Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
BIOCHIMIE MEDICALĂ
PARTEA I
Oradea, 2016
REFERENȚI:
2
„Science is more than a body of knowledge. It’s a way of thinking,
a way of sceptically interrogating the universe‖.
Carl Sagan
3
CUPRINS
LUCRAREA 1 .......................................................................................................... 9
I. ORGANIZAREA ŞI PROTECŢIA MUNCII ÎN LABORATORUL DE
BIOCHIMIE (IOANA CODREANU)................................................................... 9
II. ECHIPAMENTE ŞI APARATURǍ DE LABORATOR. ............................ 12
OPERAŢII UZUALE ÎN LABORATOR. METODE DE SEPARARE
(LUMINIŢA FRITEA) ......................................................................................... 12
II.1. STICLĂRIA DE LABORATOR ............................................................. 12
II.2. APARATURA DE LABORATOR .......................................................... 14
II.3. OPERAŢII UZUALE ÎN LABORATOR. METODE DE SEPARARE
............................................................................................................................. 15
III. FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ REZULTATELE ANALIZELOR
(CAMELIA MRAZ) ............................................................................................. 19
III.1. VARIAŢII ANALITICE ....................................................................... 19
III.2. VARIAŢII BIOLOGICE ...................................................................... 20
IV. NOŢIUNI DE ANALIZĂ CHIMICĂ (LUMINIŢA FRITEA) .................. 26
IV.1. NOŢIUNEA DE ATOM-GRAM, MOLECULĂ-GRAM,
ECHIVALENT-GRAM, OSMOL ................................................................... 26
IV.2. SOLUŢII. MODUL DE EXPRIMARE A CONCENTRAŢIILOR .... 28
IV.2.1. Exprimarea fizică a concentraţiei unei soluţii ............................... 28
IV.2.2. Exprimarea chimică a concentraţiei unei soluţii ........................... 30
IV.2.3. Noţiunea de titru şi factor ................................................................ 31
IV.3. UNITĂŢI ŞI MODURI DE EXPRIMARE ÎN LABORATORUL
CLINIC .............................................................................................................. 32
LUCRAREA 2 ........................................................................................................ 33
V. MEDIUL INTERN. ANALIZA BIOCHIMICĂ A SÂNGELUI (CAMELIA
MRAZ) ................................................................................................................... 33
V.1. PROPRIETĂŢILE SÂNGELUI .............................................................. 33
V.2. FUNCŢIILE SÂNGELUI......................................................................... 34
V.3. COMPONENTELE SÂNGELUI ............................................................ 36
V.4. TEHNICA RECOLTǍRII SÂNGELUI PRIN SISTEMUL
VACUTAINER ................................................................................................. 39
LUCRAREA 3 ........................................................................................................ 43
VI. ECHILIBRUL ACIDO-BAZIC. PH ............................................................. 43
VOLUMETRIA ACIDO-BAZICǍ. ACIDOZA ŞI ALCALOZA (CAMELIA
MRAZ, LUMINIŢA FRITEA) ............................................................................ 43
VI.1. pH. SISTEME TAMPON. ECUAŢIA HENDERSON -
HASSELBALCH. MECANISME DE REGLARE A ECHILIBRULUI
ACIDO-BAZIC ................................................................................................. 43
VI.1.1. Concepţia de acid şi bază, respectiv de pH şi pOH ....................... 43
VI.1.2. Sisteme tampon ................................................................................. 46
VI.1.3. Mecanisme de reglare a echilibrului acido-bazic .......................... 49
4
VI.2. DETERMINAREA REZERVEI ALCALINE PRIN METODE
VOLUMETRICE .............................................................................................. 51
VI.2.1. Metode volumetrice .......................................................................... 51
VI.2.2. Determinarea rezervei alcaline prin metode volumetrice ............ 53
VI.3. TULBURĂRI ALE ECHILIBRULUI ACIDO-BAZIC....................... 55
VI.3.1. Acidoza metabolică ........................................................................... 56
VI.3.2. Alcaloza metabolică .......................................................................... 57
VI.3.3. Acidoza respiratorie ......................................................................... 58
VI.3.4. Alcaloza respiratorie ........................................................................ 59
VI.3.5. Tulburări acido-bazice mixte .......................................................... 61
VI.3.6. Explorarea echilibrului acido-bazic ................................................ 61
LUCRAREA 4 ........................................................................................................ 63
VII. ELECTROLIŢI. ANIONI. CATIONI. METODE DE DOZARE (IOANA
CODREANU) ........................................................................................................ 63
VII.1. APA ......................................................................................................... 63
VII.2. ELECTROLIŢII .................................................................................... 66
VII.2.1. Metode utilizate pentru determinarea electroliţilor .................... 67
VII.2.2. Dozarea sodiului şi a potasiului ..................................................... 68
VII.2.3. Dozarea calciului ............................................................................. 71
VII.2.4. Dozarea magneziului ...................................................................... 73
VII.2.5. Dozarea fierului seric ..................................................................... 75
VII.2.6. Dozarea clorului .............................................................................. 76
VII.2.7. Fosforul ............................................................................................ 79
LUCRAREA 5 ........................................................................................................ 82
VIII. AMINOACIZII. REACŢII DE IDENTIFICARE (LUMINIŢA FRITEA,
IOANA CODREANU) .......................................................................................... 82
VIII.1. REACŢII DE IDENTIFICARE A AMINOACIZILOR DATORATE
GRUPǍRII AMINO ......................................................................................... 83
VIII.1.1. Reacţia ninhidrinei ........................................................................ 83
VIII.2. REACŢII DE IDENTIFICARE A AMINOACIZILOR DATORATE
GRUPǍRII CARBOXIL .................................................................................. 84
VIII.2.1. Reacţia cu ionii de cupru (Cu2+) în mediu alcalin ...................... 84
VIII.3. REACŢII DE IDENTIFICARE A AMINOACIZILOR DATORATE
RADICALULUI R ............................................................................................ 85
VIII.3.1. Reacţia xantoproteică.................................................................... 85
VIII.3.2. Reacţia Millon ................................................................................ 85
VIII.3.3. Reacţia Adamkiewicz-Hopkins .................................................... 86
VIII.3.4. Reacţia Sakaguchi ......................................................................... 87
VIII.3.5. Reacţia Erlich-Pauli ...................................................................... 87
VIII.4. REACŢII SPECIFICE AMINOACIZILOR CU SULF ................... 88
VIII.5. DOZAREA AMINOACIZILOR PRIN METODA SŐRENSEN .... 90
LUCRAREA 6 ........................................................................................................ 93
IX. REACŢII DE IDENTIFICARE A PROTEINELOR. PUNCTUL
IZOELECTRIC (CAMELIA MRAZ, IOANA CODREANU) ......................... 93
5
IX.1. REACŢII DE IDENTIFICARE A PROTEINELOR .......................... 93
IX.1.1. Reacţia biuretului ............................................................................. 93
IX.1.2. Reacţia cu beta-naftochinona .......................................................... 95
IX.2. REACŢII DE PRECIPITARE A PROTEINELOR ............................ 95
IX.2.1. Reacţii de precipitare reversibile .................................................... 95
IX.2.2. Reacţii de precipitare ireversibile ................................................... 96
IX.3. DETERMINAREA PUNCTULUI IZOELECTRIC AL
PROTEINELOR ............................................................................................... 99
LUCRAREA 7 ...................................................................................................... 102
X. METODE OPTICE DE ANALIZĂ. DETERMINAREA PROTEINELOR
TOTALE DIN SER (LUMINIŢA FRITEA, CAMELIA MRAZ).................. 102
X.1. METODE SPECTROSCOPICE DE ANALIZĂ ................................. 102
X.1.1. Radiaţia electromagnetică şi spectrul de absorbţie ...................... 102
X.1.2. Legea absorbţiei radiaţiilor ............................................................. 104
X.1.3. Determinări calitative şi cantitative ............................................... 105
X.1.4. Princpiul de funcţionare a unui spectrofotometru ........................ 107
X.2. DETERMINAREA PROTEINELOR TOTALE DIN SER ................ 107
X.2.1. Dozarea proteinelor prin metoda Gornall ..................................... 108
LUCRAREA 8 ...................................................................................................... 112
XI. PROTEINOGRAMA. FRACŢIUNI ELECTROFORETICE
(ALEXANDRU JURCĂ) .................................................................................... 112
XI.1. ELECTROFOREZA ............................................................................. 112
XI.1.1. Electroforeza proteinelor serice .................................................... 113
XI.1.2. Electroforeza în gel de agaroză ..................................................... 113
LUCRAREA 9 ...................................................................................................... 120
XII. ANALIZA BIOCHIMICǍ A VITAMINELOR (LUMINIŢA FRITEA,
ALEXANDRU JURCĂ) ..................................................................................... 120
XII.1. REACŢII PENTRU CAROTENOIDE ŞI VITAMINA A ............... 120
XII.1.1. Identificarea carotenoidelor şi a vitaminei A cu SbCl3: reacţia
CARR-PRICE ............................................................................................. 120
XII.1.2. Identificarea vitaminei A cu acid tricloracetic ........................... 121
XII.1.3. Dozarea vitaminei A ..................................................................... 121
XII.2. REACŢII PENTRU PROVITAMINELE ŞI VITAMINELE D ..... 122
XII.2.1. Reacţia Liebermann-Burchard.................................................... 122
XII.2.2. Reacţia cu anilina şi HCl .............................................................. 122
XII.2.3. Reacţia CARR-PRICE ................................................................. 122
XII.2.4. Identificarea vitaminelor D cu aldehide aromatice ................... 123
XII.2.5. Diferenţierea între vitaminele D2 şi D3 ........................................ 123
XII.3. DOZAREA VITAMINEI PP .............................................................. 123
XII.4. REACŢII PENTRU IDENTIFICAREA ŞI DOZAREA VITAMINEI
C ........................................................................................................................ 124
XII.4.1. Identificarea vitaminei C cu azotat de argint ............................. 124
XII.4.2. Identificarea vitaminei C cu nitroprusiat de sodiu .................... 124
XII.4.3. Dozarea vitaminei C prin metoda iodometrică .......................... 124
6
XII.4.4. Dozarea vitaminei C din sânge şi urină prin metoda ROE şi
Kuether ........................................................................................................ 125
XII.5. REACŢII DE IDENTIFICARE ŞI DOZARE A VITAMINEI B1 .. 126
XII.5.1. Identificarea vitaminei B1 sub formă de tiocrom ....................... 126
XII.5.2. Dozarea vitaminei B1 prin diazotare ........................................... 127
LUCRAREA 10 .................................................................................................... 130
XIII. ANALIZA BIOCHIMICǍ A ENZIMELOR (IOANA CODREANU) . 130
XIII.1. MODALITĂŢI DE EXPRIMARE ŞI DE DETERMINARE A
ACTIVITĂŢII ENZIMATICE...................................................................... 131
XIII.2. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ENZIMATICE A
COLINESTERAZEI SERICE NESPECIFICE ........................................... 132
XIII.3. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII TRANSAMINAZELOR ....... 134
XIII.3.1. Determinarea activităţii GPT ..................................................... 135
XIII.3.2. Determinarea activităţii GOT .................................................... 136
XIII.4. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII γ-
GLUTAMILTRANSPEPTIDAZEI SERICE .............................................. 138
XIII.5. DETERMINAREA LACTAT DEHIDROGENAZEI (LDH) ........ 140
XIII.6. DETERMINAREA CREATINFOSFOKINAZEI (CK) ................. 141
LUCRAREA 11 .................................................................................................... 143
XIV. FOSFATAZA ALCALINǍ ŞI ACIDǍ (CAMELIA MRAZ)................ 143
XIV.1. DETERMINAREA EXPERIMENTALĂ A ACTIVITĂŢII
FOSFATAZEI ALCALINE ŞI ACIDE ........................................................ 143
XIV.2. DETERMINAREA FOSFATAZEI ALCALINE (FA) ................... 144
XIV.2.1. Fosfataza alcalină serică ............................................................. 146
XIV.3. FOSFATAZA ACIDĂ SERICĂ ........................................................ 148
LUCRAREA 12 .................................................................................................... 150
XV. ANALIZA BIOCHIMICĂ A GLUCIDELOR (LUMINIŢA FRITEA,
ALEXANDRU JURCĂ) ..................................................................................... 150
XV.1. REACŢIA PODOBEV- MOLISCH - UDRANSKY ......................... 152
XV.2. REACŢII DE DIFERENŢIERE A ALDOZELOR ŞI CETOZELOR
........................................................................................................................... 153
XV.2.1. Reacţia cu resorcină (Reacţia Selivanoff) ................................... 153
XV.3. REACŢII DE DIFERENŢIERE A PENTOZELOR DE HEXOZE 154
XV.3.1. Reacţia cu orcina (Reacţia Bial)................................................... 154
XV.3.2. Reacţia Bial modificată ................................................................. 154
XV.3.3. Reacţia Tollens pentru pentoze .................................................... 155
XV.3.4. Reacţia aldopentozelor cu benzidina ........................................... 155
XV.4. REACŢII DE CONDENSARE A MONOZAHARIDELOR ......... 156
CU FENILHIDRAZINA ............................................................................... 156
XV.5. ACŢIUNEA ALCALIILOR ASUPRA OZELOR ............................ 157
XV.6. REACŢII DE REDUCERE ................................................................. 158
XV.6.1. Reacţii de reducere a ionului Cu2+ ............................................... 158
XV.6.2. Reacţii de reducere a ionului Ag+ ................................................ 161
XV.6.3. Reacţii de reducere a ionului Bi3+ ................................................ 162
7
XV.6.4. Reducerea unor compuşi organici ............................................... 162
XV.7. DOZAREA GLUCIDELOR REDUCĂTOARE ............................... 164
Metoda Ionescu-Matiu.................................................................................... 164
LUCRAREA 13 .................................................................................................... 166
XVI. DOZAREA GLUCOZEI ŞI GLICEMIA (ALEXANDRU JURCĂ) .... 166
XVI.1. METODE REDUCǍTOARE ............................................................ 166
XVI.2. METODE ENZIMATICE ................................................................. 167
XVI.2.1. Metoda enzimatică cu glucozoxidază ......................................... 167
XVI.2.2. Metoda enzimatică cu glucozo-dehidrogenază ......................... 167
XVI.3. DOZAREA GLUCOZEI CU O-TOLUIDINĂ ................................ 168
XVI.4. GLICEMIA - CARACTERISTICI ................................................... 168
XVI.4.1. Valorile glicemiei ......................................................................... 169
XVI.4.2. Hemoglobina glicozilată sau glicată (HbA1c) ........................... 171
XVI.4.3. Glicozuria ..................................................................................... 171
XVI.4.4. Hiperglicemia provocată pe cale orală (testul de toleranţă la
glucoză = TTGO)......................................................................................... 172
ANEXA 1 ............................................................................................................. 175
ANEXA 2 ............................................................................................................. 177
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ......................................................................... 178
8
LUCRAREA 1
9
În cazul în care se aprinde o substanţă, la stingerea ei se va folosi apă numai
în cazul în care aceasta este miscibilă cu apa. În celelalte cazuri se vor folosi nisip,
stingătorul de incendii sau se va înăbuşi flacăra prin acoperire cu o pătură.
Disciplina şi cunoaşterea fiecărei operaţiuni de laborator care urmează a fi
executată de către studenţi, sub toate aspectele ei, pot evita accidentele.
10
Măsuri de prim ajutor
În caz de inhalare a unor vapori sau gaze toxice, pacientul trebuie scos din
mediul toxic la aer curat;
În caz de contact cu substanţe toxice la nivelul ochilor se practică spălarea
ochilor cu apă din abundenţă, ţinând ochii larg deschişi şi mişcându-i în toate
direcţiile;
Orice haină contaminată cu substanţe chimice va fi îndepărtată;
În caz de contaminare la nivelul pielii se va practica spălarea cu apă rece din
abundenţă, evitându-se folosirea substanţelor acide sau bazice care prin reacţii
exoterme pot agrava leziunile produse;
În caz de ingestie a substanţelor toxice se evită administrarea oricărei substanţe;
Important: toate persoanele care au suferit accidente trebuie transportate
la spital!
11
II. ECHIPAMENTE ŞI APARATURǍ DE LABORATOR.
OPERAŢII UZUALE ÎN LABORATOR. METODE DE SEPARARE
Figura 3. Biurete [5]; Figura 4. Biurete automate [6]; Figura 5. Biurete Schellbach
[7]
13
Figura 6. Pipete gradate [8]; Figura 7. Pipete cotate [9]; Figura 8. Pipete automate
[10]
Sensibilitatea unei balanţe reprezintă diferenţa cea mai mică de masă care
poate fi sesizată cu ajutorul balanţei respective.
În funcţie de sensibilitate, balanţele pot fi împărţite în:
- Balanţe tehnice (sensibilitate 10-2 g);
- Balanţe farmaceutice (sensibilitate 10-3 g);
- Balanţe analitice (sensibilitate 10-4 – 5·10-5 g);
- Balanţe semimicroanalitice (sensibilitate 10-5 g);
- Balanţe microanalitice (sensibilitate 10-6 g);
- Balanţe ultramicroanalitice (sensibilitate 10-7 g).
14
Figura 9. Balanţă mecanică [11] Figura 10. Balanţă electronică [12]
15
- presiunea (la gaze);
- agitarea;
- pH-ul;
- polimorfismul;
- adăugarea de substanţe intermediare pentru a facilita solubilizarea:
formarea de săruri solubile, hidrotropia, solubilizarea micelară, formarea de
complecşi de incluziune cu ciclodextrinele etc.
16
caracterizează comportamentul oricărei particule supuse ultracentrifugării. Pentru a
putea compara constantele de sedimentare între ele se utilizează noţiunea de
coeficient de sedimentare standard.
17
Electroforeza: proces ce se bazează pe proprietăţile particulelor ionizate de
a migra într-un mediu lichid (soluţia unui electrolit) sub influenţa unui câmp
electric. Migrarea particulelor în câmpul electric se realizează spre polul de semn
opus încărcării particulelor respective (particulele cu sarcină pozitivă migrează spre
catod – cataforeza; particulele cu sarcină negativă spre anod – anaforeza). Migrarea
electroforetică nu are loc la punctul izoelectric.
Tipurile de electroforeză în funcţie de materialul solid utilizat sunt:
electroforeza pe hârtie de filtru/cromatografică, pe acetat de celuloză, gel
electroforeza, electroforeza capilară.
18
III. FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ REZULTATELE
ANALIZELOR
Lucrările recente ale lui Statland şi Winkel au pus în evidenţă cele două
componente principale ale variabilei analitice:
- eroarea pre-instrumentală
- eroarea instrumentală
19
Variabila analitică instrumentală este eroarea analitică datorată metodelor
de dozare. Ea poate fi separată în variaţii analitice pe termen scurt (apreciată prin
repetabilitatea sau reproductibilitatea pe o zi) şi pe termen lung (apreciată prin
reproductibilitatea de la o zi la alta). Variaţiile analitice de la o zi la alta sunt în
general mai importante decât cele pe o zi. Când se efectuează studii pe termen
lung este de preferat ca eşantioanele să se congeleze şi să fie analizate
simultan în aceeaşi serie şi în aceeaşi zi.
Variaţiile analitice trebuie menţinute constante şi la un nivel scăzut
pentru a mări certitudinea în momentul evaluării unui rezultat individual în
intervalul de referinţă.
20
• factori metabolici: acţionează pe substratele care suferă variaţii rapide
şi sunt supuse reglării hormonale şi nervoase.
Ţinând cont de faptul că procesul de reglare intervine net asupra variaţiilor
fiziologice, putem distinge 3 categorii de constituenţi:
- constituenţi foarte bine reglaţi (electroliţii, albuminele), cei care nu
variază decât foarte puţin;
- constituenţi cu variaţii importante (de exemplu produşii finali ai
catabolismului, ca ureea, uraţii sau enzimele eliberate din ţesuturi);
- constituenţi implicaţi parţial în mecanisme de sinteză (glucoza,
colesterolul) care suferă variaţii medii.
Este important, aşadar, să se cunoască şi mecanismele biochimice şi
fiziologice care stau la baza variaţiilor biologice, ca, de exemplu, mecanismul
de acţiune al enzimelor, timpul de înjumătăţire a diverselor substanţe etc.
Deoarece aceşti factori sunt greu de clasificat, în continuare vom descrie
factorii mai importanţi care pot influenţa rezultatele analizelor.
Vârsta
Variaţiile în funcţie de vârstă sunt bine cunoscute. În primul rând trebuie
să menţionăm concentraţiile hormonilor care suferă variaţii datorită creşterii, de
la nou născut la copil şi la adult. Se cunoaşte, de asemenea, variaţia
colesterolului şi a ureei. În ultimul timp s-a constatat că şi activitatea
fosfatazei alcaline variază în funcţie de vârstă.
Sexul
Numeroşi constituenţi plasmatici au concentraţii diferite în funcţie de
sex, enumerăm doar câţiva: hemoglobina, hematocritul, fierul, cuprul,
trigliceridele, etc. La femei amilaza, transferina au concentraţii mai crescute, pe
când la bărbat activitatea fosfatazelor alcaline, a CPK, a transaminazelor, a ureei
şi a uratului sunt mai crescute.
Rasa
Acest capitol a suscitat mult interes, dar este din ce în ce mai greu de
cercetat datorită amestecului populaţiilor. S-a constatat că la rasa neagră
concentraţia plasmatică în trigliceride, potasiu şi sodiu este mai crescută decât la
albi, iar concentraţia în acid uric este mult mai crescută la anumite populaţii din
Oceania.
21
implicaţi în ciclu, apar numeroase variaţii ale aldosteronului, acizilor aminaţi,
CPK, colesterolului şi ale magneziului.
În timpul sarcinii, printre variaţiile importante cauzate de această stare,
pe lângă variaţiile hormonale, putem aminti scăderea albuminelor plasmatice, a
calciului care este legat de acestea, a imunoglobulinelor, a glucozei, a acidului
uric, a hemoglobinei şi eritrocitelor, a vitaminei C. Se observă o creştere a
proteinelor care transportă hormonii, a activităţii fosfatazei alcaline care creşte de
două ori prin aportul fosfatazei alcaline placentare.
De asemenea, creşte α-fetoproteina, α-1-antitripsina, amilaza,
P-glucuronidaza, ceruloplasmina (şi cuprul), leucin-aminopeptidaza.
Mai cresc: colesterolul, trigliceridele, fosfaţii şi volemia. În sarcina gemelară
α-fetoproteina este de două ori mai crescută decât în sarcina simplă.
Alimentaţia
Alimentaţia poate interfera dozarea colorimetrică a anumitor constituenţi
datorită conţinutului lor în diverse principii cum sunt: pigmenţii, carotenii,
antocianii.
Anumite alimente conţin serotonină, 5-hidroxi-indolacetat sau
catecolamine care pot perturba dozarea, prin metode nespecifice, a substanţelor
reducătoare.
Există alimente care au efect asupra unor constituenţi biologici prin
conţinutul lor crescut în anumite substanţe, de exemplu: spanacul, măcrişul care
conţin cantităţi crescute de acid oxalic şi care interferează în dozarea calciului;
un exces alimentar de sfeclă provoacă hiperaldosteronism şi hipokalemie.
Cafeaua şi cafeina cresc glucoza plasmatică şi acizii graşi neesterificaţi şi scad
timpul Quick.
Dar cele mai importante efecte le are un regim alimentar neechilibrat, un
regim vegetarian sau hipercarnat care modifică pH-ul, inaniţia care duce la
apariţia de corpi cetonici, etc. În postul alimentar prelungit, în afara creşterii
corpilor cetonici plasmatici, creşte secreţia de aldosteron, a trigliceridelor,
glicerolului, ureei, a acidului uric.
Ingestia de alimente provoacă variaţii dificil de controlat. Astfel, la două
ore după o masă completă (700 cal), la subiecţii sănătoşi se observă o creştere cu
15 % a concentraţiei plasmatice a glucozei, cu 15 % a fosfaţilor, cu 2 % a
albuminelor şi proteinelor, cu 20 % a AST-ului şi 6 % a ALT-ului. Colesterolul,
ureea, acidul uric, sodiul, fosfataza alcalină şi LDH-ul nu suferă variaţii.
Dar unele diferenţe nu se observă decât la anumite grupe de vârstă, cum este cazul
trigliceridelor, care, după masă, sunt mai crescute la persoane peste 40 de ani.
Efortul fizic
Creşte concentraţia albuminei şi a altor enzime plasmatice. Dacă efortul
este intens pot creşte enzimele de origine celulară: LDH, aldolaza, creatinkinaza,
AST, ALT şi chiar ornitin-carbamil-transferaza. Într-un efort de intensitate
mică creşte uşor fosfatul şi proteinele plasmatice.
22
Stresul
Stresul este un factor important de care trebuie să se ţină cont mai ales în
momentul recoltării probelor, deoarece acesta duce la creşterea concentraţiei
plasmatice a trigliceridelor, colesterolului, acidului uric, glucozei, hormonului de
creştere, noradrenalinei, hormonilor tiroidieni, a acizilor neesterificaţi.
Altitudinea
Albumina plasmatică scade după 6 săptămâni la o altitudine de 5400 m,
la fel şi aldostenuria, efect mai pronunţat mai ales la vârstnici. Hemoglobina,
hematocritul, acidul uric, noradrenalina plasmatică cresc. De asemenea, se
produce o alcaloză respiratorie de efort datorată hiperventilaţiei.
Absenţa gravitaţiei
Provoacă creşterea catecolaminelor, nespecific, legat de stresul pe care îl
reprezintă lipsa gravitaţiei. Se modifică metabolismul fosfo-calcic, apărând
osteoporoza căreia i-au fost victime cosmonauţii americani.
Ortostatismul
Proteinele serice, albuminele şi substanţele legate de proteine (colesterolul,
calciul) cresc după 15 minute de stat în picioare, datorită uşoarei hipovolemii
induse de ortostatism. Aldosteronul plasmatic creşte de 5-10 ori în ortostatism faţă
de poziţia culcat, la fel şi hematocritul care creşte cu 10 %. În urină
noradrenalina creşte de 3 ori.
Ritmurile circadiene
S-a constatat faptul că activitatea plasmatică a fosfatazei alcaline scade
de la 25 % până la 50 % dimineaţa. Concentraţia plasmatică a aldosteronului
creşte de la ora 6 până la ora 15, secreţia sa fiind mai scăzută noaptea. Probabil
acest efect este datorat poziţiei ortostatice. Dar pentru aldosteronemie există
un ritm circadian deoarece pentru o postură neschimbată secreţia maximă se
observă la ora 8 şi minimă la ora 18.
Excreţia noradrenalinei este mai crescută ziua decât noaptea.
Concentraţia plasmatică a fierului are un ritm circadian cu maxim după
amiaza şi minim la ora 4 dimineaţa.
Noaptea este crescut tonusul parasimpatic.
Biosinteza colesterolului este maximă în timpul nopţii.
În condiţii fiziologice, aproximativ 70 % din cantitatea de
hidrocortizon este secretată de către corticosuprarenală între orele 0 – 10
(maxim între orele 5-9 şi minim în timpul nopţii). În situaţiile de criză sau
stres, biosinteza glucocorticoizilor poate creşte de câteva ori.
23
Mediul
Pesticidele, insecticidele, oxidul de carbon, vaporii de benzină, solvenţii
organici, lacurile/vopselele pentru păr, etc. pot da unele modificări ale examenelor
de laborator cel mai adesea din cauza modificărilor toxice (citopenie, anemie
hemolitică, nefrotoxicitate, afecţiuni hepatice). Astfel, transaminazele,
colinesteraza, bilirubina sunt crescute, iar timpul Quick şi elementele figurate
sunt scăzute.
Frigul
La temperaturi scăzute cresc în plasmă catecolaminele, hormonii
tiroidieni, hormonul de creştere şi leucocitele. Acizii aminaţi ca tirozina şi
triptofanul plasmatic scad, pe când activitatea enzimatică a creatinkinazei creşte.
Febra
La persoanele cu febră mare s-a observat o scădere a glucozei plasmatice
şi o creştere a ureei, a uraţilor urinari şi a metabolismului bazal.
Greutatea corporală
S-a constatat faptul că hemoglobina, acidul uric plasmatic, creatinina
plasmatică, ALT-ul şi γ-glutamil-transferaza cresc cu masa corporală.
Tutunul
Pot exista diferenţe între examenele de laborator la fumători şi
nefumători. Astfel, pe lângă oxihemoglobina care este crescută la fumători,
mai creşte acidul ascorbic în plasmă, colesterolul, trigliceridele, glucoza
plasmatică, ionul tiocian în salivă. Recent s-a demonstrat valoarea net crescută a
concentraţiei de antigen carcino-embrionar la fumători faţă de nefumători
(de la 3 % la 19 %).
Medicamentele
Medicamentele pot influenţa examenele de laborator, ele ocupând un loc
important în acest domeniu. Variaţiile pe care le pot da medicamentele pot
conduce la interpretarea greşită a examenelor de laborator şi la un diagnostic
eronat.
Medicamentele pot influenţa analizele de laborator sub două aspecte:
- un aspect pur analitic: medicamentele şi/sau metaboliţii acestora pot perturba
sau interfera dozarea unor constituenţi biologici.
- un aspect biologic: ele pot provoca modificarea unui parametru biologic
printr-un mecanism fiziologic, farmacologic sau toxicologic.
În analizele de laborator trebuie să se ţină cont de interferenţele analitice
induse de către medicamente, ele reprezentând aproximativ 20 % din totalul
interferenţelor.
24
Astfel, ele pot da coloraţii similare cu unii constituenţi biologici, ca, de
exemplu, salicilaţii care dau cu reactivul Folin aceeaşi coloraţie cu aceea a
acidului uric.
Unele medicamente şi/sau metaboliţii acestora prezintă proprietăţi
reducătoare ca, de exemplu, acidul ascorbic care interferează asupra numeroase
dozări ale constituenţilor biologici care prezintă aceleaşi proprietăţi (glucoza,
acidul uric, creatinina).
Medicamentele pot acţiona asupra enzimelor şi proteinelor inhibând
activităţile şi proprietăţile caracteristice ale acestora.
Medicamentele pot forma diferite complexe cu compuşii biologici, pot
prezenta fluorescenţe proprii şi pot modifica pH-ul.
Datorită acestor interferenţe analitice ale medicamentelor trebuie
introduse metode care să ţină cont de aceşti factori.
Interferenţele biologice sunt dificil de pus în evidenţă. Totuşi înaintea
introducerii unui medicament în terapeutică se fac cercetări pe animal pentru a
urmări influenţa acestuia asupra constantelor biochimice, asupra funcţiei
hepatice, renale etc.
În acest sens, trebuie efectuate în mod obligatoriu examenele hematologice, în
particular observarea elementelor figurate, determinări enzimatice, analiza urinei,
clearence-ul creatininei etc.
Dar este practic imposibil să se atribuie o variaţie a rezultatelor
examenelor de laborator pentru un medicament fără să se ţină cont şi de
variaţiile date de vârstă, sex, greutate corporală etc.
Menţionăm doar câteva interferenţe biologice care pot să apară datorită
medicamentelor:
- fenomenele competitive de fixare a acestora pe proteine: de exemplu,
fenilbutazona deplasează anticoagulantele fixate pe proteine, potenţează acţiunea
lor şi diminuează timpul de protrombină (timpul Quick);
- inhibarea sintezei unor substanţe în organism: antihipertensivele
diminuează sinteza catecolaminelor;
- o acţiune asupra mecanismului de secreţie: pot provoca contracţia
sfincterului Oddi, modifică structurile membranare ducând la eliberarea de
enzime etc.
În concluzie este necesar să se cunoască factorii de variaţie biologică a
medicamentelor pentru o mai bună interpretare a examenelor de laborator.
25
IV. NOŢIUNI DE ANALIZĂ CHIMICĂ
26
Cantităţile de substanţă care reacţionează sau se înlocuiesc într-un proces chimic
sunt echivalente între ele.
Astfel, în mediu puternic acid (H2SO4) Mn+7 primeşte 5e- reducându-se în Mn+2
conform reacţiei:
MnO4- + 5 e- + 8 H+ = Mn2++ 4 H2O
Eg KMnO4 = 158,03 / 5 = 31,606 g
27
În mediu puternic alcalin, permanganatul reacţionează cu un singur electron
conform reacţiei:
MnO4- + e- = MnO42-
Eg KMnO4 = 158,03 / 1 = 158,03 g
𝑔/𝑙
𝑂𝑠𝑚/𝑙 =
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎𝑡𝑜𝑚𝑖𝑐ă/𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟ă
𝑚𝑔/𝑙
𝑚𝑂𝑠𝑚/𝑙 =
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎𝑡𝑜𝑚𝑖𝑐ă/𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟ă
𝑚𝑔/𝑙
𝑚𝐸𝑞/𝑙 = 𝑚𝑂𝑠𝑚/𝑙 𝑥 𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛ţ𝑎 = 𝑥 𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛ţ𝑎
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎𝑡𝑜𝑚𝑖𝑐ă
O soluţie este un amestec omogen de două sau mai multe substanţe care nu
interacţionează chimic şi care alcătuiesc o singură fază. Substanţa care predomină
se numeşte dizolvant sau solvent (starea de agregare a solventului conferă starea
fizică a soluţiei care poate fi gazoasă, lichidă sau solidă), iar substanţa (sau
substanţele) care se dispersează omogen se numeşte dizolvat, solut sau solvat.
Orice soluţie care urmează să fie folosită ca reactiv se prepară la balon cotat.
Exprimarea cantităţii de substanţă dizolvată într-o soluţie la un anumit
volum poartă numele de concentraţia soluţiei. Se utilizează două moduri de
exprimare a concentraţiei: fizică şi chimică.
28
În practică se pot întâlni următoarele situaţii:
- prepararea unei soluţii de o anumită concentraţie procentuală, pornind de
la două soluţii cu concentraţie procentuală cunoscută;
- prepararea unei soluţii mai diluate, pornind de la o soluţie mai concentrată
prin diluare cu apă.
C1 · V1 = C2 · V2
29
Dacă se cunoaşte titrul soluţiei, se poate calcula c‰ utilizând relaţia:
𝑇·1000
𝑐‰ = (d = densitatea soluţiei)
𝑑
𝑎 10 · 𝑐% · 𝑑 𝑐‰ · 𝑑 𝑇 · 1000 𝑛 · 𝐸𝑔
𝑚= = = = =
𝑀 𝑀 𝑀 𝑀 𝑀
𝑎 10 · 𝑐% · 𝑑 𝑐‰ · 𝑑 𝑇 · 1000 𝑚 · 𝑀
𝑛= = = = =
𝐸𝑔 𝐸𝑔 𝐸𝑔 𝐸𝑔 𝐸𝑔
30
IV.2.3. Noţiunea de titru şi factor
Titrul (T) unei soluţii reprezintă cantitatea de substanţă exprimată în
grame, dizolvată într-un ml de soluţie. Soluţia al cărui titru se cunoaşte se numeşte
soluţie titrată.
Exemplu: Titrul unei soluţii 1 N de NaOH este 0,040005g NaOH în 1000 ml
soluţie.
Titrul unei soluţii de exactă normalitate se numeşte titru teoretic, Tt, şi se
poate calcula cunoscând molaritatea sau normalitatea soluţiei.
Titrul unei soluţii de normalitate oarecare (diferită de normalitatea exactă,
dar cât mai apropiată posibil de aceasta) se numeşte titru real, Tr. De exemplu,
titrul mediu experimental al soluţiei de NaOH se obţine după etalonarea cu acid
oxalic (NaOH nu e stabil, ci absoarbe din aer, apă şi dioxid de carbon, formând un
strat superficial de Na2CO3 care trebuie îndepărtat prin spălare cu apă distilată,
proaspăt fiartă şi răcită; din acest motiv se cântâreşte o cantitate mai mare de
NaOH decât cea calculată teoretic).
Titrul se mai poate calcula conform relaţiilor:
𝑐% · 𝑑 𝑐‰ · 𝑑 𝑚 · 𝑀 𝑛 · 𝐸𝑔
𝑇= = = =
100 1000 1000 1000
31
Substanţele etalon secundare sau standarde secundare sunt utilizate la
stabilirea titrului altor soluţii folosite apoi la titrări volumetrice. Ex: acidul oxalic
folosit pentru stabilirea titrului soluţiei de NaOH sau KMnO4.
Condiţiile ce trebuie îndeplinite de subtanţele etalon sunt următoarele:
să aibă grad înalt de puritate şi de stabilitate, compoziţie chimică cunoscută bine
determinată, masă moleculară cât mai mare, să reacţioneze cu alte substanţe după
ecuaţii simple şi bine cunoscute.
Valorile diferitelor analize se raportează mai ales sub formă de mg/dl pentru
sânge, lichid cefalorahidian sau de mg (g) în 24 de ore pentru eliminarea urinară.
În ultimul timp se tinde însă spre un mod de exprimare uniform: mmol/l, respectiv
mmol eliminaţi în 24 de ore.
De un interes deosebit în clinică sunt valorile concentraţiilor principalilor
ioni: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, HCO3- . Exprimarea acestora se face cel mai adesea
în mEg/l. O valoare utilă este şi modul de exprimare în osmoli, respectiv mosmoli.
Pentru enzime şi uneori pentru vitamine se utilizează nomenclatura de
unitate internaţională (U.I. sau U).
Exprimarea rezultatelor obţinute în urma diferitelor măsurători se face în
funcţie de gradul de sensibilitate şi precizie a instrumentelor de măsură utilizate.
Un rezultat nu poate conţine mai multe cifre decât permite gradul de sensibilitate şi
precizie a aparatului utilizat.
Probleme:
32
LUCRAREA 2
1. CULOAREA - ROŞIE
- se datorează Hb eritrocitare
- variază în funcţie de saturaţia Hb cu oxigen
roşu aprins – sânge arterial (saturaţie 95 – 97 %)
roşu închis – sânge venos (saturaţie 75 %)
- variaţii: compuşi anormali ai Hb
roşu purpuriu – carboxihemoglobina (intoxicaţie cu CO)
roşu brun – methemoglobina
2. DENSITATEA – 1057 – 1061 g/cm3 (plasma 1027 g/cm3)
- dată de substanţele solvite (elemente figurate, proteine)
- variaţii: anemie, hipoproteinemie
poliglobulie
3. VÂSCOZITATEA - 4,4 – 4,7 centiPoise (plasma 1,86 centiPoise)
- depinde de - factori plasmatici (proteine)
- elementele figurate (E)
- influenţează rezistenţa periferică (RP) TA
- variaţii: în anemie RP
în poliglobulie RP
33
4. PRESIUNEA OSMOTICĂ
- este direct proporţională cu numărul de particule dizolvate
- este determinată de:
- electroliţi 93 %
- substanţe organice nedisociate (glucoză, uree) 7 %
• osmolaritate 285 – 300 mOsm/l
• punct crioscopic - 0,56 oC
34
- rinichii filtrează sângele şi selectează acele substanţe indispensabile
(mai ales săruri minerale), pe care le redă sistemului circulator, eliminând pe cale
urinară reziduurile.
d) Funcţia de apărare a organismului → sângele are capacitatea de a
transporta substanţele ce intervin în reacţiile specifice şi nespecifice de apărare.
Prin proteinele anticorpi, limfocite T şi B, macrofage şi plasmocite, sângele asigură
desfăşurarea proceselor imune faţă de agenţii infecţioşi – virusuri şi bacterii – sau
proteine străine.
e) Funcţia de realizare a hemostazei → trombocitele pot determina oprirea
sângerării la nivelul unui vas sanguin mic sau mijlociu.
35
Variaţii:
1. Plasma :
- lichid limpede de culoare galben pai;
- desemnează fracţiunea lichidă a sângelui şi limfei;
- în plasmă se află în suspensie celulele sanguine (hematii, leucocite şi trombocite);
- este formată din :
- apă;
- substanţe anorganice dizolvate (săruri minerale);
- diverse substanţe organice (proteine, lipide, glucide, combinaţii ale
acestora).
- serveşte ca vehicul atât pentru elementele celulare sanguine, cât şi pentru diverse
substanţe biologic active (hormoni, anticorpi etc.).
36
Compoziţia chimică a plasmei:
- 90 % apă;
- 10 % substanţe organice şi anorganice:
9 % substanţe organice:
- azotate proteice – proteine plasmatice (8 g %):
- albumine 3 g %
- globuline 4,5 g %
- fibrinogen 0,3 %
- azotate neproteice (25 – 35 mg %):
- uree
- acid uric
- creatina şi creatinina
- amoniac
- indican (se formează în intestin prin
descompunerea triptofanului sub acţiunea florei bacteriene, este absorbit prin
peretele intestinal şi eliminat urinar)
- aminoacizi şi polipeptide
- neazotate: - glucide (0,1 g%): glucoză, acid lactic, acid citric;
- lipide (0,6g%): trigliceridele, colesterol,
fosfolipide
1 % substanţe anorganice (săruri minerale):
- cloruri
- fosfaţi de Na+, K+, Ca2+, Mg2+
- iod
- brom
- fier
- cupru
37
b) Leucocitele (celulele albe) → prescurtat WBC (White Blod Cell) sunt
celule nucleate cu roluri deosebit de importante în procesele de apărare prin
fagocitoză, producere de anticorpi şi distrugerea toxinelor de origine microbiană.
Valorile normale sunt cuprinse între 4000–8000/mm3, numărul lor prezintă
variaţii fiziologice în funcţie de vârstă. Creşterea acestora peste valoarea de
8000/mm3 se numeşte leucocitoză, iar scăderea sub 4000/mm3 se
numeşte leucopenie.
38
Figura 11. Compoziţia serului şi a plasmei [35]
39
Tabel 1. Câteva aspecte importante referitoare la tehnica recoltării
Avantaje ● Utilizarea acestei metode de prelevare asigură:
- confortul pacientului;
- calitatea probei de sânge;
- securitatea personalului medical.
Pregătire ● Materiale:
- holder – un tub de material plastic care prezintă, la partea
superioară, amboul la care se ataşează acul de puncţie prin înfiletare,
iar la partea inferioară două aripioare;
- acul de puncţie protejat de carcasa bicoloră;
- tuburi vacutainer cu dopuri de diferite culori convenţionale;
- materiale necesare efectuării puncţiei venoase.
● Pacient:
- pregătirea psihică: se anunţă şi i se explică necesitatea şi
inofensivitatea tehnicii;
- pregătirea fizică;
- recoltarea se face în condiţii bazale, dimineaţa pe nemâncate –
„a jeun‖, înaintea oricărei proceduri diagnostice sau terapeutice;
- se aşează pacientul în decubit dorsal, confortabil, cu membrul
superior în abducţie, extensie şi supinaţie.
Execuţie Asistenta:
- se spală pe mâini cu apă şi săpun;
- utilizează mănuşi sterile, de unică folosinţă, de fiecare dată;
- verifică banda de siguranţă a acului (integritate, valabilitate);
- îndepărtează carcasa de culoare albă a acului prin mişcări de
răsucire;
- înfiletează capătul liber al acului în holder;
- alege locul puncţiei şi îl aseptizează;
- îndepărtează carcasa colorată a acului.
● Execută puncţia venoasă:
- introduce tubul în holder apucând aripioarele cu indexul şi mediul,
iar cu policele împinge tubul în holder şi astfel va fi străpunsă
diafragma gumată a dopului;
- după prelevarea sângelui se scoate tubul din holder prin mişcări de
împingere asupra aripioarelor laterale şi i se imprimă mişcări uşoare
40
de înclinare-răsturnare pentru omogenizare cu aditivul;
- se introduce tubul următor;
- se retrage acul din venă şi se face o compresiune asupra locului
puncţiei timp de 1 – 3 minute fără a flecta antebraţul pe braţ;
- se aplică un plasture post-injecţie.
■ IMPORTANT:
Tuburile vacutainer se utilizează în funcţie de codul de culoare al dopului de
cauciuc (codurile de culoare pentru substanţele anticoagulante sunt descrise în
ISO/DIS 6710), astfel:
41
Verde: litiu heparină – se obţine plasmă pentru analize biochimice.
Probleme:
3. Care este cel mai potrivit moment pentru recoltarea sângelui cu scopul de a
determina principalii parametri biochimici:
a. postprandial
b. a jeun
c. după administrarea unui stimulent
d. după efort fizic
42
LUCRAREA 3
- -
HA + B A + HB
[acid conjugat] [baza conjugată]
[bază conjugata] [bazaconjugată]
[bază conjugata] [acid conjugat]
43
Deoarece concentraţia protonilor [H+] (sau a ionilor de hidroniu, H3O+)
poate avea valori extrem de scăzute (între 10-3 – 10-14 M), foarte dificil de utilizat
în practică, Sörensen a propus utilizarea noţiunii de pH, definită ca logaritmul
zecimal cu semn schimbat al concentraţiei ionilor H+.
pH este o exprimare foarte scurtă care desemnează activitatea ionilor de
hidrogen. Prin definiţie, pH este logaritmul negativ al activităţii ionilor de
hidrogen. În mod similar, se calculează logaritmul negativ al activităţii ionilor de
hidroxil, exprimat sub formă de pOH.
1 1
pH log a H log log H [H ] log
a H H [H ]
1 1
pOH log a OH log log OH [OH ] log
a OH OH [OH ]
[H ][OH ] 10 14 = Kw
[H ][OH ] K p
log[H ] log[OH ] log K p
pH pOH pKp
44
De exemplu, dacǎ [H+] = 10ˉ7 → pH = -log 10ˉ7; respectiv pH = 7; sau
7
1/10ˉ = 7.
O soluţie este acidă dacă [H+] > 10-7 > [OH-], deci pH < 7.
O soluţie este alcalină dacă [OH-] > 10-7 > [H+], deci pH > 7.
O soluţie este neutră dacă [H+] = 10-7 = [OH-], deci pH = 7.
Acizii tari (HCl, HNO3, H2SO4) în soluţie apoasă sunt complet ionizaţi, iar
concetraţia ionilor H+ este egală cu concetraţia molară a acidului (C); Ka > 10-1:
AH + H2O → H3O + A-
pH = - lg [H+] = - lg C = pC
Bazele tari (NaOH, KOH, LiOH, etc.) sunt complet disociate în apă, iar
concentraţia molară a bazei reprezintă concentraţia ionilor HO-, Kb > 10-1:
B + H2O → BH+ + HO-
pOH = - lg C = pC; pH = 14 - pOH
Tăria unui acid sau a unei baze se exprimă prin constanta de aciditate (Ka),
respectiv constanta de bazicitate (Kb). Cu cât valoarea constantei de aciditate este
mai mare, cu atât acidul este mai ionizat, adică mai tare şi implicit baza conjugată
este mai slabă. Cu cât constanta de bazicitate este mai mare, cu atât baza acceptă
mai uşor protoni, adică este mai tare.
[H+] · [A-]
Ka = ———— ;
[HA]
[H+] = Ka · C
Bazele slabe (NH3, NR3, Mg(OH)2, Al(OH)3, Zn(OH)2 etc.) ionizează slab
în soluţie apoasă, echilibrul fiind deplasat spre stânga; Kb < 10-5:
[HO-] = Kb · C
45
- lg Kb = pKb; pOH = - lg [OH-] = ½ (pKb + pC) ; pH = 14 – pOH.
Ka · Kb = KH2O
HA ↔ H+ + Aˉ
[H+] [A-]
Ka = —————;
[HA]
46
În momentul în care se adaugă ioni de hidrogen în solutia tampon, ei se
combinǎ cu Aˉ (baza conjugată) şi echilibrul este deplasat spre stânga (H+ + A- =>
HA). Şi se formează mai mult HA decât prin scoaterea excesului de ioni de
hidrogen din soluţie. În mod similar, pe măsură ce ionii de hidrogen sunt extraşi
din soluţie prin adăugarea unei baze puternice, reacţia se deplasează spre dreapta,
refăcând concentraţia ionilor de hidrogen şi reducând cantitatea de HA (OH- + HA
=> A- + H2O). Un sistem tampon poate compensa un influx de ioni de hidrogen sau
hidroxil pe un domeniu de pH ce corepunde pKa±1.
Cel mai important sistem tampon din sânge este format din acid carbonic
(un acid slab format din dioxid de carbon dizolvat în sânge) şi ionul bicarbonat
(baza slabă corespunzătoare). Acidul carbonic este un acid slab (parţial disociat):
[H2CO3]
Ka = ———————
[HCO3ˉ][H+]
47
Creşterea concentraţiei de HCO3ˉ va deplasa spre stânga sensul reacţiei 1,
astfel scade disocierea acidului carbonic şi eliberarea de H+. În acest fel, „şocul‖ de
H+ produs de acidul tare este amortizat de sistemul tampon care capteazǎ H+ sub
formǎ nedisociatǎ în acceptorul de H+ care în cazul de faţǎ este HCO3ˉ.
[H2CO3]
[H+] = K —————
[HCO3ˉ]
1 1 [HCO3ˉ]
pH = log ——— = log ( — · ———— )
[H+] K [H2CO3]
1 [HCO3ˉ]
pH = log —— + log ————
K [H2CO3]
[HCO3ˉ]
pH = pK + log ————
[H2CO3]
[Aˉ]
pH = pK + log ——
[AH]
[HCO3ˉ]
pH = 6,1 + log ————
[H2CO3]
Atunci când raportul între [HCO3ˉ] şi [H2CO3] este de 20, iar log 20 = 1,3,
pH = 6,1 + 1,3 = 7,4.
48
Astfel, pentru existenţa unui pH normal, raportul între concentraţiile de
bicarbonat şi de acid carbonic trebuie să fie 20/1 (de exemplu, 24 mEq bicarbonat
şi 1,2 mEq acid carbonic); ori de câte ori scade numărătorul (bicarbonatul) sau
creşte numitorul (acidul carbonic), valoarea acestui raport scade şi se va ajunge la o
deviere spre latura acidă, respectiv o scădere a pH-ului; invers, creşterea
bicarbonaţilor sau scăderea acidului carbonic va duce la o creştere a pH-ului, adică
la o deviere spre latura alcalină.
Dar componenta acidului carbonic este raportată cu bioxidul de carbon
dizolvat (CO2 + H2O ↔ H2CO3). CO2 dizolvat este proporţional cu presiunea
parţială CO2. Într-adevăr, legea lui Henry arată că [CO2] în soluţie = s·pCO2 unde s
este solubilitatea gazelor în apă.
În consecinţă [H2CO3] poate fi înlocuit în ecuaţia de masă cu pCO2.
O înţelegere a rolului sistemului tampon bicarbonat în explorarea echilibrului
acido-bazic poate fi realizat prin referirea la relaţia [H+] care este proporţional la o
anumită pCO2/[ HCO3 ] şi demonstrează că nivelul ionilor de hidrogen în sânge
variază la modificarea concentraţiei de bicarbonat şi pCO2.
Dacă în rest totul rămâne constant:
- Adaosul ionilor de hidrogen, îndepărtarea bicarbonatului sau creşterea pCO2, va
avea drept rezultat o creştere a [H+].
- Îndepărtarea ionilor de hidrogen, adăugarea bicarbonatului sau scăderea pCO2
va avea ca efect scăderea [H+].
50
VI.2. DETERMINAREA REZERVEI ALCALINE PRIN METODE
VOLUMETRICE
A + B = AB
A = substanţa de analizat numită şi titrat
B = reactivul a cărui concentraţie este cunoscută, numit titrant.
51
punctul final al titrării (când se opreşte adăugarea reactivului de titrare). Diferenţa
dintre punctul de echivalenţă şi cel final trebuie să fie cât mai mică sau nulă.
Determinarea punctului de echivalenţă se poate face pe cale chimică
(folosind indicatori) sau pe cale instrumentală (folosind instrumente care măsoară
variaţia unor proprietăţi fizice ale soluţiilor).
52
VI.2.2. DETERMINAREA REZERVEI ALCALINE PRIN METODE
VOLUMETRICE
Tehnica de lucru:
Într-un pahar Erlenmeyer peste proba de analizat (10 ml) se adaugă câteva
picături de fenolftaleină. Soluţia colorată în roşu se titrează cu HCl 0,1 N până la
roz deschis. Se notează volumul V1(ml) de HCl 0,1 N utilizat pentru dozarea a
jumătate din cantitatea de CO32-. Se continuă apoi titrarea în prezenţă de metiloranj
până la culoarea roşu-portocaliu. Se notează volumul V2(ml) de HCl 0,1 N utilizat
pentru dozarea întregii cantităţi de HCO3-.
Calcul:
M NaHCO3 = 84.01 g/mol; M Na2CO3 = 106 g/mol
53
10 ml probă ................................ a g NaHCO3
1000 ml ............................... x g NaHCO3
x = 100 · a g NaHCO3/L
sau
1 ml HCl 0,1N ................................... 0,0053 g Na2CO3 (M/20000)
2·V1HCl · F HCl ................................... b g Na2CO3
b = 2·V1HCl · F HCl x 0,0053 g Na2CO3
Interpretarea rezultatelor
Valorile normale ale ionului HCO3- trebuie să fie cuprinse în intervalul 24 –
27 mEq/L, iar cele ale ionului CO32- în jur de 1,2 mEq/L, astfel încât raportul
HCO3-/CO32- să fie aproximativ 20. Deoarece sistemul carbonat/bicarbonat este
primul care intervine şi se modifică relativ uşor prin respiraţie, totalitatea CO2
conţinută ca atare sau sub formă de bicarbonaţi în 100 ml plasmă exprimat ca ml
CO2 la 00C şi la 1 atm, formează rezerva alcalină (55-70 ml în mod obişnuit).
pH-ul sângelui uman are în mod obişnuit valoarea de 7,4 ± 0,04. Valori ale
pH-ului sub 7,35 apar în cazul acidozei, iar peste 7,45 în alcaloză. Ambele stări sunt
periculoase şi se manifestă clinic prin semne de afectare a sistemului nervos.
Menţinerea unor limite de +/- 0,04 unităţi de pH se face prin 3 mecanisme
principale :
1. capacitatea de tamponare a sistemelor fizico-chimice din plasmă şi hematii;
2. controlul respirator al eliminării CO2;
3. reglarea renală a acidifierii urinii.
Primele 2 mecanisme intervin imediat, iar cel de-al treilea după un interval
de timp mai lung. Principalul sistem tampon în hematii este sistemul
hemoglobină/hemoglobină oxigenată, iar în plasmă sistemul carbonat/bicarbonat.
54
Datorită pătrunderii ionului bicarbonat prin membrana hematiilor cele 2 sisteme
sunt legate funcţional. În plus, datorită reversibilităţii reacţiei catalizate de una din
cele mai active enzime (anhidraza carbonică), excesul de acid carbonic poate fi
eliminat prin respiraţie.
anhidraza carbonicã
+ -
CO2 + H2O H + HCO3
55
Acidemia şi alcalinemia se referă la concentraţia de H+ din sânge,
reprezentând o valoare crescută sau scăzută faţă de normal. Aceşti termeni nu sunt
frecvent folosiţi.
Paraclinic:
- pH < 7,35;
- modificare primară: bicarbonat < 24 mEq/L (este folosit pentru compensarea
rapidă);
- pCO2 > 40 mmHg, dacă apare compensarea pCO2 < 35 mmHg.
Manifestările clinice:
durere de cap, letargie, greaţă, vomă, diaree;
prezenţa hiperpotasemiei, care însoţeşte acidoza poate mări riscul aritmiilor
cardiace care pot conduce la stop cardiac. Apar tulburări ale conştienţei ce pot duce
la comă şi deces.
56
Mecanisme de compensare/corectare:
respiratorie: răspunsul compensator la acidoza metabolică este
hiperventilaţia, creşterea [H+] serveşte drept un stimulent puternic pentru centrul
respirator. Respiraţia Kussmaul este profundă, rapidă şi zgomotoasă, fiind întâlnită
în acidoze. Hiperventilaţia este răspunsul fiziologic la acidoză şi se instalează
rapid;
renală: eliminarea unei urini acide;
sau prin neutralizarea din sucul gastric a excesului de acizi.
Cauzele alcalozei:
1. Pierderea de ioni de hidrogen în cursul vărsăturilor este întâlnită în cazul
pacienţilor cu stenoză pilorică. Obstrucţia dintre stomac şi duoden face ca
pierderile de H+ să nu fie însoţite de o pierdere de bicarbonaţi, iar dacă nu survine o
eliminare rapidă a acestora la nivelul rinichilor se va instala o alcaloză metabolică.
2. Administrarea terapeutică a unei cantităţi mari de bicarbonat sub formă
de infuzii intravenoase sau chiar pe cale orală, poate depăşi capacitatea de
eliminare renală; sau a unor medicamente bazice.
3. Pierderi de potasiu. În pierderile severe de potasiu, adesea o consecinţă a
terapiei cu diuretice, ionii de hidrogen sunt reţinuţi în celule pentru a înlocui lipsa
ionilor de potasiu. La nivelul tubului renal sunt eliminaţi mai mulţi ioni de
hidrogen decât de potasiu. Sodiul nu poate pătrunde în celule ca să înlocuiască
deficitul de potasiu. În ciuda alcalozei, urina este acidă. Aceasta este aciduria
paradoxală.
4. Anumite diuretice, tulburări endocrine, deshidratări severe.
Paraclinic:
- pH > 7,45;
- modificarea primară: bicarbonat > 27 mEq/L;
- pCO2 valori normale, dacă apare compensarea creşte > 45 mmHg.
Manifestările clinice:
Efectele clinice ale alcalozei includ hipoventilaţie, pierderea conştienţei şi
în cele din urmă comă. Crampele musculare, tetania, aritmiile şi paresteziile pot fi
o consecinţă a scăderii concentraţiei de calciu plasmatic, care este o consecinţă a
alcalozei.
57
Mecanisme de compensare/corectare:
respiratorie: hipoventilaţie (creşterea pH-ului inhibă centrul respirator
cauzând hipoventilaţie ce va determina acumularea de CO2 în sânge);
renală: eliminarea unei urini alcaline (rinichii conservă H+ şi elimină HCO3-)
Tratament:
Soluţii conţinând cloruri (Cl- înlocuieşte HCO3-);
Soluţii de electroliţi (pentru a-i compensa pe cei pierduţi prin vărsături);
Tratamentul celorlalte cauze/tulburări.
Cauze:
- deprimarea centrilor respiratori în afecţiuni neurologice sau în intoxicaţii cu
morfină, barbiturice;
- afecţiuni pulmonare cu reducerea parenchimului pulmonar;
- scăderea capacităţii de difuziune alveolo-capilară.
Paraclinic:
- pH < 7,35;
- modificare primară: pCO2 > 45 mmHg (hipercapnie);
- bicarbonat valori normale, dacă apare compensarea > 27 mEq/L.
Manifestări clinice:
- deficienţă respiratorie;
- letargie, dezorientare;
- tremor, convulsie, comă.
Mecanisme de compensare/corectare:
- respiratorie: creşterea pCO2 determină stimularea centrilor respiratori şi
hiperventilaţie permiţând eliminarea de CO2 şi H2O la nivelul plămânilor;
- renală: eliminarea de H+ în urina acidă determinând reabsorbţia HCO3- deja
crescut în sânge. Creşterea reabsobţiei de HCO3- determină o excreţie crescută a Cl-
în urină, generând o scădere a Cl- în plasmă.
Tratament:
- restaurarea/stimularea respiraţiei;
- soluţie lactat administrată IV;
- tratarea patologiilor existente.
58
Acidoza respiratorie poate să fie acută sau cronică.
Problema principală în acidoza respiratorie acută este hipoventilaţia
alveolară. Forma acută apare în câteva minute sau ore şi este decompensată.
Mecanismele compensatorii renale care reglează reabsorbţia de bicarbonaţi sunt
eficiente complet doar în 48-72 h.
Principala manifestare clinică a acidozei respiratorii constă în alterarea
stării de conştienţă, obnubilare, mergând până la comă şi poate duce chiar la deces.
Exemple de acidoză respiratorie acută sunt:
obstrucţia acută a căilor respiratorii;
bronhopneumonia;
criza de astm.
Cauze:
- altitudinea (polipnee, hiperventilaţie cu pierdere de CO2);
- hiperventilaţia cronică datorată hipoxiei din anemii, boli cardio-vasculare etc.
59
Paraclinic:
- pH > 7,45;
- modificarea primară: pCO2< 35 mmHg (hipocapnie);
- bicarbonat valori normale, dacă apare comensarea < 24 mEq/L.
Manifestări clinice:
- hiperventilaţie;
- ameţeli, confuzie;
- hiperexcitabilitate neuromusculară, parestezii, convulsii.
Mecanisme de compensare/corectare:
- respiratorie: scăderea pCO2 determină o slabă stimulare a centrilor respiratori =>
hipoventilaţie cu reţinere de CO2;
- renală: scăderea eliminării de H+ determinând scăderea reabsorbţiei de HCO3- =>
urină alcalină. Pentru a compensa pierderile de bicarbonat, apare o creştere a
reabsorbţiei renale de Cl-.
Tratament:
- înlăturarea cauzei care a determinat hiperventilaţia;
- respirarea unui amestec bogat în CO2 (în clinici);
- soluţii conţinând cloruri (Cl- înlocuieşte HCO3-).
60
VI.3.5. Tulburări acido-bazice mixte
Parametrii Astrup:
pH-ul actual: valoarea medie normală a pH-ului sanguin; valori normale
între 7,36 – 7,44;
pH-ul standard = 7,36 – 7,44 în condiţii standard: pCO2 = 40 mmHg,
T = 37 °C, saturaţie în O2 a Hb = 100 %;
Bicarbonatul standard = 24 – 27 mEg/L măsurat în aceleaşi condiţii
standard menţionate anterior;
Bicarbonatul actual (real): valoarea HCO3- în sângele analizat; valoarea
normală 24 – 27 mEg/L;
61
pCO2 = 40 ± 2 mmHg sau 1,25 mEg/L; presiunea parţială a CO2 măsurat în
plasmă;
Baze tampon: concentraţia tuturor bazelor care intervin în captarea ionilor
H+ (Hb, proteine, fosfaţi, etc.); valoarea normală = 40-50 mEg/L;
Bazele exces: reprezintă cantitatea de acizi sau baze care ar putea restabili
echilibrul acido-bazic într-un litru de sânge la un pCO2 de 40 mmHg.
Valoarea normală este între +2 şi -2 nmoli/l sau mEq/l.
Probleme:
62
LUCRAREA 4
VII.1. APA
63
Reglarea hormonală a apei din organism este realizată de :
- Hormonul antidiuretic (ADH) prin care se realizează controlul reabsorbţiei
apei la nivelul tubului contort distal şi colector al nefronului.
- Aldosterona participă la menţinerea homeostaziei hidrice şi electrolitice
prin efectul său de a determina reabsorbţia Na+ la nivelul tubului contort distal şi în
mod secundar determină eliminarea renală de H+, K+ şi NH4+. Controlul secreţiei
de aldosteronă este realizat prin factori multipli dintre care amintim sistemul
renină- angiotensină, kalemia, natremia şi concentraţia plasmatică de ACTH.
Aportul de apă în organism se poate realiza pe mai multe căi:
- exogenă, prin ingestia apei ca atare sau sub forma apei conţinute în alimente
- endogenă, provenită din procesele metabolice.
Există o interdependenţă între apa formată şi cea eliminată. Eliminarea apei
se face pe cale renală, cutanată, digestivă şi pulmonară.
1) Deshidratări hipertone (globale) apar când pierderea de apă este mai mare
decât cea de Na+. Deshidratările hipertone interesează în primul rând sectorul
extracelular, fiind caracterizate de hiperosmolaritatea lichidelor extracelulare.
Aceasta stimulează secreţia de ADH şi aldosteron, ceea ce are ca şi urmare
scăderea compensatorie a eliminărilor urinare, instalându-se oliguria. În acelaşi
timp deshidratarea stimulează senzaţia de sete care va contribui şi ea la corectarea
deshidratării.
64
3) Deshidratările izotone sunt rezultatul pierderilor concomitente şi
echilibrate de apă şi electroliţi. Acestea pot fi produse de hemoragii acute, pierderi
de lichide pe cale digestivă sau secundar administrării de medicamente diuretice în
doză prea mare. Pierderile de lichide izotone duc la instalarea hipovolemiei care va
determina scăderea debitului cardiac şi a fluxului sangiun renal, cu scăderea
filtrăriii glomerulare şi a diurezei. Secundar apar tahicardie, hipotensiune şi
senzaţia de sete.
65
VII.2. ELECTROLIŢII
𝑔/𝑙
Osm/l = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎𝑡𝑜𝑚𝑖𝑐 ă
𝑚𝑔 /𝑙
mOsm/l = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎𝑡𝑜𝑚𝑖𝑐 ă
𝑚𝑔 /𝑙
mEq/l = mOsm/l x valenţa = 𝑚𝑎𝑠𝑎 x valenţa
𝑎𝑡𝑜𝑚𝑖𝑐 ă
66
VII.2.1. Metode utilizate pentru determinarea electroliţilor
67
elementele anorganice sunt diluate 1:100 sau 1:200 cu apă deionizată şi cu un
standard intern de litiu de 15 mEg/l.
Spectrometria de absorbţie atomică este o metodă de mare sensibilitate şi
specificitate care poate fi folosită în laboratorul clinic pentru a determina calciu,
magneziu, litiu, plumb, cupru, fier, zinc şi alţi ioni metalici. Principiul de
funcţionare a acestui tip de aparat este destul de asemănător cu flamfotometrul cu
deosebirea că în acest tip de aparat se măsoară lumina emisă de atomii neexcitaţi.
În spectrofotometrele cu absorbţie atomică, elementele sunt vaporizate printr-o
descărcare într-un catod cu heliu sau argon. Proba este aspirată în flacăra formată
dintr-un amestec de aer şi acetilenă asemănător flamfotometrului.
Variaţii patologice :
Hiponatremie:
- diaree severă;
- transpiraţii masive;
- arsuri extinse;
- diabet zaharat cu acidoză;
68
- insuficienţa renală, insuficienţă corticosuprarenală;
- administrare de diuretice.
Hipernatremie:
- stenoza pilorică;
- hiperaldosteronism;
- corticoterapie.
Variaţii patologice:
Hipokaliemie :
- este insoţită de tulburări neuro-musculare şi cardiace şi se întâlnesc în cadrul
patologiei chirurgicale: obstrucţie intestinală, stenoză pilorică;
- dializa peritoneală;
- nefropatii tubulare.
Hiperkalemie :
- distrucţii celulare (sindroame hemolitice, sindrom de strivire, arsuri întinse);
- insuficienţa renală acută şi cronică.
Principiu:
Proba se introduce în flacără şi pentru o temperatură constantă a flacării în
anumite condiţii, intensitatea radiaţiei emise este proporţională cu concentraţia
metalului în soluţie. Se determină intensitatea radiaţiei emise, selecţionate cu
ajutorul unor filtre (de interferenţă, specifice fiecărui metal).
69
Aparatura:
Fotometrul cu flacără, vase din material plastic pentru păstrarea soluţiilor
etalon şi efectuarea diluţiilor, pipete, baloane cotate sau biurete.
Reactivi:
Ca regulă generală, toţi reactivii vor fi păstraţi în flacoane de polietilenă şi
nu în vase de sticlă fiindcă silicaţii din sticlă cedează mai mult sau mai puţin ionii
de sodiu şi potasiu în soluţie. La prepararea soluţiilor etalon se va folosi apă
bidistilată sau tridistilată.
Soluţiile etalon se prepară din NaCl şi KCl uscate în prealabil timp de 24 de
ore la 1100C într-o etuvă şi lăsate să se răcescă într-un exicator.
1. Soluţie etalon NaCl: 7,35 g NaCl, 5 ml formaldehidă 40% şi apă bidistilată ad
1000 ml. Soluţia conţine 3 mg Na/ml şi se diluează 1:500 la folosire.
2. Soluţie etalon KCl: 1,91 g KCl, 5 ml formaldehidă 40% şi apă bidistilată ad 1000
ml. Soluţia conţine 1mg K/ml şi se diluează 1:100 în momentul folosirii.
Tehnica de lucru:
1. Dozarea se poate face pe ser sau plasmă. În primul caz decolarea cheagului
înainte de centrifugare produce o uşoară hemoliză ceea ce introduce o eroare
importantă, având în vedere că hematiile conţin de 20 de ori mai mult K+ decât
plasma. Dacă se lucrează pe plasmă, sângele se va recolta pe anticoagulant lipsit de
Na+ şi K+ (heparinat de litiu şi amoniu) şi se vor separa hematiile în prima oră după
recoltare, altfel se obţin valori fals crescute pentru K+. Practic se recoltează 5 ml
sânge pe câteva picături de heparinat de litiu, eventual direct într-un tub de
centrifugă.
2. Diluţiile serului sau ale plasmei variază în funcţie de aparat. Diluţiile se aleg în
funcţie de curba de etalonare utilizată (făcută cu soluţiile etalon). Se recomandă ca
diluţiile să se facă cu foarte mare grijă, iar pentru măsurarea apei bidistilate se
recomandă folosirea unei biurete, în acest caz eroarea de măsurare a volumului
fiind constantă.
Practic, se poate proceda în felul următor: se introduc 0,1 ml ser într-un
flacon de material plastic şi se adaugă 9,9 ml apă bidistilată dintr-o biuretă de 10
ml. Se agită bine. Se ia 1 ml din această soluţie (1:100), se introduce în alt flacon şi
se adaugă 4 ml apă bidistilată din biuretă. Se obţine astfel diluţia de 1:500.
Pentru adaptarea ultramicroanalitică se iau 50 μl ser şi 4,95 ml apă pentru diluţia
1:100. Din aceasta se ia 1 ml şi se adaugă 4 ml apă (diluţia 1:500).
70
VII.2.3. DOZAREA CALCIULUI
Variaţii patologice:
Hipercalcemie:
- hiperparatiroidism (datorită mobilizării calciului de la nivel osos);
- nefropatii cronice (datorită deficitului de eliminare);
- mielom multiplu şi toate procesele cu osteoliză activă;
- hipervitaminoza D.
Hipocalcemie:
- hipoparatiroidism;
- rahitism;
- tetanie;
- hipovitaminoza D;
- subnutriţie.
Principiu:
Glioxal-bis(2-hidroxianil) formează cu ionii de calciu, în mediu metanolic
alcalin, un complex colorat a cărui absorbţie de lumină, măsurată la o lungime de
undă de 530-550 nm, este direct proportională cu concentraţia calciului seric.
71
Reactivi:
1. soluţie metanolică de GBHA 0,075 %;
2. hidroxid de sodiu 0,25 N;
3. soluţie standard de calciu (10 mg/dl).
Pregătirea materialului:
Probele de ser clare, nehemolizate pot fi analizate fără deproteinizare şi
diluţie folosind 20 µl (microprobe). Dacă nu avem la îndemână micropipete sau
serul este tulbure sau hemolizat, se face fie diluţie, fie deproteinizare în următorul
mod: la 0,10 ml ser se adaugă 2,40 ml apă distilată sau 0,10 ml metanol.
În situaţia în care se utilizează diluţia, analiza se efectuează în continuare pe un
volum de 0,50 ml. Proba tratată cu metanol se introduce pentru deproteinizare
3 minute într-o baie de apă la fierbere, apoi se adaugă 2,40 ml HCl 0,005 N şi se
păstrează în continuare pe baia de apă încă 5 minute la fierbere. Proba fierbinte se
centrifughează timp de 3 minute la 4000 de rotaţii/minut şi se continuă apoi analiza
pe un volum de 0,50 ml, supernatant, măsurat la temperatura camerei. La fel se va
proceda şi cu eprubetele standard şi martor care se consideră a fi diluat.
Tehnica de lucru:
În 3 eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 1):
Calcul:
Ca2+ (mg/dl) = Ep/Es x 10
72
VII.2.4. DOZAREA MAGNEZIULUI
Principiu:
În soluţie puternic alcalină, magneziul din ser formează particule coloidale
de Mg(OH)2. Colorantul galben de titan este adsorbit pe aceste particule şi
formează un complex colorat în roşu care este apoi stabilizat cu alcool polivinilic şi
dozat spectrofotometric la 540 nm.
Reactivi:
1. Soluţie stoc galben de titan. Se dizolvă 0,5 g galben de titan în 100 ml apă
bidistilată. Reactivul este stabil şi se păstrează în sticle de polietilenă.
2. Reactiv galben de titan (soluţie de lucru). Se diluează 2 ml din soluţia stoc la 100
ml cu apă bidistilată. Se prepară proaspăt de fiecare dată.
3. NaOH 7,5 %.
4. Reactiv alcool polivinilic: se dizolvă 1g alcool polivinilic în 400 ml apă
bidistilată, încălzindu-se uşor. Se răceşte şi se aduce la 1000 ml cu apă bidistilată.
Soluţia este stabilă şi se păstrează în sticle de polietilenă.
5. Standard de Mg2+ (soluţie stoc). Se dizolvă 8,358 g MgCl2·6H2O sau 8,8178 g
Mg(CH3COO)2·4H2O în apă distilată şi se aduce volumul la 1000 ml.
73
6. Standard de lucru. Se diluează 1 ml din soluţia precedentă la 200 ml cu apă
distilată. Se prepară de preferinţă proaspătă. Această soluţie conţine 5 μg ioni de
Mg/ml.
Tehnica de lucru:
Se pregătesc 4 eprubete pentru probă, proba martor şi două probe standard
(standard 1 şi standard 2), în care se adaugă reactivii conform următorului tabel:
Calcul:
Pentru calcul se foloseşte standardul a cărui extincţie este cea mai apropiată
de extincţia probei de analizat.
Pentru standardul 1:
Ep/Es1 x 0,005 x 100/0,2 = mg Mg2+/100 ml
Ep/Es x 2,5 = mg Mg2+/100ml
Pentru standardul 2:
Ep/Es2 x 0,01 x 100/0,2 = mg Mg2+/100ml
Ep/Es x 5 = mg Mg2+/100ml
Variaţii patologice:
Hipomagnezemia apare în:
- rahitism;
- tetanie;
- alcoolism;
- hiperaldosteronism;
- hipotiroidism;
- malabsorbţie.
74
Hipermagnezemia este întâlnită în:
- ciroze grave;
- insuficienţă renală;
- hipertiroidii;
- deshidratări;
- sindrom Cushing.
Principiu:
Serul de analizat se tratează cu acid clorhidric pentru a se elibera Fe3+ din
cadrul complexului Fe-transferină şi se precipită proteinele cu acid tricloracetic.
În filtrat trece Fe3+ care este redus cu hidrochinona la Fe2+. Fierul redus formează cu
o-fenantrolina un complex de culoare roşie care poate fi dozat prin spectrofometrie.
Reactivi:
1. HCl 1 N
2. Sol. Acid tricloracetic 20%
3. Sol. Hidrochinonă 2% (proaspăt preparată)
4. Sol. de o-fenantrolină clorhidrică 1% (se acidulează cu 2-3 picături de HCl
concentrat)
5. Sol. semisaturată de acetat de sodiu (se diluează o soluţie saturată în
proporţie de 1:1)
6. Sol. standard de fier 10 mg%: 0,0497 g FeSO4·7H2O la 100 ml apă
bidistilată
7. Sol. standard de lucru: se diluează 1 ml sol. standard stoc la 100 ml cu apă
bidistilată (1 µg Fe2+/ml).
Tehnica de lucru:
Se ia o eprubetă de centrifugă pentru probă şi 2 eprubete obişnuite pentru
martor şi standard, în care se introduc următorii reactivi conform tabelului de mai
jos (Tabelul 3):
75
Tabel 3. Tehnica dozării fierului
Reactivi (ml) Proba Martor Standard
Ser 2 - -
Apă distilată - 2 -
Sol. Standard (1µg Fe/ml) - - 2
HCl 1N 1 1 1
Proba se agită puternic, apoi 10 min. repaus
Acid tricloracetic 20 % 2 2 2
Proba se centrifughează la 3500 rpm Din acest amestec se scot:
Supernatant 2 2 2
Hidrochinonă 2 % 0,2 0,2 0,2
Sol. o-fenantrolină 1 % 0,1 0,1 0,1
Sol. semisat. de acetat de sodiu 2 2 2
Calcul:
µg Fe2+/100ml = Ep/Es x 100
Valori normale:
Femei = 80-130 µg/100 ml ser
Bărbaţi = 90-160 µg/100 ml ser
Variaţii patologice:
Hipersideremia: apare în anemia Biermer, anemii şi ictere hemolitice, hepatite
severe.
Hiposideremia: este întâlnită în anemii hipocrome, posthemoragice, feriprive, dar şi
în avitaminoze, tumori maligne, malabsorbţie, nefropatii cronice, infecţii cronice
etc.
76
Procedeul titrimetric Schales şi Schales
Principiu:
Ionii de clor sunt determinaţi prin titrare în mediu acid (pH < 3) cu azotat
mercuric cu care formează clorura mercurică nedisociată. Câtă vreme sunt prezenţi
ionii de clor, ionii de Hg+2 reacţionează pentru a forma HgCl2. La punctul final ionii
de Hg+2 în exces reacţionează cu indicatorul (difenilcarbazona) dând o coloraţie
violetă.
Tehnica de lucru:
Se introduc în 2 pahare Erlenmeyer de 25 ml următoarele soluţii (Tabelul 4):
Reactivi:
1. Soluţia de azotat de Hg 0,01 N: 1,083 g de oxid roşu de mercur sunt
dizolvaţi în 11 ml HNO3 conc. şi se diluează cu apă bidistilată până la 1000 ml.
Soluţia se mai poate prepara şi din azotat mercuric din care se dizolvă 1,6 g în 10 ml
HNO3 şi cca 700 ml apă, după aceea se aduce volumul la 1000 ml.
2. Soluţia indicator difenilcarbazona 0,01 M: se prepară cât mai puţină soluţie
în proporţia: 5 mg difenilcarbazona la 2 ml metanol sau etanol 950. Se păstrează în
frigider în flacon de culoare brună de preferinţă din polietilenă şi se utilizează timp
de o lună. După această perioadă culoarea soluţiei se schimbă din portocalie-
roşietică în galbenă, iar detectarea punctului final devine dificilă.
3. Soluţia H2SO4 conc. şi 53 părţi de apă.
4. Soluţie standard de clorură de potasiu 0,1 N: se dizolvă 7,455 g KCl (uscat
şi răcit în exicator) în apă bidistilată şi se completează cu apă la 1000 ml după care
se adaugă 1 ml cloroform. Se conservă un an la frigider, în vas de polietilenă.
5. Soluţie de wolframat de Na 10 %.
Calcul:
Fiecare ml soluţie azotat mercuric corespunde la 0,01 echivalenţi de clor.
77
sau:
ml azotat mercuric x 100 = mEg/l azotat mercuric
ml azotat mercuric x 586 = mg NaCl/100ml
ml azotat mercuric x 354,5 = mg Cl-/100 ml
Această formulă este valabilă dacă la titrarea soluţiei de KCl s-a folosit 1 ml
azotat mercuric.
Dacă acest volum diferă de 1 ml se va utiliza formula:
mEg Cl-/l = [ml azotat mercuric (proba) / ml azotat mercuric (standard)] x 100
Valori normale:
- clor plasmatic: 355-375 mg%; 100-105 mEg/l;
- clor globular: 180 mg%; 0-52 mEg/l;
- raport eritroplasmatic: 0,50 – 0,52.
Variaţii patologice :
Hipercloremii:
- acidoze metabolice;
- aport crescut de cloruri (când rinichiul are o funcţie deficientă);
- în afecţiuni care reduc eliminările de cloruri (nefropatii interstiţiale, acidoza
tubulară renală, intoxicaţii).
Creşterea raportului Cl- globular/Cl- plasmatic se întâlneşte în nefrite cronice cu
azotemie crescută.
78
Hipocloremii:
- diaree;
- vărsături;
- administrări îndelungate de medicamente diuretice;
- insuficienţe renale cronice şi acute.
VII.2.7. FOSFORUL
Principiu:
Se precipită proteinele cu acid tricloracetic, apoi din filtrat, fosfatul
anorganic împreună cu molibdatul de amoniu, în mediu acid, formează
fosfomolibdatul de amoniu (un precipitat de culoare galbenă). Ulterior acesta este
redus la albastru de molibden, solubil în apă, care se măsoară spectrofotometric la o
lungime de undă de 660 nm.
Reactivi:
1. Sol. acid tricloracetic 20 %.
2. Sol. molibdat de amoniu: 25 g molibdat de amoniu se dizolvă în 300 ml apă
distilată, se adaugă 75 ml acid sulfuric conc. şi se completează la 500 ml cu apă
distilată.
3. Sol. hidrochinonă 1% : 1 g hidrochinonă se dizolvă în 60 ml apă distilată cu o
picătură de acid sulfuric concentrat şi se completează cu 100 ml apă distilată.
Soluţia se poate păstra câteva zile la frigider.
4. Sol. sulfit de sodiu 20% (Na2SO3·7H2O). Se prepară în momentul întrebuinţării.
79
5. Sol. stadard stoc PO43- = 0,1 P mg/ml : se cântăresc 0,493 g KH2PO4, se dizolvă
în 1000 ml apă distilată în balon cotat.
6. Sol. standard de lucru (10µg P/ml): se diluează 10 ml sol. standard stoc cu 90 ml
apă distilată, în balon cotat de 100 ml.
Tehnica de lucru:
La 2 ml ser sau plasmă se adaugă 4 ml apa distilată şi 4 ml soluţie acid
tricloracetic 20%. Se agită pentru amestecare, se lasă în repaus 20 minute după care
se centrifughează sau se filtrează. După această operaţie, se pregătesc 3 eprubete în
care se introduc următorii reactivi (Tabelul 5):
Calcul:
Ep/Es x 3 = mg P/100 ml ser
Valori normale:
- adulţi: 3,5-5 mg/100 ml ser;
- copii: 4-7 mg /100 ml ser
Variaţii patologice:
Hiperfosfatemie:
- hipoparatiroidism;
- acromegalie, gigatism;
- hipervitaminoza D;
- insuficienţă renală acută şi cronică;
- leucemie.
Hipofosfatemie:
- hiperparatiroidism;
- hipovitaminoza D (rahitism si osteomalacie).
80
Probleme:
1. Deshidratările izotone:
a. Sunt rezultatul pierderilor concomitente şi echilibrate de apă şi electroliţi
b. Pot fi produse de hemoragii acute
c. Duc la instalarea hipovolemiei
d. Toate răspunsurile sunt corecte
e. Nici o variantă de răspuns nu este corectă
81
LUCRAREA 5
R R
│ + │
H2N—C—COOH H3N—C—COO−
│ │
H H
82
Identificarea aminoacizilor se bazează pe următoarele tipuri de reacţii de
culoare:
- reacţii generale datorate grupărilor funcţionale ale aminoacizilor: carboxil şi
amino;
- reacţii datorate radicalilor din molecula aminoacizilor şi care sunt, de obicei,
specifice pentru aminoacizii care au radical diferit.
O O
OH -
H
+ R - CH - COO + R - CH = O + CO2 + NH3
OH + OH
NH3
O O
O O O HO
OH H
+ NH3 + N
OH OH
O O O O
83
VIII.2. REACŢII DE IDENTIFICARE A AMINOACIZILOR
DATORATE GRUPǍRII CARBOXIL
Tehnica de lucru:
Peste soluţia unui aminoacid se adaugă NaOH pentru alcalinizare, după care
se adaugă o soluţie de CuSO4. Se observă apariţia unei coloraţii albastre. Această
reacţie este utilizată şi la dozarea spectrofotometrică a unui aminoacid.
Reactivi :
1. Soluţie de aminoacid de concentraţie necunoscută;
2. Soluţie standard de alanină (40 nM);
3. Suspensie Cu3(PO4)2.
Tehnica de lucru:
Deoarece reactivul de culoare este el însuşi colorat este necesară prepararea
unui martor. Conversia extincţiei în concentraţie se va face pe seama unei curbe de
etalonare efectuate cu o soluţie standard de alanină (Tabelul 1).
84
VIII.3. REACŢII DE IDENTIFICARE A AMINOACIZILOR
DATORATE RADICALULUI R
O2N
2HNO3
HO CH2 - CH - COOH HO CH2 - CH - COOH
2H2O
NH2 NH2
O2N
Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. HNO3 conc.
3. NH4OH conc.
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se iau 2 – 3 ml soluţie proteică la care se adaugă
aproximativ 1 ml HNO3 conc. Se constată apariţia unui precipitat alb. Se fierbe 1-2
minute, se răceşte şi se adaugă NH4OH (2 ml) până la apariţia unui precipitat
galben portocaliu.
ON
85
Reactivi:
1. Soluţie de tirozină 1 g% sau soluţie apoasă de proteine;
2. Reactiv Millon (5g Hg + 10 ml HNO3 + 30 ml apă distilată).
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se iau 2 ml soluţie proteică şi se adaugă 0,5 ml reactiv
Millon. Se observă apariţia unui precipitat alb. Se încălzeşte eprubeta la 50-600C
după care precipitatul devine roz.
HOOC COOH
H2N - CH CH - NH2
Reactivi :
1. Soluţie proteică concentrată
2. Acid acetic glacial
3. H2SO4 conc.
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se iau 1-2 ml soluţie proteică concentrată, se adaugă 0,5 ml
acid acetic glacial şi se lasă să se prelingă pe pereţii eprubetei 0,5-1 ml H2SO4
conc. La limita de separare apare un inel violaceu.
86
VIII.3.4. Reacţia Sakaguchi
Este specifică pentru arginină. Datorită restului guanidinic, arginina
reacţionează cu α-naftolul în prezenţa hipobromitului de sodiu şi formează o
coloraţie roşie.
O
HN = C - NH2 HN = C - N
OH Br
NH NH O
NaOBr
(CH2)3 + 2 (CH2)3
CHNH2 CHNH2
COOH COOH
Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Soluţie de hipobromit de sodiu (1 ml NaOH 33% + 2 picături de apă de brom);
3. Soluţie α-naftol 0,1 N;
4. NaOH 10%
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se ia 1 ml soluţie proteică diluată, se alcalinizează cu 1 ml
NaOH 10%, apoi se adaugă 1 ml α-naftol şi hipobromit de sodiu, picătură cu
picătură, până la apariţia unei coloraţii vişinii, care indică prezenţa argininei sau a
compuşilor cu grupări guanidinice. La încălzire culoarea dispare.
N CH2 - CH - COOH
+
NH2 + 2[N N SO3H + N2CO3
N
H
NH2
CH2 - CH - COOH
N
NaO3S N =N N =N SO3Na
N
H
87
Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Acid sulfanilic (5 g la 1000 ml apă distilată);
3. Na2CO3 5 g%;
4. NaNO2 2-3 g%.
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se tratează 1 ml acid sulfanilic cu 2 ml NaNO2 pentru a
forma acid diazobenzensulfonic. Se adaugă 1 ml soluţie proteică diluată şi 3-4 ml
Na2CO3. Se obţine o culoare portocalie care se intensifică la încălzire.
CH2SH CH2OH
CH - NH2 + 2NaOH CH - NH2 + Na2S + H2O
COOH COOH
Reactivi:
1. Soluţie proteică concentrată;
2. NaOH 10%;
3. Pb(CH3-COO)2 soluţie saturată.
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se iau 3 ml soluţie proteică concentrată şi acelaşi volum de
NaOH 10%. După o fierbere de 3 – 5 minute se adaugă acetat de plumb şi se fierb
din nou. Se obţine un precipitat de sulfură de plumb de culoare neagră.
88
HOOC
O2N S
+ HS - CH2 - CH - COOH
O2N S NH2
HOOC
HOOC
HOOC
Reactivi:
1. Soluţie de clorhidrat de cisteină 0,2 mM în tampon fosfat 0,05 M, pH 7,4;
2. Soluţie DTNB (0,0149 g DTNB se dizolvă în 130 ml tampon fosfat 0,05 M,
pH = 7,4 şi se completează la 250 ml cu etanol 95%);
3. Tampon fosfat 0,05 M, pH=7,4;
4. Soluţie proteică de analizat sau ser sanguin.
Tehnica de lucru:
Se pregătesc o serie de eprubete conform tabelului 2:
89
VIII.5. DOZAREA AMINOACIZILOR PRIN METODA SŐRENSEN
Principiu:
Într-o primă etapă aminoacidul formează cu formaldehida un produs ce are
gruparea aminică blocată. Aminoacidul rămâne doar cu gruparea carboxil liberă,
care conferă caracterul acid. Astfel, în a doua etapă gruparea carboxil poate fi
neutralizată cu NaOH în prezenţa fenolftaleinei.
Reactivi:
1. Soluţie de aminoacid de concentraţie necunoscută;
2. Soluţie aldehidă formică 10% neutralizată cu NaOH în prezenţa fenolftaleinei;
3. HCl 1%;
4. NaOH 0,1N.
Tehnica de lucru:
a) Pregătirea martorului:
Deoarece aminoacizii formolizaţi sunt acizi slabi, sărurile lor cu hidroxizii
alcalini hidrolizând puternic, pentru a putea fi dozaţi se împiedică hidroliza prin
titrare la un pH alcalin (9-9,5). Din această cauză este necesară pregătirea unui
martor şi supratitrarea probei până la culoarea martorului. Astfel, într-un pahar
Erlenmeyer se fierb 20 ml apă distilată, se adaugă 10 ml aldehidă formică
neutralizată, 10 picături fenolftaleină şi 0,4 ml NaOH 0,1 N, măsuraţi cu biureta. Se
obţine o culoare violetă.
b) Dozarea solutiei de aminoacid:
Într-un pahar Erlenmeyer se introduc 10 ml soluţie de aminoacid, se adaugă
NaOH 0,1 N (sau HCl 1%) până se obţine o culoare slab roz. Se adaugă 10 ml
aldehidă formică neutralizată şi se titrează cu NaOH 0,1 N până când se obţine
intensitatea de culoarea martorului. Se notează cu N, numărul de mililitri de NaOH
utilizaţi la titrare.
Calcul:
C – concentraţia aminoacidului, exprimată în mg glicocol/l soluţie
7,5 – echivalentul glicocolului
0,4 – reprezintă ml NaOH 0,1 N adăugaţi martorului şi respectiv ml NaOH 0,1 N
cu care s-a supratitrat proba.
90
( N 0,4) x7,5 x1000
c mg glicocol/ 1000ml solutie
10
unde:
N – ml NaOH 0,1 N cu care s-a supratitrat proba prin aducere la intensitatea de
culoare a martorului;
0,0014 – echivalentul azotului.
Interpretarea rezultatelor:
În mod normal cantitatea de aminoacid eliminată în 24 de ore variază între
50-500 mg azot, ceea ce reprezintă aproximativ 2 g acizi aminaţi liberi sau legaţi.
Aproximativ 70% din această valoare este reprezentată de taurină, glicocol,
histidină, metilhistidină şi variază cu regimul alimentar şi vârsta.
Variaţii patologice se înregistrează în afecţiuni hepatice, diabet grav, acidoză,
cancer.
F
NO2
NO2
+ H2N - CH - R O2N NH - CH - R
COOH COOH
NO2
Reactivi:
1. Indicator: 100 mg fenolftaleină se dizolvă în 100 ml etanol.
2. NaOH 200 mmol/l
3. Reactiv 2,4-dinitrofluorbenzen. Se dizolvă 650 l reactiv în 50 ml acetonă.
Se poate păstra 2 luni la 40C.
4. Na2B4O7 132 mmol/l (50 g Na2B4O7 x 10H2O se dizolvă într-un litru apă).
Se prepară înainte de utilizare.
91
5. Soluţie de 2,4-dinitrofluorbenzen de lucru. Înainte de utilizare se prepară o
soluţie de 2,4-dinitrofluorbenzen prin diluarea soluţiei stoc. Astfel un volum din
soluţia stoc se diluează cu 9 volume de tetraborat de sodiu.
6. HCl în dioxan. 2 ml acid clorhidric concentrat se diluează cu 100 ml dioxan.
7. Soluţie standard stoc de aminoacid 20 mmol/l. Se dizolvă 1,471 g acid glutamic
şi 0,751 g glicină în 100 ml apă, la care se adaugă 2 g benzoat de sodiu şi 700 ml
HCl 1 mol/l, apoi aducem cu apă distilată la 1 litru.
8. Soluţie standard de aminoacid de lucru. Se diluează 1, 2, respectiv 4 ml din
soluţia standard stoc de aminoacid la 10 ml cu apă rezultând soluţii ce conţin 2, 4,
respectiv 8 mmol aminoacid/l.
Tehnica de lucru:
Într-un pahar de 100 ml se măsoară 1 ml urină (din urină colectată în 24 de
ore) şi se adaugă 10-15 ml apă. Se adaugă 2-4 picături indicator şi NaOH până
când soluţia devine roz. Se fierbe uşor timp de 15 minute adăugând din nou picături
de NaOH în acest timp, până ce soluţia colorată în roz nu se mai decolorează.
Dacă este necesar se adaugă apă pentru prevenirea evaporării la sec.
Se iau 3 eprubete în care se introduc următorii reactivi:
- În eprubeta ce constituie proba se adaugă 1 ml urină diluată şi 1 ml DNFB de
lucru;
- În a doua eprubetă ce constituie martorul de urină, se introduce 1 ml urină diluată
şi 1 ml tetraborat;
- În a treia eprubetă ce va conţine reactivul martor, se introduc 1 ml apă şi 1 ml
DNFB de lucru.
Eprubetele se incubează 15 minute la 700C, apoi se lasă să stea 5-10 minute
la temperatura camerei, după care se adaugă 5 ml dioxan în HCl.
Se citeşte extincţia probei, a urinei martor şi a reactivului martor la 420 nm
faţă de o soluţie ce conţine 1 ml apă şi 5 ml dioxan în HCl. Pentru pregătirea
standardului tratăm 1 ml din fiecare din cele 3 diluţii ale soluţiei standard de
aminoacid în aceleaşi condiţii ca şi urina, după care se citeşte extincţia.
Calcul:
Azot aminoacidic urinar (mmol/24h) =
Ep/Es x 20 (40 sau 80) x factorul de diluţie/1000 x volumul urinei din 24h (ml)
Probleme:
92
LUCRAREA 6
93
O R2 H
H2N N COOH
2 N
R1 H O R3
OH R2 4NaOH
Cu(OH)2
H2 N N COOH
2 N
R1 OH R3
Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată
2. Uree cristalizată
3. Soluţie CuSO4 1g%
4. Soluţie NaOH 10%
NaOOC R3
R3-CH CH-COONa
O N N O
C C
Cu
R1 N N R1
NaO-C C-ONa
R2 R2
proteinat de cupru
Tehnica de lucru:
Reacţia se efectuează comparativ pe 3 probe: soluţie proteică, biuret şi un
martor.
Într-o eprubetă uscată se iau aproximativ 0,2 g de uree şi se încălzesc până
la topirea cristalelor, cu eliminare de amoniac, ceea ce denotă transformarea ureei
în biuret. Masa obţinută se dizolvă în 1-2 ml apă şi se adaugă acelaşi volum de
NaOH 10 % şi 2-3 picături de CuSO4. Apare o coloraţie roz-violacee.
În altă eprubetă se iau 1-2 ml soluţie proteică diluată, acelaşi volum de
NaOH 10 % şi 2-3 picături de CuSO4, apare o culoare violetă.
În eprubeta martor se iau 1-2 ml apă, acelaşi volum de NaOH 10 % şi 2-3
picături de CuSO4, apare o culoare albastră dată de Cu(OH)2.
Reacţia are o sensibilitate de 1:10000 şi este mult aplicată pentru dozarea
proteinelor prin metoda Gornall.
94
IX.1.2. Reacţia cu beta-naftochinona
Aminoacizii, peptidele şi proteinele cu grupări alfa-aminice libere se
condensează în mediu alcalin cu formarea unei coloraţii roşii sau roşie-brună.
O O OH
O R OH OH
2 + HC - NH2 +
-
COO
-
N - CH - COO
R
Reactivi:
1. Soluţie de aminoacizi, de peptonă şi soluţie proteică diluată;
2. Soluţie carbonat de sodiu 2%;
3. Soluţie β-naftochinonsulfonat 10 g%.
Tehnica de lucru:
Se iau în eprubete diferite câte 1 ml soluţie de aminoacid, peptonă şi soluţie
proteică diluată şi în fiecare se adaugă câte 1 ml soluţie carbonat de sodiu şi apoi cu
picătura reactivul β-naftochinonă. După scurt timp se observă în toate eprubetele
apariţia unei coloraţii roşii sau roşie-brună cu nuanţe şi intensităţi diferite în funcţie
de numărul grupărilor α-aminice libere.
95
Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Soluţie saturată de sulfat de amoniu;
3. Sulfat de amoniu cristalizat;
4. Clorură de sodiu cristalizată;
5. Sulfat de sodiu cristalizat.
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 2 ml soluţie proteică diluată şi se tratează cu un
volum egal de soluţie saturată de sulfat de amoniu. Se obţine astfel o soluţie
semisaturată de sulfat de amoniu în care după câtva timp precipită globulinele.
Se filtrează şi peste soluţia obţinută se adaugă cristale fine de sulfat de amoniu
până la saturare, se observă formarea precipitatului de albumină. Metoda serveşte
la separarea albuminelor de globuline din ser.
Într-o serie de alte eprubete se tratează 2 ml soluţie proteică diluată cu
NaCl, MgSO4 şi Na2SO4 până la saturare când precipită o parte din proteine, se
filtrează şi se acidulează soluţia cu acid acetic. Se observă apariţia unui nou
precipitat: albuminele.
2. Precipitarea cu alcool
Reacţiile se bazează pe proprietatea proteinelor de a deveni insolubile în
prezenţa unor solvenţi organici. Unii din agenţii precipitanţi (alcool, acetonă)
fixează apa din molecula proteinelor ai căror radicali lipsiţi de apă floculează.
Concentraţia optimă în alcool, pH-ul, temperatura de precipitare constituie
parametrii care variază de la o proteină la alta. Precipitarea proteinelor cu alcool se
foloseşte la separarea proteinelor din ser.
Reactivi:
1. Soluţie proteică;
2. Alcool de 950.
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se iau 2 ml soluţie proteică, 2 ml alcool şi se agită puternic.
După câtva timp va apare un precipitat fin de proteină. Adăugând peste precipitat
10 ml apă, acesta se redizolvă, prin diluarea alcoolului.
96
Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Soluţie Pb(CH3-COO)2 0,5%;
3. Soluţie CuSO4 1g%;
4. Soluţie AgNO3 3g%.
Tehnica de lucru:
În 3 eprubete se introduce câte 1 ml soluţie proteică şi se adaugă în prima
soluţia de acetat de plumb, în a doua soluţia de sulfat de cupru şi în a treia soluţia
de azotat de argint. În toate eprubetele se observă apariţia unui precipitat.
Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Acid acetic 1 g% şi 10 g%;
3. Soluţie apoasă saturată de tanin;
4. Soluţie apoasă saturată de acid picric;
5. Soluţie de hexacianoferat (II) de potasiu 10 g%.
Tehnica de lucru:
În 3 eprubete se iau câte 2-3 ml soluţie proteică. În prima se adaugă 1-2 ml
acid acetic 1g% şi 1-2 ml tanin, în a doua se adaugă 1-2 ml acid acetic 1% şi 1 ml
soluţie de acid picric, iar în a treia 1 ml acid acetic 10% şi câteva picături de
ferocianură de potasiu. În toate eprubetele se observă apariţia unui precipitat.
Tehnica de lucru:
În 3 eprubete se introduc câte 1 ml de acid azotic, clorhidric, respectiv
sulfuric şi apoi cu precauţie câte 1 ml din soluţia de proteină în fiecare eprubetă.
La suprafaţa de separare dintre cele două soluţii se obţin precipitate albe sub formă
de disc (inel). Apoi eprubetele se agită. Precipitatele formate se dizolvă în exces de
acid clorhidric şi sulfuric, dar nu şi în exces de acid azotic. Precipitarea proteinelor
cu acid azotic concentrat serveşte pentru punerea în evidenţă a proteinelor din urina
patologică.
97
4. Precipitarea proteinelor cu acizii organici
Acidul tricloracetic, acidul sulfosalicilic, amestecul de acid citric-picric
(reactivul Essbach) sunt frecvent utilizaţi pentru precipitarea proteinelor din
lichidele biologice.
Tehnica de lucru:
Peste 2-3 ml soluţie proteică se adaugă 0,5-1 ml soluţie acid tricloracetic cu
apariţia unui precipitat alb abundent.
- - -
+........ O3S +........ O3S COO ........+
sau
-
+........ O3S OH
Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Soluţie acid sulfosalicilic 15-20 g la 100 ml apă bidistilată;
Tehnica de lucru:
Se iau într-o eprubetă 1-2 ml soluţie proteică peste care se adaugă cu
picătura aproximativ 0,5 ml soluţie de acid sulfosalicilic. Apare un precipitat alb
sub forma unui nor care permite urmărirea mersului picăturii de reactiv. Această
metodă are o mare sensibilitate, fapt care o recomandă la analiza urinii.
98
5. Precipitarea proteinelor prin încălzire
Majoritatea proteinelor prin încălzire la diferite temperaturi coagulează şi se
produce o precipitare ireversibilă. Precipitarea este maximă la punctul izoelectric al
proteinei, şi, în consecinţă, la acest tip de precipitare un rol deosebit îl are pHi.
Prezenţa diferitelor săruri favorizează, de asemenea, precipitarea.
Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Soluţie acid acetic 1 % si 10 %;
3. Soluţie NaCl saturată;
4. Soluţie NaOH 10%.
Tehnica de lucru:
În 5 eprubete se iau câte 2 ml soluţie proteică.
- în prima nu se adaugă nici un reactiv, ci se încălzeşte direct în flacară. Se observă
apariţia unui precipitat.
- în a doua eprubetă se adaugă 1-2 picături acid acetic 1 % şi se încălzeşte.
Precipitarea este mai rapidă şi mai completă, deoarece pH-ul soluţiei este mai
aproape de pHi al proteinei.
- în a treia eprubetă se adaugă 0,5 ml acid acetic 10 %. Precipitatul ce apare este
mai puţin abundent faţă de cel din eprubeta a doua, sau chiar inexistent datorită
depăşirii pHi al proteinei.
- în a patra eprubetă se adaugă 0,5 ml acid acetic 10 % si 0,5 ml soluţie NaCl
saturată. La încălzire apare un precipitat favorizat de NaCl.
- în a cincea eprubetă se adaugă 0,5 ml soluţie NaOH 10 %. Se observă că proteina
nu precipită nici la încălzire, mediul fiind prea alcalin.
99
Sarcina electrică globală a unei proteine este suma algebrică a sarcinilor
pozitive şi negative şi care depinde de reacţia (pH-ul) mediului. În mediu alcalin
proteina posedă o încărcare electrică negativă, iar în mediu acid o încărcare
electrică pozitivă.
Pentru fiecare proteină există o concentraţie a ionilor de hidrogen la care
suma algebrică a sarcinilor pozitive şi negative este egală cu zero, proteina fiind
indiferentă faţă de curentul electric. Acest pH al mediului se numeşte punct
izoelectric. La acest pH proteina precipită deoarece are cea mai mică presiune
osmotică şi cea mai mică solubilitate.
În consecinţă, proteinele în soluţii tampon cu pH corespunzător pHi pierd
sarcinile electrice, devin neutre, nestabile şi precipită. Adaosul de solvenţi organici
(alcool, acetonă) favorizează precipitarea. pH-ul izoelectric reprezintă o constantă
importantă deoarece fiecare proteină are un pHi caracteristic, de exemplu:
hemoglobina = 6,8; caseina = 4,7 ; gelatina = 4,6.
Reactivi:
1. Soluţie de caseină 0,5 %: 0,25 g caseină pură se suspendă în 20 ml apă
distilată, se adaugă apoi 5 ml NaOH 1N şi după neutralizare cu 5 ml acid acetic 1N
se completează cu apă la 50 ml.
2. Soluţii de acid acetic: 1N, 0,1N, 0,01N.
Tehnica de lucru:
În 9 eprubete se prepară soluţiile indicate în tabelul de mai jos, se adaugă
soluţia de caseină şi se agită. După 15 minute se notează gradul de precipitare din
fiecare eprubetă. pH-ul eprubetei care prezintă precipitarea maximă corespunde
punctului izoelectric al caseinei (Tabelul 1).
100
Probleme:
101
LUCRAREA 7
ν = c/λ
8
unde c = 3 · 10 m/s = viteza luminii în vid.
102
În urma interacţiunii unui sistem (substanţă) cu o radiaţie incidentă, pot
apărea:
- o parte din radiaţia incidentă este absorbită. Specia absorbantă înaintea
interacţiunii e în stare neexcitată, care după absorbţia de energie trece într-o stare
excitată cu un nivel energetic ridicat (are loc saltul electronilor de pe un anumit
nivel energetic –HOMO- pe unul superior-LUMO) (Figura 14). Starea excitată are
o viaţă scurtă (în medie 10-8 secunde) şi revine la nivelul energetic iniţial eliberând
energia absorbită anterior (mai redusă ca intensitate) sub formă de energie calorică
sau chimică;
- o altă parte a radiaţiei incidente este difuzată de particulele/componentele
sistemului (stă la baza metodelor nefelometrice si turbidimetrice);
- trecerea radiaţiei prin sistem poate determina schimbarea direcţiei (vitezei) de
propagare (stă la baza proceselor de refracţie şi polarimetrice).
O radiaţie policromă (ex. lumina solară care acoperă tot domeniul vizibil)
este compusă din fotoni cu diferite energii, lungimi de undă, frecvenţe. O radiaţie
monocromatică este alcătuită din fotoni cu aceeaşi lungime de undă.
Culoarea unei substanţe depinde de absorbţia sau de reflectivitatea acesteia.
Culoarea percepută de ochiul uman este culoarea complementară celei absorbite
(Figura 15).
103
Figura 15. Absorbanţa şi culorile complementare [39]
I = I0 · 10 - εcl
I = intensitatea luminii transmise;
I0 = intensitatea luminii incidente
ε = coeficient molar de extincţie, constantă, depinde de structura substanţei;
c = concentraţia (%, g/l);
l = grosimea stratului absorbant (cm).
T = I/I0
104
Logaritmul cu semn schimbat al transmisiei se numeşte extincţie (E),
densitate optică (DO) sau absorbanţă (A).
E = –logT
Io
E log cl
I
Determinări calitative
Moleculele care conţin electroni π absorb în UV (200-400 nm), iar cele care
prezintă cel puţin un sistem de duble legături conjugate absorb în vizibil (400-800
nm). Prezenţa în structura substanţelor organice a unei legături nesaturate, a unui
105
cromofor, determină absorbţia luminii în acest domeniu de lungime de undă.
Maximul de absorbţie al unui cromofor poate fi influenţat de celelalte grupări
funcţionale din jurul acestuia, de solvent, pH şi temperatură.
Determinări cantitative
Concentraţia probei de analizat se determină prin următoarele metode:
1. Metoda grafică: prin interpolare pe curba de etalonare;
2. Folosind factorul de pantă (F): reprezintă cotangenta unghiului format de
curba de etalonare cu abscisă.
Extincţiile se citesc faţă de un martor (blanc) care conţine toţi reactivii folosiţi în
tehnica respectivă cu excepţia compusului de analizat.
Cproba = Eproba / ε · l
106
X.1.4. Principiul de funcţionare a unui spectrofotometru
107
apărarea specifică şi nespecifică a organismului (factori de coagulare,
imunoglobuline);
menţinerea echilibrului acido bazic.
Principiu:
Proteinele reacţionează cu Cu2+ în mediu alcalin şi formează complecşi
coloraţi în violet. Intensitatea culorii se măsoară spectrofotometric şi este
proporţională cu cantitatea de proteină din probă.
Reactivi:
1. Reactivul Gornall: tartrat dublu de Na şi K 45g, KI 5g, CuSO4∙5H2O 15g şi
NaOH 8g, care se dizolvă într-un litru de apă distilată.
2. Soluţie standard de proteină 10 mg/ml
3. Ser.
Tehnica de lucru:
În 3 eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 1):
108
Calcul:
mg proteină/ml = Ep/Es x 200
109
- intensificarea catabolismului - febră
- inflamaţii
- hipertiroidism
- neoplasme
- hiperhidratarea - administrare intravenoasă rapidă de lichide
- pseudohipoproteinemie: prin diluţie (recoltare de pe branulă)
- intoxicaţii - benzen
- fosfor
- tetraclorura de carbon
110
Probleme:
111
LUCRAREA 8
XI.1. ELECTROFOREZA
Electroforeza este metoda cea mai accesibilă clinic pentru separarea
macromoleculelor încărcate electric pe baza mobilităţii lor într-un câmp electric.
Astfel, migrarea particulelor în câmpul electric se produce spre polul de semn opus
încărcării particulelor respective, particulele încărcate pozitiv vor migra spre
electrodul încărcat negativ (catod), iar cele încărcate negativ spre polul pozitiv
(anod).
Viteza de migrare a ionilor depinde de mai mulţi factori şi anume:
sarcina electrică;
mărimea şi forma particulelor;
tensiunea aplicată;
forţa ionică;
pH-ul electrolitului;
temperatura şi vâscozitatea;
natura suportului solid (hârtie cromatografică, acetat de celuloză, gel).
În acest sens, viteza de migrare este invers proporţională cu dimensiunea
(greutatea) particulelor şi direct proporţională cu sarcina lor electrică; deci
particulele cele mai uşoare şi mai puternic încărcate vor migra cel mai repede şi se
vor deplasa cel mai departe pe suportul de migrare.
Numărul ionilor pozitivi sau negativi este funcţie de natura macromoleculei,
de pH-ul şi de tăria ionică a mediului. În acest sens la punctul izoelectric, când toate
sarcinile pozitive sunt egale cu cele negative, nu are loc migrarea electroforetică.
Sunt cunoscute mai multe tipuri de electroforeză, în cele mai multe cazuri
fiind diferit suportul pe care se realizează migrarea electroforetică a particulelor.
Astfel cele mai des utilizate în laboratoarele clinice sunt:
Electroforeza pe hârtie folosită ca metodă analitică şi micropreparativă;
datorită avantajelor pe care le prezintă, se răspândeşte pe scară din ce în ce
mai mare.
Electroforeza în geluri de agaroză reprezintă metoda standard de analiză a
proteinelor şi în principal a acizilor nucleici ADN.
Electroforeza este folosită în special în chimia aminoacizilor, peptidelor,
proteinelor, zaharurilor şi a componentelor acizilor nucleici, astfel putând fi
separate: lipoproteine, imunoglobuline, izoenzime şi hemoglobine.
Astăzi cea mai larg utilizată metodă de electroforeză este cea a proteinelor
serice sau din alte lichide biologice.
112
XI.1.1. Electroforeza proteinelor serice
113
- diversificarea parametrilor investigaţi (proteine, lipoproteine, izoenzime,
hemoglobine normale şi patologice);
- aplicabilitatea în cazul mai multor lichide biologice (ser, dar şi urina, LCR
şi altele), precum şi faptul că pentru aceste lichide nu mai este nevoie de
concentrarea lor, fiind astfel înlăturat un neajuns important care făcea, de
multe ori, impracticabilă metoda pentru electroforeza proteinelor urinare,
din LCR şi din alte fluide hipoproteice.
Componentele aparatului de electroforeză sunt în mare parte identice
indiferent de metodele utilizate sau de producătorul sistemului (Figura 17).
Acestea vor include obligatoriu următoarele componente:
Tehnica de lucru:
Se umplu cuvele aparatului de electroforeza cu soluţia tampon, astfel încât
electrozii să fie inundaţi.
Serurile de studiat se vor aplica cu ajutorul pipetelor la nivelul godeurilor
de pe plăcile de migrare, iar apoi aceste folii (plăci) se aşază în camera umedă între
114
cele două cuve, având grijă ca cele două capete ale plăcii să fie imersate în soluţia
tampon. Se deschide întrerupătorul de la redresorul de curent, se setează tensiunea
la 100V şi timpul de operare la 15-20 minute. După acest interval se întrerupe
curentul şi se scot foliile complet transparente şi lipsite de gel, dar conţinând
fracţiunile proteice încă invizibile.
Paşii următori cuprind imersia plăcii în amestecul de colorant şi fixator de 3
ori consecutiv timp de 10 minute, urmat de spălarea şi uscarea plăcii.
La final pe suprafaţa foliei vor apărea colorate benzile corespunzătoare
fiecărei fracţiuni proteice. Determinarea cantitativă a fracţiunilor proteice se face
prin scanare densitometrică cu ajutorul densitometrului care interpretează gelurile
şi se vor putea apoi vizualiza curbele pentru fiecare probă, variaţiile absorbţiei fiind
interpretate grafic pe o axă XY, obţinându-se direct fracţiunile proteice respective,
urmând a fi apoi printate şi arhivate de imprimanta analizorului.
Valori normale
Modul în care realizăm procesul electroforetic ne permite separarea
proteinelor serice în 5 fracţiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta, gama globuline) la pH
9.2 sau in 6 fractiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta 1, beta2, gama globuline) la pH
8.5.
115
Proteinemia normală presupune o valoare totală normală şi o repartiţie
procentuală caracteristică a fiecărei fracţiuni proteice:
Variaţii fiziologice
Electroforeza proteinelor serice ale sugarului este asemănătoare cu cea a
adultului, dar prezintă o scădere a vârfului γ-globulinelor, mai ales în perioada de 3
– 6 luni când există o hipo-gamaglobulinemie fiziologică.
La adulţi electroforegrama este cea descrisă mai sus, fără diferenţe majore
între cele două sexe. Nu se observă nici o variaţie semnificativă a valorilor la femei
pe durata ciclului menstrual.
La vârstnici se observă în general o scădere a vârfului γ-globulinelor
asemănătoare cu scăderile din deficitele imune şi o hipoalbuminemie. 75 % dintre
bătrâni prezintă o hipoproteinemie datorată scăderii simultane a albuminelor şi
imunoglobulinelor.
Variaţiile determinate de oboseală (diminuarea gamaglobulinelor) şi de
condiţiile climatice sunt relativ reduse. O dietă deficitară în proteine poate influenţa
traseul electroforetic în sensul diminuării albuminelor şi creşterii globulinelor, în
special a fracţiunii beta.
Sarcina, mai ales în al treilea trimestru, determină o diminuare a
albuminelor şi o creştere a α2 şi β-globulinelor, în timp ce γ-globulinele au valori
normale.
Variaţii patologice
Creşterea raportului albumine/globuline nu are importanţă prea mare, dar
scăderea acestuia sub cifra 1 sugerează boli care scad sinteza de albumină sanguină
sau boli care cresc sinteza de globuline. Cauzele care duc la scăderea albuminelor
sunt aceleaşi care produc şi scăderea proteinelor totale.
Variaţiile concentraţiilor fracţiunilor majore au corespondenţă în diferite
stări patologice:
116
a)Albumina
Creşterea fracţiei albuminei se constată în:
- alimentaţie excesivă;
- mielom multiplu, boala Waldenström, colagenoze, sarcoidoză;
- stări de hemoconcentraţiei şi deshidratare (vărsături, diaree,
transpiraţii abundente);
- creştere relativă: după administrarea unor medicamente (corticosteroizi,
insulină, steroizi anabolici, mialgin, morfină, tiroidă).
b) Globuline
Scăderea globulinelor are valoare prognostică importantă în hepatite.
α1-globuline:
Creşterea fracţiei:
- apare în infecţii acute şi cronice, glomerulonefrită acută şi
cronică, poliartrită, lupus eritematos.
Scăderea fracţiei:
- apare în insuficienţă hepatică acută şi în sindrom nefrotic.
α2-globuline:
Au valoare diagnostică foarte redusă şi valoare prognostică pentru
hepatitele grave.
Valori scăzute:
- izolate sau asociate cu scăderea α1-globulinelor în ciroze hepatice
severe sau oricare afecţiune hepatică gravă!
Valori crescute:
- sindrom nefrotic, cancere hepatice severe, atrofie hepatică, hepatite
epidemice şi ictere mecanice de cauză neoplazică (creşteri uşoare).
117
β-globuline
Au valoare diagnostică şi prognostică pentru gravitatea hepatitelor.
Valori scăzute:
- afecţiuni hepatice grave;
- atrofie hepatică acută;
- ictere grave.
Valori crescute:
- primele săptămâni postinfarct miocardic acut;
- diabet zaharat;
- amiloidoză;
- sindrom nefrotic;
- unele neoplasme (în special cele metastatice);
- sarcoidoză;
- ciroze (cresc încet dar ajung la valori ridicate);
- hepatite: acute epidemice, toxice, etilice, icter mecanic.
γ-globuline:
Valori scăzute:
- sindrom nefrotic;
- agamaglobulinemii;
- hipogamaglobulinemii congenitale sau dobândite: mielom, leucemie
limfatică cronică, limfoame.
Valori crescute semnifică un proces imunologic cronic asociat cu:
- infecţii subacute şi cronice;
- parazitoze, viroze;
- inflamaţii cronice;
- boli de colagen: poliartrita reumatoidă, lupus eritematos sistemic;
- afecţiuni hepatice: hepatite cronice active; ciroza hepatică;
- neoplazii: boala Hodgkin, leucemie mielomonocitară cronică.
Estomparea sau absenţa benzii gama sugerează un deficit imun
(agamaglobulinemie).
118
Probleme:
119
LUCRAREA 9
Principiu:
Se cunosc reacţii comune datorate catenei polienice care în prezenţă de
fenoli, acizi minerali sau organici, a clorurilor acide generează compuşi coloraţi.
Cea mai uzuală este reacţia de culoare cu SbCl3 (reacţia Carr-Price).
Reactivi:
1. Soluţie uleioasă de vitamina A sau ulei de peşte;
2. Soluţie cloroformică saturată de SbCl3; 30 g clorură de stibiu se agită
timp de 2 ore cu 70 ml cloroform într-o sticlă cu dop rodat. Reactivul se poate
folosi timp de o săptămână.
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă peste 4-5 picături de soluţie de analizat (vitamina A sau ulei
de peşte) se adaugă 1 ml soluţie cloroformică de clorură de stibiu şi se observă
apariţia unei coloraţii albastre.
120
Observaţii:
1. Mulţi compuşi prezenţi în grăsimile naturale (de ex. acizii graşi
polinesaturaţi) interferează cu vitamina A şi falsifică rezultatele, de aceea se
recomandă eliminarea lor prin saponificare. În acest scop se fierbe produsul de
analizat cu KOH, soluţie alcoolică sau apoasă, după caz şi se extrage cu eter care
ulterior se evaporă şi reziduul se reia cu cloroform (soluţiile pure sau farmaceutice
nu necesită aceste operaţii).
2. Reacţia este dată şi de către produşii de oxidare ai clorofilei, iar vitamina
D dă o reacţie cu o culoare diferită.
3. Urmele de apă transformă triclorura de stibiu în oxiclorură care nu
reacţionează cu vitamina A şi de aceea este absolut necesar să se lucreze în
eprubete uscate şi cu reactivi lipsiţi de apă sau să se adauge câteva picături de
anhidridă acetică.
4. Reacţia se pretează determinării cantitative a vitaminei A, prin măsurarea
intensităţii albastre la 620 nm. Pentru această determinare s-au construit
colorimetre speciale Lovibond, etalonate pentru culoarea albastră şi care au condus
la stabilirea unităţilor Lovibond sau unităţi albastre.
Principiu:
Molecula vitaminei A se oxidează cu dicromat de potasiu în mediu acid şi
se dozează spectrofotometric excesul de dicromat.
Reactivi:
1. Soluţie de vitamina A de dozat;
2. Soluţie de dicromat de potasiu 0,01N;
3. HCl conc;
4. KI 10%;
5. Tiosulfat de sodiu 0,01N;
6. Amidon (indicator);
Tehnica de lucru:
Într-un balon prevăzut cu refrigerent ascendent se introduc 0,1 ml soluţie de
vitamina A, 14 ml apă, 40 ml dicromat şi 2 ml HCl conc. şi se fierbe amestecul
timp de o oră. După răcire se iau în 4 baloane Erlenmeyer câte 14 ml din soluţia din
121
balon, care se vor titra. În fiecare balon se adaugă 5 ml KI 10% şi se titrează cu
tiosulfat de sodiu în prezenţă de amidon ca indicator.
Calcul:
Vit. A (mg/100ml) = (10-N) x 0,00008 x 1,0316 x 4000 x 1,001
Unde: 1,001 – factor de corecţie
N – numărul de ml tiosulfat folosit la titrare
Vit. A (mg/100ml) = (10-N) x 0,33
Principiu:
Soluţia cloroformică de vitamina D în prezenţa anhidridei acetice şi a
acidului sulfuric concentrat dă naştere unei culori care virează de la roz-violaceu la
albastru şi apoi la verde.
Reactivi:
1. Soluţie cloroformică de provitamina D sau de vitamina D: 0,5 g la 100 ml;
2. Anhidridă acetică;
3. Acid sulfuric concentrat.
Tehnica de lucru:
La 1 ml soluţie de vitamină sau provitamină D se adaugă 1 ml anhidridă
acetică şi 5 picături de acid sulfuric; se observă o coloraţie roşie care trece în final
în verde.
Reacţia nu este specifică deoarece este dată şi de compuşii sterolici.
122
XII.2.4. Identificarea vitaminelor D cu aldehide aromatice
Vitaminele D în prezenţa aldehidelor aromatice (vanilina, furfurol, aldehida
anisică) şi în prezenţa acidului percloric dă compuşi coloraţi. Reacţia efectuată în
condiţii bine specificate permite şi determinarea cantitativă a vitaminelor D.
Reactivi:
1. Soluţie de vitamina D în benzen
2. Soluţie de aldehidă aromatică 0,1 g% în benzen
3. Acid acetic glacial
4. Reactiv percloric: 2 ml aldehidă acetică, 2,5 ml acid acetic glacial şi 0,5
ml soluţie 70% de acid percloric se încălzesc la 95-1000C timp de ½ oră.
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie benzenică de vitamina D şi 1 ml
soluţie aromatică în benzen şi se încălzesc la fierbere în baie de apă. Se adaugă 2
picături reactiv percloric şi se fierbe încă 1 minut, apoi se lasă să se răcească la
temperatura camerei. La soluţia tulbure verde se adaugă 1,5 ml acid acetic glacial şi
se urmăreşte culoarea formată.
Reactivi:
1. Soluţie vit. PP: 0,5-1 g la 100 ml
2. Soluţie fenolftaleină 1 g la 100 ml alcool
3. Soluţie NaOH 0,1N
4. Soluţie CuSO4 1 g la 100 ml apă distilată
5. Soluţie HCl 10 g %
6. Soluţie KI 10 g%
7. Soluţie tiosulfat de sodiu 0,01N
8. Soluţie amidon 1 g la 100 ml apă distilată
123
O O
Cu
O O
N N
precipitat albastru
Tehnica de lucru:
Se introduc într-o eprubetă 2,5 ml soluţie de vitamina PP de dozat şi în altă
eprubetă (martor) 2,5 ml apă. În fiecare eprubetă se adaugă NaOH 0,1N, cu
picătura, până la virajul indicatorului fenolftaleină în roz-pal şi apoi câte 2 ml
soluţie de sulfat de cupru 1%. După 30 de minute de repaus se filtrează prin filtru
de hârtie, spălând de 2-3 ori fiecare eprubetă cu câte 2 ml apă şi adunând filtratele
în 2 flacoane Erlenmeyer. În fiecare se adaugă 1 ml HCl 10% şi 2 ml KI 10%.
Iodul eliberat se titrează cu tiosulfat 0,01 N, în prezenţă de amidon până la incolor.
Calcul:
N – ml folosiţi la titrarea martorului
n – ml folosiţi la titrarea probei cu vit. PP
124
Reactivi:
1. Soluţie de vitamina C
2. Soluţie de iod 0,01 N
3. Soluţie amidon
Tehnica de lucru:
Într-un balon Erlenmeyer se iau 10 ml soluţie de vitamina C şi se titrează cu
iod în prezenţă de amidon, până la persistenţa culorii albastre. Se notează cu N –
numărul de ml de iod folosiţi la titrare.
Calcul:
Vit. C (mg/100ml) = N x 0,88 x 10
Principiu:
Acidul ascorbic este oxidat în prealabil la acid dehidroascorbic cu ajutorul
noritului (cărbune animal activat). Acidul dehidroascorbic reacţionează cu
2,4-dinitrofenilhidrazina în prezenţa acidului sulfuric formând un compus colorat.
Reactivi:
1. Norit: 100g norit se suspendă în 500 ml HCl 10% se încălzeşte la fierbere şi
se filtrează la vid. Sedimentul se reia cu 50 ml apă distilată şi se filtrează
din nou. Operaţia de spălare se repetă până când filtratul dă o reacţie
negativă sau foarte slabă pentru ionul Fe (III). Se usucă 24 de ore la 110 -
112 0C.
2. Soluţie de acid tricloracetic 7%, ATA.
3. Soluţie etalon de acid ascorbic: 100 mg acid ascorbic se dizolvă în 100 ml
ATA 7%
4. Soluţie tiouree 5,5% în amestec hidroalcoolic (alcool : apă 1:1)
5. Soluţie 2,4-dinitrofenilhidrazină 2% în acid sulfuric 9N
6. Acid sulfuric 9N
Tehnica de lucru:
La 1,5 ml sânge recoltat pe oxalat se adaugă 6 ml ATA şi un vârf de spatulă
de norit. Se agită şi după 10 minute se filtrează.
Urina se diluează cu ATA în proporţie de 1:10. La 0,5 ml urină se adaugă
9,5 ml ATA şi un vârf de spatulă de norit, se agită şi se filtrează după 10 minute.
Proba etalon se obţine tratând 0,5 ml soluţie etalon (reactivul 3) cu 9,5 ml
ATA şi un vârf de spatulă de norit. Se agită şi se filtrează după 10 minute. Filtratul
conţine 50 μg acid ascorbic/ml.
125
În continuare se pregătesc 4 eprubete astfel (Tabelul 1):
Tabel 1. Tehnica dozării vitaminei C din sânge şi urină prin metoda ROE şi
Kuether
Reactivi (ml) E1 E2 E3 M
Filtrat sanguin 2 - - -
Filtrat de urină - 2 - -
Filtrat din soluţia etalon - - 1 -
ATA - - 1 2
Tiouree 2 picături 2 picături 2 picături 2 picături
DNFH 0,5 0,5 0,5 0,5
Eprubetele se ţin 2 ½ ore la 37 0C şi apoi se plasează într-o baie de gheaţă
H 2SO4 85% 2,5 2,5 2,5 2,5
Calcul:
Ascorbemia (mg%) = 12,5 x E1 / E3
Ascorburia (mg%) = 500 x E2 / E3.
CH3 CH3
+
N N K3[Fe(CN)6] N N
CH2CH2OH CH2CH2OH
H3C N NH2 S H3C N N S
tiamina tiocrom
Reactivi:
1. soluţie de tiamină 1 %
2. hexacianoferat de potasiu 5 %
3. NaOH 10 %
4. HCl 10 %
5. alcool butilic sau amilic
126
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se tratează 1 ml soluţie vitamină B1 cu 0,5 ml NaOH şi
0,5 ml hexacianoferat de potasiu. Se adaugă apoi 1 ml butanol şi se agită puternic.
În stratul alcoolic apare o fluorescenţă albastră care dispare prin acidulare şi
reapare la alcalinizare.
Reactivi:
1. Soluţie de vitamină B1
2. Soluţie etalon de vitamină B1 : 0,2 mg/ml
3. Reactivul diazobenzensulfonic:
Soluţia A: 0,45 g acid sulfanilic se tratează cu 4,5 ml HCl concentrat şi
aproximativ 40 ml apă distilată. Se încălzeşte pe baie de apă până la dizolvare, iar
după răcire se aduce la un volum de 50 ml.
Soluţia B: se prepară extemporaneu prin dizolvarea a 0,9 g NaNO2 în 20 ml apă
distilată.
Soluţia C: se prepară extemporaneu la gheaţă. Se iau 3 ml din soluţia A şi 3 ml
din soluţia B. După 5 minute se completează cu apă la 100 ml.
4. Soluţie alcalină: 100 ml NaOH 1N se amestecă cu 100 ml NaHCO3
5,76 g%.
5. Formol.
Tehnica de lucru:
Se pregătesc 3 eprubete conform tabelului următor (Tabelul 2):
Calcul:
vitamină B1 (ml/100ml) = Ep / Es x 20
127
Tabel 3. Vitaminele şi implicaţiile lor
128
Vitamina A Funcţia reproducătoare Impotenţă Creşterea
(retinol, Funcţia vizuală Cecitate nocturnă pragului vizual
retinal, acid Promovarea creşterii Retard de creştere Uscăciunea
retinoic, β- Diferenţierea şi întreţinerea Xeroftalmie corneei
caroten) ţesuturilor epiteliale
Expresia genică
Vitamina D Absorbţia de calciu Rahitism (la Oase moi,
(colecalciferol, copii) flexibile
ergocalciferol) Osteomalacie (la
adulţi)
Vitamina K γ-carboxilarea restului La nou-născuţi Hemoragie
(menadionă, glutamat din componenţa Rară la adulţi
menachinonă, factorilor de coagulare şi a
filochinonă) altor proteine
Vitamina E Antioxidant Rară Fragilitatea
(α-tocoferol) eritrocitelor
determină
anemie
hemolitică
Probleme:
129
LUCRAREA 10
130
XIII.1. MODALITĂŢI DE EXPRIMARE ŞI DE DETERMINARE A
ACTIVITĂŢII ENZIMATICE
E / min
c / min
sd
131
Pentru a putea urmări o reacţie enzimatică prin variaţia E/min este necesar
ca substratul sau produsul de reacţie să fie colorat sau să absoarbă în UV.
+ AcChE
(CH3)3N - CH2 - CH2 - O - OC - CH3
+
(CH3)3N - CH2 - CH2 - OH + CH3COOH
+ ChE +
(CH3)3N - CH2 - CH2 - O - OC - R (CH3)3N - CH2 - CH2 - OH + R - COOH
Dozarea acestei enzime în ser (valoare normală: 3-8 U/ml ser) are valoare
diagnostică în laboratorul clinic:
- este un indicator preţios în depistarea intoxicaţiilor cu organofosforice când
activitatea enzimei scade până la 10% din valoarea normală;
- în insuficienţa hepatică (ciroză) este, de asemenea, scăzută datorită capacităţii
reduse de biosinteză proteică a ficatului.
Principiu:
Pentru vizualizarea produşilor de reacţie se utilizează un analog de substrat:
butiriltiocolina (un atom de O este înlocuit cu S) care prin hidroliză enzimatică în
prezenţa de ChE pune în libertate tiocolina; aceasta formează cu DTNB (reactiv de
culoare pentru grupările SH) un compus colorat cu maxim de absorbţie la 412 nm
(mM = 13,6).
132
+ ChE
(CH3)3N - CH2 - CH2 - S - OC - (CH2)2 - CH3
+
(CH3)3N - CH2 - CH2 - SH + HOOC - (CH2)2 - CH3
COOH
S NO2
+
(CH3)3N - CH2 - CH2 - SH +
S NO2
COOH
HOOC COOH
+
O2N S - CH2 - CH2 - N(CH3)3 + HS NO2
Reactivi:
1. Soluţie substrat: butiriltiocolină 10 mM în tampon fosfat 20 mM pH =7,8
2. Ser dil.1/100;
3. Reactiv de culoare: DTNB 0,2 mM în tampon fosfat 20 mM, pH = 7 şi
etanol 1:1.
Tehnica de lucru:
În 2 eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 1):
133
Calcul:
E / min
UI / ml ser moli substrat / min/ ml ser dil .serului
E412nm
E412nm 2400
x 8,8 E412nm
136 2
Tehnica de lucru:
În două eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 2):
Calcul:
mg prot / ml ser 100E540. A
A = inversul coeficientului de pantă stabilit la curba de dozare a proteinelor.
C
A
E
134
reversibilă între PALPO şi piridoxamin fosfat. În reacţiile de transaminare are loc
transferul unei grupări aminice donor pe un -cetoacid acceptor.
Reactivi:
1. Soluţie tampon-substrat (tampon fosfat 100 mM pH=7,4; D-L alanina
200 mM; acid -cetoglutaric 2 mM);
2. Reactiv de culoare: 2,4-dinitrofenilhidrazină 1 mM;
3. Soluţie NaOH 0,4 N.
Tehnica de lucru:
În două eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 3):
135
Tabel 4. Corespondenţa între valoarea E546nm şi activitatea enzimatică (mU)
E546nm mU/ml E546nm mU/ml
0,025 2 0,200 29
0,050 5 0,225 34
0,075 9 0,250 39
0,100 12 0,275 45
0,125 16 0,300 52
0,125 16 0,300 52
0,175 24 0,350 68
0,375 77
GOT
HOOC - CH2 - CH - COOH + HOOC - CH2 - CH2 - C - COOH
NH2 O
Reactivi:
1. Soluţie tampon-substrat pH 7,4;
2. Reactiv de culoare: 2,4-dinitrofenilhidrazină 1 mM;
3. Soluţie NaOH 0,4 N.
136
Tehnica de lucru:
În două eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 5):
137
Interpretarea rezultatelor
GOT:
- Creşteri marcate (de 10-100 ori faţă de valorile normale) se observă în:
- infarctul miocardic, creşterile apar după 4 ore de la debutul bolii, cu un
maxim la 24-48 ore şi revenirea la normal în 4-7 zile.
- hepatită virală acută,
- necroză toxică a ficatului.
- Creşteri moderate se observă în:
- evoluţia hepatitelor cronice,
- ictere mecanice,
- mononucleoză infecţioasă,
- anemii hemolitice severe
- leziuni musculare accidentale şi în distrofia musculară progresivă
GPT:
- Creşteri marcate (de aproape 100 ori faţă de valorile normale) apar în:
- hepatita virală acută
- necroza toxică a ficatului.
- Creşteri moderate apar în:
- hepatita cronică şi ciroze,
- ficatul de stază cardiacă,
- mononucleoza infecţioasă.
Principiu:
-Glutamiltranspeptidaza (-GT) catalizează transferul acidului glutamic de
pe un donor (-glutamil-p-nitroanilidă), pe un acceptor (glicilglicină). În urma
reacţiei se formează p-nitroanilină colorată în galben (mM = 9,9).
Reactivi:
1. Substrat în Tris –HCl;
2. Ser de analizat;
3. Acid acetic 1N.
138
O 2N NH - C = O + CH2 - COOH
(CH2)2 NH - C = O
CH - NH2 CH2 - NH
COOH
Tehnica de lucru:
Pentru fiecare determinare se pregătesc 2 eprubete în care se introduc
(Tabelul 7):
Calcul:
1 UI este cantitatea de enzimă care catalizează transferul a 1 mol de acid
glutamic de pe un donor pe acceptor la temperatura de 250C în timp de 1 minut.
Activitatea enzimei serice se exprimă în U/L.
Activitatea -GT ( U/L ) = 460 x E405/20 minute
Interpretarea rezultatelor
Valori normale:
6 - 28 U/L la bărbaţi;
4 - 18 U/L la femei.
139
Testul -GT este folosit în diagnosticul suferinţelor hepatice, fiind mult mai
sensibil decât fosfataza alcalină pentru depistarea formelor de colestază şi este
singurul test enzimatic pentru decelarea hepatopatiilor alcoolice.
Valori crescute se întâlnesc şi în:
- alcoolism;
- hepatite cronice;
- neoplasm primitiv sau metastazic al ficatului;
- insuficienţă cardiacă cu stază hepatică;
- leziuni pancreatice;
- administrare de barbiturice.
Reactivi :
1. Reactiv 1:
- tampon Tris 80 mmol/l, pH=7,5
- NaCl 200 mmol/l
- piruvat 1,6 mmol/l
2. Reactiv 2 : NADH 0,200 mmol/l
3. Ser diluat 1:5 cu apă distilată
Pentru prepararea reactivului de lucru se amestecă reactivul 1 cu reactivul 2 în
raport volumetric 1:1. Stabilitatea reactivului de lucru este de 3 zile la 20-25°C sau
de 3 saptămâni la 2-8°C.
140
Tehnica de lucru :
În cuva spectrofotometrului se introduc reactivii conform tabelului 8:
Calcul:
LDH UI/l = ΔE/minut x 4127 x 5
141
Variaţii patologice: creşteri ale activităţii CK:
- infarct miocardic acut;
- distrofie musculară;
- în leziuni cerebrale (pe seama izoenzimei BB provenită din creier);
- efort fizic intens.
Probleme:
142
LUCRAREA 11
Principiu:
Determinarea activităţii celor două enzime în laborator se bazează pe
proprietatea lor de a hidroliza esterii fosforici. Ca substrat se utilizează un produs
artificial: esterul acidului fosforic cu p-nitrofenolul (p-nitrofenilfosfatul). Acest
ester incolor este hidrolizat de o enzimă cu punerea în libertate a p-nitrofenolului,
colorat în galben în mediu alcalin.
143
Reactivi:
1. Soluţie de substrat în tampoane de diferite pH-uri
2. Ser
3. NaOH 0,02 N
Tehnica de lucru:
Se pregăteşte o serie de 12 eprubete în care se introduc următorii reactivi
(Tabelul 1):
E405nm / min
U /l ser 43,2 E 405nm
nM
144
Principiu:
Se determină colorimetric cantitatea de p-nitrofenol rezultată prin acţiunea
enzimei asupra p-nitrofenilfosfatului utilizat ca substrat.
Reactivi:
1. Soluţie tampon-substrat cu pH=10,5: tampon glicocol 0,05 M, MgCl2
0,0005 M, p-nitrofenilfosfat 0,0055 M. Se dizolvă 375 mg glicocol, 10 mg
MgCl2·6H2O şi 165 mg p-nitrofenilfosfat sare de sodiu în 42 ml NaOH 0,1N;
2. NaOH 0,02 N;
3. Soluţie p-nitrofenol 5.10-5 M. Se dizolvă 695 mg p-nitrofenol în 1000 ml
NaOH 0,02N. 10 ml din această soluţie se diluează cu NaOH 0,02N la 1000 ml.
Tehnica de lucru:
În 2 eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 2):
Calcul:
Activitatea FA se obţine din tabelul 3 sau din următoarea formulă de calcul:
mU / ml 200E 405nm
Valori normale:
- adult: 20-40 mU/ml;
- copil: 38-138 mU/ml.
145
Tabel 3. Corespondenţa între valoarea E405nm şi activitatea enzimatică (mU)
E405nm mU E405nm mU E405nm mU
0,050 10 0,280 56 0,540 108
0,060 12 0,300 60 0,560 112
0.070 14 0,320 64 0,580 116
0,080 16 0,340 68 0,600 120
0,090 18 0,360 72 0,620 124
0,100 20 0,380 76 0,640 128
0,120 24 0,400 80 0,660 132
0,140 28 0,420 84 0,680 136
0,160 32 0,440 88 0,700 140
0,180 36 0,460 92 0,720 144
0,200 40 0,480 96 0,740 148
0,220 44 0,500 100 0,760 152
0,240 48 0,520 104 0,780 156
0,260 52
146
hiperparatiroidism. În tumorile de diverse etiologii FA are valoare de marker
tumoral (depistarea metastazelor hepatice sau osoase).
147
Valori crescute în neoplasme: ocazional tumorile (în special hipernefromul) pot
produce o FA identică sau similară cu forma placentară (izoenzimă Regan)
Creşteri:
- Manopere - tuşeul rectal;
- masajul prostatic;
- biopsia prostatică;
- rezecţia transuretrală de prostată;
- cateterismul vezical;
- cistoscopia.
148
- Cancerul de prostată metastazat când tumora depăşeşte capsula prostatică.
! Deoarece fosfataza acidă prostatică nu prezintă valori crescute în stadiile
precoce ale cancerului de prostată, acest test nu se recomandă în scop de screening;
! Screening – PSA (Prostatic Specific Antigen): valoare normală < 4 ng/ml
- Metastaze osoase ale tumorilor de:
- colon;
- mamare;
- corticosuprarenale;
- pulmonare.
- Distrugerea trombocitelor - tromboze;
- trombastenie;
- embolie pulmonară.
- Leucemie granulocitară
- Boli genetice determinate de deficienţe ale unor enzime lizozomale
- boala Gaucher;
- boala Nieman – Pick.
Probleme:
149
LUCRAREA 12
Exemplu:
CH2OH-(CHOH)n-CH=O – aldoză (exemplu glucoza, n = 4)
CH2OH-(CHOH)n-CO-CH2OH – cetoză (exemplu fructoza, n = 3)
150
În organism glucidele îndeplinesc funcţii multiple:
- sunt surse nemijlocite de energie (oxidarea glucozei);
- au rol de substanţe de rezervă (glucoza poate constitui depozite de energie sub
formă de glicogen hepatic şi muscular, la animale şi om, sau amidon la plante);
- îndeplinesc roluri de substanţe structurale şi de susţinere (polizaharidele intră în
structura ţesuturilor conective ale matricei osoase la animale);
- au funcţii specifice: mucopolizaharidele intră în structura substanţelor de grup
sangvin, participă la procesele imunitare, intră în structura heparinei.
151
XV.1. Reacţia Podobev- Molisch - Udransky
OH
HOHC - CHOH
H2SO4 + 2
R - HC CH - CHO R CHO -H2O
-3H2O O
HO OH
OH OH OH OH
ox
CH C
O O
R R
Reactivi:
1. Glucoză 1%, zaharoză 1% etc.
2. Soluţie de α-naftol în alcool etilic (proaspăt preparată);
3. H2SO4 concentrat.
Tehnica de lucru:
Se iau într-o eprubetă 2-3 picături soluţie de glucoză 1%, se adaugă 5
picături soluţie de α-naftol şi se agită conţinutul eprubetei. Se toarnă încet, cu
atenţie, pe peretele interior al eprubetei aproximativ 1 ml H2SO4 conc. La nivelul
de separare a celor două lichide se formează un inel violet.
Observaţii:
Reacţia se datorează compuşilor care conţin în moleculă lor oze, cum sunt
de ex. nucleoproteidele, mucoproteidele etc.
Inelul de culoare violetă (caracteristic) poate fi însoţit sau să fie substituit
cu inele de culori diferite, de ex.:
- inel verde, cauzat de acţiunea acidului asupra α-naftolului;
- inel alb, în cazul prezenţei proteinelor care precipită în mediu acid;
- inel roşu, datorat unor substanţe organice cu alte structuri.
152
XV.2. REACŢII DE DIFERENŢIERE A ALDOZELOR ŞI
CETOZELOR
HO OH
ALDOZA R CH=O + 2
O -H2O
OH OH
R O R O
O O
OH O
Reactivi:
1. Reactiv Selivanoff: se dizolvă 0,1g resorcină în 100 ml HCl 1:1
2. Fructoză 1% sau zaharoză 1%;
3. Glucoză 1%, arabinoză 1%.
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se pun 2 picături soluţie de glucoză 1% şi în alta 2 picături
soluţie de fructoză sau zaharoză. Se adaugă în ambele eprubete câte 2 ml reactiv
Selivanoff şi se aşează într-o baie de apă la 30-600C timp de 15 minute sau se
încălzeşte uşor direct în flacară.
În eprubeta cu aldoză apare o coloraţie slab roz, galbenă sau soluţia rămâne
incoloră, în timp ce în eprubeta cu cetoză se produce o coloraţie roşie. Reacţia este
pozitivă cu cetozele: de culoare roşie şi este negativă cu aldozele: incoloră sau
culori slabe.
153
XV.3. REACŢII DE DIFERENŢIERE A PENTOZELOR DE HEXOZE
CH3
PENTOZÃ HCl (conc)
HEXOZÃ R CHO + 2
O
HO OH
HO
CH3
HO
R CH
O HO
CH3
HO
Reactivi:
1. Reactiv Bial: 1 g orcină în 1000 ml HCl;
2. Soluţii de arabinoză 1%, riboză 1% etc.
3. Soluţii de glucoză 1%, galactoză 1%, fructoză 1% etc.
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se iau 5 picături soluţie pentoză şi în alta 5 picături soluţie de
hexoză şi se adaugă în ambele câte 3 ml reactiv Bial. Eprubetele se ţin pe baie de
apă în fierbere sau se încălzesc uşor în flacără.
În eprubeta cu pentoză se obţine o culoare violetă (reacţie pozitivă), iar în
eprubeta cu hexoză se obţine o culoare portocalie-brună (reacţie negativă).
154
Reactivi:
1. Reactiv Bial modificat: se dizolvă 6 g orcină în 200 ml alcool etilic şi se
adaugă 2 ml FeCl3 1%;
2. Soluţii de pentoze si hexoze 1-2 %;
3. HCl concentrat.
Tehnica de lucru:
Se iau într-o eprubetă 2 ml soluţie de pentoză şi în alta 2 ml soluţie de
hexoză. În ambele se adaugă câte 10 picături reactiv Bial modificat şi câte 2 ml HCl
concentrat. Eprubetele se agită, se acoperă cu un dop de vată şi se ţin 10 minute în
baia de apă, care fierbe.
Reacţia este pozitivă cu pentozele obţinându-se o coloraţie albastră-verde.
Reactivi:
1. Reactiv Tollens: soluţie de fluoroglucină 2% în alcool 86o;
2. Soluţii de pentoze şi hexoze 1-2 %;
3. HCl concentrat.
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se iau 2 ml soluţie pentoză şi în alta 2 ml hexoză. În ambele
eprubete se adaugă câte 3 picături reactiv Tollens, 2 ml HCl conc. şi se încălzesc
până la fierbere.
Reacţia este pozitivă pentru pentoze, care formează mai întâi o coloraţie roz
ce trece în roşu-vişiniu.
PENTOZÃ 2
CH=O + H2N NH2
O
155
Reactivi:
1. Soluţie de benzidină 4% în acid acetic glacial;
2. Soluţii 2% de oze: aldopentoze (riboză), hexoze (glucoză, fructoză).
Tehnica de lucru:
La 0,5 ml reactiv se adaugă o picătură din soluţia de oză.
Eprubeta conţinând acest amestec se fierbe 3-4 minute şi apoi se răceşte.
Aldopentozele libere dau o coloraţie de la roz la roşu, în timp ce hexozele şi
cetopentozele nu dau reacţia.
CH=N-HN-C6H5
CHO CH=N-HN-C6H5
C=O
H - C - OH H - C - OH
C6H5-NH-NH2
HO - C - H
HO - C - H C6H5-NH-NH2 HO - C - H
-H2O C6H5-NH2 + NH3 H - C - OH
H - C - OH H - C - OH
H - C - OH
H - C - OH H - C - OH
CH2OH
CH2OH CH2OH
CH=N-HN-C6H5
C = N-HN-C6H5 HN-C6H5
N
C6H5-NH-NH2 HO - C - H H
-H2O H - C - OH N
HOH2C-(CHOH)3 N
H - C - OH osazonã
(formulã chelaticã)
CH2OH
156
Fenilhidrazonele sunt specifice pentru diferitele oze. Osazonele sunt identice
pentru ozele epimere (care diferă numai la grupările de la C1 şi C3, de exemplu:
glucoza, fructoza) şi diferite pentru zaharurile neepimere şi permit astfel, pe baza
proprietăţilor lor caracteristice (forma cristalelor, punct de topire, solubilitate),
diferenţierea zaharurilor (de ex: diferenţierea glucozei faţă de galactoză).
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă peste 2 ml soluţie de glucoză se adaugă 2 ml soluţie de
2,4- dinitrofenilhidrazină în H2SO4. Soluţia se încălzeşte uşor până la apariţia
precipitatului roşu de 2,4-dinitrofenilhidrazonă.
Reacţia cu fenilhidrazină permite determinarea glucozei, în soluţie pură,
până la diluţia de 0,01 g% şi prezintă un interes deosebit, fiind utilă în clinică pentru
diferenţierea glicozuriei (diabet zaharat) de lactozuriile fiziologice care apar la
unele femei în ultimele luni de graviditate şi în perioada alăptării.
H - C - OH H- C =O
H- C =O
H - C - OH C - OH HO - C - H
endiol aldoza II
Aldoza I
D-manoza (2,5%)
D-glucoza (63,5%)
CH2OH
C=O
cetoza
fructoza (21%)
Reactivi:
1. Soluţie de glucoză 1%;
2. NaOH 0,1N şi 10%;
3. HCl 0,1 N, cu adaus de 1 ml FeCl3 10%.
157
Tehnica de lucru:
a) Dacă se urmăreşte numai evidenţierea caramelului se tratează 5 ml
soluţie glucoză 1% cu 2 ml NaOH 10% şi se încălzeşte la fierbere. Soluţia devine
galbenă şi culoarea virează spre brun, concomitent cu apariţia unui miros de
caramel, care se accentuează prin acidularea soluţiei. Dacă acidularea se face cu
H2SO4 este necesară o răcire prealabilă a eprubetei.
b) Dacă se urmăreşte evidenţierea compuşilor cu grupare endiol se iau
într-o eprubetă 2 ml soluţie glucoză 1 % şi exact 5 ml NaOH 0,1 N. Se fierbe şi se
obţine o culoare galbenă datorită caramelului. Se răceşte soluţia şi se adaugă exact
5 ml HCl 0,1 N (care conţine FeCl3). În cazul prezenţei formei ―endiol― se observă
o coloraţie violetă (reacţie pozitivă), care nu apare cu soluţia de glucoză, ca atare
(care nu a fost încălzită cu baze).
1. Reacţia Trommer
Ionul de Cu2+ este redus de către gruparea carbonilică a glucidelor, în mediu
alcalin şi la cald, la ion cupros (Cu+), respectiv la Cu2O. Particulele de Cu2O în
absenţa coloizilor protectori se depun ca un sediment roşu. Concomitent se produce
oxidarea funcţiei aldehidice la carboxil (de la glucoză la acid gluconic).
158
CuSO 4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na 2SO 4
OH
Cu OH
Cu Cu - OH Cu
OH RCHO
O O
OH H2O RCOOH Cu - OH H2O Cu
Cu
Cu
OH
OH
Reactivi:
1. Soluţie de CuSO4 10%;
2. Soluţie de NaOH 10%;
3. Soluţii de glucide reducătoare 1%: glucoză, galactoză;
4. Soluţii de glucide nereducătoare 1%: zaharoză.
Tehnica de lucru:
Se iau în 2 eprubete câte 2 ml soluţie de zahăr reducător (glucoză) şi
respectiv nereducător (zaharoză), se adaugă câte 5 picături de CuSO4 10 % şi
5 picături de NaOH 10%. Ambele eprubete se încălzesc la partea superioară a
lichidului.
Se observă că în eprubeta cu zahăr reducător apare un precipitat galben,
care devine roşu, Cu2O, care denotă o reacţie pozitivă, în timp ce în eprubetă cu
zaharoză reacţia este negativă.
2. Reacţia Fehling
Reacţia este similară cu reacţia Trommer, doar că în acest caz se procedează
la solubilizarea Cu(OH)2 prin tratarea cu tartrat dublu de sodiu şi potasiu (sarea
Seignette), care intră în compoziţia reactivului Fehling II. În urma amestecării celor
doi reactivi Fehling se formează între Cu2+ şi sarea Seignette un complex cu
structură de chelat care favorizează dizolvarea Cu(OH)2.
Reactivi:
1. Soluţie de zaharuri reducătoare 1%: glucoză, galactoză.
2. Soluţie de zahăr nereducător 1%: zaharoză.
3. Reactiv Fehling I : 35 g CuSO4·5H2O
5 ml H2SO4 conc.
200 ml apă distilată.
După dizolvare se completează cu apă distilată la 1000 ml.
159
Tehnica de lucru:
Se introduc în două eprubete câte 2 ml reactiv Fehling I şi 2 ml reactiv
Fehling II şi se încălzeşte la fierbere 2 minute. În prima eprubetă se adaugă 5 ml
zahăr reducător şi se încălzeşte 1 minut direct în flacără. Se observă schimbarea
culorii şi apariţia unui precipitat. Se repetă reacţia cu a doua eprubetă la care se
adaugă 5 ml zahăr nereducător. După încălzire în flacără nu se observă schimbări
semnificative.
La prima încălzire, amestecul de reactivi Fehling I şi II trebuie să-şi păstreze
culoarea albastră.
Cea de-a doua încălzire serveşte reacţiei de oxido-reducere, când culoarea
albastră a soluţiei dispare şi se produce un precipitat de culoare galbenă sau roşie,
care indică prezenţa zaharului reducător.
3. Reacţia Benedict
Reacţia este similară cu reacţia Trommer şi cu reacţia Fehling, doar că
pentru solubilizarea precipitatului de Cu(OH)2 se foloseşte citratul.
Reactivi:
1. Reactiv Benedict: 173 g citrat de sodiu·2H2O
100 g Na2CO3 anhidru
800 ml apă distilată
Se dizolvă prin încălzire, se filtrează şi se aduce la 850 ml. Separat se
dizolvă 17,3 g CuSO4 pur, cristalizat, în 100-150 ml apă distilată şi se adaugă sub
agitare în porţiuni mici la soluţia precedentă şi se completează cu apă distilată la
volumul final de 1000 ml. Reactivul se poate păstra un timp destul de lung;
2. Glucoză 5 %;
3. Zaharoză 5 %.
Tehnica de lucru:
În 2 eprubete se introduc câte 5 ml reactiv Benedict. În prima se adaugă
0,5 ml glucoză, iar în a doua aceeaşi cantitate de zaharoză. Se fierb ambele eprubete
direct la flacără timp de 2 minute şi se răcesc. În prima eprubetă se va forma un
precipitat roşu (reacţie pozitivă), iar în a doua nu se produc modificări semnificative
(reacţie negativă).
După culoarea obţinută se poate aprecia, cu aproximaţie concentraţia
glucozei şi anume:
160
Prezenţa unor compuşi de tipul creatininei, cloroformului, acidului uric nu
interferă cu reactivul Benedict, spre deosebire de reactivul Fehling.
4. Reacţia Cole
Reacţia decurge similar cu reacţiile anterioare, cu deosebirea că se foloseşte
glicerina ca agent de dizolvare a Cu2O.
Reactivi:
1. Na2CO3 anhidru;
2. Glicerină;
3. CuSO4;
4. Soluţii de glucide 1g% şi 0,1g%.
Tehnica de lucru:
La 5 ml soluţie de glucide se adaugă un vârf de cuţit de Na2CO3 anhidru,
3 picături glicerină şi 2 picături CuSO4 1%. Se agită bine şi se fierbe 1 minut.
În cazul probei pozitive, Cu2O format rămâne în soluţie sub formă hidratată
coloidală de CuOH de culoare galbenă. Se consideră că testul Cole este cel mai
sensibil dintre reacţiile de reducere şi permite diferenţierea glucidelor de compuşii
cu grupare aldehidică liberă sau cu funcţie endiol.
1. Reacţia Tollens
Glucidele reducătoare transformă Ag+ la Ag0 care se depune pe pereţii
eprubetei sub formă de argint metalic fin (oglinda de argint). Concomitent
gruparea aldehidică din molecula glucidelor reducătoare este oxidată la acidul
corespunzător.
2AgOH + 4NH4OH + -
2[Ag(NH3)2] OH + 4H2O
+ - -
2[Ag(NH3)2] OH + R CHO 2Ag + 4NH3 + H2O + R-COOH
Reactivi:
1. Soluţie de AgNO3 2% în apă bidistilată;
2. Soluţie de amoniac diluat 5%;
3. Soluţie glucoză 2%.
161
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă foarte curată se introduc, în ordine: 5 ml AgNO3 2% şi apoi
soluţia de amoniac, picătură cu picătură, până la apariţia şi apoi dizolvarea
precipitatului care se formează, evitându-se excesul. Se adaugă 3 ml soluţie
glucoză, se agită şi se lasă pe baie de apă la 600C timp de 15 minute şi se observă
formarea „oglinzii de argint ―.
1. Reacţia Nylander
Reacţia se bazează pe reducerea azotatului de bismut (III) (subnitrat de
bismut) în mediu alcalin la Bi metalic negru, în prezenţa glucidelor reducătoare
care se oxidează la acizii corespunzători.
Reactivi:
1. Reactiv Nylander: se dizolvă 2 g nitrat bazic de bismut (III) şi 4 g tartrat
dublu de sodiu şi potasiu în 100 ml NaOH 10 %. Se încălzeşte pe baie de
apă la fierbere, se răceşte şi se aduce cu apă la 1000 ml;
2. Glucoză 2 %.
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 2 ml soluţie de glucoză 2 % şi 0,5 ml reactiv
Nylander şi se încălzeşte direct în flacără, timp de câteva minute. Reacţia este
pozitivă când se obţine un precipitat de culoare neagră (Bi metalic) şi este sensibilă
chiar la cantităţi foarte mici de oze.
OH OH
O2N NO2 O2N NH2
3RCHO + 2H2O + 3R-COOH
3H2O
NO2 NO2
162
Reactivi:
1. Soluţie de acid picric;
2. Soluţie de glucoză;
3. NaOH 10%.
Tehnica de lucru:
Se introduc într-o eprubetă 2 ml soluţie de acid picric, 1 ml soluţie de
glucoză şi 1 ml NaOH 10% şi se fierbe.
Reacţia este pozitivă când apare o culoare portocalie la încălzire (culoarea
galbenă indică o reacţie negativă). Reacţia poate servi şi la dozarea glucozei din
lichidele biologice, ex. reacţia Seifert-Crecelius.
Reactivi:
1. Soluţie de albastru de metilen 0,1 % în apă
2. Soluţie glucoză 1%;
3. NaOH 2N.
163
Tehnica de lucru:
Se introduc într-o eprubetă 5 ml apă, 10 picături soluţie de albastru de
metilen şi 2 picături de NaOH 2 N şi se încălzeşte. Se adaugă câteva picături de
glucoză 1 %, treptat, până se obţine decolorarea probei, în timpul încălzirii de
câteva secunde la fierbere.
După câteva minute de repaus se agită şi se observă recolorarea albastrului
de metilen datorită efectului oxigenului din aer. Dacă eprubeta nu se agită,
recolorarea apare mai încet, de la suprafaţa eprubetei spre interior.
Reactivi:
1. Soluţia de fericianură: 46 g K3[Fe(CN)6] şi 46 g NaOH se dizolvă în apă
distilată şi se completează cu apă distilată la 1000 ml. Se păstrează la
frigider.
2. Soluţie saturată de acid picric (aprox.1,2 %). Se obţine prin dizolvarea a
1,3 g de acid picric în 100 ml apă distilată la fierbere.
3. Soluţie de glucoză 0,5 % şi o soluţie de glucoză de concentraţie
necunoscută.
Tehnica de lucru:
a) Determinarea factorului reactivului
Într-un balon termorezistent se introduc exact 10 ml soluţie fericianură şi se adaugă
10 picături soluţie de acid picric şi 20 ml apă distilată. Se încălzeşte la fierbere şi se
titrează din biuretă cu soluţia de glucoză 0,5 %, menţinând tot timpul soluţia în
fierbere, până la virajul culorii de la galben spre roşu-portocaliu, notând cu N, ml
glucoză utilizaţi.
5N
f
1000
164
Calcul:
1000 f
glucoza ( g / l )
N'
Probleme:
165
LUCRAREA 13
166
XVI.2. METODE ENZIMATICE
167
XVI.3. DOZAREA GLUCOZEI CU O-TOLUIDINĂ
Tehnica de lucru:
În 3 eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 1):
Calcul:
mg glucoza/100 ml sânge = Ep/Es x 100
168
membranelor celulare la glucoză, toate acestea având ca efect scăderea glucozei în
sânge.
Glicemia este factorul reglator principal al secreţiei de insulină;
astfel glicemia à jeun este suficientă pentru a declanşa secreţia de insulină, iar
eliberarea insulinei creşte odată cu nivelul glicemiei, răspunsul maxim obţinându-se
la 300-500 mg/dl.
Glucagonul, celălalt hormon pancreatic, accelerează conversia glicogenului
în glucoză şi determină astfel creşterea glicemiei adică hiperglicemia.
Alţi hormoni care deţin un rol important în metabolismul glucozei sunt:
ACTH-ul, glucocorticoizii, adrenalina, tiroxina.
169
Valorile normale ale glicemiei se vor modifica odată cu apariţia patologiei
determinată de hiperglicemia persistentă (Tabelul 3).
Există mai multe forme de diabet zaharat dintre care cel mai frecvent
întâlnite sunt :
diabetul zaharat tip 1 (diabet insulino-dependent, diabet juvenil) este
definit ca procesul etiologic caracterizat prin distrucţia celulelor beta
pancreatice secretante de insulină, ducând la deficienţa absolută de insulină
cu evoluţie spre cetoacidoză şi deznodământ fatal dacă nu se corectează
prin tratament exclusiv cu insulină. Pacienţii au o dependenţă vitală faţă de
tratamentul cu insulină, în lipsa căruia nu pot supravieţui. Acest tip de
diabet poate apărea la orice vârstă, dar îl întâlnim mai ales la copii,
adolescenţi şi adulţi tineri.
diabetul zaharat tip 2 (diabet insulino-independent) este definit ca procesul
etiologic caracterizat prin asocierea a două defecte celulare: rezistenţa la
insulină şi deficienţa funcţiei pancreatice. Acest tip reprezintă majoritatea
cazurilor de diabet (90 - 95 %) şi apare în general la adulţi. Simptomele se
dezvoltă lent astfel încât multe persoane cu nivel crescut al glucozei în
sânge nu au nici un simptom.
diabetul gestaţional este o formă de diabet ce apare în timpul sarcinii la
2 - 5 % dintre femeile însărcinate, poate dispărea după naştere sau poate
anunţa instalarea tipului 2 de diabet mai târziu în cursul vieţii.
alte tipuri de diabet sunt date de defecte genetice în funcţionarea celulelor
pancreatice producătoare de insulină, boli ale pancreasului exocrin (fibroza
chistică) sau administrarea de medicamente.
170
XVI.4.2. Hemoglobina glicozilată sau glicată (HbA1c)
La concentraţii fiziologice ale glucozei, hemoglobina (dar şi alte proteine)
suferă un proces de glicare, cu formarea unui compus intermediar - aldimină (sau
bază Schiff), proces care este, însă, reversibil; la concentraţii persistent crescute ale
glucozei, aldimina se transformă printr-o reacţie ireversibilă într-un compus
ketoaminic, acesta constituind produsul final al dozării HbA1c.
Studiile clinice şi experimentale au arătat că, dintre toate proteinele ce suferă
procese de glicare, fracţiunea glicată a hemoglobinei A1c constituie cel mai bun
indicator al controlului glicemic în DZ.
HbA1c a fost introdusă recent în criteriile de diagnostic ale diabetului
zaharat (în special cel de tip 2) şi reprezintă un test de evaluare şi monitorizare pe
termen lung a controlului glicemic. Cantitatea de HbA1c este proporţională cu
nivelul mediu al glucozei sangvine (glicemia medie) (Tabelul 4).
XVI.4.3. Glicozuria
În mod normal glucoza nu se găseşte în urină, decât dacă nivelul ei în sânge
depăşeste capacitatea de reabsorbţie tubulară. Pragul renal pentru glucoză (nivelul
glicemiei de la care apare glicozuria) este atins atunci când concentraţia glucozei în
plasmă este peste 180 mg/dl. Dozarea glucozei din urină (glicozuria) se determină
calitativ şi cantitativ în urina totală de 24h.
Valorea normală: cantităţi nedetectabile de glucoză în urină (metoda Benedict).
171
Identificarea nivelului de corpi cetonici în urină este importantă în diagnosticul
severităţii diabetului.
În afara diabetului zaharat, cetonuria mai poate apărea şi în inaniţie, diaree,
vărsături, boli hepatice grave.
172
Rezultatele testului pot fi raportate grafic astfel (Figura 19):
Principiu:
Bolnavul va fi supus aceloraşi condiţii ca şi în cazul testului TTGO, după
care se injectează intravenos 1 g de tolbutamid. Se vor face recoltări pentru
determinarea glicemiei la intervale de 30 de minute timp de 2 - 3 ore. Valorile
obţinute se înscriu pe o curbă.
Interpretare:
în mod normal tolbutamidul administrat i.v. produce eliberarea de insulină
din pancreas, care determină la 30 de minute de la injectare, o scădere a
glicemiei cu peste 25 % din valoarea sa iniţială, revenind la normal după
90 - 120 de minute;
curba de tip diabet zaharat se caracterizează prin scăderea discretă
(sub 25 %) şi tardivă (la 2 ore de la injectare) a glicemiei;
în hiperinsulinismul organic (insulinom) scăderea glicemiei este masivă –
peste 35 - 40 % din valoarea sa iniţială la 30 de minute de la recoltare.
Curba nu revine la normal nici după 180 de minute.
173
Probleme:
174
ANEXA 1
Tabel 1. Valori normale ale principalilor parametri biochimici în sânge
175
BIOCHIMIE
Albumina 3.5 - 5.0 mg/dL
Fosfataza alcalină (copii) 38 - 138 U/L
Fosfataza alcalină (adulţi) 20 - 40 U/L
Amoniac 11 - 35 µmol/L
Amilaza 50 - 150 U/dL
AST, SGOT 2 - 20 U/L
ALT, SGPT 2 - 16.5 U/L
LDH 138 - 276 U/L
γ-GT (bărbaţi) 6 - 28 U/L
γ-GT (femei) 4 - 18 U/L
Bilirubina directă 0.0 - 0.25 mg/dL
Bilirubina indirectă total minus direct
Bilirubina totală 0.2 - 1 mg/dL
Calciu (total) 9 - 11 mg/dL
Cloruri 355 – 375 mg/dL
Creatina (bărbaţi) 0.2 - 0.6 mg/dL
Creatina (femei) 0.6 - 1.0 mg/dL
Creatinina (bărbaţi) 0.6 - 1.2 mg/dL
Creatinina (femei) 0.5 - 1 mg/dL
70 - 110 mg/dL
Glucoza
(glicozuria ≥ 180 mg/dL)
Fier (bărbaţi) 90 - 160 µg/dL
Fier (femei) 80 – 130 µg/dL
Capacitate totală de legare a fierului 250 - 400 µg/dL
Magneziu 1.8 - 2.9 mg/dL
Osmolaritate 300-310 mOsm/L
Fosfor (adulţi) 3.5 – 5 mg/dL
Fosfor (copii) 4 – 7 mg/dL
Potasiu 16 – 20 mg/dL
Sodiu 310 – 345 mg/dL
Proteine totale 7 - 9 g/dL
Fibrinogen 200 - 400 mg/dL
Uree 20 - 40 mg/dL
Acid uric (bărbaţi) 3.5 - 8 mg/dL
Acid uric (femei) 2.5 - 7 mg/dL
PROFILUL LIPIDIC (Adult)
Lipide totale 600 – 800 mg/dl
Colesterol (total) < 200 mg/dL
Colesterol (HDL) > 60 mg/dL
Colesterol (LDL) < 130 mg/dL
Trigliceride 50 - 150 mg/dL
176
ANEXA 2
Tabel 1. Multiplii şi submultiplii unităţilor de măsură
1024 yotta Y
1021 zetta Z
1018 exa E
1015 peta P
1012 tera T
109 giga G
106 mega M
103 kilo k
102 hecto h
101 deca da
100 - -
10-1 deci d
10-2 centi c
10-3 mili m
10-6 micro μ
10-9 nano n
10-12 pico p
10-15 femto f
10-18 atto a
10-21 zepto z
10-24 yokto y
177
Bibliografie selectivă
178
17. Osan A, Nagy E, Tero-Vescan A, Biochimie practică. University Press,
Târgu-Mures; 2008. 169 p.
18. Bodoki E, Cristea C, Săndulescu R, Oprean R. Metode de separare şi
analiză instrumentală. Editura Risoprint, Cluj-Napoca; 2014. 86 p.
19. Săndulescu R, Oprean R, Mirel S, Ede E, Cristea C, Lotrean S. Chimie
analitică calitativă, ghid de lucrări practice. Ediţia a-III-a, Editura Risoprint,
Cluj-Napoca; 2015. 276 p.
20. Săndulescu R, Oprean R, Mirel S, Bodoki E, Cristea C, Lotrean S. Chimie
analitică cantitativă: analiza volumetrică şi gravimetrică, ghid de lucrări
practice. Editura Risoprint, Cluj-Napoca; 2014. 183 p.
21. Bodoki E, Cristea C, Săndulescu R, Oprean R. Quantitative analytical
chemistry. Editura Risoprint, Cluj-Napoca; 2013. 191 p.
22. Bodoki E, Cristea C, Hârceagă V, Cernat A, Feier B, Iacob B, et all.
Separation methods and instrumental analysis - laboratory guidebook.
Editura Risoprint, Cluj-Napoca; 2014. 91 p.
23. Maghiar AL. Lucrări practice de fiziologie. Editura Universităţii din
Oradea; 2013. 209 p.
24. Champe PC, Richard AH, Ferrier DR. Lippincott Biochimie ilustrată. ediţia
a-4-a, Editura Medicală Callistro Bucureşti; 2010. 520 p.
25. Cristea-Popa E, Popescu A, Truţia E, Dinu V. Tratat de Biochimie
Medicală. Editura Medicală-Bucureşti; 2006. 775p.
26. Campbell PN, Smith AD. Biochimie ilustrată. Editura Academiei Române,
Bucureşti; 2004. 216 p.
27. Gilău D, Antonescu A, Dobjanschi L, Gilău RD, Gilău L. Compendiu de
Biochimie medicală. Editura Imprimeriei de Vest, Oradea; 2002. 274 p.
28. Gilău L, Proinov I. Biochimie medicală, Partea I. Editura Universităţii din
Oradea; 1999. 242 p.
29. Mihele D. Biochimie clinică. Editura Medicală Bucureşti; 2006. 486 p.
30. Dobjanschi L, Antonescu A, Bogdan N, Codreanu I, Gilău D, Mureşan M,
Gilău L. Lucrări practice de biochimie. Editura Imprimeriei de Vest,
Oradea; 2001. 178 p.
31. Moldoveanu E, Marta D. Biochimie Medicală-Lucrări practice pentru
studenţi. Editura Universităţii ―Titu Maiorescu‖, Bucureşti; 2011. 82 p.
32. Vicaş S. Chimie organică şi biochimie – lucrări practice. Editura
AcademicPres, Cluj-Napoca, 2008. 160 p.
33. Farmacopeea Română, Ediţia a-X-a, Editura Medicală, Bucureşti; 2008.
1315 p.
34. Dobjanschi L. Biochimie medicală. Editura Universitaţii Oradea; 2007. 253
p.
35. Medical labs [online]. [2014] [accesat 2016 octombrie 20]; disponibil pe:
URL: http://www.medical-labs.net/difference-between-plasma-and-serum-
1531/.
179
36. Medicina de urgenţă [online]. [2016] [accesat 2016 octombrie 20];
disponibil pe: URL: http://salvezidacastiisaactionezi.blogspot.ro/2016/01/
recoltarea-sangelui-prin-sistemul.html.
37. Fay MM: Chemistry, chapter 5 [online]. [2014] [accesat 2016 octombrie
20]; disponibil pe: URL: http://wps.prenhall.com/wps/media/objects/
602/616516/Media_Assets/Chapter05/Text_Images/FG05_03.JPG.
38. Patel T, Kukkar V, Sovasia N, Seth GL, Bihani SD: Electronic transition in
uv visible spectroscopy [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016
octombrie 20]; disponibil pe: URL: http://www.pharmatutor.org/articles/
summary-on-electronic-transition-in-uv-visible-spectroscopy.
39. Owen A: Tutorial on UV-Visible Spectroscopy [online]. [2000] [accesat
2016 octombrie 20]; disponibil pe: URL: http://www.agilent.com/cs/
Satellite?assettype=GSA_C&assetid=1404943754587&d=&formassembly=
false&pagename=Agilent/GSA_C/GenericInnerTemplateWithFourZones_
New.
40. Heda N: Spectrophotometry - Principles [online]. [2013] [accesat 2016
octombrie 20]; disponibil pe: URL: http://namrataheda.blogspot.ro/
2013/06/spectrophotometry-part-1.html.
41. Radu OM, Gutkin D: Case 638 - Recurrent pneumonia and pain crises in a
young female patient [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016 octombrie
20]; disponibil pe: URL: http://path.upmc.edu/cases/case638.html.
42. Scrigroup [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016 octombrie 20];
disponibil pe: URL: http://www.scrigroup.com/sanatate/
FIZIOPATOLOGIA-METABOLISMULUI-94416.php.
43. Sebia [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016 octombrie 20]; disponibil
pe: URL: http://www.sebia.com/en-EN/produits/hydragel-proteine.
44. Bioterapiro [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016 octombrie 20];
disponibil pe: URL: http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_
index_ enciclopedic_terapeuticDiabet_zaharat.html.
180