MARIA PRISECARU

TINA OANA CRISTEA

ROXANA VOICU

BIOLOGIE CELULAR I MOLECULAR

Curs universitar

Editura ALMA MATER Bacu 2011

Refereni tiinifici: Prof.univ.dr. BARABA NECULAI Prof.univ.dr. BATTES KLAUS WERNER

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei PRISECARU, MARIA Biologie celular i molecular / Prisecaru Maria, Cristea Oana Tina, Voicu Roxana. Bacu : Alma Mater, 2011 Bibliogr. ISBN 978-606-527-116-6 I. Cristea, Oana Tina II. Voicu, Roxana Elena 576.3 577.2

Tipar executat la:

UNIVERSITATEA VASILE ALECSANDRI DIN BACU Calea Mreti, Nr. 157, 600115 Tel. ++40-234-542411, tel./ fax ++40-234-516345 e-mai: www.ub.ro; stiinte@ub.ro

ISBN 978-606-527-116-6

Prezenta lucrare se adreseaz n primul rnd studenilor i cercetrilor din diferite domenii ale tiinelor biologice, oferind cunotinele de baz n domeniul biologiei celulare i moleculare, fcndu-se ns frecvente referiri la cele mai recente descoperiri i interpretri, cunoscut fiind faptul c Biologia este o tiin dinamic, care se bazeaz n principal pe teorii susinute de rezultate experimentale obinute din cercetare i experimentare.

CUPRINS

Introducere 1. Consideraii generale privind domeniul de studiu al biologiei celulare i moleculare 1.1. Definiie i caracteristici 1.2. Scurt istoric 1.3. Contribuii romneti n studiul celulei 1.4. Principalele teorii care au condus la modul actual de gndire despre natura materiei vii 1.4.1. Teoria celular 1.4.2. Teoria cromozomial a ereditii 1.4.3. Teoria molecular a materiei vii 1.4.4. Teoria biostructural a materiei vii 1.4.5. Teoria evoluionist, originea vieii i a omului 2. Membranele celulare 2.1. Definiia i clasificarea membranelor celulare 2.2. Organizarea membranelor celulare 2.2.1. Caracterizarea componentelor lipidice ale membranelor celulare 2.2.2. Componenta proteic a membranelor celulare 2.2.3. Mobilitatea lipidelor i proteinelor de membran 2.2.4. Componenta glucidic membranar 2.2.5. Glicocalixul. 2.2.6. Apa. 2.2.7. Asimetria distribuiei componentelor membranare 2.3. Mecanismele de transport prin membranele celulare 2.3.1. Procesul calitativ al traversrii membranelor 2.3.2. Transportul ionilor i moleculelor mici prin membranele celulare 2.3.2.1. Transportul pasiv 2.3.2.2. Transportul activ 2.3.3. Transportul macromoleculelor i particulelor prin membrana plasmatic 2.4. Receptorii din membran 2.4.1. Tipuri de receptori 2.4.2. Modaliti de comunicare intercelular. 2.4.2.1. Comunicarea intercelular la distan 2.4.2.2. Contactul intracelular direct 2.4.3. Receptorii celulelor nervoase. 2.4.4. Receptorii care controleaz permeabilitatea ionic 2.4.5. Cuplajul celular metabolic i electric 2.5. Schimburile energetice n celula vie 2.5.1. Noiuni generale de termodinamic 2.5.2. Transformri de energie n celula vie (energetica celular) 2.5.2.1. Molecula ATP i proprietile sale 2.5.2.2. Ali compui fosforilai 2.6. Membrane care cupleaz energie

11 12 13 14 15 17 17 18 22 22 24 26 26 27 28 30 30 31 31 32 32 33 33 34 34 36 41 44 45 46 46 46 46 48 50 51 51 53 54 56 56

2.6.1. Cloroplastele 2.6.1.1. Procesul general al fotosintezei 2.6.1.2. Reaciile de lumin 2.6.1.3. Reaciile de ntuneric 2.6.2. Mitocondriile 2.6.2.1. Degradarea glucozei de ctre mitocondrii 2.6.2.2. Ciclul glioxalatului 2.6.2.3. oxidarea acizilor grai 2.6.2.4. Sistemul transportor de electroni (lanul respirator) 2.6.2.5. Fosforilarea oxidativ 2.6.2.6. Fermentaiile 2.6.3. Comparaie ntre fotosintez i respiraie 3. Adeziunea celular. Jonciunile celulare i matricea extracelular 3.1. Molecule implicate n aderarea celul-celul 3.1.1. Selectinele 3.2.2. Domenii imunoglobulinice 3.2.3. Caderinele 3.2. Jonciunea celular 3.2.1. Jonciunile de ocluzie 3.2.2. Jonciunile de ancorare 3.2.2.1. Jonciunile de adeziune intercelular 3.2.2.2. Jonciunile de adeziune celul-matrice extracelular 3.2.2.3. Desmozomii 3.2.2.4. Hemidesmozomii 3.2.3. Jonciunile de comunicare 3.2.3.1. Structura jonciunilor de comunicare 3.2.3.2. Reglarea permeabilitii jonciunilor de comunicare 3.2.4. Jonciunile sinaptice 3.3. Matricea extracelular 3.3.1. Componentele matricei extracelulare 3.3.1.1. Glicozaminoglicanii 3.3.1.2. Proteoglicanii 3.3.1.3. Colagenul 3.3.1.4. Elastina 3.3.1.5. Fibronectinele 3.3.2. Lamina bazal 3.3.2.1. Structura laminei bazale 3.3.2.2. Funciile lamnei bazale 4. Citoscheletul 4.1. Microtubulii 4.1.1. Microtubulii semnificaia biologic 4.1.2. Structura microtubulilor 4.1.3. Polaritatea i dinamica microtubulilor. 4.1.4. Bazele diversitii structurilor microtubulilor 4.1.5. Centrii organizatorici ai microtubulilor 4.1.5.1. Centriolii i corpusculii bazali 4.1.5.2. Ultrastructura centriolilor i a corpusculilor bazali. 4.1.5.3. Replicarea centriolilor i a corpusculilor bazali. 4.1.6. Micrile cililor i flagelilor 4.1.6.1. Structura cililor i a flagelilor 4.1.6.2. Mecanismul molecular al micri cililor i flagelilor. 4.1.7. Implicarea microtubulilor n diviziunea celular

56 57 59 63 67 67 70 70 71 72 73 73 75 75 75 76 76 76 77 78 78 79 79 80 80 81 81 82 82 83 83 84 86 88 89 91 91 92 93 93 93 94 95 96 96 97 97 98 99 100 101 101

4.1.7.1. Formarea fusului de diviziune 4.1.7.2. Deplasarea cromozomilor spre regiune ecuatorial a celulei i alinierea lor n placa metafazic 4.1.7.3. Translocarea cromozomilor anafazici. 4.1.8. Transportul intracelular mediat de microtubuli. 4.2. Microfilamentele 4.2.1. Microfilamentele de actin 4.2.2.Miozina 4.2.3. Rolul actinei i miozinei n contracia muscular 4.2.4. Actina i miozina n celule nemusculare 4.2.4.1.Microvilii 4.2.4.2. Rolul actinei i miozinei n citokineza 4.2.4.3. Micarea ameboidala. 4.2.4.4. Fibrele de stress 4.3. Filamente intermediare 4.3.1. Proteine ce alctuiesc filamentele intermediare 4.3.2. Tipuri de filamente intermediare i semnificatia lor funcional 4.4. Reeaua microtrabecular 4.5. Proteinele asociate citoscheletului 5. Organizarea nucleului i expresia activitii genelor 5.1. Morfologia i structura nucleului 5.1.1. nveliul nuclear 5.1.2. Matricea nucleului 5.1.3. Proteinele contractile nucleare 5.1.4. Cromatina 5.1.5. Organizarea molecular a fibrelor de cromatina. Nucleozomii 5.2. Replicarea ADN la eucariote 5.2.1. Complexul de enzime polimerazice implicate n replicare 5.2.2. Iniierea replicrii 5.2.3. Primarea replicrii 5.2.4. Alungirea lanului de ADN nou - sintetizat i terminarea replicrii 5.2.5. Corectarea erorilor de replicare 5.2.6. Unitile de replicare 5.3. Transcripia ADN sau sinteza ARN 5.3.1. Mecanismul general 5.3.2. Elemente implicate n transcripie 5.3.3. Aparatul enzimatic de transcripie 5.3.4. Factorii de transcripie 5.3.5. Elemente de control n expresia genetic 5.4. Mecanismul transcripiei 5.5. ARN splicing 5.6. Asigurarea necesarului de ARNm 6. Transportul intracelular 6.1. Sistemul vacuolar intracitoplasmatic 6.2. Rolul citomembranelor granulare n sinteza proteic 6.3. Biosinteza proteinelor sau translaia ARNm 6.3.1. Decodificarea informaiilor genetice 6.3.2. Iniierea catenei polipeptidice 6.3.3. Alungirea sau elongarea catenei polipeptidice 6.3.4. Terminarea sintezei catenei polipeptidice 6.3.5. Particularitile decodificrii la procariote i eurocariote 6.4. Mecanismul compartimentrii celulare a proteinelor nou-sintetizate

101 103 103 104 105 106 107 108 108 109 110 111 112 112 112 114 114 114 115 115 116 118 119 119 121 123 125 126 127 127 128 129 130 130 131 132 133 133 134 136 137 138 138 139 139 140 143 146 146 149 149

6.5. Corelaia particularitilor structurale i funcionale ale reticulului 151 endoplasmatic neted cu heterogenitatea funcional a celulelor 6.6. Segregarea i concentrarea proteinelor 153 6.7. Sinteza i secreia polizaharidelor 154 6.8. Lizozomii 155 6.8.1. Funciile lizozomilor 155 6.9. Peroxizomii 158 6.10. Proteinele chaperone 158 7. Reproducerea celular 161 7.1. Ciclul celular 161 7.1.1. Ciclul celular la plante 161 7.1.2. Ciclul celular la animale 161 7.1.3. Ciclinelor i protein - kinazele dependente de cicline 164 7.1.3.1. Protein - kinazele dependente de cicline (cdk) 165 7.1.3.2. Ciclinele 165 7.1.4. Interaciunea cicline- proteina Rb - mecanism de reglare pozitiv a 168 ciclului celular 7.1.5. Reglarea ciclului celular prin mecanisme feed-back 168 7.1.6. Ali factori responsabili de controlul proliferrii celulare n 170 organismele pluricelulare 7.1.7. Ciclul cromozomial i creterea celular 170 7.1.8. Implicarea factorilor de cretere n reglarea diviziunii celulare 171 7.1.8.1. Competiia celulelor pentru factorii de cretere 173 7.1.9. Influena adeziunii celulare asupra proliferrii 173 7.2. Diviziunea celular 175 7.2.1. Mitoza (diviziunea mitotic) 175 7.2.2. Meioza (diviziunea meiotic) 181 8. Apoptoza 187 8.1. Mecanismele de producere a apoptozei 187 8.2. Necroza. 188 8.3. Frecvena procesului de apoptoz 188 8.4. Gene implicate n procesul apoptotic 189 8.4.1. Gene letale 189 8.4.2. Genele supravieuirii (gene antiapoptotice) 189 8.5. Rolul apoptozei n embriogenez i dezvoltare 190 8.6. Aspecte de reglare a apoptozei 190 8.6.1. Factori implicai n reglarea apoptozei 190 8.7. Apoptoz mbtrnire senescen 192 8.8. Apoptoza i starea de boal. 193 9. Procesul de mbatrnire-senescena 195 9.1. Gene implicate n controlul senescenei 195 9.2. Principalele mecanisme (ipotetice) implicate n senescen 196 10. Rspunsul imunitar 201 10.1. Noiuni generale despre imunitate i sistem imunitar 201 10.2. Organizarea sistemului imunitar 202 10.3. Molecule cu rol esenial n cadrul sistemului imunitar 203 10.3.1. Antigenii 203 10.3.2. Anticorpii. 204 10.3.3. Celule T 205 10.3.4. Antigeni de histocompatibilitate 205 10.3.5. Citokinele 205 10.4. Relaii de cooperare ntre componentele sistemului imun 210

10.5. Baza umoral a rspunsului imun 10.5.1. Prezentarea antigenilor 10.5.2. Producerea de anticorpi 10.6. Rspunsul imunitar mediat de celule 10.7. Interaciuni celulare n rspunsul imun 10.7.1. Unele mecanisme de aprare imun n infeciile bacteriene 10.7.1.1. Mijloace de aprare imun mediate umoral 10.7.1.2. Mijloace de aprare imun mediat celular 10.8. Reglarea imunologic 10.8.1. Reglarea normal. 10.8.2. Reglarea alterat 10.9. Intensificarea rspunsului imun 10.9.1. Sistemul complement 10.9.2. Alte categorii celulare implicate n imunitate 10.10. Finalitatea rspunsurilor imune 10.10.1. Funcia direct a anticorpilor 10.10.2. Funcia indirect a anticorpilor 10.10.3. Uciderea celulelor int 10.10.4. Procesul inflamator 10.10.5. Controlul prin reacie invers 10.11. Genetica sistemului imunitar 10.11.1. Imunodeficiena dobandit 10.11.2. Grupele sanguine 10.12. Interaciunea ntre peptidele sistemului imun i peptidele sistemului nervos i endocrin 10.13. Relaiile virusuri-celule gazd. Relaiile virusuri-membrane celulare 10.13.1. Receptorii virali 10.13.2. Penetrarea virusului n celul 10.13.3. Tipuri de efect citopatic 10.13.4. Leziuni cromozomale determinate de virusuri 10.13.5. Natura i funcia unor structuri virus-like: prionii 10.14. Relaiile bacterii-celulele gazdei 11. Biotehnologia 11.1. Ingineria genetic 11.1.1. Tipuri de transfer de gene 11.1.2. Terapie cu gene int (Gene Targeting) 11.1.3. Aplicarea metodelor de biotehnologie n agricultur n vederea obinerii de organisme transgenice 11.1.4. Ingineria genetic utilizat n prepararea de noi conservani alimentari 11.1.5. Ingineria genetic i rezolvarea unor probleme de ecologie 11.2. Alte aspecte ale biotehnologiei moderne i perspectivele secolului XXI 12. Metode i tehnici moderne molecular - biologice i aplicaiile lor 12.1. Recombinarea ADN - ului 12.1.1. Principiul recombinrii 12.1.2. Procese artificiale de recombinare ADN (Genetic Engineering) 12.1.3. Elemente de lucru utilizate n tehnologia ADN recombinat 12.1.3.1. Enzimele de restricie 12.1.3.2. ADN-ligazele (polinucleoid-ligazele) 12.1.3.3. Vectorii 12.2. Hibridarea 12.2.1. Principiu 12.2.2. Denaturarea

213 214 214 215 216 218 218 218 219 219 219 219 220 220 221 221 221 222 222 222 222 223 224 225 227 227 228 229 229 230 233 235 235 235 238 241 245 245 245 252 252 252 253 254 254 255 256 266 266 266

12.2.3. Renaturarea (annealing/reannealing) 12.2.4. Factorul stringent 12.2.5. Tipuri de hibridri 12.2.6. Hibridizare in situ 12.2.7. Importana reaciei de hibridare pentru medicin i biologie 12.3. Sonde genetice 12.4. Clonarea ADN ului 12. 5. Reacia de polimerizare n lan (PCR) 12. 6. Secvenierea ADN- ului 12.7. Fingerprinting genomic (amprente de ADN) 13. Biosenzorii 13.1. Biosenzorii sisteme de coantificare a informaiilor viului 13.2. Impactul informaional al biosenzorilor 13.3. Metodologia de cercetare a proprietilor senzorilor biologici 13.4. Aparatura de msurare 13.5. Posibiliti de folosire a biosenzorilor n biotehnologie Bibliografia

267 267 267 272 273 274 279 282 285 286 288 288 289 290 291 292 296

INTRODUCERE

Informaia a fost ntotdeauna preioas n orice domeniu de activitate, ea devenind cu att mai necesar n domeniul tiinelor biologice, astzi cnd trim o adevrat explozie a cunotinelor tiinifice cunoscut unei revoluii tiinifice. Biologia celular a evoluat n ultimii zece ani datorit progreselor realizate n cercetri de biochimie, genetic i biologie molecular, care au folosit metode i tehnici diferite, pentru investigarea unui substrat comun,celula. Tehnicile avansate de microscopie electonic, folosirea culturilor celulare, realizarea anticorpilor monoclinali, tehnologia ADNului recombinat, manipularea genetic, sunt numai cateva din aceste tehnici care i-au dovedit puterea analitic i au permis unificarea experimentului biologic, a substratului molecular i a terminologiei n biologia celular. Viaa se manifest numai n cadrul organizrii celulare a materiei vii, astfel c biologia celular, care studiaz fenomenele vieii la acest nivel de organizare, este o tiin fundamental. n acelai timp, face parte dintre tiinele nerestrictive deoarece nici un fenomen biologic nu poate fi studiat separat, fr a se lua n consideraie complexitatea lui, interaciunile cu alte structuri precum i diversitatea sistemelor de ordin superior, cu proprietile lor emergente. Cercetrile de biologie celular i molecular au acumulat deja un bagaj de date care au permis progrese uriae n medicin, tiinele ecologice, agricultur, industrie alimentar, lsnd s se ntrevad pentru viitor noi perspective fascinante de cercetare n diferite alte ramuri. Progresele ultrarapide ale biologiei celulare i moleculare au dus la dezvoltarea biotehnologiei moderne care se anun a devenii marea for industrial a secolului al XXI-lea i n care se pune sperana c va reui s rezolve problemele cele mai spinoase ale societii omeneti (alimentaia, starea de sntate, sursele de energie, poluarea ) la nivelul Terrei. La ora actual, cercetrile de biologie molecular se afl n faza clasificrii mecanismelor care stau la baza formrii i asamblrii structurilor din organismele vii, atenia fiind concentrat asupra momentului cnd se produce tranziia informaiei de la nivelul molecular ctre nivelul diferitelor sisteme i structuri intermediare ale acestor organisme; este vorba de o etap de analiz a funciilor celulare la nivel molecular (de ex. procesul respiraiei celulare, al producerii de substane energetice celulare, al transportului intracelular la nivelul organitelor, al proceselor de rennoire celular, al fenomenelor de adaptabilitate). n contextul revoluiei tiinelor biologice pe care o trim astzi, se impune tot mai mult o reconsiderare a concepiei i comportrii cercettorului tiinific n raport cu poziia omului n ciclul evolutiv al naturii. Dup cum arat Lederberg (de dou ori laureat al premiului Nobel pentru descoperiri fundamentale n domeniul geneticii bacteriene), greeala cea mai mare a oamenilor este aceea de a se supraestima i de a se considera exceptai de la legile generale ale evoluiei, cnd de fapt ei nu reprezint dect un element n circuitul evolutiv al vieii n natur. Tocmai din cauza acestei mari erori comise de oameni, cuceririle tiinei i civilizaiei umane s-au ntors de foarte multe ori, pn astzi, mpotriva omului, periclitnd viaa pe Terra. ntr-adevr, istoria societii omeneti a demonstrat deja c impactul noilor tehnologii i cel al dezvoltrii tiinelor n general nu a fost totdeauna benefic pentru rzboaiele atomice i bacteriologice, accidentele de laborator soldate cu moartea experimentatorilor, microorganisme scpate de sub control etc. Alte consecine nefaste ale tehnologiilor moderne asupra ecosistemelor n general i strii de sntate a oamenilor n particular sunt: creterea radioactivitii mediului nconjurtor (n urma accidentelor de la termocentralele nucleare), ngustarea stratului de ozon atmosferic 11

(prin folosirea n exces a freonilor), care a favorizat creterea cantitilor de radiaii ultraviolete n atmosfera terestr i implicit a frecvenei cancerelor (de piele, ochi, pulmon), creterea riscului de rspndire ultrarapid a unor boli infecioase (holera, meningita meningococic, difteria) prin creterea aglomeraiei n centrele urbane i prin deplasrile rapide i masive de populaie datorit mijloacelor ultrarapide de transport. De asemenea, defriarea unor zone de pe glob (pduri tropicale) n scopul crerii de mari aezri umane i centre industriale a determinat, pe lng dezechilibrele grave (prin scderea spaiului verde), expunerea concomitent a populaiei la noi ageni patogeni; au aprut astfel i sau rspndit pe glob: virusul febrei galbene, virusul imunodeficienei umane (HIV transmis la om foarte probabil de la primatele junglei africane), virusul Ebola (agentul febrei hemoragice), adus pentru ntia oar din Africa n Europa (la Marburg n 1967). Omul de tiin trebuie s in cont de faptul c, n natur, diversitatea foarte mare de specii este tributar n mare msur condiiilor de mediu extern; modificri majore ale acestor condiii de mediu pot declana poteniale nebnuite ale ecosistemelor cu influene posibil nocive, neintuite nc astzi, asupra echilibrului vieii pe Terra. Contient de toate aceste posibiliti,un adevrat om de tiin, trebuie s militeze ca n viitor cuceririle tiinifice s fie folosite cu mai mult discernmnt, doar n slujba binelui, pentru un grad tot mai nalt de civilizaie n societatea uman.

12

Capitolul 1 CONSIDERAII GENERALE PRIVIND DOMENIUL DE STUDIU AL BIOLOGIEI CELULARE I MOLECULARE

1.1. Definiie i caracteristici

BIOLOGIA CELULAR este o ramur a tiinelor biologice care studiaz structurile funcionale i fenomenele biologice generale comune tuturor celulelor. Se mai poate spune c biologia celular are ca obiect studiul legilor generale de desfurare a proceselor vitale la nivelul de organizare celular. Celula poate fi definit i ca unitate elementar a lumii vii, cu o ordine intern complex, ce-i confer capacitatea de cretere, dezvoltare i reproducere, precum i cu organizare dinamic, aflat n relaii de echilibru cu mediul nconjurtor (Diculescu i colab., 1983). n ierarhia nivelurilor de organizare a materiei vii, celula este considerat primul sistem biologic, deoarece nivelurile inferioare (atomi, molecule etc) nu sunt considerate vii. Orice manifestare vital are loc pe fundamentul organizrii celulare. Viaa ncepe de la celul. Din punct de vedere termodinamic, celula este un sistem deschis, adic un sistem care schimb att energie ct i substan cu mediul nconjurtor. Ca oricrui alt sistem biologic, sistemul celular i se pot descrie mai multe caracteristici : caracterul informaional, programul, echilibrul dinamic, autoreglarea i integralitate. Caracterul informaional const n aceea c n orice moment celulele recepioneaz, acumuleaz, prelucreaz i transmit informaii de tot felul. Programul este o trstur legat de capacitile structurale i funcionale ale sistemului. n orice sistem (deci i cel celular) putem distinge trei categorii de programe: a) programe pentru sine, care asigur autoconservare sistemului dat; b) programe inferioare, adic programele subsistemelor componente; n cazul celulei acestea sunt programele organitelor, ale complexelor moleculare; c) programe superioare, care asigur existena sistemului superior, n care este integrat sistemul considerat (esuturi, organe, individ pluricelular). O ilustrare a ierarhiei programelor o constituie modificrile celulelor scoase dintr-un esut (sistem superior) i cultivate n mod izolat, care se difereniaz devenind asemntoare indiferent de sursa din care provin (piele, os, ficat,rinichi etc). n cultur se menin programele pentru sine, care asigur persistena celulelor, n schimb dispare programul superior ce reflect specificul celulei n cadrul esutului i al organismului. Echilibrul dinamic sau starea staionar este caracteristic sistemelor biologice, deci i celulei; aceasta nu este niciodat ntr-un adevrat echilibru, ci ntr-un schimb continuu de materie i energie cu mediul exterior, tinznd mereu spre un regim constant de activitate numit stare staionar sau echilibru dinamic. n timp ce sistemele nebiologice evolueaz ntotdeauna n sensul creterii entropiei , deci n sensul creterii dezordinii lor i al realizrii echilibrului termodinamic, sistemele biologice au capacitatea de a compensa creterea entropiei i de a o depi pe seama surselor de energie exterioare sistemului, deci au un comportament antientropic. Organismele vii evit creterea entropiei prin preluarea din mediu a unei entropii negative, negentropia. Autoreglarea este caracteristica sistemelor biologice prin care acestea i controleaz procesele interne n funcie de relaiile cu mediul. Influenele mediului tind permanent s dezechilibreze sistemul, care contracareaz aciunile mediului reglndu-i permanent procesele interne ntr-un sens favorabil persistenei sale n timp i spaii. 13

Celula, ca orice sistem biologic, posed mecanisme de autoreglare de tipul celor descrise n cibernetic. Autoreglarea presupune existena a minimum dou elemente: unul care comand (centrul de comand) i unul efector, precum i legturilor de comunicare dintre ele. Pentru ca rspunsul s fie corespunztor cu necesitile sistemului, valoarea rspunsului trebuie comparat cu comanda. Rspunsul dat de efector trebuie comunicat receptorului pe o cale invers conexiunea invers (feed-back), pentru a avea loc compararea cu comanda primit de efector, spre deosebire de legtura de la receptor la efector care poart numele de conexiune direct. Conexiunea invers este obligatorie pentru orice sistem de autoreglare i ofer posibilitatea sistemului s fie informat despre valoarea rspunsului. Dac rspunsul nu corespunde necesitilor sistemului, se d o nou comand, un nou rspuns, o nou comparaie. Integralitatea const n faptul c un sistem nu se reduce la suma nsuirilor prilor sale componente; sistemul privit ca un ntreg, prezint nsuiri structurale i funcionale noi, pe care nu le au prile lui componente luate izolat. Nucleul sau citoplasma nu triesc izolate, celula nu poate supravieui dup distrugerea mitocondriilor etc. Datorit integralitii sunt posibile funciile biologice fundamentale: metabolismul, reproducerea, adaptarea, meninerea stabilitii strii difereniate. Autonomia celulelor ce compun organismele pluricelulare nu este absolut i se poate spune c sntatea organismului depinde n mare msur de sistemele de comunicaie i de mecanismele de coordonare dintre celule. Biologia celular s-a conturat ca o disciplin nou mai cu seam n ultimii 50 de ani ca urmare a progreselor revoluionare nregistrate n studiul celulei, pe plan metodologic i conceptual, cnd s-a produs fuziunea dintre citologie, biochimie celular, fiziologie celular i genetic molecular. n ultimii 20 de ani s-a accentuat tendina de interpretare a tuturor proceselor celulare la nivel molecular, ceea ce justific denumirea actual de biologie celular i molecular, care a devenit una dintre cele mai noi i de perspectiv ramuri ale biologiei. Ea concepe celula ca un adevrat microcosmos ,n care structurile i funciile se mbin armonios; activitatea acestui microcosmos este determinat i reglat genetic, astfel c funcionarea sa se realizeaz cu o mare eficien.

1.2. Scurt istoric

ncepnd cu secolul XX, se nregistreaz progrese nsemnate n studiul celulei, att sub raport metodologic, ct i sub raport conceptual. Printre progresele metodologice sunt de menionat: introducerea tehnicii culturilor de esuturi n vitro (Harrison, 1909), ulterior a culturilor de celule, care permit studierea comportrii celulelor prin microscopia cu contrast de faz; coloraie vital i microvital i microcinematografie; microchirurgia (Kite,1911), prin care se introduc micropipete fine n interiorul celulelor i se studiaz la microscopul optic proprietile fizico-chimice ale citoplasmei; introducerea microscopul electronic (inventat n 1937, dar utilizat n biologie dup 1954) a dus la descoperirea unei noi lumi a organizrii celulare, descifrarea ultrastructurii celulei, a detaliilor fine de organizare submicroscopic. Aceasta a marcat i trecerea de la citologia clasic la citologia modern. Dezvoltarea impetuoas a biochimiei, la nceputul secolului XX, aduce descoperirea i descifrarea oxidrilor celulare (Wieland, 1903; Warburg, 1908) i se fac primele ncercri de a le localiza n particule citoplasmatice. Punctul de convergen ntre citologie i biochimie l constituie dezvoltarea tehnicilor biochimice de fracionare a celulei prin centrifugare diferenial. Aceast linie de cercetare a fost iniiat n 1934 de Bensley i Hoerr i apoi dezvoltat cu succes de Claude, Hogeboom i alii n deceniul al V-lea. Prin centrifugare diferenial s-a realizat separarea componentelor citoplasmatice, urmat de studiul ultrastructurii i a proprietilor metabolice ale acestora. n acest fel s-au putut localiza precis anumite ci metasolice n celul (de pild ciclul Krebs, 14

oxidrile celulare i sinteza de ATP n mitocondtii) i s-au descoperit i caracterizat noi organite celulare (lizozomii i peroxizomii de ctre Christian de Dure). Introducerea microscopiei electronice i a fracionrii celulei prin centrifugare sunt cele dou tehnici majore care au revoluionat studiul celulei, ducnd la apariia unei noi ramuri a tiinelor biologice i anume biologia celular. Studiul celulei a progresat i n msura perfecionrii tehnicilor de citochimie i histochimie, prin care se deceleaz anumite componente ale celulei (acizii nucleici, proteine, glucide, lipide) se localizeaz enzime n celul sau n organite. Aceste metode se pot utiliza la microscopul optic sau la microscopul electronic. Un punct de referin la constituit citofotometria acizilor nucleici (Caspersson, 1938). De asemenea, s-au aprofundat aspectele funcionale ca urmare a progreselor nregistrate n fiziologia celular. Pe de alt parte, pornind de la structurile nucleare s-a ajuns la interpretarea i explicarea fenomenelor ereditii. Sub raport conceptual biologia celular a rezultat din fuziunea disciplinelor de citologie, biochimie celular, fiziologie celular, genetic molecular. Prin anii 60 exista deja o disciplin format, cu metodologie complex de cercetare, ilustrat de savani de renume mondial dintre care Albert Claude, George Palade, Christian de Duve, laureai ai Premiului Nobel n 1974, Keith Porter i alii. Dar progresele spectaculare n studiul celulei au continuat cu repeziciune i n scurta vreme s-a nregistrat o nou schimbare radical. Odat cu realizrile excepionale nregistrate n descifrarea structurii proteinelor i acizilor nucleici prin folosirea n special a difraciei cu raze X, a elucidrii mecanismului replicrii ADN, a biosintezei proteinelor, deci a transmiterii informaiei genetice i a expresiei genei s-a nscut biologia molecular, al crui scop este interpretarea fenomenelor biologice la nivel molecular. Cercetrile de biologie molecular au acumulat deja un bagaj de care au permis progrese uriae n diferite domenii, lsnd s se ntrevad, pentru viitor, noi perspective fascinante de cercetare (medicin, industrie alimentar, agricultur, ecologie etc). Progresele ultrarapide ale biologiei moleculare au dus la dezvoltarea biotehnologiei moderne care se anun a deveni marea for industrial a secolului al XX -lea i n care se pune sperana c va reui s rezolve problemele cele mai spinoase ale societii omeneti (alimentaia i starea de sntate). Dup cum se tie, majoritatea cercetrilor i descoperirilor epocale din biologia molecular au fost fcute n SUA, Japonia i Germania; tot n aceste ri s-a dezvoltat i biotehnologia modern. La ora actual, n SUA exist 1000 de firme specializate n probleme de biotehnologie, care lucreaz produse pentru laboratoarele de genetic i biologie molecular din ntreaga lume; n Japonia exist 300 de firme, iar n Germania 36.

1.3. Contribuii romneti n studiul celulei

n secolul al XIX-lea s-a impus coala de microscopie de la Facultatea de medicin din Bucureti (Diculescu i colab., 1983). nc din 1839 Nicolae Kretzulescu public la Paris rezultatele cercetrilor sale asupra structurii microscopice a dinilor i a mediilor transparente ale globului ocular. nvmntul disciplinelor microscopice apare la coala de medicin din Bucureti n anul 1859, reprezentat succesiv de Ludovic Fiala, Gh. Polizu i Mihail Obedenaru, care predau histologia i citologia pn n anul 1897, cnd ia fiin o catedr independent de histologie, citologie i tehnic microscopic. La aceast catedr, printre primele de acest fel din Europa, dup acela din Frana, se succed, n curs de circa 100 de ani, reprezentani de seam ca: Mihail Petrini-Galai, Alexandru Obredja, Ion Bruckner, tefan Besnea, I. T. Niculescu. Pe plan internaional se impun n mod cu totul deosebit, Gheorghe Marinescu ( 18631939), Victor Babe (1854-1926) i Ion Cantacuzino (1863-1934). Contribuiile lui Gheorghe Marinescu n neurocitologie sunt sintetizate n cartea Celul nervoas (publicat la Paris n 15

1909) care a rmas mai multe decenii o carte de baz a domeniului. Victor Babe (coautor mpreun cu francezul A. V. Cornil al primului tratat de microbiologie din lume, publicat la Paris n 1886) a descoperit peste 40 de microorganisme, unele constituind clasa Babesia (Babesiozele sunt cele mai rspndite parazite ale animalelor). Victor Babe a mai descoperit corpii Babe-Negri n neuron n turbare, corpusculii Babe-Erust n bacilul difteric. nc din 1885 a prevzut c ntre microorganisme se pot stabili relaii antagoniste, cu posibiliti de aplicare a fenomenului n terapie, concepie confirmat ulterior prin antibiotice. Ion Cantacuzino, pe lng contribuiile sale de imunologie comparat, de microbiologie i de medicin experimental, a descoperit factorul stimulator al secreiei celulare n diferite lichide biologice (de exemplu, lacrimile). coala de citofiziologie a lui Ioan Athanasiu i Ion Drgoi de la facultile de tiine naturale i medicin veterinar din Bucureti aduc valoroase contribuii de citofiziologie muscular, dintre care se remarc descoperirea tubilor transveri din celulele musculare cardiace i cele striate, lucrri publicate nc nainte de primul rzboi mondial. n perioada dintre cele dou rzboaie mondiale coala de citologie de la Facultatea de tiine naturale din Bucureti este reprezentat strlucit de Dimitrie Voinov (i continuat de Theodor Dornescu i I. Steopoe), iar cea de la Cluj de ctre I. Scriban, care s-au impus prin descoperiri legate de aparatul Golgi i lucrri de citologie animal (Ionescu-Varo i colab., 1981). n aceeai perioad Ion Drgoi, conducnd coala de histologie i citologie de la Facultatea de medicin din Cluj a efectuat cercetri deosebit de valoroase privind rolul presiunii osmotice asupra diviziunii celulare, precum i asupra respiraiei ovicitelor de mamifere. nvmntul superior i cercetarea tiinific din Romnia au depus eforturi de reorganizare n concordan cu evoluia biologiei celulare n ultimele decenii. ncepnd cu anul 1969 M. Ionescu Varo iniiaz la Facultatea de biologie din Bucureti primele cursuri i lucrri practice de biologie celular, publicnd totodat i primul manual de profil din ar. I. Diculescu i colaboratorii de la catedra de histologie i citologie a Facultii de medicin din Bucureti public prima monografie de biologie celular din literatura romn (Diculescu i colab., 1971). ncepnd cu anul universitar 1978-1979 se introduce biologia celular ca materie obligatorie n planul de nvmnt la facultile de medicin, disciplinele de profil fiind conduse de I. Diculescu la Bucureti, O. Chita la Craiova, G. Cotrutz la Iai, Silvia Andreicu la Tg. Mure, N. Frsinel la Timioara i Gh. Benga la Cluj-Napoca. Se redacteaz cursuri litografiate pentru studenii de la medicin (Benga, 1980; Diculescu i colab., 1981; Andreicu, 1982) i un manual unic ( Diculescu i colab, 1983 ). Sunt, de asemenea, de menionat laboratoarele de microscopie electronic i biologie celular i molecular din cadrul unor institute de nvmnt superior (Universitatea din ClujNapoca dr. C. Crciun, laboratorul de microscopie electronic ) i de cercetare: Institutul Dr. I. Cantacuzino (microscopie electronic dr. A. Petrovici, biologie celular dr. Gh. Gancevici), Institutul Dr. V. Babe (biologie celular dr. C. Dragomir), Institutul L. Pasteur (microscopie electronic cu baleiaj dr. N. Manolescu), Institutul tefan S. Nicolau (biologie molecular dr. L. Popa, dr. S. Antohi), Institutul Oncologic Bucureti ( biologie molecular dr. I. Voicule), Institutul de tiine biologice, Bucureti ( microscopie electronic dr. H. Tiu i colab.) i altele. Din 1979 a luat fiin Institutul de Biologie i Patologie Celular din Bucureti, aflat n legtur permanent cu secia de biologie celular a Facultii de medicin din Yale, S.U.A (profesor George Emil Palade). Merit subliniat n acest context, descoperirile de o valoare inestimabil a lui G. E. Palade, primul romn laureat al Premiului Nobel. Aprecierile de principal cartograf al celulei sau cel mai mare biolog al secolului XX (Blobel, 1980) sunt justificate nu numai de multiplele sale descoperiri, ci i de orizonturile noi deschise n biologia celular. Palade este 16

unul din pionierii elaborrii tehnicilor de microscopie electronic (a pus la punct metoda de fixare i secionare ultrafin, ce i-a permis observarea pentru prima dat a multor structuri celulare) i de centrifugare diferenial ( a introdus zaharoza ca mediu de fracionare). A descoperit ribozomii (numii i granulele lui Palade) i a precizat rolul lor n sinteza proteinelor, a elucidat calea seciei celulare, a descoperit transportul pe calea veziculelor prin endoteliul capilar i reciclarea membranelor celulare; a studiat biogeneza membranelor, i aici fiind un deschiztor de drumuri. Biologia celular i molecular reprezint nu numai unul din cele mai dinamice domenii n care avanseaz frontierele cunoaterii umane, ci i pilonul fundamental ce st la baza revoluiei tiinifice, pe care o trim n prezent, cu implicaii de maxim importan economic, medical, ecologic i n ultim analiz, filozofic. 1.4. Principalele teorii care au condus la modul actual de gndire despre

natura materiei vii

Secolul al XIX-lea a reprezentat un salt n cunoaterea organizrii materiei vii. Acumularea de date i cunotine a permis i fundamentarea unor teorii care au condus la modul actual de gndire despre natura materiei vii, printre care: Teoria celular, care a stabilit c la baza structurii esuturilor, organelor i a ntregului organism, vegetal i animal, st celula; Teoria cromozomial a ereditii, care consider c la baza controlului i transmiterii caracterelor ereditare stau cromozomii (i n ultimul timp ADN); Teoria molecular, care consider c viul este constituit din materia molecular (ca i neviul); Teoria biostructural, de dat mai recent (sec XX-lea) ce aparine academicianului E. Macovschi i care consider viul materie biostructurat, superior organizat (biostructura), form cu totul special a materiei, purttoarea nsuirilor biologice pe care le imprim viului i care include materia molecular. Teoria evoluionist, ipotez care afirm c toate speciile de animale s-au transformat unele n altele, de la primele vieti unicelulare, pn la maimu i om, n miliarde de ani, mai afirm c speciile de plante auevoluat de la forme unicelulare pn la plantele cu flori i c acest proces evolutiv s-a desfurat pe cale natural, prin factori ntmpltori.

1.4.1. Teoria celular

La sfritul secolului al XVIII-lea, epoca de invenie a primelor microscoape, R. Hooke (1665) observ c pluta este alctuit din numeroase cmrue, asemntoare unor faguri de albine, pe care le-a denumit celule (de la lat. cellula camer mic). n aceeai perioad Leuwenhoeck (1674), descoper celulele libere i identific i nucleul n eritrocite. Importana acestor noiuni nu a fost neleas dect mai trziu. La nceputul secolului al XIX-lea, dispunnd de microscoape mai perfecionate, numeroi cercettori descriu celulele n diferite organisme vii. Puin cte puin, se desprinde ideea c toate fiinele sunt alctuite din celule i din substane ce provin din activitatea lor. Schleiden (1838) i apoi Schwann (1839), exprim aceast concepie, care reprezint o sintez fundamental a cunotinelor despre celul pn la acea dat i care este nc una dintre concepiile de baz ale biologiei actuale. Observarea i studiul diviziunii celulare de ctre muli autori, conduc pe Virchow (1855) s enune o nou idee: omnis cellula e cellula (toate celulele provin dintr-o celul preexistent). 17

Fiecare celul posed un nucleu (Brown, 1831), care deriv tot dintr-un nucleu preexistent (Strasburger, 1876). Celula conine o substan gelatinoas, diafan, insolubil n ap, care se contract ntr-o mas globuloas, se ataeaz de suprafaa de seciune i se las ntins asemntor unui mucus (Dujardin, 1835). Aceast substan reprezint protoplasma (Purkinje; Von Mohl, 1840). Schneider (1873), apoi Strasburger (1876) descoper diviziunea indirect n celulele vegetale; Fleming (1880)o observ n celulele animale i o numete mitoza,; Schneider (1878) adaug termenul de cariochinez, n timpul creia cromozomii se repartizeaz n mod egal ntre celulele-fiice. n cursul fecundrii ovulului de ctre spermatozoid cei doi pronuclei fuzioneaz n oul fecundat (Hertwig, 1875). Oul (celula-ou) d natere unui nou organism. De la o generaie la alta, viaa se caracterizeaz printr-o succesiune nentrerupt de celule. Studiul creterii i dezvoltrii organismului, a maladiilor sale, a reproducerii i a fenomenelor de transmitere ereditar, sunt n raport cu structura i funcia celulelor sale. Descoperirile recente pot provoca unele dificulti, referitoare la generalizarea teoriei celulare. Este cazul virusurilor care au o organizare foarte particular. Totui, teoria celular se evideniaz ca fiind extrem de aplicabil. Nu numai celulele, dar i organitele, cum sunt cromozomii, sau moleculele ca cele de ADN (acid dezoxiribonucleic) preced structuri preexistente analoge; ele au o continuitate genetic. Dup A Lwoff (1962), teoria celular implic o unitate de plan de organizare, dar de asemenea o unitate de funcionare i o unitate de compoziie. Celulele sunt organizate dup un plan foarte general comun, ele funcioneaz dup aceleai legi i sunt constituite din molecule, care cu toat marea lor diversitate, sunt constituite dintr-un numr foarte limitat de materiale.

1.4.2. Teoria cromozomial a ereditii

Caracterul esenial al unei celule vii const n capacitatea de a transmite n mod ereditar trsturile sale de la o generaie la alta. Dei fenomenul a fost remarcat cu foarte mult timp n urm, el nu a putut fi descifrat dect spre sfritul secolului XIX-lea i nceputul secolului al XX-lea. Meritul i revine naturalistului ceh Gregor Mendel care elaboreaz (1866) dou importante legi ale geneticii, cunoscute sub numele de legile lui Mendel. n scopul de a descifra mecanismele ce determin exprimarea anumitor caractere, ct i transmiterea lor de-a lungul generaiilor, Mendel utilizeaz metoda analizei genetice (hibridologic). Principiul acestei metode const n ncruciarea unor indivizi ai aceleai specii care se deosebesc ntre ei prin una sau mai multe caractere (trsturi) individuale, bine conturate i analiza descendenilor obinui. Cel mai important factor ce poate influena rezultatele furnizate prin metoda analizei genetice l constituie puritatea genetic a genitorilor. Indivizii folosii n ncruciri trebuie s manifeste o mare constan a caracterelor ereditare. Un material biologic adecvat acestui scop este mazrea (Pisum sativum), plant folosit n experimentele efectuate de Mendel. Prima lege mendelian este legea puritii gameilor. Sub denumirea de legea puritii gameilor sunt unite de fapt dou legi sau dou principii: a uniformitii hibrizilor din prima generaie i cea a segregrii. Aceast lege se bazeaz pe rezultatele unui experiment de monohibridare (indivizii ncruciai se deosebesc printr-o singur pereche de caractere ereditare) Mendel a ncruciat un soi de mazre cu boabe de culoare galben (G) cu un alt soi ale crui boabe erau verzi (v). n urma acestei ncruciri s-a obinut prima generaie hibrid F1. Toi hibrizii din F1 prezentau boabe de culoare galben, motenind caracterul ereditar al unui singur genitor. Caracterul alternativ (culoare verde) nu a fost exprimat de nici unul din indivizii primei generaii.

18

Mendel introduce termenul de dominan pentru a definii fenomenul de exprimare, la hibrizii din F1, numai a unuia dintre caracterele parentale alternative. Caracterul ce se manifest la descendenii din prima generaie a fost numit dominant, n timp ce caracterul alternativ, nemanifestat i s-a atribuit termenul de recesiv. n urma autopolenizrii (sau ncrucirii) hibrizilor din F1 s-a obinut a doua generaie de descendeni , F2. Unii dintre acetia prezentau caracterul dominant, n timp ce alii manifestau caracterul recesiv. Difereniere caracterelor parentale la indivizii din a doua generaie a fost numit segregare. n urma unui studiu statistic al segregrii, Mendel a obinut raportul de 3:1 ntre caracterul dominant i cel recesiv (fig. 1). Mendel i-a extins cercetrile i asupra generaiilor urmtoare. El a remarcat faptul c plantele cu boabe verzi au descendeni identici. Din plantele cu boabe galbene doar o treime exprim constant caracterul ereditar, restul de dou treimi manifestnd o segregare similar generaiei F2 (3 dominant : 1 recesiv) G GG gG g Gg gg

Gamei F1
G G

Fig.1. Schema care reprezint prima lege a lui Mendel ( legea puritii gameilor ). Se poate observa c n generaie F2 raportul fenotipului dominant i cel recesiv este de 3/1. G = gena dominant; g = gena recesiv. Mendel explic rezultatele obinute lansnd ipoteza factorial care are drept suport presupunerea existenei unor factori interni materiali ce stau la baza exprimrii caracterelor ereditare. Aceti factori, intuii de Mendel, sunt cunoscui azi sun numele de gene (termen introdus n 1909 de ctre Wolhelm Johanerson). n toate organismele, factorii se gsesc n pereche, fiecare coninnd un factor dominant i altul recesiv. Astfel de cupluri au primit ulterior numele de perechi alele. Factorii sunt transmii descendenilor prin intermediul gameilor parentali (matern i patern) ce conin cte unul din factorii ce alctuiesc cuplul(sunt puri din punct de vedere genetic). n urma fecundrii, gameii se combin n moduri diferite ceea ce explic fenomenul de segregare manifestat n F2. n cazul experimentului de monohibridare se constat existena unei duble segregri, att fenotipic, ct i genotipic. Din punct de vedere fenotipic (al aspectului exterior al individului), raportul de segregare este de 3:1 (dominant/recesiv). Segregarea genotipic const n redistribuirea factorilor n cupluri diferite, n generaia F2. Analiznd diagrama lui Punnett, se constat formarea, n a doua generaie, a dou cupluri identice cu cele ale genitorilor i altor dou similare hibrizilor din F1, stabilit fiind de 1:2:1 (fig. 2).

19

Fig. 2. Diagrama factorilor ereditari aleloformi n experimentul de monohibridare. P = generaie parental; F1, F2 , F3 = generaiile filiale (hibrizii); = genitorul parental femel; = genitorul parental masculin; G = caracterul dominant (culoarea galben); g = caracterul recesiv (culoarea verde). Studiul posibilitilor de combinare a factorilor ereditari n cupluri st la baza unei noi clasificri a organismelor. Se disting, astfel, dou tipuri de organisme: homozigote (la care factorii ce alctuiesc cuplul sunt identici) i heterozigoze sau hibride (la care factorii ereditari pereche sunt diferii). Legea segregrii (disjunciei) independente a perechilor de factori ereditari respectiv a perechilor de caractere este a doua lege elaborat de Mendel. Ea este fundamentat pe un experiment de dihibridare (genitorii se deosebesc ntre ei prin dou perechi de caractere constante). Mendel a ncruciat un soi de mazre cu boabe galbene i netede (GN) cu un alt soi cu boabe verzi i zbrcite (vr) Experienele preliminare au demonstrat c att culoarea galben, ct i aspectul neted al boabelor sunt dominante asupra caracterelor alternative. n urma ncrucirii celor doi genitori s-a obinut prima generaie de descendeni F1, n care manifestate erau doar caracterele dominante.

20

Cei 16 descendeni din a doua generaie F2 rezultai prin autopolenizarea (sau ncruciarea) hibrizilor din F1, se pot ncadra n patru clase genotipice, raportul de segregare fiind de 9:3:3:1 astfel: 9 plante prezentau ambele caractere dominante (boabe galbene i netede); 3 plante manifestau primul caracter dominant (boabe galbene i zbrcite); 3 plante exprimau al doilea caracter dominant (boabe verzi i netede); 1 plant nu prezenta nici unul din caracterele dominate (boabe verzi i zbrcite). Cei ase (3+3) indivizi ce exprim genotipuri noi, diferite de cele ale genotipurilor, sunt numii recombinani. Din modul de segregare a fiecrui caracter n parte, se constat c fiecare pereche de caractere, segreg independent ntr-un raport de 3:1. Att raportul se segregare fenotipic, ct i exprimarea fenotipurilor noi se explic admind prezena n genomul hibrizilor din F1 a tuturor genelor parentale (fig.3)

Fig. 3. Schema dihibridrii i a segregrii factorilor n F1, reprezentnd cea de-a doua lege a lui Mendel. Un printe este homozigot pentru dou gene dominante: GG care determin culoarea i RR care determin forma. Cel de-al doilea printe este homozigot pentru alelele recesive gg i rr. Generaia F1 este uniform pentru caracterele dominante. Fecundarea produce un numr egal de 4 x 4 = 16 combinaii prezentate n ptratele figurii (generaia F2 ). Aceste 16 combinaii se gsesc n 4 clase de genitori. 21

Anterior experimentelor mendeliene, studiile citologice subliniau implicarea cromozomilor n procesul transmiterii ereditare a caracterelor. Corelnd datele genetice cu cele furnizate de citologie, W.S.Sutton (1903)i T. Boveri (1904) ajung la concluzia c factorii ereditari (genele) sunt localizai n cromozomi, segregarea perechilor alele, ntr-un heterozigot, explicndu-se prin segregarea cromozomilor ce conin genele n procesul de formare a celulelor sexuale (gametogeneza). Orice tip de celul diploid conine cromozomi de provenien matern i patern ce formeaz cupluri de cromozomi omologi. n timpul meiozei att ataarea cromozomilor de fibrele fusului de diviziune, ct i deplasarea lor spre polii celulei sunt fenomene ce se desfoar la ntmplare. Acest lucru explic de ce gameii rezultai n urma meiozei pot conine orice combinaie a factorilor ereditari parentali. Punerea n discuie, din perspectiva citologic, a universalitii legilor mendeliene a condus la concluzia c libera combinare a factorilor ereditari are loc numai cnd factorii ce determin exprimarea perechilor de caractere sunt localizai n perechi de cromozomi omologi diferii. Deci numrul factorilor ce segreg, independent ntre ei, poate fi cel mult egal cu numrul de perechi de cromozomi omologi prezeni ntr-un organism dat. Corelaia rezultatelor cercetrii fenomenului ereditar s-a finalizat prin elaborarea, n 1920, a Teoriei cromozomiale a ereditii, teorie preluat i dus la apogeu de Thomas Morgan (Drosophila melanogaster, analiza genetic, hri genetice) teorie susinut azi de informaiile furnizate de biologia molecular.

1.4.3. Teoria molecular a materiei vii

Conform modului actual de gndire despre natura viului, oglindit n cercetare i n programul de nvmnt, viul este constituit din materie molecular; (Bauley, 1970; Orten, Neuhaus, 1975; Tama ,1975); nsuirile biologice sunt condiionate de metabolism (Oparin, 1960; Watson 1974); moartea este consecina ncetrii metabolismului; natura materiei vii i natura materiei moarte sunt calitativ identice (Haas; 1964). S-a ajuns la convingerea c acest mod de gndire reflect natura vie aa cum este ea, deci ntru-totul realitii. Se mai consider ca numeroasele descoperiri de mare importan pentru biologie, fcute la nivel molecular ca i cele ce privesc codul genetic, mecanismul de biosintez a proteinelor, autoreglarea i coordonarea reaciilor enzimatice, sinteza genelor i altele, vin n sprijinul actualului mod de gndire despre natura materiei vii, demonstrnd valabilitatea lui. Datorit acestei situaii cercetarea viului se orienteaz tot mai mult spre aspecte legate de structura chimic a substanelor din organisme i de interrelaiile chimice i fizice dintre moleculele acestor substane. De aici abordarea tot mai frecvent a fenomenelor biologice n termeni moleculari, tendin de chimizare a diferitelor ramuri ale biologiei i apariia disciplinelor biologice noi, numite moleculare, cum sunt biologia molecular, genetica molecular, patologia molecular i chiar biochimia molecular. Astfel asistm la un adevrat triumf al molecularismului n biologie. Deci, conform modului actual de gndire, materia vie, n totalitatea ei, are natur molecular, iar descifrarea fenomenelor biologice, la nivel molecular va permite cunoaterea vieii, cunoaterea sistemelor vii (Karlson, 1967; Manta, 1968; Watson, 1974).

1.4.4. Teoria biostructural a materiei vii

Plecnd de la unele deficiene de ordin teoretic, experimental i filosofic ale teoriei moleculare acad. romn Eugen Macovschi elaboreaz o nou teorie despre natura i structura viului, teorie publicat n diverse articole i cri, ntre anii 1958-1976.

22

Conform concepiei lui Macovschi, principalele idei deficiente ale teoriei moleculare sunt urmtoarele: - Materia vie i materia moart sunt calitativ identice, dar nu se explic de ce cele dou forme ale materiei, vie i moart, au totui nsuiri att de diferite; se tie doar c formele materiei identice calitativ trebuie s aib i nsuiri de aceeai natur. - n materia vie toate reaciile chimice sunt coordonate i constituie metabolismul, viaa, fiind forma chimic de micare a materiei, dar nu se arat cum anume se realizeaz aceast coordonare a reaciilor chimice i nu se indic modul cum, de la chimismul obinuit coordonat, se ajunge la manifestrile vieii. Afirmaia c fenomenele biologice, manifestrile nsuirilor biologice ale materiei vii se reduc la chimismul obinuit este greu de neles. Se tie doar c nsuirile sunt ale materiei i depind de natura, de calitatea ei i nu sunt ale reaciilor chimice care se desfoar n materie, indiferent dac sunt sau nu coordonate. - Moartea este consecina ncetrii metabolismului adic a ncetrii coordonrii reaciilor chimice, dar nu se precizeaz cum se ajunge la ncetarea metabolismului. Prerea c odat cu moartea manifestarea nsuirilor biologice ale materiei vii nceteaz datorit ncetrii metabolismului este greu de neles. Se tie doar c ncetarea manifestrii unor nsuiri este condiionat de transformarea materiei purttoare a nsuirilor respective i nicidecum de ncetarea desfurrii sau coordonrii unor reacii chimice. - Fenomenele i legile biologice deriv, se reduc i se deduc din fenomene i legi chimice i fizice, dar nu explic n ce const i cum se realizeaz (Macovschi, 1969). Conform teoriei biostructurale, materia vie (viul) const din materie biostructural i din materie molecular coexistent. Materia biostructural este o form cu totul special a materiei, prin alctuirea sa specific, ea se deosebete de materia molecular obinuit, iar, prin structur, este purttoarea nsuirilor biologice pe care le imprim viului din care face parte. - Materia biostructural este alctuit din componente. Acestea provin din molecule normale, obinuite, ale combinaiilor chimice adecvate, care printr-un schimb de energie, realizabil numai n condiiile viului, se ncarc cu energie i trec ntr-o stare special, specific viului, integrndu-se n biostructur. Datorit strii speciale, componentele materiei biostructurale nu se mai comport ca molecule, iar datorit surplusului de energie ele exercit n cadrul materiei biostructurate anumite funcii elementare (biologice, bioritmice, cibernetice, genetice, informaionale etc.) pe care nu le pot exercita atunci cnd se afl n afara acestei materii, ca simple molecule. Exercitarea funciilor duce la manifestarea anumitor microfenomene, din a cror nsumare deriv fenomenele biologice, manifestarea vieii. Prin acumulri, cedri, i consumuri de energie, componentele pot suferi modificri care nu implic obligatoriu, dar nici nu exclud, manifestarea structurii chimice a componentelor respective. Modificrile componentelor se deosebesc profund de transformrile chimice obinuite, nu pot fi nelese i cercetate de pe poziiile chimice i reprezint modificri sau reacii biostructurale, totalitatea crora constituie biostructurismul materiei vii. Componentele materiei biostructurale se leag prin anumite fore corelative, biovalenele, care acioneaz numai n viul. Datorit acestor fore i strii speciale a componentelor, materia biostructural se prezint ca un ntreg continuu n care o modificare provocat n starea unei componente se transmite i se repercuteaz asupra strii celorlalte. Prin alctuirea, natura i funciile sale speciale, materia biostructural reprezint o structur biologic dinamic, n continu dezvoltare, care reflect stadiul superior de dezvoltare i organizare a materiei, prezint particulariti dependente de specie, individ, organ, esut, vrst etc., are nsuiri de semiconductor i de corp solid i se comport ca un sistem informaional, cibernetic, cuantificabil, cvadridimensional, purttor al bioplasmei i programului genetic, ce depete posibilitile de nelegere i de investigaie de pe poziiile moleculare. 23

Odat cu moartea, biostructura se destram, ceea ce duce nu numai la eliberarea unora din componentele ei sub form de molecule, dar i la apariia unor fragmente polinucleare mai mari sau mai mici, care includ enzime i ali compui chimici. Aceste fragmente, cu aspect de membrane, nu preexist ca atare n biostructur ci se formeaz ca artefacte pe msura destrmrii acesteia. Materia molecular coexist, formeaz materia nevie i ca atare nu este purttoarea nsuirilor biologice, dar particip la manifestarea acesteia n carul coexistenei cu materia biostructural. Biochimismul care se desfoar n materia molecular coexistent furnizeaz energia necesar att schimbrii moleculelor n componente, ct i meninerea integritii i strii funcionale normale a materiei biostructurale. La rndul ei, materia biostructural, prin fenomenele care se desfoar la nivelul ei, contribuie att la coordonarea biochimismului din materia molecular coexistent, ct i la asigurarea compoziiei chimice normale a acesteia. Astfel, cele dou forme ale materiei, biostructurat i molecular coexist i formeaz acea unitate morfo-funcional care constituie nsi materia vie. Teoria biostructural reprezint un mod de gndire despre natura materiei vii care prezint o serie de aspecte ipotetice, dar care deschide noi ci de cercetare ce vor confirma, modifica sau chiar abandona unele dintre aceste aspecte.

1.4.5. Teoria evoluionist, originea vieii i a omului

Pentru omul de cultur, evoluionismul a devenit o certitudine. Nimeni nu i pune problema originii omului dect din aceast unic perspectiv, cea a lui Darwin. n anul 1859 cercettorul britanic, Charles Darwin lansa o teorie care ncerca s explice originea speciilor de plante i animale altfel dect prin creaie. Conform acestei teorii, speciile ar evolua n mod naural unele din altele, de la forme simple la forme mai complexe i astfel ar fi luat natere toate vieuitoarele existente astzi, inclusiv omu, despre care se afirm c ar fi provenit dintr-o specie de maimu. Acest teorie, nu a fost demonstrat niciodat i au existat numeroase dicuii chiar n timpul lui Darwin, dar unele partide politice, fiind interesate mai ales de aspectul moral al problemei (dac omul se trage din maimu, atunci suntem liberi s ne purtm ca animalele ), au preluat ideea i au reuit s o impun ca teorie oficial. Astfel s-a ajuns ca n toate rile guvernate de asemenea partide s se nvee c omul se trage din maimu.i n colile din Romnia, la toate nivele continu s se predea teoria evoluionist, dei au trecut 18 ani de la cderea comunismului. Din nefericire, subiectul evoluionismului este nc ncrcat de reacii emoionale, ceea ce face ca o mulime de oameni s nu doreasc s-l discute. Iat care sunt n prezent concepiile cu privire la originea vieii i a omului: Evoluionismul ateist este ipoteza care afirm c speciile de animale s-au transformat unele n altele, de la primele vieti unicelulare pn la maimu i om, n mai multe miliarde de ani, mai afirm c speciile de plante au evoluat de la forma unicelular pn la plantele cu flori i c acest proces evolutiv s-a desfurat pe cale natural, prin factori ntmpltori. Dar, pn n prezent, nu exist nici o dovad a evoluiei speciilor, mai mult, raionamentele evoluioniste conin erori de logic i tiina actual respinge ipoteza evoluiei. Evoluionismul teist este ipoteza care afirm c evoluia speciilor este un fapt real, c ea a parcurs etapele prezenate de evoluionismul ateist, dar c este rezultatul lucrarii directe a lui Dumnezeu. Aici sunt de facut dou precizri, mai nti, ct rmne n domeniul tiinie, ipoteza evoluiei rmca o simpl ipotez, ns, n momentul n care este inclus n nvtura de credin, ipoteza devine o erezie.Teoria susine c Dumnezeu a creat doar dou vieti unicelulare pe care le-a ajutat apoi s evolueze pn la maimu i om, n miliarde de ani.

24

 Creaionismul fixist, este doctrina conform creia speciile nu sufer nici o schimbare, ci rmn exact cum au fost create. Realitatea arat c n cadrul speciilor pot aprea rase sau soiuri, fr a depi graniile speciei. Creaionismul tiinific este teoria tiinific(bazat pe genetic, pe teoria probabilitilor i pe teoria informaiei) ce demonstreaz c este imposibil ca speciile s apar spontan (din ntmplare) i s evolueze, transformndu-se una n alta. Din aceast imposibilitate rezult c speciile au fost create de un Creator. Referitor la fenomenul evoluiei se accept un proces evolutiv numit microvoluie, prin care, pornind de la populaii, rase i soiuri, prin mutaii genetice pot s apar populaii, rase i soiuri noi de plante i animale n cadrul aceleiai specii (indivizii deci, se pot ncrucia ntre ei dnd natere la urmai fertili). Prin extensia acestui fenomen evolutiv microevoluie desfurat la nivelul speciilor (care se pot ncrucia ntre ele) s-a ajuns la macroevoluie, fenomen ipotetic care ncearc s explice originea speciilor de plante i animale conform teoriei lui Darwin, teorie aflat n contradicie cu creaionismul, care afirm c speciile de plante i animale, inclusiv omul, au fost create de Dumnezeu. Unul dintre cei mai mari biologi, Piere P. Grass, fost preedinte al Academiei Franceze de tiine, i ncheie cartea sa volution du vivant (Evoluia organismelor vii,1973) cu acest nimicitor rechizitoriu al evoluiei darwiniste: Prin uzul i abuzul unor postulate ascunse, al unor ndrznee i adesea nentemeiate extrapolri, s-a creat o pseudo tiin. Ea prinde rdcini n chiar miezul biologiei, fcnd s rtceasc numeroi biochimiti i biologi, ce cred n mod sincer c acurateea conceptelor fundamentale a fost demonstrat, ceea ce este departe de realitate. ncepnd cu anii optzeci, tot mai muli savani necreaioniti au fcut cunoscut c teoria neodarwinist (modelul evoluionist actual), nu poate explica noile date din domeniul geologiei, paleontologiei, astronomiei, geneticii, fizicii, biochimiei i a altor tiine. Astfel, n anul 1985 a aprut cartea lui Michael Denton, cercettor australian n domeniul biologiei moleculare, Evolution: A Theory in Crisis (Evoluia: criza unei teorii), ce ofer o critic sistematic a modelului evoluionist actual din perspectiva mai multor discipline tiinifice.Din punctul de vedere al propriei discipline, Denton arat c descoperirile specialitilor n biologie molecular arunc din ce n ce mai multe ndoieli asupra preteniilor darwiniste. n anul 1996 apare cartea renumitului profesor de biochimie de la Berkeley University din California, Michael Behe, Darwin's Black Box (Cutia neagr a lui Darwin), n care se arat c uimitoarele descoperiri ale biochimiei nu se mpac deloc cu nici un fel de darwinism. n 1997 o alt carte ce ddea de gndit a constituit o puternic lovitur mpotriva darwinismului: Not By Chance !( Nu ntmpltor !) de Dr.Lee Spetner. Biofizician evreu, specializat n codul genetic, Spetner i-a petrecut 30 de ani cercetnd posibilitatea evoluiei la nivel genetic. El arat nu numai de ce mutaiile ntmpltoare nu vor produce niciodat schimbrile pretinse de evoluioniti, ci ofer i noi ci tiinifice de investigare a felului cum are loc variaia n limitele genetice ale fiecrui fel de organism. n ultimii ani, savani reputai au nceput s ridice serioase ndoieli asupra evoluiei, darwiniste, astfel c pn n prezent a aprut o mare cantitate de literatur tiinific extrem de critic la adresa teoriei evoluioniste. Unii caut un nou model, dei nu prea tiu unde s-l gseasc. Ar fi desigur prea mult s socotim c toi acetia se vor ntoarce ctre modelul creaionist, ntruct, nici creaia, nici evoluia nu pot fi dovedite n chip definitiv: de fapt, amndou in de credin i filozofie, de o alegere iniial.

25

Capitolul 2 MEMBRANELE CELULARE

O ramur aparte a biologiei moleculare biomembranologia - a fost oficializat n anul 1977, cu ocazia unui simpozion desfurat n Germania, la Karlsruhe. Aceast nou ramur a biologiei, care se ocup cu studiul membranelor celulare, a reuit s se contureze prin colaborarea interdisciplinar a unui numr foarte mare de specialiti n domeniul biologiei, medicinii, biofizicii, biochimiei. n 1950 erau descrise doar dou membrane: cea plasmatic i cea nuclear. n cursul anilor 60, datorit posibilitilor de investigaie oferite de microscopia electronic, au putut fi evideniate i studiate n detaliu un numr tot mai mare de structuri membranare (tip organite permanente celulare: reticul endoplasmatic, mitocondrii, complex Golgi, ct i structuri cu via limitat, tip vezicule de condensare i lipozomi). Orice ptrundere din mediul exterior n interiorul organismului implic un schimb transmembranar. Prin urmare, substanele exogene trebuie s traverseze una sau mai multe membrane biologice nainte de a ajunge la centrii activi. Traversarea membranelor este condiionat de: natura chimic i organizarea moleculelor constitutive ale membranei; proprietile fizico-chimice ale substanei, structura fizico-chimic a moleculelor mediului de o parte i de cealalt a membranei.

2.1. Definiia i clasificarea membranelor celulare

Membranele celulare reprezint structuri complexe ce delimiteaz i compartimenteaz coninutul celular. Arhitectura tuturor membranelor celulare (membrana plasmatic i membranele organitelor) prezint drept caracteristic comun asamblarea prin legturi necovalente a biomoleculelor componente (lipide i proteine) ntr-o structur dinamic i fluid. Elementul structural fundamental al membranelor celulare, dublul strat lipidic, definete modul de organizare al lipidelor i se comport ca o barier impenetrabil pentru majoritatea moleculelor hidrofile (aqua-solubile). Proteinele membranare, asociate dublului strat lipidic, asigur funcionalitatea membranelor, ele fiind implicate n multiple procese: transportul molecular i ionic transmembranar; realizarea conexiunilor intercelulare i a ancorrii celulelor n matricea extracelular; desfurarea reaciilor enzimatice asociate structurilor membranare; controlul fluxului de informaie dintre celul i mediul nconjurtor prin recunoaterea, legarea i transmiterea moleculelor-semnal; imunitatea celular. Grefarea seturilor distincte de proteine n dublul strat lipidic, ct i stabilirea unui anumit raport ntre principalele molecule componente conduc la clasificarea membranelor celulare n trei tipuri: Membrana citoplasmatic (membrana plasmatic, plasmalema) este o structur bidimensional continu (grosimea 6-10 nm), cu proprieti caracteristice de permeabilitate selectiv, ce confer individualitate celulei, separnd-o de mediul nconjurtor. Membranele interne ale celulelor eucariote endomembranele - (grosimea 6 nm) compartimenteaz spaiul intracelular, delimiteaz organitele celulare (nucleu, reticul endoplasmatic, aparat Golgi, mitocondrii, lizozomi, peroxizomi), crend astfel spaii adecvate reaciilor enzimatice celulare. Membranele speciale prezint particulariti structurale, n aceast categorie ncadrndu-se: teaca de mielin, o structur multimembranar derivat din membrana

26

plasmatic a celulelor Schwann ce nconjoar i izoleaz axonul celulelor nervoase; discurile suprapuse localizate n regiunea extern a celulelor fotoreceptoare din retin.

Fig. 4. Structura inframicroscopic a celulei 1-membrana celular; 2endoplasma (hialoplasma); 3ergastoplasm; a-reea endoplasmatic (membrane cu dublu contur); b-granulaii fine (microzomi); 4-filamente intracelulare (descoperite n celule epiteliale, fibroblati, n celule nervoase); 5-vacuol; 6-granule lipidice; 7-centrul celular; 8centrosfer; 9-nucleu; c-membrana nucleului; d-pori n membrana nucleului; 10-nucleol; 11-aparatul Golgi; 12-mitocondrii

2. 2. Organizarea membranelor celulare

n prezent se bucur de acceptare unanim modelul n mozaic fluid lipido-proteic elaborat n 1971-1972 de ctre Singer i Nicolson care satisface condiiile de stabilitate termodinamic ale sistemelor membranare. Elementele care l-au impus constau pe de o parte, n confirmarea dublului strat lipidic ca element fundamental al structurii membranelor i pe de alt parte, n definirea modului de asamblare a proteinelor n dublul strat lipidic. Autorii concep membrana celular ca pe un fluid structurat alctuit dintr-un bistrat lipidic aflat ntr-o stare de cristal lichid i care este penetrat local sau parial de proteine globulare cu caracter insular (fig. 5). Lipidele i proteinele membranare, relativ libere prezint mobilitate n planul membranei executnd micri de difuziune i rotaie n jurul propriilor axe. La componentele de baz ale membranelor - lipidele i proteinele - se adaug constant carbohidraii, apa i o serie de ioni. Pe partea citoplasmatic membrana este susinut (n numeroase cazuri) de o reea de proteine fibrilare ce constituie un citoschelet.

27

Fig. 5. Structura unei membrane biologice (Stryr, 1991) a i b = proteine periferice de membran; c = protein de membran (tip lecitinic): traverseaz bistratul lipidic; d = protein de membran (tip Ig): traverseaz bistratul lipidic Modelul mozaicului fluid ofer cadrul conceptual adecvat pentru explicarea att a funciilor de transport, ct i a plasticitii conformaionale a celulelor, a proceselor imunologice i a efectelor produse asupra membranelor de diferii ageni chimici (hormoni, mediatori chimici, medicamente, toxine etc.). Membranele biologice au structuri fluide dinamice n continu modificare; n fiecare moment, proteinele i lipidele din structura membranelor sunt nlocuite cu altele noi. Ribozomii i reticulul endoplasmatic, care sintetizeaz aceste proteine de membran, le nzestreaz cu capacitatea de a se ndrepta spre anumite inte, ctre anumite sedii celulare (transport vectorial). n celula vie, sinteza de membrane se face prin extensia membranelor preexistente (pattern-uri de membran) n cursul procesului de multiplicare celular (mitoza sau meioza), cnd celula mam transmite celor dou celule fiice o dat cu zestrea celular i o anumit zestre de membran. Aceast motenire a pattern-urilor de membran de ctre celulele fiice de la celula mam reprezint un aspect al continuitii n timp i spaiu a sistemului de membrane. Aceste aspecte de continuitate asigur de fapt continuitatea de funcionare a celulei i implicit, desfurarea normal a metabolismului celular. S-a dovedit c toate moleculele proteice din structurile de membrane vegetale sau animale au via relativ scurt, fiind nlocuite mai rapid (rapid turnover) sau mai puin rapid (slow turnover). Din acest aspect reiese c orice tip de membran biologic are o continuitate de organizare, dar nu i continuitate de substan, deoarece din stratul proteic sunt nlocuite n permanen un numr de molecule de aminoacizi vechi cu molecule noi corespunztoare, dei funcia respectivei proteine rmne n permanen nemodificat.

2.2.1. Caracterizarea componentelor lipidice ale membranelor celulare

Lipidele membranare formeaz un dublu strat cu grosimea de 4-5 nm: un strat extern, orientat spre faa extern a membranei i un strat intern, orientat spre faa intern citoplasmatic a membranei. Lipidele sunt molecule insolubile n ap, dar nalt solubile n solveni organici (cloroform). ntr-un m2 de dublu strat lipidic se gsesc 5 x 106 molecule lipidice. Dei compoziia lipidic a diferitelor membrane variaz mult, fosfolipidele, colesterolul i glicolipidele reprezint clasele de lipide cel mai frecvent ntlnite n structura membranelor biologice (tabelul 1). 28

Tabelul 1. Procent din greutatea molecular total a lipidelor membranare

Membrana plasmatic a celulei hepatice (%) 17 54 7 22 Membrana plasmatic a eritrocitului (%) 23 60 3 13 Teaca de mielin (%) 22 42 28 8 Membrana extern i intern a mitocondriei (%) 3 76 urme 21 Membrana reticulului endoplasmatic (%) 6 67 urme 27

Lipide Colesterol Fosfolipide Glicolipide Alte lipide

Bistraturile lipidice membranare sunt formate din fosfo- i glicolipide, ele reprezentnd bariere de permeabilitate pentru moleculele hidrosolubile, dei straturile sunt aproape fluide. Aceste lipide de membran sunt amfipatice, conin un cap hidrofilic, care are o varietate de structur relativ mic i poart sarcini electrice i o coad hidrofob, format din 12-24 atomi de carbon, lipsit de sarcini electrice i cu o mare varietate de structur care se datoreaz unor acizi grai deosebii. Acizii grai pot fi saturai sau nesaturai, ei difer cantitativ i calitativ n raport cu specia, vrsta, condiiile de via etc. Cu ct gradul de nesaturare al acizilor este mai mare, cu att fluiditatea structurilor membranare este mai mare. Datorit acestui caracter amfipatic, lipidele, n mediu lichid, pot forma: micelii (fig. 6a), strat dublu linear (fig. 6b), strat dublu circular (lipozomi, fig. 6c).

Fig. 6. Cele trei forme pe care le pot lua moleculele de lipide n mediu lichid datorit proprietilor lor amfipatice n acest strat dublu, capul hidrofilic este orientat spre exterior, iar coada hidrofob este orientat spre interior. Moleculele de lipide se deplaseaz foarte rapid rotindu-se n jurul propriului lor ax i difuznd lateral, n acest fel asigurnd fluiditate de membran. Fluiditatea este asigurat de prezena acizilor grai i a colesterolului. La eucariote, proporia fosfolipide/colesterol n membrana plasmatic este de 1/1, colesterolul aflndu-se la extremitatea hidrofil, prevenind scderea fluiditii membranelor. Procesul de formare a acestui bistrat lipidic n mediu apos este un proces de autoasamblare, rolul major avndu-l fora de interaciune hidrofob (interaciune necovalent). Straturile bilipidice sunt nalt impermeabile pentru ioni i pentru cele mai multe molecule polare (cu excepia apei, care traverseaz foarte rapid aceast membran). Pentru traversarea stratului bilipidic, bistratificat, o molecul necesit o cantitate foarte mare de energie.

29

2.2.2. Componenta proteic a membranelor celulare

n stratul lipidic plutesc proteine rigide hidrofobe. Proteinele reprezint 50% din volumul de membran. n timp ce lipidele au rol de barier de permeabilitate i de delimitare a componentelor biologice, proteinele mediaz aproape toate funciile, de exemplu, proteinele din membrana plasmatic au rol de pompe n transportul transmembranar, receptori, enzime, antigene de membran, iar proteinele din membrana intern a mitocondriilor i cloroplastelor au rol de transductori de energie. Membranele care ndeplinesc funcii diferite conin n structura lor i proteine diferite. Proteinele pot fi inserate n dublul strat lipidic n diferite moduri; acestea ptrund adnc sau chiar traverseaz stratul de lipide al membranei, numindu-se proteine integrale sau intrinseci (tip Ig), altele pot fi implantate la nivelul unui singur strat din cele dou ale membranei lipidice (tip lecitinic), iar altele pot fi ataate doar covalent (adsorbite) la extremitatea polar hidrofil a lipidelor i se numesc periferice sau extrinseci. Proteinele sunt amfipatice, coninnd o regiune hidrofob care reacioneaz cu regiunea hidrofil lipidic (din interiorul stratului lipidic) i o regiune hidrofil situat la suprafaa intern i respectiv extern a membranei. n acest fel cele dou suprafee de membran difer ntre ele prin cantitatea de lipide i proteine, realiznd o asimetrie funcional. n regiunea transmembranar, proteinele de membran conin predominant regiuni hidrofobe cu structur secundar tip -helix i structuri teriare i cvaternare compacte. Proteinele de membran pot forma pete difuze, se pot deplasa spre polii celulei unde sunt eliminate sau pot fi blocate n micarea lor lateral, rmnnd fixe n plan orizontal (formnd agregate care se ancoreaz de alte structuri ale citosolului sau de proteine din membranele celulare vecine). Proteinele periferice (extrinseci) pot fi eliberate prin simpla splare cu soluii saline sau prin modificri de pH (de exemplu, spectrina, localizat pe suprafaa citoplasmei eritrocitelor, sau actina, cu rol n contracia muscular). Proteinele integrale (intrinseci) interacioneaz strns cu hidrocarbonaii din lipidele de membran i nu pot fi disociate dect n prezena detergenilor i a solvenilor organici.

2.2.3. Mobilitatea lipidelor i proteinelor de membran

Lipidele i proteinele de membran difuzeaz rapid n planul membranar, avnd o micare lateral constant, ceea ce face ca o membran biologic s nu fie o structur rigid. Proteinele prezint numai difuziune lateral; lipsa difuziei transverse face posibil pstrarea timp ndelungat a asimetriei de membran. O molecul lipidic poate cltori de la un capt la altul al celulei bacteriene n timp de o secund. Unele proteine de membran difuzeaz n timp de un minut la distan de civa microni; alte proteine (rodopsina) sunt la fel de mobile ca i lipidele, altele sunt virtual imobile (fibronectina). Lipidele prezint difuziune lateral - micare paralel cu planul bistratului (difuziune n planul membranei) sau transvers (tip fleep - flop), adic rotaie spontan a moleculei lipidice de pe o fa a membranei pe cealalt. Este un proces foarte lent. Se produce o rotaie la cteva ore (de exemplu, fosfolipide, urmrite prin tehnica de rezonan magnetic). Pe baza datelor prezentate se poate considera c att fluiditatea dublului strat lipidic, ct i liber deplasare a lipidelor i proteinelor n structurile membranare, constituie principalele elemente ce stau la baza caracterului dinamic al membranelor celulare.

30

2.2.4. Componenta glucidic membranar

Carbohidraii se ntlnesc pe suprafaa tuturor membranelor plasmatice ale celulelor eucariote i reprezint 2-10% din greutatea componentelor membranare. Carbohidraii, sub forma oligo- i polizaharidelor se leag covalent de proteine i lipide formnd glicoproteinele i respectiv, glicolipidele. Dac majoritate proteinelor aflate pe suprafaa celular sunt glicoproteine, numai una din 10 molecule lipidice ale monostratului extern conine carbohidrai. Carbohidraii se ntlnesc i n structura proteoglicanilor, molecule membranare integrale alctuite din lanuri polizaharidice lungi legate de un miez proteic. Proteina din structura proteoglicanilor traverseaz dublul strat lipidic, n timp ce lanurile polizaharidice rmn n afara celulei, constituind parte component a matrixului extracelular. Zaharurile sunt foarte hidrolitice, ele prefer s se orienteze spre suprafaa apoas a membranei (i nu spre miezul hidrofob), deoarece orientarea invers ar cere un consum foarte mare de energie; deci absena respectivei cantiti de energie reprezint o barier puternic n calea rotirii de tip fleep-flop a moleculei de hidrocarbonat. Hidrocarbonaii de pe suprafaa celular au o mare densitate de structur i au rol n recunoaterea intercelular (fa de celulele sistemului imunitar). Structurile de glicoproteine au funcie de receptori, ele primesc informaia din mediul extern i o transmit spre interiorul celulei sub forma unor cascade de reacii biochimice, care au drept consecin modificri ale activitii celulare (activitatea secretorie, de multiplicare, etc).

2.2.5. Glicocalixul
Suprafaa celular este alctuit din trei elemente: cortexul celular (zona periferic citoplasmei), membrana plasmatic i glicocalixul, n cazul celulelor animale. Glicocalixul reprezint zona periferic a suprafeei celulei animale. n structura sa intr att lanurile oligo- i poliglucidice ale glicolipidelor i glioproteinelor membranare, ct i glicoproteine sintetizate de celul i apoi absorbite pe suprafaa celular (Fig. 7). Faptul c cele dou componente ale glicocalixului sunt n acelai timp i elemente ale matricei extracelulare face dificil stabilirea unei linii clare de demarcaie ntre suprafaa celular i matrice. Rolul glicocalixului nu este pe deplin elucidat. Concentraia mare de oligozaharide complexe la suprafaa celular poate sprijini ipoteza implicrii acestei structuri n procese de recunoatere celul-celul sau celul-matrice. De asemenea, majoritatea lanurilor oligozaharidice conin unul sau mai multe reziduuri de acid sialic, molecul cu sarcin electric negativ. Glicocalixul realizeaz deci, distribuia sarcinilor electrice pe suprafaa celulei. n plus, datorit ncrcrii electrice negative, glicocalixul poate funciona ca depozit de cationi (Ca2+) ce sunt mobilizai n celul n funcie de necesitile exprimate la un moment dat.

Fig. 7. Prezentarea schematic a glicocalixului

31

2.2.6. Apa
Apa deine un loc important n structura membranar alturi de celelalte componente chimice. Se gsete n proporie de 30-50 % asociat intim fie structurilor de la suprafa, fie sub form foarte ordonat, structural asemntoare gheii (apa legat chimic). ntr-o astfel de stare, apa joac un rol precumpnitor n procesele de organizare molecular a membranei, intervenind n stabilitatea structurilor proteice i fosfolipidice bistratificate, ca un liant. Permeabilitatea selectiv poate fi privit ca fiind n raport cu apa structuralizat din membran. Modificrile de permeabilitate determinate de procesul de excitaie poate fi consecina topirii structurii hidrice n anumite regiuni.

2.2.7. Asimetria distribuiei componentelor membranare

Imaginea membranei celulare ca o soluie lipidic n care plutesc moleculele proteice pare astzi simplist. n multe celule proteinele i lipidele sunt meninute n regiuni bine delimitate ale membranelor. Distribuia asimetric a moleculelor membranare joac un rol esenial n realizarea funciilor celulare. Distribuia asimetric a compartimentului lipidic pe cele dou fee ale dublului strat lipidic a fost pus n eviden pentru prima dat n membranele eritrocitelor. Astfel, n timp ce n monostratul extern al membranei predomin fosfatidilcolina i sfingomielina, stratul intern conine fosfotidiletanolamina i fosfatidilserina drept componente lipidice majore. Deosebirile dintre aceste lipide nu se limiteaz doar la natura gruprilor polare, ea se refer i la gradul de nesaturare a lanurilor hidrocarbonate, ceea ce, n planul membranei, determin o fluiditate diferit a celor dou straturi lipidice. n acest context este de remarcat faptul c exist i o distribuie asimetric a sarcinilor electrice. Singurul fosfolipid cu sarcin electric negativ, fosfatidilserina, este localizat n monostratul intern al membranei eritrocitare. Implicaiile asimetriei lipidelor la nivel funcional nu sunt nc pe deplin cunoscute. Este posibil ca activitatea diferitelor proteine membranare s fie dependent de microclimatul creat prin prezena fosfolipidelor specifice. De asemenea, activitatea enzimatic a proteinelor asociate structurilor membranare poate fi condiionat de sarcina electric a fosfolipidelor. Localizarea glicolipidelor n monostratul extern al membranelor plasmatice, ct i caracterul lor special sugereaz implicarea acestor molecule ca receptori n procesele de comunicare intercelular. n acelai timp, toate proteinele membranare integrale au o orientare strict n raport cu faa citoplasmatic i cea extern a membranei celulare. n plus, proteinele transmembranare sunt n majoritate molecule glicolizate. n membranele plasmatice lanurile oligozaharidice marcheaz faa exoplasmatic, n timp ce, n membranele organitelor celulare (reticul endoplasmatic, aparat Golgi) ele se gsesc pe faa citoplasmatic. Stricta orientare a glicoproteinelor este corelat cu funciile celor dou fee ale membranelor celulare. Moleculele proteice transmembranare ce conin cistein cunosc i ele o orientare strict. Mai mult, gruprile sulfhidril ale cisteinei formeaz puni disulfurice inter i/sau intra-catenare, doar pe fa extern a membranei. n anumite celule, distribuia asimetric a lipidelor i proteinelor conduce la delimitarea unor domenii specifice n membranele plasmatice. Astfel, membrana celulelor epiteliale este mprit n domenii distincte: apical i latero-bazal, ambele avnd un coninut proteic i lipidic diferit. Ca urmare, celulele epiteliale sunt capabile s mpiedice difuzia moleculelor membranare. Acest lucru se realizeaz prin intermediul jonciunilor strnse ce funcioneaz ca o barier ntre cele dou domenii membranare.

32

2. 3. Mecanismele de transport prin membranele celulare

Celula, din punct de vedere termodinamic, este un sistem deschis, existena sa fiind condiionat de stabilirea unei permanente comunicri cu mediul nconjurtor. Abordnd aceast problem din perspectiva schimbului de substane pe care celula l realizeaz cu mediul extern, un rol major revine membranei plasmatice datorit caracteristicii sale fundamentale, permeabilitatea selectiv. Aceasta face posibil alimentarea celulei cu molecule eseniale (glucoz, aminoacizi, lipide) i eliminarea att a produilor fiziologic activi (enzime, hormoni), ct i a celor rezultai ca deeuri n urma metabolismului celular (CO2, sruri de amoniu, uree). n paralel cu asigurarea continuitii acestor schimburi, permeabilitatea selectiv creeaz cadrul favorabil desfurrii unei activiti metabolice stabile, att prin meninerea n spaiul intracelular a unei concentraii relativ constante de substane organice, metabolii i electrolii, ct i prin reglarea volumului celular ca rezultat al relaiilor osmotice celul-mediu. Permeabilitatea selectiv se modific dinamic aflndu-se sub influena modificrilor mediului extracelular i a metabolismului celulei. Aceast caracteristic a membranelor celulare prezint particulariti n raport cu diferenierea funcional a celulelor. Selectivitatea difereniat se manifest att la trecerea substanelor din exterior n celul, ct i n sens invers. Deci, la baza noiunii de permeabilitate selectiv st conceptul de membran ca barier a schimburilor celulare. Traficul de substane ce se desfoar att prin membrana plasmatic ct i prin membranele interne ce delimiteaz organitele celulare antreneaz diferite mecanisme de transport.

2.3.1. Procesul calitativ al traversrii membranelor

Se consider c au loc urmtoarele etape (fig. 8): molecula trebuie s avanseze n zona apoas (mediu i zona periferic a membranei), ceea ce se realizeaz dup legile difuziei simple n mediu apos. Fiecare molecul formeaz legturi de hidrogen cu apa din interiorul celulei. Agitaia termic a moleculelor asigur moleculei energia de activare necesar ruperii unor legturi de hidrogen, cu refacerea lor spontan i imediat. n momentul cnd molecula atinge stratul hidrofil al membranei, acesta avnd coninut de ap apropiat de cel al mediului, permite continuarea micrii libere a moleculei. Prin urmare, traversarea stratului exterior hidrofil se realizeaz fr consum de energie (fig. 8, poriunea a); n etapa urmtoare, molecula trebuie s se desprind de stratul hidrofil i s treac n stratul lipofil, ceea ce necesit o energie de activare molecular (fig. 8, poriunea b). n raport cu caracteristicile moleculare, variaz i intensitatea energiei necesare pentru intrarea moleculei n stratul hidrofob; continuarea difuziei n startul hidrofob nu reclam energie de activare suplimentar pentru c trebuie s se desfac legturi de hidrogen (fig. 8, poriunea c); n fine, molecula prsete stratul hidrofob (fig. 8, poriunea d), fenomen facilitat de formarea legturilor de hidrogen cu moleculele de ap din stratul membranar proteic hidrofil interior, de unde trece prin acelai fenomen, n citoplasm (fig. 8, poriunea e).

33

Fig. 8. Modificrile energetice care nsoesc traversarea unei molecule hidrosolubile printr-o membran biologic (dup Maziliak). Se descriu urmtoarele posibiliti de traversare a unei membrane: proces pasiv: transfer pasiv, care asigur trecerea moleculelor mici hidrosolubile, inclusiv apa, prin simpla filtrare prin pori (filtrarea) i a moleculelor mari liposolubile prin dizolvare n membran (difuzia simpl); proces biochimic: transport specializat, fie activ, fie facilitat; proces biologic: endocitoz, cnd particulele de substan sunt nglobate de membrana celular prin micri de invaginare i transfer astfel spre interior.

2. 3 .2. Transportul ionilor i moleculelor mici prin membranele celulare

Maniera n care substanele trec prin membranele celulare este determinat pe de o parte de caracteristicile substanelor (greutate molecular, dimensiuni, form, grad de hidratare (grad de ionizare) iar pe de alt parte, de compoziia chimic a membranelor. Principalul criteriu de clasificare a tipurilor de transport l reprezint dimensiunile substanelor ce strbat membrana. Astfel, n timp ce ionii i moleculele mici traverseaz dublul strat lipidic prin difuziune sau implicnd proteinele membranare, transportul macromoleculelor i al particulelor necesit sechestrarea lor n vezicule delimitate de membrane. Un alt criteriu de clasificare este consumul de energie metabolic sub form de ATP. Din acest punct de vedere se disting dou tipuri de transport: pasiv i activ. 2.3.2.1.Transportul pasiv Traversarea membranelor celulare de ctre molecule i ioni n sensul gradientului de concentraie sau electrochimic (compus din gradientul de concentraie i gradientul electric) poart numele de transport pasiv. Procesul nu implic consum de energie (ATP), dimpotriv, el decurge cu pierdere de energie liber. Unele gaze (O2, CO2) i unele molecule mici cu caracter hidrofob sunt capabile s strbat dublul strat lipidic membranar prin difuziune simpl. Transportul moleculelor solubile n ap (glucoz, nucleotide, amonoacizi) i al unor ioni (H+, K+, Na+, Ca2+) nu poate fi realizat n aceeai manier, necesitnd participarea unor proteine membranare specifice. Acest tip de transport este denumit difuziune facilitat. a. Difuzia simpl Cel mai simplu tip de transport pasiv const n difuzia fizic a moleculelor determinat de gradientul lor de concentraie sau electrochimic. n difuzia simpl moleculele nu sunt modificate chimic sau asociate altor specii moleculare n timpul trecerii lor prin membran. Viteza cu care se desfoar etapa trecerii moleculelor din mediul apos extracelular/intracelular n interiorul hidrofob al membranei este dependent de coeficientul de partiie (K) al moleculei. Acesta msoar afinitatea relativ a moleculei pentru mediul lipidic n raport cu apa, ilustrnd gradul de hidrofobicitate al moleculei. Astfel, cu ct valoarea sa este mai mare, cu att molecula are un mai pronunat caracter hidrofob, deci este mai liposolubil i ptrunde mai repede n celul. Se constat existena unei relaii de direct proporionalitate ntre coeficientul de partiie al unei molecule i 34

constanta de permeabilitate (P) a membranei celulare. Datorit vscozitii dublului strat lipidic, viteza de difuziune a moleculei prin interiorul membranei este mult inferioar vitezei sale de difuziune printr-un mediu apos. n cazul transportului prin difuzie simpl a moleculelor fr sarcini electrice, se respect legea lui Fick. Aceasta enun c viteza de difuziune (dn/dt) a unei molecule este proporional cu diferena de concentraie, suprafaa (S) i coeficientul de permeabilitate (P). Deci, viteza de difuziune a unei molecule prin membran conform legii lui Fick este: unde: S - reprezint suprafaa membranei P este coeficientul de permeabilitate al membranei; C1aq, C2aq - sunt concentraiile mediilor apoase separate de membrana celular. Difuzia simpl prin membranele celulare se realizeaz cu pierdere de energie liber. Calculele termodinamice demonstreaz c la deplasarea unui mol de substan fr sarcin electric, de la o concentraie de 1M la o concentraie de 0,1M (la 250C) sistemul pierde o energie liber de 1,359 kcal/mol. n difuzia moleculelor ncrcate electric legea lui Fick nu mai are aplicabilitate, procesul fiind exclusiv determinat de gradientul electrochimic. b. Difuzia facilitat n procesul de difuziune facilitat, transportul pasiv al moleculelor prin membran este mediat de proteine membranare numite permeaze. Spre deosebire de difuzia simpl, difuzia facilitat se caracterizeaz prin specificitate fa de molecula transportat. Permeaza leag reversibil i complementar la un situs activ o singur specie molecular sau molecule aparinnd unei singure familii. n urma legturii ce are loc pe o fa a membranei se formeaz un complex molecul-permeaz ce traverseaz dublul strat lipidic, disociindu-se pe cealalt fa a membranei cu eliberarea moleculei transportate. Unul din modelele care au ncercat s explice maniera n care se desfoar difuzia facilitat este modelul transportorilor crui (carrier model). n acest model se consider c transportorul exercit o micare de navetare sau rotaie n dublul strat lipidic, fiind astfel capabil s treac molecula transportat de pe o fa pe alta a membranei celulare. Deoarece difuzia facilitat este un tip de transport pasiv, iar rotirea unei molecule proteice n planul membranei este defavorizat din punct de vedere energetic, modelul carrier rmne aplicabil numai pentru transportul anumitor ioni de ctre polipeptide antibiotice (de exemplu, transportul ionului de K+ de ctre valinomicin). Cea mai bine caracterizat permeaz, D-gluco-permeaz (sau D-hexozo-permeaz), catalizeaz difuzia facilitat a glucozei prin membrana eritrocitelor (Fig. 6). D-glucopermeaza este o protein transmembranar alctuit de 12 -helixuri care au n majoritate un caracter hidrofob. Are o greutate molecular de 45.000 Da. (dn/dt)= PxS (C1aq C2aq)

Fig. 9. Mecanismul transportului mediat de Dgluco-permeaz n parte, permeabilitatea selectiv a membranelor plasmatice poate fi explicit prin existena proteinelor canal. Aceste proteine transmembranare, strbtute de un canal delimitat de aminoacizi hidrofili, formeaz porii membranari. Proteinele canal specializate n transportul selectiv al diferitelor specii ionice se 35

numesc proteine canal de ioni. Transportul mediat de aceste proteine nu necesit consum de energie, ionii difuznd cu viteze diferite prin membran n sensul gradientelor de concentraie. Proteinele canal de ioni se deschid tranzitoriu, caracteristic ce a sugerat denumirea lor de proteine canal cu poart (gate channels). De regul, deschiderea canalelor reprezint un rspuns celular la diferite semnale recepionate de membrana plasmatic. n funcie de factorii ce comand deschiderea porilor, se deosebesc trei tipuri de proteine canal: cu poart comandat de stimuli mecanici; cu poart comandat de liganzi. cu poart comandat de voltaj (dependente de valoarea potenialului de membran) (Fig. 12). n acest caz canalele se deschid n urma legrii la un receptor a unei molecule semnal ce poate fi un mediator extracelular (neurotransmitor) sau un mediator intracelular (ion, nucleotid, protein de legare a GTP) (Fig. 10, 11);

A Fig. 10. Modificarea conformaional a receptorului acetilcolinic - protein canal de Na+ cu poart comandat de ligand.

B Fig. 11. Schema jonciunii neuromusculare i principalele proteine canal de ioni implicate de declanarea contraciei musculare sub aciunea impulsului nervos. A - starea de repaus; B - starea activat

Fig. 12. Structura canalului de Na+ cu poart comandat de voltaj 2.3.2.2. Transportul activ Deplasarea moleculelor i ionilor prin transport pasiv evolueaz spre egalarea concentraiilor de o parte i de alta a membranei i, implicit, dispariia potenialului 36

membranar. Pentru a menine homeostazia mediului intracelular, celula i-a creat mecanisme de transport activ capabile s deplaseze moleculele i ionii n sens invers gradientelor lor de concentraie i electrochimic. Acest tip de transport este mediat de proteine specifice i prezint toate caracteristicile cinetice ale difuziei facilitate. Plusul de independen fa de compoziia mediului nconjurtor, pe care transportul activ l ofer celulei, implic consum de energie metabolic. Astfel, eritrocitele utilizeaz 50% din energia stocat n moleculele de ATP pentru a menine o concentraie ionic relativ constant a mediului intracelular. n funcie de modul n care este utilizat energia se deosebesc dou tipuri de transport activ. n transportul activ propriu-zis, molecula transportoare are funcie ATP-azic, fiind capabil s utilizeze direct energia rezultat n urma hidrolizei ATP n procesul de transport (pompele ionice). Al doilea tip de transport activ poart numele de cotransport. n cadrul acestui transport moleculele i ionii sunt deplasai mpotriva gradientelor lor de concentraie pe seama energiei eliberate n transportul pasiv al altor molecule i ioni. n unele cazuri de cotransport, energia moleculelor de ATP este utilizat indirect prin intermediul gradientelor ionice. a. Pompele ionice Se cunosc trei clase de proteine ce cupleaz direct transportul ionilor mpotriva gradietelor lor electrochimice cu desfacerea legturilor fosfodiesterice din molecula de ATP i formarea de ADP (adenozin difosfat) i fosfor anorganic (P): clasa ATP-azelor P; clasa ATPazelor V (H+-ATP-aze); clasa ATP-azelor F. Clasa ATP-azelor P conine trei reprezentani. Primul reprezentant al acestei clase i cel mai rspndit - Na -K+-ATP-aza (pompa de Na+-K+) prezent n membranele plasmatice ale tuturor celulelor animale este unul dintre cele mai studiate sisteme de transport activ. Na+ K+-ATP-aza pompeaz Na+ n mediul extracelular i introduce K+ cu sarcin n celul. Mecanismul de aciune Na+-K+-ATP-aza, dei insuficient cunoscut, are la baz modificarea conformaional a enzimei. Astfel, este posibil formarea unor canale n proteina transportoare ce permite trecerea ionilor de Na+ i K+ prin membrana plasmatic. Energia ce asigur conversia conformaiei enzimei (E1 E2) ct i pomparea ionilor mpotriva gradientului lor de concentraie este furnizat de hidroliza moleculelor de ATP (Fig. 13). Funcionarea Na+-K+-ATP-aza asigur meninerea unei concentraii intracelulare relativ ridicat a ionilor de K+ ce condiioneaz desfurarea normal a unor procese celulare vitale cum sunt: biosinteza proteic, activitatea catalitic a unor enzime (piruvat-kinaza) i meninerea potenialului de membran a celulelor excitabile. Al doilea reprezentat al clasei de ATP-azei P este Ca2+-ATP-aza (pompa de Ca2+). Este localizat n membranele plasmatice asigurnd meninerea unei concentraii intracelulare sczute a ionilor de Ca2+. n celulele musculare enzima este prezent n membrana reticulului sarcoplasmic, fiind implicat n transportul ionilor de Ca2+ din citosol n acest organit celular. Traficul Ca2+ prin membrana reticulului sarcoplasmic n celulele musculare, mediat de Ca2+ATP-aza, este esenial n procesul de contracie relaxare muscular. Pomparea ionilor din reticulul sarcoplasmic n citosol determin contracia muscular, n timp ce nlturarea ionilor din citosol permite relaxarea muscular. O protein capabil s lege specific ionii de Ca2+ a fost identificat i n citosol. Proteina numit calmodulin este alctuit dintr-un singur lan polipeptidic i are o funcie reglatoare modificnd viteza de pompare a ionilor de Ca2+ n raport cu concentraia citosolic a acestora. Ultimul constituient al ATP-azelor P transport ionii de H+, n unele cazuri mpreun cu K+.

37

Fig. 13. Schema funcionrii Na+ - K ATP-azei a. proteina aflat n conformaie E1 leag Na+ la situsurile aflate pe faa citoplasmatic a subunitii ; b. legarea ATP este urmat de hidroliza acestuia i fosforilarea unui rest de Asp din structura proteinei (E1~P); c. energia legturii macroenergice E1~P asigur modificarea conformaional a proteinei (E1-P) i transportul Na+ n spaiul extracelular; d. K+ se leag la situsurile de pe faa exoplasmatic ale subunitii ; e. defosforilarea proteinei transportoare conduce la modificarea conformaiei (E2); f. transportul K+ prin membrana plasmatic i eliberarea lui n citosol are loc simultan cu revenirea proteinei transportoare la conformaia iniial (E1). Clasa ATP-azelor V (H+ - ATP-aze) este reprezentat de proteine transportoare ce realizeaz deplasarea protonilor n sens invers gradientului lor de concentraie. H+-ATP-aza este prezent n membranele plasmatice ale celulelor ce secret produi acizi (membrana apical a celulelor epiteliale ce mrginesc lumenul vezicii urinare) i n membranele lizozomale. Pompa de H+ dependent de ATP din membranele lizozomale are rolul de a menine un pH sczut (4,5-5) n interiorul acestui organit celular. Clasa ATP-azelor F, ca i cele ale clasei V sunt responsabile de transportul protonilor. Ceea ce caracterizeaz ATP-azele din clasa F, localizate n membrana mitocondrial, este faptul c acioneaz n sensul cuplrii-deplasrii H+ de la o concentraie mai mare la una mic cu sinteza ATP din ADP i P. b. Cotransportul activ al ionilor i al moleculelor prin membrana plasmatic nu utilizeaz n toate cazurile direct energia eliberat prin hidroliza ATP. Folosirea energiei gradientelor ionice n transportul transmembranelor activ constituie o cale indirect de utilizare a energiei stocate n ATP. Deplasarea ionilor i moleculelor mpotriva gradientelor lor de concentraie cuplat obligatoriu cu transportul pasiv al altor ioni - numii ioni cotransportai - definete procesul de cotransport. n acest transport activ, ionii de Na+ au un rol important n transportul zaharurilor i aminoacizilor n celul. Sunt descrise trei aspecte ale cotransportului: 1) uniport; 2) sinport; 3) antiport. Transportul uniport reprezint trecerea prin membran, la un moment dat, a unei singure specii moleculare sau ionice, fr a fi cuplat cu micarea altei specii moleculare. n acest caz, moleculele neutre nu se acumuleaz mpotriva gradienilor de concentraie, ci transportul lor prin membran este facilitat de gradientul de concentraie sczut i catalizat de o protein de import numit importer (fig. 14 a).

38

Fig. 14. Mecanisme de cotransport

Fig. 15. Proteina ce realizeaz simportul glucoz - Na+ asigur acumularea glucozei, mpotriva gradientului de concentraie, n celulele epiteliale ce delimiteaz lumenul intestinal. Na+K+-ATP-aza menine gradientul electrochimic al Na+ prin pomparea ionilor n afara celulei epiteliale. Cooperarea celor dou proteine transportoare face posibil preluarea continu a glucozei din lumenul intestinal. Tipul simport reprezint cotransportul a dou specii deosebite (o structur chimic solvit i union ncrcat H+) n aceeai direcie, purtai fiind de ctre o protein porter (fig. 14, b1). Dintre toate sistemele de simport cel mai bine cunoscut este simportul de lactoz n celula bacterian (Escherichia coli) (fig. 14, b2). Antrenarea n circulaie sanguin a glucozei absorbit din lumenul intestinal i deplasarea aminoacizilor din tubii renali n snge reprezint procese cu o desfurare similar, n care un rol important l joac celulele epiteliale intestinale i respectiv, tubulare. Ptrunderea acestor molecule n celulele epiteliale este cuplat obligatoriu cu intrarea ionilor de Na+. Simportul este asigurat de proteine specifice localizate n regiunea apical (cu microvili) a membranei plasmatice (fig. 15). 39

Sistemul antiport reprezint transportul de interschimb (fig. 14, c) ntre dou substraturi solubizante n dou direcii opuse, transport catalizat de o protein antiporter. Are loc schimbarea unei specii moleculare cu alta, de exemplu Na+ n locul ionului de H+, sau Cl- n locul gruprii HCO3-. Prin acest tip de transport activ, Na+ este transportat intracelular, iar concomitent Ca2+ este scos n spaiul extracelular; acest antiport reuete s menin sczut nivelul citosolic al calciului n multe celule. Majoritatea acestor tipuri de transport activ simport/antiport, n celulele animale, sunt declanate de gradieni de Na+, generai, la rndul lor, de pompe ionice de Na+- K+-ATP-az. Proteinele uniporter, simporter i antiporter au structuri asemntoare i funcioneaz prin mecanisme similare. Cele trei tipuri de transport , uniport, simport i antiport au fost descrise nti la bacterii (Escherichia coli), ulterior dovedindu-i valabilitatea n toate celulele organismelor vii (fungi, plante, animale). c. Transportul apei i reglarea volumului celular Presiunea osmotic - factor critic n transportul molecular de ap Deplasare moleculelor de ap prin membrana plasmatic sau printr-un strat de celule este rezultatul aciunii diferenei de concentraie a celor dou soluii separate de membran (stratul de celule) i /sau gradientul de presiune hidrostatic. Mecanismul transportului molecular de ap prin dublul strat lipidic nu este nc cunoscut. Studii recente sugereaz posibilitatea existenei unor proteine canal de ap la nivelul membranelor plasmatice. Reglarea volumului celular i a presiunii osmotice interne n anumite limite, celulele sunt capabile de a-i modula tensiunea osmotic intern i prin aceasta i pot menine volumul relativ constant. Introducerea unei celule ntr-un mediu hipertonic (cu o concentraie salin superioar coninutului celular) este urmat de scderea pH-ului citosolic, fapt ce determin activarea sistemului antiport Na+-H+ i Cl-HCO3-. Primul sistem asigur intrarea n celul a Na+ n schimbul ieirii H+. Al doilea sistem acioneaz n sensul deplasrii Cl- n celul i exportul de HCO3-. Speciile ionice exportate n mediul extracelular (H+ i HCO3-) sunt generate n celul ca rezultat al aciunii anhidrazei carbonice asupra produsului final al metabolismului celular CO2. Influxul de Na+ i Clconduce la creterea concentraiei saline i a tensiunii osmotice celulare ce fac posibil intrarea moleculelor de ap n celul i n unele cazuri restabilirea volumului celular iniial (fig. 16).

Fig. 16. Principalele proteine transportoare implicate n reglarea volumului celular, n condiiile n care celula se gsete ntr-un mediu hiperton (0,25 M NaCl)

40

2.3.3. Transportul macromoleculelor i particulelor prin membrana plasmatic

Schimbul de substane pe care l realizeaz celula cu mediul nconjurtor nu este limitat numai la ioni, molecule mici i ap. Diferitele macromolecule (proteine, polinucleotide, poliglucide) i particule traverseaz membrana plasmatic prin mecanisme de transport mediate de vezicule. Se disting dou tipuri de transport: exocitoza i endocitoza. Prin exocitoz macromoleculele sintetizate n celul sunt excretate n spaiul extracelular. Endocitoza este implicat n transportul n celul a diverselor molecule, ct i a fraciunilor din fluidul interstiial (pinocitoza). Dei decurg dup mecanisme diferite, cele dou procese de transport menionate prezint unele caracteristici comune: sechestrarea moleculelor i a particulelor transportate n vezicule; asigurarea unui transport strict direcionat; rolul critic al procesului de fuziune membranar. Materialele ce ptrund n celul prin endocitoz sunt fie supuse aciunii enzimelor hidrolitice lizozomale, fie eliberate din nou n mediul extracelular. De cele mai multe ori macromoleculele de secreie sunt eliberate din celul prin aceeai regiune a membranei plasmatice prin care ele au ptruns. Exist ns situaii n care macromoleculele traverseaz spaiul celular fiind secretate printr-o alt regiune membranar. Acest ultim tip de transport poart numele de transcitoz. Procesul de exocitoz st la baza desfurrii secreiei celulare (fig. 17). Studiul transportului macromoleculelor din celul n mediul extracelular sugereaz existena a dou tipuri de exocitoz: constitutiv i reglat (fig. 18). Exocitoza constitutiv este comun tuturor celulelor i asigur eliminarea continu a macromoleculelor sintetizate n spaiul extracelular. Secreia celular de hormoni, neurotransmitori i enzime digestive este realizat prin exocitoz reglat. n acest caz moleculele sunt mpachetate n vezicule de secreii, iar fuziunea lor cu membrana plasmatic este comandat de un semnal extracelular, de cele mai multe ori, un mesager chimic.

Fig. 17. Calea clasic de transport a moleculelor de secreie n spaiul extracelular 41

Fig. 18. Prezentarea schematic a exocitozei constitutive i reglate Endocitoza definete transportul mediat de vezicule din mediul extracelular n celul al unor macromolecule, ct i a substanelor dizolvate n lichidul interstiial (fig. 19). n funcie de mecanismul procesului de endocitoz distingem: endocitoza mediat de receptori i pinocitoza. Endocitoza mediat de receptori, reprezint un tip de transport specific i eficient al macromoleculelor. n urma recunoateri i legrii lor la receptori de membran, macromoleculele intr n celule sub forma complexului de ligand-receptor, fr a fi nsoite de fluidul extracelular. De exemplu, colesterolul circul n snge legat de o protein cu care formeaz complexe numite lipoproteine cu densitate sczut (LDL) (fig. 20).

Fig. 19. Calea urmat de particulele ce au ptruns n celul prin endocitoz

Fig. 20. Endocitoza mediat de receptori pentru LDL 42

Procesul de endocitoz mediat de receptoriare o semnificaie biologic foarte larg, prezentnd cteva aspecte particulare deosebit de importante i anume: eliberarea metaboliilor eseniali ctre celule a colesterolului, a complexelor vitaminice B12, a ionilor de fier, care sunt recunoscui de ctre receptorii de suprafa ai celulelor, fiind fixai i importai intracelular; modularea rspunsului la muli hormoni de natur proteic i factori de cretere (de ex insulina, factorul de cretere epidermic, etc). Endocitoza ndeprteaz aceti hormoni din circulaie i fie celula, temporar, mai puin receptiv la acetia, prin scderea numrului de receptori celulari; captarea proteinelor intite pentru distrugere i eliberarea acestora ctre lizozomi(de ex celulele hepatice capteaz i distrug glicoproteinele plasmatice senescente). Majoritatea receptorilor de pe suprafaa celulelor care mediaz endocitoza sunt glicoproteine transmembranare. Aceti receptori au: un domeniu extracelular; 1-2, helixuri transmembranare; mic regiune citosolic. Muli dintre aceti receptori sunt localizai n anumite regiuni ale membranei plasmatice, care ulterior invaginndu-se vor forma cavele (coate pita). Partea citosolic a acestor zone, constituie un strat gros de clatrin (protein ce va forma o reea n jurul veziculelor membranare). Caveolele reprezin 2% din suprafaa unei celule animale. Mecanismul endocitozei Endocitoza ncepe cu invaginarea unei asemenea regiuni din membrana plasmatic, cu formarea unei caveole; clatrina formeaz o reea n jurul acesteia pe care apoi o nchide rezultnd n final o vezicul cu manta de clatrin(diametrul de 800A). Vezicule prinde rapid clatrina i devine endozom (receptozom). Endozomii fuzioneaz i formeaz vezicule mai mari cu diametrul de 2000-6000A (n circa 20 de secunde).Caracteristic pentru endozomi este pH-ul acid care determin disocierea celor mai multe complexe receptor proteine; rezult deci c soarta substratului este decisiv la acest nivel. Eliberarea clatrinei din vezicule reprezint un moment cheie n endocitoz deoarece prezena acestei mantale proteice n jurul veziculei ar mpiedica transmiterea proteinelor importate i a receptorilor ctre destinaiile lor. Clatrina este reciclat de ctre o enzim activat de ATP. Acidifierea endozomilor prin aciunilor unor pompe protonice (activate de ATP) duce la disocierea complexelor receptor-proteine, etap absolut necesar pentru sortarea proteinelor i dirijarea lor ctre destinaii specifice. n raport cu mrimea i complexitatea particulelor endocitate, se disting dou variante particulare ale endocitozei i anume: fagocitoza: endocitoza macromoleculelor sau a particulelor mici, corpusculare (virusuri, bacterii, fragmente de celule eucariote sau chiar celule ntregi); pinocitoza: endocitarea moleculelor solubile (toxinele bacteriene). Fagocitoza (gr. fagiere=a mnca) este un proces de transport mediat de vezicule prin care celulele sunt capabile s ingere diverse particule din spaiul extracelular. Dac la organismele unicelulare fagocitoza reprezint principala cale de nutriie, la mamifere procesul joac un rol important n aprarea organismului. Celule specializate numite fagocite sunt capabile s nglobeze i s distrug substane strine, microorganisme, celule mbtrnite i maligne, resturi celulare etc. n organismele animale se disting dou tipuri de celule sanguine ce acioneaz ca fagocite: monocitele (ce migreaz n esuturi dnd natere macrofagelor i ele celule cu funcie fagocitar) i neutrofilele. Legarea particulelor de fagocit - prima etap a fagocitozei - implic participarea receptorilor de membran ce recunosc specific liganzii aflai pe suprafaa particulei int. 43

Pentru a putea fi fagocitate, bacteriile sunt supuse unui proces de opsonizare (gr. opsonein=a pregti pentru mncare) ce const n acoperirea suprafeei bacteriene cu anticorpi i/sau componente ale complementului. Anticorpii se ataeaz pe suprafaa bacteriilor n aa fel nct regiunea prin care acetia se leag la receptori, numit regiune Fc, este expus spre exterior. Receptorul Fc din membrana plasmatic a fagocitelor interacioneaz cu anticorpii legnd cele dou suprafee membranare printr-un mecanism tip fermoar (membrane-zippering-mechanism) ce face posibil fagocitoza (fig. 21). Exist posibilitatea stabilirii unor legturi ncruciate ntre anticorpii ataai pe suprafaa celulei int cu formarea unor aglomerri (clusterii), proces numit patching. Dup un scurt timp de la formarea cluster-ilor, anticorpii se deplaseaz spre un pol al celulei-int genernd o structur de tip calot ce mpiedic fagocitarea celulei int (fig 21). Procesul de calotare (capping) este energo-dependent necesitnd prezena moleculelor de ATP. Activarea receptorilor specifici de ctre anticorpi, componente ale complementului sau diverse oligozaharide de pe suprafaa microorganismelor, prin formarea complexului ligandreceptor, genereaz un semnal intracelular ce declaneaz ingestia. Fig. 21. Fagocitoza se realizeaz printr-un mecanism membrane-zipper A distribuirea uniform a anticorpilor pe suprafaa celulei - int face posibil fagocitarea acesteia B procesul de capping mpiedic fagocitarea celulei-int Pinocitoza este un fenomen observat la macrofage i reprezentat de invaginarea unei pri a membranei celulare, sub influena unor particule mici, solubile (picturi),cu formarea n final a unor vezicule citoplasmatice (cu dimensiuni de 1-2m). Aceast vezicul migreaz de la membrana celular spre regiunea perinuclear, unde fuzioneaz cu lizozomii, coninutul veziculei fiind hidrolizat. Transcitoza definete un tip de transport specific transcelular, al diferitelor microelemente. Procesul este ntlnit n celule (epiteliale) ale cror membrane plasmatice sunt mprite n domenii distincte (apical i latero-bazal) datorit pronunatei asimetriei n distribuia elementelor lipidice i proteice componente. Un exemplu de transcitoz l reprezint transportul din stomac n circuitul sanguin al anticorpilor la nou-nscut, anticorpi primii odat cu laptele matern.

2.4. RECEPTORII DIN MEMBRAN

Receptorii membranari sunt glicoproteine transmembranare, avnd funcia de legare specific i cu afinitate mare a unor molecule extracelulare numite liganzi (hormoni, neurotransmitori, etc.) prin legarea crora se induc rspunsuri celulare caracteristice. Unii dintre aceti liganzi sunt numii mesageri de ordinul I. n interiorul plasmalemei, receptorul activat interacioneaz apoi cu un sistem enzimatic care genereaz n citosol un mesager de ordin II, de obicei cAMP (adenozin-monofosfatul ciclic). Al doilea mesager declaneaz un lan de reacii intracelulare care provoac n ultim instan rspunsul celulei int la ligantul fiziologic n cauz (fig. 22, 23, 24, 25).

44

n cazurile cnd interaciunile molecul semnal receptorul genereaz un nucleotid ciclic (adenozin sau guanozin- monofosfat ciclic) ci provoac un influx rapid de ioni de calciu (Ca+2), n matricea citoplasmatic, datorit deschiderii canalelor de calciu ale membranelor celulare, atunci Ca+2, este considerat ca un mesager de ordinul II. Ligantul de care se leag de receptor prin fore slabe (hidrofobe,legturi de hidrogen), ntr-o zon specific din molecula receptorului. Prin legarea de receptor apar diferite modificri ale plasmalemei ce induc apoi efecte intracelulare. Exemple de modificri ale plasmalemei pot fi: Redistribuirea receptorilor cu agregarea lor n anumite zone ale plasmalemei urmat de endocitoz; Modificri de permeabilitate a membranei, se produc la legarea neurotransmitorilor de membrana postsinaptic i au rol n transmiterea i generarea impulsului nervos Activarea unor enzime din plasmalem (activarea adenilatciclazei de ctre hormonii polipeptidicihidrosolubili). Creterea intracelular a Ca+2 (prin deschiderea unor canale din plasmalem care permit ptrunderea calciului extracelular ce se leag n citosol de proteine specifice, de ex calmodulina). De remarcat c folosirea mesagerilor de ordin I i activarea multor proteine i enzime prin legarea unei singure molecule de ligand au ca rezultat creterea extrem de mare a eficienei receptorilor al cror procent nu depete 1% din totalul proteinelor de membran.

2.4.1.Tipuri de receptori
Se pot distinge dou categorii mari de receptori dup originea ligandului pe care l leag: receptori pentru substane endogene i receptori pentru substane exogene. a. Receptorii pentru neurotransmitori sunt situai n membrana postsinaptic a celulei nervoase, musculare sau alte celule efectuare (de ex, receptorii pentru acetilcolin, adrenalin, noradrenalin, dopamin, serotonin, histamin, acid gamma-amino-butiric, acid glutamic, glicin, acid aspartic, peptide mici ca encefalina).Unele dintre aceste molecule acioneaz strict numai asupra unei celule postsinaptice, altele pot difuza local,influennd mai multe celule, deci avnd efecte de mediatori chimici locali. b. Receptori pentru hormoni sunt localizai diferit n celul,dup cum hormonul este hidrofil sau hidrofos (cum este cazul hormonilor steroizi i tiroidieni), el ptrunde uor prin plasmalema celulei int i se leag de receptorii intracelulari. Dimpotriv, hormonii hidrofili se leag de receptorii din plasmalem i aceti receptori transmit celulei informaia necesar spre a-i modifica metabolismul. n acesta categorie intr receptorii pentru insulin, glucagon, adrenalin, hormoni ai hipofizei, parathormonul. c. Receptori implicai n reacii imunitare sunt receptori pentru antigene endogene (foarte numeroi n plasmalema unor limfocite), receptori pentru anticorpi, receptori pentru complement. Receptorii pentru substane exogene (vehiculate de obicei pe cale umoral) includ: receptori pentru virusuri; receptori pentru antigene strine de organism receptori pentru toxine bacteriene receptori pentru medicamente receptori pentru lecitine Dei conceptul de receptor a fost enunat de mai bine de 100 de ani de ctre P Erlich i M. Hangley, pentru a explica mecanismul de aciune al medicamentelor i toxinelor numai recent, datorit progreselor tehnicii, au putut fi vizualizai unii receptori n esuturi umane obinute post-mortem. 45

2.4.2. Modaliti de comunicare intercelular

Sistemele de comunicare intercelular reprezint cheia nelegerii funcionrii armonioase a celor aproximativ1x 1015celule din organismul uman. Comunicarea ntre celule este necesar ncepnd cu dezvoltarea i organizarea acestora n esuturi,continund cu controlul creterii i diviziunii, ca i pentru coordonarea diverselor activiti ale celulelor mature. Pe de alt parte, ntr-o serie de boli alterarea comunicrii are un rol patogenic important. Cile principale prin care se realizeaz schimbul mesajelor sunt: a) transmiterea indirect la distan b) transmiterea direct ntre celulele aflate n contact. 2.4.2.1.Comunicarea intercelular la distan Celulele pot schimba ntre ele, la distan,mesaje care difuzeaz n spaiul extracelular. Acesta este cazul a dou mecanisme fundamentale de transmitere a informaiei: - transmiterea nervoas, adaptat comunicrii rapide i selective a mesajelor i, - transmiterea umoral, consecutiv eliberrii unui mesager chimic n torentul circulator fiind adecvat transmiterii de informaii generale, de exemplu metabolice. n ambele cazuri membranele celulare au un rol principal ndeosebi prin existena receptorilor specifici 2.4.2.2.Contactul intracelular direct Contactul celular direct, cnd mesajele se transmit fr o difuziune semnificativ n spaiile extracelulare pot fi: permanente tranzitorii episodice Contactul direct permanent se realizeaz de obicei prin intermediul jonciunilor permeabile de tip gap care leag direct compartimentele citoplasmatice ale celulelor ce se influeneaz reciproc i prin care trec molecule mici. Contacul intercelular direct cu caracter efemer, tranzitoriu este exemplificat tipic de cooperarea celulelor sistemului imunitar a crui organizare este astzi comparat cu aceea a sistemului nervos elaborndu-se conceptul de reea imunitar. De asemenea exist i cazul conjugrii celor dou posibiliti de comunicare anterioar cnd mesajele se transmit la distan prin contacte interpuse (de exemplu, cazul reelei nervoase dintre celulele senzoriale i cele musculare). Principalele sisteme de mesageri i semnale intercelulare sunt hormonii (care nu mai sunt considerai produi exclusiv ai glandelor endocrine), neurohormonii i neuromediatorii, ionii i nucleotidele, polinucleotidele i ARN, virusurile i interferonii, factorii de cretere, anticorpii i antigenele, semnalele bioelectrice, etc.

2.4.3. Receptorii celulelor nervoase

Cnd informaia circula rapid de la i ctre anumite locuri, mesajele sunt vehiculate printr-un mecanism electric de ctre nervi prin transmisie chimic ntre neuroni i ntre acetia i celulele receptoare senzoriale sau efectuare. Pe plan celular, legtura este stabilizat prin contacte sinaptice intercelulare de 15 nm dintre celulele care particip la transmiterea mesajelor. Odat cu apariia potenialului de aciune, captul nervului elibereaz neurotransmitorii n spaiul sinaptic de unde o parte sunt distrui i o alta se prinde de receptorii specifici. Astfel de neurotransmitori sunt: acetilcolina, noradrenalina, dopamina, glutamatul, glicina, ATP, substana P (un decapeptid), etc . Dintre receptorii i antigonitii lor, fac parte: receptorul colinergic, sensibil la nicotin (-bungarotoxina); receptorul colinergic, sensibil la muscarin cu antagonist atropina; -adrenergic (fentolamina); -adrenergic 46

(propanolul); si alii . Axonul unui neuron motor de la broasc, parcurgnd cteva sute de micrometrii pe suprafaa unui muchi, formeaz cteva sute de contacte sinaptice la 1m . n fiecare regiune presinaptic se gsesc vezicule presinaptice la captul terminaiei nervoase. Fiecare terminaie conine aproximativ 10000 molecule de acetilcolina. Fuziunea veziculelor cu acetilcolina cu membrana presinaptice este declanat de o cretere rapid i trectoare a concentraiei Ca2+ n butonul terminal al axonului. Probabil c exocitoza se realizeaz prin filamentele mecanocontractile membranare, sub influena Ca2+, dar imediat acest Ca2+ liber dispare n momentul contopirii veziculelor cu membrana presinaptica. Ataarea veziculelor cu acetilcolina de membrana presinaptica se face pe unele proteine intrinseci membranare, aezate pe doua iruri la fiecare sinapsa. n mai puin de 100ms coninutul de circa 10000 molecule de acetil-colina iese prin exocitoza n spaiul sinaptic, legndu-se de receptorii membranari postsinaptici. Receptorii membranari postsinaptici sunt concepui ca nite canale proteice care se deschid la neurotransmitor. Cnd doua molecule dintr-un neuro-transmitaor (acetilcolina) se leag de un receptor postsinaptic, scade energia stadiului conformaional deschis i, n acest mod, canalul proteic al respectivului receptor se va deschide; aceasta se face la ntmplare, ntr-o ms, cele 10000 molecule de acetilcolina trecnd prin cele circa 2000 de canale n acelai timp cu 20000 ioni de Na+ ntr-un sens si tot atia de potasiu (K+) n sens invers. Diferena de voltaj ntre K+ care iese n spaiul sinaptic si Na+ care intra n celula este aproape 0 (zero). Asemenea apropiere de zero depinde de numrul canalelor deschise i de durata acestui stadiu. Deci, acetilcolina se descrca prin impuls nervos (impulsul nervos este acela care deschide canalele proteice) i realizeaz n membrana postsinaptic prin mediaie chimica un potenial de membrana cu ajutorul canalelor receptoare de acetilcolina care transporta K+ i Na+. Propagarea mai departe a influxului nervos depinde de existenta n membrana neuronului a unor canale ce se deschid pentru Na+ la o modificare a voltajului membranar i a cror funcionare de ,,poarta nchis i deschis pentru Na+ este cauza, de fapt a potenialului de aciune (P.A.) (fig. 22). Fig. 22. Influxul nervos (schem) n momentul aplicrii unui stimul are loc o depolarizare locala slab caracterizat printr-o mic modificare de voltaj care deschide canalele pentru Na+, transfernd voltajul mai departe. Ptrunderea Na+, se accelereaz, pana ce suprafaa interna a membranei se pozitiveaz pe o unica poriune. Ieirea ionilor de K+ restabilete repede potenialul negativ al membranei . Inversarea voltajului determin potenialul de aciune ce se propag de-a lungul axonului (fig. 23).

Fig. 23. Canalele de Na+ i K+ (schem) 47

Canalul Na+ este o protein de circa 300000 daltoni, cu un por de 0,4-0,6 nm prin care trec ioni de Na+ cu o molecul de ap. Pe suprafaa sa canalul are grupri ncrcate electric n poziii bine determinate. Asemenea sarcini confer canalului un moment dipol electric mare, care variaz n direcie i mrime de cte ori se schimb conformaia molecular a canalului, dup cum el se nchide i apoi se deschide. Diferena de potenial a membranei n repaus este, dup cum se tie, 70mV ntre incarcatura pozitiv de la exterior i cea negativ de la interior, ceea ce nseamn un cmp electric mare membranar, de aproximativ 100KV/cm. n consecina, dipolii electrici ai proteinelor canalului Na+ se aliniaz cu cmpul electric membranar. Modificrile n intensitatea cmpului membranar pot, s schimbe conformaia proteinei canalului din ,,nchis n ,,deschis, astfel c faa intern (sau citoplasmatic) devine pozitiv prin ptrunderea Na+. Diferena de voltaj transmembranar care deschide canalul Na+ acioneaz de asemenea, asupra canalului, determinndu-i o stare conformaional ,,nchis, diferit de aceea din starea de repaus; este starea de inactivare ce apare mult mai lent ca procesul de activare, aa fel nct canalele rmn deschise scurt timp, pentru ca apoi sa se nchid prin inactivare. Canalele rmn n stare de inactivare cteva ms i abia apoi se nchid trecnd n starea de repaus. Deschiderea canalelor Na+ se face n modul ,,totul sau nimic, deoarece fiecare canal deschizndu-se face s creasc conductana membranei de 8x10-12ohmi (). Apoi, prin scoaterea K+ de ctre canalele K+ n afara fibrei nervoase, se stabilete incarcatura negativ a feei citoplasmatice a membranei; contracarnd canalul Na+. Este de remarcat c, n axon se genereaz un singur impuls care se propag de-a lungul sau n urma unui singur stimul, spre deosebire de corpul neuronului care, produce o serie de impulsuri la diferite intensiti ale aceluiai stimul.

2.4.4. Receptorii care controleaz permeabilitatea ionic

esuturile electrogene ale petilor electrici au puine jonciuni neuromusculare. Membranele lor postsinaptice sunt foarte bogate nsa ntr-un receptor colinergic reglat de nicotina . Cantitile mici de nicotina sensibilizeaz receptorii, iar cele mari l blocheaz . Este vorba de un complex de 3-4 polipeptide cu o greutate molecular de 200000-300000 fiecare polipeptid avnd o GM=40000-65000 . Receptorul este relativ hidrofob i glicolizat cu manoza i galactoza. De un asemenea complex se pot lega, experimental, 4 molecule de bungarotoxina marcat, constatndu-se, dup izolarea membranelor postsinaptice, asistent a 30000 molecule de toxina marcat pe un m2, deci aproximativ 7500 receptori dispui n arii hexagonale la suprafaa membranei. Fiecare complex are 250000 daltoni, fiind compus din 3-4 tipuri de polipeptide de 50000 daltoni, hidrofobe i glicolizate cu manoza i galactoza. Un complex prezint patru situsuri de legare pentru acetilcolina. Aceti receptori, care se gsesc i n creierul mamiferelor, sunt blocai cnd n sngele circulant apare un anticorp al sau datorit unei condiii autoimunitare. n acest caz, nu se mai poate realiza transmisia neuromusculara i apare o maladie muscular degenerativ.

48

Fig. 24. Transmisia chimic prin sinapse O caracteristic a receptorilor este c prezint ntotdeauna trei stri conformaionale ale proteinelor constitutive, i anume, o stare de repaus, una de activitate marcat prin conductanei Na+ i alta de desensibilizare (sau un stadiu rezistent la activare). Exista o multitudine de receptori a cror funcionare este legat de canalele ionofore ale membranei celulare, funcionnd cu ,,poricare se deschid i se nchid sub influenele chimice sau datorit variaiilor de voltaj transmembranar. Receptorul acetilcolinei (antagonistul lui fiind bungarotoxina) acioneaz cnd capteaz neurotransmittorul, deschiznd canalul Na+ ce ptrunde astfel nuntru (Na+). i invers sunt inhibitori ai 49

neurotransmitorilor care au efecte de hiperpolarizare prin intermediul receptorilor specifici (ex. stricnina care sensibilizeaz specific receptorul pentru glicina), crete permeabilitatea pentru Cl- i K+ . Modificrile n conductana membranei pentru Na+ i K+ se datoresc unor canale care se nchid i se deschid selectiv fa de ioni, ca n fibra nervoas. Aa, de exemplu sunt canalele ce las s treac Na+, nu i K+, altele care permit trecerea K+ nu i a Na+ , unele las pentru 100 ioni K+ s mai treac i 85 Na+, altele pentru 100 K+ las s treac doar 7 Na+. Canalele prin care trec 100 K+ i 85 Na+ sunt activate de acetilcolina, avnd un por de 0,8nm diametru, destul de apos. Canalele K+ sunt mult mai mici i au foarte puina ap, cu toate c molecula de K+ este de 30 de ori mai mare dect Na+; densitatea unor asemenea canale este cuprins ntre 0- 10000m2 (fig. 24). Procesul acesta de control a permeabilitii ionice prin receptori este foarte vechi, datnd de la infuzorii ciliai la care exist receptori de presiune. Astfel, cnd un parameci noat i ntlnete un obstacol, brusc se inverseaz btaia cililor i el noat atunci napoi. Experimental, aceasta inversare a btii ciliare se realizeaz n prezenta unei soluii de KCl datorit unui influx al Ca2+ n infuzor, ca rspuns la presiune sau depolarizare. Celulele sunt foarte sensibile la o variaie citoplasmatic a Ca2+, deoarece Ca2+ intracelular este ntr-o mic cantitate (0,01-1 M), fa de cel extracelular (1m M). Chiar cel mai mic influx de Ca2+ care trece prin canalele sale membranare produce perturbri n concentraia sa intracelular, cu modificrile fiziologice corespunztoare. Aa de exemplu, discurile membranare ale celulelor cu bastonae din retina conin ,,pori ionice de Ca2+, care sunt activate de ctre interaciunea luminii cu rodopsina. Creterea Ca2+ citoplasmatic de la 10-8 M la 10-6 M, ca rspuns la lumina, inhiba micarea Na+ prin membrana, hiperpolarizand celula i inhibnd sinapsele de la baza celulei. Tot astfel, activarea unei serii de receptori produce mobilizarea Ca2+ (receptorii colinergici, -adrenergici, angiotensinici, -glucozei, etc) n celula inta. Ca2+, ajuns n celule ,,coopereaz la realizarea exocitozei, contraciei musculare, glicogenolizei, creterii cantitii de c GMP etc. Asemenea procese mediate de Ca2+ se realizeaz printr-o proteina ce leag Ca intrat n celula, denumit calmodulina. Ea se leag cu patru ioni de Ca modificndu-si conformaia, dup care reacioneaz cu o apoenzima sau cu o proteina receptoare, lund o noua conformaie i participnd la tot felul de activiti moleculare, cu diferite rspunsuri fiziologice. Calmodulina interacionnd ireversibil cu Ca2+ formeaz complexul proteina +4Ca2+ a crui activitate este reglat de fluxul deschiderii canalelor de Ca2+.

2.4.5. Cuplajul celular metabolic i electric

Cuplajul celular se realizeaz structural prin jonciuni strnse (,,cu gol i ,,scalariforme), care solidarizeaz celulele adiacente pe anumite poriuni. Astfel, orice cuplaj prin jonciuni dintre celulele adiacente face posibil ca o modificare a potenialului de membrana ntr-o celula s se propage i n celelalte. De exemplu, conductana electric realizata la nivelul jonciunilor ,,cu gol dintre celulele adiacente este de 106 ori mai mare ca n restul membranelor celulare nelegate ntre ele. Trecerea diferitelor molecule prin jonciunile cu gol depind de meninerea n hialoplasma a unei concentraii de Ca2+ sub 10-5 M. Cnd concentraia Ca2+ crete n celula, atunci scade i permeabilitatea jonciunilor i crete iar cnd scade nivelul Ca2+. Studiile electrofiziologice i de microinjecii au presupus existena unor canale la nivelul jonciunilor, de 2nm diametru i 20nm lungime. Aceste canale au fost confirmate de ME care a artat c la nivelul acestor jonciuni exist nite particule intramembranare care formeaz suprafee mozaicate n hexagoane i care reprezint proteinele cu canalele moleculare.

50

2.5. Schimburile energetice n celula vie

Descoperirile tiinifice au permis omului s utilizeze cantiti considerabile de energie. Aceast energie se prezint sub mai multe forme: mecanic, hidraulic, caloric, electric, nuclear etc. Energia este utilizat n maniere foarte variate, suferind numeroase transformri n instrumente sau maini pe care le utilizm zilnic. Astfel, motoarele, care funcioneaz cu benzin sau electricitate, produc energie mecanic. Un receptor radio utilizeaz energia radiaiilor electromagnetice i transform energia electric n energie acustic. n celulele vii exist, de asemenea, sisteme capabile de a converti energie dintr-o form n alta. Astfel, radiaiile solare ( energia luminoas ) sunt transformate n energie chimic; transformarea are loc n cloroplaste. Energia astfel recuperat poate, n continuare, s serveasc la biosinteze sau activiti fizice sau mecanice, graie unor dispozitive care asigur conversia necesar. Aceste transformri au loc n sisteme constituite din ansambluri de molecule specifice. nainte de a studia sistemele biologice care asigur transferul sau conversia energiei, este util s ne amintim cteva noiuni fundamentale de termodinamic.

2.5.1. Noiuni generale de termodinamic

Studiul energiei i transformrile sale reprezint o ramur a fizicii denumit termodinamic. Noiunile generale de termodinamic sunt aplicabile i la sistemele vii. NOTIUNEA DE ENTALPIE. S considerm un sistem, ca acela al unui fenomen fizic sau reacie chimic. Sistemul se caracterizeaz prin stadiul su iniial i stadiul su final. Trecnd de la stadiu iniial la stadiul final, sistemul poate elibera energie n mediul su nconjurtor. Astfel, dac sistemul emite cldur, el va fi exotermic. Invers, dac sistemul consum cldur (energie caloric ), preluat din mediul ambiant, el este endotermic. Pare dificil, dac nu chiar imposibil, de a evalua energia care exist ntr-un sistem izolat, considerat la un stadiu dat. Din contra, putem msura destul de uor schimburile energetice care afecteaz sistemul cnd acesta trece de la un stadiu la altul. Astfel, schimburile de energie intern E , pe care le sufer sistemul, este egal cu cantitatea de cldur Q pe care o primete din mediul exterior, mai puin lucrul mecanic ( travaliul ) pe care l realizeaz, W: E = Q W Aceast relaie demonstreaz capacitatea de conservare a energiei. Conform primului principiu al termodinamicii, energia total a Universului rmne constant. Energia nu se pierde, ci sufer transformri. ntr-o reacie chimic ce se deruleaz sub presiune constant ( de exemplu, presiunea atmosferic ), schimbul caloric care afecteaz sistemul ( cldura de reacie ), constituie, prin definiie, un schimb de entalpie H: E = H - W Dac sistemul nu produce nici un lucru mecanic, atunci relaia este: E = H Aceast relaie permite evaluarea schimburilor energetice interne ale unei reacii care se deruleaz sub presiune constant, cu un volum constant. Putem msura schimburile de entalpie cu ajutorul unui calorimetru. Astfel, cldura de combustie a glucozei se ridic la 673.000 cal/mol, la 20 0 C, la presiune atmosferic: H = - 673.000 cal/mol 51

Valoarea sa este negativ deoarece energia caloric produs de sistem este cedat mediului nconjurtor. VARIAIA ENTALPIEI LIBERE. S considerm o reacie reversibil n condiii izoterme. Aceast reacie tinde s dobndeasc un statut de echilibru. Dac o alt reacie se va opune, prima va realiza un efort (lucru mecanic, travaliu ), pentru a-i obine statutul de echilibru. Energia cheltuit pentru acest efort reprezint un potenial chimic. Aceast energie ( potenialul chimic ), numit i energie liber, este desemnat astzi prin expresia entalpie liber. Cnd reacia realizeaz un lucru mecanic, variaia entalpiei libere ( G ) este negativ i reacia este exergonic. Diminuarea entalpiei libere a sistemului reprezint cantitatea maxim de energie disponibil care ar putea fi transformat n energie chimic. Dac, la o temperatur i presiune constant, variaia entalpiei libere ntre stadiul iniial i stadiul final al reaciei este negativ (F< 0), reacia se poate realiza spontan. Ea va avea loc foarte rapid n prezena unor enzime specifice. Enzima diminueaz energia de activare, care , pe de alt parte, nu depinde de variaia entalpiei libere. n cazul unei variaii de entalpie liber pozitiv (F> 0 ), reacia nu se mai poate realiza spontan. Se spune c este o reacie endergonic (endoergonic)., pentru c ea are loc cu un aport exterior de energie care i este necesar. Acest aport exterior de energie poate proveni din energia radiaiilor luminoase sau din cuplajul cu o alt reacie, n mod obligatoriu, exergonic. Pentru a se putea realiza cuplarea cu o alt reacie, este necesar ca diminuarea entalpiei libere a sistemului exergonic s fie mai ridicat dect consumul sistemului endergonic. Variaiei entalpiei libere este semnificativ prin posibilitatea de a ti dac o reacie are sau nu loc spontan. VARIAIA ENTALPIEI LIBERE I VARIAIA ENTROPIEI. n toate sistemele se pot distinge dou forme de energie, una numit energie intern, alta numit entropie. n sistemul reprezentat de o reacie chimic, energia intern corespunde celei are este reprezentat de diferite legturi chimice i care poate fi convertit ntr-o alt form de energie: mecanic, chimic, fizic. Entropia reprezint energia cinetic a atomilor i moleculelor, energie care se exprim sub form de vibraii, rotaii sau translaii. Entropia este nul ntr-un cristal perfect la 0 absolut i, relativ sczut, ntr-un solid. Ea este foarte ridicat ntr-un gaz, unde dezordinea molecular este foarte accentuat. Entropia crete odat cu temperatura, n msura n care se accentueaz (crete) caracterul dezordonat al moleculelor. Fie o reacie chimic care evolueaz spontan, de-o manier reversibil fa de poziia sa de echilibru. Reacia urmtoare leag variaia entalpiei libere G, variaia entalpiei H i variaia entropiei S : G = H T S T, reprezint temperatura absolut a reaciei. O scdere a schimbului de energie liber este totdeauna asociat cu o cretere de entropie. Schimbul de entropie al sistemului, S, la o valoare pozitiv se exprim n calorii/grad/mol. Dup al doilea principiu al termodinamicii, entropia total a unui sistem trebuie s creasc. Stadiul dezordonat al energiei componenilor si are totdeauna tendina de acrete. Totui, entropia poate s scad ntr-un sistem unde au loc reacii de sintez i, n mod particular, n fotosintez. RAPORTUL NTRE VARIAIA ENTALPIEI LIBERE I CONSTANA DE ECHILIBRU. S considerm urmtoarea reacie chimic reversibil: A B. Ea atinge nivelul su de echilibru cnd survin modificrile reaciei. n egalitatea : Keq = B [

] /A [ ]

52

Keq, reprezint constanta de echilibru pentru o temperatur i o presiune determinat. Constanta de echilibru este legat de schimburile entalpiei libere prin reacia: G0 = - RT In Keq Unde R este constanta gazelor perfecte ( 1,987 cal/mol/grad ), T este temperatura absolut, Keq este logaritmul cu semn schimbat al constantei de echilibru iar G0 schimbul standard al entropiei libere. n cazuri diferite se determin G, reacia efectundu-se la un pH = 7. determinnd constanta de echilibru Keq, plecnd de la analiza chimic, putem, n continuare, s calculm variaia entropiei libere a sistemului G0. S considerm echilibrul: Glucoz 1 fosfat glucoz 6 fosfat, catalizat de enzima fosfoglucomutaz. La 250 C, la pH = 7, soluia are 0,001 M de glucoz 1 fosfat la stadiul iniial. La stadiul final, analiza chimic indic un echilibru ntre 0,001 M de glucoz 1 fosfat i 0,019 M de glucoz 6 fosfat. Keq = 0,019 / 0,001 = 19 G = - 1,987 x 298 x In 19 = - 1745 cal / mol. Un asemenea echilibru, unde variaia entalpiei libere este negativ, se efectueaz spontan, de la stnga la dreapta; reacia este exergonic. Dac G este pozitiv, reacia va avea loc spontan, de la dreapta la stnga.

2.5.2. Transformri de energie n celula vie (energetica celular)

Celula este sediul activitilor mecanice, cum sunt micrile intracitoplasmatice, deformrile, deplasrile, creterea etc. Ea efectueaz, de asemenea, activiti fizice: absoarbe activ substane, transport molecule, concentreaz soluii, menine un anumit echilibru osmotic etc. Celula realizeaz i activiti chimice : sinteze de macromolecule ( glucide, lipide, protide, acizi nucleici ), plecnd de la numeroase molecule mici. De exemplu, pentru a forma o singur legtur peptidic, sunt necesare 4000 calorii/mol. Aceast valoare reprezint schimbul de entalpie liber (G) care aici este pozitiv. Ori, pentru a construi o singur macromolecul de protein este necesar s se stabileasc sute sau chiar mii de legturi peptidice i, deci, de o mare cantitate de energie. Pentru a face fa acestui necesar imens de energie celula dispune de mecanisme complexe proprii. Intre nevoia i aportul de energie exist intermediari capabili s efectueze multiple transformri. Aceti intermediari sunt derivai fosforilai ai nucleotidelor, un rol aparte dintre aceti compui l are molecula de ATP ( adenozin trifosfatul sau acidul adenozin trifosforic). Dei orice molecula care participa la metabolismul celular conine o anumit cantitate de energie, doar un numr foarte redus din ele au o importan n stocarea i vehicularea energiei chimice celulare. Aceti compui trebuie s poat ngloba o cantitate apreciabil de energie i s poat ceda acolo unde i cnd este necesar. Compuii care fac parte din aceast categorie i datoreaz numele de macroergici (bogai n energie) faptului c hidroliza lor se soldeaz totdeauna cu eliberarea unei importante cantiti de energie. Principalul izvor al energiei celulelor aerobe este procentul de respiraie celular: AH2+ 1/2O2H 2 O + energie

53

n care A simbolizeaz un substrat oarecare, iar AH2-substrat redus. Energia degajat n cursul respiraiei celulare este un mod normal parial recuperat n cadrul unui proces biologic cuplat. Recuperarea se face prin stocarea energiei n molecule de ATP (adenozin trifosfatul sau acidul adenozintrifosforic), care se formeaz prin fosforilarea moleculelor de ADP (adenozin difosfat sau acidul adenozindifosforic). ntruct aceast fosforilare este cuplat cu oxidrile din cadrul respiraiei procesul de recuperare a energiei respiratorii se numete fosforilare oxidativ: nADP + nPa+ energie n ATP Astfel, reprezentarea simbolic a proceselor cuplate generatoare i recuperatoare de energie poate fi urmtoarea: AH2 + nADP + nPa + O2 A+ n ATP + H 2O Organismul utilizeaz n permanen mari cantiti de energie att pentru sinteza compuilor cu structuri complexe (proteine, lipide, polizaharide) ct i pentru susinerea unor procese cum sunt: contracia muscular, excitaia nervoas, transportul activ i altele. De aceea, transferul energiei libere rezultat din reaciile exergonice ale cilor degradative ctre aceste procese, trebuie s se realizeze eficient. Constana temperaturii face ca transferul energiei n sistemele biologice s fie posibil numai prin reacii cuplate: dou reacii sunt cuplate dac energia liber a uneia care este exergonic, cedeaz energiei determin desfurarea celeilalte care este endergonic (consum energie). n organism exist numeroase reacii cuplate prin intermediul acidului acetic a crei formare ntro reacie puternic exergonic asigur desfurarea celei de-a doua, endergonic. Cuplarea celor dou reacii e redat n figura 25. Fig. 25. Schema unei reacii cuplate Mecanismul acestui sistem de cuplaj asigur transferul energiei libere de la reaciile degradative ale glucidelor, lipidelor i protidelor ctre cale mai diverse reacii consumatoare de energie. Sistemul ATPADP constituie intermediarul energetic comun n majoritatea reaciilor cuplate. Caracterul macroenergetic al legturilor PO, din molecula ATP care scindeaz hidrolitic e reprezentat de energia G. 2.5.2.1. Molecula ATP i proprietile sale Toate celulele, vegetale, animale i bacteriene depind de ATP, compus izolat n anul 1930, din extracte acide de muchi. Materia vie conine 0,5 2,5 mg ATP/mol. Poate fi obinut n stare pur prin cromatografie pe schimbtori de ioni. Molecula de ATP este alctuit dintr-o baz azotat purinic adenina, un zahr pentoz i trei radicali fosfat (Fig. 26).

Fig. 26. Structura moleculei de ATP (a); complexul ATP cu ionul de Mg 2+ (b).

54

n celul, cea mai mare parte a ATP- ului formeaz un complex cu ionul de Mg 2+. n molecul, fosfatul terminal este stereochimic vecin cu un grup aminat al adeninei (fig. 30, b). Magneziul stabilete legtura cu adenina i cu cei doi fosfai terminali. Fosfaii poart patru sarcini negative, apropiate unele de altele i care se resping. ATP este un polifosfat puternic ncrcat electric. Prin hidroliz el se descompune n ADP i acid fosforic. Aceti doi copui, ATP i ADP, sunt sediul unor reanjamente ale atomilor, care se realizeaz n maniera n care nivelul de energie al moleculelor este cel mai sczut posibil. Ambii poart ncrctur negativ. Hidroloza produce o important scdere a energiei libere a sistemului: G = - 7000 cal/mol (pH 7; 25oC) Putem spune c legtura fosfat este bogat n energie, ceea ce este, de fapt, o neconcordan. Energia considerabil de aici nu corespunde celei de la legtura covalent dintre P i O. Ea provine din hidroliza legturii anhidrid fosforic. ADP poate, de asemenea, s se disocieze elibernd o cantitate de energie egal cu precedenta. Compuii formai prin hidroliz sunt AMP (adenozin monofosfatul sau acidul adenozinmonofosforic) i acidul fosforic. AMP poate, la rndul su s fie descompus, dar hidroliza legturii ester care reine fosfatul genereaz mult mai puin energie. Reaciile de transfer de fosfat (fosforilare defosforilare) se fac totdeauna de la un compus cu potenial de transfer ridicat ctre unul cu potenial de transfer sczut. Deci, compuii cu fosfor pot fi donatori sau acceptori de fosfat dup cum potenialul lor de transfer e mai ridicat sau mai sczut. Dac lum ecuaia ATP ADP +Pa, dac ea se desfoar spre stnga ATP e donator de Pa n sens opus, ADP devine acceptor de Pa transformndu-se n ATP. Gruprile fosfat cedate de compuii macroergici ajung la acceptori nu direct, ci prin intermediul sistemului ATPADP. Acest sistem face legtura dintre compui macroergici (Penolpiruvat, 3-diP-glicerat i P-creatina) spre compui microergici (glucoza, glicerol). Sistemul ATP ADP funcioneaz astfel ca o baterie de energie (dinam celular).(fig.27). Fig. 27. Schema dinamului celular (Florkin,modificat de Lippman) Sistemul ATPADP ca donator de energie este implicat ntr-o serie de procese biochimice importante cum ar fi: contracia muscular (sistemul creatinkinazic) al celui de-al doilea mesager implicat n ptrunderea unor hormoni prin membrana celular (sistemul adenilatkinazic), dar i n procesele de glicoliz sau de oxidare aerob a glucidelor. (fig. 28).

55

Fig. 28. - Implicarea sistemului ATPADP n unele procese biochimice celulare Aceste diverse reacii sunt reversibile. Este permanent necesar s se furnizeze energie pentru refacerea AMP, ADP i ATP- ului. Disocierea sau recombinarea unui compus fosforilat ca ATP se realizeaz n prezena enzimei adenozin trifosfataza (ATP-aza). 2.5.2.2. Ali compui fosforilai Celula conine o multitudine de compui fosforilai. Printre acetia, PEP (fosfoenolpiruvatul) conine o energie liber de hidroliz considerabil (G = - 12 800 cal/mol), mult mai ridicat dect cea a ATP ului (G = - 7000 cal/mol). Aceti compui au tendina de a se descompune cednd o molecul de acid fosforic i energie, favoriznd sinteza de ATP din ADP i fosfai liberi, prezeni n mediu. Ali compui au o energie liber de hidroliz mult mai mic dect ATP-ul. Un exemplu este glucozo -1-fosfat, G = 5000 cal/mol. Aceti compui se formeaz n prezena ATP-ului care se descompune cednd energie i o molecul de acid fosforic. ntre aceste dou exemple extreme de potenial energetic, PEP i glucozo -1- fosfat, exist numeroi compui intermediari . Diferiii compui fasfarai pot fi repartizai pe o scar, dup potenialul lor de transfer al grupului fosfat. Grupul fosfat tinde s treac de la compusul cu potenial de transfer ridicat, spre cel cu potenial mai sczut. Sistemul ADP ATP, care are un potenial de transfer de valoare medie, regleaz transferul ntre cele dou tipuri de compui. Exist i compui fosfarai, derivai de nucleotide, analogi ATP ului, dar n cantiti mult mai sczute. Astfel sunt: uridintrifosfatul (UTP), citidintrifosfatul (CTP), guanozintrifosfatul (GTP) etc. Aceste substane posed, de asemenea, legturi macroergice fosfat cu un nalt potenial de energie.

2.6. Membrane care cupleaz energie

Membranele capabile de captarea i conversia energiei aparin cloroplastelor i mitocondriilor.

2.6.1. Cloroplastele
Viaa pe Pmnt depinde de energia produs de steaua noastr apropiat, soarele. Energia solar traverseaz spaiul sub form de lumin. Aici, pe Pmnt, lumina solar este captat de numeroasele frunze sau organe verzi ale plantelor. Acestea sunt capabile nu numai s capteze lumina solar ci s o i prelucreze n hran. 56

Cloroplastele sau plastidele verzi, prezente n toate organele verzi ale plantelor, sunt responsabile de conversia energiei luminoase n energie chimic, datorit clorofilei pe care o conin. Studiile de microscopie electronic au evideniat pe suprafaa lamelor stromatice i granare, particule globulare cu dimensiuni de 100-200A0, considerate unitile funcionale ale fotosintezei i care au fost numite cuantosomi (Park i Pon,1963) . Un cuantosom este format, se pare, dintr-un strat de substane proteice mbibate cu ap i o component lipidic Molecula bipolar a clorofilei se orienteaz cu polul hidrofil (inelul porfirinic) spre stratul proteic, n timp ce polul hidrofob (reprezentat de fitol) se ndreapt spre lipoizii de structur ai lamelei granare. S-a stabilit c un cuantosom conine: circa 160molecule de clorofila-a, 70 molecule de clorofila-b, 48 molecule de carotenoizi, sute de molecule de lipide, circa 9500 atomi de azot proteic, precum i doi atomi de mangan, doisprezece atomi de fier i sase atomi de cupru. Membranele tilacoidelor, conin 12% pigmeni de dou categorii: clorofile 10% i carotenoizi 2%. Culorea verde a frunzelor este dat de prezena clorofilelor care mascheaz culoarea galben portocalie a carotenoizilor. Dintr-un extract brut de pigmeni (extract in aceton sau n alcool) poate fi separat prin cromatografie pe hrtie, plac sau coloan fiecare pigment din amestec. a. Pigmenii clorofilieni Exist dou tipuri de clorofile a i b, la plantele superioare, clorofila a, de culoare verde albastr, este mai frecvent dect clorofila b, de culoare verde glbui. Structura chimic a celor dou clorofile este apropiat. Se disting dou regiuni: o regiune porfirinic (inel porfirinic) cu un atom de magneziu n centru i cu o coad fitolalcool cu C20. Majoritatea moleculelor de clorofil sunt asociate proteinelor membranare (cromoproteine). Sineza clorofilelor se face n interiorul cloroplastelor. La plantele superioare, una dintre multiplele etape de sintez necesit lumin i fier, de unde sindromul de cloroz(nglbenire) n cazul carenei de fier sau lumin (etiolarea). b. Pigmenii carotenoidici Sunt pigmeni lipofili derivai de la izopren. Acetia sunt: licopenul de culoare roie i carotenul de culoare portocalie; xantofilele, derivai hidroxilai ai pigmenilor carotenoidici sau oxicaroteni. 2.6.1.1. Procesul general al fotosintezei Cloroplastele reprezint suportul material, adic sediul la nivelul cruia se desfoar grandiosul proces al fotosintezei, n timpul cruia se sintetizeaz, n prezena luminii, substane organice din CO2 i ap. Aceasta transformare de substan realizat n celula vegetal este dublat de conversia, la fel de intens de energie, pentru ca sinteza moleculelor organice nseamn nmagazinarea de energie chimic provenit din conversia energiei solare. S-a stabilit ca n procesul de fotosinteza, exista doua tipuri de reacii: reacii de lumina (faza de lumina, faza lui Hill) si faza de ntuneric (faza obscura sau faza lui Blackman sau ciclul Calvin) (fig. 29).

57

Fig. 29 - Schema fotosintezei: A - reaciile de lumin; B - reaciile de ntuneric (dup P. Sitte, 1965)

n reaciile de lumina, care au loc n tilacoidele cloroplastului, hidrogenul este smuls de la moleculele de ap i dus de o serie de transformri la NADP, cu degajare de O2 n afara celulei. Acest transfer este posibil graie aportului de energie libera-energie luminoasa-, care provoac starea de excitaie electronica a moleculei de clorofila. Concomitent cu acest transport de H2 (sau de electroni), are loc convertirea energiei luminoase n energie chimic, prin reacia de fotofosforilare, cu sinteza moleculei macroergice de ATP . Se pare ca pentru fiecare doi electroni transportai revin dou (sau fraciuni ntre 1 i 2) molecule de ATP. Reaciile de lumina pot fi sintetizate astfel: H2O + NADP O2 + NADPH2; 2ADP + Pi 2 ATP n reaciile de ntuneric, care se petrec n stroma cloroplastului, NADPH2 produc n reaciile de lumina este folosit pentru reducerea CO2. Aceste reacii sunt asociate cu o cretere n energia libera a sistemului celular, provenit din descompunerea ATP rezultat n fotofaza. Reaciile de ntuneric pot fi sintetizate astfel: CO2 + 2NADPH2 (CH2O) + H2O + 2NADP 3ATP 3ADP + 3Pi Astfel, procesele generale ale fotosintezei pot fi reprezentate prin reacia: lumin CO2 + H2O (CH2O) + O Hv

58

2.6.1.2. Reaciile de lumin a. Fotonul Lumina este un fenomen de natur ondulatorie i corpuscular. Fiecare corpuscul sau foton, transport o energie W(un quantum) care are o valoare dat de lungimea de und asociat relaiei W=h; h este o constant, (constanta lui Planck) iar este frecvena undei(numrul de vibraii /secund), =c/, c-viteza luminii n vid. Astfel, un foton de lumin albastr cu o lungime mic a undei, transport mai mult energie dect un foton de lumin roie cu lungime de und nalt. b. Procesul de absorbie a energiei luminoase Posibilitatea de a utiliza radiaiile luminoase de ctre celulele plantelor verzi se datoreaz faptului c ele conin n cloroplaste molecule de clorofila capabile de aa numitul efect fotoelectric, care consta n emisiunea de electroni din atomul unei molecule, sub aciunea luminii. Astfel, sub aciunea radiaiilor luminoase cu lungimea de unda ntre 380770nm, molecula de clorofila intra n starea de ,,excitaie electronica (stare activa),care se caracterizeaz fata de starea fundamental printr-un exces de energie. Molecula de clorofila poate atinge trei niveluri de excitaie electronica: 1. Adsorbind radiaii cu lungimea de unda de 430nm (radiaii albastre), un electron al moleculei este dizolvat i trece pe orbita liber, meninndu-i sensul spinului. Energia nmagazinata n acest caz este egala cu 65Kcal/mol/gram. Aceasta reprezint o stare de excitaie singletic a moleculei de clorofila, avnd cel mai nalt nivel energetic faa de starea fundamentala, ca urmare a duratei foarte scurte de viaa (10-12 10-11s) este incapabil s induc reacie fotochimic. Dezactivarea, ce aduce revenirea la starea fundamental a moleculei se face prin pierdere de cldura (24Kcal/ mol/gram) i molecula cade la un alt nivel energetic de excitaie singlatica, cu 41Kcal/mol/gram. 2. Cnd molecula de clorofila este bombardat cu fotoni de lumina roie (cu lungimea undei 670nm), ea atinge acelai nivel energetic (41Kcal/mol/gram) . Durata de viaa a acestei stri de excitaie electronica este puin mai mare (10-9s), totui nc insuficient pentru inducerea reaciei fotochimice. Molecula ajuns la acest nivel se dezactiveaz prin emisie de fluorescenta, sau prin pierdere de cldur, n valoare de 10Kcal/mol/gram. Cu aceasta ocazie se poate ntmpla s aib loc i rsturnarea spinului (care se face cu cheltuiala de energie de excitaie) molecula caznd la un al treilea nivel energetic de excitaie electronic, numit stare tripletica (sau metastabila). -4 -2 3. Starea de excitaie tripletica are o durata de viaa mai lung (10 -10 s) i, datorit ei, dei are cel mai sczut nivel energetic (31Kcal/mol/gram), se poate dezactiva prin inducerea unei reacii fotochimice (fig.30).

Fig. 30. Strile de excitaie electronic a unei molecule de clorofil (dup Libbert, 1974) 59

Exist mai multe forme ale clorofilei-a, n funcie de molecula proteic cu care este complexat i care nu sunt echivalente funcional. B. Kok si G. Hoch (1961) au descoperit o clorofila-a, care absoarbe radiaii cu lungime de unda de 700nm; iar G. Doring i colab. (1967) o alt form activ a clorofilei-a, cu maximum de absorbie la 682nm. Aceste forme au fost notate convenional ,,P700 pentru fotosistemul I i ,,P680 pentru fotosistemul II i numai electronul dizlocat de pe aceste molecule este att de bogat n energie, nct provoac reacia fotochimica. Celelalte forme de clorofila-a i clorofila-b, carotenoizii, ficoeritrina i ficocianina (de la alge)transfera energia luminoas pe care o absoarbe pigmentul P700, care reprezint ,,centrul fotochimic al fotosistemului I, energia avnd tendina s migreze spre molecule care absorb radiaii cu lungime de unda mai mare. c. Fotosistemul I si II Bazndu-se pe observaii ncepute din 1941 Emerson a artat (n 1957) ca daca alga Chlorella este expusa la radiaii roii cu =680nm, se constata ca procesul fotosintetic decurge mult mai slab dect atunci cnd este expusa aciunii ntregului spectru luminos. De asemenea, acest cercettor a mai stabilit ca daca radiaiile de lungime de unda () de 680nm sunt asociate cu radiaiile de mai mica, procesul fotosintetic arata un efect global superior sumei celor doua efecte pariale produse de cele doua lungimi de unda aplicate independent. Acest fenomen a fost denumit ,,efectul Emerson si a dus la ideea ca fotosinteza implica doua reacii fotochimice n care lumina este absorbita de pigmeni diferii. Studii ulterioare au confirmat existena celor doua reacii fotochimice, dup unii ,,nseriate, dar contrar supoziii originale a lui Emerson s-a stabilit de ctre E. Rabinowith si colab. (1969) c clorofila-a participa la ambele reacii. Cercetri mai recente au stabilit ca unitatea procesului fotosintetic este compusa din doua fotosisteme (fotosistemul I i fotosistemul II), fiecare fiind responsabil pentru anumite reacii fotochimice avnd fiecare cte un centru fotochimic. Cele doua sisteme sunt individualizata funcional si structural, dar sunt legate ntre ele prin intermediul lanului transportorilor de electroni. Pigmenii care absorb lumina sunt distribuii ntre cele doua sisteme. Fotosistemul I este reprezentat de particule mai mici si conine ca ,,centru fotochimic molecule de P700 (clorofila-a cu maxim de absorbie la 700nm) sau clorofila-a I, reprezint deci pigmentul fotochimic activ al acestui sistem. Alturi de P700 mai exista si clorofila cu maxim de absorbie la 680nm si o molecula de citocrom f . Se pare ca PS I nu conine sau conine o cantitate foarte mica de clorofila-b. Fotosistemul II este reprezentat de particule mai mari. El conine clorofila-a cu maxim de absorbie la 680nm (sau dup alii la 672), cunoscuta sub denumirea de P680 sau clorofila-a II si care reprezint pigmentul activ al acestui sistem. Alturi de P680 sistemul mai conine clorofila-b si pigmeni accesorii (clorofila-c i fucoxantina la algele brune, proteinele ficobilinice la algele roii si albastre). Energia luminoasa pe care o absorb aceti pigmeni este mai mica sau egala 680nm si apoi transferata centrului fotochimic al sistemului I. Att clorofila-a I ct si clorofila-a II, socotite ca sensibilizatori optici, sunt singurii pigmeni specializai n transformarea energiei luminoase n energie chimica. De asemenea, fiecrui sistem i corespund reacii fotochimice diferite, PS I fiind raspunztor de formarea NADPH2, iar PS II de degajarea O2. La bacteriile fotosintetizatoare nu exista dect un singur sistem pigmentar, echivalent cu PS I. Se pare ca pigmenii -carotenoizi sunt prezeni n ambele fotosisteme .

60

d. Secvena transferului de electroni Transferul de electroni de la moleculele de ap (donor de e- ) la NADP (acceptor final) implica o serie de transportori de e- cu o secvena specific. Transferul de e- se poate face spontan dac are loc ntre un sistem foarte reductor, cu potenial redox sczut i un sistem mai puin reductor, cu potenial redox ridicat.. n procesul de fotosinteza potenialul redox al sistemului O2/H2o este foarte ridicat (+0,8 voli la pH=7) iar cel al sistemului CO2/CH2O este foarte sczut (-0.42 voli la un pH=7). Deci fotosinteza este un proces constituit dintr-o serie de reacii de oxido-reducere, care evolueaz ntre un oxidant (CO2) cu potenial redox 0.4 V i un reductant (H2O), cu potenial redox +0.8 V, deci n sens invers gradientului de potenial redox. Migrarea protonilor de la H2O la CO2 nu se realizeaz spontan, ci cu aport de energie liber, care este adus de molecula clorofilei. Ea accepta fotoni incideni, induce oxidarea apei i transporta H+ (respectiv electroni) ntre cele dou sisteme redox . e. Fotoliza apei (oxidarea H2O) Provocat de molecula de clorofila excitat, este etapa eseniala a fazei de lumina. Reacia a fost descoperit n anul 1973 de ctre R. Hill i ea se desfoar probabil n doua etapa: hv H2O H+ + e- + OH 2OH H2O O2 Deci din fotoliza apei rezulta H+ legat (sau agentul reductor) pentru ca ea se efectueaz cu intervenia unui transportor, apoi a unui acceptor de H+ i un radical (OH-) care va fi oxidat n prezenta unei enzime cu eliberare de O2. Mecanismul eliberrii O2 este incomplet cunoscut . Se presupune c radicalul OH- se fixeaz pe un acceptor organic care se izomerizeaz ntr-un peroxid, din care O2 va fi eliberat de o peroxidoza (catalaza). catalaza 4OH 2H2O2 2H2O + O2 Rolul de acceptor pare s fie jucat de carotenoizi i de acidul tioctic. f. Lanul transferului de electroni Reacia de oxidare a apei este legat direct de FS II, n care funcioneaz ca un centru de reacii P680, care absorb radiaiile luminii mai mici sau egale cu 680nm . Aceste radiaii produc excitarea moleculelor de clorofila-a care cedeaz energie sub forma de e-, pentru a reveni la starea fundamental. Ca donator de e- pentru P680 functioneaza molecule de apa. Electronul de la molecula de P680 este transferat unui acceptor cu natura chimica nc necunoscut, denumit Q. La rndul su, Q pierde electronul n favoarea unei molecule de plastochinona, care se reduce . Prin intermediul unei plastocianine, molecula de plastochinona transfera e- la citocromul b6 care, la rndul sau, l cedeaz citocromului f.

61

Electronul eliberat de citocromul f furnizeaz clorofilei P700 (centrul de reacie al PS I), electronul pe care acesta l-a pierdut sub aciunea radiaiilor luminoase cu = 680nm. Electronul pierdut de P700 este imediat preluat de un acceptor de e-, necunoscut denumit X, de la care apoi este cedat ferredoxinei, pe care o reduce i creia i transfera energie. Ferredoxina redus transfer e- primit moleculei de NADP, care apoi este redus la NADPH2, reacia fiind catalizat de o ferredoxin NADP reductoza. Pe parcursul transferului de e , la fiecare treapta a transportului se pierde energie, adic exist o cdere a nivelului energetic al electronului cu fiecare nou acceptor al su, astfel nct electronul ajunge ,,descrcat de energie la molecula de clorofila P700 i aceasta se dezactiveaz trecnd n starea ei fundamentala. Datorita cedrii de energie pe parcursul transportului de e-, este posibil sinteza de ATP (rezervorul energetic celular), printr-o reacie de fotofosforilare (fig.31).

Fig. 31. Schema transferului de electroni n fotosintez

g. Fotofosforilarea Capacitatea de fosforilare a cloroplastelor a fost descoperit de D. Arnon i colab. (1954). Transportul de e-, de la ap la NDAP este nsoit de expulsia a doi protoni H+(la nivelul plastochinonei) din stroma cloroplastului, ctre spaiul intratilacoidal, care se adaug protonilor rezultai din fotoliza apei. ncrctura pozitiv se acumuleaz deci n spaiul tilacoidal. Membrana tilacoidal fiind impermeabil pentru protoni, se creaz un gradient electrochimic de protoni care va permite funcionarea ATP-azei membranare.

62

Fig. 32. Schema fosforilrii lineare (I) i ciclice (II)

S-a precizat ca fosforilarea se poate realiza pe dou ci: fotofosforilarea ciclica i aciclica (linear). Pentru ambele ci exist locuri de fosforilare situate pe lanurile transportoare ntre citocromi . Fosforilarea aciclica. n aceasta reacie formarea ATP este asociat cu reducerea NADP i este implicat i fotosistemul II, deci i fotoliza apei. n transferul electronilor provenii de la ap, energia necesar sintezei moleculelor de ATP se elibereaz ntre citocromul-b i citocromul-f. Cercetri recente, bazate pe studiul spectrelor de absorbie a luminii, precum i pe determinarea potenialului redox al sistemelor transportoare de e-, implic n fosforilarea linear citocromul b559 asociat cu plastochinona, locul fosforilarii fiind sistemul ntre citocromul-b559-plastochinona i citocromul-f + plastochinona. Fosforilarea ciclica. Are loc n prezena unor sisteme redox i a luminii . Electronul trasferat de P700 ferredoxinei, n loc sa fie cedat n final, NADP, poate fi transportat enzimatic pe citocromi, de unde este dus napoi la molecula de clorofila-a din fotosistemul I, energia pentru sinteza ATP fiind eliberat ntre citocromul-b6 i citocromul (fig. 32). 2.6.1.3. Reaciile de ntuneric a. Ciclul Calvin (calea C3 de reducerea CO2) NADPH2 i ATP produi n faza de lumina sunt utilizai n stroma cloroplastului, la ncorporarea CO2 n compui organici (fig. 33). Cu ajutorul izotopului marcat 14C, furnizat Ca14CO2 unei culturi de Chlorella, Calvin i Benson (1949-1950) au reuit s elucideze calea urmat de CO2 n cloroplaste. Dup numai 5 sec, izotopul radioactiv a fost gsit n proporie de 87% n acid fosfogliceric, 10% n acid fosfopiruvic i 3% n acid malic. Deci primul produs dup absorbia CO2 este acidul fosfogliceric (APG), marcat n funcia sa carboxilic. ncorporarea moleculei de CO2 se face prin carboxilarea unui acceptor al su, care s-a gsit c este un ester fosforic al unei pentoze: ribulozo -1,5 difosfatul (RIDP), reacia fiind catalizat de carboxidismutaza. Ribuloza difosfatul adiionnd CO2 formeaz un compus intermediar instabil, cu 6 atomi de C, care se descompune hidrolitic, rezultnd dou molecule de acid fosfogliceric. Imediat dup formarea acidului fosfogliceric apar trioze fosforilate, marcate la funcia aldehidica. Reacia de reducere a funciei carboxilice din molecula de acid fosfogliceric se petrece n dou etape, sub aciunea NADPH2 i a energiei sincronizate n molecula de ATP. Astfel ,,agentul reducator (NADPH2) i ,, energia de asimilaie (ATP) leag cele dou faze ale procesului de fotosintez. Deci, reducerea CO2 nu se face n mod direct, ci el este ncorporat mai nti n ribulozo- difosfat, apoi n acid fosfogliceric, care se reduce formnd aldehida fosfogliceric.

63

Fig. 33. Localizarea activitii biochimice n cloroplast (dup Binet i Brunel, 1968)

64

Fig. 34 Schema reducerii CO2 Triozele obinute sunt antrenate ntr-o serie de transformri, desfurate ntr-o secvena ciclica (ciclul Calvin) pe parcursul cruia, n urma unor serii de condensri, se formeaz hexozele i n final, amidonul. Din totalul moleculelor de trioze, numai a VI-a parte parcurge aceast cale, iar celelalte cinci molecule ajung, prin faze intermediare la regenerarea moleculelor de ribozo-difosfat, capabile s accepte noi molecule de CO2 (fig. 34). Exist nsa plante la care celulele mezofilului foliar sunt incapabile s fixeze CO2 n hidraii de C, dar el se ncorporeaz activ n fosfoenol- piruvat (PEP) rezultnd acizii tetracarbonici : malic i aspartic. Astfel, CO2 ajunge pe ribulozo-difosfat intermediat de fosfoenol piruvat, prin transcarboxilare.

65

Dup acest criteriu, plantele se mpart n dou grupe mari, notate prescurtat cu C3fotosintetizante i respectiv C4- fotosintetizante . Calea C4 s-a gsit la specii aparinnd mai multor familii de plante, n majoritate tropicale i subtropicale. Unele genuri, ca de exemplu Atriplex, conin att specii C3 ct i C4. b. Calea C4 - de reducere a CO2 n structura frunzei la speciile de plante tropicale i subtropicale, apar unele particularitai anatomice i de ultrastructur. Astfel, n jurul nervurilor se formeaz o teac de celule parenchimatice mari, adesea lipsite de grana, care sunt singurele capabile sa reduc CO2 pe calea ciclului Calvin. Restul celulelor din mezofil sunt mai mici, au cloroplaste mai mrunte cu ultrastructura normal, n ele desfasurndu-se ciclul Hatch Stac (Calvin). ntre aceste dou tipuri de celule existnd un schimb intens de substane . Speciile de plante C4 fotosintetizante au fost mprite la rndul lor, dup reaciile particulare care duc la eliberarea CO2, n trei grupe. Grupa plantelor ,,NADP-ME, n care intervine enzima malica, dependena de NADP (de ex. Triticum sp.); Grupa plantelor ,,PCK, n care activeaz o fosfoenolpiruvat-carboxikinaza (de ex. Panicum maximum); Grupa ,,NAD-ME n care este activat enzima malica dependena de NAD (de ex. Atriplex spongiosa). n desfurarea ciclului Calvin, la toate cele trei tipuri exist momente comune. Astfel este momentul fixrii CO2 pe oxalocetat, reacie catalizat de fosfoenol-piruvat carboxilaza i care se petrece n citoplasma celulelor mezofilului frunzelor. Mai departe, desfurarea ciclului difer la cele trei tipuri de plante. n plantele din grupa NADP-ME, oxalatul este redus la malat n cloroplastele celulelor mezofilului, iar acesta este translocat n celulele tecii perifasciculare, unde este descompus (n cloroplastul acestora), eliberndu-se CO2 care parcurge ciclul Calvin, formndu-se n final, amidonul. Agentul reductor l constituie NADPH2, format din malat prin intervenia enzimei malice dependena de NADP . Cloroplastele celulelor tecii fasciculare furnizeaz ATP n ele avnd loc fosforilarea. Este de notat faptul c plantele C4 utilizeaz o molecul de ATP n plus, fat de plantele C3, pentru fiecare molecul de CO2 fixata de hidrai de carbon (fig. 35A).

Fig. 35. A. Fixarea CO2 pe calea C4: A - plante "NADP - ME"; B - plante "PCK"; C - plante "NAD-ME"; ciclul FRC - ciclul fotosintetic de reducere a CO2 66

n celelalte dou tipuri de plante C4 (PCK si NAD-ME) oxalatul format de fosfoenolpiruvat-carboxilaza, n primul moment al fixrii CO2, este convertit prin transaminare, n afara cloroplastului, la aspartat, care migreaz apoi n teaca perifasciculara de celule, unde din nou, este convertit prin transaminare napoi la oxalacetat. Aceasta noua transaminare este localizat la tipul de plante ,,PCK n citoplasma celulelor perifasciculare, iar la tipul de plante ,,NAD-ME n mitocondriile lor. n plantele ,,PCK oxalatul este decarboxilat de o PEP-carboxilaza citoplasmatic formndu-se acid PEP, care este apoi convertit la piruvat (fig. 35 B). n plantele NAD-ME, oxalatul este mai nti redus de ctre NAD-malat dehidrogenaz n mitocondrii, apoi sufer n aceleai organite o decarboxilare oxidativ prin intervenia enzimei malice, dependent de NAD. Piruvatul eliberat la ambele tipuri de plante, este convertit n alanina prin transformare, iar alanina se ntoarce n celulele mezofilului unde este transaminat din nou producndu-se piruvat, care este reconvertit n cloroplaste la PEP (fig. 35 C). Astfel, calea C4 se caracterizeaz prin transportul unor mari cantitai de malat sau aspartat din celulele mezofilului n celulele tecii perifasciculare i cantitai corespunztoare de piruvat sau alanina n direcie opus. Acest flux, intercelular are loc, se crede prin plasmodesmele din pereii celor dou tipuri de celule.

2.6.2. Mitocondriile
Mitocondria este considerat ,,centrul respiraiei celulare funcia principal const n nglobarea energiei sub forma de legturi macroergice de ATP. Mitocondriile, datorit echipamentului lor enzimatic, localizat att n membrane, ct i n matrice, ndeplinesc n biologia celulei urmtoarele roluri: asigur n parte degradarea glucozei, sunt sediul efecturii ciclului Krebs i al lanului respirator ce deriv din acest ciclu, asigura efectuarea ciclului glicoxalatului i sunt sediul unor sinteze i degradri de substane. 2.6.2.1.Degradarea glucozei de ctre mitocondrii Se admite n general, c degradarea glucozei are loc n dou etape: una extramitocondriala, care ia sfrit cu formarea a dou molecule de acid piruvic dintr-o molecula de glucoza i alta intramitocondrial n care are loc oxidarea total a acidului piruvic n CO2 si H2O. Prima serie de reacii este cunoscut sub denumirea de glicoliza, calea EmdenMeyerhof, faza anaeroba a oxidrii glucozei sau calea formrii piruvatului. n linii mari, procesul de degradare anaerob a glucozei se desfasoar astfel: ATP fosforilare ADP glucoza fosfokinaza izomerizare glucoza-6-fosfat hexozoizomeraza ATP fosforilare ADP fructoza-6-fosfat fosfofructokinaza dihidroizi-acetona 3-fosfat aldehida-3-fosfoglicerina aldolaza acid piruvic (2 molecule) piruvatkinaza 67 NADHH+NAD acid-3-fosfogliceric ambele sunt reduse de NADH fructoza-1.6-difosfat fructoza-6-fosfat

Deci, n etapa extramitocondriala dintr-o molecul de glucoza rezult dou molecule de acid piruvic (glicoliza), urmnd ca oxidarea complet a acidului piruvic, n CO2 si H2O s aib loc intramitocondrial, n ciclul Krebs. n acest scop acidul piruvic este convertit n prezena coenzimei-A (Co-A) n acetil-Co-A, cnd are loc o reacie complex de decarboxilare oxidativa, la care particip NAD+ ca acceptor de H+ i enzima piruvatdecarboxilaza. Ciclul Krebs Denumit i ciclul citric sau ciclul tricarboxilic (deoarece n desfurarea lui intervin acizi cu trei grupri COOH), se desfoar n exclusivitate n matrice, iar reacia lui fundamental este oxidarea completa a gruprii acetil a acetil-Co-A. Aceasta oxidare este realizat numai dac n mediu se gsete n exces alt substan acidul oxalacetic, care ia natere n urma carboxilarii n hialoplasma a acidului piruvic, n prezenta oxalacetalcarboxilazei i a ionilor de Mn2+, cofactor:
Mn2+

acidul piruvic oxalacetal-carboxilaza.

acid oxalacetic

Dac n legtura cu producerea glucolizei mai exist nc deosebire de vederi n ceea ce privete nivelul celular la care are loc, n schimb toi biochimitii, bazndu-se pe date experimentale, sunt de acord ca ciclul Krebs se desfoar exclusiv n mitocondrie i constitue cea mai important cale catabolica aeroba a oxidrii hidrailor de C, a acizilor grai i a majoritii aminoacizilor pn la CO2 i H2O, cu punerea n libertate a unei importante cantitai de energie. Fazele de desfurare a acestui ciclu, stabilite de Krebs nc din 1930, au putut fi urmrite i controlate n ultimele decenii cu ajutorul suspensiilor de mitocondrii. Acest ciclu are loc n mai multe etape, reaciile fiecrei etape fiind catalizate de cte o enzim. Prima etap, considerat cea mai important, const n ptrunderea acidului oxalacetic n matricea mitocondriei, ptrundere nlesnit de acetil-Co-A-sintetaza, identificat recent n membran mitocondriala extern, prin condensare cu acetil-Co-A, aceasta va da natere acidului citric, reacie catalizat de citrat-sintetaza. Acid oxalacetc + acetil - Co-A Citrat-sintetaza Mg2+ Acidul citric astfel format, n urma unor izomerizri i decarboxilari d natere la o serie de acizi tri i dicarboxilici ca acizii: izocitric, aconitic, cetoglutaric, succinic, fumaric, malic, acizi cu 6,5 i 4 atomi de carbon i, n sfrit acidul oxalacetic de la care s-a plecat n tot acest timp, acidul acetic provenit din acidul piruvic iniial, s-a degradat n CO2 si H2O, iar acidul oxalacetic activat, rezultat din transformarea altei molecule de acid piruvic (provenit dintr-o nou molecula de glucoza), relund ciclul Krebs (fig. 36). acid citric + HS Co-A

68

Fig. 36. Ciclul Krebs 69

n cadrul ciclului Krebs se disting opt grupe, n urma crora rezult dou molecule de CO2 (reaciile III i IV) i opt atomi de H+. Ciclul Krebs este conectat cu lanul respirator i, mpreun elibereaz 216Kcal, din care 191 provin din lanul respirator . Energia chimic rezultat este stocat n ATP (38 de molecule). n afara de oxidarea completa a radicalului acetil i de stocarea energiei, ciclul Krebs asigur formarea a numeroase substane, cum sunt: -cetogentaratul, care poate da prin aminare glutamat, care la rndul su este precursorul argininei, prolinei i hidroxiprolinei; acidul oxalacetic d prin transformare acid aspartic care este precursorul -alaninei, treoninei, metioninei, lizinei; acidul succinic este precursorul nucleelor tetrapirolice care intra n constituia citocromilor. 2.6.2.2.Ciclul glioxalatului Studiile efectuate n special n ultimele decenii au demonstrat c numeroi mutani de bacterii i ciuperci cresc i se dezvolt mult mai bine pe mediile de cultur crora li s-a adugat acetat . Cutndu-se explicarea aciunii ionului acetat, s-a constatat printre altele, c prezena acestuia n mediul de cultur determin producerea de zahr i de proteine prin intermediul ciclului glicoxalatului datorit izocitrazei i malat-sintetazei, enzime care lipsesc din celulele animale, bacteriile i ciupercile ntrerup ciclul Krebs la nivelul acizilor izocitric i malic. Izocitraza descompune acidul izocitric n acizii glicoxalic i succinic, iar malat-sintetaza, n urma condensrii acidului glicoxalic cu o molecul de acetat, d natere la malat, totul are loc ca i cnd dou molecule de acetat au dat natere prin convertire unei molecule de succinat, care intervine n sinteza zaharurilor i proteinelor ce apar n mediul de cultur. 2.6.2.3. oxidarea acizilor grai Lipidele se metabolizeaz direct sub aciunea lipazei n glicerol i acizi grai. Acizii grai sunt oxidai la nivelul mitocondriei. Schema procesului de oxidare a acizilor grai a fost elaborat de Lynen i este reprezentat de o elice n care fiecare spir corespunde formrii unui acetil-Co-A. n prezena ATP, intervin sisteme enzimatice n frunte cu HS-Co-A, producnd treptat pierderea unui acid gras cu doi atomi de carbon mai puin . Molecula de CH3-COOH rezultat nu rmne liber, ca atare, ci se combin imediat cu SH-Co-A, dnd acetil- Co-A care intra n combinaie cu acidul oxalacetic, cu formare de acid citric care trece n ciclul Krebs unde va fi complet degradat n ap i CO2. n felul acesta, ntregul lan lung al acidului gras este transformat integral n CO2 i H2O i energie . Formarea fiecrei molecule de acetil-Co-A reprezentat n urma acestei oxidri este nsoit de reducerea unei molecule de NAD la NADH2 i a unei molecule de FAD la FADH2. De asemenea, cercetrile au artat ca acizii aminati rezultai din hidroliza proteidelor n urma unui proces de dezaminare oxidativ dau natere la acizi cetonici, care pot intra n diverse etape ale ciclului Krebs att n mitocondria animal, ct i n cea vegetal (fig. 37).

70

Fig. 37. - oxidarea acizilor grai

2.6.2.4. Sistemul transportor de electroni (lanul respirator) Lanul respirator denumit i lanul citocromic sau sistemul transportor de electroni, reprezint ansamblul de reacii care au loc n mitocondrie, prin care electronii pierdui de substane (glucide, lipide sau protide), n timpul dehidrogenarii lor n matrice sunt transportai pn la oxigen acionndu-l; oxigenul astfel activat devine acceptor de protoni (H+), dnd natere la H2O. Studiile biochimice ,,n situ i ,,n vitro au demonstrat c acceptorii de H+ eliberat de substrat sunt NAD, NADP, FAD, iar cei de electroni sunt citocromii, derivai ai hematinei, n care fierul poate exista fie sub forma de Fe2+, fie Fe3+. Din mitocondrii au fost izolai mai muli citocromi care aparin claselor a, b, c; de asemenea s-a mai precizat c citocromii mitocondriali a i b sunt insolubili n apa i sunt activi numai asociai cu fosfolipide, iar citocromul c este foarte solubil n apa. Transportul protonilor (H+) i electronilor e pn la O2 se face prin intermediul nucleotidelor i citocromului. Unele din aceste nucleotide, ca FAD sunt n realitate coenzimele hidrogenazelor i anume NADH2-dehidrogenazei i succin-dehidrogenazei. Aceste dehidrogenaze cu coenzime flavinice, colorate n galben, sunt denumite flavo-proteine. 71

Cercetrile biochimice din ultimele decenii au dus la concluzia c n procesul de trecere al H+ pe NAD i NADP, care la rndul lor l transport pe FAD, intervine ubichinona sau coenzima Q. Din punct de vedere structural coenzima Q este o chinona cu un lan lateral poliizoprenic. Studiile de chimie ultrastructural i tehnicile de fragmentare a mitocondriei, au stabilit ca ntregul lan respirator se afla localizat n membrana mitocondriei interne, n oxizomi, activitatea lui fiind n funcie de integrarea structural a oxizomilor. Green (1964) a reuit s izoleze din oxizomi patru complexe enzimatice, denumite convenional I , II, III si IV . Dou din acestea, I i II sunt dehidrogenaze i sunt localizate la baza oxizomului, complexul III, localizat n regiunea mediana, catalizeaz reaciile ce au loc de la coenzima Q pn la citocromul C, iar complexul IV, care se gsete la vrful oxizomului, catalizeaz reaciile terminale ale lanului respirator, adic transferul electronilor de la citocromul c la O2, n vederea activrii lui. 2.6.2.5. Fosforilarea oxidativ Electronii n lungul lanului respirator sufer o scdere de potenial, materializat printro eliberare de energie, care are loc n etape i care servete pentru regenerarea moleculelor de

Fig. 38. Conceptul fosforilrii oxidative 72

ATP prin fosforilarea ADP cu fosfat anorganic (Pi) existent n matricea mitocondriei (fig. 38). Formarea ATP are loc n trei etape si anume: o prima etapa o constitue oxidarea NADH2 de ctre FAD, o a doua oxidarea citocromului b de ctre citocromul c i a treia, oxidarea citocromului a, rezultnd n final trei molecule de ATP. Ansamblul acestor reacii de oxidare i fosforilare a fost denumit fosforilare oxidativa. Energia astfel stocat sub forma de ATP servete n majoritatea cazurilor la biosinteza unor substane de mare importan. Fosforilarea oxidativ, denumit i fosforilare cuplat, are un rol deosebit de important n reglarea numeroaselor etape ale metabolismului celular i justific denumirea de ,, central energetic a celulei care se d mitocondriei. Oxidarea complet a unei molecule de glucoz (glicoliz + ciclul Krebs) permite sinteza a 38 de molecule de ATP. Ecuaia global a respiraiei unei molecule de glucoz se poate scrie astfel: C 6 H 12O 6 + 6O2 + 6 H2O 6CO2+ 12H2O + 38 ATP 2.6.2.6. Fermentaiile Exigena organismelor fa de oxigen nu sunt identice. Astfel se disting urmtoarele trei grupe: Organismele strict aerobe, care nu pot tri dect n prezena oxigenului (animalele, plantele, unele microorganisme) Organismele strict anaerobe, care nu pot tri dect n absena oxigenului liber, care le este nociv (numeroase microorganisme, de ex Clostridium) Organisme aerobe facultative, care pot tri att n prezena ct i n absena oxigenului din mediu. Astfel, levurile aparin acestei categorii dar i unele plante superioare care sunt capabile s reziste la asfixie, adoptnd o activitate metabolic diferit de respiraie, numit fermentaie. Fermentaia este oxidarea incomplet a unui substrat organic n absena oxigenului (metabolism anaerob); acest substrat organic este transformat ntr-un produs rezidual organic. Reaciile enzimatice care transform substratul organic sunt cele de la glicoliz (localizate n citoplasma citoplasma celular). Substratul este deci degradat pn la acid piruvic. NADH2 format neoxidat de oxigenul atmosferic din mitocondrie, va reduce acidul piruvic, transformndu-l ntrun produs rezidual produs ultim rezidual din procesul fermentaiei. Dup natura acestui produs rezidual i a echipamentului enzimatic al organismului fermentativ, pot exista mai multe tipuri de fermentaie (alcoolic, lactic, acetic etc). Metabolismul anaerob este mult mai puin eficace n ceea ce privete producerea de energie, dect respiraia, deoarece fermentaia nu utilizeaz n totalitate energia substratului degradat pentru sinteza ATP, de la o molecul de glucoz fermentat se formeaz doar dou molecule de ATP, n timp ce n cursul oxidrii complete dintr-o molecul de glucoz rezult 38 molecule de ATP. Randamentul fermentaiei este de 2%, fa de 45% ct este pentru respiraie. Organismele care i obin energia din fermentaie trebuie s descompun cantiti considerabile de substrat; aceste organisme se numesc ,,descompuntori.

2.6.3.Comparaie ntre fotosintez i respiraie

Fotosinteza i respiraia sunt dou procese antagonice dar complementare: din punct de vedere energetic, fotosinteza transform energia luminoas n energie chimic, acumulat n legturile carbon-hidrogen; respiraia rupe aceast legtur i elibereaz energie; din punct de vedere metabolic, fotosinteza construiete materie organic prin fixarea i reducerea carbonului mineral, astfel c plantele cresc n greutate. Dar respiraia 73

degradeaz rezervele organice (derivai de carbon) prin oxidare i greutatea plantelor scade prin pierderea carbon mineral; schimburile gazoase sunt n sens invers: fotosinteza absoarbe CO2 i ap i degaj O2. Oxigenul fotosintetic degajat n biosfer asigur viaa organismelor superioare (eucariote) care respir acest oxigen, degajnd CO2 i ap; fotosinteza se manifest numai n prezena luminii. Intensitatea respiraiei este identic att n condiii de obscuritate ct i de lumin; mecanismele biochimice sunt antagonice: lanurile transportorilor de electroni funcioneaz n sens opus. Lanul fotosintetic, permite transportul electronilor de la ap la NADH2, lanul respirator invers, electronii sunt transportai de la NADH2 la oxigen, rezultnd ap. glucoza construit n cursul ciclului Calvin (faza de ntuneric a fotosintezei) prin carboxilare, hidrogenare i condensare, este tiat de glicoliz, dehidrogenat i decarboxilat de ciclul Krebs. Respiraia i fotosinteza sunt procese care se opun reciproc, dar, ambele particip la meninerea vieii i creterea organismelor vegetale sau animale. Formula general pentru fotosintez este urmtoarea: Energie (lumina) + 6CO2 + 6H2O C6 H 12O6 + 6 O2 Formula general pentru respiraie conine aceeai compui : C 6H 12 O 6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H 2 O + energie (ATP) Dup cum se observ din formulele generale ale fotosintezei i respiraiei celulare, aceste reacii sunt exact n opoziie una cu alta, respiraia elibernd energia captat (de la soare) de fotosintez. Cele dou procese au i etape similare. Astfel, ambele implic conversia energiei dintr-o form n alta. n fotosintez, energia, (lumina) solar este convertit n energie chimic. n respiraie, energia chimic este convertit n ATP. n ambele procese energia electronilor ce se deplaseaz de-a lungul unui lan este folosit pentru sinteza ATP-ului. Att cloroplastul ct i mitocondria au o ultrastructur asemntoare, ceea ce reflect i funcii asemntoare (transformatori de energie). Lanul transportatorilor de electroni, prezent att n mitocondrie ct i n cloroplast, se datoreaz aranjamentului membranelor interne, care este foarte asemntor, n aceste dou organite. Toate organismele scindeaz molecule organice pentru a-i asigura combustibilul necesar proceselor vitale, dar numai plantele autotrofe sunt capabile s capteze energia solar i s o transforme n hran . Conversia energiei este procesul de baz de care depind toate fiinele vii.

74

Capitolul 3
ADEZIUNEA CELULAR. JONCIUNILE CELULARE I MATRICEA EXTRACELULAR
n organismele pluricelulare, celulele specializate n realizarea unei anumite funcii se recunosc i interacioneaz specific formnd esuturi, care prin asociere dau natere unitilor funcionale, numite organe. Interaciunea dintre celule poate fi joncional ( prin intermediul unor structuri specializate numite jonciuni celulare) sau non-jonctional ( prin intermediul moleculelor suprafeei celulare). Astfel, recunoaterea i aderarea intercelular este posibil datorit moleculelor de pe suprafaa celular, care pot fi diferite calitativ i cantitativ, manifestnd specificitate celular. Suprafaa celular poate media trei tipuri de aderare: a) homofilic, dac moleculele suprafeei celular care interacioneaz sunt identice; b) heterofilic, dac moleculele suprafeei celulare sunt diferite dar complementare i c) prin molecul linker, molecul extracelular, ce nu aparine suprafeei celulare. Un rol important n stabilirea structurilor tisulare l are matricea extracelular, o reea complex de macromolecule prezent n spaiile interstiiale i care se afl ntr-o permanent interrelaie cu celulele. Ancorarea celulelor n matricea extracelular se realizeaz prin jonciunile celulmatrice, regiuni specializate din membrana plasmatic. Implicarea jonciunilor intercelulare i a matricei, n adeziunea celular, variaz funcie de tipul celular. n esutul epitelial, celulele sunt strns unite ntre ele, iar matricea extracelular este slab reprezentat. Rezistena esutului epitelial la forele la forele mecanice ce acioneaz asupra sa este conferit de proteine fibrilare intracelulare (elemente de citoschelet), care se aeaz pe faa intern a membranei plasmatice, unde se formeaz jonciuni specializate cu suprafaa altor celule sau cu matricea extracelular. n esutul conjunctiv, celulele sunt dispersate n matricea extracelular, care ocup cea mai mare parte a volumului tisular. n acest caz, elementele componente ale matricei asigur stabilitatea tisular prelund aproape n totalitate stress-ul mecanic.

3.1. Molecule implicate n aderarea celul-celul

Din categoria moleculelor suprafeei celulare implicate n aderarea celular nonjoncional fac parte: selectinele, domeniile imunoglobulinice i caderinele.

3.1.1. Selectinele
Sunt proteine identificate pe suprafaa membranar a leucocitelor, plachetelor sanguine, celulelor endoteliale. Sunt implicate n medierea interaciunii limfocitelor cu peretele venulelor sau cu nodulii limfatici, fapt pentru care se numesc i proteine transmembranare limfocitare. Selectinele recunosc i leag formaiuni specifice de oligozaharide care aparin altei celulei. Ele posed un domeniu citoplasmatic care traverseaz membrana plasmatic i un segment extracelular de lungimi variabile care se termin cu un domeniu pentru lectin. Acest domeniu terminal leag lectine, proteine de legare care recunosc i leag specific moleculele de carbohidrai de la suprafaa celulei nvecinate. Legarea selectinelor la carbohidrai este Ca2+ dependent. Selectinele sunt importante n rspunsul inflamator. Ele mediaz legarea neutrofilelor de peretele vasului de snge, favoriznd invazia neutrofilelor prin peretele vasului la locul infeciei sau leziunii. Pentru procesul invaziei neutrofilelor sunt necesare integrine (proteine receptori membranari de recunoatere).

75

3.1.2. Domenii imunoglobulinice

Unele domenii imunoglobulinice care nu aparin structurii unui anticorp pot media interaciuni non-joncionale celul-celul Ca2+ dependete, homosau heterofilic. Interaciunea heterofilic presupune prezena integrinelor. Proteinele care conin domenii imunoglobulinice aparin IgSF (superfamiliei imunoglobulinelor). Aderarea celor dou celule adiacente se realizeaz prin suprapunerea domeniului Ig al unei celule cu domeniul Ig al celulei vecine. Membrii numeroi ai IgSF mediaz interaciunea celular n elaborarea rspunsului imun. Unul dintre acetia, numit VCAMs (vascular cell- adhesion molecules) factorul de adeziune vascular este important n dezvoltarea sistemului circulator la embrion i n legarea neutrofilelor de peretele vascular nainte de invazie. Ali doi reprezentani al IgSF sunt NCAMs (neural cell- adhesion molecules) sau factorul de adeziune neural i L1, ambii foarte importani n dezvoltarea sistemului nervos la embrion. NCAMs mediaz interaciunea celul-celul, iar L1 mediaz alungirea conului de cretere n timpul dezvoltrii neuronilor. Un domeniu Ig conine proteine de suprafa ale unei celule care pot interaciona cu o molecul de integrin ale altei celule (de exemplu, aderarea neutrofilului la peretele vascular, interaciune mediat de NCAMs celulelor endoteliale i integrinele neutrofilelor).

3.1.3. Caderinele
Sunt reprezentate de o larg familie de glicoproteine de adeziune, Ca2+ dependente. Ele mediaz interaciuni celulare homotipice non-joncionale i joncionale i transmit semnale din matrixul extracelular n citoplasm. Caderinele au fost identificate n diferite pri ale corpului (N-caderina n sistemul nervos, P- caderina n placent, E- caderina n esutul epitelial). Caracteristic acestui tip de glicoproteine este faptul c ele leag intre ele celule de acelai tip i, deci i caderine de acelai tip. Caderinele sunt alctuite dintr-un segment lung extracelular ce conine 5 domenii de legare, un segment transmembranar i un mic domeniu citoplasmatic. Domeniul citoplasmatic interacioneaz cu proteine din citosol care fixeaz caderine ce aparin citoscheletului i transmit informaii n citoplasm. Caderinele de pe aceeai suprafa celular se asociaz formnd dimeri. Segmentele extracelulare ce aparin la dou celule adiacente pot interaciona prin juxtapoziia poriunilor terminale sau a segmentului n totalitate. Ca2+ leag segmentele n tandem meninndu-le ntr-o stare rigid, stare necesar legrii unei caderine de caderina celulei alturate. Caderinele sunt molecule implicate n recunoaterea celulelor de acelai tip, aderarea i meninerea lor ntr-un esut, respectiv alctuirea unui esut la embrion i meninerea integritii unui esut la adult. n cancer, se produc modificri conformaionale ale caderinelor care duc la scderea adezivitii celulare, eliberarea celulelor oncogene din esut i migrarea lor, cu posibilitatea iniierii metastazelor.

3.2. Jonciunea celular

Jonciunile celulare (jonciunile intercelulare i jonciunile celul-matrice extracelular), structuri specializate i stabile, permit sau mpiedic schimburile intercelulare i mediaz contactele celul-celul i celul-matrice. Din punct de vedere funcional se deosebesc trei categorii principale de jonciuni: Jonciunile de ocluzie sudeaz membranele plasmatice ale celulelor epiteliale, blocnd fluxul de molecule i ioni dintre lumenul organelor cavitare i spaiile interstiiale; 76

Jonciunile de ancorare asigur legarea strns a celulelor unele de altele i a acestora cu matricea extracelular; Jonciunile de comunicare sunt implicate n cuplarea electric i metabolic a celulelor ce ndeplinesc aceeai funcie. Jonciuni sinaptice conecteaz partea terminal a unui axon neuronal ( butonul terminal) cu celula int.

3.2.1. Jonciunile de ocluzie

Jonciunile de ocluzie (zonulae occludens numite i jonciuni strnse sau impermeabile (tight jonction) sunt reprezentate la polul apical al celulelor epiteliale ce delimiteaz lumenul unor caviti. Observarea la microscopul electronic a unei seciuni prin jonciunile de ocluzie ofer imaginea a dou membrane plasmatice adiacente care din loc n loc se gsesc n contact direct. Aceste puncte de sudur, separate de mici spaii interstiiale, sunt rezultatul anastomozei proteinelor joncionale prezente n membranele plasmatice ale celulelor nvecinate. Dei proteinele nu au fost nc izolate, substratul molecular proteic al jonciunilor de ocluzie este sugerat de aciunea denaturant pe care proteazele o au asupra acestor structuri. Proteinele joncionale sunt ordonat depuse n mai multe iruri ce nconjoar celula n regiunea apical. Jonciunile de ocluzie se formeaz n urma stabilirii contactului ntre irurile de proteine aparinnd celulelor alturate, oferind, n ansamblu, imaginea unei centuri situate imediat sub suprafaa cu microvili a celulei epiteliale (fig.39) Fig. 39 Jonciunile strnse sunt formate din mai multe iruri de perechi de proteine joncionale situate n regiunea apical a membranei plasmatice. Aceste structuri joncionale mpiedic deplasarea moleculelor i a ionilor din lumenul organelor cavitare n spaiile interstiiale. Capacitatea de ocluzie variaz funcie de tipul de esut epitelial. n plus, se sugereaz existena unei relaii logaritmice ntre numrul irurilor de proteine joncionale i gradul de impermeabilitate al jonciunilor pentru diferite specii ionice. n celulele epiteliale sunt pompate selectiv substane nutritive care, n urma unui transport transcelular, difuzeaz n esutul conjunctiv de unde sunt preluate, n circulaia sangvin. Acest flux unidirecional al moleculelor, din lumen prin celulele epiteliale n snge, este condiionat de distribuirea asimetric a componentelor membranare, care determin apariia unor domenii distincte apical i laterobazal n membrana plasmatic a celulelor epiteliale. Un exemplu concret l constituie absorbia glucozei din lumenul intestinal, proces care implic dou tipuri de proteine cu o strict localizare membranar. Proteinele din domeniul apical (faa luminal a membranei), transport activ glucoza pompnd-o din lumen n celulele epiteliale. Eliberarea glucozei n spaiile interstiiale se realizeaz prin difuziune mediat de un set de permeaze, prezent n domeniul laterobazal. Prezena jonciunilor de ocluzie la polul apical al celulelor face imposibil retrodifuziunea glucozei din interstiii n lumenul intestinal. (fig. 40). 77

Fig. 40 Transportul glucozei n celulele epiteliale ce delimiteaz lumenul intestinal. Jonciunile strnse sunt implicate n meninerea prioritii celulelor epiteliale mpiedicnd difuzia proteinelor transportoare n planul membranei plasmatice Meninerea polaritii celulelor epiteliale constituie a doua funcie a jonciunilor de ocluzie. Acestea acioneaz n sensul mpiedicrii difuziei prin dublul strat lipidic al moleculelor ce compun domeniile membranare. Un argument n favoarea acestei afirmaii este pierderea polaritii celulare, datorit migrrii lipidelor din stratul exoplasmatic i al proteinelor n membrana plasmatic, ca urmare a scderii concentraiei Ca2+ n mediul extracelular, element esenial n meninerea integritii jonciunilor de ocluzie. Att prin mpiedicarea schimburilor lumen-interstiiu, ct i prin meninerea stabilitii domeniilor membranare, jonciunile de ocluzie permit esutului epitelial s se comporte ca o barier cu o permeabilitate selectiv.

3.2.2 Jonciunile de ancorare

Jonciunile de ancorare asigur contactul celul-celul i celul-matrice extracelul. Acest tip de jonciune antreneaz elementele de citoschelet crend structuri de rezisten n celulele supuse stress-ului mecanic (epitelii, miocard, miometru etc). Din punct de vedere structural, jonciunile de ancorare sunt alctuite din dou clase de proteine: proteine de ataare intracelular i glicoproteine transmembranare de legare. Proteinele de ataare intracelular leag elementele de citoschelet de complexul joncional, n timp ce, glicoproteinele transmembranare interacioneaz prin domeniile lor intracelulare cu proteinele de ataare, iar prin cele extracelulare cu glicoproteine transmembranare din celulele adiacente. innd cont de tipul elementelor de citoschelet asociate - filamente de actin sau filamente intermediare jonciunile de ancorare se clasific n jonciuni de adeziune i structuri desmozomale. Att jonciunile de adeziune, ct i structurile desmozomale se subdivid n jonciuni de adeziune intercelulare i jonciuni de adeziune celul-matrice i respectiv, desmozomi i hemidesmozomi, funcie de tipul de contact pe care l mediaz. Toate cele patru tipuri de jonciuni de ancorare coexist n celulele esutului epitelial. 3.2.2.1 Jonciunile de adeziune intercelular n celulele epiteliale, jonciunile de adeziune intercelular sunt localizate la polul apical, imediat sub jonciunile de ocluzie. Aceste structuri constituie situsuri de ancorare ale filamentelor de actin dispuse n mnunchiuri. Orientate paralel cu membrana plasmatic mnunchiurile de filamente de actin nconjoar polul apical al celulei formnd o band de adeziune continu (zonulae adherens). Benzile de adeziune aparinnd celulelor nvecinate se gsesc n opoziie direct, contactul acestora fiind mediat de structurile joncionale de adeziune intercelular. Datorit aspectului lor, aceste jonciuni au fost numite desmozomi n 78

band (belt desmosomes), denumire eronat, deoarece din punct de vedere chimic cele dou structuri joncionale sunt deosebite. Filamentele de actin interacioneaz cu complexul joncional printr-un set de proteine de ataare dintre care cel mai bine caracterizate sunt vinculina i -actinina. Proteinele de ataare se leag de domeniul intracelular al unei glicoproteine transmembranare, ancornd astfel filamentele de actin n embrana plasmatic. Glicoproteina (uvomorulina) este un membru al familiei moleculelor de adeziune intracelular calciu dependente, numite caderine. Domeniul extracelular al glicoproteinei interacioneaz cu domeniile extracelulare ale glicoproteinelor din membrana plasmatic a celulelor nvecinate. Ca rezultat al acestor interacii, ce au la baz un mecanism Ca2+ dependent, membranele plasmatice adiacente sunt meninute la o distan de 15-20 nm una de ceallant (fig. 41). Conectarea reelelor transcelulare de filamente de actin asigur adeziunea celulelor epiteliale conferind totodat rigiditate structurii tisulare. Fig. 41 Distribuia proteinelor de legare a actinei i uvomorulinei la nivelul jonciunilor de adeziune intercelular din celulele epiteliale 3.2.2.2 Jonciunile de adeziune celul-matrice extracelular Jonciunile de adeziune celul-matrice asigur contactul dintre celul i matricea extracelular prin conectarea filamentelor de actin, ce alctuiesc citoscheletul, cu elemente componente ale matricei. Aderarea celulelor la matrice implic regiuni specializate ale membranei plasmatice, numite contacte focale sau plci de adeziune. La nivelul plcilor de adeziune se stabilete contactul dintre mnunchiurile de filamente de actin i un element al matricei, prin intermediul unei glicoproteine transmembranare, ce aparine familiei integrinelor. De cele mai multe ori, elementul matriceal este fibronectina, iar glicoproteina transmembranar este receptorul pentru fibrobnectin. Legarea filamentelor de actin de domeniul intracelular al receptorului este indirect, fiind mediat de cel puin pentru tipuri de proteine de ataare: o protein ce leag capul filamentelor de actin (actin-filament-capping protein), -actinina, vinculina i talina. 3.2.2.3 Desmozomii Dependent (fig. 42). desmozomii (desmozomii n pat) constituie regiuni de cimentare intercelular. Aceste structuri joncionale realizeaz contactul dintre filamentele intermediare ale celulelor adiacente, n urma crora se formeaz o reea transtisular continu. Tipul filamentelor intermediare antrenate de desmozomii n adeziunea intercelular difer funcie de tipul celular. n celulele epiteliale, structurile desmozomale le sunt asociate filamentele de cheratin, n celulele musculare ale inimii, filamentele de desmin, n celulele mezenchimale, filamentele de vimentin etc. Vizualizarea la microscopul electronic a desmozomilor ofer imaginea a dou discuri dense (15-20 nm grosime), situate pe faa citoplasmatic a membranelor celulelor adiacente, 79

numite plci citoplasmatice. Placa citoplasmatic este alctuit dintr-un complex de proteine de ataare desmoplachine ce leag tangenial filamentele intermediare i o glicoprotein transmembranar desmoglina-care interacioneaz prin domeniul su intracelular cu proteine de ataare. Cele dou plci citoplasmatice din membranele adiacente sunt conectate ca urmare a interaciunii domeniilor extracelulare ale desmoglinelor printr-un mecanism Ca2+ Fig. 42 Structuri desmozomale n esutul epitelial. (a) Desmozomul este alctuit din dou plci citoplasmatice situate pe feele citoplasmatice ale plasmalemelor celor dou celule adiacente. Filamentele intermediare se ataeaz tangenial de plcile citoplasmatice. Glicoproteinele transmembranare interacioneaz prin domeniile lor extracelulare, consolidnd structura desmozomal. (b) Hemidesmozomul asigur ancorarea celulelor n matricea extracelular. Este alctuit dintr-o singur plac citoplasmaticde care filamentele intermediare sunt legate prin capete. n boala Penfigus se sintetizeaz anticorpi mpotriva propriilor glicoproteine transmembranare. Legarea anticorpilor de desmoglin afecteaz structura desmozomilor responsabili de aderarea intercelular a celulelor esutului epitelial din piele. Devenit lax, esutul epitelial este incapabil de a mai funciona ca barier. Moleculele aflate n soluie difuzeaz printre celulele epiteliale spre exterior, fapt ce confer pielii un aspect vezicular. De vreme ce anticorpii afecteaz doar desmozomii din piele se presupune existena unor deosebiri biochimice ntre acetia i cei prezeni n alte esuturi. Studiul desmozomilor a pus n eviden implicaiile funcionale pe care aceste structuri le au n alte esuturi dect cel epitelial. Astfel, n celulele ce alctuiesc esutul muscular cardiac, filamentele de desmin asociate desmozomilor constituie o cale de transmitere a forei de contracie, iar n muchii netezi desmozomii sunt considerai echivaleni funcionali ai discurilor Z din muchii scheletici. 3.2.2.4 Hemidesmozomii Hemidesmozomii, similari desmozomilor din punct de vedere morfologic, asigur contactul dintre regiunea bazal a membranei celulelor epiteliale i o structur specializat a matricei extracelulare, numit lamina bazal. Placa citoplasmatic constituie situsul de ancorare a filamentelor de cheratin ce intr n alctuirea citoscheletului celulei epiteliale. Legarea plcii citoplasmatice de lamina bazal este mediat de o glicoprotein transmembranar. n esuturile epiteliale, unde de regul se semnaleaz prezena ambelor structuri desmozomale (desmozomi n pat i hemidesmozomi), acestea sunt implicate att n asigurarea adeziunii celulare, ct i n distribuirea forelor mecanice n ntregul esut epitelial i esutul conjunctiv adiacent.

3.2.3 Jonciunile de comunicare

Jonciunile de comunicare (permeabile, gap junction) au o larg rspndire, regsinduse n toate esuturile organismelor animale. n regiunea jonciunilor de comunicare, 80

membranele plasmatice adiacente sunt separate de un spaiu ngust (2-4 nm grosime) ntrerupt din loc n loc de particule cilindrice. Aceste particule sunt strbtute de un canal ce face posibil contactul dintre citoplasmele celulelor cuplate prin jonciunile de comunicare. Canalul, cu un diametru de 1,5-2nm, permite trecerea liber, dintr-o celul n alta, a moleculelor cu greuti moleculare sub 1500 -2000 Dar (glucide, aminoacizi, nucleotide, hormoni etc.)i a diferitelor specii ionice. Prin stabilirea acestui tip de comunicare intercelular, jonciunile permeabile constituie elementul-cheie al cuplrii electrice i metabolice celulare, proces, ce st la baza coordonrii activitii celulelor ntr-un esut. Cuplarea electric mediat de jonciunile de comunicare asigur: sincronizarea contraciilor celulelor ce alctuiesc esutul muscular; peristaltismul intestinal; propagarea potenialului de aciune de la un neuron la altul. Prin cuplarea metabolic, celulele sunt capabile s transfere diferite molecule celulelor nvecinate incapabile s le sintetizeze. De asemenea, prin canalele jonciunilor de comunicare pot trece mediatori intracelulari (ioni de Ca, AMP-ciclicetc.), implicai n reglarea numeroaselor procese metabolice celulare. Deplasarea mediatorilor intracelulari de la o celul la alta prin jonciunile de comunicare, explic activarea diferiilor stimuli hormonali (vezi subcap.1.3.2). Jonciunile de comunicare au un rol important n procesul de embriogenez. Se presupune c primele etape ce urmeaz fecundrii majoritatea celulelor sunt cuplate electric. Pe parcursul proceselor de difereniere, grupuri de celule cu o entitate distinct se decupleaz de restul celulelor urmnd o cale comun de dezvoltare. Apariia defectelor n dezvoltarea embrionului ca urmare a injectrii, n etapele timpurii ale embriogenezei, a unor inhibitori ai jonciunilor de comunicare sprijin aceast ipotez. 3.2.3.1 Structura jonciunilor de comunicare n alctuirea jonciunilor de comunicare intr un singur tip de protein transmembranar, numit conexin (280000-320000Da). Lanul polipeptidic (280 aminoacizi) strbate de patru ori membrana plasmatic. Cele patru domenii membranare prezint o conformaie helix. Al treilea domeniu -helix al conexinei are un caracter amfipatic. Prin asocierea a ase molecule de conexin ia natere o structur conexon. n interiorul conexonului, domeniile helix amfipatice, ale fiecrei proteine componente delimiteaz un canal ce strbate membrana plasmatic (fig.43). Fig. 43 a) Jonciunile de comunicare. Conexonii, complexe proteice prezente n membranele plasmatice sunt poziionai cap la cap, dnd natere unor canale de comunicare intercelular. b) Poziionarea n membrana plasmatic a conexinei-subunitate a conexonului. n regiunea membranar implicat n jonciunile de comunicare, sute de conexoni se aglomereaz formnd cluster-i (mnunchiuri) Conexonii din membranele celulelor nvecinate se aeaz cap la cap formnd un canal de comunicare continuu ntre citoplasmele celor celule. 3.2.3.2 Reglarea permeabilitii jonciunilor de comunicare Jonciunile de comunicare sunt structuri cu caracter dinamic, permeabilitatea lor fiind dependent de diveri factori: 81

Scderea pH-ului citosolic; creterea concentraiei Ca2+ liber n citosol; valoarea potenialului de membran la nivelul jonciunilor; semnale chimice extracelulare etc. Modificarea permeabilitii are la baz capacitatea jonciunilor de comunicare de a adopt dou conformaii distincte: nchis i deschis (fig. 44) Fig. 44 Schema modificrii conformaionale a conexonilor Existena unui mecanism de reglare a permeabilitii structurilor joncionale dependent de concentraia de Ca2+din citosol are o importan vital pentru funcionarea normal a celulelor asociate din esuturi. Alterarea grav a structurii celulare (ruperea membranei plasmatice, moarte celular etc.) este nsoit de pierderea unor cantitii nsemnate de metabolii celulari, n paralel cu creterea influxului de ioni de Na i Ca. n acest caz, concentraia mare a ionilor de Ca impune nchiderea jonciunilor de comunicare dintre celulele deteriorate i cele i cele normale. Prin aceast decuplare, sunt izolate regiunile tisulare afectate, ceea ce face posibil funcionarea normal a celulelor n restul esutului. Cretere permeabilitii jonciunilor de comunicare, n prezena unui semnal chimic extracelular, st la baza activitii celulare n cascad. Un exemplu concret l constituie rspunsul celular la aciunea hormonului glucagon, ce comand oprirea sintezei de glicogen n celulele hepatice i eliberarea glucozei n snge. n celulele hepatice stimulate de glucagon, are loc creterea concentraiei de AMP-c, care activeaz protein kinazele AMP-c dependente. Ele fosforileaz att enzimele, ct i conexina din structura jonciunilor de comunicare. Fosforilarea conexinei impune adoptarea conformaiei deschis de ctre jonciuni, ceea ce permite trecerea AMP-c din celula activat n celulele nvecinate. Activarea acestora nu necesit contactul direct cu hormonul, transmiterea semnalului realizndu-se prin AMP-c.

3.2.4. Jonciunile sinaptice

Sunt structuri specializate de legtur ntre neuroni. Prin jonciunea sinaptic, un axon n cretere se ataeaz la celula-int Acest tip de jonciune este mediat de protocaderine (glicoproteine ce aparin familiei caderinelor; conin 6 domenii extracelulare de legare n tandem). Exist mai mult de 50 de gene ce controleaz sinteza diferitelor protocaderine. Numrul mare de protocaderine asociate n diferite combinaii dau specificitatea sinaptic. Rolul protocaderinelor este acela de a ine la distana optim cele dou componenete membranare ale sinapsei membrana presinaptic i cea postsinaptic, pentru a facilita transmiterea sinaptic.

3. 3. Matricea extracelular
Matricea extracelular reprezint o reea complex de carbohidrai i proteine ce ocup spaiile interstiiale. Considerat un suport inert ce ofer doar stabilitate fizic esuturilor, matricea extracelular se relev, azi, ca o structur dinamic ce joac un rol esenial n dezvoltarea, migrarea, proliferarea, forma i funciile metabolice ale celulelor cu care se afl ntr-un contact permanent. Arhitectura, elementele componente, ct i rolul matricei extracelulare difer funcie de tipul tisular. La interfaa dintre esutul epitelial i esutul conjunctiv subadiacent, se afl o structur specializat a matricei extracelulare, numit lamin bazal, care mediaz contactul 82

dintre cele dou esuturi. n glomerulii renali, lamina bazal se comport ca un filtru permind trecerea apei, ionilor i a moleculelor mici din snge n spaiul urinar. n esutul conjunctiv lax, pe care se sprijin esutul epitelial i diferitele glande. n esutul conjunctiv ce nconjoar capilarele sangvine, reeaua intricat de macromolecule din spaiile interstiiale permite difuzia liber a nutrienilor i a oxigenului din snge n celulele esuturilor periferice. n esutul conjunctiv dens, prezent n cartilaje, tendoane i oase, matricea extracelular este responsabil de elasticitatea i rezistena mecanic ale acestor structuri.

3.3.1 Componentele matricei extracelulare

Macromoleculele ce alctuiesc matricea extracelular sunt secretate de ctre celulele ce se gsesc dispersate n matrice i care aparin clasei fibroblastelor. n matricea extracelular sunt prezente polizaharide de tipul glicozaminoglicanilor (GAG) care, de regul, sunt legate covalent de moleculele proteice, formnd proteoglicani. Proteinele fibrilare constituie cea de-a doua component a matricei. Se disting dou tipuri de proteine fibrilare: proteine structurale (colagenul i elastina) i proteine de adeziune (fibronectina i laminina). Proteinele fibrilare, dispuse n reea, sunt responsabile de organizarea matricei, conferindu-i totodat rezisten mecanic. Aceast reea proteic este nglobat n gelul hidrat de polizaharide. Faza apoas a gelului permite difuzia metaboliilor, hormonilor etc. n spaiul dintre celule i n capilarele sangvine. 3.3.1.1 Glicozaminoglicanii Glicozaminoglicanii reprezint lanuri poliglucidice lineare a cror unitate structural este un diglucid. n mod obligatoriu, unul din componentele diglucidului este un amino-glucid de tipul N-acetilglucozaminei, al doilea rest glucidic este, de cele mai multe ori, acidul uronic. Aminoglucidul din unitatea diglucidic poart grupri sulfat. Att gruprile sulfat, ct i gruprile carboxil ale acidului uronic confer glicozaminoglicanilor ncrcare electric negativ. Ca rezultat al aciunii forelor de electrostatic, moleculele leag diferii cationi (n special Na+). Specii ionice osmotice active, cationii cresc gradul de hidratare al matricei. Aceasta determin creterea turgescenei matricei extracelulare, factor ce confer structurii rezisten la forele de compresie. Lanurile poliglucidice hidrofile, adopt o conformaie de tip random coil (ncolcire aleatorie). Dei glicozaminoglicanii reprezint 10% din masa proteinelor fibrilare, datorit conformaiei adoptate, aceste molecule ocup cea mai mare parte a spaiului interstiial. Funcie de tipul de reziduuri glucidice, a legturilor ce se stabilesc ntre acestea, a numrului i a localizrii gruprilor sulfat, se disting patru clase de glicozaminoglicani: 1. acidul hialuronic; 2. condroitin sulfat i dermatan sulfat; 3. heparan sulfat i heparin; 4. cheratan sulfat. Cu excepia acidului hialuronic, toate celelalte clase ale glicozaminoglicanilor prezint caracteristici comune: conin grupri sulfat legate de reziduuri glucidice; conin uniti diglucidice diferite dispuse ntr-o secven complex. sunt molecule scurte (mai puin de 300 reziduuri glucidice) formeaz proteoglicani. Att lanul poliglucidic lung (cteva sute de reziduuri glucidice), ct i unitile diglucidice nesulfatate, ce se repet regulat, definesc acidul hialuronic drept un reprezentant atipic al glicozaminoglicanilor. 83

Structura simpl a acestei molecule, prezena i implicarea sa n fazele timpurii ale embriogenezei sugereaz faptul c acidul hialuronic este primul reprezentant al glicozaminoglicanilor, din el derivnd celelalte clase. Moleculele de acid hialuronic se leag de suprafaa celulelor care migreaz,acoperindule ca o haina. Acest fapt, mpiedic adeziunea intracelular, fcnd posibil deplasarea liber a celulelor i favoriznd proliferarea lor. Prin acest mecanism, acidul hialuronic joac un rol important n migrarea celulelor pe parcursul morfogenezei i al reparrii structurilor tisulare. 3. 3.1.2 Proteoglicanii Proteoglicanii sunt reprezentai n toate esuturile conjunctive i matricele extracelulare. Aceste molecule conin un miez proteic (core) n care sunt ancorate lanuri de glicozaminoglicani. Structuri heterogene, proteoglicanii difer prin greutatea molecular, componenta proteic, numrul i tipul lanurilor de glicozaminoglicani, aranjarea gruprilor hidroxil, sulfat i carboxil n lanurile poliglucidice. Componenta proteic a proteoglicanilor este sintetizat la nivelul ribozomilor ataai de RE rugos. Concomitent cu procesul de translaie proteic are loc translocarea proteinei n aparatul Golgi unde este asamblat n proteoglicani. n prima etap a sintezei proteglicanilor, o secven tricglucidic se leag covalent de un rest de serin din molecula proteic (fig. 45). Fig. 45 - Structura proteoglicanilor. Glicozaminoglicanii se leag prin intermediul unei secvene triglucidice de un rest de Ser prezent n structura componentei proteice a proteoglicanilor. Restul de Ser este frecvent localizat n interiorul unei secvene specifice de aminoacizi: Asp(Glu)-Asp(Gky)-X-Ser-GlyX-Gly, unde X poate fi oricare aminoacid.

La aceast secven ce servete drept primer se leag unul cte unul reziduurile glucidice printr-o reacie catalizat de glicozil-transferaza. Simultan cu elongarea lanurilor poliglucidice are loc n aparatul Golgi procesarea acestora, reacii de sulfatare i epimerizare. Eliminai n spaiul interstiial, proteoglicanii formeaz geluri hidratate, cu densiti diferite i pori de mrime variabil, ce regleaz traficul molecular i deplasarea celulelor funcie de mrimea sau/i sarcina lor electric. Structura heterogen a proteoglicanilor sugereaz faptul c aceasta nu constituie unica lor funcie. Cercetri n acest sens au pus n eviden capacitatea proteoglicanilor de a lega molecule semnal (ex. factorul de cretere al fibroblatilor FGF). Organizarea acestor molecule n matricea extracelular este nc un subiect controversat. n cartilaje, proteoglicanii formeaz agregate ce pot atinge o lungime de 4m i o mas molecular de aproximativ 2 x 108 Da. Componenta central a acestor agregate o constituie acidul hialuronic. Miezul proteic al proteoglicanilor, de care sunt ataate multiple lanuri condroitin sulfat i cheratan sulfat se leag, necovalent de acidul hialuronic. Lanurile sunt stabilizate de proteine de legare (fig. 46). 84

Fig. 46 Proteoglicanii din cartilagii conin i acid hialuronic legat necovalent, prin intermediul unor proteine liker de miezul proteic. Pe o singur molecul de acid hialuronic se pot lega o sut de monomeri de proteoglicani. Acest tip de organizare a proteoglicanilor confer elasticitate cartilajelor. Proteoglicanii sunt prezeni i la nivelul membranelor plasmatice ale multor tipuri celulare. De miezul integrat n membrana plasmatic i care proemin n spaiul extracelular este ataat un numr mic de lanuri de glicozaminoglicani (fig. 47).

Fig. 47 a) Proteoglicani prezeni la nivel la nivelul membranelor plasmatice. Miezul proteic de care sunt ataate patru lanuri de heparan sulfat i dou de condroitin sulfat traverseaz integral membrana plasmatic; b) Legarea lanurilor de condroitin sulfat la miezul proteic al proteoglicanilor din membran. n acest caz proteoglicanii sunt implicai n legarea celulelor de matricea extracelular i n organizarea acromoleculelor ce compun matricea.

85

3.3.1.3 Colagenul Colagenul reprezint o familie de proteine fibrilare insolubile, sintetizate n fibroblaste i reprezentate n toate organismele animale la nivelul matricei extracelulare i a esutului conjunctiv. Este principala component a matricei extracelulare. Se cunosc poate 12 tipuri de colagen. Dintre acestea tipurile I, II, i III ntlnite n special n esutul conjunctiv, au capacitate de autoasamblare, formnd polimeri ce poart numele de fibrile de colagen. Tipul IV constituie comportamentul principal al laminei bazale, unde formeaz o reea bidimensional. a. Structura moleculelor de colagen Unitatea structural fundamental a colagenului este o molecul proteic cu o lungime de 300nm i un diametru de 1,5 nm, alctuit din trei subuniti: dou lanuri 1 i un lan 2. Celelalte trei tipuri polipeptidice, ce conin fiecare 1050 aminoacizi, se nfoar unul n jurul celorlalte, de la stnga spre dreapta, formnd o structur de tipul triplu helix. Fiecare rotaie complet (tur) a helixuluide faptul c conine trei aminoacizi (fig. 48) Fig. 48 - a) Modelul lanului polipeptidic alfa din molecula de colagen. Gly ocup a treia poziie n secvena repetitiv: Gly-X-Y, unde X i Y reprezint oricare alt aminoacid. b) Modelul moleculei de colagen. Cele trei lanuri alfa formeaz un tripluhelix. Repetiia glicinei (Gly) la fiecare a treia poziie, este justificat de faptul c aceasta este singurul aminoacid suficient de mic pentru a ocupa spaiul din interiorul triplu-helixului. Molecula de colagen este bogat n prolin, lizin, aminoacizi ce apar de cele mai multe ori sub form hidroxilat. Gruprile hidroxil ale hidroxiprolinei particip la formarea legturilor de hidrogen ce stabilizeaz triplu-helixul. n boala numit scorbut, datorat deficienei de vitamina C, este inhibat reacia de hidroxilare a prolinei, ceea ce mpiedic organizarea lanurilor polipeptidice n triplu-helix. Acestea sunt rapid degradate sub aciunea unei enzime, numit colagenaz. n consecin, matricea extracelular i vasele sangvine devin extrem de fragile, iar dinii se desprind din alveolele dentare. Gruprile hidroxil ale hidroxilizinei sunt implicate ntr-o reacie de glicozilare. Glicozilarea colagenului confer acestei molecule capacitatea de a se autoasambla n spaiul extracelular.

86

b. Sinteza colagenului Prezena secvenei repetitive Gly-X-Y (unde X,Y reprezint diferii aminoacizi cu excepia glicinei)n structura colagenului, reflect organizarea genelor ce l codific, sugernd faptul c evoluia acestor gene are la baz fenomenul de duplicare genic. Gena ce codific lanul 1 conine 41 de exoni. Cea mai mare parte a exonilor este alctuit din 54 perechi de baze (pb) sau multipli de doi sau trei ai acestui numr, sintetiznd 1,2 sau 3 uniti primordiale. O unitate primordial conine 6 secvene repetitive Gly-X-Y. Un numr mic de exoni din structura genei au pierdut, pe parcursul evoluiei 9pb, unitile primordiale codificate de ctre acetia fiind mai scurte cu o secven Gly-X-Y. Locul de sintez al lanurilor polipeptidice ce formeaz colagenul l constituie ribozomii ataai de RE rugos. Ca rezultat al translaiei la nivel ribozomal sunt sintetizate lanurile pro-. Acestea sunt introduse n lumenul RE rugos, datorit prezenei n structura lor a secvenei semnal (signal peptide). n regiunile carboxil- i amino- terminale lanurile pro- conin alte dou secvene, numite propeptide. Aceste dou secvene formeaz domenii globulare, n timp ce restul lanului adopt o conformaie de tip helix. n lumenul RE reziduurile de lizin i prolin sunt hidroxilate, iar ntre secvenele propeptidice a trei lanuri pro- se stabilesc puni disulfurice intercatenare. Ulterior formrii legturilor disulfurice, lanurile se unesc (direcia C - N), genernd molecula de procolagen. Din RE, procolagenul este transportat n aparatul Golgi, unde se desfoar mai multe runde de procesare ce constau, n principal, n adaosul de reziduuri glucidice la hidroxilizin. Moleculele de procolagen sunt eliminate din aparatul Golgi n spaiul extracelular. Sub aciunea procolagen peptidazelor, secvenele sunt clivate proteolitic, molecula de procolagen fiind convertit n colagen. Proteoliza secvenelor propeptidice n spaiul extracelular mpiedic autoasamblarea colagenului n interiorul celulei,ceea ce ar avea drept consecin distrugerea celular. c. Asamblarea moleculelor de colagen n spaiul extracelular n spaiul extracelular, moleculele de colagen (numit i tropocolagen) de tip I, II i III se asociaz spontan formnd polimeri ordonai ce poart numele de fibrile de colagen (50nm n diametru). n fibrile, moleculele sunt dispuse n iruri longitudinale. ntre moleculele nvecinate ale aceluiai ir exist o distan (gap) de 35 nm. Moleculele de colagen din irurile adiacente sunt deplasate unele fa de altele cu 67 nm, ceea ce reprezint mai puin de o ptrime din lungimea total a moleculei. Se constat c din cinci n cinci molecule de colagen sunt aliniate identic (fig. 49). Spaierea colagenului n fibrile confer acetia o maxim elasticitate. n regiunile amino-i carboxil-terminale ale colagenului exist segmente scurte ce au o conformaie triplu-helix. Resturile de lizin sau/i hidroxilizin din aceste regiuni particip la legturi covalente ncruciate ce se stabilesc ntre extremitatea carboxilic a unei molecule adiacente. Aceste legturi au rolul de a stabiliza asamblarea colagenului n fibrile. Organizarea fibrilelor difer de la esut la altul. n piele, acestea se ntretaie crend o reea lax. n oase i n cornee, fibrilele de colagen sunt dispuse n plci ordonat aranjate; fibrilele aceleiai plci sunt paralele ntre ele i perpendiculare pe cale ale plcilor adiacente. n tendoane fibrilelor formeaz mnunchiuri, numite fibre. Fibrele sunt dispuse paralel i orientate pe direcia forei ce acioneaz asupra tendonului.

87

Fig. 49 a) Sinteza colagenului i asamblarea sa n fibre n spaiul extracelular. 3.3.1.4. Elastina Elastina este o protein neglicozilat, puternic hidrofob, a crei secven de aminoacizi (830) este bogat n glicin i prolin. Este proteina major a reelelor de fibre elastice din matricea extracelular. Spre deosebire de colagen, are un coninut sczut de lizin. n matricea extracelular, resturile de lizin ale moleculei proteice particip la formarea legturilor covalente ncruciate ce stabilizeaz elastina ntr-o reea (filamente sau foie) ale crei ochiuri i modific forma n raport cu direcia forei ce acioneaz asupra sa. Elasticitatea reelei se datoreaz capacitaii moleculelor de elastin de a adopta mai multe conformaii random-coil. Oscilarea ntre conformaii caracterizate de diferite grade de relaxare a moleculelor de elastin asamblate n reea, confer acestei proteine proprieti elastice similare cauciucului. Filamentele de elastin reprezint constitueni principali ai reelei de fibre elastice prezente n matricea extracelular din piele, vase sangvine sau plmni. Componentul minor al fibrelor elastice este o glicoprotein. Dispus pe suprafaa fibrelor, glicoproteina intervine n organizarea moleculelor de elastin.

88

3.3.1.5. Fibronectinele Fibronectinele aparin clasei glicoproteinelor de adeziune, a cror funcie principal este de a media adeziunea celul-matrice extracelular. Fibronectinele au un rol important n meninerea formei celulelor, n organizarea citoscheletului, iar pe parcursul embriogenezei sunt implicate n migrarea i diferenierea celular. n organismele animale, fibronectinele sunt ntlnite n: snge i alte fluide, sub form de dimeri solubili, favoriznd fagocitoza, migrarea celulelor imune (n special macrofage), ataarea trombocitelor de regiunile alterate ale vaselor sangvine; ataate tranzitoriu pe suprafaa celular, ca oligomeri de fibronectin; n matricea extracelular, unde formeaz fibre insolubile. a) Structura fibronectinelor Se cunosc mai multe tipuri de fibronectine. Codificate de ctre o unic gen (70 kb), fibronectinele sunt rezultatul splicing-ului alternativ al moleculei de ARN-m. Funcie de tipul celular, pot fi generate una pn la 20 molecule diferite de ARN-m pentru fibronectin ce dau natere unui numr echivalent de lanuri polipeptidice. Din punct de vedere structural, fibronectina este un dimer alctuit din dou subuniti identice. Regiunile carboxiterminale ale celor dou lanuri polipeptidice (2500 aminoacizi fiecare) ce formeaz dimerul sunt legate printr-o pereche de puni disulfurice. Fiecare subunitate prezint ase domenii globulare, unite prin regiuni flexibile ale lanului polipeptidic. Fiecare domeniu globular asigur legarea specific a fibronectinei la receptori celulari, colagen, fibrin i proteoglicani sulfatai (figura 50). Identificarea, izolarea i secvenializarea domeniului prin care fibronectina se leag la suprafaa celular au condus la evidenierea unei secvene tetrapeptidice-Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS). Secvena RGD este comun mai multor proteine extracelulare de adeziune. Ea permite recunoaterea i legarea proteinelor de ctre integrine, o familie de receptori de membran omologi. Dat fiind specificitatea recunoaterii receptor-ligand, se sugereaz implicarea, n acest proces, i a altor secvene din structura proteinelor de adeziune. Fig. 50 a) Structura fibronectinei. Cele dou lanuri polipeptidice sunt legate prin puni disulfurice. Fiecare lan prezint domenii globulare ce leag specific molecule din matricea extracelular sau receptori de membran; b) domeniile de legare specific au fost puse n eviden prin digestie cu proteaze. Se cunosc ase domenii: dou pentru heparan sulfat; dou pentru fibrin; unul pentru colagen; unul pentru receptorul fibronectinei.

89

b) Receptorul pentru fibronectin-reprezentant al familiei integrinelor Receptorul pentru fibronectin este un heteromer alctuit din dou lanuri polipeptidice . i , asociate prin legturi necovalente. Lanul (140.000 Da) este scindat n dou segmente; unul transmembranar i altul extracelular. Segmentele sunt legate ntre ele printr-o punte disulfuric . Lanul conine secvene repetitive bogate n cistein. Ambele lanuri polipeptidice ale receptorului sunt glicozilate (figura 51). Fig. 51 Structura receptorului pentru fibronectin Rolul moleculei receptor este de a media contactul dintre fibronectin (recunoate secvena RGDS) i elementele din structura citoscheletului (filamentele de actin). Receptorul pentru fibronectin este un membru al familiei integrinelor. Din aceast familie mai fac parte receptorul pentru laminin, o parte din receptorii pentru colagen, etc. Toate aceste molecule au o structur similar, fiind implicate n legarea componentelor matriceale de elementele citoscheletului. Nu toi receptorii pentru constituenii matricei extracelulare aparin familiei integrinelor. Mai mult, n anumite celule, receptorul pentru colagen este reprezentat de o glicoprotein transmembranar cu o structur diferit de cea a integrinelor. c) Migrarea i aderarea fibroblastelor n matricea extracelular proces ce implic recunoaterea fibronectin receptor n organismele animale adulte, migrarea celular este un fenomen rar ntlnit. O excepie o constituie procesul de reparare a leziunilor, n care fibroblatii i celulele sistemului imun migreaz spre zona afectat. Aceste celule traverseaz cheagurile sangvine al cror element constituent principal este fibrina. Fibronectina, secretat de ctre fibroblati se leag printr-unul din domeniile sale globulare la fibrin. Pe de alt parte, prezentnd secvena specific RGD, fibronectina este recunoscut i legat de receptorul pentru fibronectin din membrana plasmatic a fibroblastelor. Datorit mobilitii laterale a receptorului n membrana plasmatic, pe parcursul migrrii fibroblastelor, se stabilesc i se desfac succesiv contactele celul-matrice. n momentul n care deplasarea nceteaz, n citoplasm se organizeaz fibrele de stres bogate n actin. Aceste fibre se leag de receptor prin intermediul proteinelor de ataare intracelulare (vinculina i talin), imobilizndu-l n membrana plasmatic (fig. 52). Fig. 52 Modelul regiunii de contact fibroblast-substrat. Fibrele de actin se ataeaz prin intermediul vinculinei i a talinei de receptorul pentru fibronectin. Receptorul leag fibronectina care, la rndul sau, interacioneaz cu alte elemente ale matricei extracelulare (colagen, proteoglicani). Contactul dintre fibronectine, din spaiul extracelular i mnunchiurile de fibre de actin, din interiorul celulei, mediat de receptorul pentru fibronectin, asigur aderarea celulei la matricea extracelular.

90

3.3.2. Lamina bazal

Lamina bazal, structur specializat a matricei extracelulare, delimiteaz suprafaa bazal a celulelor epiteliate i endoteliale, separnd aceste celule de esutul conjunctiv subadiacent. Ea nconjoar celule individuale (musculare, adipoase, celule Schwann) sau se afl interpus ntre dou straturi unicelulare n glomerulii renali i n alveolele pulmonare. La microscopul electronic, lamila bazal apare din trei straturi: un strat electrono-transparent (lamina lucida sau lamina rara) situat n imediata vecintate a membranei plastice a celulelor ce se sprijin pe lamila bazal; un strat electrono-dens (lamina densa); un strat cu aspect reticular (lamina reticularis) alctuit din colagen i care are rolul de a lega lamila bazal de esutul conjunctiv. 3.3.2.1. Structura laminei bazale Moleculele componente ale lamilei bazale sunt sintetizate sunt sintetizate de ctre celulele epiteliate, endoteliale i mezenchimale. Dei compoziia lamilei bazale variaz de la un esut la altul, colagenul de tip IV, proteoglicanii (heparan sulfat) i laminina sunt elemente comune tuturor acestor structuri. a) Colagenul de tip IV Moleculele de colagen de tip IV sunt prezentate n exclusivitate n lamila bazal. Ele reprezint elementul constituient major al lamilei densa ce compune lamila bazal. Similar moleculelor de colagen fibrilar, colagenul de tip IV este alctuit din trei lanuri polipeptidice ce formeaz un truplu helix (40 nm lungime). Secvena repetitiv Gly-X-Y, caracteristic tuturor moleculelor de colagen, este ntrerupt de aproximativ 20 de ori n molecula de tip IV, ceea ce justific apariia unor discontinuiti n structura truplu-helixului. Existena zonelor de discontinuitate confer ntregii molecule o mai mare flexibilitate. Spre deosebire de moleculele de colagen interstiial, secvenele propeptidice amino-i carboxi-terminale ale colagenului IV nu sunt scindate proteolitic dup eliberarea sa n mediul extracelular. Secvenele propeptidice carboxi-terminale formeaz domenii prin intermediul crora monomerii interacioneaz formnd dimeri lineari. Dimerii se asociaz lateral prin regiunile cu conformaie triplu-helix dnd natere unei reele plane cu ochiuri hexagonale. Regiunile amino terminale ce predomin de o parte i de alta a planului reelei se asociaz prin legturi covalente genernd o reea multistratificat (figura 53). Fig. 53 Modelul asocierii moleculelor de colagen de tip IV i formarea reelei multistratificate. n aceast reea, moleculele de colagen sunt stabilizate prin legturi covalente ncruciate i puni disulfurice. b) Laminina-glicoprotein major a lamilei bazale Laminina este localizat pe faa dinspre membrana plasmatic a lamilei densa mediind legarea lamilei bazale de suprafaa celular. Molecula (850.000 Da) este alctuit din trei lanuri polipeptidice; un lan lung A i dou lanuri mai scurte B. lanurile sunt unite prin puni disulfurice ntr-o structur 91

cruciform. Cele trei brae scurte ale moleculei de laminin prezint cte o pereche de domenii globulare, iar braul scurt are un singur domeniu (figura 54). Fig. 54 Structura lamininei Proteina prezint trei lanuri polipeptidice (A, B1 i B2) i conine mai multe domenii funcionale: - un situs de legare a colagenului IV; - un situs de legare a proteoglicanilor sulfatai; - dou sau mai multe situsuri de legare la receptori de membran. Ca i fibrotectina, laminina conine mai multe domenii funcionale: cte un domeniu leag colagenul IV i heparan sulfatul, iar unul sau mai multe domenii sunt implicate n legarea receptorului prin laminin. Receptorii pentru laminin difer funcie de tipul celular, dar cel puin o parte a acestora aparin familiei integrinelor. 3.3.2.2. Funciile laminei bazale Lamina bazal se caracterizeaz printr-o pronunat heterogenitate funcional determinat de necesitile fiziologice ale diferitelor esuturi. Interpus ntre esutul epitelial i esutul conjunctiv subadiacent, lamina bazal susine celulele epiteliale i totodat funcioneaz ca un filtru molecular i celular ntre cele dou compartimente tisulare. n glomerii renali, rolul laminei bazale const n reglarea traficului de molecule din snge n urin. La nivelul jonciunilor neuromusculare, lamina bazal prezint o compoziie chimic particular ceea ce-i permite exercitarea funciei de coordonare a organizrii spaiale a componentelor joncionale de o parte i de alta a sinapsei. n regenerarea tisular, lamina bazal constituie eafodul pe care celulele migreaz ndreptndu-se spre zona afectat. Reglarea funciilor celulare vitale: adeziunea, creterea i diferenierea celular sunt independente de legarea receptorilor celulari la elementele componente ale laminei bazale.

92

Capitolul 4 CITOSCHELETUL
Citoscheletul este alctuit din microtubuli, filamente de actin, filamente intermediare, o reea microtrabecular i din proteine asociate. Citoscheletul este o structur dinamic. Capacitatea sa de a-i modifica structura, funcie de necesitaile celulare,are la baza reaciile de polimerizare i depolimerizare ale microfilamentelor i ale microtubuliilor. Proteinele asociate au rol de a regla procesele de polimerizare i depolimerizare ale filamentelor,de a interconecta elementele de citoschelet n reea i de a le lega de organitele celular i/sau membrana plasmatic. Implicat n inducerea i meninerea formei celulei i a prelungirilor celulare (cili,flageli,microvili,axoni),citoscheletul are n principal o funcie de susinere. Acesteia i se adaug o funcie motil. Principalele micri celulare asigurate de elementele de citoschelet sunt: micarea cililor i a flagelilor; deplasarea celulelor ce prezint un tip de locomoie ameboidal; transportul intracelular de particule materiale, vezicule de transport i organite celulare; translocarea cromozomilor n timpul diviziunii celulare; desfaurarea citokinezei; contracia muscular; Interaciunea elementelor de citoschelet cu membrana plasmatic, la nivelul structurilor joncionale, prin intermediul proteinelor de adeziune intracelular, solidarizeaz celule n esuturi, conferind acestora rezisten. Se apreciaz c realizarea acestora funcii constituie rezultatul cooperrii citoscheletului cu reeaua microtrabecular.

4.1. Microtubulii
Au fost evideniai pentru prima dat, cu ajutorul microscopului electronic, n celulele animale de ctre d. Slauttersack (1963), care a introdus i termenul de microtubul.

4.1.1. Microtubulii semnificaia biologic

Microtubulii sunt substructuri celulare omniprezente n citoplasma celulelor eucariote. n citoplasm, ei se gsesc fie izolai microtubuli citoplasmatici, fie fasciculai, dnd natere unor formaiuni cu caracter efemer fibrele fusului de diviziune, sau permanent centrioli, corpusculi bazali i axonemele organitelor locomotorii (cili, flageli). Microtubulii ndeplinesc n celul un rol structural, intervenind ca parte component a citoscheletului, n inducerea i meninerea geometria spaial a celulelor, i un rol dinamic, aceste structuri coordonnd motilitatea celular. Principalele micri asociate microtubulilor sunt: micrile cililor i flagelilor ce asigur deplasarea celulelor libere, mobile; transportul intracelular de particule, vezicule i organite celulare (nucleu, plastide, mitocondrii) translocarea anafazic a cromozomilor. Studiul comparativ al microtululilor din diferite compartimente celulare a artat c tratamentul cu colchicin, temperaturile sczute i presiune hidrostatic mare determin degradarea microtubulilor citoplasmatici i a celor ce alctuiesc fusul mitotic, dar nu afecteaz 93

structurile microtubulare stabile (cetrioli, corpusculi bazali, microtubuli din organitele locomotorii). Aceste rezultate demonstreaz existena unei populaii heterogene de microtubuli.

4.1.2. Structura microtubulilor

n imaginile electronomicroscopice, microtubulii se disting ca structuri cilindroide de lungimi variabile (pn la zeci de nm) i cu un diametru relativ constant de 24 nm. Fiecare microtubul este alctuit din 13 protofilamente dispuse paralel cu axul longitudinal i care delimiteaz un lumen. Protofilamentele sunt rezultatul asocierii cap la coad a unui numr variabil de heterodimeri, ce poart numele de tubulin (100.000 Da). Orientarea dimerilor, de tubulin n protofilamente, confer microtubulilor un caracter polar, ce este conservant n toate structurile microtubulare. Unitatea fundamental a microtubulilor, tubulina, este alctuit din dou proteine distincte: alfa i beta tubulina (fiecare 50.000 Da). Cele dou componente proteice ce compun heterodimerul sunt dispune heicoidal n peretele microtubulului. (fig. 55). Fig. 55 Modelul structurii tridimensionale a microtubulilor. (Fiecare din cele 13 protofilamente ce alctuiesc peretele microtubulului este format din heterodimeri de tubulin i , aezai cap la coad. n preparatele pure de microtubuli, n afara heterodimerilor de tubulin, s-a observat prezena unor proteine cu mase moleculare diferite. Deoarece, diversele structuri microtubulare conin diferite tipuri de molecule proteice, iniial, s-a considerat c acestea sunt proteine de contaminare. Dar raportul cantitativ constant dintre proteine i subunitile de tubulin, observat pe parcursul mai multor cicluri de polimerizare i depolimerizare, a condus la concluzia c proteinele sunt asociate specific tubulinelor, motiv pentru care au fost numite proteine asociate microtubulilor (microtubule associated proteins - MAP). Cele mai bine caracterizate proteine asociate sunt proteinele tau, localizate exclusiv n structurile microtubulare din axonii celulelor nervoase. Codificate de o unic gen, cele cinci proteine tau cunoscute astzi, sunt rezultatul unui proces de splicing (combinare) alternativ. Alte proteine asociate prezente n celulele nervoase sunt MAP1-MAP2. MAP1 este asociat microtubulilor din axoni i dendrite, n timp ce MAP2 este ntlnit doar n structurile microtubulare din dendrite. Proteinele asociate au rol de a consolida structurile microtubulare prin interconectarea microtubulilor adiaceni i de a stabiliza edificiul arhitectural al citoscheletului prin legarea filamentelor intermediare. Majoritatea proteinelor asociate sunt fosforilate. Ciclurile de fosforilare i defosforilare ale acestora pot constitui o etap important n reglarea asamblrii microtubulilor. Aceast presupunere este confirmat n cazul proteinei tau ce prezint activitatea ATP - azic i care acioneaz n sensul accelerrii polimerizrii microtubulilor.

94

4.1.3. Polaritatea i dinamica microtubulilor

Geneza microtubulilor este un proces de autoasamblare a tubulului. Studiile n vitro au demonstrat formarea microtubulilor ntr-o soluie pur de dimeri, la 37C, n prezena GTP (guanozin trifosfat) i a ionilor bivaleni. Sinteza microtubului primer, prima etap a polimerizrii, se desfoar lent, dar alungirea primer-ului, prin adugarea de noi dimeri de tubulin, este un proces mult mai rapid. Expunerea unei soluii de microtubuli la temperaturi sczute (0C) are un rezultat contrar, determinnd depolimerizarea cu eliberarea dimerilor stabili. Creterea temperaturii la 37C este nsoit de reasamblarea microtubulilor. Se demonstreaz astfel caracterul dinamic al microtubulilor, structuri ce-i modific lungimea ca rezultatul a reaciilor de polimerizare i depolimerizare. Dei adugarea sau pierderea subunitilor de tubulin poate avea loc n oricare din capetele microtubului, observaiile electrono-microscopice subliniaz funcionalitatea diferit a extremitilor acestor structuri. Viteza reaciilor de polimerizare i depolimerizare este de dou ori mai mare la unul din capete, simbolizat cu plus (+). Captul opus a fost notat cu minus (-). In vitro, la o anumit concentraie a dimerilor liberi de tubulin se atinge o stare de echilibru (steady state), numrul dimerilor adugai fiind egal cu cel al subunitilor disociate de microtubuli. Aceast concentraie a fost numit concentraie critic (Cc). Cnd concentraia dimerilor liberi depete valoarea critic predomin procesul de polimerizare, n timp ce, scderea concentraiei de tubulin, sub concentraia critic, are ca rezultat depolimerizarea microtubulilor. n consecin, concentraia dimerilor liberi reprezint principalul factor implicat n reglarea polimerizrii i depolimerizrii microtubulilor. Studiul dinamicii microtubulilor, n culturi de celule, a evideniat aspecte surprinztoare i aparent contrare rezultatelor, experimentelor in vitro. Se constat astfel, c, n timp ce unii microtubuli sunt subiectul unor repetate i rapide procese de polimerizare i depolimerizare, n aceeai celul (la aceeai concentraie a dimerilor liberi) ali microtubuli se alungesc continuu sau rmn la o lungime constant pe parcursul perioadei de observaie. Manifestarea simultan a fenomenelor de cretere i descretere n lungime a microtubulior este explicat prin modelul dinamic (dynamic instability model). Acest model sugereaz c o anumit structur a extremitilor microtubulilor de determin adugarea sau disocierea subunitilor proteice. Fiecare dimer de tubulin conine dou molecule de GTP. Pe parcursul polimerizrii sau n etapa imediat urmtoare ncorporrii dimerului (preferenial la captul +), GTP este hidrolizat la GDP (guanozin difosfat). Stabilitatea microtubulului apare reglat de doi factori concentraia de tubulin liber i viteza reaciei de hidroliz a GTP. Dac, concentraia dimerilor liberi este superioar valorii critice, polimerizarea microtubulilor este favorizat, iar viteza acestei reacii este mai mare dect cea a hidrolizei GTP. n consecin, la extremitatea + se formeaz un cap GTP. Microtubulii care au o strucrur cap GTP, sunt stabili i pot servi ca primer-i n procesul de polimerizare; se pot alungi. La o concentraie sczut a tubulinei libere (C < C C ), viteza de disociere a dimerilor depete viteza de polimerizare, ceea ce conduce la formare GDP. Prezena structurii GDP este asociat cu instabilitatea microtubulilor, determinnd o accelerare a depolimerizrii. n ceea ce privete influena celui de-al doilea factor, asupra stabilitii microtubulilor, se constat c, cu ct viteza de hidroliz a GTP este mai mic, cu att este mai favorizat formarea unui cap GTP i deci, alungirea microtubulului. Viteza mare a hidrolizei GTP are un efect contrar. Modelul susine c variaiile locale ale celor doi factori pot determina evoluia diferit a microtubulilor dintr-o celul; n timp ce unii microtubuli se alungesc, alii sufer un proces de depolimerizare.

95

4.1.4. Bazele diversitii structurilor microtubulilor

Dei toi microtubulii prezint o organizare fundamental comun, structurile rezultate prin asocierea acestora sunt foarte diferite, chiar i n cadrul aceleiai celule. Iniial, diversitatea structurilor microtubulare a fost pus pe seama existenei, la organismele eucariote, a subtipurilor de alfa i beta tubulin. Aceste proteine sunt codificate de aceleai gene sau de gene diferite, caz n care poart numele de izotipuri. Secvenele de aminoacizi ale izotipurilor de alfa i beta tubulin sunt aproape identice la psri i roztoare. Diferenele dintre subtipuri sunt, n mare parte, rezultatul modificrilor posttranslaionale. Astfel, tubulinele alfa sunt antrenate ntr-o reacie de acetilare a unui rest de lizin i sufer adiia sau deleia unei tirozine carboxi-terminale. La tubulinele beta se remarc modificri ale segmentelor carboxi terminale. Este posibil c aceste modificri structurale s condiioneze ncorporarea subunitilor n diferite structuri microtubulare i legarea lor la proteinele asociate. Recent, s-a demonstrat c heterogenitatea subunitilor de tubulin nu poate explica diversitatea structurilor microtubulare, deoarece modificrile posttranslaionale nu afecteaz semnificativ funcionalitatea microtuburilor. Cercetri efectuate pe structurile microtubulare din neuron au condus la concluzia c fiecare microtubul conine subuniti alfa i beta echivalente funcional, particularitile acestor structuri fiind dictate de tipul proteinelor asociate ce copolimerizeaz cu tubulinele sau se leag de microtubuli ulterior polimerizrii.

4.1.5. Centrii organizatorici ai microtubulilor

Distribuia nealeatorie a microtubulilor n celul a condus la ipoteza existenei unor factori ce controleaz nucleaia, diferenierea i dispunerea acestor formaiuni celulare. Aceti factori a cror existen a fost demonstrat prin cercetri experimentale poart numele de centrii organizatori ai microtubulilor (MTOC) sau centrii de nucleaie. Astzi, dispunem de numeroase argumente ce atest faptul c cel puin centriolii i corpusculii bazali acioneaz ca centrii organizatorici ai micritubulilor. Microtubuli au o orientare strict n raport cu centrele de nucleaie (fig. 56). Fig. 56 Orientarea microtubulilor n raport cu centrele de nucleaie: A Celul ciliat aflat n interfaz.Microtubulii citopasmatici au captul (-) ancorat n regiunea pericentriolar.Microtubulii ce intr n structura axonemei au captul poziionat proximal fa de corpusculul bazal; B Celul nervoas.Microtubulii din axon sunt orientai cu captul spre corpusculul bazal.Microtubulii din dendrite nu au o orientare fix; C Celul aflat n mitoz.Microtubulii fasciculai dau natere fibrelor fusului de diviziune ce se difereniaz ntre cei doi centrii celulari prezeni la polii opui ai celulei.

96

Capetele (-) sunt inserate n centrul organizator i stabilizate de proteinele asociate, n timp ce, capetele (+) distale sunt libere. Sechestrarea i stabilizarea capetelor explic de ce n vivo adugarea i disocierea dimerilor are loc doar la capetele (+) libere. De la aceast orientate fac excepie microtubulii din dendritele i axonii neuronilor. Datorit absenei centrului organizator n dendrite, microtubulii nu pstreaz aceeai polaritate; ei sunt dispui fie cu captul (+), fie cu captul (-) spre corpul celular. La baza axonului se remarc prezena unui centru organizator, dar nu toi microtubulii radiaz din aceasta. Microtubulii ce au ca punct de plecare centrul de nucleaie prezint o orientare obinuit (captul (+) liber). Este posibil ca acetia s dicteze i poziionarea microtubulilor liberi de vreme ce, n axon toi microtubulii au aceeai polaritate; captul (-) este orientat spre corpul celular. 4.1.5.1. Centriolii i corpusculii bazali n coordonare asamblrii microtubulilor i a motiliti celulare un rol-cheie l joac structurile microtubulare specializate. Microtubulii din celulele aflate n interfaza i cei care alctuiesc fibrele fusului mitotic i au originea ntr-o regiune perinuclear, numit centrul celular. Structura centrului celular este complex, ea constnd dintr-o pereche de centrioli situai central, nconjurai de o zon citoplasmatic amorf, numit centrozom sau regiune pericentriolar, delimitat, la rndul su, de o zon mai puin dens i relativ omogen, centrosfera. Cercetrile experimentale au demonstrat faptul c centriolii izolai sau nsoii de materialul pericentriolar sun capabili s iniieze polimerizarea tubulinei in vitro i s coordoneze nucleaia microtubulilor in vivo. n imaginile electronomicroscopice se observ ns c microtubulii nu au ca punct de plecare centriolii, ei radiind din regiunea pericentriolar. Un argument n plus, n favoarea rolului de centru organizator al centrozomului, l constituie pstrarea capacitii de organizare a microtubulilor n celulele eucariote, din care lipsesc centriolii. Se presupune c n celulele n care att centriolii, ct i centrozomul sunt prezeni ambele structuri coordoneaz formarea microtubulilor din celulele aflate n interfaz i acelor din fibrele fusului mitotic. n formarea microtubulilor ce alctuiesc axonemele cililor i flagelilor sunt implicate alte structuri microtubulare, localizate la baza organitelor locomotorii i care poart numele de corpusculi bazali. Pe lng rolul de centri organizatori ai microtubulilor, centriolii stau la baza fenomenelor de motilitate manifestate n timpul diviziuni celulare, iar corpusculii bazali, coordoneaz micrile cililor i flagelilor. 4.1.5.2. Ultrastructura centriolilor i a corpusculilor bazali Studiile de microscopie electronic au condus la elucidare ultrastructurii centriolilor i corpusculilor bazali. Ambele structuri microtubulare au forma unui cilindru ( 0,2 m diametru i 0,4 m lungime ). Perei cilindrului sunt constituii din 9 fibrile dispuse circular, echidistant i nclinate la un unghi de 30-40. Fibrilele sunt imobilizate ntr-o matrice amorf ce nconjoar cilindrul. Fiecare fibril este format din 3 subfibrile reprezentate de trei microtubuli. Subfibrilele din fiecare triplet sunt notate cu A,B i C dinspre lumenul cilindrului spre exterior. Subfibrila A este un microtubul complex, format din 13 protofilamente, n timp ce subfibrilele B i C sunt incomplete (10-11 protofilamente). La captul proximal al centriolilor i corpusculilor bazali se constant prezena unui miez cilindric central, interconectat cu fibrilele periferice. Aceast structur, asemntoare unei roi cu spie, este absent n regiune distal a celor dou structuri microtubulare. (fig. 57).

97

Fig. 57 Structura corpusculilor bazali i a centriolilor.Cele 9 fibrile periferice formeaz peretele unui element de form cilindric. Fiecare fibril este un triplet de microtubuli (A,B,C). Fibrilele sunt legate ntre ele prin proteine conectoare. 4.1.5.3. Replicarea centriolilor i a corpusculilor bazali Replicarea centriolilor are loc la un anumit moment al ciclului celular. n interfaz, la nceputul perioadei G1, cei doi centrioli, prezeni n centrul celular, sunt situai unul lng altul cu axele lungi n unghi drept. La sfritul perioadei G1, centriolii se separ, pentru ca n perioada sintetic ( S ) din fiecare centriol prexistent s se diferenieze cte un centriolfiu, numit procentriol. Fiecare procentriol este orientat perpendicular pe centriolul din care a provenit. Iniial, mai mici dect centrioli parentali, procentriolii se alungesc continuu, atingnd dezvoltarea maxim n metafaz. La nceputul profazei, centrul celular se divide, iar cele dou perechi de centrioli, fiecare constituie dintr-un centriol matur i altul n cretere, se separ. Perechile de centrioli migreaz spre polii celulei unde n metafaz alctuiesc polii fusului de diviziune. n momentul separri celulelor-fiice rezultate n urma diviziunii celulare fiecare, va conine cte un cuplu de centrioli maturi, orientai perpendicular unul pe cellalt i nconjurai de materialul pericetriol. (fig. 58).

Fig. 58 Schema replicrii centriolilor. Un fenomen replicativ similar este ntlnit i la corpusculii bazali. Corpusculul nou format se difereniaz din cel preexistent i se orienteaz perpendicular pe aceasta. n momentul n care ajunge la maturitate, el se separ de corpusculul parental, genernd apariia unui nou flagel sau a unui nou cil. Replicarea centriolilor i a corpusculilor bazali nu este pe deplin elucidat. Cercetri recente au demonstrat existena la nivelul corpusculilor bazali a unei molecule mici (6-9 milioane pb ) de ADN linear. Acest ADN conine informaia necesar codificrii majoritii proteinelor existente n corpusculi. Se presupune c translaia are loc n ribozomii citoplasmatici, proteinele sintetizate fiind apoi transportate i integrate n corpusculii bazali. Prezena ADN la nivelul corpusculilor bazali explic capacitatea lor de autoreplicare.

98

Exist date experimentale ce confirm presupunerea prezenei n centrioli a unui ADN propriu. Se sugereaz c ADN centriolar se gsete n nucleu ntr-o form inactiv, iar n urma translocrii sale n centriol, molecula este activ. Interconvertibilitatea demonstrat a centriolilor i corpusculilori bazali, asemnrile structurale i funcionale dintre acetia i nu n ultimul rnd prezena ADN au condus la concluzia c centrii organizatorici ai microtubulilor sunt componente ale unui sistem citoplasmatic. Capacitatea celulei de a coordona modificrile morfologice i funcionale ce nsoesc procesele de cretere i difereniere celular se pot explica prin activarea i dezactivarea centrelor de nucleaie, ca rezultat al cooperrii dintre unitatea genetic nuclear i cea proprie sistemului citoplasmatic.

4.1.6. Micrile cililor i flagelilor

Cilii i flagelii sunt prelungiri celulare cu caracter permanent, prezente n multe celule eucariote animale i vegetale. Dei ntre cili i flageli exist unele deosebiri, ei sunt considerai variante ale acelai organit. La mamifere,inclusiv la om, celulele ciliate se gsesc n mucoasa tractului respirator,avnd rolul de a ndeprta particulele materiale ce ptrund n momentul inspirului n cavitile nazale, faringe i trahee. Ele sunt prezente i n mucoasa oviductului, cilii asigurnd deplasare ovulului. Spermatozoidul este singura celul flagelat din organismele mamifere. Flageli execut micri ondulatorii, cu amplitudine constant, n acelai plan. n majoritatea cazurilor, micrile se propag de la baza organitului ctre captul su opus. Uneori micarea sub forma unei unde plane este nlocuit de o alt helicoidal. Cilii execut micri ciclice, n doi timpi: o btaie activ i o alta de ntorcere. Fiecare ciclu dureaz 0,1-0,2 secunde. Btaia const n nclinarea sub un unghi larg a cilului aflat n extensie. Aproape concomitent are loc curbarea cilului n regiunea bazal, moment ce marcheaz nceputul micrii de ntoarcere. Curbarea se propag de-a lungul cilului determinnd revenirea organitului la poziia iniial (fig. 59).

Fig. 59 Schema micrilor cililor. Micarea cililor, ce formeaz o suprafa ciliat este defazat, diferena de faz ntre micrile a doi cili consecutivi fiind constant. Att micarea cililor, ct i a flagelilor sunt procese energo-dependente, energia necesar fiind furnizat prin hidroliza ATP.

99

4.1.6.1. Structura cililor i a flagelilor Cilii i flagelii celulelor eucariote au un plan de organizare comun, la baza structurii lor aflndu-se microtubulii. Ambele organite sunt alctuite din trei pri: cilul sau flagelul propriu-zis, corpusculul bazal i rdcinile. Cilul sau flagelul propriu-zis const dintr-o structur microtubular complex, numit axonem, nconjurat de hialoplasm i protejat la exterior de o membran celular simpl, generat prin expansiunea plasmalemei. Axonema este alctuit din 9 fibre periferice i 2 centrale. Fibrele periferice sunt dublete subfibrilare ce se extind din corpusculul bazal n flagel (cil). Cele 2 subfibrile sunt notate cu A i B. Subfibrila A este un microtubul complet (13protofilamente), n timp ce subfibrila B este incomplet (10-11 protofilamente). Rolul-cheie n interconectarea microtubulilor revine unei proteine numit tectin. n regiunea central a lumenului axonemei sunt localizate cele 2 fibre centrale, notate cu C1 i C2 . Fiecare este alctuit dintr-un unic microtubul 1 (singlet). Cele 2 fibre centrale sunt interconectate prin puni transversale i nconjurate de o structur fibrilar numit teaca intern. De subfibrila A, n partea opus subfibrilei b, sunt ancorate 2 brae orientate n direcia acelor ceasornicului i alctuite dintr-o protein ce poart numele de dinein. Braele externe ale dineinei apar de-a lungul microtubulilor la intervale regulate de 24 nm, iar distana dintre braele interne succesive este de 32 nm. Tot din subfibrile A pleac spre centrul axonemei brae radiale ce se termin n aproprierea tecii interne, prin regiuni regulare i care creeaz imaginea unei roi cu spie. (fig. 60).

Fig. 60 A. Structura axonemei. Peretele axonemei este alctuit din 9 fibre periferice, fiecare format din dou subfibrile (A i B ). Braele dineinei i elementele radiale sunt ataate pe subfibrila A. n lumenul axonemei se gsesc singletele centrale, interconectate prin puni transversale i nconjurate de teaca intern; B. Fibra periferic este un dublet de microtubuli. Subfibrila A este un microtubul complet (13 protofilamente), subfibrila B este un microtubul incomplet (10 11 protofilamente). 100

Axonema este stabilizat prin interconectarea fibrelor periferice. Subfibrila A, dintr-un dublet, este legat de subfibrile B a dubletului adiacent prin intermediul unei proteine contractile numit nexin. Cilul sau flagelul propriu-zis este ancorat n corpul celular prin rdcini cu o structur variat. 4.1.6.2. Mecanismul molecular al micri cililor i flagelilor n micrile cililor i flagelilor un rol important l joac dineina, o protein alctuit din mai multe polipeptide, cu mase moleculare variate. La extremitatea fiecrui bra de dinein exist 2-3 regiuni globulare, reprezentate de un polipeptid (400.000 Da) cu activitatea ATP azic. n timpul micrii cililor i flagelilor, energia eliberat prin hidroliza ATP este utilizat n scopul desfacerii i refacerii succesive a legturilor dintre dineinile ataate de subfibrila A a unui dublet i subfibrila B a dubletului adiacent. Aceast deplasare a punilor laterale dintre fibrele determin alunecarea dubletelor unul fa de altul i n consecin nclinarea cilului (flagelului). Elementele radiale i teaca intern au rolul de a coordona intrarea n aciune a dineinei, de la baza cilului (flagelului) spre vrful acestuia, convertind glisarea dubletelor ntr-o micare de nclinare a axonemei. Nexina, proteina contractil ce leag fibrele periferice adiacente, mpiedic disocierea dubletelor n momentul glisrii. Spre deosebire de cili, flageli se mic n acelai plan. Aceast limitare a micri este impus pe de o parte de existena unei legturi rigide, cu caracter permanent ntre dubletele externe, iar pe de alt parte de diferenele morfologice dintre fibrele centrale.

4.1.7. Implicarea microtubulilor n diviziunea celular

Microtubulii joac un rol-cheie n trei procese importante ce se desfoar n cadrul diviziuni celulare: formarea fusului de diviziune; deplasarea cromozomilori n planul ecuatorial i celulei i alinierea n placa metafazic; translocarea cromozomilori anafazici. 4.1.7.1. Formarea fusului de diviziune n celulele aflate n interfaz, microtubulii citoplasmatici radiaz din centrozomul centrului celular, avnd o orientare unipolar. Intrarea celulei n diviziune este anticipat de autoreplicarea centriolilor, scindarea materialului pericentriolar i formare celui de-al doilea centru celular. Cei doi centrozomi coordoneaz nucleaia microtubulilor care prin asociere genereaz fibre. Fibrele, cu captul (-) inserat n centrozom i captul (+) distal, liber, sunt dispuse de jur-mprejurul fiecrui centrozom i poart numele de fibre asteriene (stelare). Totalitatea fibrelor asteriene ce radiaz dintr-un singur centrozom alctuiete asterul. Fibrele din cei doi asteri ce se gsesc n contact se alungesc prin polimerizarea tubulinei, determinnd deprtarea centrilor celulari i deplasarea lor spre polii celulei, unde vor constitui polii fusului de diviziune. (fig. 61).

101

Fig. 61 Formarea fusului de diviziune: a) fibrele asteriene radiaz din regiunea pericentriolar; b) replicarea centriolilor are drept consecin apariia celui de-al doilea centru celular; Alungirea fibrelor asteriene i deplasarea celor doi centrii celulari spre polii opui ai celulei; c) diferenierea fibrelor polare ale fusului de diviziune ntre cei doi centrii celulari; d) ancorarea cromozomilor la polii fusului de diviziune prin fibrele kinetocorice. Fibrele ce pleac din centrozom spre planul ecuator al celulei poart numele de fibre polare. Acestea se alungesc prin adugarea dimerilor de tubulin la capetele (+) libere. n momentul dezorganizrii membranei nucleare, fibrele polare ptrund n spaiul nuclear i ancoreaz prin capetele (+) kinetocorii cromozomilor. Fibrele ce leag kinetocorii de polii fusului de diviziune se numesc fibre kinetocorice. Kinetocorii sunt complexe multiproteice cu structura trilamelar, ce se dezvolt pe cele dou fee opuse ale centromerului (constricie primare) la nivelul cruia sunt unite cele dou cromatide ale cromozomului metafazic. Formarea acestei structuri specializate n interconectarea cromozomilor cu polii fusului de diviziune este controlat de secvene de ADN, numite ADN centromeric. Secvenele au capacitatea de a lega proteine specifice ce iniiaz formarea complexului multiproteic. Totalitatea fibrelor asteriene, polare i kinetocorice ce radiaz din cei doi centrozomi, alctuiete fusul mitotic sau fusul de diviziune. Fusul de diviziune este format din dou semifusuri, fiecare coninnd fibrele ce pleac de la un singur centrozom. Caracterul polar al fusului de diviziune poate explica prin existena unui proces de stabilizare selectiv a fibrelor polare. n acest proces sunt implicate proteine asociate microtubulilor ce interconecteaz n plan ecuatorial fibrele polare nvecinate antiparalele, mpiedicnd depolimerizarea acestora.

102

4.1.7.2. Deplasarea cromozomilor spre regiune ecuatorial a celulei i alinierea lor n placa metafazic n prometafaz, cromozomii se mic dezordonat, oscilnd ntre cei doi poli ai fusului de diviziune. n timpul acestor micri, un set de fibre polare captureaz unul din cei doi kinotocori ai cromozomului, dup care i cellalt kinetocor este ancorat de fibrele polare ce pleac din centrozomul opus. Fiecare cromozom va avea astfel o orientare strict n raport cu fusul diviziuni, prezentnd kinetocorii spre cei doi poli ai celulei. Deplasarea cromozomilor spre planul ecuatorial al celulei este determinat n parte de polimerizare fibrelor kinetocorice. Aceste fibre au captul (-) inserat n controzom i captul (+) legat de kinetocor i stabilizat prin proteine. Injectnd tubulin marcat, ntr-o celul aflat n metafaz, s-a constatat c dimeri sunt incorporai la captul (+) al fibrelor kinetocorice. n timp ce detaarea prin micromanipulare a fibrelor kinetocorice de cromozomi declaneaz un proces rapid de depolimerizare a acestor fibre. Aceasta sugereaz c kinetocorul protejeaz capetele (+) ale fibrelor kinetocorice, mpiedicndu-le depolimerizarea. Avnd ambele capete protejate, prin kinetocor i centrozom, fibrele kinetocorice au o stabilitate mult superioar celorlalte fibre ce alctuiesc fusul de diviziune. Polimerizarea fibrelor kinetocorice nu reprezint singurul proces ce explic deplasarea cromozomilor i alinierea lor n placa ecuatorial. Ruperea experimental a fibrelor kinetocorice ce leag cromozomul de unul din polii fusului de diviziune este precedat de rapid deplasare a cromozomului spre polul de care a rmas ataat. Aceasta demonstreaz caracterul elastic al fibrelor kinetocorice. Deplasrii cromozomilor, ancorai n fibrele de diviziune, spre unul din cei doi poli, i se opune o for ce atrage cromozomii spre polul opus. Fora este direct proporional cu lungimea fibrelor kinetocorice. S-a observat c, n urma exciziei kinetocorului, prin microchirurgie cu raze laser de pe un bra cromozomial, aceasta se deprteaz spre polul fusului de diviziune cel mai apropiat. Micarea braului, lipsit de kinetocor, nu se datoreaz ancorrii sale la fibrele fusului de diviziune. O explicaie a acestui fenomen ar putea-o constitui rapida polimerizare a fibrelor fusului de diviziuni ce genereaz un curent care respinge structurile neataate spre regiunea ecuatorial a celulei. Cele dou fore de respingere i atracie, spre polii celulei, acioneaz asupra cromozomilor i dup alinierea lor n placa metafazic, ceea ce justific permanenta reajustare a poziiei lor prin micarea oscilatorii de mic amplitudine. 4.1.7.3. Translocarea cromozomilor anafazici Desvrirea replicrii centromerilor i separarea cromatidelor surori ale cromozomilor metafazici marcheaz sfritul metafazei i iniiaz o alt etap a mitozei, anafaza. n anafaz au loc dou evenimente distincte cu o desfurare simultan n timp. Primul eveniment const n deplasarea cromatidelor surori spre polii opui ai fusului de diviziune i constituie anafaza A. Pe parcursul anafazei A, fibrele kinetocorice se scurteaz prin disocierea de tubulin de la capetele (+) (fig. 62). Fig. 62 Deplasarea cromozomilor spre polii opui ai celulei n anafaz. Mecanismul prin care cromatidele ascensioneaz spre polii fusului de diviziune nu este nc elucidat. Pn n prezent au fost elaborate trei modele teoretice alternative ale acestui mecanism.

103

n primul model, rolul-cheie l joac anumite proteine kinetocorice cu activitate ATPazic similare dineinei i kinezinei. Proteinele leaga capetele (+) ale fibrelor kinetocorice i le stabilizeaz. Energia eliberat prin hidroliz ATP asigur deplasarea de-a lungul fibrelor a proteinelor kinetocorice cu funcie ATP-azic, care antreneaz n aceast micare ntreaga cromatid. Prin deplasarea proteinelor sun expuse capetelor (+) ale fibrelor kinetocorice care sufer depolimerizarea. Elementul central al celulei de-al doilea model l constituie depolimerizarea fibrelor kinetocorice. Disocierea dimerilor de tubulin este nsoit de ruperea i refacerea ciclic a legturilor dintre proteinele kinetocorice (ce nu prezint activitatea ATP azic) i microtubulii ce alctuiesc fibrele kinetocorice. Aceste proteine manifest probabil o afinitate crescut pentru tubulina polimerizat. n cel de-al treilea model, fibrele kinetocorice au numai rolul de a direciona deplasarea cromatidelor. Fora ce determin aceast micare este generat de alte structuri, cum ar fi un sistem de filamente elastice ce interconectez kinetocorii i polii fusului de diviziune. Al doilea eveniment l constituie anafaza B i este reprezentat de alungirea fusului mitotic i deprtarea centrilori celulari. Fora ce determin acest proces este generat de interaciunea fibrelor polare antiparalele (din cele dou semifusuri) ce se ntreptrund n regiunea ecuatorial a fusului de diviziune. Rezultatele cercetrilor efectuate au condus la elaborarea unui model al mecanismului elongarii fusului de diviziune. Modelul se bazeaz pe dou elemente: polimerizarea fibrelor polare i presupunerea axistenei unor proteine cu activitate ATP-azic, similare dineinei sau kinezinei. Prin adugarea dimerilor de tubulin la capetele (+) libere ale fibrelor polare antiparalele acestea se alungesc i se suprapun n regiunea ecuatorial a fusului de diviziune. Se presupune c proteinele cu activitate ATP - azic sunt ataate de fibrele polare ale unui semifus. Energia eliberat prin hidroliza ATP permite deplasarea proteinelor de-a lungul fibrelor polare ce alctuiesc al doilea semifus. Fibrele antiparalele sunt mpinse spre centrii celulari determinnd,n final, deprtarea lor. Nu este exclus posibilitatea ca prin interaciile cu cortica celular microtubulii din fibrele asteriene s participe la deplasarea n direcii opuse a polilor fusului, diviziune n timpul anafazei B.

4.1.8.Transportul intracelular mediat de microtubuli

Organitele, veziculele i particulele proteice nu se deplaseaz haotic n spaiul intracelular. Ele sunt transportate n anumite situsuri, pe direci i cu viteze caracteristice. n stricta orientare a transportului intracelular un rol-cheie l joac microtubulii. Iniial, studiul implicrii acestor elemente de citoschelet n transportul intracelular a folosit, ca sistem experimental, celulele nervoase. Aceast alegere se baza pe faptul c ribozomii sunt abseni din axoni neuronilor, prezena proteinelor i a organitelor celulare fiind rezultatul unui proces de transport de la situsurile de sintez, din corpul celular, spre regiunea sinaptic. Procesul poart numele de transport axonal anterograd. n paralele, n axon are loc i un transport retrograd n care sunt antrnate vezicule ce conin fragmente de membran i proteine citosolice. Acestea se deplaseaz dinspre terminaiile sinaptice spre corpul celular, unde vor fi degradate de ctre enzimele lizozomale. Transportul axonal anterograd a fost pus n eviden prin injectarea aminoacizilor marcai radioactiv i urmrirea, prin metode autoradiografice, a proteinelor libere sau incorporate n organitele celulare ce i conineau. Experimentul a demonstrat c deplasarea proteinelor, veziculelor i a organitelor nu are loc cu aceeai vitez. Cu cea mai mare vitez (3mm/sec) sunt deplasate particulele i veziculele mici, n timp ce proteinele ce intr n alctuirea citoscheletului se deplaseaz foarte incet (fraciuni de mm/zi).

104

O valoare intermediar o are viteza de transport a mitocondriilor. Tehnica microscopiei computerizate n contras de faz a permis vizualizarea asocierii organitelor cu structuri celulare filamentoase i deplasarea lor de-a lungul axonului. n unele cazuri, se pot observa dou organite deplasndu-se de-a lungul aceluiai filament, n direci opuse, fr a intra n coliziune. Aceasta indic faptul c fiecare filament transportor conine mai multe benzi de transport pentru organitele celulare. ncercrile de a caracteriza aceste filamente au condus la concluzia c ele reprezint, de fapt, microtubuli plasmatici. n plus, studiul efectuat pe culturi de fibroblaste a demonstrat implicarea microtubulilor n dispersarea veziculelor rezultate prin fragmentarea aparatului Golgi, pe parcursul mitozei, i reagregarea lor n interfaza ciclului celular. Pentru a nelege mecanismul transportului intracelular asociat microtubulilor, s-a realizat un sistem experimental ce coninea microtubuli obinui prin autopolimerizarea dimerilor necontaminai cu proteine asociate sau citosolice i vezicule sinaptice izolate din diferite tipuri celulare. S-a observat c att legarea, ct i deplasarea veziculelor necesit prezena n sistem a ATP i a unor proteine specifice cu funcia ATP-azc. Una dintre aceste proteine este kinezina (380.000 Da). Molecula alctuit din patru lanuri polipeptidice este capabil s lege, printr-unul din capete, microtubulul, iar prin cellalt capt, vezicula transportat. n prezena ATP, kinezina de deplaseaz de-a lungul microtubulului mpreun cu vezicula pe care a legat-o. Proteina asigur transportul anterograd al veziculelor, deoarece ea se deplaseaz ntotdeauna de la captul (-) al microtubulului spre captul (+) al acestuia. Modul n care kinezina utilizeaz energia eliberat prin hidroliza ATP pentru a asigura transportul veziculelor de-a lungul microtubulului este nc neelucidat (fig. 63). Fig. 63 a) Transportul anterograd al veziculelor de-a lungul microtubulilor mediat de kinezin; b) Imobilizate pe suprafaa unei plci de sticl, moleculele de kinezin deplaseaz microtubulul asociat spre captul su (-). Responsabil de transportul retrograd al veziculelor este o protein asociat cu microtubulii plasmatici numit MAPIC (1.000.000 Da) sau dinein citoplasmatic. n mod similar kinezinei, proteina MAPIC este capabil s lege microtubulul i vezicula de transport, dar ea se deplaseaz dinspre captul (+) spre captul (-) al microtubulului, folosind energia rezultat din hidroliza ATP.

4. 2. Microfilamentele
Microfilamentele de actina sunt componente citoplasmatice prezente n toate celulele eucariote. Att n celulele musculare, ct i n alte tipuri celulare ele sunt asociate cu o protein fibrilar, numit miozin. n citoplasma tuturor celulelor, cu excepia celor musculare, ntlnim microfilamentele izolate cu o distribuie relativ difuz i dinamic. 105

Acestea particip alturi de microtubulii citoplasmatici i filamentele inermediare la organizarea stucturii complexe a citoscheletului. n fibrele de stress, inelele contractile i microvili, microfilamentele sunt fasciculate (asociate n mnunchiuri), ele ndeplinind att un rol structural, de susinere, ct i un rol dinamic, fiind implicate n micrile celulare ce au la baz mecanismul actin miozin. n celulele musculare microfilamentele particip la realizarea contraciei musculare. Aceste forme diferite de organizare a microfilamentelor, ct i funciile asociate lor sunt determinate de tipul proteinelor ce leag specific actina.

4.2.1. Microfilamentele de actin

Actina reprezint principala component a microfilamentelor. Actinele, izolate din diferite organisme i tipuri celulare, au mase moleculare, conformaie i secven de aminoacizi similare. Acest fapt sugereaz c genele codanate au evoluat dintr-o gen ancestral comun. La psri i mamifere exist cel puin 6 gene diferite ce codific actina. Din cele 6 protein, 4 prezint un grad nalt de omologie (din cei 375 de aminoacizi doar 6 sunt diferii). Aceste proteine se numesc alfa actine. Fiecare specie molecular de alfa actin este prezent exclusiv ntr-un singur tip de celul muscular (din muchii striai, miocard, muchii netezi ce delimiteaz vasele sangvine sau muchii enterici ce mrginesc lumenul intestinal). Celelalte 2 specii moleculare de actin notate cu beta i gama au un grad de omologie mai sczut i sunt prezente n citoplasma tuturor tipurilor celulare. ncercrile de izolare i caracterizare a acestor proteine au evideniat faptul c numrul tipurilor de actine este mai mare dect cel al genelor care le codific. Se apreciaz c modificrile posttranslaionale (acetilarea aminoacizilor din segmentul amino-terminal, metilarea unui rest de histidin) sunt responsabile de apariia unui numr att de mare de specii moleculare.Experimentele in vitro au demonstrat c moleculele de actina purificate din diverse surse sunt capabile s copolimerizeze i c toate stimuleaz activitatea ATP - azic a miozinei. Dei, nc, nedemonstrat experimental, este posibil ca speciile moleculare de actin s manifeste o afinitate diferit fa de proteinele citoplasmatice cu care se asociaz. Acest lucru ar explica funciile diferite ale microfilamentelor.Actina este un polipeptid cu o mas molecular de 42.000 Da. Aspectul globular al proteinei justific denumirea de actin globular sau actin G. La o concentraie ionic similar cele existente n spaiu intracelular actina G polimerizeaz, n vitro, genernd filamente de actin, numite actin fibrilar sau actin F. Filamentele de actin obinute n vitro sunt identice cu microfilamentele izolate din celule. n filament moleculele de actin G, avnd caracter polar, se asociaz cap la coad formnd un helix monocateran cu o grosime aproximativ de 7 nm. Pe fiecare tur de helix se gsesc dou molecule de actin. Fiecare monomer este orientat perpendicular pe axa helixului stabilind interacii puternice cu cei doi monomeri situai n imediata vecintate i interacii slabe cu moleculele de actin G dispuse la dreapta i la stnga sa de-a lungul helixului (fig. 64). Fig. 64 Modelul molecular al actinei fibrilare (actina F). Att polaritatea subunitilor componente, ct i stricta orientare a acestora n structura helicoidal confer polaritate filamentului de actin. Dinamica microfilamentelor amintete de cea a microtubulilor. Adugarea monomerilor sau disocierea lor pot avea loc la oricare din capetele microfilamentului, dar viteza cu care se desfoar reaciile de polimerizare i depolimerizare la captul (+) este de 5-10 ori mai mare dect la captul (-). 106

Similar dimerilor de tubulin ce stabilesc interacii puternice cu GTP, monomeri de actin leag strns ATP. Hidroliza ATP are loc imediat dup ncorporarea actinei G n microfilament. Posibilele structuri cap ATP sau ADP nu influeneaz polimerizarea monomerilor i aceasta se datoreaz, n mare parte, faptului c la concentrarea ionic intracelular (0,15M,KCI) este favorizat polimerizarea actinei. Pe de alt parte, concentraia intracelular a monomerilor liberi este mult mai mare dect concentraia critic. n consecin, microfilamentele sunt structuri mult mai stabile dect micro tubulii. Aceast stabilitate este accentuat prin ataarea de microfilamente a proteinelor asociate.

4.2.2. Miozina
Miozina este o protein cu larg rspndire n celulele organismelor eucariote. Pn n prezent se cunosc 2 specii moleculare ale acestei proteine. Miozina tip I este absent n celulele musculare, ea fiind implicat n fenomenele de motilitate celular, ce au la baz mecanismul actin- miozin. Miozina de tip II se gsete att n celulele musculare din muchii striai i netezi, ct i n alte tipuri celulare. Datorit rolului pe care miozina de tip II, din celulele musculare, l joac n contracia muscular, ea a constituit subiectul numeroaselor cercetri experimentale. Miozina de tip II (470.000 Da) este alctuit din 6 lanuri polipeptidice dintre care 2 lanuri grele (230.000 Da/lan) i 2 perechi de lanuri uoare (20.000 Da/lan). Lanurile grele sunt identice. Fiecare este format dintr-o regiune alfa heicoidal cu o lungime de 30 nm, numit coad i o regiune globular carboxi terminal, cu diametrul de 4 nm, numit cap. Regiunile alfa helicoidale ale celor 2 lanuri grele sunt rsucite una n jurul celeilalte, n timp ce regiunile globulare rmn separate. Perechile de lanuri uoare sunt ataate celor dou regiuni globulare. Lanurile uoare ce alctuiesc o pereche sunt identice ntre ele, dar diferite de lanurile celeilalte perechi. n structura de miozin II se remarc existena a dou puncte de flexiune ce marcheaz domeniile structurale ale prote (fig.65).

Fig. 65 Modelul molecular al miozinei. Molecula este alctuit din dou lanuri grele i dou perechi de lanuri uoare. Lanurile grele prezint cte o regiune amino terminal globular, numit cap i o regiune helicoidal, carboxi terminal, numit coad. Molecula prezint dou puncte de flexiune. Primul punct de flexiune este situat n regiunea alfa hericoidal, n timp ce al doilea separ capul bilobat de coada moleculei. Miozina poate fi scindat la nivelul punctelor de flexiune sub aciunea unor enzime cu activitate proteazic. Chimotripsina scindeaz miozina n dou domenii. Primul domeniu, meromiozina grea (HMM) conine capul bilobat i un segment din coada lanurilor grele, iar al doilea domeniu meromiozina uoar (LMM), cuprinde segmentul aminoterminal al cozilor. Prin tratarea domeniului HMM cu papain segmentul de coad este degradat i sunt eliberate fragmentele S1, ce conin cte un cap globular i perechea de lanuri uoare asociate acestuia. Fragmentele S1, prezint activitate ATP azic. Pe regiunea globular ce formeaz capul lanurilor grele ale miozinei, sunt localizate att situsurile de legare ale ATP ct i cele pentru actin. 107

Studiile biochimice au evideniat faptul c n prezena filamentelor de actin activitatea ATP azic a miozinei este stimulat; viteza de hidroliz a ATP crete de 200 de ori. Moleculele de miozin polimerizeaz genernd filamente de miozin. Polimerizarea implic agregarea cozilor moleculelor de miozin. n celulele nemusculare, filamentele de miozin au dimensiuni mici (diametru 60 ) i caracter tranzitoriu, ceea ce face dificil vizualizarea lor la microscopul electronic. Organizarea n filamente a miozinei a fost pus n eviden, pentru prima oar, n celulele musculare unde ele au o structur particular i sunt numite filamente groase. Filamentele groase (diametru 150-200 ) conin 500-600 molecule de miozin. Orientarea moleculelor n filament imprim acestuia un caracter bipolar. Fiecare filament este alctuit dintr-o regiune central i 2 regiuni terminale. Regiunea central are un caracter exclusiv fibrilar fiind format prin suprapunerea cozilor antiparalele ale moleculelor de miozin. n cele 2 regiuni terminale, capetele moleculelor de miozin se ataeaz de jur-mprejurul filamentului, determinnd ngroarea acestuia.

4.2.3. Rolul actinei i miozinei n contracia muscular

Mecanismul actin miozin st la baza unui tip particular de micare celular, realizat de structuri specializate din muchii striaii, netezi i cardiaci i care poart numele de contracie muscular. Muchii striai primesc o inervaie motorie somatic. Datorit inseriilor osoase ei asigur deplasarea i pstrarea poziiei corpului. Musculatura neted prezint o inervaie vegetativ. Muchii netezi nconjoar organele interne, fiind prezeni la nivelul intestinului gros i subire al vezici biliare i al vaselor sangvine. Contracia i relaxarea muchilor netezi asigur deplasarea alimentelor de-a lungul tractului digestiv i controleaz diametrul vaselor sangvine. Spre deosebire de muchii striai, cei netezi se contract mai lent, tensiunea dezvoltat fiind meninut pe o durat mai mare de timp. Muchii cardiaci se aseamn din punct de vedere structural cu cei striai, dar se afl ca i muchii netezi sub controlul inervaiei vegetative. Prin contracia lor, sngele este pompat n circuitul sanguin.

4.2.4. Actina i miozina n celule nemusculare

Filamentele de actin din celulele nemusculare au un pronunat caracter tranzitoriu. Formarea reelei de microfilamente este reglat de factori proteici i concentraia ionilor de Ca. Una dintre cele mai importante proteine ce influeneaz procesul de polimerizare a actinei, n aceste celule, este profilina. Proteina se leag de monomerii de actin formnd un complex numit profilin-actin. Deoarece profilina blocheaz etapa de nucleaie, complexul este incapabil s polimerizeze spontan. n plus modul de legare a profilinei la monomer face imposibil legarea complexului la captul (-) al unui filament de actin preexistent, polimerizarea putnd avea loc doar la capatul (+) al acestuia. Dup legarea profilin-actinei la capatul (+) al filamentului de actin, profilina este eliberat crend posibilitatea adugrii unui alt complex i alungirii filamentului. n mod obinuit, capetele (+) ale filamentelor de actin sunt ancorate n membrana plasmatic i/sau stabilizate prin proteine asociate. n acest caz, profilina blocheaz complet polimerizarea actinei (fig. 66).

108

Fig. 66- Rolul profilinei n polimerizarea actinei, n celulele nemusculare. Reglarea procesului de polimerizare i depolimerizare a actinei prin ionii de Ca este mediat de cel putin dou proteine similare ca structur i funcie: vilina i gelsolina. La o concentraie citosolic mare a ionilor de Ca, proteinele rup filamentele lungi de actin, rmnnd ataate la captul (+) al fiecrui fragment, mpiedicnd astfel reasamblarea filamentelor. O dat cu scderea concentraiei Ca2+, vilina (nu i gelsolina) este capabil s accelereze procesul de polimerizare al actinei. Ambele proteine joac i un rol structural, interconectnd filamentele de actin n mnunchiuri. Filamentele de miozin din celulele nemusculare sunt mult mai mici (10-20 molecule) dect cele din celulele musculare. Molecula de miozin se aseaman cu cea din muchii netezi. Activarea funciei sale ATP-azice necesit fosforilarea lanurilor uoare i este reglat de complexul calmodulin Ca2+. Din celulele nemusculare au fost izolate i proteine asociate intalnite n celulele musculare, dintre care : tropomiozina i alfa-actinina. Prezena calmodulinei, ca protein reglatoare, explic absena complexului troponinic din celulele nemusculare. 4.2.4.1. Microvilii Microvilii sunt expansiuni ale celulelor epiteliale ce delimiteaz lumenul intestinal i al tubului contort proximal n rinichi. Ei contribuie la mrirea cu 25% a suprafeei de absorbie a celulelor epiteliale. Structuri necontractile, microvilii sunt alctuii dintr-o regiune central i o reea terminal (fig. 67). Regiunea central este reprezentat de un manunchi de filamente de actin dispuse paralel. Ele indeplinesc un rol structural, meninnd forma microvilului. Filamentele prezint aceeai polaritate. Capetele (+) sunt indreptate spre vrful microvilului.

109

Fig. 67- Structura microvililor.Elementul central l reprezint mnunchiul de filamente de actin.Filamentele sunt interconectate prin proteine de legare i ancorate n membrana plasmatic ce delimiteaz microvilul prin proteina 110 Kda i calmodulina.Filamentele de actin fasciculate se extind din corpul microvilului n reeaua terminal unde sunt stabilizate prin intermediul unor proteineconectoare (fodrina, spectrina etc.). Din regiunea central lipsesc miozina, tropomiozina i alfa actinina. n schimb, au fost izolate alte proteine asociate filamentelor de actin, dintre care fimbrina i vilina. Ambele proteine au rolul de a stabiliza filamentele n mnunchiuri. Cea mai interesant protein, asociat filamentelor de actin din microvili, este o protein similar miozinei de tip I, proteina 110, cu activitate ATP-azic. Impreun cu calmodulina, proteina leag filamentele de actin de la exteriorul manunchiului de membrana ce delimiteaz microvilul. Se apreciaz ca tensiunea generat de proteina similar miozinei de tip I asigur meninerea n poziie central a mnunchiului de filamente. La polul bazal, regiunea central este ancorat ntr-o reea terminal, alctuit din filamente scurte de actin i proteine asociate. Filamentele din reeaua terminal interconecteaz filamentele de actin din manunchi i leag mnunchiurile ntre ele. Acelai rol l joac i fodrina, principal proteina asociat, prezent n reeaua terminal. 4.2.4.2. Rolul actinei i miozinei n citokineza Filamentele de actin i miozina joac un rol in desfaurarea citokinezei la celulele animale. Ele alctuiesc o structura contractila, cu caracter tranzitoriu, numita inel contractil, localizat imediat sub membrana plasmatic la nivelul antului de clivare. n inelul contractil , flamentele scurte bipolare de miozina i filamentele de actin sunt organizate n microsarcomere similare celor din muchii striai, dar mult mai mici, din care lipsesc discurile Z. Filamentele de actin i minisarcomerele adiacente sunt legate prin alfaactinina i probabil i alte proteine asociate. Inelul se contract prin mecanismul actin-miozina. Simultan are loc un proces de depolimerizare a filamentelor de actin, ceea ce determin micorarea continu a diametrului inelului contractil i, in final, separarea toatal a celor 2 celule fiice rezultate prin diviziunea celular.

110

4.2.4.3. Micarea ameboidala Micarea ameboidala este un tip particular de locomoie ntalnit frecvent la protozoare, dar comuna i altor tipuri celulare dintre care i celulelor ce intra n alcatuirea organismului uman : macrofage, fibroblaste, limfocite. Miscarea ameboidala se realizeaz prin emiterea i retracia continu a unor prelungiri celulare i are la baza tranzitia reversibila a hialoplasmei din stare de gel n stare fluid (sol). Studiile electronomicrodcopice, efectuate iniial pe protozoare i ulterior extinse la celulele din organismul uman ce prezint acest tip de locomoie, au pus in evidena existena a 2 regiuni diferite ale citoplasmei. Regiunea central, numit endoplasm, conine particule i organite celulare aflate intro permanenta micare. n aceast regiune hialoplasma se gsete n starea de sol. n regiunea distal a prelungirilor celulare, imediat sub membrana plasmatic, este localizat ectoplasma. Lipsit de organite celulare, ectoplasma conine o reea tridimensionala de filamente de actin. Filamentele sunt interconectate prin proteine ascociate. Una dintre acestea este filamina, o molecula flexibil alcatuit din 2 lanuri polipeptidice, prezent n nodurile reelei. Alte proteine asociate filamentelor de actin din ectoplasma sunt alfa actinina i gelsolina (fig. 68). Fig. 68 Filamina leag filamentele de actin, favoriznd formarea unei reele tridimensionale. Studiul emiterii i retractiei prelungirilor celulare numite pesudopode, la protozoare a demonstrat interconvertibilitatea celor 2 regiuni ceitoplasmatice. Pe parcursul formarii pseudopodelor, are loc deplasarea endoplasmei din centrul celulei n prelungirile celulare. n regiunea distala a pesudopodului endoplasma se transform n ectoplasma prin tranziia sol-gel a hialoplasmei. Procesele inverse au loc n momentul retractarii pseudopodelor. Se apreciaz ca treansformarea reversibil a endoplasmei n ectoplasma este controlat de celula i reglat prin concentraia intracelular a ionilor de Ca i pH. Aceti doi factori afecteaz organizarea filamentelor de actin n cele 2 regiuni citoplasmatice printr-un mecanism nc suficient elucidat, n care un rol important par s-l aib proteinele asociate. Filamina i alfa actinina, proteine implicate n formarea i stabilizarea reelei filamentelor de actin , asigur probabil tranziia hialoplasmei n starea de gel. O dat cu creterea concentraiei intracelular a ionilor de Ca, filamentele de actin sunt scindate de gelsolina, reeaua se dezorganizeaz i hialoplasma trece n stare de sol. Dintre celulele din organismul uman ce se deplaseaza prin miscarile ameboidale, cele mai bine studiate sunt fibroblastele. Fibroblastul emite continuu, pe direcia miscrii m prelungirii celulare, numite lamelipode. n timpul deplasrii, unele lamelipode ader la substrat , prin intermediul unor structuri specializate, numite placi de adeziune sau contacte focale. Alte lamelipode se ntorc spre partea dorsal a corpului celular.Pe parcursul deplasrii, corpul celular lasa n urm o coad numit fibr retractil.Fibra rmne aderent la substratul pe care se realizeaza micarea fibroblastului , fiind supus n acelai timp tensiunii generate de ondulatiile de suprafata. Aciunea conjugat a acestor 2 fore conduce la elongarea fibrei retractile. n final, fora ce asigur naintarea fibroblastului determin fie detaarea fibrei de substrat, fie ruperea ei i ulterior retracia cozii n corpul celular (fig. 69).

111

Fig. 69 Schema deplasrii fibroblatilor. 4.2.4.4.Fibrele de stress n ataarea de substrat a fibroblastelor cultivate in vitro rolul principal revine fibrelor de stress. Fibrele de stress sunt manunchiuri paralele de filamente de actin, localizate n regiunea citoplasmatica aflat n proximitatea plasmalemei aflat n contact cu substratul. n zonele de contact, filamentele de actin apr a fi inserate n membrana plasmatic. Alaturi de actin n fibrele de stress sunt prezente : miozina, alfa-actinina, tropomiozina i proteina reglatoare miozin-LC kinaza. Se sugereaza ca filamentele de actin i miozina sunt organizate n microsarcomere, teniunea generata prin mecanismul actin miozina determinand aplatizarea fibroblastelor n culturi. Cercetarile experimentale au confirmat aceast ipotez. ndepartarea celulelor de pe substrat este nsoit de nlocuirea fibrelor de stress cu o reea de filamente de actin i revenirea celulei la forma sferic. Reintroducerea fibroblastelor n cultura este urmat la cateva ore de reorganizarea fibrelor de stress, ataarea celulelor de suport i aplatizarea lor.

4.3. Filamente intermediare

Filamentele intermediare sunt elemente de citoschelet mai groase dect microfilamentele de actin i mai subiri dect microtubulii. Iniial, ele au fost puse n evidena n celulele muschilor striai , unde formeaza o matrice ce nconjoar i interconecteaza discurile Z. Ulterior, au fost identificate i n alte tipuri celulare (celule epiteliale, mezenchimale i neuroni). n celule, filamentele intermediare se pot gasi n ectoplasma, ancorate n structuri periferice (desmozomi) sau situate n prelungirile celulare (axoni).

4.3.1. Proteine ce alctuiesc filamentele intermediare

Ca i microfilamentele de actin i microtubulii, filamentele intermediare sunt rezultatul polimerizarii subunitailor proteice. Spre deosebire de actin G i tubulina, proteinele ce formeaza filamentele intermediare sunt specifice pentru un anumit tip celular. La vertebratele superioare s-au identificat 5 tipuri de molecule proteice distincte ce intra n constituia filamentelor intermediare : vimentina (57 000 Da) ; desmina (55 000 Da) ; neurofilamentele (trei specii moleculare : NF1 70 000 Da ; NFm 150 000 Da; NFh 210 000 Da); proteina gliala fibrilara acida( GFAP 50 000 Da) ; citocheratinele (peste 30 de specii moleculare). 112

Diversitatea proteinelor ce alctuiesc filamentele intermediare nu constituie singurul aspect ce le difereniaz de subunitaile proteice ale microfilamentelor de actin i microtubulilor. Cele cinci tipuri de proteine prezint caracteristici structurale comune, fiind formate dintr-o regiune central alfa helicoidala i 2 domenii globulare, de mrimi variabile, n regiunile carboxi- i amino- terminale. Deosebirile exist i n maniera n care proteinele se asociaz n filamente (fig. 70).

Fig. 70 Nivele de asamblare ale filamentelor intermediare. Subunitatile proteice formeaz dimeri prin nfaurarea strans una n jurul celeilalte, a regiunilor centrale, n timp ce capetele globulare rmn separate. n dimeri, subunitile sunt orientate paralel. Aceleai regiuni centrale par a fi responsabile de asocierea dimerilor n tetrameri dar la acest nivel de agregare dimerii sunt antiparaleli. Prin legarea cap la cap a tetramerilor se formeaz protofilamentul, iar 8 protofilamente genereaz filamentul intermediar. S-a constatat c vimentina, desmina, proteina gliala fibrilara acid i NF1 formeaz homopolimeri. n celulele n care genele ce codific vimentina i desmina se coexprima, proteinele copolimerizeaz. Cele 30 de tipuri de citocheratine sunt mparite n 2 clase distincte : acide i bazice /neutre. n filamentele de keratina raportul dintre citocheratine de tip I i cele de tip II este de 1 :1. Studiul polimerizarii n vitro a monomerilor ce alcatuiesc filamente intermediare a demonstrat c acest proces nu necesit consum de energie metabolic. Modul de ordonare al subunitailor proteice n filamente imprim acestora un caracter apolar. Deci, spre deosebire de microfilamentele de actin i microtubuli, filamentele intermediare au capete echivalente funcional; polimerizarea i depolimerizarea se desfaoar cu aceeai viteza la ambele extremitai. Cercetrile experimentale au demonstrat c n condiii fiziologice, 1% din proteine ce formeaz filamentele intermediare se gsesc sub form de monomeri liberi, n timp ce 99 % dintre acestea sunt asociate n filamente. Raportul dintre subunitile libere i polimerizate exprim caracterul mult mai stabil al filamentelor intermediare comparativ cu microfilamentele de actin i microtubulii. 113

4.3.2. Tipuri de filamente intermediare i semnificatia lor funcional

Filamentele de vimentina sunt prezente n celulele mezenchimale ( celule endoteliale ale vaselor sangvine) i unele celule epiteliale. n celulele epiteliale filamentele de vimentina sunt ancorate n desmozomi, contribuind la creterea rigiditii esutului epitelial. n adipocite filamentele nconjoar picturile lipidice, mpiedicandu-le s fuzioneze ntre ele sau cu membranele celulare. n toate tipurile celulare filamentele de vimentina sunt fizic legate de membrana nuclear, fiind probabil implicate n coordonarea spaial a nucleului celular. Se constat existena unei strnse asocieri ntre filamentele de vimentina i microtubuli. Studiile efectuate de fibroblasti cultivai in vitro au demonstrat ca n celulele aflate n mitoza, filamentele intermediare nconjoar manunchiurile de microtubuli ce formeaz fibrele fusului de diviziune. Cele 2 tipuri de filamente sunt interconectate prin proteine, nca neidentificate. Tratarea acestor celule cu colchicina a condus la dezasamblarea microtubulilor urmat de deplasarea filamentelor de vimentina ce se organizeaz n manunchiuri n apropierea nucleului. Acest experiment sugereaz rolul important pe care microtubulii l au n organizarea filamentelor de vimentina. Filamentele de desmina se ntalnesc n toate tipurile de celule musculare. Filamentele din celulele muchilor striai formeaz o reea ce strabate ntreaga miofibra i care leag discurile Z ntre ele, de membrana plasmatic i, posibil , de unele organite celulare(mitocondrii). Se apreciaz c filamentele de desmina joac, n principal, un rol structural, susinand discurile Z i miofibrele. Neurofilamentele sunt prezente exclusiv n axonii celulelor nervoase. n corpul celular cele trei polipeptide (NF1, NFm i NFh) se asambleaz n filamente i se asociaz cu microtubulii.. Complexele neurofilamentate-microtubuli se deplaseaz n axon, conferindu-i acestuia stabilitate. Filamentele gliale sunt caracteristice celulei gliale. Filamentele de cheratin sunt ntalnite n celulele epiteliale. Ancorate n desmozomi, filamentele de cheratina formeaz n celula epiteliala o reea ce asigur rezistena epiteliilor la factori mecanici. Se apreciaz ca fiecare tip de celula epiteliala conine un complement chitocheratinic specific.

4.4. Reeaua microtrabecular

n celul, microfilamentele, microtubulii i practic toate celelalte componente subcelulare sunt conectate de un sistem de microteabecule (mici bare). Reeaua microtrabeculara a fost descris la mrimi de circa 300.000x n citoplasma celulelor examinate la microscopul de nalt voltaj (peste 1.000.000. de voli) care genereaz electroni rapizi ce pot penetra seciuni relativ groase. Microtrabeculele (4mm) pot fi expresia fenomenului de gelificare cnd filamentele de actin se leag ncruciat unul de altul. n consecina unii autori contest realitatea lor biologic considerandu-le un artefact; alii, dimpotriv, le atribuie rol de suport al materiei biostructurale ( Eugen Macovschi, 1958).

4.5. Proteinele asociate citoscheletului

O serie de proteine sunt asociate citoscheletului, oferind una din cheile nelegerii structurii i funciunii acestuia. Sunt bine cunoscute n prezent circa 14 proteine asociate cu actina (acrinogelina, acumentina, ankirina, brevina, caldesmona, filamina, fimbrina, fodrina, fragmina, gelsolina, profilina, vilina, vinculina, calmodulina), 9 proteine asociate cu filamentele intermediare (prekeratine, desmina, filagrina, plactin, protein fibrilar acid glial, proteinele neurofilamentelor, inemina, titina, vimentina) i 7 proteine asociate cu microtubulii (clatrina, dineina, MAP, MAP1, MAP2, nexina,) prezente predominant n anumite celule i avnd proprieti diverse. 114

Capitolul 5 ORGANIZAREA NUCLEULUI I EXPRESIA ACTIVITII GENELOR

Nucleul reprezint compartimentul care ncorporeaz genomul nuclear, deci el conine aproape ntreaga informaie genetic. n situaia aceasta, el ndeplinete funciile de pstrare n condiii de securitate a ADN-lui, de transmitere nealterat a acestei informaii descendenilor, de reglare i control a activitii celulei, prin semnale ce sunt recepionate de molecula de ADN. n esen, funciile fundamentale ale nucleului se rezum la dou procese bazate pe existena n acest compartiment a genomului celular i anume: replicarea ADN, proces complex prin care molecula de ADN se autoreproduce i d natere la copii identice, ce vor fi transmise celulelor fiice; replicarea are loc n faza S (de sintez) a ciclului celular; transcripia ADN, proces la fel de complex, prin care informaia coninut n secvena ADN, este realizat prin sinteza moleculelor de ARN. ARN apare fie ca produs finit cum ARN ribozomal (ARNr) i ARN de transport (ARNt), fie ca produs intermediar ARN mesager (ARNm), care urmeaz s transmit mesajul de la ADN n sinteza proteinelor, necesare funciilor vitale ale celulei. Transcripia ADN se desfoar pe toat perioada interfazei i este blocat n faza M (mitoza).

5.1. Morfologia i structura nucleului

Nucleul este constituit dintr-un nveli (nucleolema, anvelopa nuclear), o materie intern, cromatina i unul sau mai muli nucleoli care se gsesc n substana de fond, nucleoplasma (matricea). El exist la toate celule organismelor eucariote, mai puin la eritrocitele vertebratelor superioare, unde este eliminat printr-o exocitoz n cursul eritropoezei. Nucleul este constituentul esenial al celulelor eucariote fr de care existena lor ar fi compromis. ADN-ul cromozomilor este astfel organizat, nct o parte din secvenele de baze purinice i pirimidinice reprezint cadrul dup care sunt transcrise diferite mesaje sub form de ARN, cealalt parte a ADN-ului cromozomial are, probabil, rol n reglarea activitii transcripionale. Secvenele de baze purinice i pirimidinice se pstreaz de-a lungul generaiilor de celule datorit replicrii semiconservative a ADN cromozomial. Tot n nucleu au loc sintezele diferitelor ADN-uri care, trecnd n citoplasm, constituie aa numitul aparat de biosintez proteic (fig. 71).

115

Fig. 71. Diagrama structurii nucleului.

5.1.1. nveliul nuclear

Pe faa intern a membranei nucleare se distribuie, la nucleul vertebratelor, o mpslire de fibre fine, groas de circa 200 - 600 , care menine rigiditatea nucleelor. Studiind raporturile nveliului nuclear, se observ c membrana extern, citoplasmatic, dezvolt prelungiri scurte sau chiar tubuli care fac legtura cu reticulul endoplasmatic. Aria extern a nucleului este acoperit cu ribozomi; n plus, n multe cazuri apar aglomerri juxtanucleare de mitocondrii furnizoare de energie. Datorit grosimii sale, membrana nucleului este invizibil la microscopul fotonic. ns o parte din cromatin este dispus sub membrana nucleului, astfel c pe seciunile de esuturi colorate, liziera de cromatin perinuclear apare colorat, indicnd i limita extern a nucleului. La microscopul electronic se observ bine c membrana nucleului este dubl, prezentnd pe faa sa intern din loc n loc, ngrori de care se prind fibrile cromatinei. Cromatin se mai ancoreaz i la exteriorul inelelor i chiar la granulul central. Totalitatea acestor fibre de cromatin constituie cromatin perinuclear . O funcie important a nveliului nuclear const n schimburile nucleoplasmatice, chiar dac nu toate categoriile de molecule l strbat . Astfel, prin nveliul nucleilor izolai nu trec glicogenul i ovalbumina, n schimb trec tripsina, ribomeleaza, DNA-aza, histonele, polianionii ca heparina i Hb i bineneles, nucleotidele i aminoacizii, n vivo", ionii strbat n ambele sensuri nveliul nuclear, astfel c nuntrul nucleelor se acumuleaz o cantitate dubl de Na+ i K+ fa de citoplasm . Aminoacizii, monozaharidele i dizaharidele (GM sub 500) ptrund prin dubla membran nuclear, iar prin pori trec riboproteine sub form de ribozomi, dar i ribonucleaz sau feritin. De regul, calea de trecere transmembranar este urmat de molecule mici de tipul Fe coloidal, dar s-a observat c i o serie de substane elaborate de reticulul endoplasmatic pot trece din el n spaiul perinuclear (anticorpii antiperoxidazici ai hemocitoblatilor). 116

Prin nmugurirea" membranei exterioare a nucleului se formeaz lamele inela-te n citoplasm, care sunt purttoare de ribozomi sau ARN ncorporat n membrane . La nucleele celulelor reproductoare, att de la plante ct i de la animale, se pot observa nmuguriri ale nveliului nuclear care dau natere la vezicule ce ptrund n citoplasm unde, dezorganizndu-se elibereaz coninutul de nucleoproteine. Prin granulul su central, polul opune totui o rezisten difuziei libere a diferitelor molecule n valoare de 1/cm2. Moleculele cu sarcin electric pozitiv trec uor din citoplasm n nucleu, ns cele ncrcate negativ sunt oprite de inelele porilor de care se leag . EM s-au observat ieind helixuri de ribonucleoproteine prin porii nucleelor de amibe, iar prin porii nucleelor glandelor salivare de chironomide trec granule de 200 - 400 diametru, tot de ribonucleoproteine. Ribonucleoproteinele ajunse n citoplasm reprezint diferii ARN m, precum i fraciile 18 S, 25 S, 5 S ale ARN v asociate cu proteinele lor specifice. nsi ca numrul porilor poate crete sau scade d o indicaie asupra rolului lor n reglajul transferului de informaie care, n mare, se realizeaz de la nucleu ctre citoplasm prin mesageri dar i de la citoplasm spre nucleu prin proteine histonice i nonhistonice, printre nonhistonice figurnd unele enzime. Este bine cunoscut faptul c, sub aciunea fitohemaglutininei, limfocitele n cultur se transform n limfoblati. Fitohemaglutinina acioneaz asupra unor receptori membranari care activeaz AMP-cicloza, producnd cAMP. Acest nucleotid ciclic stimuleaz o proteinkinaza, care produce o protein ce ptrunde n nucleu. Acolo determin o puternic activitate transcripional, sintetizndu-se ARN m, ARN t i ARN v care trec din nucleu n citoplasm. Astfel se asigur o intens activitate de biosinteze citoplasmatice, dar i de mitoze ale limfoblatilor. nveliul nuclear mai are i rol de formarea lamelelor inelate . n telofaz, cnd are loc refacerea membranei nucleare pe seama reticulului endoplasmatic, rmne un surplus" de membrane endoplasmatice fie incluse n nucleu, fie n citoplasm din jurul acestuia. Membranele respective se dispun paralel i nu mai particip la reconstrucia nveliului nuclear din cauza rapiditii ciclului celular. Asemenea membrane inelate se ntlnesc, de obicei, n celule embrionare i sexuale cu cicluri celulare scurte. n interfaz, membrana exterioar a nucleului nmugurete spre citoplasm vezicule care ulterior se desprind i, aezndu-se cap la cap, constituie lamele inelate. Prin contopirea acestora rezult cisternele golgiene. n alte cazuri, membrana exterioar a nucleului, dup ce pierde ribozomii, nmugurete pe o poriune anumit, dnd natere unei serii de vezicule. Acestea, cu timpul, se desprind i depunndu-se n iraguri, se contopesc formnd cisterne golgiene. n timp ce se formeaz o cistern, pe faa sa extern (uneori convex) se dispune un alt ir de vezicule, i aa mai departe, n asemenea mod lund natere un dictiozom. Porii Dubla membran este strbtut de pori avnd un diametru de circa 700 care conine fiecare cte un inel proteic ce limiteaz orificiul porului la 500 . Distana dintre centrele a doi pori alturai este de circa 1300 , sau un multiplu al acestui numr, existnd ntotdeauna o legtur cu cromozomii interfazici, deoarece opt fibrile ale cromatinei se ataeaz de marginile fiecrui por . De fiecare por sunt asociate o serie de structuri care fac parte din matricea nuclear . Fiecare por cuprinde un material inelar, o diafragm, un granul central i un material fibrilar. Materialul inelar cuprinde opt particule sferice proteice de circa 200 diametru aezate pe fiecare fa a porului; acest material i modific structura n funcie de metabolismul celular.

117

Dilatrile i contraciile porilor se explic prin adiia, respectiv pierderea proteinelor constitutive ale inelului. Diafragma este o substan dens, amorf din interiorul porului, care se ntinde spre centrul lui, unde se afl un granul central riboproteic de 250 diametru. De el se leag fibrilele de 50 diametru, care fac legtura cu particulele sferice interne i externe ale porului. O fibril ncercuiete lumenul porului la interior, solidariznd astfel materialul su fibrilar ( fig. 72; fig. 73). Fig. 72. Structura porului nuclear: a( structura octogonal a complexului nuclear al porului n membrana nuclear; b) o seciune vertical a complexului; granula central apare numai n anumii pori.

Fig. 73. Seciune prin porul nuclear care prezint schematic i ipotetic sub form de cilindru, tunelul care ar exista n structura porului i prin care moleculele sunt transportate n interiorul sau exteriorul nucleului.

5.1.2.Matricea nucleului
Reprezint o structur proteic format dintr-o reea de fibrile foarte strnse i fine, care umplu complet spaiile dintre blocurile mai mici sau mai mari de cromatin. Matricea nucleului poate fi vzut la microscopul fotonic prin tratarea celulelor cu alfaamanitin. Acest alcaloid produce n dou ore contracia cromatinei, iar dup fixare i colorare cu hemalaun-enzim, la microscopul fotonic se observ cum matricea este separat de blocurile cromatinei contractat, prin conturri clare, necolorabile (deci spaii goale). Matricea dintre blocurile cromatinei este Feulgen (-), deci nu conine ADN i se coloreaz slab cu albastru de toluidin, hemalaun sau verde luminos, deci nu conine grupri fosfatice multe. Matricea rezist bine la digestia" cu RN-az, dar poate fi uor solubilizat cu pepsin, ceea ce indic un coninut predominant proteic. Tratarea nucleilor izolai din culturi celulare (Hela - S3) cu tampoane bogate n sruri, DN-az i ditiotreitol a permis izolarea unei structuri de natur proteic asemntoare ca aspect cu cea a nucleului, dar golit" de cromatin care a fost digerat cu DN- az. Analizele ultrastructurale i biochimice indic faptul c matricea const din elemente membranare i fibrilare cu o compoziie chimic de 87% proteine, 12% fosfolipide, 1% ADN, 0,1% ARN. Proteinele separate prin electroforez n strat subire de dodecil-sulfat de sodiu (SDS) n gel de poliacrilamid s-au dispus n 30 - 35 de benzi cu GM ntre 14.000 - 20.000. Matricea este reprezentat prin dou clase de peptide majore, cu o greutate maxim cuprins ntre 14.000 - 18.000 i respectiv 45.000-75.000. 118

n celulele sincronizate (aduse la aceeai faz a ciclului celular) se constat c n toate fazele ciclului celular au loc sinteze de polipeptide matriceale, dar ele sunt mai reduse n faza S/G2 (divizibil). Dup diviziunea celular, n lipsa biosintezei proteice, vechile polipeptide cu GM cuprins ntre 45.000 - 75.000 persist dup mitoz i refac noua matrice a nucleului interfazic. Cercetrile de histochimie EM, combinat cu analiza electroforetic a proteinelor matriceale, au permis fundamentarea teoriei fibrilare a matricei nucleare (D. Comings i T. Okada, 1978). Dup extragerea cromatinei nucleelor hepatocitelor de oarece cu soluii saline concentrate i tratate apoi cu DN-az i TRITON X-100 rmne numai matricea, cu o structur fibrilar, care este reprezentat prin porii i lamina fibrilar a nveliului nuclear, componenta fibrilar a nucleolilor i matricea intranuclear propriu-zis. E.M., matricea nuclear este compus din fibrile proteice de 20 - 30 , denumite matrixin. Ele se asociaz n fibre mai groase, de 100 - 300 . Separarea electroforetic a matrixinei evideniaz trei benzi polipeptidice cu greutatea maxim 65.000, 67.000 i 68.000. Peste tot matrixin se leag de fibrile de cromatin, ea avnd un rol principal n organizarea acestor fibre n cromomerele cromozomilor mitotici i meiotici.

5.1.3.Proteinele contractile nucleare

Au fost evideniate n diferite tipuri de nuclee din care s-au extras cromatin. Apoi din cromatin s-au izolat mai departe proteinele nonhistonice, prin electroforez . n felul acesta sau putut separa: miozina (G.M. 200.000), actina (G.M. 45.000), tropomiozina (G.M. 34.000) i subunitile sale. Comparndu-se coninutul n miozina i actin din cromatin hepatocitelor i cea a neuronilor, se constat c n ficat miozina este n cantitate de 1,8 mai mare ca n creier i actina de 2,3 ori. Este foarte probabil ca activitatea transcripional a hepatocitelor n mesager (ARN m) ai actinei i miozinei s fie de dou ori mai mare ca n neuroni. Exist deci un raport invers proporional dintre coninutul actinei cromozomale i activitatea transcripional. Probabil, actina exercit o represie asupra cromatinei, prin condensarea ei la maximum, fcnd-o astfel netranscripional. Se pare c actina nu se leag direct cu ADM ci realizeaz un anumit tip de condensarea cromatinei.

5.1.4.Cromatina
Toi nucleii prezint n interfa regiuni extrem de mpachetate ale fibrelor cromozomale . Nucleii interfazici fixai i colorai cu colorani bazici (albastru de toluidin, de metilen, Azur A etc.), care coloreaz cromatina, o evideniaz sub form de particule mai mari sau mai mici i mplntate n matrice, ca o ptur subire cromatic pe faa intern a nveliului nuclear i una sau mai multe blocuri n jurul nucleonului. Aspectul general al cromatinei este asemntor la nucleii aceluiai tip celular, dar variaz n anumite limite dup fixarea folosit . Astfel, cromatina se poate prezenta sub form de grmezi sau grmjoare de granule fine i prelverulente, pn la o reea cu unele noduri ceva mai groase. Aspectul variaz dup tipul de celul i gradul ei de activitate metabolic, dar i ci specia considerat . Examenul electrono-microscopic al cromatinei arat ca ea este format din fibre mpachetate - filamente nucleoproteice - cu traiectorie spiralat i cu diametrul variabil. In zonele mai groase fibrele au diametrul de 200 - 500 , pe cnd n zonele subiri de numai 60 100 . ntre grmezile de cromatina se gsesc spaii intercromatiniene, colorate slab cu colorani bazici, n care se mai afl o serie de structuri: fibrile cromatiniene, distanate unele de altele i fr traiecte spiralate; fibrile pericromatice, de 30 - 50 diametru, care mrginesc blocurile de cromatina; granule intercromatiniene, de 250 diametru, formate din tasri de fibrile pericromatiniene. Asemenea granule sunt rezistente la DN-az i numai dup tratare cu pronaz 119

pot fi digerate dup aceea cu DN-az. Asemenea granule intercromatiniene par a fi trei forme succesive de ARN m i ARN v care ies din nucleu n citoplasm unde rmne ctva timp inactive datorit proteinelor pe care le conin granule pericromatiniene situate la periferia cromatinei, mari de 450 diametru i nconjurate de un halou clar care le separ de masa fibrelor cromatinei. Asemenea granule sunt formate din fibrile de 30 diametru, foarte neregulate ca traseu, ce depesc uneori marginea granulelor . Ele sunt tot de natur ribonucleoproteic i au rol n transmiterea unor informaii n sens invers, adic de la ARN la ADN; corpii spiralai din regiunile intercromatiniene, care reprezint mpachetri de fibrile rsucite, de 400 - 600 diametru, asociate sub form de agregate sferice de 0,5. Ele sunt tot de natur ribonucleoproteic i mai conine i nite fibrile subiri, de 50 , care se nfoar n jurul axului lor. Cromatina se gsete sub dou forme: eucromatin, considerat ca fiind acea parte din cromatin cu fibre fine i uniforme repartizate n nucleu, active n replicarea ADN i n transcripia ARN i heterocromatina rezultat compactizarea cromatinei sub form de granule i grmezi de diferite mrimi. Este intens colorabil n rou prin reacia Feulgen pentru ADN i albastru cnd se trateaz cu colorani bazici. Studiile comparative de ME efectuate la plante i animale au artat c structuralizarea cromatinei se prezint, funcional i evolutiv, diferit la plante i animale. Astfel, n nucleii de Arabidopis cromatin formeaz cromocentre (cromozomi heterocromatici sau poriuni de cromozomi care rmn condensate i astfel colorabile n interfaz); la Viscum album heterocromatina este reprezentat tot prin cromocentre, n schimb eucromatin formeaz cromomere i cromonemate mai subiri dect heterocromatina, dar la fel de intens colorabile. La Hedera helix, nucleii meristematici prezint blocuri mari de heterocromatina condensat printre eucromatin decondensat, sau nucleii aduli, care printr-o subreplicare (replicare a numai unei pri din genom) devin tetraploizi (4n), sufer o cdere apreciabil a cantitii de heterocromatina condensat . n acest caz, eucromatin nu mai este activ n replicarea ei, probabil, numai n transcripie . ntre speciile de plante exist o variaie a cantitii de cromatin condensat prin faptul c att heterocromatina, ct i eucromatin se condenseaz. Condensarea eucromatinei este determinat la plante de cantitatea de ADN a speciei date, precum i de compoziia acesteia. Variaia cantitii de cromatin din nucleii unei specii de plante este expresia replicrii difereniale a heterocromatinei, care este n ntregime constitutiv i nu se exprim prin condensri i decondensri funcionale n raport cu activitatea fiziologic a celulelor . La mamifere, ns celulele cu o activitate mitotic intens sunt complet eucromatice, adic cu cromatin decondensat. La aceeai cantitate de ADN n esutul considerat, coexist nuclee cu cromatin decondensat, mase de cromatin i nuclee cu aproape toat cromatin condensat. n toi aceti nuclei cromatin condensat este constitutiv, Giemsa + i ncorporeaz mai trziu timidin tritiat, deci are o replicare ntrziat - expresie a inactivrii difereniale a cromatinei. O stare de condensare complet a cromatinei se ntlnete la eritrocitele nucleate ale nemamiferelor i care este total nereplicativ, ca i n nucleii spermatozoizilor. La animale, gradul condensrii cromatinei este dependent de funcia celulei, fiind specific unei activiti tisulare anumite. Heterocromatina transcrie o foarte mic cantitate de ARN. Dat fiind complexitatea problemei, este necesar de schiat o clasificare a aspectelor pe care la prezint condensarea i decondensarea cromatinei: Termenul de heterocromatina" se folosete pentru heterocromatina constitutiv, care ocup o regiune permanent condensat din cromozom i a crei localizare este identic la cromozomii analogi. Aceasta conine o mare cantitate de ADN respectiv (secvene de baze care se repet), se replic dup eucromatin, nu transcrie ARN i se coloreaz diferit;

120

Termenul de heterocromatina facultativ" exemplific cromozomul X, inactiv, al femelelor de mamifere, care apare heteropicnotic n interfaz, adic foarte condensat i colorabil (cromatina sexual). La fel sunt i cromozomii X sau Y din celulele sexuale ale unor insecte care se aglomereaz n corpusculi Feulgen +. Acest tip de heterocomatin se caracterizeaz prin prezena unor proteine care modific ADN fcndu-l total inactiv, deoarece caracterele localizate pe un singur cromozom X - genele recesive - sunt singurele care se pot manifesta; aceasta deoarece cromozomul Y la mamifere a suferit o inactivare genetic prin heterocromatinizare, astfel c genele de pe X au devenit semizigote la mascul. Termenul de cromatina condensat" semnific eucromatina inactivat n mod specific de proteine, cum este cazul limfocitelor inactive, al eritrocitelor nucleate, al spermatoizilor etc. Prin stimularea celulelor cu lecitine, acestea se transform n celule blastice (tinere), iar cromatina se decondenseaz i ADN-ul poate sintetiza diferii ARN mesageri .

5.1.5.Organizarea molecular a fibrelor de cromatina. Nucleozomii

Organizarea molecular a fibrelor de cromatina este realizat prin dublu helix al ADN i prin diferite proteine (histone, protamine, nonhistone foarte variate). Analiza cromatinei interfazice realizat prin metoda precipitrii cu magneziu, arat c ADN este 19,4%, ARN 14% i proteinele 66.6% . Dintre proteine, 30,6% sunt solubile n 0,2 MH2SO4 . Considernd c fiecare cromozom este format dintr-un singur dublu-helix de ADN, spiralizat la rndul su ns de cteva ori, s-a putut calcula c lungimea total a ADN tuturor cromozomilor complet despiralizai dintr-un nucleu este, n medie. De un metru la mamifere . Cnd volumul nucleului respectiv este n jur de 15 3, se pune ntrebarea cum este posibil s ncap un metru ADN, orict ar fi el de subire (20 ), ntr-un volum att de mic? Mai mult chiar, existena ADN cromozomal n micul volum oferit de nucleu asigur o serie de funcii i roluri ale cromozomilor cum sunt replicarea i reparaia materialului genetic (ADN), precum i transcrierea diferitelor ARN etc. La aceast ntrebare s-a rspuns prin teoria structurii nucleozomale a cromozomilor. O serie de cercetri din ultimii 10 ani (P. Oudet i Ada Olins, R.D.Kornberg, A. Klug) au dus la concluzia existenei n nuclee a unor corpusculi numii nucleozimi. Ei sunt compui dintr-un miez histonic, n jurul cruia se nfoar dublul helix al ADN . ntregul dublu helix al ADN al fiecrui cromozom se nfoar pe un ir enorm de asemenea corpusculi hiostonici, ntr-un mod nentrerupt, adic de la un capt la cellalt al cromozomului. Aceast situaie sugereaz imaginea unor mrgele nirate pe a. ADN ar reprezenta aa, iar miezul histonic ar fi mrgelele. Numai c n cazul structurii nucleozomale, corpusculul nu este strbtut de helixul dublu al ADN, ci acesta se nfoar n jurul corpuscului. Miezul histonic al nucleozomilor este constituit din patru clase histonice: H4, H3, H2A i H2B, avnd un coninut de 25% lizin, arginin i histidin. Moleculele histonice H4 i H3 sunt identice la toate speciile, n schimb moleculele H2A i H2B au o mai mic fidelitate, cu toate c poriunea fr caracter bazic a rmas nemodificat. Miezul nucleozomului este reprezentat printr-un set de opt molecule histonice, i anume, cte dou din clasa H4, H3, H2A i H2B; miezul este deci, un octamer histonic. Acest complex, de histone, numit octamer, ce constituie miezul nucleosomic, este nconjurat la exterior de dou spire ale ADN-ului cromozomal, constituit din 166 nucleotide. Legtura dintre doi nucleozomi succesivi se face printr-un segment de dublu helix ADN cu o lungime variabil de cteva zeci de perechi de nucleotide care este asociat cu o molecul de histon H1. Molecula H, (H, din nucleii eritrocitelor de pasre) este diferit de celelalte clase histonice, deoarece este de dou ori mai mare cu o bazicitate crescut la 37%, cu un coninut ridicat de lizin, alanin i valin, s-a artat c, n soluii tampon cu o concentraie ionic medie, regiunile mijlocii i carboxiterminale ale moleculelor celor 5 clase histonice (H1, H2A, H2B, H3, H4) sunt globulare (fig. 74).

121

Fig.74 - Structura nucleozomilor. Nucleozomii sunt formai din dou spire de ADN (ture) care nfoar un miez (core) format din 8 molecule de histone (cte 2 de fiecare tip de histon (H2A,H2B,H3 i H4). Nucleozomii sunt legai ntre ei de un fragmant de ADN linker care nu este legat de proteine.Prin hidroliz enzimatic nucleozomii se separ coninnd ADN de aprox. 146 pb. Moleculele histonice se pot separa una de alta i apoi reasocia experimental, toate sau o parte din ele, pentru a se cunoate rolul fiecruia n ansamblul molecular nucleozomal. Nucleonii au form sferic i un diametru de 100 . n urma digestiei prelungite a cromatinei, cu nucleoz, urmat de purificare, rezult particule lipsite de histon H1 care conine 140 10 perechi de baze de ADN. Variabilitatea lungimii de la 180 la 250 perechi de nucleotide este determinat n exclusivitate de variabilitatea lungimii segmentului internucleosomic. Localizarea i asamblarea celor 8 molecule histonice n miezul nucleosomic sunt cu aproximaie cunoscute. Partea central a octomerului histonic este format dintr-o unitate tetrameric (2H3+2H4). Octomerul histonicare form de inim, datorit aranjamentului sub form de disc al tetramerului 2H3 - 2H4, care formeaz partea central i vrful inferior al inimii i asocierii sale cu cei doi dimeri (2H2A i 2H2B) spre a forma cele dou vrfuri superioare ale inimii. Octomerul este probabil stabilizat n urma interaciunii capetelor C - terminale hidrofalse ale histonelor care, fiind globulare, se angreneaz spre a constitui partea central a octomerului, pe cnd, capetele N - terminale, bogate n arginin i lizin rmn la periferie sub forma unei cozi care interacioneaz cu ADN ce se nfoar n jurul miezului sub forma aproape dou (l i 3/4) tururi super helicale negative. Studiile de reconstituire de cromatin n care s-au format cele patru fracii histonice ce alctuiesc miezul nucleosomic, n diferite combinaii, au condus la obinerea unor date care confirm aranjamentul stabilit de histonele n alctuirea nucleosomilor. Nici o combinaie de histone nu se poate realiza atunci cnd se omit histonele H3 i H4, cel mai puternic asociindu-se aceste histone bogate n arginin a cror secven de aminoacizi a fost puternic conservat n decursul evoluiei. Interaciunile dintre moleculele H3 i H4 sunt foarte puternice i ele confer miezului nucleosomal o form special de glug, deci controleaz starea conformaional a complexului de molecule. Toate histonele, cu excepia hi se leag i neutralizeaz sarcinile negative numai pe o parte ale dublului helix ADN, pe partea opus fiind nc prezente repulsii de aceeai sarcin, permind astfel plierea ADN n jurul miezului histonic. Cromatina lipsit de histona H1 nu prezint o structur regulat. Cnd din cromatin se extrage H1 i este meninut la puteri ionice sczute, nucleosonii sunt nc distribuii de-a lungul matrixului ADN la aproximativ 200 perechi de baze, dar au un aspect mai puin regulat i ADN nu mai intr n i iese din miezul nucleosomic la acelai punct, ci la puncte opuse. Dac puterea ionic este ridicat peste 40mM NaCl, cromatina se condenseaz n aglomerri, nu n structuri helicale. 122

Aceste cercetri sugereaz c histona H1 are un rol structural i este esenial pentru nivelele superioare de organizare a cromatinei. Constituenii de baz ai cromozomului eucariot sunt fibrile de cromatina de 100 i 300 diametru. Dac cromatina intact care conine toate histonele este meninut la o concentraie sczut de sruri (1mM NaCl), acestea se prezint ca o structur destul de deschis, cu nucleosonii bine definii, cu ADN ce intr i iese din direcii opuse la un acelai punct. Aceast form s-a numit filament nucleosomal, avnd diametru de 100 . n prezena unor concentraii saline apropiate de tonicitatea celular, lanul nucleosomal formeaz suprastructuri helicoidale cu ture de ctre ase nucleozomi. Sunt aa numiii solenoizi sau supersuperhelix, care pot fi vzui la microscopul electronic; diametru unei structuri supersuperhelix sau solenoid este de 250 - 300 . n cromozomii metafazici s-au evideniat (Back, 1979) fibre ce circa 400 diametru care s-ar forma prin condensarea fibrelor de 250 - 300 diametru, rezultnd o structur suprasolenoidal care s-a numit fibra-unitar (unit-fiber). Prin plierea acestei fibre rezult morfologia cromozomului metafazic. n cromozomi, cromatina este ancorat la un schelet proteinic care formeaz partea central a ntregii structuri cromozomale. Dac din cromozomi sunt eliminate histonele i asemenea - se vizualizeaz EM, acest schelet proteinic mpreun cu ADN formeaz un halou" de circa 4.000 bucle de aproximativ 40.000 - 90.000 perechi de baze lungime, bucle care pornesc cu o ramur dintr-un punct al scheletului proteinic i se ntorc cu cealalt ramur ntr-un punct adiacent acestuia. Cnd se reasociaz cu histone, ADN-ul formeaz structuri moniliforme (structur nucleosomal). O condensare ulterioar produce fibra de 100 , apoi fibra de 300 (solenoizii) care la rndul lor sunt organizate, de asemenea, n fibre cu configuraii helicale de ordin superior. Pornind de la ADN, condensarea general este de 5.000 - 8.000 ori pn la 250.000 de ori n cromozomul metafazic. Aa se explic cum moleculele de ADN extinse de la nivelul cromozomilor complementului cromozomal uman avnd o lungime total de 164 - 170 cm (aproximativ 2 m) pot fi adpostite la nivelul celor 46 de cromozomi a cror lungime total este de pn la 200 m. La fel se explic i n cazul mamiferelor posibilitatea cuprinderii moleculei de ADN care alctuiete cromozomii ntr-un volum nuclear foarte mic. Ierarhia de helixuri a fibrei de cromatina pornete de la dublu helix ADN care se condenseaz de apte ori n nucleosom, fibra nucleosomal se spiraleaz la rndul ei de cinci ori n solenoid i de 40 de ori ca suprasolenoid. Aceasta se mai condenseaz nc de cinci ori, aa nct n cromozomul metafizic condensarea ajunge la un nivel mediu de 7.000 ori. Prin digestia" cromatinei cu eudonucleoza micrococal s-au obinut particule nucleosomal monomerice de care sunt asociate ADN-polimerazele, care mpreun cu alte enzime (fosfoprotein-fosfatazele acide i neutre, enzimele de restricie i reparaie, RN-azele, proteazele etc) i diferite proteine de structur, sunt clasate n aa-numitele proteine nonhistonice. Studii biochimice au artat c n nucleu, ca i n mitocondrii i cloroplaste, se gsesc o serie de ADN-polimeraze prin care se realizeaz replicarea semiconservativ a ADN.

5. 2. Replicarea ADN la eucariote

Deoarece ADN conine informaia genetic a celulei, sinteza sa este unul dintre cele mai importante evenimente din viaa acesteia . Realizat prin intervenia unui complex aparat enzimatic, sinteza ADN, este o reacie de tip selectiv, reprezentnd singurul caz din lumea biomolecular n care o substan i dirijeaz propria sa sintez . Replicarea acizilor nucleici st la baza reproducerii vieii, orice sistem biologic realiznd sinteza replicativ de ADN ca o precerin a reproducerii sale. Complementaritatea celor dou catene a dublului helix ADN a sugerat lui Naston i Crik modelul semiconservativ de replicare. Aa cum a artat Batson (1976), mecanismul replicrii este asemntor 123

mecanismului cheie-broasc, vrnd s sugereze, prin acest sistem dual mecanic, complementaritatea structural-funcional a celor dou catene ADN, fiecare servind drept model, drept matri, pentru sinteza unei noi catene complementare care se numete replic. Termenul de REPLICARE deriv de la cuvntul englezesc to replicate" = a copia (fig. 75). Fig. 75 - nlnuirea bazelor ntr-o singur caten de ADN. Sinteza unei noi molecule de ADN se realizeaz aadar printr-un proces de copiere, unic n lumea macromoleculelor i n lumea vie, proces care se numete replicare. Replicarea este caracteristic doar acizilor nucleici. Acetia prezint o structur uimitor de potrivit pentru realizarea replicrii n care, dintr-o molecul iniial iau natere dou molecule identice ntre ele i totodat identice cu molecula iniial. Astfel, molecula iniial i topete" identitatea n cele dou molecule fizice care deriv din ea i care sunt identice ei. Se asigur, pe de o parte reproducerea fidel i continuitatea fenomenului ereditar de-a lungul generaiilor (fig. 76).

Fig. 76. a). Schema simplificat a replicrii semiconservative. Bazele din cele dou catene ADN (vechi sau noi) sunt complementare.Cnd ele se separ n cursul replicrii,sunt adugate bazele complementare la catenele vechi pentru a forma catenele noi (fiice).Acest model asigur ca moleculele noi de ADN s fie identice cu cele vechi. b). Replicarea la eucariote (se realizeaz bidirecional; de la o singur origine (O) se formeaz dou furci de replicare n direcii opuse). n condiiile vieii actuale, replicarea acizilor nucleici nu poate avea loc dect n celule, fie procariote, fie eucariote. Replicare acizilor nucleici virali nu poate avea loc n virion - particul viral natural - ci numai n celula gazd n care au ptruns n timpul infeciei virale. Este, de asemenea, remarcabil pentru lumea vie faptul c nu se poate crea de -novo" nici o molecul de ADN, sinteza replicativ a ADN implicnd existena obligatorie a unei molecule preformate care particip direct n reacie, avnd loc formarea a dou molecule fiice, identice cu molecula preformat. Continuitatea este asigurat de faptul c n moleculele nou formate intr i cte o caten din molecula iniial, astfel c moleculele fiice vor avea o caten veche 124

cea care a funcionat ca matri i o caten nou sintetizat - replicarea complementar a matriei. Moleculele fizice de ADN motenind doar una din cele dou catene ale moleculeimam, mecanismul de replicare se numete semiconservativ. In vivo sinteza acizilor nucleici se desfoar n trei etape: a.) sinteza precursorilor nucleotidelor purinice i pirimidinice adic a acidului inozinic i respectiv acidului uridilic ; b.) sinteza nucleotidelor propriu-zise care intr direct n alctuirea macromoleculei acizilor nucleici: dezoxiadenozintrifosfat - d ATP ; dezoxigreananozintrifosfat - d GTP ; dezoxicitidintrifosfat - d CTP ; dezoxitimidintrifosfat - d TTP (pentru ADN) i: adenoziritrifosfat - ATP; guanozintrifosfat - GTP; citidintrifosfat - CTP; uridintrifosfat - UTP pentru ARN. c.) polimerizarea ordonat a nucleotidelor ntr-o secven complementar unei matrie dup modelul semiconservativ i sub cataliza unor enzime polimerazice celulare.

5.2.1.Complexul de enzime polimerazice implicate n replicare

n desfurarea reaciei de polimerizare este necesar prezena tuturor celor patru tipuri de dezoxiribonucleide sub form lor trifosfatic, absena numai a uneia dintre ele blocnd activitatea enzimei polimerizatoare. La bacterii au fost descrise trei enzime ADN - polimerizatoare: ADN -polimeraza I numit enzima lui Kornserg i simbolizat Pol I, ADN - polimeraza II i ADN - polimeraza III. Dei la nceput s-a crezut c ADN - pol I este implicat n reacia de replicare, ulterior sa dovedit c doar ADN - pol III este enzima polimerizatoare n replicare, pe cnd ADN - pol I joac rol esenial n repararea leziunilor produse n ADN de ctre diferii ageni mutageni fizici sau chimici. Funcia ADN - pol II bacteriene nu este nc precizat, dar ea nu joac rol esenial n replicare, putnd, de asemenea, fi implicat n procesele reparatorii sau de recombinare. La eucariote s-au descris mai multe tipuri de ADN polimeraze: polimeraza alfa () - implicat n replicarea propriu - zis; este responsabil de 80% din activitatea total a enzimelor de replicare. S-ar prea c vertebratele au acelai fel de polimeraza, iar nevertebratele una asemntoare. Polimeraza a este constituit dintr-o unitate catalitic de 150.000 daltoni, asociat cu 4 polipeptide de 54.000, 58.000, 61.000 i 64.000 daltoni ce formeaz subunitatea heteropolimeric stimulatoare a regiunii catalitice sau cu funcie stabilizatoare a complexului ADN-polimeraza. - polimeraza beta (), implicat n reparare. Este prezent la toate metazoarele, dar nu se ntlnete la plante i protezoare, n timp ce a polimeraz se afl la toate celulele eucariate . O caracteristic interesant a - ADN - palimeraz este capacitatea de a folosi o matrice ribonucleotidic n prezena unei amorse" ADN. Aceast proprietate amintete de transriptaza invers viral, cu precizarea c enzima poate copia un ARN natural. polimeraza gama (), care se pare a fi polimeraza mitocondrial, fiind prezent i n mitocondrii, nu numai n nucleu. ADN - polimerazele prezint specificitate de direcie, nu ns i de secven (nu recunosc o anumit secven specific de baze azotate din ADN), deplasndu-se pe ambele catene matri doar n direcie dinspre 3' spre 5', cataliznd formarea punilor fosfodiestenice (polimerizarea nucleotidelor) doar n direcia 5' spre 3', astfel c totdeauna polaritatea replicei este de sens opus polaritii matricei, catenele complementare fiind deci antiparalele .

125

Faptul c ADN - polimeraza nu are specificitate de secven este dovedit de folosirea, n reaciile n vitro", n calitate de matri, dar monocatene de ADN de orice proeminen ar fi ele. ADN - polimeraza nu poate folosi ca matri ADN bicatenar.

5.2.2. Iniierea replicrii

Separarea celor dou catene complementare - ce devin catene matri - n procesul de replicare se realizeaz progresiv, astfel c, n desfurarea procesului, macromoleculele ADN capt forma literei Y ", bifurcaia sa numindu-se bifurcaie de replicare i reprezentnd cele dou catene - matri ce-i expun bazele n vederea mperecherii cu bazele azotate ale nucleotidelor libere. La nivelul bifurcaiei de replicare se desfoar procesele mecanismului semiconservativ de replicare prin intervenia unui complex aparat enzimatic. Iniierea replicrii se face ntr-un punct de pe macromolecul ADN numit originea replicrii. O asemenea secven de origine se caracterizeaz (la toate sistemele biologice analizate) G - C. La nivelul perechilor A - T are loc iniierea separrii celor dou catene, aceste perechi avnd doar dou puni de H, sunt mai uor de separat comparativ cu perechile G - C care avnd trei puni de H sunt mai stabile . n celule, macromoleculele ADN se afl sub form de structuri teriene sau cuaternare, iar cele circulare, cum sunt ADN bacterian, ADN mitocondrial, datorit superspiralizrii prezint numeroase superrsuciri. n vederea replicrii, pentru a se permite naintarea bifurcaiei de replicare de-a lungul circumferinei moleculei, este necesar relaxarea macromoleculei torsionate, prin superspiralizare. Aceast torsionare este nlturat prin aciunea unei enzime care are capacitatea de a introduce crestturi monocatenare tranziente n duplexul ADN, ceea ce permite rotaia liber a unei catene, n jurul celeilalte. Aceast enzima numit iniial pivotaz, enzima de cretere - nchidere, enzima de relaxare pe ADN sau UNWINDAZ, a primit n ultimul timp numele de TOPOIZOMERAZ - ADN. Topoizomerazele introduc superspiralizri tranziente negative n ADN. Topoizomeraza este alctuit din dou subuniti luate de cte dou ori, constituind un tetramer. Una din aceste subuniti funcioneaz ca topoizomeraz propriu-zis, pe cnd cea de-a doua subunitate a topoizomerazei acioneaz ca ADN - GIRAZ sau PROTEIN OMEGA () introducnd tururi superhelicale n ADN nou sintetizat, refcnd starea superhelical a moleculei fiice de ADN . De aceea, metaforic s-a spus c topoizomerazele - ADN desfac i fac nodurile din ADN". ADN-giraza superspiralizeaz ADN printr-un mecanism numit inversie de semn, n care o superhelice pozitiv este direct convertit ntr-una negativ, printr-o cretere tranzient monocatenar a ADN bicatenar ntr-un anumit punct. La eucariote s-a artat c proteinele nonhistonice, desemnate HMG1 i HMG2, pot separa catenele dublului - helix ADN. Dup intervenia topoizomerazei care determin relaxarea ADN la nivelul originii replicrii, intervin enzime numite HELICAZE - ADN. Acestea realizeaz separarea catenelor prin ruperea punilor de H, folosind energia provenit prin defosforilarea ATP. Exist i alternativa ca primul eveniment n separarea catenelor dublului helix s fie intervenia la punctul de iniiere a replicrii, a unei endonucleoze care, recunoscnd n mod specific secvena de nucleotide de la nivelul acestei origini, produce o tiere" a uneia dintre cele dou catene tiere care nu este altceva dect desfacerea unei legturi covalente fosfodiesterice. n urma acestei creteri" rezult 2 extremiti, una avnd gruparea 3' - OH i alta 5' - fosfat. Energia liber de la nivelul acestei creteri" este suficient pentru a desface nc 2-3 puni de H, moment n care se ataeaz ADN - polimeraza - enzima polimerizatoare. La E. coli, helicaza descris sub denumirea de protein reparatorie se deplaseaz pe monocatena ADN n direcia 3' - 5', ndeprtnd catena complementar. O alt helicaza numit helicaza III se deplaseaz n direcia 5' - 3', avnd o aceiai aciune ca i proteina reparatorie. Proteine neenzimatice denumite UNWINDAZE sau proteine destabilizatoare ale dublului helix (HDP), respectiv proteine de topire a ADN, intervin n asigurarea stabilizrii monocatenelor, 126

nepermind, odat ataate la ele, reasocierea monocatenelor complementare, astfel c acestea s poat funciona ca matri. Dup desfacerea structurii bicatenare n monocatenare i stabilizarea monocatenelor la nivelul originii replicrii, intervine enzima PRIMAZA care determin sinteza unui scurt segment de ARN care s-a numit ARN-PRIMER.

5.2.3. Primarea replicrii

Toate enzimele ADN - polimerazice au capacitatea de a alungi catene polinucleotidice deja existente, nu ns i de a iniia sinteza de novo" a unei catene. Pentru aceasta, n desfurarea polimerizrii de nucleotide din cadrul replicrii ADN, este necesar ca prim etap intervenia unui ARN - polimeraze - enzima care are capacitatea de a iniia sinteza de novo" de catene polinucleotidice, folosind ca model o catena - matri . Aceast intervenie a ARN - polimerazei n procesul de replicare a ADN apare ca un element ajuttor, dar esenial. Prin activitatea ARN - polimerazei n procesul de iniiere a replicrii ADN se sintetizeaz un scurt segment de ARN (primer).

5.2.4. Alungirea lanului de ADN nou - sintetizat i terminarea replicrii

Captul 3'-OH al fiecrui nucleotid aliniat pe matri, servete de fiecare dat drept primer pentru activitatea de polimerizare a ADN - polimerazei. Polaritatea opus a catenelor - matri, 3' - 5' pe una i 5' - 3' pe cealalt, a ridicat problema existenei a dou polimeraze care s catalizeze polimerizarea, una n direcia 3' - 5', alta n direcia 5' - 3' . Dar, n ciuda tuturor ncercrilor, nu au fost descoperite dou ADN polimeraze care s polimerizeze n direcii opuse. S-a stabilit cu certitudine c n replicare intervine o singur enzim polimerizatoare - la bacterii ADN - pol III, care se deplaseaz numai n direcia 3' - 5' pe ambele catene matri, determinnd polimerizarea numai n direcia 5' - 3'. n anul 1968, Okazaki i colaboratorii au demonstrat prin experiene de marcare pulsatorie (contactul materialului biologic cu H - timidin este de foarte scurt durat), c noile catene complementare catenelor - matri sunt sintetizate pe segmente mici, care sau numit fragmente OKAZAKI, avnd circa 1.000 - 2.000 nucleotide i apoi aceste fragmente sunt unite prin puni fosfodiesterice sub aciunea unei enzime numite ADN - ligaza, rezultnd segmente mai lungi. n ultim instan, rezult din unirea acestora din urm catena nou sintetizat, replic a matriei. Fiecare fragment Okazaki va fi primat, de un ARN - PRIMER, prin intervenia primazei. Dup sinteza fragmentului Okazaki, ARN - primer este ndeprtat prin excizie de ctre un ADN - polimeraza I care are activitatea exonucleazic (de hidroliza legturilor fosfodiesterice). Golul rmas n urma exciziei ARN primer va fi umplut prin activitatea tot ADN - pol I care va realiza completarea printr-o reacie de polimerizare regional. n felul acesta fragmentele Okazaki sunt asamblate fr ARN -primer. Modelul de replicare discontinu propus de OKAZAKI s-a dovedit a fi aplicabil la toate sistemele biologice . Este posibil ca replicarea pe o catena s fie naintat fa de cea de-a doua catena sau unirea fragmentelor OKAZAKI s fie mai rapid pe o catena, numit catena directoare (leading), pe cnd aceea cu sintez ncetinit se numete catena succesoare (lagging) (fig. 77; fig. 78).

127

Fig. 77 - Replicarea ADN. Se realizeaz n direcia 5' - 3'. Catena leading se sintetizeaz n mod continuu, catena lagging se sintetizeaz n mod discontinuu; fagmentele Okazaki sunt unite de ctre ADN ligaz. n aceste condiii i pe catena lagging sinteza are loc tot n direcia 5' - 3'. Fig. 78 - Schema general a replicrii n care fiecare enzim sau protein auxiliar sunt prezentate n mod individual.Ele acioneaz la nivelul furcii de replicare.

5.2.5. Corectarea erorilor de replicare

Replicarea ADN, fiind un proces complex, care se desfoar cu mare vitez, necesit ca produii rezultai s fie copiai cu mare acuratee, iar n cazul cnd sau introdus erori, n mod accidental, ele s fie corectate imediat. La nivel molecular exist mecanisme care asigur corecia replicrii i care face ca un nucleotid liber, greit mperecheat cu nucleotidul de pe matri s fie excizat, altfel desfurarea polimerizrii este stopat (fig. 79).

128

Fig. 79 - Schema reparrii ADN (nlocuirea dimerilor de timin). Acest sistem de corectare postreplicativ, implic mai multe etape i mai multe enzime de reparare: - recunoaterea bazei incorecte introduse (deci a mutaiei) - ndeprtarea secvenei lezate de ctre nucleaze, fiind eliminate de la 10, pn la 50 nucleotide - completarea regiunii excizate cu o secven corect, de ctre polimeraza I - unirea fragmentelor pentru stabilirea continuitii catenei, de ctre ADN ligaz (fig. 80).

Fig. 81 - Schema general a sistemului de reparare postreplicativ la bacterii, care cuprinde cel puin 4 etape: recunoaterea leziunii ADN; ndeprtarea de ctre nucleaze a secvenei lezate; completarea de ctre ADN-pol I a ntreruperii create n monocatena de ADN; legarea celor dou capete de ctre ADN ligaz.

5.2.6. Unitile de replicare

Numite i repliconi - la procariote, reprezentai de cromozomul bacterian care funcioneaz ca unitate de replicare, la eucariote reprezint acele regiuni ale ADN unde se gsesc punctele de iniiere (de origine) ale replicrii. Spre deosebire de cromozomul viral i bacterian, cromozomul eucariotelor este o structur multirepliconic, fiind constituit din mai muli repliconi (uniti de replicare), complementar - matriei ADN. Acest segment de ARN s-a numit PRIMER, procesul n care are loc sinteza sa s-a numit PRIMARE, iar ARN - polimeraza care catalizeaz asemenea sintez s-a numit PRIMAZ. Sinteza unei catene ADN, a replicei, ncepe deci de la primerul ARN, sub aciunea ADN polimerazei care este eficient n alungirea catenei polinucleotidice iniiat prin sinteza primerului ARN. ARN - primer ofer ADN - polimerazei captul su de 3'-OH, care este liber i care ptrunde ntr-un sit special al acestei enzime numit SIT PENTRU CAPTUL 3'-OH Ah PRIMERULUI. ADN - polimeraza realizeaz n cadrul aciunii sale catalitice condensarea, adic esterificarea grupei 3'-OH a primerului ARN cu grupa 5' - fosfat a primerului dezoxiribonucleotid trifosfat aliniat pe matri n virtutea complementaritii sale cu baza azotat corespunztoare din matri.

129

5.3. Transcripia ADN sau sinteza ARN 5.3.1. Mecanismul general

Mecanismul prin care informaia genetic, coninut n molecula de ADN, se materializeaz n sinteza proteinelor a fost elucidat n ultimii 40 de ani. Proteinele sunt componente celulare care, de fapt, realizeaz toate activitile ce au loc n celul. Numrul proteinelor este de aproximativ 109 1010 molecule/celul, reprezentate de aprox. 10. 000 de tipuri diferite. Desfurarea acestui flux informaional apare sub denumirea de dogm central a biologiei moleculare ( 1960 1970 ). Aceast dogm consider c ADN transmite informaia la ARN i de la ARN la proteine, dup schema: Transcripie Translaie ADN ---------------- ARN ------------- PROTEINE Mesager de transport ribozomal Temin i Baltimore au stabilit (1970) c este posibil transmiterea informaiei i de la ARN la ADN, proces realizat de o enzim (ce se gsete de la virusuri pn la eucariote) denumit reverstranscriptaz. n acest caz, ARNm reprezint matricea (template) pentru molecula de ADN, procesul fiind denumit reverstranscripie i astfel dogma central este contrazis. Din schema de mai sus, se observ c ADN nu intervine direct n sinteza proteinelor. Transmiterea informaiei se face prin ARNm, care este un produs intermediar, a crei funcie este de a translata mesajul genetic n proteine. Acest proces de sintez a ARN este denumit transcripia ADN, sinteza ARN sau expresia genic. Se folosete termenul de expresie genic, pentru c o regiune din molecula de ADN reprezentat de o gen, cnd este activat, transcrie un ARNm pentru o protein dat. Indiferent din ce celul provine ADN (procariote sau eucariote) conine mii de gene a cror secven corespunde, n ntregime sau parial, secvenei aminoacizilor din proteine. Secvena genelor din genomul celulelor procariote corespunde n ntregime secvenei aminoacizilor din proteina pe care a codificat-o i ele sunt numite gene coliniare (fig. 82). Spre deosebire de acestea, genele din genomul celulelor eucariote sunt ntrerupte de secvene care nu vor fi regsite n secvena proteinelor. Astfel, o gen (sau mai bine zis unitatea transcriptibil a genei) la eucariote este format din dou grupuri de secvene: exoni, secvene care sunt transcrise n ARN precursor, sunt coninute de ARNm i sunt regsite n secvena aminoacizilor din protein; introni, secvene din gen, care sunt transcrise n ARN precursor, dar nu mai sunt coninute n ARNm i deci nu se mai gsesc n secvena aminoacizilor din proteinele transcrise (fig.83). n prima etap, gena este transcris n ntregime ntr-o molecul de ARN numit precursor (pre-mesager sau ARN nuclear heterolog). Intronii sunt eliminai din molecula de ARN precursor prin mecanisme speciale. n urma acestui proces, rezult o molecul de ARNm, care conine numai exoni i a cror secven servete pentru sinteza proteinelor. Astfel, molecula de ARNm apare mult mai mic dect transcriptul primar ARN heterolog. Fig. 82 - Gen structural care corespunde exact secvenei ARNm i proteinei sintetizate.

130

Fig. 83 - Gene structurale eucariote intrerupte de introni. Din ARN precursor intronii sunt ndeprtai, exonii sunt unii ntre ei (splicing) pentru a da natere ARNm sau matur, care prin translata proteina, n care secvenele intronilor nu se mai regsesc. Majoritatea genelor pentru ARNt sau ARNr din genomul a numeroase eucariote conin i ele introni care sunt eliminai din transcriptul primar. Chiar i ADN mitocondrial conine uneori introni n genele care codific toate tipurile de ARN. Sunt ns gene care nu au introni, de exemplu, genele pentru histone, interferoni i retrogenele (genele provenite din revers- sau retrotranscripia ARNm).

5.3.2. Elemente implicate n transcripie

Transcripia implic sinteza unui lan polinucleotidic de ARN care preia mesajul de pe molecula de ADN. ARN este, ca i ADN, un lan lung neramificat, format din cele patru nucleotide (A,U,G,C) informaia genetic a unei singure catene de ADN va fi transmis la o secven complementar de ARN. n acest scop, cele dou catene de ADN se vor separa, temporar i pe lungimi scurte, pentru ca una s serveasc de matrice pentru ribonucleotidele ce vor fi aezate complementar secvenei catenei de ADN. Deci ARNm (ca i celelalte tipuri de ARN) sintetizat ca un lan monocatenar este complementar catenei de ADN care l-a transcris i este identic cu cealalt caten de ADN netranscris (fig. 84).

Fig. 84 - Transcripia ADN. ARN polimeraza sintetizeaz ARN, copiind mesajul de pe o singur caten ADN. Opiunea pentru catena ce va fi copiat este determinat de poziia promotorului n secvena ADN. 131

Transcripia ADN este un mecanism coplicat, care necesit un aparat de transcripie. Pe lng ARN polimeraza specific fiecrui ARN sunt implicate n acest proces numeroase proteine auxiliare (factori de transcripie) i o serie de elemente de control existente n structura ADN.

5.3.3. Aparatul enzimatic de transcripie

Transcripia ADN implic producerea a trei specii de ARN: ARN mesager (ARNm), ARN ribozomal (ARNr) i ARN de transfer sau de transport (ARNt). Procesul de transcripie este realizat de enzima ARN polimeraza. La procariote exist un singur tip de ARN polimeraz care este responsabil pentru sinteza celor trei specii de ARN. La E.coli numrul total de molecule de ARN polimeraz/celul este de aprox. 7000. Angajate n transcripie sunt probabil 2000-5000 de molecule. Enzima complet sau holoenzima are o greutate molecular de aprox. 480.000 Da i este format din dou componente: enzima core (de baz) i factorul (sigma). Greutatea molecular a factorului variaz de la 32000 la 92000 da. Enzima, pe lng factorul , conine alte patru componente, codificate de gene distincte i care au funcii diferite n procesul de transcripie. Iniierea transcripiei se face prin holoenzim (enzima complet), factorul fiind componenta implicat numai n recunoaterea i fixarea corect a punctului de iniiere. Transcripia odat iniiat este continuat de enzima core, deoarece factorul nemaifiind necesar , se desprinde de complex i se asociaz la o alt ARN- polimeraz, care va ncepe activitatea la un alt punct de iniiere. La celulele eucariote, aparatul de transcripie este mult mai complex i mai puin cunoscut dect la procariote. ntr-o celul eucariot exist trei tipuri de ARN- polimeraze nucleare. Ele ocup poziii distincte n spaiu nuclear i fiecare tip de enzim prezint o structur complex. La eucariote, cele trei specii de ARN (ARNr, ARNm, ARNt) sunt transcrise, fiecare, de ctre un tip de polimeraz, i anume: - ARN-polimeraza I este o enzim localizat n nucleol i catalizeaz transcripia ARNr; ea reprezint activitatea sintetic cea mai mare (aprox. 50 70 % din total); - ARN- polimeraza II este o enzim nucleoplasmatic, responsabil pentru transcripia ARNm (activitate egal cu aprox. 20 40 % din total); - ARN- polimeraza III este o enzim tot nucleoplasmatic care transcrie ARNt i 5S ARNr activitate egal cu aprox. 10 % din total ). Fiecare celul eucariot conine ntre 2 x 104 pn la 2 x 107 molecule de ARNpolimeraze. Procesul de transcripie catalizat de ARN- polimeraze prezit trei etape importante. 1. etapa de iniiere, care include: recunoaterea de ctre ARN- polimeraz a genei care trebuie transcris ( gena int ), a punctului de iniiere unde are loc desfacerea helixului ADN pentru generarea unei regiuni monocatenare scurte i ncorporarea primelor nucleotide care formeaz lanul de ARN; secvena ADN necesar pentru realizarea acestor reacii este reprezentat de promotor; locul la care primul nucleotid este ncorporat se numete punct de iniiere (start point i se noteaz cu + 1); 2. etapa de elongaie, reprezint faza n care nucleotidele sunt legate covalent la captul 3' al lanului polinucleotidic. Bazele sunt adugate succesiv la lanul ARN, cnd are loc formarea hibridului molecular ADN-ARN, n regiunea desfurat a helixului. Sinteza continu i polimeraza alunec de-a lungul ADN, desfcnd dublul helix pentru a expune un nou segment al matricei sub form monocatenar; 3. etapa de terminare, care reprezint punctul unde sinteza lanului de ARN se termin iar hibridul ADN-ARN format, se separ. ADN se reface sub form de dublu helix, ARNpolimeraza i molecula de ARN sintetizat se desprind i devin libere n mediu. 132

Terminarea sintezei este realizat de o secven specific n structura genei care se numete terminator. Pentru realizarea procesului complex de transcripie, pe lng ARN-polimeraz este necesar un mare numr de proteine auxiliare numite factori de transcripie, care interacioneaz cu secvene specifice de ADN i care pot aciona stimulator sau inhibitor asupra expresiei genice.

5.3.4. Factorii de transcripie

Spre deosebire de procariote, unde ARN-polimeraza se leag de ADN, la eucariote ADN-polimeraza se leag de proteine care au identificat promotorul genei ce va fi transcris. Aceste proteine, reprezint factorii de transcripie care intr n aparatul transcripional format din aprox. 20 de proteine, implicat n: - meninerea duplexului ADN dup legarea factorilor de transcripie (FT); - meninerea strii active a genei int sub aciunea altor factori transcripionali i legarea ARN-polimerazei; - obinerea energiei necesare sintezei, prin hidroliza ATP; - iniierea transcripiei ( a sintezei ARN); - elongarea transcriptului. Cercetri analitice au permis s se izoleze i purifice, din extractul nuclear, o serie de factori de transcripie. Primul care recunoate promotorul i n special TATA-box, este factorul de transcripie D (notat TFIID), TF de la transcription factor i II de la ARN-polomeraza II. Pentru c el se leag de secvena TATA-box a promotorului a fost denumit i TBP (TATABinding Protein). Acest factor odat legat la ADN va atrage i ali factori de transcripie, ct i ARN- polimeraza. Ali factori de transcripie (notai cu I, II, III, specificnd tipul de ARN-polimeraz care se leag) sunt notai cu litere: A (de ex: TFIA), B (TFIIB), D, E, F, G, H. Dac ARN-polimerazele sunt universale, identice pentru toate esuturile i celulele, factorii de transcripie sunt specifici pentru anumite esuturi. Ei joaca un rol important n diferneierea celular i meninerea tipurilor de celule. Pe lng aceti factori de transcripie, implicai direct n sinteza ARN exist i proteine care regleaz desfurarea procesului, n sensul ca l intensific, atenueaz, nu blocheaz. Acestea sunt proteine reglatoare, care ca i factorii de transcripie au capacitatea de a se lega de ADN. Pentru acestea se impun cel puin doua condiii: - proteina trebuie sa conin n structura ei o secvena specific de aminoacizi (de obicei 10100) care reprezint domeniul (sau motif-ul) de interaciune cu ADN. Aceste domenii sunt considerate ca elemente de recunoatere a genelor int i de aceea se numesc i capete de citire (Reading Head); - la nivelul ADN trebuie s existe de asemenea secvene nucleotidice specifice (de obicei 515) care s corespund domeniilor (motif-elor) din proteinele reglatoare respective. Aceste secvene sunt denumite elemente responsive (Responsive elements). n aceasta categorie de proteine intr receptorii hormonali steroidici, care transport hormoni (corticoizi, estradiol, progesteron etc.) n nucleu i interactioneaz cu secvenele specifice ADN (elementele responsive) iniiind, accelernd sau blocnd transcrierea unor gene.

5.3.5. Elemente de control n expresia genetic

Reglarea specific a expresiei genice implic sinteza ARN, care copiaz o singur caten a moleculei de ADN. Catena care se copiaz asigur sinteza moleculei de ARN n direcia 5'-3' (deci va fi ntotdeauna catena ADN cu direcia 3'-5', iar catena nou va avea direcia 5'-3'. O gen conine att informaia pentru structura proteinei, ct i elementele (secvenele) de control care regleaz expresia genei, deci a sintezei ARN. (fig. 106). 133

Gena din punct de vedere funcional i structural conine 2 regiuni: regiunea reglatoare i regiunea de transcripie (sau unitatea transcriptibil) care sunt separate de punctul de iniiere a sintezei ARN (punctul start care se noteaza cu +1, adic primul nucleotid din molecula ARN). Regiunea reglatoare, care nu se transcrie, are ca element principal promotorul: o secven de nucleotide specific fiecarei gene, iar la eucariote (mamifere) de factorii de transcripie. La bacterii promotorul conine doua secvene caracteristice i necesare pentru legarea ARN polimerazei si pozionarea ei cu precizie fa de punctul de iniiere: secventa-10,care reprezint TATA-box (sau PRINBOW BOX); secvena -35 (minus indicnd c aceste secvene se afl la stnga fa de punctul de iniiere, adic upstream (fig. 85).

Fig. 85 - Schema generala a elementelor de control. Promotor cu (TATA box); secvenele activatoare UAS i enhancer-ii La eucariote promotorul conine 2 secvene caracteristice: - secventa -27, care reprezinta TATA-box (sau HAGNESS BOX) - secvena -84. TATA box situat la -27 pb este secvena indispensabil pentru iniierea corect a transcripiei de la punctul start (acelai rol l are secvena -10 la procariote). Promotorul este considerat o secven eseniala pentru reglarea ARN polimerazelor i a factorilor de transcripie. Abilitatea promotorului de a iniia transcrierea unei gene poate fi foarte mult acentuat de prezena unui enhancer. Enhancer-ii sunt elemente reglatorii implicai n activarea ratei de transcripie a unei gene. Ei pot crete transcripia unui promotor pn la 1000 de ori. Ei determin acetilarea histonelor care determin o relaxare a miezului histonelor, promotorul devenind mai accesibil factorilor de transcripie. Enhancer-ii pot fi situai n secvena de ADN n susul (upstram) promotorului su n josul lui (down stream) fa de punctul de iniiere a sintezei ARN(+1) (fig 85). Exist i alte elemente similare, de exemplu la drojdii, aa-numitele secvene activatoare(upstream activator sequences UAS). Aceste secvente UAS care sunt localizate la distane diferite de promotor pot funciona n orice orientare. Enhancerii i aceste elemente UAS pot exista pn la 3000-5000 pb distan de promotor, de unde i pot exercita efectul pozitiv asupra transcripiei.

5.4. Mecanismul transcripiei

n general, ambele catene ale ADN pot servi drept matrice pentru sinteza ARNm. n realitate, numai o singur caten a ADN este transcris, iar ARN sintetizat este echivalent n secvena nucleotidelor cu monocatena de ADN netranscris (catena opus). Promotorul, care, n funcie de poziia lui n secvena ADN, asigur legarea ARN polimerazei i orienteaz citirea (sinteza) ntr-o direcie sau alta. n orice caz, sinteza ARN avnd loc numai in direcia 5 3, promotorul, n funcie de orientarea n structura ADN, va decide care caten de ADN va fi copiat (fig. 86). 134

Figura 86 - Promotorul este orientat bine(in direcia 3-5 a catenei ADN) si sinteza ARN se va face in direcia 53. La procariote legarea ARN polimerazei la promotor este determinat de dou secvene scurte: secvena-35 i secvena-10. Aceste dou secvene mpreun cu punctul de iniiere (+1) determin de fapt promotorul i aezarea topografic, direcia de transcripie (-35-10+1). Modificri importante (mutaii) produse la nivelul acestor secvene (numite secvene consens) au ca efect abolirea activitii de promotor. La bacterii, factorul sigma () are rol de recunoatere a secvenei promotorului i de fixare corect a punctului de iniiere a sintezei. La E. coli, fixarea polimerazei s-a constatat c are loc n dou etape: - ataarea lejer a enzimei complete, la secvena -35, unde se formeaz un complex nchis. - apoi, complexul nchis este transformat ntr-un complex deschis, cnd, aprox. 17 pb, ncepnd de la secvena -10, se desfac, expunnd catena matrice a ADN permind introducerea primelor ribonucleotide (necesare sintezei moleculei de ARN) pentru iniierea sintezei (a transcripiei). Secvena -10 conine n general, baze AT, care permit desfacerea dublei catene a ADN, cu mai mult uurin dect perechile GC (fig. 87). Figura 87 Secvena -10 (TATA box),format din baze de complementare T-A,A-T,se desfac pentru a permite transcripia unei catene de ADN. Dup ce ARN-polimeraza s-a fixat i aprox. 8 nucleotide ARN au fost ataate pe matria ADN, factorul sigma () se desprinde de ARN-polimeraza. Enzima core poate continua n aceste condiii sinteza ARN. n timpul elongaiei, unde intervine un numr de factori de elongaie, sinteza catenei de ARN se desfoar cu o vitez de aprox. 30 nucleotide pe secund. Prin urmare, un polimer ARN de aprox. 5000 nucleotide, la temperatura de 370 C, este realizat n aprox. 3 minute. Factorii de elongaie sunt de fapt proteine a cror structura este cunoscut, ns funcia lor exact nu a fost elucidat. Procesul de elongaie a moleculei de ARN este oprit, n momentul cnd enzima ntlnete o alt secven special n regiunea transcriptibil a ADN ( de obicei 6A ce vor fi reprezentate n ARN prin UUU). Aceast secven a fost denumit terminator. Secvea terminator reprezint semnalul terminrii sintezei i la acest punct ARN-polimeraza se desprinde de catena ADN, iar hibridul format din moleculele ADN-ARN se desface, duplexul ADN se reface, iar molecula ARN transcris este eliberat n mediu. 135

La eucariote, ARN+polimeraza nu recunoate direct promotorul, ci prin intermediul unuia dintre factorii de traanscripie specifici procesului de sintez a ARN. ARN+polimeraza se va lega de factorul rspectiv i nu de secvena de ADN. Factorii care iniiaz transcripia se deosebesc se ceosebesc de factorul sigma pe care l conine ARN-polimeraza bacterian. Factorii de transcripie formeaz complexe de transcripie, relativ stabile, care n mod selectiv atrag moleculele de ARN-polimeraz la promotorul de care ei s-au legat. Secvena desfurrii procesului ar fi urmtoarea: - primul factor de transcripie care recunoate promotorul, n special TATA box, este TFIID (sau TBP); - complexul ADN+TFIID acioneaz ca un situs de legare pentru un alt factor: TGIIB care legndu-se va stabiliza complexul. Acest factor are aciune ATP-azic, elibernd energia necesar desfacerii catenelor de ADN, pentru formarea complexului deschis (open); - la acest complex se asociaz ali factori: TFIIE i TFIIH; - acum, de acest complex se leag ARN-polimeraza II i n urma unui proces ATP-dependent ncepe iniierea transcripiei. Iniierea ncepe cnd s-a format complexul de iniiere, la nivelul promotorului genei int; - la acest complex se asociaz un alt factor: TFIIS, care este factorul de elongaie. Acest factor mpiedic terminarea prematur a sintezei ARN. ARN-polimeraza I i II formeaz complexe cu factori de transcripie care se leag upstream (naintea punctului de iniiere) pe cnd majoritatea factorilor de transcripie pentru ARN+polimeraza II se leag downstream (n mijlocul unitii de transcripie). Viteza de sintez a ARN este de 45 nucleotide/secund. Sinteza (transcripia) trebuie fcut cu acuratee pentru ca la nivelul ARN nu exist sisteme de corectare a erorilor. Dac au aprut erori, ARN avnd un timp de njumtire biologic ( T1/2) relativ scurt, nu pot produce perturbaii de ordin genetic, (transmisibile) ca n cazul erorilor ADN. Procesul pe etape, prezentat n cazul procariotelor, se pare c este asemntor i pentru eucariote, cu excepia c ARN sintetizat este reprezentat de molecule precursor, care necesit a fi procesate. Procesarea, numit ARN splising, este necesar pentru eliminarea secvenelor intronice, care au fost transcrise n ARN precursor, dar care nu vor mai fi regsite n secvena aminoacizilor din proteinele corespunztoare.

5.5. ARN splicing

n procesul de transcripie produii sintetizai sunt reprezentai de fapt de precursorii ARNt, ARNr i ARNm (numit i pre-ARNm). Moleculele de ARN precursor, nainte de a fi exportate n citoplasm, ca s devin funcionale sunt supuse la o serie de modificri: tiere, ordonare i unire (splicing). Acest proces este necesar pentru ca intronii prezeni n moleculele precursor s fie eliminai i numai secvenele exonice s fie unite, pentru a realiza molecula de ARN matur. Procesul trebuie s se realizeze cu mare acuratee. O eroare produs, prin introducerea unui singur nucleotid necorespunztor, poate conduce la un ARNm care nu mai poate translata o protein funcional. Cercetrile experimentale au relevat dou aspecte n splicing-ul ARN, i anume: - self-splicing-ul ARN care a fost pus n eviden la nivelul pre-ARNm mitocondrial; - splicing-ul ARN nuclear ce are lor la nivelul pre-ARNm. Odat cu descoperirea intronilor self-splicing, acetia au putut fi comparai cu structura intronilor din pre-ARNm. Din aceast analiz a reieit c intronii self-splicing pot fi mprii n dou clase: introni de grupa I i introni de grupa II. Cataliza este realizat de un complex ribonucleoproteic, numit splisozom (spliceosome), care conine ribonucleoproteine nucleare mici (U1, U2, U5, U4,U6) plus alte componenete.

136

La intronii din grupa I reacia de splicing ncepe la o nucleotid guanodinic (G), iar intronii din grupa II la o nucleotid adeninic (A). La ambele grupuri s-a constatat c splicingul are lor n urma a dou reacii de transesterificare ( transfer de grupri fosfat ) i anume: - o adenin (A) din secvena intronului, situat aproape de situsul splice 3', realizeaz un atac nucleofil (prin gruparea terminal 2-hidroxi - de la riboz) la nivelul situsul splice 5', unde molecula de pre-ARNm este clivat. Captul 5' al intronului devenit liber se leag covalent de adenina intronului formnd o bucl; - n etapa a doua hidroxilul 3' al primului exon, care s-a format n prima etap, se ataeaz la captul celui de-al doilea exon, unde are loc cel de-al doilea atac nucleofil, rupnd molecula de pre-ARNm. n urma acestui atac intronul este ndeprtat i cei doi exoni care erau separai n molecula precursor, se unesc. n felul acesta toi intronii din molecula de ARN precursor sunt eliminai. Genele celulelor de la mamifere conin mai muli introni dect exoni. Mrimea lor este de aprox. 80 pn la 10.000 nucleotide sau chiar mai mult. Se pare c intronii reprezint un sac de acumulare a mutaiilor i protejeaz n felul acesta ADN-ul de anumite leziuni. Exonii existeni se unesc cap la cap i realizeaz o molecul matur de ARNm. Aceste molecule sunt exportate n citoplasm i pe baza informaiei pe care le conin se face sinteza proteinelor funcionale. ARNm, prin transcripie conine urmtoarele secvene importante: - o secven specific (5-10 nucleotide) care asigur legarea ARNm de subunitatea mic a ribozomului, numit Ribosome Binding Sequence (secven de legare la ribozomi); - urmat de codonul de iniiere a translaiei ( AUG); - secvena de nucleotide (codoni) pentru sinteza polipeptidului (proteinei); - o secven terminator (stop) reprezentat de unul din codonii stop sau terminatori: UAA, UGA sau UAG (acetia nu codific nici un aminoacid). Dup transcripie i splicing (procesare) ARNm sufer dou procese (posttranscripionale) i anume: - captarea ARNm n urma cruia se adaug la prima guanidin (la capul moleculei), o grupare metil ( CH3) n poziia 5'; - se adaug o coad de poli (A)+ la capul 31-OH terminal al moleculei. Coada formeaz un polimer de aprox. 200 , fiind realizat de o enzim numit poli(A) polimeraza. Aceste dou procese nu sunt codificate n secvena ADN, de aceea ele sunt numite procese post-transcripionale.

5.6. Asigurarea necesarului de ARNm

Genele din genomul celulelor haploide se gsesc ntr-o singur copie, deci n cele diloide se gsesc n cel puin dou copii. Pentru asigurarea o cantitate suficient de proteine pentru celul sau organism, celula folosete dou moduri de amplificare a ARNm, i anume: gena respectiv va fi transcris de mai multe ori i va rezulta o cantitate mai mare de ARNm; i/sau - ARNm este folosit de mai multe ori pentru sinteza proteinei respective. n acest caz el va avea un T1/2 mai mare i nu se va degrada dup ce a dat prima copie de protein. Prin acest mecanism se explic cum gena fibroinei (2 copii/genom) produce n 4 zile 105 molecule de ARNm, iar ARNm produce 1010 molecule de fibroin. Aceast cantitate formeaz firele necesare pentru o gogoa la viermele de mtase. Sunt gene care codific un singur tip de protein, ns ele se gsesc n genomul celular n mai multe copii. Acesta este cazul genelor pentru histone: H1, H2A, H2B, H3 i H4.

137

Capitolul 6 TRANSPORTUL INTRACELULAR

n anul 1976, un grup de cercettori de la Yale University (G.E.Palade, Jamieson, Tartecoff, Sheele i Berger), studiind mecanismul sintezei zimogenului de ctre celulele acinoase pancreatice (celule specializate n sinteza i exportul proteinelor), au reuit s demonstreze pentru ntia oar, drumul complet al unei proteine (protein de tip secretor) de la sintez pn la eliminarea sa din celul, astfel au putut fi difereniate fazele: - de sintez proteic la nivelul ribozomilor; - de concentrare, segregare a proteinelor n cisternele reticului endoplasmatic(RE); - de transport intracelular, prin mbarcarea proteinelor n vezicule de transport (vezicule carriers) i dirijarea lor spre complexul Golgi; - de concentrare a proteinelor n vezicule de condensare (la polul apical al celulei, acinul pancreatic); - exportul (eliminarea) proteinelor n lumenul acinului pancreatic. Rezultatele acestor studii au deschis calea cercetrilor n problema transportului intracelular. Treptat s-a dovedit c aproape toate proteinele membranare (cu excepia unei pri din proteinele membranelor mitocondriale i cloroplastice) sunt sintetizate la nivelul ribozomilor. Producia de proteine n celule este concentrat ntr-un compartiment anumit denumit citozom (matrice celular). Din acest compartiment celular de sintez proteic, proteinele sunt dirijate cu precizie i cu maximum de eficien ctre circa 20-25 de destinaii diferite: biomembrane, elemente structurale, coninutul unor compartimente celulare. Dirijarea precis a proteinelor non-sintetizate ctre o anumit destinaie final se datoreaz unei anumite informaii pe care proteina o poart n structura sa. Este vorba despre un semnal specific al proteinei (o anumit structur chimic) pentru recunoaterea respectivei proteine de ctre un anumit receptor de membran (situs membranar).

6.1. Sistemul vacuolar intracitoplasmatic

Folosirea microscopului electronic a artat prezena intracitoplasmatic a unui sistem complex de membrane, care limiteaz tubuli, trabecule, vezicule, saci turtii sau cisterne .Componenta membranar intracitoplasmatic are o structur trilaminar, cu o grosime variabil ntre 50 70 , caracteristic. Diversitatea, complexitatea i plasticitatea sistemului de citomembrane constituie un suport structural important n explicarea heterogenitii funcionale care caracterizeaz biologia celulei. Componentele reticulului endoplasmatic pstreaz strnse interrelaii topografice i funcionale ntre ele, ca i cu toate organitele celulare . Astfel, exist o relaie direct cu zonele aparatului Golgi, elemente ale reticulului constituind membranele saculilor golgieni. Tot elemente ale reticulului endoplasmatic sunt implicate n geneza lizozomilor. Prin legturile contractate cu membrana celular plasmatic, ct i prin comunicarea direct cu membrana nuclear, componentele reticulului endoplasmatic servesc transportului de materiale n celul; sunt de asemenea, n contact cu mitocondriile, n jurul crora formeaz tubuli orientai regulat. Aceste observaii au acreditat ideea c, pe de o parte, ntre citomembranele sistemului vacuolar i celelalte membrane celulare (plasmatic, nuclear) exist relaii de continuitate, iar pe de alt parte diferitele tipuri de reticul endoplasmatic se pot transforma unul n altul. Astfel, s-au constatat contacte ntre reticulul endoplasmatic i membrana celular, ceea ce sugereaz o continuitate ntre aceste categorii de membrane. 138

n acelai timp, relaiile de continuitate ntre membrana nuclear extern i membranele rugoase, ct i asemnrile ultrastructurale dintre acestea, au permis a se considera c spaiul perinuclear este o extindere a sistemului vacuolar citoplasmatic. Consecinele acestor continuiti sunt importante funcional. n mod evident, spaiul perinuclear este n comunicare cu toate regiunile celulei, pe calea cisternelor citomembranelor reticulare. Sunt cazuri cnd membrana nuclear trimite prelungiri ndreptate ctre aparatul Golgi Corelaia de acest tip a permis aprecierea c membrana nuclear poate contribuie la formarea membranelor golgiene. Microscopul electronic a semnalat i formarea membranelor golgiene netede pe seama membranei nucleare. n afara acestor corelaii ale membranelor golgiene cu membranele nucleare i citoplasmatice, frecvent au fost observate continuiti structurale i funcionale ale acestora cu reticulul endoplasmatic cu ribozomi. n apropierea zonelor Golgi, reticulul endoplasmatic capt aspect vezicular, pierde ribozomii i se transform n membrane agranulare netede. Astfel, s-a acreditat ideea unei modificri succesive, ergastoplasma i reticulul endoplasmatic nuclear fiind aspecte ale aceluiai sistem structural endocelular, care corespund la stri funcionale distincte, iar veziculele mici reprezint structuri de transport care asigur legturi funcionale dintre reticulul endoplasmatic i aparatul Golgi. Dup structura sa, sistemul vacuolar citoplasmatic se mparte n reticul endoplasmatic granular (ergastoplasm), reticul endoplasmatic neted (agranular), acesta n raport cu prezena sau absena la suprafaa membranelor a poliribozomilor, aparatul Golgi, ca o difereniere a sistemului vacuolar citoplasmatic i structurile lizozomale.

6.2. Rolul citomembranelor granulare n sinteza proteic

O dezvoltare abundent a citomembranelor granulare se observ n celule angajate activ n sinteza de proteine de export (secretorii), cum sunt celulele glandelor salivare, pancreas exocrin. O dezvoltare abundent a sa se observ n celulele organului Corti, epiteliul tiroidian, nefrocite. Studiile lui George Palade, aduc precizri asupra modalitii in care reticulul endoplasmatic particip la sinteza proteinelor intracelulare, artnd c la nivelul reticulului endoplasmatic granular sunt sintetizate proteinele de export. Rezultatul acestor studii este sintetizat n teoria lui Palade asupra mecanismului sintezei proteinelor secretate, dup care, spre deosebire de sinteza proteinelor structurale, al crui sediu este reprezentat de ceilali ribozomi i se realizeaz ntr-un timp lung, sediul sintezei proteinelor secretate este reticulul endoplasmatic granular la nivelul ribozomilor ataai de membrane, ntr-un timp scurt (pn la un minut). Dup sintez, proteinele secretate sunt transferate n cisterne, prin sistemul de citomembrane, unde se matureaz n timp, de circa 90 minute. Dup transferul n spaiul intracisternal, proteinele sunt transferate n zona golgian.

6. 3. Biosinteza proteinelor sau translaia ARNm

Prin microscopie electronic (Porter i colab, 1945) i prin metode biochimice s-a demonstrat existena ribozomilor legai de membrana reticului endoplasmatic i rolul major al reticulului endoplasmatic n biosinteza proteic. n celula vie, ribozomii sunt situsul sintezei proteinelor. n decursul acestui proces ARNm, cu ajutorul codului su triplet nucleotidic, poart mesajul ADN i se fixeaz de ribozomi. Complexele aminoacizilor-t-ARNm (aminoacil-t-ARN) recunosc acest cod triplet i aminoacizii se adaug pe rnd, lanului polipeptidic n cretere. Codul este tradus de ARN-m, care se deplaseaz traversnd ribozomul. n mod simultan, moleculele de ARN-t se elibereaz i complexele noi de aminoacil-t-ARN se fixeaz pe ribozomi. O serie de factori de natur proteic ce au situsuri de fixare pe ribozomi, favorizeaz acestora citire a mesajelor venite de la ADN, iar la sfritul ei polipeptidul se elibereaz de ARN-t. 139

6.3.1. Decodificarea informaiilor genetice

n cadrul sintezei proteice se realizeaz ultima etap a transferului informaiei genetice coninut n secvena de baze azotate din ADN. Ea este transcris sub form de mesaj genetic n ARNm i acesta este tradus, respectiv decodificat, la nivelul ribozomului, dintr-o secven de codoni, ntr-o secven de aminoacizi. Astfel informaia genetic din stare potenial aflat n structura ADN, devine o realitate ntr-o secven de aminoacizi de la nivelul catenelor polipeptidice. Al treilea nivel de transfer informaional (translaia) condiioneaz convertirea informaiei din alfabetul cu 4 litere al ARNm (A-U; C-G) n alfabetul de 20 litere, reprezint cei 20 aminoacizi eseniali ai proteinelor. Dicionarul folosit de celul, n aceast traducere este reprezentat de colecia sa format din cele 54 tipuri de ARNt.(fig. 88).

Fig. 88 - Al treilea nivel informaional (translaia) Toate procesele metabolice ale celulei se bazeaz pe existena i funcionarea proteinelor care pot avea fie rol structural (colagenul), fie rol metabolic transportor (hemoglobina), fie rol n aprarea organismului (imunoglobulinele), fie rol enzimatic. Pn n prezent au fost identificate, la diferite sisteme biologice analizate, peste 100 000 de proteine diferite. Rolul proteinelor n desfurarea proceselor vieii este esenial. nsi structura, dar mai ales desfurarea celor dou funcii eseniale ale materialului genetic autocatalitic (replicare) i heterocatalitic (dirijarea de sinteze specifice de proteine sau de alte biomolecule: ARNm, ARNt, ARNr) sunt dependente de proteine precum histonele, 140

proteinele enzime, n cadrul crora intr i cele care au rol hotrtor n replicarea ADN (polimeraze, topoizomeraze, ADN-ligaze, etc), n transcrierea (ARN polimeraze), n translaie (factori de iniiere i terminare), n recombinare (recombinaze), n repararea leziunilor induse de ADN (excionaze, polimeraze, ADN- ligaze). Este evident c fr participarea proteinelor, materialul genetic nu ar putea s ndeplineasc nici una din funciile sale. n cadrul biosintezei proteinelor particip deopotriv acizii nucleici i proteinele. Pentru sinteza unei singure catene polipeptidice sunt mobilizate sute de alte molecule proteice cu rol structural i enzimatic. Aceast intervenie a unui numr mare de proteine n diferite etape ale procesului decodific rii este cerut de o traducere exact a mesajului genetic. Proteinele sunt polimeri de aminoacizi. Polimerizarea aminoacizi, realizat la nivelul ribozomilor, implic formarea de legturi sau puni peptidice ntre gruparea carboxil (COOH) a unui aminoacid i gruparea amino (- NH2) a altui aminoacid cu eliminarea unei molecule de H2O. Formarea de puni peptidice succesive determin polimerizarea aminoacizi liberi, adic includerea lor ntr-o caten polipeptidic care reprezint structura primar a proteinei . Unele proteine sunt alctuite dintr-o singur caten polipeptidic, altele din mai multe catene polipeptidice identice sau diferite, n ultimul caz, informaia genetic pentru fiecare dintre aceste catene polipeptidice diferite, fiind deinut de gene diferite, participante n alctuirea aceleai proteine ( o gen o caten polipeptidic). La terminarea catenei polipeptidice, aceasta se prezint sub forma structurii sale primare, reprezentnd secvene de aminoacizi care a fost determinat de mesajul genetic, adic de secvena codonilor din ADN m . Caten polipeptidic este apoi supus prelucrrii post translaionale n cadrul creia ea adopt o structur secundar prin interaciunea aminoacizilor si, n anumite condiii fiziologice, de t sau pH, prin intermediul unor puni de H sau al unor puni bisulfidice (- S S -). Prin acestea, catena polipeptidic capt configuraii spaiale bidimensionale sau tridimensionale . n urma formrii punilor de H, intercatenare dintre gruprile ceto (C = O) i imino (N = H) ale legturilor peptidice, rezultnd o configuraie regulat a polipeptidului, cunoscut sub denumirea de configuraia - helix al crui model a fost propus de Linus Pauling pentru care a primit premiul Nobel. Prin rsucirea catenelor polipeptidice asupra lor nsele datorit aciunii unor fore de atracie dintre diferite aminoacizi ai catenei polipeptidice rezult structura teriar a proteinei . Ea are la baz legturi de H, electrostatice, hidrofile sau covalente. Cnd proteina este alctuit din mai multe catene polipeptidice identice sau diferite, asocierea lor pentru a alctui molecula proteic funcional se realizeaz, de asemenea, prin intermediul unor asemenea legturi i acest caz proteina se prezint sub form de structur cuaternar. Hemoglobina uman normal (HbA) este alctuit din 2 catene i 2; molecula de insulina este format din dou catene polipeptidice; o caten A, format din 21 aminoacizi i o caten B format din 30 aminoacizi; iar molecula de imunoglobulin anticorp are dou catene grele (H) i dou uoare (L) unite ntre ele prin puni bisulfidice (- S - S - ) ca i catenele de insulin. Se nelege de la sine c pentru ndeplinirea funciei sale normale, proteina trebuie s fie normal la toate nivelele sale structurale : primar, secundar, teriar i cuaternar, structura primar fiind determinat pentru toate celelalte nivele structurale. Structura i funcia proteinelor reprezint expresia primar a informaiei genetice. n decodificarea informa iei genetice rolul primordial l joac acizii ribonucleici celulari: ARNm, ARNt i ARNr . Rolul ARN n decodificarea informaiei genetice a fost evideniat dup anul 1950 de ctre BRACHE T i CASPERSSON, sinteza proteic fiind nsoit de o cretere considerabil a cantitii de ARN n celul. 141

Toate tipurile de ARN celular sunt sintetizate pe matria de ADN, n cadrul cruia exist pe lng genele structurale ce determin informaia genetic pentru sinteza diferitelor proteine, informaie ce este transcris n ARN m care devine astfel purttor de mesaje genetic, i gene pentru diferite tipuri de ARNt i ARNr. Dintre toate cele trei tipuri fundamentale de ARN celular, doar ARNm este tradus n protein, ARNt i ARNr ndeplinind ns roluri eseniale n asigurarea traducerii mesajului genetic din ARNm. Dependena sintezei proteice de informaia genetic din nucleu i de sinteza diferitelor categorii de ARN celular pe matria de ADN nuclear a fost determinat de Brodnet (1955), Mazia i Prescott (1963) la alga verde unicelular Acetabularia mediterranea". Ribozomii asigur interaciunea ARNm -ARNt n cadrul creia codonii din ARN m sunt recunoscui secvenial de anticodonii din ARNt - urile corespunztoare, asigurndu-se astfel citirea mesajului genetic . Integritatea structural - funcional a ribozomilor condiioneaz o citire corect a mesajului genetic i o traducere fidela a sa ntr-o secven de aminoacizi. De exemplu, la bacteria E. coli, antibioticul streptomicin interacioneaz cu 2 situsuri ale proteinei ribozomale Gu asociat cu ARNr 16G din subunitatea ribozomal mic (30 S) ceea ce face ca ribozomul s nu mai fie funcional, iar biosinteza proteic s fie stopat. Acest lucru nu se ntmpl ns i la mutan ii rezisten i la streptomicin , ace tia prezentnd n catena polipeptidic a proteinei ribozomale Gi2 dou substituii de aminoacizi n poziiile 42 i 87. Rezult c aceast protein ribozomal este esenial n mperecherea codon anticodon de la nivelul ribozomului. Folosindu-se ageni care blocheaz sinteza ARN m (actinomicina D) s-a demonstrat c sinteza proteic , n aceste condiii dureaz atta timp ct s fie sintetizat circa 1 0 2 0 molecule proteice. Aceasta nseamn c dup folosirea ca mesager pentru sinteza a 10 - 20 catene polipeptidice o molecul de ARN m este hidrolizat, fiind necesar sinteza (sau adugarea n cazul sistemului acelular de sintez (in vitro) a unei noi molecule de ARN m, pentru ca sinteza proteic s poat continua . De astfel, n celul, n condiii normale, are loc o amplificare genetic" indirect realizat nu prin mrirea numrului de copii ale genei ci prin transcrierea repetatat a informaiei genetice coninut de o gen cu sinteza unui numr mare de molecule ale unui ARNm. Astfel, se poate realiza sinteza unui numr mare de catene polipeptidice. Viteza de transcriere a unei gene este variabil . De exemplu gena triptofansintetazei (enzim ce intervine n sinteza triptofanului) este de 28 nucleotide pe secund, iar traducerea ARN m corespunztor se face cu viteza de 21nucleotide/ secund, la 370 C. Sinteza hemoglobinei umane se realizeaz cu o vitez de 4 aminoacizi/ secund la aceeai temperatur. Dac celula vegetal poate s-i sintetizeze toi aminoacizi de care are nevoie, celula animal nu poate sintetiza dect o parte dintre ei. Astfel, din cei aproximativ 100 de aminoacizi identificai numai 20 intr, n mod obinuit, n structura celor circa 100.000 de proteine naturale identificate pn n prezent, proteine care au specificitate de specie, organ, esut, celul i chiar organit celular. Pentru celula animal, urmtorii 10 aminoacizi sunt eseniali sau indispensabili, adic trebuie s-i primeasc prin surse alogene (prin hran, de exemplu), deoarece nu este capabil s-i sintetizeze singur: lizina, triptofonul, arginina, metionina, leucina, izoleucina, valina, fenilalanina, arginina i histidina.

142

Aminoacizii: glicina, alanina, serina, cisteina, acidul aspartic, asparagina, acidul glutamic, glutamina, tirazina i prolina sunt neeseniale, pentru c celula animal i poate produce pe diferite ci metabolice, pornind de la aminoacizii eseniali. Ca orice reacie de polimerizare i biosinteza proteinelor se desfoar n trei etape ce se succed nentrerupt: iniierea, alungirea (sau elongaia) i terminarea catenei polipeptidice.

6.3.2.Iniierea catenei polipeptidice

Sinteza unei catene polipeptidice ncepe cu un aminoacid -N - terminal i se termin cu un aminoacid - C - terminal. Ordinea includerii aminoacizilor n catena polipeptidic este stabilit de ordinea codonilor din ARNm. Prima etap n biosinteza proteic este activarea aminoacizilor cu ajutorul ATP, reacia fiind catalizat de enzima aminoacilsintetaza (numit i aminoacid ARN t - ligaza) i care este specific fiecrui aminoacid. Aminoacilsintetazele sunt enzime cheie n recunoaterea" cifrului codului genetic. Aminoacizii nu se pot lega direct la ARN m . Este necesar o molecul adaptatoare reprezentat de ARN t. Mai are loc ataarea aminoacidului activat de ARNt corespunztor lui (n etapa a doua), ataare realizat la gruparea CCA de la captul 31 al ARNt i care este catalizat de aceeai enzim aminoacilsintetaz, folosind energia rezultat din hidroliza ATP: ATP + H2O ATP + H2O ADP + H2O ADN + P AMP + PP AMP +P cu eliberarea a 7 Kcal./mol cu eliberarea a 8 Kcal./mol cu eliberarea a 6 Kcal./mol

Pentru formarea legturii peptidice se folosesc 0,5 Kcal./mol, restul de energie liber fiind necesar meninerii echilibrului reaciei spre a se realiza sinteza proteic i nu a avea loc hidroliza proteinelor. ntre restul de adenozin (A) de la captul 31 al ARN t i aminoacidul activat se formeaz o legtur covalent macroergic a crei energie va fi folosit n reacia de polimerizare a aminoacizilor:+ AA1+ATP aminoacilsintetaz AA1 ~ AMP + P + P AA1 ~ AMP + ARNt aminoacilsintetaza AA1 ~ ARNt + AMP Ataarea eronat a unui aminoacid la ARN t, altul dect cel care este specific acelui ARN t va fi eliminat prin intervenia aceleiai enzime aminoacil - sintetaza, care prezint o activitate de corecie, recunoscnd aceast eroare" i hidroliznd legtura dintre aminoacidul greit ataat i ARNt. Este un lucru bine stabilit c dei exist mai multe tipuri de ARN t pentru un acelai aminoacid (fapt determinat de caracterul degenerat al codonului genetic), exist doar o singur enzim aminoacil - ARNt sintetaz pentru fiecare aminoacid. Aminoacilarea ARNt catalizat de aceste enzime este un proces riguros controlat deoarece o nc rcare gre it a unui ARNt cu un aminoacid necorespunz tor are aceeai consecin ca i o mutaie - determinnd includerea eronat a unui aminoacid n catena polipeptidic. Aminoacil - sintetazele i ARNt joac deci rol esenial n decodificarea informaiei genetice.

143

Etapa a treia n iniierea unei catene polipeptidice se desfoar la nivelul ribozomului care prezint suprafee specifice de legare stereochimic a ARNm, ARNt i a catenei polipeptidice n cretere. Ribozomul asigur de aa manier asocierea acestor trei elemente, nct s fac posibil recunoaterea codonului din ARNm de ctre anticodonul corespunztor din ARNt, pe principiul complementaritii, cu constituirea unei asocieri tranzitorii prin intermediul punilor de H, asociere care dureaz pn ce aminoacidul legat de ARN t este deconectat de la acesta i nserat la catena polipeptidic unde rmne ataat de aminoacidul precedent, printr-o legtur chimic covalent legtura peptidic (fig. 89). Fig. 89 Schema transmiterii informaiei: codon (ARN m) anticodon (ARN t) aminoacid Proteina ribozomal S1 cu proprieti contractile joac un rol important n realizarea opoziiei mesagerului (ARNm) i adaptorului (ARNt) ea asigurnd deplierea ARNm atunci cnd acesta, interacioneaz cu ribozomii i legarea acestuia la subunitatea ribozomal mic 30 S. Iniierea catenei polipeptidice este asigurat de intervenia unor factori de iniiere de natur proteic, denumii IF1, IF2 i IF3. Cu ajutorul unei secvene denumit secven leader aflat la captul S1 al ARNm, acesta se leag la subunitatea ribozomal mic 30 S, secvena leader nefiind tradus. La acest complex ARNm - subunitatea ribozom de 30 S se ataeaz subunitii ribozomale de 50 S, constituindu-se particule ribozomale ntregi (70 S la bacteria E. coli) funcionale n asigurarea sintezei catenei polipeptidice .Complexul aminoacil ARNt se asociaz cu subunitatea ribozom 50 S care prezint trei situsuri : situsul aminoacil (A), situsul peptidil (P) i situsul de ieire - exit - (E). n situsul A ptrunde aminoacil ARN t corespunztor codonului din ARNm recunoscut de anticodonul din ARNt. De regul situsul P accept complexul aminoacil ARNt numai dac acesta a realizat recunoaterea codon - anticodon, adic numai dac a trecut prin situsul A i apoi a fost translocat n situsul P. Acceptarea se bazeaz pe unele posibile modificri conformaionale pe care le-a suferit complexul aminoacil ARN t cnd a fost n situsul A. La nivelul ribozomului, sinteza tuturor catenelor polipeptidice ncepe cu metionina, al crui codon din ARNm este codonul de iniiere AUG sau, mai rar GUG. Dar, n interiorul catenei polipeptidice metionina este specificat de acelai codon AUG . Ca urmare, pentru ca ribozomul s recunoasc n mod specific codonul de ini iere AUG este necesar un semnalul suplimentar de discriminare ntre AUG iniiator i AUG din interiorul mesajului genetic. 144

Acest semnal discriminator este reprezentat de aa numita secven Shine - Dalgarno, descoperit de Shine i Dalgrano n anul 1975. Aceasta reprezint o secven de 7 - 15 ribonucleotide bogate n purine i aflat n amonte de codonul de iniiere AUG, fiind complementare cu 3 - 7 baze dintr-o secven de polinucleotide de la captul 3' al moleculei de ARNr de 16 S din cadrul subunitii ribozomale mici (30S) . Aceast interaciune dintre captul 3' al moleculei de ARNr 16 S i secvena Shine - Dalgarno din ARN m selecioneaz codonul AUG iniiator i-1 aduce la nivelul situsului P al ribozomului, fr al mai trece la nivelul situsului A, aceasta fiind unica excepie, toi ceilali codoni trebuind s treac mai nti la nivelul situsului P. n plus, o secven n bucl (hairpird) adiacent secvenei Sherie - Dalgarno are valoarea unui semnal suplimentar de iniiere. O alt particularitate a procesului de iniiere este folosirea unui ARN t specific de iniiere ce difer de omologul su ce interacioneaz cu codoni AUG interni pentru metionin . Acest ARN t iniiator a fost denumit f - metionin ARN tMET la procariote i i - metionin - ARN t MET la eucariote . Dup ncrcarea ARN tMET iniiator cu metionin el devine metionil ARN t MET i este supus unei formulri prin ataarea grupului formil sub aciunea enzimei formilaz la gruparea NH2 a metioninei aceasta devenind formilmetionin (f - ARN t MET). Formilaza este ntlnit la procariote i ca urmare doar la aceste organisme primul aminoacid al oricrei catene poliptidice este formilmetionin ARNt iniiator ncrcat cu formilmetianin este singurul ARN t care se leag direct la situsul P al ribozomului cu ajutorul factorului de iniiere IF2. Acest f- Met - ARN t se leag la ARNr 23 S cu o mai mare afinitate dect la orice alt ARNr, ceea ce face s aib loc selecia f -Met - ARNt n situsul P. Formilarea metioninei determin blocarea gruprii amino, ceea ce face ca ea s nu mai poat participa n vreo reacie de polimerizare. Ca urmare formil - metionina ocup poziia unu a catenei polipeptidice dar ofer restul reactant COOH care unindu-se cu gruparea NH2 a urmtorului aminoacid, prin eliminarea unei molecule de ap, va forma puntea legtur peptidic. Dup terminarea sintezei catenei polipeptidice grupa formil de la metianin este ndep rtat prin interven ia unei enzime de deformilare, iar uneori este ndeprtat nsi metionina (fig.90).

Fig. 90 - Sinteza proteic: ciclul de elongare al lanului peptidic.Formarea legturilor aminoacil ARNt, formarea legturilor peptidice,translocaia (adaptat dup Stryger, 1991). 145

6.3.3.Alungirea sau elongarea catenei polipeptidice

O dat format prima legtur peptidic, ARNt iniiator, rmas fr aminoacid, prsete situsul P. Eliberat, acesta va putea primi cel de-al doilea aminoacil - ARNt care a trecut n prealabil prin situsul A spre a se realiza recunoaterea codon - anticodon. Se formeaz cea de-a doua punte peptidic i translocarea succesiv din A n P permite citirea secvenial, codon dup codon, a ntregului mesaj genetic coninut n ARNm, de ctre anticodonii complexelor aminoacil - ARNt ce ptrund, de asemenea, secvenial prin situsul A al ribozomului, selecia complexului aminoacil ARNt din amestecul de aminoacil ARNt - uri fcndu-se n virtutea complementaritii codon - anticodon. Translocarea succesiv din A n P, nsoit de fiecare dat de formarea unei noi legturi peptidice, condiioneaz desfurarea celei de-a doua etape n biosinteza catenei polipeptidice i anume elongarea sau alungirea catenei . n alungirea catenei polipeptidice intervin aa numiii factori de elongaie (alungire) care au fost denumii EF -Ts i EF-G, care nu sunt altceva dect proteine ribozomale care se ataeaz particulei ribozomale n faza de funcionare a acesteia n sinteza proteic . Aceti factori de elongaie se fixeaz n subunitatea ribozomal mare (50 S) ntre proteinele h17 i h12. EF - T4 i EF - Ts asigur fixarea aminoacil ARNt pe ribozom iar EF - G determin deplasarea acestui complex la nivelul ribozomului. Funcionarea unor asemenea factori de elongaie este dependent de energia eliberat prin hidroliza GTP. Dup ce ribozomul a asigurat traducerea a circa 25 de codoni, captul 5'al ARNm devine liber spre a forma cel de-al doilea complex de iniiere i astfel, al doilea ribozom se angajeaz n traducerea mesajului genetic spre a asigura sinteza unei a doua catene polipeptidice, apoi un al treilea, al patrulea si aa mai departe, astfel c, la un moment dat, aceeai molecul de ARNm este asociat cu mai muli ribozomi, rezultnd un polisom sau poliribozom.

6.3.4.Terminarea sintezei catenei polipeptidice

Cnd, n deplasarea sa pe macromolecula de ARNm, ribozomul ajunge cu situsul su A n dreptul unui codon nonsens ( codon de stop sau codon terminal ) n acest situs nu mai ptrunde nici un complex aminoacil - ARNt -, deoarece nu exist anticodoni care s recunoasc codonii nonsens . Ca urmare, are loc ncetarea sintezei catenei polipeptidice. Codonii UAA, UAG i UGA sunt codoni nonsens sau terminatori care sunt recunoscui de factori de eliberare sau de terminare denumii TF - Ri, TF - R2 i TF - R3. Din interaciunea codonilor nonsens cu factorul de terminare - ribozom, rezult un complex de terminare care nu mai permite alungirea n continuare a catenei polipeptidice TF - R3 din cadrul acestui complex, acionnd enzimatic la nivelul situsului P, separ grupul carboxil al aminoacidului C terminal de legtura sa cu ARN t printr-o hidroliza. TF - R3 va rupe legtura esterificat a catenei polipeptidice cu ARNt final, aflat n situsul A i astfel pot fi eliberai din ribozom att catena polipeptidic, ct i ARN t, avnd loc totodat disocierea" ribozomului n cele dou subuniti ale sale, proces care este mediat de IF3. Proteinele ribozomale h1 i h2 sunt implicate n terminarea sintezei catenei polipeptidice pe o cale neelucidat (fig.91, 92).

146

Fig. 91 Schema sintezei proteinelor la procariote 147

Fig. 92 Schema sintezei proteinelor la eucariote 148

6.3.5.Particularitile decodificrii la procariote i eurocariote

La procariote, transcrierea mesajului genetic i traducerea sa pot avea loc simultan, deoarece nainte ca s fie terminat sinteza ARNm pe matria de ADN captul su 5' poate s se asocieze cu ribozomii spre a forma complexul de iniiere n traducerea sa ntr-o caten polipeptidic. ARNm la procariote este policistronic, deoarece aceeai molecul de ARNm poate transcrie mai multe gene structurale ale aceluiai operon, purtnd mesajul genetic pentru mai multe catene polipeptidice, reprezentnd enzime diferite care intervin ntr-o aceea i cale metabolic . De exemplu, n sinteza histidinei intervin 10 enzime-10 gene. La eucariote, transcrierea are loc n nucleu, iar traducerea n citoplasm unde se afl ribozomii. Trecerea mesagerului ARNm din nucleu n citoplasm , se realizeaz la nivelul porilor anvelopei nucleare. ARNm la eucariote este monocistronic , fiecare molecul de ARN purtnd mesajul genetic pentru sinteza unei singure catene polipeptidice.

6.4. Mecanismul sintetizate

compartimentrii

celulare

proteinelor

nou-

Ribozomii, substratul molecular complex pe care se traduce mesajul ARNm n molecule proteice, n celula eucariot apar ca dou popula ii spa ial separate: ribozomii ata a i de membrana RE i ribozomii neataa i de membran , care sunt liberi n citosol (dar i ei apar legai de fibre ce apar in citoscheletului). Ambele tipuri de ribozomi sunt din punct de vedere structural i funcional echivalente. Ei difer numai prin tipul de proteine pe care le sintetizeaz (tabelul 2). Diferenierea este nscris n mesajul moleculei de ARNm, ntr-o secven de nucleotide special pe care o posed ( secven a semnal sau secven a leader sau signal peptide ). Dup ini ierea translaiei proteina cu aceast secven va orienta ribozomul spre RE, care se va ata a de membrana organitului. Pe ace ti ribozomii sunt sintetizate numai acele proteine care vor fi introduse n RE, modificate i care apoi, n cea mai mare parte vor fi secretate (exportate) sau transportate la diferite organite i la membrana plasmatic . Moleculele de ARNm care nu posed aceast secven n structura lor se leag de ribozomii care vor r mne n citosol (ribozomii liberi). Pe ei sunt sintetizate toate celelalte proteine, care nu necesit o prelucrare special (glicolizare, acetilare, etc.) prelucrare care are loc numai n RE i aparatul Golgi. Tabelul 2. Proteinele sintetizate de diferite clase de ribozomi
Localizarea ribozomilor Clasa de proteine sintetizate - proteine secretate - glicoproteinele pentru membranele :plasmatice, nucleare, RE, aparatul Golgi - enzime lizozomale - enzime ale REG - enzime ale aparatului Golgi - proteine ataate pe suprafaa extern a membranei celulare (fibronectina, laminina, colagenul). proteine citoplasmatice solubile proteine ataate pe suprafaa extern a membranei celulare (actina, spectrina,) proteine mitocondriale codificate de ADN-ul nuclear proteine peroxizomale - proteine nucleare (histone, lamine)

Ribozomii citoplasmatici legai de membranele RE

Ribozomii citoplasmatici nelegai de membranele RE(ribozomii liberi )

149

Compartimentarea intercelular a noilor proteine sintetizate n hialoplasm are loc n faze separate n timp i spaiu. ntr-o prim faz considerat a fi compartimentarea primar, proteinele nou sintetizate se mpart n proteine care rmn n hialoplasm, proteine care migreaz n nucleu i proteine care sunt transferate prin membranele intracelulare sau se ncorporeaz n membrane. n faza de compartimentare secundar, dintre proteinele ce se transfer prin membrane unele ies din reticulul endoplamatic i trec n lizozomii primari, n peroxizomi, n mitocondrii i cloroplaste i altele sunt ncorporate de membrana celular. Ca exemplu, vom analiza ptrunderea proteinelor de secreie n cisternele RE. Cum se cunoate din experienele lui G.Palade, proteinele de secreie sunt sintetizate de ribozomii ataai de membrana RE i apoi transferate prin membrana acestuia n interiorul lui. Din cisternele RE, se desprind vezicule pline cu proteinele de secreie care sunt transportate la aparatul Golgi, unde sufer transformri i se includ n granulele de secreie al cror coninut va fi exocitat. ARNm al unor asemenea proteine de exportconine n afar de codonul iniiator al translaiei, un codon semnal care, tradus ntr-un peptid semnal (signal recognition particule SRP) compus din 15-25 aminoacizi, face posibil jonciunea ribozomilor funcionali cu membrana RE. Acest legtur se realizeaz datorit unor proteine receptoare (SRP-receptor), care fac parte din structura membranei RE. Asemenea proteine membranare joac rol de adevrai receptori ribozomali. Cnd peptidul semnal vine n contact cu receptorii membranari, acetia se mic n planul tangenial al membranei i se agreg ntr-un canal sau tunel membranar. Asocierea receptorilor membranari stabilete situsuri de fixare pentru subunitatea mare a ribozomului, care permite tunelului su, cu peptidul n formare, s vin n prelungire cu tunelul membranar neoformat. Astfel peptidul semnal este separat de stratul bimolecular de fosfolipide i prin tunelul membranar, va intra n interiorul cisternei RE, dup care va continua s intre restul lanului polipeptidic. Dar, n momentul n care peptidul semnal ajunge n lumenul reticulului, o peptidaz semnal membranar le secioneaz de lanul peptidic n formare. Sinteza se continu i polipeptidul propriu-zis trece n ntregime prin tunelul membranar, n cisterna membranar, pn la terminarea lanului. Atunci peptidul va fi liber n ntregime n spaiul intercisternal. Apoi, prin difuzia n planul membranei reticului a receptorilor semnalului, se dezorganizeaz tunelul membranar de care era legat ribozomul care, se desprinde i se desface n cele dou subuniti (fig. 93).

Fig. 93- Schema general a transportului proteinei nou sintetizate n lumenul reticulului endoplasmatic (RE): 150

1) Proteina fiind n curs de sintetizare, o particul semnal de recunoatere (SRP) se leag de secvena semnal a proteinei (signal peptide) i de ribozom; 2) Complexul format se leag de receptorul SRP din membrana RE; 3) Proteina, prin secvena semnal este inserat n membran i translocat n lumen; 4) Complexul ribozom SRP se disociaz i ribozomul continu translaia, iar SRP este deplasat i reciclat. n concepia lui G Blobel, formarea tunelui transmembranar din proteinele receptoare, scoaterea peptidului - semnal de ctre peptidaz i segregarea final a lanului complet polipeptidic n spaiul intracisternal al RE sunt considerate ca un program cotranslaional. Detaarea ribozomului i dispersarea proteinelor receptoare ale tunelului n membran reprezint fenomene post-translaionale. n unele cazuri, lanul polipeptidic n formare are o secven stop (foarte hidrofob) care, trecnd prin membran dezorganizeaz tunelul i oprete transferul lanului. Aa se ntmpl cu proteina G a virusului Stomatitis vezicular, care rmne cu captul carboxil n afar i cu cel amino nuntru. Este interesant cazul proteinelor lizozomale ale fibroblatilor, care sunt acumulate n RE mpreun cu proteinele peroxizomale i cele secretoare. Aceste proteine sunt eliminate din celule, ns cele lizozomale, care conin n plus i carbohidrai, fiind recunoscute de receptorii membranari (aprox. jumtate din numrul lor) sunt reintroduse n celul prin pinocitoz. Pe de alt parte, se consider c proteinele lizozomale sunt sortate de celelalte proteine n cadrul regiunilor RE pregolgian i anume, n zona proxim a complexului Golgi. Spre deosebire de proteinele de secreie, proteinele lizozomale i cele peroxizomale au secvene de sortare n plus, prin care, ele ptrund n anumite membrane ce conin receptori pentru anumite secvene i astfel iau natere vacuolele cu enzimele lizozomale i peroxizomale. Citocrom C- oxidaza mitocondrial este constituit din 7 subuniti proteice, dintre care 4 se sintetizeaz n citoplasm i 3 n mitocondrii. n citoplasm, se sintetitizeaz o protein precursoare peroximal mai mare dect suma celor patru subuniti, diferena reprezentnd tocmai suma unor secvene semnal cu care recunosc receptorii suprafeei mitocondriale, ceea ce le permit ncorporarea lor n membrana intern mitocondrial. Dup ptrunderea celor 4 subuniti, acetia pierd oligopeptidele semnal.

6.5. Corelaia particularitilor structurale i funcionale ale reticulului endoplasmatic neted cu heterogenitatea funcional a celulelor
Reticulul endoplasmatic neted prezint o dispoziie a elementelor structurale, caracteristic pentru fiecare tip de celul, particularitatea structural fiind legat de heterogenitatea funcional a celulelor respective. Astfel, celulele care sintetizeaz steroli prezint un reticul endoplasmatic neted format din numeroi tubuli ramificai i bifurcai, dispui ntr-o reea complex n toat citoplasma. n celulele luteinice ale corpului progestativ din ovar, reticulul prezint numeroase vezicule fenestrate, turtite, n strns vecintate cu mitocondriile. O form specializat de organizare a reticulului endoplasmatic nuclear se ntlnete la fibrele musculare striate, unde n jurul fiecrei miofibrile, se gsete un sistem de tubuli i cisterne dispuse longitudinal, constituind un sistem perimiofibrilar numit reticul sarcoplasmic (sarcotubuli). Tubulii alungii ai reticulului endoplasmatic fuzioneaz n zona striei H, ca i n zona benzii Z, n cte o cistern, aa nct formeaz un fel de manon continuu n jurul miofibrilei, ntins ntre dou benzi Z(sarcomer).

151

La acest nivel (banda Z), ntre dou cisterne ale celor dou manoane ale reticulului sarcoplasmic ptrunde o invaginaie a plasmalemei turtit n plan transversal al fibrilei (tubulul T). n felul acesta, la nivelul benzii Z se formeaz o triad, cu dou elemente (dou cisterne) ale reticulului sarcoplasmic i un tubul T (fig. 94). Triada aceasta este foarte important funcional i anume prin tubulii T se transmite potenialul de aciune de la suprafa la elementele contractile. Fig. 94 - Reticulul endoplasmatic al fibrelor musculare striate (reticulul sarcoplasmic). Tot prin tubulul T, din plasm intr n reticulul sarcoplasmic ioni de Ca 2+ i ATP, difuznd uor prin reticul i permind contracia muscular . Reticulul uureaz distribuia rapid a Ca2+ i ATP la nivelul miofibrilelor, printre care se gsete dispus. Manonul din dreptul benzii A conine cea mai mare cantitate de Ca2+ i ATP, necesar tocmai n acest loc unde apare contracia. n timpul relaxrii, Ca2+ se acumuleaz n cisternele terminale ale reticulului sarcoplasmic i, de aici trece n tubulii transveri (T) i apoi n sarcoplasm. O alt dispoziie particular a reticulului endoplasmatic nuclear este cea de pe faa intern a membranei plasmatice la neuroni, att ai vertebratelor ct i ai nevertebratelor, unde se gsesc vezicule mari, turtite numite cisternele de sub plasmalem. Aceste cisterne sunt numai n neuroni (nu i n celulele Schwann sau celulele endoteliale), att n sistemul nervos central ct i cel periferic. Structuri asemntoare se gsesc i n unele celule senzoriale sau musculare, care genereaz sau conduc variaii de potenial electric. Studiile lui Porter i Palade asupra reticulului endoplasmatic la muchii vertebratelor au artat asocierea acestor cisterne cu anumite locuri de pe plasmalem prin care stimulii pot ajunge n celule. Cisternele stau, deci, la baza aa-numitelor locuri senzitive (senzitive spots). Sarcolema cu cisterne prezint o permeabilitate selectiv, ionii specifici fiind absorbii la suprafaa membranelor intracelulare ale cisternelor. Cisternele modific mobilitatea i concentraia ionilor la suprafaa intern a sarcolemei. Asocierea cisternelor cu mitocondriile sugereaz c, n asemenea mod, permeabilitatea membranelor este modificat i transferul de materiale uurat, datorit energiei rezultat din hidroliza ATP din mitocondrii. O alt form particular de organizare a reticulului endoplasmatic nuclear a fost observat n unele celule secretoare ale adenohipofizei, unde tubulii reticulari se dispun concentric, asemntor unui bulb de ceap secionat. Aezate lng nucleu, aceste formaiuni au fost numite paranuclei endoplasmici. Formaiuni asemntoare au fost observate n hepatocite dup administrarea de toxice sau dup hepatectonie experimental.

152

Un tip special de reticul neted a fost descris n celulele stratului pigmentar al retinei, unde ocup aproximativ 50% din citoplasm, gsindu-se situat la polul bazal al celulei i n procesele care migreaz ntre conuri i bastonae. Structurile reticu-lului formeaz aa-numiii corpi mielinici, care au un aspect lenticular biconvex, de 4 - 5 n axul lung, alctuii din sculee turtite, dispuse n stive. Adesea corpii mieloizi sunt grupai cte 4 5 laolalt. Asemnarea citomembranelor celulelor pigmentare cu structurile din complexul de fotorecepie a luminii, permit interpretarea c i acestea intervenin n metabolismul vitaminei A i conversia rodopsinei. Pe numeroase tipuri de celule au fost evideniat o variaie cantitativ i calitativ a reticulului endoplasmatic n cursul desfurrii procesului de difereniere celular. Astfel, n hepatocitele de obolan, n ziua a treia prenatal reticulul endoplasmatic neted lipsete, fiind prezent cel granular, n ziua a opta postnatal reticulul devine de tip neted. Modificrile se reflect n variaiile raportului ARN/protein, care scade n favoarea raportului fosfolipoproteic /protein. Aceast modificare a raportului este proporional cu vrsta . Noile membrane sunt, deci, sintetizate n reticulul endoplasmatic granular i transferate apoi reticulului endoplasmatic neted. Pe lng fosfolipide i proteine, citomembranele netede conin i enzime. Faptul c celulele a cror funcie principal este sinteza lipidelor sau sterolilor au un reticul neted dezvoltat au dus la concluzia localizrii la nivelul acestuia a enzimelor de sintez a sterolilor, trigliceridelor i a altor lipide . A fost atestat, de asemenea i localizarea enzimelor care particip la sinteza glicogenului. Date experimentale sugereaz sinteza la nivelul reticulului endoplasmatic neted a enzimelor detoxifiante, capabile s anihileze aciuni ale drogurilor (exemplu fenobarbital). Dispoziia spaial a reticulului permite considerarea acestui sistem structural, ca un sistem circular endocelular, foarte mobil, la nivelul cruia se pot realiza schimburi de substane ntre mediul extracelular i matricea nuclear. Reticulul endoplasmatic intervine n schimburile ionice ntre citoplasm i nucleu, concomitent cu un intens schimb hidric. Un rol important al reticulului endoplasmatic este hidroxilarea medicamentelor Peste dou sute de compusi chimice, printre care fenobarbitalul i hidrocarburile polichimice declaneaz in vivo un efect inductor asupra enzimelor microzomale (microzomi = fraciuni heterogene cuprinznd fragmente din membranele reticulului endoplasmatic, membrana nuclear, membrana plasmatic, ribozomi), iar n unele cazuri produc chiar o amplificare genic a unor enzime implicate n aprarea organismului.

6.6. Segregarea i concentrarea proteinelor

Studii efectuate cu 3H leucin n pancreas au stabilit c proteinele sintetizate n ribozomi (reticulul endoplasmatic granular) sunt trecute apoi n reticulul endoplasmatic neted. S-a stabilit c n reticulul endoplasmatic granular se sintetizeaz dou tipuri de proteine: o protein secundar, ntr-un ritm sczut i o protein exportabil, cu un turnover foarte rapid. n vecintatea aparatului Golgi ergastoplasma pierde ribozonii i membrana devine neted. Reticulul endoplasmatic neted astfel format se veziculez, constriciile fiind un stadiu n detaarea de microvezicule libere, care sunt identice cu acelea din vecintatea dictiozomului. Coninutul veziculelor trece apoi n vacuolele de condensare, mecanismul intern fiind nc discutabil. Observaiile au sugerat cel puin trei ci: 1) fuzionarea veziculelor cu cisterne ale dictiozomilor; 2) fuzionarea veziculelor cu vacuole de condensare; 3) fuzionarea unor microvezicule Golgi formnd o vacuol multiveziculat la care membranele vor forma membrana limitant a vacuolei de condensare. 153

n vacuola de concentrare proteinele sufer un proces de concentrare n granule de zimogen printr-un mecanism nc neclar (probabil printr-un proces de deshidratare, apa acumulndu-se n sculeii care se umfl). Proteinele granulelor de zimogen sunt reprezentate de o serie de enzime condensate care se descarc la exterior prin pinocitoz invers.

6.7. Sinteza i secreia polizaharidelor

Sinteza zaharurilor complexe, cum este glicogenul, are loc la nivelul citoplasmei fundamentale. n schimb, sinteza glicoproteinelor i mucopolizaharidelor se efectueaz n aparatul Golgi. n formarea granulelor de diferite glicoproteine a fost formulat prerea c exist dou etape: ntr-o prim etap, datorit unei transferaze, n reticulul endoplasmatic ptrund N acetilgalactozomin i monozohexozomin, care se leag de lanul polipeptidic sintetizat la acest nivel. Vacuolele transportoare duc aceste proteine la care s-au adiionat grupri glucidice, la aparatul Golgi, unde ntr-o a doua etap, se adiioneaz galactoza, fructoza, manoza i acidul sialic, n circa 5 minute. O localizare n timp n diferite formaiuni ale aparatului Golgi a fost observat i pentru sulful radioactiv 35S injectat ca SO4Na2, acesta aprnd mai nti n dictiozomi i apoi n granule de mucus. Detectarea mucopolizaharidelor acide s-a fcut, de asemenea, numai la nivelul zonei Golgi, care asigur formarea proteinelor n vacuolele din concavitatea cisternelor i n granulele de secreie. n formarea lipoproteinelor, sinteza iniial este asociat cu reticulul endoplasmatic, membranele golgiene avnd rolul de a uni produii separai (proteine lipide) ntr-o molecul mare complexul lipoproteic. ntruct produii secretai de aparatul Golgi au un caracter variat, se apreciaz c aceast zon posed mecanisme speciale pentru formarea de entiti macromoleculare. Ca atare, complexul de membrane al aparatului Golgi nu poate fi privit numai ca un compartiment de pasaj al unor tipuri de molecule, ci ca pe un compartiment la nivelul cruia are loc o activitate enzimatic mult diferit i o complexare a moleculelor mici ntr-o molecul mare. Aceste complexe macromoleculare specifice sunt formate din combinaii ntre proteine, hidrai de C i lipide. Reacia de sulfatare este interpretat tot ca o form special de complexare. Produsul care urmeaz s fie secretat va suporta apoi o remaniere suplimentar dup detaarea veziculelor din sculeii golgieni. Produsul secretat se prezint ca material diferit (enzime, mucus, nveli celular, hormoni etc.). Granule dense la fluxul de e- (ME) au fost observate i n zonele golgiene la numeroase tipuri de celule neurosecretoare, considerndu-se neurosecreia ca produs al lamelelor golgiene. Se precizeaz ca la acest nivel membranele aparatului Golgi joac rolul de complexare, folosind i materialul sintetizat n reticulul endoplasmatic. Un rol particular al aparatului Golgi este evideniat n formarea acrozomului din spermatozoid, care are o poziie supra nuclear. La nivelul spermatocitelor s-a evideniat apariia unor granule proacrozomale n zona central a aparatului Golgi, care, prin fuzionare, dau natere acrozomului matur. S-a evideniat de asemenea, rolul reticulului endoplasmatic in elaborarea unor vezicule care, fuzionnd cu lamelele golgiene, furnizeaz cel puin o parte din materialul acrozomal. La contactul cu ovulul i sub influena acestuia, acrozomul sufer o serie de transformri variabile dar care includ eliberarea de substane litice care particip la liza structurilor rezistente ale ovulului fa de ptrunderea spermatozoidului. Complexul golgian este, structural i funcional, legat de reticulul endoplasmatic i, aa cum e arat polaritatea lui, endomembranele se modific ntr-un flux continuu de la reticul spre membrana celular. n cursul acestui flux membranar, aparatul Golgi transfer i concentreaz proteinele, neoformeaz materiale membranare, sintetizeaz polizaharide i 154

glicoproteine. Participarea aparatului Golgi la formarea noilor membrane celulare a fost considerat de unii autori ca o funcie principal a sa. S-a acreditat ideea unui circuit intracelular al subunitilor membranare hialoplasmice care participa la formarea veziculelor transpoare ce se desprind din reticulul endoplasmatic, apoi imbogatesc membranele golgiene, reinoindu-le permanent, fiind posibila formarea vacuolelor de secretie, care, in final, se deschid la exteriorul celulelor. Aceste vacuole se fragmenteaza dupa exocitoz in vezicule mici prin a caror dezorganizare se reface stocul subunitatilor membranare din hialoplasma. Secreiile solide. Aparatul Golgi ndeplinete un rol i n secreiile solide i anume, astzi este dovedit c particip la formarea pereilor celulozici ai plantelor prin sinteza celulozei.

6.8. Lizozomii
Sunt structuri tranzitorii din multe celule, limitate la o membran, care includ o serie de hidrolaze acide. Ei se gsesc n hepatocite, pe lng canaliculii biliari i abund n macrofage, histiocite, granulocite, la diferite alge unicelulare, granulele vitelusului proteic (n faza cnd cristalizeaz proteinele sunt tot formatiuni lizozomale). Tot o activitate litic au i veziculele golgiene, ca de exemplu din glanda multifid de melc. Sinteza enzimelor lizozomale are loc n poliribozomii reticulului endoplasmatic, de unde trec pe faa distal a aparatului Golgi format din saculi i tubuli anastomazai. De aici, prin nmugurirea acestora, se formeaz lizozomii.

6.8.1. Funciile lizozomilor

Rolul lizozomilor primari este de a aproviziona cu enzime fagozomii sau autofagozomii, transformndu-i n vacuole heterofagice, respectiv autofagice sau s elimine la exterior coninutul lor, n realizarea unei digestii externe, ca n cazul diferitelor glande de la vertebrate (fig. 95).

Fig. 95 - Clasificarea dat de Ch. de Duve funcionalitile lizozomilor 155

Endocitoza diferitelor particule sau pinocitoza lichidului extracelular se face cu participarea filamentelor mecanocontraciilor sub-membranare (fig. 96). Particulele care ader la suprafaa membranei celulare, imobilizeaz proteinele acesteia, crescnd permeabilitatea Na+ care intr n celul i provoac depolarizarea membranei. Unda de depolarizare elibereaz Ca2+ din reticulul endoplasmatic.

Fig. 96 - Dinamica endocitozei; desfurarea procesului este figurat de la stnga la dreapta: sub aciunea Ca++ filamentele contractile de sub membrana celular realizeaz nglobarea unei particule care intr n citoplasm, nconjurat de membrana respectiv. Circulnd n citoplasm se ncarc cu enzimele lizozomale, transformndu-se n heterolizozomi, dup care corpii reziduali pot fi excretai printr-un mecanism n care proteinele mecanocontractile, sub aciunea Ca++, se deprteaz de faa intern a membranei i uureaz astfel deschiderea vacuolei n exterior n prezena Ca2+ are loc reunirea actinei cu miozina i formarea actomiozinei, proces care este nsoit de contracia microfilamentelor respective in sensul invaginrii membranei celulare. Astfel, fagozomul iniial, a mic invaginare ce conine o mic parte din mediul extern, este separat de citoplasm printr-o poriune din membrana plasmatic. Glicocalixul ei, devenit interior, se separ de membran formnd n interiorul fagozomului o mas amorf, polizaharidic, care apoi dispare. Dup pierderea glicocalixului fagozomul sufer o deshidratare, nu mai are form sferic, migreaz prin cile microtubulare de-a lungul citoplasmei i se fragmenteaz. Fogozomul se poate deschide la exterior (regurgitare), sau se asociaz cu lizozomii primari devenind vacuole heterofagice. Vacuolele heterafagice pot acumula colorani i medicamente din mediul extracelular. 156

Astfel, clorochina, acumulndu-se n heterolizozomii plasmodiului malariei, determin ruperea membranei i enzimelor lizozomale distrug parazitul. n mod normal, particulele captate prin fagocitoz sunt digerate n vacuole heterofagice i componentele lor trec prin membrana lizozomal n citoplasm, hrnind celula. La fel sunt digerate bacteriile de ctre leucocitele neutrofile i macrofage i sunt degradate substanele toxice i medicamentoase, prin aceasta detoxificndu-se organismul. Enzimele lizozomale eliminate n afara celulelor permit unor celule s-i croiasc drum printre zone tisulare compacte i greu de strbtut. Se tie c una din proprietile fundamentale ale celulelor este de a-i rennoi permanent structurile lor funcionale. Acest proces are loc pe trei ci: prin hidrolazele nelizozomale din nucleu i citoplasm; prin enzimele lizozomale care ies din lizozomii primari i diger structurile respective; prin autofagie. Autofagozomii care se formeaz n ficat i rinichi distrug permanent organitele celulare n mod constant, metabolismul celulelor refolosind n acelai timp materialele acestora n sinteze ulterioare. Vacuola autofagic se constituie din contopirea unui autofagozom cu lizozomii primari. Autofagozomul ia natere prin circumscrierea unei poriuni de citoplasm cu organitele respective de ctre membranele cisternelor reticulului endoplasmatic sau ale saculilor golgieni; n alte cazuri, rezult din contopirea mai multor vacuole endocitare. Cnd autofagozomul s-a format, n el se vars coninutul enzimatic al lizozomilor primari. n circa 300 de zile mitocondriile unui hepatocit se rennoiesc de aproximativ 30 de ori, ceea ce nseamn c ntr-o celul o mitocondrie este distrus la fiecare 15 minute. n cursul ontogeniei, autofagia unei structuri constituie un mecanism care influeneaz integralitatea organelor, curburile encefalului, individualizarea falangelor, formarea rinichiului, dispariia cozii larvare la anure, etc. Tot prin autofagie se limiteaz extinderea unor procese degenerative (ale hepatocitelor i celulelor pancreatice de actinomicin inhibitor al sintezei ARN) etc. Celulele unui animal supus la inaniie se nutresc prin autofagia propriului coninut, iar celulele moarte sunt lizate de enzimele lizozomale proprii. Cnd organismul nu mai are nevoie de anumii hormoni atunci glandele care le elaboreaz distrug prin autofagie granulele de secreie respectiv. Ceea ce rmne nedigerat n hetero-fagozomi i autofagozomi apare sub forma unor figuri mielinice, pigmeni biliari, feritine, lipofuxime etc. Rezult aa-ziii corpi reziduali care pot s-i elimine de foarte multe ori coninutul afar. Faptul c enzimele lizozomale nu diger membrana lizozomilor s-ar putea datora rezistenei nveliului propriu glicoproteic de pe faa intern a membranei lizozomale. Fig. 97 - Funciile peroxizonilor 157

Sunt cazuri cnd membrana lizozomal este distrus prin diferii factori externi (ocuri traumatice, anoxie, endotoxine, virusuri, praf de crbune etc.). n maladii ca pneumoconiozele (leziuni pulmonare, ale branhiilor, scleroza parenchinului pulmonar) datorit inhalrii de C, Be, Si, Zn se produc lize ale membranei lizozomilor, iar enzimele eliberate omoar celule. ntr-o serie de maladii genetice, fie membranele lizozomilor fuzioneaz dnd lizozomi mari de 2 5 , permeabili ce produc scderea rezistenei organismului la infecii, spleno i hepatomegalie, albinism, fotofobie, iar la copii moartea rapid, fie, sunt cazuri cnd nu se mai pot transcrie mesaje pentru o serie de enzime lizozomale (glucozidaze, sfingomielinaze, galactizidaze) astfel c, o serie de substane ce ptrund n lizozomi, negsind enzima respectiv responsabil de hidroliza lor, se acumuleaz in cantitate mare ntr-o serie de celule, cu diferite consecine chimice.

6.9. Peroxizomii
Sunt corpusculi de 0,5 formai dintr-o membran i o matrice, iar uneori cu formaiuni poli-i multitubulare, denumite nucleoizi sau o plac marginal mai dens la primate. n peroxizomi se ntlnete catalaza care distruge H2O2 cu producere de H2O, fie prin oxidarea unui substrat redus, fie cnd donorul de O2 este H2O2 . Peroxizomii produc o cantitate mic de energie, regleaz catabolismul glucozei, jucnd rol n gluconeogenez, sintetiznd glucoza din precursori neglucidici, intervenind i n sinteza sterolilor (fig. 97).

6.10. Proteinele chaperone

Studiile de specialitate i biologie molecular din ultimii ani au demonstrat, pe un numr mare tot mai mare de organisme procariote i eucariote, existena unei clase speciale de proteine cu rol esenial n viaa celulei. Aceste proteine au fost denumite proteine chaperone sau chaperoni moleculari, ceea ce nseamn proteine de nsoire deoarece intervin pe tot parcursul sintezei celorlalte proteine din organisme, post-translaional, determinnd conformaia structural normal, starea corect de pliere i agregare final a acestora i implicit, funcionarea normal corespunztoare; ele reactiveaz proteinele legate dup stres i au rol de catalizatori prin creterea vitezei de nfurare a proteinelor, ajutndu-le astfel s-i gseasc o structur teriar stabil. Proteinele charperone au capacitatea comun de a-i regla propria asamblare i pliere (mpturire) motiv pentru care au fost numite i autofoldaze. Cunoaterea acestei noi clase de proteine a permis n ultimii ani deschiderea unor noi ci n abordarea i nelegerea proceselor celulare survenite n condiii de stres, senescen ct i n fenomenele degenerative tip boli prionice .Datele acumulate pledeaz pentru existena unui numr foarte mare i complex de proprieti funcionale ale acestor proteine. Cercetrile efectuate n ultimii 25 de ani au demonstrat c exist o uniformitate izbitoare n modul n care diferite organisme rspund la diferite forme de stres. Rspunsul la stres implic alturarea transcrierii unui set anumit de gene care codific pentru proteinele de oc termic (hsp) numite i proteine de stres. Dintre acestea cea mai cunoscut la bacterii este proteina de oc termic hsp70k1. Aceste proteine de stres ajut celulelor supuse stresului s-i menin proteinele ntr-o conformaie corect, ajut ca aceste proteine s fie translocate ctre diferite organite celulare (transport
1

kilodaltoni

158

vectorial), i ghideaz att proteinele normale nou-sintetizate, ct i pe cele anormale, s ating o conformaie normal. Proteinele de stres joac un rol important i n condiii de nonstres, anume n perioada de difereniere celular, cretere i dezvoltare. n condiii de stres pot s apar proteine mpturite, sau o mare cantitate de proteine nascente nempturite; aceste stri declaneaz imediat rspunsul la stres, sugernd deci c o protein anormal mpturit reprezint component cheie a procesului de recunoatere a stresului de ctre celul. Rspunsul la stres este reglat n principal la nivel de transcriere, dei, n unele cazuri, au fost deschise i reglri la nivel de translaie. Modul n care celula este capabil s sesizeze acumularea intracelular de proteine anormal mpturite,declannd procesul de transcriere/translaie a proteinelor de stres nu este nc bine cunoscut. n celula eucariot, reticulul endoplasmatic (RE) se comport ca nu senzor ce capteaz toate variaiile n condiii de stres (metabolismul calciului, potenialul redox, proteinele semimpturite din lumenul i membrana RE. Proteina chaperone grp94 este cea mai abudent dintre toi chaperonii din RE (n proporie de 50%) i aparatul Golgi, corespunzndu-i n citoplasm proteina chaperone hsp90. Se pare c grp94 este o glicoprotein transmembranar (hidrofob i cu afinitate pentru lipide); est considerat drept marker de stres. n aceste condiii, grp94 se redistribuie n aparatul Golgi, cantitatea ei crete n nucleu i este secretat parial n mediul extracelular. Studiile asupra redistribuirii proteinei grp94 n condiii de stres au adus lumin asupra nelegerii patern-urilor de glicolizare ale grp94 modific dup stresul celular. Proteina chaperone hsp90 este de asemenea implic n protecia microtubulilor i a filamentoase citoplasmatice fa de stres (oc termic). Dintre proteinele de stres, cele mai cunoscute sunt proteinele de oc termic hsp (heat shock protein). Proteinele hsp se difereniaz ntre ele prin greutatea lor molecular (exprimat n kda): hsp60, hsp70, hsp90. Proteinelor chaperone li se atribuie multiple funcii: protecia celular crescut n condiii de stres, acordnd termotoleran. Hsp90 protejeaz proteinele int de proteoliz i le asigur nmagazinarea; determinarea strii de mpturire,asamblare/dezasamblare a proteinelor non-sintetizate; chaperonii hsp60 i hsp70 au rol n mpturire, translocaie, asamblare, stabilitate; hsp90 are rol n reglarea, activitatea factorilor de transcriere i a activitii kinazelor proteice. Hsp90 constituie 1-2% din totalul proteinelor citoplasmatice. Aceast protein a fost deschis att la procariote ct i la eucariote. Formeaz complexe mari citosolice cu numeroi ali chaperoni; traficul proteinelor (transport vectorial); la procariote s-a demonstrat existena unui sistem de proteine chaperone care acioneaz succesiv, ntr-o reacie n lan, avnd rol vital n sinteza, translocaia, plierea i funcionarea normal a proteinelor nou-sintetizate. La eucariote, proteina chaperone hsp70 are rol n sortarea proteinelor anormale, dar i a anumitor proteine normale (cu via scurt) att la procariote ct i la eucariote; asamblarea complexelor ribonucleoproteice a ribozomilor. Hsp90 se asociaz cu fibrele de ribonucleoproteine modulnd stuctura ARN-ului;

159

biogeneza mitocondriilor i peroxizomilor. Chaperonii, prezeni n toate organismele, au rol i n biogeneza unor structuri macromoleculare. Dintre acetia, proteinele hsp60 i hsp70 s-au dovedit a avea rol n biogeneza mitocondriilor. Proteinele hsp70 au rol i n stabilizarea citosolica a proteinelor peroxizemale. rspunsul imun; faptul c proteinele chapenare au potenialul de a-i crete sinteza i in condiii de stres, ar explica n mare msur , rolul n imunogenitate. ntr-un numr mare de infecii (bacteriene i parazitare cu protozoare i helmini) moleculele chaperone devin inte imune proeminente pentru celulele T. Au fost deschise drept inte imune proteinele hsp10 de la Mycobacterium leprae i proteinele hsp60 i hsp70 de la Mycobacterium leprae i M. tuberculosis; replicarea ADN-ului la virusuri, procariote i eucariote. Chaperonii au rolul n meninerea strii de rsucire moderat a moleculelor de ADN; n aceast stare, ADN-ul poate fi uor antrenat n activitatea de transcriere, replicare, recombinare. Hsp90 este implicat n asamblarea diferitelor complexe virale (complex ARN reverstransciptaza); asamblarea i reglarea activitii receptorilor pentru hormonii steroizi.Hsp90, prin legarea de receptorii pentru hormonii steroizi, face ca acestora s se menin n stare parial despturit capabil de a fixa hormonul respectiv; rolul protector n SNC. Unele observaii sugereaz c hsp exercit o aciune de citoprotecie asupra SNC ca urmare a rspunsului la stres. Stresul excitator este mediat de scderea cantitii intracelulare de glucoz, activitatea kinazei, scderea pH-ului intracelular, clivajul proteolitic al proteinelor structurale i prezena de radicali liberi mediai de denaturarea proteinelor. Starea toxic este potenat de eliberarea continu de glutamat dup producerea leziunii iniiale. Toate aceste procese sunt implicate n producerea rspunsului de tip proteine oc termic (hsp). Cel mai mare rol protector l au proteinele din familia hsp70. Proteinele hsp70 sunt prezente n esutul nervos i n condiii de nonstres. Aceste proteine hsp70 reprezint o protein asociat cu microtuburi i implicat n transportul axonal lent. Hsp70 se leag de ATP, avnd o slab aciune ATP-zica; poate fi fosforilat n prezena unui nalt nivel de calciu. Mecanismul protector al hsp se pare c este legat de combinarea acestora cu proteazele, fosfolipazele, kinazele sau receptrii controlul transmitorilor, avnd drept rezultat atenuarea efectelor distructive.S-a demonstrat c insulina induce producerea de proteine hsp70; intervin n procesul de dezvoltare celular. Date recente (Cyermely i Colab, 1998) arat c funcia major a hsp90 pare a fi participarea acesteia la omogenizarea, meninerea i remodelarea arhitecturii celulare (citoscheletul). Hsp90 i grp94 intervin n ciclul celular i diferenierea celular (hsp90 intervine dezvoltarea neural, retinian, osoas, muscular). Hsp90 se asociaz cu nucleolii, cu fibrele de ribonuleoproteine ale pericromatinei , moduleaz stuctura ADN-ului nuclear, a ARN-ului i proteinelor . Se ataeaz de ADN desfurnd activitate de tip topoizomeraz i nucleaz, regenereaz ADN-ul dup oc termic; prin formarea complexelor ADN-hsp90-histone, din cursul mitozei, proteina hsp face posibil asamblarea centrozomilor, rearanjrile majore n structurile nucleare n cursul oogenezei i embriogenezei precoce.

Hsp90 i grp94 intervin n apoptoz i n procesele de mbtrnire celular; aceti caperonii ofer celulei protecie fa de factorii de necroz a tumorilor (TNF) i fa de leziunile oxidative.

160

Capitolul 7 REPRODUCEREA CELULAR

Creterea organismelor i transmiterea caracterelor ereditare de-a lungul generaiilor au la baz o caracteristic fundamental a materiei vii - reproducerea. La nivel celular, reproducerea se realizeaz prin forme diferite. Reproducerea celulelor eucariote are loc printr-un proces complex denumit diviziune celular, n urma acestui proces, celula parental se divide, dnd natere la dou celule fiice. Diviziunea celular implic desfurarea unor evenimente celulare replicative, prin care se realizeaz duplicarea constituenilor celulari i distributive, ce asigur partiia constituenilor celulei n celulele fiice. Apariia unor descendeni celulari cu acelai potenial genetic reclam exercitarea unui riguros control asupra replicrii i distribuirii materialului genetic. Procesul distributiv al moleculelor ADN se realizeaz prin mecanisme specializate, la eucariote cele mai frecvent ntlnite fiind mitoza i meioza. Mitoza este caracteristic celulelor somatice i asigur o repartizare egal n celulele fiice a materialului genetic replicat. Meioza este ntlnit la celulele germinale. n urma meiozei se formeaz 4 celule fiice (gameii), fiecare prezentnd o jumtate din informaia genetic a celulei parentale. Prin fuziunea gameilor (spermatozoidul i ovulul) ia natere oul fecundat din care se dezvolt ulterior ntregul organism multicelular. Acest capitol i propune s prezinte principalele etape ale reproducerii celulare i mecanismele de control implicate n desfurarea acestui complex proces.

7.1. Ciclul celular

Reproducerea celular implic evenimente multiple i complexe ce se succed ciclic i care constituie ciclul celular. Funcie de compartimentele celulare n care se desfoar aceste evenimente se disting dou componente ale ciclului celular: ciclul cromozomial i ciclul citoplasmatic. n ciclul cromozomial dublarea cantitii de ADN alterneaz cu mitoza; n ciclul citoplasmatic are lor dublarea numrului de organite celulare i citokineza.

7.1.1. Ciclul celular la plante

La plantele superioare rata ciclurilor celulare este invers proporional cu temperatura (5 30o), la fiecare interval de temperatur diferite faze ale ciclului rmnnd constante ca cinetic. Iniierea replicrii genomului depinde de o sintez proteic prealabil, care este inductoare pentru nucleii cu capacitate de replicaie; aceast capacitate pare a fi coordonat de prezena intranuclear a ADNr, adic a segmentului genomic ce transcrie ARNr (organizatorul nuclear). Duplicarea cromozomilor nu pare s fie n legtur cu distribuia lor, fiind posibile mitoze fr duplicarea cromozomilor sau duplicarea fr mitoze, ceea ce duce la endoploidii. O alt sintez proteic are loc la nceputul fazei G2, fiind necesar condensrii cromozomilor profazici. Sinteza care are loc chiar n profaz este necesar desfurrii mitozei i dac ea lipsete celulele revin n interfaz .
o

7.1.2. Ciclul celular la animale

Ca i la plante, cea mai mare parte a ciclului celular de la animale este reprezentat de interfaz, adic de perioada de la sfritul unei diviziuni i nceputul urmtoarei.
161

Nucleul nu prezint n interfaz transformri vizibile la microscopul fotonic, n schimb, citospectrofotometric, se poate detecta, dup reacia Feulgen pentru AND, dublarea a acestuia, ca i a histonelor (fig. 98). Interfaza Faza G1. Urmeaz mitozei i dureaz 5 10 ore la mamifere . n cursul ei nu se nregistreaz noi sinteze de ADN i celulele conin cantitatea de ADN caracteristic speciei sa esutului respectiv . La om (46 cromozomi), cantitatea de ADN a nucleilor diploizi este de 6,8 x 10 12g, cantitate care rmne constant n decursul perioadei G1. Fibra nucleozomal unitar, de aproximativ 250 diametru, formeaz n anumite locuri de-a lungul cromozomilor mpachetri mai voluminoase, denumite cromomere n raport cu proteinele matriceale. Aglomerarea mai multor cromomere d natere blocurilor de heterocromatin. Fibrele de cromatin dintre blocurile heterocromatinice sunt mai puin mpachetate, constituind eucromatina. Biosinteza proteic depinde de activitatea genic transcripional din eucromatin, care elaboreaz diferiti mesageri sub form de ARN m ce servesc dup aceea n biosinteza proteic citoplasmatic . Faza S . Dureaz 6 8 ore, n cursul creia cantitatea de ADN se dubleaz . Aceast replicare necesit separarea celor dou lanuri de ADN n punctele de iniiere. Fiecare lan servete ca model complementar al altuia nou care se sintetizeaz enzimatic . Marcajele cu 3H timidin a unor culturi celulare sincronizate arat c ncorporarea marcajului (3H timidin) are loc n primele 10 minute ale fazei i apare pe autoradiografii la periferia nucleului i nucleolului. Rata replicrii helixului de ADN de la mamifere este de 0,5 1 / minut, raportul dintre lungimea cromatinei cu fibra unitar de 250 diametru i lungimea ADN este la nucleii umani de 1 : 4.

Fig. 98 - Ciclul celular i mitoza celulei animale

162

n aceast perioad sintetic cantitatea de ADN crete de la nivelul diploid 2n, trecnd prin etape intermediare: 2,5C; 3C, 3,5C pn ajunge la nivelul 4C, moment n care, prin mecanisme foarte exacte de reglaj celular, nc necunoscute, este ncetat ncorporarea de 3H timidin. Celula i-a dublat cantitatea de ADN; iniial n vederea repartizrii aceleiai cantiti 2C, de ADN n celulele fiice, respectiv aceleiai cantiti de informaie genetic. Prin inerea materialului biologic n contact cu 3H timidin pentru durate diferite de timp presupuse a corespunde nceputului, mijlocului i sfritului perioadei S, se evideniaz autoradiografic o replicare timpurie, mijlocie i trzie (tardiv) a unor segmente cromozomale sau cromozomi ntregi ai complementului unei celule sau specii. Cnd materialul biologic este inut mai puin timp n contact cu izotopul, se constat c numai anumite pri ale cromozomilor metafazici vor apare radiografic ca grain-uri (puncte) de ncorporare a acestuia. Acestea sunt segmentele eucromatice ale cromozomilor; care au deci replicare precoce, la nceputul perioadei S. Cnd materialul biologic st mai mult timp n contact cu trasorul, corespunznd la 1 / 2 sau 2/3 din stadiul S, se constat c cea mai mare parte a cromozomului metafazici ca i cei mai muli din cromozomii complementului prezint marcaj radioactiv, puine segmente, respectiv cromozomii, rmnnd totui nemarcai. Acestea sunt segmente heterocromatice, respectiv cromozomi cu replicare tardiv. Cnd materialul biologic a stat n contact cu trasorul pentru un timp ce corespunde unei perioade S integrale, cromozomii metafazici, apar total marcai radioactiv. Faza G2. Este mai scurt, durnd 4 5 ore i ncepe odat cu terminarea replicrii heterocromatinei. Sintezele de ADN persist, iar cantitatea de ADN este dubl fa de G1. Faza M (sau mitotic). Reprezint separarea duplexurilor de cromozomi (sau a cromatidelor surori, dup unii autori), mpreun cu dou loturi de citoplasm care includ toi constituenii si, n cele dou celule fiice. Prin cinematografie cu contrast de faz s-a stabilit c profaza dureaz 10 15 minute, prometafaza i metafaza 25 35 minute, anafaza 5 8 minute i telofaza 20 minute . Derularea ciclului celular implic reglarea succesiunii evenimentelor ce se desfoar n cadrul acestuia Acurateea proceselor de replicare i segregare a ADN depinde de rezolvarea de ctre celul a problemei succesiunii evenimentelor ciclului celular ntr-o ordine strict, astfel nct, declanarea unui nou eveniment s survin doar n urma ncheierii complete a evenimentului precedent. Rezolvarea acestei probleme reclam funcionarea unor mecanisme de control i existena la nivel celular a unor factori reglatori. Primele date privind existena unor factori implicai n reglarea ciclului celular au fost furnizate de experienele de fuziune celular Obinerea populaiilor de celule sincronizate (n care celulele se afl n aceeai perioad a ciclului celular) i experienele de fuziune celular au sugerat existena unor factori reglatori ce controleaz trei evenimente cheie ale ciclului celular: a) iniierea sintezei ADN; b) derularea replicrii materialului genetic nuclear; c) declanarea procesului mitotic n care are loc segregarea materialului genetic. S-a constatat c n urma fuzionrii unei celule aflate n perioada G1 cu o alta ce se gsete n perioada S a ciclului celular, ADN celulei G1 ncepe s se replice. Experimentul a stat la baza presupunerii existenei unui semnal capabil s activeze aparatul ADN replicativ. Acest semnal absent probabil din celulele G1, dar prezent n citoplasm celulelor S a fost numit activator al perioadei S (S - phase activator). Deoarece n celulele hibride G2 x G1 nu s-a nregistrat iniiera replicrii ADN n nucleul G2, s-a considerat c activatorul fazei S este eliminat (sau blocat) din citoplasm celulelor, la scurt timp dup ncheierea perioadei sintetice.

163

n urma fuziunii celulelor aflate n perioadele G2 i S ale ciclului celular, sinteza ADN n nucleul celulelor din S continu pn n momentul replicrii complete a materialului lor genetic, ceea ce indic absena unui inhibitor al sintezei ADN n citoplasm celulelor G2. n acelai timp prezena activatorului perioadei S nu pare s afecteze nucleul G2 de vreme ce nu se nregistreaz o reiniiere a replicrii ADN n acest nucleu, procesul replicativ fiind blocat pn la trecerea celulei n perioada G1 a unui nou ciclu celular. Funcionarea unui mecanism de blocare a sintezei ADN poate explica de ce ntr-o celul nu are loc derularea repetat a procesului ADN replicativ. S-a constatat c att replicarea incomplet a materialului genetic, ct i existena unor erori n molecule ADN nou sintetizate ce reclam intervenia mecanismelor de reparare, determin ntrzierea intrrii celulei n mitoz. Deoarece procesul replicativ i cel de reparare sunt asociate cu existena ADN monocatenar, se consider c excesul de ADN monocatenar declaneaz sinteza unui factor citoplasmatic, semnal ce mpiedic intrarea celulelor n mitoz pn n momentul desvririi replicrii sau reparii erorilor. Acest factor ce controleaz acurateea procesului ADN replicativ a fost numit semnal de ntrziere a perioadei mitotice (M - phase delaying signal). Intrarea celulelor n mitoz este determinat de dispariia semnalului de ntrziere a mitozei i acumularea n citoplasm a unui factor ce iniiaz mecanismul de segregare a materialului genetic, numit factor de activare a mitozei (M - phase promoting factor: MPF). Studiile bazate pe experienele de fuziune celular, n care s-au obinut hibrizi g1 X M; G2 x M i S x M, au demonstrat c prezena MPF (factor citoplasmatic prezent n celulele aflate n mitoz) declaneaz n nucleul celulelor aflate n oricare perioad a ciclului celular condensarea cromatinei, eveniment caracteristic mitozei. Se sugereaz c factorul de ntrziere a mitozei exercit un efect inhibitor asupra sintezei MPF. Aciunea inhibitoare dispare n prezena MPF de vreme ce n celulele hibride, rezultate prin fuziunea celulelor G1, S sau G2 cu celulele M, n care factorii citoplasmatici coexist, are loc condensarea cromatinei.

7.1.3. Ciclinele i protein - kinazele dependente de cicline

Ciclinele i protein - kinazele dependente de cicline constituie componentele motorului ciclului celular. Modificrile aprute n statusul motorului, ca urmare a interaciunilor dintre cele dou componente, declaneaz evenimentele ciclului celular (fig. 99). Aceste evenimente pot fi clasificate n patru grupe: a) evenimente declanate de depirea punctului de START: - iniierea replicrii ADN; - replicarea centrilor organizatori ai microtubulilor (MTOC). b) evenimente ce au loc pe parcursul derulrii replicrii ADN. c) evenimente iniiate n momentul intrrii celulei n mitoz; - asamblarea fusului de diviziune; - condensarea cromatinei; - dezorganizarea membranei nucleare. d) evenimente ce marcheaz ncheierea procesului mitotic; - dezasamblarea fusului de diviziune; - segregarea cromozomilor; - decondensarea cromatinei; - reorganizarea membranei nucleare; - citokineza.

164

Fig. 99 - Schema general a funcionrii motorului ciclului celular. Interaciunile ce se stabilesc ntre cicline i protein kinaze dependente de cicline (cdk) au ca rezultat declanarea evenimentelor caracteristice diviziunii celulare. 7.1.3.1. Protein - kinazele dependente de cicline (cdk) Prima protein kinaz dependent de cicline (34 KDa) a fost descoperit n 1988 ca produs al genei cdc2 din Saccharomices pompe i al genei CDC 28 din Saccharomices cerevisiae. Ea a fost numit proteina p34 cdc2/CDC28 sau cdk1. Proteina cdk1 joac un rol important n controlul ciclului celular, opernd la nivelul punctelor de grani G1/S i G2/M. Gene omologe cdc2/CDC28 au fost identificate i n genomul uman. Introduse prin clonare n drojdii defective n cdc2/CDC28, genele umane au fost capabile s suplineasc absena genelor corespondente din drojdii. Constatarea sugereaz c proteina cdkl a fost conservat de-a lungul evoluiei speciilor, acest element implicat n reglarea ciclului celular fiind comun tuturor celulelor eucariote. Descoperirea unei proteine, p33 (33KDa), numit cdk2 datorit asemnrii structurale i funcionale cu cdk1, a demonstrat existena unei ntregi familii de protein kinaze dependente de cicline. n prezent, ase membri ai acestei familii au fost identificai. 7.1.3.2. Ciclinele Ciclinele reprezint un grup restrns de proteine a cror sintez se realizeaz ntr-o manier dependent de perioadele ciclului celular. Ele activeaz cdk formnd cu acestea complexe ce prezint activitate kinazic. Pe parcursul formrii complexelor, ciclinele induc modificri conformaionale i de locaie a cdk ceea ce confer acestora specificitate n fosforilarea diferitelor substrate. Specificitatea activitii catalititce a complexelor ciclin/cdk st la baza parcurgerii de ctre celul a ciclului celular.

165

Fig. 100 - Complexele ciclin/cdk implicate n diferitele perioade ale ciclului celular. Spre deosebire de cicline, care se acumuleaz n celul ntr-o manier dependent de perioadele ciclului celular, cdk sunt prezente pe tot parcursul ciclului celular. Funcie de omologia secvenelor de aminoacizi i implicarea lor n perioadele ciclului celular, ciclinele se clasific n trei grupe (fig. 100): a) ciclinele perioadei G1 (ciclinele G1): ciclineie D i E; b) ciclinele perioadei S: ciclina A; c) ciclinele perioadei M (cicline mitotice): ciclina B. Ciclinele G1 asigur traversarea de ctre celul a perioadei G1 i tranziia G1/S. Din aceast grup fac parte cele trei subtipuri ale ciclinei D (D1, D2, D3) i ciclina E. Ciclinele D sunt sintetizate n faza timpurie a perioadei G1. Ele formeaz complexe cu diferite tipuri de cdk (cdk1 - cdk6). Se sugereaz c complexele ciclina D/cdk constituie primele componente ale cascadei ciclinelor, ele acionnd n sensul activrii ciclinelor E, care Ia rndul lor activeaz ciclinele A implicate n derularea perioadei sintetice a ciclului celular. Ciclinele E sunt sintetizate trziu n G1. Mai selective comparativ cu ciclinele D, ciclinele E se asociaz doar cu cdk2 i cdk3. Aciunea celor dou tipuri de complexe G1 se suprapune spre sfritul perioadei G1 avnd ca rezultat propulsarea celulei n perioada sintetic a ciclului celular. Ciclina A se asociaz cu cdk2 la grania dintre perioadele G, i S. Complexul favorizeaz derularea perioadei sintetice i intrarea celulei n G2. n faza trzie a perioadei S se formeaz complexul ciclina A/cdk1 ce conduce celula de-a lungul perioadei G2 spre grania G/M. Ciclina B prin asociere cu cdk1 d natere unui complex cunoscut sub numele de factor de promovare a celulei n mitoz (MPF Maturation Promotion Factor) ce opereaz n punctul de tranziie G2/M. Studiile efectuate pe drojdii au furnizat informaii interesante cu privire la modul n care complexul ciclin B/p34cdc2 acioneaz n sensul propulsrii celulei n perioada mitotic a ciclului celular (figura 101).

166

Fig. 101 - Ciclinele B se acumuleaz pe parcursul interfazei, formnd prin asociere cu p34cdc2 complexul pre-MPF. Acesta este imediat fosforilat la nivelul Tyr 15 i a Thr 160 din p34cdc2 de ctre tirozin/treonin kinaza (wee1), pierzndu-i activitatea kinazic. Sub aciunea tirozin fosfatazei (cdc25) pre-MPF este defosforilat, transformndu-se n MPF activ la nceputul mitozei. n ultimele etape ale mitozei ciclinele B sunt rapid degradate de proteaze. Sinteza ciclinelor B este iniiat n faza trzie a perioadei sintetice. Pe parcursul perioadei G2 ciclinele B se asociaz cu p34cdc2 dnd natere unui complex pre-MPF, lipsit de activitate kinazic. Pierderea activitii kinazice de ctre pre-MPF se datoreaz faptului c acest complex constituie unul dintre substratele unei tirozin/treonin kinaze. Enzima, produs al genei weel, fosforileaz tirozina 15 i treonina 160 din lanul de aminoacizi ai proteinei p34cdc2. Fosforilarea tirozinei 15 este responsabil de inhibarea funciei kinazice a proteinei p34cdc2. Defosforilarea tirozinei 15 are loc la sfritul perioadei G2 a ciclului celular, sub aciunea unei tirozin fosfataze codificat de gena cdc25. Reacia de defosforilare, transform pre-MPF inactiv n MPF cu activitate protein kinazic (figura 102). MPF inhib tirozin/treonin kinaza i activeaz tirozin fosfataza, ceea ce conduce la acumularea masiv a MPF n citoplasm i, ulterior, declanarea unei rapide i ireversibile treceri a celulei n perioada mitotit a ciclului celular. Fig. 102 - Reaciile de fosforilare i defosforilare ale MPF Evenimentele ce marcheaz intrarea celulei n perioada mitotic sunt rezultatul fosforilrii directe sau indirecte a unor proteine de ctre MPF. Prin fosforilarea laminelor nucleare, MPF declaneaz dezorganizarea membranei nucleare. Fosforilarea histonei H1, proces ce iniiaz condensarea cromatinei, este cataliuzaqt de proteinkinaza, enzim activat prin fosforilare de ctre MPF. Se consider c un mecanism indirect de fosforilare similar st la baza asamblrii fusului de diviziune. Dintre enzimele activate de MPF fac parte i cele implicate n conjugarea ciclinelor cu molecula marker a proteolizei, numit ubiquitin.

167

n urma ubiquitinrii, ciclinele sunt rapid degradate. Scderea concentraiei ciclinelor n celul este urmat de disocierea complexelor ciclin/cdk. n absena aciunii efectorilor pozitiv (cicline) scade capacitatea catalitic a cdk ceea ce determin ieirea celulelor din mitoz i intrarea lor ntr-un nou ciclu celular.

7.1.4. Interaciunea cicline- proteina Rb - mecanism de reglare pozitiv a ciclului celular

Proteina Rb transcris de antioncogena Rb1 este o protein nuclear ce face parte dintrun mecanism de blocare a proliferrii celulare sub aciunea factorilor antimitotici (sau n absena factorilor mitotici). n stare hipofosforilat proteina Rb leag diferite proteine nucleare implicate n reglarea principalelor procese ce asigur creterea celular, inclusiv factori de transcripie. Unul dintre acetia este factorul E2F responsabil de exprimarea genei ce codific ciclina A. Sechestrarea factorului E2F blocheaz sinteza ciclinei A, ceea ce determin meninerea celulei n G1. Ciclinele D prezint o secven peptidic amino-terminal (Leu-X-Cys-X-Glu) prin care se pot lega la un domeniu specific (pocket region) al proteinei RB, blocndu-l. Pe de alt parte, datorit activitii kinazice, complexele ciclina D/cdk determin trecerea proteinei Rb n stare hiperfosforilat, ceea ce conduce la eliberarea factorului E2F i sinteza ciclinei A. La rndul lor, ciclinele A menin proteinele RB n stare hiperfosforilat pe parcursul perioadelor S, G2 i M ale ciclului celular (figura 103). Se sugereaz c proteinele Rb funcioneaz ca un comutator molecular n activarea n cascad a ciclinelor prin reglarea sintezei ciclinei A. Fig. 103 - Fosforilarea proteinei RB are loc la sfritul perioadei G1 sub aciunea complexelor ciclin D/cdk. Proteina este meninut n stare hiperfosforilat pn la ultimele etape ale mitozei, cnd revine n starea hipofosforilat.

7.1.5. Reglarea ciclului celular prin mecanisme feed-back

Apariia unei desincronizri ntre durata necesar desfurrii unui eveniment al ciclului celular i funcionarea motorului are ca rezultat iniierea n celul a unui nou eveniment naintea ncheierii celui precedent. Aceasta conduce inevitabil la alterare genetic i moarte celular. Existena unor mecanisme de control feed-back face posibil ncetinirea sau blocarea temporar a motorului ciclului celular n momentul n care desincronizarea a fost detectat. Un exemplu n acest sens este oprirea intrrii celulei n mitoz, prin blocarea activrii MPF n condiiile unei replicri incomplete a ADN (fig. 104). Un mecanism de control feed-back reclam existena a cel puin trei elemente: a) un senzor ce monitorizeaz desfurarea evenimentului; b) un semnal generat de senzor; c) un rspuns la nivelul motorului celular care permite progresia, ntrzierea sau oprirea depirii punctului de control de ctre celul. Tot prin mecanisme feed-back celula este capabil s detecteze i s remedieze erori ce apar n desfurarea proceselor de replicare i segregare a materialului genetic. Un rol interesant n unele mecanisme feed-back l au inhibitorii cdk (ICDK). Aceste proteine au drept int cdk i complexele ciclin/cdk, n special cele active n perioada G.
168

Un inhibitor cdk este produsul genei GADD45 (Specific Growth Arrest DNA Damage Inductible). El face parte dintr-o cale de transmitere a semnalelor ce controleaz oprirea ciclului celular n urma lezrii ADN sub aciunea radiaiilor ionizante. Aceast cale mai implic cel puin doi participani: proteina codificat de gena AT (ataxie-telangiectazie) i proteina p53 (figura 110). n urma detectrii leziunii la nivel ADN, se remarc acumularea proteinelor p53 n celul, printr-un mecanism ce implic produsul genei AT. Proteina p53 funcioneaz ca un factor de transcripie ce induce exprimarea genei GADD45. Prin aciunea inhibitoare asupra complexelor cicline G,/cdk, proteina GADD, prelugete perioada G, oferind timp celulei s repare leziunea nainte de a intra n perioada S a ciclului celular. Acest mecanism feed-back este inactivat la persoanele ce sufer de ataxietelangiectazie, o boal autozomal recesiv ce se manifest prin hipersensibilitate la radiaii, o inciden crescut a cancerelor, ataxie cerebral progresiv i deficiene n sistemul imun. Recent s-a descoperit un alt mecanism p53 dependent, prin care celula este oprit n perioada G1 ca urmare a lezrii ADN prin radiaii ionizante sau ali factori de stres celular. Proteina p53 induce exprimarea unei gene ce codific un inhibitor cdk, numit proteina p21 (WAF1 -Activated Fragment-1 sau CIP1 cdk Interacting Protein-1).Prin legarea proteinei p21 de diferii cdk ce acioneaz n G, este blocat activarea complexelor ciclin G,/cdk ceea ce mpiedic fosforilarea substratelor int, cum ar fi proteinele Rb. n acelai mod se consider c ar aciona i proteina 16 (p 16). Fig. 104 - Mecanismele feedback sincronizeaz funcionarea motorului ciclului celular cu derularea evenimentelor celulare. Sunt prezentate schematic trei situaii: a) sincronizarea perfect a replicrii ADN cu activarea MPF ce declaneaz mitoza; b) replicarea ADN nu este complet ncheiat n momentul activrii MPF. c) Desincronizarea conduce la moarte celular; d) activarea MPF este blocat prin mecanism feed-back ceea ce permite finalizarea procesului replicativ.

169

Fig. 105 - Mecanisme feed-back controleaz replicarea ADN n celulele supuse aciunii factorilor de stress (radiaii ionizante). Sunt prezentate dou ci de control dependente de proteina p53. Att calea AT p53 - GADD45, ct i calea p53 - p21 - RB conduc la oprirea celulei n G1 ca urmare a detectrii unei leziuni la nivel ADN. GADD45 i p21 funcioneaz ca inhibitori ai cdk activi n perioada G1 a ciclului celular.

7.1.6. Ali factori responsabili de controlul proliferrii celulare n organismele pluricelulare

n organismele unicelulare, proliferarea este un proces rapid a crui desfurare este influenat n principal de aportul nutriional i viteza metabolismului celular. n organismele pluricelulare, celulele individuale ce le compun coopereaz n scopul asigurrii supravieuirii acestora. Meninerea integritii structurale a organismului reclam stabilirea unui permanent echilibru ntre proliferare i moarte celular (apoptoz). Acest echilibru este reglat prin numeroi factori extra i intracelulari. Majoritatea acestor factori acioneaz asupra unui punct de control (check point) echivalent punctului start la drojdii, numit punct de restricie (R). Diveri factori ce regleaz trecerea celulelor din G1 n S impun reguli stricte de depire a punctului de restricie, ceea ce ilustreaz semnificaia sa deosebit de complex la organismele pluricelulare. nclcarea acestor reguli determin grave modificri la nivel celular ce conduc la malignizare sau moarte celular. Diversitatea factorilor i a mecanismelor prin care ei regleaz trecerea din G1 n S a celulelor ce alctuiesc organismele pluricelulare sugereaz existena la sfritul perioadei G1 a mai multor puncte de restricii.

7.1.7. Ciclul cromozomial i creterea celular

Similar organismelor unicelulare, depirea perioadei G1 de ctre celulele organismelor pluricelulare este condiionat de atingerea dimensiunii standard. Exist foarte puini indici cu privire la modalitatea prin care celulele sunt capabile s-i sesizeze propria dimensiune. Dat fiind relaia de proporionalitate dintre dimensiunea celulei i gradul su de ploidie, s-a sugerat c raportul dintre volumul celular i cantitatea total de ADN sau numrul seturilor de gene din genomul celular ar constitui un factor critic. Mecanismul prin care dimensiunea celulei influeneaz ciclul cromozomial implic probabil sinteza unei molecule ntr-o manier dependent de cantitatea de ADN celular, n aceste condiii, raportul dintre cantitatea total a moleculei i ADN celular rmne constant.

170

Scderea concentraiei moleculei sub o valoare prag, determinat de creterea volumului celular, ar putea constitui un semnal de depire al punctului de restricie i de iniiere a replicrii ADN. n organismele pluricelulare numeroase celule se gsesc n stadiul G0. n aceste celule raportul dintre sinteza i degradarea proteinelor este modificat n comparaie cu cel al celulelor proliferative aflate n perioada G1. Att aparatul proteosintetic (ribozomi, ARNm, proteine implicate n desfurarea sau reglarea acestui proces), ct i viteza sintezei proteice sunt mult diminuate. Celula i sintetizeaz proteinele de ntreinere, rmnnd viabil, dar nu mai crete, n urma stimulrii cu factori de cretere a celulelor aflate n G0, se constat o intensificare a proteosintezei, ea evolund paralel cu ciclul cromozomial. Legtura dintre creterea i proliferarea celular nu este rigid. Afirmaia se bazeaz pe rezultatele experienelor pe culturi de celule n care s-a reuit blocarea sintezei proteice fr ca ciclul cromozomial s fie afectat i invers. De asemenea, pentru unele celule aflate n G0, (de exemplu neuronii) creterea celular nu reclam replicarea ADN.

7.1.8. Implicarea factorilor de cretere n reglarea diviziunii celulare

Factorii de cretere sunt proteine implicate specific n stimularea diviziunii celulare. Recunoaterea lor de ctre celule prin intermediul receptorilor, prezeni la nivelul membranei plasmatice, reprezint o prim etap a unui mecanism complex finalizat prin inducerea replicrii ADN. Factorul de cretere derivat din trombocite (platelet-derivated growth factor-PDGF) este unul din cele aproximativ 30 de tipuri de factori de cretere identificai. El stimuleaz proliferarea fibroblatilor n culturi celulare i a celulelor din esuturile conjunctiv i muscular neted, fcnd astfel posibil repararea leziunilor tisulare. Ali factori de cretere sunt prezentai n tabelul 3. Recunoaterea i legarea factorului de cretere de ctre receptorul specific declaneaz evenimente ce se deruleaz n cascad, prin intermediul crora semnalul este transmis de la nivelul membranei plasmatice la genele implicate n proliferarea celular (procesul fiind denumit signal transduction). n transmiterea semnalului un rol important l are fosforilarea proteinelor antrenate n acest proces. Receptorul pentru factorul de cretere este o protein cu activitate tirozinkinazic. Formarea complexului receptor-factor de cretere determin autofosforilarea la nivelul tirozinei a regiunii intracitoplasmatice a receptorului, care devine astfel capabila sa fosforileze alte proteine asociate membranei plasmatice. Semnalul amplificat este preluat de proteine citoplasmatice cu activitate tirozin sau treonin/ serin-kinazica i ulterior transmis n nucleu proteinelor ce joaca rolul de factori de reglare ai replicrii i ai transcripiei AND. Factorii de reglare opereaz la nivelul materialului genetic n sensul activrii genelor ce transcriu proteinele implicate n iniierea sintezei AND, fapt care determin depirea de ctre celul a punctului de restricie. Majoritatea proteinelor antrenate n rspunsul celular la factorii de cretere sunt codificate de proto-oncogene, gene care prin diferite mecanisme (mutaie punctiform, rearanjare cromozomial, amplificare genetic sau inserie mutational) se pot activa, devenind oncogene, capabile s induc transformarea malign a celulei (fig. 106).

171

Tabelul 3. Factorii de cretere i aciunea lor asupra celulelor int Factorii de cretere Factorul de cretere epidermal (EGF) Factori de cretere de tip insulinic (IGF-I; IGF-II) Aciunea asupra celulelor inta Stimuleaz proliferarea mai multor tipuri celulare. Stimuleaz proliferarea adipocitelor si a celulelor di tesutul conjunctiv. Stimuleaz proliferarea: - fibroblatilor; Factorul de cretere a fibroblastilor - celulelor endoteliale; (FGF) - mioblatilor. Induce creterea axonal si viabilitatea neuronilor Factorul de cretere neuronal (NGF) simpatici i senzori. Interleukina 2 (IL2) Stimuleaz proliferarea limfocitelor T. Stimuleaz proliferarea celulelor stem i a Interleukina 3 (IL3) majoritatii celulelor precursoare ale multor celule difereniate. Stimuleaz proliferarea celulelor precur-soare ale Eritropoietina eritrocitelor. Stimuleaz proliferarea: - celulelor precursoare ale macrofagelor i Factori de stimulare a coloniilor granulocitelor; granulocitare (G-CSF) - neutrofilelor. Factori de stimulare a coloniilor de Stimuleaz proliferarea: macrofage (M-CSF) - celulelor precursoare ale macrofagelor i granulocitelor; - macrofagelor. Fig. 106 - Principalele proteine codificate de protooncogene ce intervin n transmiterea semnalului de proliferare celular de la factorul de cretere la ADN. Activitatea proto-oncogenelor n oncogene i implicit codificarea unor proteine ce prezint modificri calitative sau/i cantitative conduce la pierderea capacitii celulei de a rspumde corect fa de factorii de cretere. Celulele transformate se comport ca i cum complexul receptor-factor de cretere ar avea un caracter permanent, ramnnd ntro continu stare proliferativ. 7.1.8.1. Competiia celulelor pentru factorii de cretere Deoarece celulele conin numeroase tipuri de receptori, proliferarea este dependent de coexistena mai multor factori de cretere. n organismele pluricelulare, factorii de cretere prezeni n combinaii variate regleaz selectiv diviziunea diferitelor tipuri celulare. Factorii de cretere constituie elemente prin care celulele sunt capabile s controleze proliferarea altor celule (mecanisme paracrine) ce se ncadreaz n clase diferite sau aparin aceleiai clase (mecanisme autocrine).
172

n acest ultim caz, cooperarea intercelular permite meninerea unei anumite densitatea a populaiei celulare. Afirmaia se bazeaz pe rezultatele studiilor interprinse pe culturi celulare. S-a observat c ntr-o cultur de fibroblati formarea monostratului induce inhibarea proliferrii celulare, fenomen cunoscut sub numele de inhibiie de contact sau inhibarea diviziunii celulare dependenta de densitate. Densitatea populaiei celulare n monostrat, la care proliferarea este inhibata, depinde de concentraia factorilor de cretere din mediu. Deoarece factorii de cretere sunt prezeni n mediu n concentraii foarte mici (PDGF=10-10 M), iar celulele int conin numeroi receptori specifici (105 receptori pentru PDGF/ fibroblast), celulele ce alctuiesc populaia se gsesc ntr-o permanent competiie pentru factorii de cretere. n momentul n care densitatea populaiei celulare depaete o valoare prag, concentraia factorilor de cretere scade i n consecina diviziunea celulara este oprit. 7.1.9. Influena adeziunii celulare asupra proliferrii S-a constatat ca celulele cultivate n suspensie, supuse unei permanente agitari, devin sferice i i pierd capacitatea proliferativ, fenomen numit dependena de ancorare a diviziunii celulare. n culturile statice, celulele se ataeaz de suportul solid, prin intermediul contactelor focale ce reprezint locuri de ancorare n matricea extracelular a filamentelor de actin ce alctuiesc citoscheletul. Ataarea impune celulei adoptarea unei forme aplatizate i favorizeaz proliferarea acesteia, fapt ce sugereaz existenta unui mecanism ce cupleaz diviziunea celulara cu organizarea citoscheletului. La majoritatea celulelor organismelor vertebrate, formarea adeziunilor intercelulare i celula-matrice este o condiie important n depirea punctului de restricie . Dup intrarea n perioada sintetic, pn la ncheierea mitozei, celulele pierd parial legturile ce le stabilizeaz n esut i se rotunjesc (fig.107).

Fig. 107 - Celulele ce se gsesc n mitoz pierd legturile ce le stabilizeaz n esut prin dezorganizarea contactelor focale Mecanismul ce st la baza pierderii de ctre celule a adeziunii la substrat (in vitro) sau la matricea extracelular (in vivo) este nc insuficient cunoscut. Un rol important n acest mecanism l joac proteina SRC, care, conform experimentelor cu anticorpi monoclinali, pare a fi concentrate la nivelul contactelor focale. Proteina cu activitate tirozin-kinazica, SRC, poate determina dezorganizarea contactelor focale pe doua ci.
173

Prima cale implic fosforilarea receptorului pentru fibronectin. n urma fosforilrii scade afinitatea receptorului pentru fibronectin (element al matricei extracelulare), ct i pentru talin (protein de adeziune intacelular). Acest fapt conduce la instabilizarea legturilor dintre componentele contactului focal i la eliberarea mnunchiurilor de filamente de actin. A doua cale const n secreia masiv a unei enzime proteolitice, numit activator de plasminogen. Ea este capabil s activeze prin clivarea plasminogenului, plasmina, o alta enzima proteolitic. Printre proteinele degradate de plasmin se numr i proteinele matricei extracelulare, inclusiv fibronectina. Activarea SRC n celulele normale are loc n urma legrii unui factor de cretere la receptorul specific (fig.108).

Fig. 108 - Schema modificrilor ce apar la nivelul contactelor focale ca urmare a recunoaterii i legrii factorilor de cretere de ctre receptori specifici Exist cel puin patru argumente ce stau la baza acestei afirmaii: aciunea SRC are caracter tranzitoriu; SRC este implicat n stimularea proliferrii celulare prin factori de cretere; ntr-o prim etap, stimularea unei celule prin factori de cretere determin pierderea de ctre celula a adeziunii la substrat; in vivo, dezorganizarea structurii complexe de la nivelul contactelor focale nu este suficient pentru inducerea replicrii ea necesit i prezena factorilor de cretere. Gsirea unui rspuns cu privire la modul prin care adeziunea celular declaneaz replicarea AND i depirea punctului de restricie se dovedete a fi foarte dificil. Pn n prezent, se consider c pentru inducerea sintezei ADN, ntr-o celul normal, sunt necesare trei evenimente: ancorarea celulei la matricea extracelular prin asamblarea ntr-o structur complex a proteinelor intercelulare specializate i a elementelor de citoschelet; activitatea acestei structuri prin factori de cretere i eliberarea unui semnal ce dicteaz depirea punctului de restricie; dezasamblarea structurilor ce asigura adeziunile celul-celul i celul-matrice, ca rezultat al eliberrii semnalului.

174

Ciclurile de ataare i detaare celular permit probabil rearanjarea punctelor de contact, implicate n adeziunea celul-celul i celul-matrice. Aceasta face posibil ordonarea i ulterior legarea n esut a celulelor rezultate n urma diviziunii celulare. n celulele maligne dezorganizarea structurilor implicate n adeziunea celular este suficient, pentru generarea semnalului de proliferare.

7. 2. Diviziunea celular
n cea de-a patra perioada a ciclului celular, perioada mitotic, au loc procese distributive, de repartizare n celulele fiice ale constituenilor celulari implicai n interfaz. Totalitatea acestor procese poarta numele de diviziune celular indirect, deoarece nti are loc cariokineza, denumirea fiind sugerat de schimbrile majore ce au la nivelul nucleului celular i apoi citokineza, respectiv separarea maselor de citoplasm (diviziunea citoplasmei). Desfasurarea diviziunii celulare indirecte necesit diferenierea n spaiul intracelular a aparatului mitotic. Acesta este alctuit din dou componente: aparatul cromatic (cromozomii) i aparatul acromatic (fusul de diviziune i centrii celulari). Formarea aparatului mitotic este iniiat de proteine activate prin fosforilare direct sau indirecta de catre MPF. Activarea protein kinazei H1 de ctre MPF face posibil fosforilarea histonei H1 i, n consecin, condensarea cromatinei i apariia cromozomilor. Acest eveniment fascinant al diviziunii mitotice constituie pentru celul un mecanism eficient ce garanteaz repartizarea egal a materialului genetic n celulele fiice. Segregarea cromozomilor ar fi nsa imposibil n absena aparatului acromatic a crui organizare implic fosforilarea indirect a proteinelor asociate cu microtubulii de ctre MPF. Apariia celui de al doilea centru celular confer celulei un caracter bipolar. ntre cei doi poli ai celulei se formeaza fusul de diviziune ce are rolul de a ancora i separa cromatidele surori ale cromozomului mitotic, care se comport ca elemente pasive n procesul de segregare. La celulelor, cu un numar mare de cromozomi, s-a impus rezolvarea problemei uurrii accesului fibrelor fusului de diviziune la cromozomi. Soluia pe care celula a gsit-o, pentru aceasta problem, const n dezorganizarea i reorganizarea membranei nucleare. Modificrile la nivelul membranei nucleare se datoreaz fosforilrii i defosforilrii laminelor, proces reglat direct de MPF. Se apreciaz c MPF nu regleaz doar procesul distributiv al materialuilui genetic, ci i scindarea celulei parentale n celulele fiice (citokineza). Este posibil ca acest mecanism de reglare s se realizeze prin fosforilarea proteinelor asociate filamentelor de actin i miozin ce intr n structura inelului contractil. n funcie de modul de desfurare, se deosebesc dou tipuri de diviziune celular indirect : Mitoza i Meioza.

7.2.1. Mitoza (diviziunea mitotic)

Mitoza (greaca: mithos=a, fir) constituie tipul de diviziune caracteristic celulelor somatice ale tuturor organismelor eucariote. Ea este denumit i diviziune ecvaional, deoarece n cadrul ei celula i conserv garnitura cromozomilal initial, celulele fiice prezentand acelai numr de cromozomi ca i celula parental.

175

Fig. 109 - Schema general a mitozei. Mitoza poate fi imprit n cinci etape caracterizate prin modificri morfologice specifice : profaza, prometafaza, metafaza, anafaza i telofaza. Cea de-a asea etap a diviziunii mitotice, citokineza, debuteaz n anafaz i se ncheie la sfritul ciclului celular (fig.109). A. Profaza Profaza se caracterizeaza prin condensarea cromatinei i individualizarea cromozomilor sub forma unor filamente, subiri, duble i ataate pe faa exoplasmatic a membranei interne nucleare. Filamentele sunt intim asociate formnd un spirem (ghem). Cele doua cromatide ce alcatuiesc cromozomul sunt unite la nivelul centromerului i sunt strns rsucite una n jurul celeilalte (spiralizarea plactonemic). Condensrea cromatinei continu pe intreaga durat a profazei conducnd la scurtarea i ingrosarea progresiv a filamentelor cromatidice. La nceputul profazei centrul celular se divide genernd doi centri celulari. Fiecare conine cte o pereche de centrioli din care unul matur i altul n crestere. Centrii celulari rezultati se deplaseaza spre polii opui ai celulei. Concomitent se nregistreaz dezorganizarea microtubulilor citoplasmatici, parte component a citoscheletului interfazic i apariia fusului de diviziune, structura bipolar alcatuit din microtubuli i proteine asociate, dispus ntre cei doi centrii celulari. Fusul de diviziune se asambleaz iniial n afara nucleului. Profaza se caracterizez prin condensarea cromatinei cu individualizarea cromozomilor bicromatidici, diferenierea fusului de diviziune i dezorganizarea nucleolului (fig. 110).

Fig. 110 - Profaza

176

Creterea gradului de condensare a cromatinei este nsoit de o ncetinire a proceselor de transcripie i sintez proteic. Principalele proteine sintetizate n profaza timpurie i mijlocie sunt cele implicate n condensarea cromatinei i edificarea aparatului acromatic. Scderea gradat a procesului transcriptional determin iniial micorarea volumului nucleolar i ulterior, la sfritul profazei, fragmentarea i completa sa dezorganizare ca rezultat al blocrii sintezei ARN. B. Prometafaza Prometafaza debuteaz prin fragmentarea nveliului nuclear n vezicule delimitate de membran ce staioneaz pe ntreaga durat a mitozei n jurul fusului de diviziune. n urma acestui eveniment, carioplasma fuzioneaz cu hialoplasma formnd mixoplasma. Dezasamblarea membranei nucleare permite accesul fibrelor fusului de diviziune n regiunea nuclear (fig. 111).

Fig. 111. Prometafaz n prometafaza pe cele doua fee opuse ale centromerului se matureaz complexe proteice specilizate n ancorarea cromozomilor de ctre fibrele fusoriale, numite kinetocori. Cei doi kinetocori ai unui cromozom sunt capturai de fibre ale fusului de diviziune ce pleac din centrii celulari opui. Acestea au fost numite fibre kinetocorice. Fibrele fusoriale libere, orientate spre planul ecuatorial al celulei, poart numele de fibre polare. Tensiunea exercitat de fibrele kinetocorice asupra cromozomilor imprim acestora o micare agitat, de oscilare ntre cei doi poli celulari. C. Metafaza Metafaza este inert din punct de vedere sintetic, cromatina atingnd condensarea maxim. Cromatidele surori ale cromozomului metafazic sunt situate una alturi de cealalt. Fibrele kinetocorice aliniaz cromozomii ntr-un singur plan perpendicular pe axa fusului de diviziune, localizat la jumatatea distanei ce separ polii celulari, formand placa ecuatorial sau metafazic (fig. 112). Alinierea cromozomilor n planul ecuatorial al fusului de diviziune constituie principalul eveniment al metafazei.

177

Fig. 112 - Metafaza: alinierea cromozomilor n planul ecuatorial al fusului de diviziune, formnd placa ecuatorial sau metafazic Mecanismul deplasrii cromozomilor spre regiunea ecuatorial a celulei i a alinierii lor n placa metafazic este prezentat pe larg n capitolul 4. La sfritul metafazei are loc desvarirea replicrii centromerilor, ceea ce are drept consecin separarea cromatidelor surori ale cromozomilor n anafaz. D. Anafaza Primul eveniment ce marcheaz nceputul anafazei const n segregarea kinetocorilor pereche din fiecare cromozom, ca rezultat a replicrii centromerilor i separarea ulterioara a cromatidelor surori. S-a constatat c detaarea, prin micromanipulare, a fibrelor kinetocorice ce ancoreaz unul din cromozomii metafazici nu interfer cu separarea cromatidelor surori. Segregarea cromatidelor tuturor cromozomilor, inclusiv a celui detaat se desfoar simultan. Observaia sugereaz ca iniierea anafazei nu este dictate de aparatul acromatic, ci de un semnal specific. Studiile ntreprinse , pe cultura de celule, au demonstrate ca declanarea anafazei este nsoit de creterea concentraiei intercelulare a ionilor de calciu. Mai mult, creterea experimental a concentraiei de Ca2+ n spaiul intracelular conduce la iniierea prematur a anafazei. Se consider c un semnal, nc necunoscut, determina eliberarea Ca2+ din veziculele delimitate de membrane ce nconjoar fusul de diviziune i prin aceasta, intrarea celulei n anafaz. La trecerea celulei din metafaz la anafaz are loc defosforilarea unui numr mare de proteine, inclusiv histonele H1 i laminele. Identificarea proteinelor antrenate n aceasta reacie ar putea reprezenta o cale spre descoperirea semnalului ce iniiaz anafaza. n anafaza, cromatidele surori ale cromozomilor sunt deplasate spre poli opui ai celulei cu viteza de aproximativ 1mm/min. Acest eveniment ce constituie anafaza A este rezultatul depolimerizrii fibrelor kinetocorice. Concomitent are loc ndeprtarea polilor celulari prin alungirea fibrelor polare, eveniment ce marcheaz anafaza B. Mecanismele prin care se realizeaz translocarea cromozomilor anafazici i ndeprtarea polilor celulari sunt prezentate n capitolul ce prezint elementele componente al citoscheletului (capitolul 4). Cromozomii anafazici, monocromatici sufer de regul un proces de decondesare, nsoit de creterea lor n lungime. La sfritul anafazei, cromozomii se afla grupai la cei doi poli ai celulei i fibrele kinetocorice dispar (fig. 113).

178

Fig. 113 - Anafaza; a) depolimerizarea fibrelor kinetocorice; b) polimerizarea fibrelor polare. E. Telofaza n telofaz se desfoar procese inverse celor ce au loc n profaza. Decondensarea cromozomilor continu. Dac la nceputul telofazei ei au aspectul unor fibre fine, alungite i ncolcite unele n jurul altora formnd cte un spirem, la fiecare pol celular, spre sfritul ei, cromatina i recapt aspectul caracteristic interfazei (fig. 114). Fig. 114 - Telofaza Veziculele delimitate de membran, ce nconjoar fusul de diviziune, fuzioneaz delimitnd doua spaii nucleare situate la polii celulari opui. Porii nucleari se reasambleaz, iar laminele defosforilate se reasociaz formnd lamina nuclear. Un rol important n reorganizarea membranei nucleare l are lamina B ce rmne permanent ataata de membranele veziculelor rezultate prin fragmentarea nveliului nuclear n prometafaz. La nivel nuclear, rencepe sinteza ARN, iar n citoplasm procesul de proteosintez se intensific. Transcripia genelor ARNr, din organizatorii nucleolari i formarea subunitilor ribonucleoproteice (RNP) prin asocierea ARNr cu proteinele specifice importate n nucleul din citoplasma, conduc la reapariia nucleolului. La om, cele cinci perechi de organizatori nucleolari controleaz formarea n telofaz a cinci nucleoli. De regula acetia fuzioneaz astfel nct n majoritatea celulelor interfazice nucleul celular prezint un singur nucleol. Pe ntreaga durata a telofazei are loc dezorganizarea aparatului acromatic.

179

F. Citokineza Citokineza definete fenomenul de diviziune a citoplasmei. Dei s-a constatat ca citokineza nu are loc niciodat naintea diviziunii nucleare, totui procesul mitotic nu condiioneaz strict declanarea diviziunii citoplasmatice. Studiul primei etape a dezvoltrii embrionale la Drosophila melanogaster ne ofer un exemplu concret. Oul fecundat al Drosophilei melanogaster parcurge 13 cicluri de diviziuni nucleare, transformndu-se intr-o celula multinuclear. Prima diviziune citoplasmatica are loc dup cel de-al 13-lea ciclu mitotic si conduce la formarea aproximativ a 600 de celule uninucleate. La celulele animale diviziunea citoplasmatica se realizeaz prin clivarea. Locul de clivare devine vizibil nc din anafaza, sub forma unei adncituri (sunt), pe suprafaa membranei plasmatice. El este situate in planul plcii ecuatoriale, perpendicular pe fusul de diviziune. Experimentele efectuate, in vitro, n care s-a realizat deplasarea prin micromanipulare, a fusului mitotic la nceputul anafazei, au avut drept rezultat invariabil schimbarea situsului de clivare. Aceasta demonstreaz ca planul de scindare al citoplasmei este determinat spaial de poziia fusului de diviziune. Deci, este posibil ca o anume orientare a fusului de diviziune s dicteze caracterul simetric sau asimetric al diviziuni celulare. Recent, s-a constatat ca distrugerea fusului mitotic, prin tratare cu colchicina, dup apariia anului de clivare nu duce la blocarea diviziunii citoplasmice. Deci, dup momentul iniierii clivrii, mecanismul citokinezei devine independent de structurile microtubulare. Rolul principal revine acum inelului contractil. Aceast structura alctuit din filamente de actin i miozin, ataate de fosa citoplasmatic a plasmalemei prin proteine nc necaracterizate, se asambleaz la nceputul anafazei. Contracia inelului prin mecanismul actin - miozin concomitent cu depolimerizarea filamentelor de actin ce-l alctuiesc, conduc la continua micorare a diametrului sau/i implicit la adncirea anului de clivare. La sfritul perioadei mitotice cele doua celule fiice sunt nc unite printr-o regiune central (midbody), ce conine fibre polare ale fusului de diviziune parial dezorganizate nconjurate de hialoplasma (fig. 115). Fig. 115 - n cazul celulelor animale citokineza se realizeaz prin clivare. Separarea completa a celulelor fiice, moment ce marcheaz desavarirea citokinezei, are loc la nceputul urmtoarei interfaze. Fiecare celul fiic motenete n urma citokinezei un set de componente celulare, deoarece, cu excepia nucleului, organitele celulare nu se pot duplica n absena unei copii preexistente, n celula parental are loc duplicarea constituenilor celulari naintea declanrii citokinezei. Duplicarea organitelor celulare se realizeaz prin mecanisme diferite. Mitocondriile cresc i se divid prin fisiune, aparatul Golgi i reticulul endoplasmatic se fragmenteaz n vezicule din care se vor fi construite noile organite celulare, n timp ce ribozomii se multiplic prin asamblarea elementelor constituente (ARNr i proteine ribozomale).
180

innd cont de numrul de copii ale organitelor celulare dintr-o celul eucariot i de duplicarea lor naintea diviziunii, se apreciaz c celula nu dispune de un mecanism specializat de distribuire a organitelor celulare. S-a constatat c suprafaa total a celulelor fiice este mai mare dect cea a celulei parentale. Deci, membrana plamatic a celulei ce se divide este insuficient pentru celulele rezultate n urma citokinezei. Aceasta impune intensificarea biosintezei membranei plasmatice n celula parentalp , anterior declanrii diviziunii celulare.

7.2.2. Meioza (diviziunea meiotic)

Meioza (geac meiosis = micorare) este ntlnit n procesul de gametogenez (formarea gameilor) i reprezint un tip de diviziune nuclear caracteristic celulelor germinale. Meioza se caracterizeaz prin njumtirea numrului de cromozomi n celulele progene. n celulele diploide (2n), inclusiv cele germinale, nucleul conine cu excepia cromozomilor de sex (X i Y), perechi de cromozomi omologi, fiecare pereche fiind alctuit dintr-un cromozom matern i altul patern. Gameii ( spermatozoidul i ovulul) rezultai prin diviziunea celulelor germinale sunt celule haploide (n). n nucleul lor se gsesc cte un cromozom din fiecare pereche de omologi (autozomii) i un singur cromozom ce determin sexul (heterozomii, X i Y). Meioza reprezint un mecanism complex ce implic desfurarea succesiv a dou diviziuni indirecte meioza I i meioza II (fig.116). Fig. 116 - Schema general a meiozei Cele doua diviziuni ce au loc n cadrul meiozei sunt precedate de o interfaza premeitica (identic cu interfaza mitotic) i separate de o interfaz scurt, din care lipsete perioada sintetica (replicarea AND), numit Interfaza meiotic. A. Prima diviziune a meiozei (meioza I) Meioza este o diviziune reducional complet diferit de mitoza somatic. Ea asigur njumtirea numrului de cromozomi n celulele progene. Meioza I are loc imediat dup ncheierea interfazei premeiotice, astfel nct la nceputul acestei diviziuni AND este complet replicat (celulele sunt tetraploide), fiecare cromozom fiind alctuit din doua cromatide surori. Cromozomii bicromatidici omologi (matern i patern) se grupeaz n perechi formnd o structura tetracromatidic, numit cromozom bivalent sau tetrad.
181

Cromatidele nesurori ale bivalentului sunt antrenate n procese de remaniere cromozomial. Separarea ulterioar a cromozomilor omologi , translocarea acestora spre polii celulari opui i citokineza conduc la formarea a dou celule progene. Fiecare progen conine cte dou copii ale unui singur cromozom din fiecare pereche de omologi ai celulei parentale (jumtate din numrul cromozomilor celulei mam). Copiile sunt asociate formnd un cromozom bicromatidic . nelegerea proceselor ce se desfoar pe parcursul meiozei, face necesar prezentarea etapizat a acestui tip de diviziune Similar mitozei somatice, n cadrul meiozei I, se disting cinci etape: profaza, prometafaza, metafaza, anafaza i telofaza. Meioza I se ncheie cu procesul de citokinez. a) Profaza meiozei (profaza I) Profaza I se deosebete de profaza mitotic att sub aspectul duratei (90-95% din desfurarea meiozei I), ct i sub cel al evenimentelor ce au loc n aceast etap. Profaza I este mprit n cinci stadii succesive: leptoten, zigoten, pachiten, diploten i diachineza. Laptotenul se caracterizeaz prin condensarea cromatinei i individualizarea cromozomilor sub forma unor filamente lungi i subiri. Deoarece in perioada S a interfazei, materialul genetic al celulei parentale (2N) a fost replicat, celula n leptoten este tetraploid (4N). Fiecare cromozom este alctuit din dou cromatide surori unite la nivelul centromerului i intim asociate, ceea ce ofer cromozomului un aspect monocromatidic Cromozomi sunt ataai cu ambele capete de nveliul nuclear prin intermediul unor structuri specializate numite placi de ataare. La sfritul leptotenului, pe o singura parte, n lungul fiecrui cromozom se difereniaz o lama proteic (400-700 A grosime), numita ax. Cromatina ce formeaz cromatidele surori proemineaz sub forma unor bucle, pe faa opus axei (fig.117). Fig. 117 - Stadiul de leptoten Zigotenul reprezint stadiul n care are loc conjugarea cromozomilor omologi, numit sinapsis (sinapsarea sau formarea sinapsei). Conjugarea este anticipat de apropierea omologilor. Recunoaterea i gruparea cromozomilor omologi n pereche se realizeaz prin intermediul proteinelor ce intr n alctuirea axelor. Un rol n aceste evenimente il joaca i nveliul nuclear de vreme ce, n zigoten, cromozomi continu s fie ataai de membrana nuclear. Conjugarea cromozomilor omologi poate fi iniiat de la o extremitate a acestora (proterminal) ori din una sau mai multe regiuni centrale (procentric). Iniierea conjugrii implic interacii ntre perechile de baze complementare ale ADN din regiuni cromozomiale specifice numite zigomere sau sinapsomere. Prin stabilirea interaciilor se realizeaz alinierea cromozomilor, astfel ncat fiecare gen dintr-un cromozom este juxtapus genei omologe din cromozomul pereche. Din punctele de iniiere conjugarea se extinde progresiv, cuprinznd integral cromozomii prealiniai ntr-o manier zipper like (zipper = fermoar). Rezultatul desvririi conjugrii l constituie formarea bivalenilor, numii i tetrade, denumire sugerat de numrul cromatidelor ce-i alctuiesc.

182

n momentul conjugrii, cele doua axe ale cromozomilor omologi sunt dispuse fa n fa, la o distanta de 100 nm, constituind elementele laterale ale unei structuri trilamelare, numit complex sinaptinemal. O lama proteic (200 grosime) este interpus ntre cele doua axe. Ea reprezint cea de-a treia component a complexului sinaptonemal i poarta numele de element central. Elementele laterale sunt conectate la elementul central prin intermediul unor benzi protice transversale dispuse n mod similar treptelor unei scri (fig. 118). Fig. 118. Stadiul de zigoten. n meioza I, complexul sinaptonemal joac un rol important n stabilizarea cromozomilor omologi n tetrad. Conjugarea cromozomilor X si Y, pe parcursul meiozei I a celulelor germinale din indivizii masculi, este posibil datorit existenei la cei doi cromozomi de sex a unei regiuni terminale omologe. Pachitenul ncepe n momentul desvririi conjugrii cromozomilor. Ca rezultat al condensrii progresive a cromatinei pe parcursul primelor doua stadii ale profazei I , n pachiten cromozomii sunt mai groi i mai scuri. Principalul eveniment ce caracterizeaz pachitenul este crossing-over-ul, fenomenul ce implica ruperea n aceiai poziie a extremitii unei cromatide materne i a alteia paterne i reunirea ncruciat a fragmentelor. Prin schimbul reciproc de fragmente ntre cromatidele surori se realizeaz recombinarea genetic. Fiecare cromozom va conine gene aparinnd ambilor genitori, noua combinaie de gene creat transmindu-se generaiilor urmtoare. Structura ce ofer premisele desfaurrii crossing-over-ului este reprezentat de complexul sinaptonemal. Procesul de recombinare este catalizat de ctre complexe multiproteice a cror diametru este de 90 nm, numite noduli de recombinare. Acetia se formeaz n interiorul complexului sinaptonemal ocupnd aproape integral spaiul ce separa cele dou axe ale cromozomilor omologi (fig.119). Fig. 119. Stadiul de pachiten Dei implicarea complexelor multiproteice n recombinarea genetic nu a fost demonstrat experimental, se consider c nodulii de recombinare conin ntregul echipament enzimatic necesar clivrii cromatidelor surori, reunirii ncruciate a fragmentelor cromatidice.

183

Participarea acestor noduli n desfurarea crossing-over-ului a fost sugerat de urmtoarele constatri: a. corelarea existent ntre numrul nodulilor i cel al chiasmelor evideniate n stadiul urmtor al profazei I; b. distribuia spaial similar a nodulilor de recombinare i a evenimentelor de crossingover de-a lungul complexului sinaptonemal; c. la mutani de Drosophila melanogaster ce prezint o diminuare i o distribuie anormal a crossing-over-ului, numrul nodulilor de recombinare este mai mic, iar localizarea lor difer de cea ntlnit la indivizii normali. Aceste observaii atest rolul important pe care nodulii l joac n procesul de recombinare, numrul i localizarea acestora n complexul sinaptonemal determinnd frecvena i situsul crossing-over-ului. Diplotenul reprezint stadiul profazei I n care are loc separarea parial a omologilor prin dezorganizarea complexului sinaptonemal. Cromozomi omologi rmn ataai la nivelul situsurilor la care are loc crossing-over-ului. Aceste puncte de ataare poart numele de chiasme. Dei ncep s se formeze n pachiten, chiasmele devin vizibile numai dup desinapsarea cromozomilor ce alctuiesc bivalentul. Concomitent cu desinapsarea omologilor are loc separarea cromatidelor surori ce rmn unite prin centromer. Ambele evenimente sunt caracteristice stadiului diploten . Bivalenii pot prezenta una sau mai multe chiasme, numrul lor ilustrnd frecventa crossing-over-ului. La nivelul fiecrei chiasme, doua din cele patru cromatide ale bivalentului se intersecteaz n spaial delimitat de cromatidele omologe (fig. 120). Fig. 120 - Stadiul de diploten Dei teoretic, chiasmele se pot forma n orice zon cromozomial s-a constatat absen lor n regiunile heterocromatidice. Deci, aceste regiuni nu sunt antrenate n evenimente de crossing-over mpiedic desfurarea unui eveniment similar n zonele imediat nvecinate, ceea ce impune o anumit distan ntre chiasmele situate pe acelai bra cromozomial . Ea a fost denumit distan de interferen . n meioza I, chiasma joac un rol similar celui pe care l are centromerul n mitoz, asigurnd segregarea corect a materialului genetic. Absena chiasmei ntr-un bivalent face imposibil segregarea cromozomilor omologi n urmtoarele etape ale meiozei, fenomen cunoscut sub numele nondisjunctie. n acest caz, o parte din gameii rezultai vor avea un cromozom n minus, n timp ce alii vor conine o copie cromozomial n plus. Deoarece n ocite, diplotenul poate dura luni sau ani, n acest stadiu cromatina sufer un proces de uoar decondensare ceea ce face ca sinteza ARN s fie reiniiat. Diachineza debuteaz cu condensarea cromatinei i blocarea transcripiei. Cromozomii se detaeaz de membrana nuclear. n fiecare bivalent cromozomii omologi sunt unii la nivelul chiasmelor iar cromatidele surorii ale fiecrui cromozom din pereche sunt legate prin intermediul centromerului (fig.121).

184

Fig. 121 - Diachineza n timpul diachinezei chiasmele ncep s se deplaseze spre extremitile cromozomilor, fenomen numit terminalizare. b) Prometafaza meioze I (prometafaza I). n prometafaza l, se dezorganizeaz nveliul nuclear i se formeaz aparatul acromatic. La nivelul centromerelor se difereniaz kinetocorii. Cei doi kinetocori ce se dezvolt pe centromerul unui cromozom bivalent sunt ancorai de fibre kinetocorice ce pornesc de la acelai pol al fusului de diviziune. Kinetocorii de pe centromerul cromozomului omolog sunt legai prin fibre kinetocorice de polul opus. c) Metafaza meiozei I (metafaza I) Mobilizarea bivalenilor spre regiunea ecuatorial a celulei i alinierea lor n placa metafazic, constituie evenimentele caracteristice metafazei I. Cei doi centromeri ai bivalentului sunt orientai spre polii celulari opui (fig. 122). Fig. 122 - Metafaza meiozei I. Bivalenii sunt aliniai n placa ecuatorial. Kinetocorii de pe cromatidele surori sunt orientai spre acelai pol al fusului de diviziune. Chiasmele localizate terminal menin cromozomii omologi unii pe toat durata metafazei I. Sfritul acestei etape este marcat de dispariia chiasmelor i eliberarea cromozomilor din bivalent. d) Anafaza meiozei I (anafaza I) Odat eliberai din tetrada.cromozomii omologi sunt translocai spre polii celulari opui printr-un mecanism similar celui ntlnit n mitoz (depolimerizarea fibrelor kinetocorice i alungirea fibrelor polare). Spre deosebire de cromozomii monocromatidici din anafaz mitotica, cromozomii din anafaza mitozei I sunt bicromatidici (fig. 123). Migrarea la polii celulari ai cromozomilor bicromatidici conduce la reducerea la jumtate a numrului de cromozomi prezeni iniial n celuia parental. Concomitent ncepe procesul de decondensare a cromozomilor. Fig. 123 - Anafaza meiozei I. Cromozomii omologi sunt completseparai i migreaz spre polii opui ai celulei e) Telofaza meiozei I (telofaza I) n telofaza I, cromozomii se gsesc la polii fusului de diviziune. Decondensarea cromozomilor continua fr ca acetia s-i piard individualitatea. Relaxarea cromatinei face posibil renceperea sintezei ARN.
185

Membrana nuclear se reorganizeaz delimitnd cei doi nuclei rezultai n urma diviziunii. Meioza I se ncheie cu procesul de citokineza prin care sunt separate celulele progene. Fiecare progen conine o jumtate din garnitur cromozomial a celulei parentale, dei cantitatea de ADN corespunde unei celule diploide. Aceasta se explic prin existena n fiecare celul a dou copii ale aceluiai cromozom. Datorit recombinrii genetice ce are loc n profaza I, copiile nu sunt perfect identice (fig. 124). Fig. 124 - Celulele fiice rezultate n urma primei diviziuni meiotice Interfaza meiotic Mai scurt dect interfaza mitotic, interfaza meiotic, ce separ cele dou diviziuni meiotice se caracterizeaz prin absena perioadei S. Pe parcursul interfazei meiotice se desfoar procese transcripionale i de proteosintez ce pregtesc intrarea celulei n meioza II. Se apreciaz c acum are loc reorganizarea kinetocorilor, care se poziioneaz pe feele opuse ale centromerului fiecrui cromozom bicromatidic. Reorientarea face posibil segregarea materialului genetic pe parcursul celei de-a doua diviziuni meiotice. Interfaza meiotic nu este ntlnit la toate celulele eucariote, fiind posibil derularea succesiv a celor dou diviziuni. B. A doua diviziune a meiozei (meioza II) n celulele progene, rezultate n urma meiozei I, iniierea celei de-a doua diviziuni meiotice, are loc simultan. Meioza II reprezint, de fapt, o diviziune mitotic, ecvaional, ce asigur repartizarea egal a copiilor cromozomiale din cele dou celule fiice i n consecin formarea gameilor. Etapele i evenimentele celulare caractzeristice acestora sunt similare celor ntlnite n cadrul diviziunii mitotice. Meioza II debuteaz cu profaza II, etap mult mai scurt dect profaza mitotic, n care are loc formarea unui nou aparat acromatic i dezorganizarea nveluului nuclear. Fibrele kinetocorice ce radiaz din polii opui ai fusului de diviziune ancoreaz kinetocorii de pe cele dou cromatide ce alctuiesc fiecare cromozom.Unite prin intermediul centromerului, cromatidele surori sunt deplasate i aliniate n planul ecuatorial al celulei formnd n metafaza II placa metafazic. Sfritul acestei etape este marcat de replicarea centromerului i separarea celor dou cromatide. n anafaza II cromatidele surori sunt translocate spre polii opui ai celulei.Cromozomii monocromatidici anafazici se alungesc ca rezultat al relaxrii cromatinei. n telofaza II decondensarea cromozomilor continu astfel nct la sfritul meiozei II cromatina i recapt aspectul caracteristic interfazei. La polii opui ai celulelor se reorganizeaz nveliul nuclear. Separarea celor patru celule haploide (gameii) este consecina direct a procesului de diviziune citoplasmatic.
186

Capitolul 8 APOPTOZA
Apoptoza reprezint procesul fiziologic de moarte celulara programat (PCD = Programmed Cellular Death). Timp ndelungat au fost studiate doar mecanismele de proliferare i difereniere celular, n vreme ce procesul de moarte celular a fost considerat doar un proces haotic. Procesul apoptotic are loc n toate organismele vii, att n viaa embrionar ct i n cea adult, prin acest mecanism, organismele eliminnd celulele nedorite, nocive sau anormale din punct de vedere funcional. Apoptoza nu rezult din leziune, nu este reversibil i nici nociv pentru organism, ci chiar necesar pentru meninerea normalitii. Drept sinonime pentru apoptoza celular se mai folosesc denumirile: moarte celular normal sau moarte celular fiziologic. Astzi se cunoate c procesul de apoptoz are rol n medierea proceselor de dezvoltare i a efectelor nutriionale care prelungesc cursul vieii. Descreterea anormal a apoptozei poate avea rol n declanarea bolilor autoimune i a evenimentelor legate de senescen (tumorigenez).

8.1. Mecanismele de producere a apoptozei

n cursul procesului de apoptoz se elimin un numr mare de celule fr a se produce vreun proces inflamator. Arhitectura tisular i celular adiacent este pstrat intact i ea umple spaiile lsate goale de celula apoptotic. Celulele apoptotice sunt caracterizate printr-un proces de adunare i redistribuire a cromatinei sub forma unei mase compacte care rmne pe membrana nuclear, urmat de zbrcirea suprafeei celulare. Organitele celulare i in special mitocondriile sunt bine conservate, iar celula apoptotic se rupe n corpusculi apoptotici. Asemenea corpi apoptotici pot transporta antigene (incluznd fragmente de AND intacte), care, n condiii anormale, pot deveni responsabile de dezvoltare de autoanticorpi (n lupusul eritematos sintetic). Deoarece aceti corpusculi sunt rapid generai de celulele vecine i fagocite, ei sunt observai foarte rar chiar i n timus, acolo unde viteza apoptozei este foarte mare. Procesul de apoptoz se desfoar n trei timpi : n faza iniial, celulele individuale, enclavate n esutul normal, pierd legturile cu celulele vecine, cromatina nuclear se condenseaz, rezultnd fragmentarea AND-ului celular; celulele se retract din cauza pierderii de coninut citoplasmic i a condensrii proteinei citoplasmatice; cele mai multe organite citoplasmatice rmn ns intacte; n faza a doua, membrana celular se zbrcete, se gurete i se fragmenteaz, formndu-se corpi apoptotici care conin resturi nucleare; n faza final, celulele vecine i macrofagele fagociteaz aceste fragmente pn la completa lor degradare (fig.125).

187

Fig. 125 - Aspecte de apoptoz Procesul de apoptoz este foarte rapid i dureaz n total cteva ore. Apoptoza ca proces active necesit att energie n form de ATP, ct i sintez de ARN i de proteine. Formarea inozitolfosfailor care determin creterea concentraiei intracelulare de ioni Ca+ este un eveniment precoce al apoptozei, urmat de exportul rapid i selective de ioni i ap, ceea ce are drept consecin condensarea citoplasmei i cromatinei i formarea fragmentelor ADN. Corpusculii apoptotici conin un schelet de proteine crosslinkate (anvelope) rezistente la proteoliz. Recunoaterea celulelor apoptotice i fagocitarea lor de ctre celulele fagocite par a fi mediate de ctre numeroi receptori (vitronectina, tromboplastina etc.) de pe celulele umflate; proteazele dependente de prezena ionilor Ca+ pot participa la degradarea citoscheletului corpusculilor apoptotici. n cursul apoptozei, pe partea extrem a membranei plasmatice apare fosfatidilserina, care, n mod normal, i are sediul pe partea intern a acesteia, aspect ce trebuie luat n considerare, deoarece poate semnifica un semnal de activare a fagocitrii celulelor apoptotice.

8. 2. Necroza
Spre deosebire de apoptoz (moarte celular normal), necroza reprezint o moarte celular patologic; este un proces pasiv care apare sub aciunea unor noxe celulare, avnd drept consecin leziuni grave. n cursul necrozei se produce dilatarea reticulului endoplasmatic, creterea volumului mitocondriilor, flocularea cromatinei nucleare, umflarea celulelor urmat de ruperea, printr-un dezechilibru osmotic, a respectivelor celule. Cromatina devine tot mai compact i nu apare distribuit pe membrana nuclear; apar leziuni ultrastructurale ale organitelor celulare; n final, membrane plasmatic, organitele i nucleul se dezintegreaz, iar resturile sunt digerate de ctre fagocitele infiltrate. n contrast cu apoptoza, n care procesul se produce ntr-o celul solitar, n cazul necrozei procesul apare simultan ntr-un grup de celule n care s-a produs n prealabil o leziune n arhitectura celular. n final, ingestia fagocitar de celule necrozate (n contrast cu cele apoptotice) este acompaniat de eliberarea de mediatori chimici ai inflamaiei, care induc un rspuns de tip inflamator. Aceste aspecte se explic prin existena unui set diferit de semnale, implicat n fagocitoza celulelor apoptotice, n comparaie cu setul de semnale implicat n fagocitarea celulelor necrotice sau a agenilor infecioi.

8.3. Frecvena procesului de apoptoz

Dup cum s-a artat mai sus, apoptoza este un mecanism eficient de eliminare att a anumitor celule n cursul dezvoltrii embrionare ct i a celulelor adulte normale. Exist de obicei un numr de celule normale care sunt depite la un moment dat dintr-o multitudine de cauze; un exemplu este cel al celulelor neuronale care se produc n exces n 188

sistemul nervos al vertebratelor; n acest caz, 50% din diferitele tipuri de neuroni mor curnd dup ce au format conexiunile sinaptice cu celulele int. Aceste celule neuronale au avut probabil o funcie n timpul evoluiei i dezvoltrii, dar au ncetat la un moment dat s mai fie necesare (au atins momentul de regresie a metamorfozei lor). Apoptoza are loc i n celulele adulte somatice, n cursul rennoirii normale a esuturilor.

8.4. Gene implicate n procesul apoptotic 8.4.1. Gene letale

n prezent exist evidena unei gene sau a unui set de gene care codific proteine cu efect letal (de sinucidere) asupra celulei purttoare. Astfel, la organismul nevertebrat Caenorhabditis elegans (nematode) au fost descrise dou asemenea gene: Ced 3 i Ced 4 cu aciune letal; n cazul n care una din aceste gene este inactiva prin mutaie, nu mai survine moartea celular. Aceste dou gene acioneaz autonom pentru a produce moartea celular programat. n mod similar, un numr de gene letale au fost evideniate la mamifere; astfel, sa artat c gena protooncogen c-myc, care n mod normal stimuleaz diviziunea celular, este implicate i n inducerea apoptozei. n cazul genei supresoare de tumori p53, s-a observat cum creterea nivelului proteinei p53 este asociat cu moartea celular apoptotic. Aceste gene s-au dovedit eseniale pentru moartea celular apoptic, apoptoza rezultnd n cazul supra expresiei genelor c-myc sau p53, sau prin coexpresia simultan a mai multor gene. Apoptoza trebuie privit ca un proces fiziologic normal fa de influenele mediului extern; acest proces este mediat de o cascad de transducii de semnale la suprafaa celular, probabil printr-un program genetic ndreptat mpotriva unei stri antiproliferative. Astzi se tiu nc puine lucruri despre cile acestei mori celulare. S-a demonstrat c multe gene letale sunt activate n cursul apoptozei. Dup cum am artat deja, se pare c o cretere a concentraiei ionilor de Ca2+ n citosul ar avea un rol important n funcia de reglare a apoptozei; totui acest mecanism rmne nc neclarificat. Se pare c acest calciu citosolic ar declana i evenimentele secundare legate de activarea transglutaminazelor. Enzimele de membran i citosolice (n particular proteinaza C) implicate n fosforilarea proteinelor au rol central n transducerea semnalelor apoptotice. Pornirea apoptozei necesit inducerea unui program genetic nou. Este posibil ca i oncogenele nucleare cu activitate reglatorie transcripional s aib un rol n apoptoz.

8.4.2. Genele supravieuirii (gene antiapoptotice)

Genele supravieuirii sunt acelea care, n mod normal, acioneaz ca o frn asupra mecanismului de moarte celular normal. Dac aceste gene sunt inactivate printr-o mutaie, multe celule care ar tri n mod normal mai departe sunt supuse, n acest caz, apoptozei. La organismul Caenorhabditis elegans,gena Ced-9 s-a dovedit c acioneaz drept antogonist al morii apoptotice celulare. Activarea anormal a acestei gene Ced-9 face ca moartea celular s nu se mai produc. n cazul contrar, cnd se inactiveaz gena Ced-9, celula intr sub influena genelor Ced-3 i Ced-4, care determin moartea precoce a respectivului organism. Astzi este demonstrat faptul c asemenea gene de supravieuire exist i n celulele mamiferelor. Astfel, la mamifere, s-a descris o protein din constituia membranei interne a mitocondriilor bcl-2, care, n condiii de supraexprimare, determin inhibarea apoptozei.

189

Aceast protein bcl-2 nu stimuleaz proliferarea celular, ci favorizeaz supravieuirea celular ntr-o stare nonciclin; aceeai gen bcl-2 inhib inducerea apoptozei de ctre gena c-myc i face celulele mai puin sensibile la radiaii i droguri citotoxice.

8.5.

Rolul apoptozei n embriogenez i dezvoltare

n prezent se tie c echilibrul apoptotic joac un rol important n embriogenez i dezvoltare. Exprimarea fiziologic a genei bcl-2 (inhibitoare a apoptozei) este prezentat n esuturile fetale unde probabil joac un rol n dezvoltarea i morfogeneza normal. Este demonstrat faptul c exist un impact important al nutriiei din cursul embriogenezei i perioadei precoce de dup natere asupra dezvoltrii nou-nscutului i evoluiei individului n cursul vieii adulte. La specia uman, greutatea mai mare la natere i alptare la sn micoreaz riscul dezvoltrii bolilor cardiace la vrst adult. Pe modele animale s-a dovedit experimental existena unei tumorigeneze crescute n cazul n care respectivele animale au primit o diet bogat n grsimi n cursul embriogenezei, prin scderea nivelului apoptozei, dar nu i atunci cnd aceast diet a fost administrat dup natere i nrcare. Respectivele efecte tumorigene imprimate de dieta bogat n grsimi din cursul embriogenezei au aprut abia la a doua generaie.

8.6.

Aspecte de reglare a apoptozei

De mare importan pentru un organism este meninerea balanei ntre genele letale i genele de supravieuire, dar modul n care se menine aceast balan este n prezent foarte puin cunoscut. Se tie c semnalele extracelulare pot rupe aceast balan, rezultatul fiind supravieuirea sau moartea, dup cum sunt induse sau supresate respectivele gene. S-a dovedit c niveluri nalte ale proteinei corespunztoare genei bcl-2 de la mamifere inhib apoptoza, iar cele ale proteinei corespunztoare genei Ced-9 de la nematodul Caenorhabditis elegans au un efect similar. Experiena in vivo a demonstrat c, n absena hormonilor specifici, multe celule dependente de sistemul endocrin (de exemplu, neuronii i oligodendrocitele) necesit pentru dezvoltare factori neurotrofici i citokine, iar alte celule (tip celule hemotopoietice) necesit unul sau mai muli factori de stimulare (de exemplu, limfocitele T necesit interleukina 2). Trebuie menionat cazul particular al blastomerelor, care supravieuiesc i se divid n cultur, n absena moleculelor semnal exogene; blastomerele sunt unicele celule embrionare care necesit un minimum de comunicare. n general, att supravieuirea ct i proliferarea sunt simulate prin semnale provenite de la alte celule; se pare c exist un control al mediului asupra vieuirii i morii celulare.

8.6.1. Factori implicai n reglarea apoptozei

Factori inductori Printre factorii interni care declaneaz i controleaz apoptoza se numr tiroxina, glucocorticoizii, retinoizii (molecule lipofile). Acetia interacioneaz cu receptorii nucleari, determinnd activarea transcrierii genelor legate de inducerea apoptozei. S-a demonstrat, de asemenea, c un antigen de suprafa al timocitelor (antigenul Fas) este implicat n procesul de apoptoz. Ageni externi nefiziologici, ca radiaiile ionizate, substanele toxice (toxine), drogurile (ageni antitumorali chemoterapeutici), ocul termic ester-forbolul, ionii de Ca++, acioneaz ca inductori ai apoptozei.

190

Factori inhibitori

Factorii de cretere, factorii de activare a macrofagelor, factorii serici i citokinele (aTNF) inhib apoptoza. De asemenea, la vertebrate, apoptoza este inhibat de ctre toi inhibitorii sintezei ARN-ului, ai sintezei proteice, ai proteinkinazei, ai tirozinfosforilrii, ai endonucleazelor, ai transaminazelor i ai proteazelor. A fost evideniat existena unui timing (intrare n funcie la un moment precis) al apoptozei, n special n cursul morfogenezei i dezvoltrii. Aceste aspecte sunt ns foarte greu de urmrit i clarificat, deoarece citoplasma celular i nucleul celular sunt potenial autonome n declanarea procesului de apoptoz, i anume: celulele fr nucleu pot declana apoptoza, dar i nucleii pot declana modificri caracteristice de apoptoz n ADN-ul unor celule intacte. Glucocorticoizi sistem imun apoptoz

Nelson (1992) emite ipoteza conform creia ar exista o implicare neuroendocrin n ntrzierea mbtrnirii ca urmare a dietei hipocalorice. La oareci s-a demonstrat experimental c o diet hipocaloric crete nivelul glicocorticoizilor n cadrul ritmului circadian, cu ncepere nainte de miezul nopii, atingnd vrful chiar nainte de ora prnzului; scderea nivelului de corticosteron are loc dup administrarea hranei; acest rezultat demonstreaz importana ritmului cardiac atunci cnd se urmrete msurarea nivelelor circulatorii ale adrenocorticosteroizilor, ct i faptul c reducerea raportului de colorii poate afecta semnificativ secreia de adrenocorticoizi. Se pare c att indigestia total de calorii ct i pattern-urile de alimentare (perioada de post cu hrnire intermitent/acces continuu la hran) ar putea influena viteza apoptozei i a proliferrii celulare. Hrana hipocaloric cronic crete att nivelul diurn al corticoizilor plasmatici, ct i rata apoptozei. Hrnirea dup o perioad de post apare asociat cu o scdere a ratei de apoptoz. Dieta hipocaloric favorizeaz, prin creterea nivelului corticoizilor (cu rol important n modularea apoptozei), ntrzierea mbtrnirii celulare i a fenomenelor de tumorigenez. Sistemul imun produce un mare exces de limfocite care sunt programate s moar dac nu sunt recrutate pentru rspunsul imun. Se presupune c, n organele nonlimfoide, apoptoza este foarte restrns i foarte rar n comparaie cu cea n sistemul imun. La un individ normal, nivelul de corticoizi i rspunsul glucocorticoid la stres scade cu vrsta, dar acest declin poate fi atenuat printr-o diet hipocaloric. Nivelul crescut de corticoizi cu capacitate de a elimina selectiv, prin apoptoz, celulele limfoide n exces (de exemplu, celule T autoreactive ale sistemului imunitar) caracterizeaz un sistem imunitar tnr. Prelungirea acestei capaciti n cursul vieii adulte ar putea fi ntreinut timp ndelungat printr-o diet hipocaloric. Pentru meninerea unei funcii normale a timusului este necesar un anumit nivel de baz al glucocorticoizilor circulani. Celulele timice intrinseci exprim enzime steroidogene i produc pregnenolon i dezoxicorticosteron. Se pare c aceti steroizi sintetizai local acioneaz ntr-o manier paracrin. Faptul c glucocorticoizii pot fi sintetizai local de organele aparatului imunitar (incluznd aici i timusul) ridic posibilitatea ca o diet hipocaloric s aib efecte favorabile asupra bolii autoimune, prin modularea general local de glucocorticoizi. S-a avansat ipoteza conform creia glucocorticoizii ar putea modula procesul de selecie i maturare, n cursul dezvoltrii sistemului imun. Din cele prezentata mai sus reiese c sistemul imun incluznd timusul ar putea fi un focar important pentru dezvoltarea i pentru efectele de maturare ale glucocorticoizilor, n funcie de modularea dietei alimentare. Corticoizii (sintetizai fie sistemic, fie local) ar putea avea un efect critic asupra proceselor timice i de imprinting, incluznd selecia pozitiv a celulelor CD4 i CD8. 191

Lipidele - 3 i apoptoza

Asocierea acizilor grai saturai cu incidena crescut a bolilor cardiovasculare a determinat substituirea, n dieta alimentar, a grsimilor saturate cu uleiuri vegetale nesaturate ( - 6). n SUA, consumul de grsimi este 170 grame pe zi, din care 90% sunt de origine vegetal. Substituirea grsimilor saturate cu uleiuri vegetale reduce cantitatea de colesterol i de lipide LDL. Acizii grai nesaturai i metaboliii lor servesc nu numai drept componeni structurali ai celulelor i ca substrat pentru sinteza prostaglandinelor, leucotrienelor i trumboxanului, ci ei mediaz i exprimarea genelor. Acidul eicosapentaenoic (EAP) scade proliferarea i stimuleaz apoptoza. Acidul arahidonic (care asigur fluiditatea membranelor celulare) poate activa receptorii nucleari pentru hormoni steroizi, tiroidieni i retinoizi; aceast observaie sugereaz c acizii grai polinesaturai ar putea avea efect direct asupra supresrii genelor H-ras (p.221) n ultima vreme s-a trecut la utilizarea uleiurilor nesaturate -3 extrase din petele oceanic, constatndu-se c acest tip de ulei a adus beneficii, ameliornd severitatea bolii autoimune i prelungirea vieii. Esenial este c acest ulei de pete s fie conservat cu anti-oxidani potrivii (vitamina E), pentru a mpiedica oxidarea i rencezeala n cursul perioadei de pstrare. Lipidele oxidate pot determina formarea de radicali liberi, ceea ce ar putea explica unele rezultate nefavorabile (contradictorii) obinute n studiile anterioare referitoare la efectele uleiurilor de pete. n prezent se recomand o utilizare a uleiurilor de pete -3 ca supliment n diet, dar cu condiia mbuntirii procesului tehnologic (cu adaos de antioxidani corespunztori). Uleiurile nesaturate -3 i -6 duc la scderea bolii arteriosclerotice; n plus -3 au efect favorabil asupra funciei imune i supresoare a tumorigenezei. S-a dovedit c consumul crescut de lipide -3 are la om efecte benefice n caz de artrit, boli cardiovasculare, diabet, boli renale i boli de piele. Efectul uleiurilor de pete asupra apoptozei s-ar realiza prin exprimarea crescut a enzimelor antioxidante i scderea formrii de radicali liberi. Lipidele -3 cresc exprimarea enzimelor de tip superoxiddismutaza i catalaza, care ndeprteaz (mtur) radicalii liberi scad nivelul peroxizilor circulani, reduc stresul oxidativ cronic. Deci lipidele -3, administrate n cadrul dietei alimentare, ar putea scdea producerea de radicali liberi i ar menine un nivel normal de apoptoz.

8. 7. Apoptoz mbtrnire senescen

Printr-un proces de apoptoz controlat genetic n cursul vieii, se produce treptat o pierdere de mas celular, ceea ce duce la mbtrnire. Procesul normal de mbtrnire evolueaz ctre stadiul final de senescen, cnd celulele nu mai prolifereaz, devenind rezistente att la proliferare ct i la apoptoz. O dat cu naintarea n vrst scade eficiena apoptozei, organismul fiind predispus la modificrile legate de vrst (degenerri, dereglri imune, tumorigenez). Dereglarea apoptozei poate duce la alterarea funcie imune, la dezvoltarea bolii autoimune i la tumorigenez. n prezent se tie c o diet hipocaloric (fr malnutriie sau deficiene de elemente eseniale, dar cu scderea aportului de carbohidrai, proteine, grsimi) duce la creterea nivelului apoptozei, ntrziind mbtrnirea, prelungind perioada de via i ntrziind momentul apariiei modificrilor legate de vrst (degenerri, dereglri imune, tumorigenez); pn n prezent sa dat totui prea puin atenie legturii existente ntre prelungirea perioadei de via (prin administrarea unei diete hipocalorice), pe de o parte, i nivelul apoptozei, pe de alt parte. 192

Dei mecanismele implicate n procesul de senescen i tumorigenez rmn insuficient clarificate, se cunoate faptul c acumularea de radicali liberi derivai dintr-un metabolism oxidativ i leziunile celulare rezultate din acionarea radicalilor liberi joac un rol important n aceste fenomene. Printr-o diet hipocaloric se poate reduce stresul oxidativ, homeostazia celular fiind meninut i asigurndu-se prelungirea vieii.

8.8. Apoptoza i starea de boal

Agenii infecioi virali i infecia viral Agenii virali patogeni dezvolt strategii pentru inhibarea apoptozei, permind astfel replicarea viral n celula gazd, a crei via este prelungit. Astfel, s-a demonstrat c adenovirusurile, virusul papilloma uman i SV40 pot modula apoptoza, prin interaciunea unei proteine virale cu proteina celular p53. n cazul infeciei cu virusul HIV1, depleia de limfocite este rezultatul unui proces complex, n care legtura glicoproteinei gp120 (de pe suprafaa virusului HIV1) de antigenul CD4 al limfocitelor T CD4 face celula sensibil la apoptoz, la a doua stimulare. innd cont de acest aspect, Sindromul de Imunodeficien Acut la Om (SIDA) poate fi privit ca un dezechilibru ntre viteza morii celulelor limfocite T CD4 i procesul de rennoire a acestor celule. Apoptoza crescut peste normal poate fi deci nociv prin pierderea unor celule CD4, a cror prezen ar fi att de necesar n cazul de mai sus. Boala autoimun Boala autoimun reprezint o alt consecin a dereglrii apoptozei n sistemul imunologic. n condiii normale, limfocitele (autoreactive) mor prin apoptoz. Un deficit n deleia (dispariia, moartea) lor, predispune la boala autoimun. Supresia apoptozei joac un rol important att n bolile autoimune, ct i n patogeneza cancerului (de exemplu n limfoame). Administrarea de glucocorticoizi exogeni amelioreaz boala autoimun (de exemplu, lupusul eritematos) prin creterea apoptozei. S-a observat de asemenea c o perioad scurt de post sau de regim hipocaloric are efecte evidente asupra sintezei de glucocorticoizi i asupra creterii apoptozei, care contribuie la eradicarea celulelor autoreactive din boala autoimun in vivo. S-a demonstrat c administrarea de uleiuri -3 (din pete oceanic) duce la supresia bolii autoimune i la prelungirea vieii. Celulele CD4-CD8- (precursoare ale celulelor timice T) rezistente la apoptoz, exprim o cantitate mai mare de protein bcl-2 dect celulele CD4+ i CD8+ sensibile la apoptoz, confirmnd astfel c ar exista o corelaie ntre exprimarea genei bcl-2 i rezistena la apoptoz. Apoptoza i procesul de oncogenez

Procesul neoplazic este neles astzi drept o dereglare a echilibrului apoptoz/proliferare celular. Conform ipotezei lui Stryer (1991), toate genele oncogene cunoscute pn astzi ar fi forme alterate ale genelor celulare normale. Aceste gene oncogene pot influena circuitele moleculare care controleaz creterea i dezvoltarea. n acest context trebuie privit i aciunea genei protooncogene celulare c-myc. n condiii normale, gena c-myc, menine un echilibru ntre proliferarea celular i apoptoz. n condiii anormale, un retrovirus cu rol declanator, prin inserie pe respectiva gen protooncogen, poate activa transcrierea genei c-myc, ceea ce are drept consecin o dereglare a echilibrului apoptoz/proliferare celular; n aceste condiii de dereglare a 193

apoptozei, apare o deteriorare a funciei sistemului imun i o cretere a riscului de tumorigenez o dat cu naintarea n vrst. Prin activarea produs prin inseria retrovirusului, gena protooncogen c-myc devine oncogen (implicat n geneza limfomului Burkitt). Se admite astzi c procesul de oncogenez apare n urma unor modificri de replicare a ADN, cnd se produce o acumulare anormal de celule cu mutaie. n general, proporia dintre diviziunea celular i moartea celular determin viteza de dezvoltare a unui proces oncogen. Unele celule canceroase se divid mult mai ncet dect celulele normale, dar procesul neoplazic se poate totui ntinde din cauza perioadei de via prelungite a respectivei celule. Apoptoza trebuie privit ca o msur de protecie care previne transformarea malign. n organisme au evoluat mecanisme eficiente pentru eliminarea celulelor cu leziuni genetice (rezultate dintr-o diviziune neprogramat), supunnd aceste celule transformate apoptozei, drept rspuns la semnalele adverse de cretere. Luvers, apariia unei tumori necesit evenimente genetice secundare care s atrage calea apoptotic; cel mai bun exemplu n acest sens sunt evenimentele mutaionale suferite de gena gp53 supresoare de tumori. Produsul genei gp53 normale a fost numit poliistul molecular, deoarece induce poptoza n celulele care au suferit leziuni ireversibile ale ADN. Mutaii ale genei supresoare ale tumorii gb53 reprezint una din alterrile genetice cel mai frecvent semnalate n cazul tumorilor umane. Genele codificatoare de proteine care confer rezisten la apoptoz ar putea fi, de asemenea, incriminate n oncogenez; o asemenea gen ar fi protooncogen bc1-2 (gen mitocondrial), care inhib apoptoza ntr-un numr de tipuri celulare.

194

Capitolul 9 PROCESUL DE MBATRNIRE-SENESCENA

Sedlow 1974 i Curtis 1996 indic strnsa interrelaie /eficena reparrii ADN-ului (prin excizia leziunilor) i durata de viaa a speciilor. La mamifere (inclusiv la om) perioada lung de viaa se gsete sub controlul unui numr foarte mare de gene (control poligenic), i anume: gene pentru replicarea corect a ADN-ului; gene pentru repararea ADN-ului; gene pentru sinteza de factori antioxidani (enzime etc.); gene pentru sinteza corect a proteinelor; gene pentru supresia de tumori; gene pentru reglarea activitii sistemului inimi. Dup maturarea total a unui organism, ncepe procesul mbtrnirii, acesta reprezentnd inexorabilul declin al capacitai de meninere homeostaziei fiziologice. mbtrnirea reprezint pierderea treptat a masei celulare dintr-un organism, prin apoptoza controlat genetic. Pierderea celulelor premature sau excesive, n cursul unui proces de mbtrnire precoce (de exemplu, sindromul Werner) poate duce la disfuncie de organ sau boal. Procesul normal de mbtrnire evolueaz treptat ctre senescen. Senescena este stadiul final al mbtrnirii cnd celulele nu mai prolifereaz, ele devenind rezistente att la proliferare, ct i la apoptoz (celulele devin senescente n momentul n care telomerele devin brusc prea scurte i nu mai pot suporta o nou diviziune celular).

9.1. Gene implicate n controlul senescenei

Senescena este o caracteristic a organismelor superioare. Acest proces se afl sub un control genetic activ, fiind implicate trei categorii de gene: Gene reglatoare pentru meninerea integritii somatice i a proceselor de reparare. Aceste gene regleaz sistemele intracelulare (mecanismul de reparare a ADN-ului, aciunea enzimelor antioxidante) pn la mecanismele de turnover celular (ale sistemului imun, ale structurilor epidermice etc.) Prin reglarea acestor procese, activitatea respectivelor gene menine un nivel nalt de protecie fa de agenii de stress intrinseci i extrinseci, mpiedicnd acumularea de leziuni somatice responsabile de producerea senescenei. Gene pleiotrope. Aceste gene confer avantaje n stadiile timpurii de via, dar ulterior sufer deleii, avnd n consecin o serie de efecte negative asupra organismului.

Factori genetici individuali. Aceti factori determin fenotipurile procesului de mbtrnire-senescen, care ulterior este modular (amplificat sau meninut la nivel sczut) prin aciunea agenilor din mediu extern. n reglarea mbtrnirii celular i a senescenei, un rol important are, dup ultimele date un ceas (un mecanism programator) reprezentat de telomere. Acestea sunt secvene repetitive de ADN situate la extremitile libere ale cromozomilor liniari. Astfel la om capetele cromozomilor conin 2-3kb de uniti repetitive telomerice, (TTAGGG), n ADN-ul telomeric, secvenele TTAGGG sunt orientate cu extremitile bogate n G spre capul 3 OH 195

al firului de ADN, aprnd astfel, n final, orientate n tandem pe cele dou fire ale dublului lan de ADN cromozomial cu capete libere. Telomerele nu sunt codificatoare (nu conin gene), n celule, ele au rol de a cronometra fiecare diviziune celular, probabil datorit aciunii enzimei telomeraza. Telomelere sunt structuri importante ale arhitecturii cromozomiale, n condiii normale, ele mpiedic fuziunea extremitilor cromozomiale ct i dezintegrarea ADN-ului fiind totodat i responsabil de fixarea cromozomilor pe membrana nuclear. Telomerele au fost deja clonate i secveniate (ADN-ul telomeric reprezentnd 0,03% din totalul ADN-ului genomului uman). Ele nu se sintetizeaz n cadrul ciclului de replicare a lanului ADN corespunztor ci separat sub aciunea telomerazei. Sub aciunea acesteia se adun mai nti blocuri de oligonucleotide telomerice care se fixeaz la capul 3-OH al lanului ADN matria (fig 126). Telomeraza (complex ribonucleioproteic) orienteaz capetele bgate n G ale respectivelor secvenelor telomerice spre extremitatea 3-OH a lanului matri. Aceast alungire a lanului matrice duce la formarea unui loop astfel nct captul 3OH ajunge s serveasc drept primer pentru sinteza unor noi secvene nucleotidice telomerice n apropierea lanului fiic.. ADN-ligaza ajut la fixarea acestor noi secvene telometrice la captul 5 al lanului fiic iar apoi nick-aza cliveaz loop-ul la nivelul subsecventelor telomerice (secvene incomplet sintetizate) astfel nct, n final, capetele celor dou fire de ADN s rmn libere. Pe cele dou fire de ADN telomerele sunt formate din secvene repetitive identice dar aezate n tandem (5-TTAGGG fa de TTAGGG-3-OH). Rezult o caten fiic de aceeai lungime cu catena matrice dar cu secvene telomerice mai puin numeroase; aceast catena fiic va juca rol de matri n runda urmtoare de replicare i va da natere unei noi catene fiice cu un numr i mai mic de secvene telomerice astfel nct, dup un numr de replici, catena fiic rezultat, cu telomerul foarte scurt va deveni incapabil de o nou replicare.

Fig. 126 - Terminalizarea cromozomilor sub aciunea telomerazelor Nu se cunoate nc bine interrelaia dintre apoptoz i lungimea tolomerelor, n cursul perioadei de mbtrnire; se tie doar c apoptoz ntrzie mbtrnirea i supreseaz tumorigeneza, acest fenomen fiind acompaniat att de supresarea leziunilor celulare cumulative, ct i de ce a leziunilor ADN.

9. 2. Principalele mecanisme (ipotetice) implicate n senescen

Aceste mecanisme sunt: Acumularea de mutai somatice; Acumularea de leziuni oxidative; Acumularea de proteine aberante; Acumularea de mutaii n ADN-ul mitocondrial.

196

Plecndu-se de la studiul acestor patru mecanisme, care au o aciune sinergic, s-a ajuns la elaborarea unei teorii a reelei prin care se ncearc ipotetic s se explice astzi intrigarea i interaciunea la nivel molecular a mecanismelor implicate n procesul de senescen (fig. 127).

Fig. 127 - Reeaua interaciunilor dintre diferite mecanisme intracelulare ipotetice implicate n procesul de senescen (dup Kingwood, 1996). A. Acumularea de mutaii somatice n culturile de esuturi prenatale provenite de la roztoare s-a demonstrat c celulele au capacitate foarte nalt de reparare ADN, aceast capacitate scznd o dat cu creterea numrului de pasaje. Culturile celulare de fibroblaste umane diploide au oferit, de asemenea, un model experimental excelent pentru studiul fenomenelor de nbtrnire; pe acest model s-a demonstrat c pentru respectivele celule, dup o perioad de multiplicare activ, timpul de generaie crete, iar apoi mitoza nceteaz progresiv (perioad de senescen); potenialul de cretere n cultur a acestor celule este invers proporional cu vrsta donatorului de celule. O dat cu naintarea n vrst, eficena apoptozei scade, organismul fiind mai predispus la modificrile de vrst (degenerri, dereglri imune, tumorigeneza). n celulele vrstnice exist o frecven nalt de ruperi de lanuri ADN (probabil prin acumularea situs-uri labile la alcalii); concomitent apar modificri ale histonelor, care ngreuneaz accesibilitatea enzimelor la nivelul cromatinei, n vederea aciunii de reparare a ADN. Organismele care triesc mai mult timp fie acumuleaz n cursul vieii cantiti mai mari de ADN lezat dect organismele cu via mai scurt, fie posed sistem de reparare ADN mult mai eficient. Multe teorii referitoare la mbtrnirea celular se bazeaz pe ipoteza leziunii genomului celular somatic,multe dintre aceste teorii postuleaz o relaie ntre viaa celulei i apariia leziunilor (erorilor) ADN. Pn n prezent mutaiile somatice au fost studiate foarte puin. Un asemenea exemplu de mutaii somatice aprut la un moment dat n cursul vieii n organisme este apariia unui spot bleu pe un iris brun. George Martin de la Universitatea Washington din Seattle (1996) estimeaz c mutaiile care ating 7% din genomul uman pot avea capacitatea de a modula apariia unui fenotip al procesului de mbtrnire la om.

197

O singur mutaie nu este suficient pentru declanarea unui proces de mbtrnire, ci sunt necesare cel puin cteva mutaii pentru a modula aspectele multiple ale unui fenotip de mbtrnire (de exemplu sindromul Werner la aduli sau sindromul Giolford la copii). n aceste dou sindroame a fost evideniat o mutaie tip deleie pe braul scurt al cromozomului 8 (Gotto i colab 1982). Strnsa interrelaie dintre mutaii i mbtrnire a fost demonstrat i de constatarea existenei unui grup semnificativ de patern-uri de mutaii somatice specifice de specie n cursul procesului de mbtrnire la mamifere .Tot la mamifere s-a constatat c frecvena unor mutaii intragenice i cromozomiale se afl invers cu longevitatea respectivului organism, cu ct numrul este mai mare cu att viaa respectivului organism este mai scurt. B. Acumulare de leziuni oxidative Produii oxidani rezultai din metabolismul normal determin treptat o dat cu naintarea n vrst, leziuni ale ADN-ului proteinelor i lipidelor. Aciunea acestor produi este echivalenta cu cea a radiaiilor. Aceti produi oxidani contribuie la : - procesul de mbtrnire; - producerea de boli degenerative (prin leziuni somatice celulare, o dat cu mbtrnirea: cancer, boli cardiace, disfuncii imunologice i cerebrale, cataracta). Experimental, s-a demonstrat c leziunile oxidative ale ADN-ului se acumuleaz o dat cu vrsta, un oarece devenind astfel btrn n numai doi ani (cnd se acumuleaz circa un milion de leziuni ADN per celul). Dei organismele posed factori de aprare cu aciune antioxidant (ascorbat tocoferoli, carotenoizi, sistem enzimatic auto oxidant tip superooxiddismutaza), ADN-ul sufer efecte oxidante care se acumuleaz cu vrsta, deoarece respectivele sisteme de aprare nu sunt perfecte. Numrul loviturilor oxidante asupra ADN-ului per celul i per zi este de circa 100 000 la oarece i de zece ori mai mic la om. Enzimele de reparare a ADN-ului ndeprteaz eficient un numr mare de leziuni, dar nu reuesc nici ele s le ndeprteze pe toate. Mutaiile se acumuleaz o dat cu vrsta prin multiplicarea respectivelor leziunilor ADN n cursul diviziunilor celulare. n cursul fosforilrilor oxidative se produc substane oxidante la nivelul mitocondriilor, avnd drept consecin un nivel de zece ori mai mare al leziunilor oxidative la nivelul ADN-ului mitocondrial dect la nivelul ADN ului nuclear. Celulele se apr singure mpotriva unui numr mare de leziuni printr-un turnover constant mitocondrial, prin care se ndeprteaz, probabil, mitocondriile alterate (care produc un numr mare de substane oxidante). Totui leziunile oxidative reuesc s se acumuleze cu vrsta, mai mult n ADN ul mitocondrial dect n cel nuclear. Substanele oxidante produc leziuni i la nivelul proteinelor, enzimele proteolitice protectoare care hidrolizeaz proteinele oxidante nu sunt suficiente pentru a mpiedica acumularea de proteine oxidate o dat cu naintarea n vrst. George Martin de la Departamentul de Patologie i Genetic al Universiti Washington din Seattler arat c exist o strns legtur ntre mbtrnirea biologic intrinsec i biologia neoplozilor, aceast interrelaia dezvoltndu-se pe baza unei instabiliti genomice. Cel puin pentru regnul animal, se consider astzi c biologi neoploziei este un aspect particular al mbtrnirii precoce intrinsece (de exemplu, adenocarcinoamele de colon i prostata). Ca i n cazul senescenei, se pare c n procesul de tumorigeneza radicalii liberi derivai dintr-un metabolism oxidativ au un rol important n provocarea leziunilor celulare. C. Acumulare de proteine aberante S-a artat deja la capitolul referitor la acumularea de mutaii somatice c o dat cu naintarea n vrst apar histone modificate, care ngreuneaz accesibilitatea enzimelor de reparare la nivelul cromatinei, n vederea reparrii ADN.

198

Una dintre teoriile mbtrniri celulare (teoria lui Orgel) susine c apariia ntmpltoare a cromozomilor n genomul celular ar explica acumularea de anomalii n moleculele proteice eseniale din organism. Din punct de vedere teoretic, un asemenea fenomen s-ar explica prin acumularea treptat de ADN, care duce la deteriorarea mai mult sau mai puin rapid a mecanismelor de transcriere i translaie, avnd drept consecin sinteza unor proteine deficitare i scurtarea vieii. Cercetrile din ultimii ani menioneaz alterarea sintezei unor proteine reglatoare n perioada de cretere somatic, ca urmare a unor fenomene epigenice ce apar n cursul vieii, subliniind rolul acestor fenomene n procesul de mbtrnire. Prin fenomene epigenice (epimutaii) se neleg acele evenimente acumulate care pot duce la alternarea structurii i funciei genelor, fr apariia unei modificri n senescena primar a nucleotidelor. n acest fenomen s-ar ncadra reactivrile (paradoxale) unor anumite locusu-uri de pe cromozom (de exemplu cromozomul x la oarece) drept consecin a unor modificri ale strii de metilare a citozinei de pe lanul ADN cromozomial. n 1983 Wilson i Jones arat c metilarea ADN-ului scade o dat cu vrsta (cu excepia celulelor neopolizice). Faptul c alterri n metilarea ADN-ului au fost observate la oareci cu vrsta de 6 luni demonstreaz c aceste modificri sunt determinate viitoarea dezvoltare i adaptare, consecina acestor modificri fiind tulburarea sintezei unor proteine reglatoare n perioada de cretere somatic. Din datele acumulate pn n prezent s-a putut conchide c procesul de alterare a metilrii ADN-ului, o dat iniiat, evolueaz permanent, ducnd tardiv n cursul vieii la efecte negative, atunci cnd fora de selecie natural a organismului scade evident. Un alt aspect al acumulrii de proteine aberante este cel al acumulrii cu mult peste nivelul normal admis de proteine oxidante n organism; aceast situaie duce la declanarea unuia dintre cele dou sindroame de mbtrnire prematur: sindromul Werner i sindromul Hutchinson Gilford (progeria). n aceste sindroame de mbtrnire precoce la om se produce o pierdere celular prematur i excesiv, avnd drept consecin disfuncii de organe i instalare unei stri de boal. Sindromul Werner este o boal autosomal de tip recesiv caracterizat printr-un numr mare de degenerai tipice; prima manifestare este ntrzierea creteri urmat de albirea prului atrofia esutului subcutant i a pielii, hiprekeratoza cderea generalizat a prului, alterarea vocii, cataracta bilateral, ulceraii ale pielii n jumtate din cazuri apare diabetul zaharat; alte semne tipice arterioscleroza sever, osteoporoza, atrofia muscular scheletic, degenerescena grav testicular, durata medie de via de 47 de ani, n 10% din cazuri apar neoplasme. n acest sindrom a fost evideniat un linkaj genetic constituit din 5 markeri pe cromozomul 8 (Gotto et al. 1992). Sindromul Rothmund Thomson este o afeciune congenital transmis recesiv, considerat de unii autorii drept o variant a sindromului Werner. Sindromul Hutchinson Gilford (progeri) este o afeciune autosomal cu transmisie recesiv, cu semn de senilitate evident deja la vrsta de 10 ani. Boala prezint complicaii de tip arterioscleroz coronariana, care determin moartea pacienilor n primii 20 de ani de viaa. Pe culturi celulare provenite de la persoane cu acest sindrom, Epstein i colaboratorii au evideniat o restaurare defectuoas a ADN-ului. Celulele nu au supravieuit n cultur mai mult de 11 generaii, celulele au fost incapabile s restaureze corect lanurile de ADN, dup expunerea la raza y i cobalt. D. Acumularea de mutaii n ADN-ul mitocondrial (ADNmt) Se consider ca ntr-un organism normal (cel puin teoretic) toate moleculele de ADNmt sunt identice; aceast situaie caracterizeaz starea de homoplasmie. n cazul unei boli mitocondriale cu mutaii (de exemplu deleie) respectivul organism conine mai multe tipuri de ADNmt, situaia care caracterizeaz starea de heteroplasmie. Starea de heteroplasmie poate aprea i la un individ normal, o dat cu naintare n vrst; o 199

deleie, o dat aprut pe ADNmt, se multiplic exponenial cu vrsta. Nivelele cele mai nalte de deleie au fost evideniate postmitotic n esuturile aerobe muchi scheletici, muchiul cardiac i SNC). Aceste observaii au crescut interesul cercettorilor pentru rolul jucat de mutaiile de la nivelul ADNmt n cursul procesului de mbtrnire i n cel al bolilor neurodegenerative. n cursul procesului normal de mbtrnire la un individ sntos, proporia de ADNmt cu deleie este n foarte rare cazuri mai mare de 0,1% din totalul ADNmt i poate fi detectat numai prin reacia polimerizrii n lan; reiese deci c nu este nc clarificat dac orice deficit funcional poate fi legat de acest tip de mutaie. n schimb n bolile mitocondriale bazat pe selecii ale ADNmt, proporia de ADNmt, cu deleie trebuie s reprezinte mai mult de 60% din ADNmt total pentru a putea fi exprimat fenotipic. Leziunile oxidative continue ale ADN-ului sunt responsabile de scderea capacitaii de fosforilare oxidativ o dat cu naintarea n vrsta. Se pare c un proces similar ar fi implicat n pierderea de neuroni, predispunnd astfel organism la unul din fenotipurile neurodegenerative tip boala Parkinson, boala Huntington sau boala Alzheimer. La om este astzi dovedit statistic c o dat cu vrsta crete i incidena bolilor. Constatrile de pn n prezent ne permit s afirmm c exist o relaie direct ntre procesul de mbtrnire i boal, dei natura precis a acestei relaii nu este nc dovedit experimental din considerente etice. Este foarte greu de afirmat c la o vrst naintat (de 90 ani sau mai mult), ntr-un organism chiar aparent sntos nu au aprut modificri patologice n corp, creier, sistemul senzorial, chiar dac acea persoan nu a fost diagnosticat cu o anumit boal specific. Modificri la nivelul anumitor organe apar n mod normal o dat cu vrsta, cci senescena, dei este un proces fiziologic normal, implic apariia unor aspecte anormale. Astfel n cursul senescenei se produce, treptat, o modificare a genotipului somatic i totodat acumularea unor defecte care pot duce la un moment dat la conturarea unui anumit fenotip (de boal). Unele boli apar cu frecven mai mare la vrst mai naintat, deoarece mecanismele cauzale necesit probabil un timp pentru ca efectele lor s devin evidente. Astfel acumularea de alterri somatice pot duce, n cadrul bolilor degenerative asociate procesului de mbtrnire, la malignizarea ntr-o linie celular. n contextul relaiei mai sus amintite, mbtrnirea-boal se poate afirma c exist o relaie fundamental direct ntre mbtrnire i cancer. Se pare c acelai mecanism care protejeaz organismul mpotriva acumulrii unor leziuni responsabile de senescen protejeaz organismul i mpotriva unor mutaii ce duc la declanarea cancerului. Astzi sunt considerai factori care ntrzie (protejeaz organismul de) senescen: dieta hipocaloric i exerciiul fizic. La om, este dovedit c subnutriia crete ulterior n via, riscul de hipertensiune i boli cardiovasculare. n schimb, nutriia hipocaloric postnatal, la roztoare duce la creterea evident a duratei de via. Implicaiile interaciunii dintre dieta hipercaloric i mecanismul fundamental care regleaz senescena i durata vieii la om rmne nc a fi investigat n detaliu. Referitor la exerciiul fizic se consider c acesta aplic cu regularitate la om poate ameliora modificrile legate de vrst la nivelul mitocondriilor din esutul muscular. Exerciiul fizic, prin creterea vitezei turnover-ului la nivelul mitocondriilor, ntrzie mbtrnirea aparatului mitocondrial din esutul muscular.

200

Capitolul 10 RSPUNSUL IMUNITAR

10. 1. Noiuni generale despre imunitate i sistem imunitar
Imunitatea reprezint capacitatea de a recunoate i neutraliza macromolecule sau celule strine organismului i care, ptrunse n mediul intern, ar putea produce dereglri ale homeostaziei. Imunitatea nltur, n afar de substanele strine i pe cele proprii organismului, dar pe care acesta nu le mai recunoate ca proprii, din cauz c au suferit anumite modificri. Imunitatea poate fi motenit (natural), cnd s-a instalat ca urmare a contactului generaiilor anterioare cu un anumit antigen i se transmite ereditar, sau poate fi dobndit, ca urmare a contactului prealabil al organismului cu un anumit antigen (imunitate consecutiv anumitor boli infecioase). Imunitatea poate fi dobndit i artificial, prin vaccinuri care conin germeni atenuai sau mori imunitate activ, sau prin administrarea unor seruri imune coninnd anticorpi specifici imunitate pasiv. Sistemul imunitar este un sistem responsabil cu aprarea organismului mpotriva efectelor nocive ale corpurilor strine (antigeni). Principala funie a sistemului imunitar este de a recunoate i ataca antigenii strini. Rspunsurile imunitare sunt de dou tipuri: 1. Rspunsuri umorale - ce constau n generarea de anticorpi, (proteine cu structuri similare), cunoscute sub numele de imunoglobuline i care sunt specifici unui anumit antigen; n cadrul rspunsului imunitar umoral specific, anticorpii sunt produi pe calea stimulrii limfotitelor B sau a celulelor plasmatice (plasmocite). 2. Rspunsuri celulare - de exemplu infiltrarea limfocitelor n pielea sau organul grefat. Rspunsul imunitar celular este generat de limfocitele T, care stimulate specific devin celule T efectoare. Celulele T sunt de mai multe feluri n funcie de natura reaciei pe care o determin. Astfel, celulele T pot s: - amplifice rspunsul imunitar (celular T ajuttoare); - reduc rspunsul imunitar (celule T supresoare); - distrug efectiv celelele int (celule T citotoxice). Rspunsul imunitar umoral este important pentru infeciile bacteriene, iar rspunsul imunitar celular pentru aciunea organismului asupra celulelor maligne, a transplatelor tisulare i infeciilor (ciuperci sau fungi). Limfocitele au un rol deosebit de important n cazul, ambelor tipuri de rspuns imunitar, demonstrndu-se c aceste celule pot transforma de la un organism la altul capacitatea de a produce anticorpi i de a rejecta grefele .Aceast capacitate de transfer a limfocitelor face ca ele s joace un rol cheie n apariia rspunsurilor imunitare. Rspunsul imunitar celular este dependent de starea timusului de aceea limfocitele respective poart numele de celule T (timus dependente). Similar, limfocitele productoare de anticorpi, care sunt dependente de mduva osoas poart numele de celule B (de la bursa lui Fabricius, organ limfoid prezent la psri, timus independente). Sistemul imunitar acionez deci ca un sistem defensiv n cazul apariiilor unor infecii. Din aceast cauz, persoanele cu deficiene imunitare congenitale, dac sunt netratate, nu pot supravieui (fig. 128). Un rspuns imunitar const din dou pri: 1. rspunsul specific la un anumit antigen; 2. cretere nespecific a efectului rspunsului. n cazul rspunsului imunitar specific, acesta este mai rapid i cu o amploare mai mare n cazul n care rentlnete un antigen particular. Aceast comportare poart numele de memorie imunitar, i este cea care asigur eficiena ridicat a acinii sistemului imunitar.
201

Fig. 128 - Componentele sistemului imun Un rspuns are dou faze: 1. faza de recunoatere - n care antigenul este recunoscut ca un corp strin; 2. faza activ n care aticorpii elimin antigenul

10.2. Organizarea sistemului imunitar

Celulele eseniale pentru generarea rspunsului imunitar, limfocitele ii au originea n mduva oaselor. Din cadrul sismului imunitar fac parte dou categorii de organe: 1. Organe limfocitare primare: timusul i mduva osoas ce conin celule care dezvolt un proces de maturare a celulelor sensibile la antigeni; 2. Organe limfocitare secundare: nodulii limfocitari, splina i esuturi limfocitare asociate mucoaselor care sunt cele ce conin celule sensibile la antigeni aflate intr-un circuit de recirculare prin organism. 3. Celule libere, circulante n fluxul sanguin. Din aceast categorie fac parte limfocitele, macrofagele, neutrofilele, bazofilele, eozinofilele. Celula central in imunologie este limfocitul. Limfocitele sunt componente celulare specifice pentru antigeni. Ele acioneaz prin receptorii de pe suprafaa membranei, fiecare receptor avnd o nalt specificitate. Diferite clone limfocitare au propria lor specificitate unic. Studiul markerilor de pe suprafaa limfocitar i a activitii lor funcionale a permis identificarea celor dou populaii de limfocite T (timus dependente) i B (bursodependente de la bursa lui Fabricius, organ limfoid ntlnit la psri, timus independente). Celulele T i B circul prin organism pe un traseu bine stabilit prin organele limfocitare secundare. Cele mai multe celule limfocite care sunt recirculate sunt cele de tip T, al cror ciclu complet dureaz aproximativ 24 de ore, dar sunt recirculate i celule B, inclusiv cele care au memorie". Originea limfocitelor i diferenierea. La mamifere precursorii limfocitelor apar n insule sanguine din sacul vitelin i migreaz prin placent n ficat, splin i mduv osoas. n timpul vieii mduva osoas produce celule sus care au printre descendenii lor i precursorii limfocitelor. Limfocitele T. Sunt derivate din timus sau influenate de timus n timpul dezvoltrii lor. Ele migreaz nc din timpul vieii fetale n timus unde se difereniaz diferit n zona cortical, fa de zona medular. n zona cortical, aproximativ 90% din celulele T se divid rapid, conin pe suprafa muli antigeni i sunt sensibilile la liza prin aciunea corticosteroizilor. n zona medular, limfocitele n numr redus sunt rezistente la cortizon, se divid lent i conin pe suprafa puini antigeni. Celulele care prsesc timusul dobndesc receptorul pentru antigen, intr n organe limfoide secundare (ganglioni limfatici, splin) i se localizeaz n arii timodependente. Aceste celule T au via scurt. Dac sunt expuse la antigen se maturizeaz n celule sensibilizate care sunt circulante i au via lung. Aceste celule sunt capabile s se transforme n celule efectoare timice dac sunt reexpuse la antigen. Limfocitele T sunt rspunztoare de reactivitatea cutanat ntrziat, aprarea mpotriva anumitor microorganisme, fungi, bacterii patogene, virusuri, respingerea alogrefelor, imunitatea antitumoral. Limfocitele T nu produc anticorpi circulani i nu dau natere la celule secretoare de anticorpi. Exist dou categorii funcionale de limfocite T: limfocite T
202

reglatoare care pot amplifica (celule helper) sau pot suprima (celule supresoare) rspunsurile altor limfocite (T sau B) i limfocite T efectoare, rspunztoare de reacii imune mediate celular, cum sunt: reaciile de hipersensibilitate cutanat ntrziat, respingerea de grefe i tumori, eliminarea de celule infectate etc. Din aceast categorie fac parte limfocitele T citotoxice (celule killer), care particip ultimile la rspunsul imun i limfocitele T de hipersensibilitate ntrziat, care elibereaz limfokine (citokine), glicoproteine care mediaz rspunsul inflamator. Limfocitele B. Limfocitele B i celulele plasmatice produc anticorpi sau imunoglobuline (Ig), proteine plasmatice circulante i sunt rspunztoare de imunitatea umoral. Dup generarea lor n mduva osoas, celulele B imunocompetente migreaz n arii specifice din organe limfoide periferice. Aceste celule au via scurt ca i celulele T i necesit expunerea la antigen pentru a se maturiza n celule B sensibilizate, recirculante, care rspund la reexpunerea la antigen prin proliferare i difereniere prin celule B de memorie i plasmocite. Rolul principal al limfocitelor B este n realizarea imunitii rapide. Rspunsul imun primar are loc la primul contact al limfocitului cu antigenul. Limfocitul se transform n limfoblast (imunoblast) care are un nucleu palid cu o cantitate mare de eucromatin i 2 - 4 nucleoli. Dup activare, limfocitele B se divid i dau natere la clone celulare B. Unele limfoblaste se difereniaz n plasmocite, celule care produc imunoglobuline, iar altele devin circulante, transformndu-se n celule cu memorie, reinnd n memoria lor primul contact cu acelai antigen. Se dezvolt astfel un rspuns imun secundar, prin care la un nou contact cu antigenul, celulele cu memorie l recunosc i se transform mai rapid n imunoblaste.

10.3. Molecule cu rol esenial n cadru sistemului imunitar 10.3.1. Antigenii

Antigenul (Ag) este capabil s provoace un rspuns imun. El reacioneaz att cu receptorii celulelor T, ct i cu anticorpii. O molecul antigenic poate avea mai muli determinani antigenici (epitopi): fiecare epitop se poate lega cu un anticorp individual i o singur molecul care poate deci provoca mai multe molecule de anticorpi. Anumite molecule numite haptene dei nu sunt capabile s provoace rspunsuri imunitare ele nsele, pot ns s reacioneze cu anticorpi existeni i cu celule T receptoare. Asemenea molecule trebuie s se asocieze cu moleculele - purttor pentru a fi antigeni. Pentru anumite chimicale, cum ar fi medicamentele, purttorul poate fi o (auto)protein gazd. Structura teriar, ca i secvena de aminoacid este important pentru determinarea caracterului antigenic. Lipidele pure nu sunt antigeni (nu provoac un rspuns imun), iar acizii nucleici sunt de asemenea slabi antigeni. Antigenii sunt la rndul lor mprii n mai multe categorii, n funcie de factorii necesari a interveni pentru provocarea rspunsului imun, astfel : a. antigeni dependeni de timus necesit participarea celulelor T pentru a provoca producerea de anticorpi (exemple de asemenea antigeni sunt serurile de proteine strine i celulele roii strine de corp); b. antigeni independeni de timus: nu necesit celule T pentru producia de anticorpi, ei stimulnd direct limfocitele B pentru a produce anticorpi Ig; asemenea antigeni sunt polizaharidele bacteriale (din pereii celulari bacteriali) i endotoxinele. Exist i ali factori diferii de proprietile intrinseci ale antigenilor, care influeneaz calitatea rspunsului imun, printre care se pot enumera: natura moleculelor (coninutul de proteine, mrimea, solubilitatea); doza (mic, moderat, mare); calea de intrare (injecie intradermale, intramuscular, intravenoas, subcutanat, pe cale oral, inhalare); adugarea unor substane cu efect sinergetic, de exemplu adjuvante ali antigeni etc.; factorii genetici.
203

10.3.2. Anticorpii
Anticorpii (Ac) sau imunoglobulinele (Ig) sunt molecule proteice heterogene cu proprietatea de asociere specific cu substana care a provocat formarea lor (antigenul). Sunt produi de celulele B i plasmocite, provenite din celule B. Cu excepia Ig naturale, anticorpii se formeaz ca rspuns la o substan strin (Ag). Ig reprezint receptorul celulei B pentru Ag. Imunoglbulinele reprezint 20 % din totalul proteinelor plasmatice. La electroforeza serului, majoritatea Ig migreaz spre gamaglobuline, dar cantiti semnificative migreaz i spre zona betaglobulinic; diferite cantiti de Ig se gsesc n lichidele extravasculare, n secreii exocrine, pe suprafaa limfocitelor. Un anticorp n structura sa de baz este alctuit din patru lanuri: - dou lanuri identice grele (H); - dou lanuri identice usoare (L). Fiecare lan este alctuit din domenii de aproximativ 110 aminoacizi. Domeniile au aceeai structur de baz i la compararea secvenelor de aminoacizi se pot pune n eviden multe arii similare. Domeniul terminal N al lanurilor grele si al celor uoare este foarte important pentru recunoaterea antigenilor, deoarece el cuprinde zona de legtur. Secvena de aminoacid a acestor domenii terminale variaz de la anticorp la anticorp, de aceea sunt cunoscute sub numele de regiuni variabile V. nvecinat cu regiunea variabil a moleculei de anticorp se afl regiunea constant C, constituit dintr-un domeniu n cazul lanurilor uoare i din trei domenii n cazul celor grele (fig. 129). Fig. 129 - Structura de baz a unui anticorp. VL - reprezint domeniul variabil al lanului uor; CL - domeniul constant al lanului uor; VH- domeniul variabil al lanului greu; CH- domoniul constant al lanului greu. Lanurile grele determin clasa (isotipul) anticorpului, precum i funcia fiziologic a unei molecule particulare de anticorp. Cnd un domeniu terminal N al unei molecule de imunoglobuline a reacionat cu un anticorp, molecula sufer o schimbare n conformaia lanurilor grele. Principalele clase de imunoglobuline sunt urmtoarele: - IgM are o molecul mare, constituit din patru uniti de baz meninute ntr-o structur unitar de un lan de legtur, rolul major al acestor imunoglobuline fiind neutralizarea vascular a microorganismelor, n sprecial a viruilor; reprezint 10 % din totalul imunoglobulinelor; - IgG este o imunoglobulin mai mic, care poate uor penetra esuturile; este singura imunoglobulin care penetreaz placenta pentru a furniza protecie imunologic ftului; reprezint 75 % din totalul imunoglobulinelor; - IgA este imunoglobulina cea mai important care apare n mucoase; ea este o secreie a mucoaselor i const din dou uniti de baz unite printr-un lan de legtur; reprezint 15 % din totalul imunoglobulinelor; - IgD este imunoglobina sccretat de limfocitele B i probabil implicat n activarea acestor celule de ctre antigeni; reprezint 0,2 % din totalul imunoglobulinelor; - IgE este imunoglobina produs de plasma celulelor, dar principalul ei rol fiziologic nu este nc cunoscut, dei se bnuiete c este implicat n expulzarea paraziilor intestinali, n inflamaii i alergii; reprezint 0,04 % din totalul imunoglobulinelor.
204

10.3.3. Celule T
Celulele T recunosc un antigen atunci cnd le este prezentat ntr-o form adecvat, adic n general, dup prelucrarea lor de ctre celulele de prezentare (macrofagele). Celulele receptoare T prezint dou lanuri, alfa i beta. Structura probabil a unei astfel de celule este prezentat n figura 130. Fig.130 - Structura celulei receptoare T La fel ca imunoglobulinele, ambele lanuri de celule T receptoare au regiuni variabile, regiunile constante sunt alctuite din domenii, iar lanurile sunt pliate. Aceste similariti au dus la presupunerea c genele pentru celulele T receptoare i au originea n aceleai gene printe ca genele pentru imunogiobuline, ambele fiind membre ale familiei de supergene".

10.3.4. Antigeni de histocompatibilitate

Aceti antigeni nu sunt att de bine definii, dar au un rol important n rspunsul imun. Au denumirea dc antigeni de histocompatibilitate din cauza reaciilor foarte puternice pe care le provoac n cazul nepotrivirii transplanturilor de organe. Sunt implicate n recunoaterea antigenilor de ctre majoritatea celulelor T. Antigenii de histocompatibilitate umani sunt cunoscui sub denumirea de antigeni HLA i sunt la rndul lor de dou tipuri: - antigeni HLA de clasa I; - antigeni HLA de clasa II. n figura 131 se prezint structura acestor antigeni. Acestea sunt glucoproteine de la suprafaa celulelor i au un grad avansat de polimorfism genetic, adic variabilitate genetic ntre indivizi. Majoritatea indivizilor care nu sunt nrudii prezint antigeni HLA diferii, deci este foarte dificil obinerea unei potriviri a acestor antigeni n cazul unor transplanturi de organe de la indivizi nenrudii. Fig. 131 - Structura unor antigeni

10.3.5. Citokinele
Fazele de desfurare ale imunitii naturale i specifice (mpotriva virusurilor i bacteriilor, de exemplu), sunt n mare parte mediate de hormoni proteinici numii citokine. n imunitatea natural citokinele efectuare sunt produse in special de fagocitele mononucleare i astfel sunt numite monokine. Dei monokinele pot fi induse direct de microbi, ele pot fi de asemenea secretate de fagocitele mononucleare celulelor T stimulate antigenic deci ca parte a imuniti specifice.

205

De asemenea, monokinele joac roluri importante fiind continuatori ai activrii limfocitelor, amplificnd astfel mecanismele pentru rspunsurile imune specifice. In imunitatea specific, majoritatea citokinelor sunt produse de limfocitele T activate i se numesc limfokine. Celulele T produc cteva citokine ce regleaz activarea, creterea i diferenierea populaiilor limfocitare variate. Alte citokine, derivate din celulele T activeaz i regleaz celulele inflamatorii care sunt fagocitele mononucleare, neutrofilele i eozinofilele. Aceste citokine sunt molecule efectuare ale imunitii imediate celular i sunt, de asemenea, responsabile pentru comunicaiile dintre celulele sistemelor imune i inflamatorii. Limfocitele i fagocitele mononucleare produc i alte citokine numite factori stimulatori ai coloniei, ce stimuleaz creterea i diferenierea leucocitelor imature in mduva oaselor. Prin urmare, citokinele sunt un grup divers de glicoproteine, avnd urmtoarele proprieti generale: - citokinele sunt produse n timpul fazelor efectuare ale imunitii naturale i specifice i servesc medierii i reglrii rspunsurilor imune i inflamatorii; - secreia citokinelor este un eveniment self-limitat scurt. Citokinele nu sunt stocate ca moleculele pre-formate i sinteza lor este iniiat de o nou transcripie genic. Activarea transcripional este tranzitorie, moleculele de ARNm sunt instabile; combinaia unei perioade scurte de transcripie cu o durat de via a ARNm pentru citokine determin caracterul tranzitoriu al sintezei citokinelor. Odat sintetizate citokinele sunt rapid secretate; - multe citokine sunt produse de diverse tipuri celulare. Citokinele produse deci de tipuri celulare diverse, acioneaz de asemenea, asupra multor tipuri de celule diferite, proprietate numit pleiotropism; - aciunile citokinelor sunt deseori redundante, de fapt fiind implicate mai multe citokine diferite); citokinele influeneaz sinteza altor citokine; citokinele influeneaz aciunea altor citokine (doua citokine pot avea aciune antagonic,ori sinergic-efect crescut ori adiionale); - citokinele, ca i ali hormoni polipeptidici iniiaz aciunea lor prin legarea la receptorii specifici de pe suprafaa celulelor int. Cnd aceeai celul int secret citadine aciunea se numete autocrin; cnd o celula din apropriere secret citokin, aciunea se numete paracrina, iar cnd o celul este stimulat de la distan prin citokinele secretate n circulaie, aciunea este endocrin, ca in cazul hormonilor adevrai; Expresia multor receptori ai citokinelor este reglat de semnale specifice (care pot fi alte citokine, de exemplu). Majoritatea rspunsurilor celulare la citokine este lent, dup o perioad de cteva ore i necesit un nou ARNm i sinteza proteic. Pentru multe celule int, citokinele acioneaz ca regulatori ai diviziunii celulare, adic ca factori de cretere (de pild, ca factori de cretere epiteliali i mezenchimali n repararea tisular). Funciile citokinelor sunt clasificate astfel: mediatori ai imunitii naturale (induse de ageni infecioi din fagocitele mononucleare); regulatori ai activitii, creterii i diferenierii limfocitelor (induse n rspunsul recunoaterii antigenului specific de limfocitele T); activatori ai celulelor inflamatoare nespecifice (induse ca rspuns la recunoaterea antigenului specific de limfocitele T); stimulatori ai creterii leucocitelor imature i ai diferenierii (produi de limfocite stimulate i alte celule). Citokinele ce mediaz imunitatea natural Citokinele ce mediaz imunitatea natural mpotriva infeciei virale i pe cea care iniiaz reaciile inflamatorii mpotriva bacteriilor sunt urmtoarele:- interferonii tip I; - factorul de necroza tumoare; - interleuchina; -1; - interleukina-6: - citokinele inflamatorii cu greutate molecular joas.

206

Interferonul tip (IFN I) Include dou grupe de proteine distincte serologic i anume IFN-A (produse de fagocit molecular n principal) i IFN-B (produse de fibroblast) avnd patru aciuni biologice: 1. IFN de tip I inhib replicarea viral: IFN induce sinteza unui numr de enzime, ca 2-1oligoadenilat, sinteza care interfer cu replicarea ADN ori ARN viral. 2. Aciunea antiviral a IFN este de tip paracrin, adic celula infectat viral secret IFN pentru protecia celulelor vecine nc neinfectate. Se spune c o celul care a rspuns la IFN i este rezistent la infecia viral se afl intr-o stare antiviral; 3. IFN inhib proliferarea celular. Aceast aciune este datorit acelorai enzime care inhib replicarea viral dar i induciei altor enzime ce previne sinteza aminoacizilor, n special a aminoacizilor eseniali ca triptofanul; 4. IFN crete potenialul letal al limfocitelor nativ ucigae; 5. IFN moduleaz expresia molecular autogenelor de histocompatibilitate. Acei interferoni cresc expresia moleculelor din clasa I i inhib expresia celor din clasa II. Deoarece majoritatea limfocitelor citolitice recunosc antigenele strine legate de clasa I de antigene ale complexului major de histocompatibilitate IFN ajut faza efectuare a rspunsurilor imune mediate celular, mrind eficiena uciderii;n acelai timp; IFN poate inhib faza cognitiv a rspunsurilor imune, prevenind activarea ajuttoare. Prin urmarea cele trei activiti funciilor litice ale limfocitelor ucigae si creterea in expresia moleculelor din clasa I a complexului major de histocompatibilitate, acioneaz concertat eradicarea infeciei virale. Factorul de necroz a tumori (FTN) Este principalul mediator al rspunsului gazdei la bacterii gram negative. Sursa celulara major a acestui factor sunt fagocitele mononucleare activate de lipopolizaharidul (endotoxina) derivat din peretele celular al bacteriei. Acest factor, al concentraiei sczute (cea 10-9 M) acioneaz local ca regulator paracrin i autocrin al leucocitelor i celulelor endoteliale, astfel: 1. FNT permite celulelor endoteliale s devin adezive pentru leucocite iniial pentru neutrofile, apoi pentru monocite care se acumuleaz la locurile inflamaiei; 2. FNT activeaz leucocitele inflamatori pentru a omor, n special neutrofilele dar i eozinofilele mononucleare; 3. FNT stimuleaz fagocitele mononucleare i alte celule Nn produc citokine, n special IL-1 Ni IL-6; 4. FNT este un costimulator al activitii celulei T; 5. FNT induce sinteza CSF de ctre celule endoteliale i fibroblaste; 6. FNT exercit o aciune protectoare mpotriva viruilor i amprente expresia clase I de molecule ale complexului major de histocompatibilitate potennd liza mediata de limfocite asupra celulelor infectate viral. De asemenea JFNT exercit aciuni sistematice diverse (este un hidrogen endogen, simuleaz fagocitele mononucleare s secrete IL-1 Ni IL 6, hepatocitele s sintetizeze anumite proteine serice, etc.), iar n concentraii mari poate avea efecte letale (deprim contractilitatea miocardului, reduce presiunea sanguina i perfuzii, cauzeaz trombon intravascular,etc.) Interleukina-1 (IL-1) Funcia principal a IL-1 este acea de mediator al rspunsului inflamator n imunitatea natural. Sursa celular a IL-1 este fagocitul mononuclear activ. Local, acest factor mrete proliferarea celulelor T CD i creterea i diferenierea celulelor B, stimuleaz diferite celule n rspunsul imun, etc. Interleukina-6 (IL-6) Este sintetizat de celule endoteliale, fibroblaste, etc avnd dou aciuni binecunoscutele hepatocite (care sintetizeaz fibrinogen ce contribuie la faza acut) i pe celulele B, ca principal factor de cretere.
207

Citokinele inflamatorii cu greutate moleculara joas: familia interlekina-8 Aceste citokine inflamatorii deriv din: a. celule T activate antigenic; b. fagocite mononucleare,celule endoteliale, fibroblaste sau celule epiteliale; c. plachete. Ele servesc ca principali mediatori secundari ai inflamaiei. Citokinele ce regleaz activarea limfocitelor, creterea i diferenierea Aceste citokinele sunt produse n principal de limfocitele active antigenic, n special din subsetul CD. Aceste celule T sunt utile att pentru rspunsul imun mediat umoral, ct i pentru acela mediat celular, n mare parte prin secreia citokinelor. Citokinele ce acioneaz primar pentru a regla limfocitele, sunt interleukina-2, interleukina4, factorul de transformare a creterii ( -FTC). Interleukina-2 (IL-2) IL-2 este principala citokin responsabil pentru trecerea limfocitelor T de la fazi G la faza S a ciclului celular. Este produs n special de celulele T. CD acioneaz pe aceleai celule care o produc, deci ea funcioneaz ca un factor de cretere endocrin. Acioneaz de asemenea pe limfocitele T din apropiere (pe ambele substraturi CD i CD) i deci este totodat i un factor de cretere endocrin. n timpul rspunsurilor imune fiziologice, ce nu circula n snge pentru a aciona la distan i de aceea nu este considerat un factor de cretere endocrin. Principalele ei aciuni pe limfocite sunt: Interleukina-2 este factorul de cretere endocrin major pentru limfocitele T Ni cantitatea de IL-2 sintetizat de celulele T CD activate este un determinant important al magnitudinii rspunsurilor imune; IL-2 stimuleaz creterea celulelor nativ ucigae i mrete funcia lor catalitica (sunt produse aa numite celule killer-activate de limfokinaz). IL-2 acioneaz pe celulele B umane ca un factor de cretere ct i un stimul pentru sinteza anticorpilor. Deoarece IL-2 este considerat in prezent o "cheie" n imunologia celulei T i un agent terapeutic promitor n lupta anticanceroas, menionm c n structura tridimensional a proteinei a fost identificat recent un helix necesar pentru folding-ul teriar bioactivcare este un mnunchi afla- helical antiparalel (0,3 nm), captul C-terminal formnd helixul ce se extinde de la poziia 117 la 133 n secvenele de aminoacizi. Interleukina (IL-4) IL-4 este produs de celule T CD Ni are efecte importante pe patru timpuri de celule: IL-4 este un factor de cretere i difereniere pentru limfocitele B (putnd fi necesar att pentru proliferare ct i pentru secreia anticorpilor de celulele B ca rspuns la antigenele proteice). IL-4 este singurul factor comutator cunoscut pentru producerea IgE. IL-4 este un factor de cretere autocrin pentru un subset de celule T CD clonate c secret IL4JL-5 Ni IL-6 n contrast cu majoritatea clonelor cere produc IL-2, gamainterferon i limfotoxin; IL-4 este un factor de cretere pentru mastocite i acioneaz sinergic cu IL-3 Nn stimularea proliferrii mastocitelor; IL-4 este de asemenea un factor de activare a macrofagelor (chiar dac efectele de potenare sunt mai reduse dect efectele gama-interferonului). De asemenea, s-a sugerat recent c IL-4 poate contribui si la imunitatea mediat celular.

1. 2. 3. 4.

208

Factorul de transformare a creterii ( - FTC) Celulele T activate antigenic ct i macrofagele activate secret - FC biologic activ. Aciunile acestui factor sunt pleiotropice. El inhib creterea multor tipuri celulare i stimuleaz creterea altora; uneori ns poate fie s inhibe creterea aceluiai tip celular n cultur; - FTC cauzeaz sinteza proteinelor matrice extracelulare asemenea, - FTC determina creterea de noi vase sanguine, un proces numit angiogenez. Ca o citokin, - FTC este poteniala important deoarece antagonizeaz multe rspunsuri ale limfocitelor. De exemplu, - FTC inhib proliferarea celulelor T la miogen policlonali, inhib maturarea celulelor CTL1, inhib activarea macrofagelor, etc. n vivo, anumite tumori pot scpa de un rspuns imun secretnd mari cantiti de - FTC. Citokinele ce activeaz celulele inflamatorii Aceste citokine provin n principal din limfocite T CD i CD i servesc n special activrii funciilor celulelor efectoare nespecifice. Astfel, aceste citokine mediaz faza efectoare a rspunsurilor imune mediate celulare i ele includ gama-interferon, limfotoxin, interleukina-5 i factorul de inhibare a migrrii. Interferonul imun sau gamma (gamma-IFN) Acest interferon (numit i interferonul tip II) induce - ca i interferonul tip I - o stare antiviral i antiproliferativ, ns are cteva proprieti legate de imunoreglare care ii separ funcional de IFN tip I. Este produs att de celulele T ajuttoare CD ce secret IL-2 ct de celulele T CD. n imunoreglare, acest interferon are urmtoarele funcii: 1. Gama-IFN este un activator important al fagocitelor mononucleare. El induce direct sinteza enzimelor ce permit macrofagelor s omoare microbii fagocitai. Citokinele care cauzeaz modificri funcionale n favoritele mono nucleare au fost numite factori de activare a macrofagelor. Astfel, gama-IFN este principalul factor de activare a macrofagelor i el furnizeaz mijloace prin care celulele T activeaz macrofagele; 2. Gama-IFN crete expresia molecular din clasa I de antigene a complexului major de histocompatibilitate, n contrast cu IFN tip I care, la o varietate de tipuri celulare, determin expresia molecular din clasa 11 a acestui complex; 3. Gama-IF acioneaz direct pe limfocite T i B pentru a promova diferenierea; 4. Gama-IFN activeaz neutrofilele (ns mai puin dect FTN sau limfotoxin); 5. Gama-IFN este un activator potent al celulelor nativ ucigae (mai mult dect IFN tip l); 6. Gama-IFN este un activator al celulelor endoteliale vasculare (promovnd adeziunea limfocitelor CD i altereaz caracterele morfologice ce faciliteaz extravazarea limfocitelor). Limfotoxina Limfotoxina este sintetizat de celulele T i de obicei acioneaz local ca un factor paracrin i nu ca mediator al injuriei sinteticele este un activator potent al neutrofilelor furniznd limfocitelor un mijloc de reglare a reaciilor inflamatorii acute. LT este, de asemenea un activator al celulelor endoteliale vasculare acuznd creterea aderrii leucocitelor la endoteliu, producerea citokinelor i modificri morfologice ce faciliteaz extravazarea leucocitelor. Interleukina-5 (IL-5 ) Este produs de celulele T CD activate i mastocitele activate. O aciune important; IL-5 este capacitatea de a stimula centra i diferenierea eozinofilelor i de a activa eozinofilele mature ca acestea sa poat omor helminii.

209

Factorul de inhibare a migrrii Acumularea fagocitelor mononucleare n esuturi depinde de reinere acestor celule ca rspuns la citokinele produse local ce inhib motilitatea. Se considera n prezent c reinerea leucocitele n esuturi este controlat de exprimarea recepionerilor specifici pentru moleculele matrice extracelulare, cum sunt integrinele. Acest factor nu reprezint o citokin unic, fiind donate molecule cu aceast activitate. Citokine ce stimuleaz hematopoieza Reaciile imune i inflamatorii care consum leucocitele induc producerea de noi leucocite care nlocuiesc celulele inflamatorii. Se tie c maturarea unei leucocite implic comutarea la o linie particular cu pierderea capacitii de dezvoltare n alte tipuri de celule mature. Citokinele ce stimuleaz expansiunea i diferenierea progenitorilor din mduva oaselor sunt denumite factori de stimulare a coloanei (FSC). Aciunile acestor citokine sunt influenate de alte citokine. De exemplu FNT, LT, gama-IFN, FTC inhib creterea celulelor din mduva oaselor, n timp ce IL-l, IL-6, mresc rspunsul la aceti factori. Mediatorii creterii leucocitelor imature B ai diferenierii lor sunt interleukina-3 de stimulare a coloniei macrofagelor, factorul de stimulare a coloniei granulocite-macrofag, factorul de stimulare a coloniei granulocitelor B, interleukina-7. n timp ce interleukina-3 (cunoscut ca factor de multitudine) promoveaz expansiunea celulelor ce se difereniaz n toate tipurile de celule mature cunoscute, aciunea inteleukina-7, recent descris, vizeaz progeniturii hematopoietice comutaii la linia limfocitelor B. n concluzie, citokinele exercit numeroase funcii utile organismului, ns n cazul producerii lor excesive se poate instala dezordinea tisular i chiar moartea. Ele servesc creterii chiar i a celulelor nemuritoare, adic celulelor canceroase. De exemplu, IL-6 acioneaz ca factor de cretere pentru multe celule maligne plasmatice (plasmacitoame sau mieloame) B, astfel multe celule tumorale ce cresc autonom secret IL 6 ca un factor de cretere autocrin. Mai mult, IL-6 promoveaz creterea celulelor somatice hibride produse prin fuziunea celulelor B normale cu celule mielomului, adic a "hibridoamelor"ce produc anticorpi monoclinali.

10.4. Relaii de cooperare ntre componentele sistemului imun

Antigenele macromoleculare conin epitopi multipli sau determinani, fiecare din acetia putnd fi recunoscui de un anticorp. Anticorpi sunt produi in RER al celulei B; lg de la suprafaa celulei B este receptorul celulei B pentru antigen. Moleculele de anticorpi secretai neutralizeaz antigenele, activeaz sistemul complement, obsonizeaz antigenele i amplific fagocitoza lor de ctre diferite celule. n plus, diferite izotipuri de anticorpi se leag la receptorii Fc pe eozinofile, mastocite i celule native ucigae i stimuleaz funciile acestor celule ca pe o consecin a legrii antigenului. Ali receptori Fc de pe celulele epiteliale mediaz transportul transepitelial al anticorpilor IgA si IgG. Celulele T recunosc antigenul numai pe suprafaa celulelor accesorii, n asociaie cu produsul unei gene a self-ului, complex major de histocompatibilitate. Prin urmare, celulele T recunosc i rspund la antigenele proteice strine numai cnd antigenul este ataat de suprafaa altor celule, n timp ce celulele B i anticorpii secretai leag antigenele solubile aflate n circulaie sau n faza apoas. Limfocitele T helper i citolitice specifice pentru antigenele proteice strine recunosc deci simultan dou structuri, antigenul strin i o molecul MHC self, prezente pe suprafaa celulelor accesorii sau celulelor int. Celulele accesorii cel mai bine definite pentru limfocite T helper includ: - fagocitele mononucleare; - limfocite B; - celule dendritice (celule de prezentare, respectiv macrofagele);
210

- celule Langerhans ale pielii; - celulele endoteliale. Limfocitele T helper CD+4 recunosc antigenele n asociaie cu produsele clasei a doua a complexului major de histocompatibilitate i celulele CD+8, CTL 1 recunosc antigenii n asociaie cu produsele genice din clasa ntia complexului major de histocompatibilitate. CD4 i CD8 sunt glicoproteine de suprafaa exprimate exclusiv pe sub seturi de celule T mature cu modele distincte de restricie a complexului major de histocompatibilitate. Proteinele exogene strine sunt internalizate n celulele accesorii unde sufer procesarea ntr-un compartiment vezicular acid. Procesarea asigura ca poriuni ale unei proteine (heptone imunodominante) se vor lega la moleculele clasei II a complexului major de histocompatibilitate i vor forma complexe imunogenice. Aceste complexe sunt exprimate pe suprafaa celulelor accesorii, unde sunt recunoscute de celulele T CD+4. Genele complexului major de histocompatibilitate clasa I funcioneaz ca gene ale rspunsului imun; produsele lor se leag selectiv i prezint unele antigene, dar nu altele. Antigenele int pentru CD+8 CTL sunt proteine sintetizate endogen, astfel ca antigenele virale, care sunt procesate i asociate cu moleculele complexului major de histocompatibilitate clasa I. Multe tipuri celulare au capacitatea de a prezenta antigenele celulelor T ajuttoare CD+4. Reglarea expresiei genelor complexului major de histocompatibilitate clasa II reprezint un punct de control important pentru rspunsurile imune. Anomaliile antigenelor de histocompatibilitate asociate unor boli ca spondilita anchilozant. artrita reumatoid, hemocromatoza idiopatic, sindromul Sjogren ct i o serie de boli autoimune (de exemplu lupusul sistemic eritomatos, miastenia gravis, dermatita herpetiform, diabetul insulinodependent etc). Celulele T limitate la un complex de histocompatibilitate exprim clonal receptori proteici heterodimerici (alfa,beta) legai prin legturi disulfidice ce sunt omologi moleculelor Ig. Aceti receptori leag specific antigenul procesat complexat la moleculele complexului major de histocompatibilitate de suprafaa celulelor (APC 1). Rezultatul legrii antigen-complex major de histocompatibilitate la celulele T este o serie de evenimente intracelulare numite cu un termen comun activarea celulei T care ncepe cu generarea celui de al doilea mesager i terminarea cu dezvoltarea funciilor efectuare i proliferarea celulei T. Cele mai timpurii evenimente din aceast cascad includ modificarea fosfolipidelor membranare, activitate crescut a proteinkinazei C, creterea concentraiei n calciul citoplasmatic; apoi cteva proteine sunt fosforilate. Aceti mesageri secundari stimuleaz transcripia genelor necesare pentru rspunsurile proliferative i efectoare ale celulei T. Diviziunea mitotic a celulelor T are ca rezultat expansiunea clonelor de celule cu aceiai specificitate antigenic i astfel amplific rspunsurile imune la un antigen particular. Pe limfocitele B se gsesc markeri fenotipici i moleculari funcionali de suprafa. n plus la Ig i clasa II ale complexului major de histocompatibilitate (cu rol n interaciunea celul T-B), limfocitele B exprim o varietate de proteine de suprafa cu semnificaie funcional (incluznd receptorul C3d pentru virusul Epstein Barr). Aceste proteine de pe suprafaa celulelor B sunt importante deoarece: - ele pot fi de markeri fenotipici de maturitate i ai liniei de celule B; - ele pot funciona activnd ori reglnd celula B; - anticorpi mpotriva proteinelor de suprafa pot fi utilizai s localizeze i s trateze tumori derivate din limfocitele Bd) unele proteine de suprafa sunt receptori pentru citokine. De exemplu, celulele B exprim receptori de nalt afinitate pentru cteva citokine incluznd IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 i IL-6. n general celulele B n repaos exprim un numr sczut de receptori pentru citokine (de la cteva sute la 1.000 per celul), ns exprimarea acestora este crescut pe celulele B stimulate via Ig din membran, cu anticorp anti-lg sau prin ali activatori policlonali. Prin urmare, rspunsurile anticorpului sunt iniiate prin interaciunea antigenului cu molecule Ig specifice de membran de suprafaa limfocitelor B.
211

Aceast interaciune stimuleaz celulele B s intre n ciclul celular, probabil via producere de mesageri secunzi intracelulari. n plus, antigenele proteice ale celulei T sunt procesate de ctre celulele B i prezentate n asociaie clasa II de molecule ale complexului major de histocompatibilitate, limfocitelor T ajuttoare. Interaciunea limitat la complexul major de histocompatibilitate dintre celula B i limfocitele T ajuttoare furnizeaz ea nsi semnale activatoare celulelor B restante i conduce la secreia diverselor citokine de ctre celulele T. Diferite citokine induc proliferarea celulelor B, secreia anticorpilor i alte trsturi ale rspunsului imun umoral la antigenele proteice. Celulele accesorii (de exemplu macrofagele) pot juca un rol important n iniierea rspunsului imun, prezentnd antigenele celulelor T i secretnd citokine ce promoveaz expansiunea i diferenierea ambelor feluri de limfocite, T i B. Principalele funciuni ale fagocitelor mononucleare (monocite, macrofage) n imunitatea natural includ urmtoarele: macrofagele fagociteaz particule strine (microbi, macromolecule, incluznd antigene i chiar esuturi proprii vtmate ori moarte, de exemplu eritrocite senescene); substanele fagocitate sunt degradate de enzimele lizozomale. n plus, aceste celule secret enzime, specii reactive de oxigen, mediatori derivai din lipide, ca prostagladinele, toate acestea omornd microbii, controlnd ntinderea infeciei i pot vtma chiar esuturile normale n imediata vecintate; macrofagele produc citokine care recruteaz alte celule inflamatorii, n special neutrofile i sunt responsabile pentru multe din efectele sistemice ale inflamaiei ( febra, eritemul, tumefierea, creterea temperaturii locale). Macrofagele produc de asemenea factori de cretere pentru fibroblaste i endoteliul vascular ce promoveaz repararea esuturilor vtmate. Fagocitele mononucleare joac urmtoarele roluri n faza cognitiv, de activare i efectuare a rspunsurilor imune specifice: Macrofagele dispun antigene strine pe suprafaa lor intr-o form ce poate fi recunoscut de limfocitele T antigene specifice. Ele secret i conin n membran proteine ce promoveaz activarea celulei T; n faza de efectuare a rspunsurilor imune mediate celular celulele T ajuttoare secret citokine ce activeaz macrofagele. Macrofagele astfel activate sunt mai eficiente in realizarea funciilor fagocitice, degradative i citolitice dect celulele nestimulate. n acest fel, macrofagele figureaz printre principalele celule efectuare ale imuniti medie celular; n faza efectuare a rspunsurilor imune umorale antigene strine, ca microbii, devin nvelite sau opsorizate de anticorpi i proteine ale complementului. Deoarece macrofagele exprim receptori de suprafa pentru anticorpi i anumite proteine ale complementului, ele leag i fagociteaz particulele opsonizate mult mai avid dect pe cele nenvelite (neopsonizate). Astfel, macrofagele particip la eliminarea antigenelor strine prin rspunsuri imune umorale. Capacitatea macrofagelor i limfocitelor de a-i stimula unele altora funciile dovedesc un mecanism de amplificare important pentru imunitatea specific. n plus, la limfocite i fagocitele mononucleare, alte leucocite i granulocite particip n faza efectuare a rspunsurilor imune specifice. Granulocitele, numite i celule inflamatorii, deoarece joac roluri importante n inflamaie i imunitatea natural, au i funcia de a elimina microbi i celulele moarte. Ele sunt stimulate ca i macrofagele, de citokinele derivate din celula T i fagociteaz particule opsonizate. Neutrofilele rspund rapid la stimuli chemotactici putnd fi iniial activate de citokinele produse de macrofage. Ele posed receptori pentru poriunea Fc a anticorpilor i pentru proteinele complementului, migrnd i acumulndu-se la locuri de activare a complementului. Ele fagociteaz particule opsorizate i funcioneaz ca celule efectuare ale imuniti umorale. Eozinofilele exprima receptori Fc pentru o clas de anticorpi IgE, fiind efectori importani in reaciile imune la antigenii ce induc nivelele ridicate de IgE, astfel ca parazii, ele distrug
212

helmini ce rezist deseori enzimelor lizozomale ale neutrofilelor i macrofagelor. Eozinofilele sunt numeroase la locurile reaciilor de hipersensibilitate imediat,in alergie, datorate producerii de anticorpi IgE. Eozinofilele sunt activate i de ali anticorpi ca formula secretat AigA. Creterea i diferenierea eozinofilelor sunt stimulate de o citokin derivat din celula T helper numit interleukina-5, astfel nct activarea celulei T herper poate contribui la acumularea eozinofilelor la locurile cu reacii de infestare parazit i alergice. Bazofilele i mastocitele exprim receptori de nalt afinitate pentru IgE i leag astfel anticorpi IgE. Interaciunea antigenelor cu aceste molecule IgE stimuleaz bazofilele i mastocitele de a excreta coninutul granulelor lor, care sunt mediatori chimici ai hipersensibiliti imediate. Astfel, aceste granulocite sunt celule efectuare ale hipersensibiliti imediate datorit IgE. Prin urmare, citokinele servesc multor funciuni ce sunt critice n aprarea mpotriva agenilor patogeni i furnizeaz legturi ntre imunitate specific i natural. Este tiut c interferonii, de exemplu, au aciunea antiviral, antiproliferativ i imuno modulatoare. Citokinele regleaz de asemenea amplitudinea i natura rspunsurilor imune prin influenarea creterii i diferenierii limfocitelor. n sfrit, citokinele asigur mecanisme de amplificare importante ce fac capabile limfocitele n numr sczut, specifice pentru oricare antigen, s activeze o varietate de mecanisme efectuare pentru a elimina antigenul. Pe de alt parte, cnd rezult un defect n unul din efectorii sistemului imun (limfocitele T i B, fagocite, proteinele complementului) se vorbete de imunocompromis. De asemenea, producia excesiv ori aciunile citokinelor pot conduce la distrucie tisular i chiar moarte. Imunopatia instalat n anumite cazuri poate conduce deci la cronicizare ori moarte. Administrarea citokinelor sau a inhibitorilor lor constituie o abordare potenial pentru modificarea rspunsurilor biologice asociate cu boal. De pild efectele antitumorale ale interleukinei-1 pot fi nregistrate prin 3 mecanisme: direct citolitic; activarea celulelor imune; inducia linfokinelor antitumorale sau facilitarea efectelor lor.

10.5. Baza umoral a rspunsului imun

Este mediat de celulele B, productoare de Ig. S-a stabilit c limfocitele sunt celule care iniiaz rspunsul imunitar specific i care posed memorie imunitar. Unele dintre ele sunt responsabile cu recunoaterea, iar altele cu efectuarea aciunii. Limfocitele efectoare sunt de dou tipuri: celule B i celule T. Cum s-a spus anterior, celulele B produc anticorpi, responsabili cu neutralizarea, opsonizarea sau dizolvarea antigenilor. Celulete T pot fi la rndul lor mprite n trei categorii, n funce de natura lor, astfel: - celule T ajuttoare actioneaz pentru pregtirea terenului de aciune a celulelor T efectoare i supresoare i a celulelor B; - celulele T efectoare distrug antigenii sau determin inflamarea ca rspuns la aciunea antigenului; - celuleT supresoare suspend, atunci cnd acest lucru este necesar, aciunea celulelor T ajuttoare, deci implicit, aciunea celulelor T efectoare i a celulelor B.

213

10.5.1. Prezentarea antigenilor

Primul stadiu al rspunsului imun la aciunea oricrui tip de antigen implic modificarea antigenului de ctre macrofagi. Acesta nu este un proces specific. Macrofagele au rol n concentrarea i prezentarea unor antigene, n prelucrarea antigenelor, n reglarea tipului de rspuns i amploarea rspunsului imunitar. Antigenul purtat de ctre macrofag este apoi prezentat" limfocitelor care sunt predeterminate s reacioneze la antigen. Din cauza tipului de aciune desfurat de ctre macrofagi, acestea sunt denumite celule de prezentare (sau auxiliare). Procesul ce are loc la nivelul celulelor macrofage este o parte esenial a procesului de generare a rspunsului imun care implic celulele T. Calitatea rspunsului este mbuntit de prezena celulelor macrofage datorit, probabil, producerii de factori solubilizani, inclusiv interleukine 1.

10.5.2. Producerea de anticorpi

Producerea de anticorpi implic cel puin patru tipuri de celule: - celulele macrofage care acioneaz ca celule de prezentare - celule B; - dou tipuri ce celule T, ajuttoare i supresoare. Celulele B Anticorpii sunt produi de ctre celulele B, care pot fi uor recunoscute datorit prezenei pe suprafaa lor a imunoglobulinelor. O astfel de celul pare capabil s produc mai multe tipuri de imunoglobuline, pe msur ce se maturizeaz. Astfel, de la producerea de IgM, poate trece la producerea de IgM i IgD pentru ca n final s produc IgG, IgA i IgE. Tipul final de imunoglobulinde la suprafa pare s prezinte natura anticorpului produs de celul. Aceast secven de maturare se potrivete cu cinetica rspunsului, rspunsul primar fiind preponderent IgM, iar cel secundar preponderant IgG (fig. 132). Fig. 132 - Ciclul de dezvoltare al celulelor B; C - lan citoplasmatic; S - lan de suprafa. O parte din celulele B rspund direct la antigenii numii antigeni Tindependeni. Ele au determinani antigenici i repetabili i determin un rspuns cu IgM, nu cu IgG, IgA sau IgE. Asemenea substane pot provoca proliferarea nespecific a celulelor B de memorie (celule produse care prezint aceleai imunoglobuline la suprafa), de accea sunt cunoscute sub denumirea de celule B policlonale mitogene. Pentru aceste aciuni nespecifice pot fi responsabili i ali determinani, alii dect epitopi.

214

Majoritatea celulelor B ns nu rspund direct n majoritatea antigenilor chiar cnd acetia sunt prezentai de celulele ajuttoare adecvate. Este nevoie de nc un semnal de activare pentru stimularea acestor celule B. Deoarece semnalele sunt n mod normal generate de celulele T, antigenii sunt denumii antigeni T-dependeni. Adugarea celulelor T determin un rspuns, chiar dac celulele T singure nu sunt capabile s determine anticorpi. Celulele T sunt de aceea denumite ajuttoare. Celulele T ajuttoare Aciunea celulelor T este specific antigenului. Doar celulele ajuttoare T care au rspuns la antigenul prezentat de ctre celulele macrofage poate n continuare s ajute celulele B. Celulele ajuttoare T recunosc la celulele de prezentare antigenul i antigenul HLA de clasa II ca un complex. Ele recunosc apoi aceeai combinaie de antigen i antigen de clasa II specific celulei B corespunztoare. Chiar dac celulele T sunt separate de celulele B printr-o membran, ele pot nc s stimuleze un rspuns la celulele B, sugernd faptul c factorul solubilizant eliberat de celulele T mediaz efectul de ajutorare a celuleor B. Antigenii de clasa II joac un rol important n activitatea celulelor ajuttoare T. Celulele T de la un individ nu pot coopera cu celulele macrofage i celulele B de la altul. Cnd o celul ajuttoare T ntlnete un antigen pentru prima dat, ea ajut pe de o parte celulele B, iar pe de alt parte declaneaz un proces de transformare i proliferare care are ca efect o cretere a numrului de celele ajuttoare T specifice, disponibile atunci cnd individul va fi din nou supus aciunii antigenului. Rspunsul imunitar la o expunere ulterioar va fi mai rapid i mult mai viguros. Celulele T au glicoproteine de suprafa specifice care acioneaz ca marcatori care le difereniaz. Ele pot fi recunoscute de anticorpii monoclonali. Unele din aceste glicoproteine se gsesc doar la celulele T. Recunoaterea antigenului implic mai muli receptori la suprafaa celulelor T ajuttoare. Celule B, care recunosc antigenul prin imunoglobulinele de suprafa, vd acelai epitop difereniat. De exemplu, haptenele pot fi recunoscute ca antigeni de celulele T doar cuplate cu un purttor, iar haptenele libere pot reaciona cu anticorpii. Celulele T supresoare Efectele celulelor T ajuttoare sunt contrabalansate de celulele T supresoare. Acestea au pe suprafa o glicoprotein specific CDS, iar funcia lor nu este n totalitate cunoscute. Ele par s fie capabile s lege direct antigenul, fr a necesita i aciunea celulelor de prezentare, acionnd mai degrab asupra celulelor ajuttoare T dect asupra celulelor B. Ca i celulele T ajuttoare, celulele supresoare T sunt specifice unui anumit antigen. Aciunea celulelor T supresoare poate fi accentuat de anumite aciuni de imunizare; de exemplu, la animalele de experiment injectarea repetat a unor doze relativ mari de antigen poate duce la toleran n care nu este produs nici un anticorp specific ca rspuns la aciunea antigenului, pe cnd capacitatea de rspuns la ali antigeni rmne nemodificat.

10.6. Rspunsul imunitar mediat de celule

Rspunsul specific antigenului mediat este generat de celule limfocitare T. Celulele T pot s: dezintegreze antigenii specifici: citotoxicitate; elibereze substane solubile biologic active (limfokine) care stimuleaz inflamarea: hipersensibilitate ntrziat.

215

Aceste dou tipuri de rspunsuri ale celulelor T sunt mediate de populaii specifice: citotoxicitatea este determinat de celulele citotoxice T; hipersensibilitatea ntrziat este determinat de celalele T de hipersensibilitate ntrziat. Celulele citotoxice T Celulele citotoxice T dizolv celulele infectate cu virusuri. Aceast citotoxicitate este dependent de virus i doar celulele care prezint proteine virale relevante la suprafaa lor sunt distruse. De vreme ce pe suprafaa celulelor infectate apar proteinele specifice virusului nainte de producerea altor virusuri, celulele citotoxice T sunt foarte importante n faza de refacere, distrugnd celulele infectate nainte de producerea altor particule virale. n comparaie cu celulele T ajuttoare, celulele citotoxice T recunosc antigenii virali mpreun cu antigenii HLA de clasa I. Ele prezint specificitate pentru antigenii HLA, putnd distruge doar celulele care prezint acelai antigen HLA clasa I. Inducerea celulelor citotoxice T necesit celule precursoare i interleukine 2 de la celulele T ajuttoare. Inducerea este declanat de antigenii de clasa I i este reglat de celulele T supresoare. Celulele citotoxice T sunt implicate n rejecia grefelor. Celulele T de hipersensibilitate ntrziat Reacia de tip hipersensibilitate ntrziat este cunoscut de foarte mult timp. Reaciile determinate de vaccinuri sunt de acelai tip. De exemplu, reacia la injecia intradermal cu tuberculin n cazul testului Hantoux este o reacie de acest tip. n contact cu antigenii strini, celulele T de hipersensibilitate ntrziat elibereaz limfokine care mediaz un rspuns imflamatoriu. Limfokinele sunt substane solubile capabite s influeneze cinetica altor celule inflamatoare. Sunt atrase la locul unde are loc reacia de hipersensibilitate ntrziatcelule macrofage, neutrofile i alte limfocite; celulele sunt apoi imobilizate i este declanat inflamarea. Macrofagii pot fi de asemenea activai de linokine s distrug paraziii intracelulari ca microbacteriile. Limfokinele includ interferon, care este bine cunoscut pentru efectul su antiviral direct, dar care activeaz de asemenea un tip de celule ucigae naturale NK (Natural Killer).

10.7. Interaciuni celulare n rspunsul imun

Mecanismele de declanare i control ale reaciilor imune sunt complexe i antreneaz o cascad de reacii de stimulare sau inhibiie ntre diversele populaii celulare i speciile moleculare. n linii mari, succesiunea evenimentelor care au loc dup ptrunderea antigenului n organism este urmtoarea: n cteva minute, antigenul este captat de ctre macrofage i degradat n fagolizozomi n material neantigenic i n componente nalt imunogene. Fraciunile imunogene sunt proiectate pe membrane macrofagului, care le transport la nivelul organelor limfoide secundare. Prin receptorii pentru antigen, limfocitele primesc informaii referitoare la structura imunogenului, acestea sunt traduse i transmise AND-ului care la rndul su v-a ordona diviziunea celular. Clona respectiv ncepe s se multiplice activ, s elaboreze limfokine care vor aciona asupra macrofagelor, a unor limfocite nc nesensibilizate i asupra altor celule accesorii. Macrofagele la rndul lor, elibereaz monokine, amplificnd i mai mult reaciile. Celulele efectuare de la nivelul organelor limfoide formeaz foliculi i centri germinativi unde i vor exercita activitatea distructiv, acionnd asupra antigenului fie direct, prin reacii de citotoxicitate , fie indirect prin secreie de imunoglobuline cu funcii de anticorp. Deoarece limfocitele cu receptori pentru antigenul n cauz prsesc circulaia i se localizeaz n organele limfoide, n primele momente ale stimulului antigenic proporia lor in sngele periferic scade considerabil. Cnd limfocitele B sunt stimulate antigenic ele se divid prin mitoze repetate, dnd natere la clone celulare B. Din acestea unele imunoblaste se difereniaz n plasmocite - celule secretoare de imunoglobuline.
216

Alte imunoblaste se rentorc la forma de limfocit circulant, devenind celule B cu memorie. Acestea rein n memoria lor (n acizii nucleici) primul contact cu antigenul. Anticorpii sintetizai sunt exocitai i depui fie la suprafaa membranei celulare, fie trecui n snge, declanndu-se imunitatea umoral rapid. Dup 24-48 de ore, datorit proliferrii clonale active, celulele de memorie ncep s revin n circulaie, unde patruleaz un timp ndelungat, pregtite s fac fa unui nou atac. Celulele efectuare rmn la nivelul centrilor germinativi unde continu prolifelarea i secreia de limfokine sau monokine, organul limfoid fiind astfel crescut n volum tumefiat i edemaiat. Durata scurt de via a celulelor efectuare reprezint un mijloc eficient de stingere a reaciilor imune. Dup ce complexele antigen-anticorp uor fagocitabile sunt eliminate din organism, celulele efectuare mor, rmnnd de veghe numai celulele de memorie, cu via lung, care asigur supravegherea imunologic. Spre deosebire de limfocitele diversificate clonal, macrofagul capteaz antigenul nespecific, aceiai celul putnd fagocita diferite molecule indiferent de structura lor. Antigenul formnd complexe cu anticorpii, complexele se vor ataa la FcR (receptorul Fc fragment cristalizat), a macrofagului (opsonizare), funciile fagocitare fiind mult activate. Legarea prin poriune Fc a complexelor antigen-anticorp la FcR a macrofagului, induce i formarea unor compui chimici simpli, care ar stimula la rndul lor sinteza i exprimarea pe membrana macrofagului a antigenelor I (asociate regiunii I din MHC major histocompatibility complex class I). Fc este un receptor membranar care leag Ig. Este un dimer constituit din dou jumti C-terminale ale lanurilor H (grele) de Ig. Receptorii Fc sunt glicopreteine rezistente la tripsin, nu i la pronaz. Interaciunea celular ar interesa succesiv cte dou tipuri de celule legate prin puni formate de ctre antigen: macrofag i limfocit TH ( helper) i ulterior limfocit TH i limfocit B. n unele situaii, celula care reprezint antigenul limfocitului T poate fi limfocitul B i nu macrofagul. n aceast interaciune guverneaz aceleai restricii genetice ca acele implicate n interaciunea limfocite T - macrofag, n care macrofagul prezint antigenul "prelucrat" limfocitelor T i eventual cel "neprelucrat" limfocitelor B. Prezentarea antigenului de ctre macrofag att celulelor T, ct i celulelor B, poate fi important n reaciile imune fa de antigene cu molecul mare, care trebuie "sfrmate", operaie de care sunt capabile numai celulele cu funcii fagocitare. Interaciunea s-ar putea instala i simultan, ntre toate 3 tipuri celulare (macrofag, celule T i B) dup cum coopereaz s-ar putea realiza fr contact intercelular, prin mediatori eliberai de limfocitul helper sau ajuttor (TH) care ar activa macrofagul sau direct celula B. De asemenea, cooperarea celular se instaleaz atunci cnd limfocitele sunt expuse stimulilor mitogenici i nu numai celor antigenici. n declanarea i controlul rspunsului imun intervin numeroi factori a cror apariie i dispariie din scen este ordonat de multiple semnale i circuite de reglare i control. De exemplu, o populaie de celule T ajuttoare (TH) activeaz multiplicarea i transformarea unei clone de precursori B spre plasmocite secretoare de imunoglobina dar prin alte canale semnalizeaz i celule T supresoare (TS) care vor controla att proliferarea precursorilor B ct i cea a limfocitelor TH. Astfel se asigur un permanent control homeostatic care menine cadrul normal al reaciilor imune.

10.7.1. Unele mecanisme de aprare imun n infeciile bacteriene

n general, sunt folosite predominant mecanismele imunitii mediate umoral mpotriva speciilor care triesc n afara celulei i cele alte imunitii mediate celular contra celor adaptate la viaa intercelular, fr a fi ns granie rigide ntre cele dou tipuri de reacii imune. De asemenea poate interveni i citotoxicitate anticorpodependent (ADCC), adic mijloace de aprare celular condiionate ins de prezena anticorpilor specifici.
217

10.7.1.1. Mijloace de aprare imun mediate umoral Sunt cunoscute in infeciile bacteriene: a. imobilizarea germenilor ciliai sau flagelai; b. inhibiia aderenei; c. bacterioliza dependent de anticorpi; d. neutralizarea toxinelor bacteriene; e. opsonizarea. Imobilizarea germenilor ciliai sau flagelai poate fi realizat practic de ctre toate clasele imunoglobuline i se dovedete eficient n frnarea virulenei unor germeni gram negative (Salmonella, Proteus, E.coli, etc). Inhibiia aderenei la seroase sau mucoase se realizeaz de asemenea, graie anticorpilor (n special cei din clasa IgA), care interfernd cu adezinele, inhib aderarea i, n consecin, multiplicarea bacteriei. Bacterioliza dependent de complement, ca i n cazul hemolizei prin complementare loc ca urmare a activrii complementului de ctre anticorpii care s-au fixat pe bacterie, mai susceptibile la liz fiind formele SD, ale germenilor gram-negativi (cei gram-pozitivi sunt practice rezisteni). Acest mijloc de aprare antimicrobian nu este important deoarece subiecii cu deficiene congenitale n componentele complementului nu sunt mai semnificativ expui la infecii n comparaie cu cei normali. In schimb, neutralizarea toxinelor bacteriene (realizat aproape exclusive de ctre anticorpii din clasa IgG) este un mijloc important de aprare (n special n cazul germenilor din genurile Clostridium, Staphylococcus etc. care secret exotoxine). In ceea ce privete opsonizarea, se tie c bacteriile au o serie de factori care le protejeaz de aciunea fagocitar a macrofagelor. Este cazul capsulei proteinei M la Streptococcus, microvililor, polizaharizilor capsulari, proprietilor hidrofile ale peretelui celulei bacteriene, etc. mpotriva acestor factori antifagocitari, granulocitele i macrofagele au receptori membranar pentru fragmentul Fc sau pentru fraciuni ale complementului prin intermediul crora bacteria este "prins" pe ci indirecte. "Activarea" fagocitozei sau "opsonizarea" este mediat prin anticorpi din clasa IgG, prin factorii C3 sau C4 ai complementului, ori n absena anticorpilor specifici. De exemplu, pentru a conferi condiii favorabile opsonizrii S. typhimurium, trebuie s fixeze cca 8.000 molecule de IgG pe suprafaa bacteriei. n cazul complexelor antigen + anticorp, fragmentul FC este fixat la FCR i bacteria este fagocitat. n cazul complementelor C3 sau C4, are loc ataarea la receptorul pentru complement, dar nu i fagocitoza, bacteria fiind "reinut" la peretele celulei. Prin urmare, mecanismele opsonizrii includ legarea complexului bacterie-anticorp prin receptorul pentru FC (FCR) sau legarea complexului bacterie-anticorp prin receptorul complement (CR), iar n absena anticorpilor specifici opsonizarea se realizeaz fie prin activarea complementului pe cale alternativ, fie prin agregate de molecule de imunoglobulin fr funcii specifice pentru bacteria respectiv. 10.7.1.2. Mijloace de aprare imun mediat celular Unele bacterii (M .tuberculosis, Toxoplasma etc.), chiar dac sunt fagocitate de ctre macrofagele opsonizate, nu sunt atacate de enzimele lizozomale, fiind inhibat fuziunea lizozomilor cu fagozomii. Nefiind distruse, bacteriile pot persista timp ndelungat n fagozomi sau distrug fagozomi, i ajung n citoplasm. Astfel simpla opsonizare este total ineficient deoarece, dup fagocitare, este omort de regul, celula fagocitat i nu bacteria. Prin mecanisme mediate celular, macrofagele, sunt activate de limfokine eliberate n special din limfocite T, dobndesc proprieti citotoxice i bactericide i prolifereaz la locul infeciei sau inflamaiei. La rndul lor, macrofagele activeaz funciile citotoxice ale limfocitelor T care apoi distruge eficient celulele infectate bacterian (sau viral). Bacteriile sau celulele infectate cu bacterii pot fi lizate spontan, natural i de celule nativ-ucigae (NK).
218

10.8. Reglarea imunologic

Reglarea imunologica este de foarte mare importan mai ales n cazul maladiilor umane, deoarece orice dezordine poate cauza o boal autoimun sau o boal de imunodeficieni.

10.8.1. Reglarea normal

Factorii care regleaz un rspuns imun normal sunt multiplii, dar ei includ disponibilitatea antigenilor i influena anticorpilor anti-idiotip. Disponibititatea antigenitor Rspunsul imun este declanat n mod natural de antigeni. Concentraia de antigeni va scdea n urma metabolizrii sau ndeprtrii acestora, ca urmare a proceselor imune care au loc. Stimulul de baz, pentru rspunsul imun devine deci mai slab, declannd doar clonele care au receptori cu mare afinitate. Rata n care antigenii declanez celulele B este probabil un factor important n limitarea producerii de anticorpi. Anticorpi anti-idiotip Structura zonei de legtur a antigenului este unic pentru fiecare anticorp i poart numele de idiotip. Sunt produi anumii anticorpi anti-idiotip n cadrul unui rspuns imun normal; asemenea anticorpi sunt, prin definiie, autoanticorpi. Se pare c asemenea anticorpi anti-idiotip sunt implicai n cazul reglrii unui rspuns imun normal.

10.8.2. Reglarea alterat

Factorii care regleaz rspunsul imun pot fi manipulai experimental. Ajustarea adecvat a dozei i a ratei de expunere la un anumit antigen, poate mpiedica apariia unui rspuns imun. Aceast stare de absen a rspunsului este cunoscut sub numele de toleran. Mecanismele implicate includ activarea celulelor T supresoare i eliminarea celulelor ajutatoare T i a celulelor B corespunztoare. Exist bineneles, tolerana natural la antigenii proprii. Este esenial ca un sistem imunitar s nu reacioneze cu celulele gazd. Inexistena auto-toleranei duce la apariia bolilor autoimune.

10.9. Intensificarea rspunsului imun

Rolul rspunsului imun este distrugerea antigenilor strini, indiferent dac acetia sunt molecule inerte sau organisme. nteprtarea atigenilor este influenat de mai muli factori printre care: - concentraia de antigeni; - zona de ptrundere a antigenului; - disponitilitatea anticorpilor; - viteza rspunsului imun. Anumii factori nespecifici pot crete efectele anticorpilor. Principalii factori sunt: - celulele fagocitare (macrofagii i leucocitele poliformonucleare care indeprteaz antigenii). - sistemul complementar care poate fi s distrug un organism, fie s faciliteze, fagocitarea sa.
219

10.9.1. Sistemul complement

Sistemul complementar const dintr-o serie de proteine activate pe rnd. Componentele exist n mod normal ca i precursori inactivi, dar o dat activat, o component complementar poate aciona ca o enzim care scindeaz mai multe molecule ale urmtoarei componente din secven. Fiecare precursor este scindat n dou sau mai multe fragmente, ca n figura 133. Fig. 133 - Scindarea unei molecule precursoare sub aciunea unei componenete complementare Fragmentul principal are dou zone active biologic: - o zon pentru legarea de membran celular; - o zon pentru scindarea enzimatic a componentei complementare urmtoare. Fragmentele minore generate prin scindare au proprieti biologice deosebit de importante n faza fluid, cum ar fi, de exemplu, activarea chemotactic. Rolul major al cii complementare este furnizarea unei posibiliti de nlturare i distrugere a antigenului, indiferent dac acesta devine sau nu nvelit cu anticorpul. Funcia de baz a sistemului complementar este probabil opsonizarea microorganismelor i complexelor imune; microorganismele nvelite (opsonizate) cu imunoglobuline i/sau complement sunt mult mai uor recunoscute de macrofagi i mult mai repede fagocitate. Fragmentele minore sunt generate la aproximativ fiecare etap n cascad i contribuie la generarea rspunsului inflamator. Unele dintre ele cresc permeabilitatea vascular, n timp ce altele atrag neutrofilele i macrofagele pentru fazele urmtoare de opsonizare i fagocitare.

10. 9.2. Alte categorii celulare implicate n imunitate

Macrofagele Macrofagele sunt celule echivalente cu monocitele i mpreun cu monocitele, reprezint sistemul mononuclear responsabil cu fagocitoza. Limfocitele i mcrofagele provin din trunchiuri nrudite de celule din mduva spinrii. Monocitele circul doar cteva ore nainte de a intra n esuturi, unde triesc pentru cteva sptmni sau luni, devenind nedifereniabile de macrofagi. esuturile macrofage sunt eterogene n aspect, metabolism i probabil n funcie. O funcie major sistemului de fagocite mononucleare este fagocitoza organismclor care invadeaz organismul gazdei i a altor antigeni. Macrofagii au n interior nite granule care conin diferite enzime degradate cu care distrug materialul fagocitat. Materialul distrus poate fi un organism viabil, celule moarte, un antigen sau un complex imun. Pentru a-i putea ndeplini funcia, macrofagii trebuie sa fie activai n aceast stare, ei prezint o potenialitate distrugtoare crescut. Macrofagii sunt de asemenea importani pentru prezentarea antigenilor altor celule ale sistemului imunitar, aa cum a fost prezentat anterior.

220

Leucocite neutrofile polimorfonucleare Neutrofilele joac un rol foarte important n aprarea organismului n cazul infeciilor acute. Ele pot adera sau pot migra din vasele de snge n esuturi. Aceast migrare apare ca efect a aciunii agenilor chemotactici produi la locul inflamaiei. Neutrofilele sunt celule fagocitare. Din punct de vedere morfo-fiziologic, procesul de fagocitare este similar att neutrofilelor ct i fagocitelor mononucleare. Neutrofilele, n plus, sunt, capabile s degradeze substanele pe care le diger. Realizarea acestei degradri necesit o cantitate considerabil de energie, un consum marit i o producie crescut de superoxid. Celule ucigae (killer) Celulele ucigase sunt celuule non- fagocitare mononucleare cu morfologie limfoid, responsabil pentru citotoxicitatea dependent de anticorp. Ele sunt capabile s recunoasc celulele care au reacionat sub aciunea IgG i le distrug, printr-un mecanism nc necunoscut. Ele nu pot distruge celule n absena anticorpului. Celule ucigae naturale (natural killer) Celulele ucigae naturale ( NK ) arat c limfocitele granulare mari pot distruge celule . n absena anticorpului sau stimulrii antigenice i sunt diferite de celulele ucigae prezentate anterior. Ele pot fi activate nespecific de ageni mitogeni sau interferon i deci pot fi recrutate de orice celul T. De menionat c celule ucigae naturale nu sunt celule ale sistemului imunitar n sens strict ca macrofagii de exemplu, i nu au memorie imunitar. Aria lor potenial n aciune este foarte mare. Organismele care au un deficit de celule ucigae naturale au o inciden , mai mare a tumorilor. Aceste celule sunt considerate foarte importante pentru supravegherea aprrii organismului mpotriva tumorilor.

10.10. Finalitatea rspunsurilor imune

O dat ce sistemul imun a fost iniiat, rezultatul final al aciunii sale depinde de natura i localizarea antigenului, indiferent dac rspunsul predominant a fost de natur umoral sau mediat de celule.

10.10.1. Funcia direct a anticorpilor

Neutralizarea este unul din efectele directe ale anticorpilor, iar IgG este n mod special remarcabil pentru aceasta. Un mare numr de antigeni, inclusiv toxina tetanusului, difteriei i muli virui, pot fi neutralizai de anticorpi. O dat neutralizate, aceste substane nu se mai pot lega de esuturile receptoare; complexul autigen-anticorp rezultat este n general ndepttat din circulaie i distrus de macrofagi. Desi rolul anticorpilor IgE nu este inc cunoscut, ei par s fie implicai n expulzarea paraziilor din tractul gastrointestinal.

10.10.2. Funcia indirect a anticorpilor

Opsonizarea este procesul prin care un antigen devine nvelit cu substane care l face s fie mai uor distrus de celulele fagocitare ( fig. 134).

221

Fig. 134 - Relaia dintre opsonizare i fagocitare.

10.10.3. Uciderea celulelor int

Celulele int ucise ca urmare a unui rspuns imun includ organismele i celule care conin antigeni virali sau tumorali specifici la suprafa. Aceste celule int pot fi distruse de mecanisme specifice.

10.10.4. Procesul inflamator

Inflamarea este definit ca o cretere a permeabilitii vasculare nsoit de infiltrarea celulelor inflamatoare. Creterea permeabilitii vasculare este determinat de un numr de ageni specifici, printre care fragmente de complement.

10.10.5. Controlul prin reacie invers

O etap important a rspunsului imun este declanarea unui mecanism de autocontrol (feed-back), mecanism care mpiedic eventualele reacii de autodistrugere a organismului.

10.11. Genetica sistemului imunitar

Dup cum a fost menionat anterior, fiecare molecul de imunoglobulin este de fapt o protein compus din dou lanuri uoare (L) identice i dou lanuri grele (H) identice, care sunt legate prin puni. Exist doua tipuri de lanuri uoare: - lan uor de tip Kappa; - lan uor de tip Lambda. Lanurile uoare sunt identice la toate clasele de imunoglobuline dar fiecare clas are un lan greu caracteristic, dup cum este prezentat n tabelul urmator: Clasele Ig G Ig M Ig A Ig D Ig E Greutatea molecular 150000 900000 160000 185000 200000
222

Lan greu

Lan uor k/ k/ k/ k/ k/

Fiecare lan al imunoglobulinei conine trei regiuni: - regiunea variabil (V); - regiunea de jonciune (J); - regiunea constant (C). n lanurile grele exist o regiune diversificat (D), aflat ntre regiunile variabile i cea de jonciune. Gena responsabil cu crearea lanului uor Kappa se gsete pe braul scurt al cromozomului 2, n timp ce gena pentru lanul uor Lambda este pe cromozomul 22. Locusul pentru gena lanului greu este pe cromozomul 14. Fiecare din aceste gene este n realitate o gen cluster (ciorchine). Gena cluster pentru lanul greu conine: aproximativ 200 de gene variabile; circa 50 de gene diverse; 6 gene de jonciune una sau mai multe gene pentru regiunea constant a fiecrei clase de imunoglobuline. n fiecare celul plasmatic, printr-un proces de recombinare somatic o gen V, o gen D, o gen J i o gen C sunt alaturate i transcrise ntr-o molecul unic continu a ARN-ului mesager. Restul de ADN al mnunchiului este excizat i constituie marcatori pentru limfocitele de origine ale celulelor B. Se poate produce orice combinaie, acestea ducnd la mai mult de 12000 de combinaii posibile. Suplimentar, se pot nsera extranucleotide la nivelul jonciunii i aceste gene sunt predispuse s sufere mutaii somatice dup ce au fost obinute, ceea ce are ca rezultat o mai mare diverisificare. Dei combinaia VDJ de obicei rmne constant pentru celulele plasmatice i toi descendenii lor, este posibil o schimbare a genelor constante, de exemplu pentru IgM spre IgG, dar specificitatea antigenic rmne neschimbat. Aceasta este realizat iniial de diferitele fragmente ale ARN-ului lipite i secvenializate, cu ajutorul ADN-t recombinat. Receptorul celulelor B este anticorp (de ebicei de tip IgM) i astfel, o celul plasmatic care rspunde la diferii antigeni poate s exprime o combinaie VDJC diferit. Genele cluster pentru lanurile uoare Kappa i Lambda au o structur similar cu aproximativ 200 de gene variabile i 4 gene de jonciune, dar n schimb au o genconstant i nu au gene diferite. Fiecare celul plasmatic produce lanul uor VJC ntr-o singur combinaie i produce fie lanul Kappa, fie lanul Lambda, dar nu amndou. Aceast abilitate a fiecrei gene cluster de a produce diferite polipeptide este o excepie important a regulii: o gen - o polipeptid. Receptorul celulelor T este foarte asemntor ca structur cu imunoglobulina i const din doua lanuri: un lan alfa i un lan beta. Aceste lanuri sunt legate ntre ele prin puni bisulfurice. Gena cluster pentru lanul alfa al receptorului T este pe cromozomul 14, iar gena cluster pentru lanul beta este pe cromozomul T. Fiecare are o structur analoag cu gena cluster pentru lantul usor al imunoglobulinei, iar amndou sufer o recombinare somatic pentru celulele T cu specificitaii diferite.

10.11.1. Imunodeficiena dobndit

Imunodeficiena dobndit poate apare n fiecare sau n amndou componentele rspunsului imun. Simptomele i semnele acesteia depind de mecanismele de aprare rmase intacte, dar n general includ invaziile timpurii susceptibile fa de infecii.

223

Aa cum sunt conturate tabelul de mai jos, aceste condiii de apariie arat o eterogenitate genetic. Boal Combinaii imunodeficiene severe Agammaglobulinemia Sindromul Wiskott-Aldrich Boli granulomatice cronice Sindromul Chediak-Higashi Sindromul DiGeorge Deficien Properdin Sindromul Limfoproliferativ Moduri de motenire AR, XR XR, AR XR XR,AR AR deleie cromozomial XR XR

Imunodeficiena motenit este cauzat n 50% din cazuri de defectele anticopilor, n 400% din cazuri ca urmare a defectelor de imunitate celular, iar n 60/o din cazuri depinde de defectele sistemului complementar. Cele mai previzibile defecte sunt deficienele IgA-lor (1/570), iar muli din aceti pacieni sunt asimptomatici cu o frecven de 1/1000 de combinaii n cazul unor deficiene ale sistemului fagocitar i o frecven de 1/70000 pentru combinaii imunodeficiente severe.

10.11.2. Grupele sanguine

Grupe sanguine sunt determinate de proteinele de suprafa ale antigenilor de pe celulele roii. Pn acum au fost descrise aproximativ 400 de grupse sanguine, iar dintre acestea cel mai bine cunoscute sunt ABO i sistemele Rh ale grupelor sanguine. Sistemul sanguin ABO Exist 4 fenotipuri majore AB0: .A, B, 0 i AB, care sunt determinate de reacia celulelor roii ale indivizilor cu anticorpii respectivi anti-A i anti-B, conform tabelului de mai jos: Fenotipul celulelor roii 0 A A AB Anti-A + + Anti-B + + -

unde: + nseamn aglutinare, iar non-aglitinare .

Antigenii AB0 sunt de asemenea prezeni pe multe alte celule din organism, inclusiv pe celulele sanguine. Indivizii care au grupa A au antigen A pe celulele lor roii, cei care au grupa B au antigeni B, cei cu grupa AB au ambele tipuri de antigeni, iar cei cu grupa 0 nu au nici un antigen. Indivizii cu grupa A au n serul lor IgM anti-B (izo-glutine), cu grupa B auanti-A, iar cei cu grupa 0 le au pe amndou.

224

Gena pentru grupele AB0 este localizat lnga braul lung al cromozomului 9 i au fost identificate 3 alele majore: 0, A i B. Dei sunt posibile genotipuri 00, AA, A0, BB, B0 i AB, A i B sunt gene dominante, iar gena pentru grupa 0 este recesiv. n continuare este prezentat un tabel cu genotipurile i fenotipurile locusurilor AB0: Genotip 00 AA A0 BB B0 AB Fenotip 0 A B B B AB UK frecvena 0,46 0,42 0,09 0,09 0,09 0,03 Antigene ale celulor roii nici unul A B B B AB Anticorpi serici Anti-A, Anti-B Anti-B Anti-A Anti-A Anti-A nici unul

Nu este posibil s distingem n grupele sanguine grupa AA de A0 sau BB de B0, dar acest lucru se poate face folosnd informaii de ascenden. Sistemul Rh sanguin Exist 2 fenotipuri Rh: Rh + i Rh Aceste fenotipuri sunt determinate de reacia celulelor roii ale indivizilor cu anticorpii anti-Rh.Persoanele Rh + posed antigeni Rh pe celulele lor roii i pe cele tisulare, n timp ce persoanele cu Rh - nu au aceti antigelii. Complexul genelor pentru Rh este pe cromozomul 1 cu 2 altele, fiecare avnd 3 locusuri strns legate C, c, E, i D sau non-D. Persoanele cu Rh + sunt hetero- sau homozigote pentru alelele D (tabelul 4). Tabelul 4. Genotipurile i fenotipurile Rh. Genotip cde/cde CDe/cde CDe/CDe cDE/ede cDe/cDE cDE/cDE altele (rare) 85% din populaia Europei Occidentale, de exemplu, are Rh+, dar acest procent variaz la alte popoare. Aproape toi orientalii i nord-americanii au Rh+ de asemenea, n timp ce 30% din populaia basc sunt Rh. Notaie prescurtat rr Rr RR Rr RR RR UK frecvena 0,15 0,32 0,17 0,13 0,14 0,04 0,05 Fenotip Rh + + + + + posibil +

10.12. Interaciunea ntre peptidele sistemului imun i peptidele sistemului nervos i endocrin
Sistemul imun interacioneaz cu sistemul nervos i endocrin prin inervaii ale esutului limfoid, neurohormoni endocrini sau neuropeptide i vice-versa. Organele limfoide primesc o extensiv inervaie intraparenchimal simpatic.
225

Celulele sistemului limfoid poart receptori adrenergici. Numrul de receptori variaz cu tipul celular, astfel: celule supresoare T > monocite > celule citotoxice T >celule helper. Dup ablaia sistemului nervos simpatic la animale, numrul receptorilor 2 -adrenergici crete pe celule limfoide; antagonitii-adrenergici cresc nivelul cAMP n celulei limfoide i altereaz funcia. Datele experimentale sugereaz c sistemul nervos simpatic moduleaz rspunsurile imune i c supraactivitatea sistemului nervos simpatic aa cum este de ateptat n stres scade responsivitatea imun. Efectul modulator al sistemului nervos simpatic este mediat n partea via neurotransmitori i n parte printr-o peptid cu greutate molecular mare ce inhib marcat rspunsul limfocitar proliferativ i reduce producia de IL-l i FNT de ctre macrofage. Neuronii simpatici rspund direct la IL-1, cel puin n vitro i se tie c coninutul n norepinefrin din organele limfoide scade n timpul rspunsului imun. Sistemul imun este capabil s produc factori, care pe lng rolul lor crucial n timp rspunsului imun servesc integrrii circuitelor imuno-neuro-endocrine cu consecine imuno regulatoare i metabolice pentru gazd. Celulele imune stimulate pot crete nivelele sanguine n hormonul adrenocorticotrop (ACTH) i corticosteroidul i scade coninutul de norepinefrin al hipotalamusului, mimnd astfel dou din modificrile neuroendocrine observate n timpul rspunsului imun. De asemenea, s-a artat recent c IL-1 induce o rapid i profunda cretere n ACTH i corticosteroidul din snge ,fr s afecteze marcat nivelele sanguin ale altor "hormoni ai stresului",cum sunt catecolaminele, prolactina,hormonul creteri i hormonul - melanostimulator. Alt efect important al IL-1 este capacitatea sa de a afecta homeostazia glucozei. Injectarea n vivo a acestei citokine are ca rezultat o profund hipoglicemie, care nu se datoreaz aciunilor secretagoge insulinice ale acestei citokine. Mai mult ,o simpl injectare a IL-1 poate normaliza nivelele sanguine n glucoz pentru o durat de cel puin 6 ore la animale diabetice incluznd oarecele diabetic insulino-rezistent. Modularea citokinonic a neuropeptidelor hipotalamice: interleukine ce regleaz creterea i stresul. Reglarea central a sistemului imun este in prezent bine stabilit, sporind dovezile c peptidele legate de imunitate(adic citokinele) pot afecta profund sistemul nervos central. S-a relevat faptul c IL-1 i IL-6 induc rapid eliberarea somatostatinei IL-1 induc ncet dar semnificativ creterea i n alte neuropeptide hipotalamice. Se pare c interleukinele pleiotropice stimuleaz axa hipotalamo-hipofizaro-adrenal ntr-un loc situat probabil n nucleul paraventricular i ar deprima creterea prin stimularea predominat a somatostatinei comparativ cu factorul liberator al hormonului creterii. Se consider c stresul infeciilor i traumatismelor pot stimula macrofagele i nevroglia s produc citokine IL-1,care n schimb regleaz secreia anumitor hormoni ce pot influenta evenimentele imune , n timp ce stresul psihologic induce secreia interleukinei-6 (ce este mediat de sistemul nervos autonom). O alt citokin care posed efecte pleiotropice este factorul de necroz (-FTN) derivat din macrofag . -FTN stimuleaz secreia IL-1 de ctre macrofagele activitatea, promoveaz mobilizarea grsimilor corpului i pierderea n greutate i are proprieti anorexigene.P Lng aceste efecte, -FTN exercit cteva efecte extraimunologice. Printre altele -FTN este cunoscut ca un mediator al reelei bidirecionale neuro-endocrino-imune. Citokinele interfereaz cu secreia hormonilor, incluznd n reproducere (n acest cu hormonul luteinizant, LH i foliculinstimulator, FSN). De reinut c att interleukina-l-alfa ( IL-l ) ct i factorul de necroz tumoral - FTN mpart cu hormonul liberator al corticotropinei unele efecte comportamentale ca mediatori ai sistemului. Att IL-1 ct i - FTN pot induce, similar hormonului eliminator a corticotropinei, beta-endorfina ,adrenocorticotropin, sintetaz eliberarea de prolactin.

226

Se tie c factorul hipotalamic eliberator de corticotropin are rol pivot n reglarea axei hipotalamice-hipofizare-suprarenale, i exercit efectele centrale inhibitorii pe funcii reproductoare (ce poate fi inhibat de stres). Aceste efecte au loc prin eliberarea de betaendorfina neuronal i hipofizar i sunt anatagonizate prin tratament cu antagonitii opiacei. De asemenea IL-1, -FTN i hormonul eliberator de corticotropin induc o cretere a pragului nociceptiv. Hormonul eliberator de corticotropin i citokinele difer ns n ceea ce privete tipul de stres pe care l recunosc, adic stresul cognitiv sau non-cognitiv. Alte studii recente sugereaz creterea produciei de peptide neuroendocrine dup stimularea celulelor cu IL-2. Astfel, prin metode imunohistochimice s-a detectat clonarea intens a citoplasmei celulelor mononucleare (ACTH i endorfinice pozitive) din sngele periferic i o cretere a dimensiunii celulare medii dup stimularea cu interleukina -2. Alte studii sugereaz, n plus, c una din moleculele de ACTH ce este sintetizat de celule imune stimuleaz direct migrarea monocitelor umane, sugerndu-se astfel un rol posibil al peptidelor ACTH in rspunsul imun. In prezent, numeroase interaciuni intre sistemele imune i neuroendocrine sunt demonstrate i se crede c numeroase peptide pot fi utile noilor strategii terapeutice.

10.13. Relaiile virusuri-celule gazd. Relaiile virusuri-membrane celulare 10.13.1. Receptorii virali
Prezena sau absenta receptorilor celulari specifici influeneaz nemijlocit spectrul de gazd tropismul tisular i celular al virusului;elementele respective pot interveni ns n etape ulterioare, de exemplu penetrare, decapsidare, antrenare a metabolismului celulei gazd n producia componentelor virale. Receptori celulari sunt, frecvent, de natur glicoproteic iar acidul sialic este considerat o component critic n interaciunea virus-receptor. Virusul Sendai se leag de o structur carbohidrat specific ( NeuAc ) dar nu de alte gangliozide, coninnd unul sau mai multe reziduuri de acid neurinamic. Alte mixoviruri sunt mai puin restrictive. Pentru virusul gripal toi compuii neurinamic pot aciona ca receptori indiferent de modalitatea de legare a carbohidratului. Virusurile gripale A i B au receptori (glicoforina) pe hematii; virusul rabic are receptori pentru acetilcolin la jonciunea neuromuscular; virusul Epstein-Barr are receptori ( CR2 pentru C3d ) pe limfocite B iar HIV are receptori (molecula CD4 sau T4) pe limfocit T etc. Trei metode moderne au permis studiu receptorilor celulari cu acuratee: a) sinteza anticorpilor monoclonali antireceptori; b) sinteza anticorpilor antiidiotip care mimeaz antigenele virale; c) utilizarea unor analogi peptidici ale situsurile de ancorare viral A fost introdus conceptul de receptor productiv, adic de receptor care conduce singur la infecie, deosebit de alii implicai n legarea nespecific a virionilor. Ataarea nespecific a virionilor la unele substraturi (colagenul de exemplu), poate avea importan patogenic pentru c se realizeaz concentraii mari de virusuri n zone unde exist i receptori productivi. n general, organele-int ale infeciei virale au astfel de receptori productivi care sunt similari cu receptorii cu afinitate nalt. Receptorii cu afinitate nalt la nivelul "butonilor" terminali ale axonilor explic neurotropismul unor virusuri. n ceea ce privete virusul gripal, care este bine cunoscut, datele de biologie molecular precizeaz urmtoarele: acest virus este un orthomixovirus cu nveli membranar; anvelopa const dintr-un strat bilipidic cu proteina M asociat cu poriunea intern a dublului strat i dou glicoproteine membranare, ai cror spiculi extramembranari se pot observa n microscopia
227

electronic. Una dintre proteinele transmembranare este hemaglutinina, iar cealalt, naurominidaza. Aceste dou proteine permit virusului s se lege de suprafaa celulei gazd i s fuzioneze cu membrana celular. A fost clonat gena pentru neuraminidaz, proteina coninnd 454 aminoacizi cu greutatea molecular 50.087 Da. Aceast protein prezint o zon hidrofob major, care o ancoreaz in membrana viral. Proteina prezint 5 situsuri de glicozilare i este incorporat in membrana viral sub forma unui trimer simetric cu laturile polipeptidice identice. Rolul neuraminidazei in infecie nu este cunoscut,dar se tie c ea cliveaz acidul N-acetilneuraminic(acid sialic) al lanului hidrocarbonat glicoproteina. Substratul neuraminidazei poate fi glicoproteina celulei-gazd sau glicoproteina-hemaglutinic a virusului. Activitatea enzimatic a neuraminidazei este necesar pentru producerea infeciei, deoarece anticorpii antineuraminidaz inhib replicarea viral. Cealalt glicoprotein transmembranar a virusului gripal, hemaglutinina, leag virusul la acidul sialic coninut de receptorii membranei celulei-gazd. De asemenea,ea mediaz fuziunea celular a virusului. Hemaglutinina virusului gripal este un trimer de 224.640 Da. Fiecare trimer conine un lan oligozaharidic. Glucidele sunt localizate la suprafaa proteinei pe ntreaga sa lungime si au rolul de a proteja hemaglutinina de degradarea proteolitica nespecifica. Pentru ca virusul gripal sa fuzioneze cu membrane celulei-gazda,hemaglutinina trebuie sa cliveze in doua fragmente , HA1 si HA2, prin hidroliza legturii peptidice a argininei din poziia 238. Clivarea hemaglutiniei n cele dou fragmente crete infeciozitatea virusului de 100 ori, fr s afecteze activitatea hemaglutinic. Molecula de hemaglutinina provoac fuziunea n absena oricror alte componente virale.Tipul viral cel mai patogen al gripei - tipul A - conine 13 subtipuri de hemaghetinine (HA) notate HA1 - HA 13 si 9 antigene de tip neuraminidaza (N) notate Nl-N9. Fiecare virus prezint 300-600 spiculi de hemaglutina care explica ataarea virionilor la celule. Intr-o prima etap, hemaglutinidele virale se leag pe reziduurile de acid sialic ale glicoforinelor A. Caracterizarea precis a domeniilor de legare la nivelul proteinelor virale i a receptorilor celulelor gazd deschide o noua cale n terapia antiviral: experimentarea i producerea unor ageni care s acioneze n competiie cu virusurile n legarea pe receptor.

10.13.2. Penetrarea virusului n celul

Procesul de internalizare a virionilor, declanat de ataarea lor ireversibil la receptorii celulari este numit viropexie (enducitoza). n plus, virusurile cu anvelopa (ortho-si paramixovirusurile, rhabdo- si togavirusurile etc.) datorit includerii n structura externa a unei poriuni lipidice pot penetra si printr-un proces de fuziune. Ptrunderea paramixovirusurilor n celul prin fuziunea dintre anvelopa viral i membrana celular, perturbeaz permeabilitatea acesteia din urma, ceea ce poate avea urmri toxice ca hemoliza (la hematii), liza "din afar" (la celulele nucleate) i chiar modificrii nucleare i alterri cromozomale. Studii electronomicroscopie combinate cu detectare a antigenului cu anticorpi marcai de peroxidaz au lmurit n cazul virusurilor respirator sinciial i rujeolic, secvena evenimentelor timpurii ale infeciei. Astfel, consecutive absorbiei (la +37C) anvelopa viral i membrana celulara fuzioneaz, apoi antigenele virale se disperseaz n regiunile adiacente ale membranei, ntreaga celul devenind specific reactiv cu anticorpii antivirali marcai. Aceasta difuziune explic cel puin dou fenomene: - starea refractara a celulelor la fuziunea cu alte virusuri i, - difuzarea infeciei din aproape n aproape prin antrenarea celulelor vecine n procesul de sincitizare. n cazul papovavirusurilor, ca rezultat al absorbiei se noteaz o cretere rapida a fluiditii membranei celulare datorit activitii unor enzime membranare, probabil declanat de procesul endociotic.

228

Prin urmare, absoria la suprafaa celulei este urmat de penetraia virusului n celul, care se poate desfoar pe doua ci: a) fuziune directa cu membrane plasmatic; b) prin endocitoza (viropexie) simpl (absorptiva) sau mediat de receptori (clatrinic). Virusurile ncapsulate pot urma ambele cai, n timp ce virusurile nude numai endocitoza. Endozomul (fagozomul) fuzioneaz apoi cu lizozomul a crui aciditate favorizeaz fuziunea membranelor virale i lizozomale ; procesul este foarte rapid, nct expulzarea nucleocapsidei n citoplasma se efectueaz fr distrugerea ei de ctre enzimele lizozomale de degradare.

10.13.3. Tipuri de efect citopatic

Sunt descris mai multe tipuri morfologice de efecte citopatice viral - induse n culturi, de pild: a. citotoxic (produs de infecii masive, hiperacut, fr a exista timp pentru sinteza virusului progen; leziunile au fost asimilate cu fenomenul lizei "din afara" in cazul bacteriilor parazitate de fagi); b. citolitic (caracterizat prin alterri celulare acute-rotunjire,ratatinare-i pierderea capacitaii celulelor de a retine coloranii vitali); c. sinciial (indus de virusuri care poseda proteine structurale de "difuziune" ca herpesvirusuri, paramixovirusuri, retrovirusuri); d. incluziogen (caracteristic unei replicri virale relativ lente i nsoit, n afara de apariia incluziilor virale (noi particule de virus) de vacuolizari citoplasmice, citomegalie, sincitizare etc. De reinut faptul ca relaiilor virus-celula gazda, exprimate morfologic, le corespunde o proporie semnificativ mai mare de interaciuni neproductive, aa cum infeciile clinic aparente sunt amplificate epidemiologic de infeciile subclinice.

10.13.4. Leziuni cromozomale determinate de virusuri

Virusurile induc diverse anomalii cromozomale ca: aberaii cromozomale (fragmentri, pulverizaii, rupturi, schimburi cromatiniene); anomalii ale aparatului mitotic (mitoze multipolare , mitoze colchicina-like); cariotip anormal cu complement instabil sau stabil; policariocite. n ceea ce privete patogeneza virala la nivel molecular, de notat ca datele actuale evideniaz adaptarea continu a genomului viral i a gazdei, astfel nct s fie asigurat supravieuirea ambilor parteneri. Temin a propus o serie de intermediari evolutivi ntre elementele genetice mobile i retrovirusuri, trecnd prin provirusuri. nsi retrovirusurile cuprind grupe evolutive si anume: retrovirusuri nononcogene, lent-oncogene i rapid oncogene . Se tie c un concept recent asupra oncogenezei virale susine integrarea unui provirus retroviral adiacent la o gen celular potenial oncogen (c-onc). Important din punct de vedere teoretic este deci faptul ca inserarea elementelor genetice mobile (sau a provirusurilor) ntr-un loc sau altul al genomului celular mobil este urmat de inactivarea sau activarea unor gene celulare. Astfel de activri, consecin a controlului exercitat de un nou promotor, pot fi la originea unor tumori canceroase. -

229

10.13.5. Natura i funcia unor structuri virus-like: prionii

Un capitol de patologie molecular a celulei interesant n virusologie, genetic i clinic privete n prezent natura, compoziia chimica si funcia unor structuri puse in evident prin diverse metode, ori demonstrate direct prin microscopie electronic. Astfel proteina prion (PrP) este una din proteinele majore produse in exces in encefalopatiile spongiforme subacute la om si animale de laborator. Natura exact a agenilor neconvenionali care induc aceste boli este necunoscuta in prezent. Au fost evocate cteva ipoteze conform crora agenii ar prezenta: un virus convenional, o noua clasa de ageni numii virioni, o protein autoreplicabil (numita Prion), un retrovirus sau este vorba de o boala post-translational , care implic dereglarea sintezei proteice. Acumularea PrP , ca i a proteinei acidice fibrilare gliale (GFAP) n infeciile experimentale la oarece cu scrapie, n special n creier, implic aceste proteine n mecanismele lezionale ale sistemului nervos central (SNC). PrP (33-35 KD) este o sialoglicoprotein celular localizat pe faa extern a neuronilor n cultur, ancorat printr-un glicolipid fosfatidilinozitol. Nivelul expresiei genetice PrP este meninut strict pe parcursul vieii. Studii de cinetic a expresiei genetice PrP si GFAP pun n evidena faptul c ARNm GFAP i PrP variaz semnificativ n timpul dezvoltrii normale postnatale a creierului de oarece. ARNm pentru proteina prion a fost detectat imediat dup natere i a crescut de patru ori n dezvoltarea ontogenetic. n prezent este investigat expresia genelor PrP si GFAP n creierul in dezvoltare infectat cu scabie pentru cunoaterea mecanismelor de reglare i/sau dereglare n astfel de infecii. Toate encefalopatiile spongiforme transmisibile, incluznd scrapia, sindromul GerstmannStraussler-Scheingker i encefalopatia spongiform bovin conin forma agregat, parial rezistent la proteaze, ca un marker specific pentru boala oferit de aceast protein PrP. Se consider n prezent c spre deosebire de PrP normal de la suprafaa neuronilor, forma agregat PrP apare fie dintr-o infecie , sau de la o gen mutant PrP, care acioneaz ca un catalizator n conversia proteinei normale endogene PrP n cea agregat i abundent, astfel inct funcia normal a proteinei este abolit i rezult boala degenerativ. Conform altor opinii, proteina normal PrP acioneaz ca receptor pentru un agent al scrapiei nc neidentificat; de asemenea este incriminat un mic acid nucleic care este un virus neconvenional ( de aceea este dat denumirea de virus neconvenional sau virin). Din alt punct de vedere este frapant similitutidinea de patologie a scrapiei cu studii recente privind receptorul poliovirus (PVR).Unele studii recente transgenetice au artat de exemplu c oarecele transgenetic exprimnd PVR uman devine susceptibil la poliovirus; oarecele normal este rezistent. Pe msur ce oarecii transgenetici ce exprim PVR au dezvoltat aceast boal, ei arat modificri patologice corespunztoare. O variant a PrP a fost implicat recent n producerea sindromului Gerstmann-StrausslerSchemgker, boal uman rar similar scrapiei, caracterizat prin patologie spongiform, protein PrP proteaz rezistent si placi (depozite mari proteice). S-a artat n cazul acestui sindrom, un linkaj ntre incidena bolii i mutaia proteinei PrP i anume, o substituie a proliniei cu leucina la codonul 103. Ar fi vorba deci de o leziune genetic care poate cauza neurodegenerarea spongiform transmisibil sau mutaia produce o modificare n structura proteinei sau n stabilitate, care mimeaz efectul legrii unui agent patogen. Termenul de prion a fost introdus n biologia molecular n anul 1982 de ctre Harley Prusiner de la universitatea din San Francisco. Prionii (cunoscui i sub numele de protovirine, virineos, virusuri latente) reprezint o clas de ageni infecioi subvirali, cu greutatea de 27000-30000, unici n felul lor, fiind rezisteni la toate procesele de inactivare care degradeaz acizii nucleici (cldura, razele u.v, radiaii ionizante); prionii rmn o enigm o perplexitate a biologiei moleculare, deoarece admiterea existenei lor drept ageni infecioi, lipsii de acid nucleic i formai exclusiv din
230

proteine, ar pleda pentru drmarea dogmei centrale a biologiei moleculare, prin acceptarea unei codificri i multiplicri a acestei proteine prionice infecioase, nu prin intermediul acidului nucleic al celulei gazd. Pentru acelai motiv,bolile prionice sunt considerate astzi pseudoinfecioase n comparaie cu bolile infecioase clasice, ale cror ageni etiologici sunt microorganisme (virusuri, bacterii) care conin n structura lor acid nucleic. Caracteristicile principale ale bolilor prionice sunt: - afecteaz sistemul nervos central (SNC) provocnd encefalopalii spongiforme; - au o perioad foarte lung de incubaie: de la cteva luni la 37-40 de ani; - au o evoluie lent, progresiv, totdeauna letal. Pna n prezent au fost deschise 12 boli priorice: ase la animale i ase la om (tabelul 4). Dintre acestea, cele mai bine studiate sunt scrapie la animale i boala Crentzfeldt-Jakobs (CJD) la om. Celelalte zece boli prezint similariti de ordin clinic, anatomo-patologice i hismitochimic cu aspectele din scrapie. n aceste boli, principala caracteristic molecular o reprezint acumularea masiv n SNS a unei proteine PrPc a gazdei, dar ntr-o izomorf anormal tip PrPsc (tip protein din scrapie) la animal respeciv PrPcjd (tip protein din CJD la om). n prezent se admit trei posibiliti de producere a bolilor prionice : infecia lent, infecie sporadic i alterare genetic (tabelul 5). Tabelul 5. Bolile prionice Nr. crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Scleroza multipl 12. Boala lui Alper
231

Boala Scarpie Eucefalopatia transmisibil curcilor (TME) Boala cronic devastatoare (CWD) Eucefalopatia spongiform a copitatelor (EVE) Eucefalopatia spongiform felin(FSE) Eucefalopatia spongiform bovin(BSE) boala vacilor nebune Kuru Boala Crentyfeldt - Jakols Sindromul GertmannStrussler Insomnia fatal familial

Frecvena SUA, Anglia, Frana, Elveia Rar dar cu mortalitate >90% SUA(Colorado, Wyoming) Anglia Anglia(1989) Anglia Papua Noua Guinee 1/1.000.000 pe tot globul <0,1milion/an Japonia Italia, Anglia, Frana, America Insulele Faroe, Scoia, Irlanda, Key West

Gazda natural capre, oi curci elan, cprior Nyola i antilopa african pisici domestice bovine om om om om om, unele tulpini au produs scrapie la oi om

Data transmiterii exprerimentale 1936 1939 1983 1988 1966 1968 1981 1993

Particulariti de difereniere a prionilor de virusuri Prionii se difereniaz de virusuri prin urmtoarele caracteristici majore: Absena ADN-ului. n ncercrile de purificare a prionilor, prin electroforez n gel sarcosil i sedimentare n gradient discontinuu de sucroza (protein) cu greutatea molecular de 27.000-30.000 (PrP= protein prionic), dar nici un acid nucleic. Structura exclusiv proteic. n esutul cerebral al animalelor cu infecie prionic plci de amiloid i fibre amiloide (SAF =fibre asociate scrapiei). Amiloidul reprezint un derivat dintr-o glicoprotein celular normal (PrPc), care se gsete n mod normal pe membrana celulei neuronale.Se tie astzi c n cursul infeciei prionice se produce conversia unei cantiti de protein PrPc (prin modificri posttranslaionale) n PrPsc reprezint tocmai SAF (protein nalt infecioas). Plcile amiloide sunt incluzii de prioni. PrPc i PrPsc au aceeai greutate molecular (33-35Kda), dar PrPc poate fi complet digerat n vitro de proteineaza K, n timp ce PrPsc este rezistent, fiind doar parial digerat lsnd un miez rezistent proteinoza K; acest miez este reprezentat de PrP 27-30 (GM= 30Kda). PrPsc are o are o abilitate foarte mare de a determina modificri posttranslaionale ale propriei molecule i de a forma amiloid, fapt pentru care are consecine asupra replicrii, transmisibilitii i neuropatogenici bolii. Fibrele de amiloid reprezint produse de degradare (de rupere) PrPsc infecioase. Modificrile posttranslaionale care contribuie la transformarea PrPc n PrPsc au fost considerate un timp doar modificri conformaionale de mpturire (substituirea -helixurilor cu -sheet-uri); date recente pledeaz i pentru modificri de ordin chimic. Absena imunitii. Spre deosebire de virusuri, care produc rspuns imun prionii nu sunt imunogeni. Bolile prionice sunt cu evoluie lent, apar paradoxal n absena oricrui rspuns imun care a putea opune rezisten naintrii infeciei. Existena unor forme multiple cu grad nalt de infeciozitate. Prionii pot exista sub form de bastonae, complexe proteice cu lipit-detergent (DhPCs) i sub form de lipozomi. Aceste forme sunt interconvertibile; n toate aceste forme singura molecul identificat este tot PrPsc. Ipoteze referitoare la natura prionilor Referitor la natura prionilor s-au emis imens unele ipoteze (ipoteza viroidului animal, ipoteza virin, ipoteza retrovirusului, grupul ipotezelor de ageni infecioi fr geamn etc.). Pn n prezent nici una din ipoteze nu se bucur de adeziunea ntregii comuniti tiinifice. Prionii rmn o clas aparte, fr precedent, de ageni infecioi fudamental diferii de virusuri i viroizi. Multe ntrebri referitoare la prionii i atept rspunsul n viitor. Este de menionat ns faptul c problema BSE (boala vacii nebune) i cea a radioactivitii ocup n prezent aceeai ni psihologic n societate, n timp ce fumatul, obezitatea, abuzul de alcool, lipsa de micare (ageni ai unor boli cu inciden a mortalitii extrem de mare pe glob) sunt total ignorai. Ipoteza viroidului animal Viroizii sunt ageni subvirali exclusiv din ARN fr nveli (capsid) proteic. Spre deosebire ns de viroizii cunoscui (potato spindle tuber viroid), foarte rezisteni la u.v., prionii sunt de 10 ori mai rezisteni dect ARN-ul purificat al acestora; de asemenea, n timp ce viroizii sunt sensibili la nuleaz, prionii sunt rezisteni. Ipoteza virin O molecul de acid nucleic ce conine informaia biologic (prion) ar fi protejat de o molecul de protein a gazdei, fomnd mpreun o particul infecioas, capabil de replicare; prezena acestui acid nucleic nu a fost nc confirmat.
232

Ipoteza retrovirusului Pentru asigurarea retroviral a prionilor se aduc ca argumente tropismul pentru SNC i modificrile de membran (induse foarte rar) fr rspuns inflamator major. Argumente contra originii retrovirale a prioinilor sunt urmtoarele: nu a putut fi pus n eviden nici un retrovirus, prin metodele actuale, n bolile prioniei; rezisten foarte mare la formaldehid i glutaradeldehid (retrovirusurile fiind sensibile la aceste doua substane).

Grupul ipotezelor de ageni infecioi fr genom Plecnd de la conceptul iniial de prior respectiv protein autoreplicabil, se emit mai multe ipostaze prin care se ncearc explicarea modificrii proteinei celulare normale PrPc n protein izomorf patologic PrPsc, fie datorit unor mutaii suferit de gena ce codific PrPc, fie datorit unor perturbatori ce apar posttranslaional n conformaia spaial a proteinei n diferite etape. Modele viitoare Modelele transgenetice dei au sporit cunoaterea noastr n nelegerea bolilor scrapielike nu au clarificat totui complet rolul proteinei PrP. Se sper ca n viitorul apropiat s se creeze prin recombinare omoloag, linii de oarece cu modificri precise n gena PrP endogen i fr nici o extracopie. De pild, oareci cu gene PrP nefuncionale ar permite s se elucideze funcia normal a PrP n sistemul nervos i ar putea fi folosii s demonstreze dac aceast protein a gazdei este ntr-adevr necesar pentru replicarea agentului scrapie. De asemenea, numeroase observaii electronomicroscopice n boli ca lupusul eritematos ,dermatomiozit, glomerulonferit, etc, s-au referit la incluziile "tubulare" (paramixovirus-like) dm citoplasm celulelor endoteliale , fibroblastelor, macrofagelor , limfocitelor, etc. Formaiunile respective au circa 1,5 um n diametru i fiecare tubul msoar circa 20-25 nm. In seciune transversal, tubulii prezint un mers dens (probabil acid nucleic), apoi o zon cu densitate medie i o ptur periferic (probabil proteic), fiind similar ca aspect general cu nucleocapsidele fr nveli ale paramixovirusurilor.n sprijinul naturii virale a "tubulilor" pe lng trsturile morfologice n examinarea direct , s-a invocat capacitatea acestora de a perpetua n culturile de celule pstrndu-se sensibilitatea la ribonucleaza ct si depozitarea complexelor imune virale de tip C n piele. S-a emis chiar ipoteza potrivit creia etipatogenia aa-ziselor colagenoze s-ar petrece mai nti infecia viral (acidul nucleic viral ar fii un timp n stare biofit )i apoi imunocompromisul indus de virus. Conform altor opinii,asemenea agregate tubulare larg rspndite la om i la animale , n diferite esuturi i n diferite boli, ar prezenta fie material celular alterat eliberat n circulaii dup rniri , fie produse de regenerare celular sau chiar complexe imune. De regul RER apare anormal dilatat n celulele endoteliale ale vaselor sanguine din piele i muchiul scheletic la subieci cu astfel de boli, coninnd tubulii caracteristici. Dei problema acestor formaiuni tubulare este i ea grevat de necunoscute , se accept nc folosirea lor ca elemente de diagnostic n unele boli ale esutului conjunctiv. n sfrit, n sindromul de imunodeficien dobndit (SIDA) unele limfocite conin n citoplasm particule sferice , dispuse ordonat dup un model paracristalin- ca un stadiu n morfogeneza viral.

10.14. Relaiile bacterii-celulele gazdei

Bacteriile sunt importante din punct de vedere teoretic i practic prin rolul jucat n experienele de recombinare a ADN (inginerie genetic) i prin caracterul patogen al unor specii. n patogenia uman ele produc infecii-boal, datorit factorilor de patogenitate determinai genetic.
233

Prin virulena lor, ele pot depi capacitile de aprare al gazdei, factorii de virulen incluznd factorii de colonizare i factorii care contribuie la multiplicare. O importan major pentru aderen i colonizare o are doza infectant; n intestin numai o singur celul bacterian din cteva mii ajunge s adere i s colonizeze. n procesul de aderen particip anumite structuri macromoleculare antigenetice, de la suprafaa bacteriei numite adezine i receptorii corespunztori ai celulelor epiteliale. Adezinele(glicoproteine,liporoteine de 1000-125000 Da) sunt reprezentate n general de filamente (numite fimbrii la bacteriile gram-negative)i de fibrile (la cele gram-pozitive). Prezena receptorilor celulari corespunztori diferitelor adezine determin n mare parte specificitate de specie sau de esut a aderenei bacteriene. Odat aderate i nglobate n stratul de mucus secretat de celulele epiteliale, unele bacterii se limiteaz la epitelii (C. dipteriac, E. coli etc) ntruct nu pot trece de fagocitele subepiteliale anticorpi, factori bactericizi serici etc, n timp ce altele (Str. pyogenes, Salmonella etc) ptrund n esuturile subepiteliale. Penetrarea acestora este asigurat de enzime (histolitice i citolitice) componente ale peretelui celular (peptidoglicani etc) i de endocitoz de ctre celulele epiteliale care ulterior le exociteaz. Dup depirea membranelor bazale (care acionnd ca un filtru le temporizeaz diseminarea),bacteriile ajung n esutul subepitelial de unde pe cale limfatic i/sau sanguin, sau fagocitate, pot difuza n tot organismul. De reinut c bacteriile foarte mobile i subiri (spirochetele) ptrund prin epiteliile gazdei att prin endocitoz ct i prin micri active datorit aparatului locomotor, formei spiralate i extremitilor ascuite, singura zon unde se gsesc i adezine. Fibrele periplasmatice ale spirochetei Tr. pallidum sunt implicare n locomoia bacteriei care se deplaseaz "nurubndu-se" n mediul lichid. Dac virusurile gripale sunt cantonate la epiteliul ciliar al tractului respirator superior, n cazul bacteriilor deficiene ale aparatului mucociliar ale acestui tract favorizeaz producerea sinuzitelor, bronitelor, pneumoniilor, de ctre flora nazofaringian normal. Sisteme enzimatice complexe situate la suprafaa celulei bacteriene sau eliberate n mediu (care permit consumul elementelor nutritive ca atare sau modificate conform necesitilor metabolice proprii) asigur multiplicarea lor. Agresinele de la suprafa (mucopeptide, polipeptide, enzime) permit inhibarea ori ocolirea mecanismelor de aprare a gazdei, iar toxinele (proteice i lipopolizaharidice) genereaz diverse efecte patologice; toxina difteric, de pild citotoxic, inhib sinteza proteinelor, producnd leziuni predominant cardiace, hepatorenale i nervoase. Oricare ar fi gradul patogenecitii bacteriei implicate i severitatea cii de ptrundere n organism, starea de imunitate a gazdei reprezint factorul major de condiionare a manifestrii patogenitii.

234

Capitolul 11 BIOTEHNOLOGIA
Secolul XX i n special perioada de dup al doilea Rzboi Mondial, a nsemnat un uria pas nainte n dezvoltarea cercetrilor de genetic i inginerie genetic, de biologie celular i molecular, de biochimie i microbiologie, precum i a tehnicilor de culturi de celule vegetale, animale i microorganisme. S-au creat astfel premizele apariii biotehnologiilor moderne i a bioindustriei. Biotehnologia este o ramur industrial complex care utilizeaz drept materie prim microoganismele (bacterii, drojdii, mucegaiuri etc), culturi de celule vegetale i animale, pentru obinerea de organisme i de substane utile economic. Astfel, biotehnologiile moderne au mari implicaii n industria alimentar ( producerea de proteine monocelulare neconvenionale, sinteza unor aminoacizi eseniali, cum sunt lizina i acidul glutonic, producerea de enzime, sinteza de aditivi alimentari), n industria farmaceutic (producerea de antibiotice, hormoni, vitamine, substane antivirale i amtitumorale, vaccinuri, anticorpi monoclonali etc), n bioexploatarea petrolului i minereurilor (creterea gradului de recuperare cu ajutorul unor microorganisme), n ecologie ( valorificare biomasei, preparate cu rol n purificarea apelor industriale i menajere ), n medicin (produse de interes medical utilizate n diagnostic, tratament sau cercetare fundamental. O importan deosebit au biotehnologiile moderne pentru manipularea genomului celulei vegetale i animale n vederea crerii de soiuri de plante i rase de animale pe ci neconvenionale, mult mai repede i mai eficient.

11.1. Ingineria genetic

Progresele spectaculoase ale biologiei, aa cum se exprim ele n realizrile ingineriei genetice sunt strns legate de naintarea impresionant a tehnicilor analitice, ca ultracentrifugare, marcarea moleculelor prin izotopi radioactivi, electroforez, cromatografia de afinitate (de ex., tehnica separrii moleculelor complexe prin anticorpii monoclonali corespunztori), electrofocalizarea bidimensional (permind analiza a 50 000 de proteine ale unei celule), microanaliza (de ex., determinarea structurii primare a unei proteine pornind de la numai 10 nanograme, dar i a structurii altor macromolecule biologice).

11.1.1. Tipuri de transfer de gene

Prin aceast tehnologie se realizeaz noi combinaii de ADN de la dou organisme diferite, prin transfer de gene de la un organism la altul, obinndu-se n acest fel organisme transgenice. Pn n prezent s-au obinut urmtoarele tipuri de transfer de gene: a) Gene virale transferate la virusuri; b) Gene virale transferate la eucariote; c) Gene de la procariote transferate la procariote; d) Gene de la procariote transferate la eucariote; e) Gene de la eucariote transferate la procariote; f) Gene de la eucariote transferate la eucariote. Gene virale transferate la virusuri. Folosindu-se un asemenea transfer s-a putut obine prin tehnica de recombinare genetic un nou vaccin rabic cu o eficien mult crescut fa de cele folosite n mod obinuit. 235

Rabia este o infecie viral ce se transmite prin muctur (n cazuri speciale i prin aer) de cine, vulpe (Europa), sconci, ratoni, lupi, cini, vulpi polare, lilieci (America). n fiecare an se nregistreaz 50000 de decese umane prin rabie pe glob (majoritatea n Asia) i cteva milioane de decese la animale. Gene virale transferate la eucariote. n 1995, Becker i Darai arat c ingineria genetic cu virui vectoare reprezint un subiect de prim importan pentru dezvoltarea protocoalelor de terapie genic la om. Cu ajutorul retrovirusului recombinat Herpes simplex tip I a fost transportat gena timidinkinaza HSV-1TK de la acest virus n celule pulmonare canceroase de la om. Respectiva enzim a indus n celulele canceroase sinteza de monofosfat de aciclovir i ganciclovir i apoi fosforilarea acestora pn la forma de trifosfat, care a inhibat sinteza ADN celular din celulele canceroase, oprind diviziunea celular i propagarea celulelor neoplazice. n aceeai categorie de transfer de gene se ncadreaz metoda de preparare a vaccinului hepatitei B (vaccin Engerix-B). Biologia molecular a permis determinarea cvasi-total a materialului genetic al virusului hepatitei B. Astfel, n secvena ADN a fost identificat gena S drept responsabil se sinteza proteinei S (antigen HBs); proteina S este un antigen de suprafa al virusului (antigen prezent, n mod constant, n serul bolnavilor de hepatit viral tip B). Prin aplicarea unei tehnologii genetice, din ADN viral a fost izolat gena S i, cu ajutorul unui vector, a fost inserat n materialul genetic al unei celule gazd eucariote ( o levur), care prin multiplicare a permis ulterior exprimarea i sinteza n cantitate mare a respectivei proteine a antigenului HBs. Respectivul antigen nu este infecios, ci doar imunogen. Pentru prepararea vaccinului Engerix-B (ADN recombinat), a fost selecionat levura Saccharomyces cerevisiae (1991) (Smith Kline-RIT). Pentru producerea vaccinului la scar industrial, tulpina de levur pe care se realizeaz procesul de recombinare este nsmnat n cuve de fermentaie (bioreactoare), n care levura se multiplic rapid, producnd proteina-antigen HBs. Celulele de levur sunt apoi recoltate, broyate, iar antigenul HBs este izolat i nalt purificat, nainte de a fi condiionat n vaccin. Gene de la procariote transferate la procariote Pentru a realiza introducerea ADN-ului (gena) bacterian ntr-o alt bacterie, sunt folosite dou tehnici. Prima const n utilizarea plasmidelor* ca vectori, iar a doua n utilizarea bacteriofagilor. Deoarece bacteriile sunt organisme haploide, reasortarea materialului genetic nu se poate realiza prin recombinare n cadrul aceleai celule, ci prin transferul de material genetic de la o tulpin donoare la una receptoare (diferit de prima), din cadrul aceleiai specii sau ntre specii bacteriene nrudite. Rezult o celul care conine ntreg genomul receptorului i un fragment din genomul donorului. S-au descris patru mecanisme diferite de transfer genetic: transformarea; transducia; conjugarea; transpoziia (translocarea sau recombinarea cu specificitate de situs). Transformarea reprezint prelucrarea unei molecule de ADN de la o tulpin donor de ctre o celul receptoare competent. ADN-ul transformat se leag de celula competent, la nivelul unor situs-uri specifice ale nveliului celular, ptrunde apoi n celula receptor i se integreaz prin recombinare n regiunea omolog a cromozomului receptor. * Plasmidele = clas major de elemente genetice mobile, formate dintr-un duplex ADN; sunt cromozomi accesorii, se pot replica autonom (replicon).

236

Transducia reprezint transferul de material genetic de la o bacterie la alta, prin intermediul fagilor transductori. Acest fenomen este practic posibil la toate speciile bacterine, dar numai anumii fagi au proprietatea de a fi transductori (fagul de la E. coli, fagul P1 de la E. coli, fagul P22 de la Salmeonella typhimurium). Conversia. Anumii fagi (convertizori) transport gene cu alte funcii dect cele virale, cel mai cunoscut fiind gena tox responsabil de toxinogeneza tulpinilor de bacil difteric. Conjugarea presupune un transfer de material genetic de la celula donatoare la celula receptoare, prin intermediul factorului de fertilitate F (factor plasmidic = vector), numit i factor de fertilitate. Transferul de material genetic este polarizat de la celula F+ (celula donatoare, care conine factorul de fertilitate F ) ctre celula F- (celula receptoare, lipsit de factorul F), ncepnd cu captul 5 al ADN-ului. Factorul F ptruns n celula receptoare Fpoate rmne liber n citoplasm i atunci celula F- devine F+, sau se poate integra n cromozomul bacterian (cu frecven de 105 per generaie); n acest ultim caz, celula receptoare F- devine Hfr (high frequeney recombination), deoarece prezint frecvena nalt de recombinare. Transpoziia este fenomenul prin care copii (elemente transpozabile) ale unor secvene specifice de acid nucleic, dintr-un genom bacterian, se deplaseaz de-a lungul aceluiai lan de acid nucleic sau pe cel al altui genom bacterian, avnd capacitatea de a se insera pe unul sau mai multe situs-uri specifice. Gene de la procariote transferate la eucariote S-a obinut transferul unei gene (responsabil de sinteza unei endotoxine care omoar insectele) de la Bacillus thuringiensis n celule vegetale (bumbac) cu ajutorul unui plasmid Ti asociat cu un retrovirus. Aceast tehnologie generic este folosit cu rezultate foarte bune de mai bine de 30 de ani. Plasmidul Ti provine de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, bacterie care paraziteaz plantele; plasmidul Ti poate trece spontan n celulele vegetale infectndu-le, rezultatul fiind producerea unor tumori la plante, tumori cunoscute sub numele de creasta cocoului. Aceste plasmide Ti, folosite astzi, n asociere cu un retrovirus, drept vectori pentru manipulri genetice (transfer ntre o celul procariot i o celul eucariot), i pierd capacitatea tumorigen i o pstreaz doar pe cea de vector a unei gene strine (de ex., gena de sintez a endotoxinei bacteriene de mai sus). Gene de la eucariote transferate la procariote Acest transfer este practicat de 20 de ani. Genele din genomul eucariot sunt transferate cu ajutorul unui vehicul corespunztor n organismul procariot iar apoi aceste noi gene transferate se multiplic (cu rat foarte nalt) n organismul procariot. n acest fel, organismele procariote (microorganisme tip bacterii) cu rat foarte nalt de multiplicare pot fi utilizate pentru sinteza anumitor gene din organismele superioare. Acest tip de combinaie ADN in vitro, urmat de clonarea genelor nou transferate, se folosete astzi pe scar industrial i se realizez dup urmtoarele etape: ADN din cromozomul organismului eucariot este extras i purificat, apoi tiat de endonucleaze de restricie; se folosete un vehicul izolat dintr-o bacterie. Plasmidul de form circular este deschis (cu ajutorul unei enzime de restricie), obinndu-se un lan ADN unic. Deoarece endonucleazele se fixeaz pe plasmid doar la nivelul acelorai secvene de baze ca cele de pe fragmentul ADN, rezult locuri de tiere cu secvene complementare. Acest aspect reprezint condiia esenial pentru fuziunea fragmentului ADN cu plasmidul deschis. Pe baza capetelor ADN lan unic cu secvene complementare (sub influena ADN-ligazei) se pot lega cele dou lanuri ADN strine (plasmid + gena de la eucariot), formnd deci un lan dublu ADN. n acest fel, plasmidul se nchide, incluznd i gena eucariot, care devine astfel o parte integrant din sistemul genetic al procariotului, rezultnd un plasmid 237

hibrid. Pentru a se facilita ptrunderea acestui plasmid hibrid n celula bacterian se folosete soluia de CaCl2, care crete permeabilitatea membranei bacteriene, determinnd terminarea transferului de gene. selectarea celulelor bacteriene care conin gena eucariot se realizeaz cu ajutorul unui plasmid care poart unul sau mai muli markeri de rezisten la antibiotice. Dac cultura bacterian cu plasmidul mai sus-menionat este pus n prezena antibioticelor respective, bacteriile, cu cteva excepii, vor fi omorte. O bacterie rezistent posed o gen (eucariot) strin (cuplat cu plasmid cu markeri de rezisten). Aceste celule bacteriene cresc pe respectivul mediu sub form de colonii n care exist un numr de ordinul a sute de milioane de celule bacteriene cu gen eucariot, deci fiecare celul bacterian dintr-o colonie rezistent la antibiotice conine o gen eucariot. Aceste celule bacteriene au fost transformate. Prin tehnologia genetic de transfer de gene de la eucariote la procariote s-au obinut urmtoarele sinteze: - somatotropina (hormon de cretere uman) (1979) - interleukina uman (1980) - interferon leucocitar de fibroblati (1980). Gene de la eucariote transferate la eucariote Gene umane (responsabile de sinteza unor produse metabolice) au fost transferate n celule de drojdii; acestea, dup integrarea n genomul lor a genelor umane, au putut sintetiza produse metabolice umane. n prezent drojdiile se folosesc n acest scop pe scar larg n industria farmaceutic. Gene umane au fost inoculate i n culturi de celule de mamifere. De pild, gena uman (de pe cromozomul 10) responsabil de sinteza factorului VIII al coagulrii a fost clonat i transferat n celule renale de hamster, celula de hamster ncepnd s sintetizeze produsul acestei gene, adic factorul VIII de coagulare, necesar n tratamentul hemofilicilor; preul acestui produs s-a dovedit a fi mult mai ieftin dect al factorului VIII extras din plasma de la om sntos. Pentru cele 4000 de boli genetice umane cunoscute astzi ca nevindecabile se preconizeaz o terapie genetic prin: reperarea genelor mutante responsabile de defectul genetic i ulterior, nlocuirea genei mutante printr-o alel normal. Aceast terapie este nc la nceput; se ncearc introducerea unei gene normale n genomul pacientului i urmrirea acestei aciuni n timp. Acest prim pas reprezint adiia de gene; principiul acestei metode este recoltarea de la pacieni de celule cu defect, injectarea acestora cu gene sntoase fixate pe un virus vector, apoi reinfuzarea respectivelor celule la pacient.

11.1.2.

Terapie cu gene int (Gene Targeting)

n condiiile progresului actual al tiinelor biologice, exist premisele tratrii ntr-un viitor foarte apropiat a unor boli genetice, infecii HIV, boli neoplazice. n aceste boli, terapia cu gene are drept scop introducerea unor gene intacte din punct de vedere funcional n celulele cu gen defect i apoi exprimarea acestor gene nou introduse. Din punct de vedere teoretic, terapia cu gene poate fi de dou feluri: terapie cu gene somatice, n care celulele receptoare de gen intact sunt celulele organismului. n acest caz, tratamentul este restrns doar la pacienii tratai, dar rmne fr efect asupra descendenilor; terapie cu gene sexuale, n care celulele receptoare de gen intact pot fi celulele sexuale sau celula ou fecundat, n acest caz influena tratamentului transmindu-se progeniturii. Astzi este ns interzis prin lege transferul de gene la nivelul celulelor sexuale umane; rmne practicabil doar terapia cu gene n celulele somatice. Principiile de baz ale terapiei cu gene sunt urmtoarele: 238

recoltarea de celule int de la pacient; cultivarea i multiplicarea celulelor int n culturi celulare, n condiii speciale; clonarea genelor sntoase; introducerea n celulele int cu ajutorul unor vectori corespunztori (retrovirusuri) a unor gene sntoase; selectarea celulelor care conin gene sntoase strine i exprimarea lor; multiplicarea celulelor dorite n culturi de celule; reintroducerea acestor celule la pacieni.

a. Terapia cu gene n boli ereditare Majoritatea bolilor genetice la om sunt determinate de mutaii punctiforme sau deleii. n prezent se studiaz posibilitile tratrii, pe baza terapiei cu gene, a urmtoarelor boli ereditare: boli sanguine de tip talasemie i meniscocitoz (sickle cell anemia); n aceste boli exist o gen deficitar n sinteza subunitii tip -globin din structura hemoglobinei; celulele int pentru terapia cu gene sunt reprezentate, n acest caz, de celulele stem pentru seria eritrocitar din mduva osoas; hipercolesterolemia familial; este o tulburare genetic a metabolismului grsimilor, bazat pe absena receptorilor LDL (lipoproteine cu densitatea sczut) ai celulelor hepatice. Anderson i colab. De la Univ. Houston din Texas preconizeaz pentru tratamentul acestei boli realizarea unor neo-organe (structuri din materiale artificiale plasate n vecintatea ficatului), n care sunt introduse celule hepatice injectate cu gene care au capacitatea de a atrage colesterolul. Acest neo-organ (cu rol de ligand), dac va fi conectat printr-o reea de vase sanguine cu ficatul, va extrage excesul de colesterol din sistemul circulator (unde colesterolul poate determina tulburri cardiovasculare) i l va ndrepta prin reeaua sanguin ctre ficat, care l va elimina; distrofia muscular Duchenne; se manifest printr-o topire rapid a masei musculare; boala apare ca urmare a inactivrii genei responsabil de sinteza distrofinei. Aceast inactivare este consecina inseriei, n exonul 48 al respectivei gene, a unui retrotranspozon L1; mucoviscidoza (fibroza chistic) este o boal genetic recesiv care afecteaz pancreasul exocrin; se caracterizeaz prin creterea consistenei secreiei pancreatice avnd drept consecin obturarea glandelor exocrine i formarea de chisturi pancreatice cu distrugerea esutului pancreatic i scderea nivelului enzimelor pancreatice. n aceast boal este prezent i un deficit funcional al enzimei mitocondriale NAD- dehidrogenaza ct i o cretere intercelular de ioni de Ca++; boala imunodeficienei combinate severe (SCID) cu deficit funcional al limfocitelor T (prin absena enzimei adenozindezaminaza A i B). Aceast boal este foarte rar, pn astzi fiind descrise numai 50 de cazuri n literatura de specialitate. Absena respectivei enzime determin scderea capacitii de aprare a organismului i moartea copilului n primul an de via. Epoca terapiei cu gene a nceput n septembrie 1990 n SUA, cnd Francis Anderson, eful seciei de Hematologie Molecular de la Naional Heart, Lung and Blood Institute al Universitii Houston Texas, i medicii Michael Blaese i Kenneth Culver de la Naional Cancer Institute au efectuat prima terapie cu gene tocmai ntr-un caz cu deficit funcional de limfocite T. Procedeul a constat n recoltarea de limfocite T de la copilul bolnav; aceste limfocite au fost cultivate i multiplicate n culturi celulare. Cu ajutorul unui vector, aceste celule T din culturi au fost inoculate cu gene pentru enzima adenozindezaminaz. Apoi aceste limfocite inoculate au fost cultivate i multiplicate mai departe n culturi celulare, fiind apoi reinfuzate i.v. la acelai copil. Acest tratament va trebui repetat n cursul vieii pacientului. Cu referire special la utilizarea retrovirusurilor drept vectori de gene, trebuie menionat c Richard Mulligan de la Massachusetts Institute of Tehnology a imaginat o metod eficace 239

de prelucrare prealabil a acestui virus. Aceast prelucrare const n eliminarea prealabil a majoritii genelor virale din structura acestuia i combinarea ulterioar a segmentului de virus rmas cu genele care urmeaz s fi injectate n celulele umane. n acest fel, virusul lipsit de majoritatea genelor proprii devine inofensiv, deposedat fiind de capacitatea infecioas, pstrnd ns capacitatea ca, o dat introdus ntr-o celul, s-i poat ngloba ncrctura genetic n aceasta. Retrovirusurile reprezint astzi uneltele cele mai larg utilizate n ingineria genetic. Retrovirusurile sunt mai mici dect celelalte virusuri i, spre deosebire de acestea, nu ucid celulele pe care le contamineaz. Fenomenul prin care retrovirusul vector transport i fixeaz o anumit gen n nucleul unei celule intite poart numele de transducie. Pentru terapia genic, alegerea celulelor int este foarte important. Iniial s-a ncercat folosirea celulelor stem (celule-tulpin) din mduva osoas, dar aceste celule s-au dovedit a fi inte foarte dificile, fiind foarte greu de obinut; proporia acestor celule stem n esuturile medulare este mai mic de 1/10000 i nu exist nici o metod adecvat de separare a celulelor stem de celelalte celule. n plus, fenomenul de transducie poate avea loc doar n celule care se divid, or celulele stem, se divid foarte rar, deci transducia n aceste celule este practic imposibil. De aceea, dei celulele stem au o durat de via infinit n comparaie cu limfocitele ( cu via doar de cteva luni), au fost preferate limfocitele drept celule int pentru vectori. Pentru a fi altoite cu retrovirusul transductor, limfocitele sunt puse n contact, ntr-o mixtur cu acesta, ntr-o cultur de celule; n cteva ore virusul va ptrunde n majoritatea acestor limfocite, care apoi vor fi infuzate pacientului. Este posibil ca limfocitele corectate (prin injectare cu virus vector + gena pentru sinteza enzimatic) s asigure un timp, cel puin parial, un anumit nivel imunitar organismului. b. Terapia cu gene n infecia HIV Anderson i colab. mpreun cu R. Gallo (National Cancer Institute) preconizeaz tratamentul cazurilor de SIDA prin terapie intit cu o gen pentru sinteza unei proteine receptoare CD4 pe suprafaa limfocitului. n prezena respectivei gene, limfocitele ar fi capabile s sintetizeze o cantitate mare din aceast protein. Virusul HIV, n primul stadiu al ptrunderii sale n organism, se fixeaz pe aceast protein de pe suprafaa limfocitelor. n cazul n care n sistemul sanguin ar putea exista i circula o cantitate mare dintr-o protein similar, aceast protein ar putea fixa virusul HIV, acesta nemaiputnd s ptrund n celulele sistemului imunitar, ciclul de multiplicare viral intracelular fiind astfel oprit. c. Terapia cu gene n boli neoplazice A fost utilizat ntia oar n melanomul malign. n 1991, dou persoane cu forme avansate de melanom malign au fost supuse urmtorului tratament: li s-au extras o cantitate de macrofage pe care s-au grefat apoi vectorii (retrovirusuri) purttori de gene pentru sinteza de factor de necroz a tumorilor (factor TNF). Factorul TNF este o protein format din 157 de aminoacizi cu rol n captarea i distrugerea celulelor tumorale i a substanelor strine organismului. n mod normal, acest factor TNF este sintetizat de macrofage i eliberat n circulaie; n cazul acestor doi pacieni cu macrofage defectuoase, TNF nu se poate injecta direct n torentul circulator, deoarece exist pericolul diluiei acestui factor, la locul tumorii nemaifiind posibil s ajung o concentraie suficient de activ de TNF. De aceea, macrofagele extrase i ntreinute pe culturi celulare au fost inoculate cu vector purttor de TNF i apoi reinlocuite la cei doi pacieni cu melanom.

240

11.1.3. Aplicarea metodelor de biotehnologie n agricultur n vederea obinerii de organisme transgenice

Biotehnologiile moderne, aplicabile la plante i animale, au n vedere obinerea de organisme modificate genetic (transgenice), care s prezinte caracteristici mbuntite, n interesul omului. a. La plante Pn de curnd, cunotinele de genetic vegetal se foloseau doar pentru studiul ereditii, pentru analiza segregrilor* la descendenii rezultai din hibridizri. Posibilitatea de a utiliza elementele disociate (esuturi, celule) din organisme vegetale, de a manipula i cultiva in vitro, n vederea regenerrii plantelor, a deschis primele ci de intervenie genetic;de asemenea, obinerea primelor organisme transgenice a deschis noi perspective n ingineria genetic vegetal. Organismele transgenice (plante i animale) sunt organisme care pe lng nzestrarea lor genetic ctig proprieti noi, ce se incorporeaz n genom i se transmit descendenilor. Biotehnologia de hibridare somatic Aceast procedur permite hibridri totale sau pariale, permutaii de organite citoplasmatice, fuzionare de protoplati (celule fr perete pectocelulozic) chiar de la dou specii diferite. Se obin hibrizi n afara sexualitii. Prin acest procedeu se obine regenerarea unui numr mare de plante - figurile: 135, 136 i 137).

Fig. 135 - Etapele de izolare i cultur a protoplatilor (dup CachiCosma,1984). 241

Fig. 136 - Prin fuziunea protoplatilor se produc hibrizi somatici, cibrizi i himere (dup Badea i Raicu, 1984).

Fig. 137 - Prezentare schematic a principalelor posibiliti de obinere a unor noi varieti de plante (dup Brezeanu i Soran, 1985). Biotehnologie de haploidizare esuturi care au suportat meioza (deci sunt haploide) sau celule rezultate din pseudofecundaie provocat sunt introduse n culturi in vitro. Exist 2 tipuri de haploidizare: - androgeneza = cultura i regenerarea plantelor plecnd de la microspori (fig. 138); - ginogeneza = cultura i regenerarea plantelor plecnd de la ovul sau de la celule haploide asociate.

242

Fig. 138 - Diferite faze ale desfurrii androgenezei la Datura innoxia: 1 structuri embrionare difereniate direct din anter; 2,3 plante complet difereniate din antere; 4 plant androgenetic n tub; 5 plant androgenetic la ghiveci (dup Badea i colab.,1987). Plantele regenerate au un singur set cromozomial (patern de androgenez i respectiv matern de ginogenez) i ar fi rmas sterile dac n-ar fi fost puse la punct mecanismele de autodedublare a acestor cromozomi. Prin aceste metode de haplodiploidizare se creaz plante diploide perfect homozigote (linii izogene) i de utilitate major n ameliorarea calitii speciilor de plante (descendeni absolut omogeni n anumite condiii de reproducere) (fig. 139). Fig. 139 - Obinerea de plante haploide, linii izogene i mutante la nivel haploid prin cultura in vitro a gametofiilor. Biotehnologie de transfer Un exemplu a fost menionat la capitolul despre tipurile de transfer de gene procariote la eucariote n scopul obinerii de specii de plante (bumbac) rezistente la insecte. Primele organisme transgenice prin biotehnologie de transfer s-au obinut la cereale: la orez n 1988, la porumb n 1990, la gru n 1992. Spre aceste trei specii de cereale, care reprezint circa jumtate din necesarul de substrat alimentar pentru alimentaia populaiei globului cu proprieti ct mai adecvate, prin folosirea tehnologiei genetice. n general se urmresc obinerea urmtoarelor proprieti n noile organisme transgenice: fixarea azotului din atmosfer; rezistena la infecii virale, bacteriene, vegetale, insecte; tolerana la uscciune, temperatur nefavorabil, metale grele, concentraie crescut de Na n sol, ierbicide; creterea produciei de substane nutritive, creterea cantitii de acizi grai nesaturai; izolarea din plante a substanelor cu proprieti farmaceutice.

243

Pn n prezent au fost obinute noi soiuri transgenice de roii, gru, tutun i petunii, rezistente la uscciune, cldur, metale grele, grad nalt de salinitate i rezistente la insecticide. n anul 1992 erau raportate 40 de soiuri noi de plante transgenice. n timp ce pentru o cultivare de plante clasice sunt necesari zece ani, pentru obinerea unui nou caracter, n cazul utilizrii tehnicilor genetice, acest interval scade la ase ani. n 1994, n SUA a fost proiectat crearea unor soiuri de plante transgenice rezistente la ierbicide, n timp ce buruienile rmn sensibile la ierbicide. Obinerea de noi soiuri de plante rezistente la infeciile virale se realizeaz prin: integrarea unei pri din ADN viral n genomul plantei; prin aceasta, exprimarea proteinei de nveli viral va asigura rezistena plantei la respectivul virus; inhibarea replicrii virale prin tehnica antisens (1992). n 1993, n SUA au fost obinute soiuri de roii transgenice prin metoda de inhibare cu ARN antisens, care a oprit sinteza enzimei poligalacturonaza, responsabil de compunerea peretelui celular al tomatei. n aceste condiii, tomatele pot fi culese cnd se afl la punctul favorabil al coacerii i se pot pstra ase-opt sptmni fr a fi puse la rece. n 1995, n SUA se prevedea obinerea de noi soiuri de plante transgenice rezistente la insecte, care s fie livrate pe pia n urmtorii zece ani. Pentru viitor, trebuie luate n considerare anumite riscuri care apar drept consecin a apariiei unor variante de specii vegetale. Pentru acest motiv oamenii de tiin vor trebui s foloseasc cu mult grij i msur aceste posibiliti moderne ale biotehnologiei. Dintre riscurile posibile, se pot enumera: pierderea diversitii lumii vegetale, avnd drept consecin dezechilibrul ecosistemelor; deteptarea unor gene ancestrale nedorite; riscul dezvoltrii explozive a unor patotipuri adaptate n mod special; restrngerea gamei de caliti organoleptice naturale ale unor noi sorturi de legume i fructe; noi biosinteze, neprevzute n prezent; posibiliti de biosinteze nedorite de acizi grai, glucozide, alcaloizi, enzime, hormoni (produse vegetale); dezechilibre nutriionale. Prevenirea riscurilor menionate mai sus cere mult pruden ct i anticiparea remediilor posibile nainte de crearea noilor variante. n acest sens se recomand: evitarea difuzrilor tipurilor omogene i uniforme de vegetale pe suprafee foarte ntinse; efectuarea detailat a analizelor de structur i control n faza precoce a noilor variante ale unui sort vegetal; ncheierea de acorduri internaionale pentru nfiinarea unei comisii de etic cu posibiliti de control permanent, etap de etap, asupra varietilor nou-obinute. b. La animale S-au obinut crapi transgenici prin transfer de gene de cretere de la cretere de la pstrvi; aceste noi organisme transgenice au avut o vitez mult mai mare de cretere dect organismele noi organisme transgenice au avut ovitez mult mai mare de cretere dect organismele normale. La porci au fost transferate gene responsabile de sinteza hormonului de cretere, n vederea obinerii unor organisme transgenice cu metabolism activat, cu o eficien nalt de utilizare a hranei i cu o cretere foarte rapid.

244

11.1.4. Ingineria genetic utilizat n prepararea de noi conservani alimentari

Nizina, substan din categoria lantibioticelor, i-a gsit o foarte larg aplicabilitate practic n industria alimentar; astfel, n 1989, nizina era utilizat drept conservant alimentar n peste 50 de ri de pre glob. Nizina este produs de tulpinile de Lactococcus lactis 6F3, ATTC 11454 GR. 4 Lancefield; n concentraie mai mic de 30 l/ml inhib dezvoltarea diferitelor specii de germeni gram-pozitive , prezentnd activitate inhibitorie maxim la un pH mai mic de 5,5. Nizina inhib de asemenea sporularea la bacterii din genul Clostridium i Bacillus, dar nu are nici un efect asupra majoritii bacteriilor gram-negative i nici asupra fungilor i levurilor. Din 1951, nizina este folosit n industria alimentar pe scar internaional, drept conservant natural pentru vegetale, fructe, brnzeturi proaspete i procesate, carne, pete, cacao, buturi alcoolice (vinuri). Aceast larg utilizare se datorete faptului c nizina prezint marele avantaj de a nu avea efecte nocive asupra organismului viu, n comparaie cu nitraii i nitriii (folosii tot drept conservani), care prin producerea de nitrozamine au aciune carcinogen asupra organismelor. Pentru produsele n care nu se poate renuna total la adaosul de nitrai (nizina fiind ineficient asupra florei gram-negative), cantitatea de nitrai poate fi redus considerabil, prin utilizarea lor asociat cu nizina. Nizina prezint i avantajul de a fi hidrolizat complet de ctre proteazele tractului digestiv uman, neproducnd nici o dereglare a florei intestinale gram-negative. Totui n prezent se consider c posibilitile de utilizare ale nizinei drept conservant alimentar sunt nc limitate din cauza slabei ei solubiliti i a stabilitii sczute la pH neutru; n prezent ea poate fi utilizat drept conservant activ n alimente cu pH-ul mai mare de 6,5. n perspectiva dezvoltrii biotehnologice, se preconizeaz obinerea prin procedee de inginerie genetic i proteic a unor variante de nizin cu spectru larg de activitate, variante ce vor putea fi utilizate drept conservante ntr-o gam mult mai larg de produse alimentare, evitndu-se astfel nocivitatea altor conservani alimentari asupra sntii publice. n ultimii ani, prin studiile de micribiologie au fost identificate tulpini microbiene care printr-un proces de bioconversie microbian/enzimatic acioneaz asupra acizilor grai (acid linoleic i linolenic) i esterilor, ambele clase de substane derivate din uleiuri vegetale, ducnd n final la obinerea unor arome naturale (lactone i metilketone) cu utilizare larg n industria alimentar.

11.1.5. Ingineria genetic i rezolvarea unor probleme de ecologie

Posibilitile tehnologiei genetice au importan nu numai pentru dezvoltarea cercetrii fundamentale, a dezvoltrii tiinelor medicale i agriculturii, ci i pentru rezolvarea n viitor a unor probleme ecologice, de exemplu creterea sintezei unor resurse naturale din mediu. Multe tulpini bacteriene de Pseudomonas putida posed un plasmid responsabil de descompunerea hidrocarburilor din petrol, aspect ce semnific posibilitatea unei mai bune utilizri a petrolului brut natural. n acest sens, se ncearc n prezent obinerea unei bacterii mbuntite, al crei plasmid s creasc eficiena utilizrii petrolului brut.

11.2. Alte aspecte ale biotehnologiei moderne i perspectivele secolului XXI

Progresele recente n cunoaterea la nivel molecular a interaciunilor extra- i intracelulare, mediate de clase specifice de molecule i semnale au contribuit la construirea unui fundament pentru elaborarea viitoarelor strategii de sintez a unor noi ageni terapeutici cu urmtoarele caliti: 245

eliberarea intit (situs-specific) n circulaie prelungirea timpului de njumtire efect prelungit la locul de aciune efecte benefice mrite asupra organismului. n acest sens exist deja o metodologie pentru obinerea unor proteine-himere, cu aplicabilitate practic n domeniul terapiei: A. anticanceroase B. antivirale C. cardiovasculare D. n boli metabolice.

A. Terapia anticanceroas n prezent, terapia anticanceroas cu citostatice este nesatisfctoare ntr-un numr mare de cazuri din cauza: dezvoltrii rezistenei la droguri efectelor secundare nocive (imunodepresie medular, toxicitate hepatic i renal etc.). innd seama de aceste considerente, cercettorii i-au propus: mbuntirea gradului de aciune selectiv a drogului, nelegnd prin aceasta o aciune ct mai intit asupra celulelor tumorale, bazndu-se pe achiziiile cele mai recente ale biologiei moleculare; minimalizarea ct mai mult cu putin a efectelor toxice secundare ale drogurilor, n cursul distribuiei acestora n organismul bolnav. Pornindu-se de la aceste elemente, s-a ncercat construirea unor noi molecule cu potenial antiumoral, i anume: a. Inhibitori ai topoizomerazelor Topoizomerazele sunt enzime destinate a modifica structura spaial a ADN-ului nainte de replicare, suprimnd superrsucirile dublului helix. b. Molecule active pe tubulin (antimitotice) Au aciune antimitotic mpiedicnd diviziunea celular prin stabilizarea microtubulilor (spre diferen de Vinca, alcaloizi care determin depolimerizarea tubulinei). Dintre antimitotice, taxolul a fost testat experimental prin administrare intratumoral n tumori vezicale la oarece. Acesta s-a dovedit foarte eficace n asociaie cu alte antimitotice curente, prezentnd sinergie cu metotrexatul i adriamicina. Derivaii de platin reprezint astzi o clas foarte studiat de antimitotice; dintre acestea, pentru cisplatin i carboplatin a fost demonstrat eficacitatea clinic. Diaminociclohexanul i axoliplatina sunt n curs de experimentare i nu au atins nc faza de testare clinic; sunt platine liposolubile care se pot administra cu ajutorul liposomilor. c. Substane antiangiogenice S-a studiat rolul factorului de cretere fibroblastic (bFGF) asupra mecanismelor de angiogenez (geneza vaselor sanguine) i consecina acesteia asupra metastazrii. S-a constatat c acest factor bFGF are o aciune de stimulare a proliferrii celulelor endoteliale de activare a angiogenezei (neoformaie de vase sanguine). Pentru contracararea aciunii bFGF, a fost sugerat un mecanism de blocare a receptorilor celulelor endoteliale cu ajutorul unor analogi ai heparinei, peptide antagonice, anticorpi. Pe modele experimentale s-a demonstrat i eficacitatea ologozaharidelor sulfatate, care, blocnd receptorii celulelor endoteliale, opresc fixarea bFGF pe respectivii receptori, mpiedicnd n consecin angiogeneza i inhibnd simultan adenoamele experimentale (de pancreas, sn, prostat) de origine uman.

246

Se pare c aceste substane antiangiogenice acioneaz prin oprirea dezvoltrii de noi vase sanguine i nu prin distrugerea celor formate; deci opresc neoformaia i, n consecin. metastazarea. d. Inhibitori de kinaze Sunt inhibitori ai tirozinkinazei proteinkinazelor, tioindolului, inhib autofosforilarea bFGF (via tirozinfosforilare); prin inhibarea aciunii bFGF este oprit proliferarea fibroblastelor, fiind astfel inhibat dezvoltarea metastazelor (prin inhibarea neoformaiei de vase de sanguine). e. Substane antisens Studiul acestor substane a fost posibil datorit cercetrilor de biologie molecular; aciunea lor a fost urmrit pn n prezent pe linii celulare, intele principale de aciune a acestor substane dovedindu-se a fi: gena oncogen c-myc (pentru substanele AACR 1833, AACR 3154. AACR 3668, AACR 3672, AACR 3679) proteinele p120 (pentru substanele AACR 1832, AAXR 3155) proteinele p53 (pentru substanele AACR 3630, AACR 3668). n prezent sunt studiate metodele de inoculare cele mai eficiente a acestor substane n organismul bolnav, cutndu-se a se ameliora penetrabilitatea lor n celule. Pentru a se nelege mecanismul de aciune (controlul) al ciclului nucleic antisens asupra unui proces de oncogenez (expresie oncogen), trebuie amintit mai nti c transformarea celulelor normale n cellule maligne reprezint un proces n mai multe etape: activarea protooncogenelor inactivarea genelor supresoare de tumori inactivarea genelor de reparare a ADN. Pornind de la aceste aspecte, astzi sunt urmrite urmtoarele obiective: descompunerea unor droguri care s poat inhiba selectiv efectele biologice ale produilor oncogeni restabilirea funciei factorilor supresori de tumori i a genelor pentru repararea ADN-ului. Majoritatea drogurilor existente n prezent acioneaz la nivelul proteinelor. Chiar i drogurile anticanceroase care interacioneaz cu ADN i exercit aciunea biologic prin inhibarea enzimelor (topoizomeraze) care proceseaz ADN. Modul cel mai simplu de a corecta activitatea acidului nucleic este cel de a folosi tocmai acid nucleic; pornindu-se de la aceast idee, s-au preparat fragmente scurte de acid nucleic (oligonucleotide), care s se lege selectiv de o secven complementar a unui acid nucleic unic lan (un ARNm sau un ARN viral). Acest oligonucleotid (antisens) blocheaz, prin legarea lui de ARN-ul int (target), translaia sau respectiv reverstranscriptaza ARN-ului (viral) int. Oligonucleotidele antisens sunt fosfodiesteri naturali care au diferite mecanisme de aciune. Oligonucleotidele antisens de tip oligofosfotioai se folosesc i n tratamentul leucemiilor i al infeciilor cu HIV. Un oligoribonucleotid (ribozim) ARN se leag de o secven complementar a ARN int, ca i oligonucleotidul antisens, dar poate include n plus i clivajul catalitic al ARN intit. f. Strategia de sens cu structuri oligonucleotidice n 1980 a aprut o nou strategie i anume cea a antigenelor n care oligonucleotidul are drept int un ADN dublu helical, pentru a forma n final un triplu helix la nivelul cruia este blocat transcrierea (ceea ce reprezint blocarea primei etape a expresiei genelor). Oligonucleotidele pot fi folosite pentru controlul genelor n aa-numita strategie de sens (sense approach); este vorba de un oligonucleotid capcan, folosit pentru a prinde n curs un factor de transcriere (de expresie) care duce n final la alterarea expresiei tuturor genelor de pe respectivul fragment ADN. Rezult c n comparaie cu strategiile antisens (tip ribozim), strategia de sens este mai piin selectiv. Totui oligonucleotidele capcan pot 247

fi utilizate pentru a prinde n curs exprimarea unui numr de gene din genomul unui virus sau al unui parazit. Efectul acestor oligonucleotide de strategie de se3ns poate fi deci selectiv pe un virus sau parazit. g. Strategia aptamer Recent a fost elaborat un nou mod de utilizare a acestor oligonucleotide, pe baza legrilor lor de o protein a crei funcie normal nu implic creo interaciune cu acidul nucleic; este vorba de strategia aptamer. n cadrul acestei strategii, se folosesc oligonucleotidele cu rol de liganzi pentru enzime, receptori, factori de cretere. h. Utilizarea anticorpilor monoclonali Dezvoltarea intensiv a noilor concepte molecular-biologice din imunologia ultimilor 20 de ani a deschis noi perspective n terapia cancerului. Una din problemele dezbtute n prezent n aceast direcie este obinerea unor proteine de fuziune cu anticorpii monoclonali recombinai, n scopul utilizrii acestor noi preparate n imunoterapia cancerului. i. Proteine de fuziune (anticorpi monoclonali - interleukina IL2) Aceste proteine de fuziune au fost realizate prin tehnici de inginerie genetic. Anticorpii monoclonali antitumorali (cu specificitate unic), care, n condiii de recombinare, poart fixate pe molecula lor citokine, direcioneaz aceste citokine atunci cnd sunt introdui n organismul bolnav ctre situs-urile celulelor tumorale corespunztoare. Aceste proteine de fuziune (anticorpi-IL2) sunt injectate n organismul bolnav. Construirea acestei proteine fuzionate recombinate se face n scopul obinerii unei eficiene biologice optime, prin combinarea capacitii de intire unic a anticorpilor monoclonali cu activitile multifuncionale ale citokinelor. j. Terapie genetic cu gene codificatoare pentru citokine S-a pornit de la observaia c citokinele regleaz reactivitatea imunologic, maturaia, activitatea i migrarea celulelor inflamatoare. Observaiile efectuate pe animale de experien au artat c o provizie local format din diferite tipuri de citokine infuzate direct, sau obinut n urma unei terapii genice cu gene (sintetizatoare) de citokine, poate induce o imunitate antitumoral puternic de lung durat i ocazional, poate determina chiar i ndeprtarea unei tumori preexistente. n 1995, literatura de specialitate semnala existena a 19 cazuri clinice la om, supuse tratamentului cu citokine. Principiul acestei terapii const n implatarea n organismul bolnav a unor celule somatice (limfocite) modificate din punct de vedere genetic (limfocite pe care sau transferat n prealabil gene codificatoare de citokine); aceste celule limfocitare vor fi foarte bune vehicule n organismul bolnav datorit capacitii lor de a prolifera, ca rspuns la administrarea de interleukina 2 (IL2) sau antigen, ct i datorit faptului de a putea migra i rspndi n tot organismul. Schmidt-Wolf i colab. (1995) au propus un protocol de terapie genic bazat pe utilizarea celulelor CIK (celule killer transfectate cu gena IL7) pentru inducere de citokine IL7. Aceste celule CIK s-au dovedit a fi celule efectoare citotoxice foarte eficiente, cu efect antitumoral mult mai nalt dect cel al celulelor LAK (celule killer activate de limfokine standard). B. Terapie antiviral Terapie anti-HIV La nceputul anilor 1980 exista n ntreaga lume opinia c datorit antibioticelor i vaccinurilor va fi rezolvat problema infeciilor bacteriene i virale, deoarece aceste preparate terapeutice reuiser mai mult sau mai puin s duc la dispariia acestor infecii de pe glob. Dar n 1981 aprea virusul HIV (Human Immunodeficiency Virus), care se dovedete foarte 248

curnd a declana mari epidemii SIDA (Syndrome dImmuno-Deficience Acquise) pe glob, crend o panic tot att de grav ca i cea determinat de ciuma bubonic din Europa secolului al XIV-lea. n decembrie 1994, datele OMS estimau n lume: 4,5 milioane cazuri de boal SIDA declanat, din care doar 1025073 cazuri nregistrate; 17 milioane de persoane infectate (purttoare de virus) HIV, din care un milion de copii. n Romnia s-au nregistrat ntre 1985-1994, 3119 cazuri de boal SIDA, dintre care 2885 la copii i 234 la aduli. La sfritul anului 1999, Programul UNAIDS i al OMS-ului raporta 50 de milioane de persoane infectate cu HIV de la declanarea epidemiei de SIDA, din care 16 milioane au decedat din cauza bolii. n 1999, numrul cazurilor noi de persoane infectate a fost de 5,6 milioane iar decesele au atins cifra record de 2,6 milioane de persoane pe glob. n Romnia, la 30 septembrie 1999 se nregistrau 10000 de persoane infectate cu HIV, dintre care 6000 deja bolnave. Trebuie remarcat diferena ntre infecie i boal; o persoan poate fi infectat cu virus HIV fr a fi nc bolnav. Infecia nseamn c virusul HIV, prezint n organism dar ascuns n nucleul celulelor limfocitare, se afl n stare dormind timp de luni de zile pn la 5-20 de ani; persoana este sero-pozitiv, dar nu este nc bolnav. Boala reprezint starea organismului n momentul n care virusul HIV din stare dormind se trezete, se multiplic, invadeaz organismul, devenind deci agresiv, avnd drept consecin apariia simptomelor de boal. Astzi infevia HIV reprezint o criz major de sntate public. Conform rapoartelor OMS, pentru anul 2000 se prevd pe Terra 30 de milioane de purttori HIV. Pn n prezent oamenii de tiin nu au reuit s prepare nc un vaccin pentru aceast infecie, din cauza marii variabiliti a virusului HIV. Aceast mare variaie genetic a virusului a constituit obstacolul major n prepararea unui vaccin HIV. Pentru a se prepara substane terapeutice cu aciune antiviral au fost necesare nti studii de biologie molecular n vederea determinrii structurii virusului HIV i a ciclului de via al acestuia. Virusul HIV face parte din categoria virusurilor ARN (retrovirusuri) care prezint un aspect particular de multiplicare. Studiile molecular-biologice au demonstrat c ciclul de via a HIV n organismul uman cuprinde3 trei etape: I.- ARN viral se transcrie n ADN n prezena enzimei virale revers transcriptaza; acest aspect reprezint particularitatea multiplicrii acestui virus, i anume curgerea invers a informaiei genetice din direcia ARNADN II. - Acest ADN viral (copie dup ARN) se integreaz n genomul celulei gazd sub influena enzimei virale integraza;urmeaz starea dormind a virusului. III. - Etapa de transcriere: dup tiparul (pattern-ul) ADN viral integrat, se resintetizeaz ARN viral i proteina viral corespunztoare, dar aceast protein primar nou-sintetizat are lanuri foarte lungi i este inactiv. Pentru a deveni activ, aceast protein foarte lung trebuie secionat (procesat) de nite enzime virale numite proteaze. Prezena acestor proteine scurte i active, ct i cea a respectivului ARN viral nou format vor duce la formarea virusului matur care va fi capabil s invadeze alte celule. Substanele anti-HIV utilizate pn n prezent, de tipul zidovudinului (analogi nucleozidici) i derivai (dideoxiinozin, dideoxicitidin),acioneaz la nivelul etapei I, fiind inhibitoare ale reverstranscriptazei i mpiedicnd astfel conservarea virusului n copii, n stare dormind i integrat n nucleul celulelor, virusul ARN disprnd prin imposibilitatea multiplicrii sale. Dar aceste substane terapeutice s-au dovedit a avea efecte toxice foarte puternice, n special la nivelul sistemului nervos central (SNC). De asemenea, aceste substane au determinat i dezvoltarea rezistenei virusului HIV la drog.

249

n prezent se experimenteaz o substan cu aciune anti-HIV la nivelul etapei a III-a de dezvoltare a virusului, i anume o substan care s inhibe proteazele virale, mpiedicnd tierea lanurilor lungi de proteine inactive. n aceste condiii, proteina rmnnd sub form de lan lung i inactiv, virusul matur nu se mai poate forma, disprnd deci posibilitatea de invadare de ctre virus a altor celule ale organismului. n 1997 trei companii mari farmaceutice lucrau la obinerea unei asemenea substane de tip inhibitori ai proteazei virusului HIV, i anume: firma Merck, Sharp & Dohme - substan cod 693541 firma Hoffmann-LaRoche - substan cod Ro-31-8959 firma Abbott - substan cod A-77003 Substratul de preparare a substanei active prea a fi un material biologic, dar firmele pstrau secretul de fabricaie. Rmn nc de rezolvat probleme legate de: - aciunile secundare farmacokinetice (toxice); - dezvoltarea rezistenei la drog; - eficacitatea substanei prin administrare per os . C. Terapie intit cardiovascular Se refer la tratamentul cu anticorpi monoclonali antitrombocite umane n cazul infarctelor, n scopul unei trombolize rapide i al prevenirii reocluziei. S-au preparat anticorpi monoclonali (anti Mo-1) fat de receptorul de adeziune al trombocitelor. Studii in vitro pe cine au demonstrat capacitatea acestor anticorpi de a reduce leziunile ischemice miocardice postinfarct cu 46% n comparaie cu animalul martor. Reducerea zonei de infarct s-a dovedit a fi independent de severitatea ischimei. S-a observat, de asemenea, o mbuntire a recanalizrii arteriale coronariene, prin injectarea de anticorpi monoclonali antireceptor trombocite umane (gpIIb i gpIIIa) i activarea reocluziei vasculare. Metoda Anderson pentru liza trombilor vasculari se bazeaz pe receptorii gpIIb i gpIIIa, sintetizai de gene din familia genelor integrine; aceti receptori mediaz mecanismele de adeziune (fixare) de fibrinogen, fibronectina, vitronectina, factor Wilabrand, trombospondin. n cazul implantelor vasculare se preconizeaz nvelirea acestor receptori n strat de celule injectate cu o gen sintetizatoare de un factor litic care, prin liza cheagului sanguin, s previn apariia trombilor vasculari. D. Terapie n boli metabolice Prepararea de liganzi proteici tip lipoproteine Apolipoproteinelesunt proteine care datorit structurilor lor helicale amfipatice leag lipide. Ele reprezint liganzi pentru receptori specifici. Apolipoproteinele de densitate nalt (HDL), prin legarea lor de o mare varietate de celule (macrofage, hepatocite) i esuturi, joac un rol esenial n transportul i reglarea metabolismului colesterolului. Se preconizeaz utilizarea lor n tratamentul hipercolesterolemiei familiale. E. Vaccinuri recombinate n pragul mileniului al treilea, cercetrile sunt aproape gata s introduc n practica medical tehnologia unei noi vaccinri, cea a imunizrii directe cu ADN; ar fi al cincilea tip de vaccinare cunoscut n istoria medicinii dup: vaccinurile vii atenuate, cele cu ageni microbieni omori, cu componente purificate i cele obinute prin inginerie genetic. n cadrul tehnologiei vaccinurilor ADN, ADN-ul care codific o protein specific este cuplat cu elementele genetice de control pentru a se obine plasmide care se vor replica atunci cnd vor fi introduse n bacterii corespunztoare. Creterea bacteriilor va duce la producerea unui numr mare de copii plasmidice din care se separ ADN-ul imunizat pentru a fi folosit apoi drept vaccin.

250

n prezent se ncearc prepararea unor asemenea vaccinuri pentru administrare nazal sau per os, lundu-se n considerare faptul c acest tip de vaccin este mult mai sigur, mai puin costisitor i mai uor de administrat dect vaccinurile convenionale. Se preconizeaz c acest tip nou de vaccin va avea o eficien enorm asupra bolilor infecioase care astzi dau nc o rat foarte nalt de mortalitate, n bolile emergente, bolile reemergente, ct i n cazurile de rezisten la chimioterapice. Prin vaccinarea cu ADN existnd posibilitatea de a vaccina pentru un numr mare mai mare de proteine specifice deodat, aceast vaccinare apare ca o terapie multidrog. Vaccinurile ADN stimuleaz att imunitatea umoral ct i cea celular ; potenialul acestor vaccinuri de a stimula capacitatea citolitic a celulelor T reprezint un punct de rscruce n vaccinologie. S-a demonstrat c aceste vaccinuri ADN induc celulele T de tip T1 helper cu efect mpotriva virusului HIV. Aceste vaccinuri produc un rspuns imun persistent, ca i vaccinurile cu virusuri atenuate, dar fr a exista pericolul rectigrii virulenei de ctre virusul vaccinant. Toate aceste vaccinuri ADN se prepar dup acelai principiu al plasmidelor, nefiind necesar de fiecare dat inventarierea unei noi tehnologii, n funcie de fiecare agent infecios. Aceste vaccinuri sunt foarte stabile att la temperatur sczut ct i foarte ridicat, motiv pentru care se pot transporta la temperatura mediului ambiant fr a fi necesar refrigerarea. F. Aciunea de depoluare a ecosistemelor n condiiile creterii populaiei globului, a urbanizrii i industrializrii, consecutiv cu lipsa unei educaii ecologice elementare a populaiei, necesar pentru conservarea mediului nconjurtor, n ultimii 30 de ani s-a ajuns la un dezechilibru ecologic major care astzi amenin viaa pe Terra (defriri masive, deertificri ntinse, grad foarte ridicat de poluare a rurilor, fluviilor, distrugerea florei i faunei marine etc.). n aceste condiii , astzi oamenii de tiin pun tot mai acut problema refacerii cadrului natural i a reciclrii deeurilor poluante. n acest context, cercettorii ncearc s foloseasc agenii microbieni (bacterii) n aciunea de reducere a polurii solului (pentru dezintegrarea gunoiului i a deeurilor domestice, municipale, industriale) ct i a contaminanilor din mediul extern. Astfel, dup ndeprtarea prealabil a coninutului toxic de metale grele (Cd, Zn, Cu) din gunoaiele menajere, se trece la prelucrarea reziduurilor organice n vederea obinerii unei producii eficiente de compost care s aib caliti foarte apropiate de ngrmntul natural pentru agricultur. Acest nou compost mbuntete structura solului iar prin coninutul su n microorganisme (care au capacitatea de a inhiba dezvoltarea unei flore microbiene fitopatogene de sol) contribuie la mbuntirea calitii plantelor i a recoltelor. Pe viitor vor continua investigaiile n vederea detectrii unor microorganisme cu potenial de degradare i transformare a poluanilor din diferite deeuri materiale. n vederea progresului rapid n aceast direcie se urmrete crearea i aplicarea unei tehnologii sensor care s cuantifice activitatea fiziologic i biochimic a microorganismelor.

251

Capitolul 12 METODE I TEHNICI MODERNE MOLECULAR - BIOLOGICE I APLICAIILE LOR

12. 1. RECOMBINAREA ADN - ului
Teoria stabilitaii genomului celular a fost zdruciunat n anul 1951, odat cu descoperirea elementelor transpozabile. Fenomenul destabilizrii genomului celular a rmas inexplicabil pn n momentul n care a fost posibil studiul moleculei de ADN. Concentrarea studiilor asupra ADN a fcut posibil injectarea genelor cu ajutorul virusurilor vectoare in celule, deschiznd perspectivele noii terapii cu gene (terapie genetic = Gene Targeting). Respectivele virusuri (vectoare de gene) cu aspect de ,,ace snt introduse intit prin ,,mpucare (shotgun) ntr-un numr foarte mare de ,,inte celulare, care includ linii foarte variate de organisme; Aceast metod a dus la o revoluie tehnico-tiinific a crei consecin a fost construirea de noi genotopuri, la toate tipurile de bacterii, plante, animale. Faptul c informaia genetic a organismelor vii se gsete acumulat pe helixul ADN, iar acest material genetic poate fi izolat iar cele dou lanuri ale dublului helix ADN separate i apoi fiecare din cele dou lanuri recombinate cu un alt lan de ADN strin complementar, d posibilitatea crerii de noi organisme, att n condiii naturale,ct i laborator. Procese naturale de recombinare ADN (recombinare genetic) Joac un rol foarte important n natur, reprezentnd un factor evolutiv; existena acestor procese se explic apariia unor noi specii. Procese artificiale de recombinare ADN (tehnologia ADN-ului recombinat) Se realizeaz n condiii de laborator, n vederea obinerii de noi variante de microorganisme i plante, printr-un numr de metode ce formeaz tehnologia genetic, cunoscute la nivel internaional sub numele de Genetic Engineering. Descrierea compoziiei i structurii spaiale a ADN de ctre J. D. Watson i Fr. Crick din anii 1953 au reprezentat cunotinele fundamentale care au stat ulterior la baza noilor direcii de cercetare, i anume a tehnologiei genetice. Prima reuit de recombinare a fost realizat n SUA n 1970. Aceste tehnici ncearc pe cale artificial combinatrea informaiei genetice (a genelor) de la dou organisme diferite, n vederea crerii unui organism nou cu proprietai prestabile (intite); organismele rezultate sunt organismele recombinate care formeaz astzi obiectul unor studii cu implicaii deosebite n dezvoltarea tiinific i economic pe scar internaional, cu mari perspective de viitor. Aceste tehnici de recombinare genetic stau la baza cercetrilor fundamentale i aplicare n biologia molecular, farmacologie i n medicina viitorului, n scopul ameliorrii diagnosticului i terapiei medicale ntr-un numr mare de boli. Aceste tehnici vor avea implicatii majore i n dezvoltarea agriculturii, n ceea ce privete crearea unur specii noi de plante cu o mare eficien economic.

12.1.1. Principiul recombinrii

Un proces natural de recombinare genetic exist la organismele eucariote (cu set diploid de cromozomi) n cursul meiozei (diviziune reducional). Meioza are loc n celulele germinale i duce la reducerea setului dublu de cromozomi (set diploid) n set haploid (simplu). n prima faz se produce un schimb de fragmente cromatidiene ntre cromozomi omologi (M/P=materni/paterni) alturai printr-un fenomen de ,,crossing-over, ceea ce reprezint un fenomen de recombinare genetic. 252

ntr-un organism diploid cu un anumit numr de perechi de cromozomi omologi i o singur pereche de cromozomi sexuali, fiecare cromozom n interfaz apare format din cte dou cromatide (iar fiecare cromatiod la rndul ei dintr-o molecul de ADN dublu helix). Prin ncruciarea cromatidelor (crossing-over) pe locul de ncruciare, lanurile duble ADN ale celor dou cromatide vor fi tiate, vor interschimba fragmente de ADN, iar apoi capetele tiate se vor lega altfel, rezultnd cromatide recombinate (molecule ADN recombinate). La cromozomii umani exist n medie dou-trei asemenea fenomene de crossing-over i interschimburi de fragmente ADN pe ambele cromatide ale unui cromozom. Aceste procese se produc att de exact, nct nu se pierde nici un nucleoid. Dup interschimburile ntre cromatidele cromozomilor omologi se produce separarea acestor cromozomi cu cromatidele interschimbate i mparirea lor ntre cele dou celule fiice. n faza a II-a a meiozei urmeaz separarea cromatidelor n patru celule germinative mature. Aceste patru celule pot conine: c1 = numai material matern c2 = numai material patern c2 i c3 = material cromatidian recombinat (rezultat din fenomenul de crossing-over) matern i patern.

12.1.2. Procese artificiale de recombinare ADN (Genetic Engineering)

Cu ani n urm era posibil doar cercetarea indirect a ADN-ului asupra produselor ARN i proteice, sau analiza genetic foarte laborioas asupra funciei genelor prin cercetarea aspectelor fenotipice ale organismelor mutante i ale progeniturii acestora. Tehnologia ADNului recombinat, care a aprut n jurul anilor 70, a revoluionat biochimia, oferind posibilitaile cele mai eficiente pentru analizarea i modificarea genelor (ADN) i proteinelor din organismele vii. Pe baza acestei tehnologii, astzi poate fi modificat ntr-un mod dinainte stabilit i intit bagajul genetic al organismelor. Tehnicile de recombinare ADN stau la baza progreselor biotehnologiei moderne, aceste tehnici viznd direct informaia genetic a organismelor, utilizarea acestor metode putnd duce n viitor la nfrngerea barierei ntre specii. Prin procedeele de inginerie genetic se poate obine, prin introducerea unei informaii genetice ntr-un organism, un organism cu priorieti noi (de exemplu, obinerea de noi soiuri de plante cu rezisten crescut i ageni duntori). Tehnologia ADN recombinant presupune urmtoarele etape: tierea lanurilor duble ADN n fragmente specifice, prin aciunea enzimelor de restricie, astfel nct s fie obinute n final fragmente ADN de lan unic; pe aceast cale, moleculele ADN cu greutate molecular nalta snt tiate n molecule cu greutate molecular mult mai mic. Concomitent cu ADN-ul de cercetat, vectorul (virusul) este supus i el aciunii acelorai enzime de restricie, pentru c, n final, pe ambele lanuri de acid nucleic (lan unic de cercetat i lan unic al vectorului), s se obin acelai tip de capete adezive: fragmentul de acid nucleic de cercetat, ct i cel al vectorului se leag covalent (n cursul unui process de circularizare) n prezena ADN-ligazelor introducerea, o data cu vectorul, a respectivului fragment de ADN selecionat i fixat pe vector n celula gazd (celula bacterian avirulent de Esch. coli K12) multiplicarea sincron, o data cu celula gazd, a vectorului i a fragmentului ADN strin ncorparat n genomul celulei gazd. Apar n consecin un numr mare de celule purttoare de copii identice de ADN recombinat. Acest process poart numele de clonare. n cadrul acestui proces, celula bacterian astfel ,,nou construit (cu ADN recombinat) reprezint celula cap de colon. Construirea unui genom nou prin introducerea unei secvene ADN strine n genomul unei celule gazd (de exemplu, bacteria, organisme multicelulare) reprezint de fapt tehnica de inginerie genetic prin care se obin genomuri modificate ce pot fi ulterior exprimate 253

(transcrise i translaionate) de ctre celula gazd, prin sinteza de noi proteine (caractere noi ctigate de celula gazd). Termenul Genetic Engineering este adesea folosit drept similar celui de recombinare ADN, din care rezult un nou genom (prin introducerea, n genomul unei celule, a unei secvene strine de ADN cu autorul vectorului), celula respectiv ctig caractere noi. Prin aceste metode genetice pot fi manipulate, modificate i interschimbate sau nou recombinate att secvenele codificatoare, ct i secvenele de control ale unei gene. Este posibil s se fac noi combinaii pentru secvenele de control ale unei gene i s se determine n acest fel exprimarea unei gene dorite, intr-o anumit celul. Astfel, prin alegerea unei anumite secvene de control, se poate reui exprimarea practice permanent a unei gene altminteri slab activ; n acest context proteinele, care n cantiti mari n calula nou construit. Pentru creterea acestei cantiti de proteine se utilizeaz de regul fragmente de ADNc (secvene codificatoare fr introni). Dac se urmrete introducerea i exprimarea unor gene eucariote n bacterii i drojdii, se folosesc tot fragmente ADNc deoarece aceste microorganisme nu snt capabile s ndeprteze prin fenomene de splicing din ARNm transcris secvenele de introni. Etapele metodei de inginerie genetic utilizat n vederea obinerii unei anumite proteine n cantitate mare snt urmtoarele: se pornete de la matricea ADN; se obine o copie de ADNc (n prezena reverstranscriptazei); se obine un lan dublu ADN; respectivul lan dublu ADN este clonat; fragmentul ADNc clonat este nglobat n vectorul de exprimare; fragmentul ADNc nglobat n vector este introdus n celula receptor o dat cu vectorul; n celula receptor se produce transcrierea i translaia fragmentului ADNc strain (introdus), obinndu-se n final sinteza proteinei dorite. Folosind aceast metod s-a reuit ca celulele bacteriene, drojdiile i celulele de memifere s fie aduse n starea de a produce cantiti mari de anumite proteine int. n acest fel devine posibil analiza proteinelor celulare, care, n mod normal se gsesc n organism n cantiti foarte mici (doar urme) i ar scpa astfel cercetrii. Proteinele sintetizate prin aceast metod i-au gsit utilizare n terapie i profilaxie. Pornindu-se de la aflarea expresiei anumitor gene s-a putut ajunge la descifrarea funciei unor proteine cu rol n procesele i diviziune celular, prin aceasta crendu-se bazele pentru cercetarea i gsirea cauzelor unor boli genetice.

12.1.3. Elemente de lucru utilizate n tehnologia ADN recombinat

Aceste elemente de lucru sunt reprezentate de: enzimele de restricie; ADN-ligazele; vectorii.

12.1. 3. 1. Enzimele de restricie Sunt endonucleaze de origine bacterian; ele cliveaz moleculele de ADN strain (de exemplu, ADN viral ptruns n respectica celul bacterian) fr a cliva ns ADN-ul bacterian propriu, deoarece ADN-ul bacterian poart un semn de recunoatere (un password ) care este reprezentat de nite situs-uri specifice metilate. Metilarea reprezint un mecanism de aprare al celulei bacteriene fa de propriile endonucleaze; ntr-o celul bacterian, un dublu helix ADN nou-sintetizat i metilat numai pe un lan este recunoscut ca propriu de ctre celula bacterian, nefiind digerat de endonucleaze, iar n timp metilaze convertete treptat ADNhemimetilat n total metilat. Metilazele recunosc pe lanul ADN bacterian aceleai secvene ca i endonucleazele. Nucleazele bacteriene se clasific n: 254

exonuleaze care se fixeaz pe molecula de ADN numai la captul ei; endonucleaze care nu se fixeaz la extermitile moleculei ADN, ci se fixeaz n interiorul moleculei de ADN, unde produc ruptura (tierea). n aceast categorie se ncadreaz i endonucleazele de restricie. Endonucleazele de restricie au aciuni secvenial-specific; se fixeaz pe o anumit secven nucleotidic, despicnd-o (clivare prin hidroloza legturii fosfodiesterice) ndeprtnd astfel respectivul segment dublu de ADN. Secvenele de baze recunoscute de ctre aceste enzime snt palindromice (aceleai, dar poziionate n sens invers pe cele dou fire ale dublului helix ADN), fiind citite de aceste enzime la fel pe cele dou lanuri i rezultnd un clivaj poziionat simetric pe ambele lanuri. Aceste endonucleaze se gsesc n numr mare la procariote. S-au descris enzimele de restricie I, II i III, dintre care: enzimele I i II recunosc secvenele specifice i se fixeaz pe acestea cu urmtoarele particularitai: enzimele I taie nespecific 100-1000 de perechi de baze, n afara regiunii specifice n direcia 5 3 pe lanul ADN; enzimele II au locul recunoatere, fixare i tiere (4-6 nucleoide) de obicei constant deci au specificitate de secven absolut, motiv pentru care snt preferate n studiile de recombinare ADN; enzimele III taie nespecific 20-30 de perechi de baz n direcia 5 3 pe lanul ADN. Endonuleozele de restricie sunt denumite dup microorganismele din care se izoleaz: enzime I Eco K i B (izolate din E. coli); enzime II Eci RI (izolate din E. coli); pot recunoate situs-urile int ale ADN ului palindronic, dar n prealabil trebuie s fie rupte perechile de baze care in unite cele dou lanuri complementare ADN Bam HI (izolate din Bacillus amilolichefaciens) Hpa I (izolate din Haemophilus parainfluenzae) Hin + III (izolate din Haemophilus influenzae) Enzima II au fost supranumite i, foarfeci moleculari; ele recunosc o secven de 4-6 nucleotide i pot tia cele dou lanuri ale helixului ADN, n mod: simetric, rezultnd capete drepte; asimetric, rezultnd capete coezive. Pn n prezent s-au purificat peste 90 de enzime de restricie. Un segment de ADN obinut prin aciunea unei enzime de restricie poate fi clivat main departe n segmente mai mici de ctre alte enzime de restricie. Structurile acestor fragmente finale pot servi drept, amprente (fingerprints) ale unei molecule de ADN. Cromozomii compleci care conin sute de milioane de bace pot fi astfel secionai i apoi cartai stabilindu-li-se harta genelor, prin folosirea enzimelor de restricie. Prin enzimele de restricie s-a descris i un grup special de enzime care au fost numite izoschizomeri; acestea recunosc aceleai secvene nucleotidice, dei fiecare taie asemenea secvene localizate, ns n poziii diferite pe respectivul lan ADN. Descrierea enzimelor endonucleaze de restricie a fcut posibil revoluia tiinific biologic i dezvoltarea tehnologiei ADN recombinat (modificri intite n structiura genelor i proteinelor i analiza acestora bazat pe enzimologia acizilor nucleici). 12.1. 3. 2. ADN-ligazele (polinucleoid-ligazele) ADN-ligazele nu pot lega dou lanuri unice de ADN, ci doar dou lanuri ADN ce aparin aceleiai molecule ADN duble helix. Aceste enzime catalizeaz formarea unei legturi fosfodiesterice ntre gruparea 3-OH a unei extermiti a unui lan ADN i gruparea 5-fosfat de la extermitatea celuilalt lan. Procesul de legare (linkare) mediat de ADN-ligaze este esenial pentru sinteza normal a ADN, procesul de reparare a ADN, procesul de recombinare genetic..

255

12.1.3.3. Vectorii Se deosebesc dou categorii majore de vectori: A. Vectori de expresie; B. Vectorispeciali. Vectorii de expresie Vectorii folosii pentru sinteza unor cantiti mari de proteine: - plasmide: factorul F, factorul R, factorul Col; - bacteriofagi: fagul ; 80; fagul - cosmide (fragmente de * + plasmid ) - fragemide (+plasmid) - secvene de inserie (SI) 0,8-1,4 kb. Vectori de transcriere (pentru sinteza ARN): - plasmid + promotor (SP6) - plasmid +2 promotori (SP6 T7) Vectori speciali: - retrovirusuri - retrovirus+plasmid Ti A. Vectori de expresie a1). Vectori folosii pentru sinteza unor cantitai mari de proteine. Plasmidele Reprezint o clas major de elemente genetice mobile. Sunt prezente att celulele procariote (bacterii), ct i la eucariote. La procariote sunt molecule de ADN dublu helix circular din dimensiuni de la dou la cteva sute de kilobaze; reprezint material genetic extracromozomial (cromozomi accesorii). Spre diferen de ADN-ul cromozomial, esenial pentru supravieuirea celulei, ADN-ul extracromozomial poate disparea la un moment dat din celul, fr ca absena acestuia s afecteze viaa celulara. n unele celule pot exista simultan 1*20 copii ale unei plasmide. n celula bacterian, genomul celular este reprezentat de materialul genetic cromozomial genetic cromozomial i extracromozomial (inconstant). Greutatea molecular a unui plasmid variaz ntre 1,5-200 x 10 6 daltoni (5% din greutatea cromozomial). Un plasmid este constituit dintr-un segment format din una sau mai multe gene, care imprim o proprietate sau mai multe proprieti celulei bacteriene (de exemplu, rezisten sau multirezisten la antibiotice);un segment care asigur transferul plasmidic de la o celul la alta (factor de transfer). n 1976, plasmidele erau definite de Novick drept ,,repliconi stabili motenii n stare extracromozomial, capabili a se replica independent de cromozom. n 1981, Dhillon i Colob. propun pentru plasmide termenul de ,,repliconi accesori (neeseniali), dar astzi se tie c aceti repliconi joac un rol important n procesele de selecie i de adaptare a celulelor bacteriene, ca rspuns la modificarile din mediul extern. Plasmidele s-au dovedit a fi unelte foarte valoroase n cercetarile efectuate n scopul aprofundrii unor procese fundamentale de biologie molecular (replicarea ADN, incompatibilitatea). Astzi plasmidele sunt considerate ,,entiti fundamentale ale celulei bacteriene, reprezentnd o parte vital a pool-ului de gene, determinnd potenialul de adaptare al celulei gazd la condiiile de mediu. Prin ctigarea plasmidelor, celulele bacteriene au fost nzestrate cu noi ci enzimatice n cursul evoluiei. Zestrea plasmidic este un atribut de tulpin (i nu de specie).

256

Plasmidele pot fi: neintegrate, libere n citoplasma celulei. Se mai numesc i autonome (de exemplu, factorii de bacteriocinogenie ColE1 colE8, Col I, Col V). aceste plasmide de replica autonom, asincron i mai frecvent dect ADN-ul cromozomial; n acest caz exist 10-20 de copii per celul; integrate (epizomi), inserate n cromozomul bacterian (de exemplu, factori de bacteriocinogenie pentru sinteza piocinelor). De replica concomitent cu ADN cromozomial i exist n una-dou copii per celul. n 1972, Clowes delimita dou grupe majore de gene plasmidice (plasmid-borngenes): agregate, exclusiv de origine extracromozomial; au potenial de rspndire foarte larg a anumitor caractere printe bacterii; s-au dezvoltat primele, din ele derivnd apoi cointegratele. Snt sisteme economice pentru conservarea anumitor mesaje genetice care se transmit masei de celule dar n caz de nevoie, n cursul procesului de adaptare la noi condiii de mediu. Una sau mai multe plasmide (neconjugative, de exemplu factorul Col) se transmit 100% de la o celul la alta cu ajutorul factorul F (plasmid conjugativ); n cazul tratamentului celulei receptor cu un factor curing (acridin oranj etc.) se pierde doar factorul F, dar rmn factorii Col (linkaj reversibil). cointegrate reprezint elemente genetice compuse din doi sau mai muli repliconi aezai ntr-o continuitate liniar, n care fiecare replicon i pstreaz independena fizic a replicrii deoarece fiecare replicon are propriul su replicator (de exemplu, cointegratul F. ColV. ColB. trp.cys.) Cointegratele sunt sisteme funcionale mai eficiente dect cele ale agregatelor din punct de vedere al transferului i stabilitii caracterelor linkate. n raport cu caracterele fenotipice exprimate, se cunosc pn n prezent urmtoarele tipuri de plasmide: de rezisten la agenii microbieni; de rezisten la raze u.v. (codific enzime care intervin n mecanismele de reparare a ADN celular); pentru sinteza bacteriocinelor; pentru sinteza agenilor antitumorali: de exemplu, agrocina 84 (sintetizat de tulpina bacterian de Agrobacterium radiobacter) cu aciune bactericid asupra bacteriei abrobacter tumefaciens (agent de colonizare, adeziune, hemolizine, enterotoxine, factori chelatori de ioni de fier); codificatoare de enzime ale unor ci metabolice, fixate de azot (de exemplu, la tulpini de Klebsiella), degradarea camforului, toluenului (tulpina de Pseudomonas); plasmide ,,criptice ale unor caractere somatice (nu au putut fi nc indetinficate). Factorul F Este plasmidul care induce conjugarea la bacterii. Acest fenomen presupune un transfer de material genetic de la celula donoare, la celula receptoare, prin intermediul factorului F (factor plasmidic-vector), numit i factor de fertilitate. Celula donoare conine factorul F liber n citoplasm este notat F+, sau inclus n cromozomi (Hfr); celula receptoare (F-) este celula care primete factorul F. Reiese de aici c trasnferul de material genetic este polarizat de la celula F+ sau Hfr ctre celula F-, ncepnd de la captul 5 al ADN-ului. Factorul Col Reprezint plasmidul responsabil de sinteza colicinelor (bacteriocine produse de tulpinile bacteriene de Escherichia coli). n general bacteriocinele sunt principii actici sintetizate de bacterii, cu aciune bactericid asupra unor bacterii din aceeai specie, specii inrudite dar i foarte ndeprtate. Bacteriocinele se subdivid n dou categorii:

257

necorpusculare (nonparticulare) cu greutate molecular mica, de natur chimic enzimatic, analogi adenin-nucleozidici, proteic dau de natur complex glicoproteic. corpuscular (particular) cu greutate molecular mare, prezentnd aspecte omologe cu diferite, componente fagice defective (capete goale de fagi, structuri de cozi goale sau pline, cozi fagice incomplete umplute cu un lan scurt de ADN). Printre bacteriocinele cele mai studiate i mai bine cunoscute astzi se numr colocinele i cloacina DF13. Producerea de bacteriocine se datoreaz prezenei plasmidului de bacteriocinogenie n respectivea celul bacterian. Plasmidul (factor genetic responsabil de sinteza de bacteriocin) poate fi: nonintegrat (replicon accesoriu), liber n citoplasm; de exemplu, factorii Col E1, E2, E3, E6, EI, EV,i ColDf 13; integrat n cromozom; de exempli, factorul pentru sinteza aeruginocinelor,colicinelor I-2, V- K94, i piocinelor. Plasmidele nonintegrate se subdivid n: nonconjugate: se transmit numai cu ajutorul factorului F sau al unui fag transductant, au o greutate molecular joas, ntre (4,2-8) x 10 8 megadaltoni prezint un numr mic de greutate molecular joas, de obicei n numr mare de copii (15-60) per ADN cromozomial (de exemplu, factorii Col E1, E1a, E2, E3, E7, A, K, CloDF13); conjugative: se transmit singure prin conjugare, au greutate molecular (40-80)x10 6 megadaltoni, au un numr, mare de gene funcionale (100-200), de obicei prezente n 1-2 copii per celul (de exemplu, factorii Col, Col Ib, Col IB, Col I, Col V). Structura plasmidelor Col nonintegrate conjugative i nonconjugative a fost studiat cu ajutorul endonucleozelor de restricie; acest studiu a demonstrat c ambele tipuri de plasmide conin n structura lor: - un grup de gene (cluster) ,,rep esenial pentru replicarea autonom; locus-ul de origine pentru replicarea plasmidului este prezent ntr-un punct pe aceast zon; - o gen responsabil de sinteza proteinei (colicin); - o gen responsabil pentru sinteza proteinei de imunitate (evideniat la plasmidele Col E1, E2, E3, CloDf13). Plasmidele conjugative posed n plus: un extra grup (extracluster) de gene (G T) implicate transfer. Acest grup de gene conine circa 20% din SADN-ul plasmidic. n general, celulele bacteriocinogene sunt immune la propria bacteriocin datorit prezenei de imunitate mai sus mentionate. Ruperea acestei imuniti se produce doar n prezena unei concentraii foarte nalte de bacteriocin, acest fenomen purtnd numele de fenomenul de rupere a imunitii (break-down immunity). Exist ns i cazuri particulare n care unele bacteriocine (welchicinele) sunt active chiar i pe celulele productoare (n acest caz explicaia fiind absena genei de imunitate pe plasmidul de bacteriocinogenie). n funcie de interrelaiile de factorul Col cu ali factori plasmidiali din celula bacterian, s-au descris: agregate; de exemplu linkajele: F. ColE2 i Col Ib. Col E1, n ultimul agregat factorul Col Ib jucnd rol de factor de transfer. Aceste aggregate au origine exclusiv extracromozomial i posed un potenial foarte nalt de rspndire a proprietii de bacteriogenie n populaia bacterian; cointegrate; de exemplu, combinaia F. Col V. trp.cys. Se pare c proprietatea de colicinogenie este mai rar rspndit la tulpinile bacteriene de origine uman, dar este prevalent n flora apelor menajere i n populaia de enterobacterii de la animalele domestice. Cu referire special la rolul plasmidelor de bacteriocinogenie n organismul uman i animal, trebuie menionate urmtoarele: factorul Col v codific sinteza unui sistem de chelare (fixate, legare i transport) al fierului din mediul extern, de ctre celula bacterian, ducnd astfel la creterea virulenei 258

bacteriilor. n acest sens, sistemul aerobactinei este considerat astzi un mijloc crucial de supravieuire i proliferare a celulelor bacteriene invasive; factorul Col V confer tulpinilor bacteriene capacitate de supravieuire n ser in vitro, crescnd rezistena acestora la efectul bactericid al serului; factorul Col confer capacitatea de adeziune celulelor bacteriene pe epiteliul intestinal (atribut al virulenei celulei bacteriene); la tulpinile de Esch. coli enterale autohtone, factorul Col are rol protector determinnd producerea de colocine cu aciune ndreptat mpotriva unor bacterii enterale patogene (de exemplu, Shigella), ngreunndu-le acestora implantarea; n culturi celulare s-a remarcat o aciune de inactivare a toxinei tulpinilor de E coli enterotoxigene de ctre colicina sintetizat de alte tulpini de Myzobacterium smegmatis are o aciune citocid asupra celulelor eucariote tumorale (inhib creterea celulelor tumorale umane,animale), dar rmne fr efect asupra celulelor normale din aceeai specie (datorit selectivitii de membran) prezint agrocina (bacteriocin); tulpinile bacteriene de Agrobacterium radiobacter produc bacteriocina agrocin 84, capabil s omoare tulpina bacterian Agrobacteruim tumefaciens (purttoare de plasmid Ti), care determin o stare canceroas (boala cocoului) la plante dicitiledonate. Se presupune c structuri nucleozidice analogigrocinei 84 cu aciuni citocid pe celulele canceroase ar fi mai rspndite n natur dect se cunoate astzi; plasmidele Col sunt considerate a fi entiti fundamentale pentru multe celule bacteriene inndu-se cont de faptul c sunt implicate n multe activiti celulare.Pe baza cunotinelor actuale despre plasmidele Col se poate aprecia c acestea reprezint o parte vital din poolul de gene al speciilor bacteriene. Cele dou posibiliti de linkaj al plasmidelor de bacteriocinogenie (system aggregate i cointegrate) pot fi considerate aspecte particulare ale potenialului de adaptare n cursul evoluiei. Gradele diferite de complexitate prezente de diferitele sisteme de bacteriocinogenie pot imprima i explica potenialul de adaptabilitate al celulei gazd la condiiile permanent n schimbare din: - datele acumulate pna n prezent pledeaz pentru o strns relaie filogenetic ntre plasmidele de bacteriocinogenie (factorul Col), pe de o parte i factorii plasmidiali F i R, pe de alt parte; - prezena i similaritatea genelor ,,kill i ,,de imunitate n plasmide de bacteriocinogenie i fagi pledeaza pentru o strns interrelaie n cursul evoluiei ntre aceti determinani genetici; - fenomenul de bacteriocinogenie este considerat a fi un split-phenotype al rspunsului celular SOS la ageni inductori (raze u.v., mitomicina C, acid nalidixic). Genele celulare rec A i lex A posed o capacitate complex de a regla diferite rspunsuri celulare SOS, incluznd aici i fenomenul de bacteriocinogenie, n scopul asigurrii supravieuirii i adaptrii celulare la condiiile de mediu extern. A fost dovedit rolul multiplu de copii plasmidice autonome/integrate per celul; - datele prezente sugereaz c fenomenul de bacteriocinogenie semnific o cale enzimatic specific cstigat n cursul evoluiei; - studiul fenomenului de bacteriocinogenie a permis aprofundarea unor aspecte fundamentale de biologie molecular (replicarea ADN-ului plasmidic, controlul replicrii, fenomenul de incompatibilitate plasmidial, interrelaiile evolutive ntre celula gazd i factorul Col). Factorul R Fenomenul de rezisten la drog a fost descris de ctre Ehrlich n perioada anilor19101913. Rezistena celulelor bacteriene la antibiotice prezint dou aspecte: rezistena natural proprietate intrinsec a speciei, stabil, de natur cromozomial;

259

rezistena dobndit caracter ctigat n urma unei terapii cu antibiotice (prin ctigarea de plasmid R, mutaie, sau n urma unui process de recombinare). Plasmidele R (factori de rezisten multipl la antibiotice) au fost descries att la germeni gram-pozitivi ct i gram-negativi. Au fost semnalate ntia oar n Japonia, bacilii Gram negative (Akiba,1959). Factorii R sunt molecule de ADN, dublu catenar formnd anse nchise covalent autonome n citoplasma celular bacterian. Au sisteme proprii de replicare i pot exista n mai multe copii. Posed unul sau mai muli determinani de rezisten (markeri). Se pot transfera: vertical la descendeni (ereditate extracromozomial) orizontal ntre specii. Acest ADN plasmadial codific sinteza de proteine (enzime) prin intermediul unui ARNm. Factorii R sunt: - conjugativi (autotransferabili), au greutate molecular de 20 x 106 2000 x 106 daltoni, sunt alctuii din trei secvene nucleotidice cointegrate, i anume: factorul RTF (factor de transfer de rezisten similar factorului F) care iniiaz transferul plasmidului de la celula donoare la celula receptoare; factorul codificator al autoreplicrii plasmidului (replicator); determinanii de rezisten la antibiotice de la 1 pna la 20 de markeri. Cu ct plastidele sunt mai mari, cu att replicarea lor se produce mai lent (I -2 copii/celul). - nonconjugativi (netransferabili), posed un ADN circular, fr factorul RTF, coninnd numai replicatorul i determinanii de rezisten. Au greutatea molecular de 0,5x106 pn la 5,5x106 daltoni, codific rezistena la unul-dou antibiotice, replicarea este mai rapid pe generaie, se formeaz uor copii multiple. Transferul plasmidelor R se face ntre celulele bacteriene, depind barierele de specie, gen i chiar de familie. Se realizeaz prin mecanisme de: - transfer clasic (conjugarea la bacili gram negativi, transducie la stafilococi i transformare) - recombinare (pe baza omologiei ADN gazd-ADN strin) prin crossing-over la nivelul cromozomului bacterian. Acest fenomen de recombinare este foarte rar. Plasmidele R pot fi pierdute: - spontan; se pot pierde unul sau mai muli markeri de rezisten, de exemplu prin conservarea tulpinilor bacteriene la +4 C cteva luni.; - sub influena unor factori fizici (raze u.v.), chimici (acridinoranj, acriflavin). Reasortarea plasmidelor R (din punct de vedere al numrului, proprietilor si sediului markerilor) se realizeaz prin elemente transpozabile tip transpozomi. Transpozomii sunt elemente genetice mobile ce poart gene determinate de rezisten la antibiotice; ei se pot exciza dintr-un ADN i autoinsera n altul (ntr-un plasmid sau cromozom). Se pot integra n situs-uri diferite, pe aceeai molecul de ADN. Prin mecanismele lor de translocare (cromozom-plasmid, plasmid-cromozom) determin un schimb larg de determinanii R intre specii. Au fost descrii transpozomi care codific rezistena la - lactamine (penicilina, ampicilina), la trimetoprim/sulfametoxozol, neomicin/kanamicin, gentamicin/tobramicin, eritomicin etc. Unii trenspozomi au dimensiuni foarte mari, codificnd rezistena la un numr foarte mare de antibiotice. Referitor la circuitul plasmidelor R n natur trebuie menionat c flora intestinal comensal i saproft (oportunist patogen) la om i la animale este izvorul natural de bacili gram-negativi; la nivelul acestor germeni microbieni are loc cel mai important schimb de plasmide R ntre specii. Mecanismele de rearanjare a markerilor de rezisten plasmidici i 260

transferul plasmidic explic formarea rapid a rezervorului de bacterii multi-rezistente. Epidemiile apar atunci cnd aceste plasmide R cu markeri multipli de rezisten ajung la bacterii nalt patogene i cu nalt contagiozitate. Rspndirea plasmidelor R este favorizat de utilizarea necontrolat i abuziv a antibioticelor, condiii ce determin selectarea i vehicularea n cadrul infeciilor intraspitaliceti a unor tulpini bacteriene cu un spectru foarte larg de antibiorezisten, ce creeaz mari dificulti terapeutice. Bacteriofagii Sunt virusuri care infecteaz bacteriile. Se fixeaz pe membrana celulei bacteriene, unde i abandoneaz nveliul proteic, injectndu-i materialul genetic n celula bacterian. Virusurile mprumut aparatul metabolismului celular bacterian, pentru propria replicare, sunt deci parazii obligatorii ai celulelor, multiplicndu-se pe socoteala acestora. In natur, virusurile apar n general drept parazii obligatorii ai organismelor i celulelor vii (bacterii, plante, animale, celule umane). Materialul genetic ai virusurilor const din ADN sau ARN, n form liniar sau circular nchis. Materialul genetic viral, dup injectare n celula bacterian, poate evolua pe una din cele dou ci: - poate fi integrat n genomul bacterian (cale lizogen) - poate trece imediat la multiplicare folosind aparatul enzimatic de sintez al celulei bacteriene gazd (receptoare). Noii fagi sintetizai prin acest ciclu litic" ,n urma lizei celulare, sunt eliberai n mediul extern, de unde ptrund i paraziteaz alte celule bacteriene.

Fagul
Este foarte bine studiat i utilizat ca vector. Cu ajutorul sistemului proteic reglator este capabil s aleag ntre cele dou posibiliti de evoluie mai sus prezentate. Alegerea cii de multiplicare este determinat de starea de nutriie i sntate a celulei receptor (gazd). Gazda fagului este celula bacterian de E. coli.; genomul acestui fag este reprezentat de un lan dublu ADN. Din ADN-ul fagului poate fi ndeprtat o cantitate de 40% fr ca funciile vitale ale acestui fag s fie evident influenate. Datorit acestui aspect este posibil ca n fagul s poat fi introdus ADN strin. Membrana proteic a fagului are o capacitate limitat de acceptare de ADN, deci cantitatea de ADN strin ce poate fi nglobat este limitat. Dup introducerea ADN strin prin membrana proteic fagului se poate trece la injectarea acestui fag (n care este nglobat ADN-ul strin) n celulele bacteriene de E coli. Bacteriofagii au un sistem propriu de transport pentru fragmentele ADN strine care pot fi astfel introduse pe cale natural i multiplicate n celula gazd. Fagii lizogeni pot media (ca i factorii plasmidici F) schimburi de gene. Astfel fagul (ADN) se poate insera pe cromozomul celulei de E coli ntre genele gal i bio. Cnd se formeaz virionii progeni, excizia nu este totdeauna precis, n acelai loc. n unul din 105 virioni, ADN-ul fagului conine fie operonul gal, fie operonul bio. Infecia cu asemenea fagi se numete gal sau bio; ea introduce genele celulei bacteriene de E coli, alturi de genele fagului ntr-o nou celul infectat de respectivul fag. Fagul 80 Este nrudit cu fagul; se insera lng operonul trp i poate purta gena trp de la o celul infectat la alta.

261

Fagul Se insera n orice loc pe cromozomul celulei de E. coli; transport totdeauna un fragment din acest cromozom. Aceti fagi transductori (ca i factorul plasmidic F) sunt elemente genetice mobile care declaneaz interschimbul ntre genele bacteriene, accelernd n acest fel evoluia bacterian. Cosmide Sunt plasmide n care a fost introdus un anumit fragment de ADN din fagul . Cosmidele sunt mbrcate n membrana proteic a acestui fag. Prin infecie fagic (ptrunderea fagului n celul), cosmidul este injectat n respectiva celul gazd. n celula gazd, cosmidul se replic apoi ca un plasmid. Fagemide Reprezint o nou clas de vectori n care o parte din genomul unui fag cu lan unic ADN (de exemplu M13) este combinat cu un plasmid ADN. Fagemidul se multiplic n celula gazd ca un plasmid cu lan dublu ADN. Dac n momentul introducerii fagului se injecteaz n celula gazd i un fag helper, atunci famegidul se multiplic ca un fag cu lan unic ADN. Secvene de inserie (SI) Sunt elemente transpozabile. Transpoziia este fenomenul prin care copii (elemente transpozabile) ale unor secvene specifice de ADN dmtr-un genom, se deplaseaz de-a lungul aceluiai lan de ADN sau pe cel al altui genom, avnd capacitatea de a se insera pe unul sau mai multe situs-uri specifice. S-au descris dou tipuri de elemente transpozabile: secvene de inserie (SI) cu dimensiuni de 0,8-1,4 kilobaze (kilobaza (kb)=1000 perechi de baze); transpozonii (Tn) cu dimensiuni de 3-20 kb (numii i gene sritoare). 2) Vectorii de transcriere. Reprezint o clas special a vectorilor de expresie. Se folosesc pentru sinteza ARN. Prototipul acestor vectori de transcriere este format dintr-un plasmid n care a fost nglobat un fag, promotor (SP6) sau chiar doi fagi promotori (fagii SP6 i T7). Vectorul format din plasmid cu un fag promotor ( SP6) Acest vector poart numele de SP6. Celula gazd pentru SP6 este celula bacterian de Salmonella typhimurium; promotorul SP6 reprezint secvena start ADN de unde pornete transcrierea (deci sinteza ARNm-ului). n spatele promotorului SP6 se gsete o zon format dintr-un numr de secvene nucleotidice (zona MC S= muItiple cloning site), care ofer mai multe locuri de tiere pentru multe enzime de restricie (Fig. 140). Fig. 140 - Vector format din plasmid i fag promotor SP6. Este de menionat c zona MCS reprezint poriunea din sistemul vector unde pot fi nglobate de plasmid noi fragmente de ADN. Dup tierea zonei MCS n dou, de ctre o enzim de restricie, i 262

nglobarea unui fragment de ADN dublu lan (fragment ADN sau ADNc) n mijlocul zonei MCS (fig.134), zona MCS este tiat din nou de ctre alte enzime ADNc de restricie, vectorul linearizndu-se (fig.141).

Fig. 141 - Tierea zonei MCS i nglobarea unui nou fragment ADN

Fig. 142 - Vector linearizat De obicei ADN-ul nglobat este cel care urmeaz a fi transcris n ARN. Transcrierea cu ajutorul unui singur fag promotor este unidirecional. Vectorul format dintr-un plasmid i doi fagi promotori (SP6 i T7). Acest sistem cu doi promotori este vector bidirecional, deoarece cei doi promotori dirijeaz transcrierea n sensuri opuse (fig. 143 i fig. 144).

Fig. 143 - Vector format dintr-un plasmid i doi fagi promotori

Fig. 144 - Tierea cu ajutorul enzimelor de restricie a celor dou zone MCS i transcrierea n sens opus a celor dou lanuri ADN cu ajutorul fagilor SP6 i T7 263

Pentru utilizarea acestui sistem de transcriere bidirecional se aleg dou enzime diferite de restricie; aceste dou enzime acioneaz pe situs-uri diferite pe zona MCS, dup tierea prealabil a acestei zone n dou segmente ntre care a fost nglobat noul segment ADN. Astfel prima enzim taie primul fragment MCS ntre fagul SP6 i ADN-ul nglobat, iar a doua enzim taie al doilea fragment MCS ntre fagul T7 i ADN-ul nglobat. Promotorii SP6 i T7 sunt astfel orientai nct primul s conduc transcrierea unui lan din ADN dublu-lan nglobat ntr-un sens iar al doilea promotor, transcrierea celuilalt lan ADN (al aceluiai ADN dublu lan nou-nglobat) n sens opus (fig. 145). Acest sistem vector cu doi promotori care acioneaz n dou sensuri opuse, permind transcrierea concomitent a celor dou lanuri a ADN (dublu-lan) nou-nglobat, se numete vector bidirecional.

Fig. 145 - Tietura I Vector linearizat. Utilizarea sistemului SP6 pentru transcrierea unuia din lanurile ADN nglobate. Alegerea vectorilor Se face dup mrimea fragmentului ADN care urmeaz a fi nglobat ntr-o celul. Lungimea fragmentului ADN sau ARN se stabilete dup numrul de perechi de baze: 1 kb (kilobaz) = 1000 baze (sau 500 perechi de baze); 1 mb (megabaze) = 1 milion de baze (sau 500 000 perechi de baze). Cosmidele se folosesc drept vehicule pentru fragmente foarte mari de ADN (de 30-45 kb). n ultima vreme s-au putut construi cosmide-vectori n care s-au putut ngloba fragmente mari de ADN de 100 kb - 1 mb, de pild vectori YAC (yeast artificial chromosome), numii i minicromozomi. Un vector tip YAC se comport n celulele de drojdii ca un cromozom care se dubleaz nainte de diviziunea celular, iar, n cursul acestei diviziuni, i mparte materialul ADN ntre cele dou celule fiice. Aceste cosmide ajut la studiul poziiei genelor pe harta genetic a cromozomului sau pe fragmente lungi de ADN. Vectorii de expresie reprezint vectori construii anume care conin n structura lor multe secvente de control optim pentru transcrierea i translaia genelor. Fiecare fragment de ADNc strin care va fi nglobat de ctre vector se va fixa pe acest vector tocmai n apropierea acestei secvene de control (cu rol de promotor); aceasta secven de control (promotor) va porni apoi transcrierea secventei ADNc strain inglobat. S-au construit un numar mare de vectori de expresie care s fie propice pentru diferite tipuri de celule. Secvenele de control nu sunt aceleai pentru diferitele tipuri de celule. Vectorii de expresie trebuie selectionai pentru fiecare tip de celul n care urmeaz a fi introdus o gena strain pentru a se obtine sinteza 264

unei anumite proteine. Astfel, prin alegerea unor vectori de expresie adecvai, s-a reuit introducerea unor fragmente ADNc strin (de la eucariote) n celula bacterian i sinteza ulterioar a urmatoarelor proteine: insulina; eritropoetina; factorul VIII de coagulare; somatotropina; activator de plasminogen; vaccinuri pentru boli bacteriene i virale; anticorpi monoclonali; factori imunologici (factori de necroza a tumorilor, interferon, interleukine); hiradin (antitrombotic); pn de curnd principiul activ se extragea direct din rme. B. Vectori speciali b1. Retrovirusurile Sunt virusuri ARN cu o treapt ADN n replicare (de exemplu: HIV, VISNA). Multe retrovirusuri sunt oncogene, putADN determina formarea unor tumori in organismul gazda (virusul sarcomului Rous, virusul leucemiei aviare). Retrovirusurile ARN au capacitatea ca, o dat patrunse n organismul celulei gazd s declaneze, n prezena reverstranscriptazei, o transcriere invers, adic de la ARN spre ADN, determinnd astfel sinteza unui ADN dublu lant (dup paltern-ul respectivului ARN viral). Acest ADN dublu lan se integreaz apoi n cromozomul celulei gazd (uman sau animal). Celula poart n acest fel, integrat n cromozomul ei, informaia pentru sinteza virusului ARN, care este declansat ns doar n anumite condiii. Retrovirusurile sunt mai mici decat celelalte virusuri; spre deosebire de virusurile ADN, ele nu ucid (nu lezeaza) celulele pe care le contamineaz, motiv pentru care ele sunt folosite astzi drept vectori n tehnicile de inginerie genetic i de terapie genetic, n scopul transferului unor gene strine n celula int. n aceste cazuri, retrovirusurile joac rolul unor carcase pentru transportul respectivelor gene strine ctre o anumit celul int. A fost imaginat o metod eficace de prelucrare prealabil a retrovirusului vector (Richard Mulligan de la Massachusetts Institute of Technology USA), prin care se elimin n prealabil un numr de gene virale, iar segmentul de virus rmas este combinat apoi cu gene care urmeaz a fi injectate intit ntr-o anumit celul. n acest fel, virusul, lipsit de majoritatea genelor sale, devine inofensiv, deposedat de capacitatea lui infecioasa, dar vector de o gena (de gene) nou, pe care a fixat-o i pe care o introduce n celula int (mecanismul de transductie); injectat n celula inta, prin mecanismul de transcriere inversa, retrovirusul vector declanseaz actiunea reverstranscriptazei care determin sinteza ADN-ului corespunzator (replic a ARN-ului vector + gena fixat). Aceasta replic ADN se integreaz n cromozomul celulei gazd, conferind celulei gazd o noua proprietate corespunzatoare noii gene fixate. Retrovirusurile reprezint astazi uneltele (vectorii) cele mai utilizate n ingineria genetic pentru transportul de gene ctre genomul unei celule tint. b 2. Retrovirusuri i plasmidul Ti Plasmidele Ti se gscsc n bacteriile Agrobacterium tumefaciens din sol. Prin infectarea unor leziuni ale plantelor cu aceast bacterie, plasmidele Ti ajunse n celulele vegetale determin apariia unei tumori. Deci plasmidele Ti au efect tumorigen. 265

Prin utilizarea unui vector special, format dintr-un retrovirus i un plasmid Ti, acesta din urm, prin prelucrarea prealabila, pierde capacitatea de a mai produce tumori i pstreaz doar rolul de vector de gene ctre o celul int. Procesul de transfectie si vectori speciali n biologia moleculara, introducerea unui ADN strin (gene) n celulele organismelor superioare (plante, mamifere) poart numele de tranfecie. Introducerea acestor gene strine n organismul plantelor sau mamiferelor (animale, om) se face cu ajutorul unor vectori speciali: plasmide Ti i retrovirasuri. Dintre aceti vectori, retrovirusurile reprezint astazi uneltele (vectorii) cele mai larg utilizate n ingineria genetic i terapia genic, prin transport de gene ctre genomul unor celule int. Introducerea acestor gene strine n celule se mai poate face cu ajutorul particulelor de metal nobil (experiene balistice biologice), dar aceste metode produc leziuni grave celulei. Alt metod const n supunerea celulei unui cmp electric (electroporare), tratament prin care respectivele celule devin capabile (permeabile) s accepte macromoleculele din exterior. Se mai utilizeaz razele laser care produc orificii foarte fine n peretele celular rigid (la plante) prin care se injecteaz apoi molecula de ADN strin.

12.2. HIBRIDAREA
Este o tehnica de recombinare de acizi nucleici, care vizeaza construirea unei molecule de acid nucleic dublu lant din doua lanturi unice, separate, pe baza complementaritatii bazelor azotate. Imperecherea de baze complementare se poate face intre: ADN - ADN ADN-ARN ARN-ARN Totdeauna hibridizarea are loc intre doua lanturi unice de acid nucleic. Hibridizarea se foloseste ori de cate ori se urmareste identificarea secventelor nucleotidice pe un acid nucleic (secventa tinta).

12.2.1. Principiu
Se analizeaza o secventa de acid nucleic unic lant (secventa tinta). Analiza acestei secvente necunoscute se face fata de o sonda genetica (proba de acid nucleic) marcata (radioactive sau prin alte metode) cu o secventa de baze cunoscute. Daca sonda si secventa tinta sunt total sau partial complementare din punct de vedere al secventelor de baze nucleotidice, se formeaza o molecula hibrid de acid nucleic in care se identified secventele nucleotidice pe secventa tinta, in raport cu bazele (complementare) de pe secventa nucleotidica cunoscuta a sondei genetice. Pentru lucru, ADN dublu lant trebuie intai denaturat (supus actiunii caldurii sau substantelor chimice alcaline) pentru a fi disociat in lanturi unice. Lantul unic va reprezenta apoi substratul pe care se va efectua hibridizarea cu sonda genetica.

12.2. 2. Denaturarea
Dupa cum s-a aratat, pentru analiza si identificarea secventelor nucleotidice ale unui acid nucleic tinta, acesta trebuie intai adus la forma de lanturi unice prin denaturare. Denaturarea reprezinta modificarea structurii acidului nucleic prin tratament cu caldura (temperatura de 266

100"C) sau substante chimice, sau supunerea in mediu alcalin (pH>l 1). Folosind aceste metode se realizeaza desfacerea legaturii de hidrogen dintre bazele complementare. a). Denaturarea prin caldura Reprezinta taierea lantului dublu ADN cu ajutorul temperaturii inalte. Punctul de topire reprezinta temperatura la care 50% din respectivul acid nucleic dublu lant disociaza in unic lant. Acest punct de topire poate fi influentat de: o zona bogata in guanina-citozina, care cere totdeauna o temperatura mai inalta, deoarece aceste baze se leaga prin trei punti de hidrogen, in timp ce bazele adeninatimina se leaga doar prin doua punti de hidrogen; concentratia in NaCl a solutiei; o concentrate scazuta de NaCl determina destabilizarea moleculei de acid nucleic, aceasta necesitADN o temperatura de topire mai scazuta; concentratia cationilor. b). Denaturarea chimica Se face prin adaos de substante denaturante (formamida, uree) care determina scaderea punctului de topire.

12.2.3. Renaturarea (annealing/reannealing)

Reprezinta o hibridizare. Prin scaderea temperaturii sau a pH-ului este favorizata refacerea gaturilor intre bazele complementare de pe cele doua lanturi unice de ADN - ARN sau ARN - ADN. Reactiile de renaturare se produc de regula la temperaturi care corespund unei iferente de 20-30 C fata de temperatura punctului de topire al dublului lant de acid nucleic. iaca temperatura insa scade brusc, lanturile raman separate. Cantitatea de acid nucleic unic lant, care prin renaturarea trece in dublu lant, depinde de: - concentratia moleculara a acidului nucleic din solutie; - lungimea moleculei de acid nucleic; - zona bogata n guanina-citozina; concentratia n NaCl; - concentraia de formamida.

12.2.4. Factorul stringent

Este un important factor de hibridizare. Reprezint intensitatea reactiei de hibridizare. Dac dou lanuri unice de acid nucleic sunt pe toat lungimea lor formate din baze implementare, iar conditiile de reacie sunt favorabile, stringenta (intensitatea) reaciei de ambinare este foarte puternic. Dac pe cele dou lanuri de acid nucleic exist doar zone pariale cu baze complementare, stringent este mai scazut (aceast situaie apare n special atunci cADN cele dou lanuri de acid nucleic provin din dou organisme diferite).

12.2.5. Tipuri de hibridri

a. Hibridare Blotting: a.1. Southern Blotting (ADN Blotting) a.2. Norhern Blotting (ARN Blotting) a.3. Western Blotting (Protein blotting) a.4. Dot Blotting 267

a.5.Slot Blotting b. Hibridizare in situ; c. Hibridizare Colonial. a. Hibridizare Blotting Este o tehnic special prin care acidul nucleic int (de cercetat) este axtras din materialul de cercetat prin nclzire la 100 grade C i rcire la ghea i apoi depus pe o membran(de nitroceluloz sau filtru de nylon) i fixat. Hibridarea acestui acid nucleic necunoscut are loc direct pe filtru cu ajutorul sondei genetice (acid nucleic cunoscut i marcat). Noiunea de "Blot" reprezint fitrul+acidul nucleic fixat(imobilizat). Aciunea de "Blotting" reprezint trecerea acidului nucleic pe filtru. Exist mai multe variante de hibridare Blotting i anume: a.1. Southern Blotting A fost imaginat de Southern n 1975.Evideniaz secvenele specifice ale unor fragmente de ADN separate prin gelelectroforez. Etapele reaciei: - se extrage ADN dintr-un produs patologic lichid(ser sanguin care conine acid nucleic viral) sau solid(celule,esuturi); - ADN este tiat cu enzime de restricie; - fragmente de ADN(de circa 1000 perechi de baze)snt supuse electroforezei i separate n funcie de greutatea lor molecular; - fragmentele ADN obinute n gel snt supuse denaturrii; - trecerea fragmentelor de lan unic ADN de pe gelul sensibil(de nitroceluloz) care fixeaz aceste fragmente de ADN. Pentru transferul respectivelor fragmente de ADN de pe gel pe fitru se folosesc diferite metode,dintre care una este cea prin transfer capilar (Fig.146). Gelul (2) este pus pe hrtie de fitru (1) umed(care a absorbit prin capilaritatea lichid din vasul cu soluie tampon); peste gel (2) se pune alt hrtie de filtru (3) uscat, care se ngreuneaz prin aplicare,deasupra ei,a unei lame de sticl (4) i a unei greuti (5). Curentul de lichid care rezult din soluia tampon i care se formeaz prin capilaritate,de la hrtia de fitru umed spre cea uscat,acioneaz i scoate prin splare moleculele ADN din gel i le trage ctre i pe hrtia de fitru superioar (4). Fragmentele de lan unic ADN fixate pe hrtia de fitru superioar prin aciunea cldurii snt tratate(hibridizate) cu sonde genetice ADN sau ARN (marcate radioactiv). Hibridizarea se realizeaz prin incubarea hrtiei de fitru (3) ntr-o soluie care conine sonda genetic radioactiv (de exemplu, ADN marcat cu 32P); molecula-hibrid realizat va fi evideniat prin metoda autoradiografic sub form de benzi. Utilizarea practic a variantei Southern Blotting Gelul (2) este pus pe hrtie de fitru (1) umed(care a absorbit prin capilaritatea lichid din vasul cu soluie tampon); peste gel (2) se pune alt hrtie de filtru (3) uscat, care se ngreuneaz prin aplicare,deasupra ei,a unei lame de sticl (4) i a unei greuti (5). Curentul de lichid care rezult din soluia tampon i care se formeaz prin capilaritate,de la hrtia de fitru umed spre cea uscat,acioneaz i scoate prin splare moleculele ADN din gel i le trage ctre i pe hrtia de fitru superioar (4). Fragmentele de lan unic ADN fixate pe hrtia de fitru superioar prin aciunea cldurii snt tratate(hibridizate) cu sonde genetice ADN sau ARN (marcate radioactiv). Hibridizarea se realizeaz prin incubarea hrtiei de fitru (3) ntr-o soluie care conine sonda genetic radioactiv (de exemplu, ADN marcat cu 32P); moleculahibrid realizat va fi evideniat prin metoda autoradiografic sub form de benzi.

268

Fig. 146 - Hibridarea Southern Blotting 269

Utilizarea practic a variantei Southern Blotting Prin apariia unei mutaii n genomul celulelor germinative (modificarea unei baze), care se motenete, respectiv ADN modificat, dac va fi supus aciunii enzimelor de restricie,va prezenta una din urmtoarele dou ipostaze posibile: - lanul ADN rmne netiat,deoarece enzimele de restricie nu mai recunosc situs-ul specific; - din contr, poate apare un nou situs specific de tiere pentru aceste enzime. n acest al doilea caz, pot aprea n consecin noi tipare de fragmente ADN; acest fragment a fost numit "polimorfism de lungime al fragmentelor de restricie" (RFLP). Studiul acestor fragmente i a diferenei dintre ele, cu ajutorul metodei Southern Blotting,a putut aduce noi informaii n cercetrile efectuate asupra unor boli genetice i n medicina judiciar. Astfel s-a putut demonstra c: - la germenii univitelini, aceste tipare RFLP snt complet identice; - la rude, aceleai tipare RFLP snt n mare parte identice; - n boli genetice se evideniaz prezena unor gene defecte (pe baza unor fragmente ADN cu un tipar individual); - prezena unor modificri genetice n cazul unor procese tumorale; - pe baza tiparelor RFLP s-au putut clasifica microorganismele (virusuri i bacterii) - n medicina judiciar, pe baza pattern-urilor RFLP (ADN minisatelite=fragmente hipervariabile din genom, care nu snt transcriptibile) se poate face determinarea paternitaii. De asemenea, pe baza acelorai pattern-uri RFLP se pot face identificri de persoane n criminalistic, prin studiul unor probe de snge sau sperm; ADN de origine uman i cel provenind de la cimpanzeu i goril snt omologate n proporie de 97%(diferena const n cromozomul X). Speciile de cimpanzeii sunt mult mai copiate de om dect alte specii de maimua. n Africa de Sud a fost studiat originea speciei Quagga (Equus quagga), care a disprut n 1883, i pe baza studiilor filogenetice s-a stabilit c aceasta reprezint forma originar a tuturor speciilor de zebr; Studiul genelor pentru globin la primate (responsabile pentru sinteza proteinei hemoglobin) a demonstrat c aceste gene snt localizate la un loc,ntr-un cluster pe cromozomii umani 11 i 16. Dimensiunea acestor clusteri este asemntoare la om, goril i gibon. a. 2. Northern Blotting Aceast variant a hibridizrii Blot pune n eviden secvene specifice ale unor fragmente ARN departe prin gelelectroforez. Etapele reaciei sunt: - ARN este extras din materialul de cercetat; - ARN este pus n prezena substanei denaturatei (glicoxal dimetilsulfoxid formaidehid sau metilmercur); - ARN este supus separrii electroforetice; - transferul moleculelor ARN pe filtru (nylon sau mitriceluloz); - hibridizarea ARN de pe filtru cu o sond genetic ARN sau ADN; - evidenierea moleculei hibrid construite. Aplicaii practice ale variantei Northen Blotting - determinarea ribotipurilor tulpinilor bacteriene (n studii genetice, epidemiologice). - n epidemiologie, reprezint o motod foarte modern i util de cercetare pentru determinarea filiaiei cazurilor n epidemii, aceast metod fiind mult mai sensibil dect determinarea hizotipurilor de tulpini. Astfel, n actuala a VII -a pandemie de horel, cu ajutorul metodei de ribotipare s-a putut demonstra c profilul genetic al tulpinilor de Vibrio cholerae biotip eltor, prezente n Asia i Europa, este n mai mult de 70% din cazuri identic. 270

a. 3. Western Blotting (tehnica immunoassay) Aceast variant a hibridizrii Blot nu reprezint o reacie de hibridizare propriu-zis (anume construirea unei molecule ADN dublu lan din dou lanuri separate de ADN). Aceast variant folosete doar principiul reaciei de hibridizare, i anume desfaurarea substratului de cercetat pe gel de electroforez i apoi trecerea acestuia pe o membran de nitroceluloz,unde este apoi cuplat i evideniat prin intermediul unor grupri chimice complementare.n acest caz de Western Blotting, substratul de cercetat nu este reprezentat de un acid nucleic ci de o protein. Reacia folosete la evidenierea unor cantiti foarte mici de proteine prezente n lichidele sau celulele unui organism, prin cuplarea acestora cu anticorpi specifici corespunztori (marcai). Etapele reaciei sunt urmtoarele: - proteina este supus electroforezei n gel SDS*-policrilamid; - transferul spoturilor proteice (antigene) pe membrana de nitroceluloz; - adaos de anticorpi specifici marcari (cu enzime sau radionuclizi); - splarea anticorpilor rmai nefixai; - aplicarea deasupra membranei de nitroceluloz a unui film fotografic; - expunere i developare; - citirea prin autoradiografie a benzilor de protein cu ajutorul anticorpilor specifici marcai i fixai. Avantajul metodei este acela de a pune n evidena prezena unei anumite proteine, dintro mixtur complex.Aceast metod este folosit pentru clonarea genelor. a. 4. Dot Blotting Se execut pe o plac de plexiglas cu godeuri rotunde (fig.147). Este necesar extracia prealabil a acidului nucleic din probele de cercetatare(ser,extracte celulare sau tisulare. Proba de acid nucleic extras se depune ntr-unul din godeurile rotunde ale plcii de plexiglas.n fiecare godeu se depune alt prob de acid nucleic,n total pe o plac depunnduse attea probe cte godeuri are placa. Apoi respectiva plac se acoper cu hrtie de filtru, care absoarbe aventualele probe de acid nucleic prezent. Nu se face nici o separare electroforetic; probele de acid nucleic de pe hrtia de filtru snt supuse apoi denaturrii (prin nclzire la 100 gradeC i rcire la ghea). Apoi probele de acid nucleic denaturat de pe filtru snt hibridizate cu sonde genetice. Fig. 147 - Tehnica Dot Bloptting a. 5. Slot Blotting Se execut pe o plac de plexiglas cu godeuri de form dreptunghiular (Schlitz-uri = tieturi sau Slot-uri). Principiul metodei este identic cu cel de la Dot Blotting. Aceste ultime dou variante de hibridizare se folosesc atunci cnd se lucreaz deodat cu un numr foarte mare de probe patologice nefracionate (probe de ser, extract celulare sau tisulare). 271

12.2.6. Hibridizare in situ

Se efectueaz direct pe celule i esuturi. n cazul hibridizrii Blotting este necesar extracia prealabil a acidului nucleic din proba de cercetat; prin aceast extracie, se pierde ns informaia asupra sediului exact al respectivului acid nucleic (ADN sau ARN) din anumite structuri celulare. Aceast informaie se poate obine numai cu ajutorul hibridizrii in situ.Prin aceast ultim metod se poate realiza evaluarea exact a distribuiei anumitor secvene ADN sau ARN direct in situ simultan cu determinri calitative i semicantitative. Se folosesc fragmente de esuturi, amprente de celule, culturi celulare (prelucrate, aplicative i fixate pe lame obiective). Fixarea se face cu xilol, etanol (100% i apoi 70%). Lama obiectiv cu celule fixate corespunde filtrului cu acid nucleic legat prin hibridizare Blotting. Reacia de denaturare i hibridizare se face pe lama obiectiv i anume: dup depunerea probei pe lama obiectiv, pentru denaturarea probei se folosete o nclzire puternic sau tratarea cu proteaze i digitonin, ultima slbind i desfcnd citoscheletul i rezultnd molecula int de acid nucleic unic.Lama cu prob pentru denaturarea se acoper cu o plac, realizndu-se o camer umed. Dup denaturare, lama se spal (pentru ndeprtarea particulelor nelegate) i abia apoi urmeaz hibridizarea cu sonda (ADN sau ARN) marcat; n cazul reuitei hibridizrii, secvenele int din acidul nucleic de cercetat (din esuturi) snt evideniate la autoradiografie (prin cuplare cu secvenele de acid nucleic complementare din probele marcate cu biotin). Biotina din sond a fost fixat de un necleotid cu uracil; acest uracil se va mperechea n lanul de acid nucleic int cu o adenin;dup ce se produce aceast reacie de hibridizare, se face o splare cu o soluie tampon,care ndeparteaz moleculele nelegate de acid nucleic din prob. Marcarea cu biotin este evideniat ulterior prin diferite variante de lucru (vezi "Sonde genetice.Marcarea"). Aplicaiile practice in situ sunt: evidenierea i localizarea diferiilor ageni infecioi n diferite celule i esuturi ale organismului: virusul hepatitei virale tip B, HIV, virusul Epstein-Barr, virusul cito-megaliei, virusul herpes simplex, virusul papilloma; cercetarea relaiilor virus-procese oncogene (de exemplu, relaia virusul hepatitei virale tip B-carcinom hepatic); diagnosticul pre- i postnatal n boli genetice; localizarea genelor defecte pe cromozom (de exemplu, n fibroza chistic, distrofia muscular Duchenne); identificarea anormalitilor cromozomiale (de exemplu: trisomia 21, sindromul Langdon Down, sindromul Turner); stabilirea sexului la embrion; cercetarea tiparelor de expresie genetic (stabilirea momentului activrii anumitor gene); stabilirea hrii genetice cromozomiale (stabilirea relativ a locus-ului fiecrei gene pe cromozom); hibridarea colonial. Pe plci cu medii de cultur se nsmneaz colonii bacteriene din dou tipuri de clone: o clon bacterian de origine(cu plasmid); o clon bacterian cu ADN int (cu plasmid+ fragmente de ADN int). Prin replica plating se obine copii ale acestor colonii din cele dou clone pe un filtru de nitroceluloz. Aceste copii de clone bacteriene (de pe fitru) sunt supuse lizei pentru a se obine ADN. ADN este supus denaturrii pentru obinerea lanurilor unice de ADN. Lanul unic ADN este supus hibridizrii cu probele ADN cunoscut i marcat radioactiv. Dup fixarea probelor ADN radioactive(fixarea complementar)pe lanul unic de ADN int 272

(de cercetat) se procedeaz la evidenierea autoradiografic a marcrii pe un film Roentgen. Prin compararea imaginii radiografice se identific i se difereniaz clonele bacteriene care conin fragmente de ADN int fa de clonele bacteriene de origine. Clonele bacteriene care poart ADN int recombinant (plasmid + ADN int) vor fi multiplicate mai departe (sincron se vor multiplica i fragmentele de ADN straniu).

12.2.7. Importana reaciei de hibridare pentru medicin i biologie

Aceast reacie a pus bazele unui numr de tehnici care au ajutat la progresul cercetrii biologice fundamentale,ct i la progresul diagnosticului medical ntr-un numr de boli. Astfel s-a reuit: stabilirea concentraiei anumitor secvene ADN sau ARN ntr-o mixtur de secvene; determinarea numrului de copii dintr-o anumit secven prezent ntr-un dovedirea gradului de nrudire ntre diferite organisme n raport cu numrul de secvene ADN identice; stabilirea activitii genelor pentru care s-au pus n eviden moleculele de ARNm corespunztoare; evidenierea secvenelor specifice ADN i ARN n material biologic de cercetat (snge, celule, esuturi); evidenierea acidului nucleic viral; n serul sanguin LCR, n vederea elucidrii diagnosticului unor infecii virale cronice: evidenierea acidului nucleic viral n aceste produse semnific prezena particulei virale n organismul respectiv. Evidenierea prezenei acidului nucleic viral direct n produsele patologice (ser, LCR) sau n materialul citologic reprezint o posibilitate de diagnostic rapid i precoce, n vederea instituirii a unei terapii de urgen n special la persoanele bolnave de SIDA sau la cele imunosupresate (terapeutic) n urma unor transplante de organe. n aceste cazuri diagnosticul serologic de obicei nu poate fi de ajutor deoarece pozitivarea serului n cazul infeciei cu HIV se produce abia dup cteva sptmni de infecie, iar n cazul imunosupresailor dup cteva luni sau chiar deloc; evidenierea prezeniei virale n tumori de origine viral; studiul efectuat asupra produsului de transcriere (ARNm) a unor secvene ADN celulare glucogene nevirale a ajutat la complectarea i aprofundarea diagnosticului de tumor. Astfel o reacie de tip imunohistochimic a putut pune n eviden un produs de transcriere (ARNm) specific de esut (de exemplu, prezena unui anumit ARNm corespunztor unei munoglobuline prezente n caz de limfoane maligne sau prezena unui anumit ARNm hormonal n anumite tumori neuroendocrine. Aceast metod reprezint o unealt foarte eficient pentru cercetarea activitii genelor oncogene prin evidenierea indirect imunohistochimic a produselor lor de translaie (ARNm corespunztor); diagnosticul pre- i postnatal al bolilor ereditare (la femei care doresc copii sau la care se pune problema ntreruperii sarcinii); determinarea defectelor metabolice; utilizarea metodelor ce folosesc sonde genetice pentru diagnosticarea infeciilor virale ale arborilor fructiferi (cu o precizie de diagnostic pentru o cantitatea de antigen de 2x10 nanograme); aplicaii n epidemiologia molecular n vederea depistrii unor noi markeri genetici (de exemplu, robotip, pulsotip); se precizeaz ca n viitor metoda hibridizrii s ofere posibiliti pentru elucidarea mecanismelor de reglare a activitii genelor.

273

12. 3. SONDE GENETICE

Cu ajutorul enzimelor de restricie, astzi se pot izola, teoretic, toate genele tuturor organismelor vii, n vederea obinerii unei bnci de gene (le vivant mondial). Principiul hibridizrii n vitro a dou ADN-uri complementare st la baza metodei care folosete sondele moleculare(coduri de ADN cunoscute asociate cu un marker). Cu ajutorul unor asemenea sonde, la un individ dintr-o anumit specie se pot repera codurile complementare pe care sonda "le lumineaz" prin procesul de hibridizare molecular. Cu ajutorul ADN-polimerazelor s-a reuit i amplificarea ulterioar a acestor fragmente de ADN bine determinate i deci clonarea genelor pentru a face i mai uoar (mai sensibil) reperea lor. Astzi,graie sondelor genetice, etichetarea, reperarea i cartografierea genelor au devenit operaii de rutin n marile laboratoare din lume, ceea ce va asigura n viitor progresul rapid al alctuirii hrilor cromozomiale complete ale genomului uman. Sondele genetice (probe de acid nucleic tip ADN sau ARN marcate) reprezint unealta esenial de lucru n metoda de hibridizare pentru analiza secvenelor nucleotidice din secvenele "int" ale ADN-ului de cercetat (genele). Aceste sonde genetice (proba de ADN sau ARN) sunt marcate (radioactiv sau nonradioactiv) pe un singur nucleotid (cu o secven de baze cunoscute). n prezent sondele genetice pentru cercetare i diagnostic se pot comADNa i cumpra de la casele productoare. Sondele genetice se prepar prin aceleai metode de hibridizare utilizate i pentru secvenierea (sequencing) acidului nucleic, i anume prin metodele Blot (Western Blot,Southern Blot) i metoda hibridizrii in situ. A. Prepararea probelor de acid nucleic(sonde genetice) pentru reaciile de hibridizare Sondele genetice pot fi: probe de ADN i probe de ARN. a. Prepararea probelor de ADN: a.1. Din fragmente ADN dublu lan clonate (n vederea obinerii ulterioare de sonde genetice). Aceste fragmente se obin prin ncorporarea de fragmente da ADN genomic(tiate cu ajutorul enzimelor de restricie) sau de fragmente ADNc (sintetizate cu ajutorul reverstranscriptazei dup modelul unei matriceARNm) ntr-un vector i prin introducerea lor, o dat cu acest vector (recombinant), ntr-o celul gazd, unde vectorul se multiplic rezultnd n final o cantitate mare de ADN clonat. Pentru hibridizri snt n special de preferat fragmentele ADNc clonat, deoarece reprezint secvene de ADN fr introni i fr alt secven care ar putea reaciona nespecific. Moleculele ADNc sunt, iniial, unic lan, dar prin diferite metode sunt transformate n ADN dublu lan i apoi introduse n vectori i multiplicate o dat cu acetia n celula gazd. n acest caz, ntr-o molecul final de ADNc dublu lan doar un lan conine secvene corespunztoare moleculei matri ARNm, iar cellalt lan ADNc reprezint secvenele complementare respectivului lan matri ARNm. Probele ADN dublu lan pot fi ulterior marcate n vederea obinerii sondelor genetice (vezi Marcarea sondelor genetice). a.2. Sub forma de oligonucleotide ADN unic lan prin sinteza chimic n "maini de gene". n aceste maini se pot realiza concomitent sinteza i marcarea sondelor genetice. Aceste oligonucleotide ADN-unic lan reprezint baza material pentru: sonde genetice; sinteza de gene; primeri pentru reacii polimerazice n lan.

274

b.Prepararea probelor ARN (sonde genetice) b.1. n " maini de gene":ca i probele ADN unic lan. b.2. Prin metoda de transcriere in vitro cu ajutorul vectorilor de transcriere. Aceast metod de transcriere in vitro (sinteza ARNm dup o matri ADN) se realizeaz cu ajutorul vectorilor de transcriere unudurecionali i bidirecionali, n vederea obinerii de probe ARN lan unic (sond genetic), care se utilizeaz ulterior n reaciile de hibridare.Prin aceast metod, ADN este transcris n afara celulei, n ARN, ARN-ul respectiv putnd fi marcat direct n cursul sintezei. Vectorii de transcriere (clas aparte a vectorilor de expresie), nu se folosesc cai ceilali vectori de expresie pentru sinteza de proteine, ci pentru sinteza de ARN. Vectorii de transcriere sunt formai dintr-un plasmid ADN, n care au fost nglobai un fag promotor (SP6) sau doi fagi promotori (SP6 i T7). n cazul vectorilor cu un fag promotor (SP6), transcrierea in vitro va fi unidirecional, iar n cazul vectorilor cu doi fagi promotori, bidirecional. Promotorul reprezint secvene de ADN de unde ncepe procesul de transcriere, deci sinteza ARNm. b.2.1. Transcrierea unidirecional cu ajutorul SP6 Dup nglobarea n sistemul SP6, ADN-ul strin este cel care urmeaz a fi transcris n ARN. Dup linearizare se adaug n mediu SP6-ARN-polimeraza i patru ribonucleotide (dintre care trei nucleotide marcate i unul nemarcat).ARN- polimeraza se va lega de promotorul SP6 pornind transcrierea genelor n direcia SP6>fragment MCS>fragment ADN nou nglobat (fig. 148). Va fi transcris unul din cele dou lanuri de ADN nou nglobat. n sintez, ARN-polimeraza va folosi ribonucleotidele marcate i nemarcate, pentru formarea unei molecule ARNm conform matriei ADN.

Fig. 148 - Transcrierea unidirecional cu ajutorul SP6 Avnd n vedere c transcrierea ncepe la nivelul promotorului SP6 i se termin la locul de tiere a enzimei de restricie, nseamn c prin utilizarea diferitelor enzime de restricie se poate prestabili lungimea lanului transcris i se pot obine lanuri ARNm transcrise de lungimi prestabilite. b.2.2.Transcrierea bidirecional cu ajutorul vectorului bidirecional cu doi promotori ( SP6 i T7). Vectorul bidirecional este format din ADN plasmidic, SP6, zona MCS i T7 (vezi fig. 137). Cei doi promotori dirijeaj transcrierea n dou sensuri opuse. Prin introducerea i nglobarea ntr-un vector de transcriere bidirecional a unui dublu lan ADN (de exemplu, ADNc ntre dou segmente de MCS i dup linearizarea vectorului), se poate stabili de la nceput care din cele dou lanuri ADNc va fi transcris n ARN. Fiecare din cele dou polimeraze necesare pentru transcrierea respectivului lan ARN i anume, SP6 ARN polimeraza i T7 - ARN polimeraza , se leag specific doar de promotorul corespunztor. Dup linearizare, n funcie de enzima de restricie folosit, ct i de ARN-polimeraza utilizat pentru transcriere, se va sintetiza ARN sau ARN antisens.

275

ntr-un dublu helix ADN: - un lan ADN este complementar cu ARNm de origine utilizat pentru sinteza ADNc; - al doilea lan conine aceleai secvene de nucleotide ca i ARNm de origine. Prin transcrierea: - primului lan ADN, rezult ARN sens identic i cu acelai sens ca i ARNm de origine; - celui de-al doilea lan ADN, rezult ARNm antisens = complementar fa de ARNm de origine: Acest ARN antisens se mai notweaz ARNc (complementar) i are sensul invers dect ARNm sens (normal). Probele de ARN obinute n maini de gene ct i prin metoda transcrierii cu ajutorul vectorilor fagici, pot fi marcate direct n soluia de sintez cu ajutorul nucleotidelor marcate (vezi Marcarea). Probele de lan unic ARN astfel obinute i marcate se utilizeaz ulterior n reacii de hibridare, ca sonde genetice. B. Marcarea Se face pe un sungur nucleotid, cu o substan care l face vizibil din punct de vedere biochimic sau imunohistochimic. a. Marcarea radioactiv Se face cu radioizotopi 3H,35S, 125I, 32P.La alegerea izotopului trebuie inut cont de timpul de njumtire (timp necesar pentru ca substana radioactiv s se descompun n proporie de 50%). Astfel, timpul de njumtire pentru : 3 H este de 12,35 ani; 35 S este de 87,4 ani; 125 I este de 60 de zile; 32 P este de 14,3 zile. Atomul radioactiv introdus n prob prin dezintegrare va emite radiaii care vor fi evideniate la autoradiografie (impresionarea plcii Roentgen la iluminarea cu radiaii u.v.). Timpul de expunere a filmului la u.v. va fi diferit n funcie de izotopul folosit: - pentru hibridarea Blotting se folosete proba marcat cu 32P; - pentru hibridarea in situ se folosete proba marcat cu 3H. n ultima vreme exist tendina ca substanele radioactive s fie abADNonate din cauza efectului lor nociv asupra organismului i nlocuirea lor cu substane neradioactive. b. Marcarea neradioactiv Se face n dou etape: Etapa I marcarea probelor cu biotin (cel mai frecvent), bromdeoxiuridin, digoxigenin. Etapa II probele marcate sunt evideniate prin intermediul legrii markerului de avidin (glicoprotein din ou)/streptovidin (sintetizat din ciuperca Streptomyces avidinii) i anticorpi antimarker (de exemplu, antibiotina) marcai cu fluorocrom. Etapa I Markerul (biotina) se leag printr-un lan de legare numit spacer de baza uracil din nucleotid. Acest bra de legare va uura i legarea ulterioar a biotinei de proteinele avidin/streptovidin, n etapa II. n mod normal uracilul se nglobeaz numai n ARN, nu i n ADN, dar n condiii de laborator, prin intermediul spacer-ului de la biotin se pot realiza dou tipuri de legturi: - legtura cu nucleozidul natural; - legtura cu nucleozidul artificial. De exemplu: Bio UTP; Biotin spacer uracil zahr trifosfat Bio dUTP; Biotin spacer uracil zahr trifosfat. Pentru aceste structuri se folosesc n laborator trifosfaii nucleozidelor. ATP-ul din nucleotidele ADN este transportor de energie pentru metabolismul celular. 276

Att Bio UTP, ct i Bio dUTP sunt derivate biotinate ale dezoxiuridin trifosfstului i , respectiv ribouridin trifosfatului i vor fi nglobate n locul dezoxitimidin trifosfatului i, respecti n ARN, n locul rbouridin trifosfatului. n momentul hibridrii cu segmente ADN int, nucleotidele cu uracil se mperecheaz, pe lanul complementar de ADN ca i pe lanul ARN, tot cu un nucleotid cu adenin. Etapa a II-a Probele de mai sus biotinate se evideniaz prin legarea biotinei de avidin/streptovidin sau anticorpi antibiotin marcai cu fluorocrom.Biotina prezint o mare afinitate pentru avidin. Legtura bitin + avidin este foarte puternic i aproape ireversibil. Din cauza unor reacii nespecifice se prefer streptovividina n locul avidinei. n final, pentru a se evidenia prezena complexului molecular hibrid biotin avidin/streptovidin, acesta este marcat prin diferite metode. C. nglobarea nucleotidelor marcate n sonda genetic Se realizeaz prin: a. Metode enzimatice b. Metode chimice. a. Metode enzimatice nglobarea nucleotidelor marcate radioactiv sau neradioactiv se face cu ajutorul unei reacii enzimatice, n prezena ionilor de Mg++. I. Nick - translaia Cea mai folosit metod pentru marcarea sondelor este Nick-translaia (translaia prin tiere). n aceast metod se folosesc dou enzime: ADN-aza I i ADN polimeraza I. ADN- aza I este o enzim de restricie extras din pancreas de bou; ea taie legturile fosfodiesterice de ADN unic sau dublu lan; nu atac ARN i acioneaz n prezena ionilor de Mg++ i Mn++ (fig. 149).

Fig. 149 - Acinea ADN- azei I pe dublul lan ADN m prezena ionilor de Mg++ i Mn++ ADN- polimeraza I (polimeraza Kornberg) este izolat din E. coli, are aciune polimerazic 5' > 3', fixeaz nucleotidul ADN la captul liber 3' (mai scurt) al moleculei ADN parial dublu lan, n funcie de complementaritatea fa de nucleotidele de pe lanul matri corespunztor (fig. 150). ADN polimeraza I are i o aciune exonucleazic n ambele sensuri: 5 ' > 3' i 3' > 5' ; aceast aciune apare doar cnd n cursul sintezei unui ADN sunt introduse nucleotide false (fig. 151).

Fig. 150 - Aciunea 5 ' > 3' polimerazic a ADN- polimeraza I

277

Fig. 151 - Aciunea exonucleazic n ambele sensuri ale ADN polimerazei I. Astfel, dup ncorporarea nucleotidelor marcate, dublul lan ADN este denaturat (cele dou lanuri sunt separate); se vor obine fragmente de lanuri unice ADN marcate de diferite lungimi i cu diferite secvene de baze (sonde genetice) (fig.152). Fig. 152 - Schema Nick translaiei (dup Hermaun , 1991). II. Oligomarcare (RADNom Priming, RADNom Priming Oligolabelling,FeinbergVogelstein Technik) Spre diferena de nicktranslatie, in oligomarcare se folosesc drept matrie lanturi unice de ADN rezultate dintr-o denaturare prealabila a unui lan ADN. Se folosete enzima Klenow Polimeraza care reprezinta un fragment de ADNpolimeraza. Klenow Polimeraza poseda activitate 5 3, si 3- 5 exonucleazica (dar nu prezinta activitate 5- 3 exonucleazica). Se mai utilizeaz un amestec de hexanucleotide (oligonucleotide sintetizate cu ajutorul unei maini de gene ); ele sunt structuri formate fiecare sir cate sase nucleoide care contin practic toate combinaiile de secvene nucleotidice posibile, reprezentate de nucleotide ADN marcate (.) ct i nemarcate (o), aflate de obicei in proporie de la 1 la 3. Numele metodei de RADNom Priming deriv de la utilizarea drept primeri a hexanucleotidelor cu secvene ntampltoare (randomized primer). 278

III. Marcare terminala a lanturilor ADN (Endlabelling). Pot fi marcate capetele 3 si 5 ale moleculei ADN i ARN. Spre diferena de primele doua metode (1 i 2), prin care sunt marcate moleculele de ADN probe (sonde genetice), n aceasta a treia metoda marcare se face numai la capetele moleculei ADN-proba rezultata ;de aceea, sensibilitatea moleculei de ADN rezultata prin aceast metoda este mult mai mic.Acest tip de marcare se efectueaza atat pe ADN unic lan ct i dublu lan.Exista mai multe metode de marcare terminal. Marcarea terminal 3 a ADN:se face cu ajutorul enzimei transferaza terminala*. Aceast enzim, n cazul de fa, catalizeaz fixarea nucleotidului pe capatul 3-OH liber al moleculei ADN unic (sau dublu lan). Enzima nu are nevoie de nici o matria; va rezulta deci un ADN lan unic cu un capat 3-OH liber (i respectiv un ADN cu un capat format dintrun lan 3-OH care atrna n afara). n aceasta metoda se folosete doar un singur nucleotide ADN marcat (de exemplu, cu biotina): dezoxiribouridinbiotinat (Bio-dUTP). Acest Bio-dUTP este legat prin aciunea transferezei terminale de capetele 3-OH ale unei molecule ADN dublu lan, deci pe fiecare din cele dou lanturi, la capetele 3-OH formnd o coada cu acelai nucleotide pe ambele lanturi ale dublului lan ADN (dar la capetele opuse). Lungimea acestei cozi este dependenta de concentraia cationilor de Co++si de concentraia nucleotidelor. Cu ajutorul enzimei transferaza terminala se poate,de asemenea, ataa, unei molecule dublu lan ADN , o coada cu nucleotide nemarcate,care conin toata timina.Dupa denaturarea i hibridicarea unei asemenea probe marcate, aceast coada cu timina poate fi evideniat indirect prin fixarea, n cursul hibridizarii, a unei cozi cu adenina marcata cu biotin ape lanul ADN proba (adenine se va fixa prin complementaritate pe coada de timina). n cazul acestei hibridizari, lanul cu coada de timina reprezinta secvena inta, iar cel cu coada de adenine, secvena proba.. b) Metode chimice Reprezinta o marcare directa a acidului nucleic. 1. Marcarea cu fotobiotin. Un asemenea tip de marcare este bazat pe legarea biotinei printr-un bra de legare chimic, de acidul nucleic, pe o grupare chimica activate in prezena luminii (iluminare foarte scurta). Se formeaza o legatura stabile ntre biotina i acidul nucleic (lan unic sau dublu). 2. Marcarea cu acridin oraj. Prin cuplarea ntre acridinester i acidul nucleic se produce o legatur de chemoluminiscenta care elibereaz lumina.

12.4. CLONAREA ADN ului

Clona bacteriana reprezinta un grup de celule bacteriene identice din punct de vedere genetic, care provin dintr-o singur celula bacterian.Clonarea se poate realiza prin ncorporarea (printr-o tehnic de recombinare ADN) a unui fragment de ADN strin ntr-un vector care ulterior este introdus i multiplicat ntr-o celula gazd. n biologia molecular, clonarea semnific obinerea unei culture de celule dintr-o celul unic, astfel ncat sa se obin populaie uniforma din punct de vedere genetic. ==================================================================
*Dezoximetil-nucleotid-terminal-transferaza; aceast enzim se folosete i n experiene de clonare pentru obinerea capetelor franjurate ale fragmentelor ADN

279

A. Etapele principale ale metodei de clonare Sunt urmatoarele: extragerea unui fragment ADN, prin taierea ADN genomic, cu ajutorul enzimelor de restricie; introducerea fragmentului ADN ntr-un vector; introducerea vectorului recombinant (plasmid care a nglobat fragmentu ADN strin) n celula gazd; selectarea celulelor bacteriene care conin vectorul recombinant. Clonarea ADN se recomADN atunci cADN este necesar izolarea i multiplicarea unui segment de ADN (dintr-un genom). n majoritatea experimentelor de clonare, se folosesc celule bacteriene de E.coli. 1.Extragerea unui fragment ADN. Se lucreaza pe celule de Esch.coli.Se folosesc enzime de restricie de tip sticky* i un plasmid care poarta doua gene (markeri de rezistena la doua antibiotice: ampicilina i tetraciclina). n scopul eficienei de clonare: a) pentru a mpiedica circularizarea vectorului ADN strin, trebuie ndepartate gruprile fosfat de la extremitaile 5 ale moleculei deschise de ADN a vectorului, cu ajutorul fosfatzei alcaline.n acest fel, vectorul nu se va mai circulariza. Fosfataza alcalina se obine din celule de Esch.coli sau celule de intestine de oaie; b) pentru a permeabiliza membrane celulei bacteriene la respectivul plasmid vector, celula bacteriana trebuie tratata cu soluie CaCl2 pentru a devenit compententa; c) avnd in vedere faptul ca celulele bacteriene poseda sisteme care protejeaz celula de ptrunderea unui ADN strin, se folosesc pentru clonari celule bacteriene mutante (celule cu system de aprare mult diminuat). 2.Introducerea vectorului recombinant in celula gazda (competenta) Acest fenomen reprezinta procesul de trasformare. n soluia nutritive n care se gsesc celulele bacteriene, sincron cu multiplicarea celulelor bacteriene, se produce i multiplicarea vectorilor recombinanti incorporate. innd cont de faptul c att plasmidul ct i fragmentele ADN au locuri (situs-uri) de tiere complementare, atunci cnd vectorul deschis i segmnetul ADN strin vor veni in contact, din zonele sticky, se vor lipi i va rezulta lanul ADN recombinant (fragmentul ADN a devenit inclus in vector). De obicei, pe plasmidul iniial care poarta rezistena la antibiotice (tetra i ampicilina) se incorporeaza fragmentul ADN strin pe locul unuia din cei doi markeri, eliminADN markerul respective(de obicei se elimina gena tetra i ramane cea pentru ampicilina in momentul taierii lanului ADN de atre enzimele de restricie. 3.Testarea celulor bacteriene supuse procesului de transformare. Aceasta testare se face cu scopul de a controla daca celula bacteriana a incorporate respectivul plasmid recombinant. n acest sens, bacteriile transformate (cele care au primit vector+ADN) se testeaza pe un mediu de cultura cu ampicilina; vor supravieui numai acele celule bacteriene care au catigat rezistena la ampicilina, prin acceptarea plasmidului recombinant, purtatorde gena pentru ampicilina (rezistena la ampicilina). Din aceste bacterii cu vectori recombinant, nsmnate pe mediu de cultura cu ampicilina vor crete colonii bacteriene, din care fiecare va reprezenta o clon. 4. Selectarea celulelor bacteriene purttoare de vector recombinant. Selectarea acestor celule purttoare de plasmid cu ADN strin ncorporate i diferenierea lor de celule (clone) fr ADN strin se face prin nsmnare, prin replica

280

plating, a coloniilor bacteriene pe un mediu cu tetraciclina; pe acest mediu vor supravieui doar clonele care nu conin nici un fragment de ADN strin (celule rezistente la tetraciclina). Tip sticky=enzime care taie cele dou lanuri ale helixului dna n mod franjurat datorit faptului ca i-au pastrat gena purtatoare de aceasta rezisten (este vorba de plasmidul gol fr ADN strin ataat), n timp ce clonele care au pierdut gena de rezistena la tetra (n momentul legrii plasmidului de ADN STRIN), prin formarea unui plasmid recombinant, nu cresc pe acest mediu. Abia din acest moment se poate studia mai departe clona care conine fragmentul ADN dorit, printr-o tehnic de hibridizare speciala, i anume prin hidibridizare colonial. B. Biblioteca genomica ADN (secvene de exoni+introni) Dac genomul unui organism este secionat cu enzime de restricie, iar diferite fragmente de ADN sunt clonate (n celule bacteriene), se va obine un numar de clone corespunzADN diferitelor amestecuri (vector plasmidic+segment ADN). Totalitatea acestor clone rezultate din genomul unui organism iniial reprezint biblioteca genomica ADN. Acest mod de clonare, care duce la formarea unei biblioteci genomice ADN prin tierea genomului (cu ajutorul enzimelor de restricie) potrivit principiului ntamplrii i prin unirea fragmentelor rezultate, reprezinta tehnica mpucarii (shotgun). Clona ADN genomica a unuia i aceluiai organism este totdeauna identical i independena de tipul celular, deoarece toate celulele aceluiai organism posed o nzestrare genetic identical.Din aceasta biblioteca se obin secvene ADN necesare pentru tehnica de hibridizare; acestea vor fi folosite drept secvene ADN cu rol complementar (cu secvene ADN cunoscute), in vederea identificarii unor fragmente ADN noi, necunoscute, a caror secvene nucleotidice trebuie cercetare i identificate. Clonele genomice ADN vor conine atat secvene de introni, ct i exoni, corespunztoare genomului celulei respective de origine. Clonele din biblioteca genomica ADN se folosesc pentru: - cercetarea structurii complete a genelor; - cercetarea structurii exonilor i intronilor; - cercetarea secvenelor reglatoare. C. Biblioteca ADNc (ADN copie dupa matria de ARNm matur) Reprezint doar o informaie pur format numai din secvene de exoni.Spre diferena de biblioteca genomica ADN, care rezult din clonarea de fragmente ADNc se sintetizeaz artificial n laborator, pe o molecula de ARNm matur, drept copie complementar (n prezena enzimei reverstranscriptaza). Produsul aciunii acestei enzime va fi o molecula mixta (hibrid): ARNm-ADNc. Din acest hibrid, lanul dublu ADNc se va forma din acest lan unic ADNc, prin doua posibiliti: n prezenta ADN-polimerazei (Klenow= ADN-polimeraza I extrasa din celula de Esch.coli); n vectori; vectorii recombinai(vector+ lan unic ADNc) vor determina ulterior formarea de clone bacteriene ADNc. n timp ce clonele de ADN genomic sunt identice pentru toate celulele aceluiai organism, clonele ADNc sunt diferite pentru diferitele tipuri de celule ale aceluiai organism.n fiecare tip de celule, aceluiai tip de ADN genomic i corespund alte gene active (exoni), ceea ce nseamn ca n fiecare tip de celule poate apare un alt tip de ARNm matur, astfel ncat, aceluiai organism, biblioteca ADNc rezultata variaza de la un tip celular la altul. Clonele din biblioteca ADNc se folosesc n special n scopul analizei directe a secvenelor de baze care codifica un anumit aminoacid sau produsul proteuc final (codificat de respectivul fragment ADNc). Secvena clonelor ADNc este studiat n special prin experimentele de hibridizare. Astzi, n terapia bolilor tumorale se intrevede posibilitatea identificarii i distrugerii tintite a anumitor molecule ARNm, care induc translaia informaiei pentru sinteza unor substane oncogene. 281

Cu ajutorul experientelor de clonare s-a reuit citirea de secvene de ADN de pe lanul ADN al genomului unui organism.Pasul urmator l reprezint obinerea unor modificariale acestor segvente ADN, cu ajutorul unor tehnici de inginerie genetic (procese artificiale de recombinare ADN), ct i introducerea acestor segmente astfel modificate de ADN n celule sau organisme, unde aceste modificri urmeaza a se exprima.

12. 5. Reacia de polimerizare n lan (PCR)

A fost numit de Lederberg, n 1993, instrumental pentru democratizarea biologiei molecular.Aceast reacie d posibilitatea ca dintr-o mixture de ADN s poata fi pescuit o singura moleculara de ADN, i aceasta sa fie ulterior amplificata enzimatic, cu mijloace tehnice relative simple. Spectrul de aplicabilitate al PCR este foarte larg: de la medicina judiciara, diagnosticarea bolilor genetice pn la vanarea i identificarea de noi virusuri i studii de ecologie i arheologie (studiul ADN-ului) din fosile. PCR este folosit pentru cercetarea unor cantiti foarte mici de ADN dintr-un produs biologic. Avantajele acestei reacii sunt urmatoarele: fiind foarte sensibil, reacia poate pune n evidenta chiar i prezena unei singure molecule de ADN, in probele de cercetat (produs biologic), deoarece reacia ofera posibilitate multiplicarii (clonarii) ADN-ULUI chiar i in afara celulei vii; reacia permite chiar i multiplicarea unei singure secvene de ADN. Astzi exista masini automate (Thermai Cycler) pentru realizarea unor asemenea reacii repetate; o multiplicare suficienta de secvene de ADN este reprezentata de minimum 25 de cicluri de multiplicare; ntr-o masina automata se desfaoara 30 de cicluri ntr-un interval de 4 ore. A. Principiul reaciei. Se folosete drept matria un ADN monocatenar. n condiii de laborator n vitro, pe acest lan unic de ADN se poate sintetiza un lan complementar cu ajutorul ADN-polimerazei i n prezenta unui oligonucleotid (15-20 nucleotide) primer (armorsa). Pentru a porni sinteza noului lan ADN pe un lan ADN matria, ADN-polimeraza necesit prezenta pe matria a unui oligonucleotid primer cu capatul 3-OH liber; la acest capt urmeaza a se fixa nucleptidele ADN care vor forma noul lan. B. Efectuarea reaciei PCR poate porni de la punctul a sau b. a. ADN genomic dublu lan (de cercetat) izolat din celule i tiat n fragmente cu ajutorul enzimelor de restricie corespunztoare; b. Lan unic de ADNc, sintetizat n prealabil prin trascriere inverse a ARNm. La capatul 3 al lanului ADNc se ataeaza o coada de nucleotide-guanina cu ajutorul enzimei trasferaza terminala.Urmeaza desfaurarea PCR cu doi primeri diferii utilizai simultan, cte unul corespunzator pentru fiecare lan ADN (rezultat din ADN-ul dublu lan denaturant). Dintre cei doi primeri, primul primer este nucleotide-timina, al doilea primer este nucleotide-citozina. Etapele reaciei; denaturarea ADN-ului genomic (izolat din celule) dublu lan sau ADNc (sintetizat cu ajutorul unei molecule de ARNm) la temperature nalta (95 grade C).Acest ADN conine secvene care urmeaza a fi multiplicate (amplificate); dupa scderea temperaturii se adaug primerul n exces. n aceste condiii fixarea primerului pe ADN-ul unic lan reprezint un proces de hibridizare ce are loc la temperature sczuta (36-65 grade C). Primerul delimiteaza capatul iniial al fiecarei din cele doua secvene ADN unic lan (rezultate din denaturarea ADN-ului dublu lan) de multiplicat. Adaosul de primer se face n exces, pentru a se obine o hibridizare primer 282

lan unic de ADN i nu o hibridizarea ntre lanurile unice de ADN rezultate din denaturare. reacia de sinteza a noului lan ADN cu ajutorul ADN-polimerazei, n prezenta celor 4 tipuri de nucleotide ADN (adenine/timin/guanine/citidin deoxi-nucleozid trifosfat) pornind de la locul de fixare a primerului. ADN-polimeraza se leag de capatul 3 al primerului i sintetizeaz noul lan n direcia 5->3, folosind drept matria segmentul ADN lan unic de amplificat.Primerul va fi ncorporate n noul lan de ADN format.n acest fel lanul de ADN este dublat i, o data cu acesta, un ciclu de PCR este terminat. ncepe un nou ciclu cu denaturarea de aceasta dat a ADN-ului dublu lan nou sintetizat (n treapta anterior anterioara); mai departe, acest nou ciclu si acest ADN nou-sintetizat (prin sinteza mijlocita de ADN-polimeraza); cu fiecare nou ciclu ( de denaturare/sintez a ADN-ului) va fi dublata cantitatea de ADN rezultata din ciclul anterior. Pentru sesizarea eventualelor erori sau neajunsuri ale reaciei PCR, se recomand; - repetarea de mai multe ori a respectivei reacii pentru aceeai prob; - reacia PCR sa fie nsoit, de fiecare dat, de controale negative. C. Polimeraza utilizat n PCR. n anii 1980, se folosea ADN-polimeraza Klenow (fragment de ADN-polimeraza I de la e. coli); fiind termolabila, aceast enzima a fost apoi nlocuit cu o ADN-polimeraza ternostabil, izolat de la o bacterie termifila Thermus acquaticus. Aceasta ADN-polimeraza a fost numit Taq-polimeraza. Taq-polimeraza este stabila pn la 95 grade C. La fiecare nou ciclu al PCR se adaug Taq-polimeraza proaspt.Optimum de activitate al acestei enzime este la 75-80 grade C; aceast activitate scade cu 50% la 60 grade C i cu 90% la 37 grade C. Dac pentru PCR denaturarea ADN-ului se face la 95 grade C, noul adios de Taqpolimeraza declaneaza de fiecare dat ciclu urmtor de sinteza ADN. n acest fel, se poate efectua reacia n care toi reactivii se pun de la nceput n recipient I pn la sfaritul reaciei nu mai trebuie adaugate noi cantiti. Utilizarea Taq-polimeraza a fcut posibil automatizarea totala a acestei produceri n mainile Thermal Cyclers. n condiii normale, cu ajutorul Taq-polimerazei se pot efectua consecutive 40 de cicluri PCR, obinndu-se o amplificare ADN de ordinal 10 la puterea 6-10 la puterea 7. Dac se urmarete o amplificare ADN mai mare dect cea corespunzatoare la 40 de cicluri PCR, trebuie nceputa o noua serie de cicluri, cu ajutorul ADN-ului amplificat, obinut i diluat de 1000-10000 de ori. n acest fel, cu ajutorul a doua serii cte 40 de cicluri PCR, se poate obine o amplificare de 109 a cantitaii de ADN. Pentru o multiplicare sufienta de secvene ADN sunt necesare 2530 de cicluri de reacii automatizate, care se efectueaz, dupa cum am mai artat, n aproximativ 4 ore. D. Amplicabilitatea practica a PCR-ului. Produsele ADN obinute prin PCR sunt separate electroforetic n funcie de dimensiuni, sub forma de benzi, n gelul de electroforeza, iar apoi benzile sunt fcute vizibile, n lumina U.V. prin tratarea prealabil a gelului cu etidiumbromid. Apoi se realizeaza hibridizarea ADN-ului cu sonde genetice specifice prin metoda Souther Blotting. PCR are un spectru de aplicabilitate foarte larg. a) n diagnosticul medical. n acest scop. ADN-ul extrage din celule proaspat lizate i din celule fixate i inglobate n parafina. ADN-ul astfel extras este supus reaciei polimerazei n lan i apoi analizat cu ajutorul sondelor genetice prin reacia de hibridizare. PCR este utilizat n: diagnosticul bolilor ereditare (fibroza chistica, anemia Cooley, distrofia musculara Duchenne, fenilcetonuria). Diagnosticul bolilor ereditare, graie PCR-ului, se poate face i prenatal, n ft, prin determinarea ADN-ului din celulele trofoblastice; prin aceasta metoda se poate face 283

determinarea prenatal pentru sexul copilului i se poate pune i diagnosticul unei eventuale boli genetice. n urma recoltarii de lichid amniotic este supus determinarii cu ajutorul PCRului sau al anticorpilor monoclonali, n acest fel fiind posibila determinarea de defecte genetice cromozomiale, metabolice (enzimopatii). diagnosticul bolilor infecioase. Diagnosticul infeciei HIV cu ajutorul PCR-ului se poate face n stadiile prococe ale infeciei, prin identificarea prezentei acidului nucleic viral n snge (i anume acidul nucleic viral fixat n genomul celulei limfocitare umane), atunci cnd toate celelalte reacii serologice sunt nca negative.PCR poate da un rezultat precoce pozitiv chiar i n prezena unei singure celule infectate cu HIV ( din materialul de cercetat ). Introducerea diagnosticului rapid al infeciei HIV prin PCR este astazi absolut necesara n practic, n special n investigarea donatorilor de snge i de organe. Pentru diagnosticarea infeciei HIV ntr-o encefalita declanat de acest virus, nu este necesara o proba de esut cerebral, ci este suficienta doar o proba de LCR. n general, pentru un diagnostic prin PCR, recoltarea de probe reprezinta un stres minim pentru bolnav; n acest caz se folosesc drept probe; spalatura bucala (cu celule epiteliale), epitelii de fir de par, probe uscate de snge. PCR mai este utilizat n diagnosticul urmatoarelor boli infecioase: hepatita virala, infecia cu virus herpes simplex, virus Epstein-Barr,virus papollima, Mycobacterium tbc., Pneumocistis carinii, Neisseria meningitides, Clostridium difficile. Recent, cu ajutorul reaciei PCR au fost efectuate studii genetice asupra tulpinei de Vibro cholerae grup 0139 (izolata pentru ntaia oara, pe glob, n 1992-1993, n Bengal), reuind sa se demonstreze ca aceast tulpina ar reprezenta rezultatul unor modificri genetice suferite de tulpina Vibrio cholerae grup 01 biotip eltor, prin deletia, de pe ADN-ul cromozomial, a unui segment de 22 kb, concomitant cu inseria unui segment nou de 35 kb. PCR este utilizat i n identificarea unor germeni microbieni ramai pn astzi necultivabili, de exemplu n boala Whipple. Boala Whipple a fost semnalat pentru ntia oara n anul 1907; este primul exemplu din partologia uman n care s-a emis ipoteza prezenei posibile a unei bacterii necultivabile, imposibil de identificat prin posibilitaile clasice cunoscute. S-au postulat apoi i alte boli de etiologie posibil microbiana fara a fi nsa posibil evidenierea prezenei unor microorganisme, probabil microbian fr a fi nsa posibil evidenierea vizual, n aceste cazuri fiind necesare alte metode dect cultivarea pe medii de cultura, pentru detectarea i identificarea agenilor patogeni. Noile metode i au rdcinile n filogenetica moleculara. Boala whipple se manifesta clinic prin astralgii migratorii, febra, dureri abdominale, diaree, pierderi n greutate, apariia n ganglionii mezenterici de infiltrate macrofagice proeminente, depozite de grasime. b. n medicina judiciar PRR este folosit pentru evidenierea identitii unui fir de prsau a unei cantiti foarte mici de snge sau sperm. Astzi PCR poate fi folosit n combinaie cu metoda fingerprinting n aceleai scopuri. c. n studii ecologice Cu ajutorul PCR s-a reuit evidenierea unui numr de microorganisme n probe de pmnt i ap; au fost analizate microorganisme care pn astzi nu au putut fi cultivate pe medii de cultur, ct i microorganisme de sol care au suferit n timp modificri genetice. d. n arheologie PCR a fost utilizat pn n prezent i pentru analiza ADN provenit din mumii egiptene vechi de mai bine de 2400 de ani.

284

12. 6. SECVENIEREA ADN- ului

Analiza structurii ADN a nceput o dat cu anii '70, cu ajutorul metodei de secveniere ADN i de analiz a secvenelor nucleotidice din aceste structuri. Acest studiu a fost posibil datorit folosirii enzimelor de restricie (endonucleaze), care pot tia moleculele de ADN n fragmente de cteva sute pn la cteva mii de perechi de baze. Aceste fragmente obinute pot fi apoi separate electroforetic i analizate. La Los Angeles i la Heidelberg exist n prezent bnci de date n care au fost strnse toate secvenele ADN cunoscute pn n prezent. Genomul multor virusuri a fost total secveniat. n 1995 a fost terminat secvenierea complet a primului genom bacterian, cel de Haemophilus influenzae, urmat la scurt timp de cel de Mycoplasma genitalium. Curnd vor fi terminate i secvenierile complete ale genomurilor bacteriene Escherichia coli, Bacillus subtilis, Methanobacterium thermoautotrophicum. La drojdii (drojdia de bere Saccharomyces cerevisiae), a fost secveniat pentru prima dat un cromozom, i anume cromozomul III, dovedindu-se c conine 315 357 perechi de nucleotide i 200 de gene; la aceast analiz s-a lucrat trei ani n 35 de laboratoare din lume. Cu ajutorul acestei proceduri s-au obinut informaii i asupra materialului genetic inclus n cele 23 de perechi de cromozomi umani, i anume: - locul relativ al genelor pe cromozomi; - identificarea unuio numr de gene; - cauzele unor boli genetice. n prezent este n curs de desfurare proiectul de cercetare asupra genomului uman, genom care conine circa trei miliarde de perechi de bze (50 000 100 000 de gene). Astzi se tie c doar 3 % din genomul uman reprezint gene funcionale (exoni), restul de 97 % din genom reprezint doar balast genetic a crui semnificaie este nc necunoscut. A. Principiu Secvenierea ADN (sequencing) nseamn tierea lanului ADN n secvene i analiza ulterioar a secvenelor de baze nucleotidice din aceste fragmente. Prin descifrarea acestor secvene de baze se poate ajunge la delimitarea genelor i la stabilirea secvenelor de aminoacizi codificate de o singur gen. Ca urmare, analiza secvenial a ADN-ului i, indirect, cea a proteinelor corespunztoare pot furniza date cu privire la conformaia proteinei, funciei proteice, nrudirii dintre proteine, ct i asupra bolilor produse prin mutaii. Secvenierea ADN este o variant a tehnicii de recombinare ADN cu ajutorul creia se poate stabili secvena de baze din molecula ADN. Condiia de baza pentru realizarea acestei secvenieri este prezena unui numr suficient de copii ale moleculei de ADN. Acest lucru se poate realiza prin clonarea ADN sau prin metoda PCR. B. Metode Pentru secveniere se folosesc dou metode: a. Metoda enzimatic; tehnica Sanger (Chain Termination Tehnique). b. Metoda chimic; tehnica Maxam- Gilbert ( de obicei combinat cu metoda Sanger). a. Metoda enzimatic Tehnica Sanger Principiu: se determin secvenele de baze nucleotidice pe copia de acid nucleic i prin complementaritate se deduce secvena de baze de pe lanul de acid nucleic de origine. Etapele reaciei: lantul dublu de acid nucleic (AN) aste adus la forma de AN unic lan; pe lanul unic AN se fixeaz un primer (molecul starter sau amors). Acest primer ste un oligonucleotid scurt, preparat semiautomat prin tiere, cu ajutorul enzimelor de restricie, a unui fragment ARN. Primerul este stfel selectat nct captul 3' s se

285

potriveasc prin complementaritate, ntr-un punct, pe lanul ADN de cercetat. Acest primer este nglobat ntr-un vector sau secven cunoscut; are loc sinteza lanului ADN complementar (dup modelul matriei AN) n prezena celor patru dezoxinucleotid trifosfai (dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dintre care unul este marcat, a unui didezoxinucleotid trifosfat (ddNTP) i a ADN-polimerazei I sau reverstranscriptazei; sinteza lanului ADN se va opri acolo unde n locul unui dNTP se va ngloba un ddNTP corespunztor. n acest punct se va opri reacia polimerazei. Aceast reacie de sintez a ADN-ului se va desfura n patru variante, n fiecare din variante fiind marcat altul din cele patru dNTP-uri; cele patru molecule de ADN dublu lan obinute sunt denaturatze prin cldur; lanul de acid nucleic nou sintetizat cu un nucleotid marcat este separat prin gel elecroforez; n locul marcrii radioactive, fiecare baz este colorat cu alt substan fluorescent. Apoi se face citirea bazelor colorate de pe gelul de electroforez prin autoradiografie. b. Metoda chimic Tehnica Maxam-Gilbert Spre deosebire de tehnica Sanger, unde determinarea secvenelor se face pe lanul copie, prin tehnica Maxam-Gilbert determinarea secvenelor se face pe lanul de acid nucleic de origine. Tehica se bazeaz pe o modificare chimicaunei baze i o tiere specific la nivelul altei baze (de exemplu adenina), de pe molecula ADN. Aceste reacii au loc pe lanul ADN originar. n ultimii ani, n S.U.A. n laboratoarele de Genetic ale Universitii Berkeley, s-au realizat aparate automate pentru citirea secvenelor de baze nucleotidice din acizii nucleici cu viteza de 7 000 8 000 secvene de baze pe zi.

12.7. FINGERPRINTING GENOMIC (amprente de ADN)

a. Principiu Pe baza analizelor de secveniere a ADN-ului, s-a demonstrat c fiecare individ este caracterizat printr-un fingerprinting genomic (un pattern individual al regiunilor hipervariabile din ADN-ul genomic, i anume de pe zona ADN- urilor minisatelizate). Genomul uman conine trei miliarde de perechi de nucleotide, dintre care: 70 % reprezint secvene unice identice la toi indivizii; 30 % reprezint secvene repetitive, i anume: - nalt repetitive 7 10 %; aceeai secven de 300 perechi de nucleotide se repet de 30 000 1 milion de ori dispersat, pe toat lungimea genomului; - gene structurale pentru sinteza de ARNt, ARNr i histone; - zona spacer ce conine gene criptice (silenioase); - ADN-uri satelite nalt repetitive, netranscriptibilr, necodificatoare de proteine. 20 30 % moderat repetitive, fiecare secven cu cteva sute pn la 6 000 de perechi de nucleotide se repet n 20 30 000 de copii. b.Tehnica RFLP Cu ajutorul acestei tehnici se pun n eviden zonele de ADN variabil de la individ la individ. Aceste tipare de fragmente de ADN individual sunt reprezentate de o amprent RFLP specifc ( polimorfismul de lungime al fragmentelor de restricie). Pentru determinarea acestor tipare individuale, se izoleaz ADN-ul genomic din celulele unui organism (diferite esuturi, rdcini ale firului de pr, snge, saliv, sperm). Tehnica RFLP cuprinde urmtoarele etape: - ADN-ul extras este supus aciunii enzimelor de restricie; - Fragmentele de ADN (dublu catenar) sunt supuse migrrii bidimensionale ntr-un gel denaturat (coninnd un agent chimic denaturat ca ureea, concentraie 5 %); 286

Benzile de ADN unic lan obinute n gel sunt supuse colorrii cu etidiumbromid; Benzile ADN sunt vizualizate prin transiluminare la u.v. Aceast tehnic evideniaz att prezena/asena fragmentelor de restricie, ct i polimorfismul de lungime al respectivelor fragmente. Determinarea RFLP pentru organismele eucariote, inclusiv omul, are semnificaie, n mod deosebit, n cazul urmririi transmiterii la descendeni, a informaiei genetice parentale (prin compararea fringerprint- urilor ntre generaii). n cazul examinrii singulare ( a informaiei genetice per individ), se prefer metoda Southern Blotting a crei capacitate discriminatorie este considerat mai bun.

c.Tehnica AFLP Aceast tehnic ce combin principiul analizei RFLP cu cel al reaciei PCR nalt specific, detecteaz numai prezena sau absena fragmentelor de restricie, dar nu face i analiza polimorfismului de lungime a fragmentelor. Tehnica este considerat astzi metoda universal pentru determinarea prezenei/absenei unei anumite amprente de ADN n orice surs de origine bacterian, vegetal, animal sau uman. d.Aplicaii ale metodei amprentelor ADN n medicina judiciar: - n criminalistic; urmrirea criminalului poate fi condus n funcie de urmele gsite: amprente individuale prezente n resturi de piele, pr, snge, sperm. Dac materialul genetic se afl n cantitate foarte mic, se recurge la PCR pentru amplificarea cantitii de ADN; - diagnosticul paternitii; avnd n vedere c variaiile de ADN- urile minisatelite se motenesc dup legile mendeliene, metoda amprentelor ADN este util pentru dovedirea unei nrudiri (amprenta genetic difer de la individ la individ, se potrivete n mare parte la rude i este identic la gemenii univitelini); n medicina clinic - n boli genetice; n analiza de likage i determinarea instabilitii genetice; - n oncologie; pentru diagnosticul midificrilor genetice din celulele tumorale de la persoane cu carcinom mamar (se prepar i se compar amprente de ADN din celulele tumorale/elemente figurate sanguine cu condiia ca n proba de snge s nu existe celule modificate oncogen; - urmrirea epidimiologic a circulaiei agenilor infecioi pentru determinarea patternurilor RFLP la virusuri i tulpini bacteriene; - stabilirea interrelailor virale i bacteriene pe baz de amprente ADN, n vederea ncadrrii taxonomice a unor noi ageni infecioi; - prin introducerea tehnicii de fracionare a segmentelor de restricie i separrii acestora n gel cu gradient denaturat, se va putea, n viitor, msura frecvena mutaiilor n genomul uman,se va putea analiza instabilitatea genomului i a relaiei acestuia cu senescena i neoplazia, se vor putea realiza analize de linkage i cartare de noi gene implicate n boli genetice; n biologie - stabilirea paternitii unor psri de prad ale cror ou au fost clocite de prini adoptivi; - stabilirea de relaii genetice ntre diferite specii pe baza structurii ADN-ului, acest criteriu fiind superior celui al sistematizrii de pn n prezent, efectuat pe baz simplelor caractere morfologice; - stabilirea polimorfismului genetic n interiorul aceleiai specii (de exemplu, heterozigoii); - pe baza existenei RFLP-urilor au fost amplificate i analizate secvene nucleotidice din fragmente ADN provenite de la specii disprute; n arheologie - s-a analizat ADN-ul provenit de la mumii egiptene vechi de mai bine de 2400 de ani (prin clonare i secvenierea unor fragmente ADN de circa 3400 de baze).

287

Capitolul 13 BIOSENZORII

13.1. Biosenzorii sisteme de coantificare a informaiilor viului

Problema biosenzorilor este un capitol al biotehnicilor de cea mai mare importan mai ales n ultimii anidar i extrem de complicat i vast. De curnd, cercettorii i tehnicienii cu preocupri n acest domeniu au propus chiar o difereniere semantic a acestor sisteme de cuantificare a informaiilor ce pot fi obinute n diferitele funciuni ale lumii viului. Astfel, a fost propus o terminologie care s se refere la traductori pentru toate sistemele de nregistrare i prelucrare a informaiei ca utilizri i n biologie; senzori biologici pentru sistemele naturale ale fiinelor vii (organe de sim: vz, auz, pipit etc.) iar termenul de biosenzori s fie atribuit generic oricrui sistem simplu sau mixt (natural sau construit de om) care s nregistreze la nivel micro informaia circulant ntr-un sistem viu. Domeniile de studiu primar pentru a cunoate sau a fabrica aceti biosenzori sunt biochimia, biofizica i biocibernetica, precum i alte tiine antecesoare acestora, inclusiv microtehnologiile speciale din domeniul micromecanicii i microelectronicii. innd seama de complexitatea acestei problematici, precum i de evidenta dezvoltare a domeniului biosenzorilor i a aplicaiilor acestora n biotehnologii, ne-am propus enumerarea principalelor tipuri de biosenzori moderni i tradiionali: - senzori piezoelectrici, poteniometrici, amperometrici, electrochimici; - senzori enzimatici amperometrici (monoenzimatici i dienzimatici, mono- i multi strat): metabolici, pentru glucoz, galactoz, gluconat, lactat, piruvat, alcooli, fenoli, amine, coresterol, acizi nucleici, aminoacizi etc.; - senzori care au la baz reacii de tip imunitar: cu dispozitiv membranar, cu pierdere de reacii, imunosenzori optici; - senzori cu receptori. Dintre aplicaiile biosenzorilor, enumerm: - utilizarea biosenzorilor pentru laboratoare clinice i chimice; - monotorizarea permanent a pacienilor cu senzori implantai; - inregistrarea glucozei n snge; - msurarea de ureii din rinichiul artificial; - analiza produselor alimentare; - controlul proceselor n industria microbiologic i n protecia mediului. Determinarea selectiv i cu sensibilitate mare a unui numr crescut de combinaii are o deosebit importan, att pentru cercetare, ct i pentru diferite ramuri ale economiei, de exemplu supravegherea produciei n industia chimic i alimentar. n domeniul medical, aceast metod este de nenlocuit n stabilirea diagnosticului bolnavilor. De asemenea, n biotehnologie este necesar, printre altele, pentru analiza componentelor mediilor de cultur. O dat cu progresele remarcabile din domeniul analiticii instrumentale, de exemplu cromatografia gazoas, cromatografia fluxului de lichid (fluiditii) la presiuni ridicate, msuri spectrometrice i spectroscopia absorbiei atomice, n combinaie cu microelectronica, s-a ajuns la obinerea unei nalte selectiviti n microanalitic. Aceste metode sunt, datorit costurilor ridicate, implementate doar n cadrul laboratoarelor. Cu toate acestea, dezvoltarea msurtorilor de investigaie selective i uor de manevrat reprezint o problem cheie a analiticii. 288

ntr-o prim parte dorim s facem o analiz a unor probleme i n acelai timp un studiu paralel care s, includ date tiinifice de activitate relatate de specialiti care au lucrat nemijlocit la aceast problem. Ne bazm, n realizarea calitativ a analizei i sintezei propuse, pe experiena didactic i de cercetare dar i pe o bogat bibliografie adunat n timp, cu precdere n ultimii 7-8 ani.

13.2. Impactul informaional al biosenzorilor

tim din ce n ce mai exact felul n care sistemul genetic stocheaz i distribuie informaia, sistemul neuro-endocrin creaz i manipuleaz informaia, sistemul imunologic prelucreaz i utilizeaz informaia, ntr-un cuvnt, pe msur ce timpul se desfoar iar numrul populaiilor biologice crete, se elibereaz n proporie geometric informaia care caracterizeaz dinamica att a. sistemelor vii ct i a celor considerate nensufleite. Se creeaz firete, necesitatea recepionrii ct mai complete i mai exacte a acestei forme de existen a universului, recepionat de om drept component a tetradei care descrie o form de echilibru substan-energie-informaie-timp.Tot att de firesc, apare interesul omului pentru abinerea unor captatori ct mai fideli ai informaiei primite de la diferite sisteme vii sau nevii, nevoia de a avea senzori sensibili i fiabili pentru orice demers n domeniul cunoaterii. Dac cu muli ani n urm, senzorii mbrcau forma instrumentaiei utilizat n laboratoare pentru cercetri experimentale, n prezent aria preocuprilor n vederea obinerii unor date dinamice n studiul proceselor a conturat n profunzime imaginea despre utilitatea i importana senzorilor. Cercetrile de bionic au adus noi clarificri privind simularea i extrapolarea senzorilor naturali (din organele de sim) cu posibiliti de utilizare nu numai n biomedicin dar i n dirijarea unor procese industriale. Dezvoltarea roboticii a crescut i mai pregnant importana senzorilor, n vederea dotrii roboilor cu asemenea capaciti de orientare i de lucru. Senzorii optici bazai pe microcamere TV au fost suplimentai cu sisteme de recunoatere a formelor i imaginilor albnegru i color precum i cu analizori termici. O alt serie de aparate au fost concepute pentru prevenirea incendiilor sau decelarea fenomenelor de poluare sau de toxicitate n mediul nconjurtor. Dezvoltarea automaticii a solicitat intens crearea unor noi sisteme de culegere rapid a informaiei. Aceste preocupri, departe de a rezolva toate problemele, au creat o serie de noi ntrebri att la nivelul utilizatorilor ct mai ales a specialitilor. Iat succint, spre exemplificare, cteva din acestea. - Informaia este delimitat strict i poate crete prin adiionare sau este holografic? - Semnalele conin informaie. Sunt suport al informaiei sau sunt catalizatori ai informaiei cognoscibile? - Emiterea sau culegerea informaiei este uniform sau periodic? Aciunea sa asupra receptorilor este ritmic sau continu? - Natura este mai bogat astzi n informaie liber, circulant, dect acum 1 milion de ani? - Raportul dintre cantitatea total de informaie existent i utilizat este constant? - Creterea utilizrii informaiei i necesitatea cuprinderii sale de ctre sistemul nervos uman, poate genera, peste anumite limite, o patologie specific? - Impactul psihologic ntre necesitatea i obligaia de a consuma mereu mai mult informaie i nevoia de adaptare a omului la lumea informaional, creeaz noi probleme? Lista acestor ntrebri poate continua iar rspunsurile sunt departe de a fi complete. Dac n domeniul tehnologiilor se pare c eforturile pot fi suficient determinate, n domeniul cunoaterii biologice i medicale curiozitatea i motivaiile sunt din ce n ce mai puternice, ceea ce i-a fcut pe muli s afirme c secolul urmtor va fi secolul biologiei. tiina i industria computerelor a fcut un mare pas nainte cnd pe lng hard-ware i soft-ware a adugat brain-ware. 289

Aceast triad deschide de pe acum posibiliti nebnuite puterii de calcul i stocare n informatic. Modelul biologic ptrunde impetuos n tehnic. Cu puin timp n urm au aprut primele biocipuri. Acum ele se perfecioneaz rapid, aprnd noi componente avnd ca suport materia vie. S-a nscut un nou domeniu, biosenzorii - bioizi din ce n ce mai perfecionai. Ca n orice domeniu, culegerea i prelucrarea informaiei se face etapizat pe mai multe nivele structural-energetice, intensitatea semnalelor i informaiilor culese fiind n funcie de capacitatea receptorilor de a vehicula pe canalele specifice fluxul informaional. n acest context, senzorii construii de om se supun legilor naturale descrise de chimiafizic, fiind de fapt modele ale aplicaiilor curent utilizate de cercetrile biofizice. Fiabilitatea lor este relativ mare dar aproape n totalitate determinat de tehnologiile utilizate. n ceea ce privete senzorii naturali biologici (tactili, vizuali, auditivi etc.), calitatea informaiei prelucrate este dependent de structura anatomo-fiziologic, de sensibilitatea i modelele fixate repetitiv pe sistemele de memorare ale organismelor vii. Condiionarea genetic joac un rol determinant n acest caz. Dac ne referim la achiziiile dobndite n cadrul dezvoltrii ontogenetice i filogenetice, gradul de difereniere a prelucrrii i utilizrii semnalelor din mediul intern i extern este diferit n funcie de complexitatea organismului studiat, pe scara biologic. La om, integrarea psiho-neuro-endocrino-imunologic complic procesul de nelegere al mecanismului i modului de aciune selectiv a senzorilor biologici. Cu toate acestea, cercetarea tiinific actual ncearc s elucideze separat sau integrat modul de aciune al circulaiei pe canale informaionale a vectorilor semnalelor stimulatori sau inhibitori la nivelul diferitelor verigi biocibernetice. Variaia rapid, n timp a acestor fluxuri informaionale constituie un impediment destul de serios al cunoaterii reale, n timp util, a principalelor ci i modele reale n care selecia informaional acioneaz. Pe msur ce coborm la nivele de organizare mai profunde, cantitatea de informaie dei aparent scade, este mult mai dens, dar difereniat, cuantificarea energeticoinformaional este mai greu de realizat pentru cercettori. n aceste situaii aparatura de msurare ntmpin greuti din ce n ce mai mari ncepnd cu selecia semnalului din zgomotul de fond i nlturarea bruiajelor i pn la obinerea unor valori individualizate care pot fi interpretabile sau pot constitui valori de referin. Fr ndoial c natura a creat o multitudine de biosenzori care rezolv pe plan biologic aceste probleme. Tehnologia din momentul de fa nu este ns suficient pentru a ne oferi rezolvri concrete i acest fapt face s considerm c elaborarea i cunoaterea biosenzorilor se afl nc n domeniul pionieratului. n momentul de fa, sunt ntreprinse cercetri aprofundate privind reglarea schimburilor la nivelul membranelor celulare, al modului de aciune al microbiocurenilor, a electricitii chimice" a enzimelor de restricie i recombinare, a cunoaterii algoritmului de modificare a raporturilor de electrolii i a pompelor ionice, a biocomunicrii i modificarea cmpurilor ce acioneaz n sfera biologicului, a efectelor de finee din interaciunea macrocosmos i microcosmos. Mintea uman ncearc un efort de autodepire n nelegerea unor variante noi matematico-logice de utilizare de noi limbaje, utiliznd probabiliti neinvestigate nc, n efortul de a depi experimentalul posibil i n sperana de a deschide noi ferestre n domeniul cunoaterii.

13.3. Metodologia de cercetare a proprietilor senzorilor biologici

Sensibilitatea oricrui sistem de msur este condiionat n mare msur de calitatea traductoarelor utilizate. Traductoarele clasice (cele inductive, capacitive, rezistive etc.) au intrat n competiie cu o nou clas de traductoare, traductoarele biologice. Utilizarea unui organism viu sau a unei 290

poriuni din acesta (esut, celul, enzim), n scopul obinerii unor informaii asupra mediului nconjurtor nu este o idee nou. Ea a aprut pe la nceputul secolului, prin cercetrile efectuate de exemplu, de fizicianul C. Bose, dar a cptat o dezvoltare exploziv doar n ultimii ani, cnd tehnica de calcul i progresele tehnologice au permis-o. Dei rezultatele obinute au depit faza de laborator, extinderea pe scar larg a acestor senzori este nc limitat, att de considerente de ordin tehnologic, ct i de dificultile pe care aceti senzori le pun n faa cercettorilor privind stabilitatea i reproductibilitatea semnalelor preluate. Tendina de abordare global a interaciunilor unui biosenzor cu mediul nconjurtor,n sensul deschiderilor i intra-deschiderilor pe care o manifest, se lovete de cele mai multe ori de o inconsecven n metodologia experimental n care metodele clasice nu sunt organic integrate cu cele noi aprute. Majoritatea studiilor efectuate asupra utilizrii senzorilor biologici n msurtorile fizice, vizeaz mbuntirea performanelor aparatelor de msur, n sensul creterii-sensibilitii i selectivitii fa de mrimile msurate. Substratul biologic utilizat este de cele mai multe ori o parte specializat dintr-un sistem viu, fapt ce determin o reducere a interaciunilor pe care partea o are n cadrul ntregului, i deci, permite abordarea mai simpl a metodelor de interpretare. n momentul de fa numeroase msurtori din domeniul chimiei beneficiaz de aceasta categorie de traductoare. Tehnologia actual permite izolarea unor enzime i implementarea lor n sisteme de msurare oferind acestora sensibilitate i selectivitate ridicat, rspuns la stimul uor de recunoscut, la un pre de cost sczut. Preluarea unor semnale electrice de la pri ale unui organism viu, dei beneficiaz de avantajul selectivitii specifice unui organ specializat, ridic o serie de probleme, cum ar fi tehnica de prelevare fr traume eseniale, asigurarea condiiilor de via pe durata ct mai lung a poriunii prelevate, tehnica de implementare a electrozilor i natura materialului din care se execut acetia, n vederea reducerii perturbaiilor n funcionarea poriunii prelevate. Chiar dac se asigur toate condiiile de mai sus partea prelevat nu va beneficia de interaciunea sa cu ntregul sistem, motiv pentru care rspunsul obinut poate fi diferit sau deformat. De exemplu, se cunoate c rspunsul electric al unei fibre nervoase este diferit la msurtorile n vitro fa de cele in vivo. Din acest motiv se consider o variant posibil de utilizare ca senzor biologic a unui organism ntreg, ,problema revenind n a se determina zona sau punctele de msur i metodologia de interpretare a rezultatelor n funcie de tipul i de natura interaciunii urmrite a se msura. Dac se ine seama de necesitatea imobilizrii pe durata msurtorilor a organismului viu, se poate aprecia c planta poate rspunde cel mai bine acestei cerine (imobilizare natural).

13.4. Aparatura de msurare

Cunoaterea influenei aparaturii de msura asupra senzorului biologic este esenial n sensul reproductibilitii msurtorilor efectuate. Ea trebuie judecat prin prisma caracteristicii puternic neliniare a interfeei organism-mediu, majoritatea msurtorilor implicnd aplicarea,pe suprafaa organismului viu a unor electrozi i conectarea acestora la un sistem electronic de msurare. Mergnd mai spre concret, se constat, de exemplu, c membranele biologice (i) prezint o caracteristic neliniar a curbelor tensiune-curent. Caracteristica msurat scoate n eviden dou aspecte deosebite: asimetria (valorile curentului n cele dou sensuri nu sunt egale pentru o aceeai tensiune aplicat); prezena unor zone de rezisten negativ (fig.153).

291

Fig. 153 Curba caracteristic tensiune curent Cercetrile efectuate asupra utilizrii plantelor ca senzori biologici au scos n eviden o dinamic a acestor curbe, n special n sensul variaiei zonei de rezisten negativ. De asemenea sa constatat existena pe suprafaa frunzelor a unor puncte de rezisten electric sczute, asemntoare prin modul de identificare cu punctele de acupunctur. Spre deosebire de acestea ele sunt grupate n zone pe suprafaa frunzei, neidentificndu-se o lege de amplasare.

13.5. Posibiliti de folosire a biosenzorilor n biotehnologie

Procesele biotehnologice sunt folosite tot mai des n practic pentru a obine produse utile. Pot fi realizate noi industrii de nalt eficien, dar pentru aceasta este necesar o reglare sigur a sistemelor folosind modele matematice adecvate i o informaie ct mai complet asupra lor. Dac practic mrimile fizice pot fi msurate cu succes, n schimb parametrii chimici intercelulari sunt mai dificil de msurat; biodetectorii (biosenzorii) trebuie s rezolve aceast problem. Biosenzorul poate fi definit ca dispozitiv (de regul electronic) ce folosete molecule de interes biologic pentru a detecta molecule specifice. Poate consta dintr-un biocatalizator imobilizat i dintr-un aparat fizico-chimic care transform informaia chimic ntr-un semnal electric. O prim clasificare a unor biosenzori: - senzori enzimatici; - senzori microbieni; - imunosenzori (ca antigeni i anticorpi); - senzori ca organite celulare. Senzorii enzimatici conin o enzim determinat, care este imobilizat dup o tehnic convenabil i un senzor fizico-chimic corespunztor. Enzima reacioneaz selectiv cu substratul su, msurndu-se astfel concentraia de substrat. Stabilitatea enzimei este foarte important pentru realizarea msurtorilor. Imobilizarea de enzime i celule pe purttor s e face cu metode fizice i chimice. Prin metode chimice se realizeaz legtura covalent ntre e n z i m a i substrsatul solid. Imobilizarea este ireversibil. n cazul metodelor fizice imobilizarea este reversibil. Sunt folosite membranele semipermeabile, mai ales la construirea biosenzorilor electrochimici. n prezent, din circa 2000 de enzime, numai 30 sunt de interes comercial. n j u r de 500 sunt oxidoreductoare, cataliznd reacii c u cedare de electroni; sunt cunoscute circa 50 de oxidaze, folosite n tandem cu electrodul Clark pentru msurtori amperometrice de concentraii pentru diferite substane. n biofermentoare folosirea biosenzorilor este dificil din motivul c nu pot fi sterilizai termic i chimic, nici cu radiaii i n i c i printr-un alt procedeu. Din aceste motive, nu sunt direct folosibili n aceasta arie tehnologic. De asemenea, stabilitatea electrozilor enzimatici 292

nu este suficient pentru msurtori de lung durat. Inhibitorii din substratul de fermentaie induc erori mari de msurare. Senzorii microbieni constau din microorganisme imobilizate ntr-un suport poros; aceste microorganisme conin enzime de interes. Senzorii microbieni construii pe un principiu electrochimic pot fi mprii astfel: - senzori cu determinarea amperometric a activitii respiratorii; - senzori cu determinarea amperometric sau poteniometric a metaboliilor (substraturi electroactive). O clasificare a biosenzorilor dup metoda folosit n prelucrarea informaiei prelevate de aparate fizico-chimice ar putea fi urmtoarea: - biosenzori bazai pe metode electrochimice; - biosenzori cu procese de combustie; - biosenzori electromagnetici; - biosenzori optici; - biosenzori electronici. Biosenzorii electrochimici au la baz un electrod chimic selectiv. Se determin selectiv o substan care apare n reacia biochimic. Dm ca exemplu electrodul de glucoz (fig. 154).

Fig. 154 - Schema unui biosenzor electrochimic cu electrod de glucoz 1 catod; 2 anod; 3 membran de acetat de celuloz; 4 membran cu enzim imobilizat; 5 membran de policarbonat. Glucoza difuzeaz prin membrane (5) cu grosimea de 5 m i cu p o r i de 0,03 m care blocheaz enzime i coloizi care ar deranja zone de reacie. Cnd glucoza ajunge n stratul de mijloc se formeaz H202, proporional cu viteza de difuzie a glucozei. H202 difuzeaz la anod i acolo are l o c reacia (1). A treia pelicula este o membran de acetat de celuloz c a r e las s treac uor H202 dar reine reductori. Curenii de semnal obinut de la traductor sunt proporionali cu concentraia de glucoz din prob. Sistemul de reacii se poate schematiza astfel: (1) H2022H+ +O2 + 2 (2) 2AgCl + 22Ag + 2Cl(3) 4Ag + 4Cl- + 02 + 2H204AgCl + 40H(4) + D-glucoza + 0 2 glucozooxidaza glucono-&-lactoz +H202 Substrat +enzim produs+ enzim oxidat Enzima oxidat + intermediar enzime + intermediar oxidat + profoni Reacia la electrod este : Intermediar oxidat intermediar + electroni Ex. de intermediari : (C9H5)2Fe, (OH3C5H4)2Fe, (HOOC C5H4)FeC5H5.

293

Biosenzorii microbieni, folosesc un electrod Clark pentru p02 p r i n c a r e se determin amperometric activitatea respiratorie a microorganismului folosit. n figura 155 este prezentat schema unui electrod de glucoz microbian bazat pe determinarea amperometric a activitii respiratorii a celulelor imobilizate de Pseudomonas fluorescens. Fig. 155 - Schema unui electrod de glucoz microbian. 1 electrod de pO2; 2 membran de teflon; 3 membran calogenic cu bacterie. Glucoza i O2, intr n metabolismul bacteriei. Se msoar consumul de oxigen care este direct legat de concentraia de glucoz. Timpul de rspuns este destul de lung (circa 10 min). Precizia msurrii este bun, nefiind suprtoare interferenele cu alte glucide sau aminoacizi. Pentru acest tip de senzori a fost elaborat o metod n impulsuri, timpul de msurare scznd la circa 30 s. Biosenzorii cu produs secundar de combustie se bazeaz pe msurarea unei substane eliberate ntr-un proces biochimic enzimatic. Substana eliberat este proporional cu cantitatea de reagent. Ca exemplu, poate fi dat termistorul enzimatic i microbial (fig. 156). Corpul este prezentat de un calorimetru adiabatic n flux. Prin el trece o soluie tampon, adus cu o pomp peristaltic cu 0,5-4 ml/min. Trecnd prin schimbtorul de cldur aceasta se nclzete pn la o temperatur dat. Cnd ntr-o astfel de soluie se adaug i proba (0,1-1 ml), n tubul de curgere cu enzima imobilizat sau microorganisme are loc reacia biochimic. Ca rezultat are loc o cedare de c ldur proporional cu concentraia de substan. Se obine o diferen de temperatur t2 t1 ntre temperatura iniial constant t1 t2, ca urmare a procesului din tub. Fig. 156 - Termistor enzimatic 1 termostat; 2 schimbtori de cldur; 3 termistori; 4 tub de curgere; 5 enzim imobilizat. Metoda se folosete pentru msurtori continue. S-au construit termistori enzimatici pentru msurtori de concentraii n cazul acidului ascorbic, etanol, glucoz, lactoz, penicilina, zaharoz, trigliceride, uree. Biosenzorii electromagnetici au o nalt sensibilitate i siguran analitic, dar din cauza complexitii, au nc o aplicabilitate redus (ex. spectrometrie de mas cu enzime pentru glucoz, glutamat, L-aminoacizi). Biosenzorii electronici utilizeaz tehnici de imobilizare enzimatic i microelectronic i este o direcie de perspectiv n ce privete crearea unor dispozitive de biosenzori miniaturali, foarte sensibile i multifuncionale. Tranzistorii cu efect de cmp fac obiectul unor intense activiti de investigare. Aceti tranzistori absorb ioni din soluie prin nveliul ionoselectiv modificnd curentul prin tranzistor. 294

Biosenzorii optici s-au dezvoltat sub forma senzorilor ce au la baz reacii imunitare. Se folosete semnalul optic ce apare n timpul reaciei antigen anticorp. Spectroscopia convenional nu este aplicabil n acest caz. Senzorii de acest tip au aplicaii n medicin, independent de, faptul c nc nu s-a atins sensibilitatea determinarilor radioimunologice. n figura 157 se arat schematic senzorul enzimatic electronic cu structura de tranzitor cu efect de cmp iar n figura 158 este reprezentat schema pe msur cu un astfel de senzor, precum i dependena curentului prin surs n funcie de pH. Cu enzim imibilizat pe stratul izolator de pe poarta tranzistorului cu efect de cmp s-a realizat un biosenzor pentru msurarea ureii, aceticolinei, glucozei etc.

Fig. 157 - Senzor electronic cu enzim cu structur de tranzistor cu efect de cmp

Fig. 158 - Schema de msur cu senzorul electronic de msur i dependena curentului de pH-ul soluiei. 1 ap cu temperatura constant; 2 prob; 3 electrodul Ag - Ag Cl (past); 4 tranzistor cu efect de cmp; 5 nregistrator. Avantajele biosenzorilor electronici sunt c pot fi combinai senzori pentru mai muli componenii, au dimensiuni mici i uurina, de a fi legai la aparatura de msur. Vor fi realizai n numr mare n viitor. Se combin cu msurtorile de pH, O2, C02, potenial redox i glucoz. Probleme importante pune structura capacitiv: membrana izolator - poart. n privina perspectivelor folosirii biosenzorilor n controlul i reglarea proceselor de fermentaie, pn n 1975 au aprut 120 de patente de biosenzori (50% electrochimici). Avantajele se bazeaz pe: - enzimele imobilizate, microorganismele au aciuni selective; bun sensibilitate; pot masura concentraii foarte mici de substrat organic; aparatura nu este foarte complicat; semnalul de ieire este electric; sunt uor de indus, nu au implicaii asupra purit ii optice a probei msurate. Pot fi folosii la reglarea proceselor de fermentaie. Dezavantajele biosenzorilor pot fi rezumate astfel: - nu sunt sterilizabili nici termic, nici chimic; - au stabilitate sczut (mai cu seam pentru cei enzimatici); - biocatalizatorii sunt greu de pregtit; - apar erori din cauza inhibitorilor catalizatorilor; - dup datele fvrnizate de literatura de specialitate aceti senzori se folosesc mai cu seama n laborator; - exist problemele de pre privind aparatura, sensibilitate i selectivitatea; - cea mai mare problema este cea legat de sterilizare.

295

BIBLIOGRAFIE
1. ALBERTS B., and col., 1989 Molecular biology of the cell, General Publishing Inc., New York. 2. ALBERTS B., BRAY D., HOPKIN K., 2004 - Biologie molculaire de la cellule, Flammarion Mdecine-Sciences, Paris. 3. ANDREICUT S, BECUS, M, 1985 - Biologie Celulara, Indrumator de Lucrari Practice si demonstratii, Litografia IMF, Tg Mures. 4. ANTOHI S., GAVRIL L., 1983 Progrese n genetica molecular, Ed. tiinific i Pedagogic, Bucureti. 5. ATANASIU L., 1990 Utilizarea fotosintezei ca surs alternativ de energie, Biotehnologii moderne, ED. Tehnic, Bucureti. 6. BARABAS N., PRISECARU MARIA., 1999 - Histologie vegetala, Ed. Emil Borcea, Bacau, 1999, 150 p. 7. BEHNKE H. D., and col., 1993 Progress in botany, ed. Springer-Verlang, Heidelberg. 8. BENGA G., 1985 - "Biologia celular i molecular", Ed. Dacia, Cluj-Napoca. 9. BERCEANU ST., PUNESCU E., 1981 Biologia i patologia imunitii, Ed. Acad. Romne. 10. BOGDAN C., 1988 - Elemente de geriatrie practic. Ed. Medical, Bucureti. 11. BUCUR GH., 1987 Boli dermatovenerice, Ed. tiinific i Enciclopedic, Bucureti. 12. CACHI-COSMA D., 1987 Metode in vitro la plantele de cultur, Ed. Ceres, Bucureti. 13. CAJAL N., 1990 Tratat de virusologie medical, vol. I, 407 413, Ed. Medical, Bucureti. 14. CHIRICU, 1984 Cancerologie general, Ed. Medical, Bucureti. 15. CRLAN V.M., 2001 Clonarea animalelor i consecinele clonrii, Ed. Junimea, Iai. 16. CORMARK H. D. , 2003 - Esential Histology and Citology, Philadelphia. 17. COTRUTZ C., 1994 - Manual de Lucrari Practice de Biologie Celulara, Ed. Tehnica Chisinau. 18. CRISTEA T.O., GHICA M., PRISECARU M.,- Variatia randamentului de micropropagare in vitrodeterminate de influenta genotipului la varza alba pentru capatana-Brassica oleracea L.,forma alba,U.S.A.M.V.,Iasi,Lucr,St.,anulXLVIII vol.I, (48),seria Horticultura, Ed.Ion Ionescu de la Brad,I.S.N.N. 1454-7376, 2005, p.191-196. 19. CRISTEA TINA OANA, AMBARU SILVICA, MARIA PRISECARU, FALTICEANU MARCELA, 2008 - Effect of in vitro plant growth regulators over the meristematic and mitotic activity at different genotypes of CAPSICUM ANUUM L.. U..A.M.V. Iai, Simpozionul tiinific international Horticultura, stiinta, diversitate, armonie, Facultatea de Horticultur Iai, 29 31 Mai 2008 Lucrri tiinifice, Seria Horticultur, Editura Ion Ionescu de la Brad , I.S.S.N. 1454 7376, p. 201-206. 20. CRISTEA TINA OANA, SILVICA AMBRU, MARCELA FALTICEANU, MARIA PRISECARU, 2007 - Studies concerning the utilisation of in vitro micropropagation in the conservation process of some valuable genotypes of pepper - Capsicum anuum L., U..A.M.V. Iai, Lucrri tiinifice, Anul L, Vol. I (50) Seria Horticultur, Editura Ion Ionescu de la Brad, I.S.S.N. 1454 7376, p. 439-444. 21. CRISTEA TINA OANA, SILVICA AMBRU, MARIA PRISECARU, 2008 Cytogenetic Effects Induced by In Vitro Cultivation of Shoot Tips at Capsicum Anuum L., Universitatea de tiine Agronomice i Medicin Veterinar, Bucureti, Lucrri tiinifice UAMV Bucureti, seria V, vol. LI, ISSN 1222-5312, p. 50-55. 296

22. CRISTEA TINA OANA, 2008 - Utilizarea biotehnologiilor vegetale n ameliorarea plantelor, Ed. Vicovia, Bacu, ISBN: 978-973-1902-09-8. 23. CRUCE M., 2002 - Biologie Celulara si Moleculara, Ed. Aius Craiova. 24. DARNELL J., and col., 1990 Molecular cell biology, Sc.Am.Books, New York. 25. DNIL L., PAIS V., 1988 Ateroscleroza cerebral din sistemul carotidian, Ed. tiinific i Enciclopedic, Bucureti. 26. DICULESCU I., ONICESCU D., BENGA G., POPESCU L. M., 1983 - "Biologie celular", Ed. Did. i Ped., Bucureti. 27. DICULESCU I., ONICESCU DOINA, BENGA GH., POPESCU L. M., 1987 Histologie medical, Ed. Medical, Bucureti. 28. DIMOFTACHE C., JERMAN SONIA, 1993 Biofizic medical, partea a III-a Biofizic celular, Ed. Cerma, Bucureti. 29. DUDAN R., VIKI ALLAN, KREIS T., 1991 Trends in Cell Biology, 1, 15-19. 30. DUMITRU I.F., 1980 Biochimie, Ed. Did. i Ped., Bucureti. 31. FRASINEL N., VERDES D., 1994 - Biologie Celulara si Moleculara, Ed. Mirton, Timisoara. 32. GAVRIL L., AGRIPINA LUNGEANU, ROGOZ I., 1989 Citogenetic molecular i evoluionist, Ed. tiinific i Enciclopedic, Bucureti. 33. GAVRIL L., DABAL I., 1981 Descifrnd tainele ereditii, vol. I, II, Ed. Dacia, Cluj-Napoca. 34. GENEVES L., 1972 Biologie cellulaire, tome I, II, Dunod, Paris. 35. GHEORGHE BENGA, 2005 - Introducere n Biologie Celular i Molecular, Ed. Medical Universitar, Cluj-Napoca. 36. GHERMAN I., 1994 Bazele celulare ale creterii, diferenierii, mbtrnirii, degenerescenei i morii celulare, pag. 93, n: Curs de Biologie celular, Universitatea Ecologic, Bucureti. 37. GHIORGHI G., PETRESCU NICU D., 2005 Biotehnologiile azi, Ed. Junimea, Iai. 38. HAENEY M., 1985 Introduction to Clinical Imunology, Butterworths Update Publications, London &. 39. IONESCU-VARO M., DIMITRIU G., DELIU C., 1981 - "Biologie celular", Ed. Did. i Ped., Bucureti. 40. ISRAIL A. M., 2000 - "Biologie molecular - prezent i perspective" Ed. Humanitas, Bucureti. 41. LODISH H., 2005 - Biologie molculaire de la cellule, De Boeck Universit, Paris. 42. LODISH H., BERK A., ZIPURSKY S., MATSUDAIRA P., BALTIMORE D., DARNELL J., 1999 - Molecular Cell Biology, 4ed., New York, W. H. Freeman & Co. 43. KAPLAN J. C., 1990 - Biologie Moleculaire et medicine, Flammarion, Paris. 44. KARP G., 2004 - Biologie: cellulaire & molculaire, De Boeck Universit, Paris. 45. KLEMPERER W., 1992 Intermolecular interactions, Science, 257, 887-888. 46. M. PRISECARU, R. VOICU, A. IOSOB, Observations on the embryonic development of Triturus/Lissotriton vulgaris L., Studii i Cercet. tiin.,seria Biologie animal, 15, p.56 67, 2008. 47. MACOVSCHI E., 1984 Concepia biostructural i teoriile moleculare ale materiei vii, Ed. t. i Enciclop., Bucureti. 48. MAILLET M., 2002 - Biologie cellulaire, Masson, Paris. 49. MIXICH F., ARDELEAN A., 2002 - Principii fundamentale de biologie moleculara, Ed. Med. Univ. Craiova. 50. MURRAY A: W., 1992 Cell-cycle checkpoints and feedback controls, Nature, 359, 599-603. 51. NEACU C., 1982 Informaia biologic, Ed. t. i Enciclop., Bucureti. 297

52. PALADE G. E., 1975 Science, 189, 347. 53. PI V., 1995 - "Biologie i patologie celular i molecular", Ed. Romfel, Bucureti. 54. POLLARD Th. D., 2004 - Biologie cellulaire, Elsevier SAS, Paris. 55. POLLARD T., EARNSHAW W., 2002 - Cell Biology, Elsevier SAS, Paris. 56. POPA L., REPANOVICI R., 1982 Tehnologia ADN recombinant (Inginerie genetic), Ed. t. i Enciclop., Bucureti. 57. POPA L., REPANOVICI R., 1992 Acizii nucleici, Ed. Acad. Romne, Bucureti. 58. POPESCU-VIFOR S., i col., 1980 Genetica i eredopatologie, Ed. Did. i Ped., Bucureti. 59. PRISECARU M, GHIORGHITA G, MIHU G, NICUTA D, CRISTEA O,-Production of haploid plants by in vitro anther and ovule culture of Brassica, Ed.Corson,Genetics and evolutions,2000,vol IV,Iasi,p.169-178. 60. PRISECARU M, MIHU G,CRISTEA O.T.,-Studiu comparative privind iducerea plantelor haploide la Brassica oleracea L.,utilizand culturile de antere si ovare in vitro,U.S.A.M.V.,Iasi,Vol.Simpozionul aniversar 50 de ani de la infiintarea Fac. De Horticultura Iasi,2002,I.S.S.N.1454,p.68-74 61. PRISECARU M,,GHIORGHITA G.,-Influenta tipului de explant asupra capacitatiide regenerare din embrioni somatici la Triticum aestivum L.,Bul.Soc.Nat.Biol.Cel.,A XIV-a Ses.St.anuala,Oradea,1996,p.223. 62. PRISECARU M,CRISTEA O.T.,MIHU G.,-The preservation of some valuable genotypes of Brassica white cabbage-by in vitro microclonation,Studii si Cer.de Biol.Univ., Bacau, 2005,10,p.195-197. 63. PRISECARU M,CRISTEA O.T.,-The stimulation of the gynogenetic development to Bete vulgaris L.,by the pollination of the embryo sac with irradiated pollen.Sudii si Cercet.de Bio.,V,2001,Bacau,p.15-18. 64. PRISECARU M,MIHU G.CRISTEA O.T.-Obtaining the haploid plants to Lycopersicn esculentum L.,through in vitro androgenesis and gynogenesis,St.si Cerc.de Biol.,vol.XIV,2000, p.23-27. 65. PRISECARU M.,CRISTEA O.T.,GHICA M.,-Studies concerning the behaviour of some tomato (Lycopersicon esculentum Mill.)genotypes to in vitroanther and ovule culture.Univ.de St.Agron.si Med.Vet.,Bucuresti,2001, Lucrari St., seria V, anul XLIV; Horticultura, p.19-23. 66. PRISECARU M.,GHIORGHITA G.,- Organogeneza indirecta la sfecla de zahar (Beta vulgaris L.), St.Cerc. Biol. ,Seria Biol.Veget.,1995, p.81-84. 67. PRISECARU M.,GHIORGHITA G.,-Studiul histologic in calusul de grau (Triticum aestivun L.) obtinut prin culturile embrionilor imaturi in vitro.Bul.Soc.Nat.Biol.Cel., A XIV a Ses.St.anuala,Oradea,1996, p.222. 68. PRISECARU MARIA, GHIORGHITA G., 2002 Haploidia experimentala in contextul biotehnologiilor moderne. Editura Tehnica Bucuresti, 192p. 69. PRISECARU MARIA, VOICU ROXANA, RDUCANU DUMITRA, PRISECARU FLORIAN, 2008 - Ecotoxicologie Curs universitar, Ed. Alma Mater, Bacu, ISB 70. PRISECARU MARIA., 1994 - Cito-histo-embriologie vegetala. I. Citologie,Tipografia Univ. Bacau, 1994, 225 p. 71. PRUCE M. E., DICKINSON A. G., 1987- Journal of General Virology, 68, 79-89. 72. RAICA MARIUS, Citologie Clinica, Timisoara, 2001. 73. RAICU P., 1991 Genetica, Ed. Did. i Ped., Bucureti. 74. RUSU V., BARAN T., BRNITEANU D.D., 1991 Biomembrane i patologie, vol.2, Ed. Medical, Bucureti. 75. SASSON A., 1993 Biotehnologii i dezvoltare, Ed. Tehnic, Bucureti. 76. SLAYTER E. M., 1992 - Electronic Light Microscopy, Cambridge, UK.

298

77. STRACHAN T., READ A.P., 1999 - Human Molecular Genetics, 2ed. Oxford, UK, BIOS Scientific Publishers Ltd. 78. TOLEDANO A., LOPEZ g. MARIA, 1987 The cell membrane: esential element in the chemistry of life. Current topics in Science an medicine vol.1, Merck. 79. VOICULE N., PUIU L., 1997 - "Biologia molecular a celulei", Ed. All, Bucureti. 80. WILSON J., HUNT T., 2004 - Biologie molculaire de la cellule: livre d'exercices, Flammarion Mdecine-Sciences, Paris.

299