Sunteți pe pagina 1din 180

Coordonatori:

MARIANA MUREŞAN LUCIANA DOBJANSCHI

BIOCHIMIE MEDICALĂ

PARTEA I

Ghid de lucrări practice

Ediţie revăzută şi adăugită


ISBN 978-606-10-1823-9
ISBN 978-606-10-1824-6

Oradea, 2016
REFERENȚI:

Prof. univ. dr. Robert Săndulescu


Facultatea de Farmacie,
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Iuliu Haţieganu‖ Cluj-Napoca

Prof. univ. dr. Laura Graţiela Vicaş


Facultatea de Medicină şi Farmacie, Universitatea din Oradea

Redactare: Roxana Ivaşca


Tehnoredactare: Luminiţa Fritea, Camelia Mraz, Ioana Codreanu,
Alexandru Jurcă
Design: Luminiţa Fritea, Alexandru Jurcă

2
„Science is more than a body of knowledge. It’s a way of thinking,
a way of sceptically interrogating the universe‖.

Carl Sagan

3
CUPRINS

LUCRAREA 1 .......................................................................................................... 9
I. ORGANIZAREA ŞI PROTECŢIA MUNCII ÎN LABORATORUL DE
BIOCHIMIE (IOANA CODREANU)................................................................... 9
II. ECHIPAMENTE ŞI APARATURǍ DE LABORATOR. ............................ 12
OPERAŢII UZUALE ÎN LABORATOR. METODE DE SEPARARE
(LUMINIŢA FRITEA) ......................................................................................... 12
II.1. STICLĂRIA DE LABORATOR ............................................................. 12
II.2. APARATURA DE LABORATOR .......................................................... 14
II.3. OPERAŢII UZUALE ÎN LABORATOR. METODE DE SEPARARE
............................................................................................................................. 15
III. FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ REZULTATELE ANALIZELOR
(CAMELIA MRAZ) ............................................................................................. 19
III.1. VARIAŢII ANALITICE ....................................................................... 19
III.2. VARIAŢII BIOLOGICE ...................................................................... 20
IV. NOŢIUNI DE ANALIZĂ CHIMICĂ (LUMINIŢA FRITEA) .................. 26
IV.1. NOŢIUNEA DE ATOM-GRAM, MOLECULĂ-GRAM,
ECHIVALENT-GRAM, OSMOL ................................................................... 26
IV.2. SOLUŢII. MODUL DE EXPRIMARE A CONCENTRAŢIILOR .... 28
IV.2.1. Exprimarea fizică a concentraţiei unei soluţii ............................... 28
IV.2.2. Exprimarea chimică a concentraţiei unei soluţii ........................... 30
IV.2.3. Noţiunea de titru şi factor ................................................................ 31
IV.3. UNITĂŢI ŞI MODURI DE EXPRIMARE ÎN LABORATORUL
CLINIC .............................................................................................................. 32
LUCRAREA 2 ........................................................................................................ 33
V. MEDIUL INTERN. ANALIZA BIOCHIMICĂ A SÂNGELUI (CAMELIA
MRAZ) ................................................................................................................... 33
V.1. PROPRIETĂŢILE SÂNGELUI .............................................................. 33
V.2. FUNCŢIILE SÂNGELUI......................................................................... 34
V.3. COMPONENTELE SÂNGELUI ............................................................ 36
V.4. TEHNICA RECOLTǍRII SÂNGELUI PRIN SISTEMUL
VACUTAINER ................................................................................................. 39
LUCRAREA 3 ........................................................................................................ 43
VI. ECHILIBRUL ACIDO-BAZIC. PH ............................................................. 43
VOLUMETRIA ACIDO-BAZICǍ. ACIDOZA ŞI ALCALOZA (CAMELIA
MRAZ, LUMINIŢA FRITEA) ............................................................................ 43
VI.1. pH. SISTEME TAMPON. ECUAŢIA HENDERSON -
HASSELBALCH. MECANISME DE REGLARE A ECHILIBRULUI
ACIDO-BAZIC ................................................................................................. 43
VI.1.1. Concepţia de acid şi bază, respectiv de pH şi pOH ....................... 43
VI.1.2. Sisteme tampon ................................................................................. 46
VI.1.3. Mecanisme de reglare a echilibrului acido-bazic .......................... 49

4
VI.2. DETERMINAREA REZERVEI ALCALINE PRIN METODE
VOLUMETRICE .............................................................................................. 51
VI.2.1. Metode volumetrice .......................................................................... 51
VI.2.2. Determinarea rezervei alcaline prin metode volumetrice ............ 53
VI.3. TULBURĂRI ALE ECHILIBRULUI ACIDO-BAZIC....................... 55
VI.3.1. Acidoza metabolică ........................................................................... 56
VI.3.2. Alcaloza metabolică .......................................................................... 57
VI.3.3. Acidoza respiratorie ......................................................................... 58
VI.3.4. Alcaloza respiratorie ........................................................................ 59
VI.3.5. Tulburări acido-bazice mixte .......................................................... 61
VI.3.6. Explorarea echilibrului acido-bazic ................................................ 61
LUCRAREA 4 ........................................................................................................ 63
VII. ELECTROLIŢI. ANIONI. CATIONI. METODE DE DOZARE (IOANA
CODREANU) ........................................................................................................ 63
VII.1. APA ......................................................................................................... 63
VII.2. ELECTROLIŢII .................................................................................... 66
VII.2.1. Metode utilizate pentru determinarea electroliţilor .................... 67
VII.2.2. Dozarea sodiului şi a potasiului ..................................................... 68
VII.2.3. Dozarea calciului ............................................................................. 71
VII.2.4. Dozarea magneziului ...................................................................... 73
VII.2.5. Dozarea fierului seric ..................................................................... 75
VII.2.6. Dozarea clorului .............................................................................. 76
VII.2.7. Fosforul ............................................................................................ 79
LUCRAREA 5 ........................................................................................................ 82
VIII. AMINOACIZII. REACŢII DE IDENTIFICARE (LUMINIŢA FRITEA,
IOANA CODREANU) .......................................................................................... 82
VIII.1. REACŢII DE IDENTIFICARE A AMINOACIZILOR DATORATE
GRUPǍRII AMINO ......................................................................................... 83
VIII.1.1. Reacţia ninhidrinei ........................................................................ 83
VIII.2. REACŢII DE IDENTIFICARE A AMINOACIZILOR DATORATE
GRUPǍRII CARBOXIL .................................................................................. 84
VIII.2.1. Reacţia cu ionii de cupru (Cu2+) în mediu alcalin ...................... 84
VIII.3. REACŢII DE IDENTIFICARE A AMINOACIZILOR DATORATE
RADICALULUI R ............................................................................................ 85
VIII.3.1. Reacţia xantoproteică.................................................................... 85
VIII.3.2. Reacţia Millon ................................................................................ 85
VIII.3.3. Reacţia Adamkiewicz-Hopkins .................................................... 86
VIII.3.4. Reacţia Sakaguchi ......................................................................... 87
VIII.3.5. Reacţia Erlich-Pauli ...................................................................... 87
VIII.4. REACŢII SPECIFICE AMINOACIZILOR CU SULF ................... 88
VIII.5. DOZAREA AMINOACIZILOR PRIN METODA SŐRENSEN .... 90
LUCRAREA 6 ........................................................................................................ 93
IX. REACŢII DE IDENTIFICARE A PROTEINELOR. PUNCTUL
IZOELECTRIC (CAMELIA MRAZ, IOANA CODREANU) ......................... 93

5
IX.1. REACŢII DE IDENTIFICARE A PROTEINELOR .......................... 93
IX.1.1. Reacţia biuretului ............................................................................. 93
IX.1.2. Reacţia cu beta-naftochinona .......................................................... 95
IX.2. REACŢII DE PRECIPITARE A PROTEINELOR ............................ 95
IX.2.1. Reacţii de precipitare reversibile .................................................... 95
IX.2.2. Reacţii de precipitare ireversibile ................................................... 96
IX.3. DETERMINAREA PUNCTULUI IZOELECTRIC AL
PROTEINELOR ............................................................................................... 99
LUCRAREA 7 ...................................................................................................... 102
X. METODE OPTICE DE ANALIZĂ. DETERMINAREA PROTEINELOR
TOTALE DIN SER (LUMINIŢA FRITEA, CAMELIA MRAZ).................. 102
X.1. METODE SPECTROSCOPICE DE ANALIZĂ ................................. 102
X.1.1. Radiaţia electromagnetică şi spectrul de absorbţie ...................... 102
X.1.2. Legea absorbţiei radiaţiilor ............................................................. 104
X.1.3. Determinări calitative şi cantitative ............................................... 105
X.1.4. Princpiul de funcţionare a unui spectrofotometru ........................ 107
X.2. DETERMINAREA PROTEINELOR TOTALE DIN SER ................ 107
X.2.1. Dozarea proteinelor prin metoda Gornall ..................................... 108
LUCRAREA 8 ...................................................................................................... 112
XI. PROTEINOGRAMA. FRACŢIUNI ELECTROFORETICE
(ALEXANDRU JURCĂ) .................................................................................... 112
XI.1. ELECTROFOREZA ............................................................................. 112
XI.1.1. Electroforeza proteinelor serice .................................................... 113
XI.1.2. Electroforeza în gel de agaroză ..................................................... 113
LUCRAREA 9 ...................................................................................................... 120
XII. ANALIZA BIOCHIMICǍ A VITAMINELOR (LUMINIŢA FRITEA,
ALEXANDRU JURCĂ) ..................................................................................... 120
XII.1. REACŢII PENTRU CAROTENOIDE ŞI VITAMINA A ............... 120
XII.1.1. Identificarea carotenoidelor şi a vitaminei A cu SbCl3: reacţia
CARR-PRICE ............................................................................................. 120
XII.1.2. Identificarea vitaminei A cu acid tricloracetic ........................... 121
XII.1.3. Dozarea vitaminei A ..................................................................... 121
XII.2. REACŢII PENTRU PROVITAMINELE ŞI VITAMINELE D ..... 122
XII.2.1. Reacţia Liebermann-Burchard.................................................... 122
XII.2.2. Reacţia cu anilina şi HCl .............................................................. 122
XII.2.3. Reacţia CARR-PRICE ................................................................. 122
XII.2.4. Identificarea vitaminelor D cu aldehide aromatice ................... 123
XII.2.5. Diferenţierea între vitaminele D2 şi D3 ........................................ 123
XII.3. DOZAREA VITAMINEI PP .............................................................. 123
XII.4. REACŢII PENTRU IDENTIFICAREA ŞI DOZAREA VITAMINEI
C ........................................................................................................................ 124
XII.4.1. Identificarea vitaminei C cu azotat de argint ............................. 124
XII.4.2. Identificarea vitaminei C cu nitroprusiat de sodiu .................... 124
XII.4.3. Dozarea vitaminei C prin metoda iodometrică .......................... 124

6
XII.4.4. Dozarea vitaminei C din sânge şi urină prin metoda ROE şi
Kuether ........................................................................................................ 125
XII.5. REACŢII DE IDENTIFICARE ŞI DOZARE A VITAMINEI B1 .. 126
XII.5.1. Identificarea vitaminei B1 sub formă de tiocrom ....................... 126
XII.5.2. Dozarea vitaminei B1 prin diazotare ........................................... 127
LUCRAREA 10 .................................................................................................... 130
XIII. ANALIZA BIOCHIMICǍ A ENZIMELOR (IOANA CODREANU) . 130
XIII.1. MODALITĂŢI DE EXPRIMARE ŞI DE DETERMINARE A
ACTIVITĂŢII ENZIMATICE...................................................................... 131
XIII.2. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ENZIMATICE A
COLINESTERAZEI SERICE NESPECIFICE ........................................... 132
XIII.3. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII TRANSAMINAZELOR ....... 134
XIII.3.1. Determinarea activităţii GPT ..................................................... 135
XIII.3.2. Determinarea activităţii GOT .................................................... 136
XIII.4. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII γ-
GLUTAMILTRANSPEPTIDAZEI SERICE .............................................. 138
XIII.5. DETERMINAREA LACTAT DEHIDROGENAZEI (LDH) ........ 140
XIII.6. DETERMINAREA CREATINFOSFOKINAZEI (CK) ................. 141
LUCRAREA 11 .................................................................................................... 143
XIV. FOSFATAZA ALCALINǍ ŞI ACIDǍ (CAMELIA MRAZ)................ 143
XIV.1. DETERMINAREA EXPERIMENTALĂ A ACTIVITĂŢII
FOSFATAZEI ALCALINE ŞI ACIDE ........................................................ 143
XIV.2. DETERMINAREA FOSFATAZEI ALCALINE (FA) ................... 144
XIV.2.1. Fosfataza alcalină serică ............................................................. 146
XIV.3. FOSFATAZA ACIDĂ SERICĂ ........................................................ 148
LUCRAREA 12 .................................................................................................... 150
XV. ANALIZA BIOCHIMICĂ A GLUCIDELOR (LUMINIŢA FRITEA,
ALEXANDRU JURCĂ) ..................................................................................... 150
XV.1. REACŢIA PODOBEV- MOLISCH - UDRANSKY ......................... 152
XV.2. REACŢII DE DIFERENŢIERE A ALDOZELOR ŞI CETOZELOR
........................................................................................................................... 153
XV.2.1. Reacţia cu resorcină (Reacţia Selivanoff) ................................... 153
XV.3. REACŢII DE DIFERENŢIERE A PENTOZELOR DE HEXOZE 154
XV.3.1. Reacţia cu orcina (Reacţia Bial)................................................... 154
XV.3.2. Reacţia Bial modificată ................................................................. 154
XV.3.3. Reacţia Tollens pentru pentoze .................................................... 155
XV.3.4. Reacţia aldopentozelor cu benzidina ........................................... 155
XV.4. REACŢII DE CONDENSARE A MONOZAHARIDELOR ......... 156
CU FENILHIDRAZINA ............................................................................... 156
XV.5. ACŢIUNEA ALCALIILOR ASUPRA OZELOR ............................ 157
XV.6. REACŢII DE REDUCERE ................................................................. 158
XV.6.1. Reacţii de reducere a ionului Cu2+ ............................................... 158
XV.6.2. Reacţii de reducere a ionului Ag+ ................................................ 161
XV.6.3. Reacţii de reducere a ionului Bi3+ ................................................ 162

7
XV.6.4. Reducerea unor compuşi organici ............................................... 162
XV.7. DOZAREA GLUCIDELOR REDUCĂTOARE ............................... 164
Metoda Ionescu-Matiu.................................................................................... 164
LUCRAREA 13 .................................................................................................... 166
XVI. DOZAREA GLUCOZEI ŞI GLICEMIA (ALEXANDRU JURCĂ) .... 166
XVI.1. METODE REDUCǍTOARE ............................................................ 166
XVI.2. METODE ENZIMATICE ................................................................. 167
XVI.2.1. Metoda enzimatică cu glucozoxidază ......................................... 167
XVI.2.2. Metoda enzimatică cu glucozo-dehidrogenază ......................... 167
XVI.3. DOZAREA GLUCOZEI CU O-TOLUIDINĂ ................................ 168
XVI.4. GLICEMIA - CARACTERISTICI ................................................... 168
XVI.4.1. Valorile glicemiei ......................................................................... 169
XVI.4.2. Hemoglobina glicozilată sau glicată (HbA1c) ........................... 171
XVI.4.3. Glicozuria ..................................................................................... 171
XVI.4.4. Hiperglicemia provocată pe cale orală (testul de toleranţă la
glucoză = TTGO)......................................................................................... 172
ANEXA 1 ............................................................................................................. 175
ANEXA 2 ............................................................................................................. 177
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ......................................................................... 178

8
LUCRAREA 1

I. ORGANIZAREA ŞI PROTECŢIA MUNCII ÎN


LABORATORUL DE BIOCHIMIE

Pentru ca activitatea practică să se desfăşoare în condiţii optime şi de


siguranţă trebuie respectate anumite reguli de ordine interioară. Activitatea care se
desfăşoară în laborator prin specificul ei pretinde o anumită disciplină, o atitudine
plină de răspundere în manipularea reactivilor şi a diferitelor materiale.
Este cunoscut faptul că în laborator, dezordinea, neatenţia, superficialitatea
şi cunoaşterea insuficientă a proprietăţilor substanţelor cu care se lucrează, precum
şi a aparatelor, pot atrage după sine diferite accidente. Substanţele şi reactivii
folosiţi fiind în majoritatea lor toxici, au acţiune vătămătoare asupra organismului.
Din această cauză, substanţele nu se vor gusta niciodată, iar vaporii sau gazele
care se degajă în cursul reacţiilor se vor mirosi cu atenţie (antrenând cu mâna un
curent de aer spre nas). Lichidele inflamabile nu se vor încălzi la foc direct, ci
numai pe baia de apă şi în aparate specifice acestei operaţii. Pentru reacţiile care
necesită solvenţi inflamabili vom lua măsuri ca în laborator să nu existe nicio sursă
de flacără.
Dacă din neatenţie vreun reactiv ajunge pe haine sau pe corp, se va proceda
întâi la spălarea cu multă apă a locurilor atinse şi apoi se vor aplica substanţe care
neutralizează acţiunea acestora. Pentru acizi vom folosi substanţe slab alcaline ca:
NaHCO3 sau NH4OH diluat, iar pentru baze, acizii slabi ca: acidul boric sau acidul
acetic diluat.
Eprubeta, ca mijloc curent de efectuare a reacţiilor, nu se va umple mai mult
de 1/3 din volumul său, iar încălzirea ei se va face cu atenţie, treptat, dinspre partea
superioară a conţinutului său către cea inferioară, evitându-se astfel izbucnirea
lichidului din stratul inferior prin supraîncălzire. Încălzirea se va face asigurându-se
o agitare permanentă pentru omogenizarea lichidului din eprubetă. Eprubeta nu se
va îndrepta spre colegi sau spre cel ce lucrează.
La diluarea H2SO4 conc. se va ţine cont de marea lui aviditate faţă de apă.
Se va adăuga acid sulfuric în porţiuni mici, sub agitare continuă peste apă şi nu
invers! Dacă încălzirea vasului este prea puternică ca urmare a reacţiei exoterme
care are loc, se va răci vasul la exterior sub un curent de apă rece.
Fosforul alb se păstrează sub apă, metalele alcaline sub petrol, manipularea
lor făcându-se cu atenţie sporită. Urme din aceste substanţe lăsate din neglijenţă în
contact cu aerul pot produce incendii.
Fiecare substanţă şi reactiv vor fi etichetate, iar pentru reactivii în soluţie se
va preciza concentraţia lor.
La plecarea din laborator se vor controla atât becurile de gaz, cât şi
robinetele de apă dacă sunt închise, iar aparatele electrice se vor scoate din priză.

9
În cazul în care se aprinde o substanţă, la stingerea ei se va folosi apă numai
în cazul în care aceasta este miscibilă cu apa. În celelalte cazuri se vor folosi nisip,
stingătorul de incendii sau se va înăbuşi flacăra prin acoperire cu o pătură.
Disciplina şi cunoaşterea fiecărei operaţiuni de laborator care urmează a fi
executată de către studenţi, sub toate aspectele ei, pot evita accidentele.

Măsuri privind manipularea şi utilizarea substanţelor chimice în


laborator

 La primirea şi folosirea substanţelor pentru experienţe vor fi citite cu atenţie


etichetele pentru a nu se utiliza alte substanţe;
 Reactivii trebuie păstraţi în recipientele şi ambalajele originale deoarece acestea
asigură condiţiile optime pentru fiecare reactiv;
 Manipularea acizilor concentraţi, a amoniacului, a bromului se va face cu
precauţie;
 Substanţele care emit vapori sau gaze toxice se păstrează în locuri care permit
evacuarea lor rapidă;
 Lichidele care au tendinţa să formeze peroxizi organici se păstrează departe de
surse de lumină.

Măsuri de igienă personală

 Se interzice fumatul, consumul de alimente sau lichide;


 Purtarea unui halat şi a mănuşilor este obligatorie;
 Mâinile se spală după fiecare manipulare care ar putea implica contaminarea cu
sânge, ser, plasmă sau alte produse provenite de la bolnavi, manevră urmată de
dezinfecţia cu alcool de concentraţie peste 70 %;
 Mâinile nu se vor şterge niciodată de halat sau îmbrăcăminte.

Măsuri privind manoperele uzuale

 Se interzice aspirarea lichidului în pipetă cu gura;


 Pipetele vor fi manipulate cu baloane de cauciuc (pere de cauciuc) sau alte
dispozitive din plastic/silicon (pompe pentru pipete);
 După folosire, ustensilele de laborator nu vor fi puse pe masa de lucru, ci în
vasul cu soluţie dezinfectantă (cloramină, amestec sulfo-cromic etc.), vas care
trebuie să fie acoperit complet.

10
Măsuri de prim ajutor

 În caz de inhalare a unor vapori sau gaze toxice, pacientul trebuie scos din
mediul toxic la aer curat;
 În caz de contact cu substanţe toxice la nivelul ochilor se practică spălarea
ochilor cu apă din abundenţă, ţinând ochii larg deschişi şi mişcându-i în toate
direcţiile;
 Orice haină contaminată cu substanţe chimice va fi îndepărtată;
 În caz de contaminare la nivelul pielii se va practica spălarea cu apă rece din
abundenţă, evitându-se folosirea substanţelor acide sau bazice care prin reacţii
exoterme pot agrava leziunile produse;
 În caz de ingestie a substanţelor toxice se evită administrarea oricărei substanţe;
 Important: toate persoanele care au suferit accidente trebuie transportate
la spital!

11
II. ECHIPAMENTE ŞI APARATURǍ DE LABORATOR.
OPERAŢII UZUALE ÎN LABORATOR. METODE DE SEPARARE

II.1. STICLĂRIA DE LABORATOR

Există două tipuri de vase pentru măsurarea volumelor: vase de umplere şi


vase de golire. Pe aceste vase sunt gravate mai multe caracteristici: volumul lor,
temperatura de etalonare (20 °C), litera „U‖ – umplere, „G‖ – golire, gradaţii, tipul
sticlei etc.

1. Vase de umplere (folosite la măsurarea prin umplere a unor volume de


soluţii):
Cilindrii gradaţi (Figura 1) sunt cilindri de sticlă sau plastic cu talpă,
având gradaţii corespunzătoare volumelor de măsurat, în general subdiviziuni ale
volumului maxim ce poate fi măsurat cu cilindrul respectiv. Capacitatea cilindrilor
variază de la 5 ml la câţiva litri. Ei sunt utilizaţi în general pentru transferul de
lichide. Cilindrii gradaţi nu se utilizează pentru măsurări exacte de volume, ci
doar pentru măsurători aproximative.
Baloanele cotate (Figura 2) au partea de jos bombată, fundul plat, iar gâtul
lung şi îngust ce se închide cu un dop şlefuit (ceea ce permite răsturnarea balonului
pentru amestecarea componentelor din soluţie, fără ca lichidul să iasă din balon).
Pe gâtul acestuia este gravată cota (sau joja), indicând nivelul până unde trebuie
umplut balonul cotat pentru volumul marcat. Volumul de soluţie trebuie să aibă
meniscul inferior perfect tangent la cotă. Baloanele cotate sunt utilizate în special la
prepararea şi conservarea soluţiilor titrate.

Figura 1. Cilindru gradat [3] Figura 2. Balon cotat [4]

2. Vase de golire (folosite la măsurarea prin golire a unor volume de soluţii):


Biuretele sunt de două categorii: manuale (Figura 3) şi automate (Figura 4).
Biuretele sunt tuburi de sticlă gradate care au la partea inferioară un dispozitiv
pentru reglarea scurgerii (un robinet şlefuit şi gresat). Tuburile sunt gradate de sus
în jos şi sunt calibrate pentru diferite volume: 10, 20, 50, 100 ml.
Pentru analize microvolumetrice se utilizează microbiurete de 1-5 ml. Biuretele se
fixează în poziţie verticală, pe stative de metal, cu ajutorul unor cleme.
12
Citirea corectă a volumului la biuretă se face după tangenta orizontală la baza
meniscului (pentru soluţii incolore) sau la partea superioară a meniscului
(pentru soluţii colorate) pentru a evita eroarea de citire (eroarea de paralaxă).
Se mai utilizează şi biuretele Schellbach (Figura 5), care au pe partea internă
posterioară o dungă de culoare albastră, roşie sau neagră pe un fond alb-lăptos
evitând reflexia luminii la suprafaţa soluţiei.

Figura 3. Biurete [5]; Figura 4. Biurete automate [6]; Figura 5. Biurete Schellbach
[7]

Pipetele gradate (Figura 6) au gradaţii mai mari pentru indicarea fiecărui


mililitru şi cote intermediare, mai mici pentru zecimile de mililitru. Cu acestea se
pot măsura volume de soluţii egale cu volumul lor total sau volume intermediare
mai mici.
Pipetele cotate (negradate, volumetrice, cu bulă) (Figura 7) au două cote
extreme, servind la măsurarea unor volume de soluţie egale cu volumul total,
cuprins între cele două cote. Cu aceste pipete nu se pot măsura volume
intermediare.
Pentru aspirarea lichidului se folosesc propipete: pere de cauciuc sau pompe,
fiind interzisă folosirea cavitaţii bucale în acest scop!
Pipetele automate (Figura 8) au o precizie foarte bună şi un design
ergonomic. Ele pot fi de volum fix sau variabil. Prezintă un piston utilizat pentru
prelevarea volumului de soluţie (prin apăsare până la prima treaptă şi apoi
eliberarea treptată a acestuia), pentru eliminarea volumului prelevat (prin apăsare
până la treapta a doua), pentru reglarea volumului prin rotire şi pentru schimbarea
vârfului pentru măsurarea unei soluţii diferite de cea anterioară.

13
Figura 6. Pipete gradate [8]; Figura 7. Pipete cotate [9]; Figura 8. Pipete automate
[10]

Alte vase folosite în laboratorul de biochimie sunt: eprubetele, paharele


Erlenmeyer, paharele Berzelius, balonul cu fund rotund, seringi, pâlnii etc.

II.2. APARATURA DE LABORATOR

Măsurarea maselor diferitelor cantităţi de substanţe se face prin operaţia de


cântărire. Aparatele folosite în acest scop se numesc balanţe. O balanţă analitică
trebuie să îndeplinească criteriile de sensibilitate, precizie şi exactitate.

 Sensibilitatea unei balanţe reprezintă diferenţa cea mai mică de masă care
poate fi sesizată cu ajutorul balanţei respective.
În funcţie de sensibilitate, balanţele pot fi împărţite în:
- Balanţe tehnice (sensibilitate 10-2 g);
- Balanţe farmaceutice (sensibilitate 10-3 g);
- Balanţe analitice (sensibilitate 10-4 – 5·10-5 g);
- Balanţe semimicroanalitice (sensibilitate 10-5 g);
- Balanţe microanalitice (sensibilitate 10-6 g);
- Balanţe ultramicroanalitice (sensibilitate 10-7 g).

 Precizia unei balanţe reprezintă măsura gradului cu care aceasta va


reproduce datele obţinute, la câteva cântăriri succesive, ale unuia şi
aceluiaşi obiect.

 Exactitatea unei balanţe este dată de apropierea valorilor cântăririlor unui


obiect de valoarea sa adevărată.

Balanţele pot fi împărţite în două categorii: mecanice (Figura 9) şi


electronice (Figura 10).

14
Figura 9. Balanţă mecanică [11] Figura 10. Balanţă electronică [12]

Alte instrumente utilizate în laborator:


- Etuva (cuptor electric cu temperatură reglabilă);
- Centrifuga (utilizată pentru separarea componentelor unui amestec
heterogen pe baza forţei centrifuge);
- Spectrofotometrul (măsoară absorbţia sau transmisia unei soluţii la diferite
lungimi de undă);
- pH-metrul (măsoară pH-ul unei soluţii);
- Refractometrul (măsoară indicele de refracţie a unei soluţii);
- Polarimetrul (măsoară unghiul de rotaţie a luminii plan polarizate a unei
soluţii optic active);
- Agitatorul magnetic (pentru agitare, omogenizare).
Pentru efectuarea reacţiilor la cald se foloseşte ca şi sursă de încălzire:
becul Bunsen, baia de apă, plita electrică.

II.3. OPERAŢII UZUALE ÎN LABORATOR. METODE DE


SEPARARE

 Dizolvarea: este un fenomen fizic care constă în amestecarea solutului cu


solventul, răspândirea particulelor substanţei dizolvate (atomi, ioni, molecule)
printre particulele solventului, rezultând în final o soluţie.
Solubilitatea reprezintă numărul de moli de substanţă dizolvată într-un litru
de soluţie saturată. Factorii care influenţează solubilitatea unei substanţe sunt
multipli:
- natura chimică a solvatului şi a solventului:
Substanţele se dizolvă în solvenţi cu structură asemănătoare: substanţele ionice şi
polare se dizolvă în solvenţi polari (hidrofili), iar cele nepolare în solvenţi nepolari
(hidrofobi);
- volumul de solvent;
- dimensiunea particulelor solutului;
- temperatura (agitaţia termică);

15
- presiunea (la gaze);
- agitarea;
- pH-ul;
- polimorfismul;
- adăugarea de substanţe intermediare pentru a facilita solubilizarea:
formarea de săruri solubile, hidrotropia, solubilizarea micelară, formarea de
complecşi de incluziune cu ciclodextrinele etc.

În funcţie de cantitatea de substanţă dizolvată, soluţiile pot fi:


- Soluţii saturate: conţin cantitatea maximă de substanţă dizolvată la o
anumită temperatură;
- Soluţii nesaturate: se mai poate dizolva o cantitate de solut până la saturaţie;
- Soluţii suprasaturate: conține mai mult solut decât cantitatea
corespunzătoare coeficientului de solubilitate la temperatura ordinară, deci
conţine substanţă nedizolvată.

Fenomenul de dizolvare poate fi:


- Exoterm: se degajă căldură; dizolvarea este defavorizată de creşterea
temperaturii (ex: dizolvarea în apă a NaOH, H2SO4 etc.);
- Endoterm: absoarbe căldură; dizolvarea este favorizată de creşterea
temperaturii (ex: dizolvarea în apă a NH4Cl, NH4NO3, KNO3 etc.);
- Nuloterm: dizolvarea nu e influenţată de temperatură (exemplu dizolvarea
în apă a NaCl).

 Decantarea: metodă de separare a unui sistem heterogen format dintr-o fază


solidă şi una lichidă. Faza solidă (precipitatul, sedimentul) se lasă să sedimenteze,
apoi se transvazează lichidul limpede de deasupra (supernatantul) fie utilizând o
baghetă, fie prin scurgere.

 Centrifugarea: operaţie care permite separarea rapidă sub acţiunea forţei


centrifuge a componentelor cu densităţi diferite aflate în amestec sub forma unei
suspensii într-o fază lichidă. În funcţie de densitatea particulelor suspendate
raportată la cea a fazei lichide, suspensia se poate depune spontan pe fundul vasului
formând un depozit numit sediment, acoperit de faza lichidă numită supernatant
(procesul numindu-se sedimentare), respectiv poate forma un strat de flotaţie care
pluteşte deasupra fazei lichide (procesul numindu-se flotaţie). Fazele lichide pot fi
îndepărtate prin aspirare sau decantare. Suspensiile se introduc în eprubetele
centrifugei (acestea trebuie aşezate în perechi echilibrate şi nu trebuie să fie
încărcate mai mult decât ¾ din capacitatea lor) care se rotesc în jurul unui ax
vertical.
Ultracentrifugarea reprezintă o separare a unor particule mici
(macromolecule, componente subcelulare, virusuri etc.) utilizând acceleraţii de
ordinul sutelor de mii de g. Ultracentrifugile sunt aparate de construcţie specială.
Pe baza vitezei de sedimentare se calculează constanta de sedimentare care

16
caracterizează comportamentul oricărei particule supuse ultracentrifugării. Pentru a
putea compara constantele de sedimentare între ele se utilizează noţiunea de
coeficient de sedimentare standard.

 Filtrarea: operaţia de separare a fazelor unui amestec heterogen solid-lichid


constând în trecerea amestecului printr-o suprafaţă/strat filtrant care reţine
particulele solide (reziduu) şi permite trecerea filtratului (soluţia filtrată). Pentru
filtrare se folosesc: hârtie de filtru (cu dimensiuni variate ale diametrului porilor;
poate fi calitativă sau cantitativă; filtre netede sau creţe/plisate), pâlnie. Filtrarea se
poate efectua şi la vid, folosind o pâlnie Buchner.

 Distilarea: operaţia de separare şi de purificare a substanţelor lichide


(ce pot fi încălzite la fierbere fără a se descompune) de alte lichide cu puncte de
fierbere (volatilităţi) diferite.

 Extracţia: operaţia de separare a componenţilor unui amestec omogen sau


heterogen prin dizolvare într-un solvent corespunzător. Are la bază solubilitatea
diferită a substanţelor dintr-un amestec la tratarea cu un solvent adecvat sau cu un
amestec de solvenţi nemiscibili. Există extracţie solid-lichid şi lichid-lichid.

 Dializa: metodă de separare a substanţelor unui amestec pe baza capacităţii


diferite de difuzie a componentelor amestecului printr-o membrană
semipermeabilă.

 Liofilizarea (criodesicare, criosublimare): procesul de îndepărtare a


solvenţilor din materiale îngheţate. Acest proces de deshidratare se bazează pe
îngheţarea materialului la temperatură scăzută (- 40 °C) şi presiune redusă (vid),
urmată de sublimarea gheţii sub vid (are loc tranziţia de la starea solidă direct în
starea de vapori).

 Cromatografia cuprinde metodele de separare a amestecurilor


multicomponente, având la bază distribuţia diferită a componenţilor amestecului între
o fază mobilă (denumită şi fluid purtător sau eluent) şi o fază staţionară (denumită şi
mediu adsorbant), rezultând astfel deplasarea cu viteză diferită a componenţilor purtaţi
de faza mobilă de-a lungul fazei staţionare.
Clasificarea metodelor cromatografice:
- după natura mecanismului de separare: cromatografia de repartiţie,
cromatografia de adsorbţie, cromatografia cu schimbători de ioni,
cromatografia de excluziune sterică etc.
- după natura fazei mobile: cromatografia de lichide (pe hârtie, cromatografia în
strat subţire, cromatografia pe coloană) şi cromatografia de gaze.

17
 Electroforeza: proces ce se bazează pe proprietăţile particulelor ionizate de
a migra într-un mediu lichid (soluţia unui electrolit) sub influenţa unui câmp
electric. Migrarea particulelor în câmpul electric se realizează spre polul de semn
opus încărcării particulelor respective (particulele cu sarcină pozitivă migrează spre
catod – cataforeza; particulele cu sarcină negativă spre anod – anaforeza). Migrarea
electroforetică nu are loc la punctul izoelectric.
Tipurile de electroforeză în funcţie de materialul solid utilizat sunt:
electroforeza pe hârtie de filtru/cromatografică, pe acetat de celuloză, gel
electroforeza, electroforeza capilară.

18
III. FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ REZULTATELE
ANALIZELOR

Un examen de laborator efectuat în timpul vieţii unui individ poate da


valori diferite în funcţie de starea de sănătate sau de boală a organismului.
Cu câţiva ani în urmă, problema variaţiilor fiziologice era cel mai adesea ignorată
când se interpreta un examen de laborator. Astăzi sunt studiate cu atenţie toate
cauzele de fluctuaţie a rezultatelor şi se cercetează influenţa factorilor de variaţie,
legaţi fie de metodă, de condiţiile de prelevare sau de diferenţele intra- şi inter-
individuale.
Examenul biologic ce urmăreşte variaţiile fiziologice demonstrează faptul
că acestea sunt de amplitudine mai mică decât variaţiile patologice. Ele sunt
deci mai greu de evaluat şi necesită metode de analiză mai fine. Este deci
necesară precizarea riguroasă a limitelor în care se încadrează populaţia
sănătoasă şi stabilirea de intervale de referinţă. În aceste condiţii, cunoaşterea
variaţiilor biologice şi a factorilor care afectează concentraţia diverşilor
componenţi ai organismului uman este indispensabilă.
Trebuie subliniat faptul că termenul de valori de referinţă nu poate fi aplicat
decât subiecţilor sănătoşi şi este necesar, prin urmare, să cunoaştem biologia omului
sănătos.
Pentru o interpretare mai bună a analizelor de laborator trebuie să ţinem
seama de factorii care pot influenţa rezultatele analizelor.
Din punct de vedere didactic putem distinge două surse de variaţii:
• variaţii analitice
• variaţii biologice

III.1. VARIAŢII ANALITICE

Lucrările recente ale lui Statland şi Winkel au pus în evidenţă cele două
componente principale ale variabilei analitice:
- eroarea pre-instrumentală
- eroarea instrumentală

Variabila analitică pre-istrumentală depinde de toate sursele de variaţii


cauzate de la recoltarea probei până la determinare, precum:
• pregătirea bolnavului;
• recoltarea probelor la care trebuie să se ţină cont de ora recoltării, de
felul sângelui (venos, arterial, capilar), de aplicarea garoului sau nu,
de poziţia bolnavului, de anticoagulantul utilizat;
• pregătirea probei pentru analiză: în acest caz trebuie să se ţină cont
de timpul de la prelevarea probei până la centrifugare şi de utilizarea
sau nu a conservanţilor.

19
Variabila analitică instrumentală este eroarea analitică datorată metodelor
de dozare. Ea poate fi separată în variaţii analitice pe termen scurt (apreciată prin
repetabilitatea sau reproductibilitatea pe o zi) şi pe termen lung (apreciată prin
reproductibilitatea de la o zi la alta). Variaţiile analitice de la o zi la alta sunt în
general mai importante decât cele pe o zi. Când se efectuează studii pe termen
lung este de preferat ca eşantioanele să se congeleze şi să fie analizate
simultan în aceeaşi serie şi în aceeaşi zi.
Variaţiile analitice trebuie menţinute constante şi la un nivel scăzut
pentru a mări certitudinea în momentul evaluării unui rezultat individual în
intervalul de referinţă.

III.2. VARIAŢII BIOLOGICE

Variabila biologică intra-individuală. Această noţiune se referă la


variabilitatea datorată de-a lungul timpului individului însuşi. Ea include, deci,
toate fenomenele de reglare, în particular toate ritmurile biologice şi în primul
rând procesul de îmbătrânire. Dar acesta este dificil de izolat complet de ceilalţi
factori de variaţie.
Pe plan experimental, variaţiile intra-individuale pot fi abordate prin
măsurarea succesivă, de-a lungul timpului, a unui parametru la acelaşi individ.
Alegerea intervalului de timp este foarte variabilă, în funcţie de obiectivele
urmărite. Această variabilă este greu de urmărit deoarece este dificil să
constrângi numeroşi subiecţi să participe la un asemenea program.
Aceste studii se efectuează de obicei pe populaţii restrânse de voluntari care
trăiesc în instituţii sociale, medicale etc.

Variabila biologică inter-individuală. Această variabilă reprezintă


ansamblul variaţiilor unei populaţii. Dar o populaţie este foarte heterogenă.
Dacă ţinem cont de acest lucru şi de faptul că noţiunea de omogenitate nu poate
fi definită la modul absolut, ea fiind relativă, este evident că acest număr de
factori pe care va fi necesar să-i controlăm este indefinit şi este practic
imposibil să fie studiaţi în totalitate.

Diferitele surse de variabilitate biologică


Clasificarea factorilor de variaţie biologică se efectuează cu greutate.
S-a propus clasificarea lor în variaţii intra- şi inter-individuale, în variaţii
genetice şi dobândite, în variaţii datorate mediului, în variaţii datorate factorilor
exogeni şi endogeni.
Dacă ţinem cont de diferenţele de concentraţie plasmatică a unor
constituenţi, putem distinge două grupe de factori fiziologici:
• factori de masă: importanţa masei musculare, adipoase, hepatice, care
este determinantă, de exemplu, pentru nivelul anumitor enzime care
provin din aceste ţesuturi;

20
• factori metabolici: acţionează pe substratele care suferă variaţii rapide
şi sunt supuse reglării hormonale şi nervoase.
Ţinând cont de faptul că procesul de reglare intervine net asupra variaţiilor
fiziologice, putem distinge 3 categorii de constituenţi:
- constituenţi foarte bine reglaţi (electroliţii, albuminele), cei care nu
variază decât foarte puţin;
- constituenţi cu variaţii importante (de exemplu produşii finali ai
catabolismului, ca ureea, uraţii sau enzimele eliberate din ţesuturi);
- constituenţi implicaţi parţial în mecanisme de sinteză (glucoza,
colesterolul) care suferă variaţii medii.
Este important, aşadar, să se cunoască şi mecanismele biochimice şi
fiziologice care stau la baza variaţiilor biologice, ca, de exemplu, mecanismul
de acţiune al enzimelor, timpul de înjumătăţire a diverselor substanţe etc.
Deoarece aceşti factori sunt greu de clasificat, în continuare vom descrie
factorii mai importanţi care pot influenţa rezultatele analizelor.

Vârsta
Variaţiile în funcţie de vârstă sunt bine cunoscute. În primul rând trebuie
să menţionăm concentraţiile hormonilor care suferă variaţii datorită creşterii, de
la nou născut la copil şi la adult. Se cunoaşte, de asemenea, variaţia
colesterolului şi a ureei. În ultimul timp s-a constatat că şi activitatea
fosfatazei alcaline variază în funcţie de vârstă.

Sexul
Numeroşi constituenţi plasmatici au concentraţii diferite în funcţie de
sex, enumerăm doar câţiva: hemoglobina, hematocritul, fierul, cuprul,
trigliceridele, etc. La femei amilaza, transferina au concentraţii mai crescute, pe
când la bărbat activitatea fosfatazelor alcaline, a CPK, a transaminazelor, a ureei
şi a uratului sunt mai crescute.

Rasa
Acest capitol a suscitat mult interes, dar este din ce în ce mai greu de
cercetat datorită amestecului populaţiilor. S-a constatat că la rasa neagră
concentraţia plasmatică în trigliceride, potasiu şi sodiu este mai crescută decât la
albi, iar concentraţia în acid uric este mult mai crescută la anumite populaţii din
Oceania.

Stări fiziologice deosebite: sarcină, menopauză, menstruaţie.


S-a constatat în primul rând o modificare a concentraţiei hormonale care
atrage după sine şi alte modificări. Astfel, în menopauză scade mai întâi
progesteronul, apoi estrogenii şi mai târziu 17-cetosteroizii. Tot în menopauză creşte
net activitatea fosfatazei alcaline, concentraţia plasmatică a calciului,
colesterolului, a acidului uric. În timpul menstruaţiei, pe lângă hormonii

21
implicaţi în ciclu, apar numeroase variaţii ale aldosteronului, acizilor aminaţi,
CPK, colesterolului şi ale magneziului.
În timpul sarcinii, printre variaţiile importante cauzate de această stare,
pe lângă variaţiile hormonale, putem aminti scăderea albuminelor plasmatice, a
calciului care este legat de acestea, a imunoglobulinelor, a glucozei, a acidului
uric, a hemoglobinei şi eritrocitelor, a vitaminei C. Se observă o creştere a
proteinelor care transportă hormonii, a activităţii fosfatazei alcaline care creşte de
două ori prin aportul fosfatazei alcaline placentare.
De asemenea, creşte α-fetoproteina, α-1-antitripsina, amilaza,
P-glucuronidaza, ceruloplasmina (şi cuprul), leucin-aminopeptidaza.
Mai cresc: colesterolul, trigliceridele, fosfaţii şi volemia. În sarcina gemelară
α-fetoproteina este de două ori mai crescută decât în sarcina simplă.

Alimentaţia
Alimentaţia poate interfera dozarea colorimetrică a anumitor constituenţi
datorită conţinutului lor în diverse principii cum sunt: pigmenţii, carotenii,
antocianii.
Anumite alimente conţin serotonină, 5-hidroxi-indolacetat sau
catecolamine care pot perturba dozarea, prin metode nespecifice, a substanţelor
reducătoare.
Există alimente care au efect asupra unor constituenţi biologici prin
conţinutul lor crescut în anumite substanţe, de exemplu: spanacul, măcrişul care
conţin cantităţi crescute de acid oxalic şi care interferează în dozarea calciului;
un exces alimentar de sfeclă provoacă hiperaldosteronism şi hipokalemie.
Cafeaua şi cafeina cresc glucoza plasmatică şi acizii graşi neesterificaţi şi scad
timpul Quick.
Dar cele mai importante efecte le are un regim alimentar neechilibrat, un
regim vegetarian sau hipercarnat care modifică pH-ul, inaniţia care duce la
apariţia de corpi cetonici, etc. În postul alimentar prelungit, în afara creşterii
corpilor cetonici plasmatici, creşte secreţia de aldosteron, a trigliceridelor,
glicerolului, ureei, a acidului uric.
Ingestia de alimente provoacă variaţii dificil de controlat. Astfel, la două
ore după o masă completă (700 cal), la subiecţii sănătoşi se observă o creştere cu
15 % a concentraţiei plasmatice a glucozei, cu 15 % a fosfaţilor, cu 2 % a
albuminelor şi proteinelor, cu 20 % a AST-ului şi 6 % a ALT-ului. Colesterolul,
ureea, acidul uric, sodiul, fosfataza alcalină şi LDH-ul nu suferă variaţii.
Dar unele diferenţe nu se observă decât la anumite grupe de vârstă, cum este cazul
trigliceridelor, care, după masă, sunt mai crescute la persoane peste 40 de ani.

Efortul fizic
Creşte concentraţia albuminei şi a altor enzime plasmatice. Dacă efortul
este intens pot creşte enzimele de origine celulară: LDH, aldolaza, creatinkinaza,
AST, ALT şi chiar ornitin-carbamil-transferaza. Într-un efort de intensitate
mică creşte uşor fosfatul şi proteinele plasmatice.

22
Stresul
Stresul este un factor important de care trebuie să se ţină cont mai ales în
momentul recoltării probelor, deoarece acesta duce la creşterea concentraţiei
plasmatice a trigliceridelor, colesterolului, acidului uric, glucozei, hormonului de
creştere, noradrenalinei, hormonilor tiroidieni, a acizilor neesterificaţi.

Altitudinea
Albumina plasmatică scade după 6 săptămâni la o altitudine de 5400 m,
la fel şi aldostenuria, efect mai pronunţat mai ales la vârstnici. Hemoglobina,
hematocritul, acidul uric, noradrenalina plasmatică cresc. De asemenea, se
produce o alcaloză respiratorie de efort datorată hiperventilaţiei.

Absenţa gravitaţiei
Provoacă creşterea catecolaminelor, nespecific, legat de stresul pe care îl
reprezintă lipsa gravitaţiei. Se modifică metabolismul fosfo-calcic, apărând
osteoporoza căreia i-au fost victime cosmonauţii americani.

Ortostatismul
Proteinele serice, albuminele şi substanţele legate de proteine (colesterolul,
calciul) cresc după 15 minute de stat în picioare, datorită uşoarei hipovolemii
induse de ortostatism. Aldosteronul plasmatic creşte de 5-10 ori în ortostatism faţă
de poziţia culcat, la fel şi hematocritul care creşte cu 10 %. În urină
noradrenalina creşte de 3 ori.

Ritmurile circadiene
S-a constatat faptul că activitatea plasmatică a fosfatazei alcaline scade
de la 25 % până la 50 % dimineaţa. Concentraţia plasmatică a aldosteronului
creşte de la ora 6 până la ora 15, secreţia sa fiind mai scăzută noaptea. Probabil
acest efect este datorat poziţiei ortostatice. Dar pentru aldosteronemie există
un ritm circadian deoarece pentru o postură neschimbată secreţia maximă se
observă la ora 8 şi minimă la ora 18.
Excreţia noradrenalinei este mai crescută ziua decât noaptea.
Concentraţia plasmatică a fierului are un ritm circadian cu maxim după
amiaza şi minim la ora 4 dimineaţa.
Noaptea este crescut tonusul parasimpatic.
Biosinteza colesterolului este maximă în timpul nopţii.
În condiţii fiziologice, aproximativ 70 % din cantitatea de
hidrocortizon este secretată de către corticosuprarenală între orele 0 – 10
(maxim între orele 5-9 şi minim în timpul nopţii). În situaţiile de criză sau
stres, biosinteza glucocorticoizilor poate creşte de câteva ori.

23
Mediul
Pesticidele, insecticidele, oxidul de carbon, vaporii de benzină, solvenţii
organici, lacurile/vopselele pentru păr, etc. pot da unele modificări ale examenelor
de laborator cel mai adesea din cauza modificărilor toxice (citopenie, anemie
hemolitică, nefrotoxicitate, afecţiuni hepatice). Astfel, transaminazele,
colinesteraza, bilirubina sunt crescute, iar timpul Quick şi elementele figurate
sunt scăzute.

Frigul
La temperaturi scăzute cresc în plasmă catecolaminele, hormonii
tiroidieni, hormonul de creştere şi leucocitele. Acizii aminaţi ca tirozina şi
triptofanul plasmatic scad, pe când activitatea enzimatică a creatinkinazei creşte.

Febra
La persoanele cu febră mare s-a observat o scădere a glucozei plasmatice
şi o creştere a ureei, a uraţilor urinari şi a metabolismului bazal.

Greutatea corporală
S-a constatat faptul că hemoglobina, acidul uric plasmatic, creatinina
plasmatică, ALT-ul şi γ-glutamil-transferaza cresc cu masa corporală.

Tutunul
Pot exista diferenţe între examenele de laborator la fumători şi
nefumători. Astfel, pe lângă oxihemoglobina care este crescută la fumători,
mai creşte acidul ascorbic în plasmă, colesterolul, trigliceridele, glucoza
plasmatică, ionul tiocian în salivă. Recent s-a demonstrat valoarea net crescută a
concentraţiei de antigen carcino-embrionar la fumători faţă de nefumători
(de la 3 % la 19 %).

Medicamentele
Medicamentele pot influenţa examenele de laborator, ele ocupând un loc
important în acest domeniu. Variaţiile pe care le pot da medicamentele pot
conduce la interpretarea greşită a examenelor de laborator şi la un diagnostic
eronat.
Medicamentele pot influenţa analizele de laborator sub două aspecte:
- un aspect pur analitic: medicamentele şi/sau metaboliţii acestora pot perturba
sau interfera dozarea unor constituenţi biologici.
- un aspect biologic: ele pot provoca modificarea unui parametru biologic
printr-un mecanism fiziologic, farmacologic sau toxicologic.
În analizele de laborator trebuie să se ţină cont de interferenţele analitice
induse de către medicamente, ele reprezentând aproximativ 20 % din totalul
interferenţelor.

24
Astfel, ele pot da coloraţii similare cu unii constituenţi biologici, ca, de
exemplu, salicilaţii care dau cu reactivul Folin aceeaşi coloraţie cu aceea a
acidului uric.
Unele medicamente şi/sau metaboliţii acestora prezintă proprietăţi
reducătoare ca, de exemplu, acidul ascorbic care interferează asupra numeroase
dozări ale constituenţilor biologici care prezintă aceleaşi proprietăţi (glucoza,
acidul uric, creatinina).
Medicamentele pot acţiona asupra enzimelor şi proteinelor inhibând
activităţile şi proprietăţile caracteristice ale acestora.
Medicamentele pot forma diferite complexe cu compuşii biologici, pot
prezenta fluorescenţe proprii şi pot modifica pH-ul.
Datorită acestor interferenţe analitice ale medicamentelor trebuie
introduse metode care să ţină cont de aceşti factori.
Interferenţele biologice sunt dificil de pus în evidenţă. Totuşi înaintea
introducerii unui medicament în terapeutică se fac cercetări pe animal pentru a
urmări influenţa acestuia asupra constantelor biochimice, asupra funcţiei
hepatice, renale etc.
În acest sens, trebuie efectuate în mod obligatoriu examenele hematologice, în
particular observarea elementelor figurate, determinări enzimatice, analiza urinei,
clearence-ul creatininei etc.
Dar este practic imposibil să se atribuie o variaţie a rezultatelor
examenelor de laborator pentru un medicament fără să se ţină cont şi de
variaţiile date de vârstă, sex, greutate corporală etc.
Menţionăm doar câteva interferenţe biologice care pot să apară datorită
medicamentelor:
- fenomenele competitive de fixare a acestora pe proteine: de exemplu,
fenilbutazona deplasează anticoagulantele fixate pe proteine, potenţează acţiunea
lor şi diminuează timpul de protrombină (timpul Quick);
- inhibarea sintezei unor substanţe în organism: antihipertensivele
diminuează sinteza catecolaminelor;
- o acţiune asupra mecanismului de secreţie: pot provoca contracţia
sfincterului Oddi, modifică structurile membranare ducând la eliberarea de
enzime etc.
În concluzie este necesar să se cunoască factorii de variaţie biologică a
medicamentelor pentru o mai bună interpretare a examenelor de laborator.

25
IV. NOŢIUNI DE ANALIZĂ CHIMICĂ

Analiza chimică constă în efectuarea unor reacţii chimice în baza cărora


urmărim să precizăm natura sau cantitatea unei substanţe. Când scopul este de a
determina numai natura compuşilor necunoscuţi, se va efectua o analiză calitativă,
iar când ne interesează să precizăm şi cantitatea acestora, determinările efectuate
aparţin de domeniul analizei cantitative.
Analiza calitativă prezintă importanţă în scopul evidenţierii unor compuşi
care apar patologic în urină, suc gastric şi alte lichide sau materiale biologice. Din
acest punct de vedere, se cunoaşte valoarea pe care o are depistarea glucidelor din
urină pentru diagnosticarea diabetului zaharat.
Analiza cantitativă se poate efectua atât la componenţii care se găsesc
normal (fiziologic), ca şi constituenţi ai unui lichid biologic (ex. aciditatea sucului
gastric), dar ale căror valori pot fi, datorită anumitor condiţii, mai crescute sau mai
scăzute faţă de normal, ceea ce vine în sprijinul precizării diagnosticului clinic, cât
şi la stabilirea limitelor cantitative ale unor compuşi patologici.

IV.1. NOŢIUNEA DE ATOM-GRAM, MOLECULĂ-GRAM,


ECHIVALENT-GRAM, OSMOL

Atomul-gram reprezintă cantitatea în grame dintr-un element egală


numeric cu masa atomică a elementului. De exemplu:
Cl, ACl = 35,45, atom-gram =35,45 g
Na, ANa = 23, atom-gram = 23 g

Molecula-gram (mol) reprezintă cantitatea în grame dintr-o substanţă egală


cu valoarea numerică a masei moleculare a substanţei respective, care la rândul ei
este egală cu suma maselor atomice ale atomilor constituenţi (Tabelul 1).

Tabel 1. Exemple de calcul al masei moleculare


Molecula Masa moleculară (g/mol) Molecula-gram (g)
Cl2 70,914 70,914
HCl 36,465 36,465
NaOH 40,010 40,010

Echivalentul-gram (Eg) reprezintă cantitatea dintr-un element, exprimată


în grame, care se combină cu un atom-gram de hidrogen sau cu jumătate dintr-un
atom-gram de oxigen, sau care poate înlocui aceste cantităţi de hidrogen sau oxigen
din combinaţiile lor.
Este foarte important, ca în calculul echivalentului să ţinem seama neapărat
de reacţia chimică ce are loc, în caz contrar, calcularea greşită a echivalentului-
gram poate duce la erori foarte mari ale rezultatului analizei.

26
Cantităţile de substanţă care reacţionează sau se înlocuiesc într-un proces chimic
sunt echivalente între ele.

Echivalentul-gram al unui element chimic se calculează împărţind masa atomică


a acestuia la valenţa lui.
Exemplu:
Eg Ca = 40/2 = 20 g

Echivalentul-gram al acizilor se calculează împărţind masa moleculară a acidului


la numărul atomilor de hidrogen care participă la reacţia respectivă (numărul de
protoni cedaţi de acesta).
Exemplu:
Eg HCl = 36,465/1 = 36,465 g
Eg H2SO4 = 98,08/ 2 = 49,04 g
Eg H3PO4 = 98,04/3 = 32,68 g

Echivalentul-gram al bazelor se calculează împărţind masa moleculară a bazei la


numărul de grupări hidroxil care iau parte la reacţia respectivă (numărul de ioni
hidroxil cedaţi care e egal cu cel al protonilor acceptaţi de baza respectivă).
Exemplu:
Eg NaOH = 40,005/1 = 40,005 g
Eg Ca(OH)2 = 74,1/2 = 37,05 g

Echivalentul-gram al sărurilor se calculează împărţind masa moleculară a sării la


numărul cationilor acesteia înmulţit cu valenţa lor.
Exemplu:
Eg FeSO4·7H2O = 273,01 / 1·2 = 136,505 g
Eg Fe2(SO4)3 = 399,9 / 2·3 =66,66 g

Echivalentul-gram în reacţiile de oxido-reducere (redox) reprezintă cantitatea de


substanţă ce reacţionează (cedează sau acceptă) cu un electron-gram, respectiv cu
5,4·10-4 electroni. În reacţiile redox, pentru calcularea echivalentului-gram trebuie
să se ţină cont de numărul de electroni cedaţi sau acceptaţi.
Exemplu: MnO4- în care Mn este heptavalent reacţionează diferit în funcţie de
mediul în care are loc reacţia.

Astfel, în mediu puternic acid (H2SO4) Mn+7 primeşte 5e- reducându-se în Mn+2
conform reacţiei:
MnO4- + 5 e- + 8 H+ = Mn2++ 4 H2O
Eg KMnO4 = 158,03 / 5 = 31,606 g

În mediu slab acid sau neutru are loc reacţia:


MnO4- + 3 e- + 4 H+ = MnO2 + 2 H2O
Eg KMnO4 = 158,03 / 3 = 52,67 g

27
În mediu puternic alcalin, permanganatul reacţionează cu un singur electron
conform reacţiei:
MnO4- + e- = MnO42-
Eg KMnO4 = 158,03 / 1 = 158,03 g

Osmolul (Osm) reprezintă presiunea osmotică exercitată de 1 mol de


substanţă care nu disociază în ioni. Dacă aceasta disociază, atunci se înmulţeşte cu
numărul de ioni disociaţi (ex: 1 mol glucoza = 1 osmol; 1 mol NaCl = 2 osmoli; 1
mol CaCl2 = 3 osmoli).

𝑔/𝑙
𝑂𝑠𝑚/𝑙 =
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎𝑡𝑜𝑚𝑖𝑐ă/𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟ă

𝑚𝑔/𝑙
𝑚𝑂𝑠𝑚/𝑙 =
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎𝑡𝑜𝑚𝑖𝑐ă/𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟ă

𝑚𝑔/𝑙
𝑚𝐸𝑞/𝑙 = 𝑚𝑂𝑠𝑚/𝑙 𝑥 𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛ţ𝑎 = 𝑥 𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛ţ𝑎
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎𝑡𝑜𝑚𝑖𝑐ă

IV.2. SOLUŢII. MODUL DE EXPRIMARE A CONCENTRAŢIILOR

O soluţie este un amestec omogen de două sau mai multe substanţe care nu
interacţionează chimic şi care alcătuiesc o singură fază. Substanţa care predomină
se numeşte dizolvant sau solvent (starea de agregare a solventului conferă starea
fizică a soluţiei care poate fi gazoasă, lichidă sau solidă), iar substanţa (sau
substanţele) care se dispersează omogen se numeşte dizolvat, solut sau solvat.
Orice soluţie care urmează să fie folosită ca reactiv se prepară la balon cotat.
Exprimarea cantităţii de substanţă dizolvată într-o soluţie la un anumit
volum poartă numele de concentraţia soluţiei. Se utilizează două moduri de
exprimare a concentraţiei: fizică şi chimică.

IV.2.1. Exprimarea fizică a concentraţiei unei soluţii

a) Concentraţia procentuală (c%) reprezintă cantitatea de substanţă


exprimată în grame, dizolvată în 100 g (w/w) sau 100 ml (w/v) soluţie.
Substanţa dizolvată şi solventul au împreună 100 g.
Exemplu: Soluţia 2% NaCl conţine: 2g NaCl şi 98g H2O.
Dacă se cunoaşte titrul soluţiei, se poate calcula c% utilizând relaţia:
𝑇·100
𝑐% = 𝑑
(d = densitatea soluţiei)

28
În practică se pot întâlni următoarele situaţii:
- prepararea unei soluţii de o anumită concentraţie procentuală, pornind de
la două soluţii cu concentraţie procentuală cunoscută;
- prepararea unei soluţii mai diluate, pornind de la o soluţie mai concentrată
prin diluare cu apă.

Exemplu: Să se prepare o soluţie 50 % prin amestecarea a două soluţii cu


concentraţiile 85 % şi 35 %.
 Calculul se face cu ajutorul regulii pătratului/dreptunghiului (sau a
amestecurilor). În colţurile din stânga ale pătratului se trec concetraţiile soluţiilor
iniţiale, iar în centrul pătratului concetraţia dorită. Pe diagonalele pătratului se vor
face diferenţele dintre concentraţia dorită şi concentraţiile iniţiale, iar rezultatele se
vor trece în colţurile din dreapta ale pătratului. Rezultatele obţinute reprezintă
proporţiile în care trebuie luate şi amestecate cele două soluţii iniţiale pentru a
obţine în final soluţia de concentraţie dorită.

85 % 15 părţi (g sau ml)


50 %
35 % 35 părţi (g sau ml)

Rezultă că pentru 50 părţi soluţie 50 % se vor amesteca 15 părţi soluţie 85 % cu 35


părţi soluţie 35 %. Pentru a prepara alte cantităţi sau volume, se vor calcula
proporţional noile proporţii aferente.
În cazul diluării cu apă, în colţul din stânga jos se va trece concentraţia 0 %
a apei, iar restul procedurii rămâne la fel.
În locul concentraţiilor se pot folosi densităţile corespunzătoare
(concetraţiile fiind înlocuite cu densităţile în regula pătratului). Pentru apă se va
considera d = 1,00 g/cm3.

 O altă metodă o constituie ecuaţia fundamentală a diluţiilor:

C1 · V1 = C2 · V2

unde C1 şi V1 reprezintă concentraţia, respectiv volumul soluţiei stoc (concentrate),


iar C2 şi V2, concentraţia, respectiv volumul soluţiei diluate pe care dorim să o
obţinem.

b) Concentraţia la mie (c‰) reprezintă cantitatea de substanţă exprimată în


grame dizolvată în 1000 g soluţie. Substanţa dizolvată şi solventul au
împreună 1000 g.
Exemplu: Soluţia 9‰ de ser fiziologic conţine: 9 g NaCl şi 991 g H2O.

29
Dacă se cunoaşte titrul soluţiei, se poate calcula c‰ utilizând relaţia:
𝑇·1000
𝑐‰ = (d = densitatea soluţiei)
𝑑

IV.2.2. Exprimarea chimică a concentraţiei unei soluţii

a) Concentraţia molară (M) exprimă numărul de moli de substanţă dizolvaţi


într-un litru de soluţie (1 L = 1000 ml). Substanţa dizolvată şi apa ocupă
împreună un volum de un litru.
Exemplu: Soluţia 0,1 M HCl conţine 0,1 moli HCl (3,6465 g HCl) dizolvaţi în
1000 ml soluţie.
Molaritatea soluţiei (m) reprezintă numărul de moli de substanţă dizolvată
şi se poate calcula utilizând următoarele relaţii de calcul:

𝑎 10 · 𝑐% · 𝑑 𝑐‰ · 𝑑 𝑇 · 1000 𝑛 · 𝐸𝑔
𝑚= = = = =
𝑀 𝑀 𝑀 𝑀 𝑀

unde: a = cantitatea de substanţă cântărită; M = masa moleculară;


Eg = echivalentul-gram; T = titrul; N = normalitatea; d = densitatea.

b) Concentraţia molală reprezintă numărul de moli de substanţă dizolvaţi


într-un kg (1000 g) de solvent.

c) Concentraţia normală exprimă numărul de echivalenţi-gram de substanţă


dizolvaţi într-un litru de soluţie (1 L = 1000 ml). Substanţa dizolvată şi apa
ocupă împreună un volum de 1 litru.
Normalitatea soluţiei (n) reprezintă numărul de echivalenţi-gram de substanţă
dizolvată şi se poate calcula utilizând următoarele relaţii de calcul:

𝑎 10 · 𝑐% · 𝑑 𝑐‰ · 𝑑 𝑇 · 1000 𝑚 · 𝑀
𝑛= = = = =
𝐸𝑔 𝐸𝑔 𝐸𝑔 𝐸𝑔 𝐸𝑔

unde: a = cantitatea de substanţă cântărită; M = masa moleculară; Eg =


echivalentul-gram; T = titrul; m = molaritatea; d = densitatea.

Soluţiile care au aceeaşi normalitate conţin acelaşi număr de echivalenţi-


gram şi astfel, în titrările executate cu aceste soluţii se consumă volume egale de
soluţie titrată. Soluţiile cu aceeaşi concentraţie normală se mai numesc soluţii
izonormale.

30
IV.2.3. Noţiunea de titru şi factor
Titrul (T) unei soluţii reprezintă cantitatea de substanţă exprimată în
grame, dizolvată într-un ml de soluţie. Soluţia al cărui titru se cunoaşte se numeşte
soluţie titrată.
Exemplu: Titrul unei soluţii 1 N de NaOH este 0,040005g NaOH în 1000 ml
soluţie.
Titrul unei soluţii de exactă normalitate se numeşte titru teoretic, Tt, şi se
poate calcula cunoscând molaritatea sau normalitatea soluţiei.
Titrul unei soluţii de normalitate oarecare (diferită de normalitatea exactă,
dar cât mai apropiată posibil de aceasta) se numeşte titru real, Tr. De exemplu,
titrul mediu experimental al soluţiei de NaOH se obţine după etalonarea cu acid
oxalic (NaOH nu e stabil, ci absoarbe din aer, apă şi dioxid de carbon, formând un
strat superficial de Na2CO3 care trebuie îndepărtat prin spălare cu apă distilată,
proaspăt fiartă şi răcită; din acest motiv se cântâreşte o cantitate mai mare de
NaOH decât cea calculată teoretic).
Titrul se mai poate calcula conform relaţiilor:

𝑐% · 𝑑 𝑐‰ · 𝑑 𝑚 · 𝑀 𝑛 · 𝐸𝑔
𝑇= = = =
100 1000 1000 1000

Factorul (F) unei soluţii este un factor de corecţie utilizat pentru


transformarea volumelor de soluţii de normalitate oarecare în volumele
corespondente de exactă normalitate. Se calculează prin raportul dintre titrul real şi
titrul teoretic.
Exemplu: factorul soluţiei de NaOH cu Tr = 0,03800 g/mL este 0,95 deoarece:

F = Tr/Tt = 0,03800/0,04000 = 0,95

Importanţa factorului constă în simplificarea operaţiunilor de calcul în


titrimetrie prin corectarea valorilor de volum şi de normalitate.
Exemplu: Pentru titrarea unei soluţii de HCl s-au consumat 7,2 ml de NaOH 0,1N
având F = 1,05. Acesta este echivalent cu a folosi 7,2 x 1,05, adică 7,56 ml NaOH
exact 0,1N (adică având F = 1,00).
Factorul poate avea valori supraunitare sau subunitare, dar cu cât soluţiile
sunt preparate mai corect, cu atât valoarea lui tinde spre 1, deci titrul real se apropie
ca valoare numerică de titrul teoretic.
Substanţele etalon, numite şi substanţe titrimetrice sau standard, se
utilizează fie la dozarea directă a unor substanţe, fie la stabilirea titrului altor soluţii
ce sunt destinate apoi dozării diverselor substanţe prin titrare.
Substanţele etalon primare sau standarde primare sunt substanţe din
care se prepară soluţii de concentraţie cunoscută prin cântărirea exactă şi dizolvarea
la balon cotat. Ex: KIO3, K2Cr2O7, NaCl, KBrO3, KCl, acid oxalic.

31
Substanţele etalon secundare sau standarde secundare sunt utilizate la
stabilirea titrului altor soluţii folosite apoi la titrări volumetrice. Ex: acidul oxalic
folosit pentru stabilirea titrului soluţiei de NaOH sau KMnO4.
Condiţiile ce trebuie îndeplinite de subtanţele etalon sunt următoarele:
să aibă grad înalt de puritate şi de stabilitate, compoziţie chimică cunoscută bine
determinată, masă moleculară cât mai mare, să reacţioneze cu alte substanţe după
ecuaţii simple şi bine cunoscute.

IV.3. UNITĂŢI ŞI MODURI DE EXPRIMARE ÎN LABORATORUL


CLINIC

Valorile diferitelor analize se raportează mai ales sub formă de mg/dl pentru
sânge, lichid cefalorahidian sau de mg (g) în 24 de ore pentru eliminarea urinară.
În ultimul timp se tinde însă spre un mod de exprimare uniform: mmol/l, respectiv
mmol eliminaţi în 24 de ore.
De un interes deosebit în clinică sunt valorile concentraţiilor principalilor
ioni: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, HCO3- . Exprimarea acestora se face cel mai adesea
în mEg/l. O valoare utilă este şi modul de exprimare în osmoli, respectiv mosmoli.
Pentru enzime şi uneori pentru vitamine se utilizează nomenclatura de
unitate internaţională (U.I. sau U).
Exprimarea rezultatelor obţinute în urma diferitelor măsurători se face în
funcţie de gradul de sensibilitate şi precizie a instrumentelor de măsură utilizate.
Un rezultat nu poate conţine mai multe cifre decât permite gradul de sensibilitate şi
precizie a aparatului utilizat.

Probleme:

1. Câţi mL de H2O sunt necesari pentru a obţine 800 mL soluţie de NaOH


0,5 N prin diluarea unei soluţii de NaOH 0,8 N?
(M NaOH = 40,005 g/mol; M H2O = 18 g/mol)

2. Care este concentraţia molară a unei soluţii de HCl ştiind că 50 mL din


această soluţie conţin 400 mg HCl?
(M HCl = 36,5 g/mol)

3. Care este concentraţia normală a unei soluţii de acid sulfuric cu


T = 0.00505 g/mL? Câţi echivalenţi-gram de acid sulfruric se găsesc în 200 mL din
această soluţie?
(M H2SO4 = 98,08 g/mol)

32
LUCRAREA 2

V. MEDIUL INTERN. ANALIZA BIOCHIMICĂ A SÂNGELUI

Sângele este un ţesut conjunctiv moale de origine mezodermică.


Sângele este un ţesut lichid, format dintr-o:
- componentă lichidă: plasmă – 55 % în care se găseşte în suspensie
- componenta solidă: elementele figurate – 45 %: eritrocite, leucocite,
trombocite [E, L, T], care circulă într-un sistem închis (sistemul
circulator).
Faţă de alte ţesuturi, celulele sângelui nu sunt imobilizate, ci ele ―plutesc‖
într-un lichid vâscos (plasma). Datorită acestui fapt, sângele este un ţesut mobil
care reuşeşte să se strecoare în toate sectoarele organismului, putând fi subîmpărţit
într-un compartiment periferic (sângele periferic) şi un compartiment central
(organele hematopoietice).
Caracteristica principală a sângelui este menţinerea constantă a compoziţiei şi
proprietăţilor mediului intern.

V.1. PROPRIETĂŢILE SÂNGELUI

1. CULOAREA - ROŞIE
- se datorează Hb eritrocitare
- variază în funcţie de saturaţia Hb cu oxigen
 roşu aprins – sânge arterial (saturaţie 95 – 97 %)
 roşu închis – sânge venos (saturaţie 75 %)
- variaţii: compuşi anormali ai Hb
 roşu purpuriu – carboxihemoglobina (intoxicaţie cu CO)
 roşu brun – methemoglobina
2. DENSITATEA – 1057 – 1061 g/cm3 (plasma 1027 g/cm3)
- dată de substanţele solvite (elemente figurate, proteine)
- variaţii:  anemie, hipoproteinemie
 poliglobulie
3. VÂSCOZITATEA - 4,4 – 4,7 centiPoise (plasma 1,86 centiPoise)
- depinde de - factori plasmatici (proteine)
- elementele figurate (E)
- influenţează rezistenţa periferică (RP)  TA
- variaţii:  în anemie   RP
 în poliglobulie  RP

33
4. PRESIUNEA OSMOTICĂ
- este direct proporţională cu numărul de particule dizolvate
- este determinată de:
- electroliţi 93 %
- substanţe organice nedisociate (glucoză, uree) 7 %
• osmolaritate 285 – 300 mOsm/l
• punct crioscopic - 0,56 oC

5. pH = 7,4 (7,35 – 7,45)


- variaţii: - acidoză < 7,35
- alcaloză > 7,45

6. TEMPERATURA = 37,7 – 38oC


- minim – plămâni (36oC)
- maxim – ficat (40oC)

V.2. FUNCŢIILE SÂNGELUI

Sângele, sub influenţa forţei de contracţie a inimii, circulă în toate organele


şi ţesuturile, îndeplinind o serie de funcţii.
Funcţiile sângelui se împart în două grupe mari :

A. Vehicularea tuturor elementelor necesare vieţii celulare


a) Funcţia respiratorie → transportarea oxigenului necesar oxidărilor
biologice şi a CO2 rezultat din oxidări.
b) Funcţia de nutriţie → sângele transportă substanţele nutritive, cum sunt
glucoza, aminoacizi, acizi graşi, vitamine, care rezultă ca produşi finali ai etapei
digestive a biomoleculelor, de la nivelul intestinului subţire, prin capilarele
sanguine, vena portă, la ficat şi apoi prin vena suprahepatică în circulaţia generală
şi prin aceasta la ţesuturi.
c) Funcţia de excreţie → se realizează prin mecanismul de transport al
produşilor finali de catabolizare în cadrul metabolismului intermediar.
→ se referă şi la deşeurile eliminate de celule şi la epurarea sângelui.

! Dacă sângele din sistemul circulator nu ar reuşi să îndeplinească un rol


epurator satisfăcător, ţesuturile şi celulele din care sunt alcătuite ar fi ucise în
câteva zile de către toxine. Ajunge ca circulaţia într-o anumită zonă a corpului să
încetinească sau să se oprească pentru o perioadă scurtă de timp, ca mediul local să
devină acid şi toxic. Însă organismul posedă capacităţi uimitoare prin care reuşeşte
să purifice sângele, ajutându-se de două perechi de organe fundamentale: plămânii
şi rinichii.
- străbătând plămânii, sângele se descarcă de dioxidul de carbon, precum şi
de o serie de compuşi reziduali volatili (alcooli, corpi cetonici etc.);

34
- rinichii filtrează sângele şi selectează acele substanţe indispensabile
(mai ales săruri minerale), pe care le redă sistemului circulator, eliminând pe cale
urinară reziduurile.
d) Funcţia de apărare a organismului → sângele are capacitatea de a
transporta substanţele ce intervin în reacţiile specifice şi nespecifice de apărare.
Prin proteinele anticorpi, limfocite T şi B, macrofage şi plasmocite, sângele asigură
desfăşurarea proceselor imune faţă de agenţii infecţioşi – virusuri şi bacterii – sau
proteine străine.
e) Funcţia de realizare a hemostazei → trombocitele pot determina oprirea
sângerării la nivelul unui vas sanguin mic sau mijlociu.

B. Reglarea şi menţinerea constantă a homeostaziei (echilibrelor fizico –


chimice) ale mediului intern, după cum urmează:
- izoionia → păstrarea constantă a concentraţiilor şi raporturilor ionice şi a
echilibrului acido – bazic.
- izotonia → menţinerea la un nivel constant a presiunii osmotice a
sângelui.
! Presiunea osmotică → echilibru dinamic în cadrul celulelor vii, menţinând
constant raportul moleculelor de apă ce intră şi ies din celulă.
Osmoza → difuziunea (amestecarea, pătrunderea) solventului (apei) în
general printr-o membrană (semi)permeabilă ca, de exemplu, celulele vii,
datorită permeabilităţii membranei celulare.
- izotermia → menţinerea constantă a temperaturii corpului prin circulaţia
constantă a sângelui.

VOLEMIA (VOLUMUL SANGUIN TOTAL – VST)


Reprezintă cantitatea totală a sângelui circulant care ocupă la un moment
dat toate componentele aparatului cardiovascular: cavităţi cardiace, artere, vene şi
capilare.
Cantitatea totală de sânge din organism se poate exprima în mai multe
moduri:
= 7 - 8 % din G (greutate)
= 78 ml/kg corp
= 3 ± 0,5 l/m2 suprafaţă corporală

Un adult cu o greutate de 70 kg are în medie 5 – 5,5 litri de sânge din care


aproximativ 2/3 sunt în circulaţie, restul de 1/3 sub formă de rezervă în ficat,
splină, glande endocrine etc., la care se apelează:
- în condiţii fiziologice pentru asigurarea unui aport crescut de O2 , în cazul
efortului fizic crescut;
- patologic, în pierderi masive de sânge.

VST = volum plasmatic (VP) + volum globular (VG) E(99%), L, T

35
Variaţii:

Hipervolemia → creşterea cantităţii de sânge circulant. Se manifestă prin creştere


în greutate, edeme locale sau ascită.
- Fiziologic: - sex masculin
- nou-născut
- graviditate – trimestrul III: 20 – 30%
- altitudine – prin hipoxie
- Patologic - hiperhidratare - se întâlneşte în retenţii hidro-saline, post
transfuzional
- HTA (hipertensiunea arterială)
- poliglobulie boală (policitemia vera)
- poliglobulie secundară - datorită oxigenării defectuoase a
ţesuturilor

Hipovolemia → scăderea volumului sanguin.


- Fiziologic: - aport insuficient de lichide
- vârstnici
- deshidratarea
- clinostatism → ortostatism: în primele 20 de minute VST
scade cu 10 – 15% datorită creşterii presiunii venoase la nivelul membrelor
inferioare, cu trecerea apei şi micromoleculelor din plasmă în interstiţii
- Patologic - în deshidratări puternice (transpiraţii, vărsături, diaree)
- hemoragii masive
- stări de suprasolicitare - arsuri întinse, traumatisme
- anemii severe

V.3. COMPONENTELE SÂNGELUI

1. Plasma :
- lichid limpede de culoare galben pai;
- desemnează fracţiunea lichidă a sângelui şi limfei;
- în plasmă se află în suspensie celulele sanguine (hematii, leucocite şi trombocite);
- este formată din :
- apă;
- substanţe anorganice dizolvate (săruri minerale);
- diverse substanţe organice (proteine, lipide, glucide, combinaţii ale
acestora).
- serveşte ca vehicul atât pentru elementele celulare sanguine, cât şi pentru diverse
substanţe biologic active (hormoni, anticorpi etc.).

36
Compoziţia chimică a plasmei:
- 90 % apă;
- 10 % substanţe organice şi anorganice:
 9 % substanţe organice:
- azotate proteice – proteine plasmatice (8 g %):
- albumine 3 g %
- globuline 4,5 g %
- fibrinogen 0,3 %
- azotate neproteice (25 – 35 mg %):
- uree
- acid uric
- creatina şi creatinina
- amoniac
- indican (se formează în intestin prin
descompunerea triptofanului sub acţiunea florei bacteriene, este absorbit prin
peretele intestinal şi eliminat urinar)
- aminoacizi şi polipeptide
- neazotate: - glucide (0,1 g%): glucoză, acid lactic, acid citric;
- lipide (0,6g%): trigliceridele, colesterol,
fosfolipide
 1 % substanţe anorganice (săruri minerale):
- cloruri
- fosfaţi de Na+, K+, Ca2+, Mg2+
- iod
- brom
- fier
- cupru

2. Elementele figurate → 40 – 45 % din volumul sanguin.

a) Eritrocitele (hematiile sau globulele roşii) → prescurtat RBC (Red


Blood Cell) sunt celule anucleate transportatoare de pigment respirator
(hemoglobină). Hemoglobina (Hb, HGB) este pigmentul sanguin de natura
heteroproteică care prin proprietăţile sale fizico-chimice asigură funcţia elementară
a eritrocitului de transportor de gaze (O2 şi CO2) între plămân şi ţesuturi.
Durata de viaţă: aproximativ 120 de zile.
Sunt în număr de: - 4,2 – 4,5 milioane/mm3 la femei
- 4,5 – 5 milioane/mm3 la bărbaţi
Patologia eritrocitului se poate exprima fie printr-un deficit de număr
eritrocitar, fie deficit hemoglobinic sau global (anemii), fie print-un exces de
producţie eritrocitară (poliglobulii).

37
b) Leucocitele (celulele albe) → prescurtat WBC (White Blod Cell) sunt
celule nucleate cu roluri deosebit de importante în procesele de apărare prin
fagocitoză, producere de anticorpi şi distrugerea toxinelor de origine microbiană.
Valorile normale sunt cuprinse între 4000–8000/mm3, numărul lor prezintă
variaţii fiziologice în funcţie de vârstă. Creşterea acestora peste valoarea de
8000/mm3 se numeşte leucocitoză, iar scăderea sub 4000/mm3 se
numeşte leucopenie.

c) Trombocitele (plachetele sanguine) → prescurtat PLT (Platelets) sunt


cele mai mici elemente sanguine, anucleate, ce iau naştere în măduva osoasă
hematogenă. Funcţia lor este de a participa la hemostază prin elaborarea factorilor
de coagulare.
Au o durată scurtă de viaţă de aproximativ o săptămână.
Sunt în număr de 150000-300000/mm3.

Raportul dintre volumul plasmei şi cel al elementelor figurate se determină


cu ajutorul hematocritului. În practică, termenul de hematocrit exprimă relaţia
procentuală dintre volumul elementelor figurate şi cel al plasmei, sau doar volumul
procentual al elementelor figurate.
Valori normale ale hematocritului:
- la bărbaţi = 40 – 48 %
- la femei = 36 – 42 %
- la copii 2 – 15 ani = 36 – 39 %
Pentru evaluarea funcţiilor organismului, sângele este cea mai importantă
sursă de informaţii. Aceasta pentru că sângele poate pătrunde prin aproape toate
organele şi ţesuturile din organism, transportând toate substanţele necesare la şi de
la celule. Componentele sângelui sunt foarte mobile şi ele pot indica rapid, orice
modificare anormală în organism. Acesta este motivul pentru care sângele este unul
dintre cele mai investigate lichide biologice din organism.
Analizele biochimice se pot efectua pe sânge total, plasmă sau ser în funcţie
de analiza solicitată.
Plasma sanguină se obţine prin centrifugarea sângelui proaspăt recoltat pe
un anticoagulant:
 Heparină
 Florură de sodiu
 Citrat de potasiu
 Oxalat de potasiu
Supernatantul este constituit din plasma sanguină, iar sedimentul din
elementele figurate.
Serul sanguin se obţine prin centrifugarea sau decantarea sângelui recoltat
fără anticoagulant, după ce a fost lăsat să coaguleze la temperatura camerei timp
de 30 – 60 minute.
Serul normal este limpede, de culoare galben pai şi se deosebeşte de plasma
sanguină prin faptul că nu mai conţine fibrinogen (Figura 11).

38
Figura 11. Compoziţia serului şi a plasmei [35]

V.4. TEHNICA RECOLTǍRII SÂNGELUI PRIN SISTEMUL


VACUTAINER
Sângele pentru analizele medicale se obţine prin recoltare. Recoltarea
sângelui se poate face prin mai multe tehnici, cea mai utilizată fiind tehnica cu
sistemul holder – vacutainer (Figura 12).

Figura 12. Vacutainere pentru recoltarea sângelui [36]

39
Tabel 1. Câteva aspecte importante referitoare la tehnica recoltării
Avantaje ● Utilizarea acestei metode de prelevare asigură:
- confortul pacientului;
- calitatea probei de sânge;
- securitatea personalului medical.

Pregătire ● Materiale:
- holder – un tub de material plastic care prezintă, la partea
superioară, amboul la care se ataşează acul de puncţie prin înfiletare,
iar la partea inferioară două aripioare;
- acul de puncţie protejat de carcasa bicoloră;
- tuburi vacutainer cu dopuri de diferite culori convenţionale;
- materiale necesare efectuării puncţiei venoase.
● Pacient:
- pregătirea psihică: se anunţă şi i se explică necesitatea şi
inofensivitatea tehnicii;
- pregătirea fizică;
- recoltarea se face în condiţii bazale, dimineaţa pe nemâncate –
„a jeun‖, înaintea oricărei proceduri diagnostice sau terapeutice;
- se aşează pacientul în decubit dorsal, confortabil, cu membrul
superior în abducţie, extensie şi supinaţie.

Execuţie Asistenta:
- se spală pe mâini cu apă şi săpun;
- utilizează mănuşi sterile, de unică folosinţă, de fiecare dată;
- verifică banda de siguranţă a acului (integritate, valabilitate);
- îndepărtează carcasa de culoare albă a acului prin mişcări de
răsucire;
- înfiletează capătul liber al acului în holder;
- alege locul puncţiei şi îl aseptizează;
- îndepărtează carcasa colorată a acului.
● Execută puncţia venoasă:
- introduce tubul în holder apucând aripioarele cu indexul şi mediul,
iar cu policele împinge tubul în holder şi astfel va fi străpunsă
diafragma gumată a dopului;
- după prelevarea sângelui se scoate tubul din holder prin mişcări de
împingere asupra aripioarelor laterale şi i se imprimă mişcări uşoare

40
de înclinare-răsturnare pentru omogenizare cu aditivul;
- se introduce tubul următor;
- se retrage acul din venă şi se face o compresiune asupra locului
puncţiei timp de 1 – 3 minute fără a flecta antebraţul pe braţ;
- se aplică un plasture post-injecţie.

Pregătirea - se etichetează tuburile cu datele pacientului: nume, vârstă, sex;


probelor - se trimit la laborator.
pentru
laborator

■ IMPORTANT:
Tuburile vacutainer se utilizează în funcţie de codul de culoare al dopului de
cauciuc (codurile de culoare pentru substanţele anticoagulante sunt descrise în
ISO/DIS 6710), astfel:

 Roşu/incolor: fără aditivi – se obţine ser pentru analize biochimice


- electroforeza, transaminaze, amilazemie, fosfataza, uree sanguină, glicemie, acid
uric, creatinina, bilirubinemie, calcemie, fosforemie, sideremie, lipemie, rezerva
alcalină, imunogramă, proteina ―C‖ reactivă;
- teste de disproteinemie;
- Rh, Grup sanguin;
- ASLO (anticorpi antistreptolizină O), RBW (reacţia Bordet – Wassermann).

 Negru: citrat de sodiu 3,8 % şi proporţie sânge:anticoagulant 4:1 (volum


2,9 ml) – pentru determinarea VSH (viteza de sedimentare a hematiilor) (se agită
după recoltare printr-o mişcare lentă).

 Bleu: citrat de sodiu 3,2 % sau 3,8 % şi proporţie sânge:anticoagulant de


9:1 (volum 5 mL) – pentru determinări de coagulare (se agită după recoltare printr-
o mişcare lentă).
- fibrinogen;
- timp de protrombină.

 Mov: EDTA-K3 (volum 3 mL) – pentru determinări hematologice (se agită


după recoltare prin mişcări lente).
- hematocrit, hemoleucogramă cu formulă leucocitară;
- indici eritrocitari VEM, HEM, CHEM;
- rezistenţă globulară.

41
 Verde: litiu heparină – se obţine plasmă pentru analize biochimice.

 Gri: fluorură de sodiu – pentru determinarea glicemiei.

● Când se recoltează mai multe probe de la acelaşi pacient, umplerea tuburilor


vacutainer se face în următoarea ordine:
- tuburi fără aditivi;
- tuburi pentru probe de coagulare;
- alte tuburi cu diverşi aditivi.
● Unele vacutainere destinate obţinerii serului conţin un activator de coagulare
(care accelerează formarea cheagului) şi un gel separator, care permite menţinerea
serului după centrifugare în tuburile primare, în cursul fazei preanalitice (transport
către laborator), analitice şi postanalitice (stocarea probelor în laborator).

Probleme:

1. Selectaţi varianta care nu se regăseşte între cauzele de hipovolemie:


a. policitemia vera
b. hemoragia
c. arsuri
d. anemia

2. În care tub vacutainer se recoltează sângele pentru determinarea VSH


(viteza de sedimentare a hematiilor):
a. bleu
b. verde
c. roşu
d. negru

3. Care este cel mai potrivit moment pentru recoltarea sângelui cu scopul de a
determina principalii parametri biochimici:
a. postprandial
b. a jeun
c. după administrarea unui stimulent
d. după efort fizic

42
LUCRAREA 3

VI. ECHILIBRUL ACIDO-BAZIC. pH.


VOLUMETRIA ACIDO-BAZICǍ. ACIDOZA ŞI ALCALOZA

VI.1. pH. SISTEME TAMPON. ECUAŢIA HENDERSON -


HASSELBALCH. MECANISME DE REGLARE A
ECHILIBRULUI ACIDO-BAZIC

O proprietate importantǎ a sângelui este nivelul de aciditate şi de


alcalinitate. Aciditatea creşte când nivelul componenţilor acizi din sânge este
ridicat sau când nivelul componenţilor alcalini din sânge scade. Capacitatea aceasta
a sângelui de a menţine o stare de normalitate şi permanenta balanţǎ ce existǎ între
cele douǎ extreme reprezintǎ, de fapt, echilibrul acido-bazic. Balanţa între aciditate
şi alcalinitate este precis controlatǎ pentru cǎ pânǎ şi o micǎ abatere de la normal
poate afecta serios multe organe. Organismul foloseşte diferite mecanisme pentru a
controla echilibrul acido-bazic al sângelui.
Majoritatea proceselor metabolice din organism genereazǎ direct sau
indirect cantitǎţi apreciabile de ioni H+, ceea ce face ca ele sǎ fie considerate – în
ansamblu – drept procese producǎtoare de acizi. Dintre acestea fac parte, în primul
rând, cǎile catabolice fundamentale ale principiilor imediate (glucide, lipide,
proteine).
Reacţiile enzimatice şi implicit procesele biologice depind în mare măsură
de ionii de hidrogen (H+) din mediu. Concentraţia ionilor de hidrogen din mediul
sanguin este menţinută între 35 - 45 nmol. Valori mai mari decât 120 nmol sau mai
mici de 20 nmol sunt de obicei incompatibile cu viaţa.

VI.1.1. Concepţia de acid şi bază, respectiv de pH şi pOH


Conform teoriei Bronsted-Lowry, un acid este o moleculă sau ion capabil să
elibereze, să cedeze protoni (H+), iar o bază este o moleculă sau ion capabil să
accepte protoni. Când un acid Brønsted cedează un proton se formează o bază
Brønsted. Acidul iniţial şi baza rezultată formează o pereche de acid conjugat şi
bază conjugată. În toate reacţiile de ionizare a acizilor sau bazelor sunt implicate
perechi de acid-bază conjugată.

- -
HA + B A + HB
[acid conjugat] [baza conjugată]
[bază conjugata] [bazaconjugată]
[bază conjugata] [acid conjugat]

43
Deoarece concentraţia protonilor [H+] (sau a ionilor de hidroniu, H3O+)
poate avea valori extrem de scăzute (între 10-3 – 10-14 M), foarte dificil de utilizat
în practică, Sörensen a propus utilizarea noţiunii de pH, definită ca logaritmul
zecimal cu semn schimbat al concentraţiei ionilor H+.
pH este o exprimare foarte scurtă care desemnează activitatea ionilor de
hidrogen. Prin definiţie, pH este logaritmul negativ al activităţii ionilor de
hidrogen. În mod similar, se calculează logaritmul negativ al activităţii ionilor de
hidroxil, exprimat sub formă de pOH.

1 1
pH   log a H   log   log  H  [H  ]  log
a H  H  [H  ]

1 1
pOH   log a OH   log   log  OH  [OH  ]  log
a OH   OH  [OH  ]

În soluţii apoase echilibrul de ionizare a apei este dat de ecuaţia:

[H  ][OH  ]  10 14 = Kw

Kw este o constantă numită produsul ionic al apei.


Astfel, dacă este cunoscută concentraţia ionilor de hidrogen se poate calcula
concentraţia ionilor de hidroxil şi invers folosind relaţia dintre pH şi pOH.

[H  ][OH  ]  K p
log[H  ]  log[OH  ]  log K p

 log[H  ]  log[OH  ]   log K p

 log[H  ]  pH  log[HO ]  pOH  log K p  pKp

pH  pOH  pKp

K p  10 14 pKp   log10 14  14

44
De exemplu, dacǎ [H+] = 10ˉ7 → pH = -log 10ˉ7; respectiv pH = 7; sau
7
1/10ˉ = 7.
O soluţie este acidă dacă [H+] > 10-7 > [OH-], deci pH < 7.
O soluţie este alcalină dacă [OH-] > 10-7 > [H+], deci pH > 7.
O soluţie este neutră dacă [H+] = 10-7 = [OH-], deci pH = 7.

Acizii tari (HCl, HNO3, H2SO4) în soluţie apoasă sunt complet ionizaţi, iar
concetraţia ionilor H+ este egală cu concetraţia molară a acidului (C); Ka > 10-1:
AH + H2O → H3O + A-
pH = - lg [H+] = - lg C = pC

Bazele tari (NaOH, KOH, LiOH, etc.) sunt complet disociate în apă, iar
concentraţia molară a bazei reprezintă concentraţia ionilor HO-, Kb > 10-1:
B + H2O → BH+ + HO-
pOH = - lg C = pC; pH = 14 - pOH

Acizii slabi (HCOOH, CH3COOH, H2CO3, HCN, etc.) disociază incomplet,


echilibrul reacţiei fiind deplasat spre stânga; Ka < 10-5:
HA + H2O ↔ H3O+ + A-

Tăria unui acid sau a unei baze se exprimă prin constanta de aciditate (Ka),
respectiv constanta de bazicitate (Kb). Cu cât valoarea constantei de aciditate este
mai mare, cu atât acidul este mai ionizat, adică mai tare şi implicit baza conjugată
este mai slabă. Cu cât constanta de bazicitate este mai mare, cu atât baza acceptă
mai uşor protoni, adică este mai tare.
[H+] · [A-]
Ka = ———— ;
[HA]

[H+] = Ka · C

- lg Ka = pKa; pH = - lg [H+] = ½ (pKa + pC)

Bazele slabe (NH3, NR3, Mg(OH)2, Al(OH)3, Zn(OH)2 etc.) ionizează slab
în soluţie apoasă, echilibrul fiind deplasat spre stânga; Kb < 10-5:

B + H2O ↔ BH+ + HO-


[HO-] · [BH+]
Kb = ———— ;
[B]

[HO-] = Kb · C

45
- lg Kb = pKb; pOH = - lg [OH-] = ½ (pKb + pC) ; pH = 14 – pOH.

Ka · Kb = KH2O

Determinarea experimentală a pH-ului


Determinarea pH-ului se poate realiza utilizând:
- Metoda colorimetrică: cu indicatori de pH (coloranţi acido-bazici care îşi
modifică culoarea în funcţie de pH; vezi Tabelul 1 de la VI.2.), aceştia nu sunt
potriviţi pentru măsurători precise de pH.
- Metoda electrochimică: cu pH-metrul.
Metoda de măsurare a pH-ului cu pH-metrul este mai exactă decât cea cu
substanţe (hârtie) indicatoare şi se foloseşte ori de câte ori este necesară stabilirea
cu exactitate a valorii pH-ului. pH-metrul este un potenţiometru care măsoară
potenţialul dezvoltat între un electrod de sticlă şi unul de referinţă (se ţine cont că
59,16 mV corespund la o unitate de pH). Instrumentele moderne folosesc electrozi
combinaţi (electrodul de sticlă şi electrodul de referinţă sunt combinaţi într-un
singur electrod). Înainte de a efectua o determinare, pH-metrul trebuie etalonat cu
soluţii tampon care au valori de pH definite (pH 7; pH 4; pH 10).

VI.1.2. Sisteme tampon


Un sistem tampon este amestecul în soluţie a douǎ substanţe cu acţiuni
complementare, în sensul cǎ una dintre ele se opune scǎderii pH-ului determinat de
adaosul unui acid, iar cealaltǎ împiedicǎ creşterea pH-ului cauzatǎ de adǎugarea
unei baze. Sistemele tampon se opun atât acţiunii acizilor, cât şi acţiunii bazelor.
Tipurile clasice de sisteme tampon conţin un acid slab şi sarea lui cu o bazǎ tare
sau o bazǎ slabǎ şi sarea ei cu un acid tare, dar există şi alte tipuri, de exemplu
NaH2PO4/Na2HPO4)
Un tampon este un compus care limitează variaţiile concentraţiilor de
hidrogen (şi, astfel, ale pH-ului) când ionii de hidrogen sunt adăugaţi sau scoşi din
soluţie. Pentru a înţelege mai uşor, ne putem gândi la sistemul tampon ca la un
burete. Când ionii de hidrogen sunt în exces, buretele absoarbe excesul, iar când
rezerva de ioni scade, buretele poate fi stors pentru a elibera ioni de hidrogen.

HA ↔ H+ + Aˉ

[H+] [A-]
Ka = —————;
[HA]

[A-] = [HA] => pK = pH

46
În momentul în care se adaugă ioni de hidrogen în solutia tampon, ei se
combinǎ cu Aˉ (baza conjugată) şi echilibrul este deplasat spre stânga (H+ + A- =>
HA). Şi se formează mai mult HA decât prin scoaterea excesului de ioni de
hidrogen din soluţie. În mod similar, pe măsură ce ionii de hidrogen sunt extraşi
din soluţie prin adăugarea unei baze puternice, reacţia se deplasează spre dreapta,
refăcând concentraţia ionilor de hidrogen şi reducând cantitatea de HA (OH- + HA
=> A- + H2O). Un sistem tampon poate compensa un influx de ioni de hidrogen sau
hidroxil pe un domeniu de pH ce corepunde pKa±1.
Cel mai important sistem tampon din sânge este format din acid carbonic
(un acid slab format din dioxid de carbon dizolvat în sânge) şi ionul bicarbonat
(baza slabă corespunzătoare). Acidul carbonic este un acid slab (parţial disociat):

H2CO3 ↔ HCO3ˉ + H+ (reacţia 1)

Un exemplu de tamponare ar fi adaosul de acid clorhidric la sistemul acid


carbonic/bicarbonat:

HCl + NaHCO3 → H2CO3 + NaCl

Alt exemplu ar fi adaosul de hidroxid de sodiu la sistemul acid


carbonic/bicarbonat:

NaOH + H2CO3 → NaHCO3 + H2O

Astfel, NaOH, o bază tare, total disociată va reacţiona cu H2CO3 fiind


transformată în NaHCO3 şi apă (prin reacţia firească de neutralizare). În acest fel
concentraţia ionului H2CO3 va scădea, iar cea a HCO3ˉ va creşte, proporţional cu
cantitatea de bază tare adaugată sitemului respectiv. Practic, OH - eliberaţi de baza
tare sunt captaţi de acidul carbonic, care se transformă în HCO3ˉ, chiar partenerul
său din sistemul tampon.
Astfel, HCl, un acid tare, total disociat va reacţiona cu NaHCO3 (deoarece
acidul tare deplasează acidul mai slab din sărurile sale) fiind transformat în NaCl,
un electrolit neutru în soluţii apoase. În acest fel, concentraţia ionului HCO3ˉ va
scădea, iar cea a H2CO3 va creşte, proporţional cu cantitatea de acid tare adaugată
sitemului respectiv. Practic, H+ eliberaţi de acidul tare sunt captaţi de anionul
HCO3ˉ, care se transformă în acid carbonic, chiar partenerul său din sistemul
tampon. Acesta disociazǎ doar în micǎ mǎsurǎ, gradul de disociere fiind diminuat
şi de prezenţa anionilor bicarbonat proveniţi din disocierea sǎrii tampon (NaHCO3),
conform legii maselor:

[H2CO3]
Ka = ———————
[HCO3ˉ][H+]

47
Creşterea concentraţiei de HCO3ˉ va deplasa spre stânga sensul reacţiei 1,
astfel scade disocierea acidului carbonic şi eliberarea de H+. În acest fel, „şocul‖ de
H+ produs de acidul tare este amortizat de sistemul tampon care capteazǎ H+ sub
formǎ nedisociatǎ în acceptorul de H+ care în cazul de faţǎ este HCO3ˉ.

Din ecuaţia de mai sus se poate evalua concentraţia ionilor de hidrogen:

[H2CO3]
[H+] = K —————
[HCO3ˉ]

Aplicând noţiunea de pH, se obţine:

1 1 [HCO3ˉ]
pH = log ——— = log ( — · ———— )
[H+] K [H2CO3]

1 [HCO3ˉ]
pH = log —— + log ————
K [H2CO3]

Notând log 1/K cu simbolul pK se ajunge la expresia:

[HCO3ˉ]
pH = pK + log ————
[H2CO3]

reprezentând ecuaţia lui Henderson şi Hasselbalch şi este valabilǎ pentru orice


sistem tampon sub forma generalizatǎ:

[Aˉ]
pH = pK + log ——
[AH]

În cazul tamponului bicarbonat/acid carbonic, pK = 6,1, deci:

[HCO3ˉ]
pH = 6,1 + log ————
[H2CO3]

Atunci când raportul între [HCO3ˉ] şi [H2CO3] este de 20, iar log 20 = 1,3,
pH = 6,1 + 1,3 = 7,4.

48
Astfel, pentru existenţa unui pH normal, raportul între concentraţiile de
bicarbonat şi de acid carbonic trebuie să fie 20/1 (de exemplu, 24 mEq bicarbonat
şi 1,2 mEq acid carbonic); ori de câte ori scade numărătorul (bicarbonatul) sau
creşte numitorul (acidul carbonic), valoarea acestui raport scade şi se va ajunge la o
deviere spre latura acidă, respectiv o scădere a pH-ului; invers, creşterea
bicarbonaţilor sau scăderea acidului carbonic va duce la o creştere a pH-ului, adică
la o deviere spre latura alcalină.
Dar componenta acidului carbonic este raportată cu bioxidul de carbon
dizolvat (CO2 + H2O ↔ H2CO3). CO2 dizolvat este proporţional cu presiunea
parţială CO2. Într-adevăr, legea lui Henry arată că [CO2] în soluţie = s·pCO2 unde s
este solubilitatea gazelor în apă.
În consecinţă [H2CO3] poate fi înlocuit în ecuaţia de masă cu pCO2.
O înţelegere a rolului sistemului tampon bicarbonat în explorarea echilibrului
acido-bazic poate fi realizat prin referirea la relaţia [H+] care este proporţional la o
anumită pCO2/[ HCO3 ] şi demonstrează că nivelul ionilor de hidrogen în sânge
variază la modificarea concentraţiei de bicarbonat şi pCO2.
Dacă în rest totul rămâne constant:
- Adaosul ionilor de hidrogen, îndepărtarea bicarbonatului sau creşterea pCO2, va
avea drept rezultat o creştere a [H+].
- Îndepărtarea ionilor de hidrogen, adăugarea bicarbonatului sau scăderea pCO2
va avea ca efect scăderea [H+].

VI.1.3. Mecanisme de reglare a echilibrului acido-bazic

pH-ul sângelui în condiţii fiziologice este de 7,4 ± 0.04. pH sângelui


arterial este 7,4, iar cel venos şi al lichidului interstiţial este de 7,35 datoritǎ unei
cantitǎţi suplimentare de CO2 eliberate de ţesuturi. pH-ul intracelular este uşor mai
redus decât cel plasmatic, variind între 6,9 şi 7,4. Scǎderea debitului circulator şi
hipoxia cauzeazǎ acumularea intracelularǎ de acizi şi scǎderea pH-ului celular.
Limita inferioarǎ a pH-ului sanguin compatibilǎ cu supravieţuirea este de 7, iar cea
superioarǎ de 7,7.
Menţinerea constantǎ a pH-ului mediului intern este realizatǎ prin
mecanisme:
 fizico-chimice: sistemele tampon (acţionează cel mai rapid);
 biologice: plǎmâni, rinichi, ficat, tub digestiv, tegumente.
Principalele sisteme tampon pentru a menţine echilibrul acido-bazic
constant din sânge sunt:
1. Sistemul H2CO3/NaHCO3
2. Sistemul NaH2PO4/Na2HPO4
3. Sistemul hemoglobină acidă/oxihemoglobinat de K
4. Proteină acidă/proteinat de Na.
Concentraţia normală a [H+] are valoarea de 40 nmol şi este menţinută în
această limită prin funcţionarea normală a respiraţiei şi a rinichilor.
49
Un mecanism pe care corpul îl utilizeazǎ pentru a controla pH-ul sângelui
implicǎ eliberarea de dioxid de carbon din plǎmâni. Pe mǎsurǎ ce dioxidul de
carbon se acumuleazǎ în sânge, pH-ul sângelui scade. Când nivelul sanguin al [H+]
creşte peste valorile normale este stimulat centrul respirator, care va modifica
frecvenţa respiratorie. Creierul regleazǎ cantitatea de dioxid de carbon care este
expiratǎ prin controlul pe care îl manifestǎ asupra vitezei şi profunzimii respiraţiei.
Cantitatea de dioxid de carbon expirat şi implicit pH-ul sângelui, cresc pe măsurǎ
ce cresc viteza şi profunzimea respiraţiei. Accelerarea ritmului respirator înlǎturǎ
CO2 şi readuce pH-ul la normal. Zilnic prin plǎmâni se eliminǎ 15000 mmoli (15
moli) de dioxid de carbon (corespunzând la 15000 mmoli de H2CO3), rezultaţi din
metabolizarea completǎ a hidraţilor de carbon şi a lipidelor. CO2 de provenienţǎ
metabolicǎ reprezintǎ sarcina acidǎ volatilǎ. Plǎmânii au nevoie de 1-12 minute
pentru a readuce la normal pH-ul modificat.
Când pCO2 este 40 ± 2 mmHg, eliminarea pulmonară a CO2 este egală cu
producţia tisulară. O creştere a pCO2, asociată sau nu cu o modificare de pO2, de
pH sau de concentraţie HCO3 , stimulează centrul respirator şi prin ventilaţie pCO2
este rapid readus către valoarea normală. Stimularea centrului respirator însă, poate
fi produsă în anumite condiţii numai de scăderea de pH, astfel încât normalizarea
acestuia din urmă se va obţine prin scăderea ―compensatorie‖ a pCO2.
Rinichii intervin în excreţia sarcinii acide nevolatile, în reabsorbţia
bicarbonatului filtrat şi în amoniogenezǎ. Rinichii au cea mai mare capacitate de
neutralizare a variaţiilor de pH dintre sistemele de control al echilibrului acido-
bazic, dar necesită de la câteva ore până la câteva zile pentru a restabili [H+].
Ionii de hidrogen, tamponaţi, sunt eliminaţi din organism pe cale renală iar,
bicarbonatul reabsorbit reface sistemul tampon. La nivelul rinichilor este absorbită
întreaga cantitate de ioni de bicarbonat în stările de alcaloză. Astfel, CO2 ajuns
odată cu sângele la rinichi, sub influenţa anhidrazei carbonice formează H2CO3,
care se ionizează punând în libertate HCO3- şi H+. Ionul HCO3- difuzează din nou
în sânge, iar ionii H+ trec în lumenul tubului contort, unde întâlnesc ionii HCO3-
existenţi în urina primară, formând H2CO3. La nivelul tubilor contorţi distali o
parte din ionii H+ difuzează în lumenul tubular unde înlocuiesc în molecula
fosfatului disodic un ion de Na+, care va fi reabsorbit. Astfel fosfatul disodic se
transformă în fosfat monosodic care se elimină prin urină.

50
VI.2. DETERMINAREA REZERVEI ALCALINE PRIN METODE
VOLUMETRICE

VI.2.1. Metode volumetrice


În laboratorul clinic explorarea rezervei alcaline se face printr-o metodă
laborioasă care permite determinarea parametrilor principali şi a echilibrului acido –
bazic. În scop orientativ, serveşte însă o metodă titrimetrică/volumetrică de dozare a
cuplului carbonat/bicarbonat.
Volumetria cuprinde totalitatea metodelor de dozare care constau în
adăugarea la soluţia de analizat (cu o concentraţie necunoscută) a unei soluţii ce
conţine un reactiv în concentraţie cunoscută, până la transformarea integrală a
substanţei de analizat conform reacţiei generale:

A + B = AB
A = substanţa de analizat numită şi titrat
B = reactivul a cărui concentraţie este cunoscută, numit titrant.

Metodele volumetrice se clasifică în funcţie de natura reacţiilor ce stau la


baza determinărilor :
 volumetria prin reacţii cu transfer de protoni (acido-bazice sau protolitice)
care pot avea loc în soluţii apoase (protometria în mediu apos) sau în mediu
anhidru (protometria în mediu neapos);
 volumetria prin reacţii cu transfer de electroni, adică prin reacţii redox
(redoxometria);
 volumetria prin reacţii cu formare de precipitate (cea mai importantă e
argentometria care se utilizează la dozarea halogenurilor şi
pseudohalogenurilor sau la dozarea argintului);
 volumetria prin reacţii cu formare de combinaţii complexe
(complexometria care se utilizează la dozarea cationilor, anionilor şi a
multor substanţe organice, medicamentoase);
 volumetria prin reacţii de diazotare numită şi nitritometrie (se utilizează la
dozarea substanţelor cu funcţiune amino – amine primare aromatice – care
se diazotează cu nitrit de sodiu în mediu acid);
 volumetria prin reacţii cu formare de combinaţii puţin disociate
(mercurimetria).

Titrarea este operaţia efectuată cu ajutorul biuretei, de adăugare treptată în


porţiuni mici a soluţiei B de concentraţie cunoscută (cu titru cunoscut) peste soluţia
de analizat A. Volumul de soluţie B adăugat pentru neutralizarea/consumarea
întregii cantităţi de substanţă din soluţia de analizat A se numeşte volum de
echivalenţă, iar momentul în care reacţia devine completă se numeşte moment de
echivalenţă sau punct de echivalenţă. Datorită unor dificultăţi de ordin
experimental, punctul de echivalenţă este dificil de stabilit, astfel se determină

51
punctul final al titrării (când se opreşte adăugarea reactivului de titrare). Diferenţa
dintre punctul de echivalenţă şi cel final trebuie să fie cât mai mică sau nulă.
Determinarea punctului de echivalenţă se poate face pe cale chimică
(folosind indicatori) sau pe cale instrumentală (folosind instrumente care măsoară
variaţia unor proprietăţi fizice ale soluţiilor).

Volumetria prin reacţii acido-bazice cuprinde metodele de dozarebazate


pe reacţia de neutralizare dintre un acid şi o bază. La momentul de echivalenţă
întreaga cantitate de acid, respectiv de bază este transformată în sare şi apă.
Valoarea pH-ului la echivalenţă variază, în funcţie de natura reactanţilor astfel:
- la titrarea unui acid tare cu o bază tare (sau a unei baze tari cu un acid tare) la
echivalenţă soluţia este neutră (pH = 7);
- la titrarea unui acid slab cu o bază tare, la echivalenţă se formează o sare cu
hidroliză bazică a cărei soluţii va prezenta un caracter bazic (pH > 7);
- la titrarea unei baze slabe cu un acid tare, la echivalenţă se formează o sare cu
hidroliză acidă a cărei soluţii va prezenta un caracter acid (pH < 7).
Volumetria prin reacţii acido-bazice în mediu apos se clasifică în:
- alcalimetrie: cuprinde metodele de dozare a substanţelor cu caracter acid
folosind ca titrant soluţii de baze tari (NaOH, KOH);
- acidimetrie: cuprinde metodele de dozare a substanţelor cu caracter bazic
folosind ca titrant soluţii de acizi tari (HCl, H2SO4).
Sesizarea punctului de echivalenţă în titrările acido-bazice în mediu apos se
face cu ajutorul indicatorilor acido-bazici sau indicatori de pH.
Indicatorii acido-bazici sunt substanţe ale căror proprietăţi (culoare,
fluorescenţă, stabilitate) se modifică în funcţie de pH-ul soluţiei (adică de
concentraţia ionilor de hidrogen sau de hidroxil). Modificarea de culoare nu se
produce brusc la un anumit pH, ci într-un domeniu de pH, numit „interval de viraj",
care, în general, este egal cu 2 unităţi de pH (Tabelul 1). Pentru alegerea adecvată a
indicatorului trebuie să se ţină cont de următorul aspect: intervalul de viraj al
acestuia trebuie să corespundă pH-ului de echivalenţă.
Pentru alegerea indicatorului trebuie să se ţină cont de pH-ul la echivalenţă
şi de eroarea admisă. Astfel, cel mai simplu mod de alegere a unui indicator
potrivit ar fi ca pH-ul de echivalenţă al reacţiei, pe care se bazează titrarea, să se
găsească în intervalul de viraj al indicatorului.

Tabel 1. Indicatori acido-bazici de culoare (coloranţi organici)


Indicatorul Intervalul Virajul de culoare
de viraj
Albastru de timol 1,2 – 2,8 de la roşu la galben
Metiloranj 3,1 – 4,4 de la roşu la galben
Roşu de metil 4,4 – 6,2 de la roşu la galben
Albastru de bromtimol 6,2 – 7,6 de la galben la albastru
Fenolftaleină 8,2 – 10,0 de la incolor la roşu
Timolftaleină 9,4 – 10,6 de la incolor la albastru

52
VI.2.2. DETERMINAREA REZERVEI ALCALINE PRIN METODE
VOLUMETRICE

Dozarea cuplului carbonat/bicarbonat se face cu o soluţie de HCl 0,1 N.


Într-o primă etapă se dozează carbonatul în prezenţa fenolftaleinei, după care se
dozează întreaga cantitate de bicarbonat cu o soluţie de HCl 0,1 N, în prezenţa
metiloranjului.
Într-o primă etapă se dozează jumătate din cantitatea de carbonat de sodiu în
prezenţa fenolftaleinei (viraj de la roşu intens la roz pal), notându-se volumul de
HCl 0,1 N folosit (V1). Apoi, se adaugă 2-3 picături de metiloranj şi se continuă
dozarea întregii cantităţi de bicarbonat (atât cel rezultat în urma primei etape, cât şi
cel iniţial) cu soluţia de HCl 0,1 N, până la virajul culorii de la galben la roşu-
portocaliu, notându-se volumul folosit (V2).

Na2CO3 + HCl → NaHCO3 + NaCl

NaHCO3 total + HCl → NaCl + H2CO3



CO2 + H2O

Tehnica de lucru:
Într-un pahar Erlenmeyer peste proba de analizat (10 ml) se adaugă câteva
picături de fenolftaleină. Soluţia colorată în roşu se titrează cu HCl 0,1 N până la
roz deschis. Se notează volumul V1(ml) de HCl 0,1 N utilizat pentru dozarea a
jumătate din cantitatea de CO32-. Se continuă apoi titrarea în prezenţă de metiloranj
până la culoarea roşu-portocaliu. Se notează volumul V2(ml) de HCl 0,1 N utilizat
pentru dozarea întregii cantităţi de HCO3-.

V = V2 - V1 (ml HCl utilizaţi la dozarea HCO3- iniţial)

Calcul:
M NaHCO3 = 84.01 g/mol; M Na2CO3 = 106 g/mol

1 ml HCl 0,1N ................................... 0,008401 g NaHCO3 (M/10000)


V HCl · F HCl ................................... a g NaHCO3
a = V HCl· F HCl· 0,008401 g NaHCO3

1Eg HCl (M/1 = 36,5 g) .......................... 1Eg NaHCO3 (M/1 = 84,01 g)


V HCl · T HCl .............................................. a g NaHCO3
a = V HCl · T HCl · 84,01/36,5 g NaHCO3

53
10 ml probă ................................ a g NaHCO3
1000 ml ............................... x g NaHCO3
x = 100 · a g NaHCO3/L

1 ml HCl 0,1N ................................... 0,0106 g Na2CO3 (M/10000)


V1HCl · F HCl ................................... b g Na2CO3
b = V1HCl · F HCl x 0,0106 g Na2CO3

1Eg HCl (M/1 = 36,5 g) .......................... 1Eg Na2CO3 (M/1 = 106 g)


V1HCl · T HCl .............................................. b g Na2CO3
b = V1HCl · T HCl · 106/36,5 g Na2CO3

sau
1 ml HCl 0,1N ................................... 0,0053 g Na2CO3 (M/20000)
2·V1HCl · F HCl ................................... b g Na2CO3
b = 2·V1HCl · F HCl x 0,0053 g Na2CO3

1Eg HCl (M/1 = 36,5 g) .......................... 1Eg Na2CO3 (M/2 = 53g)


2·V1HCl · T HCl .............................................. b g Na2CO3
b = 2 · V1HCl · T HCl · 53/36,5 g Na2CO3

10 ml probă ................................ b g Na2CO3


1000 ml ............................... x g Na2CO3
x = 100 · b g Na2CO3/L

Interpretarea rezultatelor
Valorile normale ale ionului HCO3- trebuie să fie cuprinse în intervalul 24 –
27 mEq/L, iar cele ale ionului CO32- în jur de 1,2 mEq/L, astfel încât raportul
HCO3-/CO32- să fie aproximativ 20. Deoarece sistemul carbonat/bicarbonat este
primul care intervine şi se modifică relativ uşor prin respiraţie, totalitatea CO2
conţinută ca atare sau sub formă de bicarbonaţi în 100 ml plasmă exprimat ca ml
CO2 la 00C şi la 1 atm, formează rezerva alcalină (55-70 ml în mod obişnuit).
pH-ul sângelui uman are în mod obişnuit valoarea de 7,4 ± 0,04. Valori ale
pH-ului sub 7,35 apar în cazul acidozei, iar peste 7,45 în alcaloză. Ambele stări sunt
periculoase şi se manifestă clinic prin semne de afectare a sistemului nervos.
Menţinerea unor limite de +/- 0,04 unităţi de pH se face prin 3 mecanisme
principale :
1. capacitatea de tamponare a sistemelor fizico-chimice din plasmă şi hematii;
2. controlul respirator al eliminării CO2;
3. reglarea renală a acidifierii urinii.
Primele 2 mecanisme intervin imediat, iar cel de-al treilea după un interval
de timp mai lung. Principalul sistem tampon în hematii este sistemul
hemoglobină/hemoglobină oxigenată, iar în plasmă sistemul carbonat/bicarbonat.

54
Datorită pătrunderii ionului bicarbonat prin membrana hematiilor cele 2 sisteme
sunt legate funcţional. În plus, datorită reversibilităţii reacţiei catalizate de una din
cele mai active enzime (anhidraza carbonică), excesul de acid carbonic poate fi
eliminat prin respiraţie.

anhidraza carbonicã
+ -
CO2 + H2O H + HCO3

VI.3. TULBURĂRI ALE ECHILIBRULUI ACIDO-BAZIC

Evaluarea echilibrului acido-bazic al pacientului se face luând în


considerare sistemul tampon bicarbonat/acid carbonic din sânge. Orice perturbare a
homeostaziei ionilor de hidrogen va afecta sistemul tampon bicarbonat/acid
carbonic.
Atunci când se modifică concentraţia bicarbonaţilor apar anomalii de
cauză metabolică:
- în diabetul zaharat metabolismul intermediar este perturbat. În absenţa
insulinei vor fi utilizaţi acizi graşi. Ca urmare, se acumulează în organism atât acid
acetilacetic, cât şi acid β-hidroxibutiric care vor înlocui ionii bicarbonat consumaţi
în tamponarea ionilor de hidrogen disociaţi din aceşti acizi.
- pierderi de bicarbonat din spaţiul extracelular pot să mai apară în
condiţiile existenţei unei fistule duodenale.
Anomalii din cauză respiratorie se semnalează atunci când se modifică
pCO2 în sânge. Tulburările funcţiei respiratorii sunt în legătură cu schimbările
ventilaţiei pulmonare sau modificările funcţiei alveolare care afectează transportul
CO2 sau O2 la nivelul membranei alveolare (schimbul de gaze). În ambele cazuri
pCO2 se modifică şi concentraţia de acid carbonic creşte sau scade. Alterarea
funcţiei respiratorii determină creşterea pCO2 în sânge, iar hiperventilaţia duce la
scăderea pCO2.
Acidozele şi alcalozele sunt termeni clinici care definesc tulburarea acido-
bazică primară. Ei pot fi utilizaţi chiar şi când concentraţia [H+] este în limite
normale, de exemplu, când anomaliile sunt total compensate.
Cauzele pot fi respiratorii, metabolice sau mixte.
În funcţie de gradul de compensare chimico-biologică sunt: necompensate, parţial
compensate, compensate.
Astfel se pot distinge:
1. Acidoze metabolice - anomalia primară este o scădere a concentraţiei de
bicarbonat.
2. Alcaloza metabolică - anomalia primară este concentraţia de bicarbonat
crescută.
3. Acidoza respiratorie - anomalia primară este creşterea pCO2.
4. Alcaloza respiratorie - anomalia principală este scăderea pCO2.

55
Acidemia şi alcalinemia se referă la concentraţia de H+ din sânge,
reprezentând o valoare crescută sau scăzută faţă de normal. Aceşti termeni nu sunt
frecvent folosiţi.

VI.3.1. Acidoza metabolică

Într-o acidoză metabolică principala problemă este scăderea concentraţiei


de bicarbonat sub 24 mEq/L din spaţiul extracelular. Aceasta se datorează:
1. Cantităţii crescute de ioni de hidrogen (producţie crescută de acizi
rezultaţi din metabolism).
2. Aport de ioni de hidrogen sau medicamente care sunt metabolizate la
acizi.
3. Diminuarea excreţiei de ioni de hidrogen pe cale renală.
4. Pierderea de bicarbonaţi pe cale gastrointestinală sau urinară.

Cauzele acidozei metabolice:


1. Boli renale: ionii de hidrogen sunt reţinuţi împreună cu anionii, ca de
exemplu sulfatul şi fosfatul.
2. Acido-cetoza diabetică: exagerarea utilizării acizilor graşi, ca o
consecinţă a lipsei de insulină, determină producţia endogenă de acid acetilacetic şi
beta hidroxibutiric.
3. Acidoza lactică: aceasta rezultă dintr-o serie de cauze, în special din
ţesutul anoxic. În stările acute de hipoxie ca, de exemplu, insuficienţa respiratorie
sau stopul cardiac, acidoza lactică apare în câteva minute punând viaţa în pericol.
Poate să apară şi în boli hepatice. Prezenţa acidozei lactice poate fi evidenţiată prin
măsurarea concentraţiei plasmatice a lactatului.
4. Intoxicaţii sau supradozare cu medicamente: mecanismul este comun şi
constă în producţia de metaboliţi acizi - supradoză de salicilaţi, intoxicaţii cu etilen
glicol.
5. Diareea cronică sau fistula intestinală
6. Acidoza tubulară renală: celulele tubulare renale sunt incapabile să
elimine ionii de hidrogen eficient şi bicarbonatul se pierde prin urină.

Paraclinic:
- pH < 7,35;
- modificare primară: bicarbonat < 24 mEq/L (este folosit pentru compensarea
rapidă);
- pCO2 > 40 mmHg, dacă apare compensarea pCO2 < 35 mmHg.

Manifestările clinice:
 durere de cap, letargie, greaţă, vomă, diaree;
 prezenţa hiperpotasemiei, care însoţeşte acidoza poate mări riscul aritmiilor
cardiace care pot conduce la stop cardiac. Apar tulburări ale conştienţei ce pot duce
la comă şi deces.

56
Mecanisme de compensare/corectare:
 respiratorie: răspunsul compensator la acidoza metabolică este
hiperventilaţia, creşterea [H+] serveşte drept un stimulent puternic pentru centrul
respirator. Respiraţia Kussmaul este profundă, rapidă şi zgomotoasă, fiind întâlnită
în acidoze. Hiperventilaţia este răspunsul fiziologic la acidoză şi se instalează
rapid;
 renală: eliminarea unei urini acide;
 sau prin neutralizarea din sucul gastric a excesului de acizi.

Tratament: soluţie de lactat administrată IV.

VI.3.2. Alcaloza metabolică

Se caracterizează printr-o creştere a concentraţiei de bicarbonat peste 27


mEq/L.

Cauzele alcalozei:
1. Pierderea de ioni de hidrogen în cursul vărsăturilor este întâlnită în cazul
pacienţilor cu stenoză pilorică. Obstrucţia dintre stomac şi duoden face ca
pierderile de H+ să nu fie însoţite de o pierdere de bicarbonaţi, iar dacă nu survine o
eliminare rapidă a acestora la nivelul rinichilor se va instala o alcaloză metabolică.
2. Administrarea terapeutică a unei cantităţi mari de bicarbonat sub formă
de infuzii intravenoase sau chiar pe cale orală, poate depăşi capacitatea de
eliminare renală; sau a unor medicamente bazice.
3. Pierderi de potasiu. În pierderile severe de potasiu, adesea o consecinţă a
terapiei cu diuretice, ionii de hidrogen sunt reţinuţi în celule pentru a înlocui lipsa
ionilor de potasiu. La nivelul tubului renal sunt eliminaţi mai mulţi ioni de
hidrogen decât de potasiu. Sodiul nu poate pătrunde în celule ca să înlocuiască
deficitul de potasiu. În ciuda alcalozei, urina este acidă. Aceasta este aciduria
paradoxală.
4. Anumite diuretice, tulburări endocrine, deshidratări severe.

Paraclinic:
- pH > 7,45;
- modificarea primară: bicarbonat > 27 mEq/L;
- pCO2 valori normale, dacă apare compensarea creşte > 45 mmHg.

Manifestările clinice:
Efectele clinice ale alcalozei includ hipoventilaţie, pierderea conştienţei şi
în cele din urmă comă. Crampele musculare, tetania, aritmiile şi paresteziile pot fi
o consecinţă a scăderii concentraţiei de calciu plasmatic, care este o consecinţă a
alcalozei.

57
Mecanisme de compensare/corectare:
 respiratorie: hipoventilaţie (creşterea pH-ului inhibă centrul respirator
cauzând hipoventilaţie ce va determina acumularea de CO2 în sânge);
 renală: eliminarea unei urini alcaline (rinichii conservă H+ şi elimină HCO3-)

Tratament:
 Soluţii conţinând cloruri (Cl- înlocuieşte HCO3-);
 Soluţii de electroliţi (pentru a-i compensa pe cei pierduţi prin vărsături);
 Tratamentul celorlalte cauze/tulburări.

VI.3.3. Acidoza respiratorie

Apare în condiţii de creştere a concentraţiei CO2 ca urmare a unei deficienţe


respiratorii (emfizem pulmonar, obstacole pe căile respiratorii etc.) şi se
compensează prin stimularea respiraţiei.

Cauze:
- deprimarea centrilor respiratori în afecţiuni neurologice sau în intoxicaţii cu
morfină, barbiturice;
- afecţiuni pulmonare cu reducerea parenchimului pulmonar;
- scăderea capacităţii de difuziune alveolo-capilară.

Paraclinic:
- pH < 7,35;
- modificare primară: pCO2 > 45 mmHg (hipercapnie);
- bicarbonat valori normale, dacă apare compensarea > 27 mEq/L.

Manifestări clinice:
- deficienţă respiratorie;
- letargie, dezorientare;
- tremor, convulsie, comă.

Mecanisme de compensare/corectare:
- respiratorie: creşterea pCO2 determină stimularea centrilor respiratori şi
hiperventilaţie permiţând eliminarea de CO2 şi H2O la nivelul plămânilor;
- renală: eliminarea de H+ în urina acidă determinând reabsorbţia HCO3- deja
crescut în sânge. Creşterea reabsobţiei de HCO3- determină o excreţie crescută a Cl-
în urină, generând o scădere a Cl- în plasmă.

Tratament:
- restaurarea/stimularea respiraţiei;
- soluţie lactat administrată IV;
- tratarea patologiilor existente.

58
Acidoza respiratorie poate să fie acută sau cronică.
Problema principală în acidoza respiratorie acută este hipoventilaţia
alveolară. Forma acută apare în câteva minute sau ore şi este decompensată.
Mecanismele compensatorii renale care reglează reabsorbţia de bicarbonaţi sunt
eficiente complet doar în 48-72 h.
Principala manifestare clinică a acidozei respiratorii constă în alterarea
stării de conştienţă, obnubilare, mergând până la comă şi poate duce chiar la deces.
Exemple de acidoză respiratorie acută sunt:
 obstrucţia acută a căilor respiratorii;
 bronhopneumonia;
 criza de astm.

Acidoza respiratorie cronică este, de obicei, o stare de lungă durată şi


tulburarea este compensată pe cale renală. Problema principală şi în această situaţie
este diminuarea ventilaţiei alveolare. Modificările pot fi compensate parţial sau
complet. La nivelul tubilor renali excreţia ionilor de hidrogen creşte, cu generarea
bicarbonaţilor. Concentraţia sanguină a [H+] are tendinţe de normalizare.

Există un interval de câteva zile necesare de la apariţia tulburării pentru ca


rinichii să răspundă la nivelul crescut de pCO2 şi [H+]. La mulţi pacienţi cu
afecţiuni respiratorii cronice, mecanismele renale compensatorii vor păstra
concentraţia sanguină a [H+] aproape de normal, în ciuda micşorării ventilaţiei
pulmonare. În stările stabile de bronşită cronică, [H+] este în limite normale cu
toate că pCO2 are valori crescute. Acest lucru este realizat numai menţinând o
concentraţie de bicarbonaţi de două ori mai mare decât cea normală. pO 2 este de
obicei scăzută, şi scăderea se accentuează pe măsură ce afecţiunea pulmonară
evoluează în timp.
Exemple de afecţiuni cronice respiratorii sunt:
 emfizemul;
 bronşita cronică.

VI.3.4. Alcaloza respiratorie


Alcaloza respiratorie este mai puţin frecventă decât acidoza. Poate să apară
ca urmare a unei respiraţii accelerate, hiperventilaţiei şi când efortul compensator
renal are o eficienţă limitată.
Exemple sunt: criza de isterie, respiraţia asistată, leziuni tumorale, intoxicaţii (cu
salicilaţi), afecţiuni cardiace etc.

Cauze:
- altitudinea (polipnee, hiperventilaţie cu pierdere de CO2);
- hiperventilaţia cronică datorată hipoxiei din anemii, boli cardio-vasculare etc.

59
Paraclinic:
- pH > 7,45;
- modificarea primară: pCO2< 35 mmHg (hipocapnie);
- bicarbonat valori normale, dacă apare comensarea < 24 mEq/L.

Manifestări clinice:
- hiperventilaţie;
- ameţeli, confuzie;
- hiperexcitabilitate neuromusculară, parestezii, convulsii.

Mecanisme de compensare/corectare:
- respiratorie: scăderea pCO2 determină o slabă stimulare a centrilor respiratori =>
hipoventilaţie cu reţinere de CO2;
- renală: scăderea eliminării de H+ determinând scăderea reabsorbţiei de HCO3- =>
urină alcalină. Pentru a compensa pierderile de bicarbonat, apare o creştere a
reabsorbţiei renale de Cl-.

Tratament:
- înlăturarea cauzei care a determinat hiperventilaţia;
- respirarea unui amestec bogat în CO2 (în clinici);
- soluţii conţinând cloruri (Cl- înlocuieşte HCO3-).

Tabel 2. Tulburările echilibrului acido-bazic (EAB)


Tulburări Modif. Modificare Exemple
EAB primară compensatorie
Acidoză  HCO3- H2CO3 nemodif N  pH D diabet
metabolică H2CO3 (hiperventilaţie)  pH N C zaharat
Acidoză  H2CO3 HCO3- nemodif N pH D HCO3- afecţiuni
respiratorie (pCO2) (reabs. renală )  pH N C respiratorii
Alcaloză  HCO3- H2CO3 nemodif N  pH D H2CO3 vărsături
metabolică (hipoventilaţie)  pH N C severe
Alcaloză  H2CO3 HCO3- nemodif N  pH D HCO3- hiperpnee
respiratorie (pCO2) (reabs. renală )  pH N C voluntară
C = compensată; D = decompensată; N = normal

60
VI.3.5. Tulburări acido-bazice mixte

O tulburare acido-bazică este considerată mixtă când este produsă de


intervenţia a cel puţin doi factori etiologici ce acţionează concomitent.
Unii bolnavi pot să aibă ambele tipuri de dezechilibre: acidoză metabolică
şi respiratorie, ca în bronşitele cronice cu deteriorarea funcţiei renale. Concentraţia
[H+] creşte, pCO2, de asemenea, iar bicarbonaţii vor avea valori scăzute.
Tulburările care intervin pot fi convergente (aditive pe modificarea de pH)
sau pot fi divergente (modifică pH în sens opus).
Poate exista o acidoză metabolică şi o alcaloză respiratorie coexistentă, cum
apare în intoxicaţiile cu salicilaţi.
Alcaloza mixtă, metabolică şi respiratorie apare în unele situaţii ca de
exemplu:
- la bolnavii hepatici trataţi cu diuretice;
- tratament cu diuretic la un bolnav cu metastaze osoase;
- ventilaţie asistată la bolnavi ce au pierdut ioni de H+ prin vărsături.
Alcaloza respiratorie cu acidoză metabolică poate apărea în insuficienţa
renală cu stare septică, şoc septic.
Acidoza respiratorie cu alcaloză metabolică se întâlneşte într-o boală
pulmonară cronică cu hipoventilaţie alveolară căruia i s-a administrat un tratament
diuretic masiv.

VI.3.6. Explorarea echilibrului acido-bazic

Explorarea echilibrului acido-bazic se poate efectua din sângele arterial şi


venos. Recoltarea se face în seringi ce conţin heparină. Puncţia arterială este
neplăcută pentru pacient, astfel că recoltarea poate fi limitată la câteva situaţii cum
ar fi evaluarea pO2, dacă pacientul este respirat artificial, dacă se suspicionează o
exacerbare a unei boli pulmonare cronice, etc.
Determinările de pH şi de bicarbonaţi se fac cu ajutorul unor analizoare
automate. Se măsoară astfel pH-ul, presiunile parţiale de oxigen şi de bioxid de
carbon şi, pornind de la aceşti parametri, se pot calcula şi alţii.
Cea mai completă informaţie privind echilibrul acido-bazic este furnizată de
investigaţia Astrup, combinată cu monograma Sigard-Andersen.

Parametrii Astrup:
 pH-ul actual: valoarea medie normală a pH-ului sanguin; valori normale
între 7,36 – 7,44;
 pH-ul standard = 7,36 – 7,44 în condiţii standard: pCO2 = 40 mmHg,
T = 37 °C, saturaţie în O2 a Hb = 100 %;
 Bicarbonatul standard = 24 – 27 mEg/L măsurat în aceleaşi condiţii
standard menţionate anterior;
 Bicarbonatul actual (real): valoarea HCO3- în sângele analizat; valoarea
normală 24 – 27 mEg/L;

61
 pCO2 = 40 ± 2 mmHg sau 1,25 mEg/L; presiunea parţială a CO2 măsurat în
plasmă;
 Baze tampon: concentraţia tuturor bazelor care intervin în captarea ionilor
H+ (Hb, proteine, fosfaţi, etc.); valoarea normală = 40-50 mEg/L;
 Bazele exces: reprezintă cantitatea de acizi sau baze care ar putea restabili
echilibrul acido-bazic într-un litru de sânge la un pCO2 de 40 mmHg.
Valoarea normală este între +2 şi -2 nmoli/l sau mEq/l.

Dozarea concentraţiei de potasiu este, de asemenea, importantă în


explorarea echilibrului acido-bazic.
Corectarea echilibrului acido-bazic se efectuează în funcţie de etiologie şi
de mecanismul de producere a anomaliei.

Probleme:

1. Enumeraţi principalele sisteme tampon prezente în sânge implicate în


menţinerea echilibrului acido-bazic.

2. Menţionaţi care este tulburarea echilibrului acido-bazic cunoscând


următorii parametri:
pH = 7,30, HCO3- = 23 mEq/L, pCO2 = 37 mmHg

3. Calculaţi concentraţia procentuală, c% (m/V), a unei soluţii de NaHCO3


ştiind că pentru titrarea a 30 ml din această soluţie s-au folosit 13 ml soluţie HCl
0.1N de exactă normalitate (F = 1).

62
LUCRAREA 4

VII. ELECTROLIŢI. ANIONI. CATIONI. METODE DE


DOZARE

VII.1. APA

Apa reprezintă mediul optim pentru desfăşurarea proceselor biochimice care


au loc în organismul uman, ea reprezentând vehiculul care asigură transportul şi
schimburile metabolice. Apa totală liberă este distribuită în 2 sectoare principale:
compartimentul celular şi cel extracelular.
Apa celulară se găseşte în citoplasmă, nucleu, mitocondrii şi lizozomi.
Apa extracelulară este separată de cea celulară prin membranele celulare.
Ea este repartizată în mai multe compartimente: intravascular, interstiţial,
transcelular şi ţesut conjunctiv dens (cartilaje şi oase). Compartimentul
intravascular conţine plasma sanguină şi limfa. Compartimentul interstiţial este
reprezentat de fapt de un ultrafiltrat plasmatic care scaldă celulele, separat fiind de
compartimentul intravascular prin membranele capilarelor. Acestea permit o
circulaţie hidroelectrolitică liberă, dar se opun ieşirii proteinelor din vase.
Compartimentul transcelular se referă la lichidul cefalorahidian, la mediile
lichidiene oculare şi articulare, şi la lichidele din seroase. Apa din compartimentul
hidric din ţesutul conjunctiv dens (cartilaje şi oase) se deplasează lent şi are
schimburi foarte reduse cu restul lichidelor organismului.
În condiţii normale, organismul uman nu întâmpină dificultăţi în procesul de
înlocuire a pierderilor fiziologice de lichide. Cantitatea de apă, ca şi ceilalţi
constituenţi ai sângelui, îşi păstrează o valoare aproape constantă datorită unui
control riguros exercitat de organism prin mecanisme fiziologice şi hormonale
proprii.
În sectorul extracelular reglarea apei este dependentă de sodiu, principalul
cation extracelular, ale cărui modificări, alături de anionii extracelulari (anionul
clorură şi bicarbonat), vor determina modificări ale bilanţului hidric.
Reglarea apei în sectorul intracelular este dependentă de osmolaritatea
lichidelor extracelulare. Osmolaritatea (presiunea osmotică) reprezintă numărul
de osmoli/litru de soluţie şi este determinată de numărul de particule dizolvate în
lichide. Aceste particule dizolvate de care depinde presiunea osmotică se numesc
osmoli (1mol = 1osmol). Pentru moleculele care disociază, fiecare ion reprezintă un
osmol. În cazul plasmei sau serului, osmolaritatea se exprimă în miliosmoli care
pentru electroliţi corespund cu miliechivalenţi. Valorile normale ale osmolarităţii
plasmei sunt cuprinse între 300-310 mOsm/L.

63
Reglarea hormonală a apei din organism este realizată de :
- Hormonul antidiuretic (ADH) prin care se realizează controlul reabsorbţiei
apei la nivelul tubului contort distal şi colector al nefronului.
- Aldosterona participă la menţinerea homeostaziei hidrice şi electrolitice
prin efectul său de a determina reabsorbţia Na+ la nivelul tubului contort distal şi în
mod secundar determină eliminarea renală de H+, K+ şi NH4+. Controlul secreţiei
de aldosteronă este realizat prin factori multipli dintre care amintim sistemul
renină- angiotensină, kalemia, natremia şi concentraţia plasmatică de ACTH.
Aportul de apă în organism se poate realiza pe mai multe căi:
- exogenă, prin ingestia apei ca atare sau sub forma apei conţinute în alimente
- endogenă, provenită din procesele metabolice.
Există o interdependenţă între apa formată şi cea eliminată. Eliminarea apei
se face pe cale renală, cutanată, digestivă şi pulmonară.

Anomalii ale echilibrului hidroelectrolitic pot fi determinate de un aport


insuficient de apă sau de pierderea în exces a apei (deshidratările).
Deshidratarea se poate instala în următoarele condiţii:
- secreţie sudorală excesivă
- diaree marcată
- diureza exagerată în caz de deficit de vasopresină
Pierderile excesive de apă sunt însoţite aproape constant de o pierdere mai
mare sau mai mică de electroliţi. Raportul dintre cantitatea de apă şi Na+ din
lichidul pierdut permite clasificarea deshidratărilor în :

1) Deshidratări hipertone (globale) apar când pierderea de apă este mai mare
decât cea de Na+. Deshidratările hipertone interesează în primul rând sectorul
extracelular, fiind caracterizate de hiperosmolaritatea lichidelor extracelulare.
Aceasta stimulează secreţia de ADH şi aldosteron, ceea ce are ca şi urmare
scăderea compensatorie a eliminărilor urinare, instalându-se oliguria. În acelaşi
timp deshidratarea stimulează senzaţia de sete care va contribui şi ea la corectarea
deshidratării.

2) Deshidratări hipotone sunt determinate de pierderi de Na+ în exces faţă de


pierderile de apă întâlnite în situaţii patologice în care rinichiul nu mai are
capacitatea de a reţine Na+: insuficienţa renală cronică în stadiul poliuric, în
insuficienţa corticosuprarenalei sau în cazul administrării îndelungate de
medicamente diuretice.
Poliuria va determina pierderea unor cantităţi semnificative de apă din organism
care va avea ca rezultat instalarea hipovolemiei.
Scăderea presiunii osmotice a lichidelor extracelulare datorită hiponatremiei va
favoriza transferul apei din sectorul extracelular în cel celular. Astfel se produce un
sindrom de deshidratare extracelulară şi hiperhidratare celulară.

64
3) Deshidratările izotone sunt rezultatul pierderilor concomitente şi
echilibrate de apă şi electroliţi. Acestea pot fi produse de hemoragii acute, pierderi
de lichide pe cale digestivă sau secundar administrării de medicamente diuretice în
doză prea mare. Pierderile de lichide izotone duc la instalarea hipovolemiei care va
determina scăderea debitului cardiac şi a fluxului sangiun renal, cu scăderea
filtrăriii glomerulare şi a diurezei. Secundar apar tahicardie, hipotensiune şi
senzaţia de sete.

Retenţia în exces a apei (hiperhidratările) sunt sindroame caracterizate prin


retenţii apoase însoţite de un bilanţ sodic pozitiv, ele putând fi extracelulare,
celulare sau globale.
1) Hiperhidratările extracelulare şi formarea edemelor
Edemul semnifică prezenţa unui exces de lichid în ţesuturile organismului.
Edemul apare în special la nivelul compartimentului extracelular.
Cauzele edemelor :
a) Edem produs de extravazarea exagerată de lichid din capilare sau datorat
obstrucţiei limfatice.
b) Edem produs de retenţia de apă şi sare.
Mecanismele care duc la apariţia edemelor se pot asocia şi uneori interfera
în funcţie de afecţiunea care provoacă edemul. Una din cele mai frecvente cauze de
producere a edemului este insuficienţa cardiacă: inima nu mai pompează sângele
în mod eficient, astfel creşte presiunea în vene şi capilare. Presiunea arterială are
tendinţa să scadă, ceea ce are efect asupra irigaţiei rinichiului, ducând la scăderea
eliminării de apă şi Na+ de către rinichi.
Altă cauză care poate duce la constituirea edemului este scăderea
proteinemiei, în special hipoalbiminemia. Apare modificarea repartiţiei
intercompartimentale a apei prin scăderea presiunii coloid osmotice din vase şi
creşterea acesteia în compartimentul interstiţial.
Afecţiunile care compromit funcţia renală (de ex. glomerulonefrita) pot
determina reducerea excreţiei de apă şi a ionilor de Na+ pe cale renală, apare edemul
extracelular şi hipertensiune datorită creşterii volemiei.
Edemul din ciroza hepatică decompensată asociat cu ascita este caracterizat
de retenţie hidrosalină, hipertensiune şi hipoalbuminemie.

2) Hiperhidratările celulare sunt consecinţa reducerii eliminărilor


hidrosaline datorită fie alterării funcţiei renale, fie datorită unor tulburări endocrine
care afectează funcţiile rinichiului.
3) Hiperhidratările globale sunt formele cele mai grave de acumulări
hidrosaline la nivelul tuturor sectoarelor, asociate fiind cu deficit de eliminare.
Aceste situaţii apar în hipersecreţii de ADH produse de diferite agresiuni
(traumatisme, intervenţii chirurgicale), leziuni renale, nefropatii cronice,
administrare în exces de perfuzii cu seruri glucozate.

65
VII.2. ELECTROLIŢII

Substanţele minerale (electroliţii) deţin un rol important în menţinerea


integrităţii morfologice şi funcţionale a organismului. Ele sunt substanţe ce nu se
pot sintetiza sau degrada în organism. Electroliţii dizolvaţi în plasmă sunt în stare
ionică, existând un echilibru între anioni şi cationi. În condiţii fiziologice,
elementele minerale se află în cantităţi relativ constante. Funcţia de excreţie joacă
un rol important în menţinerea constantă a concentraţiei electroliţilor în mediul
intern. Orice stare patologică severă a organismului este însoţită de perturbări ale
echilibrului hidroelectrolitic.
Electroliţii din sânge se împart în anioni şi cationi.
Cationii cantitativ mai importanţi din sânge sunt: sodiu (Na+), potasiu (K+),
calciu (Ca2+), magneziu (Mg2+) şi în mai mică măsură fierul (Fe2+), cuprul (Cu2+),
zincul (Zn2+).
Anionii cantitativ mai importanţi din sânge sunt: clorul (sub forma de
clorură Cl-), bicarbonatul (HCO3-), fosfatul (HPO42-) şi în proporţie mai mică
sulfatul
(SO42-).
Unităţile de măsură utilizate pentru exprimarea cantităţii de electrolit sunt
mg/dl, osmol/l (mosmol/l) şi mEq/l. Osmol/l reprezintă raportul dintre cantitatea de
substanţă (exprimată în grame/l) şi masa atomică a substanţei respective.

𝑔/𝑙
Osm/l = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎𝑡𝑜𝑚𝑖𝑐 ă

𝑚𝑔 /𝑙
mOsm/l = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎𝑡𝑜𝑚𝑖𝑐 ă

𝑚𝑔 /𝑙
mEq/l = mOsm/l x valenţa = 𝑚𝑎𝑠𝑎 x valenţa
𝑎𝑡𝑜𝑚𝑖𝑐 ă

În cazul ionilor monovalenţi, valoarea exprimată în mEq/l este egală cu cea


exprimată în mosm/l.
Distribuţia electroliţilor între spaţiul extracelular şi cel intracelular este
diferită în cazul :
- sodiului (Na+) - principalul cation extracelular;
- clorului (Cl-) - principalul anion extracelular;
- potasiului (K+) - principalul cation intracelular;
- fosfatului (HPO42-) - principalul anion intracelular.
Compoziţia în electroliţi a spaţiului intravascular şi a celui interstiţial diferă
foarte puţin (peretele vascular este permeabil pentru electroliţi). Diferenţa între cele
două spaţii este semnificativă din punct de vedere al conţinutului proteic, care este
mai mare în spaţiul intravascular, aceasta contribuind la menţinerea presiunii
coloid-osmotice crescute în sistemul vascular.

66
VII.2.1. Metode utilizate pentru determinarea electroliţilor

Determinarea ionilor anorganici se realizează cu ajutorul flamfotometrelor


şi a aparatelor ce utilizează spectrometria cu absorbţie atomică.
În contextul necesităţii determinărilor electroliţilor în mod curent, metodele
chimice nu ar fi făcut faţă numărului mare de analize. Faţă de 1-2 ore, cât dura o
metodă chimică, flamfotometria permite determinări ce durează mai puţin de un
minut şi cu precizie mult mai mare.
Principiul flanfotometriei se bazează pe capacitatea unor elemente
chimice care, prin introducerea lor într-o flacară neluminoasă, să emită lumină la o
lungime de undă caracteristică atomilor respectivi. Atomii acestor elemente trec
datorită energiei termice a flăcării într-o stare excitată, revenind spontan apoi la
nivelul iniţial, fundamental, dar emiţând surplusul de energie sub formă de lumină,
la o lungime de undă caracteristică, spre exemplu 589 nm pentru sodiu. În anumite
limite, cantitatea de lumină emisă este proporţională cu concentraţia atomilor
introduşi în flacără, cu condiţia aspirării soluţiei de analizat cu o viteză constantă.
Cantitatea de lumină variază în funcţie de temperatura flăcării. Atât aspirarea
soluţiei de analizat, cât şi debitul gazelor care întreţin flacăra trebuie întreţinute
riguros constant.
Lungimea de undă caracteristică fiecărui element de analizat este
monitorizată printr-un sistem de prismă şi filtre specific fiecărui tip de
flamfotometru. Intensitatea luminii emise este măsurată printr-o fotocelulă cuplată
cu un aparat adecvat de măsurat. Curentul electric obţinut va permite citirea
concentraţiei elementului chimic direct în miliechivalenţi, în funcţie de tipul
aparatului. Determinările se fac intercalând obligatoriu un standard din elementul
de măsurat. La calibrarea metodei trebuie verificat domeniul liniar al relaţiei dintre
lumina emisă (intensitatea) şi concentraţia elementului în condiţiile experimentale
constante de temperatură şi debit al gazelor. Prin flamfotometrie se determină
curent sodiul, potasiul, litiul, magneziul, fierul, calciul.
Prezenţa unui element într-o cantitate mare poate interfera cu măsurarea
concentraţiei altui element, cum este cazul determinării potasiului în prezenţa unor
concentraţii mari de sodiu. La aparatele moderne se minimalizează acest efect, dar
oricum standardele de potasiu trebuie să conţină şi o concentraţie de sodiu
cunoscută, asemănătoare aceleia obţinute prin diluarea serului: 140 mEq/l Na+ şi 5
mEq/l K+, iar în urină 50 mEq/l pentru fiecare.
Procedeul de utilizare al flamfotometrelor este simplu şi diferă de tipul
aparatului. În general, amestecul de propan şi aer produce o flacără cu o
temperatură de 1900-20000C, dar cu alte gaze se obţin temperaturi mai mici,
insuficiente pentru măsurarea altor elemente. Indiferent de tipul aparatului, toate
necesită folosirea unui standard intern. Acesta constă dintr-o concentraţie cunoscută
dintr-o sare de litiu sau cesiu care se adaugă standardelor şi martorului, tocmai în
scopul evitării interferenţelor. Aparatele moderne permit determinarea simultană a
sodiului, potasiului şi litiului. Toate lichidele biologice în care se determină

67
elementele anorganice sunt diluate 1:100 sau 1:200 cu apă deionizată şi cu un
standard intern de litiu de 15 mEg/l.
Spectrometria de absorbţie atomică este o metodă de mare sensibilitate şi
specificitate care poate fi folosită în laboratorul clinic pentru a determina calciu,
magneziu, litiu, plumb, cupru, fier, zinc şi alţi ioni metalici. Principiul de
funcţionare a acestui tip de aparat este destul de asemănător cu flamfotometrul cu
deosebirea că în acest tip de aparat se măsoară lumina emisă de atomii neexcitaţi.
În spectrofotometrele cu absorbţie atomică, elementele sunt vaporizate printr-o
descărcare într-un catod cu heliu sau argon. Proba este aspirată în flacăra formată
dintr-un amestec de aer şi acetilenă asemănător flamfotometrului.

VII.2.2. DOZAREA SODIULUI ŞI A POTASIULUI

Sodiul (Na+) este principalul cation al lichidului extracelular fiind prezent


într-o concentraţie de 310-345 mg/dl (143 mEq/l plasmă). Din totalul de sodiu al
organismului, 98 % se găseşte în sectorul extracelular şi doar 2 % în sectorul
intracelular. Concentraţia sodiului este mai mare decât a celorlalţi cationi, el
reprezentând principalul factor al reglării presiunii osmotice. Între concentraţia Na+
(extracelular) şi cea a K+ (intracelular) există un echilibru ce se realizează printr-un
mecanism de transport activ la nivelul membranelor celulare, aşa numita „pompă‖
de electroliţi.
Aportul de sodiu se face preponderent sub formă de NaCl din alimente şi
din apa potabilă. Absorbţia lui se face aproape complet în prima jumătate a
ileonului şi este practic terminată în colonul distal. Eliminările de Na+ se fac prin
urină (95 %), fecale (0,5 %) şi transpiraţie (4,5 %). Secreţia de Na+ este controlată
de către doi hormoni: aldosteronul şi peptidul natriuretic atrial.
Rolurile sodiului sunt multiple:
- ca principal cation extracelular participă la reglarea presiunii osmotice,
a volumului plasmatic (concentraţia lui fiind mai mare decât a celorlalţi cationi) şi,
de asemenea, a echilibrului acido-bazic (sistemul tampon bicarbonat de sodiu/acid
carbonic fiind cel mai important sistem tampon);
- participă la reglarea funcţiilor sistemului nervos şi a activităţii musculare;
- participă la menţinerea diferenţei de potenţial de o parte şi de alta a membranei
celulare, având rol în transmiterea impulsului nervos;
- activează unele enzime (alfa-amilaza şi beta-galactozidaza);
- are rol în transportul transmemebranar (ATP-aza Na+/K+ dependentă).

Variaţii patologice :
Hiponatremie:
- diaree severă;
- transpiraţii masive;
- arsuri extinse;
- diabet zaharat cu acidoză;

68
- insuficienţa renală, insuficienţă corticosuprarenală;
- administrare de diuretice.

Hipernatremie:
- stenoza pilorică;
- hiperaldosteronism;
- corticoterapie.

Potasiul (K+) fiind un electrolit localizat cu preponderenţă intracelular,


variaţiile sale plasmatice dau doar indicaţii aproximative asupra cantităţii de
potasiu din organism. Aproximativ 90% din potasiul organismului se găseşte în
citoplasma celulelor, cu precădere la nivelul musculaturii striate, miocard, hematii.
În sectorul extracelular şi în plasmă potasiul se găseşte într-o concentraţie medie de
4,5 mEq/l (16-20 mg/dl).
Rolurile potasiului :
- rol plastic fiind un constituent al ţesuturilor unde se găseşte fixat de proteine;
- activează unele enzime (piruvatkinaza, carbamil fosfat sintetaza).
Prezintă, de asemenea, un rol important în fenomenele de membrană, în
procesele de permeabilitate, influenţează transmiterea influxului nervos şi
excitabilitatea neuromusculară.

Variaţii patologice:
Hipokaliemie :
- este insoţită de tulburări neuro-musculare şi cardiace şi se întâlnesc în cadrul
patologiei chirurgicale: obstrucţie intestinală, stenoză pilorică;
- dializa peritoneală;
- nefropatii tubulare.

Hiperkalemie :
- distrucţii celulare (sindroame hemolitice, sindrom de strivire, arsuri întinse);
- insuficienţa renală acută şi cronică.

Pentru dozarea acestor două elemente se foloseşte fotometria de flacără,


metodă fizică foarte rapidă care nu necesită decât cantităţi foarte mici de sânge.
Metodele chimice mai vechi sunt foarte laborioase, necesită cantităţi importante de
sânge, motiv pentru care nu se mai folosesc astăzi.

Principiu:
Proba se introduce în flacără şi pentru o temperatură constantă a flacării în
anumite condiţii, intensitatea radiaţiei emise este proporţională cu concentraţia
metalului în soluţie. Se determină intensitatea radiaţiei emise, selecţionate cu
ajutorul unor filtre (de interferenţă, specifice fiecărui metal).

69
Aparatura:
Fotometrul cu flacără, vase din material plastic pentru păstrarea soluţiilor
etalon şi efectuarea diluţiilor, pipete, baloane cotate sau biurete.

Reactivi:
Ca regulă generală, toţi reactivii vor fi păstraţi în flacoane de polietilenă şi
nu în vase de sticlă fiindcă silicaţii din sticlă cedează mai mult sau mai puţin ionii
de sodiu şi potasiu în soluţie. La prepararea soluţiilor etalon se va folosi apă
bidistilată sau tridistilată.
Soluţiile etalon se prepară din NaCl şi KCl uscate în prealabil timp de 24 de
ore la 1100C într-o etuvă şi lăsate să se răcescă într-un exicator.
1. Soluţie etalon NaCl: 7,35 g NaCl, 5 ml formaldehidă 40% şi apă bidistilată ad
1000 ml. Soluţia conţine 3 mg Na/ml şi se diluează 1:500 la folosire.
2. Soluţie etalon KCl: 1,91 g KCl, 5 ml formaldehidă 40% şi apă bidistilată ad 1000
ml. Soluţia conţine 1mg K/ml şi se diluează 1:100 în momentul folosirii.

Tehnica de lucru:
1. Dozarea se poate face pe ser sau plasmă. În primul caz decolarea cheagului
înainte de centrifugare produce o uşoară hemoliză ceea ce introduce o eroare
importantă, având în vedere că hematiile conţin de 20 de ori mai mult K+ decât
plasma. Dacă se lucrează pe plasmă, sângele se va recolta pe anticoagulant lipsit de
Na+ şi K+ (heparinat de litiu şi amoniu) şi se vor separa hematiile în prima oră după
recoltare, altfel se obţin valori fals crescute pentru K+. Practic se recoltează 5 ml
sânge pe câteva picături de heparinat de litiu, eventual direct într-un tub de
centrifugă.
2. Diluţiile serului sau ale plasmei variază în funcţie de aparat. Diluţiile se aleg în
funcţie de curba de etalonare utilizată (făcută cu soluţiile etalon). Se recomandă ca
diluţiile să se facă cu foarte mare grijă, iar pentru măsurarea apei bidistilate se
recomandă folosirea unei biurete, în acest caz eroarea de măsurare a volumului
fiind constantă.
Practic, se poate proceda în felul următor: se introduc 0,1 ml ser într-un
flacon de material plastic şi se adaugă 9,9 ml apă bidistilată dintr-o biuretă de 10
ml. Se agită bine. Se ia 1 ml din această soluţie (1:100), se introduce în alt flacon şi
se adaugă 4 ml apă bidistilată din biuretă. Se obţine astfel diluţia de 1:500.
Pentru adaptarea ultramicroanalitică se iau 50 μl ser şi 4,95 ml apă pentru diluţia
1:100. Din aceasta se ia 1 ml şi se adaugă 4 ml apă (diluţia 1:500).

70
VII.2.3. DOZAREA CALCIULUI

Calciul se află în plasmă sub mai multe forme:


- legat de proteine (nedifuzabil, nedializabil) în proporţie de aproximativ 45 % care
reprezintă forma de transport;
- ionizat, în proporţie de 48 %;
- dializabil (difuzabil, ultrafiltrabil), neionizat, în proporţie de 3-4 %;
- neidentificabil 3 %.
Forma ionizată a calciului reprezintă fracţiunea activă fiziologic,
concentraţia sa reprezentând stimul specific pentru secreţia de parathormon şi
calcitonină.
Ionul de calciu (Ca2+) intervine în procesul de excitabilitate neuromusculară
(pacienţii cu hipocalcemie prezintă fasciculaţii musculare datorită scăderii
concentraţiei calciului la nivelul joncţiunilor nervoase).
Calciul ionic variază invers proporţional cu pH-ul, acidoza creşte gradul de
ionizare al calciului şi scade calciul legat de proteine. Calciul ionic intervine, de
asemenea, în procesul de coagulare şi fibrinoliză.
Aproximativ 99% din calciu este fixat în organism în oase şi dinţi sub formă
de apatite hidroxilice şi carbonice, având rol în menţinerea calcemiei.
Valori normale: 9-11 mg/dl (4,5 – 5,5 mEq/l)

Variaţii patologice:
Hipercalcemie:
- hiperparatiroidism (datorită mobilizării calciului de la nivel osos);
- nefropatii cronice (datorită deficitului de eliminare);
- mielom multiplu şi toate procesele cu osteoliză activă;
- hipervitaminoza D.

Hipocalcemie:
- hipoparatiroidism;
- rahitism;
- tetanie;
- hipovitaminoza D;
- subnutriţie.

Determinarea calciului seric cu glioxal-bis(2-hidroxianil) (GBHA)

Principiu:
Glioxal-bis(2-hidroxianil) formează cu ionii de calciu, în mediu metanolic
alcalin, un complex colorat a cărui absorbţie de lumină, măsurată la o lungime de
undă de 530-550 nm, este direct proportională cu concentraţia calciului seric.

71
Reactivi:
1. soluţie metanolică de GBHA 0,075 %;
2. hidroxid de sodiu 0,25 N;
3. soluţie standard de calciu (10 mg/dl).

Pregătirea materialului:
Probele de ser clare, nehemolizate pot fi analizate fără deproteinizare şi
diluţie folosind 20 µl (microprobe). Dacă nu avem la îndemână micropipete sau
serul este tulbure sau hemolizat, se face fie diluţie, fie deproteinizare în următorul
mod: la 0,10 ml ser se adaugă 2,40 ml apă distilată sau 0,10 ml metanol.
În situaţia în care se utilizează diluţia, analiza se efectuează în continuare pe un
volum de 0,50 ml. Proba tratată cu metanol se introduce pentru deproteinizare
3 minute într-o baie de apă la fierbere, apoi se adaugă 2,40 ml HCl 0,005 N şi se
păstrează în continuare pe baia de apă încă 5 minute la fierbere. Proba fierbinte se
centrifughează timp de 3 minute la 4000 de rotaţii/minut şi se continuă apoi analiza
pe un volum de 0,50 ml, supernatant, măsurat la temperatura camerei. La fel se va
proceda şi cu eprubetele standard şi martor care se consideră a fi diluat.

Tehnica de lucru:
În 3 eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 1):

Tabel 1. Tehnica dozării calciului


Reactivi (ml) Proba Standard Martor
Apa distilata 0,50 0,50 0,52 0,50
Microprobe/probe diluate 0,02 0,50 - - - -
Standard - - 0,02 0,50 - -
GBHA 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Omogenizare după care se adaugă repede
Hidroxid de sodiu 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

Eprubetele bine agitate sunt lăsate la temperatura camerei în repaus, apoi la


5-15 minute de la adăugarea soluţiei de hidroxid de sodiu se măsoară extincţia
probei şi a standardului faţă de martor la 540 nm.

Calcul:
Ca2+ (mg/dl) = Ep/Es x 10

72
VII.2.4. DOZAREA MAGNEZIULUI

Magneziul (Mg2+) este un cation localizat predominant intracelular.


Peste 300 de sisteme enzimatice sunt influenţate de magneziu. El îndeplineşte un
rol important în metabolismul intermediar al glucidelor, lipidelor şi proteinelor şi
favorizează absorbţia calciului, potasiului, fosforului şi sodiului. Reducerea
concentraţiei magneziului extracelular provoacă modificări ale permeabilităţii de
membrană. Magneziul seric se găseşte în concentraţie de 1,8 - 2,9 mg/dl.
Aproximativ 30% din magneziul ingerat este absorbit la nivelul intestinului subţire
şi distribuit ţesuturilor în mod activ.
Există variate metode de dozare a magneziului în lichidele biologice.
Determinarea prin spectrofotometrie de absorbţie atomică este specifică şi foarte
sensibilă. Determinarea prin fotometrie de flacără este posibilă doar cu anumite
tipuri de aparate, iar exactitatea nu este suficient demonstrată. Tehnicile bazate pe
precipitarea Mg2+ ca fosfat de magneziu şi amoniu sau cu 8-hidroxi-chinoleina sunt
nespecifice şi laborioase. Metodele care se bazează pe formarea unui colorant roşu
de către Mg2+ şi galben de titan prezintă dezavantajul instabilităţii culorii obţinute
şi a specificităţii insuficiente. Metoda complexonometrică este privită cu rezervă.
Metoda fluorometrică este specifică, sensibilă şi rapidă, însă necesită aparatură
specială. Metoda de elecţie în această situaţie este cea care utilizează colorantul
Mann şi Yoe, reactiv de culoare specific pentru magneziu, care prezintă avantajul
sensibilităţii şi rapidităţii.

Metoda cu galben de titan

Principiu:
În soluţie puternic alcalină, magneziul din ser formează particule coloidale
de Mg(OH)2. Colorantul galben de titan este adsorbit pe aceste particule şi
formează un complex colorat în roşu care este apoi stabilizat cu alcool polivinilic şi
dozat spectrofotometric la 540 nm.

Reactivi:
1. Soluţie stoc galben de titan. Se dizolvă 0,5 g galben de titan în 100 ml apă
bidistilată. Reactivul este stabil şi se păstrează în sticle de polietilenă.
2. Reactiv galben de titan (soluţie de lucru). Se diluează 2 ml din soluţia stoc la 100
ml cu apă bidistilată. Se prepară proaspăt de fiecare dată.
3. NaOH 7,5 %.
4. Reactiv alcool polivinilic: se dizolvă 1g alcool polivinilic în 400 ml apă
bidistilată, încălzindu-se uşor. Se răceşte şi se aduce la 1000 ml cu apă bidistilată.
Soluţia este stabilă şi se păstrează în sticle de polietilenă.
5. Standard de Mg2+ (soluţie stoc). Se dizolvă 8,358 g MgCl2·6H2O sau 8,8178 g
Mg(CH3COO)2·4H2O în apă distilată şi se aduce volumul la 1000 ml.

73
6. Standard de lucru. Se diluează 1 ml din soluţia precedentă la 200 ml cu apă
distilată. Se prepară de preferinţă proaspătă. Această soluţie conţine 5 μg ioni de
Mg/ml.

Tehnica de lucru:
Se pregătesc 4 eprubete pentru probă, proba martor şi două probe standard
(standard 1 şi standard 2), în care se adaugă reactivii conform următorului tabel:

Tabel 2. Tehnica dozării magneziului


Reactivi (ml) P M S1 S2
Apă bidistilată 2,8 3 2 1
Ser 0,2 - - -
Standard de lucru - - 1 2
Alcool polivinilic 0,5 0,5 0,5 0,5
Reactiv galben de titan 0,5 0,5 0,5 0,5
NaOH 7,5% 1 1 1 1

După 5 minute se citesc extincţiile probei şi ale probelor standard la 540 nm


faţă de proba martor. Coloraţia este stabilă o oră.

Calcul:
Pentru calcul se foloseşte standardul a cărui extincţie este cea mai apropiată
de extincţia probei de analizat.

Pentru standardul 1:
Ep/Es1 x 0,005 x 100/0,2 = mg Mg2+/100 ml
Ep/Es x 2,5 = mg Mg2+/100ml

Pentru standardul 2:
Ep/Es2 x 0,01 x 100/0,2 = mg Mg2+/100ml
Ep/Es x 5 = mg Mg2+/100ml

Valori normale: 1,8 - 2,9 mg/100ml (1,5 - 2,4 mEg/l)

Variaţii patologice:
Hipomagnezemia apare în:
- rahitism;
- tetanie;
- alcoolism;
- hiperaldosteronism;
- hipotiroidism;
- malabsorbţie.

74
Hipermagnezemia este întâlnită în:
- ciroze grave;
- insuficienţă renală;
- hipertiroidii;
- deshidratări;
- sindrom Cushing.

VII.2.5. DOZAREA FIERULUI SERIC

Organismul adult conţine 4-5 g de fier din care aproximativ 75 % intră în


structura hemoproteinelor (hemoglobina, mioglobina, enzime heminice), acestea
reprezentând forma funcţional activă a fierului. Aproximativ 25 % din fierul
organismului repezintă forma de stocare, legată de proteine în feritină şi
hemosiderină. Mai puţin de 1% din fierul organismului se găseşte în plasmă şi în
lichidul interstiţial legat de transferină (proteina transportoare).

Dozarea fierului seric prin Metoda Heilmeyer modificată

Principiu:
Serul de analizat se tratează cu acid clorhidric pentru a se elibera Fe3+ din
cadrul complexului Fe-transferină şi se precipită proteinele cu acid tricloracetic.
În filtrat trece Fe3+ care este redus cu hidrochinona la Fe2+. Fierul redus formează cu
o-fenantrolina un complex de culoare roşie care poate fi dozat prin spectrofometrie.

Reactivi:
1. HCl 1 N
2. Sol. Acid tricloracetic 20%
3. Sol. Hidrochinonă 2% (proaspăt preparată)
4. Sol. de o-fenantrolină clorhidrică 1% (se acidulează cu 2-3 picături de HCl
concentrat)
5. Sol. semisaturată de acetat de sodiu (se diluează o soluţie saturată în
proporţie de 1:1)
6. Sol. standard de fier 10 mg%: 0,0497 g FeSO4·7H2O la 100 ml apă
bidistilată
7. Sol. standard de lucru: se diluează 1 ml sol. standard stoc la 100 ml cu apă
bidistilată (1 µg Fe2+/ml).

Tehnica de lucru:
Se ia o eprubetă de centrifugă pentru probă şi 2 eprubete obişnuite pentru
martor şi standard, în care se introduc următorii reactivi conform tabelului de mai
jos (Tabelul 3):

75
Tabel 3. Tehnica dozării fierului
Reactivi (ml) Proba Martor Standard
Ser 2 - -
Apă distilată - 2 -
Sol. Standard (1µg Fe/ml) - - 2
HCl 1N 1 1 1
Proba se agită puternic, apoi 10 min. repaus
Acid tricloracetic 20 % 2 2 2
Proba se centrifughează la 3500 rpm Din acest amestec se scot:
Supernatant 2 2 2
Hidrochinonă 2 % 0,2 0,2 0,2
Sol. o-fenantrolină 1 % 0,1 0,1 0,1
Sol. semisat. de acetat de sodiu 2 2 2

Eprubetele se agită şi după 5 minute se citeşte extincţia pentru probă şi


standard în cuve de 1 cm la λ=510 nm faţă de martor.

Calcul:
µg Fe2+/100ml = Ep/Es x 100

Valori normale:
Femei = 80-130 µg/100 ml ser
Bărbaţi = 90-160 µg/100 ml ser

Variaţii patologice:
Hipersideremia: apare în anemia Biermer, anemii şi ictere hemolitice, hepatite
severe.
Hiposideremia: este întâlnită în anemii hipocrome, posthemoragice, feriprive, dar şi
în avitaminoze, tumori maligne, malabsorbţie, nefropatii cronice, infecţii cronice
etc.

VII.2.6. DOZAREA CLORULUI

Clorul (anionul clorură Cl-) este principalul anion al lichidelor extracelulare.


Alături de Na+ contribuie la realizarea presiunii osmotice şi a izotoniei
extracelulare. De asemenea, intervine în reglarea echilibrului acido-bazic prin
participarea la schimburile ionice tubulare de la nivelul nefronului unde contribuie
la reţinerea ionilor HCO3-
Clorul, principalul anion al plasmei, poate fi dozat prin titrare cu azotat de
mercur sau de argint, prin metode colorimetrice sau potenţiometrice.

76
Procedeul titrimetric Schales şi Schales

Principiu:
Ionii de clor sunt determinaţi prin titrare în mediu acid (pH < 3) cu azotat
mercuric cu care formează clorura mercurică nedisociată. Câtă vreme sunt prezenţi
ionii de clor, ionii de Hg+2 reacţionează pentru a forma HgCl2. La punctul final ionii
de Hg+2 în exces reacţionează cu indicatorul (difenilcarbazona) dând o coloraţie
violetă.

Tehnica de lucru:
Se introduc în 2 pahare Erlenmeyer de 25 ml următoarele soluţii (Tabelul 4):

Tabel 4. Tehnica dozării clorului


Reactivi (ml) Proba Standard
Ser 0,1 -
Standard clorură - 0,1
Sol. H2SO4 1 pic. 1 pic.
Apă distilată 1 1
Difenilcarbazona 2 pic. 2 pic.

Se agită uşor pentru amestecarea componentelor şi se titrează cu o soluţie de


azotat de mercur 0,01N până la prima apariţie a unei culori violete, dar persistente.
Se notează volumul de soluţie în ml.

Reactivi:
1. Soluţia de azotat de Hg 0,01 N: 1,083 g de oxid roşu de mercur sunt
dizolvaţi în 11 ml HNO3 conc. şi se diluează cu apă bidistilată până la 1000 ml.
Soluţia se mai poate prepara şi din azotat mercuric din care se dizolvă 1,6 g în 10 ml
HNO3 şi cca 700 ml apă, după aceea se aduce volumul la 1000 ml.
2. Soluţia indicator difenilcarbazona 0,01 M: se prepară cât mai puţină soluţie
în proporţia: 5 mg difenilcarbazona la 2 ml metanol sau etanol 950. Se păstrează în
frigider în flacon de culoare brună de preferinţă din polietilenă şi se utilizează timp
de o lună. După această perioadă culoarea soluţiei se schimbă din portocalie-
roşietică în galbenă, iar detectarea punctului final devine dificilă.
3. Soluţia H2SO4 conc. şi 53 părţi de apă.
4. Soluţie standard de clorură de potasiu 0,1 N: se dizolvă 7,455 g KCl (uscat
şi răcit în exicator) în apă bidistilată şi se completează cu apă la 1000 ml după care
se adaugă 1 ml cloroform. Se conservă un an la frigider, în vas de polietilenă.
5. Soluţie de wolframat de Na 10 %.

Calcul:
Fiecare ml soluţie azotat mercuric corespunde la 0,01 echivalenţi de clor.

mEg Cl-/l = (1000 x ml azotat mercuric x 0,01) / 0,1

77
sau:
ml azotat mercuric x 100 = mEg/l azotat mercuric
ml azotat mercuric x 586 = mg NaCl/100ml
ml azotat mercuric x 354,5 = mg Cl-/100 ml
Această formulă este valabilă dacă la titrarea soluţiei de KCl s-a folosit 1 ml
azotat mercuric.
Dacă acest volum diferă de 1 ml se va utiliza formula:
mEg Cl-/l = [ml azotat mercuric (proba) / ml azotat mercuric (standard)] x 100

Dozarea clorului globular şi plasmatic


Raportul clor globular/plasmatic nu aduce decât puţine date practice,
notându-se o creştere a raportului în acidoză şi o scădere în alcaloză. Folosind
metoda Schales şi Schales se procedează în felul următor:
1. Se determină hematocritul şi se notează cu g valoarea în procente a
elementelor figurate şi cu p valoarea în procente a volumului plasmei.
2. Se determină clorul plasmatic folosind volumul de lucru indicat la ser,
luând însă în loc de ser 0,1 ml plasmă.
3. Se determină clorul total luând următoarele cantităţi: 0,4 ml sânge total, 3,2
ml apă distilată, 0,2 ml acid sulfuric 2/3N, 0,2 ml wolframat de sodiu, se amestecă
bine şi se centrifughează. Se transferă 2 ml din supernatantul clar într-un pahar
Erlenmeyer pentru titrare, se adaugă 2 picături indicator difenilcarbazona şi se
efectuează titrarea. La exprimarea rezultatului se va înmulţi numărul de ml de azotat
mercuric utilizaţi numai cu 50 în loc de 100 fiindcă 2 ml supernatant corespund la
0,2 ml sânge.
4. Se calculează acum valoarea clorului globular după formula:

Cl- globular = (Cl- total x 100) – (Cl- plasmatic x p) / g


Raportul eritroplasmatic va fi: clor globular / clor plasmatic.

Valori normale:
- clor plasmatic: 355-375 mg%; 100-105 mEg/l;
- clor globular: 180 mg%; 0-52 mEg/l;
- raport eritroplasmatic: 0,50 – 0,52.

Variaţii patologice :
Hipercloremii:
- acidoze metabolice;
- aport crescut de cloruri (când rinichiul are o funcţie deficientă);
- în afecţiuni care reduc eliminările de cloruri (nefropatii interstiţiale, acidoza
tubulară renală, intoxicaţii).
Creşterea raportului Cl- globular/Cl- plasmatic se întâlneşte în nefrite cronice cu
azotemie crescută.

78
Hipocloremii:
- diaree;
- vărsături;
- administrări îndelungate de medicamente diuretice;
- insuficienţe renale cronice şi acute.

VII.2.7. FOSFORUL

În ser fosforul se găseşte sub următoarele forme:


1. Combinat cu proteinele (în nucleoproteine şi fosfoproteine)
2. Sub formă solubilă în acid, caz în care în urma deproteinizării trece în filtrat:
- fosfaţi anorganici (80% HPO42- şi 20% H2PO4-);
- fosfaţi organici (nucleotide, nucleozidtrifosfaţi, triozofosfaţi, creatinfosfat).
3. Fosfolipide: lecitine, cefaline, sfingomieline
Fosforul intervine în numeroase procese metabolice cu importanţă majoră
pentru organism:
- mineralizarea oaselor (alături de calciu);
- menţinerea echilibrului acido-bazic (sistemul tampon al fosfaţilor);
- intervine în sinteza compuşilor macroergici celulari (ATP, GTP, creatin-fosfat,
etc.), a unor intermediari din metabolismul glucidic şi lipidic, acizilor nucleici şi a
unor enzime (NAD +, FAD, FMN etc.).
Concentraţia fosfatului seric constitue un indicator al metabolismului osos,
al funcţiei glandelor paratiroide şi a rinichiului.

Dozarea fosforului seric dupa deproteinizare (Metoda Briggs)

Principiu:
Se precipită proteinele cu acid tricloracetic, apoi din filtrat, fosfatul
anorganic împreună cu molibdatul de amoniu, în mediu acid, formează
fosfomolibdatul de amoniu (un precipitat de culoare galbenă). Ulterior acesta este
redus la albastru de molibden, solubil în apă, care se măsoară spectrofotometric la o
lungime de undă de 660 nm.

Reactivi:
1. Sol. acid tricloracetic 20 %.
2. Sol. molibdat de amoniu: 25 g molibdat de amoniu se dizolvă în 300 ml apă
distilată, se adaugă 75 ml acid sulfuric conc. şi se completează la 500 ml cu apă
distilată.
3. Sol. hidrochinonă 1% : 1 g hidrochinonă se dizolvă în 60 ml apă distilată cu o
picătură de acid sulfuric concentrat şi se completează cu 100 ml apă distilată.
Soluţia se poate păstra câteva zile la frigider.
4. Sol. sulfit de sodiu 20% (Na2SO3·7H2O). Se prepară în momentul întrebuinţării.

79
5. Sol. stadard stoc PO43- = 0,1 P mg/ml : se cântăresc 0,493 g KH2PO4, se dizolvă
în 1000 ml apă distilată în balon cotat.
6. Sol. standard de lucru (10µg P/ml): se diluează 10 ml sol. standard stoc cu 90 ml
apă distilată, în balon cotat de 100 ml.

Tehnica de lucru:
La 2 ml ser sau plasmă se adaugă 4 ml apa distilată şi 4 ml soluţie acid
tricloracetic 20%. Se agită pentru amestecare, se lasă în repaus 20 minute după care
se centrifughează sau se filtrează. După această operaţie, se pregătesc 3 eprubete în
care se introduc următorii reactivi (Tabelul 5):

Tabel 5. Tehnica dozării fosforului


Reactivi (ml) Proba Standard Martor
Supernatant (sau filtrat) 5 - -
Sol.standard de lucru (µg/ml) - 3 -
Apă distilată - 2 5
Soluţie molibdat de amoniu 1 1 1
Soluţie sulfit de sodiu 1 1 1
Soluţie hidrochinonă 1 1 1
Apă distilată 2 2 2

Se agită pentru omogenizare conţinutul fiecărei eprubete şi după 30 de minute se


citesc extincţia probei de analizat şi a eprubetei standard faţă de martor la o lungime
de undă de 660 nm.

Calcul:
Ep/Es x 3 = mg P/100 ml ser

Valori normale:
- adulţi: 3,5-5 mg/100 ml ser;
- copii: 4-7 mg /100 ml ser

Variaţii patologice:
Hiperfosfatemie:
- hipoparatiroidism;
- acromegalie, gigatism;
- hipervitaminoza D;
- insuficienţă renală acută şi cronică;
- leucemie.

Hipofosfatemie:
- hiperparatiroidism;
- hipovitaminoza D (rahitism si osteomalacie).

80
Probleme:

1. Deshidratările izotone:
a. Sunt rezultatul pierderilor concomitente şi echilibrate de apă şi electroliţi
b. Pot fi produse de hemoragii acute
c. Duc la instalarea hipovolemiei
d. Toate răspunsurile sunt corecte
e. Nici o variantă de răspuns nu este corectă

2. Hipercalcemia apare în:


a. Tetanie
b. Hipovitaminoza D
c. Hiperparatiroidism
d. Nici o variantă de răspuns nu e corectă

3. Hiponatremia apare în:


a. Hiperaldosteronism
b. Corticoterapie
c. Arsuri extinse
d. Toate variantele de răspuns sunt corecte

81
LUCRAREA 5

VIII. AMINOACIZII. REACŢII DE IDENTIFICARE

Aminoacizii constituie unitatea de bază care intră în structura tuturor


proteinelor. Un aminoacid este format din următoarele unităţi structurale legate de
carbonul α:
- o grupare amino (-NH2);
- o grupare carboxil (-COOH);
- un atom de hidrogen (-H);
- un radical R (specific fiecărui aminoacid).

Cei patru substituenţi diferiţi la carbonul α conferă activitate optică


aminoacizilor (excepţie glicina unde R = H) putând exista în două forme: dextrogir
(D) şi levogir (L). Aminoacizii care intră în structura proteinelor numiţi aminoacizi
naturali (20 ca număr) aparţin seriei L.
În stare cristalină, dar şi în soluţie apoasă, aminoacizii se află sub formă de
ioni dipolari (amfioni, zwitterioni) datorită prezenţei în moleculă a celor două
grupări funcţionale cu caracter acid (-COOH) şi bazic (-NH2). Aşadar în soluţie
apoasă se comportă atât ca acid, cât şi ca bază datorită caracterului amfoter:

R R
│ + │
H2N—C—COOH H3N—C—COO−
│ │
H H

H3N+-R-COO- + HO- ↔ H2N-R-COO- + H2O (acid)

H3N+-R-COO- + H+ ↔ H3N+-R-COOH (bază)

82
Identificarea aminoacizilor se bazează pe următoarele tipuri de reacţii de
culoare:
- reacţii generale datorate grupărilor funcţionale ale aminoacizilor: carboxil şi
amino;
- reacţii datorate radicalilor din molecula aminoacizilor şi care sunt, de obicei,
specifice pentru aminoacizii care au radical diferit.

VIII.1. REACŢII DE IDENTIFICARE A AMINOACIZILOR


DATORATE GRUPǍRII AMINO

VIII.1.1. Reacţia ninhidrinei

Reacţia ninhidrinei constituie o reacţie de grup pentru compuşii cu grupări


aminice libere (culoare albastră) şi proteine (culoare violetă). Prin încălzirea
soluţiei unui aminoacid în prezenţa ninhidrinei are loc iniţial o dezaminare
oxidativă şi o decarboxilare a aminoacidului. Se formează astfel o aldehidă, NH3 şi
CO2. Ninhidrina este redusă la hidridantină şi în etapa următoare are loc
condensarea unei molecule de ninhidrină cu hidridantină şi NH3, cu formarea unui
complex albastru–violet.
Reacţia are o mare sensibilitate, de aceea poate fi utilizată la evidenţierea
aminoacizilor separaţi prin cromatografie, evidenţierea eliminării urinare crescute a
aminoacizilor, dozarea proteinelor pe baza intensităţii culorii formate sau a
măsurării CO2 obţinut în reacţie.

O O
OH -
H
+ R - CH - COO + R - CH = O + CO2 + NH3
OH + OH
NH3
O O
O O O HO
OH H
+ NH3 + N
OH OH
O O O O

83
VIII.2. REACŢII DE IDENTIFICARE A AMINOACIZILOR
DATORATE GRUPǍRII CARBOXIL

VIII.2.1. Reacţia cu ionii de cupru (Cu2+) în mediu alcalin


Aminoacizii formează cu Cu2+ în mediu alcalin un complex colorat în albastru.

COOH COO H2N


+2
2 R - CH - NH2 + Cu R - CH Cu HC - R
NH2 OOC

Tehnica de lucru:
Peste soluţia unui aminoacid se adaugă NaOH pentru alcalinizare, după care
se adaugă o soluţie de CuSO4. Se observă apariţia unei coloraţii albastre. Această
reacţie este utilizată şi la dozarea spectrofotometrică a unui aminoacid.

Determinarea concentraţiei unei soluţii de aminoacid


Aminoacizii formează cu ionii de cupru bivalenţi, în mediu alcalin un
complex chelat albastru care prezintă maxim de extincţie la o lungime de undă de
620 nm.

Reactivi :
1. Soluţie de aminoacid de concentraţie necunoscută;
2. Soluţie standard de alanină (40 nM);
3. Suspensie Cu3(PO4)2.

Tehnica de lucru:
Deoarece reactivul de culoare este el însuşi colorat este necesară prepararea
unui martor. Conversia extincţiei în concentraţie se va face pe seama unei curbe de
etalonare efectuate cu o soluţie standard de alanină (Tabelul 1).

Tabel 1. Tehnica determinării concentraţiei unei soluţii de aminoacid


Reactivi 1 2 3 4 5 P M
Soluţie de aminoacid - - - - - 5 -
Soluţie standard de 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml - -
alanină
Apă distilată 4 ml 3 ml 2 ml 1 ml - - 5 ml
Concentraţia în mM 8 16 24 32 40 ? 0
alanină

Se agită eprubetele şi după 5 minute se centrifughează 5 minute la 4000


rpm. Se citesc extincţiile la 620 nm în cuva de 1 cm. Extincţia probei se va converti
în concentraţie prin interpolare grafică. Această metodă se poate folosi la urmărirea
vitezei de hidroliză a unei proteine sau gradului de conversie a unui aminoacid.

84
VIII.3. REACŢII DE IDENTIFICARE A AMINOACIZILOR
DATORATE RADICALULUI R

VIII.3.1. Reacţia xantoproteică


Această reacţie este specifică pentru aminoacizii aromatici cum ar fi:
tirozina, fenilalanina şi triptofanul.
Proteinele care conţin aminoacizi aromatici formeză nitroderivaţi de culoare
galbenă portocalie în prezenţa HNO3 şi alcalinizarea ulterioară.

O2N
2HNO3
HO CH2 - CH - COOH HO CH2 - CH - COOH
2H2O
NH2 NH2
O2N

Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. HNO3 conc.
3. NH4OH conc.

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se iau 2 – 3 ml soluţie proteică la care se adaugă
aproximativ 1 ml HNO3 conc. Se constată apariţia unui precipitat alb. Se fierbe 1-2
minute, se răceşte şi se adaugă NH4OH (2 ml) până la apariţia unui precipitat
galben portocaliu.

VIII.3.2. Reacţia Millon


Este specifică pentru tirozină. În prezenţa reactivului Millon (azotat şi azotit
de mercur în mediu de HNO3), soluţia de tirozină formează prin încălzire o culoare
roşie. Proteinele formează în aceste condiţii un precipitat alb care, prin încălzire
uşoară (600C), devine roz.

ON

HO CH2 - CH - COOH HO CH2 - CH - COOH


NH2 NH2
reactiv
Millon
HO - N
Hg
O CH2 - CH - COOH O CH2 - CH - COOH
NH2 NH2

85
Reactivi:
1. Soluţie de tirozină 1 g% sau soluţie apoasă de proteine;
2. Reactiv Millon (5g Hg + 10 ml HNO3 + 30 ml apă distilată).

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se iau 2 ml soluţie proteică şi se adaugă 0,5 ml reactiv
Millon. Se observă apariţia unui precipitat alb. Se încălzeşte eprubeta la 50-600C
după care precipitatul devine roz.

VIII.3.3. Reacţia Adamkiewicz-Hopkins


Este specifică pentru triptofan. Proteinele conţinând triptofan reacţionează
cu acidul glioxilic în mediu de H2SO4 conc. şi formează o culoare violetă. Reacţia
are aplicabilitate la evidenţierea triptofanului din lichidul cefalorahidian.

HOOC COOH
H2N - CH CH - NH2

- CH2 - CH - COOH CH2 CH2

NH2 + OHC - COOH


N H2O
H CO2 N N
H H

Reactivi :
1. Soluţie proteică concentrată
2. Acid acetic glacial
3. H2SO4 conc.

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se iau 1-2 ml soluţie proteică concentrată, se adaugă 0,5 ml
acid acetic glacial şi se lasă să se prelingă pe pereţii eprubetei 0,5-1 ml H2SO4
conc. La limita de separare apare un inel violaceu.

86
VIII.3.4. Reacţia Sakaguchi
Este specifică pentru arginină. Datorită restului guanidinic, arginina
reacţionează cu α-naftolul în prezenţa hipobromitului de sodiu şi formează o
coloraţie roşie.

O
HN = C - NH2 HN = C - N
OH Br
NH NH O
NaOBr
(CH2)3 + 2 (CH2)3
CHNH2 CHNH2
COOH COOH

Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Soluţie de hipobromit de sodiu (1 ml NaOH 33% + 2 picături de apă de brom);
3. Soluţie α-naftol 0,1 N;
4. NaOH 10%

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se ia 1 ml soluţie proteică diluată, se alcalinizează cu 1 ml
NaOH 10%, apoi se adaugă 1 ml α-naftol şi hipobromit de sodiu, picătură cu
picătură, până la apariţia unei coloraţii vişinii, care indică prezenţa argininei sau a
compuşilor cu grupări guanidinice. La încălzire culoarea dispare.

VIII.3.5. Reacţia Erlich-Pauli


Este specifică pentru histidină. Histidina şi tirozina în prezenţa acidului
diazobenzensulfonic formează o coloraţie roşie-portocalie. Reacţia este dată şi de
fenoli şi amine.

N CH2 - CH - COOH
+
NH2 + 2[N N SO3H + N2CO3
N
H
NH2
CH2 - CH - COOH
N
NaO3S N =N N =N SO3Na
N
H

87
Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Acid sulfanilic (5 g la 1000 ml apă distilată);
3. Na2CO3 5 g%;
4. NaNO2 2-3 g%.

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se tratează 1 ml acid sulfanilic cu 2 ml NaNO2 pentru a
forma acid diazobenzensulfonic. Se adaugă 1 ml soluţie proteică diluată şi 3-4 ml
Na2CO3. Se obţine o culoare portocalie care se intensifică la încălzire.

VIII.4. REACŢII SPECIFICE AMINOACIZILOR CU SULF


Aminoacizii cu sulf din proteine, prin încălzire cu hidroxizi alcalini
formează sulfura de sodiu, care în prezenţa sărurilor de plumb formează un
precipitat negru de sulfură de plumb.

CH2SH CH2OH
CH - NH2 + 2NaOH CH - NH2 + Na2S + H2O
COOH COOH

Na2S + Pb(OOCCH3)2 PbS + 2CH3COOH

Reactivi:
1. Soluţie proteică concentrată;
2. NaOH 10%;
3. Pb(CH3-COO)2 soluţie saturată.

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se iau 3 ml soluţie proteică concentrată şi acelaşi volum de
NaOH 10%. După o fierbere de 3 – 5 minute se adaugă acetat de plumb şi se fierb
din nou. Se obţine un precipitat de sulfură de plumb de culoare neagră.

Aminoacizii care conţin în moleculă grupări -SH se pot doza


spectrofotometric cu acid 5,5’ ditio-bis-2-nitrobenzoic (DTNB). Datorită grupei
SH pe care o conţine, cisteina reacţionează cu DTNB-ul, formând un produs colorat
în galben care se determină spectrofotometric la 412 nm.

88
HOOC

O2N S
+ HS - CH2 - CH - COOH

O2N S NH2

HOOC
HOOC

O2N S - S - CH2 - CH - COOH


NH2
O2N SH

HOOC

Reactivi:
1. Soluţie de clorhidrat de cisteină 0,2 mM în tampon fosfat 0,05 M, pH 7,4;
2. Soluţie DTNB (0,0149 g DTNB se dizolvă în 130 ml tampon fosfat 0,05 M,
pH = 7,4 şi se completează la 250 ml cu etanol 95%);
3. Tampon fosfat 0,05 M, pH=7,4;
4. Soluţie proteică de analizat sau ser sanguin.

Tehnica de lucru:
Se pregătesc o serie de eprubete conform tabelului 2:

Tabel 2. Tehnica dozării aminoacizilor cu sulf


Reactivi (ml) 1 2 3 4 5 6 7
Cisteină∙HCl 0,2 mM 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 - -
Proteină - - - - - 0,1 -
Tampon fosfat 0,9 0.8 0,7 0,6 0,5 0,9 1,0
DTNB 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Se lasă 15 minute, apoi se citesc extincţiile la spectrofotometru faţă de proba


7 (martor), la 412 nm.

89
VIII.5. DOZAREA AMINOACIZILOR PRIN METODA SŐRENSEN

Principiu:
Într-o primă etapă aminoacidul formează cu formaldehida un produs ce are
gruparea aminică blocată. Aminoacidul rămâne doar cu gruparea carboxil liberă,
care conferă caracterul acid. Astfel, în a doua etapă gruparea carboxil poate fi
neutralizată cu NaOH în prezenţa fenolftaleinei.

R - CH - COOH + O = CH2 R - CH - COOH + H2O


NH2 N = CH2

R - CH - COOH + NaOH R - CH - COONa + H2O


N = CH2 N = CH2

Reactivi:
1. Soluţie de aminoacid de concentraţie necunoscută;
2. Soluţie aldehidă formică 10% neutralizată cu NaOH în prezenţa fenolftaleinei;
3. HCl 1%;
4. NaOH 0,1N.

Tehnica de lucru:
a) Pregătirea martorului:
Deoarece aminoacizii formolizaţi sunt acizi slabi, sărurile lor cu hidroxizii
alcalini hidrolizând puternic, pentru a putea fi dozaţi se împiedică hidroliza prin
titrare la un pH alcalin (9-9,5). Din această cauză este necesară pregătirea unui
martor şi supratitrarea probei până la culoarea martorului. Astfel, într-un pahar
Erlenmeyer se fierb 20 ml apă distilată, se adaugă 10 ml aldehidă formică
neutralizată, 10 picături fenolftaleină şi 0,4 ml NaOH 0,1 N, măsuraţi cu biureta. Se
obţine o culoare violetă.
b) Dozarea solutiei de aminoacid:
Într-un pahar Erlenmeyer se introduc 10 ml soluţie de aminoacid, se adaugă
NaOH 0,1 N (sau HCl 1%) până se obţine o culoare slab roz. Se adaugă 10 ml
aldehidă formică neutralizată şi se titrează cu NaOH 0,1 N până când se obţine
intensitatea de culoarea martorului. Se notează cu N, numărul de mililitri de NaOH
utilizaţi la titrare.

Calcul:
C – concentraţia aminoacidului, exprimată în mg glicocol/l soluţie
7,5 – echivalentul glicocolului
0,4 – reprezintă ml NaOH 0,1 N adăugaţi martorului şi respectiv ml NaOH 0,1 N
cu care s-a supratitrat proba.

90
( N  0,4) x7,5 x1000
c mg glicocol/ 1000ml solutie
10

Această metodă se utilizează la dozarea aminoacizilor din urină, când în probă se


introduc 10 ml urină în locul soluţiei de aminoacid, iar restul reactivilor se adaugă
după reţeta de mai sus.
Pentru calculul aminoacizilor prezenţi în proba de urină se foloseşte următoarea
formulă de calcul:

N amoniacal = ( N-0,4 ) x 0,0014 x 100g/1000 ml

unde:
N – ml NaOH 0,1 N cu care s-a supratitrat proba prin aducere la intensitatea de
culoare a martorului;
0,0014 – echivalentul azotului.

Interpretarea rezultatelor:
În mod normal cantitatea de aminoacid eliminată în 24 de ore variază între
50-500 mg azot, ceea ce reprezintă aproximativ 2 g acizi aminaţi liberi sau legaţi.
Aproximativ 70% din această valoare este reprezentată de taurină, glicocol,
histidină, metilhistidină şi variază cu regimul alimentar şi vârsta.
Variaţii patologice se înregistrează în afecţiuni hepatice, diabet grav, acidoză,
cancer.

GOODWIN a pus la punct o metodă mai nouă de determinare a


aminoacizilor, fiind utilizată la dozarea acestora din plasmă şi urină. Metoda constă
în reacţia aminoacizilor cu 2,4-dinitrofluorbenzen, mai exact în reacţia grupării
aminice a aminoacidului în mediu alcalin cu 2,4-dinitrofluorbenzen.

F
NO2
NO2
+ H2N - CH - R O2N NH - CH - R
COOH COOH
NO2

Reactivi:
1. Indicator: 100 mg fenolftaleină se dizolvă în 100 ml etanol.
2. NaOH 200 mmol/l
3. Reactiv 2,4-dinitrofluorbenzen. Se dizolvă 650 l reactiv în 50 ml acetonă.
Se poate păstra 2 luni la 40C.
4. Na2B4O7 132 mmol/l (50 g Na2B4O7 x 10H2O se dizolvă într-un litru apă).
Se prepară înainte de utilizare.

91
5. Soluţie de 2,4-dinitrofluorbenzen de lucru. Înainte de utilizare se prepară o
soluţie de 2,4-dinitrofluorbenzen prin diluarea soluţiei stoc. Astfel un volum din
soluţia stoc se diluează cu 9 volume de tetraborat de sodiu.
6. HCl în dioxan. 2 ml acid clorhidric concentrat se diluează cu 100 ml dioxan.
7. Soluţie standard stoc de aminoacid 20 mmol/l. Se dizolvă 1,471 g acid glutamic
şi 0,751 g glicină în 100 ml apă, la care se adaugă 2 g benzoat de sodiu şi 700 ml
HCl 1 mol/l, apoi aducem cu apă distilată la 1 litru.
8. Soluţie standard de aminoacid de lucru. Se diluează 1, 2, respectiv 4 ml din
soluţia standard stoc de aminoacid la 10 ml cu apă rezultând soluţii ce conţin 2, 4,
respectiv 8 mmol aminoacid/l.

Tehnica de lucru:
Într-un pahar de 100 ml se măsoară 1 ml urină (din urină colectată în 24 de
ore) şi se adaugă 10-15 ml apă. Se adaugă 2-4 picături indicator şi NaOH până
când soluţia devine roz. Se fierbe uşor timp de 15 minute adăugând din nou picături
de NaOH în acest timp, până ce soluţia colorată în roz nu se mai decolorează.
Dacă este necesar se adaugă apă pentru prevenirea evaporării la sec.
Se iau 3 eprubete în care se introduc următorii reactivi:
- În eprubeta ce constituie proba se adaugă 1 ml urină diluată şi 1 ml DNFB de
lucru;
- În a doua eprubetă ce constituie martorul de urină, se introduce 1 ml urină diluată
şi 1 ml tetraborat;
- În a treia eprubetă ce va conţine reactivul martor, se introduc 1 ml apă şi 1 ml
DNFB de lucru.
Eprubetele se incubează 15 minute la 700C, apoi se lasă să stea 5-10 minute
la temperatura camerei, după care se adaugă 5 ml dioxan în HCl.
Se citeşte extincţia probei, a urinei martor şi a reactivului martor la 420 nm
faţă de o soluţie ce conţine 1 ml apă şi 5 ml dioxan în HCl. Pentru pregătirea
standardului tratăm 1 ml din fiecare din cele 3 diluţii ale soluţiei standard de
aminoacid în aceleaşi condiţii ca şi urina, după care se citeşte extincţia.

Calcul:
Azot aminoacidic urinar (mmol/24h) =

Ep/Es x 20 (40 sau 80) x factorul de diluţie/1000 x volumul urinei din 24h (ml)

Probleme:

1. Indicaţi formula structurală a unui aminoacid.


2. Precizaţi tipurile de reacţii de culoare utilizate pentru identificarea
aminoacizilor (cu exemple).
3. Descrieţi reacţiile specifice aminoacizilor cu sulf.

92
LUCRAREA 6

IX. REACŢII DE IDENTIFICARE A PROTEINELOR.


PUNCTUL IZOELECTRIC

Proteinele sunt componente fundamentale ale materiei vii. Ele pot fi


clasificate după produşii rezultaţi în urma procesului de hidroliză în:
a. Holoproteine care dau prin hidroliză numai aminoacizi:
1. Fibrilare: colagen, elastină, keratine etc.
2. Globulare: albumine, globuline etc.
b. Heteroproteine care prin hidroliză dau pe lângă aminoacizi şi componente
neproteice (prostetice), de exemplu nucleoproteide, mucoproteide, fosfoproteide,
cromoproteide, metaloproteide, lipoproteide.

IX.1. REACŢII DE IDENTIFICARE A PROTEINELOR


Proteinele se identifică prin reacţii de culoare şi reacţii de precipitare.
Reacţiile de culoare, de identificare a proteinelor se suprapun cu reacţiile de
identificare ale aminoacizilor. Pe lângă reacţiile de identificare descrise la
aminoacizi, amintim reacţia biuretului şi reacţia cu -naftochinona.

IX.1.1. Reacţia biuretului


Această reacţie permite identificarea proteinelor, respectiv a compuşilor
care conţin în structura lor cel puţin două legături peptidice (-CO-NH-). Denumirea
de reacţia biuretului se datoreşte faptului că biuretul, compus obţinut din 2
molecule de uree, prin eliminarea unei molecule de amoniac la încălzire, şi care
conţine gruparea -CO-NH- repetată de două ori, dă reacţie pozitivă.
Culoarea albastră este proprie reactivului (amestec de CuSO4 şi NaOH) şi
se reţin ca pozitive doar reacţiile de culoare roz sau violetă. Astfel, biuretul dă o
culoare roz şi cu exces de CuSO4, o culoare violet – roşietică cu peptidele şi o
culoare violet – albastră cu proteinele.
Mecanismul reacţiei se poate explica prin formarea complecşilor de tip
chelaţi, complecşi ce se formează atunci când un ion metalic se combină cu un
donor de electroni, cu formarea de valenţe coordinative. În complexul format de
către biuret, peptide sau proteine, cele 4 molecule de apă legate normal de ionul
Cu+2 sunt eliminate şi înlocuite cu grupările amino.

93
O R2 H
H2N N COOH
2 N
R1 H O R3
OH R2 4NaOH
Cu(OH)2
H2 N N COOH
2 N
R1 OH R3

Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată
2. Uree cristalizată
3. Soluţie CuSO4 1g%
4. Soluţie NaOH 10%

NaOOC R3
R3-CH CH-COONa
O N N O
C C
Cu
R1 N N R1
NaO-C C-ONa
R2 R2

proteinat de cupru

Tehnica de lucru:
Reacţia se efectuează comparativ pe 3 probe: soluţie proteică, biuret şi un
martor.
Într-o eprubetă uscată se iau aproximativ 0,2 g de uree şi se încălzesc până
la topirea cristalelor, cu eliminare de amoniac, ceea ce denotă transformarea ureei
în biuret. Masa obţinută se dizolvă în 1-2 ml apă şi se adaugă acelaşi volum de
NaOH 10 % şi 2-3 picături de CuSO4. Apare o coloraţie roz-violacee.
În altă eprubetă se iau 1-2 ml soluţie proteică diluată, acelaşi volum de
NaOH 10 % şi 2-3 picături de CuSO4, apare o culoare violetă.
În eprubeta martor se iau 1-2 ml apă, acelaşi volum de NaOH 10 % şi 2-3
picături de CuSO4, apare o culoare albastră dată de Cu(OH)2.
Reacţia are o sensibilitate de 1:10000 şi este mult aplicată pentru dozarea
proteinelor prin metoda Gornall.

94
IX.1.2. Reacţia cu beta-naftochinona
Aminoacizii, peptidele şi proteinele cu grupări alfa-aminice libere se
condensează în mediu alcalin cu formarea unei coloraţii roşii sau roşie-brună.

O O OH
O R OH OH
2 + HC - NH2 +
-
COO
-
N - CH - COO
R

Cu ajutorul acestei metode se determină totalitatea grupărilor α-aminice


libere sau azotul α-aminic al serului, care este un indicator pentru cantitatea
aminoacizilor liberi, şi pe de altă parte, în cursul hidrolizei proteinelor, raportul:
N α-aminoacidic/N total constituie un criteriu de apreciere a gradului de hidroliză.

Reactivi:
1. Soluţie de aminoacizi, de peptonă şi soluţie proteică diluată;
2. Soluţie carbonat de sodiu 2%;
3. Soluţie β-naftochinonsulfonat 10 g%.

Tehnica de lucru:
Se iau în eprubete diferite câte 1 ml soluţie de aminoacid, peptonă şi soluţie
proteică diluată şi în fiecare se adaugă câte 1 ml soluţie carbonat de sodiu şi apoi cu
picătura reactivul β-naftochinonă. După scurt timp se observă în toate eprubetele
apariţia unei coloraţii roşii sau roşie-brună cu nuanţe şi intensităţi diferite în funcţie
de numărul grupărilor α-aminice libere.

IX.2. REACŢII DE PRECIPITARE A PROTEINELOR


Proteinele, datorită structurii lor pot fi separate, identificate şi dozate prin
intermediul reacţiilor de precipitare. În funcţie de natura şi concentraţia agenţilor
de precipitare se pot realiza precipitări reversibile şi ireversibile.

IX.2.1. Reacţii de precipitare reversibile


1. Precipitarea proteinelor cu săruri (salefierea)
Sub influenţa unor săruri ale metalelor uşoare ca: sulfat de amoniu, sodiu,
magneziu, clorură de sodiu se produce deshidratarea particulelor proteice care
precipită reversibil, deoarece proteinele se solubilizează din nou prin diluare sau
prin îndepărtarea sărurilor precipitante prin dializă. Metoda este aplicată la
fracţionarea proteinelor (separarea globulinelor de albumine; globulinele precipită
la semisaturare cu sulfat de amoniu, iar albuminele numai la saturare).

95
Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Soluţie saturată de sulfat de amoniu;
3. Sulfat de amoniu cristalizat;
4. Clorură de sodiu cristalizată;
5. Sulfat de sodiu cristalizat.

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 2 ml soluţie proteică diluată şi se tratează cu un
volum egal de soluţie saturată de sulfat de amoniu. Se obţine astfel o soluţie
semisaturată de sulfat de amoniu în care după câtva timp precipită globulinele.
Se filtrează şi peste soluţia obţinută se adaugă cristale fine de sulfat de amoniu
până la saturare, se observă formarea precipitatului de albumină. Metoda serveşte
la separarea albuminelor de globuline din ser.
Într-o serie de alte eprubete se tratează 2 ml soluţie proteică diluată cu
NaCl, MgSO4 şi Na2SO4 până la saturare când precipită o parte din proteine, se
filtrează şi se acidulează soluţia cu acid acetic. Se observă apariţia unui nou
precipitat: albuminele.

2. Precipitarea cu alcool
Reacţiile se bazează pe proprietatea proteinelor de a deveni insolubile în
prezenţa unor solvenţi organici. Unii din agenţii precipitanţi (alcool, acetonă)
fixează apa din molecula proteinelor ai căror radicali lipsiţi de apă floculează.
Concentraţia optimă în alcool, pH-ul, temperatura de precipitare constituie
parametrii care variază de la o proteină la alta. Precipitarea proteinelor cu alcool se
foloseşte la separarea proteinelor din ser.

Reactivi:
1. Soluţie proteică;
2. Alcool de 950.

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se iau 2 ml soluţie proteică, 2 ml alcool şi se agită puternic.
După câtva timp va apare un precipitat fin de proteină. Adăugând peste precipitat
10 ml apă, acesta se redizolvă, prin diluarea alcoolului.

IX.2.2. Reacţii de precipitare ireversibile


1. Precipitarea proteinelor cu săruri ale metalelor grele
Prin acţiunea sărurilor metalelor grele (Pb, Cu, Hg, Ag), proteinele precipită
ireversibil, ele nu se redizolvă nici prin diluarea soluţiilor, nici prin dializă, deşi
prin aceste operaţii se înlătură sărurile precipitante. Această metodă se aplică la
deproteinizarea lichidelor biologice.

96
Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Soluţie Pb(CH3-COO)2 0,5%;
3. Soluţie CuSO4 1g%;
4. Soluţie AgNO3 3g%.

Tehnica de lucru:
În 3 eprubete se introduce câte 1 ml soluţie proteică şi se adaugă în prima
soluţia de acetat de plumb, în a doua soluţia de sulfat de cupru şi în a treia soluţia
de azotat de argint. În toate eprubetele se observă apariţia unui precipitat.

2. Precipitarea proteinelor cu reactivii alcaloizilor


În această categorie de agenţi de precipitare se includ reactivii care precipită
alcaloizii în mediu acid, dintre care cei mai importanţi sunt: taninul, acidul picric,
hexacianoferatul de potasiu.

Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Acid acetic 1 g% şi 10 g%;
3. Soluţie apoasă saturată de tanin;
4. Soluţie apoasă saturată de acid picric;
5. Soluţie de hexacianoferat (II) de potasiu 10 g%.

Tehnica de lucru:
În 3 eprubete se iau câte 2-3 ml soluţie proteică. În prima se adaugă 1-2 ml
acid acetic 1g% şi 1-2 ml tanin, în a doua se adaugă 1-2 ml acid acetic 1% şi 1 ml
soluţie de acid picric, iar în a treia 1 ml acid acetic 10% şi câteva picături de
ferocianură de potasiu. În toate eprubetele se observă apariţia unui precipitat.

3. Precipitarea cu acizii minerali


Reactivi:
- HNO3 conc.
- HCl conc.
- H2SO4 conc.

Tehnica de lucru:
În 3 eprubete se introduc câte 1 ml de acid azotic, clorhidric, respectiv
sulfuric şi apoi cu precauţie câte 1 ml din soluţia de proteină în fiecare eprubetă.
La suprafaţa de separare dintre cele două soluţii se obţin precipitate albe sub formă
de disc (inel). Apoi eprubetele se agită. Precipitatele formate se dizolvă în exces de
acid clorhidric şi sulfuric, dar nu şi în exces de acid azotic. Precipitarea proteinelor
cu acid azotic concentrat serveşte pentru punerea în evidenţă a proteinelor din urina
patologică.

97
4. Precipitarea proteinelor cu acizii organici
Acidul tricloracetic, acidul sulfosalicilic, amestecul de acid citric-picric
(reactivul Essbach) sunt frecvent utilizaţi pentru precipitarea proteinelor din
lichidele biologice.

a) Precipitarea proteinelor cu acidul tricloracetic


Precipitarea proteinelor cu acidul tricloracetic este frecvent folosită în
laboratorul clinic pentru deproteinizarea serului sau a sângelui.
Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Soluţie acid tricloracetic 5-20 g%;

Tehnica de lucru:
Peste 2-3 ml soluţie proteică se adaugă 0,5-1 ml soluţie acid tricloracetic cu
apariţia unui precipitat alb abundent.

b) Precipitarea proteinelor cu acid sulfosalicilic


Această metodă este una din cele mai utilizate reacţii pentru depistarea
proteinelor din urină. Se presupune că acidul sulfosalicilic reacţionează cu ambele
grupări acide formând compuşi de tipul următor:

- - -
+........ O3S +........ O3S COO ........+
sau
-
+........ O3S OH

lant proteic (LP) LP = lanţ proteic LP

Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Soluţie acid sulfosalicilic 15-20 g la 100 ml apă bidistilată;

Tehnica de lucru:
Se iau într-o eprubetă 1-2 ml soluţie proteică peste care se adaugă cu
picătura aproximativ 0,5 ml soluţie de acid sulfosalicilic. Apare un precipitat alb
sub forma unui nor care permite urmărirea mersului picăturii de reactiv. Această
metodă are o mare sensibilitate, fapt care o recomandă la analiza urinii.

98
5. Precipitarea proteinelor prin încălzire
Majoritatea proteinelor prin încălzire la diferite temperaturi coagulează şi se
produce o precipitare ireversibilă. Precipitarea este maximă la punctul izoelectric al
proteinei, şi, în consecinţă, la acest tip de precipitare un rol deosebit îl are pHi.
Prezenţa diferitelor săruri favorizează, de asemenea, precipitarea.

Reactivi:
1. Soluţie proteică diluată;
2. Soluţie acid acetic 1 % si 10 %;
3. Soluţie NaCl saturată;
4. Soluţie NaOH 10%.

Tehnica de lucru:
În 5 eprubete se iau câte 2 ml soluţie proteică.
- în prima nu se adaugă nici un reactiv, ci se încălzeşte direct în flacară. Se observă
apariţia unui precipitat.
- în a doua eprubetă se adaugă 1-2 picături acid acetic 1 % şi se încălzeşte.
Precipitarea este mai rapidă şi mai completă, deoarece pH-ul soluţiei este mai
aproape de pHi al proteinei.
- în a treia eprubetă se adaugă 0,5 ml acid acetic 10 %. Precipitatul ce apare este
mai puţin abundent faţă de cel din eprubeta a doua, sau chiar inexistent datorită
depăşirii pHi al proteinei.
- în a patra eprubetă se adaugă 0,5 ml acid acetic 10 % si 0,5 ml soluţie NaCl
saturată. La încălzire apare un precipitat favorizat de NaCl.
- în a cincea eprubetă se adaugă 0,5 ml soluţie NaOH 10 %. Se observă că proteina
nu precipită nici la încălzire, mediul fiind prea alcalin.

IX.3. DETERMINAREA PUNCTULUI IZOELECTRIC AL


PROTEINELOR

Datorită raportului dintre grupările funcţionale libere: -COOH şi -NH2


proteinele se comportă fie ca acizi, fie ca baze. Disocierea grupărilor carboxil este
cu atât mai intensă cu cât aciditatea mediului este mai redusă.
- +
(H2N)m - R - (COOH)n (H2N)m - R - (COO )n + nH

Gradul de disociere al grupărilor aminice este condiţionat de alcalinitatea


mediului: cu cât concentraţia ionilor H+ este mai mică, cu atât disocierea grupărilor
amino este mai intensă, şi invers:
+ -
R - NH3]OH R - NH3 + OH

99
Sarcina electrică globală a unei proteine este suma algebrică a sarcinilor
pozitive şi negative şi care depinde de reacţia (pH-ul) mediului. În mediu alcalin
proteina posedă o încărcare electrică negativă, iar în mediu acid o încărcare
electrică pozitivă.
Pentru fiecare proteină există o concentraţie a ionilor de hidrogen la care
suma algebrică a sarcinilor pozitive şi negative este egală cu zero, proteina fiind
indiferentă faţă de curentul electric. Acest pH al mediului se numeşte punct
izoelectric. La acest pH proteina precipită deoarece are cea mai mică presiune
osmotică şi cea mai mică solubilitate.
În consecinţă, proteinele în soluţii tampon cu pH corespunzător pHi pierd
sarcinile electrice, devin neutre, nestabile şi precipită. Adaosul de solvenţi organici
(alcool, acetonă) favorizează precipitarea. pH-ul izoelectric reprezintă o constantă
importantă deoarece fiecare proteină are un pHi caracteristic, de exemplu:
hemoglobina = 6,8; caseina = 4,7 ; gelatina = 4,6.

Determinarea punctului izoelectric al caseinei


Se urmăreşte precipitarea caseinei în raport de pH-ul unei serii de soluţii de
acid acetic.

Reactivi:
1. Soluţie de caseină 0,5 %: 0,25 g caseină pură se suspendă în 20 ml apă
distilată, se adaugă apoi 5 ml NaOH 1N şi după neutralizare cu 5 ml acid acetic 1N
se completează cu apă la 50 ml.
2. Soluţii de acid acetic: 1N, 0,1N, 0,01N.

Tehnica de lucru:
În 9 eprubete se prepară soluţiile indicate în tabelul de mai jos, se adaugă
soluţia de caseină şi se agită. După 15 minute se notează gradul de precipitare din
fiecare eprubetă. pH-ul eprubetei care prezintă precipitarea maximă corespunde
punctului izoelectric al caseinei (Tabelul 1).

Tabel 1. Tehnica determinării punctului izoelectric al caseinei


Reactivi ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Acid acetic 0,01N 0,6 1,25 2,5 5,0 - - - - -
Acid acetic 0,1N - - - - 1 2 4 8 -
Acid acetic 1N - - - - - - - - 1,6
Apă distilată 8,4 7,75 6,5 4,0 8,0 7,0 5,0 1,0 7,4
Caseină 1 1 1 1 1 1 1 1 1,0
pH 5,9 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8 1,5

100
Probleme:

1. Care dintre următoarele caracteristici vă permite să determinaţi punctul


izoelectric al aminoacizilor şi proteinelor:
a. structura cuaternară
b. solubilitatea
c. greutatea moleculară
d. structura terţiară

2. Dintre reacţiile de precipitare ireversibilă a proteinelor nu face parte:


a. precipitarea cu acidul clorhidric
b. precipitarea cu acidul tricloracetic
c. precipitarea cu sulfatul de amoniu
d. precipitarea cu hexacianoferatul de potasiu

3. Recţia biuretului este specifică pentru determinarea compuşilor care conţin


cel puţin 2 legături:
a. – CO – NH –
b. – S – S –
c. – C = C –
d. – C = O

101
LUCRAREA 7

X. METODE OPTICE DE ANALIZĂ. DETERMINAREA


PROTEINELOR TOTALE DIN SER

X.1. METODE SPECTROSCOPICE DE ANALIZĂ

X.1.1. Radiaţia electromagnetică şi spectrul de absorbţie

Metodele optice de analiză, printre cele mai utilizate în laborator, folosesc


radiaţiile de toate lungimile de undă care provoacă fenomene de absorbţie, emisie şi
difuzie la trecerea lor printr-o substanţă şi care pot fi măsurate cu aparate specifice.
Metodele spectroscopice de analiză se bazează pe determinarea şi interpretarea
spectrelor de absorbţie şi de emisie.
Radiaţiile electromagnetice se caracterizează prin lungime de undă (λ),
frecvenţă (ν) şi viteză de propagare (c):

ν = c/λ
8
unde c = 3 · 10 m/s = viteza luminii în vid.

Energia unei unde electromagnetice este direct proporţională cu frecvenţa şi


invers proporţională cu lungimea de undă.
În funcţie de lungimea de undă, radiaţiile electromagnetice sunt prezentate
în Figura 13:

Figura 13. Spectrul electromagnetic [37]

102
În urma interacţiunii unui sistem (substanţă) cu o radiaţie incidentă, pot
apărea:
- o parte din radiaţia incidentă este absorbită. Specia absorbantă înaintea
interacţiunii e în stare neexcitată, care după absorbţia de energie trece într-o stare
excitată cu un nivel energetic ridicat (are loc saltul electronilor de pe un anumit
nivel energetic –HOMO- pe unul superior-LUMO) (Figura 14). Starea excitată are
o viaţă scurtă (în medie 10-8 secunde) şi revine la nivelul energetic iniţial eliberând
energia absorbită anterior (mai redusă ca intensitate) sub formă de energie calorică
sau chimică;
- o altă parte a radiaţiei incidente este difuzată de particulele/componentele
sistemului (stă la baza metodelor nefelometrice si turbidimetrice);
- trecerea radiaţiei prin sistem poate determina schimbarea direcţiei (vitezei) de
propagare (stă la baza proceselor de refracţie şi polarimetrice).

Figura 14. Saltul electronilor determinat de absorbţia unei radiaţii [38]

O radiaţie policromă (ex. lumina solară care acoperă tot domeniul vizibil)
este compusă din fotoni cu diferite energii, lungimi de undă, frecvenţe. O radiaţie
monocromatică este alcătuită din fotoni cu aceeaşi lungime de undă.
Culoarea unei substanţe depinde de absorbţia sau de reflectivitatea acesteia.
Culoarea percepută de ochiul uman este culoarea complementară celei absorbite
(Figura 15).

103
Figura 15. Absorbanţa şi culorile complementare [39]

X.1.2. Legea absorbţiei radiaţiilor

Analiza spectroscopică care urmăreşte determinarea de concentraţii are la


bază două legi fundamentale. Aceste legi se aplică în cazul modificării puterii
radiante a unei radiaţii monocromatice odată cu modificarea grosimii stratului
străbătut de radiaţie şi modificarea concentraţiei.
Prima din legile absorbţiei radiaţiilor este atribuită lui Bouguer-Lambert şi
afirmă că pe măsură ce creşte grosimea unei probe absorbante, intensitatea radiaţiei
transmise prin probă descreşte. Dependenţa absorbţiei de concentraţie se exprimă
prin legea lui Beer: coeficientul de extincţie este proporţional cu concentraţia.
Din combinarea celor două legi rezultă legea lui Bouguer-Lambert-Beer.
Considerând un fascicol luminos monocromatic de intensitate I0 care
traversează o soluţie de concentraţie c aflată într-o cuvă de gromsime l şi care
prezintă o intensitate transmisă I, conform legii Lambert-Beer există următoarea
relaţie:

I = I0 · 10 - εcl
I = intensitatea luminii transmise;
I0 = intensitatea luminii incidente
ε = coeficient molar de extincţie, constantă, depinde de structura substanţei;
c = concentraţia (%, g/l);
l = grosimea stratului absorbant (cm).

Raportul dintre intensitatea radiaţiei transmise I şi intensitatea radiaţiei


incidente I0 se numeşte transmitanţă sau transmisie şi se notează cu T:

T = I/I0

104
Logaritmul cu semn schimbat al transmisiei se numeşte extincţie (E),
densitate optică (DO) sau absorbanţă (A).

E = –logT

Io
E  log  cl
I

Valorile convenabile pentru absorbţie sunt situate între 0.1 – 1 deoarece


peste această valoare, corectitudinea rezultatelor poate fi modificată de efectul de
umbrire al particulelor datorită unei concentraţii prea mari.
Coeficientul molar de extincţie ε este o mărime caracteristică fiecărui
compus reprezentând extincţia unei soluţii având concentraţia de 1 mol/L măsurată
într-o cuvă de 1 cm. Aceasta variază în funcţie de natura substanţei respective,
lungimea de undă, temperatură, pH, solvenţi.
În practica analitică se determină extincţia specifică E1cm1% / absorbanţa specifică
A1cm1% care reprezintă densitatea optică la o anumită lungime de undă pentru o soluţie
care conţine 1 g de substanţă în 100 mL soluţie, într-un strat de soluţie cu grosimea
de 1 cm.
Legea Lambert-Beer este valabilă în următoarele situaţii:
- radiaţia incidentă trebuie să fie monocromatică;
- concentraţia soluţiei trebuie să se situeze între anumite limite impuse de curba de
calibrare (dacă concetraţiile sunt prea mari, soluţiile se vor dilua corespunzător);
- se vor utiliza soluţii limpezi pentru a evita fenomenul de dispersie a radiaţiei;
- pH constant.
În determinările spectrofotometrice extincţia se citeşte la o lungime de undă
λmax la care substanţa prezintă un maxim de absorbţie Emax. Se trasează spectrul de
absorbţie a substanţei respective de o anumită concetraţie urmărind variaţia
absorbanţei (pe abscisă) în funcţie de lungimea de undă (λ) (pe ordonată),
determinând apoi din grafic lungimea de undă la care absorbanţa este maximă
(λmax). Dupa aceea se realizează curba de calibrare măsurând absorbanţă a minim 5
soluţii de concentraţie cunoscută a analitului respectiv la λmax (trebuie să rezulte o
dreaptă care trece prin origine).

X.1.3. Determinări calitative şi cantitative

Spectrofotometria UV-Vis este folosită atât ca metodă calitativă pentru


identificarea unei substanţe prezente într-o soluţie, cât şi cantitativă pentru
calcularea concentraţiei unei substanţe dintr-o soluţie.

 Determinări calitative
Moleculele care conţin electroni π absorb în UV (200-400 nm), iar cele care
prezintă cel puţin un sistem de duble legături conjugate absorb în vizibil (400-800
nm). Prezenţa în structura substanţelor organice a unei legături nesaturate, a unui

105
cromofor, determină absorbţia luminii în acest domeniu de lungime de undă.
Maximul de absorbţie al unui cromofor poate fi influenţat de celelalte grupări
funcţionale din jurul acestuia, de solvent, pH şi temperatură.

Deplasarea maximului de absorbţie se traduce prin:


- efect batocrom:deplasarea către lungimi de undă mai mari;
- efect hipsocrom: deplasarea către lungimi de undă mai mici;
- efect hipercrom: creşterea intensităţii absorbţiei;
- efect hipocrom: scăderea intensităţii absorbţiei.
Soluţiile conţinând cationii metalelor tranziţionale pot, de asemenea,
absorbi radiaţii cu lungimea de undă din domeniul vizibil datorită electronilor de pe
orbitalii de tip d care pot fi uşor excitaţi. Culoarea acestor soluţii poate fi
modificată de prezenţa unor anioni sau liganzi.
Acizii nucleici, aminoacizii şi proteinele absorb radiaţia electromagnetică
mai ales din domeniul UV (triptofan, tirozină, citozină) şi mai rar din cel vizibil
(doar proteinele şi/sau alţi compuşi care conţin o grupare prostetică cu Fe2+ (hemul)
sau alte metale tranziţionale absorb în vizibil). Vitamina A absoarbe, de asemenea,
radiaţia din domeniul vizibil datorită dublelor legături conjugate din structura sa.

 Determinări cantitative
Concentraţia probei de analizat se determină prin următoarele metode:
1. Metoda grafică: prin interpolare pe curba de etalonare;
2. Folosind factorul de pantă (F): reprezintă cotangenta unghiului format de
curba de etalonare cu abscisă.

F = 1/tg α = ctg α = Σ Cstd/ Σ Estd


C=E·F

3. Folosind un standard (etalon): o soluţie de concentraţie cunoscută din


substanţa de analizat:

Estd / Eproba = ε · Cstd · l / ε · Cproba · l = Cstd / Cproba


Cproba = Eproba · Cstd / Estd

Extincţiile se citesc faţă de un martor (blanc) care conţine toţi reactivii folosiţi în
tehnica respectivă cu excepţia compusului de analizat.

4. Folosind coeficientul molar de extincţie:

Cproba = Eproba / ε · l

5. Folosind extincţia specifică E1cm1%:

E1cm1% = E/l·c ; E = E1cm1%/c

106
X.1.4. Principiul de funcţionare a unui spectrofotometru

Aparatul utilizat în spectrofotometrie se numeşte spectrofotometru. Acesta


conţine diferite componente de bază (Figura 16):
- sursa de radiaţie: lampă de deuteriu pentru domeniul UV sau lampă tungsten
pentru VIS;
- sistemul de selecţie a lungimii de undă (monocromatorul) care poate fi format din
filtre colorate, monocromatoare cu retea de difracţie sau cu prismă;
- cuva cu proba de analizat (materialul din care e confecţionată cuva nu trebuie să
absoarbă în regiunea respectivă, trebuie să fie transparent pentru domeniul spectral
utilizat în analiză): pentru domeniul UV trebuie să fie din cuarţ, pentru domeniul
vizibil din sticlă sau material plastic;
- detectorul: instrumentul de măsură legat la un înregistrator = calculator.

Figura 16. Schema unui spectrofotometru convenţional [40]

X.2. DETERMINAREA PROTEINELOR TOTALE DIN SER

Plasma este un amestec coloidal în care proteinele reprezintă cel mai


semnificativ component, toate procesele care se desfăşoară într-o structură vie
depinzând direct de proteine. Proteinele sunt substanţe complexe formate din
aminoacizi uniţi între ei prin legături peptidice. Plasma conţine mai mult de 300 de
proteine diferite, fiecare având funcţie proprie: enzime, inhibitori de enzime, factori
de coagulare, anticorpi, proteine transportoare.
Parametru esenţial al homeostaziei, proteinele din plasmă îndeplinesc roluri
importante:
 menţinerea presiunii coloid osmotice a plasmei;
 transport (de metaboliţi, hormoni, vitamine, minerale);
 rezervă de aminoacizi;

107
 apărarea specifică şi nespecifică a organismului (factori de coagulare,
imunoglobuline);
 menţinerea echilibrului acido bazic.

Cu excepţia imunoglobulinelor şi a hormonilor, majoritatea proteinelor


plasmatice este sintetizată în hepatocite şi eliberată în torentul circulator.
Serul şi plasma diferă în ceea ce priveşte concentraţia de proteine şi tipul de
molecule. Astfel, serul (obţinut după încheierea procesului de coagulare) nu
conţine fibrinogen şi majoritatea factorilor implicaţi în „cascada‖ coagulării.
Există două clase mari de proteie plasmatice: albuminele şi globulinele, între care
raportul optim de concentraţie este A/G = 0,8 - 1,2 (indexul de disproteinemie).

X.2.1. Dozarea proteinelor prin metoda Gornall

Analize biochimice: Proteine totale serice (Proteinemia)


Specimen recoltat: Sânge venos
Recipient recoltare: Vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator
Metoda: Spectrofotometrie

Principiu:
Proteinele reacţionează cu Cu2+ în mediu alcalin şi formează complecşi
coloraţi în violet. Intensitatea culorii se măsoară spectrofotometric şi este
proporţională cu cantitatea de proteină din probă.

Reactivi:
1. Reactivul Gornall: tartrat dublu de Na şi K 45g, KI 5g, CuSO4∙5H2O 15g şi
NaOH 8g, care se dizolvă într-un litru de apă distilată.
2. Soluţie standard de proteină 10 mg/ml
3. Ser.

Tehnica de lucru:
În 3 eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 1):

Tabel 1. Tehnica dozării proteinelor prin metoda Gornall


Reactivi (ml) M S P
Apă distilată 1 - -
Standard - 1 -
Ser dil.1:10 - - 1
R.Gornall 4 4 4

Se incubează 15 minute la temperatura camerei, apoi se citeşte Ep şi Es la


540 nm faţă de martor.

108
Calcul:
mg proteină/ml = Ep/Es x 200

Valori de referinţă (min-max) :


- copii 0 - 1 ani: 5 - 7 g/dl;
- copii 1 - 2 ani: 5,5 - 7,5g /dl;
- adulţi: 6 - 8 g/dl.

Recomandări pentru determinarea proteinelor totale serice:


- VSH modificat;
- proteinurie;
- edem;
- poliurie;
- afecţiuni renale cronice;
- afecţiuni hepatice cronice;
- diaree cronică;
- tumori maligne;
- susceptibilitate crescută la infecţii;
- dureri osoase;
- limfoame;
- hemoragie;
- graviditate;
- traume.

Modificările concentraţiei proteinelor totale denotă o disproteinemie sau


modificarea echilibrului hidroelectrolitic. Stările de deshidratare sau hiperhidratare
sunt acompaniate de hiper- sau hipoproteinemie.

Valori scăzute (Hipoproteinemia):


- Fiziologic:
- ingerări masive de lichide
- sarcina (în special în trimestrul III, datorită hipervolemiei)
- Patologic:
- aport scăzut - malnutriţie/malabsorbţie, anorexie
- sinteză scăzută - insuficienţa hepatică,
- ciroză hepatică
- alcoolism cronic
- pierderi crescute: - renale - glomerulonefrită, sindrom nefrotic
- digestive - enteropatii cu pierderi de proteine,
- boala Crohn
- colita ulceroasă
- cutanate - arsuri
- afecţiuni dermatologice severe – eczeme, psoriazis
- sangvine - hemoragii

109
- intensificarea catabolismului - febră
- inflamaţii
- hipertiroidism
- neoplasme
- hiperhidratarea - administrare intravenoasă rapidă de lichide
- pseudohipoproteinemie: prin diluţie (recoltare de pe branulă)
- intoxicaţii - benzen
- fosfor
- tetraclorura de carbon

Valori crescute (Hipoproteinemia):


Hiperproteinemii relative:
- stări de deshidratare şi hemoconcentraţie datorită pierderilor de fluide:
- transpiraţii - fiziologic
- boli febrile
- pierderi de apă în exces pe cale intestinală: diaree, vărsături
- diabet insipid,
- poliurie.
Hiperproteinemii absolute:
- hipergamaglobulinemii
- policlonale - infecţii, inflamaţii cronice - datorită sintezei de γ-globuline
(funcţie de anticorpi)
- monoclonale - mielom multiplu
- macroglobulinemia Waldenström
- boli autoimune - sarcoidoza
- boli granulomatoase
- poliartrita reumatoidă (PAR)
- lupus eritematos sistemic (LES)

! Medicamente care afectează nivelul proteinelor:


- Scăderi - Alopurinol
- Estrogeni
- Creşteri - Corticosteroizi
- Hormoni tiroidieni
- Insulina
- Progesteron
- Androgeni

110
Probleme:

1. Enumeraţi părţile componente ale unui spectrofotometru convenţional şi


rolul îndeplinit de fiecare component.

2. Enunţaţi legea care guvernează absorbţia radiaţiilor şi condiţiile necesare


pentru îndeplinirea acesteia.

3. Enumeraţi metodele utilizate pentru calcularea concentraţiei unei probe de


analizat.

4. Valoarea normală a proteinemiei la adulţi este de:


a. 3,2-5,8 g/100 ml
b. 5,5-7,5 g/100 ml
c. 6-8 g/100 ml
d. 7,5-8,5 g/100 ml

5. În care din următoarele afecţiuni sinteza proteinelor este scăzută:


a. diabet zaharat
b. insuficienţă hepatică
c. mielom multiplu
d. insuficienţă cardiacă

111
LUCRAREA 8

XI. PROTEINOGRAMA. FRACŢIUNI ELECTROFORETICE

XI.1. ELECTROFOREZA
Electroforeza este metoda cea mai accesibilă clinic pentru separarea
macromoleculelor încărcate electric pe baza mobilităţii lor într-un câmp electric.
Astfel, migrarea particulelor în câmpul electric se produce spre polul de semn opus
încărcării particulelor respective, particulele încărcate pozitiv vor migra spre
electrodul încărcat negativ (catod), iar cele încărcate negativ spre polul pozitiv
(anod).
Viteza de migrare a ionilor depinde de mai mulţi factori şi anume:
 sarcina electrică;
 mărimea şi forma particulelor;
 tensiunea aplicată;
 forţa ionică;
 pH-ul electrolitului;
 temperatura şi vâscozitatea;
 natura suportului solid (hârtie cromatografică, acetat de celuloză, gel).
În acest sens, viteza de migrare este invers proporţională cu dimensiunea
(greutatea) particulelor şi direct proporţională cu sarcina lor electrică; deci
particulele cele mai uşoare şi mai puternic încărcate vor migra cel mai repede şi se
vor deplasa cel mai departe pe suportul de migrare.
Numărul ionilor pozitivi sau negativi este funcţie de natura macromoleculei,
de pH-ul şi de tăria ionică a mediului. În acest sens la punctul izoelectric, când toate
sarcinile pozitive sunt egale cu cele negative, nu are loc migrarea electroforetică.
Sunt cunoscute mai multe tipuri de electroforeză, în cele mai multe cazuri
fiind diferit suportul pe care se realizează migrarea electroforetică a particulelor.
Astfel cele mai des utilizate în laboratoarele clinice sunt:
 Electroforeza pe hârtie folosită ca metodă analitică şi micropreparativă;
datorită avantajelor pe care le prezintă, se răspândeşte pe scară din ce în ce
mai mare.
 Electroforeza în geluri de agaroză reprezintă metoda standard de analiză a
proteinelor şi în principal a acizilor nucleici ADN.
Electroforeza este folosită în special în chimia aminoacizilor, peptidelor,
proteinelor, zaharurilor şi a componentelor acizilor nucleici, astfel putând fi
separate: lipoproteine, imunoglobuline, izoenzime şi hemoglobine.
Astăzi cea mai larg utilizată metodă de electroforeză este cea a proteinelor
serice sau din alte lichide biologice.

112
XI.1.1. Electroforeza proteinelor serice

Electroforeza proteinelor serice este o metodă de separare a proteinelor


plasmatice bazată pe proprietatea proteinelor de a migra într-un câmp electric şi de
a precipita la punctul izoelectric. Încărcarea electrică a proteinelor este determinată
de numărul de aminoacizi cu catene laterale acide sau cu catene laterale bazice.
De asemenea, în cadrul aminoacizilor grupările reziduale -COOH şi -NH2
ale aminoacizilor au caracter amfoter şi pot fi încărcate electric, cu sarcini pozitive
sau negative în funcţie de pH-ul tamponului folosit. Astfel, vom avea două cazuri
în funcţie de pH-ul mediului:
- la valori acide de pH, grupările carboxil (-COOH) sunt doar uşor ionizate,
iar cele amino vor forma ioni -NH3+, deci proteina va căpăta o sarcină
pozitivă;
- la valori alcaline ale pH-ului, grupările amino vor fi uşor ionizate, iar cele
-COOH vor forma ioni -COO-, conferind macromoleculei o sarcină
negativă.
Ţinând cont de multitudinea de grupări reziduale, cu grade diferite de
afinitate pentru ionii H+ şi HO-, fiecare proteină se va încărca diferit în funcţie de
pH-ul soluţiei.
La atingerea punctului izoelectric (pI), numărul grupărilor încărcate pozitiv
(-NH3+) este egal c u numărul grupărilor încărcate negativ (-COO-), astfel că la un
pH mai mare decât pI, proteinele vor fi încărcate negativ, iar la un pH mai mic
decât pI, proteinele vor fi încărcate pozitiv.
La pH-ul utilizat în electroforeza proteinelor de 8,6, proteinele plasmatice
sunt încărcate negativ şi vor migra spre anod cu viteze depinzând şi de mărimea
sarcinii.
Electroforeza proteinelor se poate efectua pe două tipuri de suport inert:
- solid (hârtie Wartmann sau acetat de celuloză, s.a.);
- semisolid (gel de poliacrilamidă, agaroză, agar sau amidon).
De-a lungul timpului s-au folosit mai multe suporturi electroforetice, gelul
de agaroză fiind cel care asigura cea mai bună rezoluţie pentru separarea
proteinelor.

XI.1.2. Electroforeza în gel de agaroză

Electroforeza în gel de agaroză prezintă câteva avantaje, cele mai


importante fiind:
- gradul mare de rezoluţie, specificitate şi sensibilitate;
- rapiditatea conferită de posibilitatea analizei simultane a mai multor
parametri, ca urmare a independenţei totale a celor două module
(de migrare şi colorare);
- gradul mare de reproductibilitate prin implicarea minimă a factorului uman
(la metodele manuale);

113
- diversificarea parametrilor investigaţi (proteine, lipoproteine, izoenzime,
hemoglobine normale şi patologice);
- aplicabilitatea în cazul mai multor lichide biologice (ser, dar şi urina, LCR
şi altele), precum şi faptul că pentru aceste lichide nu mai este nevoie de
concentrarea lor, fiind astfel înlăturat un neajuns important care făcea, de
multe ori, impracticabilă metoda pentru electroforeza proteinelor urinare,
din LCR şi din alte fluide hipoproteice.
Componentele aparatului de electroforeză sunt în mare parte identice
indiferent de metodele utilizate sau de producătorul sistemului (Figura 17).
Acestea vor include obligatoriu următoarele componente:

1. Cuva de electroforeză (camera umedă) - un dispozitiv paralilipipedic, de


masă plastică, prevăzut în interior cu două compartimente paralele
despărţite între ele şi în care se găsesc:
 câte un electrod din platină sau cărbune: anodul (+) şi catodul (-);
 soluţia tampon cu pH-ul de 8,5 în cazul separării proteinelor serice.
2. Redresor pentru transformarea curentului alternativ în curent continuu şi
constant din punct de vedere al intensităţii.
3. Tăvi de colorare şi tăvi de spălare, precum şi soluţiile de colorare, spălare şi
fixare.
4. Plăcile de migrare electroforetică pe suport de agaroză, prevăzute (sau în
unele cazuri realizate ulterior) cu godeuri pentru aplicarea serului de
analizat.

Figura 17. Schema sistemului de electroforeză [41]

Tehnica de lucru:
Se umplu cuvele aparatului de electroforeza cu soluţia tampon, astfel încât
electrozii să fie inundaţi.
Serurile de studiat se vor aplica cu ajutorul pipetelor la nivelul godeurilor
de pe plăcile de migrare, iar apoi aceste folii (plăci) se aşază în camera umedă între

114
cele două cuve, având grijă ca cele două capete ale plăcii să fie imersate în soluţia
tampon. Se deschide întrerupătorul de la redresorul de curent, se setează tensiunea
la 100V şi timpul de operare la 15-20 minute. După acest interval se întrerupe
curentul şi se scot foliile complet transparente şi lipsite de gel, dar conţinând
fracţiunile proteice încă invizibile.
Paşii următori cuprind imersia plăcii în amestecul de colorant şi fixator de 3
ori consecutiv timp de 10 minute, urmat de spălarea şi uscarea plăcii.
La final pe suprafaţa foliei vor apărea colorate benzile corespunzătoare
fiecărei fracţiuni proteice. Determinarea cantitativă a fracţiunilor proteice se face
prin scanare densitometrică cu ajutorul densitometrului care interpretează gelurile
şi se vor putea apoi vizualiza curbele pentru fiecare probă, variaţiile absorbţiei fiind
interpretate grafic pe o axă XY, obţinându-se direct fracţiunile proteice respective,
urmând a fi apoi printate şi arhivate de imprimanta analizorului.

Traseul electroforetic prezintă un aspect tipic la adultul sănătos, sub forma


unei diagrame cu diferite vârfuri ce corespund fracţiilor proteice (Figura 18).
· primul vârf corespunde albuminei, care este fracţiunea cea mai rapidă,
migrând cel mai repede;
· al doilea vârf corespunde α1-globulinelor;
· al treilea vârf este al α2-globulinelor;
· al patrulea vârf este al β-globulinelor;
· ultimul vârf corespunde γ-globulinelor, cele mai lente fracţiuni proteice.

Figura 18. Electroferograma serului uman normal [42, 43]

Valori normale
Modul în care realizăm procesul electroforetic ne permite separarea
proteinelor serice în 5 fracţiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta, gama globuline) la pH
9.2 sau in 6 fractiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta 1, beta2, gama globuline) la pH
8.5.

115
Proteinemia normală presupune o valoare totală normală şi o repartiţie
procentuală caracteristică a fiecărei fracţiuni proteice:

Proteine totale 6,0 – 8,0 g%


Albumine 3,5 – 5,5 g% (50 – 62%)
Globuline 2,5 – 3,5 g% (38 – 50%)
α1-globuline 0,2 – 0,4 g% (4 – 8%)
α2-globuline 0,5 – 0,9 g% (6 – 10%)
β-globuline 0,6 – 1,1 g% (8 – 15%)
γ-globuline 0,7 – 1,7 g% (10 – 20%)
Fibrinogen 0,2 – 0,4 g%
Raport Albumine/Globuline: 1,2 – 1,5.

Variaţii fiziologice
Electroforeza proteinelor serice ale sugarului este asemănătoare cu cea a
adultului, dar prezintă o scădere a vârfului γ-globulinelor, mai ales în perioada de 3
– 6 luni când există o hipo-gamaglobulinemie fiziologică.
La adulţi electroforegrama este cea descrisă mai sus, fără diferenţe majore
între cele două sexe. Nu se observă nici o variaţie semnificativă a valorilor la femei
pe durata ciclului menstrual.
La vârstnici se observă în general o scădere a vârfului γ-globulinelor
asemănătoare cu scăderile din deficitele imune şi o hipoalbuminemie. 75 % dintre
bătrâni prezintă o hipoproteinemie datorată scăderii simultane a albuminelor şi
imunoglobulinelor.
Variaţiile determinate de oboseală (diminuarea gamaglobulinelor) şi de
condiţiile climatice sunt relativ reduse. O dietă deficitară în proteine poate influenţa
traseul electroforetic în sensul diminuării albuminelor şi creşterii globulinelor, în
special a fracţiunii beta.
Sarcina, mai ales în al treilea trimestru, determină o diminuare a
albuminelor şi o creştere a α2 şi β-globulinelor, în timp ce γ-globulinele au valori
normale.

Variaţii patologice
Creşterea raportului albumine/globuline nu are importanţă prea mare, dar
scăderea acestuia sub cifra 1 sugerează boli care scad sinteza de albumină sanguină
sau boli care cresc sinteza de globuline. Cauzele care duc la scăderea albuminelor
sunt aceleaşi care produc şi scăderea proteinelor totale.
Variaţiile concentraţiilor fracţiunilor majore au corespondenţă în diferite
stări patologice:

116
a)Albumina
Creşterea fracţiei albuminei se constată în:
- alimentaţie excesivă;
- mielom multiplu, boala Waldenström, colagenoze, sarcoidoză;
- stări de hemoconcentraţiei şi deshidratare (vărsături, diaree,
transpiraţii abundente);
- creştere relativă: după administrarea unor medicamente (corticosteroizi,
insulină, steroizi anabolici, mialgin, morfină, tiroidă).

Scăderea fracţiei albuminei se întâlneşte în:


- deficit de aport proteic (inaniţie, subnutriţie);
- tulburări de digestie şi de absorbţie proteică (vărsături, diaree cronică,
boli de pancreas, operaţii pe stomac sau duoden);
- stări de hipercatabolism proteic (boli febrile, hiperfuncţia glandei tiroide,
efort fizic intens, sarcină);
- deficit de sinteză a albuminelor în suferinţe hepatice;
- pierderi de proteine: nefrite, sindrom nefrotic, hemoragii, arsuri, necroze,
după operaţii chirurgicale;
- după intoxicaţii cu benzen, tetraclorură de carbon;
- după administrarea unor medicamente: anticoncepţionale, salicilaţi;
- stări de hiperhidratare şi stări edematoase.

b) Globuline
Scăderea globulinelor are valoare prognostică importantă în hepatite.

α1-globuline:
Creşterea fracţiei:
- apare în infecţii acute şi cronice, glomerulonefrită acută şi
cronică, poliartrită, lupus eritematos.
Scăderea fracţiei:
- apare în insuficienţă hepatică acută şi în sindrom nefrotic.

α2-globuline:
Au valoare diagnostică foarte redusă şi valoare prognostică pentru
hepatitele grave.
Valori scăzute:
- izolate sau asociate cu scăderea α1-globulinelor în ciroze hepatice
severe sau oricare afecţiune hepatică gravă!
Valori crescute:
- sindrom nefrotic, cancere hepatice severe, atrofie hepatică, hepatite
epidemice şi ictere mecanice de cauză neoplazică (creşteri uşoare).

117
β-globuline
Au valoare diagnostică şi prognostică pentru gravitatea hepatitelor.
Valori scăzute:
- afecţiuni hepatice grave;
- atrofie hepatică acută;
- ictere grave.
Valori crescute:
- primele săptămâni postinfarct miocardic acut;
- diabet zaharat;
- amiloidoză;
- sindrom nefrotic;
- unele neoplasme (în special cele metastatice);
- sarcoidoză;
- ciroze (cresc încet dar ajung la valori ridicate);
- hepatite: acute epidemice, toxice, etilice, icter mecanic.

γ-globuline:
Valori scăzute:
- sindrom nefrotic;
- agamaglobulinemii;
- hipogamaglobulinemii congenitale sau dobândite: mielom, leucemie
limfatică cronică, limfoame.
Valori crescute semnifică un proces imunologic cronic asociat cu:
- infecţii subacute şi cronice;
- parazitoze, viroze;
- inflamaţii cronice;
- boli de colagen: poliartrita reumatoidă, lupus eritematos sistemic;
- afecţiuni hepatice: hepatite cronice active; ciroza hepatică;
- neoplazii: boala Hodgkin, leucemie mielomonocitară cronică.
Estomparea sau absenţa benzii gama sugerează un deficit imun
(agamaglobulinemie).

118
Probleme:

1. Viteza de migrare a ionilor în câmp electric depinde de următorii factori :


a) tensiunea aplicată acestui câmp
b) natura electrozilor
c) dimensiunea şi natura particulelor ce migrează
d) dimensiunea plăcii de migrare
e) structura (natura) plăcii de migrare

2. Încărcarea electrică a proteinelor este determinată de :


a) lungimea lanţurilor de aminoacizi din structura sa
b) numărul de aminoacizi cu catene laterale acide sau cu catene laterale bazice
c) pH-ul soluţiei în care se găseşte proteina
d) natura radicalilor R- ai aminoacizilor prezenţi în proteină
e) natura punţilor de legătură din structura proteinei

3. Care din următoarele afirmaţii referitoare la fracţiunile proteice sunt false :


a) globulinele constituie procentual cea mai mare fracţiune proteică (50% - 62%)
b) creşteri ale γ-globuline apar neoplazii, infecţii, parazitoze şi boli de colagen
c) diferenţe majore între fracţiuni apar în funcţie de sexul pacientului şi condiţiile
de recoltare
d) fibrinogenul constituie una din principalele fracţiuni proteice obţinute
electroforetic
e) afecţiunile inflamatorii hepatice sunt caracterizate prin scăderea fracţiunii
globulinice

119
LUCRAREA 9

XII. ANALIZA BIOCHIMICǍ A VITAMINELOR

Vitaminele sunt compuşi organici neînrudiţi din punct de vedere chimic


care trebuie suplimentaţi prin dietă deoarece nu pot fi sintetizaţi în cantităţi
adecvate de organismul uman.
Vitaminele sunt clasificate în funcţie de solubilitatea lor în apă sau solvenţi
nepolari în:
- vitamine hidrosolubile (9 vitamine: acidul folic, cobalamina, acidul
ascorbic, piridoxina, tiamina, niacina, riboflavina, biotina şi acidul
pantotenic);
- vitamine liposolubile (4 vitamine: vitaminele A, D, E şi K).

Pentru analiza vitaminelor se pot aplica metode fizico-chimice şi biologice.


Cele biologice au avantajul specificităţii, dar sunt mai greu de efectuat (necesită
animale de experienţă, culturi de microorganisme şi un timp mai îndelungat), de
aceea se aplică, cel puţin orientativ, metodele fizico-chimice care corespund
analizei preparatelor farmaceutice, alimentelor şi lichidelor biologice.

XII.1. REACŢII PENTRU CAROTENOIDE ŞI VITAMINA A

XII.1.1. Identificarea carotenoidelor şi a vitaminei A cu SbCl3: reacţia


CARR-PRICE

Principiu:
Se cunosc reacţii comune datorate catenei polienice care în prezenţă de
fenoli, acizi minerali sau organici, a clorurilor acide generează compuşi coloraţi.
Cea mai uzuală este reacţia de culoare cu SbCl3 (reacţia Carr-Price).

Reactivi:
1. Soluţie uleioasă de vitamina A sau ulei de peşte;
2. Soluţie cloroformică saturată de SbCl3; 30 g clorură de stibiu se agită
timp de 2 ore cu 70 ml cloroform într-o sticlă cu dop rodat. Reactivul se poate
folosi timp de o săptămână.

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă peste 4-5 picături de soluţie de analizat (vitamina A sau ulei
de peşte) se adaugă 1 ml soluţie cloroformică de clorură de stibiu şi se observă
apariţia unei coloraţii albastre.

120
Observaţii:
1. Mulţi compuşi prezenţi în grăsimile naturale (de ex. acizii graşi
polinesaturaţi) interferează cu vitamina A şi falsifică rezultatele, de aceea se
recomandă eliminarea lor prin saponificare. În acest scop se fierbe produsul de
analizat cu KOH, soluţie alcoolică sau apoasă, după caz şi se extrage cu eter care
ulterior se evaporă şi reziduul se reia cu cloroform (soluţiile pure sau farmaceutice
nu necesită aceste operaţii).
2. Reacţia este dată şi de către produşii de oxidare ai clorofilei, iar vitamina
D dă o reacţie cu o culoare diferită.
3. Urmele de apă transformă triclorura de stibiu în oxiclorură care nu
reacţionează cu vitamina A şi de aceea este absolut necesar să se lucreze în
eprubete uscate şi cu reactivi lipsiţi de apă sau să se adauge câteva picături de
anhidridă acetică.
4. Reacţia se pretează determinării cantitative a vitaminei A, prin măsurarea
intensităţii albastre la 620 nm. Pentru această determinare s-au construit
colorimetre speciale Lovibond, etalonate pentru culoarea albastră şi care au condus
la stabilirea unităţilor Lovibond sau unităţi albastre.

XII.1.2. Identificarea vitaminei A cu acid tricloracetic

Se introduc într-o eprubetă 4-5 picături soluţie uleioasă de vitamina A şi se


adaugă 1 ml soluţie cloroformică de acid tricloracetic (30 g acid tricloracetic
dizolvat în 100 ml cloroform); apare imediat o culoare galbenă care trece în
albastru.

XII.1.3. Dozarea vitaminei A

Principiu:
Molecula vitaminei A se oxidează cu dicromat de potasiu în mediu acid şi
se dozează spectrofotometric excesul de dicromat.

Reactivi:
1. Soluţie de vitamina A de dozat;
2. Soluţie de dicromat de potasiu 0,01N;
3. HCl conc;
4. KI 10%;
5. Tiosulfat de sodiu 0,01N;
6. Amidon (indicator);

Tehnica de lucru:
Într-un balon prevăzut cu refrigerent ascendent se introduc 0,1 ml soluţie de
vitamina A, 14 ml apă, 40 ml dicromat şi 2 ml HCl conc. şi se fierbe amestecul
timp de o oră. După răcire se iau în 4 baloane Erlenmeyer câte 14 ml din soluţia din

121
balon, care se vor titra. În fiecare balon se adaugă 5 ml KI 10% şi se titrează cu
tiosulfat de sodiu în prezenţă de amidon ca indicator.

Calcul:
Vit. A (mg/100ml) = (10-N) x 0,00008 x 1,0316 x 4000 x 1,001
Unde: 1,001 – factor de corecţie
N – numărul de ml tiosulfat folosit la titrare
Vit. A (mg/100ml) = (10-N) x 0,33

Cunoscând că o unitate internaţională de vitamina A este echivalentă cu


0,344 μg acetat de vitamina A sau 0,3 μg vitamina A alcool pură, valoarea găsită în
mg se poate exprima în U.I.

XII.2. REACŢII PENTRU PROVITAMINELE ŞI VITAMINELE D

XII.2.1. Reacţia Liebermann-Burchard

Principiu:
Soluţia cloroformică de vitamina D în prezenţa anhidridei acetice şi a
acidului sulfuric concentrat dă naştere unei culori care virează de la roz-violaceu la
albastru şi apoi la verde.

Reactivi:
1. Soluţie cloroformică de provitamina D sau de vitamina D: 0,5 g la 100 ml;
2. Anhidridă acetică;
3. Acid sulfuric concentrat.

Tehnica de lucru:
La 1 ml soluţie de vitamină sau provitamină D se adaugă 1 ml anhidridă
acetică şi 5 picături de acid sulfuric; se observă o coloraţie roşie care trece în final
în verde.
Reacţia nu este specifică deoarece este dată şi de compuşii sterolici.

XII.2.2. Reacţia cu anilina şi HCl


Vitaminele din grupul D, în prezenţa anilinei şi a HCl dau o coloraţie roşie.
Într-o eprubetă se ia 1 ml soluţie de vitamina D sau ulei de peşte şi se adaugă
câteva picături de soluţie anilină-HCl (părţi egale de anilină şi HCl) şi se observă
apariţia unei coloraţii roşii.

XII.2.3. Reacţia CARR-PRICE


1 ml soluţie cloroformică de vitamina D 0,5% se tratează cu 4 ml soluţie
cloroformică de clorură de stibiu şi se obţine o culoare galben-portocalie, diferită
de culoarea albastră pe care o dă vitamina A în aceleaşi condiţii.

122
XII.2.4. Identificarea vitaminelor D cu aldehide aromatice
Vitaminele D în prezenţa aldehidelor aromatice (vanilina, furfurol, aldehida
anisică) şi în prezenţa acidului percloric dă compuşi coloraţi. Reacţia efectuată în
condiţii bine specificate permite şi determinarea cantitativă a vitaminelor D.

Reactivi:
1. Soluţie de vitamina D în benzen
2. Soluţie de aldehidă aromatică 0,1 g% în benzen
3. Acid acetic glacial
4. Reactiv percloric: 2 ml aldehidă acetică, 2,5 ml acid acetic glacial şi 0,5
ml soluţie 70% de acid percloric se încălzesc la 95-1000C timp de ½ oră.

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie benzenică de vitamina D şi 1 ml
soluţie aromatică în benzen şi se încălzesc la fierbere în baie de apă. Se adaugă 2
picături reactiv percloric şi se fierbe încă 1 minut, apoi se lasă să se răcească la
temperatura camerei. La soluţia tulbure verde se adaugă 1,5 ml acid acetic glacial şi
se urmăreşte culoarea formată.

XII.2.5. Diferenţierea între vitaminele D2 şi D3


Vitaminele D2 şi D3 dau culori diferite cu acidul sulfuric concentrat.
În două eprubete se iau câte 1ml soluţie alcoolică 0,1% de vitamina D2 şi
respectiv soluţie alcoolică 0,1% vitamina D3 şi apoi se adaugă în fiecare eprubetă
câte 2 picături apă, după care se adaugă cu precauţie pe pereţii eprubetei câte 1 ml
acid sulfuric concentrat. La zona de contact apare o culoare portocalie ce trece în
roşu pentru vitamina D2, în timp ce vitamina D3 dă o coloraţie galbenă.

XII.3. DOZAREA VITAMINEI PP

Vitamina PP se precipită în mediu neutru cu o soluţie de sulfat de cupru, iar


excesul se determină iodometric.

Reactivi:
1. Soluţie vit. PP: 0,5-1 g la 100 ml
2. Soluţie fenolftaleină 1 g la 100 ml alcool
3. Soluţie NaOH 0,1N
4. Soluţie CuSO4 1 g la 100 ml apă distilată
5. Soluţie HCl 10 g %
6. Soluţie KI 10 g%
7. Soluţie tiosulfat de sodiu 0,01N
8. Soluţie amidon 1 g la 100 ml apă distilată

123
O O
Cu
O O

N N
precipitat albastru

Tehnica de lucru:
Se introduc într-o eprubetă 2,5 ml soluţie de vitamina PP de dozat şi în altă
eprubetă (martor) 2,5 ml apă. În fiecare eprubetă se adaugă NaOH 0,1N, cu
picătura, până la virajul indicatorului fenolftaleină în roz-pal şi apoi câte 2 ml
soluţie de sulfat de cupru 1%. După 30 de minute de repaus se filtrează prin filtru
de hârtie, spălând de 2-3 ori fiecare eprubetă cu câte 2 ml apă şi adunând filtratele
în 2 flacoane Erlenmeyer. În fiecare se adaugă 1 ml HCl 10% şi 2 ml KI 10%.
Iodul eliberat se titrează cu tiosulfat 0,01 N, în prezenţă de amidon până la incolor.

Calcul:
N – ml folosiţi la titrarea martorului
n – ml folosiţi la titrarea probei cu vit. PP

Vit. PP (g/100ml) = (N-n) x 0,002462 x 40

XII.4. REACŢII PENTRU IDENTIFICAREA ŞI DOZAREA


VITAMINEI C

XII.4.1. Identificarea vitaminei C cu azotat de argint


Într-o eprubetă la 1 ml soluţie de acid ascorbic 0,5 % se adaugă 0,5 ml acid
azotic 10 % şi 0,3 ml azotat de argint 2 %, observându-se apariţia unui precipitat
cenuşiu (Ag metalic).

XII.4.2. Identificarea vitaminei C cu nitroprusiat de sodiu


1 ml soluţie de vitamina C 5 % se tratează cu 4 picături de nitroprusiat şi 3
picături de NaOH 10 %, observându-se apariţia unei coloraţii galben-verzui, care la
adăugare de acid acetic 10 % trece în albastru-violet.

XII.4.3. Dozarea vitaminei C prin metoda iodometrică


Reacţiile folosite uzual în scopul evidenţierii şi dozării vitaminei C se
bazează pe proprietăţile sale reducătoare. Acidul ascorbic are proprietatea de a
reduce soluţia de iod 0,01N. Această metodă de dozare a vitaminei C serveşte la
dozarea vitaminei din preparatele farmaceutice şi din extractele vegetale.

124
Reactivi:
1. Soluţie de vitamina C
2. Soluţie de iod 0,01 N
3. Soluţie amidon

Tehnica de lucru:
Într-un balon Erlenmeyer se iau 10 ml soluţie de vitamina C şi se titrează cu
iod în prezenţă de amidon, până la persistenţa culorii albastre. Se notează cu N –
numărul de ml de iod folosiţi la titrare.

Calcul:
Vit. C (mg/100ml) = N x 0,88 x 10

XII.4.4. Dozarea vitaminei C din sânge şi urină prin metoda ROE şi


Kuether

Principiu:
Acidul ascorbic este oxidat în prealabil la acid dehidroascorbic cu ajutorul
noritului (cărbune animal activat). Acidul dehidroascorbic reacţionează cu
2,4-dinitrofenilhidrazina în prezenţa acidului sulfuric formând un compus colorat.

Reactivi:
1. Norit: 100g norit se suspendă în 500 ml HCl 10% se încălzeşte la fierbere şi
se filtrează la vid. Sedimentul se reia cu 50 ml apă distilată şi se filtrează
din nou. Operaţia de spălare se repetă până când filtratul dă o reacţie
negativă sau foarte slabă pentru ionul Fe (III). Se usucă 24 de ore la 110 -
112 0C.
2. Soluţie de acid tricloracetic 7%, ATA.
3. Soluţie etalon de acid ascorbic: 100 mg acid ascorbic se dizolvă în 100 ml
ATA 7%
4. Soluţie tiouree 5,5% în amestec hidroalcoolic (alcool : apă 1:1)
5. Soluţie 2,4-dinitrofenilhidrazină 2% în acid sulfuric 9N
6. Acid sulfuric 9N

Tehnica de lucru:
La 1,5 ml sânge recoltat pe oxalat se adaugă 6 ml ATA şi un vârf de spatulă
de norit. Se agită şi după 10 minute se filtrează.
Urina se diluează cu ATA în proporţie de 1:10. La 0,5 ml urină se adaugă
9,5 ml ATA şi un vârf de spatulă de norit, se agită şi se filtrează după 10 minute.
Proba etalon se obţine tratând 0,5 ml soluţie etalon (reactivul 3) cu 9,5 ml
ATA şi un vârf de spatulă de norit. Se agită şi se filtrează după 10 minute. Filtratul
conţine 50 μg acid ascorbic/ml.

125
În continuare se pregătesc 4 eprubete astfel (Tabelul 1):

Tabel 1. Tehnica dozării vitaminei C din sânge şi urină prin metoda ROE şi
Kuether
Reactivi (ml) E1 E2 E3 M
Filtrat sanguin 2 - - -
Filtrat de urină - 2 - -
Filtrat din soluţia etalon - - 1 -
ATA - - 1 2
Tiouree 2 picături 2 picături 2 picături 2 picături
DNFH 0,5 0,5 0,5 0,5
Eprubetele se ţin 2 ½ ore la 37 0C şi apoi se plasează într-o baie de gheaţă
H 2SO4 85% 2,5 2,5 2,5 2,5

După 20 de minute se citesc extincţiile primelor 3 eprubete faţă de martor.

Calcul:
Ascorbemia (mg%) = 12,5 x E1 / E3
Ascorburia (mg%) = 500 x E2 / E3.

XII.5. REACŢII DE IDENTIFICARE ŞI DOZARE A VITAMINEI B1

XII.5.1. Identificarea vitaminei B1 sub formă de tiocrom


Identificarea vitaminei B1 se bazează pe oxidarea tiaminei sub acţiunea
hexacianoferatului (III) de potasiu în mediu alcalin la tiocrom, compus ce prezintă
o fluorescenţă albastră.

CH3 CH3
+
N N K3[Fe(CN)6] N N
CH2CH2OH CH2CH2OH
H3C N NH2 S H3C N N S

tiamina tiocrom

Reactivi:
1. soluţie de tiamină 1 %
2. hexacianoferat de potasiu 5 %
3. NaOH 10 %
4. HCl 10 %
5. alcool butilic sau amilic

126
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se tratează 1 ml soluţie vitamină B1 cu 0,5 ml NaOH şi
0,5 ml hexacianoferat de potasiu. Se adaugă apoi 1 ml butanol şi se agită puternic.
În stratul alcoolic apare o fluorescenţă albastră care dispare prin acidulare şi
reapare la alcalinizare.

XII.5.2. Dozarea vitaminei B1 prin diazotare


Metoda se bazează pe reacţia de diazotare-cuplare pe care vitamina B1 o dă
cu acidul diazo-benzensulfonic, cu formarea unui compus colorimetrabil. Adaosul
de aldehidă formică sau alcool butilic stabilizează culoarea, în timp ce substanţele
reducătoare (cisteina, ionii de cupru, mercur, argint) deranjează reacţia.

Reactivi:
1. Soluţie de vitamină B1
2. Soluţie etalon de vitamină B1 : 0,2 mg/ml
3. Reactivul diazobenzensulfonic:
Soluţia A: 0,45 g acid sulfanilic se tratează cu 4,5 ml HCl concentrat şi
aproximativ 40 ml apă distilată. Se încălzeşte pe baie de apă până la dizolvare, iar
după răcire se aduce la un volum de 50 ml.
Soluţia B: se prepară extemporaneu prin dizolvarea a 0,9 g NaNO2 în 20 ml apă
distilată.
Soluţia C: se prepară extemporaneu la gheaţă. Se iau 3 ml din soluţia A şi 3 ml
din soluţia B. După 5 minute se completează cu apă la 100 ml.
4. Soluţie alcalină: 100 ml NaOH 1N se amestecă cu 100 ml NaHCO3
5,76 g%.
5. Formol.

Tehnica de lucru:
Se pregătesc 3 eprubete conform tabelului următor (Tabelul 2):

Tabel 2. Tehnica dozării vitaminei B1 prin diazotare


Reactivi (ml) P S M
Soluţie de vitamină B1 0,5 - -
Soluţie etalon de vitamină B1 - 0,5 -
Apă bidistilată - - 0,5
Reactiv C 3 3 3
Soluţie alcalină 7 7 7
Formol 0,2 0,2 0,2

După o oră de repaus se citesc extincţiile probei de dozat şi a standardului


faţă de martor la 530nm.

Calcul:
vitamină B1 (ml/100ml) = Ep / Es x 20

127
Tabel 3. Vitaminele şi implicaţiile lor

VITAMINA FUNCŢIE DEFICIENŢA SEMNE ŞI


SIMPTOME
Acid folic Transferul grupărilor cu un Anemie Anemie
atom de carbon; megaloblastică Malformaţii
Sinteza de metionină, Defecte de tub congenitale
purine şi timidin- neuronal
monofosfat
Vitamina B12 Cofactor pentru reacţii: Anemie Anemie
(cobalamina) Homocisteină → metionină pernicioasă megaloblastică
Metilmalonil CoA → Demenţă Simptome
succinil CoA Degenerare neuro-psihice
medulară
Vitamina C Antioxidant Scorbut Gingivită, gingii
(acid Cofactor pentru reacţii de moi
ascorbic) hidroxilare: Dinţi mobili în
În procolagen: alveole dentare
prolină → hidroxiprolină Vindecare lentă
Lizină → hidroxilizină a plăgilor
Vitamina B6 Cofactor enzimatic mai ales Rară Glosită
(piridoxină, în metabolismul Neuropatie
Piridoxamină, aminoacizilor
piridoxal)
Vitamina B1 Cofactor enzimatic în Beriberi Tahicardie,
(tiamină) catalizarea: Sindromul vărsături,
Piruvat → acetil CoA Wernicke- convulsii
α cetoglutarat → succinil Korsakoff (mai Apatie, pierderi
CoA ales la alcoolici) de memorie,
Ribozo-5-P → xilulozo-5-P nistagmus
Sedoheptulozo-7-P →
gliceraldehid-3-P
Oxidarea aminoacizilor cu
lanţ ramificat
Niacină Transfer de electroni Pelagră Dermatită
(acid Diaree
nicotinic, Demenţă
nicotinamidă)
Vitamina B2 Transfer de electroni Rară Dermatită
(riboflavina) Stomatită
Biotină Reacţii de carboxilare Rară -
Acid Transport de grupări acil Rară -
pantotenic

128
Vitamina A Funcţia reproducătoare Impotenţă Creşterea
(retinol, Funcţia vizuală Cecitate nocturnă pragului vizual
retinal, acid Promovarea creşterii Retard de creştere Uscăciunea
retinoic, β- Diferenţierea şi întreţinerea Xeroftalmie corneei
caroten) ţesuturilor epiteliale
Expresia genică
Vitamina D Absorbţia de calciu Rahitism (la Oase moi,
(colecalciferol, copii) flexibile
ergocalciferol) Osteomalacie (la
adulţi)
Vitamina K γ-carboxilarea restului La nou-născuţi Hemoragie
(menadionă, glutamat din componenţa Rară la adulţi
menachinonă, factorilor de coagulare şi a
filochinonă) altor proteine
Vitamina E Antioxidant Rară Fragilitatea
(α-tocoferol) eritrocitelor
determină
anemie
hemolitică

Probleme:

1. Precizaţi criteriul de clasificare a vitaminelor şi enumeraţi exemplele din


fiecare clasă.

2. Precizaţi reacţiile de identificare şi cele de dozare ale vitaminei C.

3. Precizaţi reacţia de diferenţiere între vitamina D2 şi D3.

129
LUCRAREA 10

XIII. ANALIZA BIOCHIMICǍ A ENZIMELOR

Enzimele sau biocatalizatorii sunt substanţe de natură proteică care au rolul


de a cataliza procesele biochimice ce se desfăşoară în organism.
Principiile generale şi procedeele de preparare a enzimelor în formă pură
sunt cele valabile pentru proteine. Se alege o sursă bogată în enzima care ne
interesează şi se aplică tehnicile cele mai adecvate, exploatând diferenţele între
proprietăţile enzimei şi ale tuturor celorlalţi componenţi prezenţi, între care pot fi
zeci sau sute de alte proteine. De regulă este necesară o succesiune de etape care să
conducă în final la un preparat de puritate avansată, cu un bun randament.
Urmărirea purificării progresive pe parcursul diferitelor faze este condiţionată de
aplicarea unei metode sensibile şi specifice de măsurare cantitativă a activităţii
enzimei respective.
Prima operaţie este eliberarea enzimei în formă solubilă din celula intactă.
Tehnica de degradare a membranelor celulare (prin mijloace mecanice, tratament de
congelare-decongelare, sonicare, liză cu enzime adăugate sau detergenţi) şi
vehiculul se aleg în funcţie de natura şi localizarea enzimei. Extractul astfel obţinut
este supus apoi fracţionării care constituie purificarea propriu-zisă, realizată prin
îndepărtarea diferiţilor contaminanţi micro- şi macromoleculari şi ionici.
În acest scop sunt aplicate o serie de operaţii bazate pe:
- dimensiunile moleculare: dializa, ultrafiltrarea, centrifugarea de zonă, gel
filtrarea;
- solubilitate: precipitări cu săruri neutre, cu solvenţi organici, precipitarea la pHi,
tratament termic;
- încărcare electrică: electroforeza, cromatografia cu schimbători de ioni;
- adsorbţia selectivă: pe coloane de silicagel;
- afinitatea biologică pentru un ligand specific: cromatografia de afinitate.
În prezent, există procedee standard care aplică iniţial tehnicile bazate pe
dimensiunile moleculare şi solubilitate şi apoi separări cromatografice. În final este
adesea posibil să se cristalizeze enzima purificată. Pentru o anumită enzimă,
secvenţa etapelor de purificare se determină experimental, prin analogie cu
metodele folosite la proteine similare.
Fracţionarea este controlată prin testarea activităţii, enzima fiind considerată
pură când se ajunge la o activitate specifică maximă şi constantă. Puritatea este
confirmată de omogenitatea preparatului, stabilitatea prin criterii fizico-chimice
valabile şi pentru alte proteine ca: electroforeza pe gel de poliacrilamidă, analiza de
sedimentare la ultracentrifugare, gel-filtrarea.

130
XIII.1. MODALITĂŢI DE EXPRIMARE ŞI DE DETERMINARE A
ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

În condiţii optime viteza unei reacţii depinde direct proporţional de


cantitatea enzimei care o catalizează. Măsurând viteza reacţiei, cantitatea de substrat
ce se transformă per unitate de timp, obţinem o valoare proporţională cu
concentraţia enzimei. Un asemenea mod de dozare este mult mai comod, (adesea
singurul posibil) decât dozarea cantităţii absolute. Enzimele fiind proteine nu pot fi
deosebite una de alta prin reacţii generale, de exemplu reacţia biuretului.
După modul de exprimare a cantităţii substratului şi respectiv a unităţii de
timp la care se raportează, exprimarea activităţii se face în:
- UI, o unitate internatională de activitate enzimatică fiind cantitatea de enzimă
care transformă 1 mol substrat (10-6 moli) în timp de 1 minut, la 250C, în condiţii
optime de reacţie.
- Pentru enzimele din preparate biologice sau enzime pure, activitatea se
raportează la mg proteină şi se notează cu Act. Specifică.
Activitatea specifică = UI / mg proteină = moli substrat transformat
/min./mg.prot.
- Dacă se cunoaşte greutatea moleculră a enzimei, activitatea enzimatică se
poate exprima în activitate molară sau moleculară sau TN (număr de turnover) =
număr de molecule de substrat transformate de o moleculă de enzimă, respectiv de
un mol de centru activ (dacă enzima are mai mulţi centri activi) pe minut.
- Activitatea enzimatică se poate exprima şi în moli de substrat transformaţi de
enzimă pe secundă, katal (Kat), Kat (moli/sec) sau nKat (nmoli/sec).
Pentru determinarea experimentală a activităţii enzimatice e necesară
respectarea următoarelor condiţii:
- menţinerea constantă şi optimă a pH-ului şi temperaturii mediului de reacţie;
- substratul să fie în concentraţie saturată pentru ca viteza de reacţie să nu
depindă de concentraţia de substrat (V = Vmax);
- să fie prezenţi în mediul de reacţie coenzime şi metale necesare activităţii
enzimatice, în concentraţii saturate ca să nu fie factori limitanţi de viteză.
În aceste condiţii activitatea enzimatică şi viteza reacţiei enzimatice depind
numai de concentraţia de enzimă şi ca atare se poate determina cantitativ.
Pentru determinarea experimentală a activităţii enzimatice se utilizează
metodele colorimetrice care prezintă avantajul de a fi simple, rapide şi precise.
În principiu se urmăreşte variaţia extincţiei în timp (E/min), care conform legii lui
Lambert-Beer este proporţională cu C/min, deci tocmai cu activitatea enzimatică.
E  cd

E / min
c / min 
sd

Unde:  = coeficientul mM de extincţie.

131
Pentru a putea urmări o reacţie enzimatică prin variaţia E/min este necesar
ca substratul sau produsul de reacţie să fie colorat sau să absoarbă în UV.

XIII.2. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ENZIMATICE A


COLINESTERAZEI SERICE NESPECIFICE

Colinesterazele sunt enzime din clasa hidrolazelor, subclasa esteraze.


După mecanismul de acţiune sunt serin-hidrolaze.
Se cunosc două enzime:
- Acetilcolinesteraza, cu o specificitate strict pentru acetilcolină, este
prezentă în diferite ţesuturi, mai cu seamă în eritrocite şi creier şi are un rol major
în transmiterea influxului nervos. Prezenţa în eritrocite şi în alte ţesuturi este legată
de rolul enzimei în permeabilitatea celulară.

+ AcChE
(CH3)3N - CH2 - CH2 - O - OC - CH3
+
(CH3)3N - CH2 - CH2 - OH + CH3COOH

- Acilcolinacilhidrolaza sau colinesteraza nespecifică (pseudocolin-


esteraza) hidrolizează nespecific esterii de colină:

+ ChE +
(CH3)3N - CH2 - CH2 - O - OC - R (CH3)3N - CH2 - CH2 - OH + R - COOH

Dozarea acestei enzime în ser (valoare normală: 3-8 U/ml ser) are valoare
diagnostică în laboratorul clinic:
- este un indicator preţios în depistarea intoxicaţiilor cu organofosforice când
activitatea enzimei scade până la 10% din valoarea normală;
- în insuficienţa hepatică (ciroză) este, de asemenea, scăzută datorită capacităţii
reduse de biosinteză proteică a ficatului.

Principiu:
Pentru vizualizarea produşilor de reacţie se utilizează un analog de substrat:
butiriltiocolina (un atom de O este înlocuit cu S) care prin hidroliză enzimatică în
prezenţa de ChE pune în libertate tiocolina; aceasta formează cu DTNB (reactiv de
culoare pentru grupările SH) un compus colorat cu maxim de absorbţie la 412 nm
(mM = 13,6).

132
+ ChE
(CH3)3N - CH2 - CH2 - S - OC - (CH2)2 - CH3
+
(CH3)3N - CH2 - CH2 - SH + HOOC - (CH2)2 - CH3

COOH

S NO2
+
(CH3)3N - CH2 - CH2 - SH +
S NO2

COOH

HOOC COOH

+
O2N S - CH2 - CH2 - N(CH3)3 + HS NO2

Reactivi:
1. Soluţie substrat: butiriltiocolină 10 mM în tampon fosfat 20 mM pH =7,8
2. Ser dil.1/100;
3. Reactiv de culoare: DTNB 0,2 mM în tampon fosfat 20 mM, pH = 7 şi
etanol 1:1.

Tehnica de lucru:
În 2 eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 1):

Tabel 1. Tehnica determinării activităţii enzimatice a colinesterazei serice


nespecifice
Reactivi (ml) P M
Soluţie substrat 0,2 0,2
Ser diluat 1/100 0,2 -
Se incubează 10 minute
Reactiv de culoare 2,0 2,0
Apă distilată - 0,2

Se citeşte E412nm probei faţă de martor.

133
Calcul:
E / min
UI / ml ser  moli substrat / min/ ml ser   dil .serului 
E412nm
E412nm 2400
x  8,8  E412nm
136 2

Pentru determinarea activităţii specifice se dozează şi proteina din serul


respectiv prin metoda Gornall astfel:

Tehnica de lucru:
În două eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 2):

Tabel 2. Tehnica dozării proteinei prin metoda Gornall


Reactivi P M
Ser diluat 1/100 1,0 -
Apă distilată - 1,0
Reactiv Gornall 4,0 4,0

După 15 minute se citeşte extincţia probei la 540 nm faţă de martor.

Calcul:
mg prot / ml ser  100E540. A
A = inversul coeficientului de pantă stabilit la curba de dozare a proteinelor.
C
A
E

Activitatea specifică a ChE serice va fi egală cu:


UI / ml ser
mg prot / ml ser

XIII.3. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII TRANSAMINAZELOR

Transaminazele sunt enzime care catalizează reacţii de transaminare.


Reacţiile de transaminare decurg după un mecanism numit: ping - pong. Acest tip
de mecanism cinetic se caracterizează prin aceea că unul dintre substrate se leagă
de enzimă, căreia îi produce o modificare chimică prin transferul unei grupe
aminice, iar produsul realizat din transferul acestui substrat este îndepărtat.
Urmează apoi legarea celui de al doilea substrat pe enzimă, substrat care acceptă
gruparea funcţională de la enzimă formând al doilea produs care este şi el eliberat.
Modificarea chimică este de fapt suportată de către coenzimă având loc o tranziţie

134
reversibilă între PALPO şi piridoxamin fosfat. În reacţiile de transaminare are loc
transferul unei grupări aminice donor pe un -cetoacid acceptor.

XIII.3.1. Determinarea activităţii GPT

Transaminaza glutamico-piruvică (GPT), denumită şi alaninamino-


transferază (ALT, ALAT) catalizează reacţia de transfer a grupării amino de la
alanină la acidul -cetoglutaric, rezultând acid piruvic şi acid L-glutamic:
GPT
H3C - CH - COOH + HOOC - CH2 - CH2 - C - COOH
NH2 O
H3C - C - COOH + HOOC - CH2 - CH2 - CH - COOH
O NH2

Pentru a doza GPT se lasă să reacţioneze serul de analizat asupra


-cetoglutaratului şi alaninei în soluţie tampon. Cantitatea de piruvat se determină
spectrofotometric sub formă de 2,4 – dinitrofenilhidrazonă.

Reactivi:
1. Soluţie tampon-substrat (tampon fosfat 100 mM pH=7,4; D-L alanina
200 mM; acid -cetoglutaric 2 mM);
2. Reactiv de culoare: 2,4-dinitrofenilhidrazină 1 mM;
3. Soluţie NaOH 0,4 N.

Tehnica de lucru:
În două eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 3):

Tabel 3. Tehnica determinării activităţii GPT


Reactivi (ml) P M
Soluţie tampon-substrat 0,5 0,5
Ser proaspăt nehemolizat 0,1 -
Apă distilată - 0,1
o
Se agită şi se incubează 30 de minute la 37 C, apoi se adaugă:
Reactiv de culoare 0,5 0,5
Se agită şi se lasă la temp. camerei 20 de minute, după care se adaugă:
NaOH 0,4N 5,0 5,0

Se agită şi după 5 minute se citeşte extincţia probei faţă de martor


(la 546 nm), în cuvă de 1 cm (Tabelul 4).
Dacă extincţia depăşeşte valoarea de 0,375 se diluează serul 1:10 şi se repetă
determinarea în condiţiile de mai sus.

135
Tabel 4. Corespondenţa între valoarea E546nm şi activitatea enzimatică (mU)
E546nm mU/ml E546nm mU/ml
0,025 2 0,200 29
0,050 5 0,225 34
0,075 9 0,250 39
0,100 12 0,275 45
0,125 16 0,300 52
0,125 16 0,300 52
0,175 24 0,350 68
0,375 77

Valorile normale în ser sunt 2-16,5 mU/ml ser.

XIII.3.2. Determinarea activităţii GOT

Transaminaza glutamico-oxalacetică (GOT), denumită şi


aspartataminotransferază (AST, ASAT), catalizează transferul grupării amino de la
acidul L-aspartic la acidul -cetoglutaric, rezultând acid L-glutamic şi acid
oxalilacetic.
Reacţiile care au loc sunt următoarele:

GOT
HOOC - CH2 - CH - COOH + HOOC - CH2 - CH2 - C - COOH
NH2 O

HOOC - CH2 - C - COOH + HOOC - CH2 - CH2 - CH - COOH


O NH2

HOOC - CH2 - C - COOH CH3 - C - COOH + CO2


O O

Pentru a doza GOT se lasă să reacţioneze serul de analizat asupra


-cetoglutaratului şi aspartatului în soluţia tampon.
Piruvatul rezultat în urma reacţiilor de mai sus, reacţionează cu
2,4-dinitrofenilhidrazină în mediu alcalin şi formează 2,4-dinitrofenilhidrazonă de
culoare roşie care se determină spetrofotometric la 546 nm.

Reactivi:
1. Soluţie tampon-substrat pH 7,4;
2. Reactiv de culoare: 2,4-dinitrofenilhidrazină 1 mM;
3. Soluţie NaOH 0,4 N.

136
Tehnica de lucru:
În două eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 5):

Tabel 5. Tehnica determinării activităţii GOT


Reactivi (ml) P M
Soluţie tampon-substrat 0,5 0,5
Ser proaspăt nehemolizat 0,1 -
Apă distilată - 0,1
o
Se agită şi se incubează 30 de minute la 37 C, apoi se adaugă:
Reactiv de culoare 0,5 0,5
Se agită şi se lasă la temp. camerei 20 de minute, după care se adaugă:
NaOH 0,4N 5 5

Se agită eprubetele, iar după 5 minute se citeşte extincţia probei faţă de


martor la 546 nm în cuva de 1 cm (Tabelul 6).
Dacă extincţia depăşeşte valoarea de 0,260 se diluează serul 1:10 şi se repetă
determinarea în condiţiile de mai sus.

Tabel 6. Corespondenţa între valoarea E546nm şi activitatea enzimatică (mU)


E546nm mU/ml E546nm mU/ml
0,020 4 0,160 34
0,040 8 0,180 40
0,060 11 0,200 48
0,080 16 0,220 57
0,100 19 0,240 67
0,120 24 0,260 80
0,140 28

Dacă citirile nu se pot executa la 546 nm se face o curbă de etalonare a


piruvatului.
Valorile normale în ser sunt 2-20 mU/ml.

137
Interpretarea rezultatelor

GOT:
- Creşteri marcate (de 10-100 ori faţă de valorile normale) se observă în:
- infarctul miocardic, creşterile apar după 4 ore de la debutul bolii, cu un
maxim la 24-48 ore şi revenirea la normal în 4-7 zile.
- hepatită virală acută,
- necroză toxică a ficatului.
- Creşteri moderate se observă în:
- evoluţia hepatitelor cronice,
- ictere mecanice,
- mononucleoză infecţioasă,
- anemii hemolitice severe
- leziuni musculare accidentale şi în distrofia musculară progresivă

GPT:
- Creşteri marcate (de aproape 100 ori faţă de valorile normale) apar în:
- hepatita virală acută
- necroza toxică a ficatului.
- Creşteri moderate apar în:
- hepatita cronică şi ciroze,
- ficatul de stază cardiacă,
- mononucleoza infecţioasă.

Raportul GOT/GPT se numeşte coeficient DE RITTIS = 1,33 la subiecţii


normali. Acest raport:
- scade în leziunile inflamatorii ale ficatului datorită creşterii marcante a GPT.
- leziunile necrotice duc la creşterea GOT, iar raportul GOT/GPT creşte.
- hemoliza duce la creşteri ale GOT-ului.

XIII.4. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII


γ-GLUTAMILTRANSPEPTIDAZEI SERICE

Principiu:
-Glutamiltranspeptidaza (-GT) catalizează transferul acidului glutamic de
pe un donor (-glutamil-p-nitroanilidă), pe un acceptor (glicilglicină). În urma
reacţiei se formează p-nitroanilină colorată în galben (mM = 9,9).

Reactivi:
1. Substrat în Tris –HCl;
2. Ser de analizat;
3. Acid acetic 1N.

138
O 2N NH - C = O + CH2 - COOH
(CH2)2 NH - C = O
CH - NH2 CH2 - NH
COOH

O 2N NH2 + CH2 - COOH


NH - C = O
CH2 - NH
C=O
(CH2)2
CH - NH2
COOH

Tehnica de lucru:
Pentru fiecare determinare se pregătesc 2 eprubete în care se introduc
(Tabelul 7):

Tabel 7. Tehnica determinării activităţii γ-glutamiltranspeptidazei serice


Reactivi (ml) M P
Substrat Tris în HCl 0,30 0,30
Ser - 0,02
o
Se incubează la 25 C timp de 20 de minute, apoi se adaugă:
Acid acetic 1N 1,50 1,50
Ser 0,02 -

Se citeşte extincţia probei faţă de martor la 405 nm după 30 de minute de la


adăugarea ultimului reactiv.

Calcul:
1 UI este cantitatea de enzimă care catalizează transferul a 1 mol de acid
glutamic de pe un donor pe acceptor la temperatura de 250C în timp de 1 minut.
Activitatea enzimei serice se exprimă în U/L.
Activitatea -GT ( U/L ) = 460 x E405/20 minute

Interpretarea rezultatelor
Valori normale:
6 - 28 U/L la bărbaţi;
4 - 18 U/L la femei.

139
Testul -GT este folosit în diagnosticul suferinţelor hepatice, fiind mult mai
sensibil decât fosfataza alcalină pentru depistarea formelor de colestază şi este
singurul test enzimatic pentru decelarea hepatopatiilor alcoolice.
Valori crescute se întâlnesc şi în:
- alcoolism;
- hepatite cronice;
- neoplasm primitiv sau metastazic al ficatului;
- insuficienţă cardiacă cu stază hepatică;
- leziuni pancreatice;
- administrare de barbiturice.

XIII.5. DETERMINAREA LACTAT DEHIDROGENAZEI (LDH)

Lactatdehidrogenaza se găseşte în cantităţi mari la nivelul muşchiului striat,


ficat, miocard, rinichi şi în cantităţi mai reduse în pancreas, eritrocite şi plămâni.
LDH prezintă 5 izoenzime, repartizate diferit în ţesuturi. LDH 1 predomină în
muşchiul cardiac, în timp ce LDH 5 în ficat şi muşchii scheletici. Valoare
diagnostică specifică o au modificările izoenzimatice. Creşteri ale LDH 1 şi LDH 2
se întâlnesc în infarctul miocardic şi anemie, iar a LDH 4 şi LDH 5 în leziuni
hepatice şi procese neoplazice.

Determinarea LDH serică


Principiu:
În condiţii de anaerobioză, piruvatul este redus la lactat sub acţiunea lactat
dehidrogenazei (LDH). NADH+H+ utilizat pentru acest proces reductiv este
rezultat din dehidrogenarea gliceraldehidei-3 fosfat (GA-3-P).
Se incubează reactivul ce conţine piruvatul şi NADH+H+ cu enzima din ser
la pH = 7,4 sau reactivul lactat şi NAD cu enzima din ser la pH = 9.
Se urmăreşte scăderea absorbţiei la 340 nm în primul caz sau creşterea absorbţiei în
al doilea caz.
Piruvat + NADH+H+ → L-lactat + NAD+

Reactivi :
1. Reactiv 1:
- tampon Tris 80 mmol/l, pH=7,5
- NaCl 200 mmol/l
- piruvat 1,6 mmol/l
2. Reactiv 2 : NADH 0,200 mmol/l
3. Ser diluat 1:5 cu apă distilată
Pentru prepararea reactivului de lucru se amestecă reactivul 1 cu reactivul 2 în
raport volumetric 1:1. Stabilitatea reactivului de lucru este de 3 zile la 20-25°C sau
de 3 saptămâni la 2-8°C.

140
Tehnica de lucru :
În cuva spectrofotometrului se introduc reactivii conform tabelului 8:

Tabel 8. Tehnica dozării lactat dehidrogenazei


Reactivi Proba
Reactiv de lucru 1000 µl
Ser(diluat 1:5) 200 µl

Se citeşte extincţia inţială la 340 nm şi se porneşte simultan cronometrul.


Se citeşte din nou extincţia după 1, 2 şi 3 minute. Se calculează ΔE/minut.

Calcul:
LDH UI/l = ΔE/minut x 4127 x 5

Valori normale : 138-276 UI/l


Creşteri apar în :
- infarct miocardic acut;
- hepatita virală;
- boli ale musculaturii scheletice;
- mononucleoza infecţioasă;
- afecţiuni neoplazice.

XIII.6. DETERMINAREA CREATINFOSFOKINAZEI (CK)

Creatinfosfokinaza (CK) împreună cu izoenzima sa MB sunt printre cei mai


folosiţi markeri serici de necroză miocardică pentru practica medicală. Creşterea
enzimei este rapidă după instalarea infarctului miocardic. Enzima are trei
izoenzime: BB (izoenzima cerebrală), MB (izoenzima din muşchiul cardiac) şi MM
(izoenzima principală din musculatura scheletică).
Enzima creşte în ser la 4-8 ore de la debutul necrozei, atinge un maxim la
24-36 ore şi revine la normal în 3-5 zile. O determinare succesivă la interval de 12
ore în primele 2 zile şi apoi zilnic până la normalizare poate realiza o estimare
semnificativă a mărimii necrozei în numeroase cazuri.
Deoarece metodele de dozare presupun utilizarea unor reactivi foarte
costisitori se preferă achiziţionarea de truse-kit de la firmele producătoare mari
care permit efectuarea unui număr mai mare de determinări.

Valori normale : - bărbaţi: 20-70 U/l;


- femei: 10-50 U/l.

141
Variaţii patologice: creşteri ale activităţii CK:
- infarct miocardic acut;
- distrofie musculară;
- în leziuni cerebrale (pe seama izoenzimei BB provenită din creier);
- efort fizic intens.

Probleme:

1. Creşteri marcate ale GOT apar în:


a) infarctul miocardic acut
b) hepatita virala acută
c) ficatul de stază cardiac

2. Enumeraţi situaţiile patologice în care cresc valorile enzimei gama GT.

3. Care sunt cele 3 izoenzime ale creatinfosfokinazei?

142
LUCRAREA 11

XIV. FOSFATAZA ALCALINǍ ŞI ACIDǍ

XIV.1. DETERMINAREA EXPERIMENTALĂ A ACTIVITĂŢII


FOSFATAZEI ALCALINE ŞI ACIDE

Activitatea enzimatică este dependentă de pH-ul mediului în care îşi


desfăşoară activitatea. Dacă se reprezintă grafic variaţia activităţii enzimatice în
funcţie de pH se obţine o curbă în clopot cu un maxim caracteristic pentru fiecare
enzimă, maxim care reprezintă pH-ul optim. Sub sau peste pH-ul optim activitatea
enzimelor scade mult, cunoaşterea pH-ului optim fiind aşadar obligatorie atunci
când se măsoară activitatea unei enzime.
Un exemplu interesant în acest sens îl oferă fosfatazele, enzime din clasa
hidrolazelor, subclasa esteraze. Fosfatazele sunt fosfomonoesteraze care catalizează
reacţii de tipul:
R - OPO3H2 + H2O R - OH + H3PO4

Se cunosc fosfataze care diferă prin pH-ul optim de acţiune:


- fosfataza alcalină cu pH optim de 10,45;
- fosfataza acidă cu pH optim de 4,8.
Pentru determinarea diferenţiată a activităţii acestor două enzime trebuie să
se lucreze la pH-ul optim respectiv.

Principiu:
Determinarea activităţii celor două enzime în laborator se bazează pe
proprietatea lor de a hidroliza esterii fosforici. Ca substrat se utilizează un produs
artificial: esterul acidului fosforic cu p-nitrofenolul (p-nitrofenilfosfatul). Acest
ester incolor este hidrolizat de o enzimă cu punerea în libertate a p-nitrofenolului,
colorat în galben în mediu alcalin.

O2N OPO3H2 + H2O O2N OH + H3PO4

Se urmăreşte variaţia activităţii fosfatazelor serice la diferite pH-uri şi se


reprezintă grafic activitatea enzimatică în funcţie de pH.

143
Reactivi:
1. Soluţie de substrat în tampoane de diferite pH-uri
2. Ser
3. NaOH 0,02 N

Tehnica de lucru:
Se pregăteşte o serie de 12 eprubete în care se introduc următorii reactivi
(Tabelul 1):

Tabel 1. Tehnica determinării activităţii fosfatazelor serice la diferite pH-uri


Epr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH 3,5 4.0 4,5 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 10,5 11,0 -
Apă dist. - - - - - - - - - - - 1,0
Tampon 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 -
Ser 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Se incubează 20 min. la temperatura camerei, după care se adaugă:
NaOH 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Se citeşte extincţia la 405 nm şi se calculează activitatea enzimatică în U/l.


Se reprezintă grafic U/l în funcţie de pH. Maximele de activitate reprezintă
activitatea fosfatazică a serului respectiv. Rezultatele se interpretează comparându-
le cu valorile normale.

E405nm / min
U /l  ser  43,2  E 405nm
nM

XIV.2. DETERMINAREA FOSFATAZEI ALCALINE (FA)

Prin denumirea de fosfatază alcalină sunt cuprinse un grup de enzime


(fosfataze), care transferă o grupare fosfat de la un ester fosforic formându-se un
alcool şi un al doilea ester fosforic.
Activitatea optimă a acestor fosfataze este în jurul valorii de pH=10 şi
necesită Mg2+ şi Zn2+ pentru stabilitate şi activitate maximă. Inhibitorii naturali par
să fie Ca2+, fosfaţi anorganici, substanţe ce conţin grupări –SH (cisteina, glutationul
redus), fluoruri. Majoritatea tampoanelor folosite cresc mult viteza de reacţie a FA,
acţionând ca acceptor de grupări fosfat printr-o reacţie de transfosforilare.
Necunoscându-se substratul natural, pentru măsurarea activităţii FA se foloseşte p-
nitrofenilfosfat sau α-naftol monofosfat.
Nu se pot folosi decât serul sau plasma heparinizată deoarece alţi coagulanţi
inhibă FA prin complexarea magneziului.
Determinarea activităţii FA se face în prezent cu truse kit care au la bază
metoda colorimetrică cu p-nitrofenilfosfat.

144
Principiu:
Se determină colorimetric cantitatea de p-nitrofenol rezultată prin acţiunea
enzimei asupra p-nitrofenilfosfatului utilizat ca substrat.

Reactivi:
1. Soluţie tampon-substrat cu pH=10,5: tampon glicocol 0,05 M, MgCl2
0,0005 M, p-nitrofenilfosfat 0,0055 M. Se dizolvă 375 mg glicocol, 10 mg
MgCl2·6H2O şi 165 mg p-nitrofenilfosfat sare de sodiu în 42 ml NaOH 0,1N;
2. NaOH 0,02 N;
3. Soluţie p-nitrofenol 5.10-5 M. Se dizolvă 695 mg p-nitrofenol în 1000 ml
NaOH 0,02N. 10 ml din această soluţie se diluează cu NaOH 0,02N la 1000 ml.

Tehnica de lucru:
În 2 eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 2):

Tabel 2. Tehnica dozării fosfatazei alcaline


Reactivi Probă Martor
Soluţie tampon-substrat 0,2 ml 0,2 ml
Ser proaspăt 0,1 ml -
Se agită şi se incubează 30 de minute la 370C, după care
se adaugă următorii reactivi:
NaOH 0,02N 2,5 ml 2,5 ml
Ser - 0,1 ml

Se citeşte Ep faţă de martor la 405 nm în cuve de 1 cm.

Calcul:
Activitatea FA se obţine din tabelul 3 sau din următoarea formulă de calcul:

mU / ml  200E 405nm

Dacă E405nm depăşeşte valoarea de 0,780 se lucrează cu ser diluat în


proporţie de 1:10.

Valori normale:
- adult: 20-40 mU/ml;
- copil: 38-138 mU/ml.

145
Tabel 3. Corespondenţa între valoarea E405nm şi activitatea enzimatică (mU)
E405nm mU E405nm mU E405nm mU
0,050 10 0,280 56 0,540 108
0,060 12 0,300 60 0,560 112
0.070 14 0,320 64 0,580 116
0,080 16 0,340 68 0,600 120
0,090 18 0,360 72 0,620 124
0,100 20 0,380 76 0,640 128
0,120 24 0,400 80 0,660 132
0,140 28 0,420 84 0,680 136
0,160 32 0,440 88 0,700 140
0,180 36 0,460 92 0,720 144
0,200 40 0,480 96 0,740 148
0,220 44 0,500 100 0,760 152
0,240 48 0,520 104 0,780 156
0,260 52

XIV.2.1. Fosfataza alcalină serică


Determinarea FA serice constituie un test curent în laboratorul clinic.
FA este prezentă în majoritatea ţesuturilor: căi biliare, oase, ficat, intestin,
rinichi, plasmă, placentă, glande mamare.
FA plasmatică este alcătuită în principal din izoenzimele hepatobiliară,
osoasă, şi în cantităţi mici cele intestinală, renală, la care se adaugă în timpul
sarcinii o formă tranzitorie (forma placentară). La adulţi predomină forma hepato-
biliară.
Enzima este localizată la nivelul membranei celulare, fiind implicată în
mecanismele de transport ale metaboliţilor prin membrană. Participă la absorbţia
lipidelor şi a calciului. Sub acţiunea FA intestinale, compuşii care traversează
membrana intestinală sub formă fosforilată sunt defosforilaţi pentru a trece în
circulaţia sangvină.
Deşi se poate face o evaluare rezonabilă în privinţa originii hepatice sau
non-hepatice a creşterii FA utilizând doar date clinice, există şi metode biochimice
ce pot face diferenţierea între izoenzime. Separarea se poate face:
- Electroforetic: migrează în general în zona α2;
- Inactivare prin căldură (cea din os mai rapid);
- Inhibare chimică cu uree.

Recomandări pentru determinarea FA


Determinarea FA este de obicei folosită pentru diagnosticul diferenţial al
bolilor hepatice.
Altă arie de utilizări clinice include afecţiunile osoase, fiind la ora actuală
singura enzimă cu importanţă practică pentru patologia ţesutului osos, şi in

146
hiperparatiroidism. În tumorile de diverse etiologii FA are valoare de marker
tumoral (depistarea metastazelor hepatice sau osoase).

Creşteri ale valorile FA:


FA hepato-biliară:
- secretată de celulele care mărginesc canalele biliare;
- creşterea ei marcată în plasmă e caracteristică pentru sindromul colestatic:
obstrucţia mecanică a căilor biliare extrahepatice sau în colestaza intrahepatică;
- o creştere de 10 ori - în cancer de cap de pancreas
- litiaza coledociană
- hepatita colestatică medicamentoasă
- o creştere de 5-20 ori - în ciroza biliară primitivă
- carcinoame hepatice primare sau metastatice
- creşteri uşoare/moderate (de 2 ori normalul) - în hepatita virală
- ciroză
- creşteri de până la 5 ori normalul - în mononucleoza infecţioasă
- în infecţia cu citomegalovirus
- în ingestia cronică de alcool FA poate avea valoare normală/crescută, sunt însă
constant crescute γ-GT, AST (GPT) şi eventual, bilirubina;
- valori crescute mai pot apărea în boli hepatice de cauza infiltrativă:
- sarcoidoza
- tuberculoza
- amiloidoza
- abcese.
FA osoasă:
- are originea în osteoblaste;
- creşte în afecţiuni osoase însoţite de procese reparatorii prin activitatea
osteoblastelor;
- hiperparatiroidism - creştere moderată care nu apare înaintea modificărilor
scheletice
- apare şi hipercalcemia şi hiperfosfatemia
- hipertiroidism;
- boala Paget – creştere marcată, dar calciul şi fosforul au valori normale;
- tumori osoase;
- metastaze osoase;
- osteomalacie;
- rahitism – creşterea apare înainte de manifestările clinice;
- în evoluţia fracturilor multiple.

FA placentară: - apare în săptămânile 16-20 ale unei sarcini normale, crescând


până la nivelul maxim (de 2 ori normalul) la debutul travaliului.
FA intestinală: - în diverse afecţiuni ulcerative ale tractului gastrointestinal;
- malabsorbţie severă;
- infarct intestinal.

147
Valori crescute în neoplasme: ocazional tumorile (în special hipernefromul) pot
produce o FA identică sau similară cu forma placentară (izoenzimă Regan)

Scăderi ale valorilor FA:


- hipofosfatazia familială (deficit genetic în mineralizarea oaselor cu eliminare
crescută a fosforului);
- hipotiroidism, cretinism;
- malnutritie: deficit de zinc, deficit de magneziu;
- intoxicaţie cu beriliu (inactivează ionii de magneziu);
- scorbut;
- femeile aflate în post menopauză cu osteoporoză care urmează tratament
estrogenic substitutiv.

XIV.3. FOSFATAZA ACIDĂ SERICĂ

Hidrolizează esterii fosforici la un pH acid = 4,5 - 4,9.


Enzima este localizată la nivelul diferitelor organe:
- prostată – 1/3 din cantitatea totală, activitatea enzimei fiind de aproximativ 100 de
ori mai mare decât în celelalte ţesuturi;
- oase;
- ficat;
- splină;
- rinichi;
- măduvă osoasă;
- elemente figurate;
- glande endocrine.
Activitatea enzimei este inhibată de: - temperatură > 37oC
- pH > 7
- fluoruri
- oxalat
Izoenzima prostatică este foarte labilă la temperatura camerei, de aceea
recoltarea şi păstrarea se face pe gheaţă.

Valoarea normală: până la 11 U/l

Creşteri:
- Manopere - tuşeul rectal;
- masajul prostatic;
- biopsia prostatică;
- rezecţia transuretrală de prostată;
- cateterismul vezical;
- cistoscopia.

148
- Cancerul de prostată metastazat când tumora depăşeşte capsula prostatică.
! Deoarece fosfataza acidă prostatică nu prezintă valori crescute în stadiile
precoce ale cancerului de prostată, acest test nu se recomandă în scop de screening;
! Screening – PSA (Prostatic Specific Antigen): valoare normală < 4 ng/ml
- Metastaze osoase ale tumorilor de:
- colon;
- mamare;
- corticosuprarenale;
- pulmonare.
- Distrugerea trombocitelor - tromboze;
- trombastenie;
- embolie pulmonară.
- Leucemie granulocitară
- Boli genetice determinate de deficienţe ale unor enzime lizozomale
- boala Gaucher;
- boala Nieman – Pick.

Probleme:

1. Următoarele afecţiuni pot reprezenta cauze de creştere a activităţii fosfatazei


acide, cu excepţia:
a. cancerul de prostată metastazat
b. cancerul de cap de pancreas
c. metastaze osoase ale tumorilor mamare
d. leucemia granulocitară

2. În care din următoarele afecţiuni fosfataza alcalină nu creşte:


a. rahitism
b. boala Paget
c. sarcoidoză
d. scorbut

3. Izoenzima Regan este identică cu fosfataza alcalină – forma:


a. hepato-biliară
b. intestinală
c. placentară
d. osoasă

149
LUCRAREA 12

XV. ANALIZA BIOCHIMICĂ A GLUCIDELOR

Glucidele sau zaharurile sunt compuşi polihidroxicarbonilici ce conţin în


structura lor o grupare funcţională carbonil (aldehidă sau cetonă) şi două sau mai
multe grupări funcţionale hidroxilice. Astfel, glucidele pot fi polihidroxialdehide
(aldoze, ex. glucoza) sau polihidroxicetone (cetoze, ex. fructoza).

Exemplu:
CH2OH-(CHOH)n-CH=O – aldoză (exemplu glucoza, n = 4)
CH2OH-(CHOH)n-CO-CH2OH – cetoză (exemplu fructoza, n = 3)

Datorită prezenţei în moleculă a atomilor de carbon asimetrici există izomeri


optici: enantiomer dextrogir (D) şi levogir (L). Gruparea funcţională aldehidică sau
cetonică poate să formeze cu o grupare alcoolică un semiacetal, rezultând astfel
configuraţia ciclică de furan sau piran.

După numărul atomilor de carbon din moleculă distingem:


trioze (3C), tetroze (4C), pentoze (5C), hexoze (6C) etc.

150
În organism glucidele îndeplinesc funcţii multiple:
- sunt surse nemijlocite de energie (oxidarea glucozei);
- au rol de substanţe de rezervă (glucoza poate constitui depozite de energie sub
formă de glicogen hepatic şi muscular, la animale şi om, sau amidon la plante);
- îndeplinesc roluri de substanţe structurale şi de susţinere (polizaharidele intră în
structura ţesuturilor conective ale matricei osoase la animale);
- au funcţii specifice: mucopolizaharidele intră în structura substanţelor de grup
sangvin, participă la procesele imunitare, intră în structura heparinei.

Identificarea şi dozarea glucidelor se bazează pe reacţiile grupelor


funcţionale (carbonil şi hidroxil), pe interacţiile dintre acestea şi pe unele
caracteristici ale moleculei întregi. Astfel, glucidele pot să participe la următoarele
tipuri de reacţii: de culoare, de condensare, epimerizare şi reducere.
Sub acţiunea acizilor minerali concentraţi (la cald), prin pierderea a 3
molecule de apă, pentozele se transformă în furfural, metilpentozele în
metilfurfural, hexozele în hidroximetilfurfural.

Glucoză Hidroximetilfurfural (HMF)

Polizaharidele şi dizaharidele suferă o hidroliză prealabilă la monozaharide,


care se comportă în continuare ca şi monozaharidele. Compuşii furfuralici formaţi
se condensează cu diferiţi polifenoli cu formarea unor produşi coloraţi care permit
identificarea şi/sau diferenţierea glucidelor.

151
XV.1. Reacţia Podobev- Molisch - Udransky

Glucidele de interes biologic formează în prezenţă de H2SO4 concentrat


derivaţi furfuralici care se condensează cu α-naftolul cu formarea unor compuşi
coloraţi în violet.

OH
HOHC - CHOH
H2SO4 + 2
R - HC CH - CHO R CHO -H2O
-3H2O O
HO OH

OH OH OH OH

ox
CH C

O O

R R

Reactivi:
1. Glucoză 1%, zaharoză 1% etc.
2. Soluţie de α-naftol în alcool etilic (proaspăt preparată);
3. H2SO4 concentrat.

Tehnica de lucru:
Se iau într-o eprubetă 2-3 picături soluţie de glucoză 1%, se adaugă 5
picături soluţie de α-naftol şi se agită conţinutul eprubetei. Se toarnă încet, cu
atenţie, pe peretele interior al eprubetei aproximativ 1 ml H2SO4 conc. La nivelul
de separare a celor două lichide se formează un inel violet.

Observaţii:
Reacţia se datorează compuşilor care conţin în moleculă lor oze, cum sunt
de ex. nucleoproteidele, mucoproteidele etc.
Inelul de culoare violetă (caracteristic) poate fi însoţit sau să fie substituit
cu inele de culori diferite, de ex.:
- inel verde, cauzat de acţiunea acidului asupra α-naftolului;
- inel alb, în cazul prezenţei proteinelor care precipită în mediu acid;
- inel roşu, datorat unor substanţe organice cu alte structuri.

152
XV.2. REACŢII DE DIFERENŢIERE A ALDOZELOR ŞI
CETOZELOR

XV.2.1. Reacţia cu resorcină (Reacţia Selivanoff)


În prezenţa HCl 1:1 (1 parte HCl conc + 1 parte apă distilată) zaharurile
formează compuşi furfuralici care prin condensare cu resorcină formează compuşi
de tipul trifenilmetanilor, coloraţi în roşu. Reacţia este mai rapidă în cazul
cetozelor, comparativ cu aldozele, fapt ce permite diferenţierea lor. Reacţiile care
au loc sunt următoarele:

HO OH
ALDOZA R CH=O + 2
O -H2O

OH OH

R O R O
O O

OH O

Reactivi:
1. Reactiv Selivanoff: se dizolvă 0,1g resorcină în 100 ml HCl 1:1
2. Fructoză 1% sau zaharoză 1%;
3. Glucoză 1%, arabinoză 1%.

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se pun 2 picături soluţie de glucoză 1% şi în alta 2 picături
soluţie de fructoză sau zaharoză. Se adaugă în ambele eprubete câte 2 ml reactiv
Selivanoff şi se aşează într-o baie de apă la 30-600C timp de 15 minute sau se
încălzeşte uşor direct în flacară.
În eprubeta cu aldoză apare o coloraţie slab roz, galbenă sau soluţia rămâne
incoloră, în timp ce în eprubeta cu cetoză se produce o coloraţie roşie. Reacţia este
pozitivă cu cetozele: de culoare roşie şi este negativă cu aldozele: incoloră sau
culori slabe.

153
XV.3. REACŢII DE DIFERENŢIERE A PENTOZELOR DE HEXOZE

XV.3.1. Reacţia cu orcina (Reacţia Bial)


În prezenţa acizilor concentraţi pentozele se transformă în furfural care
ulterior formează produşi de condensare coloraţi în violet în prezenţa orcinei
(metil-resorcină). În aceleaşi condiţii, hexozele formează produşi de culoare
portocalie-brună. Reacţiile care au loc sunt următoarele:

CH3
PENTOZÃ HCl (conc)
HEXOZÃ R CHO + 2
O
HO OH

HO

CH3

HO
R CH
O HO

CH3

HO

Reactivi:
1. Reactiv Bial: 1 g orcină în 1000 ml HCl;
2. Soluţii de arabinoză 1%, riboză 1% etc.
3. Soluţii de glucoză 1%, galactoză 1%, fructoză 1% etc.

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se iau 5 picături soluţie pentoză şi în alta 5 picături soluţie de
hexoză şi se adaugă în ambele câte 3 ml reactiv Bial. Eprubetele se ţin pe baie de
apă în fierbere sau se încălzesc uşor în flacără.
În eprubeta cu pentoză se obţine o culoare violetă (reacţie pozitivă), iar în
eprubeta cu hexoză se obţine o culoare portocalie-brună (reacţie negativă).

XV.3.2. Reacţia Bial modificată


Datorită faptului că reactivul Bial nu se păstrează decât cel mult
o săptămână, se foloseşte reactivul Bial modificat, care are o mai bună stabilitate
(6 luni). În cazul reactivului Bial modificat, orcina este dizolvată în alcool etilic şi
se adaugă şi FeCl3.

154
Reactivi:
1. Reactiv Bial modificat: se dizolvă 6 g orcină în 200 ml alcool etilic şi se
adaugă 2 ml FeCl3 1%;
2. Soluţii de pentoze si hexoze 1-2 %;
3. HCl concentrat.

Tehnica de lucru:
Se iau într-o eprubetă 2 ml soluţie de pentoză şi în alta 2 ml soluţie de
hexoză. În ambele se adaugă câte 10 picături reactiv Bial modificat şi câte 2 ml HCl
concentrat. Eprubetele se agită, se acoperă cu un dop de vată şi se ţin 10 minute în
baia de apă, care fierbe.
Reacţia este pozitivă cu pentozele obţinându-se o coloraţie albastră-verde.

XV.3.3. Reacţia Tollens pentru pentoze


În prezenţa acizilor concentraţi pentozele se transformă în furfural care
formează compuşi coloraţi în roşu-vişiniu în prezenţa fluoroglucinei (1,3,5-
trihidroxibenzen) sau a pirogalolului (1,2,3-trihidroxibenzen).

Reactivi:
1. Reactiv Tollens: soluţie de fluoroglucină 2% în alcool 86o;
2. Soluţii de pentoze şi hexoze 1-2 %;
3. HCl concentrat.

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se iau 2 ml soluţie pentoză şi în alta 2 ml hexoză. În ambele
eprubete se adaugă câte 3 picături reactiv Tollens, 2 ml HCl conc. şi se încălzesc
până la fierbere.
Reacţia este pozitivă pentru pentoze, care formează mai întâi o coloraţie roz
ce trece în roşu-vişiniu.

XV.3.4. Reacţia aldopentozelor cu benzidina


Aldopentozele formează cu benzidina în mediu de acid acetic glacial o
coloraţie roz. Cetopentozele şi hexozele nu dau această reacţie.

PENTOZÃ 2
CH=O + H2N NH2
O

-2H2O CH=N N=HC


O O

155
Reactivi:
1. Soluţie de benzidină 4% în acid acetic glacial;
2. Soluţii 2% de oze: aldopentoze (riboză), hexoze (glucoză, fructoză).

Tehnica de lucru:
La 0,5 ml reactiv se adaugă o picătură din soluţia de oză.
Eprubeta conţinând acest amestec se fierbe 3-4 minute şi apoi se răceşte.
Aldopentozele libere dau o coloraţie de la roz la roşu, în timp ce hexozele şi
cetopentozele nu dau reacţia.

XV.4. REACŢII DE CONDENSARE A MONOZAHARIDELOR


CU FENILHIDRAZINA

Zaharurile reacţionează în mediu acid cu fenilhidrazina cu formarea


produşilor de reacţie: fenilhidrazone şi osazone. Fenilhidrazonele se obţin prin
tratarea zaharurilor la rece şi în raport molecular de 1:1 cu fenilhidrazină, iar
osazonele prin tratarea zaharurilor la cald şi cu exces de fenilhidrazină. Reacţia se
petrece în 3 etape succesive:
1. Condensarea unei molecule de fenilhidrazină cu gruparea carbonilică
(aldehidă sau cetonă) a glucidelor, cu formarea fenilhidrazonei;
2. Reacţia de oxido-reducere: fenilhidrazona formată în prima etapă
reacţionează cu o nouă moleculă de fenilhidrazină, care se reduce la anilină şi
amoniac, concomitent cu oxidarea unei grupări alcool (din vecinătatea atomului de
carbon la care s-a legat fenilhidrazina) cu apariţia unei noi grupări carbonilice:
la atomul C2 în cazul aldozei (iniţiale) şi la atomul C1 pentru cetoze;
3. Reacţia unei noi molecule de fenilhidrazină cu funcţia carbonil nou
formată cu producerea osazonelor.

CH=N-HN-C6H5
CHO CH=N-HN-C6H5
C=O
H - C - OH H - C - OH
C6H5-NH-NH2
HO - C - H
HO - C - H C6H5-NH-NH2 HO - C - H
-H2O C6H5-NH2 + NH3 H - C - OH
H - C - OH H - C - OH
H - C - OH
H - C - OH H - C - OH
CH2OH
CH2OH CH2OH

CH=N-HN-C6H5
C = N-HN-C6H5 HN-C6H5
N
C6H5-NH-NH2 HO - C - H H
-H2O H - C - OH N
HOH2C-(CHOH)3 N
H - C - OH osazonã
(formulã chelaticã)
CH2OH

156
Fenilhidrazonele sunt specifice pentru diferitele oze. Osazonele sunt identice
pentru ozele epimere (care diferă numai la grupările de la C1 şi C3, de exemplu:
glucoza, fructoza) şi diferite pentru zaharurile neepimere şi permit astfel, pe baza
proprietăţilor lor caracteristice (forma cristalelor, punct de topire, solubilitate),
diferenţierea zaharurilor (de ex: diferenţierea glucozei faţă de galactoză).

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă peste 2 ml soluţie de glucoză se adaugă 2 ml soluţie de
2,4- dinitrofenilhidrazină în H2SO4. Soluţia se încălzeşte uşor până la apariţia
precipitatului roşu de 2,4-dinitrofenilhidrazonă.
Reacţia cu fenilhidrazină permite determinarea glucozei, în soluţie pură,
până la diluţia de 0,01 g% şi prezintă un interes deosebit, fiind utilă în clinică pentru
diferenţierea glicozuriei (diabet zaharat) de lactozuriile fiziologice care apar la
unele femei în ultimele luni de graviditate şi în perioada alăptării.

XV.5. ACŢIUNEA ALCALIILOR ASUPRA OZELOR

În prezenţa hidroxizilor diluaţi se produce o epimerizare a ozelor cu


formarea, în cazul glucozei, a unui amestec în echilibru, între glucoză-manoză-
fructoză şi o formă intermediară ―en-diol―:
Procesul de epimerizare continuă de-a lungul lanţului de atomi de carbon,
formându-se 2,3-endiol, 3,4-endiol etc. La cald se formează caramelul, un produs cu
miros caracteristic, nedefinit chimic.
Reacţia de evidenţiere a endiolilor este cunoscută sub denumirea de reacţia
Moore.

H - C - OH H- C =O
H- C =O
H - C - OH C - OH HO - C - H

endiol aldoza II
Aldoza I
D-manoza (2,5%)
D-glucoza (63,5%)

CH2OH
C=O
cetoza
fructoza (21%)

Reactivi:
1. Soluţie de glucoză 1%;
2. NaOH 0,1N şi 10%;
3. HCl 0,1 N, cu adaus de 1 ml FeCl3 10%.

157
Tehnica de lucru:
a) Dacă se urmăreşte numai evidenţierea caramelului se tratează 5 ml
soluţie glucoză 1% cu 2 ml NaOH 10% şi se încălzeşte la fierbere. Soluţia devine
galbenă şi culoarea virează spre brun, concomitent cu apariţia unui miros de
caramel, care se accentuează prin acidularea soluţiei. Dacă acidularea se face cu
H2SO4 este necesară o răcire prealabilă a eprubetei.
b) Dacă se urmăreşte evidenţierea compuşilor cu grupare endiol se iau
într-o eprubetă 2 ml soluţie glucoză 1 % şi exact 5 ml NaOH 0,1 N. Se fierbe şi se
obţine o culoare galbenă datorită caramelului. Se răceşte soluţia şi se adaugă exact
5 ml HCl 0,1 N (care conţine FeCl3). În cazul prezenţei formei ―endiol― se observă
o coloraţie violetă (reacţie pozitivă), care nu apare cu soluţia de glucoză, ca atare
(care nu a fost încălzită cu baze).

XV.6. REACŢII DE REDUCERE

Gruparea carbonil din structura glucidelor le imprimă un caracter reducător


ce se manifestă, de exemplu, în mediu alcalin şi la cald asupra ionilor metalici:
Cu2+, Ag+, Hg2+, Bi3+, Se4+ sau asupra unor compuşi organici, de exemplu cei care
îşi schimbă culoarea prin oxido-reducere: acid picric - acid picramic, albastru de
metilen - leucoderivat. Concomitent, gruparea aldehidică a ozei se oxidează la acid
aldonic.

XV.6.1. Reacţii de reducere a ionului Cu2+


Soluţiile cu sulfat de cupru în mediu alcalin produc precipitatul de
Cu(OH)2, dar care deranjează reacţia cu glucidele. De aceea pentru evitarea
precipitării Cu(OH)2 se adaugă diferiţi compuşi, în special polialcooli sau hidroxi-
acizi, care formează complecşi coloidali solubili cu ionul de Cu2+, ca de exemplu:
- reacţia Fehling: complexul Na-K-tartrat;
- reacţia Benedict: complexul Na-citrat;
- reacţia Cole: complexul cu glicerina.
Utilizarea Na2CO3 prezintă unele avantaje faţă de NaOH: stabilitatea mai
mare a reactivilor şi o mai mică interferare cu alţi compuşi reducători, care
reacţionează similar cu glucidele în mediile cu baze, ca de exemplu: acid uric,
creatinină, cloroform. Totuşi valoarea reacţiilor de reducere este limitată de faptul
că ele sunt relativ nonspecifice deoarece asemănător cu glucidele reacţionează şi
derivaţii acestora, de exemplu: glucuronidele de tip ester (formate cu metaboliţii
medicamentelor), acizii uronici liberi.

1. Reacţia Trommer
Ionul de Cu2+ este redus de către gruparea carbonilică a glucidelor, în mediu
alcalin şi la cald, la ion cupros (Cu+), respectiv la Cu2O. Particulele de Cu2O în
absenţa coloizilor protectori se depun ca un sediment roşu. Concomitent se produce
oxidarea funcţiei aldehidice la carboxil (de la glucoză la acid gluconic).

158
CuSO 4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na 2SO 4

OH
Cu OH
Cu Cu - OH Cu
OH RCHO
O O
OH H2O RCOOH Cu - OH H2O Cu
Cu
Cu
OH
OH

Reactivi:
1. Soluţie de CuSO4 10%;
2. Soluţie de NaOH 10%;
3. Soluţii de glucide reducătoare 1%: glucoză, galactoză;
4. Soluţii de glucide nereducătoare 1%: zaharoză.

Tehnica de lucru:
Se iau în 2 eprubete câte 2 ml soluţie de zahăr reducător (glucoză) şi
respectiv nereducător (zaharoză), se adaugă câte 5 picături de CuSO4 10 % şi
5 picături de NaOH 10%. Ambele eprubete se încălzesc la partea superioară a
lichidului.
Se observă că în eprubeta cu zahăr reducător apare un precipitat galben,
care devine roşu, Cu2O, care denotă o reacţie pozitivă, în timp ce în eprubetă cu
zaharoză reacţia este negativă.

2. Reacţia Fehling
Reacţia este similară cu reacţia Trommer, doar că în acest caz se procedează
la solubilizarea Cu(OH)2 prin tratarea cu tartrat dublu de sodiu şi potasiu (sarea
Seignette), care intră în compoziţia reactivului Fehling II. În urma amestecării celor
doi reactivi Fehling se formează între Cu2+ şi sarea Seignette un complex cu
structură de chelat care favorizează dizolvarea Cu(OH)2.

Reactivi:
1. Soluţie de zaharuri reducătoare 1%: glucoză, galactoză.
2. Soluţie de zahăr nereducător 1%: zaharoză.
3. Reactiv Fehling I : 35 g CuSO4·5H2O
5 ml H2SO4 conc.
200 ml apă distilată.
După dizolvare se completează cu apă distilată la 1000 ml.

4. Reactiv Fehling II : NaOH 3% -300ml


Sare Seignette -150 ml
Apă distilată la -1000 ml.

159
Tehnica de lucru:
Se introduc în două eprubete câte 2 ml reactiv Fehling I şi 2 ml reactiv
Fehling II şi se încălzeşte la fierbere 2 minute. În prima eprubetă se adaugă 5 ml
zahăr reducător şi se încălzeşte 1 minut direct în flacără. Se observă schimbarea
culorii şi apariţia unui precipitat. Se repetă reacţia cu a doua eprubetă la care se
adaugă 5 ml zahăr nereducător. După încălzire în flacără nu se observă schimbări
semnificative.
La prima încălzire, amestecul de reactivi Fehling I şi II trebuie să-şi păstreze
culoarea albastră.
Cea de-a doua încălzire serveşte reacţiei de oxido-reducere, când culoarea
albastră a soluţiei dispare şi se produce un precipitat de culoare galbenă sau roşie,
care indică prezenţa zaharului reducător.

3. Reacţia Benedict
Reacţia este similară cu reacţia Trommer şi cu reacţia Fehling, doar că
pentru solubilizarea precipitatului de Cu(OH)2 se foloseşte citratul.

Reactivi:
1. Reactiv Benedict: 173 g citrat de sodiu·2H2O
100 g Na2CO3 anhidru
800 ml apă distilată
Se dizolvă prin încălzire, se filtrează şi se aduce la 850 ml. Separat se
dizolvă 17,3 g CuSO4 pur, cristalizat, în 100-150 ml apă distilată şi se adaugă sub
agitare în porţiuni mici la soluţia precedentă şi se completează cu apă distilată la
volumul final de 1000 ml. Reactivul se poate păstra un timp destul de lung;
2. Glucoză 5 %;
3. Zaharoză 5 %.

Tehnica de lucru:
În 2 eprubete se introduc câte 5 ml reactiv Benedict. În prima se adaugă
0,5 ml glucoză, iar în a doua aceeaşi cantitate de zaharoză. Se fierb ambele eprubete
direct la flacără timp de 2 minute şi se răcesc. În prima eprubetă se va forma un
precipitat roşu (reacţie pozitivă), iar în a doua nu se produc modificări semnificative
(reacţie negativă).
După culoarea obţinută se poate aprecia, cu aproximaţie concentraţia
glucozei şi anume:

- opalescenţă cu nuanţă verde - sub 0,1 g% glucoză


- turbulenţă puternică de culoare galben-verde - 0,2 - 0,3 g% glucoză
- precipitat galben-portocaliu - aprox. 0,5g% glucoză
- precipitat roşu - peste 1 g% glucoză

160
Prezenţa unor compuşi de tipul creatininei, cloroformului, acidului uric nu
interferă cu reactivul Benedict, spre deosebire de reactivul Fehling.

4. Reacţia Cole
Reacţia decurge similar cu reacţiile anterioare, cu deosebirea că se foloseşte
glicerina ca agent de dizolvare a Cu2O.

Reactivi:
1. Na2CO3 anhidru;
2. Glicerină;
3. CuSO4;
4. Soluţii de glucide 1g% şi 0,1g%.

Tehnica de lucru:
La 5 ml soluţie de glucide se adaugă un vârf de cuţit de Na2CO3 anhidru,
3 picături glicerină şi 2 picături CuSO4 1%. Se agită bine şi se fierbe 1 minut.
În cazul probei pozitive, Cu2O format rămâne în soluţie sub formă hidratată
coloidală de CuOH de culoare galbenă. Se consideră că testul Cole este cel mai
sensibil dintre reacţiile de reducere şi permite diferenţierea glucidelor de compuşii
cu grupare aldehidică liberă sau cu funcţie endiol.

XV.6.2. Reacţii de reducere a ionului Ag+

1. Reacţia Tollens
Glucidele reducătoare transformă Ag+ la Ag0 care se depune pe pereţii
eprubetei sub formă de argint metalic fin (oglinda de argint). Concomitent
gruparea aldehidică din molecula glucidelor reducătoare este oxidată la acidul
corespunzător.

2AgNO3 + 2NH4OH 2AgOH + 2NH4NO3

2AgOH + 4NH4OH + -
2[Ag(NH3)2] OH + 4H2O
+ - -
2[Ag(NH3)2] OH + R CHO 2Ag + 4NH3 + H2O + R-COOH

Reactivi:
1. Soluţie de AgNO3 2% în apă bidistilată;
2. Soluţie de amoniac diluat 5%;
3. Soluţie glucoză 2%.

161
Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă foarte curată se introduc, în ordine: 5 ml AgNO3 2% şi apoi
soluţia de amoniac, picătură cu picătură, până la apariţia şi apoi dizolvarea
precipitatului care se formează, evitându-se excesul. Se adaugă 3 ml soluţie
glucoză, se agită şi se lasă pe baie de apă la 600C timp de 15 minute şi se observă
formarea „oglinzii de argint ―.

XV.6.3. Reacţii de reducere a ionului Bi3+

1. Reacţia Nylander
Reacţia se bazează pe reducerea azotatului de bismut (III) (subnitrat de
bismut) în mediu alcalin la Bi metalic negru, în prezenţa glucidelor reducătoare
care se oxidează la acizii corespunzători.

Bi(OH)2NO3 + NaOH Bi(OH)3 + NaNO3

2Bi(OH)3 + 3R-CHO 2Bi + 3H2O + 3R-COOH

Reactivi:
1. Reactiv Nylander: se dizolvă 2 g nitrat bazic de bismut (III) şi 4 g tartrat
dublu de sodiu şi potasiu în 100 ml NaOH 10 %. Se încălzeşte pe baie de
apă la fierbere, se răceşte şi se aduce cu apă la 1000 ml;
2. Glucoză 2 %.

Tehnica de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 2 ml soluţie de glucoză 2 % şi 0,5 ml reactiv
Nylander şi se încălzeşte direct în flacără, timp de câteva minute. Reacţia este
pozitivă când se obţine un precipitat de culoare neagră (Bi metalic) şi este sensibilă
chiar la cantităţi foarte mici de oze.

XV.6.4. Reducerea unor compuşi organici

1. Reducerea acidului picric


Glucidele reducătoare, în mediu alcalin şi la cald, reduc acidul picric de
culoare galbenă la acid picramic de culoare roşie-portocalie, simultan cu oxidarea
grupării aldehidice a ozei la gruparea acidă.

OH OH
O2N NO2 O2N NH2
3RCHO + 2H2O + 3R-COOH
3H2O

NO2 NO2

162
Reactivi:
1. Soluţie de acid picric;
2. Soluţie de glucoză;
3. NaOH 10%.

Tehnica de lucru:
Se introduc într-o eprubetă 2 ml soluţie de acid picric, 1 ml soluţie de
glucoză şi 1 ml NaOH 10% şi se fierbe.
Reacţia este pozitivă când apare o culoare portocalie la încălzire (culoarea
galbenă indică o reacţie negativă). Reacţia poate servi şi la dozarea glucozei din
lichidele biologice, ex. reacţia Seifert-Crecelius.

2. Reducerea albastrului de metilen


Glucidele reducătoare reduc albastrul de metilen la un leucoderivat (derivat
fără culoare). În prezenţa oxigenului din aer are loc o reoxidare şi recolorare,
proces similar cu acţiunea unor dehidrogenaze, când albastrul de metilen serveşte
ca transportor de H+ de la un donor de H+ (glucoză) pe un acceptor de H+ (în
experienţa de faţă, oxigenul), cu diferenţa că albastrul de metilen este autooxidabil,
adică reacţionează direct cu O2 din aer, ceea ce nu se întâmplă de obicei cu
dehidrogenazele.

Reactivi:
1. Soluţie de albastru de metilen 0,1 % în apă
2. Soluţie glucoză 1%;
3. NaOH 2N.

163
Tehnica de lucru:
Se introduc într-o eprubetă 5 ml apă, 10 picături soluţie de albastru de
metilen şi 2 picături de NaOH 2 N şi se încălzeşte. Se adaugă câteva picături de
glucoză 1 %, treptat, până se obţine decolorarea probei, în timpul încălzirii de
câteva secunde la fierbere.
După câteva minute de repaus se agită şi se observă recolorarea albastrului
de metilen datorită efectului oxigenului din aer. Dacă eprubeta nu se agită,
recolorarea apare mai încet, de la suprafaţa eprubetei spre interior.

XV.7. DOZAREA GLUCIDELOR REDUCĂTOARE


Metoda Ionescu-Matiu

Glucidele reduc la cald şi în mediu alcalin, fericianura de potasiu


(K3[Fe(CN)6], hexacianoferat III de potasiu). Când întreaga cantitate de fericianură
a fost complet redusă, primele picături de glucoză în exces intră în reacţie cu acidul
picric (folosit ca indicator) şi culoarea soluţiei virează de la galben spre roşu-
portocaliu.

Reactivi:
1. Soluţia de fericianură: 46 g K3[Fe(CN)6] şi 46 g NaOH se dizolvă în apă
distilată şi se completează cu apă distilată la 1000 ml. Se păstrează la
frigider.
2. Soluţie saturată de acid picric (aprox.1,2 %). Se obţine prin dizolvarea a
1,3 g de acid picric în 100 ml apă distilată la fierbere.
3. Soluţie de glucoză 0,5 % şi o soluţie de glucoză de concentraţie
necunoscută.

Tehnica de lucru:
a) Determinarea factorului reactivului
Într-un balon termorezistent se introduc exact 10 ml soluţie fericianură şi se adaugă
10 picături soluţie de acid picric şi 20 ml apă distilată. Se încălzeşte la fierbere şi se
titrează din biuretă cu soluţia de glucoză 0,5 %, menţinând tot timpul soluţia în
fierbere, până la virajul culorii de la galben spre roşu-portocaliu, notând cu N, ml
glucoză utilizaţi.

5N
f 
1000

b) Determinarea concentraţiei unei soluţii necunoscute de glucoză


Se lucrează exact ca la punctul a), cu singura deosebire că se titrează din biuretă cu
soluţia de glucoză de concentraţie necunoscută. Se notează numărul de ml glucoză
utilizaţi cu N’.

164
Calcul:
1000 f
glucoza ( g / l ) 
N'

Metoda are aplicaţie în biochimia clinică la dozarea glucozei din urină.

Probleme:

1. Precizaţi aspectele structurale specifice glucidelor.

2. Enumeraţi şi detaliaţi reacţiile de reducere ale glucidelor.

3. Precizaţi reacţia de diferenţiere a aldozelor de cetoze şi reacţiile de


diferenţiere a pentozelor de hexoze.

165
LUCRAREA 13

XVI. DOZAREA GLUCOZEI ŞI GLICEMIA

Dozarea glucozei reprezintă una dintre cele mai uzitate reacţii de


identificare a unui component biochimic, constituind o metodă de rutină în
laboratorul clinic şi biochimic.
Acest proces de identificare calitativă şi cantitativă a glucozei s-a bazat pe
proprietatea reducătoare a acestei hexoze: reducerea hidroxidului cupric şi
reducerea fericianurii. Trebuie precizat însă că substanţele reducătoare din sânge
cuprind alături de glucoză şi alţi compuşi cum ar fi: glutationul, acidul ascorbic,
glicuronizii şi acidul uric etc. Din acest motiv valorile glicemiei obţinute prin astfel
de metode sunt cu aproximativ 10 mg (şi în unele condiţii chiar cu 20 mg) mai
ridicate decât rezultatele obţinute prin metoda enzimatică specifică cu glucozo-
oxidaza.
Recent au fost introduse metode rapide colorimetrice, bazate pe reacţii
directe între glucoză şi o substanţă cromogenă precum o-toluidina sau antrona şi
care dau rezultate mult mai apropiate de valorile obţinute prin dozarea enzimatică
specifică a glucozei.
Metodele utilizate pentru identificarea glucozei sunt:

XVI.1. METODE REDUCǍTOARE

Metodele reducătoare se bazează pe caracterul reducător al glucozei asupra


unor oxidanţi blânzi, ioni metalici: Cu2+, Bi3+, Ag+, Hg2+, Fe3+.
a. Metoda Nelson: glucoza reduce CuSO4 în mediu alcalin la Cu2O care
reacţionează cu arsenomolibdatul de amoniu formând un compus colorat,
colorimetrabil.
b. Metoda Hagedon-Jensen prin care glucoza reduce fericianura la ferocianură,
iar excesul de fericianură oxidează I- la I2 care se titrează cu Na2S2O3 în prezenţa
amidonului.
c. Acţiunea glucozei asupra iodului; excesul de iod rezultat se titrează cu
tiosulfat de sodiu (Na2S2O3).
În general aceste metode reducătoare sunt metode laborioase, nu foarte
sensibile şi nespecifice.

166
XVI.2. METODE ENZIMATICE

Acestea sunt cele mai specifice metode de identificare, se pretează la


automatizare şi sunt cele utilizate în mod curent în laboratoarele de analize
medicale.

XVI.2.1. Metoda enzimatică cu glucozoxidază


Glucozo-oxidaza (GOD) catalizează oxidarea glucozei după ecuaţia:

Glucoza + H2O acid gluconic + H2O2

H2O2 + DH2 → D + 2 H2O

DH2 - colorant reducător


D - colorant oxidat

Glucozo-oxidaza este o enzimă bacteriană FAD-dependentă, reacţia putând


fi scrisă:

Glucoza + FAD → gluconolactona + FADH2

Gluconolactona + H2O → acid gluconic

FADH2 + O2 → FAD + H2O2

Oxigenul eliberat de peroxidaza (POD) din apa oxigenată formată, oxidează


o-dianisidina, formând un compus colorat a cărui coloraţie este proporţională cu
concentraţia glucozei.

XVI.2.2. Metoda enzimatică cu glucozo-dehidrogenază


Glucozo-dehidrogenaza (GDH) este o enzimă NAD-dependentă care
catalizează oxidarea glucozei la acid gluconic conform reacţiei:

Glucoza + NAD+ → gluconolactona + NADH + H+

Gluconolactona + H2O → acid gluconic

167
XVI.3. DOZAREA GLUCOZEI CU O-TOLUIDINĂ

Conjugarea aldo- şi cetohexozelor cu amine aromatice va duce la formarea


de produşi coloraţi. Pentru dozarea glucozei, amina cea mai apropiată este
o-toluidina care în mediu acid (acid acetic) formează cu aldohexozele un compus
colorat în albastru-verde şi care se determină prin spectrofotometrie la 630 nm.

Tehnica de lucru:
În 3 eprubete se introduc următorii reactivi (Tabelul 1):

Tabel 1. Tehnica dozării glucozei cu o-toluidina


Reactivi (ml) P S M
Ser 0,1 - -
Standard glucoza - 0,1 -
Apă distilată - - 0,1
o-toluidina 3 3 3

Eprubetele se ţin în baia de apă adusă la fierbere timp de 8 minute.


După răcire se citesc extincţia probei (Ep) şi extincţia standardului (Es) faţă de
martor la o lungime de undă de 630 nm.

Calcul:
mg glucoza/100 ml sânge = Ep/Es x 100

În clinică ceto- sau aldopentozele dau coloraţie cu o-toluidină, dar de


intensitate foarte slabă, neglijabilă pentru concentraţia acestor substanţe în sânge.

Dozarea glucozei cu antronă presupune deshidratarea glucozei cu acid


sulfuric obţinându-se hidroximetilfurfurol care cu antrona formează un compus de
condensare colorat în galben roşiatic, extincţia citindu-se la 620 nm.

XVI.4. GLICEMIA - CARACTERISTICI

Glucoza reprezintă cea mai importanta sursă de energie a organismului şi


provine în principal din alimente bogate în carbohidraţi. În urma procesului de
digestie este eliberată glucoza în sânge şi apoi transportată la nivelul celulelor
pentru a fi utilizată în metabolismul celular. Există doi hormoni importanţi pentru
reglarea nivelului glucozei în sânge: insulina şi glucagonul.
Insulina este un hormon polipeptidic produs de celulele β ale insulelor
Langerhans pancreatice care are rolul de a transporta glucoza din sânge la nivel
celular pentru a fi utilizată ca sursă de energie, precum şi creşterea permeabilităţii

168
membranelor celulare la glucoză, toate acestea având ca efect scăderea glucozei în
sânge.
Glicemia este factorul reglator principal al secreţiei de insulină;
astfel glicemia à jeun este suficientă pentru a declanşa secreţia de insulină, iar
eliberarea insulinei creşte odată cu nivelul glicemiei, răspunsul maxim obţinându-se
la 300-500 mg/dl.
Glucagonul, celălalt hormon pancreatic, accelerează conversia glicogenului
în glucoză şi determină astfel creşterea glicemiei adică hiperglicemia.
Alţi hormoni care deţin un rol important în metabolismul glucozei sunt:
ACTH-ul, glucocorticoizii, adrenalina, tiroxina.

XVI.4.1. Valorile glicemiei

Glicemia se poate exprima în mg/dl sau în mmol/l. Unitatea de măsură în


Sistemul International este milimol/litru (mmol/l), însă mai des folosită este
exprimarea în miligram/decilitru (mg/dl). Nivelul glicemiei variază fiziologic cu
alimentaţia şi în funcţie de unii factori externi: frig, emoţie, efort muscular.
În absenţa unui marker biologic mai specific pentru a defini diabetul,
determinarea glucozei plasmatice a rămas elementul de bază al criteriilor de
diagnostic.
Practic se pot recolta 4 tipuri de probe biologice :
1. glucoza plasmatică/serică determinată á jeun (bazală);
2. glucoza serică determinată la două ore postprandial;
3. glucoza plasmatică/serică recoltată într-un moment oarecare al zilei,
indiferent de intervalul de la ultima masă (random);
4. glucoza plasmatică/serică determinată în cadrul testului de toleranţă la
glucoză (la 2 ore după administrarea a 75 g glucoză).

Valorile normale ale glicemiei sunt situate între (Tabelul 2):

Tabel 2. Valorile normale ale glicemiei


 Glicemia à jeun 70 – 110 mg/dl
(4,1 – 6,1 mmol/l)

În funcţie de metoda de laborator folosită, aceste valori pot varia puţin


(60-110 mg/dl).

169
Valorile normale ale glicemiei se vor modifica odată cu apariţia patologiei
determinată de hiperglicemia persistentă (Tabelul 3).

Tabel 3. Valori modificate ale glicemiei


 Glicemia bazală modificată sau 100 – 125 mg/dl
prediabetul (IFG= impaired fasting (5,6 – 7,0 mmol/l)
glucose)
 Diabet zaharat ≥ 126 mg/dl
(≥ 7,0 mmol/l)

Diabetul zaharat este un sindrom complex indus de tulburarea secreţiei de


insulină de către pancreas sau de rezistenţa celulelor periferice la acţiunea insulinei,
acestea având ca efect creşterea nivelului glucozei în sânge peste limitele
considerate normale = hiperglicemia.

Există mai multe forme de diabet zaharat dintre care cel mai frecvent
întâlnite sunt :
 diabetul zaharat tip 1 (diabet insulino-dependent, diabet juvenil) este
definit ca procesul etiologic caracterizat prin distrucţia celulelor beta
pancreatice secretante de insulină, ducând la deficienţa absolută de insulină
cu evoluţie spre cetoacidoză şi deznodământ fatal dacă nu se corectează
prin tratament exclusiv cu insulină. Pacienţii au o dependenţă vitală faţă de
tratamentul cu insulină, în lipsa căruia nu pot supravieţui. Acest tip de
diabet poate apărea la orice vârstă, dar îl întâlnim mai ales la copii,
adolescenţi şi adulţi tineri.
 diabetul zaharat tip 2 (diabet insulino-independent) este definit ca procesul
etiologic caracterizat prin asocierea a două defecte celulare: rezistenţa la
insulină şi deficienţa funcţiei pancreatice. Acest tip reprezintă majoritatea
cazurilor de diabet (90 - 95 %) şi apare în general la adulţi. Simptomele se
dezvoltă lent astfel încât multe persoane cu nivel crescut al glucozei în
sânge nu au nici un simptom.
 diabetul gestaţional este o formă de diabet ce apare în timpul sarcinii la
2 - 5 % dintre femeile însărcinate, poate dispărea după naştere sau poate
anunţa instalarea tipului 2 de diabet mai târziu în cursul vieţii.


 alte tipuri de diabet sunt date de defecte genetice în funcţionarea celulelor
pancreatice producătoare de insulină, boli ale pancreasului exocrin (fibroza
chistică) sau administrarea de medicamente.

Testele de laborator utilizate pentru depistarea (screening-ul), diagnosticul,


cât şi monitorizarea diabetului zaharat se bazează pe determinarea prin metode de
laborator a glucozei serice/plasmatice, a hemoglobinei glicate (HbA1c) şi a corpilor
cetonici.

170
XVI.4.2. Hemoglobina glicozilată sau glicată (HbA1c)
La concentraţii fiziologice ale glucozei, hemoglobina (dar şi alte proteine)
suferă un proces de glicare, cu formarea unui compus intermediar - aldimină (sau
bază Schiff), proces care este, însă, reversibil; la concentraţii persistent crescute ale
glucozei, aldimina se transformă printr-o reacţie ireversibilă într-un compus
ketoaminic, acesta constituind produsul final al dozării HbA1c.
Studiile clinice şi experimentale au arătat că, dintre toate proteinele ce suferă
procese de glicare, fracţiunea glicată a hemoglobinei A1c constituie cel mai bun
indicator al controlului glicemic în DZ.
HbA1c a fost introdusă recent în criteriile de diagnostic ale diabetului
zaharat (în special cel de tip 2) şi reprezintă un test de evaluare şi monitorizare pe
termen lung a controlului glicemic. Cantitatea de HbA1c este proporţională cu
nivelul mediu al glucozei sangvine (glicemia medie) (Tabelul 4).

Tabel 4. Corelaţia dintre HbA1c şi glicemie


 Normoglicemie < 5,7 %
 Prediabet 5,7 – 6,4 %

 Diabet > 6,4 %

Metoda de referinţă standardizată (IFCC) pentu analiza HbA1c este


cromatografia de lichide, dar poate fi utilizată şi electroforeza.
Pentru diagnosticul diabetului zaharat pe lângă aceste analize este necesar şi
realizarea hiperglicemiei provocată pe cale orală (test de încărcare cu glucoză
administrată oral).

XVI.4.3. Glicozuria
În mod normal glucoza nu se găseşte în urină, decât dacă nivelul ei în sânge
depăşeste capacitatea de reabsorbţie tubulară. Pragul renal pentru glucoză (nivelul
glicemiei de la care apare glicozuria) este atins atunci când concentraţia glucozei în
plasmă este peste 180 mg/dl. Dozarea glucozei din urină (glicozuria) se determină
calitativ şi cantitativ în urina totală de 24h.
Valorea normală: cantităţi nedetectabile de glucoză în urină (metoda Benedict).

Dozarea corpilor cetonici


În urina subiecţilor sănătoşi, corpii cetonici (acidul betahidrobutiric,
acetilacetic şi acetona) sunt nedecelabili cu metodele obişnuite. Când nivelul lor
sanguin creşte vor apărea şi în urină (cetonuria).
Producţia de corpi cetonici creşte ca urmare a amplificării procesului de
beta-oxidare a acizilor graşi la nivelul celulelor hepatice, în absenţa insulinei.
Prezenţa cetonuriei este echivalentă cu decompensarea metabolică cetoacidoza.

171
Identificarea nivelului de corpi cetonici în urină este importantă în diagnosticul
severităţii diabetului.
În afara diabetului zaharat, cetonuria mai poate apărea şi în inaniţie, diaree,
vărsături, boli hepatice grave.

XVI.4.4. Hiperglicemia provocată pe cale orală (testul de toleranţă la


glucoză = TTGO)
Se bazează pe determinarea glicemiei în mai multe rânduri după o încărcare
cu glucoză. Testul se efectuează dimineaţa (între orele 7 şi 10), după un repaus
nocturn şi alimentar de cel puţin 10 ore (se poate consuma doar apă).
Se recoltează prima glicemie din sânge venos sau capilar pe nemâncate,
apoi se administrează 75 g glucoză anhidră dizolvată în 300 ml apă, care trebuie
băută în cel mult 3 minute (la copii cantitatea de glucoză administrată este în
funcţie de greutatea corporeală: 1,75 g/kg corp – maximum 75 g.).
Se determină glicemia în majoritatea situaţiilor clinice la 120 minute de la
ingerarea glucozei sau în anumite situaţii clinice la: 30, 60, 90, 120, 180 de minute
(Tabelul 5).

Tabel 5. Interpretarea rezultatelor testului de toleranţă la glucoză


 Diabet zaharat
Glicemia bazală ≥ 110 mg%
Glicemia la 2h ≥ 200 mg%
 Scăderea toleranţei la glucoză
Glicemia bazală < 110 mg%
Glicemia la 2h 140 – 200 mg%

 Glicemie bazală modificată


Glicemia bazală < 110 mg%
Glicemia la 2h < 140 mg%

172
Rezultatele testului pot fi raportate grafic astfel (Figura 19):

Figura 19. Testul de toleranţă la glucoză [44]

Testul la tolbutamid intravenous. Acest test explorează capacitatea de secreţie a


insulinei, tolbutamida fiind o sulfamidă cu proprietăţi hipoglicemiante.

Principiu:
Bolnavul va fi supus aceloraşi condiţii ca şi în cazul testului TTGO, după
care se injectează intravenos 1 g de tolbutamid. Se vor face recoltări pentru
determinarea glicemiei la intervale de 30 de minute timp de 2 - 3 ore. Valorile
obţinute se înscriu pe o curbă.

Interpretare:
 în mod normal tolbutamidul administrat i.v. produce eliberarea de insulină
din pancreas, care determină la 30 de minute de la injectare, o scădere a
glicemiei cu peste 25 % din valoarea sa iniţială, revenind la normal după
90 - 120 de minute;
 curba de tip diabet zaharat se caracterizează prin scăderea discretă
(sub 25 %) şi tardivă (la 2 ore de la injectare) a glicemiei;
 în hiperinsulinismul organic (insulinom) scăderea glicemiei este masivă –
peste 35 - 40 % din valoarea sa iniţială la 30 de minute de la recoltare.
Curba nu revine la normal nici după 180 de minute.

173
Probleme:

1. Care din următoarele afirmaţii referitoare la metodele de determinare ale


glucozei sunt reale:
a) gluco-dehidrogenaza este o enzimă ce catalizează oxidarea glucozei la acid
gluconic şi apă
b) metodele reductive implică şi ioni metalici: Cu+2, Bi+3, Ag +,Hg+2, Fe+3
c) dozarea cu o-toluidină este o metodă ce implică utilizarea colorimetriei
d) metodele reductive implică iodul în diferite etape
e) cea mai specifică şi uzitată metodă de determinare este cea enzimatică

2. Valorile glicemiei prezintă următoarele caracteristici reale :


a) pot varia în funcţie de o serie de factori : frig, emoţie, efort muscular
b) unitatea de măsură în Sistemul International este miligram/decilitru (mg/dl),
însă mai des folosită este exprimarea în milimol/litru (mmol/l)
c) valoarea glicemiei ajeun poate influenţată de orarul de recoltare pe parcursul a
24 ore
d) este influenţată în principal de doi hormoni
e) valorile în diabetul zaharat sunt ≥ 126 mg/dl

3. Afirmaţiile următoare referitoare la glicemie sunt reale exceptând două;


identificaţi-le :
a) hiperglicemia marcată şi prelungită poate constitui o cauză a glicozuriei
b) HbA1c alături de valoarea glicemiei constituie criteriu de diagnostic ale
diabetului zaharat
c) fiziologic în urina normală nu pot fi decelaţi corpii cetonici: acidul butiric,
acidul acetic şi acetona
d) TTGO necesită o determinare la intervale fixe a nivelului glicemiei
e) hiperglicemia poate implica prezenţa numai a diabetului tip I şi II

174
ANEXA 1
Tabel 1. Valori normale ale principalilor parametri biochimici în sânge

HEMATOLOGIE – ERITROCITE (RBC)


bărbaţi 4.5 - 5.5 mil./ mm3
femei 4 - 5 mil./ mm3
copii 3.5 - 5.0 mil./ mm3
HEMATOLOGIE – LEUCOCITE (WBC)
bărbaţi 4000 - 8000 / mm3
femei 4000 - 8000 / mm3
copii 5000 - 10000 / mm3
HEMOGLOBINA (Hb)
bărbaţi 14 - 18 g/dL
femei 11 - 16 g/dL
copii 10 - 14 g/dL
nou născuţi 15 - 25 g/dL
HEMATOCRIT (Hct)
bărbaţi 40 - 54%
femei 37 - 47%
copii 30 - 45%
VEM (volum eritrocitar mediu) 80 - 100 fL
HEM (hemoglobina eritrocitară medie) 27 - 35 pg
CHEM (concentraţia medie de hemoglobină) 31 - 37%
Neutrofile 50 - 81%
Limfocite 14 - 44%
Monocite 2 - 6%
Eozinofile 1 - 5%
Bazofile 0 - 1%
PARAMETRI HEMODINAMICI
Presiunea arterială sistolică 90 - 140 mm Hg
Presiunea arterială diastolică 60 - 90 mm Hg
GAZE SANGUINE - PARAMETRII ASTRUP
pH 7.35 - 7.45
pCO2 35 - 40 mm Hg
HCO3- 22 - 27 mEq/L
Saturaţia în O2 96 - 100%
pO2 85 - 100 mm Hg
Baze exces -2 pana la +2 mEq/L
Baze tampon 40-50 mEq/L

175
BIOCHIMIE
Albumina 3.5 - 5.0 mg/dL
Fosfataza alcalină (copii) 38 - 138 U/L
Fosfataza alcalină (adulţi) 20 - 40 U/L
Amoniac 11 - 35 µmol/L
Amilaza 50 - 150 U/dL
AST, SGOT 2 - 20 U/L
ALT, SGPT 2 - 16.5 U/L
LDH 138 - 276 U/L
γ-GT (bărbaţi) 6 - 28 U/L
γ-GT (femei) 4 - 18 U/L
Bilirubina directă 0.0 - 0.25 mg/dL
Bilirubina indirectă total minus direct
Bilirubina totală 0.2 - 1 mg/dL
Calciu (total) 9 - 11 mg/dL
Cloruri 355 – 375 mg/dL
Creatina (bărbaţi) 0.2 - 0.6 mg/dL
Creatina (femei) 0.6 - 1.0 mg/dL
Creatinina (bărbaţi) 0.6 - 1.2 mg/dL
Creatinina (femei) 0.5 - 1 mg/dL
70 - 110 mg/dL
Glucoza
(glicozuria ≥ 180 mg/dL)
Fier (bărbaţi) 90 - 160 µg/dL
Fier (femei) 80 – 130 µg/dL
Capacitate totală de legare a fierului 250 - 400 µg/dL
Magneziu 1.8 - 2.9 mg/dL
Osmolaritate 300-310 mOsm/L
Fosfor (adulţi) 3.5 – 5 mg/dL
Fosfor (copii) 4 – 7 mg/dL
Potasiu 16 – 20 mg/dL
Sodiu 310 – 345 mg/dL
Proteine totale 7 - 9 g/dL
Fibrinogen 200 - 400 mg/dL
Uree 20 - 40 mg/dL
Acid uric (bărbaţi) 3.5 - 8 mg/dL
Acid uric (femei) 2.5 - 7 mg/dL
PROFILUL LIPIDIC (Adult)
Lipide totale 600 – 800 mg/dl
Colesterol (total) < 200 mg/dL
Colesterol (HDL) > 60 mg/dL
Colesterol (LDL) < 130 mg/dL
Trigliceride 50 - 150 mg/dL

176
ANEXA 2
Tabel 1. Multiplii şi submultiplii unităţilor de măsură

1024 yotta Y
1021 zetta Z
1018 exa E
1015 peta P
1012 tera T
109 giga G
106 mega M
103 kilo k
102 hecto h
101 deca da
100 - -
10-1 deci d
10-2 centi c
10-3 mili m
10-6 micro μ
10-9 nano n
10-12 pico p
10-15 femto f
10-18 atto a
10-21 zepto z
10-24 yokto y

177
Bibliografie selectivă

1. Mureşan M, Dobjanschi L, Antonescu A, Codreanu I, Mraz C. Biochimie


medicală şi farmaceutică: aplicaţii practice, vol. I. Editura Universităţii din
Oradea, Oradea; 2007. 154 p.
2. Mureşan M, Dobjanschi L, Antonescu A, Codreanu I, Mraz C. Biochimie
medicală şi farmaceutică: aplicaţii practice, vol. II. Editura Universităţii din
Oradea, Oradea; 2007. 115 p.
3. Global step [online]. [accesat 2016 octombrie 20]; disponibil pe: URL:
http://www.echipamentelaborator.ro/cilindri-gradati/c/.
4. Aparatura de laborator [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016 octombrie
20]; disponibil pe: URL: http://www.aparatura-de-laborator.ro/laborator/42-
sticlarie-de-laborator/60-baloane-cotate/172-balon-cotat-clasa-a-sticla-alba-
ns-1221---100-ml.html.
5. Equimed [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016 octombrie 20];
disponibil pe: URL: http://www.equimed-dg.pl/prod119-biureta_kl_as.html.
6. Club afaceri [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016 octombrie 20];
disponibil pe: URL: http://www.clubafaceri.ro/12220/biureta-automata-
pellet-sticla-alba-clasa-a-10_0%2c1-2865886.html.
7. Cowie [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016 octombrie 20]; disponibil
pe: URL: http://www.cowie.com/catalogue/buret.htm.
8. Glastron Laboratory Equipments [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016
octombrie 20]; disponibil pe: URL: http://www.exportersindia.com/
glastronin/pipettes-india-672875.htm.
9. Poulten & Graf superior laboratory products [online]. [dată necunoscută]
[accesat 2016 octombrie 20]; disponibil pe: URL: http://www.poulten-
graf.de/products/volumetric-glassware/pipettes/?L=2.
10. Hiwtc [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016 octombrie 20]; disponibil
pe: URL: http://www.hiwtc.com/buy/accumax-pro-micropipette-83478/.
11. Rasfoiesc.com [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016 octombrie 20];
disponibil pe: URL: http://www.rasfoiesc.com/inginerie/tehnica-mecanica/
Masurarea-masei-cu-balanta43.php.
12. Tech Med Instruments [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016
octombrie 20]; disponibil pe: URL: http://www.techmed.ro/balante-
analitice.php.
13. Jebeleanu G, Diaconescu L, Dronca M, et al. Biochimie medicală - caiet de
lucrări practice. Casa Cărţii de Sţiinţă, Cluj-Napoca; 2014. 199 p.
14. Olteanu I, Dican L. Biochimie – curs, lucrări practice. Editura Medicală
Universitară „Iuliu Haţieganu‖, Cluj-Napoca; 2005. 322 p.
15. Kaycsa A, Anghel A, Tămaş L, et al. Lucrări practice de biochimie pentru
studenţii facultăţilor de Farmacie. Editura Waldpress, Timişoara; 2014. 331
p.
16. Anghel A, Rusu V, Kaycsa A, et al. Chimie şi biochimie medicală. Aplicaţii
practice şi de laborator clinic. Editura Eurostampa, Timişoara; 2006. 347 p.

178
17. Osan A, Nagy E, Tero-Vescan A, Biochimie practică. University Press,
Târgu-Mures; 2008. 169 p.
18. Bodoki E, Cristea C, Săndulescu R, Oprean R. Metode de separare şi
analiză instrumentală. Editura Risoprint, Cluj-Napoca; 2014. 86 p.
19. Săndulescu R, Oprean R, Mirel S, Ede E, Cristea C, Lotrean S. Chimie
analitică calitativă, ghid de lucrări practice. Ediţia a-III-a, Editura Risoprint,
Cluj-Napoca; 2015. 276 p.
20. Săndulescu R, Oprean R, Mirel S, Bodoki E, Cristea C, Lotrean S. Chimie
analitică cantitativă: analiza volumetrică şi gravimetrică, ghid de lucrări
practice. Editura Risoprint, Cluj-Napoca; 2014. 183 p.
21. Bodoki E, Cristea C, Săndulescu R, Oprean R. Quantitative analytical
chemistry. Editura Risoprint, Cluj-Napoca; 2013. 191 p.
22. Bodoki E, Cristea C, Hârceagă V, Cernat A, Feier B, Iacob B, et all.
Separation methods and instrumental analysis - laboratory guidebook.
Editura Risoprint, Cluj-Napoca; 2014. 91 p.
23. Maghiar AL. Lucrări practice de fiziologie. Editura Universităţii din
Oradea; 2013. 209 p.
24. Champe PC, Richard AH, Ferrier DR. Lippincott Biochimie ilustrată. ediţia
a-4-a, Editura Medicală Callistro Bucureşti; 2010. 520 p.
25. Cristea-Popa E, Popescu A, Truţia E, Dinu V. Tratat de Biochimie
Medicală. Editura Medicală-Bucureşti; 2006. 775p.
26. Campbell PN, Smith AD. Biochimie ilustrată. Editura Academiei Române,
Bucureşti; 2004. 216 p.
27. Gilău D, Antonescu A, Dobjanschi L, Gilău RD, Gilău L. Compendiu de
Biochimie medicală. Editura Imprimeriei de Vest, Oradea; 2002. 274 p.
28. Gilău L, Proinov I. Biochimie medicală, Partea I. Editura Universităţii din
Oradea; 1999. 242 p.
29. Mihele D. Biochimie clinică. Editura Medicală Bucureşti; 2006. 486 p.
30. Dobjanschi L, Antonescu A, Bogdan N, Codreanu I, Gilău D, Mureşan M,
Gilău L. Lucrări practice de biochimie. Editura Imprimeriei de Vest,
Oradea; 2001. 178 p.
31. Moldoveanu E, Marta D. Biochimie Medicală-Lucrări practice pentru
studenţi. Editura Universităţii ―Titu Maiorescu‖, Bucureşti; 2011. 82 p.
32. Vicaş S. Chimie organică şi biochimie – lucrări practice. Editura
AcademicPres, Cluj-Napoca, 2008. 160 p.
33. Farmacopeea Română, Ediţia a-X-a, Editura Medicală, Bucureşti; 2008.
1315 p.
34. Dobjanschi L. Biochimie medicală. Editura Universitaţii Oradea; 2007. 253
p.
35. Medical labs [online]. [2014] [accesat 2016 octombrie 20]; disponibil pe:
URL: http://www.medical-labs.net/difference-between-plasma-and-serum-
1531/.

179
36. Medicina de urgenţă [online]. [2016] [accesat 2016 octombrie 20];
disponibil pe: URL: http://salvezidacastiisaactionezi.blogspot.ro/2016/01/
recoltarea-sangelui-prin-sistemul.html.
37. Fay MM: Chemistry, chapter 5 [online]. [2014] [accesat 2016 octombrie
20]; disponibil pe: URL: http://wps.prenhall.com/wps/media/objects/
602/616516/Media_Assets/Chapter05/Text_Images/FG05_03.JPG.
38. Patel T, Kukkar V, Sovasia N, Seth GL, Bihani SD: Electronic transition in
uv visible spectroscopy [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016
octombrie 20]; disponibil pe: URL: http://www.pharmatutor.org/articles/
summary-on-electronic-transition-in-uv-visible-spectroscopy.
39. Owen A: Tutorial on UV-Visible Spectroscopy [online]. [2000] [accesat
2016 octombrie 20]; disponibil pe: URL: http://www.agilent.com/cs/
Satellite?assettype=GSA_C&assetid=1404943754587&d=&formassembly=
false&pagename=Agilent/GSA_C/GenericInnerTemplateWithFourZones_
New.
40. Heda N: Spectrophotometry - Principles [online]. [2013] [accesat 2016
octombrie 20]; disponibil pe: URL: http://namrataheda.blogspot.ro/
2013/06/spectrophotometry-part-1.html.
41. Radu OM, Gutkin D: Case 638 - Recurrent pneumonia and pain crises in a
young female patient [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016 octombrie
20]; disponibil pe: URL: http://path.upmc.edu/cases/case638.html.
42. Scrigroup [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016 octombrie 20];
disponibil pe: URL: http://www.scrigroup.com/sanatate/
FIZIOPATOLOGIA-METABOLISMULUI-94416.php.
43. Sebia [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016 octombrie 20]; disponibil
pe: URL: http://www.sebia.com/en-EN/produits/hydragel-proteine.
44. Bioterapiro [online]. [dată necunoscută] [accesat 2016 octombrie 20];
disponibil pe: URL: http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_
index_ enciclopedic_terapeuticDiabet_zaharat.html.

180