MARIA PRISECARU

TINA OANA CRISTEA

ROXANA VOICU

BIOLOGIE CELULARĂ ŞI MOLECULARĂ
Curs universitar

Editura „ ALMA MATER ” Bacău 2011

Referenţi ştiinţifici: Š Prof.univ.dr. BARABAŞ NECULAI Š Prof.univ.dr. BATTES KLAUS WERNER

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României PRISECARU, MARIA Biologie celulară şi moleculară / Prisecaru Maria, Cristea Oana Tina, Voicu Roxana. Bacău : Alma Mater, 2011 Bibliogr. ISBN 978-606-527-116-6 I. Cristea, Oana Tina II. Voicu, Roxana Elena 576.3 577.2

Tipar executat la:

UNIVERSITATEA „VASILE ALECSANDRI” DIN BACĂU Calea Mărăşeşti, Nr. 157, 600115 Tel. ++40-234-542411, tel./ fax ++40-234-516345 e-mai: www.ub.ro; stiinte@ub.ro

ISBN 978-606-527-116-6

Prezenta lucrare se adresează în primul rând studenţilor şi cercetărilor din diferite domenii ale ştiinţelor biologice, oferind cunoştinţele de bază în domeniul biologiei celulare şi moleculare, făcându-se însă frecvente referiri la cele mai recente descoperiri şi interpretări, cunoscut fiind faptul că Biologia este o ştiinţă dinamică, care se bazează în principal pe teorii susţinute de rezultate experimentale obţinute din cercetare şi experimentare.

CUPRINS

Introducere 1. Consideraţii generale privind domeniul de studiu al biologiei celulare şi moleculare 1.1. Definiţie şi caracteristici 1.2. Scurt istoric 1.3. Contribuţii româneşti în studiul celulei 1.4. Principalele teorii care au condus la modul actual de gândire despre natura materiei vii 1.4.1. Teoria celulară 1.4.2. Teoria cromozomială a eredităţii 1.4.3. Teoria moleculară a materiei vii 1.4.4. Teoria biostructurală a materiei vii 1.4.5. Teoria evoluţionistă, originea vieţii şi a omului 2. Membranele celulare 2.1. Definiţia şi clasificarea membranelor celulare 2.2. Organizarea membranelor celulare 2.2.1. Caracterizarea componentelor lipidice ale membranelor celulare 2.2.2. Componenta proteică a membranelor celulare 2.2.3. Mobilitatea lipidelor şi proteinelor de membrană 2.2.4. Componenta glucidică membranară 2.2.5. Glicocalixul. 2.2.6. Apa. 2.2.7. Asimetria distribuţiei componentelor membranare 2.3. Mecanismele de transport prin membranele celulare 2.3.1. Procesul calitativ al traversării membranelor 2.3.2. Transportul ionilor şi moleculelor mici prin membranele celulare 2.3.2.1. Transportul pasiv 2.3.2.2. Transportul activ 2.3.3. Transportul macromoleculelor şi particulelor prin membrana plasmatică 2.4. Receptorii din membrană 2.4.1. Tipuri de receptori 2.4.2. Modalităţi de comunicare intercelulară. 2.4.2.1. Comunicarea intercelulară la distanţă 2.4.2.2. Contactul intracelular direct 2.4.3. Receptorii celulelor nervoase. 2.4.4. Receptorii care controlează permeabilitatea ionică 2.4.5. Cuplajul celular metabolic şi electric 2.5. Schimburile energetice în celula vie 2.5.1. Noţiuni generale de termodinamică 2.5.2. Transformări de energie în celula vie (energetica celulară) 2.5.2.1. Molecula ATP şi proprietăţile sale 2.5.2.2. Alţi compuşi fosforilaţi 2.6. Membrane care cuplează energie

11 12 13 14 15 17 17 18 22 22 24 26 26 27 28 30 30 31 31 32 32 33 33 34 34 36 41 44 45 46 46 46 46 48 50 51 51 53 54 56 56

2.6.1. Cloroplastele 2.6.1.1. Procesul general al fotosintezei 2.6.1.2. Reacţiile de lumină 2.6.1.3. Reacţiile de întuneric 2.6.2. Mitocondriile 2.6.2.1. Degradarea glucozei de către mitocondrii 2.6.2.2. Ciclul glioxalatului 2.6.2.3. β oxidarea acizilor graşi 2.6.2.4. Sistemul transportor de electroni (lanţul respirator) 2.6.2.5. Fosforilarea oxidativă 2.6.2.6. Fermentaţiile 2.6.3. Comparaţie între fotosinteză şi respiraţie 3. Adeziunea celulară. Joncţiunile celulare şi matricea extracelulară 3.1. Molecule implicate în aderarea celulă-celulă 3.1.1. Selectinele 3.2.2. Domenii imunoglobulinice 3.2.3. Caderinele 3.2. Joncţiunea celulară 3.2.1. Joncţiunile de ocluzie 3.2.2. Joncţiunile de ancorare 3.2.2.1. Joncţiunile de adeziune intercelulară 3.2.2.2. Joncţiunile de adeziune celulă-matrice extracelulară 3.2.2.3. Desmozomii 3.2.2.4. Hemidesmozomii 3.2.3. Joncţiunile de comunicare 3.2.3.1. Structura joncţiunilor de comunicare 3.2.3.2. Reglarea permeabilităţii joncţiunilor de comunicare 3.2.4. Joncţiunile sinaptice 3.3. Matricea extracelulară 3.3.1. Componentele matricei extracelulare 3.3.1.1. Glicozaminoglicanii 3.3.1.2. Proteoglicanii 3.3.1.3. Colagenul 3.3.1.4. Elastina 3.3.1.5. Fibronectinele 3.3.2. Lamina bazală 3.3.2.1. Structura laminei bazale 3.3.2.2. Funcţiile lamnei bazale 4. Citoscheletul 4.1. Microtubulii 4.1.1. Microtubulii – semnificaţia biologică 4.1.2. Structura microtubulilor 4.1.3. Polaritatea şi dinamica microtubulilor. 4.1.4. Bazele diversităţii structurilor microtubulilor 4.1.5. Centrii organizatorici ai microtubulilor 4.1.5.1. Centriolii şi corpusculii bazali 4.1.5.2. Ultrastructura centriolilor şi a corpusculilor bazali. 4.1.5.3. Replicarea centriolilor şi a corpusculilor bazali. 4.1.6. Mişcările cililor şi flagelilor 4.1.6.1. Structura cililor şi a flagelilor 4.1.6.2. Mecanismul molecular al mişcări cililor şi flagelilor. 4.1.7. Implicarea microtubulilor în diviziunea celulară

56 57 59 63 67 67 70 70 71 72 73 73 75 75 75 76 76 76 77 78 78 79 79 80 80 81 81 82 82 83 83 84 86 88 89 91 91 92 93 93 93 94 95 96 96 97 97 98 99 100 101 101

1. Formarea fusului de diviziune 4.1. Actina şi miozina în celule nemusculare 4.7. Sistemul vacuolar intracitoplasmatic 6. Proteine ce alcătuiesc filamentele intermediare 4.3. Primarea replicării 5.5.1.1.3. Filamente intermediare 4. Nucleozomii 5.4. Fibrele de stress 4.1.2. Matricea nucleului 5.4.1.2.3. Complexul de enzime polimerazice implicate în replicare 5.3.2.1. Iniţierea catenei polipeptidice 6. Rolul citomembranelor granulare în sinteza proteică 6.2. Organizarea nucleului şi expresia activităţii genelor 5. Microfilamentele 4. Organizarea moleculară a fibrelor de cromatina.1.1. Mecanismul transcripţiei 5.1. Cromatina 5. Rolul actinei şi miozinei în citokineza 4.4.3. Asigurarea necesarului de ARNm 6.2.8. Alungirea sau elongarea catenei polipeptidice 6.2.3.2. 4.4. Transportul intracelular mediat de microtubuli.1. Elemente de control în expresia genetică 5. Terminarea sintezei catenei polipeptidice 6. Mecanismul compartimentării celulare a proteinelor nou-sintetizate 101 103 103 104 105 106 107 108 108 109 110 111 112 112 112 114 114 114 115 115 116 118 119 119 121 123 125 126 127 127 128 129 130 130 131 132 133 133 134 136 137 138 138 139 139 140 143 146 146 149 149 .2.5.4. Factorii de transcripţie 5. Proteinele contractile nucleare 5. Decodificarea informaţiilor genetice 6. Alungirea lanţului de ADN nou .5.2.Microvilii 4.7. Deplasarea cromozomilor spre regiune ecuatorială a celulei şi alinierea lor în placa metafazică 4.4. Particularităţile decodificării la procariote şi eurocariote 6.2.3.3. Morfologia şi structura nucleului 5.6.3.2.3. Rolul actinei şi miozinei în contracţia musculară 4. Unităţile de replicare 5.4. ARN splicing 5. Învelişul nuclear 5.4. Biosinteza proteinelor sau translaţia ARNm 6.7.3. Reţeaua microtrabeculară 4.3. Corectarea erorilor de replicare 5.1. Mecanismul general 5.3.2. 4. Elemente implicate în transcripţie 5.2.6.2.4.1.1.4.1.4. Transportul intracelular 6.1.2. Iniţierea replicării 5. Transcripţia ADN sau sinteza ARN 5. Tipuri de filamente intermediare şi semnificatia lor funcţională 4.2.2.3. Microfilamentele de actină 4.3.1.5.4.3.3. Aparatul enzimatic de transcripţie 5.3. Translocarea cromozomilor anafazici.1.3.2.sintetizat şi terminarea replicării 5.2.3.5.2.2.2.2.4.Miozina 4.3. 4.5. Mişcarea ameboidala.2.1.4.2. Proteinele asociate citoscheletului 5. Replicarea ADN la eucariote 5.3.

1. Peroxizomii 158 6.8. Segregarea şi concentrarea proteinelor 153 6.3.8.1.4. Citokinele 205 10.9.8.1.1.4.6. Procesul de îmbatrînire-senescenţa 195 9.6. Gene letale 189 8. Ciclul celular la plante 161 7. Ciclinele 165 7.1. Organizarea sistemului imunitar 202 10.3.2. Protein .1.7. Sinteza şi secreţia polizaharidelor 154 6. Reglarea ciclului celular prin mecanisme feed-back 168 7.2. Gene implicate în procesul apoptotic 189 8. Mecanismele de producere a apoptozei 187 8. Gene implicate în controlul senescenţei 195 9.1. Genele supravieţuirii (gene antiapoptotice) 189 8.1.2.1. Diviziunea celulară 175 7.1.3.3. Mitoza (diviziunea mitotică) 175 7.4. 193 9. Ciclul cromozomial şi creşterea celulară 170 7.6.1.8. Anticorpii. Interacţiunea cicline.2.6.3.1.5.3. Rolul apoptozei în embriogeneză şi dezvoltare 190 8.2.1.5.4. Relaţii de cooperare între componentele sistemului imun 210 .9.3. Ciclul celular 161 7.4. Apoptoză – îmbătrânire – senescenţă 192 8.mecanism de reglare pozitivă a 168 ciclului celular 7.5.5.2. Apoptoza 187 8. Meioza (diviziunea meiotică) 181 8.2. Influenţa adeziunii celulare asupra proliferării 173 7. Antigenii 203 10. Molecule cu rol esenţial în cadrul sistemului imunitar 203 10.2. Reproducerea celulară 161 7.1. Ciclinelor şi protein .1.8.proteina Rb .2.10. Necroza.2. Frecvenţa procesului de apoptoză 188 8.1.4. Celule T 205 10. Principalele mecanisme (ipotetice) implicate în senescenţă 196 10.kinazele dependente de cicline (cdk) 165 7.1.1. Proteinele chaperone 158 7.3. Lizozomii 155 6.6. Competiţia celulelor pentru factorii de creştere 173 7.1.7.1. Implicarea factorilor de creştere în reglarea diviziunii celulare 171 7.7. Factori implicaţi în reglarea apoptozei 190 8. Aspecte de reglare a apoptozei 190 8. 188 8.1.3. Apoptoza şi starea de boală. Antigeni de histocompatibilitate 205 10. Funcţiile lizozomilor 155 6.3. Răspunsul imunitar 201 10.3.1. Ciclul celular la animale 161 7. Alţi factori responsabili de controlul proliferării celulare în 170 organismele pluricelulare 7.1.kinazele dependente de cicline 164 7. Noţiuni generale despre imunitate şi sistem imunitar 201 10.2. Corelaţia particularităţilor structurale şi funcţionale ale reticulului 151 endoplasmatic neted cu heterogenitatea funcţională a celulelor 6. 204 10.1.

2.2. Tipuri de transfer de gene 11.2. Genetica sistemului imunitar 10. Baza umorală a răspunsului imun 10. Leziuni cromozomale determinate de virusuri 10. Funcţia directă a anticorpilor 10. Grupele sanguine 10. Răspunsul imunitar mediat de celule 10.1.11.1.13.3.1.14.1. Procese artificiale de recombinare ADN (Genetic Engineering) 12.10. Terapie cu gene ţintă (Gene Targeting) 11.1.ului 12.4. Relaţiile virusuri-celule gazdă.2. Metode şi tehnici moderne molecular . Interacţiuni celulare în răspunsul imun 10. Relaţiile bacterii-celulele gazdei 11.1. Elemente de lucru utilizate în tehnologia ADN recombinat 12. Mijloace de apărare imună mediate umoral 10.5.1. Sistemul complement 10.11. Ingineria genetică şi rezolvarea unor probleme de ecologie 11.9. Controlul prin reacţie inversă 10. Reglarea alterată 10.1. Imunodeficienţa dobandită 10.13.2.2.1. Producerea de anticorpi 10.1. Funcţia indirectă a anticorpilor 10.8.13.2.7.10. Receptorii virali 10.10.1. Aplicarea metodelor de biotehnologie în agricultură în vederea obţinerii de organisme transgenice 11.13.8.1. Alte aspecte ale biotehnologiei moderne şi perspectivele secolului XXI 12.3. Principiu 12. Reglarea imunologică 10. Penetrarea virusului în celulă 10. Uciderea celulelor ţintă 10. Vectorii 12.1. Enzimele de restricţie 12.1.9. Procesul inflamator 10. Intensificarea răspunsului imun 10.6.3.1.1. Natura şi funcţia unor structuri virus-like: prionii 10.13.2.4.5. ADN-ligazele (polinucleoid-ligazele) 12. Biotehnologia 11.3.10.1.1. Interacţiunea între peptidele sistemului imun şi peptidele sistemului nervos şi endocrin 10.7.2. Ingineria genetică 11.1. Hibridarea 12. Relaţiile virusuri-membrane celulare 10.2.5.1. Recombinarea ADN . Finalitatea răspunsurilor imune 10.7.1. Denaturarea 213 214 214 215 216 218 218 218 219 219 219 219 220 220 221 221 221 222 222 222 222 223 224 225 227 227 228 229 229 230 233 235 235 235 238 241 245 245 245 252 252 252 253 254 254 255 256 266 266 266 .2.2.12.10. Unele mecanisme de apărare imună în infecţiile bacteriene 10.5.7.9.2.13.10.3.1.4. Mijloace de apărare imună mediată celular 10.1.3.3. Tipuri de efect citopatic 10. Reglarea normală.5.8.1.3.11.2.5.biologice şi aplicaţiile lor 12. Prezentarea antigenilor 10.10.1.1.2. Principiul recombinării 12. Alte categorii celulare implicate în imunitate 10. Ingineria genetică utilizată în prepararea de noi conservanţi alimentari 11. 10.1.

Tipuri de hibridări 12. Metodologia de cercetare a proprietăţilor senzorilor biologici 13.6.5.ului 12.2. Renaturarea (annealing/reannealing) 12.2.2. Sonde genetice 12. Hibridizare in situ 12. Factorul stringent 12.4. Importanţa reacţiei de hibridare pentru medicină şi biologie 12.5. Posibilităţi de folosire a biosenzorilor în biotehnologie Bibliografia 267 267 267 272 273 274 279 282 285 286 288 288 289 290 291 292 296 . Biosenzorii 13. Aparatura de măsurare 13. 6. 5.4.2.2.7. Clonarea ADN – ului 12.3.7.3. Biosenzorii – sisteme de coantificare a informaţiilor viului 13. Fingerprinting genomic (amprente de ADN) 13.12.4. Secvenţierea ADN.1.2. Impactul informaţional al biosenzorilor 13.3. Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) 12.

atenţia fiind concentrată asupra momentului când se produce tranziţia informaţiei de la nivelul molecular către nivelul diferitelor sisteme şi structuri intermediare ale acestor organisme. genetică şi biologie moleculară. Cercetările de biologie celulară şi moleculară au acumulat deja un bagaj de date care au permis progrese uriaşe în medicină. manipularea genetică. fără a se lua în consideraţie complexitatea lui. interacţiunile cu alte structuri precum şi diversitatea sistemelor de ordin superior.celula. al transportului intracelular la nivelul organitelor. al fenomenelor de adaptabilitate). cu proprietăţile lor emergente. agricultură. sursele de energie. greşeala cea mai mare a oamenilor este aceea de a se supraestima şi de a se considera exceptaţi de la legile generale ale evoluţiei. istoria societăţii omeneşti a demonstrat deja că impactul noilor tehnologii şi cel al dezvoltării ştiinţelor în general nu a fost totdeauna benefic pentru războaiele atomice şi bacteriologice. al proceselor de reînnoire celulară. pentru investigarea unui substrat comun. Viaţa se manifestă numai în cadrul organizării celulare a materiei vii. După cum arată Lederberg (de două ori laureat al premiului Nobel pentru descoperiri fundamentale în domeniul geneticii bacteriene). când de fapt ei nu reprezintă decât un element în circuitul evolutiv al vieţii în natură. Biologia celulară a evoluat în ultimii zece ani datorită progreselor realizate în cercetări de biochimie. La ora actuală. face parte dintre ştiinţele „nerestrictive” deoarece nici un fenomen biologic nu poate fi studiat separat. industrie alimentară. până astăzi.INTRODUCERE Informaţia a fost întotdeauna preţioasă în orice domeniu de activitate. periclitând viaţa pe Terra. ştiinţele ecologice. tehnologia ADNului recombinat. al producerii de substanţe energetice celulare. Tocmai din cauza acestei mari erori comise de oameni. împotriva omului. care studiază fenomenele vieţii la acest nivel de organizare. astfel că biologia celulară. se impune tot mai mult o reconsiderare a concepţiei şi comportării cercetătorului ştiinţific în raport cu poziţia omului în ciclul evolutiv al naturii. În contextul revoluţiei ştiinţelor biologice pe care o trăim astăzi. a substratului molecular şi a terminologiei în biologia celulară. microorganisme scăpate de sub control etc. astăzi când trăim o adevărată explozie a cunoştinţelor ştiinţifice cunoscut unei revoluţii ştiinţifice. procesul respiraţiei celulare. realizarea anticorpilor monoclinali. accidentele de laborator soldate cu moartea experimentatorilor. care au folosit metode şi tehnici diferite. Progresele ultrarapide ale biologiei celulare şi moleculare au dus la dezvoltarea biotehnologiei moderne care se anunţă a devenii marea forţă industrială a secolului al XXI-lea şi în care se pune speranţa că va reuşi să rezolve problemele cele mai spinoase ale societăţii omeneşti (alimentaţia. cuceririle ştiinţei şi civilizaţiei umane s-au întors de foarte multe ori. poluarea ) la nivelul Terrei. Alte consecinţe nefaste ale tehnologiilor moderne asupra ecosistemelor în general şi stării de sănătate a oamenilor în particular sunt: creşterea radioactivităţii mediului înconjurător (în urma accidentelor de la termocentralele nucleare). sunt numai cateva din aceste tehnici care şi-au dovedit puterea analitică şi au permis unificarea experimentului biologic. lăsând să se întrevadă pentru viitor noi perspective fascinante de cercetare în diferite alte ramuri. Tehnicile avansate de microscopie electonică. este vorba de o etapă de analiză a funcţiilor celulare la nivel molecular (de ex. cercetările de biologie moleculară se află în faza clasificării mecanismelor care stau la baza formării şi asamblării structurilor din organismele vii. Într-adevăr. În acelaşi timp. starea de sănătate. folosirea culturilor celulare. ea devenind cu atât mai necesară în domeniul ştiinţelor biologice. îngustarea stratului de ozon atmosferic 11 . este o ştiinţă fundamentală.

difteria) prin creşterea aglomeraţiei în centrele urbane şi prin deplasările rapide şi masive de populaţie datorită mijloacelor ultrarapide de transport. pe lângă dezechilibrele grave (prin scăderea spaţiului verde). pentru un grad tot mai înalt de civilizaţie în societatea umană. doar în slujba binelui. expunerea concomitentă a populaţiei la noi agenţi patogeni. care a favorizat creşterea cantităţilor de radiaţii ultraviolete în atmosfera terestră şi implicit a frecvenţei cancerelor (de piele. Conştient de toate aceste posibilităţi. creşterea riscului de răspândire ultrarapidă a unor boli infecţioase (holera. 12 . pulmon). De asemenea. virusul imunodeficienţei umane (HIV – transmis la om foarte probabil de la primatele junglei africane). adus pentru întâia oară din Africa în Europa (la Marburg în 1967). Omul de ştiinţă trebuie să ţină cont de faptul că.(prin folosirea în exces a freonilor). ochi. defrişarea unor zone de pe glob (păduri tropicale) în scopul creării de mari aşezări umane şi centre industriale a determinat.un adevărat om de ştiinţă. neintuite încă astăzi. virusul Ebola (agentul febrei hemoragice). în natură. au apărut astfel şi sau răspândit pe glob: virusul febrei galbene. asupra echilibrului vieţii pe Terra. meningita meningococică. trebuie să militeze ca în viitor cuceririle ştiinţifice să fie folosite cu mai mult discernământ. modificări majore ale acestor condiţii de mediu pot declanşa potenţiale nebănuite ale ecosistemelor cu influenţe posibil nocive. diversitatea foarte mare de specii este tributară în mare măsură condiţiilor de mediu extern.

ale complexelor moleculare. aceasta nu este niciodată într-un adevărat echilibru. echilibrul dinamic. Celula poate fi definită şi ca unitate elementară a lumii vii. în cazul celulei acestea sunt programele organitelor. În orice sistem (deci şi cel celular) putem distinge trei categorii de programe: a) programe “pentru sine”. în schimb dispare programul superior ce reflectă specificul celulei în cadrul ţesutului şi al organismului. sistemele biologice au capacitatea de a compensa creşterea entropiei şi de a o depăşi pe seama surselor de energie exterioare sistemului. Definiţie şi caracteristici BIOLOGIA CELULARĂ este o ramură a ştiinţelor biologice care studiază structurile funcţionale şi fenomenele biologice generale comune tuturor celulelor. dezvoltare şi reproducere. Din punct de vedere termodinamic. Caracterul informaţional constă în aceea că în orice moment celulele recepţionează. care contracarează acţiunile mediului reglându-şi permanent procesele interne într-un sens favorabil persistenţei sale în timp şi spaţii. cu o ordine internă complexă. Viaţa începe de la celulă. 13 . care asigură existenţa sistemului superior. individ pluricelular). deci au un comportament antientropic.. c) programe superioare. 1983). În timp ce sistemele nebiologice evoluează întotdeauna în sensul creşterii entropiei .rinichi etc). celula este un sistem deschis. Autoreglarea este caracteristica sistemelor biologice prin care acestea îşi controlează procesele interne în funcţie de relaţiile cu mediul. ci într-un schimb continuu de materie şi energie cu mediul exterior.1. prelucrează şi transmit informaţii de tot felul. În ierarhia nivelurilor de organizare a materiei vii. deoarece nivelurile inferioare (atomi. os. care asigură persistenţa celulelor. b) programe inferioare. Se mai poate spune că biologia celulară are ca obiect studiul legilor generale de desfăşurare a proceselor vitale la nivelul de organizare celulară. precum şi cu organizare dinamică. adică programele subsistemelor componente. Echilibrul dinamic sau starea staţionară este caracteristică sistemelor biologice. acumulează. deci în sensul creşterii dezordinii lor şi al realizării echilibrului termodinamic. În cultură se menţin programele “pentru sine”. adică un sistem care schimbă atât energie cât şi substanţă cu mediul înconjurător. Influenţele mediului tind permanent să dezechilibreze sistemul. O ilustrare a ierarhiei programelor o constituie modificările celulelor scoase dintr-un ţesut (sistem superior) şi cultivate în mod izolat. Ca oricărui alt sistem biologic. Orice manifestare vitală are loc pe fundamentul organizării celulare. în care este integrat sistemul considerat (ţesuturi. tinzând mereu spre un regim constant de activitate numit stare staţionară sau echilibru dinamic.Capitolul 1 CONSIDERAŢII GENERALE PRIVIND DOMENIUL DE STUDIU AL BIOLOGIEI CELULARE ŞI MOLECULARE 1. organe. care se diferenţiază devenind asemănătoare indiferent de sursa din care provin (piele. Programul este o trăsătură legată de capacităţile structurale şi funcţionale ale sistemului. autoreglarea şi integralitate. celula este considerată primul sistem biologic. deci şi celulei. negentropia. care asigură autoconservare sistemului dat. ficat. Organismele vii evită creşterea entropiei prin preluarea din mediu a unei entropii negative. sistemul celular i se pot descrie mai multe caracteristici : caracterul informaţional. aflată în relaţii de echilibru cu mediul înconjurător (Diculescu şi colab. ce-i conferă capacitatea de creştere. molecule etc) nu sunt considerate „vii”. programul.

o nouă comparaţie. ca orice sistem biologic. Scurt istoric Începând cu secolul XX. Biologia celulară s-a conturat ca o disciplină nouă mai cu seamă în ultimii 50 de ani ca urmare a progreselor revoluţionare înregistrate în studiul celulei. sistemul privit ca un întreg. care permit studierea comportării celulelor prin microscopia cu contrast de fază.1911). urmată de studiul ultrastructurii şi a proprietăţilor metabolice ale acestora. Conexiunea inversă este obligatorie pentru orice sistem de autoreglare şi oferă posibilitatea sistemului să fie informat despre valoarea răspunsului. 14 . Prin centrifugare diferenţială s-a realizat separarea componentelor citoplasmatice. când s-a produs fuziunea dintre citologie. prezintă însuşiri structurale şi funcţionale noi. descifrarea ultrastructurii celulei. care a devenit una dintre cele mai noi şi de perspectivă ramuri ale biologiei. cât şi sub raport conceptual. Punctul de convergenţă între citologie şi biochimie îl constituie dezvoltarea tehnicilor biochimice de fracţionare a celulei prin centrifugare diferenţială. ceea ce justifică denumirea actuală de biologie celulară şi moleculară. prin care se introduc micropipete fine în interiorul celulelor şi se studiază la microscopul optic proprietăţile fizico-chimice ale citoplasmei.2. se înregistrează progrese însemnate în studiul celulei. pe care nu le au părţile lui componente luate izolat. Autonomia celulelor ce compun organismele pluricelulare nu este absolută şi se poate spune că sănătatea organismului depinde în mare măsură de sistemele de comunicaţie şi de mecanismele de coordonare dintre celule. menţinerea stabilităţii stării diferenţiate. celula nu poate supravieţui după distrugerea mitocondriilor etc. precum şi legăturilor de comunicare dintre ele. reproducerea. coloraţie vitală şi microvitală şi microcinematografie.Celula. Printre progresele metodologice sunt de menţionat: introducerea tehnicii culturilor de ţesuturi “ în vitro “ (Harrison. pentru a avea loc compararea cu comanda primită de efector. valoarea răspunsului trebuie comparată cu comanda. 1908) şi se fac primele încercări de a le localiza în particule citoplasmatice. Această linie de cercetare a fost iniţiată în 1934 de Bensley şi Hoerr şi apoi dezvoltată cu succes de Claude. Ea concepe celula ca un adevărat microcosmos . atât sub raport metodologic. Răspunsul dat de efector trebuie comunicat receptorului pe o cale inversă conexiunea inversă (feed-back). În acest fel s-au putut localiza precis anumite căi metasolice în celulă (de pildă ciclul Krebs. Nucleul sau citoplasma nu trăiesc izolate. În ultimii 20 de ani s-a accentuat tendinţa de interpretare a tuturor proceselor celulare la nivel molecular. posedă mecanisme de autoreglare de tipul celor descrise în cibernetică. pe plan metodologic şi conceptual. la începutul secolului XX. adaptarea. un nou răspuns. Dacă răspunsul nu corespunde necesităţilor sistemului. activitatea acestui microcosmos este determinată şi reglată genetic. biochimie celulară. se dă o nouă comandă. Hogeboom şi alţii în deceniul al V-lea. 1903. Pentru ca răspunsul să fie corespunzător cu necesităţile sistemului. a detaliilor fine de organizare submicroscopică. ulterior a culturilor de celule. fiziologie celulară şi genetică moleculară. introducerea microscopul electronic (inventat în 1937. Integralitatea constă în faptul că un sistem nu se reduce la suma însuşirilor părţilor sale componente.în care structurile şi funcţiile se îmbină armonios. spre deosebire de legătura de la receptor la efector care poartă numele de conexiune directă. Aceasta a marcat şi trecerea de la citologia clasică la citologia modernă. 1909). aduce descoperirea şi descifrarea oxidărilor celulare (Wieland. Datorită integralităţii sunt posibile funcţiile biologice fundamentale: metabolismul. dar utilizat în biologie după 1954) a dus la descoperirea unei noi lumi a organizării celulare. 1. Warburg. Dezvoltarea impetuoasă a biochimiei. Autoreglarea presupune existenţa a minimum două elemente: unul care comandă (centrul de comandă) şi unul efector. astfel că funcţionarea sa se realizează cu o mare eficienţă. microchirurgia (Kite.

Alexandru Obredja. Progresele ultrarapide ale biologiei moleculare au dus la dezvoltarea biotehnologiei moderne care se anunţă a deveni marea forţă industrială a secolului al XX -lea şi în care se pune speranţa că va reuşi să rezolve problemele cele mai spinoase ale societăţii omeneşti (alimentaţia şi starea de sănătate). Aceste metode se pot utiliza la microscopul optic sau la microscopul electronic. cu metodologie complexă de cercetare. 1938). în SUA există 1000 de firme specializate în probleme de biotehnologie. pornind de la structurile nucleare s-a ajuns la interpretarea şi explicarea fenomenelor eredităţii. pentru viitor. Gheorghe Marinescu ( 18631939). Polizu şi Mihail Obedenaru. Un punct de referinţă la constituit citofotometria acizilor nucleici (Caspersson. majoritatea cercetărilor şi descoperirilor epocale din biologia moleculară au fost făcute în SUA. George Palade. Contribuţii româneşti în studiul celulei În secolul al XIX-lea s-a impus şcoala de microscopie de la Facultatea de medicină din Bucureşti (Diculescu şi colab. Gh. Învăţământul disciplinelor microscopice apare la şcoala de medicină din Bucureşti în anul 1859. s-au aprofundat aspectele funcţionale ca urmare a progreselor înregistrate în fiziologia celulară. Ştefan Besnea. reprezentanţi de seamă ca: Mihail Petrini-Galaţi. Studiul celulei a progresat şi în măsura perfecţionării tehnicilor de citochimie şi histochimie. Pe de altă parte. Cercetările de biologie moleculară au acumulat deja un bagaj de care au permis progrese uriaşe în diferite domenii. ilustrată de savanţi de renume mondial dintre care Albert Claude. laureaţi ai Premiului Nobel în 1974. biochimie celulară. proteine. Dar progresele spectaculare în studiul celulei au continuat cu repeziciune şi în scurta vreme s-a înregistrat o nouă schimbare radicală. ducând la apariţia unei noi ramuri a ştiinţelor biologice şi anume biologia celulară. După cum se ştie.3. industrie alimentară. se succed. La această catedră. La ora actuală. De asemenea. Sub raport conceptual biologia celulară a rezultat din fuziunea disciplinelor de citologie. T.oxidările celulare şi sinteza de ATP în mitocondtii) şi s-au descoperit şi caracterizat noi organite celulare (lizozomii şi peroxizomii de către Christian de Dure). Introducerea microscopiei electronice şi a fracţionării celulei prin centrifugare sunt cele două tehnici majore care au revoluţionat studiul celulei. Keith Porter şi alţii. a biosintezei proteinelor. fiziologie celulară. a elucidării mecanismului replicării ADN. printre primele de acest fel din Europa. lăsând să se întrevadă. iar în Germania 36. tot în aceste ţări s-a dezvoltat şi biotehnologia modernă. Prin anii ’60 exista deja o disciplină formată. când ia fiinţă o catedră independentă de histologie. ecologie etc). glucide. Japonia şi Germania. al cărui scop este interpretarea fenomenelor biologice la nivel molecular. în Japonia există 300 de firme. 1983). genetică moleculară. noi perspective fascinante de cercetare (medicină. prin care se decelează anumite componente ale celulei (acizii nucleici. Contribuţiile lui Gheorghe Marinescu în neurocitologie sunt sintetizate în cartea “Celulă nervoasă” (publicată la Paris în 15 . în curs de circa 100 de ani. reprezentat succesiv de Ludovic Fiala. I. Încă din 1839 Nicolae Kretzulescu publică la Paris rezultatele cercetărilor sale asupra structurii microscopice a dinţilor şi a mediilor transparente ale globului ocular.. Pe plan internaţional se impun în mod cu totul deosebit. 1. Victor Babeş (1854-1926) şi Ion Cantacuzino (1863-1934). care lucrează produse pentru laboratoarele de genetică şi biologie moleculară din întreaga lume. Niculescu. Odată cu realizările excepţionale înregistrate în descifrarea structurii proteinelor şi acizilor nucleici prin folosirea în special a difracţiei cu raze X. care predau histologia şi citologia până în anul 1897. Ion Bruckner. citologie şi tehnică microscopică. agricultură. deci a transmiterii informaţiei genetice şi a expresiei genei s-a născut biologia moleculară. după acela din Franţa. Christian de Duve. lipide) se localizează enzime în celulă sau în organite.

E. unele constituind clasa Babesia (Babesiozele sunt cele mai răspândite parazite ale animalelor). de asemenea. de menţionat laboratoarele de microscopie electronică şi biologie celulară şi moleculară din cadrul unor institute de învăţământ superior (Universitatea din ClujNapoca – dr. concepţie confirmată ulterior prin antibiotice. Silvia Andreicuţ la Tg. C. Cornil al primului tratat de microbiologie din lume. G. primul român laureat al Premiului Nobel. I. H. 1982) şi un manual unic ( Diculescu şi colab. cu posibilităţi de aplicare a fenomenului în terapie. a descoperit factorul stimulator al secreţiei celulare în diferite lichide biologice (de exemplu. Cotrutz la Iaşi. I. Începând cu anul universitar 1978-1979 se introduce biologia celulară ca materie obligatorie în planul de învăţământ la facultăţile de medicină.U. Diculescu la Bucureşti. Încă din 1885 a prevăzut că între microorganisme se pot stabili relaţii antagoniste. Diculescu şi colaboratorii de la catedra de histologie şi citologie a Facultăţii de medicină din Bucureşti publică prima monografie de biologie celulară din literatura română (Diculescu şi colab. Chita la Craiova. de microbiologie şi de medicină experimentală. Voiculeţ). laboratorul de microscopie electronică ) şi de cercetare: Institutul “ Dr. Popa. Crăciun. În perioada dintre cele două războaie mondiale şcoala de citologie de la Facultatea de Ştiinţe naturale din Bucureşti este reprezentată strălucit de Dimitrie Voinov (şi continuată de Theodor Dornescu şi I. Manolescu). În aceeaşi perioadă Ion Drăgoi. Andreicuţ. Frăsinel la Timişoara şi Gh. Nicolau” (biologie moleculară – dr. iar cea de la Cluj de către I. Steopoe). 1983 ). O. Tiţu şi colab. Merită subliniat în acest context. disciplinele de profil fiind conduse de I. A. lucrări publicate încă înainte de primul război mondial. Institutul de ştiinţe biologice. C. Pasteur” (microscopie electronică cu baleiaj – dr..1909) care a rămas mai multe decenii o carte de bază a domeniului. Sunt. Bucureşti ( microscopie electronică – dr. 1980. corpusculii Babeş-Erust în bacilul difteric. Dragomir). Scriban. publicând totodată şi primul manual de profil din ţară. precum şi asupra respiraţiei ovicitelor de mamifere. S. Palade este 16 . Învăţământul superior şi cercetarea ştiinţifică din România au depus eforturi de reorganizare în concordanţă cu evoluţia biologiei celulare în ultimele decenii. conducând şcoala de histologie şi citologie de la Facultatea de medicină din Cluj a efectuat cercetări deosebit de valoroase privind rolul presiunii osmotice asupra diviziunii celulare. pe lângă contribuţiile sale de imunologie comparată. Institutul “ Dr. Mureş. descoperirile de o valoare inestimabilă a lui G. care s-au impus prin descoperiri legate de aparatul Golgi şi lucrări de citologie animală (Ionescu-Varo şi colab. Şcoala de citofiziologie a lui Ioan Athanasiu şi Ion Drăgoi de la facultăţile de ştiinţe naturale şi medicină veterinară din Bucureşti aduc valoroase contribuţii de citofiziologie musculară. Babeş ” (biologie celulară – dr. lacrimile). L. Gancevici). Cantacuzino “ (microscopie electronică – dr. N. Antohi). Victor Babeş (coautor împreună cu francezul A.. Institutul “Ştefan S. Victor Babeş a mai descoperit corpii Babeş-Negri în neuron în turbare. Ionescu – Varo iniţiază la Facultatea de biologie din Bucureşti primele cursuri şi lucrări practice de biologie celulară. Se redactează cursuri litografiate pentru studenţii de la medicină (Benga. 1981). ci şi de orizonturile noi deschise în biologia celulară. S. Institutul Oncologic Bucureşti ( biologie moleculară – dr. V. Diculescu şi colab. I. Palade. biologie celulară – dr. Institutul “L. dintre care se remarcă descoperirea tubilor transverşi din celulele musculare cardiace şi cele striate.A (profesor George Emil Palade). Ion Cantacuzino.. aflat în legătură permanentă cu secţia de biologie celulară a Facultăţii de medicină din Yale. dr. Aprecierile de “principal cartograf al celulei” sau “cel mai mare biolog al secolului XX” (Blobel.) şi altele. Din 1979 a luat fiinţă “Institutul de Biologie şi Patologie Celulară” din Bucureşti. publicat la Paris în 1886) a descoperit peste 40 de microorganisme. Petrovici. Începând cu anul 1969 M. Benga la Cluj-Napoca. 1980) sunt justificate nu numai de multiplele sale descoperiri. Gh. 1971). 1981. V. N.

se desprinde ideea că toate fiinţele sunt alcătuite din celule şi din substanţe ce provin din activitatea lor. Macovschi şi care consideră viul materie biostructurată. a studiat biogeneza membranelor. Observarea şi studiul diviziunii celulare de către mulţi autori. Teoria biostructurală. filozofică. 17 . Schleiden (1838) şi apoi Schwann (1839). cu implicaţii de maximă importanţă economică. în miliarde de ani. pe care o trăim în prezent. mai afirmă că speciile de plante auevoluat de la forme unicelulare până la plantele cu flori şi că acest proces evolutiv s-a desfăşurat pe cale naturală. care consideră că viul este constituit din materia moleculară (ca şi neviul). a elucidat calea secţiei celulare. Hooke (1665) observă că pluta este alcătuită din numeroase „cămăruţe”. 1. conduc pe Virchow (1855) să enunţe o nouă idee: omnis cellula e cellula (toate celulele provin dintr-o celulă preexistentă). până la maimuţă şi om. Teoria moleculară. dispunând de microscoape mai perfecţionate. Acumularea de date şi cunoştinţe a permis şi fundamentarea unor teorii care au condus la modul actual de gândire despre natura materiei vii.unul din pionierii elaborării tehnicilor de microscopie electronică (a pus la punct metoda de fixare şi secţionare ultrafină. A descoperit ribozomii (numiţi şi “granulele lui Palade”) şi a precizat rolul lor în sinteza proteinelor. Biologia celulară şi moleculară reprezintă nu numai unul din cele mai dinamice domenii în care avansează frontierele cunoaşterii umane. Principalele teorii care au condus la modul actual de gândire despre natura materiei vii Secolul al XIX-lea a reprezentat un salt în cunoaşterea organizării materiei vii.4. ipoteză care afirmă că toate speciile de animale s-au transformat unele în altele. Importanţa acestor noţiuni nu a fost înţeleasă decât mai târziu. care a stabilit că la baza structurii ţesuturilor. În aceeaşi perioadă Leuwenhoeck (1674). superior organizată (biostructura). formă cu totul specială a materiei. Teoria evoluţionistă. care consideră că la baza controlului şi transmiterii caracterelor ereditare stau cromozomii (şi în ultimul timp ADN). 1. asemănătoare unor faguri de albine. ci şi pilonul fundamental ce stă la baza revoluţiei ştiinţifice. care reprezintă o sinteză fundamentală a cunoştinţelor despre celulă până la acea dată şi care este încă una dintre concepţiile de bază ale biologiei actuale. R. şi aici fiind un deschizător de drumuri. epoca de invenţie a primelor microscoape. prin factori întâmplători. medicală. Teoria cromozomială a eredităţii.4. exprimă această concepţie. numeroşi cercetători descriu celulele în diferite organisme vii. de dată mai recentă (sec XX-lea) ce aparţine academicianului E. ce i-a permis observarea pentru prima dată a multor structuri celulare) şi de centrifugare diferenţială ( a introdus zaharoza ca mediu de fracţionare). printre care: Teoria celulară. Puţin câte puţin. La începutul secolului al XIX-lea. organelor şi a întregului organism. cellula – cameră mică). ecologică şi în ultimă analiză. descoperă celulele libere şi identifică şi nucleul în eritrocite. de la primele vietăţi unicelulare. pe care le-a denumit „celule” (de la lat. Teoria celulară La sfârşitul secolului al XVIII-lea. vegetal şi animal. purtătoarea însuşirilor biologice pe care le imprimă viului şi care include materia moleculară. stă celula. a descoperit transportul pe calea veziculelor prin endoteliul capilar şi reciclarea membranelor celulare.1.

Fiecare celulă posedă un nucleu (Brown. Este cazul virusurilor care au o organizare foarte particulară. dar şi organitele. Von Mohl. cât şi transmiterea lor de-a lungul generaţiilor. Totuşi. Toţi hibrizii din F1 prezentau boabe de culoare galbenă. Nu numai celulele. Studiul creşterii şi dezvoltării organismului. Mendel utilizează metoda analizei genetice (hibridologică). a maladiilor sale. dar de asemenea o unitate de funcţionare şi o unitate de compoziţie. În scopul de a descifra mecanismele ce determină exprimarea anumitor caractere. ele au o continuitate genetică. Celula conţine o substanţă „gelatinoasă. bine conturate şi analiza descendenţilor obţinuţi. cunoscute sub numele de legile lui Mendel. sau moleculele ca cele de ADN (acid dezoxiribonucleic) preced structuri preexistente analoge. care cu toată marea lor diversitate. Fleming (1880)o observă în celulele animale şi o numeşte mitoza. Prima lege mendeliană este legea purităţii gameţilor. se ataşează de suprafaţa de secţiune şi se lasă întinsă asemănător unui mucus” (Dujardin.. Deşi fenomenul a fost remarcat cu foarte mult timp în urmă. 1840). Un material biologic adecvat acestui scop este mazărea (Pisum sativum). În urma acestei încrucişări s-a obţinut prima generaţie hibridă F1. sunt în raport cu structura şi funcţia celulelor sale. care se contractă într-o masă globuloasă. în timpul căreia cromozomii se repartizează în mod egal între celulele-fiice. sunt constituite dintr-un număr foarte limitat de materiale. Indivizii folosiţi în încrucişări trebuie să manifeste o mare constanţă a caracterelor ereditare. Oul (celula-ou) dă naştere unui nou organism. insolubilă în apă. 1. Schneider (1873). Sub denumirea de „legea purităţii gameţilor ” sunt unite de fapt două legi sau două principii: a uniformităţii hibrizilor din prima generaţie şi cea a segregării. Celulele sunt organizate după un plan foarte general comun. ele funcţionează după aceleaşi legi şi sunt constituite din molecule. plantă folosită în experimentele efectuate de Mendel. De la o generaţie la alta. Teoria cromozomială a eredităţii Caracterul esenţial al unei celule vii constă în capacitatea de a transmite în mod ereditar trăsăturile sale de la o generaţie la alta. el nu a putut fi descifrat decât spre sfârşitul secolului XIX-lea şi începutul secolului al XX-lea. Meritul îi revine naturalistului ceh Gregor Mendel care elaborează (1866) două importante legi ale geneticii. teoria celulară implică o unitate de plan de organizare. a reproducerii şi a fenomenelor de transmitere ereditară. viaţa se caracterizează printr-o succesiune neîntreruptă de celule. apoi Strasburger (1876) descoperă diviziunea indirectă în celulele vegetale.2. cum sunt cromozomii. Cel mai important factor ce poate influenţa rezultatele furnizate prin metoda analizei genetice îl constituie puritatea genetică a genitorilor. După A Lwoff (1962). Descoperirile recente pot provoca unele dificultăţi. Această lege se bazează pe rezultatele unui experiment de monohibridare (indivizii încrucişaţi se deosebesc printr-o singură pereche de caractere ereditare) Mendel a încrucişat un soi de mazăre cu boabe de culoare galbenă (G) cu un alt soi ale cărui boabe erau verzi (v). Principiul acestei metode constă în încrucişarea unor indivizi ai aceleaşi specii care se deosebesc între ei prin una sau mai multe caractere (trăsături) individuale. 1876). În cursul fecundării ovulului de către spermatozoid cei doi pronuclei fuzionează în oul fecundat (Hertwig. Schneider (1878) adaugă termenul de cariochineză. diafană. referitoare la generalizarea teoriei celulare.4. teoria celulară se evidenţiază ca fiind extrem de aplicabilă. Această substanţă reprezintă protoplasma (Purkinje. care derivă tot dintr-un nucleu preexistent (Strasburger. 1831). Caracterul alternativ (culoare verde) nu a fost exprimat de nici unul din indivizii primei generaţii. moştenind caracterul ereditar al unui singur genitor. 1875). 1835). 18 .

se constată formarea. Mendel şi-a extins cercetările şi asupra generaţiilor următoare. atât fenotipică. În cazul experimentului de monohibridare se constată existenţa unei duble segregări. În urma fecundării. În urma autopolenizării (sau încrucişării) hibrizilor din F1 s-a obţinut a doua generaţie de descendenţi . Se poate observa că în generaţie F2 raportul fenotipului dominant şi cel recesiv este de 3/1. 2). în timp ce caracterul alternativ. Segregarea genotipică constă în redistribuirea factorilor în cupluri diferite. numai a unuia dintre caracterele parentale alternative. în timp ce alţii manifestau caracterul recesiv. în a doua generaţie. raportul de segregare este de 3:1 (dominant/recesiv). Caracterul ce se manifestă la descendenţii din prima generaţie a fost numit dominant. Unii dintre aceştia prezentau caracterul dominant. nemanifestat i s-a atribuit termenul de recesiv.Mendel introduce termenul de dominanţă pentru a definii fenomenul de exprimare. În toate organismele. cât şi genotipică. El a remarcat faptul că plantele cu boabe verzi au descendenţi identici. fiecare conţinând un factor dominant şi altul recesiv. intuiţi de Mendel. Astfel de cupluri au primit ulterior numele de perechi alele. Factorii sunt transmişi descendenţilor prin intermediul gameţilor parentali (matern şi patern) ce conţin câte unul din factorii ce alcătuiesc cuplul(sunt puri din punct de vedere genetic). F2. factorii se găsesc în pereche. g = gena recesivă. – Schema care reprezintă prima lege a lui Mendel ( legea purităţii gameţilor ). gameţii se combină în moduri diferite ceea ce explică fenomenul de segregare manifestat în F2. sunt cunoscuţi azi sun numele de gene (termen introdus în 1909 de către Wolhelm Johanerson). Mendel explică rezultatele obţinute lansând ipoteza factorială care are drept suport presupunerea existenţei unor factori interni materiali ce stau la baza exprimării caracterelor ereditare. a două cupluri identice cu cele ale genitorilor şi altor două similare hibrizilor din F1. În urma unui studiu statistic al segregării. Mendel a obţinut raportul de 3:1 între caracterul dominant şi cel recesiv (fig. 19 . Analizând diagrama lui Punnett. stabilit fiind de 1:2:1 (fig.1. G = gena dominantă. 1). la hibrizii din F1. Diferenţiere caracterelor parentale la indivizii din a doua generaţie a fost numită segregare. restul de două treimi manifestând o segregare similară generaţiei F2 (3 dominant : 1 recesiv) ♂ G GG gG g Gg gg Gameţi F1 ♀ G G Fig. Din punct de vedere fenotipic (al aspectului exterior al individului). în generaţia F2. Aceşti factori. Din plantele cu boabe galbene doar o treime exprimă constant caracterul ereditar.

Se disting. g = caracterul recesiv (culoarea verde). Studiul posibilităţilor de combinare a factorilor ereditari în cupluri stă la baza unei noi clasificări a organismelor. în care manifestate erau doar caracterele dominante. F3 = generaţiile filiale (hibrizii). Legea segregării (disjuncţiei) independente a perechilor de factori ereditari respectiv a perechilor de caractere este a doua lege elaborată de Mendel. P = generaţie parentală. astfel. F2 . F1. 2. = genitorul parental femel. G = caracterul dominant (culoarea galbenă). cât şi aspectul neted al boabelor sunt dominante asupra caracterelor alternative. Diagrama factorilor ereditari aleloformi în experimentul de monohibridare.Fig. 20 . În urma încrucişării celor doi genitori s-a obţinut prima generaţie de descendenţi F1. Mendel a încrucişat un soi de mazăre cu boabe galbene şi netede (GN) cu un alt soi cu boabe verzi şi zbârcite (vr) Experienţele preliminare au demonstrat că atât culoarea galbenă. două tipuri de organisme: homozigote (la care factorii ce alcătuiesc cuplul sunt identici) şi heterozigoze sau hibride (la care factorii ereditari pereche sunt diferiţi). = genitorul parental masculin. Ea este fundamentată pe un experiment de dihibridare (genitorii se deosebesc între ei prin două perechi de caractere constante).

3) Fig. reprezentând cea de-a doua lege a lui Mendel. Aceste 16 combinaţii se găsesc în 4 clase de genitori. Generaţia F1 este uniformă pentru caracterele dominante. Cel de-al doilea părinte este homozigot pentru alelele recesive gg şi rr. Din modul de segregare a fiecărui caracter în parte. Cei şase (3+3) indivizi ce exprimă genotipuri noi. Atât raportul se segregare fenotipică. 3. segregă independent într-un raport de 3:1.Cei 16 descendenţi din a doua generaţie F2 rezultaţi prin autopolenizarea (sau încrucişarea) hibrizilor din F1. Fecundarea produce un număr egal de 4 x 4 = 16 combinaţii prezentate în pătratele figurii (generaţia F2 ). Š 3 plante exprimau al doilea caracter dominant (boabe verzi şi netede). raportul de segregare fiind de 9:3:3:1 astfel: Š 9 plante prezentau ambele caractere dominante (boabe galbene şi netede). diferite de cele ale genotipurilor. Schema dihibridării şi a segregării factorilor în F1. Š 1 plantă nu prezenta nici unul din caracterele dominate (boabe verzi şi zbârcite). cât şi exprimarea fenotipurilor noi se explică admiţând prezenţa în genomul hibrizilor din F1 a tuturor genelor parentale (fig. Š 3 plante manifestau primul caracter dominant (boabe galbene şi zbârcite). Un părinte este homozigot pentru două gene dominante: GG care determină culoarea şi RR care determină forma. se constată că fiecare pereche de caractere. sunt numiţi recombinanţi. se pot încadra în patru clase genotipice. 21 .

a universalităţii legilor mendeliene a condus la concluzia că libera combinare a factorilor ereditari are loc numai când factorii ce determină exprimarea perechilor de caractere sunt localizaţi în perechi de cromozomi omologi diferiţi. între anii 1958-1976. Teoria moleculară a materiei vii Conform modului actual de gândire despre natura viului. În timpul meiozei atât ataşarea cromozomilor de fibrele fusului de diviziune. studiile citologice subliniau implicarea cromozomilor în procesul transmiterii ereditare a caracterelor. făcute la nivel molecular ca şi cele ce privesc codul genetic. tendinţă de „chimizare” a diferitelor ramuri ale biologiei şi apariţia disciplinelor biologice noi. la nivel molecular va permite cunoaşterea vieţii.4. are natură moleculară. Tamaş . viul este constituit din materie moleculară. Punerea în discuţie. moartea este consecinţa încetării metabolismului. din perspectiva citologică.1975).3. demonstrând valabilitatea lui. S-a ajuns la convingerea că acest mod de gândire reflectă natura vie aşa cum este ea. în 1920. patologia moleculară şi chiar biochimia moleculară.4. analiza genetică. Neuhaus. poate fi cel mult egal cu numărul de perechi de cromozomi omologi prezenţi într-un organism dat. teorie publicată în diverse articole şi cărţi. Corelaţia rezultatelor cercetării fenomenului ereditar s-a finalizat prin elaborarea. Teoria biostructurală a materiei vii Plecând de la unele deficienţe de ordin teoretic. Watson 1974). sinteza genelor şi altele. Deci numărul factorilor ce segregă. cât şi deplasarea lor spre polii celulei sunt fenomene ce se desfăşoară la întâmplare. 1960. Watson. teorie preluată şi dusă la apogeu de Thomas Morgan (Drosophila melanogaster. Astfel asistăm la un adevărat triumf al „molecularismului” în biologie. însuşirile biologice sunt condiţionate de metabolism (Oparin.Anterior experimentelor mendeliene. Se mai consideră ca numeroasele descoperiri de mare importanţă pentru biologie. 1970. Orice tip de celulă diploidă conţine cromozomi de provenienţă maternă şi paternă ce formează cupluri de cromozomi omologi. Corelând datele genetice cu cele furnizate de citologie. în totalitatea ei.4. 22 . într-un heterozigot. român Eugen Macovschi elaborează o nouă teorie despre natura şi structura viului. 1. cum sunt biologia moleculară. 1974). deci întru-totul realităţii. segregarea perechilor alele. autoreglarea şi coordonarea reacţiilor enzimatice. conform modului actual de gândire. cunoaşterea sistemelor vii (Karlson. Acest lucru explică de ce gameţii rezultaţi în urma meiozei pot conţine orice combinaţie a factorilor ereditari parentali.S. genetica moleculară. natura materiei vii şi natura materiei moarte sunt calitativ identice (Haas. W. Orten. Deci. De aici abordarea tot mai frecventă a fenomenelor biologice în termeni moleculari.Sutton (1903)şi T. materia vie. hărţi genetice) teorie susţinută azi de informaţiile furnizate de biologia moleculară. 1964). mecanismul de biosinteză a proteinelor. Boveri (1904) ajung la concluzia că factorii ereditari (genele) sunt localizaţi în cromozomi. numite moleculare. 1967. vin în sprijinul actualului mod de gândire despre natura materiei vii. a Teoriei cromozomiale a eredităţii. oglindit în cercetare şi în programul de învăţământ. Manta. Datorită acestei situaţii cercetarea viului se orientează tot mai mult spre aspecte legate de structura chimică a substanţelor din organisme şi de interrelaţiile chimice şi fizice dintre moleculele acestor substanţe. (Bauley. independent între ei. 1975. 1. iar descifrarea fenomenelor biologice. explicându-se prin segregarea cromozomilor ce conţin genele în procesul de formare a celulelor sexuale (gametogeneza). experimental şi filosofic ale teoriei moleculare acad. 1968.

23 . din a căror însumare derivă fenomenele biologice. individ. se încarcă cu energie şi trec într-o stare specială. manifestarea vieţii. ale combinaţiilor chimice adecvate. fiind forma chimică de mişcare a materiei. vie şi moartă. au totuşi însuşiri atât de diferite. iar datorită surplusului de energie ele exercită în cadrul materiei biostructurate anumite funcţii elementare (biologice. nu pot fi înţelese şi cercetate de pe poziţiile chimice şi reprezintă modificări sau reacţii biostructurale. cibernetic.Materia vie şi materia moartă sunt calitativ identice. dar nu explică în ce constă şi cum se realizează (Macovschi. Materia biostructurală este o formă cu totul specială a materiei. prezintă particularităţi dependente de specie. dar nici nu exclud. Părerea că odată cu moartea manifestarea însuşirilor biologice ale materiei vii încetează datorită încetării metabolismului este greu de înţeles. prin structură. ea se deosebeşte de materia moleculară obişnuită. se reduc şi se deduc din fenomene şi legi chimice şi fizice. cvadridimensional. genetice. manifestările însuşirilor biologice ale materiei vii se reduc la chimismul obişnuit este greu de înţeles. care reflectă stadiul superior de dezvoltare şi organizare a materiei. Datorită acestor forţe şi stării speciale a componentelor. Prin alcătuirea. . Afirmaţia că fenomenele biologice. dar nu se arată cum anume se realizează această coordonare a reacţiilor chimice şi nu se indică modul cum. informaţionale etc. se ştie doar că formele materiei identice calitativ trebuie să aibă şi însuşiri de aceeaşi natură. . viaţa. în continuă dezvoltare. purtător al bioplasmei şi programului genetic. este purtătoarea însuşirilor biologice pe care le imprimă viului din care face parte. vârstă etc. totalitatea cărora constituie biostructurismul materiei vii. 1969). Se ştie doar că încetarea manifestării unor însuşiri este condiţionată de transformarea materiei purtătoare a însuşirilor respective şi nicidecum de încetarea desfăşurării sau coordonării unor reacţii chimice. . are însuşiri de semiconductor şi de corp solid şi se comportă ca un sistem informaţional. de la chimismul obişnuit coordonat. cuantificabil. indiferent dacă sunt sau nu coordonate. de calitatea ei şi nu sunt ale reacţiilor chimice care se desfăşoară în materie. ce depăşeşte posibilităţile de înţelegere şi de investigaţie de pe poziţiile moleculare. ca simple molecule. biovalenţele. dar nu se explică de ce cele două forme ale materiei. care printr-un schimb de energie.În materia vie toate reacţiile chimice sunt coordonate şi constituie metabolismul. obişnuite. Se ştie doar că însuşirile sunt ale materiei şi depind de natura.Moartea este consecinţa încetării metabolismului adică a încetării coordonării reacţiilor chimice. bioritmice. dar nu se precizează cum se ajunge la încetarea metabolismului. natura şi funcţiile sale speciale. cedări. şi consumuri de energie. componentele materiei biostructurale nu se mai comportă ca molecule. Prin acumulări. Exercitarea funcţiilor duce la manifestarea anumitor microfenomene. Datorită stării speciale.) pe care nu le pot exercita atunci când se află în afara acestei materii.. manifestarea structurii chimice a componentelor respective. se ajunge la manifestările vieţii. realizabil numai în condiţiile viului.Conform concepţiei lui Macovschi. cibernetice. integrându-se în biostructură. componentele pot suferi modificări care nu implică obligatoriu. iar. Componentele materiei biostructurale se leagă prin anumite forţe corelative. materia biostructurală se prezintă ca un întreg continuu în care o modificare provocată în starea unei componente se transmite şi se repercutează asupra stării celorlalte. materia biostructurală reprezintă o structură biologică dinamică. Acestea provin din molecule normale. materia vie (viul) constă din materie biostructurală şi din materie moleculară coexistentă. prin alcătuirea sa specifică.Fenomenele şi legile biologice derivă. Modificările componentelor se deosebesc profund de transformările chimice obişnuite. care acţionează numai în viul. ţesut. organ. principalele idei deficiente ale teoriei moleculare sunt următoarele: . Conform teoriei biostructurale.Materia biostructurală este alcătuită din componente. . specifică viului.

4. ceea ce duce nu numai la eliberarea unora din componentele ei sub formă de molecule. În anul 1859 cercetătorul britanic. prin factori întâmplători. la toate nivele continuă să se predea teoria evoluţionistă. Nimeni nu îşi pune problema originii omului decât din această unică perspectivă. Astfel s-a ajuns ca în toate ţările guvernate de asemenea partide să se înveţe că omul se trage din maimuţă. speciile ar evolua în mod naural unele din altele. Teoria evoluţionistă. 24 . că ea a parcurs etapele prezenate de evoluţionismul ateist. Acestă teorie. fiind interesate mai ales de aspectul moral al problemei (dacă omul se trage din maimuţă. în momentul în care este inclusă în învăţătura de credinţă. în mai multe miliarde de ani. însă. deşi au trecut 18 ani de la căderea comunismului. formează materia nevie şi ca atare nu este purtătoarea însuşirilor biologice. ipoteza devine o erezie. dar şi la apariţia unor fragmente polinucleare mai mari sau mai mici. nu există nici o dovadă a evoluţiei speciilor. subiectul evoluţionismului este încă încărcat de reacţii emoţionale. de la forme simple la forme mai complexe şi astfel ar fi luat naştere toate vieţuitoarele existente astăzi. cât şi menţinerea integrităţii şi stării funcţionale normale a materiei biostructurale. Aceste fragmente. Astfel. atunci suntem liberi să ne purtăm ca animalele ). Conform acestei teorii.5.Teoria susţine că Dumnezeu a creat doar două vietăţi unicelulare pe care le-a ajutat apoi să evolueze până la maimuţă şi om. mai întâi. mai mult. cu aspect de membrane. cât rămâne în domeniul ştiinţie. în miliarde de ani. biostructurată şi moleculară coexistă şi formează acea unitate morfo-funcţională care constituie însăşi materia vie. prin fenomenele care se desfăşoară la nivelul ei.Şi în şcolile din România. raţionamentele evoluţioniste conţin erori de logică şi ştiinţa actuală respinge ipoteza evoluţiei. au preluat ideea şi au reuşit să o impună ca teorie oficială. 1. dar că este rezultatul lucrarii directe a lui Dumnezeu. despre care se afirmă că ar fi provenit dintr-o specie de maimuţă. Iată care sunt în prezent concepţiile cu privire la originea vieţii şi a omului: Š Evoluţionismul ateist este ipoteza care afirmă că speciile de animale s-au transformat unele în altele. modifica sau chiar abandona unele dintre aceste aspecte. Teoria biostructurală reprezintă un mod de gândire despre natura materiei vii care prezintă o serie de aspecte ipotetice. Aici sunt de facut două precizări. nu a fost demonstrată niciodată şi au existat numeroase dicuţii chiar în timpul lui Darwin. ceea ce face ca o mulţime de oameni să nu dorească să-l discute. biostructura se destramă. Materia moleculară coexistă. originea vieţii şi a omului Pentru omul de cultură. ipoteza evoluţiei rămâca o simplă ipoteză. dar care deschide noi căi de cercetare ce vor confirma. nu preexistă ca atare în biostructură ci se formează ca artefacte pe măsura destrămării acesteia. Š Evoluţionismul teist este ipoteza care afirmă că evoluţia speciilor este un fapt real. dar participă la manifestarea acesteia în carul coexistenţei cu materia biostructurală. Din nefericire. contribuie atât la coordonarea biochimismului din materia moleculară coexistentă. materia biostructurală. dar unele partide politice. mai afirmă că speciile de plante au evoluat de la forma unicelulară până la plantele cu flori şi că acest proces evolutiv s-a desfăşurat pe cale naturală. cele două forme ale materiei. care includ enzime şi alţi compuşi chimici. până în prezent. de la primele vietăţi unicelulare până la maimuţă şi om. cea a lui Darwin. inclusiv omu. cât şi la asigurarea compoziţiei chimice normale a acesteia.Odată cu moartea. Dar. La rândul ei. Biochimismul care se desfăşoară în materia moleculară coexistentă furnizează energia necesară atât schimbării moleculelor în componente. Charles Darwin lansa o teorie care încerca să explice originea speciilor de plante şi animale altfel decât prin creaţie. evoluţionismul a devenit o certitudine.

Prin extensia acestui fenomen evolutiv – microevoluţie – desfăşurat la nivelul speciilor (care se pot încrucişa între ele) s-a ajuns la macroevoluţie. au fost create de Dumnezeu. rase şi soiuri. În anul 1996 apare cartea renumitului profesor de biochimie de la Berkeley University din California. 25 . s-a creat o pseudo – ştiinţă. pornind de la populaţii. ce cred în mod sincer că acurateţea conceptelor fundamentale a fost demonstrată. tot mai mulţi savanţi necreaţionişti au făcut cunoscut că teoria neodarwinistă (modelul evoluţionist actual). amândouă ţin de credinţă şi filozofie. fenomen ipotetic care încearcă să explice originea speciilor de plante şi animale conform teoriei lui Darwin. rase şi soiuri noi de plante şi animale în cadrul aceleiaşi specii (indivizii deci. Spetner şi-a petrecut 30 de ani cercetând posibilitatea evoluţiei la nivel genetic. prin mutaţii genetice pot să apară populaţii. astronomiei. Š Creaţionismul ştiinţific este teoria ştiinţifică(bazată pe genetică. deşi nu prea ştiu unde să-l găsească. darwiniste. Astfel. cercetător australian în domeniul biologiei moleculare. ci rămân exact cum au fost create. în anul 1985 a apărut cartea lui Michael Denton. inclusiv omul. pe teoria probabilităţilor şi pe teoria informaţiei) ce demonstrează că este imposibil ca speciile să apară spontan (din întâmplare) şi să evolueze. Denton arată că descoperirile specialiştilor în biologie moleculară aruncă din ce în ce mai multe îndoieli asupra pretenţiilor darwiniste. este doctrina conform căreia speciile nu suferă nici o schimbare. În 1997 o altă carte ce dădea de gândit a constituit o puternică lovitură împotriva darwinismului: Not By Chance !( Nu întâmplător !) de Dr. Darwin's Black Box (Cutia neagră a lui Darwin). specializat în codul genetic. transformându-se una în alta. nu poate explica noile date din domeniul geologiei. în care se arată că uimitoarele descoperiri ale biochimiei nu se împacă deloc cu nici un fel de darwinism. nici creaţia. Evolution: A Theory in Crisis (Evoluţia: criza unei teorii). care afirmă că speciile de plante şi animale. fost preşedinte al Academiei Franceze de Ştiinţe. Biofizician evreu. Referitor la fenomenul „evoluţiei” se acceptă un proces evolutiv numit microvoluţie. ci oferă şi noi căi ştiinţifice de investigare a felului cum are loc variaţia în limitele genetice ale fiecărui fel de organism. Michael Behe. întrucât.” Începând cu anii optzeci. ceea ce este departe de realitate. geneticii. El arată nu numai de ce mutaţiile întâmplătoare nu vor produce niciodată schimbările pretinse de evoluţionişti. fără a depăşi graniţile speciei.Lee Spetner. nici evoluţia nu pot fi dovedite în chip definitiv: de fapt. paleontologiei. de o alegere iniţială. teorie aflată în contradicţie cu creaţionismul. astfel că până în prezent a apărut o mare cantitate de literatură ştiinţifică extrem de critică la adresa teoriei evoluţioniste. Ea prinde rădăcini în chiar miezul biologiei. Realitatea arată că în cadrul speciilor pot apărea rase sau soiuri. În ultimii ani. Unii caută un nou model. al unor îndrăzneţe şi adesea neîntemeiate extrapolări. fizicii.Š Creaţionismul fixist. Din această imposibilitate rezultă că speciile au fost create de un Creator. Grassé.1973) cu acest nimicitor rechizitoriu al evoluţiei darwiniste: „ Prin uzul şi abuzul unor postulate ascunse. prin care. Unul dintre cei mai mari biologi. savanţi reputaţi au început să ridice serioase îndoieli asupra evoluţiei. ce oferă o critică sistematică a modelului evoluţionist actual din perspectiva mai multor discipline ştiinţifice. biochimiei şi a altor ştiinţe. făcând să rătăcească numeroşi biochimişti şi biologi. îşi încheie cartea sa Ľ Évolution du vivant (Evoluţia organismelor vii. se pot încrucişa între ei dând naştere la urmaşi fertili). Piere P.Din punctul de vedere al propriei discipline. Ar fi desigur prea mult să socotim că toţi aceştia se vor întoarce către „modelul creaţionist”.

Această nouă ramură a biologiei. legarea şi transmiterea moleculelor-semnal. Orice pătrundere din mediul exterior în interiorul organismului implică un schimb transmembranar. aparat Golgi. cu proprietăţi caracteristice de permeabilitate selectivă. a reuşit să se contureze prin colaborarea interdisciplinară a unui număr foarte mare de specialişti în domeniul biologiei.(grosimea 6 nm) compartimentează spaţiul intracelular. substanţele exogene trebuie să traverseze una sau mai multe membrane biologice înainte de a ajunge la centrii activi. plasmalema) este o structură bidimensională continuă (grosimea 6-10 nm). Elementul structural fundamental al membranelor celulare. Š controlul fluxului de informaţie dintre celulă şi mediul înconjurător prin recunoaşterea. cât şi stabilirea unui anumit raport între principalele molecule componente conduc la clasificarea membranelor celulare în trei tipuri: Membrana citoplasmatică (membrana plasmatică. tip vezicule de condensare şi lipozomi). Proteinele membranare. au putut fi evidenţiate şi studiate în detaliu un număr tot mai mare de structuri membranare (tip organite permanente celulare: reticul endoplasmatic. mitocondrii. complex Golgi. Arhitectura tuturor membranelor celulare (membrana plasmatică şi membranele organitelor) prezintă drept caracteristică comună asamblarea prin legături necovalente a biomoleculelor componente (lipide şi proteine) într-o structură dinamică şi fluidă. defineşte modul de organizare al lipidelor şi se comportă ca o barieră impenetrabilă pentru majoritatea moleculelor hidrofile (aqua-solubile). proprietăţile fizico-chimice ale substanţei. Grefarea seturilor distincte de proteine în dublul strat lipidic.1. Definiţia şi clasificarea membranelor celulare Membranele celulare reprezintă structuri complexe ce delimitează şi compartimentează conţinutul celular. Membranele speciale prezintă particularităţi structurale. dublul strat lipidic. asigură funcţionalitatea membranelor. Š realizarea conexiunilor intercelulare şi a ancorării celulelor în matricea extracelulară. 2. structura fizico-chimică a moleculelor mediului de o parte şi de cealaltă a membranei. în această categorie încadrându-se: teaca de mielină. Traversarea membranelor este condiţionată de: natura chimică şi organizarea moleculelor constitutive ale membranei. cât şi structuri cu viaţă limitată. mitocondrii. cu ocazia unui simpozion desfăşurat în Germania. Membranele interne ale celulelor eucariote – endomembranele . Prin urmare. reticul endoplasmatic. care se ocupă cu studiul membranelor celulare. creând astfel spaţii adecvate reacţiilor enzimatice celulare. Š imunitatea celulară. medicinii. biochimiei.Capitolul 2 MEMBRANELE CELULARE O ramură aparte a biologiei moleculare – biomembranologia . o structură multimembranară derivată din membrana 26 . În cursul anilor 60. lizozomi. Š desfăşurarea reacţiilor enzimatice asociate structurilor membranare. separând-o de mediul înconjurător. la Karlsruhe. delimitează organitele celulare (nucleu.a fost oficializată în anul 1977. asociate dublului strat lipidic. biofizicii. peroxizomi). ce conferă individualitate celulei. În 1950 erau descrise doar două membrane: cea plasmatică şi cea nucleară. datorită posibilităţilor de investigaţie oferite de microscopia electronică. ele fiind implicate în multiple procese: Š transportul molecular şi ionic transmembranar.

relativ libere prezintă mobilitate în planul membranei executând mişcări de difuziune şi rotaţie în jurul propriilor axe. Lipidele şi proteinele membranare. în confirmarea dublului strat lipidic ca element fundamental al structurii membranelor şi pe de altă parte. 9-nucleu. 27 . apa şi o serie de ioni. La componentele de bază ale membranelor . 8centrosferă. a-reţea endoplasmatică (membrane cu dublu contur).se adaugă constant carbohidraţii. 4-filamente intracelulare (descoperite în celule epiteliale. 10-nucleol. 11-aparatul Golgi. 5). Autorii concep membrana celulară ca pe un fluid structurat alcătuit dintr-un bistrat lipidic aflat într-o stare de cristal lichid şi care este penetrat local sau parţial de proteine globulare cu caracter insular (fig.plasmatică a celulelor Schwann ce înconjoară şi izolează axonul celulelor nervoase. discurile suprapuse localizate în regiunea externă a celulelor fotoreceptoare din retină. c-membrana nucleului. 2. în celule nervoase). Elementele care l-au impus constau pe de o parte. Fig. fibroblaşti. d-pori în membrana nucleului. 7-centrul celular. 3ergastoplasmă. 5-vacuolă. 4. în definirea modului de asamblare a proteinelor în dublul strat lipidic.lipidele şi proteinele . Pe partea citoplasmatică membrana este susţinută (în numeroase cazuri) de o reţea de proteine fibrilare ce constituie un citoschelet. 12-mitocondrii 2. 6-granule lipidice. 2endoplasma (hialoplasma). b-granulaţii fine (microzomi). Structura inframicroscopică a celulei 1-membrana celulară. Organizarea membranelor celulare În prezent se bucură de acceptare unanimă modelul în „mozaic fluid” lipido-proteic elaborat în 1971-1972 de către Singer şi Nicolson care satisface condiţiile de stabilitate termodinamică ale sistemelor membranare.

Fig. către anumite sedii celulare (transport vectorial). fiind înlocuite mai rapid (rapid turnover) sau mai puţin rapid (slow turnover). în fiecare moment. dar nu şi continuitate de substanţă. S-a dovedit că toate moleculele proteice din structurile de membrane vegetale sau animale au viaţă relativ scurtă. Lipidele sunt molecule insolubile în apă.2. proteinele şi lipidele din structura membranelor sunt înlocuite cu altele noi. orientat spre faţa internă citoplasmatică a membranei. cât şi a plasticităţii conformaţionale a celulelor. mediatori chimici. În celula vie. Din acest aspect reiese că orice tip de membrană biologică are o continuitate de organizare. când celula mamă transmite celor două celule fiice o dată cu zestrea celulară şi o anumită zestre de membrană. orientat spre faţa externă a membranei şi un strat intern. 1991) a şi b = proteine periferice de membrană. d = proteină de membrană (tip Ig): traversează bistratul lipidic Modelul „mozaicului fluid” oferă cadrul conceptual adecvat pentru explicarea atât a funcţiilor de transport. toxine etc. Membranele biologice au structuri fluide dinamice în continuă modificare. c = proteină de membrană (tip lecitinic): traversează bistratul lipidic. 2.1. 5. Deşi compoziţia lipidică a diferitelor membrane variază mult. medicamente. le înzestrează cu capacitatea de a se îndrepta spre anumite ţinte. Ribozomii şi reticulul endoplasmatic. colesterolul şi glicolipidele reprezintă clasele de lipide cel mai frecvent întâlnite în structura membranelor biologice (tabelul 1). Caracterizarea componentelor lipidice ale membranelor celulare Lipidele membranare formează un dublu strat cu grosimea de 4-5 nm: un strat extern. Această moştenire a pattern-urilor de membrană de către celulele fiice de la celula mamă reprezintă un aspect al continuităţii în timp şi spaţiu a sistemului de membrane. deoarece din stratul proteic sunt înlocuite în permanenţă un număr de molecule de aminoacizi vechi cu molecule noi corespunzătoare. fosfolipidele. sinteza de membrane se face prin extensia membranelor preexistente (pattern-uri de membrană) în cursul procesului de multiplicare celulară (mitoza sau meioza). deşi funcţia respectivei proteine rămâne în permanenţă nemodificată. Într-un µm2 de dublu strat lipidic se găsesc 5 x 106 molecule lipidice. a proceselor imunologice şi a efectelor produse asupra membranelor de diferiţi agenţi chimici (hormoni. desfăşurarea normală a metabolismului celular.). 28 . Aceste aspecte de continuitate asigură de fapt continuitatea de funcţionare a celulei şi implicit. dar înalt solubile în solvenţi organici (cloroform). care sintetizează aceste proteine de membrană. Structura unei membrane biologice (Stryr.

6a). Cu cât gradul de nesaturare al acizilor este mai mare. Fluiditatea este asigurată de prezenţa acizilor graşi şi a colesterolului. 6c). ei diferă cantitativ şi calitativ în raport cu specia. 6. în mediu lichid. Procesul de formare a acestui bistrat lipidic în mediu apos este un proces de autoasamblare. Moleculele de lipide se deplasează foarte rapid rotindu-se în jurul propriului lor ax şi difuzând lateral. pot forma: micelii (fig. colesterolul aflându-se la extremitatea hidrofilă. în acest fel asigurând fluiditate de membrană. bistratificat. lipsită de sarcini electrice şi cu o mare varietate de structură care se datorează unor acizi graşi deosebiţi. iar coada hidrofobă este orientată spre interior. Acizii graşi pot fi saturaţi sau nesaturaţi. Straturile bilipidice sunt înalt impermeabile pentru ioni şi pentru cele mai multe molecule polare (cu excepţia apei. care traversează foarte rapid această membrană). Aceste lipide de membrană sunt amfipatice. Pentru traversarea stratului bilipidic. vârsta. Datorită acestui caracter amfipatic.şi glicolipide. 29 . Cele trei forme pe care le pot lua moleculele de lipide în mediu lichid datorită proprietăţilor lor amfipatice În acest strat dublu. rolul major avându-l forţa de interacţiune hidrofobă (interacţiune necovalentă). condiţiile de viaţă etc.Tabelul 1. La eucariote. prevenind scăderea fluidităţii membranelor. o moleculă necesită o cantitate foarte mare de energie. Fig. 6b). cu atât fluiditatea structurilor membranare este mai mare. ele reprezentând bariere de permeabilitate pentru moleculele hidrosolubile. capul hidrofilic este orientat spre exterior. strat dublu circular (lipozomi. strat dublu linear (fig. care are o varietate de structură relativ mică şi poartă sarcini electrice şi o coadă hidrofobă. fig. formată din 12-24 atomi de carbon. lipidele. conţin un cap hidrofilic. proporţia fosfolipide/colesterol în membrana plasmatică este de 1/1. deşi straturile sunt aproape fluide. Procent din greutatea moleculară totală a lipidelor membranare Membrana plasmatică a celulei hepatice (%) 17 54 7 22 Membrana plasmatică a eritrocitului (%) 23 60 3 13 Teaca de mielină (%) 22 42 28 8 Membrana externă şi internă a mitocondriei (%) 3 76 urme 21 Membrana reticulului endoplasmatic (%) 6 67 urme 27 Lipide Colesterol Fosfolipide Glicolipide Alte lipide Bistraturile lipidice membranare sunt formate din fosfo.

În regiunea transmembranară. 2. Proteinele pot fi inserate în dublul strat lipidic în diferite moduri. Componenta proteică a membranelor celulare În stratul lipidic plutesc proteine rigide hidrofobe. de exemplu. iar proteinele din membrana internă a mitocondriilor şi cloroplastelor au rol de transductori de energie. adică rotaţie spontană a moleculei lipidice de pe o faţă a membranei pe cealaltă. O moleculă lipidică poate călători de la un capăt la altul al celulei bacteriene în timp de o secundă. Proteinele prezintă numai difuziune laterală. fosfolipide. cu rol în contracţia musculară).flop).2. Proteinele periferice (extrinseci) pot fi eliberate prin simpla spălare cu soluţii saline sau prin modificări de pH (de exemplu. proteinele mediază aproape toate funcţiile. având o mişcare laterală constantă. proteinele de membrană conţin predominant regiuni hidrofobe cu structură secundară tip α-helix şi structuri terţiare şi cvaternare compacte. se pot deplasa spre polii celulei unde sunt eliminate sau pot fi blocate în mişcarea lor laterală. antigene de membrană. enzime. Membranele care îndeplinesc funcţii diferite conţin în structura lor şi proteine diferite. constituie principalele elemente ce stau la baza caracterului dinamic al membranelor celulare. realizând o asimetrie funcţională.3.2. În timp ce lipidele au rol de barieră de permeabilitate şi de delimitare a componentelor biologice. localizată pe suprafaţa citoplasmei eritrocitelor. Mobilitatea lipidelor şi proteinelor de membrană Lipidele şi proteinele de membrană difuzează rapid în planul membranar. conţinând o regiune hidrofobă care reacţionează cu regiunea hidrofilă lipidică (din interiorul stratului lipidic) şi o regiune hidrofilă situată la suprafaţa internă şi respectiv externă a membranei. altele sunt virtual imobile (fibronectina). Lipidele prezintă difuziune laterală . altele pot fi implantate la nivelul unui singur strat din cele două ale membranei lipidice (tip lecitinic). În acest fel cele două suprafeţe de membrană diferă între ele prin cantitatea de lipide şi proteine. proteinele din membrana plasmatică au rol de pompe în transportul transmembranar. ceea ce face ca o membrană biologică să nu fie o structură rigidă. sau actina.2. acestea pătrund adânc sau chiar traversează stratul de lipide al membranei. cât şi liberă deplasare a lipidelor şi proteinelor în structurile membranare. iar altele pot fi ataşate doar covalent (adsorbite) la extremitatea polară hidrofilă a lipidelor şi se numesc periferice sau extrinseci.2. receptori. 30 . Pe baza datelor prezentate se poate considera că atât fluiditatea dublului strat lipidic. rămânând fixe în plan orizontal (formând agregate care se ancorează de alte structuri ale citosolului sau de proteine din membranele celulare vecine). Este un proces foarte lent. Proteinele reprezintă 50% din volumul de membrană. urmărite prin tehnica de rezonanţă magnetică). alte proteine (rodopsina) sunt la fel de mobile ca şi lipidele. numindu-se proteine integrale sau intrinseci (tip Ig). Proteinele integrale (intrinseci) interacţionează strâns cu hidrocarbonaţii din lipidele de membrană şi nu pot fi disociate decât în prezenţa detergenţilor şi a solvenţilor organici. lipsa difuziei transverse face posibilă păstrarea timp îndelungat a asimetriei de membrană. Se produce o rotaţie la câteva ore (de exemplu.mişcare paralelă cu planul bistratului (difuziune în planul membranei) sau transversă (tip fleep . Unele proteine de membrană difuzează în timp de un minut la distanţă de câţiva microni. spectrina. Proteinele sunt amfipatice. Proteinele de membrană pot forma pete difuze.

De asemenea. ele preferă să se orienteze spre suprafaţa apoasă a membranei (şi nu spre miezul hidrofob). Glicocalixul realizează deci. Rolul glicocalixului nu este pe deplin elucidat.5. ele primesc informaţia din mediul extern şi o transmit spre interiorul celulei sub forma unor cascade de reacţii biochimice. Zaharurile sunt foarte hidrolitice. Componenta glucidică membranară Carbohidraţii se întâlnesc pe suprafaţa tuturor membranelor plasmatice ale celulelor eucariote şi reprezintă 2-10% din greutatea componentelor membranare. majoritatea lanţurilor oligozaharidice conţin unul sau mai multe reziduuri de acid sialic.şi poliglucidice ale glicolipidelor şi glioproteinelor membranare. Proteina din structura proteoglicanilor traversează dublul strat lipidic.2. sub forma oligo. Hidrocarbonaţii de pe suprafaţa celulară au o mare densitate de structură şi au rol în recunoaşterea intercelulară (faţă de celulele sistemului imunitar). În structura sa intră atât lanţurile oligo. de multiplicare.4.2. Faptul că cele două componente ale glicocalixului sunt în acelaşi timp şi elemente ale matricei extracelulare face dificilă stabilirea unei linii clare de demarcaţie între suprafaţa celulară şi matrice. glicolipidele. în cazul celulelor animale.şi polizaharidelor se leagă covalent de proteine şi lipide formând glicoproteinele şi respectiv. Concentraţia mare de oligozaharide complexe la suprafaţa celulară poate sprijini ipoteza implicării acestei structuri în procese de recunoaştere celulă-celulă sau celulă-matrice. datorită încărcării electrice negative. în timp ce lanţurile polizaharidice rămân în afara celulei. distribuţia sarcinilor electrice pe suprafaţa celulei. Structurile de glicoproteine au funcţie de receptori. 7). molecule membranare integrale alcătuite din lanţuri polizaharidice lungi legate de un miez proteic. Carbohidraţii se întâlnesc şi în structura proteoglicanilor. membrana plasmatică şi glicocalixul. 7. numai una din 10 molecule lipidice ale monostratului extern conţine carbohidraţi. cât şi glicoproteine sintetizate de celulă şi apoi absorbite pe suprafaţa celulară (Fig. care au drept consecinţă modificări ale activităţii celulare (activitatea secretorie. În plus. 2. deci absenţa respectivei cantităţi de energie reprezintă o barieră puternică în calea rotirii de tip fleep-flop a moleculei de hidrocarbonat. Glicocalixul Suprafaţa celulară este alcătuită din trei elemente: cortexul celular (zona periferică citoplasmei). Fig. Prezentarea schematică a glicocalixului 31 . Carbohidraţii.2. moleculă cu sarcină electrică negativă. glicocalixul poate funcţiona ca depozit de cationi (Ca2+) ce sunt mobilizaţi în celulă în funcţie de necesităţile exprimate la un moment dat. constituind parte componentă a matrixului extracelular. Dacă majoritate proteinelor aflate pe suprafaţa celulară sunt glicoproteine. Glicocalixul reprezintă zona periferică a suprafeţei celulei animale. etc). deoarece orientarea inversă ar cere un consum foarte mare de energie.

Ca urmare. Se găseşte în proporţie de 30-50 % asociată intim fie structurilor de la suprafaţă. este localizat în monostratul intern al membranei eritrocitare. celulele epiteliale sunt capabile să împiedice difuzia moleculelor membranare. Astfel. Este posibil ca activitatea diferitelor proteine membranare să fie dependentă de microclimatul creat prin prezenţa fosfolipidelor specifice. ceea ce. toate proteinele membranare integrale au o orientare strictă în raport cu faţa citoplasmatică şi cea externă a membranei celulare. În plus. În acelaşi timp. Deosebirile dintre aceste lipide nu se limitează doar la natura grupărilor polare. În anumite celule. determină o fluiditate diferită a celor două straturi lipidice. ea se referă şi la gradul de nesaturare a lanţurilor hidrocarbonate. Singurul fosfolipid cu sarcină electrică negativă.2. membrana celulelor epiteliale este împărţită în domenii distincte: apical şi latero-bazal. în planul membranei. intervenind în stabilitatea structurilor proteice şi fosfolipidice bistratificate. În membranele plasmatice lanţurile oligozaharidice marchează faţa exoplasmatică. aparat Golgi) ele se găsesc pe faţa citoplasmatică.6. ca un liant. în timp ce.2. structural asemănătoare gheţii (apa legată chimic). apa joacă un rol precumpănitor în procesele de organizare moleculară a membranei. doar pe faţă externă a membranei. De asemenea. Implicaţiile asimetriei lipidelor la nivel funcţional nu sunt încă pe deplin cunoscute. Astfel. Moleculele proteice transmembranare ce conţin cisteină cunosc şi ele o orientare strictă. Mai mult. fie sub formă foarte ordonată. În acest context este de remarcat faptul că există şi o distribuţie asimetrică a sarcinilor electrice. Permeabilitatea selectivă poate fi privită ca fiind în raport cu apa structuralizată din membrană. Localizarea glicolipidelor în monostratul extern al membranelor plasmatice.2. grupările sulfhidril ale cisteinei formează punţi disulfurice inter şi/sau intra-catenare. 2. fosfatidilserina. Apa Apa deţine un loc important în structura membranară alături de celelalte componente chimice. În multe celule proteinele şi lipidele sunt menţinute în regiuni bine delimitate ale membranelor. în timp ce în monostratul extern al membranei predomină fosfatidilcolina şi sfingomielina. Distribuţia asimetrică a compartimentului lipidic pe cele două feţe ale dublului strat lipidic a fost pusă în evidenţă pentru prima dată în membranele eritrocitelor. Modificările de permeabilitate determinate de procesul de excitaţie poate fi consecinţa „topirii” structurii hidrice în anumite regiuni. Acest lucru se realizează prin intermediul joncţiunilor strânse ce funcţionează ca o barieră între cele două domenii membranare.7. ambele având un conţinut proteic şi lipidic diferit. Stricta orientare a glicoproteinelor este corelată cu funcţiile celor două feţe ale membranelor celulare. în membranele organitelor celulare (reticul endoplasmatic. 32 . Într-o astfel de stare. proteinele transmembranare sunt în majoritate molecule glicolizate. cât şi caracterul lor special sugerează implicarea acestor molecule ca receptori în procesele de comunicare intercelulară. Asimetria distribuţiei componentelor membranare Imaginea membranei celulare ca o „soluţie lipidică” în care plutesc moleculele proteice pare astăzi simplistă. activitatea enzimatică a proteinelor asociate structurilor membranare poate fi condiţionată de sarcina electrică a fosfolipidelor. distribuţia asimetrică a lipidelor şi proteinelor conduce la delimitarea unor domenii specifice în membranele plasmatice. Distribuţia asimetrică a moleculelor membranare joacă un rol esenţial în realizarea funcţiilor celulare. stratul intern conţine fosfotidiletanolamina şi fosfatidilserina drept componente lipidice majore.

la baza noţiunii de permeabilitate selectivă stă conceptul de membrană ca barieră a schimburilor celulare. Traficul de substanţe ce se desfăşoară atât prin membrana plasmatică cât şi prin membranele interne ce delimitează organitele celulare antrenează diferite mecanisme de transport. ƒ în fine. porţiunea d). Mecanismele de transport prin membranele celulare Celula. porţiunea b). ƒ În raport cu caracteristicile moleculare. 8. porţiunea c). Agitaţia termică a moleculelor asigură moleculei energia de activare necesară ruperii unor legături de hidrogen. metaboliţi şi electroliţi. Procesul calitativ al traversării membranelor Se consideră că au loc următoarele etape (fig. 8. 8. ƒ în etapa următoare. ceea ce se realizează după legile difuziei simple în mediu apos. variază şi intensitatea energiei necesare pentru intrarea moleculei în stratul hidrofob. Selectivitatea diferenţiată se manifestă atât la trecerea substanţelor din exterior în celulă. molecula părăseşte stratul hidrofob (fig. existenţa sa fiind condiţionată de stabilirea unei permanente comunicări cu mediul înconjurător. Prin urmare. aminoacizi. porţiunea e). un rol major revine membranei plasmatice datorită caracteristicii sale fundamentale. permite continuarea mişcării libere a moleculei. săruri de amoniu. molecula trebuie să se desprindă de stratul hidrofil şi să treacă în stratul lipofil. Abordând această problemă din perspectiva schimbului de substanţe pe care celula îl realizează cu mediul extern. 2. acesta având conţinut de apă apropiat de cel al mediului. ƒ continuarea difuziei în startul hidrofob nu reclamă energie de activare suplimentară pentru că trebuie să se desfacă legături de hidrogen (fig. Aceasta face posibilă alimentarea celulei cu molecule esenţiale (glucoză. permeabilitatea selectivă creează cadrul favorabil desfăşurării unei activităţi metabolice stabile. Fiecare moleculă formează legături de hidrogen cu apa din interiorul celulei. 33 . porţiunea a). 8): ƒ molecula trebuie să avanseze în zona apoasă (mediu şi zona periferică a membranei). uree).2. lipide) şi eliminarea atât a produşilor fiziologic activi (enzime.3. În paralel cu asigurarea continuităţii acestor schimburi. În momentul când molecula atinge stratul hidrofil al membranei. cu refacerea lor spontană şi imediată. de unde trece prin acelaşi fenomen. cât şi în sens invers.1. din punct de vedere termodinamic. permeabilitatea selectivă. este un sistem deschis. cât şi prin reglarea volumului celular ca rezultat al relaţiilor osmotice celulă-mediu. 8. ceea ce necesită o energie de activare moleculară (fig. 3. hormoni). cât şi a celor rezultaţi ca „deşeuri” în urma metabolismului celular (CO2. Permeabilitatea selectivă se modifică dinamic aflându-se sub influenţa modificărilor mediului extracelular şi a metabolismului celulei. fenomen facilitat de formarea legăturilor de hidrogen cu moleculele de apă din stratul membranar proteic hidrofil interior. traversarea stratului exterior hidrofil se realizează fără consum de energie (fig. în citoplasmă (fig. Deci. atât prin menţinerea în spaţiul intracelular a unei concentraţii relativ constante de substanţe organice. 8. Această caracteristică a membranelor celulare prezintă particularităţi în raport cu diferenţierea funcţională a celulelor.

Se constată existenţa unei relaţii de directă proporţionalitate între coeficientul de partiţie al unei molecule şi 34 . el decurge cu pierdere de energie liberă.2. grad de hidratare (grad de ionizare) iar pe de altă parte. Unele gaze (O2.1. ilustrând gradul de hidrofobicitate al moleculei. dimpotrivă. nucleotide. Procesul nu implică consum de energie (ATP). fie facilitat. CO2) şi unele molecule mici cu caracter hidrofob sunt capabile să străbată dublul strat lipidic membranar prin difuziune simplă. 3 . de compoziţia chimică a membranelor. dimensiuni.2. Difuzia simplă Cel mai simplu tip de transport pasiv constă în difuzia fizică a moleculelor determinată de gradientul lor de concentraţie sau electrochimic. a. Transportul ionilor şi moleculelor mici prin membranele celulare Maniera în care substanţele trec prin membranele celulare este determinată pe de o parte de caracteristicile substanţelor (greutate moleculară. ƒ proces biochimic: transport specializat. fie activ. 8. necesitând participarea unor proteine membranare specifice. Un alt criteriu de clasificare este consumul de energie metabolică sub formă de ATP. care asigură trecerea moleculelor mici hidrosolubile. Astfel. amonoacizi) şi al unor ioni (H+. Ca2+) nu poate fi realizat în aceeaşi manieră. cu atât molecula are un mai pronunţat caracter hidrofob. Principalul criteriu de clasificare a tipurilor de transport îl reprezintă dimensiunile substanţelor ce străbat membrana. când particulele de substanţă sunt înglobate de membrana celulară prin mişcări de invaginare şi transfer astfel spre interior. 2.Fig. Transportul moleculelor solubile în apă (glucoză. transportul macromoleculelor şi al particulelor necesită sechestrarea lor în vezicule delimitate de membrane. Astfel.3. Din acest punct de vedere se disting două tipuri de transport: pasiv şi activ. Na+. în timp ce ionii şi moleculele mici traversează dublul strat lipidic prin difuziune sau implicând proteinele membranare. ƒ proces biologic: endocitoză. formă. K+. În difuzia simplă moleculele nu sunt modificate chimic sau asociate altor specii moleculare în timpul trecerii lor prin membrană. 2.Transportul pasiv Traversarea membranelor celulare de către molecule şi ioni în sensul gradientului de concentraţie sau electrochimic (compus din gradientul de concentraţie şi gradientul electric) poartă numele de transport pasiv. Se descriu următoarele posibilităţi de traversare a unei membrane: ƒ proces pasiv: transfer pasiv. Modificările energetice care însoţesc traversarea unei molecule hidrosolubile printr-o membrană biologică (după Maziliak). prin simpla filtrare prin pori (filtrarea) şi a moleculelor mari liposolubile prin dizolvare în membrană (difuzia simplă). inclusiv apa. Viteza cu care se desfăşoară etapa trecerii moleculelor din mediul apos extracelular/intracelular în interiorul hidrofob al membranei este dependentă de coeficientul de partiţie (K) al moleculei. cu cât valoarea sa este mai mare. Acesta măsoară afinitatea relativă a moleculei pentru mediul lipidic în raport cu apa. deci este mai liposolubilă şi pătrunde mai repede în celulă. Acest tip de transport este denumit difuziune facilitată.

străbătute de un canal delimitat de aminoacizi hidrofili. se respectă legea lui Fick. catalizează difuzia facilitată a glucozei prin membrana eritrocitelor (Fig. Mecanismul transportului mediat de Dgluco-permează În parte. În difuzia moleculelor încărcate electric legea lui Fick nu mai are aplicabilitate. C1aq. Spre deosebire de difuzia simplă. fiind astfel capabil să treacă molecula transportată de pe o faţă pe alta a membranei celulare. modelul „carrier” rămâne aplicabil numai pentru transportul anumitor ioni de către polipeptide antibiotice (de exemplu. În acest model se consideră că transportorul exercită o mişcare de navetare sau rotaţie în dublul strat lipidic. Aceste proteine transmembranare. Aceasta enunţă că viteza de difuziune (dn/dt) a unei molecule este proporţională cu diferenţa de concentraţie. formează porii membranari. Difuzia facilitată În procesul de difuziune facilitată. În cazul transportului prin difuzie simplă a moleculelor fără sarcini electrice. procesul fiind exclusiv determinat de gradientul electrochimic. suprafaţa (S) şi coeficientul de permeabilitate (P). (dn/dt)= PxS (C1aq – C2aq) Fig. Are o greutate moleculară de 45. viteza de difuziune a unei molecule prin membrană conform legii lui Fick este: unde: S . 9. Deci. Permeaza leagă reversibil şi complementar la un situs activ o singură specie moleculară sau molecule aparţinând unei singure familii. permeabilitatea selectivă a membranelor plasmatice poate fi explicită prin existenţa proteinelor canal. transportul pasiv al moleculelor prin membrană este mediat de proteine membranare numite permeaze. 6). transportul ionului de K+ de către valinomicină). Unul din modelele care au încercat să explice maniera în care se desfăşoară difuzia facilitată este modelul transportorilor cărăuşi (carrier model). Calculele termodinamice demonstrează că la deplasarea unui mol de substanţă fără sarcină electrică. b. D-gluco-permează (sau D-hexozo-permează). Datorită vâscozităţii dublului strat lipidic. C2aq .constanta de permeabilitate (P) a membranei celulare. În urma legăturii ce are loc pe o faţă a membranei se formează un complex moleculă-permează ce traversează dublul strat lipidic. D-glucopermeaza este o proteină transmembranară alcătuită de 12 α-helixuri care au în majoritate un caracter hidrofob. Cea mai bine caracterizată permează.1M (la 250C) sistemul pierde o energie liberă de 1.reprezintă suprafaţa membranei P este coeficientul de permeabilitate al membranei. disociindu-se pe cealaltă faţă a membranei cu eliberarea moleculei transportate. viteza de difuziune a moleculei prin interiorul membranei este mult inferioară vitezei sale de difuziune printr-un mediu apos. iar rotirea unei molecule proteice în planul membranei este defavorizată din punct de vedere energetic. Proteinele canal specializate în transportul selectiv al diferitelor specii ionice se 35 . Deoarece difuzia facilitată este un tip de transport pasiv. difuzia facilitată se caracterizează prin specificitate faţă de molecula transportată.sunt concentraţiile mediilor apoase separate de membrana celulară.000 Da.359 kcal/mol. de la o concentraţie de 1M la o concentraţie de 0. Difuzia simplă prin membranele celulare se realizează cu pierdere de energie liberă.

10. nucleotid. caracteristică ce a sugerat denumirea lor de proteine canal cu poartă (gate channels). Schema joncţiunii neuromusculare şi principalele proteine canal de ioni implicate de declanşarea contracţiei musculare sub acţiunea impulsului nervos. ƒ cu poartă comandată de liganzi. În funcţie de factorii ce comandă deschiderea porţilor. B Fig. se deosebesc trei tipuri de proteine canal: ƒ cu poartă comandată de stimuli mecanici. A .starea activată Fig.proteină canal de Na+ cu poartă comandată de ligand. Transportul mediat de aceste proteine nu necesită consum de energie. 12. B . ƒ cu poartă comandată de voltaj (dependente de valoarea potenţialului de membrană) (Fig. 11. 10. implicit. A Fig. Transportul activ Deplasarea moleculelor şi ionilor prin transport pasiv evoluează spre egalarea concentraţiilor de o parte şi de alta a membranei şi. ionii difuzând cu viteze diferite prin membrană în sensul gradientelor de concentraţie. 12). deschiderea canalelor reprezintă un răspuns celular la diferite semnale recepţionate de membrana plasmatică. dispariţia potenţialului 36 .numesc proteine canal de ioni. Structura canalului de Na+ cu poartă comandată de voltaj 2. De regulă.starea de repaus. proteină de legare a GTP) (Fig.2. Modificarea conformaţională a receptorului acetilcolinic . 11). Proteinele canal de ioni se deschid tranzitoriu.3.2. În acest caz canalele se deschid în urma legării la un receptor a unei molecule semnal ce poate fi un mediator extracelular (neurotransmiţător) sau un mediator intracelular (ion.

molecula transportoare are funcţie ATP-azică. celula şi-a creat mecanisme de transport activ capabile să deplaseze moleculele şi ionii în sens invers gradientelor lor de concentraţie şi electrochimic. Pompele ionice Se cunosc trei clase de proteine ce cuplează direct transportul ionilor împotriva gradietelor lor electrochimice cu desfacerea legăturilor fosfodiesterice din molecula de ATP şi formarea de ADP (adenozin difosfat) şi fosfor anorganic (P): clasa ATP-azelor P. în timp ce înlăturarea ionilor din citosol permite relaxarea musculară. În funcţie de modul în care este utilizată energia se deosebesc două tipuri de transport activ. Clasa ATP-azelor P conţine trei reprezentanţi. Energia ce asigură conversia conformaţiei enzimei (E1 → E2) cât şi pomparea ionilor împotriva gradientului lor de concentraţie este furnizată de hidroliza moleculelor de ATP (Fig. în unele cazuri împreună cu K+. Mecanismul de acţiune Na+-K+-ATP-aza. Na+ K+-ATP-aza pompează Na+ în mediul extracelular şi introduce K+ cu sarcină în celulă. eritrocitele utilizează 50% din energia stocată în moleculele de ATP pentru a menţine o concentraţie ionică relativ constantă a mediului intracelular. mediat de Ca2+ATP-aza. clasa ATP-azelor F. are la bază modificarea conformaţională a enzimei. deşi insuficient cunoscut. Funcţionarea Na+-K+-ATP-aza asigură menţinerea unei concentraţii intracelulare relativ ridicată a ionilor de K+ ce condiţionează desfăşurarea normală a unor procese celulare vitale cum sunt: biosinteza proteică. clasa ATPazelor V (H+-ATP-aze). fiind capabilă să utilizeze direct energia rezultată în urma hidrolizei ATP în procesul de transport (pompele ionice). Acest tip de transport este mediat de proteine specifice şi prezintă toate caracteristicile cinetice ale difuziei facilitate. În unele cazuri de cotransport. În celulele musculare enzima este prezentă în membrana reticulului sarcoplasmic. Ultimul constituient al ATP-azelor P transportă ionii de H+. activitatea catalitică a unor enzime (piruvat-kinaza) şi menţinerea potenţialului de membrană a celulelor excitabile. Pomparea ionilor din reticulul sarcoplasmic în citosol determină contracţia musculară. În cadrul acestui transport moleculele şi ionii sunt deplasaţi împotriva gradientelor lor de concentraţie pe seama energiei eliberate în transportul pasiv al altor molecule şi ioni. 13). este posibilă formarea unor canale în proteina transportoare ce permite trecerea ionilor de Na+ şi K+ prin membrana plasmatică.Na -K+-ATP-aza (pompa de Na+-K+) prezentă în membranele plasmatice ale tuturor celulelor animale este unul dintre cele mai studiate sisteme de transport activ. energia moleculelor de ATP este utilizată indirect prin intermediul gradientelor ionice. Pentru a menţine homeostazia mediului intracelular. O proteină capabilă să lege specific ionii de Ca2+ a fost identificată şi în citosol. fiind implicată în transportul ionilor de Ca2+ din citosol în acest organit celular. Primul reprezentant al acestei clase şi cel mai răspândit . implică consum de energie metabolică. Astfel. Traficul Ca2+ prin membrana reticulului sarcoplasmic în celulele musculare. Astfel.membranar. pe care transportul activ îl oferă celulei. 37 . Proteina numită calmodulină este alcătuită dintr-un singur lanţ polipeptidic şi are o funcţie reglatoare modificând viteza de pompare a ionilor de Ca2+ în raport cu concentraţia citosolică a acestora. este esenţial în procesul de contracţie – relaxare musculară. Al doilea reprezentat al clasei de ATP-azei P este Ca2+-ATP-aza (pompa de Ca2+). a. Plusul de independenţă faţă de compoziţia mediului înconjurător. În transportul activ propriu-zis. Este localizată în membranele plasmatice asigurând menţinerea unei concentraţii intracelulare scăzute a ionilor de Ca2+. Al doilea tip de transport activ poartă numele de cotransport.

În acest caz. În acest transport activ. Clasa ATP-azelor F. Folosirea energiei gradientelor ionice în transportul transmembranelor activ constituie o cale indirectă de utilizare a energiei stocate în ATP. Ceea ce caracterizează ATP-azele din clasa F. Clasa ATP-azelor V (H+ . b. H+-ATP-aza este prezentă în membranele plasmatice ale celulelor ce secretă produşi acizi (membrana apicală a celulelor epiteliale ce mărginesc lumenul vezicii urinare) şi în membranele lizozomale. Sunt descrise trei aspecte ale cotransportului: 1) uniport. f.ATP-aze) este reprezentată de proteine transportoare ce realizează deplasarea protonilor în sens invers gradientului lor de concentraţie. transportul K+ prin membrana plasmatică şi eliberarea lui în citosol are loc simultan cu revenirea proteinei transportoare la conformaţia iniţială (E1). legarea ATP este urmată de hidroliza acestuia şi fosforilarea unui rest de Asp din structura proteinei (E1~P). moleculele neutre nu se acumulează împotriva gradienţilor de concentraţie. Pompa de H+ dependentă de ATP din membranele lizozomale are rolul de a menţine un pH scăzut (4. b. 38 . Cotransportul activ al ionilor şi al moleculelor prin membrana plasmatică nu utilizează în toate cazurile direct energia eliberată prin hidroliza ATP.5-5) în interiorul acestui organit celular. Schema funcţionării Na+ .defineşte procesul de cotransport. fără a fi cuplată cu mişcarea altei specii moleculare. K+ se leagă la situsurile de pe faţa exoplasmatică ale subunităţii α. a unei singure specii moleculare sau ionice. 2) sinport.K ATP-azei a. 14 a). este faptul că acţionează în sensul cuplării-deplasării H+ de la o concentraţie mai mare la una mică cu sinteza ATP din ADP şi P. la un moment dat. defosforilarea proteinei transportoare conduce la modificarea conformaţiei (E2). d. ca şi cele ale clasei V sunt responsabile de transportul protonilor.Fig. e. 13. proteina aflată în conformaţie E1 leagă Na+ la situsurile aflate pe faţa citoplasmatică a subunităţii α. localizate în membrana mitocondrială. c. energia legăturii macroenergice E1~P asigură modificarea conformaţională a proteinei (E1-P) şi transportul Na+ în spaţiul extracelular. ci transportul lor prin membrană este facilitat de gradientul de concentraţie scăzută şi catalizat de o proteină de import numită importer (fig. Transportul uniport reprezintă trecerea prin membrană. 3) antiport.numiţi ioni cotransportaţi . Deplasarea ionilor şi moleculelor împotriva gradientelor lor de concentraţie cuplată obligatoriu cu transportul pasiv al altor ioni . ionii de Na+ au un rol important în transportul zaharurilor şi aminoacizilor în celulă.

Pătrunderea acestor molecule în celulele epiteliale este cuplată obligatoriu cu intrarea ionilor de Na+. Mecanisme de cotransport Fig. 15. împotriva gradientului de concentraţie. Antrenarea în circulaţie sanguină a glucozei absorbită din lumenul intestinal şi deplasarea aminoacizilor din tubii renali în sânge reprezintă procese cu o desfăşurare similară. Dintre toate sistemele de simport cel mai bine cunoscut este simportul de lactoză în celula bacteriană (Escherichia coli) (fig.Fig. 14. Simportul este asigurat de proteine specifice localizate în regiunea apicală (cu microvili) a membranei plasmatice (fig. 15). Na+K+-ATP-aza menţine gradientul electrochimic al Na+ prin pomparea ionilor în afara celulei epiteliale. Cooperarea celor două proteine transportoare face posibilă preluarea continuă a glucozei din lumenul intestinal. Tipul simport reprezintă cotransportul a două specii deosebite (o structură chimică solvită şi union încărcat H+) în aceeaşi direcţie. b2).Na+ asigură acumularea glucozei. 14. b1). Proteina ce realizează simportul glucoză . în celulele epiteliale ce delimitează lumenul intestinal. purtaţi fiind de către o proteină porter (fig. în care un rol important îl joacă celulele epiteliale intestinale şi respectiv. 39 . tubulare. 14.

sunt declanşate de gradienţi de Na+. de pompe ionice de Na+. în celulele animale. Reglarea volumului celular şi a presiunii osmotice interne În anumite limite. Speciile ionice exportate în mediul extracelular (H+ şi HCO3-) sunt generate în celulă ca rezultat al acţiunii anhidrazei carbonice asupra produsului final al metabolismului celular CO2. c) între două substraturi solubizante în două direcţii opuse.25 M NaCl) 40 . 14. Are loc schimbarea unei specii moleculare cu alta. sau Cl.Sistemul antiport reprezintă transportul de interschimb (fig. Transportul apei şi reglarea volumului celular Presiunea osmotică . Studii recente sugerează posibilitatea existenţei unor proteine canal de apă la nivelul membranelor plasmatice. Na+ este transportat intracelular. uniport. în condiţiile în care celula se găseşte într-un mediu hiperton (0. iar concomitent Ca2+ este scos în spaţiul extracelular.în celulă şi exportul de HCO3-. simport şi antiport au fost descrise întâi la bacterii (Escherichia coli). la rândul lor. Al doilea sistem acţionează în sensul deplasării Cl. Mecanismul transportului molecular de apă prin dublul strat lipidic nu este încă cunoscut. 16). Principalele proteine transportoare implicate în reglarea volumului celular. ulterior dovedindu-şi valabilitatea în toate celulele organismelor vii (fungi. plante. Prin acest tip de transport activ. c. Primul sistem asigură intrarea în celulă a Na+ în schimbul ieşirii H+. simporter şi antiporter au structuri asemănătoare şi funcţionează prin mecanisme similare. de exemplu Na+ în locul ionului de H+.K+-ATP-ază. Influxul de Na+ şi Clconduce la creşterea concentraţiei saline şi a tensiunii osmotice celulare ce fac posibilă intrarea moleculelor de apă în celulă şi în unele cazuri restabilirea volumului celular iniţial (fig. animale). Majoritatea acestor tipuri de transport activ simport/antiport. transport catalizat de o proteină antiporter. Introducerea unei celule într-un mediu hipertonic (cu o concentraţie salină superioară conţinutului celular) este urmată de scăderea pH-ului citosolic.în locul grupării HCO3-. celulele sunt capabile de a-şi modula tensiunea osmotică internă şi prin aceasta îşi pot menţine volumul relativ constant.factor critic în transportul molecular de apă Deplasare moleculelor de apă prin membrana plasmatică sau printr-un strat de celule este rezultatul acţiunii diferenţei de concentraţie a celor două soluţii separate de membrană (stratul de celule) şi /sau gradientul de presiune hidrostatică. Cele trei tipuri de transport . fapt ce determină activarea sistemului antiport Na+-H+ şi Cl-HCO3-. Proteinele uniporter. generaţi. 16. acest antiport reuşeşte să menţină scăzut nivelul citosolic al calciului în multe celule. Fig.

Există însă situaţii în care macromoleculele traversează spaţiul celular fiind secretate printr-o altă regiune membranară. neurotransmiţători şi enzime digestive este realizată prin exocitoză reglată. Se disting două tipuri de transport: exocitoza şi endocitoza. Studiul transportului macromoleculelor din celulă în mediul extracelular sugerează existenţa a două tipuri de exocitoză: constitutivă şi reglată (fig. Transportul macromoleculelor şi particulelor prin membrana plasmatică Schimbul de substanţe pe care îl realizează celula cu mediul înconjurător nu este limitat numai la ioni. fie eliberate din nou în mediul extracelular. 18). Materialele ce pătrund în celulă prin endocitoză sunt fie supuse acţiunii enzimelor hidrolitice lizozomale. În acest caz moleculele sunt împachetate în vezicule de secreţii. Procesul de exocitoză stă la baza desfăşurării secreţiei celulare (fig. Secreţia celulară de hormoni. Fig. Calea clasică de transport a moleculelor de secreţie în spaţiul extracelular 41 .2. iar fuziunea lor cu membrana plasmatică este comandată de un semnal extracelular. molecule mici şi apă. cât şi a fracţiunilor din fluidul interstiţial (pinocitoza).3.3. De cele mai multe ori macromoleculele de secreţie sunt eliberate din celulă prin aceeaşi regiune a membranei plasmatice prin care ele au pătruns. Prin exocitoză macromoleculele sintetizate în celulă sunt excretate în spaţiul extracelular. 17. Deşi decurg după mecanisme diferite. 17). Acest ultim tip de transport poartă numele de transcitoză. cele două procese de transport menţionate prezintă unele caracteristici comune: ƒ sechestrarea moleculelor şi a particulelor transportate în vezicule. de cele mai multe ori. Exocitoza constitutivă este comună tuturor celulelor şi asigură eliminarea continuă a macromoleculelor sintetizate în spaţiul extracelular. poliglucide) şi particule traversează membrana plasmatică prin mecanisme de transport mediate de vezicule. un mesager chimic. Endocitoza este implicată în transportul în celulă a diverselor molecule. ƒ asigurarea unui transport strict direcţionat. Diferitele macromolecule (proteine. ƒ rolul critic al procesului de fuziune membranară. polinucleotide.

Endocitoza mediată de receptori pentru LDL 42 . Calea urmată de particulele ce au pătruns în celulă prin endocitoză Fig. fără a fi însoţite de fluidul extracelular. macromoleculele intră în celule sub forma complexului de ligand-receptor. reprezintă un tip de transport specific şi eficient al macromoleculelor. colesterolul circulă în sânge legat de o proteină cu care formează complexe numite lipoproteine cu densitate scăzută (LDL) (fig. 20. 20). De exemplu. 18. Prezentarea schematică a exocitozei constitutive şi reglate Endocitoza defineşte transportul mediat de vezicule din mediul extracelular în celulă al unor macromolecule. cât şi a substanţelor dizolvate în lichidul interstiţial (fig. 19. Endocitoza mediată de receptori. În funcţie de mecanismul procesului de endocitoză distingem: endocitoza mediată de receptori şi pinocitoza. 19). În urma recunoaşteri şi legării lor la receptori de membrană. Fig.Fig.

Vezicule prinde rapid clatrina şi devine endozom (receptozom). Majoritatea receptorilor de pe suprafaţa celulelor care mediază endocitoza sunt glicoproteine transmembranare. Celule specializate numite fagocite sunt capabile să înglobeze şi să distrugă substanţe străine. etapă absolut necesară pentru sortarea proteinelor şi dirijarea lor către destinaţii specifice. Dacă la organismele unicelulare fagocitoza reprezintă principala cale de nutriţie. la mamifere procesul joacă un rol important în apărarea organismului. Caveolele reprezină 2% din suprafaţa unei celule animale. celule îmbătrânite şi maligne. modularea răspunsului la mulşi hormoni de natură proteică şi factori de creştere (de ex insulina. Legarea particulelor de fagocit .implică participarea receptorilor de membrană ce recunosc specific liganzii aflaţi pe suprafaţa particulei ţintă. Mecanismul endocitozei Endocitoza începe cu invaginarea unei asemenea regiuni din membrana plasmatică. Fagocitoza (gr. care sunt recunoscuţi de către receptorii de suprafaţă ai celulelor. bacterii. Mulţi dintre aceşti receptori sunt localizaţi în anumite regiuni ale membranei plasmatice. rezultă deci că soarta substratului este decisivă la acest nivel. fagiere=a mânca) este un proces de transport mediat de vezicule prin care celulele sunt capabile să ingere diverse particule din spaţiul extracelular.prima etapă a fagocitozei . temporar. prin scăderea numărului de receptori celulari. mai puţin receptivă la aceştia. helixuri transmembranare. care ulterior invaginându-se vor forma cavele (coate pita). Endozomii fuzionează şi formează vezicule mai mari cu diametrul de 2000-6000Aº (în circa 20 de secunde). prezentând câteva aspecte particulare deosebit de importante şi anume: eliberarea metaboliţilor esenţiali către celule a colesterolului. Eliberarea clatrinei din vezicule reprezintă un moment cheie în endocitoză deoarece prezenţa acestei mantale proteice în jurul veziculei ar împiedica transmiterea proteinelor importate şi a receptorilor către destinaţiile lor.Procesul de endocitoză mediată de receptoriare o semnificaţie biologică foarte largă. Aceşti receptori au: ƒ un domeniu extracelular.Caracteristic pentru endozomi este pH-ul acid care determină disocierea celor mai multe complexe receptor – proteine. a ionilor de fier. constituie un strat gros de clatrină (proteină ce va forma o reţea în jurul veziculelor membranare). În raport cu mărimea şi complexitatea particulelor endocitate. Clatrina este reciclată de către o enzimă activată de ATP. etc). fragmente de celule eucariote sau chiar celule întregi). factorul de creştere epidermic. clatrina formează o reţea în jurul acesteia pe care apoi o închide rezultând în final o veziculă cu manta de clatrină(diametrul de 800Aº). corpusculare (virusuri. cu formarea unei caveole. Partea citosolică a acestor zone. fiind fixaţi şi importaţi intracelular. În organismele animale se disting două tipuri de celule sanguine ce acţionează ca fagocite: monocitele (ce migrează în ţesuturi dând naştere macrofagelor şi ele celule cu funcţie fagocitară) şi neutrofilele. a complexelor vitaminice B12. microorganisme. resturi celulare etc. se disting două variante particulare ale endocitozei şi anume: fagocitoza: endocitoza macromoleculelor sau a particulelor mici. ƒ 1-2. Endocitoza îndepărtează aceşti hormoni din circulaţie şi fie celula. 43 . ƒ mică regiune citosolică. pinocitoza: endocitarea moleculelor solubile (toxinele bacteriene). Acidifierea endozomilor prin acţiunilor unor pompe protonice (activate de ATP) duce la disocierea complexelor receptor-proteine. captarea proteinelor ţintite pentru distrugere şi eliberarea acestora către lizozomi(de ex celulele hepatice captează şi distrug glicoproteinele plasmatice senescente).

al diferitelor microelemente. numită regiune Fc. Un exemplu de transcitoză îl reprezintă transportul din stomac în circuitul sanguin al anticorpilor la nou-născut. Fagocitoza se realizează printr-un mecanism „membrane-zipper” A – distribuirea uniformă a anticorpilor pe suprafaţa celulei . opsonein=a pregăti pentru mâncare) ce constă în acoperirea suprafeţei bacteriene cu anticorpi şi/sau componente ale complementului. 44 .4. Transcitoza defineşte un tip de transport specific transcelular. 22. 21). conţinutul veziculei fiind hidrolizat. Unii dintre aceşti liganzi sunt numiţi mesageri de ordinul I. 23. Receptorul Fc din membrana plasmatică a fagocitelor interacţionează cu anticorpii legând cele două suprafeţe membranare printr-un mecanism tip fermoar (membrane-zippering-mechanism) ce face posibilă fagocitoza (fig. În interiorul plasmalemei. Fig.ţintă face posibilă fagocitarea acesteia B – procesul de „capping” împiedică fagocitarea celulei-ţintă Pinocitoza este un fenomen observat la macrofage şi reprezentat de invaginarea unei părţi a membranei celulare. generează un semnal intracelular ce declanşează ingestia.) prin legarea cărora se induc răspunsuri celulare caracteristice. Procesul este întâlnit în celule (epiteliale) ale căror membrane plasmatice sunt împărţite în domenii distincte (apical şi latero-bazal) datorită pronunţatei asimetriei în distribuţia elementelor lipidice şi proteice componente. Al doilea mesager declanşează un lanţ de reacţii intracelulare care provoacă în ultimă instanţă răspunsul celulei ţintă la ligantul fiziologic în cauză (fig. Anticorpii se ataşează pe suprafaţa bacteriilor în aşa fel încât regiunea prin care aceştia se leagă la receptori. proces numit patching. componente ale complementului sau diverse oligozaharide de pe suprafaţa microorganismelor. 24. anticorpi primiţi odată cu laptele matern. este expusă spre exterior. Această veziculă migrează de la membrana celulară spre regiunea perinucleară. sub influenţa unor particule mici.cu formarea în final a unor vezicule citoplasmatice (cu dimensiuni de 1-2µm).Pentru a putea fi fagocitate. 25). anticorpii se deplasează spre un pol al celulei-ţintă generând o structură de tip calotă ce împiedică fagocitarea celulei ţintă (fig 21). de obicei cAMP (adenozin-monofosfatul ciclic). Activarea receptorilor specifici de către anticorpi. solubile (picături). etc. neurotransmiţători. 2. având funcţia de legare specifică şi cu afinitate mare a unor molecule extracelulare numite liganzi (hormoni. RECEPTORII DIN MEMBRANĂ Receptorii membranari sunt glicoproteine transmembranare. Există posibilitatea stabilirii unor legături încrucişate între anticorpii ataşaţi pe suprafaţa celulei ţintă cu formarea unor aglomerări (clusterii). Procesul de calotare (capping) este energo-dependent necesitând prezenţa moleculelor de ATP. prin formarea complexului ligandreceptor. receptorul activat interacţionează apoi cu un sistem enzimatic care generează în citosol un mesager de ordin II. 21. După un scurt timp de la formarea cluster-ilor. bacteriile sunt supuse unui proces de opsonizare (gr. unde fuzionează cu lizozomii.

Modificări de permeabilitate a membranei. atunci Ca+2.4. acid gamma-amino-butiric. Ligantul de care se leagă de receptor prin forţe slabe (hidrofobe. 45 . de ex calmodulina).1. receptori pentru complement. datorită progreselor tehnicii. a. receptorii pentru acetilcolină. dopamină. receptori pentru anticorpi. Dimpotrivă. altele pot difuza local.influenţând mai multe celule. parathormonul. b. într-o zonă specifică din molecula receptorului. Prin legarea de receptor apar diferite modificări ale plasmalemei ce induc apoi efecte intracelulare. serotonină. pentru a explica mecanismul de acţiune al medicamentelor şi toxinelor numai recent. Receptori pentru hormoni sunt localizaţi diferit în celulă. peptide mici ca encefalina). au putut fi vizualizaţi unii receptori în ţesuturi umane obţinute post-mortem. este considerat ca un mesager de ordinul II.Tipuri de receptori Se pot distinge două categorii mari de receptori după originea ligandului pe care îl leagă: receptori pentru substanţe endogene şi receptori pentru substanţe exogene. noradrenalină. 2. glucagon. adrenalină.monofosfat ciclic) ci provoacă un influx rapid de ioni de calciu (Ca+2).În cazurile când interacţiunile moleculă semnal receptorul generează un nucleotid ciclic (adenozin sau guanozin. Exemple de modificări ale plasmalemei pot fi: Redistribuirea receptorilor cu agregarea lor în anumite zone ale plasmalemei urmată de endocitoză. acid glutamic. c. Receptori implicaţi în reacţii imunitare sunt receptori pentru antigene endogene (foarte numeroşi în plasmalema unor limfocite). deci având efecte de mediatori chimici locali. ƒ receptori pentru antigene străine de organism ƒ receptori pentru toxine bacteriene ƒ receptori pentru medicamente ƒ receptori pentru lecitine Deşi conceptul de receptor a fost enunţat de mai bine de 100 de ani de către P Erlich şi M. hormonii hidrofili se leagă de receptorii din plasmalemă şi aceşti receptori transmit celulei informaţia necesară spre a-şi modifica metabolismul. se produc la legarea neurotransmiţătorilor de membrana postsinaptică şi au rol în transmiterea şi generarea impulsului nervos Activarea unor enzime din plasmalemă (activarea adenilatciclazei de către hormonii polipeptidicihidrosolubili). musculare sau alte celule efectuare (de ex. În acesta categorie intră receptorii pentru insulină. Receptorii pentru neurotransmiţători sunt situaţi în membrana postsinaptică a celulei nervoase. acid aspartic. datorită deschiderii canalelor de calciu ale membranelor celulare.Unele dintre aceste molecule acţionează strict numai asupra unei celule postsinaptice. histamină. De remarcat că folosirea mesagerilor de ordin I şi activarea multor proteine şi enzime prin legarea unei singure molecule de ligand au ca rezultat creşterea extrem de mare a eficienţei receptorilor al căror procent nu depăşeşte 1% din totalul proteinelor de membrană. adrenalină. glicină.după cum hormonul este hidrofil sau hidrofos (cum este cazul hormonilor steroizi şi tiroidieni).legături de hidrogen). Receptorii pentru substanţe exogene (vehiculate de obicei pe cale umorală) includ: ƒ receptori pentru virusuri. în matricea citoplasmatică. el pătrunde uşor prin plasmalema celulei ţintă şi se leagă de receptorii intracelulari. hormoni ai hipofizei. Hangley. Creşterea intracelulară a Ca+2 (prin deschiderea unor canale din plasmalemă care permit pătrunderea calciului extracelular ce se leagă în citosol de proteine specifice.

4. Astfel de neurotransmiţători sunt: acetilcolina. Comunicarea între celule este necesară începând cu dezvoltarea şi organizarea acestora în ţesuturi. Pe de altă parte. ATP. etc. Dintre receptorii şi antigoniştii lor. cazul reţelei nervoase dintre celulele senzoriale şi cele musculare). Contacul intercelular direct cu caracter efemer.Contactul intracelular direct Contactul celular direct.transmiterea umorală.4. consecutiv eliberării unui mesager chimic în torentul circulator fiind adecvată transmiterii de informaţii generale. Receptorii celulelor nervoase Când informaţia circula rapid de la şi către anumite locuri. factorii de creştere.2. Căile principale prin care se realizează schimbul mesajelor sunt: a) transmiterea indirectă la distanţă b) transmiterea directă între celulele aflate în contact. ca şi pentru coordonarea diverselor activităţi ale celulelor mature. când mesajele se transmit fără o difuziune semnificativă în spaţiile extracelulare pot fi: ƒ permanente ƒ tranzitorii ƒ episodice Contactul direct permanent se realizează de obicei prin intermediul joncţiunilor permeabile de tip „gap” care leagă direct compartimentele citoplasmatice ale celulelor ce se influenţează reciproc şi prin care trec molecule mici. De asemenea există şi cazul conjugării celor două posibilităţi de comunicare anterioară când mesajele se transmit la distanţă prin contacte interpuse (de exemplu. glutamatul. ionii şi nucleotidele. semnalele bioelectrice. capătul nervului eliberează neurotransmiţătorii în spaţiul sinaptic de unde o parte sunt distruşi şi o alta se prinde de receptorii specifici. Modalităţi de comunicare intercelulară Sistemele de comunicare intercelulară reprezintă cheia înţelegerii funcţionării armonioase a celor aproximativ1x 1015celule din organismul uman. α-adrenergic (fentolamina). În ambele cazuri membranele celulare au un rol principal îndeosebi prin existenţa receptorilor specifici 2. substanţa P (un decapeptid). glicina. fac parte: receptorul colinergic. anticorpii şi antigenele. Acesta este cazul a două mecanisme fundamentale de transmitere a informaţiei: . Pe plan celular.2. virusurile şi interferonii.transmiterea nervoasă. 2. adaptată comunicării rapide şi selective a mesajelor şi. etc . .2. sensibil la muscarină cu antagonist atropina. tranzitoriu este exemplificat tipic de cooperarea celulelor sistemului imunitar a cărui organizare este astăzi comparată cu aceea a sistemului nervos elaborându-se conceptul de „reţea imunitară”.continuând cu controlul creşterii şi diviziunii. dopamina. Odată cu apariţia potenţialului de acţiune. noradrenalina. într-o serie de boli alterarea comunicării are un rol patogenic important.4.4.2.3.2. sensibil la nicotină (α-bungarotoxina). polinucleotidele şi ARN.mesaje care difuzează în spaţiul extracelular. de exemplu metabolice.1. β-adrenergic – 46 . Principalele sisteme de mesageri şi semnale intercelulare sunt hormonii (care nu mai sunt consideraţi produşi exclusiv ai glandelor endocrine). la distanţă. receptorul colinergic. legătura este stabilizată prin contacte sinaptice intercelulare de 15 nm dintre celulele care participă la transmiterea mesajelor.Comunicarea intercelulară la distanţă Celulele pot schimba între ele. mesajele sunt vehiculate printr-un mecanism electric de către nervi prin transmisie chimică între neuroni şi între aceştia şi celulele receptoare senzoriale sau efectuare. 2. neurohormonii şi neuromediatorii.

23). Fig. se accelerează. Probabil că exocitoza se realizează prin filamentele mecanocontractile membranare. În fiecare regiune presinaptică se găsesc vezicule presinaptice la capătul terminaţiei nervoase.A. Propagarea mai departe a influxului nervos depinde de existenta în membrana neuronului a unor canale ce se deschid pentru Na+ la o modificare a voltajului membranar şi a căror funcţionare de . Ataşarea veziculelor cu acetilcolina de membrana presinaptica se face pe unele proteine intrinseci membranare. legându-se de receptorii membranari postsinaptici. acetilcolina se descărca prin impuls nervos (impulsul nervos este acela care deschide canalele proteice) şi realizează în membrana postsinaptică prin mediaţie chimica un potenţial de membrana cu ajutorul canalelor receptoare de acetilcolina care transporta K+ şi Na+. Asemenea apropiere de zero depinde de numărul canalelor deschise şi de durata acestui stadiu. Când doua molecule dintr-un neuro-transmitaţor (acetilcolina) se leagă de un receptor postsinaptic. 22. Fiecare terminaţie conţine aproximativ 10000 molecule de acetilcolina.poarta închisă şi deschisă” pentru Na+ este cauza. si alţii . Fig. pana ce suprafaţa interna a membranei se pozitivează pe o unica porţiune. cele 10000 molecule de acetilcolina trecând prin cele circa 2000 de canale în acelaşi timp cu 20000 ioni de Na+ într-un sens si tot atâţia de potasiu (K+) în sens invers. parcurgând câteva sute de micrometrii pe suprafaţa unui muşchi. În mai puţin de 100ms conţinutul de circa 10000 molecule de acetil-colina iese prin exocitoza în spaţiul sinaptic. transferând voltajul mai departe. într-o ms. Ieşirea ionilor de K+ restabileşte repede potenţialul negativ al membranei . 22). formează câteva sute de contacte sinaptice la 1µm . Deci. scade energia stadiului conformaţional deschis şi. Pătrunderea Na+. în acest mod. canalul proteic al respectivului receptor se va deschide. Axonul unui neuron motor de la broască.) (fig. 23. Receptorii membranari postsinaptici sunt concepuţi ca nişte canale proteice care se deschid la neurotransmiţător. de fapt a potenţialului de acţiune (P.. Fuziunea veziculelor cu acetilcolina cu membrana presinaptice este declanşată de o creştere rapidă şi trecătoare a concentraţiei Ca2+ în butonul terminal al axonului. Canalele de Na+ şi K+ (schemă) 47 . aceasta se face la întâmplare. dar imediat acest Ca2+ liber dispare în momentul contopirii veziculelor cu membrana presinaptica. aşezate pe doua şiruri la fiecare sinapsa.(propanolul). Diferenţa de voltaj între K+ care iese în spaţiul sinaptic si Na+ care intra în celula este aproape 0 (zero). Influxul nervos (schemă) În momentul aplicării unui stimul are loc o depolarizare locala slabă caracterizată printr-o mică modificare de voltaj care deschide canalele pentru Na+. Inversarea voltajului determină potenţialul de acţiune ce se propagă de-a lungul axonului (fig. sub influenţa Ca2+.

Canalele rămân în stare de inactivare câteva ms şi abia apoi se închid trecând în starea de repaus. care se găsesc şi în creierul mamiferelor.6 nm prin care trec ioni de Na+ cu o moleculă de apă. asupra canalului. hidrofobe şi glicolizate cu manoza şi galactoza. diferită de aceea din starea de repaus.. astfel că faţa internă (sau citoplasmatică) devine pozitivă prin pătrunderea Na+. În acest caz. Un complex prezintă patru situsuri de legare pentru acetilcolina. Aceşti receptori. Deschiderea canalelor Na+ se face în modul . nu se mai poate realiza transmisia neuromusculara şi apare o maladie musculară degenerativă. Pe suprafaţa sa canalul are grupări încărcate electric în poziţii bine determinate. deoarece fiecare canal deschizându-se face să crească conductanţa membranei de 8x10-12ohmi (Ω). Receptorul este relativ hidrofob şi glicolizat cu manoza şi galactoza. care variază în direcţie şi mărime de câte ori se schimbă conformaţia moleculară a canalului. ceea ce înseamnă un câmp electric mare membranar. pentru ca apoi sa se închidă prin inactivare. aşa fel încât canalele rămân deschise scurt timp. experimental.4. Modificările în intensitatea câmpului membranar pot. după cum el se închide şi apoi se deschide. Este vorba de un complex de 3-4 polipeptide cu o greutate moleculară de 200000-300000 fiecare polipeptid având o GM=40000-65000 . asistentă a 30000 molecule de toxina marcată pe un µm2. dipolii electrici ai proteinelor canalului Na+ se aliniază cu câmpul electric membranar. sunt blocaţi când în sângele circulant apare un anticorp al sau datorită unei condiţii autoimunitare. în axon se generează un singur impuls care se propagă de-a lungul sau în urma unui singur stimul. Fiecare complex are 250000 daltoni. În consecinţa. Apoi. 48 . contracarând canalul Na+. 4 molecule de αbungarotoxina marcată. produce o serie de impulsuri la diferite intensităţi ale aceluiaşi stimul. 2. Receptorii care controlează permeabilitatea ionică Ţesuturile electrogene ale peştilor electrici au puţine joncţiuni neuromusculare. constatându-se. de aproximativ 100KV/cm. De un asemenea complex se pot lega.Canalul Na+ este o proteină de circa 300000 daltoni... după izolarea membranelor postsinaptice. fiind compus din 3-4 tipuri de polipeptide de 50000 daltoni. 70mV între incarcatura pozitivă de la exterior şi cea negativă de la interior.deschisă”.închisă”.. iar cele mari îl blochează . să schimbe conformaţia proteinei canalului din . se stabileşte incarcatura negativă a feţei citoplasmatice a membranei. cu un por de 0. Cantităţile mici de nicotina sensibilizează receptorii. deci aproximativ 7500 receptori dispuşi în arii hexagonale la suprafaţa membranei.totul sau nimic”.închisă” în . determinându-i o stare conformaţională .4. prin scoaterea K+ de câtre canalele K+ în afara fibrei nervoase. Diferenţa de voltaj transmembranar care deschide canalul Na+ acţionează de asemenea. după cum se ştie. spre deosebire de corpul neuronului care. Asemenea sarcini conferă canalului un moment dipol electric mare. Membranele lor postsinaptice sunt foarte bogate însa într-un receptor colinergic reglat de nicotina . Este de remarcat că. Diferenţa de potenţial a membranei în repaus este.4-0. este starea de inactivare ce apare mult mai lent ca procesul de activare.

şi anume. una de activitate marcată prin conductanţei Na+ şi alta de desensibilizare (sau un stadiu rezistent la activare)..Fig. Şi invers sunt inhibitori ai 49 .porţi”care se deschid şi se închid sub influenţele chimice sau datorită variaţiilor de voltaj transmembranar. Transmisia chimică prin sinapse O caracteristică a receptorilor este că prezintă întotdeauna trei stări conformaţionale ale proteinelor constitutive. o stare de repaus. 24. Receptorul acetilcolinei (antagonistul lui fiind bungarotoxina) acţionează când captează neurotransmitătorul. funcţionând cu . Exista o multitudine de receptori a căror funcţionare este legată de canalele ionofore ale membranei celulare. deschizând canalul Na+ ce pătrunde astfel înăuntru (Na+).

porţi” ionice de Ca2+. Creşterea Ca2+ citoplasmatic de la 10-8 M la 10-6 M. stricnina care sensibilizează specific receptorul pentru glicina). brusc se inversează bătaia cililor şi el înoată atunci înapoi. orice cuplaj prin joncţiuni dintre celulele adiacente face posibilă ca o modificare a potenţialului de membrana într-o celula să se propage şi în celelalte. β-glucozei. de exemplu sunt canalele ce lasă să treacă Na+. faţă de cel extracelular (1m M). Celulele sunt foarte sensibile la o variaţie citoplasmatică a Ca2+. discurile membranare ale celulelor cu bastonaşe din retina conţin . Tot astfel. care sunt activate de către interacţiunea luminii cu rodopsina. Experimental. contracţiei musculare. densitatea unor asemenea canale este cuprinsă între 0. nu şi K+. Ca2+. angiotensinici. luând o noua conformaţie şi participând la tot felul de activităţi moleculare. Trecerea diferitelor molecule prin joncţiunile cu gol depind de menţinerea în hialoplasma a unei concentraţii de Ca2+ sub 10-5 M.4. ca în fibra nervoasă. care solidarizează celulele adiacente pe anumite porţiuni. Canalele prin care trec 100 K+ şi 85 Na+ sunt activate de acetilcolina. Calmodulina interacţionând ireversibil cu Ca2+ formează complexul proteina +4Ca2+ a cărui activitate este reglată de fluxul deschiderii canalelor de Ca2+. unele lasă pentru 100 ioni K+ să mai treacă şi 85 Na+. 2. Studiile electrofiziologice şi de microinjecţii au presupus existenţa unor canale la nivelul joncţiunilor. ca răspuns la lumina. Modificările în conductanţa membranei pentru Na+ şi K+ se datoresc unor canale care se închid şi se deschid selectiv faţă de ioni.neurotransmiţătorilor care au efecte de hiperpolarizare prin intermediul receptorilor specifici (ex. cu modificările fiziologice corespunzătoare. cu diferite răspunsuri fiziologice. datând de la infuzorii ciliaţi la care există receptori de presiune. Canalele K+ sunt mult mai mici şi au foarte puţina apă. deoarece Ca2+ intracelular este într-o mică cantitate (0. Asemenea procese mediate de Ca2+ se realizează printr-o proteina ce leagă Ca intrat în celula.şi K+ . când un parameci înoată şi întâlneşte un obstacol. hiperpolarizand celula şi inhibând sinapsele de la baza celulei.cu gol” şi . altele pentru ≈100 K+ lasă să treacă doar 7 Na+. Când concentraţia Ca2+ creşte în celula.8nm diametru. având un por de 0.scalariforme”). cu toate că molecula de K+ este de 30 de ori mai mare decât Na+. 24). creşterii cantităţii de c GMP etc. conductanţa electrică realizata la nivelul joncţiunilor . aceasta inversare a bătăii ciliare se realizează în prezenta unei soluţii de KCl datorită unui influx al Ca2+ în infuzor. ajuns în celule . α-adrenergici. activarea unei serii de receptori produce mobilizarea Ca2+ (receptorii colinergici. Ea se leagă cu patru ioni de Ca modificându-si conformaţia.. ca răspuns la presiune sau depolarizare. denumită calmodulina. etc) în celula ţinta. 50 .... Aşa de exemplu.cu gol” dintre celulele adiacente este de 106 ori mai mare ca în restul membranelor celulare nelegate între ele. Aceste canale au fost confirmate de ME care a arătat că la nivelul acestor joncţiuni există nişte particule intramembranare care formează suprafeţe mozaicate în hexagoane şi care reprezintă proteinele cu canalele moleculare. Procesul acesta de control a permeabilităţii ionice prin receptori este foarte vechi.10000µm2 (fig. Astfel. destul de apos. atunci scade şi permeabilitatea joncţiunilor şi creşte iar când scade nivelul Ca2+. altele care permit trecerea K+ nu şi a Na+ . De exemplu. glicogenolizei. creşte permeabilitatea pentru Cl. Chiar cel mai mic influx de Ca2+ care trece prin canalele sale membranare produce perturbări în concentraţia sa intracelulară.01-1µ M). Aşa. inhiba mişcarea Na+ prin membrana.. după care reacţionează cu o apoenzima sau cu o proteina receptoare.5. Cuplajul celular metabolic şi electric Cuplajul celular se realizează structural prin joncţiuni strânse (. Astfel.cooperează” la realizarea exocitozei. de 2nm diametru şi 20nm lungime.

radiaţiile solare ( energia luminoasă ) sunt transformate în energie chimică. Schimburile energetice în celula vie Descoperirile ştiinţifice au permis omului să utilizeze cantităţi considerabile de energie. el va fi exotermic. dacă sistemul consumă căldură (energie calorică ). un schimb de entalpie ∆H: ∆E = ∆H . Putem măsura schimburile de entalpie cu ajutorul unui calorimetru. calorică. Înainte de a studia sistemele biologice care asigură transferul sau conversia energiei. 2. prin definiţie. cu un volum constant. dacă nu chiar imposibil. produc energie mecanică. dacă sistemul emite căldură. sisteme capabile de a converti energie dintr-o formă în alta. ci suferă transformări. schimbul caloric care afectează sistemul ( căldura de reacţie ). Noţiunile generale de termodinamică sunt aplicabile şi la sistemele vii. schimburile de energie internă ∆E . Această energie se prezintă sub mai multe forme: mecanică. electrică.2. Astfel. Astfel. energia totală a Universului rămâne constantă. Noţiuni generale de termodinamică Studiul energiei şi transformările sale reprezintă o ramură a fizicii denumită termodinamică. Un receptor radio utilizează energia radiaţiilor electromagnetice şi transformă energia electrică în energie acustică. mai puţin lucrul mecanic ( travaliul ) pe care îl realizează. el este endotermic. Energia este utilizată în maniere foarte variate. este egal cu cantitatea de căldură Q pe care o primeşte din mediul exterior. în continuare. Astfel.1. este util să ne amintim câteva noţiuni fundamentale de termodinamică. Astfel. ca acela al unui fenomen fizic sau reacţie chimică. de a evalua energia care există într-un sistem izolat. să servească la biosinteze sau activităţi fizice sau mecanice. Trecând de la stadiu iniţial la stadiul final. Energia nu se pierde.000 cal/mol 51 . presiunea atmosferică ). motoarele. În celulele vii există. NOTIUNEA DE ENTALPIE. Conform primului principiu al termodinamicii.5. care funcţionează cu benzină sau electricitate. la 20 0 C. hidraulică. considerat la un stadiu dat. preluată din mediul ambiant. Să considerăm un sistem. Pare dificil. nucleară etc.673.5. putem măsura destul de uşor schimburile energetice care afectează sistemul când acesta trece de la un stadiu la altul. Din contra. la presiune atmosferică: ∆H = . sistemul poate elibera energie în mediul său înconjurător. Sistemul se caracterizează prin stadiul său iniţial şi stadiul său final.000 cal/mol. Invers. căldura de combustie a glucozei se ridică la 673. transformarea are loc în cloroplaste. constituie. atunci relaţia este: ∆E = ∆H Această relaţie permite evaluarea schimburilor energetice interne ale unei reacţii care se derulează sub presiune constantă. graţie unor dispozitive care asigură conversia necesară. Energia astfel recuperată poate. pe care le suferă sistemul. Astfel.W Dacă sistemul nu produce nici un lucru mecanic. de asemenea. suferind numeroase transformări în instrumente sau maşini pe care le utilizăm zilnic. Aceste transformări au loc în sisteme constituite din ansambluri de molecule specifice. W: ∆E = Q – W Această relaţie demonstrează capacitatea de conservare a energiei. Într-o reacţie chimică ce se derulează sub presiune constantă ( de exemplu.

într-un solid. Ea atinge nivelul său de echilibru când survin modificările reacţiei. care . Energia cheltuită pentru acest efort reprezintă un potenţial chimic. VARIAŢIA ENTALPIEI LIBERE ŞI VARIAŢIA ENTROPIEI. entropia totală a unui sistem trebuie să crească. ∆S. nu depinde de variaţia entalpiei libere. în mod obligatoriu. În egalitatea : Keq = B [ ] /A [ ] 52 . numită şi energie liberă. În cazul unei variaţii de entalpie liberă pozitivă (∆F> 0 ). Această energie ( potenţialul chimic ). În toate sistemele se pot distinge două forme de energie. de-o manieră reversibilă faţă de poziţia sa de echilibru. relativ scăzută. Variaţiei entalpiei libere este semnificativă prin posibilitatea de a şti dacă o reacţie are sau nu loc spontan. Se spune că este o reacţie endergonică (endoergonică). Această reacţie tinde să dobândească un statut de echilibru. una numită energie internă. Totuşi. prima va realiza un efort (lucru mecanic. Entropia este nulă într-un cristal perfect la 0 absolut şi. entropia poate să scadă într-un sistem unde au loc reacţii de sinteză şi. reprezintă temperatura absolută a reacţiei. la o valoare pozitivă se exprimă în calorii/grad/mol. Entropia reprezintă energia cinetică a atomilor şi moleculelor. rotaţii sau translaţii. Entropia creşte odată cu temperatura. la o temperatură şi presiune constantă. Ea va avea loc foarte rapid în prezenţa unor enzime specifice.. Dacă. Diminuarea entalpiei libere a sistemului reprezintă cantitatea maximă de energie disponibilă care ar putea fi transformată în energie chimică. pe de altă parte. pentru a-şi obţine statutul de echilibru. Să considerăm următoarea reacţie chimică reversibilă: A ↔ B. fizică. VARIAŢIA ENTALPIEI LIBERE.Valoarea sa este negativă deoarece energia calorică produsă de sistem este cedată mediului înconjurător. După al doilea principiu al termodinamicii. energie care se exprimă sub formă de vibraţii. este necesar ca diminuarea entalpiei libere a sistemului exergonic să fie mai ridicată decât consumul sistemului endergonic. Pentru a se putea realiza cuplarea cu o altă reacţie. chimică. este desemnată astăzi prin expresia entalpie liberă. alta numită entropie. variaţia entalpiei ∆H şi variaţia entropiei ∆S : ∆G = ∆H – T ∆S T. reacţia nu se mai poate realiza spontan. O scădere a schimbului de energie liberă este totdeauna asociată cu o creştere de entropie. reacţia se poate realiza spontan. variaţia entalpiei libere între stadiul iniţial şi stadiul final al reacţiei este negativă (∆F< 0). unde dezordinea moleculară este foarte accentuată. travaliu ). Să considerăm o reacţie reversibilă în condiţii izoterme. energia internă corespunde celei are este reprezentată de diferite legături chimice şi care poate fi convertită într-o altă formă de energie: mecanică. Dacă o altă reacţie se va opune. în mod particular. RAPORTUL ÎNTRE VARIAŢIA ENTALPIEI LIBERE ŞI CONSTANŢA DE ECHILIBRU. în măsura în care se accentuează (creşte) caracterul dezordonat al moleculelor. Acest aport exterior de energie poate proveni din energia radiaţiilor luminoase sau din cuplajul cu o altă reacţie. Stadiul dezordonat al energiei componenţilor săi are totdeauna tendinţa de acreşte. în fotosinteză. Ea este foarte ridicată într-un gaz. În sistemul reprezentat de o reacţie chimică. pentru că ea are loc cu un aport exterior de energie care îi este necesară. Fie o reacţie chimică care evoluează spontan. variaţia entalpiei libere ( ∆G ) este negativă şi reacţia este exergonică. Schimbul de entropie al sistemului. Enzima diminuează energia de activare. Reacţia următoare leagă variaţia entalpiei libere ∆G. Când reacţia realizează un lucru mecanic. exergonică.

001 M de glucoză – 1 – fosfat şi 0. concentrează soluţii. la pH = 7. Keq este logaritmul cu semn schimbat al constantei de echilibru iar ∆G0 schimbul standard al entropiei libere. Ori. catalizat de enzima fosfoglucomutază. Dacă ∆G este pozitiv. T este temperatura absolută. de asemenea. De exemplu. transportă molecule. unde variaţia entalpiei libere este negativă. deci.Keq. analiza chimică indică un echilibru între 0. de o mare cantitate de energie. putem. Constanta de echilibru este legată de schimburile entalpiei libere prin reacţia: ∆G0 = . pentru a forma o singură legătură peptidică. Aceşti intermediari sunt derivaţi fosforilaţi ai nucleotidelor.001 = 19 ∆G = . Ea efectuează. cum sunt mişcările intracitoplasmatice. Principalul izvor al energiei celulelor aerobe este procentul de respiraţie celulară: AH2+ 1/2O2→H 2 O + energie 53 . 2. Un asemenea echilibru. de la stânga la dreapta. să calculăm variaţia entropiei libere a sistemului ∆G0. protide. activităţi fizice: absoarbe activ substanţe. lipide.5. doar un număr foarte redus din ele au o importanţă în stocarea şi vehicularea energiei chimice celulare. plecând de la numeroase molecule mici. plecând de la analiza chimică.019 / 0. sunt necesare 4000 calorii/mol. deformările. reacţia este exergonică.001 M de glucoză – 1 – fosfat la stadiul iniţial. La stadiul final. Transformări de energie în celula vie (energetica celulară) Celula este sediul activităţilor mecanice. acizi nucleici ). Celula realizează şi activităţi chimice : sinteze de macromolecule ( glucide. menţine un anumit echilibru osmotic etc. Keq = 0. În cazuri diferite se determină ∆G.019 M de glucoză – 6 – fosfat. soluţia are 0. determinând constanta de echilibru Keq. în continuare.987 x 298 x In 19 = . de la dreapta la stânga. reprezintă constanta de echilibru pentru o temperatură şi o presiune determinată. Intre nevoia şi aportul de energie există intermediari capabili să efectueze multiple transformări. creşterea etc.987 cal/mol/grad ). reacţia va avea loc spontan. deplasările.2. reacţia efectuându-se la un pH = 7. un rol aparte dintre aceşti compuşi îl are molecula de ATP ( adenozin trifosfatul sau acidul adenozin trifosforic).1745 cal / mol. Această valoare reprezintă schimbul de entalpie liberă (∆G) care aici este pozitiv.RT In Keq Unde R este constanta gazelor perfecte ( 1.1. se efectuează spontan. Pentru a face faţă acestui necesar imens de energie celula dispune de mecanisme complexe proprii. Deşi orice molecula care participa la metabolismul celular conţine o anumită cantitate de energie. La 250 C. Aceşti compuşi trebuie să poată îngloba o cantitate apreciabilă de energie şi să poată ceda acolo unde şi când este necesar. Compuşii care fac parte din această categorie îşi datorează numele de macroergici (bogaţi în energie) faptului că hidroliza lor se soldează totdeauna cu eliberarea unei importante cantităţi de energie. Să considerăm echilibrul: Glucoză – 1 – fosfat ↔ glucoză – 6 – fosfat. pentru a construi o singură macromoleculă de proteină este necesar să se stabilească sute sau chiar mii de legături peptidice şi.

25. polizaharide) cât şi pentru susţinerea unor procese cum sunt: contracţia musculară. iar AH2-substrat redus. Cuplarea celor două reacţii e redată în figura 25. animale şi bacteriene depind de ATP. Întrucât această fosforilare este cuplată cu oxidările din cadrul respiraţiei procesul de recuperare a energiei respiratorii se numeşte fosforilare oxidativă: nADP + nPa+ energie→ n ATP Astfel. compus izolat în anul 1930. Poate fi obţinut în stare pură prin cromatografie pe schimbători de ioni. 26). din molecula ATP care scindează hidrolitic e reprezentat de energia G. Molecula de ATP este alcătuită dintr-o bază azotată purinică – adenina.1. 54 . reprezentarea simbolică a proceselor cuplate generatoare şi recuperatoare de energie poate fi următoarea: AH2 + nADP + nPa + ½ O2 → A+ n ATP + H 2O Organismul utilizează în permanenţă mari cantităţi de energie atât pentru sinteza compuşilor cu structuri complexe (proteine. Fig. trebuie să se realizeze eficient. vegetale. Caracterul macroenergetic al legăturilor P≈O. De aceea. Constanţa temperaturii face ca transferul energiei în sistemele biologice să fie posibil numai prin reacţii cuplate: două reacţii sunt cuplate dacă energia liberă a uneia care este exergonică.5. Fig. Molecula ATP şi proprietăţile sale Toate celulele.2. din extracte acide de muşchi. cedează energiei determină desfăşurarea celeilalte care este endergonică (consumă energie). 26. un zahăr – pentoză – şi trei radicali fosfat (Fig. În organism există numeroase reacţii cuplate prin intermediul acidului acetic a cărei formare întro reacţie puternic exergonică asigură desfăşurarea celei de-a doua. lipidelor şi protidelor către cale mai diverse reacţii consumatoare de energie. Materia vie conţine 0. care se formează prin fosforilarea moleculelor de ADP (adenozin difosfat sau acidul adenozindifosforic).În care A simbolizează un substrat oarecare. Schema unei reacţii cuplate Mecanismul acestui sistem de cuplaj asigură transferul energiei libere de la reacţiile degradative ale glucidelor. Sistemul ATP↔ADP constituie intermediarul energetic comun în majoritatea reacţiilor cuplate. endergonică. lipide. 2. complexul ATP cu ionul de Mg 2+ (b). Recuperarea se face prin stocarea energiei în molecule de ATP (adenozin trifosfatul sau acidul adenozintrifosforic).5 mg ATP/mol. transferul energiei libere rezultată din reacţiile exergonice ale căilor degradative către aceste procese. Energia degajată în cursul respiraţiei celulare este un mod normal parţial recuperată în cadrul unui proces biologic cuplat. transportul activ şi altele. excitaţia nervoasă. Structura moleculei de ATP (a).5 – 2.

ATP şi ADP.În celulă. Aceşti doi copuşi. Deci. dar şi în procesele de glicoliză sau de oxidare aerobă a glucidelor. (fig. Acest sistem face legătura dintre compuşi macroergici (Penolpiruvat. b). compuşii cu fosfor pot fi donatori sau acceptori de fosfat după cum potenţialul lor de transfer e mai ridicat sau mai scăzut. Fosfaţii poartă patru sarcini negative. 3-diP-glicerat şi P-creatina) spre compuşi microergici (glucoza. 30. În moleculă. dar hidroliza legăturii ester care reţine fosfatul generează mult mai puţină energie. Ea provine din hidroliza legăturii anhidrid fosforică. 28). Hidroloza produce o importantă scădere a energiei libere a sistemului: ∆G = . de fapt. de asemenea. o neconcordanţă. Ambii poartă încărcătură negativă. ADP devine acceptor de Pa transformându-se în ATP. la rândul său să fie descompus.modificat de Lippman) Sistemul ATP↔ADP ca donator de energie este implicat într-o serie de procese biochimice importante cum ar fi: contracţia musculară (sistemul creatinkinazic) al celui de-al doilea mesager implicat în pătrunderea unor hormoni prin membrana celulară (sistemul adenilatkinazic). Reacţiile de transfer de fosfat (fosforilare →defosforilare) se fac totdeauna de la un compus cu potenţial de transfer ridicat către unul cu potenţial de transfer scăzut. Sistemul ATP↔ ADP funcţionează astfel ca o baterie de energie (dinam celular). Magneziul stabileşte legătura cu adenina şi cu cei doi fosfaţi terminali. 25oC) Putem spune că legătura fosfat este bogată în energie. Grupările fosfat cedate de compuşii macroergici ajung la acceptori nu direct. ci prin intermediul sistemului ATP↔ADP. ATP este un polifosfat puternic încărcat electric.27). apropiate unele de altele şi care se resping.ului formează un complex cu ionul de Mg 2+. 55 . Fig. Prin hidroliză el se descompune în ADP şi acid fosforic. glicerol). Schema „dinamului celular” (Florkin. să se disocieze eliberând o cantitate de energie egală cu precedenta. Compuşii formaţi prin hidroliză sunt AMP (adenozin monofosfatul sau acidul adenozinmonofosforic) şi acidul fosforic. care se realizează în maniera în care nivelul de energie al moleculelor este cel mai scăzut posibil.(fig. cea mai mare parte a ATP.7000 cal/mol (pH 7. AMP poate. ADP poate. sunt sediul unor reanjamente ale atomilor. dacă ea se desfăşoară spre stânga ATP e donator de Pa în sens opus. ceea ce este. 27. fosfatul terminal este stereochimic vecin cu un grup aminat al adeninei (fig. Dacă luăm ecuaţia ATP ↔ADP +Pa. Energia considerabilă de aici nu corespunde celei de la legătura covalentă dintre P şi O.

Aceşti compuşi au tendinţa de a se descompune cedând o moleculă de acid fosforic şi energie.6. reglează transferul între cele două tipuri de compuşi. Sistemul ADP – ATP. există numeroşi compuşi intermediari . . PEP (fosfoenolpiruvatul) conţine o energie liberă de hidroliză considerabilă (∆G = . Aceşti compuşi se formează în prezenţa ATP-ului care se descompune cedând energie şi o moleculă de acid fosforic.ului. de asemenea. 2. Printre aceştia. pe Pământ. lumina solară este captată de numeroasele frunze sau organe verzi ale plantelor. Grupul fosfat tinde să treacă de la compusul cu potenţial de transfer ridicat.7000 cal/mol). analogi ATP ului.2. Cloroplastele Viaţa pe Pământ depinde de energia produsă de steaua noastră apropiată. Aceste substanţe posedă. favorizând sinteza de ATP din ADP şi fosfaţi liberi. soarele. Există şi compuşi fosfaraţi.6. derivaţi de nucleotide. prezenţi în mediu.Implicarea sistemului ATP↔ADP în unele procese biochimice celulare Aceste diverse reacţii sunt reversibile. Aici. 56 . guanozintrifosfatul (GTP) etc. Membrane care cuplează energie Membranele capabile de captarea şi conversia energiei aparţin cloroplastelor şi mitocondriilor. Este permanent necesar să se furnizeze energie pentru refacerea AMP.2. Energia solară traversează spaţiul sub formă de lumină. 28. 2. Acestea sunt capabile nu numai să capteze lumina solară ci să o şi prelucreze în „hrană”. spre cel cu potenţial mai scăzut. citidintrifosfatul (CTP). 2.1. mult mai ridicată decât cea a ATP –ului (∆G = . ∆G = 5000 cal/mol. după potenţialul lor de transfer al grupului fosfat.5. dar în cantităţi mult mai scăzute. PEP şi glucozo -1.Fig. Un exemplu este glucozo -1-fosfat.12 800 cal/mol). ADP şi ATP. Alţi compuşi au o energie liberă de hidroliză mult mai mică decât ATP-ul. Între aceste două exemple extreme de potenţial energetic. Alţi compuşi fosforilaţi Celula conţine o multitudine de compuşi fosforilaţi. care are un potenţial de transfer de valoare medie. Diferiţii compuşi fasfaraţi pot fi repartizaţi pe o scară. legături macroergice fosfat cu un înalt potenţial de energie.fosfat. Astfel sunt: uridintrifosfatul (UTP). Disocierea sau recombinarea unui compus fosforilat ca ATP se realizează în prezenţa enzimei adenozin trifosfataza (ATP-aza).

precum şi doi atomi de mangan. 2. faza lui Hill) si faza de întuneric (faza obscura sau faza lui Blackman sau ciclul Calvin) (fig. Studiile de microscopie electronică au evidenţiat pe suprafaţa lamelor stromatice şi granare. sunt responsabile de conversia energiei luminoase în energie chimică. 57 . se pare. dintr-un strat de substanţe proteice îmbibate cu apă şi o componentă lipidică Molecula bipolară a clorofilei se orientează cu polul hidrofil (inelul porfirinic) spre stratul proteic. una dintre multiplele etape de sinteză necesită lumină şi fier. este mai frecventă decât clorofila b. placă sau coloană fiecare pigment din amestec. Aceasta transformare de substanţă realizată în celula vegetală este dublată de conversia. xantofilele. Membranele tilacoidelor. 70 molecule de clorofila-b. Sineza clorofilelor se face în interiorul cloroplastelor. clorofila a. sute de molecule de lipide. Procesul general al fotosintezei Cloroplastele reprezintă suportul material. prezente în toate organele verzi ale plantelor. b. de unde sindromul de „cloroză”(îngălbenire) în cazul carenţei de fier sau lumină (etiolarea). conţin 12% pigmenţi de două categorii: clorofile 10% şi carotenoizi 2%. Un cuantosom este format. adică sediul la nivelul căruia se desfăşoară grandiosul proces al fotosintezei. datorită clorofilei pe care o conţin. Majoritatea moleculelor de clorofilă sunt asociate proteinelor membranare (cromoproteine).6. în timpul căruia se sintetizează. la fel de intensă de energie. de culoare verde albastră. exista doua tipuri de reacţii: reacţii de lumina (faza de lumina. Pigmenţii clorofilieni Există două tipuri de clorofile a şi b. Aceştia sunt: licopenul de culoare roşie şi carotenul de culoare portocalie.1. în timp ce polul hidrofob (reprezentat de fitol) se îndreaptă spre lipoizii de structură ai lamelei granare. particule globulare cu dimensiuni de 100-200A0. la plantele superioare. Culorea verde a frunzelor este dată de prezenţa clorofilelor care maschează culoarea galben portocalie a carotenoizilor.Cloroplastele sau plastidele verzi. pentru ca sinteza moleculelor organice înseamnă înmagazinarea de energie chimică provenită din conversia energiei solare. S-a stabilit că un cuantosom conţine: circa 160molecule de clorofila-a. Dintr-un extract brut de pigmenţi (extract in acetonă sau în alcool) poate fi separat prin cromatografie pe hârtie.1963) . circa 9500 atomi de azot proteic.1. derivaţi hidroxilaţi ai pigmenţilor carotenoidici sau oxicaroteni. La plantele superioare. 48 molecule de carotenoizi. considerate unităţile funcţionale ale fotosintezei şi care au fost numite cuantosomi (Park şi Pon. doisprezece atomi de fier şi sase atomi de cupru. a. substanţe organice din CO2 şi apă. în prezenţa luminii. S-a stabilit ca în procesul de fotosinteza. Pigmenţii carotenoidici Sunt pigmenţi lipofili derivaţi de la izopren. de culoare verde gălbui. Se disting două regiuni: o regiune porfirinică (inel porfirinic) cu un atom de magneziu în centru şi cu o coadă „fitol”alcool cu C20. 29). Structura chimică a celor două clorofile este apropiată.

Reacţiile de întuneric pot fi sintetizate astfel: CO2 + 2NADPH2 → (CH2O) + H2O + 2NADP 3ATP → 3ADP + 3Pi Astfel.reacţiile de lumină.Fig. cu sinteza moleculei macroergice de ATP . are loc convertirea energiei luminoase în energie chimică. 29 . prin reacţia de fotofosforilare. care se petrec în stroma cloroplastului. Aceste reacţii sunt asociate cu o creştere în energia libera a sistemului celular. 1965) În reacţiile de lumina. Acest transfer este posibil graţie aportului de energie libera-energie luminoasa-. B . Sitte. provenită din descompunerea ATP rezultat în fotofaza.reacţiile de întuneric (după P. care au loc în tilacoidele cloroplastului. Concomitent cu acest transport de H2 (sau de electroni). 2ADP + Pi → 2 ATP În reacţiile de întuneric. NADPH2 produc în reacţiile de lumina este folosit pentru reducerea CO2. hidrogenul este smuls de la moleculele de apă şi dus de o serie de transformări la NADP. cu degajare de O2 în afara celulei. Reacţiile de lumina pot fi sintetizate astfel: H2O + NADP → ½ O2 + NADPH2. care provoacă starea de excitaţie electronica a moleculei de clorofila. procesele generale ale fotosintezei pot fi reprezentate prin reacţia: lumină CO2 + H2O → (CH2O) + O Hv 58 . Se pare ca pentru fiecare doi electroni transportaţi revin două (sau fracţiuni între 1 şi 2) molecule de ATP.Schema fotosintezei: A .

numită stare tripletica (sau metastabila). transportă o energie W(un quantum) care are o valoare dată de lungimea de undă asociată relaţiei W=hν. ca urmare a duratei foarte scurte de viaţa (10-12 – 10-11s) este incapabilă să inducă reacţie fotochimică. ea atinge acelaşi nivel energetic (41Kcal/mol/gram) .2. h este o constantă. Energia înmagazinata în acest caz este egala cu 65Kcal/mol/gram. Dezactivarea. -4 -2 3. datorită ei. menţinându-şi sensul spinului.care se caracterizează fata de starea fundamentală printr-un exces de energie. c-viteza luminii în vid.2. cu 41Kcal/mol/gram. transportă mai multă energie decât un foton de lumină roşie cu lungime de undă înaltă. (constanta lui Planck) iar ν este frecvenţa undei(numărul de vibraţii /secundă). molecula de clorofila intra în starea de . Durata de viaţa a acestei stări de excitaţie electronica este puţin mai mare (10-9s). sau prin pierdere de căldură. 2. care consta în emisiunea de electroni din atomul unei molecule. ν=c/χ. Fiecare corpuscul sau foton. 1974) 59 .30). Procesul de absorbţie a energiei luminoase Posibilitatea de a utiliza radiaţiile luminoase de către celulele plantelor verzi se datorează faptului că ele conţin în cloroplaste molecule de clorofila capabile de aşa numitul efect fotoelectric. un foton de lumină albastră cu o lungime mică a undei. Aceasta reprezintă o stare de excitaţie singletică a moleculei de clorofila. un electron al moleculei este dizolvat şi trece pe orbita liberă. sub acţiunea radiaţiilor luminoase cu lungimea de unda între 380770nm. Starea de excitaţie tripletica are o durata de viaţa mai lungă (10 -10 s) şi. Reacţiile de lumină a. 30.excitaţie electronica” (stare activa).. Fig. Fotonul Lumina este un fenomen de natură ondulatorie şi corpusculară.1. Cu aceasta ocazie se poate întâmpla să aibă loc şi răsturnarea spinului (care se face cu cheltuiala de energie de excitaţie) molecula cazând la un al treilea nivel energetic de excitaţie electronică. Când molecula de clorofila este bombardată cu fotoni de lumina roşie (cu lungimea undei 670nm). deşi are cel mai scăzut nivel energetic (31Kcal/mol/gram).6. Astfel. Astfel. Stările de excitaţie electronică a unei molecule de clorofilă (după Libbert. Molecula ajunsă la acest nivel se dezactivează prin emisie de fluorescenta. se poate dezactiva prin inducerea unei reacţii fotochimice (fig. în valoare de 10Kcal/mol/gram. Molecula de clorofila poate atinge trei niveluri de excitaţie electronica: 1. sub acţiunea luminii. ce aduce revenirea la starea fundamentală a moleculei se face prin pierdere de căldura (24Kcal/ mol/gram) şi molecula cade la un alt nivel energetic de excitaţie singlatica. având cel mai înalt nivel energetic faţa de starea fundamentala. totuşi încă insuficientă pentru inducerea reacţiei fotochimice. b. Adsorbind radiaţii cu lungimea de unda de 430nm (radiaţii albastre).

fiecărui sistem îi corespund reacţii fotochimice diferite. Rabinowith si colab. (1967) o altă formă activă a clorofilei-a. De asemenea. Alături de P680 sistemul mai conţine clorofila-b si pigmenţi accesorii (clorofila-c şi fucoxantina la algele brune. socotite ca sensibilizatori optici. PS I fiind raspunzător de formarea NADPH2.centrul fotochimic” al fotosistemului I.centru fotochimic” molecule de P700 (clorofila-a cu maxim de absorbţie la 700nm) sau clorofila-a I. echivalent cu PS I. Atât clorofila-a I cât si clorofila-a II. Cele doua sisteme sunt individualizata funcţional si structural. Energia luminoasa pe care o absorb aceşti pigmenţi este mai mica sau egala 680nm si apoi transferata centrului fotochimic al sistemului I.. c. Studii ulterioare au confirmat existenţa celor doua reacţii fotochimice. Acest fenomen a fost denumit . procesul fotosintetic arata un efect global superior sumei celor doua efecte parţiale produse de cele doua lungimi de unda aplicate independent. De asemenea. Fotosistemul I si II Bazându-se pe observaţii începute din 1941 Emerson a arătat (în 1957) ca daca alga Chlorella este expusa la radiaţii roşii cu λ =680nm. cu maximum de absorbţie la 682nm. care reprezintă .. Doring şi colab.efectul Emerson” si a dus la ideea ca fotosinteza implica doua reacţii fotochimice în care lumina este absorbita de pigmenţi diferiţi. La bacteriile fotosintetizatoare nu exista decât un singur sistem pigmentar. Hoch (1961) au descoperit o clorofila-a. fiecare fiind responsabil pentru anumite reacţii fotochimice având fiecare câte un centru fotochimic. Se pare ca PS I nu conţine sau conţine o cantitate foarte mica de clorofila-b.. reprezintă deci pigmentul fotochimic activ al acestui sistem. dar contrar supoziţii originale a lui Emerson s-a stabilit de către E. ficoeritrina şi ficocianina (de la alge)transfera energia luminoasă pe care o absoarbe pigmentul P700.P680” pentru fotosistemul II şi numai electronul dizlocat de pe aceste molecule este atât de bogat în energie. Fotosistemul II este reprezentat de particule mai mari.Există mai multe forme ale clorofilei-a. 60 . după unii .înseriate”. Alături de P700 mai exista si clorofila cu maxim de absorbţie la 680nm si o molecula de citocrom f . dar sunt legate între ele prin intermediul lanţului transportorilor de electroni.. Cercetări mai recente au stabilit ca unitatea procesului fotosintetic este compusa din doua fotosisteme (fotosistemul I şi fotosistemul II). în funcţie de molecula proteică cu care este complexată şi care nu sunt echivalente funcţional. Kok si G. iar PS II de degajarea O2. care absoarbe radiaţii cu lungime de unda de 700nm. carotenoizii. Pigmenţii care absorb lumina sunt distribuiţi între cele doua sisteme.. Celelalte forme de clorofila-a şi clorofila-b. sunt singurii pigmenţi specializaţi în transformarea energiei luminoase în energie chimica. cunoscuta sub denumirea de P680 sau clorofila-a II si care reprezintă pigmentul activ al acestui sistem. iar G. acest cercetător a mai stabilit ca daca radiaţiile de lungime de unda (λ) de 680nm sunt asociate cu radiaţiile de mai mica. proteinele ficobilinice la algele roşii si albastre). Aceste forme au fost notate convenţional . energia având tendinţa să migreze spre molecule care absorb radiaţii cu lungime de unda mai mare. El conţine clorofila-a cu maxim de absorbţie la 680nm (sau după alţii la 672). (1969) că clorofila-a participa la ambele reacţii. se constata ca procesul fotosintetic decurge mult mai slab decât atunci când este expusa acţiunii întregului spectru luminos.P700” pentru fotosistemul I şi . Se pare ca pigmenţii β-carotenoizi sunt prezenţi în ambele fotosisteme . încât provoacă reacţia fotochimica. Fotosistemul I este reprezentat de particule mai mici si conţine ca . B..

Ea accepta fotoni incidenţi. apoi a unui acceptor de H+ şi un radical (OH-) care va fi oxidat în prezenta unei enzime cu eliberare de O2. catalaza 4OH → 2H2O2 → 2H2O + O2 Rolul de acceptor pare să fie jucat de carotenoizi şi de acidul tioctic. f. Se presupune că radicalul OH.) la NADP (acceptor final) implica o serie de transportori de e. Prin intermediul unei plastocianine. care se reduce . care evoluează între un oxidant (CO2) cu potenţial redox –0. 61 . care este adusă de molecula clorofilei. cu potenţial redox ridicat. cu potenţial redox scăzut şi un sistem mai puţin reducător. e.+ OH 2OH → H2O ½ O2 Deci din fotoliza apei rezulta H+ legat (sau agentul reducător) pentru ca ea se efectuează cu intervenţia unui transportor.8 volţi la pH=7) iar cel al sistemului CO2/CH2O este foarte scăzut (-0. la rândul sau. La rândul său. din care O2 va fi eliberat de o peroxidoza (catalaza). induce oxidarea apei şi transporta H+ (respectiv electroni) între cele două sisteme redox .se poate face spontan dacă are loc între un sistem foarte reducător.la citocromul b6 care.d. Migrarea protonilor de la H2O la CO2 nu se realizează spontan.42 volţi la un pH=7).se fixează pe un acceptor organic care se izomerizează într-un peroxid. Hill şi ea se desfăşoară probabil în doua etapa: hv H2O → H+ + e. Transferul de e. în care funcţionează ca un centru de reacţii P680. Fotoliza apei (oxidarea H2O) Provocată de molecula de clorofila excitată. Lanţul transferului de electroni Reacţia de oxidare a apei este legată direct de FS II. deci în sens invers gradientului de potenţial redox. denumit Q.. îl cedează citocromului f. În procesul de fotosinteza potenţialul redox al sistemului O2/H2o este foarte ridicat (+0. pentru a reveni la starea fundamentală. molecula de plastochinona transfera e. Ca donator de e. Q pierde electronul în favoarea unei molecule de plastochinona. care absorb radiaţiile luminii mai mici sau egale cu 680nm .pentru P680 functioneaza molecule de apa. Secvenţa transferului de electroni Transferul de electroni de la moleculele de apă (donor de e. Deci fotosinteza este un proces constituit dintr-o serie de reacţii de oxido-reducere. Electronul de la molecula de P680 este transferat unui acceptor cu natura chimica încă necunoscută. Reacţia a fost descoperită în anul 1973 de câtre R.4 V şi un reductant (H2O).cu o secvenţa specifică. Mecanismul eliberării O2 este incomplet cunoscut . Aceste radiaţii produc excitarea moleculelor de clorofila-a care cedează energie sub forma de e-. este etapa esenţiala a fazei de lumina. ci cu aport de energie liberă. cu potenţial redox +0.8 V.

care apoi este redusă la NADPH2. Transportul de e-. la fiecare treapta a transportului se pierde energie. reacţia fiind catalizată de o ferredoxin – NADP – reductoza. către spaţiul intratilacoidal. adică există o cădere a nivelului energetic al electronului cu fiecare nou acceptor al său. Ferredoxina redusă transferă e. electronul pe care acesta l-a pierdut sub acţiunea radiaţiilor luminoase cu λ = 680nm. Pe parcursul transferului de e . pe care o reduce şi căreia îi transfera energie. Arnon şi colab.primit moleculei de NADP. Fotofosforilarea Capacitatea de fosforilare a cloroplastelor a fost descoperită de D. Schema transferului de electroni în fotosinteză g. 32. (1954).. 62 Fig. 31. de la apă la NDAP este însoţit de expulsia a doi protoni H+(la nivelul plastochinonei) din stroma cloroplastului. Schema fosforilării lineare (I) şi ciclice (II) . necunoscut denumit X. Membrana tilacoidală fiind impermeabilă pentru protoni. este posibilă sinteza de ATP (rezervorul energetic celular). care se adaugă protonilor rezultaţi din fotoliza apei. printr-o reacţie de fotofosforilare (fig.Electronul eliberat de citocromul f furnizează clorofilei P700 (centrul de reacţie al PS I). Fig. Încărcătura pozitivă se acumulează deci în spaţiul tilacoidal. Electronul pierdut de P700 este imediat preluat de un acceptor de e-. de la care apoi este cedat ferredoxinei. astfel încât electronul ajunge .31). se crează un gradient electrochimic de protoni care va permite funcţionarea ATP-azei membranare. Datorita cedării de energie pe parcursul transportului de e-.descărcat de energie” la molecula de clorofila P700 şi aceasta se dezactivează trecând în starea ei fundamentala.

marcate la funcţia aldehidica. Fosforilarea ciclica.agentul reducator” (NADPH2) şi . 63 . În aceasta reacţie formarea ATP este asociată cu reducerea NADP şi este implicat şi fotosistemul II.. NADP. care se reduce formând aldehida fosfoglicerică. Calvin şi Benson (1949-1950) au reuşit să elucideze calea urmată de CO2 în cloroplaste. reducerea CO2 nu se face în mod direct. furnizat Ca14CO2 unei culturi de Chlorella. cu 6 atomi de C. Are loc în prezenţa unor sisteme redox şi a luminii . în loc sa fie cedat în final. După numai 5 sec. Încorporarea moleculei de CO2 se face prin carboxilarea unui acceptor al său. Imediat după formarea acidului fosfogliceric apar trioze fosforilate. poate fi transportat enzimatic pe citocromi. 2. de unde este dus înapoi la molecula de clorofila-a din fotosistemul I.3. energia de asimilaţie” (ATP) leagă cele două faze ale procesului de fotosinteză. Reacţiile de întuneric a..5 – difosfatul (RIDP). izotopul radioactiv a fost găsit în proporţie de 87% în acid fosfogliceric.1. În transferul electronilor proveniţi de la apă. care se descompune hidrolitic. Cu ajutorul izotopului marcat 14C. implică în fosforilarea lineară citocromul b559 asociat cu plastochinona. Deci primul produs după absorbţia CO2 este acidul fosfogliceric (APG). marcat în funcţia sa carboxilică. Deci. rezultând două molecule de acid fosfogliceric. Astfel . 10% în acid fosfopiruvic şi 3% în acid malic. Fosforilarea aciclica. energia pentru sinteza ATP fiind eliberată între citocromul-b6 şi citocromul (fig. bazate pe studiul spectrelor de absorbţie a luminii. Cercetări recente. deci şi fotoliza apei. la încorporarea CO2 în compuşi organici (fig. ci el este încorporat mai întâi în ribulozo. apoi în acid fosfogliceric.S-a precizat ca fosforilarea se poate realiza pe două căi: fotofosforilarea ciclica şi aciclica (lineară). 32). Electronul trasferat de P700 ferredoxinei. sub acţiunea NADPH2 şi a energiei sincronizate în molecula de ATP. Pentru ambele căi există locuri de fosforilare situate pe lanţurile transportoare între citocromi . 33).difosfat.6. energia necesară sintezei moleculelor de ATP se eliberează între citocromul-b şi citocromul-f. Reacţia de reducere a funcţiei carboxilice din molecula de acid fosfogliceric se petrece în două etape. care s-a găsit că este un ester fosforic al unei pentoze: ribulozo -1. reacţia fiind catalizată de carboxidismutaza. Ciclul Calvin (calea C3 de reducerea CO2) NADPH2 şi ATP produşi în faza de lumina sunt utilizaţi în stroma cloroplastului. locul fosforilarii fiind sistemul între citocromul-b559-plastochinona şi citocromul-f + plastochinona. precum şi pe determinarea potenţialului redox al sistemelor transportoare de e-. Ribuloza – difosfatul adiţionând CO2 formează un compus intermediar instabil.

Localizarea activităţii biochimice în cloroplast (după Binet şi Brunel. 33.Fig. 1968) 64 .

CO2 ajunge pe ribulozo-difosfat intermediat de fosfoenol piruvat. 34 Schema reducerii CO2 Triozele obţinute sunt antrenate într-o serie de transformări. Există însa plante la care celulele mezofilului foliar sunt incapabile să fixeze CO2 în hidraţii de C. se formează hexozele şi în final. numai a VI-a parte parcurge această cale.Fig. prin transcarboxilare. 34). prin faze intermediare la regenerarea moleculelor de ribozo-difosfat. desfăşurate într-o secvenţa ciclica (ciclul Calvin) pe parcursul căruia. 65 . în urma unor serii de condensări.piruvat (PEP) rezultând acizii tetracarbonici : malic şi aspartic. capabile să accepte noi molecule de CO2 (fig. dar el se încorporează activ în fosfoenol. Astfel. Din totalul moleculelor de trioze. iar celelalte cinci molecule ajung. amidonul.

NAD-ME” în care este activată enzima malica dependenţa de NAD (de ex. amidonul. iar acesta este translocat în celulele tecii perifasciculare. formându-se în final. ciclul FRC .de reducere a CO2 În structura frunzei la speciile de plante tropicale şi subtropicale. b. plantele se împart în două grupe mari.plante "NADP . Între aceste două tipuri de celule existând un schimb intens de substanţe . la toate cele trei tipuri există momente comune.. C . 35A). format din malat prin intervenţia enzimei malice dependenţa de NADP . Fig. care sunt singurele capabile sa reducă CO2 pe calea ciclului Calvin. Panicum maximum). Atriplex spongiosa). au cloroplaste mai mărunte cu ultrastructura normală.. Grupa plantelor . în trei grupe. apar unele particularitaţi anatomice şi de ultrastructură. adesea lipsite de grana.PCK”. dependenţa de NADP (de ex.). reacţie catalizată de fosfoenol-piruvat carboxilaza şi care se petrece în citoplasma celulelor mezofilului frunzelor. oxalatul este redus la malat în cloroplastele celulelor mezofilului. Cloroplastele celulelor tecii fasciculare furnizează ATP în ele având loc fosforilarea. în jurul nervurilor se formează o teacă de celule parenchimatice mari. Triticum sp. 35. desfăşurarea ciclului diferă la cele trei tipuri de plante. Mai departe. B . Restul celulelor din mezofil sunt mai mici. În desfăşurarea ciclului Calvin. pentru fiecare moleculă de CO2 fixata de hidraţi de carbon (fig. Este de notat faptul că plantele C4 utilizează o moleculă de ATP în plus. În plantele din grupa NADP-ME.fotosintetizante . Unele genuri. notate prescurtat cu C3fotosintetizante şi respectiv C4. unde este descompus (în cloroplastul acestora). Calea C4 s-a găsit la specii aparţinând mai multor familii de plante. fată de plantele C3. în majoritate tropicale şi subtropicale. conţin atât specii C3 cât şi C4.După acest criteriu. în care activează o fosfoenolpiruvat-carboxikinaza (de ex. Calea C4 . în care intervine enzima malica. Grupa plantelor .plante "NAD-ME".ME". ca de exemplu Atriplex. Grupa .. Agentul reducător îl constituie NADPH2.NADP-ME”.plante "PCK". Astfel este momentul fixării CO2 pe oxalocetat. în ele desfasurându-se ciclul Hatch – Stac (Calvin). Astfel. A.ciclul fotosintetic de reducere a CO2 66 . Speciile de plante C4 fotosintetizante au fost împărţite la rândul lor. Fixarea CO2 pe calea C4: A . după reacţiile particulare care duc la eliberarea CO2. eliberându-se CO2 care parcurge ciclul Calvin.

în primul moment al fixării CO2. este convertit prin transaminare înapoi la oxalacetat. care ia sfârşit cu formarea a două molecule de acid piruvic dintr-o molecula de glucoza şi alta intramitocondrială în care are loc oxidarea totală a acidului piruvic în CO2 si H2O.NAD-ME” în mitocondriile lor. că degradarea glucozei are loc în două etape: una extramitocondriala. intercelular are loc.2.PCK” în citoplasma celulelor perifasciculare. Mitocondriile Mitocondria este considerată .. care este reconvertit în cloroplaste la PEP (fig. care migrează apoi în teaca perifasciculara de celule. Prima serie de reacţii este cunoscută sub denumirea de glicoliza.6.6-difosfat fructoza-6-fosfat . oxalatul este mai întâi redus de către NAD-malat dehidrogenază în mitocondrii. asigura efectuarea ciclului glicoxalatului şi sunt sediul unor sinteze şi degradări de substanţe. Mitocondriile. 2. se crede prin plasmodesmele din pereţii celor două tipuri de celule. este convertit în alanina prin transformare. îndeplinesc în biologia celulei următoarele roluri: asigură în parte degradarea glucozei. care este apoi convertit la piruvat (fig. apoi suferă în aceleaşi organite o decarboxilare oxidativă prin intervenţia enzimei malice.2. În linii mari. calea EmdenMeyerhof. procesul de degradare anaerobă a glucozei se desfasoară astfel: ATP fosforilare ADP glucoza fosfokinaza izomerizare glucoza-6-fosfat hexozoizomeraza ATP fosforilare ADP fructoza-6-fosfat fosfofructokinaza dihidroizi-acetona 3-fosfat aldehida-3-fosfoglicerina aldolaza acid piruvic (2 molecule) piruvatkinaza 67 NADH→H+NAD acid-3-fosfogliceric ambele sunt reduse de NADH fructoza-1.. Aceasta noua transaminare este localizată la tipul de plante .PCK” oxalatul este decarboxilat de o PEP-carboxilaza citoplasmatică formându-se acid PEP. Piruvatul eliberat la ambele tipuri de plante.centrul respiraţiei celulare” funcţia principală constă în înglobarea energiei sub forma de legături macroergice de ATP. 2. iar alanina se întoarce în celulele mezofilului unde este transaminată din nou producându-se piruvat. sunt sediul efectuării ciclului Krebs şi al lanţului respirator ce derivă din acest ciclu. Acest flux.Degradarea glucozei de către mitocondrii Se admite în general. datorită echipamentului lor enzimatic. iar la tipul de plante . În plantele .În celelalte două tipuri de plante C4 (PCK si NAD-ME) oxalatul format de fosfoenolpiruvat-carboxilaza. localizat atât în membrane. cât şi în matrice.. în afara cloroplastului.6. 35 C). 35 B). calea C4 se caracterizează prin transportul unor mari cantitaţi de malat sau aspartat din celulele mezofilului în celulele tecii perifasciculare şi cantitaţi corespunzătoare de piruvat sau alanina în direcţie opusă.. Astfel. la aspartat. faza anaeroba a oxidării glucozei sau calea formării piruvatului. În plantele NAD-ME. dependentă de NAD. este convertit prin transaminare.1. unde din nou.

cofactor: Mn2+ acidul piruvic oxalacetal-carboxilaza. se desfăşoară în exclusivitate în matrice. la care participă NAD+ ca acceptor de H+ şi enzima piruvatdecarboxilaza. acid citric + HS – Co-A 68 . constă în pătrunderea acidului oxalacetic în matricea mitocondriei. Aceasta oxidare este realizată numai dacă în mediu se găseşte în exces altă substanţă– acidul oxalacetic. reluând ciclul Krebs (fig. fumaric. Ciclul Krebs Denumit şi ciclul citric sau ciclul tricarboxilic (deoarece în desfăşurarea lui intervin acizi cu trei grupări –COOH). reacţiile fiecărei etape fiind catalizate de câte o enzimă. în etapa extramitocondriala dintr-o moleculă de glucoza rezultă două molecule de acid piruvic (glicoliza). rezultat din transformarea altei molecule de acid piruvic (provenit dintr-o nouă molecula de glucoza). în prezenta oxalacetalcarboxilazei şi a ionilor de Mn2+.5 şi 4 atomi de carbon şi. Acest ciclu are loc în mai multe etape. a acizilor graşi şi a majorităţii aminoacizilor până la CO2 şi H2O. reacţie catalizată de citrat-sintetaza. acid oxalacetic Dacă în legătura cu producerea glucolizei mai există încă deosebire de vederi în ceea ce priveşte nivelul celular la care are loc. pătrundere înlesnită de acetil-Co-A-sintetaza. în sfârşit acidul oxalacetic de la care s-a plecat în tot acest timp. bazându-se pe date experimentale. cetoglutaric. malic. Fazele de desfăşurare a acestui ciclu. în ciclul Krebs. stabilite de Krebs încă din 1930. Acid oxalacetc + acetil . în CO2 si H2O să aibă loc intramitocondrial. aceasta va da naştere acidului citric. acizi cu 6. iar acidul oxalacetic activat. iar reacţia lui fundamentală este oxidarea completa a grupării acetil a acetil-Co-A. succinic.Co-A Citrat-sintetaza Mg2+ Acidul citric astfel format. 36). s-a degradat în CO2 si H2O. În acest scop acidul piruvic este convertit în prezenţa coenzimei-A (Co-A) în acetil-Co-A. în schimb toţi biochimiştii. au putut fi urmărite şi controlate în ultimele decenii cu ajutorul suspensiilor de mitocondrii. Prima etapă. identificată recent în membrană mitocondriala externă. în urma unor izomerizări şi decarboxilari dă naştere la o serie de acizi tri şi dicarboxilici ca acizii: izocitric. sunt de acord ca ciclul Krebs se desfăşoară exclusiv în mitocondrie şi constitue cea mai importantă cale catabolica aeroba a oxidării hidraţilor de C. considerată cea mai importantă. aconitic. când are loc o reacţie complexă de decarboxilare oxidativa.Deci. cu punerea în libertate a unei importante cantitaţi de energie. prin condensare cu acetil-Co-A. urmând ca oxidarea completă a acidului piruvic. acidul acetic provenit din acidul piruvic iniţial. care ia naştere în urma carboxilarii în hialoplasma a acidului piruvic.

Ciclul Krebs 69 .Fig. 36.

Ciclul glioxalatului Studiile efectuate în special în ultimele decenii au demonstrat că numeroşi mutanţi de bacterii şi ciuperci cresc şi se dezvoltă mult mai bine pe mediile de cultură cărora li s-a adăugat acetat .2. Molecula de CH3-COOH rezultată nu rămâne liberă. ciclul Krebs asigură formarea a numeroase substanţe.În cadrul ciclului Krebs se disting opt grupe. lizinei.2. Formarea fiecărei molecule de acetil-Co-A reprezentată în urma acestei β oxidări este însoţită de reducerea unei molecule de NAD la NADH2 şi a unei molecule de FAD la FADH2. bacteriile şi ciupercile întrerup ciclul Krebs la nivelul acizilor izocitric şi malic. întregul lanţ lung al acidului gras este transformat integral în CO2 şi H2O şi energie . În afara de oxidarea completa a radicalului acetil şi de stocarea energiei. totul are loc ca şi când două molecule de acetat au dat naştere prin convertire unei molecule de succinat. iar malat-sintetaza. dă naştere la malat. că prezenţa acestuia în mediul de cultură determină producerea de zahăr şi de proteine prin intermediul ciclului glicoxalatului datorită izocitrazei şi malat-sintetazei. β oxidarea acizilor graşi Lipidele se metabolizează direct sub acţiunea lipazei în glicerol şi acizi graşi. Acizii graşi sunt oxidaţi la nivelul mitocondriei. acidul oxalacetic dă prin transformare acid aspartic care este precursorul β-alaninei. producând treptat pierderea unui acid gras cu doi atomi de carbon mai puţin . enzime care lipsesc din celulele animale.6. care la rândul său este precursorul argininei. dând acetil. Ciclul Krebs este conectat cu lanţul respirator şi. prolinei şi hidroxiprolinei. cercetările au arătat ca acizii aminati rezultaţi din hidroliza proteidelor în urma unui proces de dezaminare oxidativă dau naştere la acizi cetonici. Căutându-se explicarea acţiunii ionului acetat. împreună eliberează 216Kcal. 2. care intervine în sinteza zaharurilor şi proteinelor ce apar în mediul de cultură.Co-A care intra în combinaţie cu acidul oxalacetic. Izocitraza descompune acidul izocitric în acizii glicoxalic şi succinic. 70 . În felul acesta. ci se combină imediat cu SH-Co-A. în urma cărora rezultă două molecule de CO2 (reacţiile III şi IV) şi opt atomi de H+. s-a constatat printre altele. ca atare. cum sunt: α-cetogentaratul. care poate da prin aminare glutamat. intervin sisteme enzimatice în frunte cu HS-Co-A. din care 191 provin din lanţul respirator . Schema procesului de oxidare a acizilor graşi a fost elaborată de Lynen şi este reprezentată de o elice în care fiecare spiră corespunde formării unui acetil-Co-A. cu formare de acid citric care trece în ciclul Krebs unde va fi complet degradat în apă şi CO2. treoninei.6.3. cât şi în cea vegetală (fig. acidul succinic este precursorul nucleelor tetrapirolice care intra în constituia citocromilor. De asemenea. care pot intra în diverse etape ale ciclului Krebs atât în mitocondria animală. în urma condensării acidului glicoxalic cu o moleculă de acetat. metioninei.2. 37). Energia chimică rezultată este stocată în ATP (38 de molecule). În prezenţa ATP. 2.

Studiile biochimice .4. b. reprezintă ansamblul de reacţii care au loc în mitocondrie..6.. prin care electronii pierduţi de substanţe (glucide. în timpul dehidrogenarii lor în matrice sunt transportaţi până la oxigen acţionându-l. sunt denumite flavo-proteine. ca FAD sunt în realitate coenzimele hidrogenazelor şi anume NADH2-dehidrogenazei şi succin-dehidrogenazei. Sistemul transportor de electroni (lanţul respirator) Lanţul respirator denumit şi lanţul citocromic sau sistemul transportor de electroni.oxidarea acizilor graşi 2. NADP.2. Unele din aceste nucleotide. lipide sau protide). în care fierul poate exista fie sub forma de Fe2+. iar cei de electroni sunt citocromii. Din mitocondrii au fost izolaţi mai mulţi citocromi care aparţin claselor a. c. FAD.în vitro” au demonstrat că acceptorii de H+ eliberat de substrat sunt NAD. β. colorate în galben. dând naştere la H2O. derivaţi ai hematinei. Aceste dehidrogenaze cu coenzime flavinice. iar citocromul c este foarte solubil în apa. de asemenea s-a mai precizat că citocromii mitocondriali a şi b sunt insolubili în apa şi sunt activi numai asociaţi cu fosfolipide. Transportul protonilor (H+) şi electronilor ⎯e până la O2 se face prin intermediul nucleotidelor şi citocromului.Fig. 71 . 37. fie Fe3+. oxigenul astfel activat devine acceptor de protoni (H+).în situ” şi .

2. catalizează reacţiile ce au loc de la coenzima Q până la citocromul C. în vederea activării lui. Două din acestea. localizat în regiunea mediana. Fosforilarea oxidativă Electronii în lungul lanţului respirator suferă o scădere de potenţial. denumite convenţional I . III si IV . materializată printro eliberare de energie. complexul III. Green (1964) a reuşit să izoleze din oxizomi patru complexe enzimatice. iar complexul IV. în oxizomi. care se găseşte la vârful oxizomului. intervine ubichinona sau coenzima Q. au stabilit ca întregul lanţ respirator se afla localizat în membrana mitocondriei interne. 38. 2. Din punct de vedere structural coenzima Q este o chinona cu un lanţ lateral poliizoprenic. I şi II sunt dehidrogenaze şi sunt localizate la baza oxizomului.6. Studiile de chimie ultrastructurală şi tehnicile de fragmentare a mitocondriei. catalizează reacţiile terminale ale lanţului respirator. II. care are loc în etape şi care serveşte pentru regenerarea moleculelor de Fig.5.Cercetările biochimice din ultimele decenii au dus la concluzia că în procesul de trecere al H+ pe NAD şi NADP. adică transferul electronilor de la citocromul că la O2. care la rândul lor îl transportă pe FAD. Conceptul fosforilării oxidative 72 . activitatea lui fiind în funcţie de integrarea structurală a oxizomilor.

2. NADH2 format – neoxidat de oxigenul atmosferică din mitocondrie. care nu pot trăi decât în prezenţa oxigenului (animalele. transformându-l întrun „produs rezidual” produs ultim rezidual din procesul fermentaţiei. Dar respiraţia 73 . respiraţia rupe această legătură şi eliberează energie. pot exista mai multe tipuri de fermentaţie (alcoolică.6.2. aceste organisme se numesc . Randamentul fermentaţiei este de 2%. numită fermentaţie. astfel că plantele cresc în greutate. Formarea ATP are loc în trei etape si anume: o prima etapa o constitue oxidarea NADH2 de câtre FAD. fotosinteza construieşte materie organică prin fixarea şi reducerea carbonului mineral. acetică etc). 38). Ecuaţia globală a respiraţiei unei molecule de glucoză se poate scrie astfel: C 6 H 12O 6 + 6O2 + 6 H2O→ 6CO2+ 12H2O + 38 ATP 2.ATP prin fosforilarea ADP cu fosfat anorganic (Pi) existent în matricea mitocondriei (fig. acumulată în legăturile carbon-hidrogen.descompunători”. o a doua oxidarea citocromului b de către citocromul c şi a treia. care pot trăi atât în prezenţa cât şi în absenţa oxigenului din mediu. de la o moleculă de glucoză fermentată se formează doar două molecule de ATP. adoptând o activitate metabolică diferită de respiraţie. care le este nociv (numeroase microorganisme.6. Metabolismul anaerob este mult mai puţin eficace în ceea ce priveşte producerea de energie. acest substrat organic este transformat într-un produs rezidual organic. decât respiraţia. Fermentaţiile Exigenţa organismelor faţă de oxigen nu sunt identice. levurile aparţin acestei categorii dar şi unele plante superioare care sunt capabile să reziste la asfixie. faţă de 45% cât este pentru respiraţie. După natura acestui produs rezidual şi a echipamentului enzimatic al organismului fermentativ.6. Fermentaţia este oxidarea incompletă a unui substrat organic în absenţa oxigenului (metabolism anaerob). oxidarea citocromului a. Astfel se disting următoarele trei grupe: Organismele strict aerobe. denumită şi fosforilare cuplată. deoarece fermentaţia nu utilizează în totalitate energia substratului degradat pentru sinteza ATP. care nu pot trăi decât în absenţa oxigenului liber.3. lactică.. unele microorganisme) Organismele strict anaerobe. Energia astfel stocată sub forma de ATP serveşte în majoritatea cazurilor la biosinteza unor substanţe de mare importanţă. va reduce acidul piruvic.Comparaţie între fotosinteză şi respiraţie Fotosinteza şi respiraţia sunt două procese antagonice dar complementare: din punct de vedere energetic. de ex Clostridium) Organisme aerobe facultative. rezultând în final trei molecule de ATP. Reacţiile enzimatice care transformă substratul organic sunt cele de la glicoliză (localizate în citoplasma citoplasma celulară).. centrală energetică” a celulei care se dă mitocondriei. din punct de vedere metabolic. Ansamblul acestor reacţii de oxidare şi fosforilare a fost denumit fosforilare oxidativa. are un rol deosebit de important în reglarea numeroaselor etape ale metabolismului celular şi justificş denumirea de . fotosinteza transformă energia luminoasă în energie chimic. plantele. Oxidarea completă a unei molecule de glucoză (glicoliză + ciclul Krebs) permite sinteza a 38 de molecule de ATP. Astfel. Substratul este deci degradat până la acid piruvic. în timp ce în cursul oxidării complete dintr-o moleculă de glucoză rezultă 38 molecule de ATP. Fosforilarea oxidativă. Organismele care îşi obţin energia din fermentaţie trebuie să descompună cantităţi considerabile de substrat.

lanţul respirator invers.degradează rezervele organice (derivaţi de carbon) prin oxidare şi greutatea plantelor scade prin pierderea carbon mineral. 74 . prezent atât în mitocondrie cât şi în cloroplast. dar. dehidrogenată şi decarboxilată de ciclul Krebs. este „tăiată” de glicoliză. respiraţia eliberând energia captată (de la soare) de fotosinteză. aceste reacţii sunt exact în opoziţie una cu alta. În respiraţie. dar numai plantele autotrofe sunt capabile să capteze energia solară şi să o transforme în „hrană” . glucoza construită în cursul ciclului Calvin (faza de întuneric a fotosintezei) prin carboxilare. schimburile gazoase sunt în sens invers: fotosinteza absoarbe CO2 şi apă şi degajă O2. energia. degajând CO2 şi apă. Formula generală pentru fotosinteză este următoarea: Energie (lumina) + 6CO2 + 6H2O →C6 H 12O6 + 6 O2 Formula generală pentru respiraţie conţine aceeaşi compuşi : C 6H 12 O 6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H 2 O + energie (ATP) După cum se observă din formulele generale ale fotosintezei şi respiraţiei celulare. Lanţul fotosintetic. ambele participă la menţinerea vieţii şi creşterea organismelor vegetale sau animale. fotosinteza se manifestă numai în prezenţa luminii. În ambele procese energia electronilor ce se deplasează de-a lungul unui lanţ este folosită pentru sinteza ATP-ului. Cele două procese au şi etape similare. permite transportul electronilor de la apă la NADH2. rezultând apă. Conversia energiei este procesul de bază de care depind toate fiinţele vii. (lumina) solară este convertită în energie chimică. mecanismele biochimice sunt antagonice: lanţurile transportorilor de electroni funcţionează în sens opus. ambele implică conversia energiei dintr-o formă în alta. Oxigenul fotosintetic degajat în biosferă asigură viaţa organismelor superioare (eucariote) care respiră acest oxigen. energia chimică este convertită în ATP. Intensitatea respiraţiei este identică atât în condiţii de obscuritate cât şi de lumină. care este foarte asemănător. ceea ce reflectă şi funcţii asemănătoare (transformatori de energie). Lanţul transportatorilor de electroni. Respiraţia şi fotosinteza sunt procese care se opun reciproc. În fotosinteză. electronii sunt transportaţi de la NADH2 la oxigen. hidrogenare şi condensare. în aceste două organite. se datorează aranjamentului membranelor interne. Astfel. Atât cloroplastul cât şi mitocondria au o ultrastructură asemănătoare. Toate organismele scindează molecule organice pentru a-şi asigura „combustibilul” necesar proceselor vitale.

Capitolul 3 ADEZIUNEA CELULARĂ. Pentru procesul invaziei neutrofilelor sunt necesare integrine (proteine receptori membranari de recunoaştere). proteine de legare care recunosc şi leagă specific moleculele de carbohidraţi de la suprafaţa celulei învecinate.1. 75 . elementele componente ale matricei asigură stabilitatea tisulară preluând aproape în totalitate stress-ul mecanic. o reţea complexă de macromolecule prezentă în spaţiile interstiţiale şi care se află într-o permanentă interrelaţie cu celulele. Molecule implicate în aderarea celulă-celulă Din categoria moleculelor suprafeţei celulare implicate în aderarea celulară nonjoncţională fac parte: selectinele. Selectinele Sunt proteine identificate pe suprafaţa membranară a leucocitelor. în adeziunea celulară. iar matricea extracelulară este slab reprezentată. celulele sunt dispersate în matricea extracelulară. domeniile imunoglobulinice şi caderinele. celulelor endoteliale. Rezistenţa ţesutului epitelial la forţele la forţele mecanice ce acţionează asupra sa este conferită de proteine fibrilare intracelulare (elemente de citoschelet). În ţesutul conjunctiv. moleculă extracelulară. Ele mediază legarea neutrofilelor de peretele vasului de sânge. Interacţiunea dintre celule poate fi joncţională ( prin intermediul unor structuri specializate numite joncţiuni celulare) sau non-jonctională ( prin intermediul moleculelor suprafeţei celulare). plachetelor sanguine. JONCŢIUNILE CELULARE ŞI MATRICEA EXTRACELULARĂ În organismele pluricelulare. 3. b) heterofilică. favorizând invazia neutrofilelor prin peretele vasului la locul infecţiei sau leziunii. manifestând specificitate celulară. fapt pentru care se numesc şi proteine transmembranare limfocitare. Selectinele sunt importante în răspunsul inflamator. dacă moleculele suprafeţei celulară care interacţionează sunt identice. Selectinele recunosc şi leagă formaţiuni specifice de oligozaharide care aparţin altei celulei. Ele posedă un domeniu citoplasmatic care traversează membrana plasmatică şi un segment extracelular de lungimi variabile care se termină cu un domeniu pentru lectină. care se aşează pe faţa internă a membranei plasmatice.1. Astfel. Ancorarea celulelor în matricea extracelulară se realizează prin joncţiunile celulămatrice. celulele specializate în realizarea unei anumite funcţii se recunosc şi interacţionează specific formând ţesuturi.1. variază funcţie de tipul celular. celulele sunt strâns unite între ele. care pot fi diferite calitativ şi cantitativ. unde se formează joncţiuni specializate cu suprafaţa altor celule sau cu matricea extracelulară. dacă moleculele suprafeţei celulare sunt diferite dar complementare şi c) prin moleculă linker. Acest domeniu terminal leagă lectine. care prin asociere dau naştere unităţilor funcţionale. În acest caz. Un rol important în stabilirea structurilor tisulare îl are matricea extracelulară. recunoaşterea şi aderarea intercelulară este posibilă datorită moleculelor de pe suprafaţa celulară. numite organe. ce nu aparţine suprafeţei celulare. Legarea selectinelor la carbohidraţi este Ca2+ dependentă. Sunt implicate în medierea interacţiunii limfocitelor cu peretele venulelor sau cu nodulii limfatici. 3. regiuni specializate din membrana plasmatică. Implicarea joncţiunilor intercelulare şi a matricei. care ocupă cea mai mare parte a volumului tisular. Suprafaţa celulară poate media trei tipuri de aderare: a) homofilică. În ţesutul epitelial.

ambii foarte importanţi în dezvoltarea sistemului nervos la embrion. E. iar L1 mediază alungirea conului de creştere în timpul dezvoltării neuronilor.3. Ca2+ leagă segmentele în tandem menţinându-le într-o stare rigidă.adhesion molecules) sau factorul de adeziune neurală şi L1. Aderarea celor două celule adiacente se realizează prin suprapunerea domeniului Ig al unei celule cu domeniul Ig al celulei vecine. Alţi doi reprezentanţi al IgSF sunt NCAMs (neural cell. cu posibilitatea iniţierii metastazelor.1. Unul dintre aceştia. interacţiune mediată de NCAMs celulelor endoteliale şi integrinele neutrofilelor).2. Joncţiunea celulară Joncţiunile celulare (joncţiunile intercelulare şi joncţiunile celulă-matrice extracelulară). Domeniul citoplasmatic interacţionează cu proteine din citosol care fixează caderine ce aparţin citoscheletului şi transmit informaţii în citoplasmă. blocând fluxul de molecule şi ioni dintre lumenul organelor cavitare şi spaţiile interstiţiale. Proteinele care conţin domenii imunoglobulinice aparţin IgSF (superfamiliei imunoglobulinelor). NCAMs mediază interacţiunea celulă-celulă. Caderinele au fost identificate în diferite părţi ale corpului (N-caderina în sistemul nervos. Domenii imunoglobulinice Unele domenii imunoglobulinice care nu aparţin structurii unui anticorp pot media interacţiuni non-joncţionale celulă-celulă Ca2+ dependete. se produc modificări conformaţionale ale caderinelor care duc la scăderea adezivităţii celulare. 3. Caderinele sunt molecule implicate în recunoaşterea celulelor de acelaşi tip. un segment transmembranar şi un mic domeniu citoplasmatic. deci şi caderine de acelaşi tip. Segmentele extracelulare ce aparţin la două celule adiacente pot interacţiona prin juxtapoziţia porţiunilor terminale sau a segmentului în totalitate. structuri specializate şi stabile. Caderinele de pe aceeaşi suprafaţă celulară se asociază formând dimeri. Interacţiunea heterofilică presupune prezenţa integrinelor. homosau heterofilică. P.1.2. permit sau împiedică schimburile intercelulare şi mediază contactele celulă-celulă şi celulă-matrice.caderina în placentă. Din punct de vedere funcţional se deosebesc trei categorii principale de joncţiuni: ƒ Joncţiunile de ocluzie sudează membranele plasmatice ale celulelor epiteliale. Caracteristic acestui tip de glicoproteine este faptul că ele leagă intre ele celule de acelaşi tip şi. 3. eliberarea celulelor oncogene din ţesut şi migrarea lor. Un domeniu Ig conţine proteine de suprafaţă ale unei celule care pot interacţiona cu o moleculă de integrină ale altei celule (de exemplu. Caderinele sunt alcătuite dintr-un segment lung extracelular ce conţine 5 domenii de legare. În cancer. Caderinele Sunt reprezentate de o largă familie de glicoproteine de adeziune.adhesion molecules) – factorul de adeziune vasculară – este important în dezvoltarea sistemului circulator la embrion şi în legarea neutrofilelor de peretele vascular înainte de invazie. respectiv alcătuirea unui ţesut la embrion şi menţinerea integrităţii unui ţesut la adult. Ele mediază interacţiuni celulare homotipice non-joncţionale şi joncţionale şi transmit semnale din matrixul extracelular în citoplasmă.3. aderarea şi menţinerea lor într-un ţesut. aderarea neutrofilului la peretele vascular. 76 . Ca2+ dependente. stare necesară legării unei caderine de caderina celulei alăturate. Membrii numeroşi ai IgSF mediază interacţiunea celulară în elaborarea răspunsului imun. numit VCAMs (vascular cell.caderina în ţesutul epitelial).

Joncţiunile de comunicare sunt implicate în cuplarea electrică şi metabolică a celulelor ce îndeplinesc aceeaşi funcţie. Aceste puncte de „sudură”. Joncţiunile de ocluzie se formează în urma stabilirii contactului între şirurile de proteine aparţinând celulelor alăturate. Aceste structuri joncţionale împiedică deplasarea moleculelor şi a ionilor din lumenul organelor cavitare în spaţiile interstiţiale. 3. Capacitatea de ocluzie variază funcţie de tipul de ţesut epitelial. Proteinele din domeniul apical (faţa luminală a membranei). care determină apariţia unor domenii distincte – apical şi laterobazal – în membrana plasmatică a celulelor epiteliale. difuzează în ţesutul conjunctiv de unde sunt preluate. transportă activ glucoza pompând-o din lumen în celulele epiteliale. sunt rezultatul anastomozei proteinelor joncţionale prezente în membranele plasmatice ale celulelor învecinate. 77 . imaginea unei centuri situate imediat sub suprafaţa cu microvili a celulei epiteliale (fig. Joncţiunile de ocluzie Joncţiunile de ocluzie („zonulae occludens” – numite şi joncţiuni strânse sau impermeabile (tight jonction) sunt reprezentate la polul apical al celulelor epiteliale ce delimitează lumenul unor cavităţi. (fig. oferind. Deşi proteinele nu au fost încă izolate. 39 – Joncţiunile strânse sunt formate din mai multe şiruri de perechi de proteine joncţionale situate în regiunea apicală a membranei plasmatice.39) Fig. separate de mici spaţii interstiţiale. din lumen prin celulele epiteliale în sânge. În plus. Proteinele joncţionale sunt ordonat depuse în mai multe şiruri ce înconjoară celula în regiunea apicală. 40). în ansamblu. în circulaţia sangvină. Joncţiuni sinaptice conectează partea terminală a unui axon neuronal ( butonul terminal) cu celula – ţintă. în urma unui transport transcelular. substratul molecular proteic al joncţiunilor de ocluzie este sugerat de acţiunea denaturantă pe care proteazele o au asupra acestor structuri.1. Acest flux unidirecţional al moleculelor.2. Observarea la microscopul electronic a unei secţiuni prin joncţiunile de ocluzie oferă imaginea a două membrane plasmatice adiacente care din loc în loc se găsesc în contact direct. proces care implică două tipuri de proteine cu o strictă localizare membranară. este condiţionat de distribuirea asimetrică a componentelor membranare. Un exemplu concret îl constituie absorbţia glucozei din lumenul intestinal. Prezenţa joncţiunilor de ocluzie la polul apical al celulelor face imposibilă retrodifuziunea glucozei din interstiţii în lumenul intestinal. se sugerează existenţa unei relaţii logaritmice între numărul şirurilor de proteine joncţionale şi gradul de impermeabilitate al joncţiunilor pentru diferite specii ionice. prezent în domeniul laterobazal.ƒ ƒ ƒ Joncţiunile de ancorare asigură legarea strânsă a celulelor unele de altele şi a acestora cu matricea extracelulară. Eliberarea glucozei în spaţiile interstiţiale se realizează prin difuziune mediată de un set de permeaze. În celulele epiteliale sunt pompate selectiv substanţe nutritive care.

2. 3. joncţiunile de ancorare sunt alcătuite din două clase de proteine: proteine de ataşare intracelulară şi glicoproteine transmembranare de legare. Proteinele de ataşare intracelulară leagă elementele de citoschelet de complexul joncţional. Benzile de adeziune aparţinând celulelor învecinate se găsesc în opoziţie directă. Orientate paralel cu membrana plasmatică mănunchiurile de filamente de actină înconjoară polul apical al celulei formând o bandă de adeziune continuă („zonulae adherens”). imediat sub joncţiunile de ocluzie. datorită migrării lipidelor din stratul exoplasmatic şi al proteinelor în membrana plasmatică. 40 – Transportul glucozei în celulele epiteliale ce delimitează lumenul intestinal.2. joncţiunile de adeziune intercelulară sunt localizate la polul apical. Acestea acţionează în sensul împiedicării difuziei prin dublul strat lipidic al moleculelor ce compun domeniile membranare. joncţiunile de ocluzie permit ţesutului epitelial să se comporte ca o barieră cu o permeabilitate selectivă. miocard. cât şi prin menţinerea stabilităţii domeniilor membranare.filamente de actină sau filamente intermediare – joncţiunile de ancorare se clasifică în joncţiuni de adeziune şi structuri desmozomale. cât şi structurile desmozomale se subdivid în joncţiuni de adeziune intercelulare şi joncţiuni de adeziune celulă-matrice şi respectiv.Fig. Datorită aspectului lor. Aceste structuri constituie situsuri de ancorare ale filamentelor de actină dispuse în mănunchiuri. aceste joncţiuni au fost numite desmozomi în 78 . miometru etc). funcţie de tipul de contact pe care îl mediază. Un argument în favoarea acestei afirmaţii este pierderea polarităţii celulare. Toate cele patru tipuri de joncţiuni de ancorare coexistă în celulele ţesutului epitelial. Atât prin împiedicarea schimburilor lumen-interstiţiu.2. iar prin cele extracelulare cu glicoproteine transmembranare din celulele adiacente. element esenţial în menţinerea integrităţii joncţiunilor de ocluzie. Joncţiunile strânse sunt implicate în menţinerea priorităţii celulelor epiteliale împiedicând difuzia proteinelor transportoare în planul membranei plasmatice Menţinerea polarităţii celulelor epiteliale constituie a doua funcţie a joncţiunilor de ocluzie. ca urmare a scăderii concentraţiei Ca2+ în mediul extracelular. desmozomi şi hemidesmozomi. în timp ce.1 Joncţiunile de adeziune intercelulară În celulele epiteliale.2 Joncţiunile de ancorare Joncţiunile de ancorare asigură contactul celulă-celulă şi celulă-matrice extracelulă. glicoproteinele transmembranare interacţionează prin domeniile lor intracelulare cu proteinele de ataşare. Acest tip de joncţiune antrenează elementele de citoschelet creând structuri de rezistenţă în celulele supuse stress-ului mecanic (epitelii. Atât joncţiunile de adeziune. Din punct de vedere structural. 3. Ţinând cont de tipul elementelor de citoschelet asociate . contactul acestora fiind mediat de structurile joncţionale de adeziune intercelulară.

Ca rezultat al acestor interacţii. În celulele epiteliale. ancorând astfel filamentele de actină în embrana plasmatică. ce aparţine familiei integrinelor. în celulele musculare ale inimii. Glicoproteina (uvomorulina) este un membru al familiei moleculelor de adeziune intracelulară calciu dependente. 42). Aderarea celulelor la matrice implică regiuni specializate ale membranei plasmatice. fiind mediată de cel puţin pentru tipuri de proteine de ataşare: o proteină ce leagă capul filamentelor de actină („actin-filament-capping protein”). Fig. numite contacte focale sau plăci de adeziune. în celulele mezenchimale. Filamentele de actină interacţionează cu complexul joncţional printr-un set de proteine de ataşare dintre care cel mai bine caracterizate sunt vinculina şi α-actinina. ce au la bază un mecanism Ca2+ dependent. membranele plasmatice adiacente sunt menţinute la o distanţă de 15-20 nm una de cealălantă (fig. La nivelul plăcilor de adeziune se stabileşte contactul dintre mănunchiurile de filamente de actină şi un element al matricei. De cele mai multe ori. iar glicoproteina transmembranară este receptorul pentru fibrobnectină. Proteinele de ataşare se leagă de domeniul intracelular al unei glicoproteine transmembranare. filamentele de vimentină etc. prin intermediul unei glicoproteine transmembranare. Tipul filamentelor intermediare antrenate de desmozomii în adeziunea intercelulară diferă funcţie de tipul celular.2. α-actinina. 79 . filamentele de desmină. în urma cărora se formează o reţea transtisulară continuă. structurile desmozomale le sunt asociate filamentele de cheratină.3 Desmozomii Dependent (fig. vinculina şi talina. desmozomii (desmozomii în pată) constituie regiuni de cimentare intercelulară. numite caderine. Domeniul extracelular al glicoproteinei interacţionează cu domeniile extracelulare ale glicoproteinelor din membrana plasmatică a celulelor învecinate. denumire eronată. elementul matriceal este fibronectina.bandă (belt desmosomes). 41 – Distribuţia proteinelor de legare a actinei şi uvomorulinei la nivelul joncţiunilor de adeziune intercelulară din celulele epiteliale 3. Conectarea reţelelor transcelulare de filamente de actină asigură adeziunea celulelor epiteliale conferind totodată rigiditate structurii tisulare. cu elemente componente ale matricei.2.2. Vizualizarea la microscopul electronic a desmozomilor oferă imaginea a două discuri dense (15-20 nm grosime). ce alcătuiesc citoscheletul. Legarea filamentelor de actină de domeniul intracelular al receptorului este indirectă. 3. Aceste structuri joncţionale realizează contactul dintre filamentele intermediare ale celulelor adiacente.2. 41).2 Joncţiunile de adeziune celulă-matrice extracelulară Joncţiunile de adeziune celulă-matrice asigură contactul dintre celulă şi matricea extracelulară prin conectarea filamentelor de actină. deoarece din punct de vedere chimic cele două structuri joncţionale sunt deosebite. situate pe faţa citoplasmatică a membranelor celulelor adiacente.

În regiunea joncţiunilor de comunicare. Este alcătuit dintr-o singură placă citoplasmaticăde care filamentele intermediare sunt legate prin capete. Moleculele aflate în soluţie difuzează printre celulele epiteliale spre exterior.4 Hemidesmozomii Hemidesmozomii. În boala Penfigus se sintetizează anticorpi împotriva propriilor glicoproteine transmembranare. Filamentele intermediare se ataşează tangenţial de plăcile citoplasmatice. Legarea anticorpilor de desmoglină afectează structura desmozomilor responsabili de aderarea intercelulară a celulelor ţesutului epitelial din piele. filamentele de desmină asociate desmozomilor constituie o cale de transmitere a forţei de contracţie. Studiul desmozomilor a pus în evidenţă implicaţiile funcţionale pe care aceste structuri le au în alte ţesuturi decât cel epitelial. În ţesuturile epiteliale. Astfel. asigură contactul dintre regiunea bazală a membranei celulelor epiteliale şi o structură specializată a matricei extracelulare. 80 . (b) Hemidesmozomul asigură ancorarea celulelor în matricea extracelulară. Placa citoplasmatică constituie situsul de ancorare a filamentelor de cheratină ce intră în alcătuirea citoscheletului celulei epiteliale. De vreme ce anticorpii afectează doar desmozomii din piele se presupune existenţa unor deosebiri biochimice între aceştia şi cei prezenţi în alte ţesuturi. regăsinduse în toate ţesuturile organismelor animale. „gap junction”) au o largă răspândire. 3. consolidând structura desmozomală. Devenit lax. similari desmozomilor din punct de vedere morfologic. fapt ce conferă pielii un aspect vezicular. unde de regulă se semnalează prezenţa ambelor structuri desmozomale (desmozomi în pată şi hemidesmozomi). 42 – Structuri desmozomale în ţesutul epitelial. 3.3 Joncţiunile de comunicare Joncţiunile de comunicare (permeabile. ţesutul epitelial este incapabil de a mai funcţiona ca barieră.2. (a) Desmozomul este alcătuit din două plăci citoplasmatice situate pe feţele citoplasmatice ale plasmalemelor celor două celule adiacente. numită lamina bazală.2.numite plăci citoplasmatice. acestea sunt implicate atât în asigurarea adeziunii celulare.2. iar în muşchii netezi desmozomii sunt consideraţi echivalenţi funcţionali ai discurilor „Z” din muşchii scheletici. Legarea plăcii citoplasmatice de lamina bazală este mediată de o glicoproteină transmembranară. Glicoproteinele transmembranare interacţionează prin domeniile lor extracelulare. Cele două plăci citoplasmatice din membranele adiacente sunt conectate ca urmare a interacţiunii domeniilor extracelulare ale desmoglinelor printr-un mecanism Ca2+ Fig. în celulele ce alcătuiesc ţesutul muscular cardiac. Placa citoplasmatică este alcătuită dintr-un complex de proteine de ataşare – desmoplachine – ce leagă tangenţial filamentele intermediare şi o glicoproteină transmembranară – desmoglina-care interacţionează prin domeniul său intracelular cu proteine de ataşare. cât şi în distribuirea forţelor mecanice în întregul ţesut epitelial şi ţesutul conjunctiv adiacent.

Apariţia defectelor în dezvoltarea embrionului ca urmare a injectării. ƒ peristaltismul intestinal. Lanţul polipeptidic (280 aminoacizi) străbate de patru ori membrana plasmatică. ƒ propagarea potenţialului de acţiune de la un neuron la altul. Canalul. domeniile αhelix amfipatice. Prin asocierea a şase molecule de conexină ia naştere o structură conexon. nucleotide. proces. 3. În regiunea membranară implicată în joncţiunile de comunicare. Prin cuplarea metabolică. dând naştere unor canale de comunicare intercelulară. Cuplarea electrică mediată de joncţiunile de comunicare asigură: ƒ sincronizarea contracţiilor celulelor ce alcătuiesc ţesutul muscular. Prin stabilirea acestui tip de comunicare intercelulară. implicaţi în reglarea numeroaselor procese metabolice celulare. Joncţiunile de comunicare au un rol important în procesul de embriogeneză. aminoacizi. ce stă la baza coordonării activităţii celulelor într-un ţesut.5-2nm.1. grupuri de celule cu o entitate distinctă se decuplează de restul celulelor urmând o cale comună de dezvoltare.membranele plasmatice adiacente sunt separate de un spaţiu îngust (2-4 nm grosime) întrerupt din loc în loc de particule cilindrice. Conexonii. explică activarea diferiţilor stimuli hormonali (vezi subcap.3. Deplasarea mediatorilor intracelulari de la o celulă la alta prin joncţiunile de comunicare. Aceste particule sunt străbătute de un canal ce face posibil contactul dintre citoplasmele celulelor cuplate prin joncţiunile de comunicare.3. dintr-o celulă în alta. a moleculelor cu greutăţi moleculare sub 1500 -2000 Dar (glucide.)şi a diferitelor specii ionice. numită conexină (280000-320000Da).2. a unor inhibitori ai joncţiunilor de comunicare sprijină această ipoteză. în etapele timpurii ale embriogenezei. cu un diametru de 1. b) Poziţionarea în membrana plasmatică a conexinei-subunitate a conexonului. Fig. Cele patru domenii membranare prezintă o conformaţie αhelix. ale fiecărei proteine componente delimitează un canal ce străbate membrana plasmatică (fig. 43 – a) Joncţiunile de comunicare.2 Reglarea permeabilităţii joncţiunilor de comunicare Joncţiunile de comunicare sunt structuri cu caracter dinamic. De asemenea. AMP-ciclicetc. sute de conexoni se aglomerează formând cluster-i (mănunchiuri) Conexonii din membranele celulelor învecinate se aşează cap la cap formând un canal de comunicare continuu între citoplasmele celor celule. hormoni etc.2.).3.43). Se presupune că primele etape ce urmează fecundării majoritatea celulelor sunt cuplate electric. prin canalele joncţiunilor de comunicare pot trece mediatori intracelulari (ioni de Ca. permite trecerea liberă. joncţiunile permeabile constituie elementul-cheie al cuplării electrice şi metabolice celulare. 3. Al treilea domeniu α-helix al conexinei are un caracter amfipatic. În interiorul conexonului. Pe parcursul proceselor de diferenţiere.2). celulele sunt capabile să transfere diferite molecule celulelor învecinate incapabile să le sintetizeze.1 Structura joncţiunilor de comunicare În alcătuirea joncţiunilor de comunicare intră un singur tip de proteină transmembranară. permeabilitatea lor fiind dependentă de diverşi factori: 81 . complexe proteice prezente în membranele plasmatice sunt poziţionaţi cap la cap.

care mediază contactul 82 . sunt izolate regiunile tisulare afectate. Creştere permeabilităţii joncţiunilor de comunicare. La interfaţa dintre ţesutul epitelial şi ţesutul conjunctiv subadiacent. în prezenţa unui semnal chimic extracelular. numită lamină bazală. În acest caz. Există mai mult de 50 de gene ce controlează sinteza diferitelor protocaderine. azi. Activarea acestora nu necesită contactul direct cu hormonul. Joncţiunile sinaptice Sunt structuri specializate de legătură între neuroni. Arhitectura. matricea extracelulară se relevă. se află o structură specializată a matricei extracelulare. ce comandă oprirea sintezei de glicogen în celulele hepatice şi eliberarea glucozei în sânge. forma şi funcţiile metabolice ale celulelor cu care se află într-un contact permanent. ca o structură dinamică ce joacă un rol esenţial în dezvoltarea. cât şi rolul matricei extracelulare diferă funcţie de tipul tisular.Scăderea pH-ului citosolic. semnale chimice extracelulare etc. Rolul protocaderinelor este acela de a ţine la distanţa optimă cele două componenete membranare ale sinapsei – membrana presinaptică şi cea postsinaptică. Un exemplu concret îl constituie răspunsul celular la acţiunea hormonului glucagon.4. are loc creşterea concentraţiei de AMP-c. 3. Prin joncţiunea sinaptică. migrarea. Fosforilarea conexinei impune adoptarea conformaţiei deschisă de către joncţiuni. Numărul mare de protocaderine asociate în diferite combinaţii dau specificitatea sinaptică. concentraţia mare a ionilor de Ca impune închiderea joncţiunilor de comunicare dintre celulele deteriorate şi cele şi cele normale. proliferarea. Considerată un suport inert ce oferă doar stabilitate fizică ţesuturilor. elementele componente. 44 – Schema modificării conformaţionale a conexonilor Existenţa unui mecanism de reglare a permeabilităţii structurilor joncţionale dependentă de concentraţia de Ca2+din citosol are o importanţă vitală pentru funcţionarea normală a celulelor asociate din ţesuturi. Alterarea gravă a structurii celulare (ruperea membranei plasmatice. moarte celulară etc. creşterea concentraţiei Ca2+ liber în citosol. 3. pentru a facilita transmiterea sinaptică. În celulele hepatice stimulate de glucagon. stă la baza activităţii celulare în cascadă. valoarea potenţialului de membrană la nivelul joncţiunilor. transmiterea semnalului realizându-se prin AMP-c. Modificarea permeabilităţii are la bază capacitatea joncţiunilor de comunicare de a adoptă două conformaţii distincte: închisă şi deschisă (fig. conţin 6 domenii extracelulare de legare în tandem).) este însoţită de pierderea unor cantităţii însemnate de metaboliţi celulari. ceea ce permite trecerea AMP-c din celula activată în celulele învecinate. cât şi conexina din structura joncţiunilor de comunicare. Prin această decuplare. ceea ce face posibilă funcţionarea normală a celulelor în restul ţesutului. 44) Fig. ƒ ƒ ƒ ƒ 3. în paralel cu creşterea influxului de ioni de Na şi Ca.2. care activează protein kinazele AMP-c dependente. un axon în creştere se ataşează la celula-ţintă Acest tip de joncţiune este mediat de protocaderine (glicoproteine ce aparţin familiei caderinelor. Ele fosforilează atât enzimele. Matricea extracelulară Matricea extracelulară reprezintă o reţea complexă de carbohidraţi şi proteine ce ocupă spaţiile interstiţiale.

lamina bazală se comportă ca un filtru permiţând trecerea apei. datorită conformaţiei adoptate. 3. pe care se sprijină ţesutul epitelial şi diferitele glande. în spaţiul dintre celule şi în capilarele sangvine. Deşi glicozaminoglicanii reprezintă 10% din masa proteinelor fibrilare. Aceasta determină creşterea turgescenţei matricei extracelulare. Lanţurile poliglucidice hidrofile. sunt responsabile de organizarea matricei. moleculele leagă diferiţi cationi (în special Na+). prezent în cartilaje. Cu excepţia acidului hialuronic. aceste molecule ocupă cea mai mare parte a spaţiului interstiţial. În ţesutul conjunctiv ce înconjoară capilarele sangvine. de regulă. ce se repetă regulat. hormonilor etc. 3. Funcţie de tipul de reziduuri glucidice.1 Glicozaminoglicanii Glicozaminoglicanii reprezintă lanţuri poliglucidice lineare a căror unitate structurală este un diglucid. dispuse în reţea. acidul uronic. În ţesutul conjunctiv lax. Proteinele fibrilare. Aminoglucidul din unitatea diglucidică poartă grupări sulfat. factor ce conferă structurii rezistenţă la forţele de compresie. 4. În mod obligatoriu. Specii ionice osmotice active.3. ƒ conţin unităţi diglucidice diferite dispuse într-o secvenţă complexă. Această reţea proteică este înglobată în gelul hidrat de polizaharide. În glomerulii renali.1. 3. ƒ sunt molecule scurte (mai puţin de 300 reziduuri glucidice) ƒ formează proteoglicani. cât şi unităţile diglucidice nesulfatate. ionilor şi a moleculelor mici din sânge în spaţiul urinar. toate celelalte clase ale glicozaminoglicanilor prezintă caracteristici comune: ƒ conţin grupări sulfat legate de reziduuri glucidice. de cele mai multe ori. a numărului şi a localizării grupărilor sulfat. adoptă o conformaţie de tip „random coil” („încolăcire aleatorie”).3. cationii cresc gradul de hidratare al matricei. Atât lanţul poliglucidic lung (câteva sute de reziduuri glucidice). al doilea rest glucidic este. reţeaua intricată de macromolecule din spaţiile interstiţiale permite difuzia liberă a nutrienţilor şi a oxigenului din sânge în celulele ţesuturilor periferice. matricea extracelulară este responsabilă de elasticitatea şi rezistenţa mecanică ale acestor structuri. În ţesutul conjunctiv dens. cât şi grupările carboxil ale acidului uronic conferă glicozaminoglicanilor încărcare electrică negativă. tendoane şi oase. conferindu-i totodată rezistenţă mecanică.1 Componentele matricei extracelulare Macromoleculele ce alcătuiesc matricea extracelulară sunt secretate de către celulele ce se găsesc dispersate în matrice şi care aparţin clasei fibroblastelor. unul din componentele diglucidului este un amino-glucid de tipul N-acetilglucozaminei. acidul hialuronic. 83 . Proteinele fibrilare constituie cea de-a doua componentă a matricei. a legăturilor ce se stabilesc între acestea. cheratan sulfat. formând proteoglicani. În matricea extracelulară sunt prezente polizaharide de tipul glicozaminoglicanilor (GAG) care. 2. Faza apoasă a gelului permite difuzia metaboliţilor. Se disting două tipuri de proteine fibrilare: proteine structurale (colagenul şi elastina) şi proteine de adeziune (fibronectina şi laminina). Atât grupările sulfat. se disting patru clase de glicozaminoglicani: 1.dintre cele două ţesuturi. Ca rezultat al acţiunii forţelor de electrostatică. sunt legate covalent de moleculele proteice. definesc acidul hialuronic drept un reprezentant atipic al glicozaminoglicanilor. condroitin sulfat şi dermatan sulfat. heparan sulfat şi heparină.

Moleculele de acid hialuronic se leagă de suprafaţa celulelor care migrează. Prin acest mecanism. Organizarea acestor molecule în matricea extracelulară este încă un subiect controversat. o secvenţă tricglucidică se leagă covalent de un rest de serină din molecula proteică (fig. Simultan cu elongarea lanţurilor poliglucidice are loc în aparatul Golgi procesarea acestora. din el derivând celelalte clase. Lanţurile sunt stabilizate de proteine de legare (fig. Miezul proteic al proteoglicanilor. aranjarea grupărilor hidroxil. acidul hialuronic joacă un rol important în migrarea celulelor pe parcursul morfogenezei şi al reparării structurilor tisulare.Structura simplă a acestei molecule. În cartilaje. 45). unde X poate fi oricare aminoacid. sulfat şi carboxil în lanţurile poliglucidice. prezenţa şi implicarea sa în fazele timpurii ale embriogenezei sugerează faptul că acidul hialuronic este primul reprezentant al glicozaminoglicanilor. de care sunt ataşate multiple lanţuri condroitin sulfat şi cheratan sulfat se leagă. componenta proteică. reacţii de sulfatare şi epimerizare. Cercetări în acest sens au pus în evidenţă capacitatea proteoglicanilor de a lega molecule semnal (ex. Glicozaminoglicanii se leagă prin intermediul unei secvenţe triglucidice de un rest de Ser prezent în structura componentei proteice a proteoglicanilor. 84 . Acest fapt. În prima etapă a sintezei proteglicanilor. proteoglicanii formează geluri hidratate. 3. Fig.acoperindule ca o „haina”. Eliminaţi în spaţiul interstiţial.1. La această secvenţă ce serveşte drept „primer” se leagă unul câte unul reziduurile glucidice printr-o reacţie catalizată de glicozil-transferaza. necovalent de acidul hialuronic. cu densităţi diferite şi pori de mărime variabilă. Structura heterogenă a proteoglicanilor sugerează faptul că aceasta nu constituie unica lor funcţie.2 Proteoglicanii Proteoglicanii sunt reprezentaţi în toate ţesuturile conjunctive şi matricele extracelulare. Componenta proteică a proteoglicanilor este sintetizată la nivelul ribozomilor ataşaţi de RE rugos. 3. ce reglează traficul molecular şi deplasarea celulelor funcţie de mărimea sau/şi sarcina lor electrică. făcând posibilă deplasarea liberă a celulelor şi favorizând proliferarea lor. proteoglicanii diferă prin greutatea moleculară. Componenta centrală a acestor agregate o constituie acidul hialuronic. împiedică adeziunea intracelulară. 45 . Structuri heterogene. 46). Aceste molecule conţin un miez proteic (core) în care sunt ancorate lanţuri de glicozaminoglicani. Concomitent cu procesul de translaţie proteică are loc translocarea proteinei în aparatul Golgi unde este asamblată în proteoglicani. proteoglicanii formează agregate ce pot atinge o lungime de 4µm şi o masă moleculară de aproximativ 2 x 108 Da. Restul de Ser este frecvent localizat în interiorul unei secvenţe specifice de aminoacizi: Asp(Glu)-Asp(Gky)-X-Ser-GlyX-Gly. factorul de creştere al fibroblaştilor – FGF).Structura proteoglicanilor. numărul şi tipul lanţurilor de glicozaminoglicani.

Fig. 46 – Proteoglicanii din cartilagii conţin şi acid hialuronic legat necovalent, prin intermediul unor proteine liker de miezul proteic. Pe o singură moleculă de acid hialuronic se pot lega o sută de monomeri de proteoglicani. Acest tip de organizare a proteoglicanilor conferă elasticitate cartilajelor. Proteoglicanii sunt prezenţi şi la nivelul membranelor plasmatice ale multor tipuri celulare. De miezul integrat în membrana plasmatică şi care proemină în spaţiul extracelular este ataşat un număr mic de lanţuri de glicozaminoglicani (fig. 47).

Fig. 47 – a) Proteoglicani prezenţi la nivel la nivelul membranelor plasmatice. Miezul proteic de care sunt ataşate patru lanţuri de heparan sulfat şi două de condroitin sulfat traversează integral membrana plasmatică; b) Legarea lanţurilor de condroitin sulfat la miezul proteic al proteoglicanilor din membrană. În acest caz proteoglicanii sunt implicaţi în legarea celulelor de matricea extracelulară şi în organizarea acromoleculelor ce compun matricea.

85

3.3.1.3 Colagenul Colagenul reprezintă o familie de proteine fibrilare insolubile, sintetizate în fibroblaste şi reprezentate în toate organismele animale la nivelul matricei extracelulare şi a ţesutului conjunctiv. Este principala componentă a matricei extracelulare. Se cunosc poate 12 tipuri de colagen. Dintre acestea tipurile I, II, şi III întâlnite în special în ţesutul conjunctiv, au capacitate de autoasamblare, formând polimeri ce poartă numele de fibrile de colagen. Tipul IV constituie comportamentul principal al laminei bazale, unde formează o reţea bidimensională. a. Structura moleculelor de colagen Unitatea structurală fundamentală a colagenului este o moleculă proteică cu o lungime de 300nm şi un diametru de 1,5 nm, alcătuită din trei subunităţi: două lanţuri α1 şi un lanţ α2. Celelalte trei tipuri polipeptidice, ce conţin fiecare 1050 aminoacizi, se înfăşoară unul în jurul celorlalte, de la stânga spre dreapta, formând o structură de tipul triplu helix. Fiecare rotaţie completă (tur) a helixuluide faptul că conţine trei aminoacizi (fig. 48) Fig. 48 - a) Modelul lanţului polipeptidic alfa din molecula de colagen. Gly ocupă a treia poziţie în secvenţa repetitivă: Gly-X-Y, unde X şi Y reprezintă oricare alt aminoacid. b) Modelul moleculei de colagen. Cele trei lanţuri alfa formează un tripluhelix. Repetiţia glicinei (Gly) la fiecare a treia poziţie, este justificată de faptul că aceasta este singurul aminoacid suficient de mic pentru a ocupa spaţiul din interiorul triplu-helixului. Molecula de colagen este bogată în prolină, lizină, aminoacizi ce apar de cele mai multe ori sub formă hidroxilată. Grupările hidroxil ale hidroxiprolinei participă la formarea legăturilor de hidrogen ce stabilizează triplu-helixul. În boala numită scorbut, datorat deficienţei de vitamina C, este inhibată reacţia de hidroxilare a prolinei, ceea ce împiedică organizarea lanţurilor polipeptidice în triplu-helix. Acestea sunt rapid degradate sub acţiunea unei enzime, numită colagenază. În consecinţă, matricea extracelulară şi vasele sangvine devin extrem de fragile, iar dinţii se desprind din alveolele dentare. Grupările hidroxil ale hidroxilizinei sunt implicate într-o reacţie de glicozilare. Glicozilarea colagenului conferă acestei molecule capacitatea de a se autoasambla în spaţiul extracelular.

86

b. Sinteza colagenului Prezenţa secvenţei repetitive – Gly-X-Y (unde X,Y reprezintă diferiţi aminoacizi cu excepţia glicinei)în structura colagenului, reflectă organizarea genelor ce îl codifică, sugerând faptul că evoluţia acestor gene are la bază fenomenul de duplicare genică. Gena ce codifică lanţul α1 conţine 41 de exoni. Cea mai mare parte a exonilor este alcătuită din 54 perechi de baze (pb) sau multipli de doi sau trei ai acestui număr, sintetizând 1,2 sau 3 unităţi primordiale. O unitate primordială conţine 6 secvenţe repetitive Gly-X-Y. Un număr mic de exoni din structura genei au pierdut, pe parcursul evoluţiei 9pb, unităţile primordiale codificate de către aceştia fiind mai scurte cu o secvenţă Gly-X-Y. Locul de sinteză al lanţurilor polipeptidice ce formează colagenul îl constituie ribozomii ataşaţi de RE rugos. Ca rezultat al translaţiei la nivel ribozomal sunt sintetizate lanţurile pro-α. Acestea sunt introduse în lumenul RE rugos, datorită prezenţei în structura lor a secvenţei semnal („signal peptide”). În regiunile carboxil- şi amino- terminale lanţurile pro-α conţin alte două secvenţe, numite propeptide. Aceste două secvenţe formează domenii globulare, în timp ce restul lanţului adoptă o conformaţie de tip helix. În lumenul RE reziduurile de lizină şi prolină sunt hidroxilate, iar între secvenţele propeptidice a trei lanţuri pro-α se stabilesc punţi disulfurice intercatenare. Ulterior formării legăturilor disulfurice, lanţurile se unesc (direcţia C - N), generând molecula de procolagen. Din RE, procolagenul este transportat în aparatul Golgi, unde se desfăşoară mai multe runde de procesare ce constau, în principal, în adaosul de reziduuri glucidice la hidroxilizină. Moleculele de procolagen sunt eliminate din aparatul Golgi în spaţiul extracelular. Sub acţiunea procolagen peptidazelor, secvenţele sunt clivate proteolitic, molecula de procolagen fiind convertită în colagen. Proteoliza secvenţelor propeptidice în spaţiul extracelular împiedică autoasamblarea colagenului în interiorul celulei,ceea ce ar avea drept consecinţă distrugerea celulară. c. Asamblarea moleculelor de colagen în spaţiul extracelular În spaţiul extracelular, moleculele de colagen (numit şi tropocolagen) de tip I, II şi III se asociază spontan formând polimeri ordonaţi ce poartă numele de fibrile de colagen (50nm în diametru). În fibrile, moleculele sunt dispuse în şiruri longitudinale. Între moleculele învecinate ale aceluiaşi şir există o distanţă („gap”) de 35 nm. Moleculele de colagen din şirurile adiacente sunt deplasate unele faţă de altele cu 67 nm, ceea ce reprezintă mai puţin de o pătrime din lungimea totală a moleculei. Se constată că din cinci în cinci molecule de colagen sunt aliniate identic (fig. 49). Spaţierea colagenului în fibrile conferă aceştia o maximă elasticitate. În regiunile amino-şi carboxil-terminale ale colagenului există segmente scurte ce au o conformaţie triplu-helix. Resturile de lizină sau/şi hidroxilizină din aceste regiuni participă la legături covalente încrucişate ce se stabilesc între extremitatea carboxilică a unei molecule adiacente. Aceste legături au rolul de a stabiliza asamblarea colagenului în fibrile. Organizarea fibrilelor diferă de la ţesut la altul. În piele, acestea se întretaie creând o reţea laxă. În oase şi în cornee, fibrilele de colagen sunt dispuse în plăci ordonat aranjate; fibrilele aceleiaşi plăci sunt paralele între ele şi perpendiculare pe cale ale plăcilor adiacente. În tendoane fibrilelor formează mănunchiuri, numite fibre. Fibrele sunt dispuse paralel şi orientate pe direcţia forţei ce acţionează asupra tendonului.

87

Fig. 49 – a) Sinteza colagenului şi asamblarea sa în fibre în spaţiul extracelular. 3.3.1.4. Elastina Elastina este o proteină neglicozilată, puternic hidrofobă, a cărei secvenţă de aminoacizi (830) este bogată în glicină şi prolină. Este proteina majoră a reţelelor de fibre elastice din matricea extracelulară. Spre deosebire de colagen, are un conţinut scăzut de lizină. În matricea extracelulară, resturile de lizină ale moleculei proteice participă la formarea legăturilor covalente încrucişate ce stabilizează elastina într-o reţea (filamente sau foiţe) ale cărei ochiuri îşi modifică forma în raport cu direcţia forţei ce acţionează asupra sa. Elasticitatea reţelei se datorează capacitaţii moleculelor de elastină de a adopta mai multe conformaţii random-coil. Oscilarea între conformaţii caracterizate de diferite grade de relaxare a moleculelor de elastină asamblate în reţea, conferă acestei proteine proprietăţi elastice similare cauciucului. Filamentele de elastină reprezintă constituenţi principali ai reţelei de fibre elastice prezente în matricea extracelulară din piele, vase sangvine sau plămâni. Componentul minor al fibrelor elastice este o glicoproteină. Dispusă pe suprafaţa fibrelor, glicoproteina intervine în organizarea moleculelor de elastină.

88

3.3.1.5. Fibronectinele Fibronectinele aparţin clasei glicoproteinelor de adeziune, a căror funcţie principală este de a media adeziunea celulă-matrice extracelulară. Fibronectinele au un rol important în menţinerea formei celulelor, în organizarea citoscheletului, iar pe parcursul embriogenezei sunt implicate în migrarea şi diferenţierea celulară. În organismele animale, fibronectinele sunt întâlnite în: ƒ sânge şi alte fluide, sub formă de dimeri solubili, favorizând fagocitoza, migrarea celulelor imune (în special macrofage), ataşarea trombocitelor de regiunile alterate ale vaselor sangvine; ƒ ataşate tranzitoriu pe suprafaţa celulară, ca oligomeri de fibronectină; ƒ în matricea extracelulară, unde formează fibre insolubile. a) Structura fibronectinelor Se cunosc mai multe tipuri de fibronectine. Codificate de către o unică genă (70 kb), fibronectinele sunt rezultatul splicing-ului alternativ al moleculei de ARN-m. Funcţie de tipul celular, pot fi generate una până la 20 molecule diferite de ARN-m pentru fibronectină ce dau naştere unui număr echivalent de lanţuri polipeptidice. Din punct de vedere structural, fibronectina este un dimer alcătuit din două subunităţi identice. Regiunile carboxiterminale ale celor două lanţuri polipeptidice (2500 aminoacizi fiecare) ce formează dimerul sunt legate printr-o pereche de punţi disulfurice. Fiecare subunitate prezintă şase domenii globulare, unite prin regiuni flexibile ale lanţului polipeptidic. Fiecare domeniu globular asigură legarea specifică a fibronectinei la receptori celulari, colagen, fibrină şi proteoglicani sulfataţi (figura 50). Identificarea, izolarea şi secvenţializarea domeniului prin care fibronectina se leagă la suprafaţa celulară au condus la evidenţierea unei secvenţe tetrapeptidice-Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS). Secvenţa RGD este comună mai multor proteine extracelulare de adeziune. Ea permite recunoaşterea şi legarea proteinelor de către integrine, o familie de receptori de membrană omologi. Dată fiind specificitatea recunoaşterii receptor-ligand, se sugerează implicarea, în acest proces, şi a altor secvenţe din structura proteinelor de adeziune. Fig. 50 – a) Structura fibronectinei. Cele două lanţuri polipeptidice sunt legate prin punţi disulfurice. Fiecare lanţ prezintă domenii globulare ce leagă specific molecule din matricea extracelulară sau receptori de membrană; b) domeniile de legare specifică au fost puse în evidenţă prin digestie cu proteaze. Se cunosc şase domenii: • două pentru heparan sulfat; • două pentru fibrină; • unul pentru colagen; • unul pentru receptorul fibronectinei.

89

Lanţul α (140.α şi β. proteoglicani). o parte din receptorii pentru colagen. prezentând secvenţa specifică RGD. Toate aceste molecule au o structură similară.000 Da) este scindat în două segmente. O excepţie o constituie procesul de reparare a leziunilor. migrarea celulară este un fenomen rar întâlnit. din interiorul celulei. Fig. În momentul în care deplasarea încetează. Fig. Nu toţi receptorii pentru constituenţii matricei extracelulare aparţin familiei integrinelor. mediat de receptorul pentru fibronectină. interacţionează cu alte elemente ale matricei extracelulare (colagen. 90 . Aceste celule traversează cheagurile sangvine al căror element constituent principal este fibrina. fiind implicate în legarea componentelor matriceale de elementele citoscheletului. etc. Din această familie mai fac parte receptorul pentru laminină. 52 – Modelul regiunii de contact fibroblast-substrat. se stabilesc şi se desfac succesiv contactele celulă-matrice. în care fibroblaştii şi celulele sistemului imun migrează spre zona afectată. în anumite celule. Lanţul β conţine secvenţe repetitive bogate în cisteină. c) Migrarea şi aderarea fibroblastelor în matricea extracelulară – proces ce implică recunoaşterea fibronectină – receptor În organismele animale adulte. Fibronectina. Mai mult.b) Receptorul pentru fibronectină-reprezentant al familiei integrinelor Receptorul pentru fibronectină este un heteromer alcătuit din două lanţuri polipeptidice . fibronectina este recunoscută şi legată de receptorul pentru fibronectină din membrana plasmatică a fibroblastelor. Fibrele de actină se ataşează prin intermediul vinculinei şi a talinei de receptorul pentru fibronectină. Segmentele sunt legate între ele printr-o punte disulfurică . imobilizându-l în membrana plasmatică (fig. 52). asociate prin legături necovalente. secretată de către fibroblaşti se leagă printr-unul din domeniile sale globulare la fibrină. receptorul pentru colagen este reprezentat de o glicoproteină transmembranară cu o structură diferită de cea a integrinelor. asigură aderarea celulei la matricea extracelulară. Aceste fibre se leagă de receptor prin intermediul proteinelor de ataşare intracelulare (vinculina şi talină). la rândul săau. pe parcursul migrării fibroblastelor. Receptorul pentru fibronectină este un membru al familiei integrinelor. unul transmembranar şi altul extracelular. 51 – Structura receptorului pentru fibronectină Rolul moleculei receptor este de a media contactul dintre fibronectină (recunoaşte secvenţa RGDS) şi elementele din structura citoscheletului (filamentele de actină). Pe de altă parte. Receptorul leagă fibronectina care. în citoplasmă se organizează fibrele de stres bogate în actină. din spaţiul extracelular şi mănunchiurile de fibre de actină. Datorită mobilităţii laterale a receptorului în membrana plasmatică. Contactul dintre fibronectine. Ambele lanţuri polipeptidice ale receptorului sunt glicozilate (figura 51).

În această reţea. ƒ un strat cu aspect reticular (lamina reticularis) alcătuit din colagen şi care are rolul de a lega lamila bazală de ţesutul conjunctiv. Structura laminei bazale Moleculele componente ale lamilei bazale sunt sintetizate sunt sintetizate de către celulele epiteliate. celule Schwann) sau se află interpusă între două straturi unicelulare în glomerulii renali şi în alveolele pulmonare. Secvenţa repetitivă Gly-X-Y. Ele reprezintă elementul constituient major al lamilei densa ce compune lamila bazală. Deşi compoziţia lamilei bazale variază de la un ţesut la altul. ceea ce justifică apariţia unor discontinuităţi în structura truplu-helixului. Secvenţele propeptidice carboxi-terminale formează domenii prin intermediul cărora monomerii interacţionează formând dimeri lineari. 53 – Modelul asocierii moleculelor de colagen de tip IV şi formarea reţelei multistratificate. a) Colagenul de tip IV Moleculele de colagen de tip IV sunt prezentate în exclusivitate în lamila bazală.3. ƒ un strat electrono-dens (lamina densa). adipoase. lanţurile sunt unite prin punţi disulfurice într-o structură 91 . structură specializată a matricei extracelulare. Molecula (850. lamila bazală apare din trei straturi: ƒ un strat electrono-transparent (lamina lucida sau lamina rara) situat în imediata vecinătate a membranei plastice a celulelor ce se sprijină pe lamila bazală. Fig. Similar moleculelor de colagen fibrilar. delimitează suprafaţa bazală a celulelor epiteliate şi endoteliale. colagenul de tip IV este alcătuit din trei lanţuri polipeptidice ce formează un truplu helix (40 nm lungime). caracteristică tuturor moleculelor de colagen. Existenţa zonelor de discontinuitate conferă întregii molecule o mai mare flexibilitate.2. b) Laminina-glicoproteină majoră a lamilei bazale Laminina este localizată pe faţa dinspre membrana plasmatică a lamilei densa mediind legarea lamilei bazale de suprafaţa celulară. Lamina bazală Lamina bazală.3. Ea înconjoară celule individuale (musculare. separând aceste celule de ţesutul conjunctiv subadiacent.2. 3. colagenul de tip IV. Spre deosebire de moleculele de colagen interstiţial. Regiunile amino terminale ce predomină de o parte şi de alta a planului reţelei se asociază prin legături covalente generând o reţea multistratificată (figura 53). moleculele de colagen sunt stabilizate prin legături covalente încrucişate şi punţi disulfurice.1. un lanţ lung A şi două lanţuri mai scurte B. La microscopul electronic. endoteliale şi mezenchimale. este întreruptă de aproximativ 20 de ori în molecula de tip IV.000 Da) este alcătuită din trei lanţuri polipeptidice. proteoglicanii (heparan sulfat) şi laminina sunt elemente comune tuturor acestor structuri. secvenţele propeptidice amino-şi carboxi-terminale ale colagenului IV nu sunt scindate proteolitic după eliberarea sa în mediul extracelular. Dimerii se asociază lateral prin regiunile cu conformaţie triplu-helix dând naştere unei reţele plane cu ochiuri hexagonale.3.

lamina bazală constituie eşafodul pe care celulele migrează îndreptându-se spre zona afectată.3. În glomerii renali. B1 şi B2) şi conţine mai multe domenii funcţionale: . 92 . Fig. lamina bazală susţine celulele epiteliale şi totodată funcţionează ca un filtru molecular şi celular între cele două compartimente tisulare. rolul laminei bazale constă în reglarea traficului de molecule din sânge în urină. Reglarea funcţiilor celulare vitale: adeziunea.două sau mai multe situsuri de legare la receptori de membrană. 54 – Structura lamininei Proteina prezintă trei lanţuri polipeptidice (A.un situs de legare a colagenului IV. creşterea şi diferenţierea celulară sunt independente de legarea receptorilor celulari la elementele componente ale laminei bazale.2. iar braţul scurt are un singur domeniu (figura 54). Funcţiile laminei bazale Lamina bazală se caracterizează printr-o pronunţată heterogenitate funcţională determinată de necesităţile fiziologice ale diferitelor ţesuturi. La nivelul joncţiunilor neuromusculare.2.un situs de legare a proteoglicanilor sulfataţi. Interpusă între ţesutul epitelial şi ţesutul conjunctiv subadiacent. Receptorii pentru laminină diferă funcţie de tipul celular. . iar unul sau mai multe domenii sunt implicate în legarea receptorului prin laminină. Cele trei braţe scurte ale moleculei de laminină prezintă câte o pereche de domenii globulare. laminina conţine mai multe domenii funcţionale: câte un domeniu leagă colagenul IV şi heparan sulfatul. lamina bazală prezintă o compoziţie chimică particulară ceea ce-i permite exercitarea funcţiei de coordonare a organizării spaţiale a componentelor joncţionale de o parte şi de alta a sinapsei. În regenerarea tisulară.cruciformă. Ca şi fibrotectina. dar cel puţin o parte a acestora aparţin familiei integrinelor. . 3.

conferind acestora rezistenţă. corpusculi bazali şi axonemele organitelor locomotorii (cili. o reţea microtrabeculară şi din proteine asociate. temperaturile scăzute şi presiune hidrostatică mare determină degradarea microtubulilor citoplasmatici şi a celor ce alcătuiesc fusul mitotic. cu ajutorul microscopului electronic. ƒ transportul intracelular de particule.are la baza reacţiile de polimerizare şi depolimerizare ale microfilamentelor şi ale microtubuliilor.1. mobile.1. ei se găsesc fie izolaţi – microtubuli citoplasmatici. Implicat în inducerea şi menţinerea formei celulei şi a prelungirilor celulare (cili. filamente de actină. flageli).microvili. 4.Capitolul 4 CITOSCHELETUL Citoscheletul este alcătuit din microtubuli. În citoplasmă. ƒ desfaşurarea citokinezei. Microtubulii îndeplinesc în celulă un rol structural.de a interconecta elementele de citoschelet în reţea şi de a le lega de organitele celular şi/sau membrana plasmatică. fie fasciculaţi.1. Microtubulii Au fost evidenţiaţi pentru prima dată. mitocondrii) ƒ translocarea anafazică a cromozomilor. dând naştere unor formaţiuni cu caracter efemer – fibrele fusului de diviziune.axoni). 4. dar nu afectează 93 . Capacitatea sa de a-şi modifica structura. funcţie de necesitaţile celulare. în celulele animale de către d.citoscheletul are în principal o funcţie de susţinere. ƒ translocarea cromozomilor în timpul diviziunii celulare. Microtubulii – semnificaţia biologică Microtubulii sunt substructuri celulare omniprezente în citoplasma celulelor eucariote.flageli. intervenind ca parte componentă a citoscheletului. Interacţiunea elementelor de citoschelet cu membrana plasmatică. filamente intermediare. Acesteia i se adaugă o funcţie motilă. şi un rol dinamic. ƒ deplasarea celulelor ce prezintă un tip de locomoţie ameboidal. aceste structuri coordonând motilitatea celulară. solidarizează celule în ţesuturi. Studiul comparativ al microtululilor din diferite compartimente celulare a arătat că tratamentul cu colchicină. Principalele mişcări asociate microtubulilor sunt: ƒ mişcările cililor şi flagelilor ce asigură deplasarea celulelor libere. Proteinele asociate au rol de a regla procesele de polimerizare şi depolimerizare ale filamentelor. Principalele mişcări celulare asigurate de elementele de citoschelet sunt: ƒ mişcarea cililor şi a flagelilor. Se apreciază că realizarea acestora funcţii constituie rezultatul cooperării citoscheletului cu reţeaua microtrabeculară. în inducerea şi menţinerea geometria spaţială a celulelor. Slauttersack (1963). Citoscheletul este o structură dinamică. ƒ transportul intracelular de particule materiale. ƒ contracţia musculară. vezicule de transport şi organite celulare. plastide. sau permanent – centrioli. vezicule şi organite celulare (nucleu. la nivelul structurilor joncţionale. prin intermediul proteinelor de adeziune intracelulară. care a introdus şi termenul de microtubul.

Dar raportul cantitativ constant dintre proteine şi subunităţile de tubulină. Structura microtubulilor În imaginile electronomicroscopice. Unitatea fundamentală a microtubulilor. s-a considerat că acestea sunt proteine de contaminare. în afara heterodimerilor de tubulină. 55 – Modelul structurii tridimensionale a microtubulilor. Cele mai bine caracterizate proteine asociate sunt proteinele tau.azică şi care acţionează în sensul accelerării polimerizării microtubulilor. 94 . Cele două componente proteice ce compun heterodimerul sunt dispune heicoidal în peretele microtubulului. Deoarece. (Fiecare din cele 13 protofilamente ce alcătuiesc peretele microtubulului este formată din heterodimeri de tubulină α şi β. Proteinele asociate au rol de a consolida structurile microtubulare prin interconectarea microtubulilor adiacenţi şi de a stabiliza edificiul arhitectural al citoscheletului prin legarea filamentelor intermediare. ce este conservant în toate structurile microtubulare. tubulina. Ciclurile de fosforilare şi defosforilare ale acestora pot constitui o etapă importantă în reglarea asamblării microtubulilor. Aceste rezultate demonstrează existenţa unei populaţii heterogene de microtubuli. sunt rezultatul unui proces de splicing (combinare) alternativ. Alte proteine asociate prezente în celulele nervoase sunt MAP1-MAP2.000 Da). Orientarea dimerilor. motiv pentru care au fost numite proteine asociate microtubulilor (microtubule associated proteins . cele cinci proteine tau cunoscute astăzi. localizate exclusiv în structurile microtubulare din axonii celulelor nervoase.1.structurile microtubulare stabile (cetrioli. Fig. în timp ce MAP2 este întâlnită doar în structurile microtubulare din dendrite.000 Da). este alcătuită din două proteine distincte: alfa şi beta tubulina (fiecare 50. a condus la concluzia că proteinele sunt asociate specific tubulinelor.MAP). 55). Fiecare microtubul este alcătuit din 13 protofilamente dispuse paralel cu axul longitudinal şi care delimitează un lumen. Protofilamentele sunt rezultatul asocierii cap la coadă a unui număr variabil de heterodimeri. În preparatele pure de microtubuli. corpusculi bazali. Majoritatea proteinelor asociate sunt fosforilate.2. observat pe parcursul mai multor cicluri de polimerizare şi depolimerizare. aşezaţi cap la coadă. ce poartă numele de tubulină (100. iniţial. microtubuli din organitele locomotorii). de tubulină în protofilamente. Această presupunere este confirmată în cazul proteinei tau ce prezintă activitatea ATP . microtubulii se disting ca structuri cilindroide de lungimi variabile (până la zeci de nm) şi cu un diametru relativ constant de 24 nm. diversele structuri microtubulare conţin diferite tipuri de molecule proteice. conferă microtubulilor un caracter polar. MAP1 este asociată microtubulilor din axoni şi dendrite. Codificate de o unică genă. (fig. s-a observat prezenţa unor proteine cu mase moleculare diferite. 4.

Fiecare dimer de tubulină conţine două molecule de GTP. prin adăugarea de noi dimeri de tubulină. la extremitatea + se formează un cap GTP. concentraţia dimerilor liberi este superioară valorii critice. Această concentraţie a fost numită concentraţie critică (Cc). Studiile în vitro au demonstrat formarea microtubulilor într-o soluţie pură de dimeri. Viteza mare a hidrolizei GTP are un efect contrar. are ca rezultat depolimerizarea microtubulilor. 95 . Deşi adăugarea sau pierderea subunităţilor de tubulină poate avea loc în oricare din capetele microtubului. alţii suferă un proces de depolimerizare. GTP este hidrolizat la GDP (guanozin difosfat). Când concentraţia dimerilor liberi depăşeşte valoarea critică predomină procesul de polimerizare. experimentelor in vitro. dar alungirea primer-ului. În ceea ce priveşte influenţa celui de-al doilea factor. Dacă.3. polimerizarea microtubulilor este favorizată. Viteza reacţiilor de polimerizare şi depolimerizare este de două ori mai mare la unul din capete. în timp ce unii microtubuli sunt subiectul unor repetate şi rapide procese de polimerizare şi depolimerizare. Pe parcursul polimerizării sau în etapa imediat următoare încorporării dimerului (preferenţial la capătul +). structuri ce-şi modifică lungimea ca rezultatul a reacţiilor de polimerizare şi depolimerizare. scăderea concentraţiei de tubulină. ceea ce conduce la formare GDP. viteza de disociere a dimerilor depăşeşte viteza de polimerizare.4. că. alungirea microtubulului. concentraţia dimerilor liberi reprezintă principalul factor implicat în reglarea polimerizării şi depolimerizării microtubulilor. iar viteza acestei reacţii este mai mare decât cea a hidrolizei GTP. numărul dimerilor adăugaţi fiind egal cu cel al subunităţilor disociate de microtubuli. în timp ce unii microtubuli se alungesc. Polaritatea şi dinamica microtubulilor Geneza microtubulilor este un proces de autoasamblare a tubulului.1. sunt stabili şi pot servi ca primer-i în procesul de polimerizare. în aceeaşi celulă (la aceeaşi concentraţie a dimerilor liberi) alţi microtubuli se alungesc continuu sau rămân la o lungime constantă pe parcursul perioadei de observaţie. Prezenţa structurii GDP este asociată cu instabilitatea microtubulilor. La o concentraţie scăzută a tubulinei libere (C < C C ). prima etapă a polimerizării. Sinteza microtubului primer. se desfăşoară lent. Modelul susţine că variaţiile locale ale celor doi factori pot determina evoluţia diferită a microtubulilor dintr-o celulă. In vitro. cu atât este mai favorizată formarea unui cap GTP şi deci. Capătul opus a fost notat cu minus (-). a evidenţiat aspecte surprinzătoare şi aparent contrare rezultatelor. Studiul dinamicii microtubulilor. asupra stabilităţii microtubulilor. Se constată astfel. determinând o accelerare a depolimerizării. Manifestarea simultană a fenomenelor de creştere şi descreştere în lungime a microtubulior este explicată prin modelul dinamic (dynamic instability model). Se demonstrează astfel caracterul dinamic al microtubulilor. sub concentraţia critică. În consecinţă. în timp ce. cu cât viteza de hidroliză a GTP este mai mică. în culturi de celule. se constată că. observaţiile electrono-microscopice subliniază funcţionalitatea diferită a extremităţilor acestor structuri. Stabilitatea microtubulului apare reglată de doi factori concentraţia de tubulină liberă şi viteza reacţiei de hidroliză a GTP. la o anumită concentraţie a dimerilor liberi de tubulină se atinge o stare de echilibru (steady state). Acest model sugerează că o anumită structură a extremităţilor microtubulilor de determină adăugarea sau disocierea subunităţilor proteice. Creşterea temperaturii la 37ºC este însoţită de reasamblarea microtubulilor. simbolizat cu plus (+). în prezenţa GTP (guanozin trifosfat) şi a ionilor bivalenţi. În consecinţă. este un proces mult mai rapid. Microtubulii care au o strucrură cap GTP. la 37ºC. se pot alungi. Expunerea unei soluţii de microtubuli la temperaturi scăzute (0ºC) are un rezultat contrar. determinând depolimerizarea cu eliberarea dimerilor αβ stabili.

Astăzi. Recent. La tubulinele beta se remarcă modificări ale segmentelor carboxi –terminale. s-a demonstrat că heterogenitatea subunităţilor de tubulină nu poate explica diversitatea structurilor microtubulare. deoarece modificările posttranslaţionale nu afectează semnificativ funcţionalitatea microtuburilor. Secvenţele de aminoacizi ale izotipurilor de alfa şi beta tubulină sunt aproape identice la păsări şi rozătoare. chiar şi în cadrul aceleiaşi celule.Microtubulii din axon sunt orientaţi cu capătul spre corpusculul bazal.Microtubulii citopasmatici au capătul (-) ancorat în regiunea pericentriolară. 56 – Orientarea microtubulilor în raport cu centrele de nucleaţie: A – Celulă ciliată aflată în interfază. caz în care poartă numele de izotipuri.1.1. B – Celulă nervoasă. Astfel.4. a subtipurilor de alfa şi beta tubulină.Microtubulii fasciculaţi dau naştere fibrelor fusului de diviziune ce se diferenţiază între cei doi centrii celulari prezenţi la polii opuşi ai celulei. tubulinele alfa sunt antrenate într-o reacţie de acetilare a unui rest de lizină şi suferă adiţia sau deleţia unei tirozine carboxi-terminale. rezultatul modificărilor posttranslaţionale. C – Celulă aflată în mitoză. Bazele diversităţii structurilor microtubulilor Deşi toţi microtubulii prezintă o organizare fundamentală comună. Aceşti factori a căror existenţă a fost demonstrată prin cercetări experimentale poartă numele de centrii organizatori ai microtubulilor (MTOC) sau centrii de nucleaţie.4. Aceste proteine sunt codificate de aceleaşi gene sau de gene diferite. particularităţile acestor structuri fiind dictate de tipul proteinelor asociate ce copolimerizează cu tubulinele sau se leagă de microtubuli ulterior polimerizării. Centrii organizatorici ai microtubulilor Distribuţia nealeatorie a microtubulilor în celulă a condus la ipoteza existenţei unor factori ce controlează nucleaţia. la organismele eucariote.Microtubulii din dendrite nu au o orientare fixă. 56). Microtubuli au o orientare strictă în raport cu centrele de nucleaţie (fig. structurile rezultate prin asocierea acestora sunt foarte diferite.5. Fig.Microtubulii ce intră în structura axonemei au capătul poziţionat proximal faţă de corpusculul bazal. Cercetări efectuate pe structurile microtubulare din neuron au condus la concluzia că fiecare microtubul conţine subunităţi alfa şi beta echivalente funcţional. diferenţierea şi dispunerea acestor formaţiuni celulare. diversitatea structurilor microtubulare a fost pusă pe seama existenţei. Este posibil că aceste modificări structurale să condiţioneze încorporarea subunităţilor în diferite structuri microtubulare şi legarea lor la proteinele asociate. Iniţial. dispunem de numeroase argumente ce atestă faptul că cel puţin centriolii şi corpusculii bazali acţionează ca centrii organizatorici ai micritubulilor. în mare parte. 4. Diferenţele dintre subtipuri sunt. 96 .

în axon toţi microtubulii au aceeaşi polaritate. 97 . În formarea microtubulilor ce alcătuiesc axonemele cililor şi flagelilor sunt implicate alte structuri microtubulare. Cercetările experimentale au demonstrat faptul că centriolii izolaţi sau însoţiţi de materialul pericentriolar sun capabili să iniţieze polimerizarea tubulinei in vitro şi să coordoneze nucleaţia microtubulilor in vivo. 4. numită centrul celular. Structura centrului celular este complexă. (fig. echidistant şi înclinate la un unghi de 30-40˚. Un argument în plus. Subfibrilele din fiecare triplet sunt notate cu A. Această structură. de o zonă mai puţin densă şi relativ omogenă. coordonează mişcările cililor şi flagelilor. din care lipsesc centriolii. centriolii stau la baza fenomenelor de motilitate manifestate în timpul diviziuni celulare. Ambele structuri microtubulare au forma unui cilindru ( 0.Capetele (-) sunt inserate în centrul organizator şi stabilizate de proteinele asociate.2. interconectat cu fibrilele periferice. este absentă în regiune distală a celor două structuri microtubulare. La baza axonului se remarcă prezenţa unui centru organizator. numită centrozom sau regiune pericentriolară. asemănătoare unei roţi cu spiţe. Microtubulii din celulele aflate în interfaza şi cei care alcătuiesc fibrele fusului mitotic îşi au originea într-o regiune perinucleară. centrosfera.2 µm diametru şi 0. Este posibil ca aceştia să dicteze şi poziţionarea microtubulilor liberi de vreme ce. Pereţi cilindrului sunt constituiţi din 9 fibrile dispuse circular. dar nu toţi microtubulii radiază din aceasta. format din 13 protofilamente. în timp ce. capetele (+) distale sunt libere. Se presupune că în celulele în care atât centriolii. La capătul proximal al centriolilor şi corpusculilor bazali se constantă prezenţa unui miez cilindric central. Microtubulii ce au ca punct de plecare centrul de nucleaţie prezintă o orientare obişnuită (capătul (+) liber). Ultrastructura centriolilor şi a corpusculilor bazali Studiile de microscopie electronică au condus la elucidare ultrastructurii centriolilor şi corpusculilor bazali. înconjuraţi de o zonă citoplasmatică amorfă. în favoarea rolului de centru organizator al centrozomului.5. localizate la baza organitelor locomotorii şi care poartă numele de corpusculi bazali. Fiecare fibrilă este formată din 3 subfibrile reprezentate de trei microtubuli. cât şi centrozomul sunt prezenţi ambele structuri coordonează formarea microtubulilor din celulele aflate în interfază şi acelor din fibrele fusului mitotic. ea constând dintr-o pereche de centrioli situaţi central. iar corpusculii bazali. 4.1. 57). ei sunt dispuşi fie cu capătul (+). la rândul său. Sechestrarea şi stabilizarea capetelor explică de ce în vivo adăugarea şi disocierea dimerilor are loc doar la capetele (+) libere.5. Centriolii şi corpusculii bazali În coordonare asamblării microtubulilor şi a motilităţi celulare un rol-cheie îl joacă structurile microtubulare specializate. ei radiind din regiunea pericentriolară.1. fie cu capătul (-) spre corpul celular. Fibrilele sunt imobilizate într-o matrice amorfă ce înconjoară cilindrul. capătul (-) este orientat spre corpul celular. Datorită absenţei centrului organizator în dendrite. în timp ce subfibrilele B şi C sunt incomplete (10-11 protofilamente). Subfibrila A este un microtubul complex.1. microtubulii nu păstrează aceeaşi polaritate. De la această orientate fac excepţie microtubulii din dendritele şi axonii neuronilor. În imaginile electronomicroscopice se observă însă că microtubulii nu au ca punct de plecare centriolii. îl constituie păstrarea capacităţii de organizare a microtubulilor în celulele eucariote. delimitată.4 µm lungime ).B şi C dinspre lumenul cilindrului spre exterior. Pe lângă rolul de centri organizatori ai microtubulilor.

În interfază. va conţine câte un cuplu de centrioli maturi.Fig. la începutul perioadei G1. Iniţial. proteinele sintetizate fiind apoi transportate şi integrate în corpusculii bazali. fiecare constituie dintr-un centriol matur şi altul în creştere. La sfârşitul perioadei G1. Perechile de centrioli migrează spre polii celulei unde în metafază alcătuiesc polii fusului de diviziune. În momentul în care ajunge la maturitate. sunt situaţi unul lângă altul cu axele lungi în unghi drept. el se separă de corpusculul parental. Cercetări recente au demonstrat existenţa la nivelul corpusculilor bazali a unei molecule mici (6-9 milioane pb ) de ADN linear. Un fenomen replicativ similar este întâlnit şi la corpusculii bazali. (fig. În momentul separări celulelor-fiice rezultate în urma diviziunii celulare fiecare. iar cele două perechi de centrioli. Fiecare fibrilă este un triplet de microtubuli (A. pentru ca în perioada sintetică ( S ) din fiecare centriol prexistent să se diferenţieze câte un centriolfiu. Replicarea centriolilor şi a corpusculilor bazali nu este pe deplin elucidată.Cele 9 fibrile periferice formează peretele unui element de formă cilindrică. 57 – Structura corpusculilor bazali şi a centriolilor. Fibrilele sunt legate între ele prin proteine conectoare.1. se separă. procentriolii se alungesc continuu. 98 . 4. atingând dezvoltarea maximă în metafază. centriolii se separă. centrul celular se divide. mai mici decât centrioli parentali. cei doi centrioli. Se presupune că translaţia are loc în ribozomii citoplasmatici. numit procentriol. Corpusculul nou format se diferenţiază din cel preexistent şi se orientează perpendicular pe aceasta. Fiecare procentriol este orientat perpendicular pe centriolul din care a provenit. Acest ADN conţine informaţia necesară codificării majorităţii proteinelor existente în corpusculi. Fig.3. 58).5. prezenţi în centrul celular. Replicarea centriolilor şi a corpusculilor bazali Replicarea centriolilor are loc la un anumit moment al ciclului celular. Prezenţa ADN la nivelul corpusculilor bazali explică capacitatea lor de autoreplicare. La începutul profazei.C). generând apariţia unui nou flagel sau a unui nou cil.B. 58 – Schema replicării centriolilor. orientaţi perpendicular unul pe celălalt şi înconjuraţi de materialul pericetriol.

faringe şi trahee. celulele ciliate se găsesc în mucoasa tractului respirator. În majoritatea cazurilor. ei sunt consideraţi variante ale acelaşi organit. Curbarea se propagă de-a lungul cilului determinând revenirea organitului la poziţia iniţială (fig. mişcările se propagă de la baza organitului către capătul său opus.2 secunde. Fiecare ciclu durează 0. ce formează o suprafaţă ciliată este defazată. 4. 59 – Schema mişcărilor cililor. Bătaia constă în înclinarea sub un unghi larg a cilului aflat în extensie. Interconvertibilitatea demonstrată a centriolilor şi corpusculilori bazali.având rolul de a îndepărta particulele materiale ce pătrund în momentul inspirului în cavităţile nazale. diferenţa de fază între mişcările a doi cili consecutivi fiind constantă. cu amplitudine constantă. Cilii execută mişcări ciclice. energia necesară fiind furnizată prin hidroliza ATP. asemănările structurale şi funcţionale dintre aceştia şi nu în ultimul rând prezenţa ADN au condus la concluzia că centrii organizatorici ai microtubulilor sunt componente ale unui sistem citoplasmatic. La mamifere. Atât mişcarea cililor.Există date experimentale ce confirmă presupunerea prezenţei în centrioli a unui ADN propriu. cât şi a flagelilor sunt procese energo-dependente. 59). cilii asigurând deplasare ovulului.6. în acelaşi plan. Se sugerează că ADN centriolar se găseşte în nucleu într-o formă inactivă.1. Ele sunt prezente şi în mucoasa oviductului. molecula este activă. 99 . Flageli execută mişcări ondulatorii. Fig. prezente în multe celule eucariote animale şi vegetale. iar în urma translocării sale în centriol. moment ce marchează începutul mişcării de întoarcere. în doi timpi: o bătaie activă şi o alta de întorcere. Deşi între cili şi flageli există unele deosebiri. Mişcările cililor şi flagelilor Cilii şi flagelii sunt prelungiri celulare cu caracter permanent. Mişcarea cililor. Spermatozoidul este singura celulă flagelată din organismele mamifere.inclusiv la om. Aproape concomitent are loc curbarea cilului în regiunea bazală. Capacitatea celulei de a coordona modificările morfologice şi funcţionale ce însoţesc procesele de creştere şi diferenţiere celulară se pot explica prin activarea şi dezactivarea centrelor de nucleaţie. ca rezultat al cooperării dintre unitatea genetică nucleară şi cea proprie sistemului citoplasmatic. Uneori mişcarea sub forma unei unde plane este înlocuită de o altă helicoidală.1-0.

Peretele axonemei este alcătuit din 9 fibre periferice. Tot din subfibrile A pleacă spre centrul axonemei braţe radiale ce se termină în aproprierea tecii interne. Cele 2 subfibrile sunt notate cu A şi B. Fibra periferică este un dublet de microtubuli. Subfibrila A este un microtubul complet (13 protofilamente).6. Braţele externe ale dineinei apar de-a lungul microtubulilor la intervale regulate de 24 nm. Structura axonemei. Cele 2 fibre centrale sunt interconectate prin punţi transversale şi înconjurate de o structură fibrilară numită teaca internă. sunt ancorate 2 braţe orientate în direcţia acelor ceasornicului şi alcătuite dintr-o proteină ce poartă numele de dineină.1. Axonema este alcătuită din 9 fibre periferice şi 2 centrale. înconjurată de hialoplasmă şi protejată la exterior de o membrană celulară simplă.4. Subfibrila A este un microtubul complet (13protofilamente). la baza structurii lor aflându-se microtubulii. numită axonemă. notate cu C1 şi C2 . Rolul-cheie în interconectarea microtubulilor revine unei proteine numită tectină. 60). generată prin expansiunea plasmalemei. Fiecare este alcătuită dintr-un unic microtubul 1 (singlet). interconectate prin punţi transversale şi înconjurate de teaca internă.1. În lumenul axonemei se găsesc singletele centrale. subfibrila B este un microtubul incomplet (10 – 11 protofilamente). corpusculul bazal şi rădăcinile. Structura cililor şi a flagelilor Cilii şi flagelii celulelor eucariote au un plan de organizare comun. în partea opusă subfibrilei b. Fibrele periferice sunt dublete subfibrilare ce se extind din corpusculul bazal în flagel (cil). În regiunea centrală a lumenului axonemei sunt localizate cele 2 fibre centrale. Ambele organite sunt alcătuite din trei părţi: cilul sau flagelul propriu-zis. fiecare formată din două subfibrile (A şi B ). Cilul sau flagelul propriu-zis constă dintr-o structură microtubulară complexă. Fig. 100 . iar distanţa dintre braţele interne succesive este de 32 nm. prin regiuni regulare şi care creează imaginea unei roţi cu spiţe. 60 – A. B. (fig. De subfibrila A. Braţele dineinei şi elementele radiale sunt ataşate pe subfibrila A. în timp ce subfibrila B este incompletă (10-11 protofilamente).

convertind glisarea dubletelor într-o mişcare de înclinare a axonemei. Această deplasare a punţilor laterale dintre fibrele determină alunecarea dubletelor unul faţă de altul şi în consecinţă înclinarea cilului (flagelului). dintr-un dublet. Fibrele din cei doi asteri ce se găsesc în contact se alungesc prin polimerizarea tubulinei. Cei doi centrozomi coordonează nucleaţia microtubulilor care prin asociere generează fibre. cu capătul (-) inserat în centrozom şi capătul (+) distal.6. determinând depărtarea centrilor celulari şi deplasarea lor spre polii celulei. 4.1. este legată de subfibrile B a dubletului adiacent prin intermediul unei proteine contractile numită nexină. La extremitatea fiecărui braţ de dineină există 2-3 regiuni globulare. Spre deosebire de cili. liber. Intrarea celulei în diviziune este anticipată de autoreplicarea centriolilor. sunt dispuse de jur-împrejurul fiecărui centrozom şi poartă numele de fibre asteriene (“stelare”). (fig.7. cu caracter permanent între dubletele externe.1. În timpul mişcării cililor şi flagelilor.1. 4. Această limitare a mişcări este impusă pe de o parte de existenţa unei legături rigide.Axonema este stabilizată prin interconectarea fibrelor periferice.7. iar pe de altă parte de diferenţele morfologice dintre fibrele centrale. Nexina. scindarea materialului pericentriolar şi formare celui de-al doilea centru celular. Elementele radiale şi teaca internă au rolul de a coordona intrarea în acţiune a dineinei. având o orientare unipolară. flageli se mişcă în acelaşi plan. 101 .000 Da) cu activitatea ATP azică. Fibrele.2. împiedică disocierea dubletelor în momentul glisării. Totalitatea fibrelor asteriene ce radiază dintr-un singur centrozom alcătuieşte asterul. unde vor constitui polii fusului de diviziune. ƒ translocarea cromozomilori anafazici. Formarea fusului de diviziune În celulele aflate în interfază. Mecanismul molecular al mişcări cililor şi flagelilor În mişcările cililor şi flagelilor un rol important îl joacă dineina. Implicarea microtubulilor în diviziunea celulară Microtubulii joacă un rol-cheie în trei procese importante ce se desfăşoară în cadrul diviziuni celulare: ƒ formarea fusului de diviziune. 61). de la baza cilului (flagelului) spre vârful acestuia. o proteină alcătuită din mai multe polipeptide. energia eliberată prin hidroliza ATP este utilizată în scopul desfacerii şi refacerii succesive a legăturilor dintre dineinile ataşate de subfibrila A a unui dublet şi subfibrila B a dubletului adiacent. Subfibrila A. proteina contractilă ce leagă fibrele periferice adiacente. 4. reprezentate de un polipeptid (400.1. cu mase moleculare variate. ƒ deplasarea cromozomilori în planul ecuatorial şi celulei şi alinierea în ƒ placa metafazică. microtubulii citoplasmatici radiază din centrozomul centrului celular. Cilul sau flagelul propriu-zis este ancorat în corpul celular prin rădăcini cu o structură variată.

Totalitatea fibrelor asteriene. fibrele polare pătrund în spaţiul nuclear şi ancorează prin capetele (+) kinetocorii cromozomilor. Alungirea fibrelor asteriene şi deplasarea celor doi centrii celulari spre polii opuşi ai celulei. fiecare conţinând fibrele ce pleacă de la un singur centrozom. ce se dezvoltă pe cele două feţe opuse ale centromerului (constricţie primare) la nivelul căruia sunt unite cele două cromatide ale cromozomului metafazic.Fig. Acestea se alungesc prin adăugarea dimerilor de tubulină la capetele (+) libere. Fibrele ce leagă kinetocorii de polii fusului de diviziune se numesc fibre kinetocorice. 102 . împiedicând depolimerizarea acestora. În momentul dezorganizării membranei nucleare. Caracterul polar al fusului de diviziune poate explica prin existenţa unui proces de stabilizare selectivă a fibrelor polare. c) – diferenţierea fibrelor polare ale fusului de diviziune între cei doi centrii celulari. Formarea acestei structuri specializate în interconectarea cromozomilor cu polii fusului de diviziune este controlată de secvenţe de ADN. alcătuieşte fusul mitotic sau fusul de diviziune. Kinetocorii sunt complexe multiproteice cu structura trilamelară. Fusul de diviziune este format din două semifusuri. numite ADN centromeric. 61 – Formarea fusului de diviziune: a) – fibrele asteriene radiază din regiunea pericentriolară. Secvenţele au capacitatea de a lega proteine specifice ce iniţiază formarea complexului multiproteic. b) – replicarea centriolilor are drept consecinţă apariţia celui de-al doilea centru celular. polare şi kinetocorice ce radiază din cei doi centrozomi. Fibrele ce pleacă din centrozom spre planul ecuator al celulei poartă numele de fibre polare. În acest proces sunt implicate proteine asociate microtubulilor ce interconectează în plan ecuatorial fibrele polare învecinate antiparalele. d) – ancorarea cromozomilor la polii fusului de diviziune prin fibrele kinetocorice.

i se opune o forţă ce atrage cromozomii spre polul opus. Injectând tubulină marcată. 103 .1. s-a constatat că dimeri sunt incorporaţi la capătul (+) al fibrelor kinetocorice. Deplasarea cromozomilor spre planul ecuatorial al celulei este determinată în parte de polimerizare fibrelor kinetocorice. Primul eveniment constă în deplasarea cromatidelor surori spre polii opuşi ai fusului de diviziune şi constituie anafaza A. fibrele kinetocorice se scurtează prin disocierea de tubulină de la capetele (+) (fig. oscilând între cei doi poli ai fusului de diviziune.2. ceea ce justifică permanenta reajustare a poziţiei lor prin mişcarea oscilatorii de mică amplitudine. Fig. Având ambele capete protejate. Aceasta demonstrează caracterul elastic al fibrelor kinetocorice. În timpul acestor mişcări. în urma exciziei kinetocorului. Deplasării cromozomilor. Cele două forţe de respingere şi atracţie. S-a observat că. 62).3. Ruperea experimentală a fibrelor kinetocorice ce leagă cromozomul de unul din polii fusului de diviziune este precedată de rapidă deplasare a cromozomului spre polul de care a rămas ataşat. 62 – Deplasarea cromozomilor spre polii opuşi ai celulei în anafază. prezentând kinetocorii spre cei doi poli ai celulei. acţionează asupra cromozomilor şi după alinierea lor în placa metafazică. O explicaţie a acestui fenomen ar putea-o constitui rapida polimerizare a fibrelor fusului de diviziuni ce generează un curent care respinge structurile neataşate spre regiunea ecuatorială a celulei. un set de fibre polare capturează unul din cei doi kinotocori ai cromozomului.1. prin microchirurgie cu raze laser de pe un braţ cromozomial. Mişcarea braţului.7. ancoraţi în fibrele de diviziune. Fiecare cromozom va avea astfel o orientare strictă în raport cu fusul diviziuni. împiedicându-le depolimerizarea. Translocarea cromozomilor anafazici Desăvârşirea replicării centromerilor şi separarea cromatidelor surori ale cromozomilor metafazici marchează sfârşitul metafazei şi iniţiază o altă etapă a mitozei. Până în prezent au fost elaborate trei modele teoretice alternative ale acestui mecanism. spre polii celulei.4.7. Aceasta sugerează că kinetocorul protejează capetele (+) ale fibrelor kinetocorice. anafaza. Pe parcursul anafazei A. 4. cromozomii se mişcă dezordonat. după care şi celălalt kinetocor este ancorat de fibrele polare ce pleacă din centrozomul opus. nu se datorează ancorării sale la fibrele fusului de diviziune. Mecanismul prin care cromatidele ascensionează spre polii fusului de diviziune nu este încă elucidat. aceasta se depărtează spre polul fusului de diviziune cel mai apropiat. Aceste fibre au capătul (-) inserat în controzom şi capătul (+) legat de kinetocor şi stabilizat prin proteine. În timp ce detaşarea prin micromanipulare a fibrelor kinetocorice de cromozomi declanşează un proces rapid de depolimerizare a acestor fibre. Polimerizarea fibrelor kinetocorice nu reprezintă singurul proces ce explică deplasarea cromozomilor şi alinierea lor în placa ecuatorială. lipsit de kinetocor. prin kinetocor şi centrozom. În anafază au loc două evenimente distincte cu o desfăşurare simultană în timp. Deplasarea cromozomilor spre regiune ecuatorială a celulei şi alinierea lor în placa metafazică În prometafază. Forţa este direct proporţională cu lungimea fibrelor kinetocorice. spre unul din cei doi poli. fibrele kinetocorice au o stabilitate mult superioară celorlalte fibre ce alcătuiesc fusul de diviziune. într-o celulă aflată în metafază.

Fibrele antiparalele sunt împinse spre centrii celulari determinând. din corpul celular.în final. Elementul central al celulei de-al doilea model îl constituie depolimerizarea fibrelor kinetocorice.8. În cel de-al treilea model. în axon are loc şi un transport retrograd în care sunt antrnate vezicule ce conţin fragmente de membrană şi proteine citosolice. În stricta orientare a transportului intracelular un rol-cheie îl joacă microtubulii. Forţa ce determină acest proces este generată de interacţiunea fibrelor polare antiparalele (din cele două semifusuri) ce se întrepătrund în regiunea ecuatorială a fusului de diviziune. Ele sunt transportate în anumite situsuri. în timp ce proteinele ce intră în alcătuirea citoscheletului se deplasează foarte incet (fracţiuni de mm/zi). prezenţa proteinelor şi a organitelor celulare fiind rezultatul unui proces de transport de la situsurile de sinteză. Al doilea eveniment îl constituie anafaza B şi este reprezentat de alungirea fusului mitotic şi depărtarea centrilori celulari. rolul-cheie îl joacă anumite proteine kinetocorice cu activitate ATPazică similare dineinei şi kinezinei. celulele nervoase. Rezultatele cercetărilor efectuate au condus la elaborarea unui model al mecanismului elongarii fusului de diviziune. prin metode autoradiografice. Prin adăugarea dimerilor de tubulină la capetele (+) libere ale fibrelor polare antiparalele acestea se alungesc şi se suprapun în regiunea ecuatorială a fusului de diviziune. pe direcţi şi cu viteze caracteristice. unde vor fi degradate de către enzimele lizozomale. Se presupune că proteinele cu activitate ATP . În paralele. Energia eliberată prin hidroliza ATP permite deplasarea proteinelor de-a lungul fibrelor polare ce alcătuiesc al doilea semifus. a proteinelor libere sau incorporate în organitele celulare ce îi conţineau. Cu cea mai mare viteză (3mm/sec) sunt deplasate particulele şi veziculele mici. depărtarea lor. Experimentul a demonstrat că deplasarea proteinelor. care antrenează în această mişcare întreaga cromatidă. studiul implicării acestor elemente de citoschelet în transportul intracelular a folosit.azică sunt ataşate de fibrele polare ale unui semifus. fibrele kinetocorice au numai rolul de a direcţiona deplasarea cromatidelor. 104 . Procesul poartă numele de transport axonal anterograd. Modelul se bazează pe două elemente: polimerizarea fibrelor polare şi presupunerea axistenţei unor proteine cu activitate ATP-azică. Disocierea dimerilor de tubulină este însoţită de ruperea şi refacerea ciclică a legăturilor dintre proteinele kinetocorice (ce nu prezintă activitatea ATP – azică) şi microtubulii ce alcătuiesc fibrele kinetocorice. Aceste proteine manifestă probabil o afinitate crescută pentru tubulina polimerizată. Energia eliberată prin hidroliză ATP asigură deplasarea de-a lungul fibrelor a proteinelor kinetocorice cu funcţie ATP-azică. Acestea se deplasează dinspre terminaţiile sinaptice spre corpul celular. Forţa ce determină această mişcare este generată de alte structuri. veziculele şi particulele proteice nu se deplasează haotic în spaţiul intracelular.În primul model. Această alegere se baza pe faptul că ribozomii sunt absenţi din axoni neuronilor. Proteinele leaga capetele (+) ale fibrelor kinetocorice şi le stabilizează. Prin deplasarea proteinelor sun expuse capetelor (+) ale fibrelor kinetocorice care suferă depolimerizarea.Transportul intracelular mediat de microtubuli Organitele. similare dineinei sau kinezinei. Transportul axonal anterograd a fost pus în evidenţă prin injectarea aminoacizilor marcaţi radioactiv şi urmărirea.1. 4. cum ar fi un sistem de filamente elastice ce interconecteză kinetocorii şi polii fusului de diviziune. veziculelor şi a organitelor nu are loc cu aceeaşi viteză. diviziune în timpul anafazei B. spre regiunea sinaptică. Nu este exclusă posibilitatea ca prin interacţiile cu cortica celulară microtubulii din fibrele asteriene să participe la deplasarea în direcţii opuse a polilor fusului. Iniţial. ca sistem experimental.

se pot observa două organite deplasându-se de-a lungul aceluiaşi filament. microtubulul. iar prin celălalt capăt. fără a intra în coliziune. Modul în care kinezina utilizează energia eliberată prin hidroliza ATP pentru a asigura transportul veziculelor de-a lungul microtubulului este încă neelucidat (fig. Responsabilă de transportul retrograd al veziculelor este o proteină asociată cu microtubulii plasmatici numită MAPIC (1. Molecula alcătuită din patru lanţuri polipeptidice este capabilă să lege. de fapt. întâlnim microfilamentele izolate cu o distribuţie relativ difuză şi dinamică. În mod similar kinezinei. cât şi deplasarea veziculelor necesită prezenţa în sistem a ATP şi a unor proteine specifice cu funcţia ATP-azcă. microtubuli plasmatici. Atât în celulele musculare. kinezina de deplasează de-a lungul microtubulului împreună cu vezicula pe care a legat-o. b) Imobilizate pe suprafaţa unei plăci de sticlă. şi reagregarea lor în interfaza ciclului celular. vezicula transportată. numită miozină. proteina MAPIC este capabilă să lege microtubulul şi vezicula de transport. s-a realizat un sistem experimental ce conţinea microtubuli obţinuţi prin autopolimerizarea dimerilor necontaminaţi cu proteine asociate sau citosolice şi vezicule sinaptice izolate din diferite tipuri celulare. Pentru a înţelege mecanismul transportului intracelular asociat microtubulilor.000 Da) sau dineină citoplasmatică. 105 .O valoare intermediară o are viteza de transport a mitocondriilor. deoarece ea se deplasează întotdeauna de la capătul (-) al microtubulului spre capătul (+) al acestuia. Microfilamentele Microfilamentele de actina sunt componente citoplasmatice prezente în toate celulele eucariote. studiul efectuat pe culturi de fibroblaste a demonstrat implicarea microtubulilor în dispersarea veziculelor rezultate prin fragmentarea aparatului Golgi.000. În plus. În citoplasma tuturor celulelor. cu excepţia celor musculare. Fig. printr-unul din capete. folosind energia rezultată din hidroliza ATP. 63 a) Transportul anterograd al veziculelor de-a lungul microtubulilor mediat de kinezină. Una dintre aceste proteine este kinezina (380. În prezenţa ATP. S-a observat că atât legarea. cât şi în alte tipuri celulare ele sunt asociate cu o proteină fibrilară. Tehnica microscopiei computerizate în contras de fază a permis vizualizarea asocierii organitelor cu structuri celulare filamentoase şi deplasarea lor de-a lungul axonului. Aceasta indică faptul că fiecare filament transportor conţine mai multe “benzi de transport “ pentru organitele celulare. 63). pe parcursul mitozei. dar ea se deplasează dinspre capătul (+) spre capătul (-) al microtubulului. în direcţi opuse.000 Da). 4. În unele cazuri. Proteina asigură transportul anterograd al veziculelor. 2. moleculele de kinezină deplasează microtubulul asociat spre capătul său (-). Încercările de a caracteriza aceste filamente au condus la concluzia că ele reprezintă.

metilarea unui rest de histidină) sunt responsabile de apariţia unui număr atât de mare de specii moleculare. este posibil ca speciile moleculare de actină să manifeste o afinitate diferită faţă de proteinele citoplasmatice cu care se asociază. Fiecare specie moleculară de alfa actină este prezentă exclusiv într-un singur tip de celulă musculară (din muşchii striaţi. 4 prezintă un grad înalt de omologie (din cei 375 de aminoacizi doar 6 sunt diferiţi). În fibrele de stress. Filamentele de actină obţinute în vitro sunt identice cu microfilamentele izolate din celule. Atât polaritatea subunităţilor componente. Fig. încă.Acestea participă alături de microtubulii citoplasmatici şi filamentele inermediare la organizarea stucturii complexe a citoscheletului. în vitro. Pe fiecare tur de helix se găsesc două molecule de actină. La păsări şi mamifere există cel puţin 6 gene diferite ce codifică actina. conformaţie şi secvenţă de aminoacizi similare. Aceste forme diferite de organizare a microfilamentelor. Actinele. 106 .Experimentele in vitro au demonstrat că moleculele de actina purificate din diverse surse sunt capabile să copolimerizeze şi că toate stimulează activitatea ATP . 64). Aceste proteine se numesc alfa actine. inelele contractile şi microvili. Acest lucru ar explica funcţiile diferite ale microfilamentelor. microfilamentele sunt fasciculate (asociate în mănunchiuri). cât şi stricta orientare a acestora în structura helicoidală conferă polaritate filamentului de actină. Acest fapt sugerează că genele codanate au evoluat dintr-o genă ancestrală comună. În celulele musculare microfilamentele participă la realizarea contracţiei musculare. cât şi un rol dinamic. La o concentraţie ionică similară cele existente în spaţiu intracelular actina G polimerizează. având caracter polar. miocard. Adăugarea monomerilor sau disocierea lor pot avea loc la oricare din capetele microfilamentului. generând filamente de actină.000 Da. de susţinere. Se apreciază că modificările posttranslaţionale (acetilarea aminoacizilor din segmentul amino-terminal. Din cele 6 proteină. muşchii netezi ce delimitează vasele sangvine sau muşchii enterici ce mărginesc lumenul intestinal). Deşi. Celelalte 2 specii moleculare de actină notate cu beta şi gama au un grad de omologie mai scăzut şi sunt prezente în citoplasma tuturor tipurilor celulare.2. se asociază cap la coadă formând un helix monocateran cu o grosime aproximativ de 7 nm. 4. Fiecare monomer este orientat perpendicular pe axa helixului stabilind interacţii puternice cu cei doi monomeri situaţi în imediata vecinătate şi interacţii slabe cu moleculele de actină G dispuse la dreapta şi la stânga sa de-a lungul helixului (fig. izolate din diferite organisme şi tipuri celulare. ele îndeplinind atât un rol structural.azică a miozinei. dar viteza cu care se desfăşoară reacţiile de polimerizare şi depolimerizare la capătul (+) este de 5-10 ori mai mare decât la capătul (-). nedemonstrat experimental. Microfilamentele de actină Actina reprezintă principala componentă a microfilamentelor. numite actină fibrilară sau actină F. În filament moleculele de actină G. Dinamica microfilamentelor aminteşte de cea a microtubulilor. 64 – Modelul molecular al actinei fibrilare (actina F). au mase moleculare. Încercările de izolare şi caracterizare a acestor proteine au evidenţiat faptul că numărul tipurilor de actine este mai mare decât cel al genelor care le codifică. Aspectul globular al proteinei justifică denumirea de actină globulară sau actină G.Actina este un polipeptid cu o masă moleculară de 42. cât şi funcţiile asociate lor sunt determinate de tipul proteinelor ce leagă specific actina. fiind implicate în mişcările celulare ce au la bază mecanismul actină – miozină.1.

Molecula este alcătuită din două lanţuri grele şi două perechi de lanţuri uşoare. iar al doilea domeniu meromiozina uşoară (LMM). ea a constituit subiectul numeroaselor cercetări experimentale. Până în prezent se cunosc 2 specii moleculare ale acestei proteine. numită coadă şi o regiune globulară carboxi – terminală. cât şi în alte tipuri celulare. îl joacă în contracţia musculară.miozină. Prin tratarea domeniului HMM cu papaină segmentul de coadă este degradat şi sunt eliberate fragmentele S1. monomeri de actină leagă strâns ATP. Perechile de lanţuri uşoare sunt ataşate celor două regiuni globulare.2. Miozina Miozina este o proteină cu largă răspândire în celulele organismelor eucariote. numită cap.65).2. 107 . Posibilele structuri cap ATP sau ADP nu influenţează polimerizarea monomerilor şi aceasta se datorează. În consecinţă. prezintă activitate ATP – azică. dar diferite de lanţurile celeilalte perechi. Fiecare este format dintr-o regiune alfa heicoidală cu o lungime de 30 nm. numită cap şi o regiune α – helicoidală. Pe regiunea globulară ce formează capul lanţurilor grele ale miozinei. Regiunile alfa helicoidale ale celor 2 lanţuri grele sunt răsucite una în jurul celeilalte. sunt localizate atât situsurile de legare ale ATP cât şi cele pentru actină. în timp ce regiunile globulare rămân separate. ce conţin câte un cap globular şi perechea de lanţuri uşoare asociate acestuia. Miozina de tip II (470. numită coadă. Miozina tip I este absentă în celulele musculare. din celulele musculare. Lanţurile grele sunt identice. cuprinde segmentul aminoterminal al cozilor. meromiozina grea (HMM) conţine capul bilobat şi un segment din coada lanţurilor grele. Lanţurile uşoare ce alcătuiesc o pereche sunt identice între ele. Miozina poate fi scindată la nivelul punctelor de flexiune sub acţiunea unor enzime cu activitate proteazică.000 Da/lanţ). Primul punct de flexiune este situat în regiunea alfa hericoidală. Miozina de tip II se găseşte atât în celulele musculare din muşchii striaţi şi netezi. În structura de miozină II se remarcă existenţa a două puncte de flexiune ce marchează domeniile structurale ale prote (fig. ea fiind implicată în fenomenele de motilitate celulară. microfilamentele sunt structuri mult mai stabile decât micro tubulii.15M. Primul domeniu. cu diametrul de 4 nm. Datorită rolului pe care miozina de tip II. în timp ce al doilea separă capul bilobat de coada moleculei. în mare parte. concentraţia intracelulară a monomerilor liberi este mult mai mare decât concentraţia critică. ce au la bază mecanismul actină. Lanţurile grele prezintă câte o regiune amino – terminală globulară.KCI) este favorizată polimerizarea actinei. Chimotripsina scindează miozina în două domenii. 4. faptului că la concentrarea ionică intracelulară (0.Similar dimerilor de tubulină ce stabilesc interacţii puternice cu GTP. Această stabilitate este accentuată prin ataşarea de microfilamente a proteinelor asociate. Molecula prezintă două puncte de flexiune. Hidroliza ATP are loc imediat după încorporarea actinei G în microfilament. Fig.000 Da/lanţ) şi 2 perechi de lanţuri uşoare (20. Pe de altă parte. Fragmentele S1.000 Da) este alcătuită din 6 lanţuri polipeptidice dintre care 2 lanţuri grele (230. carboxi – terminală. 65 – Modelul molecular al miozinei.

sângele este pompat în circuitul sanguin. În cele 2 regiuni terminale. În acest caz. cei netezi se contractă mai lent. fiind prezenţi la nivelul intestinului gros şi subţire al vezici biliare şi al vaselor sangvine. în aceste celule. capetele (+) ale filamentelor de actină sunt ancorate în membrana plasmatică şi/sau stabilizate prin proteine asociate.2. Muşchii striaţi primesc o inervaţie motorie somatică. Regiunea centrală are un caracter exclusiv fibrilar fiind formată prin suprapunerea cozilor antiparalele ale moleculelor de miozină.4. Orientarea moleculelor în filament imprimă acestuia un caracter bipolar. viteza de hidroliză a ATP creşte de 200 de ori. Formarea reţelei de microfilamente este reglată de factori proteici şi concentraţia ionilor de Ca. Filamentele groase (diametru 150-200 Å) conţin 500-600 molecule de miozină. Actina şi miozina în celule nemusculare Filamentele de actină din celulele nemusculare au un pronunţat caracter tranzitoriu. Datorită inserţiilor osoase ei asigură deplasarea şi păstrarea poziţiei corpului. ceea ce face dificilă vizualizarea lor la microscopul electronic. Deoarece profilina blochează etapa de nucleaţie. tensiunea dezvoltată fiind menţinută pe o durată mai mare de timp.2. 66). Polimerizarea implică agregarea cozilor moleculelor de miozină. În celulele nemusculare. dar se află ca şi muşchii netezi sub controlul inervaţiei vegetative. Prin contracţia lor.Studiile biochimice au evidenţiat faptul că în prezenţa filamentelor de actină activitatea ATP – azică a miozinei este stimulată. 108 . polimerizarea putând avea loc doar la capatul (+) al acestuia. este profilina. În mod obişnuit. Muşchii cardiaci se aseamănă din punct de vedere structural cu cei striaţi. Contracţia şi relaxarea muşchilor netezi asigură deplasarea alimentelor de-a lungul tractului digestiv şi controlează diametrul vaselor sangvine. Organizarea în filamente a miozinei a fost pusă în evidenţă. Musculatura netedă prezintă o inervaţie vegetativă. realizată de structuri specializate din muşchii striaţii. Rolul actinei şi miozinei în contracţia musculară Mecanismul actină – miozină stă la baza unui tip particular de mişcare celulară.3. Fiecare filament este alcătuit dintr-o regiune centrală şi 2 regiuni terminale. În plus modul de legare a profilinei la monomer face imposibilă legarea complexului la capătul (-) al unui filament de actină preexistent. profilina este eliberată creând posibilitatea adăugării unui alt complex şi alungirii filamentului. filamentele de miozină au dimensiuni mici (diametru 60 Å) şi caracter tranzitoriu. 4. pentru prima oară. profilina blochează complet polimerizarea actinei (fig. Proteina se leagă de monomerii de actină formând un complex numit profilin-actină. 4. în celulele musculare unde ele au o structură particulară şi sunt numite filamente groase. Muşchii netezi înconjoară organele interne. capetele moleculelor de miozină se ataşează de jur-împrejurul filamentului. Moleculele de miozină polimerizează generând filamente de miozină. determinând îngroşarea acestuia. Una dintre cele mai importante proteine ce influenţează procesul de polimerizare a actinei. complexul este incapabil să polimerizeze spontan. netezi şi cardiaci şi care poartă numele de contracţie musculară. După legarea profilin-actinei la capatul (+) al filamentului de actină. Spre deosebire de muşchii striaţi.

109 . Prezenţa calmodulinei. menţinând forma microvilului. Filamentele prezintă aceeaşi polaritate. 4. rămânând ataşate la capătul (+) al fiecărui fragment.4.Rolul profilinei în polimerizarea actinei. 66. explică absenţa complexului troponinic din celulele nemusculare. microvilii sunt alcătuiţi dintr-o regiune centrală şi o reţea terminală (fig. La o concentraţie citosolică mare a ionilor de Ca.1.2. în celulele nemusculare. Filamentele de miozină din celulele nemusculare sunt mult mai mici (10-20 molecule) decât cele din celulele musculare. Ei contribuie la mărirea cu 25% a suprafeţei de absorbţie a celulelor epiteliale. Microvilii Microvilii sunt expansiuni ale celulelor epiteliale ce delimitează lumenul intestinal şi al tubului contort proximal în rinichi. vilina (nu şi gelsolina) este capabilă să accelereze procesul de polimerizare al actinei. 67).Fig. Molecula de miozină se aseamană cu cea din muşchii netezi. O dată cu scăderea concentraţiei Ca2+. împiedicând astfel reasamblarea filamentelor. Ele indeplinesc un rol structural. interconectând filamentele de actină în mănunchiuri. Activarea funcţiei sale ATP-azice necesită fosforilarea lanţurilor uşoare şi este reglată de complexul calmodulină – Ca2+. proteinele rup filamentele lungi de actină. ca proteină reglatoare. Reglarea procesului de polimerizare şi depolimerizare a actinei prin ionii de Ca este mediată de cel putin două proteine similare ca structură şi funcţie: vilina şi gelsolina. dintre care : tropomiozina şi alfa-actinina. Ambele proteine joacă şi un rol structural. Structuri necontractile. Regiunea centrală este reprezentată de un manunchi de filamente de actină dispuse paralel. Capetele (+) sunt indreptate spre vârful microvilului. Din celulele nemusculare au fost izolate şi proteine asociate intalnite în celulele musculare.

tropomiozina şi alfa actinina. asociată filamentelor de actină din microvili. 67. 4.2. numita inel contractil. dintre care fimbrina şi vilina. este o proteină similară miozinei de tip I. Cea mai interesantă proteină. ceea ce determină micşorarea continuă a diametrului inelului contractil şi. regiunea centrală este ancorată într-o reţea terminală.2. prezentă în reţeaua terminală. au fost izolate alte proteine asociate filamentelor de actină. proteina 110.Elementul central îl reprezintă mănunchiul de filamente de actină. În inelul contractil .). Ambele proteine au rolul de a stabiliza filamentele în mănunchiuri. flamentele scurte bipolare de miozina şi filamentele de actină sunt organizate în microsarcomere similare celor din muşchii striaţi. dar mult mai mici. cu activitate ATP-azică. din care lipsesc discurile Z.Filamentele sunt interconectate prin proteine de legare şi ancorate în membrana plasmatică ce delimitează microvilul prin proteina 110 Kda şi calmodulina. Filamentele din reţeaua terminală interconectează filamentele de actină din manunchi şi leagă mănunchiurile între ele. spectrina etc. separarea toatală a celor 2 celule fiice rezultate prin diviziunea celulară. Inelul se contractă prin mecanismul actină-miozina. La polul bazal.Filamentele de actină fasciculate se extind din corpul microvilului în reţeaua terminală unde sunt stabilizate prin intermediul unor proteineconectoare (fodrina.Fig. Ele alcătuiesc o structura contractila. Acelaşi rol îl joacă şi fodrina. in final.4. Rolul actinei şi miozinei în citokineza Filamentele de actină şi miozina joacă un rol in desfaşurarea citokinezei la celulele animale. principală proteina asociată. alcătuită din filamente scurte de actină şi proteine asociate. Impreună cu calmodulina.Structura microvililor. cu caracter tranzitoriu. Se apreciază ca tensiunea generată de proteina similară miozinei de tip I asigură menţinerea în poziţie centrală a mănunchiului de filamente. proteina leagă filamentele de actină de la exteriorul manunchiului de membrana ce delimitează microvilul. 110 . localizat imediat sub membrana plasmatică la nivelul şantului de clivare. Filamentele de actină şi minisarcomerele adiacente sunt legate prin alfaactinina şi probabil şi alte proteine asociate. În schimb. Din regiunea centrală lipsesc miozina. Simultan are loc un proces de depolimerizare a filamentelor de actină.

pe direcţia miscării m prelungirii celulare. fiind supusă în acelaşi timp tensiunii generate de ondulatiile de suprafata. Alte proteine asociate filamentelor de actină din ectoplasma sunt alfa actinina şi gelsolina (fig. Procesele inverse au loc în momentul retractarii pseudopodelor. Acţiunea conjugată a acestor 2 forţe conduce la elongarea fibrei retractile. efectuate iniţial pe protozoare şi ulterior extinse la celulele din organismul uman ce prezintă acest tip de locomoţie. Fig. asigură probabil tranziţia hialoplasmei în starea de gel. Aceşti doi factori afectează organizarea filamentelor de actină în cele 2 regiuni citoplasmatice printr-un mecanism încă suficient elucidat. fibroblaste. În această regiune hialoplasma se găseşte în starea de sol. numite lamelipode. limfocite. prezentă în nodurile reţelei. Lipsită de organite celulare.3.4. Filamina şi alfa actinina. imediat sub membrana plasmatică. este localizată ectoplasma. numite placi de adeziune sau contacte focale.2. conţine particule şi organite celulare aflate intro permanenta mişcare. Miscarea ameboidala se realizează prin emiterea şi retracţia continuă a unor prelungiri celulare şi are la baza tranzitia reversibila a hialoplasmei din stare de gel în stare fluidă (sol). Regiunea centrală.Pe parcursul deplasării. 68 – Filamina leagă filamentele de actină. Mişcarea ameboidala Mişcarea ameboidala este un tip particular de locomoţie întalnită frecvent la protozoare. corpul celular lasa în urmă o coadă numită fibră retractilă. forţa ce asigură înaintarea fibroblastului determină fie detaşarea fibrei de substrat.4. Pe parcursul formarii pseudopodelor. dar comuna şi altor tipuri celulare dintre care şi celulelor ce intra în alcatuirea organismului uman : macrofage. În regiunea distală a prelungirilor celulare. Fibroblastul emite continuu. În final. numită endoplasmă. au pus in evidenţa existenţa a 2 regiuni diferite ale citoplasmei. în care un rol important par să-l aibă proteinele asociate. În timpul deplasării. 68). fie ruperea ei şi ulterior retracţia cozii în corpul celular (fig. Dintre celulele din organismul uman ce se deplaseaza prin miscarile ameboidale. unele lamelipode aderă la substrat . Studiile electronomicrodcopice. Filamentele sunt interconectate prin proteine ascociate. favorizând formarea unei reţele tridimensionale. Una dintre acestea este filamina. Se apreciază ca treansformarea reversibilă a endoplasmei în ectoplasma este controlată de celula şi reglată prin concentraţia intracelulară a ionilor de Ca şi pH. O dată cu creşterea concentraţiei intracelulară a ionilor de Ca. are loc deplasarea endoplasmei din centrul celulei în prelungirile celulare. ectoplasma conţine o reţea tridimensionala de filamente de actină. reţeaua se dezorganizează şi hialoplasma trece în stare de sol. 111 . proteine implicate în formarea şi stabilizarea reţelei filamentelor de actină . În regiunea distala a pesudopodului endoplasma se transformă în ectoplasma prin tranziţia sol-gel a hialoplasmei. o molecula flexibilă alcatuită din 2 lanţuri polipeptidice. Studiul emiterii şi retractiei prelungirilor celulare numite pesudopode. filamentele de actină sunt scindate de gelsolina. prin intermediul unor structuri specializate. cele mai bine studiate sunt fibroblastele. 69). Alte lamelipode se întorc spre partea dorsală a corpului celular. la protozoare a demonstrat interconvertibilitatea celor 2 regiuni ceitoplasmatice.Fibra rămâne aderentă la substratul pe care se realizeaza mişcarea fibroblastului .

1. alfa-actinina.2. au fost identificate şi în alte tipuri celulare (celule epiteliale.4. filamentele de actină apr a fi inserate în membrana plasmatică. proteinele ce formeaza filamentele intermediare sunt specifice pentru un anumit tip celular. Îndepartarea celulelor de pe substrat este însoţită de înlocuirea fibrelor de stress cu o reţea de filamente de actină şi revenirea celulei la forma sferică. filamentele intermediare se pot gasi în ectoplasma. 4.4. filamentele intermediare sunt rezultatul polimerizarii subunitaţilor proteice. În zonele de contact. 112 . mezenchimale şi neuroni). unde formeaza o matrice ce înconjoară şi interconecteaza discurile Z. tenşiunea generata prin mecanismul actină –miozina determinand aplatizarea fibroblastelor în culturi. NFm 150 000 Da. Alaturi de actină în fibrele de stress sunt prezente : miozina. În celule. ƒ desmina (55 000 Da) . Reintroducerea fibroblastelor în cultura este urmată la cateva ore de reorganizarea fibrelor de stress.3. 4. Cercetarile experimentale au confirmat această ipoteză. Ulterior. ƒ citocheratinele (peste 30 de specii moleculare). ƒ proteina gliala fibrilara acida( GFAP 50 000 Da) . tropomiozina şi proteina reglatoare miozin-LC kinaza. Spre deosebire de actină G şi tubulina. 69 – Schema deplasării fibroblaştilor.Fibrele de stress În ataşarea de substrat a fibroblastelor cultivate in vitro rolul principal revine fibrelor de stress.3. ƒ neurofilamentele (trei specii moleculare : NF1 70 000 Da . NFh 210 000 Da). Fibrele de stress sunt manunchiuri paralele de filamente de actină. ele au fost puse în evidenţa în celulele muschilor striaţi . La vertebratele superioare s-au identificat 5 tipuri de molecule proteice distincte ce intra în constituţia filamentelor intermediare : ƒ vimentina (57 000 Da) . ancorate în structuri periferice (desmozomi) sau situate în prelungirile celulare (axoni). Iniţial. Se sugereaza ca filamentele de actină şi miozina sunt organizate în microsarcomere. 4. Proteine ce alcătuiesc filamentele intermediare Ca şi microfilamentele de actină şi microtubulii. localizate în regiunea citoplasmatica aflată în proximitatea plasmalemei aflată în contact cu substratul. ataşarea celulelor de suport şi aplatizarea lor.Fig. Filamente intermediare Filamentele intermediare sunt elemente de citoschelet mai groase decât microfilamentele de actină şi mai subţiri decât microtubulii.

Cele cinci tipuri de proteine prezintă caracteristici structurale comune. proteinele copolimerizează. spre deosebire de microfilamentele de actină şi microtubuli. proteina gliala fibrilara acidă şi NF1 formează homopolimeri. în regiunile carboxi. 70 – Nivele de asamblare ale filamentelor intermediare. 70). în timp ce capetele globulare rămân separate. Cele 30 de tipuri de citocheratine sunt împarţite în 2 clase distincte : acide şi bazice /neutre. Aceleaşi regiuni centrale par a fi responsabile de asocierea dimerilor în tetrameri dar la acest nivel de agregare dimerii sunt antiparaleli. Prin legarea cap la cap a tetramerilor se formează protofilamentul. 113 . Fig. a regiunilor centrale.şi amino. polimerizarea şi depolimerizarea se desfaşoară cu aceeaşi viteza la ambele extremitaţi.terminale. Deci. în timp ce 99 % dintre acestea sunt asociate în filamente. iar 8 protofilamente generează filamentul intermediar. subunităţile sunt orientate paralel. În celulele în care genele ce codifică vimentina şi desmina se coexprima. Subunitatile proteice formează dimeri prin înfaşurarea stransă una în jurul celeilalte. de mărimi variabile.Diversitatea proteinelor ce alcătuiesc filamentele intermediare nu constituie singurul aspect ce le diferenţiază de subunitaţile proteice ale microfilamentelor de actină şi microtubulilor. fiind formate dintr-o regiune centrală alfa helicoidala şi 2 domenii globulare. Raportul dintre subunităţile libere şi polimerizate exprimă caracterul mult mai stabil al filamentelor intermediare comparativ cu microfilamentele de actină şi microtubulii. Cercetările experimentale au demonstrat că în condiţii fiziologice. S-a constatat că vimentina. Studiul polimerizarii în vitro a monomerilor ce alcatuiesc filamente intermediare a demonstrat că acest proces nu necesită consum de energie metabolică. În dimeri. desmina. Modul de ordonare al subunitaţilor proteice în filamente imprimă acestora un caracter apolar. filamentele intermediare au capete echivalente funcţional. 1% din proteine ce formează filamentele intermediare se găsesc sub formă de monomeri liberi. Deosebirile există şi în maniera în care proteinele se asociază în filamente (fig. În filamentele de keratina raportul dintre citocheratine de tip I şi cele de tip II este de 1 :1.

Cele 2 tipuri de filamente sunt interconectate prin proteine. şinemina. brevina. oferind una din cheile înţelegerii structurii şi funcţiunii acestuia. MAP.000.5.4. proteină fibrilară acidă glială. dineina. gelsolina. Proteinele asociate citoscheletului O serie de proteine sunt asociate citoscheletului.. Tipuri de filamente intermediare şi semnificatia lor funcţională Filamentele de vimentina sunt prezente în celulele mezenchimale ( celule endoteliale ale vaselor sangvine) şi unele celule epiteliale. filamentele de cheratina formează în celula epiteliala o reţea ce asigură rezistenţa epiteliilor la factori mecanici. proteinele neurofilamentelor. dimpotrivă. 114 . acumentina. Ancorate în desmozomi. nexina. Se apreciază ca fiecare tip de celula epiteliala conţine un complement chitocheratinic specific. filamentele intermediare înconjoară manunchiurile de microtubuli ce formează fibrele fusului de diviziune. Filamentele gliale sunt caracteristice celulei gliale. Tratarea acestor celule cu colchicina a condus la dezasamblarea microtubulilor urmată de deplasarea filamentelor de vimentina ce se organizează în manunchiuri în apropierea nucleului. conferindu-i acestuia stabilitate. înca neidentificate. calmodulina). de unele organite celulare(mitocondrii). MAP2. Filamentele din celulele muşchilor striaţi formează o reţea ce strabate întreaga miofibra şi care leagă discurile Z între ele.000. Filamentele de cheratină sunt întalnite în celulele epiteliale.) prezente predominant în anumite celule şi având proprietăţi diverse. plactină.4. profilina. de membrana plasmatică şi. MAP1. Se apreciază că filamentele de desmina joacă. 4. vilina. titina. posibil . Acest experiment sugerează rolul important pe care microtubulii îl au în organizarea filamentelor de vimentina. caldesmona. Microtrabeculele (4mm) pot fi expresia fenomenului de gelificare când filamentele de actină se leagă încrucişat unul de altul.2. Complexele neurofilamentate-microtubuli se deplasează în axon. Reţeaua microtrabeculara a fost descrisă la mărimi de circa 300. fodrina. vimentina) şi 7 proteine asociate cu microtubulii (clatrina. împiedicandu-le să fuzioneze între ele sau cu membranele celulare. le atribuie rol de suport al materiei biostructurale ( Eugen Macovschi. Se constată existenţa unei strânse asocieri între filamentele de vimentina şi microtubuli. de volţi) care generează electroni rapizi ce pot penetra secţiuni relativ groase. 1958). vinculina. NFm şi NFh) se asamblează în filamente şi se asociază cu microtubulii. Neurofilamentele sunt prezente exclusiv în axonii celulelor nervoase. un rol structural. fragmina. în principal. În toate tipurile celulare filamentele de vimentina sunt fizic legate de membrana nucleară. 9 proteine asociate cu filamentele intermediare (prekeratine. fimbrina. contribuind la creşterea rigidităţii ţesutului epitelial. Filamentele de desmina se întalnesc în toate tipurile de celule musculare. filagrina. ankirina.3. filamina. În celulele epiteliale filamentele de vimentina sunt ancorate în desmozomi. În consecinţa unii autori contestă realitatea lor biologică considerandu-le un artefact. Sunt bine cunoscute în prezent circa 14 proteine asociate cu actina (acrinogelina. microtubulii şi practic toate celelalte componente subcelulare sunt conectate de un sistem de microteabecule (mici bare). fiind probabil implicate în coordonarea spaţială a nucleului celular. În corpul celular cele trei polipeptide (NF1. desmina. 4. Reţeaua microtrabeculară În celulă. microfilamentele. susţinand discurile Z şi miofibrele. alţii. În adipocite filamentele înconjoară picăturile lipidice. Studiile efectuate de fibroblasti cultivaţi in vitro au demonstrat ca în celulele aflate în mitoza.000x în citoplasma celulelor examinate la microscopul de înalt voltaj (peste 1.

Morfologia şi structura nucleului Nucleul este constituit dintr-un înveliş (nucleolema. el îndeplineşte funcţiile de păstrare în condiţii de securitate a ADN-lui. prin care informaţia conţinută în secvenţa ADN. Tot în nucleu au loc sintezele diferitelor ADN-uri care. Nucleul este constituentul esenţial al celulelor eucariote fără de care existenţa lor ar fi compromisă. care urmează să transmită mesajul de la ADN în sinteza proteinelor. 71). nucleoplasma (matricea).1. cealaltă parte a ADN-ului cromozomial are. cromatina şi unul sau mai mulţi nucleoli care se găsesc în substanţa de fond. este realizată prin sinteza moleculelor de ARN. mai puţin la eritrocitele vertebratelor superioare. trecând în citoplasmă. de reglare şi control a activităţii celulei. de transmitere nealterată a acestei informaţii descendenţilor. În esenţă. prin semnale ce sunt recepţionate de molecula de ADN. ce vor fi transmise celulelor fiice. probabil. anvelopa nucleară). proces complex prin care molecula de ADN se autoreproduce şi dă naştere la copii identice. ARN apare fie ca produs finit cum ARN ribozomal (ARNr) şi ARN de transport (ARNt). În situaţia aceasta. necesare funcţiilor vitale ale celulei. o materie internă. replicarea are loc în faza S (de sinteză) a ciclului celular. 5. El există la toate celule organismelor eucariote. constituie aşa numitul aparat de biosinteză proteică (fig. încât o parte din secvenţele de baze purinice şi pirimidinice reprezintă cadrul după care sunt transcrise diferite mesaje sub formă de ARN. transcripţia ADN. rol în reglarea activităţii transcripţionale. Secvenţele de baze purinice şi pirimidinice se păstrează de-a lungul generaţiilor de celule datorită replicării semiconservative a ADN cromozomial. proces la fel de complex. deci el conţine aproape întreaga informaţie genetică. ADN-ul cromozomilor este astfel organizat. Transcripţia ADN se desfăşoară pe toată perioada interfazei şi este blocată în faza M (mitoza).Capitolul 5 ORGANIZAREA NUCLEULUI ŞI EXPRESIA ACTIVITĂŢII GENELOR Nucleul reprezintă compartimentul care încorporează genomul nuclear. funcţiile fundamentale ale nucleului se rezumă la două procese bazate pe existenţa în acest compartiment a genomului celular şi anume: replicarea ADN. 115 . unde este eliminat printr-o exocitoză în cursul eritropoezei. fie ca produs intermediar ARN mesager (ARNm).

Fig. 71. Diagrama structurii nucleului.

5.1.1. Învelişul nuclear
Pe faţa internă a membranei nucleare se distribuie, la nucleul vertebratelor, o împâslire de fibre fine, groasă de circa 200 - 600 Ả, care menţine rigiditatea nucleelor. Studiind raporturile învelişului nuclear, se observă că membrana externă, citoplasmatică, dezvoltă prelungiri scurte sau chiar tubuli care fac legătura cu reticulul endoplasmatic. Aria externă a nucleului este acoperită cu ribozomi; în plus, în multe cazuri apar aglomerări juxtanucleare de mitocondrii furnizoare de energie. Datorită grosimii sale, membrana nucleului este invizibilă la microscopul fotonic. Însă o parte din cromatină este dispusă sub membrana nucleului, astfel că pe secţiunile de ţesuturi colorate, liziera de cromatină perinucleară apare colorată, indicând şi limita externă a nucleului. La microscopul electronic se observă bine că membrana nucleului este dublă, prezentând pe faţa sa internă din loc în loc, îngroşări de care se prind fibrile cromatinei. Cromatină se mai ancorează şi la exteriorul inelelor şi chiar la granulul central. Totalitatea acestor fibre de cromatină constituie cromatină perinucleară . O funcţie importantă a învelişului nuclear constă în schimburile nucleoplasmatice, chiar dacă nu toate categoriile de molecule îl străbat . Astfel, prin învelişul nucleilor izolaţi nu trec glicogenul şi ovalbumina, în schimb trec tripsina, ribomeleaza, DNA-aza, histonele, polianionii ca heparina şi Hb şi bineînţeles, nucleotidele şi aminoacizii, „în vivo", ionii străbat în ambele sensuri învelişul nuclear, astfel că înăuntrul nucleelor se acumulează o cantitate dublă de Na+ şi K+ faţă de citoplasmă . Aminoacizii, monozaharidele şi dizaharidele (GM sub 500) pătrund prin dubla membrană nucleară, iar prin pori trec riboproteine sub formă de ribozomi, dar şi ribonuclează sau feritină. De regulă, calea de trecere transmembranară este urmată de molecule mici de tipul Fe coloidal, dar s-a observat că şi o serie de substanţe elaborate de reticulul endoplasmatic pot trece din el în spaţiul perinuclear (anticorpii antiperoxidazici ai hemocitoblaştilor). 116

Prin „înmugurirea" membranei exterioare a nucleului se formează lamele inela-te în citoplasmă, care sunt purtătoare de ribozomi sau ARN încorporat în membrane . La nucleele celulelor reproducătoare, atât de la plante cât şi de la animale, se pot observa înmuguriri ale învelişului nuclear care dau naştere la vezicule ce pătrund în citoplasmă unde, dezorganizându-se eliberează conţinutul de nucleoproteine. Prin granulul său central, polul opune totuşi o rezistenţă difuziei libere a diferitelor molecule în valoare de 1Ω/cm2. Moleculele cu sarcină electrică pozitivă trec uşor din citoplasmă în nucleu, însă cele încărcate negativ sunt oprite de inelele porilor de care se leagă . EM s-au observat ieşind helixuri de ribonucleoproteine prin porii nucleelor de amibe, iar prin porii nucleelor glandelor salivare de chironomide trec granule de 200 - 400 Å diametru, tot de ribonucleoproteine. Ribonucleoproteinele ajunse în citoplasmă reprezintă diferiţi ARN m, precum şi fracţiile 18 S, 25 S, 5 S ale ARN v asociate cu proteinele lor specifice. Însăşi ca numărul porilor poate creşte sau scade dă o indicaţie asupra rolului lor în reglajul transferului de informaţie care, în mare, se realizează de la nucleu către citoplasmă prin mesageri dar şi de la citoplasmă spre nucleu prin proteine histonice şi nonhistonice, printre nonhistonice figurând unele enzime. Este bine cunoscut faptul că, sub acţiunea fitohemaglutininei, limfocitele în cultură se transformă în limfoblaşti. Fitohemaglutinina acţionează asupra unor receptori membranari care activează AMP-cicloza, producând cAMP. Acest nucleotid ciclic stimulează o proteinkinaza, care produce o proteină ce pătrunde în nucleu. Acolo determină o puternică activitate transcripţională, sintetizându-se ARN m, ARN t şi ARN v care trec din nucleu în citoplasmă. Astfel se asigură o intensă activitate de biosinteze citoplasmatice, dar şi de mitoze ale limfoblaştilor. Învelişul nuclear mai are şi rol de formarea lamelelor inelate . în telofază, când are loc refacerea membranei nucleare pe seama reticulului endoplasmatic, rămâne un „surplus" de membrane endoplasmatice fie incluse în nucleu, fie în citoplasmă din jurul acestuia. Membranele respective se dispun paralel şi nu mai participă la reconstrucţia învelişului nuclear din cauza rapidităţii ciclului celular. Asemenea membrane inelate se întâlnesc, de obicei, în celule embrionare şi sexuale cu cicluri celulare scurte. În interfază, membrana exterioară a nucleului înmugureşte spre citoplasmă vezicule care ulterior se desprind şi, aşezându-se cap la cap, constituie lamele inelate. Prin contopirea acestora rezultă cisternele golgiene. În alte cazuri, membrana exterioară a nucleului, după ce pierde ribozomii, înmugureşte pe o porţiune anumită, dând naştere unei serii de vezicule. Acestea, cu timpul, se desprind şi depunându-se în şiraguri, se contopesc formând cisterne golgiene. În timp ce se formează o cisternă, pe faţa sa externă (uneori convexă) se dispune un alt şir de vezicule, şi aşa mai departe, în asemenea mod luând naştere un dictiozom. Porii Dubla membrană este străbătută de pori având un diametru de circa 700 Å care conţine fiecare câte un inel proteic ce limitează orificiul porului la 500 Å. Distanţa dintre centrele a doi pori alăturaţi este de circa 1300 Å, sau un multiplu al acestui număr, existând întotdeauna o legătură cu cromozomii interfazici, deoarece opt fibrile ale cromatinei se ataşează de marginile fiecărui por . De fiecare por sunt asociate o serie de structuri care fac parte din matricea nucleară . Fiecare por cuprinde un material inelar, o diafragmă, un granul central şi un material fibrilar. Materialul inelar cuprinde opt particule sferice proteice de circa 200 Å diametru aşezate pe fiecare faţă a porului; acest material îşi modifică structura în funcţie de metabolismul celular.

117

Dilatările şi contracţiile porilor se explică prin adiţia, respectiv pierderea proteinelor constitutive ale inelului. Diafragma este o substanţă densă, amorfă din interiorul porului, care se întinde spre centrul lui, unde se află un granul central riboproteic de 250 Å diametru. De el se leagă fibrilele de 50 Å diametru, care fac legătura cu particulele sferice interne şi externe ale porului. O fibrilă încercuieşte lumenul porului la interior, solidarizând astfel materialul său fibrilar ( fig. 72; fig. 73). Fig. 72. Structura porului nuclear: a( structura octogonală a complexului nuclear al porului în membrana nucleară; b) o secţiune verticală a complexului; granula centrală apare numai în anumiţi pori.

Fig. 73. Secţiune prin porul nuclear care prezintă schematic şi ipotetic sub formă de cilindru, tunelul care ar exista în structura porului şi prin care moleculele sunt transportate în interiorul sau exteriorul nucleului.

5.1.2.Matricea nucleului
Reprezintă o structură proteică formată dintr-o reţea de fibrile foarte strânse şi fine, care umplu complet spaţiile dintre blocurile mai mici sau mai mari de cromatină. Matricea nucleului poate fi văzută la microscopul fotonic prin tratarea celulelor cu alfaamanitină. Acest alcaloid produce în două ore contracţia cromatinei, iar după fixare şi colorare cu hemalaun-enzimă, la microscopul fotonic se observă cum matricea este separată de blocurile cromatinei contractată, prin conturări clare, necolorabile (deci spaţii goale). Matricea dintre blocurile cromatinei este Feulgen (-), deci nu conţine ADN şi se colorează slab cu albastru de toluidină, hemalaun sau verde luminos, deci nu conţine grupări fosfatice multe. Matricea rezistă bine la „digestia" cu RN-ază, dar poate fi uşor solubilizată cu pepsină, ceea ce indică un conţinut predominant proteic. Tratarea nucleilor izolaţi din culturi celulare (Hela - S3) cu tampoane bogate în săruri, DN-ază şi ditiotreitol a permis izolarea unei structuri de natură proteică asemănătoare ca aspect cu cea a nucleului, dar „golită" de cromatină care a fost digerată cu DN- ază. Analizele ultrastructurale şi biochimice indică faptul că matricea constă din elemente membranare şi fibrilare cu o compoziţie chimică de 87% proteine, 12% fosfolipide, 1% ADN, 0,1% ARN. Proteinele separate prin electroforeză în strat subţire de dodecil-sulfat de sodiu (SDS) în gel de poliacrilamidă s-au dispus în 30 - 35 de benzi cu GM între 14.000 - 20.000. Matricea este reprezentată prin două clase de peptide majore, cu o greutate maximă cuprinsă între 14.000 - 18.000 şi respectiv 45.000-75.000. 118

În celulele sincronizate (aduse la aceeaşi fază a ciclului celular) se constată că în toate fazele ciclului celular au loc sinteze de polipeptide matriceale, dar ele sunt mai reduse în faza S/G2 (divizibil). După diviziunea celulară, în lipsa biosintezei proteice, vechile polipeptide cu GM cuprinsă între 45.000 - 75.000 persistă după mitoză şi refac noua matrice a nucleului interfazic. Cercetările de histochimie EM, combinată cu analiza electroforetică a proteinelor matriceale, au permis fundamentarea teoriei fibrilare a matricei nucleare (D. Comings şi T. Okada, 1978). După extragerea cromatinei nucleelor hepatocitelor de şoarece cu soluţii saline concentrate şi tratate apoi cu DN-ază şi TRITON X-100 rămâne numai matricea, cu o structură fibrilară, care este reprezentată prin porii şi lamina fibrilară a învelişului nuclear, componenta fibrilară a nucleolilor şi matricea intranucleară propriu-zisă. E.M., matricea nucleară este compusă din fibrile proteice de 20 - 30 Å, denumite matrixină. Ele se asociază în fibre mai groase, de 100 - 300 Å. Separarea electroforetică a matrixinei evidenţiază trei benzi polipeptidice cu greutatea maximă 65.000, 67.000 şi 68.000. Peste tot matrixină se leagă de fibrile de cromatină, ea având un rol principal în organizarea acestor fibre în cromomerele cromozomilor mitotici şi meiotici.

5.1.3.Proteinele contractile nucleare
Au fost evidenţiate în diferite tipuri de nuclee din care s-au extras cromatină. Apoi din cromatină s-au izolat mai departe proteinele nonhistonice, prin electroforeză . În felul acesta sau putut separa: miozina (G.M. 200.000), actina (G.M. 45.000), tropomiozina (G.M. 34.000) şi subunităţile sale. Comparându-se conţinutul în miozina şi actină din cromatină hepatocitelor şi cea a neuronilor, se constată că în ficat miozina este în cantitate de 1,8 mai mare ca în creier şi actina de 2,3 ori. Este foarte probabil ca activitatea transcripţională a hepatocitelor în mesager (ARN m) ai actinei şi miozinei să fie de două ori mai mare ca în neuroni. Există deci un raport invers proporţional dintre conţinutul actinei cromozomale şi activitatea transcripţională. Probabil, actina exercită o represie asupra cromatinei, prin condensarea ei la maximum, făcând-o astfel netranscripţională. Se pare că actina nu se leagă direct cu ADM ci realizează un anumit tip de condensarea cromatinei.

5.1.4.Cromatina
Toţi nucleii prezintă în interfaţă regiuni extrem de împachetate ale fibrelor cromozomale . Nucleii interfazici fixaţi şi coloraţi cu coloranţi bazici (albastru de toluidină, de metilen, Azur A etc.), care colorează cromatina, o evidenţiază sub formă de particule mai mari sau mai mici şi împlântate în matrice, ca o pătură subţire cromatică pe faţa internă a învelişului nuclear şi una sau mai multe blocuri în jurul nucleonului. Aspectul general al cromatinei este asemănător la nucleii aceluiaşi tip celular, dar variază în anumite limite după fixarea folosită . Astfel, cromatina se poate prezenta sub formă de grămezi sau grămăjoare de granule fine şi prelverulente, până la o reţea cu unele noduri ceva mai groase. Aspectul variază după tipul de celulă şi gradul ei de activitate metabolică, dar şi ci specia considerată . Examenul electrono-microscopic al cromatinei arată ca ea este formată din fibre împachetate - filamente nucleoproteice - cu traiectorie spiralată şi cu diametrul variabil. In zonele mai groase fibrele au diametrul de 200 - 500 Å, pe când în zonele subţiri de numai 60 100 Å. între grămezile de cromatina se găsesc spaţii intercromatiniene, colorate slab cu coloranţi bazici, în care se mai află o serie de structuri: ƒ fibrile cromatiniene, distanţate unele de altele şi fără traiecte spiralate; ƒ fibrile pericromatice, de 30 - 50 Å diametru, care mărginesc blocurile de cromatina; ƒ granule intercromatiniene, de 250 Å diametru, formate din tasări de fibrile pericromatiniene. Asemenea granule sunt rezistente la DN-ază şi numai după tratare cu pronază 119

pot fi digerate după aceea cu DN-ază. Asemenea granule intercromatiniene par a fi trei forme succesive de ARN m şi ARN v care ies din nucleu în citoplasmă unde rămâne câtva timp inactive datorită proteinelor pe care le conţin ƒ granule pericromatiniene situate la periferia cromatinei, mari de 450 Å diametru şi înconjurate de un halou clar care le separă de masa fibrelor cromatinei. Asemenea granule sunt formate din fibrile de 30 Å diametru, foarte neregulate ca traseu, ce depăşesc uneori marginea granulelor . Ele sunt tot de natură ribonucleoproteică şi au rol în transmiterea unor informaţii în sens invers, adică de la ARN la ADN; ƒ corpii spiralaţi din regiunile intercromatiniene, care reprezintă împachetări de fibrile răsucite, de 400 - 600 Å diametru, asociate sub formă de agregate sferice de 0,5µ. Ele sunt tot de natură ribonucleoproteică şi mai conţine şi nişte fibrile subţiri, de 50 Å, care se înfăşoară în jurul axului lor. Cromatina se găseşte sub două forme: eucromatină, considerată ca fiind acea parte din cromatină cu fibre fine şi uniforme repartizate în nucleu, active în replicarea ADN şi în transcripţia ARN şi heterocromatina rezultată compactizarea cromatinei sub formă de granule şi grămezi de diferite mărimi. Este intens colorabilă în roşu prin reacţia Feulgen pentru ADN şi albastru când se tratează cu coloranţi bazici. Studiile comparative de ME efectuate la plante şi animale au arătat că structuralizarea cromatinei se prezintă, funcţional şi evolutiv, diferit la plante şi animale. Astfel, în nucleii de Arabidopis cromatină formează cromocentre (cromozomi heterocromatici sau porţiuni de cromozomi care rămân condensate şi astfel colorabile în interfază); la Viscum album heterocromatina este reprezentată tot prin cromocentre, în schimb eucromatină formează cromomere şi cromonemate mai subţiri decât heterocromatina, dar la fel de intens colorabile. La Hedera helix, nucleii meristematici prezintă blocuri mari de heterocromatina condensată printre eucromatină decondensată, sau nucleii adulţi, care printr-o subreplicare (replicare a numai unei părţi din genom) devin tetraploizi (4n), suferă o cădere apreciabilă a cantităţii de heterocromatina condensată . în acest caz, eucromatină nu mai este activă în replicarea ei, probabil, numai în transcripţie . Între speciile de plante există o variaţie a cantităţii de cromatină condensată prin faptul că atât heterocromatina, cât şi eucromatină se condensează. Condensarea eucromatinei este determinată la plante de cantitatea de ADN a speciei date, precum şi de compoziţia acesteia. Variaţia cantităţii de cromatină din nucleii unei specii de plante este expresia replicării diferenţiale a heterocromatinei, care este în întregime constitutivă şi nu se exprimă prin condensări şi decondensări funcţionale în raport cu activitatea fiziologică a celulelor . La mamifere, însă celulele cu o activitate mitotică intensă sunt complet eucromatice, adică cu cromatină decondensată. La aceeaşi cantitate de ADN în ţesutul considerat, coexistă nuclee cu cromatină decondensată, mase de cromatină şi nuclee cu aproape toată cromatină condensată. În toţi aceşti nuclei cromatină condensată este constitutivă, Giemsa + şi încorporează mai târziu timidină tritiată, deci are o replicare întârziată - expresie a inactivării diferenţiale a cromatinei. O stare de condensare completă a cromatinei se întâlneşte la eritrocitele nucleate ale nemamiferelor şi care este total nereplicativă, ca şi în nucleii spermatozoizilor. La animale, gradul condensării cromatinei este dependent de funcţia celulei, fiind specifică unei activităţi tisulare anumite. Heterocromatina transcrie o foarte mică cantitate de ARN. Dat fiind complexitatea problemei, este necesar de schiţat o clasificare a aspectelor pe care la prezintă condensarea şi decondensarea cromatinei: Termenul de „heterocromatina" se foloseşte pentru heterocromatina constitutivă, care ocupă o regiune permanent condensată din cromozom şi a cărei localizare este identică la cromozomii analogi. Aceasta conţine o mare cantitate de ADN respectiv (secvenţe de baze care se repetă), se replică după eucromatină, nu transcrie ARN şi se colorează diferit;

120

iar miezul histonic ar fi mărgelele. oricât ar fi el de subţire (20 Å).Organizarea moleculară a fibrelor de cromatina. deoarece este de două ori mai mare cu o bazicitate crescută la 37%. se pune întrebarea cum este posibil să încapă un metru ADN. astfel că genele de pe X au devenit semizigote la mascul. constituit din 166 nucleotide. Miezul nucleozomului este reprezentat printr-un set de opt molecule histonice. H2A. în medie. Miezul histonic al nucleozomilor este constituit din patru clase histonice: H4. care apare heteropicnotic în interfază. H2A şi H2B.2 MH2SO4 . nonhistone foarte variate). H4) sunt globulare (fig. A. precum şi transcrierea diferitelor ARN etc. (H. Moleculele histonice H4 şi H3 sunt identice la toate speciile. având un conţinut de 25% lizină. al spermatoizilor etc. La această întrebare s-a răspuns prin teoria structurii nucleozomale a cromozomilor.4%. în schimb moleculele H2A şi H2B au o mai mică fidelitate. ARN 14% şi proteinele 66. s-a putut calcula că lungimea totală a ADN tuturor cromozomilor complet despiralizaţi dintr-un nucleu este. Considerând că fiecare cromozom este format dintr-un singur dublu-helix de ADN. într-un mod neîntrerupt. cu toate că porţiunea fără caracter bazic a rămas nemodificată. şi anume. întregul dublu helix al ADN al fiecărui cromozom se înfăşoară pe un şir enorm de asemenea corpusculi hiostonici. deoarece caracterele localizate pe un singur cromozom X . existenţa ADN cromozomal în micul volum oferit de nucleu asigură o serie de funcţii şi roluri ale cromozomilor cum sunt replicarea şi reparaţia materialului genetic (ADN).sunt singurele care se pot manifesta. Analiza cromatinei interfazice realizată prin metoda precipitării cu magneziu. din nucleii eritrocitelor de pasăre) este diferită de celelalte clase histonice. miezul este deci. alanină şi valină. într-un volum atât de mic? Mai mult chiar. H3. ci acesta se înfăşoară în jurul corpuscului. Această situaţie sugerează imaginea unor mărgele înşirate pe aţă. al eritrocitelor nucleate. spiralizat la rândul său însă de câteva ori. cum este cazul limfocitelor inactive. protamine. Klug) au dus la concluzia existenţei în nuclee a unor corpusculi numiţi nucleozimi. ADN ar reprezenta aţa. acestea se transformă în celule blastice (tinere). regiunile mijlocii şi carboxiterminale ale moleculelor celor 5 clase histonice (H1. adică de la un capăt la celălalt al cromozomului. este înconjurat la exterior de două spire ale ADN-ului cromozomal. Acest complex. numit octamer. al femelelor de mamifere. în soluţii tampon cu o concentraţie ionică medie. corpusculul nu este străbătut de helixul dublu al ADN. aceasta deoarece cromozomul Y la mamifere a suferit o inactivare genetică prin heterocromatinizare. inactiv. Legătura dintre doi nucleozomi succesivi se face printr-un segment de dublu helix ADN cu o lungime variabilă de câteva zeci de perechi de nucleotide care este asociat cu o moleculă de histonă H1. 121 . ce constituie miezul nucleosomic.5.1.Termenul de „heterocromatina facultativă" exemplifică cromozomul X. Termenul de „cromatina condensată" semnifică eucromatina inactivată în mod specific de proteine. s-a arătat că. R. La fel sunt şi cromozomii X sau Y din celulele sexuale ale unor insecte care se aglomerează în corpusculi Feulgen +.6% . Ei sunt compuşi dintr-un miez histonic. adică foarte condensat şi colorabil (cromatina sexuală). De un metru la mamifere . un octamer histonic. câte două din clasa H4. H2B. Molecula H.genele recesive . Oudet şi Ada Olins. 74). 30. Nucleozomii Organizarea moleculară a fibrelor de cromatina este realizată prin dublu helix al ADN şi prin diferite proteine (histone. H3.6% sunt solubile în 0. arată că ADN este 19.D. arginină şi histidină. O serie de cercetări din ultimii 10 ani (P. Dintre proteine. Prin stimularea celulelor cu lecitine. iar cromatina se decondensează şi ADN-ul poate sintetiza diferiţi ARN mesageri . în jurul căruia se înfăşoară dublul helix al ADN . de histone. 5. H2A şi H2B. Acest tip de heterocomatină se caracterizează prin prezenţa unor proteine care modifică ADN făcându-l total inactiv. H3.Kornberg. Când volumul nucleului respectiv este în jur de 15 µ3. cu un conţinut ridicat de lizină. Numai că în cazul structurii nucleozomale.

toate sau o parte din ele. Variabilitatea lungimii de la 180 la 250 perechi de nucleotide este determinată în exclusivitate de variabilitatea lungimii segmentului internucleosomic. rezultă particule lipsite de histonă H1 care conţine 140 ± 10 perechi de baze de ADN. deci controlează starea conformaţională a complexului de molecule. Nucleozomii sunt formaţi din două spire de ADN (ture) care înfăşoară un miez („core”) format din 8 molecule de histone (câte 2 de fiecare tip de histonă (H2A.Fig. în diferite combinaţii. nu în structuri helicale.Prin hidroliză enzimatică nucleozomii se separă conţinând ADN de aprox.Structura nucleozomilor. Cromatina lipsită de histona H1 nu prezintă o structură regulată. În urma digestiei prelungite a cromatinei. pe partea opusă fiind încă prezente repulsii de aceeaşi sarcină. Când din cromatină se extrage H1 şi este menţinută la puteri ionice scăzute. Partea centrală a octomerului histonic este formată dintr-o unitate tetramerică (2H3+2H4). ci la puncte opuse. Studiile de reconstituire de cromatină în care s-au format cele patru fracţii histonice ce alcătuiesc miezul nucleosomic. Localizarea şi asamblarea celor 8 molecule histonice în miezul nucleosomic sunt cu aproximaţie cunoscute. cu nucleoză.H3 şi H4).H2B. Dacă puterea ionică este ridicată peste 40mM NaCl. fiind globulare. pentru a se cunoaşte rolul fiecăruia în ansamblul molecular nucleozomal. dar au un aspect mai puţin regulat şi ADN nu mai intră în şi iese din miezul nucleosomic la acelaşi punct. Nici o combinaţie de histone nu se poate realiza atunci când se omit histonele H3 şi H4. permiţând astfel plierea ADN în jurul miezului histonic.terminale.74 . cromatina se condensează în aglomerări. datorită aranjamentului sub formă de disc al tetramerului 2H3 . cu excepţia hi se leagă şi neutralizează sarcinile negative numai pe o parte ale dublului helix ADN. Nucleonii au formă sferică şi un diametru de 100 Å. capetele N . cel mai puternic asociindu-se aceste histone bogate în arginină a căror secvenţă de aminoacizi a fost puternic conservată în decursul evoluţiei. au condus la obţinerea unor date care confirmă aranjamentul stabilit de histonele în alcătuirea nucleosomilor. pe când. bogate în arginină şi lizină rămân la periferie sub forma unei cozi care interacţionează cu ADN ce se înfăşoară în jurul miezului sub forma aproape două (l şi 3/4) tururi super helicale negative. Octomerul histonicare formă de inimă. 146 pb. urmată de purificare. Nucleozomii sunt legaţi între ei de un fragmant de ADN „linker” care nu este legat de proteine. nucleosonii sunt încă distribuiţi de-a lungul matrixului ADN la aproximativ 200 perechi de baze. se angrenează spre a constitui partea centrală a octomerului. Octomerul este probabil stabilizat în urma interacţiunii capetelor C . Interacţiunile dintre moleculele H3 şi H4 sunt foarte puternice şi ele conferă miezului nucleosomal o formă specială de glugă. care formează partea centrală şi vârful inferior al inimii şi asocierii sale cu cei doi dimeri (2H2A şi 2H2B) spre a forma cele două vârfuri superioare ale inimii. Moleculele histonice se pot separa una de alta şi apoi reasocia experimental. 122 . Toate histonele.terminale hidrofalse ale histonelor care.2H4.

Pornind de la ADN.000 ori până la 250. orice sistem biologic realizând sinteza replicativă de ADN ca o precerinţă a reproducerii sale. apoi fibra de 300 Å (solenoizii) care la rândul lor sunt organizate. mecanismul replicării este asemănător 123 . Când se reasociază cu histone. Sunt aşa numiţii solenoizi sau supersuperhelix. cu ADN ce intră şi iese din direcţii opuse la un acelaşi punct. sinteza ADN. Constituenţii de bază ai cromozomului eucariot sunt fibrile de cromatina de 100 şi 300 Å diametru.8. Complementaritatea celor două catene a dublului helix ADN a sugerat lui Naston şi Crik modelul semiconservativ de replicare. Aşa cum a arătat Batson (1976). lanţul nucleosomal formează suprastructuri helicoidale cu ture de către şase nucleozomi. cu nucleosonii bine definiţi. Replicarea ADN la eucariote Deoarece ADN conţine informaţia genetică a celulei. Studii biochimice au arătat că în nucleu. În cromozomi.300 Å. În cromozomii metafazici s-au evidenţiat (Back. având diametru de 100 Å. ca şi în mitocondrii şi cloroplaste. 5. în fibre cu configuraţii helicale de ordin superior.90. RN-azele. Ierarhia de helixuri a fibrei de cromatina porneşte de la dublu helix ADN care se condensează de şapte ori în nucleosom. Aceasta se mai condensează încă de cinci ori. fibra nucleosomală se spiralează la rândul ei de cinci ori în solenoid şi de 40 de ori ca suprasolenoid.170 cm (aproximativ 2 m) pot fi adăpostite la nivelul celor 46 de cromozomi a căror lungime totală este de până la 200 µm. aşa încât în cromozomul metafizic condensarea ajunge la un nivel mediu de 7. Replicarea acizilor nucleici stă la baza reproducerii vieţii.000 de ori în cromozomul metafazic. acestea se prezintă ca o structură destul de deschisă. proteazele etc) şi diferite proteine de structură. enzimele de restricţie şi reparaţie. de asemenea. Această formă s-a numit filament nucleosomal. Aşa se explică cum moleculele de ADN extinse de la nivelul cromozomilor complementului cromozomal uman având o lungime totală de 164 . La fel se explică şi în cazul mamiferelor posibilitatea cuprinderii moleculei de ADN care alcătuieşte cromozomii într-un volum nuclear foarte mic. 2. care împreună cu alte enzime (fosfoprotein-fosfatazele acide şi neutre. acest schelet proteinic împreună cu ADN formează un „halou" de circa 4. Dacă cromatina intactă care conţine toate histonele este menţinută la o concentraţie scăzută de săruri (1mM NaCl).000 . În prezenţa unor concentraţii saline apropiate de tonicitatea celulară. Prin „digestia" cromatinei cu eudonucleoza micrococală s-au obţinut particule nucleosomală monomerice de care sunt asociate ADN-polimerazele. sinteza sa este unul dintre cele mai importante evenimente din viaţa acesteia . se găsesc o serie de ADN-polimeraze prin care se realizează replicarea semiconservativă a ADN. Dacă din cromozomi sunt eliminate histonele şi asemenea . sunt clasate în aşa-numitele proteine nonhistonice. O condensare ulterioară produce fibra de 100 Å. bucle care pornesc cu o ramură dintr-un punct al scheletului proteinic şi se întorc cu cealaltă ramură într-un punct adiacent acestuia. 1979) fibre ce circa 400 Å diametru care s-ar forma prin condensarea fibrelor de 250 . ADN-ul formează structuri moniliforme (structură nucleosomală). cromatina este ancorată la un schelet proteinic care formează partea centrală a întregii structuri cromozomale. Prin plierea acestei fibre rezultă morfologia cromozomului metafazic.se vizualizează EM. Realizată prin intervenţia unui complex aparat enzimatic.000 perechi de baze lungime. condensarea generală este de 5.000 . este o reacţie de tip selectiv.000 bucle de aproximativ 40.300 Å diametru. rezultând o structură suprasolenoidală care s-a numit fibra-unitară (unit-fiber). diametru unei structuri supersuperhelix sau solenoid este de 250 .Aceste cercetări sugerează că histona H1 are un rol structural şi este esenţială pentru nivelele superioare de organizare a cromatinei. care pot fi văzuţi la microscopul electronic. reprezentând singurul caz din lumea biomoleculară în care o substanţă îşi dirijează propria sa sinteză .000 ori.

sinteza replicativă a ADN implicând existenţa obligatorie a unei molecule preformate care participă direct în reacţie.sunt adăugate bazele complementare la catenele vechi pentru a forma catenele noi (fiice). prin acest sistem dual mecanic. pentru sinteza unei noi catene complementare care se numeşte replică. Este. vrând să sugereze. unic în lumea macromoleculelor şi în lumea vie. identice cu molecula preformată. Replicarea la eucariote (se realizează bidirecţional. remarcabil pentru lumea vie faptul că nu se poate crea „de -novo" nici o moleculă de ADN. drept matriţă. 75 .Înlănţuirea bazelor într-o singură catenă de ADN. Aceştia prezintă o structură uimitor de potrivită pentru realizarea replicării în care.particulă virală naturală . Astfel.Când ele se separă în cursul replicării. de la o singură origine (O) se formează două furci de replicare în direcţii opuse).Acest model asigură ca moleculele noi de ADN să fie identice cu cele vechi. Schema simplificată a replicării semiconservative. b). Bazele din cele două catene ADN (vechi sau noi) sunt complementare.ci numai în celula gazdă în care au pătruns în timpul infecţiei virale. dintr-o moleculă iniţială iau naştere două molecule identice între ele şi totodată identice cu molecula iniţială. fiecare servind drept model. replicarea acizilor nucleici nu poate avea loc decât în celule. de asemenea. Replicarea este caracteristică doar acizilor nucleici. complementaritatea structural-funcţională a celor două catene ADN. Fig. pe de o parte reproducerea fidelă şi continuitatea fenomenului ereditar de-a lungul generaţiilor (fig. fie procariote. având loc formarea a două molecule fiice. a). 76. Termenul de REPLICARE derivă de la cuvântul englezesc „to replicate" = a copia (fig. Continuitatea este asigurată de faptul că în moleculele nou formate intră şi câte o catenă din molecula iniţială. astfel că moleculele fiice vor avea o catenă veche 124 .mecanismului cheie-broască. Fig. Sinteza unei noi molecule de ADN se realizează aşadar printr-un proces de copiere. molecula iniţială îşi „topeşte" identitatea în cele două molecule fizice care derivă din ea şi care sunt identice ei. În condiţiile vieţii actuale. 76). Replicare acizilor nucleici virali nu poate avea loc în virion . 75). Se asigură. proces care se numeşte replicare. fie eucariote.

d CTP .GTP. 61. ƒ citidintrifosfat . Deşi la început s-a crezut că ADN . putând. astfel că totdeauna polaritatea replicei este de sens opus polarităţii matricei.UTP pentru ARN. 58. ADN . La bacterii au fost descrise trei enzime ADN .replicarea complementară a matriţei. asociată cu 4 polipeptide de 54. catalizând formarea punţilor fosfodiestenice (polimerizarea nucleotidelor) doar în direcţia 5' spre 3'.) sinteza precursorilor nucleotidelor purinice şi pirimidinice adică a acidului inozinic şi respectiv acidului uridilic . absenţa numai a uneia dintre ele blocând activitatea enzimei polimerizatoare. ƒ dezoxicitidintrifosfat .000 daltoni.pol III este enzima polimerizatoare în replicare. dar nu se întâlneşte la plante şi protezoare. 5. este responsabilă de 80% din activitatea totală a enzimelor de replicare. cu precizarea că enzima poate copia un ARN natural.d ATP . pe când ADN . O caracteristică interesantă a β .polimeraza II şi ADN . S-ar părea că vertebratele au acelaşi fel de polimeraza.000. fi implicată în procesele reparatorii sau de recombinare. .CTP. c. deplasându-se pe ambele catene matriţă doar în direcţie dinspre 3' spre 5'.) sinteza nucleotidelor propriu-zise care intră direct în alcătuirea macromoleculei acizilor nucleici: ƒ dezoxiadenozintrifosfat .d TTP (pentru ADN) şi: ƒ adenoziritrifosfat . catenele complementare fiind deci antiparalele .1. ƒ dezoxigreananozintrifosfat .Complexul de enzime polimerazice implicate în replicare În desfăşurarea reacţiei de polimerizare este necesară prezenţa tuturor celor patru tipuri de dezoxiribonucleide sub formă lor trifosfatică. ADN . fiind prezentă şi în mitocondrii. implicată în reparare.ATP. Este prezentă la toate metazoarele. 125 .polimeraza beta (β).2.000 şi 64.000.polimeraza III.zisă. care se pare a fi polimeraza mitocondrială. La eucariote s-au descris mai multe tipuri de ADN polimeraze: ƒ polimeraza alfa (α) .ADN . Moleculele fizice de ADN moştenind doar una din cele două catene ale moleculeimamă. ƒ guanozintrifosfat . iar nevertebratele una asemănătoare.implicată în replicarea propriu . mecanismul de replicare se numeşte semiconservativ. ƒ polimeraza gama (γ).pol II bacteriene nu este încă precizată.000 daltoni ce formează subunitatea heteropolimerică stimulatoare a regiunii catalitice sau cu funcţie stabilizatoare a complexului ADN-polimeraza. în timp ce a polimerază se află la toate celulele eucariate . In vivo sinteza acizilor nucleici se desfăşoară în trei etape: a. dar ea nu joacă rol esenţial în replicare.palimerază este capacitatea de a folosi o matrice ribonucleotidică în prezenţa unei „amorse" ADN. Polimeraza a este constituită dintr-o unitate catalitică de 150. b. Funcţia ADN .polimerazele prezintă specificitate de direcţie.pol I este implicată în reacţia de replicare. nu însă şi de secvenţă (nu recunosc o anumită secvenţă specifică de baze azotate din ADN).d GTP . ƒ dezoxitimidintrifosfat .cea care a funcţionat ca matriţă şi o catenă nouă sintetizată . Această proprietate aminteşte de transriptaza inversă virală. ƒ uridintrifosfat .) polimerizarea ordonată a nucleotidelor într-o secvenţă complementară unei matriţe după modelul semiconservativ şi sub cataliza unor enzime polimerazice celulare. de asemenea.pol I joacă rol esenţial în repararea leziunilor produse în ADN de către diferiţi agenţi mutageni fizici sau chimici. ulterior sa dovedit că doar ADN . nu numai în nucleu.polimerizatoare: ADN -polimeraza I numită enzima lui Kornserg şi simbolizată Pol I.

O asemenea secvenţă de origine se caracterizează (la toate sistemele biologice analizate) G . intervin enzime numite HELICAZE . În urma acestei „creşteri" rezultă 2 extremităţi.3'. în jurul celeilalte.C. Această torsionare este înlăturată prin acţiunea unei enzime care are capacitatea de a introduce crestături monocatenare tranziente în duplexul ADN. bifurcaţia sa numindu-se bifurcaţie de replicare şi reprezentând cele două catene . recunoscând în mod specific secvenţa de nucleotide de la nivelul acestei origini. desemnate HMG1 şi HMG2. ADN mitocondrial. cum sunt ADN bacterian. La eucariote s-a arătat că proteinele nonhistonice. având o aceiaşi acţiune ca şi proteina reparatorie. moment în care se ataşează ADN .enzima polimerizatoare. enzima de creştere . În celule.polimeraza nu are specificitate de secvenţă este dovedit de folosirea. macromoleculele ADN capătă forma literei „Y ". iar cele circulare. Iniţierea replicării se face într-un punct de pe macromoleculă ADN numit originea replicării. constituind un tetramer. macromoleculele ADN se află sub formă de structuri terţiene sau cuaternare. La E.ADN. Topoizomerazele introduc superspiralizări tranziente negative în ADN. Iniţierea replicării Separarea celor două catene complementare . aceste perechi având doar două punţi de H. După intervenţia topoizomerazei care determină relaxarea ADN la nivelul originii replicării. Acestea realizează separarea catenelor prin ruperea punţilor de H. dar monocatene de ADN de orice proeminenţă ar fi ele. pot separa catenele dublului .în procesul de replicare se realizează progresiv. pentru a se permite înaintarea bifurcaţiei de replicare de-a lungul circumferinţei moleculei.2. Topoizomeraza este alcătuită din două subunităţi luate de câte două ori. La nivelul bifurcaţiei de replicare se desfăşoară procesele mecanismului semiconservativ de replicare prin intervenţia unui complex aparat enzimatic.Faptul că ADN .2. În vederea replicării. este necesară relaxarea macromoleculei torsionate. ceea ce permite rotaţia liberă a unei catene.5'. ADN-giraza superspiralizează ADN printr-un mecanism numit inversie de semn. pe când cea de-a doua subunitate a topoizomerazei acţionează ca ADN . 126 . a unei endonucleoze care. Energia liberă de la nivelul acestei „creşteri" este suficientă pentru a desface încă 2-3 punţi de H. îndepărtând catena complementară.polimeraza .ce devin catene matriţă .matriţă ce-şi expun bazele în vederea împerecherii cu bazele azotate ale nucleotidelor libere. sunt mai uşor de separat comparativ cu perechile G . metaforic s-a spus că topoizomerazele . refăcând starea superhelicală a moleculei fiice de ADN .OH şi alta 5' . în desfăşurarea procesului. enzima de relaxare pe ADN sau UNWINDAZĂ.T are loc iniţierea separării celor două catene. 5. helicaza descrisă sub denumirea de proteină reparatorie se deplasează pe monocatena ADN în direcţia 3' . astfel că. ADN . a primit în ultimul timp numele de TOPOIZOMERAZĂ . în reacţiile „în vitro". datorită superspiralizării prezintă numeroase superrăsuciri.helix ADN. respectiv proteine de topire a ADN. în calitate de matriţă. Proteine neenzimatice denumite UNWINDAZE sau proteine destabilizatoare ale dublului helix (HDP). prin superspiralizare. Există şi alternativa ca primul eveniment în separarea catenelor dublului helix să fie intervenţia la punctul de iniţiere a replicării. Una din aceste subunităţi funcţionează ca topoizomerază propriu-zisă. La nivelul perechilor A . coli. intervin în asigurarea stabilizării monocatenelor.GIRAZĂ sau PROTEINĂ OMEGA (Ω) introducând tururi superhelicale în ADN nou sintetizat. printr-o creştere tranzientă monocatenară a ADN bicatenar într-un anumit punct. produce o „tăiere" a uneia dintre cele două catene tăiere care nu este altceva decât desfacerea unei legături covalente fosfodiesterice. De aceea.C care având trei punţi de H sunt mai stabile .fosfat. una având gruparea 3' .ADN „desfac şi fac nodurile din ADN". folosind energia provenită prin defosforilarea ATP. O altă helicaza numită helicaza III se deplasează în direcţia 5' . Această enzima numită iniţial pivotază. în care o superhelice pozitivă este direct convertită într-una negativă.închidere.ADN.polimeraza nu poate folosi ca matriţă ADN bicatenar.

3' pe cealaltă. astfel că acestea să poată funcţiona ca matriţă. determinând polimerizarea numai în direcţia 5' . nu însă şi de a iniţia sinteza „de novo" a unei catene.000 nucleotide şi apoi aceste fragmente sunt unite prin punţi fosfodiesterice sub acţiunea unei enzime numite ADN . După desfacerea structurii bicatenare în monocatenare şi stabilizarea monocatenelor la nivelul originii replicării. prin intervenţia primazei. Polaritatea opusă a catenelor . în ultimă instanţă.5' pe una şi 5' .3'. Alungirea lanţului de ADN nou .la bacterii ADN . 3' . în desfăşurarea polimerizării de nucleotide din cadrul replicării ADN. Dar. rezultând segmente mai lungi. 5.nepermiţând. odată ataşate la ele. intervine enzima PRIMAZA care determină sinteza unui scurt segment de ARN care s-a numit ARN-PRIMER. În felul acesta fragmentele Okazaki sunt asamblate fără ARN -primer.timidină este de foarte scurtă durată).sintetizat şi terminarea replicării Capătul 3'-OH al fiecărui nucleotid aliniat pe matriţă.3' .ligaza. 78).polimerazice au capacitatea de a alungi catene polinucleotidice deja existente. care sau numit fragmente OKAZAKI.matriţă. care se deplasează numai în direcţia 3' . folosind ca model o catena . Prin activitatea ARN . că noile catene complementare catenelor . Este posibil ca replicarea pe o catena să fie înaintată faţă de cea de-a doua catena sau unirea fragmentelor OKAZAKI să fie mai rapidă pe o catena. Această intervenţie a ARN .matriţă sunt sintetizate pe segmente mici. este necesară ca primă etapă intervenţia unui ARN . fig.polimeraze .5'. 5. una în direcţia 3' . rezultă din unirea acestora din urmă catena nou sintetizată. 77.PRIMER.polimerazei în procesul de iniţiere a replicării ADN se sintetizează un scurt segment de ARN (primer).4. În anul 1968. numită catena directoare (leading). nu au fost descoperite două ADN polimeraze care să polimerizeze în direcţii opuse. serveşte de fiecare dată drept primer pentru activitatea de polimerizare a ADN . Golul rămas în urma exciziei ARN primer va fi umplut prin activitatea tot ADN .matriţă .enzima care are capacitatea de a iniţia sinteza „de novo" de catene polinucleotidice. Primarea replicării Toate enzimele ADN . reasocierea monocatenelor complementare.primer este îndepărtat prin excizie de către un ADN .pol III. a ridicat problema existenţei a două polimeraze care să catalizeze polimerizarea. pe când aceea cu sinteză încetinită se numeşte catena succesoare (lagging) (fig.3.pol I care va realiza completarea printr-o reacţie de polimerizare regională.polimerazei. Pentru aceasta. ARN . După sinteza fragmentului Okazaki. în ciuda tuturor încercărilor.2. 127 .polimeraza I care are activitatea exonucleazică (de hidroliza legăturilor fosfodiesterice). Fiecare fragment Okazaki va fi primat.000 . având circa 1. de un ARN .2. dar esenţial. alta în direcţia 5' .polimerazei în procesul de replicare a ADN apare ca un element ajutător.5' pe ambele catene matriţă. Modelul de replicare discontinuă propus de OKAZAKI s-a dovedit a fi aplicabil la toate sistemele biologice . S-a stabilit cu certitudine că în replicare intervine o singură enzimă polimerizatoare .2. replică a matriţei. Okazaki şi colaboratorii au demonstrat prin experienţe de marcare pulsatorie (contactul materialului biologic cu H .

Schema generală a replicării în care fiecare enzimă sau proteină auxiliară sunt prezentate în mod individual. Se realizează în direcţia 5' . fiind un proces complex.Fig.2. ele să fie corectate imediat.3'. iar în cazul când sau introdus erori.Replicarea ADN. catena lagging se sintetizează în mod discontinuu. care se desfăşoară cu mare viteză.3'. greşit împerecheat cu nucleotidul de pe matriţă să fie excizat. 78 . Catena leading se sintetizează în mod continuu. altfel desfăşurarea polimerizării este stopată (fig. 79). 77 . 128 . Corectarea erorilor de replicare Replicarea ADN.Ele acţionează la nivelul furcii de replicare. necesită ca produşii rezultaţi să fie copiaţi cu mare acurateţe. La nivel molecular există mecanisme care asigură corecţia replicării şi care face ca un nucleotid liber. 5. fagmentele Okazaki sunt unite de către ADN – ligază. în mod accidental. În aceste condiţii şi pe catena lagging sinteza are loc tot în direcţia 5' . Fig.5.

de către ADN – ligază (fig.polimerazei capătul său de 3'-OH. 80).polimeraza realizează în cadrul acţiunii sale catalitice condensarea. sub acţiunea ADN polimerazei care este eficientă în alungirea catenei polinucleotidice iniţiată prin sinteza primerului ARN. Fig. la eucariote reprezintă acele regiuni ale ADN unde se găsesc punctele de iniţiere (de origine) ale replicării. Sinteza unei catene ADN. completarea de către ADN-pol I a întreruperii create în monocatena de ADN. fiind constituit din mai mulţi repliconi (unităţi de replicare). ARN . adică esterificarea grupei 3'-OH a primerului ARN cu grupa 5' . cromozomul eucariotelor este o structură multirepliconică.2. Spre deosebire de cromozomul viral şi bacterian. ADN .la procariote.recunoaşterea bazei incorecte introduse (deci a mutaţiei) .fosfat a primerului dezoxiribonucleotid trifosfat aliniat pe matriţă în virtutea complementarităţii sale cu baza azotată corespunzătoare din matriţă. Unităţile de replicare Numite şi repliconi . reprezentaţi de cromozomul bacterian care funcţionează ca unitate de replicare. 79 . complementar . legarea celor două capete de către ADN ligază. implică mai multe etape şi mai multe enzime de reparare: . 129 . începe deci de la primerul ARN. Acest sistem de corectare postreplicativ. până la 50 nucleotide . a replicei. îndepărtarea de către nucleaze a secvenţei lezate. Acest segment de ARN s-a numit PRIMER.6.polimeraza care catalizează asemenea sinteză s-a numit PRIMAZĂ. 81 . fiind eliminate de la 10.completarea regiunii excizate cu o secvenţă corectă. iar ARN .unirea fragmentelor pentru stabilirea continuităţii catenei. care cuprinde cel puţin 4 etape: recunoaşterea leziunii ADN. care este liber şi care pătrunde într-un sit special al acestei enzime numit SIT PENTRU CAPĂTUL 3'-OH Ah PRIMERULUI. 5.primer oferă ADN . de către polimeraza I .îndepărtarea secvenţei lezate de către nucleaze.Schema reparării ADN (înlocuirea dimerilor de timină).matriţei ADN.Schema generală a sistemului de reparare postreplicativ la bacterii. procesul în care are loc sinteza sa s-a numit PRIMARE.Fig.

Secvenţa genelor din genomul celulelor procariote corespunde în întregime secvenţei aminoacizilor din proteina pe care a codificat-o şi ele sunt numite gene coliniare (fig. realizează toate activităţile ce au loc în celulă. Astfel.1. sunt conţinute de ARNm şi sunt regăsite în secvenţa aminoacizilor din proteină. secvenţei aminoacizilor din proteine. se materializează în sinteza proteinelor a fost elucidat în ultimii 40 de ani. de fapt. Din schema de mai sus. care sunt transcrise în ARN precursor. ƒ introni. În acest caz. când este activată. Acest proces de sinteză a ARN este denumit transcripţia ADN. care conţine numai exoni şi a căror secvenţă serveşte pentru sinteza proteinelor. reprezentate de aprox. secvenţe din genă. proces realizat de o enzimă (ce se găseşte de la virusuri până la eucariote) denumită reverstranscriptază. conţinută în molecula de ADN.83). genele din genomul celulelor eucariote sunt întrerupte de secvenţe care nu vor fi regăsite în secvenţa proteinelor. Transmiterea informaţiei se face prin ARNm. a cărei funcţie este de a translata mesajul genetic în proteine. Se foloseşte termenul de expresie genică. rezultă o moleculă de ARNm. după schema: Transcripţie Translaţie ADN ----------------→ ARN -------------→ PROTEINE Mesager de transport ribozomal Temin şi Baltimore au stabilit (1970) că este posibilă transmiterea informaţiei şi de la ARN la ADN. în întregime sau parţial. Această dogmă consideră că ADN transmite informaţia la ARN şi de la ARN la proteine. Astfel. dar nu mai sunt conţinute în ARNm şi deci nu se mai găsesc în secvenţa aminoacizilor din proteinele transcrise (fig. Intronii sunt eliminaţi din molecula de ARN precursor prin mecanisme speciale. 82). Fig. Desfăşurarea acestui flux informaţional apare sub denumirea de dogmă centrală a biologiei moleculare ( 1960 – 1970 ). pentru că o regiune din molecula de ADN reprezentată de o genă.3. În prima etapă. Proteinele sunt componente celulare care. 000 de tipuri diferite. transcrie un ARNm pentru o proteină dată. Transcripţia ADN sau sinteza ARN 5. Spre deosebire de acestea. procesul fiind denumit reverstranscripţie şi astfel dogma centrală este contrazisă.Genă structurală care corespunde exact secvenţei ARNm şi proteinei sintetizate. sinteza ARN sau expresia genică.5. care este un produs intermediar. 130 . 82 . Mecanismul general Mecanismul prin care informaţia genetică. Numărul proteinelor este de aproximativ 109 – 1010 molecule/celulă. ARNm reprezintă matricea (template) pentru molecula de ADN. gena este transcrisă în întregime într-o moleculă de ARN numită precursor (pre-mesager sau ARN nuclear heterolog). Indiferent din ce celulă provine ADN (procariote sau eucariote) conţine mii de gene a căror secvenţă corespunde. molecula de ARNm apare mult mai mică decât transcriptul primar – ARN heterolog. secvenţe care sunt transcrise în ARN precursor. În urma acestui proces.3. 10. se observă că ADN nu intervine direct în sinteza proteinelor. o genă (sau mai bine zis unitatea transcriptibilă a genei) la eucariote este formată din două grupuri de secvenţe: ƒ exoni.

format din cele patru nucleotide (A.Transcripţia ADN. exonii sunt uniţi între ei (splicing) pentru a da naştere ARNm sau matur.Gene structurale eucariote intrerupte de introni. 84). ARN polimeraza sintetizează ARN. în care secvenţele intronilor nu se mai regăsesc. 131 . temporar şi pe lungimi scurte.G.3.sau retrotranscripţia ARNm). genele pentru histone. 84 . un lanţ lung neramificat. care prin translata proteina. pentru ca una să servească de matrice pentru ribonucleotidele ce vor fi aşezate complementar secvenţei catenei de ADN. În acest scop. ca şi ADN. 83 . Chiar şi ADN mitocondrial conţine uneori introni în genele care codifică toate tipurile de ARN. Majoritatea genelor pentru ARNt sau ARNr din genomul a numeroase eucariote conţin şi ele introni care sunt eliminaţi din transcriptul primar. Opţiunea pentru catena ce va fi copiată este determinată de poziţia promotorului în secvenţa ADN. copiind mesajul de pe o singură catenă ADN. de exemplu. Sunt însă gene care nu au introni. ARN este. Din ARN precursor intronii sunt îndepărtaţi. interferoni şi retrogenele (genele provenite din revers. Deci ARNm (ca şi celelalte tipuri de ARN) sintetizat ca un lanţ monocatenar este complementar catenei de ADN care l-a transcris şi este identic cu cealaltă catenă de ADN netranscrisă (fig. Fig.C) informaţia genetică a unei singure catene de ADN va fi transmisă la o secvenţă complementară de ARN.Fig.U.2. Elemente implicate în transcripţie Transcripţia implică sinteza unui lanţ polinucleotidic de ARN care preia mesajul de pe molecula de ADN. cele două catene de ADN se vor separa. 5.

1. La E.ARN.3. . Sinteza continuă şi polimeraza alunecă de-a lungul ADN. codificate de gene distincte şi care au funcţii diferite în procesul de transcripţie. 3. în regiunea desfăşurată a helixului. desfăcând dublul helix pentru a expune un nou segment al matricei sub formă monocatenară. 10 % din total ).polimerază a genei care trebuie transcrisă ( gena ţintă ).ARN-polimeraza I – este o enzimă localizată în nucleol şi catalizează transcripţia ARNr. Enzima completă sau holoenzima are o greutate moleculară de aprox. ARNm. ea reprezintă activitatea sintetică cea mai mare (aprox. etapa de elongaţie. a punctului de iniţiere unde are loc desfacerea helixului ADN pentru generarea unei regiuni monocatenare scurte şi încorporarea primelor nucleotide care formează lanţul de ARN. Greutatea moleculară a factorului σ variază de la 32000 la 92000 da. Ele ocupă poziţii distincte în spaţiu nuclear şi fiecare tip de enzimă prezintă o structură complexă. ARNt) sunt transcrise. La procariote există un singur tip de ARN polimerază care este responsabilă pentru sinteza celor trei specii de ARN. deoarece factorul σ nemaifiind necesar . locul la care primul nucleotid este încorporat se numeşte punct de iniţiere (start point şi se notează cu + 1). 50 – 70 % din total). responsabilă pentru transcripţia ARNm (activitate egală cu aprox. Fiecare celulă eucariotă conţine între 2 x 104 până la 2 x 107 molecule de ARNpolimeraze. etapa de iniţiere. Transcripţia odată iniţiată este continuată de enzima core.polimeraza II – este o enzimă nucleoplasmatică. Pe lângă ARN polimeraza specifică fiecărui ARN sunt implicate în acest proces numeroase proteine auxiliare (factori de transcripţie) şi o serie de elemente de control existente în structura ADN. .polimeraze prezită trei etape importante. Angajate în transcripţie sunt probabil 2000-5000 de molecule. Procesul de transcripţie catalizat de ARN. cele trei specii de ARN (ARNr.polimeraze nucleare.3. Procesul de transcripţie este realizat de enzima ARN polimeraza. 2. La eucariote. 480. 132 .coli numărul total de molecule de ARN polimerază/celulă este de aprox. care include: recunoaşterea de către ARN. etapa de terminare. când are loc formarea hibridului molecular ADN-ARN.Transcripţia ADN este un mecanism coplicat. Aparatul enzimatic de transcripţie Transcripţia ADN implică producerea a trei specii de ARN: ARN mesager (ARNm). reprezintă faza în care nucleotidele sunt legate covalent la capătul 3' al lanţului polinucleotidic. ADN se reface sub formă de dublu helix. aparatul de transcripţie este mult mai complex şi mai puţin cunoscut decât la procariote. pe lângă factorul σ. 7000.polimeraza III – este o enzimă tot nucleoplasmatică care transcrie ARNt şi 5S ARNr activitate egală cu aprox. Bazele sunt adăugate succesiv la lanţul ARN. se separă.polimerază. de către un tip de polimerază. care necesită un aparat de transcripţie.000 Da şi este formată din două componente: enzima core (de bază) şi factorul σ (sigma). 20 – 40 % din total). Într-o celulă eucariotă există trei tipuri de ARN. ARN ribozomal (ARNr) şi ARN de transfer sau de transport (ARNt). şi anume: . fiecare. 5. care va începe activitatea la un alt punct de iniţiere.ARN. factorul σ fiind componenta implicată numai în recunoaşterea şi fixarea corectă a punctului de iniţiere. ARNpolimeraza şi molecula de ARN sintetizată se desprind şi devin libere în mediu. Iniţierea transcripţiei se face prin holoenzimă (enzima completă). secvenţa ADN necesară pentru realizarea acestor reacţii este reprezentată de promotor. Enzima. care reprezintă punctul unde sinteza lanţului de ARN se termină iar hibridul ADN-ARN format. conţine alte patru componente. La celulele eucariote. se desprinde de complex şi se asociază la o altă ARN.

. Factorii de transcripţie Spre deosebire de procariote. Aceste secvenţe sunt denumite elemente responsive (Responsive elements). atenuează. în sensul ca îl intensifică. implicat în: . . (fig. Alţi factori de transcripţie (notaţi cu I. factorii de transcripţie sunt specifici pentru anumite ţesuturi. este factorul de transcripţie D (notat TFIID). 106). În aceasta categorie de proteine intră receptorii hormonali steroidici. 5. Acestea sunt proteine reglatoare. prin hidroliza ATP.3. Elemente de control în expresia genetică Reglarea specifică a expresiei genice implică sinteza ARN. la eucariote ADN-polimeraza se leagă de proteine care au identificat promotorul genei ce va fi transcrisă. Pentru acestea se impun cel puţin doua condiţii: . estradiol. progesteron etc. Catena care se copiază asigură sinteza moleculei de ARN în direcţia 5'-3' (deci va fi întotdeauna catena ADN cu direcţia 3'-5'. pe lângă ARN-polimerază este necesar un mare număr de proteine auxiliare numite factori de transcripţie. care copiază o singură catenă a moleculei de ADN.) în nucleu şi interactionează cu secvenţele specifice ADN (elementele responsive) iniţiind. care interacţionează cu secvenţe specifice de ADN şi care pot acţiona stimulator sau inhibitor asupra expresiei genice.polimeraza. care transportă hormoni (corticoizi. Pe lângă aceşti factori de transcripţie. implicaţi direct în sinteza ARN există şi proteine care reglează desfăşurarea procesului. din extractul nuclear. Primul care recunoaşte promotorul şi în special TATA-box. III. Ei joaca un rol important în diferneţierea celulară şi menţinerea tipurilor de celule. . H. cât şi ARN. Acest factor odată legat la ADN va atrage şi alţi factori de transcripţie. specificând tipul de ARN-polimerază care se leagă) sunt notaţi cu litere: A (de ex: TFIA). deci a sintezei ARN. care ca şi factorii de transcripţie au capacitatea de a se lega de ADN. E. . nu blochează.la nivelul ADN trebuie să existe de asemenea secvenţe nucleotidice specifice (de obicei 515) care să corespundă domeniilor (motif-elor) din proteinele reglatoare respective. accelerând sau blocând transcrierea unor gene.elongarea transcriptului. Dacă ARN-polimerazele sunt universale. TF de la transcription factor şi II de la ARN-polomeraza II. unde ARN-polimeraza se leagă de ADN. 133 . cât şi elementele (secvenţele) de control care reglează expresia genei. Aceste proteine. G. 20 de proteine. D. o serie de factori de transcripţie. Cercetări analitice au permis să se izoleze şi purifice.5.obţinerea energiei necesare sintezei. Pentru că el se leagă de secvenţa TATA-box a promotorului a fost denumit şi TBP (TATABinding Protein). 5. Aceste domenii sunt considerate ca elemente de recunoaştere a genelor ţintă şi de aceea se numesc şi capete de citire (Reading Head).3. O genă conţine atât informaţia pentru structura proteinei. reprezintă factorii de transcripţie care intră în aparatul transcripţional format din aprox.menţinerea duplexului ADN după legarea factorilor de transcripţie (FT). F.proteina trebuie sa conţină în structura ei o secvenţa specifică de aminoacizi (de obicei 10100) care reprezintă domeniul (sau motif-ul) de interacţiune cu ADN.Terminarea sintezei este realizată de o secvenţă specifică în structura genei care se numeşte terminator.menţinerea stării active a genei ţintă sub acţiunea altor factori transcripţionali şi legarea ARN-polimerazei. identice pentru toate ţesuturile şi celulele. B (TFIIB). Pentru realizarea procesului complex de transcripţie.4.iniţierea transcripţiei ( a sintezei ARN). iar catena nouă va avea direcţia 5'-3'. II. .

Promotorul este considerat o secvenţă esenţiala pentru reglarea ARN polimerazelor şi a factorilor de transcripţie. are ca element principal promotorul: o secvenţă de nucleotide specifică fiecarei gene. Promotorul. Enhancer-ii pot fi situaţi în secvenţa de ADN „în susul” (upstram) promotorului său „în josul” lui (down stream) faţă de punctul de iniţiere a sintezei ARN(+1) (fig 85). La bacterii promotorul conţine doua secvenţe caracteristice şi necesare pentru legarea ARN polimerazei si pozţionarea ei cu precizie faţă de punctul de iniţiere: ƒ secventa-10. Promotor cu (TATA box).Gena din punct de vedere funcţional şi structural conţine 2 regiuni: regiunea reglatoare şi regiunea de transcripţie (sau unitatea transcriptibilă) care sunt separate de punctul de iniţiere a sintezei ARN (punctul start care se noteaza cu +1. aşa-numitele secvenţe activatoare(upstream activator sequences – UAS). Abilitatea promotorului de a iniţia transcrierea unei gene poate fi foarte mult acentuată de prezenţa unui enhancer. care reprezinta TATA-box (sau HAGNESS BOX) . de exemplu la drojdii. adică upstream (fig. de unde îşi pot exercita efectul pozitiv asupra transcripţiei. iar ARN sintetizat este echivalent în secvenţa nucleotidelor cu monocatena de ADN netranscrisă (catena opusă). Enhancer-ii sunt elemente reglatorii implicaţi în activarea ratei de transcripţie a unei gene. care nu se transcrie. care. adică primul nucleotid din molecula ARN). 85 . ambele catene ale ADN pot servi drept matrice pentru sinteza ARNm. ƒ secvenţa -35 (minus indicând că aceste secvenţe se află la stânga faţă de punctul de iniţiere. promotorul devenind mai accesibil factorilor de transcripţie. 134 . promotorul. va decide care catenă de ADN va fi copiată (fig. Ei determină acetilarea histonelor care determină o relaxare a miezului histonelor. În realitate. în funcţie de orientarea în structura ADN.secventa -27. numai o singură catenă a ADN este transcrisă.care reprezintă TATA-box (sau PRINBOW BOX). Mecanismul transcripţiei În general. sinteza ARN având loc numai in direcţia 5’ – 3’.Schema generala a elementelor de control. Există şi alte elemente similare. iar la eucariote (mamifere) de factorii de transcripţie. Regiunea reglatoare. în funcţie de poziţia lui în secvenţa ADN. Aceste secvente UAS care sunt localizate la distanţe diferite de promotor pot funcţiona în orice orientare. TATA box situată la -27 pb este secvenţa indispensabilă pentru iniţierea corectă a transcripţiei de la punctul start (acelaşi rol îl are secvenţa -10 la procariote). secvenţele activatoare –UAS şi enhancer-ii La eucariote promotorul conţine 2 secvenţe caracteristice: . 85). asigură legarea ARN polimerazei şi orientează “citirea” (sinteza) într-o direcţie sau alta.secvenţa -84. În orice caz. Fig. 86).4. 5. Ei pot creşte transcripţia unui promotor până la 1000 de ori. Enhancerii şi aceste elemente UAS pot exista până la 3000-5000 pb distanţă de promotor.

unde se formează un complex “închis”.formată din baze de complementare T-A. 135 . Secvenţa -10 conţine în general. La procariote legarea ARN polimerazei la promotor este determinată de două secvenţe scurte: secvenţa-35 şi secvenţa-10. factorul sigma (σ) se desprinde de ARN-polimeraza. coli.se desfac pentru a permite transcripţia unei catene de ADN. Factorii de elongaţie sunt de fapt proteine a căror structura este cunoscută. Secveţa terminator reprezintă semnalul terminării sintezei şi la acest punct ARN-polimeraza se desprinde de catena ADN. fixarea polimerazei s-a constatat că are loc în două etape: . factorul sigma (σ) are rol de recunoaştere a secvenţei promotorului şi de fixare corectă a punctului de iniţiere a sintezei. baze AT. Modificări importante (mutaţii) produse la nivelul acestor secvenţe (numite secvenţe consens) au ca efect abolirea activităţii de promotor. când.apoi.ataşarea lejeră a enzimei complete. se desfac. direcţia de transcripţie (-35…-10…+1). . La E.A-T. 17 pb. 8 nucleotide ARN au fost ataşate pe matriţa ADN. în momentul când enzima întâlneşte o altă secvenţă specială în regiunea transcriptibilă a ADN ( de obicei 6A ce vor fi reprezentate în ARN prin UUU…). Această secvenţă a fost denumită terminator. la temperatura de 370 C.Figura 86 . însă funcţia lor exactă nu a fost elucidată. Figura 87 – Secvenţa -10 (TATA box). duplexul ADN se reface. 3 minute. Procesul de elongaţie a moleculei de ARN este oprit. începând de la secvenţa -10. 87). este realizat în aprox. 5000 nucleotide. Prin urmare. expunând catena matrice a ADN permiţând introducerea primelor ribonucleotide (necesare sintezei moleculei de ARN) pentru iniţierea sintezei (a transcripţiei). După ce ARN-polimeraza s-a fixat şi aprox. unde intervine un număr de factori de elongaţie. În timpul elongaţiei. aprox. la secvenţa -35. 30 nucleotide pe secundă. complexul “închis” este transformat într-un complex “deschis’. iar hibridul format din moleculele ADN-ARN se desface. Aceste două secvenţe împreună cu punctul de iniţiere (+1) determină de fapt promotorul şi aşezarea topografică. iar molecula ARN transcrisă este eliberată în mediu. sinteza catenei de ARN se desfăşoară cu o viteză de aprox. care permit desfacerea dublei catene a ADN. un polimer ARN de aprox.Promotorul este orientat bine(in direcţia 3’-5’ a catenei ADN) si sinteza ARN se va face in direcţia 5’3’. cu mai multă uşurinţă decât perechile GC (fig. La bacterii. Enzima core poate continua în aceste condiţii sinteza ARN.

ARN-polimeraza I şi II formează complexe cu factori de transcripţie care se leagă upstream (înaintea punctului de iniţiere) pe când majoritatea factorilor de transcripţie pentru ARN+polimeraza II se leagă downstream (în mijlocul unităţii de transcripţie). 136 . Sinteza (transcripţia) trebuie făcută cu acurateţe pentru ca la nivelul ARN nu există sisteme de corectare a erorilor. U4. 5. . Moleculele de ARN precursor. Factorii de transcripţie formează complexe de transcripţie. Procesul pe etape. Acest factor împiedică terminarea prematură a sintezei ARN. este necesară pentru eliminarea secvenţelor intronice. Viteza de sinteză a ARN este de 45 nucleotide/secundă. care în mod selectiv atrag moleculele de ARN-polimerază la promotorul de care ei s-au legat. Procesul trebuie să se realizeze cu mare acurateţe.self-splicing-ul ARN care a fost pus în evidenţă la nivelul pre-ARNm mitocondrial.5. se pare că este asemănător şi pentru eucariote. ARNr şi ARNm (numit şi pre-ARNm). Secvenţa desfăşurării procesului ar fi următoarea: . dar care nu vor mai fi regăsite în secvenţa aminoacizilor din proteinele corespunzătoare. relativ stabile. Factorii care iniţiază transcripţia se deosebesc se ceosebesc de factorul sigma pe care îl conţine ARN-polimeraza bacteriană. la nivelul promotorului genei ţintă.complexul ADN+TFIID acţionează ca un situs de legare pentru un alt factor: TGIIB care legându-se va stabiliza complexul. ca să devină funcţionale sunt supuse la o serie de modificări: tăiere. ARN+polimeraza nu recunoaşte direct promotorul.primul factor de transcripţie care recunoaşte promotorul. Cataliza este realizată de un complex ribonucleoproteic. ARN având un timp de înjumătăţire biologic ( T1/2) relativ scurt. . ARN splicing În procesul de transcripţie produşii sintetizaţi sunt reprezentaţi de fapt de precursorii ARNt. . eliberând energia necesară desfacerii catenelor de ADN. şi anume: .la acest complex se asociază alţi factori: TFIIE şi TFIIH. ci prin intermediul unuia dintre factorii de traanscripţie specifici procesului de sinteză a ARN. pentru a realiza molecula de ARN matur. care conţine ribonucleoproteine nucleare mici (U1. care este factorul de elongaţie. ordonare şi unire (splicing). înainte de a fi exportate în citoplasmă. . pentru formarea complexului deschis (open).splicing-ul ARN nuclear ce are lor la nivelul pre-ARNm. prin introducerea unui singur nucleotid necorespunzător. (transmisibile) ca în cazul erorilor ADN. Odată cu descoperirea intronilor self-splicing. aceştia au putut fi comparaţi cu structura intronilor din pre-ARNm. Acest proces este necesar pentru ca intronii prezenţi în moleculele precursor să fie eliminaţi şi numai secvenţele exonice să fie unite.la acest complex se asociază un alt factor: TFIIS. U5.U6) plus alte componenete. U2.acum. Din această analiză a reieşit că intronii self-splicing pot fi împărţiţi în două clase: introni de grupa I şi introni de grupa II. care necesită a fi procesate. este TFIID (sau TBP). Dacă au apărut erori.La eucariote. Iniţierea începe când s-a format complexul de iniţiere. Procesarea. ARN+polimeraza se va lega de factorul rspectiv şi nu de secvenţa de ADN. Cercetările experimentale au relevat două aspecte în splicing-ul ARN. numită ARN splising. poate conduce la un ARNm care nu mai poate translata o proteină funcţională. numit splisozom (spliceosome). care au fost transcrise în ARN precursor. Acest factor are acţiune ATP-azică. . de acest complex se leagă ARN-polimeraza II şi în urma unui proces ATP-dependent începe iniţierea transcripţiei. cu excepţia că ARN sintetizat este reprezentat de molecule precursor. O eroare produsă. prezentat în cazul procariotelor. în special TATA box. nu pot produce perturbaţii de ordin genetic.

fiind realizată de o enzimă numită poli(A) polimeraza. Capătul 5' al intronului devenit liber se leagă covalent de adenina intronului formând o buclă. . şi/sau .La intronii din grupa I reacţia de splicing începe la o nucleotidă guanodinică (G). se ataşează la capătul celui de-al doilea exon. numită Ribosome Binding Sequence (secvenţă de legare la ribozomi). În felul acesta toţi intronii din molecula de ARN precursor sunt eliminaţi. deci în cele diloide se găsesc în cel puţin două copii. H2A. celula foloseşte două moduri de amplificare a ARNm.de la riboză) la nivelul situsul splice 5'. Exonii existenţi se unesc cap la cap şi realizează o moleculă matură de ARNm. Asigurarea necesarului de ARNm Genele din genomul celulelor haploide se găsesc într-o singură copie. Coada formează un polimer de aprox. . Pentru asigurarea o cantitate suficientă de proteine pentru celulă sau organism. 5. 137 . Acesta este cazul genelor pentru histone: H1.se adaugă o „coadă” de poli (A)+ la capul 31-OH terminal al moleculei. UGA sau UAG (aceştia nu codifică nici un aminoacid). Această cantitate formează firele necesare pentru o gogoaşă la viermele de mătase. În acest caz el va avea un T1/2 mai mare şi nu se va degrada după ce a dat prima copie de proteină.urmată de codonul de iniţiere a translaţiei ( AUG). unde molecula de pre-ARNm este clivată. iar ARNm produce 1010 molecule de fibroină. realizează un atac nucleofil (prin gruparea terminală 2-hidroxi .o secvenţă terminator (stop) reprezentată de unul din codonii stop sau terminatori: UAA. şi anume: gena respectivă va fi transcrisă de mai multe ori şi va rezulta o cantitate mai mare de ARNm. situată aproape de situsul splice 3'. rupând molecula de pre-ARNm. În urma acestui atac intronul este îndepărtat şi cei doi exoni care erau separaţi în molecula precursor. H3 şi H4. Aceste două procese nu sunt codificate în secvenţa ADN. ARNm.captarea ARNm în urma căruia se adaugă la prima guanidină (la capul moleculei). Sunt gene care codifică un singur tip de proteină. prin transcripţie conţine următoarele secvenţe importante: . iar intronii din grupa II la o nucleotidă adeninică (A). După transcripţie şi splicing (procesare) ARNm suferă două procese (posttranscripţionale) şi anume: . . . 200 Ǻ. o grupare metil (– CH3) în poziţia 5'. Mărimea lor este de aprox. de aceea ele sunt numite procese post-transcripţionale.ARNm este folosit de mai multe ori pentru sinteza proteinei respective. unde are loc cel de-al doilea atac nucleofil.000 nucleotide sau chiar mai mult. Aceste molecule sunt exportate în citoplasmă şi pe baza informaţiei pe care le conţin se face sinteza proteinelor funcţionale. 80 până la 10. Genele celulelor de la mamifere conţin mai mulţi introni decât exoni.o adenină (A) din secvenţa intronului.în etapa a doua hidroxilul 3' al primului exon. H2B. însă ele se găsesc în genomul celular în mai multe copii.6. . Se pare că intronii reprezintă un „sac” de acumulare a mutaţiilor şi protejează în felul acesta ADN-ul de anumite leziuni. Prin acest mecanism se explică cum gena fibroinei (2 copii/genom) produce în 4 zile 105 molecule de ARNm.secvenţa de nucleotide (codoni) pentru sinteza polipeptidului (proteinei). La ambele grupuri s-a constatat că splicingul are lor în urma a două reacţii de transesterificare ( transfer de grupări fosfat ) şi anume: .o secvenţă specifică (5-10 nucleotide) care asigură legarea ARNm de subunitatea mică a ribozomului. care s-a format în prima etapă. se unesc.

în contact cu mitocondriile. drumul complet al unei proteine (proteină de tip secretor) de la sinteză până la eliminarea sa din celulă. Rezultatele acestor studii au deschis calea cercetărilor în problema transportului intracelular. . vezicule. există o relaţie directă cu zonele aparatului Golgi.exportul (eliminarea) proteinelor în lumenul acinului pancreatic. proteinele sunt dirijate cu precizie şi cu maximum de eficienţă către circa 20-25 de destinaţii diferite: biomembrane. care limitează tubuli. 138 .Capitolul 6 TRANSPORTUL INTRACELULAR În anul 1976. segregare a proteinelor în cisternele reticului endoplasmatic(RE). studiind mecanismul sintezei zimogenului de către celulele acinoase pancreatice (celule specializate în sinteza şi exportul proteinelor). acinul pancreatic). Astfel. între citomembranele sistemului vacuolar şi celelalte membrane celulare (plasmatică. .de concentrare a proteinelor în vezicule de condensare (la polul apical al celulei. elemente structurale.1. au reuşit să demonstreze pentru întâia oară. Prin legăturile contractate cu membrana celulară plasmatică. Tot elemente ale reticulului endoplasmatic sunt implicate în geneza lizozomilor. pe de o parte. Jamieson. cu o grosime variabilă între 50 – 70 Ǻ. Tartecoff. ca şi cu toate organitele celulare . astfel au putut fi diferenţiate fazele: . Sistemul vacuolar intracitoplasmatic Folosirea microscopului electronic a arătat prezenţa intracitoplasmatică a unui sistem complex de membrane. 6. Sheele şi Berger). iar pe de altă parte diferitele tipuri de reticul endoplasmatic se pot transforma unul în altul. trabecule. cât şi prin comunicarea directă cu membrana nucleară. Producţia de proteine în celule este concentrată într-un compartiment anumit denumit citozom (matrice celulară). Dirijarea precisă a proteinelor non-sintetizate către o anumită destinaţie finală se datorează unei anumite informaţii pe care proteina o poartă în structura sa. .Palade. sunt de asemenea. caracteristică. Astfel. . Diversitatea.E. Aceste observaţii au acreditat ideea că.de transport intracelular.de concentrare.de sinteză proteică la nivelul ribozomilor. Treptat s-a dovedit că aproape toate proteinele membranare (cu excepţia unei părţi din proteinele membranelor mitocondriale şi cloroplastice) sunt sintetizate la nivelul ribozomilor. Din acest compartiment celular de sinteză proteică. componentele reticulului endoplasmatic servesc transportului de materiale în celulă. s-au constatat contacte între reticulul endoplasmatic şi membrana celulară. nucleară) există relaţii de continuitate. ceea ce sugerează o continuitate între aceste categorii de membrane. saci turtiţi sau cisterne . prin îmbarcarea proteinelor în vezicule de transport (vezicule carriers) şi dirijarea lor spre complexul Golgi. Este vorba despre un semnal specific al proteinei (o anumită structură chimică) pentru recunoaşterea respectivei proteine de către un anumit receptor de membrană (situs membranar). Componentele reticulului endoplasmatic păstrează strânse interrelaţii topografice şi funcţionale între ele. conţinutul unor compartimente celulare. un grup de cercetători de la Yale University (G. elemente ale reticulului constituind membranele saculilor golgieni. complexitatea şi plasticitatea sistemului de citomembrane constituie un suport structural important în explicarea heterogenităţii funcţionale care caracterizează biologia celulei. în jurul cărora formează tubuli orientaţi regulat.Componenta membranară intracitoplasmatică are o structură trilaminară.

de circa 90 minute. O serie de factori de natură proteică ce au situsuri de fixare pe ribozomi. sediul sintezei proteinelor secretate este reticulul endoplasmatic granular la nivelul ribozomilor ataşaţi de membrane. O dezvoltare abundentă a sa se observă în celulele organului Corti. după care.În acelaşi timp. reticulul endoplasmatic capătă aspect vezicular. În afara acestor corelaţii ale membranelor golgiene cu membranele nucleare şi citoplasmatice. ergastoplasma şi reticulul endoplasmatic nuclear fiind aspecte ale aceluiaşi sistem structural endocelular. 3. Codul este tradus de ARN-m. favorizează acestora „citire” a mesajelor venite de la ADN. pe calea cisternelor citomembranelor reticulare. 139 .2. al cărui sediu este reprezentat de ceilalţi ribozomi şi se realizează într-un timp lung. După sinteză. nefrocite. După structura sa. iar veziculele mici reprezintă structuri „de transport” care asigură legături funcţionale dintre reticulul endoplasmatic şi aparatul Golgi. frecvent au fost observate continuităţi structurale şi funcţionale ale acestora cu reticulul endoplasmatic cu ribozomi. prin sistemul de citomembrane. cu ajutorul codului său triplet nucleotidic. ribozomii sunt „situsul” sintezei proteinelor. arătând că la nivelul reticulului endoplasmatic granular sunt sintetizate proteinele „de export”. În mod evident. Rolul citomembranelor granulare în sinteza proteică O dezvoltare abundentă a citomembranelor granulare se observă în celule angajate activ în sinteza de proteine „de export” (secretorii). După transferul în spaţiul intracisternal. 6. poartă mesajul ADN şi se fixează de ribozomi. aduc precizări asupra modalităţii in care reticulul endoplasmatic participă la sinteza proteinelor intracelulare. Microscopul electronic a semnalat şi formarea membranelor golgiene netede pe seama membranei nucleare. care se deplasează traversând ribozomul. pancreas exocrin. În celula vie. pierde ribozomii şi se transformă în membrane agranulare netede. În mod simultan. acesta în raport cu prezenţa sau absenţa la suprafaţa membranelor a poliribozomilor. moleculele de ARN-t se eliberează şi complexele noi de aminoacil-t-ARN se fixează pe ribozomi. într-un timp scurt (până la un minut). reticul endoplasmatic neted (agranular). cât şi asemănările ultrastructurale dintre acestea. cum sunt celulele glandelor salivare. relaţiile de continuitate între membrana nucleară externă şi membranele rugoase. s-a acreditat ideea unei modificări succesive. 1945) şi prin metode biochimice s-a demonstrat existenţa ribozomilor legaţi de membrana reticului endoplasmatic şi rolul major al reticulului endoplasmatic în biosinteza proteică. Studiile lui George Palade. Complexele aminoacizilor-t-ARNm (aminoacil-t-ARN) ”recunosc” acest cod triplet şi aminoacizii se adaugă pe rând. În apropierea zonelor Golgi. sistemul vacuolar citoplasmatic se împarte în reticul endoplasmatic granular (ergastoplasmă). proteinele secretate sunt transferate în cisterne. care corespund la stări funcţionale distincte. Biosinteza proteinelor sau translaţia ARNm Prin microscopie electronică (Porter şi colab. În decursul acestui proces ARNm. Consecinţele acestor continuităţi sunt importante funcţional. spaţiul perinuclear este în comunicare cu toate regiunile celulei. iar la sfârşitul ei polipeptidul se eliberează de ARN-t. au permis a se considera că spaţiul perinuclear este o extindere a sistemului vacuolar citoplasmatic. 6. unde se maturează în timp. lanţului polipeptidic în creştere. aparatul Golgi. Astfel. spre deosebire de sinteza proteinelor structurale. Sunt cazuri când membrana nucleară trimite prelungiri îndreptate către aparatul Golgi Corelaţia de acest tip a permis aprecierea că membrana nucleară poate contribuie la formarea membranelor golgiene. epiteliul tiroidian. ca o diferenţiere a sistemului vacuolar citoplasmatic şi structurile lizozomale. proteinele sunt transferate în zona golgiană. Rezultatul acestor studii este sintetizat în teoria lui Palade asupra mecanismului sintezei proteinelor secretate.

peste 100 000 de proteine diferite.1. Dicţionarul folosit de celulă. Fig. 88). fie rol enzimatic. la diferite sisteme biologice analizate. Rolul proteinelor în desfăşurarea proceselor vieţii este esenţial. dar mai ales desfăşurarea celor două funcţii esenţiale ale materialului genetic – autocatalitică (replicare) şi heterocatalitică (dirijarea de sinteze specifice de proteine sau de alte biomolecule: ARNm. fie rol metabolic transportor (hemoglobina). 140 .3. Al treilea nivel de transfer informaţional (translaţia) condiţionează convertirea informaţiei din alfabetul cu 4 litere al ARNm (A-U. C-G) în alfabetul de 20 litere.(fig. Decodificarea informaţiilor genetice În cadrul sintezei proteice se realizează ultima etapă a transferului informaţiei genetice conţinută în secvenţa de baze azotate din ADN. devine o „realitate” într-o secvenţă de aminoacizi de la nivelul catenelor polipeptidice. într-o secvenţă de aminoacizi.Al treilea nivel informaţional (translaţia) Toate procesele metabolice ale celulei se bazează pe existenţa şi funcţionarea proteinelor care pot avea fie rol structural (colagenul). fie rol în apărarea organismului (imunoglobulinele). ARNt. ARNr) sunt dependente de proteine precum histonele. la nivelul ribozomului. respectiv decodificat. Însăşi structura. dintr-o secvenţă de codoni. Astfel informaţia genetică din stare potenţială aflată în structura ADN. Ea este transcrisă sub formă de mesaj genetic în ARNm şi acesta este tradus. Până în prezent au fost identificate. reprezintă cei 20 aminoacizi esenţiali ai proteinelor. 88 . în această traducere este reprezentat de colecţia sa formată din cele 54 tipuri de ARNt.6.

structura primară fiind determinată pentru toate celelalte nivele structurale. implică formarea de legături sau punţi peptidice între gruparea carboxil (COOH) a unui aminoacid şi gruparea amino (. în ultimul caz. Prin acestea. Se înţelege de la sine că pentru îndeplinirea funcţiei sale normale. de t° sau pH. în translaţie (factori de iniţiere şi terminare). materialul genetic nu ar putea să îndeplinească nici una din funcţiile sale. Structura şi funcţia proteinelor reprezintă expresia primară a informaţiei genetice.ligaze). reprezentând secvenţe de aminoacizi care a fost determinată de mesajul genetic. cunoscută sub denumirea de configuraţia α .proteinele – enzime. Polimerizarea aminoacizi.S S -). molecula de insulina este formată din două catene polipeptidice. ARNt şi ARNr . prin intermediul unor asemenea legături şi acest caz proteina se prezintă sub formă de structură cuaternară. Pentru sinteza unei singure catene polipeptidice sunt mobilizate sute de alte molecule proteice cu rol structural şi enzimatic. adică includerea lor într-o catenă polipeptidică care reprezintă structura primară a proteinei . Formarea de punţi peptidice succesive determină polimerizarea aminoacizi liberi. terţiar şi cuaternar. de asemenea. sinteza proteică fiind însoţită de o creştere considerabilă a cantităţii de ARN în celulă. catena polipeptidică capătă configuraţii spaţiale bidimensionale sau tridimensionale . în transcrierea (ARN polimeraze). formată din 21 aminoacizi ş i o catenă B format ă din 30 aminoacizi. electrostatice. în recombinare (recombinaze). realizată la nivelul ribozomilor. în urma formării punţilor de H. În decodificarea informa ţ iei genetice rolul primordial îl joac ă acizii ribonucleici celulari: ARNm. Această intervenţie a unui număr mare de proteine în diferite etape ale procesului decodifică rii este cerută de o traducere exactă a mesajului genetic. Rolul ARN în decodificarea informaţiei genetice a fost evidenţiat după anul 1950 de către BRACHE T şi CASPERSSON. În cadrul biosintezei proteinelor participă deopotrivă acizii nucleici ş i proteinele. prin intermediul unor punţi de H sau al unor punţi bisulfidice (. aceasta se prezintă sub forma structurii sale primare. Hemoglobina umană normală (HbA) este alcătuită din 2 catene α şi 2β. Unele proteine sunt alcătuite dintr-o singură catenă polipeptidică. în anumite condiţii fiziologice. Proteinele sunt polimeri de aminoacizi. 141 . polimeraze. etc).S . o catenă A. asocierea lor pentru a alcătui molecula proteică funcţională se realizează. ADN. proteina trebuie să fie normală la toate nivelele sale structurale : primar.helix al cărui model a fost propus de Linus Pauling pentru care a primit premiul Nobel. iar molecula de imunoglobulină anticorp are două catene grele (H) şi două uşoare (L) unite între ele prin punţi bisulfidice (. hidrofile sau covalente. informaţia genetică pentru fiecare dintre aceste catene polipeptidice diferite.S . ADN-ligaze. participante în alcătuirea aceleaşi proteine ( o genă – o catenă polipeptidică). rezultând o configuraţie regulată a polipeptidului. Prin răsucirea catenelor polipeptidice asupra lor însele datorită acţiunii unor forţe de atracţie dintre diferite aminoacizi ai catenei polipeptidice rezultă structura terţiar ă a proteinei . topoizomeraze. în repararea leziunilor induse de ADN (excionaze. Catenă polipeptidică este apoi supusă prelucrării post translaţionale în cadrul căreia ea adoptă o structură secundară prin interacţiunea aminoacizilor săi. fiind deţinută de gene diferite. altele din mai multe catene polipeptidice identice sau diferite.) ca şi catenele de insulină. Este evident că fără participarea proteinelor. secundar. adică de secvenţa codonilor din ADN m .NH2) a altui aminoacid cu eliminarea unei molecule de H2O. în cadrul cărora intră şi cele care au rol hotărâtor în replicarea ADN (polimeraze. Ea are la baz ă legături de H. Când proteina este alcătuită din mai multe catene polipeptidice identice sau diferite. La terminarea catenei polipeptidice. intercatenare dintre grupările ceto (C = O) ş i imino (N = H) ale legăturilor peptidice.

în cadrul căruia există pe lângă genele structurale ce determină informaţia genetică pentru sinteza diferitelor proteine. pentru ca sinteza proteică să poată continua . De exemplu. adică trebuie să-i primească prin surse alogene (prin hrană. izoleucina. 142 . celulă şi chiar organit celular. ace ş tia prezentând în catena polipeptidică a proteinei ribozomale Gi2 două substituţii de aminoacizi în poziţiile 42 şi 87. în aceste condiţii durează atâta timp cât să fie sintetizată circa 1 0 2 0 molecule proteice. asigurându-se astfel citirea mesajului genetic . Ribozomii asigură interacţiunea ARNm -ARNt în cadrul căreia codonii din ARN m sunt recunoscuţi secvenţial de anticodonii din ARNt . în structura celor circa 100. organ. în mod obişnuit. Pentru celula animală. triptofonul. la 370 C. în celulă. are loc o „amplificare genetică" indirectă realizată nu prin mărirea numărului de copii ale genei ci prin transcrierea repetatată a informaţiei genetice conţinută de o genă cu sinteza unui număr mare de molecule ale unui ARNm. la bacteria E. leucina. Dependenţa sintezei proteice de informaţia genetică din nucleu şi de sinteza diferitelor categorii de ARN celular pe matriţa de ADN nuclear a fost determinată de Brodnet (1955). fiind necesară sinteza (sau adăugarea în cazul sistemului acelular de sinteză (in vitro) a unei noi molecule de ARN m. informaţie ce este transcrisă în ARN m care devine astfel purtător de mesaje genetic. celula animală nu poate sintetiza decât o parte dintre ei. coli. fenilalanina. Aceasta înseamnă că după folosirea ca mesager pentru sinteza a 10 . Acest lucru nu se întâmplă îns ă ş i la mutan ţ ii rezisten ţ i la streptomicin ă . De exemplu gena triptofansintetazei (enzimă ce intervine în sinteza triptofanului) este de 28 nucleotide pe secundă. se poate realiza sinteza unui număr mare de catene polipeptidice. metionina.20 catene polipeptidice o moleculă de ARN m este hidrolizată. arginina şi histidina. şi gene pentru diferite tipuri de ARNt şi ARNr.urile corespunzătoare. deoarece nu este capabilă să-i sintetizeze singură: lizina. Integritatea structural . iar biosinteza proteică să fie stopată.Toate tipurile de ARN celular sunt sintetizate pe matriţa de ADN.funcţională a ribozomilor condiţionează o citire corectă a mesajului genetic şi o traducere fidela a sa într-o secvenţă de aminoacizi. antibioticul streptomicină interacţionează cu 2 situsuri ale proteinei ribozomale Gu asociată cu ARNr 16G din subunitatea ribozomală mică (30 S) ceea ce face ca ribozomul să nu mai fie funcţional. Astfel. valina. doar ARNm este tradus în proteină. iar traducerea ARN m corespunzător se face cu viteza de 21nucleotide/ secundă. Mazia şi Prescott (1963) la alga verde unicelulară „Acetabularia mediterranea". Dacă celula vegetală poate să-şi sintetizeze toţi aminoacizi de care are nevoie. Folosindu-se agenţi care blochează sinteza ARN m (actinomicina D) s-a demonstrat c ă sinteza proteică . de exemplu). De astfel. arginina. proteine care au specificitate de specie. Rezultă că această proteină ribozomală este esenţială în împerecherea codon anticodon de la nivelul ribozomului. Dintre toate cele trei tipuri fundamentale de ARN celular. din cei aproximativ 100 de aminoacizi identificaţi numai 20 intră. Astfel. Viteza de transcriere a unei gene este variabil ă . în condiţii normale. următorii 10 aminoacizi sunt esenţiali sau indispensabili. Sinteza hemoglobinei umane se realizează cu o viteză de 4 aminoacizi/ secundă la aceeaşi temperatură. ţesut.000 de proteine naturale identificate până în prezent. ARNt şi ARNr îndeplinind însă roluri esenţiale în asigurarea traducerii mesajului genetic din ARNm.

terminal. pentru că celula animală îi poate produce pe diferite căi metabolice./mol.Aminoacizii: glicina./mol Pentru formarea legăturii peptidice se folosesc 0. Aminoacilarea ARNt catalizat ă de aceste enzime este un proces riguros controlat deoarece o înc ărcare gre şit ă a unui ARNt cu un aminoacid necorespunză tor are aceeaşi consecinţă ca şi o mutaţie . Prima etapă în biosinteza proteică este activarea aminoacizilor cu ajutorul ATP. există doar o singură enzimă aminoacil . Ordinea includerii aminoacizilor în catena polipeptidică este stabilită de ordinea codonilor din ARNm. recunoscând această „eroare" şi hidrolizând legătura dintre aminoacidul greşit ataşat şi ARNt. Mai are loc ataşarea aminoacidului activat de ARNt corespunzător lui (în etapa a doua). acidul aspartic.2.sintetazele şi ARNt joacă deci rol esenţial în decodificarea informaţiei genetice./mol cu eliberarea a 8 Kcal.terminal şi se termină cu un aminoacid .determinând includerea eronată a unui aminoacid în catena polipeptidică. Ca orice reacţie de polimerizare şi biosinteza proteinelor se desfăşoară în trei etape ce se succed neîntrerupt: iniţierea. Aminoacilsintetazele sunt enzime cheie în „recunoaşterea" cifrului codului genetic. restul de energie liberă fiind necesară menţinerii echilibrului reacţiei spre a se realiza sinteza proteică şi nu a avea loc hidroliza proteinelor. altul decât cel care este specific acelui ARN t va fi eliminată prin intervenţia aceleiaşi enzime aminoacil .3. pornind de la aminoacizii esenţiali.5 Kcal. cisteina. Aminoacil . care prezintă o activitate de corecţie. acidul glutamic. 143 . serina.ligaza) şi care este specifică fiecărui aminoacid. reacţia fiind catalizată de enzima aminoacilsintetaza (numită şi aminoacid ARN t . alanina. tirazina ş i prolina sunt neesenţiale. asparagina. 6. ataşare realizată la gruparea CCA de la capătul 31 al ARNt şi care este catalizată de aceeaşi enzimă aminoacilsintetază. Este necesară o moleculă adaptatoare reprezentată de ARN t. glutamina.Iniţierea catenei polipeptidice Sinteza unei catene polipeptidice începe cu un aminoacid -N . Între restul de adenozină (A) de la capătul 31 al ARN t şi aminoacidul activat se formează o legătură covalentă macroergică a cărei energie va fi folosită în reacţia de polimerizare a aminoacizilor:+ AA1+ATP aminoacilsintetază AA1 ~ AMP + P + P AA1 ~ AMP + ARNt aminoacilsintetaza AA1 ~ ARNt + AMP Ataşarea eronată a unui aminoacid la ARN t.ARNt – sintetază pentru fiecare aminoacid. folosind energia rezultată din hidroliza ATP: ATP + H2O ATP + H2O ADP + H2O ADN + P AMP + PP AMP +P cu eliberarea a 7 Kcal.sintetaza. Este un lucru bine stabilit că deşi există mai multe tipuri de ARN t pentru un acelaşi aminoacid (fapt determinat de caracterul degenerat al codonului genetic). Aminoacizii nu se pot lega direct la ARN m .C . alungirea (sau elongaţia) şi terminarea catenei polipeptidice./mol cu eliberarea a 6 Kcal.

acesta se leagă la subunitatea ribozomală mică 30 S. secvenţa leader nefiind tradusă. situsul peptidil (P) şi situsul de ieşire . Cu ajutorul unei secvenţe denumită secvenţă leader aflată la capătul S1 al ARNm. De regulă situsul P acceptă complexul aminoacil ARNt numai dacă acesta a realizat recunoaşterea codon . La nivelul ribozomului. 144 . Ribozomul asigură de aşa manieră asocierea acestor trei elemente.anticodon. denumiţi IF1. În situsul A pătrunde aminoacil ARN t corespunzător codonului din ARNm recunoscut de anticodonul din ARNt. constituindu-se particule ribozomale întregi (70 S la bacteria E. interacţionează cu ribozomii şi legarea acestuia la subunitatea ribozomală mică 30 S. printr-o legătură chimică covalentă — legătura peptidică (fig. IF2 şi IF3.Complexul aminoacil ARNt se asociază cu subunitatea ribozom 50 S care prezintă trei situsuri : situsul aminoacil (A). 89 – Schema transmiterii informaţiei: codon (ARN m) – anticodon (ARN t) – aminoacid Proteina ribozomală S1 cu proprietăţi contractile joacă un rol important în realizarea opoziţiei mesagerului (ARNm) şi adaptorului (ARNt) ea asigurând deplierea ARNm atunci când acesta. La acest complex ARNm . 89). cu constituirea unei asocieri tranzitorii prin intermediul punţilor de H. Iniţierea catenei polipeptidice este asigurată de intervenţia unor factori de iniţiere de natură proteică. ARNt şi a catenei polipeptidice în creştere. adică numai dacă a trecut prin situsul A şi apoi a fost translocat în situsul P.(E).Etapa a treia în iniţierea unei catene polipeptidice se desfăşoară la nivelul ribozomului care prezintă suprafeţe specifice de legare stereochimică a ARNm. Fig.exit . asociere care durează până ce aminoacidul legat de ARN t este deconectat de la acesta şi înserat la catena polipeptidică unde rămâne ataşat de aminoacidul precedent. al cărui codon din ARNm este codonul de iniţiere AUG sau. în interiorul catenei polipeptidice metionina este specificată de acelaşi codon AUG . încât să facă posibilă recunoaşterea codonului din ARNm de către anticodonul corespunzător din ARNt. Dar. sinteza tuturor catenelor polipeptidice începe cu metionina. Acceptarea se bazează pe unele posibile modificări conformaţionale pe care le-a suferit complexul aminoacil ARN t când a fost în situsul A.subunitatea ribozom de 30 S se ataşează subunităţii ribozomale de 50 S. coli) funcţionale în asigurarea sintezei catenei polipeptidice . pentru ca ribozomul să recunoască în mod specific codonul de ini ţiere AUG este necesar un semnalul suplimentar de discriminare între AUG iniţiator şi AUG din interiorul mesajului genetic. pe principiul complementarităţii. mai rar GUG. Ca urmare.

90).7 baze dintr-o secvenţă de polinucleotide de la capătul 3' al moleculei de ARNr de 16 S din cadrul subunităţii ribozomale mici (30S) . 145 .Sinteza proteică: ciclul de elongare al lanţului peptidic. formarea legăturilor peptidice. ceea ce face să aibă loc selecţia f -Met . O altă particularitate a procesului de iniţiere este folosirea unui ARN t specific de iniţiere ce diferă de omologul său ce interacţionează cu codoni AUG interni pentru metionină . După terminarea sintezei catenei polipeptidice grupa formil de la metianină este îndep ă rtat ă prin intervenţ ia unei enzime de deformilare.Formarea legăturilor aminoacil – ARNt.metionină . iar uneori este îndepărtată însăşi metionina (fig.ARNt în situsul P. descoperită de Shine şi Dalgrano în anul 1975.metionină ARN tMET la procariote şi i . Fig. Acest ARN t iniţiator a fost denumit f .Dalgarno are valoarea unui semnal suplimentar de iniţiere.translocaţia (adaptat după Stryger. va forma puntea legătură peptidică.ARN t se leagă la ARNr 23 S cu o mai mare afinitate decât la orice alt ARNr. ceea ce face ca ea să nu mai poată participa în vreo reacţie de polimerizare.Met . 90 . Formilaza este întâlnită la procariote şi ca urmare doar la aceste organisme primul aminoacid al oricărei catene poliptidice este formilmetionină ARNt iniţiator încărcat cu formilmetianină este singurul ARN t care se leagă direct la situsul P al ribozomului cu ajutorul factorului de iniţiere IF2.Dalgarno. Acest f. aceasta fiind unica excepţie.metionina ocupă poziţia unu a catenei polipeptidice dar oferă restul reactant COOH care unindu-se cu gruparea NH2 a următorului aminoacid. Aceasta reprezintă o secvenţă de 7 .ARN t MET la eucariote .Dalgarno din ARN m selecţionează codonul AUG iniţiator şi-1 aduce la nivelul situsului P al ribozomului. fără al mai trece la nivelul situsului A. prin eliminarea unei molecule de apă.15 ribonucleotide bogate în purine şi aflată în amonte de codonul de iniţiere AUG. În plus. 1991). o secvenţă în buclă (hairpird) adiacentă secvenţei Sherie . toţi ceilalţi codoni trebuind să treacă mai întâi la nivelul situsului P. Această interacţiune dintre capătul 3' al moleculei de ARNr 16 S şi secvenţa Shine . După încărcarea ARN tMET iniţiator cu metionină el devine metionil ARN t MET şi este supus unei formulări prin ataşarea grupului formil sub acţiunea enzimei formilază la gruparea NH2 a metioninei aceasta devenind formilmetionină (f .Acest semnal discriminator este reprezentat de aşa numita secvenţă Shine . fiind complementare cu 3 . Formilarea metioninei determină blocarea grupării amino.ARN t MET). Ca urmare formil .

având loc totodată disocierea" ribozomului în cele două subunităţi ale sale.ARNt ce pătrund. capătul 5'al ARNm devine liber spre a forma cel de-al doilea complex de iniţiere şi astfel.R3. secvenţial prin situsul A al ribozomului. rămas fără aminoacid. EF . rezult ă un complex de terminare care nu mai permite alungirea în continuare a catenei polipeptidice TF .ARNt -. de către anticodonii complexelor aminoacil . După ce ribozomul a asigurat traducerea a circa 25 de codoni.91. astfel că. are loc încetarea sintezei catenei polipeptidice. 146 . acesta va putea primi cel de-al doilea aminoacil .Ts asigură fixarea aminoacil ARNt pe ribozom iar EF . TF .T4 şi EF . ARNt iniţiator. care nu sunt altceva decât proteine ribozomale care se ataşează particulei ribozomale în faza de funcţionare a acesteia în sinteza proteică . UAG şi UGA sunt codoni nonsens sau terminatori care sunt recunoscuţi de factori de eliberare sau de terminare denumiţi TF .Ri. Translocarea succesivă din A în P.R3 va rupe legătura esterificată a catenei polipeptidice cu ARNt final. a întregului mesaj genetic conţinut în ARNm. însoţită de fiecare dată de formarea unei noi legături peptidice. ribozomul ajunge cu situsul său A în dreptul unui codon nonsens ( codon de stop sau codon terminal ) în acest situs nu mai pătrunde nici un complex aminoacil . Din interacţiunea codonilor nonsens cu factorul de terminare . la un moment dat. În alungirea catenei polipeptidice intervin aşa numiţii factori de elongaţie (alungire) care au fost denumiţi EF -Ts şi EF-G. TF . aflat în situsul A şi astfel pot fi eliberaţi din ribozom atât catena polipeptidică. Se formează cea de-a doua punte peptidică şi translocarea succesivă din A în P permite citirea secvenţială. în deplasarea sa pe macromolecula de ARNm. al doilea ribozom se angajează în traducerea mesajului genetic spre a asigura sinteza unei a doua catene polipeptidice.3.anticodon. Proteinele ribozomale h1 ş i h2 sunt implicate în terminarea sintezei catenei polipeptidice pe o cale neelucidată (fig. Aceşti factori de elongaţie se fixează în subunitatea ribozomală mare (50 S) între proteinele h17 şi h12.Terminarea sintezei catenei polipeptidice Când. Eliberat.R3 din cadrul acestui complex. 6. separă grupul carboxil al aminoacidului C terminal de legătura sa cu ARN t printr-o hidroliza. aceeaşi moleculă de ARNm este asociată cu mai mulţi ribozomi. de asemenea.uri făcându-se în virtutea complementarităţii codon .anticodon.ribozom.Alungirea sau elongarea catenei polipeptidice O dată formată prima legătură peptidică. cât şi ARN t. Ca urmare. proces care este mediat de IF3. Codonii UAA. 92). apoi un al treilea.6.G determină deplasarea acestui complex la nivelul ribozomului. rezultând un polisom sau poliribozom. acţionând enzimatic la nivelul situsului P. Funcţionarea unor asemenea factori de elongaţie este dependentă de energia eliberată prin hidroliza GTP. codon după codon. selecţia complexului aminoacil ARNt din amestecul de aminoacil ARNt . condiţionează desfăşurarea celei de-a doua etape în biosinteza catenei polipeptidice şi anume elongarea sau alungirea catenei .4.R2 şi TF .ARNt care a trecut în prealabil prin situsul A spre a se realiza recunoaşterea codon . deoarece nu există anticodoni care să recunoască codonii nonsens . al patrulea si aşa mai departe.3.3. părăseşte situsul P.

91 – Schema sintezei proteinelor la procariote 147 .Fig.

Fig. 92 – Schema sintezei proteinelor la eucariote 148 .

proteine citoplasmatice solubile proteine ataşate pe suprafaţa externă a membranei celulare (actina. Ambele tipuri de ribozomi sunt din punct de vedere structural şi funcţional echivalente. acetilare.enzime ale REG . colagenul). Pe ei sunt sintetizate toate celelalte proteine. purtând mesajul genetic pentru mai multe catene polipeptidice. deoarece aceeaşi moleculă de ARNm poate transcrie mai multe gene structurale ale aceluiaşi operon. modificate ş i care apoi. Mecanismul sintetizate compartimentării celulare a proteinelor nou- Ribozomii. în cea mai mare parte vor fi secretate (exportate) sau transportate la diferite organite ş i la membrana plasmatică .proteine ataşate pe suprafaţa externă a membranei celulare (fibronectina.3.proteine nucleare (histone. Trecerea mesagerului ARNm din nucleu în citoplasmă . etc.4. transcrierea mesajului genetic şi traducerea sa pot avea loc simultan. se realizează la nivelul porilor anvelopei nucleare. ARNm la eucariote este monocistronic .6.5. care sunt liberi în citosol (dar şi ei apar legaţi de fibre ce apar ţin citoscheletului). La eucariote. care nu necesită o prelucrare special ă (glicolizare. De exemplu. laminina. RE. iar traducerea în citoplasmă unde se afl ă ribozomii.enzime ale aparatului Golgi . Dup ă iniţ ierea translaţiei proteina cu această secven ţă va orienta ribozomul spre RE.) prelucrare care are loc numai în RE şi aparatul Golgi. fiecare molecul ă de ARN purtând mesajul genetic pentru sinteza unei singure catene polipeptidice. Ei diferă numai prin tipul de proteine pe care le sintetizează (tabelul 2). reprezentând enzime diferite care intervin într-o aceeaş i cale metabolică . în sinteza histidinei intervin 10 enzime-10 gene.proteine secretate . aparatul Golgi . Proteinele sintetizate de diferite clase de ribozomi Localizarea ribozomilor Clasa de proteine sintetizate . Moleculele de ARNm care nu posedă această secvenţă în structura lor se leagă de ribozomii care vor ră mâne în citosol (ribozomii liberi). deoarece înainte ca să fie terminată sinteza ARNm pe matriţa de ADN capătul său 5' poate să se asocieze cu ribozomii spre a forma complexul de iniţiere în traducerea sa într-o catenă polipeptidică. Tabelul 2. în celula eucariotă apar ca două popula ţii spaţ ial separate: ribozomii ataş aţ i de membrana RE ş i ribozomii neataşa ţi de membrană .glicoproteinele pentru membranele :plasmatice.) proteine mitocondriale codificate de ADN-ul nuclear proteine peroxizomale .enzime lizozomale . 6. Pe aceş ti ribozomii sunt sintetizate numai acele proteine care vor fi introduse în RE. lamine) Ribozomii citoplasmatici legaţi de membranele RE Ribozomii citoplasmatici nelegaţi de membranele RE(ribozomii liberi ) 149 . care se va ataş a de membrana organitului. spectrina. nucleare. substratul molecular complex pe care se traduce mesajul ARNm în molecule proteice. transcrierea are loc în nucleu. Diferenţierea este înscrisă în mesajul moleculei de ARNm. într-o secvenţă de nucleotide specială pe care o posedă ( secvenţ a semnal sau secvenţ a leader sau signal peptide ).Particularităţile decodificării la procariote şi eurocariote La procariote. ARNm la procariote este policistronic.

un codon semnal care. să vină în prelungire cu tunelul membranar neoformat. după care va continua să intre restul lanţului polipeptidic. proteine care migrează în nucleu şi proteine care sunt transferate prin membranele intracelulare sau se încorporează în membrane. Într-o primă fază considerată a fi compartimentarea primară. Apoi.Compartimentarea intercelulară a noilor proteine sintetizate în hialoplasmă are loc în faze separate în timp şi spaţiu. cu peptidul în formare. o peptidază semnal membranară le secţionează de lanţul peptidic în formare. în mitocondrii şi cloroplaste şi altele sunt încorporate de membrana celulară. în peroxizomi. Acestă legătură se realizează datorită unor proteine receptoare (SRP-receptor). în momentul în care peptidul semnal ajunge în lumenul reticulului. se desprinde şi se desface în cele două subunităţi (fig. face posibilă joncţiunea ribozomilor funcţionali cu membrana RE. Sinteza se continuă şi polipeptidul propriu-zis trece în întregime prin tunelul membranar. În faza de compartimentare secundară. Asocierea receptorilor membranari stabileşte situsuri de fixare pentru subunitatea mare a ribozomului. unde suferă transformări şi se includ în granulele de secreţie al căror conţinut va fi exocitat. prin difuzia în planul membranei reticului a receptorilor semnalului. Astfel peptidul semnal este separat de stratul bimolecular de fosfolipide şi prin tunelul membranar. proteinele de secreţie sunt sintetizate de ribozomii ataşaţi de membrana RE şi apoi transferate prin membrana acestuia în interiorul lui. Din cisternele RE. Dar. ARNm al unor asemenea proteine „de export”conţine în afară de codonul iniţiator al translaţiei. se dezorganizează tunelul membranar de care era legat ribozomul care. care fac parte din structura membranei RE. Fig. 93.Palade. Asemenea proteine membranare joacă rol de adevăraţi receptori ribozomali. proteinele nou sintetizate se împart în proteine care rămân în hialoplasmă. care permite tunelului său. va intra în interiorul cisternei RE. Când peptidul semnal vine în contact cu receptorii membranari. vom analiza pătrunderea proteinelor de secreţie în cisternele RE. Atunci peptidul va fi liber în întregime în spaţiul intercisternal. se desprind vezicule pline cu proteinele de secreţie care sunt transportate la aparatul Golgi. Ca exemplu. până la terminarea lanţului. Cum se cunoaşte din experienţele lui G. dintre proteinele ce se transferă prin membrane unele ies din reticulul endoplamatic şi trec în lizozomii primari. 93). în cisterna membranară. aceştia se mişcă în planul tangenţial al membranei şi se agregă într-un canal sau „tunel” membranar. tradus într-un peptid semnal (signal recognition particule SRP) compus din 15-25 aminoacizi.Schema generală a transportului proteinei nou – sintetizate în lumenul reticulului endoplasmatic (RE): 150 .

particularitatea structurală fiind legată de heterogenitatea funcţională a celulelor respective. ele pătrund în anumite membrane ce conţin receptori pentru anumite secvenţe şi astfel iau naştere vacuolele cu enzimele lizozomale şi peroxizomale. constituind un sistem perimiofibrilar numit reticul sarcoplasmic (sarcotubuli). Aşa se întâmplă cu proteina G a virusului Stomatitis vezicular. caracteristică pentru fiecare tip de celulă. diferenţa reprezentând tocmai suma unor secvenţe „semnal” cu care recunosc receptorii suprafeţei mitocondriale.5. ca şi în zona benzii Z. Detaşarea ribozomului şi dispersarea proteinelor receptoare ale tunelului în membrană reprezintă fenomene post-translaţionale. 151 . care sunt acumulate în RE împreună cu proteinele peroxizomale şi cele secretoare. unde în jurul fiecărei miofibrile. prin care. în strânsă vecinătate cu mitocondriile. se găseşte un sistem de tubuli şi cisterne dispuse longitudinal. aşa încât formează un fel de manşon continuu în jurul miofibrilei. în câte o cisternă. reticulul prezintă numeroase vezicule fenestrate. formarea „tunelui” transmembranar din proteinele receptoare. O formă specializată de organizare a reticulului endoplasmatic nuclear se întâlneşte la fibrele musculare striate. ceea ce le permit încorporarea lor în membrana internă mitocondrială. celulele care sintetizează steroli prezintă un reticul endoplasmatic neted format din numeroşi tubuli ramificaţi şi bifurcaţi. Spre deosebire de proteinele de secreţie.1) Proteina fiind în curs de sintetizare. aceştia pierd oligopeptidele semnal. dintre care 4 se sintetizează în citoplasmă şi 3 în mitocondrii. Astfel. proteinele lizozomale şi cele peroxizomale au” secvenţe de sortare” în plus. Pe de altă parte. o particulă semnal de recunoaştere (SRP) se leagă de secvenţa semnal a proteinei (signal peptide) şi de ribozom. Aceste proteine sunt eliminate din celule. Tubulii alungiţi ai reticulului endoplasmatic fuzionează în zona striei H. care rămâne cu capătul carboxil în afară şi cu cel amino înăuntru. Corelaţia particularităţilor structurale şi funcţionale ale reticulului endoplasmatic neted cu heterogenitatea funcţională a celulelor Reticulul endoplasmatic neted prezintă o dispoziţie a elementelor structurale. După pătrunderea celor 4 subunităţi. În celulele luteinice ale corpului progestativ din ovar. Citocrom C. se sintetitizează o proteină precursoare peroximală mai mare decât suma celor patru subunităţi. iar SRP este deplasat şi reciclat. 2) Complexul format se leagă de receptorul SRP din membrana RE. dispuşi într-o reţea complexă în toată citoplasma.oxidaza mitocondrială este constituită din 7 subunităţi proteice. turtite. 3) Proteina. Este interesant cazul proteinelor lizozomale ale fibroblaştilor. În unele cazuri. În citoplasmă. fiind „recunoscute” de receptorii membranari (aprox. scoaterea peptidului . se consideră că proteinele lizozomale sunt „sortate” de celelalte proteine în cadrul regiunilor RE pregolgian şi anume.semnal de către peptidază şi segregarea finală a lanţului complet polipeptidic în spaţiul intracisternal al RE sunt considerate ca un program cotranslaţional. întins între două benzi Z(sarcomer). 6. prin secvenţa semnal este inserată în membrană şi translocată în lumen. 4) Complexul ribozom – SRP se disociază şi ribozomul continuă translaţia. jumătate din numărul lor) sunt reintroduse în celulă prin pinocitoză. însă cele lizozomale. trecând prin membrană dezorganizează tunelul şi opreşte transferul lanţului. în zona proximă a complexului Golgi. În concepţia lui G Blobel. lanţul polipeptidic în formare are o secvenţă „stop” (foarte hidrofobă) care. care conţin în plus şi carbohidraţi.

Structuri asemănătoare se găsesc şi în unele celule senzoriale sau musculare. atât în sistemul nervos central cât şi cel periferic. Triada aceasta este foarte importantă funcţional şi anume prin tubulii T se transmite potenţialul de acţiune de la suprafaţă la elementele contractile. cu două elemente (două cisterne) ale reticulului sarcoplasmic şi un tubul T (fig. turtite numite cisternele de sub plasmalemă. Aşezate lângă nucleu. printre care se găseşte dispus. la baza aşa-numitelor locuri senzitive („senzitive spots”). Cisternele modifică mobilitatea şi concentraţia ionilor la suprafaţa internă a sarcolemei. aceste formaţiuni au fost numite paranuclei endoplasmici. Asocierea cisternelor cu mitocondriile sugerează că. difuzând uşor prin reticul şi permiţând contracţia musculară . Fig. O altă formă particulară de organizare a reticulului endoplasmatic nuclear a fost observată în unele celule secretoare ale adenohipofizei. Ca2+ se acumulează în cisternele terminale ale reticulului sarcoplasmic şi. unde se găsesc vezicule mari. 152 . O altă dispoziţie particulară a reticulului endoplasmatic nuclear este cea de pe faţa internă a membranei plasmatice la neuroni. permeabilitatea membranelor este modificată şi transferul de materiale uşurat. datorită energiei rezultată din hidroliza ATP din mitocondrii.Reticulul endoplasmatic al fibrelor musculare striate (reticulul sarcoplasmic). 94 . necesară tocmai în acest loc unde apare contracţia. Studiile lui Porter şi Palade asupra reticulului endoplasmatic la muşchii vertebratelor au arătat asocierea acestor cisterne cu anumite locuri de pe plasmalemă prin care stimulii pot ajunge în celule. de aici trece în tubulii transverşi (T) şi apoi în sarcoplasmă. în asemenea mod. 94). Aceste cisterne sunt numai în neuroni (nu şi în celulele Schwann sau celulele endoteliale). asemănător unui bulb de ceapă secţionat. atât ai vertebratelor cât şi ai nevertebratelor. În timpul relaxării. din plasmă intră în reticulul sarcoplasmic ioni de Ca 2+ şi ATP. În felul acesta. Reticulul uşurează distribuţia rapidă a Ca2+ şi ATP la nivelul miofibrilelor. unde tubulii reticulari se dispun concentric.La acest nivel (banda Z). deci. Sarcolema cu cisterne prezintă o permeabilitate selectivă. între două cisterne ale celor două manşoane ale reticulului sarcoplasmic pătrunde o invaginaţie a plasmalemei turtită în plan transversal al fibrilei (tubulul T). Formaţiuni asemănătoare au fost observate în hepatocite după administrarea de toxice sau după hepatectonie experimentală. ionii specifici fiind absorbiţi la suprafaţa membranelor intracelulare ale cisternelor. care generează sau conduc variaţii de potenţial electric. Tot prin tubulul T. Manşonul din dreptul benzii A conţine cea mai mare cantitate de Ca2+ şi ATP. la nivelul benzii Z se formează o triadă. Cisternele stau.

mecanismul intern fiind încă discutabil. Această modificare a raportului este proporţională cu vârsta .6. deci. Conţinutul veziculelor trece apoi în vacuolele de condensare. În vecinătatea aparatului Golgi ergastoplasma pierde ribozonii şi membrana devine netedă. printre care fenobarbitalul şi hidrocarburile polichimice declanşează in vivo un efect inductor asupra enzimelor microzomale (microzomi = fracţiuni heterogene cuprinzând fragmente din membranele reticulului endoplasmatic. trigliceridelor şi a altor lipide . sintetizate în reticulul endoplasmatic granular şi transferate apoi reticulului endoplasmatic neted. 2) fuzionarea veziculelor cu vacuole de condensare. Reticulul endoplasmatic intervine în schimburile ionice între citoplasmă şi nucleu. care sunt identice cu acelea din vecinătatea dictiozomului. care scade în favoarea raportului fosfolipoproteic /proteină. Structurile reticu-lului formează aşa-numiţii corpi mielinici. constricţiile fiind un stadiu în detaşarea de microvezicule libere. A fost atestată. 153 . Noile membrane sunt. Reticulul endoplasmatic neted astfel format se veziculeză. Un rol important al reticulului endoplasmatic este hidroxilarea medicamentelor Peste două sute de compusi chimice. permit interpretarea că şi acestea intervenin în metabolismul vitaminei A şi conversia rodopsinei. S-a stabilit că în reticulul endoplasmatic granular se sintetizează două tipuri de proteine: o proteină „secundară”. Faptul că celulele a căror funcţie principală este sinteza lipidelor sau sterolilor au un reticul neted dezvoltat au dus la concluzia localizării la nivelul acestuia a enzimelor de sinteză a sterolilor. Asemănarea citomembranelor celulelor pigmentare cu structurile din complexul de fotorecepţie a luminii. Date experimentale sugerează sinteza la nivelul reticulului endoplasmatic neted a enzimelor detoxifiante. Observaţiile au sugerat cel puţin trei căi: 1) fuzionarea veziculelor cu cisterne ale dictiozomilor. cu un „turnover” foarte rapid. Adesea corpii mieloizi sunt grupaţi câte 4 – 5 laolaltă. Astfel. în hepatocitele de şobolan. fiind prezent cel granular. iar în unele cazuri produc chiar o amplificare genică a unor enzime implicate în apărarea organismului. Pe numeroase tipuri de celule au fost evidenţiată o variaţie cantitativă şi calitativă a reticulului endoplasmatic în cursul desfăşurării procesului de diferenţiere celulară.5µ în axul lung. Segregarea şi concentrarea proteinelor Studii efectuate cu 3H – leucină în pancreas au stabilit că proteinele sintetizate în ribozomi (reticulul endoplasmatic granular) sunt trecute apoi în reticulul endoplasmatic neted. ca un „sistem circular” endocelular. Dispoziţia spaţială a reticulului permite considerarea acestui sistem structural. de asemenea şi localizarea enzimelor care participă la sinteza glicogenului. dispuse în stive.Un tip special de reticul neted a fost descris în celulele stratului pigmentar al retinei. 6. în ziua a opta postnatală reticulul devine de tip neted. 3) fuzionarea unor microvezicule Golgi formând o vacuolă multiveziculată la care membranele vor forma membrana limitantă a vacuolei de condensare. ribozomi). de 4 . citomembranele netede conţin şi enzime. în ziua a treia prenatală reticulul endoplasmatic neted lipseşte. într-un ritm scăzut şi o proteină „exportabilă”. găsindu-se situat la polul bazal al celulei şi în procesele care migrează între conuri şi bastonaşe. capabile să anihileze acţiuni ale drogurilor (exemplu fenobarbital). membrana nucleară. Pe lângă fosfolipide şi proteine. la nivelul căruia se pot realiza schimburi de substanţe între mediul extracelular şi matricea nucleară. foarte mobil. care au un aspect lenticular biconvex. unde ocupă aproximativ 50% din citoplasmă. membrana plasmatică. alcătuiţi din săculeţe turtite. Modificările se reflectă în variaţiile raportului ARN/proteină. concomitent cu un intens schimb hidric.

Aceste complexe macromoleculare specifice sunt formate din combinaţii între proteine. hormoni etc. manoza şi acidul sialic. Se precizează ca la acest nivel membranele aparatului Golgi joacă rolul de „complexare”. care se leagă de lanţul polipeptidic sintetizat la acest nivel. complexul de membrane al aparatului Golgi nu poate fi privit numai ca un compartiment de pasaj al unor tipuri de molecule. endomembranele se modifică într-un flux continuu de la reticul spre membrana celulară. are loc la nivelul citoplasmei fundamentale. Ca atare. prin fuzionare.(ME) au fost observate şi în zonele golgiene la numeroase tipuri de celule neurosecretoare. Întrucât produşii secretaţi de aparatul Golgi au un caracter variat.). considerându-se neurosecreţia ca produs al lamelelor golgiene. se adiţionează galactoza. structural şi funcţional. fructoza. furnizează cel puţin o parte din materialul acrozomal. În schimb. acesta apărând mai întâi în dictiozomi şi apoi în granule de mucus. Produsul care urmează să fie secretat va suporta apoi o remaniere suplimentară după detaşarea veziculelor din săculeţii golgieni. ci ca pe un compartiment la nivelul căruia are loc o activitate enzimatică mult diferită şi o complexare a moleculelor mici într-o moleculă mare. acrozomul suferă o serie de transformări variabile dar care includ eliberarea de substanţe litice care participă la liza structurilor rezistente ale ovulului faţă de pătrunderea spermatozoidului. Un rol particular al aparatului Golgi este evidenţiat în formarea acrozomului din spermatozoid. se apreciază că această zonă posedă mecanisme speciale pentru formarea de entităţi macromoleculare. datorită unei transferaze. unde într-o a doua etapă. S-a evidenţiat de asemenea. O localizare în timp în diferite formaţiuni ale aparatului Golgi a fost observată şi pentru sulful radioactiv 35S injectat ca SO4Na2. folosind şi materialul sintetizat în reticulul endoplasmatic. care are o poziţie supra nucleară. numai la nivelul zonei Golgi. rolul reticulului endoplasmatic in elaborarea unor vezicule care. 6. În formarea granulelor de diferite glicoproteine a fost formulată părerea că există două etape: într-o primă etapă. fuzionând cu lamelele golgiene. în circa 5 minute. Complexul golgian este. legat de reticulul endoplasmatic şi. sinteza glicoproteinelor şi mucopolizaharidelor se efectuează în aparatul Golgi. sintetizează polizaharide şi 154 . înveliş celular. La nivelul spermatocitelor s-a evidenţiat apariţia unor granule proacrozomale în zona centrală a aparatului Golgi. În formarea lipoproteinelor. Detectarea mucopolizaharidelor acide s-a făcut. neoformează materiale membranare. de asemenea. hidraţi de C şi lipide. aparatul Golgi transferă şi concentrează proteinele. mucus. sinteza iniţială este asociată cu reticulul endoplasmatic. Sinteza şi secreţia polizaharidelor Sinteza zaharurilor complexe. Vacuolele transportoare duc aceste proteine la care s-au adiţionat grupări glucidice. Proteinele granulelor de zimogen sunt reprezentate de o serie de enzime condensate care se descarcă la exterior prin pinocitoză inversă. aşa cum e arată polaritatea lui. dau naştere acrozomului matur.7. Reacţia de sulfatare este interpretată tot ca o formă specială de complexare. care. la aparatul Golgi. În cursul acestui flux membranar.În vacuola de concentrare proteinele suferă un proces de concentrare în granule de zimogen printr-un mecanism încă neclar (probabil printr-un proces de deshidratare. care asigură formarea proteinelor în vacuolele din concavitatea cisternelor şi în granulele de secreţie. La contactul cu ovulul şi sub influenţa acestuia. membranele golgiene având rolul de a uni produşii separaţi (proteine – lipide) într-o moleculă mare – complexul lipoproteic. în reticulul endoplasmatic pătrund N – acetilgalactozomină şi monozohexozomină. Granule dense la fluxul de e. apa acumulându-se în săculeţii care se umflă). cum este glicogenul. Produsul secretat se prezintă ca material diferit (enzime.

Fig. care. Aceste vacuole se fragmenteaza dupa exocitoză in vezicule mici prin a caror dezorganizare se reface stocul subunitatilor membranare din hialoplasma. ca în cazul diferitelor glande de la vertebrate (fig. S-a acreditat ideea unui circuit intracelular al subunităţilor membranare hialoplasmice care participa la formarea veziculelor transpoare ce se desprind din reticulul endoplasmatic. De aici. histiocite. astăzi este dovedit că participă la formarea pereţilor celulozici ai plantelor prin sinteza celulozei. de Duve funcţionalităţile lizozomilor 155 . Aparatul Golgi îndeplineşte un rol şi în secreţiile solide şi anume. în realizarea unei „digestii externe”. apoi imbogatesc membranele golgiene. pe lângă canaliculii biliari şi abundă în macrofage. Tot o activitate litică au şi veziculele golgiene. se deschid la exteriorul celulelor. la diferite alge unicelulare. granulele vitelusului proteic (în faza când cristalizează proteinele sunt tot formatiuni lizozomale). Participarea aparatului Golgi la formarea noilor membrane celulare a fost considerată de unii autori ca o funcţie principală a sa.Clasificarea dată de Ch. 95). in final. Lizozomii Sunt structuri tranzitorii din multe celule. reinoindu-le permanent. granulocite. transformându-i în vacuole heterofagice.1. Funcţiile lizozomilor Rolul lizozomilor primari este de a aproviziona cu enzime fagozomii sau autofagozomii. care includ o serie de hidrolaze acide. 6.glicoproteine. 6. ca de exemplu din glanda multifidă de melc.8. de unde trec pe faţa distală a aparatului Golgi formată din saculi şi tubuli anastomazaţi. Ei se găsesc în hepatocite. fiind posibila formarea vacuolelor de secretie.8. limitate la o membrană. respectiv autofagice sau să elimine la exterior conţinutul lor. prin înmugurirea acestora. 95 . Sinteza enzimelor lizozomale are loc în poliribozomii reticulului endoplasmatic. Secreţiile solide. se formează lizozomii.

desfăşurarea procesului este figurată de la stânga la dreapta: sub acţiunea Ca++ filamentele contractile de sub membrana celulară realizează înglobarea unei particule care intră în citoplasmă.Endocitoza diferitelor particule sau pinocitoza lichidului extracelular se face cu participarea filamentelor mecanocontracţiilor sub-membranare (fig. 96 . polizaharidică. Vacuolele heterafagice pot acumula coloranţi şi medicamente din mediul extracelular. 156 . a mică invaginare ce conţine o mică parte din mediul extern. sau se asociază cu lizozomii primari devenind vacuole heterofagice. 96). care apoi dispare. Fig. Astfel. crescând permeabilitatea Na+ care intră în celulă şi provoacă depolarizarea membranei. după care corpii reziduali pot fi excretaţi printr-un mecanism în care proteinele mecanocontractile. transformându-se în heterolizozomi. se separă de membrană formând în interiorul fagozomului o masă amorfă. se depărtează de faţa internă a membranei şi uşurează astfel deschiderea vacuolei în exterior În prezenţa Ca2+ are loc reunirea actinei cu miozina şi formarea actomiozinei. sub acţiunea Ca++. Fogozomul se poate deschide la exterior (regurgitare). Unda de depolarizare eliberează Ca2+ din reticulul endoplasmatic. migrează prin căile microtubulare de-a lungul citoplasmei şi se fragmentează. înconjurată de membrana respectivă. Particulele care aderă la suprafaţa membranei celulare. imobilizează proteinele acesteia.Dinamica endocitozei. Circulând în citoplasmă se încarcă cu enzimele lizozomale. proces care este însoţit de contracţia microfilamentelor respective in sensul invaginării membranei celulare. este separat de citoplasmă printr-o porţiune din membrana plasmatică. fagozomul iniţial. După pierderea glicocalixului fagozomul suferă o deshidratare. nu mai are formă sferică. Glicocalixul ei. devenit interior.

În mod normal. În cursul ontogeniei. clorochina. Celulele unui animal supus la inaniţie se nutresc prin autofagia propriului conţinut. Enzimele lizozomale eliminate în afara celulelor permit unor celule să-şi croiască drum printre zone tisulare compacte şi greu de străbătut. dispariţia cozii larvare la anure. curburile encefalului. Autofagozomul ia naştere prin circumscrierea unei porţiuni de citoplasmă cu organitele respective de către membranele cisternelor reticulului endoplasmatic sau ale saculilor golgieni. hrănind celula. autofagia unei structuri constituie un mecanism care influenţează integralitatea organelor. Acest proces are loc pe trei căi: prin hidrolazele nelizozomale din nucleu şi citoplasmă. particulele captate prin fagocitoză sunt digerate în vacuole heterofagice şi componentele lor trec prin membrana lizozomală în citoplasmă. acumulându-se în heterolizozomii plasmodiului malariei. Când autofagozomul s-a format. Autofagozomii care se formează în ficat şi rinichi distrug permanent organitele celulare în mod constant. ceea ce înseamnă că într-o celulă o mitocondrie este distrusă la fiecare 15 minute. prin aceasta detoxificându-se organismul. prin autofagie. Tot prin autofagie se limitează extinderea unor procese degenerative (ale hepatocitelor şi celulelor pancreatice de actinomicină – inhibitor al sintezei ARN) etc. metabolismul celulelor refolosind în acelaşi timp materialele acestora în sinteze ulterioare.Funcţiile peroxizonilor 157 . formarea rinichiului. Rezultă aşa-zişii „corpi reziduali” care pot să-şi elimine de foarte multe ori conţinutul afară. pigmenţi biliari. rezultă din contopirea mai multor vacuole endocitare. La fel sunt digerate bacteriile de către leucocitele neutrofile şi macrofage şi sunt degradate substanţele toxice şi medicamentoase. în el se varsă conţinutul enzimatic al lizozomilor primari. iar celulele moarte sunt lizate de enzimele lizozomale proprii. Faptul că enzimele lizozomale nu digeră membrana lizozomilor s-ar putea datora rezistenţei învelişului propriu glicoproteic de pe faţa internă a membranei lizozomale. individualizarea falangelor. feritine. Fig. etc. În circa 300 de zile mitocondriile unui hepatocit se reînnoiesc de aproximativ 30 de ori. în alte cazuri. Se ştie că una din proprietăţile fundamentale ale celulelor este de a-şi reînnoi permanent structurile lor funcţionale. determină ruperea membranei şi enzimelor lizozomale distrug parazitul. 97 .Astfel. prin enzimele lizozomale care ies din lizozomii primari şi digeră structurile respective. Ceea ce rămâne nedigerat în hetero-fagozomi şi autofagozomi apare sub forma unor figuri mielinice. Când organismul nu mai are nevoie de anumiţi hormoni atunci glandele care le elaborează distrug prin autofagie granulele de secreţie respectivă. lipofuxime etc. Vacuola autofagică se constituie din contopirea unui autofagozom cu lizozomii primari.

permeabili ce produc scăderea rezistenţei organismului la infecţii. Aceste proteine au fost denumite „proteine chaperone” sau „chaperoni moleculari”.). iar uneori cu formaţiuni poli-şi multitubulare.Sunt cazuri când membrana lizozomală este distrusă prin diferiţi factori externi (şocuri traumatice. Proteinele charperone au capacitatea comună de a-şi regla propria asamblare şi pliere (împăturire) motiv pentru care au fost numite şi autofoldaze. ceea ce înseamnă „proteine de însoţire” deoarece intervin pe tot parcursul sintezei celorlalte proteine din organisme. 6. se acumulează in cantitate mare într-o serie de celule. jucând rol în gluconeogeneză.9. Peroxizomii Sunt corpusculi de 0. fie prin oxidarea unui substrat redus. spleno şi hepatomegalie. endotoxine. Răspunsul la stres implică alăturarea transcrierii unui set anumit de gene care codifică pentru proteinele de şoc termic (hsp) numite şi „proteine de stres”. În peroxizomi se întâlneşte catalaza care distruge H2O2 cu producere de H2O. Peroxizomii produc o cantitate mică de energie. post-translaţional. determinând conformaţia structurală normală. ajută ca aceste proteine să fie translocate către diferite organite celulare (transport 1 kilodaltoni 158 . intervenind şi în sinteza sterolilor (fig. Aceste proteine de stres ajută celulelor supuse stresului să-şi menţină proteinele într-o conformaţie corectă. Si. 6. scleroza parenchinului pulmonar) datorită inhalării de C. cu diferite consecinţe chimice. sintetizând glucoza din precursori neglucidici.Datele acumulate pledează pentru existenţa unui număr foarte mare şi complex de proprietăţi funcţionale ale acestor proteine. Proteinele chaperone Studiile de specialitate şi biologie moleculară din ultimii ani au demonstrat. ajutându-le astfel să-şi găsească o structură terţiară stabilă. praf de cărbune etc. pe un număr mare tot mai mare de organisme procariote şi eucariote. denumite nucleoizi sau o placă marginală mai densă la primate. anoxie. fie. fie membranele lizozomilor fuzionează dând lizozomi mari de 2 – 5 µφ. sfingomielinaze. fie când donorul de O2 este H2O2 . Cunoaşterea acestei noi clase de proteine a permis în ultimii ani deschiderea unor noi căi în abordarea şi înţelegerea proceselor celulare survenite în condiţii de stres. albinism. Be. iar enzimele eliberate omoară celule. Zn – se produc lize ale membranei lizozomilor. Cercetările efectuate în ultimii 25 de ani au demonstrat că există o uniformitate izbitoare în modul în care diferite organisme răspund la diferite forme de stres. iar la copii moartea rapidă. virusuri.10. senescenţă cât şi în fenomenele degenerative tip boli prionice .5 µφ formaţi dintr-o membrană şi o matrice. ele reactivează proteinele legate după stres şi au rol de catalizatori prin creşterea vitezei de înfăşurare a proteinelor. negăsind enzima respectivă responsabilă de hidroliza lor. starea corectă de pliere şi agregare finală a acestora şi implicit. Într-o serie de maladii genetice. existenţa unei clase speciale de proteine cu rol esenţial în viaţa celulei. funcţionarea normală corespunzătoare. fotofobie. În maladii ca pneumoconiozele (leziuni pulmonare. ale branhiilor. sunt cazuri când nu se mai pot transcrie mesaje pentru o serie de enzime lizozomale (glucozidaze. galactizidaze) astfel că. Dintre acestea cea mai cunoscută la bacterii este proteina de şoc termic hsp70k1. o serie de substanţe ce pătrund în lizozomi. 97). reglează catabolismul glucozei.

la procariote s-a demonstrat existenţa unui sistem de proteine chaperone care acţionează succesiv. translocaţia. Hsp90 se asociază cu fibrele de ribonucleoproteine modulând stuctura ARN-ului. proteinele semiîmpăturite din lumenul şi membrana RE. traficul proteinelor (transport vectorial). au fost deschise şi reglări la nivel de translaţie.asamblare/dezasamblare a proteinelor non-sintetizate. proteina chaperone hsp70 are rol în sortarea proteinelor anormale. creştere şi dezvoltare. Formează complexe mari citosolice cu numeroşi alţi chaperoni. stabilitate. să atingă o conformaţie normală. Studiile asupra redistribuirii proteinei grp94 în condiţii de stres au adus lumină asupra înţelegerii patern-urilor de glicolizare ale grp94 modifică după stresul celular. Dintre proteinele de stres. Proteinele de stres joacă un rol important şi în condiţii de nonstres. Această proteină a fost deschisă atât la procariote cât şi la eucariote. sau o mare cantitate de proteine nascente neâmpăturite. - - 159 . Proteinelor chaperone li se atribuie multiple funcţii: protecţia celulară crescută în condiţii de stres. acordând termotoleranţă. asamblarea complexelor ribonucleoproteice a ribozomilor. Răspunsul la stres este reglat în principal la nivel de transcriere. est considerată drept „marker de stres”. cât şi pe cele anormale. având rol vital în sinteza. activitatea factorilor de transcriere şi a activităţii kinazelor proteice. reticulul endoplasmatic (RE) se comportă ca nu senzor ce captează toate variaţiile în condiţii de stres (metabolismul calciului. Proteina chaperone hsp90 este de asemenea implică în protecţia microtubulilor şi a filamentoase citoplasmatice faţă de stres (şoc termic). Hsp90 constituie 1-2% din totalul proteinelor citoplasmatice. corespunzându-i în citoplasmă proteina chaperone hsp90. plierea şi funcţionarea normală a proteinelor nou-sintetizate. hsp70. grp94 se redistribuie în aparatul Golgi. În celula eucariotă. cele mai cunoscute sunt proteinele de şoc termic hsp (heat shock protein). La eucariote. Proteinele hsp se diferenţiază între ele prin greutatea lor moleculară (exprimată în kda): hsp60. şi ghidează atât proteinele normale nou-sintetizate. determinarea stării de împăturire. dar şi a anumitor proteine normale (cu viaţă scurtă) atât la procariote cât şi la eucariote. în unele cazuri.declanşând procesul de transcriere/translaţie a proteinelor de stres nu este încă bine cunoscut. hsp90. Se pare că grp94 este o glicoproteină transmembranară (hidrofobă şi cu afinitate pentru lipide). hsp90 are rol în reglarea. cantitatea ei creşte în nucleu şi este secretată parţial în mediul extracelular. sugerând deci că o proteină anormal împăturită reprezintă componentă cheie a procesului de recunoaştere a stresului de către celulă. În condiţii de stres pot să apară proteine împăturite. Proteina chaperone grp94 este cea mai abudentă dintre toţi chaperonii din RE (în proporţie de 50%) şi aparatul Golgi. În aceste condiţii.vectorial). translocaţie. Modul în care celula este capabilă să sesizeze acumularea intracelulară de proteine anormal împăturite. chaperonii hsp60 şi hsp70 au rol în împăturire. anume în perioada de diferenţiere celulară. asamblare. potenţialul redox. Hsp90 protejează proteinele ţintă de proteoliză şi le asigură înmagazinarea. într-o reacţie în lanţ. aceste stări declanşează imediat răspunsul „la stres”. deşi.

intervin în procesul de dezvoltare celulară. Unele observaţii sugerează că hsp exercită o acţiune de citoprotecţie asupra SNC ca urmare a răspunsului la stres.Hsp90. Hsp70 se leagă de ATP. Dintre aceştia. Într-un număr mare de infecţii (bacteriene şi parazitare cu protozoare şi helminţi) moleculele chaperone devin ţinte imune proeminente pentru celulele T. Hsp90 este implicat în asamblarea diferitelor complexe virale (complex ARN reverstransciptaza). având o slabă acţiune ATP-zica. Proteinele hsp70 au rol şi în stabilizarea citosolica a proteinelor peroxizemale. Chaperonii au rolul în menţinerea stării de răsucire moderată a moleculelor de ADN. prin formarea complexelor ADN-hsp90-histone. aceşti caperonii oferă celulei protecţie faţă de factorii de necroză a tumorilor (TNF) şi faţă de leziunile oxidative. cu fibrele de ribonuleoproteine ale pericromatinei . poate fi fosforilată în prezenţa unui înalt nivel de calciu. Se ataşează de ADN desfăşurând activitate de tip topoizomerază şi nuclează. prin legarea de receptorii pentru hormonii steroizi. scăderea pH-ului intracelular. kinazele sau receptării controlul transmiţătorilor. Date recente (Cyermely şi Colab. Hsp90 se asociază cu nucleolii.S-a demonstrat că insulina induce producerea de proteine hsp70. Cel mai mare rol protector îl au proteinele din familia hsp70. proteinele hsp60 şi hsp70 s-au dovedit a avea rol în biogeneza mitocondriilor. rolul în imunogenitate. ADN-ul poate fi uşor antrenat în activitatea de transcriere. fosfolipazele. Aceste proteine hsp70 reprezintă o proteină asociată cu microtuburi şi implicată în transportul axonal lent. în această stare.- biogeneza mitocondriilor şi peroxizomilor. musculară). asamblarea şi reglarea activităţii receptorilor pentru hormonii steroizi. Toate aceste procese sunt implicate în producerea răspunsului de tip proteine şoc termic (hsp). clivajul proteolitic al proteinelor structurale şi prezenţa de radicali liberi mediaţi de denaturarea proteinelor. rolul protector în SNC. osoasă. retiniană. a ARN-ului şi proteinelor . Mecanismul protector al hsp se pare că este legat de combinarea acestora cu proteazele. ar explica în mare măsură . Stresul excitator este mediat de scăderea cantităţii intracelulare de glucoză. activitatea kinazei. - - - - - Hsp90 şi grp94 intervin în apoptoză şi în procesele de îmbătrânire celulară. regenerează ADN-ul după şoc termic. modulează stuctura ADN-ului nuclear. proteina hsp face posibilă asamblarea centrozomilor. tuberculosis. recombinare. menţinerea şi remodelarea arhitecturii celulare (citoscheletul). Hsp90 şi grp94 intervin în ciclul celular şi diferenţierea celulară (hsp90 intervine dezvoltarea neurală. 160 . prezenţi în toate organismele. având drept rezultat atenuarea efectelor distructive. faptul că proteinele chapenare au potenţialul de a-şi creşte sinteza şi in condiţii de stres. 1998) arată că funcţia majoră a hsp90 pare a fi participarea acesteia la omogenizarea. Proteinele hsp70 sunt prezente în ţesutul nervos şi în condiţii de nonstres. rearanjările majore în structurile nucleare în cursul oogenezei şi embriogenezei precoce. au rol şi în biogeneza unor structuri macromoleculare. procariote şi eucariote. Chaperonii. replicare. Starea toxică este potenţată de eliberarea continuă de glutamat după producerea leziunii iniţiale. răspunsul imun. Au fost deschise drept ţinte imune proteinele hsp10 de la Mycobacterium leprae şi proteinele hsp60 şi hsp70 de la Mycobacterium leprae şi M. face ca acestora să se menţină în stare parţial despăturită capabilă de a fixa hormonul respectiv. replicarea ADN-ului la virusuri. din cursul mitozei.

Sinteza care are loc chiar în profază este necesară desfăşurării mitozei şi dacă ea lipseşte celulele revin în interfază . care este inductoare pentru nucleii cu capacitate de replicaţie. o 7. O altă sinteză proteică are loc la începutul fazei G2. adică a segmentului genomic ce transcrie ARNr (organizatorul nuclear). 7.1. Ciclul celular la plante La plantele superioare rata ciclurilor celulare este invers proporţională cu temperatura (5 – 30o). Funcţie de compartimentele celulare în care se desfăşoară aceste evenimente se disting două componente ale ciclului celular: ciclul cromozomial şi ciclul citoplasmatic. Reproducerea celulelor eucariote are loc printr-un proces complex denumit diviziune celulară. fiecare prezentând o jumătate din informaţia genetică a celulei parentale. Apariţia unor descendenţi celulari cu acelaşi potenţial genetic reclamă exercitarea unui riguros control asupra replicării şi distribuirii materialului genetic. această capacitate pare a fi coordonată de prezenţa intranucleară a ADNr. ceea ce duce la endoploidii. reproducerea se realizează prin forme diferite. 7. fiind posibile mitoze fără duplicarea cromozomilor sau duplicarea fără mitoze. Ciclul celular la animale Ca şi la plante. Acest capitol îşi propune să prezinte principalele etape ale reproducerii celulare şi mecanismele de control implicate în desfăşurarea acestui complex proces. Mitoza este caracteristică celulelor somatice şi asigură o repartizare egală în celulele fiice a materialului genetic replicat. Meioza este întâlnită la celulele germinale. Duplicarea cromozomilor nu pare să fie în legătură cu distribuţia lor. prin care se realizează duplicarea constituenţilor celulari şi distributive. Iniţierea replicării genomului depinde de o sinteză proteică prealabilă. Diviziunea celulară implică desfăşurarea unor evenimente celulare replicative.Capitolul 7 REPRODUCEREA CELULARĂ Creşterea organismelor şi transmiterea caracterelor ereditare de-a lungul generaţiilor au la bază o caracteristică fundamentală a materiei vii . celula parentală se divide.1. dând naştere la două celule fiice. în urma acestui proces. în urma meiozei se formează 4 celule fiice (gameţii). În ciclul cromozomial dublarea cantităţii de ADN alternează cu mitoza. Prin fuziunea gameţilor (spermatozoidul şi ovulul) ia naştere oul fecundat din care se dezvoltă ulterior întregul organism multicelular. fiind necesară condensării cromozomilor profazici. în ciclul citoplasmatic are lor dublarea numărului de organite celulare şi citokineza. la fiecare interval de temperatură diferite faze ale ciclului rămânând constante ca cinetică. cea mai mare parte a ciclului celular de la animale este reprezentată de interfază. Ciclul celular Reproducerea celulară implică evenimente multiple şi complexe ce se succed ciclic şi care constituie ciclul celular.reproducerea.1. Procesul distributiv al moleculelor ADN se realizează prin mecanisme specializate. la eucariote cele mai frecvent întâlnite fiind mitoza şi meioza. adică de perioada de la sfârşitul unei diviziuni şi începutul următoarei.1. 161 .2. ce asigură partiţia constituenţilor celulei în celulele fiice. La nivel celular.

după reacţia Feulgen pentru AND. Această replicare necesită separarea celor două lanţuri de ADN în punctele de iniţiere. Urmează mitozei şi durează 5 – 10 ore la mamifere . Fibra nucleozomală unitară. 98). Biosinteza proteică depinde de activitatea genică transcripţională din eucromatină. în schimb. raportul dintre lungimea cromatinei cu fibra unitară de 250 Å diametru şi lungimea ADN este la nucleii umani de 1 : 4. dublarea a acestuia. în cursul căreia cantitatea de ADN se dublează . ca şi a histonelor (fig. de aproximativ 250Å diametru. se poate detecta. care elaborează diferiti mesageri sub formă de ARN m ce servesc după aceea în biosinteza proteică citoplasmatică . cantitate care rămâne constantă în decursul perioadei G1. Marcajele cu 3H – timidină a unor culturi celulare sincronizate arată că încorporarea „marcajului” (3H timidină) are loc în primele 10 minute ale fazei şi apare pe autoradiografii la periferia nucleului şi nucleolului. În cursul ei nu se înregistrează noi sinteze de ADN şi celulele conţin cantitatea de ADN caracteristică speciei sa ţesutului respectiv . Interfaza Faza G1.8 x 10 –12g. Fibrele de cromatină dintre blocurile heterocromatinice sunt mai puţin împachetate. Faza S .5 – 1 µ / minut. Rata replicării helixului de ADN de la mamifere este de 0. 98 .Nucleul nu prezintă în interfază transformări vizibile la microscopul fotonic. denumite cromomere în raport cu proteinele matriceale. Durează 6 – 8 ore. Fig. La om (46 cromozomi). constituind eucromatina. citospectrofotometric. cantitatea de ADN a nucleilor diploizi este de 6.Ciclul celular şi mitoza celulei animale 162 . Aglomerarea mai multor cromomere dă naştere blocurilor de heterocromatină. Fiecare lanţ serveşte ca model complementar al altuia nou care se sintetizează enzimatic . formează în anumite locuri de-a lungul cromozomilor împachetări mai voluminoase.

În această perioadă sintetică cantitatea de ADN creşte de la nivelul diploid 2n, trecând prin etape intermediare: 2,5C; 3C, 3,5C până ajunge la nivelul 4C, moment în care, prin mecanisme foarte exacte de reglaj celular, încă necunoscute, este încetată încorporarea de 3H timidină. Celula şi-a dublat cantitatea de ADN; iniţială în vederea repartizării aceleiaşi cantităţi 2C, de ADN în celulele fiice, respectiv aceleiaşi cantităţi de informaţie genetică. Prin ţinerea materialului biologic în contact cu 3H – timidină pentru durate diferite de timp presupuse a corespunde începutului, mijlocului şi sfârşitului perioadei S, se evidenţiază autoradiografic o replicare timpurie, mijlocie şi târzie (tardivă) a unor segmente cromozomale sau cromozomi întregi ai complementului unei celule sau specii. Când materialul biologic este ţinut mai puţin timp în contact cu izotopul, se constată că numai anumite părţi ale cromozomilor metafazici vor apare radiografic ca „grain-uri” (puncte) de încorporare a acestuia. Acestea sunt segmentele eucromatice ale cromozomilor; care au deci replicare precoce, la începutul perioadei S. Când materialul biologic stă mai mult timp în contact cu trasorul, corespunzând la 1 / 2 sau 2/3 din stadiul S, se constată că cea mai mare parte a cromozomului metafazici ca şi cei mai mulţi din cromozomii complementului prezintă marcaj radioactiv, puţine segmente, respectiv cromozomii, rămânând totuşi nemarcaţi. Acestea sunt segmente heterocromatice, respectiv cromozomi cu replicare tardivă. Când materialul biologic a stat în contact cu trasorul pentru un timp ce corespunde unei perioade S integrale, cromozomii metafazici, apar total marcaţi radioactiv. Faza G2. Este mai scurtă, durând 4 – 5 ore şi începe odată cu terminarea replicării heterocromatinei. Sintezele de ADN persistă, iar cantitatea de ADN este dublă faţă de G1. Faza M (sau mitotică). Reprezintă separarea duplexurilor de cromozomi (sau a cromatidelor – surori, după unii autori), împreună cu două loturi de citoplasmă care includ toţi constituenţii săi, în cele două celule fiice. Prin cinematografie cu contrast de fază s-a stabilit că profaza durează 10 – 15 minute, prometafaza şi metafaza 25 – 35 minute, anafaza 5 – 8 minute şi telofaza 20 minute . Derularea ciclului celular implică reglarea succesiunii evenimentelor ce se desfăşoară în cadrul acestuia Acurateţea proceselor de replicare şi segregare a ADN depinde de rezolvarea de către celulă a problemei succesiunii evenimentelor ciclului celular într-o ordine strictă, astfel încât, declanşarea unui nou eveniment să survină doar în urma încheierii complete a evenimentului precedent. Rezolvarea acestei probleme reclamă funcţionarea unor mecanisme de control şi existenţa la nivel celular a unor factori reglatori. Primele date privind existenţa unor factori implicaţi în reglarea ciclului celular au fost furnizate de experienţele de fuziune celulară Obţinerea populaţiilor de celule sincronizate (în care celulele se află în aceeaşi perioadă a ciclului celular) şi experienţele de fuziune celulară au sugerat existenţa unor factori reglatori ce controlează trei evenimente cheie ale ciclului celular: a) iniţierea sintezei ADN; b) derularea replicării materialului genetic nuclear; c) declanşarea procesului mitotic în care are loc segregarea materialului genetic. S-a constatat că în urma fuzionării unei celule aflate în perioada G1 cu o alta ce se găseşte în perioada S a ciclului celular, ADN celulei G1 începe să se replice. Experimentul a stat la baza presupunerii existenţei unui semnal capabil să activeze aparatul ADN replicativ. Acest semnal absent probabil din celulele G1, dar prezent în citoplasmă celulelor S a fost numit activator al perioadei S (S - phase activator). Deoarece în celulele hibride G2 x G1 nu s-a înregistrat iniţiera replicării ADN în nucleul G2, s-a considerat că activatorul fazei S este eliminat (sau blocat) din citoplasmă celulelor, la scurt timp după încheierea perioadei sintetice.

163

În urma fuziunii celulelor aflate în perioadele G2 şi S ale ciclului celular, sinteza ADN în nucleul celulelor din S continuă până în momentul replicării complete a materialului lor genetic, ceea ce indică absenţa unui inhibitor al sintezei ADN în citoplasmă celulelor G2. în acelaşi timp prezenţa activatorului perioadei S nu pare să afecteze nucleul G2 de vreme ce nu se înregistrează o reiniţiere a replicării ADN în acest nucleu, procesul replicativ fiind blocat până la trecerea celulei în perioada G1 a unui nou ciclu celular. Funcţionarea unui mecanism de blocare a sintezei ADN poate explica de ce într-o celulă nu are loc derularea repetată a procesului ADN replicativ. S-a constatat că atât replicarea incompletă a materialului genetic, cât şi existenţa unor erori în molecule ADN nou sintetizate ce reclamă intervenţia mecanismelor de reparare, determină întârzierea intrării celulei în mitoză. Deoarece procesul replicativ şi cel de reparare sunt asociate cu existenţa ADN monocatenar, se consideră că excesul de ADN monocatenar declanşează sinteza unui factor citoplasmatic, semnal ce împiedică intrarea celulelor în mitoză până în momentul desăvârşirii replicării sau reparăii erorilor. Acest factor ce controlează acurateţea procesului ADN replicativ a fost numit semnal de întârziere a perioadei mitotice (M - phase delaying signal). Intrarea celulelor în mitoză este determinată de dispariţia semnalului de întârziere a mitozei şi acumularea în citoplasmă a unui factor ce iniţiază mecanismul de segregare a materialului genetic, numit factor de activare a mitozei (M - phase promoting factor: MPF). Studiile bazate pe experienţele de fuziune celulară, în care s-au obţinut hibrizi g1 X M; G2 x M şi S x M, au demonstrat că prezenţa MPF (factor citoplasmatic prezent în celulele aflate în mitoză) declanşează în nucleul celulelor aflate în oricare perioadă a ciclului celular condensarea cromatinei, eveniment caracteristic mitozei. Se sugerează că factorul de întârziere a mitozei exercită un efect inhibitor asupra sintezei MPF. Acţiunea inhibitoare dispare în prezenţa MPF de vreme ce în celulele hibride, rezultate prin fuziunea celulelor G1, S sau G2 cu celulele M, în care factorii citoplasmatici coexistă, are loc condensarea cromatinei.

7.1.3. Ciclinele şi protein - kinazele dependente de cicline
Ciclinele şi protein - kinazele dependente de cicline constituie componentele motorului ciclului celular. Modificările apărute în statusul motorului, ca urmare a interacţiunilor dintre cele două componente, declanşează evenimentele ciclului celular (fig. 99). Aceste evenimente pot fi clasificate în patru grupe: a) evenimente declanşate de depăşirea punctului de START: - iniţierea replicării ADN; - replicarea centrilor organizatori ai microtubulilor (MTOC). b) evenimente ce au loc pe parcursul derulării replicării ADN. c) evenimente iniţiate în momentul intrării celulei în mitoză; - asamblarea fusului de diviziune; - condensarea cromatinei; - dezorganizarea membranei nucleare. d) evenimente ce marchează încheierea procesului mitotic; - dezasamblarea fusului de diviziune; - segregarea cromozomilor; - decondensarea cromatinei; - reorganizarea membranei nucleare; - citokineza.

164

Fig. 99 - Schema generală a funcţionării motorului ciclului celular. Interacţiunile ce se stabilesc între cicline şi protein kinaze dependente de cicline (cdk) au ca rezultat declanşarea evenimentelor caracteristice diviziunii celulare. 7.1.3.1. Protein - kinazele dependente de cicline (cdk) Prima protein kinază dependentă de cicline (34 KDa) a fost descoperită în 1988 ca produs al genei cdc2 din Saccharomices pompe şi al genei CDC 28 din Saccharomices cerevisiae. Ea a fost numită proteina p34 cdc2/CDC28 sau cdk1. Proteina cdk1 joacă un rol important în controlul ciclului celular, operând la nivelul punctelor de graniţă G1/S şi G2/M. Gene omologe cdc2/CDC28 au fost identificate şi în genomul uman. Introduse prin clonare în drojdii defective în cdc2/CDC28, genele umane au fost capabile să suplinească absenţa genelor corespondente din drojdii. Constatarea sugerează că proteina cdkl a fost conservată de-a lungul evoluţiei speciilor, acest element implicat în reglarea ciclului celular fiind comun tuturor celulelor eucariote. Descoperirea unei proteine, p33 (33KDa), numită cdk2 datorită asemănării structurale şi funcţionale cu cdk1, a demonstrat existenţa unei întregi familii de protein kinaze dependente de cicline. în prezent, şase membri ai acestei familii au fost identificaţi. 7.1.3.2. Ciclinele Ciclinele reprezintă un grup restrâns de proteine a căror sinteză se realizează într-o manieră dependentă de perioadele ciclului celular. Ele activează cdk formând cu acestea complexe ce prezintă activitate kinazică. Pe parcursul formării complexelor, ciclinele induc modificări conformaţionale şi de locaţie a cdk ceea ce conferă acestora specificitate în fosforilarea diferitelor substrate. Specificitatea activităţii catalititce a complexelor ciclină/cdk stă la baza parcurgerii de către celulă a ciclului celular.

165

Fig. 100 - Complexele ciclină/cdk implicate în diferitele perioade ale ciclului celular. Spre deosebire de cicline, care se acumulează în celulă într-o manieră dependentă de perioadele ciclului celular, cdk sunt prezente pe tot parcursul ciclului celular. Funcţie de omologia secvenţelor de aminoacizi şi implicarea lor în perioadele ciclului celular, ciclinele se clasifică în trei grupe (fig. 100): a) ciclinele perioadei G1 (ciclinele G1): ciclineie D şi E; b) ciclinele perioadei S: ciclina A; c) ciclinele perioadei M (cicline mitotice): ciclina B. Ciclinele G1 asigură traversarea de către celulă a perioadei G1 şi tranziţia G1/S. Din această grupă fac parte cele trei subtipuri ale ciclinei D (D1, D2, D3) şi ciclina E. Ciclinele D sunt sintetizate în faza timpurie a perioadei G1. Ele formează complexe cu diferite tipuri de cdk (cdk1 - cdk6). Se sugerează că complexele ciclina D/cdk constituie primele componente ale cascadei ciclinelor, ele acţionând în sensul activării ciclinelor E, care Ia rândul lor activează ciclinele A implicate în derularea perioadei sintetice a ciclului celular. Ciclinele E sunt sintetizate târziu în G1. Mai selective comparativ cu ciclinele D, ciclinele E se asociază doar cu cdk2 şi cdk3. Acţiunea celor două tipuri de complexe G1 se suprapune spre sfârşitul perioadei G1 având ca rezultat propulsarea celulei în perioada sintetică a ciclului celular. Ciclina A se asociază cu cdk2 la graniţa dintre perioadele G, şi S. Complexul favorizează derularea perioadei sintetice şi intrarea celulei în G2. În faza târzie a perioadei S se formează complexul ciclina A/cdk1 ce conduce celula de-a lungul perioadei G2 spre graniţa G/M. Ciclina B prin asociere cu cdk1 dă naştere unui complex cunoscut sub numele de factor de promovare a celulei în mitoză (MPF – Maturation Promotion Factor) ce operează în punctul de tranziţie G2/M. Studiile efectuate pe drojdii au furnizat informaţii interesante cu privire la modul în care complexul ciclină B/p34cdc2 acţionează în sensul propulsării celulei în perioada mitotică a ciclului celular (figura 101).

166

Fig. 101 - Ciclinele B se acumulează pe parcursul interfazei, formând prin asociere cu p34cdc2 complexul pre-MPF. Acesta este imediat fosforilat la nivelul Tyr 15 şi a Thr 160 din p34cdc2 de către tirozin/treonin kinaza (wee1), pierzându-şi activitatea kinazică. Sub acţiunea tirozin fosfatazei (cdc25) pre-MPF este defosforilat, transformându-se în MPF activ la începutul mitozei. în ultimele etape ale mitozei ciclinele B sunt rapid degradate de proteaze. Sinteza ciclinelor B este iniţiată în faza târzie a perioadei sintetice. Pe parcursul perioadei G2 ciclinele B se asociază cu p34cdc2 dând naştere unui complex pre-MPF, lipsit de activitate kinazică. Pierderea activităţii kinazice de către pre-MPF se datorează faptului că acest complex constituie unul dintre substratele unei tirozin/treonin kinaze. Enzima, produs al genei weel, fosforilează tirozina 15 şi treonina 160 din lanţul de aminoacizi ai proteinei p34cdc2. Fosforilarea tirozinei 15 este responsabilă de inhibarea funcţiei kinazice a proteinei p34cdc2. Defosforilarea tirozinei 15 are loc la sfârşitul perioadei G2 a ciclului celular, sub acţiunea unei tirozin fosfataze codificată de gena cdc25. Reacţia de defosforilare, transformă pre-MPF inactiv în MPF cu activitate protein kinazică (figura 102). MPF inhibă tirozin/treonin kinaza şi activează tirozin fosfataza, ceea ce conduce la acumularea masivă a MPF în citoplasmă şi, ulterior, declanşarea unei rapide şi ireversibile treceri a celulei în perioada mitotită a ciclului celular. Fig. 102 - Reacţiile de fosforilare şi defosforilare ale MPF Evenimentele ce marchează intrarea celulei în perioada mitotică sunt rezultatul fosforilării directe sau indirecte a unor proteine de către MPF. Prin fosforilarea laminelor nucleare, MPF declanşează dezorganizarea membranei nucleare. Fosforilarea histonei H1, proces ce iniţiază condensarea cromatinei, este cataliuzaqtă de proteinkinaza, enzimă activată prin fosforilare de către MPF. Se consideră că un mecanism indirect de fosforilare similar stă la baza asamblării fusului de diviziune. Dintre enzimele activate de MPF fac parte şi cele implicate în conjugarea ciclinelor cu molecula marker a proteolizei, numită ubiquitină.

167

ceea ce conduce la eliberarea factorului E2F şi sinteza ciclinei A.Fosforilarea proteinei RB are loc la sfârşitul perioadei G1 sub acţiunea complexelor ciclină D/cdk. b) un semnal generat de senzor. 168 .proteina Rb . Ciclinele D prezintă o secvenţă peptidică amino-terminală (Leu-X-Cys-X-Glu) prin care se pot lega la un domeniu specific (pocket region) al proteinei RB. Un mecanism de control feed-back reclamă existenţa a cel puţin trei elemente: a) un senzor ce monitorizează desfăşurarea evenimentului. Sechestrarea factorului E2F blochează sinteza ciclinei A. când revine în starea hipofosforilată.În urma ubiquitinării. c) un răspuns la nivelul motorului celular care permite progresia. 7. La rândul lor. Aceasta conduce inevitabil la alterare genetică şi moarte celulară. Tot prin mecanisme feed-back celula este capabilă să detecteze şi să remedieze erori ce apar în desfăşurarea proceselor de replicare şi segregare a materialului genetic. ceea ce determină menţinerea celulei în G1.4. Interacţiunea cicline. Scăderea concentraţiei ciclinelor în celulă este urmată de disocierea complexelor ciclină/cdk. În stare hipofosforilată proteina Rb leagă diferite proteine nucleare implicate în reglarea principalelor procese ce asigură creşterea celulară.5. Se sugerează că proteinele Rb funcţionează ca un comutator molecular în activarea în cascadă a ciclinelor prin reglarea sintezei ciclinei A.1. complexele ciclina D/cdk determină trecerea proteinei Rb în stare hiperfosforilată. Reglarea ciclului celular prin mecanisme feed-back Apariţia unei desincronizări între durata necesară desfăşurării unui eveniment al ciclului celular şi funcţionarea motorului are ca rezultat iniţierea în celulă a unui nou eveniment înaintea încheierii celui precedent. datorită activităţii kinazice. în special cele active în perioada G.1. 104). în absenţa acţiunii efectorilor pozitiv (cicline) scade capacitatea catalitică a cdk ceea ce determină ieşirea celulelor din mitoză şi intrarea lor într-un nou ciclu celular. inclusiv factori de transcripţie. Pe de altă parte. întârzierea sau oprirea depăşirii punctului de control de către celulă. 7. Existenţa unor mecanisme de control feed-back face posibilă încetinirea sau blocarea temporară a motorului ciclului celular în momentul în care desincronizarea a fost detectată. Fig. G2 şi M ale ciclului celular (figura 103). Proteina este menţinută în stare hiperfosforilată până la ultimele etape ale mitozei. ciclinele A menţin proteinele RB în stare hiperfosforilată pe parcursul perioadelor S. Un exemplu în acest sens este oprirea intrării celulei în mitoză. blocându-l. Unul dintre aceştia este factorul E2F responsabil de exprimarea genei ce codifică ciclina A.mecanism de reglare pozitivă a ciclului celular Proteina Rb transcrisă de antioncogena Rb1 este o proteină nucleară ce face parte dintrun mecanism de blocare a proliferării celulare sub acţiunea factorilor antimitotici (sau în absenţa factorilor mitotici). ciclinele sunt rapid degradate. 103 . prin blocarea activării MPF în condiţiile unei replicări incomplete a ADN (fig. Un rol interesant în unele mecanisme feed-back îl au inhibitorii cdk (ICDK). Aceste proteine au drept ţintă cdk şi complexele ciclină/cdk.

/cdk ceea ce împiedică fosforilarea substratelor ţintă.Mecanismele feedback sincronizează funcţionarea motorului ciclului celular cu derularea evenimentelor celulare. b) replicarea ADN nu este complet încheiată în momentul activării MPF. printr-un mecanism ce implică produsul genei AT. d) activarea MPF este blocată prin mecanism feed-back ceea ce permite finalizarea procesului replicativ. Prin acţiunea inhibitoare asupra complexelor cicline G. prelugeşte perioada G./cdk. c) Desincronizarea conduce la moarte celulară. proteina GADD. se remarcă acumularea proteinelor p53 în celulă. cum ar fi proteinele Rb. Proteina p53 funcţionează ca un factor de transcripţie ce induce exprimarea genei GADD45. Acest mecanism feed-back este inactivat la persoanele ce suferă de ataxietelangiectazie. numit proteina p21 (WAF1 -Activated Fragment-1 sau CIP1 –cdk Interacting Protein-1). Această cale mai implică cel puţin doi participanţi: proteina codificată de gena AT (ataxie-telangiectazie) şi proteina p53 (figura 110). Sunt prezentate schematic trei situaţii: a) sincronizarea perfectă a replicării ADN cu activarea MPF ce declanşează mitoza. o incidenţă crescută a cancerelor.Prin legarea proteinei p21 de diferiţi cdk ce acţionează în G. oferind timp celulei să repare leziunea înainte de a intra în perioada S a ciclului celular. prin care celula este oprită în perioada G1 ca urmare a lezării ADN prin radiaţii ionizante sau alţi factori de stres celular. ataxie cerebrală progresivă şi deficienţe în sistemul imun. El face parte dintr-o cale de transmitere a semnalelor ce controlează oprirea ciclului celular în urma lezării ADN sub acţiunea radiaţiilor ionizante. o boală autozomală recesivă ce se manifestă prin hipersensibilitate la radiaţii. 169 . în acelaşi mod se consideră că ar acţiona şi proteina 16 (p 16).Un inhibitor cdk este produsul genei GADD45 (Specific Growth Arrest DNA Damage Inductible). este blocată activarea complexelor ciclină G. Proteina p53 induce exprimarea unei gene ce codifică un inhibitor cdk. 104 . În urma detectării leziunii la nivel ADN. Recent s-a descoperit un alt mecanism p53 dependent. Fig.

în aceste condiţii. ceea ce ilustrează semnificaţia sa deosebit de complexă la organismele pluricelulare. depăşirea perioadei G1 de către celulele organismelor pluricelulare este condiţionată de atingerea dimensiunii standard. În organismele pluricelulare. 7.7. s-a sugerat că raportul dintre volumul celular şi cantitatea totală de ADN sau numărul seturilor de gene din genomul celular ar constitui un factor critic. numit punct de restricţie (R). Mecanismul prin care dimensiunea celulei influenţează ciclul cromozomial implică probabil sinteza unei molecule într-o manieră dependentă de cantitatea de ADN celular. Încălcarea acestor reguli determină grave modificări la nivel celular ce conduc la malignizare sau moarte celulară. 105 . Menţinerea integrităţii structurale a organismului reclamă stabilirea unui permanent echilibru între proliferare şi moarte celulară (apoptoză).p21 . Dat fiind relaţia de proporţionalitate dintre dimensiunea celulei şi gradul său de ploidie.GADD45. Există foarte puţini indici cu privire la modalitatea prin care celulele sunt capabile să-şi sesizeze propria dimensiune. Diverşi factori ce reglează trecerea celulelor din G1 în S impun reguli stricte de depăşire a punctului de restricţie.1.1.RB conduc la oprirea celulei în G1 ca urmare a detectării unei leziuni la nivel ADN.Mecanisme feed-back controlează replicarea ADN în celulele supuse acţiunii factorilor de stress (radiaţii ionizante). Sunt prezentate două căi de control dependente de proteina p53. raportul dintre cantitatea totală a moleculei şi ADN celular rămâne constantă. Diversitatea factorilor şi a mecanismelor prin care ei reglează trecerea din G1 în S a celulelor ce alcătuiesc organismele pluricelulare sugerează existenţa la sfârşitul perioadei G1 a mai multor puncte de restricţii. Atât calea AT p53 .6. Acest echilibru este reglat prin numeroşi factori extra şi intracelulari. Alţi factori responsabili de controlul proliferării celulare în organismele pluricelulare În organismele unicelulare. 170 . proliferarea este un proces rapid a cărui desfăşurare este influenţată în principal de aportul nutriţional şi viteza metabolismului celular. 7. cât şi calea p53 . GADD45 şi p21 funcţionează ca inhibitori ai cdk activi în perioada G1 a ciclului celular. Majoritatea acestor factori acţionează asupra unui punct de control (check point) echivalent punctului start la drojdii. celulele individuale ce le compun cooperează în scopul asigurării supravieţuirii acestora. Ciclul cromozomial şi creşterea celulară Similar organismelor unicelulare.Fig.

Celula îşi sintetizează proteinele de întreţinere. prin intermediul cărora semnalul este transmis de la nivelul membranei plasmatice la genele implicate în proliferarea celulară (procesul fiind denumit signal transduction). Afirmaţia se bazează pe rezultatele experienţelor pe culturi de celule în care s-a reuşit blocarea sintezei proteice fără ca ciclul cromozomial să fie afectat şi invers. Factorii de reglare operează la nivelul materialului genetic în sensul activării genelor ce transcriu proteinele implicate în iniţierea sintezei AND. Implicarea factorilor de creştere în reglarea diviziunii celulare Factorii de creştere sunt proteine implicate specific în stimularea diviziunii celulare. amplificare genetică sau inserţie mutatională) se pot activa. El stimulează proliferarea fibroblaştilor în culturi celulare şi a celulelor din ţesuturile conjunctiv şi muscular neted. gene care prin diferite mecanisme (mutaţie punctiformă. proteine implicate în desfăşurarea sau reglarea acestui proces). (de exemplu neuronii) creşterea celulară nu reclamă replicarea ADN. Majoritatea proteinelor antrenate în răspunsul celular la factorii de creştere sunt codificate de proto-oncogene. Semnalul amplificat este preluat de proteine citoplasmatice cu activitate tirozin sau treonin/ serin-kinazica şi ulterior transmis în nucleu proteinelor ce joaca rolul de factori de reglare ai replicării şi ai transcripţiei AND. ea evoluând paralel cu ciclul cromozomial. făcând astfel posibilă repararea leziunilor tisulare. 106). În aceste celule raportul dintre sinteza şi degradarea proteinelor este modificat în comparaţie cu cel al celulelor proliferative aflate în perioada G1. 7. fapt care determină depăşirea de către celulă a punctului de restricţie. capabile să inducă transformarea malignă a celulei (fig. Alţi factori de creştere sunt prezentaţi în tabelul 3. Atât aparatul proteosintetic (ribozomi. în urma stimulării cu factori de creştere a celulelor aflate în G0. prezenţi la nivelul membranei plasmatice. ar putea constitui un semnal de depăşire al punctului de restricţie şi de iniţiere a replicării ADN. care devine astfel capabila sa fosforileze alte proteine asociate membranei plasmatice. Legătura dintre creşterea şi proliferarea celulară nu este rigidă. reprezintă o primă etapă a unui mecanism complex finalizat prin inducerea replicării ADN.1. determinată de creşterea volumului celular. 171 . În organismele pluricelulare numeroase celule se găsesc în stadiul G0. cât şi viteza sintezei proteice sunt mult diminuate. Recunoaşterea lor de către celule prin intermediul receptorilor. În transmiterea semnalului un rol important îl are fosforilarea proteinelor antrenate în acest proces. De asemenea. rămânând viabilă. Recunoaşterea şi legarea factorului de creştere de către receptorul specific declanşează evenimente ce se derulează în cascadă. pentru unele celule aflate în G0. rearanjare cromozomială.Scăderea concentraţiei moleculei sub o valoare prag. ARNm.8. Receptorul pentru factorul de creştere este o proteină cu activitate tirozinkinazică. dar nu mai creşte. Formarea complexului receptor-factor de creştere determină autofosforilarea la nivelul tirozinei a regiunii intracitoplasmatice a receptorului. devenind oncogene. se constată o intensificare a proteosintezei. Factorul de creştere derivat din trombocite (platelet-derivated growth factor-PDGF) este unul din cele aproximativ 30 de tipuri de factori de creştere identificaţi.

172 . Stimulează proliferarea celulelor precur-soare ale Eritropoietina eritrocitelor. Factorul de creştere a fibroblastilor . Factorii de creştere constituie elemente prin care celulele sunt capabile să controleze proliferarea altor celule (mecanisme paracrine) ce se încadrează în clase diferite sau aparţin aceleiaşi clase (mecanisme autocrine). Competiţia celulelor pentru factorii de creştere Deoarece celulele conţin numeroase tipuri de receptori. Stimulează proliferarea: . Interleukina 2 (IL2) Stimulează proliferarea limfocitelor T. Stimulează proliferarea: . Induce creşterea axonală si viabilitatea neuronilor Factorul de creştere neuronal (NGF) simpatici şi senzori. Factori de stimulare a coloniilor de Stimulează proliferarea: macrofage (M-CSF) .neutrofilelor. Stimulează proliferarea celulelor stem şi a Interleukina 3 (IL3) majoritatii celulelor precursoare ale multor celule diferenţiate. Factorii de creştere şi acţiunea lor asupra celulelor ţintă Factorii de creştere Factorul de creştere epidermal (EGF) Factori de creştere de tip insulinic (IGF-I. factorii de creştere prezenţi în combinaţii variate reglează selectiv diviziunea diferitelor tipuri celulare.macrofagelor. granulocitare (G-CSF) .celulelor precursoare ale macrofagelor şi granulocitelor.celulelor precursoare ale macrofagelor şi Factori de stimulare a coloniilor granulocitelor.fibroblaştilor. Celulele transformate se comportă ca şi cum complexul receptor-factor de creştere ar avea un caracter permanent. 106 . Fig. Stimulează proliferarea adipocitelor si a celulelor di tesutul conjunctiv. ramânând întro continuă stare proliferativă.celulelor endoteliale. 7. Activitatea proto-oncogenelor în oncogene şi implicit codificarea unor proteine ce prezintă modificări calitative sau/şi cantitative conduce la pierderea capacităţii celulei de a răspumde corect faţă de factorii de creştere.8.1. .Principalele proteine codificate de protooncogene ce intervin în transmiterea semnalului de proliferare celulară de la factorul de creştere la ADN. În organismele pluricelulare. IGF-II) Acţiunea asupra celulelor ţinta Stimulează proliferarea mai multor tipuri celulare. proliferarea este dependentă de coexistenţa mai multor factori de creştere.Tabelul 3.1.mioblaştilor. (FGF) .

prin intermediul contactelor focale ce reprezintă locuri de ancorare în matricea extracelulară a filamentelor de actină ce alcătuiesc citoscheletul. Ataşarea impune celulei adoptarea unei forme aplatizate şi favorizează proliferarea acesteia.1. SRC. celulele se ataşează de suportul solid. Proteina cu activitate tirozin-kinazica. Densitatea populaţiei celulare în monostrat. În culturile statice.Celulele ce se găsesc în mitoză pierd legăturile ce le stabilizează în ţesut prin dezorganizarea contactelor focale Mecanismul ce stă la baza pierderii de către celule a adeziunii la substrat (in vitro) sau la matricea extracelulară (in vivo) este încă insuficient cunoscut. cooperarea intercelulară permite menţinerea unei anumite densitatea a populaţiei celulare. fenomen numit dependenţa de ancorare a diviziunii celulare. 173 . În momentul în care densitatea populaţiei celulare depaşeşte o valoare prag. fenomen cunoscut sub numele de inhibiţie de contact sau inhibarea diviziunii celulare dependenta de densitate. care. pare a fi concentrate la nivelul contactelor focale. Fig. formarea adeziunilor intercelulare şi celula-matrice este o condiţie importantă în depăşirea punctului de restricţie . Deoarece factorii de creştere sunt prezenţi în mediu în concentraţii foarte mici (PDGF=10-10 M). După intrarea în perioada sintetică. supuse unei permanente agitari. la care proliferarea este inhibata. concentraţia factorilor de creştere scade şi în consecinţa diviziunea celulara este oprită.În acest ultim caz. Influenţa adeziunii celulare asupra proliferării S-a constatat ca celulele cultivate în suspensie. depinde de concentraţia factorilor de creştere din mediu. poate determina dezorganizarea contactelor focale pe doua căi. S-a observat că într-o cultură de fibroblaşti formarea monostratului induce inhibarea proliferării celulare. fapt ce sugerează existenta unui mecanism ce cuplează diviziunea celulara cu organizarea citoscheletului. până la încheierea mitozei.9. iar celulele ţintă conţin numeroşi receptori specifici (105 receptori pentru PDGF/ fibroblast). devin sferice şi îşi pierd capacitatea proliferativă. La majoritatea celulelor organismelor vertebrate. conform experimentelor cu anticorpi monoclinali. celulele ce alcătuiesc populaţia se găsesc într-o permanentă competiţie pentru factorii de creştere. celulele pierd parţial legăturile ce le stabilizează în ţesut şi se rotunjesc (fig. Un rol important în acest mecanism îl joacă proteina SRC. 107 .107). Afirmaţia se bazează pe rezultatele studiilor interprinse pe culturi celulare. 7.

Printre proteinele degradate de plasmină se numără şi proteinele matricei extracelulare. Activarea SRC în celulele normale are loc în urma legării unui factor de creştere la receptorul specific (fig. inclusiv fibronectina. plasmina. Fig. ca rezultat al eliberării semnalului. numită activator de plasminogen. Până în prezent. dezorganizarea structurii complexe de la nivelul contactelor focale nu este suficientă pentru inducerea replicării ea necesită şi prezenţa factorilor de creştere. A doua cale constă în secreţia masivă a unei enzime proteolitice. ƒ într-o primă etapă. Ea este capabilă să activeze prin clivarea plasminogenului. stimularea unei celule prin factori de creştere determină pierderea de către celula a adeziunii la substrat. ƒ activitatea acestei structuri prin factori de creştere şi eliberarea unui semnal ce dictează depăşirea punctului de restricţie. Găsirea unui răspuns cu privire la modul prin care adeziunea celulară declanşează replicarea AND şi depăşirea punctului de restricţie se dovedeşte a fi foarte dificilă. În urma fosforilării scade afinitatea receptorului pentru fibronectină (element al matricei extracelulare). căt şi pentru talină (proteină de adeziune intacelulară). 108 . o alta enzima proteolitică. se consideră că pentru inducerea sintezei ADN.Prima cale implică fosforilarea receptorului pentru fibronectină. sunt necesare trei evenimente: ƒ ancorarea celulei la matricea extracelulară prin asamblarea într-o structură complexă a proteinelor intercelulare specializate şi a elementelor de citoschelet. într-o celulă normală. 174 . Acest fapt conduce la instabilizarea legăturilor dintre componentele contactului focal şi la eliberarea mănunchiurilor de filamente de actină.Schema modificărilor ce apar la nivelul contactelor focale ca urmare a recunoaşterii şi legării factorilor de creştere de către receptori specifici Există cel puţin patru argumente ce stau la baza acestei afirmaţii: ƒ acţiunea SRC are caracter tranzitoriu. ƒ SRC este implicată în stimularea proliferării celulare prin factori de creştere.108). ƒ in vivo. ƒ dezasamblarea structurilor ce asigura adeziunile celulă-celulă şi celulă-matrice.

deoarece întâi are loc cariokineza. În funcţie de modul de desfăşurare. proces reglat direct de MPF. Acesta este alcătuit din două componente: aparatul cromatic (cromozomii) şi aparatul acromatic (fusul de diviziune şi centrii celulari). au loc procese distributive. pentru generarea semnalului de proliferare. 7.1. Activarea protein kinazei H1 de către MPF face posibilă fosforilarea histonei H1 şi. Se apreciază că MPF nu reglează doar procesul distributiv al materialuilui genetic. În celulele maligne dezorganizarea structurilor implicate în adeziunea celulară este suficientă. Desfasurarea diviziunii celulare indirecte necesită diferenţierea în spaţiul intracelular a aparatului mitotic. Totalitatea acestor procese poarta numele de diviziune celulară indirectă. pentru aceasta problemă. de repartizare în celulele fiice ale constituenţilor celulari implicaţi în interfază. care se comportă ca elemente pasive în procesul de segregare. La celulelor. Aceasta face posibilă ordonarea şi ulterior legarea în ţesut a celulelor rezultate în urma diviziunii celulare. Acest eveniment fascinant al diviziunii mitotice constituie pentru celulă un mecanism eficient ce garantează repartizarea egală a materialului genetic în celulele fiice. Ea este denumită şi diviziune ecvaţională. deoarece în cadrul ei celula îşi conservă garnitura cromozomilală initială.Ciclurile de ataşare şi detaşare celulară permit probabil rearanjarea punctelor de contact. Soluţia pe care celula a găsit-o. 7. Apariţia celui de al doilea centru celular conferă celulei un caracter bipolar. 2. se deosebesc două tipuri de diviziune celulară indirectă : Mitoza şi Meioza. 175 . implicate în adeziunea celulă-celulă şi celulă-matrice.2. constă în dezorganizarea şi reorganizarea membranei nucleare. fir) constituie tipul de diviziune caracteristic celulelor somatice ale tuturor organismelor eucariote. Diviziunea celulară În cea de-a patra perioada a ciclului celular. s-a impus rezolvarea problemei uşurării accesului fibrelor fusului de diviziune la cromozomi. Este posibil ca acest mecanism de reglare să se realizeze prin fosforilarea proteinelor asociate filamentelor de actină şi miozină ce intră în structura inelului contractil. Formarea aparatului mitotic este iniţiată de proteine activate prin fosforilare directă sau indirecta de catre MPF. ci şi scindarea celulei parentale în celulele fiice (citokineza). respectiv separarea maselor de citoplasmă (diviziunea citoplasmei). Segregarea cromozomilor ar fi însa imposibilă în absenţa aparatului acromatic a cărui organizare implică fosforilarea indirectă a proteinelor asociate cu microtubulii de către MPF. Modificările la nivelul membranei nucleare se datorează fosforilării şi defosforilării laminelor. în consecinţă. denumirea fiind sugerată de schimbările majore ce au la nivelul nucleului celular şi apoi citokineza. cu un numar mare de cromozomi. perioada mitotică. condensarea cromatinei şi apariţia cromozomilor. Între cei doi poli ai celulei se formeaza fusul de diviziune ce are rolul de a ancora şi separa cromatidele surori ale cromozomului mitotic. Mitoza (diviziunea mitotică) Mitoza (greaca: mithos=aţă. celulele fiice prezentand acelaşi număr de cromozomi ca şi celula parentală.

110). 109 . duble şi ataşate pe faţa exoplasmatică a membranei interne nucleare. subţiri.Schema generală a mitozei. Mitoza poate fi impărţită în cinci etape caracterizate prin modificări morfologice specifice : profaza. Cea de-a şasea etapă a diviziunii mitotice. Filamentele sunt intim asociate formând un spirem (ghem). metafaza. La începutul profazei centrul celular se divide generând doi centri celulari. diferenţierea fusului de diviziune şi dezorganizarea nucleolului (fig. Fiecare conţine câte o pereche de centrioli din care unul matur şi altul în crestere. debutează în anafază şi se încheie la sfârşitul ciclului celular (fig. Profaza Profaza se caracterizeaza prin condensarea cromatinei şi individualizarea cromozomilor sub forma unor filamente. Cele doua cromatide ce alcatuiesc cromozomul sunt unite la nivelul centromerului şi sunt strâns răsucite una în jurul celeilalte (spiralizarea plactonemică).Fig. citokineza. Fusul de diviziune se asamblează iniţial în afara nucleului.109). anafaza şi telofaza. Profaza se caracterizeză prin condensarea cromatinei cu individualizarea cromozomilor bicromatidici. Fig. 110 . dispusă între cei doi centrii celulari.Profaza 176 . prometafaza. A. structura bipolară alcatuită din microtubuli şi proteine asociate. Concomitent se înregistrează dezorganizarea microtubulilor citoplasmatici. Condensrea cromatinei continuă pe intreaga durată a profazei conducând la scurtarea şi ingrosarea progresivă a filamentelor cromatidice. Centrii celulari rezultati se deplaseaza spre polii opuşi ai celulei. parte componentă a citoscheletului interfazic şi apariţia fusului de diviziune.

de oscilare între cei doi poli celulari. Acestea au fost numite fibre kinetocorice. 177 .Creşterea gradului de condensare a cromatinei este însoţită de o încetinire a proceselor de transcripţie şi sinteză proteică. C. Tensiunea exercitată de fibrele kinetocorice asupra cromozomilor imprimă acestora o mişcare agitată. B. Fibrele kinetocorice aliniază cromozomii într-un singur plan perpendicular pe axa fusului de diviziune. Metafaza Metafaza este inertă din punct de vedere sintetic. poartă numele de fibre polare. fragmentarea şi completa sa dezorganizare ca rezultat al blocării sintezei ARN. Cei doi kinetocori ai unui cromozom sunt capturaţi de fibre ale fusului de diviziune ce pleacă din centrii celulari opuşi. formand placa ecuatorială sau metafazică (fig. la sfârşitul profazei. În urma acestui eveniment. 111. numite kinetocori. localizat la jumatatea distanţei ce separă polii celulari. Fig. Cromatidele surori ale cromozomului metafazic sunt situate una alături de cealaltă. Prometafază În prometafaza pe cele doua feţe opuse ale centromerului se maturează complexe proteice specilizate în ancorarea cromozomilor de către fibrele fusoriale. 112). cromatina atingând condensarea maximă. Fibrele fusoriale libere. Dezasamblarea membranei nucleare permite accesul fibrelor fusului de diviziune în regiunea nucleară (fig. Scăderea gradată a procesului transcriptional determină iniţial micşorarea volumului nucleolar şi ulterior. Prometafaza Prometafaza debutează prin fragmentarea învelişului nuclear în vezicule delimitate de membrană ce staţionează pe întreaga duratî a mitozei în jurul fusului de diviziune. carioplasma fuzionează cu hialoplasma formând mixoplasma. Alinierea cromozomilor în planul ecuatorial al fusului de diviziune constituie principalul eveniment al metafazei. orientate spre planul ecuatorial al celulei. Principalele proteine sintetizate în profaza timpurie şi mijlocie sunt cele implicate în condensarea cromatinei şi edificarea aparatului acromatic. 111).

inclusiv a celui detaşat se desfăşoară simultan. Anafaza Primul eveniment ce marchează începutul anafazei constă în segregarea kinetocorilor pereche din fiecare cromozom. Concomitent are loc îndepărtarea polilor celulari prin alungirea fibrelor polare. În anafaza. S-a constatat că detaşarea. cromozomii se afla grupaţi la cei doi poli ai celulei şi fibrele kinetocorice dispar (fig. determina eliberarea Ca2+ din veziculele delimitate de membrane ce înconjoară fusul de diviziune şi prin aceasta. Identificarea proteinelor antrenate în aceasta reacţie ar putea reprezenta o cale spre descoperirea semnalului ce iniţiază anafaza. La sfârşitul anafazei. ci de un semnal specific. monocromatici suferă de regulă un proces de decondesare. D. intrarea celulei în anafază. prin micromanipulare.Metafaza: alinierea cromozomilor în planul ecuatorial al fusului de diviziune.Fig. Cromozomii anafazici. Segregarea cromatidelor tuturor cromozomilor. 178 . a fibrelor kinetocorice ce ancorează unul din cromozomii metafazici nu interferă cu separarea cromatidelor surori. însoţit de creşterea lor în lungime. inclusiv histonele H1 şi laminele. La sfârşitul metafazei are loc desăvarşirea replicării centromerilor. au demonstrate ca declanşarea anafazei este însoţită de creşterea concentraţiei intercelulare a ionilor de calciu. formând placa ecuatorială sau metafazică Mecanismul deplasării cromozomilor spre regiunea ecuatorială a celulei şi a alinierii lor în placa metafazică este prezentat pe larg în capitolul 4. pe cultura de celule. La trecerea celulei din metafază la anafază are loc defosforilarea unui număr mare de proteine. 112 . Observaţia sugerează ca iniţierea anafazei nu este dictate de aparatul acromatic. Studiile întreprinse . Acest eveniment ce constituie anafaza A este rezultatul depolimerizării fibrelor kinetocorice. încă necunoscut. cromatidele surori ale cromozomilor sunt deplasate spre poli opuşi ai celulei cu viteza de aproximativ 1mm/min. eveniment ce marchează anafaza B. 113). Mai mult. ceea ce are drept consecinţă separarea cromatidelor surori ale cromozomilor în anafază. creşterea experimentală a concentraţiei de Ca2+ în spaţiul intracelular conduce la iniţierea prematură a anafazei. Se consideră că un semnal. Mecanismele prin care se realizează translocarea cromozomilor anafazici şi îndepărtarea polilor celulari sunt prezentate în capitolul ce prezintă elementele componente al citoscheletului (capitolul 4). ca rezultat a replicării centromerilor şi separarea ulterioara a cromatidelor surori.

Telofaza În telofază se desfăşoară procese inverse celor ce au loc în profaza.Fig. la fiecare pol celular.Telofaza Veziculele delimitate de membrană. fuzionează delimitând doua spaţii nucleare situate la polii celulari opuşi. La nivel nuclear. 114). reîncepe sinteza ARN. iar în citoplasmă procesul de proteosinteză se intensifică. iar laminele defosforilate se reasociază formând lamina nucleară. spre sfârşitul ei. conduc la reapariţia nucleolului. Porii nucleari se reasamblează. Transcripţia genelor ARNr. alungite şi încolăcite unele în jurul altora formând câte un spirem. cromatina îşi recapătă aspectul caracteristic interfazei (fig. din organizatorii nucleolari şi formarea subunităţilor ribonucleoproteice (RNP) prin asocierea ARNr cu proteinele specifice importate în nucleul din citoplasma. Dacă la începutul telofazei ei au aspectul unor fibre fine. Decondensarea cromozomilor continuă. La om. De regula aceştia fuzionează astfel încât în majoritatea celulelor interfazice nucleul celular prezintă un singur nucleol. 114 . cele cinci perechi de organizatori nucleolari controlează formarea în telofază a cinci nucleoli. Un rol important în reorganizarea membranei nucleare îl are lamina B ce rămâne permanent ataşata de membranele veziculelor rezultate prin fragmentarea învelişului nuclear în prometafază. 179 . E. 113 .Anafaza. b) polimerizarea fibrelor polare. a) depolimerizarea fibrelor kinetocorice. Pe întreaga durata a telofazei are loc dezorganizarea aparatului acromatic. ce înconjoară fusul de diviziune. Fig.

Citokineza Citokineza defineşte fenomenul de diviziune a citoplasmei.În cazul celulelor animale citokineza se realizează prin clivare. Aceasta demonstrează ca planul de scindare al citoplasmei este determinat spaţial de poziţia fusului de diviziune. Separarea completa a celulelor fiice. pe suprafaţa membranei plasmatice. aparatul Golgi şi reticulul endoplasmatic se fragmentează în vezicule din care se vor fi construite noile organite celulare. Contracţia inelului prin mecanismul actină . a fusului mitotic la începutul anafazei. ce conţine fibre polare ale fusului de diviziune parţial dezorganizate înconjurate de hialoplasma (fig. 115 .miozină concomitent cu depolimerizarea filamentelor de actină ce-l alcătuiesc. Fiecare celulă fiică moşteneşte în urma citokinezei un set de componente celulare. Oul fecundat al Drosophilei melanogaster parcurge 13 cicluri de diviziuni nucleare. Duplicarea organitelor celulare se realizează prin mecanisme diferite. în celula parentală are loc duplicarea constituenţilor celulari înaintea declanşării citokinezei. Rolul principal revine acum inelului contractil. El este situate in planul plăcii ecuatoriale. Experimentele efectuate. Locul de clivare devine vizibil încă din anafaza. moment ce marchează desavarşirea citokinezei. sub forma unei adâncituri (sunt). transformându-se intr-o celula multinucleară. 115). ataşate de fosa citoplasmatică a plasmalemei prin proteine încă necaracterizate. după momentul iniţierii clivării. Studiul primei etape a dezvoltării embrionale la Drosophila melanogaster ne oferă un exemplu concret. prin tratare cu colchicina. s-a constatat ca distrugerea fusului mitotic. Mitocondriile cresc şi se divid prin fisiune. Deci. mecanismul citokinezei devine independent de structurile microtubulare. Prima diviziune citoplasmatica are loc după cel de-al 13-lea ciclu mitotic si conduce la formarea aproximativ a 600 de celule uninucleate. Deşi s-a constatat ca citokineza nu are loc niciodată înaintea diviziunii nucleare. 180 . are loc la începutul următoarei interfaze. cu excepţia nucleului. La celulele animale diviziunea citoplasmatica se realizează prin clivarea. totuşi procesul mitotic nu condiţionează strict declanşarea diviziunii citoplasmatice.F. Deci. în timp ce ribozomii se multiplică prin asamblarea elementelor constituente (ARNr şi proteine ribozomale). după apariţia şanţului de clivare nu duce la blocarea diviziunii citoplasmice. se asamblează la începutul anafazei. perpendicular pe fusul de diviziune. Fig. deoarece. La sfârşitul perioadei mitotice cele doua celule fiice sunt încă unite printr-o regiune centrală (“midbody”). organitele celulare nu se pot duplica în absenţa unei copii preexistente. Recent. Această structura alcătuită din filamente de actină şi miozină. in vitro. este posibil ca o anume orientare a fusului de diviziune să dicteze caracterul simetric sau asimetric al diviziuni celulare. au avut drept rezultat invariabil schimbarea situsului de clivare. în care s-a realizat deplasarea prin micromanipulare. conduc la continua micşorare a diametrului sau/şi implicit la adâncirea şanţului de clivare.

numită cromozom bivalent sau tetradă. În nucleul lor se găsesc câte un cromozom din fiecare pereche de omologi (autozomii) şi un singur cromozom ce determină sexul (heterozomii. Gameţii ( spermatozoidul şi ovulul) rezultaţi prin diviziunea celulelor germinale sunt celule haploide (n). fiecare cromozom fiind alcătuit din doua cromatide surori. Deci. inclusiv cele germinale. Meioza reprezintă un mecanism complex ce implică desfăşurarea succesivă a două diviziuni indirecte – meioza I şi meioza II (fig. Meioza I are loc imediat după încheierea interfazei premeiotice. În celulele diploide (2n). fiecare pereche fiind alcătuită dintr-un cromozom matern şi altul patern. A.116). se apreciază că celula nu dispune de un mecanism specializat de distribuire a organitelor celulare. Meioza (diviziunea meiotică) Meioza (geacă ”meiosis = micşorare”) este întâlnită în procesul de gametogeneză (formarea gameţilor) şi reprezintă un tip de diviziune nucleară caracteristic celulelor germinale. perechi de cromozomi omologi. S-a constatat că suprafaţa totală a celulelor fiice este mai mare decât cea a celulei parentale. membrana plamatică a celulei ce se divide este insuficientă pentru celulele rezultate în urma citokinezei. 181 . Meioza se caracterizează prin înjumătăţirea numărului de cromozomi în celulele progene. Prima diviziune a meiozei (meioza I) Meioza este o diviziune reducţională complet diferită de mitoza somatică. Fig. astfel încât la începutul acestei diviziuni AND este complet replicat (celulele sunt tetraploide). Cromozomii bicromatidici omologi (matern şi patern) se grupează în perechi formând o structura tetracromatidică.2. nucleul conţine cu excepţia cromozomilor de sex (X şi Y). 7. din care lipseşte perioada sintetica (replicarea AND).Schema generală a meiozei Cele doua diviziuni ce au loc în cadrul meiozei sunt precedate de o interfaza premeitica (identică cu interfaza mitotică) şi separate de o interfază scurtă. Aceasta impune intensificarea biosintezei membranei plasmatice în celula parentalăp .2. anterior declanşării diviziunii celulare. X şi Y). 116 .Ţinând cont de numărul de copii ale organitelor celulare dintr-o celulă eucariotă şi de duplicarea lor înaintea diviziunii. Ea asigură înjumătăţirea numărului de cromozomi în celulele progene. numită Interfaza meiotică.

Copiile sunt asociate formând un cromozom bicromatidic . cuprinzând integral cromozomii prealiniaţi într-o manieră zipper like (zipper = fermoar). translocarea acestora spre polii celulari opuşi şi citokineza conduc la formarea a două celule progene. Iniţierea conjugării implică interacţii între perechile de baze complementare ale ADN din regiuni cromozomiale specifice numite zigomere sau sinapsomere. Deoarece in perioada S a interfazei. 182 . diploten şi diachineza. în lungul fiecărui cromozom se diferenţiază o lama proteică (400-700 A grosime). La sfârşitul leptotenului.117). Un rol în aceste evenimente il joaca şi învelişul nuclear de vreme ce. Conjugarea este anticipată de apropierea omologilor. Cromatina ce formează cromatidele surori proeminează sub forma unor bucle. Meioza I se încheie cu procesul de citokineză. Separarea ulterioară a cromozomilor omologi . materialul genetic al celulei parentale (2N) a fost replicat. Conjugarea cromozomilor omologi poate fi iniţiată de la o extremitate a acestora (proterminală) ori din una sau mai multe regiuni centrale (procentrică). anafaza şi telofaza. pe faţa opusă axei (fig. pachiten. Fig. zigoten. Înţelegerea proceselor ce se desfăşoară pe parcursul meiozei. astfel încat fiecare genă dintr-un cromozom este juxtapusă genei omologe din cromozomul pereche. a) Profaza meiozei (profaza I) Profaza I se deosebeşte de profaza mitotică atât sub aspectul duratei (90-95% din desfăşurarea meiozei I). denumire sugerată de numărul cromatidelor ce-i alcătuiesc. Prin stabilirea interacţiilor se realizează alinierea cromozomilor. numiţi şi tetrade. Laptotenul se caracterizează prin condensarea cromatinei şi individualizarea cromozomilor sub forma unor filamente lungi şi subţiri. metafaza. celula în leptoten este tetraploidă (4N). în cadrul meiozei I. Profaza I este împărţită în cinci stadii succesive: leptoten. cromozomi continuă să fie ataşaţi de membrana nucleară. Rezultatul desăvârşirii conjugării îl constituie formarea bivalenţilor. face necesară prezentarea etapizată a acestui tip de diviziune Similar mitozei somatice. Fiecare cromozom este alcătuit din două cromatide surori unite la nivelul centromerului şi intim asociate. cât şi sub cel al evenimentelor ce au loc în această etapă.Cromatidele nesurori ale bivalentului sunt antrenate în procese de remaniere cromozomială. în zigoten. numit sinapsis (sinapsarea sau formarea sinapsei). ceea ce oferă cromozomului un aspect monocromatidic Cromozomi sunt ataşaţi cu ambele capete de învelişul nuclear prin intermediul unor structuri specializate numite placi de ataşare. se disting cinci etape: profaza.Stadiul de leptoten Zigotenul reprezintă stadiul în care are loc conjugarea cromozomilor omologi. pe o singura parte. numita axă. prometafaza. Recunoaşterea şi gruparea cromozomilor omologi în pereche se realizează prin intermediul proteinelor ce intră în alcătuirea axelor. Fiecare progen conţine câte două copii ale unui singur cromozom din fiecare pereche de omologi ai celulei parentale (jumătate din numărul cromozomilor celulei mamă). Din punctele de iniţiere conjugarea se extinde progresiv. 117 .

Procesul de recombinare este catalizat de către complexe multiproteice a căror diametru este de 90 nm. 118. noua combinaţie de gene creată transmiţându-se generaţiilor următoare. Aceştia se formează în interiorul complexului sinaptonemal ocupând aproape integral spaţiul ce separa cele două axe ale cromozomilor omologi (fig. complexul sinaptonemal joacă un rol important în stabilizarea cromozomilor omologi în tetradă. 118). reunirii încrucişate a fragmentelor cromatidice. numită complex sinaptinemal. O lama proteică (200 Å grosime) este interpusă între cele doua axe. constituind elementele laterale ale unei structuri trilamelare. Fiecare cromozom va conţine gene aparţinând ambilor genitori. Stadiul de pachiten Deşi implicarea complexelor multiproteice în recombinarea genetică nu a fost demonstrată experimental. Fig. Prin schimbul reciproc de fragmente între cromatidele surori se realizează recombinarea genetică. Conjugarea cromozomilor X si Y.În momentul conjugării. pe parcursul meiozei I a celulelor germinale din indivizii masculi. Elementele laterale sunt conectate la elementul central prin intermediul unor benzi protice transversale dispuse în mod similar treptelor unei scări (fig. Ea reprezintă cea de-a treia componentă a complexului sinaptonemal şi poarta numele de element central. Fig. în pachiten cromozomii sunt mai groşi şi mai scurţi. Pachitenul începe în momentul desăvârşirii conjugării cromozomilor. 119. 183 . Principalul eveniment ce caracterizează pachitenul este crossing-over-ul. la o distanta de 100 nm. se consideră că nodulii de recombinare conţin întregul echipament enzimatic necesar clivării cromatidelor surori. fenomenul ce implica ruperea în aceiaşi poziţie a extremităţii unei cromatide materne şi a alteia paterne şi reunirea încrucişată a fragmentelor. este posibilă datorită existenţei la cei doi cromozomi de sex a unei regiuni terminale omologe. Ca rezultat al condensării progresive a cromatinei pe parcursul primelor doua stadii ale profazei I . Structura ce oferă premisele desfaşurării crossing-over-ului este reprezentată de complexul sinaptonemal. cele doua axe ale cromozomilor omologi sunt dispuse faţă în faţă. Stadiul de zigoten. numite noduli de recombinare.119). În meioza I.

c. În acest caz.121). Diachineza debutează cu condensarea cromatinei şi blocarea transcripţiei.Stadiul de diploten Deşi teoretic. Fig. În fiecare bivalent cromozomii omologi sunt uniţi la nivelul chiasmelor iar cromatidele surorii ale fiecărui cromozom din pereche sunt legate prin intermediul centromerului (fig. În meioza I. distribuţia spaţială similară a nodulilor de recombinare şi a evenimentelor de crossingover de-a lungul complexului sinaptonemal. doua din cele patru cromatide ale bivalentului se intersectează în spaţial delimitat de cromatidele omologe (fig. Deşi încep să se formeze în pachiten. Aceste observaţii atestă rolul important pe care nodulii îl joacă în procesul de recombinare. Aceste puncte de ataşare poartă numele de chiasme. Ambele evenimente sunt caracteristice stadiului diploten . Cromozomi omologi rămân ataşaţi la nivelul situsurilor la care are loc crossing-over-ului. Diplotenul reprezintă stadiul profazei I în care are loc separarea parţială a omologilor prin dezorganizarea complexului sinaptonemal.Participarea acestor noduli în desfăşurarea crossing-over-ului a fost sugerată de următoarele constatări: a. în timp ce alţii vor conţine o copie cromozomială în plus. chiasma joacă un rol similar celui pe care îl are centromerul în mitoză. diplotenul poate dura luni sau ani. Absenţa chiasmei într-un bivalent face imposibilă segregarea cromozomilor omologi în următoarele etape ale meiozei. Ea a fost denumită distanţă de interferenţă . chiasmele devin vizibile numai după desinapsarea cromozomilor ce alcătuiesc bivalentul. Bivalenţii pot prezenta una sau mai multe chiasme. în acest stadiu cromatina suferă un proces de uşoară decondensare ceea ce face ca sinteza ARN să fie reiniţiată. La nivelul fiecărei chiasme. o parte din gameţii rezultaţi vor avea un cromozom în minus. 120). Deci. 120 . 184 . numărul lor ilustrând frecventa crossing-over-ului. ceea ce impune o anumită distanţă între chiasmele situate pe acelaşi braţ cromozomial . iar localizarea lor diferă de cea întâlnită la indivizii normali. numărul şi localizarea acestora în complexul sinaptonemal determinând frecvenţa şi situsul crossing-over-ului. Concomitent cu desinapsarea omologilor are loc separarea cromatidelor surori ce rămân unite prin centromer. aceste regiuni nu sunt antrenate în evenimente de crossing-over împiedică desfăşurarea unui eveniment similar în zonele imediat învecinate. corelarea existentă între numărul nodulilor şi cel al chiasmelor evidenţiate în stadiul următor al profazei I. Deoarece în ocite. b. Cromozomii se detaşează de membrana nucleară. chiasmele se pot forma în orice zonă cromozomială s-a constatat absenţă lor în regiunile heterocromatidice. numărul nodulilor de recombinare este mai mic. fenomen cunoscut sub numele nondisjunctie. asigurând segregarea corectă a materialului genetic. la mutanţi de Drosophila melanogaster ce prezintă o diminuare şi o distribuţie anormală a crossing-over-ului.

Cei doi kinetocori ce se dezvoltă pe centromerul unui cromozom bivalent sunt ancoraţi de fibre kinetocorice ce pornesc de la acelaşi pol al fusului de diviziune.cromozomii omologi sunt translocaţi spre polii celulari opuşi printr-un mecanism similar celui întâlnit în mitoză (depolimerizarea fibrelor kinetocorice şi alungirea fibrelor polare). Cromozomii omologi sunt completseparaţi şi migrează spre polii opuşi ai celulei e) Telofaza meiozei I (telofaza I) În telofaza I. Relaxarea cromatinei face posibilă reînceperea sintezei ARN. cromozomii din anafaza mitozei I sunt bicromatidici (fig. 122). Fig. Decondensarea cromozomilor continua fără ca aceştia să-şi piardă individualitatea. 123 . Spre deosebire de cromozomii monocromatidici din anafază mitotica. Bivalenţii sunt aliniaţi în placa ecuatorială. fenomen numit terminalizare.Anafaza meiozei I. Concomitent începe procesul de decondensare a cromozomilor. 185 . Kinetocorii de pe centromerul cromozomului omolog sunt legaţi prin fibre kinetocorice de polul opus. Kinetocorii de pe cromatidele surori sunt orientaţi spre acelaşi pol al fusului de diviziune.Metafaza meiozei I. La nivelul centromerelor se diferenţiază kinetocorii. 123). se dezorganizează învelişul nuclear şi se formează aparatul acromatic. Cei doi centromeri ai bivalentului sunt orientaţi spre polii celulari opuşi (fig. Migrarea la polii celulari ai cromozomilor bicromatidici conduce la reducerea la jumătate a numărului de cromozomi prezenţi iniţial în celuia parentală. constituie evenimentele caracteristice metafazei I. d) Anafaza meiozei I (anafaza I) Odată eliberaţi din tetrada. c) Metafaza meiozei I (metafaza I) Mobilizarea bivalenţilor spre regiunea ecuatorială a celulei şi alinierea lor în placa metafazică. În prometafaza l. Sfârşitul acestei etape este marcat de dispariţia chiasmelor şi eliberarea cromozomilor din bivalent. 121 . cromozomii se găsesc la polii fusului de diviziune.Fig. Fig. Chiasmele localizate terminal menţin cromozomii omologi uniţi pe toată durata metafazei I. b) Prometafaza meioze I (prometafaza I).Diachineza În timpul diachinezei chiasmele încep să se deplaseze spre extremităţile cromozomilor. 122 .

Sfârşitul acestei etape este marcat de replicarea centromerului şi separarea celor două cromatide. Datorită recombinării genetice ce are loc în profaza I. Fibrele kinetocorice ce radiază din polii opuşi ai fusului de diviziune ancorează kinetocorii de pe cele două cromatide ce alcătuiesc fiecare cromozom. La polii opuşi ai celulelor se reorganizează învelişul nuclear. iniţierea celei de-a doua diviziuni meiotice. B. care se poziţionează pe feţele opuse ale centromerului fiecărui cromozom bicromatidic. copiile nu sunt perfect identice (fig. de fapt. Etapele şi evenimentele celulare caractzeristice acestora sunt similare celor întâlnite în cadrul diviziunii mitotice. Separarea celor patru celule haploide (gameţii) este consecinţa directă a procesului de diviziune citoplasmatică. 186 . cromatidele surori sunt deplasate şi aliniate în planul ecuatorial al celulei formând în metafaza II placa metafazică.Celulele fiice rezultate în urma primei diviziuni meiotice Interfaza meiotică Mai scurtă decât interfaza mitotică. Fiecare progen conţine o jumătate din garnitură cromozomială a celulei parentale. Meioza II debutează cu profaza II. În anafaza II cromatidele surori sunt translocate spre polii opuşi ai celulei. în care are loc formarea unui nou aparat acromatic şi dezorganizarea înveluşului nuclear. are loc simultan. În telofaza II decondensarea cromozomilor continuă astfel încât la sfârşitul meiozei II cromatina îşi recapătă aspectul caracteristic interfazei. Pe parcursul interfazei meiotice se desfăşoară procese transcripţionale şi de proteosinteză ce pregătesc intrarea celulei în meioza II. deşi cantitatea de ADN corespunde unei celule diploide. Aceasta se explică prin existenţa în fiecare celulă a două copii ale aceluiaşi cromozom. Fig. interfaza meiotică. Meioza II reprezintă. Se apreciază că acum are loc reorganizarea kinetocorilor. ce asigură repartizarea egală a copiilor cromozomiale din cele două celule fiice şi în consecinţă formarea gameţilor. Reorientarea face posibilă segregarea materialului genetic pe parcursul celei de-a doua diviziuni meiotice. Meioza I se încheie cu procesul de citokineza prin care sunt separate celulele progene.Unite prin intermediul centromerului. 124). A doua diviziune a meiozei (meioza II) În celulele progene. rezultate în urma meiozei I. fiind posibilă derularea succesivă a celor două diviziuni. Interfaza meiotică nu este întâlnită la toate celulele eucariote. etapă mult mai scurtă decât profaza mitotică. o diviziune mitotică. ecvaţională.Cromozomii monocromatidici anafazici se alungesc ca rezultat al relaxării cromatinei. 124 .Membrana nucleară se reorganizează delimitând cei doi nuclei rezultaţi în urma diviziunii. ce separă cele două diviziuni meiotice se caracterizează prin absenţa perioadei S.

Drept sinonime pentru apoptoza celulară se mai folosesc denumirile: moarte celulară normală sau moarte celulară fiziologică. Deoarece aceşti corpusculi sunt rapid generaţi de celulele vecine şi fagocite. care. urmată de zbârcirea suprafeţei celulare. rezultând fragmentarea AND-ului celular. Descreşterea anormală a apoptozei poate avea rol în declanşarea bolilor autoimune şi a evenimentelor legate de senescenţă (tumorigeneză). pot deveni responsabile de dezvoltare de autoanticorpi (în lupusul eritematos sintetic). - - 187 .Capitolul 8 APOPTOZA Apoptoza reprezintă procesul fiziologic de moarte celulara programată (PCD = Programmed Cellular Death). prin acest mecanism. enclavate în ţesutul normal. atât în viaţa embrionară cât şi în cea adultă. Arhitectura tisulară şi celulară adiacentă este păstrată intactă şi ea umple spaţiile lăsate goale de celula apoptotică. celulele individuale. membrana celulară se zbârceşte. Astăzi se cunoaşte că procesul de apoptoză are rol în medierea proceselor de dezvoltare şi a efectelor nutriţionale care prelungesc cursul vieţii. pierd legăturile cu celulele vecine. în faza finală. în condiţii anormale. în vreme ce procesul de moarte celulară a fost considerat doar un proces haotic. cromatina nucleară se condensează. Procesul de apoptoză se desfăşoară în trei timpi : în faza iniţială.1. se găureşte şi se fragmentează. iar celula apoptotică se rupe în corpusculi apoptotici. Mecanismele de producere a apoptozei În cursul procesului de apoptoză se elimină un număr mare de celule fără a se produce vreun proces inflamator. Procesul apoptotic are loc în toate organismele vii. formându-se corpi apoptotici care conţin resturi nucleare. acolo unde viteza apoptozei este foarte mare. nocive sau anormale din punct de vedere funcţional. Timp îndelungat au fost studiate doar mecanismele de proliferare şi diferenţiere celulară. cele mai multe organite citoplasmatice rămân însă intacte. Celulele apoptotice sunt caracterizate printr-un proces de adunare şi redistribuire a cromatinei sub forma unei mase compacte care rămâne pe membrana nucleară. celulele vecine şi macrofagele fagocitează aceste fragmente până la completa lor degradare (fig. în faza a doua. ei sunt observaţi foarte rar chiar şi în timus. 8. organismele eliminând celulele nedorite. nu este reversibilă şi nici nocivă pentru organism. Asemenea corpi apoptotici pot transporta antigene (incluzând fragmente de AND intacte). ci chiar necesară pentru menţinerea normalităţii. celulele se retractă din cauza pierderii de conţinut citoplasmic şi a condensării proteinei citoplasmatice.125). Organitele celulare şi in special mitocondriile sunt bine conservate. Apoptoza nu rezultă din leziune.

care induc un răspuns de tip inflamator. cât şi sinteză de ARN şi de proteine. un exemplu este cel al celulelor neuronale care se produc în exces în 188 . În cursul necrozei se produce dilatarea reticulului endoplasmatic. în cazul necrozei procesul apare simultan într-un grup de celule în care s-a produs în prealabil o leziune în arhitectura celulară. organitele şi nucleul se dezintegrează. având drept consecinţă leziuni grave.Fig. Apoptoza ca proces active necesită atât energie în formă de ATP. Formarea inozitolfosfaţilor care determină creşterea concentraţiei intracelulare de ioni Ca²+ este un eveniment precoce al apoptozei. implicat în fagocitoza celulelor apoptotice. deoarece poate semnifica un semnal de activare a fagocitării celulelor apoptotice. în final. flocularea cromatinei nucleare. 8. în care procesul se produce într-o celulă solitară. Frecvenţa procesului de apoptoză După cum s-a arătat mai sus. 125 . Necroza Spre deosebire de apoptoză (moarte celulară normală). aspect ce trebuie luat în considerare.) de pe celulele umflate.3. tromboplastina etc. este un proces pasiv care apare sub acţiunea unor noxe celulare. în mod normal. 8. În cursul apoptozei. necroza reprezintă o moarte celulară patologică. iar resturile sunt digerate de către fagocitele infiltrate. membrane plasmatică. Aceste aspecte se explică prin existenţa unui set diferit de semnale. În final. În contrast cu apoptoza. Cromatina devine tot mai compactă şi nu apare distribuită pe membrana nucleară. printr-un dezechilibru osmotic.Aspecte de apoptoză Procesul de apoptoză este foarte rapid şi durează în total câteva ore. în comparaţie cu setul de semnale implicat în fagocitarea celulelor necrotice sau a agenţilor infecţioşi. apoptoza este un mecanism eficient de eliminare atât a anumitor celule în cursul dezvoltării embrionare cât şi a celulelor adulte normale. ceea ce are drept consecinţă condensarea citoplasmei şi cromatinei şi formarea fragmentelor ADN. proteazele dependente de prezenţa ionilor Ca²+ pot participa la degradarea citoscheletului corpusculilor apoptotici. urmat de exportul rapid şi selective de ioni şi apă. umflarea celulelor urmată de ruperea. îşi are sediul pe partea internă a acesteia. pe partea extremă a membranei plasmatice apare fosfatidilserina. apar leziuni ultrastructurale ale organitelor celulare. creşterea volumului mitocondriilor. 2. Recunoaşterea celulelor apoptotice şi fagocitarea lor de către celulele fagocite par a fi mediate de către numeroşi receptori (vitronectina. Corpusculii apoptotici conţin un schelet de proteine crosslinkate (anvelope) rezistente la proteoliză. ingestia fagocitară de celule necrozate (în contrast cu cele apoptotice) este acompaniată de eliberarea de mediatori chimici ai inflamaţiei. Există de obicei un număr de celule normale care sunt depăşite la un moment dat dintr-o multitudine de cauze. a respectivelor celule. care.

Genele supravieţuirii (gene antiapoptotice) Genele supravieţuirii sunt acelea care. La organismul Caenorhabditis elegans. acţionează ca o frână asupra mecanismului de moarte celulară normală.gena Ced-9 s-a dovedit că acţionează drept antogonist al morţii apoptotice celulare. multe celule care ar trăi în mod normal mai departe sunt supuse. apoptoza rezultând în cazul supra expresiei genelor c-myc sau p53. în condiţii de supraexprimare.4. 189 . probabil printr-un program genetic îndreptat împotriva unei stări antiproliferative. dar au încetat la un moment dat să mai fie necesare (au atins momentul de regresie a metamorfozei lor). Aceste gene s-au dovedit esenţiale pentru moartea celulară apoptică. este implicate şi în inducerea apoptozei. În mod similar. Gene implicate în procesul apoptotic 8. care determină moartea precoce a respectivului organism. care în mod normal stimulează diviziunea celulară. În cazul contrar. sau prin coexpresia simultană a mai multor gene. astfel. 8. Aceste două gene acţionează autonom pentru a produce moartea celulară programată. Gene letale În prezent există evidenţa unei gene sau a unui set de gene care codifică proteine cu efect letal (de sinucidere) asupra celulei purtătoare. Astfel. Se pare că acest calciu citosolic ar declanşa şi evenimentele secundare legate de activarea transglutaminazelor. S-a demonstrat că multe gene letale sunt activate în cursul apoptozei. la organismul nevertebrat Caenorhabditis elegans (nematode) au fost descrise două asemenea gene: Ced 3 şi Ced 4 cu acţiune letală. în acest caz. După cum am arătat deja. în cazul în care una din aceste gene este inactiva prin mutaţie. sa arătat că gena protooncogenă c-myc.2. 8. determină inhibarea apoptozei. apoptozei. Astăzi se ştiu încă puţine lucruri despre căile acestei morţi celulare. un număr de gene letale au fost evidenţiate la mamifere. în acest caz. s-a descris o proteină din constituţia membranei interne a mitocondriilor bcl-2. În cazul genei supresoare de tumori p53. Aceste celule neuronale au avut probabil o funcţie în timpul evoluţiei şi dezvoltării.4. în mod normal. se pare că o creştere a concentraţiei ionilor de Ca2+ în citosul ar avea un rol important în funcţia de reglare a apoptozei.sistemul nervos al vertebratelor. Astăzi este demonstrat faptul că asemenea gene de supravieţuire există şi în celulele mamiferelor. când se inactivează gena Ced-9. Enzimele de membrană şi citosolice (în particular proteinaza C) implicate în fosforilarea proteinelor au rol central în transducerea semnalelor apoptotice. celula intră sub influenţa genelor Ced-3 şi Ced-4. Apoptoza trebuie privită ca un proces fiziologic normal faţă de influenţele mediului extern. Activarea anormală a acestei gene Ced-9 face ca moartea celulară să nu se mai producă.4. care. totuşi acest mecanism rămâne încă neclarificat. 50% din diferitele tipuri de neuroni mor curând după ce au format conexiunile sinaptice cu celulele ţintă. nu mai survine moartea celulară. Pornirea apoptozei necesită inducerea unui program genetic nou. acest proces este mediat de o cascadă de transducţii de semnale la suprafaţa celulară. Astfel. Este posibil ca şi oncogenele nucleare cu activitate reglatorie transcripţională să aibă un rol în apoptoză. Apoptoza are loc şi în celulele adulte somatice. la mamifere. în cursul reînnoirii normale a ţesuturilor. Dacă aceste gene sunt inactivate printr-o mutaţie. s-a observat cum creşterea nivelului proteinei p53 este asociată cu moartea celulară apoptotică.1.

8. prin scăderea nivelului apoptozei. dar modul în care se menţine această balanţă este în prezent foarte puţin cunoscut. rezultatul fiind supravieţuirea sau moartea. Respectivele efecte tumorigene imprimate de dieta bogată în grăsimi din cursul embriogenezei au apărut abia la a doua generaţie. neuronii şi oligodendrocitele) necesită pentru dezvoltare factori neurotrofici şi citokine. ionii de Ca++. de asemenea. retinoizii (molecule lipofile).1. după cum sunt induse sau supresate respectivele gene. blastomerele sunt unicele celule embrionare care necesită un minimum de comunicare. Experienţa in vivo a demonstrat că. se pare că există un control al mediului asupra vieţuirii şi morţii celulare. Rolul apoptozei în embriogeneză şi dezvoltare În prezent se ştie că echilibrul apoptotic joacă un rol important în embriogeneză şi dezvoltare. determinând activarea transcrierii genelor legate de inducerea apoptozei. S-a dovedit că niveluri înalte ale proteinei corespunzătoare genei bcl-2 de la mamifere inhibă apoptoza. şocul termic ester-forbolul. 190 . La specia umană. Agenţi externi nefiziologici. glucocorticoizii. în absenţa moleculelor semnal exogene. drogurile (agenţi antitumorali chemoterapeutici). acţionează ca inductori ai apoptozei. Exprimarea fiziologică a genei bcl-2 (inhibitoare a apoptozei) este prezentată în ţesuturile fetale unde probabil joacă un rol în dezvoltarea şi morfogeneza normală. substanţele toxice (toxine). ca radiaţiile ionizate. în absenţa hormonilor specifici. greutatea mai mare la naştere şi alăptare la sân micşorează riscul dezvoltării bolilor cardiace la vârstă adultă. ci favorizează supravieţuirea celulară într-o stare nonciclină.6. limfocitele T necesită interleukina 2). Aspecte de reglare a apoptozei De mare importanţă pentru un organism este menţinerea balanţei între genele letale şi genele de supravieţuire. Trebuie menţionat cazul particular al blastomerelor. atât supravieţuirea cât şi proliferarea sunt simulate prin semnale provenite de la alte celule. Aceştia interacţionează cu receptorii nucleari. că un antigen de suprafaţă al timocitelor (antigenul Fas) este implicat în procesul de apoptoză. iar alte celule (tip celule hemotopoietice) necesită unul sau mai mulţi factori de stimulare (de exemplu. care supravieţuiesc şi se divid în cultură. Pe modele animale s-a dovedit experimental existenţa unei tumorigeneze crescute în cazul în care respectivele animale au primit o dietă bogată în grăsimi în cursul embriogenezei. Factori implicaţi în reglarea apoptozei • Factori inductori Printre factorii interni care declanşează şi controlează apoptoza se numără tiroxina. 8. 8. În general. iar cele ale proteinei corespunzătoare genei Ced-9 de la nematodul Caenorhabditis elegans au un efect similar. aceeaşi genă bcl-2 inhibă inducerea apoptozei de către gena c-myc şi face celulele mai puţin sensibile la radiaţii şi droguri citotoxice.5.6. S-a demonstrat. Este demonstrat faptul că există un impact important al nutriţiei din cursul embriogenezei şi perioadei precoce de după naştere asupra dezvoltării nou-născutului şi evoluţiei individului în cursul vieţii adulte.Această proteină bcl-2 nu stimulează proliferarea celulară. Se ştie că semnalele extracelulare pot rupe această balanţă. dar nu şi atunci când această dietă a fost administrată după naştere şi înţărcare. multe celule dependente de sistemul endocrin (de exemplu.

nivelul de corticoizi şi răspunsul glucocorticoid la stres scade cu vârsta. Din cele prezentata mai sus reiese că sistemul imun incluzând timusul ar putea fi un focar important pentru dezvoltarea şi pentru efectele de maturare ale glucocorticoizilor. Aceste aspecte sunt însă foarte greu de urmărit şi clarificat. în funcţie de modularea dietei alimentare. Hrana hipocalorică cronică creşte atât nivelul diurn al corticoizilor plasmatici. dar şi nucleii pot declanşa modificări caracteristice de apoptoză în ADN-ul unor celule intacte. apoptoza este inhibată de către toţi inhibitorii sintezei ARN-ului. ai tirozinfosforilării. A fost evidenţiată existenţa unui timing (intrare în funcţie la un moment precis) al apoptozei. Nivelul crescut de corticoizi cu capacitate de a elimina selectiv. întârzierea îmbătrânirii celulare şi a fenomenelor de tumorigeneză. Dieta hipocalorică favorizează. La şoareci s-a demonstrat experimental că o dietă hipocalorică creşte nivelul glicocorticoizilor în cadrul ritmului circadian. Se presupune că. celule T autoreactive ale sistemului imunitar) caracterizează un sistem imunitar tânăr. celulele limfoide în exces (de exemplu. Hrănirea după o perioadă de post apare asociată cu o scădere a ratei de apoptoză. ai proteinkinazei. cât şi faptul că reducerea raportului de colorii poate afecta semnificativ secreţia de adrenocorticoizi. atingând vârful chiar înainte de ora prânzului. şi anume: celulele fără nucleu pot declanşa apoptoza. prin modularea generală local de glucocorticoizi. Corticoizii (sintetizaţi fie sistemic. dar acest declin poate fi atenuat printr-o dietă hipocalorică. Se pare că aceşti steroizi sintetizaţi local acţionează într-o manieră paracrină. Pentru menţinerea unei funcţii normale a timusului este necesar un anumit nivel de bază al glucocorticoizilor circulanţi. La un individ normal. 191 . incluzând selecţia pozitivă a celulelor CD4 şi CD8. în organele nonlimfoide. ai endonucleazelor. acest rezultat demonstrează importanţa ritmului cardiac atunci când se urmăreşte măsurarea nivelelor circulatorii ale adrenocorticosteroizilor. ai transaminazelor şi ai proteazelor. apoptoza este foarte restrânsă şi foarte rară în comparaţie cu cea în sistemul imun. cu începere înainte de miezul nopţii. Faptul că glucocorticoizii pot fi sintetizaţi local de organele aparatului imunitar (incluzând aici şi timusul) ridică posibilitatea ca o dietă hipocalorică să aibă efecte favorabile asupra bolii autoimune. S-a avansat ipoteza conform căreia glucocorticoizii ar putea modula procesul de selecţie şi maturare. fie local) ar putea avea un efect critic asupra proceselor timice şi de imprinting. prin apoptoză. Se pare că atât indigestia totală de calorii cât şi pattern-urile de alimentare (perioada de post cu hrănire intermitentă/acces continuu la hrană) ar putea influenţa viteza apoptozei şi a proliferării celulare. la vertebrate. deoarece citoplasma celulară şi nucleul celular sunt potenţial autonome în declanşarea procesului de apoptoză. prin creşterea nivelului corticoizilor (cu rol important în modularea apoptozei). Prelungirea acestei capacităţi în cursul vieţii adulte ar putea fi întreţinută timp îndelungat printr-o dietă hipocalorică. scăderea nivelului de corticosteron are loc după administrarea hranei. cât şi rata apoptozei. în special în cursul morfogenezei şi dezvoltării. ai sintezei proteice. factorii de activare a macrofagelor. • Glucocorticoizi – sistem imun – apoptoză Nelson (1992) emite ipoteza conform căreia ar exista o implicare neuroendocrină în întârzierea îmbătrânirii ca urmare a dietei hipocalorice. De asemenea. Sistemul imun produce un mare exces de limfocite care sunt programate să moară dacă nu sunt recrutate pentru răspunsul imun. în cursul dezvoltării sistemului imun. Celulele timice intrinseci exprimă enzime steroidogene şi produc pregnenolon şi dezoxicorticosteron. factorii serici şi citokinele (aTNF) inhibă apoptoza.• Factori inhibitori Factorii de creştere.

Lipidele Ω-3 cresc exprimarea enzimelor de tip superoxiddismutaza şi catalaza. Acidul eicosapentaenoic (EAP) scade proliferarea şi stimulează apoptoza. proteine. În prezent se recomandă o utilizare a uleiurilor de peşte Ω-3 ca supliment în dietă. dereglări imune. dar cu condiţia îmbunătăţirii procesului tehnologic (cu adaos de antioxidanţi corespunzători). până în prezent sa dat totuşi prea puţină atenţie legăturii existente între prelungirea perioadei de viaţă (prin administrarea unei diete hipocalorice). tumorigeneză). dar cu scăderea aportului de carbohidraţi. ameliorând severitatea bolii autoimune şi prelungirea vieţii. pe de altă parte. tumorigeneză). întârziind îmbătrânirea. În prezent se ştie că o dietă hipocalorică (fără malnutriţie sau deficienţe de elemente esenţiale. ceea ce duce la îmbătrânire. ar putea scădea producerea de radicali liberi şi ar menţine un nivel normal de apoptoză. pe de o parte. Uleiurile nesaturate Ω-3 şi Ω-6 duc la scăderea bolii arteriosclerotice. leucotrienelor şi trumboxanului. Procesul normal de îmbătrânire evoluează către stadiul final de senescenţă. Dereglarea apoptozei poate duce la alterarea funcţie imune. reduc stresul oxidativ cronic. în plus Ω-3 au efect favorabil asupra funcţiei imune şi supresoare a tumorigenezei. când celulele nu mai proliferează.221) În ultima vreme s-a trecut la utilizarea uleiurilor nesaturate Ω-3 extrase din peştele oceanic. prelungind perioada de viaţă şi întârziind momentul apariţiei modificărilor legate de vârstă (degenerări. consumul de grăsimi este 170 grame pe zi. tiroidieni şi retinoizi. Esenţial este că acest ulei de peşte să fie conservat cu anti-oxidanţi potriviţi (vitamina E). În SUA. pentru a împiedica oxidarea şi reîncezeala în cursul perioadei de păstrare. constatându-se că acest tip de ulei a adus beneficii. diabet. devenind rezistente atât la proliferare cât şi la apoptoză.• Lipidele Ω . S-a dovedit că consumul crescut de lipide Ω-3 are la om efecte benefice în caz de artrită. Apoptoză – îmbătrânire – senescenţă Printr-un proces de apoptoză controlat genetic în cursul vieţii. Efectul uleiurilor de peşte asupra apoptozei s-ar realiza prin exprimarea crescută a enzimelor antioxidante şi scăderea formării de radicali liberi. Substituirea grăsimilor saturate cu uleiuri vegetale reduce cantitatea de colesterol şi de lipide LDL. în dieta alimentară. la dezvoltarea bolii autoimune şi la tumorigeneză. Lipidele oxidate pot determina formarea de radicali liberi. 7. 192 .6). administrate în cadrul dietei alimentare. această observaţie sugerează că acizii graşi polinesaturaţi ar putea avea efect direct asupra supresării genelor H-ras (p. 8. se produce treptat o pierdere de masă celulară. boli renale şi boli de piele. care îndepărtează (mătură) radicalii liberi scad nivelul peroxizilor circulanţi. Acidul arahidonic (care asigură fluiditatea membranelor celulare) poate activa receptorii nucleari pentru hormoni steroizi. Acizii graşi nesaturaţi şi metaboliţii lor servesc nu numai drept componenţi structurali ai celulelor şi ca substrat pentru sinteza prostaglandinelor. dereglări imune. organismul fiind predispus la modificările legate de vârstă (degenerări. şi nivelul apoptozei. Deci lipidele Ω-3. ci ei mediază şi exprimarea genelor. O dată cu înaintarea în vârstă scade eficienţa apoptozei. grăsimi) duce la creşterea nivelului apoptozei. din care 90% sunt de origine vegetală. ceea ce ar putea explica unele rezultate nefavorabile (contradictorii) obţinute în studiile anterioare referitoare la efectele uleiurilor de peşte. a grăsimilor saturate cu uleiuri vegetale nesaturate (Ω . boli cardiovasculare.3 şi apoptoza Asocierea acizilor graşi saturaţi cu incidenţa crescută a bolilor cardiovasculare a determinat substituirea.

ƒ Boala autoimună Boala autoimună reprezintă o altă consecinţă a dereglării apoptozei în sistemul imunologic. confirmând astfel că ar exista o corelaţie între exprimarea genei bcl-2 şi rezistenţa la apoptoză. prin interacţiunea unei proteine virale cu proteina celulară p53. în care legătura glicoproteinei gp120 (de pe suprafaţa virusului HIV1) de antigenul CD4 al limfocitelor T CD4 face celula sensibilă la apoptoză. Un deficit în deleţia (dispariţia.8. cât şi în patogeneza cancerului (de exemplu în limfoame). homeostazia celulară fiind menţinută şi asigurându-se prelungirea vieţii. s-a demonstrat că adenovirusurile. exprimă o cantitate mai mare de proteină bcl-2 decât celulele CD4+ şi CD8+ sensibile la apoptoză. depleţia de limfocite este rezultatul unui proces complex. care contribuie la eradicarea celulelor autoreactive din boala autoimună in vivo. în aceste condiţii de dereglare a 193 .Deşi mecanismele implicate în procesul de senescenţă şi tumorigeneză rămân insuficient clarificate. În condiţii normale. 8. un retrovirus cu rol declanşator. Ţinând cont de acest aspect. Administrarea de glucocorticoizi exogeni ameliorează boala autoimună (de exemplu. poate activa transcrierea genei c-myc.(precursoare ale celulelor timice T) rezistente la apoptoză. S-a demonstrat că administrarea de uleiuri Ω-3 (din peşte oceanic) duce la supresia bolii autoimune şi la prelungirea vieţii. În condiţii normale. ceea ce are drept consecinţă o dereglare a echilibrului apoptoză/proliferare celulară. predispune la boala autoimună. lupusul eritematos) prin creşterea apoptozei. la a doua stimulare. se cunoaşte faptul că acumularea de radicali liberi derivaţi dintr-un metabolism oxidativ şi leziunile celulare rezultate din acţionarea radicalilor liberi joacă un rol important în aceste fenomene. limfocitele (autoreactive) mor prin apoptoză. virusul papilloma uman şi SV40 pot modula apoptoza. Conform ipotezei lui Stryer (1991). Astfel. S-a observat de asemenea că o perioadă scurtă de post sau de regim hipocaloric are efecte evidente asupra sintezei de glucocorticoizi şi asupra creşterii apoptozei. Sindromul de Imunodeficienţă Acută la Om (SIDA) poate fi privit ca un dezechilibru între viteza morţii celulelor limfocite T CD4 şi procesul de reînnoire a acestor celule. toate genele oncogene cunoscute până astăzi ar fi forme alterate ale genelor celulare normale. permiţând astfel replicarea virală în celula gazdă. Apoptoza şi starea de boal㠃 Agenţii infecţioşi virali şi infecţia virală Agenţii virali patogeni dezvoltă strategii pentru inhibarea apoptozei. gena c-myc. În condiţii anormale. În cazul infecţiei cu virusul HIV1. moartea) lor. ƒ Apoptoza şi procesul de oncogeneză Procesul neoplazic este înţeles astăzi drept o dereglare a echilibrului apoptoză/proliferare celulară. Aceste gene oncogene pot influenţa circuitele moleculare care controlează creşterea şi dezvoltarea. Celulele CD4-CD8. prin inserţie pe respectiva genă protooncogenă. Apoptoza crescută peste normal poate fi deci nocivă prin pierderea unor celule CD4. Supresia apoptozei joacă un rol important atât în bolile autoimune. a cărei viaţă este prelungită. menţine un echilibru între proliferarea celulară şi apoptoză. În acest context trebuie privită şi acţiunea genei protooncogene celulare c-myc. Printr-o dietă hipocalorică se poate reduce stresul oxidativ. a căror prezenţă ar fi atât de necesară în cazul de mai sus.

incriminate în oncogeneză. proporţia dintre diviziunea celulară şi moartea celulară determină viteza de dezvoltare a unui proces oncogen. apare o deteriorare a funcţiei sistemului imun şi o creştere a riscului de tumorigeneză o dată cu înaintarea în vârstă. deoarece induce poptoza în celulele care au suferit leziuni ireversibile ale ADN.apoptozei. drept răspuns la semnalele adverse de creştere. 194 . Mutaţii ale genei supresoare ale tumorii gb53 reprezintă una din alterările genetice cel mai frecvent semnalate în cazul tumorilor umane. apariţia unei tumori necesită evenimente genetice secundare care să atrage calea apoptotică. În general. dar procesul neoplazic se poate totuşi întinde din cauza perioadei de viaţă prelungite a respectivei celule. Produsul genei gp53 normale a fost numit “poliţistul molecular“. care inhibă apoptoza într-un număr de tipuri celulare. de asemenea. Luvers. supunând aceste celule transformate apoptozei. Prin activarea produsă prin inserţia retrovirusului. Apoptoza trebuie privită ca o măsură de protecţie care previne transformarea malignă. cel mai bun exemplu în acest sens sunt evenimentele mutaţionale suferite de gena gp53 supresoare de tumori. gena protooncogenă c-myc devine oncogenă (implicată în geneza limfomului Burkitt). În organisme au evoluat mecanisme eficiente pentru eliminarea celulelor cu leziuni genetice (rezultate dintr-o diviziune neprogramată). Se admite astăzi că procesul de oncogeneză apare în urma unor modificări de replicare a ADN. Genele codificatoare de proteine care conferă rezistenţă la apoptoză ar putea fi. când se produce o acumulare anormală de celule cu mutaţie. o asemenea genă ar fi protooncogenă bc1-2 (genă mitocondrială). Unele celule canceroase se divid mult mai încet decât celulele normale.

Acestea sunt secvenţe repetitive de ADN situate la extremităţile libere ale cromozomilor liniari. care ulterior este modular (amplificat sau menţinut la nivel scăzut) prin acţiunea agenţilor din mediu extern. ƒ Gene pleiotrope. ƒ gene pentru sinteza de factori antioxidanţi (enzime etc. acţiunea enzimelor antioxidante) până la mecanismele de turnover celular (ale sistemului imun. acesta reprezentând inexorabilul declin al capacitaţi de menţinere homeostaziei fiziologice. (TTAGGG). dar ulterior suferă deleţii. şi anume: ƒ gene pentru replicarea corectă a ADN-ului. având în consecinţă o serie de efecte negative asupra organismului. secvenţele TTAGGG sunt orientate cu extremităţile bogate în G spre capul 3 OH 195 ƒ . ƒ gene pentru repararea ADN-ului. în cursul unui proces de îmbătrânire precoce (de exemplu. împiedicând acumularea de leziuni somatice responsabile de producerea senescenţei. începe procesul îmbătrânirii. Gene implicate în controlul senescenţei Senescenţa este o caracteristică a organismelor superioare. Îmbătrânirea reprezintă pierderea treptată a masei celulare dintr-un organism. activitatea respectivelor gene menţine un nivel înalt de protecţie faţă de agenţii de stress intrinseci şi extrinseci. Aceşti factori determină fenotipurile procesului de îmbătrânire-senescenţă. ƒ gene pentru reglarea activităţii sistemului inimi. după ultimele date un ceas (un mecanism programator) reprezentat de telomere. sindromul Werner) poate duce la disfuncţie de organ sau boală. ale structurilor epidermice etc. În reglarea îmbătrânirii celulară şi a senescenţei. Procesul normal de îmbătrânire evoluează treptat către senescenţă. Acest proces se află sub un control genetic activ. După maturarea totală a unui organism. Aceste gene reglează sistemele intracelulare (mecanismul de reparare a ADN-ului. ƒ gene pentru supresia de tumori. un rol important are.). cât şi la apoptoză (celulele devin senescente în momentul în care telomerele devin brusc prea scurte şi nu mai pot suporta o nouă diviziune celulară).1. Pierderea celulelor premature sau excesive. ele devenind rezistente atât la proliferare. 9. Aceste gene conferă avantaje în stadiile timpurii de viaţă. în ADN-ul telomeric. Senescenţa este stadiul final al îmbătrânirii când celulele nu mai proliferează. fiind implicate trei categorii de gene: ƒ Gene reglatoare pentru menţinerea integrităţii somatice şi a proceselor de reparare. La mamifere (inclusiv la om) perioada lungă de viaţa se găseşte sub controlul unui număr foarte mare de gene (control poligenic). ƒ gene pentru sinteza corectă a proteinelor. Astfel la om capetele cromozomilor conţin 2-3kb de unităţi repetitive telomerice.Capitolul 9 PROCESUL DE ÎMBATRÎNIRE-SENESCENŢA Sedlow 1974 şi Curtis 1996 indică strânsa interrelaţie /eficenţa reparării ADN-ului (prin excizia leziunilor) şi durata de viaţa a speciilor. Factori genetici individuali. prin apoptoza controlată genetic.) Prin reglarea acestor procese.

cu telomerul foarte scurt va deveni incapabilă de o nouă replicare. după un număr de replici. ADN-ligaza ajută la fixarea acestor noi secvenţe telometrice la capătul 5’ al lanţului fiică iar apoi nick-aza clivează loop-ul la nivelul subsecventelor telomerice (secvenţe incomplet sintetizate) astfel încât.. 196 . Această alungire a lanţului matrice duce la formarea unui loop astfel încât capătul 3’OH ajunge să servească drept primer pentru sinteza unor noi secvenţe nucleotidice telomerice în apropierea lanţului fiică. apărând astfel. ele împiedică fuziunea extremităţilor cromozomiale cât şi dezintegrarea ADN-ului fiind totodată şi responsabil de fixarea cromozomilor pe membrana nucleară. Rezultă o catenă fiică de aceeaşi lungime cu catena matrice dar cu secvenţe telomerice mai puţin numeroase.03% din totalul ADN-ului genomului uman). Sub acţiunea acesteia se adună mai întâi blocuri de oligonucleotide telomerice care se fixează la capul 3’-OH al lanţului ADN matriţa (fig 126). Pe cele două fire de ADN telomerele sunt formate din secvenţe repetitive identice dar aşezate în tandem (5’-TTAGGG faţă de TTAGGG-3’-OH). în condiţii normale. Telomelere sunt structuri importante ale arhitecturii cromozomiale. în celule. ele au rol de a cronometra fiecare diviziune celulară. Ele nu se sintetizează în cadrul ciclului de replicare a lanţului ADN corespunzător ci separat sub acţiunea telomerazei. în final. în final.Terminalizarea cromozomilor sub acţiunea telomerazelor Nu se cunoaşte încă bine interrelaţia dintre apoptoză şi lungimea tolomerelor. această catena fiică va juca rol de matriţă în runda următoare de replicare şi va da naştere unei noi catene fiice cu un număr şi mai mic de secvenţe telomerice astfel încât. Telomerele nu sunt codificatoare (nu conţin gene). Principalele mecanisme (ipotetice) implicate în senescenţă Aceste mecanisme sunt: • Acumularea de mutaţi somatice. capetele celor două fire de ADN să rămână libere. Fig. cât şi de ce a leziunilor ADN. se ştie doar că apoptoză întârzie îmbătrânirea şi supresează tumorigeneza. • Acumularea de leziuni oxidative. acest fenomen fiind acompaniat atât de supresarea leziunilor celulare cumulative.al firului de ADN. 126 . Telomerele au fost deja clonate şi secvenţiate (ADN-ul telomeric reprezentând 0. catena fiică rezultată. Telomeraza (complex ribonucleioproteic) orientează capetele băgate în G ale respectivelor secvenţelor telomerice spre extremitatea 3’-OH a lanţului matriţă. 2. în cursul perioadei de îmbătrânire. 9. probabil datorită acţiunii enzimei telomeraza. • Acumularea de proteine aberante. • Acumularea de mutaţii în ADN-ul mitocondrial. orientate în tandem pe cele două fire ale dublului lanţ de ADN cromozomial cu capete libere.

potenţialul de creştere în cultură a acestor celule este invers proporţional cu vârsta donatorului de celule. care au o acţiune sinergică. În celulele vârstnice există o frecvenţă înaltă de ruperi de lanţuri ADN (probabil prin acumularea situs-uri labile la alcalii). 127). 1996). George Martin de la Universitatea Washington din Seattle (1996) estimează că mutaţiile care ating 7% din genomul uman pot avea capacitatea de a modula apariţia unui fenotip al procesului de îmbătrânire la om. Culturile celulare de fibroblaste umane diploide au oferit.Reţeaua interacţiunilor dintre diferite mecanisme intracelulare ipotetice implicate în procesul de senescenţă (după Kingwood. Pînă în prezent mutaţiile somatice au fost studiate foarte puţin. concomitent apar modificări ale histonelor. Multe teorii referitoare la îmbătrânirea celulară se bazează pe ipoteza leziunii genomului celular somatic. O dată cu înaintarea în vârstă. Organismele care trăiesc mai mult timp fie acumulează în cursul vieţii cantităţi mai mari de ADN lezat decât organismele cu viaţă mai scurtă. 197 .Plecându-se de la studiul acestor patru mecanisme. în vederea acţiunii de reparare a ADN. un model experimental excelent pentru studiul fenomenelor de înbătrînire. dereglări imune. eficenţa apoptozei scade. Fig. A. care îngreunează accesibilitatea enzimelor la nivelul cromatinei. tumorigeneza).multe dintre aceste teorii postulează o relaţie între viaţa celulei şi apariţia leziunilor (erorilor) ADN. s-a ajuns la elaborarea unei teorii a reţelei prin care se încearcă ipotetic să se explice astăzi intrigarea şi interacţiunea la nivel molecular a mecanismelor implicate în procesul de senescenţă (fig. această capacitate scăzând o dată cu creşterea numărului de pasaje. 127 . timpul de generaţie creşte. după o perioadă de multiplicare activă. pe acest model s-a demonstrat că pentru respectivele celule. iar apoi mitoza încetează progresiv (perioadă de senescenţă). Acumularea de mutaţii somatice În culturile de ţesuturi prenatale provenite de la rozătoare s-a demonstrat că celulele au capacitate foarte înaltă de reparare ADN. de asemenea. fie posedă sistem de reparare ADN mult mai eficient. Un asemenea exemplu de mutaţii somatice apărut la un moment dat în cursul vieţii în organisme este apariţia unui spot bleu pe un iris brun. organismul fiind mai predispus la modificările de vârstă (degenerări.

care îngreunează accesibilitatea enzimelor de reparare la nivelul cromatinei. Experimental. o dată cu îmbătrânirea: cancer.Tot la mamifere s-a constatat că frecvenţa unor mutaţii intragenice şi cromozomiale se află invers cu longevitatea respectivului organism. mai mult în ADN –ul mitocondrial decât în cel nuclear.procesul de îmbătrânire. Mutaţiile se acumulează o dată cu vârsta prin multiplicarea respectivelor leziunilor ADN în cursul diviziunilor celulare. boli cardiace.producerea de boli degenerative (prin leziuni somatice celulare. Strânsa interrelaţie dintre mutaţii şi îmbătrânire a fost demonstrată şi de constatarea existenţei unui grup semnificativ de patern-uri de mutaţii somatice specifice de specie în cursul procesului de îmbătrânire la mamifere . Enzimele de reparare a ADN-ului îndepărtează eficient un număr mare de leziuni. B. această interrelaţia dezvoltându-se pe baza unei instabilităţi genomice. deoarece respectivele sisteme de apărare nu sunt perfecte. Totuşi leziunile oxidative reuşesc să se acumuleze cu vârsta. adenocarcinoamele de colon şi prostata). cataracta). Acţiunea acestor produşi este echivalenta cu cea a radiaţiilor. mitocondriile alterate (care produc un număr mare de substanţe oxidante). În cursul fosforilărilor oxidative se produc substanţe oxidante la nivelul mitocondriilor. C. cu cît numărul este mai mare cu atât viaţa respectivului organism este mai scurtă. carotenoizi. se consideră astăzi că biologi neoploziei este un aspect particular al îmbătrânirii precoce intrinsece (de exemplu. s-a demonstrat că leziunile oxidative ale ADN-ului se acumulează o dată cu vârsta. Deşi organismele posedă factori de apărare cu acţiune antioxidantă (ascorbat tocoferoli. Numărul loviturilor oxidante asupra ADN-ului per celulă şi per zi este de circa 100 000 la şoarece şi de zece ori mai mic la om. dar nu reuşesc nici ele să le îndepărteze pe toate. Aceşti produşi oxidanţi contribuie la : . Acumulare de leziuni oxidative Produşii oxidanţi rezultaţi din metabolismul normal determină treptat o dată cu înaintarea în vârstă. Ca şi în cazul senescenţei. . disfuncţii imunologice şi cerebrale. leziuni ale ADN-ului proteinelor şi lipidelor. 198 . Acumulare de proteine aberante S-a arătat deja la capitolul referitor la acumularea de mutaţii somatice că o dată cu înaintarea în vârstă apar histone modificate. probabil.O singură mutaţie nu este suficientă pentru declanşarea unui proces de îmbătrânire. Substanţele oxidante produc leziuni şi la nivelul proteinelor. enzimele proteolitice protectoare care hidrolizează proteinele oxidante nu sunt suficiente pentru a împiedica acumularea de proteine oxidate o dată cu înaintarea în vârstă. ADN-ul suferă efecte oxidante care se acumulează cu vârsta. un şoarece devenind astfel bătrân în numai doi ani (când se acumulează circa un milion de leziuni ADN per celulă). Cel puţin pentru regnul animal. în vederea reparării ADN. având drept consecinţă un nivel de zece ori mai mare al leziunilor oxidative la nivelul ADN-ului mitocondrial decât la nivelul ADN –ului nuclear. ci sunt necesare cel puţin câteva mutaţii pentru a modula aspectele multiple ale unui fenotip de îmbătrânire (de exemplu sindromul Werner la adulţi sau sindromul Giolford la copii). Celulele se apără singure împotriva unui număr mare de leziuni printr-un turnover constant mitocondrial. În aceste două sindroame a fost evidenţiată o mutaţie tip deleţie pe braţul scurt al cromozomului 8 (Gotto şi colab 1982). prin care se îndepărtează. se pare că în procesul de tumorigeneza radicalii liberi derivaţi dintr-un metabolism oxidativ au un rol important în provocarea leziunilor celulare. sistem enzimatic auto oxidant tip superooxiddismutaza). George Martin de la Departamentul de Patologie şi Genetică al Universităţi Washington din Seattler arată că există o strânsă legătură între îmbătrânirea biologică intrinsecă şi biologia neoplozilor.

1992). Cercetările din ultimii ani menţionează alterarea sintezei unor proteine reglatoare în perioada de creştere somatică. ca urmare a unor fenomene epigenice ce apar în cursul vieţii.Una dintre teoriile îmbătrâniri celulare (teoria lui Orgel) susţine că apariţia întâmplătoare a cromozomilor în genomul celular ar explica acumularea de anomalii în moleculele proteice esenţiale din organism. În aceste sindroame de îmbătrânire precoce la om se produce o pierdere celulară prematură şi excesivă. În 1983 Wilson şi Jones arată că metilarea ADN-ului scade o dată cu vârsta (cu excepţia celulelor neopolizice). ducând tardiv în cursul vieţii la efecte negative. ulceraţii ale pielii în jumătate din cazuri apare diabetul zaharat. consecinţa acestor modificări fiind tulburarea sintezei unor proteine reglatoare în perioada de creştere somatică. hiprekeratoza căderea generalizată a părului. Boala prezintă complicaţii de tip arterioscleroză coronariana. fără apariţia unei modificări în senescenţa primară a nucleotidelor. În cazul unei boli mitocondriale cu mutaţii (de exemplu deleţie) respectivul organism conţine mai multe tipuri de ADNmt. care determină moartea pacienţilor în primii 20 de ani de viaţa. atrofia musculară scheletică. Acumularea de mutaţii în ADN-ul mitocondrial (ADNmt) Se consideră ca într-un organism normal (cel puţin teoretic) toate moleculele de ADNmt sunt identice. durata medie de viaţă de 47 de ani. cu semn de senilitate evidentă deja la vârsta de 10 ani. Din punct de vedere teoretic. care duce la deteriorarea mai mult sau mai puţin rapidă a mecanismelor de transcriere şi translaţie. situaţia care caracterizează starea de heteroplasmie. Din datele acumulate până în prezent s-a putut conchide că procesul de alterare a metilării ADN-ului. o dată cu înaintare în vârstă. evoluează permanent. alterarea vocii. alte semne tipice arterioscleroza severă. Prin fenomene epigenice (epimutaţii) se înţeleg acele evenimente acumulate care pot duce la alternarea structurii şi funcţiei genelor. Faptul că alterări în metilarea ADN-ului au fost observate la şoareci cu vârsta de 6 luni demonstrează că aceste modificări sunt determinate viitoarea dezvoltare şi adaptare. Pe culturi celulare provenite de la persoane cu acest sindrom. Un alt aspect al acumulării de proteine aberante este cel al acumulării cu mult peste nivelul normal admis de proteine oxidante în organism. având drept consecinţă disfuncţii de organe şi instalare unei stări de boală. Sindromul Werner este o boală autosomală de tip recesiv caracterizată printr-un număr mare de degeneraţi tipice. În acest fenomen s-ar încadra reactivările (paradoxale) unor anumite locusu-uri de pe cromozom (de exemplu cromozomul x la şoarece) drept consecinţă a unor modificări ale stării de metilare a citozinei de pe lanţul ADN cromozomial. Celulele nu au supravieţuit în cultură mai mult de 11 generaţii. degenerescenţa gravă testiculară. atunci când forţa de selecţie naturală a organismului scade evident. celulele au fost incapabile să restaureze corect lanţurile de ADN. o 199 . În acest sindrom a fost evidenţiat un linkaj genetic constituit din 5 markeri pe cromozomul 8 (Gotto et al. considerată de unii autorii drept o variantă a sindromului Werner. Epstein şi colaboratorii au evidenţiat o restaurare defectuoasă a ADN-ului. D. Sindromul Rothmund Thomson este o afecţiune congenitală transmisă recesiv. o dată iniţiat. această situaţie caracterizează starea de homoplasmie. Sindromul Hutchinson Gilford (progeri) este o afecţiune autosomală cu transmisie recesivă. această situaţie duce la declanşarea unuia dintre cele două sindroame de îmbătrânire prematură: sindromul Werner şi sindromul Hutchinson Gilford (progeria). osteoporoza. subliniind rolul acestor fenomene în procesul de îmbătrînire. Starea de heteroplasmie poate apărea şi la un individ normal. prima manifestare este întârzierea creşteri urmată de albirea părului atrofia ţesutului subcutant şi a pielii. în 10% din cazuri apar neoplasme. după expunerea la raza y şi cobalt. un asemenea fenomen s-ar explica prin acumularea treptată de ADN. având drept consecinţă sinteza unor proteine deficitare şi scurtarea vieţii. cataracta bilaterală.

Se pare că un proces similar ar fi implicat în pierderea de neuroni. se multiplică exponenţial cu vârsta. muşchiul cardiac şi SNC). În schimb în bolile mitocondriale bazată pe selecţii ale ADNmt. În contextul relaţiei mai sus amintite. în cadrul bolilor degenerative asociate procesului de îmbătrânire. Modificări la nivelul anumitor organe apar în mod normal o dată cu vârsta. creier. Astăzi sunt consideraţi factori care întârzie (protejează organismul de) senescenţă: dieta hipocalorică şi exerciţiul fizic. În schimb. Implicaţiile interacţiunii dintre dieta hipercalorică şi mecanismul fundamental care reglează senescenţa şi durata vieţii la om rămâne încă a fi investigat în detaliu.deleţie. o modificare a genotipului somatic şi totodată acumularea unor defecte care pot duce la un moment dat la conturarea unui anumit fenotip (de boală). Constatările de până în prezent ne permit să afirmăm că există o relaţie directă între procesul de îmbătrânire şi boală. la rozătoare duce la creşterea evidentă a duratei de viaţă. deşi este un proces fiziologic normal. La om este astăzi dovedit statistic că o dată cu vârsta creşte şi incidenţa bolilor. boala Huntington sau boala Alzheimer. prin creşterea vitezei turnover-ului la nivelul mitocondriilor. Se pare că acelaşi mecanism care protejează organismul împotriva acumulării unor leziuni responsabile de senescenţă protejează organismul şi împotriva unor mutaţii ce duc la declanşarea cancerului. la malignizarea într-o linie celulară. este dovedit că subnutriţia creşte ulterior în viaţă. Unele boli apar cu frecvenţă mai mare la vârstă mai înaintată. nutriţia hipocalorică postnatală. La om. Exerciţiul fizic.1% din totalul ADNmt şi poate fi detectată numai prin reacţia polimerizării în lanţ. chiar dacă acea persoană nu a fost diagnosticată cu o anumită boală specifică. deşi natura precisă a acestei relaţii nu este încă dovedită experimental din considerente etice. Este foarte greu de afirmat că la o vârstă înaintată (de 90 ani sau mai mult). deoarece mecanismele cauzale necesită probabil un timp pentru ca efectele lor să devină evidente. întârzie îmbătrânirea aparatului mitocondrial din ţesutul muscular. căci senescenţa. treptat. o dată apărută pe ADNmt. În cursul procesului normal de îmbătrânire la un individ sănătos. implică apariţia unor aspecte anormale. sistemul senzorial. Astfel în cursul senescenţei se produce. într-un organism chiar aparent sănătos nu au apărut modificări patologice în corp. Leziunile oxidative continue ale ADN-ului sunt responsabile de scăderea capacitaţii de fosforilare oxidativă o dată cu înaintarea în vârsta. predispunând astfel organism la unul din fenotipurile neurodegenerative tip boala Parkinson. 200 . Referitor la exerciţiul fizic se consideră că acesta aplică cu regularitate la om poate ameliora modificările legate de vârstă la nivelul mitocondriilor din ţesutul muscular. îmbătrânirea-boală se poate afirma că există o relaţie fundamentală directă între îmbătrânire şi cancer. Nivelele cele mai înalte de deleţie au fost evidenţiate postmitotic în ţesuturile aerobe muşchi scheletici. cu deleţie trebuie să reprezinte mai mult de 60% din ADNmt total pentru a putea fi exprimat fenotipic. Aceste observaţii au crescut interesul cercetătorilor pentru rolul jucat de mutaţiile de la nivelul ADNmt în cursul procesului de îmbătrânire şi în cel al bolilor neurodegenerative. Astfel acumularea de alterări somatice pot duce. riscul de hipertensiune şi boli cardiovasculare. proporţia de ADNmt cu deleţie este în foarte rare cazuri mai mare de 0. reiese deci că nu este încă clarificat dacă orice deficit funcţional poate fi legat de acest tip de mutaţie. proporţia de ADNmt.

Imunitatea poate fi dobândită şi artificial. Sistemul imunitar este un sistem responsabil cu apărarea organismului împotriva efectelor nocive ale corpurilor străine (antigeni). celulele T pot să: . 2. răspunsul specific la un anumit antigen. Imunitatea poate fi moştenită (naturală).amplifice răspunsul imunitar (celular T ajutătoare).reducă răspunsul imunitar (celule T supresoare). Astfel. care stimulate specific devin celule T efectoare. Principala funţie a sistemului imunitar este de a recunoaşte şi ataca antigenii străini. nu pot supravieţui (fig. 2. acesta este mai rapid şi cu o amploare mai mare în cazul în care reîntâlneşte un antigen particular. când s-a instalat ca urmare a contactului generaţiilor anterioare cu un anumit antigen şi se transmite ereditar. Din această cauză. cunoscute sub numele de imunoglobuline şi care sunt specifici unui anumit antigen. Răspunsurile imunitare sunt de două tipuri: 1. 201 . Limfocitele au un rol deosebit de important în cazul. creştere nespecifică a efectului răspunsului. în afară de substanţele străine şi pe cele proprii organismului. Sistemul imunitar acţioneză deci ca un sistem defensiv în cazul apariţiilor unor infecţii. prin vaccinuri care conţin germeni atenuaţi sau morţi – imunitate activă. şi este cea care asigură eficienţa ridicată a acţinii sistemului imunitar. în cadrul răspunsului imunitar umoral specific.Capitolul 10 RĂSPUNSUL IMUNITAR 10. Răspunsuri celulare . Răspunsul imunitar celular este dependent de starea timusului de aceea limfocitele respective poartă numele de celule T (timus dependente). limfocitele producătoare de anticorpi. ca urmare a contactului prealabil al organismului cu un anumit antigen (imunitate consecutivă anumitor boli infecţioase). . (proteine cu structuri similare). Similar. a transplatelor tisulare şi infecţiilor (ciuperci sau fungi). dacă sunt netratate. ar putea produce dereglări ale homeostaziei.Această capacitate de transfer a limfocitelor face ca ele să joace un rol cheie în apariţia răspunsurilor imunitare.de exemplu infiltrarea limfocitelor în pielea sau organul grefat. Răspunsuri umorale . În cazul răspunsului imunitar specific. persoanele cu deficienţe imunitare congenitale.distrugă efectiv celelele ţintă (celule T citotoxice). din cauză că au suferit anumite modificări. Celulele T sunt de mai multe feluri în funcţie de natura reacţiei pe care o determină. Răspunsul imunitar umoral este important pentru infecţiile bacteriene. Această comportare poartă numele de memorie imunitară. organ limfoid prezent la păsări.ce constau în generarea de anticorpi. . 1. ambelor tipuri de răspuns imunitar. dar pe care acesta nu le mai recunoaşte ca proprii. care sunt dependente de măduva osoasă poartă numele de celule B (de la bursa lui Fabricius. Imunitatea înlătură. Un răspuns imunitar constă din două părţi: 1. sau poate fi dobândită. demonstrându-se că aceste celule pot transforma de la un organism la altul capacitatea de a produce anticorpi şi de a rejecta grefele . pătrunse în mediul intern. 128). timus independente). iar răspunsul imunitar celular pentru acţiunea organismului asupra celulelor maligne. anticorpii sunt produşi pe calea stimulării limfotitelor B sau a celulelor plasmatice (plasmocite). Răspunsul imunitar celular este generat de limfocitele T. sau prin administrarea unor seruri imune conţinând anticorpi specifici – imunitate pasivă. Noţiuni generale despre imunitate şi sistem imunitar Imunitatea reprezintă capacitatea de a recunoaşte şi neutraliza macromolecule sau celule străine organismului şi care.

Limfocitele T nu produc anticorpi circulanţi şi nu dau naştere la celule secretoare de anticorpi. fungi.Componentele sistemului imun Un răspuns are două faze: 1.Fig. Există două categorii funcţionale de limfocite T: limfocite T 202 . macrofagele. Limfocitele T. aproximativ 90% din celulele T se divid rapid. respingerea alogrefelor. Organizarea sistemului imunitar Celulele esenţiale pentru generarea răspunsului imunitar. Aceste celule sunt capabile să se transforme în celule efectoare timice dacă sunt reexpuse la antigen. Aceste celule T au viaţă scurtă. Sunt derivate din timus sau influenţate de timus în timpul dezvoltării lor. se divid lent şi conţin pe suprafaţă puţini antigeni. splina şi ţesuturi limfocitare asociate mucoaselor care sunt cele ce conţin celule sensibile la antigeni aflate intr-un circuit de recirculare prin organism. fiecare receptor având o înaltă specificitate. faţă de zona medulară. 2. Celula centrală in imunologie este limfocitul. al căror ciclu complet durează aproximativ 24 de ore. Diferite clone limfocitare au propria lor specificitate unică. Limfocitele sunt componente celulare specifice pentru antigeni. faza de recunoaştere . Din cadrul sismului imunitar fac parte două categorii de organe: 1. 2. Originea limfocitelor şi diferenţierea. conţin pe suprafaţă mulţi antigeni şi sunt sensibilile la liza prin acţiunea corticosteroizilor. circulante în fluxul sanguin. virusuri. Dacă sunt expuse la antigen se maturizează în celule sensibilizate care sunt circulante şi au viaţă lungă. splină) şi se localizează în arii timodependente. Celulele care părăsesc timusul dobândesc receptorul pentru antigen. inclusiv cele care au „memorie". Din această categorie fac parte limfocitele. organ limfoid întâlnit la păsări. apărarea împotriva anumitor microorganisme. Ele migrează încă din timpul vieţii fetale în timus unde se diferenţiază diferit în zona corticală. Organe limfocitare secundare: nodulii limfocitari.în care antigenul este recunoscut ca un corp străin. intră în organe limfoide secundare (ganglioni limfatici. Organe limfocitare primare: timusul şi măduva osoasă ce conţin celule care dezvoltă un proces de maturare a celulelor sensibile la antigeni. Cele mai multe celule limfocite care sunt recirculate sunt cele de tip T. În zona medulară. bacterii patogene. Ele acţionează prin receptorii de pe suprafaţa membranei. faza activă în care aticorpii elimină antigenul 10.2. Celulele T şi B circulă prin organism pe un traseu bine stabilit prin organele limfocitare secundare. imunitatea antitumorală. limfocitele în număr redus sunt rezistente la cortizon. Celule libere. splină şi măduvă osoasă. Studiul markerilor de pe suprafaţa limfocitară şi a activităţii lor funcţionale a permis identificarea celor două populaţii de limfocite T (timus dependente) şi B (bursodependente – de la bursa lui Fabricius. Limfocitele T sunt răspunzătoare de reactivitatea cutanată întârziată. În zona corticală. eozinofilele. În timpul vieţii măduva osoasă produce celule susă care au printre descendenţii lor şi precursorii limfocitelor. limfocitele işi au originea în măduva oaselor. 3. timus independente). 128 . neutrofilele. dar sunt recirculate şi celule B. La mamifere precursorii limfocitelor apar în insule sanguine din sacul vitelin şi migrează prin placentă în ficat. bazofilele.

adăugarea unor substanţe cu efect sinergetic. calea de intrare (injecţie intradermale. După generarea lor în măduva osoasă. răspunzătoare de reacţii imune mediate celular. care eliberează limfokine (citokine). reţinând în memoria lor primul contact cu acelaşi antigen. purtătorul poate fi o (auto)proteină gazdă. inhalare). subcutanată. antigeni independenţi de timus: nu necesită celule T pentru producţia de anticorpi. transformându-se în celule cu memorie. pe cale orală. moderată. care participă ultimile la răspunsul imun şi limfocitele T de hipersensibilitate întârziată. factorii genetici. Din această categorie fac parte limfocitele T citotoxice (celule killer). Antigenii sunt la rândul lor împărţiţi în mai multe categorii. Se dezvoltă astfel un răspuns imun secundar. O moleculă antigenică poate avea mai mulţi determinanţi antigenici (epitopi): fiecare epitop se poate lega cu un anticorp individual şi o singură moleculă care poate deci provoca mai multe molecule de anticorpi. Unele limfoblaste se diferenţiază în plasmocite. ei stimulând direct limfocitele B pentru a produce anticorpi Ig. solubilitatea). care răspund la reexpunerea la antigen prin proliferare şi diferenţiere prin celule B de memorie şi plasmocite. doza (mică.3. care influenţează calitatea răspunsului imun. celulele B imunocompetente migrează în arii specifice din organe limfoide periferice. cum ar fi medicamentele.purtător pentru a fi antigeni. Aceste celule au viaţă scurtă ca şi celulele T şi necesită expunerea la antigen pentru a se maturiza în celule B sensibilizate. Limfocitele B.3.1.4 nucleoli. limfocitele B se divid şi dau naştere la clone celulare B. Anumite molecule numite haptene deşi nu sunt capabile să provoace răspunsuri imunitare ele însele. Răspunsul imun primar are loc la primul contact al limfocitului cu antigenul.reglatoare care pot amplifica (celule helper) sau pot suprima (celule supresoare) răspunsurile altor limfocite (T sau B) şi limfocite T efectoare. Rolul principal al limfocitelor B este în realizarea imunităţii rapide. glicoproteine care mediază răspunsul inflamator. Există şi alţi factori diferiţi de proprietăţile intrinseci ale antigenilor. recirculante. ca şi secvenţa de aminoacid este importantă pentru determinarea caracterului antigenic. pot însă să reacţioneze cu anticorpi existenţi şi cu celule T receptoare. Molecule cu rol esenţial în cadru sistemului imunitar 10. prin care la un nou contact cu antigenul. în funcţie de factorii necesari a interveni pentru provocarea răspunsului imun. mare). asemenea antigeni sunt polizaharidele bacteriale (din pereţii celulari bacteriali) şi endotoxinele. proteine plasmatice circulante şi sunt răspunzătoare de imunitatea umorală. Pentru anumite chimicale. cum sunt: reacţiile de hipersensibilitate cutanată întârziată. Limfocitul se transformă în limfoblast (imunoblast) care are un nucleu palid cu o cantitate mare de eucromatină şi 2 . respingerea de grefe şi tumori. b. mărimea. celulele cu memorie îl recunosc şi se transformă mai rapid în imunoblaste. printre care se pot enumera: natura moleculelor (conţinutul de proteine. celule care produc imunoglobuline. iar acizii nucleici sunt de asemenea slabi antigeni. de exemplu adjuvante alţi antigeni etc. 203 . După activare. antigeni dependenţi de timus necesită participarea celulelor T pentru a provoca producerea de anticorpi (exemple de asemenea antigeni sunt serurile de proteine străine şi celulele roşii străine de corp). Asemenea molecule trebuie să se asocieze cu moleculele . intravenoasă. iar altele devin circulante. cât şi cu anticorpii. Limfocitele B şi celulele plasmatice produc anticorpi sau imunoglobuline (Ig). Antigenii Antigenul (Ag) este capabil să provoace un răspuns imun. Structura terţiară. eliminarea de celule infectate etc. 10. El reacţionează atât cu receptorii celulelor T. intramusculară. Lipidele pure nu sunt antigeni (nu provoacă un răspuns imun). astfel : a..

reprezintă 15 % din totalul imunoglobulinelor. provenite din celule B.două lanţuri identice usoare (L). reprezintă 0. Învecinat cu regiunea variabilă a moleculei de anticorp se află regiunea constantă C. Sunt produşi de celulele B şi plasmocite. reprezintă 75 % din totalul imunoglobulinelor. Secvenţa de aminoacid a acestor domenii terminale variază de la anticorp la anticorp. dar principalul ei rol fiziologic nu este încă cunoscut.IgG este o imunoglobulină mai mică. Fig. reprezintă 10 % din totalul imunoglobulinelor. 129). Un anticorp în structura sa de bază este alcătuit din patru lanţuri: .IgE este imunoglobina produsă de plasma celulelor. 204 .domeniul variabil al lanţului greu. Cu excepţia Ig naturale. de aceea sunt cunoscute sub numele de regiuni variabile V. Lanţurile grele determină clasa (isotipul) anticorpului. . în secreţii exocrine. VL . CL . reprezintă 0.Structura de bază a unui anticorp. . VH.reprezintă domeniul variabil al lanţului uşor. La electroforeza serului. . molecula suferă o schimbare în conformaţia lanţurilor grele. în inflamaţii şi alergii. Principalele clase de imunoglobuline sunt următoarele: .04 % din totalul imunoglobulinelor.IgM are o moleculă mare. deşi se bănuieşte că este implicată în expulzarea paraziţilor intestinali. în sprecial a viruşilor. diferite cantităţi de Ig se găsesc în lichidele extravasculare.două lanţuri identice grele (H). majoritatea Ig migrează spre gamaglobuline. dar cantităţi semnificative migrează şi spre zona betaglobulinică. pe suprafaţa limfocitelor. Când un domeniu terminal N al unei molecule de imunoglobuline a reacţionat cu un anticorp. este singura imunoglobulină care penetrează placenta pentru a furniza protecţie imunologică fătului.domoniul constant al lanţului greu. Fiecare lanţ este alcătuit din domenii de aproximativ 110 aminoacizi. precum şi funcţia fiziologică a unei molecule particulare de anticorp.10. CH. constituită din patru unităţi de bază menţinute într-o structură unitară de un lanţ de legătură. Domeniul terminal N al lanţurilor grele si al celor uşoare este foarte important pentru recunoaşterea antigenilor.3. Anticorpii Anticorpii (Ac) sau imunoglobulinele (Ig) sunt molecule proteice heterogene cu proprietatea de asociere specifică cu substanţa care a provocat formarea lor (antigenul). 129 . ea este o secreţie a mucoaselor şi constă din două unităţi de bază unite printr-un lanţ de legătură. care poate uşor penetra ţesuturile. Imunoglbulinele reprezintă 20 % din totalul proteinelor plasmatice. rolul major al acestor imunoglobuline fiind neutralizarea vasculară a microorganismelor.IgD este imunoglobina sccretată de limfocitele B şi probabil implicată în activarea acestor celule de către antigeni.domeniul constant al lanţului uşor. Domeniile au aceeaşi structură de bază şi la compararea secvenţelor de aminoacizi se pot pune în evidenţă multe arii similare. deoarece el cuprinde zona de legătură. . .IgA este imunoglobulina cea mai importantă care apare în mucoase.2. Ig reprezintă receptorul celulei B pentru Ag. anticorpii se formează ca răspuns la o substanţă străină (Ag). constituită dintr-un domeniu în cazul lanţurilor uşoare şi din trei domenii în cazul celor grele (fig.2 % din totalul imunoglobulinelor.

Antigenii de histocompatibilitate umani sunt cunoscuţi sub denumirea de antigeni HLA şi sunt la rândul lor de două tipuri: . .antigeni HLA de clasa I. 205 .3. 131 . ele pot fi de asemenea secretate de fagocitele mononucleare celulelor T stimulate antigenic deci ca parte a imunităţi specifice.Structura celulei receptoare T La fel ca imunoglobulinele. Fig. dar au un rol important în răspunsul imun. iar lanţurile sunt pliate.5. Structura probabilă a unei astfel de celule este prezentată în figura 130.130 . după prelucrarea lor de către celulele de prezentare (macrofagele). adică variabilitate genetică între indivizi. Au denumirea dc antigeni de histocompatibilitate din cauza reacţiilor foarte puternice pe care le provoacă în cazul nepotrivirii transplanturilor de organe.3. regiunile constante sunt alcătuite din domenii.3.4.antigeni HLA de clasa II. În imunitatea naturală citokinele efectuare sunt produse in special de fagocitele mononucleare şi astfel sunt numite monokine. adică în general. Deşi monokinele pot fi induse direct de microbi. deci este foarte dificilă obţinerea unei potriviri a acestor antigeni în cazul unor transplanturi de organe de la indivizi neînrudiţi. ambele lanţuri de celule T receptoare au regiuni variabile. Celule T Celulele T recunosc un antigen atunci când le este prezentat într-o formă adecvată. 10. ambele fiind membre ale familiei de „supergene".3. Citokinele Fazele de desfăşurare ale imunităţii naturale şi specifice (împotriva virusurilor şi bacteriilor. sunt în mare parte mediate de hormoni proteinici numiţi citokine. Celulele receptoare T prezintă două lanţuri. alfa şi beta. de exemplu). Aceste similarităţi au dus la presupunerea că genele pentru celulele T receptoare îşi au originea în aceleaşi gene părinte ca genele pentru imunogiobuline. Sunt implicate în recunoaşterea antigenilor de către majoritatea celulelor T. Acestea sunt glucoproteine de la suprafaţa celulelor şi au un grad avansat de polimorfism genetic. Fig.Structura unor antigeni 10. Majoritatea indivizilor care nu sunt înrudiţi prezintă antigeni HLA diferiţi. Antigeni de histocompatibilitate Aceşti antigeni nu sunt atât de bine definiţi. În figura 131 se prezintă structura acestor antigeni.10.

Când aceeaşi celulă ţintă secretă citadine acţiunea se numeşte autocrină. citokinele sunt un grup divers de glicoproteine. ca şi alţi hormoni polipeptidici iniţiază acţiunea lor prin legarea la receptorii specifici de pe suprafaţa celulelor ţintă.interleuchina.interferonii tip I. Limfocitele şi fagocitele mononucleare produc şi alte citokine numite factori stimulatori ai coloniei.De asemenea. proprietate numită pleiotropism. 206 . . Majoritatea răspunsurilor celulare la citokine este lentă. Citokinele nu sunt stocate ca moleculele pre-formate şi sinteza lor este iniţiată de o nouă transcripţie genică. . citokinele acţionează ca regulatori ai diviziunii celulare. când o celula din apropriere secretă citokină.citokinele. citokinele influenţează sinteza altor citokine. ƒ stimulatori ai creşterii leucocitelor imature şi ai diferenţierii (produşi de limfocite stimulate şi alte celule). . Celulele T produc câteva citokine ce reglează activarea. având următoarele proprietăţi generale: . de exemplu).factorul de necroza tumoare. după o perioadă de câteva ore şi necesită un nou ARNm şi sinteza proteică. majoritatea citokinelor sunt produse de limfocitele T activate şi se numesc limfokine. creşterii şi diferenţierii limfocitelor (induse în răspunsul recunoaşterii antigenului specific de limfocitele T). creşterea şi diferenţierea populaţiilor limfocitare variate.multe citokine sunt produse de diverse tipuri celulare. acţiunea se numeşte paracrina.citokinele inflamatorii cu greutate moleculară joasă. Citokinele produse deci de tipuri celulare diverse. -1. adică ca factori de creştere (de pildă. asupra multor tipuri de celule diferite. Aceste citokine sunt molecule efectuare ale imunităţii imediate celular şi sunt. de fapt fiind implicate mai multe citokine diferite). moleculele de ARNm sunt instabile. citokinele influenţează acţiunea altor citokine (doua citokine pot avea acţiune antagonică. Alte citokine. ca factori de creştere epiteliali şi mezenchimali în repararea tisulară). monokinele joacă roluri importante fiind continuatori ai activării limfocitelor. amplificând astfel mecanismele pentru răspunsurile imune specifice. Expresia multor receptori ai citokinelor este reglată de semnale specifice (care pot fi alte citokine.ori sinergică-efect crescut ori adiţionale). Funcţiile citokinelor sunt clasificate astfel: ƒ mediatori ai imunităţii naturale (induse de agenţi infecţioşi din fagocitele mononucleare). de asemenea. In imunitatea specifică. .interleukina-6: . Prin urmare. derivate din celulele T activează şi reglează celulele inflamatorii care sunt fagocitele mononucleare. Citokinele ce mediază imunitatea naturală Citokinele ce mediază imunitatea naturală împotriva infecţiei virale şi pe cea care iniţiază reacţiile inflamatorii împotriva bacteriilor sunt următoarele:. Activarea transcripţională este tranzitorie. iar când o celulă este stimulată de la distanţă prin citokinele secretate în circulaţie. Pentru multe celule ţintă. ce stimulează creşterea şi diferenţierea leucocitelor imature in măduva oaselor. ƒ regulatori ai activităţii.secreţia citokinelor este un eveniment self-limitat scurt. . . neutrofilele şi eozinofilele.citokinele sunt produse în timpul fazelor efectuare ale imunităţii naturale şi specifice şi servesc medierii şi reglării răspunsurilor imune şi inflamatorii.acţiunile citokinelor sunt deseori redundante. Odată sintetizate citokinele sunt rapid secretate. . combinaţia unei perioade scurte de transcripţie cu o durată de viaţă a ARNm pentru citokine determină caracterul tranzitoriu al sintezei citokinelor. acţionează de asemenea. responsabile pentru comunicaţiile dintre celulele sistemelor imune şi inflamatorii. ƒ activatori ai celulelor inflamatoare nespecifice (induse ca răspuns la recunoaşterea antigenului specific de limfocitele T). ca in cazul hormonilor adevăraţi. acţiunea este endocrină.

3.în acelaşi timp. sinteza care interferă cu replicarea ADN ori ARN viral. Deoarece majoritatea limfocitelor citolitice recunosc antigenele străine legate de clasa I de antigene ale complexului major de histocompatibilitate IFN ajută faza efectuare a răspunsurilor imune mediate celular. ca 2-1oligoadenilat. etc. Această acţiune este datorită aceloraşi enzime care inhibă replicarea virală dar şi inducţiei altor enzime ce previne sinteza aminoacizilor. ca principal factor de creştere. iar în concentraţii mari poate avea efecte letale (deprimă contractilitatea miocardului. 6. Se spune că o celulă care a răspuns la IFN şi este rezistentă la infecţia virală se află intr-o stare antivirală. FNT stimulează fagocitele mononucleare şi alte celule Nn produc citokine.) Interleukina-1 (IL-1) Funcţia principală a IL-1 este acea de mediator al răspunsului inflamator în imunitatea naturală. Acţiunea antivirală a IFN este de tip paracrin. IFN poate inhibă faza cognitiv a răspunsurilor imune. hepatocitele să sintetizeze anumite proteine serice. Local.). FNT activează leucocitele inflamatori pentru a omorî.etc. IFN inhibă proliferarea celulară. 3. Prin urmarea cele trei activităţi funcţiilor litice ale limfocitelor ucigaşe si creşterea in expresia moleculelor din clasa I a complexului major de histocompatibilitate. 207 . De asemenea JFNT exercită acţiuni sistematice diverse (este un hidrogen endogen. FNT permite celulelor endoteliale să devină adezive pentru leucocite iniţial pentru neutrofile. Sursa celulară a IL-1 este fagocitul mononuclear activ. 4. acţionează concertat eradicarea infecţiei virale. FNT exercită o acţiune protectoare împotriva viruşilor şi amprente expresia clase I de molecule ale complexului major de histocompatibilitate potenţând liza mediata de limfocite asupra celulelor infectate viral. mărind eficienţa uciderii. fibroblaste. etc. acest factor măreşte proliferarea celulelor T CD şi creşterea şi diferenţierea celulelor B. 5. FNT este un costimulator al activităţii celulei T. etc având două acţiuni binecunoscutele hepatocite (care sintetizează fibrinogen ce contribuie la faza acută) şi pe celulele B. astfel: 1. IFN modulează expresia moleculară autogenelor de histocompatibilitate. adică celula infectată viral secretă IFN pentru protecţia celulelor vecine încă neinfectate. IFN creşte potenţialul letal al limfocitelor nativ ucigaşe. 5. în special neutrofilele dar şi eozinofilele mononucleare. apoi pentru monocite care se acumulează la locurile inflamaţiei. Acei interferoni cresc expresia moleculelor din clasa I şi inhibă expresia celor din clasa II. în special IL-1 Ni IL-6. al concentraţiei scăzute (cea 10-9 M) acţionează local ca regulator paracrin şi autocrin al leucocitelor şi celulelor endoteliale. 2.Interferonul tip (IFN I) Include două grupe de proteine distincte serologic şi anume IFN-A (produse de fagocit molecular în principal) şi IFN-B (produse de fibroblast) având patru acţiuni biologice: 1. Acest factor. cauzează trombon intravasculară. în special a aminoacizilor esenţiali ca triptofanul. FNT induce sinteza CSF de către celule endoteliale şi fibroblaste. Interleukina-6 (IL-6) Este sintetizată de celule endoteliale. simulează fagocitele mononucleare să secrete IL-1 Ni IL 6. 4. Factorul de necroză a tumori (FTN) Este principalul mediator al răspunsului gazdei la bacterii gram negative. stimulează diferite celule în răspunsul imun. 2. Sursa celulara majoră a acestui factor sunt fagocitele mononucleare activate de lipopolizaharidul (endotoxina) derivat din peretele celular al bacteriei. IFN de tip I inhibă replicarea virală: IFN induce sinteza unui număr de enzime. reduce presiunea sanguina şi perfuzii. prevenind activarea ajutătoare.

Acţionează de asemenea pe limfocitele T din apropiere (pe ambele substraturi CD şi CD) şi deci este totodată şi un factor de creştere endocrin. Ele servesc ca principali mediatori secundari ai inflamaţiei. IL-4 este singurul factor comutator cunoscut pentru producerea IgE. Principalele ei acţiuni pe limfocite sunt: Interleukina-2 este factorul de creştere endocrin major pentru limfocitele T Ni cantitatea de IL-2 sintetizată de celulele T CD activate este un determinant important al magnitudinii răspunsurilor imune. 208 . s-a sugerat recent că IL-4 poate contribui si la imunitatea mediată celular. menţionăm că în structura tridimensională a proteinei a fost identificat recent un helix necesar pentru folding-ul terţiar bioactiv—care este un mănunchi afla. creşterea şi diferenţierea Aceste citokinele sunt produse în principal de limfocitele active antigenic. Citokinele ce reglează activarea limfocitelor. deci ea funcţionează ca un factor de creştere endocrin. 3. IL-2 acţionează pe celulele B umane ca un factor de creştere cât şi un stimul pentru sinteza anticorpilor. β factorul de transformare a creşterii (β -FTC).Citokinele inflamatorii cu greutate moleculara joasă: familia interlekina-8 Aceste citokine inflamatorii derivă din: a. 2. Deoarece IL-2 este considerat in prezent o "cheie" în imunologia celulei T şi un agent terapeutic promiţător în lupta anticanceroasă. interleukina4. Citokinele ce acţionează primar pentru a regla limfocitele. Aceste celule T sunt utile atât pentru răspunsul imun mediat umoral. sunt interleukina-2. Interleukina (IL-4) IL-4 este produsă de celule T CD Ni are efecte importante pe patru timpuri de celule: IL-4 este un factor de creştere şi diferenţiere pentru limfocitele B (putând fi necesară atât pentru proliferare cât şi pentru secreţia anticorpilor de celulele B ca răspuns la antigenele proteice). Interleukina-2 (IL-2) IL-2 este principala citokină responsabilă pentru trecerea limfocitelor T de la fazi G la faza S a ciclului celular.3 nm). cât şi pentru acela mediat celular. c. ce nu circula în sânge pentru a acţiona la distanţă şi de aceea nu este considerată un factor de creştere endocrin. În timpul răspunsurilor imune fiziologice. IL-4 este un factor de creştere pentru mastocite şi acţionează sinergic cu IL-3 Nn stimularea proliferării mastocitelor. IL-4 este de asemenea un factor de activare a macrofagelor (chiar dacă efectele de potenţare sunt mai reduse decât efectele gama-interferonului). în special din subsetul CD. CD acţionează pe aceleaşi celule care o produc. De asemenea.celule endoteliale. fagocite mononucleare. gamainterferon şi limfotoxină.helical antiparalel (0. celule T activate antigenic. b. IL-4 este un factor de creştere autocrin pentru un subset de celule T CD clonate c secretă IL4JL-5 Ni IL-6 în contrast cu majoritatea clonelor cere produc IL-2. plachete. Este produsă în special de celulele T. fibroblaste sau celule epiteliale. capătul C-terminal formând helixul ce se extinde de la poziţia 117 la 133 în secvenţele de aminoacizi. în mare parte prin secreţia citokinelor. IL-2 stimulează creşterea celulelor nativ ucigaşe şi măreşte funcţia lor catalitica (sunt produse aşa numite celule killer-activate de limfokinază). 1. 4.

FC biologic activ. Gama-IFN creşte expresia moleculară din clasa I de antigene a complexului major de histocompatibilitate. Ca o citokină. 2. β .FTC determina creşterea de noi vase sanguine. inhibă maturarea celulelor CTL1. β . Interleukina-5 (IL-5 ) Este produsă de celulele T CD activate şi mastocitele activate. De exemplu. inhibă activarea macrofagelor. un proces numit angiogeneză. limfotoxină. Citokinele care cauzează modificări funcţionale în favoritele mono nucleare au fost numite factori de activare a macrofagelor. Este produs atât de celulele T ajutătoare CD ce secretă IL-2 cât de celulele T CD. 5. 6.ca şi interferonul tip I . producerea citokinelor şi modificări morfologice ce facilitează extravazarea leucocitelor. Gama-IFN este un activator potent al celulelor nativ ucigaşe (mai mult decât IFN tip l). Gama-IFN este un activator important al fagocitelor mononucleare. Astfel. Gama-IF acţionează direct pe limfocite T şi B pentru a promova diferenţierea.Factorul β de transformare a creşterii ( β . β . anumite tumori pot scăpa de un răspuns imun secretând mari cantităţi de β . Limfotoxina Limfotoxina este sintetizată de celulele T şi de obicei acţionează local ca un factor paracrin şi nu ca mediator al injuriei sinteticele este un activator potent al neutrofilelor furnizând limfocitelor un mijloc de reglare a reacţiilor inflamatorii acute. Acţiunile acestui factor sunt pleiotropice. Gama-IFN este un activator al celulelor endoteliale vasculare (promovând adeziunea limfocitelor CD şi alterează caracterele morfologice ce facilitează extravazarea limfocitelor). acest interferon are următoarele funcţii: 1. Gama-IFN activează neutrofilele (însă mai puţin decât FTN sau limfotoxină). LT este.FTC este potenţiala important deoarece antagonizează multe răspunsuri ale limfocitelor. determină expresia moleculară din clasa 11 a acestui complex. Interferonul imun sau gamma (gamma-IFN) Acest interferon (numit şi interferonul tip II) induce . IL-5 este capacitatea de a stimula centra şi diferenţierea eozinofilelor şi de a activa eozinofilele mature ca acestea sa poată omorî helminţii. însă are câteva proprietăţi legate de imunoreglare care ii separă funcţională de IFN tip I. interleukina-5 şi factorul de inhibare a migrării. uneori însă poate fie să inhibe creşterea aceluiaşi tip celular în cultură. la o varietate de tipuri celulare. 4.FTC inhibă proliferarea celulelor T la miogen policlonali. în contrast cu IFN tip I care. 3. 209 . Astfel.FTC cauzează sinteza proteinelor matrice extracelulare asemenea. În vivo. O acţiune importantă. El induce direct sinteza enzimelor ce permit macrofagelor să omoare microbii fagocitaţi. El inhibă creşterea multor tipuri celulare şi stimulează creşterea altora.FTC. Citokinele ce activează celulele inflamatorii Aceste citokine provin în principal din limfocite T CD şi CD şi servesc în special activării funcţiilor celulelor efectoare nespecifice. aceste citokine mediază faza efectoare a răspunsurilor imune mediate celulare şi ele includ gama-interferon. de asemenea un activator al celulelor endoteliale vasculare acuzând creşterea aderării leucocitelor la endoteliu. etc.FTC) Celulele T activate antigenic cât şi macrofagele activate secretă β .o stare antivirală şi antiproliferativă. gama-IFN este principalul factor de activare a macrofagelor şi el furnizează mijloace prin care celulele T activează macrofagele. În imunoreglare. β .

fagocitele mononucleare. În concluzie. vizează progeniturii hematopoietice comutaţii la linia limfocitelor B. . diferite izotipuri de anticorpi se leagă la receptorii Fc pe eozinofile. Acest factor nu reprezintă o citokină unică. adică celulelor canceroase. Acţiunile acestor citokine sunt influenţate de alte citokine. Limfocitele T helper şi citolitice specifice pentru antigenele proteice străine recunosc deci simultan două structuri. celulele T recunosc şi răspund la antigenele proteice străine numai când antigenul este ataşat de suprafaţa altor celule. fiind donate molecule cu această activitate. antigenul străin şi o moleculă MHC self. De exemplu. cum sunt integrinele. în timp ce IL-l. acţiunea inteleukina-7. Celulele T recunosc antigenul numai pe suprafaţa celulelor accesorii. factorul de stimulare a coloniei granulocite-macrofag. Relaţii de cooperare între componentele sistemului imun Antigenele macromoleculare conţin epitopi multipli sau determinanţi. recent descrisă. respectiv macrofagele). activează sistemul complement. factorul de stimulare a coloniei granulocitelor B.limfocite B. adică a "hibridoamelor"ce produc anticorpi monoclinali.Factorul de inhibare a migrării Acumularea fagocitelor mononucleare în ţesuturi depinde de reţinere acestor celule ca răspuns la citokinele produse local ce inhibă motilitatea. complex major de histocompatibilitate. În plus. obsonizează antigenele şi amplifică fagocitoza lor de către diferite celule. Ele servesc creşterii chiar şi a celulelor nemuritoare. LT. Mediatorii creşterii leucocitelor imature B ai diferenţierii lor sunt interleukina-3 de stimulare a coloniei macrofagelor. Se considera în prezent că reţinerea leucocitele în ţesuturi este controlată de exprimarea recepţionerilor specifici pentru moleculele matrice extracelulare. Moleculele de anticorpi secretaţi neutralizează antigenele. prezente pe suprafaţa celulelor accesorii sau celulelor ţintă. interleukina-7. Celulele accesorii cel mai bine definite pentru limfocite T helper includ: . în asociaţie cu produsul unei gene a self-ului. Se ştie că maturarea unei leucocite implică comutarea la o linie particulară cu pierderea capacităţii de dezvoltare în alte tipuri de celule mature. măresc răspunsul la aceşti factori. Citokine ce stimulează hematopoieza Reacţiile imune şi inflamatorii care consumă leucocitele induc producerea de noi leucocite care înlocuiesc celulele inflamatorii. mastocite şi celule native ucigaşe şi stimulează funcţiile acestor celule ca pe o consecinţă a legării antigenului. Prin urmare. 10. gama-IFN. IL-6 acţionează ca factor de creştere pentru multe celule maligne plasmatice (plasmacitoame sau mieloame) B. Anticorpi sunt produşi in RER al celulei B. De exemplu FNT.4. . Alţi receptori Fc de pe celulele epiteliale mediază transportul transepitelial al anticorpilor IgA si IgG. citokinele exercită numeroase funcţii utile organismului. însă în cazul producerii lor excesive se poate instala dezordinea tisulară şi chiar moartea. lg de la suprafaţa celulei B este receptorul celulei B pentru antigen. 210 .celule dendritice (celule de prezentare. fiecare din aceştia putând fi recunoscuţi de un anticorp. FTC inhibă creşterea celulelor din măduva oaselor. astfel multe celule tumorale ce cresc autonom secretă IL 6 ca un factor de creştere autocrin. În timp ce interleukina-3 (cunoscută ca factor de multitudine) promovează expansiunea celulelor ce se diferenţiază în toate tipurile de celule mature cunoscute. IL-6. IL-6 promovează creşterea celulelor somatice hibride produse prin fuziunea celulelor B normale cu celule mielomului. în timp ce celulele B şi anticorpii secretaţi leagă antigenele solubile aflate în circulaţie sau în faza apoasă. Mai mult. Citokinele ce stimulează expansiunea şi diferenţierea progenitorilor din măduva oaselor sunt denumite factori de stimulare a coloanei (FSC).

Reglarea expresiei genelor complexului major de histocompatibilitate clasa II reprezintă un punct de control important pentru răspunsurile imune.ele pot funcţiona activând ori reglând celula B. Rezultatul legării antigen-complex major de histocompatibilitate la celulele T este o serie de evenimente intracelulare numite cu un termen comun activarea celulei T care începe cu generarea celui de al doilea mesager şi terminarea cu dezvoltarea funcţiilor efectuare şi proliferarea celulei T. care sunt procesate şi asociate cu moleculele complexului major de histocompatibilitate clasa I. cu anticorp anti-lg sau prin alţi activatori policlonali. 211 . CD4 şi CD8 sunt glicoproteine de suprafaţa exprimate exclusiv pe sub seturi de celule T mature cu modele distincte de restricţie a complexului major de histocompatibilitate. Diviziunea mitotică a celulelor T are ca rezultat expansiunea clonelor de celule cu aceiaşi specificitate antigenică şi astfel amplifică răspunsurile imune la un antigen particular. Genele complexului major de histocompatibilitate clasa I funcţionează ca gene ale răspunsului imun. miastenia gravis. celulele B exprimă receptori de înaltă afinitate pentru câteva citokine incluzând IL-1. creşterea concentraţiei în calciul citoplasmatic. Aceste complexe sunt exprimate pe suprafaţa celulelor accesorii. Limfocitele T helper CD+4 recunosc antigenele în asociaţie cu produsele clasei a doua a complexului major de histocompatibilitate şi celulele CD+8.beta) legaţi prin legături disulfidice ce sunt omologi moleculelor Ig. Proteinele exogene străine sunt internalizate în celulele accesorii unde suferă procesarea într-un compartiment vezicular acid. Prin urmare. produsele lor se leagă selectiv şi prezintă unele antigene. De exemplu. În plus la Ig şi clasa II ale complexului major de histocompatibilitate (cu rol în interacţiunea celulă T-B). apoi câteva proteine sunt fosforilate.anticorpi împotriva proteinelor de suprafaţă pot fi utilizaţi să localizeze şi să trateze tumori derivate din limfocitele Bd) unele proteine de suprafaţă sunt receptori pentru citokine. Aceste proteine de pe suprafaţa celulelor B sunt importante deoarece: . . răspunsurile anticorpului sunt iniţiate prin interacţiunea antigenului cu molecule Ig specifice de membrană de suprafaţa limfocitelor B. Multe tipuri celulare au capacitatea de a prezenta antigenele celulelor T ajutătoare CD+4. IL-2. Anomaliile antigenelor de histocompatibilitate asociate unor boli ca spondilita anchilozantă. hemocromatoza idiopatică. activitate crescută a proteinkinazei C. CTL 1 recunosc antigenii în asociaţie cu produsele genice din clasa întâia complexului major de histocompatibilitate.. artrita reumatoidă. Antigenele ţintă pentru CD+8 CTL sunt proteine sintetizate endogen.000 per celulă). astfel ca antigenele virale. . Pe limfocitele B se găsesc markeri fenotipici şi moleculari funcţionali de suprafaţă. Aceşti receptori leagă specific antigenul procesat complexat la moleculele complexului major de histocompatibilitate de suprafaţa celulelor (APC 1).celule Langerhans ale pielii. Aceşti mesageri secundari stimulează transcripţia genelor necesare pentru răspunsurile proliferative şi efectoare ale celulei T. Celulele T limitate la un complex de histocompatibilitate exprimă clonal receptori proteici heterodimerici (alfa. diabetul insulinodependent etc). IL-4. . În general celulele B în repaos exprimă un număr scăzut de receptori pentru citokine (de la câteva sute la 1. Procesarea asigura ca porţiuni ale unei proteine (heptone imunodominante) se vor lega la moleculele clasei II a complexului major de histocompatibilitate şi vor forma complexe imunogenice.ele pot fi de markeri fenotipici de maturitate şi ai liniei de celule B. limfocitele B exprimă o varietate de proteine de suprafaţă cu semnificaţie funcţională (incluzând receptorul C3d pentru virusul Epstein Barr). Cele mai timpurii evenimente din această cascadă includ modificarea fosfolipidelor membranare. sindromul Sjogren cât şi o serie de boli autoimune (de exemplu lupusul sistemic eritomatos.celulele endoteliale. unde sunt recunoscute de celulele T CD+4. IL-5 şi IL-6. dermatita herpetiformă. însă exprimarea acestora este crescută pe celulele B stimulate via Ig din membrană. dar nu altele.

alte leucocite şi granulocite participă în faza efectuare a răspunsurilor imune specifice. Capacitatea macrofagelor şi limfocitelor de a-şi stimula unele altora funcţiile dovedesc un mecanism de amplificare importantă pentru imunitatea specifică. numite şi celule inflamatorii.Această interacţiune stimulează celulele B să intre în ciclul celular. Ele fagocitează particule opsorizate şi funcţionează ca celule efectuare ale imunităţi umorale. Macrofagele astfel activate sunt mai eficiente in realizarea funcţiilor fagocitice. migrând şi acumulându-se la locuri de activare a complementului. T şi B. eritemul. În acest fel. ƒ macrofagele produc citokine care recrutează alte celule inflamatorii. mediatori derivaţi din lipide. Eozinofilele exprima receptori Fc pentru o clasă de anticorpi IgE. Granulocitele. ƒ Macrofagele produc de asemenea factori de creştere pentru fibroblaste şi endoteliul vascular ce promovează repararea ţesuturilor vătămate. În plus. ele distrug 212 . ƒ în faza de efectuare a răspunsurilor imune mediate celular celulele T ajutătoare secretă citokine ce activează macrofagele. Interacţiunea limitată la complexul major de histocompatibilitate dintre celula B şi limfocitele T ajutătoare furnizează ea însăşi semnale activatoare celulelor B restante şi conduce la secreţia diverselor citokine de către celulele T. Diferite citokine induc proliferarea celulelor B. degradative şi citolitice decât celulele nestimulate. de exemplu eritrocite senescenţe). fiind efectori importanţi in reacţiile imune la antigenii ce induc nivelele ridicate de IgE. limfocitelor T ajutătoare. deoarece joacă roluri importante în inflamaţie şi imunitatea naturală. ca microbii. macromolecule. În plus. astfel ca paraziţi. Astfel. substanţele fagocitate sunt degradate de enzimele lizozomale. Principalele funcţiuni ale fagocitelor mononucleare (monocite. au şi funcţia de a elimina microbi şi celulele moarte. macrofagele figurează printre principalele celule efectuare ale imunităţi medie celular. În plus. specii reactive de oxigen. ele leagă şi fagocitează particulele opsonizate mult mai avid decât pe cele neînvelite (neopsonizate). Deoarece macrofagele exprimă receptori de suprafaţă pentru anticorpi şi anumite proteine ale complementului. creşterea temperaturii locale). Fagocitele mononucleare joacă următoarele roluri în faza cognitivă. Neutrofilele răspund rapid la stimuli chemotactici putând fi iniţial activate de citokinele produse de macrofage. Ele sunt stimulate ca şi macrofagele. probabil via producere de mesageri secunzi intracelulari. toate acestea omorând microbii. în faza efectuare a răspunsurilor imune umorale antigene străine. aceste celule secretă enzime. Ele secretă şi conţin în membrană proteine ce promovează activarea celulei T. ca prostagladinele. de citokinele derivate din celula T şi fagocitează particule opsonizate. prezentând antigenele celulelor T şi secretând citokine ce promovează expansiunea şi diferenţierea ambelor feluri de limfocite. secreţia anticorpilor şi alte trăsături ale răspunsului imun umoral la antigenele proteice. în special neutrofile şi sunt responsabile pentru multe din efectele sistemice ale inflamaţiei ( febra. devin învelite sau opsorizate de anticorpi şi proteine ale complementului. controlând întinderea infecţiei şi pot vătăma chiar ţesuturile normale în imediata vecinătate. incluzând antigene şi chiar ţesuturi proprii vătămate ori moarte. macrofage) în imunitatea naturală includ următoarele: ƒ macrofagele fagocitează particule străine (microbi. tumefierea. Ele posedă receptori pentru porţiunea Fc a anticorpilor şi pentru proteinele complementului. Celulele accesorii (de exemplu macrofagele) pot juca un rol important în iniţierea răspunsului imun. de activare şi efectuare a răspunsurilor imune specifice: ƒ Macrofagele dispun antigene străine pe suprafaţa lor intr-o formă ce poate fi recunoscută de limfocitele T antigene specifice. macrofagele participă la eliminarea antigenelor străine prin răspunsuri imune umorale. antigenele proteice ale celulei T sunt procesate de către celulele B şi prezentate în asociaţie clasa II de molecule ale complexului major de histocompatibilitate. la limfocite şi fagocitele mononucleare.

in alergie. Interacţiunea antigenelor cu aceste molecule IgE stimulează bazofilele şi mastocitele de a excreta conţinutul granulelor lor. Prin urmare. când rezultă un defect în unul din efectorii sistemului imun (limfocitele T şi B. au acţiunea antivirală. atunci când acest lucru este necesar. Imunopatia instalată în anumite cazuri poate conduce deci la cronicizare ori moarte. Administrarea citokinelor sau a inhibitorilor lor constituie o abordare potenţială pentru modificarea răspunsurilor biologice asociate cu boală. Creşterea şi diferenţierea eozinofilelor sunt stimulate de o citokină derivată din celula T helper numită interleukina-5. ƒ inducţia linfokinelor antitumorale sau facilitarea efectelor lor. opsonizarea sau dizolvarea antigenilor. în funcţe de natura lor. iar altele cu efectuarea acţiunii.5.celulele T efectoare – distrug antigenii sau determină inflamarea ca răspuns la acţiunea antigenului. S-a stabilit că limfocitele sunt celule care iniţiază răspunsul imunitar specific şi care posedă memorie imunitară. Este ştiut că interferonii. Cum s-a spus anterior. Eozinofilele sunt activate şi de alţi anticorpi ca formula secretată AigA. citokinele asigură mecanisme de amplificare importante ce fac capabile limfocitele în număr scăzut. Eozinofilele sunt numeroase la locurile reacţiilor de hipersensibilitate imediată. aceste granulocite sunt celule efectuare ale hipersensibilităţi imediate datorită IgE. astfel: . celulele B produc anticorpi. acţiunea celulelor T efectoare şi a celulelor B. Limfocitele efectoare sunt de două tipuri: celule B şi celule T. ƒ activarea celulelor imune. care sunt mediatori chimici ai hipersensibilităţi imediate.celuleT supresoare – suspendă. Celulete T pot fi la rândul lor împărţite în trei categorii. să activeze o varietate de mecanisme efectuare pentru a elimina antigenul. . 213 . 10. responsabili cu neutralizarea. În sfârşit. Pe de altă parte. deci implicit. fagocite. de exemplu. Astfel. Baza umorală a răspunsului imun Este mediată de celulele B. specifice pentru oricare antigen. citokinele servesc multor funcţiuni ce sunt critice în apărarea împotriva agenţilor patogeni şi furnizează legături între imunitate specifică şi naturală. . astfel încât activarea celulei T herper poate contribui la acumularea eozinofilelor la locurile cu reacţii de infestare parazită şi alergice. Citokinele reglează de asemenea amplitudinea şi natura răspunsurilor imune prin influenţarea creşterii şi diferenţierii limfocitelor. producţia excesivă ori acţiunile citokinelor pot conduce la distrucţie tisulară şi chiar moarte.celule T ajutătoare – actionează pentru pregătirea terenului de acţiune a celulelor T efectoare şi supresoare şi a celulelor B. Unele dintre ele sunt responsabile cu recunoaşterea. datorate producerii de anticorpi IgE. Bazofilele şi mastocitele exprimă receptori de înaltă afinitate pentru IgE şi leagă astfel anticorpi IgE. antiproliferativă şi imuno modulatoare. De pildă efectele antitumorale ale interleukinei-1 pot fi înregistrate prin 3 mecanisme: ƒ direct citolitic. De asemenea. producătoare de Ig.helminţi ce rezistă deseori enzimelor lizozomale ale neutrofilelor şi macrofagelor. proteinele complementului) se vorbeşte de imunocompromis. acţiunea celulelor T ajutătoare.

care pot fi uşor recunoscute datorită prezenţei pe suprafaţa lor a imunoglobulinelor. Acesta nu este un proces specific.10.lanţ de suprafaţă. Ele au determinanţi antigenici şi repetabili şi determină un răspuns cu IgM. C . alţii decât epitopi. în prelucrarea antigenelor.2. O astfel de celulă pare capabilă să producă mai multe tipuri de imunoglobuline. Celulele B Anticorpii sunt produşi de către celulele B. 10. în reglarea tipului de răspuns şi amploarea răspunsului imunitar. IgA şi IgE. Procesul ce are loc la nivelul celulelor macrofage este o parte esenţială a procesului de generare a răspunsului imun care implică celulele T. Din cauza tipului de acţiune desfăşurat de către macrofagi. 132 . Astfel. ajutătoare şi supresoare.1. IgA sau IgE. acestea sunt denumite celule de prezentare (sau auxiliare). iar cel secundar preponderant IgG (fig.două tipuri ce celule T.5. inclusiv interleukine 1.5. Tipul final de imunoglobulinăde la suprafaţă pare să prezinte natura anticorpului produs de celulă. Antigenul purtat de către macrofag este apoi „prezentat" limfocitelor care sunt predeterminate să reacţioneze la antigen. Macrofagele au rol în concentrarea şi prezentarea unor antigene. 214 . poate trece la producerea de IgM şi IgD pentru ca în final să producă IgG. Asemenea substanţe pot provoca proliferarea nespecifică a celulelor B de memorie (celule produse care prezintă aceleaşi imunoglobuline la suprafaţă). S . Producerea de anticorpi Producerea de anticorpi implică cel puţin patru tipuri de celule: . pe măsură ce se maturizează.Ciclul de dezvoltare al celulelor B. răspunsul primar fiind preponderent IgM. O parte din celulele B răspund direct la antigenii numiţi antigeni Tindependenţi. Fig. nu cu IgG.celulele macrofage ─care acţionează ca celule de prezentare . Pentru aceste acţiuni nespecifice pot fi responsabili şi alţi determinanţi. Prezentarea antigenilor Primul stadiu al răspunsului imun la acţiunea oricărui tip de antigen implică modificarea antigenului de către macrofagi. de accea sunt cunoscute sub denumirea de celule B policlonale mitogene. 132). .celule B. Această secvenţă de maturare se potriveşte cu cinetica răspunsului.lanţ citoplasmatic. Calitatea răspunsului este îmbunătăţit de prezenţa celulelor macrofage datorită. probabil. producerii de factori solubilizanţi. de la producerea de IgM.

Celulele T sunt de aceea denumite ajutătoare. antigenii sunt denumiţi antigeni T-dependenţi. ele pot încă să stimuleze un răspuns la celulele B. ea ajută pe de o parte celulele B. Celulele T de la un individ nu pot coopera cu celulele macrofage şi celulele B de la altul. Răspunsul imunitar mediat de celule Răspunsul specific antigenului mediat este generat de celule limfocitare T. Celulele T pot să: dezintegreze antigenii specifici: citotoxicitate. Celule B. Este nevoie de încă un semnal de activare pentru stimularea acestor celule B. Unele din aceste glicoproteine se găsesc doar la celulele T. Antigenii de clasa II joacă un rol important în activitatea celulelor ajutătoare T. celulele supresoare T sunt specifice unui anumit antigen. Când o celulă ajutătoare T întâlneşte un antigen pentru prima dată. Ele par să fie capabile să lege direct antigenul. 10. la animalele de experiment injectarea repetată a unor doze relativ mari de antigen poate duce la toleranţă în care nu este produs nici un anticorp specific ca răspuns la acţiunea antigenului. Ele pot fi recunoscute de anticorpii monoclonali.6. acţionând mai degrabă asupra celulelor ajutătoare T dect asupra celulelor B. Recunoaşterea antigenului implică mai mulţi receptori la suprafaţa celulelor T ajutătoare. fără a necesita şi acţiunea celulelor de prezentare. Răspunsul imunitar la o expunere ulterioară va fi mai rapid şi mult mai viguros. iar haptenele libere pot reacţiona cu anticorpii. Acestea au pe suprafaţă o glicoproteină specifică CDS.Majoritatea celulelor B însă nu răspund direct în majoritatea antigenilor chiar când aceştia sunt prezentaţi de celulele ajutătoare adecvate. disponibile atunci când individul va fi din nou supus acţiunii antigenului. pe când capacitatea de răspuns la alţi antigeni rămâne nemodificată. Celulele T ajutătoare Acţiunea celulelor T este specifică antigenului. Ca şi celulele T ajutătoare. sugerând faptul că factorul solubilizant eliberat de celulele T mediază efectul de ajutorare a celuleor B. iar pe de altă parte declanşează un proces de transformare şi proliferare care are ca efect o creştere a numărului de celele ajutătoare T specifice. Deoarece semnalele sunt în mod normal generate de celulele T. Ele recunosc apoi aceeaşi combinaţie de antigen şi antigen de clasa II specific celulei B corespunzătoare. iar funcţia lor nu este în totalitate cunoscute. elibereze substanţe solubile biologic active (limfokine) care stimulează inflamarea: hipersensibilitate întârziată. 215 . Celulele ajutătoare T recunosc la celulele de prezentare antigenul şi antigenul HLA de clasa II ca un complex. Adăugarea celulelor T determină un răspuns. Doar celulele ajutătoare T care au răspuns la antigenul prezentat de către celulele macrofage poate în continuare să ajute celulele B. de exemplu. haptenele pot fi recunoscute ca antigeni de celulele T doar cuplate cu un purtător. văd acelaşi epitop diferenţiat. Chiar dacă celulele T sunt separate de celulele B printr-o membrană. chiar dacă celulele T singure nu sunt capabile să determine anticorpi. Acţiunea celulelor T supresoare poate fi accentuată de anumite acţiuni de imunizare. Celulele T au glicoproteine de suprafaţă specifice care acţionează ca marcatori care le diferenţiază. De exemplu. care recunosc antigenul prin imunoglobulinele de suprafaţă. Celulele T supresoare Efectele celulelor T ajutătoare sunt contrabalansate de celulele T supresoare.

putând distruge doar celulele care prezintă acelaşi antigen HLA clasa I. reacţia la injecţia intradermală cu tuberculină în cazul testului Hantoux este o reacţie de acest tip. În linii mari. a unor limfocite încă nesensibilizate şi asupra altor celule accesorii. care le transportă la nivelul organelor limfoide secundare.Aceste două tipuri de răspunsuri ale celulelor T sunt mediate de populaţii specifice: citotoxicitatea este determinată de celulele citotoxice T. acestea sunt traduse şi transmise AND-ului care la rândul său v-a ordona diviziunea celulară. 10. Interacţiuni celulare în răspunsul imun Mecanismele de declanşare şi control ale reacţiilor imune sunt complexe şi antrenează o cascadă de reacţii de stimulare sau inhibiţie între diversele populaţii celulare şi speciile moleculare. Limfokinele includ interferon. Macrofagii pot fi de asemenea activaţi de linokine să distrugă paraziţii intracelulari ca microbacteriile. hipersensibilitatea întârziată este determinată de celalele T de hipersensibilitate întârziată. Fracţiunile imunogene sunt proiectate pe membrane macrofagului. celulele sunt apoi imobilizate şi este declanşată inflamarea. succesiunea evenimentelor care au loc după pătrunderea antigenului în organism este următoarea: în câteva minute. Limfokinele sunt substanţe solubile capabite să influenţeze cinetica altor celule inflamatoare. În comparaţie cu celulele T ajutătoare. De exemplu. Clona respectivă începe să se multiplice activ. antigenul este captat de către macrofage şi degradat în fagolizozomi în material neantigenic şi în componente înalt imunogene. prin reacţii de citotoxicitate . Macrofagele la rândul lor. acţionând asupra antigenului fie direct. limfocitele primesc informaţii referitoare la structura imunogenului. Inducerea celulelor citotoxice T necesită celule precursoare şi interleukine – 2 de la celulele T ajutătoare.celule secretoare de imunoglobuline. Celulele citotoxice T Celulele citotoxice T dizolvă celulele infectate cu virusuri. neutrofile şi alte limfocite. fie indirect prin secreţie de imunoglobuline cu funcţii de anticorp. Celulele citotoxice T sunt implicate în rejecţia grefelor. În contact cu antigenii străini. 216 . Când limfocitele B sunt stimulate antigenic ele se divid prin mitoze repetate. în primele momente ale stimulului antigenic proporţia lor in sângele periferic scade considerabil. Prin receptorii pentru antigen. Această citotoxicitate este dependentă de virus şi doar celulele care prezintă proteine virale relevante la suprafaţa lor sunt distruse. Deoarece limfocitele cu receptori pentru antigenul în cauză părăsesc circulaţia şi se localizează în organele limfoide. distrugând celulele infectate înainte de producerea altor particule virale. Celulele efectuare de la nivelul organelor limfoide formează foliculi şi centri germinativi unde îşi vor exercita activitatea distructivă. Sunt atrase la locul unde are loc reacţia de hipersensibilitate întârziatăcelule macrofage.7. celulele citotoxice T sunt foarte importante în faza de refacere. să elaboreze limfokine care vor acţiona asupra macrofagelor. Celulele T de hipersensibilitate întârziată Reacţia de tip hipersensibilitate întârziată este cunoscută de foarte mult timp. dând naştere la clone celulare B. amplificând şi mai mult reacţiile. Ele prezintă specificitate pentru antigenii HLA. Din acestea unele imunoblaste se diferenţiază în plasmocite . eliberează monokine. care este bine cunoscut pentru efectul său antiviral direct. De vreme ce pe suprafaţa celulelor infectate apar proteinele specifice virusului înainte de producerea altor virusuri. Reacţiile determinate de vaccinuri sunt de acelaşi tip. dar care activează de asemenea un tip de celule ucigaşe naturale NK (Natural Killer). celulele T de hipersensibilitate întârziată eliberează limfokine care mediază un răspuns imflamatoriu. Inducerea este declanşată de antigenii de clasa I şi este reglată de celulele T supresoare. celulele citotoxice T recunosc antigenii virali împreună cu antigenii HLA de clasa I.

sunt folosite predominant mecanismele imunităţii mediate umoral împotriva speciilor care trăiesc în afara celulei şi cele alte imunităţii mediate celular contra celor adaptate la viaţa intercelulară. Legarea prin porţiune Fc a complexelor antigen-anticorp la FcR a macrofagului. macrofagul captează antigenul nespecific.macrofag.1. În această interacţiune guvernează aceleaşi restricţii genetice ca acele implicate în interacţiunea limfocite T . adică mijloace de apărare celulară condiţionate insă de prezenţa anticorpilor specifici. funcţiile fagocitare fiind mult activate. poate fi importantă în reacţiile imune faţă de antigene cu moleculă mare. Interacţiunea celulară ar interesa succesiv câte două tipuri de celule legate prin punţi formate de către antigen: macrofag şi limfocit TH ( helper) şi ulterior limfocit TH şi limfocit B. în care macrofagul prezintă antigenul "prelucrat" limfocitelor T şi eventual cel "neprelucrat" limfocitelor B. Unele mecanisme de apărare imună în infecţiile bacteriene În general. complexele se vor ataşa la FcR (receptorul Fc – fragment cristalizat). induce şi formarea unor compuşi chimici simpli. fără a fi însă graniţe rigide între cele două tipuri de reacţii imune. operaţie de care sunt capabile numai celulele cu funcţii fagocitare. 217 . care ar stimula la rândul lor sinteza şi exprimarea pe membrana macrofagului a antigenelor I (asociate regiunii I din MHC – major histocompatibility complex class I). Durata scurtă de viaţă a celulelor efectuare reprezintă un mijloc eficient de stingere a reacţiilor imune. care trebuie "sfărâmate". aceiaşi celulă putând fagocita diferite molecule indiferent de structura lor. 10. datorită proliferării clonale active. cooperarea celulară se instalează atunci când limfocitele sunt expuse stimulilor mitogenici şi nu numai celor antigenici. unde patrulează un timp îndelungat. Astfel se asigură un permanent control homeostatic care menţine cadrul normal al reacţiilor imune. Interacţiunea s-ar putea instala şi simultan. celula care reprezintă antigenul limfocitului T poate fi limfocitul B şi nu macrofagul.Alte imunoblaste se reîntorc la forma de limfocit circulant. rămânând de veghe numai celulele de memorie. o populaţie de celule T ajutătoare (TH) activează multiplicarea şi transformarea unei clone de precursori B spre plasmocite secretoare de imunoglobina dar prin alte canale semnalizează şi celule T supresoare (TS) care vor controla atât proliferarea precursorilor B cât şi cea a limfocitelor TH. fie trecuţi în sânge. nu şi la pronază. devenind celule B cu memorie. cu viaţă lungă. care asigură supravegherea imunologică. După ce complexele antigen-anticorp uşor fagocitabile sunt eliminate din organism. Este un dimer constituit din două jumătăţi C-terminale ale lanţurilor H (grele) de Ig. De asemenea. între toate 3 tipuri celulare (macrofag. celule T şi B) după cum cooperează s-ar putea realiza fără contact intercelular. pregătite să facă faţă unui nou atac. a macrofagului (opsonizare). prin mediatori eliberaţi de limfocitul helper sau ajutător (TH) care ar activa macrofagul sau direct celula B. celulele de memorie încep să revină în circulaţie. declanşându-se imunitatea umorală rapidă. În declanşarea şi controlul răspunsului imun intervin numeroşi factori a căror apariţie şi dispariţie din scenă este ordonată de multiple semnale şi circuite de reglare şi control. Celulele efectuare rămân la nivelul centrilor germinativi unde continuă prolifelarea şi secreţia de limfokine sau monokine. Spre deosebire de limfocitele diversificate clonal. În unele situaţii. celulele efectuare mor.7. Prezentarea antigenului de către macrofag atât celulelor T. De exemplu. cât şi celulelor B. Antigenul formând complexe cu anticorpii. Anticorpii sintetizaţi sunt exocitaţi şi depuşi fie la suprafaţa membranei celulare. Fc este un receptor membranar care leagă Ig. Receptorii Fc sunt glicopreteine rezistente la tripsină. Acestea reţin în memoria lor (în acizii nucleici) primul contact cu antigenul. De asemenea poate interveni şi citotoxicitate anticorpodependentă (ADCC). organul limfoid fiind astfel crescut în volum tumefiat şi edemaţiat. După 24-48 de ore.

În cazul complexelor antigen + anticorp.1. fiind inhibată fuziunea lizozomilor cu fagozomii. iar în absenţa anticorpilor specifici opsonizarea se realizează fie prin activarea complementului pe cale alternativă. Prin urmare. chiar dacă sunt fagocitate de către macrofagele opsonizate. neutralizarea toxinelor bacteriene (realizată aproape exclusive de către anticorpii din clasa IgG) este un mijloc important de apărare (în special în cazul germenilor din genurile Clostridium. care secretă exotoxine). e. granulocitele şi macrofagele au receptori membranar pentru fragmentul Fc sau pentru fracţiuni ale complementului prin intermediul cărora bacteria este "prinsă" pe căi indirecte. care interferând cu adezinele. după fagocitare. nu sunt atacate de enzimele lizozomale. prin factorii C3 sau C4 ai complementului. microvililor. b. "Activarea" fagocitozei sau "opsonizarea" este mediată prin anticorpi din clasa IgG. macrofagele activează funcţiile citotoxice ale limfocitelor T care apoi distruge eficient celulele infectate bacterian (sau viral). Împotriva acestor factori antifagocitari. 10. Proteus. macrofagele. Inhibiţia aderenţei la seroase sau mucoase se realizează de asemenea.10. trebuie să fixeze cca 8.7. este omorâtă de regulă. şi ajung în citoplasmă. În cazul complementelor C3 sau C4. ca şi în cazul hemolizei prin complementare loc ca urmare a activării complementului de către anticorpii care s-au fixat pe bacterie. Este cazul capsulei proteinei M la Streptococcus. ori în absenţa anticorpilor specifici. Toxoplasma etc. typhimurium. In ceea ce priveşte opsonizarea. etc). multiplicarea bacteriei. fie prin agregate de molecule de imunoglobulină fără funcţii specifice pentru bacteria respectivă. inhibiţia aderenţei. bacteriile pot persista timp îndelungat în fagozomi sau distrug fagozomi. Prin mecanisme mediate celular.000 molecule de IgG pe suprafaţa bacteriei. In schimb.1.coli. La rândul lor. bacteria fiind "reţinută" la peretele celulei.2. ale germenilor gram-negativi (cei gram-pozitivi sunt practice rezistenţi). c. sunt activate de limfokine eliberate în special din limfocite T. dar nu şi fagocitoza. pentru a conferi condiţii favorabile opsonizării S. Imobilizarea germenilor ciliaţi sau flagelaţi poate fi realizată practic de către toate clasele imunoglobuline şi se dovedeşte eficientă în frânarea virulenţei unor germeni gram negative (Salmonella. natural şi de celule nativ-ucigaşe (NK). în consecinţă. E. d.). are loc ataşarea la receptorul pentru complement. De exemplu. Nefiind distruse. Mijloace de apărare imună mediate umoral Sunt cunoscute in infecţiile bacteriene: a. se ştie că bacteriile au o serie de factori care le protejează de acţiunea fagocitară a macrofagelor. celula fagocitată şi nu bacteria. Mijloace de apărare imună mediată celular Unele bacterii (M .1. graţie anticorpilor (în special cei din clasa IgA). inhibă aderarea şi. Staphylococcus etc. Bacterioliza dependentă de complement. neutralizarea toxinelor bacteriene. bacterioliza dependentă de anticorpi. Acest mijloc de apărare antimicrobiană nu este important deoarece subiecţii cu deficienţe congenitale în componentele complementului nu sunt mai semnificativ expuşi la infecţii în comparaţie cu cei normali. Astfel simpla opsonizare este total ineficientă deoarece. etc.tuberculosis. proprietăţilor hidrofile ale peretelui celulei bacteriene. Bacteriile sau celulele infectate cu bacterii pot fi lizate spontan. mai susceptibile la liză fiind formele SD. dobândesc proprietăţi citotoxice şi bactericide şi proliferează la locul infecţiei sau inflamaţiei. polizaharizilor capsulari. 218 .7. opsonizarea. imobilizarea germenilor ciliaţi sau flagelaţi. fragmentul FC este fixat la FCR şi bacteria este fagocitată. mecanismele opsonizării includ legarea complexului bacterie-anticorp prin receptorul pentru FC (FCR) sau legarea complexului bacterie-anticorp prin receptorul complement (CR).

Este esenţial ca un sistem imunitar să nu reacţioneze cu celulele gazdă. pentru răspunsul imun devine deci mai slab.disponitilitatea anticorpilor. Mecanismele implicate includ activarea celulelor T supresoare şi eliminarea celulelor ajutatoare T şi a celulelor B corespunzătoare.celulele fagocitare (macrofagii şi leucocitele poliformonucleare care indepărtează antigenii). Intensificarea răspunsului imun Rolul răspunsului imun este distrugerea antigenilor străini.9. 10.zona de pătrundere a antigenului. Inexistenţa auto-toleranţei duce la apariţia bolilor autoimune. . poate împiedica apariţia unui răspuns imun. Există bineînţeles. asemenea anticorpi sunt.sistemul complementar care poate fi să distrugă un organism. Stimulul de bază. 10. autoanticorpi. 219 . Reglarea normală Factorii care reglează un răspuns imun normal sunt multiplii. Întepărtarea atigenilor este influenţată de mai mulţi factori printre care: . 10. dar ei includ disponibilitatea antigenilor şi influenţa anticorpilor anti-idiotip. indiferent dacă aceştia sunt molecule inerte sau organisme. declanşând doar clonele care au receptori cu mare afinitate. Principalii factori sunt: . Anticorpi anti-idiotip Structura zonei de legătură a antigenului este unică pentru fiecare anticorp şi poartă numele de idiotip. fie să faciliteze.2. Se pare că asemenea anticorpi anti-idiotip sunt implicaţi în cazul reglării unui răspuns imun normal.1. Această stare de absenţă a răspunsului este cunoscută sub numele de toleranţă. Disponibititatea antigenitor Răspunsul imun este declanşat în mod natural de antigeni. toleranţa naturală la antigenii proprii.8. .8. prin definiţie. . deoarece orice dezordine poate cauza o boală autoimună sau o boală de imunodeficienţi. ca urmare a proceselor imune care au loc. Reglarea alterată Factorii care reglează răspunsul imun pot fi manipulaţi experimental.concentraţia de antigeni. Rata în care antigenii declanşeză celulele B este probabil un factor important în limitarea producerii de anticorpi. . Sunt produşi anumiţi anticorpi anti-idiotip în cadrul unui răspuns imun normal.10. Ajustarea adecvată a dozei şi a ratei de expunere la un anumit antigen. Anumiţi factori nespecifici pot creşte efectele anticorpilor. Reglarea imunologică Reglarea imunologica este de foarte mare importanţă mai ales în cazul maladiilor umane. Concentraţia de antigeni va scădea în urma metabolizării sau îndepărtării acestora.viteza răspunsului imun. fagocitarea sa.8.

un antigen sau un complex imun. O funcţie majoră sistemului de fagocite mononucleare este fagocitoza organismclor care invadează organismul gazdei şi a altor antigeni. metabolism şi probabil în funcţie.2. în timp ce altele atrag neutrofilele şi macrofagele pentru fazele următoare de opsonizare şi fagocitare. macrofagii trebuie sa fie activaţi în această stare. microorganismele învelite (opsonizate) cu imunoglobuline şi/sau complement sunt mult mai uşor recunoscute de macrofagi şi mult mai repede fagocitate.10. Unele dintre ele cresc permeabilitatea vasculară. Sistemul complement Sistemul complementar constă dintr-o serie de proteine activate pe rând. Macrofagii au în interior nişte granule care conţin diferite enzime degradate cu care distrug materialul fagocitat. Materialul distrus poate fi un organism viabil. Ţesuturile macrofage sunt eterogene în aspect. devenind nediferenţiabile de macrofagi. Fiecare precursor este scindat în două sau mai multe fragmente. Componentele există în mod normal ca şi precursori inactivi. 133 . Limfocitele şi mcrofagele provin din trunchiuri înrudite de celule din măduva spinării. dar o dată activată. celule moarte.Scindarea unei molecule precursoare sub acţiunea unei componenete complementare Fragmentul principal are două zone active biologic: . 10. cum ar fi. unde trăiesc pentru câteva săptămâni sau luni. o componentă complementară poate acţiona ca o enzimă care scindează mai multe molecule ale următoarei componente din secvenţă. de exemplu. Macrofagii sunt de asemenea importanţi pentru prezentarea antigenilor altor celule ale sistemului imunitar. Alte categorii celulare implicate în imunitate Macrofagele Macrofagele sunt celule echivalente cu monocitele şi împreună cu monocitele. 220 . ei prezintă o potenţialitate distrugătoare crescută. aşa cum a fost prezentat anterior.9. Fragmentele minore sunt generate la aproximativ fiecare etapă în cascadă şi contribuie la generarea răspunsului inflamator. Rolul major al căii complementare este furnizarea unei posibilităţi de înlăturare şi distrugere a antigenului. reprezintă sistemul mononuclear responsabil cu fagocitoza. ca în figura 133.o zonă pentru scindarea enzimatică a componentei complementare următoare.o zonă pentru legarea de membrană celulară. Fragmentele minore generate prin scindare au proprietăţi biologice deosebit de importante în faza fluidă.1. indiferent dacă acesta devine sau nu învelit cu anticorpul. Fig. Funcţia de bază a sistemului complementar este probabil opsonizarea microorganismelor şi complexelor imune. Monocitele circulă doar câteva ore înainte de a intra în ţesuturi. 9. Pentru a-şi putea îndeplini funcţia. activarea chemotactică. .

O dată neutralizate. aceste substanţe nu se mai pot lega de ţesuturile receptoare. un consum marit şi o producţie crescută de superoxid. ei par să fie implicaţi în expulzarea paraziţilor din tractul gastrointestinal. Această migrare apare ca efect a acţiunii agenţilor chemotactici produşi la locul inflamaţiei. Organismele care au un deficit de celule ucigaşe naturale au o incidenţă . şi nu au memorie imunitară. capabile să degradeze substanţele pe care le digeră. Funcţia indirectă a anticorpilor Opsonizarea este procesul prin care un antigen devine învelit cu substanţe care îl face să fie mai uşor distrus de celulele fagocitare ( fig. De menţionat că celule ucigaşe naturale nu sunt celule ale sistemului imunitar în sens strict ca macrofagii de exemplu. Celule ucigaşe (killer) Celulele ucigase sunt celuule non. 10.2. difteriei şi mulţi viruşi. 10. Neutrofilele sunt celule fagocitare. Realizarea acestei degradări necesită o cantitate considerabilă de energie. Ele pot fi activate nespecific de agenţi mitogeni sau interferon şi deci pot fi recrutate de orice celulă T. 221 .10. În absenţa anticorpului sau stimulării antigenice şi sunt diferite de celulele ucigaşe prezentate anterior. procesul de fagocitare este similar atât neutrofilelor cât şi fagocitelor mononucleare. inclusiv toxina tetanusului. Aceste celule sunt considerate foarte importante pentru supravegherea apărării organismului împotriva tumorilor. pot fi neutralizaţi de anticorpi. Desi rolul anticorpilor IgE nu este îincă cunoscut.Leucocite neutrofile polimorfonucleare Neutrofilele joacă un rol foarte important în apărarea organismului în cazul infecţiilor acute. 134). Celule ucigaşe naturale (natural killer) Celulele ucigaşe naturale ( NK ) arată că limfocitele granulare mari pot distruge celule . Ele sunt capabile să recunoască celulele care au reacţionat sub acţiunea IgG şi le distrug. Ele pot adera sau pot migra din vasele de sînge în ţesuturi. Un mare număr de antigeni. printr-un mecanism încă necunoscut. Neutrofilele. în plus. 10. Din punct de vedere morfo-fiziologic. Aria lor potenţială în acţiune este foarte mare.10. mai mare a tumorilor. Finalitatea răspunsurilor imune O dată ce sistemul imun a fost iniţiat. iar IgG este în mod special remarcabil pentru aceasta. responsabilă pentru citotoxicitatea dependentă de anticorp.1. sunt. complexul autigen-anticorp rezultat este în general îndepăttat din circulaţie şi distrus de macrofagi. Funcţia directă a anticorpilor Neutralizarea este unul din efectele directe ale anticorpilor. rezultatul final al acţiunii sale depinde de natura şi localizarea antigenului.fagocitare mononucleare cu morfologie limfoidă. indiferent dacă răspunsul predominant a fost de natură umorală sau mediat de celule.10. Ele nu pot distruge celule în absenţa anticorpului.

10.10. 10. Procesul inflamator Inflamarea este definit ca o creştere a permeabilităţii vasculare însoţită de infiltrarea celulelor „inflamatoare”. Uciderea celulelor ţintă Celulele ţintă ucise ca urmare a unui răspuns imun includ organismele şi celule care conţin antigeni virali sau tumorali specifici la suprafaţă. 134 . Aceste celule ţintă pot fi distruse de mecanisme specifice. Genetica sistemului imunitar După cum a fost menţionat anterior.lanţ uşor de tip Kappa. Există doua tipuri de lanţuri uşoare: . 10. după cum este prezentat în tabelul urmator: Clasele Ig G Ig M Ig A Ig D Ig E Greutatea moleculară 150000 900000 160000 185000 200000 222 Lanţ greu γ µ α ρ ε Lanţ uşor k/γ k/γ k/γ k/γ k/γ .3. Lanţurile uşoare sunt identice la toate clasele de imunoglobuline dar fiecare clasă are un lanţ greu caracteristic.11. . 10. Creşterea permeabilităţii vasculare este determinată de un număr de agenţi specifici.lanţ uşor de tip Lambda. Controlul prin reacţie inversă O etapă importantă a răspunsului imun este declanşarea unui mecanism de autocontrol (feed-back).10.5. care sunt legate prin punţi.Relaţia dintre opsonizare şi fagocitare.4.Fig. fiecare moleculă de imunoglobulină este de fapt o proteină compusă din două lanţuri uşoare (L) identice şi două lanţuri grele (H) identice. mecanism care împiedică eventualele reacţii de autodistrugere a organismului. printre care fragmente de complement.10.

Restul de ADN al mănunchiului este excizat şi constituie marcatori pentru limfocitele de origine ale celulelor B. Suplimentar. iar amîndouă suferă o recombinare somatică pentru celulele T cu specificitaţii diferite. Genele cluster pentru lanţurile uşoare Kappa şi Lambda au o structură similară cu aproximativ 200 de gene variabile şi 4 gene de joncţiune. Aceasta este realizată iniţial de diferitele fragmente ale ARN-ului lipite şi secvenţializate. Deşi combinaţia VDJ de obicei rămîne constantă pentru celulele plasmatice şi toţi descendenţii lor. acestea ducînd la mai mult de 12000 de combinaţii posibile. printr-un proces de recombinare somatică o genă V. aflată între regiunile variabile şi cea de joncţiune. circa 50 de gene diverse.1. dar în general includ invaziile timpurii susceptibile faţă de infecţii. Această abilitate a fiecărei gene cluster de a produce diferite polipeptide este o excepţie importantă a regulii: o genă . 10. o celulă plasmatică care răspunde la diferiţi antigeni poate să exprime o combinaţie VDJC diferită. . Receptorul celulelor B este anticorp (de ebicei de tip IgM) şi astfel. dar specificitatea antigenică rămîne neschimbată. Gena responsabilă cu crearea lanţului uşor Kappa se găseşte pe braţul scurt al cromozomului 2. de exemplu pentru IgM spre IgG.Fiecare lanţ al imunoglobulinei conţine trei regiuni: .regiunea variabilă (V). fie lanţul Lambda.regiunea de joncţiune (J). o genă D. dar nu amîndouă. dar în schimb au o genăconstantă şi nu au gene diferite. Locusul pentru gena lanţului greu este pe cromozomul 14. . ceea ce are ca rezultat o mai mare diverisificare. în timp ce gena pentru lanţul uşor Lambda este pe cromozomul 22. În lanţurile grele există o regiune diversificată (D). În fiecare celulă plasmatică. 223 . 6 gene de joncţiune ş una sau mai multe gene pentru regiunea constantă a fiecărei clase de imunoglobuline. Imunodeficienţa dobîndită Imunodeficienţa dobîndită poate apare în fiecare sau în amîndouă componentele răspunsului imun. se pot însera extranucleotide la nivelul joncţiunii şi aceste gene sunt predispuse să sufere mutaţii somatice după ce au fost obţinute. Simptomele şi semnele acesteia depind de mecanismele de apărare rămase intacte. este posibilă o schimbare a genelor constante. Fiecare din aceste gene este în realitate o genă cluster (ciorchine). Gena cluster pentru lanţul greu conţine: aproximativ 200 de gene variabile. cu ajutorul ADN-t recombinat.regiunea constantă (C). Se poate produce orice combinaţie. Gena cluster pentru lanţul alfa al receptorului T este pe cromozomul 14. Aceste lanţuri sunt legate între ele prin punţi bisulfurice. Fiecare are o structură analoagă cu gena cluster pentru lanţtul usor al imunoglobulinei. Fiecare celulă plasmatică produce lanţul uşor VJC într-o singură combinaţie şi produce fie lanţul Kappa. iar gena cluster pentru lanţul beta este pe cromozomul T.11. o genă J şi o genă C sunt alaturate şi transcrise într-o moleculă unică continuă a ARN-ului mesager. Receptorul celulelor T este foarte asemănător ca structură cu imunoglobulina şi constă din doua lanţuri: un lanţ alfa şi un lanţ beta.o polipeptidă.

0 şi AB. Până acum au fost descrise aproximativ 400 de grupse sanguine. aceste condiţii de apariţie arată o eterogenitate genetică. iar cei cu grupa 0 nu au nici un antigen. iar mulţi din aceşti pacienţi sunt asimptomatici cu o frecvenţă de 1/1000 de combinaţii în cazul unor deficienţe ale sistemului fagocitar şi o frecvenţă de 1/70000 pentru combinaţii imunodeficiente severe. conform tabelului de mai jos: Fenotipul celulelor roşii 0 A A AB Anti-A + + Anti-B + + - unde: + înseamnă aglutinare. Indivizii cu grupa A au în serul lor IgM anti-B (izo-glutine). iar dintre acestea cel mai bine cunoscute sunt ABO şi sistemele Rh ale grupelor sanguine.A.2. Boală Combinaţii imunodeficienţe severe Agammaglobulinemia Sindromul Wiskott-Aldrich Boli granulomatice cronice Sindromul Chediak-Higashi Sindromul DiGeorge Deficienţă Properdin Sindromul Limfoproliferativ Moduri de moştenire AR. cu grupa B auanti-A. care sunt determinate de reacţia celulelor roşii ale indivizilor cu anticorpii respectivi anti-A şi anti-B. iar în 60/o din cazuri depinde de defectele sistemului complementar. Cele mai previzibile defecte sunt deficienţele IgA-lor (1/570). inclusiv pe celulele sanguine. în 400% din cazuri ca urmare a defectelor de imunitate celulară. 224 .11. 10.AR AR deleţie cromozomială XR XR Imunodeficienţa moştenită este cauzată în 50% din cazuri de defectele anticopilor. Grupele sanguine Grupe sanguine sunt determinate de proteinele de suprafaţă ale antigenilor de pe celulele roşii. iar cei cu grupa 0 le au pe amândouă. XR XR. iar – non-aglitinare .Aşa cum sunt conturate tabelul de mai jos. AR XR XR. B. Indivizii care au grupa A au antigen A pe celulele lor roşii. Antigenii AB0 sunt de asemenea prezenţi pe multe alte celule din organism. cei cu grupa AB au ambele tipuri de antigeni. cei care au grupa B au antigeni B. Sistemul sanguin ABO Există 4 fenotipuri majore AB0: .

09 0. Genotipurile şi fenotipurile Rh. şi D sau non-D. Organele limfoide primesc o extensivă inervaţie intraparenchimală simpatică.04 0.09 0. A şi B. Genotip cde/cde CDe/cde CDe/CDe cDE/ede cDe/cDE cDE/cDE altele (rare) 85% din populaţia Europei Occidentale. B0 şi AB. Interacţiunea între peptidele sistemului imun şi peptidele sistemului nervos şi endocrin Sistemul imun interacţionează cu sistemul nervos şi endocrin prin inervaţii ale ţesutului limfoid. Deşi sunt posibile genotipuri 00.42 0. E.sau homozigote pentru alelele D (tabelul 4). În continuare este prezentat un tabel cu genotipurile şi fenotipurile locusurilor AB0: Genotip 00 AA A0 BB B0 AB Fenotip 0 A B B B AB UK frecvenţa 0. în timp ce 30% din populaţia bască sunt Rh. c.15 0.03 Antigene ale celulor roşii nici unul A B B B AB Anticorpi serici Anti-A. A0.Gena pentru grupele AB0 este localizată lânga braţul lung al cromozomului 9 şi au fost identificate 3 alele majore: 0. fiecare având 3 locusuri strâns legate C. Persoanele cu Rh + sunt hetero. Sistemul Rh sanguin Există 2 fenotipuri Rh: Rh + şi Rh Aceste fenotipuri sunt determinate de reacţia celulelor roşii ale indivizilor cu anticorpii anti-Rh.46 0.12. are Rh+.14 0.09 0. neurohormoni endocrini sau neuropeptide şi vice-versa. dar acest lucru se poate face folosînd informaţii de ascendenţă. AA. iar gena pentru grupa 0 este recesivă. în timp ce persoanele cu Rh .nu au aceşti antigelii.05 Fenotip Rh + + + + + posibil + 10.13 0. 225 . Notaţie prescurtată rr Rr RR Rr RR RR UK frecvenţa 0. A şi B sunt gene dominante. Anti-B Anti-B Anti-A Anti-A Anti-A nici unul Nu este posibil să distingem în grupele sanguine grupa AA de A0 sau BB de B0. dar acest procent variază la alte popoare. Tabelul 4.17 0. de exemplu.Persoanele Rh + posedă antigeni Rh pe celulele lor roşii şi pe cele tisulare. Aproape toţi orientalii şi nord-americanii au Rh+ de asemenea. Complexul genelor pentru Rh este pe cromozomul 1 cu 2 altele. BB.32 0.

mimând astfel două din modificările neuroendocrine observate în timpul răspunsului imun. Sistemul imun este capabil să producă factori.cum sunt catecolaminele. LH şi foliculinstimulator. Numărul de receptori variază cu tipul celular. Neuronii simpatici răspund direct la IL-1. care pe lângă rolul lor crucial în timp răspunsului imun servesc integrării circuitelor imuno-neuro-endocrine cu consecinţe imuno regulatoare şi metabolice pentru gazdă. similar hormonului eliminator a corticotropinei. beta-endorfina .melanostimulator. α -FTN exercită câteva efecte extraimunologice. sporind dovezile că peptidele legate de imunitate(adică citokinele) pot afecta profund sistemul nervos central. Citokinele interferează cu secreţia hormonilor. antagoniştii-adrenergici cresc nivelul cAMP în celulei limfoide şi alterează funcţia. care nu se datorează acţiunilor secretagoge insulinice ale acestei citokine. promovează mobilizarea grăsimilor corpului şi pierderea în greutate şi are proprietăţi anorexigene. numărul receptorilor β2 -adrenergici creşte pe celule limfoide. astfel: celule supresoare T > monocite > celule citotoxice T >celule helper. Datele experimentale sugerează că sistemul nervos simpatic modulează răspunsurile imune şi că supraactivitatea sistemului nervos simpatic aşa cum este de aşteptat în stres scade responsivitatea imun.fără să afecteze marcat nivelele sanguin ale altor "hormoni ai stresului". Atât IL-1 cât şi α .Celulele sistemului limfoid poartă receptori adrenergici. S-a relevat faptul că IL-1 şi IL-6 induc rapid eliberarea somatostatinei IL-1 induc încet dar semnificativ creşterea şi în alte neuropeptide hipotalamice. s-a arătat recent că IL-1 induce o rapid şi profunda creştere în ACTH şi corticosteroidul din sânge .FTN pot induce. Modularea citokinonică a neuropeptidelor hipotalamice: interleukine ce reglează creşterea şi stresul.P Lângă aceste efecte. incluzând în reproducere (în acest cu hormonul luteinizant. în timp ce stresul psihologic induce secreţia interleukinei-6 (ce este mediată de sistemul nervos autonom). Se consideră că stresul infecţiilor şi traumatismelor pot stimula macrofagele şi nevroglia să producă citokine IL-1. α -FTN stimulează secreţia IL-1 de către macrofagele activitatea. 226 . Efectul modulator al sistemului nervos simpatic este mediată în partea via neurotransmiţători şi în parte printr-o peptidă cu greutate moleculară mare ce inhibă marcat răspunsul limfocitar proliferativ şi reduce producţia de IL-l şi FNT de către macrofage.FTN împart cu hormonul liberator al corticotropinei unele efecte comportamentale ca mediatori ai sistemului.hormonul creşteri şi hormonul α. Injectarea în vivo a acestei citokine are ca rezultat o profundă hipoglicemie. FSN).care în schimb reglează secreţia anumitor hormoni ce pot influenta evenimentele imune . cel puţin în vitro şi se ştie că conţinutul în norepinefrină din organele limfoide scade în timpul răspunsului imun. Celulele imune stimulate pot creşte nivelele sanguine în hormonul adrenocorticotrop (ACTH) şi corticosteroidul şi scade conţinutul de norepinefrină al hipotalamusului. Printre altele α -FTN este cunoscut ca un mediator al reţelei bidirecţionale neuro-endocrino-imune. sintetază eliberarea de prolactină.adrenocorticotropină.o simplă injectare a IL-1 poate normaliza nivelele sanguine în glucoză pentru o durată de cel puţin 6 ore la animale diabetice incluzând şoarecele diabetic insulino-rezistent. prolactina. De asemenea. Se pare că interleukinele pleiotropice stimulează axa hipotalamo-hipofizaro-adrenală într-un loc situat probabil în nucleul paraventricular şi ar deprima creşterea prin stimularea predominată a somatostatinei comparativ cu factorul liberator al hormonului creşterii. O altă citokină care posedă efecte pleiotropice este factorul de necroză (α-FTN) derivat din macrofag . Mai mult . Reglarea centrală a sistemului imun este in prezent bine stabilit. De reţinut că atât interleukina-l-alfa ( IL-l ) cât şi factorul de necroză tumorală α . După ablaţia sistemului nervos simpatic la animale. Alt efect important al IL-1 este capacitatea sa de a afecta homeostazia glucozei.

Se ştie că factorul hipotalamic eliberator de corticotropină are rol pivot în reglarea axei hipotalamice-hipofizare-suprarenale, şi exercită efectele centrale inhibitorii pe funcţii reproducătoare (ce poate fi inhibată de stres). Aceste efecte au loc prin eliberarea de betaendorfina neuronală şi hipofizară şi sunt anatagonizate prin tratament cu antagoniştii opiacei. De asemenea IL-1, α -FTN şi hormonul eliberator de corticotropină induc o creştere a pragului nociceptiv. Hormonul eliberator de corticotropină şi citokinele diferă însă în ceea ce priveşte tipul de stres pe care îl recunosc, adică stresul cognitiv sau non-cognitiv. Alte studii recente sugerează creşterea producţiei de peptide neuroendocrine după stimularea celulelor cu IL-2. Astfel, prin metode imunohistochimice s-a detectat clonarea intensă a citoplasmei celulelor mononucleare (ACTH şi β endorfinice pozitive) din sângele periferic şi o creştere a dimensiunii celulare medii după stimularea cu interleukina -2. Alte studii sugerează, în plus, că una din moleculele de ACTH ce este sintetizat de celule imune stimulează direct migrarea monocitelor umane, sugerându-se astfel un rol posibil al peptidelor ACTH in răspunsul imun. In prezent, numeroase interacţiuni intre sistemele imune şi neuroendocrine sunt demonstrate şi se crede că numeroase peptide pot fi utile noilor strategii terapeutice.

10.13. Relaţiile virusuri-celule gazdă. Relaţiile virusuri-membrane celulare 10.13.1. Receptorii virali
Prezenţa sau absenta receptorilor celulari specifici influenţează nemijlocit spectrul de gazdă tropismul tisular şi celular al virusului;elementele respective pot interveni însă în etape ulterioare, de exemplu penetrare, decapsidare, antrenare a metabolismului celulei gazdă în producţia componentelor virale. Receptori celulari sunt, frecvent, de natură glicoproteică iar acidul sialic este considerat o componentă critică în interacţiunea virus-receptor. Virusul Sendai se leagă de o structură carbohidrat specifică ( NeuAc ) dar nu de alte gangliozide, conţinând unul sau mai multe reziduuri de acid neurinamic. Alte mixoviruri sunt mai puţin restrictive. Pentru virusul gripal toţi compuşii neurinamic pot acţiona ca receptori indiferent de modalitatea de legare a carbohidratului. Virusurile gripale A şi B au receptori (glicoforina) pe hematii; virusul rabic are receptori pentru acetilcolină la joncţiunea neuromusculară; virusul Epstein-Barr are receptori ( CR2 pentru C3d ) pe limfocite B iar HIV are receptori (molecula CD4 sau T4) pe limfocit T etc. Trei metode moderne au permis studiu receptorilor celulari cu acurateţe: a) sinteza anticorpilor monoclonali antireceptori; b) sinteza anticorpilor antiidiotip care mimează antigenele virale; c) utilizarea unor analogi peptidici ale situsurile de ancorare virală A fost introdus conceptul de receptor productiv, adică de receptor care conduce singur la infecţie, deosebit de alţii implicaţi în legarea nespecifică a virionilor. Ataşarea nespecifică a virionilor la unele substraturi (colagenul de exemplu), poate avea importanţă patogenică pentru că se realizează concentraţii mari de virusuri în zone unde există şi receptori productivi. În general, organele-ţintă ale infecţiei virale au astfel de receptori productivi care sunt similari cu receptorii cu afinitate înaltă. Receptorii cu afinitate înaltă la nivelul "butonilor" terminali ale axonilor explică neurotropismul unor virusuri. În ceea ce priveşte virusul gripal, care este bine cunoscut, datele de biologie moleculară precizează următoarele: acest virus este un orthomixovirus cu înveliş membranar; anvelopa constă dintr-un strat bilipidic cu proteina M asociată cu porţiunea internă a dublului strat şi două glicoproteine membranare, ai căror spiculi extramembranari se pot observa în microscopia
227

electronică. Una dintre proteinele transmembranare este hemaglutinina, iar cealaltă, naurominidaza. Aceste două proteine permit virusului să se lege de suprafaţa celulei gazdă şi să fuzioneze cu membrana celulară. A fost clonată gena pentru neuraminidază, proteina conţinând 454 aminoacizi cu greutatea moleculară 50.087 Da. Această proteină prezintă o zonă hidrofobă majoră, care o ancorează in membrana virală. Proteina prezintă 5 situsuri de glicozilare şi este incorporată in membrana virală sub forma unui trimer simetric cu laturile polipeptidice identice. Rolul neuraminidazei in infecţie nu este cunoscut,dar se ştie că ea clivează acidul N-acetilneuraminic(acid sialic) al lanţului hidrocarbonat glicoproteina. Substratul neuraminidazei poate fi glicoproteina celulei-gazdă sau glicoproteina-hemaglutinică a virusului. Activitatea enzimatică a neuraminidazei este necesară pentru producerea infecţiei, deoarece anticorpii antineuraminidază inhibă replicarea virală. Cealaltă glicoproteină transmembranară a virusului gripal, hemaglutinina, leagă virusul la acidul sialic conţinut de receptorii membranei celulei-gazdă. De asemenea,ea mediază fuziunea celulară a virusului. Hemaglutinina virusului gripal este un trimer de 224.640 Da. Fiecare trimer conţine un lanţ oligozaharidic. Glucidele sunt localizate la suprafaţa proteinei pe întreaga sa lungime si au rolul de a proteja hemaglutinina de degradarea proteolitica nespecifica. Pentru ca virusul gripal sa fuzioneze cu membrane celulei-gazda,hemaglutinina trebuie sa cliveze in doua fragmente , HA1 si HA2, prin hidroliza legăturii peptidice a argininei din poziţia 238. Clivarea hemaglutiniei în cele două fragmente creşte infecţiozitatea virusului de 100 ori, fără să afecteze activitatea hemaglutinică. Molecula de hemaglutinina provoacă fuziunea ăn absenţa oricăror alte componente virale.Tipul viral cel mai patogen al gripei - tipul A - conţine 13 subtipuri de hemaghetinine (HA) notate HA1 - HA 13 si 9 antigene de tip neuraminidaza (N) notate Nl-N9. Fiecare virus prezintă 300-600 spiculi de hemaglutina care explica ataşarea virionilor la celule. Intr-o prima etapă, hemaglutinidele virale se leagă pe reziduurile de acid sialic ale glicoforinelor A. Caracterizarea precisă a domeniilor de legare la nivelul proteinelor virale şi a receptorilor celulelor gazdă deschide o noua cale în terapia antivirală: experimentarea şi producerea unor agenţi care să acţioneze în competiţie cu virusurile în legarea pe receptor.

10.13.2. Penetrarea virusului în celulă
Procesul de internalizare a virionilor, declanşat de ataşarea lor ireversibilă la receptorii celulari este numit viropexie (enducitoza). În plus, virusurile cu anvelopa (ortho-si paramixovirusurile, rhabdo- si togavirusurile etc.) datorită includerii în structura externa a unei porţiuni lipidice pot penetra si printr-un proces de fuziune. Pătrunderea paramixovirusurilor în celulă prin fuziunea dintre anvelopa virală şi membrana celulară, perturbează permeabilitatea acesteia din urma, ceea ce poate avea urmări toxice ca hemoliza (la hematii), liza "din afară" (la celulele nucleate) şi chiar modificării nucleare şi alterări cromozomale. Studii electronomicroscopie combinate cu detectare a antigenului cu anticorpi marcaţi de peroxidază au lămurit în cazul virusurilor respirator sinciţial şi rujeolic, secvenţa evenimentelor timpurii ale infecţiei. Astfel, consecutive absorbţiei (la +37C) anvelopa virală şi membrana celulara fuzionează, apoi antigenele virale se dispersează în regiunile adiacente ale membranei, întreaga celulă devenind specific reactivă cu anticorpii antivirali marcaţi. Aceasta difuziune explică cel puţin două fenomene: - starea refractara a celulelor la fuziunea cu alte virusuri şi, - difuzarea infecţiei din aproape în aproape prin antrenarea celulelor vecine în procesul de sincitizare. În cazul papovavirusurilor, ca rezultat al absorbţiei se notează o creştere rapida a fluidităţii membranei celulare datorită activităţii unor enzime membranare, probabil declanşată de procesul endociotic.

228

Prin urmare, absorţia la suprafaţa celulei este urmată de penetraţia virusului în celulă, care se poate desfăşoară pe doua căi: a) fuziune directa cu membrane plasmatică; b) prin endocitoza (viropexie) simplă (absorptiva) sau mediată de receptori (clatrinică). Virusurile încapsulate pot urma ambele cai, în timp ce virusurile nude numai endocitoza. Endozomul (fagozomul) fuzionează apoi cu lizozomul a cărui aciditate favorizează fuziunea membranelor virale şi lizozomale ; procesul este foarte rapid, încât expulzarea nucleocapsidei în citoplasma se efectuează fără distrugerea ei de către enzimele lizozomale de degradare.

10.13.3. Tipuri de efect citopatic
Sunt descris mai multe tipuri morfologice de efecte citopatice viral - induse în culturi, de pildă: a. citotoxic (produs de infecţii masive, hiperacut, fără a exista timp pentru sinteza virusului progen; leziunile au fost asimilate cu fenomenul lizei "din afara" in cazul bacteriilor parazitate de fagi); b. citolitic (caracterizat prin alterări celulare acute-rotunjire,ratatinare-şi pierderea capacitaţii celulelor de a retine coloranţii vitali); c. sinciţial (indus de virusuri care poseda proteine structurale de "difuziune" ca herpesvirusuri, paramixovirusuri, retrovirusuri); d. incluziogen (caracteristic unei replicări virale relativ lente şi însoţit, în afara de apariţia incluziilor virale (noi particule de virus) de vacuolizari citoplasmice, citomegalie, sincitizare etc. De reţinut faptul ca relaţiilor virus-celula gazda, exprimate morfologic, le corespunde o proporţie semnificativ mai mare de interacţiuni neproductive, aşa cum infecţiile clinic aparente sunt amplificate epidemiologic de infecţiile subclinice.

10.13.4. Leziuni cromozomale determinate de virusuri
Virusurile induc diverse anomalii cromozomale ca: aberaţii cromozomale (fragmentări, pulverizaţii, rupturi, schimburi cromatiniene); anomalii ale aparatului mitotic (mitoze multipolare , mitoze colchicina-like); cariotip anormal cu complement instabil sau stabil; policariocite. În ceea ce priveşte patogeneza virala la nivel molecular, de notat ca datele actuale evidenţiază adaptarea continuă a genomului viral şi a gazdei, astfel încât să fie asigurată supravieţuirea ambilor parteneri. Temin a propus o serie de intermediari evolutivi între elementele genetice mobile şi retrovirusuri, trecând prin provirusuri. Însăşi retrovirusurile cuprind grupe evolutive si anume: retrovirusuri nononcogene, lent-oncogene şi rapid oncogene . Se ştie că un concept recent asupra oncogenezei virale susţine integrarea unui provirus retroviral adiacent la o genă celulară potenţial oncogenă (c-onc). Important din punct de vedere teoretic este deci faptul ca inserarea elementelor genetice mobile (sau a provirusurilor) într-un loc sau altul al genomului celular mobil este urmată de inactivarea sau activarea unor gene celulare. Astfel de activări, consecinţă a controlului exercitat de un nou promotor, pot fi la originea unor tumori canceroase. -

229

10.13.5. Natura şi funcţia unor structuri virus-like: prionii
Un capitol de patologie moleculară a celulei interesant în virusologie, genetică şi clinică priveşte în prezent natura, compoziţia chimica si funcţia unor structuri puse in evidentă prin diverse metode, ori demonstrate direct prin microscopie electronică. Astfel proteina prion (PrP) este una din proteinele majore produse in exces in encefalopatiile spongiforme subacute la om si animale de laborator. Natura exactă a agenţilor neconvenţionali care induc aceste boli este necunoscuta in prezent. Au fost evocate câteva ipoteze conform cărora agenţii ar prezenta: un virus convenţional, o noua clasa de agenţi numiţi virioni, o proteină autoreplicabilă (numita Prion), un retrovirus sau este vorba de o boala post-translatională , care implică dereglarea sintezei proteice. Acumularea PrP , ca şi a proteinei acidice fibrilare gliale (GFAP) în infecţiile experimentale la şoarece cu scrapie, în special în creier, implică aceste proteine în mecanismele lezionale ale sistemului nervos central (SNC). PrP (33-35 KD) este o sialoglicoproteină celulară localizată pe faţa externă a neuronilor în cultură, ancorată printr-un glicolipid fosfatidilinozitol. Nivelul expresiei genetice PrP este menţinut strict pe parcursul vieţii. Studii de cinetică a expresiei genetice PrP si GFAP pun în evidenţa faptul că ARNm GFAP şi PrP variază semnificativ în timpul dezvoltării normale postnatale a creierului de şoarece. ARNm pentru proteina prion a fost detectată imediat după naştere şi a crescut de patru ori în dezvoltarea ontogenetică. În prezent este investigată expresia genelor PrP si GFAP în creierul in dezvoltare infectat cu scabie pentru cunoaşterea mecanismelor de reglare şi/sau dereglare în astfel de infecţii. Toate encefalopatiile spongiforme transmisibile, incluzând scrapia, sindromul GerstmannStraussler-Scheingker şi encefalopatia spongiformă bovină conţin forma agregată, parţial rezistentă la proteaze, ca un marker specific pentru boala oferit de această proteină PrP. Se consideră în prezent că spre deosebire de PrP normală de la suprafaţa neuronilor, forma agregată PrP apare fie dintr-o infecţie , sau de la o genă mutantă PrP, care acţionează ca un catalizator în conversia proteinei normale endogene PrP în cea agregată şi abundentă, astfel incît funcţia normală a proteinei este abolită şi rezultă boala degenerativă. Conform altor opinii, proteina normală PrP acţionează ca receptor pentru un agent al scrapiei încă neidentificat; de asemenea este incriminat un mic acid nucleic care este un virus neconvenţional ( de aceea este dată denumirea de virus neconvenţional sau virină). Din alt punct de vedere este frapantă similitutidinea de patologie a scrapiei cu studii recente privind receptorul poliovirus (PVR).Unele studii recente transgenetice au arătat de exemplu că şoarecele transgenetic exprimând PVR uman devine susceptibil la poliovirus; şoarecele normal este rezistent. Pe măsură ce şoarecii transgenetici ce exprimă PVR au dezvoltat această boală, ei arată modificări patologice corespunzătoare. O variantă a PrP a fost implicată recent în producerea sindromului Gerstmann-StrausslerSchemgker, boală umană rară similară scrapiei, caracterizată prin patologie spongiformă, proteină PrP protează rezistentă si placi (depozite mari proteice). S-a arătat în cazul acestui sindrom, un linkaj între incidenţa bolii şi mutaţia proteinei PrP şi anume, o substituţie a proliniei cu leucina la codonul 103. Ar fi vorba deci de o leziune genetică care poate cauza neurodegenerarea spongiformă transmisibilă sau mutaţia produce o modificare în structura proteinei sau în stabilitate, care mimează efectul legării unui agent patogen. Termenul de prion a fost introdus în biologia moleculară în anul 1982 de către Harley Prusiner de la universitatea din San Francisco. Prionii (cunoscuţi şi sub numele de protovirine, virineos, virusuri latente) reprezintă o clasă de agenţi infecţioşi subvirali, cu greutatea de 27000-30000, unici în felul lor, fiind rezistenţi la toate procesele de inactivare care degradează acizii nucleici (căldura, razele u.v, radiaţii ionizante); prionii rămân o enigmă „o perplexitate” a biologiei moleculare, deoarece admiterea existenţei lor drept agenţi infecţioşi, lipsiţi de acid nucleic şi formaţi exclusiv din
230

proteine, ar pleda pentru dărmarea dogmei centrale a biologiei moleculare, prin acceptarea unei codificări şi multiplicări a acestei proteine prionice infecţioase, nu prin intermediul acidului nucleic al celulei gazdă. Pentru acelaşi motiv,bolile prionice sunt considerate astăzi „pseudoinfecţioase” în comparaţie cu bolile infecţioase clasice, ale căror agenţi etiologici sunt microorganisme (virusuri, bacterii) care conţin în structura lor acid nucleic. Caracteristicile principale ale bolilor prionice sunt: - afectează sistemul nervos central (SNC) provocând encefalopalii spongiforme; - au o perioadă foarte lungă de incubaţie: de la câteva luni la 37-40 de ani; - au o evoluţie lentă, progresivă, totdeauna letală. Pâna în prezent au fost deschise 12 boli priorice: şase la animale şi şase la om (tabelul 4). Dintre acestea, cele mai bine studiate sunt scrapie la animale şi boala Crentzfeldt-Jakobs (CJD) la om. Celelalte zece boli prezintă similarităţi de ordin clinic, anatomo-patologice şi hismitochimic cu aspectele din scrapie. În aceste boli, principala caracteristică moleculară o reprezintă acumularea masivă în SNS a unei proteine PrPc a gazdei, dar într-o izomorfă anormală tip PrPsc (tip proteină din scrapie) la animal respeciv PrPcjd (tip proteină din CJD la om). În prezent se admit trei posibilităţi de producere a bolilor prionice : infecţia lentă, infecţie sporadică şi alterare genetică (tabelul 5). Tabelul 5. Bolile prionice Nr. crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Scleroza multiplă 12. Boala lui Alper
231

Boala Scarpie Eucefalopatia transmisibilă curcilor (TME) Boala cronică devastatoare (CWD) Eucefalopatia spongiformă a copitatelor (EVE) Eucefalopatia spongiformă felină(FSE) Eucefalopatia spongiformă bovină(BSE) boala vacilor nebune Kuru Boala Crentyfeldt - Jakols Sindromul GertmannStröussler Insomnia fatală familială

Frecvenţa SUA, Anglia, Franţa, Elveţia Rară dar cu mortalitate >90% SUA(Colorado, Wyoming) Anglia Anglia(1989) Anglia Papua – Noua Guinee 1/1.000.000 pe tot globul <0,1milion/an Japonia Italia, Anglia, Franţa, America Insulele Faroe, Scoţia, Irlanda, Key West

Gazda naturală capre, oi curci elan, căprior Nyola şi antilopa africană pisici domestice bovine om om om om om, unele tulpini au produs scrapie la oi om

Data transmiterii exprerimentale 1936 1939 1983 1988 1966 1968 1981 1993

PrPsc are o are o abilitate foarte mare de a determina modificări posttranslaţionale ale propriei molecule şi de a forma amiloid. fiind doar parţial digerată lăsând un miez rezistent proteinoza K. Fibrele de amiloid reprezintă produse de degradare (de rupere) PrPsc infecţioase. în timp ce fumatul. dar PrPc poate fi complet digerată „în vitro” de proteineaza K. dar nici un acid nucleic. Ipoteza virină O moleculă de acid nucleic ce conţine informaţia biologică (prion) ar fi protejată de o moleculă de proteină a gazdei. PrPc şi PrPsc au aceeaşi greutate moleculară (33-35Kda). transmisibilităţii şi neuropatogenici bolii. date recente pledează şi pentru modificări de ordin chimic. acest miez este reprezentat de PrP 27-30 (GM= 30Kda). Ipoteze referitoare la natura prionilor Referitor la natura prionilor s-au emis imens unele ipoteze (ipoteza viroidului animal. abuzul de alcool. Existenţa unor forme multiple cu grad înalt de infecţiozitate. complexe proteice cu lipit-detergent (DhPCs) şi sub formă de lipozomi. în timp ce viroizii sunt sensibili la nulează. lipsa de mişcare (agenţi ai unor boli cu incidenţă a mortalităţii extrem de mare pe glob) sunt total ignoraţi. care produc răspuns imun prionii nu sunt imunogeni. în toate aceste forme singura moleculă identificată este tot PrPsc. care se găseşte în mod normal pe membrana celulei neuronale. fără precedent. prezenţa acestui acid nucleic nu a fost încă confirmată. Până în prezent nici una din ipoteze nu se bucură de adeziunea întregii comunităţi ştiinţifice. În încercările de purificare a prionilor. 232 . În ţesutul cerebral al animalelor cu infecţie prionică plăci de amiloid şi fibre amiloide (SAF =fibre asociate scrapiei).000-30. de asemenea. Prionii rămân o clasă aparte. capabilă de replicare. Prionii pot exista sub formă de bastonaşe.v. Amiloidul reprezintă un derivat dintr-o glicoproteină celular normală (PrPc). Absenţa imunităţii. Ipoteza viroidului animal Viroizii sunt agenţi subvirali exclusiv din ARN fără înveliş (capsidă) proteic. ipoteza retrovirusului.).. Este de menţionat însă faptul că problema BSE (boala vacii nebune) şi cea a radioactivităţii ocupă în prezent aceeaşi nişă psihologică în societate. Structura exclusiv proteică. prionii sunt rezistenţi. prin electroforeză în gel sarcosil şi sedimentare în gradient discontinuu de sucroza (proteină) cu greutatea moleculară de 27. Plăcile amiloide sunt incluzii de prioni. obezitatea. de agenţi infecţioşi fudamental diferiţi de virusuri şi viroizi.Se ştie astăzi că în cursul infecţiei prionice se produce conversia unei cantităţi de proteină PrPc (prin modificări posttranslaţionale) în PrPsc reprezintă tocmai SAF (proteină înalt infecţioasă). ipoteza virină.Particularităţi de diferenţiere a prionilor de virusuri Prionii se diferenţiază de virusuri prin următoarele caracteristici majore: Absenţa ADN-ului. grupul ipotezelor de agenţi infecţioşi „fără geamăn” etc. în timp ce PrPsc este rezistentă. Spre deosebire de virusuri. Spre deosebire însă de viroizii cunoscuţi (potato spindle tuber viroid). fapt pentru care are consecinţe asupra replicării. Multe întrebări referitoare la prionii îşi aşteptă răspunsul în viitor. Bolile prionice sunt cu evoluţie lentă. prionii sunt de 10 ori mai rezistenţi decât ARN-ul purificat al acestora. apar paradoxal în absenţa oricărui răspuns imun care a putea opune rezistenţă înaintării infecţiei.000 (PrP= proteină prionică). foarte rezistenţi la u. Aceste forme sunt interconvertibile. fomând împreună o particulă infecţioasă. Modificările posttranslaţionale care contribuie la transformarea PrPc în PrPsc au fost considerate un timp doar modificări conformaţionale de împăturire (substituirea α-helixurilor cu β-sheet-uri).

glomerulonferită. prin metodele actuale. s-au referit la incluziile "tubulare" (paramixovirus-like) dm citoplasmă celulelor endoteliale . Deşi problema acestor formaţiuni tubulare este şi ea grevată de necunoscute . fie produse de regenerare celulară sau chiar complexe imune. linii de şoarece cu modificări precise în gena PrP endogenă şi fără nici o extracopie. 10. în sindromul de imunodeficienţă dobândită (SIDA) unele limfocite conţin în citoplasmă particule sferice . în diferite ţesuturi şi în diferite boli. Conform altor opinii. fie datorită unor mutaţii suferită de gena ce codifică PrPc. numeroase observaţii electronomicroscopice în boli ca lupusul eritematos . De asemenea. În patogenia umană ele produc infecţii-boală. fiind similar ca aspect general cu nucleocapsidele fără înveliş ale paramixovirusurilor. s-a invocat capacitatea acestora de a perpetua în culturile de celule păstrându-se sensibilitatea la ribonucleaza cât si depozitarea complexelor imune virale de tip C în piele. 233 . dispuse ordonat după un model paracristalin.14. Relaţiile bacterii-celulele gazdei Bacteriile sunt importante din punct de vedere teoretic şi practic prin rolul jucat în experienţele de recombinare a ADN (inginerie genetică) şi prin caracterul patogen al unor specii. Formaţiunile respective au circa 1. etc. macrofagelor . Argumente contra originii retrovirale a prioinilor sunt următoarele: nu a putut fi pus în evidenţă nici un retrovirus. apoi o zonă cu densitate medie şi o pătură periferică (probabil proteică). etc. ar prezenta fie material celular alterat eliberat în circulaţii după răniri . De regulă RER apare anormal dilatat în celulele endoteliale ale vaselor sanguine din piele şi muşchiul scheletic la subiecţi cu astfel de boli. rezistenţă foarte mare la formaldehidă şi glutaradeldehidă (retrovirusurile fiind sensibile la aceste doua substanţe). tubulii prezintă un mers dens (probabil acid nucleic). se emit mai multe ipostaze prin care se încearcă explicarea modificării proteinei celulare normale PrPc în proteină izomorfă patologică PrPsc. se acceptă încă folosirea lor ca elemente de diagnostic în unele boli ale ţesutului conjunctiv. conţinând tubulii caracteristici. fibroblastelor. În sfârşit. Grupul ipotezelor de agenţi infecţioşi „fără genom” Plecând de la conceptul iniţial de prior respectiv „proteină autoreplicabilă”. S-a emis chiar ipoteza potrivit căreia etipatogenia aşa-ziselor colagenoze s-ar petrece mai întâi infecţia virală (acidul nucleic viral ar fii un timp în stare biofită )şi apoi imunocompromisul indus de virus. Modele viitoare Modelele transgenetice deşi au sporit cunoaşterea noastră în înţelegerea bolilor scrapielike nu au clarificat totuşi complet rolul proteinei PrP. limfocitelor.dermatomiozită.Ipoteza retrovirusului Pentru asigurarea retrovirală a prionilor se aduc ca argumente tropismul pentru SNC şi modificările de membrană (induse foarte rar) fără răspuns inflamator major. In secţiune transversală. datorită factorilor de patogenitate determinaţi genetic. Se speră ca în viitorul apropiat să se creeze prin recombinare omoloagă.În sprijinul naturii virale a "tubulilor" pe lângă trăsăturile morfologice în examinarea directă .asemenea agregate tubulare larg răspândite la om şi la animale . şoareci cu gene PrP nefuncţionale ar permite să se elucideze funcţia normală a PrP în sistemul nervos şi ar putea fi folosiţi să demonstreze dacă această proteină a gazdei este într-adevăr necesară pentru replicarea agentului scrapie. De pildă. fie datorită unor perturbatori ce apar posttranslaţional în conformaţia spaţială a proteinei în diferite etape.ca un stadiu în morfogeneza virală. în bolile prioniei.5 um în diametru şi fiecare tubul măsoară circa 20-25 nm.

hepatorenale şi nervoase. O importanţă majoră pentru aderenţă şi colonizare o are doza infectantă. în cazul bacteriilor deficienţe ale aparatului mucociliar ale acestui tract favorizează producerea sinuzitelor. pot difuza în tot organismul. în timp ce altele (Str. de pildă citotoxică. Adezinele(glicoproteine. Fibrele periplasmatice ale spirochetei Tr. toxina difterică. În procesul de aderenţă participă anumite structuri macromoleculare antigenetice. în intestin numai o singură celulă bacteriană din câteva mii ajunge să adere şi să colonizeze. formei spiralate şi extremităţilor ascuţite. După depăşirea membranelor bazale (care acţionând ca un filtru le temporizează diseminarea). pneumoniilor. de la suprafaţa bacteriei numite adezine şi receptorii corespunzători ai celulelor epiteliale. Sisteme enzimatice complexe situate la suprafaţa celulei bacteriene sau eliberate în mediu (care permit consumul elementelor nutritive ca atare sau modificate conform necesităţilor metabolice proprii) asigură multiplicarea lor. de către flora nazofaringiană normală. Dacă virusurile gripale sunt cantonate la epiteliul ciliar al tractului respirator superior. producând leziuni predominant cardiace. 234 . coli etc) întrucât nu pot trece de fagocitele subepiteliale anticorpi. factori bactericizi serici etc. Prezenţa receptorilor celulari corespunzători diferitelor adezine determină în mare parte specificitate de specie sau de ţesut a aderenţei bacteriene. polipeptide. starea de imunitate a gazdei reprezintă factorul major de condiţionare a manifestării patogenităţii. Agresinele de la suprafaţă (mucopeptide.liporoteine de 1000-125000 Da) sunt reprezentate în general de filamente (numite fimbrii la bacteriile gram-negative)şi de fibrile (la cele gram-pozitive). enzime) permit inhibarea ori ocolirea mecanismelor de apărare a gazdei. dipteriac. sau fagocitate. unele bacterii se limitează la epitelii (C. iar toxinele (proteice şi lipopolizaharidice) generează diverse efecte patologice.bacteriile ajung în ţesutul subepitelial de unde pe cale limfatică şi/sau sanguină. pyogenes. pallidum sunt implicare în locomoţia bacteriei care se deplasează "înşurubându-se" în mediul lichid.Prin virulenţa lor. singura zonă unde se găsesc şi adezine. Oricare ar fi gradul patogenecităţii bacteriei implicate şi severitatea căii de pătrundere în organism. ele pot depăşi capacităţile de apărare al gazdei. inhibă sinteza proteinelor. Salmonella etc) pătrund în ţesuturile subepiteliale. Odată aderate şi înglobate în stratul de mucus secretat de celulele epiteliale. E. factorii de virulenţă incluzând factorii de colonizare şi factorii care contribuie la multiplicare. De reţinut că bacteriile foarte mobile şi subţiri (spirochetele) pătrund prin epiteliile gazdei atât prin endocitoză cât şi prin mişcări active datorită aparatului locomotor. Penetrarea acestora este asigurată de enzime (histolitice şi citolitice) componente ale peretelui celular (peptidoglicani etc) şi de endocitoză de către celulele epiteliale care ulterior le exocitează. bronşitelor.

în bioexploatarea petrolului şi minereurilor (creşterea gradului de recuperare cu ajutorul unor microorganisme). biotehnologiile moderne au mari implicaţii în industria alimentară ( producerea de proteine monocelulare neconvenţionale. sinteza unor aminoacizi esenţiali. mucegaiuri etc). 235 .1.. Gene virale transferate la virusuri. producerea de enzime. cromatografia de afinitate (de ex.1. ca ultracentrifugare. animale şi microorganisme.Capitolul 11 BIOTEHNOLOGIA Secolul XX şi în special perioada de după al doilea Război Mondial. d) Gene de la procariote transferate la eucariote. prin transfer de gene de la un organism la altul. marcarea moleculelor prin izotopi radioactivi. c) Gene de la procariote transferate la procariote. în medicină (produse de interes medical utilizate în diagnostic. aşa cum se exprimă ele în realizările ingineriei genetice sunt strâns legate de înaintarea impresionantă a tehnicilor analitice. de biochimie şi microbiologie. de biologie celulară şi moleculară. mult mai repede şi mai eficient. în ecologie ( valorificare biomasei. b) Gene virale transferate la eucariote. Astfel. vaccinuri. hormoni. Până în prezent s-au obţinut următoarele tipuri de transfer de gene: a) Gene virale transferate la virusuri. precum şi a tehnicilor de culturi de celule vegetale. dar şi a structurii altor macromolecule biologice). electrofocalizarea bidimensională (permiţând analiza a 50 000 de proteine ale unei celule). Biotehnologia este o ramură industrială complexă care utilizează drept materie primă microoganismele (bacterii. 11. vitamine. culturi de celule vegetale şi animale. f) Gene de la eucariote transferate la eucariote. 11. tratament sau cercetare fundamentală. drojdii. cum sunt lizina şi acidul glutonic. Folosindu-se un asemenea transfer s-a putut obţine prin tehnica de recombinare genetică un nou vaccin rabic cu o eficienţă mult crescută faţă de cele folosite în mod obişnuit. e) Gene de la eucariote transferate la procariote. preparate cu rol în purificarea apelor industriale şi menajere ). Ingineria genetică Progresele spectaculoase ale biologiei. a însemnat un uriaş pas înainte în dezvoltarea cercetărilor de genetică şi inginerie genetică. Tipuri de transfer de gene Prin această tehnologie se realizează noi combinaţii de ADN de la două organisme diferite.1.. determinarea structurii primare a unei proteine pornind de la numai 10 nanograme. sinteza de aditivi alimentari). substanţe antivirale şi amtitumorale. S-au creat astfel premizele apariţii biotehnologiilor moderne şi a bioindustriei. anticorpi monoclonali etc). electroforeză. microanaliza (de ex. pentru obţinerea de organisme şi de substanţe utile economic. obţinându-se în acest fel organisme transgenice. în industria farmaceutică (producerea de antibiotice. tehnica separării moleculelor complexe prin anticorpii monoclonali corespunzători). O importanţă deosebită au biotehnologiile moderne pentru manipularea genomului celulei vegetale şi animale în vederea creării de soiuri de plante şi rase de animale pe căi neconvenţionale.

în care levura se multiplică rapid. ratoni. proteina S este un antigen de suprafaţă al virusului (antigen prezent. producând proteina-antigen HBs. Celulele de levură sunt apoi recoltate. în serul bolnavilor de hepatită virală tip B). • transpoziţia (translocarea sau recombinarea cu specificitate de situs). Astfel. În aceeaşi categorie de transfer de gene se încadrează metoda de preparare a vaccinului hepatitei B (vaccin Engerix-B). Respectivul antigen nu este infecţios. lilieci (America). iar a doua în utilizarea bacteriofagilor. care prin multiplicare a permis ulterior exprimarea şi sinteza în cantitate mare a respectivei proteine a antigenului HBs. vulpi polare. Pentru prepararea vaccinului Engerix-B (ADN recombinat). reasortarea materialului genetic nu se poate realiza prin recombinare în cadrul aceleaşi celule. din cadrul aceleiaşi specii sau între specii bacteriene înrudite. 236 . cu ajutorul unui vector. se pot replica autonom (replicon).Rabia este o infecţie virală ce se transmite prin muşcătură (în cazuri speciale şi prin aer) de câine. Pentru producerea vaccinului la scară industrială. Prin aplicarea unei tehnologii genetice. din ADN viral a fost izolată gena S şi. Gene virale transferate la eucariote. În fiecare an se înregistrează 50000 de decese umane prin rabie pe glob (majoritatea în Asia) şi câteva milioane de decese la animale. sconcşi. Rezultă o celulă care conţine întreg genomul receptorului şi un fragment din genomul donorului. Biologia moleculară a permis determinarea cvasi-totală a materialului genetic al virusului hepatitei B. a fost inserată în materialul genetic al unei celule gazdă eucariote ( o levură). • conjugarea. la nivelul unor situs-uri specifice ale învelişului celular. Prima constă în utilizarea plasmidelor* ca vectori. pătrunde apoi în celula receptor şi se integrează prin recombinare în regiunea omologă a cromozomului receptor. * Plasmidele = clasă majoră de elemente genetice mobile. care a inhibat sinteza ADN celular din celulele canceroase. oprind diviziunea celulară şi propagarea celulelor neoplazice. formate dintr-un duplex ADN. tulpina de levură pe care se realizează procesul de recombinare este însămânţată în cuve de fermentaţie (bioreactoare). lupi. înainte de a fi condiţionat în vaccin. ci doar imunogen. • transducţia. câini. iar antigenul HBs este izolat şi înalt purificat. În 1995. Transformarea reprezintă prelucrarea unei molecule de ADN de la o tulpină donor de către o celulă receptoare competentă. Becker şi Darai arată că ingineria genetică cu viruşi vectoare reprezintă un subiect de primă importanţă pentru dezvoltarea protocoalelor de terapie genică la om. a fost selecţionată levura Saccharomyces cerevisiae (1991) (Smith Kline-RIT). ADN-ul transformat se leagă de celula competentă. S-au descris patru mecanisme diferite de transfer genetic: • transformarea. sunt folosite două tehnici. Respectiva enzimă a indus în celulele canceroase sinteza de monofosfat de aciclovir şi ganciclovir şi apoi fosforilarea acestora până la forma de trifosfat. vulpe (Europa). Cu ajutorul retrovirusului recombinat Herpes simplex tip I a fost transportată gena timidinkinaza HSV-1TK de la acest virus în celule pulmonare canceroase de la om. sunt cromozomi accesorii. Gene de la procariote transferate la procariote Pentru a realiza introducerea ADN-ului (gena) bacterian într-o altă bacterie. în mod constant. broyate. Deoarece bacteriile sunt organisme haploide. ci prin transferul de material genetic de la o tulpină donoare la una receptoare (diferită de prima). în secvenţa ADN a fost identificată gena S drept responsabilă se sinteza proteinei S (antigen HBs).

celula receptoare F. Factorul F pătruns în celula receptoare Fpoate rămâne liber în citoplasmă şi atunci celula F. fagul P1 de la E. cel mai cunoscut fiind gena “tox” responsabilă de toxinogeneza tulpinilor de bacil difteric. formând deci un lanţ dublu ADN. gena de sinteză a endotoxinei bacteriene de mai sus). rezultând un plasmid 237 .devine Hfr (high frequeney recombination). rezultă locuri de tăiere cu secvenţe complementare. rezultatul fiind producerea unor tumori la plante. Conjugarea presupune un transfer de material genetic de la celula donatoare la celula receptoare. deoarece prezintă frecvenţa înaltă de recombinare. coli. sau se poate integra în cromozomul bacterian (cu frecvenţă de 105 per generaţie)..(celula receptoare. Gene de la eucariote transferate la procariote Acest transfer este practicat de 20 de ani. Deoarece endonucleazele se fixează pe plasmid doar la nivelul aceloraşi secvenţe de baze ca cele de pe fragmentul ADN. Anumiţi fagi (convertizori) transportă gene cu alte funcţii decât cele virale. lipsită de factorul F). Transferul de material genetic este polarizat de la celula F+ (celula donatoare. Conversia. folosite astăzi. Gene de la procariote transferate la eucariote S-a obţinut transferul unei gene (responsabilă de sinteza unei endotoxine care omoară insectele) de la Bacillus thuringiensis în celule vegetale (bumbac) cu ajutorul unui plasmid Ti asociat cu un retrovirus. în acest ultim caz. prin intermediul fagilor transductori. Acest fenomen este practic posibil la toate speciile bacterine. având capacitatea de a se insera pe unul sau mai multe situs-uri specifice. Această tehnologie generică este folosită cu rezultate foarte bune de mai bine de 30 de ani. Acest aspect reprezintă condiţia esenţială pentru fuziunea fragmentului ADN cu plasmidul deschis. Plasmidul Ti provine de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. plasmidul Ti poate trece spontan în celulele vegetale infectându-le. apoi tăiat de endonucleaze de restricţie. în asociere cu un retrovirus. se foloseşte astăzi pe scară industrială şi se realizeză după următoarele etape: ƒ ADN din cromozomul organismului eucariot este extras şi purificat. dar numai anumiţi fagi au proprietatea de a fi transductori (fagul λ de la E. Genele din genomul eucariot sunt transferate cu ajutorul unui vehicul corespunzător în organismul procariot iar apoi aceste noi gene transferate se multiplică (cu rată foarte înaltă) în organismul procariot. urmată de clonarea genelor nou transferate.Transducţia reprezintă transferul de material genetic de la o bacterie la alta. care conţine factorul de fertilitate F ) către celula F. În acest fel. Aceste plasmide Ti. dintr-un genom bacterian. plasmidul se închide. obţinându-se un lanţ ADN unic. ƒ se foloseşte un vehicul izolat dintr-o bacterie. prin intermediul factorului de fertilitate F (factor plasmidic = vector). tumori cunoscute sub numele de “creasta cocoşului”. îşi pierd capacitatea tumorigenă şi o păstrează doar pe cea de vector a unei gene străine (de ex. numit şi factor de fertilitate. începând cu capătul 5’ al ADN-ului. incluzând şi gena eucariotă. bacterie care parazitează plantele. organismele procariote (microorganisme tip bacterii) cu rată foarte înaltă de multiplicare pot fi utilizate pentru sinteza anumitor gene din organismele superioare. fagul P22 de la Salmeonella typhimurium). coli. care devine astfel o parte integrantă din sistemul genetic al procariotului. Acest tip de combinaţie ADN in vitro. drept vectori pentru manipulări genetice (transfer între o celulă procariotă şi o celulă eucariotă).devine F+. În acest fel. Pe baza capetelor ADN lanţ unic cu secvenţe complementare (sub influenţa ADN-ligazei) se pot lega cele două lanţuri ADN străine (plasmid + gena de la eucariot). Transpoziţia este fenomenul prin care copii (elemente transpozabile) ale unor secvenţe specifice de acid nucleic. se deplasează de-a lungul aceluiaşi lanţ de acid nucleic sau pe cel al altui genom bacterian. Plasmidul de formă circulară este deschis (cu ajutorul unei enzime de restricţie).

infecţii HIV. În prezent drojdiile se folosesc în acest scop pe scară largă în industria farmaceutică.1. În acest caz.interleukina umană (1980) . există premisele tratării într-un viitor foarte apropiat a unor boli genetice. au putut sintetiza produse metabolice umane.hibrid. Pentru cele 4000 de boli genetice umane cunoscute astăzi ca nevindecabile se preconizează o terapie genetică prin: reperarea genelor mutante responsabile de defectul genetic şi ulterior. terapia cu gene poate fi de două feluri: ƒ terapie cu gene somatice. adică factorul VIII de coagulare. ƒ terapie cu gene sexuale. Terapie cu gene ţintă (Gene Targeting) În condiţiile progresului actual al ştiinţelor biologice. tratamentul este restrâns doar la pacienţii trataţi. gena umană (de pe cromozomul 10) responsabilă de sinteza factorului VIII al coagulării a fost clonată şi transferată în celule renale de hamster. Acest prim pas reprezintă “adiţia de gene“. principiul acestei metode este recoltarea de la pacienţi de celule cu defect. Aceste celule bacteriene cresc pe respectivul mediu sub formă de colonii în care există un număr de ordinul a sute de milioane de celule bacteriene cu genă eucariotă. care creşte permeabilitatea membranei bacteriene. Aceste celule bacteriene au fost transformate. terapia cu gene are drept scop introducerea unor gene intacte din punct de vedere funcţional în celulele cu genă defectă şi apoi exprimarea acestor gene nou introduse. după integrarea în genomul lor a genelor umane. determinând terminarea transferului de gene. vor fi omorâte. Pentru a se facilita pătrunderea acestui plasmid hibrid în celula bacteriană se foloseşte soluţia de CaCl2. În aceste boli. De pildă. deci fiecare celulă bacteriană dintr-o colonie rezistentă la antibiotice conţine o genă eucariotă. preţul acestui produs s-a dovedit a fi mult mai ieftin decât al factorului VIII extras din plasma de la om sănătos. Principiile de bază ale terapiei cu gene sunt următoarele: 238 . Gene de la eucariote transferate la eucariote Gene umane (responsabile de sinteza unor produse metabolice) au fost transferate în celule de drojdii. ƒ selectarea celulelor bacteriene care conţin gena eucariotă se realizează cu ajutorul unui plasmid care poartă unul sau mai mulţi markeri de rezistenţă la antibiotice. în acest caz influenţa tratamentului transmiţându-se progeniturii. O bacterie rezistentă posedă o genă (eucariotă) străină (cuplată cu plasmid cu markeri de rezistenţă). dar rămâne fără efect asupra descendenţilor. Din punct de vedere teoretic. celula de hamster începând să sintetizeze produsul acestei gene. necesar în tratamentul hemofilicilor. injectarea acestora cu gene sănătoase fixate pe un virus vector. boli neoplazice. Această terapie este încă la început. se încearcă introducerea unei gene normale în genomul pacientului şi urmărirea acestei acţiuni în timp. acestea. rămâne practicabilă doar terapia cu gene în celulele somatice. în care celulele receptoare de genă intactă pot fi celulele sexuale sau celula ou fecundată.2. Astăzi este însă interzis prin lege transferul de gene la nivelul celulelor sexuale umane. bacteriile.interferon leucocitar de fibroblaşti (1980). 11. Prin tehnologia genetică de transfer de gene de la eucariote la procariote s-au obţinut următoarele sinteze: . apoi reinfuzarea respectivelor celule la pacient.somatotropina (hormon de creştere uman) (1979) . Dacă cultura bacteriană cu plasmidul mai sus-menţionat este pusă în prezenţa antibioticelor respective. în care celulele receptoare de genă intactă sunt celulele organismului. Gene umane au fost inoculate şi în culturi de celule de mamifere. înlocuirea genei mutante printr-o alelă normală. cu câteva excepţii.

Procedeul a constat în recoltarea de limfocite T de la copilul bolnav. aceste celule T din culturi au fost inoculate cu gene pentru enzima adenozindezaminază. ƒ mucoviscidoza (fibroza chistică) este o boală genetică recesivă care afectează pancreasul exocrin. fiind apoi reinfuzate i. Terapia cu gene în boli ereditare Majoritatea bolilor genetice la om sunt determinate de mutaţii punctiforme sau deleţii. Apoi aceste limfocite inoculate au fost cultivate şi multiplicate mai departe în culturi celulare. Cu ajutorul unui vector. în acest caz.v. Anderson şi colab. aceste limfocite au fost cultivate şi multiplicate în culturi celulare. Cu referire specială la utilizarea retrovirusurilor drept vectori de gene. a următoarelor boli ereditare: ƒ boli sanguine de tip talasemie şi meniscocitoză (sickle cell anemia). care îl va elimina. va extrage excesul de colesterol din sistemul circulator (unde colesterolul poate determina tulburări cardiovasculare) şi îl va îndrepta prin reţeaua sanguină către ficat. clonarea genelor sănătoase. Acest tratament va trebui repetat în cursul vieţii pacientului. pe baza terapiei cu gene. când Francis Anderson. se manifestă printr-o topire rapidă a masei musculare. boala apare ca urmare a inactivării genei responsabilă de sinteza distrofinei. dacă va fi conectat printr-o reţea de vase sanguine cu ficatul. în condiţii speciale. ƒ hipercolesterolemia familială. în care sunt introduse celule hepatice injectate cu gene care au capacitatea de a atrage colesterolul. Lung and Blood Institute al Universităţii Houston Texas. multiplicarea celulelor dorite în culturi de celule. de celulele stem pentru seria eritrocitară din măduva osoasă. reintroducerea acestor celule la pacienţi. a. Această inactivare este consecinţa inserţiei. Această boală este foarte rară. în aceste boli există o genă deficitară în sinteza subunităţii tip β-globină din structura hemoglobinei. De la Univ. este o tulburare genetică a metabolismului grăsimilor. În această boală este prezent şi un deficit funcţional al enzimei mitocondriale NAD.ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ recoltarea de celule ţintă de la pacient.dehidrogenaza cât şi o creştere intercelulară de ioni de Ca++. introducerea în celulele ţintă cu ajutorul unor vectori corespunzători (retrovirusuri) a unor gene sănătoase. ƒ boala imunodeficienţei combinate severe (SCID) cu deficit funcţional al limfocitelor T (prin absenţa enzimei adenozindezaminaza A şi B). bazat pe absenţa receptorilor LDL (lipoproteine cu densitatea scăzută) ai celulelor hepatice. ƒ distrofia musculară Duchenne. şeful secţiei de Hematologie Moleculară de la Naţional Heart. Houston din Texas preconizează pentru tratamentul acestei boli realizarea unor ‘neo-organe’ (structuri din materiale artificiale plasate în vecinătatea ficatului). În prezent se studiază posibilităţile tratării. şi medicii Michael Blaese şi Kenneth Culver de la Naţional Cancer Institute au efectuat prima terapie cu gene tocmai într-un caz cu deficit funcţional de limfocite T. celulele ţintă pentru terapia cu gene sunt reprezentate. se caracterizează prin creşterea consistenţei secreţiei pancreatice având drept consecinţă obturarea glandelor exocrine şi formarea de chisturi pancreatice cu distrugerea ţesutului pancreatic şi scăderea nivelului enzimelor pancreatice. trebuie menţionat că Richard Mulligan de la Massachusetts Institute of Tehnology a imaginat o metodă eficace 239 . în exonul 48 al respectivei gene. cultivarea şi multiplicarea celulelor ţintă în culturi celulare. până astăzi fiind descrise numai 50 de cazuri în literatura de specialitate. a unui retrotranspozon L1. Acest ‘neo-organ’ (cu rol de ligand). selectarea celulelor care conţin gene sănătoase străine şi exprimarea lor. la acelaşi copil. Absenţa respectivei enzime determină scăderea capacităţii de apărare a organismului şi moartea copilului în primul an de viaţă. Epoca terapiei cu gene a început în septembrie 1990 în SUA.

c. deci transducţia în aceste celule este practic imposibilă. Este posibil ca limfocitele corectate (prin injectare cu virus vector + gena pentru sinteza enzimatică) să asigure un timp. dar aceste celule s-au dovedit a fi ţinte foarte dificile. nu ucid celulele pe care le contaminează. Fenomenul prin care retrovirusul vector transportă şi fixează o anumită genă în nucleul unei celule ţintite poartă numele de transducţie. În acest fel. în primul stadiu al pătrunderii sale în organism. păstrând însă capacitatea ca. În mod normal. proporţia acestor celule stem în ţesuturile medulare este mai mică de 1/10000 şi nu există nici o metodă adecvată de separare a celulelor stem de celelalte celule. În plus. În cazul în care în sistemul sanguin ar putea exista şi circula o cantitate mare dintr-o proteină similară. Factorul TNF este o proteină formată din 157 de aminoacizi cu rol în captarea şi distrugerea celulelor tumorale şi a substanţelor străine organismului. două persoane cu forme avansate de melanom malign au fost supuse următorului tratament: li s-au extras o cantitate de macrofage pe care s-au grefat apoi vectorii (retrovirusuri) purtători de gene pentru sinteza de ‘factor de necroză a tumorilor ‘ (factor TNF). acest factor TNF este sintetizat de macrofage şi eliberat în circulaţie. macrofagele extrase şi întreţinute pe culturi celulare au fost inoculate cu vector purtător de TNF şi apoi reinlocuite la cei doi pacienţi cu melanom. acesta nemaiputând să pătrundă în celulele sistemului imunitar. au fost preferate limfocitele drept celule ţintă pentru vectori. deoarece există pericolul diluţiei acestui factor. În prezenţa respectivei gene. virusul lipsit de majoritatea genelor proprii devine inofensiv. într-o cultură de celule. se fixează pe această proteină de pe suprafaţa limfocitelor. cel puţin parţial. Această prelucrare constă în eliminarea prealabilă a majorităţii genelor virale din structura acestuia şi combinarea ulterioară a segmentului de virus rămas cu genele care urmează să fi injectate în celulele umane. fiind foarte greu de obţinut. limfocitele ar fi capabile să sintetizeze o cantitate mare din această proteină. b. Pentru a fi ‘altoite’ cu retrovirusul transductor. Iniţial s-a încercat folosirea celulelor stem (celule-tulpină) din măduva osoasă. Gallo (National Cancer Institute) preconizează tratamentul cazurilor de SIDA prin terapie ţintită cu o genă pentru sinteza unei proteine receptoare CD4 pe suprafaţa limfocitului. deposedat fiind de capacitatea infecţioasă. deşi celulele stem au o durată de viaţă infinită în comparaţie cu limfocitele ( cu viaţă doar de câteva luni). Pentru terapia genică. Terapia cu gene în infecţia HIV Anderson şi colab. De aceea. această proteină ar putea fixa virusul HIV. în cazul acestor doi pacienţi cu macrofage defectuoase. Retrovirusurile sunt mai mici decât celelalte virusuri şi. Împreună cu R. Terapia cu gene în boli neoplazice A fost utilizată întâia oară în melanomul malign. TNF nu se poate injecta direct în torentul circulator. alegerea celulelor ţintă este foarte importantă.de prelucrare prealabilă a acestui virus. spre deosebire de acestea. o dată introdus într-o celulă. în câteva ore virusul va pătrunde în majoritatea acestor limfocite. or celulele stem. la locul tumorii nemaifiind posibil să ajungă o concentraţie suficient de activă de TNF. Retrovirusurile reprezintă astăzi uneltele cele mai larg utilizate în ingineria genetică. un anumit nivel imunitar organismului. Virusul HIV. fenomenul de transducţie poate avea loc doar în celule care se divid. care apoi vor fi infuzate pacientului. într-o mixtură cu acesta. să-şi poată îngloba încărcătura genetică în aceasta. În 1991. 240 . De aceea. ciclul de multiplicare virală intracelulară fiind astfel oprit. limfocitele sunt puse în contact. se divid foarte rar.

cunoştinţele de genetică vegetală se foloseau doar pentru studiul eredităţii.11. au în vedere obţinerea de organisme modificate genetic (transgenice). în vederea regenerării plantelor.Etapele de izolare şi cultură a protoplaştilor (după CachiţăCosma. 135 .3. 136 şi 137). permutaţii de organite citoplasmatice. în interesul omului. Se obţin hibrizi în afara sexualităţii. Biotehnologia de hibridare somatică Această procedură permite hibridări totale sau parţiale. Fig. a deschis primele căi de intervenţie genetică. a.1984). Prin acest procedeu se obţine regenerarea unui număr mare de plante . ce se incorporează în genom şi se transmit descendenţilor. Aplicarea metodelor de biotehnologie în agricultură în vederea obţinerii de organisme transgenice Biotehnologiile moderne. La plante Până de curând. Organismele transgenice (plante şi animale) sunt organisme care pe lângă înzestrarea lor genetică câştigă proprietăţi noi. de a manipula şi cultiva in vitro. celule) din organisme vegetale.figurile: 135. fuzionare de protoplaşti (celule fără perete pectocelulozic) chiar de la două specii diferite. Posibilitatea de a utiliza elementele disociate (ţesuturi. aplicabile la plante şi animale. obţinerea primelor organisme transgenice a deschis noi perspective în ingineria genetică vegetală. care să prezinte caracteristici îmbunătăţite.1. 241 .de asemenea. pentru analiza segregărilor* la descendenţii rezultaţi din hibridizări.

cibrizi şi himere (după Badea şi Raicu.ginogeneza = cultura şi regenerarea plantelor plecând de la ovul sau de la celule haploide asociate.Fig.Prezentare schematică a principalelor posibilităţi de obţinere a unor noi varietăţi de plante (după Brezeanu şi Soran. Biotehnologie de haploidizare Ţesuturi care au suportat meioza (deci sunt haploide) sau celule rezultate din pseudofecundaţie provocată sunt introduse în culturi in vitro. Există 2 tipuri de haploidizare: . 137 . 1985).Prin fuziunea protoplaştilor se produc hibrizi somatici. .androgeneza = cultura şi regenerarea plantelor plecând de la microspori (fig. 138). 242 . 136 . Fig. 1984).

linii izogene şi mutante la nivel haploid prin cultura in vitro a gametofiţilor. creşterea cantităţii de acizi graşi nesaturaţi. 243 . 139 . insecte. 5 – plantă androgenetică la ghiveci (după Badea şi colab. la grâu în 1992. metale grele. Primele organisme transgenice prin biotehnologie de transfer s-au obţinut la cereale: la orez în 1988. Biotehnologie de transfer Un exemplu a fost menţionat la capitolul despre tipurile de transfer de gene procariote la eucariote în scopul obţinerii de specii de plante (bumbac) rezistente la insecte.1987). 2.Fig.Diferite faze ale desfăşurării androgenezei la Datura innoxia: 1 – structuri embrionare diferenţiate direct din anteră. ƒ creşterea producţiei de substanţe nutritive. Plantele regenerate au un singur set cromozomial (patern de androgeneză şi respectiv matern de ginogeneză) şi ar fi rămas sterile dacă n-ar fi fost puse la punct mecanismele de autodedublare a acestor cromozomi. care reprezintă circa jumătate din necesarul de substrat alimentar pentru alimentaţia populaţiei globului cu proprietăţi cât mai adecvate. 139). bacteriene. vegetale.3 – plante complet diferenţiate din antere.. 138 . În general se urmăresc obţinerea următoarelor proprietăţi în noile organisme transgenice: ƒ fixarea azotului din atmosferă. Spre aceste trei specii de cereale. prin folosirea tehnologiei genetice. ierbicide. la porumb în 1990. 4 – plantă androgenetică în tub. Prin aceste metode de haplodiploidizare se crează plante diploide perfect homozigote (linii izogene) şi de utilitate majoră în ameliorarea calităţii speciilor de plante (descendenţi absolut omogeni în anumite condiţii de reproducere) (fig.Obţinerea de plante haploide. concentraţie crescută de Na în sol. ƒ toleranţa la uscăciune. Fig. temperatură nefavorabilă. ƒ rezistenţa la infecţii virale. ƒ izolarea din plante a substanţelor cu proprietăţi farmaceutice.

în vederea obţinerii unor organisme transgenice cu metabolism activat. pentru obţinerea unui nou caracter. în SUA au fost obţinute soiuri de roşii transgenice prin metoda de inhibare cu ARN antisens. enzime. glucozide. rezistente la uscăciune. în cazul utilizării tehnicilor genetice. etapă de etapă. În aceste condiţii. alcaloizi. în SUA a fost proiectată crearea unor soiuri de plante transgenice rezistente la ierbicide. În timp ce pentru o cultivare de plante clasice sunt necesari zece ani. grâu. La animale S-au obţinut crapi transgenici prin transfer de gene de creştere de la creştere de la păstrăvi. Obţinerea de noi soiuri de plante rezistente la infecţiile virale se realizează prin: ƒ integrarea unei părţi din ADN viral în genomul plantei. În 1995. metale grele. 244 . ƒ încheierea de acorduri internaţionale pentru înfiinţarea unei comisii de etică cu posibilităţi de control permanent. neprevăzute în prezent. Dintre riscurile posibile. hormoni (produse vegetale). responsabilă de compunerea peretelui celular al tomatei. La porci au fost transferate gene responsabile de sinteza hormonului de creştere. se pot enumera: ƒ pierderea diversităţii lumii vegetale. În 1994. care a oprit sinteza enzimei poligalacturonaza. grad înalt de salinitate şi rezistente la insecticide. având drept consecinţă dezechilibrul ecosistemelor. în timp ce buruienile rămân sensibile la ierbicide. exprimarea proteinei de înveliş viral va asigura rezistenţa plantei la respectivul virus.Până în prezent au fost obţinute noi soiuri transgenice de roşii. asupra varietăţilor nou-obţinute. ƒ restrângerea gamei de calităţi organoleptice naturale ale unor noi sorturi de legume şi fructe. b. ƒ deşteptarea unor gene ancestrale nedorite. căldură. tutun şi petunii. acest interval scade la şase ani. prin aceasta. în SUA se prevedea obţinerea de noi soiuri de plante transgenice rezistente la insecte. Prevenirea riscurilor menţionate mai sus cere multă prudenţă cât şi anticiparea remediilor posibile înainte de crearea noilor variante. ƒ posibilităţi de biosinteze nedorite de acizi graşi. care să fie livrate pe piaţă în următorii zece ani. ƒ riscul dezvoltării explozive a unor ‘patotipuri’ adaptate în mod special. aceste noi organisme transgenice au avut o viteză mult mai mare de creştere decât organismele noi organisme transgenice au avut oviteză mult mai mare de creştere decât organismele normale. tomatele pot fi culese când se află la punctul favorabil al coacerii şi se pot păstra şase-opt săptămâni fără a fi puse la rece. cu o eficienţă înaltă de utilizare a hranei şi cu o creştere foarte rapidă. trebuie luate în considerare anumite riscuri care apar drept consecinţă a apariţiei unor variante de specii vegetale. În acest sens se recomandă: ƒ evitarea difuzărilor tipurilor omogene şi uniforme de vegetale pe suprafeţe foarte întinse. Pentru viitor. ƒ noi biosinteze. Pentru acest motiv oamenii de ştiinţă vor trebui să folosească cu multă grijă şi măsură aceste posibilităţi moderne ale biotehnologiei. În anul 1992 erau raportate 40 de soiuri noi de plante transgenice. ƒ dezechilibre nutriţionale. ƒ efectuarea detailată a analizelor de structură şi control în faza precoce a noilor variante ale unui sort vegetal. ƒ inhibarea replicării virale prin tehnica antisens (1992). În 1993.

de exemplu creşterea sintezei unor resurse naturale din mediu.1. 11. mediate de clase specifice de molecule şi semnale au contribuit la construirea unui fundament pentru elaborarea viitoarelor strategii de sinteză a unor noi agenţi terapeutici cu următoarele calităţi: 245 . cacao. prin studiile de micribiologie au fost identificate tulpini microbiene care printr-un proces de bioconversie microbiană/enzimatică acţionează asupra acizilor graşi (acid linoleic şi linolenic) şi esterilor. Nizina prezintă şi avantajul de a fi hidrolizată complet de către proteazele tractului digestiv uman. prin utilizarea lor asociată cu nizina. în concentraţie mai mică de 30 µl/ml inhibă dezvoltarea diferitelor specii de germeni gram-pozitive . Din 1951. a dezvoltării ştiinţelor medicale şi agriculturii. se încearcă în prezent obţinerea unei bacterii ‘ îmbunătăţite’. Nizina inhibă de asemenea sporularea la bacterii din genul Clostridium şi Bacillus. se preconizează obţinerea prin procedee de inginerie genetică şi proteică a unor variante de nizină cu spectru larg de activitate. fructe. şi-a găsit o foarte largă aplicabilitate practică în industria alimentară. ducând în final la obţinerea unor arome naturale (lactone şi metilketone) cu utilizare largă în industria alimentară. al cărei plasmid să crească eficienţa utilizării petrolului brut.2.şi intracelulare. dar nu are nici un efect asupra majorităţii bacteriilor gram-negative şi nici asupra fungilor şi levurilor. ci şi pentru rezolvarea în viitor a unor probleme ecologice. 11. în comparaţie cu nitraţii şi nitriţii (folosiţi tot drept conservanţi).5. brânzeturi proaspete şi procesate. evitându-se astfel nocivitatea altor conservanţi alimentari asupra sănătăţii publice. Totuşi în prezent se consideră că posibilităţile de utilizare ale nizinei drept conservant alimentar sunt încă limitate din cauza slabei ei solubilităţi şi a stabilităţii scăzute la pH neutru. neproducând nici o dereglare a florei intestinale gram-negative. ambele clase de substanţe derivate din uleiuri vegetale. nizina este folosită în industria alimentară pe scară internaţională. Alte aspecte ale biotehnologiei moderne şi perspectivele secolului XXI Progresele recente în cunoaşterea la nivel molecular a interacţiunilor extra. în prezent ea poate fi utilizată drept conservant activ în alimente cu pH-ul mai mare de 6.5. aspect ce semnifică posibilitatea unei mai bune utilizări a petrolului brut natural. În acest sens. Pentru produsele în care nu se poate renunţa total la adaosul de nitraţi (nizina fiind ineficientă asupra florei gram-negative).11. Ingineria genetică utilizată în prepararea de noi conservanţi alimentari Nizina. Multe tulpini bacteriene de Pseudomonas putida posedă un plasmid responsabil de descompunerea hidrocarburilor din petrol.4. Această largă utilizare se datoreşte faptului că nizina prezintă marele avantaj de a nu avea efecte nocive asupra organismului viu. care prin producerea de nitrozamine au acţiune carcinogenă asupra organismelor. băuturi alcoolice (vinuri). nizina era utilizată drept conservant alimentar în peste 50 de ţări de pre glob. ATTC 11454 GR.5. substanţă din categoria lantibioticelor. în 1989. peşte. Ingineria genetică şi rezolvarea unor probleme de ecologie Posibilităţile tehnologiei genetice au importanţă nu numai pentru dezvoltarea cercetării fundamentale. cantitatea de nitraţi poate fi redusă considerabil. prezentând activitate inhibitorie maximă la un pH mai mic de 5. astfel.1. carne. Nizina este produsă de tulpinile de Lactococcus lactis 6F3. În ultimii ani. 4 Lancefield. În perspectiva dezvoltării biotehnologice. drept conservant natural pentru vegetale. variante ce vor putea fi utilizate drept conservante într-o gamă mult mai largă de produse alimentare.

în cursul distribuţiei acestora în organismul bolnav. 246 . b. a fost sugerat un mecanism de blocare a receptorilor celulelor endoteliale cu ajutorul unor analogi ai heparinei. peptide antagonice. Molecule active pe tubulină (antimitotice) Au acţiune antimitotică împiedicând diviziunea celulară prin stabilizarea microtubulilor (spre diferenţă de Vinca. împiedicând în consecinţă angiogeneza şi inhibând simultan adenoamele experimentale (de pancreas. şi anume: a. s-a încercat construirea unor noi molecule cu potenţial antiumoral. ƒ minimalizarea cât mai mult cu putinţă a efectelor toxice secundare ale drogurilor. blocând receptorii celulelor endoteliale. prezentând sinergie cu metotrexatul şi adriamicina. înţelegând prin aceasta o acţiune cât mai ţintită asupra celulelor tumorale. Diaminociclohexanul şi axoliplatina sunt în curs de experimentare şi nu au atins încă faza de testare clinică. Inhibitori ai topoizomerazelor Topoizomerazele sunt enzime destinate a modifica structura spaţială a ADN-ului înainte de replicare.ƒ ƒ ƒ ƒ eliberarea ţintită (situs-specifică) în circulaţie prelungirea timpului de înjumătăţire efect prelungit la locul de acţiune efecte benefice mărite asupra organismului. Ţinând seama de aceste considerente. anticanceroase B. cercetătorii şi-au propus: ƒ îmbunătăţirea gradului de acţiune selectivă a drogului. Derivaţii de platină reprezintă astăzi o clasă foarte studiată de antimitotice. anticorpi. Acesta s-a dovedit foarte eficace în asociaţie cu alte antimitotice curente. A. cardiovasculare D.). Dintre antimitotice. taxolul a fost testat experimental prin administrare intratumorală în tumori vezicale la şoarece. Pornindu-se de la aceste elemente. sunt platine liposolubile care se pot administra cu ajutorul liposomilor. alcaloizi care determină depolimerizarea tubulinei). În acest sens există deja o metodologie pentru obţinerea unor proteine-himere. c. care. suprimând superrăsucirile dublului helix. terapia anticanceroasă cu citostatice este nesatisfăcătoare într-un număr mare de cazuri din cauza: ƒ dezvoltării rezistenţei la droguri ƒ efectelor secundare nocive (imunodepresie medulară. Substanţe antiangiogenice S-a studiat rolul factorului de creştere fibroblastic (bFGF) asupra mecanismelor de angiogeneză (geneza vaselor sanguine) şi consecinţa acesteia asupra metastazării. prostată) de origine umană. toxicitate hepatică şi renală etc. Pentru contracararea acţiunii bFGF. bazându-se pe achiziţiile cele mai recente ale biologiei moleculare. cu aplicabilitate practică în domeniul terapiei: A. Terapia anticanceroasă În prezent. dintre acestea. sân. pentru cisplatină şi carboplatină a fost demonstrată eficacitatea clinică. S-a constatat că acest factor bFGF are o acţiune de stimulare a proliferării celulelor endoteliale de activare a angiogenezei (neoformaţie de vase sanguine). opresc fixarea bFGF pe respectivii receptori. antivirale C. în boli metabolice. Pe modele experimentale s-a demonstrat şi eficacitatea ologozaharidelor sulfatate.

dar poate include în plus şi clivajul catalitic al ARN ţintit. Pentru a se înţelege mecanismul de acţiune (‘’controlul’’) al ciclului nucleic antisens asupra unui proces de oncogeneză (“expresie oncogenă“). care să se lege selectiv de o secvenţă complementară a unui acid nucleic unic lanţ (un ARNm sau un ARN viral). în consecinţă. Oligonucleotidele antisens sunt fosfodiesteri naturali care au diferite mecanisme de acţiune. Acest oligonucleotid (antisens) blochează. AACR 3672. ţintele principale de acţiune a acestor substanţe dovedindu-se a fi: ƒ gena oncogenă c-myc (pentru substanţele AACR 1833. d. Substanţe antisens Studiul acestor substanţe a fost posibil datorită cercetărilor de biologie moleculară. acţiunea lor a fost urmărită până în prezent pe linii celulare. s-au preparat fragmente scurte de acid nucleic (oligonucleotide). metastazarea. Un oligoribonucleotid (ribozim) ARN se leagă de o secvenţă complementară a ARN ţintă. În prezent sunt studiate metodele de inoculare cele mai eficiente a acestor substanţe în organismul bolnav. ca şi oligonucleotidul antisens. e. folosit pentru a prinde “în cursă” un factor de transcriere (de expresie) care duce în final la alterarea expresiei tuturor genelor de pe respectivul fragment ADN. pornindu-se de la această idee. este vorba de un oligonucleotid “capcană”. prin legarea lui de ARN-ul ţintă (target). AACR 3154. tioindolului.Se pare că aceste substanţe antiangiogenice acţionează prin oprirea dezvoltării de noi vase sanguine şi nu prin distrugerea celor formate. translaţia sau respectiv reverstranscriptaza ARN-ului (viral) ţintă. Strategia “ de sens” cu structuri oligonucleotidice În 1980 a apărut o nouă strategie şi anume cea a antigenelor în care oligonucleotidul are drept “ţintă” un ADN dublu helical. astăzi sunt urmărite următoarele obiective: ƒ descompunerea unor droguri care să poată inhiba selectiv efectele biologice ale produşilor oncogeni ƒ restabilirea funcţiei factorilor supresori de tumori şi a genelor pentru repararea ADN-ului. Chiar şi drogurile anticanceroase care interacţionează cu ADN îşi exercită acţiunea biologică prin inhibarea enzimelor (topoizomeraze) care procesează ADN. AACR 3668). Pornind de la aceste aspecte. trebuie amintit mai întâi că transformarea celulelor normale în cellule maligne reprezintă un proces în mai multe etape: ƒ activarea protooncogenelor ƒ inactivarea genelor supresoare de tumori ƒ inactivarea genelor de reparare a ADN. prin inhibarea acţiunii bFGF este oprită proliferarea fibroblastelor. AAXR 3155) ƒ proteinele p53 (pentru substanţele AACR 3630. strategia de sens este mai piţin selectivă. Oligonucleotidele antisens de tip oligofosfotioaţi se folosesc şi în tratamentul leucemiilor şi al infecţiilor cu HIV. Inhibitori de kinaze Sunt inhibitori ai tirozinkinazei proteinkinazelor. deci opresc neoformaţia şi. Oligonucleotidele pot fi folosite pentru controlul genelor în aşa-numita strategie de sens (sense approach). Modul cel mai simplu de a corecta activitatea acidului nucleic este cel de a folosi tocmai acid nucleic. căutându-se a se ameliora penetrabilitatea lor în celule. pentru a forma în final un triplu helix la nivelul căruia este blocată transcrierea (ceea ce reprezintă blocarea primei etape a expresiei genelor). AACR 3668. Majoritatea drogurilor existente în prezent acţionează la nivelul proteinelor. AACR 3679) ƒ proteinele p120 (pentru substanţele AACR 1832. inhibă autofosforilarea bFGF (via tirozinfosforilare). Totuşi oligonucleotidele “capcană” pot 247 . Rezultă că în comparaţie cu strategiile “antisens” (tip ribozim). fiind astfel inhibată dezvoltarea metastazelor (prin inhibarea neoformaţiei de vase de sanguine). f.

maturaţia. receptori. este vorba de strategia aptamer. (1995) au propus un protocol de terapie genică bazat pe utilizarea celulelor CIK (celule killer transfectate cu gena IL7) pentru inducere de citokine IL7. Strategia aptamer Recent a fost elaborat un nou mod de utilizare a acestor oligonucleotide. Proteine de fuziune (anticorpi monoclonali . Terapie antivirală Terapie anti-HIV La începutul anilor 1980 exista în întreaga lume opinia că datorită antibioticelor şi vaccinurilor va fi rezolvată problema infecţiilor bacteriene şi virale. În 1995. sau obţinută în urma unei terapii genice cu gene (sintetizatoare) de citokine. direcţionează aceste citokine atunci când sunt introduşi în organismul bolnav către situs-urile celulelor tumorale corespunzătoare. aceste celule limfocitare vor fi foarte bune vehicule în organismul bolnav datorită capacităţii lor de a prolifera. poartă fixate pe molecula lor citokine. Principiul acestei terapii constă în implatarea în organismul bolnav a unor celule somatice (limfocite) modificate din punct de vedere genetic (limfocite pe care sau transferat în prealabil gene codificatoare de citokine). g. Efectul acestor oligonucleotide de strategie de se3ns poate fi deci selectiv pe un virus sau parazit. Una din problemele dezbătute în prezent în această direcţie este obţinerea unor proteine de fuziune cu anticorpii monoclonali recombinaţi. Aceste proteine de fuziune (anticorpi-IL2) sunt injectate în organismul bolnav. în condiţii de recombinare. Terapie genetică cu gene codificatoare pentru citokine S-a pornit de la observaţia că citokinele reglează reactivitatea imunologică. prin combinarea capacităţii de ţintire unică a anticorpilor monoclonali cu activităţile multifuncţionale ale citokinelor. cu efect antitumoral mult mai înalt decât cel al celulelor LAK (celule killer activate de limfokine standard). literatura de specialitate semnala existenţa a 19 cazuri clinice la om. În cadrul acestei strategii. ca răspuns la administrarea de interleukina 2 (IL2) sau antigen. în scopul utilizării acestor noi preparate în imunoterapia cancerului. care se dovedeşte foarte 248 . poate determina chiar şi îndepărtarea unei tumori preexistente. poate induce o imunitate antitumorală puternică de lungă durată şi ocazional. Construirea acestei proteine fuzionate recombinate se face în scopul obţinerii unei eficienţe biologice optime. activitatea şi migrarea celulelor inflamatoare. B. Dar în 1981 apărea virusul HIV (Human Immunodeficiency Virus). Schmidt-Wolf şi colab. Utilizarea anticorpilor monoclonali Dezvoltarea intensivă a noilor concepte molecular-biologice din imunologia ultimilor 20 de ani a deschis noi perspective în terapia cancerului.interleukina IL2) Aceste proteine de fuziune au fost realizate prin tehnici de inginerie genetică. cât şi datorită faptului de a putea migra şi răspândi în tot organismul. pe baza legărilor lor de o proteină a cărei funcţie normală nu implică creo interacţiune cu acidul nucleic. deoarece aceste preparate terapeutice reuşiseră mai mult sau mai puţin să ducă la dispariţia acestor infecţii de pe glob. Anticorpii monoclonali antitumorali (cu specificitate unică). Aceste celule CIK s-au dovedit a fi celule efectoare citotoxice foarte eficiente. se folosesc oligonucleotidele cu rol de liganzi pentru enzime. i. factori de creştere. h. Observaţiile efectuate pe animale de experienţă au arătat că “o provizie locală” formată din diferite tipuri de citokine infuzate direct. j. care. supuse tratamentului cu citokine.fi utilizate pentru a prinde “în cursă” exprimarea unui număr de gene din genomul unui virus sau al unui parazit.

În 1999. În România. . În decembrie 1994. Conform rapoartelor OMS. Boala reprezintă starea organismului în momentul în care virusul HIV din “stare dormindă” se trezeşte. Prezenţa acestor proteine scurte şi active. persoana este sero-pozitivă. 3119 cazuri de boală SIDA.Acest ADN viral (copie după ARN) se integrează în genomul celulei gazdă sub influenţa enzimei virale integraza.6 milioane de persoane pe glob. se resintetizează ARN viral şi proteina virală corespunzătoare. dintre care 6000 deja bolnave. acest aspect reprezintă particularitatea multiplicării acestui virus. Studiile molecular-biologice au demonstrat că ciclul de viaţă a HIV în organismul uman cuprinde3 trei etape: I. se află în “stare dormindă” timp de luni de zile până la 5-20 de ani. numărul cazurilor noi de persoane infectate a fost de 5. Pentru a se prepara substanţe terapeutice cu acţiune antivirală au fost necesare întâi studii de biologie moleculară în vederea determinării structurii virusului HIV şi a ciclului de viaţă al acestuia. cât şi cea a respectivului ARN viral nou format vor duce la formarea virusului matur care va fi capabil să invadeze alte celule. având drept consecinţă apariţia simptomelor de boală. din care 16 milioane au decedat din cauza bolii. Astăzi infevţia HIV reprezintă o criză majoră de sănătate publică. din care un milion de copii. de tipul zidovudinului (analogi nucleozidici) şi derivaţi (dideoxiinozin. din care doar 1025073 cazuri înregistrate. devenind deci agresiv.urmează starea dormindă a virusului.acţionează la nivelul etapei I. III. creând o panică tot atât de gravă ca şi cea determinată de ciuma bubonică din Europa secolului al XIV-lea. la 30 septembrie 1999 se înregistrau 10000 de persoane infectate cu HIV. . invadează organismul. La sfârşitul anului 1999. în stare dormindă şi integrată în nucleul celulelor. din cauza marii variabilităţi a virusului HIV. se multiplică. virusul ARN dispărând prin imposibilitatea multiplicării sale. o persoană poate fi infectată cu virus HIV fără a fi încă bolnavă.5 milioane cazuri de boală SIDA declanşată. ƒ 17 milioane de persoane infectate (purtătoare de virus) HIV. dar nu este încă bolnavă. Virusul HIV face parte din categoria virusurilor ARN (retrovirusuri) care prezintă un aspect particular de multiplicare. Substanţele anti-HIV utilizate până în prezent. în special la nivelul sistemului nervos central (SNC).. Dar aceste substanţe terapeutice s-au dovedit a avea efecte toxice foarte puternice. Programul UNAIDS şi al OMS-ului raporta 50 de milioane de persoane infectate cu HIV de la declanşarea epidemiei de SIDA. Această mare variaţie genetică a virusului a constituit obstacolul major în prepararea unui vaccin HIV. Infecţia înseamnă că virusul HIV. dar această proteină primară nou-sintetizată are lanţuri foarte lungi şi este inactivă. De asemenea. Trebuie remarcată diferenţa între infecţie şi boală. Până în prezent oamenii de ştiinţă nu au reuşit să prepare încă un vaccin pentru această infecţie.Etapa de transcriere: după tiparul (pattern-ul) ADN viral integrat. 249 . aceste substanţe au determinat şi dezvoltarea rezistenţei virusului HIV la drog.ARN viral se transcrie în ADN în prezenţa enzimei virale revers transcriptaza. datele OMS estimau în lume: ƒ 4. În România s-au înregistrat între 1985-1994. pentru anul 2000 se prevăd pe Terra 30 de milioane de purtători HIV. şi anume curgerea inversă a informaţiei genetice din direcţia ARN→ADN II. dideoxicitidin).6 milioane iar decesele au atins cifra record de 2. prezintă în organism dar ascuns în nucleul celulelor limfocitare. Pentru a deveni activă. fiind inhibitoare ale reverstranscriptazei şi împiedicând astfel conservarea virusului în copii. această proteină foarte lungă trebuie secţionată (procesată) de nişte enzime virale numite proteaze. dintre care 2885 la copii şi 234 la adulţi.curând a declanşa mari epidemii SIDA (Syndrome d’Immuno-Deficience Acquise) pe glob.

În 1997 trei companii mari farmaceutice lucrau la obţinerea unei asemenea substanţe de tip inhibitori ai proteazei virusului HIV. cercetările sunt aproape gata să introducă în practica medicală tehnologia unei noi vaccinări. Apolipoproteinele de densitate înaltă (HDL). Sharp & Dohme . Ele reprezintă liganzi pentru receptori specifici. ar fi al cincilea tip de vaccinare cunoscut în istoria medicinii după: vaccinurile vii atenuate. aceşti receptori mediază mecanismele de adeziune (fixare) de fibrinogen. Vaccinuri recombinate În pragul mileniului al treilea. în scopul unei trombolize rapide şi al prevenirii reocluziei. ADN-ul care codifică o proteină specifică este cuplat cu elementele genetice de control pentru a se obţine plasmide care se vor replica atunci când vor fi introduse în bacterii corespunzătoare. prin injectarea de anticorpi monoclonali antireceptor trombocite umane (gpIIb şi gpIIIa) şi activarea reocluziei vasculare. Se preconizează utilizarea lor în tratamentul hipercolesterolemiei familiale. 250 .eficacitatea substanţei prin administrare per os . proteina rămânând sub formă de lanţ lung şi inactivă. cea a imunizării directe cu ADN. cu componente purificate şi cele obţinute prin inginerie genetică. o îmbunătăţire a recanalizării arteriale coronariene.dezvoltarea rezistenţei la drog. În cadrul tehnologiei vaccinurilor ADN. Creşterea bacteriilor va duce la producerea unui număr mare de copii plasmidice din care se separă ADN-ul imunizat pentru a fi folosit apoi drept vaccin. trombospondin. E. D. Studii in vitro pe câine au demonstrat capacitatea acestor anticorpi de a reduce leziunile ischemice miocardice postinfarct cu 46% în comparaţie cu animalul martor. Terapie ţintită cardiovasculară Se referă la tratamentul cu anticorpi monoclonali antitrombocite umane în cazul infarctelor. fibronectina. În aceste condiţii. În cazul implantelor vasculare se preconizează învelirea acestor receptori în strat de celule injectate cu o genă sintetizatoare de un factor litic care.acţiunile secundare farmacokinetice (toxice). şi anume: ƒ firma Merck. împiedicând tăierea lanţurilor lungi de proteine inactive. Terapie în boli metabolice Prepararea de liganzi proteici tip lipoproteine Apolipoproteinelesunt proteine care datorită structurilor lor helicale amfipatice leagă lipide. dar firmele păstrau secretul de fabricaţie. dispărând deci posibilitatea de invadare de către virus a altor celule ale organismului. cele cu agenţi microbieni omorâţi.substanţă cod Ro-31-8959 ƒ firma Abbott . S-au preparat anticorpi monoclonali (anti Mo-1) fată de receptorul de adeziune al trombocitelor. prin liza cheagului sanguin. . .substanţă cod 693541 ƒ firma Hoffmann-LaRoche . virusul matur nu se mai poate forma.În prezent se experimentează o substanţă cu acţiune anti-HIV la nivelul etapei a III-a de dezvoltare a virusului.substanţă cod A-77003 Substratul de preparare a substanţei active părea a fi un material biologic. sintetizaţi de gene din familia genelor “integrine”. Reducerea zonei de infarct s-a dovedit a fi independentă de severitatea ischimei. S-a observat. prin legarea lor de o mare varietate de celule (macrofage. C. Metoda Anderson pentru liza trombilor vasculari se bazează pe receptorii gpIIb şi gpIIIa. factor Wilabrand. vitronectina. de asemenea. hepatocite) şi ţesuturi. joacă un rol esenţial în transportul şi reglarea metabolismului colesterolului. să prevină apariţia trombilor vasculari. şi anume o substanţă care să inhibe proteazele virale. Rămân încă de rezolvat probleme legate de: .

Prin vaccinarea cu ADN existând posibilitatea de a vaccina pentru un număr mare mai mare de proteine specifice deodată. Acest nou compost îmbunătăţeşte structura solului iar prin conţinutul său în microorganisme (care au capacitatea de a inhiba dezvoltarea unei flore microbiene fitopatogene de sol) contribuie la îmbunătăţirea calităţii plantelor şi a recoltelor. se trece la prelucrarea reziduurilor organice în vederea obţinerii unei producţii eficiente de compost care să aibă calităţi foarte apropiate de îngrăşământul natural pentru agricultură. Pe viitor vor continua investigaţiile în vederea detectării unor microorganisme cu potenţial de degradare şi transformare a poluanţilor din diferite deşeuri materiale. necesară pentru conservarea mediului înconjurător. motiv pentru care se pot transporta la temperatura mediului ambiant fără a fi necesară refrigerarea.). Zn. distrugerea florei şi faunei marine etc. potenţialul acestor vaccinuri de a stimula capacitatea citolitică a celulelor T reprezintă un punct de răscruce în vaccinologie. Cu) din gunoaiele menajere. după îndepărtarea prealabilă a conţinutului toxic de metale grele (Cd. industriale) cât ţi a contaminanţilor din mediul extern. Aceste vaccinuri produc un răspuns imun persistent. dar fără a exista pericolul recâştigării virulenţei de către virusul vaccinant. 251 . cercetătorii încearcă să folosească agenţii microbieni (bacterii) în acţiunea de reducere a poluării solului (pentru dezintegrarea gunoiului şi a deşeurilor domestice. deşertificări întinse. astăzi oamenii de ştiinţă pun tot mai acut problema refacerii cadrului natural şi a reciclării deşeurilor poluante. În acest context. bolile reemergente. Astfel. În vederea progresului rapid în această direcţie se urmăreşte crearea şi aplicarea unei „tehnologii sensor” care să cuantifice activitatea fiziologică şi biochimică a microorganismelor. În aceste condiţii . F. fluviilor. această vaccinare apare ca o terapie “multidrog”. Toate aceste vaccinuri ADN se prepară după acelaşi principiu al plasmidelor. Vaccinurile ADN stimulează atât imunitatea umorală cât şi cea celulară . Se preconizează că acest tip nou de vaccin va avea o eficienţă enormă asupra bolilor infecţioase care astăzi dau încă o rată foarte înaltă de mortalitate. în bolile emergente. municipale. în ultimii 30 de ani s-a ajuns la un dezechilibru ecologic major care astăzi ameninţă viaţa pe Terra (defrişări masive. Aceste vaccinuri sunt foarte stabile atât la temperatură scăzută cât şi foarte ridicată. Acţiunea de depoluare a ecosistemelor În condiţiile creşterii populaţiei globului. ca şi vaccinurile cu virusuri atenuate. luându-se în considerare faptul că acest tip de vaccin este mult mai sigur. S-a demonstrat că aceste vaccinuri ADN induc celulele T de tip T1 helper cu efect împotriva virusului HIV. nefiind necesară de fiecare dată inventarierea unei noi tehnologii.În prezent se încearcă prepararea unor asemenea vaccinuri pentru administrare nazală sau per os. mai puţin costisitor şi mai uşor de administrat decât vaccinurile convenţionale. grad foarte ridicat de poluare a râurilor. în funcţie de fiecare agent infecţios. cât şi în cazurile de rezistenţă la chimioterapice. consecutiv cu lipsa unei educaţii ecologice elementare a populaţiei. a urbanizării şi industrializării.

Procese artificiale de recombinare ADN (tehnologia ADN-ului recombinat) Se realizează în condiţii de laborator.împuşcare” (shotgun) într-un numǎr foarte mare de . cu mari perspective de viitor. în vederea creării unui organism nou cu proprietaţi prestabile (ţintite). printr-un număr de metode ce formează tehnologia genetică. odatǎ cu descoperirea elementelor transpozabile. Principiul recombinării Un proces natural de recombinare genetică există la organismele eucariote (cu set diploid de cromozomi) în cursul meiozei (diviziune reducţională). Procese naturale de recombinare ADN (recombinare genetică) Joacă un rol foarte important în natură.BIOLOGICE ŞI APLICAŢIILE LOR 12.1.ului Teoria stabilitaţii genomului celular a fost zdruciunatǎ în anul 1951.Capitolul 12 METODE ŞI TEHNICI MODERNE MOLECULAR . atît în condiţii naturale. existenţa acestor procese se explică apariţia unor noi specii. reprezentând un factor evolutiv. Aceste tehnici vor avea implicatii majore şi în dezvoltarea agriculturii. iar acest material genetic poate fi izolat iar cele douǎ lanţuri ale dublului helix ADN separate şi apoi fiecare din cele douǎ lanţuri recombinate cu un alt lanţ de ADN străin complementar. şi anume a tehnologiei genetice.. în ceea ce priveşte crearea unur specii noi de plante cu o mare eficienţă economică. Aceastǎ metodǎ a dus la o revoluţie tehnico-ştiinţificǎ a cǎrei consecinţǎ a fost construirea de noi genotopuri. plante.ţinte celulare”. animale.. care includ linii foarte variate de organisme. Meioza are loc în celulele germinale şi duce la reducerea setului dublu de cromozomi (set diploid) în set haploid (simplu). D. RECOMBINAREA ADN . 12. Descrierea compoziţiei şi structurii spaţiale a ADN de către J. Watson şi Fr. 1. în vederea obţinerii de noi variante de microorganisme şi plante. Fenomenul destabilizării genomului celular a rǎmas inexplicabil până în momentul în care a fost posibil studiul moleculei de ADN.ace” sînt introduse ţintit prin .crossing-over”.. ceea ce reprezintă un fenomen de recombinare genetică. organismele rezultate sunt organismele recombinate care formează astăzi obiectul unor studii cu implicaţii deosebite în dezvoltarea ştiinţifică şi economică pe scară internaţională.1. Aceste tehnici de recombinare genetică stau la baza cercetărilor fundamentale şi aplicare în biologia moleculară. deschizînd perspectivele noii terapii cu gene (terapie geneticǎ = Gene Targeting). În prima fază se produce un schimb de fragmente cromatidiene între cromozomi omologi (M/P=materni/paterni) alăturaţi printr-un fenomen de . Concentrarea studiilor asupra ADN a fǎcut posibilǎ injectarea genelor cu ajutorul virusurilor vectoare in celule. Respectivele virusuri (vectoare de gene) cu aspect de . dǎ posibilitatea creǎrii de noi organisme.cât şi laborator. cunoscute la nivel internaţional sub numele de Genetic Engineering. la toate tipurile de bacterii. Aceste tehnici încearcă pe cale artificială combinatrea informaţiei genetice (a genelor) de la două organisme diferite.. Crick din anii 1953 au reprezentat cunoştinţele fundamentale care au stat ulterior la baza noilor direcţii de cercetare. 252 . Prima reuşită de recombinare a fost realizată în SUA în 1970. Faptul cǎ informaţia geneticǎ a organismelor vii se gǎseşte acumulatǎ pe helixul ADN. în scopul ameliorării diagnosticului şi terapiei medicale într-un număr mare de boli. farmacologie şi în medicina viitorului.

12. moleculele ADN cu greutate moleculară înalta sînt tăiate în molecule cu greutate moleculară mult mai mică. fiecare cromozom în interfază apare format din cîte două cromatide (iar fiecare cromatiodă la rîndul ei dintr-o moleculă de ADN dublu helix). Tehnicile de recombinare ADN stau la baza progreselor biotehnologiei moderne. celula bacteriană astfel . a respectivului fragment de ADN selecţionat şi fixat pe vector în celula gazdă (celula bacteriană avirulentă de Esch. pe această cale. Prin procedeele de inginerie genetică se poate obţine. lanţurile duble ADN ale celor două cromatide vor fi tăiate. cît şi cel al vectorului se leagă covalent (în cursul unui process de circularizare) în prezenţa ADN-ligazelor ƒ introducerea. Tehnologia ADNului recombinat. După interschimburile între cromatidele cromozomilor omologi se produce separarea acestor cromozomi cu cromatidele interschimbate şi împarţirea lor între cele două celule fiice.nou construită” (cu ADN recombinat) ƒ reprezintă celula cap de colonă. La cromozomii umani există în medie două-trei asemenea fenomene de crossing-over şi interschimburi de fragmente ADN pe ambele cromatide ale unui cromozom. aceste tehnici vizînd direct informaţia genetică a organismelor. obţinerea de noi soiuri de plante cu rezistenţă crescută şi agenţi dăunători). astăzi poate fi modificat într-un mod dinainte stabilit şi ţintit bagajul genetic al organismelor. organisme multicelulare) reprezintă de fapt tehnica de inginerie genetică prin care se obţin genomuri modificate ce pot fi ulterior exprimate 253 . prin introducerea unei informaţii genetice într-un organism. În faza a II-a a meiozei urmează separarea cromatidelor în patru celule germinative mature. rezultând cromatide recombinate (molecule ADN recombinate). Acest process poartă numele de clonare. sau analiza genetică foarte laborioasă asupra funcţiei genelor prin cercetarea aspectelor fenotipice ale organismelor mutante şi ale progeniturii acestora. a revoluţionat biochimia. vor interschimba fragmente de ADN. Aceste procese se produc atît de exact. iar apoi capetele tăiate se vor lega altfel. bacteria. a vectorului şi a fragmentului ADN străin încorparat în genomul celulei gazdă.Într-un organism diploid cu un anumit număr de perechi de cromozomi omologi şi o singură pereche de cromozomi sexuali. pentru că. care a apărut în jurul anilor ’70.1. o data cu vectorul. Pe baza acestei tehnologii. o data cu celula gazdă.2. vectorul (virusul) este supus şi el acţiunii aceloraşi enzime de restricţie. pe ambele lanţuri de acid nucleic (lanţ unic de cercetat şi lanţ unic al vectorului). Construirea unui genom nou prin introducerea unei secvenţe ADN străine în genomul unei celule gazdă (de exemplu.. Prin încrucişarea cromatidelor (crossing-over) pe locul de încrucişare. Aceste patru celule pot conţine: ƒ c1 = numai material matern ƒ c2 = numai material patern ƒ c2 şi c3 = material cromatidian recombinat (rezultat din fenomenul de crossing-over) matern şi patern. astfel încât să fie obţinute în final fragmente ADN de lanţ unic. încît nu se pierde nici un nucleoid. în final. Tehnologia ADN recombinant presupune următoarele etape: ƒ tăierea lanţurilor duble ADN în fragmente specifice. Procese artificiale de recombinare ADN (Genetic Engineering) Cu ani în urmă era posibilă doar cercetarea indirectă a ADN-ului asupra produselor ARN şi proteice. oferind posibilitaţile cele mai eficiente pentru analizarea şi modificarea genelor (ADN) şi proteinelor din organismele vii. În cadrul acestui proces. un organism cu priorietăţi noi (de exemplu. prin acţiunea enzimelor de restricţie. coli K12) ƒ multiplicarea sincronă. să se obţină acelaşi tip de capete adezive: ƒ fragmentul de acid nucleic de cercetat. Concomitent cu ADN-ul de cercetat. Apar în consecinţă un număr mare de celule purtătoare de copii identice de ADN recombinat. utilizarea acestor metode putînd duce în viitor la înfrângerea barierei între specii.

ƒ se obţine o copie de ADNc (în prezenţa reverstranscriptazei). se folosesc tot fragmente ADNc deoarece aceste microorganisme nu sînt capabile să îndepărteze prin fenomene de splicing din ARNm transcris secvenţele de introni. celula respectivă cîştigă caractere noi. nefiind digerat de endonucleaze. Folosind această metodă s-a reuşit ca celulele bacteriene. se poate reuşi exprimarea practice permanentă a unei gene altminteri slab activă. ƒ fragmentul ADNc clonat este înglobat în vectorul de exprimare. 12. cît şi secvenţele de control ale unei gene.1.(transcrise şi translaţionate) de către celula gazdă. Enzimele de restricţie Sunt endonucleaze de origine bacteriană. prin sinteza de noi proteine (caractere noi cîştigate de celula gazdă). obţinându-se în final sinteza proteinei dorite. a unei secvenţe străine de ADN cu autorul vectorului). intr-o anumită celulă. care în cantităţi mari în calula nou construită. într-o celulă bacteriană. prin alegerea unei anumite secvenţe de control. 1. Etapele metodei de inginerie genetică utilizată în vederea obţinerii unei anumite proteine în cantitate mare sînt următoarele: ƒ se porneşte de la matricea ADN. drojdiile şi celulele de memifere să fie aduse în starea de a produce cantităţi mari de anumite proteine ţintă. ƒ respectivul lanţ dublu ADN este clonat. Proteinele sintetizate prin această metodă şi-au găsit utilizare în terapie şi profilaxie. un dublu helix ADN nou-sintetizat şi metilat numai pe un lanţ este recunoscut ca propriu de către celula bacteriană. Nucleazele bacteriene se clasifică în: 254 . Astfel.1. Elemente de lucru utilizate în tehnologia ADN recombinat Aceste elemente de lucru sunt reprezentate de: enzimele de restricţie. iar în timp metilaze converteşte treptat ADNhemimetilat în total metilat. deoarece ADN-ul bacterian poartă un semn de recunoaştere (un password ) care este reprezentat de nişte situs-uri specifice metilate. Pornindu-se de la aflarea expresiei anumitor gene s-a putut ajunge la descifrarea funcţiei unor proteine cu rol în procesele şi diviziune celulară. ele clivează moleculele de ADN strain (de exemplu. Metilarea reprezintă un mecanism de apărare al celulei bacteriene faţă de propriile endonucleaze. ADN-ligazele. vectorii. 3. ƒ fragmentul ADNc înglobat în vector este introdus în celula receptor o dată cu vectorul. Este posibil să se facă noi combinaţii pentru secvenţele de control ale unei gene şi să se determine în acest fel exprimarea unei gene dorite. În acest fel devine posibilă analiza proteinelor celulare. ADN viral pătruns în respectica celulă bacteriană) fără a cliva însă ADN-ul bacterian propriu. ƒ se obţine un lanţ dublu ADN. în acest context proteinele. Dacă se urmăreşte introducerea şi exprimarea unor gene eucariote în bacterii şi drojdii. prin aceasta creîndu-se bazele pentru cercetarea şi găsirea cauzelor unor boli genetice. Termenul Genetic Engineering este adesea folosit drept similar celui de recombinare ADN. care. modificate şi interschimbate sau nou recombinate atît secvenţele codificatoare. ƒ în celula receptor se produce transcrierea şi translaţia fragmentului ADNc strain (introdus). Metilazele recunosc pe lanţul ADN bacterian aceleaşi secvenţe ca şi endonucleazele. în mod normal se găsesc în organism în cantităţi foarte mici (doar urme) şi ar scăpa astfel cercetării. în genomul unei celule. Pentru creşterea acestei cantităţi de proteine se utilizează de regulă fragmente de ADNc (secvenţe codificatoare fără introni). Prin aceste metode genetice pot fi manipulate. din care rezultă un nou genom (prin introducerea.3. 12.

acestea recunosc aceleaşi secvenţe nucleotidice. rezultând capete coezive.exonuleaze care se fixează pe molecula de ADN numai la capătul ei. pot recunoaşte situs-urile ţintă ale ADN ului palindronic. ƒ ƒ 255 . 12. motiv pentru care sînt preferate în studiile de recombinare ADN. Endonuleozele de restricţie sunt denumite după microorganismele din care se izolează: ƒ enzime I Eco K şi B (izolate din E. Structurile acestor fragmente finale pot servi drept. se fixează pe o anumită secvenţă nucleotidică. endonucleaze care nu se fixează la extermităţile moleculei ADN. Prin enzimele de restricţie s-a descris şi un grup special de enzime care au fost numite izoschizomeri.1. dintre care: ƒ enzimele I şi II recunosc secvenţele specifice şi se fixează pe acestea cu următoarele particularitaţi: ƒ enzimele I taie nespecific 100-1000 de perechi de baze. rezultând capete drepte. ƒ enzime II Eci RI (izolate din E. procesul de reparare a ADN. 2. ci se fixează în interiorul moleculei de ADN. În această categorie se încadrează şi endonucleazele de restricţie. coli). însă în poziţii diferite pe respectivul lanţ ADN. în mod: simetric. ƒ enzimele III taie nespecific 20-30 de perechi de bază în direcţia 5’ Æ 3’ pe lanţul ADN. Secvenţele de baze recunoscute de către aceste enzime sînt palindromice (aceleaşi. fiind citite de aceste enzime la fel pe cele două lanţuri şi rezultând un clivaj poziţionat simetric pe ambele lanţuri. Endonucleazele de restricţie au acţiuni secvenţial-specifică. dar în prealabil trebuie să fie rupte perechile de baze care ţin unite cele două lanţuri complementare ADN ƒ Bam HI (izolate din Bacillus amilolichefaciens) ƒ Hpa I (izolate din Haemophilus parainfluenzae) ƒ Hin + III (izolate din Haemophilus influenzae) Enzima II au fost supranumite şi. Procesul de legare (linkare) mediat de ADN-ligaze este esenţial pentru sinteza normală a ADN. dar poziţionate în sens invers pe cele două fire ale dublului helix ADN). Un segment de ADN obţinut prin acţiunea unei enzime de restricţie poate fi clivat main departe în segmente mai mici de către alte enzime de restricţie. foarfeci moleculari”. II şi III. ƒ enzimele II au locul recunoaştere. în afara regiunii specifice în direcţia 5’ Æ 3’ pe lanţul ADN. 3. amprente” (fingerprints) ale unei molecule de ADN. Până în prezent s-au purificat peste 90 de enzime de restricţie. coli).. ADN-ligazele (polinucleoid-ligazele) ADN-ligazele nu pot lega două lanţuri unice de ADN. Aceste endonucleaze se găsesc în număr mare la procariote. Descrierea enzimelor endonucleaze de restricţie a făcut posibilă revoluţia ştiinţifică biologică şi dezvoltarea tehnologiei ADN recombinat (modificări ţintite în structiura genelor şi proteinelor şi analiza acestora bazată pe enzimologia acizilor nucleici). asimetric. Aceste enzime catalizează formarea unei legături fosfodiesterice între gruparea 3’-OH a unei extermităţi a unui lanţ ADN şi gruparea 5’-fosfat de la extermitatea celuilalt lanţ. S-au descris enzimele de restricţie I. ci doar două lanţuri ADN ce aparţin aceleiaşi molecule ADN duble helix. despicând-o (clivare prin hidroloza legăturii fosfodiesterice) îndepărtând astfel respectivul segment dublu de ADN. procesul de recombinare genetică. fixare şi tăiere (4-6 nucleoide) de obicei constant deci au specificitate de secvenţă absolută. unde produc ruptura (tăierea). ele recunosc o secvenţă de 4-6 nucleotide şi pot tăia cele două lanţuri ale helixului ADN. Cromozomii complecşi care conţin sute de milioane de bace pot fi astfel secţionaţi şi apoi cartaţi stabilindu-li-se harta genelor. prin folosirea enzimelor de restricţie. deşi fiecare taie asemenea secvenţe localizate.

În 1976. ADN-ul extracromozomial poate disparea la un moment dat din celulă. Vectori folosiţi pentru sinteza unor cantitaţi mari de proteine. fără ca absenţa acestuia să afecteze viaţa celulara.entităţi fundamentale ale celulei bacteriene”. incompatibilitatea). La procariote sunt molecule de ADN dublu helix circular din dimensiuni de la două la cîteva sute de kilobaze. celulele bacteriene au fost înzestrate cu noi căi enzimatice în cursul evoluţiei. Vectorii Se deosebesc două categorii majore de vectori: A. Dhillon şi Colob..1. În unele celule pot exista simultan 1*20 copii ale unei plasmide. Spre diferenţă de ADN-ul cromozomial.cosmide (fragmente de φ* λ+ plasmid ) .secvenţe de inserţie (SI) 0. dar astăzi se ştie că aceşti repliconi joacă un rol important în procesele de selecţie şi de adaptare a celulelor bacteriene.un segment care asigură transferul plasmidic de la o celulă la alta (factor de transfer).bacteriofagi: fagul λ. capabili a se replica independent de cromozom”. Sunt prezente atît celulele procariote (bacterii). rezistenţă sau multirezistenţă la antibiotice). Astăzi plasmidele sunt considerate . Vectori de transcriere (pentru sinteza ARN): . reprezintă material genetic extracromozomial (cromozomi accesorii). φ80. Prin cîştigarea plasmidelor.. B. Un plasmid este constituit dintr-un segment format din una sau mai multe gene.plasmid + φ promotor (SP6) . care imprimă o proprietate sau mai multe proprietăţi celulei bacteriene (de exemplu. . determinînd potenţialul de adaptare al celulei gazdă la condiţiile de mediu.fragemide (φ+plasmid) . Vectorii de expresie Vectorii folosiţi pentru sinteza unor cantităţi mari de proteine: . În celula bacteriană.5-200 x 10 6 daltoni (5% din greutatea cromozomială). Vectori de expresie a1). ca răspuns la modificarile din mediul extern. genomul celular este reprezentat de materialul genetic cromozomial genetic cromozomial şi extracromozomial (inconstant).4 kb. cît şi la eucariote.retrovirusuri .retrovirus+plasmid Ti A.8-1.3. propun pentru plasmide termenul de . factorul R. Vectori de expresie. Zestrea plasmidică este un atribut de tulpină (şi nu de specie). Plasmidele s-au dovedit a fi unelte foarte valoroase în cercetarile efectuate în scopul aprofundării unor procese fundamentale de biologie moleculară (replicarea ADN. Greutatea moleculară a unui plasmid variază între 1..3. În 1981.plasmid +2 φ promotori (SP6 ş T7) Vectori speciali: . 256 . fagul µ .12.repliconi accesori” (neesenţiali). esenţial pentru supravieţuirea celulei. Plasmidele Reprezintă o clasă majoră de elemente genetice mobile.plasmide: factorul F. factorul Col. reprezentînd o parte vitală a pool-ului de gene.repliconi stabili moşteniţi în stare extracromozomială. Vectorispeciali. plasmidele erau definite de Novick drept .

numit şi factor de fertilitate. la tulpini de Klebsiella). adeziune. de exemplu factorul Col) se transmit 100% de la o celulă la alta cu ajutorul factorul F (plasmid conjugativ). libere în citoplasma celulei. degradarea camforului. ColB. Factorul F Este plasmidul care induce conjugarea la bacterii. aceste plasmide de replica autonom. ƒ integrate (epizomi). dar rămân factorii Col (linkaj reversibil). enterotoxine. hemolizine. De replica concomitent cu ADN cromozomial şi există în una-două copii per celulă. în care fiecare replicon îşi păstrează independenţa fizică a replicării deoarece fiecare replicon are propriul său replicator (de exemplu. În general bacteriocinele sunt principii actici sintetizate de bacterii.) se pierde doar factorul F. În 1972. ƒ pentru sinteza agenţilor antitumorali: de exemplu. ƒ de rezistenţă la raze u. celula receptoare (F-) este celula care primeşte factorul F. Una sau mai multe plasmide (neconjugative. agrocina 84 (sintetizată de tulpina bacteriană de Agrobacterium radiobacter) cu acţiune bactericidă asupra bacteriei abrobacter tumefaciens (agent de colonizare. în cursul procesului de adaptare la noi condiţii de mediu. factori de bacteriocinogenie pentru sinteza piocinelor). inserate în cromozomul bacterian (de exemplu. (codifică enzime care intervin în mecanismele de reparare a ADN celular). au potenţial de răspândire foarte larg a anumitor caractere printe bacterii. specii inrudite dar şi foarte îndepărtate.Plasmidele pot fi: ƒ neintegrate. Acest fenomen presupune un transfer de material genetic de la celula donoare. toluenului (tulpina de Pseudomonas). se cunosc pînă în prezent următoarele tipuri de plasmide: ƒ de rezistenţă la agenţii microbieni. Clowes delimita două grupe majore de gene plasmidice (plasmid-borngenes): ƒ agregate. începând de la capătul 5’ al ADN-ului. trp. din ele derivînd apoi cointegratele. fixate de azot (de exemplu. factorii de bacteriocinogenie ColE1 Æ colE8. Sînt sisteme economice pentru conservarea anumitor mesaje genetice care se transmit masei de celule dar în caz de nevoie.. sau inclus în cromozomi (Hfr). ƒ pentru sinteza bacteriocinelor. cointegratul F. Se mai numesc şi autonome (de exemplu. ColV. în acest caz există 10-20 de copii per celulă. ƒ codificatoare de enzime ale unor căi metabolice. cu acţiune bactericidă asupra unor bacterii din aceeaşi specie. prin intermediul factorului F (factor plasmidic-vector).v. Factorul Col Reprezintă plasmidul responsabil de sinteza colicinelor (bacteriocine produse de tulpinile bacteriene de Escherichia coli). Col V). ƒ plasmide .) Cointegratele sunt sisteme funcţionale mai eficiente decît cele ale agregatelor din punct de vedere al transferului şi stabilităţii caracterelor linkate. Reiese de aici că trasnferul de material genetic este polarizat de la celula F+ sau Hfr către celula F-. exclusiv de origine extracromozomială.cys. asincron şi mai frecvent decît ADN-ul cromozomial. Celula donoare conţine factorul F liber în citoplasmă este notată F+. Col I. Bacteriocinele se subdivid în două categorii: 257 . ƒ cointegrate reprezintă elemente genetice compuse din doi sau mai mulţi repliconi aşezaţi într-o continuitate liniară.criptice” ale unor caractere somatice (nu au putut fi încă indetinficate). În raport cu caracterele fenotipice exprimate. la celula receptoare. s-au dezvoltat primele. în cazul tratamentului celulei receptor cu un factor curing (acridin oranj etc. factori chelatori de ioni de fier).

EV. trebuie menţionate următoarele: ƒ factorul Col v codifică sinteza unui sistem de chelare (fixate. de exempli. de obicei în număr mare de copii (15-60) per ADN cromozomial (de exemplu.şi ColDf 13. Col Ib. cozi fagice incomplete umplute cu un lanţ scurt de ADN). Ruperea acestei imunităţi se produce doar în prezenţa unei concentraţii foarte înalte de bacteriocină. Plasmidele conjugative posedă în plus: un extra grup (extracluster) de gene (G – T) implicate transfer. ducînd astfel la creşterea virulenţei 258 ƒ . K. . CloDF13). A. factorii Col E1.o genă responsabilă de sinteza proteinei (colicină). E2. acest studiu a demonstrat că ambele tipuri de plasmide conţin în structura lor: . s-au descris: ƒ agregate. E7. şi piocinelor. E3. Plasmidele nonintegrate se subdivid în: ƒ nonconjugate: se transmit numai cu ajutorul factorului F sau al unui fag transductant. de natură chimică enzimatică. Col V. ƒ corpusculară (particulară) cu greutate moleculară mare. E6. E1a.cys. ƒ integrat în cromozom. Col E1. proteică dau de natură complexă glicoproteică.K94. . E2. Plasmidul (factor genetic responsabil de sinteza de bacteriocină) poate fi: ƒ nonintegrat (replicon accesoriu). Aceste aggregate au origine exclusiv extracromozomială şi posedă un potenţial foarte înalt de răspândire a proprietăţii de bacteriogenie în populaţia bacteriană. au un număr. de exemplu. combinaţia F. Se pare că proprietatea de colicinogenie este mai rar răspândită la tulpinile bacteriene de origine umană.. dar este prevalentă în flora apelor menajere şi în populaţia de enterobacterii de la animalele domestice. E3. legare şi transport) al fierului din mediul extern. între (4. factorii Col E1. analogi adenin-nucleozidici. Structura plasmidelor Col nonintegrate conjugative şi nonconjugative a fost studiată cu ajutorul endonucleozelor de restricţie. Col I. acest fenomen purtând numele de fenomenul de rupere a imunităţii (break-down immunity). factorii Col. E3. în ultimul agregat factorul Col Ib jucând rol de factor de transfer.rep” esenţial pentru replicarea autonomă. ƒ conjugative: se transmit singure prin conjugare. Col V). au o greutate moleculară joasă. Cu referire specială la rolul plasmidelor de bacteriocinogenie în organismul uman şi animal. de exemplu linkajele: F. structuri de cozi goale sau pline.2-8) x 10 8 megadaltoni prezintă un număr mic de greutate moleculară joasă. celulele bacteriocinogene sunt immune la propria bacteriocină datorită prezenţei de imunitate mai sus mentionate. componente fagice defective (capete goale de fagi. au greutate moleculară (40-80)x10 6 megadaltoni. CloDf13). Printre bacteriocinele cele mai studiate şi mai bine cunoscute astăzi se numără colocinele şi cloacina DF13. E2. EI. de exemplu. ColE2 şi Col Ib. Producerea de bacteriocine se datorează prezenţei plasmidului de bacteriocinogenie în respectivea celulă bacteriană. În general. Există însă şi cazuri particulare în care unele bacteriocine (welchicinele) sunt active chiar şi pe celulele producătoare (în acest caz explicaţia fiind absenţa genei de imunitate pe plasmidul de bacteriocinogenie). locus-ul de origine pentru replicarea plasmidului este prezent într-un punct pe această zonă.colicinelor I-2. În funcţie de interrelaţiile de factorul Col cu alţi factori plasmidiali din celula bacteriană. prezentînd aspecte omologe cu diferite.necorpusculare (nonparticulare) cu greutate moleculară mica. de către celula bacteriană. liber în citoplasmă. de obicei prezente în 1-2 copii per celulă (de exemplu. Acest grup de gene conţine circa 20% din SADN-ul plasmidic. factorul pentru sinteza aeruginocinelor. trp. Col IB.un grup de gene (cluster) .o genă responsabilă pentru sinteza proteinei de imunitate (evidenţiată la plasmidele Col E1. mare de gene funcţionale (100-200). V. ƒ cointegrate.

stabilă. 259 .. tulpinile bacteriene de Agrobacterium radiobacter produc bacteriocina agrocină 84. capabilă să omoare tulpina bacteriană Agrobacteruim tumefaciens (purtătoare de plasmid Ti).prezenţa şi similaritatea genelor .datele prezente sugerează că fenomenul de bacteriocinogenie semnifică o cale enzimatică specifică cîstigată în cursul evoluţiei. Cele două posibilităţi de linkaj al plasmidelor de bacteriocinogenie (system aggregate şi cointegrate) pot fi considerate aspecte particulare ale potenţialului de adaptare în cursul evoluţiei. ƒ în culturi celulare s-a remarcat o acţiune de inactivare a toxinei tulpinilor de E coli enterotoxigene de către colicina sintetizată de alte tulpini de Myzobacterium smegmatis are o acţiune citocidă asupra celulelor eucariote tumorale (inhibă creşterea celulelor tumorale umane. dar rămîne fără efect asupra celulelor normale din aceeaşi specie (datorită selectivităţii de membrană) prezintă agrocina (bacteriocină). Rezistenţa celulelor bacteriene la antibiotice prezintă două aspecte: ƒ rezistenţa naturală – proprietate intrinsecă a speciei. fenomenul de incompatibilitate plasmidială. .bacteriilor.. . În acest sens. în scopul asigurării supravieţuirii şi adaptării celulare la condiţiile de mediu extern. pe de o parte şi factorii plasmidiali F şi R.Pe baza cunoştinţelor actuale despre plasmidele Col se poate aprecia că acestea reprezintă o parte vitală din poolul de gene al speciilor bacteriene.de imunitate” în plasmide de bacteriocinogenie şi fagi pledeaza pentru o strînsă interrelaţie în cursul evoluţiei între aceşti determinanţi genetici.datele acumulate pîna în prezent pledează pentru o strînsă relaţie filogenetică între plasmidele de bacteriocinogenie (factorul Col).animale). . factorul Col are rol protector determinând producerea de colocine cu acţiune îndreptată împotriva unor bacterii enterale patogene (de exemplu. controlul replicării. Factorul R Fenomenul de rezistenţă la drog a fost descris de către Ehrlich în perioada anilor19101913. ƒ plasmidele Col sunt considerate a fi entităţi fundamentale pentru multe celule bacteriene ţinându-se cont de faptul că sunt implicate în multe activităţi celulare. Gradele diferite de complexitate prezente de diferitele sisteme de bacteriocinogenie pot imprima şi explica potenţialul de adaptabilitate al celulei gazdă la condiţiile permanent în schimbare din: .. ƒ factorul Col conferă capacitatea de adeziune celulelor bacteriene pe epiteliul intestinal (atribut al virulenţei celulei bacteriene). sistemul aerobactinei este considerat astăzi un mijloc crucial de supravieţuire şi proliferare a celulelor bacteriene invasive. A fost dovedit rolul multiplu de copii plasmidice autonome/integrate per celulă. pe de altă parte. interrelaţiile evolutive între celula gazdă şi factorul Col). îngreunîndu-le acestora implantarea. incluzînd aici şi fenomenul de bacteriocinogenie. coli enterale autohtone. crescând rezistenţa acestora la efectul bactericid al serului. Shigella).v.fenomenul de bacteriocinogenie este considerat a fi un split-phenotype al răspunsului celular SOS la agenţi inductori (raze u. Genele celulare rec A şi lex A posedă o capacitate complexă de a regla diferite răspunsuri celulare SOS.kill” şi .studiul fenomenului de bacteriocinogenie a permis aprofundarea unor aspecte fundamentale de biologie moleculară (replicarea ADN-ului plasmidic. ƒ factorul Col V conferă tulpinilor bacteriene capacitate de supravieţuire în ser in vitro. acid nalidixic). Se presupune că structuri nucleozidice analogigrocinei 84 cu acţiuni citocidă pe celulele canceroase ar fi mai răspândite în natură decît se cunoaşte astăzi. . ƒ la tulpinile de Esch. care determină o stare canceroasă (boala cocoşului) la plante dicitiledonate. mitomicina C. de natură cromozomială.

conţinând numai replicatorul şi determinanţii de rezistenţă. se pot pierde unul sau mai mulţi markeri de rezistenţă. Factorii R sunt: . proprietăţilor si sediului markerilor) se realizează prin elemente transpozabile tip transpozomi.v. Posedă unul sau mai mulţi determinanţi de rezistenţă (markeri). plasmid-cromozom) determină un schimb larg de determinanţii R intre specii. dublu catenar formând anse închise covalent autonome în citoplasma celulară bacteriană. pe aceeaşi moleculă de ADN. sau în urma unui process de recombinare). Transferul plasmidelor R se face între celulele bacteriene.. Cu cât plastidele sunt mai mari.). la trimetoprim/sulfametoxozol. sunt alcătuiţi din trei secvenţe nucleotidice cointegrate. la nivelul acestor germeni microbieni are loc cel mai important schimb de plasmide R între specii. Acest fenomen de recombinare este foarte rar. Au sisteme proprii de replicare şi pot exista în mai multe copii. Referitor la circuitul plasmidelor R în natură trebuie menţionat că flora intestinală comensală şi saprofîtă (oportunist patogenă) la om şi la animale este izvorul natural de bacili gram-negativi.5x106 până la 5.nonconjugativi (netransferabili). ampicilina). Se pot transfera: ƒ vertical la descendenţi (ereditate extracromozomială) ƒ orizontal între specii. codificând rezistenţa la un număr foarte mare de antibiotice.sub influenţa unor factori fizici (raze u. se formează uşor copii multiple. neomicină/kanamicină. au greutate moleculară de 20 x 106 Æ 2000 x 106 daltoni. Au fost semnalate întîia oară în Japonia. replicarea este mai rapidă pe generaţie. cu atât replicarea lor se produce mai lent (I -2 copii/celulă). eritomicină etc. Se pot integra în situs-uri diferite. Factorii R sunt molecule de ADN.1959). de exemplu prin conservarea tulpinilor bacteriene la +4 C câteva luni. gentamicină/tobramicină. codifică rezistenţa la unul-două antibiotice. depăşind barierele de specie. mutaţie.conjugativi (autotransferabili). bacilii Gram negative (Akiba. Se realizează prin mecanisme de: . Plasmidele R (factori de rezistenţă multiplă la antibiotice) au fost descries atît la germeni gram-pozitivi cît şi gram-negativi. chimici (acridinoranj. gen şi chiar de familie.spontan. Mecanismele de rearanjare a markerilor de rezistenţă plasmidici şi 260 ƒ . fără factorul RTF. ƒ factorul codificator al autoreplicării plasmidului (replicator). Prin mecanismele lor de translocare (cromozom-plasmid. transducţie la stafilococi şi transformare) .lactamine (penicilina.5x106 daltoni.rezistenţa dobîndită – caracter cîştigat în urma unei terapii cu antibiotice (prin cîştigarea de plasmid R. Acest ADN plasmadial codifică sinteza de proteine (enzime) prin intermediul unui ARNm.transfer clasic (conjugarea la bacili gram negativi. posedă un ADN circular. ei se pot exciza dintr-un ADN şi autoinsera în altul (într-un plasmid sau cromozom). .recombinare (pe baza omologiei ADN gazdă-ADN străin) prin crossing-over la nivelul cromozomului bacterian. Au greutatea moleculară de 0. ƒ determinanţii de rezistenţă la antibiotice de la 1 pâna la 20 de markeri. Reasortarea plasmidelor R (din punct de vedere al numărului. acriflavină). şi anume: ƒ factorul RTF (factor de transfer de rezistenţă similar factorului F) care iniţiază transferul plasmidului de la celula donoare la celula receptoare. Unii trenspozomi au dimensiuni foarte mari. . Transpozomii sunt elemente genetice mobile ce poartă gene determinate de rezistenţă la antibiotice. Plasmidele R pot fi pierdute: . Au fost descrişi transpozomi care codifică rezistenţa la β.

poate evolua pe una din cele două căi: . sunt eliberaţi în mediul extern.poate fi integrat în genomul bacterian (cale lizogenă) . Cu ajutorul sistemului proteic reglator este capabil să aleagă între cele două posibilităţi de evoluţie mai sus prezentate.poate trece imediat la multiplicare folosind aparatul enzimatic de sinteză al celulei bacteriene gazdă (receptoare). Bacteriofagii au un sistem propriu de transport pentru fragmentele ADN străine care pot fi astfel introduse pe cale naturală şi multiplicate în celula gazdă. Din ADN-ul fagului λ poate fi îndepărtată o cantitate de 40% fără ca funcţiile vitale ale acestui fag să fie evident influenţate. Când se formează virionii progeni. Astfel fagul λ (ADN) se poate insera pe cromozomul celulei de E coli între genele gal şi bio. 261 . Se fixează pe membrana celulei bacteriene. plante. celule umane). se insera lângă operonul trp şi poate purta gena trp de la o celulă infectată la alta. Alegerea căii de multiplicare este determinată de starea de nutriţie şi sănătate a celulei receptor (gazdă). injectându-şi materialul genetic în celula bacteriană. Infecţia cu asemenea fagi se numeşte λ gal sau λ bio. Epidemiile apar atunci când aceste plasmide R cu markeri multipli de rezistenţă ajung la bacterii înalt patogene şi cu înaltă contagiozitate. Materialul genetic viral. în acelaşi loc. în formă liniară sau circulară închisă. ce creează mari dificultăţi terapeutice.în urma lizei celulare. animale. de unde pătrund şi parazitează alte celule bacteriene. Virusurile împrumută aparatul metabolismului celular bacterian. Bacteriofagii Sunt virusuri care infectează bacteriile. Membrana proteică a fagului are o capacitate limitată de acceptare de ADN. După introducerea ADN străin prin membrana proteică fagului λ se poate trece la injectarea acestui fag (în care este înglobat ADN-ul străin) în celulele bacteriene de E coli.transferul plasmidic explică formarea rapidă a rezervorului de bacterii multi-rezistente. excizia nu este totdeauna precisă. alături de genele fagului λ într-o nouă celulă infectată de respectivul fag. deci cantitatea de ADN străin ce poate fi înglobată este limitată. ea introduce genele celulei bacteriene de E coli. Noii fagi sintetizaţi prin acest ciclu „litic" . multiplicându-se pe socoteala acestora. In natură. după injectare în celula bacteriană. Fagul φ 80 Este înrudit cu fagul. condiţii ce determină selectarea şi vehicularea în cadrul infecţiilor intraspitaliceşti a unor tulpini bacteriene cu un spectru foarte larg de antibiorezistenţă.. Fagii lizogeni pot media (ca şi factorii plasmidici F) schimburi de gene. ADN-ul fagului λ conţine fie operonul gal. În unul din 105 virioni. sunt deci paraziţi obligatorii ai celulelor. coli. fie operonul bio. Gazda fagului λ este celula bacteriană de E. unde îşi abandonează învelişul proteic. genomul acestui fag este reprezentat de un lanţ dublu ADN. virusurile apar în general drept paraziţi obligatorii ai organismelor şi celulelor vii (bacterii. Materialul genetic ai virusurilor constă din ADN sau ARN. Răspândirea plasmidelor R este favorizată de utilizarea necontrolată şi abuzivă a antibioticelor. pentru propria replicare. Datorită acestui aspect este posibil ca în fagul să poată fi introdus ADN străin. Fagul λ Este foarte bine studiat şi utilizat ca vector.

Prototipul acestor vectori de transcriere este format dintr-un plasmid în care a fost înglobat un fag. Prin infecţie fagică (pătrunderea fagului în celulă). Cosmidele sunt îmbrăcate în membrana proteică a acestui fag. Fig.Vector format din plasmid şi fag promotor SP6. Celula gazdă pentru φ SP6 este celula bacteriană de Salmonella typhimurium. Cosmide Sunt plasmide în care a fost introdus un anumit fragment de ADN din fagul λ . accelerând în acest fel evoluţia bacteriană. Fagemidul se multiplică în celula gazdă ca un plasmid cu lanţ dublu ADN. având capacitatea de a se insera pe unul sau mai multe situs-uri specifice. Secvenţe de inserţie (SI) Sunt elemente transpozabile.8-1. cosmidul este injectat în respectiva celulă gazdă.Fagul µ Se insera în orice loc pe cromozomul celulei de E. Aceşti fagi transductori (ca şi factorul plasmidic F) sunt elemente genetice mobile care declanşează interschimbul între genele bacteriene. se deplasează de-a lungul aceluiaşi lanţ de ADN sau pe cel al altui genom. După tăierea zonei MCS în două. transportă totdeauna un fragment din acest cromozom. şi 262 . în spatele promotorului φ SP6 se găseşte o zonă formată dintr-un număr de secvenţe nucleotidice (zona MC S= muItiple cloning site). Reprezintă o clasă specială a vectorilor de expresie. promotor (SP6) sau chiar doi fagi promotori (fagii SP6 şi T7). Se folosesc pentru sinteza ARN. de către o enzimă de restricţie. Vectorul format din plasmid cu un fag promotor ( φ SP6) Acest vector poartă numele de SP6. Transpoziţia este fenomenul prin care copii (elemente transpozabile) ale unor secvenţe specifice de ADN dmtr-un genom. cosmidul se replică apoi ca un plasmid.4 kilobaze (kilobaza (kb)=1000 perechi de baze). S-au descris două tipuri de elemente transpozabile: secvenţe de inserţie (SI) cu dimensiuni de 0. 140). În celula gazdă. Fagemide Reprezintă o nouă clasă de vectori în care o parte din genomul unui fag cu lanţ unic ADN (de exemplu M13) este combinat cu un plasmid ADN. 2) Vectorii de transcriere. transpozonii (Tn) cu dimensiuni de 3-20 kb (numiţi şi gene săritoare). care oferă mai multe locuri de tăiere pentru multe enzime de restricţie (Fig. Dacă în momentul introducerii fagului se injectează în celula gazdă şi un fag helper. Este de menţionat că zona MCS reprezintă porţiunea din sistemul vector unde pot fi înglobate de plasmid noi fragmente de ADN. coli. promotorul φ SP6 reprezintă secvenţa start ADN de unde porneşte transcrierea (deci sinteza ARNm-ului). atunci famegidul se multiplică ca un fag cu lanţ unic ADN. 140 .

vectorul linearizîndu-se (fig. Transcrierea cu ajutorul unui singur fag promotor este unidirecţională. 142 .141). 144 . Fig.Vector format dintr-un plasmid şi doi fagi promotori Fig. Vectorul format dintr-un plasmid şi doi fagi promotori (SP6 şi T7). 143 .Tăierea cu ajutorul enzimelor de restricţie a celor două zone MCS şi transcrierea în sens opus a celor două lanţuri ADN cu ajutorul fagilor SP6 şi T7 263 .Vector linearizat De obicei ADN-ul înglobat este cel care urmează a fi transcris în ARN. zona MCS este tăiată din nou de către alte enzime ADNc de restricţie. 144). deoarece cei doi promotori dirijează transcrierea în sensuri opuse (fig. 141 .înglobarea unui fragment de ADN dublu lanţ (fragment ADN sau ADNc) în mijlocul zonei MCS (fig.134). 143 şi fig. Acest sistem cu doi promotori este vector bidirecţional.Tăierea zonei MCS şi înglobarea unui nou fragment ADN Fig. Fig.

Vectorii de expresie trebuie selectionaţi pentru fiecare tip de celulă în care urmează a fi introdusă o gena straină pentru a se obtine sinteza 264 . iar a doua enzimă taie al doilea fragment MCS între fagul T7 şi ADN-ul înglobat. Acest sistem vector cu doi promotori care acţionează în două sensuri opuse.Tăietura I – Vector linearizat. Secvenţele de control nu sunt aceleaşi pentru diferitele tipuri de celule. Astfel prima enzimă taie primul fragment MCS între fagul SP6 şi ADN-ul înglobat. 145). de pildă vectori YAC (yeast artificial chromosome). după tăierea prealabilă a acestei zone în două segmente între care a fost înglobat noul segment ADN.1 mb. Un vector tip YAC se comportă în celulele de drojdii ca un cromozom care se dublează înainte de diviziunea celulară.Pentru utilizarea acestui sistem de transcriere bidirecţională se aleg două enzime diferite de restricţie. în cursul acestei diviziuni. aceasta secvenţă de control (promotor) va porni apoi transcrierea secventei ADNc strain inglobat. În ultima vreme s-au putut construi cosmide-vectori în care s-au putut îngloba fragmente mari de ADN de 100 kb . Vectorii de expresie reprezintă vectori construiţi anume care conţin în structura lor multe secvente de control optim pentru transcrierea şi translaţia genelor. aceste două enzime acţionează pe situs-uri diferite pe zona MCS. Fig. Aceste cosmide ajută la studiul poziţiei genelor pe harta genetică a cromozomului sau pe fragmente lungi de ADN. Fiecare fragment de ADNc străin care va fi înglobat de către vector se va fixa pe acest vector tocmai în apropierea acestei secvenţe de control (cu rol de promotor). Lungimea fragmentului ADN sau ARN se stabileşte după numărul de perechi de baze: 1 kb (kilobază) = 1000 baze (sau 500 perechi de baze). Alegerea vectorilor Se face după mărimea fragmentului ADN care urmează a fi înglobat într-o celulă. 1 mb (megabaze) = 1 milion de baze (sau 500 000 perechi de baze). permiţând transcrierea concomitentă a celor două lanţuri a ADN (dublu-lanţ) nou-înglobat. Promotorii SP6 şi T7 sunt astfel orientaţi încât primul să conducă transcrierea unui lanţ din ADN dublu-lanţ înglobat într-un sens iar al doilea promotor. transcrierea celuilalt lanţ ADN (al aceluiaşi ADN dublu lanţ nou-înglobat) în sens opus (fig. 145 . Cosmidele se folosesc drept vehicule pentru fragmente foarte mari de ADN (de 30-45 kb). îşi împarte materialul ADN între cele două celule fiice. Utilizarea sistemului SP6 pentru transcrierea unuia din lanţurile ADN înglobate. se numeşte vector bidirecţional. numiţi şi minicromozomi. iar. S-au construit un numar mare de vectori de expresie care să fie propice pentru diferite tipuri de celule.

determinând astfel sinteza unui ADN dublu lant (după paltern-ul respectivului ARN viral). eritropoetina. Celula poartă în acest fel. până de curând principiul activ se extragea direct din râme. Astfel. Prin infectarea unor leziuni ale plantelor cu această bacterie. În acest fel. lipsit de majoritatea genelor sale. s-a reuşit introducerea unor fragmente ADNc străin (de la eucariote) în celula bacteriană şi sinteza ulterioară a urmatoarelor proteine: insulina.unei anumite proteine. somatotropina. În aceste cazuri. activator de plasminogen. anticorpi monoclonali. o dată patrunse în organismul celulei gazdă să declanşeze. în prezenţa reverstranscriptazei. pe care a fixat-o şi pe care o introduce în celula ţintă (mecanismul de transductie). ele nu ucid (nu lezeaza) celulele pe care le contaminează. informaţia pentru sinteza virusului ARN. Retrovirusurile sunt mai mici decat celelalte virusuri. factori imunologici (factori de necroza a tumorilor. adică de la ARN spre ADN. Vectori speciali b1. prin alegerea unor vectori de expresie adecvaţi. factorul VIII de coagulare. virusul leucemiei aviare). injectat în celula ţinta. b 2. VISNA). prin care se elimină în prealabil un număr de gene virale. putADN determina formarea unor tumori in organismul gazda (virusul sarcomului Rous. interferon. hiradin (antitrombotic). iar segmentul de virus rămas este combinat apoi cu gene care urmează a fi injectate ţintit într-o anumită celulă. vaccinuri pentru boli bacteriene şi virale. devine inofensiv. o transcriere inversă. plasmidele Ti ajunse în celulele vegetale determină apariţia unei tumori. prin mecanismul de transcriere inversa. retrovirusul vector declansează actiunea reverstranscriptazei care determină sinteza ADN-ului corespunzator (replică a ARN-ului vector + gena fixată). Acest ADN dublu lanţ se integrează apoi în cromozomul celulei gazdă (umană sau animală). în scopul transferului unor gene străine în celula ţintă. deposedat de capacitatea lui infecţioasa. A fost imaginată o metodă eficace de prelucrare prealabilă a retrovirusului vector (Richard Mulligan de la Massachusetts Institute of Technology USA). B. retrovirusurile joacă rolul unor carcase pentru transportul respectivelor gene străine către o anumită celulă ţintă. conferind celulei gazdă o noua proprietate corespunzatoare noii gene fixate. 265 . motiv pentru care ele sunt folosite astăzi drept vectori în tehnicile de inginerie genetică şi de terapie genetică. Retrovirusurile reprezintă astazi uneltele (vectorii) cele mai utilizate în ingineria genetică pentru transportul de gene către genomul unei celule tintă. Multe retrovirusuri sunt oncogene. integrată în cromozomul ei. Retrovirusurile Sunt virusuri ARN cu o treaptă ADN în replicare (de exemplu: HIV. care este declansată însă doar în anumite condiţii. virusul. dar vector de o gena (de gene) nouă. Retrovirusurile ARN au capacitatea ca. Aceasta replică ADN se integrează în cromozomul celulei gazdă. spre deosebire de virusurile ADN. interleukine). Retrovirusuri şi plasmidul Ti Plasmidele Ti se găscsc în bacteriile Agrobacterium tumefaciens din sol. Deci plasmidele Ti au efect tumorigen.

dar aceste metode produc leziuni grave celulei. 12. Introducerea acestor gene străine în organismul plantelor sau mamiferelor (animale. in raport cu bazele (complementare) de pe secventa nucleotidica cunoscuta a sondei genetice. Hibridizarea se foloseste ori de cate ori se urmareste identificarea secventelor nucleotidice pe un acid nucleic (secventa tinta). om) se face cu ajutorul unor vectori speciali: plasmide Ti şi retrovirasuri. HIBRIDAREA Este o tehnica de recombinare de acizi nucleici. Daca sonda si secventa tinta sunt total sau partial complementare din punct de vedere al secventelor de baze nucleotidice. pierde capacitatea de a mai produce tumori şi păstrează doar rolul de vector de gene către o celulă ţintă. prin transport de gene către genomul unor celule ţintă. Altă metodă constă în supunerea celulei unui câmp electric (electroporare). prin prelucrarea prealabila. 12. Procesul de transfectie si vectori speciali În biologia molecularaâă. Denaturarea Dupa cum s-a aratat. Pentru lucru. tratament prin care respectivele celule devin capabile (permeabile) să accepte macromoleculele din exterior. Principiu Se analizeaza o secventa de acid nucleic unic lant (secventa tinta).2. format dintr-un retrovirus şi un plasmid Ti. Dintre aceşti vectori. care vizeaza construirea unei molecule de acid nucleic dublu lant din doua lanturi unice. 2. Imperecherea de baze complementare se poate face intre: ADN .1. se formeaza o molecula hibrid de acid nucleic in care se identified secventele nucleotidice pe secventa tinta. Analiza acestei secvente necunoscute se face fata de o sonda genetica (proba de acid nucleic) marcata (radioactive sau prin alte metode) cu o secventa de baze cunoscute. ADN dublu lant trebuie intai denaturat (supus actiunii caldurii sau substantelor chimice alcaline) pentru a fi disociat in lanturi unice. mamifere) poartă numele de tranfecţie. acesta trebuie intai adus la forma de lanturi unice prin denaturare. acesta din urmă. retrovirusurile reprezintă astazi uneltele (vectorii) cele mai larg utilizate în ingineria genetică şi terapia genică. introducerea unui ADN străin (gene) în celulele organismelor superioare (plante. Denaturarea reprezinta modificarea structurii acidului nucleic prin tratament cu caldura (temperatura de 266 . Se mai utilizează razele laser care produc orificii foarte fine în peretele celular rigid (la plante) prin care se injectează apoi molecula de ADN străin.ADN ADN-ARN ARN-ARN Totdeauna hibridizarea are loc intre doua lanturi unice de acid nucleic. pentru analiza si identificarea secventelor nucleotidice ale unui acid nucleic tinta.Prin utilizarea unui vector special. pe baza complementaritatii bazelor azotate. Lantul unic va reprezenta apoi substratul pe care se va efectua hibridizarea cu sonda genetica.2. separate. Introducerea acestor gene străine în celule se mai poate face cu ajutorul particulelor de metal nobil (experienţe balistice biologice).2. 12.

12.ARN sau ARN . a). Renaturarea (annealing/reannealing) Reprezinta o hibridizare. iar conditiile de reacţie sunt favorabile.concentraţia de formamida.2.4.2. Cantitatea de acid nucleic unic lant. concentratia cationilor. stringenta (intensitatea) reacţiei de ambinare este foarte puternică. iaca temperatura insa scade brusc. b).100"C) sau substante chimice. Southern Blotting (ADN Blotting) a.2. aceasta necesitADN o temperatura de topire mai scazuta. depinde de: .5. Norhern Blotting (ARN Blotting) a. in timp ce bazele adeninatimina se leaga doar prin doua punti de hidrogen. 12. Denaturarea prin caldura Reprezinta taierea lantului dublu ADN cu ajutorul temperaturii inalte. Reprezintă intensitatea reactiei de hibridizare. Denaturarea chimica Se face prin adaos de substante denaturante (formamida. Dacă pe cele două lanţuri de acid nucleic există doar zone parţiale cu baze complementare. Dot Blotting 267 . .concentratia moleculara a acidului nucleic din solutie. . Punctul de topire reprezinta temperatura la care 50% din respectivul acid nucleic dublu lant disociaza in unic lant. Factorul stringent Este un important factor de hibridizare.lungimea moleculei de acid nucleic. Dacă două lanţuri unice de acid nucleic sunt pe toată lungimea lor formate din baze implementare.3. uree) care determina scaderea punctului de topire. lanturile raman separate. care prin renaturarea trece in dublu lant. Folosind aceste metode se realizeaza desfacerea legaturii de hidrogen dintre bazele complementare.3.zona bogata în guanina-citozina.2. Hibridare Blotting: a.1. care cere totdeauna o temperatura mai inalta.ADN. . Tipuri de hibridări a. concentratia în NaCl. Western Blotting (Protein blotting) a. 12. concentratia in NaCl a solutiei. Prin scaderea temperaturii sau a pH-ului este favorizata refacerea gaturilor intre bazele complementare de pe cele doua lanturi unice de ADN . Acest punct de topire poate fi influentat de: o zona bogata in guanina-citozina. Reactiile de renaturare se produc de regula la temperaturi care corespund unei iferente de 20-30 C fata de temperatura punctului de topire al dublului lant de acid nucleic. stringentă este mai scazută (această situaţie apare în special atunci cADN cele două lanţuri de acid nucleic provin din două organisme diferite). o concentrate scazuta de NaCl determina destabilizarea moleculei de acid nucleic.4. deoarece aceste baze se leaga prin trei punti de hidrogen. sau supunerea in mediu alcalin (pH>l 1).

Hibridizare in situ.deasupra ei. Gelul (2) este pus pe hărtie de fitru (1) umedă(care a absorbit prin capilaritatea lichid din vasul cu soluţie tampon). Hibridizare Blotting Este o tehnică specială prin care acidul nucleic ţintă (de cercetat) este axtras din materialul de cercetat prin încălzire la 100 grade C şi răcire la gheaţă şi apoi depus pe o membrană(de nitroceluloză sau filtru de nylon) şi fixat. care se îngreunează prin aplicare.5.146). Utilizarea practică a variantei Southern Blotting Gelul (2) este pus pe hărtie de fitru (1) umedă(care a absorbit prin capilaritatea lichid din vasul cu soluţie tampon).fragmente de ADN(de circa 1000 perechi de baze)sînt supuse electroforezei şi separate în funcţie de greutatea lor moleculară. . Hibridarea acestui acid nucleic necunoscut are loc direct pe filtru cu ajutorul sondei genetice (acid nucleic cunoscut şi marcat). peste gel (2) se pune altă hîrtie de filtru (3) uscată. Hibridizarea se realizează prin incubarea hîrtiei de fitru (3) într-o soluţie care conţine sonda genetică radioactivă (de exemplu. Fragmentele de lanţ unic ADN fixate pe hîrtia de fitru superioară prin acţiunea căldurii sînt tratate(hibridizate) cu sonde genetice ADN sau ARN (marcate radioactiv). c. moleculahibrid realizată va fi evidenţiată prin metoda autoradiografică sub formă de benzi.Slot Blotting b. Southern Blotting A fost imaginată de Southern în 1975.1.de la hîrtia de fitru umedă spre cea uscată.dintre care una este cea prin transfer capilar (Fig. a.ţesuturi).acţionează şi scoate prin spălare moleculele ADN din gel şi le trage către şi pe hîrtia de fitru superioară (4).se extrage ADN dintr-un produs patologic lichid(ser sanguin care conţine acid nucleic viral) sau solid(celule.a unei lame de sticlă (4) şi a unei greutăţi (5). Etapele reacţiei: . Noţiunea de "Blot" reprezintă fitrul+acidul nucleic fixat(imobilizat). . Fragmentele de lanţ unic ADN fixate pe hîrtia de fitru superioară prin acţiunea căldurii sînt tratate(hibridizate) cu sonde genetice ADN sau ARN (marcate radioactiv). molecula-hibrid realizată va fi evidenţiată prin metoda autoradiografică sub formă de benzi.Evidenţiază secvenţele specifice ale unor fragmente de ADN separate prin gelelectroforeză. ADN marcat cu 32P).trecerea fragmentelor de lanţ unic ADN de pe gelul sensibil(de nitroceluloză) care fixează aceste fragmente de ADN. Acţiunea de "Blotting" reprezintă trecerea acidului nucleic pe filtru. . Există mai multe variante de hibridare Blotting şi anume: a.a unei lame de sticlă (4) şi a unei greutăţi (5). Curentul de lichid care rezultă din soluţia tampon şi care se formează prin capilaritate.fragmentele ADN obţinute în gel sînt supuse denaturării.ADN este tăiat cu enzime de restricţie. Curentul de lichid care rezultă din soluţia tampon şi care se formează prin capilaritate. ADN marcat cu 32P). Hibridizarea se realizează prin incubarea hîrtiei de fitru (3) într-o soluţie care conţine sonda genetică radioactivă (de exemplu.de la hîrtia de fitru umedă spre cea uscată. care se îngreunează prin aplicare.acţionează şi scoate prin spălare moleculele ADN din gel şi le trage către şi pe hîrtia de fitru superioară (4). Hibridizare Colonială.deasupra ei. Pentru transferul respectivelor fragmente de ADN de pe gel pe fitru se folosesc diferite metode.a. . 268 . peste gel (2) se pune altă hîrtie de filtru (3) uscată.

Hibridarea Southern Blotting 269 .Fig. 146 .

pot apărea în consecinţă noi tipare de fragmente ADN. acest fragment a fost numit "polimorfism de lungime al fragmentelor de restricţie" (RFLP). epidemiologice).pe baza tiparelor RFLP s-au putut clasifica microorganismele (virusuri şi bacterii) . . .prezenţa unor modificări genetice în cazul unor procese tumorale. . gorilă şi gibon. aceste tipare RFLP sînt complet identice. pe baza pattern-urilor RFLP (ADN minisatelite=fragmente hipervariabile din genom.lanţul ADN rămîne netăiat. Studiul genelor pentru globină la primate (responsabile pentru sinteza proteinei hemoglobină) a demonstrat că aceste gene sînt localizate la un loc. Northern Blotting Această variantă a hibridizării Blot pune în evidenţă secvenţe specifice ale unor fragmente ARN departe prin gelelectroforeză. această metodă fiind mult mai sensibilă decât determinarea hizotipurilor de tulpini.din contră. Studiul acestor fragmente şi a diferenţei dintre ele.evidenţierea moleculei hibrid construite. reprezintă o motodă foarte modernă şi utilă de cercetare pentru determinarea filiaţiei cazurilor în epidemii. Astfel. în actuala a VII -a pandemie de horelă. cu ajutorul metodei Southern Blotting. prin studiul unor probe de sânge sau spermă. . prezente în Asia şi Europa.în medicina judiciară. a. ADN de origine umană şi cel provenind de la cimpanzeu şi gorilă sînt omologate în proporţie de 97%(diferenţa constă în cromozomul X).ARN este pus în prezenţa substanţei denaturatei (glicoxal dimetilsulfoxid formaidehidă sau metilmercur). aceleaşi tipare RFLP sînt în mare parte identice.în boli genetice se evidenţiază prezenţa unor gene defecte (pe baza unor fragmente ADN cu un tipar individual).transferul moleculelor ARN pe filtru (nylon sau mitriceluloză). Etapele reacţiei sunt: . respectiv ADN modificat. Astfel s-a putut demonstra că: . . care se moşteneşte. dacă va fi supus acţiunii enzimelor de restricţie. . . poate apare un nou situs specific de tăiere pentru aceste enzime. Aplicaţii practice ale variantei Northen Blotting . cu ajutorul metodei de ribotipare s-a putut demonstra că profilul genetic al tulpinilor de Vibrio cholerae biotip eltor. 2. În Africa de Sud a fost studiată originea speciei Quagga (Equus quagga). şi pe baza studiilor filogenetice s-a stabilit că aceasta reprezintă forma originară a tuturor speciilor de zebră.Utilizarea practică a variantei Southern Blotting Prin apariţia unei mutaţii în genomul celulelor germinative (modificarea unei baze). .la rude.hibridizarea ARN de pe filtru cu o sondă genetică ARN sau ADN.În epidemiologie.deoarece enzimele de restricţie nu mai recunosc situs-ul specific.a putut aduce noi informaţii în cercetările efectuate asupra unor boli genetice şi în medicina judiciară. care nu sînt transcriptibile) se poate face determinarea paternitaţii. Speciile de cimpanzeii sunt mult mai copiate de om decât alte specii de maimuţa. 270 . . pe baza aceloraşi pattern-uri RFLP se pot face identificări de persoane în criminalistică. De asemenea.determinarea ribotipurilor tulpinilor bacteriene (în studii genetice.la germenii univitelini.ARN este supus separării electroforetice.va prezenta una din următoarele două ipostaze posibile: . Dimensiunea acestor clusteri este asemănătoare la om. . este în mai mult de 70% din cazuri identic. . care a dispărut în 1883.ARN este extras din materialul de cercetat. În acest al doilea caz.într-un cluster pe cromozomii umani 11 şi 16.

în total pe o placă depunînduse atîtea probe câte godeuri are placa. Aceste ultime două variante de hibridizare se folosesc atunci când se lucrează deodată cu un număr foarte mare de probe patologice nefracţionate (probe de ser. Această variantă foloseşte doar principiul reacţiei de hibridizare. Principiul metodei este identic cu cel de la Dot Blotting. Western Blotting (tehnica immunoassay) Această variantă a hibridizării Blot nu reprezintă o reacţie de hibridizare propriu-zisă (anume construirea unei molecule ADN dublu lanţ din două lanţuri separate de ADN). . Avantajul metodei este acela de a pune în evidenţa prezenţa unei anumite proteine. Etapele reacţiei sunt următoarele: . a. extract celulare sau tisulare).Tehnica Dot Bloptting a.transferul spoturilor proteice (antigene) pe membrana de nitroceluloză. . Reacţia foloseşte la evidenţierea unor cantităţi foarte mici de proteine prezente în lichidele sau celulele unui organism. Dot Blotting Se execută pe o placă de plexiglas cu godeuri rotunde (fig. 4. 271 . prin cuplarea acestora cu anticorpi specifici corespunzători (marcaţi). 5.extracte celulare sau tisulare. Proba de acid nucleic extrasă se depune într-unul din godeurile rotunde ale plăcii de plexiglas.În acest caz de Western Blotting.expunere şi developare. Apoi respectiva placă se acoperă cu hîrtie de filtru. Fig. probele de acid nucleic de pe hîrtia de filtru sînt supuse apoi denaturării (prin încălzire la 100 gradeC şi răcire la gheaţă).aplicarea deasupra membranei de nitroceluloză a unui film fotografic. care absoarbe aventualele probe de acid nucleic prezent.spălarea anticorpilor rămaşi nefixaţi.Această metodă este folosită pentru clonarea genelor.unde este apoi cuplat şi evidenţiat prin intermediul unor grupări chimice complementare.proteina este supusă electroforezei în gel SDS*-policrilamidă. şi anume desfaşurarea substratului de cercetat pe gel de electroforeză şi apoi trecerea acestuia pe o membrană de nitroceluloză.În fiecare godeu se depune altă probă de acid nucleic.147). . 147 . Apoi probele de acid nucleic denaturat de pe filtru sînt hibridizate cu sonde genetice.citirea prin autoradiografie a benzilor de proteină cu ajutorul anticorpilor specifici marcaţi şi fixaţi. . Nu se face nici o separare electroforetică. . 3. Slot Blotting Se execută pe o placă de plexiglas cu godeuri de formă dreptunghiulară (Schlitz-uri = tăieturi sau Slot-uri). substratul de cercetat nu este reprezentat de un acid nucleic ci de o proteină. . Este necesară extracţia prealabilă a acidului nucleic din probele de cercetatare(ser. dintro mixtură complexă.adaos de anticorpi specifici marcarţi (cu enzime sau radionuclizi).a.

virusul Epstein-Barr. pentru denaturarea probei se foloseşte o încălzire puternică sau tratarea cu proteaze şi digitonină. După denaturare. diagnosticul pre. virusul cito-megaliei. cercetarea tiparelor de expresie genetică (stabilirea momentului activării anumitor gene). hibridarea colonială.Prin această ultimă metodă se poate realiza evaluarea exactă a distribuţiei anumitor secvenţe ADN sau ARN direct in situ simultan cu determinări calitative şi semicantitative. În cazul hibridizării Blotting este necesară extracţia prealabilă a acidului nucleic din proba de cercetat. Pe plăci cu medii de cultură se însămînţează colonii bacteriene din două tipuri de clone: o clonă bacteriană de origine(cu plasmid).după ce se produce această reacţie de hibridizare. Marcarea cu biotină este evidenţiată ulterior prin diferite variante de lucru (vezi "Sonde genetice. virusul papilloma. prin această extracţie. Fixarea se face cu xilol. în cazul reuşitei hibridizării. o clonă bacteriană cu ADN ţintă (cu plasmid+ fragmente de ADN ţintă). Aceste copii de clone bacteriene (de pe fitru) sunt supuse lizei pentru a se obţine ADN. relaţia virusul hepatitei virale tip B-carcinom hepatic). secvenţele ţintă din acidul nucleic de cercetat (din ţesuturi) sînt evidenţiate la autoradiografie (prin cuplare cu secvenţele de acid nucleic complementare din probele marcate cu biotină). identificarea anormalităţilor cromozomiale (de exemplu: trisomia 21. lama se spală (pentru îndepărtarea particulelor nelegate) şi abia apoi urmează hibridizarea cu sonda (ADN sau ARN) marcată. aplicative şi fixate pe lame obiective). în fibroza chistică.Marcarea"). ultima slăbind şi desfăcând citoscheletul şi rezultînd molecula ţintă de acid nucleic unic.2. stabilirea sexului la embrion. etanol (100% şi apoi 70%). se pierde însă informaţia asupra sediului exact al respectivului acid nucleic (ADN sau ARN) din anumite structuri celulare. Această informaţie se poate obţine numai cu ajutorul hibridizării in situ. Lama obiectiv cu celule fixate corespunde filtrului cu acid nucleic legat prin hibridizare Blotting. Prin replica plating se obţine copii ale acestor colonii din cele două clone pe un filtru de nitroceluloză. culturi celulare (prelucrate. Aplicaţiile practice in situ sunt: evidenţierea şi localizarea diferiţilor agenţi infecţioşi în diferite celule şi ţesuturi ale organismului: virusul hepatitei virale tip B. Hibridizare in situ Se efectuează direct pe celule şi ţesuturi. amprente de celule.6. Lanţul unic ADN este supus hibridizării cu probele ADN cunoscut şi marcat radioactiv. sindromul Turner).Lama cu probă pentru denaturarea se acoperă cu o placă. Biotina din sondă a fost fixată de un necleotid cu uracil. ADN este supus denaturării pentru obţinerea lanţurilor unice de ADN. localizarea genelor defecte pe cromozom (de exemplu. HIV.care îndepartează moleculele nelegate de acid nucleic din probă. distrofia musculară Duchenne). se face o spălare cu o soluţie tampon.şi postnatal în boli genetice. Reacţia de denaturare şi hibridizare se face pe lama obiectiv şi anume: după depunerea probei pe lama obiectiv. virusul herpes simplex.12. acest uracil se va împerechea în lanţul de acid nucleic ţintă cu o adenină. cercetarea relaţiilor virus-procese oncogene (de exemplu. După fixarea probelor ADN radioactive(fixarea complementară)pe lanţul unic de ADN ţintă 272 . sindromul Langdon Down. realizîndu-se o cameră umedă. Se folosesc fragmente de ţesuturi. stabilirea hărţii genetice cromozomiale (stabilirea relativă a locus-ului fiecărei gene pe cromozom).

În aceste cazuri diagnosticul serologic de obicei nu poate fi de ajutor deoarece pozitivarea serului în cazul infecţiei cu HIV se produce abia după câteva săptămâni de infecţie. evidenţierea secvenţelor specifice ADN şi ARN în material biologic de cercetat (sânge. pulsotip). 273 .(de cercetat) se procedează la evidenţierea autoradiografică a marcării pe un film Roentgen. Prin compararea imaginii radiografice se identifică şi se diferenţiază clonele bacteriene care conţin fragmente de ADN ţintă faţă de clonele bacteriene de origine. determinarea numărului de copii dintr-o anumită secvenţă prezentă într-un dovedirea gradului de înrudire între diferite organisme în raport cu numărul de secvenţe ADN identice. prezenţa unui anumit ARNm corespunzător unei munoglobuline prezente în caz de limfoane maligne sau prezenţa unui anumit ARNm hormonal în anumite tumori neuroendocrine. în vederea elucidării diagnosticului unor infecţii virale cronice: evidenţierea acidului nucleic viral în aceste produse semnifică prezenţa particulei virale în organismul respectiv. Astfel o reacţie de tip imunohistochimic a putut pune în evidenţă un produs de transcriere (ARNm) specific de ţesut (de exemplu. Clonele bacteriene care poartă ADN ţintă recombinant (plasmid + ADN ţintă) vor fi multiplicate mai departe (sincron se vor multiplica şi fragmentele de ADN straniu). în serul sanguin LCR. ƒ utilizarea metodelor ce folosesc sonde genetice pentru diagnosticarea infecţiilor virale ale arborilor fructiferi (cu o precizie de diagnostic pentru o cantitatea de antigen de 2x10 nanograme). ƒ aplicaţii în epidemiologia moleculară în vederea depistării unor noi markeri genetici (de exemplu. stabilirea activităţii genelor pentru care s-au pus în evidenţă moleculele de ARNm corespunzătoare. ţesuturi). Importanţa reacţiei de hibridare pentru medicină şi biologie Această reacţie a pus bazele unui număr de tehnici care au ajutat la progresul cercetării biologice fundamentale.7. robotip. în vederea instituirii a unei terapii de urgenţă în special la persoanele bolnave de SIDA sau la cele imunosupresate (terapeutic) în urma unor transplante de organe.2. Astfel s-a reuşit: stabilirea concentraţiei anumitor secvenţe ADN sau ARN într-o mixtură de secvenţe. ƒ studiul efectuat asupra produsului de transcriere (ARNm) a unor secvenţe ADN celulare glucogene nevirale a ajutat la complectarea şi aprofundarea diagnosticului de tumoră. Această metodă reprezintă o unealtă foarte eficientă pentru cercetarea activităţii genelor oncogene prin evidenţierea indirectă imunohistochimică a produselor lor de translaţie (ARNm corespunzător). ƒ se precizează ca în viitor metoda hibridizării să ofere posibilităţi pentru elucidarea mecanismelor de reglare a activităţii genelor. iar în cazul imunosupresaţilor după câteva luni sau chiar deloc. ƒ determinarea defectelor metabolice.cît şi la progresul diagnosticului medical într-un număr de boli. evidenţierea acidului nucleic viral. Evidenţierea prezenţei acidului nucleic viral direct în produsele patologice (ser. celule. ƒ evidenţierea prezenţiei virale în tumori de origine virală. LCR) sau în materialul citologic reprezintă o posibilitate de diagnostic rapid şi precoce. 12. ƒ diagnosticul pre.şi postnatal al bolilor ereditare (la femei care doresc copii sau la care se pune problema întreruperii sarcinii).

Astăzi. într-o moleculă finală de ADNc dublu lanţ doar un lanţ conţine secvenţe corespunzătoare moleculei matriţă ARNm. unde vectorul se multiplică rezultînd în final o cantitate mare de ADN clonat. o dată cu acest vector (recombinant). SONDE GENETICE Cu ajutorul enzimelor de restricţie. 274 . Probele ADN dublu lanţ pot fi ulterior marcate în vederea obţinerii sondelor genetice (vezi „ Marcarea sondelor genetice”). şi anume prin metodele Blot (Western Blot. În aceste maşini se pot realiza concomitent sinteza şi marcarea sondelor genetice.2. În acest caz.12. A.graţie sondelor genetice. a. la un individ dintr-o anumită specie se pot repera codurile complementare pe care sonda "le luminează" prin procesul de hibridizare moleculară. 3. reperarea şi cartografierea genelor au devenit operaţii de rutină în marile laboratoare din lume. a. Aceste fragmente se obţin prin încorporarea de fragmente da ADN genomic(tăiate cu ajutorul enzimelor de restricţie) sau de fragmente ADNc (sintetizate cu ajutorul reverstranscriptazei după modelul unei matriceARNm) într-un vector şi prin introducerea lor. Cu ajutorul unor asemenea sonde. Din fragmente ADN dublu lanţ clonate (în vederea obţinerii ulterioare de sonde genetice). ƒ sinteza de gene. Pentru hibridizări sînt în special de preferat fragmentele ADNc clonat. unic lanţ. Sondele genetice (probe de acid nucleic tip ADN sau ARN marcate) reprezintă unealta esenţială de lucru în metoda de hibridizare pentru analiza secvenţelor nucleotidice din secvenţele "ţintă" ale ADN-ului de cercetat (genele). Aceste sonde genetice (proba de ADN sau ARN) sunt marcate (radioactiv sau nonradioactiv) pe un singur nucleotid (cu o secvenţă de baze cunoscute). etichetarea.1. ceea ce va asigura în viitor progresul rapid al alcătuirii hărţilor cromozomiale complete ale genomului uman. teoretic. În prezent sondele genetice pentru cercetare şi diagnostic se pot comADNa şi cumpăra de la casele producătoare.Southern Blot) şi metoda hibridizării in situ. Sub forma de oligonucleotide ADN unic lanţ prin sinteza chimică în "maşini de gene". Moleculele ADNc sunt. Aceste oligonucleotide ADN-unic lanţ reprezintă baza materială pentru: ƒ sonde genetice. Prepararea probelor de ADN: a. Principiul hibridizării în vitro a două ADN-uri complementare stă la baza metodei care foloseşte sondele moleculare(coduri de ADN cunoscute asociate cu un marker). Prepararea probelor de acid nucleic(sonde genetice) pentru reacţiile de hibridizare Sondele genetice pot fi: probe de ADN şi probe de ARN. iar celălalt lanţ ADNc reprezintă secvenţele complementare respectivului lanţ matriţă ARNm. într-o celulă gazdă. deoarece reprezintă secvenţe de ADN fără introni şi fără altă secvenţă care ar putea reacţiona nespecific. Cu ajutorul ADN-polimerazelor s-a reuşit şi amplificarea ulterioară a acestor fragmente de ADN bine determinate şi deci clonarea genelor pentru a face şi mai uşoară (mai sensibilă) reperea lor. toate genele tuturor organismelor vii. ƒ primeri pentru reacţii polimerazice în lanţ. dar prin diferite metode sunt transformate în ADN dublu lanţ şi apoi introduse în vectori şi multiplicate o dată cu aceştia în celula gazdă. astăzi se pot izola. Sondele genetice se prepară prin aceleaşi metode de hibridizare utilizate şi pentru secvenţierea (sequencing) acidului nucleic. iniţial. în vederea obţinerii unei bănci de gene (le vivant mondial).

b. 137). b. Transcrierea unidirecţională cu ajutorul φ SP6 După înglobarea în sistemul SP6.Transcrierea unidirecţională cu ajutorul φ SP6 Având în vedere că transcrierea începe la nivelul promotorului SP6 şi se termină la locul de tăiere a enzimei de restricţie. Promotorul reprezintă secvenţe de ADN de unde începe procesul de transcriere. În " maşini de gene":ca şi probele ADN unic lanţ. Fiecare din cele două polimeraze necesare pentru transcrierea respectivului lanţ ARN şi anume.2. bidirecţională. După linearizare se adaugă în mediu SP6-ARN-polimeraza şi patru ribonucleotide (dintre care trei nucleotide marcate şi unul nemarcat). Vectorii de transcriere sunt formaţi dintr-un plasmid ADN. nu se folosesc caşi ceilalţi vectori de expresie pentru sinteza de proteine. se leagă specific doar de promotorul corespunzător. SP6 – ARN polimeraza şi T7 .1. După linearizare. ci pentru sinteza de ARN. zona MCS şi φ T7 (vezi fig. în ARN. în funcţie de enzima de restricţie folosită. deci sinteza ARNm. se poate stabili de la început care din cele două lanţuri ADNc va fi transcris în ARN.2. Vectorul bidirecţional este format din ADN plasmidic. 148).Transcrierea bidirecţională cu ajutorul vectorului bidirecţional cu doi promotori (φ SP6 şi φ T7).ARN polimeraza . Va fi transcris unul din cele două lanţuri de ADN nou înglobat. ADN-ul străin este cel care urmează a fi transcris în ARN. 275 . se va sintetiza ARN sau ARN antisens. ADN este transcris în afara celulei.polimeraza se va lega de promotorul SP6 pornind transcrierea genelor în direcţia SP6>fragment MCS>fragment ADN nou înglobat (fig. ARN-ul respectiv putând fi marcat direct în cursul sintezei. înseamnă că prin utilizarea diferitelor enzime de restricţie se poate prestabili lungimea lanţului transcris şi se pot obţine lanţuri ARNm transcrise de lungimi prestabilite. În sinteză. Prin introducerea şi înglobarea într-un vector de transcriere bidirecţională a unui dublu lanţ ADN (de exemplu. Vectorii de transcriere (clasă aparte a vectorilor de expresie). Această metodă de transcriere in vitro (sinteza ARNm după o matriţă ADN) se realizează cu ajutorul vectorilor de transcriere unudurecţionali şi bidirecţionali. cât şi de ARN-polimeraza utilizată pentru transcriere. φ SP6. Prin metoda de transcriere in vitro cu ajutorul vectorilor de transcriere.1.2.ARN. în care au fost înglobaţi un fag promotor (SP6) sau doi fagi promotori (SP6 şi T7). transcrierea in vitro va fi unidirecţională. ARN-polimeraza va folosi ribonucleotidele marcate şi nemarcate. În cazul vectorilor cu un fag promotor (SP6).Prepararea probelor ARN (sonde genetice) b.b. care se utilizează ulterior în reacţiile de hibridare. b. pentru formarea unei molecule ARNm conform matriţei ADN. iar în cazul vectorilor cu doi fagi promotori. Fig. 148 . ăn vederea obţinerii de probe ARN lanţ unic (sondă genetică).2. Cei doi promotori dirijeajă transcrierea în două sensuri opuse.Prin această metodă. ADNc între două segmente de MCS şi după linearizarea vectorului).

b. 32P. rezultă ARNm antisens = complementar faţă de ARNm de origine: Acest ARN antisens se mai notwează ARNc (complementar) şi are sensul invers decât ARNm sens (normal). Marcarea Se face pe un sungur nucleotid. prin intermediul spacer-ului de la biotină se pot realiza două tipuri de legături: . . . pot fi marcate direct în soluţia de sinteză cu ajutorul nucleotidelor marcate (vezi „Marcarea”). Biotină – spacer – uracil – zahăr – trifosfat.4 ani. . Etapa I Markerul (biotina) se leagă printr-un lanţ de legare numit spacer de baza uracil din nucleotid. Prin transcrierea: . Acest braţ de legare va uşura şi legarea ulterioară a biotinei de proteinele avidină/streptovidină.3 zile.La alegerea izotopului trebuie ţinut cont de timpul de înjumătăţire (timp necesar pentru ca substanţa radioactivă să se descompună în proporţie de 50%). a. Probele de ARN obţinute în maşini de gene cât şi prin metoda transcrierii cu ajutorul vectorilor fagici. ATP-ul din nucleotidele ADN este transportor de energie pentru metabolismul celular.celui de-al doilea lanţ ADN.35S.un lanţ ADN este complementar cu ARNm de origine utilizat pentru sinteza ADNc. De exemplu: Bio – UTP. Biotină – spacer – uracil – zahăr – trifosfat Bio – dUTP. În mod normal uracilul se înglobează numai în ARN. În ultima vreme există tendinţa ca substanţele radioactive să fie abADNonate din cauza efectului lor nociv asupra organismului şi înlocuirea lor cu substanţe neradioactive.al doilea lanţ conţine aceleaşi secvenţe de nucleotide ca şi ARNm de origine. Timpul de expunere a filmului la u. timpul de înjumătăţire pentru : 3 H este de 12. Atomul radioactiv introdus în probă prin dezintegrare va emite radiaţii β care vor fi evidenţiate la autoradiografie (impresionarea plăcii Roentgen la iluminarea cu radiaţii u. Marcarea neradioactivă Se face în două etape: Etapa I – marcarea probelor cu biotină (cel mai frecvent). dar în condiţii de laborator.).v. Etapa II – probele marcate sunt evidenţiate prin intermediul legării markerului de avidină (glicoproteină din ou)/streptovidină (sintetizată din ciuperca Streptomyces avidinii) şi anticorpi antimarker (de exemplu. bromdeoxiuridină. cu o substanţă care îl face vizibil din punct de vedere biochimic sau imunohistochimic.v. 276 . ca sonde genetice.pentru hibridarea Blotting se foloseşte proba marcată cu 32P. Marcarea radioactivă Se face cu radioizotopi 3H. Probele de lanţ unic ARN astfel obţinute şi marcate se utilizează ulterior în reacţii de hibridare. antibiotina) marcaţi cu fluorocrom. 32 P este de 14. va fi diferit în funcţie de izotopul folosit: . 125 I este de 60 de zile. digoxigenină. în etapa II. rezultă ARN sens identic şi cu acelaşi sens ca şi ARNm de origine.35 ani.Într-un dublu helix ADN: . Pentru aceste structuri se folosesc în laborator trifosfaţii nucleozidelor. 35 S este de 87. Astfel.legătura cu nucleozidul natural. nu şi în ADN.pentru hibridarea in situ se foloseşte proba marcată cu 3H. 125I.legătura cu nucleozidul artificial. B. .primului lanţ ADN.

I.polimeraza I (polimeraza Kornberg) este izolată din E. Fig. Metode enzimatice b. în locul rbouridin – trifosfatului. în funcţie de complementaritatea faţă de nucleotidele de pe lanţul matriţă corespunzător (fig. Fig. pentru a se evidenţia prezenţa complexului molecular hibrid biotină – avidină/streptovidină. 150). Metode chimice.translaţia Cea mai folosită metodă pentru marcarea sondelor este Nick-translaţia (translaţia prin tăiere). cât şi Bio – dUTP sunt derivate biotinate ale dezoxiuridin – trifosfstului şi . ADN. 149). pe lanţul complementar de ADN ca şi pe lanţul ARN. În momentul hibridării cu segmente ADN ţintă. În final. această acţiune apare doar când în cursul sintezei unui ADN sunt introduse nucleotide false (fig. tot cu un nucleotid cu adenină.Acţiunea 5 ' > 3' polimerazică a ADN. respectiv ribouridin – trifosfatului şi vor fi înglobate în locul dezoxitimidin – trifosfatului şi.azei I pe dublul lanţ ADN îm prezenţa ionilor de Mg++ şi Mn++ ADN.aza I este o enzimă de restricţie extrasă din pancreas de bou. Metode enzimatice Înglobarea nucleotidelor marcate radioactiv sau neradioactiv se face cu ajutorul unei reacţii enzimatice. acesta este marcat prin diferite metode. nu atacă ARN şi acţionează în prezenţa ionilor de Mg++ şi Mn++ (fig. 149 . în prezenţa ionilor de Mg++. ea taie legăturile fosfodiesterice de ADN unic sau dublu lanţ. are acţiune polimerazică 5' > 3'.polimeraza I 277 . coli. 151). În această metodă se folosesc două enzime: ADN-aza I şi ADN – polimeraza I. 150 . Înglobarea nucleotidelor marcate în sonda genetică Se realizează prin: a.Acţinea ADN.Atât Bio – UTP.Biotina prezintă o mare afinitate pentru avidină. a. respecti în ARN. ADN – polimeraza I are şi o acţiune exonucleazică în ambele sensuri: 5 ' > 3' şi 3' > 5' . Nick . C. nucleotidele cu uracil se împerechează. Etapa a II-a Probele de mai sus biotinate se evidenţiază prin legarea biotinei de avidină/streptovidină sau anticorpi antibiotină marcaţi cu fluorocrom. Din cauza unor reacţii nespecifice se preferă streptovividina în locul avidinei. Legătura bitină + avidină este foarte puternică şi aproape ireversibilă. fixează nucleotidul ADN la capătul liber 3' (mai scurt) al moleculei ADN parţial dublu lanţ.

Se foloseşte enzima Klenow Polimeraza care reprezinta un fragment de ADNpolimeraza. si 3’.3’ exonucleazica). 278 .) cît şi nemarcate (o).Fig. Se mai utilizează un amestec de hexanucleotide (oligonucleotide sintetizate cu ajutorul unei maşini de gene ). Fig. Numele metodei de RADNom Priming derivă de la utilizarea drept primeri a hexanucleotidelor cu secvenţe întamplătoare (randomized primer).Schema Nick – translaţiei (după Hermaun . 1991).5’ exonucleazica (dar nu prezinta activitate 5’. Astfel. RADNom Priming Oligolabelling. in oligomarcare se folosesc drept matriţe lanturi unice de ADN rezultate dintr-o denaturare prealabila a unui lanţ ADN.FeinbergVogelstein Technik) Spre diferenţa de “nicktranslatie”. Klenow Polimeraza poseda activitate 5’ – 3’. se vor obţine fragmente de lanţuri unice ADN marcate de diferite lungimi şi cu diferite secvenţe de baze (sonde genetice) (fig. ele sunt structuri formate fiecare sir cate sase nucleoide care contin practic toate combinaţiile de secvenţe nucleotidice posibile. dublul lanţ ADN este denaturat (cele două lanţuri sunt separate). aflate de obicei in proporţie de la 1 la 3.152). după încorporarea nucleotidelor marcate. reprezentate de nucleotide ADN marcate (. 152 . Oligomarcare (RADNom Priming.Acţiunea exonucleazică în ambele sensuri ale ADN – polimerazei I. 151 . II.

pe o grupare chimica activate in prezenţa luminii (iluminare foarte scurta).de asemenea. Spre diferenţa de primele doua metode (1 şi 2). lanţul cu coada de timina reprezinta secvenţa ţinta. unei molecule dublu lanţ ADN . va rezulta deci un ADN lanţ unic cu un capat 3’-OH liber (şi respectiv un ADN cu un capat format dintrun lanţ 3’-OH care atârna în afara). Marcarea cu fotobiotină. în aceasta a treia metoda marcare se face numai la capetele moleculei ADN-proba rezultata . Enzima nu are nevoie de nici o matriţa.4. secvenţa proba.Clonarea se poate realiza prin încorporarea (printr-o tehnică de recombinare ADN) a unui fragment de ADN străin într-un vector care ulterior este introdus şi multiplicat într-o celula gazdă. cu biotina): dezoxiribouridinbiotinat (Bio-dUTP). Marcarea cu acridin oraj. a unei cozi cu adenina marcata cu biotin ape lanţul ADN proba (adenine se va fixa prin complementaritate pe coada de timina). catalizează fixarea nucleotidului pe capatul 3’-OH liber al moleculei ADN unic (sau dublu lanţ). Această enzimă. în cazul de faţă. o coada cu nucleotide nemarcate. Pot fi marcate capetele 3’ si 5’ ale moleculei ADN şi ARN.. În biologia moleculară. 12. de acidul nucleic. În aceasta metoda se foloseşte doar un singur nucleotide ADN marcat (de exemplu. ƒ 2. această coada cu timina poate fi evidenţiată indirect prin fixarea. ƒ 1. Marcarea terminală 3’ a ADN:se face cu ajutorul enzimei transferaza terminala*. Se formeaza o legatura stabile între biotina şi acidul nucleic (lanţ unic sau dublu). Cu ajutorul enzimei transferaza terminala se poate. această enzimă se foloseşte şi în experienţe de clonare pentru obţinerea capetelor franjurate ale fragmentelor ADN 279 .Exista mai multe metode de marcare terminală. prin care sunt marcate moleculele de ADN probe (sonde genetice). b) Metode chimice Reprezinta o marcare directa a acidului nucleic. În cazul acestei hibridizari. ================================================================== *Dezoximetil-nucleotid-terminal-transferaza. Acest Bio-dUTP este legat prin acţiunea transferezei terminale de capetele 3’-OH ale unei molecule ADN dublu lanţ. clonarea semnifică obţinerea unei culture de celule dintr-o celulă unică. deci pe fiecare din cele două lanturi. iar cel cu coada de adenine. care provin dintr-o singură celula bacteriană.Acest tip de marcare se efectueaza atat pe ADN unic lanţ cît şi dublu lanţ. sensibilitatea moleculei de ADN rezultata prin această metoda este mult mai mică. Lungimea acestei cozi este dependenta de concentraţia cationilor de Co++si de concentraţia nucleotidelor. Un asemenea tip de marcare este bazat pe legarea biotinei printr-un braţ de legare chimică.Dupa denaturarea şi hibridicarea unei asemenea “probe marcate”. astfel încat sa se obţină populaţie uniforma din punct de vedere genetic.de aceea. CLONAREA ADN – ului Clona bacteriana reprezinta un grup de celule bacteriene identice din punct de vedere genetic.III. în cursul hibridizarii.care conţin toata timina. ataşa. Prin cuplarea între acridinester şi acidul nucleic se produce o legatură de chemoluminiscenta care eliberează lumina. la capetele 3’-OH formînd o coada cu acelaşi nucleotide pe ambele lanturi ale dublului lanţ ADN (dar la capetele opuse). Marcare terminala a lanturilor ADN (Endlabelling).

coli. Aceasta testare se face cu scopul de a controla daca celula bacteriana a incorporate respectivul plasmid recombinant. cu ajutorul fosfatzei alcaline. din care fiecare va reprezenta o clonă. b) pentru a permeabiliza membrane celulei bacteriene la respectivul plasmid vector. bacteriile transformate (cele care au primit vector+ADN) se testeaza pe un mediu de cultura cu ampicilina. 1. se folosesc celule bacteriene de E. Se lucreaza pe celule de Esch. purtatorde gena pentru ampicilina (rezistenţa la ampicilina). 3. c) având in vedere faptul ca celulele bacteriene poseda sisteme care protejează celula de pătrunderea unui ADN străin. În soluţia nutritive în care se găsesc celulele bacteriene. ƒ introducerea fragmentului ADN într-un vector. eliminADN markerul respective(de obicei se elimina gena tetra şi ramane cea pentru ampicilina in momentul taierii lanţului ADN de atre enzimele de restricţie. Fosfataza alcalina se obţine din celule de Esch. ƒ selectarea celulelor bacteriene care conţin vectorul recombinant. trebuie îndepartate grupările fosfat de la extremitaţile 5’ ale moleculei deschise de ADN a vectorului. se produce şi multiplicarea vectorilor recombinanti incorporate. Din aceste bacterii cu vectori recombinant.În acest fel. vectorul nu se va mai circulariza.Introducerea vectorului recombinant in celula gazda (competenta) Acest fenomen reprezinta procesul de trasformare.Testarea celulor bacteriene supuse procesului de transformare. În scopul eficienţei de clonare: a) pentru a împiedica circularizarea vectorului ADN străin. În majoritatea experimentelor de clonare. vor supravieţui numai acele celule bacteriene care au caştigat rezistenţa la ampicilina.Se folosesc enzime de restricţie de tip sticky* şi un plasmid care poarta doua gene (markeri de rezistenţa la doua antibiotice: ampicilina şi tetraciclina).Extragerea unui fragment ADN. se vor lipi şi va rezulta lanţul ADN recombinant (fragmentul ADN a devenit inclus in vector). prin replica 280 . 2. Etapele principale ale metodei de clonare Sunt urmatoarele: ƒ extragerea unui fragment ADN. prin acceptarea plasmidului recombinant. însămînţate pe mediu de cultura cu ampicilina vor creşte colonii bacteriene. Ţinând cont de faptul că atît plasmidul cît şi fragmentele ADN au locuri (situs-uri) de tăiere complementare. celula bacteriana trebuie tratata cu soluţie CaCl2 pentru a devenit compententa. prin taierea ADN genomic. din zonele sticky. se folosesc pentru clonari celule bacteriene mutante (celule cu system de apărare mult diminuat). pe plasmidul iniţial care poarta rezistenţa la antibiotice (tetra şi ampicilina) se incorporeaza fragmentul ADN străin pe locul unuia din cei doi markeri. ƒ introducerea vectorului recombinant (plasmid care a înglobat fragmentu ADN străin) în celula gazdă.coli. În acest sens. Clonarea ADN se recomADNă atunci cADN este necesară izolarea şi multiplicarea unui segment de ADN (dintr-un genom). cu ajutorul enzimelor de restricţie. 4. De obicei.A.coli sau celule de intestine de oaie. atunci cînd vectorul deschis şi segmnetul ADN străin vor veni in contact. Selectarea celulelor bacteriene purtătoare de vector recombinant. Selectarea acestor celule purtătoare de plasmid cu ADN străin încorporate şi diferenţierea lor de celule (clone) fără ADN străin se face prin însămînţare. sincron cu multiplicarea celulelor bacteriene.

care rezultă din clonarea de fragmente ADNc se sintetizează artificial în laborator. vectorii recombinaţi(vector+ lanţ unic ADNc) vor determina ulterior formarea de clone bacteriene ADNc.cercetarea secvenţelor reglatoare. necunoscute. acestea vor fi folosite drept secvenţe ADN cu rol complementar (cu secvenţe ADN cunoscute).cercetarea structurii exonilor şi intronilor. Produsul acţiunii acestei enzime va fi o molecula mixta (hibrid): ARNm-ADNc. Clonele din biblioteca genomica ADN se folosesc pentru: . şi anume prin hidibridizare colonială. Biblioteca genomica ADN (secvenţe de exoni+introni) Dacă genomul unui organism este secţionat cu enzime de restricţie.Din aceasta biblioteca se obţin secvenţe ADN necesare pentru tehnica de hibridizare. in vederea identificarii unor fragmente ADN noi. care duce la formarea unei biblioteci genomice ADN prin tăierea genomului (cu ajutorul enzimelor de restricţie) potrivit principiului întamplării şi prin unirea fragmentelor rezultate. a caror secvenţe nucleotidice trebuie cercetare şi identificate. Tip sticky=enzime care taie cele două lanţuri ale helixului dna în mod franjurat datorită faptului ca şi-au pastrat gena purtatoare de aceasta rezistenţă (este vorba de plasmidul “gol” fără ADN străin ataşat). aceluiaşi tip de ADN genomic îi corespund alte gene active (exoni).cercetarea structurii complete a genelor. în timp ce clonele care au pierdut gena de rezistenţa la tetra (în momentul legării plasmidului de ADN STRĂIN). în vectori. Biblioteca ADNc (ADN copie dupa matriţa de ARNm matur) Reprezintă doar o informaţie pură formată numai din secvenţe de exoni. Abia din acest moment se poate studia mai departe clona care conţine fragmentul ADN dorit. Astăzi.În fiecare tip de celule. . drept copie complementară (în prezenţa enzimei reverstranscriptaza).Spre diferenţa de biblioteca genomica ADN. care induc translaţia informaţiei pentru sinteza unor substanţe oncogene. în terapia bolilor tumorale se intrevede posibilitatea identificarii şi distrugerii tintite a anumitor molecule ARNm. se va obţine un numar de clone corespunzADN diferitelor amestecuri (vector plasmidic+segment ADN). C. Secvenţa clonelor ADNc este studiată în special prin experimentele de hibridizare. printr-o tehnică de hibridizare speciala. B. prin formarea unui plasmid recombinant. Clonele din biblioteca ADNc se folosesc în special în scopul analizei directe a secvenţelor de baze care codifica un anumit aminoacid sau produsul proteuc final (codificat de respectivul fragment ADNc). 281 . aceluiaşi organism. pe o molecula de ARNm matur. clonele ADNc sunt diferite pentru diferitele tipuri de celule ale aceluiaşi organism. prin doua posibilităţi: în prezenta ADN-polimerazei (Klenow= ADN-polimeraza I extrasa din celula de Esch.plating. Din acest hibrid. astfel încat. În timp ce clonele de ADN genomic sunt identice pentru toate celulele aceluiaşi organism. deoarece toate celulele aceluiaşi organism posedă o înzestrare genetică identical. lanţul dublu ADNc se va forma din acest lanţ unic ADNc. pe acest mediu vor supravieţui doar clonele care nu conţin nici un fragment de ADN străin (celule rezistente la tetraciclina). cît şi exoni. Totalitatea acestor clone rezultate din genomul unui organism iniţial reprezintă biblioteca genomica ADN. biblioteca ADNc rezultata variaza de la un tip celular la altul. a coloniilor bacteriene pe un mediu cu tetraciclina. reprezinta tehnica “împuşcarii” (shotgun). corespunzătoare genomului celulei respective de origine.coli). . nu cresc pe acest mediu. Clona ADN genomica a unuia şi aceluiaşi organism este totdeauna identical şi independenţa de tipul celular. Acest mod de clonare. ceea ce înseamnă ca în fiecare tip de celule poate apare un alt tip de ARNm matur. Clonele genomice ADN vor conţine atat secvenţe de introni. iar diferite fragmente de ADN sunt clonate (în celule bacteriene).

unde aceste modificări urmeaza a se exprima. Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) A fost numită de Lederberg. Spectrul de aplicabilitate al PCR este foarte larg: de la medicina judiciara. diagnosticarea bolilor genetice pînă la “vanarea” şi identificarea de noi virusuri şi studii de ecologie şi arheologie (studiul ADN-ului) din fosile. PCR este folosită pentru cercetarea unor cantităţi foarte mici de ADN dintr-un produs biologic. reacţia permite chiar şi multiplicarea unei singure secvenţe de ADN. b. cu ajutorul unor tehnici de inginerie genetică (procese artificiale de recombinare ADN). Principiul reacţiei. reacţia poate pune în evidenta chiar şi prezenţa unei singure molecule de ADN. A.Această reacţie dă posibilitatea ca dintr-o mixture de ADN să poata fi “pescuită” o singura moleculara de ADN. În condiţii de laborator în vitro. Astăzi exista masini automate (Thermai Cycler) pentru realizarea unor asemenea reacţii repetate. “instrumental pentru democratizarea biologiei moleculară”.Urmeaza desfaşurarea PCR cu doi primeri diferiţi utilizaţi simultan. pentru a se obţine o hibridizare primer 282 . ƒ denaturarea ADN-ului genomic (izolat din celule) dublu lanţ sau ADNc (sintetizat cu ajutorul unei molecule de ARNm) la temperature înalta (95 grade C). 5. in probele de cercetat (produs biologic). primul primer este nucleotide-timina. Etapele reacţiei. În aceste condiţii fixarea primerului pe ADN-ul unic lanţ reprezintă un proces de hibridizare ce are loc la temperature scăzuta (36-65 grade C). al doilea primer este nucleotide-citozina.Acest ADN conţine secvenţe care urmeaza a fi multiplicate (amplificate). ADN-polimeraza necesită prezenta pe matriţa a unui oligonucleotid primer cu capatul 3’-OH liber. Avantajele acestei reacţii sunt urmatoarele: fiind foarte sensibilă. Lanţ unic de ADNc. ƒ dupa scăderea temperaturii se adaugă primerul în exces. cît şi introducerea acestor segmente astfel modificate de ADN în celule sau organisme. sintetizat în prealabil prin trascriere inverse a ARNm. în 1993. Efectuarea reacţiei PCR poate porni de la punctul a sau b. şi aceasta sa fie ulterior amplificata enzimatic. B.Cu ajutorul experientelor de clonare s-a reuşit citirea de secvenţe de ADN de pe lanţul ADN al genomului unui organism. deoarece reacţia ofera posibilitate multiplicarii (clonarii) ADN-ULUI chiar şi in afara celulei vii. a. Se foloseşte drept matriţa un ADN monocatenar. Dintre cei doi primeri. La capatul 3’ al lanţului ADNc se ataşeaza o coada de nucleotide-guanina cu ajutorul enzimei trasferaza terminala. o multiplicare suficienta de secvenţe de ADN este reprezentata de minimum 25 de cicluri de multiplicare. la acest capăt urmeaza a se fixa nucleptidele ADN care vor forma noul lanţ. Pentru a porni sinteza noului lanţ ADN pe un lanţ ADN matriţa. ADN genomic dublu lanţ (de cercetat) izolat din celule şi tăiat în fragmente cu ajutorul enzimelor de restricţie corespunzătoare. într-o masina automata se desfaşoara 30 de cicluri într-un interval de 4 ore. Primerul delimiteaza capatul iniţial al fiecarei din cele doua secvenţe ADN unic lanţ (rezultate din denaturarea ADN-ului dublu lanţ) de multiplicat.Pasul urmator îl reprezintă obţinerea unor modificariale acestor segvente ADN. cu mijloace tehnice relative simple. câte unul corespunzator pentru fiecare lanţ ADN (rezultat din ADN-ul dublu lanţ denaturant). Adaosul de primer se face în exces. 12. pe acest lanţ unic de ADN se poate sintetiza un lanţ complementar cu ajutorul ADN-polimerazei şi în prezenta unui oligonucleotid (15-20 nucleotide) primer (armorsa).

Utilizarea Taq-polimeraza a făcut posibilă automatizarea totala a acestei produceri în maşinile Thermal Cyclers. Diagnosticul bolilor ereditare. în lumina U.V. izolată de la o bacterie termifila Thermus acquaticus. în prezenta celor 4 tipuri de nucleotide ADN (adenine/timin/guanine/citidin deoxi-nucleozid trifosfat) pornind de la locul de fixare a primerului. Dacă se urmareşte o amplificare ADN mai mare decât cea corespunzatoare la 40 de cicluri PCR. fenilcetonuria). cu ajutorul ADN-ului amplificat. de fiecare dată. C. mai departe. prin aceasta metoda se poate face 283 .În acest fel lanţul de ADN este dublat şi. Dacă pentru PCR denaturarea ADN-ului se face la 95 grade C. iar apoi benzile sunt făcute vizibile. obţinut şi diluat de 1000-10000 de ori. . trebuie începuta o noua serie de cicluri. noul adios de Taqpolimeraza declanşeaza de fiecare dată ciclu următor de sinteza ADN. anemia Cooley. La fiecare nou ciclu al PCR se adaugă Taq-polimeraza proaspătă. În acest fel. se recomandă. se poate efectua reacţia în care toţi reactivii se pun de la început în recipient I până la sfarşitul reacţiei nu mai trebuie adaugate noi cantităţi. cu ajutorul a doua serii câte 40 de cicluri PCR. ADN-ul extrage din celule proaspat lizate şi din celule fixate şi inglobate în parafina. . prin tratarea prealabilă a gelului cu etidiumbromid. ADN-polimeraza se leagă de capatul 3’ al primerului şi sintetizează noul lanţ în direcţia 5’->3’. În condiţii normale. D. Amplicabilitatea practica a PCR-ului. Pentru o multiplicare sufienta de secvenţe ADN sunt necesare 2530 de cicluri de reacţii automatizate.Primerul va fi încorporate în noul lanţ de ADN format. Aceasta ADN-polimeraza a fost numită Taq-polimeraza. Produsele ADN obţinute prin PCR sunt separate electroforetic în funcţie de dimensiuni. Apoi se realizeaza hibridizarea ADN-ului cu sonde genetice specifice prin metoda Souther Blotting. în aproximativ 4 ore.reacţia PCR sa fie însoţită. de controale negative. coli). dupa cum am mai arătat. se poate face şi prenatal.Optimum de activitate al acestei enzime este la 75-80 grade C. această activitate scade cu 50% la 60 grade C şi cu 90% la 37 grade C. această enzima a fost apoi înlocuită cu o ADN-polimeraza ternostabilă. Taq-polimeraza este stabila până la 95 grade C.lanţ unic de ADN şi nu o hibridizarea între lanţurile unice de ADN rezultate din denaturare. distrofia musculara Duchenne. graţie PCR-ului. obţinându-se o amplificare ADN de ordinal 10 la puterea 6-10 la puterea 7. PCR are un spectru de aplicabilitate foarte larg. În anii 1980. care se efectuează. În acest scop. ƒ cu fiecare nou ciclu ( de denaturare/sinteză a ADN-ului) va fi dublata cantitatea de ADN rezultata din ciclul anterior. prin determinarea ADN-ului din celulele trofoblastice. fiind termolabila. Pentru sesizarea eventualelor erori sau neajunsuri ale reacţiei PCR. în făt. se folosea ADN-polimeraza Klenow (fragment de ADN-polimeraza I de la e. a) În diagnosticul medical. sub forma de benzi. un ciclu de PCR este terminat. ƒ reacţia de sinteza a noului lanţ ADN cu ajutorul ADN-polimerazei. cu ajutorul Taq-polimerazei se pot efectua consecutive 40 de cicluri PCR.repetarea de mai multe ori a respectivei reacţii pentru aceeaşi probă. ADN-ul astfel extras este supus reacţiei polimerazei în lanţ şi apoi analizat cu ajutorul sondelor genetice prin reacţia de hibridizare. În acest fel. Polimeraza utilizată în PCR. ƒ începe un nou ciclu cu denaturarea de aceasta dată a ADN-ului dublu lanţ nou sintetizat (în treapta anterior anterioara). PCR este utilizat în: diagnosticul bolilor ereditare (fibroza chistica. acest nou ciclu si acest ADN nou-sintetizat (prin sinteza mijlocita de ADN-polimeraza). în gelul de electroforeza. folosind drept matriţa segmentul ADN lanţ unic de amplificat. se poate obţine o amplificare de 109 a cantitaţii de ADN. o data cu acesta.

imposibil de identificat prin posibilitaţile clasice cunoscute.PCR poate da un rezultat precoce pozitiv chiar şi în prezenţa unei singure celule infectate cu HIV ( din materialul de cercetat ). de exemplu în boala Whipple. PCR mai este utilizat în diagnosticul urmatoarelor boli infecţioase: hepatita virala. Clostridium difficile. Introducerea diagnosticului rapid al infecţiei HIV prin PCR este astazi absolut necesara în practică. reuşind sa se demonstreze ca această tulpina ar reprezenta rezultatul unor modificări genetice suferite de tulpina Vibrio cholerae grup 01 biotip eltor. în Bengal). pierderi în greutate. pentru un diagnostic prin PCR. nu este necesara o proba de ţesut cerebral. d. infecţia cu virus herpes simplex. Boala Whipple a fost semnalată pentru întâia oara în anul 1907. ci este suficienta doar o proba de LCR. atunci când toate celelalte reacţii serologice sunt înca negative. probe uscate de sânge. Noile metode îşi au rădăcinile în filogenetica moleculara. apariţia în ganglionii mezenterici de infiltrate macrofagice proeminente. spalatura bucala (cu celule epiteliale). În urma recoltarii de lichid amniotic este supus determinarii cu ajutorul PCRului sau al anticorpilor monoclonali. probabil microbiană fără a fi însa posibilă evidenţierea vizuală. Diagnosticul infecţiei HIV cu ajutorul PCR-ului se poate face în stadiile prococe ale infecţiei. recoltarea de probe reprezinta un stres minim pentru bolnav. prin deletia. Pneumocistis carinii. PCR este utilizat şi în identificarea unor germeni microbieni ramaşi până astăzi necultivabili.virus papollima. depozite de grasime. c. dureri abdominale. au fost analizate microorganisme care până astăzi nu au putut fi cultivate pe medii de cultură. pentru detectarea şi identificarea agenţilor patogeni. Neisseria meningitides. În arheologie PCR a fost utilizată până în prezent şi pentru analiza ADN provenit din mumii egiptene vechi de mai bine de 2400 de ani. Astăzi PCR poate fi folosită în combinaţie cu metoda fingerprinting în aceleaşi scopuri. În medicina judiciară PRR este folosit pentru evidenţierea identităţii unui fir de părsau a unei cantităţi foarte mici de sânge sau spermă. concomitant cu inserţia unui segment nou de 35 kb. Boala whipple se manifesta clinic prin astralgii migratorii. Pentru diagnosticarea infecţiei HIV într-o encefalita declanşată de acest virus. în acest caz se folosesc drept probe. Recent. diaree. febra.. în special în investigarea donatorilor de sânge şi de organe. a unui segment de 22 kb. în acest fel fiind posibila determinarea de defecte genetice cromozomiale. b. diagnosticul bolilor infecţioase. S-au postulat apoi şi alte boli de etiologie posibil microbiana fara a fi însa posibilă evidenţierea prezenţei unor microorganisme. În general. Mycobacterium tbc. epitelii de fir de par. pe glob. de pe ADN-ul cromozomial.determinarea prenatal pentru sexul copilului şi se poate pune şi diagnosticul unei eventuale boli genetice. prin identificarea prezentei acidului nucleic viral în sânge (şi anume acidul nucleic viral fixat în genomul celulei limfocitare umane). cât şi microorganisme de sol care au suferit în timp modificări genetice. în aceste cazuri fiind necesare alte metode decât cultivarea pe medii de cultura. în 1992-1993. metabolice (enzimopatii). virus Epstein-Barr. În studii ecologice Cu ajutorul PCR s-a reuşit evidenţierea unui număr de microorganisme în probe de pământ şi apă. 284 . cu ajutorul reacţiei PCR au fost efectuate studii genetice asupra tulpinei de Vibro cholerae grup 0139 (izolata pentru întaia oara. este primul exemplu din partologia umană în care s-a emis ipoteza prezenţei posibile a unei bacterii necultivabile.

pe lanţul unic AN se fixează un primer (moleculă starter sau amorsă). Metoda chimică. În prezent este în curs de desfăşurare proiectul de cercetare asupra genomului uman. La Los Angeles şi la Heidelberg există în prezent bănci de date în care au fost strânse toate secvenţele ADN cunoscute până în prezent. urmat la scurt timp de cel de Mycoplasma genitalium. a. Etapele reacţiei: lantul dublu de acid nucleic (AN) aste adus la forma de AN unic lanţ. la această analiză s-a lucrat trei ani în 35 de laboratoare din lume. Aceste fragmente obţinute pot fi apoi separate electroforetic şi analizate. cel de Haemophilus influenzae. Metoda enzimatică Tehnica Sanger Principiu: se determină secvenţele de baze nucleotidice pe copia de acid nucleic şi prin complementaritate se deduce secvenţa de baze de pe lanţul de acid nucleic de origine. Primerul este stfel selectat încât capătul 3' să se 285 . tehnica Sanger (Chain Termination Tehnique). Acest studiu a fost posibil datorită folosirii enzimelor de restricţie (endonucleaze). tehnica Maxam. dovedindu-se că conţine 315 357 perechi de nucleotide şi 200 de gene.ului Analiza structurii ADN a început o dată cu anii '70. Metode Pentru secvenţiere se folosesc două metode: a. b. În 1995 a fost terminată secvenţierea completă a primului genom bacterian. Secvenţierea ADN este o variantă a tehnicii de recombinare ADN cu ajutorul căreia se poate stabili secvenţa de baze din molecula ADN. .12. Astăzi se ştie că doar 3 % din genomul uman reprezintă gene funcţionale (exoni). a fost secvenţiat pentru prima dată un cromozom. cu ajutorul enzimelor de restricţie. analiza secvenţială a ADN-ului şi. Acest lucru se poate realiza prin clonarea ADN sau prin metoda PCR. cât şi asupra bolilor produse prin mutaţii. şi anume cromozomul III.Gilbert ( de obicei combinată cu metoda Sanger). genom care conţine circa trei miliarde de perechi de bze (50 000 – 100 000 de gene). Metoda enzimatică. Acest primer ste un oligonucleotid scurt. indirect. Methanobacterium thermoautotrophicum. înrudirii dintre proteine. Condiţia de baza pentru realizarea acestei secvenţieri este prezenţa unui număr suficient de copii ale moleculei de ADN.identificarea unuio număr de gene. Cu ajutorul acestei proceduri s-au obţinut informaţii şi asupra materialului genetic inclus în cele 23 de perechi de cromozomi umani. Prin descifrarea acestor secvenţe de baze se poate ajunge la delimitarea genelor şi la stabilirea secvenţelor de aminoacizi codificate de o singură genă. 6. SECVENŢIEREA ADN. şi anume: . care pot tăia moleculele de ADN în fragmente de cîteva sute până la câteva mii de perechi de baze. preparat semiautomat prin tăiere. a unui fragment ARN. Principiu Secvenţierea ADN (sequencing) înseamnă tăierea lanţului ADN în secvenţe şi analiza ulterioară a secvenţelor de baze nucleotidice din aceste fragmente. cea a proteinelor corespunzătoare pot furniza date cu privire la conformaţia proteinei. .cauzele unor boli genetice.locul relativ al genelor pe cromozomi. funcţiei proteice. Ca urmare. Bacillus subtilis. restul de 97 % din genom reprezintă doar „balast genetic” a cărui semnificaţie este încă necunoscută. La drojdii (drojdia de bere – Saccharomyces cerevisiae). cu ajutorul metodei de secvenţiere ADN şi de analiză a secvenţelor nucleotidice din aceste structuri. A. B. Genomul multor virusuri a fost total secvenţiat. Curând vor fi terminate şi secvenţierile complete ale genomurilor bacteriene Escherichia coli.

Tehica se bazează pe o modificare chimicăaunei baze şi o tăiere specifică la nivelul altei baze (de exemplu adenina). Aceste tipare de fragmente de ADN individual sunt reprezentate de o amprentă RFLP specifcă ( polimorfismul de lungime al fragmentelor de restricţie). necodificatoare de proteine. pe toată lungimea genomului.ADN-ul extras este supus acţiunii enzimelor de restricţie. fiecare bază este colorată cu altă substanţă fluorescentă. sânge. dintre care: ƒ 70 % reprezintă secvenţe unice identice la toţi indivizii. . ƒ 30 % reprezintă secvenţe repetitive. are loc sinteza lanţului ADN complementar (după modelul matriţei AN) în prezenţa celor patru dezoxinucleotid trifosfaţi (dNTP: dATP.urilor minisatelizate). .zona spacer ce conţine gene criptice (silenţioase). şi anume: . salivă. în locul marcării radioactive. netranscriptibilr. aceeaşi secvenţă de 300 perechi de nucleotide se repetă de 30 000 – 1 milion de ori dispersat.gene structurale pentru sinteza de ARNt. Această reacţie de sinteză a ADN-ului se va desfăşura în patru variante. FINGERPRINTING GENOMIC (amprente de ADN) a. Acest primer este înglobat într-un vector sau secvenţă cunoscută. . Genomul uman conţine trei miliarde de perechi de nucleotide.7. b. s-au realizat aparate automate pentru citirea secvenţelor de baze nucleotidice din acizii nucleici cu viteza de 7 000 – 8 000 secvenţe de baze pe zi. dGTP.înalt repetitive 7 – 10 %. lanţul de acid nucleic nou sintetizat cu un nucleotid marcat este separat prin gel elecroforeză. . în fiecare din variante fiind marcat altul din cele patru dNTP-uri. În acest punct se va opri reacţia polimerazei. Apoi se face citirea bazelor colorate de pe gelul de electroforeză prin autoradiografie. Metoda chimică Tehnica Maxam-Gilbert Spre deosebire de tehnica Sanger. de pe molecula ADN. Aceste reacţii au loc pe lanţul ADN originar. rădăcini ale firului de păr. s-a demonstrat că fiecare individ este caracterizat printr-un fingerprinting genomic (un pattern individual al regiunilor hipervariabile din ADN-ul genomic. ARNr şi histone. 12. pe lanţul ADN de cercetat. Tehnica RFLP cuprinde următoarele etape: .ADN-uri satelite înalt repetitive. în laboratoarele de Genetică ale Universităţii Berkeley.A. dintre care unul este marcat. Pentru determinarea acestor tipare individuale. dCTP). dTTP. În ultimii ani. b. fiecare secvenţă cu câteva sute până la 6 000 de perechi de nucleotide se repetă în 20 – 30 000 de copii. se izolează ADN-ul genomic din celulele unui organism (diferite ţesuturi. cele patru molecule de ADN dublu lanţ obţinute sunt denaturatze prin căldură. a unui didezoxinucleotid trifosfat (ddNTP) şi a ADN-polimerazei I sau reverstranscriptazei.Tehnica RFLP Cu ajutorul acestei tehnici se pun în evidenţă zonele de ADN variabil de la individ la individ. 286 . concentraţie 5 %). spermă).potrivească prin complementaritate.U. sinteza lanţului ADN se va opri acolo unde în locul unui dNTP se va îngloba un ddNTP corespunzător. şi anume de pe zona ADN. prin tehnica Maxam-Gilbert determinarea secvenţelor se face pe lanţul de acid nucleic de origine. unde determinarea secvenţelor se face pe lanţul copie. într-un punct.Fragmentele de ADN (dublu catenar) sunt supuse migrării bidimensionale într-un gel denaturat (conţinând un agent chimic denaturat ca ureea. în S. Principiu Pe baza analizelor de secvenţiere a ADN-ului. ƒ 20 – 30 % moderat repetitive.

. . heterozigoţii). Tehnica este considerată astăzi metoda universală pentru determinarea prezenţei/absenţei unei anumite amprente de ADN în orice sursă de origine bacteriană. se recurge la PCR pentru amplificarea cantităţii de ADN. În biologie . se va putea.- Benzile de ADN unic lanţ obţinute în gel sunt supuse colorării cu etidiumbromid.în boli genetice.stabilirea de relaţii genetice între diferite specii pe baza structurii ADN-ului.urile minisatelite se moştenesc după legile mendeliene. în mod deosebit. . d. în vederea încadrării taxonomice a unor noi agenţi infecţioşi. urmărirea criminalului poate fi condusă în funcţie de urmele găsite: amprente individuale prezente în resturi de piele. cât şi polimorfismul de lungime al respectivelor fragmente.v. acest criteriu fiind superior celui al sistematizării de până în prezent. având în vedere că variaţiile de ADN.pe baza existenţei RFLP-urilor au fost amplificate şi analizate secvenţe nucleotidice din fragmente ADN provenite de la specii dispărute. se preferă metoda Southern Blotting a cărei capacitate discriminatorie este considerată mai bună.se va putea analiza instabilitatea genomului şi a relaţiei acestuia cu senescenţa şi neoplazia. Benzile ADN sunt vizualizate prin transiluminare la u. se potriveşte în mare parte la rude şi este identică la gemenii univitelini). În arheologie .diagnosticul paternităţii. .Tehnica AFLP Această tehnică ce combină principiul analizei RFLP cu cel al reacţiei PCR înalt specifică. dar nu face şi analiza polimorfismului de lungime a fragmentelor. are semnificaţie. efectuat pe bază simplelor caractere morfologice. . a informaţiei genetice parentale (prin compararea fringerprint.Aplicaţii ale metodei amprentelor ADN În medicina judiciară: . . pentru diagnosticul midificărilor genetice din celulele tumorale de la persoane cu carcinom mamar (se prepară şi se compară amprente de ADN din celulele tumorale/elemente figurate sanguine cu condiţia ca în proba de sânge să nu existe celule modificate oncogen. animală sau umană. Determinarea RFLP pentru organismele eucariote. c. păr.stabilirea interrelaţilor virale şi bacteriene pe bază de amprente ADN.urilor între generaţii). . vegetală.stabilirea polimorfismului genetic în interiorul aceleiaşi specii (de exemplu. măsura frecvenţa mutaţiilor în genomul uman.în criminalistică. În medicina clinică . sânge.în oncologie. în cazul urmăririi transmiterii la descendenţi.stabilirea paternităţii unor păsări de pradă ale căror ouă au fost clocite de părinţi adoptivi. detectează numai prezenţa sau absenţa fragmentelor de restricţie. .urmărirea epidimiologică a circulaţiei agenţilor infecţioşi pentru determinarea patternurilor RFLP la virusuri şi tulpini bacteriene. inclusiv omul. Dacă materialul genetic se află în cantitate foarte mică. În cazul examinării singulare ( a informaţiei genetice per individ). se vor putea realiza analize de linkage şi cartare de noi gene implicate în boli genetice.prin introducerea tehnicii de fracţionare a segmentelor de restricţie şi separării acestora în gel cu gradient denaturat. 287 . în analiza de likage şi determinarea instabilităţii genetice. metoda amprentelor ADN este utilă pentru dovedirea unei înrudiri (amprenta genetică diferă de la individ la individ. spermă. în viitor. Această tehnică evidenţiază atât prezenţa/asenţa fragmentelor de restricţie.s-a analizat ADN-ul provenit de la mumii egiptene vechi de mai bine de 2400 de ani (prin clonare şi secvenţierea unor fragmente ADN de circa 3400 de baze).

. electrochimici. cât şi pentru diferite ramuri ale economiei. enumerăm: . De curând. a fost propusă o terminologie care să se refere la traductori pentru toate sistemele de înregistrare şi prelucrare a informaţiei ca utilizări şi în biologie. precum şi alte ştiinţe antecesoare acestora. atât pentru cercetare. amperometrici. biofizica şi biocibernetica. în combinaţie cu microelectronica. auz. Astfel. Domeniile de studiu primar pentru a cunoaşte sau a fabrica aceşti biosenzori sunt biochimia. pipăit etc. pentru analiza componentelor mediilor de cultură. aminoacizi etc. O dată cu progresele remarcabile din domeniul analiticii instrumentale. De asemenea.senzori piezoelectrici. fenoli. inclusiv microtehnologiile speciale din domeniul micromecanicii şi microelectronicii. lactat. implementate doar în cadrul laboratoarelor. s-a ajuns la obţinerea unei înalte selectivităţi în microanalitică. Biosenzorii – sisteme de coantificare a informaţiilor viului Problema biosenzorilor este un capitol al biotehnicilor de cea mai mare importanţă –mai ales în ultimii ani—dar şi extrem de complicată şi vastă. această metodă este de neînlocuit în stabilirea diagnosticului bolnavilor.măsurarea de ureii din rinichiul artificial. de exemplu supravegherea producţiei în industia chimică şi alimentară. Determinarea selectivă şi cu sensibilitate mare a unui număr crescut de combinaţii are o deosebită importanţă.utilizarea biosenzorilor pentru laboratoare clinice şi chimice.şi multi strat): metabolici. . printre altele. galactoză. 288 . datorită costurilor ridicate. senzori biologici – pentru sistemele naturale ale fiinţelor vii (organe de simţ: văz.monotorizarea permanentă a pacienţilor cu senzori implantaţi.. mono. .) iar termenul de biosenzori să fie atribuit generic oricărui sistem simplu sau mixt (natural sau construit de om) care să înregistreze la nivel micro informaţia circulantă într-un sistem viu. potenţiometrici.inregistrarea glucozei în sânge. precum şi de evidenta dezvoltare a domeniului biosenzorilor şi a aplicaţiilor acestora în biotehnologii. dezvoltarea măsurătorilor de investigaţie selective şi uşor de manevrat reprezintă o problemă cheie a analiticii. cromatografia fluxului de lichid (fluidităţii) la presiuni ridicate.analiza produselor alimentare.senzori enzimatici amperometrici (monoenzimatici şi dienzimatici.senzori care au la bază reacţii de tip imunitar: cu dispozitiv membranar. cercetătorii şi tehnicienii cu preocupări în acest domeniu au propus chiar o diferenţiere semantică a acestor sisteme de cuantificare a informaţiilor ce pot fi obţinute în diferitele funcţiuni ale lumii viului. ne-am propus enumerarea principalelor tipuri de biosenzori moderni şi tradiţionali: . Cu toate acestea. cu pierdere de reacţii. gluconat. de exemplu cromatografia gazoasă. . Dintre aplicaţiile biosenzorilor. imunosenzori optici.Capitolul 13 BIOSENZORII 13. coresterol. amine.1. pentru glucoză. piruvat. . . acizi nucleici. . . Aceste metode sunt. Ţinând seama de complexitatea acestei problematici. în biotehnologie este necesară. măsuri spectrometrice şi spectroscopia absorbţiei atomice. În domeniul medical.senzori cu receptori.controlul proceselor în industria microbiologică şi în protecţia mediului. alcooli.

Dezvoltarea automaticii a solicitat intens crearea unor noi sisteme de culegere rapidă a informaţiei. senzorii îmbrăcau forma instrumentaţiei utilizată în laboratoare pentru cercetări experimentale. includă date ştiinţifice de activitate relatate de specialişti care au lucrat nemijlocit la această problemă. Cercetările de bionică au adus noi clarificări privind simularea şi extrapolarea senzorilor naturali (din organele de simţ) cu posibilităţi de utilizare nu numai în biomedicină dar şi în dirijarea unor procese industriale. 289 .Impactul psihologic între necesitatea şi obligaţia de a consuma mereu mai multă informaţie şi nevoia de adaptare a omului la lumea informaţională. pe măsură ce timpul se desfăşoară iar numărul populaţiilor biologice creşte. apare interesul omului pentru abţinerea unor captatori cît mai fideli ai informaţiei primite de la diferite sisteme vii sau nevii. Aceste preocupări. Dacă cu mulţi ani în urmă. Ştiinţa şi industria computerelor a făcut un mare pas înainte când pe lângă hard-ware şi soft-ware a adăugat brain-ware. sistemelor vii cît şi a celor considerate neînsufleţite. nevoia de a avea senzori sensibili şi fiabili pentru orice demers în domeniul cunoaşterii. cu precădere în ultimii 7-8 ani. sistemul imunologic prelucrează şi utilizează informaţia.Într-o primă parte dorim să facem o analiză a unor probleme şi în acelaşi timp un studiu paralel care să. poate genera.Raportul dintre cantitatea totală de informaţie existentă şi utilizată este constant? . recepţionată de om drept componentă a tetradei care descrie o formă de echilibru substanţă-energie-informaţie-timp. peste anumite limite. Dezvoltarea roboticii a crescut şi mai pregnant importanţa senzorilor. o patologie specifică? . în vederea dotării roboţilor cu asemenea capacităţi de orientare şi de lucru.2. Se creează fireşte. . decât acum 1 milion de ani? . departe de a rezolva toate problemele. spre exemplificare. Senzorii optici bazaţi pe microcamere TV au fost suplimentaţi cu sisteme de recunoaştere a formelor şi imaginilor albnegru şi color precum şi cu analizori termici. creează noi probleme? Lista acestor întrebări poate continua iar răspunsurile sunt departe de a fi complete.Tot atît de firesc. Iată succint. Sunt suport al informaţiei sau sunt catalizatori ai informaţiei cognoscibile? . pe experienţa didactică şi de cercetare dar şi pe o bogată bibliografie adunată în timp.Emiterea sau culegerea informaţiei este uniformă sau periodică? Acţiunea sa asupra receptorilor este ritmică sau continuă? . sistemul neuro-endocrin crează şi manipulează informaţia. în domeniul cunoaşterii biologice şi medicale curiozitatea şi motivaţiile sunt din ce în ce mai puternice.Natura este mai bogată astăzi în informaţie liberă. se eliberează în proporţie geometrică informaţia care caracterizează dinamica atât a.Semnalele conţin informaţie. 13. Ne bazăm. au creat o serie de noi întrebări atât la nivelul utilizatorilor cât mai ales a specialiştilor. în realizarea calitativă a analizei şi sintezei propuse. circulantă.Informaţia este delimitată strict şi poate creşte prin adiţionare sau este holografică? . ceea ce i-a făcut pe mulţi să afirme că secolul următor va fi secolul biologiei. Impactul informaţional al biosenzorilor Ştim din ce în ce mai exact felul în care sistemul genetic stochează şi distribuie informaţia. Dacă în domeniul tehnologiilor se pare că eforturile pot fi suficient determinate. necesitatea recepţionării cât mai complete şi mai exacte a acestei forme de existenţă a universului. O altă serie de aparate au fost concepute pentru prevenirea incendiilor sau decelarea fenomenelor de poluare sau de toxicitate în mediul înconjurător. într-un cuvânt. în prezent aria preocupărilor în vederea obţinerii unor date dinamice în studiul proceselor a conturat în profunzime imaginea despre utilitatea şi importanţa senzorilor.Creşterea utilizării informaţiei şi necesitatea cuprinderii sale de către sistemul nervos uman. câteva din acestea.

Metodologia de cercetare a proprietăţilor senzorilor biologici Sensibilitatea oricărui sistem de măsură este condiţionată în mare măsură de calitatea traductoarelor utilizate. integrarea psiho-neuro-endocrino-imunologică complică procesul de înţelegere al mecanismului şi modului de acţiune selectiv a senzorilor biologici. Traductoarele clasice (cele inductive. pe scara biologică. intensitatea semnalelor şi informaţiilor culese fiind în funcţie de capacitatea receptorilor de a vehicula pe canalele specifice fluxul informaţional.) au intrat în competiţie cu o nouă clasă de traductoare. Fără îndoială că natura a creat o multitudine de biosenzori care rezolvă pe plan biologic aceste probleme. a electricităţii „chimice" a enzimelor de restricţie şi recombinare. este mult mai densă. apărând noi componente având ca suport materia vie. Mintea umană încearcă un efort de autodepăşire în înţelegerea unor variante noi matematico-logice de utilizare de noi limbaje. a cunoaşterii algoritmului de modificare a raporturilor de electroliţi şi a pompelor ionice. În acest context. La om. cantitatea de informaţie deşi aparent scade. biosenzorii .3. dar diferenţiat. în timp a acestor fluxuri informaţionale constituie un impediment destul de serios al cunoaşterii reale. S-a născut un nou domeniu.bioizi din ce în ce mai perfecţionaţi. fiind de fapt modele ale aplicaţiilor curent utilizate de cercetările biofizice. Tehnologia din momentul de faţă nu este însă suficientă pentru a ne oferi rezolvări concrete şi acest fapt face să considerăm că elaborarea şi cunoaşterea biosenzorilor se află încă în domeniul pionieratului. culegerea şi prelucrarea informaţiei se face etapizat pe mai multe nivele structural-energetice.). În momentul de faţă. Dacă ne referim la achiziţiile dobândite în cadrul dezvoltării ontogenetice şi filogenetice. vizuali. traductoarele biologice. Variaţia rapidă. cuantificarea energeticoinformaţională este mai greu de realizat pentru cercetători. a principalelor căi şi modele reale în care selecţia informaţională acţionează. Condiţionarea genetică joacă un rol determinant în acest caz. a biocomunicării şi modificarea câmpurilor ce acţionează în sfera biologicului. utilizând probabilităţi neinvestigate încă. senzorii construiţi de om se supun legilor naturale descrise de chimiafizică. 13. Cu puţin timp în urmă au apărut primele biocipuri. al modului de acţiune al microbiocurenţilor. sunt întreprinse cercetări aprofundate privind reglarea schimburilor la nivelul membranelor celulare. capacitive. rezistive etc. Utilizarea unui organism viu sau a unei 290 . Fiabilitatea lor este relativ mare dar aproape în totalitate determinată de tehnologiile utilizate. auditivi etc. În ceea ce priveşte senzorii naturali biologici (tactili. calitatea informaţiei prelucrate este dependentă de structura anatomo-fiziologică. cercetarea ştiinţifică actuală încearcă să elucideze separat sau integrat modul de acţiune al circulaţiei pe canale informaţionale a vectorilor semnalelor stimulatori sau inhibitori la nivelul diferitelor verigi biocibernetice. Ca în orice domeniu. Cu toate acestea. În aceste situaţii aparatura de măsurare întâmpină greutăţi din ce în ce mai mari începând cu selecţia semnalului din zgomotul de fond şi înlăturarea bruiajelor şi până la obţinerea unor valori individualizate care pot fi interpretabile sau pot constitui valori de referinţă. Modelul biologic pătrunde impetuos în tehnică. a efectelor de fineţe din interacţiunea macrocosmos şi microcosmos. de sensibilitatea şi modelele fixate repetitiv pe sistemele de memorare ale organismelor vii.Această triadă deschide de pe acum posibilităţi nebănuite puterii de calcul şi stocare în informatică. în timp util. gradul de diferenţiere a prelucrării şi utilizării semnalelor din mediul intern şi extern este diferit în funcţie de complexitatea organismului studiat. în efortul de a depăşi experimentalul posibil şi în speranţa de a deschide noi ferestre în domeniul cunoaşterii. Acum ele se perfecţionează rapid. Pe măsură ce coborâm la nivele de organizare mai profunde.

153). Preluarea unor semnale electrice de la părţi ale unui organism viu. dar a căpătat o dezvoltare explozivă doar în ultimii ani. Tendinţa de abordare globală a interacţiunilor unui biosenzor cu mediul înconjurător. în vederea reducerii perturbaţiilor în funcţionarea porţiunii prelevate.4. prin cercetările efectuate de exemplu. de exemplu.porţiuni din acesta (ţesut. Chiar dacă se asigură toate condiţiile de mai sus partea prelevată nu va beneficia de interacţiunea sa cu întregul sistem. în scopul obţinerii unor informaţii asupra mediului înconjurător nu este o idee nouă. asigurarea condiţiilor de viaţă pe durata cât mai lungă a porţiunii prelevate. motiv pentru care răspunsul obţinut poate fi diferit sau deformat. Majoritatea studiilor efectuate asupra utilizării senzorilor biologici în măsurătorile fizice. permite abordarea mai simplă a metodelor de interpretare. ridică o serie de probleme. şi deci. Mergând mai spre concret. cum ar fi tehnica de prelevare fără traume esenţiale. vizează îmbunătăţirea performanţelor aparatelor de măsură. Dacă se ţine seama de necesitatea imobilizării pe durata măsurătorilor a organismului viu. Caracteristica măsurată scoate în evidenţă două aspecte deosebite: asimetria (valorile curentului în cele două sensuri nu sunt egale pentru o aceeaşi tensiune aplicată). Bose. Tehnologia actuală permite izolarea unor enzime şi implementarea lor în sisteme de măsurare oferind acestora sensibilitate şi selectivitate ridicată. . În momentul de faţă numeroase măsurători din domeniul chimiei beneficiază de aceasta categorie de traductoare. de fizicianul C. Ea a apărut pe la începutul secolului. Deşi rezultatele obţinute au depăşit faza de laborator.pe suprafaţa organismului viu a unor electrozi şi conectarea acestora la un sistem electronic de măsurare. la un preţ de cost scăzut. se cunoaşte că răspunsul electric al unei fibre nervoase este diferit la măsurătorile în vitro faţă de cele „in vivo”. Ea trebuie judecată prin prisma caracteristicii puternic neliniare a interfeţei organism-mediu. se loveşte de cele mai multe ori de o inconsecvenţă în metodologia experimentală în care metodele clasice nu sunt organic integrate cu cele noi apărute. se poate aprecia că planta poate răspunde cel mai bine acestei cerinţe (imobilizare naturală).în sensul deschiderilor şi intra-deschiderilor pe care o manifestă. în sensul creşterii-sensibilităţii şi selectivităţii faţă de mărimile măsurate. 291 . prezenţa unor zone de rezistenţă negativă (fig. Substratul biologic utilizat este de cele mai multe ori o parte specializată dintr-un sistem viu. răspuns la stimul uşor de recunoscut. celulă.problema revenind în a se determina zona sau punctele de măsură şi metodologia de interpretare a rezultatelor în funcţie de tipul şi de natura interacţiunii urmărite a se măsura. Aparatura de măsurare Cunoaşterea influenţei aparaturii de măsura asupra senzorului biologic este esenţială în sensul reproductibilităţii măsurătorilor efectuate. majoritatea măsurătorilor implicând aplicarea. deşi beneficiază de avantajul selectivităţii specifice unui organ specializat. fapt ce determină o reducere a interacţiunilor pe care partea o are în cadrul întregului. De exemplu. extinderea pe scară largă a acestor senzori este încă limitată. tehnica de implementare a electrozilor şi natura materialului din care se execută aceştia. Din acest motiv se consideră o variantă posibilă de utilizare ca senzor biologic a unui organism întreg. atât de considerente de ordin tehnologic. enzimă). 13. cât şi de dificultăţile pe care aceşti senzori le pun în faţa cercetătorilor privind stabilitatea şi reproductibilitatea semnalelor preluate. când tehnica de calcul şi progresele tehnologice au permis-o. se constată. că membranele biologice (i) prezintă o caracteristică neliniară a curbelor tensiune-curent.

măsurându-se astfel concentraţia de substrat. Enzima reacţionează selectiv cu substratul său. mai ales la construirea biosenzorilor electrochimici. Dacă practic mărimile fizice pot fi măsurate cu succes. În biofermentoare folosirea biosenzorilor este dificilă din motivul c ă nu pot fi sterilizaţi termic ş i chimic. catalizând reacţii c u cedare de electroni.5. De asemenea sa constatat existenţa pe suprafaţa frunzelor a unor puncte de rezistenţă electrică scăzute. . În cazul metodelor fizice imobilizarea este reversibilă. . Imobilizarea este ireversibilă.Fig. în schimb parametrii chimici intercelulari sunt mai dificil de măsurat. Spre deosebire de acestea ele sunt grupate în zone pe suprafaţa frunzei. asemănătoare prin modul de identificare cu punctele de acupunctură. sunt cunoscute circa 50 de oxidaze. Sunt folosite membranele semipermeabile. din circa 2000 de enzime. stabilitatea electrozilor enzimatici 292 .senzori microbieni. Stabilitatea enzimei este foarte importantă pentru realizarea măsurătorilor. Prin metode chimice se realizează legătura covalentă între e n z i m a şi substrsatul solid. De asemenea.senzori ca organite celulare. Senzorii enzimatici conţin o enzim ă determinată.imunosenzori (ca antigeni şi anticorpi).senzori enzimatici. neidentificându-se o lege de amplasare. Posibilităţi de folosire a biosenzorilor în biotehnologie Procesele biotehnologice sunt folosite tot mai des în practică pentru a obţine produse utile. Imobilizarea de enzime şi celule pe purtător s e face cu metode fizice şi chimice. Biosenzorul poate fi definit ca dispozitiv (de regulă electronic) ce foloseşte molecule de interes biologic pentru a detecta molecule specifice. 153 Curba caracteristică tensiune – curent Cercetările efectuate asupra utilizării plantelor ca senzori biologici au scos în evidenţă o dinamică a acestor curbe. În prezent. 13. Poate consta dintr-un biocatalizator imobilizat şi dintr-un aparat fizico-chimic care transformă informaţia chimică într-un semnal electric. . Pot fi realizate noi industrii de înaltă eficienţă. folosite în tandem cu electrodul Clark pentru măsurători amperometrice de concentraţii pentru diferite substanţe. în special în sensul variaţiei zonei de rezistenţă negativă. Din aceste motive. nu sunt direct folosibili î n aceasta arie tehnologică. nici cu radiaţii şi n i c i printr-un alt procedeu. dar pentru aceasta este necesară o reglare sigură a sistemelor folosind modele matematice adecvate şi o informaţie cât mai completă asupra lor. biodetectorii (biosenzorii) trebuie s ă rezolve această problemă. care este imobilizată după o tehnică convenabilă şi un senzor fizico-chimic corespunzător. O primă clasificare a unor biosenzori: . numai 30 sunt de interes comercial. Î n j u r de 500 sunt oxidoreducătoare.

senzori cu determinarea amperometrică sau potenţiometrică a metaboliţilor (substraturi electroactive). .nu este suficientă pentru măsurători de lungă durată.Schema unui biosenzor electrochimic cu electrod de glucoză 1 – catod. Fig. 154 . O clasificare a biosenzorilor după metoda folosită în prelucrarea informaţiei prelevate de aparate fizico-chimice ar putea fi următoarea: . 154). Sistemul de reacţii se poate schematiza astfel: (1) H202→2H+ +O2 + 2ē (2) 2AgCl + 2ē→2Ag + 2Cl(3) 4Ag + 4Cl. Curenţii de semnal obţinut de la traductor sunt proporţionali cu concentraţia de glucoză din probă. . Glucoza difuzează prin membrane (5) cu grosimea de 5 µm şi cu p o r i de 0.+ 02 + 2H20→4AgCl + 40H(4) β+ D-glucoza + 0 2 glucozooxidaza glucono-&-lactoză +H202 Substrat +enzimă ↔ produs+ enzimă oxidată Enzima oxidată + intermediar ↔ enzime + intermediar oxidat + profoni Reacţia la electrod este : Intermediar oxidat ↔intermediar + electroni Ex.biosenzori bazaţi pe metode electrochimice. H202 difuzează la anod şi acolo are l o c reacţia (1).biosenzori electromagnetici. proporţional cu viteza de difuzie a glucozei.senzori cu determinarea amperometrică a activităţii respiratorii. 4 – membrană cu enzimă imobilizată. Inhibitorii din substratul de fermentaţie induc erori mari de măsurare. Când glucoza ajunge în stratul de mijloc se formează H202. 3 – membrană de acetat de celuloză. Senzorii microbieni constau din microorganisme imobilizate într-un suport poros. . 5 – membrană de policarbonat.03 µm care blochează enzime ş i coloizi care ar deranja zone de reacţie. (OH3C5H4)2Fe.biosenzori cu procese de combustie. (HOOC C5H4)FeC5H5. aceste microorganisme conţin enzime de interes. A treia pelicula este o membrană de acetat de celuloză c a r e lasă s ă treacă uşor H202 dar reţine reductori. . Senzorii microbieni construiţi pe un principiu electrochimic pot fi împărţiţi astfel: . 293 .biosenzori optici.biosenzori electronici. de intermediari : (C9H5)2Fe. . Se determină selectiv o substanţă care apare în reacţia biochimică. Dăm ca exemplu electrodul de glucoză (fig. Biosenzorii electrochimici au la bază un electrod chimic selectiv. 2 – anod.

1 – electrod de pO2. în tubul de curgere cu enzima imobilizată sau microorganisme are loc reacţia biochimică. au încă o aplicabilitate redusă (ex. 3 – membrană calogenică cu bacterie. 3 – termistori. 155 . 5 – enzimă imobilizată. zaharoză.1-1 ml). Trecând prin schimbătorul de căldură aceasta se încălzeşte până la o temperatură dată. Se măsoară consumul de oxigen care este direct legat de concentraţia de glucoză. Ca exemplu. glucoză. Se obţine o diferenţă de temperatură t2 – t1 între temperatura iniţială constantă t1 ─ t2.Biosenzorii microbieni. Ca rezultat are loc o cedare de c ă ldură proporţională cu concentraţia de substanţă. 156). etanol. Corpul este prezentat de un calorimetru adiabatic în flux. Biosenzorii cu produs secundar de combustie se bazează pe măsurarea unei substanţe eliberate într-un proces biochimic enzimatic.Schema unui electrod de glucoză microbian. Când într-o astfel de soluţie se adaugă şi proba (0. În figura 155 este prezentată schema unui electrod de glucoză microbian bazat pe determinarea amperometrică a activităţii respiratorii a celulelor imobilizate de Pseudomonas fluorescens. Pentru acest tip de senzori a fost elaborată o metodă în impulsuri. poate fi dat termistorul enzimatic şi microbial (fig. S-au construit termistori enzimatici pentru măsurători de concentraţii în cazul acidului ascorbic. 294 . Prin el trece o soluţie tampon. Metoda se foloseşte pentru măsurători continue. Biosenzorii electronici utilizează tehnici de imobilizare enzimatică şi microelectronică şi este o direcţie de perspectivă în ce priveşte crearea unor dispozitive de biosenzori miniaturali. Timpul de răspuns este destul de lung (circa 10 min). 4 – tub de curgere. dar din cauza complexităţii. 156 . penicilina. foarte sensibile şi multifuncţionale. intră în metabolismul bacteriei.5-4 ml/min. 2 – schimbători de căldură. glutamat. Substanţa eliberată este proporţională cu cantitatea de reagent. 2 – membrană de teflon. uree. L-aminoacizi). Glucoza şi O2. timpul de măsurare scăzând la circa 30 s. spectrometrie de masă cu enzime pentru glucoză. ca urmare a procesului din tub. Precizia măsurării este bună. folosesc un electrod Clark pentru p02 p r i n c a r e se determină amperometric activitatea respiratorie a microorganismului folosit. nefiind supărătoare interferenţele cu alte glucide sau aminoacizi. adusă cu o pompă peristaltică cu 0.Termistor enzimatic 1 – termostat. Fig. trigliceride. lactoză. Biosenzorii electromagnetici au o înaltă sensibilitate şi siguranţă analitică. Fig. Aceşti tranzistori absorb ioni din soluţie prin învelişul ionoselectiv modificând curentul prin tranzistor. Tranzistorii cu efect de câmp fac obiectul unor intense activităţi de investigare.

microorganismele au acţiuni selective. Senzorii de acest tip au aplicaţii în medicină. de a fi legaţi la aparatura de măsură. Cu enzimă imibilizată pe stratul izolator de pe poarta tranzistorului cu efect de cîmp s-a realizat un biosenzor pentru măsurarea ureii.Biosenzorii optici s-au dezvoltat sub forma senzorilor ce au la baz ă reacţii imunitare. . precum şi dependenţa curentului prin sursă în funcţie de pH. Se foloseşte semnalul optic ce apare în timpul reacţiei antigen─ anticorp. bună sensibilitate. În privinţa perspectivelor folosirii biosenzorilor în controlul şi reglarea proceselor de fermentaţie. aceticolinei. 158 . sensibilitate şi selectivitatea. Avantajele se bazează pe: . Pot fi folosiţi la reglarea proceselor de fermentaţie. 4 – tranzistor cu efect de câmp.Ag Cl (pastă). . Probleme importante pune structura capacitivă: membrana izolator . faptul că încă nu s-a atins sensibilitatea determinarilor radioimunologice.apar erori din cauza inhibitorilor catalizatorilor. Dezavantajele biosenzorilor pot fi rezumate astfel: . Vor fi realizaţi în număr mare în viitor.poartă. .biocatalizatorii sunt greu de pregătit. 3 – electrodul Ag . . independent de. În figura 157 se arată schematic senzorul enzimatic electronic cu structura de tranzitor cu efect de cîmp iar în figura 158 este reprezentată schema pe măsură cu un astfel de senzor. nici chimic. potenţial redox şi glucoză. 295 . Se combină cu măsurătorile de pH. glucozei etc. Fig.după datele fvrnizate de literatura de specialitate aceşti senzori se folosesc mai cu seama în laborator. au dimensiuni mici şi uşurinţa. 2 – probă. Spectroscopia convenţională nu este aplicabilă în acest caz. O2.cea mai mare problema este cea legată de sterilizare. nu au implicaţii asupra purit ăţ ii optice a probei măsurate. . 157 .Senzor electronic cu enzimă cu structură de tranzistor cu efect de câmp Fig.nu sunt sterilizabili nici termic. . până în 1975 au apărut 120 de patente de biosenzori (50% electrochimici).există problemele de preţ privind aparatura. aparatura nu este foarte complicată. pot masura concentraţii foarte mici de substrat organic.enzimele imobilizate.au stabilitate scăzută (mai cu seamă pentru cei enzimatici). semnalul de ieşire este electric. 5 – înregistrator.Schema de măsură cu senzorul electronic de măsură şi dependenţa curentului de pH-ul soluţiei. Avantajele biosenzorilor electronici sunt că pot fi combinaţi senzori pentru mai mulţi componenţii. 1 – apă cu temperatura constantă. sunt uşor de indus. C02.

Bucureşti. Seria Horticultură.N.V. Bucureşti. seria V. 1987 – Boli dermatovenerice. 1994 . 6. 4.Ş...Biologie Celulara. BECUS. 1990 – Utilizarea fotosintezei ca sursă alternativă de energie. 2007 . AMBARUŞ SILVICA. 2003 . Bucureşti. ANDREICUT S. 1454-7376. Junimea. Medicală. Vol.V.Lucr. Tehnica Chisinau. BOGDAN C.U.M. Bucureşti.. New York. Springer-Verlang.Histologie vegetala. 10. Ed.S. p. 407 – 413. and col. BERCEANU ST. 1454 – 7376. SILVICA AMBĂRUŞ.. Ştiinţifică şi Enciclopedică. BARABAS N. Flammarion Médecine-Sciences. 1999 . Ştiinţifică şi Pedagogică. 11.. ATANASIU L. Philadelphia.seria Horticultura. 1990 – Tratat de virusologie medicală.S. 29 – 31 Mai 2008 Lucrări ştiinţifice. Tehnică. GHICA M. Emil Borcea. ALBERTS B. 17. Române.Ion Ionescu de la Brad. Ed.Esential Histology and Citology. BENGA G. LI. MARIA PRISECARU.. diversitate..V.I. Bucureşti. CRISTEA TINA OANA. p.S. Ed. 1981 – Biologia şi patologia imunităţii.S. BRAY D. D.Ş.. D. ED. FALTICEANU MARCELA. CORMARK H. MARCELA FALTICEANU. 19.. 150 p.S..A. Bacau.A. ed. Medicală. 20.anulXLVIII vol. CRISTEA TINA OANA. Paris. (48)... Ed. 2001 – Clonarea animalelor şi consecinţele clonării. Ed. and col. Cluj-Napoca.forma alba. 15.M.. 1989 – Molecular biology of the cell. 2004 . 201-206. CRISTEA TINA OANA.Studies concerning the utilisation of “in vitro” micropropagation in the conservation process of some valuable genotypes of pepper . PRISECARU M. I.St. 7. General Publishing Inc. 1985 . 5... PĂUNESCU E. 18."Biologia celulară şi moleculară". Editura “Ion Ionescu de la Brad”.. Ed. Ed..N... CACHIŢĂ-COSMA D.. 21. SILVICA AMBĂRUŞ. CAJAL N... I.Effect of „in vitro” plant growth regulators over the meristematic and mitotic activity at different genotypes of CAPSICUM ANUUM L. 1993 – Progress in botany. 2. 1983 – Progrese în genetica moleculară. 2008 . vol. Iaşi. 1985 . U. 439-444.Biologie moléculaire de la cellule. armonie″. Ed. I.Variatia randamentului de micropropagare “in vitro”determinate de influenta genotipului la varza alba pentru capatana-Brassica oleracea L. CÎRLAN V.Iasi. 9. .Manual de Lucrari Practice de Biologie Celulara. 2008 Cytogenetic Effects Induced by „In Vitro” Cultivation of Shoot Tips at Capsicum Anuum L. Biotehnologii moderne. Ed.O. Universitatea de Ştiinţe Agronomice şi Medicină Veterinară. Dacia. Ed. 16. Lucrări ştiinţifice.. Editura “Ion Ionescu de la Brad ”. 12. ISSN 1222-5312. 14. 1999. 296 . CHIRICUŢĂ.. Bucureşti.A. Anul L. COTRUTZ C.M. 8. Lucrări ştiinţifice UŞAMV Bucureşti.N. I (50) Seria Horticultură. ALBERTS B. Ed.Capsicum anuum L. 50-55. p. Medicală. Heidelberg. MARIA PRISECARU.. 2005. ANTOHI S... vol. Ed.. HOPKIN K.I. PRISECARU MARIA. 3. Bucureşti.. 13.191-196.BIBLIOGRAFIE 1. Iaşi. Tg Mures. Iaşi.S. M. Bucureşti. MARIA PRISECARU. p. 1984 – Cancerologie generală. BUCUR GH. stiinta.. CRISTEA T.M. 1454 – 7376.N. Indrumator de Lucrari Practice si demonstratii. 1987 – Metode in vitro la plantele de cultură. BEHNKE H. Acad. Litografia IMF. U. Simpozionul ştiinţific international ″Horticultura.. Ceres..Elemente de geriatrie practică. 1988 . GAVRILĂ L. Facultatea de Horticultură Iaşi.

297 . GAVRILĂ L. 43. 23.. 45.Biologie: cellulaire & moléculaire. 2004 . 49. MIXICH F..56 – 67. New York. Bucureşti. 51... 1981 . Ed. 31. FRASINEL N. 47. M.. 1991 – Trends in Cell Biology. Humanitas. pag. ARDELEAN A. and col. POPESCU L. Timisoara. JERMAN SONIA. 1994 – Bazele celulare ale creşterii. M. KARP G. 24.Biologie Celulara si Moleculara. 2008. Ed. II... 29.Principii fundamentale de biologie moleculara. şi Ped. 33. DICULESCU I. şi Enciclop. IONESCU-VARO M.. GHEORGHE BENGA. Craiova.. 37. Ed. 36. Ed.. VERDES D. New York. MAILLET M.. Univ. Ed. Aius Craiova.. Ştiinţifică şi Enciclopedică. 2005 .prezent şi perspective" Ed."Biologie celulară". 1989 – Citogenetică moleculară şi evoluţionistă. MATSUDAIRA P. Studii şi Cercet. Masson.. p. Bucureşti.F. 35. 15. KREIS T. Did. Sc. 2005 .Am.22. Paris. BENGA GH. II. 46. Bacău.. M. De Boeck Université.Biologie cellulaire. 2005 – Biotehnologiile azi. 39. şi Enciclop. LODISH H.. Ed. 32.. GHERMAN I. DARNELL J. 1992 – Cell-cycle checkpoints and feedback controls. Vicovia. partea a III-a Biofizică celulară. A. Bucureşti.Biologie Moleculaire et medicine. MURRAY A: W. îmbătrânirii.. ZIPURSKY S. Şt. Ed. 1999 .. şi Ped. Cluj-Napoca. 257.. 1990 – Molecular cell biology. 1981 – Descifrând tainele eredităţii. Paris. 1990 . 1980 – Biochimie. DABALĂ I.. PRISECARU. 44. Nature.. ROGOZ I. London &.Utilizarea biotehnologiilor vegetale în ameliorarea plantelor. KLEMPERER W. 359. BENGA G. De Boeck Université. 1992 – Intermolecular interactions. vol. DUMITRU I. Cerma... Bucureşti. 1987 – Histologie medicală. DUDAN R. R. 599-603. 50. 887-888.. Science.. 1. Did. ONICESCU DOINA. 1985 – Introduction to Clinical Imunology. Freeman & Co.. 1984 – Concepţia biostructurală şi teoriile moleculare ale materiei vii.. H. tome I.. Bucureşti. KAPLAN J. 1988 – Ateroscleroza cerebrală din sistemul carotidian. ISBN: 978-973-1902-09-8. Dacia. Ed.. LODISH H. 1993 – Biofizică medicală.. 42. Ed.. DICULESCU I. Observations on the embryonic development of Triturus/Lissotriton vulgaris L. Mirton. GENEVES L.. Med. Butterworths Update Publications. Bucureşti. 2002 .... CRISTEA TINA OANA. 28.. MACOVSCHI E.. 26. Ed. DELIU C. AGRIPINA LUNGEANU. Medicalã Universitarã. Did."Biologie celulară". CRUCE M. C. Universitatea Ecologică. GAVRILĂ L. Şt. GHIORGHIŢĂ G.. 34. DIMITRIU G. 38.. Ed.Biologie moléculaire de la cellule. Bucureşti.. POPESCU L. BALTIMORE D.Molecular Cell Biology. 27. 40. PAIS V.. Ed. 4ed. DĂNĂILĂ L. 41. 93. Bucureşti. DARNELL J.. şi Ped. 2002 . Bucureşti.Books... ISRAIL A. Iaşi. Bucureşti. degenerescenţei şi morţii celulare. DIMOFTACHE C. I. M. PETRESCU NICUŢĂ D. Flammarion. VIKI ALLAN. 1972 – Biologie cellulaire. 2002 . Bucureşti.seria Biologie animală. 15-19. 1994 . Paris. 2008 ...Introducere în Biologie Celularã şi Molecularã.. VOICU.. Ed. Ştiinţ. 2000 ... Paris. BERK A. 1982 – Informaţia biologică.Biologie Celulara si Moleculara. 25. IOSOB."Biologie moleculară . Dunod. Ed. Ed.. 48. Medicală. Ed.. ONICESCU D. diferenţierii. Paris. în: Curs de Biologie celulară. Ştiinţifică şi Enciclopedică. 30. 1983 . Junimea.. NEACŞU C... Cluj-Napoca. HAENEY M. W.

A.Bul. 1994 . p. MIHU G. 73. 74. 347. PRISECARU MARIA.vol.-The stimulation of the gynogenetic development to Bete vulgaris L. şi Enciclop. PRISECARU MARIA. POLLARD Th..Vol.81-84.. Bucureşti. PRISECARU M. Bucureşti. Şt.223.Veget. „Alma Mater”. Ed. Ed.-Obtaining the haploid plants to Lycopersicn esculentum L. VOICU ROXANA. 69.T.Agron.Biologie cellulaire. PRISECARU M. Paris.. Ed.) obtinut prin culturile embrionilor imaturi “in vitro”. 60. PRISECARU M.GHIORGHITA G. seria V.Nat.. BARAN T. RAICA MARIUS. 192p. ISB 70.CRISTEA O.-Studies concerning the behaviour of some tomato (Lycopersicon esculentum Mill. PRISECARU MARIA.-The preservation of some valuable genotypes of Brassica –white cabbage-by “in vitro” microclonation...I.Genetics and evolutions.. Horticultura.Sudii si Cercet. POPA L.Seria Biol. GHIORGHITA G..T. 2002 . REPANOVICI R. UK.222. RUSU V.2000. 56. 1991 – Biomembrane şi patologie.Ecotoxicologie – Curs universitar..Bucuresti.. SASSON A.p. 57.S. NICUTA D. PĂIŞ V.. 79-89.MIHU G.T..1996.GHIORGHITA G."Biologie şi patologie celulară şi moleculară".-Production of haploid plants by in vitro anther and ovule culture of Brassica.Cerc. Timisoara. Paris. 1987. 68.Cel.19-23.. Romfel. Elsevier SAS. PRISECARU FLORIAN.Electronic Light Microscopy.D. E..Corson. St.10.. Cambridge.. 1975 – Science..T.GHICA M.. PRISECARU M.-Studiu comparative privind iducerea plantelor haploide la Brassica oleracea L. Did..CRISTEA O..195-197.Nat. 1994.68-74 61.p. Şi Ped. 63. Bucureşti.GHIORGHITA G.de St. 2005. REPANOVICI R.. 59. SLAYTER E. 225 p. Bacau.. 298 .. Române.Biol.Iasi.S. PRISECARU M. Ed.Cell Biology. p. 189. 1992 – Acizii nucleici. 1980 – Genetica şi eredopatologie..N. Bucureşti.si Med.U. 65.St..de Biol.Cel. Did..Iasi. Bacău. Ed. Editura Tehnica Bucuresti.169-178.. 1993 – Biotehnologii şi dezvoltare... POPESCU-VIFOR S. Tehnică.St. 1992 .St.. 62.anuala.V. 2001.Vet. Ed.)genotypes to “in vitro”anther and ovule culture. Bacau.p. POPA L.2001. A XIV a Ses.through “in vitro” androgenesis and gynogenesis.by the pollination of the embryo sac with irradiated pollen. 2008 .)..CRISTEA O.utilizand culturile de antere si ovare “in vitro”.-Influenta tipului de explant asupra capacitatiide regenerare din embrioni somatici la Triticum aestivum L.CRISTEA O.Bul. D.Studii si Cer. Citologie.CRISTEA O. PRISECARU M.23-27. Acad. Lucrari St.de Bio.p. 66. 1982 – Tehnologia ADN recombinant (Inginerie genetică).si Cerc... 53.2. p.. 68. EARNSHAW W. PRISECARU M.. anul XLIV.de Biol.2000. şi col.52.Soc.1996.2002. PALADE G. RĂDUCANU DUMITRA. Medicală.. CRISTEA O.”Simpozionul aniversar “50 de ani de la infiintarea Fac.T.Univ. Ed. 64. p. 58..A XIV-a Ses. 71.M. Bucureşti.Oradea. PRISECARU M. GHIORGHITA G. 76. 72. G.p.. 2002 – Haploidia experimentala in contextul biotehnologiilor moderne. E. .1995.. RAICU P. 75.2001.Soc. PRISECARU M.vol IV. Ed. Citologie Clinica. şi Ped. BRĂNIŞTEANU D. DICKINSON A...Bacau.. 67.XIV. POLLARD T...Tipografia Univ.. PRUCE M. 1995 .anuala.V.MIHU G.-Studiul histologic in calusul de grau (Triticum aestivun L.... I.S.1454. M...Biol. 54. Bucureşti.Univ. Bucureşti. Ed. MIHU G..15-18. vol. 55. 2004 .Cito-histo-embriologie vegetala. De Horticultura Iasi.Organogeneza indirecta la sfecla de zahar (Beta vulgaris L. Biol.Journal of General Virology. 1991 – Genetica. Elsevier SAS.Oradea.

Human Molecular Genetics. READ A. VOICULEŢ N. STRACHAN T. BIOS Scientific Publishers Ltd.1...P.."Biologia moleculară a celulei". Ed. 79.. Bucureşti. 1997 .. Oxford. HUNT T. All. PUIU L. WILSON J. Paris. MARIA. Flammarion Médecine-Sciences. 299 . 78.77. TOLEDANO A. 1999 . 80. 2004 . Current topics in Science an medicine vol. UK.Biologie moléculaire de la cellule: livre d'exercices. Merck.. LOPEZ g.. 2ed. 1987 – The cell membrane: esential element in the chemistry of life.