MARIA PRISECARU

TINA OANA CRISTEA

ROXANA VOICU

BIOLOGIE CELULARĂ ŞI MOLECULARĂ
Curs universitar

Editura „ ALMA MATER ” Bacău 2011

Referenţi ştiinţifici: Š Prof.univ.dr. BARABAŞ NECULAI Š Prof.univ.dr. BATTES KLAUS WERNER

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României PRISECARU, MARIA Biologie celulară şi moleculară / Prisecaru Maria, Cristea Oana Tina, Voicu Roxana. Bacău : Alma Mater, 2011 Bibliogr. ISBN 978-606-527-116-6 I. Cristea, Oana Tina II. Voicu, Roxana Elena 576.3 577.2

Tipar executat la:

UNIVERSITATEA „VASILE ALECSANDRI” DIN BACĂU Calea Mărăşeşti, Nr. 157, 600115 Tel. ++40-234-542411, tel./ fax ++40-234-516345 e-mai: www.ub.ro; stiinte@ub.ro

ISBN 978-606-527-116-6

Prezenta lucrare se adresează în primul rând studenţilor şi cercetărilor din diferite domenii ale ştiinţelor biologice, oferind cunoştinţele de bază în domeniul biologiei celulare şi moleculare, făcându-se însă frecvente referiri la cele mai recente descoperiri şi interpretări, cunoscut fiind faptul că Biologia este o ştiinţă dinamică, care se bazează în principal pe teorii susţinute de rezultate experimentale obţinute din cercetare şi experimentare.

CUPRINS

Introducere 1. Consideraţii generale privind domeniul de studiu al biologiei celulare şi moleculare 1.1. Definiţie şi caracteristici 1.2. Scurt istoric 1.3. Contribuţii româneşti în studiul celulei 1.4. Principalele teorii care au condus la modul actual de gândire despre natura materiei vii 1.4.1. Teoria celulară 1.4.2. Teoria cromozomială a eredităţii 1.4.3. Teoria moleculară a materiei vii 1.4.4. Teoria biostructurală a materiei vii 1.4.5. Teoria evoluţionistă, originea vieţii şi a omului 2. Membranele celulare 2.1. Definiţia şi clasificarea membranelor celulare 2.2. Organizarea membranelor celulare 2.2.1. Caracterizarea componentelor lipidice ale membranelor celulare 2.2.2. Componenta proteică a membranelor celulare 2.2.3. Mobilitatea lipidelor şi proteinelor de membrană 2.2.4. Componenta glucidică membranară 2.2.5. Glicocalixul. 2.2.6. Apa. 2.2.7. Asimetria distribuţiei componentelor membranare 2.3. Mecanismele de transport prin membranele celulare 2.3.1. Procesul calitativ al traversării membranelor 2.3.2. Transportul ionilor şi moleculelor mici prin membranele celulare 2.3.2.1. Transportul pasiv 2.3.2.2. Transportul activ 2.3.3. Transportul macromoleculelor şi particulelor prin membrana plasmatică 2.4. Receptorii din membrană 2.4.1. Tipuri de receptori 2.4.2. Modalităţi de comunicare intercelulară. 2.4.2.1. Comunicarea intercelulară la distanţă 2.4.2.2. Contactul intracelular direct 2.4.3. Receptorii celulelor nervoase. 2.4.4. Receptorii care controlează permeabilitatea ionică 2.4.5. Cuplajul celular metabolic şi electric 2.5. Schimburile energetice în celula vie 2.5.1. Noţiuni generale de termodinamică 2.5.2. Transformări de energie în celula vie (energetica celulară) 2.5.2.1. Molecula ATP şi proprietăţile sale 2.5.2.2. Alţi compuşi fosforilaţi 2.6. Membrane care cuplează energie

11 12 13 14 15 17 17 18 22 22 24 26 26 27 28 30 30 31 31 32 32 33 33 34 34 36 41 44 45 46 46 46 46 48 50 51 51 53 54 56 56

2.6.1. Cloroplastele 2.6.1.1. Procesul general al fotosintezei 2.6.1.2. Reacţiile de lumină 2.6.1.3. Reacţiile de întuneric 2.6.2. Mitocondriile 2.6.2.1. Degradarea glucozei de către mitocondrii 2.6.2.2. Ciclul glioxalatului 2.6.2.3. β oxidarea acizilor graşi 2.6.2.4. Sistemul transportor de electroni (lanţul respirator) 2.6.2.5. Fosforilarea oxidativă 2.6.2.6. Fermentaţiile 2.6.3. Comparaţie între fotosinteză şi respiraţie 3. Adeziunea celulară. Joncţiunile celulare şi matricea extracelulară 3.1. Molecule implicate în aderarea celulă-celulă 3.1.1. Selectinele 3.2.2. Domenii imunoglobulinice 3.2.3. Caderinele 3.2. Joncţiunea celulară 3.2.1. Joncţiunile de ocluzie 3.2.2. Joncţiunile de ancorare 3.2.2.1. Joncţiunile de adeziune intercelulară 3.2.2.2. Joncţiunile de adeziune celulă-matrice extracelulară 3.2.2.3. Desmozomii 3.2.2.4. Hemidesmozomii 3.2.3. Joncţiunile de comunicare 3.2.3.1. Structura joncţiunilor de comunicare 3.2.3.2. Reglarea permeabilităţii joncţiunilor de comunicare 3.2.4. Joncţiunile sinaptice 3.3. Matricea extracelulară 3.3.1. Componentele matricei extracelulare 3.3.1.1. Glicozaminoglicanii 3.3.1.2. Proteoglicanii 3.3.1.3. Colagenul 3.3.1.4. Elastina 3.3.1.5. Fibronectinele 3.3.2. Lamina bazală 3.3.2.1. Structura laminei bazale 3.3.2.2. Funcţiile lamnei bazale 4. Citoscheletul 4.1. Microtubulii 4.1.1. Microtubulii – semnificaţia biologică 4.1.2. Structura microtubulilor 4.1.3. Polaritatea şi dinamica microtubulilor. 4.1.4. Bazele diversităţii structurilor microtubulilor 4.1.5. Centrii organizatorici ai microtubulilor 4.1.5.1. Centriolii şi corpusculii bazali 4.1.5.2. Ultrastructura centriolilor şi a corpusculilor bazali. 4.1.5.3. Replicarea centriolilor şi a corpusculilor bazali. 4.1.6. Mişcările cililor şi flagelilor 4.1.6.1. Structura cililor şi a flagelilor 4.1.6.2. Mecanismul molecular al mişcări cililor şi flagelilor. 4.1.7. Implicarea microtubulilor în diviziunea celulară

56 57 59 63 67 67 70 70 71 72 73 73 75 75 75 76 76 76 77 78 78 79 79 80 80 81 81 82 82 83 83 84 86 88 89 91 91 92 93 93 93 94 95 96 96 97 97 98 99 100 101 101

2.1. Elemente de control în expresia genetică 5.1.1.1. Morfologia şi structura nucleului 5.3.1. Factorii de transcripţie 5.1.2. Replicarea ADN la eucariote 5. Aparatul enzimatic de transcripţie 5.2. Cromatina 5.6.1. Microfilamentele de actină 4.5. Alungirea sau elongarea catenei polipeptidice 6.2.2.1.4. Corectarea erorilor de replicare 5.4.Microvilii 4.3. ARN splicing 5. Primarea replicării 5.3.3.2.7. Rolul citomembranelor granulare în sinteza proteică 6.1.1. Fibrele de stress 4.2.1.5. Organizarea moleculară a fibrelor de cromatina. Elemente implicate în transcripţie 5.3.2.3.2. Iniţierea catenei polipeptidice 6.2.3.4.4.3.5.7.2.Miozina 4.1.4.3.3.5. Translocarea cromozomilor anafazici. Transportul intracelular mediat de microtubuli. Microfilamentele 4. Actina şi miozina în celule nemusculare 4.3.2. Reţeaua microtrabeculară 4. Organizarea nucleului şi expresia activităţii genelor 5.1.1.1. Proteinele contractile nucleare 5.4. Sistemul vacuolar intracitoplasmatic 6. Biosinteza proteinelor sau translaţia ARNm 6.4.3.2.8.2.3. 4. Matricea nucleului 5.2.2. Învelişul nuclear 5.3.7. Complexul de enzime polimerazice implicate în replicare 5.3. Mecanismul transcripţiei 5.3. Mecanismul compartimentării celulare a proteinelor nou-sintetizate 101 103 103 104 105 106 107 108 108 109 110 111 112 112 112 114 114 114 115 115 116 118 119 119 121 123 125 126 127 127 128 129 130 130 131 132 133 133 134 136 137 138 138 139 139 140 143 146 146 149 149 . 4.4. Decodificarea informaţiilor genetice 6.3.3.1.4.1. Rolul actinei şi miozinei în contracţia musculară 4.2. Nucleozomii 5.2.4.1. Filamente intermediare 4.3.2.4. Terminarea sintezei catenei polipeptidice 6.3. 4. Mişcarea ameboidala. Asigurarea necesarului de ARNm 6. Transcripţia ADN sau sinteza ARN 5. Proteinele asociate citoscheletului 5.2.2.4. Tipuri de filamente intermediare şi semnificatia lor funcţională 4.3. Mecanismul general 5.1. Deplasarea cromozomilor spre regiune ecuatorială a celulei şi alinierea lor în placa metafazică 4.3.4. Iniţierea replicării 5. Alungirea lanţului de ADN nou .5.sintetizat şi terminarea replicării 5. Unităţile de replicare 5.2. Proteine ce alcătuiesc filamentele intermediare 4.2.4.6. Transportul intracelular 6. Particularităţile decodificării la procariote şi eurocariote 6.2.5.2. Rolul actinei şi miozinei în citokineza 4. Formarea fusului de diviziune 4.

Antigenii 203 10. Apoptoza 187 8. Factori implicaţi în reglarea apoptozei 190 8.4. Ciclul celular la plante 161 7. Rolul apoptozei în embriogeneză şi dezvoltare 190 8.kinazele dependente de cicline (cdk) 165 7.6. Meioza (diviziunea meiotică) 181 8.7.6.2.1.8.3.1. Ciclul celular la animale 161 7. Lizozomii 155 6.1. Răspunsul imunitar 201 10.4. Diviziunea celulară 175 7. Influenţa adeziunii celulare asupra proliferării 173 7.1.1. Protein . Procesul de îmbatrînire-senescenţa 195 9. Anticorpii.1. Genele supravieţuirii (gene antiapoptotice) 189 8. Competiţia celulelor pentru factorii de creştere 173 7.5.8.1.1.1.4.1.2. Ciclinelor şi protein . Funcţiile lizozomilor 155 6.1. Ciclul cromozomial şi creşterea celulară 170 7.kinazele dependente de cicline 164 7. 204 10.5. Implicarea factorilor de creştere în reglarea diviziunii celulare 171 7. Organizarea sistemului imunitar 202 10.3.8. Proteinele chaperone 158 7. Antigeni de histocompatibilitate 205 10.1.6. Peroxizomii 158 6. Gene letale 189 8. Molecule cu rol esenţial în cadrul sistemului imunitar 203 10.1. Corelaţia particularităţilor structurale şi funcţionale ale reticulului 151 endoplasmatic neted cu heterogenitatea funcţională a celulelor 6.8.3.3.1. Relaţii de cooperare între componentele sistemului imun 210 .7.2. Aspecte de reglare a apoptozei 190 8. Alţi factori responsabili de controlul proliferării celulare în 170 organismele pluricelulare 7. 193 9.2. Celule T 205 10.3.2.1.9.1.1.9.4.1.2.1. Sinteza şi secreţia polizaharidelor 154 6.1.5. 188 8. Reglarea ciclului celular prin mecanisme feed-back 168 7.4.3.4.6.5.1. Principalele mecanisme (ipotetice) implicate în senescenţă 196 10. Apoptoza şi starea de boală. Ciclinele 165 7.proteina Rb . Noţiuni generale despre imunitate şi sistem imunitar 201 10.1.3. Apoptoză – îmbătrânire – senescenţă 192 8.mecanism de reglare pozitivă a 168 ciclului celular 7.3. Segregarea şi concentrarea proteinelor 153 6.3. Gene implicate în controlul senescenţei 195 9. Frecvenţa procesului de apoptoză 188 8.3.2. Interacţiunea cicline. Mitoza (diviziunea mitotică) 175 7. Necroza.2. Citokinele 205 10.3. Gene implicate în procesul apoptotic 189 8.10.8. Mecanismele de producere a apoptozei 187 8. Ciclul celular 161 7.1.1.6.2.7.2.2. Reproducerea celulară 161 7.

Sistemul complement 10.7.13.13.13.3. Tipuri de transfer de gene 11. ADN-ligazele (polinucleoid-ligazele) 12.1.8. Finalitatea răspunsurilor imune 10.1.2.5.2.1.3. Uciderea celulelor ţintă 10.2. Ingineria genetică 11. Natura şi funcţia unor structuri virus-like: prionii 10.1.10.1. Alte categorii celulare implicate în imunitate 10.1. Prezentarea antigenilor 10.7.ului 12.2. Elemente de lucru utilizate în tehnologia ADN recombinat 12.biologice şi aplicaţiile lor 12.1.1.2.2. Aplicarea metodelor de biotehnologie în agricultură în vederea obţinerii de organisme transgenice 11.4. Denaturarea 213 214 214 215 216 218 218 218 219 219 219 219 220 220 221 221 221 222 222 222 222 223 224 225 227 227 228 229 229 230 233 235 235 235 238 241 245 245 245 252 252 252 253 254 254 255 256 266 266 266 . Terapie cu gene ţintă (Gene Targeting) 11.3.2. Procese artificiale de recombinare ADN (Genetic Engineering) 12.3.13. Reglarea imunologică 10.1.10. Reglarea normală.2.2.7.2.5.13.11.8.1.1.5.5.10.1. Receptorii virali 10.9. Metode şi tehnici moderne molecular .1.7. Hibridarea 12.6. Biotehnologia 11.2.2. Ingineria genetică şi rezolvarea unor probleme de ecologie 11.1.3. Procesul inflamator 10.1. Imunodeficienţa dobandită 10.5. Principiu 12.10.10. Principiul recombinării 12. Enzimele de restricţie 12.4. Intensificarea răspunsului imun 10. Baza umorală a răspunsului imun 10.2.1.10. Mijloace de apărare imună mediate umoral 10. Penetrarea virusului în celulă 10. Recombinarea ADN .3.1. Controlul prin reacţie inversă 10. Relaţiile virusuri-membrane celulare 10.1.14. Răspunsul imunitar mediat de celule 10.1.1. Genetica sistemului imunitar 10. Funcţia indirectă a anticorpilor 10.5.1.1. Leziuni cromozomale determinate de virusuri 10. Funcţia directă a anticorpilor 10.11.1. 10.4. Relaţiile virusuri-celule gazdă.10. Tipuri de efect citopatic 10.3. Alte aspecte ale biotehnologiei moderne şi perspectivele secolului XXI 12.1. Mijloace de apărare imună mediată celular 10. Interacţiunea între peptidele sistemului imun şi peptidele sistemului nervos şi endocrin 10. Relaţiile bacterii-celulele gazdei 11.2. Reglarea alterată 10.9. Vectorii 12.2.12.1. Interacţiuni celulare în răspunsul imun 10.1.1. Producerea de anticorpi 10.13. Ingineria genetică utilizată în prepararea de noi conservanţi alimentari 11. Grupele sanguine 10.3.8.9.11. Unele mecanisme de apărare imună în infecţiile bacteriene 10.

Renaturarea (annealing/reannealing) 12. Posibilităţi de folosire a biosenzorilor în biotehnologie Bibliografia 267 267 267 272 273 274 279 282 285 286 288 288 289 290 291 292 296 .7.2.4.4.2. Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) 12.12. Importanţa reacţiei de hibridare pentru medicină şi biologie 12. Biosenzorii – sisteme de coantificare a informaţiilor viului 13. Aparatura de măsurare 13. Factorul stringent 12. Metodologia de cercetare a proprietăţilor senzorilor biologici 13.2. Secvenţierea ADN. Fingerprinting genomic (amprente de ADN) 13. Biosenzorii 13. Hibridizare in situ 12.3. Clonarea ADN – ului 12.1.4. 6.3.2. 5. Tipuri de hibridări 12.5. Sonde genetice 12.5.2.3. Impactul informaţional al biosenzorilor 13.7.2.ului 12.6.

al producerii de substanţe energetice celulare. al transportului intracelular la nivelul organitelor. care au folosit metode şi tehnici diferite. greşeala cea mai mare a oamenilor este aceea de a se supraestima şi de a se considera exceptaţi de la legile generale ale evoluţiei. împotriva omului. Cercetările de biologie celulară şi moleculară au acumulat deja un bagaj de date care au permis progrese uriaşe în medicină. realizarea anticorpilor monoclinali. este vorba de o etapă de analiză a funcţiilor celulare la nivel molecular (de ex. manipularea genetică. îngustarea stratului de ozon atmosferic 11 . este o ştiinţă fundamentală. sursele de energie. Tehnicile avansate de microscopie electonică. microorganisme scăpate de sub control etc. până astăzi. În acelaşi timp. cercetările de biologie moleculară se află în faza clasificării mecanismelor care stau la baza formării şi asamblării structurilor din organismele vii. În contextul revoluţiei ştiinţelor biologice pe care o trăim astăzi. astăzi când trăim o adevărată explozie a cunoştinţelor ştiinţifice cunoscut unei revoluţii ştiinţifice. istoria societăţii omeneşti a demonstrat deja că impactul noilor tehnologii şi cel al dezvoltării ştiinţelor în general nu a fost totdeauna benefic pentru războaiele atomice şi bacteriologice.celula. cuceririle ştiinţei şi civilizaţiei umane s-au întors de foarte multe ori. astfel că biologia celulară. industrie alimentară. La ora actuală. fără a se lua în consideraţie complexitatea lui. cu proprietăţile lor emergente. al proceselor de reînnoire celulară. agricultură. procesul respiraţiei celulare. ştiinţele ecologice. atenţia fiind concentrată asupra momentului când se produce tranziţia informaţiei de la nivelul molecular către nivelul diferitelor sisteme şi structuri intermediare ale acestor organisme. sunt numai cateva din aceste tehnici care şi-au dovedit puterea analitică şi au permis unificarea experimentului biologic. ea devenind cu atât mai necesară în domeniul ştiinţelor biologice. al fenomenelor de adaptabilitate). face parte dintre ştiinţele „nerestrictive” deoarece nici un fenomen biologic nu poate fi studiat separat. Alte consecinţe nefaste ale tehnologiilor moderne asupra ecosistemelor în general şi stării de sănătate a oamenilor în particular sunt: creşterea radioactivităţii mediului înconjurător (în urma accidentelor de la termocentralele nucleare). folosirea culturilor celulare. Tocmai din cauza acestei mari erori comise de oameni. a substratului molecular şi a terminologiei în biologia celulară. Progresele ultrarapide ale biologiei celulare şi moleculare au dus la dezvoltarea biotehnologiei moderne care se anunţă a devenii marea forţă industrială a secolului al XXI-lea şi în care se pune speranţa că va reuşi să rezolve problemele cele mai spinoase ale societăţii omeneşti (alimentaţia.INTRODUCERE Informaţia a fost întotdeauna preţioasă în orice domeniu de activitate. După cum arată Lederberg (de două ori laureat al premiului Nobel pentru descoperiri fundamentale în domeniul geneticii bacteriene). periclitând viaţa pe Terra. genetică şi biologie moleculară. starea de sănătate. tehnologia ADNului recombinat. se impune tot mai mult o reconsiderare a concepţiei şi comportării cercetătorului ştiinţific în raport cu poziţia omului în ciclul evolutiv al naturii. interacţiunile cu alte structuri precum şi diversitatea sistemelor de ordin superior. poluarea ) la nivelul Terrei. accidentele de laborator soldate cu moartea experimentatorilor. care studiază fenomenele vieţii la acest nivel de organizare. lăsând să se întrevadă pentru viitor noi perspective fascinante de cercetare în diferite alte ramuri. Biologia celulară a evoluat în ultimii zece ani datorită progreselor realizate în cercetări de biochimie. Într-adevăr. Viaţa se manifestă numai în cadrul organizării celulare a materiei vii. când de fapt ei nu reprezintă decât un element în circuitul evolutiv al vieţii în natură. pentru investigarea unui substrat comun.

12 . trebuie să militeze ca în viitor cuceririle ştiinţifice să fie folosite cu mai mult discernământ. doar în slujba binelui. Omul de ştiinţă trebuie să ţină cont de faptul că. difteria) prin creşterea aglomeraţiei în centrele urbane şi prin deplasările rapide şi masive de populaţie datorită mijloacelor ultrarapide de transport. modificări majore ale acestor condiţii de mediu pot declanşa potenţiale nebănuite ale ecosistemelor cu influenţe posibil nocive. Conştient de toate aceste posibilităţi. pulmon).(prin folosirea în exces a freonilor). adus pentru întâia oară din Africa în Europa (la Marburg în 1967). au apărut astfel şi sau răspândit pe glob: virusul febrei galbene. în natură. pe lângă dezechilibrele grave (prin scăderea spaţiului verde). virusul Ebola (agentul febrei hemoragice). neintuite încă astăzi. De asemenea. ochi. virusul imunodeficienţei umane (HIV – transmis la om foarte probabil de la primatele junglei africane). pentru un grad tot mai înalt de civilizaţie în societatea umană. creşterea riscului de răspândire ultrarapidă a unor boli infecţioase (holera. expunerea concomitentă a populaţiei la noi agenţi patogeni. care a favorizat creşterea cantităţilor de radiaţii ultraviolete în atmosfera terestră şi implicit a frecvenţei cancerelor (de piele. defrişarea unor zone de pe glob (păduri tropicale) în scopul creării de mari aşezări umane şi centre industriale a determinat. diversitatea foarte mare de specii este tributară în mare măsură condiţiilor de mediu extern. asupra echilibrului vieţii pe Terra. meningita meningococică.un adevărat om de ştiinţă.

organe.. ci într-un schimb continuu de materie şi energie cu mediul exterior. Din punct de vedere termodinamic. negentropia. precum şi cu organizare dinamică. individ pluricelular).1. În orice sistem (deci şi cel celular) putem distinge trei categorii de programe: a) programe “pentru sine”. Orice manifestare vitală are loc pe fundamentul organizării celulare. Viaţa începe de la celulă. În ierarhia nivelurilor de organizare a materiei vii. deci şi celulei. ce-i conferă capacitatea de creştere.rinichi etc). os. care contracarează acţiunile mediului reglându-şi permanent procesele interne într-un sens favorabil persistenţei sale în timp şi spaţii. echilibrul dinamic. Organismele vii evită creşterea entropiei prin preluarea din mediu a unei entropii negative. programul. acumulează. Definiţie şi caracteristici BIOLOGIA CELULARĂ este o ramură a ştiinţelor biologice care studiază structurile funcţionale şi fenomenele biologice generale comune tuturor celulelor. aflată în relaţii de echilibru cu mediul înconjurător (Diculescu şi colab. prelucrează şi transmit informaţii de tot felul. ficat. O ilustrare a ierarhiei programelor o constituie modificările celulelor scoase dintr-un ţesut (sistem superior) şi cultivate în mod izolat. care asigură autoconservare sistemului dat. care asigură existenţa sistemului superior. adică un sistem care schimbă atât energie cât şi substanţă cu mediul înconjurător. Influenţele mediului tind permanent să dezechilibreze sistemul. Celula poate fi definită şi ca unitate elementară a lumii vii. în schimb dispare programul superior ce reflectă specificul celulei în cadrul ţesutului şi al organismului. Programul este o trăsătură legată de capacităţile structurale şi funcţionale ale sistemului. care asigură persistenţa celulelor. celula este un sistem deschis. sistemul celular i se pot descrie mai multe caracteristici : caracterul informaţional. tinzând mereu spre un regim constant de activitate numit stare staţionară sau echilibru dinamic. în care este integrat sistemul considerat (ţesuturi. molecule etc) nu sunt considerate „vii”. cu o ordine internă complexă. Autoreglarea este caracteristica sistemelor biologice prin care acestea îşi controlează procesele interne în funcţie de relaţiile cu mediul. Caracterul informaţional constă în aceea că în orice moment celulele recepţionează. deci au un comportament antientropic. deoarece nivelurile inferioare (atomi. ale complexelor moleculare. c) programe superioare. 13 . adică programele subsistemelor componente. 1983). sistemele biologice au capacitatea de a compensa creşterea entropiei şi de a o depăşi pe seama surselor de energie exterioare sistemului. în cazul celulei acestea sunt programele organitelor. autoreglarea şi integralitate. Se mai poate spune că biologia celulară are ca obiect studiul legilor generale de desfăşurare a proceselor vitale la nivelul de organizare celulară. care se diferenţiază devenind asemănătoare indiferent de sursa din care provin (piele. aceasta nu este niciodată într-un adevărat echilibru. Ca oricărui alt sistem biologic. În timp ce sistemele nebiologice evoluează întotdeauna în sensul creşterii entropiei . b) programe inferioare. Echilibrul dinamic sau starea staţionară este caracteristică sistemelor biologice. În cultură se menţin programele “pentru sine”. deci în sensul creşterii dezordinii lor şi al realizării echilibrului termodinamic. dezvoltare şi reproducere.Capitolul 1 CONSIDERAŢII GENERALE PRIVIND DOMENIUL DE STUDIU AL BIOLOGIEI CELULARE ŞI MOLECULARE 1. celula este considerată primul sistem biologic.

coloraţie vitală şi microvitală şi microcinematografie. Prin centrifugare diferenţială s-a realizat separarea componentelor citoplasmatice. la începutul secolului XX. Dezvoltarea impetuoasă a biochimiei.în care structurile şi funcţiile se îmbină armonios. Conexiunea inversă este obligatorie pentru orice sistem de autoreglare şi oferă posibilitatea sistemului să fie informat despre valoarea răspunsului. introducerea microscopul electronic (inventat în 1937. Dacă răspunsul nu corespunde necesităţilor sistemului. Datorită integralităţii sunt posibile funcţiile biologice fundamentale: metabolismul. ceea ce justifică denumirea actuală de biologie celulară şi moleculară. aduce descoperirea şi descifrarea oxidărilor celulare (Wieland. pe plan metodologic şi conceptual. se înregistrează progrese însemnate în studiul celulei. adaptarea. Hogeboom şi alţii în deceniul al V-lea. În ultimii 20 de ani s-a accentuat tendinţa de interpretare a tuturor proceselor celulare la nivel molecular. Această linie de cercetare a fost iniţiată în 1934 de Bensley şi Hoerr şi apoi dezvoltată cu succes de Claude. Warburg. descifrarea ultrastructurii celulei. a detaliilor fine de organizare submicroscopică. Integralitatea constă în faptul că un sistem nu se reduce la suma însuşirilor părţilor sale componente. Scurt istoric Începând cu secolul XX. un nou răspuns. care a devenit una dintre cele mai noi şi de perspectivă ramuri ale biologiei. Pentru ca răspunsul să fie corespunzător cu necesităţile sistemului. Ea concepe celula ca un adevărat microcosmos . Autoreglarea presupune existenţa a minimum două elemente: unul care comandă (centrul de comandă) şi unul efector. celula nu poate supravieţui după distrugerea mitocondriilor etc. Autonomia celulelor ce compun organismele pluricelulare nu este absolută şi se poate spune că sănătatea organismului depinde în mare măsură de sistemele de comunicaţie şi de mecanismele de coordonare dintre celule. pe care nu le au părţile lui componente luate izolat. cât şi sub raport conceptual. fiziologie celulară şi genetică moleculară. Aceasta a marcat şi trecerea de la citologia clasică la citologia modernă.1911). atât sub raport metodologic. Biologia celulară s-a conturat ca o disciplină nouă mai cu seamă în ultimii 50 de ani ca urmare a progreselor revoluţionare înregistrate în studiul celulei. reproducerea. astfel că funcţionarea sa se realizează cu o mare eficienţă. Printre progresele metodologice sunt de menţionat: introducerea tehnicii culturilor de ţesuturi “ în vitro “ (Harrison. Punctul de convergenţă între citologie şi biochimie îl constituie dezvoltarea tehnicilor biochimice de fracţionare a celulei prin centrifugare diferenţială. care permit studierea comportării celulelor prin microscopia cu contrast de fază. În acest fel s-au putut localiza precis anumite căi metasolice în celulă (de pildă ciclul Krebs. o nouă comparaţie. urmată de studiul ultrastructurii şi a proprietăţilor metabolice ale acestora. se dă o nouă comandă. 1909). ca orice sistem biologic. 14 . spre deosebire de legătura de la receptor la efector care poartă numele de conexiune directă.2. ulterior a culturilor de celule. microchirurgia (Kite. biochimie celulară. prezintă însuşiri structurale şi funcţionale noi. când s-a produs fuziunea dintre citologie. sistemul privit ca un întreg. 1908) şi se fac primele încercări de a le localiza în particule citoplasmatice. prin care se introduc micropipete fine în interiorul celulelor şi se studiază la microscopul optic proprietăţile fizico-chimice ale citoplasmei. posedă mecanisme de autoreglare de tipul celor descrise în cibernetică.Celula. activitatea acestui microcosmos este determinată şi reglată genetic. Nucleul sau citoplasma nu trăiesc izolate. menţinerea stabilităţii stării diferenţiate. 1. valoarea răspunsului trebuie comparată cu comanda. Răspunsul dat de efector trebuie comunicat receptorului pe o cale inversă conexiunea inversă (feed-back). 1903. dar utilizat în biologie după 1954) a dus la descoperirea unei noi lumi a organizării celulare. precum şi legăturilor de comunicare dintre ele. pentru a avea loc compararea cu comanda primită de efector.

Învăţământul disciplinelor microscopice apare la şcoala de medicină din Bucureşti în anul 1859. iar în Germania 36. lăsând să se întrevadă. citologie şi tehnică microscopică. Keith Porter şi alţii. cu metodologie complexă de cercetare. 1938). agricultură. când ia fiinţă o catedră independentă de histologie. Progresele ultrarapide ale biologiei moleculare au dus la dezvoltarea biotehnologiei moderne care se anunţă a deveni marea forţă industrială a secolului al XX -lea şi în care se pune speranţa că va reuşi să rezolve problemele cele mai spinoase ale societăţii omeneşti (alimentaţia şi starea de sănătate). fiziologie celulară. care predau histologia şi citologia până în anul 1897. laureaţi ai Premiului Nobel în 1974. deci a transmiterii informaţiei genetice şi a expresiei genei s-a născut biologia moleculară. Ştefan Besnea. pornind de la structurile nucleare s-a ajuns la interpretarea şi explicarea fenomenelor eredităţii. Gheorghe Marinescu ( 18631939). în curs de circa 100 de ani. La ora actuală. Cercetările de biologie moleculară au acumulat deja un bagaj de care au permis progrese uriaşe în diferite domenii. Pe de altă parte. industrie alimentară. noi perspective fascinante de cercetare (medicină. Pe plan internaţional se impun în mod cu totul deosebit. Victor Babeş (1854-1926) şi Ion Cantacuzino (1863-1934). a elucidării mecanismului replicării ADN. Ion Bruckner. printre primele de acest fel din Europa. Sub raport conceptual biologia celulară a rezultat din fuziunea disciplinelor de citologie. prin care se decelează anumite componente ale celulei (acizii nucleici. Prin anii ’60 exista deja o disciplină formată. Niculescu. 1. Japonia şi Germania. biochimie celulară. La această catedră. pentru viitor. George Palade. al cărui scop este interpretarea fenomenelor biologice la nivel molecular. Odată cu realizările excepţionale înregistrate în descifrarea structurii proteinelor şi acizilor nucleici prin folosirea în special a difracţiei cu raze X. Polizu şi Mihail Obedenaru. ducând la apariţia unei noi ramuri a ştiinţelor biologice şi anume biologia celulară. Aceste metode se pot utiliza la microscopul optic sau la microscopul electronic. T. Contribuţii româneşti în studiul celulei În secolul al XIX-lea s-a impus şcoala de microscopie de la Facultatea de medicină din Bucureşti (Diculescu şi colab. tot în aceste ţări s-a dezvoltat şi biotehnologia modernă. I.oxidările celulare şi sinteza de ATP în mitocondtii) şi s-au descoperit şi caracterizat noi organite celulare (lizozomii şi peroxizomii de către Christian de Dure). Încă din 1839 Nicolae Kretzulescu publică la Paris rezultatele cercetărilor sale asupra structurii microscopice a dinţilor şi a mediilor transparente ale globului ocular. care lucrează produse pentru laboratoarele de genetică şi biologie moleculară din întreaga lume. majoritatea cercetărilor şi descoperirilor epocale din biologia moleculară au fost făcute în SUA. De asemenea.. Studiul celulei a progresat şi în măsura perfecţionării tehnicilor de citochimie şi histochimie. glucide. proteine. în SUA există 1000 de firme specializate în probleme de biotehnologie. reprezentanţi de seamă ca: Mihail Petrini-Galaţi. Gh. în Japonia există 300 de firme. a biosintezei proteinelor. ecologie etc). genetică moleculară. reprezentat succesiv de Ludovic Fiala. După cum se ştie. s-au aprofundat aspectele funcţionale ca urmare a progreselor înregistrate în fiziologia celulară. după acela din Franţa. Introducerea microscopiei electronice şi a fracţionării celulei prin centrifugare sunt cele două tehnici majore care au revoluţionat studiul celulei. se succed. lipide) se localizează enzime în celulă sau în organite. Contribuţiile lui Gheorghe Marinescu în neurocitologie sunt sintetizate în cartea “Celulă nervoasă” (publicată la Paris în 15 .3. Dar progresele spectaculare în studiul celulei au continuat cu repeziciune şi în scurta vreme s-a înregistrat o nouă schimbare radicală. Christian de Duve. 1983). Un punct de referinţă la constituit citofotometria acizilor nucleici (Caspersson. ilustrată de savanţi de renume mondial dintre care Albert Claude. Alexandru Obredja.

Diculescu şi colaboratorii de la catedra de histologie şi citologie a Facultăţii de medicină din Bucureşti publică prima monografie de biologie celulară din literatura română (Diculescu şi colab. Se redactează cursuri litografiate pentru studenţii de la medicină (Benga. C. Institutul “Ştefan S.. Mureş. Chita la Craiova. Ion Cantacuzino. I. G.U. Aprecierile de “principal cartograf al celulei” sau “cel mai mare biolog al secolului XX” (Blobel. Victor Babeş (coautor împreună cu francezul A. Andreicuţ. S. Institutul de ştiinţe biologice. care s-au impus prin descoperiri legate de aparatul Golgi şi lucrări de citologie animală (Ionescu-Varo şi colab. O. primul român laureat al Premiului Nobel. A. conducând şcoala de histologie şi citologie de la Facultatea de medicină din Cluj a efectuat cercetări deosebit de valoroase privind rolul presiunii osmotice asupra diviziunii celulare. S. Popa. N. Sunt. lacrimile). V. cu posibilităţi de aplicare a fenomenului în terapie. dr. Dragomir). Voiculeţ). laboratorul de microscopie electronică ) şi de cercetare: Institutul “ Dr. I. Şcoala de citofiziologie a lui Ioan Athanasiu şi Ion Drăgoi de la facultăţile de ştiinţe naturale şi medicină veterinară din Bucureşti aduc valoroase contribuţii de citofiziologie musculară. precum şi asupra respiraţiei ovicitelor de mamifere. de microbiologie şi de medicină experimentală. H. Începând cu anul universitar 1978-1979 se introduce biologia celulară ca materie obligatorie în planul de învăţământ la facultăţile de medicină. aflat în legătură permanentă cu secţia de biologie celulară a Facultăţii de medicină din Yale. a descoperit factorul stimulator al secreţiei celulare în diferite lichide biologice (de exemplu. Începând cu anul 1969 M. de asemenea. Cantacuzino “ (microscopie electronică – dr. V. Pasteur” (microscopie electronică cu baleiaj – dr. pe lângă contribuţiile sale de imunologie comparată. Bucureşti ( microscopie electronică – dr. publicat la Paris în 1886) a descoperit peste 40 de microorganisme. 1981). biologie celulară – dr. I. Tiţu şi colab. Steopoe). N. Gancevici).) şi altele.1909) care a rămas mai multe decenii o carte de bază a domeniului. Încă din 1885 a prevăzut că între microorganisme se pot stabili relaţii antagoniste. Manolescu). dintre care se remarcă descoperirea tubilor transverşi din celulele musculare cardiace şi cele striate. 1971). Nicolau” (biologie moleculară – dr. Victor Babeş a mai descoperit corpii Babeş-Negri în neuron în turbare. 1980. Palade este 16 . unele constituind clasa Babesia (Babesiozele sunt cele mai răspândite parazite ale animalelor). Silvia Andreicuţ la Tg. 1983 ). Babeş ” (biologie celulară – dr. 1982) şi un manual unic ( Diculescu şi colab. concepţie confirmată ulterior prin antibiotice. 1981. disciplinele de profil fiind conduse de I. C. E. Diculescu la Bucureşti. Ionescu – Varo iniţiază la Facultatea de biologie din Bucureşti primele cursuri şi lucrări practice de biologie celulară. Diculescu şi colab. Petrovici. de menţionat laboratoarele de microscopie electronică şi biologie celulară şi moleculară din cadrul unor institute de învăţământ superior (Universitatea din ClujNapoca – dr. Învăţământul superior şi cercetarea ştiinţifică din România au depus eforturi de reorganizare în concordanţă cu evoluţia biologiei celulare în ultimele decenii. iar cea de la Cluj de către I. Institutul “L. În perioada dintre cele două războaie mondiale şcoala de citologie de la Facultatea de Ştiinţe naturale din Bucureşti este reprezentată strălucit de Dimitrie Voinov (şi continuată de Theodor Dornescu şi I. Cotrutz la Iaşi. Crăciun. Gh. 1980) sunt justificate nu numai de multiplele sale descoperiri. ci şi de orizonturile noi deschise în biologia celulară. Institutul “ Dr. Frăsinel la Timişoara şi Gh.A (profesor George Emil Palade). Cornil al primului tratat de microbiologie din lume. descoperirile de o valoare inestimabilă a lui G. Institutul Oncologic Bucureşti ( biologie moleculară – dr. În aceeaşi perioadă Ion Drăgoi. lucrări publicate încă înainte de primul război mondial. Merită subliniat în acest context.. Din 1979 a luat fiinţă “Institutul de Biologie şi Patologie Celulară” din Bucureşti. Antohi). publicând totodată şi primul manual de profil din ţară.. corpusculii Babeş-Erust în bacilul difteric. Benga la Cluj-Napoca. Palade. L. Scriban.

filozofică. Teoria biostructurală. Hooke (1665) observă că pluta este alcătuită din numeroase „cămăruţe”. Teoria cromozomială a eredităţii. ce i-a permis observarea pentru prima dată a multor structuri celulare) şi de centrifugare diferenţială ( a introdus zaharoza ca mediu de fracţionare). superior organizată (biostructura). până la maimuţă şi om. a elucidat calea secţiei celulare. La începutul secolului al XIX-lea. Observarea şi studiul diviziunii celulare de către mulţi autori. descoperă celulele libere şi identifică şi nucleul în eritrocite. Importanţa acestor noţiuni nu a fost înţeleasă decât mai târziu. ipoteză care afirmă că toate speciile de animale s-au transformat unele în altele. Teoria moleculară. printre care: Teoria celulară. epoca de invenţie a primelor microscoape. formă cu totul specială a materiei. dispunând de microscoape mai perfecţionate. pe care o trăim în prezent. exprimă această concepţie. ecologică şi în ultimă analiză. În aceeaşi perioadă Leuwenhoeck (1674). se desprinde ideea că toate fiinţele sunt alcătuite din celule şi din substanţe ce provin din activitatea lor. Principalele teorii care au condus la modul actual de gândire despre natura materiei vii Secolul al XIX-lea a reprezentat un salt în cunoaşterea organizării materiei vii. Biologia celulară şi moleculară reprezintă nu numai unul din cele mai dinamice domenii în care avansează frontierele cunoaşterii umane. Macovschi şi care consideră viul materie biostructurată. pe care le-a denumit „celule” (de la lat. 1. cu implicaţii de maximă importanţă economică. Teoria evoluţionistă. organelor şi a întregului organism. R. purtătoarea însuşirilor biologice pe care le imprimă viului şi care include materia moleculară. A descoperit ribozomii (numiţi şi “granulele lui Palade”) şi a precizat rolul lor în sinteza proteinelor. vegetal şi animal. mai afirmă că speciile de plante auevoluat de la forme unicelulare până la plantele cu flori şi că acest proces evolutiv s-a desfăşurat pe cale naturală. şi aici fiind un deschizător de drumuri. Puţin câte puţin. conduc pe Virchow (1855) să enunţe o nouă idee: omnis cellula e cellula (toate celulele provin dintr-o celulă preexistentă). care a stabilit că la baza structurii ţesuturilor. Teoria celulară La sfârşitul secolului al XVIII-lea. care consideră că viul este constituit din materia moleculară (ca şi neviul). cellula – cameră mică). de dată mai recentă (sec XX-lea) ce aparţine academicianului E. Schleiden (1838) şi apoi Schwann (1839). Acumularea de date şi cunoştinţe a permis şi fundamentarea unor teorii care au condus la modul actual de gândire despre natura materiei vii. 1. medicală. 17 . prin factori întâmplători.4. care reprezintă o sinteză fundamentală a cunoştinţelor despre celulă până la acea dată şi care este încă una dintre concepţiile de bază ale biologiei actuale.unul din pionierii elaborării tehnicilor de microscopie electronică (a pus la punct metoda de fixare şi secţionare ultrafină. de la primele vietăţi unicelulare.1. asemănătoare unor faguri de albine. a studiat biogeneza membranelor. numeroşi cercetători descriu celulele în diferite organisme vii. a descoperit transportul pe calea veziculelor prin endoteliul capilar şi reciclarea membranelor celulare.4. stă celula. ci şi pilonul fundamental ce stă la baza revoluţiei ştiinţifice. care consideră că la baza controlului şi transmiterii caracterelor ereditare stau cromozomii (şi în ultimul timp ADN). în miliarde de ani.

Studiul creşterii şi dezvoltării organismului. cum sunt cromozomii. ele funcţionează după aceleaşi legi şi sunt constituite din molecule. referitoare la generalizarea teoriei celulare. De la o generaţie la alta. Schneider (1878) adaugă termenul de cariochineză. Această substanţă reprezintă protoplasma (Purkinje. se ataşează de suprafaţa de secţiune şi se lasă întinsă asemănător unui mucus” (Dujardin. În urma acestei încrucişări s-a obţinut prima generaţie hibridă F1. Cel mai important factor ce poate influenţa rezultatele furnizate prin metoda analizei genetice îl constituie puritatea genetică a genitorilor. Celula conţine o substanţă „gelatinoasă. cât şi transmiterea lor de-a lungul generaţiilor. Celulele sunt organizate după un plan foarte general comun. 1. 1831). a reproducerii şi a fenomenelor de transmitere ereditară. în timpul căreia cromozomii se repartizează în mod egal între celulele-fiice. sunt în raport cu structura şi funcţia celulelor sale. Sub denumirea de „legea purităţii gameţilor ” sunt unite de fapt două legi sau două principii: a uniformităţii hibrizilor din prima generaţie şi cea a segregării.4. el nu a putut fi descifrat decât spre sfârşitul secolului XIX-lea şi începutul secolului al XX-lea. După A Lwoff (1962). 1875). Este cazul virusurilor care au o organizare foarte particulară. apoi Strasburger (1876) descoperă diviziunea indirectă în celulele vegetale..Fiecare celulă posedă un nucleu (Brown. insolubilă în apă. Această lege se bazează pe rezultatele unui experiment de monohibridare (indivizii încrucişaţi se deosebesc printr-o singură pereche de caractere ereditare) Mendel a încrucişat un soi de mazăre cu boabe de culoare galbenă (G) cu un alt soi ale cărui boabe erau verzi (v). 1876). dar de asemenea o unitate de funcţionare şi o unitate de compoziţie. Toţi hibrizii din F1 prezentau boabe de culoare galbenă. Descoperirile recente pot provoca unele dificultăţi. Meritul îi revine naturalistului ceh Gregor Mendel care elaborează (1866) două importante legi ale geneticii. care se contractă într-o masă globuloasă. bine conturate şi analiza descendenţilor obţinuţi. În cursul fecundării ovulului de către spermatozoid cei doi pronuclei fuzionează în oul fecundat (Hertwig. Totuşi. Indivizii folosiţi în încrucişări trebuie să manifeste o mare constanţă a caracterelor ereditare. sau moleculele ca cele de ADN (acid dezoxiribonucleic) preced structuri preexistente analoge. moştenind caracterul ereditar al unui singur genitor. Nu numai celulele. Un material biologic adecvat acestui scop este mazărea (Pisum sativum). cunoscute sub numele de legile lui Mendel. dar şi organitele. Principiul acestei metode constă în încrucişarea unor indivizi ai aceleaşi specii care se deosebesc între ei prin una sau mai multe caractere (trăsături) individuale. plantă folosită în experimentele efectuate de Mendel. Oul (celula-ou) dă naştere unui nou organism.2. Caracterul alternativ (culoare verde) nu a fost exprimat de nici unul din indivizii primei generaţii. 1835). a maladiilor sale. În scopul de a descifra mecanismele ce determină exprimarea anumitor caractere. Fleming (1880)o observă în celulele animale şi o numeşte mitoza. teoria celulară implică o unitate de plan de organizare. 1840). care cu toată marea lor diversitate. teoria celulară se evidenţiază ca fiind extrem de aplicabilă. care derivă tot dintr-un nucleu preexistent (Strasburger. Mendel utilizează metoda analizei genetice (hibridologică). Schneider (1873). Von Mohl. 18 . sunt constituite dintr-un număr foarte limitat de materiale. Teoria cromozomială a eredităţii Caracterul esenţial al unei celule vii constă în capacitatea de a transmite în mod ereditar trăsăturile sale de la o generaţie la alta. viaţa se caracterizează printr-o succesiune neîntreruptă de celule. Deşi fenomenul a fost remarcat cu foarte mult timp în urmă. ele au o continuitate genetică. diafană. Prima lege mendeliană este legea purităţii gameţilor.

Unii dintre aceştia prezentau caracterul dominant. cât şi genotipică. la hibrizii din F1. restul de două treimi manifestând o segregare similară generaţiei F2 (3 dominant : 1 recesiv) ♂ G GG gG g Gg gg Gameţi F1 ♀ G G Fig. În cazul experimentului de monohibridare se constată existenţa unei duble segregări. g = gena recesivă. nemanifestat i s-a atribuit termenul de recesiv. factorii se găsesc în pereche. în generaţia F2. Mendel şi-a extins cercetările şi asupra generaţiilor următoare.1. în timp ce alţii manifestau caracterul recesiv. Segregarea genotipică constă în redistribuirea factorilor în cupluri diferite. Diferenţiere caracterelor parentale la indivizii din a doua generaţie a fost numită segregare. Aceşti factori. Mendel a obţinut raportul de 3:1 între caracterul dominant şi cel recesiv (fig. Mendel explică rezultatele obţinute lansând ipoteza factorială care are drept suport presupunerea existenţei unor factori interni materiali ce stau la baza exprimării caracterelor ereditare. stabilit fiind de 1:2:1 (fig. În urma unui studiu statistic al segregării. atât fenotipică. Din plantele cu boabe galbene doar o treime exprimă constant caracterul ereditar. – Schema care reprezintă prima lege a lui Mendel ( legea purităţii gameţilor ). sunt cunoscuţi azi sun numele de gene (termen introdus în 1909 de către Wolhelm Johanerson). 19 . fiecare conţinând un factor dominant şi altul recesiv. F2. în timp ce caracterul alternativ. gameţii se combină în moduri diferite ceea ce explică fenomenul de segregare manifestat în F2. Caracterul ce se manifestă la descendenţii din prima generaţie a fost numit dominant. Din punct de vedere fenotipic (al aspectului exterior al individului). a două cupluri identice cu cele ale genitorilor şi altor două similare hibrizilor din F1. se constată formarea. numai a unuia dintre caracterele parentale alternative. raportul de segregare este de 3:1 (dominant/recesiv). G = gena dominantă. Factorii sunt transmişi descendenţilor prin intermediul gameţilor parentali (matern şi patern) ce conţin câte unul din factorii ce alcătuiesc cuplul(sunt puri din punct de vedere genetic). 2). Se poate observa că în generaţie F2 raportul fenotipului dominant şi cel recesiv este de 3/1. intuiţi de Mendel. Analizând diagrama lui Punnett. El a remarcat faptul că plantele cu boabe verzi au descendenţi identici. În toate organismele.Mendel introduce termenul de dominanţă pentru a definii fenomenul de exprimare. în a doua generaţie. Astfel de cupluri au primit ulterior numele de perechi alele. 1). În urma autopolenizării (sau încrucişării) hibrizilor din F1 s-a obţinut a doua generaţie de descendenţi . În urma fecundării.

Se disting. cât şi aspectul neted al boabelor sunt dominante asupra caracterelor alternative. Diagrama factorilor ereditari aleloformi în experimentul de monohibridare. două tipuri de organisme: homozigote (la care factorii ce alcătuiesc cuplul sunt identici) şi heterozigoze sau hibride (la care factorii ereditari pereche sunt diferiţi). în care manifestate erau doar caracterele dominante. F3 = generaţiile filiale (hibrizii). Mendel a încrucişat un soi de mazăre cu boabe galbene şi netede (GN) cu un alt soi cu boabe verzi şi zbârcite (vr) Experienţele preliminare au demonstrat că atât culoarea galbenă. astfel. 2. F2 . Studiul posibilităţilor de combinare a factorilor ereditari în cupluri stă la baza unei noi clasificări a organismelor. În urma încrucişării celor doi genitori s-a obţinut prima generaţie de descendenţi F1. Ea este fundamentată pe un experiment de dihibridare (genitorii se deosebesc între ei prin două perechi de caractere constante). 20 . F1. g = caracterul recesiv (culoarea verde). P = generaţie parentală. = genitorul parental masculin. Legea segregării (disjuncţiei) independente a perechilor de factori ereditari respectiv a perechilor de caractere este a doua lege elaborată de Mendel. = genitorul parental femel. G = caracterul dominant (culoarea galbenă).Fig.

se constată că fiecare pereche de caractere. Š 3 plante manifestau primul caracter dominant (boabe galbene şi zbârcite). Generaţia F1 este uniformă pentru caracterele dominante.3) Fig. Un părinte este homozigot pentru două gene dominante: GG care determină culoarea şi RR care determină forma. sunt numiţi recombinanţi. raportul de segregare fiind de 9:3:3:1 astfel: Š 9 plante prezentau ambele caractere dominante (boabe galbene şi netede). Š 1 plantă nu prezenta nici unul din caracterele dominate (boabe verzi şi zbârcite). Fecundarea produce un număr egal de 4 x 4 = 16 combinaţii prezentate în pătratele figurii (generaţia F2 ). 21 . Schema dihibridării şi a segregării factorilor în F1. segregă independent într-un raport de 3:1. cât şi exprimarea fenotipurilor noi se explică admiţând prezenţa în genomul hibrizilor din F1 a tuturor genelor parentale (fig. Aceste 16 combinaţii se găsesc în 4 clase de genitori. Cei şase (3+3) indivizi ce exprimă genotipuri noi. diferite de cele ale genotipurilor. Atât raportul se segregare fenotipică. Din modul de segregare a fiecărui caracter în parte.Cei 16 descendenţi din a doua generaţie F2 rezultaţi prin autopolenizarea (sau încrucişarea) hibrizilor din F1. se pot încadra în patru clase genotipice. Š 3 plante exprimau al doilea caracter dominant (boabe verzi şi netede). 3. reprezentând cea de-a doua lege a lui Mendel. Cel de-al doilea părinte este homozigot pentru alelele recesive gg şi rr.

viul este constituit din materie moleculară.4.1975). Acest lucru explică de ce gameţii rezultaţi în urma meiozei pot conţine orice combinaţie a factorilor ereditari parentali. între anii 1958-1976. demonstrând valabilitatea lui. Deci numărul factorilor ce segregă. (Bauley. Manta.4. are natură moleculară. S-a ajuns la convingerea că acest mod de gândire reflectă natura vie aşa cum este ea. cum sunt biologia moleculară. numite moleculare. W. Boveri (1904) ajung la concluzia că factorii ereditari (genele) sunt localizaţi în cromozomi. la nivel molecular va permite cunoaşterea vieţii. Teoria biostructurală a materiei vii Plecând de la unele deficienţe de ordin teoretic. Corelând datele genetice cu cele furnizate de citologie. vin în sprijinul actualului mod de gândire despre natura materiei vii. 1968. sinteza genelor şi altele. 1964). În timpul meiozei atât ataşarea cromozomilor de fibrele fusului de diviziune. hărţi genetice) teorie susţinută azi de informaţiile furnizate de biologia moleculară.S. genetica moleculară.Sutton (1903)şi T. analiza genetică. De aici abordarea tot mai frecventă a fenomenelor biologice în termeni moleculari. făcute la nivel molecular ca şi cele ce privesc codul genetic. oglindit în cercetare şi în programul de învăţământ. Datorită acestei situaţii cercetarea viului se orientează tot mai mult spre aspecte legate de structura chimică a substanţelor din organisme şi de interrelaţiile chimice şi fizice dintre moleculele acestor substanţe. natura materiei vii şi natura materiei moarte sunt calitativ identice (Haas.3. Orten. teorie publicată în diverse articole şi cărţi. Deci. experimental şi filosofic ale teoriei moleculare acad. moartea este consecinţa încetării metabolismului. a universalităţii legilor mendeliene a condus la concluzia că libera combinare a factorilor ereditari are loc numai când factorii ce determină exprimarea perechilor de caractere sunt localizaţi în perechi de cromozomi omologi diferiţi. Watson. Se mai consideră ca numeroasele descoperiri de mare importanţă pentru biologie. într-un heterozigot. mecanismul de biosinteză a proteinelor. 1974). Teoria moleculară a materiei vii Conform modului actual de gândire despre natura viului. explicându-se prin segregarea cromozomilor ce conţin genele în procesul de formare a celulelor sexuale (gametogeneza). conform modului actual de gândire. teorie preluată şi dusă la apogeu de Thomas Morgan (Drosophila melanogaster. a Teoriei cromozomiale a eredităţii. cât şi deplasarea lor spre polii celulei sunt fenomene ce se desfăşoară la întâmplare. Orice tip de celulă diploidă conţine cromozomi de provenienţă maternă şi paternă ce formează cupluri de cromozomi omologi. 1970. 1975. iar descifrarea fenomenelor biologice. român Eugen Macovschi elaborează o nouă teorie despre natura şi structura viului. Tamaş .4. 22 . Neuhaus. independent între ei. segregarea perechilor alele. 1960. însuşirile biologice sunt condiţionate de metabolism (Oparin. 1967. materia vie. în 1920. deci întru-totul realităţii. studiile citologice subliniau implicarea cromozomilor în procesul transmiterii ereditare a caracterelor. tendinţă de „chimizare” a diferitelor ramuri ale biologiei şi apariţia disciplinelor biologice noi. Astfel asistăm la un adevărat triumf al „molecularismului” în biologie. patologia moleculară şi chiar biochimia moleculară.Anterior experimentelor mendeliene. Corelaţia rezultatelor cercetării fenomenului ereditar s-a finalizat prin elaborarea. 1. autoreglarea şi coordonarea reacţiilor enzimatice. Watson 1974). din perspectiva citologică. poate fi cel mult egal cu numărul de perechi de cromozomi omologi prezenţi într-un organism dat. în totalitatea ei. Punerea în discuţie. cunoaşterea sistemelor vii (Karlson. 1.

bioritmice. totalitatea cărora constituie biostructurismul materiei vii. principalele idei deficiente ale teoriei moleculare sunt următoarele: . Modificările componentelor se deosebesc profund de transformările chimice obişnuite. specifică viului. 23 . integrându-se în biostructură. componentele materiei biostructurale nu se mai comportă ca molecule. şi consumuri de energie. natura şi funcţiile sale speciale. dar nu se arată cum anume se realizează această coordonare a reacţiilor chimice şi nu se indică modul cum. iar. Se ştie doar că încetarea manifestării unor însuşiri este condiţionată de transformarea materiei purtătoare a însuşirilor respective şi nicidecum de încetarea desfăşurării sau coordonării unor reacţii chimice. Conform teoriei biostructurale. cibernetice. iar datorită surplusului de energie ele exercită în cadrul materiei biostructurate anumite funcţii elementare (biologice. Părerea că odată cu moartea manifestarea însuşirilor biologice ale materiei vii încetează datorită încetării metabolismului este greu de înţeles. indiferent dacă sunt sau nu coordonate. . dar nici nu exclud. materia vie (viul) constă din materie biostructurală şi din materie moleculară coexistentă. are însuşiri de semiconductor şi de corp solid şi se comportă ca un sistem informaţional. 1969). cuantificabil. se reduc şi se deduc din fenomene şi legi chimice şi fizice. Prin acumulări. informaţionale etc.Materia biostructurală este alcătuită din componente. care printr-un schimb de energie. ale combinaţiilor chimice adecvate. în continuă dezvoltare. obişnuite. realizabil numai în condiţiile viului. manifestarea vieţii. vie şi moartă. Prin alcătuirea. Datorită stării speciale.În materia vie toate reacţiile chimice sunt coordonate şi constituie metabolismul. cibernetic.Materia vie şi materia moartă sunt calitativ identice. Se ştie doar că însuşirile sunt ale materiei şi depind de natura. prezintă particularităţi dependente de specie. care acţionează numai în viul. vârstă etc. nu pot fi înţelese şi cercetate de pe poziţiile chimice şi reprezintă modificări sau reacţii biostructurale. viaţa. ţesut. ca simple molecule. organ. Componentele materiei biostructurale se leagă prin anumite forţe corelative. din a căror însumare derivă fenomenele biologice. de la chimismul obişnuit coordonat. cedări. . Materia biostructurală este o formă cu totul specială a materiei.Fenomenele şi legile biologice derivă. materia biostructurală se prezintă ca un întreg continuu în care o modificare provocată în starea unei componente se transmite şi se repercutează asupra stării celorlalte. se ştie doar că formele materiei identice calitativ trebuie să aibă şi însuşiri de aceeaşi natură. Datorită acestor forţe şi stării speciale a componentelor. este purtătoarea însuşirilor biologice pe care le imprimă viului din care face parte. ce depăşeşte posibilităţile de înţelegere şi de investigaţie de pe poziţiile moleculare.Conform concepţiei lui Macovschi. purtător al bioplasmei şi programului genetic. ea se deosebeşte de materia moleculară obişnuită.) pe care nu le pot exercita atunci când se află în afara acestei materii. componentele pot suferi modificări care nu implică obligatoriu. individ. se ajunge la manifestările vieţii. prin alcătuirea sa specifică. . genetice. cvadridimensional. de calitatea ei şi nu sunt ale reacţiilor chimice care se desfăşoară în materie. dar nu se precizează cum se ajunge la încetarea metabolismului. care reflectă stadiul superior de dezvoltare şi organizare a materiei. fiind forma chimică de mişcare a materiei. au totuşi însuşiri atât de diferite.. manifestările însuşirilor biologice ale materiei vii se reduc la chimismul obişnuit este greu de înţeles. dar nu se explică de ce cele două forme ale materiei.Moartea este consecinţa încetării metabolismului adică a încetării coordonării reacţiilor chimice. Exercitarea funcţiilor duce la manifestarea anumitor microfenomene. manifestarea structurii chimice a componentelor respective. se încarcă cu energie şi trec într-o stare specială. biovalenţele. prin structură. materia biostructurală reprezintă o structură biologică dinamică. . dar nu explică în ce constă şi cum se realizează (Macovschi. Afirmaţia că fenomenele biologice. Acestea provin din molecule normale.

au preluat ideea şi au reuşit să o impună ca teorie oficială. Aici sunt de facut două precizări. Charles Darwin lansa o teorie care încerca să explice originea speciilor de plante şi animale altfel decât prin creaţie. dar că este rezultatul lucrarii directe a lui Dumnezeu. ceea ce duce nu numai la eliberarea unora din componentele ei sub formă de molecule.4. La rândul ei. raţionamentele evoluţioniste conţin erori de logică şi ştiinţa actuală respinge ipoteza evoluţiei. Astfel s-a ajuns ca în toate ţările guvernate de asemenea partide să se înveţe că omul se trage din maimuţă. Teoria biostructurală reprezintă un mod de gândire despre natura materiei vii care prezintă o serie de aspecte ipotetice. Iată care sunt în prezent concepţiile cu privire la originea vieţii şi a omului: Š Evoluţionismul ateist este ipoteza care afirmă că speciile de animale s-au transformat unele în altele. la toate nivele continuă să se predea teoria evoluţionistă. că ea a parcurs etapele prezenate de evoluţionismul ateist. Teoria evoluţionistă. ipoteza devine o erezie. deşi au trecut 18 ani de la căderea comunismului. nu a fost demonstrată niciodată şi au existat numeroase dicuţii chiar în timpul lui Darwin. fiind interesate mai ales de aspectul moral al problemei (dacă omul se trage din maimuţă. Aceste fragmente. În anul 1859 cercetătorul britanic. mai afirmă că speciile de plante au evoluat de la forma unicelulară până la plantele cu flori şi că acest proces evolutiv s-a desfăşurat pe cale naturală. contribuie atât la coordonarea biochimismului din materia moleculară coexistentă. cu aspect de membrane. Dar. atunci suntem liberi să ne purtăm ca animalele ). însă. inclusiv omu. Materia moleculară coexistă. mai întâi. cele două forme ale materiei.Odată cu moartea. Astfel. de la forme simple la forme mai complexe şi astfel ar fi luat naştere toate vieţuitoarele existente astăzi. dar care deschide noi căi de cercetare ce vor confirma. modifica sau chiar abandona unele dintre aceste aspecte. Din nefericire. originea vieţii şi a omului Pentru omul de cultură. Biochimismul care se desfăşoară în materia moleculară coexistentă furnizează energia necesară atât schimbării moleculelor în componente.Şi în şcolile din România. de la primele vietăţi unicelulare până la maimuţă şi om. cât şi la asigurarea compoziţiei chimice normale a acesteia. prin fenomenele care se desfăşoară la nivelul ei. ceea ce face ca o mulţime de oameni să nu dorească să-l discute. până în prezent. materia biostructurală. cea a lui Darwin. în mai multe miliarde de ani. Nimeni nu îşi pune problema originii omului decât din această unică perspectivă. speciile ar evolua în mod naural unele din altele. Conform acestei teorii. care includ enzime şi alţi compuşi chimici. despre care se afirmă că ar fi provenit dintr-o specie de maimuţă. mai mult. subiectul evoluţionismului este încă încărcat de reacţii emoţionale.Teoria susţine că Dumnezeu a creat doar două vietăţi unicelulare pe care le-a ajutat apoi să evolueze până la maimuţă şi om. nu există nici o dovadă a evoluţiei speciilor. 24 . Acestă teorie. ipoteza evoluţiei rămâca o simplă ipoteză. biostructurată şi moleculară coexistă şi formează acea unitate morfo-funcţională care constituie însăşi materia vie. dar şi la apariţia unor fragmente polinucleare mai mari sau mai mici. cât şi menţinerea integrităţii şi stării funcţionale normale a materiei biostructurale. formează materia nevie şi ca atare nu este purtătoarea însuşirilor biologice. dar participă la manifestarea acesteia în carul coexistenţei cu materia biostructurală. evoluţionismul a devenit o certitudine. nu preexistă ca atare în biostructură ci se formează ca artefacte pe măsura destrămării acesteia. dar unele partide politice. în momentul în care este inclusă în învăţătura de credinţă. prin factori întâmplători. biostructura se destramă.5. în miliarde de ani. 1. Š Evoluţionismul teist este ipoteza care afirmă că evoluţia speciilor este un fapt real. cât rămâne în domeniul ştiinţie.

amândouă ţin de credinţă şi filozofie. cercetător australian în domeniul biologiei moleculare. ci rămân exact cum au fost create. în anul 1985 a apărut cartea lui Michael Denton. prin care. nici creaţia. Referitor la fenomenul „evoluţiei” se acceptă un proces evolutiv numit microvoluţie. În ultimii ani. Unul dintre cei mai mari biologi. prin mutaţii genetice pot să apară populaţii. tot mai mulţi savanţi necreaţionişti au făcut cunoscut că teoria neodarwinistă (modelul evoluţionist actual).Din punctul de vedere al propriei discipline.1973) cu acest nimicitor rechizitoriu al evoluţiei darwiniste: „ Prin uzul şi abuzul unor postulate ascunse. Ar fi desigur prea mult să socotim că toţi aceştia se vor întoarce către „modelul creaţionist”. Realitatea arată că în cadrul speciilor pot apărea rase sau soiuri. Darwin's Black Box (Cutia neagră a lui Darwin). fost preşedinte al Academiei Franceze de Ştiinţe. Michael Behe. inclusiv omul.Lee Spetner. nu poate explica noile date din domeniul geologiei. ci oferă şi noi căi ştiinţifice de investigare a felului cum are loc variaţia în limitele genetice ale fiecărui fel de organism.” Începând cu anii optzeci. În anul 1996 apare cartea renumitului profesor de biochimie de la Berkeley University din California. al unor îndrăzneţe şi adesea neîntemeiate extrapolări. ce cred în mod sincer că acurateţea conceptelor fundamentale a fost demonstrată. geneticii. Ea prinde rădăcini în chiar miezul biologiei. biochimiei şi a altor ştiinţe. El arată nu numai de ce mutaţiile întâmplătoare nu vor produce niciodată schimbările pretinse de evoluţionişti. Grassé. Biofizician evreu. s-a creat o pseudo – ştiinţă. Unii caută un nou model. îşi încheie cartea sa Ľ Évolution du vivant (Evoluţia organismelor vii. fenomen ipotetic care încearcă să explice originea speciilor de plante şi animale conform teoriei lui Darwin. Denton arată că descoperirile specialiştilor în biologie moleculară aruncă din ce în ce mai multe îndoieli asupra pretenţiilor darwiniste. Piere P. făcând să rătăcească numeroşi biochimişti şi biologi. ce oferă o critică sistematică a modelului evoluţionist actual din perspectiva mai multor discipline ştiinţifice. ceea ce este departe de realitate. deşi nu prea ştiu unde să-l găsească. de o alegere iniţială. Š Creaţionismul ştiinţific este teoria ştiinţifică(bazată pe genetică. Din această imposibilitate rezultă că speciile au fost create de un Creator. Prin extensia acestui fenomen evolutiv – microevoluţie – desfăşurat la nivelul speciilor (care se pot încrucişa între ele) s-a ajuns la macroevoluţie. fizicii. întrucât. specializat în codul genetic. pe teoria probabilităţilor şi pe teoria informaţiei) ce demonstrează că este imposibil ca speciile să apară spontan (din întâmplare) şi să evolueze. Evolution: A Theory in Crisis (Evoluţia: criza unei teorii). au fost create de Dumnezeu. este doctrina conform căreia speciile nu suferă nici o schimbare. rase şi soiuri. astfel că până în prezent a apărut o mare cantitate de literatură ştiinţifică extrem de critică la adresa teoriei evoluţioniste. savanţi reputaţi au început să ridice serioase îndoieli asupra evoluţiei. teorie aflată în contradicţie cu creaţionismul. astronomiei. Spetner şi-a petrecut 30 de ani cercetând posibilitatea evoluţiei la nivel genetic. transformându-se una în alta. se pot încrucişa între ei dând naştere la urmaşi fertili). fără a depăşi graniţile speciei. paleontologiei. 25 .Š Creaţionismul fixist. darwiniste. nici evoluţia nu pot fi dovedite în chip definitiv: de fapt. în care se arată că uimitoarele descoperiri ale biochimiei nu se împacă deloc cu nici un fel de darwinism. rase şi soiuri noi de plante şi animale în cadrul aceleiaşi specii (indivizii deci. pornind de la populaţii. Astfel. care afirmă că speciile de plante şi animale. În 1997 o altă carte ce dădea de gândit a constituit o puternică lovitură împotriva darwinismului: Not By Chance !( Nu întâmplător !) de Dr.

ele fiind implicate în multiple procese: Š transportul molecular şi ionic transmembranar. datorită posibilităţilor de investigaţie oferite de microscopia electronică. Š desfăşurarea reacţiilor enzimatice asociate structurilor membranare. în această categorie încadrându-se: teaca de mielină. tip vezicule de condensare şi lipozomi). au putut fi evidenţiate şi studiate în detaliu un număr tot mai mare de structuri membranare (tip organite permanente celulare: reticul endoplasmatic. a reuşit să se contureze prin colaborarea interdisciplinară a unui număr foarte mare de specialişti în domeniul biologiei. medicinii. defineşte modul de organizare al lipidelor şi se comportă ca o barieră impenetrabilă pentru majoritatea moleculelor hidrofile (aqua-solubile). plasmalema) este o structură bidimensională continuă (grosimea 6-10 nm). Traversarea membranelor este condiţionată de: natura chimică şi organizarea moleculelor constitutive ale membranei. Membranele interne ale celulelor eucariote – endomembranele . proprietăţile fizico-chimice ale substanţei. o structură multimembranară derivată din membrana 26 .(grosimea 6 nm) compartimentează spaţiul intracelular. reticul endoplasmatic. asociate dublului strat lipidic. complex Golgi. asigură funcţionalitatea membranelor. mitocondrii.Capitolul 2 MEMBRANELE CELULARE O ramură aparte a biologiei moleculare – biomembranologia . Orice pătrundere din mediul exterior în interiorul organismului implică un schimb transmembranar.1. Š realizarea conexiunilor intercelulare şi a ancorării celulelor în matricea extracelulară. cât şi stabilirea unui anumit raport între principalele molecule componente conduc la clasificarea membranelor celulare în trei tipuri: Membrana citoplasmatică (membrana plasmatică. structura fizico-chimică a moleculelor mediului de o parte şi de cealaltă a membranei. aparat Golgi. separând-o de mediul înconjurător. cu proprietăţi caracteristice de permeabilitate selectivă. În cursul anilor 60. peroxizomi). delimitează organitele celulare (nucleu. lizozomi. Definiţia şi clasificarea membranelor celulare Membranele celulare reprezintă structuri complexe ce delimitează şi compartimentează conţinutul celular. 2. mitocondrii.a fost oficializată în anul 1977. substanţele exogene trebuie să traverseze una sau mai multe membrane biologice înainte de a ajunge la centrii activi. creând astfel spaţii adecvate reacţiilor enzimatice celulare. Prin urmare. Arhitectura tuturor membranelor celulare (membrana plasmatică şi membranele organitelor) prezintă drept caracteristică comună asamblarea prin legături necovalente a biomoleculelor componente (lipide şi proteine) într-o structură dinamică şi fluidă. Š imunitatea celulară. biofizicii. cu ocazia unui simpozion desfăşurat în Germania. dublul strat lipidic. cât şi structuri cu viaţă limitată. legarea şi transmiterea moleculelor-semnal. la Karlsruhe. biochimiei. ce conferă individualitate celulei. Proteinele membranare. Š controlul fluxului de informaţie dintre celulă şi mediul înconjurător prin recunoaşterea. Grefarea seturilor distincte de proteine în dublul strat lipidic. Membranele speciale prezintă particularităţi structurale. Elementul structural fundamental al membranelor celulare. Această nouă ramură a biologiei. care se ocupă cu studiul membranelor celulare. În 1950 erau descrise doar două membrane: cea plasmatică şi cea nucleară.

în confirmarea dublului strat lipidic ca element fundamental al structurii membranelor şi pe de altă parte. în definirea modului de asamblare a proteinelor în dublul strat lipidic. Fig. 3ergastoplasmă. 8centrosferă. 4. discurile suprapuse localizate în regiunea externă a celulelor fotoreceptoare din retină. 2endoplasma (hialoplasma).lipidele şi proteinele . d-pori în membrana nucleului. fibroblaşti. 5). 12-mitocondrii 2.plasmatică a celulelor Schwann ce înconjoară şi izolează axonul celulelor nervoase. Autorii concep membrana celulară ca pe un fluid structurat alcătuit dintr-un bistrat lipidic aflat într-o stare de cristal lichid şi care este penetrat local sau parţial de proteine globulare cu caracter insular (fig. c-membrana nucleului. 7-centrul celular. relativ libere prezintă mobilitate în planul membranei executând mişcări de difuziune şi rotaţie în jurul propriilor axe. Pe partea citoplasmatică membrana este susţinută (în numeroase cazuri) de o reţea de proteine fibrilare ce constituie un citoschelet. Structura inframicroscopică a celulei 1-membrana celulară. apa şi o serie de ioni. a-reţea endoplasmatică (membrane cu dublu contur). Elementele care l-au impus constau pe de o parte. Organizarea membranelor celulare În prezent se bucură de acceptare unanimă modelul în „mozaic fluid” lipido-proteic elaborat în 1971-1972 de către Singer şi Nicolson care satisface condiţiile de stabilitate termodinamică ale sistemelor membranare. 2. b-granulaţii fine (microzomi). 10-nucleol. 5-vacuolă. 9-nucleu. La componentele de bază ale membranelor . Lipidele şi proteinele membranare. 4-filamente intracelulare (descoperite în celule epiteliale. 27 . 11-aparatul Golgi.se adaugă constant carbohidraţii. 6-granule lipidice. în celule nervoase).

mediatori chimici. 28 . 1991) a şi b = proteine periferice de membrană. fiind înlocuite mai rapid (rapid turnover) sau mai puţin rapid (slow turnover).1. sinteza de membrane se face prin extensia membranelor preexistente (pattern-uri de membrană) în cursul procesului de multiplicare celulară (mitoza sau meioza). d = proteină de membrană (tip Ig): traversează bistratul lipidic Modelul „mozaicului fluid” oferă cadrul conceptual adecvat pentru explicarea atât a funcţiilor de transport. 5. Membranele biologice au structuri fluide dinamice în continuă modificare. În celula vie. toxine etc. în fiecare moment. le înzestrează cu capacitatea de a se îndrepta spre anumite ţinte. Structura unei membrane biologice (Stryr.Fig. Ribozomii şi reticulul endoplasmatic. 2. colesterolul şi glicolipidele reprezintă clasele de lipide cel mai frecvent întâlnite în structura membranelor biologice (tabelul 1). dar înalt solubile în solvenţi organici (cloroform). deşi funcţia respectivei proteine rămâne în permanenţă nemodificată. orientat spre faţa externă a membranei şi un strat intern. Din acest aspect reiese că orice tip de membrană biologică are o continuitate de organizare. proteinele şi lipidele din structura membranelor sunt înlocuite cu altele noi. dar nu şi continuitate de substanţă.). desfăşurarea normală a metabolismului celular. orientat spre faţa internă citoplasmatică a membranei.2. fosfolipidele. cât şi a plasticităţii conformaţionale a celulelor. a proceselor imunologice şi a efectelor produse asupra membranelor de diferiţi agenţi chimici (hormoni. Lipidele sunt molecule insolubile în apă. deoarece din stratul proteic sunt înlocuite în permanenţă un număr de molecule de aminoacizi vechi cu molecule noi corespunzătoare. care sintetizează aceste proteine de membrană. Caracterizarea componentelor lipidice ale membranelor celulare Lipidele membranare formează un dublu strat cu grosimea de 4-5 nm: un strat extern. când celula mamă transmite celor două celule fiice o dată cu zestrea celulară şi o anumită zestre de membrană. Într-un µm2 de dublu strat lipidic se găsesc 5 x 106 molecule lipidice. Deşi compoziţia lipidică a diferitelor membrane variază mult. Aceste aspecte de continuitate asigură de fapt continuitatea de funcţionare a celulei şi implicit. către anumite sedii celulare (transport vectorial). S-a dovedit că toate moleculele proteice din structurile de membrane vegetale sau animale au viaţă relativ scurtă. medicamente. Această moştenire a pattern-urilor de membrană de către celulele fiice de la celula mamă reprezintă un aspect al continuităţii în timp şi spaţiu a sistemului de membrane. c = proteină de membrană (tip lecitinic): traversează bistratul lipidic.

6. în acest fel asigurând fluiditate de membrană. iar coada hidrofobă este orientată spre interior. strat dublu linear (fig. deşi straturile sunt aproape fluide.şi glicolipide. condiţiile de viaţă etc. Straturile bilipidice sunt înalt impermeabile pentru ioni şi pentru cele mai multe molecule polare (cu excepţia apei. fig. 6c). Fig. rolul major avându-l forţa de interacţiune hidrofobă (interacţiune necovalentă).Tabelul 1. colesterolul aflându-se la extremitatea hidrofilă. 6a). 29 . strat dublu circular (lipozomi. cu atât fluiditatea structurilor membranare este mai mare. conţin un cap hidrofilic. Acizii graşi pot fi saturaţi sau nesaturaţi. Cu cât gradul de nesaturare al acizilor este mai mare. o moleculă necesită o cantitate foarte mare de energie. Pentru traversarea stratului bilipidic. lipsită de sarcini electrice şi cu o mare varietate de structură care se datorează unor acizi graşi deosebiţi. care traversează foarte rapid această membrană). lipidele. Moleculele de lipide se deplasează foarte rapid rotindu-se în jurul propriului lor ax şi difuzând lateral. Fluiditatea este asigurată de prezenţa acizilor graşi şi a colesterolului. formată din 12-24 atomi de carbon. Aceste lipide de membrană sunt amfipatice. prevenind scăderea fluidităţii membranelor. Procesul de formare a acestui bistrat lipidic în mediu apos este un proces de autoasamblare. care are o varietate de structură relativ mică şi poartă sarcini electrice şi o coadă hidrofobă. proporţia fosfolipide/colesterol în membrana plasmatică este de 1/1. La eucariote. Procent din greutatea moleculară totală a lipidelor membranare Membrana plasmatică a celulei hepatice (%) 17 54 7 22 Membrana plasmatică a eritrocitului (%) 23 60 3 13 Teaca de mielină (%) 22 42 28 8 Membrana externă şi internă a mitocondriei (%) 3 76 urme 21 Membrana reticulului endoplasmatic (%) 6 67 urme 27 Lipide Colesterol Fosfolipide Glicolipide Alte lipide Bistraturile lipidice membranare sunt formate din fosfo. în mediu lichid. Datorită acestui caracter amfipatic. 6b). Cele trei forme pe care le pot lua moleculele de lipide în mediu lichid datorită proprietăţilor lor amfipatice În acest strat dublu. vârsta. capul hidrofilic este orientat spre exterior. ele reprezentând bariere de permeabilitate pentru moleculele hidrosolubile. pot forma: micelii (fig. bistratificat. ei diferă cantitativ şi calitativ în raport cu specia.

Proteinele sunt amfipatice. iar proteinele din membrana internă a mitocondriilor şi cloroplastelor au rol de transductori de energie. proteinele de membrană conţin predominant regiuni hidrofobe cu structură secundară tip α-helix şi structuri terţiare şi cvaternare compacte. cât şi liberă deplasare a lipidelor şi proteinelor în structurile membranare. Este un proces foarte lent. Pe baza datelor prezentate se poate considera că atât fluiditatea dublului strat lipidic. urmărite prin tehnica de rezonanţă magnetică). În acest fel cele două suprafeţe de membrană diferă între ele prin cantitatea de lipide şi proteine. numindu-se proteine integrale sau intrinseci (tip Ig). proteinele din membrana plasmatică au rol de pompe în transportul transmembranar. Membranele care îndeplinesc funcţii diferite conţin în structura lor şi proteine diferite. acestea pătrund adânc sau chiar traversează stratul de lipide al membranei. proteinele mediază aproape toate funcţiile. 2. antigene de membrană. de exemplu.2. O moleculă lipidică poate călători de la un capăt la altul al celulei bacteriene în timp de o secundă. Proteinele integrale (intrinseci) interacţionează strâns cu hidrocarbonaţii din lipidele de membrană şi nu pot fi disociate decât în prezenţa detergenţilor şi a solvenţilor organici. iar altele pot fi ataşate doar covalent (adsorbite) la extremitatea polară hidrofilă a lipidelor şi se numesc periferice sau extrinseci.2. Unele proteine de membrană difuzează în timp de un minut la distanţă de câţiva microni. ceea ce face ca o membrană biologică să nu fie o structură rigidă. Se produce o rotaţie la câteva ore (de exemplu. 30 . alte proteine (rodopsina) sunt la fel de mobile ca şi lipidele. cu rol în contracţia musculară). Componenta proteică a membranelor celulare În stratul lipidic plutesc proteine rigide hidrofobe. enzime. Proteinele reprezintă 50% din volumul de membrană. spectrina. receptori. realizând o asimetrie funcţională. altele pot fi implantate la nivelul unui singur strat din cele două ale membranei lipidice (tip lecitinic). fosfolipide. altele sunt virtual imobile (fibronectina). adică rotaţie spontană a moleculei lipidice de pe o faţă a membranei pe cealaltă.2. rămânând fixe în plan orizontal (formând agregate care se ancorează de alte structuri ale citosolului sau de proteine din membranele celulare vecine). În regiunea transmembranară.mişcare paralelă cu planul bistratului (difuziune în planul membranei) sau transversă (tip fleep . conţinând o regiune hidrofobă care reacţionează cu regiunea hidrofilă lipidică (din interiorul stratului lipidic) şi o regiune hidrofilă situată la suprafaţa internă şi respectiv externă a membranei. Proteinele periferice (extrinseci) pot fi eliberate prin simpla spălare cu soluţii saline sau prin modificări de pH (de exemplu. Proteinele pot fi inserate în dublul strat lipidic în diferite moduri. Lipidele prezintă difuziune laterală . sau actina.2. localizată pe suprafaţa citoplasmei eritrocitelor. Proteinele de membrană pot forma pete difuze. se pot deplasa spre polii celulei unde sunt eliminate sau pot fi blocate în mişcarea lor laterală.flop). având o mişcare laterală constantă. constituie principalele elemente ce stau la baza caracterului dinamic al membranelor celulare. lipsa difuziei transverse face posibilă păstrarea timp îndelungat a asimetriei de membrană. Proteinele prezintă numai difuziune laterală.3. În timp ce lipidele au rol de barieră de permeabilitate şi de delimitare a componentelor biologice. Mobilitatea lipidelor şi proteinelor de membrană Lipidele şi proteinele de membrană difuzează rapid în planul membranar.

în cazul celulelor animale. În plus. Structurile de glicoproteine au funcţie de receptori. de multiplicare. cât şi glicoproteine sintetizate de celulă şi apoi absorbite pe suprafaţa celulară (Fig. Prezentarea schematică a glicocalixului 31 . 2.5. Glicocalixul Suprafaţa celulară este alcătuită din trei elemente: cortexul celular (zona periferică citoplasmei). 7. distribuţia sarcinilor electrice pe suprafaţa celulei. 7). Zaharurile sunt foarte hidrolitice. Proteina din structura proteoglicanilor traversează dublul strat lipidic.2. Faptul că cele două componente ale glicocalixului sunt în acelaşi timp şi elemente ale matricei extracelulare face dificilă stabilirea unei linii clare de demarcaţie între suprafaţa celulară şi matrice. Rolul glicocalixului nu este pe deplin elucidat. Glicocalixul reprezintă zona periferică a suprafeţei celulei animale. De asemenea. Carbohidraţii se întâlnesc şi în structura proteoglicanilor. glicocalixul poate funcţiona ca depozit de cationi (Ca2+) ce sunt mobilizaţi în celulă în funcţie de necesităţile exprimate la un moment dat. Concentraţia mare de oligozaharide complexe la suprafaţa celulară poate sprijini ipoteza implicării acestei structuri în procese de recunoaştere celulă-celulă sau celulă-matrice. majoritatea lanţurilor oligozaharidice conţin unul sau mai multe reziduuri de acid sialic. constituind parte componentă a matrixului extracelular. Componenta glucidică membranară Carbohidraţii se întâlnesc pe suprafaţa tuturor membranelor plasmatice ale celulelor eucariote şi reprezintă 2-10% din greutatea componentelor membranare. molecule membranare integrale alcătuite din lanţuri polizaharidice lungi legate de un miez proteic. deoarece orientarea inversă ar cere un consum foarte mare de energie. Fig.2. ele preferă să se orienteze spre suprafaţa apoasă a membranei (şi nu spre miezul hidrofob). ele primesc informaţia din mediul extern şi o transmit spre interiorul celulei sub forma unor cascade de reacţii biochimice.4.2. glicolipidele. datorită încărcării electrice negative. membrana plasmatică şi glicocalixul. care au drept consecinţă modificări ale activităţii celulare (activitatea secretorie.şi poliglucidice ale glicolipidelor şi glioproteinelor membranare. Hidrocarbonaţii de pe suprafaţa celulară au o mare densitate de structură şi au rol în recunoaşterea intercelulară (faţă de celulele sistemului imunitar). Glicocalixul realizează deci. În structura sa intră atât lanţurile oligo. Dacă majoritate proteinelor aflate pe suprafaţa celulară sunt glicoproteine. numai una din 10 molecule lipidice ale monostratului extern conţine carbohidraţi. sub forma oligo. deci absenţa respectivei cantităţi de energie reprezintă o barieră puternică în calea rotirii de tip fleep-flop a moleculei de hidrocarbonat.şi polizaharidelor se leagă covalent de proteine şi lipide formând glicoproteinele şi respectiv. etc). moleculă cu sarcină electrică negativă. Carbohidraţii. în timp ce lanţurile polizaharidice rămân în afara celulei.

structural asemănătoare gheţii (apa legată chimic). Moleculele proteice transmembranare ce conţin cisteină cunosc şi ele o orientare strictă. Asimetria distribuţiei componentelor membranare Imaginea membranei celulare ca o „soluţie lipidică” în care plutesc moleculele proteice pare astăzi simplistă. aparat Golgi) ele se găsesc pe faţa citoplasmatică. grupările sulfhidril ale cisteinei formează punţi disulfurice inter şi/sau intra-catenare. distribuţia asimetrică a lipidelor şi proteinelor conduce la delimitarea unor domenii specifice în membranele plasmatice. 32 . Localizarea glicolipidelor în monostratul extern al membranelor plasmatice. ea se referă şi la gradul de nesaturare a lanţurilor hidrocarbonate. Mai mult. fie sub formă foarte ordonată. În membranele plasmatice lanţurile oligozaharidice marchează faţa exoplasmatică. toate proteinele membranare integrale au o orientare strictă în raport cu faţa citoplasmatică şi cea externă a membranei celulare. intervenind în stabilitatea structurilor proteice şi fosfolipidice bistratificate. Implicaţiile asimetriei lipidelor la nivel funcţional nu sunt încă pe deplin cunoscute. proteinele transmembranare sunt în majoritate molecule glicolizate. 2. Distribuţia asimetrică a compartimentului lipidic pe cele două feţe ale dublului strat lipidic a fost pusă în evidenţă pentru prima dată în membranele eritrocitelor.6. Este posibil ca activitatea diferitelor proteine membranare să fie dependentă de microclimatul creat prin prezenţa fosfolipidelor specifice. Acest lucru se realizează prin intermediul joncţiunilor strânse ce funcţionează ca o barieră între cele două domenii membranare. Apa Apa deţine un loc important în structura membranară alături de celelalte componente chimice. În acelaşi timp. doar pe faţă externă a membranei. stratul intern conţine fosfotidiletanolamina şi fosfatidilserina drept componente lipidice majore. În plus. în planul membranei.2. cât şi caracterul lor special sugerează implicarea acestor molecule ca receptori în procesele de comunicare intercelulară. În anumite celule. De asemenea. activitatea enzimatică a proteinelor asociate structurilor membranare poate fi condiţionată de sarcina electrică a fosfolipidelor. Astfel. celulele epiteliale sunt capabile să împiedice difuzia moleculelor membranare. este localizat în monostratul intern al membranei eritrocitare. În acest context este de remarcat faptul că există şi o distribuţie asimetrică a sarcinilor electrice. Se găseşte în proporţie de 30-50 % asociată intim fie structurilor de la suprafaţă. membrana celulelor epiteliale este împărţită în domenii distincte: apical şi latero-bazal. apa joacă un rol precumpănitor în procesele de organizare moleculară a membranei. În multe celule proteinele şi lipidele sunt menţinute în regiuni bine delimitate ale membranelor. Modificările de permeabilitate determinate de procesul de excitaţie poate fi consecinţa „topirii” structurii hidrice în anumite regiuni.2. ca un liant. Ca urmare. Singurul fosfolipid cu sarcină electrică negativă. în membranele organitelor celulare (reticul endoplasmatic. Stricta orientare a glicoproteinelor este corelată cu funcţiile celor două feţe ale membranelor celulare. ceea ce. în timp ce. Deosebirile dintre aceste lipide nu se limitează doar la natura grupărilor polare.2. Permeabilitatea selectivă poate fi privită ca fiind în raport cu apa structuralizată din membrană. ambele având un conţinut proteic şi lipidic diferit. Distribuţia asimetrică a moleculelor membranare joacă un rol esenţial în realizarea funcţiilor celulare.7. fosfatidilserina. în timp ce în monostratul extern al membranei predomină fosfatidilcolina şi sfingomielina. determină o fluiditate diferită a celor două straturi lipidice. Astfel. Într-o astfel de stare.

din punct de vedere termodinamic. porţiunea b). În paralel cu asigurarea continuităţii acestor schimburi. Prin urmare. la baza noţiunii de permeabilitate selectivă stă conceptul de membrană ca barieră a schimburilor celulare. porţiunea c). ƒ continuarea difuziei în startul hidrofob nu reclamă energie de activare suplimentară pentru că trebuie să se desfacă legături de hidrogen (fig.1. este un sistem deschis. hormoni).3. 8. Selectivitatea diferenţiată se manifestă atât la trecerea substanţelor din exterior în celulă. lipide) şi eliminarea atât a produşilor fiziologic activi (enzime. permeabilitatea selectivă. metaboliţi şi electroliţi. permite continuarea mişcării libere a moleculei. un rol major revine membranei plasmatice datorită caracteristicii sale fundamentale.2. 8): ƒ molecula trebuie să avanseze în zona apoasă (mediu şi zona periferică a membranei). variază şi intensitatea energiei necesare pentru intrarea moleculei în stratul hidrofob. 33 . Traficul de substanţe ce se desfăşoară atât prin membrana plasmatică cât şi prin membranele interne ce delimitează organitele celulare antrenează diferite mecanisme de transport. atât prin menţinerea în spaţiul intracelular a unei concentraţii relativ constante de substanţe organice. molecula părăseşte stratul hidrofob (fig. cât şi a celor rezultaţi ca „deşeuri” în urma metabolismului celular (CO2. ceea ce se realizează după legile difuziei simple în mediu apos. 8. Această caracteristică a membranelor celulare prezintă particularităţi în raport cu diferenţierea funcţională a celulelor. cât şi în sens invers. 2. Aceasta face posibilă alimentarea celulei cu molecule esenţiale (glucoză. ƒ în fine. Agitaţia termică a moleculelor asigură moleculei energia de activare necesară ruperii unor legături de hidrogen. porţiunea a). în citoplasmă (fig. porţiunea d). În momentul când molecula atinge stratul hidrofil al membranei. fenomen facilitat de formarea legăturilor de hidrogen cu moleculele de apă din stratul membranar proteic hidrofil interior. Abordând această problemă din perspectiva schimbului de substanţe pe care celula îl realizează cu mediul extern. ƒ în etapa următoare. 3. de unde trece prin acelaşi fenomen. existenţa sa fiind condiţionată de stabilirea unei permanente comunicări cu mediul înconjurător. Mecanismele de transport prin membranele celulare Celula. Permeabilitatea selectivă se modifică dinamic aflându-se sub influenţa modificărilor mediului extracelular şi a metabolismului celulei. cu refacerea lor spontană şi imediată. traversarea stratului exterior hidrofil se realizează fără consum de energie (fig. molecula trebuie să se desprindă de stratul hidrofil şi să treacă în stratul lipofil. permeabilitatea selectivă creează cadrul favorabil desfăşurării unei activităţi metabolice stabile. Fiecare moleculă formează legături de hidrogen cu apa din interiorul celulei. Procesul calitativ al traversării membranelor Se consideră că au loc următoarele etape (fig. porţiunea e). uree). acesta având conţinut de apă apropiat de cel al mediului. 8. Deci. cât şi prin reglarea volumului celular ca rezultat al relaţiilor osmotice celulă-mediu. 8. aminoacizi. ƒ În raport cu caracteristicile moleculare. săruri de amoniu. ceea ce necesită o energie de activare moleculară (fig. 8.

care asigură trecerea moleculelor mici hidrosolubile. când particulele de substanţă sunt înglobate de membrana celulară prin mişcări de invaginare şi transfer astfel spre interior. Unele gaze (O2. Se descriu următoarele posibilităţi de traversare a unei membrane: ƒ proces pasiv: transfer pasiv. prin simpla filtrare prin pori (filtrarea) şi a moleculelor mari liposolubile prin dizolvare în membrană (difuzia simplă). grad de hidratare (grad de ionizare) iar pe de altă parte. 3 . Ca2+) nu poate fi realizat în aceeaşi manieră. Astfel.3.Transportul pasiv Traversarea membranelor celulare de către molecule şi ioni în sensul gradientului de concentraţie sau electrochimic (compus din gradientul de concentraţie şi gradientul electric) poartă numele de transport pasiv. CO2) şi unele molecule mici cu caracter hidrofob sunt capabile să străbată dublul strat lipidic membranar prin difuziune simplă. Viteza cu care se desfăşoară etapa trecerii moleculelor din mediul apos extracelular/intracelular în interiorul hidrofob al membranei este dependentă de coeficientul de partiţie (K) al moleculei. el decurge cu pierdere de energie liberă. Modificările energetice care însoţesc traversarea unei molecule hidrosolubile printr-o membrană biologică (după Maziliak). Transportul moleculelor solubile în apă (glucoză. ilustrând gradul de hidrofobicitate al moleculei.Fig. Un alt criteriu de clasificare este consumul de energie metabolică sub formă de ATP. 8. Principalul criteriu de clasificare a tipurilor de transport îl reprezintă dimensiunile substanţelor ce străbat membrana. Se constată existenţa unei relaţii de directă proporţionalitate între coeficientul de partiţie al unei molecule şi 34 . Din acest punct de vedere se disting două tipuri de transport: pasiv şi activ. fie facilitat. 2. formă. amonoacizi) şi al unor ioni (H+. ƒ proces biochimic: transport specializat. de compoziţia chimică a membranelor.1. deci este mai liposolubilă şi pătrunde mai repede în celulă. Difuzia simplă Cel mai simplu tip de transport pasiv constă în difuzia fizică a moleculelor determinată de gradientul lor de concentraţie sau electrochimic. K+. Acest tip de transport este denumit difuziune facilitată. În difuzia simplă moleculele nu sunt modificate chimic sau asociate altor specii moleculare în timpul trecerii lor prin membrană. Na+. cu atât molecula are un mai pronunţat caracter hidrofob. dimpotrivă. necesitând participarea unor proteine membranare specifice. Astfel. în timp ce ionii şi moleculele mici traversează dublul strat lipidic prin difuziune sau implicând proteinele membranare.2. cu cât valoarea sa este mai mare. a.2. dimensiuni. nucleotide. 2. Procesul nu implică consum de energie (ATP). inclusiv apa. transportul macromoleculelor şi al particulelor necesită sechestrarea lor în vezicule delimitate de membrane. Transportul ionilor şi moleculelor mici prin membranele celulare Maniera în care substanţele trec prin membranele celulare este determinată pe de o parte de caracteristicile substanţelor (greutate moleculară. fie activ. Acesta măsoară afinitatea relativă a moleculei pentru mediul lipidic în raport cu apa. ƒ proces biologic: endocitoză.

viteza de difuziune a unei molecule prin membrană conform legii lui Fick este: unde: S . disociindu-se pe cealaltă faţă a membranei cu eliberarea moleculei transportate.1M (la 250C) sistemul pierde o energie liberă de 1. de la o concentraţie de 1M la o concentraţie de 0.constanta de permeabilitate (P) a membranei celulare. Calculele termodinamice demonstrează că la deplasarea unui mol de substanţă fără sarcină electrică. iar rotirea unei molecule proteice în planul membranei este defavorizată din punct de vedere energetic. procesul fiind exclusiv determinat de gradientul electrochimic. Cea mai bine caracterizată permează. În difuzia moleculelor încărcate electric legea lui Fick nu mai are aplicabilitate. catalizează difuzia facilitată a glucozei prin membrana eritrocitelor (Fig. formează porii membranari. În cazul transportului prin difuzie simplă a moleculelor fără sarcini electrice. Are o greutate moleculară de 45. suprafaţa (S) şi coeficientul de permeabilitate (P). modelul „carrier” rămâne aplicabil numai pentru transportul anumitor ioni de către polipeptide antibiotice (de exemplu. Deoarece difuzia facilitată este un tip de transport pasiv.359 kcal/mol. Permeaza leagă reversibil şi complementar la un situs activ o singură specie moleculară sau molecule aparţinând unei singure familii. 9. transportul pasiv al moleculelor prin membrană este mediat de proteine membranare numite permeaze. D-glucopermeaza este o proteină transmembranară alcătuită de 12 α-helixuri care au în majoritate un caracter hidrofob. străbătute de un canal delimitat de aminoacizi hidrofili. se respectă legea lui Fick. Proteinele canal specializate în transportul selectiv al diferitelor specii ionice se 35 . Deci. Aceasta enunţă că viteza de difuziune (dn/dt) a unei molecule este proporţională cu diferenţa de concentraţie. viteza de difuziune a moleculei prin interiorul membranei este mult inferioară vitezei sale de difuziune printr-un mediu apos. b. Difuzia simplă prin membranele celulare se realizează cu pierdere de energie liberă. transportul ionului de K+ de către valinomicină). Spre deosebire de difuzia simplă. C2aq . 6). În acest model se consideră că transportorul exercită o mişcare de navetare sau rotaţie în dublul strat lipidic.sunt concentraţiile mediilor apoase separate de membrana celulară. D-gluco-permează (sau D-hexozo-permează). Datorită vâscozităţii dublului strat lipidic. permeabilitatea selectivă a membranelor plasmatice poate fi explicită prin existenţa proteinelor canal. Mecanismul transportului mediat de Dgluco-permează În parte. (dn/dt)= PxS (C1aq – C2aq) Fig.000 Da. Difuzia facilitată În procesul de difuziune facilitată. difuzia facilitată se caracterizează prin specificitate faţă de molecula transportată. fiind astfel capabil să treacă molecula transportată de pe o faţă pe alta a membranei celulare. În urma legăturii ce are loc pe o faţă a membranei se formează un complex moleculă-permează ce traversează dublul strat lipidic. Unul din modelele care au încercat să explice maniera în care se desfăşoară difuzia facilitată este modelul transportorilor cărăuşi (carrier model). Aceste proteine transmembranare.reprezintă suprafaţa membranei P este coeficientul de permeabilitate al membranei. C1aq.

11.starea activată Fig. caracteristică ce a sugerat denumirea lor de proteine canal cu poartă (gate channels). proteină de legare a GTP) (Fig.3. 10.proteină canal de Na+ cu poartă comandată de ligand. Schema joncţiunii neuromusculare şi principalele proteine canal de ioni implicate de declanşarea contracţiei musculare sub acţiunea impulsului nervos. Proteinele canal de ioni se deschid tranzitoriu. În acest caz canalele se deschid în urma legării la un receptor a unei molecule semnal ce poate fi un mediator extracelular (neurotransmiţător) sau un mediator intracelular (ion. În funcţie de factorii ce comandă deschiderea porţilor. Structura canalului de Na+ cu poartă comandată de voltaj 2. 11). ionii difuzând cu viteze diferite prin membrană în sensul gradientelor de concentraţie. ƒ cu poartă comandată de liganzi. A Fig. B Fig. A . implicit. dispariţia potenţialului 36 . ƒ cu poartă comandată de voltaj (dependente de valoarea potenţialului de membrană) (Fig. Modificarea conformaţională a receptorului acetilcolinic .2.starea de repaus. 12. deschiderea canalelor reprezintă un răspuns celular la diferite semnale recepţionate de membrana plasmatică.2. 12). se deosebesc trei tipuri de proteine canal: ƒ cu poartă comandată de stimuli mecanici.numesc proteine canal de ioni. nucleotid. Transportul mediat de aceste proteine nu necesită consum de energie. 10. Transportul activ Deplasarea moleculelor şi ionilor prin transport pasiv evoluează spre egalarea concentraţiilor de o parte şi de alta a membranei şi. B . De regulă.

Na -K+-ATP-aza (pompa de Na+-K+) prezentă în membranele plasmatice ale tuturor celulelor animale este unul dintre cele mai studiate sisteme de transport activ. mediat de Ca2+ATP-aza. Ultimul constituient al ATP-azelor P transportă ionii de H+. Al doilea tip de transport activ poartă numele de cotransport. Acest tip de transport este mediat de proteine specifice şi prezintă toate caracteristicile cinetice ale difuziei facilitate. 13). În funcţie de modul în care este utilizată energia se deosebesc două tipuri de transport activ. În transportul activ propriu-zis. Funcţionarea Na+-K+-ATP-aza asigură menţinerea unei concentraţii intracelulare relativ ridicată a ionilor de K+ ce condiţionează desfăşurarea normală a unor procese celulare vitale cum sunt: biosinteza proteică. este esenţial în procesul de contracţie – relaxare musculară. Plusul de independenţă faţă de compoziţia mediului înconjurător. este posibilă formarea unor canale în proteina transportoare ce permite trecerea ionilor de Na+ şi K+ prin membrana plasmatică. activitatea catalitică a unor enzime (piruvat-kinaza) şi menţinerea potenţialului de membrană a celulelor excitabile. pe care transportul activ îl oferă celulei. Clasa ATP-azelor P conţine trei reprezentanţi. Proteina numită calmodulină este alcătuită dintr-un singur lanţ polipeptidic şi are o funcţie reglatoare modificând viteza de pompare a ionilor de Ca2+ în raport cu concentraţia citosolică a acestora. în timp ce înlăturarea ionilor din citosol permite relaxarea musculară. implică consum de energie metabolică. 37 . Na+ K+-ATP-aza pompează Na+ în mediul extracelular şi introduce K+ cu sarcină în celulă. clasa ATP-azelor F. Mecanismul de acţiune Na+-K+-ATP-aza.membranar. molecula transportoare are funcţie ATP-azică. Pompele ionice Se cunosc trei clase de proteine ce cuplează direct transportul ionilor împotriva gradietelor lor electrochimice cu desfacerea legăturilor fosfodiesterice din molecula de ATP şi formarea de ADP (adenozin difosfat) şi fosfor anorganic (P): clasa ATP-azelor P. a. Astfel. Traficul Ca2+ prin membrana reticulului sarcoplasmic în celulele musculare. În celulele musculare enzima este prezentă în membrana reticulului sarcoplasmic. În cadrul acestui transport moleculele şi ionii sunt deplasaţi împotriva gradientelor lor de concentraţie pe seama energiei eliberate în transportul pasiv al altor molecule şi ioni. fiind implicată în transportul ionilor de Ca2+ din citosol în acest organit celular. Este localizată în membranele plasmatice asigurând menţinerea unei concentraţii intracelulare scăzute a ionilor de Ca2+. clasa ATPazelor V (H+-ATP-aze). O proteină capabilă să lege specific ionii de Ca2+ a fost identificată şi în citosol. Pomparea ionilor din reticulul sarcoplasmic în citosol determină contracţia musculară. Astfel. Primul reprezentant al acestei clase şi cel mai răspândit . fiind capabilă să utilizeze direct energia rezultată în urma hidrolizei ATP în procesul de transport (pompele ionice). are la bază modificarea conformaţională a enzimei. Pentru a menţine homeostazia mediului intracelular. deşi insuficient cunoscut. în unele cazuri împreună cu K+. Al doilea reprezentat al clasei de ATP-azei P este Ca2+-ATP-aza (pompa de Ca2+). energia moleculelor de ATP este utilizată indirect prin intermediul gradientelor ionice. eritrocitele utilizează 50% din energia stocată în moleculele de ATP pentru a menţine o concentraţie ionică relativ constantă a mediului intracelular. Energia ce asigură conversia conformaţiei enzimei (E1 → E2) cât şi pomparea ionilor împotriva gradientului lor de concentraţie este furnizată de hidroliza moleculelor de ATP (Fig. În unele cazuri de cotransport. celula şi-a creat mecanisme de transport activ capabile să deplaseze moleculele şi ionii în sens invers gradientelor lor de concentraţie şi electrochimic.

3) antiport. Sunt descrise trei aspecte ale cotransportului: 1) uniport. b. H+-ATP-aza este prezentă în membranele plasmatice ale celulelor ce secretă produşi acizi (membrana apicală a celulelor epiteliale ce mărginesc lumenul vezicii urinare) şi în membranele lizozomale. Cotransportul activ al ionilor şi al moleculelor prin membrana plasmatică nu utilizează în toate cazurile direct energia eliberată prin hidroliza ATP. 2) sinport. În acest caz. Schema funcţionării Na+ . 38 . c. este faptul că acţionează în sensul cuplării-deplasării H+ de la o concentraţie mai mare la una mică cu sinteza ATP din ADP şi P. proteina aflată în conformaţie E1 leagă Na+ la situsurile aflate pe faţa citoplasmatică a subunităţii α.numiţi ioni cotransportaţi . Ceea ce caracterizează ATP-azele din clasa F. f.defineşte procesul de cotransport. a unei singure specii moleculare sau ionice.ATP-aze) este reprezentată de proteine transportoare ce realizează deplasarea protonilor în sens invers gradientului lor de concentraţie. Folosirea energiei gradientelor ionice în transportul transmembranelor activ constituie o cale indirectă de utilizare a energiei stocate în ATP. 14 a). e. ci transportul lor prin membrană este facilitat de gradientul de concentraţie scăzută şi catalizat de o proteină de import numită importer (fig.Fig. În acest transport activ.5-5) în interiorul acestui organit celular. Clasa ATP-azelor V (H+ . legarea ATP este urmată de hidroliza acestuia şi fosforilarea unui rest de Asp din structura proteinei (E1~P). transportul K+ prin membrana plasmatică şi eliberarea lui în citosol are loc simultan cu revenirea proteinei transportoare la conformaţia iniţială (E1). moleculele neutre nu se acumulează împotriva gradienţilor de concentraţie. ionii de Na+ au un rol important în transportul zaharurilor şi aminoacizilor în celulă. K+ se leagă la situsurile de pe faţa exoplasmatică ale subunităţii α. d. fără a fi cuplată cu mişcarea altei specii moleculare. Pompa de H+ dependentă de ATP din membranele lizozomale are rolul de a menţine un pH scăzut (4. Deplasarea ionilor şi moleculelor împotriva gradientelor lor de concentraţie cuplată obligatoriu cu transportul pasiv al altor ioni . energia legăturii macroenergice E1~P asigură modificarea conformaţională a proteinei (E1-P) şi transportul Na+ în spaţiul extracelular. Transportul uniport reprezintă trecerea prin membrană. localizate în membrana mitocondrială. b. la un moment dat. ca şi cele ale clasei V sunt responsabile de transportul protonilor.K ATP-azei a. defosforilarea proteinei transportoare conduce la modificarea conformaţiei (E2). 13. Clasa ATP-azelor F.

14. b1). Tipul simport reprezintă cotransportul a două specii deosebite (o structură chimică solvită şi union încărcat H+) în aceeaşi direcţie. 15. Na+K+-ATP-aza menţine gradientul electrochimic al Na+ prin pomparea ionilor în afara celulei epiteliale. 39 . 14. b2). împotriva gradientului de concentraţie. Mecanisme de cotransport Fig. Proteina ce realizează simportul glucoză . 14. în care un rol important îl joacă celulele epiteliale intestinale şi respectiv.Na+ asigură acumularea glucozei.Fig. 15). purtaţi fiind de către o proteină porter (fig. Cooperarea celor două proteine transportoare face posibilă preluarea continuă a glucozei din lumenul intestinal. Pătrunderea acestor molecule în celulele epiteliale este cuplată obligatoriu cu intrarea ionilor de Na+. tubulare. Dintre toate sistemele de simport cel mai bine cunoscut este simportul de lactoză în celula bacteriană (Escherichia coli) (fig. în celulele epiteliale ce delimitează lumenul intestinal. Antrenarea în circulaţie sanguină a glucozei absorbită din lumenul intestinal şi deplasarea aminoacizilor din tubii renali în sânge reprezintă procese cu o desfăşurare similară. Simportul este asigurat de proteine specifice localizate în regiunea apicală (cu microvili) a membranei plasmatice (fig.

Speciile ionice exportate în mediul extracelular (H+ şi HCO3-) sunt generate în celulă ca rezultat al acţiunii anhidrazei carbonice asupra produsului final al metabolismului celular CO2. transport catalizat de o proteină antiporter. Studii recente sugerează posibilitatea existenţei unor proteine canal de apă la nivelul membranelor plasmatice. Mecanismul transportului molecular de apă prin dublul strat lipidic nu este încă cunoscut. Fig. Reglarea volumului celular şi a presiunii osmotice interne În anumite limite. plante.factor critic în transportul molecular de apă Deplasare moleculelor de apă prin membrana plasmatică sau printr-un strat de celule este rezultatul acţiunii diferenţei de concentraţie a celor două soluţii separate de membrană (stratul de celule) şi /sau gradientul de presiune hidrostatică.K+-ATP-ază. simport şi antiport au fost descrise întâi la bacterii (Escherichia coli). de pompe ionice de Na+. celulele sunt capabile de a-şi modula tensiunea osmotică internă şi prin aceasta îşi pot menţine volumul relativ constant. Cele trei tipuri de transport . Proteinele uniporter. c) între două substraturi solubizante în două direcţii opuse. de exemplu Na+ în locul ionului de H+. simporter şi antiporter au structuri asemănătoare şi funcţionează prin mecanisme similare. 14.în celulă şi exportul de HCO3-.Sistemul antiport reprezintă transportul de interschimb (fig. la rândul lor. Prin acest tip de transport activ. Transportul apei şi reglarea volumului celular Presiunea osmotică . sau Cl. acest antiport reuşeşte să menţină scăzut nivelul citosolic al calciului în multe celule. iar concomitent Ca2+ este scos în spaţiul extracelular.25 M NaCl) 40 . Principalele proteine transportoare implicate în reglarea volumului celular. Introducerea unei celule într-un mediu hipertonic (cu o concentraţie salină superioară conţinutului celular) este urmată de scăderea pH-ului citosolic. uniport. Influxul de Na+ şi Clconduce la creşterea concentraţiei saline şi a tensiunii osmotice celulare ce fac posibilă intrarea moleculelor de apă în celulă şi în unele cazuri restabilirea volumului celular iniţial (fig. Majoritatea acestor tipuri de transport activ simport/antiport. generaţi. ulterior dovedindu-şi valabilitatea în toate celulele organismelor vii (fungi. în condiţiile în care celula se găseşte într-un mediu hiperton (0. fapt ce determină activarea sistemului antiport Na+-H+ şi Cl-HCO3-. c.în locul grupării HCO3-. animale). sunt declanşate de gradienţi de Na+. 16). Al doilea sistem acţionează în sensul deplasării Cl. Primul sistem asigură intrarea în celulă a Na+ în schimbul ieşirii H+. Are loc schimbarea unei specii moleculare cu alta. 16. Na+ este transportat intracelular. în celulele animale.

17). Procesul de exocitoză stă la baza desfăşurării secreţiei celulare (fig. poliglucide) şi particule traversează membrana plasmatică prin mecanisme de transport mediate de vezicule. Deşi decurg după mecanisme diferite. Diferitele macromolecule (proteine. ƒ asigurarea unui transport strict direcţionat. neurotransmiţători şi enzime digestive este realizată prin exocitoză reglată. Fig. În acest caz moleculele sunt împachetate în vezicule de secreţii. Materialele ce pătrund în celulă prin endocitoză sunt fie supuse acţiunii enzimelor hidrolitice lizozomale. De cele mai multe ori macromoleculele de secreţie sunt eliberate din celulă prin aceeaşi regiune a membranei plasmatice prin care ele au pătruns. fie eliberate din nou în mediul extracelular. cele două procese de transport menţionate prezintă unele caracteristici comune: ƒ sechestrarea moleculelor şi a particulelor transportate în vezicule. polinucleotide. Transportul macromoleculelor şi particulelor prin membrana plasmatică Schimbul de substanţe pe care îl realizează celula cu mediul înconjurător nu este limitat numai la ioni. molecule mici şi apă. de cele mai multe ori.3. Prin exocitoză macromoleculele sintetizate în celulă sunt excretate în spaţiul extracelular. ƒ rolul critic al procesului de fuziune membranară. 18). iar fuziunea lor cu membrana plasmatică este comandată de un semnal extracelular. Acest ultim tip de transport poartă numele de transcitoză. Se disting două tipuri de transport: exocitoza şi endocitoza. Există însă situaţii în care macromoleculele traversează spaţiul celular fiind secretate printr-o altă regiune membranară. un mesager chimic. 17. Secreţia celulară de hormoni. Endocitoza este implicată în transportul în celulă a diverselor molecule. Calea clasică de transport a moleculelor de secreţie în spaţiul extracelular 41 . Exocitoza constitutivă este comună tuturor celulelor şi asigură eliminarea continuă a macromoleculelor sintetizate în spaţiul extracelular.3. cât şi a fracţiunilor din fluidul interstiţial (pinocitoza).2. Studiul transportului macromoleculelor din celulă în mediul extracelular sugerează existenţa a două tipuri de exocitoză: constitutivă şi reglată (fig.

19. 20. Fig. Endocitoza mediată de receptori pentru LDL 42 . Endocitoza mediată de receptori. De exemplu.Fig. 18. Calea urmată de particulele ce au pătruns în celulă prin endocitoză Fig. cât şi a substanţelor dizolvate în lichidul interstiţial (fig. În funcţie de mecanismul procesului de endocitoză distingem: endocitoza mediată de receptori şi pinocitoza. 20). 19). reprezintă un tip de transport specific şi eficient al macromoleculelor. macromoleculele intră în celule sub forma complexului de ligand-receptor. colesterolul circulă în sânge legat de o proteină cu care formează complexe numite lipoproteine cu densitate scăzută (LDL) (fig. Prezentarea schematică a exocitozei constitutive şi reglate Endocitoza defineşte transportul mediat de vezicule din mediul extracelular în celulă al unor macromolecule. fără a fi însoţite de fluidul extracelular. În urma recunoaşteri şi legării lor la receptori de membrană.

fiind fixaţi şi importaţi intracelular.Procesul de endocitoză mediată de receptoriare o semnificaţie biologică foarte largă. pinocitoza: endocitarea moleculelor solubile (toxinele bacteriene). Clatrina este reciclată de către o enzimă activată de ATP. modularea răspunsului la mulşi hormoni de natură proteică şi factori de creştere (de ex insulina. Mecanismul endocitozei Endocitoza începe cu invaginarea unei asemenea regiuni din membrana plasmatică. etc). rezultă deci că soarta substratului este decisivă la acest nivel. fragmente de celule eucariote sau chiar celule întregi). În raport cu mărimea şi complexitatea particulelor endocitate. Celule specializate numite fagocite sunt capabile să înglobeze şi să distrugă substanţe străine. constituie un strat gros de clatrină (proteină ce va forma o reţea în jurul veziculelor membranare). care sunt recunoscuţi de către receptorii de suprafaţă ai celulelor. Vezicule prinde rapid clatrina şi devine endozom (receptozom). Partea citosolică a acestor zone. clatrina formează o reţea în jurul acesteia pe care apoi o închide rezultând în final o veziculă cu manta de clatrină(diametrul de 800Aº). prezentând câteva aspecte particulare deosebit de importante şi anume: eliberarea metaboliţilor esenţiali către celule a colesterolului. celule îmbătrânite şi maligne. Mulţi dintre aceşti receptori sunt localizaţi în anumite regiuni ale membranei plasmatice. microorganisme. se disting două variante particulare ale endocitozei şi anume: fagocitoza: endocitoza macromoleculelor sau a particulelor mici. Aceşti receptori au: ƒ un domeniu extracelular. Endozomii fuzionează şi formează vezicule mai mari cu diametrul de 2000-6000Aº (în circa 20 de secunde). Legarea particulelor de fagocit . resturi celulare etc. la mamifere procesul joacă un rol important în apărarea organismului. factorul de creştere epidermic. a ionilor de fier. cu formarea unei caveole. temporar.Caracteristic pentru endozomi este pH-ul acid care determină disocierea celor mai multe complexe receptor – proteine. În organismele animale se disting două tipuri de celule sanguine ce acţionează ca fagocite: monocitele (ce migrează în ţesuturi dând naştere macrofagelor şi ele celule cu funcţie fagocitară) şi neutrofilele.prima etapă a fagocitozei . mai puţin receptivă la aceştia. Endocitoza îndepărtează aceşti hormoni din circulaţie şi fie celula. Fagocitoza (gr. a complexelor vitaminice B12. prin scăderea numărului de receptori celulari. captarea proteinelor ţintite pentru distrugere şi eliberarea acestora către lizozomi(de ex celulele hepatice captează şi distrug glicoproteinele plasmatice senescente). etapă absolut necesară pentru sortarea proteinelor şi dirijarea lor către destinaţii specifice. fagiere=a mânca) este un proces de transport mediat de vezicule prin care celulele sunt capabile să ingere diverse particule din spaţiul extracelular.implică participarea receptorilor de membrană ce recunosc specific liganzii aflaţi pe suprafaţa particulei ţintă. Dacă la organismele unicelulare fagocitoza reprezintă principala cale de nutriţie. care ulterior invaginându-se vor forma cavele (coate pita). Acidifierea endozomilor prin acţiunilor unor pompe protonice (activate de ATP) duce la disocierea complexelor receptor-proteine. ƒ mică regiune citosolică. Caveolele reprezină 2% din suprafaţa unei celule animale. corpusculare (virusuri. Eliberarea clatrinei din vezicule reprezintă un moment cheie în endocitoză deoarece prezenţa acestei mantale proteice în jurul veziculei ar împiedica transmiterea proteinelor importate şi a receptorilor către destinaţiile lor. bacterii. ƒ 1-2. Majoritatea receptorilor de pe suprafaţa celulelor care mediază endocitoza sunt glicoproteine transmembranare. 43 . helixuri transmembranare.

sub influenţa unor particule mici.Pentru a putea fi fagocitate. neurotransmiţători. receptorul activat interacţionează apoi cu un sistem enzimatic care generează în citosol un mesager de ordin II. Un exemplu de transcitoză îl reprezintă transportul din stomac în circuitul sanguin al anticorpilor la nou-născut. După un scurt timp de la formarea cluster-ilor. Transcitoza defineşte un tip de transport specific transcelular. este expusă spre exterior. bacteriile sunt supuse unui proces de opsonizare (gr. Există posibilitatea stabilirii unor legături încrucişate între anticorpii ataşaţi pe suprafaţa celulei ţintă cu formarea unor aglomerări (clusterii). generează un semnal intracelular ce declanşează ingestia. având funcţia de legare specifică şi cu afinitate mare a unor molecule extracelulare numite liganzi (hormoni. de obicei cAMP (adenozin-monofosfatul ciclic). Unii dintre aceşti liganzi sunt numiţi mesageri de ordinul I. Această veziculă migrează de la membrana celulară spre regiunea perinucleară. 21). conţinutul veziculei fiind hidrolizat. Procesul de calotare (capping) este energo-dependent necesitând prezenţa moleculelor de ATP. prin formarea complexului ligandreceptor. În interiorul plasmalemei. 2. proces numit patching. Anticorpii se ataşează pe suprafaţa bacteriilor în aşa fel încât regiunea prin care aceştia se leagă la receptori. Receptorul Fc din membrana plasmatică a fagocitelor interacţionează cu anticorpii legând cele două suprafeţe membranare printr-un mecanism tip fermoar (membrane-zippering-mechanism) ce face posibilă fagocitoza (fig. al diferitelor microelemente. Fig.4. solubile (picături). componente ale complementului sau diverse oligozaharide de pe suprafaţa microorganismelor. Fagocitoza se realizează printr-un mecanism „membrane-zipper” A – distribuirea uniformă a anticorpilor pe suprafaţa celulei . Activarea receptorilor specifici de către anticorpi. 22.) prin legarea cărora se induc răspunsuri celulare caracteristice. anticorpii se deplasează spre un pol al celulei-ţintă generând o structură de tip calotă ce împiedică fagocitarea celulei ţintă (fig 21).ţintă face posibilă fagocitarea acesteia B – procesul de „capping” împiedică fagocitarea celulei-ţintă Pinocitoza este un fenomen observat la macrofage şi reprezentat de invaginarea unei părţi a membranei celulare. Procesul este întâlnit în celule (epiteliale) ale căror membrane plasmatice sunt împărţite în domenii distincte (apical şi latero-bazal) datorită pronunţatei asimetriei în distribuţia elementelor lipidice şi proteice componente. 23. numită regiune Fc. unde fuzionează cu lizozomii. Al doilea mesager declanşează un lanţ de reacţii intracelulare care provoacă în ultimă instanţă răspunsul celulei ţintă la ligantul fiziologic în cauză (fig. anticorpi primiţi odată cu laptele matern. opsonein=a pregăti pentru mâncare) ce constă în acoperirea suprafeţei bacteriene cu anticorpi şi/sau componente ale complementului.cu formarea în final a unor vezicule citoplasmatice (cu dimensiuni de 1-2µm). RECEPTORII DIN MEMBRANĂ Receptorii membranari sunt glicoproteine transmembranare. 21. etc. 44 . 25). 24.

Modificări de permeabilitate a membranei.legături de hidrogen). receptori pentru anticorpi. dopamină. au putut fi vizualizaţi unii receptori în ţesuturi umane obţinute post-mortem. este considerat ca un mesager de ordinul II. b. adrenalină. histamină.după cum hormonul este hidrofil sau hidrofos (cum este cazul hormonilor steroizi şi tiroidieni). a. într-o zonă specifică din molecula receptorului. el pătrunde uşor prin plasmalema celulei ţintă şi se leagă de receptorii intracelulari.Tipuri de receptori Se pot distinge două categorii mari de receptori după originea ligandului pe care îl leagă: receptori pentru substanţe endogene şi receptori pentru substanţe exogene. acid gamma-amino-butiric.4. receptorii pentru acetilcolină.1. Creşterea intracelulară a Ca+2 (prin deschiderea unor canale din plasmalemă care permit pătrunderea calciului extracelular ce se leagă în citosol de proteine specifice. Prin legarea de receptor apar diferite modificări ale plasmalemei ce induc apoi efecte intracelulare. acid aspartic. acid glutamic. se produc la legarea neurotransmiţătorilor de membrana postsinaptică şi au rol în transmiterea şi generarea impulsului nervos Activarea unor enzime din plasmalemă (activarea adenilatciclazei de către hormonii polipeptidicihidrosolubili). în matricea citoplasmatică. Receptorii pentru substanţe exogene (vehiculate de obicei pe cale umorală) includ: ƒ receptori pentru virusuri. serotonină. Exemple de modificări ale plasmalemei pot fi: Redistribuirea receptorilor cu agregarea lor în anumite zone ale plasmalemei urmată de endocitoză. parathormonul. receptori pentru complement. c.Unele dintre aceste molecule acţionează strict numai asupra unei celule postsinaptice. Receptori pentru hormoni sunt localizaţi diferit în celulă. În acesta categorie intră receptorii pentru insulină. adrenalină. datorită progreselor tehnicii. noradrenalină.influenţând mai multe celule. Receptorii pentru neurotransmiţători sunt situaţi în membrana postsinaptică a celulei nervoase. Dimpotrivă. glicină. Hangley. musculare sau alte celule efectuare (de ex. hormonii hidrofili se leagă de receptorii din plasmalemă şi aceşti receptori transmit celulei informaţia necesară spre a-şi modifica metabolismul. pentru a explica mecanismul de acţiune al medicamentelor şi toxinelor numai recent. 2.monofosfat ciclic) ci provoacă un influx rapid de ioni de calciu (Ca+2). glucagon. ƒ receptori pentru antigene străine de organism ƒ receptori pentru toxine bacteriene ƒ receptori pentru medicamente ƒ receptori pentru lecitine Deşi conceptul de receptor a fost enunţat de mai bine de 100 de ani de către P Erlich şi M. deci având efecte de mediatori chimici locali. datorită deschiderii canalelor de calciu ale membranelor celulare. 45 . hormoni ai hipofizei. De remarcat că folosirea mesagerilor de ordin I şi activarea multor proteine şi enzime prin legarea unei singure molecule de ligand au ca rezultat creşterea extrem de mare a eficienţei receptorilor al căror procent nu depăşeşte 1% din totalul proteinelor de membrană. Receptori implicaţi în reacţii imunitare sunt receptori pentru antigene endogene (foarte numeroşi în plasmalema unor limfocite). atunci Ca+2. altele pot difuza local.În cazurile când interacţiunile moleculă semnal receptorul generează un nucleotid ciclic (adenozin sau guanozin. de ex calmodulina). Ligantul de care se leagă de receptor prin forţe slabe (hidrofobe. peptide mici ca encefalina).

receptorul colinergic. etc. 2. adaptată comunicării rapide şi selective a mesajelor şi. Acesta este cazul a două mecanisme fundamentale de transmitere a informaţiei: . Pe plan celular. Dintre receptorii şi antigoniştii lor.Contactul intracelular direct Contactul celular direct. la distanţă. Contacul intercelular direct cu caracter efemer. într-o serie de boli alterarea comunicării are un rol patogenic important. de exemplu metabolice. Modalităţi de comunicare intercelulară Sistemele de comunicare intercelulară reprezintă cheia înţelegerii funcţionării armonioase a celor aproximativ1x 1015celule din organismul uman. neurohormonii şi neuromediatorii. polinucleotidele şi ARN. semnalele bioelectrice.2.continuând cu controlul creşterii şi diviziunii.4.2. cazul reţelei nervoase dintre celulele senzoriale şi cele musculare). substanţa P (un decapeptid). α-adrenergic (fentolamina). .4. anticorpii şi antigenele. virusurile şi interferonii.1. glicina.mesaje care difuzează în spaţiul extracelular. factorii de creştere. Receptorii celulelor nervoase Când informaţia circula rapid de la şi către anumite locuri. ionii şi nucleotidele. etc .4. sensibil la nicotină (α-bungarotoxina). noradrenalina. Astfel de neurotransmiţători sunt: acetilcolina. De asemenea există şi cazul conjugării celor două posibilităţi de comunicare anterioară când mesajele se transmit la distanţă prin contacte interpuse (de exemplu. Principalele sisteme de mesageri şi semnale intercelulare sunt hormonii (care nu mai sunt consideraţi produşi exclusiv ai glandelor endocrine). 2.transmiterea umorală. Pe de altă parte. glutamatul. când mesajele se transmit fără o difuziune semnificativă în spaţiile extracelulare pot fi: ƒ permanente ƒ tranzitorii ƒ episodice Contactul direct permanent se realizează de obicei prin intermediul joncţiunilor permeabile de tip „gap” care leagă direct compartimentele citoplasmatice ale celulelor ce se influenţează reciproc şi prin care trec molecule mici.2.transmiterea nervoasă. Căile principale prin care se realizează schimbul mesajelor sunt: a) transmiterea indirectă la distanţă b) transmiterea directă între celulele aflate în contact. ca şi pentru coordonarea diverselor activităţi ale celulelor mature. Comunicarea între celule este necesară începând cu dezvoltarea şi organizarea acestora în ţesuturi. consecutiv eliberării unui mesager chimic în torentul circulator fiind adecvată transmiterii de informaţii generale. β-adrenergic – 46 .Comunicarea intercelulară la distanţă Celulele pot schimba între ele. dopamina. capătul nervului eliberează neurotransmiţătorii în spaţiul sinaptic de unde o parte sunt distruşi şi o alta se prinde de receptorii specifici. legătura este stabilizată prin contacte sinaptice intercelulare de 15 nm dintre celulele care participă la transmiterea mesajelor.4. mesajele sunt vehiculate printr-un mecanism electric de către nervi prin transmisie chimică între neuroni şi între aceştia şi celulele receptoare senzoriale sau efectuare. sensibil la muscarină cu antagonist atropina. Odată cu apariţia potenţialului de acţiune. fac parte: receptorul colinergic. În ambele cazuri membranele celulare au un rol principal îndeosebi prin existenţa receptorilor specifici 2.2. ATP.2. tranzitoriu este exemplificat tipic de cooperarea celulelor sistemului imunitar a cărui organizare este astăzi comparată cu aceea a sistemului nervos elaborându-se conceptul de „reţea imunitară”.3.

Fuziunea veziculelor cu acetilcolina cu membrana presinaptice este declanşată de o creştere rapidă şi trecătoare a concentraţiei Ca2+ în butonul terminal al axonului. În mai puţin de 100ms conţinutul de circa 10000 molecule de acetil-colina iese prin exocitoza în spaţiul sinaptic. legându-se de receptorii membranari postsinaptici. 23.A. si alţii . Fig. sub influenţa Ca2+. pana ce suprafaţa interna a membranei se pozitivează pe o unica porţiune. scade energia stadiului conformaţional deschis şi. cele 10000 molecule de acetilcolina trecând prin cele circa 2000 de canale în acelaşi timp cu 20000 ioni de Na+ într-un sens si tot atâţia de potasiu (K+) în sens invers. de fapt a potenţialului de acţiune (P. Pătrunderea Na+. Fiecare terminaţie conţine aproximativ 10000 molecule de acetilcolina. Deci. aşezate pe doua şiruri la fiecare sinapsa. Influxul nervos (schemă) În momentul aplicării unui stimul are loc o depolarizare locala slabă caracterizată printr-o mică modificare de voltaj care deschide canalele pentru Na+. Probabil că exocitoza se realizează prin filamentele mecanocontractile membranare.(propanolul). 22.) (fig. se accelerează. parcurgând câteva sute de micrometrii pe suprafaţa unui muşchi. Ataşarea veziculelor cu acetilcolina de membrana presinaptica se face pe unele proteine intrinseci membranare. canalul proteic al respectivului receptor se va deschide. În fiecare regiune presinaptică se găsesc vezicule presinaptice la capătul terminaţiei nervoase. Inversarea voltajului determină potenţialul de acţiune ce se propagă de-a lungul axonului (fig. Axonul unui neuron motor de la broască. Ieşirea ionilor de K+ restabileşte repede potenţialul negativ al membranei . Diferenţa de voltaj între K+ care iese în spaţiul sinaptic si Na+ care intra în celula este aproape 0 (zero). Fig. Canalele de Na+ şi K+ (schemă) 47 . într-o ms. formează câteva sute de contacte sinaptice la 1µm . Propagarea mai departe a influxului nervos depinde de existenta în membrana neuronului a unor canale ce se deschid pentru Na+ la o modificare a voltajului membranar şi a căror funcţionare de . 23). aceasta se face la întâmplare.poarta închisă şi deschisă” pentru Na+ este cauza. Când doua molecule dintr-un neuro-transmitaţor (acetilcolina) se leagă de un receptor postsinaptic. 22). Receptorii membranari postsinaptici sunt concepuţi ca nişte canale proteice care se deschid la neurotransmiţător.. transferând voltajul mai departe. dar imediat acest Ca2+ liber dispare în momentul contopirii veziculelor cu membrana presinaptica. Asemenea apropiere de zero depinde de numărul canalelor deschise şi de durata acestui stadiu. acetilcolina se descărca prin impuls nervos (impulsul nervos este acela care deschide canalele proteice) şi realizează în membrana postsinaptică prin mediaţie chimica un potenţial de membrana cu ajutorul canalelor receptoare de acetilcolina care transporta K+ şi Na+. în acest mod.

hidrofobe şi glicolizate cu manoza şi galactoza. contracarând canalul Na+. determinându-i o stare conformaţională . să schimbe conformaţia proteinei canalului din .4.Canalul Na+ este o proteină de circa 300000 daltoni. constatându-se. după izolarea membranelor postsinaptice. asupra canalului. Deschiderea canalelor Na+ se face în modul . aşa fel încât canalele rămân deschise scurt timp. sunt blocaţi când în sângele circulant apare un anticorp al sau datorită unei condiţii autoimunitare. Diferenţa de potenţial a membranei în repaus este.totul sau nimic”. iar cele mari îl blochează . ceea ce înseamnă un câmp electric mare membranar. după cum el se închide şi apoi se deschide. Pe suprafaţa sa canalul are grupări încărcate electric în poziţii bine determinate. Aceşti receptori. pentru ca apoi sa se închidă prin inactivare.. Receptorii care controlează permeabilitatea ionică Ţesuturile electrogene ale peştilor electrici au puţine joncţiuni neuromusculare. 48 . astfel că faţa internă (sau citoplasmatică) devine pozitivă prin pătrunderea Na+. În acest caz.. deci aproximativ 7500 receptori dispuşi în arii hexagonale la suprafaţa membranei.6 nm prin care trec ioni de Na+ cu o moleculă de apă.închisă”. prin scoaterea K+ de câtre canalele K+ în afara fibrei nervoase. experimental. Cantităţile mici de nicotina sensibilizează receptorii. Asemenea sarcini conferă canalului un moment dipol electric mare. 4 molecule de αbungarotoxina marcată. Membranele lor postsinaptice sunt foarte bogate însa într-un receptor colinergic reglat de nicotina . Diferenţa de voltaj transmembranar care deschide canalul Na+ acţionează de asemenea.deschisă”. cu un por de 0. Canalele rămân în stare de inactivare câteva ms şi abia apoi se închid trecând în starea de repaus. produce o serie de impulsuri la diferite intensităţi ale aceluiaşi stimul. Este vorba de un complex de 3-4 polipeptide cu o greutate moleculară de 200000-300000 fiecare polipeptid având o GM=40000-65000 . 2. Modificările în intensitatea câmpului membranar pot. fiind compus din 3-4 tipuri de polipeptide de 50000 daltoni. Receptorul este relativ hidrofob şi glicolizat cu manoza şi galactoza. după cum se ştie. de aproximativ 100KV/cm. asistentă a 30000 molecule de toxina marcată pe un µm2. dipolii electrici ai proteinelor canalului Na+ se aliniază cu câmpul electric membranar. se stabileşte incarcatura negativă a feţei citoplasmatice a membranei. diferită de aceea din starea de repaus. deoarece fiecare canal deschizându-se face să crească conductanţa membranei de 8x10-12ohmi (Ω).4-0. Un complex prezintă patru situsuri de legare pentru acetilcolina.închisă” în .. care se găsesc şi în creierul mamiferelor. nu se mai poate realiza transmisia neuromusculara şi apare o maladie musculară degenerativă. spre deosebire de corpul neuronului care. Este de remarcat că. Fiecare complex are 250000 daltoni. În consecinţa.4. 70mV între incarcatura pozitivă de la exterior şi cea negativă de la interior.. care variază în direcţie şi mărime de câte ori se schimbă conformaţia moleculară a canalului. De un asemenea complex se pot lega. este starea de inactivare ce apare mult mai lent ca procesul de activare. Apoi. în axon se generează un singur impuls care se propagă de-a lungul sau în urma unui singur stimul.

o stare de repaus. 24. Transmisia chimică prin sinapse O caracteristică a receptorilor este că prezintă întotdeauna trei stări conformaţionale ale proteinelor constitutive. Exista o multitudine de receptori a căror funcţionare este legată de canalele ionofore ale membranei celulare. şi anume. deschizând canalul Na+ ce pătrunde astfel înăuntru (Na+). funcţionând cu .Fig.porţi”care se deschid şi se închid sub influenţele chimice sau datorită variaţiilor de voltaj transmembranar. Şi invers sunt inhibitori ai 49 . Receptorul acetilcolinei (antagonistul lui fiind bungarotoxina) acţionează când captează neurotransmitătorul. una de activitate marcată prin conductanţei Na+ şi alta de desensibilizare (sau un stadiu rezistent la activare)..

conductanţa electrică realizata la nivelul joncţiunilor .cooperează” la realizarea exocitozei. Aceste canale au fost confirmate de ME care a arătat că la nivelul acestor joncţiuni există nişte particule intramembranare care formează suprafeţe mozaicate în hexagoane şi care reprezintă proteinele cu canalele moleculare. Procesul acesta de control a permeabilităţii ionice prin receptori este foarte vechi.. aceasta inversare a bătăii ciliare se realizează în prezenta unei soluţii de KCl datorită unui influx al Ca2+ în infuzor.scalariforme”). denumită calmodulina. Tot astfel. altele pentru ≈100 K+ lasă să treacă doar 7 Na+. deoarece Ca2+ intracelular este într-o mică cantitate (0. cu modificările fiziologice corespunzătoare. contracţiei musculare. Creşterea Ca2+ citoplasmatic de la 10-8 M la 10-6 M. nu şi K+..4. datând de la infuzorii ciliaţi la care există receptori de presiune. α-adrenergici. ca în fibra nervoasă.5. ajuns în celule . β-glucozei. având un por de 0.01-1µ M). Astfel. brusc se inversează bătaia cililor şi el înoată atunci înapoi. de 2nm diametru şi 20nm lungime. creşte permeabilitatea pentru Cl. când un parameci înoată şi întâlneşte un obstacol. hiperpolarizand celula şi inhibând sinapsele de la baza celulei. orice cuplaj prin joncţiuni dintre celulele adiacente face posibilă ca o modificare a potenţialului de membrana într-o celula să se propage şi în celelalte. Celulele sunt foarte sensibile la o variaţie citoplasmatică a Ca2+. ca răspuns la presiune sau depolarizare. discurile membranare ale celulelor cu bastonaşe din retina conţin . după care reacţionează cu o apoenzima sau cu o proteina receptoare.cu gol” şi . creşterii cantităţii de c GMP etc.. glicogenolizei. Cuplajul celular metabolic şi electric Cuplajul celular se realizează structural prin joncţiuni strânse (. ca răspuns la lumina. 2. Canalele K+ sunt mult mai mici şi au foarte puţina apă. Modificările în conductanţa membranei pentru Na+ şi K+ se datoresc unor canale care se închid şi se deschid selectiv faţă de ioni. de exemplu sunt canalele ce lasă să treacă Na+. activarea unei serii de receptori produce mobilizarea Ca2+ (receptorii colinergici.şi K+ . luând o noua conformaţie şi participând la tot felul de activităţi moleculare. care solidarizează celulele adiacente pe anumite porţiuni. Trecerea diferitelor molecule prin joncţiunile cu gol depind de menţinerea în hialoplasma a unei concentraţii de Ca2+ sub 10-5 M. Ca2+.. Chiar cel mai mic influx de Ca2+ care trece prin canalele sale membranare produce perturbări în concentraţia sa intracelulară. Aşa de exemplu..porţi” ionice de Ca2+. altele care permit trecerea K+ nu şi a Na+ . Ea se leagă cu patru ioni de Ca modificându-si conformaţia. Când concentraţia Ca2+ creşte în celula. Studiile electrofiziologice şi de microinjecţii au presupus existenţa unor canale la nivelul joncţiunilor.cu gol” dintre celulele adiacente este de 106 ori mai mare ca în restul membranelor celulare nelegate între ele. 50 . destul de apos. angiotensinici. care sunt activate de către interacţiunea luminii cu rodopsina. 24). Asemenea procese mediate de Ca2+ se realizează printr-o proteina ce leagă Ca intrat în celula. etc) în celula ţinta. cu toate că molecula de K+ este de 30 de ori mai mare decât Na+. De exemplu. atunci scade şi permeabilitatea joncţiunilor şi creşte iar când scade nivelul Ca2+. Aşa. Experimental. faţă de cel extracelular (1m M). Calmodulina interacţionând ireversibil cu Ca2+ formează complexul proteina +4Ca2+ a cărui activitate este reglată de fluxul deschiderii canalelor de Ca2+. unele lasă pentru 100 ioni K+ să mai treacă şi 85 Na+. stricnina care sensibilizează specific receptorul pentru glicina). Astfel. Canalele prin care trec 100 K+ şi 85 Na+ sunt activate de acetilcolina.neurotransmiţătorilor care au efecte de hiperpolarizare prin intermediul receptorilor specifici (ex.8nm diametru.10000µm2 (fig. cu diferite răspunsuri fiziologice. densitatea unor asemenea canale este cuprinsă între 0. inhiba mişcarea Na+ prin membrana.

schimburile de energie internă ∆E . la presiune atmosferică: ∆H = . considerat la un stadiu dat. Invers. de a evalua energia care există într-un sistem izolat. schimbul caloric care afectează sistemul ( căldura de reacţie ).2. Această energie se prezintă sub mai multe forme: mecanică.000 cal/mol 51 .1. W: ∆E = Q – W Această relaţie demonstrează capacitatea de conservare a energiei.W Dacă sistemul nu produce nici un lucru mecanic. de asemenea. transformarea are loc în cloroplaste. ci suferă transformări. atunci relaţia este: ∆E = ∆H Această relaţie permite evaluarea schimburilor energetice interne ale unei reacţii care se derulează sub presiune constantă.000 cal/mol. pe care le suferă sistemul. radiaţiile solare ( energia luminoasă ) sunt transformate în energie chimică. preluată din mediul ambiant. Sistemul se caracterizează prin stadiul său iniţial şi stadiul său final. electrică. energia totală a Universului rămâne constantă. el este endotermic. motoarele. dacă nu chiar imposibil. Astfel. sistemul poate elibera energie în mediul său înconjurător. sisteme capabile de a converti energie dintr-o formă în alta. Un receptor radio utilizează energia radiaţiilor electromagnetice şi transformă energia electrică în energie acustică. căldura de combustie a glucozei se ridică la 673. Trecând de la stadiu iniţial la stadiul final. constituie. calorică. putem măsura destul de uşor schimburile energetice care afectează sistemul când acesta trece de la un stadiu la altul. presiunea atmosferică ). Energia nu se pierde. Astfel. un schimb de entalpie ∆H: ∆E = ∆H . ca acela al unui fenomen fizic sau reacţie chimică. În celulele vii există. dacă sistemul consumă căldură (energie calorică ). Aceste transformări au loc în sisteme constituite din ansambluri de molecule specifice. graţie unor dispozitive care asigură conversia necesară. hidraulică. el va fi exotermic. Astfel. în continuare. la 20 0 C. Conform primului principiu al termodinamicii. 2. NOTIUNEA DE ENTALPIE. Energia este utilizată în maniere foarte variate. prin definiţie. Astfel. Înainte de a studia sistemele biologice care asigură transferul sau conversia energiei. cu un volum constant.5. Într-o reacţie chimică ce se derulează sub presiune constantă ( de exemplu. dacă sistemul emite căldură.673. Energia astfel recuperată poate. suferind numeroase transformări în instrumente sau maşini pe care le utilizăm zilnic. nucleară etc. Să considerăm un sistem. Schimburile energetice în celula vie Descoperirile ştiinţifice au permis omului să utilizeze cantităţi considerabile de energie. este egal cu cantitatea de căldură Q pe care o primeşte din mediul exterior. Din contra.5. mai puţin lucrul mecanic ( travaliul ) pe care îl realizează. Noţiunile generale de termodinamică sunt aplicabile şi la sistemele vii. Noţiuni generale de termodinamică Studiul energiei şi transformările sale reprezintă o ramură a fizicii denumită termodinamică. să servească la biosinteze sau activităţi fizice sau mecanice. este util să ne amintim câteva noţiuni fundamentale de termodinamică. Astfel. produc energie mecanică. care funcţionează cu benzină sau electricitate. Pare dificil. Putem măsura schimburile de entalpie cu ajutorul unui calorimetru.

Valoarea sa este negativă deoarece energia calorică produsă de sistem este cedată mediului înconjurător. într-un solid. unde dezordinea moleculară este foarte accentuată. Diminuarea entalpiei libere a sistemului reprezintă cantitatea maximă de energie disponibilă care ar putea fi transformată în energie chimică. nu depinde de variaţia entalpiei libere. variaţia entalpiei ∆H şi variaţia entropiei ∆S : ∆G = ∆H – T ∆S T. este necesar ca diminuarea entalpiei libere a sistemului exergonic să fie mai ridicată decât consumul sistemului endergonic. Energia cheltuită pentru acest efort reprezintă un potenţial chimic. Entropia creşte odată cu temperatura. Când reacţia realizează un lucru mecanic. Schimbul de entropie al sistemului. Entropia reprezintă energia cinetică a atomilor şi moleculelor. rotaţii sau translaţii. în mod obligatoriu. Dacă. În toate sistemele se pot distinge două forme de energie. pentru a-şi obţine statutul de echilibru. Să considerăm o reacţie reversibilă în condiţii izoterme. Să considerăm următoarea reacţie chimică reversibilă: A ↔ B. O scădere a schimbului de energie liberă este totdeauna asociată cu o creştere de entropie. în măsura în care se accentuează (creşte) caracterul dezordonat al moleculelor. După al doilea principiu al termodinamicii. Reacţia următoare leagă variaţia entalpiei libere ∆G. Se spune că este o reacţie endergonică (endoergonică). travaliu ). Entropia este nulă într-un cristal perfect la 0 absolut şi. alta numită entropie. entropia poate să scadă într-un sistem unde au loc reacţii de sinteză şi. Stadiul dezordonat al energiei componenţilor săi are totdeauna tendinţa de acreşte. este desemnată astăzi prin expresia entalpie liberă. pe de altă parte.. una numită energie internă. Pentru a se putea realiza cuplarea cu o altă reacţie. exergonică. reprezintă temperatura absolută a reacţiei. Ea atinge nivelul său de echilibru când survin modificările reacţiei. care . În sistemul reprezentat de o reacţie chimică. Totuşi. VARIAŢIA ENTALPIEI LIBERE ŞI VARIAŢIA ENTROPIEI. Fie o reacţie chimică care evoluează spontan. Ea va avea loc foarte rapid în prezenţa unor enzime specifice. Această energie ( potenţialul chimic ). Acest aport exterior de energie poate proveni din energia radiaţiilor luminoase sau din cuplajul cu o altă reacţie. reacţia se poate realiza spontan. Această reacţie tinde să dobândească un statut de echilibru. relativ scăzută. la o valoare pozitivă se exprimă în calorii/grad/mol. fizică. VARIAŢIA ENTALPIEI LIBERE. variaţia entalpiei libere între stadiul iniţial şi stadiul final al reacţiei este negativă (∆F< 0). chimică. Enzima diminuează energia de activare. variaţia entalpiei libere ( ∆G ) este negativă şi reacţia este exergonică. în mod particular. ∆S. În egalitatea : Keq = B [ ] /A [ ] 52 . prima va realiza un efort (lucru mecanic. de-o manieră reversibilă faţă de poziţia sa de echilibru. energie care se exprimă sub formă de vibraţii. numită şi energie liberă. la o temperatură şi presiune constantă. energia internă corespunde celei are este reprezentată de diferite legături chimice şi care poate fi convertită într-o altă formă de energie: mecanică. Variaţiei entalpiei libere este semnificativă prin posibilitatea de a şti dacă o reacţie are sau nu loc spontan. entropia totală a unui sistem trebuie să crească. reacţia nu se mai poate realiza spontan. Ea este foarte ridicată într-un gaz. Dacă o altă reacţie se va opune. în fotosinteză. În cazul unei variaţii de entalpie liberă pozitivă (∆F> 0 ). pentru că ea are loc cu un aport exterior de energie care îi este necesară. RAPORTUL ÎNTRE VARIAŢIA ENTALPIEI LIBERE ŞI CONSTANŢA DE ECHILIBRU.

concentrează soluţii. La stadiul final.019 / 0.2. de o mare cantitate de energie. menţine un anumit echilibru osmotic etc.001 = 19 ∆G = . Transformări de energie în celula vie (energetica celulară) Celula este sediul activităţilor mecanice.1.019 M de glucoză – 6 – fosfat. reacţia este exergonică. Aceşti intermediari sunt derivaţi fosforilaţi ai nucleotidelor. putem. în continuare. Deşi orice molecula care participa la metabolismul celular conţine o anumită cantitate de energie. protide. soluţia are 0. catalizat de enzima fosfoglucomutază. Dacă ∆G este pozitiv. lipide.5. Aceşti compuşi trebuie să poată îngloba o cantitate apreciabilă de energie şi să poată ceda acolo unde şi când este necesar.1745 cal / mol. Un asemenea echilibru. 2.987 x 298 x In 19 = . Principalul izvor al energiei celulelor aerobe este procentul de respiraţie celulară: AH2+ 1/2O2→H 2 O + energie 53 . de asemenea. plecând de la analiza chimică. acizi nucleici ).Keq. de la dreapta la stânga. reprezintă constanta de echilibru pentru o temperatură şi o presiune determinată. Compuşii care fac parte din această categorie îşi datorează numele de macroergici (bogaţi în energie) faptului că hidroliza lor se soldează totdeauna cu eliberarea unei importante cantităţi de energie.001 M de glucoză – 1 – fosfat la stadiul iniţial. pentru a construi o singură macromoleculă de proteină este necesar să se stabilească sute sau chiar mii de legături peptidice şi. La 250 C. un rol aparte dintre aceşti compuşi îl are molecula de ATP ( adenozin trifosfatul sau acidul adenozin trifosforic). T este temperatura absolută. Să considerăm echilibrul: Glucoză – 1 – fosfat ↔ glucoză – 6 – fosfat. la pH = 7. pentru a forma o singură legătură peptidică. determinând constanta de echilibru Keq.RT In Keq Unde R este constanta gazelor perfecte ( 1. cum sunt mişcările intracitoplasmatice. doar un număr foarte redus din ele au o importanţă în stocarea şi vehicularea energiei chimice celulare. transportă molecule. deplasările. Această valoare reprezintă schimbul de entalpie liberă (∆G) care aici este pozitiv. se efectuează spontan. analiza chimică indică un echilibru între 0. sunt necesare 4000 calorii/mol. Keq este logaritmul cu semn schimbat al constantei de echilibru iar ∆G0 schimbul standard al entropiei libere. În cazuri diferite se determină ∆G. unde variaţia entalpiei libere este negativă. Constanta de echilibru este legată de schimburile entalpiei libere prin reacţia: ∆G0 = . creşterea etc. reacţia va avea loc spontan. deformările. Ea efectuează. De exemplu. deci. să calculăm variaţia entropiei libere a sistemului ∆G0. Pentru a face faţă acestui necesar imens de energie celula dispune de mecanisme complexe proprii. Celula realizează şi activităţi chimice : sinteze de macromolecule ( glucide.001 M de glucoză – 1 – fosfat şi 0. de la stânga la dreapta. reacţia efectuându-se la un pH = 7. Ori.987 cal/mol/grad ). activităţi fizice: absoarbe activ substanţe. Keq = 0. plecând de la numeroase molecule mici. Intre nevoia şi aportul de energie există intermediari capabili să efectueze multiple transformări.

Structura moleculei de ATP (a). Constanţa temperaturii face ca transferul energiei în sistemele biologice să fie posibil numai prin reacţii cuplate: două reacţii sunt cuplate dacă energia liberă a uneia care este exergonică.2.5. Molecula de ATP este alcătuită dintr-o bază azotată purinică – adenina. excitaţia nervoasă. endergonică. Întrucât această fosforilare este cuplată cu oxidările din cadrul respiraţiei procesul de recuperare a energiei respiratorii se numeşte fosforilare oxidativă: nADP + nPa+ energie→ n ATP Astfel. 26). 54 .În care A simbolizează un substrat oarecare. din molecula ATP care scindează hidrolitic e reprezentat de energia G. 2.5 – 2. care se formează prin fosforilarea moleculelor de ADP (adenozin difosfat sau acidul adenozindifosforic). Fig. 25. animale şi bacteriene depind de ATP. lipidelor şi protidelor către cale mai diverse reacţii consumatoare de energie. transportul activ şi altele. Fig. polizaharide) cât şi pentru susţinerea unor procese cum sunt: contracţia musculară. Poate fi obţinut în stare pură prin cromatografie pe schimbători de ioni. complexul ATP cu ionul de Mg 2+ (b). Cuplarea celor două reacţii e redată în figura 25.5 mg ATP/mol. Molecula ATP şi proprietăţile sale Toate celulele. Caracterul macroenergetic al legăturilor P≈O. Schema unei reacţii cuplate Mecanismul acestui sistem de cuplaj asigură transferul energiei libere de la reacţiile degradative ale glucidelor. iar AH2-substrat redus. compus izolat în anul 1930. reprezentarea simbolică a proceselor cuplate generatoare şi recuperatoare de energie poate fi următoarea: AH2 + nADP + nPa + ½ O2 → A+ n ATP + H 2O Organismul utilizează în permanenţă mari cantităţi de energie atât pentru sinteza compuşilor cu structuri complexe (proteine. Energia degajată în cursul respiraţiei celulare este un mod normal parţial recuperată în cadrul unui proces biologic cuplat. Recuperarea se face prin stocarea energiei în molecule de ATP (adenozin trifosfatul sau acidul adenozintrifosforic). lipide. trebuie să se realizeze eficient. În organism există numeroase reacţii cuplate prin intermediul acidului acetic a cărei formare întro reacţie puternic exergonică asigură desfăşurarea celei de-a doua. Sistemul ATP↔ADP constituie intermediarul energetic comun în majoritatea reacţiilor cuplate.1. De aceea. 26. Materia vie conţine 0. transferul energiei libere rezultată din reacţiile exergonice ale căilor degradative către aceste procese. vegetale. cedează energiei determină desfăşurarea celeilalte care este endergonică (consumă energie). un zahăr – pentoză – şi trei radicali fosfat (Fig. din extracte acide de muşchi.

de fapt. ADP devine acceptor de Pa transformându-se în ATP. Fig. ATP şi ADP. ci prin intermediul sistemului ATP↔ADP. glicerol). 3-diP-glicerat şi P-creatina) spre compuşi microergici (glucoza.ului formează un complex cu ionul de Mg 2+. 30. 27. Magneziul stabileşte legătura cu adenina şi cu cei doi fosfaţi terminali. dar hidroliza legăturii ester care reţine fosfatul generează mult mai puţină energie. Deci. de asemenea. Sistemul ATP↔ ADP funcţionează astfel ca o baterie de energie (dinam celular). Compuşii formaţi prin hidroliză sunt AMP (adenozin monofosfatul sau acidul adenozinmonofosforic) şi acidul fosforic. o neconcordanţă. AMP poate. cea mai mare parte a ATP. ATP este un polifosfat puternic încărcat electric.(fig. Dacă luăm ecuaţia ATP ↔ADP +Pa. apropiate unele de altele şi care se resping. dar şi în procesele de glicoliză sau de oxidare aerobă a glucidelor. 55 . ceea ce este. Schema „dinamului celular” (Florkin. Fosfaţii poartă patru sarcini negative. Hidroloza produce o importantă scădere a energiei libere a sistemului: ∆G = . Ea provine din hidroliza legăturii anhidrid fosforică. fosfatul terminal este stereochimic vecin cu un grup aminat al adeninei (fig. Prin hidroliză el se descompune în ADP şi acid fosforic. Ambii poartă încărcătură negativă. Aceşti doi copuşi. dacă ea se desfăşoară spre stânga ATP e donator de Pa în sens opus.7000 cal/mol (pH 7. Grupările fosfat cedate de compuşii macroergici ajung la acceptori nu direct. b). sunt sediul unor reanjamente ale atomilor. să se disocieze eliberând o cantitate de energie egală cu precedenta. ADP poate.27).modificat de Lippman) Sistemul ATP↔ADP ca donator de energie este implicat într-o serie de procese biochimice importante cum ar fi: contracţia musculară (sistemul creatinkinazic) al celui de-al doilea mesager implicat în pătrunderea unor hormoni prin membrana celulară (sistemul adenilatkinazic). Acest sistem face legătura dintre compuşi macroergici (Penolpiruvat. Reacţiile de transfer de fosfat (fosforilare →defosforilare) se fac totdeauna de la un compus cu potenţial de transfer ridicat către unul cu potenţial de transfer scăzut.În celulă. Energia considerabilă de aici nu corespunde celei de la legătura covalentă dintre P şi O. În moleculă. care se realizează în maniera în care nivelul de energie al moleculelor este cel mai scăzut posibil. (fig. la rândul său să fie descompus. 25oC) Putem spune că legătura fosfat este bogată în energie. compuşii cu fosfor pot fi donatori sau acceptori de fosfat după cum potenţialul lor de transfer e mai ridicat sau mai scăzut. 28).

citidintrifosfatul (CTP). 2.6. Există şi compuşi fosfaraţi. Este permanent necesar să se furnizeze energie pentru refacerea AMP. ∆G = 5000 cal/mol. pe Pământ.Fig.Implicarea sistemului ATP↔ADP în unele procese biochimice celulare Aceste diverse reacţii sunt reversibile. de asemenea. Alţi compuşi fosforilaţi Celula conţine o multitudine de compuşi fosforilaţi. Aici. spre cel cu potenţial mai scăzut. 56 . Printre aceştia.2. există numeroşi compuşi intermediari . 2. Energia solară traversează spaţiul sub formă de lumină. . reglează transferul între cele două tipuri de compuşi. dar în cantităţi mult mai scăzute. Grupul fosfat tinde să treacă de la compusul cu potenţial de transfer ridicat. soarele.7000 cal/mol). Alţi compuşi au o energie liberă de hidroliză mult mai mică decât ATP-ul. Între aceste două exemple extreme de potenţial energetic. PEP şi glucozo -1. care are un potenţial de transfer de valoare medie.fosfat. Sistemul ADP – ATP. Aceşti compuşi se formează în prezenţa ATP-ului care se descompune cedând energie şi o moleculă de acid fosforic. 28. Aceste substanţe posedă. Acestea sunt capabile nu numai să capteze lumina solară ci să o şi prelucreze în „hrană”.1. 2. guanozintrifosfatul (GTP) etc. lumina solară este captată de numeroasele frunze sau organe verzi ale plantelor.ului. mult mai ridicată decât cea a ATP –ului (∆G = . Disocierea sau recombinarea unui compus fosforilat ca ATP se realizează în prezenţa enzimei adenozin trifosfataza (ATP-aza). Membrane care cuplează energie Membranele capabile de captarea şi conversia energiei aparţin cloroplastelor şi mitocondriilor. legături macroergice fosfat cu un înalt potenţial de energie. ADP şi ATP. Un exemplu este glucozo -1-fosfat. derivaţi de nucleotide. Cloroplastele Viaţa pe Pământ depinde de energia produsă de steaua noastră apropiată. Aceşti compuşi au tendinţa de a se descompune cedând o moleculă de acid fosforic şi energie. favorizând sinteza de ATP din ADP şi fosfaţi liberi. analogi ATP ului. după potenţialul lor de transfer al grupului fosfat. Diferiţii compuşi fasfaraţi pot fi repartizaţi pe o scară.12 800 cal/mol).5. Astfel sunt: uridintrifosfatul (UTP).2.6. PEP (fosfoenolpiruvatul) conţine o energie liberă de hidroliză considerabilă (∆G = . prezenţi în mediu.

a. Membranele tilacoidelor.1. exista doua tipuri de reacţii: reacţii de lumina (faza de lumina. adică sediul la nivelul căruia se desfăşoară grandiosul proces al fotosintezei. clorofila a. considerate unităţile funcţionale ale fotosintezei şi care au fost numite cuantosomi (Park şi Pon. precum şi doi atomi de mangan. Se disting două regiuni: o regiune porfirinică (inel porfirinic) cu un atom de magneziu în centru şi cu o coadă „fitol”alcool cu C20. la fel de intensă de energie. Aceştia sunt: licopenul de culoare roşie şi carotenul de culoare portocalie. circa 9500 atomi de azot proteic. b. prezente în toate organele verzi ale plantelor. se pare. doisprezece atomi de fier şi sase atomi de cupru. Procesul general al fotosintezei Cloroplastele reprezintă suportul material. în timp ce polul hidrofob (reprezentat de fitol) se îndreaptă spre lipoizii de structură ai lamelei granare. Culorea verde a frunzelor este dată de prezenţa clorofilelor care maschează culoarea galben portocalie a carotenoizilor. Studiile de microscopie electronică au evidenţiat pe suprafaţa lamelor stromatice şi granare. Sineza clorofilelor se face în interiorul cloroplastelor. de culoare verde albastră. de unde sindromul de „cloroză”(îngălbenire) în cazul carenţei de fier sau lumină (etiolarea). de culoare verde gălbui. una dintre multiplele etape de sinteză necesită lumină şi fier. faza lui Hill) si faza de întuneric (faza obscura sau faza lui Blackman sau ciclul Calvin) (fig. 57 .1963) . 2. Majoritatea moleculelor de clorofilă sunt asociate proteinelor membranare (cromoproteine). 48 molecule de carotenoizi. derivaţi hidroxilaţi ai pigmenţilor carotenoidici sau oxicaroteni.6. xantofilele. placă sau coloană fiecare pigment din amestec. la plantele superioare. Structura chimică a celor două clorofile este apropiată. 29). conţin 12% pigmenţi de două categorii: clorofile 10% şi carotenoizi 2%. în prezenţa luminii. 70 molecule de clorofila-b. sunt responsabile de conversia energiei luminoase în energie chimică. Pigmenţii carotenoidici Sunt pigmenţi lipofili derivaţi de la izopren. sute de molecule de lipide. în timpul căruia se sintetizează. S-a stabilit ca în procesul de fotosinteza.1. datorită clorofilei pe care o conţin. S-a stabilit că un cuantosom conţine: circa 160molecule de clorofila-a. este mai frecventă decât clorofila b.Cloroplastele sau plastidele verzi. Aceasta transformare de substanţă realizată în celula vegetală este dublată de conversia. particule globulare cu dimensiuni de 100-200A0. Pigmenţii clorofilieni Există două tipuri de clorofile a şi b. Un cuantosom este format. substanţe organice din CO2 şi apă. Dintr-un extract brut de pigmenţi (extract in acetonă sau în alcool) poate fi separat prin cromatografie pe hârtie. pentru ca sinteza moleculelor organice înseamnă înmagazinarea de energie chimică provenită din conversia energiei solare. dintr-un strat de substanţe proteice îmbibate cu apă şi o componentă lipidică Molecula bipolară a clorofilei se orientează cu polul hidrofil (inelul porfirinic) spre stratul proteic. La plantele superioare.

1965) În reacţiile de lumina. 2ADP + Pi → 2 ATP În reacţiile de întuneric. Concomitent cu acest transport de H2 (sau de electroni). prin reacţia de fotofosforilare. hidrogenul este smuls de la moleculele de apă şi dus de o serie de transformări la NADP. cu sinteza moleculei macroergice de ATP . care se petrec în stroma cloroplastului. provenită din descompunerea ATP rezultat în fotofaza. Reacţiile de întuneric pot fi sintetizate astfel: CO2 + 2NADPH2 → (CH2O) + H2O + 2NADP 3ATP → 3ADP + 3Pi Astfel. care au loc în tilacoidele cloroplastului.reacţiile de întuneric (după P. care provoacă starea de excitaţie electronica a moleculei de clorofila. B .Fig. Aceste reacţii sunt asociate cu o creştere în energia libera a sistemului celular. Acest transfer este posibil graţie aportului de energie libera-energie luminoasa-.Schema fotosintezei: A . are loc convertirea energiei luminoase în energie chimică. Reacţiile de lumina pot fi sintetizate astfel: H2O + NADP → ½ O2 + NADPH2.reacţiile de lumină. 29 . procesele generale ale fotosintezei pot fi reprezentate prin reacţia: lumină CO2 + H2O → (CH2O) + O Hv 58 . cu degajare de O2 în afara celulei. Se pare ca pentru fiecare doi electroni transportaţi revin două (sau fracţiuni între 1 şi 2) molecule de ATP. NADPH2 produc în reacţiile de lumina este folosit pentru reducerea CO2. Sitte.

Reacţiile de lumină a. Starea de excitaţie tripletica are o durata de viaţa mai lungă (10 -10 s) şi. Fiecare corpuscul sau foton. -4 -2 3. sub acţiunea luminii. Astfel. un foton de lumină albastră cu o lungime mică a undei. Cu aceasta ocazie se poate întâmpla să aibă loc şi răsturnarea spinului (care se face cu cheltuiala de energie de excitaţie) molecula cazând la un al treilea nivel energetic de excitaţie electronică. datorită ei. Fig. numită stare tripletica (sau metastabila). transportă mai multă energie decât un foton de lumină roşie cu lungime de undă înaltă. (constanta lui Planck) iar ν este frecvenţa undei(numărul de vibraţii /secundă). un electron al moleculei este dizolvat şi trece pe orbita liberă. Aceasta reprezintă o stare de excitaţie singletică a moleculei de clorofila. Stările de excitaţie electronică a unei molecule de clorofilă (după Libbert. având cel mai înalt nivel energetic faţa de starea fundamentala. ea atinge acelaşi nivel energetic (41Kcal/mol/gram) . b.2. 1974) 59 . ce aduce revenirea la starea fundamentală a moleculei se face prin pierdere de căldura (24Kcal/ mol/gram) şi molecula cade la un alt nivel energetic de excitaţie singlatica. deşi are cel mai scăzut nivel energetic (31Kcal/mol/gram). în valoare de 10Kcal/mol/gram.care se caracterizează fata de starea fundamentală printr-un exces de energie. Când molecula de clorofila este bombardată cu fotoni de lumina roşie (cu lungimea undei 670nm). Procesul de absorbţie a energiei luminoase Posibilitatea de a utiliza radiaţiile luminoase de către celulele plantelor verzi se datorează faptului că ele conţin în cloroplaste molecule de clorofila capabile de aşa numitul efect fotoelectric. sau prin pierdere de căldură.2. h este o constantă. c-viteza luminii în vid. sub acţiunea radiaţiilor luminoase cu lungimea de unda între 380770nm. care consta în emisiunea de electroni din atomul unei molecule. Durata de viaţa a acestei stări de excitaţie electronica este puţin mai mare (10-9s). Fotonul Lumina este un fenomen de natură ondulatorie şi corpusculară. ν=c/χ. 30. Adsorbind radiaţii cu lungimea de unda de 430nm (radiaţii albastre).6.1. se poate dezactiva prin inducerea unei reacţii fotochimice (fig. molecula de clorofila intra în starea de .excitaţie electronica” (stare activa). Dezactivarea. menţinându-şi sensul spinului..30). 2. Astfel. Energia înmagazinata în acest caz este egala cu 65Kcal/mol/gram. cu 41Kcal/mol/gram. transportă o energie W(un quantum) care are o valoare dată de lungimea de undă asociată relaţiei W=hν. ca urmare a duratei foarte scurte de viaţa (10-12 – 10-11s) este incapabilă să inducă reacţie fotochimică. Molecula de clorofila poate atinge trei niveluri de excitaţie electronica: 1. Molecula ajunsă la acest nivel se dezactivează prin emisie de fluorescenta. totuşi încă insuficientă pentru inducerea reacţiei fotochimice.

reprezintă deci pigmentul fotochimic activ al acestui sistem. sunt singurii pigmenţi specializaţi în transformarea energiei luminoase în energie chimica.P700” pentru fotosistemul I şi . încât provoacă reacţia fotochimica. De asemenea. se constata ca procesul fotosintetic decurge mult mai slab decât atunci când este expusa acţiunii întregului spectru luminos... iar PS II de degajarea O2. Kok si G. care reprezintă . cu maximum de absorbţie la 682nm. energia având tendinţa să migreze spre molecule care absorb radiaţii cu lungime de unda mai mare. cunoscuta sub denumirea de P680 sau clorofila-a II si care reprezintă pigmentul activ al acestui sistem. Doring şi colab. B. Studii ulterioare au confirmat existenţa celor doua reacţii fotochimice. (1969) că clorofila-a participa la ambele reacţii. socotite ca sensibilizatori optici. Fotosistemul II este reprezentat de particule mai mari.centrul fotochimic” al fotosistemului I. PS I fiind raspunzător de formarea NADPH2. Energia luminoasa pe care o absorb aceşti pigmenţi este mai mica sau egala 680nm si apoi transferata centrului fotochimic al sistemului I. carotenoizii... Fotosistemul I si II Bazându-se pe observaţii începute din 1941 Emerson a arătat (în 1957) ca daca alga Chlorella este expusa la radiaţii roşii cu λ =680nm. fiecărui sistem îi corespund reacţii fotochimice diferite. Pigmenţii care absorb lumina sunt distribuiţi între cele doua sisteme.înseriate”. Hoch (1961) au descoperit o clorofila-a.. care absoarbe radiaţii cu lungime de unda de 700nm. Alături de P680 sistemul mai conţine clorofila-b si pigmenţi accesorii (clorofila-c şi fucoxantina la algele brune. Se pare ca pigmenţii β-carotenoizi sunt prezenţi în ambele fotosisteme . El conţine clorofila-a cu maxim de absorbţie la 680nm (sau după alţii la 672). Cele doua sisteme sunt individualizata funcţional si structural. Acest fenomen a fost denumit .P680” pentru fotosistemul II şi numai electronul dizlocat de pe aceste molecule este atât de bogat în energie. c. Celelalte forme de clorofila-a şi clorofila-b. dar sunt legate între ele prin intermediul lanţului transportorilor de electroni. ficoeritrina şi ficocianina (de la alge)transfera energia luminoasă pe care o absoarbe pigmentul P700. proteinele ficobilinice la algele roşii si albastre). (1967) o altă formă activă a clorofilei-a. în funcţie de molecula proteică cu care este complexată şi care nu sunt echivalente funcţional. Se pare ca PS I nu conţine sau conţine o cantitate foarte mica de clorofila-b.Există mai multe forme ale clorofilei-a. Alături de P700 mai exista si clorofila cu maxim de absorbţie la 680nm si o molecula de citocrom f . Atât clorofila-a I cât si clorofila-a II. fiecare fiind responsabil pentru anumite reacţii fotochimice având fiecare câte un centru fotochimic. Rabinowith si colab. iar G.centru fotochimic” molecule de P700 (clorofila-a cu maxim de absorbţie la 700nm) sau clorofila-a I. echivalent cu PS I. 60 . Aceste forme au fost notate convenţional . Fotosistemul I este reprezentat de particule mai mici si conţine ca . La bacteriile fotosintetizatoare nu exista decât un singur sistem pigmentar. după unii .efectul Emerson” si a dus la ideea ca fotosinteza implica doua reacţii fotochimice în care lumina este absorbita de pigmenţi diferiţi. Cercetări mai recente au stabilit ca unitatea procesului fotosintetic este compusa din doua fotosisteme (fotosistemul I şi fotosistemul II).. De asemenea. dar contrar supoziţii originale a lui Emerson s-a stabilit de către E. acest cercetător a mai stabilit ca daca radiaţiile de lungime de unda (λ) de 680nm sunt asociate cu radiaţiile de mai mica. procesul fotosintetic arata un efect global superior sumei celor doua efecte parţiale produse de cele doua lungimi de unda aplicate independent.

este etapa esenţiala a fazei de lumina. Q pierde electronul în favoarea unei molecule de plastochinona. Reacţia a fost descoperită în anul 1973 de câtre R. cu potenţial redox +0. din care O2 va fi eliberat de o peroxidoza (catalaza). induce oxidarea apei şi transporta H+ (respectiv electroni) între cele două sisteme redox .pentru P680 functioneaza molecule de apa. care este adusă de molecula clorofilei.4 V şi un reductant (H2O).8 V.d. Secvenţa transferului de electroni Transferul de electroni de la moleculele de apă (donor de e.se fixează pe un acceptor organic care se izomerizează într-un peroxid. care absorb radiaţiile luminii mai mici sau egale cu 680nm . Electronul de la molecula de P680 este transferat unui acceptor cu natura chimica încă necunoscută. cu potenţial redox scăzut şi un sistem mai puţin reducător. ci cu aport de energie liberă.la citocromul b6 care. Fotoliza apei (oxidarea H2O) Provocată de molecula de clorofila excitată. 61 . care evoluează între un oxidant (CO2) cu potenţial redox –0.) la NADP (acceptor final) implica o serie de transportori de e. Transferul de e.se poate face spontan dacă are loc între un sistem foarte reducător. Aceste radiaţii produc excitarea moleculelor de clorofila-a care cedează energie sub forma de e-. În procesul de fotosinteza potenţialul redox al sistemului O2/H2o este foarte ridicat (+0.+ OH 2OH → H2O ½ O2 Deci din fotoliza apei rezulta H+ legat (sau agentul reducător) pentru ca ea se efectuează cu intervenţia unui transportor. Se presupune că radicalul OH. apoi a unui acceptor de H+ şi un radical (OH-) care va fi oxidat în prezenta unei enzime cu eliberare de O2.cu o secvenţa specifică. catalaza 4OH → 2H2O2 → 2H2O + O2 Rolul de acceptor pare să fie jucat de carotenoizi şi de acidul tioctic. pentru a reveni la starea fundamentală. Migrarea protonilor de la H2O la CO2 nu se realizează spontan. Lanţul transferului de electroni Reacţia de oxidare a apei este legată direct de FS II. denumit Q. molecula de plastochinona transfera e.42 volţi la un pH=7). Ea accepta fotoni incidenţi. Deci fotosinteza este un proces constituit dintr-o serie de reacţii de oxido-reducere. îl cedează citocromului f. Prin intermediul unei plastocianine. f. Hill şi ea se desfăşoară probabil în doua etapa: hv H2O → H+ + e. Mecanismul eliberării O2 este incomplet cunoscut .8 volţi la pH=7) iar cel al sistemului CO2/CH2O este foarte scăzut (-0. deci în sens invers gradientului de potenţial redox. La rândul său. la rândul sau. care se reduce . Ca donator de e. e. cu potenţial redox ridicat.. în care funcţionează ca un centru de reacţii P680.

Transportul de e-. Schema transferului de electroni în fotosinteză g. Membrana tilacoidală fiind impermeabilă pentru protoni.Electronul eliberat de citocromul f furnizează clorofilei P700 (centrul de reacţie al PS I). către spaţiul intratilacoidal. (1954). de la care apoi este cedat ferredoxinei. Pe parcursul transferului de e . astfel încât electronul ajunge . adică există o cădere a nivelului energetic al electronului cu fiecare nou acceptor al său. Arnon şi colab.primit moleculei de NADP. la fiecare treapta a transportului se pierde energie. reacţia fiind catalizată de o ferredoxin – NADP – reductoza. Electronul pierdut de P700 este imediat preluat de un acceptor de e-. Datorita cedării de energie pe parcursul transportului de e-. 62 Fig. este posibilă sinteza de ATP (rezervorul energetic celular).. Fig. de la apă la NDAP este însoţit de expulsia a doi protoni H+(la nivelul plastochinonei) din stroma cloroplastului. care apoi este redusă la NADPH2. pe care o reduce şi căreia îi transfera energie. electronul pe care acesta l-a pierdut sub acţiunea radiaţiilor luminoase cu λ = 680nm.descărcat de energie” la molecula de clorofila P700 şi aceasta se dezactivează trecând în starea ei fundamentala. Fotofosforilarea Capacitatea de fosforilare a cloroplastelor a fost descoperită de D.31). 32. Ferredoxina redusă transferă e. se crează un gradient electrochimic de protoni care va permite funcţionarea ATP-azei membranare. care se adaugă protonilor rezultaţi din fotoliza apei. 31. Încărcătura pozitivă se acumulează deci în spaţiul tilacoidal. printr-o reacţie de fotofosforilare (fig. Schema fosforilării lineare (I) şi ciclice (II) . necunoscut denumit X.

poate fi transportat enzimatic pe citocromi. marcat în funcţia sa carboxilică. Reacţia de reducere a funcţiei carboxilice din molecula de acid fosfogliceric se petrece în două etape.6. energia pentru sinteza ATP fiind eliberată între citocromul-b6 şi citocromul (fig. Deci primul produs după absorbţia CO2 este acidul fosfogliceric (APG). precum şi pe determinarea potenţialului redox al sistemelor transportoare de e-. la încorporarea CO2 în compuşi organici (fig. Ribuloza – difosfatul adiţionând CO2 formează un compus intermediar instabil.. deci şi fotoliza apei. cu 6 atomi de C.. Imediat după formarea acidului fosfogliceric apar trioze fosforilate. în loc sa fie cedat în final. implică în fosforilarea lineară citocromul b559 asociat cu plastochinona. ci el este încorporat mai întâi în ribulozo. reducerea CO2 nu se face în mod direct. 32). marcate la funcţia aldehidica. de unde este dus înapoi la molecula de clorofila-a din fotosistemul I. Cu ajutorul izotopului marcat 14C. care s-a găsit că este un ester fosforic al unei pentoze: ribulozo -1. 2. Pentru ambele căi există locuri de fosforilare situate pe lanţurile transportoare între citocromi . reacţia fiind catalizată de carboxidismutaza. bazate pe studiul spectrelor de absorbţie a luminii. În transferul electronilor proveniţi de la apă. Fosforilarea ciclica. Reacţiile de întuneric a. locul fosforilarii fiind sistemul între citocromul-b559-plastochinona şi citocromul-f + plastochinona.5 – difosfatul (RIDP). sub acţiunea NADPH2 şi a energiei sincronizate în molecula de ATP. energia de asimilaţie” (ATP) leagă cele două faze ale procesului de fotosinteză. Electronul trasferat de P700 ferredoxinei. 33). furnizat Ca14CO2 unei culturi de Chlorella. care se reduce formând aldehida fosfoglicerică. NADP. Ciclul Calvin (calea C3 de reducerea CO2) NADPH2 şi ATP produşi în faza de lumina sunt utilizaţi în stroma cloroplastului.S-a precizat ca fosforilarea se poate realiza pe două căi: fotofosforilarea ciclica şi aciclica (lineară). 10% în acid fosfopiruvic şi 3% în acid malic. care se descompune hidrolitic.agentul reducator” (NADPH2) şi .1. energia necesară sintezei moleculelor de ATP se eliberează între citocromul-b şi citocromul-f. 63 . Astfel . Deci. izotopul radioactiv a fost găsit în proporţie de 87% în acid fosfogliceric. În aceasta reacţie formarea ATP este asociată cu reducerea NADP şi este implicat şi fotosistemul II.3. Încorporarea moleculei de CO2 se face prin carboxilarea unui acceptor al său. Cercetări recente. Calvin şi Benson (1949-1950) au reuşit să elucideze calea urmată de CO2 în cloroplaste. Are loc în prezenţa unor sisteme redox şi a luminii . După numai 5 sec. rezultând două molecule de acid fosfogliceric.difosfat. Fosforilarea aciclica. apoi în acid fosfogliceric.

33.Fig. Localizarea activităţii biochimice în cloroplast (după Binet şi Brunel. 1968) 64 .

se formează hexozele şi în final. 65 . iar celelalte cinci molecule ajung. dar el se încorporează activ în fosfoenol. prin faze intermediare la regenerarea moleculelor de ribozo-difosfat.Fig. Astfel.piruvat (PEP) rezultând acizii tetracarbonici : malic şi aspartic. numai a VI-a parte parcurge această cale. desfăşurate într-o secvenţa ciclica (ciclul Calvin) pe parcursul căruia. 34). amidonul. prin transcarboxilare. în urma unor serii de condensări. CO2 ajunge pe ribulozo-difosfat intermediat de fosfoenol piruvat. Din totalul moleculelor de trioze. capabile să accepte noi molecule de CO2 (fig. Există însa plante la care celulele mezofilului foliar sunt incapabile să fixeze CO2 în hidraţii de C. 34 Schema reducerii CO2 Triozele obţinute sunt antrenate într-o serie de transformări.

. în ele desfasurându-se ciclul Hatch – Stac (Calvin).plante "NADP .ciclul fotosintetic de reducere a CO2 66 . Grupa .După acest criteriu. plantele se împart în două grupe mari. Panicum maximum).. Astfel.plante "NAD-ME". oxalatul este redus la malat în cloroplastele celulelor mezofilului. în trei grupe. conţin atât specii C3 cât şi C4. pentru fiecare moleculă de CO2 fixata de hidraţi de carbon (fig. fată de plantele C3. Triticum sp.de reducere a CO2 În structura frunzei la speciile de plante tropicale şi subtropicale. Speciile de plante C4 fotosintetizante au fost împărţite la rândul lor. Fig. Agentul reducător îl constituie NADPH2. desfăşurarea ciclului diferă la cele trei tipuri de plante. B . unde este descompus (în cloroplastul acestora). eliberându-se CO2 care parcurge ciclul Calvin. la toate cele trei tipuri există momente comune. dependenţa de NADP (de ex.ME". format din malat prin intervenţia enzimei malice dependenţa de NADP . Este de notat faptul că plantele C4 utilizează o moleculă de ATP în plus.NAD-ME” în care este activată enzima malica dependenţa de NAD (de ex. formându-se în final. ciclul FRC .plante "PCK". În plantele din grupa NADP-ME.PCK”.. Între aceste două tipuri de celule existând un schimb intens de substanţe . care sunt singurele capabile sa reducă CO2 pe calea ciclului Calvin. adesea lipsite de grana. Atriplex spongiosa). amidonul. Unele genuri. Mai departe. Grupa plantelor . apar unele particularitaţi anatomice şi de ultrastructură.). Restul celulelor din mezofil sunt mai mici.fotosintetizante . A. Cloroplastele celulelor tecii fasciculare furnizează ATP în ele având loc fosforilarea.NADP-ME”. după reacţiile particulare care duc la eliberarea CO2. Grupa plantelor . 35. în majoritate tropicale şi subtropicale. în jurul nervurilor se formează o teacă de celule parenchimatice mari. În desfăşurarea ciclului Calvin. notate prescurtat cu C3fotosintetizante şi respectiv C4. Fixarea CO2 pe calea C4: A . în care intervine enzima malica. Calea C4 s-a găsit la specii aparţinând mai multor familii de plante. b. reacţie catalizată de fosfoenol-piruvat carboxilaza şi care se petrece în citoplasma celulelor mezofilului frunzelor. au cloroplaste mai mărunte cu ultrastructura normală. iar acesta este translocat în celulele tecii perifasciculare. C . Calea C4 . ca de exemplu Atriplex. 35A). Astfel este momentul fixării CO2 pe oxalocetat. în care activează o fosfoenolpiruvat-carboxikinaza (de ex.

centrul respiraţiei celulare” funcţia principală constă în înglobarea energiei sub forma de legături macroergice de ATP. Acest flux. se crede prin plasmodesmele din pereţii celor două tipuri de celule.2. 2.NAD-ME” în mitocondriile lor. Piruvatul eliberat la ambele tipuri de plante.. este convertit prin transaminare înapoi la oxalacetat. Mitocondriile.În celelalte două tipuri de plante C4 (PCK si NAD-ME) oxalatul format de fosfoenolpiruvat-carboxilaza. la aspartat. care este reconvertit în cloroplaste la PEP (fig.. intercelular are loc. calea EmdenMeyerhof. asigura efectuarea ciclului glicoxalatului şi sunt sediul unor sinteze şi degradări de substanţe. sunt sediul efectuării ciclului Krebs şi al lanţului respirator ce derivă din acest ciclu. apoi suferă în aceleaşi organite o decarboxilare oxidativă prin intervenţia enzimei malice.6-difosfat fructoza-6-fosfat . în afara cloroplastului.. Astfel.1. care ia sfârşit cu formarea a două molecule de acid piruvic dintr-o molecula de glucoza şi alta intramitocondrială în care are loc oxidarea totală a acidului piruvic în CO2 si H2O. că degradarea glucozei are loc în două etape: una extramitocondriala. În plantele . 35 C). În plantele NAD-ME. este convertit prin transaminare. oxalatul este mai întâi redus de către NAD-malat dehidrogenază în mitocondrii. iar alanina se întoarce în celulele mezofilului unde este transaminată din nou producându-se piruvat. dependentă de NAD. în primul moment al fixării CO2. cât şi în matrice. localizat atât în membrane.6. calea C4 se caracterizează prin transportul unor mari cantitaţi de malat sau aspartat din celulele mezofilului în celulele tecii perifasciculare şi cantitaţi corespunzătoare de piruvat sau alanina în direcţie opusă. care este apoi convertit la piruvat (fig. Mitocondriile Mitocondria este considerată .PCK” oxalatul este decarboxilat de o PEP-carboxilaza citoplasmatică formându-se acid PEP. procesul de degradare anaerobă a glucozei se desfasoară astfel: ATP fosforilare ADP glucoza fosfokinaza izomerizare glucoza-6-fosfat hexozoizomeraza ATP fosforilare ADP fructoza-6-fosfat fosfofructokinaza dihidroizi-acetona 3-fosfat aldehida-3-fosfoglicerina aldolaza acid piruvic (2 molecule) piruvatkinaza 67 NADH→H+NAD acid-3-fosfogliceric ambele sunt reduse de NADH fructoza-1.6. este convertit în alanina prin transformare. iar la tipul de plante . îndeplinesc în biologia celulei următoarele roluri: asigură în parte degradarea glucozei. datorită echipamentului lor enzimatic. faza anaeroba a oxidării glucozei sau calea formării piruvatului.Degradarea glucozei de către mitocondrii Se admite în general. Prima serie de reacţii este cunoscută sub denumirea de glicoliza. Aceasta noua transaminare este localizată la tipul de plante . 35 B). În linii mari..2. unde din nou.PCK” în citoplasma celulelor perifasciculare. 2. care migrează apoi în teaca perifasciculara de celule.

cofactor: Mn2+ acidul piruvic oxalacetal-carboxilaza. în prezenta oxalacetalcarboxilazei şi a ionilor de Mn2+. identificată recent în membrană mitocondriala externă.5 şi 4 atomi de carbon şi. cetoglutaric. Ciclul Krebs Denumit şi ciclul citric sau ciclul tricarboxilic (deoarece în desfăşurarea lui intervin acizi cu trei grupări –COOH). au putut fi urmărite şi controlate în ultimele decenii cu ajutorul suspensiilor de mitocondrii. acidul acetic provenit din acidul piruvic iniţial. Fazele de desfăşurare a acestui ciclu. prin condensare cu acetil-Co-A. fumaric. iar reacţia lui fundamentală este oxidarea completa a grupării acetil a acetil-Co-A.Co-A Citrat-sintetaza Mg2+ Acidul citric astfel format. reacţie catalizată de citrat-sintetaza. a acizilor graşi şi a majorităţii aminoacizilor până la CO2 şi H2O. succinic. în urma unor izomerizări şi decarboxilari dă naştere la o serie de acizi tri şi dicarboxilici ca acizii: izocitric. malic. în CO2 si H2O să aibă loc intramitocondrial. În acest scop acidul piruvic este convertit în prezenţa coenzimei-A (Co-A) în acetil-Co-A. rezultat din transformarea altei molecule de acid piruvic (provenit dintr-o nouă molecula de glucoza). stabilite de Krebs încă din 1930. acid citric + HS – Co-A 68 . cu punerea în libertate a unei importante cantitaţi de energie. sunt de acord ca ciclul Krebs se desfăşoară exclusiv în mitocondrie şi constitue cea mai importantă cale catabolica aeroba a oxidării hidraţilor de C. acizi cu 6. în etapa extramitocondriala dintr-o moleculă de glucoza rezultă două molecule de acid piruvic (glicoliza). Aceasta oxidare este realizată numai dacă în mediu se găseşte în exces altă substanţă– acidul oxalacetic. care ia naştere în urma carboxilarii în hialoplasma a acidului piruvic. considerată cea mai importantă.Deci. la care participă NAD+ ca acceptor de H+ şi enzima piruvatdecarboxilaza. Acid oxalacetc + acetil . aconitic. pătrundere înlesnită de acetil-Co-A-sintetaza. Prima etapă. se desfăşoară în exclusivitate în matrice. iar acidul oxalacetic activat. s-a degradat în CO2 si H2O. bazându-se pe date experimentale. în ciclul Krebs. aceasta va da naştere acidului citric. constă în pătrunderea acidului oxalacetic în matricea mitocondriei. în schimb toţi biochimiştii. în sfârşit acidul oxalacetic de la care s-a plecat în tot acest timp. urmând ca oxidarea completă a acidului piruvic. Acest ciclu are loc în mai multe etape. reacţiile fiecărei etape fiind catalizate de câte o enzimă. reluând ciclul Krebs (fig. când are loc o reacţie complexă de decarboxilare oxidativa. acid oxalacetic Dacă în legătura cu producerea glucolizei mai există încă deosebire de vederi în ceea ce priveşte nivelul celular la care are loc. 36).

Fig. Ciclul Krebs 69 . 36.

care poate da prin aminare glutamat. Energia chimică rezultată este stocată în ATP (38 de molecule). care pot intra în diverse etape ale ciclului Krebs atât în mitocondria animală. din care 191 provin din lanţul respirator . cercetările au arătat ca acizii aminati rezultaţi din hidroliza proteidelor în urma unui proces de dezaminare oxidativă dau naştere la acizi cetonici. β oxidarea acizilor graşi Lipidele se metabolizează direct sub acţiunea lipazei în glicerol şi acizi graşi. lizinei. Formarea fiecărei molecule de acetil-Co-A reprezentată în urma acestei β oxidări este însoţită de reducerea unei molecule de NAD la NADH2 şi a unei molecule de FAD la FADH2. iar malat-sintetaza. care la rândul său este precursorul argininei.3. că prezenţa acestuia în mediul de cultură determină producerea de zahăr şi de proteine prin intermediul ciclului glicoxalatului datorită izocitrazei şi malat-sintetazei.Co-A care intra în combinaţie cu acidul oxalacetic. treoninei. ciclul Krebs asigură formarea a numeroase substanţe. metioninei. s-a constatat printre altele. 37). Izocitraza descompune acidul izocitric în acizii glicoxalic şi succinic. împreună eliberează 216Kcal.6. bacteriile şi ciupercile întrerup ciclul Krebs la nivelul acizilor izocitric şi malic. În prezenţa ATP. cum sunt: α-cetogentaratul. Căutându-se explicarea acţiunii ionului acetat. totul are loc ca şi când două molecule de acetat au dat naştere prin convertire unei molecule de succinat. De asemenea. 2. ci se combină imediat cu SH-Co-A. cu formare de acid citric care trece în ciclul Krebs unde va fi complet degradat în apă şi CO2.2. acidul oxalacetic dă prin transformare acid aspartic care este precursorul β-alaninei. întregul lanţ lung al acidului gras este transformat integral în CO2 şi H2O şi energie . în urma condensării acidului glicoxalic cu o moleculă de acetat. Molecula de CH3-COOH rezultată nu rămâne liberă. care intervine în sinteza zaharurilor şi proteinelor ce apar în mediul de cultură.6. acidul succinic este precursorul nucleelor tetrapirolice care intra în constituia citocromilor. în urma cărora rezultă două molecule de CO2 (reacţiile III şi IV) şi opt atomi de H+. enzime care lipsesc din celulele animale. În felul acesta.În cadrul ciclului Krebs se disting opt grupe. prolinei şi hidroxiprolinei. intervin sisteme enzimatice în frunte cu HS-Co-A. dă naştere la malat. Ciclul Krebs este conectat cu lanţul respirator şi. dând acetil.2.2. producând treptat pierderea unui acid gras cu doi atomi de carbon mai puţin . ca atare. 2.Ciclul glioxalatului Studiile efectuate în special în ultimele decenii au demonstrat că numeroşi mutanţi de bacterii şi ciuperci cresc şi se dezvoltă mult mai bine pe mediile de cultură cărora li s-a adăugat acetat . Acizii graşi sunt oxidaţi la nivelul mitocondriei. În afara de oxidarea completa a radicalului acetil şi de stocarea energiei. 70 . Schema procesului de oxidare a acizilor graşi a fost elaborată de Lynen şi este reprezentată de o elice în care fiecare spiră corespunde formării unui acetil-Co-A. cât şi în cea vegetală (fig.

iar citocromul c este foarte solubil în apa. sunt denumite flavo-proteine. Din mitocondrii au fost izolaţi mai mulţi citocromi care aparţin claselor a.oxidarea acizilor graşi 2. prin care electronii pierduţi de substanţe (glucide. oxigenul astfel activat devine acceptor de protoni (H+). în care fierul poate exista fie sub forma de Fe2+. 37.Fig..2. de asemenea s-a mai precizat că citocromii mitocondriali a şi b sunt insolubili în apa şi sunt activi numai asociaţi cu fosfolipide. Sistemul transportor de electroni (lanţul respirator) Lanţul respirator denumit şi lanţul citocromic sau sistemul transportor de electroni. derivaţi ai hematinei. Studiile biochimice . NADP. ca FAD sunt în realitate coenzimele hidrogenazelor şi anume NADH2-dehidrogenazei şi succin-dehidrogenazei. 71 . β. Aceste dehidrogenaze cu coenzime flavinice.6.4. dând naştere la H2O. lipide sau protide). c. colorate în galben. Transportul protonilor (H+) şi electronilor ⎯e până la O2 se face prin intermediul nucleotidelor şi citocromului. iar cei de electroni sunt citocromii. Unele din aceste nucleotide. reprezintă ansamblul de reacţii care au loc în mitocondrie.. în timpul dehidrogenarii lor în matrice sunt transportaţi până la oxigen acţionându-l.în situ” şi . b. fie Fe3+.în vitro” au demonstrat că acceptorii de H+ eliberat de substrat sunt NAD. FAD.

Din punct de vedere structural coenzima Q este o chinona cu un lanţ lateral poliizoprenic. în oxizomi. 2. activitatea lui fiind în funcţie de integrarea structurală a oxizomilor.Cercetările biochimice din ultimele decenii au dus la concluzia că în procesul de trecere al H+ pe NAD şi NADP. denumite convenţional I . Conceptul fosforilării oxidative 72 .2. catalizează reacţiile ce au loc de la coenzima Q până la citocromul C. care se găseşte la vârful oxizomului. iar complexul IV. localizat în regiunea mediana. complexul III. Fosforilarea oxidativă Electronii în lungul lanţului respirator suferă o scădere de potenţial. intervine ubichinona sau coenzima Q.6. 38. Green (1964) a reuşit să izoleze din oxizomi patru complexe enzimatice. adică transferul electronilor de la citocromul că la O2. care are loc în etape şi care serveşte pentru regenerarea moleculelor de Fig. Două din acestea. II. au stabilit ca întregul lanţ respirator se afla localizat în membrana mitocondriei interne. III si IV . catalizează reacţiile terminale ale lanţului respirator. I şi II sunt dehidrogenaze şi sunt localizate la baza oxizomului. în vederea activării lui. Studiile de chimie ultrastructurală şi tehnicile de fragmentare a mitocondriei. care la rândul lor îl transportă pe FAD.5. materializată printro eliberare de energie.

După natura acestui produs rezidual şi a echipamentului enzimatic al organismului fermentativ.6. faţă de 45% cât este pentru respiraţie. Dar respiraţia 73 . plantele. Oxidarea completă a unei molecule de glucoză (glicoliză + ciclul Krebs) permite sinteza a 38 de molecule de ATP. care le este nociv (numeroase microorganisme. centrală energetică” a celulei care se dă mitocondriei. decât respiraţia. denumită şi fosforilare cuplată. Metabolismul anaerob este mult mai puţin eficace în ceea ce priveşte producerea de energie. de ex Clostridium) Organisme aerobe facultative. are un rol deosebit de important în reglarea numeroaselor etape ale metabolismului celular şi justificş denumirea de . astfel că plantele cresc în greutate. Organismele care îşi obţin energia din fermentaţie trebuie să descompună cantităţi considerabile de substrat. oxidarea citocromului a. lactică. Fermentaţiile Exigenţa organismelor faţă de oxigen nu sunt identice. care nu pot trăi decât în absenţa oxigenului liber. în timp ce în cursul oxidării complete dintr-o moleculă de glucoză rezultă 38 molecule de ATP. 38). Randamentul fermentaţiei este de 2%. va reduce acidul piruvic. din punct de vedere metabolic. care pot trăi atât în prezenţa cât şi în absenţa oxigenului din mediu. NADH2 format – neoxidat de oxigenul atmosferică din mitocondrie. numită fermentaţie.6. care nu pot trăi decât în prezenţa oxigenului (animalele.ATP prin fosforilarea ADP cu fosfat anorganic (Pi) existent în matricea mitocondriei (fig. fotosinteza construieşte materie organică prin fixarea şi reducerea carbonului mineral.Comparaţie între fotosinteză şi respiraţie Fotosinteza şi respiraţia sunt două procese antagonice dar complementare: din punct de vedere energetic. respiraţia rupe această legătură şi eliberează energie. aceste organisme se numesc . acumulată în legăturile carbon-hidrogen. Astfel se disting următoarele trei grupe: Organismele strict aerobe.6. Reacţiile enzimatice care transformă substratul organic sunt cele de la glicoliză (localizate în citoplasma citoplasma celulară). adoptând o activitate metabolică diferită de respiraţie.. fotosinteza transformă energia luminoasă în energie chimic.descompunători”. o a doua oxidarea citocromului b de către citocromul c şi a treia.3.. levurile aparţin acestei categorii dar şi unele plante superioare care sunt capabile să reziste la asfixie.2. transformându-l întrun „produs rezidual” produs ultim rezidual din procesul fermentaţiei. acetică etc). acest substrat organic este transformat într-un produs rezidual organic. Substratul este deci degradat până la acid piruvic. deoarece fermentaţia nu utilizează în totalitate energia substratului degradat pentru sinteza ATP. Fermentaţia este oxidarea incompletă a unui substrat organic în absenţa oxigenului (metabolism anaerob). Ecuaţia globală a respiraţiei unei molecule de glucoză se poate scrie astfel: C 6 H 12O 6 + 6O2 + 6 H2O→ 6CO2+ 12H2O + 38 ATP 2. Energia astfel stocată sub forma de ATP serveşte în majoritatea cazurilor la biosinteza unor substanţe de mare importanţă. Astfel. de la o moleculă de glucoză fermentată se formează doar două molecule de ATP. Ansamblul acestor reacţii de oxidare şi fosforilare a fost denumit fosforilare oxidativa. Fosforilarea oxidativă. pot exista mai multe tipuri de fermentaţie (alcoolică. unele microorganisme) Organismele strict anaerobe. 2. Formarea ATP are loc în trei etape si anume: o prima etapa o constitue oxidarea NADH2 de câtre FAD. rezultând în final trei molecule de ATP.

Lanţul fotosintetic. energia. Conversia energiei este procesul de bază de care depind toate fiinţele vii. 74 . se datorează aranjamentului membranelor interne. electronii sunt transportaţi de la NADH2 la oxigen. Toate organismele scindează molecule organice pentru a-şi asigura „combustibilul” necesar proceselor vitale. Respiraţia şi fotosinteza sunt procese care se opun reciproc. fotosinteza se manifestă numai în prezenţa luminii. degajând CO2 şi apă. În ambele procese energia electronilor ce se deplasează de-a lungul unui lanţ este folosită pentru sinteza ATP-ului. Intensitatea respiraţiei este identică atât în condiţii de obscuritate cât şi de lumină. mecanismele biochimice sunt antagonice: lanţurile transportorilor de electroni funcţionează în sens opus. dar numai plantele autotrofe sunt capabile să capteze energia solară şi să o transforme în „hrană” . În respiraţie. în aceste două organite. lanţul respirator invers. ambele implică conversia energiei dintr-o formă în alta. Oxigenul fotosintetic degajat în biosferă asigură viaţa organismelor superioare (eucariote) care respiră acest oxigen.degradează rezervele organice (derivaţi de carbon) prin oxidare şi greutatea plantelor scade prin pierderea carbon mineral. aceste reacţii sunt exact în opoziţie una cu alta. Cele două procese au şi etape similare. hidrogenare şi condensare. glucoza construită în cursul ciclului Calvin (faza de întuneric a fotosintezei) prin carboxilare. care este foarte asemănător. dehidrogenată şi decarboxilată de ciclul Krebs. dar. Atât cloroplastul cât şi mitocondria au o ultrastructură asemănătoare. rezultând apă. ceea ce reflectă şi funcţii asemănătoare (transformatori de energie). respiraţia eliberând energia captată (de la soare) de fotosinteză. Lanţul transportatorilor de electroni. ambele participă la menţinerea vieţii şi creşterea organismelor vegetale sau animale. schimburile gazoase sunt în sens invers: fotosinteza absoarbe CO2 şi apă şi degajă O2. prezent atât în mitocondrie cât şi în cloroplast. este „tăiată” de glicoliză. energia chimică este convertită în ATP. permite transportul electronilor de la apă la NADH2. Astfel. În fotosinteză. Formula generală pentru fotosinteză este următoarea: Energie (lumina) + 6CO2 + 6H2O →C6 H 12O6 + 6 O2 Formula generală pentru respiraţie conţine aceeaşi compuşi : C 6H 12 O 6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H 2 O + energie (ATP) După cum se observă din formulele generale ale fotosintezei şi respiraţiei celulare. (lumina) solară este convertită în energie chimică.

variază funcţie de tipul celular. care pot fi diferite calitativ şi cantitativ. care ocupă cea mai mare parte a volumului tisular. Rezistenţa ţesutului epitelial la forţele la forţele mecanice ce acţionează asupra sa este conferită de proteine fibrilare intracelulare (elemente de citoschelet). Selectinele recunosc şi leagă formaţiuni specifice de oligozaharide care aparţin altei celulei.1. în adeziunea celulară. celulelor endoteliale. În ţesutul conjunctiv. domeniile imunoglobulinice şi caderinele. Selectinele sunt importante în răspunsul inflamator. o reţea complexă de macromolecule prezentă în spaţiile interstiţiale şi care se află într-o permanentă interrelaţie cu celulele. recunoaşterea şi aderarea intercelulară este posibilă datorită moleculelor de pe suprafaţa celulară. Un rol important în stabilirea structurilor tisulare îl are matricea extracelulară. b) heterofilică. dacă moleculele suprafeţei celulară care interacţionează sunt identice. care prin asociere dau naştere unităţilor funcţionale. Pentru procesul invaziei neutrofilelor sunt necesare integrine (proteine receptori membranari de recunoaştere). 3. Interacţiunea dintre celule poate fi joncţională ( prin intermediul unor structuri specializate numite joncţiuni celulare) sau non-jonctională ( prin intermediul moleculelor suprafeţei celulare). În acest caz. Selectinele Sunt proteine identificate pe suprafaţa membranară a leucocitelor. proteine de legare care recunosc şi leagă specific moleculele de carbohidraţi de la suprafaţa celulei învecinate. Implicarea joncţiunilor intercelulare şi a matricei. celulele sunt dispersate în matricea extracelulară.Capitolul 3 ADEZIUNEA CELULARĂ. Suprafaţa celulară poate media trei tipuri de aderare: a) homofilică. elementele componente ale matricei asigură stabilitatea tisulară preluând aproape în totalitate stress-ul mecanic. iar matricea extracelulară este slab reprezentată. Ancorarea celulelor în matricea extracelulară se realizează prin joncţiunile celulămatrice. dacă moleculele suprafeţei celulare sunt diferite dar complementare şi c) prin moleculă linker. ce nu aparţine suprafeţei celulare.1. Acest domeniu terminal leagă lectine. plachetelor sanguine. Molecule implicate în aderarea celulă-celulă Din categoria moleculelor suprafeţei celulare implicate în aderarea celulară nonjoncţională fac parte: selectinele. regiuni specializate din membrana plasmatică. care se aşează pe faţa internă a membranei plasmatice. Ele posedă un domeniu citoplasmatic care traversează membrana plasmatică şi un segment extracelular de lungimi variabile care se termină cu un domeniu pentru lectină. numite organe. Legarea selectinelor la carbohidraţi este Ca2+ dependentă. 75 . Astfel. celulele specializate în realizarea unei anumite funcţii se recunosc şi interacţionează specific formând ţesuturi. favorizând invazia neutrofilelor prin peretele vasului la locul infecţiei sau leziunii. manifestând specificitate celulară. celulele sunt strâns unite între ele.1. fapt pentru care se numesc şi proteine transmembranare limfocitare. moleculă extracelulară. JONCŢIUNILE CELULARE ŞI MATRICEA EXTRACELULARĂ În organismele pluricelulare. În ţesutul epitelial. Ele mediază legarea neutrofilelor de peretele vasului de sânge. 3. unde se formează joncţiuni specializate cu suprafaţa altor celule sau cu matricea extracelulară. Sunt implicate în medierea interacţiunii limfocitelor cu peretele venulelor sau cu nodulii limfatici.

eliberarea celulelor oncogene din ţesut şi migrarea lor. blocând fluxul de molecule şi ioni dintre lumenul organelor cavitare şi spaţiile interstiţiale. Domenii imunoglobulinice Unele domenii imunoglobulinice care nu aparţin structurii unui anticorp pot media interacţiuni non-joncţionale celulă-celulă Ca2+ dependete.1.1. Un domeniu Ig conţine proteine de suprafaţă ale unei celule care pot interacţiona cu o moleculă de integrină ale altei celule (de exemplu.caderina în ţesutul epitelial). Domeniul citoplasmatic interacţionează cu proteine din citosol care fixează caderine ce aparţin citoscheletului şi transmit informaţii în citoplasmă.caderina în placentă.3. Aderarea celor două celule adiacente se realizează prin suprapunerea domeniului Ig al unei celule cu domeniul Ig al celulei vecine. Caderinele sunt molecule implicate în recunoaşterea celulelor de acelaşi tip. cu posibilitatea iniţierii metastazelor. homosau heterofilică. respectiv alcătuirea unui ţesut la embrion şi menţinerea integrităţii unui ţesut la adult. aderarea neutrofilului la peretele vascular. interacţiune mediată de NCAMs celulelor endoteliale şi integrinele neutrofilelor). 3. Interacţiunea heterofilică presupune prezenţa integrinelor.adhesion molecules) – factorul de adeziune vasculară – este important în dezvoltarea sistemului circulator la embrion şi în legarea neutrofilelor de peretele vascular înainte de invazie. Din punct de vedere funcţional se deosebesc trei categorii principale de joncţiuni: ƒ Joncţiunile de ocluzie sudează membranele plasmatice ale celulelor epiteliale. structuri specializate şi stabile. Unul dintre aceştia.2. Caderinele sunt alcătuite dintr-un segment lung extracelular ce conţine 5 domenii de legare. un segment transmembranar şi un mic domeniu citoplasmatic.2. NCAMs mediază interacţiunea celulă-celulă. stare necesară legării unei caderine de caderina celulei alăturate. 3. Caderinele de pe aceeaşi suprafaţă celulară se asociază formând dimeri. numit VCAMs (vascular cell.adhesion molecules) sau factorul de adeziune neurală şi L1. Segmentele extracelulare ce aparţin la două celule adiacente pot interacţiona prin juxtapoziţia porţiunilor terminale sau a segmentului în totalitate. aderarea şi menţinerea lor într-un ţesut. P. Membrii numeroşi ai IgSF mediază interacţiunea celulară în elaborarea răspunsului imun. iar L1 mediază alungirea conului de creştere în timpul dezvoltării neuronilor. În cancer. Caderinele au fost identificate în diferite părţi ale corpului (N-caderina în sistemul nervos. Alţi doi reprezentanţi al IgSF sunt NCAMs (neural cell. deci şi caderine de acelaşi tip. Caderinele Sunt reprezentate de o largă familie de glicoproteine de adeziune. Ca2+ leagă segmentele în tandem menţinându-le într-o stare rigidă. Joncţiunea celulară Joncţiunile celulare (joncţiunile intercelulare şi joncţiunile celulă-matrice extracelulară).3. Proteinele care conţin domenii imunoglobulinice aparţin IgSF (superfamiliei imunoglobulinelor). 76 . Caracteristic acestui tip de glicoproteine este faptul că ele leagă intre ele celule de acelaşi tip şi. Ca2+ dependente. permit sau împiedică schimburile intercelulare şi mediază contactele celulă-celulă şi celulă-matrice. E. Ele mediază interacţiuni celulare homotipice non-joncţionale şi joncţionale şi transmit semnale din matrixul extracelular în citoplasmă. ambii foarte importanţi în dezvoltarea sistemului nervos la embrion. se produc modificări conformaţionale ale caderinelor care duc la scăderea adezivităţii celulare.

ƒ ƒ ƒ Joncţiunile de ancorare asigură legarea strânsă a celulelor unele de altele şi a acestora cu matricea extracelulară. difuzează în ţesutul conjunctiv de unde sunt preluate. (fig. sunt rezultatul anastomozei proteinelor joncţionale prezente în membranele plasmatice ale celulelor învecinate. Observarea la microscopul electronic a unei secţiuni prin joncţiunile de ocluzie oferă imaginea a două membrane plasmatice adiacente care din loc în loc se găsesc în contact direct. Un exemplu concret îl constituie absorbţia glucozei din lumenul intestinal. Prezenţa joncţiunilor de ocluzie la polul apical al celulelor face imposibilă retrodifuziunea glucozei din interstiţii în lumenul intestinal. care determină apariţia unor domenii distincte – apical şi laterobazal – în membrana plasmatică a celulelor epiteliale. proces care implică două tipuri de proteine cu o strictă localizare membranară. în circulaţia sangvină. 39 – Joncţiunile strânse sunt formate din mai multe şiruri de perechi de proteine joncţionale situate în regiunea apicală a membranei plasmatice. substratul molecular proteic al joncţiunilor de ocluzie este sugerat de acţiunea denaturantă pe care proteazele o au asupra acestor structuri.39) Fig. Capacitatea de ocluzie variază funcţie de tipul de ţesut epitelial. Aceste structuri joncţionale împiedică deplasarea moleculelor şi a ionilor din lumenul organelor cavitare în spaţiile interstiţiale. În celulele epiteliale sunt pompate selectiv substanţe nutritive care. în ansamblu. imaginea unei centuri situate imediat sub suprafaţa cu microvili a celulei epiteliale (fig. 40). Acest flux unidirecţional al moleculelor. separate de mici spaţii interstiţiale. Eliberarea glucozei în spaţiile interstiţiale se realizează prin difuziune mediată de un set de permeaze. prezent în domeniul laterobazal. Deşi proteinele nu au fost încă izolate. este condiţionat de distribuirea asimetrică a componentelor membranare. Aceste puncte de „sudură”. din lumen prin celulele epiteliale în sânge. Joncţiunile de ocluzie se formează în urma stabilirii contactului între şirurile de proteine aparţinând celulelor alăturate. Joncţiuni sinaptice conectează partea terminală a unui axon neuronal ( butonul terminal) cu celula – ţintă.2. 3. se sugerează existenţa unei relaţii logaritmice între numărul şirurilor de proteine joncţionale şi gradul de impermeabilitate al joncţiunilor pentru diferite specii ionice. În plus. Joncţiunile de ocluzie Joncţiunile de ocluzie („zonulae occludens” – numite şi joncţiuni strânse sau impermeabile (tight jonction) sunt reprezentate la polul apical al celulelor epiteliale ce delimitează lumenul unor cavităţi. Proteinele din domeniul apical (faţa luminală a membranei).1. Proteinele joncţionale sunt ordonat depuse în mai multe şiruri ce înconjoară celula în regiunea apicală. oferind. transportă activ glucoza pompând-o din lumen în celulele epiteliale. Joncţiunile de comunicare sunt implicate în cuplarea electrică şi metabolică a celulelor ce îndeplinesc aceeaşi funcţie. 77 . în urma unui transport transcelular.

cât şi prin menţinerea stabilităţii domeniilor membranare. 3. miocard. Atât joncţiunile de adeziune. glicoproteinele transmembranare interacţionează prin domeniile lor intracelulare cu proteinele de ataşare. Un argument în favoarea acestei afirmaţii este pierderea polarităţii celulare. element esenţial în menţinerea integrităţii joncţiunilor de ocluzie.Fig. Aceste structuri constituie situsuri de ancorare ale filamentelor de actină dispuse în mănunchiuri. 3. Din punct de vedere structural. Proteinele de ataşare intracelulară leagă elementele de citoschelet de complexul joncţional. ca urmare a scăderii concentraţiei Ca2+ în mediul extracelular. cât şi structurile desmozomale se subdivid în joncţiuni de adeziune intercelulare şi joncţiuni de adeziune celulă-matrice şi respectiv. în timp ce. Toate cele patru tipuri de joncţiuni de ancorare coexistă în celulele ţesutului epitelial.2. Acest tip de joncţiune antrenează elementele de citoschelet creând structuri de rezistenţă în celulele supuse stress-ului mecanic (epitelii. 40 – Transportul glucozei în celulele epiteliale ce delimitează lumenul intestinal. funcţie de tipul de contact pe care îl mediază. Benzile de adeziune aparţinând celulelor învecinate se găsesc în opoziţie directă. datorită migrării lipidelor din stratul exoplasmatic şi al proteinelor în membrana plasmatică.filamente de actină sau filamente intermediare – joncţiunile de ancorare se clasifică în joncţiuni de adeziune şi structuri desmozomale. iar prin cele extracelulare cu glicoproteine transmembranare din celulele adiacente. Joncţiunile strânse sunt implicate în menţinerea priorităţii celulelor epiteliale împiedicând difuzia proteinelor transportoare în planul membranei plasmatice Menţinerea polarităţii celulelor epiteliale constituie a doua funcţie a joncţiunilor de ocluzie. imediat sub joncţiunile de ocluzie. desmozomi şi hemidesmozomi. contactul acestora fiind mediat de structurile joncţionale de adeziune intercelulară. joncţiunile de adeziune intercelulară sunt localizate la polul apical. Datorită aspectului lor. aceste joncţiuni au fost numite desmozomi în 78 .2 Joncţiunile de ancorare Joncţiunile de ancorare asigură contactul celulă-celulă şi celulă-matrice extracelulă. joncţiunile de ancorare sunt alcătuite din două clase de proteine: proteine de ataşare intracelulară şi glicoproteine transmembranare de legare. Atât prin împiedicarea schimburilor lumen-interstiţiu.2. Ţinând cont de tipul elementelor de citoschelet asociate . Acestea acţionează în sensul împiedicării difuziei prin dublul strat lipidic al moleculelor ce compun domeniile membranare. miometru etc). Orientate paralel cu membrana plasmatică mănunchiurile de filamente de actină înconjoară polul apical al celulei formând o bandă de adeziune continuă („zonulae adherens”). joncţiunile de ocluzie permit ţesutului epitelial să se comporte ca o barieră cu o permeabilitate selectivă.2.1 Joncţiunile de adeziune intercelulară În celulele epiteliale.

Aceste structuri joncţionale realizează contactul dintre filamentele intermediare ale celulelor adiacente. cu elemente componente ale matricei. structurile desmozomale le sunt asociate filamentele de cheratină. 41). Filamentele de actină interacţionează cu complexul joncţional printr-un set de proteine de ataşare dintre care cel mai bine caracterizate sunt vinculina şi α-actinina. filamentele de desmină. Tipul filamentelor intermediare antrenate de desmozomii în adeziunea intercelulară diferă funcţie de tipul celular. În celulele epiteliale.bandă (belt desmosomes). filamentele de vimentină etc. deoarece din punct de vedere chimic cele două structuri joncţionale sunt deosebite. Conectarea reţelelor transcelulare de filamente de actină asigură adeziunea celulelor epiteliale conferind totodată rigiditate structurii tisulare. Fig.2. membranele plasmatice adiacente sunt menţinute la o distanţă de 15-20 nm una de cealălantă (fig. în celulele mezenchimale. elementul matriceal este fibronectina. ce aparţine familiei integrinelor. desmozomii (desmozomii în pată) constituie regiuni de cimentare intercelulară. vinculina şi talina.2 Joncţiunile de adeziune celulă-matrice extracelulară Joncţiunile de adeziune celulă-matrice asigură contactul dintre celulă şi matricea extracelulară prin conectarea filamentelor de actină. ancorând astfel filamentele de actină în embrana plasmatică. în celulele musculare ale inimii. 42). denumire eronată.2. Glicoproteina (uvomorulina) este un membru al familiei moleculelor de adeziune intracelulară calciu dependente. α-actinina.3 Desmozomii Dependent (fig. iar glicoproteina transmembranară este receptorul pentru fibrobnectină. ce alcătuiesc citoscheletul. numite contacte focale sau plăci de adeziune. La nivelul plăcilor de adeziune se stabileşte contactul dintre mănunchiurile de filamente de actină şi un element al matricei. prin intermediul unei glicoproteine transmembranare. Ca rezultat al acestor interacţii. ce au la bază un mecanism Ca2+ dependent. 41 – Distribuţia proteinelor de legare a actinei şi uvomorulinei la nivelul joncţiunilor de adeziune intercelulară din celulele epiteliale 3. numite caderine. 79 . fiind mediată de cel puţin pentru tipuri de proteine de ataşare: o proteină ce leagă capul filamentelor de actină („actin-filament-capping protein”). 3. Legarea filamentelor de actină de domeniul intracelular al receptorului este indirectă. Vizualizarea la microscopul electronic a desmozomilor oferă imaginea a două discuri dense (15-20 nm grosime). Proteinele de ataşare se leagă de domeniul intracelular al unei glicoproteine transmembranare.2. situate pe faţa citoplasmatică a membranelor celulelor adiacente.2. Domeniul extracelular al glicoproteinei interacţionează cu domeniile extracelulare ale glicoproteinelor din membrana plasmatică a celulelor învecinate. De cele mai multe ori. în urma cărora se formează o reţea transtisulară continuă. Aderarea celulelor la matrice implică regiuni specializate ale membranei plasmatice.

Este alcătuit dintr-o singură placă citoplasmaticăde care filamentele intermediare sunt legate prin capete. unde de regulă se semnalează prezenţa ambelor structuri desmozomale (desmozomi în pată şi hemidesmozomi). 80 . Cele două plăci citoplasmatice din membranele adiacente sunt conectate ca urmare a interacţiunii domeniilor extracelulare ale desmoglinelor printr-un mecanism Ca2+ Fig. 42 – Structuri desmozomale în ţesutul epitelial.2. Studiul desmozomilor a pus în evidenţă implicaţiile funcţionale pe care aceste structuri le au în alte ţesuturi decât cel epitelial. De vreme ce anticorpii afectează doar desmozomii din piele se presupune existenţa unor deosebiri biochimice între aceştia şi cei prezenţi în alte ţesuturi.3 Joncţiunile de comunicare Joncţiunile de comunicare (permeabile.2.2. consolidând structura desmozomală. Legarea plăcii citoplasmatice de lamina bazală este mediată de o glicoproteină transmembranară.4 Hemidesmozomii Hemidesmozomii. 3. (b) Hemidesmozomul asigură ancorarea celulelor în matricea extracelulară. Placa citoplasmatică este alcătuită dintr-un complex de proteine de ataşare – desmoplachine – ce leagă tangenţial filamentele intermediare şi o glicoproteină transmembranară – desmoglina-care interacţionează prin domeniul său intracelular cu proteine de ataşare. Placa citoplasmatică constituie situsul de ancorare a filamentelor de cheratină ce intră în alcătuirea citoscheletului celulei epiteliale. iar în muşchii netezi desmozomii sunt consideraţi echivalenţi funcţionali ai discurilor „Z” din muşchii scheletici. asigură contactul dintre regiunea bazală a membranei celulelor epiteliale şi o structură specializată a matricei extracelulare. În ţesuturile epiteliale. filamentele de desmină asociate desmozomilor constituie o cale de transmitere a forţei de contracţie. 3. ţesutul epitelial este incapabil de a mai funcţiona ca barieră. „gap junction”) au o largă răspândire. Devenit lax. Glicoproteinele transmembranare interacţionează prin domeniile lor extracelulare. fapt ce conferă pielii un aspect vezicular. acestea sunt implicate atât în asigurarea adeziunii celulare. cât şi în distribuirea forţelor mecanice în întregul ţesut epitelial şi ţesutul conjunctiv adiacent. Legarea anticorpilor de desmoglină afectează structura desmozomilor responsabili de aderarea intercelulară a celulelor ţesutului epitelial din piele. regăsinduse în toate ţesuturile organismelor animale. Filamentele intermediare se ataşează tangenţial de plăcile citoplasmatice. În regiunea joncţiunilor de comunicare.numite plăci citoplasmatice. Moleculele aflate în soluţie difuzează printre celulele epiteliale spre exterior. Astfel. În boala Penfigus se sintetizează anticorpi împotriva propriilor glicoproteine transmembranare. numită lamina bazală. similari desmozomilor din punct de vedere morfologic. în celulele ce alcătuiesc ţesutul muscular cardiac. (a) Desmozomul este alcătuit din două plăci citoplasmatice situate pe feţele citoplasmatice ale plasmalemelor celor două celule adiacente.

Prin cuplarea metabolică.2). cu un diametru de 1. ale fiecărei proteine componente delimitează un canal ce străbate membrana plasmatică (fig. a moleculelor cu greutăţi moleculare sub 1500 -2000 Dar (glucide. dintr-o celulă în alta.2. grupuri de celule cu o entitate distinctă se decuplează de restul celulelor urmând o cale comună de dezvoltare.3. Deplasarea mediatorilor intracelulari de la o celulă la alta prin joncţiunile de comunicare. a unor inhibitori ai joncţiunilor de comunicare sprijină această ipoteză. nucleotide. Cele patru domenii membranare prezintă o conformaţie αhelix. dând naştere unor canale de comunicare intercelulară. Fig. hormoni etc. Conexonii. permite trecerea liberă. 43 – a) Joncţiunile de comunicare. Al treilea domeniu α-helix al conexinei are un caracter amfipatic. ƒ peristaltismul intestinal. complexe proteice prezente în membranele plasmatice sunt poziţionaţi cap la cap. numită conexină (280000-320000Da). În interiorul conexonului. 3.1 Structura joncţiunilor de comunicare În alcătuirea joncţiunilor de comunicare intră un singur tip de proteină transmembranară. Apariţia defectelor în dezvoltarea embrionului ca urmare a injectării. sute de conexoni se aglomerează formând cluster-i (mănunchiuri) Conexonii din membranele celulelor învecinate se aşează cap la cap formând un canal de comunicare continuu între citoplasmele celor celule.2 Reglarea permeabilităţii joncţiunilor de comunicare Joncţiunile de comunicare sunt structuri cu caracter dinamic.3. prin canalele joncţiunilor de comunicare pot trece mediatori intracelulari (ioni de Ca. b) Poziţionarea în membrana plasmatică a conexinei-subunitate a conexonului. Aceste particule sunt străbătute de un canal ce face posibil contactul dintre citoplasmele celulelor cuplate prin joncţiunile de comunicare. Pe parcursul proceselor de diferenţiere. AMP-ciclicetc.membranele plasmatice adiacente sunt separate de un spaţiu îngust (2-4 nm grosime) întrerupt din loc în loc de particule cilindrice. în etapele timpurii ale embriogenezei. Canalul. Cuplarea electrică mediată de joncţiunile de comunicare asigură: ƒ sincronizarea contracţiilor celulelor ce alcătuiesc ţesutul muscular. domeniile αhelix amfipatice.1. În regiunea membranară implicată în joncţiunile de comunicare.5-2nm. ce stă la baza coordonării activităţii celulelor într-un ţesut. explică activarea diferiţilor stimuli hormonali (vezi subcap. ƒ propagarea potenţialului de acţiune de la un neuron la altul. implicaţi în reglarea numeroaselor procese metabolice celulare. Joncţiunile de comunicare au un rol important în procesul de embriogeneză.43). Se presupune că primele etape ce urmează fecundării majoritatea celulelor sunt cuplate electric. Lanţul polipeptidic (280 aminoacizi) străbate de patru ori membrana plasmatică.2. proces. celulele sunt capabile să transfere diferite molecule celulelor învecinate incapabile să le sintetizeze. aminoacizi.3. joncţiunile permeabile constituie elementul-cheie al cuplării electrice şi metabolice celulare. 3. Prin asocierea a şase molecule de conexină ia naştere o structură conexon. permeabilitatea lor fiind dependentă de diverşi factori: 81 .)şi a diferitelor specii ionice. Prin stabilirea acestui tip de comunicare intercelulară. De asemenea.).

transmiterea semnalului realizându-se prin AMP-c. Arhitectura. cât şi rolul matricei extracelulare diferă funcţie de tipul tisular. Rolul protocaderinelor este acela de a ţine la distanţa optimă cele două componenete membranare ale sinapsei – membrana presinaptică şi cea postsinaptică.4. pentru a facilita transmiterea sinaptică. Există mai mult de 50 de gene ce controlează sinteza diferitelor protocaderine. Prin această decuplare. Joncţiunile sinaptice Sunt structuri specializate de legătură între neuroni. 44 – Schema modificării conformaţionale a conexonilor Existenţa unui mecanism de reglare a permeabilităţii structurilor joncţionale dependentă de concentraţia de Ca2+din citosol are o importanţă vitală pentru funcţionarea normală a celulelor asociate din ţesuturi. Numărul mare de protocaderine asociate în diferite combinaţii dau specificitatea sinaptică. Creştere permeabilităţii joncţiunilor de comunicare. Alterarea gravă a structurii celulare (ruperea membranei plasmatice. moarte celulară etc. elementele componente. un axon în creştere se ataşează la celula-ţintă Acest tip de joncţiune este mediat de protocaderine (glicoproteine ce aparţin familiei caderinelor.) este însoţită de pierderea unor cantităţii însemnate de metaboliţi celulari. sunt izolate regiunile tisulare afectate. În acest caz. care activează protein kinazele AMP-c dependente. care mediază contactul 82 . migrarea. Un exemplu concret îl constituie răspunsul celular la acţiunea hormonului glucagon.2. Considerată un suport inert ce oferă doar stabilitate fizică ţesuturilor. Fosforilarea conexinei impune adoptarea conformaţiei deschisă de către joncţiuni. 44) Fig.Scăderea pH-ului citosolic. matricea extracelulară se relevă. concentraţia mare a ionilor de Ca impune închiderea joncţiunilor de comunicare dintre celulele deteriorate şi cele şi cele normale. 3. stă la baza activităţii celulare în cascadă. Matricea extracelulară Matricea extracelulară reprezintă o reţea complexă de carbohidraţi şi proteine ce ocupă spaţiile interstiţiale. ceea ce permite trecerea AMP-c din celula activată în celulele învecinate. proliferarea. valoarea potenţialului de membrană la nivelul joncţiunilor. în paralel cu creşterea influxului de ioni de Na şi Ca. Ele fosforilează atât enzimele. conţin 6 domenii extracelulare de legare în tandem). Activarea acestora nu necesită contactul direct cu hormonul. În celulele hepatice stimulate de glucagon. cât şi conexina din structura joncţiunilor de comunicare. numită lamină bazală. La interfaţa dintre ţesutul epitelial şi ţesutul conjunctiv subadiacent. Prin joncţiunea sinaptică. ceea ce face posibilă funcţionarea normală a celulelor în restul ţesutului. în prezenţa unui semnal chimic extracelular. ƒ ƒ ƒ ƒ 3. ce comandă oprirea sintezei de glicogen în celulele hepatice şi eliberarea glucozei în sânge. se află o structură specializată a matricei extracelulare. azi. Modificarea permeabilităţii are la bază capacitatea joncţiunilor de comunicare de a adoptă două conformaţii distincte: închisă şi deschisă (fig. ca o structură dinamică ce joacă un rol esenţial în dezvoltarea. are loc creşterea concentraţiei de AMP-c. semnale chimice extracelulare etc. 3. forma şi funcţiile metabolice ale celulelor cu care se află într-un contact permanent. creşterea concentraţiei Ca2+ liber în citosol.

moleculele leagă diferiţi cationi (în special Na+). toate celelalte clase ale glicozaminoglicanilor prezintă caracteristici comune: ƒ conţin grupări sulfat legate de reziduuri glucidice. pe care se sprijină ţesutul epitelial şi diferitele glande. tendoane şi oase. dispuse în reţea. Ca rezultat al acţiunii forţelor de electrostatică. formând proteoglicani.dintre cele două ţesuturi. sunt responsabile de organizarea matricei. ƒ sunt molecule scurte (mai puţin de 300 reziduuri glucidice) ƒ formează proteoglicani. Atât grupările sulfat. condroitin sulfat şi dermatan sulfat. Specii ionice osmotice active. ionilor şi a moleculelor mici din sânge în spaţiul urinar. Se disting două tipuri de proteine fibrilare: proteine structurale (colagenul şi elastina) şi proteine de adeziune (fibronectina şi laminina). 2. ce se repetă regulat. 3. a legăturilor ce se stabilesc între acestea. de cele mai multe ori. Deşi glicozaminoglicanii reprezintă 10% din masa proteinelor fibrilare. datorită conformaţiei adoptate. Faza apoasă a gelului permite difuzia metaboliţilor. Atât lanţul poliglucidic lung (câteva sute de reziduuri glucidice). Proteinele fibrilare constituie cea de-a doua componentă a matricei. cât şi grupările carboxil ale acidului uronic conferă glicozaminoglicanilor încărcare electrică negativă. acidul hialuronic. prezent în cartilaje. a numărului şi a localizării grupărilor sulfat. 83 . de regulă.1 Glicozaminoglicanii Glicozaminoglicanii reprezintă lanţuri poliglucidice lineare a căror unitate structurală este un diglucid.3. Această reţea proteică este înglobată în gelul hidrat de polizaharide. Lanţurile poliglucidice hidrofile. În ţesutul conjunctiv ce înconjoară capilarele sangvine. Cu excepţia acidului hialuronic. Aceasta determină creşterea turgescenţei matricei extracelulare. cheratan sulfat. cationii cresc gradul de hidratare al matricei. unul din componentele diglucidului este un amino-glucid de tipul N-acetilglucozaminei. 3.1 Componentele matricei extracelulare Macromoleculele ce alcătuiesc matricea extracelulară sunt secretate de către celulele ce se găsesc dispersate în matrice şi care aparţin clasei fibroblastelor. lamina bazală se comportă ca un filtru permiţând trecerea apei. În glomerulii renali. al doilea rest glucidic este. reţeaua intricată de macromolecule din spaţiile interstiţiale permite difuzia liberă a nutrienţilor şi a oxigenului din sânge în celulele ţesuturilor periferice. 4. Funcţie de tipul de reziduuri glucidice. cât şi unităţile diglucidice nesulfatate. În matricea extracelulară sunt prezente polizaharide de tipul glicozaminoglicanilor (GAG) care. definesc acidul hialuronic drept un reprezentant atipic al glicozaminoglicanilor. hormonilor etc. În ţesutul conjunctiv lax. În mod obligatoriu. în spaţiul dintre celule şi în capilarele sangvine.1.3. sunt legate covalent de moleculele proteice. conferindu-i totodată rezistenţă mecanică. Proteinele fibrilare. matricea extracelulară este responsabilă de elasticitatea şi rezistenţa mecanică ale acestor structuri. aceste molecule ocupă cea mai mare parte a spaţiului interstiţial. factor ce conferă structurii rezistenţă la forţele de compresie. 3. În ţesutul conjunctiv dens. se disting patru clase de glicozaminoglicani: 1. acidul uronic. Aminoglucidul din unitatea diglucidică poartă grupări sulfat. adoptă o conformaţie de tip „random coil” („încolăcire aleatorie”). heparan sulfat şi heparină. ƒ conţin unităţi diglucidice diferite dispuse într-o secvenţă complexă.

84 . acidul hialuronic joacă un rol important în migrarea celulelor pe parcursul morfogenezei şi al reparării structurilor tisulare. proteoglicanii formează geluri hidratate. 3.Structura simplă a acestei molecule. proteoglicanii formează agregate ce pot atinge o lungime de 4µm şi o masă moleculară de aproximativ 2 x 108 Da. Lanţurile sunt stabilizate de proteine de legare (fig. componenta proteică. făcând posibilă deplasarea liberă a celulelor şi favorizând proliferarea lor.1. 45 . reacţii de sulfatare şi epimerizare. Structuri heterogene. Concomitent cu procesul de translaţie proteică are loc translocarea proteinei în aparatul Golgi unde este asamblată în proteoglicani. 46). cu densităţi diferite şi pori de mărime variabilă. de care sunt ataşate multiple lanţuri condroitin sulfat şi cheratan sulfat se leagă. prezenţa şi implicarea sa în fazele timpurii ale embriogenezei sugerează faptul că acidul hialuronic este primul reprezentant al glicozaminoglicanilor. unde X poate fi oricare aminoacid. În cartilaje. Componenta proteică a proteoglicanilor este sintetizată la nivelul ribozomilor ataşaţi de RE rugos. În prima etapă a sintezei proteglicanilor. Structura heterogenă a proteoglicanilor sugerează faptul că aceasta nu constituie unica lor funcţie. împiedică adeziunea intracelulară. Eliminaţi în spaţiul interstiţial. Aceste molecule conţin un miez proteic (core) în care sunt ancorate lanţuri de glicozaminoglicani.Structura proteoglicanilor.2 Proteoglicanii Proteoglicanii sunt reprezentaţi în toate ţesuturile conjunctive şi matricele extracelulare. factorul de creştere al fibroblaştilor – FGF). La această secvenţă ce serveşte drept „primer” se leagă unul câte unul reziduurile glucidice printr-o reacţie catalizată de glicozil-transferaza. o secvenţă tricglucidică se leagă covalent de un rest de serină din molecula proteică (fig. Glicozaminoglicanii se leagă prin intermediul unei secvenţe triglucidice de un rest de Ser prezent în structura componentei proteice a proteoglicanilor. Miezul proteic al proteoglicanilor. 45). Cercetări în acest sens au pus în evidenţă capacitatea proteoglicanilor de a lega molecule semnal (ex. numărul şi tipul lanţurilor de glicozaminoglicani. Componenta centrală a acestor agregate o constituie acidul hialuronic. Prin acest mecanism. ce reglează traficul molecular şi deplasarea celulelor funcţie de mărimea sau/şi sarcina lor electrică. proteoglicanii diferă prin greutatea moleculară. Acest fapt. Moleculele de acid hialuronic se leagă de suprafaţa celulelor care migrează. Fig. 3.acoperindule ca o „haina”. Organizarea acestor molecule în matricea extracelulară este încă un subiect controversat. din el derivând celelalte clase. Simultan cu elongarea lanţurilor poliglucidice are loc în aparatul Golgi procesarea acestora. sulfat şi carboxil în lanţurile poliglucidice. necovalent de acidul hialuronic. aranjarea grupărilor hidroxil. Restul de Ser este frecvent localizat în interiorul unei secvenţe specifice de aminoacizi: Asp(Glu)-Asp(Gky)-X-Ser-GlyX-Gly.

Fig. 46 – Proteoglicanii din cartilagii conţin şi acid hialuronic legat necovalent, prin intermediul unor proteine liker de miezul proteic. Pe o singură moleculă de acid hialuronic se pot lega o sută de monomeri de proteoglicani. Acest tip de organizare a proteoglicanilor conferă elasticitate cartilajelor. Proteoglicanii sunt prezenţi şi la nivelul membranelor plasmatice ale multor tipuri celulare. De miezul integrat în membrana plasmatică şi care proemină în spaţiul extracelular este ataşat un număr mic de lanţuri de glicozaminoglicani (fig. 47).

Fig. 47 – a) Proteoglicani prezenţi la nivel la nivelul membranelor plasmatice. Miezul proteic de care sunt ataşate patru lanţuri de heparan sulfat şi două de condroitin sulfat traversează integral membrana plasmatică; b) Legarea lanţurilor de condroitin sulfat la miezul proteic al proteoglicanilor din membrană. În acest caz proteoglicanii sunt implicaţi în legarea celulelor de matricea extracelulară şi în organizarea acromoleculelor ce compun matricea.

85

3.3.1.3 Colagenul Colagenul reprezintă o familie de proteine fibrilare insolubile, sintetizate în fibroblaste şi reprezentate în toate organismele animale la nivelul matricei extracelulare şi a ţesutului conjunctiv. Este principala componentă a matricei extracelulare. Se cunosc poate 12 tipuri de colagen. Dintre acestea tipurile I, II, şi III întâlnite în special în ţesutul conjunctiv, au capacitate de autoasamblare, formând polimeri ce poartă numele de fibrile de colagen. Tipul IV constituie comportamentul principal al laminei bazale, unde formează o reţea bidimensională. a. Structura moleculelor de colagen Unitatea structurală fundamentală a colagenului este o moleculă proteică cu o lungime de 300nm şi un diametru de 1,5 nm, alcătuită din trei subunităţi: două lanţuri α1 şi un lanţ α2. Celelalte trei tipuri polipeptidice, ce conţin fiecare 1050 aminoacizi, se înfăşoară unul în jurul celorlalte, de la stânga spre dreapta, formând o structură de tipul triplu helix. Fiecare rotaţie completă (tur) a helixuluide faptul că conţine trei aminoacizi (fig. 48) Fig. 48 - a) Modelul lanţului polipeptidic alfa din molecula de colagen. Gly ocupă a treia poziţie în secvenţa repetitivă: Gly-X-Y, unde X şi Y reprezintă oricare alt aminoacid. b) Modelul moleculei de colagen. Cele trei lanţuri alfa formează un tripluhelix. Repetiţia glicinei (Gly) la fiecare a treia poziţie, este justificată de faptul că aceasta este singurul aminoacid suficient de mic pentru a ocupa spaţiul din interiorul triplu-helixului. Molecula de colagen este bogată în prolină, lizină, aminoacizi ce apar de cele mai multe ori sub formă hidroxilată. Grupările hidroxil ale hidroxiprolinei participă la formarea legăturilor de hidrogen ce stabilizează triplu-helixul. În boala numită scorbut, datorat deficienţei de vitamina C, este inhibată reacţia de hidroxilare a prolinei, ceea ce împiedică organizarea lanţurilor polipeptidice în triplu-helix. Acestea sunt rapid degradate sub acţiunea unei enzime, numită colagenază. În consecinţă, matricea extracelulară şi vasele sangvine devin extrem de fragile, iar dinţii se desprind din alveolele dentare. Grupările hidroxil ale hidroxilizinei sunt implicate într-o reacţie de glicozilare. Glicozilarea colagenului conferă acestei molecule capacitatea de a se autoasambla în spaţiul extracelular.

86

b. Sinteza colagenului Prezenţa secvenţei repetitive – Gly-X-Y (unde X,Y reprezintă diferiţi aminoacizi cu excepţia glicinei)în structura colagenului, reflectă organizarea genelor ce îl codifică, sugerând faptul că evoluţia acestor gene are la bază fenomenul de duplicare genică. Gena ce codifică lanţul α1 conţine 41 de exoni. Cea mai mare parte a exonilor este alcătuită din 54 perechi de baze (pb) sau multipli de doi sau trei ai acestui număr, sintetizând 1,2 sau 3 unităţi primordiale. O unitate primordială conţine 6 secvenţe repetitive Gly-X-Y. Un număr mic de exoni din structura genei au pierdut, pe parcursul evoluţiei 9pb, unităţile primordiale codificate de către aceştia fiind mai scurte cu o secvenţă Gly-X-Y. Locul de sinteză al lanţurilor polipeptidice ce formează colagenul îl constituie ribozomii ataşaţi de RE rugos. Ca rezultat al translaţiei la nivel ribozomal sunt sintetizate lanţurile pro-α. Acestea sunt introduse în lumenul RE rugos, datorită prezenţei în structura lor a secvenţei semnal („signal peptide”). În regiunile carboxil- şi amino- terminale lanţurile pro-α conţin alte două secvenţe, numite propeptide. Aceste două secvenţe formează domenii globulare, în timp ce restul lanţului adoptă o conformaţie de tip helix. În lumenul RE reziduurile de lizină şi prolină sunt hidroxilate, iar între secvenţele propeptidice a trei lanţuri pro-α se stabilesc punţi disulfurice intercatenare. Ulterior formării legăturilor disulfurice, lanţurile se unesc (direcţia C - N), generând molecula de procolagen. Din RE, procolagenul este transportat în aparatul Golgi, unde se desfăşoară mai multe runde de procesare ce constau, în principal, în adaosul de reziduuri glucidice la hidroxilizină. Moleculele de procolagen sunt eliminate din aparatul Golgi în spaţiul extracelular. Sub acţiunea procolagen peptidazelor, secvenţele sunt clivate proteolitic, molecula de procolagen fiind convertită în colagen. Proteoliza secvenţelor propeptidice în spaţiul extracelular împiedică autoasamblarea colagenului în interiorul celulei,ceea ce ar avea drept consecinţă distrugerea celulară. c. Asamblarea moleculelor de colagen în spaţiul extracelular În spaţiul extracelular, moleculele de colagen (numit şi tropocolagen) de tip I, II şi III se asociază spontan formând polimeri ordonaţi ce poartă numele de fibrile de colagen (50nm în diametru). În fibrile, moleculele sunt dispuse în şiruri longitudinale. Între moleculele învecinate ale aceluiaşi şir există o distanţă („gap”) de 35 nm. Moleculele de colagen din şirurile adiacente sunt deplasate unele faţă de altele cu 67 nm, ceea ce reprezintă mai puţin de o pătrime din lungimea totală a moleculei. Se constată că din cinci în cinci molecule de colagen sunt aliniate identic (fig. 49). Spaţierea colagenului în fibrile conferă aceştia o maximă elasticitate. În regiunile amino-şi carboxil-terminale ale colagenului există segmente scurte ce au o conformaţie triplu-helix. Resturile de lizină sau/şi hidroxilizină din aceste regiuni participă la legături covalente încrucişate ce se stabilesc între extremitatea carboxilică a unei molecule adiacente. Aceste legături au rolul de a stabiliza asamblarea colagenului în fibrile. Organizarea fibrilelor diferă de la ţesut la altul. În piele, acestea se întretaie creând o reţea laxă. În oase şi în cornee, fibrilele de colagen sunt dispuse în plăci ordonat aranjate; fibrilele aceleiaşi plăci sunt paralele între ele şi perpendiculare pe cale ale plăcilor adiacente. În tendoane fibrilelor formează mănunchiuri, numite fibre. Fibrele sunt dispuse paralel şi orientate pe direcţia forţei ce acţionează asupra tendonului.

87

Fig. 49 – a) Sinteza colagenului şi asamblarea sa în fibre în spaţiul extracelular. 3.3.1.4. Elastina Elastina este o proteină neglicozilată, puternic hidrofobă, a cărei secvenţă de aminoacizi (830) este bogată în glicină şi prolină. Este proteina majoră a reţelelor de fibre elastice din matricea extracelulară. Spre deosebire de colagen, are un conţinut scăzut de lizină. În matricea extracelulară, resturile de lizină ale moleculei proteice participă la formarea legăturilor covalente încrucişate ce stabilizează elastina într-o reţea (filamente sau foiţe) ale cărei ochiuri îşi modifică forma în raport cu direcţia forţei ce acţionează asupra sa. Elasticitatea reţelei se datorează capacitaţii moleculelor de elastină de a adopta mai multe conformaţii random-coil. Oscilarea între conformaţii caracterizate de diferite grade de relaxare a moleculelor de elastină asamblate în reţea, conferă acestei proteine proprietăţi elastice similare cauciucului. Filamentele de elastină reprezintă constituenţi principali ai reţelei de fibre elastice prezente în matricea extracelulară din piele, vase sangvine sau plămâni. Componentul minor al fibrelor elastice este o glicoproteină. Dispusă pe suprafaţa fibrelor, glicoproteina intervine în organizarea moleculelor de elastină.

88

3.3.1.5. Fibronectinele Fibronectinele aparţin clasei glicoproteinelor de adeziune, a căror funcţie principală este de a media adeziunea celulă-matrice extracelulară. Fibronectinele au un rol important în menţinerea formei celulelor, în organizarea citoscheletului, iar pe parcursul embriogenezei sunt implicate în migrarea şi diferenţierea celulară. În organismele animale, fibronectinele sunt întâlnite în: ƒ sânge şi alte fluide, sub formă de dimeri solubili, favorizând fagocitoza, migrarea celulelor imune (în special macrofage), ataşarea trombocitelor de regiunile alterate ale vaselor sangvine; ƒ ataşate tranzitoriu pe suprafaţa celulară, ca oligomeri de fibronectină; ƒ în matricea extracelulară, unde formează fibre insolubile. a) Structura fibronectinelor Se cunosc mai multe tipuri de fibronectine. Codificate de către o unică genă (70 kb), fibronectinele sunt rezultatul splicing-ului alternativ al moleculei de ARN-m. Funcţie de tipul celular, pot fi generate una până la 20 molecule diferite de ARN-m pentru fibronectină ce dau naştere unui număr echivalent de lanţuri polipeptidice. Din punct de vedere structural, fibronectina este un dimer alcătuit din două subunităţi identice. Regiunile carboxiterminale ale celor două lanţuri polipeptidice (2500 aminoacizi fiecare) ce formează dimerul sunt legate printr-o pereche de punţi disulfurice. Fiecare subunitate prezintă şase domenii globulare, unite prin regiuni flexibile ale lanţului polipeptidic. Fiecare domeniu globular asigură legarea specifică a fibronectinei la receptori celulari, colagen, fibrină şi proteoglicani sulfataţi (figura 50). Identificarea, izolarea şi secvenţializarea domeniului prin care fibronectina se leagă la suprafaţa celulară au condus la evidenţierea unei secvenţe tetrapeptidice-Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS). Secvenţa RGD este comună mai multor proteine extracelulare de adeziune. Ea permite recunoaşterea şi legarea proteinelor de către integrine, o familie de receptori de membrană omologi. Dată fiind specificitatea recunoaşterii receptor-ligand, se sugerează implicarea, în acest proces, şi a altor secvenţe din structura proteinelor de adeziune. Fig. 50 – a) Structura fibronectinei. Cele două lanţuri polipeptidice sunt legate prin punţi disulfurice. Fiecare lanţ prezintă domenii globulare ce leagă specific molecule din matricea extracelulară sau receptori de membrană; b) domeniile de legare specifică au fost puse în evidenţă prin digestie cu proteaze. Se cunosc şase domenii: • două pentru heparan sulfat; • două pentru fibrină; • unul pentru colagen; • unul pentru receptorul fibronectinei.

89

etc. c) Migrarea şi aderarea fibroblastelor în matricea extracelulară – proces ce implică recunoaşterea fibronectină – receptor În organismele animale adulte. interacţionează cu alte elemente ale matricei extracelulare (colagen. Segmentele sunt legate între ele printr-o punte disulfurică . se stabilesc şi se desfac succesiv contactele celulă-matrice.α şi β.b) Receptorul pentru fibronectină-reprezentant al familiei integrinelor Receptorul pentru fibronectină este un heteromer alcătuit din două lanţuri polipeptidice . din interiorul celulei. În momentul în care deplasarea încetează. asigură aderarea celulei la matricea extracelulară. receptorul pentru colagen este reprezentat de o glicoproteină transmembranară cu o structură diferită de cea a integrinelor. 52). Fibrele de actină se ataşează prin intermediul vinculinei şi a talinei de receptorul pentru fibronectină. Toate aceste molecule au o structură similară. Pe de altă parte. 51 – Structura receptorului pentru fibronectină Rolul moleculei receptor este de a media contactul dintre fibronectină (recunoaşte secvenţa RGDS) şi elementele din structura citoscheletului (filamentele de actină). la rândul săau. Fig. Contactul dintre fibronectine. Receptorul leagă fibronectina care. pe parcursul migrării fibroblastelor. în care fibroblaştii şi celulele sistemului imun migrează spre zona afectată. Ambele lanţuri polipeptidice ale receptorului sunt glicozilate (figura 51). în anumite celule. din spaţiul extracelular şi mănunchiurile de fibre de actină. imobilizându-l în membrana plasmatică (fig. Datorită mobilităţii laterale a receptorului în membrana plasmatică. unul transmembranar şi altul extracelular. O excepţie o constituie procesul de reparare a leziunilor. Lanţul β conţine secvenţe repetitive bogate în cisteină. Receptorul pentru fibronectină este un membru al familiei integrinelor. fibronectina este recunoscută şi legată de receptorul pentru fibronectină din membrana plasmatică a fibroblastelor. în citoplasmă se organizează fibrele de stres bogate în actină. Mai mult. fiind implicate în legarea componentelor matriceale de elementele citoscheletului. mediat de receptorul pentru fibronectină. Fibronectina. o parte din receptorii pentru colagen. secretată de către fibroblaşti se leagă printr-unul din domeniile sale globulare la fibrină. migrarea celulară este un fenomen rar întâlnit. Nu toţi receptorii pentru constituenţii matricei extracelulare aparţin familiei integrinelor. Lanţul α (140. proteoglicani). 52 – Modelul regiunii de contact fibroblast-substrat. 90 . Fig. Din această familie mai fac parte receptorul pentru laminină.000 Da) este scindat în două segmente. asociate prin legături necovalente. Aceste fibre se leagă de receptor prin intermediul proteinelor de ataşare intracelulare (vinculina şi talină). Aceste celule traversează cheagurile sangvine al căror element constituent principal este fibrina. prezentând secvenţa specifică RGD.

Ea înconjoară celule individuale (musculare. ceea ce justifică apariţia unor discontinuităţi în structura truplu-helixului. colagenul de tip IV este alcătuit din trei lanţuri polipeptidice ce formează un truplu helix (40 nm lungime). ƒ un strat electrono-dens (lamina densa). proteoglicanii (heparan sulfat) şi laminina sunt elemente comune tuturor acestor structuri. Regiunile amino terminale ce predomină de o parte şi de alta a planului reţelei se asociază prin legături covalente generând o reţea multistratificată (figura 53).3. Dimerii se asociază lateral prin regiunile cu conformaţie triplu-helix dând naştere unei reţele plane cu ochiuri hexagonale. 3. b) Laminina-glicoproteină majoră a lamilei bazale Laminina este localizată pe faţa dinspre membrana plasmatică a lamilei densa mediind legarea lamilei bazale de suprafaţa celulară. Ele reprezintă elementul constituient major al lamilei densa ce compune lamila bazală. secvenţele propeptidice amino-şi carboxi-terminale ale colagenului IV nu sunt scindate proteolitic după eliberarea sa în mediul extracelular. endoteliale şi mezenchimale. separând aceste celule de ţesutul conjunctiv subadiacent. La microscopul electronic. structură specializată a matricei extracelulare. un lanţ lung A şi două lanţuri mai scurte B. Secvenţa repetitivă Gly-X-Y.3. Molecula (850. adipoase. delimitează suprafaţa bazală a celulelor epiteliate şi endoteliale. Deşi compoziţia lamilei bazale variază de la un ţesut la altul. Lamina bazală Lamina bazală.1. este întreruptă de aproximativ 20 de ori în molecula de tip IV. lanţurile sunt unite prin punţi disulfurice într-o structură 91 .000 Da) este alcătuită din trei lanţuri polipeptidice. lamila bazală apare din trei straturi: ƒ un strat electrono-transparent (lamina lucida sau lamina rara) situat în imediata vecinătate a membranei plastice a celulelor ce se sprijină pe lamila bazală. ƒ un strat cu aspect reticular (lamina reticularis) alcătuit din colagen şi care are rolul de a lega lamila bazală de ţesutul conjunctiv.3. 53 – Modelul asocierii moleculelor de colagen de tip IV şi formarea reţelei multistratificate. Existenţa zonelor de discontinuitate conferă întregii molecule o mai mare flexibilitate.2. Structura laminei bazale Moleculele componente ale lamilei bazale sunt sintetizate sunt sintetizate de către celulele epiteliate. Similar moleculelor de colagen fibrilar. a) Colagenul de tip IV Moleculele de colagen de tip IV sunt prezentate în exclusivitate în lamila bazală. Fig. În această reţea. colagenul de tip IV. moleculele de colagen sunt stabilizate prin legături covalente încrucişate şi punţi disulfurice. Spre deosebire de moleculele de colagen interstiţial. caracteristică tuturor moleculelor de colagen. Secvenţele propeptidice carboxi-terminale formează domenii prin intermediul cărora monomerii interacţionează formând dimeri lineari. celule Schwann) sau se află interpusă între două straturi unicelulare în glomerulii renali şi în alveolele pulmonare.2.

Ca şi fibrotectina. 92 . La nivelul joncţiunilor neuromusculare.2.un situs de legare a colagenului IV. Funcţiile laminei bazale Lamina bazală se caracterizează printr-o pronunţată heterogenitate funcţională determinată de necesităţile fiziologice ale diferitelor ţesuturi. . Receptorii pentru laminină diferă funcţie de tipul celular. 54 – Structura lamininei Proteina prezintă trei lanţuri polipeptidice (A. În glomerii renali. iar braţul scurt are un singur domeniu (figura 54).cruciformă. creşterea şi diferenţierea celulară sunt independente de legarea receptorilor celulari la elementele componente ale laminei bazale. Reglarea funcţiilor celulare vitale: adeziunea.un situs de legare a proteoglicanilor sulfataţi. laminina conţine mai multe domenii funcţionale: câte un domeniu leagă colagenul IV şi heparan sulfatul. Fig. Cele trei braţe scurte ale moleculei de laminină prezintă câte o pereche de domenii globulare.3. 3. .două sau mai multe situsuri de legare la receptori de membrană. lamina bazală prezintă o compoziţie chimică particulară ceea ce-i permite exercitarea funcţiei de coordonare a organizării spaţiale a componentelor joncţionale de o parte şi de alta a sinapsei. lamina bazală constituie eşafodul pe care celulele migrează îndreptându-se spre zona afectată. lamina bazală susţine celulele epiteliale şi totodată funcţionează ca un filtru molecular şi celular între cele două compartimente tisulare. iar unul sau mai multe domenii sunt implicate în legarea receptorului prin laminină. Interpusă între ţesutul epitelial şi ţesutul conjunctiv subadiacent.2. În regenerarea tisulară. dar cel puţin o parte a acestora aparţin familiei integrinelor. B1 şi B2) şi conţine mai multe domenii funcţionale: . rolul laminei bazale constă în reglarea traficului de molecule din sânge în urină.

filamente de actină. conferind acestora rezistenţă. aceste structuri coordonând motilitatea celulară. ƒ contracţia musculară. Principalele mişcări celulare asigurate de elementele de citoschelet sunt: ƒ mişcarea cililor şi a flagelilor. Acesteia i se adaugă o funcţie motilă. filamente intermediare. ƒ deplasarea celulelor ce prezintă un tip de locomoţie ameboidal.are la baza reacţiile de polimerizare şi depolimerizare ale microfilamentelor şi ale microtubuliilor. Slauttersack (1963). Microtubulii Au fost evidenţiaţi pentru prima dată. fie fasciculaţi. şi un rol dinamic. dând naştere unor formaţiuni cu caracter efemer – fibrele fusului de diviziune. dar nu afectează 93 .citoscheletul are în principal o funcţie de susţinere. intervenind ca parte componentă a citoscheletului. ƒ transportul intracelular de particule. 4. ƒ translocarea cromozomilor în timpul diviziunii celulare.de a interconecta elementele de citoschelet în reţea şi de a le lega de organitele celular şi/sau membrana plasmatică. Principalele mişcări asociate microtubulilor sunt: ƒ mişcările cililor şi flagelilor ce asigură deplasarea celulelor libere. Se apreciază că realizarea acestora funcţii constituie rezultatul cooperării citoscheletului cu reţeaua microtrabeculară.axoni). 4. care a introdus şi termenul de microtubul.1. vezicule şi organite celulare (nucleu. funcţie de necesitaţile celulare. prin intermediul proteinelor de adeziune intracelulară. solidarizează celule în ţesuturi. temperaturile scăzute şi presiune hidrostatică mare determină degradarea microtubulilor citoplasmatici şi a celor ce alcătuiesc fusul mitotic. ƒ desfaşurarea citokinezei. Microtubulii îndeplinesc în celulă un rol structural. mobile. în inducerea şi menţinerea geometria spaţială a celulelor. Interacţiunea elementelor de citoschelet cu membrana plasmatică. Proteinele asociate au rol de a regla procesele de polimerizare şi depolimerizare ale filamentelor. corpusculi bazali şi axonemele organitelor locomotorii (cili. flageli). Implicat în inducerea şi menţinerea formei celulei şi a prelungirilor celulare (cili. ei se găsesc fie izolaţi – microtubuli citoplasmatici. vezicule de transport şi organite celulare. în celulele animale de către d. la nivelul structurilor joncţionale. Citoscheletul este o structură dinamică. ƒ transportul intracelular de particule materiale. o reţea microtrabeculară şi din proteine asociate. plastide. cu ajutorul microscopului electronic. Capacitatea sa de a-şi modifica structura.flageli. sau permanent – centrioli.Capitolul 4 CITOSCHELETUL Citoscheletul este alcătuit din microtubuli.microvili. Microtubulii – semnificaţia biologică Microtubulii sunt substructuri celulare omniprezente în citoplasma celulelor eucariote.1. mitocondrii) ƒ translocarea anafazică a cromozomilor.1. Studiul comparativ al microtululilor din diferite compartimente celulare a arătat că tratamentul cu colchicină. În citoplasmă.

Alte proteine asociate prezente în celulele nervoase sunt MAP1-MAP2. sunt rezultatul unui proces de splicing (combinare) alternativ. Cele două componente proteice ce compun heterodimerul sunt dispune heicoidal în peretele microtubulului. în afara heterodimerilor de tubulină. iniţial. 55). Dar raportul cantitativ constant dintre proteine şi subunităţile de tubulină. a condus la concluzia că proteinele sunt asociate specific tubulinelor. Ciclurile de fosforilare şi defosforilare ale acestora pot constitui o etapă importantă în reglarea asamblării microtubulilor. Majoritatea proteinelor asociate sunt fosforilate. Această presupunere este confirmată în cazul proteinei tau ce prezintă activitatea ATP . Proteinele asociate au rol de a consolida structurile microtubulare prin interconectarea microtubulilor adiacenţi şi de a stabiliza edificiul arhitectural al citoscheletului prin legarea filamentelor intermediare. conferă microtubulilor un caracter polar. motiv pentru care au fost numite proteine asociate microtubulilor (microtubule associated proteins . aşezaţi cap la coadă. MAP1 este asociată microtubulilor din axoni şi dendrite. Aceste rezultate demonstrează existenţa unei populaţii heterogene de microtubuli.1.000 Da). observat pe parcursul mai multor cicluri de polimerizare şi depolimerizare. (fig. microtubuli din organitele locomotorii). diversele structuri microtubulare conţin diferite tipuri de molecule proteice.000 Da). Structura microtubulilor În imaginile electronomicroscopice. de tubulină în protofilamente. ce poartă numele de tubulină (100. 94 . microtubulii se disting ca structuri cilindroide de lungimi variabile (până la zeci de nm) şi cu un diametru relativ constant de 24 nm. Fiecare microtubul este alcătuit din 13 protofilamente dispuse paralel cu axul longitudinal şi care delimitează un lumen. s-a observat prezenţa unor proteine cu mase moleculare diferite. localizate exclusiv în structurile microtubulare din axonii celulelor nervoase. cele cinci proteine tau cunoscute astăzi. în timp ce MAP2 este întâlnită doar în structurile microtubulare din dendrite.MAP).2. Codificate de o unică genă.azică şi care acţionează în sensul accelerării polimerizării microtubulilor. 4. s-a considerat că acestea sunt proteine de contaminare. ce este conservant în toate structurile microtubulare. este alcătuită din două proteine distincte: alfa şi beta tubulina (fiecare 50.structurile microtubulare stabile (cetrioli. Orientarea dimerilor. Protofilamentele sunt rezultatul asocierii cap la coadă a unui număr variabil de heterodimeri. tubulina. În preparatele pure de microtubuli. Unitatea fundamentală a microtubulilor. Fig. 55 – Modelul structurii tridimensionale a microtubulilor. (Fiecare din cele 13 protofilamente ce alcătuiesc peretele microtubulului este formată din heterodimeri de tubulină α şi β. Deoarece. corpusculi bazali. Cele mai bine caracterizate proteine asociate sunt proteinele tau.

observaţiile electrono-microscopice subliniază funcţionalitatea diferită a extremităţilor acestor structuri. Prezenţa structurii GDP este asociată cu instabilitatea microtubulilor. polimerizarea microtubulilor este favorizată. viteza de disociere a dimerilor depăşeşte viteza de polimerizare. Pe parcursul polimerizării sau în etapa imediat următoare încorporării dimerului (preferenţial la capătul +). Fiecare dimer de tubulină conţine două molecule de GTP. alţii suferă un proces de depolimerizare. Când concentraţia dimerilor liberi depăşeşte valoarea critică predomină procesul de polimerizare. Studiul dinamicii microtubulilor. în timp ce unii microtubuli sunt subiectul unor repetate şi rapide procese de polimerizare şi depolimerizare. a evidenţiat aspecte surprinzătoare şi aparent contrare rezultatelor. sub concentraţia critică. în culturi de celule. În consecinţă. numărul dimerilor adăugaţi fiind egal cu cel al subunităţilor disociate de microtubuli. Se demonstrează astfel caracterul dinamic al microtubulilor. Polaritatea şi dinamica microtubulilor Geneza microtubulilor este un proces de autoasamblare a tubulului. este un proces mult mai rapid. dar alungirea primer-ului. are ca rezultat depolimerizarea microtubulilor. În consecinţă. Studiile în vitro au demonstrat formarea microtubulilor într-o soluţie pură de dimeri. asupra stabilităţii microtubulilor. În ceea ce priveşte influenţa celui de-al doilea factor. Capătul opus a fost notat cu minus (-). Deşi adăugarea sau pierderea subunităţilor de tubulină poate avea loc în oricare din capetele microtubului. concentraţia dimerilor liberi reprezintă principalul factor implicat în reglarea polimerizării şi depolimerizării microtubulilor. simbolizat cu plus (+). Manifestarea simultană a fenomenelor de creştere şi descreştere în lungime a microtubulior este explicată prin modelul dinamic (dynamic instability model). Viteza reacţiilor de polimerizare şi depolimerizare este de două ori mai mare la unul din capete. scăderea concentraţiei de tubulină. Această concentraţie a fost numită concentraţie critică (Cc). în aceeaşi celulă (la aceeaşi concentraţie a dimerilor liberi) alţi microtubuli se alungesc continuu sau rămân la o lungime constantă pe parcursul perioadei de observaţie. cu atât este mai favorizată formarea unui cap GTP şi deci.4. se desfăşoară lent. Viteza mare a hidrolizei GTP are un efect contrar. concentraţia dimerilor liberi este superioară valorii critice.1. determinând depolimerizarea cu eliberarea dimerilor αβ stabili. cu cât viteza de hidroliză a GTP este mai mică.3. Modelul susţine că variaţiile locale ale celor doi factori pot determina evoluţia diferită a microtubulilor dintr-o celulă. Stabilitatea microtubulului apare reglată de doi factori concentraţia de tubulină liberă şi viteza reacţiei de hidroliză a GTP. In vitro. Creşterea temperaturii la 37ºC este însoţită de reasamblarea microtubulilor. 95 . în timp ce. se constată că. prin adăugarea de noi dimeri de tubulină. Microtubulii care au o strucrură cap GTP. Sinteza microtubului primer. experimentelor in vitro. iar viteza acestei reacţii este mai mare decât cea a hidrolizei GTP. la o anumită concentraţie a dimerilor liberi de tubulină se atinge o stare de echilibru (steady state). GTP este hidrolizat la GDP (guanozin difosfat). Acest model sugerează că o anumită structură a extremităţilor microtubulilor de determină adăugarea sau disocierea subunităţilor proteice. prima etapă a polimerizării. sunt stabili şi pot servi ca primer-i în procesul de polimerizare. în timp ce unii microtubuli se alungesc. alungirea microtubulului. Se constată astfel. că. Expunerea unei soluţii de microtubuli la temperaturi scăzute (0ºC) are un rezultat contrar. în prezenţa GTP (guanozin trifosfat) şi a ionilor bivalenţi. se pot alungi. Dacă. ceea ce conduce la formare GDP. La o concentraţie scăzută a tubulinei libere (C < C C ). determinând o accelerare a depolimerizării. structuri ce-şi modifică lungimea ca rezultatul a reacţiilor de polimerizare şi depolimerizare. la 37ºC. la extremitatea + se formează un cap GTP.

Aceşti factori a căror existenţă a fost demonstrată prin cercetări experimentale poartă numele de centrii organizatori ai microtubulilor (MTOC) sau centrii de nucleaţie. tubulinele alfa sunt antrenate într-o reacţie de acetilare a unui rest de lizină şi suferă adiţia sau deleţia unei tirozine carboxi-terminale. dispunem de numeroase argumente ce atestă faptul că cel puţin centriolii şi corpusculii bazali acţionează ca centrii organizatorici ai micritubulilor.Microtubulii citopasmatici au capătul (-) ancorat în regiunea pericentriolară.Microtubulii fasciculaţi dau naştere fibrelor fusului de diviziune ce se diferenţiază între cei doi centrii celulari prezenţi la polii opuşi ai celulei.Microtubulii ce intră în structura axonemei au capătul poziţionat proximal faţă de corpusculul bazal. la organismele eucariote. rezultatul modificărilor posttranslaţionale. 4. Secvenţele de aminoacizi ale izotipurilor de alfa şi beta tubulină sunt aproape identice la păsări şi rozătoare. în mare parte.1. La tubulinele beta se remarcă modificări ale segmentelor carboxi –terminale. deoarece modificările posttranslaţionale nu afectează semnificativ funcţionalitatea microtuburilor. Aceste proteine sunt codificate de aceleaşi gene sau de gene diferite. 56 – Orientarea microtubulilor în raport cu centrele de nucleaţie: A – Celulă ciliată aflată în interfază. structurile rezultate prin asocierea acestora sunt foarte diferite. chiar şi în cadrul aceleiaşi celule. diferenţierea şi dispunerea acestor formaţiuni celulare. Astfel.5. caz în care poartă numele de izotipuri. Bazele diversităţii structurilor microtubulilor Deşi toţi microtubulii prezintă o organizare fundamentală comună. Iniţial.1. a subtipurilor de alfa şi beta tubulină. Diferenţele dintre subtipuri sunt.Microtubulii din axon sunt orientaţi cu capătul spre corpusculul bazal.Microtubulii din dendrite nu au o orientare fixă. Recent. Astăzi. particularităţile acestor structuri fiind dictate de tipul proteinelor asociate ce copolimerizează cu tubulinele sau se leagă de microtubuli ulterior polimerizării. 96 . Microtubuli au o orientare strictă în raport cu centrele de nucleaţie (fig. C – Celulă aflată în mitoză. diversitatea structurilor microtubulare a fost pusă pe seama existenţei. s-a demonstrat că heterogenitatea subunităţilor de tubulină nu poate explica diversitatea structurilor microtubulare. Centrii organizatorici ai microtubulilor Distribuţia nealeatorie a microtubulilor în celulă a condus la ipoteza existenţei unor factori ce controlează nucleaţia.4. Fig. 56). Este posibil că aceste modificări structurale să condiţioneze încorporarea subunităţilor în diferite structuri microtubulare şi legarea lor la proteinele asociate. B – Celulă nervoasă. Cercetări efectuate pe structurile microtubulare din neuron au condus la concluzia că fiecare microtubul conţine subunităţi alfa şi beta echivalente funcţional.4.

2 µm diametru şi 0. de o zonă mai puţin densă şi relativ omogenă. localizate la baza organitelor locomotorii şi care poartă numele de corpusculi bazali. Cercetările experimentale au demonstrat faptul că centriolii izolaţi sau însoţiţi de materialul pericentriolar sun capabili să iniţieze polimerizarea tubulinei in vitro şi să coordoneze nucleaţia microtubulilor in vivo. De la această orientate fac excepţie microtubulii din dendritele şi axonii neuronilor. (fig. la rândul său. asemănătoare unei roţi cu spiţe. 97 .1. centriolii stau la baza fenomenelor de motilitate manifestate în timpul diviziuni celulare.B şi C dinspre lumenul cilindrului spre exterior. echidistant şi înclinate la un unghi de 30-40˚. Fiecare fibrilă este formată din 3 subfibrile reprezentate de trei microtubuli. Fibrilele sunt imobilizate într-o matrice amorfă ce înconjoară cilindrul. iar corpusculii bazali.1. capetele (+) distale sunt libere. ei sunt dispuşi fie cu capătul (+). coordonează mişcările cililor şi flagelilor. Pe lângă rolul de centri organizatori ai microtubulilor. înconjuraţi de o zonă citoplasmatică amorfă. numită centrul celular. numită centrozom sau regiune pericentriolară. capătul (-) este orientat spre corpul celular. din care lipsesc centriolii.5. Ultrastructura centriolilor şi a corpusculilor bazali Studiile de microscopie electronică au condus la elucidare ultrastructurii centriolilor şi corpusculilor bazali. Datorită absenţei centrului organizator în dendrite. 4.5. Pereţi cilindrului sunt constituiţi din 9 fibrile dispuse circular. În formarea microtubulilor ce alcătuiesc axonemele cililor şi flagelilor sunt implicate alte structuri microtubulare. Este posibil ca aceştia să dicteze şi poziţionarea microtubulilor liberi de vreme ce. fie cu capătul (-) spre corpul celular. delimitată. Ambele structuri microtubulare au forma unui cilindru ( 0. microtubulii nu păstrează aceeaşi polaritate. La capătul proximal al centriolilor şi corpusculilor bazali se constantă prezenţa unui miez cilindric central. Această structură. Subfibrilele din fiecare triplet sunt notate cu A. În imaginile electronomicroscopice se observă însă că microtubulii nu au ca punct de plecare centriolii.4 µm lungime ). interconectat cu fibrilele periferice.2.1. îl constituie păstrarea capacităţii de organizare a microtubulilor în celulele eucariote. Un argument în plus. ei radiind din regiunea pericentriolară. format din 13 protofilamente. Centriolii şi corpusculii bazali În coordonare asamblării microtubulilor şi a motilităţi celulare un rol-cheie îl joacă structurile microtubulare specializate. 4.Capetele (-) sunt inserate în centrul organizator şi stabilizate de proteinele asociate. La baza axonului se remarcă prezenţa unui centru organizator. ea constând dintr-o pereche de centrioli situaţi central. în timp ce subfibrilele B şi C sunt incomplete (10-11 protofilamente). Microtubulii din celulele aflate în interfaza şi cei care alcătuiesc fibrele fusului mitotic îşi au originea într-o regiune perinucleară. este absentă în regiune distală a celor două structuri microtubulare. dar nu toţi microtubulii radiază din aceasta. în axon toţi microtubulii au aceeaşi polaritate. în timp ce. în favoarea rolului de centru organizator al centrozomului. Structura centrului celular este complexă. centrosfera. Subfibrila A este un microtubul complex. 57). Se presupune că în celulele în care atât centriolii. cât şi centrozomul sunt prezenţi ambele structuri coordonează formarea microtubulilor din celulele aflate în interfază şi acelor din fibrele fusului mitotic. Microtubulii ce au ca punct de plecare centrul de nucleaţie prezintă o orientare obişnuită (capătul (+) liber). Sechestrarea şi stabilizarea capetelor explică de ce în vivo adăugarea şi disocierea dimerilor are loc doar la capetele (+) libere.

(fig. Se presupune că translaţia are loc în ribozomii citoplasmatici.C). Replicarea centriolilor şi a corpusculilor bazali Replicarea centriolilor are loc la un anumit moment al ciclului celular. prezenţi în centrul celular. Fiecare procentriol este orientat perpendicular pe centriolul din care a provenit. Iniţial. În momentul în care ajunge la maturitate. va conţine câte un cuplu de centrioli maturi. În momentul separări celulelor-fiice rezultate în urma diviziunii celulare fiecare. Perechile de centrioli migrează spre polii celulei unde în metafază alcătuiesc polii fusului de diviziune. mai mici decât centrioli parentali. 4. 58).Cele 9 fibrile periferice formează peretele unui element de formă cilindrică. orientaţi perpendicular unul pe celălalt şi înconjuraţi de materialul pericetriol. Prezenţa ADN la nivelul corpusculilor bazali explică capacitatea lor de autoreplicare.3. la începutul perioadei G1. La începutul profazei. fiecare constituie dintr-un centriol matur şi altul în creştere. Acest ADN conţine informaţia necesară codificării majorităţii proteinelor existente în corpusculi. În interfază. La sfârşitul perioadei G1. se separă.5. numit procentriol. centriolii se separă. Corpusculul nou format se diferenţiază din cel preexistent şi se orientează perpendicular pe aceasta.B. 98 . proteinele sintetizate fiind apoi transportate şi integrate în corpusculii bazali. Fibrilele sunt legate între ele prin proteine conectoare. 57 – Structura corpusculilor bazali şi a centriolilor. Fiecare fibrilă este un triplet de microtubuli (A. Cercetări recente au demonstrat existenţa la nivelul corpusculilor bazali a unei molecule mici (6-9 milioane pb ) de ADN linear. procentriolii se alungesc continuu. pentru ca în perioada sintetică ( S ) din fiecare centriol prexistent să se diferenţieze câte un centriolfiu. cei doi centrioli. centrul celular se divide. Fig. el se separă de corpusculul parental. Un fenomen replicativ similar este întâlnit şi la corpusculii bazali. 58 – Schema replicării centriolilor.Fig. iar cele două perechi de centrioli. Replicarea centriolilor şi a corpusculilor bazali nu este pe deplin elucidată.1. sunt situaţi unul lângă altul cu axele lungi în unghi drept. generând apariţia unui nou flagel sau a unui nou cil. atingând dezvoltarea maximă în metafază.

Interconvertibilitatea demonstrată a centriolilor şi corpusculilori bazali.2 secunde. La mamifere. Deşi între cili şi flageli există unele deosebiri. în doi timpi: o bătaie activă şi o alta de întorcere. Atât mişcarea cililor. cât şi a flagelilor sunt procese energo-dependente. Bătaia constă în înclinarea sub un unghi larg a cilului aflat în extensie. 4. cu amplitudine constantă. Aproape concomitent are loc curbarea cilului în regiunea bazală.1-0. Mişcarea cililor. Fiecare ciclu durează 0. asemănările structurale şi funcţionale dintre aceştia şi nu în ultimul rând prezenţa ADN au condus la concluzia că centrii organizatorici ai microtubulilor sunt componente ale unui sistem citoplasmatic. cilii asigurând deplasare ovulului.1. moment ce marchează începutul mişcării de întoarcere.6.Există date experimentale ce confirmă presupunerea prezenţei în centrioli a unui ADN propriu. Fig. în acelaşi plan. 99 . În majoritatea cazurilor. Uneori mişcarea sub forma unei unde plane este înlocuită de o altă helicoidală. faringe şi trahee. Se sugerează că ADN centriolar se găseşte în nucleu într-o formă inactivă.inclusiv la om. Curbarea se propagă de-a lungul cilului determinând revenirea organitului la poziţia iniţială (fig. mişcările se propagă de la baza organitului către capătul său opus. ca rezultat al cooperării dintre unitatea genetică nucleară şi cea proprie sistemului citoplasmatic. Mişcările cililor şi flagelilor Cilii şi flagelii sunt prelungiri celulare cu caracter permanent. prezente în multe celule eucariote animale şi vegetale. 59 – Schema mişcărilor cililor. ce formează o suprafaţă ciliată este defazată. Cilii execută mişcări ciclice. Ele sunt prezente şi în mucoasa oviductului. celulele ciliate se găsesc în mucoasa tractului respirator. energia necesară fiind furnizată prin hidroliza ATP. Spermatozoidul este singura celulă flagelată din organismele mamifere. iar în urma translocării sale în centriol. Capacitatea celulei de a coordona modificările morfologice şi funcţionale ce însoţesc procesele de creştere şi diferenţiere celulară se pot explica prin activarea şi dezactivarea centrelor de nucleaţie. ei sunt consideraţi variante ale acelaşi organit. 59). molecula este activă.având rolul de a îndepărta particulele materiale ce pătrund în momentul inspirului în cavităţile nazale. Flageli execută mişcări ondulatorii. diferenţa de fază între mişcările a doi cili consecutivi fiind constantă.

în timp ce subfibrila B este incompletă (10-11 protofilamente). Fibra periferică este un dublet de microtubuli. Subfibrila A este un microtubul complet (13protofilamente). subfibrila B este un microtubul incomplet (10 – 11 protofilamente). fiecare formată din două subfibrile (A şi B ). 60 – A. iar distanţa dintre braţele interne succesive este de 32 nm. înconjurată de hialoplasmă şi protejată la exterior de o membrană celulară simplă. Subfibrila A este un microtubul complet (13 protofilamente).1. notate cu C1 şi C2 . Structura cililor şi a flagelilor Cilii şi flagelii celulelor eucariote au un plan de organizare comun. la baza structurii lor aflându-se microtubulii. generată prin expansiunea plasmalemei. interconectate prin punţi transversale şi înconjurate de teaca internă. Axonema este alcătuită din 9 fibre periferice şi 2 centrale. Braţele dineinei şi elementele radiale sunt ataşate pe subfibrila A. (fig. Ambele organite sunt alcătuite din trei părţi: cilul sau flagelul propriu-zis. Cele 2 fibre centrale sunt interconectate prin punţi transversale şi înconjurate de o structură fibrilară numită teaca internă. corpusculul bazal şi rădăcinile. B. Fiecare este alcătuită dintr-un unic microtubul 1 (singlet). Cilul sau flagelul propriu-zis constă dintr-o structură microtubulară complexă. Fibrele periferice sunt dublete subfibrilare ce se extind din corpusculul bazal în flagel (cil). În regiunea centrală a lumenului axonemei sunt localizate cele 2 fibre centrale. De subfibrila A. Fig. În lumenul axonemei se găsesc singletele centrale.4. numită axonemă. sunt ancorate 2 braţe orientate în direcţia acelor ceasornicului şi alcătuite dintr-o proteină ce poartă numele de dineină. 100 .1. prin regiuni regulare şi care creează imaginea unei roţi cu spiţe. Braţele externe ale dineinei apar de-a lungul microtubulilor la intervale regulate de 24 nm. 60).6. Rolul-cheie în interconectarea microtubulilor revine unei proteine numită tectină. Peretele axonemei este alcătuit din 9 fibre periferice. Structura axonemei. Cele 2 subfibrile sunt notate cu A şi B. Tot din subfibrile A pleacă spre centrul axonemei braţe radiale ce se termină în aproprierea tecii interne. în partea opusă subfibrilei b.

cu capătul (-) inserat în centrozom şi capătul (+) distal. La extremitatea fiecărui braţ de dineină există 2-3 regiuni globulare. o proteină alcătuită din mai multe polipeptide. flageli se mişcă în acelaşi plan. împiedică disocierea dubletelor în momentul glisării. Elementele radiale şi teaca internă au rolul de a coordona intrarea în acţiune a dineinei. cu caracter permanent între dubletele externe.7. Fibrele din cei doi asteri ce se găsesc în contact se alungesc prin polimerizarea tubulinei. Nexina. Implicarea microtubulilor în diviziunea celulară Microtubulii joacă un rol-cheie în trei procese importante ce se desfăşoară în cadrul diviziuni celulare: ƒ formarea fusului de diviziune. dintr-un dublet. energia eliberată prin hidroliza ATP este utilizată în scopul desfacerii şi refacerii succesive a legăturilor dintre dineinile ataşate de subfibrila A a unui dublet şi subfibrila B a dubletului adiacent. Această limitare a mişcări este impusă pe de o parte de existenţa unei legături rigide.6. În timpul mişcării cililor şi flagelilor. microtubulii citoplasmatici radiază din centrozomul centrului celular. Subfibrila A.2. Formarea fusului de diviziune În celulele aflate în interfază. 101 . unde vor constitui polii fusului de diviziune. 4. liber. proteina contractilă ce leagă fibrele periferice adiacente. Cilul sau flagelul propriu-zis este ancorat în corpul celular prin rădăcini cu o structură variată. sunt dispuse de jur-împrejurul fiecărui centrozom şi poartă numele de fibre asteriene (“stelare”). scindarea materialului pericentriolar şi formare celui de-al doilea centru celular. reprezentate de un polipeptid (400. Această deplasare a punţilor laterale dintre fibrele determină alunecarea dubletelor unul faţă de altul şi în consecinţă înclinarea cilului (flagelului). Cei doi centrozomi coordonează nucleaţia microtubulilor care prin asociere generează fibre. 4.Axonema este stabilizată prin interconectarea fibrelor periferice. 4. Intrarea celulei în diviziune este anticipată de autoreplicarea centriolilor. ƒ translocarea cromozomilori anafazici.1.1. Mecanismul molecular al mişcări cililor şi flagelilor În mişcările cililor şi flagelilor un rol important îl joacă dineina. de la baza cilului (flagelului) spre vârful acestuia. Fibrele. (fig.1. având o orientare unipolară.1.7. convertind glisarea dubletelor într-o mişcare de înclinare a axonemei. iar pe de altă parte de diferenţele morfologice dintre fibrele centrale. ƒ deplasarea cromozomilori în planul ecuatorial şi celulei şi alinierea în ƒ placa metafazică. Spre deosebire de cili. Totalitatea fibrelor asteriene ce radiază dintr-un singur centrozom alcătuieşte asterul. este legată de subfibrile B a dubletului adiacent prin intermediul unei proteine contractile numită nexină. 61). determinând depărtarea centrilor celulari şi deplasarea lor spre polii celulei.000 Da) cu activitatea ATP azică. cu mase moleculare variate.

Fusul de diviziune este format din două semifusuri. Fibrele ce pleacă din centrozom spre planul ecuator al celulei poartă numele de fibre polare. Caracterul polar al fusului de diviziune poate explica prin existenţa unui proces de stabilizare selectivă a fibrelor polare. Totalitatea fibrelor asteriene. ce se dezvoltă pe cele două feţe opuse ale centromerului (constricţie primare) la nivelul căruia sunt unite cele două cromatide ale cromozomului metafazic. Formarea acestei structuri specializate în interconectarea cromozomilor cu polii fusului de diviziune este controlată de secvenţe de ADN. 61 – Formarea fusului de diviziune: a) – fibrele asteriene radiază din regiunea pericentriolară. Secvenţele au capacitatea de a lega proteine specifice ce iniţiază formarea complexului multiproteic. numite ADN centromeric. împiedicând depolimerizarea acestora. 102 . fiecare conţinând fibrele ce pleacă de la un singur centrozom. Acestea se alungesc prin adăugarea dimerilor de tubulină la capetele (+) libere. Fibrele ce leagă kinetocorii de polii fusului de diviziune se numesc fibre kinetocorice. polare şi kinetocorice ce radiază din cei doi centrozomi. c) – diferenţierea fibrelor polare ale fusului de diviziune între cei doi centrii celulari. Alungirea fibrelor asteriene şi deplasarea celor doi centrii celulari spre polii opuşi ai celulei. b) – replicarea centriolilor are drept consecinţă apariţia celui de-al doilea centru celular. d) – ancorarea cromozomilor la polii fusului de diviziune prin fibrele kinetocorice. fibrele polare pătrund în spaţiul nuclear şi ancorează prin capetele (+) kinetocorii cromozomilor. În momentul dezorganizării membranei nucleare. În acest proces sunt implicate proteine asociate microtubulilor ce interconectează în plan ecuatorial fibrele polare învecinate antiparalele. Kinetocorii sunt complexe multiproteice cu structura trilamelară.Fig. alcătuieşte fusul mitotic sau fusul de diviziune.

un set de fibre polare capturează unul din cei doi kinotocori ai cromozomului. Injectând tubulină marcată.7. Deplasarea cromozomilor spre planul ecuatorial al celulei este determinată în parte de polimerizare fibrelor kinetocorice. 4.1. prezentând kinetocorii spre cei doi poli ai celulei. spre unul din cei doi poli. În anafază au loc două evenimente distincte cu o desfăşurare simultană în timp. O explicaţie a acestui fenomen ar putea-o constitui rapida polimerizare a fibrelor fusului de diviziuni ce generează un curent care respinge structurile neataşate spre regiunea ecuatorială a celulei. S-a observat că. ancoraţi în fibrele de diviziune. Având ambele capete protejate. Până în prezent au fost elaborate trei modele teoretice alternative ale acestui mecanism. Forţa este direct proporţională cu lungimea fibrelor kinetocorice. În timpul acestor mişcări. s-a constatat că dimeri sunt incorporaţi la capătul (+) al fibrelor kinetocorice. În timp ce detaşarea prin micromanipulare a fibrelor kinetocorice de cromozomi declanşează un proces rapid de depolimerizare a acestor fibre. Mecanismul prin care cromatidele ascensionează spre polii fusului de diviziune nu este încă elucidat. 62 – Deplasarea cromozomilor spre polii opuşi ai celulei în anafază. prin kinetocor şi centrozom. Aceasta sugerează că kinetocorul protejează capetele (+) ale fibrelor kinetocorice. ceea ce justifică permanenta reajustare a poziţiei lor prin mişcarea oscilatorii de mică amplitudine. 103 . aceasta se depărtează spre polul fusului de diviziune cel mai apropiat.7. spre polii celulei. i se opune o forţă ce atrage cromozomii spre polul opus. Mişcarea braţului. Fig. într-o celulă aflată în metafază. anafaza. Cele două forţe de respingere şi atracţie.3. fibrele kinetocorice se scurtează prin disocierea de tubulină de la capetele (+) (fig. Pe parcursul anafazei A. după care şi celălalt kinetocor este ancorat de fibrele polare ce pleacă din centrozomul opus. Fiecare cromozom va avea astfel o orientare strictă în raport cu fusul diviziuni. 62). în urma exciziei kinetocorului. prin microchirurgie cu raze laser de pe un braţ cromozomial. lipsit de kinetocor.1.4. Primul eveniment constă în deplasarea cromatidelor surori spre polii opuşi ai fusului de diviziune şi constituie anafaza A. Polimerizarea fibrelor kinetocorice nu reprezintă singurul proces ce explică deplasarea cromozomilor şi alinierea lor în placa ecuatorială. fibrele kinetocorice au o stabilitate mult superioară celorlalte fibre ce alcătuiesc fusul de diviziune. Translocarea cromozomilor anafazici Desăvârşirea replicării centromerilor şi separarea cromatidelor surori ale cromozomilor metafazici marchează sfârşitul metafazei şi iniţiază o altă etapă a mitozei. Aceste fibre au capătul (-) inserat în controzom şi capătul (+) legat de kinetocor şi stabilizat prin proteine. oscilând între cei doi poli ai fusului de diviziune.2. nu se datorează ancorării sale la fibrele fusului de diviziune. Deplasarea cromozomilor spre regiune ecuatorială a celulei şi alinierea lor în placa metafazică În prometafază. Ruperea experimentală a fibrelor kinetocorice ce leagă cromozomul de unul din polii fusului de diviziune este precedată de rapidă deplasare a cromozomului spre polul de care a rămas ataşat. acţionează asupra cromozomilor şi după alinierea lor în placa metafazică. Aceasta demonstrează caracterul elastic al fibrelor kinetocorice. Deplasării cromozomilor. împiedicându-le depolimerizarea. cromozomii se mişcă dezordonat.

studiul implicării acestor elemente de citoschelet în transportul intracelular a folosit. Prin adăugarea dimerilor de tubulină la capetele (+) libere ale fibrelor polare antiparalele acestea se alungesc şi se suprapun în regiunea ecuatorială a fusului de diviziune. Acestea se deplasează dinspre terminaţiile sinaptice spre corpul celular. Modelul se bazează pe două elemente: polimerizarea fibrelor polare şi presupunerea axistenţei unor proteine cu activitate ATP-azică. prin metode autoradiografice. În cel de-al treilea model. 4. Iniţial.8. Transportul axonal anterograd a fost pus în evidenţă prin injectarea aminoacizilor marcaţi radioactiv şi urmărirea. Forţa ce determină acest proces este generată de interacţiunea fibrelor polare antiparalele (din cele două semifusuri) ce se întrepătrund în regiunea ecuatorială a fusului de diviziune. celulele nervoase. prezenţa proteinelor şi a organitelor celulare fiind rezultatul unui proces de transport de la situsurile de sinteză.azică sunt ataşate de fibrele polare ale unui semifus.1. veziculele şi particulele proteice nu se deplasează haotic în spaţiul intracelular. depărtarea lor.În primul model. Experimentul a demonstrat că deplasarea proteinelor. Aceste proteine manifestă probabil o afinitate crescută pentru tubulina polimerizată.Transportul intracelular mediat de microtubuli Organitele. Se presupune că proteinele cu activitate ATP . pe direcţi şi cu viteze caracteristice. a proteinelor libere sau incorporate în organitele celulare ce îi conţineau. rolul-cheie îl joacă anumite proteine kinetocorice cu activitate ATPazică similare dineinei şi kinezinei. Energia eliberată prin hidroliza ATP permite deplasarea proteinelor de-a lungul fibrelor polare ce alcătuiesc al doilea semifus. fibrele kinetocorice au numai rolul de a direcţiona deplasarea cromatidelor.în final. Proteinele leaga capetele (+) ale fibrelor kinetocorice şi le stabilizează. Această alegere se baza pe faptul că ribozomii sunt absenţi din axoni neuronilor. Rezultatele cercetărilor efectuate au condus la elaborarea unui model al mecanismului elongarii fusului de diviziune. În stricta orientare a transportului intracelular un rol-cheie îl joacă microtubulii. în timp ce proteinele ce intră în alcătuirea citoscheletului se deplasează foarte incet (fracţiuni de mm/zi). Al doilea eveniment îl constituie anafaza B şi este reprezentat de alungirea fusului mitotic şi depărtarea centrilori celulari. Procesul poartă numele de transport axonal anterograd. Prin deplasarea proteinelor sun expuse capetelor (+) ale fibrelor kinetocorice care suferă depolimerizarea. spre regiunea sinaptică. Cu cea mai mare viteză (3mm/sec) sunt deplasate particulele şi veziculele mici. Nu este exclusă posibilitatea ca prin interacţiile cu cortica celulară microtubulii din fibrele asteriene să participe la deplasarea în direcţii opuse a polilor fusului. ca sistem experimental. din corpul celular. cum ar fi un sistem de filamente elastice ce interconecteză kinetocorii şi polii fusului de diviziune. Energia eliberată prin hidroliză ATP asigură deplasarea de-a lungul fibrelor a proteinelor kinetocorice cu funcţie ATP-azică. Forţa ce determină această mişcare este generată de alte structuri. 104 . Elementul central al celulei de-al doilea model îl constituie depolimerizarea fibrelor kinetocorice. Disocierea dimerilor de tubulină este însoţită de ruperea şi refacerea ciclică a legăturilor dintre proteinele kinetocorice (ce nu prezintă activitatea ATP – azică) şi microtubulii ce alcătuiesc fibrele kinetocorice. În paralele. similare dineinei sau kinezinei. Ele sunt transportate în anumite situsuri. unde vor fi degradate de către enzimele lizozomale. veziculelor şi a organitelor nu are loc cu aceeaşi viteză. diviziune în timpul anafazei B. în axon are loc şi un transport retrograd în care sunt antrnate vezicule ce conţin fragmente de membrană şi proteine citosolice. Fibrele antiparalele sunt împinse spre centrii celulari determinând. care antrenează în această mişcare întreaga cromatidă.

moleculele de kinezină deplasează microtubulul asociat spre capătul său (-). Proteina asigură transportul anterograd al veziculelor. cât şi deplasarea veziculelor necesită prezenţa în sistem a ATP şi a unor proteine specifice cu funcţia ATP-azcă. de fapt. folosind energia rezultată din hidroliza ATP. 4. kinezina de deplasează de-a lungul microtubulului împreună cu vezicula pe care a legat-o. s-a realizat un sistem experimental ce conţinea microtubuli obţinuţi prin autopolimerizarea dimerilor necontaminaţi cu proteine asociate sau citosolice şi vezicule sinaptice izolate din diferite tipuri celulare. Tehnica microscopiei computerizate în contras de fază a permis vizualizarea asocierii organitelor cu structuri celulare filamentoase şi deplasarea lor de-a lungul axonului. vezicula transportată. în direcţi opuse. cu excepţia celor musculare. microtubuli plasmatici. Una dintre aceste proteine este kinezina (380. În prezenţa ATP. 2. deoarece ea se deplasează întotdeauna de la capătul (-) al microtubulului spre capătul (+) al acestuia. În unele cazuri. Modul în care kinezina utilizează energia eliberată prin hidroliza ATP pentru a asigura transportul veziculelor de-a lungul microtubulului este încă neelucidat (fig. şi reagregarea lor în interfaza ciclului celular. iar prin celălalt capăt. întâlnim microfilamentele izolate cu o distribuţie relativ difuză şi dinamică.000. studiul efectuat pe culturi de fibroblaste a demonstrat implicarea microtubulilor în dispersarea veziculelor rezultate prin fragmentarea aparatului Golgi. Aceasta indică faptul că fiecare filament transportor conţine mai multe “benzi de transport “ pentru organitele celulare. Încercările de a caracteriza aceste filamente au condus la concluzia că ele reprezintă. Responsabilă de transportul retrograd al veziculelor este o proteină asociată cu microtubulii plasmatici numită MAPIC (1. proteina MAPIC este capabilă să lege microtubulul şi vezicula de transport. Microfilamentele Microfilamentele de actina sunt componente citoplasmatice prezente în toate celulele eucariote.O valoare intermediară o are viteza de transport a mitocondriilor.000 Da). În mod similar kinezinei. Pentru a înţelege mecanismul transportului intracelular asociat microtubulilor. 63 a) Transportul anterograd al veziculelor de-a lungul microtubulilor mediat de kinezină. Fig. Atât în celulele musculare.000 Da) sau dineină citoplasmatică. S-a observat că atât legarea. 105 . microtubulul. fără a intra în coliziune. se pot observa două organite deplasându-se de-a lungul aceluiaşi filament. Molecula alcătuită din patru lanţuri polipeptidice este capabilă să lege. 63). pe parcursul mitozei. În plus. cât şi în alte tipuri celulare ele sunt asociate cu o proteină fibrilară. numită miozină. În citoplasma tuturor celulelor. b) Imobilizate pe suprafaţa unei plăci de sticlă. dar ea se deplasează dinspre capătul (+) spre capătul (-) al microtubulului. printr-unul din capete.

conformaţie şi secvenţă de aminoacizi similare. Deşi. fiind implicate în mişcările celulare ce au la bază mecanismul actină – miozină. muşchii netezi ce delimitează vasele sangvine sau muşchii enterici ce mărginesc lumenul intestinal). În filament moleculele de actină G. Adăugarea monomerilor sau disocierea lor pot avea loc la oricare din capetele microfilamentului. La păsări şi mamifere există cel puţin 6 gene diferite ce codifică actina. Se apreciază că modificările posttranslaţionale (acetilarea aminoacizilor din segmentul amino-terminal. În fibrele de stress. Dinamica microfilamentelor aminteşte de cea a microtubulilor. Acest fapt sugerează că genele codanate au evoluat dintr-o genă ancestrală comună. Fiecare specie moleculară de alfa actină este prezentă exclusiv într-un singur tip de celulă musculară (din muşchii striaţi. Aceste proteine se numesc alfa actine. Fiecare monomer este orientat perpendicular pe axa helixului stabilind interacţii puternice cu cei doi monomeri situaţi în imediata vecinătate şi interacţii slabe cu moleculele de actină G dispuse la dreapta şi la stânga sa de-a lungul helixului (fig. dar viteza cu care se desfăşoară reacţiile de polimerizare şi depolimerizare la capătul (+) este de 5-10 ori mai mare decât la capătul (-). 4.Experimentele in vitro au demonstrat că moleculele de actina purificate din diverse surse sunt capabile să copolimerizeze şi că toate stimulează activitatea ATP . Acest lucru ar explica funcţiile diferite ale microfilamentelor. inelele contractile şi microvili. este posibil ca speciile moleculare de actină să manifeste o afinitate diferită faţă de proteinele citoplasmatice cu care se asociază. Atât polaritatea subunităţilor componente. Pe fiecare tur de helix se găsesc două molecule de actină. Aceste forme diferite de organizare a microfilamentelor. încă. 64 – Modelul molecular al actinei fibrilare (actina F).1. Microfilamentele de actină Actina reprezintă principala componentă a microfilamentelor. Celelalte 2 specii moleculare de actină notate cu beta şi gama au un grad de omologie mai scăzut şi sunt prezente în citoplasma tuturor tipurilor celulare. miocard. se asociază cap la coadă formând un helix monocateran cu o grosime aproximativ de 7 nm. În celulele musculare microfilamentele participă la realizarea contracţiei musculare. cât şi un rol dinamic. numite actină fibrilară sau actină F. Fig. Filamentele de actină obţinute în vitro sunt identice cu microfilamentele izolate din celule.Actina este un polipeptid cu o masă moleculară de 42.2. cât şi stricta orientare a acestora în structura helicoidală conferă polaritate filamentului de actină. de susţinere.000 Da. având caracter polar. ele îndeplinind atât un rol structural.Acestea participă alături de microtubulii citoplasmatici şi filamentele inermediare la organizarea stucturii complexe a citoscheletului. au mase moleculare. metilarea unui rest de histidină) sunt responsabile de apariţia unui număr atât de mare de specii moleculare. La o concentraţie ionică similară cele existente în spaţiu intracelular actina G polimerizează. 106 . 4 prezintă un grad înalt de omologie (din cei 375 de aminoacizi doar 6 sunt diferiţi). izolate din diferite organisme şi tipuri celulare. cât şi funcţiile asociate lor sunt determinate de tipul proteinelor ce leagă specific actina. generând filamente de actină. Din cele 6 proteină. nedemonstrat experimental. Încercările de izolare şi caracterizare a acestor proteine au evidenţiat faptul că numărul tipurilor de actine este mai mare decât cel al genelor care le codifică. microfilamentele sunt fasciculate (asociate în mănunchiuri). în vitro.azică a miozinei. Aspectul globular al proteinei justifică denumirea de actină globulară sau actină G. 64). Actinele.

în timp ce regiunile globulare rămân separate. În structura de miozină II se remarcă existenţa a două puncte de flexiune ce marchează domeniile structurale ale prote (fig. meromiozina grea (HMM) conţine capul bilobat şi un segment din coada lanţurilor grele. prezintă activitate ATP – azică. ea fiind implicată în fenomenele de motilitate celulară. Molecula este alcătuită din două lanţuri grele şi două perechi de lanţuri uşoare. Miozina de tip II se găseşte atât în celulele musculare din muşchii striaţi şi netezi. monomeri de actină leagă strâns ATP. Fig. numită cap şi o regiune α – helicoidală. faptului că la concentrarea ionică intracelulară (0. ce conţin câte un cap globular şi perechea de lanţuri uşoare asociate acestuia. cât şi în alte tipuri celulare. Fragmentele S1. Miozina Miozina este o proteină cu largă răspândire în celulele organismelor eucariote. în timp ce al doilea separă capul bilobat de coada moleculei. Lanţurile uşoare ce alcătuiesc o pereche sunt identice între ele. 4.000 Da/lanţ). 65 – Modelul molecular al miozinei. cu diametrul de 4 nm. Posibilele structuri cap ATP sau ADP nu influenţează polimerizarea monomerilor şi aceasta se datorează. numită coadă.2. Primul domeniu. Miozina tip I este absentă în celulele musculare.000 Da/lanţ) şi 2 perechi de lanţuri uşoare (20. Lanţurile grele sunt identice. microfilamentele sunt structuri mult mai stabile decât micro tubulii.65).15M. Primul punct de flexiune este situat în regiunea alfa hericoidală. Până în prezent se cunosc 2 specii moleculare ale acestei proteine. carboxi – terminală. îl joacă în contracţia musculară. dar diferite de lanţurile celeilalte perechi. Regiunile alfa helicoidale ale celor 2 lanţuri grele sunt răsucite una în jurul celeilalte. numită cap. din celulele musculare. Perechile de lanţuri uşoare sunt ataşate celor două regiuni globulare. Fiecare este format dintr-o regiune alfa heicoidală cu o lungime de 30 nm. Pe de altă parte. În consecinţă. Miozina poate fi scindată la nivelul punctelor de flexiune sub acţiunea unor enzime cu activitate proteazică.000 Da) este alcătuită din 6 lanţuri polipeptidice dintre care 2 lanţuri grele (230. cuprinde segmentul aminoterminal al cozilor. Chimotripsina scindează miozina în două domenii. 107 . în mare parte. Pe regiunea globulară ce formează capul lanţurilor grele ale miozinei. ce au la bază mecanismul actină. Miozina de tip II (470.Similar dimerilor de tubulină ce stabilesc interacţii puternice cu GTP.KCI) este favorizată polimerizarea actinei. Lanţurile grele prezintă câte o regiune amino – terminală globulară.miozină. iar al doilea domeniu meromiozina uşoară (LMM). ea a constituit subiectul numeroaselor cercetări experimentale. Datorită rolului pe care miozina de tip II. Prin tratarea domeniului HMM cu papaină segmentul de coadă este degradat şi sunt eliberate fragmentele S1. numită coadă şi o regiune globulară carboxi – terminală.2. concentraţia intracelulară a monomerilor liberi este mult mai mare decât concentraţia critică. Această stabilitate este accentuată prin ataşarea de microfilamente a proteinelor asociate. Hidroliza ATP are loc imediat după încorporarea actinei G în microfilament. sunt localizate atât situsurile de legare ale ATP cât şi cele pentru actină. Molecula prezintă două puncte de flexiune.

viteza de hidroliză a ATP creşte de 200 de ori. În plus modul de legare a profilinei la monomer face imposibilă legarea complexului la capătul (-) al unui filament de actină preexistent. Formarea reţelei de microfilamente este reglată de factori proteici şi concentraţia ionilor de Ca. În acest caz.Studiile biochimice au evidenţiat faptul că în prezenţa filamentelor de actină activitatea ATP – azică a miozinei este stimulată. 66). filamentele de miozină au dimensiuni mici (diametru 60 Å) şi caracter tranzitoriu. În celulele nemusculare. în celulele musculare unde ele au o structură particulară şi sunt numite filamente groase. Contracţia şi relaxarea muşchilor netezi asigură deplasarea alimentelor de-a lungul tractului digestiv şi controlează diametrul vaselor sangvine. determinând îngroşarea acestuia. profilina este eliberată creând posibilitatea adăugării unui alt complex şi alungirii filamentului. complexul este incapabil să polimerizeze spontan. tensiunea dezvoltată fiind menţinută pe o durată mai mare de timp. Muşchii striaţi primesc o inervaţie motorie somatică. Prin contracţia lor. în aceste celule. sângele este pompat în circuitul sanguin. polimerizarea putând avea loc doar la capatul (+) al acestuia. Musculatura netedă prezintă o inervaţie vegetativă. cei netezi se contractă mai lent. După legarea profilin-actinei la capatul (+) al filamentului de actină. Una dintre cele mai importante proteine ce influenţează procesul de polimerizare a actinei. Organizarea în filamente a miozinei a fost pusă în evidenţă. 108 .2. capetele moleculelor de miozină se ataşează de jur-împrejurul filamentului. Spre deosebire de muşchii striaţi.3. dar se află ca şi muşchii netezi sub controlul inervaţiei vegetative. Regiunea centrală are un caracter exclusiv fibrilar fiind formată prin suprapunerea cozilor antiparalele ale moleculelor de miozină. pentru prima oară. 4. Actina şi miozina în celule nemusculare Filamentele de actină din celulele nemusculare au un pronunţat caracter tranzitoriu. ceea ce face dificilă vizualizarea lor la microscopul electronic. Proteina se leagă de monomerii de actină formând un complex numit profilin-actină. netezi şi cardiaci şi care poartă numele de contracţie musculară. este profilina. Orientarea moleculelor în filament imprimă acestuia un caracter bipolar. fiind prezenţi la nivelul intestinului gros şi subţire al vezici biliare şi al vaselor sangvine. Muşchii cardiaci se aseamănă din punct de vedere structural cu cei striaţi. Deoarece profilina blochează etapa de nucleaţie. Fiecare filament este alcătuit dintr-o regiune centrală şi 2 regiuni terminale.4. Filamentele groase (diametru 150-200 Å) conţin 500-600 molecule de miozină. realizată de structuri specializate din muşchii striaţii. 4. În cele 2 regiuni terminale. Polimerizarea implică agregarea cozilor moleculelor de miozină. Rolul actinei şi miozinei în contracţia musculară Mecanismul actină – miozină stă la baza unui tip particular de mişcare celulară. Muşchii netezi înconjoară organele interne. Datorită inserţiilor osoase ei asigură deplasarea şi păstrarea poziţiei corpului. capetele (+) ale filamentelor de actină sunt ancorate în membrana plasmatică şi/sau stabilizate prin proteine asociate. Moleculele de miozină polimerizează generând filamente de miozină.2. În mod obişnuit. profilina blochează complet polimerizarea actinei (fig.

vilina (nu şi gelsolina) este capabilă să accelereze procesul de polimerizare al actinei. Filamentele de miozină din celulele nemusculare sunt mult mai mici (10-20 molecule) decât cele din celulele musculare. Structuri necontractile. 67).Fig.1. 66. La o concentraţie citosolică mare a ionilor de Ca. Activarea funcţiei sale ATP-azice necesită fosforilarea lanţurilor uşoare şi este reglată de complexul calmodulină – Ca2+. microvilii sunt alcătuiţi dintr-o regiune centrală şi o reţea terminală (fig. împiedicând astfel reasamblarea filamentelor. dintre care : tropomiozina şi alfa-actinina.4. Capetele (+) sunt indreptate spre vârful microvilului.2. Prezenţa calmodulinei. menţinând forma microvilului. interconectând filamentele de actină în mănunchiuri. Molecula de miozină se aseamană cu cea din muşchii netezi. în celulele nemusculare.Rolul profilinei în polimerizarea actinei. Microvilii Microvilii sunt expansiuni ale celulelor epiteliale ce delimitează lumenul intestinal şi al tubului contort proximal în rinichi. Filamentele prezintă aceeaşi polaritate. explică absenţa complexului troponinic din celulele nemusculare. Din celulele nemusculare au fost izolate şi proteine asociate intalnite în celulele musculare. Ambele proteine joacă şi un rol structural. rămânând ataşate la capătul (+) al fiecărui fragment. Ele indeplinesc un rol structural. Reglarea procesului de polimerizare şi depolimerizare a actinei prin ionii de Ca este mediată de cel putin două proteine similare ca structură şi funcţie: vilina şi gelsolina. Ei contribuie la mărirea cu 25% a suprafeţei de absorbţie a celulelor epiteliale. ca proteină reglatoare. Regiunea centrală este reprezentată de un manunchi de filamente de actină dispuse paralel. 109 . 4. proteinele rup filamentele lungi de actină. O dată cu scăderea concentraţiei Ca2+.

Filamentele din reţeaua terminală interconectează filamentele de actină din manunchi şi leagă mănunchiurile între ele. Acelaşi rol îl joacă şi fodrina. spectrina etc. Cea mai interesantă proteină.).Filamentele sunt interconectate prin proteine de legare şi ancorate în membrana plasmatică ce delimitează microvilul prin proteina 110 Kda şi calmodulina. 67.Structura microvililor. dintre care fimbrina şi vilina. Se apreciază ca tensiunea generată de proteina similară miozinei de tip I asigură menţinerea în poziţie centrală a mănunchiului de filamente. din care lipsesc discurile Z. localizat imediat sub membrana plasmatică la nivelul şantului de clivare. flamentele scurte bipolare de miozina şi filamentele de actină sunt organizate în microsarcomere similare celor din muşchii striaţi. 4.2. Ambele proteine au rolul de a stabiliza filamentele în mănunchiuri. Din regiunea centrală lipsesc miozina.Filamentele de actină fasciculate se extind din corpul microvilului în reţeaua terminală unde sunt stabilizate prin intermediul unor proteineconectoare (fodrina. numita inel contractil. regiunea centrală este ancorată într-o reţea terminală. tropomiozina şi alfa actinina. au fost izolate alte proteine asociate filamentelor de actină.2. Rolul actinei şi miozinei în citokineza Filamentele de actină şi miozina joacă un rol in desfaşurarea citokinezei la celulele animale. În inelul contractil . Inelul se contractă prin mecanismul actină-miozina. cu caracter tranzitoriu. este o proteină similară miozinei de tip I. cu activitate ATP-azică. alcătuită din filamente scurte de actină şi proteine asociate.Fig. La polul bazal. principală proteina asociată. proteina leagă filamentele de actină de la exteriorul manunchiului de membrana ce delimitează microvilul. dar mult mai mici. În schimb. Simultan are loc un proces de depolimerizare a filamentelor de actină. Impreună cu calmodulina. Filamentele de actină şi minisarcomerele adiacente sunt legate prin alfaactinina şi probabil şi alte proteine asociate. Ele alcătuiesc o structura contractila. separarea toatală a celor 2 celule fiice rezultate prin diviziunea celulară.4. proteina 110. asociată filamentelor de actină din microvili.Elementul central îl reprezintă mănunchiul de filamente de actină. prezentă în reţeaua terminală. 110 . ceea ce determină micşorarea continuă a diametrului inelului contractil şi. in final.

corpul celular lasa în urmă o coadă numită fibră retractilă. limfocite. Regiunea centrală. Mişcarea ameboidala Mişcarea ameboidala este un tip particular de locomoţie întalnită frecvent la protozoare. pe direcţia miscării m prelungirii celulare. proteine implicate în formarea şi stabilizarea reţelei filamentelor de actină . Miscarea ameboidala se realizează prin emiterea şi retracţia continuă a unor prelungiri celulare şi are la baza tranzitia reversibila a hialoplasmei din stare de gel în stare fluidă (sol). o molecula flexibilă alcatuită din 2 lanţuri polipeptidice. au pus in evidenţa existenţa a 2 regiuni diferite ale citoplasmei. este localizată ectoplasma. Se apreciază ca treansformarea reversibilă a endoplasmei în ectoplasma este controlată de celula şi reglată prin concentraţia intracelulară a ionilor de Ca şi pH. la protozoare a demonstrat interconvertibilitatea celor 2 regiuni ceitoplasmatice. În regiunea distală a prelungirilor celulare. Studiul emiterii şi retractiei prelungirilor celulare numite pesudopode. conţine particule şi organite celulare aflate intro permanenta mişcare. prezentă în nodurile reţelei. O dată cu creşterea concentraţiei intracelulară a ionilor de Ca. Filamina şi alfa actinina. Una dintre acestea este filamina. 68). cele mai bine studiate sunt fibroblastele. prin intermediul unor structuri specializate. asigură probabil tranziţia hialoplasmei în starea de gel. fie ruperea ei şi ulterior retracţia cozii în corpul celular (fig. dar comuna şi altor tipuri celulare dintre care şi celulelor ce intra în alcatuirea organismului uman : macrofage. numită endoplasmă.4. are loc deplasarea endoplasmei din centrul celulei în prelungirile celulare. filamentele de actină sunt scindate de gelsolina. Alte proteine asociate filamentelor de actină din ectoplasma sunt alfa actinina şi gelsolina (fig.Pe parcursul deplasării. numite placi de adeziune sau contacte focale. numite lamelipode. Fig. Procesele inverse au loc în momentul retractarii pseudopodelor.2. Lipsită de organite celulare. Alte lamelipode se întorc spre partea dorsală a corpului celular. favorizând formarea unei reţele tridimensionale. 111 . 68 – Filamina leagă filamentele de actină.3. ectoplasma conţine o reţea tridimensionala de filamente de actină.Fibra rămâne aderentă la substratul pe care se realizeaza mişcarea fibroblastului . efectuate iniţial pe protozoare şi ulterior extinse la celulele din organismul uman ce prezintă acest tip de locomoţie. Pe parcursul formarii pseudopodelor.4. În timpul deplasării. În regiunea distala a pesudopodului endoplasma se transformă în ectoplasma prin tranziţia sol-gel a hialoplasmei. unele lamelipode aderă la substrat . Dintre celulele din organismul uman ce se deplaseaza prin miscarile ameboidale. În final. Acţiunea conjugată a acestor 2 forţe conduce la elongarea fibrei retractile. reţeaua se dezorganizează şi hialoplasma trece în stare de sol. Aceşti doi factori afectează organizarea filamentelor de actină în cele 2 regiuni citoplasmatice printr-un mecanism încă suficient elucidat. în care un rol important par să-l aibă proteinele asociate. Fibroblastul emite continuu. fibroblaste. fiind supusă în acelaşi timp tensiunii generate de ondulatiile de suprafata. În această regiune hialoplasma se găseşte în starea de sol. imediat sub membrana plasmatică. Studiile electronomicrodcopice. Filamentele sunt interconectate prin proteine ascociate. 69). forţa ce asigură înaintarea fibroblastului determină fie detaşarea fibrei de substrat.

tropomiozina şi proteina reglatoare miozin-LC kinaza. Se sugereaza ca filamentele de actină şi miozina sunt organizate în microsarcomere. 4. tenşiunea generata prin mecanismul actină –miozina determinand aplatizarea fibroblastelor în culturi. 4. filamentele de actină apr a fi inserate în membrana plasmatică. au fost identificate şi în alte tipuri celulare (celule epiteliale. 69 – Schema deplasării fibroblaştilor. ƒ citocheratinele (peste 30 de specii moleculare). ƒ neurofilamentele (trei specii moleculare : NF1 70 000 Da .Fig. Reintroducerea fibroblastelor în cultura este urmată la cateva ore de reorganizarea fibrelor de stress. 112 . În zonele de contact. La vertebratele superioare s-au identificat 5 tipuri de molecule proteice distincte ce intra în constituţia filamentelor intermediare : ƒ vimentina (57 000 Da) . filamentele intermediare se pot gasi în ectoplasma. localizate în regiunea citoplasmatica aflată în proximitatea plasmalemei aflată în contact cu substratul. NFh 210 000 Da).1.3. unde formeaza o matrice ce înconjoară şi interconecteaza discurile Z. NFm 150 000 Da. Ulterior.4. Fibrele de stress sunt manunchiuri paralele de filamente de actină.4. Proteine ce alcătuiesc filamentele intermediare Ca şi microfilamentele de actină şi microtubulii. ancorate în structuri periferice (desmozomi) sau situate în prelungirile celulare (axoni). Filamente intermediare Filamentele intermediare sunt elemente de citoschelet mai groase decât microfilamentele de actină şi mai subţiri decât microtubulii. proteinele ce formeaza filamentele intermediare sunt specifice pentru un anumit tip celular. alfa-actinina.Fibrele de stress În ataşarea de substrat a fibroblastelor cultivate in vitro rolul principal revine fibrelor de stress. mezenchimale şi neuroni). Îndepartarea celulelor de pe substrat este însoţită de înlocuirea fibrelor de stress cu o reţea de filamente de actină şi revenirea celulei la forma sferică. Spre deosebire de actină G şi tubulina. Alaturi de actină în fibrele de stress sunt prezente : miozina. ƒ desmina (55 000 Da) . Iniţial.3. filamentele intermediare sunt rezultatul polimerizarii subunitaţilor proteice. ataşarea celulelor de suport şi aplatizarea lor. În celule. 4. ƒ proteina gliala fibrilara acida( GFAP 50 000 Da) . Cercetarile experimentale au confirmat această ipoteză.2. ele au fost puse în evidenţa în celulele muschilor striaţi .

Fig. spre deosebire de microfilamentele de actină şi microtubuli. proteina gliala fibrilara acidă şi NF1 formează homopolimeri. 70). filamentele intermediare au capete echivalente funcţional. Deci. în timp ce capetele globulare rămân separate. Cele 30 de tipuri de citocheratine sunt împarţite în 2 clase distincte : acide şi bazice /neutre. a regiunilor centrale. Cercetările experimentale au demonstrat că în condiţii fiziologice. În celulele în care genele ce codifică vimentina şi desmina se coexprima. Studiul polimerizarii în vitro a monomerilor ce alcatuiesc filamente intermediare a demonstrat că acest proces nu necesită consum de energie metabolică. 1% din proteine ce formează filamentele intermediare se găsesc sub formă de monomeri liberi. Aceleaşi regiuni centrale par a fi responsabile de asocierea dimerilor în tetrameri dar la acest nivel de agregare dimerii sunt antiparaleli. Subunitatile proteice formează dimeri prin înfaşurarea stransă una în jurul celeilalte. 113 . fiind formate dintr-o regiune centrală alfa helicoidala şi 2 domenii globulare. desmina. iar 8 protofilamente generează filamentul intermediar. S-a constatat că vimentina. Raportul dintre subunităţile libere şi polimerizate exprimă caracterul mult mai stabil al filamentelor intermediare comparativ cu microfilamentele de actină şi microtubulii.Diversitatea proteinelor ce alcătuiesc filamentele intermediare nu constituie singurul aspect ce le diferenţiază de subunitaţile proteice ale microfilamentelor de actină şi microtubulilor. proteinele copolimerizează. în regiunile carboxi. În filamentele de keratina raportul dintre citocheratine de tip I şi cele de tip II este de 1 :1.şi amino. polimerizarea şi depolimerizarea se desfaşoară cu aceeaşi viteza la ambele extremitaţi. Prin legarea cap la cap a tetramerilor se formează protofilamentul. În dimeri. Deosebirile există şi în maniera în care proteinele se asociază în filamente (fig. în timp ce 99 % dintre acestea sunt asociate în filamente. Modul de ordonare al subunitaţilor proteice în filamente imprimă acestora un caracter apolar. subunităţile sunt orientate paralel. de mărimi variabile.terminale. 70 – Nivele de asamblare ale filamentelor intermediare. Cele cinci tipuri de proteine prezintă caracteristici structurale comune.

de membrana plasmatică şi. 1958). Complexele neurofilamentate-microtubuli se deplasează în axon. un rol structural. calmodulina). În toate tipurile celulare filamentele de vimentina sunt fizic legate de membrana nucleară.000x în citoplasma celulelor examinate la microscopul de înalt voltaj (peste 1. microtubulii şi practic toate celelalte componente subcelulare sunt conectate de un sistem de microteabecule (mici bare). brevina. Reţeaua microtrabeculară În celulă. Microtrabeculele (4mm) pot fi expresia fenomenului de gelificare când filamentele de actină se leagă încrucişat unul de altul. caldesmona.. fiind probabil implicate în coordonarea spaţială a nucleului celular. MAP2.4. de volţi) care generează electroni rapizi ce pot penetra secţiuni relativ groase.3. filamina. împiedicandu-le să fuzioneze între ele sau cu membranele celulare. Tipuri de filamente intermediare şi semnificatia lor funcţională Filamentele de vimentina sunt prezente în celulele mezenchimale ( celule endoteliale ale vaselor sangvine) şi unele celule epiteliale. nexina.000. plactină. Filamentele gliale sunt caracteristice celulei gliale. filamentele intermediare înconjoară manunchiurile de microtubuli ce formează fibrele fusului de diviziune. susţinand discurile Z şi miofibrele. În celulele epiteliale filamentele de vimentina sunt ancorate în desmozomi.4. În consecinţa unii autori contestă realitatea lor biologică considerandu-le un artefact. alţii. Cele 2 tipuri de filamente sunt interconectate prin proteine. proteină fibrilară acidă glială. dineina. Filamentele din celulele muşchilor striaţi formează o reţea ce strabate întreaga miofibra şi care leagă discurile Z între ele. MAP1. fimbrina. gelsolina. Se apreciază că filamentele de desmina joacă. Se apreciază ca fiecare tip de celula epiteliala conţine un complement chitocheratinic specific. Neurofilamentele sunt prezente exclusiv în axonii celulelor nervoase. vimentina) şi 7 proteine asociate cu microtubulii (clatrina. de unele organite celulare(mitocondrii).000. Filamentele de desmina se întalnesc în toate tipurile de celule musculare. posibil . 4. Proteinele asociate citoscheletului O serie de proteine sunt asociate citoscheletului. le atribuie rol de suport al materiei biostructurale ( Eugen Macovschi. înca neidentificate. contribuind la creşterea rigidităţii ţesutului epitelial.5. filagrina. 9 proteine asociate cu filamentele intermediare (prekeratine. titina. profilina. vinculina. microfilamentele.2. desmina. vilina. Reţeaua microtrabeculara a fost descrisă la mărimi de circa 300. Tratarea acestor celule cu colchicina a condus la dezasamblarea microtubulilor urmată de deplasarea filamentelor de vimentina ce se organizează în manunchiuri în apropierea nucleului. oferind una din cheile înţelegerii structurii şi funcţiunii acestuia. acumentina. MAP. Sunt bine cunoscute în prezent circa 14 proteine asociate cu actina (acrinogelina. fragmina. ankirina. Acest experiment sugerează rolul important pe care microtubulii îl au în organizarea filamentelor de vimentina. În adipocite filamentele înconjoară picăturile lipidice. dimpotrivă. conferindu-i acestuia stabilitate. 4. Se constată existenţa unei strânse asocieri între filamentele de vimentina şi microtubuli.) prezente predominant în anumite celule şi având proprietăţi diverse. 114 . În corpul celular cele trei polipeptide (NF1. şinemina. filamentele de cheratina formează în celula epiteliala o reţea ce asigură rezistenţa epiteliilor la factori mecanici. fodrina. Studiile efectuate de fibroblasti cultivaţi in vitro au demonstrat ca în celulele aflate în mitoza. Ancorate în desmozomi. în principal. NFm şi NFh) se asamblează în filamente şi se asociază cu microtubulii. proteinele neurofilamentelor. Filamentele de cheratină sunt întalnite în celulele epiteliale.

este realizată prin sinteza moleculelor de ARN. rol în reglarea activităţii transcripţionale. mai puţin la eritrocitele vertebratelor superioare.1. funcţiile fundamentale ale nucleului se rezumă la două procese bazate pe existenţa în acest compartiment a genomului celular şi anume: replicarea ADN. de reglare şi control a activităţii celulei. 115 . el îndeplineşte funcţiile de păstrare în condiţii de securitate a ADN-lui. În situaţia aceasta. replicarea are loc în faza S (de sinteză) a ciclului celular. unde este eliminat printr-o exocitoză în cursul eritropoezei. Tot în nucleu au loc sintezele diferitelor ADN-uri care. 71). Nucleul este constituentul esenţial al celulelor eucariote fără de care existenţa lor ar fi compromisă. încât o parte din secvenţele de baze purinice şi pirimidinice reprezintă cadrul după care sunt transcrise diferite mesaje sub formă de ARN. anvelopa nucleară).Capitolul 5 ORGANIZAREA NUCLEULUI ŞI EXPRESIA ACTIVITĂŢII GENELOR Nucleul reprezintă compartimentul care încorporează genomul nuclear. prin care informaţia conţinută în secvenţa ADN. prin semnale ce sunt recepţionate de molecula de ADN. Morfologia şi structura nucleului Nucleul este constituit dintr-un înveliş (nucleolema. ARN apare fie ca produs finit cum ARN ribozomal (ARNr) şi ARN de transport (ARNt). 5. În esenţă. Transcripţia ADN se desfăşoară pe toată perioada interfazei şi este blocată în faza M (mitoza). nucleoplasma (matricea). proces complex prin care molecula de ADN se autoreproduce şi dă naştere la copii identice. necesare funcţiilor vitale ale celulei. transcripţia ADN. cealaltă parte a ADN-ului cromozomial are. probabil. fie ca produs intermediar ARN mesager (ARNm). ADN-ul cromozomilor este astfel organizat. El există la toate celule organismelor eucariote. ce vor fi transmise celulelor fiice. deci el conţine aproape întreaga informaţie genetică. de transmitere nealterată a acestei informaţii descendenţilor. constituie aşa numitul aparat de biosinteză proteică (fig. trecând în citoplasmă. care urmează să transmită mesajul de la ADN în sinteza proteinelor. o materie internă. cromatina şi unul sau mai mulţi nucleoli care se găsesc în substanţa de fond. Secvenţele de baze purinice şi pirimidinice se păstrează de-a lungul generaţiilor de celule datorită replicării semiconservative a ADN cromozomial. proces la fel de complex.

Fig. 71. Diagrama structurii nucleului.

5.1.1. Învelişul nuclear
Pe faţa internă a membranei nucleare se distribuie, la nucleul vertebratelor, o împâslire de fibre fine, groasă de circa 200 - 600 Ả, care menţine rigiditatea nucleelor. Studiind raporturile învelişului nuclear, se observă că membrana externă, citoplasmatică, dezvoltă prelungiri scurte sau chiar tubuli care fac legătura cu reticulul endoplasmatic. Aria externă a nucleului este acoperită cu ribozomi; în plus, în multe cazuri apar aglomerări juxtanucleare de mitocondrii furnizoare de energie. Datorită grosimii sale, membrana nucleului este invizibilă la microscopul fotonic. Însă o parte din cromatină este dispusă sub membrana nucleului, astfel că pe secţiunile de ţesuturi colorate, liziera de cromatină perinucleară apare colorată, indicând şi limita externă a nucleului. La microscopul electronic se observă bine că membrana nucleului este dublă, prezentând pe faţa sa internă din loc în loc, îngroşări de care se prind fibrile cromatinei. Cromatină se mai ancorează şi la exteriorul inelelor şi chiar la granulul central. Totalitatea acestor fibre de cromatină constituie cromatină perinucleară . O funcţie importantă a învelişului nuclear constă în schimburile nucleoplasmatice, chiar dacă nu toate categoriile de molecule îl străbat . Astfel, prin învelişul nucleilor izolaţi nu trec glicogenul şi ovalbumina, în schimb trec tripsina, ribomeleaza, DNA-aza, histonele, polianionii ca heparina şi Hb şi bineînţeles, nucleotidele şi aminoacizii, „în vivo", ionii străbat în ambele sensuri învelişul nuclear, astfel că înăuntrul nucleelor se acumulează o cantitate dublă de Na+ şi K+ faţă de citoplasmă . Aminoacizii, monozaharidele şi dizaharidele (GM sub 500) pătrund prin dubla membrană nucleară, iar prin pori trec riboproteine sub formă de ribozomi, dar şi ribonuclează sau feritină. De regulă, calea de trecere transmembranară este urmată de molecule mici de tipul Fe coloidal, dar s-a observat că şi o serie de substanţe elaborate de reticulul endoplasmatic pot trece din el în spaţiul perinuclear (anticorpii antiperoxidazici ai hemocitoblaştilor). 116

Prin „înmugurirea" membranei exterioare a nucleului se formează lamele inela-te în citoplasmă, care sunt purtătoare de ribozomi sau ARN încorporat în membrane . La nucleele celulelor reproducătoare, atât de la plante cât şi de la animale, se pot observa înmuguriri ale învelişului nuclear care dau naştere la vezicule ce pătrund în citoplasmă unde, dezorganizându-se eliberează conţinutul de nucleoproteine. Prin granulul său central, polul opune totuşi o rezistenţă difuziei libere a diferitelor molecule în valoare de 1Ω/cm2. Moleculele cu sarcină electrică pozitivă trec uşor din citoplasmă în nucleu, însă cele încărcate negativ sunt oprite de inelele porilor de care se leagă . EM s-au observat ieşind helixuri de ribonucleoproteine prin porii nucleelor de amibe, iar prin porii nucleelor glandelor salivare de chironomide trec granule de 200 - 400 Å diametru, tot de ribonucleoproteine. Ribonucleoproteinele ajunse în citoplasmă reprezintă diferiţi ARN m, precum şi fracţiile 18 S, 25 S, 5 S ale ARN v asociate cu proteinele lor specifice. Însăşi ca numărul porilor poate creşte sau scade dă o indicaţie asupra rolului lor în reglajul transferului de informaţie care, în mare, se realizează de la nucleu către citoplasmă prin mesageri dar şi de la citoplasmă spre nucleu prin proteine histonice şi nonhistonice, printre nonhistonice figurând unele enzime. Este bine cunoscut faptul că, sub acţiunea fitohemaglutininei, limfocitele în cultură se transformă în limfoblaşti. Fitohemaglutinina acţionează asupra unor receptori membranari care activează AMP-cicloza, producând cAMP. Acest nucleotid ciclic stimulează o proteinkinaza, care produce o proteină ce pătrunde în nucleu. Acolo determină o puternică activitate transcripţională, sintetizându-se ARN m, ARN t şi ARN v care trec din nucleu în citoplasmă. Astfel se asigură o intensă activitate de biosinteze citoplasmatice, dar şi de mitoze ale limfoblaştilor. Învelişul nuclear mai are şi rol de formarea lamelelor inelate . în telofază, când are loc refacerea membranei nucleare pe seama reticulului endoplasmatic, rămâne un „surplus" de membrane endoplasmatice fie incluse în nucleu, fie în citoplasmă din jurul acestuia. Membranele respective se dispun paralel şi nu mai participă la reconstrucţia învelişului nuclear din cauza rapidităţii ciclului celular. Asemenea membrane inelate se întâlnesc, de obicei, în celule embrionare şi sexuale cu cicluri celulare scurte. În interfază, membrana exterioară a nucleului înmugureşte spre citoplasmă vezicule care ulterior se desprind şi, aşezându-se cap la cap, constituie lamele inelate. Prin contopirea acestora rezultă cisternele golgiene. În alte cazuri, membrana exterioară a nucleului, după ce pierde ribozomii, înmugureşte pe o porţiune anumită, dând naştere unei serii de vezicule. Acestea, cu timpul, se desprind şi depunându-se în şiraguri, se contopesc formând cisterne golgiene. În timp ce se formează o cisternă, pe faţa sa externă (uneori convexă) se dispune un alt şir de vezicule, şi aşa mai departe, în asemenea mod luând naştere un dictiozom. Porii Dubla membrană este străbătută de pori având un diametru de circa 700 Å care conţine fiecare câte un inel proteic ce limitează orificiul porului la 500 Å. Distanţa dintre centrele a doi pori alăturaţi este de circa 1300 Å, sau un multiplu al acestui număr, existând întotdeauna o legătură cu cromozomii interfazici, deoarece opt fibrile ale cromatinei se ataşează de marginile fiecărui por . De fiecare por sunt asociate o serie de structuri care fac parte din matricea nucleară . Fiecare por cuprinde un material inelar, o diafragmă, un granul central şi un material fibrilar. Materialul inelar cuprinde opt particule sferice proteice de circa 200 Å diametru aşezate pe fiecare faţă a porului; acest material îşi modifică structura în funcţie de metabolismul celular.

117

Dilatările şi contracţiile porilor se explică prin adiţia, respectiv pierderea proteinelor constitutive ale inelului. Diafragma este o substanţă densă, amorfă din interiorul porului, care se întinde spre centrul lui, unde se află un granul central riboproteic de 250 Å diametru. De el se leagă fibrilele de 50 Å diametru, care fac legătura cu particulele sferice interne şi externe ale porului. O fibrilă încercuieşte lumenul porului la interior, solidarizând astfel materialul său fibrilar ( fig. 72; fig. 73). Fig. 72. Structura porului nuclear: a( structura octogonală a complexului nuclear al porului în membrana nucleară; b) o secţiune verticală a complexului; granula centrală apare numai în anumiţi pori.

Fig. 73. Secţiune prin porul nuclear care prezintă schematic şi ipotetic sub formă de cilindru, tunelul care ar exista în structura porului şi prin care moleculele sunt transportate în interiorul sau exteriorul nucleului.

5.1.2.Matricea nucleului
Reprezintă o structură proteică formată dintr-o reţea de fibrile foarte strânse şi fine, care umplu complet spaţiile dintre blocurile mai mici sau mai mari de cromatină. Matricea nucleului poate fi văzută la microscopul fotonic prin tratarea celulelor cu alfaamanitină. Acest alcaloid produce în două ore contracţia cromatinei, iar după fixare şi colorare cu hemalaun-enzimă, la microscopul fotonic se observă cum matricea este separată de blocurile cromatinei contractată, prin conturări clare, necolorabile (deci spaţii goale). Matricea dintre blocurile cromatinei este Feulgen (-), deci nu conţine ADN şi se colorează slab cu albastru de toluidină, hemalaun sau verde luminos, deci nu conţine grupări fosfatice multe. Matricea rezistă bine la „digestia" cu RN-ază, dar poate fi uşor solubilizată cu pepsină, ceea ce indică un conţinut predominant proteic. Tratarea nucleilor izolaţi din culturi celulare (Hela - S3) cu tampoane bogate în săruri, DN-ază şi ditiotreitol a permis izolarea unei structuri de natură proteică asemănătoare ca aspect cu cea a nucleului, dar „golită" de cromatină care a fost digerată cu DN- ază. Analizele ultrastructurale şi biochimice indică faptul că matricea constă din elemente membranare şi fibrilare cu o compoziţie chimică de 87% proteine, 12% fosfolipide, 1% ADN, 0,1% ARN. Proteinele separate prin electroforeză în strat subţire de dodecil-sulfat de sodiu (SDS) în gel de poliacrilamidă s-au dispus în 30 - 35 de benzi cu GM între 14.000 - 20.000. Matricea este reprezentată prin două clase de peptide majore, cu o greutate maximă cuprinsă între 14.000 - 18.000 şi respectiv 45.000-75.000. 118

În celulele sincronizate (aduse la aceeaşi fază a ciclului celular) se constată că în toate fazele ciclului celular au loc sinteze de polipeptide matriceale, dar ele sunt mai reduse în faza S/G2 (divizibil). După diviziunea celulară, în lipsa biosintezei proteice, vechile polipeptide cu GM cuprinsă între 45.000 - 75.000 persistă după mitoză şi refac noua matrice a nucleului interfazic. Cercetările de histochimie EM, combinată cu analiza electroforetică a proteinelor matriceale, au permis fundamentarea teoriei fibrilare a matricei nucleare (D. Comings şi T. Okada, 1978). După extragerea cromatinei nucleelor hepatocitelor de şoarece cu soluţii saline concentrate şi tratate apoi cu DN-ază şi TRITON X-100 rămâne numai matricea, cu o structură fibrilară, care este reprezentată prin porii şi lamina fibrilară a învelişului nuclear, componenta fibrilară a nucleolilor şi matricea intranucleară propriu-zisă. E.M., matricea nucleară este compusă din fibrile proteice de 20 - 30 Å, denumite matrixină. Ele se asociază în fibre mai groase, de 100 - 300 Å. Separarea electroforetică a matrixinei evidenţiază trei benzi polipeptidice cu greutatea maximă 65.000, 67.000 şi 68.000. Peste tot matrixină se leagă de fibrile de cromatină, ea având un rol principal în organizarea acestor fibre în cromomerele cromozomilor mitotici şi meiotici.

5.1.3.Proteinele contractile nucleare
Au fost evidenţiate în diferite tipuri de nuclee din care s-au extras cromatină. Apoi din cromatină s-au izolat mai departe proteinele nonhistonice, prin electroforeză . În felul acesta sau putut separa: miozina (G.M. 200.000), actina (G.M. 45.000), tropomiozina (G.M. 34.000) şi subunităţile sale. Comparându-se conţinutul în miozina şi actină din cromatină hepatocitelor şi cea a neuronilor, se constată că în ficat miozina este în cantitate de 1,8 mai mare ca în creier şi actina de 2,3 ori. Este foarte probabil ca activitatea transcripţională a hepatocitelor în mesager (ARN m) ai actinei şi miozinei să fie de două ori mai mare ca în neuroni. Există deci un raport invers proporţional dintre conţinutul actinei cromozomale şi activitatea transcripţională. Probabil, actina exercită o represie asupra cromatinei, prin condensarea ei la maximum, făcând-o astfel netranscripţională. Se pare că actina nu se leagă direct cu ADM ci realizează un anumit tip de condensarea cromatinei.

5.1.4.Cromatina
Toţi nucleii prezintă în interfaţă regiuni extrem de împachetate ale fibrelor cromozomale . Nucleii interfazici fixaţi şi coloraţi cu coloranţi bazici (albastru de toluidină, de metilen, Azur A etc.), care colorează cromatina, o evidenţiază sub formă de particule mai mari sau mai mici şi împlântate în matrice, ca o pătură subţire cromatică pe faţa internă a învelişului nuclear şi una sau mai multe blocuri în jurul nucleonului. Aspectul general al cromatinei este asemănător la nucleii aceluiaşi tip celular, dar variază în anumite limite după fixarea folosită . Astfel, cromatina se poate prezenta sub formă de grămezi sau grămăjoare de granule fine şi prelverulente, până la o reţea cu unele noduri ceva mai groase. Aspectul variază după tipul de celulă şi gradul ei de activitate metabolică, dar şi ci specia considerată . Examenul electrono-microscopic al cromatinei arată ca ea este formată din fibre împachetate - filamente nucleoproteice - cu traiectorie spiralată şi cu diametrul variabil. In zonele mai groase fibrele au diametrul de 200 - 500 Å, pe când în zonele subţiri de numai 60 100 Å. între grămezile de cromatina se găsesc spaţii intercromatiniene, colorate slab cu coloranţi bazici, în care se mai află o serie de structuri: ƒ fibrile cromatiniene, distanţate unele de altele şi fără traiecte spiralate; ƒ fibrile pericromatice, de 30 - 50 Å diametru, care mărginesc blocurile de cromatina; ƒ granule intercromatiniene, de 250 Å diametru, formate din tasări de fibrile pericromatiniene. Asemenea granule sunt rezistente la DN-ază şi numai după tratare cu pronază 119

pot fi digerate după aceea cu DN-ază. Asemenea granule intercromatiniene par a fi trei forme succesive de ARN m şi ARN v care ies din nucleu în citoplasmă unde rămâne câtva timp inactive datorită proteinelor pe care le conţin ƒ granule pericromatiniene situate la periferia cromatinei, mari de 450 Å diametru şi înconjurate de un halou clar care le separă de masa fibrelor cromatinei. Asemenea granule sunt formate din fibrile de 30 Å diametru, foarte neregulate ca traseu, ce depăşesc uneori marginea granulelor . Ele sunt tot de natură ribonucleoproteică şi au rol în transmiterea unor informaţii în sens invers, adică de la ARN la ADN; ƒ corpii spiralaţi din regiunile intercromatiniene, care reprezintă împachetări de fibrile răsucite, de 400 - 600 Å diametru, asociate sub formă de agregate sferice de 0,5µ. Ele sunt tot de natură ribonucleoproteică şi mai conţine şi nişte fibrile subţiri, de 50 Å, care se înfăşoară în jurul axului lor. Cromatina se găseşte sub două forme: eucromatină, considerată ca fiind acea parte din cromatină cu fibre fine şi uniforme repartizate în nucleu, active în replicarea ADN şi în transcripţia ARN şi heterocromatina rezultată compactizarea cromatinei sub formă de granule şi grămezi de diferite mărimi. Este intens colorabilă în roşu prin reacţia Feulgen pentru ADN şi albastru când se tratează cu coloranţi bazici. Studiile comparative de ME efectuate la plante şi animale au arătat că structuralizarea cromatinei se prezintă, funcţional şi evolutiv, diferit la plante şi animale. Astfel, în nucleii de Arabidopis cromatină formează cromocentre (cromozomi heterocromatici sau porţiuni de cromozomi care rămân condensate şi astfel colorabile în interfază); la Viscum album heterocromatina este reprezentată tot prin cromocentre, în schimb eucromatină formează cromomere şi cromonemate mai subţiri decât heterocromatina, dar la fel de intens colorabile. La Hedera helix, nucleii meristematici prezintă blocuri mari de heterocromatina condensată printre eucromatină decondensată, sau nucleii adulţi, care printr-o subreplicare (replicare a numai unei părţi din genom) devin tetraploizi (4n), suferă o cădere apreciabilă a cantităţii de heterocromatina condensată . în acest caz, eucromatină nu mai este activă în replicarea ei, probabil, numai în transcripţie . Între speciile de plante există o variaţie a cantităţii de cromatină condensată prin faptul că atât heterocromatina, cât şi eucromatină se condensează. Condensarea eucromatinei este determinată la plante de cantitatea de ADN a speciei date, precum şi de compoziţia acesteia. Variaţia cantităţii de cromatină din nucleii unei specii de plante este expresia replicării diferenţiale a heterocromatinei, care este în întregime constitutivă şi nu se exprimă prin condensări şi decondensări funcţionale în raport cu activitatea fiziologică a celulelor . La mamifere, însă celulele cu o activitate mitotică intensă sunt complet eucromatice, adică cu cromatină decondensată. La aceeaşi cantitate de ADN în ţesutul considerat, coexistă nuclee cu cromatină decondensată, mase de cromatină şi nuclee cu aproape toată cromatină condensată. În toţi aceşti nuclei cromatină condensată este constitutivă, Giemsa + şi încorporează mai târziu timidină tritiată, deci are o replicare întârziată - expresie a inactivării diferenţiale a cromatinei. O stare de condensare completă a cromatinei se întâlneşte la eritrocitele nucleate ale nemamiferelor şi care este total nereplicativă, ca şi în nucleii spermatozoizilor. La animale, gradul condensării cromatinei este dependent de funcţia celulei, fiind specifică unei activităţi tisulare anumite. Heterocromatina transcrie o foarte mică cantitate de ARN. Dat fiind complexitatea problemei, este necesar de schiţat o clasificare a aspectelor pe care la prezintă condensarea şi decondensarea cromatinei: Termenul de „heterocromatina" se foloseşte pentru heterocromatina constitutivă, care ocupă o regiune permanent condensată din cromozom şi a cărei localizare este identică la cromozomii analogi. Aceasta conţine o mare cantitate de ADN respectiv (secvenţe de baze care se repetă), se replică după eucromatină, nu transcrie ARN şi se colorează diferit;

120

într-un mod neîntrerupt. De un metru la mamifere . spiralizat la rândul său însă de câteva ori. într-un volum atât de mic? Mai mult chiar. deoarece este de două ori mai mare cu o bazicitate crescută la 37%. arată că ADN este 19. 74). în schimb moleculele H2A şi H2B au o mai mică fidelitate. A. din nucleii eritrocitelor de pasăre) este diferită de celelalte clase histonice. Termenul de „cromatina condensată" semnifică eucromatina inactivată în mod specific de proteine. întregul dublu helix al ADN al fiecărui cromozom se înfăşoară pe un şir enorm de asemenea corpusculi hiostonici. Ei sunt compuşi dintr-un miez histonic. Acest tip de heterocomatină se caracterizează prin prezenţa unor proteine care modifică ADN făcându-l total inactiv. având un conţinut de 25% lizină. al femelelor de mamifere. H2A. Moleculele histonice H4 şi H3 sunt identice la toate speciile.D. protamine. H3. aceasta deoarece cromozomul Y la mamifere a suferit o inactivare genetică prin heterocromatinizare. alanină şi valină. în jurul căruia se înfăşoară dublul helix al ADN . câte două din clasa H4. Miezul nucleozomului este reprezentat printr-un set de opt molecule histonice. ce constituie miezul nucleosomic. Acest complex. H3. Oudet şi Ada Olins. cum este cazul limfocitelor inactive.sunt singurele care se pot manifesta. Prin stimularea celulelor cu lecitine. R. s-a arătat că. un octamer histonic. Când volumul nucleului respectiv este în jur de 15 µ3. arginină şi histidină. 121 . O serie de cercetări din ultimii 10 ani (P. adică foarte condensat şi colorabil (cromatina sexuală). deoarece caracterele localizate pe un singur cromozom X .5. inactiv. este înconjurat la exterior de două spire ale ADN-ului cromozomal. corpusculul nu este străbătut de helixul dublu al ADN. al spermatoizilor etc. oricât ar fi el de subţire (20 Å).Termenul de „heterocromatina facultativă" exemplifică cromozomul X. cu toate că porţiunea fără caracter bazic a rămas nemodificată. şi anume.6% sunt solubile în 0. numit octamer. în medie. Klug) au dus la concluzia existenţei în nuclee a unor corpusculi numiţi nucleozimi. Molecula H. ci acesta se înfăşoară în jurul corpuscului. iar miezul histonic ar fi mărgelele. al eritrocitelor nucleate. H2B. miezul este deci. ARN 14% şi proteinele 66. se pune întrebarea cum este posibil să încapă un metru ADN. care apare heteropicnotic în interfază. Această situaţie sugerează imaginea unor mărgele înşirate pe aţă. Considerând că fiecare cromozom este format dintr-un singur dublu-helix de ADN. adică de la un capăt la celălalt al cromozomului.4%. cu un conţinut ridicat de lizină. 5. Numai că în cazul structurii nucleozomale.Organizarea moleculară a fibrelor de cromatina. iar cromatina se decondensează şi ADN-ul poate sintetiza diferiţi ARN mesageri . de histone. constituit din 166 nucleotide. s-a putut calcula că lungimea totală a ADN tuturor cromozomilor complet despiralizaţi dintr-un nucleu este. precum şi transcrierea diferitelor ARN etc. 30. ADN ar reprezenta aţa. H2A şi H2B. La fel sunt şi cromozomii X sau Y din celulele sexuale ale unor insecte care se aglomerează în corpusculi Feulgen +. în soluţii tampon cu o concentraţie ionică medie. (H. H3. regiunile mijlocii şi carboxiterminale ale moleculelor celor 5 clase histonice (H1. Analiza cromatinei interfazice realizată prin metoda precipitării cu magneziu.1.6% .2 MH2SO4 . H4) sunt globulare (fig.Kornberg. acestea se transformă în celule blastice (tinere). Nucleozomii Organizarea moleculară a fibrelor de cromatina este realizată prin dublu helix al ADN şi prin diferite proteine (histone.genele recesive . Dintre proteine. H2A şi H2B. astfel că genele de pe X au devenit semizigote la mascul. Legătura dintre doi nucleozomi succesivi se face printr-un segment de dublu helix ADN cu o lungime variabilă de câteva zeci de perechi de nucleotide care este asociat cu o moleculă de histonă H1. existenţa ADN cromozomal în micul volum oferit de nucleu asigură o serie de funcţii şi roluri ale cromozomilor cum sunt replicarea şi reparaţia materialului genetic (ADN). nonhistone foarte variate). Miezul histonic al nucleozomilor este constituit din patru clase histonice: H4. La această întrebare s-a răspuns prin teoria structurii nucleozomale a cromozomilor.

cu excepţia hi se leagă şi neutralizează sarcinile negative numai pe o parte ale dublului helix ADN. Octomerul histonicare formă de inimă. fiind globulare. Studiile de reconstituire de cromatină în care s-au format cele patru fracţii histonice ce alcătuiesc miezul nucleosomic. Nucleozomii sunt legaţi între ei de un fragmant de ADN „linker” care nu este legat de proteine. dar au un aspect mai puţin regulat şi ADN nu mai intră în şi iese din miezul nucleosomic la acelaşi punct. nucleosonii sunt încă distribuiţi de-a lungul matrixului ADN la aproximativ 200 perechi de baze. care formează partea centrală şi vârful inferior al inimii şi asocierii sale cu cei doi dimeri (2H2A şi 2H2B) spre a forma cele două vârfuri superioare ale inimii. Interacţiunile dintre moleculele H3 şi H4 sunt foarte puternice şi ele conferă miezului nucleosomal o formă specială de glugă.terminale.Fig. în diferite combinaţii.terminale hidrofalse ale histonelor care. nu în structuri helicale. pe când.Prin hidroliză enzimatică nucleozomii se separă conţinând ADN de aprox. pe partea opusă fiind încă prezente repulsii de aceeaşi sarcină.74 . Nucleozomii sunt formaţi din două spire de ADN (ture) care înfăşoară un miez („core”) format din 8 molecule de histone (câte 2 de fiecare tip de histonă (H2A. rezultă particule lipsite de histonă H1 care conţine 140 ± 10 perechi de baze de ADN. Cromatina lipsită de histona H1 nu prezintă o structură regulată.Structura nucleozomilor. Toate histonele. deci controlează starea conformaţională a complexului de molecule. Localizarea şi asamblarea celor 8 molecule histonice în miezul nucleosomic sunt cu aproximaţie cunoscute. pentru a se cunoaşte rolul fiecăruia în ansamblul molecular nucleozomal. Nucleonii au formă sferică şi un diametru de 100 Å. Nici o combinaţie de histone nu se poate realiza atunci când se omit histonele H3 şi H4. permiţând astfel plierea ADN în jurul miezului histonic.H3 şi H4). bogate în arginină şi lizină rămân la periferie sub forma unei cozi care interacţionează cu ADN ce se înfăşoară în jurul miezului sub forma aproape două (l şi 3/4) tururi super helicale negative. Când din cromatină se extrage H1 şi este menţinută la puteri ionice scăzute. toate sau o parte din ele. 122 .H2B. Moleculele histonice se pot separa una de alta şi apoi reasocia experimental. datorită aranjamentului sub formă de disc al tetramerului 2H3 . Dacă puterea ionică este ridicată peste 40mM NaCl. se angrenează spre a constitui partea centrală a octomerului. cel mai puternic asociindu-se aceste histone bogate în arginină a căror secvenţă de aminoacizi a fost puternic conservată în decursul evoluţiei. ci la puncte opuse. Variabilitatea lungimii de la 180 la 250 perechi de nucleotide este determinată în exclusivitate de variabilitatea lungimii segmentului internucleosomic. au condus la obţinerea unor date care confirmă aranjamentul stabilit de histonele în alcătuirea nucleosomilor.2H4. 146 pb. Octomerul este probabil stabilizat în urma interacţiunii capetelor C . cu nucleoză. urmată de purificare. În urma digestiei prelungite a cromatinei. capetele N . cromatina se condensează în aglomerări. Partea centrală a octomerului histonic este formată dintr-o unitate tetramerică (2H3+2H4).

de asemenea.000 ori. O condensare ulterioară produce fibra de 100 Å. Aşa cum a arătat Batson (1976).90. ADN-ul formează structuri moniliforme (structură nucleosomală). Constituenţii de bază ai cromozomului eucariot sunt fibrile de cromatina de 100 şi 300 Å diametru. se găsesc o serie de ADN-polimeraze prin care se realizează replicarea semiconservativă a ADN.000 ori până la 250.170 cm (aproximativ 2 m) pot fi adăpostite la nivelul celor 46 de cromozomi a căror lungime totală este de până la 200 µm. lanţul nucleosomal formează suprastructuri helicoidale cu ture de către şase nucleozomi. ca şi în mitocondrii şi cloroplaste. Prin plierea acestei fibre rezultă morfologia cromozomului metafazic. aşa încât în cromozomul metafizic condensarea ajunge la un nivel mediu de 7. sinteza sa este unul dintre cele mai importante evenimente din viaţa acesteia . care pot fi văzuţi la microscopul electronic. 1979) fibre ce circa 400 Å diametru care s-ar forma prin condensarea fibrelor de 250 .000 bucle de aproximativ 40. reprezentând singurul caz din lumea biomoleculară în care o substanţă îşi dirijează propria sa sinteză . În cromozomi. Această formă s-a numit filament nucleosomal. orice sistem biologic realizând sinteza replicativă de ADN ca o precerinţă a reproducerii sale. care împreună cu alte enzime (fosfoprotein-fosfatazele acide şi neutre. bucle care pornesc cu o ramură dintr-un punct al scheletului proteinic şi se întorc cu cealaltă ramură într-un punct adiacent acestuia. fibra nucleosomală se spiralează la rândul ei de cinci ori în solenoid şi de 40 de ori ca suprasolenoid. În cromozomii metafazici s-au evidenţiat (Back.8. proteazele etc) şi diferite proteine de structură. sinteza ADN.000 . Când se reasociază cu histone. La fel se explică şi în cazul mamiferelor posibilitatea cuprinderii moleculei de ADN care alcătuieşte cromozomii într-un volum nuclear foarte mic.000 perechi de baze lungime. Aceasta se mai condensează încă de cinci ori.300 Å diametru. Complementaritatea celor două catene a dublului helix ADN a sugerat lui Naston şi Crik modelul semiconservativ de replicare. RN-azele. Dacă cromatina intactă care conţine toate histonele este menţinută la o concentraţie scăzută de săruri (1mM NaCl). Dacă din cromozomi sunt eliminate histonele şi asemenea .Aceste cercetări sugerează că histona H1 are un rol structural şi este esenţială pentru nivelele superioare de organizare a cromatinei. Pornind de la ADN. 5. cu ADN ce intră şi iese din direcţii opuse la un acelaşi punct. Studii biochimice au arătat că în nucleu.000 de ori în cromozomul metafazic. Replicarea ADN la eucariote Deoarece ADN conţine informaţia genetică a celulei. Prin „digestia" cromatinei cu eudonucleoza micrococală s-au obţinut particule nucleosomală monomerice de care sunt asociate ADN-polimerazele.300 Å.000 . Aşa se explică cum moleculele de ADN extinse de la nivelul cromozomilor complementului cromozomal uman având o lungime totală de 164 . este o reacţie de tip selectiv.se vizualizează EM. în fibre cu configuraţii helicale de ordin superior. având diametru de 100 Å. Realizată prin intervenţia unui complex aparat enzimatic. În prezenţa unor concentraţii saline apropiate de tonicitatea celulară. acest schelet proteinic împreună cu ADN formează un „halou" de circa 4. 2. rezultând o structură suprasolenoidală care s-a numit fibra-unitară (unit-fiber). apoi fibra de 300 Å (solenoizii) care la rândul lor sunt organizate. condensarea generală este de 5. cu nucleosonii bine definiţi. cromatina este ancorată la un schelet proteinic care formează partea centrală a întregii structuri cromozomale. enzimele de restricţie şi reparaţie. Sunt aşa numiţii solenoizi sau supersuperhelix. Ierarhia de helixuri a fibrei de cromatina porneşte de la dublu helix ADN care se condensează de şapte ori în nucleosom. diametru unei structuri supersuperhelix sau solenoid este de 250 . sunt clasate în aşa-numitele proteine nonhistonice. Replicarea acizilor nucleici stă la baza reproducerii vieţii. acestea se prezintă ca o structură destul de deschisă. mecanismul replicării este asemănător 123 .

Fig. Bazele din cele două catene ADN (vechi sau noi) sunt complementare. dintr-o moleculă iniţială iau naştere două molecule identice între ele şi totodată identice cu molecula iniţială. replicarea acizilor nucleici nu poate avea loc decât în celule. 75 . vrând să sugereze. 76. prin acest sistem dual mecanic. Este. de asemenea.mecanismului cheie-broască. având loc formarea a două molecule fiice.ci numai în celula gazdă în care au pătruns în timpul infecţiei virale. pe de o parte reproducerea fidelă şi continuitatea fenomenului ereditar de-a lungul generaţiilor (fig. astfel că moleculele fiice vor avea o catenă veche 124 . Continuitatea este asigurată de faptul că în moleculele nou formate intră şi câte o catenă din molecula iniţială. unic în lumea macromoleculelor şi în lumea vie. molecula iniţială îşi „topeşte" identitatea în cele două molecule fizice care derivă din ea şi care sunt identice ei. Fig. identice cu molecula preformată. Replicarea la eucariote (se realizează bidirecţional. Termenul de REPLICARE derivă de la cuvântul englezesc „to replicate" = a copia (fig.Când ele se separă în cursul replicării. fie eucariote.particulă virală naturală . sinteza replicativă a ADN implicând existenţa obligatorie a unei molecule preformate care participă direct în reacţie. Replicarea este caracteristică doar acizilor nucleici.Înlănţuirea bazelor într-o singură catenă de ADN. Replicare acizilor nucleici virali nu poate avea loc în virion . complementaritatea structural-funcţională a celor două catene ADN.Acest model asigură ca moleculele noi de ADN să fie identice cu cele vechi. remarcabil pentru lumea vie faptul că nu se poate crea „de -novo" nici o moleculă de ADN. pentru sinteza unei noi catene complementare care se numeşte replică. drept matriţă. În condiţiile vieţii actuale.sunt adăugate bazele complementare la catenele vechi pentru a forma catenele noi (fiice). Se asigură. fiecare servind drept model. proces care se numeşte replicare. 76). a). Aceştia prezintă o structură uimitor de potrivită pentru realizarea replicării în care. Schema simplificată a replicării semiconservative. fie procariote. de la o singură origine (O) se formează două furci de replicare în direcţii opuse). Astfel. 75). Sinteza unei noi molecule de ADN se realizează aşadar printr-un proces de copiere. b).

polimerizatoare: ADN -polimeraza I numită enzima lui Kornserg şi simbolizată Pol I.implicată în replicarea propriu .polimeraza III. asociată cu 4 polipeptide de 54.) sinteza nucleotidelor propriu-zise care intră direct în alcătuirea macromoleculei acizilor nucleici: ƒ dezoxiadenozintrifosfat .) sinteza precursorilor nucleotidelor purinice şi pirimidinice adică a acidului inozinic şi respectiv acidului uridilic .polimeraza II şi ADN . deplasându-se pe ambele catene matriţă doar în direcţie dinspre 3' spre 5'.d CTP . ƒ citidintrifosfat .pol III este enzima polimerizatoare în replicare.d GTP . fiind prezentă şi în mitocondrii. dar ea nu joacă rol esenţial în replicare.000 şi 64. ADN . Deşi la început s-a crezut că ADN . ƒ dezoxigreananozintrifosfat .) polimerizarea ordonată a nucleotidelor într-o secvenţă complementară unei matriţe după modelul semiconservativ şi sub cataliza unor enzime polimerazice celulare. dar nu se întâlneşte la plante şi protezoare. La bacterii au fost descrise trei enzime ADN . absenţa numai a uneia dintre ele blocând activitatea enzimei polimerizatoare. 58. cu precizarea că enzima poate copia un ARN natural.GTP.d ATP .cea care a funcţionat ca matriţă şi o catenă nouă sintetizată . fi implicată în procesele reparatorii sau de recombinare. catalizând formarea punţilor fosfodiestenice (polimerizarea nucleotidelor) doar în direcţia 5' spre 3'. 61. este responsabilă de 80% din activitatea totală a enzimelor de replicare. ƒ guanozintrifosfat . ƒ dezoxitimidintrifosfat .polimeraza beta (β). pe când ADN . în timp ce a polimerază se află la toate celulele eucariate . 125 .Complexul de enzime polimerazice implicate în replicare În desfăşurarea reacţiei de polimerizare este necesară prezenţa tuturor celor patru tipuri de dezoxiribonucleide sub formă lor trifosfatică. Moleculele fizice de ADN moştenind doar una din cele două catene ale moleculeimamă.zisă.d TTP (pentru ADN) şi: ƒ adenoziritrifosfat . Polimeraza a este constituită dintr-o unitate catalitică de 150.UTP pentru ARN. Această proprietate aminteşte de transriptaza inversă virală.000. O caracteristică interesantă a β . ADN . iar nevertebratele una asemănătoare.000.2. La eucariote s-au descris mai multe tipuri de ADN polimeraze: ƒ polimeraza alfa (α) . catenele complementare fiind deci antiparalele .000 daltoni.CTP. In vivo sinteza acizilor nucleici se desfăşoară în trei etape: a. implicată în reparare. de asemenea. S-ar părea că vertebratele au acelaşi fel de polimeraza. ƒ uridintrifosfat . care se pare a fi polimeraza mitocondrială. Este prezentă la toate metazoarele. b.ADN . Funcţia ADN . ƒ dezoxicitidintrifosfat . 5. nu numai în nucleu. c.pol II bacteriene nu este încă precizată. mecanismul de replicare se numeşte semiconservativ.replicarea complementară a matriţei.palimerază este capacitatea de a folosi o matrice ribonucleotidică în prezenţa unei „amorse" ADN.polimerazele prezintă specificitate de direcţie.pol I este implicată în reacţia de replicare. putând. nu însă şi de secvenţă (nu recunosc o anumită secvenţă specifică de baze azotate din ADN).pol I joacă rol esenţial în repararea leziunilor produse în ADN de către diferiţi agenţi mutageni fizici sau chimici.000 daltoni ce formează subunitatea heteropolimerică stimulatoare a regiunii catalitice sau cu funcţie stabilizatoare a complexului ADN-polimeraza.1.ATP. ƒ polimeraza gama (γ). astfel că totdeauna polaritatea replicei este de sens opus polarităţii matricei. ulterior sa dovedit că doar ADN . .

ADN mitocondrial. macromoleculele ADN capătă forma literei „Y ". în calitate de matriţă. intervin în asigurarea stabilizării monocatenelor. În celule. pot separa catenele dublului . După intervenţia topoizomerazei care determină relaxarea ADN la nivelul originii replicării. helicaza descrisă sub denumirea de proteină reparatorie se deplasează pe monocatena ADN în direcţia 3' . 5. constituind un tetramer. Acestea realizează separarea catenelor prin ruperea punţilor de H. Energia liberă de la nivelul acestei „creşteri" este suficientă pentru a desface încă 2-3 punţi de H. La nivelul bifurcaţiei de replicare se desfăşoară procesele mecanismului semiconservativ de replicare prin intervenţia unui complex aparat enzimatic. pentru a se permite înaintarea bifurcaţiei de replicare de-a lungul circumferinţei moleculei. ADN-giraza superspiralizează ADN printr-un mecanism numit inversie de semn. Iniţierea replicării se face într-un punct de pe macromoleculă ADN numit originea replicării.Faptul că ADN .ADN. La E. moment în care se ataşează ADN .3'. enzima de relaxare pe ADN sau UNWINDAZĂ. îndepărtând catena complementară. în care o superhelice pozitivă este direct convertită într-una negativă. În vederea replicării. macromoleculele ADN se află sub formă de structuri terţiene sau cuaternare. Iniţierea replicării Separarea celor două catene complementare .închidere. printr-o creştere tranzientă monocatenară a ADN bicatenar într-un anumit punct.C.enzima polimerizatoare. O asemenea secvenţă de origine se caracterizează (la toate sistemele biologice analizate) G .polimeraza .în procesul de replicare se realizează progresiv. Această torsionare este înlăturată prin acţiunea unei enzime care are capacitatea de a introduce crestături monocatenare tranziente în duplexul ADN. astfel că. bifurcaţia sa numindu-se bifurcaţie de replicare şi reprezentând cele două catene . aceste perechi având doar două punţi de H. în desfăşurarea procesului. una având gruparea 3' . La nivelul perechilor A . respectiv proteine de topire a ADN. În urma acestei „creşteri" rezultă 2 extremităţi. sunt mai uşor de separat comparativ cu perechile G . folosind energia provenită prin defosforilarea ATP.2. având o aceiaşi acţiune ca şi proteina reparatorie.polimeraza nu are specificitate de secvenţă este dovedit de folosirea. metaforic s-a spus că topoizomerazele . desemnate HMG1 şi HMG2. intervin enzime numite HELICAZE .2. Proteine neenzimatice denumite UNWINDAZE sau proteine destabilizatoare ale dublului helix (HDP). pe când cea de-a doua subunitate a topoizomerazei acţionează ca ADN . coli. Una din aceste subunităţi funcţionează ca topoizomerază propriu-zisă. recunoscând în mod specific secvenţa de nucleotide de la nivelul acestei origini. La eucariote s-a arătat că proteinele nonhistonice. O altă helicaza numită helicaza III se deplasează în direcţia 5' .helix ADN. prin superspiralizare. datorită superspiralizării prezintă numeroase superrăsuciri. 126 . ceea ce permite rotaţia liberă a unei catene. Există şi alternativa ca primul eveniment în separarea catenelor dublului helix să fie intervenţia la punctul de iniţiere a replicării. produce o „tăiere" a uneia dintre cele două catene tăiere care nu este altceva decât desfacerea unei legături covalente fosfodiesterice.OH şi alta 5' .ce devin catene matriţă . Topoizomerazele introduc superspiralizări tranziente negative în ADN.C care având trei punţi de H sunt mai stabile .polimeraza nu poate folosi ca matriţă ADN bicatenar. ADN . enzima de creştere .5'. a unei endonucleoze care. este necesară relaxarea macromoleculei torsionate. De aceea.GIRAZĂ sau PROTEINĂ OMEGA (Ω) introducând tururi superhelicale în ADN nou sintetizat. Topoizomeraza este alcătuită din două subunităţi luate de câte două ori. a primit în ultimul timp numele de TOPOIZOMERAZĂ . în jurul celeilalte. Această enzima numită iniţial pivotază.fosfat. refăcând starea superhelicală a moleculei fiice de ADN .matriţă ce-şi expun bazele în vederea împerecherii cu bazele azotate ale nucleotidelor libere.ADN.ADN „desfac şi fac nodurile din ADN".T are loc iniţierea separării celor două catene. în reacţiile „în vitro". iar cele circulare. cum sunt ADN bacterian. dar monocatene de ADN de orice proeminenţă ar fi ele.

de un ARN .pol I care va realiza completarea printr-o reacţie de polimerizare regională.sintetizat şi terminarea replicării Capătul 3'-OH al fiecărui nucleotid aliniat pe matriţă.enzima care are capacitatea de a iniţia sinteza „de novo" de catene polinucleotidice.nepermiţând. în ultimă instanţă. Alungirea lanţului de ADN nou .pol III. S-a stabilit cu certitudine că în replicare intervine o singură enzimă polimerizatoare . odată ataşate la ele. nu însă şi de a iniţia sinteza „de novo" a unei catene. replică a matriţei.5'. Această intervenţie a ARN .4. 3' . pe când aceea cu sinteză încetinită se numeşte catena succesoare (lagging) (fig. determinând polimerizarea numai în direcţia 5' . Pentru aceasta.polimerazei.3' . folosind ca model o catena . astfel că acestea să poată funcţiona ca matriţă. Polaritatea opusă a catenelor . rezultă din unirea acestora din urmă catena nou sintetizată. în desfăşurarea polimerizării de nucleotide din cadrul replicării ADN. După sinteza fragmentului Okazaki. numită catena directoare (leading). Okazaki şi colaboratorii au demonstrat prin experienţe de marcare pulsatorie (contactul materialului biologic cu H . 5. este necesară ca primă etapă intervenţia unui ARN .3'. După desfacerea structurii bicatenare în monocatenare şi stabilizarea monocatenelor la nivelul originii replicării. 127 .polimeraza I care are activitatea exonucleazică (de hidroliza legăturilor fosfodiesterice). care sau numit fragmente OKAZAKI. Prin activitatea ARN . 5.PRIMER. Modelul de replicare discontinuă propus de OKAZAKI s-a dovedit a fi aplicabil la toate sistemele biologice .timidină este de foarte scurtă durată).matriţă sunt sintetizate pe segmente mici.primer este îndepărtat prin excizie de către un ADN . Golul rămas în urma exciziei ARN primer va fi umplut prin activitatea tot ADN . în ciuda tuturor încercărilor.5' pe ambele catene matriţă.2. alta în direcţia 5' . Fiecare fragment Okazaki va fi primat. reasocierea monocatenelor complementare.000 . 78).polimerazei în procesul de replicare a ADN apare ca un element ajutător. rezultând segmente mai lungi.2. ARN .matriţă. dar esenţial.la bacterii ADN . Primarea replicării Toate enzimele ADN . care se deplasează numai în direcţia 3' . În anul 1968. Este posibil ca replicarea pe o catena să fie înaintată faţă de cea de-a doua catena sau unirea fragmentelor OKAZAKI să fie mai rapidă pe o catena. având circa 1. În felul acesta fragmentele Okazaki sunt asamblate fără ARN -primer. serveşte de fiecare dată drept primer pentru activitatea de polimerizare a ADN . 77.polimerazei în procesul de iniţiere a replicării ADN se sintetizează un scurt segment de ARN (primer).000 nucleotide şi apoi aceste fragmente sunt unite prin punţi fosfodiesterice sub acţiunea unei enzime numite ADN .polimeraze . a ridicat problema existenţei a două polimeraze care să catalizeze polimerizarea. prin intervenţia primazei. intervine enzima PRIMAZA care determină sinteza unui scurt segment de ARN care s-a numit ARN-PRIMER. Dar. fig.polimerazice au capacitatea de a alungi catene polinucleotidice deja existente. una în direcţia 3' .matriţă .2.3' pe cealaltă.ligaza.5' pe una şi 5' . nu au fost descoperite două ADN polimeraze care să polimerizeze în direcţii opuse. că noile catene complementare catenelor .3.

128 . fagmentele Okazaki sunt unite de către ADN – ligază. Catena leading se sintetizează în mod continuu. ele să fie corectate imediat.Ele acţionează la nivelul furcii de replicare. fiind un proces complex.Fig. Fig. La nivel molecular există mecanisme care asigură corecţia replicării şi care face ca un nucleotid liber.Schema generală a replicării în care fiecare enzimă sau proteină auxiliară sunt prezentate în mod individual. În aceste condiţii şi pe catena lagging sinteza are loc tot în direcţia 5' . 5.3'. Corectarea erorilor de replicare Replicarea ADN. greşit împerecheat cu nucleotidul de pe matriţă să fie excizat. Se realizează în direcţia 5' . necesită ca produşii rezultaţi să fie copiaţi cu mare acurateţe. 78 .2. 77 .3'. care se desfăşoară cu mare viteză. iar în cazul când sau introdus erori. 79). catena lagging se sintetizează în mod discontinuu. altfel desfăşurarea polimerizării este stopată (fig. în mod accidental.5.Replicarea ADN.

începe deci de la primerul ARN. 79 .Schema reparării ADN (înlocuirea dimerilor de timină). procesul în care are loc sinteza sa s-a numit PRIMARE. Acest segment de ARN s-a numit PRIMER. implică mai multe etape şi mai multe enzime de reparare: . Fig. fiind eliminate de la 10. sub acţiunea ADN polimerazei care este eficientă în alungirea catenei polinucleotidice iniţiată prin sinteza primerului ARN. legarea celor două capete de către ADN ligază. iar ARN . care este liber şi care pătrunde într-un sit special al acestei enzime numit SIT PENTRU CAPĂTUL 3'-OH Ah PRIMERULUI. 80).recunoaşterea bazei incorecte introduse (deci a mutaţiei) .Fig. la eucariote reprezintă acele regiuni ale ADN unde se găsesc punctele de iniţiere (de origine) ale replicării. 5.la procariote.Schema generală a sistemului de reparare postreplicativ la bacterii. fiind constituit din mai mulţi repliconi (unităţi de replicare). 129 . până la 50 nucleotide .primer oferă ADN . complementar .completarea regiunii excizate cu o secvenţă corectă. ADN .fosfat a primerului dezoxiribonucleotid trifosfat aliniat pe matriţă în virtutea complementarităţii sale cu baza azotată corespunzătoare din matriţă. completarea de către ADN-pol I a întreruperii create în monocatena de ADN. Sinteza unei catene ADN.2. 81 . adică esterificarea grupei 3'-OH a primerului ARN cu grupa 5' . Acest sistem de corectare postreplicativ.polimeraza realizează în cadrul acţiunii sale catalitice condensarea. reprezentaţi de cromozomul bacterian care funcţionează ca unitate de replicare. îndepărtarea de către nucleaze a secvenţei lezate. cromozomul eucariotelor este o structură multirepliconică. Spre deosebire de cromozomul viral şi bacterian. de către ADN – ligază (fig.6. a replicei.polimerazei capătul său de 3'-OH. Unităţile de replicare Numite şi repliconi . care cuprinde cel puţin 4 etape: recunoaşterea leziunii ADN.matriţei ADN.unirea fragmentelor pentru stabilirea continuităţii catenei. de către polimeraza I . ARN .îndepărtarea secvenţei lezate de către nucleaze.polimeraza care catalizează asemenea sinteză s-a numit PRIMAZĂ.

secvenţe care sunt transcrise în ARN precursor. proces realizat de o enzimă (ce se găseşte de la virusuri până la eucariote) denumită reverstranscriptază. ƒ introni. molecula de ARNm apare mult mai mică decât transcriptul primar – ARN heterolog. În urma acestui proces. Indiferent din ce celulă provine ADN (procariote sau eucariote) conţine mii de gene a căror secvenţă corespunde. Fig.Genă structurală care corespunde exact secvenţei ARNm şi proteinei sintetizate.5.1.83). rezultă o moleculă de ARNm. când este activată. În acest caz. reprezentate de aprox. Această dogmă consideră că ADN transmite informaţia la ARN şi de la ARN la proteine. Astfel. se observă că ADN nu intervine direct în sinteza proteinelor. În prima etapă. care este un produs intermediar. o genă (sau mai bine zis unitatea transcriptibilă a genei) la eucariote este formată din două grupuri de secvenţe: ƒ exoni. a cărei funcţie este de a translata mesajul genetic în proteine. procesul fiind denumit reverstranscripţie şi astfel dogma centrală este contrazisă. Intronii sunt eliminaţi din molecula de ARN precursor prin mecanisme speciale. Din schema de mai sus. transcrie un ARNm pentru o proteină dată.3. Astfel. 130 . secvenţe din genă. în întregime sau parţial. Se foloseşte termenul de expresie genică. dar nu mai sunt conţinute în ARNm şi deci nu se mai găsesc în secvenţa aminoacizilor din proteinele transcrise (fig. gena este transcrisă în întregime într-o moleculă de ARN numită precursor (pre-mesager sau ARN nuclear heterolog). care sunt transcrise în ARN precursor. se materializează în sinteza proteinelor a fost elucidat în ultimii 40 de ani. Transmiterea informaţiei se face prin ARNm. Spre deosebire de acestea.3. Proteinele sunt componente celulare care. secvenţei aminoacizilor din proteine. care conţine numai exoni şi a căror secvenţă serveşte pentru sinteza proteinelor. conţinută în molecula de ADN. Desfăşurarea acestui flux informaţional apare sub denumirea de dogmă centrală a biologiei moleculare ( 1960 – 1970 ). Acest proces de sinteză a ARN este denumit transcripţia ADN. Numărul proteinelor este de aproximativ 109 – 1010 molecule/celulă. genele din genomul celulelor eucariote sunt întrerupte de secvenţe care nu vor fi regăsite în secvenţa proteinelor. Mecanismul general Mecanismul prin care informaţia genetică. realizează toate activităţile ce au loc în celulă. 82). 000 de tipuri diferite. Transcripţia ADN sau sinteza ARN 5. 82 . pentru că o regiune din molecula de ADN reprezentată de o genă. de fapt. ARNm reprezintă matricea (template) pentru molecula de ADN. sunt conţinute de ARNm şi sunt regăsite în secvenţa aminoacizilor din proteină. 10. Secvenţa genelor din genomul celulelor procariote corespunde în întregime secvenţei aminoacizilor din proteina pe care a codificat-o şi ele sunt numite gene coliniare (fig. sinteza ARN sau expresia genică. după schema: Transcripţie Translaţie ADN ----------------→ ARN -------------→ PROTEINE Mesager de transport ribozomal Temin şi Baltimore au stabilit (1970) că este posibilă transmiterea informaţiei şi de la ARN la ADN.

care prin translata proteina. cele două catene de ADN se vor separa. genele pentru histone. 5. În acest scop.G.U. ARN este. interferoni şi retrogenele (genele provenite din revers.Fig. Sunt însă gene care nu au introni.C) informaţia genetică a unei singure catene de ADN va fi transmisă la o secvenţă complementară de ARN. ARN polimeraza sintetizează ARN. Fig. în care secvenţele intronilor nu se mai regăsesc. temporar şi pe lungimi scurte.sau retrotranscripţia ARNm).2.3. ca şi ADN. 83 . 84). 131 . Din ARN precursor intronii sunt îndepărtaţi. Majoritatea genelor pentru ARNt sau ARNr din genomul a numeroase eucariote conţin şi ele introni care sunt eliminaţi din transcriptul primar. Elemente implicate în transcripţie Transcripţia implică sinteza unui lanţ polinucleotidic de ARN care preia mesajul de pe molecula de ADN. un lanţ lung neramificat.Transcripţia ADN. de exemplu. copiind mesajul de pe o singură catenă ADN.Gene structurale eucariote intrerupte de introni. Opţiunea pentru catena ce va fi copiată este determinată de poziţia promotorului în secvenţa ADN. 84 . Deci ARNm (ca şi celelalte tipuri de ARN) sintetizat ca un lanţ monocatenar este complementar catenei de ADN care l-a transcris şi este identic cu cealaltă catenă de ADN netranscrisă (fig. format din cele patru nucleotide (A. exonii sunt uniţi între ei (splicing) pentru a da naştere ARNm sau matur. Chiar şi ADN mitocondrial conţine uneori introni în genele care codifică toate tipurile de ARN. pentru ca una să servească de matrice pentru ribonucleotidele ce vor fi aşezate complementar secvenţei catenei de ADN.

La eucariote. 50 – 70 % din total). Procesul de transcripţie catalizat de ARN. La E. a punctului de iniţiere unde are loc desfacerea helixului ADN pentru generarea unei regiuni monocatenare scurte şi încorporarea primelor nucleotide care formează lanţul de ARN.polimerază a genei care trebuie transcrisă ( gena ţintă ). Sinteza continuă şi polimeraza alunecă de-a lungul ADN. se separă. secvenţa ADN necesară pentru realizarea acestor reacţii este reprezentată de promotor. ARNt) sunt transcrise. 1. când are loc formarea hibridului molecular ADN-ARN. ARNm. pe lângă factorul σ. Angajate în transcripţie sunt probabil 2000-5000 de molecule. Transcripţia odată iniţiată este continuată de enzima core.polimeraza III – este o enzimă tot nucleoplasmatică care transcrie ARNt şi 5S ARNr activitate egală cu aprox. Ele ocupă poziţii distincte în spaţiu nuclear şi fiecare tip de enzimă prezintă o structură complexă. Într-o celulă eucariotă există trei tipuri de ARN. ARNpolimeraza şi molecula de ARN sintetizată se desprind şi devin libere în mediu. Fiecare celulă eucariotă conţine între 2 x 104 până la 2 x 107 molecule de ARNpolimeraze. 20 – 40 % din total). Greutatea moleculară a factorului σ variază de la 32000 la 92000 da. Bazele sunt adăugate succesiv la lanţul ARN. locul la care primul nucleotid este încorporat se numeşte punct de iniţiere (start point şi se notează cu + 1). conţine alte patru componente.Transcripţia ADN este un mecanism coplicat.000 Da şi este formată din două componente: enzima core (de bază) şi factorul σ (sigma). se desprinde de complex şi se asociază la o altă ARN. care va începe activitatea la un alt punct de iniţiere. care necesită un aparat de transcripţie.3. Procesul de transcripţie este realizat de enzima ARN polimeraza.coli numărul total de molecule de ARN polimerază/celulă este de aprox. etapa de terminare. 5. Iniţierea transcripţiei se face prin holoenzimă (enzima completă). 7000. Enzima. reprezintă faza în care nucleotidele sunt legate covalent la capătul 3' al lanţului polinucleotidic. aparatul de transcripţie este mult mai complex şi mai puţin cunoscut decât la procariote. care reprezintă punctul unde sinteza lanţului de ARN se termină iar hibridul ADN-ARN format.polimeraze prezită trei etape importante. factorul σ fiind componenta implicată numai în recunoaşterea şi fixarea corectă a punctului de iniţiere. care include: recunoaşterea de către ARN. . de către un tip de polimerază. 480. ARN ribozomal (ARNr) şi ARN de transfer sau de transport (ARNt). desfăcând dublul helix pentru a expune un nou segment al matricei sub formă monocatenară.polimeraze nucleare. Aparatul enzimatic de transcripţie Transcripţia ADN implică producerea a trei specii de ARN: ARN mesager (ARNm). fiecare. 2. 10 % din total ). etapa de iniţiere. etapa de elongaţie. La celulele eucariote. ADN se reface sub formă de dublu helix. responsabilă pentru transcripţia ARNm (activitate egală cu aprox.ARN.ARN. în regiunea desfăşurată a helixului.polimeraza II – este o enzimă nucleoplasmatică. ea reprezintă activitatea sintetică cea mai mare (aprox. La procariote există un singur tip de ARN polimerază care este responsabilă pentru sinteza celor trei specii de ARN. 132 .ARN-polimeraza I – este o enzimă localizată în nucleol şi catalizează transcripţia ARNr. deoarece factorul σ nemaifiind necesar . codificate de gene distincte şi care au funcţii diferite în procesul de transcripţie.3. şi anume: . cele trei specii de ARN (ARNr.polimerază. . 3. Pe lângă ARN polimeraza specifică fiecărui ARN sunt implicate în acest proces numeroase proteine auxiliare (factori de transcripţie) şi o serie de elemente de control existente în structura ADN. Enzima completă sau holoenzima are o greutate moleculară de aprox.

iniţierea transcripţiei ( a sintezei ARN). (fig. 133 . O genă conţine atât informaţia pentru structura proteinei. estradiol. TF de la transcription factor şi II de la ARN-polomeraza II. Dacă ARN-polimerazele sunt universale.4. implicat în: . o serie de factori de transcripţie. II. 106). care ca şi factorii de transcripţie au capacitatea de a se lega de ADN.) în nucleu şi interactionează cu secvenţele specifice ADN (elementele responsive) iniţiind. din extractul nuclear. Pe lângă aceşti factori de transcripţie. . prin hidroliza ATP.elongarea transcriptului.3.polimeraza. Aceste domenii sunt considerate ca elemente de recunoaştere a genelor ţintă şi de aceea se numesc şi capete de citire (Reading Head). . identice pentru toate ţesuturile şi celulele. Pentru că el se leagă de secvenţa TATA-box a promotorului a fost denumit şi TBP (TATABinding Protein). factorii de transcripţie sunt specifici pentru anumite ţesuturi. Pentru acestea se impun cel puţin doua condiţii: . D. care transportă hormoni (corticoizi. 5. unde ARN-polimeraza se leagă de ADN. este factorul de transcripţie D (notat TFIID). progesteron etc. cât şi ARN. 5. Factorii de transcripţie Spre deosebire de procariote. . care interacţionează cu secvenţe specifice de ADN şi care pot acţiona stimulator sau inhibitor asupra expresiei genice. Acestea sunt proteine reglatoare. specificând tipul de ARN-polimerază care se leagă) sunt notaţi cu litere: A (de ex: TFIA).5. G. reprezintă factorii de transcripţie care intră în aparatul transcripţional format din aprox. Alţi factori de transcripţie (notaţi cu I. Pentru realizarea procesului complex de transcripţie. pe lângă ARN-polimerază este necesar un mare număr de proteine auxiliare numite factori de transcripţie. Aceste proteine.la nivelul ADN trebuie să existe de asemenea secvenţe nucleotidice specifice (de obicei 515) care să corespundă domeniilor (motif-elor) din proteinele reglatoare respective. E. în sensul ca îl intensifică. deci a sintezei ARN. 20 de proteine. H. Catena care se copiază asigură sinteza moleculei de ARN în direcţia 5'-3' (deci va fi întotdeauna catena ADN cu direcţia 3'-5'.menţinerea duplexului ADN după legarea factorilor de transcripţie (FT). Cercetări analitice au permis să se izoleze şi purifice. Elemente de control în expresia genetică Reglarea specifică a expresiei genice implică sinteza ARN. Acest factor odată legat la ADN va atrage şi alţi factori de transcripţie. F. implicaţi direct în sinteza ARN există şi proteine care reglează desfăşurarea procesului. atenuează. nu blochează. III. Ei joaca un rol important în diferneţierea celulară şi menţinerea tipurilor de celule. care copiază o singură catenă a moleculei de ADN.Terminarea sintezei este realizată de o secvenţă specifică în structura genei care se numeşte terminator. iar catena nouă va avea direcţia 5'-3'. Primul care recunoaşte promotorul şi în special TATA-box.obţinerea energiei necesare sintezei. B (TFIIB). la eucariote ADN-polimeraza se leagă de proteine care au identificat promotorul genei ce va fi transcrisă. În aceasta categorie de proteine intră receptorii hormonali steroidici. cât şi elementele (secvenţele) de control care reglează expresia genei. accelerând sau blocând transcrierea unor gene. . .menţinerea stării active a genei ţintă sub acţiunea altor factori transcripţionali şi legarea ARN-polimerazei.proteina trebuie sa conţină în structura ei o secvenţa specifică de aminoacizi (de obicei 10100) care reprezintă domeniul (sau motif-ul) de interacţiune cu ADN.3. Aceste secvenţe sunt denumite elemente responsive (Responsive elements).

La bacterii promotorul conţine doua secvenţe caracteristice şi necesare pentru legarea ARN polimerazei si pozţionarea ei cu precizie faţă de punctul de iniţiere: ƒ secventa-10. Există şi alte elemente similare. Fig. Promotorul.4. promotorul. iar la eucariote (mamifere) de factorii de transcripţie. asigură legarea ARN polimerazei şi orientează “citirea” (sinteza) într-o direcţie sau alta. 86). Promotorul este considerat o secvenţă esenţiala pentru reglarea ARN polimerazelor şi a factorilor de transcripţie. 134 . ƒ secvenţa -35 (minus indicând că aceste secvenţe se află la stânga faţă de punctul de iniţiere. în funcţie de orientarea în structura ADN. Enhancer-ii sunt elemente reglatorii implicaţi în activarea ratei de transcripţie a unei gene. adică primul nucleotid din molecula ARN). promotorul devenind mai accesibil factorilor de transcripţie. iar ARN sintetizat este echivalent în secvenţa nucleotidelor cu monocatena de ADN netranscrisă (catena opusă). În orice caz. 85 . 5. Regiunea reglatoare.secvenţa -84. care. adică upstream (fig. care nu se transcrie.Schema generala a elementelor de control. aşa-numitele secvenţe activatoare(upstream activator sequences – UAS). Abilitatea promotorului de a iniţia transcrierea unei gene poate fi foarte mult acentuată de prezenţa unui enhancer. în funcţie de poziţia lui în secvenţa ADN. Ei pot creşte transcripţia unui promotor până la 1000 de ori. Mecanismul transcripţiei În general. numai o singură catenă a ADN este transcrisă. care reprezinta TATA-box (sau HAGNESS BOX) . de exemplu la drojdii. va decide care catenă de ADN va fi copiată (fig. are ca element principal promotorul: o secvenţă de nucleotide specifică fiecarei gene. În realitate. Enhancer-ii pot fi situaţi în secvenţa de ADN „în susul” (upstram) promotorului său „în josul” lui (down stream) faţă de punctul de iniţiere a sintezei ARN(+1) (fig 85). Ei determină acetilarea histonelor care determină o relaxare a miezului histonelor. Aceste secvente UAS care sunt localizate la distanţe diferite de promotor pot funcţiona în orice orientare.secventa -27. TATA box situată la -27 pb este secvenţa indispensabilă pentru iniţierea corectă a transcripţiei de la punctul start (acelaşi rol îl are secvenţa -10 la procariote).Gena din punct de vedere funcţional şi structural conţine 2 regiuni: regiunea reglatoare şi regiunea de transcripţie (sau unitatea transcriptibilă) care sunt separate de punctul de iniţiere a sintezei ARN (punctul start care se noteaza cu +1. Promotor cu (TATA box).care reprezintă TATA-box (sau PRINBOW BOX). secvenţele activatoare –UAS şi enhancer-ii La eucariote promotorul conţine 2 secvenţe caracteristice: . 85). Enhancerii şi aceste elemente UAS pot exista până la 3000-5000 pb distanţă de promotor. sinteza ARN având loc numai in direcţia 5’ – 3’. de unde îşi pot exercita efectul pozitiv asupra transcripţiei. ambele catene ale ADN pot servi drept matrice pentru sinteza ARNm.

coli. sinteza catenei de ARN se desfăşoară cu o viteză de aprox. când. iar molecula ARN transcrisă este eliberată în mediu.formată din baze de complementare T-A. Aceste două secvenţe împreună cu punctul de iniţiere (+1) determină de fapt promotorul şi aşezarea topografică. Figura 87 – Secvenţa -10 (TATA box). Procesul de elongaţie a moleculei de ARN este oprit. un polimer ARN de aprox. 5000 nucleotide. care permit desfacerea dublei catene a ADN. La bacterii. este realizat în aprox. Secveţa terminator reprezintă semnalul terminării sintezei şi la acest punct ARN-polimeraza se desprinde de catena ADN. Secvenţa -10 conţine în general. însă funcţia lor exactă nu a fost elucidată. la temperatura de 370 C. După ce ARN-polimeraza s-a fixat şi aprox. se desfac.A-T. cu mai multă uşurinţă decât perechile GC (fig. 8 nucleotide ARN au fost ataşate pe matriţa ADN. începând de la secvenţa -10. factorul sigma (σ) are rol de recunoaştere a secvenţei promotorului şi de fixare corectă a punctului de iniţiere a sintezei. unde intervine un număr de factori de elongaţie. fixarea polimerazei s-a constatat că are loc în două etape: .se desfac pentru a permite transcripţia unei catene de ADN. . factorul sigma (σ) se desprinde de ARN-polimeraza. 87). În timpul elongaţiei. unde se formează un complex “închis”. 17 pb.Figura 86 . aprox. Factorii de elongaţie sunt de fapt proteine a căror structura este cunoscută. în momentul când enzima întâlneşte o altă secvenţă specială în regiunea transcriptibilă a ADN ( de obicei 6A ce vor fi reprezentate în ARN prin UUU…).ataşarea lejeră a enzimei complete. La procariote legarea ARN polimerazei la promotor este determinată de două secvenţe scurte: secvenţa-35 şi secvenţa-10. 30 nucleotide pe secundă. direcţia de transcripţie (-35…-10…+1).Promotorul este orientat bine(in direcţia 3’-5’ a catenei ADN) si sinteza ARN se va face in direcţia 5’3’. 3 minute. La E. iar hibridul format din moleculele ADN-ARN se desface. duplexul ADN se reface. la secvenţa -35.apoi. Modificări importante (mutaţii) produse la nivelul acestor secvenţe (numite secvenţe consens) au ca efect abolirea activităţii de promotor. complexul “închis” este transformat într-un complex “deschis’. Această secvenţă a fost denumită terminator. expunând catena matrice a ADN permiţând introducerea primelor ribonucleotide (necesare sintezei moleculei de ARN) pentru iniţierea sintezei (a transcripţiei). Prin urmare. 135 . baze AT. Enzima core poate continua în aceste condiţii sinteza ARN.

eliberând energia necesară desfacerii catenelor de ADN.complexul ADN+TFIID acţionează ca un situs de legare pentru un alt factor: TGIIB care legându-se va stabiliza complexul. Factorii de transcripţie formează complexe de transcripţie. în special TATA box.la acest complex se asociază un alt factor: TFIIS. Procesul pe etape. prezentat în cazul procariotelor. . Moleculele de ARN precursor. ARN+polimeraza se va lega de factorul rspectiv şi nu de secvenţa de ADN. care conţine ribonucleoproteine nucleare mici (U1. ARN+polimeraza nu recunoaşte direct promotorul. Factorii care iniţiază transcripţia se deosebesc se ceosebesc de factorul sigma pe care îl conţine ARN-polimeraza bacteriană. care în mod selectiv atrag moleculele de ARN-polimerază la promotorul de care ei s-au legat.self-splicing-ul ARN care a fost pus în evidenţă la nivelul pre-ARNm mitocondrial. U5. Iniţierea începe când s-a format complexul de iniţiere.splicing-ul ARN nuclear ce are lor la nivelul pre-ARNm. 5. relativ stabile. pentru a realiza molecula de ARN matur. poate conduce la un ARNm care nu mai poate translata o proteină funcţională. Sinteza (transcripţia) trebuie făcută cu acurateţe pentru ca la nivelul ARN nu există sisteme de corectare a erorilor. aceştia au putut fi comparaţi cu structura intronilor din pre-ARNm. Acest factor are acţiune ATP-azică. Cercetările experimentale au relevat două aspecte în splicing-ul ARN. Viteza de sinteză a ARN este de 45 nucleotide/secundă. Procesul trebuie să se realizeze cu mare acurateţe. se pare că este asemănător şi pentru eucariote. O eroare produsă. U4. care au fost transcrise în ARN precursor. este necesară pentru eliminarea secvenţelor intronice. înainte de a fi exportate în citoplasmă. Cataliza este realizată de un complex ribonucleoproteic. Odată cu descoperirea intronilor self-splicing. de acest complex se leagă ARN-polimeraza II şi în urma unui proces ATP-dependent începe iniţierea transcripţiei. şi anume: . Acest factor împiedică terminarea prematură a sintezei ARN. . cu excepţia că ARN sintetizat este reprezentat de molecule precursor. Procesarea. dar care nu vor mai fi regăsite în secvenţa aminoacizilor din proteinele corespunzătoare.U6) plus alte componenete. . ARN splicing În procesul de transcripţie produşii sintetizaţi sunt reprezentaţi de fapt de precursorii ARNt. ca să devină funcţionale sunt supuse la o serie de modificări: tăiere. . numit splisozom (spliceosome). Acest proces este necesar pentru ca intronii prezenţi în moleculele precursor să fie eliminaţi şi numai secvenţele exonice să fie unite.La eucariote. care este factorul de elongaţie. numită ARN splising. .la acest complex se asociază alţi factori: TFIIE şi TFIIH.primul factor de transcripţie care recunoaşte promotorul. ARN-polimeraza I şi II formează complexe cu factori de transcripţie care se leagă upstream (înaintea punctului de iniţiere) pe când majoritatea factorilor de transcripţie pentru ARN+polimeraza II se leagă downstream (în mijlocul unităţii de transcripţie). U2. pentru formarea complexului deschis (open).acum. prin introducerea unui singur nucleotid necorespunzător. Din această analiză a reieşit că intronii self-splicing pot fi împărţiţi în două clase: introni de grupa I şi introni de grupa II. 136 . ARN având un timp de înjumătăţire biologic ( T1/2) relativ scurt. Secvenţa desfăşurării procesului ar fi următoarea: . este TFIID (sau TBP). Dacă au apărut erori.5. nu pot produce perturbaţii de ordin genetic. ci prin intermediul unuia dintre factorii de traanscripţie specifici procesului de sinteză a ARN. la nivelul promotorului genei ţintă. (transmisibile) ca în cazul erorilor ADN. care necesită a fi procesate. ordonare şi unire (splicing). ARNr şi ARNm (numit şi pre-ARNm).

Sunt gene care codifică un singur tip de proteină. unde molecula de pre-ARNm este clivată.o secvenţă terminator (stop) reprezentată de unul din codonii stop sau terminatori: UAA. Exonii existenţi se unesc cap la cap şi realizează o moleculă matură de ARNm. H2B. iar ARNm produce 1010 molecule de fibroină. . Această cantitate formează firele necesare pentru o gogoaşă la viermele de mătase. Pentru asigurarea o cantitate suficientă de proteine pentru celulă sau organism. prin transcripţie conţine următoarele secvenţe importante: . 200 Ǻ. o grupare metil (– CH3) în poziţia 5'.urmată de codonul de iniţiere a translaţiei ( AUG). 137 . . se ataşează la capătul celui de-al doilea exon. iar intronii din grupa II la o nucleotidă adeninică (A). . şi anume: gena respectivă va fi transcrisă de mai multe ori şi va rezulta o cantitate mai mare de ARNm. În urma acestui atac intronul este îndepărtat şi cei doi exoni care erau separaţi în molecula precursor. rupând molecula de pre-ARNm. H3 şi H4.000 nucleotide sau chiar mai mult. Asigurarea necesarului de ARNm Genele din genomul celulelor haploide se găsesc într-o singură copie. Acesta este cazul genelor pentru histone: H1. şi/sau .o secvenţă specifică (5-10 nucleotide) care asigură legarea ARNm de subunitatea mică a ribozomului. ARNm. 5. realizează un atac nucleofil (prin gruparea terminală 2-hidroxi . La ambele grupuri s-a constatat că splicingul are lor în urma a două reacţii de transesterificare ( transfer de grupări fosfat ) şi anume: . celula foloseşte două moduri de amplificare a ARNm. . Mărimea lor este de aprox.de la riboză) la nivelul situsul splice 5'.6. . unde are loc cel de-al doilea atac nucleofil. situată aproape de situsul splice 3'. După transcripţie şi splicing (procesare) ARNm suferă două procese (posttranscripţionale) şi anume: . de aceea ele sunt numite procese post-transcripţionale. Se pare că intronii reprezintă un „sac” de acumulare a mutaţiilor şi protejează în felul acesta ADN-ul de anumite leziuni. În acest caz el va avea un T1/2 mai mare şi nu se va degrada după ce a dat prima copie de proteină. Aceste două procese nu sunt codificate în secvenţa ADN. Coada formează un polimer de aprox.secvenţa de nucleotide (codoni) pentru sinteza polipeptidului (proteinei). Capătul 5' al intronului devenit liber se leagă covalent de adenina intronului formând o buclă.o adenină (A) din secvenţa intronului.La intronii din grupa I reacţia de splicing începe la o nucleotidă guanodinică (G).ARNm este folosit de mai multe ori pentru sinteza proteinei respective. H2A. numită Ribosome Binding Sequence (secvenţă de legare la ribozomi). care s-a format în prima etapă.captarea ARNm în urma căruia se adaugă la prima guanidină (la capul moleculei). UGA sau UAG (aceştia nu codifică nici un aminoacid). Genele celulelor de la mamifere conţin mai mulţi introni decât exoni. fiind realizată de o enzimă numită poli(A) polimeraza. Aceste molecule sunt exportate în citoplasmă şi pe baza informaţiei pe care le conţin se face sinteza proteinelor funcţionale. se unesc. 80 până la 10. În felul acesta toţi intronii din molecula de ARN precursor sunt eliminaţi. însă ele se găsesc în genomul celular în mai multe copii. deci în cele diloide se găsesc în cel puţin două copii. Prin acest mecanism se explică cum gena fibroinei (2 copii/genom) produce în 4 zile 105 molecule de ARNm.în etapa a doua hidroxilul 3' al primului exon.se adaugă o „coadă” de poli (A)+ la capul 31-OH terminal al moleculei.

pe de o parte. 138 . ca şi cu toate organitele celulare . sunt de asemenea. Rezultatele acestor studii au deschis calea cercetărilor în problema transportului intracelular.1. Tartecoff. vezicule.Componenta membranară intracitoplasmatică are o structură trilaminară.de concentrare a proteinelor în vezicule de condensare (la polul apical al celulei. prin îmbarcarea proteinelor în vezicule de transport (vezicule carriers) şi dirijarea lor spre complexul Golgi. astfel au putut fi diferenţiate fazele: . s-au constatat contacte între reticulul endoplasmatic şi membrana celulară. Aceste observaţii au acreditat ideea că. Tot elemente ale reticulului endoplasmatic sunt implicate în geneza lizozomilor. elemente structurale. Jamieson. care limitează tubuli. elemente ale reticulului constituind membranele saculilor golgieni. . cât şi prin comunicarea directă cu membrana nucleară. iar pe de altă parte diferitele tipuri de reticul endoplasmatic se pot transforma unul în altul. componentele reticulului endoplasmatic servesc transportului de materiale în celulă. nucleară) există relaţii de continuitate. Astfel. Prin legăturile contractate cu membrana celulară plasmatică. între citomembranele sistemului vacuolar şi celelalte membrane celulare (plasmatică. Este vorba despre un semnal specific al proteinei (o anumită structură chimică) pentru recunoaşterea respectivei proteine de către un anumit receptor de membrană (situs membranar). ceea ce sugerează o continuitate între aceste categorii de membrane. Sistemul vacuolar intracitoplasmatic Folosirea microscopului electronic a arătat prezenţa intracitoplasmatică a unui sistem complex de membrane.Palade. există o relaţie directă cu zonele aparatului Golgi. studiind mecanismul sintezei zimogenului de către celulele acinoase pancreatice (celule specializate în sinteza şi exportul proteinelor).de concentrare. Treptat s-a dovedit că aproape toate proteinele membranare (cu excepţia unei părţi din proteinele membranelor mitocondriale şi cloroplastice) sunt sintetizate la nivelul ribozomilor. în jurul cărora formează tubuli orientaţi regulat. saci turtiţi sau cisterne . Astfel. .de sinteză proteică la nivelul ribozomilor. Dirijarea precisă a proteinelor non-sintetizate către o anumită destinaţie finală se datorează unei anumite informaţii pe care proteina o poartă în structura sa. .Capitolul 6 TRANSPORTUL INTRACELULAR În anul 1976. au reuşit să demonstreze pentru întâia oară. complexitatea şi plasticitatea sistemului de citomembrane constituie un suport structural important în explicarea heterogenităţii funcţionale care caracterizează biologia celulei. Producţia de proteine în celule este concentrată într-un compartiment anumit denumit citozom (matrice celulară). un grup de cercetători de la Yale University (G. conţinutul unor compartimente celulare. Diversitatea. Componentele reticulului endoplasmatic păstrează strânse interrelaţii topografice şi funcţionale între ele. . 6.de transport intracelular. Din acest compartiment celular de sinteză proteică. proteinele sunt dirijate cu precizie şi cu maximum de eficienţă către circa 20-25 de destinaţii diferite: biomembrane. trabecule.E. segregare a proteinelor în cisternele reticului endoplasmatic(RE).exportul (eliminarea) proteinelor în lumenul acinului pancreatic. drumul complet al unei proteine (proteină de tip secretor) de la sinteză până la eliminarea sa din celulă. în contact cu mitocondriile. cu o grosime variabilă între 50 – 70 Ǻ. caracteristică. Sheele şi Berger). acinul pancreatic).

aduc precizări asupra modalităţii in care reticulul endoplasmatic participă la sinteza proteinelor intracelulare. În afara acestor corelaţii ale membranelor golgiene cu membranele nucleare şi citoplasmatice. favorizează acestora „citire” a mesajelor venite de la ADN. cât şi asemănările ultrastructurale dintre acestea. frecvent au fost observate continuităţi structurale şi funcţionale ale acestora cu reticulul endoplasmatic cu ribozomi. spaţiul perinuclear este în comunicare cu toate regiunile celulei. poartă mesajul ADN şi se fixează de ribozomi.În acelaşi timp. iar la sfârşitul ei polipeptidul se eliberează de ARN-t. 139 . Rezultatul acestor studii este sintetizat în teoria lui Palade asupra mecanismului sintezei proteinelor secretate. aparatul Golgi. moleculele de ARN-t se eliberează şi complexele noi de aminoacil-t-ARN se fixează pe ribozomi. sediul sintezei proteinelor secretate este reticulul endoplasmatic granular la nivelul ribozomilor ataşaţi de membrane. În mod evident. O dezvoltare abundentă a sa se observă în celulele organului Corti. reticul endoplasmatic neted (agranular). Studiile lui George Palade. 3. Astfel. În apropierea zonelor Golgi. au permis a se considera că spaţiul perinuclear este o extindere a sistemului vacuolar citoplasmatic. Rolul citomembranelor granulare în sinteza proteică O dezvoltare abundentă a citomembranelor granulare se observă în celule angajate activ în sinteza de proteine „de export” (secretorii). Microscopul electronic a semnalat şi formarea membranelor golgiene netede pe seama membranei nucleare. pe calea cisternelor citomembranelor reticulare. reticulul endoplasmatic capătă aspect vezicular. proteinele secretate sunt transferate în cisterne. 6. pancreas exocrin. cum sunt celulele glandelor salivare. După structura sa. 1945) şi prin metode biochimice s-a demonstrat existenţa ribozomilor legaţi de membrana reticului endoplasmatic şi rolul major al reticulului endoplasmatic în biosinteza proteică.2. nefrocite. Complexele aminoacizilor-t-ARNm (aminoacil-t-ARN) ”recunosc” acest cod triplet şi aminoacizii se adaugă pe rând. acesta în raport cu prezenţa sau absenţa la suprafaţa membranelor a poliribozomilor. relaţiile de continuitate între membrana nucleară externă şi membranele rugoase. lanţului polipeptidic în creştere. În mod simultan. În celula vie. sistemul vacuolar citoplasmatic se împarte în reticul endoplasmatic granular (ergastoplasmă). După sinteză. pierde ribozomii şi se transformă în membrane agranulare netede. cu ajutorul codului său triplet nucleotidic. epiteliul tiroidian. O serie de factori de natură proteică ce au situsuri de fixare pe ribozomi. spre deosebire de sinteza proteinelor structurale. ribozomii sunt „situsul” sintezei proteinelor. Consecinţele acestor continuităţi sunt importante funcţional. ergastoplasma şi reticulul endoplasmatic nuclear fiind aspecte ale aceluiaşi sistem structural endocelular. s-a acreditat ideea unei modificări succesive. arătând că la nivelul reticulului endoplasmatic granular sunt sintetizate proteinele „de export”. După transferul în spaţiul intracisternal. care se deplasează traversând ribozomul. proteinele sunt transferate în zona golgiană. într-un timp scurt (până la un minut). Sunt cazuri când membrana nucleară trimite prelungiri îndreptate către aparatul Golgi Corelaţia de acest tip a permis aprecierea că membrana nucleară poate contribuie la formarea membranelor golgiene. de circa 90 minute. În decursul acestui proces ARNm. Biosinteza proteinelor sau translaţia ARNm Prin microscopie electronică (Porter şi colab. al cărui sediu este reprezentat de ceilalţi ribozomi şi se realizează într-un timp lung. 6. ca o diferenţiere a sistemului vacuolar citoplasmatic şi structurile lizozomale. prin sistemul de citomembrane. care corespund la stări funcţionale distincte. unde se maturează în timp. după care. Codul este tradus de ARN-m. iar veziculele mici reprezintă structuri „de transport” care asigură legături funcţionale dintre reticulul endoplasmatic şi aparatul Golgi.

Al treilea nivel de transfer informaţional (translaţia) condiţionează convertirea informaţiei din alfabetul cu 4 litere al ARNm (A-U. 140 . Ea este transcrisă sub formă de mesaj genetic în ARNm şi acesta este tradus. dintr-o secvenţă de codoni. la nivelul ribozomului. reprezintă cei 20 aminoacizi esenţiali ai proteinelor. Decodificarea informaţiilor genetice În cadrul sintezei proteice se realizează ultima etapă a transferului informaţiei genetice conţinută în secvenţa de baze azotate din ADN.3. dar mai ales desfăşurarea celor două funcţii esenţiale ale materialului genetic – autocatalitică (replicare) şi heterocatalitică (dirijarea de sinteze specifice de proteine sau de alte biomolecule: ARNm.(fig. peste 100 000 de proteine diferite. devine o „realitate” într-o secvenţă de aminoacizi de la nivelul catenelor polipeptidice. 88). la diferite sisteme biologice analizate. într-o secvenţă de aminoacizi. Rolul proteinelor în desfăşurarea proceselor vieţii este esenţial. fie rol în apărarea organismului (imunoglobulinele). Până în prezent au fost identificate. fie rol enzimatic. ARNr) sunt dependente de proteine precum histonele.1. C-G) în alfabetul de 20 litere. Astfel informaţia genetică din stare potenţială aflată în structura ADN. Însăşi structura. în această traducere este reprezentat de colecţia sa formată din cele 54 tipuri de ARNt. 88 . fie rol metabolic transportor (hemoglobina). Dicţionarul folosit de celulă.Al treilea nivel informaţional (translaţia) Toate procesele metabolice ale celulei se bazează pe existenţa şi funcţionarea proteinelor care pot avea fie rol structural (colagenul). Fig.6. respectiv decodificat. ARNt.

S . în translaţie (factori de iniţiere şi terminare). prin intermediul unor punţi de H sau al unor punţi bisulfidice (. participante în alcătuirea aceleaşi proteine ( o genă – o catenă polipeptidică). Polimerizarea aminoacizi. aceasta se prezintă sub forma structurii sale primare. molecula de insulina este formată din două catene polipeptidice. Pentru sinteza unei singure catene polipeptidice sunt mobilizate sute de alte molecule proteice cu rol structural şi enzimatic. de asemenea. adică includerea lor într-o catenă polipeptidică care reprezintă structura primară a proteinei . Structura şi funcţia proteinelor reprezintă expresia primară a informaţiei genetice. în urma formării punţilor de H. Când proteina este alcătuită din mai multe catene polipeptidice identice sau diferite.S . ARNt şi ARNr . etc). iar molecula de imunoglobulină anticorp are două catene grele (H) şi două uşoare (L) unite între ele prin punţi bisulfidice (. topoizomeraze. terţiar şi cuaternar. materialul genetic nu ar putea să îndeplinească nici una din funcţiile sale. prin intermediul unor asemenea legături şi acest caz proteina se prezintă sub formă de structură cuaternară. intercatenare dintre grupările ceto (C = O) ş i imino (N = H) ale legăturilor peptidice. Această intervenţie a unui număr mare de proteine în diferite etape ale procesului decodifică rii este cerută de o traducere exactă a mesajului genetic.) ca şi catenele de insulină. de t° sau pH. Rolul ARN în decodificarea informaţiei genetice a fost evidenţiat după anul 1950 de către BRACHE T şi CASPERSSON. ADN. o catenă A. realizată la nivelul ribozomilor. altele din mai multe catene polipeptidice identice sau diferite. Proteinele sunt polimeri de aminoacizi. Se înţelege de la sine că pentru îndeplinirea funcţiei sale normale. Formarea de punţi peptidice succesive determină polimerizarea aminoacizi liberi. fiind deţinută de gene diferite. hidrofile sau covalente. catena polipeptidică capătă configuraţii spaţiale bidimensionale sau tridimensionale . informaţia genetică pentru fiecare dintre aceste catene polipeptidice diferite. în ultimul caz. La terminarea catenei polipeptidice. proteina trebuie să fie normală la toate nivelele sale structurale : primar. 141 . Ea are la baz ă legături de H. în anumite condiţii fiziologice.ligaze).NH2) a altui aminoacid cu eliminarea unei molecule de H2O. reprezentând secvenţe de aminoacizi care a fost determinată de mesajul genetic. polimeraze. cunoscută sub denumirea de configuraţia α . Catenă polipeptidică este apoi supusă prelucrării post translaţionale în cadrul căreia ea adoptă o structură secundară prin interacţiunea aminoacizilor săi. în repararea leziunilor induse de ADN (excionaze. în transcrierea (ARN polimeraze). implică formarea de legături sau punţi peptidice între gruparea carboxil (COOH) a unui aminoacid şi gruparea amino (. secundar. asocierea lor pentru a alcătui molecula proteică funcţională se realizează. Hemoglobina umană normală (HbA) este alcătuită din 2 catene α şi 2β.S S -). structura primară fiind determinată pentru toate celelalte nivele structurale. În decodificarea informa ţ iei genetice rolul primordial îl joac ă acizii ribonucleici celulari: ARNm. adică de secvenţa codonilor din ADN m . Prin răsucirea catenelor polipeptidice asupra lor însele datorită acţiunii unor forţe de atracţie dintre diferite aminoacizi ai catenei polipeptidice rezultă structura terţiar ă a proteinei .proteinele – enzime. Este evident că fără participarea proteinelor. electrostatice. rezultând o configuraţie regulată a polipeptidului. formată din 21 aminoacizi ş i o catenă B format ă din 30 aminoacizi. în cadrul cărora intră şi cele care au rol hotărâtor în replicarea ADN (polimeraze. Prin acestea. Unele proteine sunt alcătuite dintr-o singură catenă polipeptidică. sinteza proteică fiind însoţită de o creştere considerabilă a cantităţii de ARN în celulă. În cadrul biosintezei proteinelor participă deopotrivă acizii nucleici ş i proteinele.helix al cărui model a fost propus de Linus Pauling pentru care a primit premiul Nobel. ADN-ligaze. în recombinare (recombinaze).

Astfel. doar ARNm este tradus în proteină.Toate tipurile de ARN celular sunt sintetizate pe matriţa de ADN.20 catene polipeptidice o moleculă de ARN m este hidrolizată. la 370 C. Rezultă că această proteină ribozomală este esenţială în împerecherea codon anticodon de la nivelul ribozomului. triptofonul. Mazia şi Prescott (1963) la alga verde unicelulară „Acetabularia mediterranea". Dacă celula vegetală poate să-şi sintetizeze toţi aminoacizi de care are nevoie. 142 . iar traducerea ARN m corespunzător se face cu viteza de 21nucleotide/ secundă. în cadrul căruia există pe lângă genele structurale ce determină informaţia genetică pentru sinteza diferitelor proteine. celulă şi chiar organit celular. Acest lucru nu se întâmplă îns ă ş i la mutan ţ ii rezisten ţ i la streptomicin ă . celula animală nu poate sintetiza decât o parte dintre ei. în structura celor circa 100. din cei aproximativ 100 de aminoacizi identificaţi numai 20 intră. în mod obişnuit. De exemplu gena triptofansintetazei (enzimă ce intervine în sinteza triptofanului) este de 28 nucleotide pe secundă. arginina şi histidina. adică trebuie să-i primească prin surse alogene (prin hrană. Astfel. fiind necesară sinteza (sau adăugarea în cazul sistemului acelular de sinteză (in vitro) a unei noi molecule de ARN m. în celulă. Pentru celula animală. are loc o „amplificare genetică" indirectă realizată nu prin mărirea numărului de copii ale genei ci prin transcrierea repetatată a informaţiei genetice conţinută de o genă cu sinteza unui număr mare de molecule ale unui ARNm. fenilalanina. informaţie ce este transcrisă în ARN m care devine astfel purtător de mesaje genetic. valina. organ. în condiţii normale. şi gene pentru diferite tipuri de ARNt şi ARNr. iar biosinteza proteică să fie stopată. ţesut. Dependenţa sintezei proteice de informaţia genetică din nucleu şi de sinteza diferitelor categorii de ARN celular pe matriţa de ADN nuclear a fost determinată de Brodnet (1955). Integritatea structural . leucina. De exemplu. la bacteria E. în aceste condiţii durează atâta timp cât să fie sintetizată circa 1 0 2 0 molecule proteice. De astfel. Dintre toate cele trei tipuri fundamentale de ARN celular.urile corespunzătoare. deoarece nu este capabilă să-i sintetizeze singură: lizina. ARNt şi ARNr îndeplinind însă roluri esenţiale în asigurarea traducerii mesajului genetic din ARNm. proteine care au specificitate de specie. ace ş tia prezentând în catena polipeptidică a proteinei ribozomale Gi2 două substituţii de aminoacizi în poziţiile 42 şi 87. coli. de exemplu).funcţională a ribozomilor condiţionează o citire corectă a mesajului genetic şi o traducere fidela a sa într-o secvenţă de aminoacizi. arginina. următorii 10 aminoacizi sunt esenţiali sau indispensabili. pentru ca sinteza proteică să poată continua . Aceasta înseamnă că după folosirea ca mesager pentru sinteza a 10 . izoleucina. Folosindu-se agenţi care blochează sinteza ARN m (actinomicina D) s-a demonstrat c ă sinteza proteică . Viteza de transcriere a unei gene este variabil ă . Sinteza hemoglobinei umane se realizează cu o viteză de 4 aminoacizi/ secundă la aceeaşi temperatură. metionina.000 de proteine naturale identificate până în prezent. Ribozomii asigură interacţiunea ARNm -ARNt în cadrul căreia codonii din ARN m sunt recunoscuţi secvenţial de anticodonii din ARNt . se poate realiza sinteza unui număr mare de catene polipeptidice. antibioticul streptomicină interacţionează cu 2 situsuri ale proteinei ribozomale Gu asociată cu ARNr 16G din subunitatea ribozomală mică (30 S) ceea ce face ca ribozomul să nu mai fie funcţional. asigurându-se astfel citirea mesajului genetic .

/mol Pentru formarea legăturii peptidice se folosesc 0. reacţia fiind catalizată de enzima aminoacilsintetaza (numită şi aminoacid ARN t .Aminoacizii: glicina. Ordinea includerii aminoacizilor în catena polipeptidică este stabilită de ordinea codonilor din ARNm. 143 . Ca orice reacţie de polimerizare şi biosinteza proteinelor se desfăşoară în trei etape ce se succed neîntrerupt: iniţierea. Este un lucru bine stabilit că deşi există mai multe tipuri de ARN t pentru un acelaşi aminoacid (fapt determinat de caracterul degenerat al codonului genetic). alungirea (sau elongaţia) şi terminarea catenei polipeptidice.3.terminal şi se termină cu un aminoacid . pentru că celula animală îi poate produce pe diferite căi metabolice. Aminoacil . 6. glutamina./mol. Este necesară o moleculă adaptatoare reprezentată de ARN t. altul decât cel care este specific acelui ARN t va fi eliminată prin intervenţia aceleiaşi enzime aminoacil . alanina. Aminoacilsintetazele sunt enzime cheie în „recunoaşterea" cifrului codului genetic.ARNt – sintetază pentru fiecare aminoacid. asparagina. ataşare realizată la gruparea CCA de la capătul 31 al ARNt şi care este catalizată de aceeaşi enzimă aminoacilsintetază. care prezintă o activitate de corecţie./mol cu eliberarea a 8 Kcal. restul de energie liberă fiind necesară menţinerii echilibrului reacţiei spre a se realiza sinteza proteică şi nu a avea loc hidroliza proteinelor.2. Aminoacilarea ARNt catalizat ă de aceste enzime este un proces riguros controlat deoarece o înc ărcare gre şit ă a unui ARNt cu un aminoacid necorespunză tor are aceeaşi consecinţă ca şi o mutaţie . acidul aspartic. acidul glutamic.Iniţierea catenei polipeptidice Sinteza unei catene polipeptidice începe cu un aminoacid -N . tirazina ş i prolina sunt neesenţiale.ligaza) şi care este specifică fiecărui aminoacid.C .terminal. există doar o singură enzimă aminoacil .sintetaza. cisteina. pornind de la aminoacizii esenţiali.determinând includerea eronată a unui aminoacid în catena polipeptidică. Mai are loc ataşarea aminoacidului activat de ARNt corespunzător lui (în etapa a doua). Prima etapă în biosinteza proteică este activarea aminoacizilor cu ajutorul ATP.5 Kcal. Aminoacizii nu se pot lega direct la ARN m . recunoscând această „eroare" şi hidrolizând legătura dintre aminoacidul greşit ataşat şi ARNt.sintetazele şi ARNt joacă deci rol esenţial în decodificarea informaţiei genetice. folosind energia rezultată din hidroliza ATP: ATP + H2O ATP + H2O ADP + H2O ADN + P AMP + PP AMP +P cu eliberarea a 7 Kcal. serina./mol cu eliberarea a 6 Kcal. Între restul de adenozină (A) de la capătul 31 al ARN t şi aminoacidul activat se formează o legătură covalentă macroergică a cărei energie va fi folosită în reacţia de polimerizare a aminoacizilor:+ AA1+ATP aminoacilsintetază AA1 ~ AMP + P + P AA1 ~ AMP + ARNt aminoacilsintetaza AA1 ~ ARNt + AMP Ataşarea eronată a unui aminoacid la ARN t.

În situsul A pătrunde aminoacil ARN t corespunzător codonului din ARNm recunoscut de anticodonul din ARNt. 89 – Schema transmiterii informaţiei: codon (ARN m) – anticodon (ARN t) – aminoacid Proteina ribozomală S1 cu proprietăţi contractile joacă un rol important în realizarea opoziţiei mesagerului (ARNm) şi adaptorului (ARNt) ea asigurând deplierea ARNm atunci când acesta. încât să facă posibilă recunoaşterea codonului din ARNm de către anticodonul corespunzător din ARNt.exit . 144 . secvenţa leader nefiind tradusă. IF2 şi IF3.subunitatea ribozom de 30 S se ataşează subunităţii ribozomale de 50 S. sinteza tuturor catenelor polipeptidice începe cu metionina. Dar. al cărui codon din ARNm este codonul de iniţiere AUG sau. La nivelul ribozomului. Ca urmare. La acest complex ARNm . De regulă situsul P acceptă complexul aminoacil ARNt numai dacă acesta a realizat recunoaşterea codon . cu constituirea unei asocieri tranzitorii prin intermediul punţilor de H. situsul peptidil (P) şi situsul de ieşire . Acceptarea se bazează pe unele posibile modificări conformaţionale pe care le-a suferit complexul aminoacil ARN t când a fost în situsul A. asociere care durează până ce aminoacidul legat de ARN t este deconectat de la acesta şi înserat la catena polipeptidică unde rămâne ataşat de aminoacidul precedent. pe principiul complementarităţii. Fig. în interiorul catenei polipeptidice metionina este specificată de acelaşi codon AUG .Etapa a treia în iniţierea unei catene polipeptidice se desfăşoară la nivelul ribozomului care prezintă suprafeţe specifice de legare stereochimică a ARNm.Complexul aminoacil ARNt se asociază cu subunitatea ribozom 50 S care prezintă trei situsuri : situsul aminoacil (A). 89). Cu ajutorul unei secvenţe denumită secvenţă leader aflată la capătul S1 al ARNm.(E). mai rar GUG. coli) funcţionale în asigurarea sintezei catenei polipeptidice . Ribozomul asigură de aşa manieră asocierea acestor trei elemente. acesta se leagă la subunitatea ribozomală mică 30 S. constituindu-se particule ribozomale întregi (70 S la bacteria E.anticodon. ARNt şi a catenei polipeptidice în creştere. printr-o legătură chimică covalentă — legătura peptidică (fig. interacţionează cu ribozomii şi legarea acestuia la subunitatea ribozomală mică 30 S. adică numai dacă a trecut prin situsul A şi apoi a fost translocat în situsul P. Iniţierea catenei polipeptidice este asigurată de intervenţia unor factori de iniţiere de natură proteică. denumiţi IF1. pentru ca ribozomul să recunoască în mod specific codonul de ini ţiere AUG este necesar un semnalul suplimentar de discriminare între AUG iniţiator şi AUG din interiorul mesajului genetic.

Aceasta reprezintă o secvenţă de 7 .ARN t se leagă la ARNr 23 S cu o mai mare afinitate decât la orice alt ARNr. O altă particularitate a procesului de iniţiere este folosirea unui ARN t specific de iniţiere ce diferă de omologul său ce interacţionează cu codoni AUG interni pentru metionină . iar uneori este îndepărtată însăşi metionina (fig. fiind complementare cu 3 .15 ribonucleotide bogate în purine şi aflată în amonte de codonul de iniţiere AUG. Formilarea metioninei determină blocarea grupării amino.Met .ARN t MET la eucariote . toţi ceilalţi codoni trebuind să treacă mai întâi la nivelul situsului P. prin eliminarea unei molecule de apă. o secvenţă în buclă (hairpird) adiacentă secvenţei Sherie . fără al mai trece la nivelul situsului A.Dalgarno.metionina ocupă poziţia unu a catenei polipeptidice dar oferă restul reactant COOH care unindu-se cu gruparea NH2 a următorului aminoacid. aceasta fiind unica excepţie. După terminarea sintezei catenei polipeptidice grupa formil de la metianină este îndep ă rtat ă prin intervenţ ia unei enzime de deformilare. Fig.90).translocaţia (adaptat după Stryger. ceea ce face să aibă loc selecţia f -Met .metionină ARN tMET la procariote şi i .Dalgarno are valoarea unui semnal suplimentar de iniţiere.Sinteza proteică: ciclul de elongare al lanţului peptidic.7 baze dintr-o secvenţă de polinucleotide de la capătul 3' al moleculei de ARNr de 16 S din cadrul subunităţii ribozomale mici (30S) .Dalgarno din ARN m selecţionează codonul AUG iniţiator şi-1 aduce la nivelul situsului P al ribozomului. Acest f. va forma puntea legătură peptidică. 145 . formarea legăturilor peptidice.Acest semnal discriminator este reprezentat de aşa numita secvenţă Shine . Ca urmare formil . descoperită de Shine şi Dalgrano în anul 1975. Această interacţiune dintre capătul 3' al moleculei de ARNr 16 S şi secvenţa Shine .ARN t MET). Formilaza este întâlnită la procariote şi ca urmare doar la aceste organisme primul aminoacid al oricărei catene poliptidice este formilmetionină ARNt iniţiator încărcat cu formilmetianină este singurul ARN t care se leagă direct la situsul P al ribozomului cu ajutorul factorului de iniţiere IF2.Formarea legăturilor aminoacil – ARNt. 1991). Acest ARN t iniţiator a fost denumit f .metionină .ARNt în situsul P. După încărcarea ARN tMET iniţiator cu metionină el devine metionil ARN t MET şi este supus unei formulări prin ataşarea grupului formil sub acţiunea enzimei formilază la gruparea NH2 a metioninei aceasta devenind formilmetionină (f . 90 . În plus. ceea ce face ca ea să nu mai poată participa în vreo reacţie de polimerizare.

91.3. proces care este mediat de IF3. care nu sunt altceva decât proteine ribozomale care se ataşează particulei ribozomale în faza de funcţionare a acesteia în sinteza proteică .R2 şi TF . în deplasarea sa pe macromolecula de ARNm. părăseşte situsul P. deoarece nu există anticodoni care să recunoască codonii nonsens . a întregului mesaj genetic conţinut în ARNm.T4 şi EF .G determină deplasarea acestui complex la nivelul ribozomului. al patrulea si aşa mai departe. 92). Funcţionarea unor asemenea factori de elongaţie este dependentă de energia eliberată prin hidroliza GTP. capătul 5'al ARNm devine liber spre a forma cel de-al doilea complex de iniţiere şi astfel.uri făcându-se în virtutea complementarităţii codon . aflat în situsul A şi astfel pot fi eliberaţi din ribozom atât catena polipeptidică. Codonii UAA. Translocarea succesivă din A în P.R3. având loc totodată disocierea" ribozomului în cele două subunităţi ale sale.Ri. acţionând enzimatic la nivelul situsului P. EF . însoţită de fiecare dată de formarea unei noi legături peptidice. condiţionează desfăşurarea celei de-a doua etape în biosinteza catenei polipeptidice şi anume elongarea sau alungirea catenei . cât şi ARN t. selecţia complexului aminoacil ARNt din amestecul de aminoacil ARNt .3. separă grupul carboxil al aminoacidului C terminal de legătura sa cu ARN t printr-o hidroliza.Terminarea sintezei catenei polipeptidice Când. secvenţial prin situsul A al ribozomului. Eliberat. Din interacţiunea codonilor nonsens cu factorul de terminare . de asemenea.ARNt -. În alungirea catenei polipeptidice intervin aşa numiţii factori de elongaţie (alungire) care au fost denumiţi EF -Ts şi EF-G. rezultând un polisom sau poliribozom. astfel că.ARNt ce pătrund. la un moment dat. UAG şi UGA sunt codoni nonsens sau terminatori care sunt recunoscuţi de factori de eliberare sau de terminare denumiţi TF .4. codon după codon. al doilea ribozom se angajează în traducerea mesajului genetic spre a asigura sinteza unei a doua catene polipeptidice. ribozomul ajunge cu situsul său A în dreptul unui codon nonsens ( codon de stop sau codon terminal ) în acest situs nu mai pătrunde nici un complex aminoacil . aceeaşi moleculă de ARNm este asociată cu mai mulţi ribozomi. 6.R3 din cadrul acestui complex. TF . ARNt iniţiator. apoi un al treilea. Proteinele ribozomale h1 ş i h2 sunt implicate în terminarea sintezei catenei polipeptidice pe o cale neelucidată (fig.Alungirea sau elongarea catenei polipeptidice O dată formată prima legătură peptidică.ARNt care a trecut în prealabil prin situsul A spre a se realiza recunoaşterea codon . TF . 146 .R3 va rupe legătura esterificată a catenei polipeptidice cu ARNt final. acesta va putea primi cel de-al doilea aminoacil . Se formează cea de-a doua punte peptidică şi translocarea succesivă din A în P permite citirea secvenţială.6. După ce ribozomul a asigurat traducerea a circa 25 de codoni. are loc încetarea sintezei catenei polipeptidice. Ca urmare.anticodon. rezult ă un complex de terminare care nu mai permite alungirea în continuare a catenei polipeptidice TF .3.Ts asigură fixarea aminoacil ARNt pe ribozom iar EF . rămas fără aminoacid.anticodon. de către anticodonii complexelor aminoacil .ribozom. Aceşti factori de elongaţie se fixează în subunitatea ribozomală mare (50 S) între proteinele h17 şi h12.

91 – Schema sintezei proteinelor la procariote 147 .Fig.

92 – Schema sintezei proteinelor la eucariote 148 .Fig.

se realizează la nivelul porilor anvelopei nucleare. în celula eucariotă apar ca două popula ţii spaţ ial separate: ribozomii ataş aţ i de membrana RE ş i ribozomii neataşa ţi de membrană . Tabelul 2. deoarece aceeaşi moleculă de ARNm poate transcrie mai multe gene structurale ale aceluiaşi operon. Dup ă iniţ ierea translaţiei proteina cu această secven ţă va orienta ribozomul spre RE. transcrierea mesajului genetic şi traducerea sa pot avea loc simultan.glicoproteinele pentru membranele :plasmatice. 6.) prelucrare care are loc numai în RE şi aparatul Golgi.proteine secretate . într-o secvenţă de nucleotide specială pe care o posedă ( secvenţ a semnal sau secvenţ a leader sau signal peptide ). Ei diferă numai prin tipul de proteine pe care le sintetizează (tabelul 2).4. substratul molecular complex pe care se traduce mesajul ARNm în molecule proteice.Particularităţile decodificării la procariote şi eurocariote La procariote. purtând mesajul genetic pentru mai multe catene polipeptidice. laminina.enzime ale REG . Pe aceş ti ribozomii sunt sintetizate numai acele proteine care vor fi introduse în RE. care nu necesită o prelucrare special ă (glicolizare. Pe ei sunt sintetizate toate celelalte proteine.proteine ataşate pe suprafaţa externă a membranei celulare (fibronectina. De exemplu. Moleculele de ARNm care nu posedă această secvenţă în structura lor se leagă de ribozomii care vor ră mâne în citosol (ribozomii liberi). fiecare molecul ă de ARN purtând mesajul genetic pentru sinteza unei singure catene polipeptidice. spectrina. La eucariote.enzime lizozomale .3. ARNm la eucariote este monocistronic . lamine) Ribozomii citoplasmatici legaţi de membranele RE Ribozomii citoplasmatici nelegaţi de membranele RE(ribozomii liberi ) 149 . aparatul Golgi . proteine citoplasmatice solubile proteine ataşate pe suprafaţa externă a membranei celulare (actina. Proteinele sintetizate de diferite clase de ribozomi Localizarea ribozomilor Clasa de proteine sintetizate . ARNm la procariote este policistronic. reprezentând enzime diferite care intervin într-o aceeaş i cale metabolică .6. Diferenţierea este înscrisă în mesajul moleculei de ARNm. în cea mai mare parte vor fi secretate (exportate) sau transportate la diferite organite ş i la membrana plasmatică . Trecerea mesagerului ARNm din nucleu în citoplasmă . modificate ş i care apoi. acetilare. colagenul).) proteine mitocondriale codificate de ADN-ul nuclear proteine peroxizomale . deoarece înainte ca să fie terminată sinteza ARNm pe matriţa de ADN capătul său 5' poate să se asocieze cu ribozomii spre a forma complexul de iniţiere în traducerea sa într-o catenă polipeptidică.enzime ale aparatului Golgi . în sinteza histidinei intervin 10 enzime-10 gene. Mecanismul sintetizate compartimentării celulare a proteinelor nou- Ribozomii. care se va ataş a de membrana organitului.proteine nucleare (histone. etc. care sunt liberi în citosol (dar şi ei apar legaţi de fibre ce apar ţin citoscheletului). transcrierea are loc în nucleu. RE. Ambele tipuri de ribozomi sunt din punct de vedere structural şi funcţional echivalente.5. nucleare. iar traducerea în citoplasmă unde se afl ă ribozomii.

În faza de compartimentare secundară. aceştia se mişcă în planul tangenţial al membranei şi se agregă într-un canal sau „tunel” membranar.Palade. până la terminarea lanţului. în mitocondrii şi cloroplaste şi altele sunt încorporate de membrana celulară. va intra în interiorul cisternei RE. vom analiza pătrunderea proteinelor de secreţie în cisternele RE. să vină în prelungire cu tunelul membranar neoformat. cu peptidul în formare. Dar. în cisterna membranară. 93). după care va continua să intre restul lanţului polipeptidic. 93. Atunci peptidul va fi liber în întregime în spaţiul intercisternal. unde suferă transformări şi se includ în granulele de secreţie al căror conţinut va fi exocitat. Cum se cunoaşte din experienţele lui G. Asemenea proteine membranare joacă rol de adevăraţi receptori ribozomali. prin difuzia în planul membranei reticului a receptorilor semnalului. Într-o primă fază considerată a fi compartimentarea primară. Sinteza se continuă şi polipeptidul propriu-zis trece în întregime prin tunelul membranar. în peroxizomi. Apoi. Astfel peptidul semnal este separat de stratul bimolecular de fosfolipide şi prin tunelul membranar. se dezorganizează tunelul membranar de care era legat ribozomul care. Când peptidul semnal vine în contact cu receptorii membranari. în momentul în care peptidul semnal ajunge în lumenul reticulului. se desprinde şi se desface în cele două subunităţi (fig. Acestă legătură se realizează datorită unor proteine receptoare (SRP-receptor). dintre proteinele ce se transferă prin membrane unele ies din reticulul endoplamatic şi trec în lizozomii primari. care permite tunelului său. se desprind vezicule pline cu proteinele de secreţie care sunt transportate la aparatul Golgi. Fig.Schema generală a transportului proteinei nou – sintetizate în lumenul reticulului endoplasmatic (RE): 150 . un codon semnal care. Asocierea receptorilor membranari stabileşte situsuri de fixare pentru subunitatea mare a ribozomului. Ca exemplu. care fac parte din structura membranei RE. proteinele de secreţie sunt sintetizate de ribozomii ataşaţi de membrana RE şi apoi transferate prin membrana acestuia în interiorul lui. o peptidază semnal membranară le secţionează de lanţul peptidic în formare. Din cisternele RE. proteinele nou sintetizate se împart în proteine care rămân în hialoplasmă. tradus într-un peptid semnal (signal recognition particule SRP) compus din 15-25 aminoacizi. proteine care migrează în nucleu şi proteine care sunt transferate prin membranele intracelulare sau se încorporează în membrane. ARNm al unor asemenea proteine „de export”conţine în afară de codonul iniţiator al translaţiei. face posibilă joncţiunea ribozomilor funcţionali cu membrana RE.Compartimentarea intercelulară a noilor proteine sintetizate în hialoplasmă are loc în faze separate în timp şi spaţiu.

o particulă semnal de recunoaştere (SRP) se leagă de secvenţa semnal a proteinei (signal peptide) şi de ribozom. unde în jurul fiecărei miofibrile. În celulele luteinice ale corpului progestativ din ovar. formarea „tunelui” transmembranar din proteinele receptoare. se sintetitizează o proteină precursoare peroximală mai mare decât suma celor patru subunităţi. În citoplasmă. Astfel. celulele care sintetizează steroli prezintă un reticul endoplasmatic neted format din numeroşi tubuli ramificaţi şi bifurcaţi. jumătate din numărul lor) sunt reintroduse în celulă prin pinocitoză. dintre care 4 se sintetizează în citoplasmă şi 3 în mitocondrii. O formă specializată de organizare a reticulului endoplasmatic nuclear se întâlneşte la fibrele musculare striate. lanţul polipeptidic în formare are o secvenţă „stop” (foarte hidrofobă) care. scoaterea peptidului . 4) Complexul ribozom – SRP se disociază şi ribozomul continuă translaţia. însă cele lizozomale. Spre deosebire de proteinele de secreţie. aceştia pierd oligopeptidele semnal. Corelaţia particularităţilor structurale şi funcţionale ale reticulului endoplasmatic neted cu heterogenitatea funcţională a celulelor Reticulul endoplasmatic neted prezintă o dispoziţie a elementelor structurale. ele pătrund în anumite membrane ce conţin receptori pentru anumite secvenţe şi astfel iau naştere vacuolele cu enzimele lizozomale şi peroxizomale. prin secvenţa semnal este inserată în membrană şi translocată în lumen. Citocrom C.1) Proteina fiind în curs de sintetizare. se consideră că proteinele lizozomale sunt „sortate” de celelalte proteine în cadrul regiunilor RE pregolgian şi anume. se găseşte un sistem de tubuli şi cisterne dispuse longitudinal. Tubulii alungiţi ai reticulului endoplasmatic fuzionează în zona striei H. diferenţa reprezentând tocmai suma unor secvenţe „semnal” cu care recunosc receptorii suprafeţei mitocondriale. trecând prin membrană dezorganizează tunelul şi opreşte transferul lanţului. 151 . în zona proximă a complexului Golgi. caracteristică pentru fiecare tip de celulă. În unele cazuri. prin care.semnal de către peptidază şi segregarea finală a lanţului complet polipeptidic în spaţiul intracisternal al RE sunt considerate ca un program cotranslaţional. Aşa se întâmplă cu proteina G a virusului Stomatitis vezicular. în câte o cisternă. particularitatea structurală fiind legată de heterogenitatea funcţională a celulelor respective. Este interesant cazul proteinelor lizozomale ale fibroblaştilor. reticulul prezintă numeroase vezicule fenestrate. care sunt acumulate în RE împreună cu proteinele peroxizomale şi cele secretoare. constituind un sistem perimiofibrilar numit reticul sarcoplasmic (sarcotubuli).oxidaza mitocondrială este constituită din 7 subunităţi proteice. ca şi în zona benzii Z. care conţin în plus şi carbohidraţi. aşa încât formează un fel de manşon continuu în jurul miofibrilei. întins între două benzi Z(sarcomer). iar SRP este deplasat şi reciclat.5. dispuşi într-o reţea complexă în toată citoplasma. Aceste proteine sunt eliminate din celule. fiind „recunoscute” de receptorii membranari (aprox. În concepţia lui G Blobel. După pătrunderea celor 4 subunităţi. 6. ceea ce le permit încorporarea lor în membrana internă mitocondrială. Detaşarea ribozomului şi dispersarea proteinelor receptoare ale tunelului în membrană reprezintă fenomene post-translaţionale. în strânsă vecinătate cu mitocondriile. 2) Complexul format se leagă de receptorul SRP din membrana RE. Pe de altă parte. turtite. proteinele lizozomale şi cele peroxizomale au” secvenţe de sortare” în plus. 3) Proteina. care rămâne cu capătul carboxil în afară şi cu cel amino înăuntru.

în asemenea mod. datorită energiei rezultată din hidroliza ATP din mitocondrii. O altă formă particulară de organizare a reticulului endoplasmatic nuclear a fost observată în unele celule secretoare ale adenohipofizei. la baza aşa-numitelor locuri senzitive („senzitive spots”). Fig. printre care se găseşte dispus. Asocierea cisternelor cu mitocondriile sugerează că. În timpul relaxării. între două cisterne ale celor două manşoane ale reticulului sarcoplasmic pătrunde o invaginaţie a plasmalemei turtită în plan transversal al fibrilei (tubulul T). atât în sistemul nervos central cât şi cel periferic. Sarcolema cu cisterne prezintă o permeabilitate selectivă. ionii specifici fiind absorbiţi la suprafaţa membranelor intracelulare ale cisternelor. În felul acesta. unde se găsesc vezicule mari. asemănător unui bulb de ceapă secţionat. 94). necesară tocmai în acest loc unde apare contracţia. Structuri asemănătoare se găsesc şi în unele celule senzoriale sau musculare. Reticulul uşurează distribuţia rapidă a Ca2+ şi ATP la nivelul miofibrilelor. atât ai vertebratelor cât şi ai nevertebratelor. deci. turtite numite cisternele de sub plasmalemă. Formaţiuni asemănătoare au fost observate în hepatocite după administrarea de toxice sau după hepatectonie experimentală. Aceste cisterne sunt numai în neuroni (nu şi în celulele Schwann sau celulele endoteliale). la nivelul benzii Z se formează o triadă. 94 . difuzând uşor prin reticul şi permiţând contracţia musculară .La acest nivel (banda Z). Tot prin tubulul T. Cisternele stau. care generează sau conduc variaţii de potenţial electric. aceste formaţiuni au fost numite paranuclei endoplasmici. din plasmă intră în reticulul sarcoplasmic ioni de Ca 2+ şi ATP. Cisternele modifică mobilitatea şi concentraţia ionilor la suprafaţa internă a sarcolemei. de aici trece în tubulii transverşi (T) şi apoi în sarcoplasmă. cu două elemente (două cisterne) ale reticulului sarcoplasmic şi un tubul T (fig. O altă dispoziţie particulară a reticulului endoplasmatic nuclear este cea de pe faţa internă a membranei plasmatice la neuroni. Aşezate lângă nucleu. permeabilitatea membranelor este modificată şi transferul de materiale uşurat. unde tubulii reticulari se dispun concentric.Reticulul endoplasmatic al fibrelor musculare striate (reticulul sarcoplasmic). Studiile lui Porter şi Palade asupra reticulului endoplasmatic la muşchii vertebratelor au arătat asocierea acestor cisterne cu anumite locuri de pe plasmalemă prin care stimulii pot ajunge în celule. Triada aceasta este foarte importantă funcţional şi anume prin tubulii T se transmite potenţialul de acţiune de la suprafaţă la elementele contractile. Manşonul din dreptul benzii A conţine cea mai mare cantitate de Ca2+ şi ATP. Ca2+ se acumulează în cisternele terminale ale reticulului sarcoplasmic şi. 152 .

membrana nucleară. cu un „turnover” foarte rapid. care sunt identice cu acelea din vecinătatea dictiozomului. capabile să anihileze acţiuni ale drogurilor (exemplu fenobarbital).Un tip special de reticul neted a fost descris în celulele stratului pigmentar al retinei. într-un ritm scăzut şi o proteină „exportabilă”. ca un „sistem circular” endocelular. 2) fuzionarea veziculelor cu vacuole de condensare. în ziua a opta postnatală reticulul devine de tip neted. ribozomi). Noile membrane sunt. Structurile reticu-lului formează aşa-numiţii corpi mielinici.6. sintetizate în reticulul endoplasmatic granular şi transferate apoi reticulului endoplasmatic neted. Asemănarea citomembranelor celulelor pigmentare cu structurile din complexul de fotorecepţie a luminii. Segregarea şi concentrarea proteinelor Studii efectuate cu 3H – leucină în pancreas au stabilit că proteinele sintetizate în ribozomi (reticulul endoplasmatic granular) sunt trecute apoi în reticulul endoplasmatic neted. dispuse în stive. 3) fuzionarea unor microvezicule Golgi formând o vacuolă multiveziculată la care membranele vor forma membrana limitantă a vacuolei de condensare. Reticulul endoplasmatic intervine în schimburile ionice între citoplasmă şi nucleu.5µ în axul lung. membrana plasmatică. Faptul că celulele a căror funcţie principală este sinteza lipidelor sau sterolilor au un reticul neted dezvoltat au dus la concluzia localizării la nivelul acestuia a enzimelor de sinteză a sterolilor. Modificările se reflectă în variaţiile raportului ARN/proteină. de asemenea şi localizarea enzimelor care participă la sinteza glicogenului. de 4 . fiind prezent cel granular. mecanismul intern fiind încă discutabil. alcătuiţi din săculeţe turtite. Dispoziţia spaţială a reticulului permite considerarea acestui sistem structural. în ziua a treia prenatală reticulul endoplasmatic neted lipseşte. În vecinătatea aparatului Golgi ergastoplasma pierde ribozonii şi membrana devine netedă. constricţiile fiind un stadiu în detaşarea de microvezicule libere. care scade în favoarea raportului fosfolipoproteic /proteină. printre care fenobarbitalul şi hidrocarburile polichimice declanşează in vivo un efect inductor asupra enzimelor microzomale (microzomi = fracţiuni heterogene cuprinzând fragmente din membranele reticulului endoplasmatic. Date experimentale sugerează sinteza la nivelul reticulului endoplasmatic neted a enzimelor detoxifiante. la nivelul căruia se pot realiza schimburi de substanţe între mediul extracelular şi matricea nucleară. Conţinutul veziculelor trece apoi în vacuolele de condensare. 153 . citomembranele netede conţin şi enzime. iar în unele cazuri produc chiar o amplificare genică a unor enzime implicate în apărarea organismului. Reticulul endoplasmatic neted astfel format se veziculeză. foarte mobil. în hepatocitele de şobolan. Adesea corpii mieloizi sunt grupaţi câte 4 – 5 laolaltă. permit interpretarea că şi acestea intervenin în metabolismul vitaminei A şi conversia rodopsinei. concomitent cu un intens schimb hidric. Un rol important al reticulului endoplasmatic este hidroxilarea medicamentelor Peste două sute de compusi chimice. care au un aspect lenticular biconvex. deci. Observaţiile au sugerat cel puţin trei căi: 1) fuzionarea veziculelor cu cisterne ale dictiozomilor. Această modificare a raportului este proporţională cu vârsta . găsindu-se situat la polul bazal al celulei şi în procesele care migrează între conuri şi bastonaşe. 6. A fost atestată. Pe numeroase tipuri de celule au fost evidenţiată o variaţie cantitativă şi calitativă a reticulului endoplasmatic în cursul desfăşurării procesului de diferenţiere celulară. unde ocupă aproximativ 50% din citoplasmă. S-a stabilit că în reticulul endoplasmatic granular se sintetizează două tipuri de proteine: o proteină „secundară”. Astfel. Pe lângă fosfolipide şi proteine. trigliceridelor şi a altor lipide .

numai la nivelul zonei Golgi. endomembranele se modifică într-un flux continuu de la reticul spre membrana celulară.În vacuola de concentrare proteinele suferă un proces de concentrare în granule de zimogen printr-un mecanism încă neclar (probabil printr-un proces de deshidratare. Complexul golgian este. prin fuzionare. Granule dense la fluxul de e. datorită unei transferaze. 6. Sinteza şi secreţia polizaharidelor Sinteza zaharurilor complexe. sinteza iniţială este asociată cu reticulul endoplasmatic. hidraţi de C şi lipide. mucus. dau naştere acrozomului matur. care. sinteza glicoproteinelor şi mucopolizaharidelor se efectuează în aparatul Golgi. Produsul secretat se prezintă ca material diferit (enzime. rolul reticulului endoplasmatic in elaborarea unor vezicule care. se adiţionează galactoza. are loc la nivelul citoplasmei fundamentale. aparatul Golgi transferă şi concentrează proteinele. structural şi funcţional. La contactul cu ovulul şi sub influenţa acestuia. în circa 5 minute. apa acumulându-se în săculeţii care se umflă). Vacuolele transportoare duc aceste proteine la care s-au adiţionat grupări glucidice. Aceste complexe macromoleculare specifice sunt formate din combinaţii între proteine. Reacţia de sulfatare este interpretată tot ca o formă specială de complexare. complexul de membrane al aparatului Golgi nu poate fi privit numai ca un compartiment de pasaj al unor tipuri de molecule. În schimb. sintetizează polizaharide şi 154 . Detectarea mucopolizaharidelor acide s-a făcut. La nivelul spermatocitelor s-a evidenţiat apariţia unor granule proacrozomale în zona centrală a aparatului Golgi. În formarea lipoproteinelor. legat de reticulul endoplasmatic şi. de asemenea. Produsul care urmează să fie secretat va suporta apoi o remaniere suplimentară după detaşarea veziculelor din săculeţii golgieni. O localizare în timp în diferite formaţiuni ale aparatului Golgi a fost observată şi pentru sulful radioactiv 35S injectat ca SO4Na2.7. aşa cum e arată polaritatea lui. considerându-se neurosecreţia ca produs al lamelelor golgiene. În formarea granulelor de diferite glicoproteine a fost formulată părerea că există două etape: într-o primă etapă. în reticulul endoplasmatic pătrund N – acetilgalactozomină şi monozohexozomină. manoza şi acidul sialic. înveliş celular. acesta apărând mai întâi în dictiozomi şi apoi în granule de mucus. Întrucât produşii secretaţi de aparatul Golgi au un caracter variat. la aparatul Golgi. Proteinele granulelor de zimogen sunt reprezentate de o serie de enzime condensate care se descarcă la exterior prin pinocitoză inversă. care asigură formarea proteinelor în vacuolele din concavitatea cisternelor şi în granulele de secreţie. În cursul acestui flux membranar. folosind şi materialul sintetizat în reticulul endoplasmatic. S-a evidenţiat de asemenea. neoformează materiale membranare. Ca atare. furnizează cel puţin o parte din materialul acrozomal.(ME) au fost observate şi în zonele golgiene la numeroase tipuri de celule neurosecretoare. acrozomul suferă o serie de transformări variabile dar care includ eliberarea de substanţe litice care participă la liza structurilor rezistente ale ovulului faţă de pătrunderea spermatozoidului. Se precizează ca la acest nivel membranele aparatului Golgi joacă rolul de „complexare”. cum este glicogenul. fuzionând cu lamelele golgiene. membranele golgiene având rolul de a uni produşii separaţi (proteine – lipide) într-o moleculă mare – complexul lipoproteic. hormoni etc. ci ca pe un compartiment la nivelul căruia are loc o activitate enzimatică mult diferită şi o complexare a moleculelor mici într-o moleculă mare. fructoza.). se apreciază că această zonă posedă mecanisme speciale pentru formarea de entităţi macromoleculare. care se leagă de lanţul polipeptidic sintetizat la acest nivel. unde într-o a doua etapă. Un rol particular al aparatului Golgi este evidenţiat în formarea acrozomului din spermatozoid. care are o poziţie supra nucleară.

95).1. S-a acreditat ideea unui circuit intracelular al subunităţilor membranare hialoplasmice care participa la formarea veziculelor transpoare ce se desprind din reticulul endoplasmatic. limitate la o membrană. histiocite. Lizozomii Sunt structuri tranzitorii din multe celule. de Duve funcţionalităţile lizozomilor 155 . Aceste vacuole se fragmenteaza dupa exocitoză in vezicule mici prin a caror dezorganizare se reface stocul subunitatilor membranare din hialoplasma. pe lângă canaliculii biliari şi abundă în macrofage. fiind posibila formarea vacuolelor de secretie. ca în cazul diferitelor glande de la vertebrate (fig. la diferite alge unicelulare. reinoindu-le permanent. Funcţiile lizozomilor Rolul lizozomilor primari este de a aproviziona cu enzime fagozomii sau autofagozomii.8. granulele vitelusului proteic (în faza când cristalizează proteinele sunt tot formatiuni lizozomale). 6. 6. se deschid la exteriorul celulelor. astăzi este dovedit că participă la formarea pereţilor celulozici ai plantelor prin sinteza celulozei. în realizarea unei „digestii externe”. Aparatul Golgi îndeplineşte un rol şi în secreţiile solide şi anume. Sinteza enzimelor lizozomale are loc în poliribozomii reticulului endoplasmatic. se formează lizozomii. in final.glicoproteine. Tot o activitate litică au şi veziculele golgiene. care. Participarea aparatului Golgi la formarea noilor membrane celulare a fost considerată de unii autori ca o funcţie principală a sa. prin înmugurirea acestora. respectiv autofagice sau să elimine la exterior conţinutul lor. care includ o serie de hidrolaze acide. granulocite. ca de exemplu din glanda multifidă de melc. De aici. apoi imbogatesc membranele golgiene. de unde trec pe faţa distală a aparatului Golgi formată din saculi şi tubuli anastomazaţi.Clasificarea dată de Ch. Fig. Ei se găsesc în hepatocite. transformându-i în vacuole heterofagice.8. Secreţiile solide. 95 .

proces care este însoţit de contracţia microfilamentelor respective in sensul invaginării membranei celulare. 96 . Astfel. Circulând în citoplasmă se încarcă cu enzimele lizozomale. desfăşurarea procesului este figurată de la stânga la dreapta: sub acţiunea Ca++ filamentele contractile de sub membrana celulară realizează înglobarea unei particule care intră în citoplasmă. 156 .Dinamica endocitozei. nu mai are formă sferică. care apoi dispare. Particulele care aderă la suprafaţa membranei celulare. a mică invaginare ce conţine o mică parte din mediul extern. Unda de depolarizare eliberează Ca2+ din reticulul endoplasmatic. imobilizează proteinele acesteia. polizaharidică. devenit interior. este separat de citoplasmă printr-o porţiune din membrana plasmatică. crescând permeabilitatea Na+ care intră în celulă şi provoacă depolarizarea membranei. se depărtează de faţa internă a membranei şi uşurează astfel deschiderea vacuolei în exterior În prezenţa Ca2+ are loc reunirea actinei cu miozina şi formarea actomiozinei. după care corpii reziduali pot fi excretaţi printr-un mecanism în care proteinele mecanocontractile. fagozomul iniţial. migrează prin căile microtubulare de-a lungul citoplasmei şi se fragmentează. transformându-se în heterolizozomi. Fogozomul se poate deschide la exterior (regurgitare). Glicocalixul ei. După pierderea glicocalixului fagozomul suferă o deshidratare.Endocitoza diferitelor particule sau pinocitoza lichidului extracelular se face cu participarea filamentelor mecanocontracţiilor sub-membranare (fig. sub acţiunea Ca++. înconjurată de membrana respectivă. sau se asociază cu lizozomii primari devenind vacuole heterofagice. Vacuolele heterafagice pot acumula coloranţi şi medicamente din mediul extracelular. 96). Fig. se separă de membrană formând în interiorul fagozomului o masă amorfă.

La fel sunt digerate bacteriile de către leucocitele neutrofile şi macrofage şi sunt degradate substanţele toxice şi medicamentoase. dispariţia cozii larvare la anure. Acest proces are loc pe trei căi: prin hidrolazele nelizozomale din nucleu şi citoplasmă. prin aceasta detoxificându-se organismul. Se ştie că una din proprietăţile fundamentale ale celulelor este de a-şi reînnoi permanent structurile lor funcţionale. metabolismul celulelor refolosind în acelaşi timp materialele acestora în sinteze ulterioare. prin enzimele lizozomale care ies din lizozomii primari şi digeră structurile respective. Celulele unui animal supus la inaniţie se nutresc prin autofagia propriului conţinut. Autofagozomii care se formează în ficat şi rinichi distrug permanent organitele celulare în mod constant. Faptul că enzimele lizozomale nu digeră membrana lizozomilor s-ar putea datora rezistenţei învelişului propriu glicoproteic de pe faţa internă a membranei lizozomale. Rezultă aşa-zişii „corpi reziduali” care pot să-şi elimine de foarte multe ori conţinutul afară. clorochina. Când autofagozomul s-a format. Tot prin autofagie se limitează extinderea unor procese degenerative (ale hepatocitelor şi celulelor pancreatice de actinomicină – inhibitor al sintezei ARN) etc. lipofuxime etc. particulele captate prin fagocitoză sunt digerate în vacuole heterofagice şi componentele lor trec prin membrana lizozomală în citoplasmă. determină ruperea membranei şi enzimelor lizozomale distrug parazitul. feritine. în alte cazuri.Astfel. În circa 300 de zile mitocondriile unui hepatocit se reînnoiesc de aproximativ 30 de ori. În mod normal. Autofagozomul ia naştere prin circumscrierea unei porţiuni de citoplasmă cu organitele respective de către membranele cisternelor reticulului endoplasmatic sau ale saculilor golgieni. Fig.Funcţiile peroxizonilor 157 . acumulându-se în heterolizozomii plasmodiului malariei. formarea rinichiului. iar celulele moarte sunt lizate de enzimele lizozomale proprii. în el se varsă conţinutul enzimatic al lizozomilor primari. Ceea ce rămâne nedigerat în hetero-fagozomi şi autofagozomi apare sub forma unor figuri mielinice. hrănind celula. Vacuola autofagică se constituie din contopirea unui autofagozom cu lizozomii primari. În cursul ontogeniei. 97 . ceea ce înseamnă că într-o celulă o mitocondrie este distrusă la fiecare 15 minute. etc. Enzimele lizozomale eliminate în afara celulelor permit unor celule să-şi croiască drum printre zone tisulare compacte şi greu de străbătut. curburile encefalului. individualizarea falangelor. autofagia unei structuri constituie un mecanism care influenţează integralitatea organelor. rezultă din contopirea mai multor vacuole endocitare. Când organismul nu mai are nevoie de anumiţi hormoni atunci glandele care le elaborează distrug prin autofagie granulele de secreţie respectivă. pigmenţi biliari. prin autofagie.

intervenind şi în sinteza sterolilor (fig. Răspunsul la stres implică alăturarea transcrierii unui set anumit de gene care codifică pentru proteinele de şoc termic (hsp) numite şi „proteine de stres”.9. Cercetările efectuate în ultimii 25 de ani au demonstrat că există o uniformitate izbitoare în modul în care diferite organisme răspund la diferite forme de stres. Dintre acestea cea mai cunoscută la bacterii este proteina de şoc termic hsp70k1. fotofobie.10.Datele acumulate pledează pentru existenţa unui număr foarte mare şi complex de proprietăţi funcţionale ale acestor proteine. fie membranele lizozomilor fuzionează dând lizozomi mari de 2 – 5 µφ. ele reactivează proteinele legate după stres şi au rol de catalizatori prin creşterea vitezei de înfăşurare a proteinelor. sfingomielinaze. negăsind enzima respectivă responsabilă de hidroliza lor. fie. Be. denumite nucleoizi sau o placă marginală mai densă la primate. 6. se acumulează in cantitate mare într-o serie de celule. praf de cărbune etc. pe un număr mare tot mai mare de organisme procariote şi eucariote.). iar la copii moartea rapidă. Zn – se produc lize ale membranei lizozomilor. senescenţă cât şi în fenomenele degenerative tip boli prionice . Aceste proteine au fost denumite „proteine chaperone” sau „chaperoni moleculari”. În peroxizomi se întâlneşte catalaza care distruge H2O2 cu producere de H2O. iar uneori cu formaţiuni poli-şi multitubulare. albinism. funcţionarea normală corespunzătoare. anoxie. ceea ce înseamnă „proteine de însoţire” deoarece intervin pe tot parcursul sintezei celorlalte proteine din organisme. 97). sintetizând glucoza din precursori neglucidici. iar enzimele eliberate omoară celule. Proteinele charperone au capacitatea comună de a-şi regla propria asamblare şi pliere (împăturire) motiv pentru care au fost numite şi autofoldaze. ajutându-le astfel să-şi găsească o structură terţiară stabilă. În maladii ca pneumoconiozele (leziuni pulmonare. sunt cazuri când nu se mai pot transcrie mesaje pentru o serie de enzime lizozomale (glucozidaze. reglează catabolismul glucozei. starea corectă de pliere şi agregare finală a acestora şi implicit. Peroxizomii produc o cantitate mică de energie. fie când donorul de O2 este H2O2 . Peroxizomii Sunt corpusculi de 0. permeabili ce produc scăderea rezistenţei organismului la infecţii. Aceste proteine de stres ajută celulelor supuse stresului să-şi menţină proteinele într-o conformaţie corectă. Într-o serie de maladii genetice. Cunoaşterea acestei noi clase de proteine a permis în ultimii ani deschiderea unor noi căi în abordarea şi înţelegerea proceselor celulare survenite în condiţii de stres.5 µφ formaţi dintr-o membrană şi o matrice. virusuri. scleroza parenchinului pulmonar) datorită inhalării de C. cu diferite consecinţe chimice. ajută ca aceste proteine să fie translocate către diferite organite celulare (transport 1 kilodaltoni 158 . galactizidaze) astfel că. determinând conformaţia structurală normală. Proteinele chaperone Studiile de specialitate şi biologie moleculară din ultimii ani au demonstrat. ale branhiilor. jucând rol în gluconeogeneză. endotoxine. existenţa unei clase speciale de proteine cu rol esenţial în viaţa celulei. 6.Sunt cazuri când membrana lizozomală este distrusă prin diferiţi factori externi (şocuri traumatice. o serie de substanţe ce pătrund în lizozomi. Si. fie prin oxidarea unui substrat redus. post-translaţional. spleno şi hepatomegalie.

În celula eucariotă.declanşând procesul de transcriere/translaţie a proteinelor de stres nu este încă bine cunoscut. Se pare că grp94 este o glicoproteină transmembranară (hidrofobă şi cu afinitate pentru lipide). creştere şi dezvoltare. având rol vital în sinteza. Modul în care celula este capabilă să sesizeze acumularea intracelulară de proteine anormal împăturite. să atingă o conformaţie normală. Proteinelor chaperone li se atribuie multiple funcţii: protecţia celulară crescută în condiţii de stres. şi ghidează atât proteinele normale nou-sintetizate. cantitatea ei creşte în nucleu şi este secretată parţial în mediul extracelular. determinarea stării de împăturire. Hsp90 se asociază cu fibrele de ribonucleoproteine modulând stuctura ARN-ului. traficul proteinelor (transport vectorial). asamblarea complexelor ribonucleoproteice a ribozomilor. Proteina chaperone grp94 este cea mai abudentă dintre toţi chaperonii din RE (în proporţie de 50%) şi aparatul Golgi. reticulul endoplasmatic (RE) se comportă ca nu senzor ce captează toate variaţiile în condiţii de stres (metabolismul calciului. deşi. Proteinele de stres joacă un rol important şi în condiţii de nonstres. dar şi a anumitor proteine normale (cu viaţă scurtă) atât la procariote cât şi la eucariote. est considerată drept „marker de stres”. La eucariote. Studiile asupra redistribuirii proteinei grp94 în condiţii de stres au adus lumină asupra înţelegerii patern-urilor de glicolizare ale grp94 modifică după stresul celular. grp94 se redistribuie în aparatul Golgi. la procariote s-a demonstrat existenţa unui sistem de proteine chaperone care acţionează succesiv.vectorial). cât şi pe cele anormale. hsp70. sau o mare cantitate de proteine nascente neâmpăturite. plierea şi funcţionarea normală a proteinelor nou-sintetizate. În condiţii de stres pot să apară proteine împăturite. chaperonii hsp60 şi hsp70 au rol în împăturire.asamblare/dezasamblare a proteinelor non-sintetizate. sugerând deci că o proteină anormal împăturită reprezintă componentă cheie a procesului de recunoaştere a stresului de către celulă. proteinele semiîmpăturite din lumenul şi membrana RE. proteina chaperone hsp70 are rol în sortarea proteinelor anormale. anume în perioada de diferenţiere celulară. într-o reacţie în lanţ. Dintre proteinele de stres. translocaţie. Formează complexe mari citosolice cu numeroşi alţi chaperoni. potenţialul redox. în unele cazuri. corespunzându-i în citoplasmă proteina chaperone hsp90. - - 159 . translocaţia. Această proteină a fost deschisă atât la procariote cât şi la eucariote. hsp90. hsp90 are rol în reglarea. Răspunsul la stres este reglat în principal la nivel de transcriere. asamblare. activitatea factorilor de transcriere şi a activităţii kinazelor proteice. Proteinele hsp se diferenţiază între ele prin greutatea lor moleculară (exprimată în kda): hsp60. stabilitate. În aceste condiţii. acordând termotoleranţă. Hsp90 protejează proteinele ţintă de proteoliză şi le asigură înmagazinarea. Proteina chaperone hsp90 este de asemenea implică în protecţia microtubulilor şi a filamentoase citoplasmatice faţă de stres (şoc termic). cele mai cunoscute sunt proteinele de şoc termic hsp (heat shock protein). au fost deschise şi reglări la nivel de translaţie. Hsp90 constituie 1-2% din totalul proteinelor citoplasmatice. aceste stări declanşează imediat răspunsul „la stres”.

prin formarea complexelor ADN-hsp90-histone. rolul în imunogenitate. activitatea kinazei. Dintre aceştia. faptul că proteinele chapenare au potenţialul de a-şi creşte sinteza şi in condiţii de stres. Stresul excitator este mediat de scăderea cantităţii intracelulare de glucoză. menţinerea şi remodelarea arhitecturii celulare (citoscheletul). - - - - - Hsp90 şi grp94 intervin în apoptoză şi în procesele de îmbătrânire celulară. replicare. kinazele sau receptării controlul transmiţătorilor. aceşti caperonii oferă celulei protecţie faţă de factorii de necroză a tumorilor (TNF) şi faţă de leziunile oxidative. Într-un număr mare de infecţii (bacteriene şi parazitare cu protozoare şi helminţi) moleculele chaperone devin ţinte imune proeminente pentru celulele T. procariote şi eucariote. Proteinele hsp70 au rol şi în stabilizarea citosolica a proteinelor peroxizemale. Chaperonii. Cel mai mare rol protector îl au proteinele din familia hsp70. osoasă. Unele observaţii sugerează că hsp exercită o acţiune de citoprotecţie asupra SNC ca urmare a răspunsului la stres. Starea toxică este potenţată de eliberarea continuă de glutamat după producerea leziunii iniţiale. scăderea pH-ului intracelular. musculară). din cursul mitozei. având drept rezultat atenuarea efectelor distructive. tuberculosis. clivajul proteolitic al proteinelor structurale şi prezenţa de radicali liberi mediaţi de denaturarea proteinelor.- biogeneza mitocondriilor şi peroxizomilor. Date recente (Cyermely şi Colab. rolul protector în SNC. Toate aceste procese sunt implicate în producerea răspunsului de tip proteine şoc termic (hsp). Mecanismul protector al hsp se pare că este legat de combinarea acestora cu proteazele. Hsp90 şi grp94 intervin în ciclul celular şi diferenţierea celulară (hsp90 intervine dezvoltarea neurală. Hsp90 se asociază cu nucleolii. ar explica în mare măsură . răspunsul imun. fosfolipazele. cu fibrele de ribonuleoproteine ale pericromatinei . intervin în procesul de dezvoltare celulară. prezenţi în toate organismele. prin legarea de receptorii pentru hormonii steroizi. regenerează ADN-ul după şoc termic. Hsp90 este implicat în asamblarea diferitelor complexe virale (complex ARN reverstransciptaza). au rol şi în biogeneza unor structuri macromoleculare. replicarea ADN-ului la virusuri. Au fost deschise drept ţinte imune proteinele hsp10 de la Mycobacterium leprae şi proteinele hsp60 şi hsp70 de la Mycobacterium leprae şi M. Se ataşează de ADN desfăşurând activitate de tip topoizomerază şi nuclează. Proteinele hsp70 sunt prezente în ţesutul nervos şi în condiţii de nonstres. modulează stuctura ADN-ului nuclear. rearanjările majore în structurile nucleare în cursul oogenezei şi embriogenezei precoce. Aceste proteine hsp70 reprezintă o proteină asociată cu microtuburi şi implicată în transportul axonal lent. 160 . poate fi fosforilată în prezenţa unui înalt nivel de calciu. Chaperonii au rolul în menţinerea stării de răsucire moderată a moleculelor de ADN. Hsp70 se leagă de ATP.Hsp90. în această stare.S-a demonstrat că insulina induce producerea de proteine hsp70. asamblarea şi reglarea activităţii receptorilor pentru hormonii steroizi. proteina hsp face posibilă asamblarea centrozomilor. a ARN-ului şi proteinelor . proteinele hsp60 şi hsp70 s-au dovedit a avea rol în biogeneza mitocondriilor. având o slabă acţiune ATP-zica. ADN-ul poate fi uşor antrenat în activitatea de transcriere. 1998) arată că funcţia majoră a hsp90 pare a fi participarea acesteia la omogenizarea. retiniană. recombinare. face ca acestora să se menţină în stare parţial despăturită capabilă de a fixa hormonul respectiv.

1. la fiecare interval de temperatură diferite faze ale ciclului rămânând constante ca cinetică.1. la eucariote cele mai frecvent întâlnite fiind mitoza şi meioza. ce asigură partiţia constituenţilor celulei în celulele fiice. Duplicarea cromozomilor nu pare să fie în legătură cu distribuţia lor.reproducerea. Apariţia unor descendenţi celulari cu acelaşi potenţial genetic reclamă exercitarea unui riguros control asupra replicării şi distribuirii materialului genetic.1. Acest capitol îşi propune să prezinte principalele etape ale reproducerii celulare şi mecanismele de control implicate în desfăşurarea acestui complex proces. o 7. fiecare prezentând o jumătate din informaţia genetică a celulei parentale. La nivel celular.2. dând naştere la două celule fiice. 161 . în urma meiozei se formează 4 celule fiice (gameţii). Iniţierea replicării genomului depinde de o sinteză proteică prealabilă. Prin fuziunea gameţilor (spermatozoidul şi ovulul) ia naştere oul fecundat din care se dezvoltă ulterior întregul organism multicelular. celula parentală se divide. Ciclul celular la animale Ca şi la plante.Capitolul 7 REPRODUCEREA CELULARĂ Creşterea organismelor şi transmiterea caracterelor ereditare de-a lungul generaţiilor au la bază o caracteristică fundamentală a materiei vii . În ciclul cromozomial dublarea cantităţii de ADN alternează cu mitoza. Reproducerea celulelor eucariote are loc printr-un proces complex denumit diviziune celulară. fiind necesară condensării cromozomilor profazici. în urma acestui proces. ceea ce duce la endoploidii. prin care se realizează duplicarea constituenţilor celulari şi distributive. Mitoza este caracteristică celulelor somatice şi asigură o repartizare egală în celulele fiice a materialului genetic replicat. Sinteza care are loc chiar în profază este necesară desfăşurării mitozei şi dacă ea lipseşte celulele revin în interfază . Ciclul celular la plante La plantele superioare rata ciclurilor celulare este invers proporţională cu temperatura (5 – 30o). 7. 7. O altă sinteză proteică are loc la începutul fazei G2. Meioza este întâlnită la celulele germinale. această capacitate pare a fi coordonată de prezenţa intranucleară a ADNr. Procesul distributiv al moleculelor ADN se realizează prin mecanisme specializate. care este inductoare pentru nucleii cu capacitate de replicaţie. Funcţie de compartimentele celulare în care se desfăşoară aceste evenimente se disting două componente ale ciclului celular: ciclul cromozomial şi ciclul citoplasmatic. reproducerea se realizează prin forme diferite. cea mai mare parte a ciclului celular de la animale este reprezentată de interfază.1. Diviziunea celulară implică desfăşurarea unor evenimente celulare replicative. adică de perioada de la sfârşitul unei diviziuni şi începutul următoarei. Ciclul celular Reproducerea celulară implică evenimente multiple şi complexe ce se succed ciclic şi care constituie ciclul celular. adică a segmentului genomic ce transcrie ARNr (organizatorul nuclear). în ciclul citoplasmatic are lor dublarea numărului de organite celulare şi citokineza. fiind posibile mitoze fără duplicarea cromozomilor sau duplicarea fără mitoze.

care elaborează diferiti mesageri sub formă de ARN m ce servesc după aceea în biosinteza proteică citoplasmatică . 98 . ca şi a histonelor (fig. se poate detecta.5 – 1 µ / minut. Durează 6 – 8 ore. Fibra nucleozomală unitară. denumite cromomere în raport cu proteinele matriceale. formează în anumite locuri de-a lungul cromozomilor împachetări mai voluminoase. Aglomerarea mai multor cromomere dă naştere blocurilor de heterocromatină. Urmează mitozei şi durează 5 – 10 ore la mamifere . Fiecare lanţ serveşte ca model complementar al altuia nou care se sintetizează enzimatic . În cursul ei nu se înregistrează noi sinteze de ADN şi celulele conţin cantitatea de ADN caracteristică speciei sa ţesutului respectiv . Interfaza Faza G1. 98). cantitatea de ADN a nucleilor diploizi este de 6. Biosinteza proteică depinde de activitatea genică transcripţională din eucromatină. Această replicare necesită separarea celor două lanţuri de ADN în punctele de iniţiere. după reacţia Feulgen pentru AND.Ciclul celular şi mitoza celulei animale 162 . dublarea a acestuia. raportul dintre lungimea cromatinei cu fibra unitară de 250 Å diametru şi lungimea ADN este la nucleii umani de 1 : 4. în cursul căreia cantitatea de ADN se dublează . La om (46 cromozomi). Faza S . Marcajele cu 3H – timidină a unor culturi celulare sincronizate arată că încorporarea „marcajului” (3H timidină) are loc în primele 10 minute ale fazei şi apare pe autoradiografii la periferia nucleului şi nucleolului.Nucleul nu prezintă în interfază transformări vizibile la microscopul fotonic.8 x 10 –12g. Fig. în schimb. Fibrele de cromatină dintre blocurile heterocromatinice sunt mai puţin împachetate. constituind eucromatina. cantitate care rămâne constantă în decursul perioadei G1. citospectrofotometric. de aproximativ 250Å diametru. Rata replicării helixului de ADN de la mamifere este de 0.

În această perioadă sintetică cantitatea de ADN creşte de la nivelul diploid 2n, trecând prin etape intermediare: 2,5C; 3C, 3,5C până ajunge la nivelul 4C, moment în care, prin mecanisme foarte exacte de reglaj celular, încă necunoscute, este încetată încorporarea de 3H timidină. Celula şi-a dublat cantitatea de ADN; iniţială în vederea repartizării aceleiaşi cantităţi 2C, de ADN în celulele fiice, respectiv aceleiaşi cantităţi de informaţie genetică. Prin ţinerea materialului biologic în contact cu 3H – timidină pentru durate diferite de timp presupuse a corespunde începutului, mijlocului şi sfârşitului perioadei S, se evidenţiază autoradiografic o replicare timpurie, mijlocie şi târzie (tardivă) a unor segmente cromozomale sau cromozomi întregi ai complementului unei celule sau specii. Când materialul biologic este ţinut mai puţin timp în contact cu izotopul, se constată că numai anumite părţi ale cromozomilor metafazici vor apare radiografic ca „grain-uri” (puncte) de încorporare a acestuia. Acestea sunt segmentele eucromatice ale cromozomilor; care au deci replicare precoce, la începutul perioadei S. Când materialul biologic stă mai mult timp în contact cu trasorul, corespunzând la 1 / 2 sau 2/3 din stadiul S, se constată că cea mai mare parte a cromozomului metafazici ca şi cei mai mulţi din cromozomii complementului prezintă marcaj radioactiv, puţine segmente, respectiv cromozomii, rămânând totuşi nemarcaţi. Acestea sunt segmente heterocromatice, respectiv cromozomi cu replicare tardivă. Când materialul biologic a stat în contact cu trasorul pentru un timp ce corespunde unei perioade S integrale, cromozomii metafazici, apar total marcaţi radioactiv. Faza G2. Este mai scurtă, durând 4 – 5 ore şi începe odată cu terminarea replicării heterocromatinei. Sintezele de ADN persistă, iar cantitatea de ADN este dublă faţă de G1. Faza M (sau mitotică). Reprezintă separarea duplexurilor de cromozomi (sau a cromatidelor – surori, după unii autori), împreună cu două loturi de citoplasmă care includ toţi constituenţii săi, în cele două celule fiice. Prin cinematografie cu contrast de fază s-a stabilit că profaza durează 10 – 15 minute, prometafaza şi metafaza 25 – 35 minute, anafaza 5 – 8 minute şi telofaza 20 minute . Derularea ciclului celular implică reglarea succesiunii evenimentelor ce se desfăşoară în cadrul acestuia Acurateţea proceselor de replicare şi segregare a ADN depinde de rezolvarea de către celulă a problemei succesiunii evenimentelor ciclului celular într-o ordine strictă, astfel încât, declanşarea unui nou eveniment să survină doar în urma încheierii complete a evenimentului precedent. Rezolvarea acestei probleme reclamă funcţionarea unor mecanisme de control şi existenţa la nivel celular a unor factori reglatori. Primele date privind existenţa unor factori implicaţi în reglarea ciclului celular au fost furnizate de experienţele de fuziune celulară Obţinerea populaţiilor de celule sincronizate (în care celulele se află în aceeaşi perioadă a ciclului celular) şi experienţele de fuziune celulară au sugerat existenţa unor factori reglatori ce controlează trei evenimente cheie ale ciclului celular: a) iniţierea sintezei ADN; b) derularea replicării materialului genetic nuclear; c) declanşarea procesului mitotic în care are loc segregarea materialului genetic. S-a constatat că în urma fuzionării unei celule aflate în perioada G1 cu o alta ce se găseşte în perioada S a ciclului celular, ADN celulei G1 începe să se replice. Experimentul a stat la baza presupunerii existenţei unui semnal capabil să activeze aparatul ADN replicativ. Acest semnal absent probabil din celulele G1, dar prezent în citoplasmă celulelor S a fost numit activator al perioadei S (S - phase activator). Deoarece în celulele hibride G2 x G1 nu s-a înregistrat iniţiera replicării ADN în nucleul G2, s-a considerat că activatorul fazei S este eliminat (sau blocat) din citoplasmă celulelor, la scurt timp după încheierea perioadei sintetice.

163

În urma fuziunii celulelor aflate în perioadele G2 şi S ale ciclului celular, sinteza ADN în nucleul celulelor din S continuă până în momentul replicării complete a materialului lor genetic, ceea ce indică absenţa unui inhibitor al sintezei ADN în citoplasmă celulelor G2. în acelaşi timp prezenţa activatorului perioadei S nu pare să afecteze nucleul G2 de vreme ce nu se înregistrează o reiniţiere a replicării ADN în acest nucleu, procesul replicativ fiind blocat până la trecerea celulei în perioada G1 a unui nou ciclu celular. Funcţionarea unui mecanism de blocare a sintezei ADN poate explica de ce într-o celulă nu are loc derularea repetată a procesului ADN replicativ. S-a constatat că atât replicarea incompletă a materialului genetic, cât şi existenţa unor erori în molecule ADN nou sintetizate ce reclamă intervenţia mecanismelor de reparare, determină întârzierea intrării celulei în mitoză. Deoarece procesul replicativ şi cel de reparare sunt asociate cu existenţa ADN monocatenar, se consideră că excesul de ADN monocatenar declanşează sinteza unui factor citoplasmatic, semnal ce împiedică intrarea celulelor în mitoză până în momentul desăvârşirii replicării sau reparăii erorilor. Acest factor ce controlează acurateţea procesului ADN replicativ a fost numit semnal de întârziere a perioadei mitotice (M - phase delaying signal). Intrarea celulelor în mitoză este determinată de dispariţia semnalului de întârziere a mitozei şi acumularea în citoplasmă a unui factor ce iniţiază mecanismul de segregare a materialului genetic, numit factor de activare a mitozei (M - phase promoting factor: MPF). Studiile bazate pe experienţele de fuziune celulară, în care s-au obţinut hibrizi g1 X M; G2 x M şi S x M, au demonstrat că prezenţa MPF (factor citoplasmatic prezent în celulele aflate în mitoză) declanşează în nucleul celulelor aflate în oricare perioadă a ciclului celular condensarea cromatinei, eveniment caracteristic mitozei. Se sugerează că factorul de întârziere a mitozei exercită un efect inhibitor asupra sintezei MPF. Acţiunea inhibitoare dispare în prezenţa MPF de vreme ce în celulele hibride, rezultate prin fuziunea celulelor G1, S sau G2 cu celulele M, în care factorii citoplasmatici coexistă, are loc condensarea cromatinei.

7.1.3. Ciclinele şi protein - kinazele dependente de cicline
Ciclinele şi protein - kinazele dependente de cicline constituie componentele motorului ciclului celular. Modificările apărute în statusul motorului, ca urmare a interacţiunilor dintre cele două componente, declanşează evenimentele ciclului celular (fig. 99). Aceste evenimente pot fi clasificate în patru grupe: a) evenimente declanşate de depăşirea punctului de START: - iniţierea replicării ADN; - replicarea centrilor organizatori ai microtubulilor (MTOC). b) evenimente ce au loc pe parcursul derulării replicării ADN. c) evenimente iniţiate în momentul intrării celulei în mitoză; - asamblarea fusului de diviziune; - condensarea cromatinei; - dezorganizarea membranei nucleare. d) evenimente ce marchează încheierea procesului mitotic; - dezasamblarea fusului de diviziune; - segregarea cromozomilor; - decondensarea cromatinei; - reorganizarea membranei nucleare; - citokineza.

164

Fig. 99 - Schema generală a funcţionării motorului ciclului celular. Interacţiunile ce se stabilesc între cicline şi protein kinaze dependente de cicline (cdk) au ca rezultat declanşarea evenimentelor caracteristice diviziunii celulare. 7.1.3.1. Protein - kinazele dependente de cicline (cdk) Prima protein kinază dependentă de cicline (34 KDa) a fost descoperită în 1988 ca produs al genei cdc2 din Saccharomices pompe şi al genei CDC 28 din Saccharomices cerevisiae. Ea a fost numită proteina p34 cdc2/CDC28 sau cdk1. Proteina cdk1 joacă un rol important în controlul ciclului celular, operând la nivelul punctelor de graniţă G1/S şi G2/M. Gene omologe cdc2/CDC28 au fost identificate şi în genomul uman. Introduse prin clonare în drojdii defective în cdc2/CDC28, genele umane au fost capabile să suplinească absenţa genelor corespondente din drojdii. Constatarea sugerează că proteina cdkl a fost conservată de-a lungul evoluţiei speciilor, acest element implicat în reglarea ciclului celular fiind comun tuturor celulelor eucariote. Descoperirea unei proteine, p33 (33KDa), numită cdk2 datorită asemănării structurale şi funcţionale cu cdk1, a demonstrat existenţa unei întregi familii de protein kinaze dependente de cicline. în prezent, şase membri ai acestei familii au fost identificaţi. 7.1.3.2. Ciclinele Ciclinele reprezintă un grup restrâns de proteine a căror sinteză se realizează într-o manieră dependentă de perioadele ciclului celular. Ele activează cdk formând cu acestea complexe ce prezintă activitate kinazică. Pe parcursul formării complexelor, ciclinele induc modificări conformaţionale şi de locaţie a cdk ceea ce conferă acestora specificitate în fosforilarea diferitelor substrate. Specificitatea activităţii catalititce a complexelor ciclină/cdk stă la baza parcurgerii de către celulă a ciclului celular.

165

Fig. 100 - Complexele ciclină/cdk implicate în diferitele perioade ale ciclului celular. Spre deosebire de cicline, care se acumulează în celulă într-o manieră dependentă de perioadele ciclului celular, cdk sunt prezente pe tot parcursul ciclului celular. Funcţie de omologia secvenţelor de aminoacizi şi implicarea lor în perioadele ciclului celular, ciclinele se clasifică în trei grupe (fig. 100): a) ciclinele perioadei G1 (ciclinele G1): ciclineie D şi E; b) ciclinele perioadei S: ciclina A; c) ciclinele perioadei M (cicline mitotice): ciclina B. Ciclinele G1 asigură traversarea de către celulă a perioadei G1 şi tranziţia G1/S. Din această grupă fac parte cele trei subtipuri ale ciclinei D (D1, D2, D3) şi ciclina E. Ciclinele D sunt sintetizate în faza timpurie a perioadei G1. Ele formează complexe cu diferite tipuri de cdk (cdk1 - cdk6). Se sugerează că complexele ciclina D/cdk constituie primele componente ale cascadei ciclinelor, ele acţionând în sensul activării ciclinelor E, care Ia rândul lor activează ciclinele A implicate în derularea perioadei sintetice a ciclului celular. Ciclinele E sunt sintetizate târziu în G1. Mai selective comparativ cu ciclinele D, ciclinele E se asociază doar cu cdk2 şi cdk3. Acţiunea celor două tipuri de complexe G1 se suprapune spre sfârşitul perioadei G1 având ca rezultat propulsarea celulei în perioada sintetică a ciclului celular. Ciclina A se asociază cu cdk2 la graniţa dintre perioadele G, şi S. Complexul favorizează derularea perioadei sintetice şi intrarea celulei în G2. În faza târzie a perioadei S se formează complexul ciclina A/cdk1 ce conduce celula de-a lungul perioadei G2 spre graniţa G/M. Ciclina B prin asociere cu cdk1 dă naştere unui complex cunoscut sub numele de factor de promovare a celulei în mitoză (MPF – Maturation Promotion Factor) ce operează în punctul de tranziţie G2/M. Studiile efectuate pe drojdii au furnizat informaţii interesante cu privire la modul în care complexul ciclină B/p34cdc2 acţionează în sensul propulsării celulei în perioada mitotică a ciclului celular (figura 101).

166

Fig. 101 - Ciclinele B se acumulează pe parcursul interfazei, formând prin asociere cu p34cdc2 complexul pre-MPF. Acesta este imediat fosforilat la nivelul Tyr 15 şi a Thr 160 din p34cdc2 de către tirozin/treonin kinaza (wee1), pierzându-şi activitatea kinazică. Sub acţiunea tirozin fosfatazei (cdc25) pre-MPF este defosforilat, transformându-se în MPF activ la începutul mitozei. în ultimele etape ale mitozei ciclinele B sunt rapid degradate de proteaze. Sinteza ciclinelor B este iniţiată în faza târzie a perioadei sintetice. Pe parcursul perioadei G2 ciclinele B se asociază cu p34cdc2 dând naştere unui complex pre-MPF, lipsit de activitate kinazică. Pierderea activităţii kinazice de către pre-MPF se datorează faptului că acest complex constituie unul dintre substratele unei tirozin/treonin kinaze. Enzima, produs al genei weel, fosforilează tirozina 15 şi treonina 160 din lanţul de aminoacizi ai proteinei p34cdc2. Fosforilarea tirozinei 15 este responsabilă de inhibarea funcţiei kinazice a proteinei p34cdc2. Defosforilarea tirozinei 15 are loc la sfârşitul perioadei G2 a ciclului celular, sub acţiunea unei tirozin fosfataze codificată de gena cdc25. Reacţia de defosforilare, transformă pre-MPF inactiv în MPF cu activitate protein kinazică (figura 102). MPF inhibă tirozin/treonin kinaza şi activează tirozin fosfataza, ceea ce conduce la acumularea masivă a MPF în citoplasmă şi, ulterior, declanşarea unei rapide şi ireversibile treceri a celulei în perioada mitotită a ciclului celular. Fig. 102 - Reacţiile de fosforilare şi defosforilare ale MPF Evenimentele ce marchează intrarea celulei în perioada mitotică sunt rezultatul fosforilării directe sau indirecte a unor proteine de către MPF. Prin fosforilarea laminelor nucleare, MPF declanşează dezorganizarea membranei nucleare. Fosforilarea histonei H1, proces ce iniţiază condensarea cromatinei, este cataliuzaqtă de proteinkinaza, enzimă activată prin fosforilare de către MPF. Se consideră că un mecanism indirect de fosforilare similar stă la baza asamblării fusului de diviziune. Dintre enzimele activate de MPF fac parte şi cele implicate în conjugarea ciclinelor cu molecula marker a proteolizei, numită ubiquitină.

167

complexele ciclina D/cdk determină trecerea proteinei Rb în stare hiperfosforilată. Scăderea concentraţiei ciclinelor în celulă este urmată de disocierea complexelor ciclină/cdk. 7. Aceste proteine au drept ţintă cdk şi complexele ciclină/cdk.1. inclusiv factori de transcripţie. La rândul lor.5. 168 . 7. Fig. ceea ce conduce la eliberarea factorului E2F şi sinteza ciclinei A. b) un semnal generat de senzor. blocându-l. ceea ce determină menţinerea celulei în G1. Un rol interesant în unele mecanisme feed-back îl au inhibitorii cdk (ICDK). întârzierea sau oprirea depăşirii punctului de control de către celulă. în absenţa acţiunii efectorilor pozitiv (cicline) scade capacitatea catalitică a cdk ceea ce determină ieşirea celulelor din mitoză şi intrarea lor într-un nou ciclu celular. Existenţa unor mecanisme de control feed-back face posibilă încetinirea sau blocarea temporară a motorului ciclului celular în momentul în care desincronizarea a fost detectată.Fosforilarea proteinei RB are loc la sfârşitul perioadei G1 sub acţiunea complexelor ciclină D/cdk. Tot prin mecanisme feed-back celula este capabilă să detecteze şi să remedieze erori ce apar în desfăşurarea proceselor de replicare şi segregare a materialului genetic. Reglarea ciclului celular prin mecanisme feed-back Apariţia unei desincronizări între durata necesară desfăşurării unui eveniment al ciclului celular şi funcţionarea motorului are ca rezultat iniţierea în celulă a unui nou eveniment înaintea încheierii celui precedent. Un exemplu în acest sens este oprirea intrării celulei în mitoză. Proteina este menţinută în stare hiperfosforilată până la ultimele etape ale mitozei.mecanism de reglare pozitivă a ciclului celular Proteina Rb transcrisă de antioncogena Rb1 este o proteină nucleară ce face parte dintrun mecanism de blocare a proliferării celulare sub acţiunea factorilor antimitotici (sau în absenţa factorilor mitotici).1. Aceasta conduce inevitabil la alterare genetică şi moarte celulară.4. în special cele active în perioada G. Sechestrarea factorului E2F blochează sinteza ciclinei A. În stare hipofosforilată proteina Rb leagă diferite proteine nucleare implicate în reglarea principalelor procese ce asigură creşterea celulară. Un mecanism de control feed-back reclamă existenţa a cel puţin trei elemente: a) un senzor ce monitorizează desfăşurarea evenimentului. ciclinele A menţin proteinele RB în stare hiperfosforilată pe parcursul perioadelor S.proteina Rb . c) un răspuns la nivelul motorului celular care permite progresia. G2 şi M ale ciclului celular (figura 103). prin blocarea activării MPF în condiţiile unei replicări incomplete a ADN (fig. 103 . Ciclinele D prezintă o secvenţă peptidică amino-terminală (Leu-X-Cys-X-Glu) prin care se pot lega la un domeniu specific (pocket region) al proteinei RB. Pe de altă parte. 104). când revine în starea hipofosforilată. ciclinele sunt rapid degradate. datorită activităţii kinazice. Unul dintre aceştia este factorul E2F responsabil de exprimarea genei ce codifică ciclina A. Interacţiunea cicline. Se sugerează că proteinele Rb funcţionează ca un comutator molecular în activarea în cascadă a ciclinelor prin reglarea sintezei ciclinei A.În urma ubiquitinării.

/cdk. Sunt prezentate schematic trei situaţii: a) sincronizarea perfectă a replicării ADN cu activarea MPF ce declanşează mitoza. Recent s-a descoperit un alt mecanism p53 dependent. d) activarea MPF este blocată prin mecanism feed-back ceea ce permite finalizarea procesului replicativ. oferind timp celulei să repare leziunea înainte de a intra în perioada S a ciclului celular. El face parte dintr-o cale de transmitere a semnalelor ce controlează oprirea ciclului celular în urma lezării ADN sub acţiunea radiaţiilor ionizante. proteina GADD./cdk ceea ce împiedică fosforilarea substratelor ţintă. b) replicarea ADN nu este complet încheiată în momentul activării MPF. este blocată activarea complexelor ciclină G.Prin legarea proteinei p21 de diferiţi cdk ce acţionează în G.Mecanismele feedback sincronizează funcţionarea motorului ciclului celular cu derularea evenimentelor celulare. prin care celula este oprită în perioada G1 ca urmare a lezării ADN prin radiaţii ionizante sau alţi factori de stres celular. c) Desincronizarea conduce la moarte celulară. 104 . prelugeşte perioada G. printr-un mecanism ce implică produsul genei AT. în acelaşi mod se consideră că ar acţiona şi proteina 16 (p 16). o boală autozomală recesivă ce se manifestă prin hipersensibilitate la radiaţii. 169 . cum ar fi proteinele Rb. se remarcă acumularea proteinelor p53 în celulă. ataxie cerebrală progresivă şi deficienţe în sistemul imun. Fig. Proteina p53 induce exprimarea unei gene ce codifică un inhibitor cdk. Acest mecanism feed-back este inactivat la persoanele ce suferă de ataxietelangiectazie.Un inhibitor cdk este produsul genei GADD45 (Specific Growth Arrest DNA Damage Inductible). Această cale mai implică cel puţin doi participanţi: proteina codificată de gena AT (ataxie-telangiectazie) şi proteina p53 (figura 110). Prin acţiunea inhibitoare asupra complexelor cicline G. numit proteina p21 (WAF1 -Activated Fragment-1 sau CIP1 –cdk Interacting Protein-1). Proteina p53 funcţionează ca un factor de transcripţie ce induce exprimarea genei GADD45. o incidenţă crescută a cancerelor. În urma detectării leziunii la nivel ADN.

7. s-a sugerat că raportul dintre volumul celular şi cantitatea totală de ADN sau numărul seturilor de gene din genomul celular ar constitui un factor critic.7. Menţinerea integrităţii structurale a organismului reclamă stabilirea unui permanent echilibru între proliferare şi moarte celulară (apoptoză). Diversitatea factorilor şi a mecanismelor prin care ei reglează trecerea din G1 în S a celulelor ce alcătuiesc organismele pluricelulare sugerează existenţa la sfârşitul perioadei G1 a mai multor puncte de restricţii. depăşirea perioadei G1 de către celulele organismelor pluricelulare este condiţionată de atingerea dimensiunii standard. Majoritatea acestor factori acţionează asupra unui punct de control (check point) echivalent punctului start la drojdii. Ciclul cromozomial şi creşterea celulară Similar organismelor unicelulare.1. Dat fiind relaţia de proporţionalitate dintre dimensiunea celulei şi gradul său de ploidie. proliferarea este un proces rapid a cărui desfăşurare este influenţată în principal de aportul nutriţional şi viteza metabolismului celular. în aceste condiţii. 7.GADD45.Mecanisme feed-back controlează replicarea ADN în celulele supuse acţiunii factorilor de stress (radiaţii ionizante). Diverşi factori ce reglează trecerea celulelor din G1 în S impun reguli stricte de depăşire a punctului de restricţie. GADD45 şi p21 funcţionează ca inhibitori ai cdk activi în perioada G1 a ciclului celular. ceea ce ilustrează semnificaţia sa deosebit de complexă la organismele pluricelulare. Există foarte puţini indici cu privire la modalitatea prin care celulele sunt capabile să-şi sesizeze propria dimensiune. Alţi factori responsabili de controlul proliferării celulare în organismele pluricelulare În organismele unicelulare. 170 . numit punct de restricţie (R). 105 .RB conduc la oprirea celulei în G1 ca urmare a detectării unei leziuni la nivel ADN. Încălcarea acestor reguli determină grave modificări la nivel celular ce conduc la malignizare sau moarte celulară.Fig.p21 . Acest echilibru este reglat prin numeroşi factori extra şi intracelulari. raportul dintre cantitatea totală a moleculei şi ADN celular rămâne constantă. celulele individuale ce le compun cooperează în scopul asigurării supravieţuirii acestora. Mecanismul prin care dimensiunea celulei influenţează ciclul cromozomial implică probabil sinteza unei molecule într-o manieră dependentă de cantitatea de ADN celular. În organismele pluricelulare.1. cât şi calea p53 . Atât calea AT p53 . Sunt prezentate două căi de control dependente de proteina p53.6.

Atât aparatul proteosintetic (ribozomi.1. ea evoluând paralel cu ciclul cromozomial. dar nu mai creşte. prin intermediul cărora semnalul este transmis de la nivelul membranei plasmatice la genele implicate în proliferarea celulară (procesul fiind denumit signal transduction). În transmiterea semnalului un rol important îl are fosforilarea proteinelor antrenate în acest proces. Formarea complexului receptor-factor de creştere determină autofosforilarea la nivelul tirozinei a regiunii intracitoplasmatice a receptorului. Celula îşi sintetizează proteinele de întreţinere.Scăderea concentraţiei moleculei sub o valoare prag. Implicarea factorilor de creştere în reglarea diviziunii celulare Factorii de creştere sunt proteine implicate specific în stimularea diviziunii celulare. proteine implicate în desfăşurarea sau reglarea acestui proces). El stimulează proliferarea fibroblaştilor în culturi celulare şi a celulelor din ţesuturile conjunctiv şi muscular neted. devenind oncogene. Afirmaţia se bazează pe rezultatele experienţelor pe culturi de celule în care s-a reuşit blocarea sintezei proteice fără ca ciclul cromozomial să fie afectat şi invers. 106). rearanjare cromozomială. Receptorul pentru factorul de creştere este o proteină cu activitate tirozinkinazică. determinată de creşterea volumului celular. Recunoaşterea şi legarea factorului de creştere de către receptorul specific declanşează evenimente ce se derulează în cascadă. se constată o intensificare a proteosintezei. rămânând viabilă. (de exemplu neuronii) creşterea celulară nu reclamă replicarea ADN. 7. gene care prin diferite mecanisme (mutaţie punctiformă. Alţi factori de creştere sunt prezentaţi în tabelul 3. pentru unele celule aflate în G0. cât şi viteza sintezei proteice sunt mult diminuate. Factorii de reglare operează la nivelul materialului genetic în sensul activării genelor ce transcriu proteinele implicate în iniţierea sintezei AND. în urma stimulării cu factori de creştere a celulelor aflate în G0. amplificare genetică sau inserţie mutatională) se pot activa. Majoritatea proteinelor antrenate în răspunsul celular la factorii de creştere sunt codificate de proto-oncogene. ARNm. care devine astfel capabila sa fosforileze alte proteine asociate membranei plasmatice. reprezintă o primă etapă a unui mecanism complex finalizat prin inducerea replicării ADN.8. Semnalul amplificat este preluat de proteine citoplasmatice cu activitate tirozin sau treonin/ serin-kinazica şi ulterior transmis în nucleu proteinelor ce joaca rolul de factori de reglare ai replicării şi ai transcripţiei AND. În aceste celule raportul dintre sinteza şi degradarea proteinelor este modificat în comparaţie cu cel al celulelor proliferative aflate în perioada G1. prezenţi la nivelul membranei plasmatice. De asemenea. Recunoaşterea lor de către celule prin intermediul receptorilor. fapt care determină depăşirea de către celulă a punctului de restricţie. Legătura dintre creşterea şi proliferarea celulară nu este rigidă. ar putea constitui un semnal de depăşire al punctului de restricţie şi de iniţiere a replicării ADN. capabile să inducă transformarea malignă a celulei (fig. Factorul de creştere derivat din trombocite (platelet-derivated growth factor-PDGF) este unul din cele aproximativ 30 de tipuri de factori de creştere identificaţi. 171 . În organismele pluricelulare numeroase celule se găsesc în stadiul G0. făcând astfel posibilă repararea leziunilor tisulare.

1. Induce creşterea axonală si viabilitatea neuronilor Factorul de creştere neuronal (NGF) simpatici şi senzori. Stimulează proliferarea: .celulelor precursoare ale macrofagelor şi Factori de stimulare a coloniilor granulocitelor.celulelor precursoare ale macrofagelor şi granulocitelor. Celulele transformate se comportă ca şi cum complexul receptor-factor de creştere ar avea un caracter permanent. Stimulează proliferarea celulelor precur-soare ale Eritropoietina eritrocitelor. Factori de stimulare a coloniilor de Stimulează proliferarea: macrofage (M-CSF) .Tabelul 3.macrofagelor. Activitatea proto-oncogenelor în oncogene şi implicit codificarea unor proteine ce prezintă modificări calitative sau/şi cantitative conduce la pierderea capacităţii celulei de a răspumde corect faţă de factorii de creştere. Factorul de creştere a fibroblastilor .neutrofilelor. factorii de creştere prezenţi în combinaţii variate reglează selectiv diviziunea diferitelor tipuri celulare. 172 . Factorii de creştere şi acţiunea lor asupra celulelor ţintă Factorii de creştere Factorul de creştere epidermal (EGF) Factori de creştere de tip insulinic (IGF-I.1.celulelor endoteliale. Interleukina 2 (IL2) Stimulează proliferarea limfocitelor T. (FGF) . 106 .8. 7. În organismele pluricelulare. granulocitare (G-CSF) . Stimulează proliferarea celulelor stem şi a Interleukina 3 (IL3) majoritatii celulelor precursoare ale multor celule diferenţiate.mioblaştilor. . Fig. Stimulează proliferarea adipocitelor si a celulelor di tesutul conjunctiv. Factorii de creştere constituie elemente prin care celulele sunt capabile să controleze proliferarea altor celule (mecanisme paracrine) ce se încadrează în clase diferite sau aparţin aceleiaşi clase (mecanisme autocrine). IGF-II) Acţiunea asupra celulelor ţinta Stimulează proliferarea mai multor tipuri celulare. Competiţia celulelor pentru factorii de creştere Deoarece celulele conţin numeroase tipuri de receptori.Principalele proteine codificate de protooncogene ce intervin în transmiterea semnalului de proliferare celulară de la factorul de creştere la ADN. Stimulează proliferarea: . proliferarea este dependentă de coexistenţa mai multor factori de creştere.fibroblaştilor. ramânând întro continuă stare proliferativă.

până la încheierea mitozei.107). care. celulele se ataşează de suportul solid. cooperarea intercelulară permite menţinerea unei anumite densitatea a populaţiei celulare.Celulele ce se găsesc în mitoză pierd legăturile ce le stabilizează în ţesut prin dezorganizarea contactelor focale Mecanismul ce stă la baza pierderii de către celule a adeziunii la substrat (in vitro) sau la matricea extracelulară (in vivo) este încă insuficient cunoscut. poate determina dezorganizarea contactelor focale pe doua căi. SRC. formarea adeziunilor intercelulare şi celula-matrice este o condiţie importantă în depăşirea punctului de restricţie . conform experimentelor cu anticorpi monoclinali.9. Fig. fenomen numit dependenţa de ancorare a diviziunii celulare. iar celulele ţintă conţin numeroşi receptori specifici (105 receptori pentru PDGF/ fibroblast).În acest ultim caz. În culturile statice. După intrarea în perioada sintetică. 107 . Ataşarea impune celulei adoptarea unei forme aplatizate şi favorizează proliferarea acesteia. Proteina cu activitate tirozin-kinazica. fapt ce sugerează existenta unui mecanism ce cuplează diviziunea celulara cu organizarea citoscheletului. La majoritatea celulelor organismelor vertebrate. S-a observat că într-o cultură de fibroblaşti formarea monostratului induce inhibarea proliferării celulare.1. devin sferice şi îşi pierd capacitatea proliferativă. la care proliferarea este inhibata. concentraţia factorilor de creştere scade şi în consecinţa diviziunea celulara este oprită. celulele ce alcătuiesc populaţia se găsesc într-o permanentă competiţie pentru factorii de creştere. 7. Densitatea populaţiei celulare în monostrat. supuse unei permanente agitari. Deoarece factorii de creştere sunt prezenţi în mediu în concentraţii foarte mici (PDGF=10-10 M). Influenţa adeziunii celulare asupra proliferării S-a constatat ca celulele cultivate în suspensie. 173 . depinde de concentraţia factorilor de creştere din mediu. prin intermediul contactelor focale ce reprezintă locuri de ancorare în matricea extracelulară a filamentelor de actină ce alcătuiesc citoscheletul. celulele pierd parţial legăturile ce le stabilizează în ţesut şi se rotunjesc (fig. În momentul în care densitatea populaţiei celulare depaşeşte o valoare prag. Afirmaţia se bazează pe rezultatele studiilor interprinse pe culturi celulare. Un rol important în acest mecanism îl joacă proteina SRC. fenomen cunoscut sub numele de inhibiţie de contact sau inhibarea diviziunii celulare dependenta de densitate. pare a fi concentrate la nivelul contactelor focale.

dezorganizarea structurii complexe de la nivelul contactelor focale nu este suficientă pentru inducerea replicării ea necesită şi prezenţa factorilor de creştere. ca rezultat al eliberării semnalului. ƒ dezasamblarea structurilor ce asigura adeziunile celulă-celulă şi celulă-matrice. A doua cale constă în secreţia masivă a unei enzime proteolitice. Până în prezent. Găsirea unui răspuns cu privire la modul prin care adeziunea celulară declanşează replicarea AND şi depăşirea punctului de restricţie se dovedeşte a fi foarte dificilă. Fig. Activarea SRC în celulele normale are loc în urma legării unui factor de creştere la receptorul specific (fig. plasmina. ƒ in vivo. ƒ într-o primă etapă.Prima cale implică fosforilarea receptorului pentru fibronectină. se consideră că pentru inducerea sintezei ADN. 108 . inclusiv fibronectina.108). În urma fosforilării scade afinitatea receptorului pentru fibronectină (element al matricei extracelulare). Acest fapt conduce la instabilizarea legăturilor dintre componentele contactului focal şi la eliberarea mănunchiurilor de filamente de actină. Printre proteinele degradate de plasmină se numără şi proteinele matricei extracelulare. ƒ activitatea acestei structuri prin factori de creştere şi eliberarea unui semnal ce dictează depăşirea punctului de restricţie. într-o celulă normală. o alta enzima proteolitică. căt şi pentru talină (proteină de adeziune intacelulară). stimularea unei celule prin factori de creştere determină pierderea de către celula a adeziunii la substrat.Schema modificărilor ce apar la nivelul contactelor focale ca urmare a recunoaşterii şi legării factorilor de creştere de către receptori specifici Există cel puţin patru argumente ce stau la baza acestei afirmaţii: ƒ acţiunea SRC are caracter tranzitoriu. ƒ SRC este implicată în stimularea proliferării celulare prin factori de creştere. Ea este capabilă să activeze prin clivarea plasminogenului. 174 . numită activator de plasminogen. sunt necesare trei evenimente: ƒ ancorarea celulei la matricea extracelulară prin asamblarea într-o structură complexă a proteinelor intercelulare specializate şi a elementelor de citoschelet.

au loc procese distributive. s-a impus rezolvarea problemei uşurării accesului fibrelor fusului de diviziune la cromozomi. Acesta este alcătuit din două componente: aparatul cromatic (cromozomii) şi aparatul acromatic (fusul de diviziune şi centrii celulari). constă în dezorganizarea şi reorganizarea membranei nucleare. Formarea aparatului mitotic este iniţiată de proteine activate prin fosforilare directă sau indirecta de catre MPF. 7. 7. Se apreciază că MPF nu reglează doar procesul distributiv al materialuilui genetic. fir) constituie tipul de diviziune caracteristic celulelor somatice ale tuturor organismelor eucariote.Ciclurile de ataşare şi detaşare celulară permit probabil rearanjarea punctelor de contact. perioada mitotică. care se comportă ca elemente pasive în procesul de segregare. Activarea protein kinazei H1 de către MPF face posibilă fosforilarea histonei H1 şi. respectiv separarea maselor de citoplasmă (diviziunea citoplasmei). se deosebesc două tipuri de diviziune celulară indirectă : Mitoza şi Meioza. La celulelor. Modificările la nivelul membranei nucleare se datorează fosforilării şi defosforilării laminelor. Mitoza (diviziunea mitotică) Mitoza (greaca: mithos=aţă. cu un numar mare de cromozomi. Acest eveniment fascinant al diviziunii mitotice constituie pentru celulă un mecanism eficient ce garantează repartizarea egală a materialului genetic în celulele fiice. Totalitatea acestor procese poarta numele de diviziune celulară indirectă. deoarece întâi are loc cariokineza. Între cei doi poli ai celulei se formeaza fusul de diviziune ce are rolul de a ancora şi separa cromatidele surori ale cromozomului mitotic. pentru generarea semnalului de proliferare. 175 . Este posibil ca acest mecanism de reglare să se realizeze prin fosforilarea proteinelor asociate filamentelor de actină şi miozină ce intră în structura inelului contractil. În funcţie de modul de desfăşurare.2. Apariţia celui de al doilea centru celular conferă celulei un caracter bipolar. pentru aceasta problemă. condensarea cromatinei şi apariţia cromozomilor. celulele fiice prezentand acelaşi număr de cromozomi ca şi celula parentală. În celulele maligne dezorganizarea structurilor implicate în adeziunea celulară este suficientă.1. Diviziunea celulară În cea de-a patra perioada a ciclului celular. Aceasta face posibilă ordonarea şi ulterior legarea în ţesut a celulelor rezultate în urma diviziunii celulare. în consecinţă. denumirea fiind sugerată de schimbările majore ce au la nivelul nucleului celular şi apoi citokineza. ci şi scindarea celulei parentale în celulele fiice (citokineza). proces reglat direct de MPF. 2. implicate în adeziunea celulă-celulă şi celulă-matrice. Soluţia pe care celula a găsit-o. Ea este denumită şi diviziune ecvaţională. de repartizare în celulele fiice ale constituenţilor celulari implicaţi în interfază. Desfasurarea diviziunii celulare indirecte necesită diferenţierea în spaţiul intracelular a aparatului mitotic. Segregarea cromozomilor ar fi însa imposibilă în absenţa aparatului acromatic a cărui organizare implică fosforilarea indirectă a proteinelor asociate cu microtubulii de către MPF. deoarece în cadrul ei celula îşi conservă garnitura cromozomilală initială.

Condensrea cromatinei continuă pe intreaga durată a profazei conducând la scurtarea şi ingrosarea progresivă a filamentelor cromatidice.109). Cea de-a şasea etapă a diviziunii mitotice. duble şi ataşate pe faţa exoplasmatică a membranei interne nucleare. structura bipolară alcatuită din microtubuli şi proteine asociate. dispusă între cei doi centrii celulari. Fig. 110). subţiri. Fusul de diviziune se asamblează iniţial în afara nucleului. Fiecare conţine câte o pereche de centrioli din care unul matur şi altul în crestere. parte componentă a citoscheletului interfazic şi apariţia fusului de diviziune. diferenţierea fusului de diviziune şi dezorganizarea nucleolului (fig. Profaza Profaza se caracterizeaza prin condensarea cromatinei şi individualizarea cromozomilor sub forma unor filamente.Fig. metafaza. La începutul profazei centrul celular se divide generând doi centri celulari. 109 . Cele doua cromatide ce alcatuiesc cromozomul sunt unite la nivelul centromerului şi sunt strâns răsucite una în jurul celeilalte (spiralizarea plactonemică).Schema generală a mitozei.Profaza 176 . Mitoza poate fi impărţită în cinci etape caracterizate prin modificări morfologice specifice : profaza. Concomitent se înregistrează dezorganizarea microtubulilor citoplasmatici. citokineza. A. Profaza se caracterizeză prin condensarea cromatinei cu individualizarea cromozomilor bicromatidici. 110 . anafaza şi telofaza. debutează în anafază şi se încheie la sfârşitul ciclului celular (fig. prometafaza. Centrii celulari rezultati se deplaseaza spre polii opuşi ai celulei. Filamentele sunt intim asociate formând un spirem (ghem).

carioplasma fuzionează cu hialoplasma formând mixoplasma. Fibrele kinetocorice aliniază cromozomii într-un singur plan perpendicular pe axa fusului de diviziune. 111. Fibrele fusoriale libere. 112). Tensiunea exercitată de fibrele kinetocorice asupra cromozomilor imprimă acestora o mişcare agitată. formand placa ecuatorială sau metafazică (fig. B. orientate spre planul ecuatorial al celulei. la sfârşitul profazei. numite kinetocori. de oscilare între cei doi poli celulari. localizat la jumatatea distanţei ce separă polii celulari. 111).Creşterea gradului de condensare a cromatinei este însoţită de o încetinire a proceselor de transcripţie şi sinteză proteică. Prometafaza Prometafaza debutează prin fragmentarea învelişului nuclear în vezicule delimitate de membrană ce staţionează pe întreaga duratî a mitozei în jurul fusului de diviziune. 177 . Dezasamblarea membranei nucleare permite accesul fibrelor fusului de diviziune în regiunea nucleară (fig. C. poartă numele de fibre polare. Cromatidele surori ale cromozomului metafazic sunt situate una alături de cealaltă. Scăderea gradată a procesului transcriptional determină iniţial micşorarea volumului nucleolar şi ulterior. Cei doi kinetocori ai unui cromozom sunt capturaţi de fibre ale fusului de diviziune ce pleacă din centrii celulari opuşi. Alinierea cromozomilor în planul ecuatorial al fusului de diviziune constituie principalul eveniment al metafazei. cromatina atingând condensarea maximă. Fig. Metafaza Metafaza este inertă din punct de vedere sintetic. Principalele proteine sintetizate în profaza timpurie şi mijlocie sunt cele implicate în condensarea cromatinei şi edificarea aparatului acromatic. Prometafază În prometafaza pe cele doua feţe opuse ale centromerului se maturează complexe proteice specilizate în ancorarea cromozomilor de către fibrele fusoriale. fragmentarea şi completa sa dezorganizare ca rezultat al blocării sintezei ARN. Acestea au fost numite fibre kinetocorice. În urma acestui eveniment.

ceea ce are drept consecinţă separarea cromatidelor surori ale cromozomilor în anafază. Acest eveniment ce constituie anafaza A este rezultatul depolimerizării fibrelor kinetocorice. Segregarea cromatidelor tuturor cromozomilor. 113). determina eliberarea Ca2+ din veziculele delimitate de membrane ce înconjoară fusul de diviziune şi prin aceasta. Anafaza Primul eveniment ce marchează începutul anafazei constă în segregarea kinetocorilor pereche din fiecare cromozom. La sfârşitul metafazei are loc desăvarşirea replicării centromerilor. La sfârşitul anafazei. inclusiv histonele H1 şi laminele. Se consideră că un semnal. Identificarea proteinelor antrenate în aceasta reacţie ar putea reprezenta o cale spre descoperirea semnalului ce iniţiază anafaza. 178 . creşterea experimentală a concentraţiei de Ca2+ în spaţiul intracelular conduce la iniţierea prematură a anafazei. au demonstrate ca declanşarea anafazei este însoţită de creşterea concentraţiei intercelulare a ionilor de calciu. ca rezultat a replicării centromerilor şi separarea ulterioara a cromatidelor surori. formând placa ecuatorială sau metafazică Mecanismul deplasării cromozomilor spre regiunea ecuatorială a celulei şi a alinierii lor în placa metafazică este prezentat pe larg în capitolul 4. inclusiv a celui detaşat se desfăşoară simultan.Fig. Cromozomii anafazici. Studiile întreprinse . încă necunoscut. pe cultura de celule. a fibrelor kinetocorice ce ancorează unul din cromozomii metafazici nu interferă cu separarea cromatidelor surori. Mecanismele prin care se realizează translocarea cromozomilor anafazici şi îndepărtarea polilor celulari sunt prezentate în capitolul ce prezintă elementele componente al citoscheletului (capitolul 4). eveniment ce marchează anafaza B. D. ci de un semnal specific. Mai mult. 112 . În anafaza.Metafaza: alinierea cromozomilor în planul ecuatorial al fusului de diviziune. însoţit de creşterea lor în lungime. Concomitent are loc îndepărtarea polilor celulari prin alungirea fibrelor polare. monocromatici suferă de regulă un proces de decondesare. cromatidele surori ale cromozomilor sunt deplasate spre poli opuşi ai celulei cu viteza de aproximativ 1mm/min. cromozomii se afla grupaţi la cei doi poli ai celulei şi fibrele kinetocorice dispar (fig. Observaţia sugerează ca iniţierea anafazei nu este dictate de aparatul acromatic. prin micromanipulare. La trecerea celulei din metafază la anafază are loc defosforilarea unui număr mare de proteine. S-a constatat că detaşarea. intrarea celulei în anafază.

conduc la reapariţia nucleolului. iar în citoplasmă procesul de proteosinteză se intensifică. fuzionează delimitând doua spaţii nucleare situate la polii celulari opuşi. cele cinci perechi de organizatori nucleolari controlează formarea în telofază a cinci nucleoli.Fig. Pe întreaga durata a telofazei are loc dezorganizarea aparatului acromatic. Telofaza În telofază se desfăşoară procese inverse celor ce au loc în profaza. a) depolimerizarea fibrelor kinetocorice. cromatina îşi recapătă aspectul caracteristic interfazei (fig. Dacă la începutul telofazei ei au aspectul unor fibre fine. ce înconjoară fusul de diviziune. La om. 114 . La nivel nuclear.Telofaza Veziculele delimitate de membrană.Anafaza. reîncepe sinteza ARN. Decondensarea cromozomilor continuă. 114). De regula aceştia fuzionează astfel încât în majoritatea celulelor interfazice nucleul celular prezintă un singur nucleol. E. din organizatorii nucleolari şi formarea subunităţilor ribonucleoproteice (RNP) prin asocierea ARNr cu proteinele specifice importate în nucleul din citoplasma. Fig. Transcripţia genelor ARNr. spre sfârşitul ei. la fiecare pol celular. alungite şi încolăcite unele în jurul altora formând câte un spirem. b) polimerizarea fibrelor polare. iar laminele defosforilate se reasociază formând lamina nucleară. Un rol important în reorganizarea membranei nucleare îl are lamina B ce rămâne permanent ataşata de membranele veziculelor rezultate prin fragmentarea învelişului nuclear în prometafază. Porii nucleari se reasamblează. 179 . 113 .

transformându-se intr-o celula multinucleară. El este situate in planul plăcii ecuatoriale. perpendicular pe fusul de diviziune. totuşi procesul mitotic nu condiţionează strict declanşarea diviziunii citoplasmatice. Această structura alcătuită din filamente de actină şi miozină. pe suprafaţa membranei plasmatice. Contracţia inelului prin mecanismul actină . Mitocondriile cresc şi se divid prin fisiune. La celulele animale diviziunea citoplasmatica se realizează prin clivarea. Deci. deoarece.În cazul celulelor animale citokineza se realizează prin clivare. organitele celulare nu se pot duplica în absenţa unei copii preexistente. Deci. Locul de clivare devine vizibil încă din anafaza. în care s-a realizat deplasarea prin micromanipulare. ataşate de fosa citoplasmatică a plasmalemei prin proteine încă necaracterizate. Separarea completa a celulelor fiice. in vitro. ce conţine fibre polare ale fusului de diviziune parţial dezorganizate înconjurate de hialoplasma (fig. Deşi s-a constatat ca citokineza nu are loc niciodată înaintea diviziunii nucleare. 115 . au avut drept rezultat invariabil schimbarea situsului de clivare. moment ce marchează desavarşirea citokinezei. Citokineza Citokineza defineşte fenomenul de diviziune a citoplasmei. 115).miozină concomitent cu depolimerizarea filamentelor de actină ce-l alcătuiesc. Studiul primei etape a dezvoltării embrionale la Drosophila melanogaster ne oferă un exemplu concret. se asamblează la începutul anafazei. în timp ce ribozomii se multiplică prin asamblarea elementelor constituente (ARNr şi proteine ribozomale). mecanismul citokinezei devine independent de structurile microtubulare.F. cu excepţia nucleului. după momentul iniţierii clivării. Experimentele efectuate. Oul fecundat al Drosophilei melanogaster parcurge 13 cicluri de diviziuni nucleare. 180 . prin tratare cu colchicina. sub forma unei adâncituri (sunt). Duplicarea organitelor celulare se realizează prin mecanisme diferite. La sfârşitul perioadei mitotice cele doua celule fiice sunt încă unite printr-o regiune centrală (“midbody”). Fig. după apariţia şanţului de clivare nu duce la blocarea diviziunii citoplasmice. are loc la începutul următoarei interfaze. s-a constatat ca distrugerea fusului mitotic. Rolul principal revine acum inelului contractil. Aceasta demonstrează ca planul de scindare al citoplasmei este determinat spaţial de poziţia fusului de diviziune. aparatul Golgi şi reticulul endoplasmatic se fragmentează în vezicule din care se vor fi construite noile organite celulare. Prima diviziune citoplasmatica are loc după cel de-al 13-lea ciclu mitotic si conduce la formarea aproximativ a 600 de celule uninucleate. în celula parentală are loc duplicarea constituenţilor celulari înaintea declanşării citokinezei. Recent. Fiecare celulă fiică moşteneşte în urma citokinezei un set de componente celulare. a fusului mitotic la începutul anafazei. conduc la continua micşorare a diametrului sau/şi implicit la adâncirea şanţului de clivare. este posibil ca o anume orientare a fusului de diviziune să dicteze caracterul simetric sau asimetric al diviziuni celulare.

numită Interfaza meiotică. Fig. Meioza se caracterizează prin înjumătăţirea numărului de cromozomi în celulele progene.Schema generală a meiozei Cele doua diviziuni ce au loc în cadrul meiozei sunt precedate de o interfaza premeitica (identică cu interfaza mitotică) şi separate de o interfază scurtă. membrana plamatică a celulei ce se divide este insuficientă pentru celulele rezultate în urma citokinezei.2. fiecare cromozom fiind alcătuit din doua cromatide surori. 181 . Cromozomii bicromatidici omologi (matern şi patern) se grupează în perechi formând o structura tetracromatidică. S-a constatat că suprafaţa totală a celulelor fiice este mai mare decât cea a celulei parentale.2. din care lipseşte perioada sintetica (replicarea AND). astfel încât la începutul acestei diviziuni AND este complet replicat (celulele sunt tetraploide). numită cromozom bivalent sau tetradă. În nucleul lor se găsesc câte un cromozom din fiecare pereche de omologi (autozomii) şi un singur cromozom ce determină sexul (heterozomii. Gameţii ( spermatozoidul şi ovulul) rezultaţi prin diviziunea celulelor germinale sunt celule haploide (n). inclusiv cele germinale. În celulele diploide (2n). X şi Y). anterior declanşării diviziunii celulare.116).Ţinând cont de numărul de copii ale organitelor celulare dintr-o celulă eucariotă şi de duplicarea lor înaintea diviziunii. 7. fiecare pereche fiind alcătuită dintr-un cromozom matern şi altul patern. Meioza (diviziunea meiotică) Meioza (geacă ”meiosis = micşorare”) este întâlnită în procesul de gametogeneză (formarea gameţilor) şi reprezintă un tip de diviziune nucleară caracteristic celulelor germinale. Meioza I are loc imediat după încheierea interfazei premeiotice. Ea asigură înjumătăţirea numărului de cromozomi în celulele progene. Meioza reprezintă un mecanism complex ce implică desfăşurarea succesivă a două diviziuni indirecte – meioza I şi meioza II (fig. 116 . Deci. nucleul conţine cu excepţia cromozomilor de sex (X şi Y). Prima diviziune a meiozei (meioza I) Meioza este o diviziune reducţională complet diferită de mitoza somatică. se apreciază că celula nu dispune de un mecanism specializat de distribuire a organitelor celulare. perechi de cromozomi omologi. Aceasta impune intensificarea biosintezei membranei plasmatice în celula parentalăp . A.

Din punctele de iniţiere conjugarea se extinde progresiv. ceea ce oferă cromozomului un aspect monocromatidic Cromozomi sunt ataşaţi cu ambele capete de învelişul nuclear prin intermediul unor structuri specializate numite placi de ataşare. numit sinapsis (sinapsarea sau formarea sinapsei).Cromatidele nesurori ale bivalentului sunt antrenate în procese de remaniere cromozomială. Iniţierea conjugării implică interacţii între perechile de baze complementare ale ADN din regiuni cromozomiale specifice numite zigomere sau sinapsomere.Stadiul de leptoten Zigotenul reprezintă stadiul în care are loc conjugarea cromozomilor omologi. a) Profaza meiozei (profaza I) Profaza I se deosebeşte de profaza mitotică atât sub aspectul duratei (90-95% din desfăşurarea meiozei I). materialul genetic al celulei parentale (2N) a fost replicat. astfel încat fiecare genă dintr-un cromozom este juxtapusă genei omologe din cromozomul pereche. numita axă. zigoten. Înţelegerea proceselor ce se desfăşoară pe parcursul meiozei. Fiecare cromozom este alcătuit din două cromatide surori unite la nivelul centromerului şi intim asociate. Fig. pe faţa opusă axei (fig. Conjugarea este anticipată de apropierea omologilor. Profaza I este împărţită în cinci stadii succesive: leptoten. Fiecare progen conţine câte două copii ale unui singur cromozom din fiecare pereche de omologi ai celulei parentale (jumătate din numărul cromozomilor celulei mamă). Cromatina ce formează cromatidele surori proeminează sub forma unor bucle. metafaza. 182 . se disting cinci etape: profaza. La sfârşitul leptotenului.117). Deoarece in perioada S a interfazei. 117 . Separarea ulterioară a cromozomilor omologi . în lungul fiecărui cromozom se diferenţiază o lama proteică (400-700 A grosime). Meioza I se încheie cu procesul de citokineză. prometafaza. numiţi şi tetrade. diploten şi diachineza. Conjugarea cromozomilor omologi poate fi iniţiată de la o extremitate a acestora (proterminală) ori din una sau mai multe regiuni centrale (procentrică). anafaza şi telofaza. Laptotenul se caracterizează prin condensarea cromatinei şi individualizarea cromozomilor sub forma unor filamente lungi şi subţiri. Prin stabilirea interacţiilor se realizează alinierea cromozomilor. cât şi sub cel al evenimentelor ce au loc în această etapă. denumire sugerată de numărul cromatidelor ce-i alcătuiesc. Un rol în aceste evenimente il joaca şi învelişul nuclear de vreme ce. Recunoaşterea şi gruparea cromozomilor omologi în pereche se realizează prin intermediul proteinelor ce intră în alcătuirea axelor. pachiten. cuprinzând integral cromozomii prealiniaţi într-o manieră zipper like (zipper = fermoar). translocarea acestora spre polii celulari opuşi şi citokineza conduc la formarea a două celule progene. cromozomi continuă să fie ataşaţi de membrana nucleară. în zigoten. face necesară prezentarea etapizată a acestui tip de diviziune Similar mitozei somatice. în cadrul meiozei I. pe o singura parte. Rezultatul desăvârşirii conjugării îl constituie formarea bivalenţilor. Copiile sunt asociate formând un cromozom bicromatidic . celula în leptoten este tetraploidă (4N).

pe parcursul meiozei I a celulelor germinale din indivizii masculi. 118.119). Aceştia se formează în interiorul complexului sinaptonemal ocupând aproape integral spaţiul ce separa cele două axe ale cromozomilor omologi (fig. în pachiten cromozomii sunt mai groşi şi mai scurţi. fenomenul ce implica ruperea în aceiaşi poziţie a extremităţii unei cromatide materne şi a alteia paterne şi reunirea încrucişată a fragmentelor. Fiecare cromozom va conţine gene aparţinând ambilor genitori. se consideră că nodulii de recombinare conţin întregul echipament enzimatic necesar clivării cromatidelor surori. O lama proteică (200 Å grosime) este interpusă între cele doua axe. Elementele laterale sunt conectate la elementul central prin intermediul unor benzi protice transversale dispuse în mod similar treptelor unei scări (fig. Fig. constituind elementele laterale ale unei structuri trilamelare. Ca rezultat al condensării progresive a cromatinei pe parcursul primelor doua stadii ale profazei I . 119.În momentul conjugării. complexul sinaptonemal joacă un rol important în stabilizarea cromozomilor omologi în tetradă. cele doua axe ale cromozomilor omologi sunt dispuse faţă în faţă. Principalul eveniment ce caracterizează pachitenul este crossing-over-ul. este posibilă datorită existenţei la cei doi cromozomi de sex a unei regiuni terminale omologe. Conjugarea cromozomilor X si Y. 118). Pachitenul începe în momentul desăvârşirii conjugării cromozomilor. Structura ce oferă premisele desfaşurării crossing-over-ului este reprezentată de complexul sinaptonemal. numite noduli de recombinare. Prin schimbul reciproc de fragmente între cromatidele surori se realizează recombinarea genetică. Stadiul de pachiten Deşi implicarea complexelor multiproteice în recombinarea genetică nu a fost demonstrată experimental. la o distanta de 100 nm. Fig. Ea reprezintă cea de-a treia componentă a complexului sinaptonemal şi poarta numele de element central. noua combinaţie de gene creată transmiţându-se generaţiilor următoare. Procesul de recombinare este catalizat de către complexe multiproteice a căror diametru este de 90 nm. În meioza I. numită complex sinaptinemal. Stadiul de zigoten. 183 . reunirii încrucişate a fragmentelor cromatidice.

Fig. Ambele evenimente sunt caracteristice stadiului diploten .121). asigurând segregarea corectă a materialului genetic. corelarea existentă între numărul nodulilor şi cel al chiasmelor evidenţiate în stadiul următor al profazei I. Ea a fost denumită distanţă de interferenţă . în acest stadiu cromatina suferă un proces de uşoară decondensare ceea ce face ca sinteza ARN să fie reiniţiată. La nivelul fiecărei chiasme. În acest caz.Stadiul de diploten Deşi teoretic. Cromozomi omologi rămân ataşaţi la nivelul situsurilor la care are loc crossing-over-ului. 184 . diplotenul poate dura luni sau ani. Deoarece în ocite. fenomen cunoscut sub numele nondisjunctie. numărul nodulilor de recombinare este mai mic. distribuţia spaţială similară a nodulilor de recombinare şi a evenimentelor de crossingover de-a lungul complexului sinaptonemal. c. în timp ce alţii vor conţine o copie cromozomială în plus. Diachineza debutează cu condensarea cromatinei şi blocarea transcripţiei. b. Aceste observaţii atestă rolul important pe care nodulii îl joacă în procesul de recombinare. Concomitent cu desinapsarea omologilor are loc separarea cromatidelor surori ce rămân unite prin centromer. aceste regiuni nu sunt antrenate în evenimente de crossing-over împiedică desfăşurarea unui eveniment similar în zonele imediat învecinate. Aceste puncte de ataşare poartă numele de chiasme. În fiecare bivalent cromozomii omologi sunt uniţi la nivelul chiasmelor iar cromatidele surorii ale fiecărui cromozom din pereche sunt legate prin intermediul centromerului (fig. numărul şi localizarea acestora în complexul sinaptonemal determinând frecvenţa şi situsul crossing-over-ului. Diplotenul reprezintă stadiul profazei I în care are loc separarea parţială a omologilor prin dezorganizarea complexului sinaptonemal. iar localizarea lor diferă de cea întâlnită la indivizii normali. 120). chiasma joacă un rol similar celui pe care îl are centromerul în mitoză. ceea ce impune o anumită distanţă între chiasmele situate pe acelaşi braţ cromozomial . Absenţa chiasmei într-un bivalent face imposibilă segregarea cromozomilor omologi în următoarele etape ale meiozei. o parte din gameţii rezultaţi vor avea un cromozom în minus. chiasmele devin vizibile numai după desinapsarea cromozomilor ce alcătuiesc bivalentul. Bivalenţii pot prezenta una sau mai multe chiasme. la mutanţi de Drosophila melanogaster ce prezintă o diminuare şi o distribuţie anormală a crossing-over-ului. doua din cele patru cromatide ale bivalentului se intersectează în spaţial delimitat de cromatidele omologe (fig.Participarea acestor noduli în desfăşurarea crossing-over-ului a fost sugerată de următoarele constatări: a. Cromozomii se detaşează de membrana nucleară. Deci. numărul lor ilustrând frecventa crossing-over-ului. Deşi încep să se formeze în pachiten. În meioza I. chiasmele se pot forma în orice zonă cromozomială s-a constatat absenţă lor în regiunile heterocromatidice. 120 .

Migrarea la polii celulari ai cromozomilor bicromatidici conduce la reducerea la jumătate a numărului de cromozomi prezenţi iniţial în celuia parentală. Relaxarea cromatinei face posibilă reînceperea sintezei ARN. 185 . În prometafaza l. Concomitent începe procesul de decondensare a cromozomilor. Decondensarea cromozomilor continua fără ca aceştia să-şi piardă individualitatea. fenomen numit terminalizare. Cei doi centromeri ai bivalentului sunt orientaţi spre polii celulari opuşi (fig. 122). 122 .Anafaza meiozei I. Sfârşitul acestei etape este marcat de dispariţia chiasmelor şi eliberarea cromozomilor din bivalent.Metafaza meiozei I. La nivelul centromerelor se diferenţiază kinetocorii. 123 . se dezorganizează învelişul nuclear şi se formează aparatul acromatic. Kinetocorii de pe centromerul cromozomului omolog sunt legaţi prin fibre kinetocorice de polul opus. Fig. d) Anafaza meiozei I (anafaza I) Odată eliberaţi din tetrada. b) Prometafaza meioze I (prometafaza I). Fig. Chiasmele localizate terminal menţin cromozomii omologi uniţi pe toată durata metafazei I. Kinetocorii de pe cromatidele surori sunt orientaţi spre acelaşi pol al fusului de diviziune. cromozomii din anafaza mitozei I sunt bicromatidici (fig.Diachineza În timpul diachinezei chiasmele încep să se deplaseze spre extremităţile cromozomilor. Cromozomii omologi sunt completseparaţi şi migrează spre polii opuşi ai celulei e) Telofaza meiozei I (telofaza I) În telofaza I.cromozomii omologi sunt translocaţi spre polii celulari opuşi printr-un mecanism similar celui întâlnit în mitoză (depolimerizarea fibrelor kinetocorice şi alungirea fibrelor polare). Cei doi kinetocori ce se dezvoltă pe centromerul unui cromozom bivalent sunt ancoraţi de fibre kinetocorice ce pornesc de la acelaşi pol al fusului de diviziune. c) Metafaza meiozei I (metafaza I) Mobilizarea bivalenţilor spre regiunea ecuatorială a celulei şi alinierea lor în placa metafazică. constituie evenimentele caracteristice metafazei I. cromozomii se găsesc la polii fusului de diviziune. 121 . Bivalenţii sunt aliniaţi în placa ecuatorială.Fig. Spre deosebire de cromozomii monocromatidici din anafază mitotica. 123).

Fig. 124 . ecvaţională. copiile nu sunt perfect identice (fig. Interfaza meiotică nu este întâlnită la toate celulele eucariote. Fibrele kinetocorice ce radiază din polii opuşi ai fusului de diviziune ancorează kinetocorii de pe cele două cromatide ce alcătuiesc fiecare cromozom. 124). o diviziune mitotică. care se poziţionează pe feţele opuse ale centromerului fiecărui cromozom bicromatidic.Celulele fiice rezultate în urma primei diviziuni meiotice Interfaza meiotică Mai scurtă decât interfaza mitotică. interfaza meiotică. Pe parcursul interfazei meiotice se desfăşoară procese transcripţionale şi de proteosinteză ce pregătesc intrarea celulei în meioza II. iniţierea celei de-a doua diviziuni meiotice. A doua diviziune a meiozei (meioza II) În celulele progene. etapă mult mai scurtă decât profaza mitotică. În telofaza II decondensarea cromozomilor continuă astfel încât la sfârşitul meiozei II cromatina îşi recapătă aspectul caracteristic interfazei. Fiecare progen conţine o jumătate din garnitură cromozomială a celulei parentale. de fapt. Meioza II debutează cu profaza II. În anafaza II cromatidele surori sunt translocate spre polii opuşi ai celulei. ce separă cele două diviziuni meiotice se caracterizează prin absenţa perioadei S. ce asigură repartizarea egală a copiilor cromozomiale din cele două celule fiice şi în consecinţă formarea gameţilor. Se apreciază că acum are loc reorganizarea kinetocorilor. Separarea celor patru celule haploide (gameţii) este consecinţa directă a procesului de diviziune citoplasmatică. deşi cantitatea de ADN corespunde unei celule diploide. Datorită recombinării genetice ce are loc în profaza I. B.Membrana nucleară se reorganizează delimitând cei doi nuclei rezultaţi în urma diviziunii. Meioza I se încheie cu procesul de citokineza prin care sunt separate celulele progene. Aceasta se explică prin existenţa în fiecare celulă a două copii ale aceluiaşi cromozom. Reorientarea face posibilă segregarea materialului genetic pe parcursul celei de-a doua diviziuni meiotice. Etapele şi evenimentele celulare caractzeristice acestora sunt similare celor întâlnite în cadrul diviziunii mitotice. cromatidele surori sunt deplasate şi aliniate în planul ecuatorial al celulei formând în metafaza II placa metafazică. fiind posibilă derularea succesivă a celor două diviziuni. în care are loc formarea unui nou aparat acromatic şi dezorganizarea înveluşului nuclear. La polii opuşi ai celulelor se reorganizează învelişul nuclear. are loc simultan. 186 . Meioza II reprezintă. rezultate în urma meiozei I.Cromozomii monocromatidici anafazici se alungesc ca rezultat al relaxării cromatinei.Unite prin intermediul centromerului. Sfârşitul acestei etape este marcat de replicarea centromerului şi separarea celor două cromatide.

Timp îndelungat au fost studiate doar mecanismele de proliferare şi diferenţiere celulară. rezultând fragmentarea AND-ului celular. care. Deoarece aceşti corpusculi sunt rapid generaţi de celulele vecine şi fagocite. celulele individuale. formându-se corpi apoptotici care conţin resturi nucleare.Capitolul 8 APOPTOZA Apoptoza reprezintă procesul fiziologic de moarte celulara programată (PCD = Programmed Cellular Death). cromatina nucleară se condensează. Mecanismele de producere a apoptozei În cursul procesului de apoptoză se elimină un număr mare de celule fără a se produce vreun proces inflamator. celulele se retractă din cauza pierderii de conţinut citoplasmic şi a condensării proteinei citoplasmatice. organismele eliminând celulele nedorite. Celulele apoptotice sunt caracterizate printr-un proces de adunare şi redistribuire a cromatinei sub forma unei mase compacte care rămâne pe membrana nucleară. cele mai multe organite citoplasmatice rămân însă intacte. prin acest mecanism. Astăzi se cunoaşte că procesul de apoptoză are rol în medierea proceselor de dezvoltare şi a efectelor nutriţionale care prelungesc cursul vieţii. în faza finală. Drept sinonime pentru apoptoza celulară se mai folosesc denumirile: moarte celulară normală sau moarte celulară fiziologică. în faza a doua. Organitele celulare şi in special mitocondriile sunt bine conservate. se găureşte şi se fragmentează. pot deveni responsabile de dezvoltare de autoanticorpi (în lupusul eritematos sintetic). enclavate în ţesutul normal. 8. acolo unde viteza apoptozei este foarte mare. Arhitectura tisulară şi celulară adiacentă este păstrată intactă şi ea umple spaţiile lăsate goale de celula apoptotică. Procesul apoptotic are loc în toate organismele vii. Procesul de apoptoză se desfăşoară în trei timpi : în faza iniţială. în condiţii anormale. - - 187 . celulele vecine şi macrofagele fagocitează aceste fragmente până la completa lor degradare (fig. urmată de zbârcirea suprafeţei celulare. în vreme ce procesul de moarte celulară a fost considerat doar un proces haotic. Asemenea corpi apoptotici pot transporta antigene (incluzând fragmente de AND intacte). nocive sau anormale din punct de vedere funcţional.1. nu este reversibilă şi nici nocivă pentru organism. pierd legăturile cu celulele vecine. Apoptoza nu rezultă din leziune. ei sunt observaţi foarte rar chiar şi în timus. Descreşterea anormală a apoptozei poate avea rol în declanşarea bolilor autoimune şi a evenimentelor legate de senescenţă (tumorigeneză). atât în viaţa embrionară cât şi în cea adultă. ci chiar necesară pentru menţinerea normalităţii. membrana celulară se zbârceşte.125). iar celula apoptotică se rupe în corpusculi apoptotici.

8. în final. iar resturile sunt digerate de către fagocitele infiltrate. În cursul apoptozei. organitele şi nucleul se dezintegrează. În final. creşterea volumului mitocondriilor. implicat în fagocitoza celulelor apoptotice. 8. membrane plasmatică. Corpusculii apoptotici conţin un schelet de proteine crosslinkate (anvelope) rezistente la proteoliză. 2. flocularea cromatinei nucleare. Formarea inozitolfosfaţilor care determină creşterea concentraţiei intracelulare de ioni Ca²+ este un eveniment precoce al apoptozei.Fig. printr-un dezechilibru osmotic. deoarece poate semnifica un semnal de activare a fagocitării celulelor apoptotice. în mod normal. urmat de exportul rapid şi selective de ioni şi apă. Frecvenţa procesului de apoptoză După cum s-a arătat mai sus. proteazele dependente de prezenţa ionilor Ca²+ pot participa la degradarea citoscheletului corpusculilor apoptotici. Cromatina devine tot mai compactă şi nu apare distribuită pe membrana nucleară. tromboplastina etc. ceea ce are drept consecinţă condensarea citoplasmei şi cromatinei şi formarea fragmentelor ADN. În contrast cu apoptoza. în cazul necrozei procesul apare simultan într-un grup de celule în care s-a produs în prealabil o leziune în arhitectura celulară. un exemplu este cel al celulelor neuronale care se produc în exces în 188 . în care procesul se produce într-o celulă solitară.3. umflarea celulelor urmată de ruperea. Există de obicei un număr de celule normale care sunt depăşite la un moment dat dintr-o multitudine de cauze. a respectivelor celule. apoptoza este un mecanism eficient de eliminare atât a anumitor celule în cursul dezvoltării embrionare cât şi a celulelor adulte normale. care induc un răspuns de tip inflamator. îşi are sediul pe partea internă a acesteia. În cursul necrozei se produce dilatarea reticulului endoplasmatic. Necroza Spre deosebire de apoptoză (moarte celulară normală). în comparaţie cu setul de semnale implicat în fagocitarea celulelor necrotice sau a agenţilor infecţioşi.) de pe celulele umflate. 125 . Apoptoza ca proces active necesită atât energie în formă de ATP.Aspecte de apoptoză Procesul de apoptoză este foarte rapid şi durează în total câteva ore. este un proces pasiv care apare sub acţiunea unor noxe celulare. necroza reprezintă o moarte celulară patologică. aspect ce trebuie luat în considerare. apar leziuni ultrastructurale ale organitelor celulare. cât şi sinteză de ARN şi de proteine. pe partea extremă a membranei plasmatice apare fosfatidilserina. Aceste aspecte se explică prin existenţa unui set diferit de semnale. care. Recunoaşterea celulelor apoptotice şi fagocitarea lor de către celulele fagocite par a fi mediate de către numeroşi receptori (vitronectina. ingestia fagocitară de celule necrozate (în contrast cu cele apoptotice) este acompaniată de eliberarea de mediatori chimici ai inflamaţiei. având drept consecinţă leziuni grave.

un număr de gene letale au fost evidenţiate la mamifere.4. Gene implicate în procesul apoptotic 8. 189 . apoptozei. Este posibil ca şi oncogenele nucleare cu activitate reglatorie transcripţională să aibă un rol în apoptoză. Astfel.4. La organismul Caenorhabditis elegans. După cum am arătat deja. Astfel. Genele supravieţuirii (gene antiapoptotice) Genele supravieţuirii sunt acelea care. Gene letale În prezent există evidenţa unei gene sau a unui set de gene care codifică proteine cu efect letal (de sinucidere) asupra celulei purtătoare. este implicate şi în inducerea apoptozei. apoptoza rezultând în cazul supra expresiei genelor c-myc sau p53. în condiţii de supraexprimare.gena Ced-9 s-a dovedit că acţionează drept antogonist al morţii apoptotice celulare. în mod normal. care determină moartea precoce a respectivului organism. 50% din diferitele tipuri de neuroni mor curând după ce au format conexiunile sinaptice cu celulele ţintă.1. astfel. În cazul genei supresoare de tumori p53. în cursul reînnoirii normale a ţesuturilor. în acest caz. Apoptoza are loc şi în celulele adulte somatice.2. nu mai survine moartea celulară. În mod similar. care. la mamifere. celula intră sub influenţa genelor Ced-3 şi Ced-4. Aceste gene s-au dovedit esenţiale pentru moartea celulară apoptică. 8. în cazul în care una din aceste gene este inactiva prin mutaţie. În cazul contrar. acest proces este mediat de o cascadă de transducţii de semnale la suprafaţa celulară. Enzimele de membrană şi citosolice (în particular proteinaza C) implicate în fosforilarea proteinelor au rol central în transducerea semnalelor apoptotice. multe celule care ar trăi în mod normal mai departe sunt supuse. Aceste celule neuronale au avut probabil o funcţie în timpul evoluţiei şi dezvoltării. se pare că o creştere a concentraţiei ionilor de Ca2+ în citosul ar avea un rol important în funcţia de reglare a apoptozei. Pornirea apoptozei necesită inducerea unui program genetic nou. Astăzi se ştiu încă puţine lucruri despre căile acestei morţi celulare. Se pare că acest calciu citosolic ar declanşa şi evenimentele secundare legate de activarea transglutaminazelor. la organismul nevertebrat Caenorhabditis elegans (nematode) au fost descrise două asemenea gene: Ced 3 şi Ced 4 cu acţiune letală. Apoptoza trebuie privită ca un proces fiziologic normal faţă de influenţele mediului extern. s-a observat cum creşterea nivelului proteinei p53 este asociată cu moartea celulară apoptotică.sistemul nervos al vertebratelor. Activarea anormală a acestei gene Ced-9 face ca moartea celulară să nu se mai producă. sa arătat că gena protooncogenă c-myc. determină inhibarea apoptozei. Dacă aceste gene sunt inactivate printr-o mutaţie. Aceste două gene acţionează autonom pentru a produce moartea celulară programată.4. care în mod normal stimulează diviziunea celulară. când se inactivează gena Ced-9. S-a demonstrat că multe gene letale sunt activate în cursul apoptozei. în acest caz. probabil printr-un program genetic îndreptat împotriva unei stări antiproliferative. acţionează ca o frână asupra mecanismului de moarte celulară normală. totuşi acest mecanism rămâne încă neclarificat. s-a descris o proteină din constituţia membranei interne a mitocondriilor bcl-2. sau prin coexpresia simultană a mai multor gene. Astăzi este demonstrat faptul că asemenea gene de supravieţuire există şi în celulele mamiferelor. 8. dar au încetat la un moment dat să mai fie necesare (au atins momentul de regresie a metamorfozei lor).

atât supravieţuirea cât şi proliferarea sunt simulate prin semnale provenite de la alte celule. S-a dovedit că niveluri înalte ale proteinei corespunzătoare genei bcl-2 de la mamifere inhibă apoptoza. ca radiaţiile ionizate. greutatea mai mare la naştere şi alăptare la sân micşorează riscul dezvoltării bolilor cardiace la vârstă adultă. dar nu şi atunci când această dietă a fost administrată după naştere şi înţărcare. retinoizii (molecule lipofile). 8. iar cele ale proteinei corespunzătoare genei Ced-9 de la nematodul Caenorhabditis elegans au un efect similar. acţionează ca inductori ai apoptozei. Factori implicaţi în reglarea apoptozei • Factori inductori Printre factorii interni care declanşează şi controlează apoptoza se numără tiroxina. ci favorizează supravieţuirea celulară într-o stare nonciclină. Agenţi externi nefiziologici. iar alte celule (tip celule hemotopoietice) necesită unul sau mai mulţi factori de stimulare (de exemplu. Experienţa in vivo a demonstrat că. de asemenea. în absenţa moleculelor semnal exogene. ionii de Ca++. Se ştie că semnalele extracelulare pot rupe această balanţă. dar modul în care se menţine această balanţă este în prezent foarte puţin cunoscut. substanţele toxice (toxine). se pare că există un control al mediului asupra vieţuirii şi morţii celulare. determinând activarea transcrierii genelor legate de inducerea apoptozei. Exprimarea fiziologică a genei bcl-2 (inhibitoare a apoptozei) este prezentată în ţesuturile fetale unde probabil joacă un rol în dezvoltarea şi morfogeneza normală. Trebuie menţionat cazul particular al blastomerelor. drogurile (agenţi antitumorali chemoterapeutici). în absenţa hormonilor specifici. 8. Pe modele animale s-a dovedit experimental existenţa unei tumorigeneze crescute în cazul în care respectivele animale au primit o dietă bogată în grăsimi în cursul embriogenezei. Este demonstrat faptul că există un impact important al nutriţiei din cursul embriogenezei şi perioadei precoce de după naştere asupra dezvoltării nou-născutului şi evoluţiei individului în cursul vieţii adulte.Această proteină bcl-2 nu stimulează proliferarea celulară. neuronii şi oligodendrocitele) necesită pentru dezvoltare factori neurotrofici şi citokine. Aceştia interacţionează cu receptorii nucleari. după cum sunt induse sau supresate respectivele gene. rezultatul fiind supravieţuirea sau moartea. Respectivele efecte tumorigene imprimate de dieta bogată în grăsimi din cursul embriogenezei au apărut abia la a doua generaţie. limfocitele T necesită interleukina 2). 8. care supravieţuiesc şi se divid în cultură. că un antigen de suprafaţă al timocitelor (antigenul Fas) este implicat în procesul de apoptoză.6. La specia umană. blastomerele sunt unicele celule embrionare care necesită un minimum de comunicare. În general. multe celule dependente de sistemul endocrin (de exemplu. S-a demonstrat. prin scăderea nivelului apoptozei. 190 . glucocorticoizii.5. şocul termic ester-forbolul. Rolul apoptozei în embriogeneză şi dezvoltare În prezent se ştie că echilibrul apoptotic joacă un rol important în embriogeneză şi dezvoltare.1. aceeaşi genă bcl-2 inhibă inducerea apoptozei de către gena c-myc şi face celulele mai puţin sensibile la radiaţii şi droguri citotoxice. Aspecte de reglare a apoptozei De mare importanţă pentru un organism este menţinerea balanţei între genele letale şi genele de supravieţuire.6.

ai proteinkinazei. A fost evidenţiată existenţa unui timing (intrare în funcţie la un moment precis) al apoptozei. prin modularea generală local de glucocorticoizi. Dieta hipocalorică favorizează. Aceste aspecte sunt însă foarte greu de urmărit şi clarificat. Celulele timice intrinseci exprimă enzime steroidogene şi produc pregnenolon şi dezoxicorticosteron. Hrănirea după o perioadă de post apare asociată cu o scădere a ratei de apoptoză. Se pare că aceşti steroizi sintetizaţi local acţionează într-o manieră paracrină. Pentru menţinerea unei funcţii normale a timusului este necesar un anumit nivel de bază al glucocorticoizilor circulanţi. ai transaminazelor şi ai proteazelor. în organele nonlimfoide. celulele limfoide în exces (de exemplu. Se pare că atât indigestia totală de calorii cât şi pattern-urile de alimentare (perioada de post cu hrănire intermitentă/acces continuu la hrană) ar putea influenţa viteza apoptozei şi a proliferării celulare. cât şi faptul că reducerea raportului de colorii poate afecta semnificativ secreţia de adrenocorticoizi. S-a avansat ipoteza conform căreia glucocorticoizii ar putea modula procesul de selecţie şi maturare. Sistemul imun produce un mare exces de limfocite care sunt programate să moară dacă nu sunt recrutate pentru răspunsul imun. factorii serici şi citokinele (aTNF) inhibă apoptoza. în funcţie de modularea dietei alimentare. La un individ normal. celule T autoreactive ale sistemului imunitar) caracterizează un sistem imunitar tânăr. scăderea nivelului de corticosteron are loc după administrarea hranei. ai endonucleazelor. cât şi rata apoptozei. dar şi nucleii pot declanşa modificări caracteristice de apoptoză în ADN-ul unor celule intacte. întârzierea îmbătrânirii celulare şi a fenomenelor de tumorigeneză. apoptoza este foarte restrânsă şi foarte rară în comparaţie cu cea în sistemul imun. Se presupune că. nivelul de corticoizi şi răspunsul glucocorticoid la stres scade cu vârsta. fie local) ar putea avea un efect critic asupra proceselor timice şi de imprinting. dar acest declin poate fi atenuat printr-o dietă hipocalorică. Prelungirea acestei capacităţi în cursul vieţii adulte ar putea fi întreţinută timp îndelungat printr-o dietă hipocalorică. Hrana hipocalorică cronică creşte atât nivelul diurn al corticoizilor plasmatici. în special în cursul morfogenezei şi dezvoltării. la vertebrate. în cursul dezvoltării sistemului imun. prin apoptoză. şi anume: celulele fără nucleu pot declanşa apoptoza. ai tirozinfosforilării. cu începere înainte de miezul nopţii. La şoareci s-a demonstrat experimental că o dietă hipocalorică creşte nivelul glicocorticoizilor în cadrul ritmului circadian. deoarece citoplasma celulară şi nucleul celular sunt potenţial autonome în declanşarea procesului de apoptoză. Corticoizii (sintetizaţi fie sistemic. atingând vârful chiar înainte de ora prânzului. Din cele prezentata mai sus reiese că sistemul imun incluzând timusul ar putea fi un focar important pentru dezvoltarea şi pentru efectele de maturare ale glucocorticoizilor. factorii de activare a macrofagelor. acest rezultat demonstrează importanţa ritmului cardiac atunci când se urmăreşte măsurarea nivelelor circulatorii ale adrenocorticosteroizilor.• Factori inhibitori Factorii de creştere. 191 . prin creşterea nivelului corticoizilor (cu rol important în modularea apoptozei). Nivelul crescut de corticoizi cu capacitate de a elimina selectiv. • Glucocorticoizi – sistem imun – apoptoză Nelson (1992) emite ipoteza conform căreia ar exista o implicare neuroendocrină în întârzierea îmbătrânirii ca urmare a dietei hipocalorice. Faptul că glucocorticoizii pot fi sintetizaţi local de organele aparatului imunitar (incluzând aici şi timusul) ridică posibilitatea ca o dietă hipocalorică să aibă efecte favorabile asupra bolii autoimune. ai sintezei proteice. De asemenea. apoptoza este inhibată de către toţi inhibitorii sintezei ARN-ului. incluzând selecţia pozitivă a celulelor CD4 şi CD8.

ci ei mediază şi exprimarea genelor. S-a dovedit că consumul crescut de lipide Ω-3 are la om efecte benefice în caz de artrită. până în prezent sa dat totuşi prea puţină atenţie legăturii existente între prelungirea perioadei de viaţă (prin administrarea unei diete hipocalorice). prelungind perioada de viaţă şi întârziind momentul apariţiei modificărilor legate de vârstă (degenerări. Procesul normal de îmbătrânire evoluează către stadiul final de senescenţă. grăsimi) duce la creşterea nivelului apoptozei. dar cu scăderea aportului de carbohidraţi. şi nivelul apoptozei. care îndepărtează (mătură) radicalii liberi scad nivelul peroxizilor circulanţi. ameliorând severitatea bolii autoimune şi prelungirea vieţii. Lipidele Ω-3 cresc exprimarea enzimelor de tip superoxiddismutaza şi catalaza.• Lipidele Ω . În prezent se recomandă o utilizare a uleiurilor de peşte Ω-3 ca supliment în dietă. întârziind îmbătrânirea. când celulele nu mai proliferează. organismul fiind predispus la modificările legate de vârstă (degenerări. se produce treptat o pierdere de masă celulară. Acidul arahidonic (care asigură fluiditatea membranelor celulare) poate activa receptorii nucleari pentru hormoni steroizi. dereglări imune. tumorigeneză). ar putea scădea producerea de radicali liberi şi ar menţine un nivel normal de apoptoză. Acidul eicosapentaenoic (EAP) scade proliferarea şi stimulează apoptoza. Deci lipidele Ω-3. pentru a împiedica oxidarea şi reîncezeala în cursul perioadei de păstrare. proteine. tiroidieni şi retinoizi. a grăsimilor saturate cu uleiuri vegetale nesaturate (Ω . în plus Ω-3 au efect favorabil asupra funcţiei imune şi supresoare a tumorigenezei. pe de o parte. 192 . din care 90% sunt de origine vegetală. ceea ce duce la îmbătrânire. boli renale şi boli de piele. Esenţial este că acest ulei de peşte să fie conservat cu anti-oxidanţi potriviţi (vitamina E). Efectul uleiurilor de peşte asupra apoptozei s-ar realiza prin exprimarea crescută a enzimelor antioxidante şi scăderea formării de radicali liberi. dereglări imune.3 şi apoptoza Asocierea acizilor graşi saturaţi cu incidenţa crescută a bolilor cardiovasculare a determinat substituirea. la dezvoltarea bolii autoimune şi la tumorigeneză. 8. constatându-se că acest tip de ulei a adus beneficii. diabet. Lipidele oxidate pot determina formarea de radicali liberi. Acizii graşi nesaturaţi şi metaboliţii lor servesc nu numai drept componenţi structurali ai celulelor şi ca substrat pentru sinteza prostaglandinelor. Dereglarea apoptozei poate duce la alterarea funcţie imune. În prezent se ştie că o dietă hipocalorică (fără malnutriţie sau deficienţe de elemente esenţiale. Substituirea grăsimilor saturate cu uleiuri vegetale reduce cantitatea de colesterol şi de lipide LDL. în dieta alimentară. 7.6). O dată cu înaintarea în vârstă scade eficienţa apoptozei. ceea ce ar putea explica unele rezultate nefavorabile (contradictorii) obţinute în studiile anterioare referitoare la efectele uleiurilor de peşte. leucotrienelor şi trumboxanului. această observaţie sugerează că acizii graşi polinesaturaţi ar putea avea efect direct asupra supresării genelor H-ras (p. pe de altă parte. boli cardiovasculare. În SUA. consumul de grăsimi este 170 grame pe zi. tumorigeneză).221) În ultima vreme s-a trecut la utilizarea uleiurilor nesaturate Ω-3 extrase din peştele oceanic. devenind rezistente atât la proliferare cât şi la apoptoză. Uleiurile nesaturate Ω-3 şi Ω-6 duc la scăderea bolii arteriosclerotice. reduc stresul oxidativ cronic. administrate în cadrul dietei alimentare. Apoptoză – îmbătrânire – senescenţă Printr-un proces de apoptoză controlat genetic în cursul vieţii. dar cu condiţia îmbunătăţirii procesului tehnologic (cu adaos de antioxidanţi corespunzători).

ƒ Apoptoza şi procesul de oncogeneză Procesul neoplazic este înţeles astăzi drept o dereglare a echilibrului apoptoză/proliferare celulară. confirmând astfel că ar exista o corelaţie între exprimarea genei bcl-2 şi rezistenţa la apoptoză. Aceste gene oncogene pot influenţa circuitele moleculare care controlează creşterea şi dezvoltarea. Celulele CD4-CD8. cât şi în patogeneza cancerului (de exemplu în limfoame). Apoptoza şi starea de boal㠃 Agenţii infecţioşi virali şi infecţia virală Agenţii virali patogeni dezvoltă strategii pentru inhibarea apoptozei. menţine un echilibru între proliferarea celulară şi apoptoză.Deşi mecanismele implicate în procesul de senescenţă şi tumorigeneză rămân insuficient clarificate. prin interacţiunea unei proteine virale cu proteina celulară p53. poate activa transcrierea genei c-myc. în aceste condiţii de dereglare a 193 . În cazul infecţiei cu virusul HIV1. predispune la boala autoimună. 8. care contribuie la eradicarea celulelor autoreactive din boala autoimună in vivo. s-a demonstrat că adenovirusurile. lupusul eritematos) prin creşterea apoptozei. Printr-o dietă hipocalorică se poate reduce stresul oxidativ.8. în care legătura glicoproteinei gp120 (de pe suprafaţa virusului HIV1) de antigenul CD4 al limfocitelor T CD4 face celula sensibilă la apoptoză. a căror prezenţă ar fi atât de necesară în cazul de mai sus. toate genele oncogene cunoscute până astăzi ar fi forme alterate ale genelor celulare normale.(precursoare ale celulelor timice T) rezistente la apoptoză. depleţia de limfocite este rezultatul unui proces complex. Administrarea de glucocorticoizi exogeni ameliorează boala autoimună (de exemplu. Ţinând cont de acest aspect. ƒ Boala autoimună Boala autoimună reprezintă o altă consecinţă a dereglării apoptozei în sistemul imunologic. Apoptoza crescută peste normal poate fi deci nocivă prin pierderea unor celule CD4. homeostazia celulară fiind menţinută şi asigurându-se prelungirea vieţii. Astfel. permiţând astfel replicarea virală în celula gazdă. moartea) lor. limfocitele (autoreactive) mor prin apoptoză. a cărei viaţă este prelungită. prin inserţie pe respectiva genă protooncogenă. S-a observat de asemenea că o perioadă scurtă de post sau de regim hipocaloric are efecte evidente asupra sintezei de glucocorticoizi şi asupra creşterii apoptozei. gena c-myc. În acest context trebuie privită şi acţiunea genei protooncogene celulare c-myc. În condiţii anormale. S-a demonstrat că administrarea de uleiuri Ω-3 (din peşte oceanic) duce la supresia bolii autoimune şi la prelungirea vieţii. Supresia apoptozei joacă un rol important atât în bolile autoimune. virusul papilloma uman şi SV40 pot modula apoptoza. se cunoaşte faptul că acumularea de radicali liberi derivaţi dintr-un metabolism oxidativ şi leziunile celulare rezultate din acţionarea radicalilor liberi joacă un rol important în aceste fenomene. ceea ce are drept consecinţă o dereglare a echilibrului apoptoză/proliferare celulară. un retrovirus cu rol declanşator. la a doua stimulare. În condiţii normale. exprimă o cantitate mai mare de proteină bcl-2 decât celulele CD4+ şi CD8+ sensibile la apoptoză. În condiţii normale. Sindromul de Imunodeficienţă Acută la Om (SIDA) poate fi privit ca un dezechilibru între viteza morţii celulelor limfocite T CD4 şi procesul de reînnoire a acestor celule. Conform ipotezei lui Stryer (1991). Un deficit în deleţia (dispariţia.

apariţia unei tumori necesită evenimente genetice secundare care să atrage calea apoptotică. incriminate în oncogeneză. drept răspuns la semnalele adverse de creştere. Apoptoza trebuie privită ca o măsură de protecţie care previne transformarea malignă. Produsul genei gp53 normale a fost numit “poliţistul molecular“. Se admite astăzi că procesul de oncogeneză apare în urma unor modificări de replicare a ADN. când se produce o acumulare anormală de celule cu mutaţie. supunând aceste celule transformate apoptozei. de asemenea. Mutaţii ale genei supresoare ale tumorii gb53 reprezintă una din alterările genetice cel mai frecvent semnalate în cazul tumorilor umane. În general. Luvers. proporţia dintre diviziunea celulară şi moartea celulară determină viteza de dezvoltare a unui proces oncogen. Genele codificatoare de proteine care conferă rezistenţă la apoptoză ar putea fi. gena protooncogenă c-myc devine oncogenă (implicată în geneza limfomului Burkitt). apare o deteriorare a funcţiei sistemului imun şi o creştere a riscului de tumorigeneză o dată cu înaintarea în vârstă. o asemenea genă ar fi protooncogenă bc1-2 (genă mitocondrială). În organisme au evoluat mecanisme eficiente pentru eliminarea celulelor cu leziuni genetice (rezultate dintr-o diviziune neprogramată). Unele celule canceroase se divid mult mai încet decât celulele normale. deoarece induce poptoza în celulele care au suferit leziuni ireversibile ale ADN. cel mai bun exemplu în acest sens sunt evenimentele mutaţionale suferite de gena gp53 supresoare de tumori. dar procesul neoplazic se poate totuşi întinde din cauza perioadei de viaţă prelungite a respectivei celule.apoptozei. 194 . care inhibă apoptoza într-un număr de tipuri celulare. Prin activarea produsă prin inserţia retrovirusului.

acţiunea enzimelor antioxidante) până la mecanismele de turnover celular (ale sistemului imun. după ultimele date un ceas (un mecanism programator) reprezentat de telomere. Senescenţa este stadiul final al îmbătrânirii când celulele nu mai proliferează. împiedicând acumularea de leziuni somatice responsabile de producerea senescenţei. ƒ Gene pleiotrope. Aceste gene conferă avantaje în stadiile timpurii de viaţă. în cursul unui proces de îmbătrânire precoce (de exemplu. ƒ gene pentru reglarea activităţii sistemului inimi. Aceşti factori determină fenotipurile procesului de îmbătrânire-senescenţă.Capitolul 9 PROCESUL DE ÎMBATRÎNIRE-SENESCENŢA Sedlow 1974 şi Curtis 1996 indică strânsa interrelaţie /eficenţa reparării ADN-ului (prin excizia leziunilor) şi durata de viaţa a speciilor. având în consecinţă o serie de efecte negative asupra organismului.). fiind implicate trei categorii de gene: ƒ Gene reglatoare pentru menţinerea integrităţii somatice şi a proceselor de reparare. ƒ gene pentru sinteza corectă a proteinelor. începe procesul îmbătrânirii. un rol important are. şi anume: ƒ gene pentru replicarea corectă a ADN-ului. Aceste gene reglează sistemele intracelulare (mecanismul de reparare a ADN-ului. Acest proces se află sub un control genetic activ. În reglarea îmbătrânirii celulară şi a senescenţei. (TTAGGG). cât şi la apoptoză (celulele devin senescente în momentul în care telomerele devin brusc prea scurte şi nu mai pot suporta o nouă diviziune celulară).1.) Prin reglarea acestor procese. 9. dar ulterior suferă deleţii. Acestea sunt secvenţe repetitive de ADN situate la extremităţile libere ale cromozomilor liniari. ale structurilor epidermice etc. activitatea respectivelor gene menţine un nivel înalt de protecţie faţă de agenţii de stress intrinseci şi extrinseci. acesta reprezentând inexorabilul declin al capacitaţi de menţinere homeostaziei fiziologice. Pierderea celulelor premature sau excesive. Procesul normal de îmbătrânire evoluează treptat către senescenţă. ele devenind rezistente atât la proliferare. în ADN-ul telomeric. ƒ gene pentru sinteza de factori antioxidanţi (enzime etc. La mamifere (inclusiv la om) perioada lungă de viaţa se găseşte sub controlul unui număr foarte mare de gene (control poligenic). ƒ gene pentru repararea ADN-ului. care ulterior este modular (amplificat sau menţinut la nivel scăzut) prin acţiunea agenţilor din mediu extern. ƒ gene pentru supresia de tumori. secvenţele TTAGGG sunt orientate cu extremităţile bogate în G spre capul 3 OH 195 ƒ . Gene implicate în controlul senescenţei Senescenţa este o caracteristică a organismelor superioare. prin apoptoza controlată genetic. Îmbătrânirea reprezintă pierderea treptată a masei celulare dintr-un organism. Factori genetici individuali. Astfel la om capetele cromozomilor conţin 2-3kb de unităţi repetitive telomerice. sindromul Werner) poate duce la disfuncţie de organ sau boală. După maturarea totală a unui organism.

apărând astfel. • Acumularea de leziuni oxidative. acest fenomen fiind acompaniat atât de supresarea leziunilor celulare cumulative. capetele celor două fire de ADN să rămână libere. Această alungire a lanţului matrice duce la formarea unui loop astfel încât capătul 3’OH ajunge să servească drept primer pentru sinteza unor noi secvenţe nucleotidice telomerice în apropierea lanţului fiică. în cursul perioadei de îmbătrânire. în final. catena fiică rezultată. după un număr de replici. ele împiedică fuziunea extremităţilor cromozomiale cât şi dezintegrarea ADN-ului fiind totodată şi responsabil de fixarea cromozomilor pe membrana nucleară. Fig. această catena fiică va juca rol de matriţă în runda următoare de replicare şi va da naştere unei noi catene fiice cu un număr şi mai mic de secvenţe telomerice astfel încât.03% din totalul ADN-ului genomului uman). ADN-ligaza ajută la fixarea acestor noi secvenţe telometrice la capătul 5’ al lanţului fiică iar apoi nick-aza clivează loop-ul la nivelul subsecventelor telomerice (secvenţe incomplet sintetizate) astfel încât. • Acumularea de mutaţii în ADN-ul mitocondrial. în celule. în condiţii normale. Telomeraza (complex ribonucleioproteic) orientează capetele băgate în G ale respectivelor secvenţelor telomerice spre extremitatea 3’-OH a lanţului matriţă. 196 . Telomerele au fost deja clonate şi secvenţiate (ADN-ul telomeric reprezentând 0. în final. Pe cele două fire de ADN telomerele sunt formate din secvenţe repetitive identice dar aşezate în tandem (5’-TTAGGG faţă de TTAGGG-3’-OH). 9.. se ştie doar că apoptoză întârzie îmbătrânirea şi supresează tumorigeneza. • Acumularea de proteine aberante. ele au rol de a cronometra fiecare diviziune celulară. Telomerele nu sunt codificatoare (nu conţin gene). Sub acţiunea acesteia se adună mai întâi blocuri de oligonucleotide telomerice care se fixează la capul 3’-OH al lanţului ADN matriţa (fig 126).Terminalizarea cromozomilor sub acţiunea telomerazelor Nu se cunoaşte încă bine interrelaţia dintre apoptoză şi lungimea tolomerelor. probabil datorită acţiunii enzimei telomeraza. Ele nu se sintetizează în cadrul ciclului de replicare a lanţului ADN corespunzător ci separat sub acţiunea telomerazei. orientate în tandem pe cele două fire ale dublului lanţ de ADN cromozomial cu capete libere. Rezultă o catenă fiică de aceeaşi lungime cu catena matrice dar cu secvenţe telomerice mai puţin numeroase. cât şi de ce a leziunilor ADN. Telomelere sunt structuri importante ale arhitecturii cromozomiale. Principalele mecanisme (ipotetice) implicate în senescenţă Aceste mecanisme sunt: • Acumularea de mutaţi somatice. 126 . cu telomerul foarte scurt va deveni incapabilă de o nouă replicare.al firului de ADN. 2.

multe dintre aceste teorii postulează o relaţie între viaţa celulei şi apariţia leziunilor (erorilor) ADN. Un asemenea exemplu de mutaţii somatice apărut la un moment dat în cursul vieţii în organisme este apariţia unui spot bleu pe un iris brun. 1996). O dată cu înaintarea în vârstă. această capacitate scăzând o dată cu creşterea numărului de pasaje. A. 197 . s-a ajuns la elaborarea unei teorii a reţelei prin care se încearcă ipotetic să se explice astăzi intrigarea şi interacţiunea la nivel molecular a mecanismelor implicate în procesul de senescenţă (fig. eficenţa apoptozei scade. În celulele vârstnice există o frecvenţă înaltă de ruperi de lanţuri ADN (probabil prin acumularea situs-uri labile la alcalii). organismul fiind mai predispus la modificările de vârstă (degenerări. fie posedă sistem de reparare ADN mult mai eficient. un model experimental excelent pentru studiul fenomenelor de înbătrînire.Plecându-se de la studiul acestor patru mecanisme. Multe teorii referitoare la îmbătrânirea celulară se bazează pe ipoteza leziunii genomului celular somatic. iar apoi mitoza încetează progresiv (perioadă de senescenţă). Organismele care trăiesc mai mult timp fie acumulează în cursul vieţii cantităţi mai mari de ADN lezat decât organismele cu viaţă mai scurtă. Culturile celulare de fibroblaste umane diploide au oferit. Pînă în prezent mutaţiile somatice au fost studiate foarte puţin. concomitent apar modificări ale histonelor. dereglări imune. Acumularea de mutaţii somatice În culturile de ţesuturi prenatale provenite de la rozătoare s-a demonstrat că celulele au capacitate foarte înaltă de reparare ADN. George Martin de la Universitatea Washington din Seattle (1996) estimează că mutaţiile care ating 7% din genomul uman pot avea capacitatea de a modula apariţia unui fenotip al procesului de îmbătrânire la om. 127 . tumorigeneza). după o perioadă de multiplicare activă. care îngreunează accesibilitatea enzimelor la nivelul cromatinei. de asemenea. potenţialul de creştere în cultură a acestor celule este invers proporţional cu vârsta donatorului de celule. în vederea acţiunii de reparare a ADN. 127). Fig. care au o acţiune sinergică.Reţeaua interacţiunilor dintre diferite mecanisme intracelulare ipotetice implicate în procesul de senescenţă (după Kingwood. pe acest model s-a demonstrat că pentru respectivele celule. timpul de generaţie creşte.

enzimele proteolitice protectoare care hidrolizează proteinele oxidante nu sunt suficiente pentru a împiedica acumularea de proteine oxidate o dată cu înaintarea în vârstă. Acumulare de proteine aberante S-a arătat deja la capitolul referitor la acumularea de mutaţii somatice că o dată cu înaintarea în vârstă apar histone modificate. probabil. deoarece respectivele sisteme de apărare nu sunt perfecte. dar nu reuşesc nici ele să le îndepărteze pe toate. Mutaţiile se acumulează o dată cu vârsta prin multiplicarea respectivelor leziunilor ADN în cursul diviziunilor celulare.procesul de îmbătrânire. Acţiunea acestor produşi este echivalenta cu cea a radiaţiilor. George Martin de la Departamentul de Patologie şi Genetică al Universităţi Washington din Seattler arată că există o strânsă legătură între îmbătrânirea biologică intrinsecă şi biologia neoplozilor. s-a demonstrat că leziunile oxidative ale ADN-ului se acumulează o dată cu vârsta. o dată cu îmbătrânirea: cancer.O singură mutaţie nu este suficientă pentru declanşarea unui proces de îmbătrânire. având drept consecinţă un nivel de zece ori mai mare al leziunilor oxidative la nivelul ADN-ului mitocondrial decât la nivelul ADN –ului nuclear. cataracta). Ca şi în cazul senescenţei. sistem enzimatic auto oxidant tip superooxiddismutaza). Experimental. Strânsa interrelaţie dintre mutaţii şi îmbătrânire a fost demonstrată şi de constatarea existenţei unui grup semnificativ de patern-uri de mutaţii somatice specifice de specie în cursul procesului de îmbătrânire la mamifere . se pare că în procesul de tumorigeneza radicalii liberi derivaţi dintr-un metabolism oxidativ au un rol important în provocarea leziunilor celulare. mai mult în ADN –ul mitocondrial decât în cel nuclear. Substanţele oxidante produc leziuni şi la nivelul proteinelor. boli cardiace. se consideră astăzi că biologi neoploziei este un aspect particular al îmbătrânirii precoce intrinsece (de exemplu. cu cît numărul este mai mare cu atât viaţa respectivului organism este mai scurtă. ADN-ul suferă efecte oxidante care se acumulează cu vârsta. în vederea reparării ADN. ci sunt necesare cel puţin câteva mutaţii pentru a modula aspectele multiple ale unui fenotip de îmbătrânire (de exemplu sindromul Werner la adulţi sau sindromul Giolford la copii). disfuncţii imunologice şi cerebrale. În cursul fosforilărilor oxidative se produc substanţe oxidante la nivelul mitocondriilor. Deşi organismele posedă factori de apărare cu acţiune antioxidantă (ascorbat tocoferoli. .Tot la mamifere s-a constatat că frecvenţa unor mutaţii intragenice şi cromozomiale se află invers cu longevitatea respectivului organism. B. Acumulare de leziuni oxidative Produşii oxidanţi rezultaţi din metabolismul normal determină treptat o dată cu înaintarea în vârstă. În aceste două sindroame a fost evidenţiată o mutaţie tip deleţie pe braţul scurt al cromozomului 8 (Gotto şi colab 1982). carotenoizi. Enzimele de reparare a ADN-ului îndepărtează eficient un număr mare de leziuni. Aceşti produşi oxidanţi contribuie la : . leziuni ale ADN-ului proteinelor şi lipidelor. Cel puţin pentru regnul animal. C. Totuşi leziunile oxidative reuşesc să se acumuleze cu vârsta. 198 . care îngreunează accesibilitatea enzimelor de reparare la nivelul cromatinei.producerea de boli degenerative (prin leziuni somatice celulare. un şoarece devenind astfel bătrân în numai doi ani (când se acumulează circa un milion de leziuni ADN per celulă). Celulele se apără singure împotriva unui număr mare de leziuni printr-un turnover constant mitocondrial. mitocondriile alterate (care produc un număr mare de substanţe oxidante). adenocarcinoamele de colon şi prostata). Numărul loviturilor oxidante asupra ADN-ului per celulă şi per zi este de circa 100 000 la şoarece şi de zece ori mai mic la om. această interrelaţia dezvoltându-se pe baza unei instabilităţi genomice. prin care se îndepărtează.

Faptul că alterări în metilarea ADN-ului au fost observate la şoareci cu vârsta de 6 luni demonstrează că aceste modificări sunt determinate viitoarea dezvoltare şi adaptare. Cercetările din ultimii ani menţionează alterarea sintezei unor proteine reglatoare în perioada de creştere somatică. Prin fenomene epigenice (epimutaţii) se înţeleg acele evenimente acumulate care pot duce la alternarea structurii şi funcţiei genelor. o 199 . Un alt aspect al acumulării de proteine aberante este cel al acumulării cu mult peste nivelul normal admis de proteine oxidante în organism. cataracta bilaterală. care determină moartea pacienţilor în primii 20 de ani de viaţa. Sindromul Werner este o boală autosomală de tip recesiv caracterizată printr-un număr mare de degeneraţi tipice. Din punct de vedere teoretic. În acest fenomen s-ar încadra reactivările (paradoxale) unor anumite locusu-uri de pe cromozom (de exemplu cromozomul x la şoarece) drept consecinţă a unor modificări ale stării de metilare a citozinei de pe lanţul ADN cromozomial.Una dintre teoriile îmbătrâniri celulare (teoria lui Orgel) susţine că apariţia întâmplătoare a cromozomilor în genomul celular ar explica acumularea de anomalii în moleculele proteice esenţiale din organism. În cazul unei boli mitocondriale cu mutaţii (de exemplu deleţie) respectivul organism conţine mai multe tipuri de ADNmt. În 1983 Wilson şi Jones arată că metilarea ADN-ului scade o dată cu vârsta (cu excepţia celulelor neopolizice). În aceste sindroame de îmbătrânire precoce la om se produce o pierdere celulară prematură şi excesivă. ulceraţii ale pielii în jumătate din cazuri apare diabetul zaharat. celulele au fost incapabile să restaureze corect lanţurile de ADN. care duce la deteriorarea mai mult sau mai puţin rapidă a mecanismelor de transcriere şi translaţie. această situaţie duce la declanşarea unuia dintre cele două sindroame de îmbătrânire prematură: sindromul Werner şi sindromul Hutchinson Gilford (progeria). Epstein şi colaboratorii au evidenţiat o restaurare defectuoasă a ADN-ului. prima manifestare este întârzierea creşteri urmată de albirea părului atrofia ţesutului subcutant şi a pielii. Boala prezintă complicaţii de tip arterioscleroză coronariana. având drept consecinţă sinteza unor proteine deficitare şi scurtarea vieţii. atrofia musculară scheletică. Din datele acumulate până în prezent s-a putut conchide că procesul de alterare a metilării ADN-ului. situaţia care caracterizează starea de heteroplasmie. consecinţa acestor modificări fiind tulburarea sintezei unor proteine reglatoare în perioada de creştere somatică. subliniind rolul acestor fenomene în procesul de îmbătrînire. evoluează permanent. 1992). Starea de heteroplasmie poate apărea şi la un individ normal. Celulele nu au supravieţuit în cultură mai mult de 11 generaţii. în 10% din cazuri apar neoplasme. cu semn de senilitate evidentă deja la vârsta de 10 ani. Pe culturi celulare provenite de la persoane cu acest sindrom. durata medie de viaţă de 47 de ani. după expunerea la raza y şi cobalt. alterarea vocii. ducând tardiv în cursul vieţii la efecte negative. Acumularea de mutaţii în ADN-ul mitocondrial (ADNmt) Se consideră ca într-un organism normal (cel puţin teoretic) toate moleculele de ADNmt sunt identice. În acest sindrom a fost evidenţiat un linkaj genetic constituit din 5 markeri pe cromozomul 8 (Gotto et al. o dată cu înaintare în vârstă. o dată iniţiat. Sindromul Hutchinson Gilford (progeri) este o afecţiune autosomală cu transmisie recesivă. osteoporoza. atunci când forţa de selecţie naturală a organismului scade evident. hiprekeratoza căderea generalizată a părului. un asemenea fenomen s-ar explica prin acumularea treptată de ADN. degenerescenţa gravă testiculară. alte semne tipice arterioscleroza severă. considerată de unii autorii drept o variantă a sindromului Werner. având drept consecinţă disfuncţii de organe şi instalare unei stări de boală. D. această situaţie caracterizează starea de homoplasmie. fără apariţia unei modificări în senescenţa primară a nucleotidelor. ca urmare a unor fenomene epigenice ce apar în cursul vieţii. Sindromul Rothmund Thomson este o afecţiune congenitală transmisă recesiv.

deleţie. proporţia de ADNmt. Se pare că acelaşi mecanism care protejează organismul împotriva acumulării unor leziuni responsabile de senescenţă protejează organismul şi împotriva unor mutaţii ce duc la declanşarea cancerului. nutriţia hipocalorică postnatală. Este foarte greu de afirmat că la o vârstă înaintată (de 90 ani sau mai mult). În contextul relaţiei mai sus amintite. Implicaţiile interacţiunii dintre dieta hipercalorică şi mecanismul fundamental care reglează senescenţa şi durata vieţii la om rămâne încă a fi investigat în detaliu. Aceste observaţii au crescut interesul cercetătorilor pentru rolul jucat de mutaţiile de la nivelul ADNmt în cursul procesului de îmbătrânire şi în cel al bolilor neurodegenerative. căci senescenţa. cu deleţie trebuie să reprezinte mai mult de 60% din ADNmt total pentru a putea fi exprimat fenotipic. În schimb. riscul de hipertensiune şi boli cardiovasculare. deşi natura precisă a acestei relaţii nu este încă dovedită experimental din considerente etice. reiese deci că nu este încă clarificat dacă orice deficit funcţional poate fi legat de acest tip de mutaţie. o dată apărută pe ADNmt. Se pare că un proces similar ar fi implicat în pierderea de neuroni.1% din totalul ADNmt şi poate fi detectată numai prin reacţia polimerizării în lanţ. sistemul senzorial. este dovedit că subnutriţia creşte ulterior în viaţă. 200 . prin creşterea vitezei turnover-ului la nivelul mitocondriilor. În cursul procesului normal de îmbătrânire la un individ sănătos. întârzie îmbătrânirea aparatului mitocondrial din ţesutul muscular. Astăzi sunt consideraţi factori care întârzie (protejează organismul de) senescenţă: dieta hipocalorică şi exerciţiul fizic. La om este astăzi dovedit statistic că o dată cu vârsta creşte şi incidenţa bolilor. îmbătrânirea-boală se poate afirma că există o relaţie fundamentală directă între îmbătrânire şi cancer. În schimb în bolile mitocondriale bazată pe selecţii ale ADNmt. Astfel acumularea de alterări somatice pot duce. muşchiul cardiac şi SNC). proporţia de ADNmt cu deleţie este în foarte rare cazuri mai mare de 0. treptat. implică apariţia unor aspecte anormale. La om. Referitor la exerciţiul fizic se consideră că acesta aplică cu regularitate la om poate ameliora modificările legate de vârstă la nivelul mitocondriilor din ţesutul muscular. Leziunile oxidative continue ale ADN-ului sunt responsabile de scăderea capacitaţii de fosforilare oxidativă o dată cu înaintarea în vârsta. într-un organism chiar aparent sănătos nu au apărut modificări patologice în corp. deşi este un proces fiziologic normal. la rozătoare duce la creşterea evidentă a duratei de viaţă. o modificare a genotipului somatic şi totodată acumularea unor defecte care pot duce la un moment dat la conturarea unui anumit fenotip (de boală). la malignizarea într-o linie celulară. Exerciţiul fizic. Modificări la nivelul anumitor organe apar în mod normal o dată cu vârsta. creier. se multiplică exponenţial cu vârsta. boala Huntington sau boala Alzheimer. Nivelele cele mai înalte de deleţie au fost evidenţiate postmitotic în ţesuturile aerobe muşchi scheletici. Astfel în cursul senescenţei se produce. deoarece mecanismele cauzale necesită probabil un timp pentru ca efectele lor să devină evidente. Constatările de până în prezent ne permit să afirmăm că există o relaţie directă între procesul de îmbătrânire şi boală. în cadrul bolilor degenerative asociate procesului de îmbătrânire. predispunând astfel organism la unul din fenotipurile neurodegenerative tip boala Parkinson. Unele boli apar cu frecvenţă mai mare la vârstă mai înaintată. chiar dacă acea persoană nu a fost diagnosticată cu o anumită boală specifică.

(proteine cu structuri similare). ar putea produce dereglări ale homeostaziei. Din această cauză. acesta este mai rapid şi cu o amploare mai mare în cazul în care reîntâlneşte un antigen particular.de exemplu infiltrarea limfocitelor în pielea sau organul grefat. Răspunsurile imunitare sunt de două tipuri: 1.Capitolul 10 RĂSPUNSUL IMUNITAR 10. . şi este cea care asigură eficienţa ridicată a acţinii sistemului imunitar. anticorpii sunt produşi pe calea stimulării limfotitelor B sau a celulelor plasmatice (plasmocite).ce constau în generarea de anticorpi. când s-a instalat ca urmare a contactului generaţiilor anterioare cu un anumit antigen şi se transmite ereditar. Sistemul imunitar acţioneză deci ca un sistem defensiv în cazul apariţiilor unor infecţii. care stimulate specific devin celule T efectoare. sau prin administrarea unor seruri imune conţinând anticorpi specifici – imunitate pasivă. Limfocitele au un rol deosebit de important în cazul. prin vaccinuri care conţin germeni atenuaţi sau morţi – imunitate activă. limfocitele producătoare de anticorpi. organ limfoid prezent la păsări. 201 .amplifice răspunsul imunitar (celular T ajutătoare). Imunitatea înlătură. Această comportare poartă numele de memorie imunitară. Celulele T sunt de mai multe feluri în funcţie de natura reacţiei pe care o determină. Noţiuni generale despre imunitate şi sistem imunitar Imunitatea reprezintă capacitatea de a recunoaşte şi neutraliza macromolecule sau celule străine organismului şi care. a transplatelor tisulare şi infecţiilor (ciuperci sau fungi). în afară de substanţele străine şi pe cele proprii organismului. iar răspunsul imunitar celular pentru acţiunea organismului asupra celulelor maligne. 1. Sistemul imunitar este un sistem responsabil cu apărarea organismului împotriva efectelor nocive ale corpurilor străine (antigeni). Un răspuns imunitar constă din două părţi: 1. Răspunsul imunitar celular este generat de limfocitele T. Răspunsul imunitar celular este dependent de starea timusului de aceea limfocitele respective poartă numele de celule T (timus dependente). cunoscute sub numele de imunoglobuline şi care sunt specifici unui anumit antigen. timus independente). sau poate fi dobândită. ca urmare a contactului prealabil al organismului cu un anumit antigen (imunitate consecutivă anumitor boli infecţioase). nu pot supravieţui (fig.reducă răspunsul imunitar (celule T supresoare). Astfel. Imunitatea poate fi moştenită (naturală). răspunsul specific la un anumit antigen. 2. dar pe care acesta nu le mai recunoaşte ca proprii. Răspunsuri umorale . În cazul răspunsului imunitar specific. în cadrul răspunsului imunitar umoral specific. ambelor tipuri de răspuns imunitar. pătrunse în mediul intern. din cauză că au suferit anumite modificări. Răspunsuri celulare . Similar. Răspunsul imunitar umoral este important pentru infecţiile bacteriene. persoanele cu deficienţe imunitare congenitale.Această capacitate de transfer a limfocitelor face ca ele să joace un rol cheie în apariţia răspunsurilor imunitare. dacă sunt netratate.distrugă efectiv celelele ţintă (celule T citotoxice). celulele T pot să: . Principala funţie a sistemului imunitar este de a recunoaşte şi ataca antigenii străini. demonstrându-se că aceste celule pot transforma de la un organism la altul capacitatea de a produce anticorpi şi de a rejecta grefele . Imunitatea poate fi dobândită şi artificial. 128). 2. care sunt dependente de măduva osoasă poartă numele de celule B (de la bursa lui Fabricius. . creştere nespecifică a efectului răspunsului.

În zona medulară. Ele acţionează prin receptorii de pe suprafaţa membranei. Dacă sunt expuse la antigen se maturizează în celule sensibilizate care sunt circulante şi au viaţă lungă. neutrofilele. se divid lent şi conţin pe suprafaţă puţini antigeni. Organizarea sistemului imunitar Celulele esenţiale pentru generarea răspunsului imunitar. 3. 2. La mamifere precursorii limfocitelor apar în insule sanguine din sacul vitelin şi migrează prin placentă în ficat. eozinofilele. Celule libere.Fig. Există două categorii funcţionale de limfocite T: limfocite T 202 . Studiul markerilor de pe suprafaţa limfocitară şi a activităţii lor funcţionale a permis identificarea celor două populaţii de limfocite T (timus dependente) şi B (bursodependente – de la bursa lui Fabricius. Organe limfocitare primare: timusul şi măduva osoasă ce conţin celule care dezvoltă un proces de maturare a celulelor sensibile la antigeni. Aceste celule sunt capabile să se transforme în celule efectoare timice dacă sunt reexpuse la antigen. faţă de zona medulară. bazofilele. Celulele care părăsesc timusul dobândesc receptorul pentru antigen. organ limfoid întâlnit la păsări. Originea limfocitelor şi diferenţierea. Celulele T şi B circulă prin organism pe un traseu bine stabilit prin organele limfocitare secundare. splină) şi se localizează în arii timodependente. Limfocitele sunt componente celulare specifice pentru antigeni. limfocitele işi au originea în măduva oaselor. În timpul vieţii măduva osoasă produce celule susă care au printre descendenţii lor şi precursorii limfocitelor. faza de recunoaştere .Componentele sistemului imun Un răspuns are două faze: 1. Celula centrală in imunologie este limfocitul. splina şi ţesuturi limfocitare asociate mucoaselor care sunt cele ce conţin celule sensibile la antigeni aflate intr-un circuit de recirculare prin organism. limfocitele în număr redus sunt rezistente la cortizon. conţin pe suprafaţă mulţi antigeni şi sunt sensibilile la liza prin acţiunea corticosteroizilor. virusuri. Limfocitele T. splină şi măduvă osoasă. faza activă în care aticorpii elimină antigenul 10. Din această categorie fac parte limfocitele.în care antigenul este recunoscut ca un corp străin. Ele migrează încă din timpul vieţii fetale în timus unde se diferenţiază diferit în zona corticală. timus independente). Organe limfocitare secundare: nodulii limfocitari. inclusiv cele care au „memorie". intră în organe limfoide secundare (ganglioni limfatici. Limfocitele T nu produc anticorpi circulanţi şi nu dau naştere la celule secretoare de anticorpi. Limfocitele T sunt răspunzătoare de reactivitatea cutanată întârziată. fiecare receptor având o înaltă specificitate. Sunt derivate din timus sau influenţate de timus în timpul dezvoltării lor. Din cadrul sismului imunitar fac parte două categorii de organe: 1. circulante în fluxul sanguin.2. apărarea împotriva anumitor microorganisme. fungi. imunitatea antitumorală. 128 . dar sunt recirculate şi celule B. macrofagele. 2. aproximativ 90% din celulele T se divid rapid. Diferite clone limfocitare au propria lor specificitate unică. Aceste celule T au viaţă scurtă. respingerea alogrefelor. Cele mai multe celule limfocite care sunt recirculate sunt cele de tip T. bacterii patogene. al căror ciclu complet durează aproximativ 24 de ore. În zona corticală.

recirculante. cât şi cu anticorpii. solubilitatea). factorii genetici. ei stimulând direct limfocitele B pentru a produce anticorpi Ig. adăugarea unor substanţe cu efect sinergetic. După generarea lor în măduva osoasă. respingerea de grefe şi tumori. prin care la un nou contact cu antigenul. cum sunt: reacţiile de hipersensibilitate cutanată întârziată. inhalare). antigeni independenţi de timus: nu necesită celule T pentru producţia de anticorpi. astfel : a.3. Răspunsul imun primar are loc la primul contact al limfocitului cu antigenul. Anumite molecule numite haptene deşi nu sunt capabile să provoace răspunsuri imunitare ele însele. calea de intrare (injecţie intradermale. proteine plasmatice circulante şi sunt răspunzătoare de imunitatea umorală. care influenţează calitatea răspunsului imun. Molecule cu rol esenţial în cadru sistemului imunitar 10. Limfocitul se transformă în limfoblast (imunoblast) care are un nucleu palid cu o cantitate mare de eucromatină şi 2 .purtător pentru a fi antigeni. cum ar fi medicamentele. Antigenii sunt la rândul lor împărţiţi în mai multe categorii. de exemplu adjuvante alţi antigeni etc. 10. asemenea antigeni sunt polizaharidele bacteriale (din pereţii celulari bacteriali) şi endotoxinele. intravenoasă. printre care se pot enumera: natura moleculelor (conţinutul de proteine. reţinând în memoria lor primul contact cu acelaşi antigen. care participă ultimile la răspunsul imun şi limfocitele T de hipersensibilitate întârziată. doza (mică. glicoproteine care mediază răspunsul inflamator. 203 . Unele limfoblaste se diferenţiază în plasmocite. Pentru anumite chimicale. răspunzătoare de reacţii imune mediate celular. intramusculară.reglatoare care pot amplifica (celule helper) sau pot suprima (celule supresoare) răspunsurile altor limfocite (T sau B) şi limfocite T efectoare. b. Există şi alţi factori diferiţi de proprietăţile intrinseci ale antigenilor. care eliberează limfokine (citokine). purtătorul poate fi o (auto)proteină gazdă. limfocitele B se divid şi dau naştere la clone celulare B. Asemenea molecule trebuie să se asocieze cu moleculele . eliminarea de celule infectate etc. ca şi secvenţa de aminoacid este importantă pentru determinarea caracterului antigenic. Antigenii Antigenul (Ag) este capabil să provoace un răspuns imun.3. pot însă să reacţioneze cu anticorpi existenţi şi cu celule T receptoare. iar altele devin circulante. antigeni dependenţi de timus necesită participarea celulelor T pentru a provoca producerea de anticorpi (exemple de asemenea antigeni sunt serurile de proteine străine şi celulele roşii străine de corp). celulele cu memorie îl recunosc şi se transformă mai rapid în imunoblaste. moderată. subcutanată. transformându-se în celule cu memorie. Lipidele pure nu sunt antigeni (nu provoacă un răspuns imun). celulele B imunocompetente migrează în arii specifice din organe limfoide periferice. Din această categorie fac parte limfocitele T citotoxice (celule killer). O moleculă antigenică poate avea mai mulţi determinanţi antigenici (epitopi): fiecare epitop se poate lega cu un anticorp individual şi o singură moleculă care poate deci provoca mai multe molecule de anticorpi.. După activare.4 nucleoli. în funcţie de factorii necesari a interveni pentru provocarea răspunsului imun. pe cale orală. care răspund la reexpunerea la antigen prin proliferare şi diferenţiere prin celule B de memorie şi plasmocite. mărimea. Structura terţiară. Limfocitele B şi celulele plasmatice produc anticorpi sau imunoglobuline (Ig). Aceste celule au viaţă scurtă ca şi celulele T şi necesită expunerea la antigen pentru a se maturiza în celule B sensibilizate. iar acizii nucleici sunt de asemenea slabi antigeni. Se dezvoltă astfel un răspuns imun secundar. Rolul principal al limfocitelor B este în realizarea imunităţii rapide. celule care produc imunoglobuline.1. El reacţionează atât cu receptorii celulelor T. mare). Limfocitele B.

IgG este o imunoglobulină mai mică.două lanţuri identice usoare (L).domeniul constant al lanţului uşor. în sprecial a viruşilor. . . rolul major al acestor imunoglobuline fiind neutralizarea vasculară a microorganismelor.IgE este imunoglobina produsă de plasma celulelor. Fiecare lanţ este alcătuit din domenii de aproximativ 110 aminoacizi.2 % din totalul imunoglobulinelor. ea este o secreţie a mucoaselor şi constă din două unităţi de bază unite printr-un lanţ de legătură. Fig. VH. reprezintă 15 % din totalul imunoglobulinelor. constituită din patru unităţi de bază menţinute într-o structură unitară de un lanţ de legătură. care poate uşor penetra ţesuturile. deşi se bănuieşte că este implicată în expulzarea paraziţilor intestinali. provenite din celule B. Când un domeniu terminal N al unei molecule de imunoglobuline a reacţionat cu un anticorp. molecula suferă o schimbare în conformaţia lanţurilor grele. Învecinat cu regiunea variabilă a moleculei de anticorp se află regiunea constantă C. Secvenţa de aminoacid a acestor domenii terminale variază de la anticorp la anticorp. Anticorpii Anticorpii (Ac) sau imunoglobulinele (Ig) sunt molecule proteice heterogene cu proprietatea de asociere specifică cu substanţa care a provocat formarea lor (antigenul). Principalele clase de imunoglobuline sunt următoarele: . reprezintă 0. La electroforeza serului. Sunt produşi de celulele B şi plasmocite. în secreţii exocrine. Ig reprezintă receptorul celulei B pentru Ag. precum şi funcţia fiziologică a unei molecule particulare de anticorp.IgA este imunoglobulina cea mai importantă care apare în mucoase.domeniul variabil al lanţului greu.10. pe suprafaţa limfocitelor. 129).Structura de bază a unui anticorp. dar principalul ei rol fiziologic nu este încă cunoscut. reprezintă 75 % din totalul imunoglobulinelor. de aceea sunt cunoscute sub numele de regiuni variabile V. majoritatea Ig migrează spre gamaglobuline. este singura imunoglobulină care penetrează placenta pentru a furniza protecţie imunologică fătului. CL .IgM are o moleculă mare. Domeniile au aceeaşi structură de bază şi la compararea secvenţelor de aminoacizi se pot pune în evidenţă multe arii similare. în inflamaţii şi alergii. constituită dintr-un domeniu în cazul lanţurilor uşoare şi din trei domenii în cazul celor grele (fig. Domeniul terminal N al lanţurilor grele si al celor uşoare este foarte important pentru recunoaşterea antigenilor. reprezintă 0. CH. Cu excepţia Ig naturale.3.04 % din totalul imunoglobulinelor. anticorpii se formează ca răspuns la o substanţă străină (Ag). . .două lanţuri identice grele (H). Un anticorp în structura sa de bază este alcătuit din patru lanţuri: . diferite cantităţi de Ig se găsesc în lichidele extravasculare.domoniul constant al lanţului greu. deoarece el cuprinde zona de legătură. 129 . Imunoglbulinele reprezintă 20 % din totalul proteinelor plasmatice. Lanţurile grele determină clasa (isotipul) anticorpului.2. reprezintă 10 % din totalul imunoglobulinelor. 204 .IgD este imunoglobina sccretată de limfocitele B şi probabil implicată în activarea acestor celule de către antigeni. . dar cantităţi semnificative migrează şi spre zona betaglobulinică. VL .reprezintă domeniul variabil al lanţului uşor.

131 . ambele lanţuri de celule T receptoare au regiuni variabile.3.5.antigeni HLA de clasa II.Structura celulei receptoare T La fel ca imunoglobulinele. adică variabilitate genetică între indivizi. Celulele receptoare T prezintă două lanţuri. În figura 131 se prezintă structura acestor antigeni. 205 .4. Deşi monokinele pot fi induse direct de microbi. Majoritatea indivizilor care nu sunt înrudiţi prezintă antigeni HLA diferiţi.Structura unor antigeni 10. după prelucrarea lor de către celulele de prezentare (macrofagele). Celule T Celulele T recunosc un antigen atunci când le este prezentat într-o formă adecvată. Aceste similarităţi au dus la presupunerea că genele pentru celulele T receptoare îşi au originea în aceleaşi gene părinte ca genele pentru imunogiobuline. adică în general. Citokinele Fazele de desfăşurare ale imunităţii naturale şi specifice (împotriva virusurilor şi bacteriilor.3. Fig.10. ele pot fi de asemenea secretate de fagocitele mononucleare celulelor T stimulate antigenic deci ca parte a imunităţi specifice. Antigenii de histocompatibilitate umani sunt cunoscuţi sub denumirea de antigeni HLA şi sunt la rândul lor de două tipuri: .antigeni HLA de clasa I. . Acestea sunt glucoproteine de la suprafaţa celulelor şi au un grad avansat de polimorfism genetic. Antigeni de histocompatibilitate Aceşti antigeni nu sunt atât de bine definiţi. Au denumirea dc antigeni de histocompatibilitate din cauza reacţiilor foarte puternice pe care le provoacă în cazul nepotrivirii transplanturilor de organe. iar lanţurile sunt pliate. ambele fiind membre ale familiei de „supergene". 10. În imunitatea naturală citokinele efectuare sunt produse in special de fagocitele mononucleare şi astfel sunt numite monokine. sunt în mare parte mediate de hormoni proteinici numiţi citokine. regiunile constante sunt alcătuite din domenii. Fig. Sunt implicate în recunoaşterea antigenilor de către majoritatea celulelor T. deci este foarte dificilă obţinerea unei potriviri a acestor antigeni în cazul unor transplanturi de organe de la indivizi neînrudiţi.3.3. dar au un rol important în răspunsul imun. Structura probabilă a unei astfel de celule este prezentată în figura 130. de exemplu).130 . alfa şi beta.

interleuchina. acţiunea este endocrină. de fapt fiind implicate mai multe citokine diferite). neutrofilele şi eozinofilele. ƒ activatori ai celulelor inflamatoare nespecifice (induse ca răspuns la recunoaşterea antigenului specific de limfocitele T). ca in cazul hormonilor adevăraţi. Odată sintetizate citokinele sunt rapid secretate.De asemenea. ce stimulează creşterea şi diferenţierea leucocitelor imature in măduva oaselor. In imunitatea specifică. Pentru multe celule ţintă. . adică ca factori de creştere (de pildă. creşterii şi diferenţierii limfocitelor (induse în răspunsul recunoaşterii antigenului specific de limfocitele T). citokinele influenţează acţiunea altor citokine (doua citokine pot avea acţiune antagonică. ƒ regulatori ai activităţii.citokinele sunt produse în timpul fazelor efectuare ale imunităţii naturale şi specifice şi servesc medierii şi reglării răspunsurilor imune şi inflamatorii.factorul de necroza tumoare. proprietate numită pleiotropism.interferonii tip I. citokinele sunt un grup divers de glicoproteine. combinaţia unei perioade scurte de transcripţie cu o durată de viaţă a ARNm pentru citokine determină caracterul tranzitoriu al sintezei citokinelor. monokinele joacă roluri importante fiind continuatori ai activării limfocitelor.secreţia citokinelor este un eveniment self-limitat scurt. având următoarele proprietăţi generale: .multe citokine sunt produse de diverse tipuri celulare. Când aceeaşi celulă ţintă secretă citadine acţiunea se numeşte autocrină. moleculele de ARNm sunt instabile. ƒ stimulatori ai creşterii leucocitelor imature şi ai diferenţierii (produşi de limfocite stimulate şi alte celule). asupra multor tipuri de celule diferite. . amplificând astfel mecanismele pentru răspunsurile imune specifice. ca şi alţi hormoni polipeptidici iniţiază acţiunea lor prin legarea la receptorii specifici de pe suprafaţa celulelor ţintă. Prin urmare. Citokinele produse deci de tipuri celulare diverse. .citokinele. acţionează de asemenea. Citokinele ce mediază imunitatea naturală Citokinele ce mediază imunitatea naturală împotriva infecţiei virale şi pe cea care iniţiază reacţiile inflamatorii împotriva bacteriilor sunt următoarele:. de exemplu). -1. Expresia multor receptori ai citokinelor este reglată de semnale specifice (care pot fi alte citokine.ori sinergică-efect crescut ori adiţionale). Citokinele nu sunt stocate ca moleculele pre-formate şi sinteza lor este iniţiată de o nouă transcripţie genică. după o perioadă de câteva ore şi necesită un nou ARNm şi sinteza proteică. derivate din celulele T activează şi reglează celulele inflamatorii care sunt fagocitele mononucleare. majoritatea citokinelor sunt produse de limfocitele T activate şi se numesc limfokine. citokinele acţionează ca regulatori ai diviziunii celulare. Funcţiile citokinelor sunt clasificate astfel: ƒ mediatori ai imunităţii naturale (induse de agenţi infecţioşi din fagocitele mononucleare).interleukina-6: . . . Majoritatea răspunsurilor celulare la citokine este lentă. 206 . . de asemenea. Activarea transcripţională este tranzitorie. Celulele T produc câteva citokine ce reglează activarea. când o celula din apropriere secretă citokină. Aceste citokine sunt molecule efectuare ale imunităţii imediate celular şi sunt. responsabile pentru comunicaţiile dintre celulele sistemelor imune şi inflamatorii. Alte citokine. .acţiunile citokinelor sunt deseori redundante.citokinele inflamatorii cu greutate moleculară joasă. citokinele influenţează sinteza altor citokine. creşterea şi diferenţierea populaţiilor limfocitare variate. Limfocitele şi fagocitele mononucleare produc şi alte citokine numite factori stimulatori ai coloniei. iar când o celulă este stimulată de la distanţă prin citokinele secretate în circulaţie. ca factori de creştere epiteliali şi mezenchimali în repararea tisulară). acţiunea se numeşte paracrina.

FNT este un costimulator al activităţii celulei T. IFN creşte potenţialul letal al limfocitelor nativ ucigaşe. Sursa celulara majoră a acestui factor sunt fagocitele mononucleare activate de lipopolizaharidul (endotoxina) derivat din peretele celular al bacteriei. hepatocitele să sintetizeze anumite proteine serice. prevenind activarea ajutătoare. 6. De asemenea JFNT exercită acţiuni sistematice diverse (este un hidrogen endogen. 5. etc. 4. FNT permite celulelor endoteliale să devină adezive pentru leucocite iniţial pentru neutrofile. mărind eficienţa uciderii. al concentraţiei scăzute (cea 10-9 M) acţionează local ca regulator paracrin şi autocrin al leucocitelor şi celulelor endoteliale. ca principal factor de creştere. Deoarece majoritatea limfocitelor citolitice recunosc antigenele străine legate de clasa I de antigene ale complexului major de histocompatibilitate IFN ajută faza efectuare a răspunsurilor imune mediate celular. stimulează diferite celule în răspunsul imun.). sinteza care interferă cu replicarea ADN ori ARN viral. Acei interferoni cresc expresia moleculelor din clasa I şi inhibă expresia celor din clasa II. FNT activează leucocitele inflamatori pentru a omorî. IFN de tip I inhibă replicarea virală: IFN induce sinteza unui număr de enzime. acţionează concertat eradicarea infecţiei virale. reduce presiunea sanguina şi perfuzii. adică celula infectată viral secretă IFN pentru protecţia celulelor vecine încă neinfectate. 2. Această acţiune este datorită aceloraşi enzime care inhibă replicarea virală dar şi inducţiei altor enzime ce previne sinteza aminoacizilor. Prin urmarea cele trei activităţi funcţiilor litice ale limfocitelor ucigaşe si creşterea in expresia moleculelor din clasa I a complexului major de histocompatibilitate.) Interleukina-1 (IL-1) Funcţia principală a IL-1 este acea de mediator al răspunsului inflamator în imunitatea naturală. 207 . IFN modulează expresia moleculară autogenelor de histocompatibilitate. FNT exercită o acţiune protectoare împotriva viruşilor şi amprente expresia clase I de molecule ale complexului major de histocompatibilitate potenţând liza mediata de limfocite asupra celulelor infectate viral.Interferonul tip (IFN I) Include două grupe de proteine distincte serologic şi anume IFN-A (produse de fagocit molecular în principal) şi IFN-B (produse de fibroblast) având patru acţiuni biologice: 1. Interleukina-6 (IL-6) Este sintetizată de celule endoteliale. 3. 5. etc având două acţiuni binecunoscutele hepatocite (care sintetizează fibrinogen ce contribuie la faza acută) şi pe celulele B. astfel: 1. Factorul de necroză a tumori (FTN) Este principalul mediator al răspunsului gazdei la bacterii gram negative. ca 2-1oligoadenilat. etc.în acelaşi timp. în special a aminoacizilor esenţiali ca triptofanul. FNT induce sinteza CSF de către celule endoteliale şi fibroblaste. FNT stimulează fagocitele mononucleare şi alte celule Nn produc citokine. 3. cauzează trombon intravasculară. Se spune că o celulă care a răspuns la IFN şi este rezistentă la infecţia virală se află intr-o stare antivirală. simulează fagocitele mononucleare să secrete IL-1 Ni IL 6. 4. iar în concentraţii mari poate avea efecte letale (deprimă contractilitatea miocardului. Sursa celulară a IL-1 este fagocitul mononuclear activ. 2. fibroblaste.etc. apoi pentru monocite care se acumulează la locurile inflamaţiei. IFN inhibă proliferarea celulară. Local. Acţiunea antivirală a IFN este de tip paracrin. Acest factor. IFN poate inhibă faza cognitiv a răspunsurilor imune. în special IL-1 Ni IL-6. acest factor măreşte proliferarea celulelor T CD şi creşterea şi diferenţierea celulelor B. în special neutrofilele dar şi eozinofilele mononucleare.

În timpul răspunsurilor imune fiziologice.3 nm). 4. IL-2 acţionează pe celulele B umane ca un factor de creştere cât şi un stimul pentru sinteza anticorpilor. 3. IL-2 stimulează creşterea celulelor nativ ucigaşe şi măreşte funcţia lor catalitica (sunt produse aşa numite celule killer-activate de limfokinază). Citokinele ce acţionează primar pentru a regla limfocitele. β factorul de transformare a creşterii (β -FTC). IL-4 este un factor de creştere autocrin pentru un subset de celule T CD clonate c secretă IL4JL-5 Ni IL-6 în contrast cu majoritatea clonelor cere produc IL-2. Acţionează de asemenea pe limfocitele T din apropiere (pe ambele substraturi CD şi CD) şi deci este totodată şi un factor de creştere endocrin. 2. IL-4 este singurul factor comutator cunoscut pentru producerea IgE. creşterea şi diferenţierea Aceste citokinele sunt produse în principal de limfocitele active antigenic. Citokinele ce reglează activarea limfocitelor. capătul C-terminal formând helixul ce se extinde de la poziţia 117 la 133 în secvenţele de aminoacizi. Aceste celule T sunt utile atât pentru răspunsul imun mediat umoral. fagocite mononucleare. Principalele ei acţiuni pe limfocite sunt: Interleukina-2 este factorul de creştere endocrin major pentru limfocitele T Ni cantitatea de IL-2 sintetizată de celulele T CD activate este un determinant important al magnitudinii răspunsurilor imune. Interleukina (IL-4) IL-4 este produsă de celule T CD Ni are efecte importante pe patru timpuri de celule: IL-4 este un factor de creştere şi diferenţiere pentru limfocitele B (putând fi necesară atât pentru proliferare cât şi pentru secreţia anticorpilor de celulele B ca răspuns la antigenele proteice). sunt interleukina-2. în special din subsetul CD. menţionăm că în structura tridimensională a proteinei a fost identificat recent un helix necesar pentru folding-ul terţiar bioactiv—care este un mănunchi afla. s-a sugerat recent că IL-4 poate contribui si la imunitatea mediată celular. fibroblaste sau celule epiteliale. IL-4 este un factor de creştere pentru mastocite şi acţionează sinergic cu IL-3 Nn stimularea proliferării mastocitelor.Citokinele inflamatorii cu greutate moleculara joasă: familia interlekina-8 Aceste citokine inflamatorii derivă din: a. Deoarece IL-2 este considerat in prezent o "cheie" în imunologia celulei T şi un agent terapeutic promiţător în lupta anticanceroasă. Este produsă în special de celulele T. plachete. IL-4 este de asemenea un factor de activare a macrofagelor (chiar dacă efectele de potenţare sunt mai reduse decât efectele gama-interferonului). CD acţionează pe aceleaşi celule care o produc. ce nu circula în sânge pentru a acţiona la distanţă şi de aceea nu este considerată un factor de creştere endocrin. Ele servesc ca principali mediatori secundari ai inflamaţiei. interleukina4. 208 . c. gamainterferon şi limfotoxină. De asemenea. b. Interleukina-2 (IL-2) IL-2 este principala citokină responsabilă pentru trecerea limfocitelor T de la fazi G la faza S a ciclului celular. celule T activate antigenic. în mare parte prin secreţia citokinelor. deci ea funcţionează ca un factor de creştere endocrin.helical antiparalel (0.celule endoteliale. cât şi pentru acela mediat celular. 1.

inhibă maturarea celulelor CTL1. Limfotoxina Limfotoxina este sintetizată de celulele T şi de obicei acţionează local ca un factor paracrin şi nu ca mediator al injuriei sinteticele este un activator potent al neutrofilelor furnizând limfocitelor un mijloc de reglare a reacţiilor inflamatorii acute. uneori însă poate fie să inhibe creşterea aceluiaşi tip celular în cultură.ca şi interferonul tip I . interleukina-5 şi factorul de inhibare a migrării. Astfel. un proces numit angiogeneză. Acţiunile acestui factor sunt pleiotropice. 209 . El induce direct sinteza enzimelor ce permit macrofagelor să omoare microbii fagocitaţi. însă are câteva proprietăţi legate de imunoreglare care ii separă funcţională de IFN tip I. 6. β . 4.FTC determina creşterea de noi vase sanguine.FTC) Celulele T activate antigenic cât şi macrofagele activate secretă β . LT este. gama-IFN este principalul factor de activare a macrofagelor şi el furnizează mijloace prin care celulele T activează macrofagele. 3. Gama-IFN creşte expresia moleculară din clasa I de antigene a complexului major de histocompatibilitate.FTC inhibă proliferarea celulelor T la miogen policlonali. O acţiune importantă.Factorul β de transformare a creşterii ( β . IL-5 este capacitatea de a stimula centra şi diferenţierea eozinofilelor şi de a activa eozinofilele mature ca acestea sa poată omorî helminţii. β . producerea citokinelor şi modificări morfologice ce facilitează extravazarea leucocitelor. în contrast cu IFN tip I care. În imunoreglare. la o varietate de tipuri celulare.FTC este potenţiala important deoarece antagonizează multe răspunsuri ale limfocitelor. În vivo. 5. Citokinele ce activează celulele inflamatorii Aceste citokine provin în principal din limfocite T CD şi CD şi servesc în special activării funcţiilor celulelor efectoare nespecifice. inhibă activarea macrofagelor. Ca o citokină. Gama-IFN este un activator potent al celulelor nativ ucigaşe (mai mult decât IFN tip l). de asemenea un activator al celulelor endoteliale vasculare acuzând creşterea aderării leucocitelor la endoteliu. Este produs atât de celulele T ajutătoare CD ce secretă IL-2 cât de celulele T CD. De exemplu. etc. anumite tumori pot scăpa de un răspuns imun secretând mari cantităţi de β . aceste citokine mediază faza efectoare a răspunsurilor imune mediate celulare şi ele includ gama-interferon. Gama-IFN este un activator important al fagocitelor mononucleare.o stare antivirală şi antiproliferativă. El inhibă creşterea multor tipuri celulare şi stimulează creşterea altora. determină expresia moleculară din clasa 11 a acestui complex. Citokinele care cauzează modificări funcţionale în favoritele mono nucleare au fost numite factori de activare a macrofagelor. limfotoxină. Interleukina-5 (IL-5 ) Este produsă de celulele T CD activate şi mastocitele activate. β . Astfel.FTC. Gama-IF acţionează direct pe limfocite T şi B pentru a promova diferenţierea. Gama-IFN este un activator al celulelor endoteliale vasculare (promovând adeziunea limfocitelor CD şi alterează caracterele morfologice ce facilitează extravazarea limfocitelor). acest interferon are următoarele funcţii: 1. 2. Interferonul imun sau gamma (gamma-IFN) Acest interferon (numit şi interferonul tip II) induce . β . Gama-IFN activează neutrofilele (însă mai puţin decât FTN sau limfotoxină).FC biologic activ.FTC cauzează sinteza proteinelor matrice extracelulare asemenea.

Acţiunile acestor citokine sunt influenţate de alte citokine. factorul de stimulare a coloniei granulocitelor B. IL-6 acţionează ca factor de creştere pentru multe celule maligne plasmatice (plasmacitoame sau mieloame) B. De exemplu FNT. astfel multe celule tumorale ce cresc autonom secretă IL 6 ca un factor de creştere autocrin.celule dendritice (celule de prezentare. 10. citokinele exercită numeroase funcţii utile organismului. diferite izotipuri de anticorpi se leagă la receptorii Fc pe eozinofile. însă în cazul producerii lor excesive se poate instala dezordinea tisulară şi chiar moartea. adică celulelor canceroase. în asociaţie cu produsul unei gene a self-ului.4. respectiv macrofagele). măresc răspunsul la aceşti factori. IL-6 promovează creşterea celulelor somatice hibride produse prin fuziunea celulelor B normale cu celule mielomului. Se ştie că maturarea unei leucocite implică comutarea la o linie particulară cu pierderea capacităţii de dezvoltare în alte tipuri de celule mature. În plus. LT.limfocite B. 210 . complex major de histocompatibilitate. în timp ce IL-l. lg de la suprafaţa celulei B este receptorul celulei B pentru antigen.Factorul de inhibare a migrării Acumularea fagocitelor mononucleare în ţesuturi depinde de reţinere acestor celule ca răspuns la citokinele produse local ce inhibă motilitatea. Acest factor nu reprezintă o citokină unică. IL-6. fiind donate molecule cu această activitate. prezente pe suprafaţa celulelor accesorii sau celulelor ţintă. activează sistemul complement. Limfocitele T helper şi citolitice specifice pentru antigenele proteice străine recunosc deci simultan două structuri. FTC inhibă creşterea celulelor din măduva oaselor. Moleculele de anticorpi secretaţi neutralizează antigenele. mastocite şi celule native ucigaşe şi stimulează funcţiile acestor celule ca pe o consecinţă a legării antigenului. vizează progeniturii hematopoietice comutaţii la linia limfocitelor B. Alţi receptori Fc de pe celulele epiteliale mediază transportul transepitelial al anticorpilor IgA si IgG. Celulele accesorii cel mai bine definite pentru limfocite T helper includ: . În concluzie. obsonizează antigenele şi amplifică fagocitoza lor de către diferite celule. acţiunea inteleukina-7. Se considera în prezent că reţinerea leucocitele în ţesuturi este controlată de exprimarea recepţionerilor specifici pentru moleculele matrice extracelulare. fiecare din aceştia putând fi recunoscuţi de un anticorp. Citokine ce stimulează hematopoieza Reacţiile imune şi inflamatorii care consumă leucocitele induc producerea de noi leucocite care înlocuiesc celulele inflamatorii. Mai mult. interleukina-7. Citokinele ce stimulează expansiunea şi diferenţierea progenitorilor din măduva oaselor sunt denumite factori de stimulare a coloanei (FSC). celulele T recunosc şi răspund la antigenele proteice străine numai când antigenul este ataşat de suprafaţa altor celule. gama-IFN.fagocitele mononucleare. Relaţii de cooperare între componentele sistemului imun Antigenele macromoleculare conţin epitopi multipli sau determinanţi. în timp ce celulele B şi anticorpii secretaţi leagă antigenele solubile aflate în circulaţie sau în faza apoasă. antigenul străin şi o moleculă MHC self. cum sunt integrinele. Anticorpi sunt produşi in RER al celulei B. Celulele T recunosc antigenul numai pe suprafaţa celulelor accesorii. Ele servesc creşterii chiar şi a celulelor nemuritoare. . factorul de stimulare a coloniei granulocite-macrofag. . adică a "hibridoamelor"ce produc anticorpi monoclinali. Prin urmare. recent descrisă. De exemplu. În timp ce interleukina-3 (cunoscută ca factor de multitudine) promovează expansiunea celulelor ce se diferenţiază în toate tipurile de celule mature cunoscute. Mediatorii creşterii leucocitelor imature B ai diferenţierii lor sunt interleukina-3 de stimulare a coloniei macrofagelor.

Antigenele ţintă pentru CD+8 CTL sunt proteine sintetizate endogen. celulele B exprimă receptori de înaltă afinitate pentru câteva citokine incluzând IL-1.celule Langerhans ale pielii. activitate crescută a proteinkinazei C. apoi câteva proteine sunt fosforilate. Cele mai timpurii evenimente din această cascadă includ modificarea fosfolipidelor membranare. În plus la Ig şi clasa II ale complexului major de histocompatibilitate (cu rol în interacţiunea celulă T-B). artrita reumatoidă. IL-5 şi IL-6. dar nu altele. care sunt procesate şi asociate cu moleculele complexului major de histocompatibilitate clasa I. răspunsurile anticorpului sunt iniţiate prin interacţiunea antigenului cu molecule Ig specifice de membrană de suprafaţa limfocitelor B. IL-2. . însă exprimarea acestora este crescută pe celulele B stimulate via Ig din membrană. diabetul insulinodependent etc). 211 . Aceste complexe sunt exprimate pe suprafaţa celulelor accesorii. Rezultatul legării antigen-complex major de histocompatibilitate la celulele T este o serie de evenimente intracelulare numite cu un termen comun activarea celulei T care începe cu generarea celui de al doilea mesager şi terminarea cu dezvoltarea funcţiilor efectuare şi proliferarea celulei T.ele pot funcţiona activând ori reglând celula B. sindromul Sjogren cât şi o serie de boli autoimune (de exemplu lupusul sistemic eritomatos. . cu anticorp anti-lg sau prin alţi activatori policlonali. Reglarea expresiei genelor complexului major de histocompatibilitate clasa II reprezintă un punct de control important pentru răspunsurile imune. Genele complexului major de histocompatibilitate clasa I funcţionează ca gene ale răspunsului imun.beta) legaţi prin legături disulfidice ce sunt omologi moleculelor Ig. Anomaliile antigenelor de histocompatibilitate asociate unor boli ca spondilita anchilozantă. limfocitele B exprimă o varietate de proteine de suprafaţă cu semnificaţie funcţională (incluzând receptorul C3d pentru virusul Epstein Barr). Proteinele exogene străine sunt internalizate în celulele accesorii unde suferă procesarea într-un compartiment vezicular acid. Diviziunea mitotică a celulelor T are ca rezultat expansiunea clonelor de celule cu aceiaşi specificitate antigenică şi astfel amplifică răspunsurile imune la un antigen particular. Aceste proteine de pe suprafaţa celulelor B sunt importante deoarece: . unde sunt recunoscute de celulele T CD+4. Prin urmare. În general celulele B în repaos exprimă un număr scăzut de receptori pentru citokine (de la câteva sute la 1.. IL-4. Multe tipuri celulare au capacitatea de a prezenta antigenele celulelor T ajutătoare CD+4. astfel ca antigenele virale. . CD4 şi CD8 sunt glicoproteine de suprafaţa exprimate exclusiv pe sub seturi de celule T mature cu modele distincte de restricţie a complexului major de histocompatibilitate. Celulele T limitate la un complex de histocompatibilitate exprimă clonal receptori proteici heterodimerici (alfa. Pe limfocitele B se găsesc markeri fenotipici şi moleculari funcţionali de suprafaţă. Limfocitele T helper CD+4 recunosc antigenele în asociaţie cu produsele clasei a doua a complexului major de histocompatibilitate şi celulele CD+8.000 per celulă). De exemplu. CTL 1 recunosc antigenii în asociaţie cu produsele genice din clasa întâia complexului major de histocompatibilitate. Aceşti receptori leagă specific antigenul procesat complexat la moleculele complexului major de histocompatibilitate de suprafaţa celulelor (APC 1). hemocromatoza idiopatică. dermatita herpetiformă.ele pot fi de markeri fenotipici de maturitate şi ai liniei de celule B. creşterea concentraţiei în calciul citoplasmatic.anticorpi împotriva proteinelor de suprafaţă pot fi utilizaţi să localizeze şi să trateze tumori derivate din limfocitele Bd) unele proteine de suprafaţă sunt receptori pentru citokine.celulele endoteliale. Aceşti mesageri secundari stimulează transcripţia genelor necesare pentru răspunsurile proliferative şi efectoare ale celulei T. Procesarea asigura ca porţiuni ale unei proteine (heptone imunodominante) se vor lega la moleculele clasei II a complexului major de histocompatibilitate şi vor forma complexe imunogenice. produsele lor se leagă selectiv şi prezintă unele antigene. miastenia gravis.

Ele sunt stimulate ca şi macrofagele. specii reactive de oxigen. în faza efectuare a răspunsurilor imune umorale antigene străine. Fagocitele mononucleare joacă următoarele roluri în faza cognitivă. ƒ în faza de efectuare a răspunsurilor imune mediate celular celulele T ajutătoare secretă citokine ce activează macrofagele. toate acestea omorând microbii. de exemplu eritrocite senescenţe). Ele secretă şi conţin în membrană proteine ce promovează activarea celulei T. limfocitelor T ajutătoare.Această interacţiune stimulează celulele B să intre în ciclul celular. ele distrug 212 . deoarece joacă roluri importante în inflamaţie şi imunitatea naturală. probabil via producere de mesageri secunzi intracelulari. Principalele funcţiuni ale fagocitelor mononucleare (monocite. Diferite citokine induc proliferarea celulelor B. Granulocitele. Astfel. de activare şi efectuare a răspunsurilor imune specifice: ƒ Macrofagele dispun antigene străine pe suprafaţa lor intr-o formă ce poate fi recunoscută de limfocitele T antigene specifice. T şi B. antigenele proteice ale celulei T sunt procesate de către celulele B şi prezentate în asociaţie clasa II de molecule ale complexului major de histocompatibilitate. În plus. prezentând antigenele celulelor T şi secretând citokine ce promovează expansiunea şi diferenţierea ambelor feluri de limfocite. macromolecule. incluzând antigene şi chiar ţesuturi proprii vătămate ori moarte. Celulele accesorii (de exemplu macrofagele) pot juca un rol important în iniţierea răspunsului imun. la limfocite şi fagocitele mononucleare. macrofagele participă la eliminarea antigenelor străine prin răspunsuri imune umorale. creşterea temperaturii locale). Eozinofilele exprima receptori Fc pentru o clasă de anticorpi IgE. Ele posedă receptori pentru porţiunea Fc a anticorpilor şi pentru proteinele complementului. Capacitatea macrofagelor şi limfocitelor de a-şi stimula unele altora funcţiile dovedesc un mecanism de amplificare importantă pentru imunitatea specifică. În plus. ca prostagladinele. astfel ca paraziţi. Macrofagele astfel activate sunt mai eficiente in realizarea funcţiilor fagocitice. Interacţiunea limitată la complexul major de histocompatibilitate dintre celula B şi limfocitele T ajutătoare furnizează ea însăşi semnale activatoare celulelor B restante şi conduce la secreţia diverselor citokine de către celulele T. degradative şi citolitice decât celulele nestimulate. În plus. aceste celule secretă enzime. ele leagă şi fagocitează particulele opsonizate mult mai avid decât pe cele neînvelite (neopsonizate). Deoarece macrofagele exprimă receptori de suprafaţă pentru anticorpi şi anumite proteine ale complementului. macrofagele figurează printre principalele celule efectuare ale imunităţi medie celular. ƒ Macrofagele produc de asemenea factori de creştere pentru fibroblaste şi endoteliul vascular ce promovează repararea ţesuturilor vătămate. secreţia anticorpilor şi alte trăsături ale răspunsului imun umoral la antigenele proteice. ƒ macrofagele produc citokine care recrutează alte celule inflamatorii. macrofage) în imunitatea naturală includ următoarele: ƒ macrofagele fagocitează particule străine (microbi. În acest fel. numite şi celule inflamatorii. controlând întinderea infecţiei şi pot vătăma chiar ţesuturile normale în imediata vecinătate. devin învelite sau opsorizate de anticorpi şi proteine ale complementului. mediatori derivaţi din lipide. de citokinele derivate din celula T şi fagocitează particule opsonizate. în special neutrofile şi sunt responsabile pentru multe din efectele sistemice ale inflamaţiei ( febra. au şi funcţia de a elimina microbi şi celulele moarte. fiind efectori importanţi in reacţiile imune la antigenii ce induc nivelele ridicate de IgE. Neutrofilele răspund rapid la stimuli chemotactici putând fi iniţial activate de citokinele produse de macrofage. ca microbii. migrând şi acumulându-se la locuri de activare a complementului. substanţele fagocitate sunt degradate de enzimele lizozomale. alte leucocite şi granulocite participă în faza efectuare a răspunsurilor imune specifice. tumefierea. eritemul. Ele fagocitează particule opsorizate şi funcţionează ca celule efectuare ale imunităţi umorale.

Bazofilele şi mastocitele exprimă receptori de înaltă afinitate pentru IgE şi leagă astfel anticorpi IgE. 10. . Prin urmare. astfel: . Imunopatia instalată în anumite cazuri poate conduce deci la cronicizare ori moarte. De pildă efectele antitumorale ale interleukinei-1 pot fi înregistrate prin 3 mecanisme: ƒ direct citolitic. 213 . datorate producerii de anticorpi IgE. Unele dintre ele sunt responsabile cu recunoaşterea. iar altele cu efectuarea acţiunii. responsabili cu neutralizarea. când rezultă un defect în unul din efectorii sistemului imun (limfocitele T şi B. .celule T ajutătoare – actionează pentru pregătirea terenului de acţiune a celulelor T efectoare şi supresoare şi a celulelor B.5. Creşterea şi diferenţierea eozinofilelor sunt stimulate de o citokină derivată din celula T helper numită interleukina-5. ƒ activarea celulelor imune. aceste granulocite sunt celule efectuare ale hipersensibilităţi imediate datorită IgE. producătoare de Ig. Celulete T pot fi la rândul lor împărţite în trei categorii. În sfârşit.in alergie. De asemenea. acţiunea celulelor T ajutătoare. Limfocitele efectoare sunt de două tipuri: celule B şi celule T. proteinele complementului) se vorbeşte de imunocompromis. astfel încât activarea celulei T herper poate contribui la acumularea eozinofilelor la locurile cu reacţii de infestare parazită şi alergice. producţia excesivă ori acţiunile citokinelor pot conduce la distrucţie tisulară şi chiar moarte. în funcţe de natura lor. Este ştiut că interferonii. citokinele servesc multor funcţiuni ce sunt critice în apărarea împotriva agenţilor patogeni şi furnizează legături între imunitate specifică şi naturală. acţiunea celulelor T efectoare şi a celulelor B. Cum s-a spus anterior. Baza umorală a răspunsului imun Este mediată de celulele B. citokinele asigură mecanisme de amplificare importante ce fac capabile limfocitele în număr scăzut. Citokinele reglează de asemenea amplitudinea şi natura răspunsurilor imune prin influenţarea creşterii şi diferenţierii limfocitelor. Eozinofilele sunt numeroase la locurile reacţiilor de hipersensibilitate imediată. S-a stabilit că limfocitele sunt celule care iniţiază răspunsul imunitar specific şi care posedă memorie imunitară. care sunt mediatori chimici ai hipersensibilităţi imediate. antiproliferativă şi imuno modulatoare. atunci când acest lucru este necesar. Pe de altă parte. fagocite. Interacţiunea antigenelor cu aceste molecule IgE stimulează bazofilele şi mastocitele de a excreta conţinutul granulelor lor.celulele T efectoare – distrug antigenii sau determină inflamarea ca răspuns la acţiunea antigenului. de exemplu. Astfel. au acţiunea antivirală. să activeze o varietate de mecanisme efectuare pentru a elimina antigenul. Administrarea citokinelor sau a inhibitorilor lor constituie o abordare potenţială pentru modificarea răspunsurilor biologice asociate cu boală. deci implicit. Eozinofilele sunt activate şi de alţi anticorpi ca formula secretată AigA. celulele B produc anticorpi.celuleT supresoare – suspendă. specifice pentru oricare antigen.helminţi ce rezistă deseori enzimelor lizozomale ale neutrofilelor şi macrofagelor. opsonizarea sau dizolvarea antigenilor. ƒ inducţia linfokinelor antitumorale sau facilitarea efectelor lor.

celulele macrofage ─care acţionează ca celule de prezentare . Macrofagele au rol în concentrarea şi prezentarea unor antigene. Acesta nu este un proces specific.două tipuri ce celule T.5. în prelucrarea antigenelor. care pot fi uşor recunoscute datorită prezenţei pe suprafaţa lor a imunoglobulinelor.celule B. Tipul final de imunoglobulinăde la suprafaţă pare să prezinte natura anticorpului produs de celulă.2. inclusiv interleukine 1. poate trece la producerea de IgM şi IgD pentru ca în final să producă IgG. IgA sau IgE. nu cu IgG.5. Antigenul purtat de către macrofag este apoi „prezentat" limfocitelor care sunt predeterminate să reacţioneze la antigen.lanţ citoplasmatic. pe măsură ce se maturizează. Această secvenţă de maturare se potriveşte cu cinetica răspunsului. Celulele B Anticorpii sunt produşi de către celulele B. Producerea de anticorpi Producerea de anticorpi implică cel puţin patru tipuri de celule: . alţii decât epitopi. Astfel. 10. în reglarea tipului de răspuns şi amploarea răspunsului imunitar. acestea sunt denumite celule de prezentare (sau auxiliare). Calitatea răspunsului este îmbunătăţit de prezenţa celulelor macrofage datorită. Fig. S .10. producerii de factori solubilizanţi. Ele au determinanţi antigenici şi repetabili şi determină un răspuns cu IgM. de la producerea de IgM. Prezentarea antigenilor Primul stadiu al răspunsului imun la acţiunea oricărui tip de antigen implică modificarea antigenului de către macrofagi. Asemenea substanţe pot provoca proliferarea nespecifică a celulelor B de memorie (celule produse care prezintă aceleaşi imunoglobuline la suprafaţă).lanţ de suprafaţă. O parte din celulele B răspund direct la antigenii numiţi antigeni Tindependenţi. probabil. O astfel de celulă pare capabilă să producă mai multe tipuri de imunoglobuline. . Pentru aceste acţiuni nespecifice pot fi responsabili şi alţi determinanţi.Ciclul de dezvoltare al celulelor B. IgA şi IgE. Din cauza tipului de acţiune desfăşurat de către macrofagi. ajutătoare şi supresoare. 132 . 132). iar cel secundar preponderant IgG (fig. 214 . C . răspunsul primar fiind preponderent IgM.1. de accea sunt cunoscute sub denumirea de celule B policlonale mitogene. Procesul ce are loc la nivelul celulelor macrofage este o parte esenţială a procesului de generare a răspunsului imun care implică celulele T.

Celulele ajutătoare T recunosc la celulele de prezentare antigenul şi antigenul HLA de clasa II ca un complex. Celulele T ajutătoare Acţiunea celulelor T este specifică antigenului. haptenele pot fi recunoscute ca antigeni de celulele T doar cuplate cu un purtător. celulele supresoare T sunt specifice unui anumit antigen. Celulele T sunt de aceea denumite ajutătoare. care recunosc antigenul prin imunoglobulinele de suprafaţă. Celulele T supresoare Efectele celulelor T ajutătoare sunt contrabalansate de celulele T supresoare. Celulele T au glicoproteine de suprafaţă specifice care acţionează ca marcatori care le diferenţiază. iar haptenele libere pot reacţiona cu anticorpii. sugerând faptul că factorul solubilizant eliberat de celulele T mediază efectul de ajutorare a celuleor B. Când o celulă ajutătoare T întâlneşte un antigen pentru prima dată. Ele par să fie capabile să lege direct antigenul. antigenii sunt denumiţi antigeni T-dependenţi. Ca şi celulele T ajutătoare. Doar celulele ajutătoare T care au răspuns la antigenul prezentat de către celulele macrofage poate în continuare să ajute celulele B. de exemplu. Răspunsul imunitar mediat de celule Răspunsul specific antigenului mediat este generat de celule limfocitare T. Chiar dacă celulele T sunt separate de celulele B printr-o membrană. Adăugarea celulelor T determină un răspuns. Deoarece semnalele sunt în mod normal generate de celulele T. Antigenii de clasa II joacă un rol important în activitatea celulelor ajutătoare T. la animalele de experiment injectarea repetată a unor doze relativ mari de antigen poate duce la toleranţă în care nu este produs nici un anticorp specific ca răspuns la acţiunea antigenului. acţionând mai degrabă asupra celulelor ajutătoare T dect asupra celulelor B. fără a necesita şi acţiunea celulelor de prezentare. pe când capacitatea de răspuns la alţi antigeni rămâne nemodificată. De exemplu. iar funcţia lor nu este în totalitate cunoscute. Unele din aceste glicoproteine se găsesc doar la celulele T. 215 .Majoritatea celulelor B însă nu răspund direct în majoritatea antigenilor chiar când aceştia sunt prezentaţi de celulele ajutătoare adecvate. 10. Recunoaşterea antigenului implică mai mulţi receptori la suprafaţa celulelor T ajutătoare. Celulele T pot să: dezintegreze antigenii specifici: citotoxicitate. chiar dacă celulele T singure nu sunt capabile să determine anticorpi. Răspunsul imunitar la o expunere ulterioară va fi mai rapid şi mult mai viguros. iar pe de altă parte declanşează un proces de transformare şi proliferare care are ca efect o creştere a numărului de celele ajutătoare T specifice. Ele recunosc apoi aceeaşi combinaţie de antigen şi antigen de clasa II specific celulei B corespunzătoare. Acţiunea celulelor T supresoare poate fi accentuată de anumite acţiuni de imunizare. Ele pot fi recunoscute de anticorpii monoclonali. văd acelaşi epitop diferenţiat.6. Celule B. ea ajută pe de o parte celulele B. elibereze substanţe solubile biologic active (limfokine) care stimulează inflamarea: hipersensibilitate întârziată. ele pot încă să stimuleze un răspuns la celulele B. Este nevoie de încă un semnal de activare pentru stimularea acestor celule B. Celulele T de la un individ nu pot coopera cu celulele macrofage şi celulele B de la altul. Acestea au pe suprafaţă o glicoproteină specifică CDS. disponibile atunci când individul va fi din nou supus acţiunii antigenului.

hipersensibilitatea întârziată este determinată de celalele T de hipersensibilitate întârziată. Când limfocitele B sunt stimulate antigenic ele se divid prin mitoze repetate.celule secretoare de imunoglobuline. Clona respectivă începe să se multiplice activ. Macrofagii pot fi de asemenea activaţi de linokine să distrugă paraziţii intracelulari ca microbacteriile.Aceste două tipuri de răspunsuri ale celulelor T sunt mediate de populaţii specifice: citotoxicitatea este determinată de celulele citotoxice T. celulele T de hipersensibilitate întârziată eliberează limfokine care mediază un răspuns imflamatoriu. De exemplu. eliberează monokine. Din acestea unele imunoblaste se diferenţiază în plasmocite . Reacţiile determinate de vaccinuri sunt de acelaşi tip. a unor limfocite încă nesensibilizate şi asupra altor celule accesorii. Sunt atrase la locul unde are loc reacţia de hipersensibilitate întârziatăcelule macrofage. celulele citotoxice T sunt foarte importante în faza de refacere. Celulele efectuare de la nivelul organelor limfoide formează foliculi şi centri germinativi unde îşi vor exercita activitatea distructivă. antigenul este captat de către macrofage şi degradat în fagolizozomi în material neantigenic şi în componente înalt imunogene. care le transportă la nivelul organelor limfoide secundare. care este bine cunoscut pentru efectul său antiviral direct. Această citotoxicitate este dependentă de virus şi doar celulele care prezintă proteine virale relevante la suprafaţa lor sunt distruse. succesiunea evenimentelor care au loc după pătrunderea antigenului în organism este următoarea: în câteva minute. Celulele T de hipersensibilitate întârziată Reacţia de tip hipersensibilitate întârziată este cunoscută de foarte mult timp. Ele prezintă specificitate pentru antigenii HLA. reacţia la injecţia intradermală cu tuberculină în cazul testului Hantoux este o reacţie de acest tip. Interacţiuni celulare în răspunsul imun Mecanismele de declanşare şi control ale reacţiilor imune sunt complexe şi antrenează o cascadă de reacţii de stimulare sau inhibiţie între diversele populaţii celulare şi speciile moleculare. putând distruge doar celulele care prezintă acelaşi antigen HLA clasa I. Fracţiunile imunogene sunt proiectate pe membrane macrofagului. Celulele citotoxice T sunt implicate în rejecţia grefelor. fie indirect prin secreţie de imunoglobuline cu funcţii de anticorp. dând naştere la clone celulare B. 10. Celulele citotoxice T Celulele citotoxice T dizolvă celulele infectate cu virusuri. distrugând celulele infectate înainte de producerea altor particule virale. În comparaţie cu celulele T ajutătoare. Limfokinele includ interferon. Macrofagele la rândul lor. neutrofile şi alte limfocite. prin reacţii de citotoxicitate . Limfokinele sunt substanţe solubile capabite să influenţeze cinetica altor celule inflamatoare. amplificând şi mai mult reacţiile. Prin receptorii pentru antigen. acţionând asupra antigenului fie direct.7. 216 . dar care activează de asemenea un tip de celule ucigaşe naturale NK (Natural Killer). Inducerea celulelor citotoxice T necesită celule precursoare şi interleukine – 2 de la celulele T ajutătoare. acestea sunt traduse şi transmise AND-ului care la rândul său v-a ordona diviziunea celulară. celulele citotoxice T recunosc antigenii virali împreună cu antigenii HLA de clasa I. Inducerea este declanşată de antigenii de clasa I şi este reglată de celulele T supresoare. În linii mari. Deoarece limfocitele cu receptori pentru antigenul în cauză părăsesc circulaţia şi se localizează în organele limfoide. De vreme ce pe suprafaţa celulelor infectate apar proteinele specifice virusului înainte de producerea altor virusuri. să elaboreze limfokine care vor acţiona asupra macrofagelor. În contact cu antigenii străini. limfocitele primesc informaţii referitoare la structura imunogenului. celulele sunt apoi imobilizate şi este declanşată inflamarea. în primele momente ale stimulului antigenic proporţia lor in sângele periferic scade considerabil.

sunt folosite predominant mecanismele imunităţii mediate umoral împotriva speciilor care trăiesc în afara celulei şi cele alte imunităţii mediate celular contra celor adaptate la viaţa intercelulară. Acestea reţin în memoria lor (în acizii nucleici) primul contact cu antigenul. poate fi importantă în reacţiile imune faţă de antigene cu moleculă mare. Celulele efectuare rămân la nivelul centrilor germinativi unde continuă prolifelarea şi secreţia de limfokine sau monokine. devenind celule B cu memorie.Alte imunoblaste se reîntorc la forma de limfocit circulant. Receptorii Fc sunt glicopreteine rezistente la tripsină. unde patrulează un timp îndelungat. Spre deosebire de limfocitele diversificate clonal. macrofagul captează antigenul nespecific. Interacţiunea celulară ar interesa succesiv câte două tipuri de celule legate prin punţi formate de către antigen: macrofag şi limfocit TH ( helper) şi ulterior limfocit TH şi limfocit B. induce şi formarea unor compuşi chimici simpli. Fc este un receptor membranar care leagă Ig. Astfel se asigură un permanent control homeostatic care menţine cadrul normal al reacţiilor imune. adică mijloace de apărare celulară condiţionate insă de prezenţa anticorpilor specifici. pregătite să facă faţă unui nou atac. De asemenea. Durata scurtă de viaţă a celulelor efectuare reprezintă un mijloc eficient de stingere a reacţiilor imune. În declanşarea şi controlul răspunsului imun intervin numeroşi factori a căror apariţie şi dispariţie din scenă este ordonată de multiple semnale şi circuite de reglare şi control. declanşându-se imunitatea umorală rapidă. complexele se vor ataşa la FcR (receptorul Fc – fragment cristalizat). între toate 3 tipuri celulare (macrofag. celulele de memorie încep să revină în circulaţie. care asigură supravegherea imunologică. 10. fie trecuţi în sânge. cooperarea celulară se instalează atunci când limfocitele sunt expuse stimulilor mitogenici şi nu numai celor antigenici. care trebuie "sfărâmate". o populaţie de celule T ajutătoare (TH) activează multiplicarea şi transformarea unei clone de precursori B spre plasmocite secretoare de imunoglobina dar prin alte canale semnalizează şi celule T supresoare (TS) care vor controla atât proliferarea precursorilor B cât şi cea a limfocitelor TH. După 24-48 de ore. În această interacţiune guvernează aceleaşi restricţii genetice ca acele implicate în interacţiunea limfocite T . care ar stimula la rândul lor sinteza şi exprimarea pe membrana macrofagului a antigenelor I (asociate regiunii I din MHC – major histocompatibility complex class I). cu viaţă lungă. Anticorpii sintetizaţi sunt exocitaţi şi depuşi fie la suprafaţa membranei celulare. aceiaşi celulă putând fagocita diferite molecule indiferent de structura lor. celule T şi B) după cum cooperează s-ar putea realiza fără contact intercelular. funcţiile fagocitare fiind mult activate. De exemplu. organul limfoid fiind astfel crescut în volum tumefiat şi edemaţiat.macrofag. prin mediatori eliberaţi de limfocitul helper sau ajutător (TH) care ar activa macrofagul sau direct celula B. operaţie de care sunt capabile numai celulele cu funcţii fagocitare. cât şi celulelor B. celulele efectuare mor. În unele situaţii. Legarea prin porţiune Fc a complexelor antigen-anticorp la FcR a macrofagului. Este un dimer constituit din două jumătăţi C-terminale ale lanţurilor H (grele) de Ig. celula care reprezintă antigenul limfocitului T poate fi limfocitul B şi nu macrofagul. datorită proliferării clonale active. nu şi la pronază. în care macrofagul prezintă antigenul "prelucrat" limfocitelor T şi eventual cel "neprelucrat" limfocitelor B. Antigenul formând complexe cu anticorpii. Unele mecanisme de apărare imună în infecţiile bacteriene În general.7. Prezentarea antigenului de către macrofag atât celulelor T.1. rămânând de veghe numai celulele de memorie. De asemenea poate interveni şi citotoxicitate anticorpodependentă (ADCC). a macrofagului (opsonizare). După ce complexele antigen-anticorp uşor fagocitabile sunt eliminate din organism. 217 . Interacţiunea s-ar putea instala şi simultan. fără a fi însă graniţe rigide între cele două tipuri de reacţii imune.

Acest mijloc de apărare antimicrobiană nu este important deoarece subiecţii cu deficienţe congenitale în componentele complementului nu sunt mai semnificativ expuşi la infecţii în comparaţie cu cei normali. 10. inhibă aderarea şi. graţie anticorpilor (în special cei din clasa IgA). Bacterioliza dependentă de complement. bacteriile pot persista timp îndelungat în fagozomi sau distrug fagozomi. Prin urmare. Inhibiţia aderenţei la seroase sau mucoase se realizează de asemenea.1. se ştie că bacteriile au o serie de factori care le protejează de acţiunea fagocitară a macrofagelor. Bacteriile sau celulele infectate cu bacterii pot fi lizate spontan. imobilizarea germenilor ciliaţi sau flagelaţi.tuberculosis. Astfel simpla opsonizare este total ineficientă deoarece.). nu sunt atacate de enzimele lizozomale. mecanismele opsonizării includ legarea complexului bacterie-anticorp prin receptorul pentru FC (FCR) sau legarea complexului bacterie-anticorp prin receptorul complement (CR). mai susceptibile la liză fiind formele SD. In ceea ce priveşte opsonizarea. are loc ataşarea la receptorul pentru complement. d. "Activarea" fagocitozei sau "opsonizarea" este mediată prin anticorpi din clasa IgG. De exemplu. E. granulocitele şi macrofagele au receptori membranar pentru fragmentul Fc sau pentru fracţiuni ale complementului prin intermediul cărora bacteria este "prinsă" pe căi indirecte. c. microvililor. dar nu şi fagocitoza. sunt activate de limfokine eliberate în special din limfocite T. bacteria fiind "reţinută" la peretele celulei. este omorâtă de regulă.000 molecule de IgG pe suprafaţa bacteriei. macrofagele activează funcţiile citotoxice ale limfocitelor T care apoi distruge eficient celulele infectate bacterian (sau viral). în consecinţă. iar în absenţa anticorpilor specifici opsonizarea se realizează fie prin activarea complementului pe cale alternativă. neutralizarea toxinelor bacteriene. opsonizarea. 218 . după fagocitare. Mijloace de apărare imună mediate umoral Sunt cunoscute in infecţiile bacteriene: a. etc). multiplicarea bacteriei. În cazul complexelor antigen + anticorp.coli. Staphylococcus etc. care interferând cu adezinele. şi ajung în citoplasmă. etc.1. trebuie să fixeze cca 8. ale germenilor gram-negativi (cei gram-pozitivi sunt practice rezistenţi). dobândesc proprietăţi citotoxice şi bactericide şi proliferează la locul infecţiei sau inflamaţiei.2.7.7. Proteus. ori în absenţa anticorpilor specifici. prin factorii C3 sau C4 ai complementului. celula fagocitată şi nu bacteria. Imobilizarea germenilor ciliaţi sau flagelaţi poate fi realizată practic de către toate clasele imunoglobuline şi se dovedeşte eficientă în frânarea virulenţei unor germeni gram negative (Salmonella. care secretă exotoxine). macrofagele. La rândul lor. ca şi în cazul hemolizei prin complementare loc ca urmare a activării complementului de către anticorpii care s-au fixat pe bacterie. chiar dacă sunt fagocitate de către macrofagele opsonizate. inhibiţia aderenţei. Este cazul capsulei proteinei M la Streptococcus. natural şi de celule nativ-ucigaşe (NK). polizaharizilor capsulari. e. Mijloace de apărare imună mediată celular Unele bacterii (M . bacterioliza dependentă de anticorpi. Nefiind distruse. Prin mecanisme mediate celular. pentru a conferi condiţii favorabile opsonizării S. typhimurium. Împotriva acestor factori antifagocitari. b. neutralizarea toxinelor bacteriene (realizată aproape exclusive de către anticorpii din clasa IgG) este un mijloc important de apărare (în special în cazul germenilor din genurile Clostridium. fiind inhibată fuziunea lizozomilor cu fagozomii. fragmentul FC este fixat la FCR şi bacteria este fagocitată. fie prin agregate de molecule de imunoglobulină fără funcţii specifice pentru bacteria respectivă.10.1. Toxoplasma etc. În cazul complementelor C3 sau C4. proprietăţilor hidrofile ale peretelui celulei bacteriene. In schimb.

Intensificarea răspunsului imun Rolul răspunsului imun este distrugerea antigenilor străini. Reglarea alterată Factorii care reglează răspunsul imun pot fi manipulaţi experimental. pentru răspunsul imun devine deci mai slab.disponitilitatea anticorpilor. Ajustarea adecvată a dozei şi a ratei de expunere la un anumit antigen. prin definiţie. fagocitarea sa. ca urmare a proceselor imune care au loc. Mecanismele implicate includ activarea celulelor T supresoare şi eliminarea celulelor ajutatoare T şi a celulelor B corespunzătoare. 10. Sunt produşi anumiţi anticorpi anti-idiotip în cadrul unui răspuns imun normal. Anumiţi factori nespecifici pot creşte efectele anticorpilor.9. poate împiedica apariţia unui răspuns imun. deoarece orice dezordine poate cauza o boală autoimună sau o boală de imunodeficienţi.8. .viteza răspunsului imun. indiferent dacă aceştia sunt molecule inerte sau organisme. dar ei includ disponibilitatea antigenilor şi influenţa anticorpilor anti-idiotip. Întepărtarea atigenilor este influenţată de mai mulţi factori printre care: . Reglarea imunologică Reglarea imunologica este de foarte mare importanţă mai ales în cazul maladiilor umane. fie să faciliteze. 10. toleranţa naturală la antigenii proprii.8.8.2. Există bineînţeles.concentraţia de antigeni. Este esenţial ca un sistem imunitar să nu reacţioneze cu celulele gazdă. Se pare că asemenea anticorpi anti-idiotip sunt implicaţi în cazul reglării unui răspuns imun normal. . 219 . Disponibititatea antigenitor Răspunsul imun este declanşat în mod natural de antigeni. Reglarea normală Factorii care reglează un răspuns imun normal sunt multiplii. . autoanticorpi.sistemul complementar care poate fi să distrugă un organism. Principalii factori sunt: . declanşând doar clonele care au receptori cu mare afinitate.celulele fagocitare (macrofagii şi leucocitele poliformonucleare care indepărtează antigenii). 10.1. Concentraţia de antigeni va scădea în urma metabolizării sau îndepărtării acestora.zona de pătrundere a antigenului. Rata în care antigenii declanşeză celulele B este probabil un factor important în limitarea producerii de anticorpi. Stimulul de bază. Anticorpi anti-idiotip Structura zonei de legătură a antigenului este unică pentru fiecare anticorp şi poartă numele de idiotip. Această stare de absenţă a răspunsului este cunoscută sub numele de toleranţă. Inexistenţa auto-toleranţei duce la apariţia bolilor autoimune. .10. asemenea anticorpi sunt.

celule moarte. Alte categorii celulare implicate în imunitate Macrofagele Macrofagele sunt celule echivalente cu monocitele şi împreună cu monocitele. activarea chemotactică. o componentă complementară poate acţiona ca o enzimă care scindează mai multe molecule ale următoarei componente din secvenţă. un antigen sau un complex imun. devenind nediferenţiabile de macrofagi. cum ar fi. de exemplu. ei prezintă o potenţialitate distrugătoare crescută. aşa cum a fost prezentat anterior. în timp ce altele atrag neutrofilele şi macrofagele pentru fazele următoare de opsonizare şi fagocitare. Macrofagii sunt de asemenea importanţi pentru prezentarea antigenilor altor celule ale sistemului imunitar. Pentru a-şi putea îndeplini funcţia. 133 . Sistemul complement Sistemul complementar constă dintr-o serie de proteine activate pe rând. ca în figura 133. dar o dată activată. Funcţia de bază a sistemului complementar este probabil opsonizarea microorganismelor şi complexelor imune. Fig. Ţesuturile macrofage sunt eterogene în aspect. unde trăiesc pentru câteva săptămâni sau luni.10. 220 .2.o zonă pentru scindarea enzimatică a componentei complementare următoare. Materialul distrus poate fi un organism viabil. macrofagii trebuie sa fie activaţi în această stare. Fragmentele minore generate prin scindare au proprietăţi biologice deosebit de importante în faza fluidă. indiferent dacă acesta devine sau nu învelit cu anticorpul.9. reprezintă sistemul mononuclear responsabil cu fagocitoza. .o zonă pentru legarea de membrană celulară. metabolism şi probabil în funcţie. microorganismele învelite (opsonizate) cu imunoglobuline şi/sau complement sunt mult mai uşor recunoscute de macrofagi şi mult mai repede fagocitate. Unele dintre ele cresc permeabilitatea vasculară. Rolul major al căii complementare este furnizarea unei posibilităţi de înlăturare şi distrugere a antigenului. Limfocitele şi mcrofagele provin din trunchiuri înrudite de celule din măduva spinării. Componentele există în mod normal ca şi precursori inactivi. 10.1. Fiecare precursor este scindat în două sau mai multe fragmente. Fragmentele minore sunt generate la aproximativ fiecare etapă în cascadă şi contribuie la generarea răspunsului inflamator. O funcţie majoră sistemului de fagocite mononucleare este fagocitoza organismclor care invadează organismul gazdei şi a altor antigeni. Macrofagii au în interior nişte granule care conţin diferite enzime degradate cu care distrug materialul fagocitat.Scindarea unei molecule precursoare sub acţiunea unei componenete complementare Fragmentul principal are două zone active biologic: . 9. Monocitele circulă doar câteva ore înainte de a intra în ţesuturi.

complexul autigen-anticorp rezultat este în general îndepăttat din circulaţie şi distrus de macrofagi. 221 . De menţionat că celule ucigaşe naturale nu sunt celule ale sistemului imunitar în sens strict ca macrofagii de exemplu. un consum marit şi o producţie crescută de superoxid. Ele pot fi activate nespecific de agenţi mitogeni sau interferon şi deci pot fi recrutate de orice celulă T. difteriei şi mulţi viruşi.2. ei par să fie implicaţi în expulzarea paraziţilor din tractul gastrointestinal.1.10. sunt. Aceste celule sunt considerate foarte importante pentru supravegherea apărării organismului împotriva tumorilor. Desi rolul anticorpilor IgE nu este îincă cunoscut. Ele sunt capabile să recunoască celulele care au reacţionat sub acţiunea IgG şi le distrug. 10. Neutrofilele. Funcţia directă a anticorpilor Neutralizarea este unul din efectele directe ale anticorpilor. Organismele care au un deficit de celule ucigaşe naturale au o incidenţă . iar IgG este în mod special remarcabil pentru aceasta. responsabilă pentru citotoxicitatea dependentă de anticorp. Neutrofilele sunt celule fagocitare. Realizarea acestei degradări necesită o cantitate considerabilă de energie. În absenţa anticorpului sau stimulării antigenice şi sunt diferite de celulele ucigaşe prezentate anterior. capabile să degradeze substanţele pe care le digeră.fagocitare mononucleare cu morfologie limfoidă. şi nu au memorie imunitară. Ele nu pot distruge celule în absenţa anticorpului.Leucocite neutrofile polimorfonucleare Neutrofilele joacă un rol foarte important în apărarea organismului în cazul infecţiilor acute. inclusiv toxina tetanusului.10. 134). Celule ucigaşe naturale (natural killer) Celulele ucigaşe naturale ( NK ) arată că limfocitele granulare mari pot distruge celule . printr-un mecanism încă necunoscut. în plus. aceste substanţe nu se mai pot lega de ţesuturile receptoare. Aria lor potenţială în acţiune este foarte mare. 10. Celule ucigaşe (killer) Celulele ucigase sunt celuule non. Finalitatea răspunsurilor imune O dată ce sistemul imun a fost iniţiat. procesul de fagocitare este similar atât neutrofilelor cât şi fagocitelor mononucleare. pot fi neutralizaţi de anticorpi. Un mare număr de antigeni. indiferent dacă răspunsul predominant a fost de natură umorală sau mediat de celule. Din punct de vedere morfo-fiziologic.10. Funcţia indirectă a anticorpilor Opsonizarea este procesul prin care un antigen devine învelit cu substanţe care îl face să fie mai uşor distrus de celulele fagocitare ( fig. mai mare a tumorilor. 10. Ele pot adera sau pot migra din vasele de sînge în ţesuturi. Această migrare apare ca efect a acţiunii agenţilor chemotactici produşi la locul inflamaţiei. O dată neutralizate. rezultatul final al acţiunii sale depinde de natura şi localizarea antigenului.

printre care fragmente de complement. 134 . Uciderea celulelor ţintă Celulele ţintă ucise ca urmare a unui răspuns imun includ organismele şi celule care conţin antigeni virali sau tumorali specifici la suprafaţă.Fig. 10. 10.10.5. Aceste celule ţintă pot fi distruse de mecanisme specifice.lanţ uşor de tip Kappa. mecanism care împiedică eventualele reacţii de autodistrugere a organismului.lanţ uşor de tip Lambda.11. Creşterea permeabilităţii vasculare este determinată de un număr de agenţi specifici. . Procesul inflamator Inflamarea este definit ca o creştere a permeabilităţii vasculare însoţită de infiltrarea celulelor „inflamatoare”. care sunt legate prin punţi. 10.10.10.3. 10. Există doua tipuri de lanţuri uşoare: . după cum este prezentat în tabelul urmator: Clasele Ig G Ig M Ig A Ig D Ig E Greutatea moleculară 150000 900000 160000 185000 200000 222 Lanţ greu γ µ α ρ ε Lanţ uşor k/γ k/γ k/γ k/γ k/γ .4.Relaţia dintre opsonizare şi fagocitare. fiecare moleculă de imunoglobulină este de fapt o proteină compusă din două lanţuri uşoare (L) identice şi două lanţuri grele (H) identice. Lanţurile uşoare sunt identice la toate clasele de imunoglobuline dar fiecare clasă are un lanţ greu caracteristic. Genetica sistemului imunitar După cum a fost menţionat anterior. Controlul prin reacţie inversă O etapă importantă a răspunsului imun este declanşarea unui mecanism de autocontrol (feed-back).

Restul de ADN al mănunchiului este excizat şi constituie marcatori pentru limfocitele de origine ale celulelor B. Fiecare din aceste gene este în realitate o genă cluster (ciorchine). fie lanţul Lambda. dar în general includ invaziile timpurii susceptibile faţă de infecţii. Aceasta este realizată iniţial de diferitele fragmente ale ARN-ului lipite şi secvenţializate. Fiecare celulă plasmatică produce lanţul uşor VJC într-o singură combinaţie şi produce fie lanţul Kappa. Gena cluster pentru lanţul alfa al receptorului T este pe cromozomul 14.o polipeptidă. ceea ce are ca rezultat o mai mare diverisificare. iar gena cluster pentru lanţul beta este pe cromozomul T.Fiecare lanţ al imunoglobulinei conţine trei regiuni: . o genă D. iar amîndouă suferă o recombinare somatică pentru celulele T cu specificitaţii diferite. Gena responsabilă cu crearea lanţului uşor Kappa se găseşte pe braţul scurt al cromozomului 2. o celulă plasmatică care răspunde la diferiţi antigeni poate să exprime o combinaţie VDJC diferită.regiunea constantă (C).regiunea variabilă (V). Fiecare are o structură analoagă cu gena cluster pentru lanţtul usor al imunoglobulinei. Simptomele şi semnele acesteia depind de mecanismele de apărare rămase intacte. Receptorul celulelor T este foarte asemănător ca structură cu imunoglobulina şi constă din doua lanţuri: un lanţ alfa şi un lanţ beta. aflată între regiunile variabile şi cea de joncţiune. Locusul pentru gena lanţului greu este pe cromozomul 14. 223 .regiunea de joncţiune (J). Gena cluster pentru lanţul greu conţine: aproximativ 200 de gene variabile. dar nu amîndouă. dar în schimb au o genăconstantă şi nu au gene diferite. se pot însera extranucleotide la nivelul joncţiunii şi aceste gene sunt predispuse să sufere mutaţii somatice după ce au fost obţinute. dar specificitatea antigenică rămîne neschimbată. Deşi combinaţia VDJ de obicei rămîne constantă pentru celulele plasmatice şi toţi descendenţii lor. Suplimentar. Aceste lanţuri sunt legate între ele prin punţi bisulfurice. În fiecare celulă plasmatică. 6 gene de joncţiune ş una sau mai multe gene pentru regiunea constantă a fiecărei clase de imunoglobuline.1. Această abilitate a fiecărei gene cluster de a produce diferite polipeptide este o excepţie importantă a regulii: o genă . Receptorul celulelor B este anticorp (de ebicei de tip IgM) şi astfel. în timp ce gena pentru lanţul uşor Lambda este pe cromozomul 22. printr-un proces de recombinare somatică o genă V. o genă J şi o genă C sunt alaturate şi transcrise într-o moleculă unică continuă a ARN-ului mesager. acestea ducînd la mai mult de 12000 de combinaţii posibile. 10. de exemplu pentru IgM spre IgG. În lanţurile grele există o regiune diversificată (D). . este posibilă o schimbare a genelor constante. .11. Imunodeficienţa dobîndită Imunodeficienţa dobîndită poate apare în fiecare sau în amîndouă componentele răspunsului imun. Se poate produce orice combinaţie. cu ajutorul ADN-t recombinat. circa 50 de gene diverse. Genele cluster pentru lanţurile uşoare Kappa şi Lambda au o structură similară cu aproximativ 200 de gene variabile şi 4 gene de joncţiune.

Indivizii care au grupa A au antigen A pe celulele lor roşii.AR AR deleţie cromozomială XR XR Imunodeficienţa moştenită este cauzată în 50% din cazuri de defectele anticopilor. Indivizii cu grupa A au în serul lor IgM anti-B (izo-glutine). Grupele sanguine Grupe sanguine sunt determinate de proteinele de suprafaţă ale antigenilor de pe celulele roşii. iar cei cu grupa 0 nu au nici un antigen. inclusiv pe celulele sanguine.2. Cele mai previzibile defecte sunt deficienţele IgA-lor (1/570).Aşa cum sunt conturate tabelul de mai jos. iar dintre acestea cel mai bine cunoscute sunt ABO şi sistemele Rh ale grupelor sanguine. B. aceste condiţii de apariţie arată o eterogenitate genetică. iar – non-aglitinare . care sunt determinate de reacţia celulelor roşii ale indivizilor cu anticorpii respectivi anti-A şi anti-B.A. Până acum au fost descrise aproximativ 400 de grupse sanguine. AR XR XR. cei cu grupa AB au ambele tipuri de antigeni. iar mulţi din aceşti pacienţi sunt asimptomatici cu o frecvenţă de 1/1000 de combinaţii în cazul unor deficienţe ale sistemului fagocitar şi o frecvenţă de 1/70000 pentru combinaţii imunodeficiente severe. iar în 60/o din cazuri depinde de defectele sistemului complementar. 224 . 0 şi AB. Boală Combinaţii imunodeficienţe severe Agammaglobulinemia Sindromul Wiskott-Aldrich Boli granulomatice cronice Sindromul Chediak-Higashi Sindromul DiGeorge Deficienţă Properdin Sindromul Limfoproliferativ Moduri de moştenire AR. Sistemul sanguin ABO Există 4 fenotipuri majore AB0: . 10. iar cei cu grupa 0 le au pe amândouă. conform tabelului de mai jos: Fenotipul celulelor roşii 0 A A AB Anti-A + + Anti-B + + - unde: + înseamnă aglutinare. cei care au grupa B au antigeni B.11. XR XR. Antigenii AB0 sunt de asemenea prezenţi pe multe alte celule din organism. în 400% din cazuri ca urmare a defectelor de imunitate celulară. cu grupa B auanti-A.

sau homozigote pentru alelele D (tabelul 4). în timp ce 30% din populaţia bască sunt Rh.13 0.Gena pentru grupele AB0 este localizată lânga braţul lung al cromozomului 9 şi au fost identificate 3 alele majore: 0. are Rh+. A şi B sunt gene dominante.14 0.05 Fenotip Rh + + + + + posibil + 10. BB.09 0.32 0. Organele limfoide primesc o extensivă inervaţie intraparenchimală simpatică. fiecare având 3 locusuri strâns legate C. dar acest lucru se poate face folosînd informaţii de ascendenţă. Persoanele cu Rh + sunt hetero. Sistemul Rh sanguin Există 2 fenotipuri Rh: Rh + şi Rh Aceste fenotipuri sunt determinate de reacţia celulelor roşii ale indivizilor cu anticorpii anti-Rh. Aproape toţi orientalii şi nord-americanii au Rh+ de asemenea. Deşi sunt posibile genotipuri 00.Persoanele Rh + posedă antigeni Rh pe celulele lor roşii şi pe cele tisulare. Notaţie prescurtată rr Rr RR Rr RR RR UK frecvenţa 0.17 0.09 0. B0 şi AB. Genotipurile şi fenotipurile Rh. Tabelul 4. în timp ce persoanele cu Rh . iar gena pentru grupa 0 este recesivă. AA.46 0. c. Complexul genelor pentru Rh este pe cromozomul 1 cu 2 altele. 225 . neurohormoni endocrini sau neuropeptide şi vice-versa. Genotip cde/cde CDe/cde CDe/CDe cDE/ede cDe/cDE cDE/cDE altele (rare) 85% din populaţia Europei Occidentale. E.03 Antigene ale celulor roşii nici unul A B B B AB Anticorpi serici Anti-A.04 0. de exemplu. A0.09 0. Anti-B Anti-B Anti-A Anti-A Anti-A nici unul Nu este posibil să distingem în grupele sanguine grupa AA de A0 sau BB de B0. A şi B.15 0.12. Interacţiunea între peptidele sistemului imun şi peptidele sistemului nervos şi endocrin Sistemul imun interacţionează cu sistemul nervos şi endocrin prin inervaţii ale ţesutului limfoid.nu au aceşti antigelii.42 0. şi D sau non-D. dar acest procent variază la alte popoare. În continuare este prezentat un tabel cu genotipurile şi fenotipurile locusurilor AB0: Genotip 00 AA A0 BB B0 AB Fenotip 0 A B B B AB UK frecvenţa 0.

o simplă injectare a IL-1 poate normaliza nivelele sanguine în glucoză pentru o durată de cel puţin 6 ore la animale diabetice incluzând şoarecele diabetic insulino-rezistent.adrenocorticotropină. Se consideră că stresul infecţiilor şi traumatismelor pot stimula macrofagele şi nevroglia să producă citokine IL-1. Mai mult . în timp ce stresul psihologic induce secreţia interleukinei-6 (ce este mediată de sistemul nervos autonom). incluzând în reproducere (în acest cu hormonul luteinizant. Datele experimentale sugerează că sistemul nervos simpatic modulează răspunsurile imune şi că supraactivitatea sistemului nervos simpatic aşa cum este de aşteptat în stres scade responsivitatea imun. promovează mobilizarea grăsimilor corpului şi pierderea în greutate şi are proprietăţi anorexigene. α -FTN stimulează secreţia IL-1 de către macrofagele activitatea.FTN împart cu hormonul liberator al corticotropinei unele efecte comportamentale ca mediatori ai sistemului. Injectarea în vivo a acestei citokine are ca rezultat o profundă hipoglicemie. α -FTN exercită câteva efecte extraimunologice. De reţinut că atât interleukina-l-alfa ( IL-l ) cât şi factorul de necroză tumorală α .care în schimb reglează secreţia anumitor hormoni ce pot influenta evenimentele imune . S-a relevat faptul că IL-1 şi IL-6 induc rapid eliberarea somatostatinei IL-1 induc încet dar semnificativ creşterea şi în alte neuropeptide hipotalamice. Sistemul imun este capabil să producă factori. Numărul de receptori variază cu tipul celular. sporind dovezile că peptidele legate de imunitate(adică citokinele) pot afecta profund sistemul nervos central. Celulele imune stimulate pot creşte nivelele sanguine în hormonul adrenocorticotrop (ACTH) şi corticosteroidul şi scade conţinutul de norepinefrină al hipotalamusului. Alt efect important al IL-1 este capacitatea sa de a afecta homeostazia glucozei. Printre altele α -FTN este cunoscut ca un mediator al reţelei bidirecţionale neuro-endocrino-imune. După ablaţia sistemului nervos simpatic la animale. care pe lângă rolul lor crucial în timp răspunsului imun servesc integrării circuitelor imuno-neuro-endocrine cu consecinţe imuno regulatoare şi metabolice pentru gazdă.cum sunt catecolaminele. De asemenea. cel puţin în vitro şi se ştie că conţinutul în norepinefrină din organele limfoide scade în timpul răspunsului imun. Atât IL-1 cât şi α . s-a arătat recent că IL-1 induce o rapid şi profunda creştere în ACTH şi corticosteroidul din sânge .fără să afecteze marcat nivelele sanguin ale altor "hormoni ai stresului". Efectul modulator al sistemului nervos simpatic este mediată în partea via neurotransmiţători şi în parte printr-o peptidă cu greutate moleculară mare ce inhibă marcat răspunsul limfocitar proliferativ şi reduce producţia de IL-l şi FNT de către macrofage. antagoniştii-adrenergici cresc nivelul cAMP în celulei limfoide şi alterează funcţia. beta-endorfina . sintetază eliberarea de prolactină. Reglarea centrală a sistemului imun este in prezent bine stabilit. Neuronii simpatici răspund direct la IL-1.hormonul creşteri şi hormonul α. numărul receptorilor β2 -adrenergici creşte pe celule limfoide.P Lângă aceste efecte. Se pare că interleukinele pleiotropice stimulează axa hipotalamo-hipofizaro-adrenală într-un loc situat probabil în nucleul paraventricular şi ar deprima creşterea prin stimularea predominată a somatostatinei comparativ cu factorul liberator al hormonului creşterii. Citokinele interferează cu secreţia hormonilor.FTN pot induce. care nu se datorează acţiunilor secretagoge insulinice ale acestei citokine. astfel: celule supresoare T > monocite > celule citotoxice T >celule helper. O altă citokină care posedă efecte pleiotropice este factorul de necroză (α-FTN) derivat din macrofag . Modularea citokinonică a neuropeptidelor hipotalamice: interleukine ce reglează creşterea şi stresul.Celulele sistemului limfoid poartă receptori adrenergici. FSN). mimând astfel două din modificările neuroendocrine observate în timpul răspunsului imun. prolactina. similar hormonului eliminator a corticotropinei. LH şi foliculinstimulator. 226 .melanostimulator.

Se ştie că factorul hipotalamic eliberator de corticotropină are rol pivot în reglarea axei hipotalamice-hipofizare-suprarenale, şi exercită efectele centrale inhibitorii pe funcţii reproducătoare (ce poate fi inhibată de stres). Aceste efecte au loc prin eliberarea de betaendorfina neuronală şi hipofizară şi sunt anatagonizate prin tratament cu antagoniştii opiacei. De asemenea IL-1, α -FTN şi hormonul eliberator de corticotropină induc o creştere a pragului nociceptiv. Hormonul eliberator de corticotropină şi citokinele diferă însă în ceea ce priveşte tipul de stres pe care îl recunosc, adică stresul cognitiv sau non-cognitiv. Alte studii recente sugerează creşterea producţiei de peptide neuroendocrine după stimularea celulelor cu IL-2. Astfel, prin metode imunohistochimice s-a detectat clonarea intensă a citoplasmei celulelor mononucleare (ACTH şi β endorfinice pozitive) din sângele periferic şi o creştere a dimensiunii celulare medii după stimularea cu interleukina -2. Alte studii sugerează, în plus, că una din moleculele de ACTH ce este sintetizat de celule imune stimulează direct migrarea monocitelor umane, sugerându-se astfel un rol posibil al peptidelor ACTH in răspunsul imun. In prezent, numeroase interacţiuni intre sistemele imune şi neuroendocrine sunt demonstrate şi se crede că numeroase peptide pot fi utile noilor strategii terapeutice.

10.13. Relaţiile virusuri-celule gazdă. Relaţiile virusuri-membrane celulare 10.13.1. Receptorii virali
Prezenţa sau absenta receptorilor celulari specifici influenţează nemijlocit spectrul de gazdă tropismul tisular şi celular al virusului;elementele respective pot interveni însă în etape ulterioare, de exemplu penetrare, decapsidare, antrenare a metabolismului celulei gazdă în producţia componentelor virale. Receptori celulari sunt, frecvent, de natură glicoproteică iar acidul sialic este considerat o componentă critică în interacţiunea virus-receptor. Virusul Sendai se leagă de o structură carbohidrat specifică ( NeuAc ) dar nu de alte gangliozide, conţinând unul sau mai multe reziduuri de acid neurinamic. Alte mixoviruri sunt mai puţin restrictive. Pentru virusul gripal toţi compuşii neurinamic pot acţiona ca receptori indiferent de modalitatea de legare a carbohidratului. Virusurile gripale A şi B au receptori (glicoforina) pe hematii; virusul rabic are receptori pentru acetilcolină la joncţiunea neuromusculară; virusul Epstein-Barr are receptori ( CR2 pentru C3d ) pe limfocite B iar HIV are receptori (molecula CD4 sau T4) pe limfocit T etc. Trei metode moderne au permis studiu receptorilor celulari cu acurateţe: a) sinteza anticorpilor monoclonali antireceptori; b) sinteza anticorpilor antiidiotip care mimează antigenele virale; c) utilizarea unor analogi peptidici ale situsurile de ancorare virală A fost introdus conceptul de receptor productiv, adică de receptor care conduce singur la infecţie, deosebit de alţii implicaţi în legarea nespecifică a virionilor. Ataşarea nespecifică a virionilor la unele substraturi (colagenul de exemplu), poate avea importanţă patogenică pentru că se realizează concentraţii mari de virusuri în zone unde există şi receptori productivi. În general, organele-ţintă ale infecţiei virale au astfel de receptori productivi care sunt similari cu receptorii cu afinitate înaltă. Receptorii cu afinitate înaltă la nivelul "butonilor" terminali ale axonilor explică neurotropismul unor virusuri. În ceea ce priveşte virusul gripal, care este bine cunoscut, datele de biologie moleculară precizează următoarele: acest virus este un orthomixovirus cu înveliş membranar; anvelopa constă dintr-un strat bilipidic cu proteina M asociată cu porţiunea internă a dublului strat şi două glicoproteine membranare, ai căror spiculi extramembranari se pot observa în microscopia
227

electronică. Una dintre proteinele transmembranare este hemaglutinina, iar cealaltă, naurominidaza. Aceste două proteine permit virusului să se lege de suprafaţa celulei gazdă şi să fuzioneze cu membrana celulară. A fost clonată gena pentru neuraminidază, proteina conţinând 454 aminoacizi cu greutatea moleculară 50.087 Da. Această proteină prezintă o zonă hidrofobă majoră, care o ancorează in membrana virală. Proteina prezintă 5 situsuri de glicozilare şi este incorporată in membrana virală sub forma unui trimer simetric cu laturile polipeptidice identice. Rolul neuraminidazei in infecţie nu este cunoscut,dar se ştie că ea clivează acidul N-acetilneuraminic(acid sialic) al lanţului hidrocarbonat glicoproteina. Substratul neuraminidazei poate fi glicoproteina celulei-gazdă sau glicoproteina-hemaglutinică a virusului. Activitatea enzimatică a neuraminidazei este necesară pentru producerea infecţiei, deoarece anticorpii antineuraminidază inhibă replicarea virală. Cealaltă glicoproteină transmembranară a virusului gripal, hemaglutinina, leagă virusul la acidul sialic conţinut de receptorii membranei celulei-gazdă. De asemenea,ea mediază fuziunea celulară a virusului. Hemaglutinina virusului gripal este un trimer de 224.640 Da. Fiecare trimer conţine un lanţ oligozaharidic. Glucidele sunt localizate la suprafaţa proteinei pe întreaga sa lungime si au rolul de a proteja hemaglutinina de degradarea proteolitica nespecifica. Pentru ca virusul gripal sa fuzioneze cu membrane celulei-gazda,hemaglutinina trebuie sa cliveze in doua fragmente , HA1 si HA2, prin hidroliza legăturii peptidice a argininei din poziţia 238. Clivarea hemaglutiniei în cele două fragmente creşte infecţiozitatea virusului de 100 ori, fără să afecteze activitatea hemaglutinică. Molecula de hemaglutinina provoacă fuziunea ăn absenţa oricăror alte componente virale.Tipul viral cel mai patogen al gripei - tipul A - conţine 13 subtipuri de hemaghetinine (HA) notate HA1 - HA 13 si 9 antigene de tip neuraminidaza (N) notate Nl-N9. Fiecare virus prezintă 300-600 spiculi de hemaglutina care explica ataşarea virionilor la celule. Intr-o prima etapă, hemaglutinidele virale se leagă pe reziduurile de acid sialic ale glicoforinelor A. Caracterizarea precisă a domeniilor de legare la nivelul proteinelor virale şi a receptorilor celulelor gazdă deschide o noua cale în terapia antivirală: experimentarea şi producerea unor agenţi care să acţioneze în competiţie cu virusurile în legarea pe receptor.

10.13.2. Penetrarea virusului în celulă
Procesul de internalizare a virionilor, declanşat de ataşarea lor ireversibilă la receptorii celulari este numit viropexie (enducitoza). În plus, virusurile cu anvelopa (ortho-si paramixovirusurile, rhabdo- si togavirusurile etc.) datorită includerii în structura externa a unei porţiuni lipidice pot penetra si printr-un proces de fuziune. Pătrunderea paramixovirusurilor în celulă prin fuziunea dintre anvelopa virală şi membrana celulară, perturbează permeabilitatea acesteia din urma, ceea ce poate avea urmări toxice ca hemoliza (la hematii), liza "din afară" (la celulele nucleate) şi chiar modificării nucleare şi alterări cromozomale. Studii electronomicroscopie combinate cu detectare a antigenului cu anticorpi marcaţi de peroxidază au lămurit în cazul virusurilor respirator sinciţial şi rujeolic, secvenţa evenimentelor timpurii ale infecţiei. Astfel, consecutive absorbţiei (la +37C) anvelopa virală şi membrana celulara fuzionează, apoi antigenele virale se dispersează în regiunile adiacente ale membranei, întreaga celulă devenind specific reactivă cu anticorpii antivirali marcaţi. Aceasta difuziune explică cel puţin două fenomene: - starea refractara a celulelor la fuziunea cu alte virusuri şi, - difuzarea infecţiei din aproape în aproape prin antrenarea celulelor vecine în procesul de sincitizare. În cazul papovavirusurilor, ca rezultat al absorbţiei se notează o creştere rapida a fluidităţii membranei celulare datorită activităţii unor enzime membranare, probabil declanşată de procesul endociotic.

228

Prin urmare, absorţia la suprafaţa celulei este urmată de penetraţia virusului în celulă, care se poate desfăşoară pe doua căi: a) fuziune directa cu membrane plasmatică; b) prin endocitoza (viropexie) simplă (absorptiva) sau mediată de receptori (clatrinică). Virusurile încapsulate pot urma ambele cai, în timp ce virusurile nude numai endocitoza. Endozomul (fagozomul) fuzionează apoi cu lizozomul a cărui aciditate favorizează fuziunea membranelor virale şi lizozomale ; procesul este foarte rapid, încât expulzarea nucleocapsidei în citoplasma se efectuează fără distrugerea ei de către enzimele lizozomale de degradare.

10.13.3. Tipuri de efect citopatic
Sunt descris mai multe tipuri morfologice de efecte citopatice viral - induse în culturi, de pildă: a. citotoxic (produs de infecţii masive, hiperacut, fără a exista timp pentru sinteza virusului progen; leziunile au fost asimilate cu fenomenul lizei "din afara" in cazul bacteriilor parazitate de fagi); b. citolitic (caracterizat prin alterări celulare acute-rotunjire,ratatinare-şi pierderea capacitaţii celulelor de a retine coloranţii vitali); c. sinciţial (indus de virusuri care poseda proteine structurale de "difuziune" ca herpesvirusuri, paramixovirusuri, retrovirusuri); d. incluziogen (caracteristic unei replicări virale relativ lente şi însoţit, în afara de apariţia incluziilor virale (noi particule de virus) de vacuolizari citoplasmice, citomegalie, sincitizare etc. De reţinut faptul ca relaţiilor virus-celula gazda, exprimate morfologic, le corespunde o proporţie semnificativ mai mare de interacţiuni neproductive, aşa cum infecţiile clinic aparente sunt amplificate epidemiologic de infecţiile subclinice.

10.13.4. Leziuni cromozomale determinate de virusuri
Virusurile induc diverse anomalii cromozomale ca: aberaţii cromozomale (fragmentări, pulverizaţii, rupturi, schimburi cromatiniene); anomalii ale aparatului mitotic (mitoze multipolare , mitoze colchicina-like); cariotip anormal cu complement instabil sau stabil; policariocite. În ceea ce priveşte patogeneza virala la nivel molecular, de notat ca datele actuale evidenţiază adaptarea continuă a genomului viral şi a gazdei, astfel încât să fie asigurată supravieţuirea ambilor parteneri. Temin a propus o serie de intermediari evolutivi între elementele genetice mobile şi retrovirusuri, trecând prin provirusuri. Însăşi retrovirusurile cuprind grupe evolutive si anume: retrovirusuri nononcogene, lent-oncogene şi rapid oncogene . Se ştie că un concept recent asupra oncogenezei virale susţine integrarea unui provirus retroviral adiacent la o genă celulară potenţial oncogenă (c-onc). Important din punct de vedere teoretic este deci faptul ca inserarea elementelor genetice mobile (sau a provirusurilor) într-un loc sau altul al genomului celular mobil este urmată de inactivarea sau activarea unor gene celulare. Astfel de activări, consecinţă a controlului exercitat de un nou promotor, pot fi la originea unor tumori canceroase. -

229

10.13.5. Natura şi funcţia unor structuri virus-like: prionii
Un capitol de patologie moleculară a celulei interesant în virusologie, genetică şi clinică priveşte în prezent natura, compoziţia chimica si funcţia unor structuri puse in evidentă prin diverse metode, ori demonstrate direct prin microscopie electronică. Astfel proteina prion (PrP) este una din proteinele majore produse in exces in encefalopatiile spongiforme subacute la om si animale de laborator. Natura exactă a agenţilor neconvenţionali care induc aceste boli este necunoscuta in prezent. Au fost evocate câteva ipoteze conform cărora agenţii ar prezenta: un virus convenţional, o noua clasa de agenţi numiţi virioni, o proteină autoreplicabilă (numita Prion), un retrovirus sau este vorba de o boala post-translatională , care implică dereglarea sintezei proteice. Acumularea PrP , ca şi a proteinei acidice fibrilare gliale (GFAP) în infecţiile experimentale la şoarece cu scrapie, în special în creier, implică aceste proteine în mecanismele lezionale ale sistemului nervos central (SNC). PrP (33-35 KD) este o sialoglicoproteină celulară localizată pe faţa externă a neuronilor în cultură, ancorată printr-un glicolipid fosfatidilinozitol. Nivelul expresiei genetice PrP este menţinut strict pe parcursul vieţii. Studii de cinetică a expresiei genetice PrP si GFAP pun în evidenţa faptul că ARNm GFAP şi PrP variază semnificativ în timpul dezvoltării normale postnatale a creierului de şoarece. ARNm pentru proteina prion a fost detectată imediat după naştere şi a crescut de patru ori în dezvoltarea ontogenetică. În prezent este investigată expresia genelor PrP si GFAP în creierul in dezvoltare infectat cu scabie pentru cunoaşterea mecanismelor de reglare şi/sau dereglare în astfel de infecţii. Toate encefalopatiile spongiforme transmisibile, incluzând scrapia, sindromul GerstmannStraussler-Scheingker şi encefalopatia spongiformă bovină conţin forma agregată, parţial rezistentă la proteaze, ca un marker specific pentru boala oferit de această proteină PrP. Se consideră în prezent că spre deosebire de PrP normală de la suprafaţa neuronilor, forma agregată PrP apare fie dintr-o infecţie , sau de la o genă mutantă PrP, care acţionează ca un catalizator în conversia proteinei normale endogene PrP în cea agregată şi abundentă, astfel incît funcţia normală a proteinei este abolită şi rezultă boala degenerativă. Conform altor opinii, proteina normală PrP acţionează ca receptor pentru un agent al scrapiei încă neidentificat; de asemenea este incriminat un mic acid nucleic care este un virus neconvenţional ( de aceea este dată denumirea de virus neconvenţional sau virină). Din alt punct de vedere este frapantă similitutidinea de patologie a scrapiei cu studii recente privind receptorul poliovirus (PVR).Unele studii recente transgenetice au arătat de exemplu că şoarecele transgenetic exprimând PVR uman devine susceptibil la poliovirus; şoarecele normal este rezistent. Pe măsură ce şoarecii transgenetici ce exprimă PVR au dezvoltat această boală, ei arată modificări patologice corespunzătoare. O variantă a PrP a fost implicată recent în producerea sindromului Gerstmann-StrausslerSchemgker, boală umană rară similară scrapiei, caracterizată prin patologie spongiformă, proteină PrP protează rezistentă si placi (depozite mari proteice). S-a arătat în cazul acestui sindrom, un linkaj între incidenţa bolii şi mutaţia proteinei PrP şi anume, o substituţie a proliniei cu leucina la codonul 103. Ar fi vorba deci de o leziune genetică care poate cauza neurodegenerarea spongiformă transmisibilă sau mutaţia produce o modificare în structura proteinei sau în stabilitate, care mimează efectul legării unui agent patogen. Termenul de prion a fost introdus în biologia moleculară în anul 1982 de către Harley Prusiner de la universitatea din San Francisco. Prionii (cunoscuţi şi sub numele de protovirine, virineos, virusuri latente) reprezintă o clasă de agenţi infecţioşi subvirali, cu greutatea de 27000-30000, unici în felul lor, fiind rezistenţi la toate procesele de inactivare care degradează acizii nucleici (căldura, razele u.v, radiaţii ionizante); prionii rămân o enigmă „o perplexitate” a biologiei moleculare, deoarece admiterea existenţei lor drept agenţi infecţioşi, lipsiţi de acid nucleic şi formaţi exclusiv din
230

proteine, ar pleda pentru dărmarea dogmei centrale a biologiei moleculare, prin acceptarea unei codificări şi multiplicări a acestei proteine prionice infecţioase, nu prin intermediul acidului nucleic al celulei gazdă. Pentru acelaşi motiv,bolile prionice sunt considerate astăzi „pseudoinfecţioase” în comparaţie cu bolile infecţioase clasice, ale căror agenţi etiologici sunt microorganisme (virusuri, bacterii) care conţin în structura lor acid nucleic. Caracteristicile principale ale bolilor prionice sunt: - afectează sistemul nervos central (SNC) provocând encefalopalii spongiforme; - au o perioadă foarte lungă de incubaţie: de la câteva luni la 37-40 de ani; - au o evoluţie lentă, progresivă, totdeauna letală. Pâna în prezent au fost deschise 12 boli priorice: şase la animale şi şase la om (tabelul 4). Dintre acestea, cele mai bine studiate sunt scrapie la animale şi boala Crentzfeldt-Jakobs (CJD) la om. Celelalte zece boli prezintă similarităţi de ordin clinic, anatomo-patologice şi hismitochimic cu aspectele din scrapie. În aceste boli, principala caracteristică moleculară o reprezintă acumularea masivă în SNS a unei proteine PrPc a gazdei, dar într-o izomorfă anormală tip PrPsc (tip proteină din scrapie) la animal respeciv PrPcjd (tip proteină din CJD la om). În prezent se admit trei posibilităţi de producere a bolilor prionice : infecţia lentă, infecţie sporadică şi alterare genetică (tabelul 5). Tabelul 5. Bolile prionice Nr. crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Scleroza multiplă 12. Boala lui Alper
231

Boala Scarpie Eucefalopatia transmisibilă curcilor (TME) Boala cronică devastatoare (CWD) Eucefalopatia spongiformă a copitatelor (EVE) Eucefalopatia spongiformă felină(FSE) Eucefalopatia spongiformă bovină(BSE) boala vacilor nebune Kuru Boala Crentyfeldt - Jakols Sindromul GertmannStröussler Insomnia fatală familială

Frecvenţa SUA, Anglia, Franţa, Elveţia Rară dar cu mortalitate >90% SUA(Colorado, Wyoming) Anglia Anglia(1989) Anglia Papua – Noua Guinee 1/1.000.000 pe tot globul <0,1milion/an Japonia Italia, Anglia, Franţa, America Insulele Faroe, Scoţia, Irlanda, Key West

Gazda naturală capre, oi curci elan, căprior Nyola şi antilopa africană pisici domestice bovine om om om om om, unele tulpini au produs scrapie la oi om

Data transmiterii exprerimentale 1936 1939 1983 1988 1966 1968 1981 1993

PrPsc are o are o abilitate foarte mare de a determina modificări posttranslaţionale ale propriei molecule şi de a forma amiloid. Structura exclusiv proteică. Spre deosebire de virusuri. care produc răspuns imun prionii nu sunt imunogeni. În ţesutul cerebral al animalelor cu infecţie prionică plăci de amiloid şi fibre amiloide (SAF =fibre asociate scrapiei). fapt pentru care are consecinţe asupra replicării. Fibrele de amiloid reprezintă produse de degradare (de rupere) PrPsc infecţioase. fără precedent. capabilă de replicare. grupul ipotezelor de agenţi infecţioşi „fără geamăn” etc. Existenţa unor forme multiple cu grad înalt de infecţiozitate. ipoteza virină. Modificările posttranslaţionale care contribuie la transformarea PrPc în PrPsc au fost considerate un timp doar modificări conformaţionale de împăturire (substituirea α-helixurilor cu β-sheet-uri).. transmisibilităţii şi neuropatogenici bolii. dar nici un acid nucleic. Ipoteza viroidului animal Viroizii sunt agenţi subvirali exclusiv din ARN fără înveliş (capsidă) proteic. prin electroforeză în gel sarcosil şi sedimentare în gradient discontinuu de sucroza (proteină) cu greutatea moleculară de 27. Amiloidul reprezintă un derivat dintr-o glicoproteină celular normală (PrPc). dar PrPc poate fi complet digerată „în vitro” de proteineaza K. Absenţa imunităţii. lipsa de mişcare (agenţi ai unor boli cu incidenţă a mortalităţii extrem de mare pe glob) sunt total ignoraţi. complexe proteice cu lipit-detergent (DhPCs) şi sub formă de lipozomi. care se găseşte în mod normal pe membrana celulei neuronale. prezenţa acestui acid nucleic nu a fost încă confirmată. date recente pledează şi pentru modificări de ordin chimic.Se ştie astăzi că în cursul infecţiei prionice se produce conversia unei cantităţi de proteină PrPc (prin modificări posttranslaţionale) în PrPsc reprezintă tocmai SAF (proteină înalt infecţioasă). în timp ce viroizii sunt sensibili la nulează. abuzul de alcool. PrPc şi PrPsc au aceeaşi greutate moleculară (33-35Kda).v. de asemenea. Până în prezent nici una din ipoteze nu se bucură de adeziunea întregii comunităţi ştiinţifice. în timp ce fumatul. foarte rezistenţi la u.000-30. în timp ce PrPsc este rezistentă. Prionii pot exista sub formă de bastonaşe. Bolile prionice sunt cu evoluţie lentă. Plăcile amiloide sunt incluzii de prioni. 232 . apar paradoxal în absenţa oricărui răspuns imun care a putea opune rezistenţă înaintării infecţiei. fiind doar parţial digerată lăsând un miez rezistent proteinoza K. de agenţi infecţioşi fudamental diferiţi de virusuri şi viroizi. Multe întrebări referitoare la prionii îşi aşteptă răspunsul în viitor.Particularităţi de diferenţiere a prionilor de virusuri Prionii se diferenţiază de virusuri prin următoarele caracteristici majore: Absenţa ADN-ului.000 (PrP= proteină prionică). fomând împreună o particulă infecţioasă. Ipoteza virină O moleculă de acid nucleic ce conţine informaţia biologică (prion) ar fi protejată de o moleculă de proteină a gazdei.). Este de menţionat însă faptul că problema BSE (boala vacii nebune) şi cea a radioactivităţii ocupă în prezent aceeaşi nişă psihologică în societate. obezitatea. în toate aceste forme singura moleculă identificată este tot PrPsc. Aceste forme sunt interconvertibile. Spre deosebire însă de viroizii cunoscuţi (potato spindle tuber viroid). ipoteza retrovirusului. În încercările de purificare a prionilor. prionii sunt rezistenţi. prionii sunt de 10 ori mai rezistenţi decât ARN-ul purificat al acestora. Prionii rămân o clasă aparte. Ipoteze referitoare la natura prionilor Referitor la natura prionilor s-au emis imens unele ipoteze (ipoteza viroidului animal. acest miez este reprezentat de PrP 27-30 (GM= 30Kda).

Conform altor opinii. fiind similar ca aspect general cu nucleocapsidele fără înveliş ale paramixovirusurilor. Relaţiile bacterii-celulele gazdei Bacteriile sunt importante din punct de vedere teoretic şi practic prin rolul jucat în experienţele de recombinare a ADN (inginerie genetică) şi prin caracterul patogen al unor specii. macrofagelor . În patogenia umană ele produc infecţii-boală. Deşi problema acestor formaţiuni tubulare este şi ea grevată de necunoscute . Grupul ipotezelor de agenţi infecţioşi „fără genom” Plecând de la conceptul iniţial de prior respectiv „proteină autoreplicabilă”. fie produse de regenerare celulară sau chiar complexe imune. în sindromul de imunodeficienţă dobândită (SIDA) unele limfocite conţin în citoplasmă particule sferice . Argumente contra originii retrovirale a prioinilor sunt următoarele: nu a putut fi pus în evidenţă nici un retrovirus. dispuse ordonat după un model paracristalin. ar prezenta fie material celular alterat eliberat în circulaţii după răniri . tubulii prezintă un mers dens (probabil acid nucleic). glomerulonferită. fie datorită unor perturbatori ce apar posttranslaţional în conformaţia spaţială a proteinei în diferite etape. 233 . De pildă. 10. limfocitelor.asemenea agregate tubulare larg răspândite la om şi la animale . se emit mai multe ipostaze prin care se încearcă explicarea modificării proteinei celulare normale PrPc în proteină izomorfă patologică PrPsc. fie datorită unor mutaţii suferită de gena ce codifică PrPc. etc. Modele viitoare Modelele transgenetice deşi au sporit cunoaşterea noastră în înţelegerea bolilor scrapielike nu au clarificat totuşi complet rolul proteinei PrP.În sprijinul naturii virale a "tubulilor" pe lângă trăsăturile morfologice în examinarea directă . fibroblastelor. şoareci cu gene PrP nefuncţionale ar permite să se elucideze funcţia normală a PrP în sistemul nervos şi ar putea fi folosiţi să demonstreze dacă această proteină a gazdei este într-adevăr necesară pentru replicarea agentului scrapie. In secţiune transversală. De asemenea. În sfârşit. etc. S-a emis chiar ipoteza potrivit căreia etipatogenia aşa-ziselor colagenoze s-ar petrece mai întâi infecţia virală (acidul nucleic viral ar fii un timp în stare biofită )şi apoi imunocompromisul indus de virus. Se speră ca în viitorul apropiat să se creeze prin recombinare omoloagă. apoi o zonă cu densitate medie şi o pătură periferică (probabil proteică). în diferite ţesuturi şi în diferite boli.Ipoteza retrovirusului Pentru asigurarea retrovirală a prionilor se aduc ca argumente tropismul pentru SNC şi modificările de membrană (induse foarte rar) fără răspuns inflamator major. conţinând tubulii caracteristici. Formaţiunile respective au circa 1. linii de şoarece cu modificări precise în gena PrP endogenă şi fără nici o extracopie. datorită factorilor de patogenitate determinaţi genetic. prin metodele actuale.5 um în diametru şi fiecare tubul măsoară circa 20-25 nm. numeroase observaţii electronomicroscopice în boli ca lupusul eritematos .14.ca un stadiu în morfogeneza virală. s-au referit la incluziile "tubulare" (paramixovirus-like) dm citoplasmă celulelor endoteliale . De regulă RER apare anormal dilatat în celulele endoteliale ale vaselor sanguine din piele şi muşchiul scheletic la subiecţi cu astfel de boli. se acceptă încă folosirea lor ca elemente de diagnostic în unele boli ale ţesutului conjunctiv. s-a invocat capacitatea acestora de a perpetua în culturile de celule păstrându-se sensibilitatea la ribonucleaza cât si depozitarea complexelor imune virale de tip C în piele.dermatomiozită. în bolile prioniei. rezistenţă foarte mare la formaldehidă şi glutaradeldehidă (retrovirusurile fiind sensibile la aceste doua substanţe).

Oricare ar fi gradul patogenecităţii bacteriei implicate şi severitatea căii de pătrundere în organism. Penetrarea acestora este asigurată de enzime (histolitice şi citolitice) componente ale peretelui celular (peptidoglicani etc) şi de endocitoză de către celulele epiteliale care ulterior le exocitează. factorii de virulenţă incluzând factorii de colonizare şi factorii care contribuie la multiplicare. E. în cazul bacteriilor deficienţe ale aparatului mucociliar ale acestui tract favorizează producerea sinuzitelor. în intestin numai o singură celulă bacteriană din câteva mii ajunge să adere şi să colonizeze. inhibă sinteza proteinelor. Dacă virusurile gripale sunt cantonate la epiteliul ciliar al tractului respirator superior.bacteriile ajung în ţesutul subepitelial de unde pe cale limfatică şi/sau sanguină. de la suprafaţa bacteriei numite adezine şi receptorii corespunzători ai celulelor epiteliale. 234 . unele bacterii se limitează la epitelii (C. De reţinut că bacteriile foarte mobile şi subţiri (spirochetele) pătrund prin epiteliile gazdei atât prin endocitoză cât şi prin mişcări active datorită aparatului locomotor. Salmonella etc) pătrund în ţesuturile subepiteliale. coli etc) întrucât nu pot trece de fagocitele subepiteliale anticorpi. factori bactericizi serici etc. în timp ce altele (Str. formei spiralate şi extremităţilor ascuţite. sau fagocitate. pot difuza în tot organismul. pyogenes. hepatorenale şi nervoase. polipeptide. iar toxinele (proteice şi lipopolizaharidice) generează diverse efecte patologice. Fibrele periplasmatice ale spirochetei Tr. Agresinele de la suprafaţă (mucopeptide. Odată aderate şi înglobate în stratul de mucus secretat de celulele epiteliale. producând leziuni predominant cardiace. O importanţă majoră pentru aderenţă şi colonizare o are doza infectantă. singura zonă unde se găsesc şi adezine.liporoteine de 1000-125000 Da) sunt reprezentate în general de filamente (numite fimbrii la bacteriile gram-negative)şi de fibrile (la cele gram-pozitive). Adezinele(glicoproteine. de pildă citotoxică. După depăşirea membranelor bazale (care acţionând ca un filtru le temporizează diseminarea). Prezenţa receptorilor celulari corespunzători diferitelor adezine determină în mare parte specificitate de specie sau de ţesut a aderenţei bacteriene. starea de imunitate a gazdei reprezintă factorul major de condiţionare a manifestării patogenităţii. enzime) permit inhibarea ori ocolirea mecanismelor de apărare a gazdei. de către flora nazofaringiană normală. bronşitelor. pneumoniilor.Prin virulenţa lor. dipteriac. În procesul de aderenţă participă anumite structuri macromoleculare antigenetice. pallidum sunt implicare în locomoţia bacteriei care se deplasează "înşurubându-se" în mediul lichid. toxina difterică. ele pot depăşi capacităţile de apărare al gazdei. Sisteme enzimatice complexe situate la suprafaţa celulei bacteriene sau eliberate în mediu (care permit consumul elementelor nutritive ca atare sau modificate conform necesităţilor metabolice proprii) asigură multiplicarea lor.

c) Gene de la procariote transferate la procariote. tehnica separării moleculelor complexe prin anticorpii monoclonali corespunzători). marcarea moleculelor prin izotopi radioactivi. obţinându-se în acest fel organisme transgenice. substanţe antivirale şi amtitumorale. b) Gene virale transferate la eucariote.Capitolul 11 BIOTEHNOLOGIA Secolul XX şi în special perioada de după al doilea Război Mondial. vitamine. preparate cu rol în purificarea apelor industriale şi menajere ). în medicină (produse de interes medical utilizate în diagnostic. animale şi microorganisme. mucegaiuri etc). anticorpi monoclonali etc). Până în prezent s-au obţinut următoarele tipuri de transfer de gene: a) Gene virale transferate la virusuri. sinteza de aditivi alimentari). biotehnologiile moderne au mari implicaţii în industria alimentară ( producerea de proteine monocelulare neconvenţionale. cromatografia de afinitate (de ex.1. Biotehnologia este o ramură industrială complexă care utilizează drept materie primă microoganismele (bacterii. precum şi a tehnicilor de culturi de celule vegetale.. producerea de enzime. f) Gene de la eucariote transferate la eucariote. prin transfer de gene de la un organism la altul.1. tratament sau cercetare fundamentală. cum sunt lizina şi acidul glutonic. culturi de celule vegetale şi animale. 235 . electroforeză. vaccinuri. dar şi a structurii altor macromolecule biologice). determinarea structurii primare a unei proteine pornind de la numai 10 nanograme. e) Gene de la eucariote transferate la procariote. O importanţă deosebită au biotehnologiile moderne pentru manipularea genomului celulei vegetale şi animale în vederea creării de soiuri de plante şi rase de animale pe căi neconvenţionale. Tipuri de transfer de gene Prin această tehnologie se realizează noi combinaţii de ADN de la două organisme diferite.1. mult mai repede şi mai eficient. microanaliza (de ex. Folosindu-se un asemenea transfer s-a putut obţine prin tehnica de recombinare genetică un nou vaccin rabic cu o eficienţă mult crescută faţă de cele folosite în mod obişnuit. pentru obţinerea de organisme şi de substanţe utile economic.. 11. în industria farmaceutică (producerea de antibiotice. în bioexploatarea petrolului şi minereurilor (creşterea gradului de recuperare cu ajutorul unor microorganisme). Astfel. Gene virale transferate la virusuri. hormoni. 11. ca ultracentrifugare. de biochimie şi microbiologie. Ingineria genetică Progresele spectaculoase ale biologiei. sinteza unor aminoacizi esenţiali. în ecologie ( valorificare biomasei. drojdii. de biologie celulară şi moleculară. d) Gene de la procariote transferate la eucariote. a însemnat un uriaş pas înainte în dezvoltarea cercetărilor de genetică şi inginerie genetică. electrofocalizarea bidimensională (permiţând analiza a 50 000 de proteine ale unei celule). aşa cum se exprimă ele în realizările ingineriei genetice sunt strâns legate de înaintarea impresionantă a tehnicilor analitice. S-au creat astfel premizele apariţii biotehnologiilor moderne şi a bioindustriei.

reasortarea materialului genetic nu se poate realiza prin recombinare în cadrul aceleaşi celule. În aceeaşi categorie de transfer de gene se încadrează metoda de preparare a vaccinului hepatitei B (vaccin Engerix-B). În fiecare an se înregistrează 50000 de decese umane prin rabie pe glob (majoritatea în Asia) şi câteva milioane de decese la animale. S-au descris patru mecanisme diferite de transfer genetic: • transformarea. câini. • transpoziţia (translocarea sau recombinarea cu specificitate de situs). oprind diviziunea celulară şi propagarea celulelor neoplazice. Pentru producerea vaccinului la scară industrială. formate dintr-un duplex ADN. lupi. sconcşi. producând proteina-antigen HBs. Rezultă o celulă care conţine întreg genomul receptorului şi un fragment din genomul donorului. sunt folosite două tehnici. Transformarea reprezintă prelucrarea unei molecule de ADN de la o tulpină donor de către o celulă receptoare competentă. ADN-ul transformat se leagă de celula competentă. Gene de la procariote transferate la procariote Pentru a realiza introducerea ADN-ului (gena) bacterian într-o altă bacterie. care prin multiplicare a permis ulterior exprimarea şi sinteza în cantitate mare a respectivei proteine a antigenului HBs. lilieci (America). la nivelul unor situs-uri specifice ale învelişului celular. Deoarece bacteriile sunt organisme haploide. Becker şi Darai arată că ingineria genetică cu viruşi vectoare reprezintă un subiect de primă importanţă pentru dezvoltarea protocoalelor de terapie genică la om. cu ajutorul unui vector. în secvenţa ADN a fost identificată gena S drept responsabilă se sinteza proteinei S (antigen HBs). vulpe (Europa). în care levura se multiplică rapid. Prin aplicarea unei tehnologii genetice. sunt cromozomi accesorii. pătrunde apoi în celula receptor şi se integrează prin recombinare în regiunea omologă a cromozomului receptor. Cu ajutorul retrovirusului recombinat Herpes simplex tip I a fost transportată gena timidinkinaza HSV-1TK de la acest virus în celule pulmonare canceroase de la om. a fost inserată în materialul genetic al unei celule gazdă eucariote ( o levură). În 1995. 236 . vulpi polare. iar a doua în utilizarea bacteriofagilor. care a inhibat sinteza ADN celular din celulele canceroase. în serul bolnavilor de hepatită virală tip B). iar antigenul HBs este izolat şi înalt purificat. Astfel. Prima constă în utilizarea plasmidelor* ca vectori. Respectivul antigen nu este infecţios. tulpina de levură pe care se realizează procesul de recombinare este însămânţată în cuve de fermentaţie (bioreactoare). înainte de a fi condiţionat în vaccin. din cadrul aceleiaşi specii sau între specii bacteriene înrudite. • transducţia. se pot replica autonom (replicon). ci doar imunogen. Celulele de levură sunt apoi recoltate. Gene virale transferate la eucariote.Rabia este o infecţie virală ce se transmite prin muşcătură (în cazuri speciale şi prin aer) de câine. Pentru prepararea vaccinului Engerix-B (ADN recombinat). * Plasmidele = clasă majoră de elemente genetice mobile. Respectiva enzimă a indus în celulele canceroase sinteza de monofosfat de aciclovir şi ganciclovir şi apoi fosforilarea acestora până la forma de trifosfat. în mod constant. Biologia moleculară a permis determinarea cvasi-totală a materialului genetic al virusului hepatitei B. ratoni. a fost selecţionată levura Saccharomyces cerevisiae (1991) (Smith Kline-RIT). proteina S este un antigen de suprafaţă al virusului (antigen prezent. ci prin transferul de material genetic de la o tulpină donoare la una receptoare (diferită de prima). • conjugarea. broyate. din ADN viral a fost izolată gena S şi.

În acest fel. dar numai anumiţi fagi au proprietatea de a fi transductori (fagul λ de la E. în asociere cu un retrovirus. fagul P1 de la E. Pe baza capetelor ADN lanţ unic cu secvenţe complementare (sub influenţa ADN-ligazei) se pot lega cele două lanţuri ADN străine (plasmid + gena de la eucariot). ƒ se foloseşte un vehicul izolat dintr-o bacterie. Această tehnologie generică este folosită cu rezultate foarte bune de mai bine de 30 de ani. lipsită de factorul F). Plasmidul de formă circulară este deschis (cu ajutorul unei enzime de restricţie). Genele din genomul eucariot sunt transferate cu ajutorul unui vehicul corespunzător în organismul procariot iar apoi aceste noi gene transferate se multiplică (cu rată foarte înaltă) în organismul procariot. Aceste plasmide Ti. gena de sinteză a endotoxinei bacteriene de mai sus). folosite astăzi. coli. Transpoziţia este fenomenul prin care copii (elemente transpozabile) ale unor secvenţe specifice de acid nucleic. Gene de la eucariote transferate la procariote Acest transfer este practicat de 20 de ani. rezultatul fiind producerea unor tumori la plante. coli. incluzând şi gena eucariotă. în acest ultim caz. sau se poate integra în cromozomul bacterian (cu frecvenţă de 105 per generaţie). Plasmidul Ti provine de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. organismele procariote (microorganisme tip bacterii) cu rată foarte înaltă de multiplicare pot fi utilizate pentru sinteza anumitor gene din organismele superioare. formând deci un lanţ dublu ADN. Acest aspect reprezintă condiţia esenţială pentru fuziunea fragmentului ADN cu plasmidul deschis. Anumiţi fagi (convertizori) transportă gene cu alte funcţii decât cele virale.devine Hfr (high frequeney recombination). drept vectori pentru manipulări genetice (transfer între o celulă procariotă şi o celulă eucariotă). Conversia. Acest fenomen este practic posibil la toate speciile bacterine. Factorul F pătruns în celula receptoare Fpoate rămâne liber în citoplasmă şi atunci celula F. dintr-un genom bacterian. plasmidul se închide. începând cu capătul 5’ al ADN-ului. Acest tip de combinaţie ADN in vitro. Transferul de material genetic este polarizat de la celula F+ (celula donatoare. cel mai cunoscut fiind gena “tox” responsabilă de toxinogeneza tulpinilor de bacil difteric.Transducţia reprezintă transferul de material genetic de la o bacterie la alta. Gene de la procariote transferate la eucariote S-a obţinut transferul unei gene (responsabilă de sinteza unei endotoxine care omoară insectele) de la Bacillus thuringiensis în celule vegetale (bumbac) cu ajutorul unui plasmid Ti asociat cu un retrovirus. prin intermediul fagilor transductori. Deoarece endonucleazele se fixează pe plasmid doar la nivelul aceloraşi secvenţe de baze ca cele de pe fragmentul ADN. apoi tăiat de endonucleaze de restricţie. bacterie care parazitează plantele. având capacitatea de a se insera pe unul sau mai multe situs-uri specifice.. urmată de clonarea genelor nou transferate. prin intermediul factorului de fertilitate F (factor plasmidic = vector). celula receptoare F. care conţine factorul de fertilitate F ) către celula F. În acest fel. care devine astfel o parte integrantă din sistemul genetic al procariotului. plasmidul Ti poate trece spontan în celulele vegetale infectându-le. fagul P22 de la Salmeonella typhimurium). rezultând un plasmid 237 . îşi pierd capacitatea tumorigenă şi o păstrează doar pe cea de vector a unei gene străine (de ex. tumori cunoscute sub numele de “creasta cocoşului”.devine F+. deoarece prezintă frecvenţa înaltă de recombinare. Conjugarea presupune un transfer de material genetic de la celula donatoare la celula receptoare.(celula receptoare. se deplasează de-a lungul aceluiaşi lanţ de acid nucleic sau pe cel al altui genom bacterian. numit şi factor de fertilitate. obţinându-se un lanţ ADN unic. se foloseşte astăzi pe scară industrială şi se realizeză după următoarele etape: ƒ ADN din cromozomul organismului eucariot este extras şi purificat. rezultă locuri de tăiere cu secvenţe complementare.

în acest caz influenţa tratamentului transmiţându-se progeniturii. Terapie cu gene ţintă (Gene Targeting) În condiţiile progresului actual al ştiinţelor biologice. infecţii HIV. gena umană (de pe cromozomul 10) responsabilă de sinteza factorului VIII al coagulării a fost clonată şi transferată în celule renale de hamster. determinând terminarea transferului de gene. injectarea acestora cu gene sănătoase fixate pe un virus vector. celula de hamster începând să sintetizeze produsul acestei gene.interferon leucocitar de fibroblaşti (1980). De pildă. Gene de la eucariote transferate la eucariote Gene umane (responsabile de sinteza unor produse metabolice) au fost transferate în celule de drojdii. În aceste boli. apoi reinfuzarea respectivelor celule la pacient. se încearcă introducerea unei gene normale în genomul pacientului şi urmărirea acestei acţiuni în timp.1. terapia cu gene poate fi de două feluri: ƒ terapie cu gene somatice. 11. Aceste celule bacteriene au fost transformate. rămâne practicabilă doar terapia cu gene în celulele somatice. Prin tehnologia genetică de transfer de gene de la eucariote la procariote s-au obţinut următoarele sinteze: . Această terapie este încă la început.somatotropina (hormon de creştere uman) (1979) . există premisele tratării într-un viitor foarte apropiat a unor boli genetice.interleukina umană (1980) . ƒ selectarea celulelor bacteriene care conţin gena eucariotă se realizează cu ajutorul unui plasmid care poartă unul sau mai mulţi markeri de rezistenţă la antibiotice. Dacă cultura bacteriană cu plasmidul mai sus-menţionat este pusă în prezenţa antibioticelor respective. vor fi omorâte. după integrarea în genomul lor a genelor umane. Pentru a se facilita pătrunderea acestui plasmid hibrid în celula bacteriană se foloseşte soluţia de CaCl2. terapia cu gene are drept scop introducerea unor gene intacte din punct de vedere funcţional în celulele cu genă defectă şi apoi exprimarea acestor gene nou introduse. necesar în tratamentul hemofilicilor. au putut sintetiza produse metabolice umane. adică factorul VIII de coagulare. ƒ terapie cu gene sexuale. Astăzi este însă interzis prin lege transferul de gene la nivelul celulelor sexuale umane. dar rămâne fără efect asupra descendenţilor. cu câteva excepţii. în care celulele receptoare de genă intactă sunt celulele organismului.2. deci fiecare celulă bacteriană dintr-o colonie rezistentă la antibiotice conţine o genă eucariotă. Gene umane au fost inoculate şi în culturi de celule de mamifere. Din punct de vedere teoretic. acestea. în care celulele receptoare de genă intactă pot fi celulele sexuale sau celula ou fecundată. care creşte permeabilitatea membranei bacteriene. preţul acestui produs s-a dovedit a fi mult mai ieftin decât al factorului VIII extras din plasma de la om sănătos. principiul acestei metode este recoltarea de la pacienţi de celule cu defect. boli neoplazice. înlocuirea genei mutante printr-o alelă normală. Aceste celule bacteriene cresc pe respectivul mediu sub formă de colonii în care există un număr de ordinul a sute de milioane de celule bacteriene cu genă eucariotă. O bacterie rezistentă posedă o genă (eucariotă) străină (cuplată cu plasmid cu markeri de rezistenţă).hibrid. tratamentul este restrâns doar la pacienţii trataţi. În prezent drojdiile se folosesc în acest scop pe scară largă în industria farmaceutică. bacteriile. În acest caz. Acest prim pas reprezintă “adiţia de gene“. Principiile de bază ale terapiei cu gene sunt următoarele: 238 . Pentru cele 4000 de boli genetice umane cunoscute astăzi ca nevindecabile se preconizează o terapie genetică prin: reperarea genelor mutante responsabile de defectul genetic şi ulterior.

Cu referire specială la utilizarea retrovirusurilor drept vectori de gene. ƒ distrofia musculară Duchenne. aceste celule T din culturi au fost inoculate cu gene pentru enzima adenozindezaminază. se caracterizează prin creşterea consistenţei secreţiei pancreatice având drept consecinţă obturarea glandelor exocrine şi formarea de chisturi pancreatice cu distrugerea ţesutului pancreatic şi scăderea nivelului enzimelor pancreatice. De la Univ. în aceste boli există o genă deficitară în sinteza subunităţii tip β-globină din structura hemoglobinei. celulele ţintă pentru terapia cu gene sunt reprezentate. Apoi aceste limfocite inoculate au fost cultivate şi multiplicate mai departe în culturi celulare. introducerea în celulele ţintă cu ajutorul unor vectori corespunzători (retrovirusuri) a unor gene sănătoase. în exonul 48 al respectivei gene. dacă va fi conectat printr-o reţea de vase sanguine cu ficatul. Această boală este foarte rară. Cu ajutorul unui vector. aceste limfocite au fost cultivate şi multiplicate în culturi celulare. a unui retrotranspozon L1. ƒ mucoviscidoza (fibroza chistică) este o boală genetică recesivă care afectează pancreasul exocrin. Houston din Texas preconizează pentru tratamentul acestei boli realizarea unor ‘neo-organe’ (structuri din materiale artificiale plasate în vecinătatea ficatului). fiind apoi reinfuzate i. Absenţa respectivei enzime determină scăderea capacităţii de apărare a organismului şi moartea copilului în primul an de viaţă. şi medicii Michael Blaese şi Kenneth Culver de la Naţional Cancer Institute au efectuat prima terapie cu gene tocmai într-un caz cu deficit funcţional de limfocite T. a următoarelor boli ereditare: ƒ boli sanguine de tip talasemie şi meniscocitoză (sickle cell anemia). care îl va elimina. Această inactivare este consecinţa inserţiei. până astăzi fiind descrise numai 50 de cazuri în literatura de specialitate. se manifestă printr-o topire rapidă a masei musculare. Epoca terapiei cu gene a început în septembrie 1990 în SUA. la acelaşi copil. va extrage excesul de colesterol din sistemul circulator (unde colesterolul poate determina tulburări cardiovasculare) şi îl va îndrepta prin reţeaua sanguină către ficat. trebuie menţionat că Richard Mulligan de la Massachusetts Institute of Tehnology a imaginat o metodă eficace 239 . a. şeful secţiei de Hematologie Moleculară de la Naţional Heart. de celulele stem pentru seria eritrocitară din măduva osoasă. ƒ hipercolesterolemia familială. cultivarea şi multiplicarea celulelor ţintă în culturi celulare. Acest ‘neo-organ’ (cu rol de ligand).ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ recoltarea de celule ţintă de la pacient. pe baza terapiei cu gene. Anderson şi colab. ƒ boala imunodeficienţei combinate severe (SCID) cu deficit funcţional al limfocitelor T (prin absenţa enzimei adenozindezaminaza A şi B). boala apare ca urmare a inactivării genei responsabilă de sinteza distrofinei. reintroducerea acestor celule la pacienţi. Terapia cu gene în boli ereditare Majoritatea bolilor genetice la om sunt determinate de mutaţii punctiforme sau deleţii. este o tulburare genetică a metabolismului grăsimilor. în condiţii speciale. clonarea genelor sănătoase. în care sunt introduse celule hepatice injectate cu gene care au capacitatea de a atrage colesterolul. În această boală este prezent şi un deficit funcţional al enzimei mitocondriale NAD. când Francis Anderson.v.dehidrogenaza cât şi o creştere intercelulară de ioni de Ca++. selectarea celulelor care conţin gene sănătoase străine şi exprimarea lor. Acest tratament va trebui repetat în cursul vieţii pacientului. Lung and Blood Institute al Universităţii Houston Texas. Procedeul a constat în recoltarea de limfocite T de la copilul bolnav. În prezent se studiază posibilităţile tratării. bazat pe absenţa receptorilor LDL (lipoproteine cu densitatea scăzută) ai celulelor hepatice. în acest caz. multiplicarea celulelor dorite în culturi de celule.

Această prelucrare constă în eliminarea prealabilă a majorităţii genelor virale din structura acestuia şi combinarea ulterioară a segmentului de virus rămas cu genele care urmează să fi injectate în celulele umane. Împreună cu R. nu ucid celulele pe care le contaminează. or celulele stem. se fixează pe această proteină de pe suprafaţa limfocitelor. macrofagele extrase şi întreţinute pe culturi celulare au fost inoculate cu vector purtător de TNF şi apoi reinlocuite la cei doi pacienţi cu melanom. cel puţin parţial. deci transducţia în aceste celule este practic imposibilă. fiind foarte greu de obţinut. În prezenţa respectivei gene. fenomenul de transducţie poate avea loc doar în celule care se divid. Fenomenul prin care retrovirusul vector transportă şi fixează o anumită genă în nucleul unei celule ţintite poartă numele de transducţie. Terapia cu gene în boli neoplazice A fost utilizată întâia oară în melanomul malign. acest factor TNF este sintetizat de macrofage şi eliberat în circulaţie. De aceea. se divid foarte rar. care apoi vor fi infuzate pacientului. deoarece există pericolul diluţiei acestui factor. această proteină ar putea fixa virusul HIV.de prelucrare prealabilă a acestui virus. într-o mixtură cu acesta. În cazul în care în sistemul sanguin ar putea exista şi circula o cantitate mare dintr-o proteină similară. În plus. Pentru terapia genică. c. la locul tumorii nemaifiind posibil să ajungă o concentraţie suficient de activă de TNF. într-o cultură de celule. b. În mod normal. Terapia cu gene în infecţia HIV Anderson şi colab. Retrovirusurile sunt mai mici decât celelalte virusuri şi. Pentru a fi ‘altoite’ cu retrovirusul transductor. în cazul acestor doi pacienţi cu macrofage defectuoase. proporţia acestor celule stem în ţesuturile medulare este mai mică de 1/10000 şi nu există nici o metodă adecvată de separare a celulelor stem de celelalte celule. Factorul TNF este o proteină formată din 157 de aminoacizi cu rol în captarea şi distrugerea celulelor tumorale şi a substanţelor străine organismului. în câteva ore virusul va pătrunde în majoritatea acestor limfocite. păstrând însă capacitatea ca. au fost preferate limfocitele drept celule ţintă pentru vectori. o dată introdus într-o celulă. acesta nemaiputând să pătrundă în celulele sistemului imunitar. Virusul HIV. Gallo (National Cancer Institute) preconizează tratamentul cazurilor de SIDA prin terapie ţintită cu o genă pentru sinteza unei proteine receptoare CD4 pe suprafaţa limfocitului. ciclul de multiplicare virală intracelulară fiind astfel oprit. limfocitele sunt puse în contact. Retrovirusurile reprezintă astăzi uneltele cele mai larg utilizate în ingineria genetică. Iniţial s-a încercat folosirea celulelor stem (celule-tulpină) din măduva osoasă. În acest fel. Este posibil ca limfocitele corectate (prin injectare cu virus vector + gena pentru sinteza enzimatică) să asigure un timp. deposedat fiind de capacitatea infecţioasă. alegerea celulelor ţintă este foarte importantă. În 1991. două persoane cu forme avansate de melanom malign au fost supuse următorului tratament: li s-au extras o cantitate de macrofage pe care s-au grefat apoi vectorii (retrovirusuri) purtători de gene pentru sinteza de ‘factor de necroză a tumorilor ‘ (factor TNF). TNF nu se poate injecta direct în torentul circulator. un anumit nivel imunitar organismului. în primul stadiu al pătrunderii sale în organism. să-şi poată îngloba încărcătura genetică în aceasta. virusul lipsit de majoritatea genelor proprii devine inofensiv. spre deosebire de acestea. limfocitele ar fi capabile să sintetizeze o cantitate mare din această proteină. dar aceste celule s-au dovedit a fi ţinte foarte dificile. deşi celulele stem au o durată de viaţă infinită în comparaţie cu limfocitele ( cu viaţă doar de câteva luni). 240 . De aceea.

de a manipula şi cultiva in vitro.de asemenea. celule) din organisme vegetale. ce se incorporează în genom şi se transmit descendenţilor. Organismele transgenice (plante şi animale) sunt organisme care pe lângă înzestrarea lor genetică câştigă proprietăţi noi.1. Aplicarea metodelor de biotehnologie în agricultură în vederea obţinerii de organisme transgenice Biotehnologiile moderne. permutaţii de organite citoplasmatice. care să prezinte caracteristici îmbunătăţite. a deschis primele căi de intervenţie genetică. în interesul omului. obţinerea primelor organisme transgenice a deschis noi perspective în ingineria genetică vegetală. 136 şi 137). Biotehnologia de hibridare somatică Această procedură permite hibridări totale sau parţiale.1984). Prin acest procedeu se obţine regenerarea unui număr mare de plante .Etapele de izolare şi cultură a protoplaştilor (după CachiţăCosma. Posibilitatea de a utiliza elementele disociate (ţesuturi. 135 . Fig.figurile: 135. au în vedere obţinerea de organisme modificate genetic (transgenice). fuzionare de protoplaşti (celule fără perete pectocelulozic) chiar de la două specii diferite.3. pentru analiza segregărilor* la descendenţii rezultaţi din hibridizări. 241 . aplicabile la plante şi animale. a.11. în vederea regenerării plantelor. cunoştinţele de genetică vegetală se foloseau doar pentru studiul eredităţii. La plante Până de curând. Se obţin hibrizi în afara sexualităţii.

cibrizi şi himere (după Badea şi Raicu. Fig.Prin fuziunea protoplaştilor se produc hibrizi somatici. 137 .ginogeneza = cultura şi regenerarea plantelor plecând de la ovul sau de la celule haploide asociate. 138). Biotehnologie de haploidizare Ţesuturi care au suportat meioza (deci sunt haploide) sau celule rezultate din pseudofecundaţie provocată sunt introduse în culturi in vitro.Prezentare schematică a principalelor posibilităţi de obţinere a unor noi varietăţi de plante (după Brezeanu şi Soran. 136 . 1985).Fig. 242 . Există 2 tipuri de haploidizare: . 1984).androgeneza = cultura şi regenerarea plantelor plecând de la microspori (fig. .

Plantele regenerate au un singur set cromozomial (patern de androgeneză şi respectiv matern de ginogeneză) şi ar fi rămas sterile dacă n-ar fi fost puse la punct mecanismele de autodedublare a acestor cromozomi. În general se urmăresc obţinerea următoarelor proprietăţi în noile organisme transgenice: ƒ fixarea azotului din atmosferă. la porumb în 1990.Obţinerea de plante haploide. bacteriene. ierbicide.Diferite faze ale desfăşurării androgenezei la Datura innoxia: 1 – structuri embrionare diferenţiate direct din anteră. Prin aceste metode de haplodiploidizare se crează plante diploide perfect homozigote (linii izogene) şi de utilitate majoră în ameliorarea calităţii speciilor de plante (descendenţi absolut omogeni în anumite condiţii de reproducere) (fig. insecte.Fig.. Primele organisme transgenice prin biotehnologie de transfer s-au obţinut la cereale: la orez în 1988.1987). la grâu în 1992. 139). 243 . ƒ creşterea producţiei de substanţe nutritive. concentraţie crescută de Na în sol.3 – plante complet diferenţiate din antere. temperatură nefavorabilă. creşterea cantităţii de acizi graşi nesaturaţi. 139 . ƒ izolarea din plante a substanţelor cu proprietăţi farmaceutice. Biotehnologie de transfer Un exemplu a fost menţionat la capitolul despre tipurile de transfer de gene procariote la eucariote în scopul obţinerii de specii de plante (bumbac) rezistente la insecte. prin folosirea tehnologiei genetice. linii izogene şi mutante la nivel haploid prin cultura in vitro a gametofiţilor. care reprezintă circa jumătate din necesarul de substrat alimentar pentru alimentaţia populaţiei globului cu proprietăţi cât mai adecvate. ƒ toleranţa la uscăciune. metale grele. Spre aceste trei specii de cereale. 5 – plantă androgenetică la ghiveci (după Badea şi colab. ƒ rezistenţa la infecţii virale. 138 . vegetale. 2. 4 – plantă androgenetică în tub. Fig.

în vederea obţinerii unor organisme transgenice cu metabolism activat. ƒ încheierea de acorduri internaţionale pentru înfiinţarea unei comisii de etică cu posibilităţi de control permanent. Pentru acest motiv oamenii de ştiinţă vor trebui să folosească cu multă grijă şi măsură aceste posibilităţi moderne ale biotehnologiei. aceste noi organisme transgenice au avut o viteză mult mai mare de creştere decât organismele noi organisme transgenice au avut oviteză mult mai mare de creştere decât organismele normale. cu o eficienţă înaltă de utilizare a hranei şi cu o creştere foarte rapidă. care a oprit sinteza enzimei poligalacturonaza. La porci au fost transferate gene responsabile de sinteza hormonului de creştere. în SUA au fost obţinute soiuri de roşii transgenice prin metoda de inhibare cu ARN antisens. se pot enumera: ƒ pierderea diversităţii lumii vegetale. În timp ce pentru o cultivare de plante clasice sunt necesari zece ani. neprevăzute în prezent. În 1995. Pentru viitor. alcaloizi. trebuie luate în considerare anumite riscuri care apar drept consecinţă a apariţiei unor variante de specii vegetale. tutun şi petunii. ƒ noi biosinteze. b. În 1993. hormoni (produse vegetale). rezistente la uscăciune. în SUA a fost proiectată crearea unor soiuri de plante transgenice rezistente la ierbicide. La animale S-au obţinut crapi transgenici prin transfer de gene de creştere de la creştere de la păstrăvi. ƒ dezechilibre nutriţionale. având drept consecinţă dezechilibrul ecosistemelor. ƒ inhibarea replicării virale prin tehnica antisens (1992). grad înalt de salinitate şi rezistente la insecticide. responsabilă de compunerea peretelui celular al tomatei. ƒ riscul dezvoltării explozive a unor ‘patotipuri’ adaptate în mod special.Până în prezent au fost obţinute noi soiuri transgenice de roşii. Obţinerea de noi soiuri de plante rezistente la infecţiile virale se realizează prin: ƒ integrarea unei părţi din ADN viral în genomul plantei. ƒ restrângerea gamei de calităţi organoleptice naturale ale unor noi sorturi de legume şi fructe. prin aceasta. care să fie livrate pe piaţă în următorii zece ani. În acest sens se recomandă: ƒ evitarea difuzărilor tipurilor omogene şi uniforme de vegetale pe suprafeţe foarte întinse. etapă de etapă. metale grele. asupra varietăţilor nou-obţinute. ƒ efectuarea detailată a analizelor de structură şi control în faza precoce a noilor variante ale unui sort vegetal. pentru obţinerea unui nou caracter. exprimarea proteinei de înveliş viral va asigura rezistenţa plantei la respectivul virus. grâu. Prevenirea riscurilor menţionate mai sus cere multă prudenţă cât şi anticiparea remediilor posibile înainte de crearea noilor variante. enzime. ƒ deşteptarea unor gene ancestrale nedorite. glucozide. Dintre riscurile posibile. în SUA se prevedea obţinerea de noi soiuri de plante transgenice rezistente la insecte. acest interval scade la şase ani. În 1994. în timp ce buruienile rămân sensibile la ierbicide. tomatele pot fi culese când se află la punctul favorabil al coacerii şi se pot păstra şase-opt săptămâni fără a fi puse la rece. În anul 1992 erau raportate 40 de soiuri noi de plante transgenice. în cazul utilizării tehnicilor genetice. În aceste condiţii. ƒ posibilităţi de biosinteze nedorite de acizi graşi. căldură. 244 .

Ingineria genetică şi rezolvarea unor probleme de ecologie Posibilităţile tehnologiei genetice au importanţă nu numai pentru dezvoltarea cercetării fundamentale. ci şi pentru rezolvarea în viitor a unor probleme ecologice. Pentru produsele în care nu se poate renunţa total la adaosul de nitraţi (nizina fiind ineficientă asupra florei gram-negative). 11. În acest sens. aspect ce semnifică posibilitatea unei mai bune utilizări a petrolului brut natural. Alte aspecte ale biotehnologiei moderne şi perspectivele secolului XXI Progresele recente în cunoaşterea la nivel molecular a interacţiunilor extra.1. Din 1951. prin utilizarea lor asociată cu nizina. brânzeturi proaspete şi procesate. ambele clase de substanţe derivate din uleiuri vegetale.şi intracelulare. Această largă utilizare se datoreşte faptului că nizina prezintă marele avantaj de a nu avea efecte nocive asupra organismului viu. peşte.5. în concentraţie mai mică de 30 µl/ml inhibă dezvoltarea diferitelor specii de germeni gram-pozitive . carne. În perspectiva dezvoltării biotehnologice. ducând în final la obţinerea unor arome naturale (lactone şi metilketone) cu utilizare largă în industria alimentară. în 1989. dar nu are nici un efect asupra majorităţii bacteriilor gram-negative şi nici asupra fungilor şi levurilor. de exemplu creşterea sintezei unor resurse naturale din mediu. drept conservant natural pentru vegetale. 4 Lancefield. Ingineria genetică utilizată în prepararea de noi conservanţi alimentari Nizina. mediate de clase specifice de molecule şi semnale au contribuit la construirea unui fundament pentru elaborarea viitoarelor strategii de sinteză a unor noi agenţi terapeutici cu următoarele calităţi: 245 . prezentând activitate inhibitorie maximă la un pH mai mic de 5. care prin producerea de nitrozamine au acţiune carcinogenă asupra organismelor. Nizina este produsă de tulpinile de Lactococcus lactis 6F3.4. variante ce vor putea fi utilizate drept conservante într-o gamă mult mai largă de produse alimentare. se încearcă în prezent obţinerea unei bacterii ‘ îmbunătăţite’. Totuşi în prezent se consideră că posibilităţile de utilizare ale nizinei drept conservant alimentar sunt încă limitate din cauza slabei ei solubilităţi şi a stabilităţii scăzute la pH neutru. ATTC 11454 GR. cacao. astfel. se preconizează obţinerea prin procedee de inginerie genetică şi proteică a unor variante de nizină cu spectru larg de activitate. al cărei plasmid să crească eficienţa utilizării petrolului brut. a dezvoltării ştiinţelor medicale şi agriculturii. 11.1. neproducând nici o dereglare a florei intestinale gram-negative. nizina era utilizată drept conservant alimentar în peste 50 de ţări de pre glob.11. Nizina inhibă de asemenea sporularea la bacterii din genul Clostridium şi Bacillus. substanţă din categoria lantibioticelor.5. prin studiile de micribiologie au fost identificate tulpini microbiene care printr-un proces de bioconversie microbiană/enzimatică acţionează asupra acizilor graşi (acid linoleic şi linolenic) şi esterilor. Multe tulpini bacteriene de Pseudomonas putida posedă un plasmid responsabil de descompunerea hidrocarburilor din petrol. fructe. cantitatea de nitraţi poate fi redusă considerabil. în prezent ea poate fi utilizată drept conservant activ în alimente cu pH-ul mai mare de 6. În ultimii ani. şi-a găsit o foarte largă aplicabilitate practică în industria alimentară. băuturi alcoolice (vinuri). în comparaţie cu nitraţii şi nitriţii (folosiţi tot drept conservanţi). evitându-se astfel nocivitatea altor conservanţi alimentari asupra sănătăţii publice. Nizina prezintă şi avantajul de a fi hidrolizată complet de către proteazele tractului digestiv uman.5.2. nizina este folosită în industria alimentară pe scară internaţională.

S-a constatat că acest factor bFGF are o acţiune de stimulare a proliferării celulelor endoteliale de activare a angiogenezei (neoformaţie de vase sanguine). prezentând sinergie cu metotrexatul şi adriamicina. suprimând superrăsucirile dublului helix. 246 . opresc fixarea bFGF pe respectivii receptori. peptide antagonice. Molecule active pe tubulină (antimitotice) Au acţiune antimitotică împiedicând diviziunea celulară prin stabilizarea microtubulilor (spre diferenţă de Vinca. anticorpi. a fost sugerat un mecanism de blocare a receptorilor celulelor endoteliale cu ajutorul unor analogi ai heparinei. care. anticanceroase B. dintre acestea. blocând receptorii celulelor endoteliale. alcaloizi care determină depolimerizarea tubulinei). antivirale C. înţelegând prin aceasta o acţiune cât mai ţintită asupra celulelor tumorale. ƒ minimalizarea cât mai mult cu putinţă a efectelor toxice secundare ale drogurilor. bazându-se pe achiziţiile cele mai recente ale biologiei moleculare. sunt platine liposolubile care se pot administra cu ajutorul liposomilor. cu aplicabilitate practică în domeniul terapiei: A. Ţinând seama de aceste considerente. Acesta s-a dovedit foarte eficace în asociaţie cu alte antimitotice curente. Dintre antimitotice. b. împiedicând în consecinţă angiogeneza şi inhibând simultan adenoamele experimentale (de pancreas. taxolul a fost testat experimental prin administrare intratumorală în tumori vezicale la şoarece. terapia anticanceroasă cu citostatice este nesatisfăcătoare într-un număr mare de cazuri din cauza: ƒ dezvoltării rezistenţei la droguri ƒ efectelor secundare nocive (imunodepresie medulară. toxicitate hepatică şi renală etc.ƒ ƒ ƒ ƒ eliberarea ţintită (situs-specifică) în circulaţie prelungirea timpului de înjumătăţire efect prelungit la locul de acţiune efecte benefice mărite asupra organismului. şi anume: a. sân. în cursul distribuţiei acestora în organismul bolnav. Pentru contracararea acţiunii bFGF. prostată) de origine umană. cardiovasculare D. A. Pe modele experimentale s-a demonstrat şi eficacitatea ologozaharidelor sulfatate. Substanţe antiangiogenice S-a studiat rolul factorului de creştere fibroblastic (bFGF) asupra mecanismelor de angiogeneză (geneza vaselor sanguine) şi consecinţa acesteia asupra metastazării. în boli metabolice. pentru cisplatină şi carboplatină a fost demonstrată eficacitatea clinică. cercetătorii şi-au propus: ƒ îmbunătăţirea gradului de acţiune selectivă a drogului. Pornindu-se de la aceste elemente. Inhibitori ai topoizomerazelor Topoizomerazele sunt enzime destinate a modifica structura spaţială a ADN-ului înainte de replicare. Diaminociclohexanul şi axoliplatina sunt în curs de experimentare şi nu au atins încă faza de testare clinică. s-a încercat construirea unor noi molecule cu potenţial antiumoral. c. Terapia anticanceroasă În prezent. Derivaţii de platină reprezintă astăzi o clasă foarte studiată de antimitotice.). În acest sens există deja o metodologie pentru obţinerea unor proteine-himere.

inhibă autofosforilarea bFGF (via tirozinfosforilare). fiind astfel inhibată dezvoltarea metastazelor (prin inhibarea neoformaţiei de vase de sanguine). în consecinţă. Oligonucleotidele antisens sunt fosfodiesteri naturali care au diferite mecanisme de acţiune. În prezent sunt studiate metodele de inoculare cele mai eficiente a acestor substanţe în organismul bolnav.Se pare că aceste substanţe antiangiogenice acţionează prin oprirea dezvoltării de noi vase sanguine şi nu prin distrugerea celor formate. Pornind de la aceste aspecte. strategia de sens este mai piţin selectivă. Majoritatea drogurilor existente în prezent acţionează la nivelul proteinelor. metastazarea. e. translaţia sau respectiv reverstranscriptaza ARN-ului (viral) ţintă. prin legarea lui de ARN-ul ţintă (target). Un oligoribonucleotid (ribozim) ARN se leagă de o secvenţă complementară a ARN ţintă. trebuie amintit mai întâi că transformarea celulelor normale în cellule maligne reprezintă un proces în mai multe etape: ƒ activarea protooncogenelor ƒ inactivarea genelor supresoare de tumori ƒ inactivarea genelor de reparare a ADN. d. Substanţe antisens Studiul acestor substanţe a fost posibil datorită cercetărilor de biologie moleculară. Inhibitori de kinaze Sunt inhibitori ai tirozinkinazei proteinkinazelor. folosit pentru a prinde “în cursă” un factor de transcriere (de expresie) care duce în final la alterarea expresiei tuturor genelor de pe respectivul fragment ADN. pornindu-se de la această idee. s-au preparat fragmente scurte de acid nucleic (oligonucleotide). Chiar şi drogurile anticanceroase care interacţionează cu ADN îşi exercită acţiunea biologică prin inhibarea enzimelor (topoizomeraze) care procesează ADN. ca şi oligonucleotidul antisens. Pentru a se înţelege mecanismul de acţiune (‘’controlul’’) al ciclului nucleic antisens asupra unui proces de oncogeneză (“expresie oncogenă“). Modul cel mai simplu de a corecta activitatea acidului nucleic este cel de a folosi tocmai acid nucleic. Rezultă că în comparaţie cu strategiile “antisens” (tip ribozim). pentru a forma în final un triplu helix la nivelul căruia este blocată transcrierea (ceea ce reprezintă blocarea primei etape a expresiei genelor). f. astăzi sunt urmărite următoarele obiective: ƒ descompunerea unor droguri care să poată inhiba selectiv efectele biologice ale produşilor oncogeni ƒ restabilirea funcţiei factorilor supresori de tumori şi a genelor pentru repararea ADN-ului. AACR 3679) ƒ proteinele p120 (pentru substanţele AACR 1832. acţiunea lor a fost urmărită până în prezent pe linii celulare. Acest oligonucleotid (antisens) blochează. care să se lege selectiv de o secvenţă complementară a unui acid nucleic unic lanţ (un ARNm sau un ARN viral). Oligonucleotidele pot fi folosite pentru controlul genelor în aşa-numita strategie de sens (sense approach). deci opresc neoformaţia şi. dar poate include în plus şi clivajul catalitic al ARN ţintit. Oligonucleotidele antisens de tip oligofosfotioaţi se folosesc şi în tratamentul leucemiilor şi al infecţiilor cu HIV. Strategia “ de sens” cu structuri oligonucleotidice În 1980 a apărut o nouă strategie şi anume cea a antigenelor în care oligonucleotidul are drept “ţintă” un ADN dublu helical. ţintele principale de acţiune a acestor substanţe dovedindu-se a fi: ƒ gena oncogenă c-myc (pentru substanţele AACR 1833. este vorba de un oligonucleotid “capcană”. AACR 3672. prin inhibarea acţiunii bFGF este oprită proliferarea fibroblastelor. tioindolului. Totuşi oligonucleotidele “capcană” pot 247 . căutându-se a se ameliora penetrabilitatea lor în celule. AAXR 3155) ƒ proteinele p53 (pentru substanţele AACR 3630. AACR 3154. AACR 3668. AACR 3668).

Schmidt-Wolf şi colab. deoarece aceste preparate terapeutice reuşiseră mai mult sau mai puţin să ducă la dispariţia acestor infecţii de pe glob. aceste celule limfocitare vor fi foarte bune vehicule în organismul bolnav datorită capacităţii lor de a prolifera. poate determina chiar şi îndepărtarea unei tumori preexistente. sau obţinută în urma unei terapii genice cu gene (sintetizatoare) de citokine. pe baza legărilor lor de o proteină a cărei funcţie normală nu implică creo interacţiune cu acidul nucleic. Aceste celule CIK s-au dovedit a fi celule efectoare citotoxice foarte eficiente. Dar în 1981 apărea virusul HIV (Human Immunodeficiency Virus). poate induce o imunitate antitumorală puternică de lungă durată şi ocazional. cu efect antitumoral mult mai înalt decât cel al celulelor LAK (celule killer activate de limfokine standard). în condiţii de recombinare.interleukina IL2) Aceste proteine de fuziune au fost realizate prin tehnici de inginerie genetică. i. se folosesc oligonucleotidele cu rol de liganzi pentru enzime. h. Efectul acestor oligonucleotide de strategie de se3ns poate fi deci selectiv pe un virus sau parazit. În 1995. Terapie genetică cu gene codificatoare pentru citokine S-a pornit de la observaţia că citokinele reglează reactivitatea imunologică. j. Una din problemele dezbătute în prezent în această direcţie este obţinerea unor proteine de fuziune cu anticorpii monoclonali recombinaţi. Utilizarea anticorpilor monoclonali Dezvoltarea intensivă a noilor concepte molecular-biologice din imunologia ultimilor 20 de ani a deschis noi perspective în terapia cancerului. poartă fixate pe molecula lor citokine. maturaţia. care se dovedeşte foarte 248 . g. receptori. Principiul acestei terapii constă în implatarea în organismul bolnav a unor celule somatice (limfocite) modificate din punct de vedere genetic (limfocite pe care sau transferat în prealabil gene codificatoare de citokine). ca răspuns la administrarea de interleukina 2 (IL2) sau antigen. B. (1995) au propus un protocol de terapie genică bazat pe utilizarea celulelor CIK (celule killer transfectate cu gena IL7) pentru inducere de citokine IL7. care. Proteine de fuziune (anticorpi monoclonali . Construirea acestei proteine fuzionate recombinate se face în scopul obţinerii unei eficienţe biologice optime. cât şi datorită faptului de a putea migra şi răspândi în tot organismul. activitatea şi migrarea celulelor inflamatoare. Aceste proteine de fuziune (anticorpi-IL2) sunt injectate în organismul bolnav. Observaţiile efectuate pe animale de experienţă au arătat că “o provizie locală” formată din diferite tipuri de citokine infuzate direct. prin combinarea capacităţii de ţintire unică a anticorpilor monoclonali cu activităţile multifuncţionale ale citokinelor. supuse tratamentului cu citokine. Anticorpii monoclonali antitumorali (cu specificitate unică). În cadrul acestei strategii. Terapie antivirală Terapie anti-HIV La începutul anilor 1980 exista în întreaga lume opinia că datorită antibioticelor şi vaccinurilor va fi rezolvată problema infecţiilor bacteriene şi virale. este vorba de strategia aptamer. în scopul utilizării acestor noi preparate în imunoterapia cancerului. Strategia aptamer Recent a fost elaborat un nou mod de utilizare a acestor oligonucleotide.fi utilizate pentru a prinde “în cursă” exprimarea unui număr de gene din genomul unui virus sau al unui parazit. direcţionează aceste citokine atunci când sunt introduşi în organismul bolnav către situs-urile celulelor tumorale corespunzătoare. factori de creştere. literatura de specialitate semnala existenţa a 19 cazuri clinice la om.

fiind inhibitoare ale reverstranscriptazei şi împiedicând astfel conservarea virusului în copii. aceste substanţe au determinat şi dezvoltarea rezistenţei virusului HIV la drog. . în stare dormindă şi integrată în nucleul celulelor. dar nu este încă bolnavă.. Astăzi infevţia HIV reprezintă o criză majoră de sănătate publică. În decembrie 1994. pentru anul 2000 se prevăd pe Terra 30 de milioane de purtători HIV. Substanţele anti-HIV utilizate până în prezent. se află în “stare dormindă” timp de luni de zile până la 5-20 de ani. Infecţia înseamnă că virusul HIV. Dar aceste substanţe terapeutice s-au dovedit a avea efecte toxice foarte puternice. şi anume curgerea inversă a informaţiei genetice din direcţia ARN→ADN II.urmează starea dormindă a virusului. 3119 cazuri de boală SIDA. 249 .acţionează la nivelul etapei I. În România s-au înregistrat între 1985-1994. De asemenea.6 milioane iar decesele au atins cifra record de 2. la 30 septembrie 1999 se înregistrau 10000 de persoane infectate cu HIV. La sfârşitul anului 1999. Programul UNAIDS şi al OMS-ului raporta 50 de milioane de persoane infectate cu HIV de la declanşarea epidemiei de SIDA. de tipul zidovudinului (analogi nucleozidici) şi derivaţi (dideoxiinozin. ƒ 17 milioane de persoane infectate (purtătoare de virus) HIV. Conform rapoartelor OMS.curând a declanşa mari epidemii SIDA (Syndrome d’Immuno-Deficience Acquise) pe glob. Virusul HIV face parte din categoria virusurilor ARN (retrovirusuri) care prezintă un aspect particular de multiplicare.6 milioane de persoane pe glob. persoana este sero-pozitivă. Boala reprezintă starea organismului în momentul în care virusul HIV din “stare dormindă” se trezeşte. având drept consecinţă apariţia simptomelor de boală. În România. se multiplică. Trebuie remarcată diferenţa între infecţie şi boală. numărul cazurilor noi de persoane infectate a fost de 5. acest aspect reprezintă particularitatea multiplicării acestui virus. Studiile molecular-biologice au demonstrat că ciclul de viaţă a HIV în organismul uman cuprinde3 trei etape: I. prezintă în organism dar ascuns în nucleul celulelor limfocitare. în special la nivelul sistemului nervos central (SNC). dintre care 6000 deja bolnave. . din cauza marii variabilităţi a virusului HIV.Acest ADN viral (copie după ARN) se integrează în genomul celulei gazdă sub influenţa enzimei virale integraza. În 1999. din care 16 milioane au decedat din cauza bolii.ARN viral se transcrie în ADN în prezenţa enzimei virale revers transcriptaza. dar această proteină primară nou-sintetizată are lanţuri foarte lungi şi este inactivă. o persoană poate fi infectată cu virus HIV fără a fi încă bolnavă. III. dideoxicitidin). dintre care 2885 la copii şi 234 la adulţi. din care un milion de copii. Pentru a se prepara substanţe terapeutice cu acţiune antivirală au fost necesare întâi studii de biologie moleculară în vederea determinării structurii virusului HIV şi a ciclului de viaţă al acestuia. Pentru a deveni activă. se resintetizează ARN viral şi proteina virală corespunzătoare. devenind deci agresiv. invadează organismul. virusul ARN dispărând prin imposibilitatea multiplicării sale. datele OMS estimau în lume: ƒ 4. creând o panică tot atât de gravă ca şi cea determinată de ciuma bubonică din Europa secolului al XIV-lea. cât şi cea a respectivului ARN viral nou format vor duce la formarea virusului matur care va fi capabil să invadeze alte celule. Până în prezent oamenii de ştiinţă nu au reuşit să prepare încă un vaccin pentru această infecţie. Această mare variaţie genetică a virusului a constituit obstacolul major în prepararea unui vaccin HIV.Etapa de transcriere: după tiparul (pattern-ul) ADN viral integrat.5 milioane cazuri de boală SIDA declanşată. această proteină foarte lungă trebuie secţionată (procesată) de nişte enzime virale numite proteaze. Prezenţa acestor proteine scurte şi active. din care doar 1025073 cazuri înregistrate.

trombospondin. aceşti receptori mediază mecanismele de adeziune (fixare) de fibrinogen. să prevină apariţia trombilor vasculari.eficacitatea substanţei prin administrare per os . Creşterea bacteriilor va duce la producerea unui număr mare de copii plasmidice din care se separă ADN-ul imunizat pentru a fi folosit apoi drept vaccin. Metoda Anderson pentru liza trombilor vasculari se bazează pe receptorii gpIIb şi gpIIIa. Reducerea zonei de infarct s-a dovedit a fi independentă de severitatea ischimei. Sharp & Dohme . Studii in vitro pe câine au demonstrat capacitatea acestor anticorpi de a reduce leziunile ischemice miocardice postinfarct cu 46% în comparaţie cu animalul martor. cercetările sunt aproape gata să introducă în practica medicală tehnologia unei noi vaccinări. o îmbunătăţire a recanalizării arteriale coronariene. S-a observat. E. 250 . dar firmele păstrau secretul de fabricaţie. .substanţă cod 693541 ƒ firma Hoffmann-LaRoche . împiedicând tăierea lanţurilor lungi de proteine inactive. Terapie ţintită cardiovasculară Se referă la tratamentul cu anticorpi monoclonali antitrombocite umane în cazul infarctelor.dezvoltarea rezistenţei la drog.substanţă cod A-77003 Substratul de preparare a substanţei active părea a fi un material biologic. Terapie în boli metabolice Prepararea de liganzi proteici tip lipoproteine Apolipoproteinelesunt proteine care datorită structurilor lor helicale amfipatice leagă lipide. În aceste condiţii. Rămân încă de rezolvat probleme legate de: . prin liza cheagului sanguin. ADN-ul care codifică o proteină specifică este cuplat cu elementele genetice de control pentru a se obţine plasmide care se vor replica atunci când vor fi introduse în bacterii corespunzătoare. vitronectina. cele cu agenţi microbieni omorâţi.În prezent se experimentează o substanţă cu acţiune anti-HIV la nivelul etapei a III-a de dezvoltare a virusului. În cazul implantelor vasculare se preconizează învelirea acestor receptori în strat de celule injectate cu o genă sintetizatoare de un factor litic care. şi anume: ƒ firma Merck.substanţă cod Ro-31-8959 ƒ firma Abbott . . C. S-au preparat anticorpi monoclonali (anti Mo-1) fată de receptorul de adeziune al trombocitelor. proteina rămânând sub formă de lanţ lung şi inactivă. de asemenea. În cadrul tehnologiei vaccinurilor ADN.acţiunile secundare farmacokinetice (toxice). în scopul unei trombolize rapide şi al prevenirii reocluziei. Ele reprezintă liganzi pentru receptori specifici. ar fi al cincilea tip de vaccinare cunoscut în istoria medicinii după: vaccinurile vii atenuate. prin legarea lor de o mare varietate de celule (macrofage. cu componente purificate şi cele obţinute prin inginerie genetică. dispărând deci posibilitatea de invadare de către virus a altor celule ale organismului. În 1997 trei companii mari farmaceutice lucrau la obţinerea unei asemenea substanţe de tip inhibitori ai proteazei virusului HIV. joacă un rol esenţial în transportul şi reglarea metabolismului colesterolului. Se preconizează utilizarea lor în tratamentul hipercolesterolemiei familiale. şi anume o substanţă care să inhibe proteazele virale. sintetizaţi de gene din familia genelor “integrine”. prin injectarea de anticorpi monoclonali antireceptor trombocite umane (gpIIb şi gpIIIa) şi activarea reocluziei vasculare. Apolipoproteinele de densitate înaltă (HDL). Vaccinuri recombinate În pragul mileniului al treilea. D. fibronectina. virusul matur nu se mai poate forma. hepatocite) şi ţesuturi. cea a imunizării directe cu ADN. factor Wilabrand.

distrugerea florei şi faunei marine etc. nefiind necesară de fiecare dată inventarierea unei noi tehnologii. Pe viitor vor continua investigaţiile în vederea detectării unor microorganisme cu potenţial de degradare şi transformare a poluanţilor din diferite deşeuri materiale. se trece la prelucrarea reziduurilor organice în vederea obţinerii unei producţii eficiente de compost care să aibă calităţi foarte apropiate de îngrăşământul natural pentru agricultură. Acţiunea de depoluare a ecosistemelor În condiţiile creşterii populaţiei globului. bolile reemergente. În aceste condiţii . Vaccinurile ADN stimulează atât imunitatea umorală cât şi cea celulară . municipale. cercetătorii încearcă să folosească agenţii microbieni (bacterii) în acţiunea de reducere a poluării solului (pentru dezintegrarea gunoiului şi a deşeurilor domestice. În acest context. Prin vaccinarea cu ADN existând posibilitatea de a vaccina pentru un număr mare mai mare de proteine specifice deodată. S-a demonstrat că aceste vaccinuri ADN induc celulele T de tip T1 helper cu efect împotriva virusului HIV. ca şi vaccinurile cu virusuri atenuate. Cu) din gunoaiele menajere. în ultimii 30 de ani s-a ajuns la un dezechilibru ecologic major care astăzi ameninţă viaţa pe Terra (defrişări masive. astăzi oamenii de ştiinţă pun tot mai acut problema refacerii cadrului natural şi a reciclării deşeurilor poluante. dar fără a exista pericolul recâştigării virulenţei de către virusul vaccinant. după îndepărtarea prealabilă a conţinutului toxic de metale grele (Cd. Zn. a urbanizării şi industrializării. potenţialul acestor vaccinuri de a stimula capacitatea citolitică a celulelor T reprezintă un punct de răscruce în vaccinologie. fluviilor. deşertificări întinse.În prezent se încearcă prepararea unor asemenea vaccinuri pentru administrare nazală sau per os. grad foarte ridicat de poluare a râurilor. consecutiv cu lipsa unei educaţii ecologice elementare a populaţiei. mai puţin costisitor şi mai uşor de administrat decât vaccinurile convenţionale. Se preconizează că acest tip nou de vaccin va avea o eficienţă enormă asupra bolilor infecţioase care astăzi dau încă o rată foarte înaltă de mortalitate. Acest nou compost îmbunătăţeşte structura solului iar prin conţinutul său în microorganisme (care au capacitatea de a inhiba dezvoltarea unei flore microbiene fitopatogene de sol) contribuie la îmbunătăţirea calităţii plantelor şi a recoltelor. în funcţie de fiecare agent infecţios. 251 . Aceste vaccinuri sunt foarte stabile atât la temperatură scăzută cât şi foarte ridicată. această vaccinare apare ca o terapie “multidrog”.). Astfel. motiv pentru care se pot transporta la temperatura mediului ambiant fără a fi necesară refrigerarea. luându-se în considerare faptul că acest tip de vaccin este mult mai sigur. F. necesară pentru conservarea mediului înconjurător. industriale) cât ţi a contaminanţilor din mediul extern. Toate aceste vaccinuri ADN se prepară după acelaşi principiu al plasmidelor. Aceste vaccinuri produc un răspuns imun persistent. în bolile emergente. În vederea progresului rapid în această direcţie se urmăreşte crearea şi aplicarea unei „tehnologii sensor” care să cuantifice activitatea fiziologică şi biochimică a microorganismelor. cât şi în cazurile de rezistenţă la chimioterapice.

dǎ posibilitatea creǎrii de noi organisme. Concentrarea studiilor asupra ADN a fǎcut posibilǎ injectarea genelor cu ajutorul virusurilor vectoare in celule. farmacologie şi în medicina viitorului. Aceste tehnici de recombinare genetică stau la baza cercetărilor fundamentale şi aplicare în biologia moleculară.. cu mari perspective de viitor. ceea ce reprezintă un fenomen de recombinare genetică. care includ linii foarte variate de organisme. în ceea ce priveşte crearea unur specii noi de plante cu o mare eficienţă economică. Watson şi Fr. la toate tipurile de bacterii. Aceastǎ metodǎ a dus la o revoluţie tehnico-ştiinţificǎ a cǎrei consecinţǎ a fost construirea de noi genotopuri.BIOLOGICE ŞI APLICAŢIILE LOR 12. în scopul ameliorării diagnosticului şi terapiei medicale într-un număr mare de boli. existenţa acestor procese se explică apariţia unor noi specii.. Meioza are loc în celulele germinale şi duce la reducerea setului dublu de cromozomi (set diploid) în set haploid (simplu). iar acest material genetic poate fi izolat iar cele douǎ lanţuri ale dublului helix ADN separate şi apoi fiecare din cele douǎ lanţuri recombinate cu un alt lanţ de ADN străin complementar. printr-un număr de metode ce formează tehnologia genetică. Principiul recombinării Un proces natural de recombinare genetică există la organismele eucariote (cu set diploid de cromozomi) în cursul meiozei (diviziune reducţională). Procese artificiale de recombinare ADN (tehnologia ADN-ului recombinat) Se realizează în condiţii de laborator.Capitolul 12 METODE ŞI TEHNICI MODERNE MOLECULAR . D. Respectivele virusuri (vectoare de gene) cu aspect de . 252 . Crick din anii 1953 au reprezentat cunoştinţele fundamentale care au stat ulterior la baza noilor direcţii de cercetare.crossing-over”. În prima fază se produce un schimb de fragmente cromatidiene între cromozomi omologi (M/P=materni/paterni) alăturaţi printr-un fenomen de . 12.1. Faptul cǎ informaţia geneticǎ a organismelor vii se gǎseşte acumulatǎ pe helixul ADN. deschizînd perspectivele noii terapii cu gene (terapie geneticǎ = Gene Targeting).împuşcare” (shotgun) într-un numǎr foarte mare de .ace” sînt introduse ţintit prin . Prima reuşită de recombinare a fost realizată în SUA în 1970.. şi anume a tehnologiei genetice. RECOMBINAREA ADN . cunoscute la nivel internaţional sub numele de Genetic Engineering. animale. reprezentând un factor evolutiv.ţinte celulare”. Aceste tehnici încearcă pe cale artificială combinatrea informaţiei genetice (a genelor) de la două organisme diferite. atît în condiţii naturale. în vederea obţinerii de noi variante de microorganisme şi plante. plante. organismele rezultate sunt organismele recombinate care formează astăzi obiectul unor studii cu implicaţii deosebite în dezvoltarea ştiinţifică şi economică pe scară internaţională. Fenomenul destabilizării genomului celular a rǎmas inexplicabil până în momentul în care a fost posibil studiul moleculei de ADN.cât şi laborator.1.ului Teoria stabilitaţii genomului celular a fost zdruciunatǎ în anul 1951. 1. Descrierea compoziţiei şi structurii spaţiale a ADN de către J. Procese naturale de recombinare ADN (recombinare genetică) Joacă un rol foarte important în natură.. odatǎ cu descoperirea elementelor transpozabile. în vederea creării unui organism nou cu proprietaţi prestabile (ţintite). Aceste tehnici vor avea implicatii majore şi în dezvoltarea agriculturii.

astfel încât să fie obţinute în final fragmente ADN de lanţ unic.Într-un organism diploid cu un anumit număr de perechi de cromozomi omologi şi o singură pereche de cromozomi sexuali. Aceste patru celule pot conţine: ƒ c1 = numai material matern ƒ c2 = numai material patern ƒ c2 şi c3 = material cromatidian recombinat (rezultat din fenomenul de crossing-over) matern şi patern. moleculele ADN cu greutate moleculară înalta sînt tăiate în molecule cu greutate moleculară mult mai mică.nou construită” (cu ADN recombinat) ƒ reprezintă celula cap de colonă. încît nu se pierde nici un nucleoid. celula bacteriană astfel . rezultând cromatide recombinate (molecule ADN recombinate).1. astăzi poate fi modificat într-un mod dinainte stabilit şi ţintit bagajul genetic al organismelor. prin acţiunea enzimelor de restricţie. sau analiza genetică foarte laborioasă asupra funcţiei genelor prin cercetarea aspectelor fenotipice ale organismelor mutante şi ale progeniturii acestora. care a apărut în jurul anilor ’70. Prin procedeele de inginerie genetică se poate obţine. iar apoi capetele tăiate se vor lega altfel. Concomitent cu ADN-ul de cercetat. coli K12) ƒ multiplicarea sincronă. Acest process poartă numele de clonare. După interschimburile între cromatidele cromozomilor omologi se produce separarea acestor cromozomi cu cromatidele interschimbate şi împarţirea lor între cele două celule fiice. utilizarea acestor metode putînd duce în viitor la înfrângerea barierei între specii. Pe baza acestei tehnologii. La cromozomii umani există în medie două-trei asemenea fenomene de crossing-over şi interschimburi de fragmente ADN pe ambele cromatide ale unui cromozom. Tehnicile de recombinare ADN stau la baza progreselor biotehnologiei moderne. organisme multicelulare) reprezintă de fapt tehnica de inginerie genetică prin care se obţin genomuri modificate ce pot fi ulterior exprimate 253 . cît şi cel al vectorului se leagă covalent (în cursul unui process de circularizare) în prezenţa ADN-ligazelor ƒ introducerea. o data cu celula gazdă. Aceste procese se produc atît de exact. lanţurile duble ADN ale celor două cromatide vor fi tăiate. pentru că. fiecare cromozom în interfază apare format din cîte două cromatide (iar fiecare cromatiodă la rîndul ei dintr-o moleculă de ADN dublu helix). Prin încrucişarea cromatidelor (crossing-over) pe locul de încrucişare. în final. o data cu vectorul. obţinerea de noi soiuri de plante cu rezistenţă crescută şi agenţi dăunători). aceste tehnici vizînd direct informaţia genetică a organismelor. prin introducerea unei informaţii genetice într-un organism. a vectorului şi a fragmentului ADN străin încorparat în genomul celulei gazdă. pe această cale. vor interschimba fragmente de ADN. bacteria. un organism cu priorietăţi noi (de exemplu. În faza a II-a a meiozei urmează separarea cromatidelor în patru celule germinative mature. a respectivului fragment de ADN selecţionat şi fixat pe vector în celula gazdă (celula bacteriană avirulentă de Esch. Procese artificiale de recombinare ADN (Genetic Engineering) Cu ani în urmă era posibilă doar cercetarea indirectă a ADN-ului asupra produselor ARN şi proteice. pe ambele lanţuri de acid nucleic (lanţ unic de cercetat şi lanţ unic al vectorului). Construirea unui genom nou prin introducerea unei secvenţe ADN străine în genomul unei celule gazdă (de exemplu. să se obţină acelaşi tip de capete adezive: ƒ fragmentul de acid nucleic de cercetat. a revoluţionat biochimia. 12. vectorul (virusul) este supus şi el acţiunii aceloraşi enzime de restricţie. oferind posibilitaţile cele mai eficiente pentru analizarea şi modificarea genelor (ADN) şi proteinelor din organismele vii. Tehnologia ADN recombinant presupune următoarele etape: ƒ tăierea lanţurilor duble ADN în fragmente specifice.. Tehnologia ADNului recombinat.2. În cadrul acestui proces. Apar în consecinţă un număr mare de celule purtătoare de copii identice de ADN recombinat.

în genomul unei celule. se folosesc tot fragmente ADNc deoarece aceste microorganisme nu sînt capabile să îndepărteze prin fenomene de splicing din ARNm transcris secvenţele de introni. Metilarea reprezintă un mecanism de apărare al celulei bacteriene faţă de propriile endonucleaze. Pentru creşterea acestei cantităţi de proteine se utilizează de regulă fragmente de ADNc (secvenţe codificatoare fără introni). ƒ se obţine o copie de ADNc (în prezenţa reverstranscriptazei). 3. Metilazele recunosc pe lanţul ADN bacterian aceleaşi secvenţe ca şi endonucleazele. prin aceasta creîndu-se bazele pentru cercetarea şi găsirea cauzelor unor boli genetice. ƒ fragmentul ADNc clonat este înglobat în vectorul de exprimare. care în cantităţi mari în calula nou construită. ele clivează moleculele de ADN strain (de exemplu. obţinându-se în final sinteza proteinei dorite.1. cît şi secvenţele de control ale unei gene. Dacă se urmăreşte introducerea şi exprimarea unor gene eucariote în bacterii şi drojdii. deoarece ADN-ul bacterian poartă un semn de recunoaştere (un password ) care este reprezentat de nişte situs-uri specifice metilate. vectorii. Etapele metodei de inginerie genetică utilizată în vederea obţinerii unei anumite proteine în cantitate mare sînt următoarele: ƒ se porneşte de la matricea ADN. 12. în acest context proteinele. ƒ respectivul lanţ dublu ADN este clonat. Prin aceste metode genetice pot fi manipulate. 12. nefiind digerat de endonucleaze. ƒ în celula receptor se produce transcrierea şi translaţia fragmentului ADNc strain (introdus). drojdiile şi celulele de memifere să fie aduse în starea de a produce cantităţi mari de anumite proteine ţintă. ADN viral pătruns în respectica celulă bacteriană) fără a cliva însă ADN-ul bacterian propriu.(transcrise şi translaţionate) de către celula gazdă. ƒ se obţine un lanţ dublu ADN. 1. intr-o anumită celulă.3. în mod normal se găsesc în organism în cantităţi foarte mici (doar urme) şi ar scăpa astfel cercetării. Nucleazele bacteriene se clasifică în: 254 . prin alegerea unei anumite secvenţe de control. Elemente de lucru utilizate în tehnologia ADN recombinat Aceste elemente de lucru sunt reprezentate de: enzimele de restricţie. modificate şi interschimbate sau nou recombinate atît secvenţele codificatoare. din care rezultă un nou genom (prin introducerea. celula respectivă cîştigă caractere noi. prin sinteza de noi proteine (caractere noi cîştigate de celula gazdă). ƒ fragmentul ADNc înglobat în vector este introdus în celula receptor o dată cu vectorul. Este posibil să se facă noi combinaţii pentru secvenţele de control ale unei gene şi să se determine în acest fel exprimarea unei gene dorite. se poate reuşi exprimarea practice permanentă a unei gene altminteri slab activă. ADN-ligazele. În acest fel devine posibilă analiza proteinelor celulare.1. Enzimele de restricţie Sunt endonucleaze de origine bacteriană. Proteinele sintetizate prin această metodă şi-au găsit utilizare în terapie şi profilaxie. Folosind această metodă s-a reuşit ca celulele bacteriene. Pornindu-se de la aflarea expresiei anumitor gene s-a putut ajunge la descifrarea funcţiei unor proteine cu rol în procesele şi diviziune celulară. iar în timp metilaze converteşte treptat ADNhemimetilat în total metilat. a unei secvenţe străine de ADN cu autorul vectorului). care. Termenul Genetic Engineering este adesea folosit drept similar celui de recombinare ADN. Astfel. un dublu helix ADN nou-sintetizat şi metilat numai pe un lanţ este recunoscut ca propriu de către celula bacteriană. într-o celulă bacteriană.

dintre care: ƒ enzimele I şi II recunosc secvenţele specifice şi se fixează pe acestea cu următoarele particularitaţi: ƒ enzimele I taie nespecific 100-1000 de perechi de baze. amprente” (fingerprints) ale unei molecule de ADN. ci se fixează în interiorul moleculei de ADN. unde produc ruptura (tăierea). Structurile acestor fragmente finale pot servi drept. rezultând capete coezive. Un segment de ADN obţinut prin acţiunea unei enzime de restricţie poate fi clivat main departe în segmente mai mici de către alte enzime de restricţie. ƒ enzime II Eci RI (izolate din E. 12. ƒ enzimele II au locul recunoaştere. foarfeci moleculari”. coli). în afara regiunii specifice în direcţia 5’ Æ 3’ pe lanţul ADN. 3.. Endonucleazele de restricţie au acţiuni secvenţial-specifică. în mod: simetric. Până în prezent s-au purificat peste 90 de enzime de restricţie. Aceste endonucleaze se găsesc în număr mare la procariote. acestea recunosc aceleaşi secvenţe nucleotidice. II şi III. motiv pentru care sînt preferate în studiile de recombinare ADN. rezultând capete drepte. se fixează pe o anumită secvenţă nucleotidică. prin folosirea enzimelor de restricţie. Aceste enzime catalizează formarea unei legături fosfodiesterice între gruparea 3’-OH a unei extermităţi a unui lanţ ADN şi gruparea 5’-fosfat de la extermitatea celuilalt lanţ. ƒ enzimele III taie nespecific 20-30 de perechi de bază în direcţia 5’ Æ 3’ pe lanţul ADN. dar poziţionate în sens invers pe cele două fire ale dublului helix ADN). Prin enzimele de restricţie s-a descris şi un grup special de enzime care au fost numite izoschizomeri. fiind citite de aceste enzime la fel pe cele două lanţuri şi rezultând un clivaj poziţionat simetric pe ambele lanţuri. ele recunosc o secvenţă de 4-6 nucleotide şi pot tăia cele două lanţuri ale helixului ADN. însă în poziţii diferite pe respectivul lanţ ADN. Procesul de legare (linkare) mediat de ADN-ligaze este esenţial pentru sinteza normală a ADN. deşi fiecare taie asemenea secvenţe localizate. S-au descris enzimele de restricţie I.1. pot recunoaşte situs-urile ţintă ale ADN ului palindronic. coli). asimetric.exonuleaze care se fixează pe molecula de ADN numai la capătul ei. fixare şi tăiere (4-6 nucleoide) de obicei constant deci au specificitate de secvenţă absolută. dar în prealabil trebuie să fie rupte perechile de baze care ţin unite cele două lanţuri complementare ADN ƒ Bam HI (izolate din Bacillus amilolichefaciens) ƒ Hpa I (izolate din Haemophilus parainfluenzae) ƒ Hin + III (izolate din Haemophilus influenzae) Enzima II au fost supranumite şi. Cromozomii complecşi care conţin sute de milioane de bace pot fi astfel secţionaţi şi apoi cartaţi stabilindu-li-se harta genelor. ADN-ligazele (polinucleoid-ligazele) ADN-ligazele nu pot lega două lanţuri unice de ADN. În această categorie se încadrează şi endonucleazele de restricţie. ƒ ƒ 255 . Endonuleozele de restricţie sunt denumite după microorganismele din care se izolează: ƒ enzime I Eco K şi B (izolate din E. endonucleaze care nu se fixează la extermităţile moleculei ADN. 2. despicând-o (clivare prin hidroloza legăturii fosfodiesterice) îndepărtând astfel respectivul segment dublu de ADN. procesul de reparare a ADN. Descrierea enzimelor endonucleaze de restricţie a făcut posibilă revoluţia ştiinţifică biologică şi dezvoltarea tehnologiei ADN recombinat (modificări ţintite în structiura genelor şi proteinelor şi analiza acestora bazată pe enzimologia acizilor nucleici). procesul de recombinare genetică. ci doar două lanţuri ADN ce aparţin aceleiaşi molecule ADN duble helix. Secvenţele de baze recunoscute de către aceste enzime sînt palindromice (aceleaşi.

Vectori de expresie. Prin cîştigarea plasmidelor.plasmid + φ promotor (SP6) .entităţi fundamentale ale celulei bacteriene”. care imprimă o proprietate sau mai multe proprietăţi celulei bacteriene (de exemplu. φ80.. Plasmidele Reprezintă o clasă majoră de elemente genetice mobile. reprezintă material genetic extracromozomial (cromozomi accesorii). capabili a se replica independent de cromozom”. Greutatea moleculară a unui plasmid variază între 1.repliconi accesori” (neesenţiali). Vectori de expresie a1).bacteriofagi: fagul λ. factorul R. 256 . B. Vectorispeciali. În 1981. fagul µ . fără ca absenţa acestuia să afecteze viaţa celulara.plasmid +2 φ promotori (SP6 ş T7) Vectori speciali: . rezistenţă sau multirezistenţă la antibiotice). Vectorii Se deosebesc două categorii majore de vectori: A. Vectori folosiţi pentru sinteza unor cantitaţi mari de proteine. Spre diferenţă de ADN-ul cromozomial. Plasmidele s-au dovedit a fi unelte foarte valoroase în cercetarile efectuate în scopul aprofundării unor procese fundamentale de biologie moleculară (replicarea ADN. celulele bacteriene au fost înzestrate cu noi căi enzimatice în cursul evoluţiei. cît şi la eucariote. reprezentînd o parte vitală a pool-ului de gene. Zestrea plasmidică este un atribut de tulpină (şi nu de specie). genomul celular este reprezentat de materialul genetic cromozomial genetic cromozomial şi extracromozomial (inconstant). În celula bacteriană.plasmide: factorul F. Vectorii de expresie Vectorii folosiţi pentru sinteza unor cantităţi mari de proteine: .3. În 1976.. incompatibilitatea). Sunt prezente atît celulele procariote (bacterii). Vectori de transcriere (pentru sinteza ARN): . plasmidele erau definite de Novick drept . În unele celule pot exista simultan 1*20 copii ale unei plasmide. ADN-ul extracromozomial poate disparea la un moment dat din celulă.secvenţe de inserţie (SI) 0.retrovirus+plasmid Ti A. La procariote sunt molecule de ADN dublu helix circular din dimensiuni de la două la cîteva sute de kilobaze.retrovirusuri . .4 kb.un segment care asigură transferul plasmidic de la o celulă la alta (factor de transfer).fragemide (φ+plasmid) . ca răspuns la modificarile din mediul extern.repliconi stabili moşteniţi în stare extracromozomială. determinînd potenţialul de adaptare al celulei gazdă la condiţiile de mediu.3.5-200 x 10 6 daltoni (5% din greutatea cromozomială).8-1. esenţial pentru supravieţuirea celulei. propun pentru plasmide termenul de .cosmide (fragmente de φ* λ+ plasmid ) .1. Astăzi plasmidele sunt considerate . dar astăzi se ştie că aceşti repliconi joacă un rol important în procesele de selecţie şi de adaptare a celulelor bacteriene. factorul Col. Un plasmid este constituit dintr-un segment format din una sau mai multe gene. Dhillon şi Colob..12.

toluenului (tulpina de Pseudomonas). asincron şi mai frecvent decît ADN-ul cromozomial. au potenţial de răspândire foarte larg a anumitor caractere printe bacterii. factori chelatori de ioni de fier).v. la celula receptoare.. celula receptoare (F-) este celula care primeşte factorul F. numit şi factor de fertilitate. cu acţiune bactericidă asupra unor bacterii din aceeaşi specie. dar rămân factorii Col (linkaj reversibil). prin intermediul factorului F (factor plasmidic-vector). de exemplu factorul Col) se transmit 100% de la o celulă la alta cu ajutorul factorul F (plasmid conjugativ). Una sau mai multe plasmide (neconjugative. ƒ de rezistenţă la raze u.) Cointegratele sunt sisteme funcţionale mai eficiente decît cele ale agregatelor din punct de vedere al transferului şi stabilităţii caracterelor linkate. ƒ codificatoare de enzime ale unor căi metabolice. libere în citoplasma celulei.cys. fixate de azot (de exemplu. adeziune. se cunosc pînă în prezent următoarele tipuri de plasmide: ƒ de rezistenţă la agenţii microbieni. factorii de bacteriocinogenie ColE1 Æ colE8. în care fiecare replicon îşi păstrează independenţa fizică a replicării deoarece fiecare replicon are propriul său replicator (de exemplu.) se pierde doar factorul F. Bacteriocinele se subdivid în două categorii: 257 . hemolizine. factori de bacteriocinogenie pentru sinteza piocinelor). În raport cu caracterele fenotipice exprimate. sau inclus în cromozomi (Hfr). În general bacteriocinele sunt principii actici sintetizate de bacterii. Factorul Col Reprezintă plasmidul responsabil de sinteza colicinelor (bacteriocine produse de tulpinile bacteriene de Escherichia coli). în cazul tratamentului celulei receptor cu un factor curing (acridin oranj etc.criptice” ale unor caractere somatice (nu au putut fi încă indetinficate). ƒ plasmide . ColV. în acest caz există 10-20 de copii per celulă. Celula donoare conţine factorul F liber în citoplasmă este notată F+. Clowes delimita două grupe majore de gene plasmidice (plasmid-borngenes): ƒ agregate. ColB. Col I.Plasmidele pot fi: ƒ neintegrate. în cursul procesului de adaptare la noi condiţii de mediu. din ele derivînd apoi cointegratele. s-au dezvoltat primele. Se mai numesc şi autonome (de exemplu. Acest fenomen presupune un transfer de material genetic de la celula donoare. agrocina 84 (sintetizată de tulpina bacteriană de Agrobacterium radiobacter) cu acţiune bactericidă asupra bacteriei abrobacter tumefaciens (agent de colonizare. începând de la capătul 5’ al ADN-ului. trp. De replica concomitent cu ADN cromozomial şi există în una-două copii per celulă. Sînt sisteme economice pentru conservarea anumitor mesaje genetice care se transmit masei de celule dar în caz de nevoie. ƒ pentru sinteza agenţilor antitumorali: de exemplu. ƒ pentru sinteza bacteriocinelor. enterotoxine. ƒ integrate (epizomi). la tulpini de Klebsiella). specii inrudite dar şi foarte îndepărtate. Factorul F Este plasmidul care induce conjugarea la bacterii. (codifică enzime care intervin în mecanismele de reparare a ADN celular). cointegratul F. Col V). inserate în cromozomul bacterian (de exemplu. exclusiv de origine extracromozomială. ƒ cointegrate reprezintă elemente genetice compuse din doi sau mai mulţi repliconi aşezaţi într-o continuitate liniară. degradarea camforului. Reiese de aici că trasnferul de material genetic este polarizat de la celula F+ sau Hfr către celula F-. În 1972. aceste plasmide de replica autonom.

liber în citoplasmă. E3. Plasmidele nonintegrate se subdivid în: ƒ nonconjugate: se transmit numai cu ajutorul factorului F sau al unui fag transductant. proteică dau de natură complexă glicoproteică. Ruperea acestei imunităţi se produce doar în prezenţa unei concentraţii foarte înalte de bacteriocină. Structura plasmidelor Col nonintegrate conjugative şi nonconjugative a fost studiată cu ajutorul endonucleozelor de restricţie. EV. Col V. E3. Există însă şi cazuri particulare în care unele bacteriocine (welchicinele) sunt active chiar şi pe celulele producătoare (în acest caz explicaţia fiind absenţa genei de imunitate pe plasmidul de bacteriocinogenie).. CloDF13).un grup de gene (cluster) . de exemplu linkajele: F. K. CloDf13). Aceste aggregate au origine exclusiv extracromozomială şi posedă un potenţial foarte înalt de răspândire a proprietăţii de bacteriogenie în populaţia bacteriană. de către celula bacteriană. În general. factorul pentru sinteza aeruginocinelor. ƒ integrat în cromozom. celulele bacteriocinogene sunt immune la propria bacteriocină datorită prezenţei de imunitate mai sus mentionate. de obicei prezente în 1-2 copii per celulă (de exemplu. acest studiu a demonstrat că ambele tipuri de plasmide conţin în structura lor: .2-8) x 10 8 megadaltoni prezintă un număr mic de greutate moleculară joasă. E2.o genă responsabilă de sinteza proteinei (colicină).şi ColDf 13. structuri de cozi goale sau pline.rep” esenţial pentru replicarea autonomă. cozi fagice incomplete umplute cu un lanţ scurt de ADN). trebuie menţionate următoarele: ƒ factorul Col v codifică sinteza unui sistem de chelare (fixate. Acest grup de gene conţine circa 20% din SADN-ul plasmidic. factorii Col E1. E6.K94. trp. Se pare că proprietatea de colicinogenie este mai rar răspândită la tulpinile bacteriene de origine umană. EI.o genă responsabilă pentru sinteza proteinei de imunitate (evidenţiată la plasmidele Col E1. ƒ corpusculară (particulară) cu greutate moleculară mare. au un număr. Producerea de bacteriocine se datorează prezenţei plasmidului de bacteriocinogenie în respectivea celulă bacteriană.colicinelor I-2. E2.necorpusculare (nonparticulare) cu greutate moleculară mica. Col Ib. au o greutate moleculară joasă. Col V). s-au descris: ƒ agregate. factorii Col E1. în ultimul agregat factorul Col Ib jucând rol de factor de transfer. locus-ul de origine pentru replicarea plasmidului este prezent într-un punct pe această zonă. . dar este prevalentă în flora apelor menajere şi în populaţia de enterobacterii de la animalele domestice. ColE2 şi Col Ib. Col IB. Plasmidele conjugative posedă în plus: un extra grup (extracluster) de gene (G – T) implicate transfer. Col I.cys. au greutate moleculară (40-80)x10 6 megadaltoni. acest fenomen purtând numele de fenomenul de rupere a imunităţii (break-down immunity). ƒ conjugative: se transmit singure prin conjugare. factorii Col. V. E2. de obicei în număr mare de copii (15-60) per ADN cromozomial (de exemplu. mare de gene funcţionale (100-200). de natură chimică enzimatică. legare şi transport) al fierului din mediul extern. A. prezentînd aspecte omologe cu diferite. între (4. de exempli. În funcţie de interrelaţiile de factorul Col cu alţi factori plasmidiali din celula bacteriană. Printre bacteriocinele cele mai studiate şi mai bine cunoscute astăzi se numără colocinele şi cloacina DF13. Plasmidul (factor genetic responsabil de sinteza de bacteriocină) poate fi: ƒ nonintegrat (replicon accesoriu). şi piocinelor. E3. ƒ cointegrate. Col E1. analogi adenin-nucleozidici. de exemplu. . E7. Cu referire specială la rolul plasmidelor de bacteriocinogenie în organismul uman şi animal. E1a. ducînd astfel la creşterea virulenţei 258 ƒ . combinaţia F. de exemplu. componente fagice defective (capete goale de fagi.

Se presupune că structuri nucleozidice analogigrocinei 84 cu acţiuni citocidă pe celulele canceroase ar fi mai răspândite în natură decît se cunoaşte astăzi. pe de altă parte. dar rămîne fără efect asupra celulelor normale din aceeaşi specie (datorită selectivităţii de membrană) prezintă agrocina (bacteriocină). Genele celulare rec A şi lex A posedă o capacitate complexă de a regla diferite răspunsuri celulare SOS. mitomicina C.. ƒ plasmidele Col sunt considerate a fi entităţi fundamentale pentru multe celule bacteriene ţinându-se cont de faptul că sunt implicate în multe activităţi celulare. care determină o stare canceroasă (boala cocoşului) la plante dicitiledonate.de imunitate” în plasmide de bacteriocinogenie şi fagi pledeaza pentru o strînsă interrelaţie în cursul evoluţiei între aceşti determinanţi genetici. sistemul aerobactinei este considerat astăzi un mijloc crucial de supravieţuire şi proliferare a celulelor bacteriene invasive. de natură cromozomială.bacteriilor. A fost dovedit rolul multiplu de copii plasmidice autonome/integrate per celulă. tulpinile bacteriene de Agrobacterium radiobacter produc bacteriocina agrocină 84. . fenomenul de incompatibilitate plasmidială. ƒ factorul Col conferă capacitatea de adeziune celulelor bacteriene pe epiteliul intestinal (atribut al virulenţei celulei bacteriene).fenomenul de bacteriocinogenie este considerat a fi un split-phenotype al răspunsului celular SOS la agenţi inductori (raze u. Cele două posibilităţi de linkaj al plasmidelor de bacteriocinogenie (system aggregate şi cointegrate) pot fi considerate aspecte particulare ale potenţialului de adaptare în cursul evoluţiei. Shigella). În acest sens.Pe baza cunoştinţelor actuale despre plasmidele Col se poate aprecia că acestea reprezintă o parte vitală din poolul de gene al speciilor bacteriene.animale). Rezistenţa celulelor bacteriene la antibiotice prezintă două aspecte: ƒ rezistenţa naturală – proprietate intrinsecă a speciei.studiul fenomenului de bacteriocinogenie a permis aprofundarea unor aspecte fundamentale de biologie moleculară (replicarea ADN-ului plasmidic. 259 . Factorul R Fenomenul de rezistenţă la drog a fost descris de către Ehrlich în perioada anilor19101913.datele prezente sugerează că fenomenul de bacteriocinogenie semnifică o cale enzimatică specifică cîstigată în cursul evoluţiei. ƒ în culturi celulare s-a remarcat o acţiune de inactivare a toxinei tulpinilor de E coli enterotoxigene de către colicina sintetizată de alte tulpini de Myzobacterium smegmatis are o acţiune citocidă asupra celulelor eucariote tumorale (inhibă creşterea celulelor tumorale umane. acid nalidixic).datele acumulate pîna în prezent pledează pentru o strînsă relaţie filogenetică între plasmidele de bacteriocinogenie (factorul Col).kill” şi ..v. factorul Col are rol protector determinând producerea de colocine cu acţiune îndreptată împotriva unor bacterii enterale patogene (de exemplu. îngreunîndu-le acestora implantarea.. în scopul asigurării supravieţuirii şi adaptării celulare la condiţiile de mediu extern. ƒ la tulpinile de Esch. capabilă să omoare tulpina bacteriană Agrobacteruim tumefaciens (purtătoare de plasmid Ti). ƒ factorul Col V conferă tulpinilor bacteriene capacitate de supravieţuire în ser in vitro. stabilă. crescând rezistenţa acestora la efectul bactericid al serului. . coli enterale autohtone. interrelaţiile evolutive între celula gazdă şi factorul Col). Gradele diferite de complexitate prezente de diferitele sisteme de bacteriocinogenie pot imprima şi explica potenţialul de adaptabilitate al celulei gazdă la condiţiile permanent în schimbare din: . . pe de o parte şi factorii plasmidiali F şi R. controlul replicării. . incluzînd aici şi fenomenul de bacteriocinogenie.prezenţa şi similaritatea genelor .

sunt alcătuiţi din trei secvenţe nucleotidice cointegrate. Transpozomii sunt elemente genetice mobile ce poartă gene determinate de rezistenţă la antibiotice. posedă un ADN circular. Reasortarea plasmidelor R (din punct de vedere al numărului. Acest ADN plasmadial codifică sinteza de proteine (enzime) prin intermediul unui ARNm. Se pot transfera: ƒ vertical la descendenţi (ereditate extracromozomială) ƒ orizontal între specii. .1959). . Posedă unul sau mai mulţi determinanţi de rezistenţă (markeri). şi anume: ƒ factorul RTF (factor de transfer de rezistenţă similar factorului F) care iniţiază transferul plasmidului de la celula donoare la celula receptoare. chimici (acridinoranj. la nivelul acestor germeni microbieni are loc cel mai important schimb de plasmide R între specii. Au fost descrişi transpozomi care codifică rezistenţa la β. Acest fenomen de recombinare este foarte rar. codifică rezistenţa la unul-două antibiotice. Factorii R sunt: . ƒ factorul codificator al autoreplicării plasmidului (replicator). Au sisteme proprii de replicare şi pot exista în mai multe copii. Plasmidele R pot fi pierdute: .spontan.conjugativi (autotransferabili).v. acriflavină). mutaţie. Unii trenspozomi au dimensiuni foarte mari.5x106 daltoni. se pot pierde unul sau mai mulţi markeri de rezistenţă. ƒ determinanţii de rezistenţă la antibiotice de la 1 pâna la 20 de markeri.. Se pot integra în situs-uri diferite. de exemplu prin conservarea tulpinilor bacteriene la +4 C câteva luni. depăşind barierele de specie.sub influenţa unor factori fizici (raze u. plasmid-cromozom) determină un schimb larg de determinanţii R intre specii. ampicilina). sau în urma unui process de recombinare). se formează uşor copii multiple. Referitor la circuitul plasmidelor R în natură trebuie menţionat că flora intestinală comensală şi saprofîtă (oportunist patogenă) la om şi la animale este izvorul natural de bacili gram-negativi. Factorii R sunt molecule de ADN.rezistenţa dobîndită – caracter cîştigat în urma unei terapii cu antibiotice (prin cîştigarea de plasmid R.lactamine (penicilina. ei se pot exciza dintr-un ADN şi autoinsera în altul (într-un plasmid sau cromozom). bacilii Gram negative (Akiba.).transfer clasic (conjugarea la bacili gram negativi. Plasmidele R (factori de rezistenţă multiplă la antibiotice) au fost descries atît la germeni gram-pozitivi cît şi gram-negativi. eritomicină etc. Prin mecanismele lor de translocare (cromozom-plasmid. dublu catenar formând anse închise covalent autonome în citoplasma celulară bacteriană. Cu cât plastidele sunt mai mari. codificând rezistenţa la un număr foarte mare de antibiotice. au greutate moleculară de 20 x 106 Æ 2000 x 106 daltoni. Transferul plasmidelor R se face între celulele bacteriene. conţinând numai replicatorul şi determinanţii de rezistenţă.nonconjugativi (netransferabili). proprietăţilor si sediului markerilor) se realizează prin elemente transpozabile tip transpozomi. gen şi chiar de familie. replicarea este mai rapidă pe generaţie. fără factorul RTF. cu atât replicarea lor se produce mai lent (I -2 copii/celulă). la trimetoprim/sulfametoxozol. Au greutatea moleculară de 0. pe aceeaşi moleculă de ADN. transducţie la stafilococi şi transformare) . gentamicină/tobramicină. Au fost semnalate întîia oară în Japonia.5x106 până la 5. Se realizează prin mecanisme de: . neomicină/kanamicină.recombinare (pe baza omologiei ADN gazdă-ADN străin) prin crossing-over la nivelul cromozomului bacterian. Mecanismele de rearanjare a markerilor de rezistenţă plasmidici şi 260 ƒ .

Astfel fagul λ (ADN) se poate insera pe cromozomul celulei de E coli între genele gal şi bio.. ADN-ul fagului λ conţine fie operonul gal. în formă liniară sau circulară închisă.poate fi integrat în genomul bacterian (cale lizogenă) .în urma lizei celulare. Noii fagi sintetizaţi prin acest ciclu „litic" . Materialul genetic ai virusurilor constă din ADN sau ARN. Se fixează pe membrana celulei bacteriene. Virusurile împrumută aparatul metabolismului celular bacterian. fie operonul bio. In natură. poate evolua pe una din cele două căi: . Fagii lizogeni pot media (ca şi factorii plasmidici F) schimburi de gene. Datorită acestui aspect este posibil ca în fagul să poată fi introdus ADN străin. deci cantitatea de ADN străin ce poate fi înglobată este limitată. Bacteriofagii Sunt virusuri care infectează bacteriile.poate trece imediat la multiplicare folosind aparatul enzimatic de sinteză al celulei bacteriene gazdă (receptoare). după injectare în celula bacteriană. Alegerea căii de multiplicare este determinată de starea de nutriţie şi sănătate a celulei receptor (gazdă). excizia nu este totdeauna precisă. Fagul λ Este foarte bine studiat şi utilizat ca vector. condiţii ce determină selectarea şi vehicularea în cadrul infecţiilor intraspitaliceşti a unor tulpini bacteriene cu un spectru foarte larg de antibiorezistenţă. 261 .transferul plasmidic explică formarea rapidă a rezervorului de bacterii multi-rezistente. ea introduce genele celulei bacteriene de E coli. Răspândirea plasmidelor R este favorizată de utilizarea necontrolată şi abuzivă a antibioticelor. După introducerea ADN străin prin membrana proteică fagului λ se poate trece la injectarea acestui fag (în care este înglobat ADN-ul străin) în celulele bacteriene de E coli. sunt eliberaţi în mediul extern. plante. Epidemiile apar atunci când aceste plasmide R cu markeri multipli de rezistenţă ajung la bacterii înalt patogene şi cu înaltă contagiozitate. injectându-şi materialul genetic în celula bacteriană. ce creează mari dificultăţi terapeutice. multiplicându-se pe socoteala acestora. Infecţia cu asemenea fagi se numeşte λ gal sau λ bio. Materialul genetic viral. Din ADN-ul fagului λ poate fi îndepărtată o cantitate de 40% fără ca funcţiile vitale ale acestui fag să fie evident influenţate. de unde pătrund şi parazitează alte celule bacteriene. sunt deci paraziţi obligatorii ai celulelor. alături de genele fagului λ într-o nouă celulă infectată de respectivul fag. coli. Cu ajutorul sistemului proteic reglator este capabil să aleagă între cele două posibilităţi de evoluţie mai sus prezentate. În unul din 105 virioni. Bacteriofagii au un sistem propriu de transport pentru fragmentele ADN străine care pot fi astfel introduse pe cale naturală şi multiplicate în celula gazdă. celule umane). Fagul φ 80 Este înrudit cu fagul. animale. Gazda fagului λ este celula bacteriană de E. genomul acestui fag este reprezentat de un lanţ dublu ADN. se insera lângă operonul trp şi poate purta gena trp de la o celulă infectată la alta. Când se formează virionii progeni. Membrana proteică a fagului are o capacitate limitată de acceptare de ADN. virusurile apar în general drept paraziţi obligatorii ai organismelor şi celulelor vii (bacterii. unde îşi abandonează învelişul proteic. în acelaşi loc. pentru propria replicare.

Fagemidul se multiplică în celula gazdă ca un plasmid cu lanţ dublu ADN. Prototipul acestor vectori de transcriere este format dintr-un plasmid în care a fost înglobat un fag. Vectorul format din plasmid cu un fag promotor ( φ SP6) Acest vector poartă numele de SP6. Reprezintă o clasă specială a vectorilor de expresie. 140). Cosmidele sunt îmbrăcate în membrana proteică a acestui fag. şi 262 . promotorul φ SP6 reprezintă secvenţa start ADN de unde porneşte transcrierea (deci sinteza ARNm-ului). Aceşti fagi transductori (ca şi factorul plasmidic F) sunt elemente genetice mobile care declanşează interschimbul între genele bacteriene.Vector format din plasmid şi fag promotor SP6. După tăierea zonei MCS în două. Dacă în momentul introducerii fagului se injectează în celula gazdă şi un fag helper. Transpoziţia este fenomenul prin care copii (elemente transpozabile) ale unor secvenţe specifice de ADN dmtr-un genom. 2) Vectorii de transcriere.8-1. atunci famegidul se multiplică ca un fag cu lanţ unic ADN. cosmidul este injectat în respectiva celulă gazdă. cosmidul se replică apoi ca un plasmid. accelerând în acest fel evoluţia bacteriană. Se folosesc pentru sinteza ARN.4 kilobaze (kilobaza (kb)=1000 perechi de baze). care oferă mai multe locuri de tăiere pentru multe enzime de restricţie (Fig. Secvenţe de inserţie (SI) Sunt elemente transpozabile. Fig. 140 . Fagemide Reprezintă o nouă clasă de vectori în care o parte din genomul unui fag cu lanţ unic ADN (de exemplu M13) este combinat cu un plasmid ADN. de către o enzimă de restricţie. având capacitatea de a se insera pe unul sau mai multe situs-uri specifice. Celula gazdă pentru φ SP6 este celula bacteriană de Salmonella typhimurium. transpozonii (Tn) cu dimensiuni de 3-20 kb (numiţi şi gene săritoare). în spatele promotorului φ SP6 se găseşte o zonă formată dintr-un număr de secvenţe nucleotidice (zona MC S= muItiple cloning site). promotor (SP6) sau chiar doi fagi promotori (fagii SP6 şi T7). Este de menţionat că zona MCS reprezintă porţiunea din sistemul vector unde pot fi înglobate de plasmid noi fragmente de ADN. Cosmide Sunt plasmide în care a fost introdus un anumit fragment de ADN din fagul λ . În celula gazdă. coli. transportă totdeauna un fragment din acest cromozom. se deplasează de-a lungul aceluiaşi lanţ de ADN sau pe cel al altui genom. S-au descris două tipuri de elemente transpozabile: secvenţe de inserţie (SI) cu dimensiuni de 0. Prin infecţie fagică (pătrunderea fagului în celulă).Fagul µ Se insera în orice loc pe cromozomul celulei de E.

144 . 143 . 144). Fig.înglobarea unui fragment de ADN dublu lanţ (fragment ADN sau ADNc) în mijlocul zonei MCS (fig.141). deoarece cei doi promotori dirijează transcrierea în sensuri opuse (fig. Transcrierea cu ajutorul unui singur fag promotor este unidirecţională. 143 şi fig. vectorul linearizîndu-se (fig. 142 .134). Vectorul format dintr-un plasmid şi doi fagi promotori (SP6 şi T7).Vector linearizat De obicei ADN-ul înglobat este cel care urmează a fi transcris în ARN.Tăierea cu ajutorul enzimelor de restricţie a celor două zone MCS şi transcrierea în sens opus a celor două lanţuri ADN cu ajutorul fagilor SP6 şi T7 263 . Acest sistem cu doi promotori este vector bidirecţional. zona MCS este tăiată din nou de către alte enzime ADNc de restricţie.Vector format dintr-un plasmid şi doi fagi promotori Fig. Fig.Tăierea zonei MCS şi înglobarea unui nou fragment ADN Fig. 141 .

iar. Cosmidele se folosesc drept vehicule pentru fragmente foarte mari de ADN (de 30-45 kb).Pentru utilizarea acestui sistem de transcriere bidirecţională se aleg două enzime diferite de restricţie. În ultima vreme s-au putut construi cosmide-vectori în care s-au putut îngloba fragmente mari de ADN de 100 kb . 145 . iar a doua enzimă taie al doilea fragment MCS între fagul T7 şi ADN-ul înglobat. îşi împarte materialul ADN între cele două celule fiice. se numeşte vector bidirecţional.1 mb. Un vector tip YAC se comportă în celulele de drojdii ca un cromozom care se dublează înainte de diviziunea celulară. Aceste cosmide ajută la studiul poziţiei genelor pe harta genetică a cromozomului sau pe fragmente lungi de ADN. Vectorii de expresie reprezintă vectori construiţi anume care conţin în structura lor multe secvente de control optim pentru transcrierea şi translaţia genelor. aceasta secvenţă de control (promotor) va porni apoi transcrierea secventei ADNc strain inglobat. Alegerea vectorilor Se face după mărimea fragmentului ADN care urmează a fi înglobat într-o celulă. după tăierea prealabilă a acestei zone în două segmente între care a fost înglobat noul segment ADN. de pildă vectori YAC (yeast artificial chromosome). S-au construit un numar mare de vectori de expresie care să fie propice pentru diferite tipuri de celule. permiţând transcrierea concomitentă a celor două lanţuri a ADN (dublu-lanţ) nou-înglobat. Vectorii de expresie trebuie selectionaţi pentru fiecare tip de celulă în care urmează a fi introdusă o gena straină pentru a se obtine sinteza 264 . aceste două enzime acţionează pe situs-uri diferite pe zona MCS. Astfel prima enzimă taie primul fragment MCS între fagul SP6 şi ADN-ul înglobat. Fig. numiţi şi minicromozomi. Acest sistem vector cu doi promotori care acţionează în două sensuri opuse. 145). Lungimea fragmentului ADN sau ARN se stabileşte după numărul de perechi de baze: 1 kb (kilobază) = 1000 baze (sau 500 perechi de baze). transcrierea celuilalt lanţ ADN (al aceluiaşi ADN dublu lanţ nou-înglobat) în sens opus (fig. Promotorii SP6 şi T7 sunt astfel orientaţi încât primul să conducă transcrierea unui lanţ din ADN dublu-lanţ înglobat într-un sens iar al doilea promotor.Tăietura I – Vector linearizat. Secvenţele de control nu sunt aceleaşi pentru diferitele tipuri de celule. în cursul acestei diviziuni. Utilizarea sistemului SP6 pentru transcrierea unuia din lanţurile ADN înglobate. Fiecare fragment de ADNc străin care va fi înglobat de către vector se va fixa pe acest vector tocmai în apropierea acestei secvenţe de control (cu rol de promotor). 1 mb (megabaze) = 1 milion de baze (sau 500 000 perechi de baze).

deposedat de capacitatea lui infecţioasa. A fost imaginată o metodă eficace de prelucrare prealabilă a retrovirusului vector (Richard Mulligan de la Massachusetts Institute of Technology USA). anticorpi monoclonali. factorul VIII de coagulare. prin care se elimină în prealabil un număr de gene virale. Aceasta replică ADN se integrează în cromozomul celulei gazdă. s-a reuşit introducerea unor fragmente ADNc străin (de la eucariote) în celula bacteriană şi sinteza ulterioară a urmatoarelor proteine: insulina. în prezenţa reverstranscriptazei. Vectori speciali b1. 265 . o dată patrunse în organismul celulei gazdă să declanşeze. plasmidele Ti ajunse în celulele vegetale determină apariţia unei tumori. prin mecanismul de transcriere inversa. motiv pentru care ele sunt folosite astăzi drept vectori în tehnicile de inginerie genetică şi de terapie genetică. care este declansată însă doar în anumite condiţii. vaccinuri pentru boli bacteriene şi virale. informaţia pentru sinteza virusului ARN. hiradin (antitrombotic). putADN determina formarea unor tumori in organismul gazda (virusul sarcomului Rous. În aceste cazuri. VISNA). factori imunologici (factori de necroza a tumorilor. prin alegerea unor vectori de expresie adecvaţi.unei anumite proteine. eritropoetina. Acest ADN dublu lanţ se integrează apoi în cromozomul celulei gazdă (umană sau animală). devine inofensiv. interleukine). b 2. determinând astfel sinteza unui ADN dublu lant (după paltern-ul respectivului ARN viral). virusul. retrovirusul vector declansează actiunea reverstranscriptazei care determină sinteza ADN-ului corespunzator (replică a ARN-ului vector + gena fixată). Retrovirusuri şi plasmidul Ti Plasmidele Ti se găscsc în bacteriile Agrobacterium tumefaciens din sol. retrovirusurile joacă rolul unor carcase pentru transportul respectivelor gene străine către o anumită celulă ţintă. ele nu ucid (nu lezeaza) celulele pe care le contaminează. Deci plasmidele Ti au efect tumorigen. injectat în celula ţinta. Retrovirusurile sunt mai mici decat celelalte virusuri. somatotropina. Celula poartă în acest fel. dar vector de o gena (de gene) nouă. Retrovirusurile ARN au capacitatea ca. conferind celulei gazdă o noua proprietate corespunzatoare noii gene fixate. Prin infectarea unor leziuni ale plantelor cu această bacterie. În acest fel. Astfel. iar segmentul de virus rămas este combinat apoi cu gene care urmează a fi injectate ţintit într-o anumită celulă. pe care a fixat-o şi pe care o introduce în celula ţintă (mecanismul de transductie). integrată în cromozomul ei. Multe retrovirusuri sunt oncogene. în scopul transferului unor gene străine în celula ţintă. virusul leucemiei aviare). B. Retrovirusurile Sunt virusuri ARN cu o treaptă ADN în replicare (de exemplu: HIV. activator de plasminogen. până de curând principiul activ se extragea direct din râme. interferon. Retrovirusurile reprezintă astazi uneltele (vectorii) cele mai utilizate în ingineria genetică pentru transportul de gene către genomul unei celule tintă. o transcriere inversă. lipsit de majoritatea genelor sale. adică de la ARN spre ADN. spre deosebire de virusurile ADN.

HIBRIDAREA Este o tehnica de recombinare de acizi nucleici. Altă metodă constă în supunerea celulei unui câmp electric (electroporare). acesta din urmă. Pentru lucru. 12. pierde capacitatea de a mai produce tumori şi păstrează doar rolul de vector de gene către o celulă ţintă. retrovirusurile reprezintă astazi uneltele (vectorii) cele mai larg utilizate în ingineria genetică şi terapia genică. prin transport de gene către genomul unor celule ţintă. pe baza complementaritatii bazelor azotate. Procesul de transfectie si vectori speciali În biologia molecularaâă. separate.Prin utilizarea unui vector special. Introducerea acestor gene străine în celule se mai poate face cu ajutorul particulelor de metal nobil (experienţe balistice biologice). 2. Daca sonda si secventa tinta sunt total sau partial complementare din punct de vedere al secventelor de baze nucleotidice. Analiza acestei secvente necunoscute se face fata de o sonda genetica (proba de acid nucleic) marcata (radioactive sau prin alte metode) cu o secventa de baze cunoscute. introducerea unui ADN străin (gene) în celulele organismelor superioare (plante. Hibridizarea se foloseste ori de cate ori se urmareste identificarea secventelor nucleotidice pe un acid nucleic (secventa tinta).1. Denaturarea Dupa cum s-a aratat. Imperecherea de baze complementare se poate face intre: ADN . in raport cu bazele (complementare) de pe secventa nucleotidica cunoscuta a sondei genetice. dar aceste metode produc leziuni grave celulei.2. Se mai utilizează razele laser care produc orificii foarte fine în peretele celular rigid (la plante) prin care se injectează apoi molecula de ADN străin. prin prelucrarea prealabila. pentru analiza si identificarea secventelor nucleotidice ale unui acid nucleic tinta. mamifere) poartă numele de tranfecţie.2. 12. Lantul unic va reprezenta apoi substratul pe care se va efectua hibridizarea cu sonda genetica. Denaturarea reprezinta modificarea structurii acidului nucleic prin tratament cu caldura (temperatura de 266 .ADN ADN-ARN ARN-ARN Totdeauna hibridizarea are loc intre doua lanturi unice de acid nucleic. ADN dublu lant trebuie intai denaturat (supus actiunii caldurii sau substantelor chimice alcaline) pentru a fi disociat in lanturi unice. Principiu Se analizeaza o secventa de acid nucleic unic lant (secventa tinta). se formeaza o molecula hibrid de acid nucleic in care se identified secventele nucleotidice pe secventa tinta. tratament prin care respectivele celule devin capabile (permeabile) să accepte macromoleculele din exterior. om) se face cu ajutorul unor vectori speciali: plasmide Ti şi retrovirasuri. Introducerea acestor gene străine în organismul plantelor sau mamiferelor (animale. care vizeaza construirea unei molecule de acid nucleic dublu lant din doua lanturi unice. acesta trebuie intai adus la forma de lanturi unice prin denaturare. Dintre aceşti vectori. 12.2. format dintr-un retrovirus şi un plasmid Ti.

deoarece aceste baze se leaga prin trei punti de hidrogen. b). Punctul de topire reprezinta temperatura la care 50% din respectivul acid nucleic dublu lant disociaza in unic lant.3. concentratia în NaCl. Reprezintă intensitatea reactiei de hibridizare. Cantitatea de acid nucleic unic lant. o concentrate scazuta de NaCl determina destabilizarea moleculei de acid nucleic.ARN sau ARN . concentratia in NaCl a solutiei. . 12.ADN. Tipuri de hibridări a. sau supunerea in mediu alcalin (pH>l 1).2. uree) care determina scaderea punctului de topire. Denaturarea chimica Se face prin adaos de substante denaturante (formamida.2.100"C) sau substante chimice. Western Blotting (Protein blotting) a.zona bogata în guanina-citozina. Denaturarea prin caldura Reprezinta taierea lantului dublu ADN cu ajutorul temperaturii inalte. Reactiile de renaturare se produc de regula la temperaturi care corespund unei iferente de 20-30 C fata de temperatura punctului de topire al dublului lant de acid nucleic. Factorul stringent Este un important factor de hibridizare. Southern Blotting (ADN Blotting) a. in timp ce bazele adeninatimina se leaga doar prin doua punti de hidrogen. lanturile raman separate.4. Dot Blotting 267 . Acest punct de topire poate fi influentat de: o zona bogata in guanina-citozina.concentratia moleculara a acidului nucleic din solutie.3. 12.4. stringentă este mai scazută (această situaţie apare în special atunci cADN cele două lanţuri de acid nucleic provin din două organisme diferite). iaca temperatura insa scade brusc. Renaturarea (annealing/reannealing) Reprezinta o hibridizare. Hibridare Blotting: a.2. aceasta necesitADN o temperatura de topire mai scazuta.2. care prin renaturarea trece in dublu lant. stringenta (intensitatea) reacţiei de ambinare este foarte puternică. Norhern Blotting (ARN Blotting) a. . depinde de: . Dacă două lanţuri unice de acid nucleic sunt pe toată lungimea lor formate din baze implementare.concentraţia de formamida. a). 12.1.5. .lungimea moleculei de acid nucleic. Folosind aceste metode se realizeaza desfacerea legaturii de hidrogen dintre bazele complementare. concentratia cationilor. iar conditiile de reacţie sunt favorabile. care cere totdeauna o temperatura mai inalta. Prin scaderea temperaturii sau a pH-ului este favorizata refacerea gaturilor intre bazele complementare de pe cele doua lanturi unice de ADN . Dacă pe cele două lanţuri de acid nucleic există doar zone parţiale cu baze complementare.

.de la hîrtia de fitru umedă spre cea uscată.dintre care una este cea prin transfer capilar (Fig.Slot Blotting b. Etapele reacţiei: .ţesuturi).fragmentele ADN obţinute în gel sînt supuse denaturării. Hibridizare Colonială.Evidenţiază secvenţele specifice ale unor fragmente de ADN separate prin gelelectroforeză. care se îngreunează prin aplicare. c. 268 . Hibridizare in situ.146). Gelul (2) este pus pe hărtie de fitru (1) umedă(care a absorbit prin capilaritatea lichid din vasul cu soluţie tampon). Hibridizarea se realizează prin incubarea hîrtiei de fitru (3) într-o soluţie care conţine sonda genetică radioactivă (de exemplu. Fragmentele de lanţ unic ADN fixate pe hîrtia de fitru superioară prin acţiunea căldurii sînt tratate(hibridizate) cu sonde genetice ADN sau ARN (marcate radioactiv). a. . Southern Blotting A fost imaginată de Southern în 1975.de la hîrtia de fitru umedă spre cea uscată. Noţiunea de "Blot" reprezintă fitrul+acidul nucleic fixat(imobilizat).1. Există mai multe variante de hibridare Blotting şi anume: a. Utilizarea practică a variantei Southern Blotting Gelul (2) este pus pe hărtie de fitru (1) umedă(care a absorbit prin capilaritatea lichid din vasul cu soluţie tampon). Pentru transferul respectivelor fragmente de ADN de pe gel pe fitru se folosesc diferite metode. . Curentul de lichid care rezultă din soluţia tampon şi care se formează prin capilaritate. moleculahibrid realizată va fi evidenţiată prin metoda autoradiografică sub formă de benzi.a unei lame de sticlă (4) şi a unei greutăţi (5). ADN marcat cu 32P).se extrage ADN dintr-un produs patologic lichid(ser sanguin care conţine acid nucleic viral) sau solid(celule. ADN marcat cu 32P).deasupra ei.ADN este tăiat cu enzime de restricţie. Hibridizarea se realizează prin incubarea hîrtiei de fitru (3) într-o soluţie care conţine sonda genetică radioactivă (de exemplu.acţionează şi scoate prin spălare moleculele ADN din gel şi le trage către şi pe hîrtia de fitru superioară (4). molecula-hibrid realizată va fi evidenţiată prin metoda autoradiografică sub formă de benzi. Fragmentele de lanţ unic ADN fixate pe hîrtia de fitru superioară prin acţiunea căldurii sînt tratate(hibridizate) cu sonde genetice ADN sau ARN (marcate radioactiv).5. peste gel (2) se pune altă hîrtie de filtru (3) uscată. Acţiunea de "Blotting" reprezintă trecerea acidului nucleic pe filtru. Hibridizare Blotting Este o tehnică specială prin care acidul nucleic ţintă (de cercetat) este axtras din materialul de cercetat prin încălzire la 100 grade C şi răcire la gheaţă şi apoi depus pe o membrană(de nitroceluloză sau filtru de nylon) şi fixat. peste gel (2) se pune altă hîrtie de filtru (3) uscată. Curentul de lichid care rezultă din soluţia tampon şi care se formează prin capilaritate.a unei lame de sticlă (4) şi a unei greutăţi (5). Hibridarea acestui acid nucleic necunoscut are loc direct pe filtru cu ajutorul sondei genetice (acid nucleic cunoscut şi marcat).a. care se îngreunează prin aplicare. .trecerea fragmentelor de lanţ unic ADN de pe gelul sensibil(de nitroceluloză) care fixează aceste fragmente de ADN.acţionează şi scoate prin spălare moleculele ADN din gel şi le trage către şi pe hîrtia de fitru superioară (4).deasupra ei.fragmente de ADN(de circa 1000 perechi de baze)sînt supuse electroforezei şi separate în funcţie de greutatea lor moleculară.

Fig. 146 .Hibridarea Southern Blotting 269 .

reprezintă o motodă foarte modernă şi utilă de cercetare pentru determinarea filiaţiei cazurilor în epidemii.în medicina judiciară. în actuala a VII -a pandemie de horelă. Studiul genelor pentru globină la primate (responsabile pentru sinteza proteinei hemoglobină) a demonstrat că aceste gene sînt localizate la un loc. . care nu sînt transcriptibile) se poate face determinarea paternitaţii. .într-un cluster pe cromozomii umani 11 şi 16. 270 . care se moşteneşte. Dimensiunea acestor clusteri este asemănătoare la om.în boli genetice se evidenţiază prezenţa unor gene defecte (pe baza unor fragmente ADN cu un tipar individual).va prezenta una din următoarele două ipostaze posibile: . . poate apare un nou situs specific de tăiere pentru aceste enzime. Aplicaţii practice ale variantei Northen Blotting .pe baza tiparelor RFLP s-au putut clasifica microorganismele (virusuri şi bacterii) . şi pe baza studiilor filogenetice s-a stabilit că aceasta reprezintă forma originară a tuturor speciilor de zebră. dacă va fi supus acţiunii enzimelor de restricţie. pe baza pattern-urilor RFLP (ADN minisatelite=fragmente hipervariabile din genom. respectiv ADN modificat.ARN este pus în prezenţa substanţei denaturatei (glicoxal dimetilsulfoxid formaidehidă sau metilmercur).la germenii univitelini.În epidemiologie. . Astfel s-a putut demonstra că: .ARN este supus separării electroforetice. În acest al doilea caz. . Astfel. aceleaşi tipare RFLP sînt în mare parte identice.transferul moleculelor ARN pe filtru (nylon sau mitriceluloză).lanţul ADN rămîne netăiat. prin studiul unor probe de sânge sau spermă. este în mai mult de 70% din cazuri identic. .ARN este extras din materialul de cercetat. Studiul acestor fragmente şi a diferenţei dintre ele. prezente în Asia şi Europa. gorilă şi gibon.a putut aduce noi informaţii în cercetările efectuate asupra unor boli genetice şi în medicina judiciară.hibridizarea ARN de pe filtru cu o sondă genetică ARN sau ADN. epidemiologice). acest fragment a fost numit "polimorfism de lungime al fragmentelor de restricţie" (RFLP). a. ADN de origine umană şi cel provenind de la cimpanzeu şi gorilă sînt omologate în proporţie de 97%(diferenţa constă în cromozomul X). . Northern Blotting Această variantă a hibridizării Blot pune în evidenţă secvenţe specifice ale unor fragmente ARN departe prin gelelectroforeză. .evidenţierea moleculei hibrid construite. Etapele reacţiei sunt: . . aceste tipare RFLP sînt complet identice. Speciile de cimpanzeii sunt mult mai copiate de om decât alte specii de maimuţa.determinarea ribotipurilor tulpinilor bacteriene (în studii genetice. De asemenea. pe baza aceloraşi pattern-uri RFLP se pot face identificări de persoane în criminalistică. pot apărea în consecinţă noi tipare de fragmente ADN. În Africa de Sud a fost studiată originea speciei Quagga (Equus quagga).prezenţa unor modificări genetice în cazul unor procese tumorale.la rude. cu ajutorul metodei Southern Blotting.Utilizarea practică a variantei Southern Blotting Prin apariţia unei mutaţii în genomul celulelor germinative (modificarea unei baze). cu ajutorul metodei de ribotipare s-a putut demonstra că profilul genetic al tulpinilor de Vibrio cholerae biotip eltor. . care a dispărut în 1883.din contră. această metodă fiind mult mai sensibilă decât determinarea hizotipurilor de tulpini. .deoarece enzimele de restricţie nu mai recunosc situs-ul specific. 2.

271 . Principiul metodei este identic cu cel de la Dot Blotting. extract celulare sau tisulare).În acest caz de Western Blotting. substratul de cercetat nu este reprezentat de un acid nucleic ci de o proteină.proteina este supusă electroforezei în gel SDS*-policrilamidă. Avantajul metodei este acela de a pune în evidenţa prezenţa unei anumite proteine.adaos de anticorpi specifici marcarţi (cu enzime sau radionuclizi). prin cuplarea acestora cu anticorpi specifici corespunzători (marcaţi).Tehnica Dot Bloptting a. 147 .a.În fiecare godeu se depune altă probă de acid nucleic. Proba de acid nucleic extrasă se depune într-unul din godeurile rotunde ale plăcii de plexiglas.extracte celulare sau tisulare. Dot Blotting Se execută pe o placă de plexiglas cu godeuri rotunde (fig. 4. 3.în total pe o placă depunînduse atîtea probe câte godeuri are placa. .transferul spoturilor proteice (antigene) pe membrana de nitroceluloză. Fig. probele de acid nucleic de pe hîrtia de filtru sînt supuse apoi denaturării (prin încălzire la 100 gradeC şi răcire la gheaţă). Această variantă foloseşte doar principiul reacţiei de hibridizare. şi anume desfaşurarea substratului de cercetat pe gel de electroforeză şi apoi trecerea acestuia pe o membrană de nitroceluloză. Apoi probele de acid nucleic denaturat de pe filtru sînt hibridizate cu sonde genetice.expunere şi developare. a.Această metodă este folosită pentru clonarea genelor. Aceste ultime două variante de hibridizare se folosesc atunci când se lucrează deodată cu un număr foarte mare de probe patologice nefracţionate (probe de ser.citirea prin autoradiografie a benzilor de proteină cu ajutorul anticorpilor specifici marcaţi şi fixaţi. .147). . . Etapele reacţiei sunt următoarele: . . Este necesară extracţia prealabilă a acidului nucleic din probele de cercetatare(ser. care absoarbe aventualele probe de acid nucleic prezent. Reacţia foloseşte la evidenţierea unor cantităţi foarte mici de proteine prezente în lichidele sau celulele unui organism. Slot Blotting Se execută pe o placă de plexiglas cu godeuri de formă dreptunghiulară (Schlitz-uri = tăieturi sau Slot-uri). Nu se face nici o separare electroforetică. dintro mixtură complexă. . 5. Western Blotting (tehnica immunoassay) Această variantă a hibridizării Blot nu reprezintă o reacţie de hibridizare propriu-zisă (anume construirea unei molecule ADN dublu lanţ din două lanţuri separate de ADN).aplicarea deasupra membranei de nitroceluloză a unui film fotografic. Apoi respectiva placă se acoperă cu hîrtie de filtru.spălarea anticorpilor rămaşi nefixaţi.unde este apoi cuplat şi evidenţiat prin intermediul unor grupări chimice complementare.

în cazul reuşitei hibridizării. Fixarea se face cu xilol. ADN este supus denaturării pentru obţinerea lanţurilor unice de ADN. Marcarea cu biotină este evidenţiată ulterior prin diferite variante de lucru (vezi "Sonde genetice. culturi celulare (prelucrate.după ce se produce această reacţie de hibridizare. HIV. Hibridizare in situ Se efectuează direct pe celule şi ţesuturi. Se folosesc fragmente de ţesuturi. lama se spală (pentru îndepărtarea particulelor nelegate) şi abia apoi urmează hibridizarea cu sonda (ADN sau ARN) marcată.Lama cu probă pentru denaturarea se acoperă cu o placă. amprente de celule. virusul Epstein-Barr. etanol (100% şi apoi 70%). cercetarea tiparelor de expresie genetică (stabilirea momentului activării anumitor gene). stabilirea sexului la embrion. identificarea anormalităţilor cromozomiale (de exemplu: trisomia 21. stabilirea hărţii genetice cromozomiale (stabilirea relativă a locus-ului fiecărei gene pe cromozom). realizîndu-se o cameră umedă. virusul herpes simplex.12. hibridarea colonială.6. cercetarea relaţiilor virus-procese oncogene (de exemplu. Lama obiectiv cu celule fixate corespunde filtrului cu acid nucleic legat prin hibridizare Blotting. În cazul hibridizării Blotting este necesară extracţia prealabilă a acidului nucleic din proba de cercetat. virusul papilloma. Această informaţie se poate obţine numai cu ajutorul hibridizării in situ. distrofia musculară Duchenne). Prin replica plating se obţine copii ale acestor colonii din cele două clone pe un filtru de nitroceluloză. sindromul Langdon Down. secvenţele ţintă din acidul nucleic de cercetat (din ţesuturi) sînt evidenţiate la autoradiografie (prin cuplare cu secvenţele de acid nucleic complementare din probele marcate cu biotină). După fixarea probelor ADN radioactive(fixarea complementară)pe lanţul unic de ADN ţintă 272 . Lanţul unic ADN este supus hibridizării cu probele ADN cunoscut şi marcat radioactiv. Pe plăci cu medii de cultură se însămînţează colonii bacteriene din două tipuri de clone: o clonă bacteriană de origine(cu plasmid). relaţia virusul hepatitei virale tip B-carcinom hepatic). o clonă bacteriană cu ADN ţintă (cu plasmid+ fragmente de ADN ţintă). virusul cito-megaliei. acest uracil se va împerechea în lanţul de acid nucleic ţintă cu o adenină. se pierde însă informaţia asupra sediului exact al respectivului acid nucleic (ADN sau ARN) din anumite structuri celulare.Prin această ultimă metodă se poate realiza evaluarea exactă a distribuţiei anumitor secvenţe ADN sau ARN direct in situ simultan cu determinări calitative şi semicantitative. se face o spălare cu o soluţie tampon. diagnosticul pre. Aplicaţiile practice in situ sunt: evidenţierea şi localizarea diferiţilor agenţi infecţioşi în diferite celule şi ţesuturi ale organismului: virusul hepatitei virale tip B.şi postnatal în boli genetice. aplicative şi fixate pe lame obiective). ultima slăbind şi desfăcând citoscheletul şi rezultînd molecula ţintă de acid nucleic unic. prin această extracţie. Reacţia de denaturare şi hibridizare se face pe lama obiectiv şi anume: după depunerea probei pe lama obiectiv. Aceste copii de clone bacteriene (de pe fitru) sunt supuse lizei pentru a se obţine ADN. După denaturare. Biotina din sondă a fost fixată de un necleotid cu uracil. pentru denaturarea probei se foloseşte o încălzire puternică sau tratarea cu proteaze şi digitonină. localizarea genelor defecte pe cromozom (de exemplu.care îndepartează moleculele nelegate de acid nucleic din probă.Marcarea"). sindromul Turner).2. în fibroza chistică.

în vederea instituirii a unei terapii de urgenţă în special la persoanele bolnave de SIDA sau la cele imunosupresate (terapeutic) în urma unor transplante de organe. iar în cazul imunosupresaţilor după câteva luni sau chiar deloc.cît şi la progresul diagnosticului medical într-un număr de boli. ƒ utilizarea metodelor ce folosesc sonde genetice pentru diagnosticarea infecţiilor virale ale arborilor fructiferi (cu o precizie de diagnostic pentru o cantitatea de antigen de 2x10 nanograme). Importanţa reacţiei de hibridare pentru medicină şi biologie Această reacţie a pus bazele unui număr de tehnici care au ajutat la progresul cercetării biologice fundamentale. Astfel o reacţie de tip imunohistochimic a putut pune în evidenţă un produs de transcriere (ARNm) specific de ţesut (de exemplu. ƒ aplicaţii în epidemiologia moleculară în vederea depistării unor noi markeri genetici (de exemplu. Prin compararea imaginii radiografice se identifică şi se diferenţiază clonele bacteriene care conţin fragmente de ADN ţintă faţă de clonele bacteriene de origine.7. în serul sanguin LCR. ƒ se precizează ca în viitor metoda hibridizării să ofere posibilităţi pentru elucidarea mecanismelor de reglare a activităţii genelor.(de cercetat) se procedează la evidenţierea autoradiografică a marcării pe un film Roentgen. determinarea numărului de copii dintr-o anumită secvenţă prezentă într-un dovedirea gradului de înrudire între diferite organisme în raport cu numărul de secvenţe ADN identice. celule. în vederea elucidării diagnosticului unor infecţii virale cronice: evidenţierea acidului nucleic viral în aceste produse semnifică prezenţa particulei virale în organismul respectiv.şi postnatal al bolilor ereditare (la femei care doresc copii sau la care se pune problema întreruperii sarcinii). Această metodă reprezintă o unealtă foarte eficientă pentru cercetarea activităţii genelor oncogene prin evidenţierea indirectă imunohistochimică a produselor lor de translaţie (ARNm corespunzător). pulsotip).2. stabilirea activităţii genelor pentru care s-au pus în evidenţă moleculele de ARNm corespunzătoare. robotip. ƒ evidenţierea prezenţiei virale în tumori de origine virală. ţesuturi). 12. prezenţa unui anumit ARNm corespunzător unei munoglobuline prezente în caz de limfoane maligne sau prezenţa unui anumit ARNm hormonal în anumite tumori neuroendocrine. ƒ diagnosticul pre. evidenţierea secvenţelor specifice ADN şi ARN în material biologic de cercetat (sânge. Evidenţierea prezenţei acidului nucleic viral direct în produsele patologice (ser. ƒ studiul efectuat asupra produsului de transcriere (ARNm) a unor secvenţe ADN celulare glucogene nevirale a ajutat la complectarea şi aprofundarea diagnosticului de tumoră. În aceste cazuri diagnosticul serologic de obicei nu poate fi de ajutor deoarece pozitivarea serului în cazul infecţiei cu HIV se produce abia după câteva săptămâni de infecţie. evidenţierea acidului nucleic viral. ƒ determinarea defectelor metabolice. 273 . Astfel s-a reuşit: stabilirea concentraţiei anumitor secvenţe ADN sau ARN într-o mixtură de secvenţe. LCR) sau în materialul citologic reprezintă o posibilitate de diagnostic rapid şi precoce. Clonele bacteriene care poartă ADN ţintă recombinant (plasmid + ADN ţintă) vor fi multiplicate mai departe (sincron se vor multiplica şi fragmentele de ADN straniu).

la un individ dintr-o anumită specie se pot repera codurile complementare pe care sonda "le luminează" prin procesul de hibridizare moleculară. a.1. Cu ajutorul ADN-polimerazelor s-a reuşit şi amplificarea ulterioară a acestor fragmente de ADN bine determinate şi deci clonarea genelor pentru a face şi mai uşoară (mai sensibilă) reperea lor. În prezent sondele genetice pentru cercetare şi diagnostic se pot comADNa şi cumpăra de la casele producătoare. Aceste oligonucleotide ADN-unic lanţ reprezintă baza materială pentru: ƒ sonde genetice. iar celălalt lanţ ADNc reprezintă secvenţele complementare respectivului lanţ matriţă ARNm. a.2. Cu ajutorul unor asemenea sonde. unde vectorul se multiplică rezultînd în final o cantitate mare de ADN clonat. o dată cu acest vector (recombinant). În aceste maşini se pot realiza concomitent sinteza şi marcarea sondelor genetice. 274 . dar prin diferite metode sunt transformate în ADN dublu lanţ şi apoi introduse în vectori şi multiplicate o dată cu aceştia în celula gazdă. într-o moleculă finală de ADNc dublu lanţ doar un lanţ conţine secvenţe corespunzătoare moleculei matriţă ARNm. deoarece reprezintă secvenţe de ADN fără introni şi fără altă secvenţă care ar putea reacţiona nespecific. ceea ce va asigura în viitor progresul rapid al alcătuirii hărţilor cromozomiale complete ale genomului uman. Astăzi. astăzi se pot izola. Principiul hibridizării în vitro a două ADN-uri complementare stă la baza metodei care foloseşte sondele moleculare(coduri de ADN cunoscute asociate cu un marker). într-o celulă gazdă. toate genele tuturor organismelor vii. în vederea obţinerii unei bănci de gene (le vivant mondial). iniţial. 3. Prepararea probelor de acid nucleic(sonde genetice) pentru reacţiile de hibridizare Sondele genetice pot fi: probe de ADN şi probe de ARN.Southern Blot) şi metoda hibridizării in situ. Moleculele ADNc sunt. Sondele genetice (probe de acid nucleic tip ADN sau ARN marcate) reprezintă unealta esenţială de lucru în metoda de hibridizare pentru analiza secvenţelor nucleotidice din secvenţele "ţintă" ale ADN-ului de cercetat (genele). etichetarea. ƒ primeri pentru reacţii polimerazice în lanţ. Din fragmente ADN dublu lanţ clonate (în vederea obţinerii ulterioare de sonde genetice). Aceste sonde genetice (proba de ADN sau ARN) sunt marcate (radioactiv sau nonradioactiv) pe un singur nucleotid (cu o secvenţă de baze cunoscute). În acest caz. Sondele genetice se prepară prin aceleaşi metode de hibridizare utilizate şi pentru secvenţierea (sequencing) acidului nucleic.graţie sondelor genetice. Aceste fragmente se obţin prin încorporarea de fragmente da ADN genomic(tăiate cu ajutorul enzimelor de restricţie) sau de fragmente ADNc (sintetizate cu ajutorul reverstranscriptazei după modelul unei matriceARNm) într-un vector şi prin introducerea lor.12. şi anume prin metodele Blot (Western Blot. reperarea şi cartografierea genelor au devenit operaţii de rutină în marile laboratoare din lume. SONDE GENETICE Cu ajutorul enzimelor de restricţie. unic lanţ. Prepararea probelor de ADN: a. teoretic. ƒ sinteza de gene. Sub forma de oligonucleotide ADN unic lanţ prin sinteza chimică în "maşini de gene". A. Pentru hibridizări sînt în special de preferat fragmentele ADNc clonat. Probele ADN dublu lanţ pot fi ulterior marcate în vederea obţinerii sondelor genetice (vezi „ Marcarea sondelor genetice”).

ARN. care se utilizează ulterior în reacţiile de hibridare. ADNc între două segmente de MCS şi după linearizarea vectorului). Vectorul bidirecţional este format din ADN plasmidic.Transcrierea bidirecţională cu ajutorul vectorului bidirecţional cu doi promotori (φ SP6 şi φ T7). 148 .2.b. 275 . SP6 – ARN polimeraza şi T7 . b. transcrierea in vitro va fi unidirecţională. Prin introducerea şi înglobarea într-un vector de transcriere bidirecţională a unui dublu lanţ ADN (de exemplu. În " maşini de gene":ca şi probele ADN unic lanţ. În cazul vectorilor cu un fag promotor (SP6). Vectorii de transcriere (clasă aparte a vectorilor de expresie). Fig. b. nu se folosesc caşi ceilalţi vectori de expresie pentru sinteza de proteine. φ SP6.2. cât şi de ARN-polimeraza utilizată pentru transcriere. se va sintetiza ARN sau ARN antisens. 137).ARN polimeraza . iar în cazul vectorilor cu doi fagi promotori. Prin metoda de transcriere in vitro cu ajutorul vectorilor de transcriere. deci sinteza ARNm. Va fi transcris unul din cele două lanţuri de ADN nou înglobat. ARN-ul respectiv putând fi marcat direct în cursul sintezei. În sinteză.Prepararea probelor ARN (sonde genetice) b.2.1. Cei doi promotori dirijeajă transcrierea în două sensuri opuse. Vectorii de transcriere sunt formaţi dintr-un plasmid ADN. b.Transcrierea unidirecţională cu ajutorul φ SP6 Având în vedere că transcrierea începe la nivelul promotorului SP6 şi se termină la locul de tăiere a enzimei de restricţie. în ARN. zona MCS şi φ T7 (vezi fig.2. Această metodă de transcriere in vitro (sinteza ARNm după o matriţă ADN) se realizează cu ajutorul vectorilor de transcriere unudurecţionali şi bidirecţionali.1. se poate stabili de la început care din cele două lanţuri ADNc va fi transcris în ARN. După linearizare. bidirecţională. în care au fost înglobaţi un fag promotor (SP6) sau doi fagi promotori (SP6 şi T7). 148). Transcrierea unidirecţională cu ajutorul φ SP6 După înglobarea în sistemul SP6. Promotorul reprezintă secvenţe de ADN de unde începe procesul de transcriere. După linearizare se adaugă în mediu SP6-ARN-polimeraza şi patru ribonucleotide (dintre care trei nucleotide marcate şi unul nemarcat). în funcţie de enzima de restricţie folosită.Prin această metodă. înseamnă că prin utilizarea diferitelor enzime de restricţie se poate prestabili lungimea lanţului transcris şi se pot obţine lanţuri ARNm transcrise de lungimi prestabilite. ADN este transcris în afara celulei. ci pentru sinteza de ARN. ADN-ul străin este cel care urmează a fi transcris în ARN. pentru formarea unei molecule ARNm conform matriţei ADN. Fiecare din cele două polimeraze necesare pentru transcrierea respectivului lanţ ARN şi anume.polimeraza se va lega de promotorul SP6 pornind transcrierea genelor în direcţia SP6>fragment MCS>fragment ADN nou înglobat (fig. ARN-polimeraza va folosi ribonucleotidele marcate şi nemarcate. ăn vederea obţinerii de probe ARN lanţ unic (sondă genetică). se leagă specific doar de promotorul corespunzător.

Etapa II – probele marcate sunt evidenţiate prin intermediul legării markerului de avidină (glicoproteină din ou)/streptovidină (sintetizată din ciuperca Streptomyces avidinii) şi anticorpi antimarker (de exemplu. În mod normal uracilul se înglobează numai în ARN.v. Marcarea neradioactivă Se face în două etape: Etapa I – marcarea probelor cu biotină (cel mai frecvent). Atomul radioactiv introdus în probă prin dezintegrare va emite radiaţii β care vor fi evidenţiate la autoradiografie (impresionarea plăcii Roentgen la iluminarea cu radiaţii u.v. 35 S este de 87. Timpul de expunere a filmului la u.legătura cu nucleozidul artificial.celui de-al doilea lanţ ADN. ATP-ul din nucleotidele ADN este transportor de energie pentru metabolismul celular.35 ani. Pentru aceste structuri se folosesc în laborator trifosfaţii nucleozidelor.35S. antibiotina) marcaţi cu fluorocrom. 32P. rezultă ARNm antisens = complementar faţă de ARNm de origine: Acest ARN antisens se mai notwează ARNc (complementar) şi are sensul invers decât ARNm sens (normal). dar în condiţii de laborator. rezultă ARN sens identic şi cu acelaşi sens ca şi ARNm de origine. . 125I.pentru hibridarea Blotting se foloseşte proba marcată cu 32P. b.La alegerea izotopului trebuie ţinut cont de timpul de înjumătăţire (timp necesar pentru ca substanţa radioactivă să se descompună în proporţie de 50%). Marcarea Se face pe un sungur nucleotid. . bromdeoxiuridină. Biotină – spacer – uracil – zahăr – trifosfat Bio – dUTP. cu o substanţă care îl face vizibil din punct de vedere biochimic sau imunohistochimic.3 zile. a.pentru hibridarea in situ se foloseşte proba marcată cu 3H.primului lanţ ADN.un lanţ ADN este complementar cu ARNm de origine utilizat pentru sinteza ADNc. prin intermediul spacer-ului de la biotină se pot realiza două tipuri de legături: . 276 . pot fi marcate direct în soluţia de sinteză cu ajutorul nucleotidelor marcate (vezi „Marcarea”). . Etapa I Markerul (biotina) se leagă printr-un lanţ de legare numit spacer de baza uracil din nucleotid.). ca sonde genetice. va fi diferit în funcţie de izotopul folosit: .Într-un dublu helix ADN: . timpul de înjumătăţire pentru : 3 H este de 12. Probele de lanţ unic ARN astfel obţinute şi marcate se utilizează ulterior în reacţii de hibridare. Probele de ARN obţinute în maşini de gene cât şi prin metoda transcrierii cu ajutorul vectorilor fagici. . Astfel. nu şi în ADN. Biotină – spacer – uracil – zahăr – trifosfat. 32 P este de 14.legătura cu nucleozidul natural.al doilea lanţ conţine aceleaşi secvenţe de nucleotide ca şi ARNm de origine. De exemplu: Bio – UTP. digoxigenină. în etapa II. Marcarea radioactivă Se face cu radioizotopi 3H. B. 125 I este de 60 de zile.4 ani. Prin transcrierea: . În ultima vreme există tendinţa ca substanţele radioactive să fie abADNonate din cauza efectului lor nociv asupra organismului şi înlocuirea lor cu substanţe neradioactive. Acest braţ de legare va uşura şi legarea ulterioară a biotinei de proteinele avidină/streptovidină.

Înglobarea nucleotidelor marcate în sonda genetică Se realizează prin: a. Din cauza unor reacţii nespecifice se preferă streptovividina în locul avidinei.polimeraza I (polimeraza Kornberg) este izolată din E. 151). respectiv ribouridin – trifosfatului şi vor fi înglobate în locul dezoxitimidin – trifosfatului şi. nucleotidele cu uracil se împerechează. C. ADN – polimeraza I are şi o acţiune exonucleazică în ambele sensuri: 5 ' > 3' şi 3' > 5' . pe lanţul complementar de ADN ca şi pe lanţul ARN. a. Fig. Metode enzimatice Înglobarea nucleotidelor marcate radioactiv sau neradioactiv se face cu ajutorul unei reacţii enzimatice. are acţiune polimerazică 5' > 3'. Fig. În final. Metode chimice.Acţiunea 5 ' > 3' polimerazică a ADN. ea taie legăturile fosfodiesterice de ADN unic sau dublu lanţ.aza I este o enzimă de restricţie extrasă din pancreas de bou.azei I pe dublul lanţ ADN îm prezenţa ionilor de Mg++ şi Mn++ ADN. tot cu un nucleotid cu adenină.translaţia Cea mai folosită metodă pentru marcarea sondelor este Nick-translaţia (translaţia prin tăiere). cât şi Bio – dUTP sunt derivate biotinate ale dezoxiuridin – trifosfstului şi . respecti în ARN.Biotina prezintă o mare afinitate pentru avidină. în prezenţa ionilor de Mg++.Atât Bio – UTP. 149 . în funcţie de complementaritatea faţă de nucleotidele de pe lanţul matriţă corespunzător (fig. 150). această acţiune apare doar când în cursul sintezei unui ADN sunt introduse nucleotide false (fig. În momentul hibridării cu segmente ADN ţintă. Nick . I. în locul rbouridin – trifosfatului.polimeraza I 277 . Legătura bitină + avidină este foarte puternică şi aproape ireversibilă. pentru a se evidenţia prezenţa complexului molecular hibrid biotină – avidină/streptovidină. acesta este marcat prin diferite metode. În această metodă se folosesc două enzime: ADN-aza I şi ADN – polimeraza I. 149). Etapa a II-a Probele de mai sus biotinate se evidenţiază prin legarea biotinei de avidină/streptovidină sau anticorpi antibiotină marcaţi cu fluorocrom. ADN.Acţinea ADN. 150 . coli. nu atacă ARN şi acţionează în prezenţa ionilor de Mg++ şi Mn++ (fig. fixează nucleotidul ADN la capătul liber 3' (mai scurt) al moleculei ADN parţial dublu lanţ. Metode enzimatice b.

) cît şi nemarcate (o). Numele metodei de RADNom Priming derivă de la utilizarea drept primeri a hexanucleotidelor cu secvenţe întamplătoare (randomized primer).Acţiunea exonucleazică în ambele sensuri ale ADN – polimerazei I.Fig. Oligomarcare (RADNom Priming. dublul lanţ ADN este denaturat (cele două lanţuri sunt separate). in oligomarcare se folosesc drept matriţe lanturi unice de ADN rezultate dintr-o denaturare prealabila a unui lanţ ADN. Se mai utilizează un amestec de hexanucleotide (oligonucleotide sintetizate cu ajutorul unei maşini de gene ). Astfel. si 3’. Klenow Polimeraza poseda activitate 5’ – 3’. 1991). după încorporarea nucleotidelor marcate.3’ exonucleazica).152). aflate de obicei in proporţie de la 1 la 3. 151 . Se foloseşte enzima Klenow Polimeraza care reprezinta un fragment de ADNpolimeraza. reprezentate de nucleotide ADN marcate (. II. Fig.FeinbergVogelstein Technik) Spre diferenţa de “nicktranslatie”. RADNom Priming Oligolabelling. 152 . 278 .5’ exonucleazica (dar nu prezinta activitate 5’. se vor obţine fragmente de lanţuri unice ADN marcate de diferite lungimi şi cu diferite secvenţe de baze (sonde genetice) (fig. ele sunt structuri formate fiecare sir cate sase nucleoide care contin practic toate combinaţiile de secvenţe nucleotidice posibile.Schema Nick – translaţiei (după Hermaun .

Marcarea cu acridin oraj. astfel încat sa se obţină populaţie uniforma din punct de vedere genetic.Acest tip de marcare se efectueaza atat pe ADN unic lanţ cît şi dublu lanţ. ataşa. cu biotina): dezoxiribouridinbiotinat (Bio-dUTP). Spre diferenţa de primele doua metode (1 şi 2). care provin dintr-o singură celula bacteriană. ƒ 1. această coada cu timina poate fi evidenţiată indirect prin fixarea. În cazul acestei hibridizari.care conţin toata timina. la capetele 3’-OH formînd o coada cu acelaşi nucleotide pe ambele lanturi ale dublului lanţ ADN (dar la capetele opuse). unei molecule dublu lanţ ADN . în aceasta a treia metoda marcare se face numai la capetele moleculei ADN-proba rezultata . această enzimă se foloseşte şi în experienţe de clonare pentru obţinerea capetelor franjurate ale fragmentelor ADN 279 . 12. ƒ 2. sensibilitatea moleculei de ADN rezultata prin această metoda este mult mai mică. Prin cuplarea între acridinester şi acidul nucleic se produce o legatură de chemoluminiscenta care eliberează lumina. în cursul hibridizarii. Lungimea acestei cozi este dependenta de concentraţia cationilor de Co++si de concentraţia nucleotidelor.Dupa denaturarea şi hibridicarea unei asemenea “probe marcate”.. în cazul de faţă. Acest Bio-dUTP este legat prin acţiunea transferezei terminale de capetele 3’-OH ale unei molecule ADN dublu lanţ. ================================================================== *Dezoximetil-nucleotid-terminal-transferaza. a unei cozi cu adenina marcata cu biotin ape lanţul ADN proba (adenine se va fixa prin complementaritate pe coada de timina). Marcare terminala a lanturilor ADN (Endlabelling). CLONAREA ADN – ului Clona bacteriana reprezinta un grup de celule bacteriene identice din punct de vedere genetic.de aceea. Această enzimă. de acidul nucleic. În aceasta metoda se foloseşte doar un singur nucleotide ADN marcat (de exemplu.III. secvenţa proba.Exista mai multe metode de marcare terminală. Marcarea cu fotobiotină. prin care sunt marcate moleculele de ADN probe (sonde genetice). b) Metode chimice Reprezinta o marcare directa a acidului nucleic. Se formeaza o legatura stabile între biotina şi acidul nucleic (lanţ unic sau dublu). pe o grupare chimica activate in prezenţa luminii (iluminare foarte scurta). iar cel cu coada de adenine. Marcarea terminală 3’ a ADN:se face cu ajutorul enzimei transferaza terminala*. lanţul cu coada de timina reprezinta secvenţa ţinta. Pot fi marcate capetele 3’ si 5’ ale moleculei ADN şi ARN. va rezulta deci un ADN lanţ unic cu un capat 3’-OH liber (şi respectiv un ADN cu un capat format dintrun lanţ 3’-OH care atârna în afara). deci pe fiecare din cele două lanturi. clonarea semnifică obţinerea unei culture de celule dintr-o celulă unică. Un asemenea tip de marcare este bazat pe legarea biotinei printr-un braţ de legare chimică. o coada cu nucleotide nemarcate.de asemenea. Cu ajutorul enzimei transferaza terminala se poate.4.Clonarea se poate realiza prin încorporarea (printr-o tehnică de recombinare ADN) a unui fragment de ADN străin într-un vector care ulterior este introdus şi multiplicat într-o celula gazdă. Enzima nu are nevoie de nici o matriţa. catalizează fixarea nucleotidului pe capatul 3’-OH liber al moleculei ADN unic (sau dublu lanţ). În biologia moleculară.

Se folosesc enzime de restricţie de tip sticky* şi un plasmid care poarta doua gene (markeri de rezistenţa la doua antibiotice: ampicilina şi tetraciclina). trebuie îndepartate grupările fosfat de la extremitaţile 5’ ale moleculei deschise de ADN a vectorului. celula bacteriana trebuie tratata cu soluţie CaCl2 pentru a devenit compententa. 3. 4.coli. din care fiecare va reprezenta o clonă.coli. c) având in vedere faptul ca celulele bacteriene poseda sisteme care protejează celula de pătrunderea unui ADN străin. 1. Fosfataza alcalina se obţine din celule de Esch. se folosesc pentru clonari celule bacteriene mutante (celule cu system de apărare mult diminuat). purtatorde gena pentru ampicilina (rezistenţa la ampicilina). se folosesc celule bacteriene de E. ƒ introducerea fragmentului ADN într-un vector. vor supravieţui numai acele celule bacteriene care au caştigat rezistenţa la ampicilina. De obicei. Etapele principale ale metodei de clonare Sunt urmatoarele: ƒ extragerea unui fragment ADN. cu ajutorul fosfatzei alcaline. În acest sens. În soluţia nutritive în care se găsesc celulele bacteriene.coli sau celule de intestine de oaie. se produce şi multiplicarea vectorilor recombinanti incorporate.A. ƒ selectarea celulelor bacteriene care conţin vectorul recombinant. se vor lipi şi va rezulta lanţul ADN recombinant (fragmentul ADN a devenit inclus in vector). Selectarea celulelor bacteriene purtătoare de vector recombinant. eliminADN markerul respective(de obicei se elimina gena tetra şi ramane cea pentru ampicilina in momentul taierii lanţului ADN de atre enzimele de restricţie. Aceasta testare se face cu scopul de a controla daca celula bacteriana a incorporate respectivul plasmid recombinant. În scopul eficienţei de clonare: a) pentru a împiedica circularizarea vectorului ADN străin. b) pentru a permeabiliza membrane celulei bacteriene la respectivul plasmid vector. prin acceptarea plasmidului recombinant. însămînţate pe mediu de cultura cu ampicilina vor creşte colonii bacteriene. Selectarea acestor celule purtătoare de plasmid cu ADN străin încorporate şi diferenţierea lor de celule (clone) fără ADN străin se face prin însămînţare. prin replica 280 . vectorul nu se va mai circulariza.Introducerea vectorului recombinant in celula gazda (competenta) Acest fenomen reprezinta procesul de trasformare. bacteriile transformate (cele care au primit vector+ADN) se testeaza pe un mediu de cultura cu ampicilina. sincron cu multiplicarea celulelor bacteriene. Se lucreaza pe celule de Esch.În acest fel. ƒ introducerea vectorului recombinant (plasmid care a înglobat fragmentu ADN străin) în celula gazdă. Clonarea ADN se recomADNă atunci cADN este necesară izolarea şi multiplicarea unui segment de ADN (dintr-un genom). Ţinând cont de faptul că atît plasmidul cît şi fragmentele ADN au locuri (situs-uri) de tăiere complementare. În majoritatea experimentelor de clonare.Extragerea unui fragment ADN. atunci cînd vectorul deschis şi segmnetul ADN străin vor veni in contact.Testarea celulor bacteriene supuse procesului de transformare. 2. Din aceste bacterii cu vectori recombinant. cu ajutorul enzimelor de restricţie. pe plasmidul iniţial care poarta rezistenţa la antibiotice (tetra şi ampicilina) se incorporeaza fragmentul ADN străin pe locul unuia din cei doi markeri. din zonele sticky. prin taierea ADN genomic.

iar diferite fragmente de ADN sunt clonate (în celule bacteriene). Tip sticky=enzime care taie cele două lanţuri ale helixului dna în mod franjurat datorită faptului ca şi-au pastrat gena purtatoare de aceasta rezistenţă (este vorba de plasmidul “gol” fără ADN străin ataşat). care rezultă din clonarea de fragmente ADNc se sintetizează artificial în laborator.cercetarea structurii exonilor şi intronilor. prin formarea unui plasmid recombinant. . şi anume prin hidibridizare colonială. în vectori.Din aceasta biblioteca se obţin secvenţe ADN necesare pentru tehnica de hibridizare. cît şi exoni. în terapia bolilor tumorale se intrevede posibilitatea identificarii şi distrugerii tintite a anumitor molecule ARNm. aceluiaşi organism. Abia din acest moment se poate studia mai departe clona care conţine fragmentul ADN dorit.plating.cercetarea structurii complete a genelor. Acest mod de clonare. acestea vor fi folosite drept secvenţe ADN cu rol complementar (cu secvenţe ADN cunoscute). pe acest mediu vor supravieţui doar clonele care nu conţin nici un fragment de ADN străin (celule rezistente la tetraciclina). lanţul dublu ADNc se va forma din acest lanţ unic ADNc. Clonele din biblioteca genomica ADN se folosesc pentru: . Astăzi. printr-o tehnică de hibridizare speciala. vectorii recombinaţi(vector+ lanţ unic ADNc) vor determina ulterior formarea de clone bacteriene ADNc. deoarece toate celulele aceluiaşi organism posedă o înzestrare genetică identical. necunoscute. aceluiaşi tip de ADN genomic îi corespund alte gene active (exoni). a coloniilor bacteriene pe un mediu cu tetraciclina.cercetarea secvenţelor reglatoare. prin doua posibilităţi: în prezenta ADN-polimerazei (Klenow= ADN-polimeraza I extrasa din celula de Esch. Clonele genomice ADN vor conţine atat secvenţe de introni. în timp ce clonele care au pierdut gena de rezistenţa la tetra (în momentul legării plasmidului de ADN STRĂIN). Clonele din biblioteca ADNc se folosesc în special în scopul analizei directe a secvenţelor de baze care codifica un anumit aminoacid sau produsul proteuc final (codificat de respectivul fragment ADNc). care induc translaţia informaţiei pentru sinteza unor substanţe oncogene. nu cresc pe acest mediu.În fiecare tip de celule. Biblioteca ADNc (ADN copie dupa matriţa de ARNm matur) Reprezintă doar o informaţie pură formată numai din secvenţe de exoni. se va obţine un numar de clone corespunzADN diferitelor amestecuri (vector plasmidic+segment ADN).coli). Biblioteca genomica ADN (secvenţe de exoni+introni) Dacă genomul unui organism este secţionat cu enzime de restricţie. reprezinta tehnica “împuşcarii” (shotgun). Din acest hibrid. a caror secvenţe nucleotidice trebuie cercetare şi identificate. În timp ce clonele de ADN genomic sunt identice pentru toate celulele aceluiaşi organism. B. drept copie complementară (în prezenţa enzimei reverstranscriptaza). care duce la formarea unei biblioteci genomice ADN prin tăierea genomului (cu ajutorul enzimelor de restricţie) potrivit principiului întamplării şi prin unirea fragmentelor rezultate. ceea ce înseamnă ca în fiecare tip de celule poate apare un alt tip de ARNm matur. astfel încat. . clonele ADNc sunt diferite pentru diferitele tipuri de celule ale aceluiaşi organism.Spre diferenţa de biblioteca genomica ADN. Clona ADN genomica a unuia şi aceluiaşi organism este totdeauna identical şi independenţa de tipul celular. corespunzătoare genomului celulei respective de origine. Secvenţa clonelor ADNc este studiată în special prin experimentele de hibridizare. C. 281 . pe o molecula de ARNm matur. in vederea identificarii unor fragmente ADN noi. Produsul acţiunii acestei enzime va fi o molecula mixta (hibrid): ARNm-ADNc. biblioteca ADNc rezultata variaza de la un tip celular la altul. Totalitatea acestor clone rezultate din genomul unui organism iniţial reprezintă biblioteca genomica ADN.

la acest capăt urmeaza a se fixa nucleptidele ADN care vor forma noul lanţ. ADN genomic dublu lanţ (de cercetat) izolat din celule şi tăiat în fragmente cu ajutorul enzimelor de restricţie corespunzătoare. Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) A fost numită de Lederberg. şi aceasta sa fie ulterior amplificata enzimatic. sintetizat în prealabil prin trascriere inverse a ARNm. Dintre cei doi primeri. in probele de cercetat (produs biologic). într-o masina automata se desfaşoara 30 de cicluri într-un interval de 4 ore. Adaosul de primer se face în exces. La capatul 3’ al lanţului ADNc se ataşeaza o coada de nucleotide-guanina cu ajutorul enzimei trasferaza terminala. PCR este folosită pentru cercetarea unor cantităţi foarte mici de ADN dintr-un produs biologic.Acest ADN conţine secvenţe care urmeaza a fi multiplicate (amplificate). Etapele reacţiei. Se foloseşte drept matriţa un ADN monocatenar. “instrumental pentru democratizarea biologiei moleculară”. în 1993. 12. Avantajele acestei reacţii sunt urmatoarele: fiind foarte sensibilă. Pentru a porni sinteza noului lanţ ADN pe un lanţ ADN matriţa. cu ajutorul unor tehnici de inginerie genetică (procese artificiale de recombinare ADN). o multiplicare suficienta de secvenţe de ADN este reprezentata de minimum 25 de cicluri de multiplicare. unde aceste modificări urmeaza a se exprima. Primerul delimiteaza capatul iniţial al fiecarei din cele doua secvenţe ADN unic lanţ (rezultate din denaturarea ADN-ului dublu lanţ) de multiplicat. Principiul reacţiei.Urmeaza desfaşurarea PCR cu doi primeri diferiţi utilizaţi simultan. Lanţ unic de ADNc.Cu ajutorul experientelor de clonare s-a reuşit citirea de secvenţe de ADN de pe lanţul ADN al genomului unui organism. În aceste condiţii fixarea primerului pe ADN-ul unic lanţ reprezintă un proces de hibridizare ce are loc la temperature scăzuta (36-65 grade C). al doilea primer este nucleotide-citozina. pe acest lanţ unic de ADN se poate sintetiza un lanţ complementar cu ajutorul ADN-polimerazei şi în prezenta unui oligonucleotid (15-20 nucleotide) primer (armorsa). Astăzi exista masini automate (Thermai Cycler) pentru realizarea unor asemenea reacţii repetate. 5. cu mijloace tehnice relative simple. reacţia poate pune în evidenta chiar şi prezenţa unei singure molecule de ADN. primul primer este nucleotide-timina. reacţia permite chiar şi multiplicarea unei singure secvenţe de ADN. câte unul corespunzator pentru fiecare lanţ ADN (rezultat din ADN-ul dublu lanţ denaturant). ƒ denaturarea ADN-ului genomic (izolat din celule) dublu lanţ sau ADNc (sintetizat cu ajutorul unei molecule de ARNm) la temperature înalta (95 grade C).Pasul urmator îl reprezintă obţinerea unor modificariale acestor segvente ADN. a. A. Efectuarea reacţiei PCR poate porni de la punctul a sau b. B. cît şi introducerea acestor segmente astfel modificate de ADN în celule sau organisme. b. diagnosticarea bolilor genetice pînă la “vanarea” şi identificarea de noi virusuri şi studii de ecologie şi arheologie (studiul ADN-ului) din fosile. Spectrul de aplicabilitate al PCR este foarte larg: de la medicina judiciara. pentru a se obţine o hibridizare primer 282 .Această reacţie dă posibilitatea ca dintr-o mixture de ADN să poata fi “pescuită” o singura moleculara de ADN. ADN-polimeraza necesită prezenta pe matriţa a unui oligonucleotid primer cu capatul 3’-OH liber. deoarece reacţia ofera posibilitate multiplicarii (clonarii) ADN-ULUI chiar şi in afara celulei vii. ƒ dupa scăderea temperaturii se adaugă primerul în exces. În condiţii de laborator în vitro.

În acest fel lanţul de ADN este dublat şi. În anii 1980. dupa cum am mai arătat. în prezenta celor 4 tipuri de nucleotide ADN (adenine/timin/guanine/citidin deoxi-nucleozid trifosfat) pornind de la locul de fixare a primerului. Amplicabilitatea practica a PCR-ului. cu ajutorul a doua serii câte 40 de cicluri PCR. În condiţii normale. noul adios de Taqpolimeraza declanşeaza de fiecare dată ciclu următor de sinteza ADN. Produsele ADN obţinute prin PCR sunt separate electroforetic în funcţie de dimensiuni. prin determinarea ADN-ului din celulele trofoblastice. în lumina U.repetarea de mai multe ori a respectivei reacţii pentru aceeaşi probă. această activitate scade cu 50% la 60 grade C şi cu 90% la 37 grade C. iar apoi benzile sunt făcute vizibile. distrofia musculara Duchenne. prin tratarea prealabilă a gelului cu etidiumbromid. a) În diagnosticul medical. prin aceasta metoda se poate face 283 . Pentru sesizarea eventualelor erori sau neajunsuri ale reacţiei PCR. fiind termolabila. Dacă se urmareşte o amplificare ADN mai mare decât cea corespunzatoare la 40 de cicluri PCR. Aceasta ADN-polimeraza a fost numită Taq-polimeraza. PCR este utilizat în: diagnosticul bolilor ereditare (fibroza chistica. Polimeraza utilizată în PCR.Primerul va fi încorporate în noul lanţ de ADN format. un ciclu de PCR este terminat. fenilcetonuria). de controale negative. se poate efectua reacţia în care toţi reactivii se pun de la început în recipient I până la sfarşitul reacţiei nu mai trebuie adaugate noi cantităţi. izolată de la o bacterie termifila Thermus acquaticus. trebuie începuta o noua serie de cicluri. ADN-ul astfel extras este supus reacţiei polimerazei în lanţ şi apoi analizat cu ajutorul sondelor genetice prin reacţia de hibridizare. ƒ începe un nou ciclu cu denaturarea de aceasta dată a ADN-ului dublu lanţ nou sintetizat (în treapta anterior anterioara). În acest fel. obţinându-se o amplificare ADN de ordinal 10 la puterea 6-10 la puterea 7.V.Optimum de activitate al acestei enzime este la 75-80 grade C. se poate face şi prenatal. această enzima a fost apoi înlocuită cu o ADN-polimeraza ternostabilă. ƒ cu fiecare nou ciclu ( de denaturare/sinteză a ADN-ului) va fi dublata cantitatea de ADN rezultata din ciclul anterior. în aproximativ 4 ore. ƒ reacţia de sinteza a noului lanţ ADN cu ajutorul ADN-polimerazei. ADN-ul extrage din celule proaspat lizate şi din celule fixate şi inglobate în parafina. Apoi se realizeaza hibridizarea ADN-ului cu sonde genetice specifice prin metoda Souther Blotting. În acest scop. folosind drept matriţa segmentul ADN lanţ unic de amplificat. PCR are un spectru de aplicabilitate foarte larg. obţinut şi diluat de 1000-10000 de ori. Diagnosticul bolilor ereditare. D. se folosea ADN-polimeraza Klenow (fragment de ADN-polimeraza I de la e.reacţia PCR sa fie însoţită. Pentru o multiplicare sufienta de secvenţe ADN sunt necesare 2530 de cicluri de reacţii automatizate. . mai departe. de fiecare dată. care se efectuează. cu ajutorul ADN-ului amplificat. Taq-polimeraza este stabila până la 95 grade C. . se recomandă. graţie PCR-ului. anemia Cooley. Utilizarea Taq-polimeraza a făcut posibilă automatizarea totala a acestei produceri în maşinile Thermal Cyclers. Dacă pentru PCR denaturarea ADN-ului se face la 95 grade C. o data cu acesta.lanţ unic de ADN şi nu o hibridizarea între lanţurile unice de ADN rezultate din denaturare. La fiecare nou ciclu al PCR se adaugă Taq-polimeraza proaspătă. coli). se poate obţine o amplificare de 109 a cantitaţii de ADN. ADN-polimeraza se leagă de capatul 3’ al primerului şi sintetizează noul lanţ în direcţia 5’->3’. cu ajutorul Taq-polimerazei se pot efectua consecutive 40 de cicluri PCR. acest nou ciclu si acest ADN nou-sintetizat (prin sinteza mijlocita de ADN-polimeraza). În acest fel. sub forma de benzi. în gelul de electroforeza. în făt. C.

pentru detectarea şi identificarea agenţilor patogeni. pentru un diagnostic prin PCR. de pe ADN-ul cromozomial.PCR poate da un rezultat precoce pozitiv chiar şi în prezenţa unei singure celule infectate cu HIV ( din materialul de cercetat ). nu este necesara o proba de ţesut cerebral. infecţia cu virus herpes simplex. PCR mai este utilizat în diagnosticul urmatoarelor boli infecţioase: hepatita virala. S-au postulat apoi şi alte boli de etiologie posibil microbiana fara a fi însa posibilă evidenţierea prezenţei unor microorganisme. au fost analizate microorganisme care până astăzi nu au putut fi cultivate pe medii de cultură. Pneumocistis carinii.virus papollima. de exemplu în boala Whipple. În urma recoltarii de lichid amniotic este supus determinarii cu ajutorul PCRului sau al anticorpilor monoclonali. În studii ecologice Cu ajutorul PCR s-a reuşit evidenţierea unui număr de microorganisme în probe de pământ şi apă. În medicina judiciară PRR este folosit pentru evidenţierea identităţii unui fir de părsau a unei cantităţi foarte mici de sânge sau spermă. c. ci este suficienta doar o proba de LCR. Introducerea diagnosticului rapid al infecţiei HIV prin PCR este astazi absolut necesara în practică. în acest fel fiind posibila determinarea de defecte genetice cromozomiale. în acest caz se folosesc drept probe. în aceste cazuri fiind necesare alte metode decât cultivarea pe medii de cultura. prin identificarea prezentei acidului nucleic viral în sânge (şi anume acidul nucleic viral fixat în genomul celulei limfocitare umane). este primul exemplu din partologia umană în care s-a emis ipoteza prezenţei posibile a unei bacterii necultivabile. depozite de grasime. prin deletia. În general. diagnosticul bolilor infecţioase. Boala whipple se manifesta clinic prin astralgii migratorii.determinarea prenatal pentru sexul copilului şi se poate pune şi diagnosticul unei eventuale boli genetice. în Bengal). a unui segment de 22 kb. cât şi microorganisme de sol care au suferit în timp modificări genetice. imposibil de identificat prin posibilitaţile clasice cunoscute. metabolice (enzimopatii). în special în investigarea donatorilor de sânge şi de organe. d. atunci când toate celelalte reacţii serologice sunt înca negative. Boala Whipple a fost semnalată pentru întâia oara în anul 1907. concomitant cu inserţia unui segment nou de 35 kb. probabil microbiană fără a fi însa posibilă evidenţierea vizuală. În arheologie PCR a fost utilizată până în prezent şi pentru analiza ADN provenit din mumii egiptene vechi de mai bine de 2400 de ani.. epitelii de fir de par. cu ajutorul reacţiei PCR au fost efectuate studii genetice asupra tulpinei de Vibro cholerae grup 0139 (izolata pentru întaia oara. pe glob. Noile metode îşi au rădăcinile în filogenetica moleculara. Neisseria meningitides. Pentru diagnosticarea infecţiei HIV într-o encefalita declanşată de acest virus. apariţia în ganglionii mezenterici de infiltrate macrofagice proeminente. diaree. reuşind sa se demonstreze ca această tulpina ar reprezenta rezultatul unor modificări genetice suferite de tulpina Vibrio cholerae grup 01 biotip eltor. în 1992-1993. PCR este utilizat şi în identificarea unor germeni microbieni ramaşi până astăzi necultivabili. probe uscate de sânge. febra. b. Mycobacterium tbc. recoltarea de probe reprezinta un stres minim pentru bolnav. Astăzi PCR poate fi folosită în combinaţie cu metoda fingerprinting în aceleaşi scopuri. 284 . dureri abdominale. pierderi în greutate. Clostridium difficile. spalatura bucala (cu celule epiteliale). Diagnosticul infecţiei HIV cu ajutorul PCR-ului se poate face în stadiile prococe ale infecţiei. virus Epstein-Barr. Recent.

Metoda chimică. cu ajutorul metodei de secvenţiere ADN şi de analiză a secvenţelor nucleotidice din aceste structuri. Metode Pentru secvenţiere se folosesc două metode: a. Prin descifrarea acestor secvenţe de baze se poate ajunge la delimitarea genelor şi la stabilirea secvenţelor de aminoacizi codificate de o singură genă. cu ajutorul enzimelor de restricţie. Methanobacterium thermoautotrophicum. SECVENŢIEREA ADN. Cu ajutorul acestei proceduri s-au obţinut informaţii şi asupra materialului genetic inclus în cele 23 de perechi de cromozomi umani. Metoda enzimatică Tehnica Sanger Principiu: se determină secvenţele de baze nucleotidice pe copia de acid nucleic şi prin complementaritate se deduce secvenţa de baze de pe lanţul de acid nucleic de origine.cauzele unor boli genetice. A. Condiţia de baza pentru realizarea acestei secvenţieri este prezenţa unui număr suficient de copii ale moleculei de ADN. tehnica Maxam. a unui fragment ARN. În 1995 a fost terminată secvenţierea completă a primului genom bacterian. Metoda enzimatică. a. care pot tăia moleculele de ADN în fragmente de cîteva sute până la câteva mii de perechi de baze.identificarea unuio număr de gene. Acest lucru se poate realiza prin clonarea ADN sau prin metoda PCR. Acest primer ste un oligonucleotid scurt.Gilbert ( de obicei combinată cu metoda Sanger). la această analiză s-a lucrat trei ani în 35 de laboratoare din lume. Bacillus subtilis. pe lanţul unic AN se fixează un primer (moleculă starter sau amorsă). Secvenţierea ADN este o variantă a tehnicii de recombinare ADN cu ajutorul căreia se poate stabili secvenţa de baze din molecula ADN. indirect. La drojdii (drojdia de bere – Saccharomyces cerevisiae). restul de 97 % din genom reprezintă doar „balast genetic” a cărui semnificaţie este încă necunoscută. Acest studiu a fost posibil datorită folosirii enzimelor de restricţie (endonucleaze). dovedindu-se că conţine 315 357 perechi de nucleotide şi 200 de gene. Aceste fragmente obţinute pot fi apoi separate electroforetic şi analizate. Principiu Secvenţierea ADN (sequencing) înseamnă tăierea lanţului ADN în secvenţe şi analiza ulterioară a secvenţelor de baze nucleotidice din aceste fragmente. Etapele reacţiei: lantul dublu de acid nucleic (AN) aste adus la forma de AN unic lanţ. înrudirii dintre proteine.locul relativ al genelor pe cromozomi. cea a proteinelor corespunzătoare pot furniza date cu privire la conformaţia proteinei. Ca urmare. b. Curând vor fi terminate şi secvenţierile complete ale genomurilor bacteriene Escherichia coli. a fost secvenţiat pentru prima dată un cromozom. analiza secvenţială a ADN-ului şi. urmat la scurt timp de cel de Mycoplasma genitalium. . preparat semiautomat prin tăiere. Primerul este stfel selectat încât capătul 3' să se 285 . B.12. În prezent este în curs de desfăşurare proiectul de cercetare asupra genomului uman. Genomul multor virusuri a fost total secvenţiat. şi anume: . şi anume cromozomul III. funcţiei proteice. genom care conţine circa trei miliarde de perechi de bze (50 000 – 100 000 de gene).ului Analiza structurii ADN a început o dată cu anii '70. La Los Angeles şi la Heidelberg există în prezent bănci de date în care au fost strânse toate secvenţele ADN cunoscute până în prezent. 6. cât şi asupra bolilor produse prin mutaţii. tehnica Sanger (Chain Termination Tehnique). . cel de Haemophilus influenzae. Astăzi se ştie că doar 3 % din genomul uman reprezintă gene funcţionale (exoni).

Pentru determinarea acestor tipare individuale.Fragmentele de ADN (dublu catenar) sunt supuse migrării bidimensionale într-un gel denaturat (conţinând un agent chimic denaturat ca ureea. .ADN-ul extras este supus acţiunii enzimelor de restricţie.A. ƒ 30 % reprezintă secvenţe repetitive. Aceste tipare de fragmente de ADN individual sunt reprezentate de o amprentă RFLP specifcă ( polimorfismul de lungime al fragmentelor de restricţie). Apoi se face citirea bazelor colorate de pe gelul de electroforeză prin autoradiografie. netranscriptibilr. FINGERPRINTING GENOMIC (amprente de ADN) a. ƒ 20 – 30 % moderat repetitive.potrivească prin complementaritate. spermă). b. în fiecare din variante fiind marcat altul din cele patru dNTP-uri. concentraţie 5 %). se izolează ADN-ul genomic din celulele unui organism (diferite ţesuturi. dCTP).gene structurale pentru sinteza de ARNt. în laboratoarele de Genetică ale Universităţii Berkeley. sinteza lanţului ADN se va opri acolo unde în locul unui dNTP se va îngloba un ddNTP corespunzător.ADN-uri satelite înalt repetitive. are loc sinteza lanţului ADN complementar (după modelul matriţei AN) în prezenţa celor patru dezoxinucleotid trifosfaţi (dNTP: dATP. Acest primer este înglobat într-un vector sau secvenţă cunoscută. În ultimii ani. 12. În acest punct se va opri reacţia polimerazei. Genomul uman conţine trei miliarde de perechi de nucleotide. Tehnica RFLP cuprinde următoarele etape: . dintre care unul este marcat.7. fiecare secvenţă cu câteva sute până la 6 000 de perechi de nucleotide se repetă în 20 – 30 000 de copii. s-au realizat aparate automate pentru citirea secvenţelor de baze nucleotidice din acizii nucleici cu viteza de 7 000 – 8 000 secvenţe de baze pe zi. dTTP. necodificatoare de proteine. lanţul de acid nucleic nou sintetizat cu un nucleotid marcat este separat prin gel elecroforeză. Tehica se bazează pe o modificare chimicăaunei baze şi o tăiere specifică la nivelul altei baze (de exemplu adenina). aceeaşi secvenţă de 300 perechi de nucleotide se repetă de 30 000 – 1 milion de ori dispersat.U. sânge. Principiu Pe baza analizelor de secvenţiere a ADN-ului. şi anume de pe zona ADN. şi anume: . . b. . pe lanţul ADN de cercetat. fiecare bază este colorată cu altă substanţă fluorescentă. Această reacţie de sinteză a ADN-ului se va desfăşura în patru variante. . pe toată lungimea genomului. a unui didezoxinucleotid trifosfat (ddNTP) şi a ADN-polimerazei I sau reverstranscriptazei.urilor minisatelizate). într-un punct. rădăcini ale firului de păr. Metoda chimică Tehnica Maxam-Gilbert Spre deosebire de tehnica Sanger.înalt repetitive 7 – 10 %. s-a demonstrat că fiecare individ este caracterizat printr-un fingerprinting genomic (un pattern individual al regiunilor hipervariabile din ADN-ul genomic.zona spacer ce conţine gene criptice (silenţioase). cele patru molecule de ADN dublu lanţ obţinute sunt denaturatze prin căldură. de pe molecula ADN. 286 . unde determinarea secvenţelor se face pe lanţul copie. Aceste reacţii au loc pe lanţul ADN originar. prin tehnica Maxam-Gilbert determinarea secvenţelor se face pe lanţul de acid nucleic de origine. în locul marcării radioactive.Tehnica RFLP Cu ajutorul acestei tehnici se pun în evidenţă zonele de ADN variabil de la individ la individ. ARNr şi histone. dintre care: ƒ 70 % reprezintă secvenţe unice identice la toţi indivizii. salivă. în S. dGTP.

Benzile ADN sunt vizualizate prin transiluminare la u.stabilirea polimorfismului genetic în interiorul aceleiaşi specii (de exemplu.Aplicaţii ale metodei amprentelor ADN În medicina judiciară: . dar nu face şi analiza polimorfismului de lungime a fragmentelor. În biologie . a informaţiei genetice parentale (prin compararea fringerprint. se vor putea realiza analize de linkage şi cartare de noi gene implicate în boli genetice.în criminalistică. se potriveşte în mare parte la rude şi este identică la gemenii univitelini). are semnificaţie. În cazul examinării singulare ( a informaţiei genetice per individ). În medicina clinică . acest criteriu fiind superior celui al sistematizării de până în prezent. 287 . . . metoda amprentelor ADN este utilă pentru dovedirea unei înrudiri (amprenta genetică diferă de la individ la individ. se preferă metoda Southern Blotting a cărei capacitate discriminatorie este considerată mai bună. vegetală. Dacă materialul genetic se află în cantitate foarte mică. Această tehnică evidenţiază atât prezenţa/asenţa fragmentelor de restricţie.se va putea analiza instabilitatea genomului şi a relaţiei acestuia cu senescenţa şi neoplazia.s-a analizat ADN-ul provenit de la mumii egiptene vechi de mai bine de 2400 de ani (prin clonare şi secvenţierea unor fragmente ADN de circa 3400 de baze). păr. având în vedere că variaţiile de ADN. . urmărirea criminalului poate fi condusă în funcţie de urmele găsite: amprente individuale prezente în resturi de piele. . în analiza de likage şi determinarea instabilităţii genetice. în viitor.Tehnica AFLP Această tehnică ce combină principiul analizei RFLP cu cel al reacţiei PCR înalt specifică. c. cât şi polimorfismul de lungime al respectivelor fragmente.urmărirea epidimiologică a circulaţiei agenţilor infecţioşi pentru determinarea patternurilor RFLP la virusuri şi tulpini bacteriene. . În arheologie .în oncologie.urilor între generaţii). spermă. în mod deosebit. măsura frecvenţa mutaţiilor în genomul uman.- Benzile de ADN unic lanţ obţinute în gel sunt supuse colorării cu etidiumbromid. inclusiv omul.urile minisatelite se moştenesc după legile mendeliene. detectează numai prezenţa sau absenţa fragmentelor de restricţie. efectuat pe bază simplelor caractere morfologice. sânge. se recurge la PCR pentru amplificarea cantităţii de ADN.în boli genetice. d. pentru diagnosticul midificărilor genetice din celulele tumorale de la persoane cu carcinom mamar (se prepară şi se compară amprente de ADN din celulele tumorale/elemente figurate sanguine cu condiţia ca în proba de sânge să nu existe celule modificate oncogen.stabilirea de relaţii genetice între diferite specii pe baza structurii ADN-ului. Tehnica este considerată astăzi metoda universală pentru determinarea prezenţei/absenţei unei anumite amprente de ADN în orice sursă de origine bacteriană. . în vederea încadrării taxonomice a unor noi agenţi infecţioşi. .stabilirea interrelaţilor virale şi bacteriene pe bază de amprente ADN. animală sau umană. heterozigoţii). în cazul urmăririi transmiterii la descendenţi. .v.diagnosticul paternităţii. se va putea.prin introducerea tehnicii de fracţionare a segmentelor de restricţie şi separării acestora în gel cu gradient denaturat. Determinarea RFLP pentru organismele eucariote.stabilirea paternităţii unor păsări de pradă ale căror ouă au fost clocite de părinţi adoptivi.pe baza existenţei RFLP-urilor au fost amplificate şi analizate secvenţe nucleotidice din fragmente ADN provenite de la specii dispărute.

măsuri spectrometrice şi spectroscopia absorbţiei atomice. Ţinând seama de complexitatea acestei problematici. potenţiometrici. . inclusiv microtehnologiile speciale din domeniul micromecanicii şi microelectronicii. lactat. În domeniul medical. cât şi pentru diferite ramuri ale economiei. .Capitolul 13 BIOSENZORII 13. această metodă este de neînlocuit în stabilirea diagnosticului bolnavilor..şi multi strat): metabolici. ne-am propus enumerarea principalelor tipuri de biosenzori moderni şi tradiţionali: . coresterol. dezvoltarea măsurătorilor de investigaţie selective şi uşor de manevrat reprezintă o problemă cheie a analiticii. De curând. pentru glucoză. pipăit etc.analiza produselor alimentare.utilizarea biosenzorilor pentru laboratoare clinice şi chimice.senzori care au la bază reacţii de tip imunitar: cu dispozitiv membranar. de exemplu supravegherea producţiei în industia chimică şi alimentară. aminoacizi etc. Biosenzorii – sisteme de coantificare a informaţiilor viului Problema biosenzorilor este un capitol al biotehnicilor de cea mai mare importanţă –mai ales în ultimii ani—dar şi extrem de complicată şi vastă. s-a ajuns la obţinerea unei înalte selectivităţi în microanalitică. biofizica şi biocibernetica. imunosenzori optici. O dată cu progresele remarcabile din domeniul analiticii instrumentale. a fost propusă o terminologie care să se refere la traductori pentru toate sistemele de înregistrare şi prelucrare a informaţiei ca utilizări şi în biologie.1. Aceste metode sunt. . galactoză. auz. senzori biologici – pentru sistemele naturale ale fiinţelor vii (organe de simţ: văz. Domeniile de studiu primar pentru a cunoaşte sau a fabrica aceşti biosenzori sunt biochimia. electrochimici. precum şi alte ştiinţe antecesoare acestora. datorită costurilor ridicate. precum şi de evidenta dezvoltare a domeniului biosenzorilor şi a aplicaţiilor acestora în biotehnologii. în biotehnologie este necesară. de exemplu cromatografia gazoasă. mono. Cu toate acestea. .senzori cu receptori. piruvat. .monotorizarea permanentă a pacienţilor cu senzori implantaţi. fenoli. amine. De asemenea. în combinaţie cu microelectronica.) iar termenul de biosenzori să fie atribuit generic oricărui sistem simplu sau mixt (natural sau construit de om) care să înregistreze la nivel micro informaţia circulantă într-un sistem viu. Astfel. 288 . .inregistrarea glucozei în sânge. alcooli. . . gluconat. cromatografia fluxului de lichid (fluidităţii) la presiuni ridicate.măsurarea de ureii din rinichiul artificial. amperometrici. Determinarea selectivă şi cu sensibilitate mare a unui număr crescut de combinaţii are o deosebită importanţă. cercetătorii şi tehnicienii cu preocupări în acest domeniu au propus chiar o diferenţiere semantică a acestor sisteme de cuantificare a informaţiilor ce pot fi obţinute în diferitele funcţiuni ale lumii viului. atât pentru cercetare. acizi nucleici. printre altele. implementate doar în cadrul laboratoarelor. pentru analiza componentelor mediilor de cultură. cu pierdere de reacţii.senzori piezoelectrici. Dintre aplicaţiile biosenzorilor.senzori enzimatici amperometrici (monoenzimatici şi dienzimatici.controlul proceselor în industria microbiologică şi în protecţia mediului. enumerăm: .

sistemul imunologic prelucrează şi utilizează informaţia. departe de a rezolva toate problemele.Creşterea utilizării informaţiei şi necesitatea cuprinderii sale de către sistemul nervos uman. recepţionată de om drept componentă a tetradei care descrie o formă de echilibru substanţă-energie-informaţie-timp. .Impactul psihologic între necesitatea şi obligaţia de a consuma mereu mai multă informaţie şi nevoia de adaptare a omului la lumea informaţională. poate genera. ceea ce i-a făcut pe mulţi să afirme că secolul următor va fi secolul biologiei.Raportul dintre cantitatea totală de informaţie existentă şi utilizată este constant? . peste anumite limite. senzorii îmbrăcau forma instrumentaţiei utilizată în laboratoare pentru cercetări experimentale. se eliberează în proporţie geometrică informaţia care caracterizează dinamica atât a. necesitatea recepţionării cât mai complete şi mai exacte a acestei forme de existenţă a universului. cu precădere în ultimii 7-8 ani.Semnalele conţin informaţie. Ne bazăm.Informaţia este delimitată strict şi poate creşte prin adiţionare sau este holografică? .Într-o primă parte dorim să facem o analiză a unor probleme şi în acelaşi timp un studiu paralel care să. o patologie specifică? . au creat o serie de noi întrebări atât la nivelul utilizatorilor cât mai ales a specialiştilor. în realizarea calitativă a analizei şi sintezei propuse. 13.2. 289 . nevoia de a avea senzori sensibili şi fiabili pentru orice demers în domeniul cunoaşterii. Iată succint. Sunt suport al informaţiei sau sunt catalizatori ai informaţiei cognoscibile? . în domeniul cunoaşterii biologice şi medicale curiozitatea şi motivaţiile sunt din ce în ce mai puternice. includă date ştiinţifice de activitate relatate de specialişti care au lucrat nemijlocit la această problemă. circulantă. Aceste preocupări. în prezent aria preocupărilor în vederea obţinerii unor date dinamice în studiul proceselor a conturat în profunzime imaginea despre utilitatea şi importanţa senzorilor. spre exemplificare. O altă serie de aparate au fost concepute pentru prevenirea incendiilor sau decelarea fenomenelor de poluare sau de toxicitate în mediul înconjurător. sistemelor vii cît şi a celor considerate neînsufleţite. creează noi probleme? Lista acestor întrebări poate continua iar răspunsurile sunt departe de a fi complete. Dezvoltarea automaticii a solicitat intens crearea unor noi sisteme de culegere rapidă a informaţiei. pe măsură ce timpul se desfăşoară iar numărul populaţiilor biologice creşte. câteva din acestea. pe experienţa didactică şi de cercetare dar şi pe o bogată bibliografie adunată în timp. Senzorii optici bazaţi pe microcamere TV au fost suplimentaţi cu sisteme de recunoaştere a formelor şi imaginilor albnegru şi color precum şi cu analizori termici.Natura este mai bogată astăzi în informaţie liberă. Dacă în domeniul tehnologiilor se pare că eforturile pot fi suficient determinate. Ştiinţa şi industria computerelor a făcut un mare pas înainte când pe lângă hard-ware şi soft-ware a adăugat brain-ware.Tot atît de firesc. Dezvoltarea roboticii a crescut şi mai pregnant importanţa senzorilor. în vederea dotării roboţilor cu asemenea capacităţi de orientare şi de lucru. sistemul neuro-endocrin crează şi manipulează informaţia. decât acum 1 milion de ani? . Cercetările de bionică au adus noi clarificări privind simularea şi extrapolarea senzorilor naturali (din organele de simţ) cu posibilităţi de utilizare nu numai în biomedicină dar şi în dirijarea unor procese industriale. apare interesul omului pentru abţinerea unor captatori cît mai fideli ai informaţiei primite de la diferite sisteme vii sau nevii.Emiterea sau culegerea informaţiei este uniformă sau periodică? Acţiunea sa asupra receptorilor este ritmică sau continuă? . într-un cuvânt. Impactul informaţional al biosenzorilor Ştim din ce în ce mai exact felul în care sistemul genetic stochează şi distribuie informaţia. Dacă cu mulţi ani în urmă. Se creează fireşte.

cantitatea de informaţie deşi aparent scade.bioizi din ce în ce mai perfecţionaţi. calitatea informaţiei prelucrate este dependentă de structura anatomo-fiziologică.) au intrat în competiţie cu o nouă clasă de traductoare. Cu puţin timp în urmă au apărut primele biocipuri. a principalelor căi şi modele reale în care selecţia informaţională acţionează. În aceste situaţii aparatura de măsurare întâmpină greutăţi din ce în ce mai mari începând cu selecţia semnalului din zgomotul de fond şi înlăturarea bruiajelor şi până la obţinerea unor valori individualizate care pot fi interpretabile sau pot constitui valori de referinţă.). Utilizarea unui organism viu sau a unei 290 . utilizând probabilităţi neinvestigate încă. Modelul biologic pătrunde impetuos în tehnică. este mult mai densă. 13. auditivi etc. intensitatea semnalelor şi informaţiilor culese fiind în funcţie de capacitatea receptorilor de a vehicula pe canalele specifice fluxul informaţional. integrarea psiho-neuro-endocrino-imunologică complică procesul de înţelegere al mecanismului şi modului de acţiune selectiv a senzorilor biologici. Acum ele se perfecţionează rapid. În ceea ce priveşte senzorii naturali biologici (tactili. apărând noi componente având ca suport materia vie. rezistive etc. Variaţia rapidă. fiind de fapt modele ale aplicaţiilor curent utilizate de cercetările biofizice. de sensibilitatea şi modelele fixate repetitiv pe sistemele de memorare ale organismelor vii. Ca în orice domeniu. a biocomunicării şi modificarea câmpurilor ce acţionează în sfera biologicului.3. în efortul de a depăşi experimentalul posibil şi în speranţa de a deschide noi ferestre în domeniul cunoaşterii. În acest context. în timp a acestor fluxuri informaţionale constituie un impediment destul de serios al cunoaşterii reale. Condiţionarea genetică joacă un rol determinant în acest caz. În momentul de faţă. pe scara biologică. S-a născut un nou domeniu. La om. biosenzorii . Mintea umană încearcă un efort de autodepăşire în înţelegerea unor variante noi matematico-logice de utilizare de noi limbaje. Tehnologia din momentul de faţă nu este însă suficientă pentru a ne oferi rezolvări concrete şi acest fapt face să considerăm că elaborarea şi cunoaşterea biosenzorilor se află încă în domeniul pionieratului. culegerea şi prelucrarea informaţiei se face etapizat pe mai multe nivele structural-energetice. senzorii construiţi de om se supun legilor naturale descrise de chimiafizică. cercetarea ştiinţifică actuală încearcă să elucideze separat sau integrat modul de acţiune al circulaţiei pe canale informaţionale a vectorilor semnalelor stimulatori sau inhibitori la nivelul diferitelor verigi biocibernetice. a electricităţii „chimice" a enzimelor de restricţie şi recombinare. Metodologia de cercetare a proprietăţilor senzorilor biologici Sensibilitatea oricărui sistem de măsură este condiţionată în mare măsură de calitatea traductoarelor utilizate. Traductoarele clasice (cele inductive. Cu toate acestea. Dacă ne referim la achiziţiile dobândite în cadrul dezvoltării ontogenetice şi filogenetice. sunt întreprinse cercetări aprofundate privind reglarea schimburilor la nivelul membranelor celulare. gradul de diferenţiere a prelucrării şi utilizării semnalelor din mediul intern şi extern este diferit în funcţie de complexitatea organismului studiat. dar diferenţiat. a efectelor de fineţe din interacţiunea macrocosmos şi microcosmos.Această triadă deschide de pe acum posibilităţi nebănuite puterii de calcul şi stocare în informatică. Pe măsură ce coborâm la nivele de organizare mai profunde. al modului de acţiune al microbiocurenţilor. în timp util. Fiabilitatea lor este relativ mare dar aproape în totalitate determinată de tehnologiile utilizate. vizuali. capacitive. a cunoaşterii algoritmului de modificare a raporturilor de electroliţi şi a pompelor ionice. cuantificarea energeticoinformaţională este mai greu de realizat pentru cercetători. Fără îndoială că natura a creat o multitudine de biosenzori care rezolvă pe plan biologic aceste probleme. traductoarele biologice.

se loveşte de cele mai multe ori de o inconsecvenţă în metodologia experimentală în care metodele clasice nu sunt organic integrate cu cele noi apărute. se poate aprecia că planta poate răspunde cel mai bine acestei cerinţe (imobilizare naturală).4. se cunoaşte că răspunsul electric al unei fibre nervoase este diferit la măsurătorile în vitro faţă de cele „in vivo”. Ea trebuie judecată prin prisma caracteristicii puternic neliniare a interfeţei organism-mediu. vizează îmbunătăţirea performanţelor aparatelor de măsură. în scopul obţinerii unor informaţii asupra mediului înconjurător nu este o idee nouă. De exemplu. prin cercetările efectuate de exemplu. Majoritatea studiilor efectuate asupra utilizării senzorilor biologici în măsurătorile fizice. Din acest motiv se consideră o variantă posibilă de utilizare ca senzor biologic a unui organism întreg. fapt ce determină o reducere a interacţiunilor pe care partea o are în cadrul întregului. celulă. extinderea pe scară largă a acestor senzori este încă limitată. la un preţ de cost scăzut. Tehnologia actuală permite izolarea unor enzime şi implementarea lor în sisteme de măsurare oferind acestora sensibilitate şi selectivitate ridicată. deşi beneficiază de avantajul selectivităţii specifice unui organ specializat. Deşi rezultatele obţinute au depăşit faza de laborator. răspuns la stimul uşor de recunoscut. asigurarea condiţiilor de viaţă pe durata cât mai lungă a porţiunii prelevate.153). se constată. cât şi de dificultăţile pe care aceşti senzori le pun în faţa cercetătorilor privind stabilitatea şi reproductibilitatea semnalelor preluate.în sensul deschiderilor şi intra-deschiderilor pe care o manifestă. Tendinţa de abordare globală a interacţiunilor unui biosenzor cu mediul înconjurător.porţiuni din acesta (ţesut. Aparatura de măsurare Cunoaşterea influenţei aparaturii de măsura asupra senzorului biologic este esenţială în sensul reproductibilităţii măsurătorilor efectuate. motiv pentru care răspunsul obţinut poate fi diferit sau deformat. dar a căpătat o dezvoltare explozivă doar în ultimii ani. majoritatea măsurătorilor implicând aplicarea. 13. Mergând mai spre concret. că membranele biologice (i) prezintă o caracteristică neliniară a curbelor tensiune-curent. Ea a apărut pe la începutul secolului. în sensul creşterii-sensibilităţii şi selectivităţii faţă de mărimile măsurate. Substratul biologic utilizat este de cele mai multe ori o parte specializată dintr-un sistem viu. Caracteristica măsurată scoate în evidenţă două aspecte deosebite: asimetria (valorile curentului în cele două sensuri nu sunt egale pentru o aceeaşi tensiune aplicată). enzimă). ridică o serie de probleme. Preluarea unor semnale electrice de la părţi ale unui organism viu. în vederea reducerii perturbaţiilor în funcţionarea porţiunii prelevate.pe suprafaţa organismului viu a unor electrozi şi conectarea acestora la un sistem electronic de măsurare. când tehnica de calcul şi progresele tehnologice au permis-o. Chiar dacă se asigură toate condiţiile de mai sus partea prelevată nu va beneficia de interacţiunea sa cu întregul sistem. Dacă se ţine seama de necesitatea imobilizării pe durata măsurătorilor a organismului viu. cum ar fi tehnica de prelevare fără traume esenţiale. 291 .problema revenind în a se determina zona sau punctele de măsură şi metodologia de interpretare a rezultatelor în funcţie de tipul şi de natura interacţiunii urmărite a se măsura. permite abordarea mai simplă a metodelor de interpretare. şi deci. de exemplu. tehnica de implementare a electrozilor şi natura materialului din care se execută aceştia. de fizicianul C. atât de considerente de ordin tehnologic. În momentul de faţă numeroase măsurători din domeniul chimiei beneficiază de aceasta categorie de traductoare. . prezenţa unor zone de rezistenţă negativă (fig. Bose.

Imobilizarea este ireversibilă. mai ales la construirea biosenzorilor electrochimici. din circa 2000 de enzime. stabilitatea electrozilor enzimatici 292 . Dacă practic mărimile fizice pot fi măsurate cu succes.Fig.imunosenzori (ca antigeni şi anticorpi). În biofermentoare folosirea biosenzorilor este dificilă din motivul c ă nu pot fi sterilizaţi termic ş i chimic. Pot fi realizate noi industrii de înaltă eficienţă. Stabilitatea enzimei este foarte importantă pentru realizarea măsurătorilor. Î n j u r de 500 sunt oxidoreducătoare. De asemenea sa constatat existenţa pe suprafaţa frunzelor a unor puncte de rezistenţă electrică scăzute. Senzorii enzimatici conţin o enzim ă determinată. În prezent. asemănătoare prin modul de identificare cu punctele de acupunctură. În cazul metodelor fizice imobilizarea este reversibilă. dar pentru aceasta este necesară o reglare sigură a sistemelor folosind modele matematice adecvate şi o informaţie cât mai completă asupra lor. Prin metode chimice se realizează legătura covalentă între e n z i m a şi substrsatul solid.senzori enzimatici. Enzima reacţionează selectiv cu substratul său. De asemenea. 153 Curba caracteristică tensiune – curent Cercetările efectuate asupra utilizării plantelor ca senzori biologici au scos în evidenţă o dinamică a acestor curbe. O primă clasificare a unor biosenzori: . biodetectorii (biosenzorii) trebuie s ă rezolve această problemă. catalizând reacţii c u cedare de electroni.senzori microbieni. în special în sensul variaţiei zonei de rezistenţă negativă. . sunt cunoscute circa 50 de oxidaze. neidentificându-se o lege de amplasare. în schimb parametrii chimici intercelulari sunt mai dificil de măsurat. 13. Poate consta dintr-un biocatalizator imobilizat şi dintr-un aparat fizico-chimic care transformă informaţia chimică într-un semnal electric. Posibilităţi de folosire a biosenzorilor în biotehnologie Procesele biotehnologice sunt folosite tot mai des în practică pentru a obţine produse utile. Spre deosebire de acestea ele sunt grupate în zone pe suprafaţa frunzei. Din aceste motive. nici cu radiaţii şi n i c i printr-un alt procedeu. folosite în tandem cu electrodul Clark pentru măsurători amperometrice de concentraţii pentru diferite substanţe. nu sunt direct folosibili î n aceasta arie tehnologică. numai 30 sunt de interes comercial.5. care este imobilizată după o tehnică convenabilă şi un senzor fizico-chimic corespunzător. măsurându-se astfel concentraţia de substrat. Imobilizarea de enzime şi celule pe purtător s e face cu metode fizice şi chimice.senzori ca organite celulare. Sunt folosite membranele semipermeabile. . Biosenzorul poate fi definit ca dispozitiv (de regulă electronic) ce foloseşte molecule de interes biologic pentru a detecta molecule specifice. .

2 – anod.senzori cu determinarea amperometrică sau potenţiometrică a metaboliţilor (substraturi electroactive). Se determină selectiv o substanţă care apare în reacţia biochimică.biosenzori bazaţi pe metode electrochimice. aceste microorganisme conţin enzime de interes. . Când glucoza ajunge în stratul de mijloc se formează H202.03 µm care blochează enzime ş i coloizi care ar deranja zone de reacţie. proporţional cu viteza de difuzie a glucozei.senzori cu determinarea amperometrică a activităţii respiratorii. Biosenzorii electrochimici au la bază un electrod chimic selectiv. 5 – membrană de policarbonat.biosenzori optici. 4 – membrană cu enzimă imobilizată. 3 – membrană de acetat de celuloză.biosenzori electronici. (HOOC C5H4)FeC5H5. Senzorii microbieni construiţi pe un principiu electrochimic pot fi împărţiţi astfel: . Curenţii de semnal obţinut de la traductor sunt proporţionali cu concentraţia de glucoză din probă.+ 02 + 2H20→4AgCl + 40H(4) β+ D-glucoza + 0 2 glucozooxidaza glucono-&-lactoză +H202 Substrat +enzimă ↔ produs+ enzimă oxidată Enzima oxidată + intermediar ↔ enzime + intermediar oxidat + profoni Reacţia la electrod este : Intermediar oxidat ↔intermediar + electroni Ex.nu este suficientă pentru măsurători de lungă durată. Glucoza difuzează prin membrane (5) cu grosimea de 5 µm şi cu p o r i de 0. 154 . .biosenzori electromagnetici. Inhibitorii din substratul de fermentaţie induc erori mari de măsurare.biosenzori cu procese de combustie. .Schema unui biosenzor electrochimic cu electrod de glucoză 1 – catod. (OH3C5H4)2Fe. de intermediari : (C9H5)2Fe. 293 . H202 difuzează la anod şi acolo are l o c reacţia (1). O clasificare a biosenzorilor după metoda folosită în prelucrarea informaţiei prelevate de aparate fizico-chimice ar putea fi următoarea: . . Dăm ca exemplu electrodul de glucoză (fig. 154). A treia pelicula este o membrană de acetat de celuloză c a r e lasă s ă treacă uşor H202 dar reţine reductori. . Fig. Senzorii microbieni constau din microorganisme imobilizate într-un suport poros. Sistemul de reacţii se poate schematiza astfel: (1) H202→2H+ +O2 + 2ē (2) 2AgCl + 2ē→2Ag + 2Cl(3) 4Ag + 4Cl.

foarte sensibile şi multifuncţionale.1-1 ml). poate fi dat termistorul enzimatic şi microbial (fig. Timpul de răspuns este destul de lung (circa 10 min). lactoză. Ca exemplu. Fig. Când într-o astfel de soluţie se adaugă şi proba (0. S-au construit termistori enzimatici pentru măsurători de concentraţii în cazul acidului ascorbic.Termistor enzimatic 1 – termostat. nefiind supărătoare interferenţele cu alte glucide sau aminoacizi. Biosenzorii cu produs secundar de combustie se bazează pe măsurarea unei substanţe eliberate într-un proces biochimic enzimatic. 294 . Precizia măsurării este bună. Se măsoară consumul de oxigen care este direct legat de concentraţia de glucoză. etanol. Biosenzorii electronici utilizează tehnici de imobilizare enzimatică şi microelectronică şi este o direcţie de perspectivă în ce priveşte crearea unor dispozitive de biosenzori miniaturali. adusă cu o pompă peristaltică cu 0. în tubul de curgere cu enzima imobilizată sau microorganisme are loc reacţia biochimică. timpul de măsurare scăzând la circa 30 s. folosesc un electrod Clark pentru p02 p r i n c a r e se determină amperometric activitatea respiratorie a microorganismului folosit. Tranzistorii cu efect de câmp fac obiectul unor intense activităţi de investigare. Trecând prin schimbătorul de căldură aceasta se încălzeşte până la o temperatură dată.Schema unui electrod de glucoză microbian. glucoză. Se obţine o diferenţă de temperatură t2 – t1 între temperatura iniţială constantă t1 ─ t2. Prin el trece o soluţie tampon. Aceşti tranzistori absorb ioni din soluţie prin învelişul ionoselectiv modificând curentul prin tranzistor. Biosenzorii electromagnetici au o înaltă sensibilitate şi siguranţă analitică. uree. Metoda se foloseşte pentru măsurători continue. Fig. zaharoză.5-4 ml/min. 155 . 4 – tub de curgere. Pentru acest tip de senzori a fost elaborată o metodă în impulsuri. 5 – enzimă imobilizată. glutamat. 3 – termistori. Glucoza şi O2. trigliceride. ca urmare a procesului din tub. spectrometrie de masă cu enzime pentru glucoză. au încă o aplicabilitate redusă (ex. dar din cauza complexităţii. 156 . L-aminoacizi). 3 – membrană calogenică cu bacterie. penicilina. 2 – membrană de teflon. Ca rezultat are loc o cedare de c ă ldură proporţională cu concentraţia de substanţă. Corpul este prezentat de un calorimetru adiabatic în flux. intră în metabolismul bacteriei. Substanţa eliberată este proporţională cu cantitatea de reagent.Biosenzorii microbieni. În figura 155 este prezentată schema unui electrod de glucoză microbian bazat pe determinarea amperometrică a activităţii respiratorii a celulelor imobilizate de Pseudomonas fluorescens. 156). 2 – schimbători de căldură. 1 – electrod de pO2.

pot masura concentraţii foarte mici de substrat organic. Avantajele biosenzorilor electronici sunt că pot fi combinaţi senzori pentru mai mulţi componenţii. independent de. 4 – tranzistor cu efect de câmp. microorganismele au acţiuni selective. În privinţa perspectivelor folosirii biosenzorilor în controlul şi reglarea proceselor de fermentaţie.apar erori din cauza inhibitorilor catalizatorilor. În figura 157 se arată schematic senzorul enzimatic electronic cu structura de tranzitor cu efect de cîmp iar în figura 158 este reprezentată schema pe măsură cu un astfel de senzor. aceticolinei. . 158 . sensibilitate şi selectivitatea. Dezavantajele biosenzorilor pot fi rezumate astfel: .Biosenzorii optici s-au dezvoltat sub forma senzorilor ce au la baz ă reacţii imunitare. sunt uşor de indus. . de a fi legaţi la aparatura de măsură.nu sunt sterilizabili nici termic.Ag Cl (pastă).poartă. Fig. Avantajele se bazează pe: .Senzor electronic cu enzimă cu structură de tranzistor cu efect de câmp Fig. potenţial redox şi glucoză. faptul că încă nu s-a atins sensibilitatea determinarilor radioimunologice.biocatalizatorii sunt greu de pregătit. 295 . Spectroscopia convenţională nu este aplicabilă în acest caz. . 157 .există problemele de preţ privind aparatura. C02. Se foloseşte semnalul optic ce apare în timpul reacţiei antigen─ anticorp. O2.cea mai mare problema este cea legată de sterilizare. Pot fi folosiţi la reglarea proceselor de fermentaţie. Senzorii de acest tip au aplicaţii în medicină. Cu enzimă imibilizată pe stratul izolator de pe poarta tranzistorului cu efect de cîmp s-a realizat un biosenzor pentru măsurarea ureii. aparatura nu este foarte complicată. până în 1975 au apărut 120 de patente de biosenzori (50% electrochimici). au dimensiuni mici şi uşurinţa.enzimele imobilizate. . semnalul de ieşire este electric. precum şi dependenţa curentului prin sursă în funcţie de pH. 1 – apă cu temperatura constantă. Probleme importante pune structura capacitivă: membrana izolator . glucozei etc.după datele fvrnizate de literatura de specialitate aceşti senzori se folosesc mai cu seama în laborator.au stabilitate scăzută (mai cu seamă pentru cei enzimatici). 2 – probă. 5 – înregistrator. . nu au implicaţii asupra purit ăţ ii optice a probei măsurate. Se combină cu măsurătorile de pH. . nici chimic. Vor fi realizaţi în număr mare în viitor.Schema de măsură cu senzorul electronic de măsură şi dependenţa curentului de pH-ul soluţiei. bună sensibilitate. 3 – electrodul Ag .

I. 16.. CHIRICUŢĂ. Bucureşti. Ed. 29 – 31 Mai 2008 Lucrări ştiinţifice.Esential Histology and Citology. CRISTEA TINA OANA. CRISTEA T... Iaşi. New York. Biotehnologii moderne.V.M. Tg Mures.N. 2001 – Clonarea animalelor şi consecinţele clonării.Capsicum anuum L. 2007 .anulXLVIII vol. Bucureşti... p.U..A. 2008 .V..forma alba. Heidelberg. 1987 – Metode in vitro la plantele de cultură. 2003 . 20. seria V. 5. diversitate. Anul L. 1988 . 1454 – 7376.Biologie moléculaire de la cellule. CAJAL N. CORMARK H. Indrumator de Lucrari Practice si demonstratii. D. BENGA G. ED. Medicală."Biologia celulară şi moleculară". 201-206. Bacau. Seria Horticultură. Tehnica Chisinau. PRISECARU MARIA. ed. GHICA M. 7. Universitatea de Ştiinţe Agronomice şi Medicină Veterinară. Ed. Iaşi.. Ed.. 1989 – Molecular biology of the cell. 1454 – 7376. BARABAS N.Ş. MARIA PRISECARU.Studies concerning the utilisation of “in vitro” micropropagation in the conservation process of some valuable genotypes of pepper .Lucr. Române. I (50) Seria Horticultură. p. 1985 .Iasi.S. 1981 – Biologia şi patologia imunităţii. 439-444.. 12. Tehnică.Variatia randamentului de micropropagare “in vitro”determinate de influenta genotipului la varza alba pentru capatana-Brassica oleracea L.. BOGDAN C. U. 1985 . Dacia. 1999. Medicală.S. 1984 – Cancerologie generală. armonie″. Cluj-Napoca.M. 2004 . BUCUR GH. Flammarion Médecine-Sciences. ANTOHI S. Lucrări ştiinţifice UŞAMV Bucureşti. ANDREICUT S.. Bucureşti. 150 p. Ştiinţifică şi Pedagogică. Lucrări ştiinţifice. Acad. 2008 Cytogenetic Effects Induced by „In Vitro” Cultivation of Shoot Tips at Capsicum Anuum L..I. 15. CACHIŢĂ-COSMA D.. 407 – 413. Ed.Ion Ionescu de la Brad.S. Ed. Emil Borcea. BECUS. SILVICA AMBĂRUŞ. Ceres. 296 . ATANASIU L. 4. Litografia IMF..S. BERCEANU ST. M.S. and col.M... Bucureşti. 19. COTRUTZ C.O.Manual de Lucrari Practice de Biologie Celulara. 9. stiinta.. Ştiinţifică şi Enciclopedică. 1990 – Utilizarea fotosintezei ca sursă alternativă de energie. Bucureşti. Ed. FALTICEANU MARCELA.. 17. Ed. 1990 – Tratat de virusologie medicală. 21. D. 2005. MARIA PRISECARU.Elemente de geriatrie practică..N. vol. 18.A. ALBERTS B. CRISTEA TINA OANA. Bucureşti. Vol. U..St.Biologie Celulara.. 1987 – Boli dermatovenerice. I.N. 1994 . Ed. and col... BEHNKE H. Ed. ISSN 1222-5312.Effect of „in vitro” plant growth regulators over the meristematic and mitotic activity at different genotypes of CAPSICUM ANUUM L. Junimea. 13. 10. . 6.. Facultatea de Horticultură Iaşi. Editura “Ion Ionescu de la Brad ”.BIBLIOGRAFIE 1..Ş. 2. GAVRILĂ L. 1999 .. PĂUNESCU E. 1993 – Progress in botany.S. 14. Philadelphia. Simpozionul ştiinţific international ″Horticultura. Ed... Iaşi.A. vol. AMBARUŞ SILVICA. 1983 – Progrese în genetica moleculară.N. Springer-Verlang.V. ALBERTS B. 50-55. MARCELA FALTICEANU. Medicală. HOPKIN K. p. p.M. SILVICA AMBĂRUŞ. MARIA PRISECARU.Histologie vegetala. 1454-7376. CÎRLAN V.seria Horticultura. I. Ed.. LI. General Publishing Inc. (48).191-196. I. Paris. Editura “Ion Ionescu de la Brad”. 8.. PRISECARU M. CRISTEA TINA OANA. Bucureşti. BRAY D. Bucureşti. 11. 3. Ed..

II. 44. Studii şi Cercet. 1... Bucureşti. Bucureşti. M. 2005 ..seria Biologie animală.. Bucureşti. 35. diferenţierii. Craiova. Ed. 38. M. şi Enciclop. Paris. PAIS V. LODISH H.. PRISECARU. Bucureşti. Cerma.... 2002 . Did. îmbătrânirii. II. 1972 – Biologie cellulaire. Ed. MAILLET M. DABALĂ I. GAVRILĂ L. Dacia. MIXICH F.. 4ed. 1982 – Informaţia biologică. 1984 – Concepţia biostructurală şi teoriile moleculare ale materiei vii. M. Ed.. DĂNĂILĂ L. Ed. Paris.. Sc.. ONICESCU DOINA. 34... MACOVSCHI E. Bucureşti. Junimea. DIMOFTACHE C.Molecular Cell Biology. Iaşi.Biologie Moleculaire et medicine.. I. POPESCU L. Did.. VOICU. CRUCE M. Paris.. BENGA G. Ed.. 24. DICULESCU I. 2002 . 1992 – Intermolecular interactions. BERK A. DARNELL J. Ed.. POPESCU L. 1999 . pag. 48. 40. KARP G. Timisoara.. 1983 . DUMITRU I. Observations on the embryonic development of Triturus/Lissotriton vulgaris L. New York.Biologie cellulaire. R. 1990 – Molecular cell biology. şi Ped. şi Enciclop. ZIPURSKY S... 1981 . GHEORGHE BENGA."Biologie celulară".Books...Am. 2005 . 49. HAENEY M. ISRAIL A. 31.. VIKI ALLAN. IOSOB. 2002 . Bucureşti.. 41. KAPLAN J. NEACŞU C. KREIS T. 2005 – Biotehnologiile azi. 887-888.. Freeman & Co. and col.. De Boeck Université. 257. W.. ISBN: 978-973-1902-09-8. 599-603. 37. Butterworths Update Publications.. 43."Biologie celulară". MATSUDAIRA P.. BALTIMORE D... GENEVES L. Bucureşti. 30. 27. şi Ped. 1991 – Trends in Cell Biology... Medicală. Ştiinţifică şi Enciclopedică... partea a III-a Biofizică celulară. JERMAN SONIA. DICULESCU I. KLEMPERER W.Biologie moléculaire de la cellule. 32. 2008 . 2004 . PETRESCU NICUŢĂ D. Ed. Ed. FRASINEL N. 29.Introducere în Biologie Celularã şi Molecularã. De Boeck Université..F. M. Ştiinţifică şi Enciclopedică.. Bucureşti. Mirton. 1994 – Bazele celulare ale creşterii.. Ed.. Med.... degenerescenţei şi morţii celulare.Biologie: cellulaire & moléculaire. Bucureşti.56 – 67. Flammarion.Principii fundamentale de biologie moleculara. Science. Univ. 2008. 45. Ştiinţ. Ed. 359. vol.. IONESCU-VARO M. DIMITRIU G. 25. Aius Craiova. Ed. Did. 1989 – Citogenetică moleculară şi evoluţionistă. Ed. Medicalã Universitarã. 1981 – Descifrând tainele eredităţii.. CRISTEA TINA OANA. BENGA GH. ARDELEAN A. Cluj-Napoca. Paris. VERDES D. ONICESCU D.. H. 2000 . 33. p. 1988 – Ateroscleroza cerebrală din sistemul carotidian... 1987 – Histologie medicală. 1992 – Cell-cycle checkpoints and feedback controls. MURRAY A: W. 1985 – Introduction to Clinical Imunology. 15. Ed. 50. C.Biologie Celulara si Moleculara. 26. 47. New York. Ed. GAVRILĂ L. 36. Humanitas."Biologie moleculară . Ed. GHIORGHIŢĂ G. Bucureşti. Bacău. London &. AGRIPINA LUNGEANU. DELIU C. ROGOZ I. 1990 . 15-19. 1980 – Biochimie.. Vicovia. în: Curs de Biologie celulară. A.prezent şi perspective" Ed.Utilizarea biotehnologiilor vegetale în ameliorarea plantelor. 297 . Ed.. 1994 . Paris. 1993 – Biofizică medicală. Dunod. Şt. DARNELL J. Bucureşti. Masson.. 23. GHERMAN I. LODISH H. Şt. Universitatea Ecologică. DUDAN R.22.Biologie Celulara si Moleculara. 51. 42.. 28. şi Ped. 93. 39. Nature. Cluj-Napoca... 46. tome I.

CRISTEA O. Editura Tehnica Bucuresti. DICKINSON A. 56. Ed.de Bio.Cerc. 57.1454.. Paris.. 1993 – Biotehnologii şi dezvoltare.. E.de St...si Cerc.A XIV-a Ses.Iasi. Ed. Române. M. PRISECARU M. 1992 – Acizii nucleici.A.-Obtaining the haploid plants to Lycopersicn esculentum L. De Horticultura Iasi...Seria Biol.. Bucureşti.Veget. 66.CRISTEA O.. Bucureşti.U.Vet.) obtinut prin culturile embrionilor imaturi “in vitro”.S. BARAN T. Cambridge. G.2002.Cell Biology. 1980 – Genetica şi eredopatologie. p..MIHU G.Corson..195-197. 1987.St. POLLARD Th. Citologie. 2008 .MIHU G.Vol.169-178.Oradea..Organogeneza indirecta la sfecla de zahar (Beta vulgaris L.Soc.S. Acad. 59. 2002 .anuala.23-27. MIHU G. 1991 – Genetica. 63. 1994 . PRISECARU M. E. 76.. POPESCU-VIFOR S.CRISTEA O. şi Enciclop. 1991 – Biomembrane şi patologie.Bul. Ed. PRISECARU M. Paris..Sudii si Cercet... 2005... şi Ped.T.Oradea. EARNSHAW W. Bucureşti.Bucuresti.2000. RĂDUCANU DUMITRA. BRĂNIŞTEANU D.St.p.I. 68. 1975 – Science.T. Elsevier SAS.2.1996.anuala. . PRISECARU M.. şi col. PĂIŞ V.through “in vitro” androgenesis and gynogenesis.Agron. Romfel.”Simpozionul aniversar “50 de ani de la infiintarea Fac... vol. PRISECARU M..-Studies concerning the behaviour of some tomato (Lycopersicon esculentum Mill. „Alma Mater”.S. p. Medicală. St.. Ed. Şt.81-84. REPANOVICI R.. 53. RUSU V. MIHU G. 69.. CRISTEA O.Electronic Light Microscopy.p.p..10. Ed. 64. Bucureşti.GHIORGHITA G.52.CRISTEA O...Cel. Elsevier SAS.222.CRISTEA O..V. Bucureşti.15-18.2001. Timisoara.. seria V.. I.)genotypes to “in vitro”anther and ovule culture.Bacau. PRUCE M.Univ. 1994.-Studiu comparative privind iducerea plantelor haploide la Brassica oleracea L. POLLARD T.Soc. PRISECARU MARIA. anul XLIV. REPANOVICI R. VOICU ROXANA.Cito-histo-embriologie vegetala.Biologie cellulaire.vol IV. D. Ed.by the pollination of the embryo sac with irradiated pollen.GHICA M. 60. 79-89.."Biologie şi patologie celulară şi moleculară". A XIV a Ses. Bacau.2000. PRISECARU M. Ed.).T.Univ.M. 225 p. Ed..Journal of General Virology.vol. ISB 70. 58. 54.Studii si Cer.. Lucrari St.Ecotoxicologie – Curs universitar.Cel. PRISECARU FLORIAN..T. 75. PRISECARU MARIA. PRISECARU M. GHIORGHITA G.1995.de Biol.si Med.p.Nat..St.. 74..Tipografia Univ.p. Bucureşti. RAICU P.1996...D. 1982 – Tehnologia ADN recombinant (Inginerie genetică).Iasi.Genetics and evolutions.-The preservation of some valuable genotypes of Brassica –white cabbage-by “in vitro” microclonation.V. 2004 . POPA L. Did. Ed. 65. PALADE G.utilizand culturile de antere si ovare “in vitro”. 298 .-The stimulation of the gynogenetic development to Bete vulgaris L. 55.223. GHIORGHITA G. p.Nat.2001. Tehnică. NICUTA D.N. 347. 1995 .68-74 61.19-23. 68. 67. p. Bucureşti..de Biol... Bacău.GHIORGHITA G. 2001. Citologie Clinica. 72. PRISECARU M. Did. RAICA MARIUS. 192p. Bacau.-Studiul histologic in calusul de grau (Triticum aestivun L.GHIORGHITA G. 62. 189.Biol. SASSON A... Biol. 2002 – Haploidia experimentala in contextul biotehnologiilor moderne.. SLAYTER E.Bul. 71. PRISECARU M.-Influenta tipului de explant asupra capacitatiide regenerare din embrioni somatici la Triticum aestivum L. Horticultura. 73.T. UK.XIV. POPA L.-Production of haploid plants by in vitro anther and ovule culture of Brassica.. Şi Ped.... 1992 .. PRISECARU MARIA.Biol.

1987 – The cell membrane: esential element in the chemistry of life.. 80."Biologia moleculară a celulei".P. Ed. TOLEDANO A. 2004 . Flammarion Médecine-Sciences. Paris. VOICULEŢ N... 1999 . LOPEZ g.. Merck. 1997 ..1. PUIU L.77.. Oxford. UK. Current topics in Science an medicine vol.. READ A. HUNT T. 2ed.Biologie moléculaire de la cellule: livre d'exercices. Bucureşti. WILSON J. 79. STRACHAN T. MARIA. 78. BIOS Scientific Publishers Ltd.Human Molecular Genetics. All. 299 .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful