MARIA PRISECARU

TINA OANA CRISTEA

ROXANA VOICU

BIOLOGIE CELULAR I MOLECULAR

Curs universitar

Editura ALMA MATER Bacu 2011

Refereni tiinifici: Prof.univ.dr. BARABA NECULAI Prof.univ.dr. BATTES KLAUS WERNER

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei PRISECARU, MARIA Biologie celular i molecular / Prisecaru Maria, Cristea Oana Tina, Voicu Roxana. Bacu : Alma Mater, 2011 Bibliogr. ISBN 978-606-527-116-6 I. Cristea, Oana Tina II. Voicu, Roxana Elena 576.3 577.2

Tipar executat la:

UNIVERSITATEA VASILE ALECSANDRI DIN BACU Calea Mreti, Nr. 157, 600115 Tel. ++40-234-542411, tel./ fax ++40-234-516345 e-mai: www.ub.ro; stiinte@ub.ro

ISBN 978-606-527-116-6

Prezenta lucrare se adreseaz n primul rnd studenilor i cercetrilor din diferite domenii ale tiinelor biologice, oferind cunotinele de baz n domeniul biologiei celulare i moleculare, fcndu-se ns frecvente referiri la cele mai recente descoperiri i interpretri, cunoscut fiind faptul c Biologia este o tiin dinamic, care se bazeaz n principal pe teorii susinute de rezultate experimentale obinute din cercetare i experimentare.

CUPRINS

Introducere 1. Consideraii generale privind domeniul de studiu al biologiei celulare i moleculare 1.1. Definiie i caracteristici 1.2. Scurt istoric 1.3. Contribuii romneti n studiul celulei 1.4. Principalele teorii care au condus la modul actual de gndire despre natura materiei vii 1.4.1. Teoria celular 1.4.2. Teoria cromozomial a ereditii 1.4.3. Teoria molecular a materiei vii 1.4.4. Teoria biostructural a materiei vii 1.4.5. Teoria evoluionist, originea vieii i a omului 2. Membranele celulare 2.1. Definiia i clasificarea membranelor celulare 2.2. Organizarea membranelor celulare 2.2.1. Caracterizarea componentelor lipidice ale membranelor celulare 2.2.2. Componenta proteic a membranelor celulare 2.2.3. Mobilitatea lipidelor i proteinelor de membran 2.2.4. Componenta glucidic membranar 2.2.5. Glicocalixul. 2.2.6. Apa. 2.2.7. Asimetria distribuiei componentelor membranare 2.3. Mecanismele de transport prin membranele celulare 2.3.1. Procesul calitativ al traversrii membranelor 2.3.2. Transportul ionilor i moleculelor mici prin membranele celulare 2.3.2.1. Transportul pasiv 2.3.2.2. Transportul activ 2.3.3. Transportul macromoleculelor i particulelor prin membrana plasmatic 2.4. Receptorii din membran 2.4.1. Tipuri de receptori 2.4.2. Modaliti de comunicare intercelular. 2.4.2.1. Comunicarea intercelular la distan 2.4.2.2. Contactul intracelular direct 2.4.3. Receptorii celulelor nervoase. 2.4.4. Receptorii care controleaz permeabilitatea ionic 2.4.5. Cuplajul celular metabolic i electric 2.5. Schimburile energetice n celula vie 2.5.1. Noiuni generale de termodinamic 2.5.2. Transformri de energie n celula vie (energetica celular) 2.5.2.1. Molecula ATP i proprietile sale 2.5.2.2. Ali compui fosforilai 2.6. Membrane care cupleaz energie

11 12 13 14 15 17 17 18 22 22 24 26 26 27 28 30 30 31 31 32 32 33 33 34 34 36 41 44 45 46 46 46 46 48 50 51 51 53 54 56 56

2.6.1. Cloroplastele 2.6.1.1. Procesul general al fotosintezei 2.6.1.2. Reaciile de lumin 2.6.1.3. Reaciile de ntuneric 2.6.2. Mitocondriile 2.6.2.1. Degradarea glucozei de ctre mitocondrii 2.6.2.2. Ciclul glioxalatului 2.6.2.3. oxidarea acizilor grai 2.6.2.4. Sistemul transportor de electroni (lanul respirator) 2.6.2.5. Fosforilarea oxidativ 2.6.2.6. Fermentaiile 2.6.3. Comparaie ntre fotosintez i respiraie 3. Adeziunea celular. Jonciunile celulare i matricea extracelular 3.1. Molecule implicate n aderarea celul-celul 3.1.1. Selectinele 3.2.2. Domenii imunoglobulinice 3.2.3. Caderinele 3.2. Jonciunea celular 3.2.1. Jonciunile de ocluzie 3.2.2. Jonciunile de ancorare 3.2.2.1. Jonciunile de adeziune intercelular 3.2.2.2. Jonciunile de adeziune celul-matrice extracelular 3.2.2.3. Desmozomii 3.2.2.4. Hemidesmozomii 3.2.3. Jonciunile de comunicare 3.2.3.1. Structura jonciunilor de comunicare 3.2.3.2. Reglarea permeabilitii jonciunilor de comunicare 3.2.4. Jonciunile sinaptice 3.3. Matricea extracelular 3.3.1. Componentele matricei extracelulare 3.3.1.1. Glicozaminoglicanii 3.3.1.2. Proteoglicanii 3.3.1.3. Colagenul 3.3.1.4. Elastina 3.3.1.5. Fibronectinele 3.3.2. Lamina bazal 3.3.2.1. Structura laminei bazale 3.3.2.2. Funciile lamnei bazale 4. Citoscheletul 4.1. Microtubulii 4.1.1. Microtubulii semnificaia biologic 4.1.2. Structura microtubulilor 4.1.3. Polaritatea i dinamica microtubulilor. 4.1.4. Bazele diversitii structurilor microtubulilor 4.1.5. Centrii organizatorici ai microtubulilor 4.1.5.1. Centriolii i corpusculii bazali 4.1.5.2. Ultrastructura centriolilor i a corpusculilor bazali. 4.1.5.3. Replicarea centriolilor i a corpusculilor bazali. 4.1.6. Micrile cililor i flagelilor 4.1.6.1. Structura cililor i a flagelilor 4.1.6.2. Mecanismul molecular al micri cililor i flagelilor. 4.1.7. Implicarea microtubulilor n diviziunea celular

56 57 59 63 67 67 70 70 71 72 73 73 75 75 75 76 76 76 77 78 78 79 79 80 80 81 81 82 82 83 83 84 86 88 89 91 91 92 93 93 93 94 95 96 96 97 97 98 99 100 101 101

4.1.7.1. Formarea fusului de diviziune 4.1.7.2. Deplasarea cromozomilor spre regiune ecuatorial a celulei i alinierea lor n placa metafazic 4.1.7.3. Translocarea cromozomilor anafazici. 4.1.8. Transportul intracelular mediat de microtubuli. 4.2. Microfilamentele 4.2.1. Microfilamentele de actin 4.2.2.Miozina 4.2.3. Rolul actinei i miozinei n contracia muscular 4.2.4. Actina i miozina n celule nemusculare 4.2.4.1.Microvilii 4.2.4.2. Rolul actinei i miozinei n citokineza 4.2.4.3. Micarea ameboidala. 4.2.4.4. Fibrele de stress 4.3. Filamente intermediare 4.3.1. Proteine ce alctuiesc filamentele intermediare 4.3.2. Tipuri de filamente intermediare i semnificatia lor funcional 4.4. Reeaua microtrabecular 4.5. Proteinele asociate citoscheletului 5. Organizarea nucleului i expresia activitii genelor 5.1. Morfologia i structura nucleului 5.1.1. nveliul nuclear 5.1.2. Matricea nucleului 5.1.3. Proteinele contractile nucleare 5.1.4. Cromatina 5.1.5. Organizarea molecular a fibrelor de cromatina. Nucleozomii 5.2. Replicarea ADN la eucariote 5.2.1. Complexul de enzime polimerazice implicate n replicare 5.2.2. Iniierea replicrii 5.2.3. Primarea replicrii 5.2.4. Alungirea lanului de ADN nou - sintetizat i terminarea replicrii 5.2.5. Corectarea erorilor de replicare 5.2.6. Unitile de replicare 5.3. Transcripia ADN sau sinteza ARN 5.3.1. Mecanismul general 5.3.2. Elemente implicate n transcripie 5.3.3. Aparatul enzimatic de transcripie 5.3.4. Factorii de transcripie 5.3.5. Elemente de control n expresia genetic 5.4. Mecanismul transcripiei 5.5. ARN splicing 5.6. Asigurarea necesarului de ARNm 6. Transportul intracelular 6.1. Sistemul vacuolar intracitoplasmatic 6.2. Rolul citomembranelor granulare n sinteza proteic 6.3. Biosinteza proteinelor sau translaia ARNm 6.3.1. Decodificarea informaiilor genetice 6.3.2. Iniierea catenei polipeptidice 6.3.3. Alungirea sau elongarea catenei polipeptidice 6.3.4. Terminarea sintezei catenei polipeptidice 6.3.5. Particularitile decodificrii la procariote i eurocariote 6.4. Mecanismul compartimentrii celulare a proteinelor nou-sintetizate

101 103 103 104 105 106 107 108 108 109 110 111 112 112 112 114 114 114 115 115 116 118 119 119 121 123 125 126 127 127 128 129 130 130 131 132 133 133 134 136 137 138 138 139 139 140 143 146 146 149 149

6.5. Corelaia particularitilor structurale i funcionale ale reticulului 151 endoplasmatic neted cu heterogenitatea funcional a celulelor 6.6. Segregarea i concentrarea proteinelor 153 6.7. Sinteza i secreia polizaharidelor 154 6.8. Lizozomii 155 6.8.1. Funciile lizozomilor 155 6.9. Peroxizomii 158 6.10. Proteinele chaperone 158 7. Reproducerea celular 161 7.1. Ciclul celular 161 7.1.1. Ciclul celular la plante 161 7.1.2. Ciclul celular la animale 161 7.1.3. Ciclinelor i protein - kinazele dependente de cicline 164 7.1.3.1. Protein - kinazele dependente de cicline (cdk) 165 7.1.3.2. Ciclinele 165 7.1.4. Interaciunea cicline- proteina Rb - mecanism de reglare pozitiv a 168 ciclului celular 7.1.5. Reglarea ciclului celular prin mecanisme feed-back 168 7.1.6. Ali factori responsabili de controlul proliferrii celulare n 170 organismele pluricelulare 7.1.7. Ciclul cromozomial i creterea celular 170 7.1.8. Implicarea factorilor de cretere n reglarea diviziunii celulare 171 7.1.8.1. Competiia celulelor pentru factorii de cretere 173 7.1.9. Influena adeziunii celulare asupra proliferrii 173 7.2. Diviziunea celular 175 7.2.1. Mitoza (diviziunea mitotic) 175 7.2.2. Meioza (diviziunea meiotic) 181 8. Apoptoza 187 8.1. Mecanismele de producere a apoptozei 187 8.2. Necroza. 188 8.3. Frecvena procesului de apoptoz 188 8.4. Gene implicate n procesul apoptotic 189 8.4.1. Gene letale 189 8.4.2. Genele supravieuirii (gene antiapoptotice) 189 8.5. Rolul apoptozei n embriogenez i dezvoltare 190 8.6. Aspecte de reglare a apoptozei 190 8.6.1. Factori implicai n reglarea apoptozei 190 8.7. Apoptoz mbtrnire senescen 192 8.8. Apoptoza i starea de boal. 193 9. Procesul de mbatrnire-senescena 195 9.1. Gene implicate n controlul senescenei 195 9.2. Principalele mecanisme (ipotetice) implicate n senescen 196 10. Rspunsul imunitar 201 10.1. Noiuni generale despre imunitate i sistem imunitar 201 10.2. Organizarea sistemului imunitar 202 10.3. Molecule cu rol esenial n cadrul sistemului imunitar 203 10.3.1. Antigenii 203 10.3.2. Anticorpii. 204 10.3.3. Celule T 205 10.3.4. Antigeni de histocompatibilitate 205 10.3.5. Citokinele 205 10.4. Relaii de cooperare ntre componentele sistemului imun 210

10.5. Baza umoral a rspunsului imun 10.5.1. Prezentarea antigenilor 10.5.2. Producerea de anticorpi 10.6. Rspunsul imunitar mediat de celule 10.7. Interaciuni celulare n rspunsul imun 10.7.1. Unele mecanisme de aprare imun n infeciile bacteriene 10.7.1.1. Mijloace de aprare imun mediate umoral 10.7.1.2. Mijloace de aprare imun mediat celular 10.8. Reglarea imunologic 10.8.1. Reglarea normal. 10.8.2. Reglarea alterat 10.9. Intensificarea rspunsului imun 10.9.1. Sistemul complement 10.9.2. Alte categorii celulare implicate n imunitate 10.10. Finalitatea rspunsurilor imune 10.10.1. Funcia direct a anticorpilor 10.10.2. Funcia indirect a anticorpilor 10.10.3. Uciderea celulelor int 10.10.4. Procesul inflamator 10.10.5. Controlul prin reacie invers 10.11. Genetica sistemului imunitar 10.11.1. Imunodeficiena dobandit 10.11.2. Grupele sanguine 10.12. Interaciunea ntre peptidele sistemului imun i peptidele sistemului nervos i endocrin 10.13. Relaiile virusuri-celule gazd. Relaiile virusuri-membrane celulare 10.13.1. Receptorii virali 10.13.2. Penetrarea virusului n celul 10.13.3. Tipuri de efect citopatic 10.13.4. Leziuni cromozomale determinate de virusuri 10.13.5. Natura i funcia unor structuri virus-like: prionii 10.14. Relaiile bacterii-celulele gazdei 11. Biotehnologia 11.1. Ingineria genetic 11.1.1. Tipuri de transfer de gene 11.1.2. Terapie cu gene int (Gene Targeting) 11.1.3. Aplicarea metodelor de biotehnologie n agricultur n vederea obinerii de organisme transgenice 11.1.4. Ingineria genetic utilizat n prepararea de noi conservani alimentari 11.1.5. Ingineria genetic i rezolvarea unor probleme de ecologie 11.2. Alte aspecte ale biotehnologiei moderne i perspectivele secolului XXI 12. Metode i tehnici moderne molecular - biologice i aplicaiile lor 12.1. Recombinarea ADN - ului 12.1.1. Principiul recombinrii 12.1.2. Procese artificiale de recombinare ADN (Genetic Engineering) 12.1.3. Elemente de lucru utilizate n tehnologia ADN recombinat 12.1.3.1. Enzimele de restricie 12.1.3.2. ADN-ligazele (polinucleoid-ligazele) 12.1.3.3. Vectorii 12.2. Hibridarea 12.2.1. Principiu 12.2.2. Denaturarea

213 214 214 215 216 218 218 218 219 219 219 219 220 220 221 221 221 222 222 222 222 223 224 225 227 227 228 229 229 230 233 235 235 235 238 241 245 245 245 252 252 252 253 254 254 255 256 266 266 266

12.2.3. Renaturarea (annealing/reannealing) 12.2.4. Factorul stringent 12.2.5. Tipuri de hibridri 12.2.6. Hibridizare in situ 12.2.7. Importana reaciei de hibridare pentru medicin i biologie 12.3. Sonde genetice 12.4. Clonarea ADN ului 12. 5. Reacia de polimerizare n lan (PCR) 12. 6. Secvenierea ADN- ului 12.7. Fingerprinting genomic (amprente de ADN) 13. Biosenzorii 13.1. Biosenzorii sisteme de coantificare a informaiilor viului 13.2. Impactul informaional al biosenzorilor 13.3. Metodologia de cercetare a proprietilor senzorilor biologici 13.4. Aparatura de msurare 13.5. Posibiliti de folosire a biosenzorilor n biotehnologie Bibliografia

267 267 267 272 273 274 279 282 285 286 288 288 289 290 291 292 296

INTRODUCERE

Informaia a fost ntotdeauna preioas n orice domeniu de activitate, ea devenind cu att mai necesar n domeniul tiinelor biologice, astzi cnd trim o adevrat explozie a cunotinelor tiinifice cunoscut unei revoluii tiinifice. Biologia celular a evoluat n ultimii zece ani datorit progreselor realizate n cercetri de biochimie, genetic i biologie molecular, care au folosit metode i tehnici diferite, pentru investigarea unui substrat comun,celula. Tehnicile avansate de microscopie electonic, folosirea culturilor celulare, realizarea anticorpilor monoclinali, tehnologia ADNului recombinat, manipularea genetic, sunt numai cateva din aceste tehnici care i-au dovedit puterea analitic i au permis unificarea experimentului biologic, a substratului molecular i a terminologiei n biologia celular. Viaa se manifest numai n cadrul organizrii celulare a materiei vii, astfel c biologia celular, care studiaz fenomenele vieii la acest nivel de organizare, este o tiin fundamental. n acelai timp, face parte dintre tiinele nerestrictive deoarece nici un fenomen biologic nu poate fi studiat separat, fr a se lua n consideraie complexitatea lui, interaciunile cu alte structuri precum i diversitatea sistemelor de ordin superior, cu proprietile lor emergente. Cercetrile de biologie celular i molecular au acumulat deja un bagaj de date care au permis progrese uriae n medicin, tiinele ecologice, agricultur, industrie alimentar, lsnd s se ntrevad pentru viitor noi perspective fascinante de cercetare n diferite alte ramuri. Progresele ultrarapide ale biologiei celulare i moleculare au dus la dezvoltarea biotehnologiei moderne care se anun a devenii marea for industrial a secolului al XXI-lea i n care se pune sperana c va reui s rezolve problemele cele mai spinoase ale societii omeneti (alimentaia, starea de sntate, sursele de energie, poluarea ) la nivelul Terrei. La ora actual, cercetrile de biologie molecular se afl n faza clasificrii mecanismelor care stau la baza formrii i asamblrii structurilor din organismele vii, atenia fiind concentrat asupra momentului cnd se produce tranziia informaiei de la nivelul molecular ctre nivelul diferitelor sisteme i structuri intermediare ale acestor organisme; este vorba de o etap de analiz a funciilor celulare la nivel molecular (de ex. procesul respiraiei celulare, al producerii de substane energetice celulare, al transportului intracelular la nivelul organitelor, al proceselor de rennoire celular, al fenomenelor de adaptabilitate). n contextul revoluiei tiinelor biologice pe care o trim astzi, se impune tot mai mult o reconsiderare a concepiei i comportrii cercettorului tiinific n raport cu poziia omului n ciclul evolutiv al naturii. Dup cum arat Lederberg (de dou ori laureat al premiului Nobel pentru descoperiri fundamentale n domeniul geneticii bacteriene), greeala cea mai mare a oamenilor este aceea de a se supraestima i de a se considera exceptai de la legile generale ale evoluiei, cnd de fapt ei nu reprezint dect un element n circuitul evolutiv al vieii n natur. Tocmai din cauza acestei mari erori comise de oameni, cuceririle tiinei i civilizaiei umane s-au ntors de foarte multe ori, pn astzi, mpotriva omului, periclitnd viaa pe Terra. ntr-adevr, istoria societii omeneti a demonstrat deja c impactul noilor tehnologii i cel al dezvoltrii tiinelor n general nu a fost totdeauna benefic pentru rzboaiele atomice i bacteriologice, accidentele de laborator soldate cu moartea experimentatorilor, microorganisme scpate de sub control etc. Alte consecine nefaste ale tehnologiilor moderne asupra ecosistemelor n general i strii de sntate a oamenilor n particular sunt: creterea radioactivitii mediului nconjurtor (n urma accidentelor de la termocentralele nucleare), ngustarea stratului de ozon atmosferic 11

(prin folosirea n exces a freonilor), care a favorizat creterea cantitilor de radiaii ultraviolete n atmosfera terestr i implicit a frecvenei cancerelor (de piele, ochi, pulmon), creterea riscului de rspndire ultrarapid a unor boli infecioase (holera, meningita meningococic, difteria) prin creterea aglomeraiei n centrele urbane i prin deplasrile rapide i masive de populaie datorit mijloacelor ultrarapide de transport. De asemenea, defriarea unor zone de pe glob (pduri tropicale) n scopul crerii de mari aezri umane i centre industriale a determinat, pe lng dezechilibrele grave (prin scderea spaiului verde), expunerea concomitent a populaiei la noi ageni patogeni; au aprut astfel i sau rspndit pe glob: virusul febrei galbene, virusul imunodeficienei umane (HIV transmis la om foarte probabil de la primatele junglei africane), virusul Ebola (agentul febrei hemoragice), adus pentru ntia oar din Africa n Europa (la Marburg n 1967). Omul de tiin trebuie s in cont de faptul c, n natur, diversitatea foarte mare de specii este tributar n mare msur condiiilor de mediu extern; modificri majore ale acestor condiii de mediu pot declana poteniale nebnuite ale ecosistemelor cu influene posibil nocive, neintuite nc astzi, asupra echilibrului vieii pe Terra. Contient de toate aceste posibiliti,un adevrat om de tiin, trebuie s militeze ca n viitor cuceririle tiinifice s fie folosite cu mai mult discernmnt, doar n slujba binelui, pentru un grad tot mai nalt de civilizaie n societatea uman.

12

Capitolul 1 CONSIDERAII GENERALE PRIVIND DOMENIUL DE STUDIU AL BIOLOGIEI CELULARE I MOLECULARE

1.1. Definiie i caracteristici

BIOLOGIA CELULAR este o ramur a tiinelor biologice care studiaz structurile funcionale i fenomenele biologice generale comune tuturor celulelor. Se mai poate spune c biologia celular are ca obiect studiul legilor generale de desfurare a proceselor vitale la nivelul de organizare celular. Celula poate fi definit i ca unitate elementar a lumii vii, cu o ordine intern complex, ce-i confer capacitatea de cretere, dezvoltare i reproducere, precum i cu organizare dinamic, aflat n relaii de echilibru cu mediul nconjurtor (Diculescu i colab., 1983). n ierarhia nivelurilor de organizare a materiei vii, celula este considerat primul sistem biologic, deoarece nivelurile inferioare (atomi, molecule etc) nu sunt considerate vii. Orice manifestare vital are loc pe fundamentul organizrii celulare. Viaa ncepe de la celul. Din punct de vedere termodinamic, celula este un sistem deschis, adic un sistem care schimb att energie ct i substan cu mediul nconjurtor. Ca oricrui alt sistem biologic, sistemul celular i se pot descrie mai multe caracteristici : caracterul informaional, programul, echilibrul dinamic, autoreglarea i integralitate. Caracterul informaional const n aceea c n orice moment celulele recepioneaz, acumuleaz, prelucreaz i transmit informaii de tot felul. Programul este o trstur legat de capacitile structurale i funcionale ale sistemului. n orice sistem (deci i cel celular) putem distinge trei categorii de programe: a) programe pentru sine, care asigur autoconservare sistemului dat; b) programe inferioare, adic programele subsistemelor componente; n cazul celulei acestea sunt programele organitelor, ale complexelor moleculare; c) programe superioare, care asigur existena sistemului superior, n care este integrat sistemul considerat (esuturi, organe, individ pluricelular). O ilustrare a ierarhiei programelor o constituie modificrile celulelor scoase dintr-un esut (sistem superior) i cultivate n mod izolat, care se difereniaz devenind asemntoare indiferent de sursa din care provin (piele, os, ficat,rinichi etc). n cultur se menin programele pentru sine, care asigur persistena celulelor, n schimb dispare programul superior ce reflect specificul celulei n cadrul esutului i al organismului. Echilibrul dinamic sau starea staionar este caracteristic sistemelor biologice, deci i celulei; aceasta nu este niciodat ntr-un adevrat echilibru, ci ntr-un schimb continuu de materie i energie cu mediul exterior, tinznd mereu spre un regim constant de activitate numit stare staionar sau echilibru dinamic. n timp ce sistemele nebiologice evolueaz ntotdeauna n sensul creterii entropiei , deci n sensul creterii dezordinii lor i al realizrii echilibrului termodinamic, sistemele biologice au capacitatea de a compensa creterea entropiei i de a o depi pe seama surselor de energie exterioare sistemului, deci au un comportament antientropic. Organismele vii evit creterea entropiei prin preluarea din mediu a unei entropii negative, negentropia. Autoreglarea este caracteristica sistemelor biologice prin care acestea i controleaz procesele interne n funcie de relaiile cu mediul. Influenele mediului tind permanent s dezechilibreze sistemul, care contracareaz aciunile mediului reglndu-i permanent procesele interne ntr-un sens favorabil persistenei sale n timp i spaii. 13

Celula, ca orice sistem biologic, posed mecanisme de autoreglare de tipul celor descrise n cibernetic. Autoreglarea presupune existena a minimum dou elemente: unul care comand (centrul de comand) i unul efector, precum i legturilor de comunicare dintre ele. Pentru ca rspunsul s fie corespunztor cu necesitile sistemului, valoarea rspunsului trebuie comparat cu comanda. Rspunsul dat de efector trebuie comunicat receptorului pe o cale invers conexiunea invers (feed-back), pentru a avea loc compararea cu comanda primit de efector, spre deosebire de legtura de la receptor la efector care poart numele de conexiune direct. Conexiunea invers este obligatorie pentru orice sistem de autoreglare i ofer posibilitatea sistemului s fie informat despre valoarea rspunsului. Dac rspunsul nu corespunde necesitilor sistemului, se d o nou comand, un nou rspuns, o nou comparaie. Integralitatea const n faptul c un sistem nu se reduce la suma nsuirilor prilor sale componente; sistemul privit ca un ntreg, prezint nsuiri structurale i funcionale noi, pe care nu le au prile lui componente luate izolat. Nucleul sau citoplasma nu triesc izolate, celula nu poate supravieui dup distrugerea mitocondriilor etc. Datorit integralitii sunt posibile funciile biologice fundamentale: metabolismul, reproducerea, adaptarea, meninerea stabilitii strii difereniate. Autonomia celulelor ce compun organismele pluricelulare nu este absolut i se poate spune c sntatea organismului depinde n mare msur de sistemele de comunicaie i de mecanismele de coordonare dintre celule. Biologia celular s-a conturat ca o disciplin nou mai cu seam n ultimii 50 de ani ca urmare a progreselor revoluionare nregistrate n studiul celulei, pe plan metodologic i conceptual, cnd s-a produs fuziunea dintre citologie, biochimie celular, fiziologie celular i genetic molecular. n ultimii 20 de ani s-a accentuat tendina de interpretare a tuturor proceselor celulare la nivel molecular, ceea ce justific denumirea actual de biologie celular i molecular, care a devenit una dintre cele mai noi i de perspectiv ramuri ale biologiei. Ea concepe celula ca un adevrat microcosmos ,n care structurile i funciile se mbin armonios; activitatea acestui microcosmos este determinat i reglat genetic, astfel c funcionarea sa se realizeaz cu o mare eficien.

1.2. Scurt istoric

ncepnd cu secolul XX, se nregistreaz progrese nsemnate n studiul celulei, att sub raport metodologic, ct i sub raport conceptual. Printre progresele metodologice sunt de menionat: introducerea tehnicii culturilor de esuturi n vitro (Harrison, 1909), ulterior a culturilor de celule, care permit studierea comportrii celulelor prin microscopia cu contrast de faz; coloraie vital i microvital i microcinematografie; microchirurgia (Kite,1911), prin care se introduc micropipete fine n interiorul celulelor i se studiaz la microscopul optic proprietile fizico-chimice ale citoplasmei; introducerea microscopul electronic (inventat n 1937, dar utilizat n biologie dup 1954) a dus la descoperirea unei noi lumi a organizrii celulare, descifrarea ultrastructurii celulei, a detaliilor fine de organizare submicroscopic. Aceasta a marcat i trecerea de la citologia clasic la citologia modern. Dezvoltarea impetuoas a biochimiei, la nceputul secolului XX, aduce descoperirea i descifrarea oxidrilor celulare (Wieland, 1903; Warburg, 1908) i se fac primele ncercri de a le localiza n particule citoplasmatice. Punctul de convergen ntre citologie i biochimie l constituie dezvoltarea tehnicilor biochimice de fracionare a celulei prin centrifugare diferenial. Aceast linie de cercetare a fost iniiat n 1934 de Bensley i Hoerr i apoi dezvoltat cu succes de Claude, Hogeboom i alii n deceniul al V-lea. Prin centrifugare diferenial s-a realizat separarea componentelor citoplasmatice, urmat de studiul ultrastructurii i a proprietilor metabolice ale acestora. n acest fel s-au putut localiza precis anumite ci metasolice n celul (de pild ciclul Krebs, 14

oxidrile celulare i sinteza de ATP n mitocondtii) i s-au descoperit i caracterizat noi organite celulare (lizozomii i peroxizomii de ctre Christian de Dure). Introducerea microscopiei electronice i a fracionrii celulei prin centrifugare sunt cele dou tehnici majore care au revoluionat studiul celulei, ducnd la apariia unei noi ramuri a tiinelor biologice i anume biologia celular. Studiul celulei a progresat i n msura perfecionrii tehnicilor de citochimie i histochimie, prin care se deceleaz anumite componente ale celulei (acizii nucleici, proteine, glucide, lipide) se localizeaz enzime n celul sau n organite. Aceste metode se pot utiliza la microscopul optic sau la microscopul electronic. Un punct de referin la constituit citofotometria acizilor nucleici (Caspersson, 1938). De asemenea, s-au aprofundat aspectele funcionale ca urmare a progreselor nregistrate n fiziologia celular. Pe de alt parte, pornind de la structurile nucleare s-a ajuns la interpretarea i explicarea fenomenelor ereditii. Sub raport conceptual biologia celular a rezultat din fuziunea disciplinelor de citologie, biochimie celular, fiziologie celular, genetic molecular. Prin anii 60 exista deja o disciplin format, cu metodologie complex de cercetare, ilustrat de savani de renume mondial dintre care Albert Claude, George Palade, Christian de Duve, laureai ai Premiului Nobel n 1974, Keith Porter i alii. Dar progresele spectaculare n studiul celulei au continuat cu repeziciune i n scurta vreme s-a nregistrat o nou schimbare radical. Odat cu realizrile excepionale nregistrate n descifrarea structurii proteinelor i acizilor nucleici prin folosirea n special a difraciei cu raze X, a elucidrii mecanismului replicrii ADN, a biosintezei proteinelor, deci a transmiterii informaiei genetice i a expresiei genei s-a nscut biologia molecular, al crui scop este interpretarea fenomenelor biologice la nivel molecular. Cercetrile de biologie molecular au acumulat deja un bagaj de care au permis progrese uriae n diferite domenii, lsnd s se ntrevad, pentru viitor, noi perspective fascinante de cercetare (medicin, industrie alimentar, agricultur, ecologie etc). Progresele ultrarapide ale biologiei moleculare au dus la dezvoltarea biotehnologiei moderne care se anun a deveni marea for industrial a secolului al XX -lea i n care se pune sperana c va reui s rezolve problemele cele mai spinoase ale societii omeneti (alimentaia i starea de sntate). Dup cum se tie, majoritatea cercetrilor i descoperirilor epocale din biologia molecular au fost fcute n SUA, Japonia i Germania; tot n aceste ri s-a dezvoltat i biotehnologia modern. La ora actual, n SUA exist 1000 de firme specializate n probleme de biotehnologie, care lucreaz produse pentru laboratoarele de genetic i biologie molecular din ntreaga lume; n Japonia exist 300 de firme, iar n Germania 36.

1.3. Contribuii romneti n studiul celulei

n secolul al XIX-lea s-a impus coala de microscopie de la Facultatea de medicin din Bucureti (Diculescu i colab., 1983). nc din 1839 Nicolae Kretzulescu public la Paris rezultatele cercetrilor sale asupra structurii microscopice a dinilor i a mediilor transparente ale globului ocular. nvmntul disciplinelor microscopice apare la coala de medicin din Bucureti n anul 1859, reprezentat succesiv de Ludovic Fiala, Gh. Polizu i Mihail Obedenaru, care predau histologia i citologia pn n anul 1897, cnd ia fiin o catedr independent de histologie, citologie i tehnic microscopic. La aceast catedr, printre primele de acest fel din Europa, dup acela din Frana, se succed, n curs de circa 100 de ani, reprezentani de seam ca: Mihail Petrini-Galai, Alexandru Obredja, Ion Bruckner, tefan Besnea, I. T. Niculescu. Pe plan internaional se impun n mod cu totul deosebit, Gheorghe Marinescu ( 18631939), Victor Babe (1854-1926) i Ion Cantacuzino (1863-1934). Contribuiile lui Gheorghe Marinescu n neurocitologie sunt sintetizate n cartea Celul nervoas (publicat la Paris n 15

1909) care a rmas mai multe decenii o carte de baz a domeniului. Victor Babe (coautor mpreun cu francezul A. V. Cornil al primului tratat de microbiologie din lume, publicat la Paris n 1886) a descoperit peste 40 de microorganisme, unele constituind clasa Babesia (Babesiozele sunt cele mai rspndite parazite ale animalelor). Victor Babe a mai descoperit corpii Babe-Negri n neuron n turbare, corpusculii Babe-Erust n bacilul difteric. nc din 1885 a prevzut c ntre microorganisme se pot stabili relaii antagoniste, cu posibiliti de aplicare a fenomenului n terapie, concepie confirmat ulterior prin antibiotice. Ion Cantacuzino, pe lng contribuiile sale de imunologie comparat, de microbiologie i de medicin experimental, a descoperit factorul stimulator al secreiei celulare n diferite lichide biologice (de exemplu, lacrimile). coala de citofiziologie a lui Ioan Athanasiu i Ion Drgoi de la facultile de tiine naturale i medicin veterinar din Bucureti aduc valoroase contribuii de citofiziologie muscular, dintre care se remarc descoperirea tubilor transveri din celulele musculare cardiace i cele striate, lucrri publicate nc nainte de primul rzboi mondial. n perioada dintre cele dou rzboaie mondiale coala de citologie de la Facultatea de tiine naturale din Bucureti este reprezentat strlucit de Dimitrie Voinov (i continuat de Theodor Dornescu i I. Steopoe), iar cea de la Cluj de ctre I. Scriban, care s-au impus prin descoperiri legate de aparatul Golgi i lucrri de citologie animal (Ionescu-Varo i colab., 1981). n aceeai perioad Ion Drgoi, conducnd coala de histologie i citologie de la Facultatea de medicin din Cluj a efectuat cercetri deosebit de valoroase privind rolul presiunii osmotice asupra diviziunii celulare, precum i asupra respiraiei ovicitelor de mamifere. nvmntul superior i cercetarea tiinific din Romnia au depus eforturi de reorganizare n concordan cu evoluia biologiei celulare n ultimele decenii. ncepnd cu anul 1969 M. Ionescu Varo iniiaz la Facultatea de biologie din Bucureti primele cursuri i lucrri practice de biologie celular, publicnd totodat i primul manual de profil din ar. I. Diculescu i colaboratorii de la catedra de histologie i citologie a Facultii de medicin din Bucureti public prima monografie de biologie celular din literatura romn (Diculescu i colab., 1971). ncepnd cu anul universitar 1978-1979 se introduce biologia celular ca materie obligatorie n planul de nvmnt la facultile de medicin, disciplinele de profil fiind conduse de I. Diculescu la Bucureti, O. Chita la Craiova, G. Cotrutz la Iai, Silvia Andreicu la Tg. Mure, N. Frsinel la Timioara i Gh. Benga la Cluj-Napoca. Se redacteaz cursuri litografiate pentru studenii de la medicin (Benga, 1980; Diculescu i colab., 1981; Andreicu, 1982) i un manual unic ( Diculescu i colab, 1983 ). Sunt, de asemenea, de menionat laboratoarele de microscopie electronic i biologie celular i molecular din cadrul unor institute de nvmnt superior (Universitatea din ClujNapoca dr. C. Crciun, laboratorul de microscopie electronic ) i de cercetare: Institutul Dr. I. Cantacuzino (microscopie electronic dr. A. Petrovici, biologie celular dr. Gh. Gancevici), Institutul Dr. V. Babe (biologie celular dr. C. Dragomir), Institutul L. Pasteur (microscopie electronic cu baleiaj dr. N. Manolescu), Institutul tefan S. Nicolau (biologie molecular dr. L. Popa, dr. S. Antohi), Institutul Oncologic Bucureti ( biologie molecular dr. I. Voicule), Institutul de tiine biologice, Bucureti ( microscopie electronic dr. H. Tiu i colab.) i altele. Din 1979 a luat fiin Institutul de Biologie i Patologie Celular din Bucureti, aflat n legtur permanent cu secia de biologie celular a Facultii de medicin din Yale, S.U.A (profesor George Emil Palade). Merit subliniat n acest context, descoperirile de o valoare inestimabil a lui G. E. Palade, primul romn laureat al Premiului Nobel. Aprecierile de principal cartograf al celulei sau cel mai mare biolog al secolului XX (Blobel, 1980) sunt justificate nu numai de multiplele sale descoperiri, ci i de orizonturile noi deschise n biologia celular. Palade este 16

unul din pionierii elaborrii tehnicilor de microscopie electronic (a pus la punct metoda de fixare i secionare ultrafin, ce i-a permis observarea pentru prima dat a multor structuri celulare) i de centrifugare diferenial ( a introdus zaharoza ca mediu de fracionare). A descoperit ribozomii (numii i granulele lui Palade) i a precizat rolul lor n sinteza proteinelor, a elucidat calea seciei celulare, a descoperit transportul pe calea veziculelor prin endoteliul capilar i reciclarea membranelor celulare; a studiat biogeneza membranelor, i aici fiind un deschiztor de drumuri. Biologia celular i molecular reprezint nu numai unul din cele mai dinamice domenii n care avanseaz frontierele cunoaterii umane, ci i pilonul fundamental ce st la baza revoluiei tiinifice, pe care o trim n prezent, cu implicaii de maxim importan economic, medical, ecologic i n ultim analiz, filozofic. 1.4. Principalele teorii care au condus la modul actual de gndire despre

natura materiei vii

Secolul al XIX-lea a reprezentat un salt n cunoaterea organizrii materiei vii. Acumularea de date i cunotine a permis i fundamentarea unor teorii care au condus la modul actual de gndire despre natura materiei vii, printre care: Teoria celular, care a stabilit c la baza structurii esuturilor, organelor i a ntregului organism, vegetal i animal, st celula; Teoria cromozomial a ereditii, care consider c la baza controlului i transmiterii caracterelor ereditare stau cromozomii (i n ultimul timp ADN); Teoria molecular, care consider c viul este constituit din materia molecular (ca i neviul); Teoria biostructural, de dat mai recent (sec XX-lea) ce aparine academicianului E. Macovschi i care consider viul materie biostructurat, superior organizat (biostructura), form cu totul special a materiei, purttoarea nsuirilor biologice pe care le imprim viului i care include materia molecular. Teoria evoluionist, ipotez care afirm c toate speciile de animale s-au transformat unele n altele, de la primele vieti unicelulare, pn la maimu i om, n miliarde de ani, mai afirm c speciile de plante auevoluat de la forme unicelulare pn la plantele cu flori i c acest proces evolutiv s-a desfurat pe cale natural, prin factori ntmpltori.

1.4.1. Teoria celular

La sfritul secolului al XVIII-lea, epoca de invenie a primelor microscoape, R. Hooke (1665) observ c pluta este alctuit din numeroase cmrue, asemntoare unor faguri de albine, pe care le-a denumit celule (de la lat. cellula camer mic). n aceeai perioad Leuwenhoeck (1674), descoper celulele libere i identific i nucleul n eritrocite. Importana acestor noiuni nu a fost neleas dect mai trziu. La nceputul secolului al XIX-lea, dispunnd de microscoape mai perfecionate, numeroi cercettori descriu celulele n diferite organisme vii. Puin cte puin, se desprinde ideea c toate fiinele sunt alctuite din celule i din substane ce provin din activitatea lor. Schleiden (1838) i apoi Schwann (1839), exprim aceast concepie, care reprezint o sintez fundamental a cunotinelor despre celul pn la acea dat i care este nc una dintre concepiile de baz ale biologiei actuale. Observarea i studiul diviziunii celulare de ctre muli autori, conduc pe Virchow (1855) s enune o nou idee: omnis cellula e cellula (toate celulele provin dintr-o celul preexistent). 17

Fiecare celul posed un nucleu (Brown, 1831), care deriv tot dintr-un nucleu preexistent (Strasburger, 1876). Celula conine o substan gelatinoas, diafan, insolubil n ap, care se contract ntr-o mas globuloas, se ataeaz de suprafaa de seciune i se las ntins asemntor unui mucus (Dujardin, 1835). Aceast substan reprezint protoplasma (Purkinje; Von Mohl, 1840). Schneider (1873), apoi Strasburger (1876) descoper diviziunea indirect n celulele vegetale; Fleming (1880)o observ n celulele animale i o numete mitoza,; Schneider (1878) adaug termenul de cariochinez, n timpul creia cromozomii se repartizeaz n mod egal ntre celulele-fiice. n cursul fecundrii ovulului de ctre spermatozoid cei doi pronuclei fuzioneaz n oul fecundat (Hertwig, 1875). Oul (celula-ou) d natere unui nou organism. De la o generaie la alta, viaa se caracterizeaz printr-o succesiune nentrerupt de celule. Studiul creterii i dezvoltrii organismului, a maladiilor sale, a reproducerii i a fenomenelor de transmitere ereditar, sunt n raport cu structura i funcia celulelor sale. Descoperirile recente pot provoca unele dificulti, referitoare la generalizarea teoriei celulare. Este cazul virusurilor care au o organizare foarte particular. Totui, teoria celular se evideniaz ca fiind extrem de aplicabil. Nu numai celulele, dar i organitele, cum sunt cromozomii, sau moleculele ca cele de ADN (acid dezoxiribonucleic) preced structuri preexistente analoge; ele au o continuitate genetic. Dup A Lwoff (1962), teoria celular implic o unitate de plan de organizare, dar de asemenea o unitate de funcionare i o unitate de compoziie. Celulele sunt organizate dup un plan foarte general comun, ele funcioneaz dup aceleai legi i sunt constituite din molecule, care cu toat marea lor diversitate, sunt constituite dintr-un numr foarte limitat de materiale.

1.4.2. Teoria cromozomial a ereditii

Caracterul esenial al unei celule vii const n capacitatea de a transmite n mod ereditar trsturile sale de la o generaie la alta. Dei fenomenul a fost remarcat cu foarte mult timp n urm, el nu a putut fi descifrat dect spre sfritul secolului XIX-lea i nceputul secolului al XX-lea. Meritul i revine naturalistului ceh Gregor Mendel care elaboreaz (1866) dou importante legi ale geneticii, cunoscute sub numele de legile lui Mendel. n scopul de a descifra mecanismele ce determin exprimarea anumitor caractere, ct i transmiterea lor de-a lungul generaiilor, Mendel utilizeaz metoda analizei genetice (hibridologic). Principiul acestei metode const n ncruciarea unor indivizi ai aceleai specii care se deosebesc ntre ei prin una sau mai multe caractere (trsturi) individuale, bine conturate i analiza descendenilor obinui. Cel mai important factor ce poate influena rezultatele furnizate prin metoda analizei genetice l constituie puritatea genetic a genitorilor. Indivizii folosii n ncruciri trebuie s manifeste o mare constan a caracterelor ereditare. Un material biologic adecvat acestui scop este mazrea (Pisum sativum), plant folosit n experimentele efectuate de Mendel. Prima lege mendelian este legea puritii gameilor. Sub denumirea de legea puritii gameilor sunt unite de fapt dou legi sau dou principii: a uniformitii hibrizilor din prima generaie i cea a segregrii. Aceast lege se bazeaz pe rezultatele unui experiment de monohibridare (indivizii ncruciai se deosebesc printr-o singur pereche de caractere ereditare) Mendel a ncruciat un soi de mazre cu boabe de culoare galben (G) cu un alt soi ale crui boabe erau verzi (v). n urma acestei ncruciri s-a obinut prima generaie hibrid F1. Toi hibrizii din F1 prezentau boabe de culoare galben, motenind caracterul ereditar al unui singur genitor. Caracterul alternativ (culoare verde) nu a fost exprimat de nici unul din indivizii primei generaii.

18

Mendel introduce termenul de dominan pentru a definii fenomenul de exprimare, la hibrizii din F1, numai a unuia dintre caracterele parentale alternative. Caracterul ce se manifest la descendenii din prima generaie a fost numit dominant, n timp ce caracterul alternativ, nemanifestat i s-a atribuit termenul de recesiv. n urma autopolenizrii (sau ncrucirii) hibrizilor din F1 s-a obinut a doua generaie de descendeni , F2. Unii dintre acetia prezentau caracterul dominant, n timp ce alii manifestau caracterul recesiv. Difereniere caracterelor parentale la indivizii din a doua generaie a fost numit segregare. n urma unui studiu statistic al segregrii, Mendel a obinut raportul de 3:1 ntre caracterul dominant i cel recesiv (fig. 1). Mendel i-a extins cercetrile i asupra generaiilor urmtoare. El a remarcat faptul c plantele cu boabe verzi au descendeni identici. Din plantele cu boabe galbene doar o treime exprim constant caracterul ereditar, restul de dou treimi manifestnd o segregare similar generaiei F2 (3 dominant : 1 recesiv) G GG gG g Gg gg

Gamei F1
G G

Fig.1. Schema care reprezint prima lege a lui Mendel ( legea puritii gameilor ). Se poate observa c n generaie F2 raportul fenotipului dominant i cel recesiv este de 3/1. G = gena dominant; g = gena recesiv. Mendel explic rezultatele obinute lansnd ipoteza factorial care are drept suport presupunerea existenei unor factori interni materiali ce stau la baza exprimrii caracterelor ereditare. Aceti factori, intuii de Mendel, sunt cunoscui azi sun numele de gene (termen introdus n 1909 de ctre Wolhelm Johanerson). n toate organismele, factorii se gsesc n pereche, fiecare coninnd un factor dominant i altul recesiv. Astfel de cupluri au primit ulterior numele de perechi alele. Factorii sunt transmii descendenilor prin intermediul gameilor parentali (matern i patern) ce conin cte unul din factorii ce alctuiesc cuplul(sunt puri din punct de vedere genetic). n urma fecundrii, gameii se combin n moduri diferite ceea ce explic fenomenul de segregare manifestat n F2. n cazul experimentului de monohibridare se constat existena unei duble segregri, att fenotipic, ct i genotipic. Din punct de vedere fenotipic (al aspectului exterior al individului), raportul de segregare este de 3:1 (dominant/recesiv). Segregarea genotipic const n redistribuirea factorilor n cupluri diferite, n generaia F2. Analiznd diagrama lui Punnett, se constat formarea, n a doua generaie, a dou cupluri identice cu cele ale genitorilor i altor dou similare hibrizilor din F1, stabilit fiind de 1:2:1 (fig. 2).

19

Fig. 2. Diagrama factorilor ereditari aleloformi n experimentul de monohibridare. P = generaie parental; F1, F2 , F3 = generaiile filiale (hibrizii); = genitorul parental femel; = genitorul parental masculin; G = caracterul dominant (culoarea galben); g = caracterul recesiv (culoarea verde). Studiul posibilitilor de combinare a factorilor ereditari n cupluri st la baza unei noi clasificri a organismelor. Se disting, astfel, dou tipuri de organisme: homozigote (la care factorii ce alctuiesc cuplul sunt identici) i heterozigoze sau hibride (la care factorii ereditari pereche sunt diferii). Legea segregrii (disjunciei) independente a perechilor de factori ereditari respectiv a perechilor de caractere este a doua lege elaborat de Mendel. Ea este fundamentat pe un experiment de dihibridare (genitorii se deosebesc ntre ei prin dou perechi de caractere constante). Mendel a ncruciat un soi de mazre cu boabe galbene i netede (GN) cu un alt soi cu boabe verzi i zbrcite (vr) Experienele preliminare au demonstrat c att culoarea galben, ct i aspectul neted al boabelor sunt dominante asupra caracterelor alternative. n urma ncrucirii celor doi genitori s-a obinut prima generaie de descendeni F1, n care manifestate erau doar caracterele dominante.

20

Cei 16 descendeni din a doua generaie F2 rezultai prin autopolenizarea (sau ncruciarea) hibrizilor din F1, se pot ncadra n patru clase genotipice, raportul de segregare fiind de 9:3:3:1 astfel: 9 plante prezentau ambele caractere dominante (boabe galbene i netede); 3 plante manifestau primul caracter dominant (boabe galbene i zbrcite); 3 plante exprimau al doilea caracter dominant (boabe verzi i netede); 1 plant nu prezenta nici unul din caracterele dominate (boabe verzi i zbrcite). Cei ase (3+3) indivizi ce exprim genotipuri noi, diferite de cele ale genotipurilor, sunt numii recombinani. Din modul de segregare a fiecrui caracter n parte, se constat c fiecare pereche de caractere, segreg independent ntr-un raport de 3:1. Att raportul se segregare fenotipic, ct i exprimarea fenotipurilor noi se explic admind prezena n genomul hibrizilor din F1 a tuturor genelor parentale (fig.3)

Fig. 3. Schema dihibridrii i a segregrii factorilor n F1, reprezentnd cea de-a doua lege a lui Mendel. Un printe este homozigot pentru dou gene dominante: GG care determin culoarea i RR care determin forma. Cel de-al doilea printe este homozigot pentru alelele recesive gg i rr. Generaia F1 este uniform pentru caracterele dominante. Fecundarea produce un numr egal de 4 x 4 = 16 combinaii prezentate n ptratele figurii (generaia F2 ). Aceste 16 combinaii se gsesc n 4 clase de genitori. 21

Anterior experimentelor mendeliene, studiile citologice subliniau implicarea cromozomilor n procesul transmiterii ereditare a caracterelor. Corelnd datele genetice cu cele furnizate de citologie, W.S.Sutton (1903)i T. Boveri (1904) ajung la concluzia c factorii ereditari (genele) sunt localizai n cromozomi, segregarea perechilor alele, ntr-un heterozigot, explicndu-se prin segregarea cromozomilor ce conin genele n procesul de formare a celulelor sexuale (gametogeneza). Orice tip de celul diploid conine cromozomi de provenien matern i patern ce formeaz cupluri de cromozomi omologi. n timpul meiozei att ataarea cromozomilor de fibrele fusului de diviziune, ct i deplasarea lor spre polii celulei sunt fenomene ce se desfoar la ntmplare. Acest lucru explic de ce gameii rezultai n urma meiozei pot conine orice combinaie a factorilor ereditari parentali. Punerea n discuie, din perspectiva citologic, a universalitii legilor mendeliene a condus la concluzia c libera combinare a factorilor ereditari are loc numai cnd factorii ce determin exprimarea perechilor de caractere sunt localizai n perechi de cromozomi omologi diferii. Deci numrul factorilor ce segreg, independent ntre ei, poate fi cel mult egal cu numrul de perechi de cromozomi omologi prezeni ntr-un organism dat. Corelaia rezultatelor cercetrii fenomenului ereditar s-a finalizat prin elaborarea, n 1920, a Teoriei cromozomiale a ereditii, teorie preluat i dus la apogeu de Thomas Morgan (Drosophila melanogaster, analiza genetic, hri genetice) teorie susinut azi de informaiile furnizate de biologia molecular.

1.4.3. Teoria molecular a materiei vii

Conform modului actual de gndire despre natura viului, oglindit n cercetare i n programul de nvmnt, viul este constituit din materie molecular; (Bauley, 1970; Orten, Neuhaus, 1975; Tama ,1975); nsuirile biologice sunt condiionate de metabolism (Oparin, 1960; Watson 1974); moartea este consecina ncetrii metabolismului; natura materiei vii i natura materiei moarte sunt calitativ identice (Haas; 1964). S-a ajuns la convingerea c acest mod de gndire reflect natura vie aa cum este ea, deci ntru-totul realitii. Se mai consider ca numeroasele descoperiri de mare importan pentru biologie, fcute la nivel molecular ca i cele ce privesc codul genetic, mecanismul de biosintez a proteinelor, autoreglarea i coordonarea reaciilor enzimatice, sinteza genelor i altele, vin n sprijinul actualului mod de gndire despre natura materiei vii, demonstrnd valabilitatea lui. Datorit acestei situaii cercetarea viului se orienteaz tot mai mult spre aspecte legate de structura chimic a substanelor din organisme i de interrelaiile chimice i fizice dintre moleculele acestor substane. De aici abordarea tot mai frecvent a fenomenelor biologice n termeni moleculari, tendin de chimizare a diferitelor ramuri ale biologiei i apariia disciplinelor biologice noi, numite moleculare, cum sunt biologia molecular, genetica molecular, patologia molecular i chiar biochimia molecular. Astfel asistm la un adevrat triumf al molecularismului n biologie. Deci, conform modului actual de gndire, materia vie, n totalitatea ei, are natur molecular, iar descifrarea fenomenelor biologice, la nivel molecular va permite cunoaterea vieii, cunoaterea sistemelor vii (Karlson, 1967; Manta, 1968; Watson, 1974).

1.4.4. Teoria biostructural a materiei vii

Plecnd de la unele deficiene de ordin teoretic, experimental i filosofic ale teoriei moleculare acad. romn Eugen Macovschi elaboreaz o nou teorie despre natura i structura viului, teorie publicat n diverse articole i cri, ntre anii 1958-1976.

22

Conform concepiei lui Macovschi, principalele idei deficiente ale teoriei moleculare sunt urmtoarele: - Materia vie i materia moart sunt calitativ identice, dar nu se explic de ce cele dou forme ale materiei, vie i moart, au totui nsuiri att de diferite; se tie doar c formele materiei identice calitativ trebuie s aib i nsuiri de aceeai natur. - n materia vie toate reaciile chimice sunt coordonate i constituie metabolismul, viaa, fiind forma chimic de micare a materiei, dar nu se arat cum anume se realizeaz aceast coordonare a reaciilor chimice i nu se indic modul cum, de la chimismul obinuit coordonat, se ajunge la manifestrile vieii. Afirmaia c fenomenele biologice, manifestrile nsuirilor biologice ale materiei vii se reduc la chimismul obinuit este greu de neles. Se tie doar c nsuirile sunt ale materiei i depind de natura, de calitatea ei i nu sunt ale reaciilor chimice care se desfoar n materie, indiferent dac sunt sau nu coordonate. - Moartea este consecina ncetrii metabolismului adic a ncetrii coordonrii reaciilor chimice, dar nu se precizeaz cum se ajunge la ncetarea metabolismului. Prerea c odat cu moartea manifestarea nsuirilor biologice ale materiei vii nceteaz datorit ncetrii metabolismului este greu de neles. Se tie doar c ncetarea manifestrii unor nsuiri este condiionat de transformarea materiei purttoare a nsuirilor respective i nicidecum de ncetarea desfurrii sau coordonrii unor reacii chimice. - Fenomenele i legile biologice deriv, se reduc i se deduc din fenomene i legi chimice i fizice, dar nu explic n ce const i cum se realizeaz (Macovschi, 1969). Conform teoriei biostructurale, materia vie (viul) const din materie biostructural i din materie molecular coexistent. Materia biostructural este o form cu totul special a materiei, prin alctuirea sa specific, ea se deosebete de materia molecular obinuit, iar, prin structur, este purttoarea nsuirilor biologice pe care le imprim viului din care face parte. - Materia biostructural este alctuit din componente. Acestea provin din molecule normale, obinuite, ale combinaiilor chimice adecvate, care printr-un schimb de energie, realizabil numai n condiiile viului, se ncarc cu energie i trec ntr-o stare special, specific viului, integrndu-se n biostructur. Datorit strii speciale, componentele materiei biostructurale nu se mai comport ca molecule, iar datorit surplusului de energie ele exercit n cadrul materiei biostructurate anumite funcii elementare (biologice, bioritmice, cibernetice, genetice, informaionale etc.) pe care nu le pot exercita atunci cnd se afl n afara acestei materii, ca simple molecule. Exercitarea funciilor duce la manifestarea anumitor microfenomene, din a cror nsumare deriv fenomenele biologice, manifestarea vieii. Prin acumulri, cedri, i consumuri de energie, componentele pot suferi modificri care nu implic obligatoriu, dar nici nu exclud, manifestarea structurii chimice a componentelor respective. Modificrile componentelor se deosebesc profund de transformrile chimice obinuite, nu pot fi nelese i cercetate de pe poziiile chimice i reprezint modificri sau reacii biostructurale, totalitatea crora constituie biostructurismul materiei vii. Componentele materiei biostructurale se leag prin anumite fore corelative, biovalenele, care acioneaz numai n viul. Datorit acestor fore i strii speciale a componentelor, materia biostructural se prezint ca un ntreg continuu n care o modificare provocat n starea unei componente se transmite i se repercuteaz asupra strii celorlalte. Prin alctuirea, natura i funciile sale speciale, materia biostructural reprezint o structur biologic dinamic, n continu dezvoltare, care reflect stadiul superior de dezvoltare i organizare a materiei, prezint particulariti dependente de specie, individ, organ, esut, vrst etc., are nsuiri de semiconductor i de corp solid i se comport ca un sistem informaional, cibernetic, cuantificabil, cvadridimensional, purttor al bioplasmei i programului genetic, ce depete posibilitile de nelegere i de investigaie de pe poziiile moleculare. 23

Odat cu moartea, biostructura se destram, ceea ce duce nu numai la eliberarea unora din componentele ei sub form de molecule, dar i la apariia unor fragmente polinucleare mai mari sau mai mici, care includ enzime i ali compui chimici. Aceste fragmente, cu aspect de membrane, nu preexist ca atare n biostructur ci se formeaz ca artefacte pe msura destrmrii acesteia. Materia molecular coexist, formeaz materia nevie i ca atare nu este purttoarea nsuirilor biologice, dar particip la manifestarea acesteia n carul coexistenei cu materia biostructural. Biochimismul care se desfoar n materia molecular coexistent furnizeaz energia necesar att schimbrii moleculelor n componente, ct i meninerea integritii i strii funcionale normale a materiei biostructurale. La rndul ei, materia biostructural, prin fenomenele care se desfoar la nivelul ei, contribuie att la coordonarea biochimismului din materia molecular coexistent, ct i la asigurarea compoziiei chimice normale a acesteia. Astfel, cele dou forme ale materiei, biostructurat i molecular coexist i formeaz acea unitate morfo-funcional care constituie nsi materia vie. Teoria biostructural reprezint un mod de gndire despre natura materiei vii care prezint o serie de aspecte ipotetice, dar care deschide noi ci de cercetare ce vor confirma, modifica sau chiar abandona unele dintre aceste aspecte.

1.4.5. Teoria evoluionist, originea vieii i a omului

Pentru omul de cultur, evoluionismul a devenit o certitudine. Nimeni nu i pune problema originii omului dect din aceast unic perspectiv, cea a lui Darwin. n anul 1859 cercettorul britanic, Charles Darwin lansa o teorie care ncerca s explice originea speciilor de plante i animale altfel dect prin creaie. Conform acestei teorii, speciile ar evolua n mod naural unele din altele, de la forme simple la forme mai complexe i astfel ar fi luat natere toate vieuitoarele existente astzi, inclusiv omu, despre care se afirm c ar fi provenit dintr-o specie de maimu. Acest teorie, nu a fost demonstrat niciodat i au existat numeroase dicuii chiar n timpul lui Darwin, dar unele partide politice, fiind interesate mai ales de aspectul moral al problemei (dac omul se trage din maimu, atunci suntem liberi s ne purtm ca animalele ), au preluat ideea i au reuit s o impun ca teorie oficial. Astfel s-a ajuns ca n toate rile guvernate de asemenea partide s se nvee c omul se trage din maimu.i n colile din Romnia, la toate nivele continu s se predea teoria evoluionist, dei au trecut 18 ani de la cderea comunismului. Din nefericire, subiectul evoluionismului este nc ncrcat de reacii emoionale, ceea ce face ca o mulime de oameni s nu doreasc s-l discute. Iat care sunt n prezent concepiile cu privire la originea vieii i a omului: Evoluionismul ateist este ipoteza care afirm c speciile de animale s-au transformat unele n altele, de la primele vieti unicelulare pn la maimu i om, n mai multe miliarde de ani, mai afirm c speciile de plante au evoluat de la forma unicelular pn la plantele cu flori i c acest proces evolutiv s-a desfurat pe cale natural, prin factori ntmpltori. Dar, pn n prezent, nu exist nici o dovad a evoluiei speciilor, mai mult, raionamentele evoluioniste conin erori de logic i tiina actual respinge ipoteza evoluiei. Evoluionismul teist este ipoteza care afirm c evoluia speciilor este un fapt real, c ea a parcurs etapele prezenate de evoluionismul ateist, dar c este rezultatul lucrarii directe a lui Dumnezeu. Aici sunt de facut dou precizri, mai nti, ct rmne n domeniul tiinie, ipoteza evoluiei rmca o simpl ipotez, ns, n momentul n care este inclus n nvtura de credin, ipoteza devine o erezie.Teoria susine c Dumnezeu a creat doar dou vieti unicelulare pe care le-a ajutat apoi s evolueze pn la maimu i om, n miliarde de ani.

24

 Creaionismul fixist, este doctrina conform creia speciile nu sufer nici o schimbare, ci rmn exact cum au fost create. Realitatea arat c n cadrul speciilor pot aprea rase sau soiuri, fr a depi graniile speciei. Creaionismul tiinific este teoria tiinific(bazat pe genetic, pe teoria probabilitilor i pe teoria informaiei) ce demonstreaz c este imposibil ca speciile s apar spontan (din ntmplare) i s evolueze, transformndu-se una n alta. Din aceast imposibilitate rezult c speciile au fost create de un Creator. Referitor la fenomenul evoluiei se accept un proces evolutiv numit microvoluie, prin care, pornind de la populaii, rase i soiuri, prin mutaii genetice pot s apar populaii, rase i soiuri noi de plante i animale n cadrul aceleiai specii (indivizii deci, se pot ncrucia ntre ei dnd natere la urmai fertili). Prin extensia acestui fenomen evolutiv microevoluie desfurat la nivelul speciilor (care se pot ncrucia ntre ele) s-a ajuns la macroevoluie, fenomen ipotetic care ncearc s explice originea speciilor de plante i animale conform teoriei lui Darwin, teorie aflat n contradicie cu creaionismul, care afirm c speciile de plante i animale, inclusiv omul, au fost create de Dumnezeu. Unul dintre cei mai mari biologi, Piere P. Grass, fost preedinte al Academiei Franceze de tiine, i ncheie cartea sa volution du vivant (Evoluia organismelor vii,1973) cu acest nimicitor rechizitoriu al evoluiei darwiniste: Prin uzul i abuzul unor postulate ascunse, al unor ndrznee i adesea nentemeiate extrapolri, s-a creat o pseudo tiin. Ea prinde rdcini n chiar miezul biologiei, fcnd s rtceasc numeroi biochimiti i biologi, ce cred n mod sincer c acurateea conceptelor fundamentale a fost demonstrat, ceea ce este departe de realitate. ncepnd cu anii optzeci, tot mai muli savani necreaioniti au fcut cunoscut c teoria neodarwinist (modelul evoluionist actual), nu poate explica noile date din domeniul geologiei, paleontologiei, astronomiei, geneticii, fizicii, biochimiei i a altor tiine. Astfel, n anul 1985 a aprut cartea lui Michael Denton, cercettor australian n domeniul biologiei moleculare, Evolution: A Theory in Crisis (Evoluia: criza unei teorii), ce ofer o critic sistematic a modelului evoluionist actual din perspectiva mai multor discipline tiinifice.Din punctul de vedere al propriei discipline, Denton arat c descoperirile specialitilor n biologie molecular arunc din ce n ce mai multe ndoieli asupra preteniilor darwiniste. n anul 1996 apare cartea renumitului profesor de biochimie de la Berkeley University din California, Michael Behe, Darwin's Black Box (Cutia neagr a lui Darwin), n care se arat c uimitoarele descoperiri ale biochimiei nu se mpac deloc cu nici un fel de darwinism. n 1997 o alt carte ce ddea de gndit a constituit o puternic lovitur mpotriva darwinismului: Not By Chance !( Nu ntmpltor !) de Dr.Lee Spetner. Biofizician evreu, specializat n codul genetic, Spetner i-a petrecut 30 de ani cercetnd posibilitatea evoluiei la nivel genetic. El arat nu numai de ce mutaiile ntmpltoare nu vor produce niciodat schimbrile pretinse de evoluioniti, ci ofer i noi ci tiinifice de investigare a felului cum are loc variaia n limitele genetice ale fiecrui fel de organism. n ultimii ani, savani reputai au nceput s ridice serioase ndoieli asupra evoluiei, darwiniste, astfel c pn n prezent a aprut o mare cantitate de literatur tiinific extrem de critic la adresa teoriei evoluioniste. Unii caut un nou model, dei nu prea tiu unde s-l gseasc. Ar fi desigur prea mult s socotim c toi acetia se vor ntoarce ctre modelul creaionist, ntruct, nici creaia, nici evoluia nu pot fi dovedite n chip definitiv: de fapt, amndou in de credin i filozofie, de o alegere iniial.

25

Capitolul 2 MEMBRANELE CELULARE

O ramur aparte a biologiei moleculare biomembranologia - a fost oficializat n anul 1977, cu ocazia unui simpozion desfurat n Germania, la Karlsruhe. Aceast nou ramur a biologiei, care se ocup cu studiul membranelor celulare, a reuit s se contureze prin colaborarea interdisciplinar a unui numr foarte mare de specialiti n domeniul biologiei, medicinii, biofizicii, biochimiei. n 1950 erau descrise doar dou membrane: cea plasmatic i cea nuclear. n cursul anilor 60, datorit posibilitilor de investigaie oferite de microscopia electronic, au putut fi evideniate i studiate n detaliu un numr tot mai mare de structuri membranare (tip organite permanente celulare: reticul endoplasmatic, mitocondrii, complex Golgi, ct i structuri cu via limitat, tip vezicule de condensare i lipozomi). Orice ptrundere din mediul exterior n interiorul organismului implic un schimb transmembranar. Prin urmare, substanele exogene trebuie s traverseze una sau mai multe membrane biologice nainte de a ajunge la centrii activi. Traversarea membranelor este condiionat de: natura chimic i organizarea moleculelor constitutive ale membranei; proprietile fizico-chimice ale substanei, structura fizico-chimic a moleculelor mediului de o parte i de cealalt a membranei.

2.1. Definiia i clasificarea membranelor celulare

Membranele celulare reprezint structuri complexe ce delimiteaz i compartimenteaz coninutul celular. Arhitectura tuturor membranelor celulare (membrana plasmatic i membranele organitelor) prezint drept caracteristic comun asamblarea prin legturi necovalente a biomoleculelor componente (lipide i proteine) ntr-o structur dinamic i fluid. Elementul structural fundamental al membranelor celulare, dublul strat lipidic, definete modul de organizare al lipidelor i se comport ca o barier impenetrabil pentru majoritatea moleculelor hidrofile (aqua-solubile). Proteinele membranare, asociate dublului strat lipidic, asigur funcionalitatea membranelor, ele fiind implicate n multiple procese: transportul molecular i ionic transmembranar; realizarea conexiunilor intercelulare i a ancorrii celulelor n matricea extracelular; desfurarea reaciilor enzimatice asociate structurilor membranare; controlul fluxului de informaie dintre celul i mediul nconjurtor prin recunoaterea, legarea i transmiterea moleculelor-semnal; imunitatea celular. Grefarea seturilor distincte de proteine n dublul strat lipidic, ct i stabilirea unui anumit raport ntre principalele molecule componente conduc la clasificarea membranelor celulare n trei tipuri: Membrana citoplasmatic (membrana plasmatic, plasmalema) este o structur bidimensional continu (grosimea 6-10 nm), cu proprieti caracteristice de permeabilitate selectiv, ce confer individualitate celulei, separnd-o de mediul nconjurtor. Membranele interne ale celulelor eucariote endomembranele - (grosimea 6 nm) compartimenteaz spaiul intracelular, delimiteaz organitele celulare (nucleu, reticul endoplasmatic, aparat Golgi, mitocondrii, lizozomi, peroxizomi), crend astfel spaii adecvate reaciilor enzimatice celulare. Membranele speciale prezint particulariti structurale, n aceast categorie ncadrndu-se: teaca de mielin, o structur multimembranar derivat din membrana

26

plasmatic a celulelor Schwann ce nconjoar i izoleaz axonul celulelor nervoase; discurile suprapuse localizate n regiunea extern a celulelor fotoreceptoare din retin.

Fig. 4. Structura inframicroscopic a celulei 1-membrana celular; 2endoplasma (hialoplasma); 3ergastoplasm; a-reea endoplasmatic (membrane cu dublu contur); b-granulaii fine (microzomi); 4-filamente intracelulare (descoperite n celule epiteliale, fibroblati, n celule nervoase); 5-vacuol; 6-granule lipidice; 7-centrul celular; 8centrosfer; 9-nucleu; c-membrana nucleului; d-pori n membrana nucleului; 10-nucleol; 11-aparatul Golgi; 12-mitocondrii

2. 2. Organizarea membranelor celulare

n prezent se bucur de acceptare unanim modelul n mozaic fluid lipido-proteic elaborat n 1971-1972 de ctre Singer i Nicolson care satisface condiiile de stabilitate termodinamic ale sistemelor membranare. Elementele care l-au impus constau pe de o parte, n confirmarea dublului strat lipidic ca element fundamental al structurii membranelor i pe de alt parte, n definirea modului de asamblare a proteinelor n dublul strat lipidic. Autorii concep membrana celular ca pe un fluid structurat alctuit dintr-un bistrat lipidic aflat ntr-o stare de cristal lichid i care este penetrat local sau parial de proteine globulare cu caracter insular (fig. 5). Lipidele i proteinele membranare, relativ libere prezint mobilitate n planul membranei executnd micri de difuziune i rotaie n jurul propriilor axe. La componentele de baz ale membranelor - lipidele i proteinele - se adaug constant carbohidraii, apa i o serie de ioni. Pe partea citoplasmatic membrana este susinut (n numeroase cazuri) de o reea de proteine fibrilare ce constituie un citoschelet.

27

Fig. 5. Structura unei membrane biologice (Stryr, 1991) a i b = proteine periferice de membran; c = protein de membran (tip lecitinic): traverseaz bistratul lipidic; d = protein de membran (tip Ig): traverseaz bistratul lipidic Modelul mozaicului fluid ofer cadrul conceptual adecvat pentru explicarea att a funciilor de transport, ct i a plasticitii conformaionale a celulelor, a proceselor imunologice i a efectelor produse asupra membranelor de diferii ageni chimici (hormoni, mediatori chimici, medicamente, toxine etc.). Membranele biologice au structuri fluide dinamice n continu modificare; n fiecare moment, proteinele i lipidele din structura membranelor sunt nlocuite cu altele noi. Ribozomii i reticulul endoplasmatic, care sintetizeaz aceste proteine de membran, le nzestreaz cu capacitatea de a se ndrepta spre anumite inte, ctre anumite sedii celulare (transport vectorial). n celula vie, sinteza de membrane se face prin extensia membranelor preexistente (pattern-uri de membran) n cursul procesului de multiplicare celular (mitoza sau meioza), cnd celula mam transmite celor dou celule fiice o dat cu zestrea celular i o anumit zestre de membran. Aceast motenire a pattern-urilor de membran de ctre celulele fiice de la celula mam reprezint un aspect al continuitii n timp i spaiu a sistemului de membrane. Aceste aspecte de continuitate asigur de fapt continuitatea de funcionare a celulei i implicit, desfurarea normal a metabolismului celular. S-a dovedit c toate moleculele proteice din structurile de membrane vegetale sau animale au via relativ scurt, fiind nlocuite mai rapid (rapid turnover) sau mai puin rapid (slow turnover). Din acest aspect reiese c orice tip de membran biologic are o continuitate de organizare, dar nu i continuitate de substan, deoarece din stratul proteic sunt nlocuite n permanen un numr de molecule de aminoacizi vechi cu molecule noi corespunztoare, dei funcia respectivei proteine rmne n permanen nemodificat.

2.2.1. Caracterizarea componentelor lipidice ale membranelor celulare

Lipidele membranare formeaz un dublu strat cu grosimea de 4-5 nm: un strat extern, orientat spre faa extern a membranei i un strat intern, orientat spre faa intern citoplasmatic a membranei. Lipidele sunt molecule insolubile n ap, dar nalt solubile n solveni organici (cloroform). ntr-un m2 de dublu strat lipidic se gsesc 5 x 106 molecule lipidice. Dei compoziia lipidic a diferitelor membrane variaz mult, fosfolipidele, colesterolul i glicolipidele reprezint clasele de lipide cel mai frecvent ntlnite n structura membranelor biologice (tabelul 1). 28

Tabelul 1. Procent din greutatea molecular total a lipidelor membranare

Membrana plasmatic a celulei hepatice (%) 17 54 7 22 Membrana plasmatic a eritrocitului (%) 23 60 3 13 Teaca de mielin (%) 22 42 28 8 Membrana extern i intern a mitocondriei (%) 3 76 urme 21 Membrana reticulului endoplasmatic (%) 6 67 urme 27

Lipide Colesterol Fosfolipide Glicolipide Alte lipide

Bistraturile lipidice membranare sunt formate din fosfo- i glicolipide, ele reprezentnd bariere de permeabilitate pentru moleculele hidrosolubile, dei straturile sunt aproape fluide. Aceste lipide de membran sunt amfipatice, conin un cap hidrofilic, care are o varietate de structur relativ mic i poart sarcini electrice i o coad hidrofob, format din 12-24 atomi de carbon, lipsit de sarcini electrice i cu o mare varietate de structur care se datoreaz unor acizi grai deosebii. Acizii grai pot fi saturai sau nesaturai, ei difer cantitativ i calitativ n raport cu specia, vrsta, condiiile de via etc. Cu ct gradul de nesaturare al acizilor este mai mare, cu att fluiditatea structurilor membranare este mai mare. Datorit acestui caracter amfipatic, lipidele, n mediu lichid, pot forma: micelii (fig. 6a), strat dublu linear (fig. 6b), strat dublu circular (lipozomi, fig. 6c).

Fig. 6. Cele trei forme pe care le pot lua moleculele de lipide n mediu lichid datorit proprietilor lor amfipatice n acest strat dublu, capul hidrofilic este orientat spre exterior, iar coada hidrofob este orientat spre interior. Moleculele de lipide se deplaseaz foarte rapid rotindu-se n jurul propriului lor ax i difuznd lateral, n acest fel asigurnd fluiditate de membran. Fluiditatea este asigurat de prezena acizilor grai i a colesterolului. La eucariote, proporia fosfolipide/colesterol n membrana plasmatic este de 1/1, colesterolul aflndu-se la extremitatea hidrofil, prevenind scderea fluiditii membranelor. Procesul de formare a acestui bistrat lipidic n mediu apos este un proces de autoasamblare, rolul major avndu-l fora de interaciune hidrofob (interaciune necovalent). Straturile bilipidice sunt nalt impermeabile pentru ioni i pentru cele mai multe molecule polare (cu excepia apei, care traverseaz foarte rapid aceast membran). Pentru traversarea stratului bilipidic, bistratificat, o molecul necesit o cantitate foarte mare de energie.

29

2.2.2. Componenta proteic a membranelor celulare

n stratul lipidic plutesc proteine rigide hidrofobe. Proteinele reprezint 50% din volumul de membran. n timp ce lipidele au rol de barier de permeabilitate i de delimitare a componentelor biologice, proteinele mediaz aproape toate funciile, de exemplu, proteinele din membrana plasmatic au rol de pompe n transportul transmembranar, receptori, enzime, antigene de membran, iar proteinele din membrana intern a mitocondriilor i cloroplastelor au rol de transductori de energie. Membranele care ndeplinesc funcii diferite conin n structura lor i proteine diferite. Proteinele pot fi inserate n dublul strat lipidic n diferite moduri; acestea ptrund adnc sau chiar traverseaz stratul de lipide al membranei, numindu-se proteine integrale sau intrinseci (tip Ig), altele pot fi implantate la nivelul unui singur strat din cele dou ale membranei lipidice (tip lecitinic), iar altele pot fi ataate doar covalent (adsorbite) la extremitatea polar hidrofil a lipidelor i se numesc periferice sau extrinseci. Proteinele sunt amfipatice, coninnd o regiune hidrofob care reacioneaz cu regiunea hidrofil lipidic (din interiorul stratului lipidic) i o regiune hidrofil situat la suprafaa intern i respectiv extern a membranei. n acest fel cele dou suprafee de membran difer ntre ele prin cantitatea de lipide i proteine, realiznd o asimetrie funcional. n regiunea transmembranar, proteinele de membran conin predominant regiuni hidrofobe cu structur secundar tip -helix i structuri teriare i cvaternare compacte. Proteinele de membran pot forma pete difuze, se pot deplasa spre polii celulei unde sunt eliminate sau pot fi blocate n micarea lor lateral, rmnnd fixe n plan orizontal (formnd agregate care se ancoreaz de alte structuri ale citosolului sau de proteine din membranele celulare vecine). Proteinele periferice (extrinseci) pot fi eliberate prin simpla splare cu soluii saline sau prin modificri de pH (de exemplu, spectrina, localizat pe suprafaa citoplasmei eritrocitelor, sau actina, cu rol n contracia muscular). Proteinele integrale (intrinseci) interacioneaz strns cu hidrocarbonaii din lipidele de membran i nu pot fi disociate dect n prezena detergenilor i a solvenilor organici.

2.2.3. Mobilitatea lipidelor i proteinelor de membran

Lipidele i proteinele de membran difuzeaz rapid n planul membranar, avnd o micare lateral constant, ceea ce face ca o membran biologic s nu fie o structur rigid. Proteinele prezint numai difuziune lateral; lipsa difuziei transverse face posibil pstrarea timp ndelungat a asimetriei de membran. O molecul lipidic poate cltori de la un capt la altul al celulei bacteriene n timp de o secund. Unele proteine de membran difuzeaz n timp de un minut la distan de civa microni; alte proteine (rodopsina) sunt la fel de mobile ca i lipidele, altele sunt virtual imobile (fibronectina). Lipidele prezint difuziune lateral - micare paralel cu planul bistratului (difuziune n planul membranei) sau transvers (tip fleep - flop), adic rotaie spontan a moleculei lipidice de pe o fa a membranei pe cealalt. Este un proces foarte lent. Se produce o rotaie la cteva ore (de exemplu, fosfolipide, urmrite prin tehnica de rezonan magnetic). Pe baza datelor prezentate se poate considera c att fluiditatea dublului strat lipidic, ct i liber deplasare a lipidelor i proteinelor n structurile membranare, constituie principalele elemente ce stau la baza caracterului dinamic al membranelor celulare.

30

2.2.4. Componenta glucidic membranar

Carbohidraii se ntlnesc pe suprafaa tuturor membranelor plasmatice ale celulelor eucariote i reprezint 2-10% din greutatea componentelor membranare. Carbohidraii, sub forma oligo- i polizaharidelor se leag covalent de proteine i lipide formnd glicoproteinele i respectiv, glicolipidele. Dac majoritate proteinelor aflate pe suprafaa celular sunt glicoproteine, numai una din 10 molecule lipidice ale monostratului extern conine carbohidrai. Carbohidraii se ntlnesc i n structura proteoglicanilor, molecule membranare integrale alctuite din lanuri polizaharidice lungi legate de un miez proteic. Proteina din structura proteoglicanilor traverseaz dublul strat lipidic, n timp ce lanurile polizaharidice rmn n afara celulei, constituind parte component a matrixului extracelular. Zaharurile sunt foarte hidrolitice, ele prefer s se orienteze spre suprafaa apoas a membranei (i nu spre miezul hidrofob), deoarece orientarea invers ar cere un consum foarte mare de energie; deci absena respectivei cantiti de energie reprezint o barier puternic n calea rotirii de tip fleep-flop a moleculei de hidrocarbonat. Hidrocarbonaii de pe suprafaa celular au o mare densitate de structur i au rol n recunoaterea intercelular (fa de celulele sistemului imunitar). Structurile de glicoproteine au funcie de receptori, ele primesc informaia din mediul extern i o transmit spre interiorul celulei sub forma unor cascade de reacii biochimice, care au drept consecin modificri ale activitii celulare (activitatea secretorie, de multiplicare, etc).

2.2.5. Glicocalixul
Suprafaa celular este alctuit din trei elemente: cortexul celular (zona periferic citoplasmei), membrana plasmatic i glicocalixul, n cazul celulelor animale. Glicocalixul reprezint zona periferic a suprafeei celulei animale. n structura sa intr att lanurile oligo- i poliglucidice ale glicolipidelor i glioproteinelor membranare, ct i glicoproteine sintetizate de celul i apoi absorbite pe suprafaa celular (Fig. 7). Faptul c cele dou componente ale glicocalixului sunt n acelai timp i elemente ale matricei extracelulare face dificil stabilirea unei linii clare de demarcaie ntre suprafaa celular i matrice. Rolul glicocalixului nu este pe deplin elucidat. Concentraia mare de oligozaharide complexe la suprafaa celular poate sprijini ipoteza implicrii acestei structuri n procese de recunoatere celul-celul sau celul-matrice. De asemenea, majoritatea lanurilor oligozaharidice conin unul sau mai multe reziduuri de acid sialic, molecul cu sarcin electric negativ. Glicocalixul realizeaz deci, distribuia sarcinilor electrice pe suprafaa celulei. n plus, datorit ncrcrii electrice negative, glicocalixul poate funciona ca depozit de cationi (Ca2+) ce sunt mobilizai n celul n funcie de necesitile exprimate la un moment dat.

Fig. 7. Prezentarea schematic a glicocalixului

31

2.2.6. Apa
Apa deine un loc important n structura membranar alturi de celelalte componente chimice. Se gsete n proporie de 30-50 % asociat intim fie structurilor de la suprafa, fie sub form foarte ordonat, structural asemntoare gheii (apa legat chimic). ntr-o astfel de stare, apa joac un rol precumpnitor n procesele de organizare molecular a membranei, intervenind n stabilitatea structurilor proteice i fosfolipidice bistratificate, ca un liant. Permeabilitatea selectiv poate fi privit ca fiind n raport cu apa structuralizat din membran. Modificrile de permeabilitate determinate de procesul de excitaie poate fi consecina topirii structurii hidrice n anumite regiuni.

2.2.7. Asimetria distribuiei componentelor membranare

Imaginea membranei celulare ca o soluie lipidic n care plutesc moleculele proteice pare astzi simplist. n multe celule proteinele i lipidele sunt meninute n regiuni bine delimitate ale membranelor. Distribuia asimetric a moleculelor membranare joac un rol esenial n realizarea funciilor celulare. Distribuia asimetric a compartimentului lipidic pe cele dou fee ale dublului strat lipidic a fost pus n eviden pentru prima dat n membranele eritrocitelor. Astfel, n timp ce n monostratul extern al membranei predomin fosfatidilcolina i sfingomielina, stratul intern conine fosfotidiletanolamina i fosfatidilserina drept componente lipidice majore. Deosebirile dintre aceste lipide nu se limiteaz doar la natura gruprilor polare, ea se refer i la gradul de nesaturare a lanurilor hidrocarbonate, ceea ce, n planul membranei, determin o fluiditate diferit a celor dou straturi lipidice. n acest context este de remarcat faptul c exist i o distribuie asimetric a sarcinilor electrice. Singurul fosfolipid cu sarcin electric negativ, fosfatidilserina, este localizat n monostratul intern al membranei eritrocitare. Implicaiile asimetriei lipidelor la nivel funcional nu sunt nc pe deplin cunoscute. Este posibil ca activitatea diferitelor proteine membranare s fie dependent de microclimatul creat prin prezena fosfolipidelor specifice. De asemenea, activitatea enzimatic a proteinelor asociate structurilor membranare poate fi condiionat de sarcina electric a fosfolipidelor. Localizarea glicolipidelor n monostratul extern al membranelor plasmatice, ct i caracterul lor special sugereaz implicarea acestor molecule ca receptori n procesele de comunicare intercelular. n acelai timp, toate proteinele membranare integrale au o orientare strict n raport cu faa citoplasmatic i cea extern a membranei celulare. n plus, proteinele transmembranare sunt n majoritate molecule glicolizate. n membranele plasmatice lanurile oligozaharidice marcheaz faa exoplasmatic, n timp ce, n membranele organitelor celulare (reticul endoplasmatic, aparat Golgi) ele se gsesc pe faa citoplasmatic. Stricta orientare a glicoproteinelor este corelat cu funciile celor dou fee ale membranelor celulare. Moleculele proteice transmembranare ce conin cistein cunosc i ele o orientare strict. Mai mult, gruprile sulfhidril ale cisteinei formeaz puni disulfurice inter i/sau intra-catenare, doar pe fa extern a membranei. n anumite celule, distribuia asimetric a lipidelor i proteinelor conduce la delimitarea unor domenii specifice n membranele plasmatice. Astfel, membrana celulelor epiteliale este mprit n domenii distincte: apical i latero-bazal, ambele avnd un coninut proteic i lipidic diferit. Ca urmare, celulele epiteliale sunt capabile s mpiedice difuzia moleculelor membranare. Acest lucru se realizeaz prin intermediul jonciunilor strnse ce funcioneaz ca o barier ntre cele dou domenii membranare.

32

2. 3. Mecanismele de transport prin membranele celulare

Celula, din punct de vedere termodinamic, este un sistem deschis, existena sa fiind condiionat de stabilirea unei permanente comunicri cu mediul nconjurtor. Abordnd aceast problem din perspectiva schimbului de substane pe care celula l realizeaz cu mediul extern, un rol major revine membranei plasmatice datorit caracteristicii sale fundamentale, permeabilitatea selectiv. Aceasta face posibil alimentarea celulei cu molecule eseniale (glucoz, aminoacizi, lipide) i eliminarea att a produilor fiziologic activi (enzime, hormoni), ct i a celor rezultai ca deeuri n urma metabolismului celular (CO2, sruri de amoniu, uree). n paralel cu asigurarea continuitii acestor schimburi, permeabilitatea selectiv creeaz cadrul favorabil desfurrii unei activiti metabolice stabile, att prin meninerea n spaiul intracelular a unei concentraii relativ constante de substane organice, metabolii i electrolii, ct i prin reglarea volumului celular ca rezultat al relaiilor osmotice celul-mediu. Permeabilitatea selectiv se modific dinamic aflndu-se sub influena modificrilor mediului extracelular i a metabolismului celulei. Aceast caracteristic a membranelor celulare prezint particulariti n raport cu diferenierea funcional a celulelor. Selectivitatea difereniat se manifest att la trecerea substanelor din exterior n celul, ct i n sens invers. Deci, la baza noiunii de permeabilitate selectiv st conceptul de membran ca barier a schimburilor celulare. Traficul de substane ce se desfoar att prin membrana plasmatic ct i prin membranele interne ce delimiteaz organitele celulare antreneaz diferite mecanisme de transport.

2.3.1. Procesul calitativ al traversrii membranelor

Se consider c au loc urmtoarele etape (fig. 8): molecula trebuie s avanseze n zona apoas (mediu i zona periferic a membranei), ceea ce se realizeaz dup legile difuziei simple n mediu apos. Fiecare molecul formeaz legturi de hidrogen cu apa din interiorul celulei. Agitaia termic a moleculelor asigur moleculei energia de activare necesar ruperii unor legturi de hidrogen, cu refacerea lor spontan i imediat. n momentul cnd molecula atinge stratul hidrofil al membranei, acesta avnd coninut de ap apropiat de cel al mediului, permite continuarea micrii libere a moleculei. Prin urmare, traversarea stratului exterior hidrofil se realizeaz fr consum de energie (fig. 8, poriunea a); n etapa urmtoare, molecula trebuie s se desprind de stratul hidrofil i s treac n stratul lipofil, ceea ce necesit o energie de activare molecular (fig. 8, poriunea b). n raport cu caracteristicile moleculare, variaz i intensitatea energiei necesare pentru intrarea moleculei n stratul hidrofob; continuarea difuziei n startul hidrofob nu reclam energie de activare suplimentar pentru c trebuie s se desfac legturi de hidrogen (fig. 8, poriunea c); n fine, molecula prsete stratul hidrofob (fig. 8, poriunea d), fenomen facilitat de formarea legturilor de hidrogen cu moleculele de ap din stratul membranar proteic hidrofil interior, de unde trece prin acelai fenomen, n citoplasm (fig. 8, poriunea e).

33

Fig. 8. Modificrile energetice care nsoesc traversarea unei molecule hidrosolubile printr-o membran biologic (dup Maziliak). Se descriu urmtoarele posibiliti de traversare a unei membrane: proces pasiv: transfer pasiv, care asigur trecerea moleculelor mici hidrosolubile, inclusiv apa, prin simpla filtrare prin pori (filtrarea) i a moleculelor mari liposolubile prin dizolvare n membran (difuzia simpl); proces biochimic: transport specializat, fie activ, fie facilitat; proces biologic: endocitoz, cnd particulele de substan sunt nglobate de membrana celular prin micri de invaginare i transfer astfel spre interior.

2. 3 .2. Transportul ionilor i moleculelor mici prin membranele celulare

Maniera n care substanele trec prin membranele celulare este determinat pe de o parte de caracteristicile substanelor (greutate molecular, dimensiuni, form, grad de hidratare (grad de ionizare) iar pe de alt parte, de compoziia chimic a membranelor. Principalul criteriu de clasificare a tipurilor de transport l reprezint dimensiunile substanelor ce strbat membrana. Astfel, n timp ce ionii i moleculele mici traverseaz dublul strat lipidic prin difuziune sau implicnd proteinele membranare, transportul macromoleculelor i al particulelor necesit sechestrarea lor n vezicule delimitate de membrane. Un alt criteriu de clasificare este consumul de energie metabolic sub form de ATP. Din acest punct de vedere se disting dou tipuri de transport: pasiv i activ. 2.3.2.1.Transportul pasiv Traversarea membranelor celulare de ctre molecule i ioni n sensul gradientului de concentraie sau electrochimic (compus din gradientul de concentraie i gradientul electric) poart numele de transport pasiv. Procesul nu implic consum de energie (ATP), dimpotriv, el decurge cu pierdere de energie liber. Unele gaze (O2, CO2) i unele molecule mici cu caracter hidrofob sunt capabile s strbat dublul strat lipidic membranar prin difuziune simpl. Transportul moleculelor solubile n ap (glucoz, nucleotide, amonoacizi) i al unor ioni (H+, K+, Na+, Ca2+) nu poate fi realizat n aceeai manier, necesitnd participarea unor proteine membranare specifice. Acest tip de transport este denumit difuziune facilitat. a. Difuzia simpl Cel mai simplu tip de transport pasiv const n difuzia fizic a moleculelor determinat de gradientul lor de concentraie sau electrochimic. n difuzia simpl moleculele nu sunt modificate chimic sau asociate altor specii moleculare n timpul trecerii lor prin membran. Viteza cu care se desfoar etapa trecerii moleculelor din mediul apos extracelular/intracelular n interiorul hidrofob al membranei este dependent de coeficientul de partiie (K) al moleculei. Acesta msoar afinitatea relativ a moleculei pentru mediul lipidic n raport cu apa, ilustrnd gradul de hidrofobicitate al moleculei. Astfel, cu ct valoarea sa este mai mare, cu att molecula are un mai pronunat caracter hidrofob, deci este mai liposolubil i ptrunde mai repede n celul. Se constat existena unei relaii de direct proporionalitate ntre coeficientul de partiie al unei molecule i 34

constanta de permeabilitate (P) a membranei celulare. Datorit vscozitii dublului strat lipidic, viteza de difuziune a moleculei prin interiorul membranei este mult inferioar vitezei sale de difuziune printr-un mediu apos. n cazul transportului prin difuzie simpl a moleculelor fr sarcini electrice, se respect legea lui Fick. Aceasta enun c viteza de difuziune (dn/dt) a unei molecule este proporional cu diferena de concentraie, suprafaa (S) i coeficientul de permeabilitate (P). Deci, viteza de difuziune a unei molecule prin membran conform legii lui Fick este: unde: S - reprezint suprafaa membranei P este coeficientul de permeabilitate al membranei; C1aq, C2aq - sunt concentraiile mediilor apoase separate de membrana celular. Difuzia simpl prin membranele celulare se realizeaz cu pierdere de energie liber. Calculele termodinamice demonstreaz c la deplasarea unui mol de substan fr sarcin electric, de la o concentraie de 1M la o concentraie de 0,1M (la 250C) sistemul pierde o energie liber de 1,359 kcal/mol. n difuzia moleculelor ncrcate electric legea lui Fick nu mai are aplicabilitate, procesul fiind exclusiv determinat de gradientul electrochimic. b. Difuzia facilitat n procesul de difuziune facilitat, transportul pasiv al moleculelor prin membran este mediat de proteine membranare numite permeaze. Spre deosebire de difuzia simpl, difuzia facilitat se caracterizeaz prin specificitate fa de molecula transportat. Permeaza leag reversibil i complementar la un situs activ o singur specie molecular sau molecule aparinnd unei singure familii. n urma legturii ce are loc pe o fa a membranei se formeaz un complex molecul-permeaz ce traverseaz dublul strat lipidic, disociindu-se pe cealalt fa a membranei cu eliberarea moleculei transportate. Unul din modelele care au ncercat s explice maniera n care se desfoar difuzia facilitat este modelul transportorilor crui (carrier model). n acest model se consider c transportorul exercit o micare de navetare sau rotaie n dublul strat lipidic, fiind astfel capabil s treac molecula transportat de pe o fa pe alta a membranei celulare. Deoarece difuzia facilitat este un tip de transport pasiv, iar rotirea unei molecule proteice n planul membranei este defavorizat din punct de vedere energetic, modelul carrier rmne aplicabil numai pentru transportul anumitor ioni de ctre polipeptide antibiotice (de exemplu, transportul ionului de K+ de ctre valinomicin). Cea mai bine caracterizat permeaz, D-gluco-permeaz (sau D-hexozo-permeaz), catalizeaz difuzia facilitat a glucozei prin membrana eritrocitelor (Fig. 6). D-glucopermeaza este o protein transmembranar alctuit de 12 -helixuri care au n majoritate un caracter hidrofob. Are o greutate molecular de 45.000 Da. (dn/dt)= PxS (C1aq C2aq)

Fig. 9. Mecanismul transportului mediat de Dgluco-permeaz n parte, permeabilitatea selectiv a membranelor plasmatice poate fi explicit prin existena proteinelor canal. Aceste proteine transmembranare, strbtute de un canal delimitat de aminoacizi hidrofili, formeaz porii membranari. Proteinele canal specializate n transportul selectiv al diferitelor specii ionice se 35

numesc proteine canal de ioni. Transportul mediat de aceste proteine nu necesit consum de energie, ionii difuznd cu viteze diferite prin membran n sensul gradientelor de concentraie. Proteinele canal de ioni se deschid tranzitoriu, caracteristic ce a sugerat denumirea lor de proteine canal cu poart (gate channels). De regul, deschiderea canalelor reprezint un rspuns celular la diferite semnale recepionate de membrana plasmatic. n funcie de factorii ce comand deschiderea porilor, se deosebesc trei tipuri de proteine canal: cu poart comandat de stimuli mecanici; cu poart comandat de liganzi. cu poart comandat de voltaj (dependente de valoarea potenialului de membran) (Fig. 12). n acest caz canalele se deschid n urma legrii la un receptor a unei molecule semnal ce poate fi un mediator extracelular (neurotransmitor) sau un mediator intracelular (ion, nucleotid, protein de legare a GTP) (Fig. 10, 11);

A Fig. 10. Modificarea conformaional a receptorului acetilcolinic - protein canal de Na+ cu poart comandat de ligand.

B Fig. 11. Schema jonciunii neuromusculare i principalele proteine canal de ioni implicate de declanarea contraciei musculare sub aciunea impulsului nervos. A - starea de repaus; B - starea activat

Fig. 12. Structura canalului de Na+ cu poart comandat de voltaj 2.3.2.2. Transportul activ Deplasarea moleculelor i ionilor prin transport pasiv evolueaz spre egalarea concentraiilor de o parte i de alta a membranei i, implicit, dispariia potenialului 36

membranar. Pentru a menine homeostazia mediului intracelular, celula i-a creat mecanisme de transport activ capabile s deplaseze moleculele i ionii n sens invers gradientelor lor de concentraie i electrochimic. Acest tip de transport este mediat de proteine specifice i prezint toate caracteristicile cinetice ale difuziei facilitate. Plusul de independen fa de compoziia mediului nconjurtor, pe care transportul activ l ofer celulei, implic consum de energie metabolic. Astfel, eritrocitele utilizeaz 50% din energia stocat n moleculele de ATP pentru a menine o concentraie ionic relativ constant a mediului intracelular. n funcie de modul n care este utilizat energia se deosebesc dou tipuri de transport activ. n transportul activ propriu-zis, molecula transportoare are funcie ATP-azic, fiind capabil s utilizeze direct energia rezultat n urma hidrolizei ATP n procesul de transport (pompele ionice). Al doilea tip de transport activ poart numele de cotransport. n cadrul acestui transport moleculele i ionii sunt deplasai mpotriva gradientelor lor de concentraie pe seama energiei eliberate n transportul pasiv al altor molecule i ioni. n unele cazuri de cotransport, energia moleculelor de ATP este utilizat indirect prin intermediul gradientelor ionice. a. Pompele ionice Se cunosc trei clase de proteine ce cupleaz direct transportul ionilor mpotriva gradietelor lor electrochimice cu desfacerea legturilor fosfodiesterice din molecula de ATP i formarea de ADP (adenozin difosfat) i fosfor anorganic (P): clasa ATP-azelor P; clasa ATPazelor V (H+-ATP-aze); clasa ATP-azelor F. Clasa ATP-azelor P conine trei reprezentani. Primul reprezentant al acestei clase i cel mai rspndit - Na -K+-ATP-aza (pompa de Na+-K+) prezent n membranele plasmatice ale tuturor celulelor animale este unul dintre cele mai studiate sisteme de transport activ. Na+ K+-ATP-aza pompeaz Na+ n mediul extracelular i introduce K+ cu sarcin n celul. Mecanismul de aciune Na+-K+-ATP-aza, dei insuficient cunoscut, are la baz modificarea conformaional a enzimei. Astfel, este posibil formarea unor canale n proteina transportoare ce permite trecerea ionilor de Na+ i K+ prin membrana plasmatic. Energia ce asigur conversia conformaiei enzimei (E1 E2) ct i pomparea ionilor mpotriva gradientului lor de concentraie este furnizat de hidroliza moleculelor de ATP (Fig. 13). Funcionarea Na+-K+-ATP-aza asigur meninerea unei concentraii intracelulare relativ ridicat a ionilor de K+ ce condiioneaz desfurarea normal a unor procese celulare vitale cum sunt: biosinteza proteic, activitatea catalitic a unor enzime (piruvat-kinaza) i meninerea potenialului de membran a celulelor excitabile. Al doilea reprezentat al clasei de ATP-azei P este Ca2+-ATP-aza (pompa de Ca2+). Este localizat n membranele plasmatice asigurnd meninerea unei concentraii intracelulare sczute a ionilor de Ca2+. n celulele musculare enzima este prezent n membrana reticulului sarcoplasmic, fiind implicat n transportul ionilor de Ca2+ din citosol n acest organit celular. Traficul Ca2+ prin membrana reticulului sarcoplasmic n celulele musculare, mediat de Ca2+ATP-aza, este esenial n procesul de contracie relaxare muscular. Pomparea ionilor din reticulul sarcoplasmic n citosol determin contracia muscular, n timp ce nlturarea ionilor din citosol permite relaxarea muscular. O protein capabil s lege specific ionii de Ca2+ a fost identificat i n citosol. Proteina numit calmodulin este alctuit dintr-un singur lan polipeptidic i are o funcie reglatoare modificnd viteza de pompare a ionilor de Ca2+ n raport cu concentraia citosolic a acestora. Ultimul constituient al ATP-azelor P transport ionii de H+, n unele cazuri mpreun cu K+.

37

Fig. 13. Schema funcionrii Na+ - K ATP-azei a. proteina aflat n conformaie E1 leag Na+ la situsurile aflate pe faa citoplasmatic a subunitii ; b. legarea ATP este urmat de hidroliza acestuia i fosforilarea unui rest de Asp din structura proteinei (E1~P); c. energia legturii macroenergice E1~P asigur modificarea conformaional a proteinei (E1-P) i transportul Na+ n spaiul extracelular; d. K+ se leag la situsurile de pe faa exoplasmatic ale subunitii ; e. defosforilarea proteinei transportoare conduce la modificarea conformaiei (E2); f. transportul K+ prin membrana plasmatic i eliberarea lui n citosol are loc simultan cu revenirea proteinei transportoare la conformaia iniial (E1). Clasa ATP-azelor V (H+ - ATP-aze) este reprezentat de proteine transportoare ce realizeaz deplasarea protonilor n sens invers gradientului lor de concentraie. H+-ATP-aza este prezent n membranele plasmatice ale celulelor ce secret produi acizi (membrana apical a celulelor epiteliale ce mrginesc lumenul vezicii urinare) i n membranele lizozomale. Pompa de H+ dependent de ATP din membranele lizozomale are rolul de a menine un pH sczut (4,5-5) n interiorul acestui organit celular. Clasa ATP-azelor F, ca i cele ale clasei V sunt responsabile de transportul protonilor. Ceea ce caracterizeaz ATP-azele din clasa F, localizate n membrana mitocondrial, este faptul c acioneaz n sensul cuplrii-deplasrii H+ de la o concentraie mai mare la una mic cu sinteza ATP din ADP i P. b. Cotransportul activ al ionilor i al moleculelor prin membrana plasmatic nu utilizeaz n toate cazurile direct energia eliberat prin hidroliza ATP. Folosirea energiei gradientelor ionice n transportul transmembranelor activ constituie o cale indirect de utilizare a energiei stocate n ATP. Deplasarea ionilor i moleculelor mpotriva gradientelor lor de concentraie cuplat obligatoriu cu transportul pasiv al altor ioni - numii ioni cotransportai - definete procesul de cotransport. n acest transport activ, ionii de Na+ au un rol important n transportul zaharurilor i aminoacizilor n celul. Sunt descrise trei aspecte ale cotransportului: 1) uniport; 2) sinport; 3) antiport. Transportul uniport reprezint trecerea prin membran, la un moment dat, a unei singure specii moleculare sau ionice, fr a fi cuplat cu micarea altei specii moleculare. n acest caz, moleculele neutre nu se acumuleaz mpotriva gradienilor de concentraie, ci transportul lor prin membran este facilitat de gradientul de concentraie sczut i catalizat de o protein de import numit importer (fig. 14 a).

38

Fig. 14. Mecanisme de cotransport

Fig. 15. Proteina ce realizeaz simportul glucoz - Na+ asigur acumularea glucozei, mpotriva gradientului de concentraie, n celulele epiteliale ce delimiteaz lumenul intestinal. Na+K+-ATP-aza menine gradientul electrochimic al Na+ prin pomparea ionilor n afara celulei epiteliale. Cooperarea celor dou proteine transportoare face posibil preluarea continu a glucozei din lumenul intestinal. Tipul simport reprezint cotransportul a dou specii deosebite (o structur chimic solvit i union ncrcat H+) n aceeai direcie, purtai fiind de ctre o protein porter (fig. 14, b1). Dintre toate sistemele de simport cel mai bine cunoscut este simportul de lactoz n celula bacterian (Escherichia coli) (fig. 14, b2). Antrenarea n circulaie sanguin a glucozei absorbit din lumenul intestinal i deplasarea aminoacizilor din tubii renali n snge reprezint procese cu o desfurare similar, n care un rol important l joac celulele epiteliale intestinale i respectiv, tubulare. Ptrunderea acestor molecule n celulele epiteliale este cuplat obligatoriu cu intrarea ionilor de Na+. Simportul este asigurat de proteine specifice localizate n regiunea apical (cu microvili) a membranei plasmatice (fig. 15). 39

Sistemul antiport reprezint transportul de interschimb (fig. 14, c) ntre dou substraturi solubizante n dou direcii opuse, transport catalizat de o protein antiporter. Are loc schimbarea unei specii moleculare cu alta, de exemplu Na+ n locul ionului de H+, sau Cl- n locul gruprii HCO3-. Prin acest tip de transport activ, Na+ este transportat intracelular, iar concomitent Ca2+ este scos n spaiul extracelular; acest antiport reuete s menin sczut nivelul citosolic al calciului n multe celule. Majoritatea acestor tipuri de transport activ simport/antiport, n celulele animale, sunt declanate de gradieni de Na+, generai, la rndul lor, de pompe ionice de Na+- K+-ATP-az. Proteinele uniporter, simporter i antiporter au structuri asemntoare i funcioneaz prin mecanisme similare. Cele trei tipuri de transport , uniport, simport i antiport au fost descrise nti la bacterii (Escherichia coli), ulterior dovedindu-i valabilitatea n toate celulele organismelor vii (fungi, plante, animale). c. Transportul apei i reglarea volumului celular Presiunea osmotic - factor critic n transportul molecular de ap Deplasare moleculelor de ap prin membrana plasmatic sau printr-un strat de celule este rezultatul aciunii diferenei de concentraie a celor dou soluii separate de membran (stratul de celule) i /sau gradientul de presiune hidrostatic. Mecanismul transportului molecular de ap prin dublul strat lipidic nu este nc cunoscut. Studii recente sugereaz posibilitatea existenei unor proteine canal de ap la nivelul membranelor plasmatice. Reglarea volumului celular i a presiunii osmotice interne n anumite limite, celulele sunt capabile de a-i modula tensiunea osmotic intern i prin aceasta i pot menine volumul relativ constant. Introducerea unei celule ntr-un mediu hipertonic (cu o concentraie salin superioar coninutului celular) este urmat de scderea pH-ului citosolic, fapt ce determin activarea sistemului antiport Na+-H+ i Cl-HCO3-. Primul sistem asigur intrarea n celul a Na+ n schimbul ieirii H+. Al doilea sistem acioneaz n sensul deplasrii Cl- n celul i exportul de HCO3-. Speciile ionice exportate n mediul extracelular (H+ i HCO3-) sunt generate n celul ca rezultat al aciunii anhidrazei carbonice asupra produsului final al metabolismului celular CO2. Influxul de Na+ i Clconduce la creterea concentraiei saline i a tensiunii osmotice celulare ce fac posibil intrarea moleculelor de ap n celul i n unele cazuri restabilirea volumului celular iniial (fig. 16).

Fig. 16. Principalele proteine transportoare implicate n reglarea volumului celular, n condiiile n care celula se gsete ntr-un mediu hiperton (0,25 M NaCl)

40

2.3.3. Transportul macromoleculelor i particulelor prin membrana plasmatic

Schimbul de substane pe care l realizeaz celula cu mediul nconjurtor nu este limitat numai la ioni, molecule mici i ap. Diferitele macromolecule (proteine, polinucleotide, poliglucide) i particule traverseaz membrana plasmatic prin mecanisme de transport mediate de vezicule. Se disting dou tipuri de transport: exocitoza i endocitoza. Prin exocitoz macromoleculele sintetizate n celul sunt excretate n spaiul extracelular. Endocitoza este implicat n transportul n celul a diverselor molecule, ct i a fraciunilor din fluidul interstiial (pinocitoza). Dei decurg dup mecanisme diferite, cele dou procese de transport menionate prezint unele caracteristici comune: sechestrarea moleculelor i a particulelor transportate n vezicule; asigurarea unui transport strict direcionat; rolul critic al procesului de fuziune membranar. Materialele ce ptrund n celul prin endocitoz sunt fie supuse aciunii enzimelor hidrolitice lizozomale, fie eliberate din nou n mediul extracelular. De cele mai multe ori macromoleculele de secreie sunt eliberate din celul prin aceeai regiune a membranei plasmatice prin care ele au ptruns. Exist ns situaii n care macromoleculele traverseaz spaiul celular fiind secretate printr-o alt regiune membranar. Acest ultim tip de transport poart numele de transcitoz. Procesul de exocitoz st la baza desfurrii secreiei celulare (fig. 17). Studiul transportului macromoleculelor din celul n mediul extracelular sugereaz existena a dou tipuri de exocitoz: constitutiv i reglat (fig. 18). Exocitoza constitutiv este comun tuturor celulelor i asigur eliminarea continu a macromoleculelor sintetizate n spaiul extracelular. Secreia celular de hormoni, neurotransmitori i enzime digestive este realizat prin exocitoz reglat. n acest caz moleculele sunt mpachetate n vezicule de secreii, iar fuziunea lor cu membrana plasmatic este comandat de un semnal extracelular, de cele mai multe ori, un mesager chimic.

Fig. 17. Calea clasic de transport a moleculelor de secreie n spaiul extracelular 41

Fig. 18. Prezentarea schematic a exocitozei constitutive i reglate Endocitoza definete transportul mediat de vezicule din mediul extracelular n celul al unor macromolecule, ct i a substanelor dizolvate n lichidul interstiial (fig. 19). n funcie de mecanismul procesului de endocitoz distingem: endocitoza mediat de receptori i pinocitoza. Endocitoza mediat de receptori, reprezint un tip de transport specific i eficient al macromoleculelor. n urma recunoateri i legrii lor la receptori de membran, macromoleculele intr n celule sub forma complexului de ligand-receptor, fr a fi nsoite de fluidul extracelular. De exemplu, colesterolul circul n snge legat de o protein cu care formeaz complexe numite lipoproteine cu densitate sczut (LDL) (fig. 20).

Fig. 19. Calea urmat de particulele ce au ptruns n celul prin endocitoz

Fig. 20. Endocitoza mediat de receptori pentru LDL 42

Procesul de endocitoz mediat de receptoriare o semnificaie biologic foarte larg, prezentnd cteva aspecte particulare deosebit de importante i anume: eliberarea metaboliilor eseniali ctre celule a colesterolului, a complexelor vitaminice B12, a ionilor de fier, care sunt recunoscui de ctre receptorii de suprafa ai celulelor, fiind fixai i importai intracelular; modularea rspunsului la muli hormoni de natur proteic i factori de cretere (de ex insulina, factorul de cretere epidermic, etc). Endocitoza ndeprteaz aceti hormoni din circulaie i fie celula, temporar, mai puin receptiv la acetia, prin scderea numrului de receptori celulari; captarea proteinelor intite pentru distrugere i eliberarea acestora ctre lizozomi(de ex celulele hepatice capteaz i distrug glicoproteinele plasmatice senescente). Majoritatea receptorilor de pe suprafaa celulelor care mediaz endocitoza sunt glicoproteine transmembranare. Aceti receptori au: un domeniu extracelular; 1-2, helixuri transmembranare; mic regiune citosolic. Muli dintre aceti receptori sunt localizai n anumite regiuni ale membranei plasmatice, care ulterior invaginndu-se vor forma cavele (coate pita). Partea citosolic a acestor zone, constituie un strat gros de clatrin (protein ce va forma o reea n jurul veziculelor membranare). Caveolele reprezin 2% din suprafaa unei celule animale. Mecanismul endocitozei Endocitoza ncepe cu invaginarea unei asemenea regiuni din membrana plasmatic, cu formarea unei caveole; clatrina formeaz o reea n jurul acesteia pe care apoi o nchide rezultnd n final o vezicul cu manta de clatrin(diametrul de 800A). Vezicule prinde rapid clatrina i devine endozom (receptozom). Endozomii fuzioneaz i formeaz vezicule mai mari cu diametrul de 2000-6000A (n circa 20 de secunde).Caracteristic pentru endozomi este pH-ul acid care determin disocierea celor mai multe complexe receptor proteine; rezult deci c soarta substratului este decisiv la acest nivel. Eliberarea clatrinei din vezicule reprezint un moment cheie n endocitoz deoarece prezena acestei mantale proteice n jurul veziculei ar mpiedica transmiterea proteinelor importate i a receptorilor ctre destinaiile lor. Clatrina este reciclat de ctre o enzim activat de ATP. Acidifierea endozomilor prin aciunilor unor pompe protonice (activate de ATP) duce la disocierea complexelor receptor-proteine, etap absolut necesar pentru sortarea proteinelor i dirijarea lor ctre destinaii specifice. n raport cu mrimea i complexitatea particulelor endocitate, se disting dou variante particulare ale endocitozei i anume: fagocitoza: endocitoza macromoleculelor sau a particulelor mici, corpusculare (virusuri, bacterii, fragmente de celule eucariote sau chiar celule ntregi); pinocitoza: endocitarea moleculelor solubile (toxinele bacteriene). Fagocitoza (gr. fagiere=a mnca) este un proces de transport mediat de vezicule prin care celulele sunt capabile s ingere diverse particule din spaiul extracelular. Dac la organismele unicelulare fagocitoza reprezint principala cale de nutriie, la mamifere procesul joac un rol important n aprarea organismului. Celule specializate numite fagocite sunt capabile s nglobeze i s distrug substane strine, microorganisme, celule mbtrnite i maligne, resturi celulare etc. n organismele animale se disting dou tipuri de celule sanguine ce acioneaz ca fagocite: monocitele (ce migreaz n esuturi dnd natere macrofagelor i ele celule cu funcie fagocitar) i neutrofilele. Legarea particulelor de fagocit - prima etap a fagocitozei - implic participarea receptorilor de membran ce recunosc specific liganzii aflai pe suprafaa particulei int. 43

Pentru a putea fi fagocitate, bacteriile sunt supuse unui proces de opsonizare (gr. opsonein=a pregti pentru mncare) ce const n acoperirea suprafeei bacteriene cu anticorpi i/sau componente ale complementului. Anticorpii se ataeaz pe suprafaa bacteriilor n aa fel nct regiunea prin care acetia se leag la receptori, numit regiune Fc, este expus spre exterior. Receptorul Fc din membrana plasmatic a fagocitelor interacioneaz cu anticorpii legnd cele dou suprafee membranare printr-un mecanism tip fermoar (membrane-zippering-mechanism) ce face posibil fagocitoza (fig. 21). Exist posibilitatea stabilirii unor legturi ncruciate ntre anticorpii ataai pe suprafaa celulei int cu formarea unor aglomerri (clusterii), proces numit patching. Dup un scurt timp de la formarea cluster-ilor, anticorpii se deplaseaz spre un pol al celulei-int genernd o structur de tip calot ce mpiedic fagocitarea celulei int (fig 21). Procesul de calotare (capping) este energo-dependent necesitnd prezena moleculelor de ATP. Activarea receptorilor specifici de ctre anticorpi, componente ale complementului sau diverse oligozaharide de pe suprafaa microorganismelor, prin formarea complexului ligandreceptor, genereaz un semnal intracelular ce declaneaz ingestia. Fig. 21. Fagocitoza se realizeaz printr-un mecanism membrane-zipper A distribuirea uniform a anticorpilor pe suprafaa celulei - int face posibil fagocitarea acesteia B procesul de capping mpiedic fagocitarea celulei-int Pinocitoza este un fenomen observat la macrofage i reprezentat de invaginarea unei pri a membranei celulare, sub influena unor particule mici, solubile (picturi),cu formarea n final a unor vezicule citoplasmatice (cu dimensiuni de 1-2m). Aceast vezicul migreaz de la membrana celular spre regiunea perinuclear, unde fuzioneaz cu lizozomii, coninutul veziculei fiind hidrolizat. Transcitoza definete un tip de transport specific transcelular, al diferitelor microelemente. Procesul este ntlnit n celule (epiteliale) ale cror membrane plasmatice sunt mprite n domenii distincte (apical i latero-bazal) datorit pronunatei asimetriei n distribuia elementelor lipidice i proteice componente. Un exemplu de transcitoz l reprezint transportul din stomac n circuitul sanguin al anticorpilor la nou-nscut, anticorpi primii odat cu laptele matern.

2.4. RECEPTORII DIN MEMBRAN

Receptorii membranari sunt glicoproteine transmembranare, avnd funcia de legare specific i cu afinitate mare a unor molecule extracelulare numite liganzi (hormoni, neurotransmitori, etc.) prin legarea crora se induc rspunsuri celulare caracteristice. Unii dintre aceti liganzi sunt numii mesageri de ordinul I. n interiorul plasmalemei, receptorul activat interacioneaz apoi cu un sistem enzimatic care genereaz n citosol un mesager de ordin II, de obicei cAMP (adenozin-monofosfatul ciclic). Al doilea mesager declaneaz un lan de reacii intracelulare care provoac n ultim instan rspunsul celulei int la ligantul fiziologic n cauz (fig. 22, 23, 24, 25).

44

n cazurile cnd interaciunile molecul semnal receptorul genereaz un nucleotid ciclic (adenozin sau guanozin- monofosfat ciclic) ci provoac un influx rapid de ioni de calciu (Ca+2), n matricea citoplasmatic, datorit deschiderii canalelor de calciu ale membranelor celulare, atunci Ca+2, este considerat ca un mesager de ordinul II. Ligantul de care se leag de receptor prin fore slabe (hidrofobe,legturi de hidrogen), ntr-o zon specific din molecula receptorului. Prin legarea de receptor apar diferite modificri ale plasmalemei ce induc apoi efecte intracelulare. Exemple de modificri ale plasmalemei pot fi: Redistribuirea receptorilor cu agregarea lor n anumite zone ale plasmalemei urmat de endocitoz; Modificri de permeabilitate a membranei, se produc la legarea neurotransmitorilor de membrana postsinaptic i au rol n transmiterea i generarea impulsului nervos Activarea unor enzime din plasmalem (activarea adenilatciclazei de ctre hormonii polipeptidicihidrosolubili). Creterea intracelular a Ca+2 (prin deschiderea unor canale din plasmalem care permit ptrunderea calciului extracelular ce se leag n citosol de proteine specifice, de ex calmodulina). De remarcat c folosirea mesagerilor de ordin I i activarea multor proteine i enzime prin legarea unei singure molecule de ligand au ca rezultat creterea extrem de mare a eficienei receptorilor al cror procent nu depete 1% din totalul proteinelor de membran.

2.4.1.Tipuri de receptori
Se pot distinge dou categorii mari de receptori dup originea ligandului pe care l leag: receptori pentru substane endogene i receptori pentru substane exogene. a. Receptorii pentru neurotransmitori sunt situai n membrana postsinaptic a celulei nervoase, musculare sau alte celule efectuare (de ex, receptorii pentru acetilcolin, adrenalin, noradrenalin, dopamin, serotonin, histamin, acid gamma-amino-butiric, acid glutamic, glicin, acid aspartic, peptide mici ca encefalina).Unele dintre aceste molecule acioneaz strict numai asupra unei celule postsinaptice, altele pot difuza local,influennd mai multe celule, deci avnd efecte de mediatori chimici locali. b. Receptori pentru hormoni sunt localizai diferit n celul,dup cum hormonul este hidrofil sau hidrofos (cum este cazul hormonilor steroizi i tiroidieni), el ptrunde uor prin plasmalema celulei int i se leag de receptorii intracelulari. Dimpotriv, hormonii hidrofili se leag de receptorii din plasmalem i aceti receptori transmit celulei informaia necesar spre a-i modifica metabolismul. n acesta categorie intr receptorii pentru insulin, glucagon, adrenalin, hormoni ai hipofizei, parathormonul. c. Receptori implicai n reacii imunitare sunt receptori pentru antigene endogene (foarte numeroi n plasmalema unor limfocite), receptori pentru anticorpi, receptori pentru complement. Receptorii pentru substane exogene (vehiculate de obicei pe cale umoral) includ: receptori pentru virusuri; receptori pentru antigene strine de organism receptori pentru toxine bacteriene receptori pentru medicamente receptori pentru lecitine Dei conceptul de receptor a fost enunat de mai bine de 100 de ani de ctre P Erlich i M. Hangley, pentru a explica mecanismul de aciune al medicamentelor i toxinelor numai recent, datorit progreselor tehnicii, au putut fi vizualizai unii receptori n esuturi umane obinute post-mortem. 45

2.4.2. Modaliti de comunicare intercelular

Sistemele de comunicare intercelular reprezint cheia nelegerii funcionrii armonioase a celor aproximativ1x 1015celule din organismul uman. Comunicarea ntre celule este necesar ncepnd cu dezvoltarea i organizarea acestora n esuturi,continund cu controlul creterii i diviziunii, ca i pentru coordonarea diverselor activiti ale celulelor mature. Pe de alt parte, ntr-o serie de boli alterarea comunicrii are un rol patogenic important. Cile principale prin care se realizeaz schimbul mesajelor sunt: a) transmiterea indirect la distan b) transmiterea direct ntre celulele aflate n contact. 2.4.2.1.Comunicarea intercelular la distan Celulele pot schimba ntre ele, la distan,mesaje care difuzeaz n spaiul extracelular. Acesta este cazul a dou mecanisme fundamentale de transmitere a informaiei: - transmiterea nervoas, adaptat comunicrii rapide i selective a mesajelor i, - transmiterea umoral, consecutiv eliberrii unui mesager chimic n torentul circulator fiind adecvat transmiterii de informaii generale, de exemplu metabolice. n ambele cazuri membranele celulare au un rol principal ndeosebi prin existena receptorilor specifici 2.4.2.2.Contactul intracelular direct Contactul celular direct, cnd mesajele se transmit fr o difuziune semnificativ n spaiile extracelulare pot fi: permanente tranzitorii episodice Contactul direct permanent se realizeaz de obicei prin intermediul jonciunilor permeabile de tip gap care leag direct compartimentele citoplasmatice ale celulelor ce se influeneaz reciproc i prin care trec molecule mici. Contacul intercelular direct cu caracter efemer, tranzitoriu este exemplificat tipic de cooperarea celulelor sistemului imunitar a crui organizare este astzi comparat cu aceea a sistemului nervos elaborndu-se conceptul de reea imunitar. De asemenea exist i cazul conjugrii celor dou posibiliti de comunicare anterioar cnd mesajele se transmit la distan prin contacte interpuse (de exemplu, cazul reelei nervoase dintre celulele senzoriale i cele musculare). Principalele sisteme de mesageri i semnale intercelulare sunt hormonii (care nu mai sunt considerai produi exclusiv ai glandelor endocrine), neurohormonii i neuromediatorii, ionii i nucleotidele, polinucleotidele i ARN, virusurile i interferonii, factorii de cretere, anticorpii i antigenele, semnalele bioelectrice, etc.

2.4.3. Receptorii celulelor nervoase

Cnd informaia circula rapid de la i ctre anumite locuri, mesajele sunt vehiculate printr-un mecanism electric de ctre nervi prin transmisie chimic ntre neuroni i ntre acetia i celulele receptoare senzoriale sau efectuare. Pe plan celular, legtura este stabilizat prin contacte sinaptice intercelulare de 15 nm dintre celulele care particip la transmiterea mesajelor. Odat cu apariia potenialului de aciune, captul nervului elibereaz neurotransmitorii n spaiul sinaptic de unde o parte sunt distrui i o alta se prinde de receptorii specifici. Astfel de neurotransmitori sunt: acetilcolina, noradrenalina, dopamina, glutamatul, glicina, ATP, substana P (un decapeptid), etc . Dintre receptorii i antigonitii lor, fac parte: receptorul colinergic, sensibil la nicotin (-bungarotoxina); receptorul colinergic, sensibil la muscarin cu antagonist atropina; -adrenergic (fentolamina); -adrenergic 46

(propanolul); si alii . Axonul unui neuron motor de la broasc, parcurgnd cteva sute de micrometrii pe suprafaa unui muchi, formeaz cteva sute de contacte sinaptice la 1m . n fiecare regiune presinaptic se gsesc vezicule presinaptice la captul terminaiei nervoase. Fiecare terminaie conine aproximativ 10000 molecule de acetilcolina. Fuziunea veziculelor cu acetilcolina cu membrana presinaptice este declanat de o cretere rapid i trectoare a concentraiei Ca2+ n butonul terminal al axonului. Probabil c exocitoza se realizeaz prin filamentele mecanocontractile membranare, sub influena Ca2+, dar imediat acest Ca2+ liber dispare n momentul contopirii veziculelor cu membrana presinaptica. Ataarea veziculelor cu acetilcolina de membrana presinaptica se face pe unele proteine intrinseci membranare, aezate pe doua iruri la fiecare sinapsa. n mai puin de 100ms coninutul de circa 10000 molecule de acetil-colina iese prin exocitoza n spaiul sinaptic, legndu-se de receptorii membranari postsinaptici. Receptorii membranari postsinaptici sunt concepui ca nite canale proteice care se deschid la neurotransmitor. Cnd doua molecule dintr-un neuro-transmitaor (acetilcolina) se leag de un receptor postsinaptic, scade energia stadiului conformaional deschis i, n acest mod, canalul proteic al respectivului receptor se va deschide; aceasta se face la ntmplare, ntr-o ms, cele 10000 molecule de acetilcolina trecnd prin cele circa 2000 de canale n acelai timp cu 20000 ioni de Na+ ntr-un sens si tot atia de potasiu (K+) n sens invers. Diferena de voltaj ntre K+ care iese n spaiul sinaptic si Na+ care intra n celula este aproape 0 (zero). Asemenea apropiere de zero depinde de numrul canalelor deschise i de durata acestui stadiu. Deci, acetilcolina se descrca prin impuls nervos (impulsul nervos este acela care deschide canalele proteice) i realizeaz n membrana postsinaptic prin mediaie chimica un potenial de membrana cu ajutorul canalelor receptoare de acetilcolina care transporta K+ i Na+. Propagarea mai departe a influxului nervos depinde de existenta n membrana neuronului a unor canale ce se deschid pentru Na+ la o modificare a voltajului membranar i a cror funcionare de ,,poarta nchis i deschis pentru Na+ este cauza, de fapt a potenialului de aciune (P.A.) (fig. 22). Fig. 22. Influxul nervos (schem) n momentul aplicrii unui stimul are loc o depolarizare locala slab caracterizat printr-o mic modificare de voltaj care deschide canalele pentru Na+, transfernd voltajul mai departe. Ptrunderea Na+, se accelereaz, pana ce suprafaa interna a membranei se pozitiveaz pe o unica poriune. Ieirea ionilor de K+ restabilete repede potenialul negativ al membranei . Inversarea voltajului determin potenialul de aciune ce se propag de-a lungul axonului (fig. 23).

Fig. 23. Canalele de Na+ i K+ (schem) 47

Canalul Na+ este o protein de circa 300000 daltoni, cu un por de 0,4-0,6 nm prin care trec ioni de Na+ cu o molecul de ap. Pe suprafaa sa canalul are grupri ncrcate electric n poziii bine determinate. Asemenea sarcini confer canalului un moment dipol electric mare, care variaz n direcie i mrime de cte ori se schimb conformaia molecular a canalului, dup cum el se nchide i apoi se deschide. Diferena de potenial a membranei n repaus este, dup cum se tie, 70mV ntre incarcatura pozitiv de la exterior i cea negativ de la interior, ceea ce nseamn un cmp electric mare membranar, de aproximativ 100KV/cm. n consecina, dipolii electrici ai proteinelor canalului Na+ se aliniaz cu cmpul electric membranar. Modificrile n intensitatea cmpului membranar pot, s schimbe conformaia proteinei canalului din ,,nchis n ,,deschis, astfel c faa intern (sau citoplasmatic) devine pozitiv prin ptrunderea Na+. Diferena de voltaj transmembranar care deschide canalul Na+ acioneaz de asemenea, asupra canalului, determinndu-i o stare conformaional ,,nchis, diferit de aceea din starea de repaus; este starea de inactivare ce apare mult mai lent ca procesul de activare, aa fel nct canalele rmn deschise scurt timp, pentru ca apoi sa se nchid prin inactivare. Canalele rmn n stare de inactivare cteva ms i abia apoi se nchid trecnd n starea de repaus. Deschiderea canalelor Na+ se face n modul ,,totul sau nimic, deoarece fiecare canal deschizndu-se face s creasc conductana membranei de 8x10-12ohmi (). Apoi, prin scoaterea K+ de ctre canalele K+ n afara fibrei nervoase, se stabilete incarcatura negativ a feei citoplasmatice a membranei; contracarnd canalul Na+. Este de remarcat c, n axon se genereaz un singur impuls care se propag de-a lungul sau n urma unui singur stimul, spre deosebire de corpul neuronului care, produce o serie de impulsuri la diferite intensiti ale aceluiai stimul.

2.4.4. Receptorii care controleaz permeabilitatea ionic

esuturile electrogene ale petilor electrici au puine jonciuni neuromusculare. Membranele lor postsinaptice sunt foarte bogate nsa ntr-un receptor colinergic reglat de nicotina . Cantitile mici de nicotina sensibilizeaz receptorii, iar cele mari l blocheaz . Este vorba de un complex de 3-4 polipeptide cu o greutate molecular de 200000-300000 fiecare polipeptid avnd o GM=40000-65000 . Receptorul este relativ hidrofob i glicolizat cu manoza i galactoza. De un asemenea complex se pot lega, experimental, 4 molecule de bungarotoxina marcat, constatndu-se, dup izolarea membranelor postsinaptice, asistent a 30000 molecule de toxina marcat pe un m2, deci aproximativ 7500 receptori dispui n arii hexagonale la suprafaa membranei. Fiecare complex are 250000 daltoni, fiind compus din 3-4 tipuri de polipeptide de 50000 daltoni, hidrofobe i glicolizate cu manoza i galactoza. Un complex prezint patru situsuri de legare pentru acetilcolina. Aceti receptori, care se gsesc i n creierul mamiferelor, sunt blocai cnd n sngele circulant apare un anticorp al sau datorit unei condiii autoimunitare. n acest caz, nu se mai poate realiza transmisia neuromusculara i apare o maladie muscular degenerativ.

48

Fig. 24. Transmisia chimic prin sinapse O caracteristic a receptorilor este c prezint ntotdeauna trei stri conformaionale ale proteinelor constitutive, i anume, o stare de repaus, una de activitate marcat prin conductanei Na+ i alta de desensibilizare (sau un stadiu rezistent la activare). Exista o multitudine de receptori a cror funcionare este legat de canalele ionofore ale membranei celulare, funcionnd cu ,,poricare se deschid i se nchid sub influenele chimice sau datorit variaiilor de voltaj transmembranar. Receptorul acetilcolinei (antagonistul lui fiind bungarotoxina) acioneaz cnd capteaz neurotransmittorul, deschiznd canalul Na+ ce ptrunde astfel nuntru (Na+). i invers sunt inhibitori ai 49

neurotransmitorilor care au efecte de hiperpolarizare prin intermediul receptorilor specifici (ex. stricnina care sensibilizeaz specific receptorul pentru glicina), crete permeabilitatea pentru Cl- i K+ . Modificrile n conductana membranei pentru Na+ i K+ se datoresc unor canale care se nchid i se deschid selectiv fa de ioni, ca n fibra nervoas. Aa, de exemplu sunt canalele ce las s treac Na+, nu i K+, altele care permit trecerea K+ nu i a Na+ , unele las pentru 100 ioni K+ s mai treac i 85 Na+, altele pentru 100 K+ las s treac doar 7 Na+. Canalele prin care trec 100 K+ i 85 Na+ sunt activate de acetilcolina, avnd un por de 0,8nm diametru, destul de apos. Canalele K+ sunt mult mai mici i au foarte puina ap, cu toate c molecula de K+ este de 30 de ori mai mare dect Na+; densitatea unor asemenea canale este cuprins ntre 0- 10000m2 (fig. 24). Procesul acesta de control a permeabilitii ionice prin receptori este foarte vechi, datnd de la infuzorii ciliai la care exist receptori de presiune. Astfel, cnd un parameci noat i ntlnete un obstacol, brusc se inverseaz btaia cililor i el noat atunci napoi. Experimental, aceasta inversare a btii ciliare se realizeaz n prezenta unei soluii de KCl datorit unui influx al Ca2+ n infuzor, ca rspuns la presiune sau depolarizare. Celulele sunt foarte sensibile la o variaie citoplasmatic a Ca2+, deoarece Ca2+ intracelular este ntr-o mic cantitate (0,01-1 M), fa de cel extracelular (1m M). Chiar cel mai mic influx de Ca2+ care trece prin canalele sale membranare produce perturbri n concentraia sa intracelular, cu modificrile fiziologice corespunztoare. Aa de exemplu, discurile membranare ale celulelor cu bastonae din retina conin ,,pori ionice de Ca2+, care sunt activate de ctre interaciunea luminii cu rodopsina. Creterea Ca2+ citoplasmatic de la 10-8 M la 10-6 M, ca rspuns la lumina, inhiba micarea Na+ prin membrana, hiperpolarizand celula i inhibnd sinapsele de la baza celulei. Tot astfel, activarea unei serii de receptori produce mobilizarea Ca2+ (receptorii colinergici, -adrenergici, angiotensinici, -glucozei, etc) n celula inta. Ca2+, ajuns n celule ,,coopereaz la realizarea exocitozei, contraciei musculare, glicogenolizei, creterii cantitii de c GMP etc. Asemenea procese mediate de Ca2+ se realizeaz printr-o proteina ce leag Ca intrat n celula, denumit calmodulina. Ea se leag cu patru ioni de Ca modificndu-si conformaia, dup care reacioneaz cu o apoenzima sau cu o proteina receptoare, lund o noua conformaie i participnd la tot felul de activiti moleculare, cu diferite rspunsuri fiziologice. Calmodulina interacionnd ireversibil cu Ca2+ formeaz complexul proteina +4Ca2+ a crui activitate este reglat de fluxul deschiderii canalelor de Ca2+.

2.4.5. Cuplajul celular metabolic i electric

Cuplajul celular se realizeaz structural prin jonciuni strnse (,,cu gol i ,,scalariforme), care solidarizeaz celulele adiacente pe anumite poriuni. Astfel, orice cuplaj prin jonciuni dintre celulele adiacente face posibil ca o modificare a potenialului de membrana ntr-o celula s se propage i n celelalte. De exemplu, conductana electric realizata la nivelul jonciunilor ,,cu gol dintre celulele adiacente este de 106 ori mai mare ca n restul membranelor celulare nelegate ntre ele. Trecerea diferitelor molecule prin jonciunile cu gol depind de meninerea n hialoplasma a unei concentraii de Ca2+ sub 10-5 M. Cnd concentraia Ca2+ crete n celula, atunci scade i permeabilitatea jonciunilor i crete iar cnd scade nivelul Ca2+. Studiile electrofiziologice i de microinjecii au presupus existena unor canale la nivelul jonciunilor, de 2nm diametru i 20nm lungime. Aceste canale au fost confirmate de ME care a artat c la nivelul acestor jonciuni exist nite particule intramembranare care formeaz suprafee mozaicate n hexagoane i care reprezint proteinele cu canalele moleculare.

50

2.5. Schimburile energetice n celula vie

Descoperirile tiinifice au permis omului s utilizeze cantiti considerabile de energie. Aceast energie se prezint sub mai multe forme: mecanic, hidraulic, caloric, electric, nuclear etc. Energia este utilizat n maniere foarte variate, suferind numeroase transformri n instrumente sau maini pe care le utilizm zilnic. Astfel, motoarele, care funcioneaz cu benzin sau electricitate, produc energie mecanic. Un receptor radio utilizeaz energia radiaiilor electromagnetice i transform energia electric n energie acustic. n celulele vii exist, de asemenea, sisteme capabile de a converti energie dintr-o form n alta. Astfel, radiaiile solare ( energia luminoas ) sunt transformate n energie chimic; transformarea are loc n cloroplaste. Energia astfel recuperat poate, n continuare, s serveasc la biosinteze sau activiti fizice sau mecanice, graie unor dispozitive care asigur conversia necesar. Aceste transformri au loc n sisteme constituite din ansambluri de molecule specifice. nainte de a studia sistemele biologice care asigur transferul sau conversia energiei, este util s ne amintim cteva noiuni fundamentale de termodinamic.

2.5.1. Noiuni generale de termodinamic

Studiul energiei i transformrile sale reprezint o ramur a fizicii denumit termodinamic. Noiunile generale de termodinamic sunt aplicabile i la sistemele vii. NOTIUNEA DE ENTALPIE. S considerm un sistem, ca acela al unui fenomen fizic sau reacie chimic. Sistemul se caracterizeaz prin stadiul su iniial i stadiul su final. Trecnd de la stadiu iniial la stadiul final, sistemul poate elibera energie n mediul su nconjurtor. Astfel, dac sistemul emite cldur, el va fi exotermic. Invers, dac sistemul consum cldur (energie caloric ), preluat din mediul ambiant, el este endotermic. Pare dificil, dac nu chiar imposibil, de a evalua energia care exist ntr-un sistem izolat, considerat la un stadiu dat. Din contra, putem msura destul de uor schimburile energetice care afecteaz sistemul cnd acesta trece de la un stadiu la altul. Astfel, schimburile de energie intern E , pe care le sufer sistemul, este egal cu cantitatea de cldur Q pe care o primete din mediul exterior, mai puin lucrul mecanic ( travaliul ) pe care l realizeaz, W: E = Q W Aceast relaie demonstreaz capacitatea de conservare a energiei. Conform primului principiu al termodinamicii, energia total a Universului rmne constant. Energia nu se pierde, ci sufer transformri. ntr-o reacie chimic ce se deruleaz sub presiune constant ( de exemplu, presiunea atmosferic ), schimbul caloric care afecteaz sistemul ( cldura de reacie ), constituie, prin definiie, un schimb de entalpie H: E = H - W Dac sistemul nu produce nici un lucru mecanic, atunci relaia este: E = H Aceast relaie permite evaluarea schimburilor energetice interne ale unei reacii care se deruleaz sub presiune constant, cu un volum constant. Putem msura schimburile de entalpie cu ajutorul unui calorimetru. Astfel, cldura de combustie a glucozei se ridic la 673.000 cal/mol, la 20 0 C, la presiune atmosferic: H = - 673.000 cal/mol 51

Valoarea sa este negativ deoarece energia caloric produs de sistem este cedat mediului nconjurtor. VARIAIA ENTALPIEI LIBERE. S considerm o reacie reversibil n condiii izoterme. Aceast reacie tinde s dobndeasc un statut de echilibru. Dac o alt reacie se va opune, prima va realiza un efort (lucru mecanic, travaliu ), pentru a-i obine statutul de echilibru. Energia cheltuit pentru acest efort reprezint un potenial chimic. Aceast energie ( potenialul chimic ), numit i energie liber, este desemnat astzi prin expresia entalpie liber. Cnd reacia realizeaz un lucru mecanic, variaia entalpiei libere ( G ) este negativ i reacia este exergonic. Diminuarea entalpiei libere a sistemului reprezint cantitatea maxim de energie disponibil care ar putea fi transformat n energie chimic. Dac, la o temperatur i presiune constant, variaia entalpiei libere ntre stadiul iniial i stadiul final al reaciei este negativ (F< 0), reacia se poate realiza spontan. Ea va avea loc foarte rapid n prezena unor enzime specifice. Enzima diminueaz energia de activare, care , pe de alt parte, nu depinde de variaia entalpiei libere. n cazul unei variaii de entalpie liber pozitiv (F> 0 ), reacia nu se mai poate realiza spontan. Se spune c este o reacie endergonic (endoergonic)., pentru c ea are loc cu un aport exterior de energie care i este necesar. Acest aport exterior de energie poate proveni din energia radiaiilor luminoase sau din cuplajul cu o alt reacie, n mod obligatoriu, exergonic. Pentru a se putea realiza cuplarea cu o alt reacie, este necesar ca diminuarea entalpiei libere a sistemului exergonic s fie mai ridicat dect consumul sistemului endergonic. Variaiei entalpiei libere este semnificativ prin posibilitatea de a ti dac o reacie are sau nu loc spontan. VARIAIA ENTALPIEI LIBERE I VARIAIA ENTROPIEI. n toate sistemele se pot distinge dou forme de energie, una numit energie intern, alta numit entropie. n sistemul reprezentat de o reacie chimic, energia intern corespunde celei are este reprezentat de diferite legturi chimice i care poate fi convertit ntr-o alt form de energie: mecanic, chimic, fizic. Entropia reprezint energia cinetic a atomilor i moleculelor, energie care se exprim sub form de vibraii, rotaii sau translaii. Entropia este nul ntr-un cristal perfect la 0 absolut i, relativ sczut, ntr-un solid. Ea este foarte ridicat ntr-un gaz, unde dezordinea molecular este foarte accentuat. Entropia crete odat cu temperatura, n msura n care se accentueaz (crete) caracterul dezordonat al moleculelor. Fie o reacie chimic care evolueaz spontan, de-o manier reversibil fa de poziia sa de echilibru. Reacia urmtoare leag variaia entalpiei libere G, variaia entalpiei H i variaia entropiei S : G = H T S T, reprezint temperatura absolut a reaciei. O scdere a schimbului de energie liber este totdeauna asociat cu o cretere de entropie. Schimbul de entropie al sistemului, S, la o valoare pozitiv se exprim n calorii/grad/mol. Dup al doilea principiu al termodinamicii, entropia total a unui sistem trebuie s creasc. Stadiul dezordonat al energiei componenilor si are totdeauna tendina de acrete. Totui, entropia poate s scad ntr-un sistem unde au loc reacii de sintez i, n mod particular, n fotosintez. RAPORTUL NTRE VARIAIA ENTALPIEI LIBERE I CONSTANA DE ECHILIBRU. S considerm urmtoarea reacie chimic reversibil: A B. Ea atinge nivelul su de echilibru cnd survin modificrile reaciei. n egalitatea : Keq = B [

] /A [ ]

52

Keq, reprezint constanta de echilibru pentru o temperatur i o presiune determinat. Constanta de echilibru este legat de schimburile entalpiei libere prin reacia: G0 = - RT In Keq Unde R este constanta gazelor perfecte ( 1,987 cal/mol/grad ), T este temperatura absolut, Keq este logaritmul cu semn schimbat al constantei de echilibru iar G0 schimbul standard al entropiei libere. n cazuri diferite se determin G, reacia efectundu-se la un pH = 7. determinnd constanta de echilibru Keq, plecnd de la analiza chimic, putem, n continuare, s calculm variaia entropiei libere a sistemului G0. S considerm echilibrul: Glucoz 1 fosfat glucoz 6 fosfat, catalizat de enzima fosfoglucomutaz. La 250 C, la pH = 7, soluia are 0,001 M de glucoz 1 fosfat la stadiul iniial. La stadiul final, analiza chimic indic un echilibru ntre 0,001 M de glucoz 1 fosfat i 0,019 M de glucoz 6 fosfat. Keq = 0,019 / 0,001 = 19 G = - 1,987 x 298 x In 19 = - 1745 cal / mol. Un asemenea echilibru, unde variaia entalpiei libere este negativ, se efectueaz spontan, de la stnga la dreapta; reacia este exergonic. Dac G este pozitiv, reacia va avea loc spontan, de la dreapta la stnga.

2.5.2. Transformri de energie n celula vie (energetica celular)

Celula este sediul activitilor mecanice, cum sunt micrile intracitoplasmatice, deformrile, deplasrile, creterea etc. Ea efectueaz, de asemenea, activiti fizice: absoarbe activ substane, transport molecule, concentreaz soluii, menine un anumit echilibru osmotic etc. Celula realizeaz i activiti chimice : sinteze de macromolecule ( glucide, lipide, protide, acizi nucleici ), plecnd de la numeroase molecule mici. De exemplu, pentru a forma o singur legtur peptidic, sunt necesare 4000 calorii/mol. Aceast valoare reprezint schimbul de entalpie liber (G) care aici este pozitiv. Ori, pentru a construi o singur macromolecul de protein este necesar s se stabileasc sute sau chiar mii de legturi peptidice i, deci, de o mare cantitate de energie. Pentru a face fa acestui necesar imens de energie celula dispune de mecanisme complexe proprii. Intre nevoia i aportul de energie exist intermediari capabili s efectueze multiple transformri. Aceti intermediari sunt derivai fosforilai ai nucleotidelor, un rol aparte dintre aceti compui l are molecula de ATP ( adenozin trifosfatul sau acidul adenozin trifosforic). Dei orice molecula care participa la metabolismul celular conine o anumit cantitate de energie, doar un numr foarte redus din ele au o importan n stocarea i vehicularea energiei chimice celulare. Aceti compui trebuie s poat ngloba o cantitate apreciabil de energie i s poat ceda acolo unde i cnd este necesar. Compuii care fac parte din aceast categorie i datoreaz numele de macroergici (bogai n energie) faptului c hidroliza lor se soldeaz totdeauna cu eliberarea unei importante cantiti de energie. Principalul izvor al energiei celulelor aerobe este procentul de respiraie celular: AH2+ 1/2O2H 2 O + energie

53

n care A simbolizeaz un substrat oarecare, iar AH2-substrat redus. Energia degajat n cursul respiraiei celulare este un mod normal parial recuperat n cadrul unui proces biologic cuplat. Recuperarea se face prin stocarea energiei n molecule de ATP (adenozin trifosfatul sau acidul adenozintrifosforic), care se formeaz prin fosforilarea moleculelor de ADP (adenozin difosfat sau acidul adenozindifosforic). ntruct aceast fosforilare este cuplat cu oxidrile din cadrul respiraiei procesul de recuperare a energiei respiratorii se numete fosforilare oxidativ: nADP + nPa+ energie n ATP Astfel, reprezentarea simbolic a proceselor cuplate generatoare i recuperatoare de energie poate fi urmtoarea: AH2 + nADP + nPa + O2 A+ n ATP + H 2O Organismul utilizeaz n permanen mari cantiti de energie att pentru sinteza compuilor cu structuri complexe (proteine, lipide, polizaharide) ct i pentru susinerea unor procese cum sunt: contracia muscular, excitaia nervoas, transportul activ i altele. De aceea, transferul energiei libere rezultat din reaciile exergonice ale cilor degradative ctre aceste procese, trebuie s se realizeze eficient. Constana temperaturii face ca transferul energiei n sistemele biologice s fie posibil numai prin reacii cuplate: dou reacii sunt cuplate dac energia liber a uneia care este exergonic, cedeaz energiei determin desfurarea celeilalte care este endergonic (consum energie). n organism exist numeroase reacii cuplate prin intermediul acidului acetic a crei formare ntro reacie puternic exergonic asigur desfurarea celei de-a doua, endergonic. Cuplarea celor dou reacii e redat n figura 25. Fig. 25. Schema unei reacii cuplate Mecanismul acestui sistem de cuplaj asigur transferul energiei libere de la reaciile degradative ale glucidelor, lipidelor i protidelor ctre cale mai diverse reacii consumatoare de energie. Sistemul ATPADP constituie intermediarul energetic comun n majoritatea reaciilor cuplate. Caracterul macroenergetic al legturilor PO, din molecula ATP care scindeaz hidrolitic e reprezentat de energia G. 2.5.2.1. Molecula ATP i proprietile sale Toate celulele, vegetale, animale i bacteriene depind de ATP, compus izolat n anul 1930, din extracte acide de muchi. Materia vie conine 0,5 2,5 mg ATP/mol. Poate fi obinut n stare pur prin cromatografie pe schimbtori de ioni. Molecula de ATP este alctuit dintr-o baz azotat purinic adenina, un zahr pentoz i trei radicali fosfat (Fig. 26).

Fig. 26. Structura moleculei de ATP (a); complexul ATP cu ionul de Mg 2+ (b).

54

n celul, cea mai mare parte a ATP- ului formeaz un complex cu ionul de Mg 2+. n molecul, fosfatul terminal este stereochimic vecin cu un grup aminat al adeninei (fig. 30, b). Magneziul stabilete legtura cu adenina i cu cei doi fosfai terminali. Fosfaii poart patru sarcini negative, apropiate unele de altele i care se resping. ATP este un polifosfat puternic ncrcat electric. Prin hidroliz el se descompune n ADP i acid fosforic. Aceti doi copui, ATP i ADP, sunt sediul unor reanjamente ale atomilor, care se realizeaz n maniera n care nivelul de energie al moleculelor este cel mai sczut posibil. Ambii poart ncrctur negativ. Hidroloza produce o important scdere a energiei libere a sistemului: G = - 7000 cal/mol (pH 7; 25oC) Putem spune c legtura fosfat este bogat n energie, ceea ce este, de fapt, o neconcordan. Energia considerabil de aici nu corespunde celei de la legtura covalent dintre P i O. Ea provine din hidroliza legturii anhidrid fosforic. ADP poate, de asemenea, s se disocieze elibernd o cantitate de energie egal cu precedenta. Compuii formai prin hidroliz sunt AMP (adenozin monofosfatul sau acidul adenozinmonofosforic) i acidul fosforic. AMP poate, la rndul su s fie descompus, dar hidroliza legturii ester care reine fosfatul genereaz mult mai puin energie. Reaciile de transfer de fosfat (fosforilare defosforilare) se fac totdeauna de la un compus cu potenial de transfer ridicat ctre unul cu potenial de transfer sczut. Deci, compuii cu fosfor pot fi donatori sau acceptori de fosfat dup cum potenialul lor de transfer e mai ridicat sau mai sczut. Dac lum ecuaia ATP ADP +Pa, dac ea se desfoar spre stnga ATP e donator de Pa n sens opus, ADP devine acceptor de Pa transformndu-se n ATP. Gruprile fosfat cedate de compuii macroergici ajung la acceptori nu direct, ci prin intermediul sistemului ATPADP. Acest sistem face legtura dintre compui macroergici (Penolpiruvat, 3-diP-glicerat i P-creatina) spre compui microergici (glucoza, glicerol). Sistemul ATP ADP funcioneaz astfel ca o baterie de energie (dinam celular).(fig.27). Fig. 27. Schema dinamului celular (Florkin,modificat de Lippman) Sistemul ATPADP ca donator de energie este implicat ntr-o serie de procese biochimice importante cum ar fi: contracia muscular (sistemul creatinkinazic) al celui de-al doilea mesager implicat n ptrunderea unor hormoni prin membrana celular (sistemul adenilatkinazic), dar i n procesele de glicoliz sau de oxidare aerob a glucidelor. (fig. 28).

55

Fig. 28. - Implicarea sistemului ATPADP n unele procese biochimice celulare Aceste diverse reacii sunt reversibile. Este permanent necesar s se furnizeze energie pentru refacerea AMP, ADP i ATP- ului. Disocierea sau recombinarea unui compus fosforilat ca ATP se realizeaz n prezena enzimei adenozin trifosfataza (ATP-aza). 2.5.2.2. Ali compui fosforilai Celula conine o multitudine de compui fosforilai. Printre acetia, PEP (fosfoenolpiruvatul) conine o energie liber de hidroliz considerabil (G = - 12 800 cal/mol), mult mai ridicat dect cea a ATP ului (G = - 7000 cal/mol). Aceti compui au tendina de a se descompune cednd o molecul de acid fosforic i energie, favoriznd sinteza de ATP din ADP i fosfai liberi, prezeni n mediu. Ali compui au o energie liber de hidroliz mult mai mic dect ATP-ul. Un exemplu este glucozo -1-fosfat, G = 5000 cal/mol. Aceti compui se formeaz n prezena ATP-ului care se descompune cednd energie i o molecul de acid fosforic. ntre aceste dou exemple extreme de potenial energetic, PEP i glucozo -1- fosfat, exist numeroi compui intermediari . Diferiii compui fasfarai pot fi repartizai pe o scar, dup potenialul lor de transfer al grupului fosfat. Grupul fosfat tinde s treac de la compusul cu potenial de transfer ridicat, spre cel cu potenial mai sczut. Sistemul ADP ATP, care are un potenial de transfer de valoare medie, regleaz transferul ntre cele dou tipuri de compui. Exist i compui fosfarai, derivai de nucleotide, analogi ATP ului, dar n cantiti mult mai sczute. Astfel sunt: uridintrifosfatul (UTP), citidintrifosfatul (CTP), guanozintrifosfatul (GTP) etc. Aceste substane posed, de asemenea, legturi macroergice fosfat cu un nalt potenial de energie.

2.6. Membrane care cupleaz energie

Membranele capabile de captarea i conversia energiei aparin cloroplastelor i mitocondriilor.

2.6.1. Cloroplastele
Viaa pe Pmnt depinde de energia produs de steaua noastr apropiat, soarele. Energia solar traverseaz spaiul sub form de lumin. Aici, pe Pmnt, lumina solar este captat de numeroasele frunze sau organe verzi ale plantelor. Acestea sunt capabile nu numai s capteze lumina solar ci s o i prelucreze n hran. 56

Cloroplastele sau plastidele verzi, prezente n toate organele verzi ale plantelor, sunt responsabile de conversia energiei luminoase n energie chimic, datorit clorofilei pe care o conin. Studiile de microscopie electronic au evideniat pe suprafaa lamelor stromatice i granare, particule globulare cu dimensiuni de 100-200A0, considerate unitile funcionale ale fotosintezei i care au fost numite cuantosomi (Park i Pon,1963) . Un cuantosom este format, se pare, dintr-un strat de substane proteice mbibate cu ap i o component lipidic Molecula bipolar a clorofilei se orienteaz cu polul hidrofil (inelul porfirinic) spre stratul proteic, n timp ce polul hidrofob (reprezentat de fitol) se ndreapt spre lipoizii de structur ai lamelei granare. S-a stabilit c un cuantosom conine: circa 160molecule de clorofila-a, 70 molecule de clorofila-b, 48 molecule de carotenoizi, sute de molecule de lipide, circa 9500 atomi de azot proteic, precum i doi atomi de mangan, doisprezece atomi de fier i sase atomi de cupru. Membranele tilacoidelor, conin 12% pigmeni de dou categorii: clorofile 10% i carotenoizi 2%. Culorea verde a frunzelor este dat de prezena clorofilelor care mascheaz culoarea galben portocalie a carotenoizilor. Dintr-un extract brut de pigmeni (extract in aceton sau n alcool) poate fi separat prin cromatografie pe hrtie, plac sau coloan fiecare pigment din amestec. a. Pigmenii clorofilieni Exist dou tipuri de clorofile a i b, la plantele superioare, clorofila a, de culoare verde albastr, este mai frecvent dect clorofila b, de culoare verde glbui. Structura chimic a celor dou clorofile este apropiat. Se disting dou regiuni: o regiune porfirinic (inel porfirinic) cu un atom de magneziu n centru i cu o coad fitolalcool cu C20. Majoritatea moleculelor de clorofil sunt asociate proteinelor membranare (cromoproteine). Sineza clorofilelor se face n interiorul cloroplastelor. La plantele superioare, una dintre multiplele etape de sintez necesit lumin i fier, de unde sindromul de cloroz(nglbenire) n cazul carenei de fier sau lumin (etiolarea). b. Pigmenii carotenoidici Sunt pigmeni lipofili derivai de la izopren. Acetia sunt: licopenul de culoare roie i carotenul de culoare portocalie; xantofilele, derivai hidroxilai ai pigmenilor carotenoidici sau oxicaroteni. 2.6.1.1. Procesul general al fotosintezei Cloroplastele reprezint suportul material, adic sediul la nivelul cruia se desfoar grandiosul proces al fotosintezei, n timpul cruia se sintetizeaz, n prezena luminii, substane organice din CO2 i ap. Aceasta transformare de substan realizat n celula vegetal este dublat de conversia, la fel de intens de energie, pentru ca sinteza moleculelor organice nseamn nmagazinarea de energie chimic provenit din conversia energiei solare. S-a stabilit ca n procesul de fotosinteza, exista doua tipuri de reacii: reacii de lumina (faza de lumina, faza lui Hill) si faza de ntuneric (faza obscura sau faza lui Blackman sau ciclul Calvin) (fig. 29).

57

Fig. 29 - Schema fotosintezei: A - reaciile de lumin; B - reaciile de ntuneric (dup P. Sitte, 1965)

n reaciile de lumina, care au loc n tilacoidele cloroplastului, hidrogenul este smuls de la moleculele de ap i dus de o serie de transformri la NADP, cu degajare de O2 n afara celulei. Acest transfer este posibil graie aportului de energie libera-energie luminoasa-, care provoac starea de excitaie electronica a moleculei de clorofila. Concomitent cu acest transport de H2 (sau de electroni), are loc convertirea energiei luminoase n energie chimic, prin reacia de fotofosforilare, cu sinteza moleculei macroergice de ATP . Se pare ca pentru fiecare doi electroni transportai revin dou (sau fraciuni ntre 1 i 2) molecule de ATP. Reaciile de lumina pot fi sintetizate astfel: H2O + NADP O2 + NADPH2; 2ADP + Pi 2 ATP n reaciile de ntuneric, care se petrec n stroma cloroplastului, NADPH2 produc n reaciile de lumina este folosit pentru reducerea CO2. Aceste reacii sunt asociate cu o cretere n energia libera a sistemului celular, provenit din descompunerea ATP rezultat n fotofaza. Reaciile de ntuneric pot fi sintetizate astfel: CO2 + 2NADPH2 (CH2O) + H2O + 2NADP 3ATP 3ADP + 3Pi Astfel, procesele generale ale fotosintezei pot fi reprezentate prin reacia: lumin CO2 + H2O (CH2O) + O Hv

58

2.6.1.2. Reaciile de lumin a. Fotonul Lumina este un fenomen de natur ondulatorie i corpuscular. Fiecare corpuscul sau foton, transport o energie W(un quantum) care are o valoare dat de lungimea de und asociat relaiei W=h; h este o constant, (constanta lui Planck) iar este frecvena undei(numrul de vibraii /secund), =c/, c-viteza luminii n vid. Astfel, un foton de lumin albastr cu o lungime mic a undei, transport mai mult energie dect un foton de lumin roie cu lungime de und nalt. b. Procesul de absorbie a energiei luminoase Posibilitatea de a utiliza radiaiile luminoase de ctre celulele plantelor verzi se datoreaz faptului c ele conin n cloroplaste molecule de clorofila capabile de aa numitul efect fotoelectric, care consta n emisiunea de electroni din atomul unei molecule, sub aciunea luminii. Astfel, sub aciunea radiaiilor luminoase cu lungimea de unda ntre 380770nm, molecula de clorofila intra n starea de ,,excitaie electronica (stare activa),care se caracterizeaz fata de starea fundamental printr-un exces de energie. Molecula de clorofila poate atinge trei niveluri de excitaie electronica: 1. Adsorbind radiaii cu lungimea de unda de 430nm (radiaii albastre), un electron al moleculei este dizolvat i trece pe orbita liber, meninndu-i sensul spinului. Energia nmagazinata n acest caz este egala cu 65Kcal/mol/gram. Aceasta reprezint o stare de excitaie singletic a moleculei de clorofila, avnd cel mai nalt nivel energetic faa de starea fundamentala, ca urmare a duratei foarte scurte de viaa (10-12 10-11s) este incapabil s induc reacie fotochimic. Dezactivarea, ce aduce revenirea la starea fundamental a moleculei se face prin pierdere de cldura (24Kcal/ mol/gram) i molecula cade la un alt nivel energetic de excitaie singlatica, cu 41Kcal/mol/gram. 2. Cnd molecula de clorofila este bombardat cu fotoni de lumina roie (cu lungimea undei 670nm), ea atinge acelai nivel energetic (41Kcal/mol/gram) . Durata de viaa a acestei stri de excitaie electronica este puin mai mare (10-9s), totui nc insuficient pentru inducerea reaciei fotochimice. Molecula ajuns la acest nivel se dezactiveaz prin emisie de fluorescenta, sau prin pierdere de cldur, n valoare de 10Kcal/mol/gram. Cu aceasta ocazie se poate ntmpla s aib loc i rsturnarea spinului (care se face cu cheltuiala de energie de excitaie) molecula caznd la un al treilea nivel energetic de excitaie electronic, numit stare tripletica (sau metastabila). -4 -2 3. Starea de excitaie tripletica are o durata de viaa mai lung (10 -10 s) i, datorit ei, dei are cel mai sczut nivel energetic (31Kcal/mol/gram), se poate dezactiva prin inducerea unei reacii fotochimice (fig.30).

Fig. 30. Strile de excitaie electronic a unei molecule de clorofil (dup Libbert, 1974) 59

Exist mai multe forme ale clorofilei-a, n funcie de molecula proteic cu care este complexat i care nu sunt echivalente funcional. B. Kok si G. Hoch (1961) au descoperit o clorofila-a, care absoarbe radiaii cu lungime de unda de 700nm; iar G. Doring i colab. (1967) o alt form activ a clorofilei-a, cu maximum de absorbie la 682nm. Aceste forme au fost notate convenional ,,P700 pentru fotosistemul I i ,,P680 pentru fotosistemul II i numai electronul dizlocat de pe aceste molecule este att de bogat n energie, nct provoac reacia fotochimica. Celelalte forme de clorofila-a i clorofila-b, carotenoizii, ficoeritrina i ficocianina (de la alge)transfera energia luminoas pe care o absoarbe pigmentul P700, care reprezint ,,centrul fotochimic al fotosistemului I, energia avnd tendina s migreze spre molecule care absorb radiaii cu lungime de unda mai mare. c. Fotosistemul I si II Bazndu-se pe observaii ncepute din 1941 Emerson a artat (n 1957) ca daca alga Chlorella este expusa la radiaii roii cu =680nm, se constata ca procesul fotosintetic decurge mult mai slab dect atunci cnd este expusa aciunii ntregului spectru luminos. De asemenea, acest cercettor a mai stabilit ca daca radiaiile de lungime de unda () de 680nm sunt asociate cu radiaiile de mai mica, procesul fotosintetic arata un efect global superior sumei celor doua efecte pariale produse de cele doua lungimi de unda aplicate independent. Acest fenomen a fost denumit ,,efectul Emerson si a dus la ideea ca fotosinteza implica doua reacii fotochimice n care lumina este absorbita de pigmeni diferii. Studii ulterioare au confirmat existena celor doua reacii fotochimice, dup unii ,,nseriate, dar contrar supoziii originale a lui Emerson s-a stabilit de ctre E. Rabinowith si colab. (1969) c clorofila-a participa la ambele reacii. Cercetri mai recente au stabilit ca unitatea procesului fotosintetic este compusa din doua fotosisteme (fotosistemul I i fotosistemul II), fiecare fiind responsabil pentru anumite reacii fotochimice avnd fiecare cte un centru fotochimic. Cele doua sisteme sunt individualizata funcional si structural, dar sunt legate ntre ele prin intermediul lanului transportorilor de electroni. Pigmenii care absorb lumina sunt distribuii ntre cele doua sisteme. Fotosistemul I este reprezentat de particule mai mici si conine ca ,,centru fotochimic molecule de P700 (clorofila-a cu maxim de absorbie la 700nm) sau clorofila-a I, reprezint deci pigmentul fotochimic activ al acestui sistem. Alturi de P700 mai exista si clorofila cu maxim de absorbie la 680nm si o molecula de citocrom f . Se pare ca PS I nu conine sau conine o cantitate foarte mica de clorofila-b. Fotosistemul II este reprezentat de particule mai mari. El conine clorofila-a cu maxim de absorbie la 680nm (sau dup alii la 672), cunoscuta sub denumirea de P680 sau clorofila-a II si care reprezint pigmentul activ al acestui sistem. Alturi de P680 sistemul mai conine clorofila-b si pigmeni accesorii (clorofila-c i fucoxantina la algele brune, proteinele ficobilinice la algele roii si albastre). Energia luminoasa pe care o absorb aceti pigmeni este mai mica sau egala 680nm si apoi transferata centrului fotochimic al sistemului I. Att clorofila-a I ct si clorofila-a II, socotite ca sensibilizatori optici, sunt singurii pigmeni specializai n transformarea energiei luminoase n energie chimica. De asemenea, fiecrui sistem i corespund reacii fotochimice diferite, PS I fiind raspunztor de formarea NADPH2, iar PS II de degajarea O2. La bacteriile fotosintetizatoare nu exista dect un singur sistem pigmentar, echivalent cu PS I. Se pare ca pigmenii -carotenoizi sunt prezeni n ambele fotosisteme .

60

d. Secvena transferului de electroni Transferul de electroni de la moleculele de ap (donor de e- ) la NADP (acceptor final) implica o serie de transportori de e- cu o secvena specific. Transferul de e- se poate face spontan dac are loc ntre un sistem foarte reductor, cu potenial redox sczut i un sistem mai puin reductor, cu potenial redox ridicat.. n procesul de fotosinteza potenialul redox al sistemului O2/H2o este foarte ridicat (+0,8 voli la pH=7) iar cel al sistemului CO2/CH2O este foarte sczut (-0.42 voli la un pH=7). Deci fotosinteza este un proces constituit dintr-o serie de reacii de oxido-reducere, care evolueaz ntre un oxidant (CO2) cu potenial redox 0.4 V i un reductant (H2O), cu potenial redox +0.8 V, deci n sens invers gradientului de potenial redox. Migrarea protonilor de la H2O la CO2 nu se realizeaz spontan, ci cu aport de energie liber, care este adus de molecula clorofilei. Ea accepta fotoni incideni, induce oxidarea apei i transporta H+ (respectiv electroni) ntre cele dou sisteme redox . e. Fotoliza apei (oxidarea H2O) Provocat de molecula de clorofila excitat, este etapa eseniala a fazei de lumina. Reacia a fost descoperit n anul 1973 de ctre R. Hill i ea se desfoar probabil n doua etapa: hv H2O H+ + e- + OH 2OH H2O O2 Deci din fotoliza apei rezulta H+ legat (sau agentul reductor) pentru ca ea se efectueaz cu intervenia unui transportor, apoi a unui acceptor de H+ i un radical (OH-) care va fi oxidat n prezenta unei enzime cu eliberare de O2. Mecanismul eliberrii O2 este incomplet cunoscut . Se presupune c radicalul OH- se fixeaz pe un acceptor organic care se izomerizeaz ntr-un peroxid, din care O2 va fi eliberat de o peroxidoza (catalaza). catalaza 4OH 2H2O2 2H2O + O2 Rolul de acceptor pare s fie jucat de carotenoizi i de acidul tioctic. f. Lanul transferului de electroni Reacia de oxidare a apei este legat direct de FS II, n care funcioneaz ca un centru de reacii P680, care absorb radiaiile luminii mai mici sau egale cu 680nm . Aceste radiaii produc excitarea moleculelor de clorofila-a care cedeaz energie sub forma de e-, pentru a reveni la starea fundamental. Ca donator de e- pentru P680 functioneaza molecule de apa. Electronul de la molecula de P680 este transferat unui acceptor cu natura chimica nc necunoscut, denumit Q. La rndul su, Q pierde electronul n favoarea unei molecule de plastochinona, care se reduce . Prin intermediul unei plastocianine, molecula de plastochinona transfera e- la citocromul b6 care, la rndul sau, l cedeaz citocromului f.

61

Electronul eliberat de citocromul f furnizeaz clorofilei P700 (centrul de reacie al PS I), electronul pe care acesta l-a pierdut sub aciunea radiaiilor luminoase cu = 680nm. Electronul pierdut de P700 este imediat preluat de un acceptor de e-, necunoscut denumit X, de la care apoi este cedat ferredoxinei, pe care o reduce i creia i transfera energie. Ferredoxina redus transfer e- primit moleculei de NADP, care apoi este redus la NADPH2, reacia fiind catalizat de o ferredoxin NADP reductoza. Pe parcursul transferului de e , la fiecare treapta a transportului se pierde energie, adic exist o cdere a nivelului energetic al electronului cu fiecare nou acceptor al su, astfel nct electronul ajunge ,,descrcat de energie la molecula de clorofila P700 i aceasta se dezactiveaz trecnd n starea ei fundamentala. Datorita cedrii de energie pe parcursul transportului de e-, este posibil sinteza de ATP (rezervorul energetic celular), printr-o reacie de fotofosforilare (fig.31).

Fig. 31. Schema transferului de electroni n fotosintez

g. Fotofosforilarea Capacitatea de fosforilare a cloroplastelor a fost descoperit de D. Arnon i colab. (1954). Transportul de e-, de la ap la NDAP este nsoit de expulsia a doi protoni H+(la nivelul plastochinonei) din stroma cloroplastului, ctre spaiul intratilacoidal, care se adaug protonilor rezultai din fotoliza apei. ncrctura pozitiv se acumuleaz deci n spaiul tilacoidal. Membrana tilacoidal fiind impermeabil pentru protoni, se creaz un gradient electrochimic de protoni care va permite funcionarea ATP-azei membranare.

62

Fig. 32. Schema fosforilrii lineare (I) i ciclice (II)

S-a precizat ca fosforilarea se poate realiza pe dou ci: fotofosforilarea ciclica i aciclica (linear). Pentru ambele ci exist locuri de fosforilare situate pe lanurile transportoare ntre citocromi . Fosforilarea aciclica. n aceasta reacie formarea ATP este asociat cu reducerea NADP i este implicat i fotosistemul II, deci i fotoliza apei. n transferul electronilor provenii de la ap, energia necesar sintezei moleculelor de ATP se elibereaz ntre citocromul-b i citocromul-f. Cercetri recente, bazate pe studiul spectrelor de absorbie a luminii, precum i pe determinarea potenialului redox al sistemelor transportoare de e-, implic n fosforilarea linear citocromul b559 asociat cu plastochinona, locul fosforilarii fiind sistemul ntre citocromul-b559-plastochinona i citocromul-f + plastochinona. Fosforilarea ciclica. Are loc n prezena unor sisteme redox i a luminii . Electronul trasferat de P700 ferredoxinei, n loc sa fie cedat n final, NADP, poate fi transportat enzimatic pe citocromi, de unde este dus napoi la molecula de clorofila-a din fotosistemul I, energia pentru sinteza ATP fiind eliberat ntre citocromul-b6 i citocromul (fig. 32). 2.6.1.3. Reaciile de ntuneric a. Ciclul Calvin (calea C3 de reducerea CO2) NADPH2 i ATP produi n faza de lumina sunt utilizai n stroma cloroplastului, la ncorporarea CO2 n compui organici (fig. 33). Cu ajutorul izotopului marcat 14C, furnizat Ca14CO2 unei culturi de Chlorella, Calvin i Benson (1949-1950) au reuit s elucideze calea urmat de CO2 n cloroplaste. Dup numai 5 sec, izotopul radioactiv a fost gsit n proporie de 87% n acid fosfogliceric, 10% n acid fosfopiruvic i 3% n acid malic. Deci primul produs dup absorbia CO2 este acidul fosfogliceric (APG), marcat n funcia sa carboxilic. ncorporarea moleculei de CO2 se face prin carboxilarea unui acceptor al su, care s-a gsit c este un ester fosforic al unei pentoze: ribulozo -1,5 difosfatul (RIDP), reacia fiind catalizat de carboxidismutaza. Ribuloza difosfatul adiionnd CO2 formeaz un compus intermediar instabil, cu 6 atomi de C, care se descompune hidrolitic, rezultnd dou molecule de acid fosfogliceric. Imediat dup formarea acidului fosfogliceric apar trioze fosforilate, marcate la funcia aldehidica. Reacia de reducere a funciei carboxilice din molecula de acid fosfogliceric se petrece n dou etape, sub aciunea NADPH2 i a energiei sincronizate n molecula de ATP. Astfel ,,agentul reducator (NADPH2) i ,, energia de asimilaie (ATP) leag cele dou faze ale procesului de fotosintez. Deci, reducerea CO2 nu se face n mod direct, ci el este ncorporat mai nti n ribulozo- difosfat, apoi n acid fosfogliceric, care se reduce formnd aldehida fosfogliceric.

63

Fig. 33. Localizarea activitii biochimice n cloroplast (dup Binet i Brunel, 1968)

64

Fig. 34 Schema reducerii CO2 Triozele obinute sunt antrenate ntr-o serie de transformri, desfurate ntr-o secvena ciclica (ciclul Calvin) pe parcursul cruia, n urma unor serii de condensri, se formeaz hexozele i n final, amidonul. Din totalul moleculelor de trioze, numai a VI-a parte parcurge aceast cale, iar celelalte cinci molecule ajung, prin faze intermediare la regenerarea moleculelor de ribozo-difosfat, capabile s accepte noi molecule de CO2 (fig. 34). Exist nsa plante la care celulele mezofilului foliar sunt incapabile s fixeze CO2 n hidraii de C, dar el se ncorporeaz activ n fosfoenol- piruvat (PEP) rezultnd acizii tetracarbonici : malic i aspartic. Astfel, CO2 ajunge pe ribulozo-difosfat intermediat de fosfoenol piruvat, prin transcarboxilare.

65

Dup acest criteriu, plantele se mpart n dou grupe mari, notate prescurtat cu C3fotosintetizante i respectiv C4- fotosintetizante . Calea C4 s-a gsit la specii aparinnd mai multor familii de plante, n majoritate tropicale i subtropicale. Unele genuri, ca de exemplu Atriplex, conin att specii C3 ct i C4. b. Calea C4 - de reducere a CO2 n structura frunzei la speciile de plante tropicale i subtropicale, apar unele particularitai anatomice i de ultrastructur. Astfel, n jurul nervurilor se formeaz o teac de celule parenchimatice mari, adesea lipsite de grana, care sunt singurele capabile sa reduc CO2 pe calea ciclului Calvin. Restul celulelor din mezofil sunt mai mici, au cloroplaste mai mrunte cu ultrastructura normal, n ele desfasurndu-se ciclul Hatch Stac (Calvin). ntre aceste dou tipuri de celule existnd un schimb intens de substane . Speciile de plante C4 fotosintetizante au fost mprite la rndul lor, dup reaciile particulare care duc la eliberarea CO2, n trei grupe. Grupa plantelor ,,NADP-ME, n care intervine enzima malica, dependena de NADP (de ex. Triticum sp.); Grupa plantelor ,,PCK, n care activeaz o fosfoenolpiruvat-carboxikinaza (de ex. Panicum maximum); Grupa ,,NAD-ME n care este activat enzima malica dependena de NAD (de ex. Atriplex spongiosa). n desfurarea ciclului Calvin, la toate cele trei tipuri exist momente comune. Astfel este momentul fixrii CO2 pe oxalocetat, reacie catalizat de fosfoenol-piruvat carboxilaza i care se petrece n citoplasma celulelor mezofilului frunzelor. Mai departe, desfurarea ciclului difer la cele trei tipuri de plante. n plantele din grupa NADP-ME, oxalatul este redus la malat n cloroplastele celulelor mezofilului, iar acesta este translocat n celulele tecii perifasciculare, unde este descompus (n cloroplastul acestora), eliberndu-se CO2 care parcurge ciclul Calvin, formndu-se n final, amidonul. Agentul reductor l constituie NADPH2, format din malat prin intervenia enzimei malice dependena de NADP . Cloroplastele celulelor tecii fasciculare furnizeaz ATP n ele avnd loc fosforilarea. Este de notat faptul c plantele C4 utilizeaz o molecul de ATP n plus, fat de plantele C3, pentru fiecare molecul de CO2 fixata de hidrai de carbon (fig. 35A).

Fig. 35. A. Fixarea CO2 pe calea C4: A - plante "NADP - ME"; B - plante "PCK"; C - plante "NAD-ME"; ciclul FRC - ciclul fotosintetic de reducere a CO2 66

n celelalte dou tipuri de plante C4 (PCK si NAD-ME) oxalatul format de fosfoenolpiruvat-carboxilaza, n primul moment al fixrii CO2, este convertit prin transaminare, n afara cloroplastului, la aspartat, care migreaz apoi n teaca perifasciculara de celule, unde din nou, este convertit prin transaminare napoi la oxalacetat. Aceasta noua transaminare este localizat la tipul de plante ,,PCK n citoplasma celulelor perifasciculare, iar la tipul de plante ,,NAD-ME n mitocondriile lor. n plantele ,,PCK oxalatul este decarboxilat de o PEP-carboxilaza citoplasmatic formndu-se acid PEP, care este apoi convertit la piruvat (fig. 35 B). n plantele NAD-ME, oxalatul este mai nti redus de ctre NAD-malat dehidrogenaz n mitocondrii, apoi sufer n aceleai organite o decarboxilare oxidativ prin intervenia enzimei malice, dependent de NAD. Piruvatul eliberat la ambele tipuri de plante, este convertit n alanina prin transformare, iar alanina se ntoarce n celulele mezofilului unde este transaminat din nou producndu-se piruvat, care este reconvertit n cloroplaste la PEP (fig. 35 C). Astfel, calea C4 se caracterizeaz prin transportul unor mari cantitai de malat sau aspartat din celulele mezofilului n celulele tecii perifasciculare i cantitai corespunztoare de piruvat sau alanina n direcie opus. Acest flux, intercelular are loc, se crede prin plasmodesmele din pereii celor dou tipuri de celule.

2.6.2. Mitocondriile
Mitocondria este considerat ,,centrul respiraiei celulare funcia principal const n nglobarea energiei sub forma de legturi macroergice de ATP. Mitocondriile, datorit echipamentului lor enzimatic, localizat att n membrane, ct i n matrice, ndeplinesc n biologia celulei urmtoarele roluri: asigur n parte degradarea glucozei, sunt sediul efecturii ciclului Krebs i al lanului respirator ce deriv din acest ciclu, asigura efectuarea ciclului glicoxalatului i sunt sediul unor sinteze i degradri de substane. 2.6.2.1.Degradarea glucozei de ctre mitocondrii Se admite n general, c degradarea glucozei are loc n dou etape: una extramitocondriala, care ia sfrit cu formarea a dou molecule de acid piruvic dintr-o molecula de glucoza i alta intramitocondrial n care are loc oxidarea total a acidului piruvic n CO2 si H2O. Prima serie de reacii este cunoscut sub denumirea de glicoliza, calea EmdenMeyerhof, faza anaeroba a oxidrii glucozei sau calea formrii piruvatului. n linii mari, procesul de degradare anaerob a glucozei se desfasoar astfel: ATP fosforilare ADP glucoza fosfokinaza izomerizare glucoza-6-fosfat hexozoizomeraza ATP fosforilare ADP fructoza-6-fosfat fosfofructokinaza dihidroizi-acetona 3-fosfat aldehida-3-fosfoglicerina aldolaza acid piruvic (2 molecule) piruvatkinaza 67 NADHH+NAD acid-3-fosfogliceric ambele sunt reduse de NADH fructoza-1.6-difosfat fructoza-6-fosfat

Deci, n etapa extramitocondriala dintr-o molecul de glucoza rezult dou molecule de acid piruvic (glicoliza), urmnd ca oxidarea complet a acidului piruvic, n CO2 si H2O s aib loc intramitocondrial, n ciclul Krebs. n acest scop acidul piruvic este convertit n prezena coenzimei-A (Co-A) n acetil-Co-A, cnd are loc o reacie complex de decarboxilare oxidativa, la care particip NAD+ ca acceptor de H+ i enzima piruvatdecarboxilaza. Ciclul Krebs Denumit i ciclul citric sau ciclul tricarboxilic (deoarece n desfurarea lui intervin acizi cu trei grupri COOH), se desfoar n exclusivitate n matrice, iar reacia lui fundamental este oxidarea completa a gruprii acetil a acetil-Co-A. Aceasta oxidare este realizat numai dac n mediu se gsete n exces alt substan acidul oxalacetic, care ia natere n urma carboxilarii n hialoplasma a acidului piruvic, n prezenta oxalacetalcarboxilazei i a ionilor de Mn2+, cofactor:
Mn2+

acidul piruvic oxalacetal-carboxilaza.

acid oxalacetic

Dac n legtura cu producerea glucolizei mai exist nc deosebire de vederi n ceea ce privete nivelul celular la care are loc, n schimb toi biochimitii, bazndu-se pe date experimentale, sunt de acord ca ciclul Krebs se desfoar exclusiv n mitocondrie i constitue cea mai important cale catabolica aeroba a oxidrii hidrailor de C, a acizilor grai i a majoritii aminoacizilor pn la CO2 i H2O, cu punerea n libertate a unei importante cantitai de energie. Fazele de desfurare a acestui ciclu, stabilite de Krebs nc din 1930, au putut fi urmrite i controlate n ultimele decenii cu ajutorul suspensiilor de mitocondrii. Acest ciclu are loc n mai multe etape, reaciile fiecrei etape fiind catalizate de cte o enzim. Prima etap, considerat cea mai important, const n ptrunderea acidului oxalacetic n matricea mitocondriei, ptrundere nlesnit de acetil-Co-A-sintetaza, identificat recent n membran mitocondriala extern, prin condensare cu acetil-Co-A, aceasta va da natere acidului citric, reacie catalizat de citrat-sintetaza. Acid oxalacetc + acetil - Co-A Citrat-sintetaza Mg2+ Acidul citric astfel format, n urma unor izomerizri i decarboxilari d natere la o serie de acizi tri i dicarboxilici ca acizii: izocitric, aconitic, cetoglutaric, succinic, fumaric, malic, acizi cu 6,5 i 4 atomi de carbon i, n sfrit acidul oxalacetic de la care s-a plecat n tot acest timp, acidul acetic provenit din acidul piruvic iniial, s-a degradat n CO2 si H2O, iar acidul oxalacetic activat, rezultat din transformarea altei molecule de acid piruvic (provenit dintr-o nou molecula de glucoza), relund ciclul Krebs (fig. 36). acid citric + HS Co-A

68

Fig. 36. Ciclul Krebs 69

n cadrul ciclului Krebs se disting opt grupe, n urma crora rezult dou molecule de CO2 (reaciile III i IV) i opt atomi de H+. Ciclul Krebs este conectat cu lanul respirator i, mpreun elibereaz 216Kcal, din care 191 provin din lanul respirator . Energia chimic rezultat este stocat n ATP (38 de molecule). n afara de oxidarea completa a radicalului acetil i de stocarea energiei, ciclul Krebs asigur formarea a numeroase substane, cum sunt: -cetogentaratul, care poate da prin aminare glutamat, care la rndul su este precursorul argininei, prolinei i hidroxiprolinei; acidul oxalacetic d prin transformare acid aspartic care este precursorul -alaninei, treoninei, metioninei, lizinei; acidul succinic este precursorul nucleelor tetrapirolice care intra n constituia citocromilor. 2.6.2.2.Ciclul glioxalatului Studiile efectuate n special n ultimele decenii au demonstrat c numeroi mutani de bacterii i ciuperci cresc i se dezvolt mult mai bine pe mediile de cultur crora li s-a adugat acetat . Cutndu-se explicarea aciunii ionului acetat, s-a constatat printre altele, c prezena acestuia n mediul de cultur determin producerea de zahr i de proteine prin intermediul ciclului glicoxalatului datorit izocitrazei i malat-sintetazei, enzime care lipsesc din celulele animale, bacteriile i ciupercile ntrerup ciclul Krebs la nivelul acizilor izocitric i malic. Izocitraza descompune acidul izocitric n acizii glicoxalic i succinic, iar malat-sintetaza, n urma condensrii acidului glicoxalic cu o molecul de acetat, d natere la malat, totul are loc ca i cnd dou molecule de acetat au dat natere prin convertire unei molecule de succinat, care intervine n sinteza zaharurilor i proteinelor ce apar n mediul de cultur. 2.6.2.3. oxidarea acizilor grai Lipidele se metabolizeaz direct sub aciunea lipazei n glicerol i acizi grai. Acizii grai sunt oxidai la nivelul mitocondriei. Schema procesului de oxidare a acizilor grai a fost elaborat de Lynen i este reprezentat de o elice n care fiecare spir corespunde formrii unui acetil-Co-A. n prezena ATP, intervin sisteme enzimatice n frunte cu HS-Co-A, producnd treptat pierderea unui acid gras cu doi atomi de carbon mai puin . Molecula de CH3-COOH rezultat nu rmne liber, ca atare, ci se combin imediat cu SH-Co-A, dnd acetil- Co-A care intra n combinaie cu acidul oxalacetic, cu formare de acid citric care trece n ciclul Krebs unde va fi complet degradat n ap i CO2. n felul acesta, ntregul lan lung al acidului gras este transformat integral n CO2 i H2O i energie . Formarea fiecrei molecule de acetil-Co-A reprezentat n urma acestei oxidri este nsoit de reducerea unei molecule de NAD la NADH2 i a unei molecule de FAD la FADH2. De asemenea, cercetrile au artat ca acizii aminati rezultai din hidroliza proteidelor n urma unui proces de dezaminare oxidativ dau natere la acizi cetonici, care pot intra n diverse etape ale ciclului Krebs att n mitocondria animal, ct i n cea vegetal (fig. 37).

70

Fig. 37. - oxidarea acizilor grai

2.6.2.4. Sistemul transportor de electroni (lanul respirator) Lanul respirator denumit i lanul citocromic sau sistemul transportor de electroni, reprezint ansamblul de reacii care au loc n mitocondrie, prin care electronii pierdui de substane (glucide, lipide sau protide), n timpul dehidrogenarii lor n matrice sunt transportai pn la oxigen acionndu-l; oxigenul astfel activat devine acceptor de protoni (H+), dnd natere la H2O. Studiile biochimice ,,n situ i ,,n vitro au demonstrat c acceptorii de H+ eliberat de substrat sunt NAD, NADP, FAD, iar cei de electroni sunt citocromii, derivai ai hematinei, n care fierul poate exista fie sub forma de Fe2+, fie Fe3+. Din mitocondrii au fost izolai mai muli citocromi care aparin claselor a, b, c; de asemenea s-a mai precizat c citocromii mitocondriali a i b sunt insolubili n apa i sunt activi numai asociai cu fosfolipide, iar citocromul c este foarte solubil n apa. Transportul protonilor (H+) i electronilor e pn la O2 se face prin intermediul nucleotidelor i citocromului. Unele din aceste nucleotide, ca FAD sunt n realitate coenzimele hidrogenazelor i anume NADH2-dehidrogenazei i succin-dehidrogenazei. Aceste dehidrogenaze cu coenzime flavinice, colorate n galben, sunt denumite flavo-proteine. 71

Cercetrile biochimice din ultimele decenii au dus la concluzia c n procesul de trecere al H+ pe NAD i NADP, care la rndul lor l transport pe FAD, intervine ubichinona sau coenzima Q. Din punct de vedere structural coenzima Q este o chinona cu un lan lateral poliizoprenic. Studiile de chimie ultrastructural i tehnicile de fragmentare a mitocondriei, au stabilit ca ntregul lan respirator se afla localizat n membrana mitocondriei interne, n oxizomi, activitatea lui fiind n funcie de integrarea structural a oxizomilor. Green (1964) a reuit s izoleze din oxizomi patru complexe enzimatice, denumite convenional I , II, III si IV . Dou din acestea, I i II sunt dehidrogenaze i sunt localizate la baza oxizomului, complexul III, localizat n regiunea mediana, catalizeaz reaciile ce au loc de la coenzima Q pn la citocromul C, iar complexul IV, care se gsete la vrful oxizomului, catalizeaz reaciile terminale ale lanului respirator, adic transferul electronilor de la citocromul c la O2, n vederea activrii lui. 2.6.2.5. Fosforilarea oxidativ Electronii n lungul lanului respirator sufer o scdere de potenial, materializat printro eliberare de energie, care are loc n etape i care servete pentru regenerarea moleculelor de

Fig. 38. Conceptul fosforilrii oxidative 72

ATP prin fosforilarea ADP cu fosfat anorganic (Pi) existent n matricea mitocondriei (fig. 38). Formarea ATP are loc n trei etape si anume: o prima etapa o constitue oxidarea NADH2 de ctre FAD, o a doua oxidarea citocromului b de ctre citocromul c i a treia, oxidarea citocromului a, rezultnd n final trei molecule de ATP. Ansamblul acestor reacii de oxidare i fosforilare a fost denumit fosforilare oxidativa. Energia astfel stocat sub forma de ATP servete n majoritatea cazurilor la biosinteza unor substane de mare importan. Fosforilarea oxidativ, denumit i fosforilare cuplat, are un rol deosebit de important n reglarea numeroaselor etape ale metabolismului celular i justific denumirea de ,, central energetic a celulei care se d mitocondriei. Oxidarea complet a unei molecule de glucoz (glicoliz + ciclul Krebs) permite sinteza a 38 de molecule de ATP. Ecuaia global a respiraiei unei molecule de glucoz se poate scrie astfel: C 6 H 12O 6 + 6O2 + 6 H2O 6CO2+ 12H2O + 38 ATP 2.6.2.6. Fermentaiile Exigena organismelor fa de oxigen nu sunt identice. Astfel se disting urmtoarele trei grupe: Organismele strict aerobe, care nu pot tri dect n prezena oxigenului (animalele, plantele, unele microorganisme) Organismele strict anaerobe, care nu pot tri dect n absena oxigenului liber, care le este nociv (numeroase microorganisme, de ex Clostridium) Organisme aerobe facultative, care pot tri att n prezena ct i n absena oxigenului din mediu. Astfel, levurile aparin acestei categorii dar i unele plante superioare care sunt capabile s reziste la asfixie, adoptnd o activitate metabolic diferit de respiraie, numit fermentaie. Fermentaia este oxidarea incomplet a unui substrat organic n absena oxigenului (metabolism anaerob); acest substrat organic este transformat ntr-un produs rezidual organic. Reaciile enzimatice care transform substratul organic sunt cele de la glicoliz (localizate n citoplasma citoplasma celular). Substratul este deci degradat pn la acid piruvic. NADH2 format neoxidat de oxigenul atmosferic din mitocondrie, va reduce acidul piruvic, transformndu-l ntrun produs rezidual produs ultim rezidual din procesul fermentaiei. Dup natura acestui produs rezidual i a echipamentului enzimatic al organismului fermentativ, pot exista mai multe tipuri de fermentaie (alcoolic, lactic, acetic etc). Metabolismul anaerob este mult mai puin eficace n ceea ce privete producerea de energie, dect respiraia, deoarece fermentaia nu utilizeaz n totalitate energia substratului degradat pentru sinteza ATP, de la o molecul de glucoz fermentat se formeaz doar dou molecule de ATP, n timp ce n cursul oxidrii complete dintr-o molecul de glucoz rezult 38 molecule de ATP. Randamentul fermentaiei este de 2%, fa de 45% ct este pentru respiraie. Organismele care i obin energia din fermentaie trebuie s descompun cantiti considerabile de substrat; aceste organisme se numesc ,,descompuntori.

2.6.3.Comparaie ntre fotosintez i respiraie

Fotosinteza i respiraia sunt dou procese antagonice dar complementare: din punct de vedere energetic, fotosinteza transform energia luminoas n energie chimic, acumulat n legturile carbon-hidrogen; respiraia rupe aceast legtur i elibereaz energie; din punct de vedere metabolic, fotosinteza construiete materie organic prin fixarea i reducerea carbonului mineral, astfel c plantele cresc n greutate. Dar respiraia 73

degradeaz rezervele organice (derivai de carbon) prin oxidare i greutatea plantelor scade prin pierderea carbon mineral; schimburile gazoase sunt n sens invers: fotosinteza absoarbe CO2 i ap i degaj O2. Oxigenul fotosintetic degajat n biosfer asigur viaa organismelor superioare (eucariote) care respir acest oxigen, degajnd CO2 i ap; fotosinteza se manifest numai n prezena luminii. Intensitatea respiraiei este identic att n condiii de obscuritate ct i de lumin; mecanismele biochimice sunt antagonice: lanurile transportorilor de electroni funcioneaz n sens opus. Lanul fotosintetic, permite transportul electronilor de la ap la NADH2, lanul respirator invers, electronii sunt transportai de la NADH2 la oxigen, rezultnd ap. glucoza construit n cursul ciclului Calvin (faza de ntuneric a fotosintezei) prin carboxilare, hidrogenare i condensare, este tiat de glicoliz, dehidrogenat i decarboxilat de ciclul Krebs. Respiraia i fotosinteza sunt procese care se opun reciproc, dar, ambele particip la meninerea vieii i creterea organismelor vegetale sau animale. Formula general pentru fotosintez este urmtoarea: Energie (lumina) + 6CO2 + 6H2O C6 H 12O6 + 6 O2 Formula general pentru respiraie conine aceeai compui : C 6H 12 O 6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H 2 O + energie (ATP) Dup cum se observ din formulele generale ale fotosintezei i respiraiei celulare, aceste reacii sunt exact n opoziie una cu alta, respiraia elibernd energia captat (de la soare) de fotosintez. Cele dou procese au i etape similare. Astfel, ambele implic conversia energiei dintr-o form n alta. n fotosintez, energia, (lumina) solar este convertit n energie chimic. n respiraie, energia chimic este convertit n ATP. n ambele procese energia electronilor ce se deplaseaz de-a lungul unui lan este folosit pentru sinteza ATP-ului. Att cloroplastul ct i mitocondria au o ultrastructur asemntoare, ceea ce reflect i funcii asemntoare (transformatori de energie). Lanul transportatorilor de electroni, prezent att n mitocondrie ct i n cloroplast, se datoreaz aranjamentului membranelor interne, care este foarte asemntor, n aceste dou organite. Toate organismele scindeaz molecule organice pentru a-i asigura combustibilul necesar proceselor vitale, dar numai plantele autotrofe sunt capabile s capteze energia solar i s o transforme n hran . Conversia energiei este procesul de baz de care depind toate fiinele vii.

74

Capitolul 3
ADEZIUNEA CELULAR. JONCIUNILE CELULARE I MATRICEA EXTRACELULAR
n organismele pluricelulare, celulele specializate n realizarea unei anumite funcii se recunosc i interacioneaz specific formnd esuturi, care prin asociere dau natere unitilor funcionale, numite organe. Interaciunea dintre celule poate fi joncional ( prin intermediul unor structuri specializate numite jonciuni celulare) sau non-jonctional ( prin intermediul moleculelor suprafeei celulare). Astfel, recunoaterea i aderarea intercelular este posibil datorit moleculelor de pe suprafaa celular, care pot fi diferite calitativ i cantitativ, manifestnd specificitate celular. Suprafaa celular poate media trei tipuri de aderare: a) homofilic, dac moleculele suprafeei celular care interacioneaz sunt identice; b) heterofilic, dac moleculele suprafeei celulare sunt diferite dar complementare i c) prin molecul linker, molecul extracelular, ce nu aparine suprafeei celulare. Un rol important n stabilirea structurilor tisulare l are matricea extracelular, o reea complex de macromolecule prezent n spaiile interstiiale i care se afl ntr-o permanent interrelaie cu celulele. Ancorarea celulelor n matricea extracelular se realizeaz prin jonciunile celulmatrice, regiuni specializate din membrana plasmatic. Implicarea jonciunilor intercelulare i a matricei, n adeziunea celular, variaz funcie de tipul celular. n esutul epitelial, celulele sunt strns unite ntre ele, iar matricea extracelular este slab reprezentat. Rezistena esutului epitelial la forele la forele mecanice ce acioneaz asupra sa este conferit de proteine fibrilare intracelulare (elemente de citoschelet), care se aeaz pe faa intern a membranei plasmatice, unde se formeaz jonciuni specializate cu suprafaa altor celule sau cu matricea extracelular. n esutul conjunctiv, celulele sunt dispersate n matricea extracelular, care ocup cea mai mare parte a volumului tisular. n acest caz, elementele componente ale matricei asigur stabilitatea tisular prelund aproape n totalitate stress-ul mecanic.

3.1. Molecule implicate n aderarea celul-celul

Din categoria moleculelor suprafeei celulare implicate n aderarea celular nonjoncional fac parte: selectinele, domeniile imunoglobulinice i caderinele.

3.1.1. Selectinele
Sunt proteine identificate pe suprafaa membranar a leucocitelor, plachetelor sanguine, celulelor endoteliale. Sunt implicate n medierea interaciunii limfocitelor cu peretele venulelor sau cu nodulii limfatici, fapt pentru care se numesc i proteine transmembranare limfocitare. Selectinele recunosc i leag formaiuni specifice de oligozaharide care aparin altei celulei. Ele posed un domeniu citoplasmatic care traverseaz membrana plasmatic i un segment extracelular de lungimi variabile care se termin cu un domeniu pentru lectin. Acest domeniu terminal leag lectine, proteine de legare care recunosc i leag specific moleculele de carbohidrai de la suprafaa celulei nvecinate. Legarea selectinelor la carbohidrai este Ca2+ dependent. Selectinele sunt importante n rspunsul inflamator. Ele mediaz legarea neutrofilelor de peretele vasului de snge, favoriznd invazia neutrofilelor prin peretele vasului la locul infeciei sau leziunii. Pentru procesul invaziei neutrofilelor sunt necesare integrine (proteine receptori membranari de recunoatere).

75

3.1.2. Domenii imunoglobulinice

Unele domenii imunoglobulinice care nu aparin structurii unui anticorp pot media interaciuni non-joncionale celul-celul Ca2+ dependete, homosau heterofilic. Interaciunea heterofilic presupune prezena integrinelor. Proteinele care conin domenii imunoglobulinice aparin IgSF (superfamiliei imunoglobulinelor). Aderarea celor dou celule adiacente se realizeaz prin suprapunerea domeniului Ig al unei celule cu domeniul Ig al celulei vecine. Membrii numeroi ai IgSF mediaz interaciunea celular n elaborarea rspunsului imun. Unul dintre acetia, numit VCAMs (vascular cell- adhesion molecules) factorul de adeziune vascular este important n dezvoltarea sistemului circulator la embrion i n legarea neutrofilelor de peretele vascular nainte de invazie. Ali doi reprezentani al IgSF sunt NCAMs (neural cell- adhesion molecules) sau factorul de adeziune neural i L1, ambii foarte importani n dezvoltarea sistemului nervos la embrion. NCAMs mediaz interaciunea celul-celul, iar L1 mediaz alungirea conului de cretere n timpul dezvoltrii neuronilor. Un domeniu Ig conine proteine de suprafa ale unei celule care pot interaciona cu o molecul de integrin ale altei celule (de exemplu, aderarea neutrofilului la peretele vascular, interaciune mediat de NCAMs celulelor endoteliale i integrinele neutrofilelor).

3.1.3. Caderinele
Sunt reprezentate de o larg familie de glicoproteine de adeziune, Ca2+ dependente. Ele mediaz interaciuni celulare homotipice non-joncionale i joncionale i transmit semnale din matrixul extracelular n citoplasm. Caderinele au fost identificate n diferite pri ale corpului (N-caderina n sistemul nervos, P- caderina n placent, E- caderina n esutul epitelial). Caracteristic acestui tip de glicoproteine este faptul c ele leag intre ele celule de acelai tip i, deci i caderine de acelai tip. Caderinele sunt alctuite dintr-un segment lung extracelular ce conine 5 domenii de legare, un segment transmembranar i un mic domeniu citoplasmatic. Domeniul citoplasmatic interacioneaz cu proteine din citosol care fixeaz caderine ce aparin citoscheletului i transmit informaii n citoplasm. Caderinele de pe aceeai suprafa celular se asociaz formnd dimeri. Segmentele extracelulare ce aparin la dou celule adiacente pot interaciona prin juxtapoziia poriunilor terminale sau a segmentului n totalitate. Ca2+ leag segmentele n tandem meninndu-le ntr-o stare rigid, stare necesar legrii unei caderine de caderina celulei alturate. Caderinele sunt molecule implicate n recunoaterea celulelor de acelai tip, aderarea i meninerea lor ntr-un esut, respectiv alctuirea unui esut la embrion i meninerea integritii unui esut la adult. n cancer, se produc modificri conformaionale ale caderinelor care duc la scderea adezivitii celulare, eliberarea celulelor oncogene din esut i migrarea lor, cu posibilitatea iniierii metastazelor.

3.2. Jonciunea celular

Jonciunile celulare (jonciunile intercelulare i jonciunile celul-matrice extracelular), structuri specializate i stabile, permit sau mpiedic schimburile intercelulare i mediaz contactele celul-celul i celul-matrice. Din punct de vedere funcional se deosebesc trei categorii principale de jonciuni: Jonciunile de ocluzie sudeaz membranele plasmatice ale celulelor epiteliale, blocnd fluxul de molecule i ioni dintre lumenul organelor cavitare i spaiile interstiiale; 76

Jonciunile de ancorare asigur legarea strns a celulelor unele de altele i a acestora cu matricea extracelular; Jonciunile de comunicare sunt implicate n cuplarea electric i metabolic a celulelor ce ndeplinesc aceeai funcie. Jonciuni sinaptice conecteaz partea terminal a unui axon neuronal ( butonul terminal) cu celula int.

3.2.1. Jonciunile de ocluzie

Jonciunile de ocluzie (zonulae occludens numite i jonciuni strnse sau impermeabile (tight jonction) sunt reprezentate la polul apical al celulelor epiteliale ce delimiteaz lumenul unor caviti. Observarea la microscopul electronic a unei seciuni prin jonciunile de ocluzie ofer imaginea a dou membrane plasmatice adiacente care din loc n loc se gsesc n contact direct. Aceste puncte de sudur, separate de mici spaii interstiiale, sunt rezultatul anastomozei proteinelor joncionale prezente n membranele plasmatice ale celulelor nvecinate. Dei proteinele nu au fost nc izolate, substratul molecular proteic al jonciunilor de ocluzie este sugerat de aciunea denaturant pe care proteazele o au asupra acestor structuri. Proteinele joncionale sunt ordonat depuse n mai multe iruri ce nconjoar celula n regiunea apical. Jonciunile de ocluzie se formeaz n urma stabilirii contactului ntre irurile de proteine aparinnd celulelor alturate, oferind, n ansamblu, imaginea unei centuri situate imediat sub suprafaa cu microvili a celulei epiteliale (fig.39) Fig. 39 Jonciunile strnse sunt formate din mai multe iruri de perechi de proteine joncionale situate n regiunea apical a membranei plasmatice. Aceste structuri joncionale mpiedic deplasarea moleculelor i a ionilor din lumenul organelor cavitare n spaiile interstiiale. Capacitatea de ocluzie variaz funcie de tipul de esut epitelial. n plus, se sugereaz existena unei relaii logaritmice ntre numrul irurilor de proteine joncionale i gradul de impermeabilitate al jonciunilor pentru diferite specii ionice. n celulele epiteliale sunt pompate selectiv substane nutritive care, n urma unui transport transcelular, difuzeaz n esutul conjunctiv de unde sunt preluate, n circulaia sangvin. Acest flux unidirecional al moleculelor, din lumen prin celulele epiteliale n snge, este condiionat de distribuirea asimetric a componentelor membranare, care determin apariia unor domenii distincte apical i laterobazal n membrana plasmatic a celulelor epiteliale. Un exemplu concret l constituie absorbia glucozei din lumenul intestinal, proces care implic dou tipuri de proteine cu o strict localizare membranar. Proteinele din domeniul apical (faa luminal a membranei), transport activ glucoza pompnd-o din lumen n celulele epiteliale. Eliberarea glucozei n spaiile interstiiale se realizeaz prin difuziune mediat de un set de permeaze, prezent n domeniul laterobazal. Prezena jonciunilor de ocluzie la polul apical al celulelor face imposibil retrodifuziunea glucozei din interstiii n lumenul intestinal. (fig. 40). 77

Fig. 40 Transportul glucozei n celulele epiteliale ce delimiteaz lumenul intestinal. Jonciunile strnse sunt implicate n meninerea prioritii celulelor epiteliale mpiedicnd difuzia proteinelor transportoare n planul membranei plasmatice Meninerea polaritii celulelor epiteliale constituie a doua funcie a jonciunilor de ocluzie. Acestea acioneaz n sensul mpiedicrii difuziei prin dublul strat lipidic al moleculelor ce compun domeniile membranare. Un argument n favoarea acestei afirmaii este pierderea polaritii celulare, datorit migrrii lipidelor din stratul exoplasmatic i al proteinelor n membrana plasmatic, ca urmare a scderii concentraiei Ca2+ n mediul extracelular, element esenial n meninerea integritii jonciunilor de ocluzie. Att prin mpiedicarea schimburilor lumen-interstiiu, ct i prin meninerea stabilitii domeniilor membranare, jonciunile de ocluzie permit esutului epitelial s se comporte ca o barier cu o permeabilitate selectiv.

3.2.2 Jonciunile de ancorare

Jonciunile de ancorare asigur contactul celul-celul i celul-matrice extracelul. Acest tip de jonciune antreneaz elementele de citoschelet crend structuri de rezisten n celulele supuse stress-ului mecanic (epitelii, miocard, miometru etc). Din punct de vedere structural, jonciunile de ancorare sunt alctuite din dou clase de proteine: proteine de ataare intracelular i glicoproteine transmembranare de legare. Proteinele de ataare intracelular leag elementele de citoschelet de complexul joncional, n timp ce, glicoproteinele transmembranare interacioneaz prin domeniile lor intracelulare cu proteinele de ataare, iar prin cele extracelulare cu glicoproteine transmembranare din celulele adiacente. innd cont de tipul elementelor de citoschelet asociate - filamente de actin sau filamente intermediare jonciunile de ancorare se clasific n jonciuni de adeziune i structuri desmozomale. Att jonciunile de adeziune, ct i structurile desmozomale se subdivid n jonciuni de adeziune intercelulare i jonciuni de adeziune celul-matrice i respectiv, desmozomi i hemidesmozomi, funcie de tipul de contact pe care l mediaz. Toate cele patru tipuri de jonciuni de ancorare coexist n celulele esutului epitelial. 3.2.2.1 Jonciunile de adeziune intercelular n celulele epiteliale, jonciunile de adeziune intercelular sunt localizate la polul apical, imediat sub jonciunile de ocluzie. Aceste structuri constituie situsuri de ancorare ale filamentelor de actin dispuse n mnunchiuri. Orientate paralel cu membrana plasmatic mnunchiurile de filamente de actin nconjoar polul apical al celulei formnd o band de adeziune continu (zonulae adherens). Benzile de adeziune aparinnd celulelor nvecinate se gsesc n opoziie direct, contactul acestora fiind mediat de structurile joncionale de adeziune intercelular. Datorit aspectului lor, aceste jonciuni au fost numite desmozomi n 78

band (belt desmosomes), denumire eronat, deoarece din punct de vedere chimic cele dou structuri joncionale sunt deosebite. Filamentele de actin interacioneaz cu complexul joncional printr-un set de proteine de ataare dintre care cel mai bine caracterizate sunt vinculina i -actinina. Proteinele de ataare se leag de domeniul intracelular al unei glicoproteine transmembranare, ancornd astfel filamentele de actin n embrana plasmatic. Glicoproteina (uvomorulina) este un membru al familiei moleculelor de adeziune intracelular calciu dependente, numite caderine. Domeniul extracelular al glicoproteinei interacioneaz cu domeniile extracelulare ale glicoproteinelor din membrana plasmatic a celulelor nvecinate. Ca rezultat al acestor interacii, ce au la baz un mecanism Ca2+ dependent, membranele plasmatice adiacente sunt meninute la o distan de 15-20 nm una de ceallant (fig. 41). Conectarea reelelor transcelulare de filamente de actin asigur adeziunea celulelor epiteliale conferind totodat rigiditate structurii tisulare. Fig. 41 Distribuia proteinelor de legare a actinei i uvomorulinei la nivelul jonciunilor de adeziune intercelular din celulele epiteliale 3.2.2.2 Jonciunile de adeziune celul-matrice extracelular Jonciunile de adeziune celul-matrice asigur contactul dintre celul i matricea extracelular prin conectarea filamentelor de actin, ce alctuiesc citoscheletul, cu elemente componente ale matricei. Aderarea celulelor la matrice implic regiuni specializate ale membranei plasmatice, numite contacte focale sau plci de adeziune. La nivelul plcilor de adeziune se stabilete contactul dintre mnunchiurile de filamente de actin i un element al matricei, prin intermediul unei glicoproteine transmembranare, ce aparine familiei integrinelor. De cele mai multe ori, elementul matriceal este fibronectina, iar glicoproteina transmembranar este receptorul pentru fibrobnectin. Legarea filamentelor de actin de domeniul intracelular al receptorului este indirect, fiind mediat de cel puin pentru tipuri de proteine de ataare: o protein ce leag capul filamentelor de actin (actin-filament-capping protein), -actinina, vinculina i talina. 3.2.2.3 Desmozomii Dependent (fig. 42). desmozomii (desmozomii n pat) constituie regiuni de cimentare intercelular. Aceste structuri joncionale realizeaz contactul dintre filamentele intermediare ale celulelor adiacente, n urma crora se formeaz o reea transtisular continu. Tipul filamentelor intermediare antrenate de desmozomii n adeziunea intercelular difer funcie de tipul celular. n celulele epiteliale, structurile desmozomale le sunt asociate filamentele de cheratin, n celulele musculare ale inimii, filamentele de desmin, n celulele mezenchimale, filamentele de vimentin etc. Vizualizarea la microscopul electronic a desmozomilor ofer imaginea a dou discuri dense (15-20 nm grosime), situate pe faa citoplasmatic a membranelor celulelor adiacente, 79

numite plci citoplasmatice. Placa citoplasmatic este alctuit dintr-un complex de proteine de ataare desmoplachine ce leag tangenial filamentele intermediare i o glicoprotein transmembranar desmoglina-care interacioneaz prin domeniul su intracelular cu proteine de ataare. Cele dou plci citoplasmatice din membranele adiacente sunt conectate ca urmare a interaciunii domeniilor extracelulare ale desmoglinelor printr-un mecanism Ca2+ Fig. 42 Structuri desmozomale n esutul epitelial. (a) Desmozomul este alctuit din dou plci citoplasmatice situate pe feele citoplasmatice ale plasmalemelor celor dou celule adiacente. Filamentele intermediare se ataeaz tangenial de plcile citoplasmatice. Glicoproteinele transmembranare interacioneaz prin domeniile lor extracelulare, consolidnd structura desmozomal. (b) Hemidesmozomul asigur ancorarea celulelor n matricea extracelular. Este alctuit dintr-o singur plac citoplasmaticde care filamentele intermediare sunt legate prin capete. n boala Penfigus se sintetizeaz anticorpi mpotriva propriilor glicoproteine transmembranare. Legarea anticorpilor de desmoglin afecteaz structura desmozomilor responsabili de aderarea intercelular a celulelor esutului epitelial din piele. Devenit lax, esutul epitelial este incapabil de a mai funciona ca barier. Moleculele aflate n soluie difuzeaz printre celulele epiteliale spre exterior, fapt ce confer pielii un aspect vezicular. De vreme ce anticorpii afecteaz doar desmozomii din piele se presupune existena unor deosebiri biochimice ntre acetia i cei prezeni n alte esuturi. Studiul desmozomilor a pus n eviden implicaiile funcionale pe care aceste structuri le au n alte esuturi dect cel epitelial. Astfel, n celulele ce alctuiesc esutul muscular cardiac, filamentele de desmin asociate desmozomilor constituie o cale de transmitere a forei de contracie, iar n muchii netezi desmozomii sunt considerai echivaleni funcionali ai discurilor Z din muchii scheletici. 3.2.2.4 Hemidesmozomii Hemidesmozomii, similari desmozomilor din punct de vedere morfologic, asigur contactul dintre regiunea bazal a membranei celulelor epiteliale i o structur specializat a matricei extracelulare, numit lamina bazal. Placa citoplasmatic constituie situsul de ancorare a filamentelor de cheratin ce intr n alctuirea citoscheletului celulei epiteliale. Legarea plcii citoplasmatice de lamina bazal este mediat de o glicoprotein transmembranar. n esuturile epiteliale, unde de regul se semnaleaz prezena ambelor structuri desmozomale (desmozomi n pat i hemidesmozomi), acestea sunt implicate att n asigurarea adeziunii celulare, ct i n distribuirea forelor mecanice n ntregul esut epitelial i esutul conjunctiv adiacent.

3.2.3 Jonciunile de comunicare

Jonciunile de comunicare (permeabile, gap junction) au o larg rspndire, regsinduse n toate esuturile organismelor animale. n regiunea jonciunilor de comunicare, 80

membranele plasmatice adiacente sunt separate de un spaiu ngust (2-4 nm grosime) ntrerupt din loc n loc de particule cilindrice. Aceste particule sunt strbtute de un canal ce face posibil contactul dintre citoplasmele celulelor cuplate prin jonciunile de comunicare. Canalul, cu un diametru de 1,5-2nm, permite trecerea liber, dintr-o celul n alta, a moleculelor cu greuti moleculare sub 1500 -2000 Dar (glucide, aminoacizi, nucleotide, hormoni etc.)i a diferitelor specii ionice. Prin stabilirea acestui tip de comunicare intercelular, jonciunile permeabile constituie elementul-cheie al cuplrii electrice i metabolice celulare, proces, ce st la baza coordonrii activitii celulelor ntr-un esut. Cuplarea electric mediat de jonciunile de comunicare asigur: sincronizarea contraciilor celulelor ce alctuiesc esutul muscular; peristaltismul intestinal; propagarea potenialului de aciune de la un neuron la altul. Prin cuplarea metabolic, celulele sunt capabile s transfere diferite molecule celulelor nvecinate incapabile s le sintetizeze. De asemenea, prin canalele jonciunilor de comunicare pot trece mediatori intracelulari (ioni de Ca, AMP-ciclicetc.), implicai n reglarea numeroaselor procese metabolice celulare. Deplasarea mediatorilor intracelulari de la o celul la alta prin jonciunile de comunicare, explic activarea diferiilor stimuli hormonali (vezi subcap.1.3.2). Jonciunile de comunicare au un rol important n procesul de embriogenez. Se presupune c primele etape ce urmeaz fecundrii majoritatea celulelor sunt cuplate electric. Pe parcursul proceselor de difereniere, grupuri de celule cu o entitate distinct se decupleaz de restul celulelor urmnd o cale comun de dezvoltare. Apariia defectelor n dezvoltarea embrionului ca urmare a injectrii, n etapele timpurii ale embriogenezei, a unor inhibitori ai jonciunilor de comunicare sprijin aceast ipotez. 3.2.3.1 Structura jonciunilor de comunicare n alctuirea jonciunilor de comunicare intr un singur tip de protein transmembranar, numit conexin (280000-320000Da). Lanul polipeptidic (280 aminoacizi) strbate de patru ori membrana plasmatic. Cele patru domenii membranare prezint o conformaie helix. Al treilea domeniu -helix al conexinei are un caracter amfipatic. Prin asocierea a ase molecule de conexin ia natere o structur conexon. n interiorul conexonului, domeniile helix amfipatice, ale fiecrei proteine componente delimiteaz un canal ce strbate membrana plasmatic (fig.43). Fig. 43 a) Jonciunile de comunicare. Conexonii, complexe proteice prezente n membranele plasmatice sunt poziionai cap la cap, dnd natere unor canale de comunicare intercelular. b) Poziionarea n membrana plasmatic a conexinei-subunitate a conexonului. n regiunea membranar implicat n jonciunile de comunicare, sute de conexoni se aglomereaz formnd cluster-i (mnunchiuri) Conexonii din membranele celulelor nvecinate se aeaz cap la cap formnd un canal de comunicare continuu ntre citoplasmele celor celule. 3.2.3.2 Reglarea permeabilitii jonciunilor de comunicare Jonciunile de comunicare sunt structuri cu caracter dinamic, permeabilitatea lor fiind dependent de diveri factori: 81

Scderea pH-ului citosolic; creterea concentraiei Ca2+ liber n citosol; valoarea potenialului de membran la nivelul jonciunilor; semnale chimice extracelulare etc. Modificarea permeabilitii are la baz capacitatea jonciunilor de comunicare de a adopt dou conformaii distincte: nchis i deschis (fig. 44) Fig. 44 Schema modificrii conformaionale a conexonilor Existena unui mecanism de reglare a permeabilitii structurilor joncionale dependent de concentraia de Ca2+din citosol are o importan vital pentru funcionarea normal a celulelor asociate din esuturi. Alterarea grav a structurii celulare (ruperea membranei plasmatice, moarte celular etc.) este nsoit de pierderea unor cantitii nsemnate de metabolii celulari, n paralel cu creterea influxului de ioni de Na i Ca. n acest caz, concentraia mare a ionilor de Ca impune nchiderea jonciunilor de comunicare dintre celulele deteriorate i cele i cele normale. Prin aceast decuplare, sunt izolate regiunile tisulare afectate, ceea ce face posibil funcionarea normal a celulelor n restul esutului. Cretere permeabilitii jonciunilor de comunicare, n prezena unui semnal chimic extracelular, st la baza activitii celulare n cascad. Un exemplu concret l constituie rspunsul celular la aciunea hormonului glucagon, ce comand oprirea sintezei de glicogen n celulele hepatice i eliberarea glucozei n snge. n celulele hepatice stimulate de glucagon, are loc creterea concentraiei de AMP-c, care activeaz protein kinazele AMP-c dependente. Ele fosforileaz att enzimele, ct i conexina din structura jonciunilor de comunicare. Fosforilarea conexinei impune adoptarea conformaiei deschis de ctre jonciuni, ceea ce permite trecerea AMP-c din celula activat n celulele nvecinate. Activarea acestora nu necesit contactul direct cu hormonul, transmiterea semnalului realizndu-se prin AMP-c.

3.2.4. Jonciunile sinaptice

Sunt structuri specializate de legtur ntre neuroni. Prin jonciunea sinaptic, un axon n cretere se ataeaz la celula-int Acest tip de jonciune este mediat de protocaderine (glicoproteine ce aparin familiei caderinelor; conin 6 domenii extracelulare de legare n tandem). Exist mai mult de 50 de gene ce controleaz sinteza diferitelor protocaderine. Numrul mare de protocaderine asociate n diferite combinaii dau specificitatea sinaptic. Rolul protocaderinelor este acela de a ine la distana optim cele dou componenete membranare ale sinapsei membrana presinaptic i cea postsinaptic, pentru a facilita transmiterea sinaptic.

3. 3. Matricea extracelular
Matricea extracelular reprezint o reea complex de carbohidrai i proteine ce ocup spaiile interstiiale. Considerat un suport inert ce ofer doar stabilitate fizic esuturilor, matricea extracelular se relev, azi, ca o structur dinamic ce joac un rol esenial n dezvoltarea, migrarea, proliferarea, forma i funciile metabolice ale celulelor cu care se afl ntr-un contact permanent. Arhitectura, elementele componente, ct i rolul matricei extracelulare difer funcie de tipul tisular. La interfaa dintre esutul epitelial i esutul conjunctiv subadiacent, se afl o structur specializat a matricei extracelulare, numit lamin bazal, care mediaz contactul 82

dintre cele dou esuturi. n glomerulii renali, lamina bazal se comport ca un filtru permind trecerea apei, ionilor i a moleculelor mici din snge n spaiul urinar. n esutul conjunctiv lax, pe care se sprijin esutul epitelial i diferitele glande. n esutul conjunctiv ce nconjoar capilarele sangvine, reeaua intricat de macromolecule din spaiile interstiiale permite difuzia liber a nutrienilor i a oxigenului din snge n celulele esuturilor periferice. n esutul conjunctiv dens, prezent n cartilaje, tendoane i oase, matricea extracelular este responsabil de elasticitatea i rezistena mecanic ale acestor structuri.

3.3.1 Componentele matricei extracelulare

Macromoleculele ce alctuiesc matricea extracelular sunt secretate de ctre celulele ce se gsesc dispersate n matrice i care aparin clasei fibroblastelor. n matricea extracelular sunt prezente polizaharide de tipul glicozaminoglicanilor (GAG) care, de regul, sunt legate covalent de moleculele proteice, formnd proteoglicani. Proteinele fibrilare constituie cea de-a doua component a matricei. Se disting dou tipuri de proteine fibrilare: proteine structurale (colagenul i elastina) i proteine de adeziune (fibronectina i laminina). Proteinele fibrilare, dispuse n reea, sunt responsabile de organizarea matricei, conferindu-i totodat rezisten mecanic. Aceast reea proteic este nglobat n gelul hidrat de polizaharide. Faza apoas a gelului permite difuzia metaboliilor, hormonilor etc. n spaiul dintre celule i n capilarele sangvine. 3.3.1.1 Glicozaminoglicanii Glicozaminoglicanii reprezint lanuri poliglucidice lineare a cror unitate structural este un diglucid. n mod obligatoriu, unul din componentele diglucidului este un amino-glucid de tipul N-acetilglucozaminei, al doilea rest glucidic este, de cele mai multe ori, acidul uronic. Aminoglucidul din unitatea diglucidic poart grupri sulfat. Att gruprile sulfat, ct i gruprile carboxil ale acidului uronic confer glicozaminoglicanilor ncrcare electric negativ. Ca rezultat al aciunii forelor de electrostatic, moleculele leag diferii cationi (n special Na+). Specii ionice osmotice active, cationii cresc gradul de hidratare al matricei. Aceasta determin creterea turgescenei matricei extracelulare, factor ce confer structurii rezisten la forele de compresie. Lanurile poliglucidice hidrofile, adopt o conformaie de tip random coil (ncolcire aleatorie). Dei glicozaminoglicanii reprezint 10% din masa proteinelor fibrilare, datorit conformaiei adoptate, aceste molecule ocup cea mai mare parte a spaiului interstiial. Funcie de tipul de reziduuri glucidice, a legturilor ce se stabilesc ntre acestea, a numrului i a localizrii gruprilor sulfat, se disting patru clase de glicozaminoglicani: 1. acidul hialuronic; 2. condroitin sulfat i dermatan sulfat; 3. heparan sulfat i heparin; 4. cheratan sulfat. Cu excepia acidului hialuronic, toate celelalte clase ale glicozaminoglicanilor prezint caracteristici comune: conin grupri sulfat legate de reziduuri glucidice; conin uniti diglucidice diferite dispuse ntr-o secven complex. sunt molecule scurte (mai puin de 300 reziduuri glucidice) formeaz proteoglicani. Att lanul poliglucidic lung (cteva sute de reziduuri glucidice), ct i unitile diglucidice nesulfatate, ce se repet regulat, definesc acidul hialuronic drept un reprezentant atipic al glicozaminoglicanilor. 83

Structura simpl a acestei molecule, prezena i implicarea sa n fazele timpurii ale embriogenezei sugereaz faptul c acidul hialuronic este primul reprezentant al glicozaminoglicanilor, din el derivnd celelalte clase. Moleculele de acid hialuronic se leag de suprafaa celulelor care migreaz,acoperindule ca o haina. Acest fapt, mpiedic adeziunea intracelular, fcnd posibil deplasarea liber a celulelor i favoriznd proliferarea lor. Prin acest mecanism, acidul hialuronic joac un rol important n migrarea celulelor pe parcursul morfogenezei i al reparrii structurilor tisulare. 3. 3.1.2 Proteoglicanii Proteoglicanii sunt reprezentai n toate esuturile conjunctive i matricele extracelulare. Aceste molecule conin un miez proteic (core) n care sunt ancorate lanuri de glicozaminoglicani. Structuri heterogene, proteoglicanii difer prin greutatea molecular, componenta proteic, numrul i tipul lanurilor de glicozaminoglicani, aranjarea gruprilor hidroxil, sulfat i carboxil n lanurile poliglucidice. Componenta proteic a proteoglicanilor este sintetizat la nivelul ribozomilor ataai de RE rugos. Concomitent cu procesul de translaie proteic are loc translocarea proteinei n aparatul Golgi unde este asamblat n proteoglicani. n prima etap a sintezei proteglicanilor, o secven tricglucidic se leag covalent de un rest de serin din molecula proteic (fig. 45). Fig. 45 - Structura proteoglicanilor. Glicozaminoglicanii se leag prin intermediul unei secvene triglucidice de un rest de Ser prezent n structura componentei proteice a proteoglicanilor. Restul de Ser este frecvent localizat n interiorul unei secvene specifice de aminoacizi: Asp(Glu)-Asp(Gky)-X-Ser-GlyX-Gly, unde X poate fi oricare aminoacid.

La aceast secven ce servete drept primer se leag unul cte unul reziduurile glucidice printr-o reacie catalizat de glicozil-transferaza. Simultan cu elongarea lanurilor poliglucidice are loc n aparatul Golgi procesarea acestora, reacii de sulfatare i epimerizare. Eliminai n spaiul interstiial, proteoglicanii formeaz geluri hidratate, cu densiti diferite i pori de mrime variabil, ce regleaz traficul molecular i deplasarea celulelor funcie de mrimea sau/i sarcina lor electric. Structura heterogen a proteoglicanilor sugereaz faptul c aceasta nu constituie unica lor funcie. Cercetri n acest sens au pus n eviden capacitatea proteoglicanilor de a lega molecule semnal (ex. factorul de cretere al fibroblatilor FGF). Organizarea acestor molecule n matricea extracelular este nc un subiect controversat. n cartilaje, proteoglicanii formeaz agregate ce pot atinge o lungime de 4m i o mas molecular de aproximativ 2 x 108 Da. Componenta central a acestor agregate o constituie acidul hialuronic. Miezul proteic al proteoglicanilor, de care sunt ataate multiple lanuri condroitin sulfat i cheratan sulfat se leag, necovalent de acidul hialuronic. Lanurile sunt stabilizate de proteine de legare (fig. 46). 84

Fig. 46 Proteoglicanii din cartilagii conin i acid hialuronic legat necovalent, prin intermediul unor proteine liker de miezul proteic. Pe o singur molecul de acid hialuronic se pot lega o sut de monomeri de proteoglicani. Acest tip de organizare a proteoglicanilor confer elasticitate cartilajelor. Proteoglicanii sunt prezeni i la nivelul membranelor plasmatice ale multor tipuri celulare. De miezul integrat n membrana plasmatic i care proemin n spaiul extracelular este ataat un numr mic de lanuri de glicozaminoglicani (fig. 47).

Fig. 47 a) Proteoglicani prezeni la nivel la nivelul membranelor plasmatice. Miezul proteic de care sunt ataate patru lanuri de heparan sulfat i dou de condroitin sulfat traverseaz integral membrana plasmatic; b) Legarea lanurilor de condroitin sulfat la miezul proteic al proteoglicanilor din membran. n acest caz proteoglicanii sunt implicai n legarea celulelor de matricea extracelular i n organizarea acromoleculelor ce compun matricea.

85

3.3.1.3 Colagenul Colagenul reprezint o familie de proteine fibrilare insolubile, sintetizate n fibroblaste i reprezentate n toate organismele animale la nivelul matricei extracelulare i a esutului conjunctiv. Este principala component a matricei extracelulare. Se cunosc poate 12 tipuri de colagen. Dintre acestea tipurile I, II, i III ntlnite n special n esutul conjunctiv, au capacitate de autoasamblare, formnd polimeri ce poart numele de fibrile de colagen. Tipul IV constituie comportamentul principal al laminei bazale, unde formeaz o reea bidimensional. a. Structura moleculelor de colagen Unitatea structural fundamental a colagenului este o molecul proteic cu o lungime de 300nm i un diametru de 1,5 nm, alctuit din trei subuniti: dou lanuri 1 i un lan 2. Celelalte trei tipuri polipeptidice, ce conin fiecare 1050 aminoacizi, se nfoar unul n jurul celorlalte, de la stnga spre dreapta, formnd o structur de tipul triplu helix. Fiecare rotaie complet (tur) a helixuluide faptul c conine trei aminoacizi (fig. 48) Fig. 48 - a) Modelul lanului polipeptidic alfa din molecula de colagen. Gly ocup a treia poziie n secvena repetitiv: Gly-X-Y, unde X i Y reprezint oricare alt aminoacid. b) Modelul moleculei de colagen. Cele trei lanuri alfa formeaz un tripluhelix. Repetiia glicinei (Gly) la fiecare a treia poziie, este justificat de faptul c aceasta este singurul aminoacid suficient de mic pentru a ocupa spaiul din interiorul triplu-helixului. Molecula de colagen este bogat n prolin, lizin, aminoacizi ce apar de cele mai multe ori sub form hidroxilat. Gruprile hidroxil ale hidroxiprolinei particip la formarea legturilor de hidrogen ce stabilizeaz triplu-helixul. n boala numit scorbut, datorat deficienei de vitamina C, este inhibat reacia de hidroxilare a prolinei, ceea ce mpiedic organizarea lanurilor polipeptidice n triplu-helix. Acestea sunt rapid degradate sub aciunea unei enzime, numit colagenaz. n consecin, matricea extracelular i vasele sangvine devin extrem de fragile, iar dinii se desprind din alveolele dentare. Gruprile hidroxil ale hidroxilizinei sunt implicate ntr-o reacie de glicozilare. Glicozilarea colagenului confer acestei molecule capacitatea de a se autoasambla n spaiul extracelular.

86

b. Sinteza colagenului Prezena secvenei repetitive Gly-X-Y (unde X,Y reprezint diferii aminoacizi cu excepia glicinei)n structura colagenului, reflect organizarea genelor ce l codific, sugernd faptul c evoluia acestor gene are la baz fenomenul de duplicare genic. Gena ce codific lanul 1 conine 41 de exoni. Cea mai mare parte a exonilor este alctuit din 54 perechi de baze (pb) sau multipli de doi sau trei ai acestui numr, sintetiznd 1,2 sau 3 uniti primordiale. O unitate primordial conine 6 secvene repetitive Gly-X-Y. Un numr mic de exoni din structura genei au pierdut, pe parcursul evoluiei 9pb, unitile primordiale codificate de ctre acetia fiind mai scurte cu o secven Gly-X-Y. Locul de sintez al lanurilor polipeptidice ce formeaz colagenul l constituie ribozomii ataai de RE rugos. Ca rezultat al translaiei la nivel ribozomal sunt sintetizate lanurile pro-. Acestea sunt introduse n lumenul RE rugos, datorit prezenei n structura lor a secvenei semnal (signal peptide). n regiunile carboxil- i amino- terminale lanurile pro- conin alte dou secvene, numite propeptide. Aceste dou secvene formeaz domenii globulare, n timp ce restul lanului adopt o conformaie de tip helix. n lumenul RE reziduurile de lizin i prolin sunt hidroxilate, iar ntre secvenele propeptidice a trei lanuri pro- se stabilesc puni disulfurice intercatenare. Ulterior formrii legturilor disulfurice, lanurile se unesc (direcia C - N), genernd molecula de procolagen. Din RE, procolagenul este transportat n aparatul Golgi, unde se desfoar mai multe runde de procesare ce constau, n principal, n adaosul de reziduuri glucidice la hidroxilizin. Moleculele de procolagen sunt eliminate din aparatul Golgi n spaiul extracelular. Sub aciunea procolagen peptidazelor, secvenele sunt clivate proteolitic, molecula de procolagen fiind convertit n colagen. Proteoliza secvenelor propeptidice n spaiul extracelular mpiedic autoasamblarea colagenului n interiorul celulei,ceea ce ar avea drept consecin distrugerea celular. c. Asamblarea moleculelor de colagen n spaiul extracelular n spaiul extracelular, moleculele de colagen (numit i tropocolagen) de tip I, II i III se asociaz spontan formnd polimeri ordonai ce poart numele de fibrile de colagen (50nm n diametru). n fibrile, moleculele sunt dispuse n iruri longitudinale. ntre moleculele nvecinate ale aceluiai ir exist o distan (gap) de 35 nm. Moleculele de colagen din irurile adiacente sunt deplasate unele fa de altele cu 67 nm, ceea ce reprezint mai puin de o ptrime din lungimea total a moleculei. Se constat c din cinci n cinci molecule de colagen sunt aliniate identic (fig. 49). Spaierea colagenului n fibrile confer acetia o maxim elasticitate. n regiunile amino-i carboxil-terminale ale colagenului exist segmente scurte ce au o conformaie triplu-helix. Resturile de lizin sau/i hidroxilizin din aceste regiuni particip la legturi covalente ncruciate ce se stabilesc ntre extremitatea carboxilic a unei molecule adiacente. Aceste legturi au rolul de a stabiliza asamblarea colagenului n fibrile. Organizarea fibrilelor difer de la esut la altul. n piele, acestea se ntretaie crend o reea lax. n oase i n cornee, fibrilele de colagen sunt dispuse n plci ordonat aranjate; fibrilele aceleiai plci sunt paralele ntre ele i perpendiculare pe cale ale plcilor adiacente. n tendoane fibrilelor formeaz mnunchiuri, numite fibre. Fibrele sunt dispuse paralel i orientate pe direcia forei ce acioneaz asupra tendonului.

87

Fig. 49 a) Sinteza colagenului i asamblarea sa n fibre n spaiul extracelular. 3.3.1.4. Elastina Elastina este o protein neglicozilat, puternic hidrofob, a crei secven de aminoacizi (830) este bogat n glicin i prolin. Este proteina major a reelelor de fibre elastice din matricea extracelular. Spre deosebire de colagen, are un coninut sczut de lizin. n matricea extracelular, resturile de lizin ale moleculei proteice particip la formarea legturilor covalente ncruciate ce stabilizeaz elastina ntr-o reea (filamente sau foie) ale crei ochiuri i modific forma n raport cu direcia forei ce acioneaz asupra sa. Elasticitatea reelei se datoreaz capacitaii moleculelor de elastin de a adopta mai multe conformaii random-coil. Oscilarea ntre conformaii caracterizate de diferite grade de relaxare a moleculelor de elastin asamblate n reea, confer acestei proteine proprieti elastice similare cauciucului. Filamentele de elastin reprezint constitueni principali ai reelei de fibre elastice prezente n matricea extracelular din piele, vase sangvine sau plmni. Componentul minor al fibrelor elastice este o glicoprotein. Dispus pe suprafaa fibrelor, glicoproteina intervine n organizarea moleculelor de elastin.

88

3.3.1.5. Fibronectinele Fibronectinele aparin clasei glicoproteinelor de adeziune, a cror funcie principal este de a media adeziunea celul-matrice extracelular. Fibronectinele au un rol important n meninerea formei celulelor, n organizarea citoscheletului, iar pe parcursul embriogenezei sunt implicate n migrarea i diferenierea celular. n organismele animale, fibronectinele sunt ntlnite n: snge i alte fluide, sub form de dimeri solubili, favoriznd fagocitoza, migrarea celulelor imune (n special macrofage), ataarea trombocitelor de regiunile alterate ale vaselor sangvine; ataate tranzitoriu pe suprafaa celular, ca oligomeri de fibronectin; n matricea extracelular, unde formeaz fibre insolubile. a) Structura fibronectinelor Se cunosc mai multe tipuri de fibronectine. Codificate de ctre o unic gen (70 kb), fibronectinele sunt rezultatul splicing-ului alternativ al moleculei de ARN-m. Funcie de tipul celular, pot fi generate una pn la 20 molecule diferite de ARN-m pentru fibronectin ce dau natere unui numr echivalent de lanuri polipeptidice. Din punct de vedere structural, fibronectina este un dimer alctuit din dou subuniti identice. Regiunile carboxiterminale ale celor dou lanuri polipeptidice (2500 aminoacizi fiecare) ce formeaz dimerul sunt legate printr-o pereche de puni disulfurice. Fiecare subunitate prezint ase domenii globulare, unite prin regiuni flexibile ale lanului polipeptidic. Fiecare domeniu globular asigur legarea specific a fibronectinei la receptori celulari, colagen, fibrin i proteoglicani sulfatai (figura 50). Identificarea, izolarea i secvenializarea domeniului prin care fibronectina se leag la suprafaa celular au condus la evidenierea unei secvene tetrapeptidice-Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS). Secvena RGD este comun mai multor proteine extracelulare de adeziune. Ea permite recunoaterea i legarea proteinelor de ctre integrine, o familie de receptori de membran omologi. Dat fiind specificitatea recunoaterii receptor-ligand, se sugereaz implicarea, n acest proces, i a altor secvene din structura proteinelor de adeziune. Fig. 50 a) Structura fibronectinei. Cele dou lanuri polipeptidice sunt legate prin puni disulfurice. Fiecare lan prezint domenii globulare ce leag specific molecule din matricea extracelular sau receptori de membran; b) domeniile de legare specific au fost puse n eviden prin digestie cu proteaze. Se cunosc ase domenii: dou pentru heparan sulfat; dou pentru fibrin; unul pentru colagen; unul pentru receptorul fibronectinei.

89

b) Receptorul pentru fibronectin-reprezentant al familiei integrinelor Receptorul pentru fibronectin este un heteromer alctuit din dou lanuri polipeptidice . i , asociate prin legturi necovalente. Lanul (140.000 Da) este scindat n dou segmente; unul transmembranar i altul extracelular. Segmentele sunt legate ntre ele printr-o punte disulfuric . Lanul conine secvene repetitive bogate n cistein. Ambele lanuri polipeptidice ale receptorului sunt glicozilate (figura 51). Fig. 51 Structura receptorului pentru fibronectin Rolul moleculei receptor este de a media contactul dintre fibronectin (recunoate secvena RGDS) i elementele din structura citoscheletului (filamentele de actin). Receptorul pentru fibronectin este un membru al familiei integrinelor. Din aceast familie mai fac parte receptorul pentru laminin, o parte din receptorii pentru colagen, etc. Toate aceste molecule au o structur similar, fiind implicate n legarea componentelor matriceale de elementele citoscheletului. Nu toi receptorii pentru constituenii matricei extracelulare aparin familiei integrinelor. Mai mult, n anumite celule, receptorul pentru colagen este reprezentat de o glicoprotein transmembranar cu o structur diferit de cea a integrinelor. c) Migrarea i aderarea fibroblastelor n matricea extracelular proces ce implic recunoaterea fibronectin receptor n organismele animale adulte, migrarea celular este un fenomen rar ntlnit. O excepie o constituie procesul de reparare a leziunilor, n care fibroblatii i celulele sistemului imun migreaz spre zona afectat. Aceste celule traverseaz cheagurile sangvine al cror element constituent principal este fibrina. Fibronectina, secretat de ctre fibroblati se leag printr-unul din domeniile sale globulare la fibrin. Pe de alt parte, prezentnd secvena specific RGD, fibronectina este recunoscut i legat de receptorul pentru fibronectin din membrana plasmatic a fibroblastelor. Datorit mobilitii laterale a receptorului n membrana plasmatic, pe parcursul migrrii fibroblastelor, se stabilesc i se desfac succesiv contactele celul-matrice. n momentul n care deplasarea nceteaz, n citoplasm se organizeaz fibrele de stres bogate n actin. Aceste fibre se leag de receptor prin intermediul proteinelor de ataare intracelulare (vinculina i talin), imobilizndu-l n membrana plasmatic (fig. 52). Fig. 52 Modelul regiunii de contact fibroblast-substrat. Fibrele de actin se ataeaz prin intermediul vinculinei i a talinei de receptorul pentru fibronectin. Receptorul leag fibronectina care, la rndul sau, interacioneaz cu alte elemente ale matricei extracelulare (colagen, proteoglicani). Contactul dintre fibronectine, din spaiul extracelular i mnunchiurile de fibre de actin, din interiorul celulei, mediat de receptorul pentru fibronectin, asigur aderarea celulei la matricea extracelular.

90

3.3.2. Lamina bazal

Lamina bazal, structur specializat a matricei extracelulare, delimiteaz suprafaa bazal a celulelor epiteliate i endoteliale, separnd aceste celule de esutul conjunctiv subadiacent. Ea nconjoar celule individuale (musculare, adipoase, celule Schwann) sau se afl interpus ntre dou straturi unicelulare n glomerulii renali i n alveolele pulmonare. La microscopul electronic, lamila bazal apare din trei straturi: un strat electrono-transparent (lamina lucida sau lamina rara) situat n imediata vecintate a membranei plastice a celulelor ce se sprijin pe lamila bazal; un strat electrono-dens (lamina densa); un strat cu aspect reticular (lamina reticularis) alctuit din colagen i care are rolul de a lega lamila bazal de esutul conjunctiv. 3.3.2.1. Structura laminei bazale Moleculele componente ale lamilei bazale sunt sintetizate sunt sintetizate de ctre celulele epiteliate, endoteliale i mezenchimale. Dei compoziia lamilei bazale variaz de la un esut la altul, colagenul de tip IV, proteoglicanii (heparan sulfat) i laminina sunt elemente comune tuturor acestor structuri. a) Colagenul de tip IV Moleculele de colagen de tip IV sunt prezentate n exclusivitate n lamila bazal. Ele reprezint elementul constituient major al lamilei densa ce compune lamila bazal. Similar moleculelor de colagen fibrilar, colagenul de tip IV este alctuit din trei lanuri polipeptidice ce formeaz un truplu helix (40 nm lungime). Secvena repetitiv Gly-X-Y, caracteristic tuturor moleculelor de colagen, este ntrerupt de aproximativ 20 de ori n molecula de tip IV, ceea ce justific apariia unor discontinuiti n structura truplu-helixului. Existena zonelor de discontinuitate confer ntregii molecule o mai mare flexibilitate. Spre deosebire de moleculele de colagen interstiial, secvenele propeptidice amino-i carboxi-terminale ale colagenului IV nu sunt scindate proteolitic dup eliberarea sa n mediul extracelular. Secvenele propeptidice carboxi-terminale formeaz domenii prin intermediul crora monomerii interacioneaz formnd dimeri lineari. Dimerii se asociaz lateral prin regiunile cu conformaie triplu-helix dnd natere unei reele plane cu ochiuri hexagonale. Regiunile amino terminale ce predomin de o parte i de alta a planului reelei se asociaz prin legturi covalente genernd o reea multistratificat (figura 53). Fig. 53 Modelul asocierii moleculelor de colagen de tip IV i formarea reelei multistratificate. n aceast reea, moleculele de colagen sunt stabilizate prin legturi covalente ncruciate i puni disulfurice. b) Laminina-glicoprotein major a lamilei bazale Laminina este localizat pe faa dinspre membrana plasmatic a lamilei densa mediind legarea lamilei bazale de suprafaa celular. Molecula (850.000 Da) este alctuit din trei lanuri polipeptidice; un lan lung A i dou lanuri mai scurte B. lanurile sunt unite prin puni disulfurice ntr-o structur 91

cruciform. Cele trei brae scurte ale moleculei de laminin prezint cte o pereche de domenii globulare, iar braul scurt are un singur domeniu (figura 54). Fig. 54 Structura lamininei Proteina prezint trei lanuri polipeptidice (A, B1 i B2) i conine mai multe domenii funcionale: - un situs de legare a colagenului IV; - un situs de legare a proteoglicanilor sulfatai; - dou sau mai multe situsuri de legare la receptori de membran. Ca i fibrotectina, laminina conine mai multe domenii funcionale: cte un domeniu leag colagenul IV i heparan sulfatul, iar unul sau mai multe domenii sunt implicate n legarea receptorului prin laminin. Receptorii pentru laminin difer funcie de tipul celular, dar cel puin o parte a acestora aparin familiei integrinelor. 3.3.2.2. Funciile laminei bazale Lamina bazal se caracterizeaz printr-o pronunat heterogenitate funcional determinat de necesitile fiziologice ale diferitelor esuturi. Interpus ntre esutul epitelial i esutul conjunctiv subadiacent, lamina bazal susine celulele epiteliale i totodat funcioneaz ca un filtru molecular i celular ntre cele dou compartimente tisulare. n glomerii renali, rolul laminei bazale const n reglarea traficului de molecule din snge n urin. La nivelul jonciunilor neuromusculare, lamina bazal prezint o compoziie chimic particular ceea ce-i permite exercitarea funciei de coordonare a organizrii spaiale a componentelor joncionale de o parte i de alta a sinapsei. n regenerarea tisular, lamina bazal constituie eafodul pe care celulele migreaz ndreptndu-se spre zona afectat. Reglarea funciilor celulare vitale: adeziunea, creterea i diferenierea celular sunt independente de legarea receptorilor celulari la elementele componente ale laminei bazale.

92

Capitolul 4 CITOSCHELETUL
Citoscheletul este alctuit din microtubuli, filamente de actin, filamente intermediare, o reea microtrabecular i din proteine asociate. Citoscheletul este o structur dinamic. Capacitatea sa de a-i modifica structura, funcie de necesitaile celulare,are la baza reaciile de polimerizare i depolimerizare ale microfilamentelor i ale microtubuliilor. Proteinele asociate au rol de a regla procesele de polimerizare i depolimerizare ale filamentelor,de a interconecta elementele de citoschelet n reea i de a le lega de organitele celular i/sau membrana plasmatic. Implicat n inducerea i meninerea formei celulei i a prelungirilor celulare (cili,flageli,microvili,axoni),citoscheletul are n principal o funcie de susinere. Acesteia i se adaug o funcie motil. Principalele micri celulare asigurate de elementele de citoschelet sunt: micarea cililor i a flagelilor; deplasarea celulelor ce prezint un tip de locomoie ameboidal; transportul intracelular de particule materiale, vezicule de transport i organite celulare; translocarea cromozomilor n timpul diviziunii celulare; desfaurarea citokinezei; contracia muscular; Interaciunea elementelor de citoschelet cu membrana plasmatic, la nivelul structurilor joncionale, prin intermediul proteinelor de adeziune intracelular, solidarizeaz celule n esuturi, conferind acestora rezisten. Se apreciaz c realizarea acestora funcii constituie rezultatul cooperrii citoscheletului cu reeaua microtrabecular.

4.1. Microtubulii
Au fost evideniai pentru prima dat, cu ajutorul microscopului electronic, n celulele animale de ctre d. Slauttersack (1963), care a introdus i termenul de microtubul.

4.1.1. Microtubulii semnificaia biologic

Microtubulii sunt substructuri celulare omniprezente n citoplasma celulelor eucariote. n citoplasm, ei se gsesc fie izolai microtubuli citoplasmatici, fie fasciculai, dnd natere unor formaiuni cu caracter efemer fibrele fusului de diviziune, sau permanent centrioli, corpusculi bazali i axonemele organitelor locomotorii (cili, flageli). Microtubulii ndeplinesc n celul un rol structural, intervenind ca parte component a citoscheletului, n inducerea i meninerea geometria spaial a celulelor, i un rol dinamic, aceste structuri coordonnd motilitatea celular. Principalele micri asociate microtubulilor sunt: micrile cililor i flagelilor ce asigur deplasarea celulelor libere, mobile; transportul intracelular de particule, vezicule i organite celulare (nucleu, plastide, mitocondrii) translocarea anafazic a cromozomilor. Studiul comparativ al microtululilor din diferite compartimente celulare a artat c tratamentul cu colchicin, temperaturile sczute i presiune hidrostatic mare determin degradarea microtubulilor citoplasmatici i a celor ce alctuiesc fusul mitotic, dar nu afecteaz 93

structurile microtubulare stabile (cetrioli, corpusculi bazali, microtubuli din organitele locomotorii). Aceste rezultate demonstreaz existena unei populaii heterogene de microtubuli.

4.1.2. Structura microtubulilor

n imaginile electronomicroscopice, microtubulii se disting ca structuri cilindroide de lungimi variabile (pn la zeci de nm) i cu un diametru relativ constant de 24 nm. Fiecare microtubul este alctuit din 13 protofilamente dispuse paralel cu axul longitudinal i care delimiteaz un lumen. Protofilamentele sunt rezultatul asocierii cap la coad a unui numr variabil de heterodimeri, ce poart numele de tubulin (100.000 Da). Orientarea dimerilor, de tubulin n protofilamente, confer microtubulilor un caracter polar, ce este conservant n toate structurile microtubulare. Unitatea fundamental a microtubulilor, tubulina, este alctuit din dou proteine distincte: alfa i beta tubulina (fiecare 50.000 Da). Cele dou componente proteice ce compun heterodimerul sunt dispune heicoidal n peretele microtubulului. (fig. 55). Fig. 55 Modelul structurii tridimensionale a microtubulilor. (Fiecare din cele 13 protofilamente ce alctuiesc peretele microtubulului este format din heterodimeri de tubulin i , aezai cap la coad. n preparatele pure de microtubuli, n afara heterodimerilor de tubulin, s-a observat prezena unor proteine cu mase moleculare diferite. Deoarece, diversele structuri microtubulare conin diferite tipuri de molecule proteice, iniial, s-a considerat c acestea sunt proteine de contaminare. Dar raportul cantitativ constant dintre proteine i subunitile de tubulin, observat pe parcursul mai multor cicluri de polimerizare i depolimerizare, a condus la concluzia c proteinele sunt asociate specific tubulinelor, motiv pentru care au fost numite proteine asociate microtubulilor (microtubule associated proteins - MAP). Cele mai bine caracterizate proteine asociate sunt proteinele tau, localizate exclusiv n structurile microtubulare din axonii celulelor nervoase. Codificate de o unic gen, cele cinci proteine tau cunoscute astzi, sunt rezultatul unui proces de splicing (combinare) alternativ. Alte proteine asociate prezente n celulele nervoase sunt MAP1-MAP2. MAP1 este asociat microtubulilor din axoni i dendrite, n timp ce MAP2 este ntlnit doar n structurile microtubulare din dendrite. Proteinele asociate au rol de a consolida structurile microtubulare prin interconectarea microtubulilor adiaceni i de a stabiliza edificiul arhitectural al citoscheletului prin legarea filamentelor intermediare. Majoritatea proteinelor asociate sunt fosforilate. Ciclurile de fosforilare i defosforilare ale acestora pot constitui o etap important n reglarea asamblrii microtubulilor. Aceast presupunere este confirmat n cazul proteinei tau ce prezint activitatea ATP - azic i care acioneaz n sensul accelerrii polimerizrii microtubulilor.

94

4.1.3. Polaritatea i dinamica microtubulilor

Geneza microtubulilor este un proces de autoasamblare a tubulului. Studiile n vitro au demonstrat formarea microtubulilor ntr-o soluie pur de dimeri, la 37C, n prezena GTP (guanozin trifosfat) i a ionilor bivaleni. Sinteza microtubului primer, prima etap a polimerizrii, se desfoar lent, dar alungirea primer-ului, prin adugarea de noi dimeri de tubulin, este un proces mult mai rapid. Expunerea unei soluii de microtubuli la temperaturi sczute (0C) are un rezultat contrar, determinnd depolimerizarea cu eliberarea dimerilor stabili. Creterea temperaturii la 37C este nsoit de reasamblarea microtubulilor. Se demonstreaz astfel caracterul dinamic al microtubulilor, structuri ce-i modific lungimea ca rezultatul a reaciilor de polimerizare i depolimerizare. Dei adugarea sau pierderea subunitilor de tubulin poate avea loc n oricare din capetele microtubului, observaiile electrono-microscopice subliniaz funcionalitatea diferit a extremitilor acestor structuri. Viteza reaciilor de polimerizare i depolimerizare este de dou ori mai mare la unul din capete, simbolizat cu plus (+). Captul opus a fost notat cu minus (-). In vitro, la o anumit concentraie a dimerilor liberi de tubulin se atinge o stare de echilibru (steady state), numrul dimerilor adugai fiind egal cu cel al subunitilor disociate de microtubuli. Aceast concentraie a fost numit concentraie critic (Cc). Cnd concentraia dimerilor liberi depete valoarea critic predomin procesul de polimerizare, n timp ce, scderea concentraiei de tubulin, sub concentraia critic, are ca rezultat depolimerizarea microtubulilor. n consecin, concentraia dimerilor liberi reprezint principalul factor implicat n reglarea polimerizrii i depolimerizrii microtubulilor. Studiul dinamicii microtubulilor, n culturi de celule, a evideniat aspecte surprinztoare i aparent contrare rezultatelor, experimentelor in vitro. Se constat astfel, c, n timp ce unii microtubuli sunt subiectul unor repetate i rapide procese de polimerizare i depolimerizare, n aceeai celul (la aceeai concentraie a dimerilor liberi) ali microtubuli se alungesc continuu sau rmn la o lungime constant pe parcursul perioadei de observaie. Manifestarea simultan a fenomenelor de cretere i descretere n lungime a microtubulior este explicat prin modelul dinamic (dynamic instability model). Acest model sugereaz c o anumit structur a extremitilor microtubulilor de determin adugarea sau disocierea subunitilor proteice. Fiecare dimer de tubulin conine dou molecule de GTP. Pe parcursul polimerizrii sau n etapa imediat urmtoare ncorporrii dimerului (preferenial la captul +), GTP este hidrolizat la GDP (guanozin difosfat). Stabilitatea microtubulului apare reglat de doi factori concentraia de tubulin liber i viteza reaciei de hidroliz a GTP. Dac, concentraia dimerilor liberi este superioar valorii critice, polimerizarea microtubulilor este favorizat, iar viteza acestei reacii este mai mare dect cea a hidrolizei GTP. n consecin, la extremitatea + se formeaz un cap GTP. Microtubulii care au o strucrur cap GTP, sunt stabili i pot servi ca primer-i n procesul de polimerizare; se pot alungi. La o concentraie sczut a tubulinei libere (C < C C ), viteza de disociere a dimerilor depete viteza de polimerizare, ceea ce conduce la formare GDP. Prezena structurii GDP este asociat cu instabilitatea microtubulilor, determinnd o accelerare a depolimerizrii. n ceea ce privete influena celui de-al doilea factor, asupra stabilitii microtubulilor, se constat c, cu ct viteza de hidroliz a GTP este mai mic, cu att este mai favorizat formarea unui cap GTP i deci, alungirea microtubulului. Viteza mare a hidrolizei GTP are un efect contrar. Modelul susine c variaiile locale ale celor doi factori pot determina evoluia diferit a microtubulilor dintr-o celul; n timp ce unii microtubuli se alungesc, alii sufer un proces de depolimerizare.

95

4.1.4. Bazele diversitii structurilor microtubulilor

Dei toi microtubulii prezint o organizare fundamental comun, structurile rezultate prin asocierea acestora sunt foarte diferite, chiar i n cadrul aceleiai celule. Iniial, diversitatea structurilor microtubulare a fost pus pe seama existenei, la organismele eucariote, a subtipurilor de alfa i beta tubulin. Aceste proteine sunt codificate de aceleai gene sau de gene diferite, caz n care poart numele de izotipuri. Secvenele de aminoacizi ale izotipurilor de alfa i beta tubulin sunt aproape identice la psri i roztoare. Diferenele dintre subtipuri sunt, n mare parte, rezultatul modificrilor posttranslaionale. Astfel, tubulinele alfa sunt antrenate ntr-o reacie de acetilare a unui rest de lizin i sufer adiia sau deleia unei tirozine carboxi-terminale. La tubulinele beta se remarc modificri ale segmentelor carboxi terminale. Este posibil c aceste modificri structurale s condiioneze ncorporarea subunitilor n diferite structuri microtubulare i legarea lor la proteinele asociate. Recent, s-a demonstrat c heterogenitatea subunitilor de tubulin nu poate explica diversitatea structurilor microtubulare, deoarece modificrile posttranslaionale nu afecteaz semnificativ funcionalitatea microtuburilor. Cercetri efectuate pe structurile microtubulare din neuron au condus la concluzia c fiecare microtubul conine subuniti alfa i beta echivalente funcional, particularitile acestor structuri fiind dictate de tipul proteinelor asociate ce copolimerizeaz cu tubulinele sau se leag de microtubuli ulterior polimerizrii.

4.1.5. Centrii organizatorici ai microtubulilor

Distribuia nealeatorie a microtubulilor n celul a condus la ipoteza existenei unor factori ce controleaz nucleaia, diferenierea i dispunerea acestor formaiuni celulare. Aceti factori a cror existen a fost demonstrat prin cercetri experimentale poart numele de centrii organizatori ai microtubulilor (MTOC) sau centrii de nucleaie. Astzi, dispunem de numeroase argumente ce atest faptul c cel puin centriolii i corpusculii bazali acioneaz ca centrii organizatorici ai micritubulilor. Microtubuli au o orientare strict n raport cu centrele de nucleaie (fig. 56). Fig. 56 Orientarea microtubulilor n raport cu centrele de nucleaie: A Celul ciliat aflat n interfaz.Microtubulii citopasmatici au captul (-) ancorat n regiunea pericentriolar.Microtubulii ce intr n structura axonemei au captul poziionat proximal fa de corpusculul bazal; B Celul nervoas.Microtubulii din axon sunt orientai cu captul spre corpusculul bazal.Microtubulii din dendrite nu au o orientare fix; C Celul aflat n mitoz.Microtubulii fasciculai dau natere fibrelor fusului de diviziune ce se difereniaz ntre cei doi centrii celulari prezeni la polii opui ai celulei.

96

Capetele (-) sunt inserate n centrul organizator i stabilizate de proteinele asociate, n timp ce, capetele (+) distale sunt libere. Sechestrarea i stabilizarea capetelor explic de ce n vivo adugarea i disocierea dimerilor are loc doar la capetele (+) libere. De la aceast orientate fac excepie microtubulii din dendritele i axonii neuronilor. Datorit absenei centrului organizator n dendrite, microtubulii nu pstreaz aceeai polaritate; ei sunt dispui fie cu captul (+), fie cu captul (-) spre corpul celular. La baza axonului se remarc prezena unui centru organizator, dar nu toi microtubulii radiaz din aceasta. Microtubulii ce au ca punct de plecare centrul de nucleaie prezint o orientare obinuit (captul (+) liber). Este posibil ca acetia s dicteze i poziionarea microtubulilor liberi de vreme ce, n axon toi microtubulii au aceeai polaritate; captul (-) este orientat spre corpul celular. 4.1.5.1. Centriolii i corpusculii bazali n coordonare asamblrii microtubulilor i a motiliti celulare un rol-cheie l joac structurile microtubulare specializate. Microtubulii din celulele aflate n interfaza i cei care alctuiesc fibrele fusului mitotic i au originea ntr-o regiune perinuclear, numit centrul celular. Structura centrului celular este complex, ea constnd dintr-o pereche de centrioli situai central, nconjurai de o zon citoplasmatic amorf, numit centrozom sau regiune pericentriolar, delimitat, la rndul su, de o zon mai puin dens i relativ omogen, centrosfera. Cercetrile experimentale au demonstrat faptul c centriolii izolai sau nsoii de materialul pericentriolar sun capabili s iniieze polimerizarea tubulinei in vitro i s coordoneze nucleaia microtubulilor in vivo. n imaginile electronomicroscopice se observ ns c microtubulii nu au ca punct de plecare centriolii, ei radiind din regiunea pericentriolar. Un argument n plus, n favoarea rolului de centru organizator al centrozomului, l constituie pstrarea capacitii de organizare a microtubulilor n celulele eucariote, din care lipsesc centriolii. Se presupune c n celulele n care att centriolii, ct i centrozomul sunt prezeni ambele structuri coordoneaz formarea microtubulilor din celulele aflate n interfaz i acelor din fibrele fusului mitotic. n formarea microtubulilor ce alctuiesc axonemele cililor i flagelilor sunt implicate alte structuri microtubulare, localizate la baza organitelor locomotorii i care poart numele de corpusculi bazali. Pe lng rolul de centri organizatori ai microtubulilor, centriolii stau la baza fenomenelor de motilitate manifestate n timpul diviziuni celulare, iar corpusculii bazali, coordoneaz micrile cililor i flagelilor. 4.1.5.2. Ultrastructura centriolilor i a corpusculilor bazali Studiile de microscopie electronic au condus la elucidare ultrastructurii centriolilor i corpusculilor bazali. Ambele structuri microtubulare au forma unui cilindru ( 0,2 m diametru i 0,4 m lungime ). Perei cilindrului sunt constituii din 9 fibrile dispuse circular, echidistant i nclinate la un unghi de 30-40. Fibrilele sunt imobilizate ntr-o matrice amorf ce nconjoar cilindrul. Fiecare fibril este format din 3 subfibrile reprezentate de trei microtubuli. Subfibrilele din fiecare triplet sunt notate cu A,B i C dinspre lumenul cilindrului spre exterior. Subfibrila A este un microtubul complex, format din 13 protofilamente, n timp ce subfibrilele B i C sunt incomplete (10-11 protofilamente). La captul proximal al centriolilor i corpusculilor bazali se constant prezena unui miez cilindric central, interconectat cu fibrilele periferice. Aceast structur, asemntoare unei roi cu spie, este absent n regiune distal a celor dou structuri microtubulare. (fig. 57).

97

Fig. 57 Structura corpusculilor bazali i a centriolilor.Cele 9 fibrile periferice formeaz peretele unui element de form cilindric. Fiecare fibril este un triplet de microtubuli (A,B,C). Fibrilele sunt legate ntre ele prin proteine conectoare. 4.1.5.3. Replicarea centriolilor i a corpusculilor bazali Replicarea centriolilor are loc la un anumit moment al ciclului celular. n interfaz, la nceputul perioadei G1, cei doi centrioli, prezeni n centrul celular, sunt situai unul lng altul cu axele lungi n unghi drept. La sfritul perioadei G1, centriolii se separ, pentru ca n perioada sintetic ( S ) din fiecare centriol prexistent s se diferenieze cte un centriolfiu, numit procentriol. Fiecare procentriol este orientat perpendicular pe centriolul din care a provenit. Iniial, mai mici dect centrioli parentali, procentriolii se alungesc continuu, atingnd dezvoltarea maxim n metafaz. La nceputul profazei, centrul celular se divide, iar cele dou perechi de centrioli, fiecare constituie dintr-un centriol matur i altul n cretere, se separ. Perechile de centrioli migreaz spre polii celulei unde n metafaz alctuiesc polii fusului de diviziune. n momentul separri celulelor-fiice rezultate n urma diviziunii celulare fiecare, va conine cte un cuplu de centrioli maturi, orientai perpendicular unul pe cellalt i nconjurai de materialul pericetriol. (fig. 58).

Fig. 58 Schema replicrii centriolilor. Un fenomen replicativ similar este ntlnit i la corpusculii bazali. Corpusculul nou format se difereniaz din cel preexistent i se orienteaz perpendicular pe aceasta. n momentul n care ajunge la maturitate, el se separ de corpusculul parental, genernd apariia unui nou flagel sau a unui nou cil. Replicarea centriolilor i a corpusculilor bazali nu este pe deplin elucidat. Cercetri recente au demonstrat existena la nivelul corpusculilor bazali a unei molecule mici (6-9 milioane pb ) de ADN linear. Acest ADN conine informaia necesar codificrii majoritii proteinelor existente n corpusculi. Se presupune c translaia are loc n ribozomii citoplasmatici, proteinele sintetizate fiind apoi transportate i integrate n corpusculii bazali. Prezena ADN la nivelul corpusculilor bazali explic capacitatea lor de autoreplicare.

98

Exist date experimentale ce confirm presupunerea prezenei n centrioli a unui ADN propriu. Se sugereaz c ADN centriolar se gsete n nucleu ntr-o form inactiv, iar n urma translocrii sale n centriol, molecula este activ. Interconvertibilitatea demonstrat a centriolilor i corpusculilori bazali, asemnrile structurale i funcionale dintre acetia i nu n ultimul rnd prezena ADN au condus la concluzia c centrii organizatorici ai microtubulilor sunt componente ale unui sistem citoplasmatic. Capacitatea celulei de a coordona modificrile morfologice i funcionale ce nsoesc procesele de cretere i difereniere celular se pot explica prin activarea i dezactivarea centrelor de nucleaie, ca rezultat al cooperrii dintre unitatea genetic nuclear i cea proprie sistemului citoplasmatic.

4.1.6. Micrile cililor i flagelilor

Cilii i flagelii sunt prelungiri celulare cu caracter permanent, prezente n multe celule eucariote animale i vegetale. Dei ntre cili i flageli exist unele deosebiri, ei sunt considerai variante ale acelai organit. La mamifere,inclusiv la om, celulele ciliate se gsesc n mucoasa tractului respirator,avnd rolul de a ndeprta particulele materiale ce ptrund n momentul inspirului n cavitile nazale, faringe i trahee. Ele sunt prezente i n mucoasa oviductului, cilii asigurnd deplasare ovulului. Spermatozoidul este singura celul flagelat din organismele mamifere. Flageli execut micri ondulatorii, cu amplitudine constant, n acelai plan. n majoritatea cazurilor, micrile se propag de la baza organitului ctre captul su opus. Uneori micarea sub forma unei unde plane este nlocuit de o alt helicoidal. Cilii execut micri ciclice, n doi timpi: o btaie activ i o alta de ntorcere. Fiecare ciclu dureaz 0,1-0,2 secunde. Btaia const n nclinarea sub un unghi larg a cilului aflat n extensie. Aproape concomitent are loc curbarea cilului n regiunea bazal, moment ce marcheaz nceputul micrii de ntoarcere. Curbarea se propag de-a lungul cilului determinnd revenirea organitului la poziia iniial (fig. 59).

Fig. 59 Schema micrilor cililor. Micarea cililor, ce formeaz o suprafa ciliat este defazat, diferena de faz ntre micrile a doi cili consecutivi fiind constant. Att micarea cililor, ct i a flagelilor sunt procese energo-dependente, energia necesar fiind furnizat prin hidroliza ATP.

99

4.1.6.1. Structura cililor i a flagelilor Cilii i flagelii celulelor eucariote au un plan de organizare comun, la baza structurii lor aflndu-se microtubulii. Ambele organite sunt alctuite din trei pri: cilul sau flagelul propriu-zis, corpusculul bazal i rdcinile. Cilul sau flagelul propriu-zis const dintr-o structur microtubular complex, numit axonem, nconjurat de hialoplasm i protejat la exterior de o membran celular simpl, generat prin expansiunea plasmalemei. Axonema este alctuit din 9 fibre periferice i 2 centrale. Fibrele periferice sunt dublete subfibrilare ce se extind din corpusculul bazal n flagel (cil). Cele 2 subfibrile sunt notate cu A i B. Subfibrila A este un microtubul complet (13protofilamente), n timp ce subfibrila B este incomplet (10-11 protofilamente). Rolul-cheie n interconectarea microtubulilor revine unei proteine numit tectin. n regiunea central a lumenului axonemei sunt localizate cele 2 fibre centrale, notate cu C1 i C2 . Fiecare este alctuit dintr-un unic microtubul 1 (singlet). Cele 2 fibre centrale sunt interconectate prin puni transversale i nconjurate de o structur fibrilar numit teaca intern. De subfibrila A, n partea opus subfibrilei b, sunt ancorate 2 brae orientate n direcia acelor ceasornicului i alctuite dintr-o protein ce poart numele de dinein. Braele externe ale dineinei apar de-a lungul microtubulilor la intervale regulate de 24 nm, iar distana dintre braele interne succesive este de 32 nm. Tot din subfibrile A pleac spre centrul axonemei brae radiale ce se termin n aproprierea tecii interne, prin regiuni regulare i care creeaz imaginea unei roi cu spie. (fig. 60).

Fig. 60 A. Structura axonemei. Peretele axonemei este alctuit din 9 fibre periferice, fiecare format din dou subfibrile (A i B ). Braele dineinei i elementele radiale sunt ataate pe subfibrila A. n lumenul axonemei se gsesc singletele centrale, interconectate prin puni transversale i nconjurate de teaca intern; B. Fibra periferic este un dublet de microtubuli. Subfibrila A este un microtubul complet (13 protofilamente), subfibrila B este un microtubul incomplet (10 11 protofilamente). 100

Axonema este stabilizat prin interconectarea fibrelor periferice. Subfibrila A, dintr-un dublet, este legat de subfibrile B a dubletului adiacent prin intermediul unei proteine contractile numit nexin. Cilul sau flagelul propriu-zis este ancorat n corpul celular prin rdcini cu o structur variat. 4.1.6.2. Mecanismul molecular al micri cililor i flagelilor n micrile cililor i flagelilor un rol important l joac dineina, o protein alctuit din mai multe polipeptide, cu mase moleculare variate. La extremitatea fiecrui bra de dinein exist 2-3 regiuni globulare, reprezentate de un polipeptid (400.000 Da) cu activitatea ATP azic. n timpul micrii cililor i flagelilor, energia eliberat prin hidroliza ATP este utilizat n scopul desfacerii i refacerii succesive a legturilor dintre dineinile ataate de subfibrila A a unui dublet i subfibrila B a dubletului adiacent. Aceast deplasare a punilor laterale dintre fibrele determin alunecarea dubletelor unul fa de altul i n consecin nclinarea cilului (flagelului). Elementele radiale i teaca intern au rolul de a coordona intrarea n aciune a dineinei, de la baza cilului (flagelului) spre vrful acestuia, convertind glisarea dubletelor ntr-o micare de nclinare a axonemei. Nexina, proteina contractil ce leag fibrele periferice adiacente, mpiedic disocierea dubletelor n momentul glisrii. Spre deosebire de cili, flageli se mic n acelai plan. Aceast limitare a micri este impus pe de o parte de existena unei legturi rigide, cu caracter permanent ntre dubletele externe, iar pe de alt parte de diferenele morfologice dintre fibrele centrale.

4.1.7. Implicarea microtubulilor n diviziunea celular

Microtubulii joac un rol-cheie n trei procese importante ce se desfoar n cadrul diviziuni celulare: formarea fusului de diviziune; deplasarea cromozomilori n planul ecuatorial i celulei i alinierea n placa metafazic; translocarea cromozomilori anafazici. 4.1.7.1. Formarea fusului de diviziune n celulele aflate n interfaz, microtubulii citoplasmatici radiaz din centrozomul centrului celular, avnd o orientare unipolar. Intrarea celulei n diviziune este anticipat de autoreplicarea centriolilor, scindarea materialului pericentriolar i formare celui de-al doilea centru celular. Cei doi centrozomi coordoneaz nucleaia microtubulilor care prin asociere genereaz fibre. Fibrele, cu captul (-) inserat n centrozom i captul (+) distal, liber, sunt dispuse de jur-mprejurul fiecrui centrozom i poart numele de fibre asteriene (stelare). Totalitatea fibrelor asteriene ce radiaz dintr-un singur centrozom alctuiete asterul. Fibrele din cei doi asteri ce se gsesc n contact se alungesc prin polimerizarea tubulinei, determinnd deprtarea centrilor celulari i deplasarea lor spre polii celulei, unde vor constitui polii fusului de diviziune. (fig. 61).

101

Fig. 61 Formarea fusului de diviziune: a) fibrele asteriene radiaz din regiunea pericentriolar; b) replicarea centriolilor are drept consecin apariia celui de-al doilea centru celular; Alungirea fibrelor asteriene i deplasarea celor doi centrii celulari spre polii opui ai celulei; c) diferenierea fibrelor polare ale fusului de diviziune ntre cei doi centrii celulari; d) ancorarea cromozomilor la polii fusului de diviziune prin fibrele kinetocorice. Fibrele ce pleac din centrozom spre planul ecuator al celulei poart numele de fibre polare. Acestea se alungesc prin adugarea dimerilor de tubulin la capetele (+) libere. n momentul dezorganizrii membranei nucleare, fibrele polare ptrund n spaiul nuclear i ancoreaz prin capetele (+) kinetocorii cromozomilor. Fibrele ce leag kinetocorii de polii fusului de diviziune se numesc fibre kinetocorice. Kinetocorii sunt complexe multiproteice cu structura trilamelar, ce se dezvolt pe cele dou fee opuse ale centromerului (constricie primare) la nivelul cruia sunt unite cele dou cromatide ale cromozomului metafazic. Formarea acestei structuri specializate n interconectarea cromozomilor cu polii fusului de diviziune este controlat de secvene de ADN, numite ADN centromeric. Secvenele au capacitatea de a lega proteine specifice ce iniiaz formarea complexului multiproteic. Totalitatea fibrelor asteriene, polare i kinetocorice ce radiaz din cei doi centrozomi, alctuiete fusul mitotic sau fusul de diviziune. Fusul de diviziune este format din dou semifusuri, fiecare coninnd fibrele ce pleac de la un singur centrozom. Caracterul polar al fusului de diviziune poate explica prin existena unui proces de stabilizare selectiv a fibrelor polare. n acest proces sunt implicate proteine asociate microtubulilor ce interconecteaz n plan ecuatorial fibrele polare nvecinate antiparalele, mpiedicnd depolimerizarea acestora.

102

4.1.7.2. Deplasarea cromozomilor spre regiune ecuatorial a celulei i alinierea lor n placa metafazic n prometafaz, cromozomii se mic dezordonat, oscilnd ntre cei doi poli ai fusului de diviziune. n timpul acestor micri, un set de fibre polare captureaz unul din cei doi kinotocori ai cromozomului, dup care i cellalt kinetocor este ancorat de fibrele polare ce pleac din centrozomul opus. Fiecare cromozom va avea astfel o orientare strict n raport cu fusul diviziuni, prezentnd kinetocorii spre cei doi poli ai celulei. Deplasarea cromozomilor spre planul ecuatorial al celulei este determinat n parte de polimerizare fibrelor kinetocorice. Aceste fibre au captul (-) inserat n controzom i captul (+) legat de kinetocor i stabilizat prin proteine. Injectnd tubulin marcat, ntr-o celul aflat n metafaz, s-a constatat c dimeri sunt incorporai la captul (+) al fibrelor kinetocorice. n timp ce detaarea prin micromanipulare a fibrelor kinetocorice de cromozomi declaneaz un proces rapid de depolimerizare a acestor fibre. Aceasta sugereaz c kinetocorul protejeaz capetele (+) ale fibrelor kinetocorice, mpiedicndu-le depolimerizarea. Avnd ambele capete protejate, prin kinetocor i centrozom, fibrele kinetocorice au o stabilitate mult superioar celorlalte fibre ce alctuiesc fusul de diviziune. Polimerizarea fibrelor kinetocorice nu reprezint singurul proces ce explic deplasarea cromozomilor i alinierea lor n placa ecuatorial. Ruperea experimental a fibrelor kinetocorice ce leag cromozomul de unul din polii fusului de diviziune este precedat de rapid deplasare a cromozomului spre polul de care a rmas ataat. Aceasta demonstreaz caracterul elastic al fibrelor kinetocorice. Deplasrii cromozomilor, ancorai n fibrele de diviziune, spre unul din cei doi poli, i se opune o for ce atrage cromozomii spre polul opus. Fora este direct proporional cu lungimea fibrelor kinetocorice. S-a observat c, n urma exciziei kinetocorului, prin microchirurgie cu raze laser de pe un bra cromozomial, aceasta se deprteaz spre polul fusului de diviziune cel mai apropiat. Micarea braului, lipsit de kinetocor, nu se datoreaz ancorrii sale la fibrele fusului de diviziune. O explicaie a acestui fenomen ar putea-o constitui rapida polimerizare a fibrelor fusului de diviziuni ce genereaz un curent care respinge structurile neataate spre regiunea ecuatorial a celulei. Cele dou fore de respingere i atracie, spre polii celulei, acioneaz asupra cromozomilor i dup alinierea lor n placa metafazic, ceea ce justific permanenta reajustare a poziiei lor prin micarea oscilatorii de mic amplitudine. 4.1.7.3. Translocarea cromozomilor anafazici Desvrirea replicrii centromerilor i separarea cromatidelor surori ale cromozomilor metafazici marcheaz sfritul metafazei i iniiaz o alt etap a mitozei, anafaza. n anafaz au loc dou evenimente distincte cu o desfurare simultan n timp. Primul eveniment const n deplasarea cromatidelor surori spre polii opui ai fusului de diviziune i constituie anafaza A. Pe parcursul anafazei A, fibrele kinetocorice se scurteaz prin disocierea de tubulin de la capetele (+) (fig. 62). Fig. 62 Deplasarea cromozomilor spre polii opui ai celulei n anafaz. Mecanismul prin care cromatidele ascensioneaz spre polii fusului de diviziune nu este nc elucidat. Pn n prezent au fost elaborate trei modele teoretice alternative ale acestui mecanism.

103

n primul model, rolul-cheie l joac anumite proteine kinetocorice cu activitate ATPazic similare dineinei i kinezinei. Proteinele leaga capetele (+) ale fibrelor kinetocorice i le stabilizeaz. Energia eliberat prin hidroliz ATP asigur deplasarea de-a lungul fibrelor a proteinelor kinetocorice cu funcie ATP-azic, care antreneaz n aceast micare ntreaga cromatid. Prin deplasarea proteinelor sun expuse capetelor (+) ale fibrelor kinetocorice care sufer depolimerizarea. Elementul central al celulei de-al doilea model l constituie depolimerizarea fibrelor kinetocorice. Disocierea dimerilor de tubulin este nsoit de ruperea i refacerea ciclic a legturilor dintre proteinele kinetocorice (ce nu prezint activitatea ATP azic) i microtubulii ce alctuiesc fibrele kinetocorice. Aceste proteine manifest probabil o afinitate crescut pentru tubulina polimerizat. n cel de-al treilea model, fibrele kinetocorice au numai rolul de a direciona deplasarea cromatidelor. Fora ce determin aceast micare este generat de alte structuri, cum ar fi un sistem de filamente elastice ce interconectez kinetocorii i polii fusului de diviziune. Al doilea eveniment l constituie anafaza B i este reprezentat de alungirea fusului mitotic i deprtarea centrilori celulari. Fora ce determin acest proces este generat de interaciunea fibrelor polare antiparalele (din cele dou semifusuri) ce se ntreptrund n regiunea ecuatorial a fusului de diviziune. Rezultatele cercetrilor efectuate au condus la elaborarea unui model al mecanismului elongarii fusului de diviziune. Modelul se bazeaz pe dou elemente: polimerizarea fibrelor polare i presupunerea axistenei unor proteine cu activitate ATP-azic, similare dineinei sau kinezinei. Prin adugarea dimerilor de tubulin la capetele (+) libere ale fibrelor polare antiparalele acestea se alungesc i se suprapun n regiunea ecuatorial a fusului de diviziune. Se presupune c proteinele cu activitate ATP - azic sunt ataate de fibrele polare ale unui semifus. Energia eliberat prin hidroliza ATP permite deplasarea proteinelor de-a lungul fibrelor polare ce alctuiesc al doilea semifus. Fibrele antiparalele sunt mpinse spre centrii celulari determinnd,n final, deprtarea lor. Nu este exclus posibilitatea ca prin interaciile cu cortica celular microtubulii din fibrele asteriene s participe la deplasarea n direcii opuse a polilor fusului, diviziune n timpul anafazei B.

4.1.8.Transportul intracelular mediat de microtubuli

Organitele, veziculele i particulele proteice nu se deplaseaz haotic n spaiul intracelular. Ele sunt transportate n anumite situsuri, pe direci i cu viteze caracteristice. n stricta orientare a transportului intracelular un rol-cheie l joac microtubulii. Iniial, studiul implicrii acestor elemente de citoschelet n transportul intracelular a folosit, ca sistem experimental, celulele nervoase. Aceast alegere se baza pe faptul c ribozomii sunt abseni din axoni neuronilor, prezena proteinelor i a organitelor celulare fiind rezultatul unui proces de transport de la situsurile de sintez, din corpul celular, spre regiunea sinaptic. Procesul poart numele de transport axonal anterograd. n paralele, n axon are loc i un transport retrograd n care sunt antrnate vezicule ce conin fragmente de membran i proteine citosolice. Acestea se deplaseaz dinspre terminaiile sinaptice spre corpul celular, unde vor fi degradate de ctre enzimele lizozomale. Transportul axonal anterograd a fost pus n eviden prin injectarea aminoacizilor marcai radioactiv i urmrirea, prin metode autoradiografice, a proteinelor libere sau incorporate n organitele celulare ce i conineau. Experimentul a demonstrat c deplasarea proteinelor, veziculelor i a organitelor nu are loc cu aceeai vitez. Cu cea mai mare vitez (3mm/sec) sunt deplasate particulele i veziculele mici, n timp ce proteinele ce intr n alctuirea citoscheletului se deplaseaz foarte incet (fraciuni de mm/zi).

104

O valoare intermediar o are viteza de transport a mitocondriilor. Tehnica microscopiei computerizate n contras de faz a permis vizualizarea asocierii organitelor cu structuri celulare filamentoase i deplasarea lor de-a lungul axonului. n unele cazuri, se pot observa dou organite deplasndu-se de-a lungul aceluiai filament, n direci opuse, fr a intra n coliziune. Aceasta indic faptul c fiecare filament transportor conine mai multe benzi de transport pentru organitele celulare. ncercrile de a caracteriza aceste filamente au condus la concluzia c ele reprezint, de fapt, microtubuli plasmatici. n plus, studiul efectuat pe culturi de fibroblaste a demonstrat implicarea microtubulilor n dispersarea veziculelor rezultate prin fragmentarea aparatului Golgi, pe parcursul mitozei, i reagregarea lor n interfaza ciclului celular. Pentru a nelege mecanismul transportului intracelular asociat microtubulilor, s-a realizat un sistem experimental ce coninea microtubuli obinui prin autopolimerizarea dimerilor necontaminai cu proteine asociate sau citosolice i vezicule sinaptice izolate din diferite tipuri celulare. S-a observat c att legarea, ct i deplasarea veziculelor necesit prezena n sistem a ATP i a unor proteine specifice cu funcia ATP-azc. Una dintre aceste proteine este kinezina (380.000 Da). Molecula alctuit din patru lanuri polipeptidice este capabil s lege, printr-unul din capete, microtubulul, iar prin cellalt capt, vezicula transportat. n prezena ATP, kinezina de deplaseaz de-a lungul microtubulului mpreun cu vezicula pe care a legat-o. Proteina asigur transportul anterograd al veziculelor, deoarece ea se deplaseaz ntotdeauna de la captul (-) al microtubulului spre captul (+) al acestuia. Modul n care kinezina utilizeaz energia eliberat prin hidroliza ATP pentru a asigura transportul veziculelor de-a lungul microtubulului este nc neelucidat (fig. 63). Fig. 63 a) Transportul anterograd al veziculelor de-a lungul microtubulilor mediat de kinezin; b) Imobilizate pe suprafaa unei plci de sticl, moleculele de kinezin deplaseaz microtubulul asociat spre captul su (-). Responsabil de transportul retrograd al veziculelor este o protein asociat cu microtubulii plasmatici numit MAPIC (1.000.000 Da) sau dinein citoplasmatic. n mod similar kinezinei, proteina MAPIC este capabil s lege microtubulul i vezicula de transport, dar ea se deplaseaz dinspre captul (+) spre captul (-) al microtubulului, folosind energia rezultat din hidroliza ATP.

4. 2. Microfilamentele
Microfilamentele de actina sunt componente citoplasmatice prezente n toate celulele eucariote. Att n celulele musculare, ct i n alte tipuri celulare ele sunt asociate cu o protein fibrilar, numit miozin. n citoplasma tuturor celulelor, cu excepia celor musculare, ntlnim microfilamentele izolate cu o distribuie relativ difuz i dinamic. 105

Acestea particip alturi de microtubulii citoplasmatici i filamentele inermediare la organizarea stucturii complexe a citoscheletului. n fibrele de stress, inelele contractile i microvili, microfilamentele sunt fasciculate (asociate n mnunchiuri), ele ndeplinind att un rol structural, de susinere, ct i un rol dinamic, fiind implicate n micrile celulare ce au la baz mecanismul actin miozin. n celulele musculare microfilamentele particip la realizarea contraciei musculare. Aceste forme diferite de organizare a microfilamentelor, ct i funciile asociate lor sunt determinate de tipul proteinelor ce leag specific actina.

4.2.1. Microfilamentele de actin

Actina reprezint principala component a microfilamentelor. Actinele, izolate din diferite organisme i tipuri celulare, au mase moleculare, conformaie i secven de aminoacizi similare. Acest fapt sugereaz c genele codanate au evoluat dintr-o gen ancestral comun. La psri i mamifere exist cel puin 6 gene diferite ce codific actina. Din cele 6 protein, 4 prezint un grad nalt de omologie (din cei 375 de aminoacizi doar 6 sunt diferii). Aceste proteine se numesc alfa actine. Fiecare specie molecular de alfa actin este prezent exclusiv ntr-un singur tip de celul muscular (din muchii striai, miocard, muchii netezi ce delimiteaz vasele sangvine sau muchii enterici ce mrginesc lumenul intestinal). Celelalte 2 specii moleculare de actin notate cu beta i gama au un grad de omologie mai sczut i sunt prezente n citoplasma tuturor tipurilor celulare. ncercrile de izolare i caracterizare a acestor proteine au evideniat faptul c numrul tipurilor de actine este mai mare dect cel al genelor care le codific. Se apreciaz c modificrile posttranslaionale (acetilarea aminoacizilor din segmentul amino-terminal, metilarea unui rest de histidin) sunt responsabile de apariia unui numr att de mare de specii moleculare.Experimentele in vitro au demonstrat c moleculele de actina purificate din diverse surse sunt capabile s copolimerizeze i c toate stimuleaz activitatea ATP - azic a miozinei. Dei, nc, nedemonstrat experimental, este posibil ca speciile moleculare de actin s manifeste o afinitate diferit fa de proteinele citoplasmatice cu care se asociaz. Acest lucru ar explica funciile diferite ale microfilamentelor.Actina este un polipeptid cu o mas molecular de 42.000 Da. Aspectul globular al proteinei justific denumirea de actin globular sau actin G. La o concentraie ionic similar cele existente n spaiu intracelular actina G polimerizeaz, n vitro, genernd filamente de actin, numite actin fibrilar sau actin F. Filamentele de actin obinute n vitro sunt identice cu microfilamentele izolate din celule. n filament moleculele de actin G, avnd caracter polar, se asociaz cap la coad formnd un helix monocateran cu o grosime aproximativ de 7 nm. Pe fiecare tur de helix se gsesc dou molecule de actin. Fiecare monomer este orientat perpendicular pe axa helixului stabilind interacii puternice cu cei doi monomeri situai n imediata vecintate i interacii slabe cu moleculele de actin G dispuse la dreapta i la stnga sa de-a lungul helixului (fig. 64). Fig. 64 Modelul molecular al actinei fibrilare (actina F). Att polaritatea subunitilor componente, ct i stricta orientare a acestora n structura helicoidal confer polaritate filamentului de actin. Dinamica microfilamentelor amintete de cea a microtubulilor. Adugarea monomerilor sau disocierea lor pot avea loc la oricare din capetele microfilamentului, dar viteza cu care se desfoar reaciile de polimerizare i depolimerizare la captul (+) este de 5-10 ori mai mare dect la captul (-). 106

Similar dimerilor de tubulin ce stabilesc interacii puternice cu GTP, monomeri de actin leag strns ATP. Hidroliza ATP are loc imediat dup ncorporarea actinei G n microfilament. Posibilele structuri cap ATP sau ADP nu influeneaz polimerizarea monomerilor i aceasta se datoreaz, n mare parte, faptului c la concentrarea ionic intracelular (0,15M,KCI) este favorizat polimerizarea actinei. Pe de alt parte, concentraia intracelular a monomerilor liberi este mult mai mare dect concentraia critic. n consecin, microfilamentele sunt structuri mult mai stabile dect micro tubulii. Aceast stabilitate este accentuat prin ataarea de microfilamente a proteinelor asociate.

4.2.2. Miozina
Miozina este o protein cu larg rspndire n celulele organismelor eucariote. Pn n prezent se cunosc 2 specii moleculare ale acestei proteine. Miozina tip I este absent n celulele musculare, ea fiind implicat n fenomenele de motilitate celular, ce au la baz mecanismul actin- miozin. Miozina de tip II se gsete att n celulele musculare din muchii striai i netezi, ct i n alte tipuri celulare. Datorit rolului pe care miozina de tip II, din celulele musculare, l joac n contracia muscular, ea a constituit subiectul numeroaselor cercetri experimentale. Miozina de tip II (470.000 Da) este alctuit din 6 lanuri polipeptidice dintre care 2 lanuri grele (230.000 Da/lan) i 2 perechi de lanuri uoare (20.000 Da/lan). Lanurile grele sunt identice. Fiecare este format dintr-o regiune alfa heicoidal cu o lungime de 30 nm, numit coad i o regiune globular carboxi terminal, cu diametrul de 4 nm, numit cap. Regiunile alfa helicoidale ale celor 2 lanuri grele sunt rsucite una n jurul celeilalte, n timp ce regiunile globulare rmn separate. Perechile de lanuri uoare sunt ataate celor dou regiuni globulare. Lanurile uoare ce alctuiesc o pereche sunt identice ntre ele, dar diferite de lanurile celeilalte perechi. n structura de miozin II se remarc existena a dou puncte de flexiune ce marcheaz domeniile structurale ale prote (fig.65).

Fig. 65 Modelul molecular al miozinei. Molecula este alctuit din dou lanuri grele i dou perechi de lanuri uoare. Lanurile grele prezint cte o regiune amino terminal globular, numit cap i o regiune helicoidal, carboxi terminal, numit coad. Molecula prezint dou puncte de flexiune. Primul punct de flexiune este situat n regiunea alfa hericoidal, n timp ce al doilea separ capul bilobat de coada moleculei. Miozina poate fi scindat la nivelul punctelor de flexiune sub aciunea unor enzime cu activitate proteazic. Chimotripsina scindeaz miozina n dou domenii. Primul domeniu, meromiozina grea (HMM) conine capul bilobat i un segment din coada lanurilor grele, iar al doilea domeniu meromiozina uoar (LMM), cuprinde segmentul aminoterminal al cozilor. Prin tratarea domeniului HMM cu papain segmentul de coad este degradat i sunt eliberate fragmentele S1, ce conin cte un cap globular i perechea de lanuri uoare asociate acestuia. Fragmentele S1, prezint activitate ATP azic. Pe regiunea globular ce formeaz capul lanurilor grele ale miozinei, sunt localizate att situsurile de legare ale ATP ct i cele pentru actin. 107

Studiile biochimice au evideniat faptul c n prezena filamentelor de actin activitatea ATP azic a miozinei este stimulat; viteza de hidroliz a ATP crete de 200 de ori. Moleculele de miozin polimerizeaz genernd filamente de miozin. Polimerizarea implic agregarea cozilor moleculelor de miozin. n celulele nemusculare, filamentele de miozin au dimensiuni mici (diametru 60 ) i caracter tranzitoriu, ceea ce face dificil vizualizarea lor la microscopul electronic. Organizarea n filamente a miozinei a fost pus n eviden, pentru prima oar, n celulele musculare unde ele au o structur particular i sunt numite filamente groase. Filamentele groase (diametru 150-200 ) conin 500-600 molecule de miozin. Orientarea moleculelor n filament imprim acestuia un caracter bipolar. Fiecare filament este alctuit dintr-o regiune central i 2 regiuni terminale. Regiunea central are un caracter exclusiv fibrilar fiind format prin suprapunerea cozilor antiparalele ale moleculelor de miozin. n cele 2 regiuni terminale, capetele moleculelor de miozin se ataeaz de jur-mprejurul filamentului, determinnd ngroarea acestuia.

4.2.3. Rolul actinei i miozinei n contracia muscular

Mecanismul actin miozin st la baza unui tip particular de micare celular, realizat de structuri specializate din muchii striaii, netezi i cardiaci i care poart numele de contracie muscular. Muchii striai primesc o inervaie motorie somatic. Datorit inseriilor osoase ei asigur deplasarea i pstrarea poziiei corpului. Musculatura neted prezint o inervaie vegetativ. Muchii netezi nconjoar organele interne, fiind prezeni la nivelul intestinului gros i subire al vezici biliare i al vaselor sangvine. Contracia i relaxarea muchilor netezi asigur deplasarea alimentelor de-a lungul tractului digestiv i controleaz diametrul vaselor sangvine. Spre deosebire de muchii striai, cei netezi se contract mai lent, tensiunea dezvoltat fiind meninut pe o durat mai mare de timp. Muchii cardiaci se aseamn din punct de vedere structural cu cei striai, dar se afl ca i muchii netezi sub controlul inervaiei vegetative. Prin contracia lor, sngele este pompat n circuitul sanguin.

4.2.4. Actina i miozina n celule nemusculare

Filamentele de actin din celulele nemusculare au un pronunat caracter tranzitoriu. Formarea reelei de microfilamente este reglat de factori proteici i concentraia ionilor de Ca. Una dintre cele mai importante proteine ce influeneaz procesul de polimerizare a actinei, n aceste celule, este profilina. Proteina se leag de monomerii de actin formnd un complex numit profilin-actin. Deoarece profilina blocheaz etapa de nucleaie, complexul este incapabil s polimerizeze spontan. n plus modul de legare a profilinei la monomer face imposibil legarea complexului la captul (-) al unui filament de actin preexistent, polimerizarea putnd avea loc doar la capatul (+) al acestuia. Dup legarea profilin-actinei la capatul (+) al filamentului de actin, profilina este eliberat crend posibilitatea adugrii unui alt complex i alungirii filamentului. n mod obinuit, capetele (+) ale filamentelor de actin sunt ancorate n membrana plasmatic i/sau stabilizate prin proteine asociate. n acest caz, profilina blocheaz complet polimerizarea actinei (fig. 66).

108

Fig. 66- Rolul profilinei n polimerizarea actinei, n celulele nemusculare. Reglarea procesului de polimerizare i depolimerizare a actinei prin ionii de Ca este mediat de cel putin dou proteine similare ca structur i funcie: vilina i gelsolina. La o concentraie citosolic mare a ionilor de Ca, proteinele rup filamentele lungi de actin, rmnnd ataate la captul (+) al fiecrui fragment, mpiedicnd astfel reasamblarea filamentelor. O dat cu scderea concentraiei Ca2+, vilina (nu i gelsolina) este capabil s accelereze procesul de polimerizare al actinei. Ambele proteine joac i un rol structural, interconectnd filamentele de actin n mnunchiuri. Filamentele de miozin din celulele nemusculare sunt mult mai mici (10-20 molecule) dect cele din celulele musculare. Molecula de miozin se aseaman cu cea din muchii netezi. Activarea funciei sale ATP-azice necesit fosforilarea lanurilor uoare i este reglat de complexul calmodulin Ca2+. Din celulele nemusculare au fost izolate i proteine asociate intalnite n