Sunteți pe pagina 1din 62

Biochimie -Lucrdri practice medicind, vol.

II

CUPMNS
Cap.I Hemoglobina. Derivafii

hemoglobinei.........,....

............ 9
Dozarea hemoglobinei ca cianmethemoglobind prin metoda Drabkin.......... 9

Cap.II Determinaren pigmenfilor btliari. Determinarea bilirubinei ... 14

tr.l Determinareabilirubineitotalecudicloraniline...........
II.2 Determinarea bilirubinei prin metoda Van den Bergh
direct[ sau rapid[

Cap.Itr

Itr.l

Vitamine

.......14
.......... 16

...............23
........24

............,.

Dozarea vitaminei C
m.1.1 Reaclia de identificare a vitaminei C cu azotat de argint........25
m.l.2Dozareavitaminei C prin metoda iodometric6........................26
........28
W.2Dozneavitaminei PP
Dozarcavitaminei PP prin metoda volumetrice................................. 30
................... 33
Itr.3 Identificarea vitaminei Be
Reacfia de identificare a vitaminei Be cu reactivul

(83).....

.............

Folin - Ciocilteu.,.
................... 35
Itr.4 Identificarea vitaminei A
Reacfia de identificare avitarrinei A cu acid tricloracetic................. 38

..............

Enzime....

................................. 39
..........40
....................42
IV.2 Influen{a pH-lui asupra actiyitifii
................44
IV.3 Determinxeaactivith[ii transaminazelor
IV.3.1 Determinarea activitilii transaminazelor serice ALAT gi
ASAT prin metoda spectrofotometrici........ ........45
IV.3.2 Determinarea activitiilii ALAT (TGP) prin metoda.
.......49
IV.3.3 Determinarea activitalii ASAT (TGO) prin metoda
.......51
fV.4 Determinareaastlitilliiy glutamiltransferazei (GGT)........................ 53
Determinarea activit5{ii y glutamiltrans fer,azei (GGT) prin
......54
metoda

Cap.IV

IV.l InfluenfatemperaturiiazupraactivitSliienzimatice

enzimatice
serice

enzimatic6

enzimaticl"
enzinaticd

..........;.;i....

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.Il

lV.5 Detenninarea activitiifii fosfatazei alcaline (FAL)


Determinarea fosfatazei alcaline (FAL) prin
metoda

spectrofotometric[

............ 56

...........57

lV.6 Determinarea activitifii amilazei....


.................59
Determinareaa-arilazei prin metoda Wohlgernuth ........ 60
lV.7 Determinarea activitifii catalazei
.................... 63
Dozarea activitiifii catalazei serice
................. 64
Cap.V Explorarea biochimicl a metabolismului mineral......................67
V.l Dozarea calciului
..........67
V.1. 1 Dozarea calciului prin metoda complexometricl
cu murexid
........67
V.I.2 Determinarea calciului prin metoda colorimeficd...................71
Y.2Dozarca magneziului
......................75
Y.2.1Dozarea magneziului in ser prin metoda colorimetric6
Mann gi Yoe
.....75
V.2.zDozarea magneziului in ser prin metoda cu gaben-titan ..........77
V.2-3 Dozarea maneziului in ser prin rnetoda colorimetricd............ 80
V.3 Determinarea fierului seric .........
..................... 83
V.3.1 Determinarea fierului prin metoda fier croma2uro1.................. 83
V.3.2 Determinarea fierului prin metoda fier ferro2in....................... 85
V.3.3 Determinarea capacitii{ii de legare a fierului...
....... 88
V.3.4 Determinareacapaciti;lii totale de fixare a fierului
prin metoda Ramsay
........... 89
Cap.VI Analiza biochimicii a urinei....

.................92
.....92
.................. 94
............94
VI.2.2 Misurltori organoleptice: culoare, miros, aspect........ ............97
VI.3 Examenul microscopic al urinei (sedimentul
........99
VI.4 Examenul fizicochimic al
............ 105
VI.4.1
.......... 105
W.4.2 M6surarea
........ 106
VI.4.3 Misurarea
......107
YI.4.4 Determinarea compozitiei
... 108
VI.4.5 Cercetarea elementelor anormale din
...... l l I
VI.4.5.1 Identificarea proteinelor
.....
I. Determin[ri
...ll2
I.a Proba cu acid acetic la cal.....----..............lt2

Recoltareaurinei.....
VI.2 Examenul macroscopic al urinei....
W.2.tMdsurarea diurezei
VI.l

urinar)
urinei........
MdsurareapH-ului
densitdlii
osmo1arit6tii...............
chimice.
urind...
urinare....

calitative..............-

ll2

q
i

Biochimie -Lacrdri practice medicind, vol.

tr

II

I.b Proba cu acid sulfosalicilic la rece ......... 113


I.c Metoda
................ l14
II. Determiniri cantitstiv.............. .. 116
Metoda dilu{iilor
........... I 16
VI.4.5.2ldentificareaglucidelorurinare...... .... l19
I. Determinlri
.................. 119
.................. 119
I.b Reac{ia
...............l2l
I.c
.................122
II. Detennin6ri
..............123
Metoda Ionescu - Matiu....
VI.4.5.3 Identificarea compugilor cetonici in urind ......,....125
................. 125
Reacfia kgal VI.4.5 .4 Cercetarea pigmenlilor biliari in urin[ ..... ............ 127
a. Urobilinogen - Metoda
.....127
b. Urobilina - Metoda Schlessinger................ ... 129
.......... 130
c.
d. Aozi gi siruri biliare - Reac{ia Hay cu
floare de sulf
........132
VI.4.5.5 Test rapid de deterrrinare a componentelor
biochimice in win[ {pH, proteine, glucoz6"
............133
.... 136
VI.4.6 Determinarea aciditifii

Heller.......
(fleller)

calitative
I.aReacliaBenedict
Fehling.....
Reac{iaNylander
cantitative
Imbert....

Erlich

Bilirubina-MetodaLugol

......

nitrifi)

urinare......

Cap.YII Analiza de laborator a lichidului cefalorahidian............... 138


Recoltarea lichidului cefa1orahidian.............. ................. 140
.......... 141
VII.2 Examenul caracteristicilor ftzice........
VII.2.I Misurareapresiunii LCR.......'...
....... 141
.........142
Vn.2.2 MisurareapH-ului
....143
W.2.3 Mlsurarea densitiifii...
VII.3 Misuritori organoleptice: aspect (culoare, claritate)
..... 143
VII.4 Examenul microscopic al LCR (citologia).
..144
VII.5 Exarnenul chimic aI LCR
...........144

VII.I

VII.5.l Determinarea proteinelor (proteinorahia)............................


I. Determinlri
I.a Reacfia
I.b Reaclia
I.c Metoda

calitative...
Pandy.......

Nonne-Appe1t..............

145
.............. 145
................ 145

..............147

He11er........
............... 148
tr. Determindri cantitative ..................... t' ..... r... ................ 49
................. 149
II.a Metoda diluliilor (Heller).....
1

Biochimie - Lucrdri practice medicind, volJl

WI.5.2
VII.5.3
VII.5.4
YII.5"5

tr.b Metoda Sicard-Cantaloube............... .... 151


Determinarea hiptofanului prin metoda Hopkins-Cole ...... 152
Determinarea
................. 154
Determinareapermeahilitifii
.............. 155
Determinarea glucozei (glicorahia)
I. Determiniri calitative
... 156
tr. Determin5ri
..............157
Determinarea clorurilor
a. MetodaVolhard....
b.
.... 159

acetonei....
lanitra{i

ReactiaFehling.....
cantitative

\III.5.6

MetodaMohr........
BlbHografie

..... 163

-,

Biochinie -Lucrdripracticemedicind,vol.

il

CAPITOLUL

IIEMOGLOBINA
DERTVATII IIEMOGLOBINEI
Hernoglobina este o heteroproteini (cromoprotein6) alcbtuitil dintr-o
globina $i o grupare prostetic5" colorate
grupare proteicd incolord
(metaloporfrrin[) hem. Globinele sunt proteine din clasa histonelor, au
caracter bazic, fiind bogate in lizinn gi histidind.
Din greutatea molecular[ a hemoglobinei de 64.450 daltoni globina
rqrezinticca.g6 7o, hemul cca.4 % gi fierulcca. 0,33 -0,34yo.
in organism hemoglobina indepline$e func1ii importante preollm:
fixarea reversibiltr a oxigenului molecular la nivelul plimdnilor,
formdnd oxihemoglobina (HbO2), forma de transport a oxigenului la lesuturi
gi a unei parli din dioxidul de carbon (l2o/o) formflnd carbhemoglobina
(HbCO2), forma de transport a dioxidului de carbon de la nivelul lesuturilor
la p16m5ni;
F participarea la structura unor sisteme tampon, contibuind astfel la
reglarea echilibrului acidobazic.
Determinarea valorilor hernoglobinei constifuie un test uzual in
diagnosticul unei anemii sau policitemii.
Determinarea hemoglobinei in s6nge poate fi efectuat[ indirect pe
baz.a capacitiitii de fixare a oxigenului sau a continutului de fier. Practic se
luti1uz.eazd metode fotometrice care m6soard pigmentul sub formfl de
oxihemoglobind sau sub fonnd de cianmethemoglobinE.

Dozarea hemoglobinei ca cianmethemoglobini


prin metoda Drabkin

Dozarea fotometrici a hemoglobinei ca cianmethemoglobinE este o


metodl standard de hemoglobinometrie.

Biachimie - Lucrdri practiee medicind,

v9!4

Principiul metodei

Fericianura de potasiu oxideaz[ Fe2* (fier feros) din hemoglobini la


Fe3*1fier feric). Astfel toate tipurile de hemoglobinl din sdnge (cu exceplia
verdoglobinei) se transform[ tn methernoglobind. Aceasta, pe mIsur6 ce se
formeazl, se combinI cu cianura de potasiu, transfonndndu-se in
cianmethemoglobind, derivatul cel mai stabil.

Materiale necesare
eprubete de hemolizl
stativ eprubete
micropipete de hernoglobini
hdrtie de frltru
spectrofotometru
cuve de 1 cm
vase cu soMe dezinfectanti

distilatii
tifon
reactivi
apd

Reactivi
Reactiv Drabkin:
0,14 g fosfat monoPotasic
0,2 g cianurd de Potasiu
apd distilatI ad.1000 (PH:6'4)
Se filtreaz[ prin hdrtia de filtru, apoi solulia se plsfteazdla frigider
in flacoane de sticlLde culoare brun[, bine inchise, aproximativ 2 luni.
7,3 7,5
Parametrii obligatorii ai soluliei Drabkin sunt pH-ul
(deoarece la pH acid precipitii proteinele, iar 1a pH alcalin precipitd
lipidele), claritatea gi stabilitatea.
Standard de cianmethernoglobinl

Proba
Sdnge capilar sau venos recoltat pe anticoagulant

(EDTA)

Tehnica de lucru
Se pregltesc dou6 eprubete de hemoliz[ in care se pipeteaz[ c6te 5
ml de reactiv Drabkin.
Se recclteazl 0,02 ml de s6nge cu ajutorul unei micropipete de
hemoglobin[, se gterge exteriorul pipetei cu o hf,rtie de filtru pentru
10

Biochimie -Lucrdri practice medicind, vol.

II

indepbrtarea surplusului de s6nge gi se adaugb in una dintre eprubete. In cea


de-a doua eprubet5 se pipeteazn0,A2 ml de solulie standard.
Se spal6 micropipeta de 2 3 ori cu gniL, ftfi barbotare. Se lasd
timp de 30 de minute in repaus.
Se citesc extincliile probei (%) 9i standardului (E ) faf6 de apd
distilatE, la lungimea de undi de 540 nm, in cuve de lcm.

Calcul

Cp:Ep/Erxg,
g hemoglobinn /100 ml

ser:

Ep

/ E, x C,

unde:
Cn concentralia probei
Eo extincfia probei

:
:
E, : extinc{ia standardului
Cr:

concentrafia standardului (13 g9lo)

Obeervafii
Pentru oblinerea unor rezultate corecte se vor respecta urmdtoarele
precau,tii cu privire la:
a. Fotometru:
o etalonare corecti cu respectarea pozi{iei gtecherului ln momentul
determin5rii;
o folosirea de cuve cu grosime de 1 cm
o citire la lungimea de undd de 540 nm fa15 de apl distilatii.
b. Standard:
o se pf,streazd,la rece gi se folosegte o singuri dat[;
r inaintea utilizirii, fiola cu standard se menfine timp de 30 de
minute la temperatura laboratorului;
r fiola cu standard are valabilitate dup[ tiliere de maxim o ord.
c. Preparare reactiv:
r cianura de potasiu este o substarr{i alb[, uscat5 (dac6 este umedE se
fine timp de24 - 48 de ore la exicator);
o cdntirire exactii a substanfelor la balanfa analitici;
o pH reactiv :'7 ,3 - 7 ,5;
r pH ap6 distilatii :6 - 6,5;
o plstrare reactiv la frigider, in flacon brun cu {op de plastic sau de
(nu
sticl[
de cauciuc);
11

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.Il

t rpartir.arc reactiv in sticlufe sau eprubete cu ajutorul biuretei sau a

pipetelor cu dublu sefirn;


o nu se sufl[ in pipeta cu reactiv, deoarece dioxidul de carbon
introdus scade pH-ul gi precipitii proteinele, iar la fotomefu se obtrin valori
crescute ale hemoglobinei.
d. Pipete, care trebuie si fie:
o curate (eventualele impuriti{i dau rea4ii secundare);
r uscate (umiditatea duce la diluarea probei cu valori sclzute ale
hemoglobinei);
o intacte (vffirl ciobit nu respectE volumul);
e. Egantion de sdnge:
o se recolteazd sffict la semn, fbr6 bule de aer;
o exteriorul pipetei se gterge cu o hdrtie de filtru pentru indepdrtarea
surplusului de sdnge.
f. Tehnici de lucru:
o micropipeta se introduce lent in reactiv,la fundul recipientului;
o elpulzia singelui se face iacet, flrE bule de aer;
se spali micropipeta de 2 - 3 ori fhrd barbotare;
(mgenizarca conlinuurlui epnrbetei se face pintr-o singur6

.
.

rcrmlree, rryid-

Tiry de rea4ie:
o tnebtrie si fie de 30 de minute; dac6 se deprqegte timpul, reaclia
devine ireversibilE, total[.
g-

Valori normale
nou-ndscut:

copii 0-lan:
copii 1-15ani:

17

-20 9/100 ml

- 19 9/100 ml
ll,2- 13,4 gll00 ml
12

birba{i:

14

* l8 9/100 ml

femei:

12

- 16 9/100 ml

Variatii patologice
Valori

'

sc6.zute ale hemoglobinei:

anemii;
hemoragii.

t2

I
3.

B@*it!*-Lvgrffiplaqttre'w'dici&.vet
Vahri

&

srescute ale hemoglobinei:

poliglobulii;
dsceidGaese;

insuficienl5puhtei&4a;
insuficim$ cardiaci;

r,.f,|ffi$i:{ ti";,

.irir

'... i ;:

"-r;

:t. , ,: r ;., , . r.i ."', ,

lr;

:i

!S-'',1."::

I !r'1

;i:,i

&3:

:l

7
I

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.Il

CAPITOLUL

il

DETERMINAREA PIGMENTILOR BILIARI


DETERMINAREA BILIRUBINEI
Pigmenlii biliari sunt produqi finali de catabolism ai hemoglobinei qi
sunt reprezentafi de bilirubind, Bilirubina este un compus liposolubil cu
structur6 lineard tetrapirolici, oblinut in urma degradErii enzimatrce a
hemului in macrofage.
In marea ei majoritate (peste 80oA), fracfiunea heminicd provine din
hemoglobin[, celelalte hemoproteine (mioglobina, citocromii, oxidazele,
catalazele) reprezentdnd surse de miniml importanfS. La randul oi,
hemoglobina provine din hematiile senescente sechestrate qi distruse de
macrofage.

II.1 Determinare& bilirubinei totale cu dicloranilini


Principiul metodei
Bilirubina tota16 din ser reac{ioneaz[ cu dicloranilina diazotatil,
rezultind azobilirubina de culoare roqie.
Materiale necesare
eprubete

stativ pentru eprubete


pipete de sticld
pipete semiautomate
conuri
spectrofotometru
cuve I cm
vase cu solu{ie dezinfectantil
apd distilatii
tifon

reactivi

t4

Biochimie -Lucrdri practice medicind, vol.

tr

II

Reactivi
Reactiv l:

Dicloranilina l,7mmolA

HCl

80 mmoVl

Reactiv 2:
AzotLtde sodiu 95 mmoVl
Se amestecn 50 ml de reactiv I cu I ml de rcactiv 2.
Amestecul de reactivi are stabiiitate timp de 5 zile la 20

de3 s[pt6m6nila2-8oC.

25oC qi

Proba
Ser

Tehnica de lucru
Se pregiitesc doud eprubete: martor, prob4.
Se

pipeteazi in eprubete conform tabelului urmitor:


Tabelul

Reactivi

Martor
100

Ser

ul

Proba
100

ul

lml

Reactiv I
Amestec R1 + R2

lml

Se agitii con{inutul eprubetelor. Se incubeazd, timp de 5 minute la


25"C,
apoi se citegte extincfia probei (&) $ a martorului (E-) fat[ de
apd distilatii, la lungimea de undi de 546 nm, tn cuve de I cm.

20

Calcul

Cp: (Ep-Er) " F'


unde:
Co

concentafia probei

Eo: extinc{iaprobei
E*

F:

extinc{ia martorului
factor :253lrmolll (la8 mgA)

l5

i
g

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.Il

II.2 Determinarea bilirubinei


prin metoda Van den Bergh directii sau rapidi
Principiul metodei

Bilirubina se afl6

in

ser sub fonnd de bilirubine indirecti

(neconjugat[, liber[), insolubild, legatii de proteine 9i de bilirubind directii


(conjugatd), so1ubi15.
Bilirubina conjugat[ reacfioneaz[ direct cu acidul sulfanilic diazotat
form0nd un azopigment colorat.
Bilirubina neconjugat[ (libere) reacfioneaz[ indirect cu acidul
sulfanilic diazotat, numai dupd ce a fost desfbcutd din legdtura proteic6 9i
solubilizat6.
in concluzie, prin ttatarea serului direct cu acid sulfanilic diazotat
complexul colorat format se datoreazi numai bilirubinei conjugate (directe)
iar prin tratarea prelungitd a serului cu un accelerator (cofein6, benzoat) qi
apoi cu acid sulfanilic diazotat complexul cotorat format se datoreazi
bilirubinei totale.
Azopigmentul format are culoare rogie ln mediu acid sau neutru gi
culoare verde-albastd ln mediu alcalin.
Se mdsoard extincfia azopigmentului neutru, rogu pentru bilirubina
directd gi extincfia azopigmentului alcalin, verde-albastru pentru bilirubina

totali.
Materiale necesare
eprubete

stativ pentru eprubete


pipete de sticld
pipete semiautomate
conuri
spectrofotometru
cuve I cm
vase cu soMe dezinfectantd
ap[ distilatii

tifon
reactivi

16

Biachimie -Lucrdripractice medicind,,vol.

II

Reactivi
Solutie de acid sulfanilic. 1,25 g acid sulfanilic, 3,5 ml HCI
concentrat (d: 1,19) se aduc Ia250 ml cu api distilatS.
Solufie de azotit de sodiu: 0,175 g NaNOz in 100 ml api distilatE.
Accelerator (solu{ie cofeind-benzoat). 13,75 g cofein6, 18,75 g
benzoat de sodiu se aduc ta250 ml cu apl distilatE.
Solufie de tarhat alcalin. 65 gtaftat dublu de sodiu gi potasiu, 19 g
NaOH se aduc 1a250 ml cu ap6 distilatS.
Ser fiziologic (NaCl solulie 0,9Vo)
Proba
Ser nehemolizat

Tehnica de lucru
Dozarea bilirubinei totale (BT)
Se pregdtesc dou6 eprubete: martor, prob6.
Se pipeteazE in eprubete conform tabelului urmdtor:
Tebelul

II
Reactivi

Ser

sulfanilic
So1. azotit de sodiu
So1. acid

Martor
0.25 ml

Proba
0.25 ml

0,25 ml

0,25

ml
0,1 ml

lml
lml
Accelerator
Se agitii gi se menfin timp de 20 de minute la
temperafura camerei dupd care se adaug6:
lml
1ml
Tartrat alcalin
Se agit6 conlinutul eprubetelor gi dup[ 5 minute se citegte extinclia
probei (Ep) fat6 de martog la lungimea de undd de 600 nm, in cuve de I cm.

Calcul
mg BT/ 100 ml ser = En xYt la x Vi
mg BT/ 100 mI ser: En x 2,6 I 1,150 x 0,25
mg BT/ 100 ml ser: En x 9,04 -

t7

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.Il

$il
unde:

a:

pentru

l.:

1,150
600 nm

coeficient procentual de extincfie al pigmentului azoic

Y1:2,6 ml -volumul final al solutiei


Vi

0,25

ml- volumul inilial al probei

Dozarea bilirubinei directe. conjueate (BD)


Se preg6tesc doud eprubete: martor, prob6.
Se pipeteazi tn eprubete conform tabelului urmdtor:
Tabelul

Itr

Martor

Proba

Ser
Ser fiziologic

0.5 ml

0.5 ml

2nn

2llnl

Sol. acid sulfanilic

0,3 ml

0,3 ml

Reactivi

0,1 ml

So1. azotit de sodiu

Prin reacfia ultimilor doi reactivi, se formeazd extemporaneu acidul


diazobenzensulfonic.
Se agitd confinutul eprubetelor gi dupn exact 5 minute se citegte
extinc{ia probei (En) fafa de martor la lungimea de und6 de 530 nm, in cuve
de 1 cm.

Calcul
mg BD/ 100 ml ser: En x Vr / a x Vi
mg BD/ 100 ml ser: En x 2,9 I 0,943 x 0,5
mg BD/ 100 ml ser = Ep x 6,1
unde:

r:

0,943

pentru l. = 530 nm

coeficient procentual de extinc{ie aI azopigmentului

Y1:2,9 ml - volumul final al soMei


Vi : 0,5 ml- volumul inilial al probei
O alti variant6 pentru aceastii determinare este cea care utl\izeazd
reactiv diazobenzensulfonic preparat extemporaneu.

18

-,

Biochimie -!-ucrdri practice medicind, vol.

II

#l

Reactiv diazobenzensulfonic :
25 ml solufie acid sulfanilic O,lVo:
I g acid sutfanilic
15 ml HCl concentrat
ap6 distilatii ad. 1.000 ml
0,75 ml solufie azotit de sodiu 0,5 {/o.

Tehnica de lucru
Se pregltesc dou[ eprubete: martor, probi.
Se pipeteazi in eprubete conform tabelului urmltor:
Tabelul

IV

Martor

Reactivi

0.5 ml
1,75 tnt

Ser
Ser

fiziologic

Proba

BT
0.5 ml
ml
0.25 ml

Accelerator

BD
0.5 ml
I,75 ml

1,75

Reactiv diazobenzensulfonic
Ap[ distilatE

0.25

0.25 ml

ml

las[ tn repaus timp de 5 minute la


intuneric, apoi se citesc extincfiile probelor (F,p) fa{f, de martor [a lungimea
de undi de 530 nm, in cuve de I cm.
Se agitii con{inutul eprubetelor. Se

Calcul
Se taseazl curba de calibrare folosindu-se o solulie de bilirubind
pur[ standard de concentrafie 20 mg/l00 ml.
Se calculeazi factorul de pant5, care in cazul de fat[ este Fp:7.
Concentrafiile bilirubinei totale (BT) pi bilirubinei directe (BD) se
calcuLeazd folosind relaf iile

mg BT/100 ml ser: Ep x Fp
mg BD/100 ml ser = Ep * Fp

Observafii
Probele de analizattrebuie ferite de lumind puternicd.
Este de preferat ca probele s[ fie prelucrate imediat de la recoltare, in
caz contar ele por fi pdstrate in frigider maxim 20 ore.

t9

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.Il

Valori normale
normal bilirubina seric[ este reprezentatil in principal de
bilirubina neconjugati (indirectd), insolubilfl in aPd, vehiculatii de
serumalbuminE. Datoriti dimensiunilor mari, acest complex nu se frltreazd
prin capilarele glomerulare, deci bilirubina este absentE in urina normal6.
Bilirubina conjugatii (directd) este hidrosolubili qi are valori misi

in mod

atunci cdnd apare ser.


Cele douE forme lmpreun[ formeazlbilirubina totalh-

Bilirubina totald (BT): 0,1 - 1 mg/dl (1,7 - 17,1 pmolinifu)


Bilirubina direct6 (BD): max. 0,25 mg/dl (ma*. 3,4 pmoli/litru)
Bilirubina indirectfl se obfine prin diferenta tntre valorile bilirubinei
totale qi ale bilirubinei directe.

La nou-ndscutul normal existii o imaturitate a UDP


glucuroniltransferazei, enzimd necesar[ form[rii bilirubinei conjugate.
Valoarea bilirubinei serice cregte pAnE la 8 mg/100 ml ser la3 - 6 zile dupd
na.$tere.

La nou-n[scu,tii prematuri valoarea bilirubinei serice poate creqte


pdn5 la 12 - 15 mg/100 ml ser. Aceastii valoare este o entitate recunoscut6
ca icterul Jiziologic al nou-ndscutului.

Tabelul Y Varialiile fuiologice ale valarilor bilirubinei totale la nou-ndscayi

Nisculi la termen
(BT me/100 ml ser)

Prematuri
(BT ms/100 ml ser)

-24 ore
24-48 ore

t2

3,5 zile
dupi I luni

12

24

1.5

1.5

Nou-niscu{i
nimita suoerioari)
0

Varia{ii patologice

in

in

care bilirubinemia depdqegte limitele superioare,


bilirubina difuzeazd din sdnge tn {esuturi, producdnd colorarea intensd in
galben a tegumentel6i qi mucoaselor (sindrom icteric). Icterul se manifesti
clinic la o bilirubinemie ce depiqegte 2 - 2,5 mgldl. Nu existil o corelafie
strdnsi intre nivelul bilirubinemiei gi intensitatea icterului.
t

cazurile

2A

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.

II

Mecanismele implicate in aparilia hiperbilirubinemiei sunt:

hiperproducfia (prin hemoliz6 excesiv[) de bilirubin[ indirectil

care conduce la icter hemolitic (prehepatic/suprahepatic)

cu

hip erbilirubinemie indirectE (neconj ugat5) ;

de captare, conjugare gi- excrefie a bilirubinei


qi
necojugate
conjugate care conduce la icter hepatic cu hiperbilirubinemie
indirect[ (neconjugatii) gi directii (conjugatii);
o deficiful de evacuare a bilei tn intestin care conduce la icter
mecanic (posthepatic/subhepatic), obstructiv cu hipeftilirubinemie directi
(codugatd).
Anomaliile genetice ale metabolismului bilirubinei sunt rare. in
funclie de tipul de hiperbilirubinemie se intilnesc:
sindroame ce evolueaz6 cu hiperbilirubinemie neconjugatil:
sindromul Gilbert;
sindromul Cri gler-Najj ar;
sindromul Arias;
F sindroame ce evolueazl cu hiperbilirubinemie conjugati:
sindromul Dubin-Johnson:
sindromul Rotor;
sindromul stocErii hepatice.
r

insuficienta

Valori crescute bilirubin6 total[


anemie hemoliticl cronicd (cregtere ugoard sub 5 mg/dl);
afecfiuni hepatocelulare (cregtere medie de 10 - 30 mg/dl);
colestaz6 intra sau extrahepaticd (cregtere severd l0 - 60 mg/dl
ser p6nd la fiA - 1000 mg/dl).
Valori crescute bilirubind liberi (neconjugatil, indirectS" prehepatic[)
ictere hemolitice;
hepatite cronice;
ciroze;
colestaz6;

defecte enzimatice

cu

caracter familial in procesul de


ln bilirubin6 conjugatl (sindromul

transformare a bilirubinei libere


Gilbert, sindrom Crigler-Najj ar).

crescute bilirubine conjugatii (directii, posthepatici):


'Valoriictere
mecanice;

hepatite;
ciroze:

2l

J-'
I

"Fiwtrffiiat+ffiipqqgFcedsdfr&id-ff
';'.';i ',:!l!':':l' t''.. 1;:-"'{ir:1 '::i''i*::it';''1i'1"':
,
:..,i: irr,-1prc&d agr6i ql*,d@qglfuitiaterk 1@9#,-de-#0relis al
W&gSAS&r;,

::.:

i:

:,,i.|:.:!.. . _:;,'. jj..',.:ji*-.r:

:;; :li;'j'ii'i.,i,:.:r

:,:lili a'',.,l'11 i . :i:'1lri:1.:r'.;;-: -,rl::;::i'..,


:. : jj,-li", lr'.'- ,i:' !i', ::!:il e
.

22,,

-t,.1.i.;,1,

.:'.a;fr'i

l,:.i','.i..{i

Biochimie * Lucrdri practice medicind, vol.

CAPITOLUL

II

ilI

VITAMII\E
Vitaminele sunt definite ca substanfe organice esenfiale pentru
men{inerea vielii gi reproducerii, care nu pot fi sintetizate tn organism gi din
acest motiv trebuie aduse din exterior prin intermediul alimentelor.
Vitaminele nu reprezintE materiale sffucturale gi nu au valoare energetici.
Ele sunt active in cantit6fi foarte mici gi sunt coenzime, cu rol indispensabil
in procesele anabolice qi catabolice (rol biostimulant).
Clasificarea vitaminelor nupoate fi fdcut6 pebaza structurii chimice,
din cauza diversitElii qi complexit5fii acesteia, ea diferind de la o vitaminl la
alta.
Criteriul principal de clasificare aL vitaminelor este caracterul
solubilitEfii lor, astfel vitaminele se clasifici in dou6 grupe: Iiposolubile Si
hidrosolubile.
Vitaminele liposolubile sunt vitaminele A, D, E, F, K. Ele se gisesc
in alimentele grase gi participl numai in procesele anabolice. Aceste
vitamine sunt insolubile in ap6 (se pierd cantitili foarte mici in cazul sp6l6rii
sau men{inerii tn apd) gi sunt vehiculate prin singe de cltre lipoproteine.
Administrate in cmtitii{i mari produc hipervitaminozhcumanifestiiri toxice.
Yilaminele hidrosolubile sunt vitaminele Br, Bz, Bo, Brz,C, PP, acidul
folic, acidul pantotenic. Au molecule polare solubile tn ap6, de aceea se
pierd ugor la sp6lare, menlinere sau fierbere in api. Majoritea lor au rol tn
procesele catabolice. Administrate in cantitiiti mari nu se acumuleazd (nu
apar hipervitaminoze).
Lipsa vitaminelor din organism, deficitul sau concentratia lor
qrescutil determin[ tulbur6ri metabolice mai mult sau mai pufin grave.
Astfel apare necesitatea determinErii cantitative gi calitative in lichidele
biologice fie pentru precizareadiagnosticului, fi.e pentru cercetare.

23

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.Il

ct

ilI.l

Doznrea vitaminei C

Vitamina C se mai numeqte vitamina antiscorbutic[. Prin structura


sa, acidul ascorbic este un derivat al hexozelor. Compusul biologic activ are
configura{ia levogird: acid L - ascorbic.

Vitamina C

Acidul ascorbic este un compus nesafurat, cu caracter acid datorit[


prezenlei celor doi hidroxili enolici capabili de a se disocia cu fonnarea de
ioni de hidrogen, mai ales pe seama hidroxilului din pozi{ia 3. Existen{a
dublei legdturi conferd acidului L-ascorbic capacitate4 de a se oxida
reversibil cu formarea de acid L-dehidroascorbic care are activitatea
vitaminic6.
Participarea acidului ascorbic in diferitele procese biochimice este
corelatd cu propriet5lile sale reduc6toare, respectiv cu capacitatea acidului
L-ascorbic (forma redus6), a acidului L-dehidroascorbic (forrna oxidatE) 9i a
produsului s6u intermediar de a forma un sistem oxido-reducf,tor (redox)
care poate s[ cedeze gi sE primeasc6 atomi de hidrogen.
Forma predominantd in organism este cea redus6, care este protejati
contra oxidirii de cltre glutation, cistein[ 9i acid adenilic.

Rol biochimic Ai fiziologic


Datoritl propriet5filor menfionate, vitamina C asigurd o desfdgurare
optimi a proceselor de oxidoreducere celulard, fiind un puternic agent
reducitor care neutralizeazL radicalii liberi. Are un efect protector asupra
eritrocitelor, deoarece previne oxidarea hemoglobinei.
24

R
I

Biochimie -Lucrdri practice medicind, vol.

II

Vitamina C asigurd structura gi funcliile fibroblagtilor, osteoblagtilor


gi odontoblagtilor (celule ce sintetizeazi colagen).

Are rol de caenzimd pentru acliunea unor oxidoreductaze gi


in sinteza colagenului (PRO, LYS) gi

hidrolaze caf,e intervin

t
.

catecolaminelor.
Cregte apdrarea organismului la infec{ii microbiene qi virale, precum
gi fa{6 de noxe: Pb, Hg, benzen.

Necesarul zilnic
Necesarul zilnic de vitamin[ C este de 60 - 80 mg.
Necesarul cregte la persoane care depun efort fizic intens sau igi
desftgoari activitatea in frig.
Sursele de vitamin[ C sunt legumele gi fructele proaspete.
De re{inut este faptul ci vitamina C este solubili gi ugor oxidabild; ea
se pierde (inactiveazd) in timpul prepardrii alimentelor.

i
)
I
I
I
:
i
I

Carenfa in vitnmina C
Carenla de vitamin[ C conduce la dezvoltarea unei maladii specifice
denumitii scorbut.
Afecliunea se caracterizeazd prin perturbarea sintezei de colagen qi
ruperea pere{ilor capilarelor, modificdri ale tesutului conjunctiv gi ale
structurii fibrelor de colagen, alterEri in procesul de formare a oaselor gi
dinflor, fr6narea cregterii, sclderea rezistenfei la infecfii.

Sindromul hemoragic se remarci prin apan\ia de petegii pe


tegumente gi mucoass, gingivoragii, epistaxis, revdrsate sanguine
intraarticulare gi intramusculare. Papilele interdentare gi gingiile sunt
tumefiate, singereaz[ cu uqurinfi, se ulcereazd qi se infecteazd", ajung6nd la
denudarea rddlcinii din{ilor (dinfii devin mobili 9i cad).
Cicatizarea pl[gilor se face defectuos (trama de fibr[ conjunctivl e
rar6 gi foarte pu{in rezistentii).

m.1.1. Reacfia de identfficare a vitaminei C


caazotat de argint

Prineipiul metodei
Vitarnina C, datorit5 proprietifii de a se oxida uqor, reduce
de argint la Ag metalic care se depune, formdnd oglindade argrnt.
25

sirurile

Etl

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.Il

Materiale necesare
eprubete

stativ pentru eprubete


pipete de sticld
bec Bunsen
frepied
sitd de azbest
vase cu solu{ie dezinfectantd
apd distilatii
tifon

reactivi

Reactivi
Solulie apoasd de vitamina C
Solufie de AgNOr 5g%
Solufie de amoniac 20o/o

Tehnica de lucru
intr-o eprubetilmare se pipeteazh;
1 ml AgNOg 5%
0,5 ml solu{ie NH3
2 ml soMe vitamina C
Confinutul eprubetei se amestecb qi se fierbe timp de 5 - l0 minute.
se observa cum se depune argintul pe perefii eprubetei, formand
oglinda de argint.

Itr.1.2 Dozarea vilaminei C prin metoda iodometrici


Principiul metodei
Vitamina C este oxidatfl cu iod la acid dehidroascorbic in mediul
acid. Ca indicator se foloseqte solufia de amidon' care se coloreaz6 ?n
albastru tn momentul tn care toatii vitamrna C a fost oxidat6. Iodul necesar
reacliei de oxidare a vitaminei C rezultd in^urma reactiei dintre iodatul de
potasiu gi iodura de potasiu in mediul acid. in paralet se efectueaz6 o prob6
martor care nu con{ine vitamina C.

26

Biochimie-Lucrdripracticemedicind,vol.ll

. _

KlO3 + 5KI + 6HCl ---, 3h + 6KC1+ 3H2O


acid L-ascorbic + 12 ---+ acid L-dehidroascorbic

Materiale necesare
flacoane Erlenmeyer 50 ml
pipete de sticli
biuretii
vase cu solu{ie dezinfectanti

api distilatii
tifon
reactivi

Reactivi
Solulie HCL2g%
Solu{ie KIlg%
Solufie KIO3 0,004 N
Solufie amidon l%

Tehnica de lucru

Infr-un flacon Erlenmeyer de 50 de ml

se

pipeteazl:

2mlH:Cl2g%
3 mlap[distilati
0,5 ml solulie iodurd de potasiu
2 ml solu{ie amidon 1%

l%

Continutul flaconului se titreaz6 imediat cu o solufie de iodat de


potasiu 0,004 N p6nn h aparifia unei coloratii albastre.
Se noteaz[ V- num[rul de milithi de KlOr 0,004 N folositi la
titrarea probei marfior.

il
h
lr
te

,a

tntr-un flacon Erlenmeyer de 50 de ml se pipeteazi:


I mlprob6destudiat

I mlHCI2g%

3 ml apidistilati
0,5 ml solulie ioduri de potasiu 1%
2 ml solutie amidon

1%

27

.:

qe

Conlinutul flaconului se titreazd imediat cu o soMe de iodat de


potasiu 0,004 N pdnd la aparilia unei colora{ii albastre.
Se noteazb V* num[rul de mililitri de KIO: 0,004 N folosili la
titrarea probei de analizat.

Calcul
Concentra{ia vitaminei C se exprimd in
Se cunosc:

Vp
de analizat

v- :

m{/o.

numlrul de milititri de KIOr 0,004 N folosili la titrarea probei


num6ru1 de

mililitri de KIor 0,004 N folosili la titrarea probei

martor
Se calculeazd:

- V. :

V numdrul de mililitri de KIol 0,004 N ce corespunde


concentraliei vitaminei C din I ml solu{ie.
V*

Masa molecular[ a vitaminei C este 176 g'


Echivalentul gram al vitaminei C este de 88 g.
Se calculeazd titrul solutiei de iodat de potasiu 0,004
vitamina C:

T no:l vitamina c: N ruo3 x Eg vitamina c /

N in raport cu

1000

T ruori vitaminac: 0,004 x 88 / 1000 : 0,000352 g vitamind C / ml KIOI

T ruoy vitaminac= 0,352 mg vitamin[ C/ ml KIO3


mg

vitaminilC o : V 1qlo: x T ruo:l vitaminac x 100

IIlI.z Dozar et vitamin ei PP (83)


vitamina 83 se mai numegte niacina

satr

factor de prevenire a

pelagrei.
Apar$ine complexului vitaminic B 9i provine din piridind'

Din punct de vedere chimic, existS 2 forme (in alimente): acidul


piridin-3-carboxilic (acid nicotinic - vitamina P) 9i amida sa denumitl
nicotinamida

- vitamina PP (forma activd).


28

.\

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.

II

Nicotinamida
)l
)l

re

in organism aproape toati cantitatea se gesege sub forma amidei.


vit Bzti Barl
60 mg

triptofan

mg vitaminb PP

Rol biochimic gi fiziologic


in lesuturile animale aproape intreaga cantitate de acid nicotic se
glsegte sub forma amidei sale - nicotinamida, care intre ?n strucfura'a doui
nucleotide (enzimele niacinice) cu rol in respira{ia celular[:
r NAD+ - nicotinarridadenindinucleotid gi
r NADP* - nicotinamidadenindinucleotidfosfat.
Prin nucleul lor piridinic, NAD* pi NADP* sunt capabile de a
participa la reacfii de oxidoreducere celulard prin transfer de hidrogen.
Prescurtat reactiile se scriu:
+

NAD* (NADP

2Il

.e+ NADH (NADPH) + If


- 2I{

NAD* gi NADP* constituie sisteme coenzimatice (cofermen{i) ale


unor importante enzime de oxidoreducere din organism cu rol in
metabolismul glucidic, protidic Ai lipidic, precum gi in metabolismul

il
r5

alcoolului etilic. Prin unirea lor cu apoenzimele specifice, catalizeazdrcacgri


de transfer a hidrogenului de pe un strat donor pe unul acceptor. Cea mai
importanti funcfie biologic[ a coenzimelor nicotinamidice const[ in
participarea lor la hansferul electronilor pi hidrogenului de la substratele
caf,e se oxideazi la oxigen in procesul de respiratie celulari.
Rolul deosebit al vitaminei PP in metabolism se traduce gi prin
participarea coenzimelor nicotinamidice la structwa unor importante
enzime:

o alcooldehidrogenaze;
29

ts

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.Il


o
o
o
o
o

aldehiddehidrogenaze;
glutamatdehidrogenaze;
fosfogliceroaldehiddehidrogenaze;
lactatdehidrogenazi;
malatdehidrogenaz[.

Necesarul zilnic
Necesarul zilnic de vitamin[ PP este de 50 mg.
Sursele de vitamin[ PP sunt reprezentate de carne qi preparate din
carne, lapte, brfutz\ ou[, cantitate mai micl in legume, fructe, legume
uscate gi cereale.

Carenfa in vitamina PP
Ansamblul stdrilor patologice determinate

de deficitul de

nicotinamidl constituie boala denumitdpelagrd gi este datorath profundelor


deregldri ale metabolismului proteinelor, lipidelor gi glucidelor. Afec{iunea
este o policaren{i care aparc inr-un reglm monoton cu m[m61igd 9i s[rac ln
alimente de origine animal[. Pelagra poart[ denumirea gi de boala celor 3 D:
dermatitL diaree, dementE.
Debutul este nespecific cu apatie, astenie, diaree. Primlvara apare un
eritem pe tegumentele descoperite, care apoi se reduce, iar tegumentele
rimdn pigmentate (,,piele de crocodil*). Sunt afectate gi mucoasele care
imbracl aspecte caracteristice: mucozxa linguald ,,limba in hartd
geografici"; mucoasa gastricd - gastritE cu anaciditate; mucoasa intestinald

enterocolitd cu diaree.

Pelagra se manifesti prin simptome cL: iritabilitate, anxietate,


inapeten{6, deregl[ri digestive, dermatologice qi nervoase, tn formele severe
apdrdnd delir, agitafie, halucina,tii.

Dozaretvitaminei PP prin metoda volumetrici


Principiul metodei
Vitamina PP in mediu slab alcalin precipiti cu sulfatul de cupru, care
se adaugi in exces. Excesul de sulfat de cupru in mediu acid se titreazd
iodometric, in paralel cu o prob[ in alb, in prezenfa soluliei de amidon.

30
L
l'

g_

Biochimie -Lucrdripracticemedicind,vol.
2CuSOq +
12

2Kl

-*

+ 2Na2SO3

II

Iz + KzSO+ + Cu2SO4

-+

Na2S2O6+ 2NaI

Materiale necesare
ml

baloane cotate 100

.n
re

flacoane iodometrice
pipete de sticlE
hdrtie de filtru
biuret5
vase cu solufie dezinfectantl

distilati
tifon
apd

le

reactivi

)r
ia

h
):

n
le
:e
1i,"

tE

Reactivi
Solu{ie vitamind PP
Solufie fenolftaleind" l% in etanol
Solufie NaOH 0,1 N
Solu{ie CUSO+ l%
Solufie HCI 10%
KI cristalizati pa
Solufie de tiosulfat de sodiu ( NazSzO:) 0,1 N
Solufie arnidon 1%

Tehnica de lucru
:e

Proba de analizat

lntr-un balon cotat de 100 ml se mdsoar5 25 ml de solu{ie vitaminl


PP qi se aduce la pH : 8,2 cu NaOH 0,lN in prezenla a doui picdturi de
fenolftaleind ca indicator.
Se adaugi 10 ml de CUSO+ 1% gi se completeazh cu ap6 distilati
pflnd la semn.

:e
.d

Se agitii gi se las6 in repaus timp de 30 de minute dupd care se


filtreazl int-un flacon iodometric.
Se adaugi 10 ml de HCI 10% qi 2 gdeKI.
Se agitit qi se 1as6ln repaus la intuneric timp de 10 minute, dupi care
se titreazl PAni h decolorare cu Na2S2O3 0,1N tn prezenla soluliei de
..
amidon (l ml) ca

indicator:

3r

i
Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.Il

ET

Se noteazd Vn numlrul de mililitri de NazSzO3 0,1N folosili la


titrarea probei de analizat.
Proba martor
In paralel se efectueazd o probb martor tnlocuind proba de analizat
cu 25 ml de apd distilati gi se aduce la pH 8,2 cu NaOH 0,1N ?n prezentp
a dou6 pic6turi de fenolftalein6 ca indicator.

Se adaug[ 10 ml de CuSO+ 1% Si se completeazd ct apd distilatE


pind la semn.
Se agiti gi se lasl in repaus timp de 30 de minute dupd care se
frLneazl, intr-un fl ac on iodometric.
Se adaugi 10 ml de HCl I0% qi 2 g de KI.
Se agitd gi se las[ in repaus la tntuneric timp de 10 minute, dupd care
se titreazd p6n[ la decolorare cu NazSzO3 0,1N in prezentp solufiei de
amidon (1 ml) ca indicator.
Se noteaz[ V- numErul de mililitri de NazSzO: 0,1N folositi la
titrarea probei martor.

Calcul
Se cunosc:

Vn:
de malizat

V-

num[rul de mililitri de NazSzO3 0,1 N folosifi la tifrarea probei


numdrul de mililitri de NazSzOr 0,1 N folosili la titrarea probei

martor
Se calculeazL:

V- -

Vp

numirul de mililitri de

NazSzO3

0,1N folosili pentru

dozarcavitaminei PP.

Titrul NazSzOt 0,1N in raport cu vitamina PP este 0,02462


vitaminl PP/ml

NazSzOg 0,1N.

vitaminl PP Vo: (V. - VJ x 0,02462 x 4

32

't

JI

Biochimie *Lucrdripractice medicind, vol.

II

fi

1a

III.3 Identificarea vitaminei

B6

zat

qa

Vitamina 86 se mai numegte piridoxina. Din punct de vedere al

structurii chimice, piridoxina reprezintd 2-metil, 3-hidroxi,

LtA

re
de

4,5dihidroximetil pirind.
Pe lAng6 piridoxin[, mai posedi activitate vitaminic6 inc[ doi
deriva{i ai 3-hidroxipirinei caxe au in pozilia 4 a inelului piridinic o grupare
aldehidicfl sau aminic[ gi care se numescpiridoxal, respectivpiridoxamind.
Tofi aceqti trei compugi poarti denumirea comun[ de vitamina 86.

Rol biochimic Ai liziologic


in alimente vitamina 86 se g6seqte cel mai mult sub forrnd de
piridoxin[.
tn organism aceasta se esterific6 cu acidul fosforic, rezult6nd
piridoxalfosfat care reprezinti cofsrmentul multor enzime.

)el
)el

nr

Cf,o

Piridoxina

Vitamina 86

iro rol in

metabolismul aminoacizilor; intrdnd in

structura unei serii de enzime (transaminaze gi decarboxilaze) catalizeazd


importante reaclii de fansformare a aminoacizilor sub form6 coenzimaticd
de piridoxalfosfat. Piridoxalfosfatul constituie componenta enzimelor ce
participl la decarboxilarea gi dezaminarea aminoacizilor.
Vitamina B6 are rol in metabolismul glicogenului, prin funcfia
catalitic6 a piridoxalfosfatului asupra fosforilazei (enzimL ce joaci un rol
central in metabolismul glicogenului).
33

t
t

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol-Il


Se presupgne participarea acestei enzime gi

in metabolismul lipidelor

(metabolismul acidului linoleic in acid arahidonic)'

Necesarul zilnic
Necesarul zilnic de vitamin[ 86 este de 1,5 -2m9
Sursele de vitamini. Be sunt reprezentate de alimente de origine
animala (ficat, rinichi), drojdia de bere, idltite, germeni gr6u, soia" alune,
nuci, pepene galben.

Carenfa de vitaminl Bc
Dezvoltarea hipovitaminozei Bo este legatii atdt de aportul sdu
insuficient in hranl, rat gi d" o dereglare a biosintezei piridoxalfosfatului tn
organism.

Deficienla in vitamina 86 apare la adu$ii rratafr, cu HIN (efect


antivitaminic B6) qi esteinsofit5 de aparilia de:
dermatite, stomatite, conjunctivite;
sparime, convulsii;
anemie;

anomalii ale metabolismului triptofanului'


Deficienla poate s[ apar6 qi la copiii alimenta{i cu lapte praf 9i se
manifestd prin:
convulsii;
modificdri EEG;
anemie prin scdderea sintezei hemului;
inthrziet ea cre gteri i.

Reactia de identilicare a vitaminei Bo


cu reactivul FoHn - Ciocilteu

Principiul metodei
Din cei fiei compuqi care au in comun aucleul piridinic (piridoxalul,
piridoxina, piridoxamina), doar piridoxina in prezenla carbonatului de sodiu

ii

reactivului Folin

- Ciocilteu

Materiale necesare
eprubete

stativ Pentru ePrubete


pipete de sticlE

dezvolta o coloralie albasfrl.

Biochimie -Lucrdri practice medicind, vol.

II

6,7

vase cu solulie dezinfectantii

ap[ distilatE
tifon
reactivi
ne

['

lu
in

Reactivi
Solufie vitamina Be
Reactiv fenolic Folin - Cioctlteu (tungstat qi molibdat de sodiu)
Solufie NazCOr 20g%
Tehnica de lucru
intr-o eprubetlmare se mlsoar6:
1 ml soMe vitaminl Bo
I ml reactiv fenolic Folin - Ciocdlteu
2 ml solu{ieNuCOt20Yo
Dup6 agitare apare imediat o coloralie albastrfl.

Interpretarea rezultatului
0,08 mg substan{[ pur6 vitamin6 Bo.
dozarea vitaminei Bo se rcalizeazd plirn metode

Reac{ia este sensibiI6la0,02


se

ln

hborator,

enzimatice qi cromatografice.

I.II.A ldentifi carea vitaminei

Vitamina A se mai numegte retinol (exterofiol). Vitaminele A sunt


derivafi ai carotenilor. Carote,nii reprezintil provitamine A. in alimente se
g[segte vitamina A = retinol / provitamina A = caroteni.
in alimente retinolii (numai in produsele animale) se prezint5 sub
doui fonne structurale denumite retinol (vitamina Ar) il dehidroretinol
(vitaminaAe).
trI,

liu

Vitamina A
35

Biochimie - Luerdri practice medicind, uol'Il

6
Sinteza vitaminelor

are loc

in intestin

sau ficat, sub acfiunea unei

enzime numitS carcteruazd.

de exemplu ?n ficat, vitaminele A


tn psuturile organismului,
-form6

se

esterificat[ cu divergi acizi (acetic, palmitic,


intalnesc frecvent sub
succinic). Esterii au o activitate biologici mai puternica decit vitaminele
libere.
in pigmentul retinian se g6segte o heteroproteind numitd rodopsind
(in celulele Ju bastonage) care reprezintii purpurul retinian (include opsina
o protein[ gi retinina- aldehida vitaminei A)'

Rol biochimic 9i fiziologic


Retinolii indeptinesc funclii biochimice qi fiziologice multiple:
o stimuleaz[ procesul de creqtere;
o previn apanlia unor leziuni ale lesutului epitelial ( keratinizarea
derm gi mucoase);
o previn scdderea rezisten{ei la infec}ii;
. previn tulburirile in formarea scheletului gi int6rzierea creqterii.
O mare importanll are participarea vitaminei A la procesele de
oxido-reducere, deoarece ea este capabil[ de a forma peroxizi caf,e
accelereazL oxi darea altor compuqi.
Retinolii intervin in funcfionarea normal[ a ochiului respectiv tn
biochimia procesului virual. Rodopsina se descompune la lumina 9i se
reface la intuneric asigUrdnd vederea ?n tumind crepusculara.

Necesarul zilnic
Necesarul zilnic de vitamin6 A:

adult: 4 - 5000UI
coPii: 2500 - 4500 UI

gravide: 6000 - 8000 UI


Sursele de vitamina A (retinolii) sunt reprezentate de ficat,

peqte

gras,lapte gi semiprepatate, gElbenuq de ou, unt'


provitaminete e lcarotenii) care au un coeficient sc5'2t de utilizare
viqine.
se gasesc in morcovi, tomate, salatE, caise, piersici, bananeo
Caren{a vitaminei A
Carenfa in vitamind A aPare in:
regimul sSrac in caroten;
stiri de denutrilie;
insufi cien!6 Pancreatici;
insufi cienP hePatocelular[;
36

rA

,il

Biochimie *Lucrdri practice medicind, vol.

rei
se
ic,
:le
nd
r-

II

obstrucfie biliar6.
Lipsa sau insuficienfa vitaminelor A in alimenta{ie conduce la:
tulburdri oculare:
dereglflri ale adaptlrii la intuneric:
hemeralopie (orbire noctumi,,orbul g6inilor");
deregl[ri degenerative ale ochiului;
xeroftalmie;
keratomalacie;
hiperkeratoz[ cu tegumente gi mucoase ffiPft, ingroqate
(keratinizate), care prezint6 cruste gi fiswi:

tegumente

cu

aspect

de ,piele de gdint',

,,broasc6
rdioasd";
mucoase afectate: bucal6, gingivald, conjunctivalL, aparat
respirator, cdi urogenitale;

ea

infectii;
malformatii fetale la gravide.
de

re
in
se

Hipervitaminoza A
Hipervitaminoza A (hipercarotenemia) apare in:
regimul bogat tn caroten;
hiperlipemie provocati de:
hipotiroidie;
diabet;
atercmatsz.d.

ite
re

Hipervitaminoza A este toxic[ pentru:


SNC (ataxie, anorexie, hipertensiune infracranianE);
ficat (hepatomegalie, fibrozd);
epitelii;
dezvoltaxea embrionului.
In intoxicalia acu6 ou vitamina A apar:
ameleli;

cefalee;
somnolenfS.

in intoxicalia

cronici cu vitamina A apar:


pierderi in greutate;
tegume,nte uscate, galbene;
leziuni osoase.

37

g
*

Biochimie - Lucrdri practice medieind, vol.Il

Reacfia de idenfficare a vitaminei A cu acid tricloracetic

Principiul metodei
Vitaminele A dau cu acidul tricloracetic
portocalie cue vireaz[ in albastru.

colorafie galben-

Materiale necesare
eprubete

stativ penftu eprubete


pipete de sticll
vase cu solutie dezinfectantl
apl distilat6

tifon
reactivi

Reactivi
Solufie uleioasd de vitamin6 A0,l mgYo
Solufie cloroformic[ cu acid tricloracetic 30Yo

Tehnica de lucru
intr-o eprubetii se m6soard 0,5 ml solulie uleioasd de vitamini A qi I
ml so$e acid tricloracetic 30yo care se prelige pe perelii eprubetei. Apare o
colora{ie galben la limita de separare a celor dou[ lichide care vheazd in
albastru.

Interp retarea rezultatelor


in mod norrral concentrafia in vitamin[ A este de 70

300 prgl100

ml ser.

tn tutUurAri de absorbfe carotenemia este mai micl de 70 - 300

pgl100 ml ser.
Hipocarotenemii se inregistreazi c6nd conceirtrafia
este mai micl de 35 pgl100m1plasmd (60 UD.

38

in vitamind A

Lil

Biochimie -Lucrfuipractice medicind, vol.

CAPITOLUL
9n-

il
eo

in

00
00

II

&l

ENZIME
Enzimele sunt biocatalizatoi sau fermenfi de natur[ organicd
sintetizate de microorganisme gi organisme vegetale sau animale.
Prin nafura lor chimici sunt proteine, prezente ln toate celulele
fesuturilor gi organelor.
Enzimele condilioneazd desfd.gurarea, coordonarea gi autoreglarea
rea{iilor specifice materiei vii, prin caxe se rcalizeaz,ilprocesele metabolice
ale creqterii, reproducerii qi ale tuturor activitiifilor celulare.
Caracterele generale ale enzimelor sunt urm[toarele:
o aclioneazd in cantitiili exfrem de mici, ceea ce atestii faptul ci au
activitate catalitici mare (nansformi cantitilfi foarte mari de substrat);
o nu se consuml;
o nu modific[ echilibrul de reaclie ci doar viteza de reac{ie;
r au actiune reversibill;
r au specificitate de reaclie gi de substrat.
Enzimele ac[toneazd, atdt in interiorul organismului, cdt gi in exhase,
in afara organismului, ceea ce permite dorarea lor in laborator. Acfiunea
enzimelor asupra tuturor activitifilor celulare face posibil ca o reactieo
incompatibiH din punct de vedere termic cu viafa (necesiti temperaturi
foarte inalte), s[ aibtr totugi loc, la o temperaturb mult mai mic[.
h funcfie de reacfia c,atalitic6 a enzimei gi de substratul asupra c[ruia
acfioneazL, enzimele se clasifici
$ase grupuri: oxidoreductaze,
transferaze, hidrolaze, izomeraze, liaze S i ligaze.
Activitatea enzimatici este influenlath de mai mulli factori, printre
qlre:

in

.
r

temperatufa;
pH_ul;

electrolitii;

o concentrafia substratului;
r concentatia enzimei;
o substantele activatoare sau inhibitoare din mediu.
39

F--I

Biochimie - Lucrdri practice medieind, vol-Il

Eil

Dozarea enzimelor se bazeazd pe determinarea activitifii lor, adic6


pe capacitatea lor de a cataliza o reaclie dat6 gi se realizeaz[ in dou6 moduri:
o mdsurarea metabolizlrii substratului ln unitate de timp;
o mdsurarea concenffaliei substratului inainte qi dup[ ac{iunea
enzimei.
Activitatea enzimatici se exprim[ ?a unitdli enzimatice raportate la 1
ml (U/mQ.
O unitate de activitate enzimatic6 rqrezrnth cantitatea de enzimd
pmol de substrat intr-un minut gi in condilii stabilite
care modific[
(standard).
Pentru a putea interpreta corect semnificafia diagnosticd a enzimelor
plasmatice trebuie avut in vedere locul lor de sintez[ qi mecanismul lor de
secr4ie.
Dozarea gi interpretarea activitifii enzimelor serice sau plasmatice
constituie o metodologie curenti in medicind cu o deosebitii valoare gi
semnifica{ie clinicd.
Determinarea activitdlii enzimatice permite un diagnostic pozitiv gi
diferenlial corect, aprecierea evoluliei unor boli, aprecierea eficacit5lii unor
terapii aplicate, identificarea unor defecte genetice, etc.
Evaluarea cantitativ6 a unor erzime din serul sanguin prezint[ o
importanld deosebiti tn cazul afec{iunilor hepatice, pancreatice, prostatice,
cardiace, in anemii, leucoze, fumori, traumatisme musculare, etc., aducdnd
informalii despre organul sau lesutul lezat gi tn acelagi timp despre
importanla gi intinderea leziunii.
Pentru determinErile enzimatice se folsegte ?n special serul sanguin
deoarece anticoagulatii inhib[ acliunea multor enzime.

fV.l Influenfa temperaturii

asupra activitiifii enzimatice

Ac{iunea temperaturii asupra reac}iilor enzimatise este dubl[:

modifici viteza reacliei enzimatice sau denatureazd enzima,

respectiV
apoettzima care este de natur6 proteici. Temperatura optimd este de +37"C,
deoarece la aceast[, temperaturi distrugerea enzimei este practic nul6, iar
viteza reacfiei este suficient de mare. Mdrind temperatura peste aceastii

valoare, se lnregistreazd o diminuare progresiv[ a vttezei de reaclie pdni la


anularea sa. Acest fapt se explicd prin denaturarea termicl a enzimei qi se
produce la o anumitd temperaturd, proprie fiecirei enzime care se nume$te
temperatur[ de inactivare.
40

,n

)I.II

licI

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.

II

Enzimele sunt termolabile, adic6 lncillzrte peste

anumitd

uri:

temperatur[ igi pierd ireversibil activitatea.

nea

Principiul metodei
Amilaza salivar6 este activtr la +37"C, dax prin fierbere
rnactiveaz.6, gi nu mai are acliune hidrolitic[ asupra amidonului.

lal
mi

Materiale necesare

lite

eprubete

:tor
de

ice

r$i

se

stativ pentru eprubete


pipete de sticlI
termostat
baie de apd
vase cu solutie dezinfectanti
ap6 distilat5

tifon

/$i

reactivi

flor

lo
C9,

ind
pre

Reactivi
Solulie amidon lYo inNaCl 0,3%
Reactiv Fehling I:

CUSO+
HzSO+

api
uin

distilatii

35 g
5

1000

ml
ml

Reactiv Fehling II:


NaOH
tartrat dublu de sodiu gi

30%

ap[ distilati ad
in momentul utiliz5rii
Fehling tr.

potasiu

se amestec6

p[r!i

300

ml

150 g

1000 ml
egale de reactiv Fehling

qi

116:

Proba

tiv

Saliv6 diluatii cu apd distilatli (pentru micgorarea v6scozitiifii salivei)

iar

Tehnica de lucru
ln aoua epnrbete se pipeteazS

,C,

stii
Ia
se

lt

cdte 4

ml de solutie de amidon lo/ofn

NaCl0,3%,
intr-o eprubetii se adaug6 I ml de saliv[ proaspdtiio nefiartEo iar in
doua eprubetl I ml de salivd diluati fiarth.
41

Biochimie - Lucrdripractice medicind,

wl.II

Se agitii eprubetele gi se introduc in termostat La +37"C timp de 15


minute.
Se adaugi in fiecare eprubetS cdte
pe baie de apd timp de 5 minute.

I ml de reactiv Fehling gi se fierb

Interpretarea rezultatelor
In eprubeta cu salivl nefiarti, enzima activd descompune amidonul
la rnaltoz5,, caf,e reduce reactivul Fehling la oxid cupros de culome rogu
ctrrilmiziu.

saliv[ ftart5,,in care amllaza din salivi a fost distrusi


prin fieraere, amidonul nefiind hidrolizat la maltoz.A" aceasta nu reduce
in

eprubeta cu

reactivul Fehling, iar confinutul din eprubetd rimdne albastru.

IV.2 Influen{a pll-lui asupra activitifii enzimatice


Yiteza reacliilor enzimatice este influenlatilin mare m6sur[ de pH-

ul mediului in care ac,tioneazd enzima, fapt explicat de natura proteicd

enzimelor.

Modificirile de activitate a enzimelor sub influenfa pH-ului mediului


sunt datorate modificbrii stabilitnfii gi a gradului de ionizare ale enzimelor,
substraturilor corespunzitoare sau complexelor enzim[ - substrat.
Sensibilitatea fath de pH a enzimelor se manifest6 in legitur6 cu
viteza de producere a reacfiei pe care o catalizeazl gi in 1egf,tur6 cu
stabilitatea 1or.
Reacfia are o vitezd maximd pentru o anumit6 valoare a pH-ului
denumit pH optim, iar abaterile de ta aceastd valoare produc o scidere
brusc5 avitezei de reacfie.
Stabilitatea enzimelor este afectati de aciditatea sau alcahnitatea
mediutui, o enzim6 fiind stabilE numai intre anumite limite de pH in cadrul
cirora se poate vorbi de un pH optim de stabilitate

Principiul metodei
Amilaza salivar[ are activitate maxim6 la un pH specific, care se
poate prlre in evidenfi prin hidroliza amidonului intr-o gan6' de pH-uri
reahzate de sisteme tampon.

42

UI

Biochimie -Lucrdri practice rnedicind, vol.

15

II

tr

Materiale necesare
eprubete

erb

stativ pentru eprubete


pipete de sticld
termostat
baie de api
vase cu solulie dezinfectant[

nul
)$u

distilatii
tifon
ap6

usi

reactivi

Ice

Reactivi
Solufii tanrpon fosfat cu pH-uri: 5,8;6,2; 6,6;7,0;7,7;8,0
Solutie amidon l% ?nNaCl 0,3%
Solu,tie Lugol (iod in iodur6 de potasiu)
Proba

rH-

Salivn diluati cu ap4 distilatii (pentru micgorarea vfiscozit5fii salivei)

ila

rlui
lor,
cu
cu
rlui
ere
tea
trut

Tehnica de lucru

in 6 eprubete se prpeteazl c6te I ml de solufie


I

37'C in termostat.
Dup[ rlcire se adaug[ tn fiecare eprubeti cdte o piclturi de solu{ie
Lugol.
Se agitn qi se unnlregte colorafia ap[rutd in fiecare eprubet5.

Interpretarea rezultatelor
pH-ul optim al activitilii asrilazei salivare se gdsegte in eprubeta
coloratil in galben rogcat, deoarece in aceasta hidroliza amidonului a avut
loc pdn6 la maLtozd gi maltodextrine.

se
.uri

tampon cu pH-uri

fieclrei eprubete.
Se adaug[ in fiecare eprubetii cite I ml solu{ie de amidon 1% gi cdte
ml de salivi diluaili gi se mentin timp de 30 de minute la temperatura de

cuprinse tntre 5,8 qi 8; se noteazdpH-ul

Eprubetele colorate in albastru indic6 prezenla amidonului


nehidrolizat, iar cele colorate in violet gi brun dovedesc o hidroliz[ parfiaH
pdndla stadiul de dextrine.

43

i
E{

fV.3 Determinarea activittrtii transaminazelor serice


Termenul de transaminaze desemneazd subclasa de enzime care
aparfine clasei transferazelor gi care catalizeazd transferul grupdrii amino
formarea unui alt
ef.mt de pe un aminoacid pe un o-cetoacid, cugrupffea
-NHt
aminoacid corespunzltor o-cetoacidului care a acceptat
pentru
plasmfi
motiv
in
manifestd
se
nu
Acliunea transaminazelor
care sunt denumite enzime plasmatice nefunclionale.
Transaminazele ar cea mai mare importanp clinicd sunt:

Y Alaninaminotransferaza (ALAD sau transaminaza glutamicpiruvicd. (rcn se gdsegte localizatd predominant in frcat, 90% in
citoplasma, 10% in mitocondrii; in cantitifi mici 9i in muqchii scheletici,
miocard, rinichi qi pancreas.
ALAT are rol in diagnosticul hepatitelor.
TGP catalizeazdreaclia de transfer a grup[rii amino de la L-alaninl
la acidul o-cetoglutaric, rezultdnd acid L-glutamic qi acid piruvic.

CH.-CH-COOH +
I

HOOC

-CHz-CHz-C-COOH
ll
o

NH2
L-alanind
+-r

e>

ac. a-cetoglutaric

CHr-C-COOH + HOOC -CHz-CHz-CH-COOH


ll

NHz
ac. L-glutamic

ac.piruvic

Y Aspartataminotransferaza (ASAT) sau transaminaza glutamicoxalaceticd (fcq are o largd rispdndire in organism, fiind prezentl in
concentrafii mari in miocard, ficat qi in coo."ntra{ii mai reduse in muqchiul
scheletic, rinichi, creier, pancreas.
ASAT are doufl izoenzvne, una cationicl (80% intramitocondrial) gi
una anionic[ (citosol), qi migreazl electroforetic cu hei componen{i: A, B 9i
C.
TGO catalizeazdreactia de transfer a grupIrii amino de la acidul Laspartic la acidul cr-cetoglutaric, rezultind acid L-glutamic ai acid
oxalacetic.

44

IJI

Biochimie -Lucrdri practice medicind, vol.

II

HOOC-CHz-CH-COOH + HOOC-CH2- CHr-C-COOH


o

NH2

are

ino

ac. a-cetoglutaric

ac- L-aspartic

e+HOOC-CHr-C-COOH +

alt

HOOC

il

m
ici,

u1a

in
riul

)$i
Iqi
Lcid

CHz- CHr-

CH

COOH +

NH,
ac. glutamic

IV.3.1 Determinarea activitifii transamin azelor serice


ALAT qi ASAT prin metoda spectrofotometric[

Principiul metodei
in reaclia catalizathde ASAT

se folose$te ca substrat acidul aspartic,


din care rezaltL acid oxalacetic. Acesta se decarboxlleazi" spontan, kecdnd
in acid piruvic. Acidul piruvic renilth qi din reac[ia catalizath de ALAT,
avind ca substrat alanina.
Acidul piruvic rezvltat din aceste reacfii reac[ioneazd cu 2,4 dinitrofenilhidrazina (DI.[PH) in mediu alcalin, formfind
dinihofenilhidrazona corespunzitoare, de culoare roqu-cdrdmiziu, care se
determind fotometric.

tT*
nc-

o
ac. oxalacetic

nc-

++

il

no'L

000r{

t\- H0^
.o'n.e-Hn{Q}no ,ffii.*-r'rx@Ho.
f

Gi{-

l'{

. ?,1 dinitrolenil.hidrrzona
^t
btrr
acidului pirwic

dinitrsfeqilihidrarino

Intensitatea colorafiei produse este direct proportionalS cu activitatea


enzimei.
Activitatea transaminazelor se calculeazi in functie de concentratia
acidului piruvic fonnat intr-un minut.

45

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.Il

Materiale necesare
eprubete

stativ pentru eprubete


pipete de sticli
termostat
spectrofotometru
cuve I cm
vase cu solutie dezinfectanti
ap[ distilatd

tifon
reactivi
Reactivi
Substrat ALAT. 1,5 g &FIPO+, 0,2A g KH2POa, 0,039 g acetoglutarat Na (sau 0,030 g acid a-cetoglutaric), 1,78 g alanin6 se dizolvl
in circa 80 ml de ap6. Se ajusteazd pH-ul solufiei la 7 ,4 cu NaOH 0,4 N apoi
se completeazd volumul la 100 ml cu ap6 bidistilat[.
Substrat ASAT. 1,5 g K2HPOa,0,20 g KH2POa, 0,039 g a-cetoglurat
Na (sau 0,030 g acid a-cetoglutaric),1,57 g aspartat de Na (sau 1,32 g acid
aspartic) se dizolv[ in aproximativ 80 ml de ap6. Se ajusteazd pH-ul solufiei
la 7,4 cu NaOH 0,4 N, apoi se completeazd volumul la 100 ml cu apl
bidistilat6.
Solufie 2,4-dinitrofenilhidrazin6 I mM. Se dizolvi 19,8 mg
dinitrofenilhidrazndin l0 ml de HCI (d: 1,19) 9i se completeazilla 100 ml
cu apd bidistilatd.
Solu{ie standard de piruvat de Na 2 mM. Se dizolvd 22 mg piruvat
de Na in 100 ml de ap6 (1 ml solufie conline 2 moli piruvat). Se adaugi 0,3
ml de cloroform pentru conservare.
Solu{ie NaOH 0,4 N
Proba
Ser nehemolizat (hematiile confin
transaminaze decdt serul sanguin).

de lA

20 ori mai

multe

Tehnica de lucru
At6t pentru determinarea ALAT, cdt gi pentru deterrninarea ASAT se
pregdtesc cdte trei eprubete: o prob[ de analizat (P), o prob[ standard (S) li
o probd martor (M).
Se pipeteazd in eprubete reactMi conform tabelului VI:
46

Itr

)I.II

Biochimie -Lucrdri practice medicind, vol.

II

Tabelul VI

ALAT

Enzime
Probe
Solu{ie substrat

ASAT

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

ALAT (ml)
Solu,tie substrat

ASAT (ml)
Se

Ser (ml)

SoMe

incubeaz[ 5 minute la37'C


0.1

0,1
0,1

0,1

Se incubeazi 30
de minute La37oC

incubeaz[ 60
de minute la37"C

standard

de oiruvat (ml)

ia-

olvI
apoi

Solu{ie 2,4-

0,5

0,5

0,5

Se

0,5

0,5

0,5

dinitro.urat

acid
u{iei

fenilhidrazinE

(ml)
Repaus 20 de minute la temperatura

camerei

apdt

mg

)ml

oYa]
0,3
r

SolulieNaOH
N

0.4

Dupi 5 minute de repaus la temperatura camerei se citeqte extincfia


probelor de analiz,at (t+) qi extincfia probelor standard (Es), fafe de martor,
la lungimea de und[ de 520 nm, in cuve de

cm.

Calcul
Se calculeaz[ concentralia piruvatului rezultat6 din reacfie pentru
fiecare enzimdin pmoli/minut/1, care se noteazd cu x.
rulte
Pentru

Tse

l)

gi

ALAT:
x

:En/E.x

2 x 1/30 x 103: Ep/ E.

x 66,7

Pentm ASAT:

En/E.x 2 x 1/ 60x 103= Ep/ Esx


47

3313

Bfo"l'f*i"

A
intema,tionale

fuud'iP'*ti""*"di 't
se determind 9i ?n unit6{i

(UI)'

pentru transformarea
tabelele de coreclie se gasesc formulele
in IJI'
concenfraliei din pmoliiminut/l, la 25oC

in

Tabelul YllTabel de coreclie

Tabelul

r]I

UI

9.5

4
6

2.5

10
13

4
4,5

14

26
28
30
32
34
36
38

16

l6

l8

40
42

20
22
23
24

7,5

18

46
48
50

19

VII

8,5
9

10
11

t2
r9

t4
l5
t7

20

2l

AMT

x t]I x
52
54

56
58
60
62
64
66
68
70
72
74
76

22
23
24
25
26
27
29
30

3l
33

34
35

36

UI

37
78
38
80
39
82
40
84
42
86
88
46
90
48
92
50
94
52
96
54
98
56
100
toz 60

Tqbel de corec{ie ASAT

x t]I x

UI

l1
l3

24
26
28
30
32
34

4
6

t4
t6

18

15

10

t7
t9

t2

20
22
23

20

UI
2l
23

25
27
29
31

UI

36
38
40
42
44
46

33
35
37

48
50

74

52
54

55

39

5l
60

4l
44

uL so va repeti
Dac[ activitatea et.o,imaticd depdqegte_ ^60.
,^rurt[, 10 minute pentru ALAT q
determinarea cu o poi*oa de incubas.
se inmu$esc cu 3.
20 deminute p."* eSni. Rezuttatetb oblinute

48

'ol.II

II

Biochimie -Lucrdri practice medicini, vol.

dt{i
IV.3.2 I)eterminarea activitnfii ALAT (TGP)
prin metoda enzimatictr

tarea

Principiul metodei
Substraturile participante in reaclia catalizatd de ALAT (TGP) sunt:
Lalanina gi a-cetoglutaratul (a-oxoglutaratul).
Piruvatul rezultat din reacfie, in prezentp lactat dehidrogenazei
fl-DfD, va reac{iona cu NADH+Ff ducind la formarea NAD* gi L-lactat.
Variafia absorban{ei mdsuratii la lungimea de undi de 340 nm este
direct proporfionalE eu activitatea ALAT (TGP).

L-alanina

TGP

alfa-cetoglutarat

++ piruvat+ L-glutamat

AIAT
LDH

piruvat +

NADH+It'

L-Iastat

Materiale necesare
eprubete

stativ pentru eprubete


pipete de sticld
termostat
spectrofotometru
cuve I cm
vase cu solutie dezinfectantd
ap6 distilatii
tifon

reactivi

Reactivi
speta

\T

qi

Reactiv Rl:
Tampon TRIS

(pH:7,5) 110 mmoVl


L-alanina
550 mmol/l

Reactiv R2:

NADH+H0,2 mmol/l
LDH
12AOUN
alfa-cetoglutarat 16 mmol/l
49

NAD+

s
Proba
Ser nehemolizat

Plasm[oblinutSdins6ngerecoltatpeEDTA/heparinl
Tehnica de lucru

*;A;b""

se pipeteazr 1

ml de

amestec de reactivi

Rl qi R2

(1:1) 9i 100 pl de Probi de anabzat'

Seagit6conlinutuleprubeteigiseincubeazAtimpdelminutla

370C.

- 365

de 340 nm (334
Se mdsoard varialia absorbanfei la lungimea deundS
nm) fa{[ de ap[ diitihti, in cuve de 1 cm, timp de tei minute'
Se calculeazd variatia absorbanlei pe minut

(AAlmin)'

Calcul

CpUA: (AA/min) x

1750 1':340 nm

CeUA: (AA/min) x

1780 )':

334 nm

CpU/I = (AA/min)

l2l0 l':

365 nm

"

unde:

concentralia Probei
AA/min : variatia absorban{ei pe minut

Cn

Observa{ii
de 340 nm
Dac6 variafia absorbanlei pe minut la lungimea de und6
(33anm)depdgegte0,17saula-lungimeadeundSde365nmdepaqegte
fiziologicl de Nacl
0,095, se va repeta determinarea cu ser diluat cu soMe
10'
in ptopo+e de t : t O iar rezultatul obfinut se va inmufi cu

Valori normale

adul1i:2:16,54
copii Pf,nA ta 5 ani: 0,2

13

UI

Vari4ii Pntologice
Cregteri importante ale ALAT aparin:
hePatita vira16 acut[;

,ol.II

Biochimie -Luerdri practice medicind, vol.

--

II

a,

hepatopatia toxicd cu necroz6;


Creqteri medii:

hepatite cronice;
ctroze;
icter mecanic;

iR2

ficatde stazlacnti,;
mononucleoza infec{ioasd.

ut la

(334

Cregterea aminotransferazelor in afecfiunile hepatice:

r cre$terea ALAT este mai importantl decdt creqterea ASAT in


kpatitele infec,tioase datontil tezdrti membranelor celulare;
r cre$terea ASAT este mai importanti dec6t cregterea ALAT in
hepatopatiile infiltrative datoriti Lezilii membranelor celulare qi
mitocondriale.

IV.33 Determinarea activitnfii ASAT (TGO)


prin metoda enzimatici
Principiul metodei

nm
se$e
t{aCl
)

Substraturile participante tn reac{ia catalizath de ASAT (IGO) sunt


L-aspartatul gi a-cetoglutaratul (a-oxoglutaratul).
Oxalacetatul rezultat din reacfie, in prezenfa malat-dehidrogenazei
(MDI{), va reac{iona cu NADH+H- duc6nd la formarea NAD- gi L-malat.
Variatia absorban{ei misurat6 la lungimea de und6 de 340 nm este
direct proporlionalE cu activitatea ASAT (TGO)
TGo

L-aspartat* a-cetoglutarat

oxalacetat

L-glutamat

ASAT

MDH

oxalacetat

+ NADH+If

Materiale necesare
eprubete

stativ pentru eprubete


pipete de sticli
termostat
spectrofotometru
51

->

L-malat + NAD*

Bio"ht*i" - Luuffi P'octi""

*dfuffi'*M

:::

cuve I cm
vase cu solutie dezinfectantb
api distilatE

tifon
reactivi

Reactivi
Reactiv Rl:
TamPon TRIS

(PH=7,8)

L-asPartat

88 mmoVl
260 mmoVl

Reactiv R2:

0,2 mmolA
NADH+If
600 U/T
MDH
9OO U/I
LDH
alfa-cetoglutarat 12 mmoVl

Proba
Ser nehemolizat

Plasmaobfinutiidins6ngerecoltatpeEDTAlheparina
Tehnica de lucru

i-tr-" .p*U.tA

se pipeteazd 1

ml de amestec de reactivi Rl qi R2

(1:l) qi 100 pldeProbd deanalizat.


Seagit6continutuleprubeteigiseincubeazStimpdelminutla
37"C.

nm (334
se m6soar6 varialia absorbanlei la lungimea de und6 de 340
_365 nm) fa!6 de ap[ distihta, tn cuve de 1 cm, timp de trei minute.
Se calcuteazb vaiatiaabsorbanfei pe minut (AA/min)'

Calcul

l':
CnU/l = (AA/min) x 1790 l':

CpUA

(AA/min) x

CeUn: (AA/min\ "

1750

334 nm

3Zl0 I = 365 nm

unde:
Cn

340 nm

concentrafia Probei

AA/min = vaiat;raabsorbanfei pe minut


52

1tr

,UI

Biochimie -Lucrdri practice medicind, vol.

II

Observafii

und[ de 340 nm
(334 nm) deplgeqte 0,17 sau la lungimea de undE de 365 nm depbqegte
0,095, se va repeta determinarea cu sef diluat cu solulie fiziologici de NaCl
in proporlie de 1:10, iar rezultatul ob,tinut se va itrmulli cu 10.
DacE variafia absorbanfei pe minut la lungimea de

Valori normale

adu{i:2-20UI
copii 3 luni

- 1 an: pfn6la 28 UI

Variafii patologice

R2

tla
334

Cregteri de 10 100 de ori ale ASAT faf5 de valorile normale se


intilnesc in:
infarct miocardic (util[ in diagnosticul infarctului miocardic acut
alituri de CK-MB qi LDH);
hepatita virali acutS;
hepatopatii toxice;
Cregteri moderate:
hepatite cronice;
ictere colestatice (cregte de 5 - 10 ori fa{e de valorile normale);
afecliuni distrofice musculare;
dup6 traumatisme, interven{ii chirurgicale;
anemii hemolitice severe;
viroze cu tropism hepatic (mononucleoza infecfioasi).
in afectiunile musculare cregterile ASAT (TGO) sunt mai mari decdt
de ALAT (TGP).

IV.4 Determinarea activitifii y glutamiltransferazei (GGT)


Gamaglutamiltransferaza (GGT) este o enzimb cu rol in
metabolismul proteinelor qi care intervine in reabsorbfia proximal[ tubulari
a aminoacizilor din frltratul glomerular.
Enzima catalizeazl transferul gruperii y-glutamil de pe un peptid pe
un alt peptid sau pe un asrinoacid:

y-glutamil-peptid A + peptid B

---+

53

peptid A + y-glutamil-peptid B

Biochimie - Lucrdri practice medicind,

wf4

Aceasti glicoproteini este rcptezentatd in procent de 18%


zaharuri neutre, 8%zaharvrtaminate 9i l0% acid sialic'

de

GGT are o rSspdndire tisular[ largil:


. majoritatea se g[septe in rinichi, tubii contorfi proximali, ansa
Henle qi zona medularI;
o cantitlli apreciabile se gdsesc in pancreas, hepatocit, canaliculele
biliare;
o cantitali reduse se gdsesc in intestin, spfine, miocard gi plim6niElectroforetic, GGT-migeazd cu 3 izoenzime: o1, a2 qi p-globuline,
ultima avdnd activitate slab[.

I)eterminarea activiti,tii 1 glutamiltransferazei (GGT)


prin metoda enzimatici

Principiul metodei
in *edi, alcalin, y glutamiltransferaza catalizeazd scindarea L-1glutamit-p-nitoanilidei gi transferul grupdrii L-1-glutamil pe glicilglicini
p,rott in libertate a nitroanilidei de culoare galben5. Cregterea valorii
":o
" mdsrnat[ la lungimea de undd de 405 nm este direct
absorbanlei
proporfional[ cu activitatea GGT.

Materiale necesare
eprubete

stativ pentru ePrubete


pipete de sticld
termostat
spectrofotometru
cuve I cm
vase cu solutie dezinfectantd
apd distilatd

tifon
reactM
Reactivi
Reactiv Rl
TamPon TRIS,

PH:8,1
54

100 mmoVl

OI.II

Biochimie -Lucrdri practice medicind, vol.

'de

II

Reactiv R2

Glicilglicind

100

L-y-glutamil-p-nitroanilid6

mmol/t

4 mmoUl

ansa

Se dizolvfl con{inutul unui flacon de reactiv R2


rlele

in

cantitatea

Rl.

corespunzdtoare de reactiv

Proba
Ser nehemolizat

line,

Tehnica de lucru
intr-o eprubeti se pipeteazS 1 ml de amestec de reactivi Rl gi R2 $
100 pl de probl de analizat.
Se agitii conlinutul eprubetei gi se incubeaz[ timp de I minut la
37"C.

L1:in[,
lorii

Se misoard varia[ta absorbanfei la lungimea de undd de 405


nm fat6 de ap6 distilatd, in cuve de I cm, timp de trei minute.
Se calculeaz6 variafia absorbanfei pe minut (AA/min).

410

Calcul

irect

" t tgO l:405


CpUn : (&Vmin) x 1339 l.:410
CeUn

(AA/min)

nm

nm

unde:
Cn concentra{ia probei
AA/min = varia,tia absorban{ei pe minut

Observafii
Daci variafia absortan{ei pe minut depiqegte 232 UlL, proba se va
dilua cu solulie de NaCl in proporfie de l:10, se va repeta determinarea gi
ruzultatul se va ?nmulli cu 10.

Valori normale

femei:

7 -32Un
bdrbafi: ll - 50 Un

))

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.Il

Variafii patologice
Valori crescute ale GGT apar tn:
hepatopatia drog indusd (inclusiv etanolicd ?n care apar
cregterile cele mai importante);
ciroza biliard primitivi (cregteri semnificative);
sindroame obstructive (cregte de 10 - 30 de ori fa{a de normal);
hepatite cronice;
neoplasm hepatic;
steatozd hepaticd;
stazd hepaticd in insuficien{a cardiacd congestivE;
afecfiuni pancreatice;
hipertrigliceridemie (creqteri u$oare de 1,5 -2 oi care sugereazi
o stimulare a proteosintezei hepatice).
Determinarea GGT este un test screening al consumului de alcool.
GGT este primul parametru care cregte qi ultimul care scade ln cazul
consumului de alcool (chiar dacd transaminazele sau alte teste hepatice sunt
normale)

IV.5 Determinarea activititii fosfatazei alcaline

Fosfataza alcalinl este o o globulini reprezentati de doul grupe


mari de enzime ce catalizeazd hidroliza esterilor fosforici la pH alcalin gi
particip[ la transportul fosforului.
Se g6segte in sistemul osos in osteoblagti (nu gi tn osteoclagti),
mucoasa intestinall (intervine in absorb,tia glucidelor), corticala renalE,
glanda mamarf, (tacta!ie), frcat, placent6, leucocite, dar localizarea
preferen{ia16 este cea hepaticd.
Fosfataza alcalini sericd este reprezentatil de izoenzime de origine
hepatici, osoasi, intestinalE iar la gravide gi de izoeru:ima placentari.

56

-'

)ol.II

Biochimie -Lucrdri practice medicind, vol.

II

tr

Determinarea FAL prin metoda spectrofotometrici


apar

al);

Principiul metodei
Enzima in mediu baz,lc wtalueazd hidroliza monofosfafilor. In urma
reacfiei renfltil p-nifiofenol gi fosfat anorganic. Ionii de Mg* cresc
rctivitatea enzimei.
Activitatea enzimaticl este direct proporlionali cu cantitatea de pnitrofenol eliberat6, respectiv cu intensitatea coloraliei obfinute.

:eazd
cool.
:azttl.
sunt

fupe
in $
ryti),
nald"
'area
igure

fosfat de p-nitofenil + H2O

fosfataza alcalind

p - nitrofenol + fosfat
-r--:t;;-----+
Mg--

Materiale necesare
eprubete

stativ pentru eprubete


pipete de sticld
tennostat
spectrofotometru
cuve I cm
vase cu solulie dezinfectanti
apd distilatii
tifon

reactivi

Reactivi
Reactiv Rl:
1 moUl
Tampon dietilamin6, pH 0,6 mmoVl
Clorur6 de
Reactiv R2:
Fosfat de p-nitrofenil (solu{ie) 10 mmoVl

9,8
magneziu

Proba
Ser nehemolizat

Plasm5

hepainizatf

Tehnica de lucru
Se amesteci reactivul R2
R I (substrat tamponat).

in

cantitatea coresprmzdtoare de tampon

57

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vol.Il

Se pipeteazi intr-o eprubeti 1 ml de amestec de reactivi Rl gi R2 qi


20 pl de probd de analizat.
Se agiti conlinutul eprubetei qi se incubeazd'xmp de I minut la37"C

(25,30'C).
Se mlsoard vana[ia absorbanlei la lungimea de undi de 405
nm fatl de api distilati, tn cuve de 1 cm, timp de trei minute.
Se calculeazb varialia absorban{ei pe minut (AA/min).

- 410

Calcul
Cp Un

: (AA/min) x 3000

1,: 405 nm

unde:

concentralia probei
AA/min vana[ia absorbanf ei pe minut
Co

Observafii
DacI varia{ia absorbanlei pe minut depaqegte 0,25, proba se va dilua
cu solutie de NaCl in proporfie de 1:10, se va repeta determinarea qi
rezultatul se va inmulli cu 10.

Valori normale

femei
blrbafi
copii in perioada

55
70

crepterii

- 170 I'IVI
- l75UVl

< 700 UVl

Variafii fiziologice
Mirirea nivelului seric al

izoerrz;imei de origine osoasii are

loc in

perioadele de creqtere (p0n6 h 15 l7 ani), copiii gi mai ales adolescenlii


prezent6nd valori duble sau chiar triple fald de adul{i (datorit5 formdrii gi
remanierii fesutului osos in cadrul procesului de cregtere al osului in
lungrme).

Variafii patotogice
FAL este unica enzimil care se determin[ uzual pentru diagnosticul
afecfiunilor osoase.
Valori crescute:
rahitism:

:x

voJ.II
R2

gi

37"C
-

410

Biochimie -Lucrdri practice nedicind., vol.

II

ff

hiperparatiroidism;
boala Paget;
tumori osteogene insofite de reacfie osteoblasticd;
metastaze osoase;
osteoporoza (modific6ri nesemnificative);

perioada de vindecare a fracturilor;


boala oaselor de marmur6;
osteomielosclerozi;
colestazd de orice cavzd (FAL crescuti denotE staza biliari):
icter obstructiv;
hepatitii toxic6;
metastaze hepatice neoplazice;
ckozd bitiard;
tratament cu epileptice, clorpromazind, estrogeni;
insuficienli renal6;
cancer renal.

dilua
gi

ea

Valori scizute:
hipofosfatazie congenital6 (rahitismul rezistent la tratamentul
cu vitamina D);
hipotiroidie;
intoxicafii cu plumb;
deficit sever de vitamina C.

IV.6 Determinalga activititii amilazei

rc in

:en{ii
rii gi
ri tn
sticul

Amilazele sunt a-1,4 glicozidaze, enzime care cataLizezi reacfiile de


hidroliz[ a leg[turilor glicozidice din amidono gtcogen gi poliglucidele
derivate ale acestora, conducdnd la produgi cu greutate molecularfl mai mici
(dextrine, maltozl gi cantitEli mici de glucozl).
in cavitatea bucal6 sunt hansfonnate enzimatic exclusiv glucidele,
prin prezen{a a-alrlrilazei salivare (ptialina) ce hidrolizeazi amidonul gi
glicogenul.
Pancreasul secret6 o fl-amilazLmai puternicd decdt cea salivari care
digerd gi amidonul crud, pe care il hansformd in maltozl, maltotriozi gi
dextrine ca gi amilaza salivarS. in sucul pancreatic existd 6 izoenzime ale
amilazei care pot fi separate electroforetic sau cromatografic.
59

Biochimie - Lucrdri practice medicind, vt

Determinals4 s-4milazei prin metoda Wohlgemuth

Principiul metodei

Amilaza are proprietatea de a hidroliza amidonul p0nd la stadiu


dextrine, trec6nd prin fragmente polizaharidice cu greutEfi din ce in ce
mici, care pierd insugirea de a se colora cu iodul.
Se apreciazd cantitatea minim[ de ser (urina, salivi diluat5 1,
necesarl hidrolizei a 2 ml de sotufie de amidon O,lyo ln 30 de minut
37"C, din care se efectueaz6 dilulii succesive. Se stabilegte dilulia ser
care mai confine suficienti enzimd ce hidrolizeazi amidonul ?n condi
date pdnn h dextrine.

Materiale necesare
eprubete

stativ pentru eprubete


pipete de sticld
termostat
vase cu solufie dez;nfectantil

distilatil
tifon
reactivi
apd

Reactivi
SolufieNaCl 0,9%
Solufie iod 0,1 N
Solu{ie amidon 0,1olo

Proba
Ser (win5, salivi)

Tehnica de lucru
Se pregdtesc 10 eprubete curate qi se pipeteazdin prima eprube
ml de ser, iar in urmdtoarele 9 eprubete cdte I ml de solufie NaCl.
Din prima eprubetd se ia I ml, se trece in a doua eprubet6 gi se ag
Se procedeazd astfeL pind la ultima eprubet[, din care se ia ml gi
aruncd, realizdndu-se astfel o serie de dilulii succsive (l/2, l/4,
r/16....11srz).
Se adaugi in toate eprubetele cdte2 ml de solulie de amidon, se a
gi se introduc la tennostat la37"C timp de 30 de minute. Apoi, in eprube

60

"e

vol.Il

Biochimie -Lucrdri practice medicind, vol.

II

ricite sub jet de ap6, se adaugl in fiecare cdte 3 picbturi de solufie de iod
0,1N.

' Eprubetele

iul de
c mai
l/10)
ute la
erului

difiile

se agit5 gi se observd culoarea format6.

Tebelul IX
Nr.
eorubeti
Ditutia
serului
Activitatea
amilazicli
(uW)

UI

t/2

r/4

t/8

16

l0

t/16

1t32

U@

Ur28

t/252

I/512

32

64

t28

256

512

t024

Culoarea din eprubeti reflectd gradul de hidrolizi al amidonului,


*fel incdt:
r eprubetele colorate in albastru confin amidon nehidrolizat;
o qrrubetele colorate in violet conlin amilodextrine;
o eprubetele colorate brun-ropcat au hidrolizd incompletl
t eritrodextrine);
r eprubetele colorate slab gilbui confin amidon hidrolizat
{flavodextrine).
r eprubetele incolore conlia amidon complet hidrolizat (acrodextrine
maltodextrine)
fl

Activitatea amilazei determinate astfel se exprimd

in

unitdli

trohlgemuth UW).
I UW reprezintil cantitatea minim[ de enziml capabild sd degradeze
n mg de amidon ?n timp de 30 minute la37"C.
I UD (unitate diastazicd) reprezintii cantitatea de enzim6 capabil[ s[
hidrolizeze 0,2 nl amidon lyao in condiliile descrise.

sethz

uw:2oUD

unde:

'?o
til:

: num[rul uttimei eprubete in care nu apare culoarea albastrl (in

care amidonul a fost hidrolizat).

agrti
rctele

6l

I
I

q
Calcul
Se calcule azd carfirtatea de amidon (mg) hidrolizath de amilaza
ril/ohlgemuth
conlinutd intr-un ml de ser. Rezultatul exprimat in unitiifi
(UW) se ob,tine inmulsnd gradul diluliei ultimei eprubete in care nu apare
culoarea albastr[ cu 2.

IJW:Voxc/100xdx103
unde:
V6 = volumul de solu{ie de amidon;
concentrafia soluliei de amidon;
d diua ultimei eprubete in care nu apare culoarea albastra.
E'x. Presupunand c6 in'eprubeta a cincea apare culoarea albastrd,

c:
:

inseamntr c[ amidonul a fost hidrolizat pdnd in eprubeta a pafra c[reia ii


corespunde dilulia 1116 falhde serul inifial.
Dacil 1116 ml ser hidtolueazi o solufie de 2 ml amidon 0,1%
(confindnd 2 mg amidon) pentru I ml de ser va corespunde o cantitate de
amidon:

(l

x 2) : 1116:2

xl6 :

32

UW

Observafii
Aceasti metodi este semicantitativL, orientativd.
Reaclii fals pozitive dau codeina, morfrua, indometacinul.

Valori normale
ser:

16

32

UW

urind:8-64UW
Varia{ii patologice
Valori crescute ale amilazei in ser:
F creqteri marcante (de 5 - 10 ori fa{5 de normal):
pancreatite acute (prin leziuni ale acinilor pancreatici);
insuficienli renalfl (anilaza are eliminare renal6);

creqteri moderate:

pancreatite cronice acuttzate;


carcinom de caP de Pancreas;
62

ts

,ol.II

Biochimie -Lucrdri practice medicind, vol.

lLaza
muth
lpare
)

II

obstruc{ii intestinale;
contuzii abdominale cu lezarea pancreasului;
ulcer perforat;
colici biliare;
afecliuni ale glandelor salivare:
parotiditd;
calcul salivar;
hipertiroidism;
cregteri pasagere:

administrare morfinE;
intoxicafii acute cu alcool.

rstrd"
:ia

ii

Existii o afecfiune cu caracter familial (defect genetic) numiti


reroamilazemie in care apar molecule anormal de mari ale enzimei ce nu
Pc fi excretate de rinichi.
Valori crescute ale amllazei in urind:

),l\o
te de

ulcer Perforat;
colici biliare.

Valo{

scdzute ale amilazei in ser:


clroze;
carcinom hepatic;
hepatite;
alcoolism.

fV.7 Determinarea activititii catalazei


Catalaz-a este o enzimd din clasa oxidoreductazelo\ care catalizeazL
nJescompunerea apei oxigenate cu eliberare de oxigen molecular, protejdnd

rstfel celula de acliunea nocivd a peroxidului de hidrogen format in timpul


metabolismului sau datoriti radiatiilor ionizante.
catalaza

HzOz+HzOz

2H2O + Oz

gdsegte aproape exclusiv in eritrocite,


rtivitatea ei crescdnd sau sc6zind in-_|
raport cu varialiilecorespunz6toare ale
Catalaza sanguinl

se

63

g
numlrului de eritrocite. Din acest motiv se efectueazL gi numirarea
eritrocitelor o data cu recoltarea sangelui pentru detenninareacatalazei-

Dozarea activiti{ii catalazei serice

Principiul metodei
Determinarea activitalii catalazei se face printr-o metodi indirecti:
unei
cataLaza dintr-un microlitru de sdnge e pus6 s[ acfioneze asupra
(in exces) de ap6 oxigenata la temperatura camerei, un anumit timp'
cantitali-Excesul
de api oxigenatE rdmas6 nefiansformat6 se titreazd tn mediu
acid cu permanganat de Potasiu.
Activitatea enzimei se determina prin cantitatea de ap4 oxigenat[
descompusdde catalaz6in 30 de minute lal7"C'

2KMnOa+ SHzOz+ 3HzSO+-+ KzSOa+ 2MnSO++ 5Oz + 8H2O


Materiale necesare
eprubete

stativ pentru ePrubete


pipete de sticld
termostat
vase cu solutie dezinfectantii
apl distilat5

tifon
reactivi

Reactivi

Solufie ap6 oxigenatii l% (3,3 ml perhidrol se aduc la 100 ml cu apd)


Solulie acid sulfiri c 20Vo
Solu{ie perlnanganat de potasiu 0,1N

Alcool amilic
Proba
Sdnge

diluat 1/1000

64

13

/OI.II

:ecti:
unei
;imp.

rediu
onatd

Bkrchimie -Lucrdri practice medicind, vol.

F]
rt

II

Tehnica de lucru
Se recolteazd din pulpa degetului cu ajutorul unei micropipete
,i-l ml sdnge care se introduc int-un balon cotat de 100 ml care con{ine l0
:nl de ap[ distilatd.
Se amestecd pentru a produce hemoliza 9i se completeazd apoi cu
rya distilati p&r[ la sernn, ob{indnd astfel o dilulie a sdngelui de 111000.
in doue flacoane Erlenmeyer, martor qi probl se pipeteazl reactivii:
.;te 10 ml de ap[ distilati gi cdte 1 ml de ser diluat l/1000.
Martorul se fierbe timp de 3 - 5 minute pentru a distruge activitatea
-rels2si, apoi se r[cegte in jet de apI rece.
Se pipeteaz6 tn ambele flacoane cite 2 ml de ap[ oxigenat5, se agit6
p se introduc la termostat timp de 30 de minute la 17"C.
Se adauga apoi in cele dou6 flacoane cdte 5 ml de acid sulfuric 20Yo
p cdte 2 - 3 picIturi de alcool amilic.
Se titreazi cele doud flacoane, martor qi prob6, cu pefinanganat de
pousiu N/10 p6n[ la culoare rczpal stabil[.

Calcul
Se calculeazd titrul permanganatului de potasiu

in raport cu

apa

oxigenati:

xnaoo+r

gzoz:0,1 x

l7 11000:0,0017 dml:1,7 mglml

unde:

volumul de permanganat de potasiu 0,1 N folosit la titrarea


rantititii totale de ap6 oxigenat5 din martor in mililitri
Yn : volumul de permanganat de potasiu 0,1 N folosit la titrarea
cantit5lii totale de api oxigenatii din probd (cu enzima activd) in mililitri

V-

ap5)
a

(V- - Vn) x T xuoo+l szoz

unde:

a:

mg apb oxigenat5 descompusdde catalaza din 1 ml ser diluat

tntrucet activitatea enzimei se exprimi prin numlrul catalazic, care


reprezintb cantitatea in mg de apd oxigenat6 descompusd de catalaza dintrun microlitru ds singe, rezultatul oblinut este chiar num6rul catalazic.
Valori diagnostice are numai indicele catalazic.
65

s=1

IffikcrMMc : trr. ffi

g#inr&fGei

:,

r:

.,il

.i:alileib 6qs rb lni


":,.rri:i;1:,1 u !"tlittq r}:;s:fl$tS 3e
;: :' : i:l:iri:filo.*::;s;'nl 6g*qElslileiirEq*
i"i:ir !:.i'{'rri:ari;Il *n';*:l;lt Euob nI
. ii', r i':sYfiffit$SlFbrc r,
iir'..ii',; i,;r , , : -'i. !il, I ';l&.i !4 rnilfrih rlqr:rb irn {Jl el6e
,',';::l'i*t*ffii#s.Sn6hwifo:; i. :"i;-rlrRii si?'ifi -a t*tofi$di:' . ri
CmGef;
- '-':. i:::: *.b.B;"ai elp:>:ngr? i66;"i6SS&fSi
:: 'r -ir,ttiii ;irdntg'gf',Sfee*q?r1'e* 1.'.::7
i;il3t; r,. .,:ffip;G6,!$ rir.,: . i
-' r:r,t':;, *i,'*b'q:cl*,;s*a+t!r*}ti *;Sclf*l'#-iq
ecgexieq' r"''
,'.'r' , : :,:w&aes&ilntheFaties(&ffih,i,i; *l*r *! iccr *g**bs eZ
,r:ii:r* lwls *, i'rei*g.S i-"+..@,il

ir', i,3gfl!'outPriqrndb :. ,,
.aiCr;.]i : :b i*l::"1-i'' ,

I
:i
I

fr
t{
rKt

itr
m
m

:: , :

,.'",

'':'..'

Il

I.:r-*,': l:,r,*c!i.r}
'

ei Ea-4q Ul,l{ uienlti{i


-1: :

,,.

---i:

- lsrlsS

:rrj ; ij'i,!!i 6.rnslurls3 sa


:Stxrr,:Eirl
ri

il-::'.,p1;1.

i .

.i,

;!

il

{i =

liil

:,r:;rt.ii,:J, -

i:;i!,

t',i

:3t!S*

ii.,tIri: ,i

sl :l;,i,ir,j
;irr

:i

; i;'

ra

ii..' : ;iit

,
jrj,:iiiJ r,-,f 1;fi

r.
I!,

-t-iil3

tl',r\ :;.1r):t

Il
I.
I
IL.

i;ii: *ii.'.: '. 'r

iri"r; ::i:

:is,l+l

iil[litils:

t?

:?irnu
.-::
gtr,r'.:r::
r:i{$
,..t.j.:itiX;
:,...i1)
:-,it;i;-i.t!;:l;
f{:i.;
:":iit -.: l;

';iff] - r;:-i.if*tlrc: l!fi*::ii';i l!:-!ri :,1;i:r, .,',,il il:itr,': : .r $OhiJiiij:'i r*el;':tni


*r!*,i i;tir,iilj ;:1 ,..,i; i;t,itt.iir;'li-jt: i',;.i::!rf.t) *i1t'i ,;t;.*f$ fit ;r.;j;1i'!rr :,j ftfri,.;..1:qlf
.-;i ,.r|:.Jt;; {t:i;i,, ,.i T'i{It:.i:i1i:* ii:rt:iijt ii-i!t;li:;:i?i ,t*i,'.:;i, l;tiiJ*r:::t; ni
.1. ,,i;iJli :;f,,.iii:lta ii.:iiiir:, i.fl-; iiir! jc{}llp$it, : iC[gV

nl

'f

i.iJ U:t "r(i', :;Lt l; ::'. ,,,,, * :. jr ii.lftti!lCV -'-' *Y


iiliiilllt. f?i iiiilSrrl ' ii.' ; f::"- rr r', ij",-ii ,ri:' tlgttil iililitrtsl
i ,l) trii,. ,i..ril :'1., i:, r i',r r ;,
; -.:' ir;i:'11,-,Y =' OV

:.t;,'rii ,:..r,.,i..

s.

ld.irrl.J.:r

!.

':'J'!r

irl.t,

ffi