor fenotipice. O tulpin poate s devin rezistent prin expunerea la aciunea medicamentului, pentru perioade lungi. Medicamentul nu produce rezistena, dar selecteaz tulpinile cu un nivel iniial redus de rezisten. In intervalul aciunii medicamentului, celula se adapteaz la concentraii progresiv crescnde de medicament. Tulpinile de Candida pot deveni tranzitoriu rezistente la medicamente, fenomen denumit rezisten epigenetic. Fenotipul rezistent poate reversa la un fenotip sensibil, odat cu ntreruperea administrrii medicamentului i eliminarea presiunii selective. C. albicans poate deveni rezistent prin mecanisme genetice mutaionale. Mutaia genic are o frecven mic (10-6 10-8). Mecanismele moleculare ale rezistenei fungilor la medicamente sunt diverse (White i colab., 1998). Cele mai frecvente includ: - diminuarea importului medicamentului n celul; - modificarea chimic sau chiar degradarea enzimatic a medicamentului n celul; - creterea ratei efluxului medicamentului; - modificarea mutaional a intei celulare a medicamentului. Metoda standard pentru evaluarea ratei importului medicamentului const n determinarea cantitii de medicament ce se asociaz cu celulele, n perioade scurte de timp (mai puin de 10 secunde). Perioada de incubaie scurt se realizeaz prin amestecul celulelor i medicamentului pe un suport inert (strat de ule i mineral). Dup incubri scurte, celulele se recolteaz i se determin cantitatea de medicament. Mecanismele prin care medicamentele sunt transportate n celul sunt necunoscute. Transportul membranar pare a fi dependent de energie. S-a studiat rata acumulrii medicamentelor pentru care CMI este

208

nalt. Utilizarea medicamentelor marcate radioactiv (fluconazol) a evideniat c, de regul, izolatele rezistente acumuleaz cantiti mai mici de medicament, comparativ cu cele rezistente. Celulele eucariote conin dou tipuri de pompe de eflux, ce contribuie la rezistena la medicamente: - transportori ABC (ATP-binding cassette); - proteina transportoare din categoria facilitatorilor majori (MF). Ambele tipuri de pompe produc rezistena la medicamente. Transportorii din familia ABC sunt proteine cu domenii membranare multiple, cu 6-7 secvene incluse n membran i cu dou domenii care leag nucleotidele (NBD = nucleotide binding domains). NBD leag ATP, utilizat ca surs de energie pentru transportorii de tip ABC. Acetia realizeaz efluxul activ din celul, al moleculelor toxice relativ hidrofobe. Transportorii din categoria MF sunt puin cunoscui la fungi, dar sunt asociai cu rezistena la molecule relativ hidrofobe. Nu conin NBD, sursa de energie fiind fora proton motrice (PMF), adic gradientul de H+ pe cele dou fee ale membranei. Transportorii MF funcioneaz prin antiport: protonii sunt pompai n celul, iar molecula substrat este pompat la exterior.

Bibliografie selectiv
1. Brajtburg J., Bolard J., Carrier effects on biological activity of amphotericin B, Clinical Microbiology Reviews. 1996, 9(4): 512-531. 2. Fromtling R.A., Overview of medically important antifungal azole derivatives, Clinical Microbiology Reviews.1988, 1(2): 187-217. 3. Georgopapadakou N. H., Walsh T. J., Antifungal agents: chemotherapeutic targets and immunologic strategies, Antimicrob. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1996, 40: 279-291 4. Hector R.F., Compounds active against cell walls of medically important fungi, Clinical Microbiology Reviews.1993, 6(1): 1-21. 5. Johnson MD, MacDougall C, Ostrosky-Zeichner L, Perfect JR, Rex JH., Combination Antifungal Therapy, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2004, 48(3): 693-715. 6. Lortholary O., Dupont B., Antifungal prophylaxis during neutropenia and immunodeficiency , Clinical Microbiology Reviews.1997, 10(3): 477-504. 7. Sheehan D.J., Hitchcock C.A., Sibley C.M., Current and Emerging Azole Antifungal Agents, Clinical Microbiology Reviews. 1999, 12(1): 40-79. 8. Topley and Wilsons Microbiology and Microbial Infections, Vol. I , II, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman, 1998. 9. Van Etten E.W., van de Rhee N.E., van Kampen K.M., Bakker-Woudenberg I.A., Effects of amphotericin B and fluconazole on the extracellular and intracellular growth of Candida albicans, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1991, 35(11): 2275-2281. 10. White T.C., Marr K.A., Bowden R.A., Clinical, Cellular, and Molecular Factors That Contribute to Antifungal Drug Resistance, Clinical Microbiology Reviews.1998, 11(2): 382-402. 11. White T.C., Marr K.A., Bowden R.A., Clinical, Cellular, and Molecular Factors That Contribute to Antifungal Drug Resistance, Clinical Microbiology Reviews.1998, 11(2): 382-402. 12. Wistreich G. A., Lechtman M. D. Microbiology, Macmillan Publishing Comp., 1984. 13. Zarnea G. Microbiologie general, Editura Didactica si Pedagogica Bucuresti, 1970

209

Capitolul 11 AGENI TERAPEUTICI AI INFECIILOR PRODUSE DE PROTOZOARE

Un grup mic de protozoare parazite produc modificri majore ale strii funcionale ale mucoasei la om: Giardia duodenalis, Trichomonas vaginalis i Entamoeba histolytica. Ulterior, s-au identificat Blastocystis hominis, Cryptosporidium parvum, Isospora spp. i Cyclospora spp. Metabolismul acestor protozoare pare a fi anaerob i microaerotolerant (Topley i Wilsons, 1998). Metabolismul anaerob protejeaz un complex enzimatic cu potenial redox sczut: piruvat-feredoxin oxidoreductaza i feredoxina, care activeaz medicamentul nitroimidazolic metronidazol, folosit pentru tratamentul infeciilor cu G. duodenalis, E. histolytica, T. vaginalis (Moulder, 1985). Astfel de ci metabolice ancestrale, funcioneaz i la bacteriile anaerobe, de asemenea sensibile la metronidazol, dar nu se regsesc la alte eucariote. Existena lor este un argument n favoarea ipotezei c protozoarele anaerobe s-au diversificat foarte timpuriu n linia de evoluie a eucariotelor.

11.1. Ageni terapeutici ai giardiozei

G. duodenalis (sinonim G. lamblia sau G. intestinalis) este un protozoar flagelat, fiind cel mai comun n tractul intestinal i produce boala diareic datorat consumului de ap contaminat i mai rar de produsele alimentare, n toat lumea. In anumite zone, consumul apei contaminate cu chiti de G. duodenalis este cauza cea mai comun a diareii cronice a cltorilor. G. duodenalis parcurge un ciclu de via, format din dou stadii. Parazitul este ingerat n form de chist inactiv, cu apa contaminat, mai rar prin alimente sau prin contact direct fecal-oral. Chistul este relativ inert, dar asigur supravieuirea n condiii improprii de mediu. Chistul evolueaz n form activ de trofozoid, n duoden, dup trecerea prin mediul acid al stomacului. Trofozoidul este forma vegetativ, care se hrnete pe mucoasa duodenal sau jejunal i se reproduce prin fisiune binar. In acest stadiu produce simptome diareice i de malabsorbie. Dup expunerea la srurile biliare, unii trofozoizi formeaz chiti n jejun i trec n fecale, completnd ciclul de propagare prin infectarea unei noi gazde. Perioada de incubaie a infeciei cu Giardia este de 1-2 sptmni. nchistarea poate fi iniiat in vitro, prin cultivarea parazitului n mediu cu o concentraie redus de sruri biliare i colesterol, urmat de cultivarea ntr-o concentraie crescut de bil, la pH alcalin (7,8). Proteinele peretelui chistului sunt transcrise, secretate n vezicule specifice stadiului de nchistare i sunt transportate n peretele celular care se formeaz n 14-16 ore. Inchistarea a fost stopat dac s-a adugat colesterolul, ceea ce duce la concluzia c nchistarea este asociat cu epuizarea colesterolului. G. duodenalis se gsete n tractul digestiv al unor mamifere: pisic, cine, bovine. Transmiterea la om se face dup ingestia apei contaminate, uurat de relativa rezisten a chistului la clorinare i de capacitatea acestuia de a supravieui n ap, timp de cteva sptmni. Transmiterea prin alimente, prin ciclul fecal-oral, n special n comunitile de copii i prin practici sexuale care includ contactul oral-anal, reprezint moduri alternative de transmitere a infeciei. Giardia este un organism eucariot tipic, cu nucleu distinct, delimitat de membrana nuclear, citoschelet, sistem de membrane intracelulare, nu are nucleol i mitocondrii, iar reproducerea este asexuat. Cele mai multe organisme eucariote i produc energia pe calea metabolismului aerob (Brock, 1998). Metabolismul energetic al paraziilor Giardia, Trichomonas i Entamoeba este de tip fermentativ. Sinteza ATP este dependent numai de reaciile de fosforilare la nivelul substratului. In absena mitocondriilor, ciclul acizilor tricarboxilici este absent, dei malat-dehidrogenaza (enzim a ciclului) este prezent (fig. 58). In consecin, glucoza nu este oxidat complet pn la CO2 i H2O, ca n metabolismul aerob, ci este catabolizat incomplet, la acetat, etanol, alanin i CO2.

210

Figura 58. Cile intermediare ale sintezei piruvatului (adaptare dup Adam, 2001).

Calea metabolismului piruvatului (produsul cii glicolitice) este modificat n funcie de condiiile anaerobe su microaerofile. Proporia produselor finale este influenat de presiunea parial a O 2 i de concentraia glucozei n mediu. In condiii strict anaerobe, produsul major al catabolismului glucide lor este alanina. Alanina se sintetizeaz ca produs final principal al metabolismului energetic, iar valina este produsul secundar. G. duodenalis nu sintetizeaz ali aminoacizi (fig. 59). In vitro, n prezena unor cantiti mici de O2 (mai mici de 0,25 QM), producerea alaninei este inhibat, dar este stimulat producerea de etanol. La concentraii mai mari de 0,46 QM de O2, producerea alaninei este complet inhibat i n metabolismul energetic sunt produse acetatul i CO2.

Figura 59. Sinteza produselor finale din piruvat, la G. duodenalis. Alanina este produs numai n condiii de anaerobioz. In reacia de decarboxilare oxidativ a piruvatului, acceptorul de electroni este feredoxina, a crui reducere este catalizat de PFOR (piruvat-feredoxin-oxidoreductaza). In condiii de aerobioz, se formeaz acetatul, iar n anaerobioz pe lng acetat, sunt produse i etanolul i alanina (dup Adam, 2001).

Aceste valori sunt relevante pentru mediul intestinal, deoarece concentraia O2 variaz ntre 0 i 60 QM. O condiie special pentru creterea in vitro a trofozoizilor de G. duodenalis este necesarul absolut pentru concentraiile relativ mari de cistein, aminoacid care confer protecie parial fa de toxicitatea O2. Alanina favorizeaz adaptarea trofozoiilor la mediul hipoosmotic. In mediul hipoosmolar, concentraia intracelular a alaninei scade printr-un mecanism de transport activ. Secreia alaninei se face printr-un transportor de alanin, care transport i L-serina, glicina, L-treonina, L-glutamina i L-asparagina. Transportorul funcioneaz ca antiport, prin schimbul alaninei intracelulare cu ali aminoacizi din mediul extracelular. Calea arginin-dihidrolazei este o surs potenial de energie. Calea funcioneaz la unele organisme procariote, iar la eucariote funcioneaz la G. duodenalis i T. vaginalis. Pe calea arginin-dihidrolazei, arginina este convertit la ornitin i NH4, cu generarea ATP din ADP, prin fosforilare la nivelul substratului. Ornitina este exportat la schimb cu arginina extracelular, printr-un mecanism de transport. Dei

211

metabolismul este anaerob, trofozoiii produc radicali liberi ai O2, care trebuie detoxificai. La G. duodenalis, prezena SOD (superoxid dismutaza), catalazei sau peroxidazei este incert. Ca o cale major a eliminrii radicalilor reducerii pariale a O2 s-a propus o NADH-oxidaz productoare de H2O. In lipsa mitocondriilor, enzimele cii glicolitice se gsesc n citosol sau pe suprafaa citosolic a membranelor. Glucoza, ca surs energetic major, este convertit la piruvat pe calea EMP (Embden-Meyerhof-Parnas) i HMP (hexozomonofosfatului).La majoritatea organismelor eucariote i procariote, conversia fructozo-6 fosfatului la fructozo-1,6-difosfat este o reacie ireversibil catalizat de fosfofructokinaza dependent de ATP. La G. duodenalis, T. vaginalis, E. histolytica, aceast reacie este catalizat de o fosfofructokinaz dependent de PPi i este reversibil. S-au identificat dou enzime care convertesc fosfoenol-piruvatul la piruvat: piruvat-kinaza dependent de ATP i piruvat-fosfat-dikinaza (PPDK piruvat p hosphate dikinase). Reacia mediat de PPDK convertete fosfoenol-piruvatul + AMP, la piruvat + 2 molecule de ATP, fiind mai avantajoas energetic. Conversia piruvatului la acetil-CoA este catalizat de piruvat-feredoxin oxidoreductaz (PFOR), care utilizeaz feredoxina ca acceptor de electroni, n locul piruvat-dehidrogenazei cu NAD de la eubacterii i eucariotele aerobe. De la PFOR, electronii sunt transferai la feredoxin. Sistemul enzimatic al piruvat-feredoxin-oxidoreductazei (PFOR) catalizeaz oxidarea piruvatului pentru a forma acetil-CoA i CO2. Feredoxina este un transportor de e-, care i poate dona unei hidrogenaze, cu formarea H2 . Feredoxinele sunt proteine cu Fe i S, care funcioneaz i n alte reacii: fixarea N2, fotosintez. PFOR catalizeaz o reacie rapid de schimb ntre CO2 i gruparea COOH a piruvatului(CH3 CO - COOH), reacie ce poate fi folosit pentru a diferenia PFOR de alte enzime de clivare a piruvatului. In condiii reductoare, reacia poate fi reversibil, permind sinteza piruvatului din acetat i CO2 .PFOR are un rol important n procesele de oxidoreducere ale bacteriilor anaerobe (Clostridium). Enzima permite reutilizarea H2 ca potenial reductor, avnd rol de hidrogenaz de nglobare. Are un potenial redox foarte mic, asemntor cu al H2 (-0,42 V). ATP este generat prin fosforilare la nivelul substratului. Unele enzime ale cii glicolitice sunt dependente de pirofosfat (PPi), n loc de ATP, ceea ce sugereaz un mecanism mai primitiv de utilizare a energiei din legtura PPi. In calea de transport a electronilor, n procesele de oxidare a substratului energetic, lipsesc citocromii. Oxidaza terminal care convertete oxigenul direct la ap, la acest organism microaerotolerant, are rolul de a proteja PFOR i feredoxinele, enzime cu potenial redox sczut, foarte sensibile la prezena O2. Sensibilitatea la aciunea metronidazolului (5-nitroimidazol) const n aceea c PFOR i feredoxina activeaz medicamentul in vitro i l reduc la forma nitroso i la ali radicali (Gardner, 2001). Astfel este ntrerupt fluxul electronilor i calea metabolic productoare de energie. La tulpinile de Giardia rezistente la metronidazol, PFOR are un nivel de 5 ori mai sczut dect la tulpinile sensibile, nivel corelat cu reducerea ratei de activare a medicamentului la forma nitroso. Efluxul crescut al metronidazolului este de asemenea implicat n protecia parazitului. Pentru tramentul infeciilor cu G. duodenalis s-au utilizat benzimidazolii. Efectul lor toxic se exercit, parial, prin legarea de citoscheletul de F-tubulin al parazitului. Legarea produce inhibiia polimerizrii citoscheletului i a nglobrii glucozei. Benzimidazolii se absorb puin din tractul gastrointestinal, dar coingestia cu alimentele grase amelioreaz absorbia. Entamoeba histolytica este una dintre cele 6 specii de amoebe parazite ale genului Entamoeba, infecioase pentru om. Stadiul de trofozoit a fost descris de Loesch (1875), iar forma de chist, de ctre Quincke i Ross (1893) (citai de Bruckner, 1992). Chitii supravieuiesc n ap i reprezint forma infecioas prin ingestia apei. Chitii sunt singurele forme infecioase. Cele mai mlte cazuri c linice sunt rezultatul eliminrii chitilor de ctre purttorii umani asimptomatici. Ciclul de dezvoltare cuprinde urmtoarele stadii morfo-funcionale: trofozoidul, prechistul, chistul, metachistul i trofozoidul metachistic. Trstura structural distinct a chistului este un perete ce se dezvolt n jurul formei prechistice. Nucleul unic se divide i rezult 4 nuclei. In stadiul de metachist, amoeba cu 4 nuclei este foarte activ, se separ de peretele chistului i prsete peretele printr-un por. In trofozoidul metachistic, cei 4 nuclei se divid i formeaz 8 trofozoizi metachistici uninucleai, de dimensiuni mai mici. Perioada de incubare dup ingestia apei contaminate cu chiti, este variabil: zile, luni sau chiar mai mult. E. histolytica este unic printre amoebele intestinale parazite la om, deoarece poate s depeasc peretele intestinal i s invadeze esuturile. S -au identificat receptorii celulari la care ader E. histolytica: o lectin cu galactoz. Epiteliul colonic i mucusul conin glicoproteine cu resturi de galactoz i N-acetilgalactozamin. Metabolismul la Entamoeba este asemntor cu al Giardia i Trichomonas: anaerob, fermentativ, ca i al bacteriilor anaerobe. Entamoeba este microaerotolerant i poate s creasc n atmosfer cu 5% O2, dar metabolismul rmne anaerob. Amoebiaza extraintestinal s-a tratat cu metronidazol, dehidroemetin i cloroquin. Cloroquina se folosete pentru tratamentul abcesului hepatic amoebic, deoarece parazitul se concentreaz n ficat, dar nu se

212

folosete pentru tratamentul amoebiazei intestinale. Tratamentul este urmat de un amoebicid luminal: iodoquinol sau paromomicin.

Structura molecular a cloroquinei

Efectele secundare ale metronidazolului sunt starea de ru general, gust metalic, vertij, disbioz intestinal i vaginal cu creterea levurilor i o reacie asemntoare cu cea produs de desulfiram (acelerarea rapid a circulaiei sngelui, tahicardie, stare de ru general, vom, hipotensiune, vedere neclar), cnd administrarea sa este nsoit de consumul alcoolului. Antibioticul macrolid azitromicin a evideniat activitate fa de E. histolytica. Are avantajul penetrrii tisulare, perioadei lungi de njumtire, administrrii orale, al toxicitii sczute, ceea ce ofer perspectiva utilizrii terapeutice.

11.2. Ageni terapeutici ai infeciilor produse de Trichomonas vaginalis

Infecia cu Trichomonas vaginalis (Donne, 1836) este transmis sexual. Cea mai frecvent form de infecie neveneric este cea perinatal. Trofozoidul este flagelat i se divide prin fisiune binar. Nu se cunosc forme chistice. T. vaginalis se ataeaz de mucina epitelial prin intermediul unor adezine lectinice. Secret proteaze care degradeaz mucina, iar prin motilitatea flagelar, colonizeaz celulele epiteliale. T. vaginalis nu are mitocondrii. Lipsesc caracteristicile metabolismului respirator (citocromii i fosforilarea oxidativ). T. vaginalis este anaerob, dar rata sa de cretere este stimulat de nivele sczute de O2. Nivelul O2 de 0,025% este limita la care E. coli comut de la metabolismul aerob, cu citocrom oxidaza terminal funcional, la metabolismul anaerob. Totui, dei rata de cretere a T. vaginalis crete la tensiuni foarte mici pariale ale O2, abia detectabile prin spectrofotometrie, calea sintezei ATP prin reacii de fosforilare oxidativ nu a fost exploatat. Nutrienii sunt preluai prin mecanisme active ale transportului membranar i prin fagocitoz. Energia este produs prin glicoliza glucozei, la glicerol i succinat, n citosol, urmat de conversia piruvatului i malatului la H2 i acetat, ntr-un organit specific, denumit hidrogenosom. Hidrogenosomul conine componente de transport al electronilor, legate de PFOR, hidrogenaz i o oxidaz. Hidrogenosomii depoziteaz Ca sub form legat de malat si acetat. Aceast structur poate fi o mitocondrie degenerat, un organit derivat din simbioza cu o bacterie nrudit cu cele care au stat la originea diferenierii mitocondriilor sau o relicv a fuziunii timpurii dintre o celula de Archaea i o bacterie care a generat un eucariot ancestral (Petrin, 1998). Nitroimidazolii. Clasa nitroimidazolilor utilizai n tratamentul infeciilor cu protozoarele anaerobe include metronidazolul, tinidazolul, ornidazolul i secnidazolul. Metronidazolul (1-(F-hidroxietil)-2-metil-5 nitroimidazol, cu denumirea comercial Flagyl) a fost descoperit n 1957, iar rezistena la medicament s-a raportat dup 1962.

Structura molecular a metronidazolului

Este un medicament eficient pentru tratamentul infeciei cu Giardia, Entamoeba i Trichomonas. Medicamentul strbate prin difuzie pasiv membrana trofozoidului i dup ce ajunge n celul, feredoxinele (proteine de transport al electronilor), doneaz electronii gruprii nitrice (NO2-) a medicamentului. Prin

213

reducerea gruprii NO2-, metronidazolul se activeaz. Medicamentul redus realizeaz un gradient care favorizeaz transportul intracelular al metronidazolului. Forma redus funcioneaz ca acceptor final de electroni i se leag covalent de macromolecula de ADN. Rezultatul legrii este pierderea structurii helicale, imposibilitatea de a funciona ca matri pentru transcrierea ARN i ruperea catenelor, cu moartea ulterioar a trofozoidului (fig. 60).

Figura 60. Particularitatea fundamental a metabolismului protozoarelor anaerobe, la care piruvat-feredoxinoxidoreductaza (PFOR) funcioneaz n locul piruvat-dehidrogenazei organismelor aerobe. Electronii rezultai din decarboxilarea oxidativ a piruvatului (reacie catalizat de PFOR), sunt transferai la feredoxina oxidat (ox), care doneaz apoi electronii la NAD(P)+ (reacie catalizat de feredoxin-NAD oxidoreductaz), regenernd rezerva intracelular de NAD(P) i feredoxin oxidat. In procesul reducerii feredoxinei, este generat acetil-CoA din piruvat i CoA redus (CoASH). Feredoxina are un potenial redox suficient de sczut pentru a cataliza reducerea i activarea metronidazolului (R-NO2), la radicalul RNO 2-, pe calea feredoxinei reduse. NADH-oxidaza are rol de oxidaz terminal n transportul electronilor la O 2, cu formarea H2O. NADH-oxidaza are de asemenea, capacitatea de a reduce furazolidonul la radicalul nitric, cu efecte toxice. Reacia P FOR se produce n hidrogenosomul de la T. vaginalis (dup Adam, 2001).

Un efect suplimentar al metronidazolului este inhibiia transportului electronilor la feredoxin i blocarea cii metabolice a piruvatului. Metronidazolul acioneaz ca i nitritul de Na, prin distrugerea centrului Fe-S al PFOR, blocnd producerea ATP. Activarea metronidazolului prin reacia de reducere, poate duce la formarea radicalilor toxici, care reacioneaz cu componentele celulare es eniale. Chitii sunt mai rezisteni la aciunea nitroimidazolilor, probabil datorit permeabilitii reduse a peretelui celular pentru medicament. Dozele orale de metronidazol sunt uor absorbite i se regsesc n fluidele organismului, cu puine efecte secundare. Este eficient att n lumenul intestinului, ct i n esuturi. Metronidazolul este activ fa de bacteriile anaerobe i protozoare, deoarece dup ce a fost redus de feredoxin, care la rndul ei a fost redus de PFOR, genereaz un radical nitric toxic. Semnalarea tulpinilor rezistente de T. vaginalis nu a ridicat proporiile epidemiei. S-a sugerat c manifestarea fenotipic a rezistenei este asociat cu pierderea vitalitii parazitului, ceea ce diminu contactul ntre partenerii activi sexual. Rezistena G. duodenalis la metronidazol a fost indus in vitro i se coreleaz cu scderea activitii piruvat-feredoxin-oxidoreductazei a parazitului, necesar reducerii activatoare a nitroimidazolilor (Snipes i colab., 2000). Nitroimidazolii cu un grad mai nalt de substituie (miconazol, clotrimazol, itraconazol, ketoconazol), cu activitate antifungic, nu sunt activi fa de G. duodenalis. Efectele secundare ale metronidazolului sunt cefaleea, vertigo, starea de ru general, gustul metalic. Alcoolul trebuie evitat, deoarece metronidazolul inhib aldehid-dehidrogenaza i implicit calea de metabolizare a alcoolului, cu stare de ru general, tulburri gastrointestinale. Metronidazolul este mutagen pentru bacterii i carcinogen pentru oarece i obolan, administrat n doze mari pentru perioade lungi. Mutagenitatea nu s-a demonstrat fa de celulele umane, ceea ce sugereaz c este un medicament sigur. Furazolidonul (un compus nitroimidazolic) este activ fa de G. duodenalis. Mecanismul aciunii const n activarea reductiv n celula trofozoidului, dar spre deosebire de metronidazol, reducerea poate fi mediat nu numai de feredoxin, ci i pe calea NADH oxidazei. Produsele reducerii sunt toxice, lezeaz molecula de ADN i au efecte letale.

214

Quinacrina, introdus ca agent antimalaric n 1930, este tolerat mai bine dect quinina. Quinacrina este un derivat al colorantului acridin. Este un agent de intercalare: se inser ntre bazele ADN la G. duodenalis i se crede c aceast interaciune produce inhibiia sintezei ADN. Toxicitatea selectiv se explic prin ratele diferite de nglobare ale medicamentului n celula de G. duodenalis i n celulele umane. In vitro, quinacrina reduce viabilitatea chitilor i rata nchistrii. Medicamentul induce starea de rezisten in vitro, corelat cu diminuarea ratei de nglobare (Upcroft, 2001). Dei interacioneaz cu ADN, quinacrina nu este carcinogen. Se absoarbe rapid din tractul intestinal i se distribuie larg n esuturi. Are efecte colaterale multiple: febr, starea de ru general, vom, vertigo, decolorarea galben a tegumentului, exacerbarea psoriazis, psihoz. Paromomicina, un antibiotic din familia aminoglicozidelor, a fost izolat n 1956. Este folosit pentru tratamentul infeciilor cu E. histolytica i T. vaginalis. Se absoarbe ntr-o proporie sczut din intestin. De aceea, chiar dozele mari realizeaz concentraii sczute n mediul intern i n urina pacienilor cu funcie renal normal. Paromomicina inhib sinteza proteinelor prin legarea cu subunitile ribosomale 30 S i 50 S. ARNr de G. duodenalis are dimensiuni neobinuit de mari.

Structura molecular a paromomicinei

Bacitracin-zinc. Bacitracina s-a izolat n 1945, dintr-o tulpin de Bacillus i a fost folosit pentru tratamentul infeciilor stafilococice severe, pn n 1960. Datorit toxicitii sale i disponibilitii unor alte antibiotice, utilizarea sa s-a limitat n special la aplicare local. Zincul a fost adugat bacitracinei pentru a-i conferi stabilitate. Bacitracina exercit efectul antibacterian prin interferena cu sinteza componentelor membranare. Eficiena bacitracinei in vitro s-a demonstrat fa de E. histolytica i Trichomonas, iar a complexului bacitracin-zinc s-a evideniat fa de G. duodenalis. Inainte de a fi acceptat n tratamentul infeciei cu Giardia, sunt necesare investigaii suplimentare. Utilizarea complexului bacitracin-zinc are dezavantajul unei nefrotoxiciti poteniale prin administrare oral prelungit i al tulburrilor gastrointestinale.

11.3. Ageni terapeutici antimalarici

Plasmodium spp face parte din grupul protozoarelor sporozoare. Sporozoarele nu au organite de locomoie, dei unele formeaz pseudopode, iar uneori, gameii au mobilitate flagelar. Sporozoarele sunt un grup mare de protozoare, toate parazite obligate, unele pentru o singur gazd, altele pentru dou, n ciclul infecios n care se succed tipuri morfologice i fiziologice distincte. Modul de nutriie este particular: hrana nu este ingerat, ci este absorbit n form solubil, prin nveliul extern, ca la bacterii i fungi. Denumirea de sporozoare presupune formarea sporilor n ciclul de via. Totui, nu formeaz spori adevrai de tipul celor fungici, ci numai structuri analoge denumite sporozoizi, implicai n transmiterea la un nou tip de gazd (Starr i colab., 1981). Cei mai importani membri ai grupului sunt coccidiile, parazite la psri i plasmodiile (agenii malariei), infecioase pentru psri i mamifere, inclusiv pentru om. Omul este infectat de 4 specii de Plasmodium care produc malaria: P. vivax, P. falciparum, P. malariae, P. ovale. Toate necesit o alternan de gazde, om-nar. Speciile de Plasmodium difer morfologic, prin unele aspecte ale ciclului de via i prin severitatea malariei. Cel mai rspndit este P. vivax. Parazitul i desfoar o parte a ciclului de via la om i

215

alta la nar, vectorul care-l transmite de la om la om. Sunt implicai numai narii din genul Anopheles. Malaria este o boal infecioas, foarte frecvent n zonele tropical i subtropical. Cea mai caracteristic trstur a malariei este reacia febril paroxistic, la intervale de 1-3 zile, care alterneaz cu stri fiziologice normale. Gazdele sporozoarelor sunt specii de nevertebrate, dar mai ales vertebrate. Unele prezint o alternan obligatorie a gazdelor, deoarece unele stadii ale ciclului se desfoar la o gazd, iar alte stadii au loc n organismul altei specii gazd. Omul este infectat prin neptura femelei de nar, care i inser trompa direct ntr-un capilar sanguin, unde inoculeaz sporozoizii. Sporozoizii plasmodiali sunt celule alungite care se formeaz n organismul narului i se localizeaz n glanda salivar a insectei. Sporozoizii sunt transportai cu torentul sanguin n tot organismul, dar sunt reinui de celulele sistemului fagocitar mononuclear din ficat (celulele Kupffer), splin i din ganglionii limfatici. Nu se cunosc mecanismele prin care parazitul strbate epiteliul capilarelor sinusoide pentru a ajunge n spaiul Disse sau trec prin celulele Kupffer din pereii capilarelor sinusoidale pentru a ajunge n hepatocite. Interaciunea cu hepatocitul, probabil este mediat de receptori: proteina major a a membranei sporozoidului interacioneaz specific c u receptorii membranei hepatocitului (fig. 61).

Figura 61. Ciclul de via al parazitului malariei ( Plasmodium sp.) n organismul narului (gazda definitiv), respectiv i respectiv al gazdei intermediare (mamifere, om) (dupa Phillips, 2001).

In ficat, sporozoidul crete i se transform n schizont. Schizontul se fragmenteaz n mii de celule fiice mici, denumite merozoizi, care sunt eliberai din ficat n snge. Creterea i diviziunea parazitului malariei n hepatocit dureaz 6-15 zile, n funcie de specie (P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae ). La sfritul ciclului preeritrocitar, mii de merozoizi sunt eliberai din hepatocite, prin sinusoide, n snge i n 15-

216

20 de secunde se fixeaz pe suprafaa eritrocitelor i le invadeaz. Recunoaterea i legarea se fac printr-o interacie foarte specific ntre ligandul merozoidului i membrana eritrocitar. In eritrocit, merozoizii se multiplic. La P. vivax i P. orale, unii sporozoizi, dup 24 de ore de dezvoltare n hepatocite, reiau ciclul de multiplicare hepatic, sau trec ntr-un stadiu dormind, de hipnozoid, unde produc o infecie persistent, de lung durat (luni sau chiar ani de zile), rezistent la tratamentul infeciei sanguine i se reactiveaz dup ntreruperea tratamentului (Phillips, 2001). Stadiul latent se reactiveaz pentru completarea ciclului hepatic i eliberarea merozoizilor n snge. Merozoizii infecteaz hematiile, iniiind stadiul de schizont eritrocitar. La P. vivax, ciclul multiplicrii n hematie i liza ei dureaz 48 de ore. Stadiul multiplicrii eritrocitare este nsoit de simptomele alternante de febr i frig. Senzaia de frig apare cnd din eritrocite se elibereaz o nou generaie de parazii. Cele mai multe plasmodii tinere, eliberate din eritrocitul lizat, reiau ciclul infecios n noi eritrocite. O parte dintre merozoizi, n interiorul eritrocitului, se difereniaz n celule specializate. Acestea sunt celule sexuale (gametocite). Gametociii eliberai din eritrocite nu pot s infecteze alte eritrocite i sunt infecioase numai pentru nar. Gametociii sunt celule sexuate care se deosebesc de celulele vegetative, att ca aspect ct i n ceea ce privete sensibilitatea la medicamentele antimalarice. Nu se dezvolt n organismul uman i nu au importan pentru producerea simptomelor malariei. Gametociii sunt ingerai de gazd odat cu sngele, prin neptur. Infecia narului ncepe odat cu ingestia celulelor sexuale ale parazitului. Gametocitele se matureaz i rezult gamei masculi i femeli. Doi gamei cu polaritate sexual opus fuzioneaz i formeaz un zigot. Dup fertilizare, zigotul se matureaz n 24 de ore n ookinet mobil. Ookinetul se deplaseaz prin micare amoeboidal printre celulele epiteliale ale intestinului mijlociu al narului i se nchisteaz pe lamina bazal (stratul matriceal extracelular ce separ hemocelul de regiunea mijlocie a intestinului). Pe lamina bazal, zigotul devine chist de reproducere, care crete progresiv prin diviziuni celulare mitotice succesive. Una dintre diviziuni este meiotic i n oochist se formeaz un numr mare de celule asexuate, denumite sporozoii. Ruperea oochistului elibereaz sporozoizii, care migreaz prin hemocel i ajung n glanda salivar a narului, pentru a completa ciclul n 7-18 zile dup ingestia gametocitului, de unde sunt inoculai la o nou gazd uman. Toate stadiile ciclului sunt haploide, cu excepia zigotului diploid, care imediat dup fertilizare sufer o diviziune meiotic n dou stadii, rezultnd celula cu un nucleu cu 4 genomuri haploide. Infecia plasmodial a gazdei nu interfer cu funciile fiziologice ale insectei, ceea ce denot c raporturile lor sunt vechi i n evoluie s -a produs o selecie a variantelor de Plasmodium, capabile s convieuiasc cu insecta. La om ns, malaria este o boal grav, uneori mortal. Datele disponibile sugereaz existena a 200-300 milioane de persoane infectate cu agentul malariei, dintre care anual mor circa 2 milioane. Maladia clinic este produs numai de paraziii asexuai eritrocitari. Paraziii hepatici persisteni i cei din stadiul sexuat (gametocite) nu produc simptome clinice. Plasmodium nu a fost cultivat pe medii artificiale. Studiile s-au fcut pe stadiul infecios eritrocitar. Hematiile infectate pot fi separate din snge i pot fi incubate in vitro, n condiii care permit multiplicarea parazitului. Parazitul are propriul sistem enzimatic generator de energie. Nu sintetizeaz CoA, pe care o preia din eritrocit. Sintetizeaz acidul folic, dac este disponibil precursorul acestuia, acidul para-amino-benzoic. Pentru sinteza proteinelor proprii, parazitul folosete aminoacizii derivai din hemoglobin, cea mai abundent protein eritrocitar (circa 90% din totalul proteinelor eritrocitare). Hemoglobina este endocitat prin pinocitoz i este hidrolizat la amnoacizi. Deoarece produsele de degradare ale hemoglobinei feroporfirinele sunt toxice pentru membrane, parazitul sechestreaz aceste produse. Hematia mamiferelor nu conine ADN, ci numai mici cantiti de ARN, ceea ce denot c, probabil, parazitul sintetizeaz bazele purinice i pirimidinice, pornind de la aminoacizi. Probabil c permeabilitatea foarte mare a membranei celulare, permite preluarea unor molecule mari din eritrocit. Permeabilitatea crescut, determin pierderea rapid a macromoleculelor n mediul extracelular, ceea ce explic parazitismul su obligat i imposibilitatea de a crete pe medii artificiale. Probabil exist diferene fiziologice ntre stadiul infecios pentru eritrocite i cel infecios pentru celulele hepatice. Schizontul eritrocitar pare adaptat s utilizeze numai hemoglobina ca surs de aminoacizi. In zonele calde ale globului, unde narii sunt numeroi, malaria este o infecie endemic. In aceste regiuni, indivizii umani dobndesc rezisten la infecia cu Plasmodium. In Africa de Vest, rezistena la malaria cauzat de P. falciparum este asociat cu prezena n hematii, a hemoglobinei S, care difer de hemoglobina A, printr-un singur aminoacid n cele dou jumti simetrice ale moleculei. In hemoglobina S, valina este nlocuit cu acidul glutamic. Hemoglobina S are afinitate sczut pentru O2, ceea ce creeaz condiii nefavorabile pentru Plasmodium, care are un metabolism strict aerob i nu se dezvolt la fel de bine n hematiile S, ca n hematiile cu hemoglobin normal A. Corelat cu afinitatea mai mic a hemoglobinei S fa de O2 este faptul ca indivizii suport greu altitudinile mari, la care presiunea O2 este mai mic, dar n regiunile joase, dezavantajul creat de hemoglobina S nu este evident. In unele regiuni mediteraneene, unde malaria este endemic, rezistena la P. falciparum este asociat cu deficiena n hematii, a enzimei glucozo-6-fosfat-dehidrogenaza. Pe baza corelaiilor dintre tipul de hemoglobin i gradul de

217

sensibilitate la infecia cu Plasmodium, se consider c parazitul malariei a fost unul dintre factorii importani n evoluia sub raport biochimic a speciei umane. Primul medicament antimalaric a fost quinina, activ fa de stadiile eritrocitare asexuate ale tuturor speciilor de Plasmodium. Este gametocid pentru toate speciile, cu excepia P. falciparum. Quinina este un agent de intercalare n molecula de ADN i inhib sinteza ADN i ARN.

Structura molecular a quininei

Chinidina, un medicament antiaritmic, izomerul optic D al chininei, este de 2-3 ori mai activ dect quinina. Agenii antimalarici sunt mprii n funcie de stadiile ciclului de via a parazitului, a crui dezvoltare o inhib: sporonticide, gametocide, schizonticide (sanguine i tisulare). Schizonticidele sanguine (chinina, clorochina, meflochina) se folosesc n tratamentul infeciilor cu Plasmodium falciparum i P. malariae, iar schizonticidul tisular primaquina este utilizat n tratamentul infeciei cu P. vivax i P. orale. Cloroquina este o baz slab, folosit ca agent antimalaric din deceniul 5 al secolului trecut, dar capacitatea ei de a crete pH veziculelor acide a fost considerat mult mai trziu. Capacitatea bazelor slabe de a crete pH intravezicular a fost presupus de de Duve, pentru a explica inhibiia catabolismul proteinelor de ctre lizosomii celulei mamaliene. Cloroquina poate s inhibe degradarea hemoglobinei ingerat de parazit prin creterea pH al vacuolei digestive, peste valoarea optim a activitii proteazelor. Mecanismul cel mai probabil, prin care cloroquina determin creterea pH intravezicular este capacitatea veziculei parazitului de a concentra cloroquina, la valori de peste 100 de ori mai mari dect cele din veziculele ce lulei mamaliene (Hemingway, 2003). Vezicula de endocitoz a parazitului are un mecanism de concentrare a cloroquinei. Dar enzimele lizosomale ale parazitului sunt active la o variaie larg a pH. Creterea pH vezicular poate omor parazitul prin inhibiia transferului hemoglobinei spre vacuola digestiv a parazitului. Att cloroquina ct i quinina acioneaz, probabil, prin formarea unui complex cu feroprotoporfirina, efectul fiind blocarea transferului pigmenilor n vezicula de endocitoz. Se produce liza timpurie a eritrocitului, nainte de desfurarea stadiului specific al dezvoltrii parazitului. Sulfonamidele i inhibitorii dihidrofolat-reductazei (trimetoprim, tetroxoprim vezi ageni chimioterapeutici ai infeciilor bacteriene) sunt activi fa de agenii malariei, prin inhibiia sintezei acidului folic, dup acelai mecanism prin care acioneaz asupra celulelor bacteriene. Acidul p-aminobenzoic i acidul folic reverseaz efectele sulfonamidelor, ceea ce sugereaz c aceti ageni sunt activ i prin inhibiia cii sintezei acidului folic.

218

Bibliografie selectiv
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Adam R.D., The biology of Giardia spp.Microbiology Reviews, 1991, 55(4): 706-732. Brock Th., Biology of microorganisms- Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1988. Bruckner D. A., Amebiasis. Clinical Microbiology Reviews, 1992, 5(4): 356-369. Gardner T.B., Hill D.R., Treatment of Giardiasis. Clinical Microbiology Reviews, 2001, 14(1): 114128. Hemingway J., Bates I., Malaria: past problems and future prospects - EMBO Reports. 2003, 4(Supp1): S29-S31. Moulder J.W., Comparative biology of intracellular parasitism - Microbiology Reviews, 1985, 49(3): 298-337. Petrin D., Delgaty K., Bhatt R., Garber G.- Clinical and Microbiological Aspects of Trichomonas vaginalis - Clinical Microbiology Reviews, 1998, 11(2): 300-317. Phillips R.S., Current Status of Malaria and Potential for Control- Clinical Microbiology Reviews, 2001, 14(1): 208-226. Snipes L.J., Gamard P.M., Narcisi E.M., Beard C.B., Lehmann T., Secor W.E. - Molecular Epidemiology of Metronidazole Resistance in a Population of Trichomonas vaginalis Clinical Isolates. Journal of Clinical Microbiology. 2000, 38(8): 3004-3009. Starr M. P i colab., The Prokaryotes, Springer Verlag, Berlin, New York, 1981. Topley and Wilsons, Microbiology and Microbial Infections, vol. I, II, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman, 1998. Upcroft P., Upcroft J. A., Drug Targets and Mechanisms of Resistance in the Anaerobic ProtozoaClinical Microbiology Reviews, 2001, Jan, 14(1): 150-164.

219

Capitolul 12 AGENI TERAPEUTICI AI INFECIILOR VIRALE

Cei mai simpli ageni infecioi sunt cel mai greu de controlat. Dificultatea major n calea gsirii unor ageni antivirali, se datoreaz incapacitii agenilor chimici de a discrimina ntre mecanismele multiplicrii virale i procesele de biosintez celular. Discriminarea acestor procese nu este posibil, deoarece moleculele specific virale sunt sintetizate de aparatul celular: ribosomii i enzimele sintezei proteice. Din aceast cauz, chimioterapia infeciilor virale rmne o problem major a cercetrii biomedicale. Insuccesele terapiei infeciilor virale, comparativ cu succesele terapiei infeciilor bacteriene, se datoreaz diferenelor fundamentale ntre bacterii i virusuri: bacteriile sunt organisme autonome, cu metabolism propriu, iar virusurile sunt entiti cu organizare acelular, care interacioneaz cu substratul celular viu ntr-o modalitate specific, prezentnd un parazitism absolut, de nivel genetic, nentlnit la bacteriile parazite.In contrast cu infeciile bacteriene, la care semnele i simptomele maladiei nsoesc multiplicarea bacterian, n cazul infeciilor virale, simptomele clinice apar numai dup o perioad de incubaie adecvat, timp n care multiplicarea viral atinge o rat maxim (Topley i Wilsons, 1990). De aceea, terapia instituit la apariia semnelor clinice ale infeciei virale va fi tardiv. S-au identificat totui, molecule specifice multiplicrii virale i ageni chimici care interfer cu aceste molecule i inhib multiplicarea viral. Activitatea antiviral a unui compus, demonstrabil in vitro, nu este suficient pentru a-l utiliza n clinic. Introducerea n clinic a unui agent antiviral este rezultatul unor studii preclinice foarte laborioase. Agenii antivirali trebuie s ndeplineasc anumite condiii: - s prezinte specificitate pentru un esut sau organ int, n care este localizat infecia viral; - s nu fie toxici pentru celule; - s fie activi att intra- ct i extracelular; - s fie stabili din punct de vedere metabolic. Foarte puine infecii virale beneficiaz de tratamentul chimioterapic: herpesvirusuri (herpes simplex i virusul zona zoster), HIV, gripa. Cele mai bune inte pentru inhibiia cu ageni antivirali sunt reprezentate de molecule care ndeplinesc o funcie specific viral i care nu au corespondent n celula gazd. Pentru a identifica moleculele specific virale cu care pot interaciona agenii antivirali, este important caracterizarea molecular a virusului, structura genomului, dar este necesar cunoaterea evenimentelor moleculare ale multiplicrii virusului. Toate treptele multiplicrii virale sunt inte poteniale pentru aciunea agenilor antivirali, dar evenimentele timpurii (ataarea, penetrarea, dezvelirea), sinteza acizilor nucleici i a proteinelor specific virale, asamblarea i eliberarea se aseamn cu procesele celulare normale i sunt catalizate, adeseori, de enzime celulare. Sinteza acizilor nucleici virali este una dintre intele predilecte ale agenilor antivirali, pentru c se deosebete de sinteza acizilor nucleici celulari i este catalizat de enzime specific virale: polimerazele ce catalizeaz sinteza ADN sau ARN viral i kinazele care fosforileaz nucleozidele sunt inte pentru agenii antivirali. Funciile acestor enzime sunt adeseori inhibate selectiv de agenii antivirali, la concentraii semnificativ mai mici dect cele inhibitoare pentru enzimele omologe ale celulei gazd. Timidin-kinazele catalizeaz fosforilarea C5 al pentozei, prima treapt a sintezei nucleozidelor pirimidinice (timidina, citidina), pentru a fi ncorporate n ADN. Nucleozid-kinazele i polimerazele ADN sunt codificate de gene virale i de gene celulare (Lehninger, 1975). Proprietile lor difer foarte mult n ceea ce privete specificitatea de substrat, afinitatea de legare i sensibilitatea fa de diferii compui chimici. Pe aceste diferene se bazeaz utilizarea analogilor nucleozidelor chimici n terapia antiviral.

12.1. Analogii nucleozidelor

Analogii nucleozidelor sunt fosforilai de nucleozid-kinazele virale i celulare i sunt ncorporai n catene ADN de ctre ADN- polimeraze, intrnd astfel n competiie cu nucleozidele naturale (Bryant, 2001). Analogii vechi ai nucleozidelor (idoxuridina, trifluorotimidina, vidarabina) sunt relativ toxici pentru organismul uman. Idoxuridina i trifluorotimidina se leag cu afinitate egal de chinazele virale i celulare, dar sunt inhibitori mai buni ai ADN-polimerazelor virale. Efectul lor este scderea ratei de sintez a ADN n celulele infectate i neinfectate. Administrarea sistemic a idoxuridinei pacienilor cu encefalit herpetic, nu a sczut riscul de deces, iar mielosupresia este accentuat la aproape toi indivizii tratai. Ins, compusul este mult mai eficient i are o toxicitate mult mai sczut atunci cnd este administrat local (n keratite herpetice). Vidarabina este analogul adenozinei. S-a sintetizat i s-a studiat ca agent antitumoral.

220

Structura molecular a bazele azotate componente ale acizilor nucleici (ciotzina, timina, uracilul, adezina, guanina)

Structura molecular a vidarabinei

Structura molecular a idoxuridinei

Ulterior s-a evideniat c vidarabina este activ fa HSV, VZV, CMV, virusul vaccinal i unele retravirusuri tumorale. Mecanismul de aciune implic fosforilarea nucleozidului de ctre enzimele celulare i ncorporarea n catena de ADN viral i celular, n curs de sintez, rezultatul fiind ncetinirea ratei sintezei ADN. Vidarabin-trifosfatul este un inhibitor competitiv al ADN-polimerazei celulare i virale. Este mai activ fa de enzimele virale, ceea ce face s aib efect inhibitor selectiv fa de sinteza ADN viral. Vidarabina inhib i alte trepte ale sintezei acizilor nucleici: poliadenilarea ARN i deoxinucleotidil-transferaza terminal. Inhib o enzim de metilare a ARNt i ARNm. Acest efect face ca vidarabina s fie toxic pentru celulele mononucleare. Se folosete ca unguent ocular pentru tratamentul cheratitei herpetice. Pentru tratamentul infeciilor herpetice prin administrare intravenoas, vidarabina a fost nlocuit de acyclovir, datorit slabei solubiliti n ap i toxicitii relativ ridicate. Ribavirina, un analog sintetic al nucleozidelor purinice(1-F -D-ribofuranozil-1,2,4-triazol-3carboxiamida), a fost sintetizat la nceputul anilor 270. Din punct de vedere structural se aseamn cu guanozina i inozina. In vitro este activ fa de o gam foarte variat de virusuri ADN i ARN: adeno-, herpesvirusuri, influenza A i B, virusul respirator sinciial, buniavirusuri, arenavirusuri, reovirusuri i HIV.

Structura molecular a ribavirinei

221

S-au propus trei mecanisme de aciune, ceea ce explic spectrul su larg de activitate. a) Medicamentul difuzeaz uor n celulele eucariote, unde este convertit de ctre enzimele celulare, la mono-, di- i trifosfat. Ribavirin-monofosfatul este un inhibitor puternic al IMP (inozin-monofosfat) dehidrogenazei, o enzim esenial pentru sinteza GTP. Rezultatul este scderea concentraiei celulare a guanozin-nucleotidului, necesar replicrii ADN celular i viral. b) Inhib procesul de bonetare (capping) al ARNm viral, etapa esenial a traducerii mesajului n proteine virale; c) Inhib direct ARN-polimeraza dependent de ARN a virusurilor influenza i ntrzie iniierea i alungirea copiilor de ARNm. Ribavirina nu este ncorporat n structura acizilor nucleici i nici nu determin terminarea transcrierii ARNm. Ribavirina este toxic: produce anemie i este embriotoxic. Anemia apare ca o consecin a difuziei i acumulrii acestui compus n eritrocit, unde nu este inactivat prin defosforilare, deoarece eritrocitul nu posed fosfataze. Astfel, eritrocitele sunt scoase prematur din circulaie. La doze mari, ribavirina inhib eritropoeza n mduva osoas. Efectele toxice sunt reversibile dup oprirea tratamentului, dar timpul de njumtire al ribavirinei este de 40 de zile i efectele se prelungesc dup oprirea tratamentului. Nu se administreaz gravidelor, deoarece puii de oarece se nasc cu malformaii scheletice i probabil efecte asemntoare s-ar produce asupra ftului uman. Ribavirina se folosete n tratamentul febrei de Lassa. Rata morii pacienilor infectai cu arenavirusul febrei de Lassa este de 55-76%, dar scade la 5-9% la cei tratai. Ribavirina se administreaz chiar profilactic la cei cu risc mare pentru febra de Lassa. Febra de Lassa este o infecie hemoragic, produs de un arenavirus (virusul corio-meningitei limfocitare LCMV), rspndit prin urina roztoarelor infectate, n ariile endemice (n Africa de vest) i adeseori este fatal. Dup o sptmn de febr i complicaii nespecifice, apare hemoragia, n special n tractul gastrointestinal i chiar moartea prin oc hipovolemic. Febra hemoragic cu sindrom renal este cauzat de virusul Hantaan (un bunyavirus), transmis prin urina roztoarelor. Medicamentul traverseaz bariera hemato-encefalic i n lichidul cerebrospinal realizeaz concentraii de 50-100% din cele serice. De aceea se folosete pentru tratamentul encefalitelor. n 1986 a nceput administrarea sub form de aerosoli pentru tratamentul infeciilor cu virusul respirator sinciial. Analogii nucleozidici utilizai n prezent n chimioterapia antiviral, sunt mai puin toxici: acyclovirul este activat numai in celulele infectate de virus, iar zidovudina inhib reverstranscriptaza, enzim absent n celulele normale ale organismului. Acyclovir cunoscut sub denumirea comercial de zovirax (9-(2-hidroxietoximetil) guanina), are cel mai bun index terapeutic dintre toi agenii antivirali n uz i este intens utilizat pentru tratamentul infeciilor cu virusul herpes simplex (Gold i Corey, 1986) A fost descoperit n anii 370 de ctre Elion i colab., ntr-un screening pentru compui cu activitate antiviral. Din punct de vedere chimic este un analog structural al guanozinei, care n locul ribozei, la baza azotat este ataat o caten lateral neciclic, careia ii lipsesc atomii de C 2 si 3. Acyclovir inhib multiplicarea HSV-1, HSV-2, VZV, cu toxicitate minim pentru celul. Este mai puin eficient fa de EBV, CMV sau HH-6 (Acosta i Balfour, 2001).

Structura molecular a acyclovirului

Structura molecular a guanozinei

Acyclovir difuzeaz liber n toate celulele, infectate i neinfectate, dar se activeaz i se acumuleaz numai n celulele infectate cu herpesvirusuri, deoarece prima treapt a activrii sale, fosforilarea n poziia 5 a catenei laterale, este catalizat numai de timidin-kinaza (enzim care catalizeaz fosforilarea C5 al pentozei, prima etap a modificrii nucleozidelor pirimidinice pentru ncorporarea n ADN) specific viral i n msur nesemnificativ, de timidin-kinaza celular. Afinitatea Tk HSV pentru acyclovir este de circa 3 milioane de ori mai mare dect a Tk celulare. Acyclovir este fosforilat mult mai rapid i de aceea este ncorporat preferenial n ADN. Fosforilrile

222

ulterioare la formele difosfat i respectiv trifosfat (activ) sunt catalizate de kinazele celulare. In cursul replicrii ADN, acyclovir-trifosfatul intr n competiie cu dGTP, care este substratul natural al ADNpolimerazei virale. ADN-polimerazele catalizeaz ncorporarea nucleotid-trifosfailor: cele specific virale sunt de circa 30 de ori mai sensibile la aciunea inhibitorului, dect ADN-polimeazele umane. Datorit faptului c molecula de acyclovir ncorporat nu ofer gruparea 3OH, urmtoarea nucleotid nu mai este legat i replicarea ADN este blocat. Odat cu legarea moleculei de acyclovir la ADN, se formeaz un complex ternar la care particip acyclovir, ADN-polimeraza i urmtorul nucleotid, ceea ce duce la scderea ampl a sintezei ADN viral. Toate aceste proprieti fac ca acyclovirul s aib aciune foarte selectiv asupra multiplicrii virale, efectele sale asupra replicrii ADN celular fiind nesemnificative. Replicarea ADN al HSV este de 3000 de ori mai sensibil dect replicarea ADN celular. Virusurile care codific sinteza unor enzime ale cror omologe exist i n celul, au avantajul c se pot multiplica n celulele care nu se divid. Herpesvirusurile se deosebesc foarte mult ntre ele, n privina sensibilitii la acyclovir (Bacon i colab., 2003). HSV este un amestec de tulpini Tk+ i Tk-. Tulpinile Tk- au capaciti limitate de a stabili infecii latente n neuroni, care s se i activeze. Predomin tulpinile Tk+, deoarece sunt mai neurovirulente i au avantajul selectiv de a stabili infecii latente n ganglionii senzitivi, cu capacitatea de reactivare. Astfel, HSV-1 i HSV-2 sunt extrem de sensibile, necesitnd in vitro concentraii de 0,04-0,4 Qg/ml pentru a obine inhibiia replicrii cu 50%. In schimb, Tk VZV nu fosforileaz acyclovir la fel de eficient ca enzima omolog de la HSV-1 i HSV-2. Astfel se explic sensibilitatea de 8-10 ori mai mic a VZV la acyclovir. CMV necesit concentraii foarte mari de acyclovir pentru blocarea multiplicrii virale, deoarece acest virus nu codific o Tk proprie. Nu se tie dac virusul Epstein-Barr codific o Tk capabil s activeze acyclovir. Acyclovirul nu poate aciona n faza de laten a nici unuia dintre virusurile herpetice. Un avantaj major al tratamentului cu acyclovir l reprezint absena unor efecte grave de toxicitate. Administrarea intravenoas produce o cretere tranzitorie a nivelului seric de creatinin, datorat probabil unei obstrucii la nivelul tubulilor renali. In literatura de specialitate a mai fost descris un sindrom neurologic tranzitoriu, ale crui manifestri clinice sunt confuzia, letargia, rareori halucinaii i com. Acest sindrom apare la pacienii imunosupresai, care primesc intravenos doze foarte mari de acyclovir. Acyclovirul previne recurena herpetic. Dup aplicare zilnic, n doze mici, sunt suprimate aproape complet recurenele frecvente. Nu produce efecte secundare, chiar dup administrare prelungit. Dac este administrat profilactic, la pacienii expui radiaiei UV solare sau artificiale, acyclovirul oral scade frecvena leziunilor herpetice, care se declaneaz n intervalul 2-7 zile, dar nu influeneaz leziunile care apar n primele 48 de ore de la expunerea la agenii declanatori. Leziunile care apar n primele 48 de ore sunt consecina reactivrii unor tulpini mai virulente, pe fondul unei reactiviti imunitare suboptimale. Acyclovirul reduce la 14% morbiditatea encefalitei herpetice.

Structura molecular a citozin-arabinozidei

Rezistena la acyclovir se instaleaz dup administrarea pentru perioade lungi de timp, a dozelor care nu suprim multiplicarea viral, n condiiile presiunii selective, datorat administrrii acyclovirului, tulpinile Tk+ nu se pot multiplica i o proporie important de virioni sufer conversie de la Tk+ la Tk- sau la forme care au capacitate redus de a codifica Tk. Astfel de mutante sunt rezistente, deoarece nu fosforileaz acyclovir. Dup oprirea tratamentului, tulpinile Tk- reverseaz la Tk+- Un alt mecanism de rezisten este expresia unei ADN-polimeraze cu afinitate redus pentru acyclovir-trifosfat i respectiv expresia unei Tk cu proprieti alterate de legare a medicamentului. In aceste cazuri, se recomand administrarea foscarnet, cu un mecanism de aciune diferit. Gancyclovir (1,3-dihidroxi-2-propoximetil guanina), este un analog nucleozidic asemntor acyclovirului, cu deosebirea c mai conine o grupare hidroximetil ce se comport asemntor cu gruparea 3hidroxil a ribofuranozei. Este activ fa de toate virusurile herpetice umane i este de 100 de ori mai eficient

223

n comparaie cu acyclovir, fa de CMV uman. Toxicitatea este ns mult mai mare dect a acyclovir i din aceast cauz este folosit doar n cazul pacienilor imunocompromii cu infecii severe provocate de CMV.

Structura molecular a gancyclovirului

Nu se cunoate mecanismul care face ca gancyclovirul s fie mult mai eficient dect acyclovir n tratamentul infeciilor produse de CMV. CMV nu posed activitate timidin-kinazic (este Tk-). In celulele infectate cu CMV, gancyclovir este activat de timidin-kinaza celular i se acumuleaz n concentraie mai mare dect acyclovir. Gancyclovir-trifosfatul (forma activ a gancyclovirului) este ncorporat n catenele ADN virale, ceea ce duce la scderea ratei replicrii genomului viral. Datorit prezenei gruprii 3OH, gancyclovir nu funcioneaz ca un terminator al sintezei catenei DNA. Acest compus are efecte mitogene asupra celulelor mamaliene, este carcinogen i embriotoxic. La om produce efecte toxice asupra mduvei osoase, la circa 25% dintre cazurile tratate. Studii recente au artat c la 8% dintre pacienii tratai cu gancyclovir pentru o perioad mai mare de 3 luni, tratamentul a euat, ceea ce sugereaz posibilitatea selectrii unor tulpini virale rezistente la acest compus.

12.2. Amine ciclice

Adamantanii (amantadina i derivatul ei E-metil-amantadina sau rimantadina) sunt utilizai pentru tratamentul infeciilor cu virusul influenza. Din punct de vedere chimic, sunt amine ciclice care deriv formal de la hidrocarbura policiclic adamantan. Amantadina este o amin triciclic, derivatul 1-amino al adamantanului, un compus complex cu 10 atomi de C, cu o structur de colivie. Rimantadina este un derivat aproape identic, metilat, al amantadinei. Ambele inhib multiplicarea virusului influenza A in vitro i in vivo, dar nu inhib virusul influenza B.

Structura molecular a amantadinei

Structura molecular a rimantadinei

Mecanismul de aciune i spectrul activitii antivirale sunt identice, ns rimantadina este metabolizat diferit de amantadin i produce efecte secundare (febr, insomnie, dificulti de concentrare). Amantadina blocheaz faza timpurie a infeciei dezvelirea- dar influeneaz i fazele tardive ale multiplicrii: asamblarea virionilor i nmugurirea (Brady i colab., 1990). Sensibilitatea virusurilor gripale la amantadin este determinat de prezena proteinei M2 la nivelul membranei plasmatice a celulelor infectate i n cantitate foarte mic n structura virionilor. S-a presupus c aceast protein ar forma canale ionice care ar permite trecerea protonilor din endosom spre interiorul virionului ducnd la scderea pH, ceea ce determin eliberarea nucleoproteinei virale n citoplasma celulei infectate. In cursul procesului de asamblare viral, protonii sunt transferai invers, la exteriorul veziculei de exocitoz, proteina M2 meninnd nivelul pH peste valoarea la care intregritatea hemaglutininei virale ar fi afectat i nu ar mai putea fi ncorporat n peplosul viral. Se pare c amantadina blocheaz mecanismul de transfer al protonilor mediat de proteina M2, inhibnd dezvelirea virionilor, maturarea virionilor sau ambele procese. n absena acidifierii regiunii centrale a

224

virionului n endosom, proteina M1 nu se disociaz de complexul ribonucleoproteic i acesta nu este transferat spre nucleu. Amantadina este mai eficace dac n organism se gsesc anticorpii specifici preformai. In vitro, la concentraii mult mai mari, adamantanii blocheaz multiplicarea i a altor virusuri ARN: influenza B i paramixovirusuri. Din aceast cauz, adamantanii se folosesc doar pentru tratamentul infeciilor cu influenza A. Variantele virale rezistente apar rapid, n 5-7 zile de terapie: 16-45% dintre izolate virale pot fi rezistente. Ambele medicamente se gsesc n formulri pentru administrare oral. Amantadina atinge nivelul maxim n plasm la 2-4 ore dup administrarea oral i peste 90% reapare nemodificat n urin. Se excret prin secreie tubular i filtrare glomerular. Rimantadina se absoarbe bine dup administrare oral (90%) i atinge valori plasmatice inferioare amantadinei. Este metabolizat n proporie mare i este eliminat prin mecanisme renale. Circa 10% se elimin nemodificat. Efectele adverse sunt determinate de tulburri ale activitii SNC: nervozitate, vertigo, insomnie. Administrarea profilactic a celor doi compui, n cazul unei epidemii, reduce riscul mbolnvirii cu 50-90%. Ambii compui sunt mai eficieni n prevenirea apariiei simptomelor clinice tipice infeciei cu virusul influenza A, dect n prevenirea apariiei infeciei propriu-zise. Dei este eficient i are toxicitate sczut, amantadina a fost un eec comercial, deoarece majoritatea indivizilor opteaz pentru vaccin sau pentru mbolnvire, dect s fac profilaxie zilnic. Rimantadina este utilizat profilactic pentru a proteja persoanele care nu au fost vaccinate sau nu pot beneficia de vaccin i care au un risc crescut de a face complicaii consecutive infeciei cu virusul gripal A.

12.3. Inhibitori ai sintezei proteinelor virale: methisazone (F -thiosemicarbazone)

Methisazone (F-thiosemicarbazone) este un compus poxvirusurilor. sintetic antiviral, inhibitor al multiplicrii

Structura molecular a methisazonei

Pentru ca efectele inhibitorii s fie demonstrabile, compusul trebuie s fie administrat la iniierea procesului infecios. Mecanismul de aciune este ipotetic: pare s inhibe traducerea ARNm viral tardiv. Consecina este o reducere net a sintezei proteinelor virale tardive, prin dezorganizarea polisomilor. Odat cu eradicarea variolei, medicamentul a ieit din uz.

12.4. Foscarnet
Foscarnet (fosfono-formiat trisodic) este un analog al pirofosfatului, care nu se aseamn cu nici un alt medicament antiviral utilizat n clinic. A fost sintetizat la sfritul anilor 470 ca o alternativ (mai puin toxic i mai eficient) la acidul fosfonoacetic. Medicamentul este foarte util pentru tratarea infeciilor cu virusuri herpetice rezistente la acyclovir.

Structura molecular a foscarnetului

Spre deosebire de compuii antivirali analogi ai bazelor azotate, foscarnet nu necesit o activare prealabil sub aciunea kinazelor virale sau celulare. Foscarnet funcioneaz ca un inhibitor necompetitiv al ARN- i ADN-polimerazelor, legndu-se la situsul de legare al pirofosfatului i inhib necompetitiv legarea de substratul nucleotidic (Piret i colab., 2001). Dei mecanismul inhibiiei sintezei ARN i ADN nu este

225

cunoscut cu exactitate, una dintre ipoteze sugereaz c forcarnet legat la polimeraz, formeaz un intermediar instabil cu nucleozid-monofosfaii, conducnd la degradarea acizilor nucleici. Foscarnet inhib polimerazele celulare ct i cele virale, dar enzimele virale sunt mult mai sensibile dect cele celulare (cele virale sunt inhibate de concentraii de 1/2 - 1/10 din cele necesare pentru inhibarea enzimelor celulare): inhib polimerazele unor tulpini ale serotipului A de virus gripal, ale virusurilor herpetice umane, virusului hepatitei B i reverstranscriptaza HIV. Foscarnet s-a dovedit a fi extrem de eficient n tratarea pacienilor SIDA, infectai cu tulpini de HSV sau VZV rezistente la aciclovir. Foscarnet are unele dezavantaje majore. Se administreaz intravenos i dozele trebuie s se repete la intervale scurte, pentru c timpul de njumtire este foarte scurt (Noormohamed i colab., 1998). De aceea se ncearc mrirea timpului de njumtire prin conjugare cu alcooli cu catena lung (derivai de la acizi grai). Un alt dezavantaj, o consecin a structurii sale chimice, este c la pH fiziologic acest compus este ionizat i traverseaz foarte greu membrana plasmatic celular. In LCR concentraia de foscarnet este de aproximativ 40% fa de cea plasmatic. Aproximativ 30% din cantitatea de foscarnet se depoziteaz n oase ceea ce determin o cretere a timpului de njumtire la cteva luni (Sjovall i colab., 1989). Medicamentul produce 2+ efecte adverse: perturbarea funciei renale, induce dezechilibre electrolitice (Ca , PO42-, K+, Mg2+). Are 2+ aciune chelatoare intens pentru ionii bivaleni, n special Ca , producnd scdere sever, n funcie de doz, ce poate fi fatal.

12.5. Terapia infeciei cu HIV

Interesul pentru terapia infeciei cu HIV este justificat de numrul n continu cretere al persoanelor infectate. Astfel, la sfritul anului 1999, 34,3 milioane persoane erau infectate sau manifestau semnele clinice ale SIDA. n fiecare zi, se infecteaz circa 15000 de persoane. 95% din totalul persoanelor infectate se gsesc n rile n curs de dezvoltare. Pn n 1999, 18,8 milioane aduli i copii au murit de SIDA, de la recunoaterea epidemiei ca entitate clinic. Gsirea unor modaliti eficiente de stopare a multiplicrii virale este foarte important pentru clinic, deoarece SIDA se coreleaz cu un titru viral crescut. Medicaia anti-HIV ncearc s blocheze multiplicarea virusului n oricare treapt a ciclului su (Schwartz i Nair, 1999). n interiorul celulei, blocarea ciclului de multiplicare este posibil prin inhibiia reverstranscriptazei sau a proteazei HIV. Medicamentele cu o relativ eficien anti-SIDA intr n 3 categorii majore: - analogi ai nucleozidelor, ce acioneaz ca inhibitori ai reverstranscriptazei; - inhibitori nenucleozidici ai reverstranscriptazei - inhibitorii activitii proteazei. Reverstranscriptaza este enzima viral care convertete informaia genetic viral ARN, ntr-o molecul complementar de ADN dublu catenar. Inhibiia reverstranscriptazei este produs de analogii nucleozidelor: zidovudina (azidotimidina - AZT), dideoxiinozina (DDI) (analog guanozinei), dideoxicitidina (DD).

Structura molecular a dideoxiinozinei

Structura molecular a dideoxicitidinei

Analogii nucleozidelor se aseamn cu substanele naturale care intr n compoziia ADN al HIV. Incorporarea analogilor bazelor blocheaz reacia de polimerizare i de sintez a ADN HIV dincolo de punctul ncorporrii acestor analogi. Primul compus al grupului este zidovudina (Gotzsche, 1993). Zidovudina (3-azido-3-deoxitimidina), analog al deoxitimidinei, denumit anterior azidotimidina (AZT), este un compus de sintez din familia analogilor nucleozidici dideoxi, la care gruprile OH 2 i 3 ale inelului F-D-ribofuranozic au fost nlocuite cu atomi de hidrogen i respectiv cu gruparea azid (N3).

226

Structura molecular a zidovudinei

Iniial, compusul a fost studiat pentru proprietile sale antineoplazice, iar ulterior s-au descoperit cele antivirale (inhibitor al virusului leucemiei felinelor). n 1985 s-a descoperit capacitatea sa de a inhiba HIV. Compusul a devenit disponibil pe pia din 1987, iar n prezent se folosete n schema tratamentului infeciei cu HIV (De Cock i colab., 1993; Zhou i colab., 1999). Compusul este fosforilat de ctre timidin-kinaza celular, n celulele infectate i neinfectate, la derivaii mono-, di- i trifosfat care reprezint formele active. Zidovudin-trifosfatul, forma activ a AZT, este un inhibitor competitiv al reverstranscriptazei HIV. Zidovudin-trifosfatul are o afinitate de 100 de ori mai mare pentru reverstranscriptaz (valoare mica a Km) dect pentru substratul natural deoxitimidin-trifosfatul (dTTP) (valoare mare a Km). Zidovudin-trifosfatul este ncorporat n lanul ADN n curs de sintez, ca AZT-monofosfat i datorit faptului c n poziia 3 se afl gruparea azido i nu o grupare hidroxil, urmtorul nucleotid nu se poate lega i sinteza ADN este stopat. Reverstranscriptaza nu excizeaz AZT ncorporat. Zidovudina este activ fa de retravirusuri mamaliene i aviare i fa de virusul Epstein-Barr. AZT se gsete n formulri pentru administrare oral i parenteral. Dup administrare oral se absoarbe repede i total, cu valori maxime n snge la 30-90 min. Penetreaz n LCR i de aceea AZT este folosit pentru tratamentul manifestrilor neurologice ale SIDA. Este catabolizat n ficat, n principal prin conjugare cu acidul glucuronic. Din acest motiv metabolizarea zidovudinei este blocat de ali compui care sunt catabolizai pe aceeai cale la nivel hepatic (ageni antiinflamatori nesteroidici, analgezice narcotice). Un dezavantaj al acestui compus este timpul de njumtire foarte scurt la nivel plasmatic fapt pentru care necesit administrare frecvent, dar n celul stabilitatea sa este net superioar. AZT traverseaz bariera placentar. Dei celulele mamaliene nu posed reverstranscriptaza, totui AZT are toxicitate moderat. Zidovudin-monofosfatul inhib competitiv timidilat-kinaza, enzima care catalizeaz conversia nucleozidmonofosfatului, la nucleozid-difosfat (Chun i colab., 2001). De aceea, n celulele infectate i n cele normale, nivelul intracelular de nucleozid di- i trifosfai scade, ceea ce duce la scderea ratei sintezei ADN. Efectele secundare ale administrrii acestui compus sunt: anemie sever, neutropenie, dureri de cap, miopatie manifestat clinic prin diminuarea capacitii contractile a musculaturii, iar anatomic prin apariia mitocondriilor anormale (cu volum crescut) n fibrele musculare. La pacienii supui tratamentelor cu zidovudin crete riscul de a dezvolta limfoame non-Hodgkin, probabil ca o consecin a imunosupresiei ndelungate (Hoggard i colab., 2001). La pacienii cu SIDA, supui unui trat ament de lung durat cu zidovudin, s-a constatat instalarea unei rezistene a virusului HIV fa de acest compus. AZT se folosete pentru tratamentul tuturor stadiilor infeciei cu HIV. Dozele mari de 1200-1500 mg/zi prelungesc supravieuirea, reduc frecvena infeciilor oportuniste, bolnavul ctig n greutate, viremia diminu, iar funcia imunitar se amelioreaz (Kakuda i colab., 2001). In prezent AZT se administreaz n doze mici (300-500 mg/zi) i are efecte secundare limitate. Doza optim este de 600 mg/zi (Cato i colab., 1998). Dup tratamentul prelungit mai mult de 6 luni, se selecteaz tulpini de HIV rezistente la AZT, datorit unei mutaii a genei care codific reverstranscriptaza i de aici decurge ineficiena tratamentului. Zidovudina nu elimin i nu neutralizeaz virusul, ci ncetinete evoluia SIDA. Efectele toxice majore ale AZT se produc la nivelul mduvei hematoformatoare, cu monocitopenie i granulocitopenie. AZT poate induce anemie sever i necesit transfuzie sau oprirea tera piei. Dozele mari produc o stare de ru general i dureri de cap. Didanozina (2-3 dideoxiinozina - ddI) este un dideoxinucleozid, analog al deoxiadenozinei. Enzimele celulare o convertesc la ddI-monofosfat, apoi la dideoxiadenozin (ddA)-monofosfat, ddA-difosfat i ddA-trifosfat (ddATP), forma activ. Ca i trifosfaii altor dideoxinucleozide, ddATP inhib competitiv RT HIV i acioneaz ca terminator al catenei de ADN. ADN-polimeraza E uman este relativ rezistent la

227

ddATP, dar variantele F i K sunt mai sensibile. In vitro, ddATP intracelular este la fel de activ fa de RT HIV, ca i zidovudina. Este activ fa de tulpinile HIV rezistente la zidovudin. La pH acid gastric, ddI este inactivat datorit hidrolizei legturii glicozidice dintre glucid i baz. De aceea se administreaz n asociaie cu un tampon al aciditii gastrice. Acyclovirul i zidovudina sunt activi numai fa de virusurile care se multiplic, iar dup oprirea tratamentului, multiplicarea viral este reluat. Acyclovir nu mpiedic recurenele ulterioare, iar zidovudina nu oprete progresia SIDA, ceea ce denot c aceti ageni nu elimin virusurile n stare latent. O alt clas de medicamente sunt inhibitorii nenucleozidici ai reverstranscriptazei. Compuii din aceast categorie (neviparina) sunt inhibitori direci ai RT HIV, deoarece interacioneaz cu proteina i altereaz conformaia situsului catalitic. O singur mutaie, chiar punctiform a genei RT, este adeseori suficient pentru a diminua eficiena acestor compui.

Structura molecular a neviparinei

n tratamentul infeciilor virale se folosete de asemenea o alt clas de ageni chimici care sunt inhibitorii proteazei. Proteaza HIV este o aspartic-proteaz, codificat de virus i are rolul de a genera peptide structurale dintr-un precursor viral. Inhibitorii proteazei sunt reprezentai de molecule peptidice mici, care mimeaz substratul natural al reaciei (Ikuta i colab., 2000). Ele acioneaz prin blocarea situsului catalitic al proteazei HIV, mpiedicnd generarea proteinelor virale prin clivarea precursorilor i astfel este stopat procesul maturrii virale. O singur mutaie a genei ce codific sinteza proteazei HIV este suficient pentru a face ca medicamentele s devin ineficiente. N-butyldeoxynojirimycin (N-butyl-DNJ) elimin complet HIV din celulele infectate cronic (Fischer i colab., 1995). Compusul acioneaz prin inhibiia glicozilrii gp120 a nveliului viral, reducnd capacitatea ei de a se lega de receptorii CD4 . Glicozilarea glicoproteinelor virale este nespecific i este catalizat de enzimele celulare, dar activitatea N-butyl-DNJ, in vitro, este foarte specific fa de celulele infectate cu HIV. O alt int a terapiei infeciei cu HIV este ARNm. Principiul const n construcia oligonucleotidelor mici, complementare genelor virale sau secvenelor ARNm (oligonucleotide antisens). Acestea se leag de acidul nucleic i blocheaz sinteza proteinelor. Deoarece gena rev are rol reglator esenial, s-a obinut ARNanti ARNm al acestei gene. Efectul a fost inhibiia sintezei proteinelor n celulele infectate cronic, in vitro. Interferena cu prima treapt a ciclului infecios legarea HIV de receptorul CD4 al membranei limfocitare a fost propus ca o modalitate de tratament. CD4 solubil recombinat este o molecul incomplet, din care lipsesc secvenele transmembranar i citosolic, care se leag cu gp120 i mpiedic legarea virusului de limfocitele TCD4. Preparatul nu este toxic, dar timpul de njumtire este foarte scurt. Un inhibitor al fuziunii enfuvirtide stopeaza intrarea virusului prin blocarea fuziunii invelisului pe calea gp41 cu membrana celulei (H. Chapel si colab. 2006). Strategia curent pentru terapia infeciei HIV este denumit HAART (Highly Active Anti-Retraviral Therapy) i utilizeaz combinaii ale diferitelor medicamente: un inhibitor al proteazei, asociat cu doi analogi nucleozidici inhibitori ai reverstranscriptazei (Blazevic i colab, 2001). La pacienii supui terapiei HAART, infecia unor noi celule nu este complet blocat. HIV persist, cu o rat foarte sczut a multiplicrii n rezervorul celular reprezentat de macrofage, celule T CD4 neangajate i chiar celulele T CD4 de memorie, ceea ce permite eliberarea virionilor progeni i infecia unor noi celule. Dovezile multiplicrii HIV la pacienii tratai HAART sunt urmtoarele: - muli pacieni au nivele plasmatice sczute ale ARN viral, sub limita de detectare prin testele convenionale (200-500 copii/ml), dar detectabile prin metode sensibile care determin cantiti de 1050 de copii ARN/ml; - pacienii tratai cu HAART devin aviremici, dar prin metoda hibridizrii in situ sau RT-PCR se detecteaz celule infectate productiv, care exprim ARN HIV-1 (Servais i colab., 2001); - diferenele cantitative dintre ADN-HIV total i integrat n celulele TCD 4 sugereaz existena celulelor infectate recent cu HIV-1, n care ADN este neintegrat. Acestea sunt copii lineare complete

228

revers-transcrise, care sufer o reacie aberant de legare cap la cap, n loc s se integreze n cromosomul gazdei. Pentru eliminarea rezervorului de virus se impune creterea dozei terapeutice combinate care s inhibe complet multiplicarea virusului. Dar rezervorul de virus are o persisten ndelungat, iar terapia HAART ete toxic. Pentru eliminarea rezervoarelor de virus se propune stimularea transcrierii i multiplicrii virale n celulele infectate latent, sub aciunea citochinelor. Odat cu multiplicarea virusului, celulele mor datorit efectului citopatic sau expun antigene virale i devin inta aciunii litice a limfocitelor TCD4 citolitice. Astfel, o combinaie de IL-2, IL-6 i TNFE poate induce activarea i multiplicarea virusului n celulele infectate latent, in vitro. IL-2 produce creterea numeric a celulelor T CD4, dar nivelul viremiei a rmas nemodificat. Celulele infectate latent cu HIV-1 nu exprim receptori de nalt afinitate pentru IL-2, citochina poate activa multiplicarea viral prin intermediul receptorilor de mic afinitate sau indirect prin alte citochine ale cascadei. Asocierea HAART cu un agent care s activeze specific numai celulele TCD4 infectate latent, ar fi soluia terapeutic ideal. Terapia multipl reduce riscul emergenei unei tulpini virale cu rezisten multipl. Terapia anti-HIV este ineficient datorit unor particulariti moleculare i biologice ale HIV: - genomul viral se integreaz ntr-un cromosom celular i infecia rmne latent o perioad nedefinit; - virusul se poate disemina prin transfer intercelular direct, fr o faz extracelular; - virusul infecteaz celule circulante (limfocite, macrofage) i se disemineaz sistemic; - virusul poate infecta celule ale SNC i agenii terapeutici ar trebui s depeasc bariera hemato encefalic; - virusul scap aciunii Ac specifici i rmne infecios; - apariia frecvent a variantelor antigenice. Imunoglobulinele antivirale sunt disponibile n 3 variante: - preparatul de globuline imune (IG) pentru injectare intramuscular ; - preparatul de imunoglobuline pentru injectare intravenoas (IVIG) ; - preparate de imunoglobuline injectabile intravenos, cu titru nalt de anticorpi. Toate variantele se obin din plasma uman i conin predominant IgG, dar i alte izotipuri. Se pot obine preparate cu un titru nalt de imunoglobuline fa de anumite antigene virale, prin imunizarea animalelor. Preparatul IG nu poate fi administrat intravenos, datorit tendinei IgG de a forma agregate, care, in vivo, fixeaz complementul. Imunoglobulinele sunt mai eficiente dac sunt administrate profilactic, dect terapeutic. Preparatele IG se folosesc n primul rnd pentru prevenirea hepatitei A i se administreaz pacienilor, n cteva zile dup consumul alimentelor contaminate. Preparatele IG hiperimune obinute prin imunizarea animalelor se administreaz postexpunere la VHB i rabie. Preparatul IG specific antirabic se obine din plasma donorilor hiperimunizai.

12.6. Imunizarea pacienilor SIDA

Variabilitatea genetic a HIV a mpiedicat dezvoltarea unui protocol al imunizrii SIDA. S-au obinut anticorpii anti-protein de nveli gp120, pentru blocarea interaciunii gp120 i implicit a infeciei (Takeda i colab., 1992). Dar abordarea n-a avut succes, deoarece gena ce codific gp120 sufer mutaii i rezult variante antigenice ale proteinei care nu sunt recunoscute de anticorpi (Cease i colab., 1987). S-au obinut vaccinuri subunitare, prin inseria ctorva gene ce codific proteine ale nveliului HIV, n genomul virusului vaccinal sau adeno, ca vectori de expresie clonai n sisteme celulare. S-a ncercat vaccinarea cu virus inactivat. Preparatul viral inactivat are utilizare limitat numai la indivizii infectai cu HIV, deoarece metodele de inactivare nu au un grad de certitudine de 100% i pot fi nsoite de pstrarea unei infecioziti reziduale. Exist ncercri de a obine virus atenuat infecios pentru a-l folosi ca agent imunizant, deoarece indivizii infectai cu HIV-2 cauzeaz o form mai uoar de SIDA, cu o perioad de laten mai lung i protejeaz fa de infecia cu HIV-1.

12.7. Rolul mutaiilor n variabilitatea ribovirusurilor. Fenomenul de rezisten

Avnd o structur genetic relativ simpl i fiind metabolic inerte, virusurile au puine mecanisme de a dobndi rezistena la agenii chimioterapeutici. Virusurile au dou proprieti care le permit s scape de aciunea inhibitorilor: - multiplicarea la un titru nalt n celula gazd sensibil; - apariia mutaiilor cu o rat nalt.

229

Mutaia este fora motrice a evoluiei sistemelor vii. Virusurile nu ntrunesc criteriile minimale ale celui mai simplu sistem viu, dar evenimentele mutaionale au o frecven mare. Cele mai multe virusuri cu genom ADN, au rate de mutaie inferioare ribovirusurilor. Mutabilitatea lor este puin cunoscut, dar este dedus indirect din diferite observaii: de exemplu, virusurile herpetice pot deveni rezistente la medicaia antiviral, fapt ce creeaz dificulti clinice. In general, genomul ribovirusurilor are dimensiuni reduse, iar rata de mutaie/nucleotid/tur de replicare este maxim, fapt care permite o rat de evoluie de milioane de ori mai rapid dect a gazdelor lor. Supuse permanent presiunii selective a factorilor de aprare a gazdei, evoluia virusurilor este exclusiv adaptativ. Ratele foarte nalte de mutaie, genereaz aa numitele mutante de roire sau populaii de quasispecii de virusuri, care confer o mare adaptabilitate multiplicrii virale, menit s compenseze ansa minim a interaciunii cu substratul permisiv. Dar rata mutaiei nu trebuie s depeasc un prag al erorilor, care ar genera un virus incapabil de multiplicare. Quasispeciile de virusuri ARN, se adapteaz la un prag de erori mutaionale, compatibil cu multiplicarea. Se consider c virusurile se multiplic la limita superioar a mutabilitii i adaptabilitii. Datorit ratei nalte a mutaiei, clonele de ribovirusuri i retravirusuri sunt quasispecii sau mutante roitoare, care prezint variaii genetice genomice. Populaiile de quasispec ii confer virusurilor cu genom ARN o adaptabilitate perfect la mediul gazdei i o capacitate de evoluie foarte rapid. Anumite secvene ale genomului sunt mai stabile dect altele, dar i cele mai stabile sufer mutaii cu o rat superioar n raport cu dezoxiribovirusurile. Mutabilitatea accentuat se datoreaz naturii intrinseci a funciei ARN-polimerazei virale, predispus la erori (error prone), ca o consecin a absenei funciei de corectare (proof reading), n timp ce majoritatea ADN-polimerazelor virale i corecteaz erorile proprii. Diferite familii de ribovirusuri au rate diferite de mutaie. Dintre enzimele de transcriere i replicare a genomului ARN, reverstranscriptazele au o predispoziie mai accentuat la erori, ceea ce se coreleaz cu o rat nalt a mutaiei n ciclul de multiplicare retraviral. Genomul integrat ca ADN proviral este copiat de aparatul enzimatic al celulei, cu o fidelitate relativ i de aceea, retravirusurile endogene evolueaz foarte lent, comparativ cu cele exogene (infecioase). Modificarea ARN posttranscriere este o cauz major a apariiei mutaiilor. Modificarea extensiv s-a descris iniial pentru ARNm al proteinei M (matrix) a virusului rujeolic de la pacienii cu PESS. Spre deosebire de modificarea frecvent A I la unele virusuri ARN, exist cteva cazuri de ARN viral i celular la care conversia A I, catalizat de ADAR are loc cu selectivitate nalt, la poziii specifice ale A. De exemplu, la HDV, ARN editing are rol esenial pentru sinteza a dou protein cu funcii diferite, de la un ORF: sinteza AgD se face dup conversia selectiv a codonului terminal amber UAG, la codonul Trp UIG. Antigenul D este o protein bazic fosforilat i se acumuleaz n nucleii celulelor infectate. Este componenta intern a HDV. Mecanismul generrii celor dou variante este urmtorul: n timpul replicrii genomului, o fracie a copiilor de ARN antigenomic, sufer unul sau mai multe evenimente de editing posttranscriere. Unul dintre ele este esenial: A din mijlocul codonului terminal amber UAG al ARN codificator al Ag D de l95 aminoacizi, este dezaminat de o enzim a celulei. Dezaminarea A are importan biologic major. Conversia A la I (Inozin) modific mesajul ARN, deoarece I este recunoscut ca G (nu ca A). Molecula de ARN astfel modificat este tradus ntr-o protein a crei secven de aminoacizi difer fa de a proteinei native. Codonul terminal amber este nlocuit cu codonul (UIG) pentru sinteza Trp. ARNm modificat, codific o protein mai mare antigenul D de 2l4 aminoacizi, o protein bazic, fosforilat care se acumuleaz n nucleul celulei infectate. Pentru virusurile cu genom ARN de polaritate negativ, hipermutaia datorat dezaminrii A este asociat cu persistena infeciei. Pentru virusurile cu genom ADN dc, modificarea reprezint un mecanism prin care copiile de ARNm timpuriu sunt inactivate. Marea diversitate a ribovirusurilor se explic prin mutabilitatea accentuat i adaptabilitatea lor. Cu puine excepii, virusurile capabile s infecteze insecte i animale superioare sau insecte i plante au genom ARN. Adaptabilitatea quasispeciilor le permite deplasarea ntre diverse medii selective. Foarte adesea, numai una sau cteva schimbri mutaionale permit unui virus s dobndeasc virulen, s-i schimbe tropismul i s devin rezistent la un medicament antiviral sau la anticorpii specifici. Variaiile secvenei de baze a quasispeciilor pot influena severitatea infeciei virale. Faptul este extrem de important pentru cercettori i pentru clinicieni, care tind s considere virusul rujeolic, HIV, virusul hepatitei C sau polio, ca entiti infecioase unice, la care diferiii pacieni rspund diferit. Se ignor natura fundamental a ribovirusurilor, adic mutabilitatea lor accentuat, materializat n existena quasispeciilor. Heterogenitatea quasispeciilor, caracterul tranzitoriu, ntmpltor, nedeterminat i imprevizibil al apariiei lor, creeaz o genetic aleatorie, contraintuitiv. Baza ubicvitii ribovirusurilor este chiar heterogenitatea lor genetic. Existena quasispeciilor ridic probleme insurmontabile controlului majoritii infeciilor cu ribovirusuri, prin intermediul vaccinurilor.

230

Vaccinarea a avut succes pentru unele viroze (produse de virusul polio, rujeola, oreionul, v ariola), deoarece anumii epitopi antigenici ai proteinelor virale, au o probabilitate mic de a se modifica, fr s compromit infeciozitatea lui. Identificarea epitopilor stabili (sau puin variabili) i imunizani (stimulatori ai rpunsului imun protector) pentru alte ribovirusuri (FMDV, HIV1, virusul hepatitei C) pune probleme dificile datorit naturii efemere a quasispecilor. Cele mai multe virusuri ARN, sufer o divergen evolutiv, prin substituia bazelor cu o rata de l/l02-l04/nucleotide/an. Rata evoluiei virusurilor nu este constant. Apariia unor noi ribovirusuri n viitor, este o certitudine. Unele apariii se vor datora contactului omului cu virusuri vechi de la animalele junglei neexplorate, iar altele vor aprea prin recombinare, reasortare sau prin mutaie. Apariia este ns condiionat de evoluia rapid a quasispeciilor i de capacitatea lor de adaptare rapid la gazda uman. Adaptarea rapid va determina transmiterea epidemic sau pandemic la om, aa cum se ntmpl cu influenza A, HIV1, sau va implica omul ca o gazd sporadic (virusul febrei hemoragice etc.). Este foarte probabil ca majoritatea ribovirusurilor umane, s fi evoluat n ultimele mii sau zeci de mii de ani, dar unele sunt mult mai recente. Dup Brown (l989), virusurile noi au evoluat din interaciunile genelor cromosomale, cu elemente genetice mobile i cu virusurile vechi i din acest punct de vedere, evoluia virusurilor este un proces care nu se temin niciodat. Dup Botstein (l982), produsul evoluiei virale nu este un virus anume, ci o familie de elemente genetice denumite module, fiecare dintre ele purtnd o funcie biologic particular. Fiecare virus este rezultatul unei combinaii favorabile de module. Recombinarea genetic furnizeaz noi variante de module, din care se perpetueaz cele mai adaptate. De cele mai multe ori, rezistena este rezultatul mutaiei genetice, care produce modificri ale enzimelor sau ale componentelor structurale ale virionului. Eficiena acestui mecanism se observ n culturile celulare, unde virusurile dezvolt rezisten dup numai cteva pasaje, n prezena agentului inhibitor. Rezistena herpesvirusurilor, la pacienii imunocompeteni apare rareori, ns tulpinile rezistente de virus influenza apar cu frecven mare. n general, virusurile rezistente la aciunea agenilor chimioterapeutici, par s aib o virulen redus i produc infecii mai uoare, n special la herpesvirusuri. Tulpinile rezistente de influenza A sunt a fel de virulente ca i tulpinile naturale. Detectarea i evaluarea genelor de rezisten se face prin diferite metode. Cele tradiionale implic inocularea culturilor celulare cu virusuri, expunerea la ageni inhibitori i determinarea modificrilor ulterioare n celul sau a cantitii de virus progen. Metoda nu este totdeauna relevant pentru populaiile de virusuri in vivo. Virusurile izolate de la pacieni sunt populaii heterogene, cu sensibilitate diferit la agenii inhibitori i chiar cu proprieti diferite de multiplicare n diferite substraturi celulare. Metodele noi pentru detectarea genelor de rezisten sunt cele moleculare, inclusiv PCR.

231

Bibliografie selectiv
1. Acosta E.P., Balfour H.H. Jr., Acyclovir for Treatment of Postherpetic Neuralgia: Efficacy and Pharmacokinetics, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45(10): 2771-2774. 2. Bacon T.H., Levin M.J., Leary J.J., Sarisky R.T., Sutton D., Herpes Simplex Virus Resistance to Acyclovir and Penciclovir after Two Decades of Antiviral Therapy, Clinical Microbiology Reviews. 2003, 16(1): 114-128. 3. Botstein D. and Maurer R., Genetic Approaches to the Analysis of Microbial Development. Ann.Rev.Genetics.1982,16: 61-8383 4. Blazevic V., Jankelevich S., Steinberg S.M., Jacobsen F., Yarchoan R., Shearer G.M., Highly Active Antiretroviral Therapy in Human Immunodeficiency Virus Type 1-Infected Children: Analysis of Cellular Immune Responses, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2001, 8(5): 943-948. 5. Brady M.T., Sears S.D., Pacini D.L., Samorodin R., DePamphilis J., Oakes M., Soo W., Clements M.L., Safety and prophylactic efficacy of low-dose rimantadine in adults during an influenza A epidemic, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1990, 34(9): 1633-1636. 6. Bryant M.L., Bridges E.G., Placidi L., Faraj A., Loi A.G., and colab., Antiviral l-Nucleosides Specific for Hepatitis B Virus Infection , Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45(1): 229-235. 7. Cato A. III, Qian J., Hsu A., Levy B., Leonard J., Granneman R., Multidose Pharmacokinetics of Ritonavir and Zidovudine in Human Immunodeficiency Virus-Infected Patients, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1998, 42(7): 1788-1793. 8. Cease K.B., Margalit H., Cornette J.L., Putney S.D., Robey W.G., Ouyang C., Streicher H.Z., Helper T-cell antigenic site identification in the acquired immunodeficiency syndrome virus gp120 envelope protein and induction of immunity in mice to the native protein using a 16-residue synthetic peptide, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1987, 84(12): 4249-4253. 9. Chun T.W., Justement J.S., Moir S., Hallahan C.W., Ehler L.A., Liu S., McLaughlin M., Dybul M., Mican J.M., Fauci A.S., Suppression of HIV replication in the resting CD4+ T cell reservoir by autologous CD8+ T cells: Implications for the development of therapeutic strategies, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2001, 98(1): 253-258. 10. De Cock K.M., Lucas S.B., Lucas S., Agness J., Kadio A., Gayle H.D., Clinical research, prophylaxis, therapy, and care for HIV disease in Africa, American Journal of Public Health. 1993, 83(10): 1385-1389. 11. Fischer P.B., Collin M., Karlsson G.B., James W., Butters T.D., Davis S.J., Gordon S., Dwek R.A., Platt F.M., The alpha-glucosidase inhibitor N-butyldeoxynojirimycin inhibits human immunodeficiency virus entry at the level of post-CD4 binding, Journal of Virology. 1995, 69(9): 5791-5797. 12. Gold D., Corey L., Acyclovir prophylaxis for herpes simplex virus infection, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1987, 31(3): 361-367. 13. Gtzsche P., Zidovudine dosage. Nordic Medical Research Councils' HIV Therapy Group, British Medical Journal. 1993, 307(6905): 682-683. 14. H. Chapel, M. Haeney, S. Misbah, N. Snowden Essential of Clinical Immunology, fifth edition, Blackwell Publishing, 2006. 15. Hoggard P.G., Sales S.D., Phiboonbanakit D., Lloyd J., Maher B.A., Khoo S.H., Wilkins E., Carey P., Hart C.A., Back D.J., Influence of Prior Exposure to Zidovudine on Stavudine Phosphorylation In Vivo and Ex Vivo, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45(2): 577-582. 16. Ikuta K., Suzuki S., Horikoshi H., Mukai T., Luftig R.B., Positive and Negative Aspects of the Human Immunodeficiency Virus Protease: Development of Inhibitors versus Its Role in AIDS Pathogenesis, Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2000, 64(4): 725-745. 17. Kakuda T.N., Page L.M., Anderson P.L., Henry K., Schacker T.W., Rhame F.S., Acosta E.P., Brundage R.C., Fletcher C.V., Pharmacological Basis for Concentration-Controlled Therapy with Zidovudine, Lamivudine, and Indinavir, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45(1): 236242. 18. Lehninger A. L. Biochimie, vol. I, Traducere dupa editia a II-a, Editura Tehnica Bucuresti, 1975. 19. Noormohamed F.H., Youle M.S., Higgs C.J., Martin-Munley S., Gazzard B.G., Lant A.F., Pharmacokinetics and Absolute Bioavailability of Oral Foscarnet in Human Immunodeficiency VirusSeropositive Patients, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1998, 42(2): 293-297.

232

20. Piret J., Lamontagne J., Dsormeaux A., Bergeron M.G., Efficacies of Gel Formulations Containing Foscarnet, Alone or Combined with Sodium Lauryl Sulfate, against Establishment and Reactivation of Latent Herpes Simplex Virus Type 1, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45(4): 10301036. 21. Schwartz S.A., Nair M.P., Current Concepts in Human Immunodeficiency Virus Infection and AIDS, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1999, 6(3): 295-305. 22. Servais J., Lambert C., Fontaine E., Plessria J.M., Robert I., Comparison of DNA Sequencing and a Line Probe Assay for Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Drug Resistance Mutations in Patients Failing Highly Active Antiretroviral Therapy, Journal of Clinical Microbiology. 2001, 39(2): 454-459. 23. Sjovall J., Bergdahl S., Movin G., Ogenstad S., Saarimki M., Pharmacokinetics of foscarnet and distribution to cerebrospinal fluid after intravenous infusion in patients with human immunodeficiency virus infection, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1989, 33(7): 10231031. 24. Takeda A., Robinson J.E., Ho D.D., Debouck C., Haigwood N.L., Ennis F.A., Distinction of human immunodeficiency virus type 1 neutralization and infection enhancement by human monoclonal antibodies to glycoprotein 120, The Journal of Clinical Investigation. 1992, 89(6): 1952-1957. 25. Topley and Wilsons. Principles of Bacteriology, Virology and Immunity, 8th Edition, Ed. M. Tom Parker, Lesslie H. Collier, 1990. 26. Zhou X.J., Sheiner L.B., DAquila R.T., Hughes M.D., Hirsch M.S., Fischl M.A., Johnson V.A., Myers M., Sommadossi J.P. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Clinical Trials Group Protocol 241 Investigators, Population Pharmacokinetics of Nevirapine, Zidovudine, and Didanosine in Human Immunodeficiency Virus-Infected Patients, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1999, 43(1): 121-128.

233