UNIVERSITATEA ALEXANDRU IOAN CUZA din IAI

COALA DOCTORAL A FACULTII DE FIZIC

Laboratorul de Biofizic Molecular i Fizic Medical

Rezumatul tezei de doctorat

INVESTIGAREA MOLECULAR A INFLUENEI

STRUCTURII UNOR PEPTIDE ASUPRA
INTERACIUNII CU SISTEMELE LIPO-PROTEICE

Conductor tiinific,
Prof. Dr. Tudor LUCHIAN

Doctorand,
Irina CHIOPU

- 2014, IAI -

UNIVERSITATEA "ALEXANDRU IOAN CUZA" DIN IAI

coala Doctoral de Fizic

V facem cunoscut faptul c n data de 1 septembrie 2014, ora 11:00, n

sala de conferine FERDINAND, domnioara Irina CHIOPU, va susine, n
edin public, teza de doctorat:
Investigarea molecular a influenei structurii unor peptide asupra interaciunii
cu sistemele lipo-proteice
n vederea obinerii titlului tiinific de doctor n domeniul fundamental tiine
Exacte, domeniul Fizic.
Comisia de examinare a tezei:
Prof. Dr. Diana MARDARE

Preedinte
Directorul colii Doctorale de Fizic
Universitatea Alexandru Ioan Cuza, Iai

Prof. Dr. Tudor LUCHIAN

Coordonator tiinific
Facultatea de Fizic
Universitatea Alexandru Ioan Cuza, Iai

Prof. Dr. Nicoleta DUMITRACU

Referent
Facultatea de Fizic
Universitatea Alexandru Ioan Cuza, Iai

C.S.I. Dr. Ioan TURCU

Referent
INCDTIM, Cluj Napoca

Conf. Dr. Drago GRIGORIU

Referent
Universitatea de Medicin i Farmacie
Gr. T. Popa, Iai

V invitm pe aceast cale s participai la edina public de susinere a tezei.


Mulumesc coordonatorului tiinific, profesor dr. Tudor Luchian i colegelor mele
dr. Aurelia Apetrei, dr. Loredana Mereu, dr. Alina Asandei pentru colaborare,
incredere i sfaturi utile oferite pe parcursul perioadei de doctorat.

Mulumesc doamnelor profesoare dr. Dorina Creang i dr. Nicoleta Dumitracu i

domnioarei lector dr. Loredana Mereu pentru sfaturile constructive
acordate n calitate de membri ai comisiei de ndrumare.

Mulumesc doamnei profesoare dr. Nicoleta Dumitracu, domnului cercettor

tiinific dr. Ioan Turcu i domnului confereniar dr. Drago Grigoriu
pentru sprijinul acordat n calitate de referei ai acestei teze.

CUPRINS
I. Motivaia studiului: Arhitectura inteligent a peptidelor cheia obinerii
unor molecule cu proprieti terapeutice superioare ............................................ 5
II. Peptidele antimicrobiene i interaciunea lor cu membranele
lipidice artificiale ...................................................................................................... 9
II.1. Caracteristici generale ale peptidelor antimicrobiene ................................................... 9
II.2. Mecanisme de destabilizare a membranelor lipidice artificiale. Tipuri de pori
transmembranari ................................................................................................................. 15
II.3. Rolul aminoacidului Triptofan n interaciunea peptid membran lipidic ............ 19

III. Detalii structurale i funcionale ale membranelor lipidice artificiale.

Proprieti electrice ale membranelor lipidice i importana acestora n
modularea activitii peptidelor ............................................................................ 24
IV. Detalii structurale i funcionale ale peptidelor antimicrobiene utilizate n
cadrul studiilor experimentale .............................................................................. 32
IV.1 Caracteristici specifice ale peptidei antimicrobiene melitina ..................................... 32
IV.2 Caracteristici specifice analogilor sintetici ai peptidei HPA3NT0:
Pep1, Pep2, Pep3 ....................................................................................................... 35

V. Interaciuni manifestate la nivel de singur molecul ale proteinelor,

peptidelor i moleculelor mici cu nanoporii proteici ........................................... 38
V.1. Descrierea detaliat a interaciunilor manifestate la nivelul porului proteic ............... 38
V.2. Detalii structurale i funcionale ale porului proteic de -hemolizin ........................ 40

VI. Detalii structurale i funcionale ale peptidelor utilizate n cadrul studiilor

experimentale la nivel de singur molecul ......................................................... 42
VI.1 Caracteristici specifice peptidei chimerice CA(1-8)MA(1-12)................................... 42
VI.2 Caracteristici specifice peptidei amiloidice uman-A(1-16), de provenien uman
i murin-A(1-16), de provenien murin ......................................................................... 46
VI.3 Efectul metalelor de tranziie asupra conformaiei peptidelor amiloidice .................. 52
VI.4 Natura chimic a interaciunii aminoacidului histidin cu ionii de cupru................... 56

VII. Tehnici i metode aplicare n studiul influenei structurii unor peptide

asupra modului de interaciune cu sistemele lipo-proteice ................................. 61
VII.1. Metoda Montal-Muller de realizare a membranelor lipidice artificiale ................ 61
VII.2. nregistrri de electrofiziologie la nivel de singur molecul. Utilizarea proteinei
-hemolizin ca nanosenzor ............................................................................................... 65
VII.3. Prepararea lipozomilor unilamelari mici prin metoda deshidratrii ......................... 67
VII.4. Metode spectrofluorometrice de analiz i control bazate pe emisia aminoacizilor
aromatici ............................................................................................................................. 72
VII.5. Tehnica monitorizrii n timp real a efluxului de calcein ncapsulat n interiorul
lipozomilor unilamelari mici sub aciunea peptidelor......................................................... 76
VII.6. Tehnica stingerii emisiei de fluorescen a floroforilor din structura peptidelor ...... 79

VIII. REZULTATE EXPERIMENTALE: .......................................................... 84

VIII.1. Studiul interaciunilor dintre peptida antimicrobian melitin i
sisteme lipidice biomimetice .............................................................................. 84
VIII.1.1. Modularea activitii peptidei antimicrobiene melitina de ctre agentul
modificator al potenialului de dipol phloretin .............................................................. 84
VIII.1.2. Influena triei ionice asupra adsorbiei i formrii de pori transmembranari de
ctre peptida antimicrobian melitin ............................................................................. 91

VIII.2. Modularea activitii unor peptide scurte de ctre modificarea

poziiei i orientrii spaiale a aminoacidului triptofan .................................. 94
VIII.2.1. Studiul activitii analogilor sintetici ai peptidei HPA3NT0: Pep1, Pep2,
Pep3 asupra membranelor lipidice prin tehnici de electrofiziologie.............................. 94
VIII.2.2.Studiul adsorbiei peptidelor Pep1, Pep2, Pep3 n sisteme de lipozomi prin
tehnici de spectroscopie de fluorescen ..................................................................... 102
VIII.2.3.Studiul cineticii de inserie i formare a porilor transmembranari
de ctre Pep1, Pep2, Pep3 prin monitorizarea spectrofluorimetric a
efluxului de calcein din lipozomi .............................................................................. 109

VIII.3. Monitorizarea schimbrilor conformaionale a unor peptide n

prezena unor metale relevante fiziologic ...................................................... 114
VIII.3.1. Studiul deplasrii spectrului de emisie a peptidei CA(1-8)MA(1-12) n
interaciunea cu ionii de cupru. Identificarea constantei de disociere Kd cu
ajutorul modelul matematic Langmuir ........................................................................ 114
VIII.3.2. Modelul matematic propus pentru caracterizarea cineticii reacilor de
asociere i disociere dintre porul proteic de hemolizin i peptida chimeric
CA(1-8)MA(1-12), complexat i necomplexat de ionii de cupru ............................ 120

VIII.4. Studiu comparativ asupra peptidelor amilodice de provenien

uman uman-A(1-16) i murin, murin-A(1-16) n interaciunea
cu ionii de cupru ............................................................................................... 136
VIII.4.1. Utilizarea porului proteic de hemolizin ca detector molecular a
diferenelor conformaionale ale peptidelor amiloidice Ab(1-16)h i Ab(1-16)r
induse de ionii de cupru .............................................................................................. 136

VIII.5. Investigarea efectelor metalelor relevante fiziologic asupra

conformaiei spaiale a peptidei amiloidice de provenien uman A(1-16)
........................................................................................................................... 151
VIII.5.1. Studiul la nivel de singur molecul a cineticii reaciei -HL Ab(1-16)h
n prezena ionilor de Cu2+, Zn2+, Fe3+ i Al3+. Determinarea constantelor de
disociere Kd ................................................................................................................ 151

Bibliografie............................................................................................................ 152

I. Motivaia studiului: Arhitectura inteligent a peptidelor cheia obinerii unor

molecule cu proprieti terapeutice superioare
Motivaia studiului peptidelor antimicrobiene
Peptidele antimicrobiene reprezint o parte esenial a sistemului imunitar care
acioneaz mpotriva infeciilor microbiene. Acestea se regsesc att la plante, insecte ct i la
vertebratele superioare. Acestea peptide naturale sunt compui bazici, cu o structur primar
de 12-50 de aminoacizi, n bazele de date existente pn la ora actual fiind inregistrate peste
800 de asemenea compui. Cte va exemple de astfel de peptide antimicrobiene mpreuna cu
sursa lor, ar fi: insect defensin A (fungi), cecropin A (insecte), melittin (venin de albine),
magainin 2 (amfibieni), tachyplesin 1 (crabi), -defensin HNP-1 (oameni).
Compoziia lor n aminoacizi, amfipaticitatea, ncrcarea electric cationic i
structurile lor sescundare, permit acestor peptide s se adoarb i s se insere n membranele
lipidice pentru a forma pori transmembranari [1,2]. Dei au existat numeroase ncercri de a
elucida mecanismul lor de aciune prin diferite modele de tipul porilor transmembranari
clasici, a porilor toroidali sau de distrugere a membranelor [3], exist nc dezbateri privind
modalitatea sau modalitile de aciune asupra microorganismelor in vivo.
n acest studiu ne-am propus investigarea influenei poziiei i orientrii geometrice
a aminoacizilor aromatici prezeni n structura primar a unor peptide antimicrobiene derivate
din peptida HPA3NT0 asupra mecanismului acestora de formare a porilor transmembranari n
bistraturi lipidice reconstituite. Rezultatele experimentale i interpretarea acestora vor oferi o
mai bun nelegere a mecanismelor de aciune litic a acestor peptide in vivo, esenial
pentru asamblarea unor noi molecule derivate din peptide antimicrobiene naturale, dar cu
proprieti superioare acestora.
Motivaia studiului interaciunilor dintre peptide i metale de tranziie
n ultimii ani interesul fa de etiologia bolilor neurodegenerative a crescut
considerabil, iar una din ipotezele propuse de studiile efectuate pn n prezent n aceast
direcie indic tulburarea homeostaziei metalelor la nivelul creierului ca i cauz principal
pentru inducerea unei conformaii anormale [4] a peptidelor i proteinelor implicate n
procesele biologice ale organismului. n majoritatea cazurilor, mpachetarea greit a
peptidelor i proteinelor induce la oligomerizarea, agregarea acestora i n final la formarea de
plgi insolubile [4]. O gam variat de boli neurodegerantive sunt afectate de procesele de
agregare a peptidelor i proteinelor, cu toate c nc nu se cunoate dac formarea de fibrile
este cauza apariiei bolilor sau doar o consecin.
n acest studiu ne-am propus ca n acest studiu s dezvoltm o serie de experimente
n care s urmrim pe de-o parte schimbarea conformaiei peptidelor amiloidice de
provenien uman i murin n urma procesului de complexare cu ionii de cupru, prin tehnici
de electrofiziologie la nivel de singur molecul, i pe de alt parte s demonstrm importana
structurii primare a peptidelor n mpachetarea greit a acestora prin prisma diferenelor
existente ntre cele dou tipuri de peptide amiloidice. n acest scop ne-am folosit de porul

proteic de -HL pentru a testa modul de interaciune a peptidelor amiloidice cu acest nanopor,
n prezena i n absena ionilor de cupru, dezvoltnd i un model matematic complex ce ne
permite analiza cantitativ a acesor interaciuni i determinarea unor parametri eseniali (i.e.
constanta de disociere) n descrierea efectelor ionilor de cupru asupra conformaiei peptidelor
amiloidice. Relevana aplicrii acestei tehnici de studiu al interaciunilor la nivel unimolecular const n uurina i elegana implementrii acesteia cu succes n analiza la
rezoluie subnanometric a moleculelor de ADN [5] i n diverse studii de detecie
molecular. Importana implementrii acestei tehnici, descris pe larg n aceast lucrare, o
prezint posibilitatea de a descrie mecanismele moleculare ce au loc ntre o singur peptid n
interaciune cu ionii de metal.
II. Peptidele antimicrobiene i interaciunea lor cu membranele lipidice artificiale
Numeroase studii au descris influena unor parametri structurali importani ai
peptidelor: sarcina electric net, helicitatea, hidrofobicitatea intrinsec, momentul hidrofob,
i mrimea domeniilor polare respectiv hidrofobe asupra efectului de permeabilizare a
membranelor, a efectului antimicrobial i hemolitic. Experimentele arat c aceti parametri
pot constitui o baz puternic n optimizarea structurii peptidelor, corelat cu activitatea lor
antimicrobial. Predominana unui mecanism de permeabilizare a membranei este determinat
de efectul cumulat al caracteristicilor structurale ale peptidei i de influena acestora asupra
etapelor de adsorbie i permeabilizare a membranelor. Principalele caracteristici care
determin activitatea i specificitatea peptidelor antimicrobiene sunt: secvena primar,
structura secundar, helicitatea, momentul hidrofob, hidrofobicitatea, unghiul de
hidrofobicitate i sarcina electric a peptidei.
Pn n prezent au fost descrise dou tipuri distincte de canale ionice formate prin
agregarea peptidelor citotoxice: porii clasici (barrel stave) al cror interior este format
numai din prile polare ale peptidelor i porii toroidali la a cror structur interioar
contribuie i capetele polare ale lipidelor ce intr n componena membranei (Fig. II.2.1).

Fig.II.2.1. Reprezentarea schematizat a

modelelor
de
formare
a
porilor
transmembranari. (a) Modelul porilor clasici;
(b) Modelul porilor toroidali [10]

Un alt mod de interaciune cu bistratul lipidic ar fi reprezentat de mecanismul de

carpetare, conform cruia peptidele se acumuleaz la interfaa bistrat/mediu apos sub forma
unui covori, cnd se depete o valoare prag a concentraiei de monomeri, membrana este

permeabilizat i dezintegrat ntr-un mod asemntor aciunii detergenilor, fr formarea

unor canale ionice distincte (Fig. II.2.2).
Fig. II.2.2. Reprezentare schematic a
modului de disrupere a membranei celulare
prin mecanismul de carpetare. Peptidele cu
structur de -helix se adsorb iniial la
interfaa membran/mediu apos (a) apoi se
acumuleaz (b) orientate paralel la suprafaa
membranei. Acumularea continu de peptide
la nivelul bistratului conduce la acoperirea
(carpetarea) acesteia cu peptide (c) i n
final, cnd se atinge o concentraie critic, la
dezintegrarea ei (d) [11].

nvestigaii de nalt rezoluie a structurii proteinelor inserate n membranele lipidice i studii

recente ale rolului aminoacizilor individuali n medierea interaciunilor proteine lipide au
artat c reziduurile polare aromatice, triptofan (Trp) i tirozin (Tyr), prezint o afinitate
specific pentru regiunea lipidic aflat la interfaa membran mediu apos. Interfaa
membran mediu apos reprezint o parte relativ mare din grosimea total a bistratului
lipidic i prezint un mediu chimic complex, care ofer multe posibiliti pentru interaciuni
necovalente cu catenele laterale ale peptidelor i proteinelor. Aceast interfa prezint un
gradient de polaritate, de la foarte apolar n apropierea regiunii cozilor hidrocarbonate ce
formeaz miezul hidrofob al membranei, pn la foarte polar, n apropierea fazei apoase.
Gruprile carboxil ale lipidelor, grupare fosfatcolin, ct i moleculele de ap din jurul
capetelor polare ale fosfolipidelor ofer posibilitatea unor interaciuni de tip dipol dipol,
cation , formarea de legturi de hidrogen cu lanurile laterale ale aminoacizilor din
structurile peptidelor i proteinelor [12,13].

Fig.II.3.1 Interaciunea cation- dintre un cation oarecare i un inel aromatic de benzen [adaptare
dup UC Davis ChemWiki].

Interaciunea cation reprezint o interaciune puternic de natur necovalent dintre

electronii orbitalilor (n care densitatea electronic este distribuit n mod uniform deasupra
i dedesubtul planului moleculei) i un cation aflat n vecintate. n cazul interaciunilor de tip
cation manifestate la interfaa dintre bistratul lipidic i mediul apos, legtura se formeaz
ntre inelul indol al aminoacidului triptofan i azotul ncrcate electric pozitiv din gruparea
colin a capetelor polare a fosfolipidelor ce compun bistratul lipidic.
Legturile de hidrogen se manifest ntre hidrogenul din gruparea NH a inelului indol a
triptofanului i oxigenul din gruparea carboxil (C=O). Tria acestor legturi depinde de tipul
de fosfolipide din componena membranei, calcule energetice din dinamica molecular au

artat c preponderena interaciunilor cation crete n cazul lipidelor n care cationul azot
este mai expus (e.g.: POPE, 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylethanolamine, unde azotul este
legat doar de trei atomi de hidrogen, fa de POPC, 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidyl-choline,
unde azotul este legat de trei grupri CH) [14].
III. Detalii structurale i funcionale ale membranelor lipidice artificiale. Proprieti
electrice ale membranelor lipidice i importana acestora n modularea activitii
peptidelor.
Membranele biologice sunt structuri polimerice alctuite n principal din lipide i
proteine, cu rol esenial n meninerea integritii celulare prin aceea c reprezint o barier de
permeaie foarte selectiv ntre mediile intra i extracelular. Acestea servesc drept suport
pentru o clas vast de proteine membranare ce sunt practic solubilizate n bistratul lipidic i
care au rol esenial n procesele de transducie celular, comunicare celular, replicarea ADNului, n procesele de recunoatere celular, etc. Dei caracteristica tuturor celulelor ce intr n
compoziia materiei vii este diversitatea funcional i structural, toate biomembranele sunt
structuri planare, cu grosimi cuprinse ntre 60 i 100, alctuite n principal din lipide i
proteine. Mai mult, biomembranele sunt suprastructuri moleculare necovalente, organizate
sub form de bistrat lipidic al cror monostraturi prezint asimetrie.
n general, se poate spune c profilul electric al biomembranelor se compune din:
contribuia potenialului transmembranar, potenialul de dipol i diferena potenialelor de
suprafa dintre cele dou fee ale membranei. n timp ce potenialul transmembranar rezult
n urma gradientului de sarcin de o parte i de alta a membranei i potenialul de suprafa
este dat de excesul de sarcin net prezent la suprafaa membranei, potenialul de dipol al
membranei i are originea n dipolii moleculari localizai la nivelul moleculelor lipidelor.
Potenialul de dipol ( d ) (Fig.III.4) reprezint cea de-a treia component a
potenialului transmembranar total. Studii structurale ale biomembranelor au relevat faptul c
originea potenialului de dipol este dat de doi factori principali i anume: pe de o parte
orientarea gruprilor dipolare localizate n moleculele lipidice (dipolul corespunztor gruprii
carbonil din legtura esteric i dipolul captului terminal P - - N + ), pe de alt parte
momentele dipolare corespunztoare moleculelor de ap situate la interfaa membran/soluie
apoas.

Fig.III.4. Reprezentare schematizat a unui bistrat lipidic (a) alctuit din fosfolipide a cror
structur prezint o regiune polar (colin-fosfat-glicerol) i dou cozi hidrocarbonate hidrofobe
(acizi grai) (bReprezentare schematic a potenialului de dipol d , corelat cu existana
momentelor dipolare diferite de zero existante n capetele hidrofile ale lipidelor ce intr n
compoziia membranelor biologice ( P P + ), ( C + O ) i a momentelor dipolare ale
moleculelor de ap.

n literatura actual, sunt cunoscute anumite molecule care pot modula amplitudinea
potenialului de dipol membranar atunci cnd ajung la suprafaa membranar. Dintre acestea,
phloretinul are abilitatea de a scdea amplitudinea potenialului de dipol. Phloretinul este un
acid slab, are valoarea pKa = 7.3 iar forma activ a acestuia este cea neutr, la un pH < 7.3.
Fig.III.6
Schem
reprezentativ
pentru absorbia moleculelor de
phloretin la interfaa membran
mediu apos. Structura chimic a
moleculei de phloretin, precum i
momentul de dipol corespunztor
acestuia dat de gruparea carboxil
(C=O) este reprezentat n stnga, iar
bistratul lipidic este reprezentat n
dreapta mpreun cu potenialul de
dipol dat de capetele polare. Direcia
pe care moleculele de phloretin se
adsorb este cu momentul de dipol
orientat invers fa de cel al capetelor
polare, astfel ducnd la o scdere a
potenialului de dipol al membranei.

IV. Detalii structurale i funcionale ale peptidelor antimicrobiene utilizate n cadrul

studiilor experimentale
Melitin (Apis Mellifera): H2N-Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-ProAla-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-CONH2

analogi HPA3NT0 (Helicobacter pylori): Phe-Lys-Arg-Leu-Glu-Lys-Leu-Phe-Ser-Lys-Ile-TrpAsn-Trp-Lys

Pep1: Leu-Lys-Arg-Leu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Lys-Ile-Trp-Asn-Lys-Trp - NH2
Pep2: Phe-Lys-Arg-Trp-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Lys-Ile-Trp-Trp-Lys-Asn - NH2
Pep3: Leu-Lys-Arg-Leu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Lys-Ile-Trp-Trp-Lys-Asn - NH2
V. Interaciuni manifestate la nivel de singur molecul ale proteinelor, peptidelor i
moleculelor mici cu nanoporii proteici
Procesul de translocare prin proteine, de dimensiuni nanometrice, inserate n
membranele celulelor eucariote este semnificativ pentru meninerea funciilor acestora. n
ultimii ani, interesul pentru astfel de procese a crescut, sesizndu-se potenialul unor proteine de
a fi utilizate n domeniul biotehnologiilor, ca i sisteme de detecie bimolecular. Astfel, aceast
tehnic a fost folosit pentru caracterizarea unor suspensii de particule [15-17], secvenierea
ADN-ului [18,19] sau detecia schimbrilor conformaionale ale peptidelor [20, 21].
Pe scurt, atunci cnd o molecul transloc printr-un por proteic de dimensiuni
nanometrice, inserat ntr-o membran lipidic ce separ dou compartimente cu coninut de
soluie electrolitic, aceasta va bloca accesul ionilor s mai parcurg traseul din interiorul
porului, ducnd la o scdere a curentului ionic iniial, corespunztor porului liber. Profilul i
succesiunea de fluctuaii de curent ionic generate de trecerea diverselor tipuri de molecule
printr-un singur por proteic pot oferi informaii utile cu privire la caracteristicile structurale ale
acestora.
Fig.V.1.1. Reprezentarea unui singur por
proteic de -HL inserat n membrana
lipidic. Peptida amiloid-beta prezentat
n prezena i n absena -ciclodextrinei
(A 42-CD) sau a moleculei de congo red.
(a) Reprezentarea a blocajelor de curent
ionic datorate inteaciunii dintre por i
complexul A 42-CD. (b) Reprezentarea a
blocajelor de curent ionic datorate
inteaciunii dintre por i complexul A 42.
(c) Reprezentarea a blocajelor de curent
ionic datorate inteaciunii dintre por i
complexul A42-congo red. [22]

-hemolizina (-HL) este o protein monomeric de 33.2 kDa solubil n ap, secretat de
bacteria Staphylococcus aureus, care prezint proprieti de autoasamblare, formnd canale
ionice heptamerice n membrane lipidice sau artificiale (Fig.V.2.1).

Fig.V.2.1 (a) Vedere lateral a complexului

heptameric de -hemolizin care arat modul
de inserie n bistratul lipidic membranar.
Complexul are o lungime i un diametru
comparabile de aproximativ 100 . (b)
Vedere a -hemolizinei din partea cis a
membranei lipidice. (c) i (d) Seciunea
longitudinal respectiv modelul space-filling
al proteinei care arat diametrul interior al
canalului acesteia la diferite poziii. Fiecare
culoare reprezint un monomer diferit de hemolizin [23].

Structura cristalin a acestei proteine este bine cunoscut [24]. Datorit posibilitii
de a introduce numeroase mutaii locale n structura -HL, proteina este un bun candidat pentru
o gam larg de aplicaii. Avnd n vedere importana biologic deosebit a interaciunii dintre
peptide i pori proteici, au fost realizate numeroase studii care investigheaz partiionarea
peptidelor n porul proteic de -HL [24-33].
VI. Detalii structurale i funcionale ale peptidelor utilizate n cadrul studiilor
experimentale la nivel de singur molecul
VI.1 Caracteristici specifice peptidei chimerice CA(1-8)MA(1-12):
CA(1-8)MA(1-12) - format prin alturarea primilor opt aminoacizi a peptidei cecropin A cu
primii doisprezece aminoacizi a peptidei magainin 2:
Lys-Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-NH2
VI.2 Caracteristici specifice peptidei amiloidice uman-A(1-16), de provenien uman i
murin-A(1-16), de provenien murin:
uman - A(1-16):
Asp - Ala - Glu - Phe - Arg - His - Asp - Ser - Gly - Tyr - Glu - Val - His - His - Gln Lys
murin - A(1-16):
Asp - Ala - Glu - Phe - Gly - His - Asp - Ser - Gly - Phe - Glu - Val - Arg - His - Gln Lys

VI.3 Efectul metalelor de tranziie asupra conformaiei peptidelor amiloidice

Din studiile efectute pn la ora actual reiese clar faptul c dereglarea homeostaziei
metalelor de tranziie prezente n organism joac un rol important n etiologia bolii
neurodegerative Alzheimer. Astfel c, elucidarea detaliilor de ordin structural ce stau la baza
interaciunilor dintre aceste metale i peptidele amilodice ar facilita nelegerea apariiei
neurotoxicitii i proiectarea unor substane chimice care s aib o aciune terapeutic. Studiile
efectuate asupra modificrilor de conformaie a acestor peptide induse de ionii de zinc indic
implicarea celor trei reziduuri de histidin (His6, His13 i His14), ca i n cazul cuprului. A patra
legtur coordonativ fiind nc necunoscut, unele studii propunnd ca posibili candidai:
oxigenul acidului glutamic (Glu11), captul N terminal atunci cnd acesta este acetilat sau
acidul aspartic (Asp1), atunci cnd captul N-terminal nu este acetilat [34]. Studii comparative,
de rezonan magnetic nuclear, 1H RMN, ce vizeaz efectului ionilor de zinc asupra
segmentului de peptid A(1-28) de provenien uman i murin dizolvat n ap sau SDS
(sodium dodecyl sulphate), la pH neutru [35] au artat c acidul glutamic (Glu11) ar avea
potenialul cel mai mare pentru a forma a patra legtur coordonativ cu ionii de zinc, iar
diferena de o histidin (H13R) dintre cele dou peptide ar fi responsabil pentru conformaia
mai stabil adoptat de peptida de provenien uman, cea care conine trei histidine, dect
cealalt, ce prezint doar dou histidine.
VI.4. Natura chimic a interaciunii aminoacidului histidin cu ionii de cupru
Nivelul de cupru regsit la nivel neuronal este crescut semnificativ la pacienii care
deja se afl ntr-o stare avansat a bolii Alzheimer fa de pacienii sntoi. Cifrele indicnd
valori ale cuprului de la 4.4 1.5 g/g n cazul eantionului control, pn la 19.3 6.3 g/g n
cazul eantionului test, ajungndu-se chiar pn la valori de 30.1 11 g/g n analizei n
mijlocul plcii senile [36].
Histidina (His) este un unul din cei 20 de aminoacizii principali care intr n
componena proteinelor i a peptidelor. Acesta conine un inel imidazol ca i caten lateral,
aromatic la orice valoare a pH-ului. Conine ase electroni : patru din dou legturi duble i doi
de la azot, acetia din urm fiind cei cu perechi de electroni liberi ce pot contribui la formarea
legturilor de coordinare cu metalele. Electronii liberi ai azotului din gruparea amin contribuie
la caracterul aromatic al inelului imidazol. Prin hibridizarea orbitalului 2sp i completarea
acestuia cu nc un electron de la atomul de hidrogen acesta nu mai are electroni liberi pentru a
forma legruri coordinative cu metalele. Pe de alt parte, azotul din grupare imin, care are dou
legturi sigma i una pi, se afl deja n stare hibridizat 2sp.

Fig.VI.4.2 Configuraiile electronice i gruparea electronilor pe subnivelele energetice a atomului

de azot simplu i n a celor din legturile gruprilor amin (dreapta), respectiv imina (stnga) a
aminoacidului histidin. Pentru simplitate reprezentrii gruprile amin (-NH2) i acidul carboxilic
(COOH) care intr n lanul polipeptidic al unei peptide au fost notate cu R, de interes fiind doar
catena lateral a aminoacidului histidin (inelul imidazol). n cazul gruprii amin hibridizarea
nivelului energetic se face la interaciunea acestuia cu atomul de hidrogen (acesta avnd doar trei
legturi de tip ), contrat gruprii imina n care nivelul energetic este deja hibridizat (acesta avnd
dou legturi de tip i una de tip ).

Astfel c perechea de electroni liberi se afl deja pe orbitalul 2sp hibridizat i cu

care poate contribui la legtura coordinativ cu ionii de cupru, mai exact cu orbitalul 4sp. Din
acest motiv, ionii de cupru se leag preferenial de atomii de azot din anumii aminoacizi, cum ar
fi histidinele din structura primar a peptidei amiloid.
VII. Tehnici i metode aplicare n studiul influenei structurii unor peptide asupra modului
de interaciune cu sistemele lipo-proteice
Metoda Montal-Muller de realizare a membranelor lipidice artificiale. Monitorizarea
canalelor voltaj dependente formate de peptidele citotoxice n bistraturi lipidice reprezint una
din tehnicile utile de investigare a formrii i stabilitii porilor transmembranari indui de
acestea la nivelul membranele celulare biologice. Amplitudinea curentului electric mediat de
porii formai de peptidele citotoxice n membranele artificiale reprezint o msur a capacitii
de penetrare a biomembranelor de catre aceste molecule peptidice. Atunci cnd peptidele se
adsorb la interfaa bistrat/mediu apos, se inser n miezul hidrofob al bistratului formnd pori
apoi transmembranari ce pot fi monitorizai nregistrnd modificrile de curent electric ce apar
n sistem n urma aplicrii unei deferene de potenial de o parte i cealalt a membranei lipidice.
(Fig.VII.1.1)

Fig.VII.1.1 Reprezentare schematizat a componentelor dispozitivului experimental utilizat pentru

realizarea biomembranelor artificiale. Bistratul lipidic se formeaz la nivelul aperturii de diametru
de 100 m din filmul de teflon cu grosime de 25 m vedere detaliat a biomembranei formate la
nivelul partiiei de teflon ce separ cele dou cuve de teflon, n care, pentru exemplificare, se
consider inserat un canal ionic de alameticin. Curentul electric a fost detectat i amplificat cu un
amplificator integrat Axopatch 200 B (Molecular Devices, USA) setat pe modul de voltaj fixat, prin
intermediul a doi electrozi de Ag/AgCl. Achiziia datelor s-a realizat cu o plac de achiziie NI PCI
6221 pe 16 bii (National Instruments USA), cu o frecven de achiziie de 30 kHz n mediul grafic
LabVIEW 8.20.

nregistrri de electrofiziologie la nivel de singur molecul. Utilizarea proteinei hemolizin ca nanosenzor. nregistrarea fluctuaiilor de curent electric mediat de canale ionice
membranare prin tehnici de electrofiziologie molecular este esenial pentru vizualizarea direct
a tranziiilor moleculare realizate de un singur canal ionic i pentru a studia fenomenele de
transport ionic sau a unor molecule mici prin aceste canale ionice. Aceste tranziii au un caracter
pur stochastic astfel nct, n descrierea comportamentului acestor molecule sunt importante
estimarea numrului exact de stri moleculare (de tip nchis i deschis) prin care poate trece
un canal ionic, determinarea ratelor de tranziie ntre aceste stri precum i analiza proceselor de
transport ionic mediate de acele canale.

Fig.VII.2.1 Fluctuaii specifice ale

curentului ionic printr-un singur por
proteic de -HL induse n urma adiiei
n partea trans a membranei lipidice a
peptidelor, nregistrate la o valoare a
diferenei de potenial aplicate de -50
mV, observate sub forma unor alterri
de tip treapt ale curentului ionic spre
valori mai pozitive ale acestuia.

10

Peptidele interacioneaz rapid cu zona de constricie a porului proteic conducnd la evenimente

de blocaj complet sau parial, cu o durat suficient de mare pentru ca monitorizarea lor s fie
posibil. Valorile amplitudinii blocajelor porului proteic de ctre peptid sunt date de
conformaia n care se regsete peptida, aceasta poate bloca complet porul n zona de
constricie, ceea ce sugereaz o aranjare spaial mai voluminoas a peptidei, sau poate bloca
parial porul, ceea ce indic o aranjare liniar a pepdei la trecea acesteia prin por.
Prepararea lipozomilor unilamelari mici prin metoda deshidratrii. Lipozomii, cele mai
ntlnite nanoparticule alctuite din molecule lipidice, pot fi reprezentai printr-o sfer a crei
diametru variaz ntre 30 nm i 10 m. Lipozomii se formeaz atunci cnd un film lipidic subire
este hidratat iar mulimile de bistraturi lichid-cristaline devin fluide i cresc n mrime. Straturile
de lipide hidratate se desprind n timpul procesului de agitaie iar capetele acestora se aproprie
pentru a evita contactul apei cu miezul hidrofob al bistratului, formnd vezicule multilamelare.
Pentru a reduce dimensiunile acestor vezicule este nevoie de aport energetic sub form de
energie sonic (sonicare) sau energie mecanic (extrudare), rezultnd astfel vezicule unilamelare
mici (SUVs).

Fig.VII.3.3 Reprezentare schematizat a

etapelor de formare a
vezicuelor
unilamelare mici (SUV). n general,
procedura de obinere a lipozomilor
presupune: prepararea lipidelor pentru
hidratate, hidratarea prin agitaie i
aducerea la o distribuie omogen a
dimensiunii veziculelor prin sonicare.

Metode spectrofluorometrice de analiz i control bazate pe emisia aminoacizilor

aromatici. Spectroscopia de fluorescen (fluorometria sau spectrofluorometria) este un tip de
spectroscopie electromagnetic ce analizeaz fluorescena unei probe de studiu. Acest tip de
analiz implic utilizarea unui fascicul de lumin, de obicei cu raze ultraviolete, care excit
electronii moleculelor din anumii compui ceea ce duce la emisia unei lumini cu energie mai
mic de obicei, dar nu neaprat, n lumina vizibil.

11

Fig. VII.4.4 Dac iniial triptofanul se

afl ntr-un solvent polar iar ulterior
trece
ntr-un
mediu
hidrofob
(apolar), spectrul de emisie va fi
deplasat spre regiunea albastr a
lungimilor de und.

Triptofanul prezint un spectru de absorbie cu maximul la 280 nm, pe cnd maximul spectrului
de emisie variaz ntre 300 i 350 nm, n funcie de polaritatea solventului [37,38]. Triptofanul
existent n structura primar a proteinelor poate fi deci utilizat pentru estimarea naturii mediului
n care se afl. n funcie de polaritatea, flexibilitatea i natura chimic a mediului n care se
gsete triptofanul, acesta va interaciona diferit la redistribuirea densitii electronice n inelul
indol al aminoacidului.
Tehnica monitorizrii n timp real a efluxului de calcein ncapsulat n interiorul
lipozomilor unilamelari mici sub aciunea peptidelor. Fluoroforul calcein se prezint sub
form de cristale de culoare portocalie, avnd lungimea de und de excitaie la 495 nm, respectiv
maximul spectrului de emisie la 525 nm (Fig.VII.5.1). n literatura de specialitate este specificat
faptul c fluoroforul calcein i auto-stinge emisia fluorescent chiar i la valori ale
concentraiei de sub 100 mM [39]. Pe parcursul experimentelor, calceina a fost solubilizat n
soluie ntr-o concentraie de 50 mM, care asigur autostingerea fluorescenei. Sistemele lipidice
utilizate n aceste experimente sunt lipozomi sferici formai prin acelai protocol ca cel descris
n subcapitolul VII.3., hidratai cu ajutorul soluiei de calcein. Pentru a elimina calceina din
mediul extern al veziculelor unilamelare mici astfel formate, suspensia de lipozomi a fost supus
unui proces de separare cromatografic pe coloane cu gel [40]. Eliminarea calceinei libere din
suspensia lipidic s-a fcut folosind Coloane PD-10 cu un coninut de gel Sephadex G-25, ce
asigur separarea compuilor cu mas molecular mare de cei cu mas molecular mic.
Peptidele citotoxice se inser n bistratul lipidic i formeaz pori transmembranari prin
intermediul crora calceina, aflat n interior la o concentraie care asigur stingerea
fluorescenei, este eliberat n mediul extern i emite fluorescent. Evoluia n timp real a
intensitii fluorescenei poate fi corelat cu cinetica de formare a porilor de ctre peptidele
citotoxice studiate.
Tehnica stingerii emisiei de fluorescen a floroforilor din structura peptidelor. Stingerea
fluorescenei (quenching) se refer la orice proces care induce scderea intensitii de
fluorescen a unor anumite substane denumite florofori n urma interaciunii acestora cu alte
molecule, denumite molecule quencher.

12

Fig.VII.6.3 Reprezentare grafic a spectrului de emisie a proteinei PV2 n care se observ scderea
intensitii de emisie n urma adiiei unei concentraii de pn la 1M de acrilamid [44].

Exist numeroase molecule quencher ce pot aciona asupra fluoroforilor stingndu-le emisia de
fluorescen prin diferite mecanisme: oxigenul, care interacioneaz cu aproximativ toate tipurile
de fluorofori, ionii greii, reziduurile de histidin i cistein, amine, ionii ale metalelor (Cu2+,
Pb2+). Acrilamid este un compus chimic alb inodor i toxic, cu o solubilitate mare n ap (2.04
kg/L la 25 C), dar i n aceton, etanol sau cloroform, polar dar neutru din punct de vedere
electric i nu se inser n miezul hidrofob al membranelor fosfolipidice. Moleculele de acrimalid
interacioneaz cu fluoroforii aflai n stare excitat inducnd scderea fluorescenei prin procese
colizionale [41 - 43]. Tehnica stingerii emisiei de fluorescen este util n numeroase aplicaii,
cum ar fi msurarea fluorescenei unei proteine transmembranare marcate fluorescent poate oferi
informaii privitoare la locaia exact a acesteia n domeniul membranar.
VIII. REZULTATE EXPERIMENTALE
VIII.1. Studiul interaciunilor dintre peptida antimicrobian melitin i sisteme lipidice
biomimetice
VIII.1.1. Modularea activitii peptidei antimicrobiene melitina de ctre agentul modificator al
potenialului de dipol phloretin
Rezultatele experimentelor de stingere a emisiei de fluorescen. Studiul efectuat a
vizat elucidarea modulrii activitii peptidei melitin de ctre moleculele de phloretin adsorbite
n membrana lipidic a veziculelor unilamelare mici (SUVs) utiliznd tehnici de spectroscopie
de fluorescen. Tehnica a presupus monitorizarea scderii emisiei de fluorescen a
fluoroforului triptofan, prezent n secvena primar a peptidei melitin, n urma interaciunilor
acestuia cu moleculele de acrilamid. Analiza cantitativ a scderii intensitii cu adiia unei
concentraii incrementale de molecule de acrimalid ne-a oferit informaii privitoare la gradul de
adsorbie al peptidei meltin n sisteme lipidice simple sau cu phloretin.

13

Fig.VIII.1.1.2 Spectrele de emisie a 1M peptid

melitin n sisteme lipidice simple. Spectrul de
emisie iniial a melitinei este reprezentat cu
negru. Se observ scderea intensitii de
fluorescen a fluoroforului triptofan din
structura peptidei melitin n urma adiiei
moleculelor de acrilamid n concentraii de 75
mM (verde) i respectiv 150 mM (rou).

Fig.VIII.1.1.3 Spectrele de emisie a 1M peptid

melitin n sisteme lipidice cu 20 M phloretin.
Spectrul de emisie iniial a melitinei este
reprezentat cu negru. Se observ scderea
intensitii de fluorescen a fluoroforului
triptofan din structura peptidei melitin n urma
adiiei moleculelor de acrilamid n concentraii
de 75 mM (albastru) i respectiv 150 mM (roz).

Se poate observa, c pentru o aceeai valoare a concentraiei de acrilamid, de exemplu 75 mM,

scderea maximului spectrului de emisie a melitinei este dimnuat n cazul sistemelor lipidice
care conin molecule de phloretin. Acest fapt este datorat gradului de expunere diminuat a
fluoroforului (aminoacidul triptofan) ctre moleculele de quencher (acrilamid), interaciunea
dintre acetia fiind diminuat. Analiza cantitativ a scderii emisiei de fluorescen i fitarea cu
ecuaia Stern-Volmer a variaiei liniare a acesteia de concentraia de acrilamid, ne ofer
posibilitate calculului constantei Stern-Volmer n cazul proceselor de quenching colizional, a
crei valoare ne indic gradul de adsorbie a peptidei n sistemele lipidice.
Fig.VIII.1.1.4 Reprezentarea fitului liniar al
datelor experimentale obinute n urma
monitorizrii scderii intensitii fluorescenei
cu creterea concentraiei de acrilamid n
sisteme lipidice simple (verde) i sisteme lipidice
cu phloretin (maro). Scderea intensitii este
reprezentat sub forma raportului dintre
maximul intensitii fluorescenei iniiale, n
absena acrilamidului i maximul intensitii
dup adiia acestuia.

MLT in:

KSV (M-1)

SUV

7.41 0.07

SUV+Phl

3.73 0.30

14

Analiza valorilor constantelor obinute ne indic faptul c monomerii de peptid melitin sunt
adsorbii ntr-o mai mare msur n sistemele lipidice cu phloretin dect n cele formate doar din
lipide simple. Prezena moleculelor de phloretin favorizeaz adsorbia peptidelor la nivelul
membranei lipidice datorit modulrii de ctre acesta a proprietilor electrice a membranei
(potenialul de dipol), jucnd un rol important n cazul interaciunilor ntre peptide
antimicrobiene i membrane specifice, cum ar fi cele bacteriene.
Rezultatele experimentelor de eliberare a calceinei din vezicule unilamelare mici.
Scopul acestui studiu a fost acela de a investiga efectul moleculelor de phloretin asupra
proceselor de inserie i de agregare a peptidelor n urma adsorbiei lor la interfaa membranei
lipidice. Cinetica de formare a porilor de ctre peptide poate fi astfel monitorizat prin
nregistrarea n timp real a modificrii maximului de emisie fluorescent a moleculelor de
calcein eliberate n mediul apos. Astfel, am nregistrat evoluia n timp a intensitii emisiei
fluorescente a moleculelor de calcein ncapsulate ntr-o concentraie iniial de 50 mM n
vezicule unilamelare mici formate din fosfatidilcolin, la lungimea de und corespunztoare
maximului de emisie (max = 520 nm), n urma eliberrii lor prin porii transmembranri formai de
peptida melitin adugat n sistem ntr-o concentraie de 3 M. Aciunea peptidei a fost studiat
prin comparaie ntre sisteme lipidice formate din vezicule unilamelare mici n concentraie
lipidic de 100 M, n absena, respectiv n prezena a 20 M molecule phloretin.

Fig.VIII.1.1.5 Evoluia temporal a intensitii

emisiei fluorescente a calceinei, ca urmare a
eliberrii acesteia din interiorul lipozomilor
formai din fosfatidilcolin, n absena (curba
verde), respectiv n prezena moleculelor de
phloretin inserate n bistratul lipidic (curba
maro), sub aciunea peptidei melitin.

Analiznd cele dou curbe, se constat c prezena moleculelor de phloretin inserate n bistratul
lipidic al lipozomilor a condus la creterea concentraiei moleculelor de calcein eliberate
(intensitatea de emisie fluorescent la saturaie este mai mare n acest caz), ca o consecin
direct a formrii unui numr mai mare de pori transmembranari n bistraturile lipidice care
conin phloretin. Prezena moleculelor de phloretin conduce la creterea activitii peptidei
melitin, prin reducerea energiei libere necesare pentru inseria monomerilor i agregarea lor sub
form de pori.

15

VIII.1.2. Influena triei ionice asupra adsorbiei i formrii de pori transmembranari de ctre
peptida antimicrobian melitin
Am nregistrat variaia n timp real a intensitii de fluorescen a floroforului
calcein nglobat n veziculele unilamelare mici la o concentraie de 50 mM. Experimentele au
fost efectuate pe sisteme lipidice formate din phosphatidylcholin (100 M), i respectiv n
sisteme lipidice formate tot din phosphatidylcholin (100 M) i phloretin (20M). Concentraia
de peptid melitin adugat n ambele sisteme a fost de 3 M, doar concentraiile de soluie
electrofiziologic utilizate au fost diferite 50 mM KCl i 200 mM KCl, la un pH = 7.3 cu 10 mM
HEPES. Lungimea de und de excitare utilizat a fost 495 nm, specific maximului de absorbie
a fluoroforului calcein.

Fig. VIII.1.2.1 Procentajul de calcein eliberat

n urma inseriei melitinei n sistemele lipidice
simple (PC) i sistemele lipidice cu phloretin
(PC+phloretin) la diferite trii ionice ale srii
KCl, 50 mM (verde) i respectiv 200 mM
(portocaliu). Procentajul de 100% de eliberare
a floroforului corespunde introducerii n sistem
a detergentului TX-100 (1%).

La concentraii mari de ioni n soluia fiziologic apare fenomenul de competitivitate ntre

reziduurile cationice ale peptidei i ionii pozitivi din sare pentru aceleai situsuri de interaciune
aflate la capetele polare ale lipidelor ce constituie membrana. n acest caz, interaciunile
electrostatice dintre aminoacizii ncrcai pozitiv ai peptidei i gruprile fosfat ale lipidelor vor fi
diminuate din cauza ionilor pozitivi de sare (K+) care induc un efect de ecranare a sarcinii
gruprilor fosfat din structura capetelor polare ale lipidelor.
VIII.2. Modularea activitii unor peptide scurte de ctre modificarea poziiei i orientrii
spaiale a aminoacidului triptofan
VIII.2.1. Studiul activitii analogilor sintetici ai peptidei HPA3NT0: Pep1, Pep2, Pep3 asupra
membranelor lipidice prin tehnici de electrofiziologie
Experimentele au fost realizate prin implementarea tehnicilor de elctrofiziologie
molecular pe bistraturi lipidice planare reconstituite prin tehnica Montal Muller. Sistemele
lipidice folosite au fost compuse dintr-un amestec de fosfolipide: POPC:DOPG, 85:15 (w/w),
pentru ca bistratul s prezinte un caracter uor anionic ce faciliteaz inseria peptidelor cationice
folosite.

16

Fig.VIII.2.1.1
nregistrri
tipice ale flucuaiilor de
curent electric mediate de
porii
transmembranari
formai de ctre peptide n
membrana lipidic anionic
PC:PG 85:15 (w/w) la o
diferen de potenial de
100 mV (panel a,e, i) i
respectiv la + 100 mV (panel
b, f, j) imediat dup
momentul inseriei i la 10
minute dup. Linia punctat
reprezint starea iniial n
care monomerii de peptid nu
interacioneaz cu bistratul.

Pentru o evaluare cantitiv a activitii peptidelor s-au efectuat diagrame curent-tensiune pentru
toate cele trei peptide utilizate i deasemenea s-a urmrit variaia deviaiei standard a curentului
ionic mediat de pori transmembranari cu potenialul aplicat n partea trans a membranei lipidice.
n cazul aplicrii potenialelor pozitive, deviaia standard a curentului ionic variaz doar pentru
pep2 i pep3, dovad a translocrii imediate a acestor dou peptide, pe cnd activitatea peptidei
pep1 rmne constant la orice valoare a potenialului pozitiv aplicat. nregistrrile efectuate la
10 minute dup inseria peptidei pep1 n bistratul lipidic arat n schimb o variaie a curentului
ionic prin pori i la aplicarea unor poteniale pozitive, fapt ce ne indic existena fenomenului de
translocare ntrziat. Acest efect poate fi pus pe seama costului energetic mai ridicat pentru ca
pep2 s traverseze membrana datorit prezenei a patru aminoacizilor aromatici din strucutra
primar a peptidei, din care trei de triptofan i unul de fenilalanin.
P =
TS

1
non el .
V + GTM
IFC
RT
1+ e

n urma fitrii datelor experimentale cu ecuaia Boltzman s-au

obinut valorile estimative ale energiilor necesare pentru ca
inseria monomerilor de peptid n bistratul lipidic s aib loc,
non el ; pep1
non el ; pep 2
GTM
=
3.5kcal / mol i GTM
=
3.3kcal / mol . Pstrnd
IFC
IFC

n ecuaia de mai sus partea dependent de potenialul aplicat invariant att pentru pep1 ct i
pentru pep2, diferena de cost energetic dintre cele dou peptide necesar n cazul peptidei pep2
pentru ca aminoacizii aromatici F1 i W4 s fie inserai n miezul hidrofob al membranei (~ 0.2
kcal/mol) a fost pus doar pe seama prii independente de potenialul electric. ntr-un model
simplificat i justificat datorit considerentelor geometrice i energetice putem presupune c cea
mai probabil orientare a peptidei pep2 n momentul n care aceasta este inserat n membrana
lipidc este cea mai stabil, deoarece n momentul adsorbiei prezint trei aminoacizi ndreptai
ctre regiunea capetelor polare din monostratul din partea cis (F1, W4 i W12), iar n momentul
inseriei peptidei acesta se acoreaz la interfaa dintre capetele polare i cozile hidrofobe cu
aminoacidul aromatic W 12.

17

VIII.2.2. Studiul adsorbiei peptidelor Pep1, Pep2, Pep3 n sisteme de lipozomi prin tehnici de
spectroscopie de fluorescen
Aceste experimente sunt bazate pe proprietatea aminoacidului triptofan, prezent n
secvena primar a celor trei peptide utilizate, de a-i deplasare maximului de emisie
fluorescent la trecerea din mediul polar al soluiei electrofiziologice n mediul mai hidrofob de
la interfaa membranei lipozomilor. innd cont de proporionalitatea care exist ntre
deplasarea maximului de emisie i concentraia de peptid adsorbit, dependena mrimii de
concentraia lipidic ofer informaii despre cum variaz de fapt concentraia de peptid
adsorbit n funcie de concentraia lipidic.
Fig.VIII.2.2.3 Variaia deplasrii
maximului de emisie a triptofanului n funcie
de concentraia lipidic njumtit pentru
peptidele utilizate i fiturile corespunztoare
acestora, reprezentate cu linie punctat pentru
pep1 (verde), pep2 (rou) i respectiv pep3
(albastru), ca urmare a adsorbiei peptidei n
concentraie de 0.5 mM la nivelul veziculelor
unilamelare mici.

= max

K a [L]
1 + K a [L]

Din datele experimentale i folosindu-ne de modelul matematic explica n detaliu anterior ce ne

ofer valorile numerice ale constantelor aparente de asociere a peptidelor cu membrana lipidic,
am calculat energia liber de partiionare a peptidelor din mediul apos a soluiei
electrofiziologice n mediul lipidic al monostratului extern al lipozomilor: pep1 (-9.29 kcal/mol),
pep2 (-10.02 kcal/mol) i pep3 (-9.01 kcal/mol).
VIII.2.3. Studiul cineticii de inserie i formare a porilor transmembranari de ctre Pep1, Pep2,
Pep3 prin monitorizarea spectrofluorimetric a efluxului de calcein din lipozomi
n cele ce urmeaz, ne-am propus efectuarea unui studiu de spectrometrie de
fluorescen prin care s poat fi monitorizat etapa de formare a porilor transmembranari de
ctre peptidele antimicrobiene n bistratul lipidic al veziculelor unilamelare mici.

18

Fig.VIII.2.3.2 Evoluia temporal a intensitii fluorescenei calceinei ca urmare a eliberrii

acesteia din interiorul lipozomilor constituii din POPC:DOPG 85:15 (w/w) sub aciunea celor trei
peptide pep n concentraie 5 M. Curbele nregistrate au fost fitate cu o sum de dou
exponeniale (rou punctat).

Curbele obinute au fost normalizate i au putut fi fitate cu ajutorul unei funcii exponeniale
corespunztoare creterii intensitii fluorescenei calceinei ca urmare a eliberri fluoroforului
prin intermediul porilor formai de ctre peptide:

) y0 + ymax e
y (t=

kapp t

, astfel obinem o

valoare observabil a constantei de reacie aparent (kapp) ce descrie cinetica de formare a porilor
transmbembranari prin bistratul lipidic al lipozomilor. Constanta aparent kapp depinde de rata
efluxului calceinei prin pori, Keflux, de fraciunea de calcein ncapsulat, f Cincaps , i de

concentraia de peptide care se gsesc n stare de por, [PL* ] : k app =f K eflux ,f Cincaps ,[PL* ] unde,

K[L]
adsorbia peptidelor la nivelul membranei este descris de reacia: PW

PL , agregarea
por
peptidelor sub form de pori este descris de relaia PL

PL* , iar eliberarea calceinei

elib
eflux
incaps

reprezint
ncapsulat n lipozomi este descris de relaia Cincaps
C . C
K

moleculele de calcein care se gsesc n interiorul lipozomilor, respectiv Celib reprezint

moleculele de fluorofor difuzate prin intermediul porilor transmembranari n mediul extern al
acestora [41]. Calculul valorilor constantei aparente de reacie (kapp) obinut n urma fitrii
datelor experimentale arat c pep1 (kapp = 0.08 s-1 ) prezint un grad mai mare de perturbare a
membranei lipozomilor, aceasta fiind mai eficient n procesul de formare a porilor i implicit al
eliberrii moleculelor de calcein comparativ cu pep2 (kapp = 0.02 s-1 ) i pep3 (kapp = 0.01 s-1).

19

VIII.3. Monitorizarea schimbrilor conformaionale a unor peptide n prezena unor

metale relevante fiziologic
VIII.3.1. Studiul deplasrii spectrului de emisie a peptidei CA(1-8)MA(1-12) n interaciunea cu
ionii de cupru. Identificarea constantei de disociere Kd cu ajutorul modelul matematic
Langmuir
Modelul matematic Langmuir propus. Pentru a monitoriza dependena procesului de complexare
a peptidei de concentraia de ioni de cupru adugat, am urmrit deplasarea ctre lungimi de
und mai mici (deplasarea ctre albastru, ) a maximului spectrului de emisie fluorescent a
reziduului Trp2 din structura primar a peptidei CAMA corespunztoare diferitelor cantiti de
cupru utilizate fa de valoarea maximului spectrului de emisie iniial, atunci cnd nc nu era
adugat cupru. Pentru a determina expresia constantei de disociere Kd, a reaciei reversibile
dintre Cu2+ i peptida CAMA, am considerat c aceasta este o reacie bimolecular simpl ntre
o peptid (P) i un ion de cupru (Cu2+), n care urma creia se formeaz un complex (P-Cu2+) cu
o constant de asociere kON i respectiv de disociere, kOFF. Constanta de disocierea a fost
determinat prin fitarea datelor experimentale cu o funcie hiperbolic, conforma ecuaiei:

= fmax = max

([ P0 ] + [Cu02 + ] + K d ) ([ P0 ] + [Cu02 + ] + K d ) 2 4[ P0 ][Cu02 + ]

2[ P0 ]
Fig.VIII.3.1.1 Variaia deplasrii maximului de
emisie al triptofanului n funcie de concentraia
de ioni de cupru, ntr-o soluie cu pH = 7, i fitul
dup ecuaia hiperbolic ce descrie reacia
bimolecular ce are loc ntre peptid i metal
(R2 = 0.88), din care am obinut valoarea pentru
constanta de disociere a peptidei CAMA cu ionii
de cupru (Kd = 6.3 M). Graficul ncadrat
reprezint spectrele de emisie fluorescent
normalizate a peptidei CAMA ([1. 5 M]) n
absena ionilor de cupru (linia continu de
culoare neagr) i n prezena concentraiei
maxime de cupru ([22 M], linia punctat de
culoare roie).

VIII.3.2. Modelul matematic propus pentru caracterizarea cineticii reacilor de asociere i

disociere dintre porul proteic de hemolizin i peptida chimeric CA(1-8)MA(1-12),
complexat i necomplexat de ionii de cupru
n primul set de experimente, am urmrit interaciunile la nivel de singur molecul
ce au loc ntre peptida CAMA, adugat n concentraie de ordin micromolar n partea trans a
membranei, i un por proteic de -HL, adugat n partea cis a membranei.

20

Fig. VIII.3.2.1 nregistrri ale curenilor ionici reprezentative ilustrnd efectul creterii
concentraiei de ioni de cupru asupra interaciunilor peptidei CAMA (30 M) cu un singur por
proteic de -HL, n cazul unei soluii electrofiziologice cu pH neutru de 2M KCl adugat n ambele
pri ale membranei. n panelurile a, b i c sunt reprezentate fluctuaiile de curent ionic date de
interaciunea peptidei cu porul (sub forma scderilor valorilor curentului fa de linia de baz,
corespunztoare curentului ionic nregistrat pentru porul liber) la aplicarea unei diferene de
potenial de + 70 mV, n absena (panel a), respectiv n prezena ionilor de cupru ntr-o concentraie
de 10 M (panel b) i 100 M (panel c).

n absena interaciunii cu peptida CAMA, am propus ca starea porul proteic de HL s fie descris sub denumirea de open state. n aceast stare, nanoporul poate interaciona
fie cu peptida necomplexat cu ioni de cupru (notat cu P) ducnd la generarea unui prim tip de
blocaj, denumit closed state, fie poate interaciona cu peptida complexat cu ioni de cupru
notat cu P-Cu2+) genernd un al doilea tip de blocaj posibil.
Fig.
VIII.3.2.2
Analiza
cantitativ a timpilor medii
ce reflect asocierea (ON;
panel a) i disocierea (OFF;
panel b) a unei singure
peptide
CAMA
n
interaciunea sa cu un por
proteic de -HL la pH = 7,
msurai pentru diferite
concentraii de ioni de
cupru (0, 3, 5, 10, 20, 50 and
100 M) adugate n partea
trans a membranei.

Schematic, reaciile ce pot avea loc, raionamentul modelului matemati bazat pe

calculul probabilitilor de interaciune dintre peptid i por precum i rezultatele obinute n
urma aplicrii acestuia sunt reprezentare n figura de mai jos:

21

Analiza volumelor peptidelor n interiorul porului proteic. Paradigma ce st la baza acestei

tehnici de studiere a dimensiunilor i conformaiilor unor compui chimici fiind una simpl:
amplitudinea blocajelor de curent electric cauzate de o peptid sau o protein n interaciune cu
un nanopor este direct proporional cu volumul dezlocuit de peptid n interiorul porului pe
toat durata interaciunii.
unde, este un factor dependent de form i
d peptida l peptida este egal cu 1, atunci cnd peptida este
V w(t )
,
I (t ) =

1 +

l por
l por privit ca fiind de form cilindric aliniat
d por

paralel la liniile de cmp electric, w(t)

reprezint volumul peptidei n interiorul porului, (-1m-1) este conductivitatea electrolitului
utilizat, V reprezint diferena de potenial aplicat pee nanopore, lp este lungimea
nanoporului, un factor de corecie, adimensional, care ajusteaz formula de mai sus atunci
cnd diametrul peptidei (dpeptida) este egal cu diametrul porului (dpor) sau atunci cnd valoarea
lungimea peptidei (lpeptida) se apropie de cea a lungimii porului (lpor).
Fig. VIII.3.2.3 (a) Reprezentare a blocajului
de curent ionic (I) generat de trecerea
peptidei CAMA (30 M) prin porul proteic
de -HL, acesta fiind direct proporional cu
volumul de electrolit dezlocuit (w) din
interiorul porului proteic. (b) Reprezentare
a nanoporului proteic de -HL inserat ntrun suport lipidic i dimensiunile acestuia.

22

n absena ionilor de cupru, blocajul mediu de curent electric generat de peptid la o

diferen de potenial constant, V = + 70 mV, are o valoare de I = 95.9 pA care conform
calcului corespunde unui volum dezlocuit de ctre peptida CAMA n interiorul porului de w
3.3 nm3. Urmnd un raionament similar, n prezena a 100 M Cu2+, blocajul curentului ionic
dat de peptida CAMA complexat cu ioni de cupru are o valoare mai mic, I = 79.4 pA, i
corespunde unui volum dezlocuit de w(CAMA, 100 M Cu2+) 2.74 nm3. Aceast diferen n
amplitudinea blocajului de curent ionic date de peptida CAMA liber sau complexat cu ioni de
cupru poate fi pus pe seama modificrilor conformaionale pe care le induce prezena ionilor de
cupru asupra peptidei, mai exact a legturii dintre acetia i aminoacidul aromatic His 15 din
structura peptidei.
VIII.4. Studiu comparativ asupra peptidelor amilodice de provenien uman uman-A(116) i murin, murin-A(1-16) n interaciunea cu ionii de cupru
VIII.4.1. Utilizarea porului proteic de hemolizin ca detector molecular a diferenelor
conformaionale ale peptidelor amiloidice Ab(1-16)h i Ab(1-16)r induse de ionii de cupru
Atunci cnd o peptida adugat n partea trans a membranei n care se afl nserat
un singur por proteic de HL, la aplicarea unei diferene de potenial se vor observa o serie de
blocaje ale curentului ionic ce trece prin por datorit interaciunilor de au loc ntre peptid i
lumenul porului. Ocluziunea porului nu este total, n special din cauza diferenelor geometrice
dintre mrimea efectiv a peptidei i diametrul porului, astfel c nc mai este permis trecerea
unor ioni ce constituie un curentul rezidual ce poate fi nregistrat.
Fig.VIII.4.1.1 nregistrri reprezentative ale de
curent ionic printr-un singur por proteic de HL la o diferen de potenial de 100 mV,
artnd blocajele induse de fragmentul 1-16 al
peptidei amiloidice de origine uman (rou,
coloana din stnga) i de origine murin
(albastru, coloana din dreapta) adugat n
trans la o concentraie de 50 M. Frecvena
filtrului trece jos, n cazul peptide amiloidice
de provenin uman a fost 10 kHz, iar n cazul
peptide amiloidice de provenin murin a fost
20 kHz, acest lucru se poate observa i n
creterea raportului zgomot semnal din al
doilea caz.

Magnitudinea blocajelor curentului ionic pot fi correlate cu curentul ionic nlocuit de prezena
peptidei n porul proteic (Iblock) i poate fi cuantificat ca fiind diferena dintre curentul ionic
nregistrat prin porul liber i curentul msurat n prezena peptidei ce rezid n interiorul porului.
S-au observat prezena a dou tipuri de blocaje corespunztoare unor valori diferite ale
amplitudinii indicnd prezena a dou populaii de peptid amiloidic, prima fiind cea aflat n

23

stare liber (necomplexat, indicat de simbolul #) i a doua corespunztoare blocajului dat de

peptida care i-a schimbat conformaia n urma interaciunii cu ionii de cupru (complexat,
indicat prin simbolul $).

Fig.VIII.4.1.2 nregistrri tipice ale curentului ionic ce reflect interaciunia dintre peptida de
provenine uman cu porul de -HL la o diferen de potenial de -100 mV, n absena (panel a) i
n prezena ionilor de curpu adugai n partea trans la diferite concentraii, i anume 0, 25, 100 i
200 M cupru (panel b, c i d). Scderile de current ionic reflect evenimentele de asociere dintre o
singur peptid cu porul proteic. Histogramele de amplitudine ne indic prezenea a dou populaii
de peptide, complexate (indicate prin $) i necomplexate (indicate prin #) cu ioni de cupru,
deasemenea i prezena unor interaciuni ce blocheaz parial porul fiind atribuite unor
interaciuni ce au loc ntre peptidele complexate i gura porului proteic (indicate prin &).

Analiza cantitativ a cineticii de interaciune a peptidei amiloidice de origine uman

cu porul proteic demonstreaz c timpul mediu dintre dou blocaje consecutive (ON), cauzate
fie de peptida liber fie de cea complexat cu ioni de cupru (Fig.VIII.4.1.3, panel (e)), precum i
durata medie a blocajelor OFF, (Fig.VIII.4.1.3, panel (f)), cresc o dat cu adiia unei
concentraii de cupru din ce n ce mai mare n partea trans a membranei.
Fig.VIII.4.1.3
Analiza
statistic
a
timpilor
dintre dou evenimente
consecutive a timpilor de
reziden a unei singure
peptide uman-A
ce
1-16

interacionez reversibil
cu un singur por de HL, msurai la diferite
concentraii de ioni de
cupru adugai n partea
trans (i.e., 0, 25, 50, 75,
100, 150 i 200 M).

24

Contrar celor observate n cazul peptidei amiloidice de origine uman (Fig.VIII.4.1.3), creterea
concentraiei de ioni de cupru din soluie adugai n partea trans a membranei lipidice a dus la o
frecven mrit a evenimentelor de asociere dintre peptida amiloidic de origine murin i porul
proteic de -hemolizin (Fig.VIII.4.1.5). Intuitiv, aceste rezultate nu ar avea sens deoarece ne
ateptam ca n urma formrii legturilor coordonative dintre situsurile de legtur ale peptidei i
ionii de cupru, conformaia peptide amiloidice murine s se modifice astfel nct probabilitatea
ca aceasta s intre n lumenul porului s scad.

Fig.VIII.4.1.5 nregistrri tipice ale curentului ionic ce reflect interaciunia dintre peptida de
provenine murin cu porul de -HL la o diferen de potenial de -100 mV, n absena (panel a) i
n prezena ionilor de curpu adugai n partea trans la diferite concentraii i anume (panel b: 100
M, panel c: 400 M). Scderile de current ionic reflect evenimentele de asociere dintre o singur
peptid cu porul proteic. Analiza statistic a timpilor dintre dou evenimente consecutive (ON,
panel a) i a timpilor de reziden (OFF, panel b) a unei singure peptide murin-A
ce
1-16

interacionez reversibil cu un singur por de -HL, msurai la diferite concentraii de ioni de

cupru adugai n partea trans.

n continuare am propus o abordare matematic pentru estimarea valorii numerice a

constantei de disociere (KD) ce descrie reacia reversibil dintre o peptid amiloidic, fie ea de
origine uman sau murin, i un ion de cupru.

25

Fig.VIII.4.1.8 Descriere cantitiv a cineticii reaciei reversibile dintre o peptid amiloidic (uman/
murin A(1-16) ) cu lumenul porului proteic. Durata medie i creterea frecvenei evenimentelor de
blocare de ctre peptida liber sau complexat cu ioni de cupru, n cazul peptidei amiloidice de
origine uman este reprezentat n panelul (a) i (b). Duratele i frecvenele evenimentelor date de
peptida amiloidic de origine murin sunt reprezentate n panelurile (c) i (d). Inversul timpului
mediu dintre dou evenimente consecutive reprezint rata de asociere a peptidei, fie ea complexat
sau necomplexat cu ioni de cupru, cu porul proteic (-triunghi cu vrful n sus), iar inversul
timpului mediu de reziden a peptidei, fie ea compelxat sau necomplexat cu ioni de cupru, n
interiorul porului reprezint rata de reacie de disociere a acesteia de porul proteic (- triunghi cu
vrful n jos). Constanta de rat de asociere (rataON) a fost obinut din panta fitului liniar al
dependenei ratei de asociere de concentraia de peptid utilizat (panelul (a) i (c)). Constanta de
rat de disociere (rataOFF) este independent de concentraia de peptid utilizat prin prisma
modelului bimolecular folosit, astfel ea fiind egal chiar cu rata de disociere.

Astfel, considernd reacia bimolecular descris n subcapitolul VIII.3.2 i avnd la

dispoziie valorile constantelor de rat de asociere (k1) i respectiv disociere (k2) obinute prin
analiza ratelor de asociere (rateON) i disociere (rateOFF) att pentru peptida amiloidic de origine
uman, ct i pentru cea de origine murin (i.e., k1 (uman A(1-16) = 32 x 103 1.1 x 103 M-1s-1,
k2 (uman A(1-16) = 2.6 x 103 17 s-1, and k1 (murin A(1-16) = 36.6 x 103 1.5 x 103 M-1s-1, k2
(murin A(1-16) = 3.9 x 103 96 s-1), i aplicnd modelul matematic descris n detaliu n
subcapitolul VIII.3.2 am reuit s obinem valori numerice estimative pentru constantele de
disociere KD, precum i valori ale constantelor de rat de asociere (k3) i disociere (k4) dintre
peptidele complexate cu ioni de cupru i porul proteic: Kd (uman A(1-16)) = 8.5 x 10-6 4.5 x 10-6

26

M , Kd (murin A(1-16)) = 5.4 x 10-5 1.6 x 10-4 M, k3 (uman A(1-16)) = 1.8 x 103 1.1 x 103 Ms , k3 (murin A(1-16)) = 82.7 x 103 31 x 103 M-1s-1. k4 (uman A(1-16)) = 58.4 4.2 s-1, k4

1 -1

(murin A(1-16)) = 2223.9 240.2 s-1. Schematic, reaciile ce pot avea loc, raionamentul
modelului matematic aplica i rezultatele obinute n urma aplicrii acestuia sunt reprezentare n
figura de mai jos:

VIII.5. Investigarea efectelor metalelor relevante fiziologic asupra conformaiei spaiale a

peptidei amiloidice de provenien uman A(1-16)
VIII.5.1. Studiul la nivel de singur molecul a cineticii reaciei -HL Ab(1-16)h n prezena
ionilor de Cu2+, Zn2+, Fe3+ i Al3+. Determinarea constantelor de disociere Kd
n acest capitol am urmrit interaciunile la nivel de singur molecul ce au loc ntre
peptida amiloid uman A1-16, adugat n concentraie de ordin micromolar (50 M) n partea
trans a membranei, i porul proteic de -HL, adugat n partea cis a membranei. Protocolul
experimental urmat a fost identic cu cel utilizat n cazul studiului prezentat n capitolul anterior,
singura diferen constnd n ionul metalului utilizat. Pe lng ionii de cupru, am dorit s punem
n eviden i efectul alto metale relevante fiziologic cu implicaii n mpachetarea greit a
peptidelor amilodice (Zn2+, Fe3+ i Al3+). Pentru a ajunge la estimri ale valorilor constantelor de
disociere, Kd, care caracterizeaz interaciunile reversibile dintre peptida uman- A1-16 i
diferitele metale, am examinat ca i n studiul precedent frecvena i durata timpilor de

27

asociere/disociere dintre peptida liber i porul proteic de -HL, la diferite concentraii ale
peptidei.

Fig.VIII.5.1.1 nregistrri tipice ale curentului ionic la nivel de singur molecul reprezentative
pentru reaciile reversibile dintre peptida uman A1-16 i porul proteic -HL la aplicarea unei
diferene de potenial constante de V = - 100 mV, n absena (panel a) i prezena ionilor de Cu2+,
Zn2+ , Fe3+ i Al3+ adugai n partea trans la o concentraie de 200 M.

nregistrrile arat c spre deosebire de Cu2+ i Zn2+, prezena ionii de Al3+ i Fe3+
presupune o schimbare mai puin semnificativ n frecvena blocajelor cauzate de peptid n
interaciunea cu porul -HL. Aceast efect este corelat cu conformaiile diferite pe care le adopt
peptida uman-A1-16 n urma interaciunii cu diferitele metale i cu afinitatea diferit pe care o
acestea fa de peptid.
Utiliznd constantele de rat de reacie obinute din aceast analiz, i fitnd
dependenele timpilor de asociere/disociere de variaia concentraiei de metal dup modelul
matematic explicat n subcapitolul VIII.3.2, am obinut valorile constantelor de disociere pentru
ionii de Cu2+ i respectiv Zn2+ cu peptidele uman- A1-16: Kd(Cu2+) = 4.5x10-7 M ; Kd (Zn2+) =
9.2x 10-5 M. Se poate observa c o afinitate mai mare pentru peptidele uman- A1-16 o prezint
ionii de cupru.
Concluzii:

Prezena moleculelor de phloretin determin eliberarea calceinei n urma formrii porilor

transmembranari de metitin ntr-un procentaj mai mare dect n cazul absenei acestora
n sistemele lipozomale;

28

Probabilitatea de inserie a peptidei melitin n membran i formarea de pori

transmembranari este favorizat la trii ionice ale srii mai mici. Acest aspect a fost
observat att pentru sistemele simple de lipozomi ct i n cele cu phloretin.

Activitatea peptidei pep1 este mai mare dect n cazul peptidei pep2, fapt pus pe seama
costului energetic mai mare necesar inseriei n miezul hidrofob al membranei lipidice a
peptidei ce conine dou puncte de ancoarea (pep2) fa de peptida ce prezint doar un
punct de ancoare la interfaa bistratului cu mediul apos (pep1).

Diferena de ~ 0.2 kcal/mol a fost atribuit energii necesare inserrii aminoacizilor

aromatici F1 i W4 ctre partea trans a membranei, prezeni n secvena primar a
peptidei pep2, poziionai la captul N-terminal, opus poziiei aminoacidului W12, ce
rmne ancorat n cazul ambelor peptide n partea cis a membranei.

Afinitiatea pentru membrana lipozomilor a peptidei cu cei mai muli aminoacizi

aromatici distribuii de ambele pri ale -helixului (pep2) este cea mai mare.
Deasemenea, pep1 avnd triptofanii W12 i W15 orientai de aceeai partea a axului helixului va avea o afinitate mai mare pentru membrane dect pep3, n care triptofanii
W12 i W13 sunt orientai de o parte i de alta a axului.

aminoacidul histind este situsul de legtur principal i pentru care ionii de cupru
prezint cea mai mare afinitate, prezena acestuia n secvena primar a peptidei CAMA
fiind cauza principal a schimbrii conformaiei suferite de ctre aceasta.

datorit schimbrilor conformaionale suferite de peptida CAMA n urma complexrii cu

ionii de cupru, aceast ntmpin o barier energetic mai mare n asocierea cu porul,
costul energetic asocierii fiind mai mare, dar o dat ce peptida complexat intr n por
interaciunile ce au loc sunt favorabile energetic.

n prezena cuprului, ambele peptide prezint o afinitate crescut pentru porul proteic de
hemolizin. Valorile obinute pentru constantele de rat de asociere i disociere
dintre por i peptidele complexate, comparativ cu cele obinute n cazul reaciei por peptid liber, pot fi puse pe seama scderii hidrofobicitii locale n urma schimbrii
conformaiei peptidelor n urma formrii legturilor coordonative cu ionii de cupru.
Totui, avnd n vedere faptul c modificrile conformaionale induse de ionii de cupru
asupra peptidei de provenien uman produc un aranjament spaial al acesteia astfel
nct s fie mai restricionat trecerii prin por, componenta energetic ce privete

29

hidrofobicitatea local crescut s fie determinant pentru creterea afinitii acesteia

pentru por. Cu toate c exist muli factori ce joac un rol important n dezvoltarea bolii
Alzheimer, aceast scdere a hidrofobicitii locale n cazul peptidei complexate cu ioni
de cupru, ar putea s explice, parial, probabilitatea mai mic de agregare n prezena
cuprului a peptidelor amiloidice la oareci.

Analiza statistic a blocajelor induse de o singur peptid A(1-16) asupra fluxul de

curent mediat de porul de -HL indic urmtoare ordine n probabilitatea de a
interaciona cu peptida: Cu2+ > Zn2+ > Fe3+ > Al3+. Aceasta implic i probabilitatea
de a induce schimbri conformaionale n structura peptidei amiloid.

Importana determinrii constantei de asociere dintre peptida amiloid i ionii metalelor

relevante prin metoda dezvoltat n aceast tez: aceast tehnic de determinare a constantei
de disociere, fa de cele utilizate pn acum (calorimetrie cu titrare izotermic, dicroism
circular, rezonan paramagnetic electronic sau spectrocopie RAMAN), care raporteaz
valori ale acesteia cuprinse ntre pM i M [6, 7, 8], unii raportnd chiar valori de oridinul
attomolar [9], prezint avantajul utilizrii de concentraii mici de peptid pentru analizele
efectuate i cel mai important asigur utilizatorul c rezultele obinute sunt date de interaciuni
dintre o singur peptid, aflat n forma sa monomeric, i ionii metalelor.

30

Bibliografie

[1] J.I. Kourie et al., Properties of cytotoxic peptide-formed ion channels, 2000, Am. J.
Physiol. Cell Physiol. 278, 1063-1087
[2] M.S.P. Sansom et al., Ion channels formed by amphipathic helical peptides, 1991, Eur.
Biophys. J. 20, 229-240
[3] H.Sato et al., Peptide-membrane interactions and mechanisms of membrane destruction
by amphipathic -helical antimicrobial peptides, 2006, BBA 9, 1245-1256
[4] D.W. Hoskin et al., Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides, 2008, BBA
Biomembranes 1778, 357-375
[5] Clarke, J., Wu, H., Jayasinghe, L., Patel, A., Reid, S. and Bayley, H. Continuous base
identification for single-molecule nanopore DNA sequencing. Nature Nanotechnology 4,
265-270 (2009).
[6] Garzon-Rodriguez, et al., Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta
peptide studied by fluorescence, Bioorg Med Chem Lett. 1999, 9(15), 2243-2248
[7] Ha C, Ryu J, Park CB., Metal ions differentially influence the aggregation and deposition
of Alzheimer's beta-amyloid on a solid template, Biochemistry 2007, 46(20), 6118-6125
[8] Tugu V, et al, Binding of zinc(II) and copper(II) to the full-length Alzheimer's amyloidbeta peptide, J Neurochem. 2008, 104(5), 1249-12459
[9] Atwood CS, et al., Dramatic aggregation of Alzheimer abeta by Cu(II) is induced by
conditions representing physiological acidosis, J Biol Chem. 1998, 273(21), 1281712826.
[10] Vicente M. Aguilella et al., Lipid charge regulation of non-specific biological ion
channels, Phys. Chem. Chem. Phys., 2014,16, 3881-3893
[11] H.Sato et al., Peptide-membrane interactions and mechanisms of membrane destruction
by amphipathic -helical antimicrobial peptides, 2006, BBA 9, 1245-1256
[12] J. Antoinette Killian and Gunnar von Heijne, How proteins adapt to a membranewater
interface, TIBS 25 SEPTEMBER 2000
[13] D.A. Dougherty, Cation-pi interactions in chemistry and biology: a new view of
benzene, peh, tyr and trp, Science, New Series 1996, 271 (5246), 163-168
[14] Stephen H White and William C Wimley, Peptides in lipid bilayers: structural and
thermodynamic basis for patitioning and folding, Current Opinion in structural biology
1994 4:79-86
[15] Gregg, E. C., Steidley, K. D., Kinetics of Cell Volume Changes of Murine Lymphoma
Cells Subjected to Different Agents In Vitro, Biophys. J. 1965, 5, 393405.
[16] DeBlois, R. W.; Bean, Counting and sizing of submicron particles by resistive pulse
technique, C. P. ReV. Sci. Instrum. 1970, 41, 909916.
[17] Bezrukov, S. M. J., Ion channels as molecular coulter counters to probe metabolite
transport, Membr. Biol. 2000, 174, 113.
[18] Deamer, D.; Branton, D., Characterization of nucleic acids by nanopore analysis , Acc.
Chem. Res. 2002, 35, 817825.

31

[19] J. Clarke et al., Continuous base identification for single-molecule nanopore DNA
sequencing, Nat. Nanotechnol. 2009, 4, 265270.
[20] Q. Zhaoet al., Real-time monitoring of peptide cleavage using a nanopore probe , J. Am.
Chem. Soc. 2009, 131, 63246325.
[21] H. Wanget al., Peering into Biological Nanopore: A Practical Technology to SingleMolecule Analysis, Chem. Asian J. 2010, 5, 19521961.
[22] David S. Talaga and JialiLi, Single-Molecule Protein Unfolding in Nanopores, J. Am.
Chem. Soc. 2009, 131, 92879297
[23] L.Z. Song et al., Structure of staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric
transmembrane pore., 1996, Science 274, 18591866
[24] S.-H. Shin et al, Kinetics of a reversible covalent-bond forming reaction observed at the
single molecule level.,. 2002, Angew. Chem. Int. Edit. 41, 3707-3709
[25] O. Braha et al., H. Simultaneous stochastic sensing of divalent metal ions,2000, Nature
Biotechnology 18, 1005-1007
[26] X. Guan et al., Stochastic sensing of TNT with a genetically engineered pore, 2005,
ChemBioChem6, 1875-1881
[27] J.J. Kasianowicz et al., Characterization of individual polynucleotide molecules using a
membrane channel., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1377013773
[28] A. Meller et al., Rapid nanopore discrimination between single polynucleotide
molecules., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1079-1084
[29] C. James et al., Continuous base identification for single-molecule nanopore DNA
sequencing., 2009, Nature Nanotechnology 4, 265-270
[30] A.J. Wolfe et al., Catalyzing the translocation of polypeptides through attractive
interactions., 2007, J. Am. Chem. Soc. 129, 14034-14041
[31] L. Movileanu et al., Interaction of peptides with a protein pore, Biophys. J. 2005, 89,
10301045
[32] Q. Zhao et al.,Study of Peptide Transport through Engineered Protein Channels, 2009, J.
Phys. Chem. B113, 35723578
[33] Ayumi Hirano-Iwata et al., The design of molecular sensing interfaces with lipid bilazer
assemblies, 2008, Trends in analytical chemistry 27(6), 512-520
[34] Danielsson, J., Pierattelli, R., Banci, L.& Graslund, A. (2007). High-resolution NMR
studies of the zinc-binding site of the Alzheimers amyloid -peptide, FEBS Journal,
274, pp. 46-59.
[35] Gaggelli,E., Janicka-Klos, A., Jankowska, E., Kozlowski, H., Migliorini, C., Molteni, E.,
Valensin, D., Valensin, G., & Wieczerzak, E. (2008). NMR Studies of the Zn2+
Interactions with Rat and Human -Amyloid (1-28) Peptides in Water-Micelle
Environment, Journal of Physical Chemistry B, 112, 100-109.
[36] M.A. Lovell, et al., Copper, iron and zinc in Alzheimer's disease senile plaques, J Neurol
Sci. 1998, 158, 4752
[37] E. Burstein et al., Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into lognormal components. I. Decomposition algorithms, 2001, Biophys, J, 81, 1699 - 1709
[38] J.R. Lakowicz, Principle of fluorescence spectroscopy, 2006 3rd edition, Springer
Scicence + Bussines Media, LLC, New York
[39] T. Ruysschaert et al., Liposome retention in size exclusion chromatography, 2005, BMC
Biotechnology 1186/1472
[40] L. Silvestro et al., The Concentration-Dependent Membrane Activity of Cecropin A,
1997, Biochemistry 36, 11452-11460

32

[41] Eftink MR, Ghiron C. 1981. Fluorescence quenching studies with proteins. Anal
Biochem 114:199227.
[42] Eftink MR. 1991. Fluorescence quenching reactions: probing biological macromolecular
structures. In Biophysical and biochemicalaspects of fluorescence spectroscopy, pp. 1
41. Ed TG Dewey. Plenum Press, New York.
[43] Eftink MR. 1991. Fluorescence quenching: theory and applications. In Topics in
fluorescence spectroscopy, Vol. 2: Principles, pp. 53126. Ed JR Lakowicz. Plenum
Press, New York.
[44] M.V. Frassa et al., A. Structure and stability of the neurotoxin PV2 from the eggs of the
apple snail Pomacea canaliculata, Biochim. Biophys. Acta 2010, 1804 (7), 14921499

33

ACTIVITATE TIINIFIC:

1. Articole publicate in extenso n reviste tiinifice indexate ISI cu factor de impact

1.

Alina Asandei, Sorana Iftemi, Loredana Mereuta, Irina Schiopu and Tudor Luchian,
Probing of Various Physiologically Relevant MetalsAmyloid- Peptide Interactions
with a Lipid Membrane-Immobilized Protein Nanopore, 2014, The journal of
membrane biology, 247 (6), pp. 523 - 530
Factor de impact: 2.478
Prim autor: nu, coautor

2. Alina Asandei*, Irina Schiopu*, Sorana Iftemi, Loredana Mereuta and Tudor
Luchian, Investigation of Cu2+ Binding to Human and Rat Amyloid Fragments A
(116) with a Protein Nanopore, 2013, Langmuir, 29 (50), pp. 15634 15642
Factor de impact: 4.186
Prim autor: da, cu contribuii egale cu CS III Dr. Alina Asandei
3. Loredana Mereuta*, Irina Schiopu*, Alina Asandei, Yoonkyung Park, Kyung-Soo
Hahm, Tudor Luchian, Protein nanopore-based, single-molecule exploration of copper
binding to an antimicrobial-derived, histidine-containing chimera peptide, 2012,
Langmuir, 28 (49), pp. 17079 17091
Factor de impact: 4.186
Prim autor: da, cu contribuii egale cu Lect. Univ. Dr. Loredana Mereuta
4. Irina Schiopu*, Loredana Mereu*, Aurelia Apetrei, Yoonkyung Park, Kyung-Soo
Hahm, Tudor Luchian, The role of tryptophan spatial arrangement for antimicrobialderived, membrane-active peptides adsorption and activity, 2012, Molecular
BioSystems, 8 (11), pp. 2860 - 2863
Factor de impact: 3.534
Prim autor: da, cu contribuii egale cu Lect. Univ. Dr. Loredana Mereuta
2. Lucrri prezentate la conferine internaionale
1. Irina Schiopu, Alina Asandei, Sorana Iftemi, Loredana Mereuta, Liliana Chiribasa,
Tudor Luchian, Single molecule probing of Cu2+ induced folding on human versus
rat amyloid A (1-16) fragments, IC-ANMBES 2014, Brasov, Romania, 13 15
Iunie 2014 (prezentare poster)

2. Irina chiopu, Loredana Mereu, Alina Asandei, Tudor Luchian, Copper(II)

binding to a histidine - containing chimera peptide: a single protein nanopore study,
FEBS Workshop: Biological surfaces and interfaces, Sant Feliu de Guixols,
Catalonia, Spania, 30 iunie 5 iulie 2013 (prezentare poster).
3. Irina chiopu, Loredana Mereu, Aurelia Apetrei, Tudor Luchian,
Electrophysiology and fluorescence studies of the key role played by the position of
aromatic amino acids in antimicrobial peptide activity and translocation, 9th
ISCBPU, International Student Conference of Balkan Physical Union, Constana,
Romnia, 5-7 iulie 2012 (prezentare oral).
4. Aurelia Apetrei, Irina chiopu, Loredana Mereu, Tudor Luchian,
Electrophysiology study of amyloid beta channel formation and activity in
reconstructed planar lipid membranes, 8th BPU, The 8th General Conference of
Balkan Physical Union, Constana, Romnia, 5-7 iulie 2012 (prezentare poster).
5. Irina chiopu, Loredana Mereu, Aurelia Apetrei, Tudor Luchian, Tryptophan
anchor position determines antimicrobial peptide activity and translocation, Third
International Symposium on Antimicrobial Peptides Today knowledge and future
applications, Lille, Frana, 13-15 iunie 2012 (prezentare poster).
3. Lucrri prezentate la conferine naionale
1. Liliana Chiribasa, Irina chiopu, Tudor Luchian, The modulatory effects exerted by
electrical properties of lipid membranes and ionic strength upon peptides biomimetic systems interactions, FTEM National Conference, Iai, 26 octombrie
2013 (prezentare orala)
2. Irina chiopu, Loredana Mereu, Alina Asandei, Tudor Luchian, Analysis of
copper ion induced peptide folding through a nanopore sensing technique, 12th
National Conference on Biophysics CNB 2013 Biophysics of Health, cu
participare internaional, Iai, 13-16 iunie 2013 (prezentare oral)
3. Liliana Chiribaa, Irina chiopu, Tudor Luchian, Mellitin affinity enhancement
through a dipole potential modifying agent, 12th National Conference on Biophysics
CNB 2013 Biophysics of Health, cu participare internaional, Iai, 13-16
iunie 2013 (prezentare poster - Premiul pentru cel mai bun poster)
4. Liliana Chiribaa, Irina chiopu, Tudor Luchian, Importana aminoacidului
Triptofan n studiul adsorbiei peptidei antimicrobiene melitin, National
Conference on Fundamental and Applied Research in Physics, Iai, 26 octombrie
2012 (prezentare poster).

5. Liliana Chiribaa, Irina chiopu, Tudor Luchian, Tryptophan fluorescence study of

the adsorption of antimicrobial peptide Melitin, FTEM National Conference, Iai,
12 14 mai 2012 (prezentare oral Premiul I)
6. Irina Schiopu, Aurelia Apetrei, Tudor Luchian, The modulatory role of cholesterol
on the activity of the antimicrobial peptide Cecropin B: a fluorescence approach,
National Conference of Biophysics, Sibiu, 10-12 noiembrie 2011 (prezentare
poster Premiul pentru cel mai bun poster)

4. Granturi de cercetare

1.

PN-II-ID-PCCE-2011-2-0027/01.06.2012 - BIOSENS: Detecia i separarea

ionic prin intermediul peptidelor ciclice, al ciclodextrinelor i al porilor proteici

2.

PN-II-PT-PCCA-2011-3.1-0595 - BIOPEP: Generarea i investigarea unor noi

peptide antimicrobiene, cu dimensiune redus. Corelarea structurii peptidelor cu
funcia lor