Sunteți pe pagina 1din 129

CUPRINS

Capitolul I.:
OBIECTIVELE ACTIVITII LABORATORULUI DE MICROBIOLOGIE.
Organizarea laboratorului de microbiologie. Norme de protecia muncii...............7
Capitolul II :
STERILIZAREA I DEZINFECIA..9
Capitolul III:
RECOLTAREA I TRANSPORTUL PRODUSELOR PATOLOGICE..20
Capitolul IV:
EXAMENUL MICROSCOPIC..27
Capitolul V:
CULTIVAREA I IZOLAREA BACTERIILOR.................................................33
Capitolul VI:
TESTAREA SENSIBILITII IN VITRO LA SUBSTANE
ANTIBACTERIENE I ANTIFUNGICE..41
Capitolul VII:
METODE IMUNOLOGICE DE UZ CURENT 48
Capitolul.VIII:
DIAGNOSTICUL INFECIILOR STAFILOCOCICE.55
Capitolul IX:
DIAGNOSTICUL INFECIILOR STREPTOCOCICE....62
Capitolul X: DIAGNOSTICUL INFECIILOR PRODUSE DE NEISSERII...70
Capitolul XI:
DIAGNOSTICUL INFECIILOR PRODUSE DE BACILI
GRAM POZITIVI74
Capitolul XII:
DIAGNOSTICUL INFECTIILOR PRODUSE DE MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS (Dr Arghir Oana).79
5

Capitolul XIII:
DIAGNOSTICUL INFECIILOR PRODUSE DE BACILI
GRAM NEGATIVI......83
Capitolul XIV:
DIAGNOSTICUL INFECIILOR PRODUSE DE BACTERII ANAEROBE
(Dr. Barbu Adina) 89
Capitolul XV:
DIAGNOSTICUL SIFILISULUI.93
Capitolul XVI:
DIAGNOSTICUL INFECIILOR PRODUSE DE CHLAMYDIA SI
MYCOPLASMA102
Capitolul XVII:
DIAGNOSTICUL INFECIILOR GENITALE ..107
Capitolul XVIII:
DIAGNOSTICUL INFECIILOR PRODUSE DE LEVURI
(CANDIDA).......................................................................................................112
Capitolul XIX
DIAGNOSTICUL INFECIEI CU TRICHOMONAS VAGINALIS...............117
Capitolul XX:
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE.
DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU HERPESVIRUSURI..119
Capitolul XXI
DIAGNOSTICUL HEPATITELOR VIRALE.................................................124
Capitolul XXII
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIEI HIV............................128
BIBLIOGRAFIE.................................................................................................132

Capitolul I
OBIECTIVELE ACTIVITII LABORATORULUI DE MICROBIOLOGIE
Organizarea laboratorului de microbiologie
Norme de protecia muncii
Principalele obiective ale activitii n laboratorul de microbiologie sunt:
Izolarea i identificarea microorganismelor prezente n produsele biologice i
aprecierea patogenitii acestora.
Testarea sensiblitii la antibiotice i chimioterapice a tulpinilor patogene
izolate.
Diagnosticul serologic: identificarea i titrarea n serul pacienilor a
antigenelor i anticorpilor dezvoltai mpotriva unor ageni infecioi bacterieni,
virali, parazitari.
Efectuarea unor studii epidemiologice i de cercetare pe baza rezultatelor
obinute n intervale de timp semnificative (ani, sezoane).
Activitatea didactic, de realizare a lucrrilor practice cu studenii i a
stagiilor medicilor rezideni.
Structura general a unui laborator de microbiologie trebuie s cuprind
Spatiul destinat laboratorului
- Sala de asteptare
- Spatiu de recoltare de snge
Spaiul destinal microbiologiei este separat de restul laboratorului , accesul fiind
restricionat la personalul laboratorului i semnalizat printr-un afi special. Acest
spaiu cuprinde:
- Spatiu de recoltare produse patologice i primire probe pentru microbiologie;
- Camera de pregatire medii pentru microbiologie, cu suprafata de 8. m2;
- Camer de lucru pentru microbiologie, cu suprafaa de 12 m2;
- spaiu de sterilizare;
- spaiu de depozitare materiale;
- vestiar pentru personal;
Toata suprafaa laboratorului trebuie pardosit cu materiale lavabile. (linoleum cu
proprieti antibacteriene destinat traficului intens)
Pereii trebuiesc zugravii cu material lavabil, iar n spaiul destinat bacteriologiei,
acetia trebuiesc placai cu faian sau linoleum antibacterian.
Circuitele funcionale
Spaiul trebuie compartimentat astfel nct s fie asigurate circuitele funcionale:
Accesul n laborator se face printr-o intrare separat. Din sala de ateptare exist
acces direct la grupul sanitar, dotat cu dou compartimente, unul destinat
personalului i altul destinat pacienilor.
Din sala de ateptare trebuie s existe accesul la sala de recolt.
7

Sala de recolt trebuie s fie alturi de spaiul de lucru, facilitnd astfel


transportul probelor.
Dotri.
Laboratorul de microbiologie trebuie s fie dotat cu:
- mese de bacteriologie cu blat de faian
- Hot cu flux laminar vertical,
- autoclav, lamp sterilizatoare cu UV,
- termostat (etuv termoreglabil), frigider, congelator,
- bec Bunsen, ans bacteriologic
- lup de laborator, microscop, lame, lamele,
- pipete sterile de unic utilizare, indicator pH,
- medii de cultur deshidratate, plci Perti sterile de unic folosin;
- sticlue de urocultur, coprorecoltoare, tampoane de recoltat exudate, toate
sterile i de unic utilizare.
Pentru imunologie sunt necesare: Microscop, centrifug, frigider, congelator,
cititor ELISA, spectrofotometru, pipete automate.
Norme de protecia muncii n laboratorul de microbiologie
Accesul n laboratorul de microbiologie este restrns la persoanele care lucreaz
n laborator. Pacienii i alte persoane care transport probe au acces numai pn la
sala de recolt i spaiul de primire probe bacteriologice.
Nu se mnnc, nu se bea i nu se fumeaz n laborator, dect n spaiul cu
destinaie special.
n trimpul lucrului trebuie purtat echipamentul de protecie: halat, mnui,
eventual masc, ochelari.
n legtur cu folosirea becului Bunsen, trebuie avut grij s nu existe scpri de
gaze.
Trebuie avut grij la manipularea substanelor dezinfectante corozive, tip
amestec sulfocromic, ce pot produce arsuri cutanate.

Capitolul II
STERILIZAREA I DEZINFECIA
Definiii:
Prin sterilizare se nelege orice metod fizic sau chimic prin care sunt
distruse microorganismele, att formele vegetative ct i formele de rezisten
( sporii ) de la nivelul unui substrat.
Rezultatul unei proceduri de sterilizare este starea de sterilitate: un substrat steril,
complet lipsit de microorganisme vii, att formele vegetative ct i formele de
rezisten
Obinerea strii de "sterilitate", precum i meninerea ei (pn n momentul
utilizrii) confer siguran maxim , probabilitatea teoretic a existenei
microorganismelor fiind 106 .
Prin dezinfecie se nelege procesul prin care sunt distruse majoritatea
microorganismelor(n proporie de pn la 99 %) de pe obiectele din mediul inert,
cu excepia formelor de rezisten (sporilor bacterieni). Substanele utilizate n
acest scop se numesc dezinfectante.
Dezinfecia se aplic n cazurile n care curenia nu elimin riscurile de rspndire
a infeciei, iar sterilizarea nu este necesar.
Reducerea numrului de microorganisme de la nivelul pielii, mucoaselor i
esuturilor vii se numete antisepsie. Substanele folosite n acest scop se numesc
antiseptice. Unele substane pot fi folosite att ca dezinfectante, ct i ca
antiseptice, n concentraii diferite.
Decontaminarea se refer la procesul sau tratamentul care se aplic
dispozitivelor medicale utilizate, avnd scopurile urmtoare: diminuarea populaiei
de microorganisme, prevenirea uscrii produselor biologice, protecia personalului
care-l manipuleaz, protecia mediului mpotriva contaminrii
Metodele de sterilizare se clasific, dup agentul sterilizant, n
a. Sterilizare prin metode fizice:
Sterilizarea prin cldur
Sterilizarea prin filtrare
Sterilizarea cu ajutorul radiaiilor
b. Sterilizarea chimic
Sterilizarea prin cldur.
Cldura este un agent relativ ieftin i foarte eficient. Se preteaz la
sterilizarea prin cldur toate materialele termorezistente.
Sterilizarea prin cldur uscat:
9

STERILIZAREA PRIN ARDEREA N FLACR (ARDEREA LA ROU)


este utilizat n bacteriologie, pentru ansa bacteriologic metalic. Ansa se ine cu
vrful n flacra becului Bunsen, pn se nroete, apoi nc 5-10 secunde. La
temperatura la care metalul este incandescent, toate microorganismele sunt distruse
prin carbonizare.
Atenie: flacra este mai fierbinte spre vrf. Dac ansa este ncrcat (conine
produs biologic sau cultur bacterian), ea se introduce la nceput n poriunea
inferioar a flcrii, pn la arderea produsului, apoi se ridic uor spre vrful
flcrii. n acest mod persoana care manipuleaz ansa evit s se stropeasc cu
materialul ce poate sri din ans.
Instrumentele metalice tietoare sau neptoare din oel inoxidabil pot fi
deteriorate dac se sterilizeaz prin aceast metod, datorit declirii oelului.
STERILIZAREA LA PUPINEL, ETUV TERMOREGLABIL
Sterilizatorul cu aer cald este un cuptor ( cuptor Pasteur) cu perei dubli, ntre
care se gasete sursa de cldur. Pereii interiori sunt perforai, pentru a permite
circulaia aerului cald. Sterilizatorul poate fi cu sau fr ventilator. El are n mod
obligatoriu un afiaj mecanic sau electronic pentru temperatur i timp, care
permite fixarea i urmrirea parametrilor de funcionare. ( Fig. 1)
Agentul de sterilizare este aerul uscat i cald , la 180C, care acionea 1
or efectiv, din momentul atingerii temperaturii de sterilizare n interiorul
ncrcturii.

Fig.II.1. a. Pupinel.

1.b. Principiul
pupinelului
10

de

funcionare

al

La sterilizatorul cu aer cald se sterilizeaz sticlria i instrumentarul care nu


suport sterilizarea cu aburi sub presiune (oel ne-inoxidabil: cromat). Sterilizatorul
cu aer cald este contraindicat pentru materiale textile, lichide i cauciuc.
Obiectele de sterilizat sunt splate, uscate i ambalate n hrtie special
( sticlria de laborator) sau cutii metalice ( instrumentarul metalic).
Cutiile metalice cu instrumentar se introduc nchise n incinta sterilizatorului
cu aer cald.
Durata meninerii sterilitii materialelor ambalate n cutii metalice este de
24 de ore de la sterilizare, cu condiia meninerii cutiilor metalice nchise.
Durata meninerii sterilitii materialelor n ambalaje de hrtie sudate este de
2 luni de la sterilizare, cu condiia meninerii integritii lor i a manipulrii
acestora numai prin intermediul coului.
La extragerea pachetelor din sterilizatorul cu aer cald se folosesc mnui .
Se lipete o etichet sau banderol pe capac pentru a identifica dispozitivele
medicale i materialele sterilizate. Se noteaz data i ora sterilizrii.
Se noteaz n caietul de sterilizare: data, coninutul cutiilor (pachetelor),
temperatura la care s-a efectuat sterilizarea, durata, rezultatele indicatorilor chimici,
semntura persoanei responsabilizate cu sterilizarea, observaii.
Sterilizarea prin cldur umed:
STERILIZAREA CU ABUR SUB PRESIUNE AUTOCLAVAREA
Principiul sterilizrii cu abur sub presiune este de a expune fiecare la
contactul cu aburul la temperatura i presiunea pentru timpul specificat: 121C la
1,01 atmosfere timp de 30 minute, pn la 134C la 2 atmosfere, timp de 30
minute.Timpul de sterilzare se msoar din momentul atingerii temperaturii
efective n interiorul ncrcturii
Prin autoclavare se pot steriliza: Instrumentar medical metalic , textile,
sticlrie, cauciuc, plastic termostabil,ap i soluiilor apoase, medii de cultur
Se pot utiliza 2 tipuri de autoclave:
1. Autoclave cu pre i post vacuumare.
Realizeaz sterilizara optim a instrumentarului chirurgical din oel
inoxidabil i singura metod posibil pentru sterilizarea materialului moale
(textile), cauciucului, sticlriei. Este folosit i n decontaminarea deeurilor din
laborator (deeuri infecioase).
2. Autoclave fr post vacuumare. Sunt folosite pentru sterilizarea mediilor
de laborator i lichidelor n flacoane. Timpul de ptrundere al aburului este
prelungit datorit eliminrii incomplete a aerului.
La ncheierea ciclului complet de sterilizare se ateapt s se rceasc, se
evacuez aburul, apoi se deschide ua autoclavului. Nu se deschide niciodat
sterilizatorul cu abur sub presiune nainte ca temperatura s fie sub 100C. La
11

extragerea pachetelor din sterilizatorul cu abur sub presiune se folosesc mnui din
bumbac.
Cutiile, casoletele, i pachetele sterilizate se depoziteaz temporar pe o
suprafa special destinat materialului steril i se aranjez n dulapuri special
destinate depozitrii materialului steril.
Cutiile, casoletele, courile, navetele cu pachetele sterilizate se eticheteaz
(banderoleaz) notndu-se data, ora, sterilizatorul cu abur sub presiune la care s-a
efectuat sterilizarea, persoana care a efectuat sterilizarea.

Fig.II.2 a. Autoclav vertical model clasic

2.b. Autoclav orizontal

12

Controlul sterilizrii se poate face face prin metode fizice, chimice i biologice.
a. Verificarea temperaturii: Se citete temperatura termometrului sau
temperatura afiat pe monitor. Temperatura se noteaz n caietul de sterilizare.
La autoclav: verificarea presiunii la manometru i a temperaturii.
b. Verificarea indicatorilor fizico-chimicici:
- virarea culorii la benzile adezive cu indicator fizico-chimic.
- virarea culorii la indicatorii fizico-chimici integratori. Indicatorul
integrator plasat n interiorul cutiilor metalice indic dac au fost ndeplinite
condiiile pentru o sterilizare eficient temperatura atins n interiorul
pachetului i timpul de expunere. n situaia n care virajul nu s-a realizat,
materialul se consider nesterilizat i nu se utilizeaz.
O dat pe lun Se utilizeaz indicator biologic cu Bacillus subtillis pentru
controlul eficacitii sterilizrii.
Pentru sterilizarea la pupinel pot fi utilizai indicatori biologici cu Bacillus subtillis
preparai industrial, comercializai, care conin 106 UFC sau preparai n laborator.
Acestea se plaseaz n mijlocul incintei sterilizatorului cu aer cald, odat cu
celelalte pachete pentru sterilizat. Se realizeaz ciclul complet de sterilzare. La
sfritul ciclului, indicatorii biologici se extrag din cutie i se incubeaz 48 ore la
56C, la laborator. Laboratorul va emite un buletin de analiz cu rezultatul
constatat.
Pentru controlul sterilizrii la autoclav sunt admii indicatorii biologici cu
forme diferite de condiionare:
Indicatori biologici cu Bacillus stearothermophylus impregnai pe supori de
bumbac n concentraii de 106 UFC.Acetia se pun n interiorul unei cutiitest. Cutia-test se introduce n autoclav odat cu materialul de sterilizat i se
realizeaz ciclul complet de sterilizare. La sfritul ciclului, indicatorul
biologic este trimis la laborator, unde este extras, nsmnat i incubat;
citirea se face la 7 zile.
Controlul bacteriologic al sterilizrii la autoclav cu indicator tipStearotest
120, pentru controlul sterilizrii la autoclav la temperatura de 120C cu o
durat de 30 minute
Acest produs este o suspensie de spori de Bacillus stearothermophyllus n
soluie nutritiv, cu indicator de pH. Coninutul fiolelor de Stearotest 120 este
limpede de culoare violet. Fiolele de tipStearotest 120 se introduc n autoclav
printre dispozitivele medicale i materialele supuse sterilizrii . Se efectueaz
sterilizarea, la 120C, timp de 30 min; dup sterilizare fiolele sunt aezate ntr-un
incubator de 56C.
Citirea i interpretarea rezultatelor:
-meninerea aspectului (culoare, transparen) nemodificat arat o sterilizare
corect;

-virajul la galben al indicatorului de pH i o uoar opalescen a


coninutului indic o sterilizare sub parametrii de eficien optim (au rmas spori
viabili s-au cultivat i au modificat aspectul produsului).
La 6 luni Se efectueaz verificarea aparatului de ctre un tehnician
autorizat.
STERILIZAREA PRIN FILTRARE
Sterilizarea prin filtrare reprezint trecerea unui lichid printr-un filtru cu porii
avnd dimensiuni mai mici dect ale bacteriilor sau ale virusurilor ( ultrafiltrare).
Filtrele bacteriologice sunt de mai bulte tipuri:
Filtre Seitz, din azbest
Filtre Chamberland, din porelan poros
Filtre din sticl Yena, etc
Filtrele se sterilizeaz prin autoclavare. Lichidul de sterilizate este aspirat cu
ajutorul unei pompe de vid.
n situaiile n care n laboratoare este necesar lucrul n condiii aseptice
(prelucrare produse ce conin M.tubreculosis, tehnic PCR), se utilizeaz incintele
asptice cu protecie suplimentar hote cu flux laminar. Aceste au un spaiu de
lucru, cu perei de sticl i un compartiment superior metalic, care conine 2-3 filtre
( foltru din fibr poliamidic i 1-2 filtre HEPA). Circulaia aerului se face cu
ajutorul unui ventilator
STERILIZAREA CU AJUTORUL RADIAIILOR
Radiaiile ionizante (,,,X) au o bun capacitate sterilizant, dar sunt
nocive pentru organismul uman. De aceea se folosesc numai n activitatea
industrial i nu sunt folosite n activitatea medical.
Radiaiile neionizante UV sunt folosite pentru sterilizarea suprafeelor i
aerului n laboratoare, sli de operaie, pentru sterilizarea apei n bazine. Lmpile
de UV trebuie folosite n laboratorul de bacteriologie cte 10 minute, de mai multe
ori pe zi, dup evacuarea prealabil a personalului din ncpere.
STERILIZAREA CHIMIC : STERILIZATOARE CU OXID DE ETILEN
Sterilizarea cu oxid de etilen se utilizeaz numai atunci cnd nu exist alt
mijloc de sterilizare adecvat pentru obiecte i echipamente termosensibile.
Materialul medico-chirurgical care se sterilizeaz cu oxid de etilen:
Obiecte din material plastic i materiale compozite, termosensibile i pentru
care se cunoate perioada de timp necesar desorbiei; polielietilen, teflon, latex,
silicon, acetatul de etilenvinil, poliuretan, polipropilen. Echipamentul medical
constituit din pri de PVC (policlorura de vinil) sterilizat iniial cu radiaii
ionizante sau raze gamma nu va fi resterilizat cu oxid de etilen, deoarece PVC
elibereaz compui toxici - etilen clorhidrin.

Oxidul de etilen este un gaz inodor, toxic, a crui prezen nu este


perceput n aer. n amestec cu aerul, este exploziv pornind de la concentraia de
3% V-V. Prin inhalare: oxidul de etilen poate provoca iritaia cilor respiratorii i
depresia sistemului nervos central , iar prin contact: reacii de iritaie a pieli i
mucoaselor la personalul care efectueaz sterilizarea.
Materialul supus insuficient tratamentului de desorbie utilizat la bolnavi
poate cauza fenomene hemolitice, stenoze traheale, colaps cardiovascular i
fenomene alergice. De aceea, sterilizatoarele cu oxidul de etilen trebuie s aib
inclus n ciclul de sterilizare desorbia la sfritul programului.
Sterilizarea cu oxid de etilen se va realiza n spaii ventilate, destinate numai
pentru aceast activitate.
DEZINFECIA
1.DEZINFECIA
CHIMIC.
SUBSTANTE
DEZINFECTANTE
SI
ANTISEPTICE
Eficiena unei proceduri de dezinfecie depinde de natura substanei
dezinfectante folosite fiind direct proporional cu concentraia acesteia i
timpul de aciune, n timp ce prezena materiilor organice ( snge, urin, materii
fecale, culturi bacteriene) i a formelor sporulate reduc efectul dezinfectant.
Spre deosebire de sterilizare, care este un termen cu semnificaie absolut
( steril sau nesteril), dezinfecia poate fi de diferite grade: dezinfecie nalt,
medie i slab.
Dezinfecia nalt este orice procedur care reuete s inactiveze formele
vegetative ale bacteriilor, virusurile, paraziii i ciupercile microscopice.
Dezinfectante puternice:
Glutaraldehida: soluie apoas 2%
Formaldehida: soluie apoas 8%
Amestecul sulfocromic: acid sulfuric+ bicromat de potasiu+ ap
Peroxidul de hidrogen 3-6%
Acidul peracetic n diferite concentraii
Hipocloritul de sodiu
Timpul de aciune necesar pentru ca aceste substane s realizeze o dezinfecie de
nivel nalt este de minim 20 minute. Este absolut necesar s se respecte
instruciunile de folosire ale fiecrui preparat comercial , aa cum sunt specificate
de productor.
Dac dezinfectantele puternice acioneaz un timp suficient i pe substratul
respectiv nu exist spori bacterieni, se poate realiza o sterilizare chimic.

Dezinfectante cu putere medie:


Realizeaz distrugerea Mycobacterium tuberculosis, a bacteriilor n form
vegetativ, a celor mai multe virusuri i fungi, dar nu i a sporilor bacterieni.
Substanele chimice care realizeaz dezinfecia de nivel intermediar sunt:
Iodofori ( compui iodai): combinaii ale iodului cu o substan
stabilizatoare sau transportatoare. La diluarea n ap, din aceste complexe se
elibereaz iodul liber, cu aciune antimicrobian 50-150 mg /1000ml ( 515%). Exemple de substane transportatoare: compui cuaternari de amoniu,
polivinilpirolidon, detergeni.
Compui clorurai: elibereaz Cl liber i ClO2. Conin 0.5-5 g Cl /1000ml.
Cloramina, hipocloritul
Alcooli: etilic, izopropilic 70% vol/vol .
Compui fenolici: 0.5-3% n ap
Detergenii
Detergeni neutri folosii pentru: mobilier, pavimente, vesel i splarea
manual a textilelor.
Detergeni alcalini sau decapani folosii pentru pavimente .
Detergeni acizi sau detartrani utilizai pentru materiale cu depuneri de
piatr: ceramic, pavimente placate cu materiale care suport acizi, sticlrie de
laborator, bazine, bazinete, urinare.
Detergenti-dezinfectantii sau detergentii cationici sunt produse a caror
proprietate principala este cea de curatare si secundar dezinfectanta.
Timpul de contact necesar al substanei chimice cu substratul tratat este de 10
minute.
Dezinfectante slabe:
Pot distruge cele mai multe bacterii n forma vegetativ, unele virusuri, unii
fungi, dar nu distrug microorganisme rezistente, ca Mycobacterium tuberculosis,
sau sporii bacterieni.
Compui cuaternari de amoniu
Dezinfectante care conin fenoli, iodofori i ageni de spumare;
Timpul de contact necesar al substanei chimice cu substratul tratat este de sub
10 minute.
n funcie de suportul tratat, se pot folosi urmtoarele metode de aplicare a
dezinfectantelor chimice
Imersie (recipiente pentru recoltarea produslor patologice, instrumente, pipete,
lame de microscop), tergere (mese de lucru n laborator, aparate, pavimente),
stropire , pulverizare ( ui, ferestre).
Pregatirea in vederea sterilizarii a materialului medico-chirurgical utilizat
cuprinde mai multe etape:

Curatare/decontaminare (predezinfectie) echipamentelor: realizat imediat


dup utilizarea acestora, ct mai aproape de locul utilizrii.
- diminueaz populaia de microorganisme
- previne uscarea produselor biologice
- contribuie la protecia personalului care-l manipuleaz
- contribuie la protecia mediului mpotriva contaminrii
Se realizeaz n dou etape
1. faza de pretratament, realizat prin imersia dispozitivelor utilizate, n
soluie de detergent - dezinfectant (cu aciune de detaare a murdriei
grosiere de pe substrat i aciune bactericid)
2. faza de curare manual sau mecanic
Clatire riguroas sub jet de ap potabil;
Dezinfectie, utilizand un dezinfectant adecvat, dintre cele cu putere nalt sau
medie;
Clatire cu ap;
Uscare cu prosop curat sau aer comprimat.
ANTISEPTICELE sunt preparate cu proprieti antimicrobiene, ele distrug, sau
inactiveaz microorgnismele de la nivelul esuturilor vii. Ele reduc temporar de pe
piele i mucoase numrul de microorganisme.
Utilizarea antisepticelor permite:
- realizarea ngrijirilor aseptice,
- reducerea transmiterii germenilor, de la bolnav la bolnav, prin intermediul
minilor,
- tratarea infeciilor locale cutanate si mucoase.
Substane antiseptice
Alcooli: etanol, izopropanol 70% vol/vol 35% vol/vol
Compui iodai 1-2%: alcool iodat, tinctur de iod, betadina:povidoneiodine 7,5-10%
Compui clorurai: Clorhexidina ( 0,75-4%), Hexaclorofen (1-3%)
H2O2 3%
Compui colorai:Violet de geniana, albastru de metilen, fucsina
Permanganat de potasiu
Nitrat de argint 0,1%
Clorura de benzalkonium:soluie alcoolic 0,1-0,2% (piele), soluie apoas
0,1-0,2%(plgi)
soluii oftalmice: 0,01%, instilaii vezic urinar i uretr: 0,005%
Spunuri i detergeni

2. DEZINFECIA PRIN MIJLOACE FIZICE


Dezinfecia prin cldur
- Cldura uscat: flambarea
Flambarea const n trecerea unui obiect prin flacr. Este utilizat n laborator,
pentru eprubete de sticl, lame de microscop, etc. Nu se folosete pentru
instrumente medico-chirurgicale.
- Cldura umed: fierberea i pasteurizarea
Fierberea n ap la temperatura de 100C timp de minim 20 minute realizeaz
distrugerea formelor vegetative ale microorganismelor patogene. Fierberea apei i
alimentelor reprezint o metod de prevenire a bolilor transmisibile cu poart de
intrare digestiv.
Pasteurizarea: este o metod de dezinfecie a lichidelor, la temperaturi cuprinse
ntre 55 - 95C. Dup expunere, de durat variabil, sunt distruse 90 95% dintre
formele vegetative ale microorganismele patogene.
Dezinfecia prin splare la temperatura de 60 - 95C este un proces complex
la care, pe lng aciunea cldurii umede, se adaug i aciunea detergenilor sau a
altor substane, ct i aciunea mecanic de splare. Acest procedeu se folosete la
splarea i dezinfecia lenjeriei, veselei, sticlriei de laborator, instrumentarului.
Dezinfecia cu raze ultraviolete
Indicaii: dezinfecia suprafeelor netede i aerului n boxe de laborator, sli de
operaii, alte spaii nchise, pentru completarea msurilor de curenie i
dezinfecie chimic.
Lmpile destinate dezinfeciei pot fi fixe sau mobile, cu tuburi de UV ntre 15 i
30 W, prevzute s funcioneze n absena omului (cu radiaie direct) sau n
prezena omului (cu radiaie indirect, ecranat i fr emisie de ozon).
Exemple de produse comerciale de detergeni dezinfectani i dezinfectani
Virkon ( Antec international) detergent-dezinfectant; amestec de peroxizi,
surfactant, acizi organici i sruri anorganice. Poate fi folosit pentru suprafee
dure ( faian, pavimente), n laboratoareele medicale pentru aparatura de
laborator, cuve, centrifugi, pipete.
Biguacid S ( Antiseptica) dezinfectant-detergent, conine didecyl-dimethyl
ammonium-chlorid i biguanin. Poate fi folosit pentru suprafee, pavimente,
grupuri sanitare.
Combi-instruments ( Antiseptica) dezinfectant-detergent lichid pentru
instrumentar chirurgical i dinlaboratoare ( sticl, porelan, metal, cauciuc, mase
plastice). Conine: glutaraldehid, clorur de benzalkonium, didecyl-dimethyl
ammonium-chlorid.

Big Spray ( Antiseptica) amestec de ethanol propanol poyhxanide. Spray


dezinfectant, utilizat prin pulverizare, pentru dezinfecia suprafeelor din sali de
operaie, ambulane,mobilier, haine, saltele, perne.
Mikrozid Liquid ( Shulke &Meyer) - amestec de etanol i propanol .
Dezinfectant pentru suprafee, grupuri sanitare.
Lysetol AF ( Shulke &Meyer)
- conine: guanidinacetat, fenoxipropanol,
clorur de benzalconiu. Dezinfectant pentru instrumentarul medico-chirurgical.
Perform FF ( Shulke &Meyer) - conine peroximonosulfat de potasiu, benzoat
de sodiu, acid tartric, spun. Indicat n dezinfecia i curarea suprafeelor i
obiectelor de inventar lavabile.
Terralin ( Shulke &Meyer) - amestec de clorur de benzalconiu i propanol.
Poate fi folosit pentru curirea i dezinfecia pardoselilor, pereilor, grupurilor
sanitare i obiectelor de inventar lavabile.

Fig.II.3.Simboluri pentru modul de utilizare a dezinfectantelor (Shulke &Meyer)

Fig.II.4.Simbol pentru dezinfecia mainilor (Shulke


&Meyer)
Exemple de produse comerciale de antiseptice
Desmanol ( Shulke &Meyer) conine digluconat de clorhexidin i propanol.
Utilizat pentru dezinfecia igienic i chirurgical a minilor.
Desderman N ( Shulke &Meyer)
- conine etanol, bifenilol, polyvidone,
isopropyl. Indicat pentru dezinfecia igienic i chirurgical a minilor.
Primasept Med ( Shulke &Meyer) conine bifenilol i propanol. Utilizat pentru
dezinfecia igienic a minilor.

Capitolul III
RECOLTAREA I TRANSPORTUL PRODUSELOR PATOLOGICE
Recoltarea produselor patologice n scopul examenului microbiologic
reprezint o etap extrem de important , de corectitudinea creia depinde n mare
msur exactitatea diagnosticului. Recoltarea produselor patologice adecvate, n
momentul corespunztor, cu respectarea regulilor de asepsie, transportul n condiii
optime i ct mai rapid spre laborator sunt absolut necesare .
Principii generale
Recoltarea probelor trebuie fcut de medic sau sub ndrumarea acestuia.
Se utilizeaz numai recoltoare sterile, pe care vor fi menionate datele de
identificare: numele pacientului, secia, produsul i data recoltrii, nainte de a se
face prelevarea.
Recoltarea unui produs biologic n vederea evidenierii florei microbiene
trebuie efectuat, pe ct posibil, naintea administrrii tratamentului cu antibiotice .
Din produsul biologic se va recolta poriunea sau fragmentul cu aspect
patologic, caracteristic.
Prelevarea trebuie fcut n momentul optim, n sensul posibilitii prezenei
unui numr ct mai mare de microorganisme i n funcie de evoluia clinic a bolii.
Cantitatea de produs trebuie s fie suficient pentru a permite efectuarea mai
multor examene.
Transportul probelor recoltate la laborator trebuie s fie fcut n timp ct
mai scurt, pentru a evita modificrile cantitative i calitative ale florei, sub aciunea
deshidratrii, modificrilor de temperatur, pH, etc. n probele pstrate prea mult
timp, microorganismele mor datorit deshidratrii, temperaturii prea sczute, sau,
din contr, unele medii ( urina) sunt favorabile multiplicrii excesive a florei
iniiale.
n cazul n care transportul poate dura mai mult timp sau nu exist
posibilitatea nsmnrii imediate a probelor, se folosesc recoltoare cu medii de
conservare i transport.
Transportul probelor se va face n containere speciale, inscripionate cu
meniunea material infectant, manipulate de persoane instruite, evitndu-se
rsturnarea containerelor i vrsarea materialelor .
Hemocultura
Prelevarea unei probe de snge pentru cultivarea pe medii adecvate
hemocultura- are indicaie n suspiciunea de bacteriemie, septicemie sau
endocardit bacterian. De asemenea hemocultura este indicat n strile febrile
prelungite fr o cauz decelabil.
Este foarte important ca puncia venoas s fie fcut n condiii de asepsie,
folosind pentru dezinfectare pielii la locul punciei venoase alcool 80-95% i

compui iodai: tintur de iod, betadin , ce vor fi lsai s acioneze pe piele minim
1 minut. Persoana care recolteaz va purta mnui sterile.
Vor fi recoltate cel puin trei probe, fie ntr-un interval de 24 h , n
suspiciunea de endocardit, fie la intervale de timp determinate de evoluia clinic,
n general n plin puseu febril, timp de 2-3 zile consecutiv. O singur prob este
insufucuent pentru stabilirea unui diagnostic corect, indiferent de rezultatul
acesteia.
Volumul de snge indicat a se recolta pentru hemocultur este de 20 ml la
adult i 1-5 ml la copii, n funcie de vrsta acestora. Sngele se recolteaz cu
seringa i se descarc imediat n mediile de cultur lichide speciale. Se folosete de
regul un set de dou medii de cultur: aerobe i anaerobe. Raportul optim snge:
mediu de cultur este de 1: 10 ( flacoanele cu medii pentru hemocultur au n
general 100 ml, pentru aduli i 20 ml pentru copii ). n cazul n care pacienii au
primit deja antibiotice, exist medii de cultur aerobe i anaerobe cu inhibitori de
antibiotice. Totui este de preferat ca mcar primele prelevri s se fac naintea
instituirii tratamentului antibacterian sau antifungic.
Incubarea hemoculturilor se face la 370 C, timp de 7 zile. n sistem clasic, se
fac treceri pe medii solide la fiecare 24 h. Hemocultoarele automate efectueaz
citiri cu ajutorul unei fotocelule ce nregistreaz modificarea turbiditii mediului
prin creterea bacterian, la intervale de timp de 15-30 minute. Confirmarea
pozitivrii hemoculturii precum i identificarea tulpinii izolate se face tot prin
trecere pe medii de cultur solide. Dac dup 7 zile hemocultura nu s-a pozitivat,
rezultatul definitiv va fi negativ ( hemocultur steril ).
Catetere intravasculare
Meninerea cateterelor intravasculare mai mult de 72h reprezint o surs
important de episoade de bacteriemie i de infecii la locul de inserie al
cateterului. Dup scoaterea cateterului, vrful de cateter segmentul distal, de 3-5
cm, secionat aseptic i introdus ntr-un tub cu capac steril, este trimis la laboratorul
de bacteriologie . Aici, peste vrful de cateter se toarn 2-3 ml bulion steril, astfel
nct s fie complet acoperit i va fi meninut astfel 24 h. Din bulion vor fi fcute
treceri pe medii de cultur solide.
Lichidul cefalorahidian ( L.C.R. )
Examenul lichidului cefalorahidian este indicat n suspiciunea de
meningit:febr, cefalee, fotofobie, redoarea cefei, etc.
Recoltarea L.C.R. se face prin puncie lombar, n condiii de asepsie strict,
dup dezinfecia pielii cu betadin sau ali compui iodai. Prelevarea se face n
sering, fr a aspira, apoi descrcat n flacoane sterile cu dop, sau-i n medii de
cultur lichide pentru hemocultur.

Este de preferat s existe flacoane diferite: pentru cultur, pentru examenul


biochimic i examenul microscopic. Dac nu exist dect un singur flacon, atunci
mai nti se efectueaz nsmnarea ( cultura), apoi examenul biochimic i cel
microscopic.
La examenul macroscopic LCR normal este incolor, limpede, transparent. n
meningitele bacteriene apare tulbure, glbui sau verzui. Culturile se fac pe medii
solide , dar pot fi fcute i n medii lichide de hemocultur, n special la analizorul
automat .
Apoi, din L.C.R. se numr elementele ( celulele), n camera de numrat
Fuchs-Rosenthal. Valoarea normal a numrului de elemente celulare este mai
mic de 5 elemente la 1 ml, acestea fiind n special limfocite. Dac numrul de
celule depete limitele fiziologice, este necesar efectuarea unu frotiu colorat
Giemsa pentru aprecierea raportului dintre mononucleare i polinucleare. n
meningitele bacteriene, numrul de celule crete la cteva sute sau chiar mii la 1ml,
predominente fiind polinuclearele. n meningitele virale, fungice i n meningita
tuberculoas, numrul de elemente este mai redus i chiar dac n primele ore
exist o predominen a polinuclearelor, ulterior raportul se inverseaz cu
predominena mononuclearelor .
L.C.R. este apoi centrifugat la 1500 g timp de 15 minute. Supernatantul este
separat i va fi folosit la examenul biochimic: dozarea proteinelor, glucozei,
clorurilor.
Din sediment se efectueaz 2-3 frotiuri, colorate A.M., Gram i la nevioe
Ziehl-Neelsen.
Teste imunologice, de detectare a antigenelor bacteriene sau fungice n LCR
sunt recomandate arunci cnd exist modificri semnificative ale LCR: leucocite,
glucoz sczut, proteine crescute, dar pe frotiu nu se observ flori sau pacientul a
fost tratat n prealabil . Pot fi detectate antigene de Streptococcus pneumoniae,
Neisseria meningitidis, Haemophylus influenzae, Streptococcus agalactiae sau
Cryptococcus neoformans
Alte lichide normal sterile: lichidul peritoneal, lichidul pleural, lichidul
sinovial, lichidul pericardic.
Aceste lichide se recolteaz de regul prin puncie transcutan, n condiii de
asepsie riguroas, n cantitate de 5-20 ml. Fiind produse normal sterile, orice
microorganism de pe piele care contamineaz proba duce la rezultate complet
eronate. Lichidul peritoneal se poate recolta i intraoperator, cu tamponul steril.
Dac lichidul este purulent, se poate efectua un frotiu colorat Gram direct din
produsul patologic. n caz contrar, se fac culturi aerobe i anaerobe.

Bila
Recoltarea bilei se poate face prin tubaj duodenal sau, dup colecistectomie,
direct din vezica biliar cu tamponul steril sau n sering.
Tubajul duodenal se efectueaz dimineaa pe nemncate, cu sonda Einhorn
introdus pe nas sau pe gur, dup ce bolnavul a fcut gargar cu ser fiziologic. Se
introduce sonda pn la diviziune 45, apoi se culc bolnavul pe parte dreapt i se
continu introducerea sondei pn la diviziunea 60. Se aspir pe sond iniial bila
A, bil amestecat cu suc duodenal. Se introduc pe sond 30 ml soluie de sulfat de
magneziu sau sulfat de sodiu 40%, cu efect coleretic i colagog. Se aspir apoi bila
B, de culoare verde nchis, vscoas ( bila vezicular), apoi bila C, mai deschis la
culoare i mai fluid ( bila hepatic). Pentru examenul bacterilogic se folosete bila
B, 10-20 ml.
Din bila B se fectueaz culturi aerobe i anaerobe.
Din eantioane de bil A, B i C se efectueaz preparate ntre lam i lamel
pentru examenul parazitologic.
Exudatul faringian i exudatul nazal
Exudatul faringian se recolteaz cu tamponul steril, de unic folosin.
Recoltarea se face dimineaa pe nemncate, nainte ca pacientul s se spele pe dini,
s-i fac toaleta bucal sau s bea ceva. De asemenea, recoltarea se face naintea
oricrui tratament cu antibiotice sau local ( badijonri cu substane antiseptice,
antifungice sau antibacteriene).
Pacientul este aezat cu faa spre lumin , i se indic s deschid gura ct
poate de mult i cu ajutorul unui apstor de limb se preseaz limba astfel nct s
se evidenieze peretele posterior al oro-faringelui i tonsilele palatine. Se
examineaz macroscopic rapid oro-faringele i cu o micare rapid, blnd dar
precis se terg cu tamponul peretele faringian i tonsilele. Nu se ating peretele
superior al palatului i nici limba .( Secreia lingual este o investigaie aparte, cnd
se recolteaz tot cu tamponul strict de pe suprafaa limbii ).
Exudatul nazal se recolteaz n mod similar, cu tampon steril , din fiecare
fos nazal.
Exudatul faringian i cel nazal se transport la laborator i se nsmneazp n
cel mai scurt timp posibil, evitndu-se uscarea tamponului i efectul temperaturii
sczute, care duc la moartea florei bacteriene, n special a streptococilor i
pneumococilor. Pentru a evita aceste neajunsuri se pot folosi tuburi cu medii de
conservare i transport.
Secreiile conjunctivale, otice, secreiile de plag
Secreia conjunctival se recolteaz cu tamponul steril, dimineaa, naintea
efecturii toaletei i naintea aplicrii de coliruri sau de creme oftalmice .

Prelevarea se va face din sacul conjunctival intern, eventual cu tamponul umezit n


ser fiziologic steril.
Secreia otic se recolteaz cu tamponul steril din conductul auditiv , nainte
de aplicare oricrui tratament cu antibiotice sau antiseptice.
Secreiile de plag se vor recolta cu tamponul steril, nainte de toaleta plgii.
Dac plaga este profund i secreia abundent, se va recolta cu seringa steril i o
prob pentru cultur n anaerobioz.
Sputa
Sputa poate fi recoltat prin expectoraie ntr-un recipient steril (gradat, de
unic folosin). Pacientul este instruit ca dimineaa, dup un acces de tuse , s
expectoreze n recipientul steril, evitnd s amentece sputa cu saliva. Acest lucru
este dificil de realizat, principalul neajuns al metodei este c produsele sunt
frecvent contaminate cu flor din cavitatea bucal.
Probele de sput recoltate n cursul bronhoscopiei sunt ferite de acest
inconvenient, contaminarea cu flor bucal fiind practic neglijabil. Aceast
metod este cea mai recomandabil.
La copiii mici, care nu tiu s expectoreze i nghit sputa. Aceasta poate fi
recoltat prin tubaj gastric urmat de introducerea a 10-20 ml ser fiziologic, urmat
de aspiraie. n lichidul aspirat va fi i sputa nghiit, dar micobacteriile i fungii
coninui pot fi de origine gastric
Urina
Recoltarea urinei pentru urocultur este indicat n suspiciunea de infecie
urinar. Recoltarea se poate face n mai multe moduri.
n majoritatea cazurilor, urina se recolteaz n timpul primei miciuni de
diminea, din mijlocul jetului. Pacienii sunt instruii ca nainte de prima
miciune s efectueze o toalet genital riguroas, cu ap i spun, apoi s se
tearg cu tifon steril, iar femeile care au secreii genitale abundente s-i introduc
un tampon intravaginal. Aceste msuri sunt absolut necesare pentru a evita
contaminarea probei de urin cu flor de la nivelul mucoasei genitale.
Recoltarea se face n flacoane steile, de unic folosin. Pacientul va ncepe
s urineze, pentru ca prima poriune a jetului s elimine flora existent la nivelul
uretrei terminale; apoi va ntrerupe voluntar miciunea; va deuruba flaconul steril
i a doua parte a jetului ( mijlocul jetului) o va urina direct n flacon 2-3 ml. Va
astupa flaconul. Va termina miciunea normal, n toalet.
La bolnavii care nu-i pot controla miciunea ( copii mici, aduli incontieni)
i la cei la care oricum se efectueaz sondaj vezical evacuator ( adenom de prostat,
etc.) recoltarea urinii pentru urocultur se face pe sond. Aici exist ns pericolul
introducerii n vezica urinar a florei de la nivelul uretrei terminale sau chiar flor
exogen.

Puncia suprapubian transcutanat permite recoltarea unei probe de urin


direct din vezica urinar.
Urina fiind un excelent mediu de cultur, ea va fi pstrat la temperatura
camaerei maximum 2h pn la nsmnare, sau la frigider maxim cteva ore.
Materiile fecale
Materiile fecale se recolteaz n scopul efecturii coproculturii sau a
examenului coproparazitologic.
Coprocultura este indicat n bolile diareice, n febra tifoid i paratifoid i
pentru depistarea portajului de enterobacterii obligat patogene. Recoltarea se face
n coprorecoltoare sterile, cu mediu de conservare i transport.
La bolnavii cu diaree, materiile fecale se recolteaz din scaunul emis
spontan, ntr-un recipient steril, fr urme de detergeni sau dezinfectani. Cu
linguria cu care este prevzut coprorecoltorul special, pacientul va recolta o
cantitate mic din prob, n special cu snge sau mucus, dac exist. Proba fa fi
introdus n coprorecoltor, n mediul de conservare i transport Carry-Blair.
Materiile fecale mai pot fi recoltate prin sondal rectal, cu sonda Nelaton ,
introdus 10-12 cm la copil i 16-18 cm la adult, i aspirnd prin presare la captul
distal al sondai. Aceasta va fi apoi descrcat n ser fiziologic sateril sau n mediu
Carry-Blair dun ciprorecoltor.
Pentru suspecii de portaj de enterobacterii patogene, recoltarea meteriilor
fecale se va face dup administrarea unui purgativ salin ( sulfat de sodiu i de
magneziu).
Pentru examenul coproparazitologic, recoltarea se face n mod similar, proba
introducndu-se ntr-un coprorecoltor de unic utilizare fr mediu de conservare i
transport.
Secreiile genitale: secreia vaginal i secreia uretral.
Secreia vaginal se recolteaz pe masa ginecologic. Este de preferat ca
feneia s se afle n primele 5-10 zile dup menstruaie, pentru a evidenia mai bine
parazitul Trichomonas vaginalis. Ce tamponul steril se recolteaz secreie din vagin
i din fundul de sac posterior, iar dun secreia acumulat pe valv, se depun probe
pe 2-3 lame de microscop, pentru preparatul proaspt i pentru frotiuri. Pentru
preparatul proaspt lamele i serul fiziologic folosit trebuie inute la termostat la 37
O
C, iar examinarea microscopic s fie fcut n 10-15 minute de la recoltare.
Frotiurile se coloreaz Albastru de metilen i Gram. Culturile se fac pe gelozsnge, geloz chocolat , Muller-Hinton sau Thayer-Martin i AABTL.
Secreia uretral la bolnavii cu uretrite acute este de obicei abundent. La
bolnavii cu uretrite cronice este mult mai redus. Ea se recolteaz dimineaa,
nainte de miciune. Dup un masaj uor al uretrei anteroare, ca s se exprime
cteva picturi de secreie (pictura matinal). Cu un tampon steril se recolteaz

pentru cultur, apoi se depune cte o pictur pe 2-3 lame de microscop, pentru
examenul direct i pentru frotiuri.
n vederea sepistrii parazitului Trichomonas se poate exmina sedimentul
urinar al primului jet de urin recoltat de diminea.
Scuame cutanate, fire de pr
Scuamele cutanate se recolteaz prin raclare uoar, cu o lam de bisturiu,
din regiunea periferic a leziunii, apoi se introduc ntr-o eprubet steril. Firelele de
pr modificate se recolteaz cu pensa prin smulgere, apoi se introduc ntr-o plac
Petri steril. Unghiile parazitate se taie cu o foarfece dezinfectat i se introduc
ntr-o plac petri steril.
Aceste produse vor fi supuse unor examene micologice i eventual
bacteriologice.

Capitolul IV
EXAMENUL MICROSCOPIC
Microscopul permite observarea corpurilor foarte mici, sub limita de
vizibilitate a ochiului liber, ntre care i microorganismele.
A. Microscopul fotonic posed o surs de iluminat, un condensor care
regleaz intensitatea luminii, un sistem de lentile care amplific imaginea, i
platina, suprafaa pe care se aeaz preparatul microscopic.
Lentila obiectiv ( numit n mod curent obiectivul ), este cea din apropierea
platinei . Un microscop are mai multe lentile obiectiv, cu putere de amplificare
diferit ( 10X, 20X, 40X, 100X) fixate pe un dispozitiv mobil numit revolver. n
funcie de necesiti, prin rotirea revolverului se utilizeaz obiectivul dorit.
Lentilele ocular ( sau ocularele), sunt cele din apropierea persoanei care face
examinarea. Ele sunt de obicei 7X sau 10X.

O c u la r e

R e v o lv e r

O b ie c t i v

C ondensor
D ia fr a g m a

M a c r o v iz a
M ic r o v iz a

S u r s a d e l u m in a
C o n t r o lu l m is c a r ii
in p la n o r iz o n ta l

Fig.IV.1. Schema unui microscop optic

Mrirea obinut cu ajutorul microscopului optic ( puterea de mrire a


microscopului ) este egal cu puterea de mrire a lentilei obiectiv nmulit cu
puterea de mrire a lentilei ocular:
Tabel IV.1. Puterea de mrire a microscopului
Obiectiv
20 X
40 X
100 X
20 X
40 X
100 X

Ocular
7X

10 X

Mrire
140
280
700
200
400
1000

O alt caracteristic a unui mocroscop este limita de rezoluie, distana cea


mai mic ntre dou puncte necesar pentru ca acestea s fie vizibile.
Microscopul optic folosete o surs de lumin cu radiaii din spectrul vizibil,
iar fasciculul de raze are un sens ascendent, paralel cu axul optic principal i
strbate direct preparatul microscopic. Limita sa de rezoluie este de 0,2 m.
Microscopul cu fond ntunecat ( ultramicroscopul) realizeaz luminarea din
lateral a preparatului; n obiectiv nu ptrund dect razele reflectate de marginile
celulelor ( bacteriilor, de exemplu), care apar albe, strlucitoare, refringente, iar
fondul este negru ( ntunecat). Aceste microscoape pot fi realizate din microscoape
optice, prin nlocuirea condensorului cu un condensor special, prevzut cu un disc
opac central . Microscopul cu fond ntunecat permite examinarea preparatelor
proaspete, necolorate (Treponeme, Leptospire) i permite studiul obiectelor
transparente.
Microscopul cu contrast de faz folosete transformarea diferenei de faz
a luminii care travreseaz un preparat n diferen de intensitate, sesizabil cu
ochiul liber. Este folosit la studiul preparatelor cu celule vii , preparatelor
proaspete necolorate i al celor slab colorate : Ricketsii, Treponeme, Leptospire.
Microscopul cu fluorescen la care sursa de lumin folosete radiaii din
domeniul U.V. apropiat spectrului vizibil i vizibil. Se bazeaz pe fenomenul de
flurescen - fenomenul de emitere a unor radiaii luminoase din spectrul vizibil de
ctre o celul sau substan, dac aceasta este supus aciunii unei radiaii excitante
externe,
cu durata mai mic de 107 sec. Fluorescena celulelor sau
microorganismelor poate fi:
- primar ( natural), proprie celulei respective
- secundar, sau rezultat prin cuplarea celulei respective cu o substan
fluorescent numit fluorocrom.
Cei mai imporani fluorocromi sunt: Izotiocianatul de fluorescein,
Rhodamina, Auramina, Eozina. Un preparat colorat cu fluorocromi trebuie
examinat ntotdeauna n paralel cu un preparat similar necolorat ( martor),

pentru a face diferena ntre fluorescena preparatului colorat de cea natural


a unor celule.
Microscopul cu florescen este folosit n bacteriologie, virusologie,
parazitologie i imunologie ( imunofluorescena).
Microscopul electronic folosete lentile electronice: cmpuri magnetice,
electrice sau electromagnetice, care acioneaz asupra unui fascicul de electroni
accelerai, pe care l poate focaliza sau defocaliza. Un astfel de microscop are o
putere de rezoluie de 100.000 ori mai mare dect a uni microscop optic.
Principalele tipuri de microscoape electronice sunt :
- M.E. prin transmisie folosit pentru examinarea unor preparate
transparente la trecerea unui fascicul de electroni. Schematic, este format
dintr-o surs de electroni accelerai ( tub electronic), sistem de lentile
condensor ( cmpuri electrice sau magnetice), portobiect, lentil obiectiv,
lentil proiector (tot electromagnetic) i ecran de observaie fluorescent
sub aciunea electronilor.
- M.E. prin baleiaj, folosit pentru observarea suprafeelor obiectelor solide.
Este format dintr-o surs de electroni accelerai, un sistem de baleiere a
fasciculului de electroni pe suprafaa preparatului de examinat, un sistem
de detecie a electronilor emii de pe suprafaa preparatului, un sistem de
amplificare video i un tub cinescopic. Ambele tipuri de M. E. Sunt dotate
cu un sistem ce asigur vid naintat pe tot traiectul parcurs de electroni,
traiect ce se gsete ntr-o structur nchis numit coloana microscopului
electronic.
Preparatele microscopice pentru microscopia fotonic utilizate n
microbiologie
n vederea examenului microbiologic, preparatele microscopice pot fi
efectuate att din produsele patologice, ct i din culturi.
Preparatele microscopice pot fi de dou feluri:
- preparate proaspete ( native), ntre lam i lamel
- preparate uscate, fixate i colorate frotiurile
Preparatul proaspt
Materiale necesare: lame de microscop curate,degresate i uscate
Lamele de microscop
Pipete, ans bacteriologic, bec Bunsen, ser fiziologic steril , soluie Lugol
Tehnica de execuie: dac produsul patologic este lichid sau cultura bacterian este
n mediu lichid, cu pipeta steril se ia o pictur din acestea i se depune pe o lam
de microscop. Se acoper cu o lamel. Se examineaz cu obiectivul 40 X.
- Dac produsul patologic este solid sau cultura bacterian este pe mediu
solid, pe lama de microscop se depune o pictur de ser fiziologic steril,

apoi ansa steril se ncarc cu produs sau cu 2-3 colonii microbiene, se


emulsioneaz n pictura de ser fiziologic, apoi se acoper cu lamel i se
examineaz cu obectivul 40X..
Este folosit pentru examinarea bacteriilor, paraziilor, fungilor
Avantajele preparatului proaspt:
- este uor de executat i se efectueaz rapid
- evideniaz forma i mobilitatea microorganismelor ( viabilitatea celor
mobile)
- preparatul poate fi examinat i la microscopul cu cu cmp ntunecat sau la
microscopul cu contrast de faz.
Dezavantaje:
- microorganismele sunt vii, deci exist posibilitatea contaminrii
- dac examinarea nu se face n 10-15 minute, preparatul se usuc i
examinarea devine imposibil
- nu poate fi pstrat.
Frotiul
Materiale necesare
Lame de microscop curate,degresate i uscate
Pipete, ans bacteriologic, bec Bunsen, ser fiziologic steril
Tehnica de execuie:
Etapele efecturii unui frotiu sunt:
a. ntinderea frotiului
b. uscarea
c. fixarea
d. colorarea
a. ntinderea frotiului: dac produsul patologic este lichid sau cultura
bacterian este n mediu lichid, cu pipeta steril se ia o pictur din acestea i
se depune pe o lam de microscop. Dac produsul patologic este solid sau
cultura bacterian este pe mediu solid, pe lama de microscop se depune o
pictur de ser fiziologic steril, apoi ansa steril se ncarc cu produs sau cu
2-3 colonii microbiene i se emulsioneaz n pictura de ser fiziologic
urmrind s se obin o suspensie omogen i nu prea dens . Apoi, cu ansa,
prin micri concentrice, se ntinde pictura n strat subire.
b. Uscarea frotiului se face la temperatura camerei. Uscarea brusc, la
temperaturi ridicate, produce fierberea apei din frotiu , cu distrugerea
morfologiei i structurii celulelor.
c. Fixarea se face la cald, prin trecerea lamei, cu frotiul n sus peste flacra
becului Bunsen de 3-4 ori. Fixarea realizeaz aderarea frotiului de lam ,
astfel nct nu se va desprinde cu ocazia procedurilor de splare din timpul
colorrii, asigur omorrea microorganismelor i crete susceptibilitatea
acestora la colorani.

d. Colorarea este o etap esenial n executarea unui frotiu. Coloraiile cel mai
frecvent folosite n bacteriologie se clasific n :
- coloraii simple: coloraia cu albastru de metilen ( A.M.)
- coloraii duble: coloraia Gram
- coloraii speciale: coloraia Ziehl-Neelsen, Coloraia Del Vechio,
coloraia pentru capsul, coloraia pentru spori, coloraia pentru flageli,
etc.
Coloraia cu albastru de metilen este o coloraie simpl, rapid, neagresiv
asupra bacteriilor prin lipsa unor timpi de decolorare i recolorare , i care
permite o orientare rapid asupra prezenei i morfologiei baceriilor. De
asemenea, permite vizualizarea capsulei bacteriene sub forma unui halou clar
n jurul acestora.
Tehnica coloraiei albastru de metilen:
- frotiul bine uscat i fixat se acoper cu soluie albastru de metilen 1%,
timp de 2-3 minute
- se scurge colorantul i se spal cu ap
- se usuc n stativ, la temperatura camerei
La examenul microscopic bacteriile i levurile apar colorate albastru nchis,
iar celulele eucariote: leucocite, celule epiteliale, etc, n albastru deschis, cu
nucleii mai nchii.
Coloraia Gram este cea mai utilizat coloraie n bacteriologie. Imaginat
n 1884 de danezul Hans Christian Gram , a suferit mici adaptri de-a lungul anilor,
dar n esen a rmas neschimbat. Permite vizualizarea marii majoriti a
bacteriilor, cu ncadrarea n categoriile morfologice: coci, bacili, etc. i
diferenierea lor n cele dou mari clase : bacterii Gram-pozitive i bacterii Gramnegative.
Timpii coloraiei Gram ( modificat de Hucker):
- frotiul uscat i fixat se acoper cu soluie de Violet de geniana sau Cristal
violet , 1-3 minute
- se scurge colorantul i se spal cu ap
- se acoper frotiul cu soluie Lugol , 1 minut
- se scurge Lugolul i se spal cu ap
- decolorare cu alcool-aceton 25 secunde (strict)
- se spal cu ap
- se acoper frotiul cu soluie fuxin 10% diluat extemporaneu, 1 minut
- se scurge colorantul i se spal cu ap
- se usuc n stativ, la temperatura camerei
La examenul microscopic, unele bacterii apar colorate n violet Gram
pozitive, altele apar colorate n roz- Gram negative.

Diferena de colorabilitate se datoreaz structurii diferete a peretelui celular


la cele dou categorii de bacterii: Unele au peretele format din mai multe straturi de
peptidoglican, impenetrabil pentru alcool-aceton, astfel nct violetul nu este
extras din celul. Altele au peretele format din puine straturi de peptidoglican i
bogate n lipide, care se solubilizeaz n alcool-aceton, permind decolorarea
violetului i colorarea cu fuxin.
Coloraia Ziehl-Neelsen evideniaz bacterii acid-alcoolo rezistente, din
genurile Mycobacterium i Nocardia.
Reactivi necesari:
- Fuxin fenicat Ziehl 1%
- soluie alcool-acid ( alcool 96% i acid aclorhidric sau azotic )
Timpii coloraiei Ziehl-Neelsen
- frotiul uscat i fixat se acoper cu fuxin Ziehl 1% i se nclzete dosul
lamei ( cu flacr de alcool) pn la emisia de vapori, de 3 ori cte 5
minute. Nu se aduce la temperatura de fierbere a colorantului
- se las s se rceasc
- se vars colorantul i se spal cu ap
- de colorare cu acid-alcool timp de 2-3 minute
- se spal cu ap
- se acoper cu albastru de metilen pentru recolorare 1 minut
- se spal, se usuc n stativ la temperatura camerei
La examinarea la microscop, bacilii acid-alcoolo- rezisteni apar colorai n rou.
Celelalte bacterii, precum i celulele eucariote din frotiurole efectuate din produsele
patologice, apar colorate n albastru.
Mecanismul coloraiei este ptrunderea fuxinei fenicate n bacterii la cald i legarea
acesteia de acizii micolici din peretele celular. La temperatura camerei, peretle
celular al acestor bacterii este impenetrabil att la amestecul decolorant, ct i la
colorarea cu A.M.

Capitolul V
CULTIVAREA I IZOLAREA BACTERIILOR
Mediile de cultur
Mediile de cultur sunt medii care permit dezvoltarea in vitro a bacteriilor.
Primele medii de cultur au fost obinute pornind de la bulionul de carne, medii
complexe cu compoziie incomplet cunoscut. n prezent se utilizeaz medii
sintetice, cu o compoziie bine precizat. Ele se comercializeaz fie gata preparate
i turnate, gata de folosire, fie sub form deshidratat, urmnd a fi rehidratate,
sterilizate i apoi turnate n plci Petri sau tuburi, n funcie de utilitatea lor. ( Fig.
V.1. i V.2.)

Fig.V.1. Medii deshidratate i suplimente selective (Oxoid)

Fig.V.2. Medii turnate n plci Petri i n tuburi (Oxoid)

Mediile de cultur trebuie s ndeplineasc anumite cerine:


s conin substanele nutritive organice necesare bacteriilor:
proteine, peptone, hidrocarburi, folosite ca surse de energie, de azot,
carbon, etc.
S conin sruri minerale: cloruri, sulfai, fosfai, oligoelemente
( Fe, Ca, Zn, Mg, Mn, Co )
S fie bine hidratate, apa fiind un element indispensabil creterii
bacteriilor
pH-ul s fie adecvat, n general neutru, dar existnd i medii cu ph
alcalin, favorabil anumitor specii.
Factorii de cretere sunt necesari anumitor bacterii: coenzime,
aminoacizi, baze purinice sau pirimidinice .
Sterilitatea mediilor este o condiie esenial pentru evaluarea
corect a unei culturi din produsele biologice.
Clasificarea mediilor de cultur
n funie de starea de agregare, mediile de cultur se clasific n:
medii lichide
medii solide
medii semisolide
Mediile lichide conin hidrolizate proteice, cu coninut variabil n aminoacizi
i peptone, de exemplu apa peptonat i bulionul. Pornind de la acest dou medii
de baz, se pot obine alte medii lichide prin adaosul altor substane.
Mediile solide conin geloz sau agar, polizaharid extras din algele marine
Gelidum sp., solubil n ap i care la temperatura de 90 O C se topete complet i
rmne n stare lichid pn la scderea temperaturii la 40O C. La aceast
temperatur se solidific sub forma unui gel transparent care, renclzit se
lichefiaz din nou. Mediile solide se obin din medii lichide prin adaosul de agar, n
concentraie de 1.5%.
Mediile semisolide au o concentraie de agar de 0.5%.
n funcie de complexitatea structurii, exist:
medii simple, ce conin un numr redus de componente i pe care
pot crete bacteriile nepretenioase; exemplu: geloza nutritiv ( geloza simpl)
medii complexe, ce conin snge, ser, ascit, oligoelemente i alte
suplimente necesare creterii bacteriilor pretenioase; exemplu: geloza snge
n funie de utilitatea mediilor de cultur, acestea se clasific n:
Medii uzuale, folosite de rutin, pe care cresc majoritatea speciilor
bacteriene de interes medical, folosite pentru nsmnarea majoritii produselor
patologice: bulionul, geloza nutritiv, geloza snge.
Medii de mbogire folosite pentru produsele paucimicrobiene i care
permit, dup incubare, dezvoltarea i nmulirea preferenial a acelor bacterii aflate

n numr mic. Aceste medii sunt medii lichide, bogate n substane nutritive. Cele
mai folosite sunt: bulionul nutritiv, bulionul cu extract de creier i cord. Dac la
aceste medii se adaug, ele devin medii selective favorabile unor anumite specii:
streptococ, pentru stafilococ (Chapmann lichid), pentru bacilul difteric ( OST), etc.
Medii difereniale i selective . Mediile difereniale conin substane
( zaharuri, aminoacizi)care sunt substrate ale unor reacii metabolice i substane
indicatoare, ce evideniaz dac tulpina bacterian testat are sau nu capacitatea de
ale utiliza. (vezi tabel V.1)
Tabel V.1. Aspectul virrii culorii la principalii indicatori
Substana indicatoare Culoarea iniial
Culoarea dup virare
Albastru de brom-timol Albastru-verzui la pH Galben la pH 6
7.6
Rou neutru
Roz - Orange la pH Rou la pH 8
6,8
Rou fenol
Rou la pH 8.4
Galben la pH 6.8
Mediile selective conin substane inhibante: antibiotice, sruri biliare,
compui colorani, care permit dezvoltarea unui numr mic de specii sau chiar ale
unei singure specii.
Unele medii posed att sistemul selectiv ct i sistemul diferenial.
Exemple:
- mediul AABTL , mediul Mac Conkey medii difereniale
- mediul Chapmann solid mediu selectiv pentru stafilococi;
- mediul ABE ( agar, bil, esculin) mediu selectiv pentru identificarea
enterococilor.
- mediul ADCL, mediul Salmonella-Shigella medii selective i difereniale pentru
enterobacterii
Medii pentru anaerobi . Culturile pentru anaerobi pot fi fcute n medii
lichide cu adaus de substane reductoare ( exemplu: bulion thioglicolat cu hemin
i Vit.K) , cu incubare n atmosfer obinuit, sau pe medii solide ( Schaedler blood
agar ) cu incubare n anaerobioz. ( fig. )
Medii pentru antibiograme: medii nutritive care permit creterea
majoritii speciilor bacteriene; se urmrete ca inhibiia creterii s fie datorat
strict antibioticelor. Exemple: Muller-Hinton solid pentru testarea susceptibilitii
antimicrobiene , Muller-Hinton solid cu adaus de Na Cl 2% pentru testarea
sensibilitii la antibiotice a stafilococilor, Muller-Hinton solid cu snge pentru
testarea sensibilitii la antibiotice streptococilor
Medii pentru identificare biochimic sunt medii ce conin un zahar
( glucoz, lactoza, zaharoz, maltoz, etc) sau alte substrate biochimice: uree, citrat,
lizin sau medii cu mai multe substrate: TSI ( triple sugar iron), MIU ( triptofan,

uree) , MILF ( triptofan, lizin, fenil-alanin) i diferii indicatori de culoare. Dup


nsmnatarea cu tulpina de cercetat i incubare, virajul culorii indic
metabolizarea substanelor respective.
Exist i galerii miniaturizate cu 12-20 medii de identificare biochimic.
Medii de conservare i transport. Compoziia lor este echilibrat n aa fel
nct s menin n produsele patologice viabilitatea microorganismelor i aspectul
cantitativ original. Sunt n general medii semisolide. Exemplu: mediul Carry-Blair.
nsmnarea mediilor de cultur
Trecerea unei cantiti din produsul biologic sau dintr-o cultur pe un mediu
n vederea izolrii microorganismelor se numete nsmnare.
nsmnarea mediilor lichide se poate face cu ansa steril, cu pipeta steril
sauprin descrcarea direct a seringii atunci cnd produsul este recoltat n sering
( snge, LCR).
Pentru nsmnarea cu ansa, aceasta se sterilizeaz n flacra becului
Bunsen, dac nu este o ans steril de unic folosin, se ncarc cu produs
biologic, apoi flaconul sau tubul cu mediu lichid se destup, se flambeaz gura
acestuia. n continuare flaconul sau tubul se nclin uor, se descarc ansa pe
peretele acestuia apoi prin micri uoare se disperseaz inoculul n masa mediului.
( Fig. V.3.)
nsmnarea mediilor solide. Se depune o cantitate mic din produsul
patologic (cu tamponul, pipeta, sau cu ansa) pe suprafaa mediului, ntr-o margine a
plcii Petri. Apoi cu ansa steril se face dispersia n vederea obinerii de colonii
izolate (fig. V.4.).
Dispersia poate fi fcut pe toat suprafaa plcii sau ntr-un sector de plac
marcat n prealabil. Se poate face o dispersie simpl, n zig-zag (fig. V.5.)sau o
dispersie n cuadrant sau pentagon deschis (fig.V.6).
nsmnarea mediilor solide turnate n tuburi n pant se face cu ansa,
descriind un zig-zag pe suprafaa pantei dinspre poriunea inferioar spre poriunea
superioar a pantei.
Mediile turnate drept n tub se nsmneaz prin neparea mediului cu ansa
n zona central i retragerea ansei pe acelai traseu.
nsmnarea mediilor anaerobe. Mediile se toarn n tuburi Weinberg,
pentru ca raportul dintre suprafaa mediului i volum s fie redus. Mediile se fierb
n prealabil timp de 20-30 minute pentru regenerare (eliminarea oricror urme de
oxigen din mediu). Dup rcire, se trece la nsmnare, cu pipeta sau cu ansa , n
profunzimea mediului. Dup nsmnare, peste mediu se adaug 2 ml ulei de
parafin steril ce mpiedic contactul direct al mediului cu aerul ( oxigenul).

Dac se folosesc sistemele de incubare n anaerobioz, nsmnarea se face


n mod obinuit pe medii solide (Schaedler blood agar), se introduc n dispozitivul
special, alturi de plicul cu substana reductoare peste care s-au turnat 10 ml ap.
Se nchide ermetic dispozitivul i se incubeaz. ( Fig.V.7.)
Incubarea mediilor nsmnate se face n termostat, la 37, timp de 24-24h,
cu unele excepii, cum ar fi hemoculturile ( 7 zile) sau culturile pentru
Mycobacterium tuberculosis ( 2-6 sptmni)
Bacteriile cu necesiti crescute de CO2 se incubeaz ntr-o atmosfer
mbogit n acest gaz, obinut prin aprinderea unei lumnri n vasul n care se
gsesc plcile nsmnate. Flacra se stinge cnd oxigenul necesar arderii a fost
consumat, acesta fiind nlocuit cu CO2. (Fig. V.8.)

Fig.V.3. nsmnarea mediilor lichide (dup Benson J.H.)

Fig.V.4. Poziia ansei pentru nsmnarea pe mediul solid (dup Benson J.H.)

Fig. V.5. Dispersia simpl

Fig.V.6. Dispersia n cuadrant deschis

Fig.V.7. Dispozitiv pentru culturi anaerobe i schema de funcionare (Oxoid)

Fig.V.8. Incubarea n atmosfer mbogit n CO2

Aspectele creterii bacteriene in vitro


n mediile de cultur lichide, creterea bacterien se manifest prin
tulburarea uniform a mediului, la care se poate aduga formarea unui vl la
suprafaa mediului sau/i a unui depozit pe fundul tubului.
Unele bacterii produc i elibereaz n mediu pigmeni extracelulari (de
exemplu bacilul piocianic elibereaz pigmeni verzui piocianina, pioverdina).
Pe mediile solide bacteriile cresc sub forma unor colonii - grupuri ,
grmezi vizibile cu ochiul liber, rezultate din multiplicarea unie singure bacterii sau
a unui numr mic de bacterii aflat n acelai loc pe suprafaa mediului, numit
unitatea formatoare de colonii ( UFC sau CFU colony forming unit).
Pentru caracterizarea creterii, trebuiesc urmrite colonii izolate, din cultur
tnr, de 24h, care au toate elementele caracteristice. n culturile vechi aspectul
coloniilor se modific, nemaifiind caracteristic.
La examinarea unei culturi, trebuie precizat dac este vorba despre o cultur
pur sau mixt, n acest caz fiind descrise fiecare tip de colonie n parte.
Tipul coloniei: exist 4 tipuri de colonii:
S smooth-neted, cu margini regulate, suprafa neted, convex, lucioas
R rough rugos, cu margini neregulate, suprafa rugoas, aspect
deshidratat
M- mucoase, cu tendina la confluare i care se detaaz greu de pe suprafaa
mediului, filante.
G glosy plate, transparente, cu aspectul unor picturi de ap
Mrimea coloniilor
Foarte mici, punctiforme, greu vizibile, cu diametrul de aproximativ 1 mm.
( exemplu coloniile de streptococ)
Medii ( exemplu coloniile de stafilococ)
Mari, sau foarte mari cu diametrul de 3-4 mm i mai mult, uor vizibile, de
exemplu coloniile enterobacteriilor
Transparena i culoarea
Coloniile pot fi transparente, semitransparente sau opace
Culoarea este dat de pigmenii intracelulari: coloniile pot fi incolore sau
pigmentate ( albe, galbene, gri, oranj, etc)
Hemoliza pe mediul geloz snge
- hemoliz complet, sub forma unei zone clare, bine delimitate
- hemoliz parial, verzuie ( viridans), mai slab delimitat.
Alte caractere
Producerea de pigmenii extracelulari difuzibili n mediu
Miros specific
Migrarea pe suprfaa mediului
Virarea culorii mediilor difereniale, etc

Capitolul VI
TESTAREA SENSIBILITII IN VITRO LA SUBSTANELE
ANTIBACTERIENE I ANTIFUNGICE
Testarea sensibilitii in vitro la substanele antibacteriene se numete
antibiogram. Testarea sensibilitii in vitro la substanele antifungice poart
numele de antifungigram. Efectuarea lor reprezint un moment important al
activitii n laboratorul de microbiologie iar utilizarea rezultatelor acestor testri
permite un tratament intit, corect i eficient.
Antibiograma difuzimetric standardizat (metoda Kirby-Bauer)
Materiale necesare
Mediul de cultur utilizat este de regul Muller-Hinton, mediu nutritiv i
fr substane inhibitoare, cu pH 7,2-7,4. O excepie o reprezint antibiograma
pentru streptococi, la care mediul utilizat este geloza-snge. Mediul se toarn n
plci Petri n strat de 4 mm grosime.
Inoculul bacterian este reprezentat de o suspensie cu densitatea de 0,5 Mc
Farland ( aproximativ 108 microorganisme / ml ), efectuat din cultura pur a
tulpinii ce urmeaz a fi testate. Aceast densitate se realizeaz cu aproximativ 2-3
colonii la 2 ml bulion , dar obligatoriu se verific i se ajusteaz la un densitometru.
Discurile cu antibiotice conin cantiti standardizate din fiecare antibiotic.
Vor fi folosite 2-3 antibiotice din fiecare clas i cteva antibiotice de rezerv. Ele
vor fi alese n funcie de tulpina bacterian testat i eventual de sediul infeciei , de
exemplu:
setul de antibiotice la care se testeaz stafilococii,
setul de antibiotice la care se testeaz streptococii,
setul de antibiotice pentru bacilii Gram-negativi,
setul de antibiotice pentru bacteriile izolate din infeciile urinare.

Fig.VI.1.Trus pentru antibiograma prin metoda difuzimetric (Bioanalyse)

Tehnica de lucru:
Suspensia bacterian este nsmnat uniform pe toat suprafaa mediului,
fie cu ajutorul unui tampon steril, fie prin inundarea plcii urmat de ndeprtarea
excesului de inocul prin aspirare cu o pipet steril.

Fig.VI.2. Insamnarea placii pentru antibiogram (dup Benson J.H.)


Se las mediul 15-20 minute s se usuce.
Se aplic comprimatele cu antibiotice, fie manual cu o pens steril fie cu
aplicatorul mecanic, la distan de minim 30 mm ntre discuri i 25 mm de
marginea plcii.

Fig.VI.3. Aplicarea microcomprimatelor cu antibiotice (dup Benson J.H.)


Se las pe masa de lucru nc 15 minute, dup care se incubeaz la 37 0C, cu
capacul n jos, 24 h.
Citire i interpretare
n timpul incubrii antibioticele difuzeaz radiar n mediu. Un antibiotic
eficient asupra tulpinii bacteriene testate realizeaz o zon de inhibiie a creterii cu
att mai mare cu ct aciunea sa se manifest i la concentraii mai mici, dar i n
funcie de mrimea moleculei acestuia i de capacitatea de difuziune.

Cu ajutorul unei rigle gradate se msoar n mm diametrul zonei de inhibiie


a fiecrui antibiotic. Prin compararea cu datele din tabele furnizate de productorii
discurilor utilizate, se face evaluarea rezultatelor, pentru fiecare antibiotic fiind
apreciat sensibilitatea tulpinii ca sensibil ( S), intermediar sensibil ( I ) sau
rezistent ( R).
Prezena de colonii n interiorul zonei de inhibiie semnific dezvoltarea
rezistenei secundare, interpretarea fiind R indiferent de mrimea diametrului zonei
respective.
Posibile surse de eroare: nerespectarea densitii inoculului, nerespectarea
puritii culturii, excesul de umiditate al mediului.

Fig.VI.4. Citirea antibiogramei (dup Benson J.H.)

Antibiograma prin metoda diluiilor


Antibiograma prin diluia antibioticului n mediu lichid
Metod cantitativ, ce permite determinarea concentraiei minime inhibitorii
(CMI) i concentraiei minime bactericide (CMB) a unui antibiotic fa de tulpina
testat. Este o metod laborioas, rezervat cercetrii i situaiilor n care este
necesar administrarea de doze mari de antibiotice ( endocardite, septicemii).
Tehnica de lucru:
I: Se pregtete o serie de eprubete cu cantiti egale de mediu Muller-Hinton
lichid ce conin diluii crescnde dintr-un antibiotic. Se folosete un martor de
cretere eprubet cu mediu dar fr antibiotic.
n eprubete se adaug cantiti egale din suspensia bacterian standard de
testat.
Se incubeaz peste noapte la 37O C.

Citire i interpretare:
n tubul martor, fr antibiotic trebuie s existe cretere bacterian )
( tulburarea mediului); eprubetele n care mediul este limpede semnific , prin lipsa
multiplicrii bacteriene, sensibilitatea la antibioticul testat.
Ultima diluie care a inhibat creterea corespunde CMI.
II: Din epubetele cu mediu clar se nsmneaz cte un sector de mediu MullerHinton solid , fr antibiotic. Dup incubare, se noteaz ultima diluie la care
bacteriile nu au crescut pe mediul solid, aceasta corespunznd CMB.
Antibiograma prin diluia antibioticului n mediu solid
Se prepar soluiile stoc de antibiotic, cu concentraii de 5,120 g/ml, din
care se vor face diluii binare, apoi diluia final 1:10 n geloz topit Muller
Hinton. Apoi geloza se toarn n plci Petri n strat de 4 mm grosime, obinndu-se
medii solide cu diferite concentraii de antibiotic. Pentru testarea streptococilor, la
geloza topit se adaug 5% snge defibrinat de cal sau de berbec.
nsmnarea mediului se vaface cu ansa calibrat de 0,001 ml, care se
ncarc cu suspensie dun cultura de testat cu densitatea de 0.5 McFarland.
Se nsmneaz i un mediu ft antibiotic, pentru controlul creterii.
CMI este dat de cea mai mic concentraie de antibiotic la carenu se observ
colonii bacteriene pe suprafaa de inoculare.
Metoda miniaturizat API de diluii n mediu lichid folosete galerii de testare a
sensibilitii, ce conin antibiotice n stare deshidratat.
Exist diferite tipur i de teste
antibiograme convenionale, cu dou concentraii limit i incubare de 18-24h
antibiograme rapide, Rapid ATB, cu incubare de 4h, pentru stafilococi i
enterobacterii.
Principiul metodei
Testele se bazeaza pe determinarea ratei de cretere a bacteriilor n prezena
antibioticului.
Galeriile sunt confecionate din material plastic transparent i conin 32
godeuri .
Primele dou godeuri nu conin antibiotic i servesc drept martor de cretere.
Lipsa creterii sau creterea insuficient n acestea invalideaza rezultatele.
Celelalte godeuri conin antibiotice n form deshidratat, n diferite concentraii.
n funcie de tipul de antibiogram, tulpina izolat poate fi testat la una sau mai
multe concentraii ale unui antibiotic. Godeurile trebuie inoculate cu o suspensie
bacterian n mediu special ATB medium sau NaCl 0,85%.
Galeriile sunt apoi incubate un interval de timp corespunztor- 4h sau 24h la 37OC.

Citirea automat a galeriilor


Msurarea creterii se face turbidimetric. Cititorul face msurtorile i le
transfer apoi n computer, care stabilete profilul corespunztor ( Rezistent,
Sensibil, Intermediar sensibil ).
Interpretarea rezultatelor
n general sunt testate dou concentraii limit, stabilite pe baze
bacteriologice, farmacocinetice i terapeutice. Aceste concentraii permit aprecierea
sensibilittii unei tulpini astfel:
Sensibil - creterea bacterian este inhibat la ambele concentraii;
Intermediar - creterea bacterian este inhibat numai de concentraia mai mare.
Rezistent - creterea bacterian nu este inhibat de nici una din concentraii.
Cnd antibioticele sunt testate la o singur concentraie, rezultatul se exprim
n
Sensibil sau Rezistent.

Fig.VI.5.: Schema de utilizare a galeriei Rapid ATB STAPH ( Bio-Merieux)

E-Test este o tehnic cantitativ de determinare a sensibilitii la subsranele


antimicrobiene. E-Test se bazeaz pe o combinaie ntre metodele diluiei i
difuziei, cuantificnd direct sensibilitatea prin determinarea valorii CMI
(concentraia minim inhibitorie).
E Test const n stripuri de plastic poros ce conin un antibiotic n
concentraii descresctoare, calibrat cu o scal de citire a CMI n g/ml. Stripul se
aplic pe suprafaa mediului inoculat n prealabil cu o suspensie standard din
tulpina de testat.
Incubarea: la 370C 24 de ore.
Citirea: CMI se citete la punctul de inhibiie complet a creterii.
Exemplu: Testarea stafilococilor la Vancomicin prin metoda E-Test n
conformitate cu normele NCCLS:
Mediul: Muller-Hinton
Inoculul: suspensie bacterian cu densitatea de 1 McF
Interpretare:
S
4 g/ml

I
8-16g/ml

R
32g/ml

Fig.VI.6. Determinarea CMI prin E-test

Capitolul VII
METODE IMUNOLOGICE DE UZ CURENT
REACTIILE DE AGLUTINARE, HEMAGLUTINARE,
HEMAGLUTINOINHIBARE
Principiul reaciilor de aglutinare este formarea de legturi ncruciate ntre
imunoglobulinele G ( IgG) bivalente sau imunoglobulinele M ( IgM) pentavalente
i antigenele cu multipli determinani antigenici ( epitopi). Aceasta face ca o
molecul de imunoglobulin s reacioneze cu determinanii antigenici mai multor
celule sau de pe suprafaa mai multor particule , producnd agregarea (aglutinarea)
i eventual sedimentarea acestora.
Reaciile sunt foarte sensibile i specifice.
Excesul de antigene nu inhib reacia, spre deosebire de excesul de anticorpi,
care poate produce fenomenul de pro-zon.
Aglutinarea direct este cea n care celulele sau particulele sunt aglutinate
direct de anticorpi. Hematiile, bacteriile, fungii i alte microorganisme pot fi
aglutinate direct de anticorpii specifici.
Testele de aglutinare direct pot fi efectuate att pentru detecia unor
antigene pe suprfaa celulelor; de exemplu antigenele de grup ABO sau Rh, fie
pentru detecia anticorpilor n ser exemplu: prezena hemaglutininelor la rece;
prezena anticorpilor anti-neutrofile
Aglutinarea indirect ( pasiv) se refer la aglutinarea unor antigene
adsorbite artificial pe suprafaa unor celule (hematii) sau particule insolubile
( latex, carbon)
Reaciile de aglutinare indirect sunt folosite:
-fie pentru detectarea anticorpilor n probe de ser, folosind antigenele
corespunztoare de pe suprafaa unor celule sau adsorbite pe suprafaa unor celule
sau particule . Exemple :reacii de latex-aglutinare pentru: ASLO ( anti-treptolizina
O), F.R. (factor reaumatoid), ANA, SLE (anticorpi antinucleari); RPR-carbon
pentru anticorpii anti-cardiolipinici.

Fig. VII.1.Schema reactiei de aglutinare indirecta RPR-carbon

- fie pentru detectarea unor antigene solubile, folosind anticorpii


corespunztori fixai pe suprafaa unei celule sau particule ( reversaglutinare): Exemplu: prin metoda latex aglutinrii, se poate determina
simultan: Coagulaza legat sau clumping factor, Proteina A, i
polizaharidele capsulare ale S.aureus. Reactivul latex conine particule de
latex sensibilizate cu anticorpi monoclonali specifici anticapsulari,
fibrinogen i IgG .
Atunci cnd antigenele sunt adsorbite pe suprafaa hematiilor, reacia se numete
hemaglutinare.
O alt categorie de reacii de hemaglutinare se refer la aglutinarea hematiilor sub
aciunea unor virusuri ( virusuri hemaglutinante) Reacia poate fi folosit la
detectarea i cuantificarea virusurilor dintr-o prob.
Prezena anticorpilor antivirali n ser determin inhibiia hemaglutinrii.
Reacia de hemaglutinoinhibare este folosit pentru diagnosticul indirect al unor
infecii virale i pentru msurarea titrului anticorpilor antivirali.

Fig. VII.2. Reactia de revers aglutinare: latex-aglutinare


I: Schema; II: Rezultat pozitiv(A) , negativ(B)

Fig. VII.3. Schema reactiei de hemaglutinare


Hemaglutinarea direct: testul Coombs direct ( TCD)
n tuburi sau n placa cu godeuri se realizeaz diluii seriate , n ser fiziologic,
ale unui ser ( imun antieritrocitar): , , 1/8, 1/16, 1/32, etc. Se adaug un ser
control pozitiv i un ser control negativ.
n fiecare tub sau godeu se adaug suspensia de hematii, astfel nct concentraia
final de celule s fie de aproximativ 1%.
Se agit uor i se las apoi nemicate, la temperatura camerei, 1-2 h
Reacia pozitiv apare sub forma unei pelicule despuse uniform pe fundul tubului
sau al godeului
Reacia negativ apare sub forma unui buton de hematii depus pe fundul tubului
sau al godeului.

Fig. VII.4. Testul Coombs ( Dup Roitt)

Pentru ca reacia s fie interpretabil, se citesc martorii pozitivi i negativi, care


trebuie s fie ca atare.
Titrul este dat de ultima diluie de ser care a determinat o reacie pozitiv, fiind egal
cu inversul acesteia.
Semnificaia diagnostic a TCD:
- AHAI idiopatic cu Ac la cald, inclusiv AHAI medicamentoas
- AHAI cu Ac la rece
- Transfuzia de snge incompatibil
- Alte cauze de AH: hepatite virale, pneumonia viral, mononucleoza infecioas,
meningita, LES i alte boli autoimune, tumori ( chist ovarian)
Cauze de eroare:
Reactivul antiglobulin uman necorespunztor i conservat necorespunztor, Snge
coagulat i conservat la frigider n prezena cheagului
Hiperproteinemie ( mielom)
Nerespectarea optimului termic al reaciei
Testele pentru detecia anticorpilor aglutinani n ser se fac prin punerea n
contact a unor diluii binare de ser cu cantitai egale de antigen. Reaciile au loc n
tuburi mici , n cantiti de 0.2 0.5 ml din fiecare reactant. Dup cteva ore de
incubare, aglutinarea este complet i tuburile sunt examinate, cu ochiul liber sau
cu lupa pentru observarea aglutinatelor. Exist i varianta aglutinrii pe lam sau
plac cu godeuri.
R. de hemaglutinare pasiv (indirect ):
Exemplu: TPHA (Treponema pallidum haemagglutination)
TPHA este o reacie de hemaglutinare indirect folosit pentru depistarea
anticorpilor ndreptai mpotriva antigenelor specifice ale treponemelor patogene.
Principiu:
Hematii aviare pe suprafaa crora au fost adsorbite antigene de Treponema
pallidum ( sua Nichols) sunt suspendate ntr-un diluent care mpiedic aglutinarea
nespecific.
Hematiile astfel sensibilizate, puse n contact cu serul unui pacient ce posed
anticorpii corespunztori, vor aglutina. Reacia poate fi efectuat calitativ sau
cantitativ.

Tehnica imunoenzimatic ELISA


Metoda ELISA presupune adsorbia unuia dintre componenii imuni
Ag sau Ac pe un suport solid. Imunoadsorbia permite fixarea ulterioar a
reactanilor din faza lichid, care urmeaz s fie identificai ( tehnici calitative ) sau
dozai ( tehnici cantitative).
Etapa final este o reacie enzimatic, relevat printr-o modificare de
culoare. Citirea se face spectrofotometric, iare interpretarea se face n funcie de
valoarea adsorbanei (intensitatea culorii), martorii +, - i valoarea de prag.
METODE
a)
b)
c)

metoda ELISA INDIRECT


metoda ELISA COMPETITIV
metoda ELISA de tip sandwich

Exemple:
Dozarea anticorpilor
a)
Metoda ELISA INDIRECT presupune urmtorii timpi:

Alegerea unei truse cu antigene specifice anticorpilor de dozat (adsorbite


pe suportul solid reprezentat de placa cu godeuri)

Adiia probei de ser.


Incubare. Anticorpii care recunosc antigenele se fixeaz de acetia i
rmn ataai
3-5 splri succesive, pentru a ndeprta Ac nefixai (necorespunztori
Ag)
adugarea conjugatului: Ac anti-imunoglobuline umane cuplai cu o
enzim (peroxidaz)
incubare
3-5 splri succesive
adugarea substratului enzimei
incubare. Probele pozitive se coloreaz, intensitatea reaciei fiind direct
proporional cu cantitatea de ac din proba de ser
stoparea reaciei i citirea

Fig. VII.5. Schema unei reacii ELISA indirecte pentru determinarea


anticorpilor n ser
b) Metoda ELISA COMPETITIV
Faza solid este identic
Proba de ser nediluat se adaug concomitent cu conjugatul
Prezena anticorpilor n prob blocheaz fixarea conjugatului.
Adugarea substratului enzimatic i reacia de culoare.
Interpretare: intensitatea culorii este invers proporional cu cantitatea
de anticorpi din prob.

Fig. VII.6. Schema unei reacii ELISA de tip competitiv


c) Metoda ELISA de tip sandwich
Se bazeaz pe faptul c Ac sunt del puin bivaleni
La faza solid se adsorb antigenele, de care se vor lega Ac din prob. Conjugatul Acenzim , ocup valenele libere ale Ac din prob ( Ac de dozat ntre 2 straturi de Ag)

Fig. VII.7. . Schema unor reacii ELISA de tip sandwich

Teste rapide imunocromatografice


Aceste teste pe principiul sandwich utilizeaz anticorpi monoclonali marcai
i fixai pe suporturi solide benzi de nitroceluloz, sub form de stripuri sau
incluse n casete. Dac antigenul cutat este prezent n prob reacioneaz cu
anticorpii marcai, iar complexul migreaz de-a lungul membranei cromatografice
care conine anticorpi policlonali n regiunea TEST. Fixarea complexelor imune
determin apariia unei linii n regiunea CONTROL, i a unei alte linii n regiunea
TEST
n absena antigenului n prob, apare doar linia din zona CONTROL.
Pe acelai principiu dar cu antigenul fixat la faza solid metoda este folosit
pentru identificarea prezenei unor anticorpi

Fig. VII.8.Schema unor teste rapide imunocromatografice

Fig. VII.9. teste rapide imunocromatografice: stripuri i casete

Capitolul VIII
DIAGNOSTICUL INFECIILOR STAFILOCOCICE
Prelevarea produsului patologic se face cu tamponul steril, tergnd cu o
uoar apsare zona afectat a tegumentului, n cazul leziunilor cutanate. Tot cu
tamponul steril se recolteaz puroi din leziunile deschise superficiale sau dup
evacuarea chirurgical a coleciilor profunde. Prelevarile trebuiesc efectuate
inaintea oricarui tratament cu antibiotice .
Examenul direct.
Din produsele patologice se pot efecta frotiuri colorate Albastru de metilen,
care se examineaz la microscopul optic, cu obiectivul 100 x cu imersie.
Stafilococii sunt coci Gram pozitivi, cu diametrul de 0.8-1 micrometri,
grupai tipic in ciorchine, dar i n grmezi, lanuri scurte, sau izolai. Ei sunt in
general necapsulai.
Caractere de cultur
nsmnarea produselor necontaminate i a celor moderat contaminate se
face n bulion i pe geloz snge.
Stafilococii sunt bacterii nepretenioase, care cresc i pe geloza simpl,
nutritiv, dar se prefer geloza snge pentru observarea hemolizei. Se foloseste
geloza cu sange defibrinat de berbec 7% si nu cu sange de om, care contine
inhibitori nespecifici si eventual anticorpi antistafilococici.
Nu este indicata la prima izolare folosirea unui mediu selectiv (Chapmann
sau Baird -Parker), care ar putea falsifica rezultatele prin selectarea exclusiva a
S.aureus, chiar in cantitate mica, neputandu-se face deosebirea dintre o colonizare
si un proces infectios real.
Daca produsul patologic este lichid de vrstur, materii fecale, sau
alimente , n cazurile de toxiinfecie alimentar, atunci este indicat folosirea
mediilor selective hiperclorurate Chapmann lichid i solid
Dupa o incubatie de 18-24h la 37 oC se obtine o cultura abundenta si
caracteristica.
Cultura in bulion are un aspect tulbure, omogen.
Cultura pe geloza -sange: colonii cu diametrul de 1-3 mm, de tip S (smooth),
bombate, lucioase, opace, cu consistenta cremoasa. Pigmentul auriu, caracteristic
speciei S.aureus apare dupa 24 sau 48h.
Alte specii care pot produce colonii pigmentate sunt: S.saprophiticus
(citreus) , S.hominis, S.haemoliticus si S.hyicus, subsp.chromogenes. Pigmentii
sunt carotenoizi, iar culoarea variaza de la galben la oranj.

S.epidermidis, S.simulans, S.intermedius, S.hyicus, subsp.hyicus, produc colonii


nepigmentate (albe ) Exista tulpini de S.aureus nepigmentate sau care si-au pierdut
capacitatea de a produce pigment datorita unor factori nefavorabili din mediu. De
aceea testul coagulazei este obligatoriu.
Hemoliza: pe mediul geloz-snge, coloniile de S.aureus pot fi nconjurate
de o zon clar de hemoliz complet.
Dintre speciile de stafilococi coagulazo-negativi mai pot produce hemoliza
complet S.haemoliticus si S.intermedius.
n caz de aspect necaracteristic , verificarea culturii se face prin frotiu din
cultur pur colorat Gram i prin evidenierea producerii de catalaz.
Testul catalazei. Catalaza - enzim ce elibereaz O2 din H2O2 este prezent
la genurile Micrococcus si Staphylococcus i absent la Streptococaceae. Se poate
determina pe lam sau n tub. Cteva colonii de stafilococ de pe un mediu de
cultur fr snge se emulsioneaz n ntr-o pictur de H 2O2 pe o lam de
microscop sau n 1 ml. H2O2 ntr-un tub de reacie. Eliberarea bulelor de gaz indic
prezena catalazei.
Teste de evideniere a caracterelor de patogenitate.
1. Coagulaza.
Coagulaza legat (clumping factor).-se determin printr-o reacie de
aglutinare pe lam
- O pictur de plasm de iepure sau uman citratat se depune pe lama i se
amestec cu coninutul unei anse incrcat cu colonii dintr-o cultur de stafilococ.
Citirea se face dup 10 secunde. Aciunea coagulazei se manifest prin apariia de
mici coaguli, datorit precipitrii fibrinogenului n fibrin.
Coagulaza liber se determin printr-o reacie de coagulare n tuburi. -se
folosesc tuburi de hemoliz sterile, n care se introduc cte 0.5 ml plasm recoltat
pe un alt anticoagulant dect citratul, de ex.pe EDTA.
-se adaug 0.1 ml din cultura in bulion, sau o colonie de pe geloza simpl
-se incubeaz tuburile la 37o .
Coagulaza liber acioneaz asupra substanei protrombin-like,
declannd reaciile ulterioare ale coagulrii.
-reacia se citete dup 4,18 i 24h.
-coagularea se prezint sub 3 aspecte: -coagulare n mas
-aspect de cap de meduza
-aspect de grunji n lichid clar
Orice grad de coagulare indic reacie pozitiv.
n timp ce coagularea pe lam este un test rapid, de screening, coagularea n
tub d rezultatul definitiv.(Lenette).
2. Prezena proteinei A

Proteina A se identific printr-o reacie de latex-aglutinare, singur sau


mpreuna cu clumping factor.
Cu ajutorul trusei Pastorex Staph Plus, ( BIORAD, Marne la Coquette,
France), prin metoda latex aglutinrii, se poate determina simultan:
a). Coagulaza legat sau clumping factor
b). Proteina A, cu afinitatea pentru fragmentul cristalizabil ( Fc) al
imunoglobulinelor de clas IgG
c) polizaharidele capsulare ale S.aureus.
Reactivul latex conine particule de latex de culoare roie sensibilizate cu anticorpi
monoclonali specifici anticapsulari, fibrinogen i IgG
Metoda: 1-3 colonii de stafilococ (de pe mediul geloz snge, geloz simpl
sau mediu hiperclorurat cu adaos de manitol) se emulsioneaz ntr-o pictur de
reactiv latex, nt-un cerc de pe cardul de aglutinare. Se omogenizeaz prin micri
uoare de rotaie timp de 30 secunde.
Citirea i interpretarea: prezena aglutinrii reacie pozitiv. Agregatele de
latex pot fi de diferite mrimi, pe fondul unui mediu clar; absena aglutinrii i
aspect uniform-lactescent reacie negativ.
Reacia se efectueaz ntotdeauna cu martori: pozitiv i negativ, pentru a se putea
valida rezultatul.
3. Determinarea DNA-azei termostabile
Metoda clasic -printr-o reacie de culoare
-se utilizeaz geloza cu adaus de ADN i albastru de toluidin ca indicator de pH;
-n geloz se taie godeuri n care se adaug cultura de stafilococ de 18h n bulion,
inactivat prin fierbere 15 minute la Bain- Marie;
-se incubeaz 2-4 h la 37oC;
Aciunea enzimei asupra ADN i fragmentarea acestuia determin
virarea culorii indicarorului n roz.
O metod mai specific, mai rapid dar mai costisitoare este prin reacia de
sero-neutralizare cu anticorpi anti DNA-az stafilococic . Rezultatul se poate citi
dupa 4 h .
Alte teste accesorii pentru S.aureus.
Fermentarea manitei n anaerobioz.Se foloseste geloza semisolid cu
adaus de manit 1 % i indicator de pH- albastru de toluidin sau rou neutru. Se
inoculeaz tulpina de studiat i se incubeaz 24-48 h la 37 o C.
S.aureus fermenteaz manita att n aerobioz ,ct i n anaerobioz
SCN fermenteaz manita strict aerob.
Producerea de acetoin ( reactia Voges-Proskauer )

Producerea de acetoin din glucoz sau piruvat este o alt reacie de


difereniere ntre S.aureus i alte specii ce pot fi ocazional coagulazo-pozitive: S.
intermedius, S.hyicus, precum i ntre S. aureus i SCN.
Punerea n eviden a toxinelor
Enterotoxinele
Cele 7 enterotoxine (A,B,C1,C2,C3,D,E ) sunt antigenice i pot fi
difereniate serologic, prin tehnici de imuno-difuzie, aglutinare, RIA, ELISA.
Exfoliatinele A i B se pot determina prin metode imunologice:CIEF
(contraimunoelectroforeza) , ELISA.
Leucocidina se poate determina prin metode imunologice, ex.latex-aglutinare.
Diagnostic indirect
Diagnosticul indirect are o valoare practic limitat.
Titrul antistafilolizinelor alfa poate prezenta interes n cazul infeciilor
profunde sau cronice, valorile normale fiind <2 UI/ml.
Cutarea anticorpilor anti-peptidoglican sau anti-acizi teichoici prin imunoelectroforez sau imuno-difuzie n gel poate avea indicaii n focare infecioase
inaccesibile culturii i endocardite cu hemoculturi negative,dar nu exist antigene
bine standardizate.
Teste biochimice de identificare a principalelor specii de stafilococi
Producerea de acid din diverse zaharuri
Fermentarea zaharurilor se poate determina clasic, prin cultivarea pe geloz
cu adaus de diferite zaharuri i indicator de culoare,sau folosind sisteme comerciale
de identificare biochimic: API - staph , API staph ident, Staph-trac-strip i alte
sisteme automatizate i miniaturizate de diagnostic ex. Micro-scan-Combo-panel
Aceste sisteme permit un diagnostic exact de specie i efectuarea de antibiograme
cantitative (CMI si CMB ) la un numr mare de antibiotice

Tabel VIII.1. Diagnosticul diferenial ntre principalele specii de stafilococ


Caracter
S.aureus S.epidermidi S.saprofiti S.interme S.hyicus
s
cus
-dius
Coagulaza
+
+/var
Rezistena la
+
novobiocin
Manitol
+
var
Var
Pigment
+
var
Var
Acetoin
+
Beta-galacto+
zidaza
Maltoza
+
Var
Fosfataza
+
+
Trehaloza
+
+
Xiloza
Sucroza
+
+
+
Antibiograma si determinarea rezistenei la Meticilin
Testarea sensibilitii la antibiotice a tulpinilor stfilococice se poate face
convenional, prin metoda difuzimetrica sau prin metoda dilutiilor , cu evidentierea
CMI i CMB.
De asemenea,exist sisteme miniaturizate sau/i automatizate pentru antibiograme
prin metoda diluiilor (Murex, API: Bio-Merieux, Baxter)
Setul de antibiotice folosit poate varia n funie de scopul
determinrii (test de rutin , cercetare ), localizarea infeciei (cutanat , osoas,
proces septicemic, infecie urinar ), sistemul folosit.
Asociatia american de laborator clinic recomand urmtoarele
antibiotice pentru testrile de rutin:
-Amikacina (sau:Gentamicina,Kanamicina,Netilmicina,Tobramicina)
-Cephalotin
-Chloramphenicol
-Clindamicina
-Eritromicina
-Meticilina,Oxacilina sau Nafcilina
-Penicilina G
-Tetraciclina
-Trimetoprim-Sulfametoxazol
-Vancomicina,Teicoplanina ( antibiotice de rezerv)

-Nitrofurantoin, Sulfizoxazol i Trimetoprim, numai pentru


infecii urinare.
Laboratorul nostru mai folosete , pentru metoda clasic Kirby Bauer i alte
antibiotice: -- Rifampicina, Norfloxacina, Ciprofloxacin, Ofloxacina ( sau alte
fluorochinolone), Lincomicina, Cefuroxim (generatia a II-a), Ceftazidim
(generatia a III-a), Linezolidul
Tulpinile meticilino-rezistente de S.aureus (MRSA) pot fi depistate cu mare
acuratee astfel:
a).Metoda difuzimetric: nsmnare n panz a inoculului pe geloz MullerHinton suplimentat cu Na Cl 4% i aplicarea de microcomprimate cu Meticilin
10 micrograme/ml, Oxacilin sau Nafcilin 6 micrograme/ml. Inoculul de 106CFU
se nsmneaz n pnz pe suprafaa plcii i se incubeaz 24-48 h la 35-35 0 C.
Creterea lent la o temperatur inferioar 37oC, marete sensibilitatea testului.
b). Metoda microdiluiilor, cu determinarea CMI, folosete bulion MullerHinton suplimentat cu cationi bivaleni i NaCl 2%. MRSA demonstreaz CMI la
meticilin de >16 micrograme/ml, iar la Oxacilin i Nafcilin de >10
micrograme/ml.
Sisteme de tipare epidemiologic
Biotiparea se folosete mai ales pentru stafilococii coagulaz negativi,
dar d rezultate valoroase i pentru S.aureus. Antibiogramele trebuie
standardizate pentru a oferi rezultate comparabile.
Tiparea fagic. Folosit din 1952, ofer rezultate valoroase i astzi pentru
tulpinile de S.aureus. Metoda const n stabilirea grupului de bacteriofagi la care
este sensibil tulpina izolat (lizosensibilitate), cu ajutorul unui set de fagi activi pe
S.aureus de origine uman.
Determinarea profilului plasmidic (tiparea plasmidic) al tulpinilor
izolate, prin electroforeza n gel de agar a ADN tratat cu enzime de restricie
permite identificarea de populaii clonale stafilococice cu noi caractere, n special
referitoare la rezistena multipl la antibiotice,ce poate fi codificat de 5-10
plasmide diferite,transferabile.
Analiza ADN cromozomial prin electroforeza n cmp tranvers alternant a
ADN tratat cu enzime de restricie, i folosirea de sonde nucleotidice, permite
identificarea genelor ce codific anumite caractere: producerea de toxine, rezistena
la antibiotice.

Fig. VIII.1. Stafilococi pe frotiu colorat Gram din produs patologic (K.Tomae)

Fig. VIII.2. Colonii de Staphylococcus aureus pe geloza sange (K.Tomae)

Figura VIII.2. ( a, b) Latex-aglutinare pe lam pentru clumping factor, proteina A


i polizaharizii de suprafa ( Bio-Rad)

Figura VIII.3. Galerie API staph

Capitolul IX
DIAGNOSTICUL INFECIILOR STREPTOCOCICE
Definiie i caractere generale: familia Streptococcaceae cuprinde coci
Gram-pozitivi, izolai i grupai n lanuri de diferite lungimi sau perechi, imobili,
nesporulai, aerobi facultativ anaerobi; sunt catalaz-negativi i oxidazo-negativi.
Streptococii sunt bacterii pretenioase nutritiv, ce necesit pentru creterea in vitro
medii complexe, nutritive, mediul de elecie fiind geloza-snge. ( Fig. IX.1., IX.2.)
Exist mai multe genuri de streptococi cu importan pentru om: Genul
Streptococcus, genul Enterococcus, genul Lactococcus. Apartenena la familia
Streptococcaceae a fost stabilit pe criterii fenotipice i de biologie molecular.
Principalele criterii de clasificare a streptococilor, care reprezint i criterii
de identificare sunt: aspectul hemolizei produs pe mediul geloz-snge i prezena
antigenului de grup Lancefield.
n funcie de hemoliz, se deosebesc:
- streptococii -hemolitici, care produc hemoliz complet, sub forma unei
zone clare, bine delimitate, cu diamentrul n general mare n raport cu
marimea coloniilor.
- Streptococii -hemolitici, produc hemoliz parial, verzuie ( viridans), mai
slab delimitat.
- Streptococii -hemolitici, produc o zon de hemoliz incomplet delimitat
de o zin nust de hemoliz incomplet
- Streptococii nehemolitici ().
Clasificarea Lancefield se bazeaz pe prezena antigenului de grup
polizaharidul C, de la nivelul peretelui celular. n funcie de cest antigen ,
streptococii aparin grupelor A-H i K-W. Exist i streptococi negrupabili, care nu
posed antigenul de grup, de exemplu streptococii viridans .
Majoritatea speciilor ntlnite la om sunt saprofite condiionat patogene i fac
parte din flora normal a tegumentului, tractului respirator, digestiv, genital. Specia
obligat patogen este Streptococcus pyogenes, dar i aceast specie poate fi izolat
i de la purttori sntoi.
Streptococcus pyogenes
Streptococul -hemolitic de grup A determin:
- infecii respiratorii: faringite, angine
- infecii cutanate: impetigo, erizipel, infecii de plag, in special la ari
- celulite, fasceita necrozant
- scarlatin
- febra puerperal, oc toxic

Fig. IX.1. Streptococi - frotiu colorat Gram (dup K.Tomae)

Fig. IX.2. Colonii de streptococ -hemolitic pe mediul geloz-snge (dup


K.Tomae)

Fig. IX.3. Testul la bacitracina (dup K.Tomae)

Recoltarea i nsmnarea produselor patologice. Produsele patologice pot fi


: exudat faringian, exudat nazal, secreie de plag, etc, n funcie de localizarea
infeciei. Acestea se recolteaz pe cat posibil naintea administrrii de
antibiotice.
nsamnarea se face, n cel mai scurt timp de la recoltare. Cnd acest lucru
nu este posibil, pentru a preveni uscarea tampoanelor, acestea se introduc n
mediu dr conservare i transport sau n 2 ml bulion steril. Mediul de elecie
este geloza-snge, cu 7% snge defibrinat de berbec. Incubarea se face la 37 0 C,
timp de 24 h.
Caracterele de cultur: Streptococii cresc sub forma unor colonii mici ( cu
diametru de aproximativ 0,5 mm), de tip S: rotunde lucioase, convexe, cu
margini regulate; mai rar, pot fi colonii mucoide sau de tip glossy, sau colonii
mai mari de 5 mm.
Hemoliza este complet, de tip .
Examenul microscopic al frotiului efectuat din cultur pur evideniaz coci
Gram-pozitivi grupai n lanuri de lugimi diferite.
Testul catalazei negativ
Testul oxidazei - negativ
Identificarea grupului: testul la bacitracin pozitiv ( sau Bacitracin pozitiv
i Biseptol negativ)
Reacii de aglutinare sau de precipitare cu seruri de grup.
Diagnosticul bolilor post-streptococice: RAA, GNA se face prin
determinarea ASLO ( Anti-streptolizina O)
Principiul metodei : reacie de aglutinare indirect
Anti-streptolizina-O ( ASLO) reprezint anticorpii specifici mpotriva unei
enzime extracelulare produse de Streptococcus pyogenes (Streptococul -hemolitic
de grup A): hemolizina sau streptolizina O. Anticorpii ASLO pot fi detectai n
serul unei persoane cu infecie streptococic de la o stmn la o lun de la
debutul infeciei.
ASLO n ser n cantitate de 200 UI / ml produc n contact cu o suspensie
de particule de latex acoperite cu streptolizin O, o reacie de aglutinare pe lam
vizibil cu ochiul liber.
Compoziia kitului:
Reactiv: suspensie de particule de latex acoperite cu streptolizin O
Control negativ: ser cu ASLO 200 UI / ml
Control pozitiv: ser cu ASLO 200 UI / ml
Carduri de reacie de unic folosin.
Reactivii sunt gata de utilizare. Ei se pstreaz la frigider i vor fi adui la
temperatura camerei nainte de utilizare.

Serurile de testat se recolteaz n tuburi vacuumate fr anticoagulant.


Serurile trebuie s fie clare. Serurile hemolizate i cele lipemice nu sunt adecvate
pentru a fi analizate. Serurile pit fi pstrate la frigider (2-8O C) maximum 7 zile.
Procedura de lucru
1. Se aduc reactivii i serurile de cercetat la temperatura camerei.
2. Se pipeteaz cte 50 l din controlul negativ , pozitiv i din fiecare ser de
cercetat n cercuri separate de pe cardul de reacie.
3. Se agit delicat flaconul cu reactiv latex pn la omogenizarea suspensiei.
innd flaconul n poziie vertical, se depune cte o pictur de reactiv
latex n fiecare cerc, lng ser.
4. Se amestec cele dou picturi cu beioare separate pentru fiecare prob.
5. Se agit manual sau mecanic prin micare rotativ 100 r.p.m. 2 minute.
Citire i interpretare
Examinarea se face timp de 1 minut dup oprorea rotirii.
Rezultat pozitiv: prezena de aglutinate vizibile indic ASLO 200 UI / ml
Rezultat negativ: absena aglutinatelor indic ASLO 200 UI / ml
Serurile de control trebuie s prezinte reacii pozitive, respectiv negative pentru
validarea celorlalte reacii.
Serurile de testat pozitive la testul calitativ vor fi titrate. Se vor face diluii
binare n ser fiziologic i se vor repeta testele. Titrul ASLO este dat de cea mai
mare diluie care a prezentat reacie pozitiv, i anume inversul diluiei X 200 UI /
ml. ( 400 UI / ml, 800 UI / ml, etc).
Valori normale: ASLO 200 UI / ml
Creterea n dinamic a titrului ASLO sau un titru ASLO 800 UI / ml
indic o posibil boal poststreptotocic.
Scderea n dinamic a titrului ASLO sub tratament, pn la normalizare este
un indicator al eficienei acestuia.
Streptoccus agalactiae Streptocul de grup B
Streptococcus agalactiae este condiionat patogen. Se gsete la aproximativ
30% dintre persoanele sntoase n flora intestinala, naso-faringian i flora
vaginal, n special la gravide.
Poate produce infecii la nou nscut: meningita neonatal i pneumonia
neonatal, cu att mai severe cu ct nou nscutul este prematur i membranele au
fost rupte de mai mult de 48h. Cele dou afeciuni se pot complica cu septicemie.
La adult produce infecii respiratorii i genitale, urinare, cutanate, i mai rar
pneumopatii, meningit, septicemie.

Caractere de cultur pe geloz snge produc coloniide tip S sau M, mici,


transparente, incolore, nconjurate de hemoliz complet.
Examenul microscopic al frotiului efectuat din cultur pur evideniaz coci
Gram-pozitivi grupai n lanuri de lugimi diferite. ( aspectul microscopic i al
culturii este identic cu S.Pyogenes).
Diferena fa de S.Pyogenes se face astfel:
Testul la Bacitracin i Biseptol: S. agalactiae este rezistent att la Bacitracin ct
i la Biseptol.
Produce hidroliza hipuratului
CAMP-test pozitiv: producerea unei proteine ( factorul CAMP), care
interacioneaz cu - hemolizina stafilococic i determin hemoliza complet.
Identificare serologic prin reacii de precipitare sau de aglutinare cu serul de
grup B.
Streptococii de grup C sunt identificai preliminar ca Streptococi hemolitici rezisteni la Bacitracin i sensibili la Biseptol, identificarea de
certitudine fcnduse prin precipitare sau aglutinare cu ser de grup C.
Ali streptococi -hemolitici ce pot fi ocazional implicai n infecii la om sunt cei
de grup F i G. Acetia se identific prin reacii de precipitare sau aglutinare cu
seruri de grup i pe baza unor reacii biochimice
Streptococii de grup D sunt streptococi care au habitatul normal n
intestinul uman: enterococii, precum i specii non-enterococice. Enterococii au fost
inclui ntr-un gen aparte, genul Enterococcus, cu 12 specii, dintre care prezint
interes medical E. Fecalis, E. Fecium i E. Durans
Pe geloz snge,enterococii cresc sub forma unor colonii mici, transparente
sau semitransparente, cu hemoliz de tip , mai rar sau .
Microscopic, enterococii apar ovalari, cu diametrul de 0,5-1 m, grupai n
perechi sau lanuri scurte.
Majoritatea tulpinilor sunt mobile.
Aglutineaz cu serul de grup D.
Testul la bil-esculin. Mediul agar-bil-esculin ( ABE) se nsmneaz cu
tulpina streptococic. Dup incubare de 24 h la 37o C, apariia unei coloraii negre
pe mai mult de jumtate din mediul nsmnat semnific reacie pozitiv. Toi
streptococii de grup D sunt pozitivi la acest test.
Tolerana la mediu hipersalin . Acest test permite diferenierea enterococilor
de ali streptococi de grup D. Doar enterococii se dezvolt uor, n 24 h pe mediu
hiperclorurat ( Na Cl 6,5%).
Alte teste folosite n identificarea enterococilor: testul de hidroliz a
argininei, testul de hidroliz a hipuratului, fermentarea unor zaharuri.

Creterea la 50 o C ( E. Fecalis, E. Faecium), creterea n mediu alcalin, cu


pH:9,6.
Streptococii viridans
Pe mediul geloz-snge produc hemoliz incomplet, verzuie de tip
Nu aglutineaz cu serurile de grup
Se difereniaz de pneumococi, care produc acelai tip de hemoliz , prin
testul la Optochin, negativ pentru streptococii viridans i pozitiv pentru
pneumococi.
Speciile pot fi difereniate ntre ele pe baza unor recii biochimice:
fermenterea unor zaharuri manitol i sorbitol, hidroliza ureei, a esculinei i
argininei.
Diagnosticul infeciilor pneumococice
Streptococcus pneumoniae (pneumococul) este o specie de streptococi de
form lanceolat, grupai n perechi (diplo),imobili, ncapsulai, alfa-hemolitici. Ca
toi streptococii alfa-hemolitici, nu posed antigen specific de grup, dar pe baza
antigenelor capsulare sunt grupai n 80 de serotipuri.

Fig.IX. 4. Pneumococi n sput (dup K.Tomae)


Pneumococii sunt sensibili la aciunea bilei i srurilor biliare, care-i lizeaz.
De asemenea , la pneumococi apare fenomenul de autoliz, n culturile vechi n
mediu lichid.
Pneumococii sunt bacterii condiionat patogene, ce determin pneumonia
pneumococic, otit medie, mastoidit. Pneumonia se poate complica cu pleurezie,
bacteriemie i consecutiv bacteriemiei: meningit, endocardit, mai rar artrit
septic.
Principalel produse patologice n care se poate identifica Str. pneumoniae
sunt: sputa, exudatul faringian, secreie otic, L.C.R., hemocultur.
Frotiul colorat Gram din produsul patologic se efectueaz pentru sput i
L.C. R. Pneumococii apar Gram-pozitivi, de form lanceolat, grupai n diplo,
ncapsulai. Alturi de ei, pe aceste frotiuri apar leucocite polinucleare,
pneumococii fiind situai extracelular. n coloraia albastru de metilen sete
evideniat bine capsula pneumococilor, ca un halou clar n jurul perechilor de coci.

Cultura pe mediul geloz-snge : peumococii produc colonii mai mari dect


ceilali streptococi, aplatizate, cu marginile ridicate i centrul deprimat, nconjurate
de hemoliz viridans.
Testul la optochin : 2-3 colonii din cultura primar se nsmneaz n
pnz pe un sector de plac cu geloz-snge. n centrul sectorului se aplic un
microcomprimat cu 5 optochin ( etil-hidro-cuprein). Se incubeaz 24 h la 37 O C.
Pneumococii sunt foarte sensibili la optochin, n jurul comprimatului formndu-se
o zon de inhibiie de minim 10 mm diametru. ( Fig. IX.4.) Ceilali streptococi
viridans sunt rezisteni la Optochin sau formeaz o zon de inhibiie foarte mic.
Biloliza: n dou eprubete se pipeteaz cte 1 ml cultur n bulion din tulpina
streptococic obinut n cultura primar. n prima eprubet se adaug 1 ml bil
steril sau 1 ml soluie 10% de sruri biliare ( dezoxicolat de sodiu). n cea de a
doua eprubet se adaug 1 ml ser fiziologic steril. Dup 30 min, n primul tub se
observ clarificarea mediului, datorit lizei bacteriilor. Dac reacia rmne
negativ, se pot introduce tuburile n termostat, la 37 O C , apoi se repet citirea.
Fermentarea inulinei test biochimic facultativ, nefiind strict specific
pentru pneumococ.
Aglutinarea cu seruri antipneumococice i cu seruri specifice de tip este o
metod rapid de identificare a antigenelor capsulare. Se efectueaz prin metoda
latex-aglutinrii.
Reacia de umflare a capsulei se realizeaz pe lam, prin punerea n contact
a1-2 colonii bacteriene cu ser antipneumococic.
Antibiograma este necesar. Dei pneumococii sunt sensibili la Penicilin,
alte beta lactamice, macrolide, etc, exist un procent de aproximativ 10% tulpini
intermediar sensibile i rezistente la aceste antibiotice.

Fig. IX.5. Colonii de Streptococcus pneumoniae pe geloza sange (dup K.Tomae)

Fig. IX.6. Testul la optochin (dup K.Tomae)

Capitolul X
DIAGNOSTICUL INFECIILOR PRODUSE DE NEISSERII
Cocii Gram-negativi cuprind genurile: Neisseria, Branhamella, Moraxella,
Kingella i Eikenella
Genul Neisseria
Genul cuprinde Coci Gram-negativi cu form reniforma (de boabe de fasole),
grupati n diplo ( perechi) cu prile concave fa n fa, sunt imobili, nesporulai,
ce pot prezenta capsul. Posed enzima citocrom-oxidaz. Sunt aerobi, dar in vitro
cresc mai bine n atmosfer mbogit cu CO2.
- dou specii patogene: N. meningitidis i N. gonorrhoeae
- specii saprofite: N. sica, N. flava, N. lactamica.
Neisseria meningitidis ( meningococul)
Neisseria meningitidis colonizeaz iniial nazofaringele, determinnd o
rinofaringit uoar sau o stare de portaj ( asimptomatic). De la acest nivel
bacteriile pot trece n circulaia general: bacteriemie, meningococemie tranzitorie
cu febr, stare general modificat, ce se poate fie rezolva sponatan n 1-2 zile, fie
se poate complica cu o meningit acut. Debutul meningitei meningococice poate fi
brusc su insidios. n meningita acut manifestrile clinice sunt febra, starea
general alterat, semnele de hipertensiune intracranian: cefalee, vrsturi, semne
de iritaie meningeal: fotofobie, redoarea cefei. Meningele sufer un proces
inflamator acut, insoit de un exsudat bogat n leucocite PMN.
Septicemia evolueaz cu febr nalt, oc, purpur, coagulare intravascular
diseminat ( CID). Forma fulminant: sindromul Waterhouse-Friderichsen apare la
5 - 15 % din cazuri i are o rat nalt a mortalitii.
Diagnosticul de laborator
Produsele patologice ce trebuiesc recoltate n suspiciunea unei infecii
meningococice sunt: secreie nazo-faringian, L.C.R., hemocultur. Recoltarea se
va face naintea administrrii de antibiotice
Examenul microscopic al frotiurilor colorate Gram efectuate din L.C.R. pot
evidenia prezena de leucocite polinucleare i a cocilor Gram negativi cu form
reniform, grupati n perechi cu prile concave fa n fa, ncapsulai, cu
localizare predominent extraleucocitar. LCR prezint o reacie inflamatorie:
leucocite 100-1000 / l, proteinorahie, hipoglucorahie (glucoza mai mic de 60%
din valoarea simultan a glicemiei).

Cultura se va face pe medii nutritive, Neisseriile fiind bacterii pretenioase:


geloz-snge i geloz chocolat, Muller-Hinton sau Thayer-Martin. Exudatele
nazo-faringiene se nsmneaz pe mediile selective Muller-Hinton +supliment
HYL sau Thayer-Martin cu Vancomicin, Colistin, Trimetroprim sau Nistatin.
Incubarea se face la 37O C, n atmosfer cu 5-10% CO2. Citirea se va face la 24 i
48h.
Coloniile sunt mici 0.5-1mm, de tip S sau M, transparente sau opace, albe-gri.
Coloniile suspecte se verific prin testul oxidazei ( pozitiv) i frotiu colorat
Gram ( coci Gram-negativi). Testul catalazei este de asemenea pozitiv.
Identificarea biochimic este necesar pentru precizarea speciei i se bazeaz
pe fermentarea zaharurilor glucoz, maltoz, lactoz i zaharoz sau fructoz cu
producerea de acid. Pentru N. meningitidis reaciile sunt: glucoz, maltoz
pozitive, lactoz i zaharoz sau fructoz negative.
Grupul serologic poate fi identificat prin reacii de latex- aglutinare pe lam cu
seruri anticapsulare polivalente, apoi monovalente.
Alte metode de diagnostic imunologic sunt: imunofluorescena indirect ( cu
anticorpi monoclonali), coaglutinare din produsul patologic ( anticorpi antimembran extern).
Diagnosticul prin metode de biologie molecular : PCR ( polimerase chain
reaction) sunt relativ rapide i foarte specifice dar au un cost ridicat, nefiind
accesibile deocamdat pentru diagnosticul de rutin . PCR poate identifica prezena
unui numr foarte mic de bacterii n LCR
Antibiograma este obligatorie, datorit apariiei de tulpini rezistente n speial la
beta-lactamice. Antibiograma se efectueaz pe mediul Muller-Hinton sau MullerHinton mbogit cu snge.
Neisseria gonorrhoeae ( gonococul)
Gonococii sunt patogeni specifici omului. Se transmit pe cale sexual. Nou
nscuii din mame infectate se pot contamina in timpul naterii. Infeciile transmise
pe cale sexual afecteaz mucoasa uretral sau rectal la brbai, mucoasa
endocervical, glandele Skene i Bartholin la femei. Infecia diseminat poate
afecta diferite esuturi.
Diagnosticul de laborator
Produsele patologice recoltate n suspiciunea de gonoree sunt secreia
uretral i/sau rectal la brbai; secreia cervical, a glandelor Bartholin i Skene
la femei.

n suspiciunea de artrit septic se recolteaz lichid sinovial. n oftalmia nounscutului se recolteaz secreie conjunctival. Acestea trebuiesc recoltate nainte
de instituirea tratamentului cu antibiotice.
n suspiciunea de infecie sistemic se recolteaz hemocultur
Examenul microscopic al frotiurilor colorate Gram din secreii evideniaz ( n
peste 90% din cazuri n uretrite i aproximativ 50% din cazuri n cervicite) prezena
de numeroase leucocite polinucleare i a cocilor Gram negativi cu form reniform,
grupati n diplo cu prile concave fa n fa, nencapsulai, cu localizare
predominent intraleucocitar. Prezena acestui aspect este sufucient pentru
diagnosticul prezumptiv de infecie gonococic.
Cultura i identificarea este necesar pentru confirmarea diagnosticului i
precizarea speciei, avnd n vedere c i alte specii nepatogene de Neisseria pot
ocazional habita mucoasele genitale.
Cultura se va face pe medii nutritive, Neisseriile fiind bacterii pretenioase:
geloz-snge i geloz chocolat, Muller-Hinton sau Thayer-Martin. Incubarea se
face la 37O C, n atmosfer cu 5-10% CO2. Citirea se va face la 24 i 48h. Coloniile
sunt mici 0.5-1mm, de tip S sau M, transparente sau opace, albe-gri. Coloniile
suspecte se verific prin testul oxidazei ( pozitiv) i frotiu colorat Gram ( coci
Gram-negativi). Testul catalazei este de asemenea pozitiv.
Identificarea biochimic este necesar pentru precizarea speciei i se bazeaz
pe fermentarea zaharurilor glucoz, maltoz, lactoz i zaharoz sau fructoz cu
producerea de acid. Pentru N. meningitidis reaciile sunt: glucoz pozitiv, maltoz
lactoz i zaharoz sau fructoz negative.
Diagnosticul imunologic poate fi fcut prin:
-imunofluorescen direct, cu anticorpi monoclonali cuplai cu fluorocromi
- ELISA pentru antigene ale N. gonorrhoeae
- biologie molecular: PCR sau LCR ( Ligase chain reaction) pentru detecia
DNA propriu N. gonorrhoeae.
Antibiograma este indicat datorit apariiei tulpinilor rezistente la Penicilin.
Trusa de antibiotice care va fi folosit va cuprinde: Penicilin, Amoxicilin,
Amoxicilin+ac. Clavulanic, Ceftriaxon, Cefixim, Doxiciclin, Spectinpmicin,
Gentamicin, Clindamicin, Ofloxacin, Ciprofloxacin, Pefloxacin.

Fig.X.1. Neisseria gonorrheae n


secreie uretral

Fig. X.2. Cultur de N. gonorrheae


pe geloz-chocolat

Fig. X.3. Fermentarea zaharurilor la N. gonorrhoeae

Fig. X.4. Antibiograma pentru o tulpin de Neisseria gonorrhoeae

Capitolul XI
DIAGNOSTICUL INFECTIILOR PRODUSE DE BACILI GRAMPOZITIVI
Genul Corynebacterium. CORYNEBACTERIUM DIPHTERIAE
Genul Corynebacterium cuprinde bacili Gram pozitivi nesporulai, imobili,
drepi sau uor ncurbai, cu extremitile ngroate, n form de mciuc, colorai
neuniform. Pot prezenta incluziuni de polimetafosfat (granulaiie metacromatice
Babe-Ernst) care se coloreaz n rou cu albastru de metilen. Au o grupare
caracteristic n form de litere chinezeti sau palisade. ( Fig.1.)
Principala specie patogen pentru om este C.diphteriae ( bacilul difteric).
Exist i specii saprofite, numite corineformi sau difteromorfi.
Caractere de cultur: C. Diphteriae este o bacterie pretenioas. Crete i
pe geloza-snge, dar crete mai bine pe medii speciale: mediul selectiv Tinsdale cu
telurit de potasiu cu ser, mediul electiv Loffler , mediul de mbogire OCST ( cu
ou, cistin, ser, telurit) sau OST ( cu ou, ser, telurit)
Majoritatea speciilor cresc la 37 o C, n aerobioz sau n atmosfer cu 5%
CO2. Dup aspectul coloniilor pe geloza snge cu cistin i telurit se disting 3
variante: var. gravis, var. mitis, var. intermedius, numite astfel deoarece s-a
considerat c determin forme grave, uoare , respectiv medii de boal.
Grupul Corynebacterium diphteriae cuprinde 3 specii toxigene:
C.diphteriae ( cu biotipurile gravis, mitis, intermedius i belfanti), C.ulcerans i
C.pseudotuberculosis.
C.diphteriae poate fi izolat att de la bolnavii de difterie ct i de la purttorii
sntoi. Difteria este deteminat de formele toxigene ale bacteriei i se manifest
n principal prin faringit, amigdalit cu false membrane, adenopatie
laterocervical, semne de toxicitate sistemic. Tulpini netoxigene de C.diphteriae
pot determina manifestri clinice locale uoare: faringit, amigdalit, dar i
endocardit.
C.ulcerans produce infecii cutanate i ale esuturilor moi i poate fi izolat de
la bolnavi din leziuni , dar i la purttori sntoi din nazofaringe.
C.pseudotuberculosis are habitatul natural animalele ( oi, cai) i ocazional
produce infecii cutanate, ale esuturilor moi i limfadenit necrozant la om.
Recoltarea produselor patologice depinde de natura infeciei:
n suspiciunea de difterie se recolteaz trei tampoane cu secreii
faringiene, cel mai corect din zonele profunde, dup detaarea cu grij a falselor
membrane i un tampon nazal.
n cercetarea portajului dou tampoane faringiene i un tampon nazal.
n infeciile cutanate sau cu alt localizare se recolteaz de la nivelul
leziunilor respective i obligatoriu un tampon nazal i unul faringian.
Din tampoanele faringiene se efectueaz:

frotiuri minim 2, colorate Gram i albastru de metilen


nsmnare pe geloz-snge
nsmnare pe medii medii solide speciale: mediul Tinsdale
nsmnare n mediul se mbogaire lichid OST sau OCST
Tamponul nazal se introduce n mediul se mbogaire lichid OST sau OCST
Examenul microscopic este foarte important, mai ales n context clinic i
epidemiologic.
Pe frotiul colorat Gram se pot observa leucocite sugestive pentru inflamaie
i bacili Gram pozitivi nesporulai, imobili, drepi sau uor ncurbai, cu
extremitile ngroate, n form de mciuc, colorai neuniform, grupai n form
de litere chinezeti sau palisade. ( fig.2)
Pe frotiul colorat A.M. se pot observa corpusculii metacromatici colorai n
rou.
Culturile se citesc dup 37 i 48h i pot prezenta urmtoarele aspecte:
Pe mediul Tinsdale modificat
colonii opace de culoare neagr, datorit producerii de H2S, de 1-2
mm, de tip R, cu margini crenelate i striaii radiare dnd aspectul de floare de
margaret ( var gravis) ( fig.3.)
Colonii opace de culoare cenuie sau neagr, de mrimi diferite, cu
margini regulate i suprafaa lucioas sau granular, mamelonat ( var
intermedius).
Colonii transparente de tip S, cenuii sau negre, de 1-2 mm, cremoase,
care prin nvechire devin rugoase ( var mitis, belfanti)
n toate variantele coloniile sunt nconjurate de un halou cafeniu, bine
delimitat.
Corineformii sunt inhibai sau dac totui cresc determin colonii lipsite de
haloul specific.
Cultura este cerificat prin frotiuri colorate A.M. i Gram.
Din coloniile suspecte i din cultura n OCST se fac teceri pe mediul
Loeffler. Pe mediul Loeffler C.diphteriae crete sub forma unor colonii albe
semicremoase, granulare.
Identificarea biochimic i enzimatic a speciei i precizarea biotipurilor
se bazeaz pe : testul catalazei , pirazinamidazei, cistinazei, ureazei, reducerea
nitrailor i fermentarea unor zaharuri. Acestea pot fi realizate prin metode clasice
sau pe kituri comerciale cum ar fi galeriile miniaturizate API CORYNE ( BioMerieux).

Fig.XI.1. C. diphteriae prezena granulaiilor i gruparea n form de litere


chinezeti ( dup www.geocites.com Atlas of Bacterial pathogens)

Fig.XI.2. C.diphteriae coloraie Gram (www.geocites.com Atlas of Bacterial


pathogens)
Fig.XI. 3. Aspectul coloniilor de C.diphteriae var gravis (www.
Anne.decoster.free.fr)
-

Testarea toxigenezei poate fi fcut in vitro prin testul de imunodifuzie


Elek, sau in vivo prin testul de patogenitate pe cobai.
Testul Elek are ca principiu reacia de precipitare ntre toxina produs de
tulpinile de Corynebacterium nsmnate i antitoxina din serul antidifteric, depus
n anuri tanate n mediu sau sub forma unor benzi de hrtie mbibate n ser
aplicate perpendicular pe striurile de nsmnare. Apariia dup 24-48h a unor linii
de precipitare n unghiul dintre acestea este reacia pozitiv i confirm producerea
de toxin de ctre tulpinile respective. ( Fig.4)

Fig.XI.4. Testul Eleck (www. Anne.decoster.free.fr)


Prin tehnici de biologie molecular poate fi evideniat gena tox+ .
Antibiograma. Dei C.diphteriae este sensibil la penicilin i Eritromicin,
considerate antibiotice de elecie, antibiograma este totui indicat, folosind aceste
antibiotice, alturi de alte beta-lactamice, trimetoprim, rifampicin, lincomicin,
clindamicin.
GENUL BACILLUS. Bacillus anthracis
Genul Bacillus, cu peste 40 specii cunoscute, cuprinde bacili Gram pozitivi
mari, de 1 m 3-8 m, cu extremitile drepte, grupai n lanuri, imobili,
sporulai.
Cei mai muli sunt saprofii, putnd fi ntlnii n aer, sol, de ex. Bacillus cereus i
Bacillus subtilis. Ocazional n urma contaminrii cu sporiaceste specii pot
determina infecii de plag, infecii ale arsurilor, oftalmii, bacterieme, septicemie,
toxiinfecii alimentare.
Bacillus anthracis este principala specie patogen i produce antraxul, o
antropozoonoz. n funcie de poarta de intrare, se cunosc 3 forme clinice: antraxul
cutanat, antraxul pulmonar, antraxul digestiv. Toate cele 3 forme clinice se pot
complica cu septicemie i meningit, cu evoluie letal.

Diagnosticul antraxului.
Produsele patologice sunt: secreie sau puroi, sput, snge, LCR, materii
fecale. Bacillus antracis este o bacterie ce rezist bine n produsul patologic
recoltat, cu sau fr mediu de conservare i transport.
Examenul microscopic al unui frotiu din produsul patologic evideniaz
bacili Gram -pozitivi, cu morfologie caracteristic ( fig.XI.5.)

Fig. XI.5.: Bacillus anthracis ( dup K.Todar)


Cultura produselor patologice nomal sterile ( snge, LCR, esuturi) se face
pe geloz nutritiv sau geloz-snge, 24h la 37 O C n aerobioz, bacteriile nefiind
pretenioase.
Produsele patologice cu flor de asociaie abundent necesit nsmnare pe medii
selective cum este geloza PLET ( polimixin, lizozim, EDTA, taliu acetat) sau
distrugerea bacteriilor vegetative asociate prin diferite metode: tratarea termic,
tratarea cu alcool, astfel nct n prob s rmn doare formele sporulate .
Pe mediul geloz-snge dezvolt colonii mari de tip R, alb-cenuii, nehemolititce,
cu aspect de cap de meduz. Se deosebesc de coloniile de B.cereus prin aceea c
acestea produc n jurul lor o zon mare de hemoliz complet.
Pe geloz ser dezvolt capsul.
Identificarea biochimic i enzimatic i pe baza unor caractere specifice:
mobilitate
absent
capsula
+
gelatina
digestie lent
lapte turnesolat
coagulare lent
hemoliza
absent
lecitinaza
+ /Reacia Ascoli este utilizat pentru diagnostic la cadavre. Aceasta presupune:
- extragerea dintr-un fragment de esut a antigenelor termostabile ( 5 min la
100o C, urmat de filtrare)
- filtratul utilizat pentru o reacie de precipitare n tub cu ser anti-crbunos

Capitolul XII
DIAGNOSTICUL INFECTIILOR PRODUSE DE MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS
Genul Mycobacterium include bacili aerobi , cu dimensiuni de 2-5 m /
0.3m, drepi sau uor ncurbai, imobili, nesporulai, nencapsulai. Ei sunt numii
bacili acid-alcoolo rezisteni ( BAAR), datorit proprietilor tinctoriale specifice.
Mycobacteriile nu se coloreaz n coloraiile uzuale i nici nu se decoloreaz, la
temperatura camerei. Aceast proprietate se datoreaz prezenei cerurilor n
structura peretelui celular.
M. tuberculosis este strict aerob. M. Bovis i africanum pot fi microaerofili.
Exist dou specii obligat patogene pentru om:
M.tuberculosis, care determin tuberculoza
M. Leprae, care preoduce lepra.
Tuberculoza la om mai poate fi produs i de alte specii, ca M. Bovis i M.
Africanum.
M. ulcerans poate determina infecie cutanat.
Alte specii, numite micobacterii atipice, sunt saprofite, condiionat patogene,
putnd determina infecii n special la bolnavii imunodeprimai: M. Kansanii, M.
Avium. M. intracelularae, M fortuitum, M. Chelonei.
Tuberculoza poate afecta orice organ, dar cea mai frecvent este
tuberculoza pulmonar. Tuberculoza pulmonar primar afecteaz n special
subieci tineri: copii sau aduli tineri. Tuberculoza secundar este caracteristic
adulilor. Alte forme de tuberculoz -tuberculoza extrapulmonar- sunt: tuberculoza
ganglionar, tuberculoza osoas, tuberculoza uro-genital, tuberculoza digestiv,
tuberculoza S.N.C., tuberculoza cutanat, tuberculoza asociat H.I.V., produs
adesea de mycobacterii atipice.
Recoltarea produselor patologice se va face n funcie de localizarea
infeciei: sput, lichid de aspiraie sau lavaj bronic, lichid pleural, probe obinute
prin biopsie, urin, lichid de spltur gastric, LCR, lichid pericardic, lichid
peritoneal. n tuberculoza miliar se recomand i hemocultura.
n suspiciunea de tuberculoz pulmonar se recomand recoltarea a trei
probe de sput succesive, obinute dimineaa.
Recoltarea se va face n recipiente sterile cu capac, evitndu-se contaminarea
mediului, i urmrind protecia personalului medical implicat.
De asemenea, laboratoarele n care se desfoar diagnosticul microbiologic
al tuberculozei acesta se va desfura n spaii separate, cu dotare adecvat.
Prelucrarea produselor patologice n vederea izolrii mycobacteriilor
presupune anumite reguli generale:
- eliminarea sau reducerea numeric a celorlalte microganisme n produsele cu
flor de asociaie, prin decontaminarea acestora;

- eliberarea mycobacteriilor aflate intracelular sau cuprinse n mase de mucus


este necesar n special pentru sput ( fluidificarea sputei);
- concentrarea produselor paucibacilare, n vederea examinrii microscopice.
Decontaminarea se realizeaz cu soluii de NaOH sau clorur de benzalconiu.
Mucoliza se realizeaz cu N-acetil-L-cistein. (NALC)
O metod ce utilizat este decontaminare-fluidificare cu soluie NaOH 4%
50ml+ citrat de sodiu 0.1M 50 ml + 0.5 g NALC pulbere. Soluia se pstreaz la
rece. n momentul folosirii se amestec n pri egale cu produsul patologic, se
centrifugheaz 15 minute la 2200 g, se arunc supernatantul i din sediment se
fac frotiuri. (Lenette)
Examenul microscopic al frotiurilor colorate Ziehl-Neelsen din produsele
patologice se efectueaz cu obiectivul 90X sau 100X cu imersie. Se urmrete
prezena celulelor epiteliale i a macrofagelor de la nivelul tractului respirator, a
leucocitelor, semnificnd reacia inflamatorie i a bacililor acid-alcoolo
rezisteni ( BAAR). n cazul n care exist semne certe de inflamaie se
examinzeaz n zig-zag ntreaga suprafa a frotiului, cel puin 100 cmpuri
microscopice.

Fig. XII.1. M. Tuberculosis n sput (www.CDC.gov)


Mycobacteriile apar ca bacili cu dimensiuni de 2-5 m / 0.3m, drepi sau uor
ncurbai, imobili, nesporulai, nencapsulai, colorai n rou n coloraia ZiehlNeelsen. ( fig. XIII.1.) La tulpinile foarte virulente, bacilii prezint aranjamente n
lanuri paralele sau corzi, datorit prezenei chord factorului.
O alt metod de colorare este cea cu fluorocromi: auramin, rhodamin.
Cultivarea
Cultivarea produselor patologice n scopul izolrii mycobacteriilor se face pe
medii speciale, mediul de elecie fiind Lowenstein-Jensen, cu amidon, glicerin,
ou, verde malahit i eventual antibiotice: Penicilin, acid nalidixic ( mediu
selectiv). Mediul Lowenstein-Jensen se toarn n tuburi n pant, iar dup

nsmnare tuburile se parafineaz pentru a mpiedica deshidratarea pe perioada


incubrii. Pot fi folosite i medii de mbogire
Incubarea se face n aerobioz, la 370 C. Atmosfera cu 5-10% CO2 n prima
sptmn favorizeaz creterea mycobacteriilor, n special la prima izolare.
Examinarea culturilor se face zilnic timp de o sptmn, apoi sptmnal timp
de 12 sptmni. Mycobacteriile patogene sunt bacterii cu cretere lent, ntre 2-8
sptmni, timpul lor de generaie fiind de 20-24h. cu.
Aspectul culturii: Pe mediul Lowenstein, mycobacteriile prezint dou tipuri de
cretere:
- cretere eugonic ( M. Tuberculosis, M. africanum), sub forma unor colonii
mari, de tip R conopidiforme, de culoare alb-glbuie, colonii ce se dezvolt
n 2-6- sptmni, n medie dup 3 sptmni.
- Cretere disgonic, ( M. Bovis), colonii mici, de tip S, alb-glbui, care apar
dup 4-8 sptmni.
Mycobacteriile saprofite au cretere rapid , dup 3-7 zile formeaz colonii mici,
de tip S, rareori de tip R sau cu aspect intermediar.
Identificarea biochimic
Pe lng durata de cretere ( rapid sau lent ) i producerea de pigmeni,
identificarea de specie se face n mod clasic pe baza unor teste biochimice. Cele
mai utilizate sunt: testul catalazei la 680 C, testul producerii de niacin, reducerea
nitratului, hidroliza Tween 80, hidroliza T2H ( acidul thiofen-2-carboxilic),
susceptibilitatea la PAS ( acidul p-amino-salicilic) i tolerana la NaCl 5%.
Alte metode de identificare: studiul cromatografic al acizilor grai din
peretele celular sau identificare genomic prin metoda PCR.
Antibiograma
Antibiograma pentru M. Tuberculosis se deosebete de cea efectuat pentru
bacteriile cu cretere rapid.
Antibiogramele pe mediu solid, indiferent de metod, presupun compararea
dezvoltrii bacililor inoculai pe un mediu martor fr antibiotice cu cea pe medii
cu antibiotice incluse. Antibiograma direct se realizeaz prin nsmnarea unui
inocul omogenizat i decontaminat din produsul patologic bogat n bacili.
Rezultatele se obin mai rapid,n 4 sptmni i populaia de bacili testat este
reprezentativ pentru situaia in vivo. Antibiograma indirect presupune testarea
unui inocul standardizat din cultura obinut n prealabil. Rezultatele se obin mai
trziu, dup 10 sptmni, dar este mai eficient pentru produsele srace n bacili,
iar standardizarea este mai bun. Exist mai multe metode: metoda concentraiilor
absolute, metoda proporiilor, metoda raportului rezistenelor
Antibiograma pe mediu lichid ( Middlebrook) a reprezentat un mare progres,
permind automatizarea i detecia precoce prin metoda radiometric, a creterii
mycobacteriilor n mediile lichide, fr i cu adaus de antibiotice.

Antibiograma se efectueaz n special pentru antituberculoasele majore,


urmrindu-se C.M.I. ( de exemplu HIN- 0.2 mg/l, RMP 2 mg/l, EMB 2,5 mg/l,
PZA 100 mg/l, SM 2 mg/l).
Prin metode de genotipare se poate identifica rezistena la Rifampicin,
considerat ca marker al rezistenei multiple la antibiotice.
Diagnosticul serologic
Determinarea anticorpilor de tip Ig G i Ig A anti-M. Tuberculosis poate fi
efectuat prin metoda ELISA, dar sensibilitatea i specificitatea acestor teste nu
este unanim acceptat ca fiind suficient de mare pentru confirmarea diagnosticului.
Intradermoreacia la tuberculoproteine ( IDR la PPD) este un test de
hipersensibilitate cutanat, de tip IV ( ntrziat). Acest test se efectueaz numai la
categorii de persoane expuse la risc crescut i nainte de efectuarea revaccinrii
BCG.
Testarea se efectueaz cu 0,1 ml PPD coninnd 2 UI, injectat intradermic n
treimea median a feei anterioare a antebraului. Citirea reaciei se face dup 72h.
Se msoar zona de eritem, se apreciaz prezena induraiei i eventual a
veziculelor.
Anergicii ( IDR 9mm) se consider neinfectai. Alergicii ( 10 mm n
absena cicatricei vaccinale i 15 mm n prezena cicatricei vaccinale ) sunt
controlai radiologic.
IDR la PPD este un test de depistare, dar confirmarea infeciei tuberculoase
se face prin metoda combinat a examenului radiologic i examenului bacteriologic
(microscopie, cultur,) sau/i PCR.

Capitolul XIII
DIAGNOSTICUL INFECTIILOR PRODUSE DE BACILII GRAM
NEGATIVI
Familia Enterobacteriaceae
Familia Enterobacteriaceae este format din peste 200 specii de bacili
Gram negativi, cu habitat natural tractul intestinal al omului i animalelor. Au
dimensiuni variabile, dar cuprinse ntre 10 16 m lungime i 0.3 m diametru,
aerobi facultativ anaerobi; unii mobili datorit unor cili peritrichi, alii imobili;
majoritatea nencapsulai, iar unii ncapsulai; nesporulai.

Fig. XIII.1. Aspect de microscopie electronic a E.coli ( K.Todar)


Caracterele biochimice cele mai importante sunt: fermentarea glucozei i
absena citocrom-oxidazei ( oxidaz-negativi).
Examenul microscopic
Cultura. Enterobacteriaceele se dezvolt cu uurin pe medii de cultur
simple sau complexe, solide sau lichide. n funcie de produsul patologic (urin,
diverse exudate, secreii de plag), dac se suspecteaz prezena acestora, cultivarea
se face de la nceput pe 2-3 medii, dintre care 1 mediu uzual i 1-2 medii selective
i difereniale pentru enterobacterii. Dac este o coprocultur, aceasta se va efectua
numai pe medii difereniale i selective.
n bulion Enterobacteriaceele se dezvolt tulburnd uniform mediul, unele
specii putnd forma sediment sau vl.
Pe mediul geloz-snge enterobacteriile formeaz colonii mari, bine vizibile,
1-3 mm diametru, semitransparente, n general de tip S. Unele tulpini pot produce
hemoliz.
Klebsiella i uneori E.coli, mai rar alte specii dezvolt colonii mari, mucoase
tip M, bombate, lucioase, cu tendina la confluare.
Genul Proteus datorit mobilitii deosebite, are capacitatea de a migra pe
suprafaa mediilor solide i dei dezvolt colonii, produce fenomenul de migrare cu

aspect de valuri pe suprafaa mediului, urmat de invazia complet a suprafeei


plcii.
Mediile selective i difereniale. Exist numeroase astfel de medii, care n
general conin substane inhibante ce mpiedic dezvoltarea bacteriilor Grampozitive i a ciupercilor i inhib migrarea bacteriilor din genul Proteus. De
asemenea conin un sistem diferenial format din lactoz i un indicator de culoare
ce vireaz n urma modificrii pH-ului.
Cele mai utilizate sunt:
- dintre mediile slab selective i difereniale:
o Mediul AABTL ( agar-albastru de brom timol lactoz ) sau
o Mediul Mc Conkey ( sruri biliare, cristal violet, rou neutru, lactoz)
- dintre mediile cu selectivitate medie i difereniale:
o Mediul ADCL ( agar, deoxicolat de Na, citrat, lactoz)
o Mediul Salmonella-Shigella ( sruri biliare+ verde briliant, lactoz,
rou neutru)
- dintre mediile puternic selective:
o mediul Wilson-Blair, cu verde briliant.
Identificarea biochimic a tulpinilor izolate se bazeaz pe identificarea
anumitor caractere metabolice. n acest scop sunt folosite medii de identificare
semisolide, sau galerii de identificare cu 12-20 reacii biochimice n mediu lichid
( de exemplu galeriile API ) Vezi fig.

Fig. Galeria API 20E (Bio-Merieux)


Cele mai importante reacii biochimice sunt
- Fermentarea glucozei, lactozei i zaharozei (mediul TSI triple sugar Iron)
- producerea de H2S ( TSI)
- capacitatea de a utiliza citratul ca unic surs de carbon ( mediul Simmons
cu citrat),
- producia de indol ( mediu MIU mobilitate, indol uree)
- descompunerea ureei ( MIU)
- producerea de lizin-decarboxilaz ( mediu cu lizin, MILF)
la acestea se adaug i prezena sau absena mobilitii.
Identificarea serologic permite precizarea prezenei antigenelor somatice
O, a celor de nveli K, V-W i a antigenelor flagelare H la enterobacteriile
flagelate. Pe baza lor se poate stabili cu precizie specia i tipul tulpinii identificate.

Antibiograma este obligatorie n toate cazurile n care se izoleaz o tulpin


bacterian din familia Enterobacteriaceae. Acestea au o sensibilitate variabil la
antibiotice i multiple mecanisme de instalare a rezistenei secundare.
GENUL ESCHERICHIA: E.coli
Cultura:
Pe mediul geloz-snge formeaz colonii mari, bine vizibile, 1-3 mm
diametru, semitransparente, n general de tip S, uneori de tip M. Unele tulpini pot
produce hemoliz.
Pe mediul AABTL: colonii mari, bine vizibile, 1-3 mm diametru, semitransparente,
n general de tip S, uneori de tip M, lactozo-fermentative (L+): de culoare galben
i producnd virajul culorii mediului de la verde la galben.
Pe mediul ADCL: colonii de talie medie (1-2 mm diametru), de tip S, uneori M,
lactozo-fermentative (L+): de culoare roie i producnd virajul culorii mediului de
la oranj deschis la rou.
Examenul microscopic al unui frotiu colorat Gram efectuat din cultur:
bacili Gram negativi.
Identificarea biochimic:
Mediu TSI
Uree Indol Mobilitate
Glucoz +
Lactoz +
Zaharoz v

Lizin

Citrat
M. Simmons

H2S

Alte teste
Identificarea antigenelor somatice pentru tulpinile enteropatogene ( EPEC)
prin reacii de aglutinare sau de latex-aglutinare .
Identificarea toxinelor
prin
teste ELISA, latex aglutinare sau
seroneutralizare.
Identificarea serologic a tulpinilor enteroinvazive ( EIEC)
Testarea cacterelor de patogenitate ale ECEH : producerea de enterocolit
hemoragic la purcel. Efect citopatic n culturi celulare ( celule Vero).
Teste de biologie molecular: PCR pentru detectarea genelor de patogenitate.
GENUL KLEBSELLA
Cultura:
Pe mediul geloz-snge formeaz colonii mari, bine vizibile, 1-3 mm
diametru, semitransparente, de tip M .

Pe mediul AABTL: colonii mari, bine vizibile, 1-3 mm diametru, semitransparente,


de tip M, lactozo-fermentative (L+): de culoare galben i producnd virajul culorii
mediului de la verde la galben.
Pe mediul ADCL: colonii de talie medie (1-2 mm diametru), de tip M, lactozofermentative (L+): de culoare roie i producnd virajul culorii mediului de la oranj
deschis la rou.
Examenul microscopic al unui frotiu colorat Gram efectuat din cultur:
bacili Gram negativi.
Identificarea biochimic pntru K. pneumoniae:
Mediu TSI
Uree Indol Mobilitate Lizin
Citrat
M. Simmons
Glucoz +
Lactoz +
+
+
+
Zaharoz v

H2S
+

Alte teste
Identificarea antigenelor capsulare prin reacii serologice de aglutinare.
Lizotiparea testarea sensibilitii tulpinilor de Klebsiella izolate la un set de
fagi litici, n special n scopuri epidemiologice .
GENUL PROTEUS
Cultura:
Pe mediul geloz-snge formeaz colonii de talie medie (1-2 mm diametru),
de tip S, greu vizibile datorit fenomenului de migrare n valuri i de invazie a
plcii.
Pe mediul AABTL: colonii de talie medie (1-2 mm diametru), de tip S, lactozononfermentative (L-): incolore sau de culoare verzuie. Culoarea mediului rmne
nemodificat. Uneori se observ fenomenul de migrare.
Pe mediul ADCL: colonii de talie medie (1-2 mm diametru), de tip S, lactozononfermentative (L-): incolore sau de culoarea mediului. Culoarea mediului
rmne nemodificat.
Examenul microscopic al unui frotiu colorat Gram efectuat din cultur:
bacili Gram negativi.
Identificarea biochimic:
Mediu TSI
Uree Indol Mobilitate
Glucoz +
Lactoz v
Zaharoz v

+++

Lizin

Citrat
M. Simmons

H2S

GENUL SALMONELLA
Diagnosticul este bacteriologic i serologic.
Diagnosticul bacteriologic. n febra tifoid i paratifoid, n funcie de stadiul
evolutiv al bolii se recolteaz urmtoarele produse patologice:
BOLNAVI BOLNAVI BOLNAVI BOLNAVI CONVA
LESCENTI
SAPT. I
SAPT. II SAPT. III SAPT. IV

PURTA
TORI
CRONICI

HEMOCULTURA
+++

++

+/-

+
+

++
-/+
+

+++
+
+

+
+
+/-

+/+/-

+/_
-

+/-

COPROCULTURA
UROCULTURA
MEDULOCULTUR
A
BILICULTURA

Coprocultura la suspecii de febr tifoid se recolteaz numai din scaunul


emis spontan, iar la purttori dup administrarea de purgativ salin. Se folosete
coprorecoltor cu mediu de conservare i transport Carry Blair.
Cultivarea se face pe medii selective i difereniale i ntr-un mediu de
mbogire cu selenit de sodiu. Se va utiliza i mediul selectiv Wilson Blair.
Pe mediul AABTL: colonii de talie medie (1-2 mm diametru), de tip S, lactozononfermentative (L-): incolore sau de culoare verzuie. Culoarea mediului rmne
nemodificat..
Pe mediul ADCL: colonii de talie medie (1-2 mm diametru), de tip S, lactozononfermentative (L-): incolore sau de culoarea mediului, cu centrul negru ( H2S).
Culoarea mediului rmne nemodificat.
Pe mediul Wilson-Blair colonii de culoare verde nchis cu halou n jurul lor.
Identificarea biochimic:
Mediu TSI
Uree Indol Mobilitate
Glucoz +
Lactoz Zaharoz -

Lizin

Citrat
M. Simmons

H2S

+/-

++/-

Identificarea serologica a tulpinilor izolate se face prin aglutinare cu seruri


polivalente anti-O, apoi cu seruri monovalente anti-O, seruri anti-H si anti-Vi.
Se poate folosi lizotipia ca metod de difereniere n cadrul serotipurilor.

GENUL SHIGELLA
Diagnosticul de laborator al disenteriei bacilare se bazeaz pe efectuarea
coproculturii. Aceasta se recolteaz dun scunul emis spontan, de preferin din
zonele cu aspect modificat: cu mucus i snge. La bolnavii cronici i purttori
recoltarea se face cu sonda Nelaton steril, prin aspirare din colonul sigmoid. Se
mai pot recolta probe direct de la nivelul leziunilor rectosigmoidiene cu ocazia
examinrii endoscopice.
Se va folosi mediul de conservare i transport Carry Blair.
Cultivarea se face pe medii selective i difereniale (AABTL, ADCL).
Incubarea se va face 24h, unele tulpini necesitnd 48h. Creterea este sub forma
unor colonii de tip S lactozo-non-fermentative.
Identificare biochimic
Mediu TSI
Uree Indol Mobilitate Lizin
Citrat
H2S
M. Simmons
Glucoz +
Lactoz -/+
Zaharoz v
Tulpinile confirmate biochimic ca aparinnd genului Shigella vor fi testate
prin reacii de aglutinare cu seruri polivalente ( Flexner, Sonne, Large-Sachs ,
Boyd), apoi cu seruri monovalente.
Caracterele de patogenitate ( enteroinvazivitatea i producerea toxinei
Shiga).
GENUL YERSINIA
n pest produsele patologice ce se recoltez sunt: puroi din bubon, sput,
snge pentru hemocultur.
Hemocultura se efectueaz n mod obinuit, cu treceri ulterioare pe gelozsnge, mediu favorabil creterii Y. Pestis i pe medii selective i difereniale.
Identificare biochimic
Mediu TSI
Uree Indol Mobilitate Lizin
Citrat
H2S
M. Simmons
Glucoz +
Lactoz +
Zaharoz Transform nitraii n nitrii.
Identificarea de specie este confirmat prin aglutinare cu ser specific.
n infecia cu Yersinia enterocolitica se efectueaz coprocultura i
hemocultura. Diagnosticul serologic pune n eviden n 90% din cazuri anticorpi
anti Y. Enterocolitica ce persist n ser n titru ridicat 2-4 luni.

Capitolul XIV:
DIAGNOSTICUL INFECIILOR PRODUSE DE BACTERII ANAEROBE
Bacteriile anaerobe sunt bacterii hipersensibile la aciunea oxigenului.
Majoritatea anaerobilor nu posed enzimele clasice citocromi, catalaze i
perioxidaze, producndu-se energia propie n cursul proceselor fermentative.
Sensibilitatea anaerobiilor la oxigen este varialbil. O mare parte din
anaerobi tolereaz 0,1-5%O2 anaerobi moderai, alii nu tolereaz nici 0,1%O 2
bacterii extrem de sensibile la oxigen. Aceste bacterii extrem de sensibile la oxigen
sunt bacterii comensale ale tubului digestiv i ale pielii.
Anaerobii se mpart n 2 mari grupe:
- anaerobi sporulai
- anaerobi nesporulati
Bacili Gram negativi nesporulai
1. BACTEROIDES
2. PORPHYROMONAS
3. PREVOTELLA
4. FUSOBACTERIUM
Coci Gram pozitivi
1.
PEPTOSTREPTOCOCCUS
2.
PEPTOCOCCUS
Coci gram negativi
1.
VEILLONELLA
Bacili gram pozitivi nesporulai
1.
ACTINOMYCES
2.
ARACHINIA
3.
BIFIDOBACTERIUM
4.
PROPIONIL BACTERIUM
5.
EUBACTERIUM
Bacili gram pozitivi sporulai
1.
CLOSTRIDIUM
Diagnosticul de laborator al infeciilor cu bacterii anaerobe nesporulate
Bacteriile anaerobe nesporulate includ coci i bacili Gram pozitivi,
coci i bacili Gram negativi, fiind prezente pe tegumente i pe mucoasele tractului

respirator superior, bucal, vaginal i digestiv fcnd parte din microbiota


indigen a acestor regiuni. n anumite condiii de alterare a capacitii
antiinfecioase a gazdei, unele specii pot cauza infecii, de obicei mixte ( n
asociaie cu bacterii aerobe facultativ anaerobe sau cu ali anaerobi).
Infeciile de la nivelul plgilor i mucoaselor lezate pot evolua cu stare
bacteriemic i septicemic. Cele mai frecvente specii ntlnite n septicemii aparin
genurilor Bacteroides i Fusobacterium. Propionibacterium i Peptostreptococcus
pot cauza n anumite condiii favorizante endocardite subacute.
Diagnosticul bacteriologic
Recoltarea i transportul produselor patologice
Produsele patologice (puroi, sput, secreie gingival) recoltate din infecii
mixte cu bacterii anaerobe au adesea nu aspect caracteristic: culoare gris murdar,
uneori ocolatie, cu miros fetid sau putrid.
Dup prelevare produsele trebuie transportate la laborator ntr-un interval de
timp ct mai scurt pentru a nu altera viabilitatea speciilor oxigen sensibile.
Produsele destinate izolrii bacteriilor anaerobe vor fii introduse dup recoltare n
containere anaerobe.
n cazul puroiului se poate folosi procedeul sering anaerob care asigur
supravieuirea bacteriilor cel puin 30 minute.
Examenul microscopic direct
n frotiurile colorate gram, cocii gram pozitivi au un aspect alungit,
asemntor coccobacililor fiind dispui n perechi, grupuri mici sau n lanuri.
Dimensiunea lor variaz de la 0,3-0,5m la 0,7-1,2 m. Cocci gram negativi apar
izolai, grupai cte doi avnd talie mic, de 0,3-0,58 m. Bacilii gram negativi sunt
polimorfi iar cei gram pozitivi ramificai.
Izolarea se face n condiii strict
Cultura
anaerobe. naintea nsmnrii recipientele cu mediul lichid se fierb la baie
de ap 15-30 minute i apoi se rcesc brusc la jet de ap. nsmnarea se face cu
ansa n profunzimea mediului.
Dup nsmnare la suprafaa mediului se depune un strat de parafin steril
pentru meninerea condiiilor de anaerobioz.
Anaerobioza mai poate fi realizat prin procedee chimice, adic introducerea
n mediul de cultur a unei substane chimice reductoare ca acidul thioglicolic.
Produsele contaminate vor fi nsmnate pe agar snge.
Incubarea se face n termostat la 37oC, n recipiente speciale. n anaerostate
oxigenul este ndeprtat prin combinare cu hidrogenul, formnd H 2O n prezena
unui catalizator de platin. n absena anaerostatului se poate utiliza metoda cu
pirogalolul alcalin. Pe faa exterioar a capacului cutiei Petri se fixeaz cu banda
adeziv un pacheel din hrtie de filtru ce conine substane reductoare. Se ia

cealalt parte a cutiei Petri i se rstoarn deasupra capacului. Se fixeaz zona de


contact a celor 2 pri a cutiei Petri cu parafin solid topit crendu-se astfel n
interior un spaiu nchis ermetic. Coloniile cresc lent n 3-5 zile i sunt mici, de tip
S translucide sau opace, nconjurate uneori de o zon de hemoliz.
Identificarea speciilor se face pe baza caracterelor morfotinctoriale, de cultur,
biochimice.
Sensibilitatea la antibiotice
Bacteriile anaerobe nesporulate sunt n general sensibile la beta-lactamine,
cloramfenicol, clindamicin, tetracicline i metronidazol. Sensibilitatea la
antibiotice a florei anaerobe nesporulate poate varia ns de la o tulpin la alta chiar
n cadrul aceleiai specii, de aceia antibiograma este necesar n toate cazurile
clinice severe.
Diagnosticul de laborator al infeciilor cu bacterii anaerobe sporulate
CLOSTRIDIUM BOTULINUM
Morfologie: bacili Gram pozitivi, lungi, cu capete rotunjite, sporulai,
mobili. Sporul este oval, terminal sau subterminal, deformant.
Patogenitate : Sporii contamineaz alimentele: legume, carne. n alimentele
conservate sau n mezeluri are loc germinarea ( anaerobioz, pstrare la
temperatura camerei) i producerea de toxin toxina botulinic o neurotoxin.
Are 8 serotipur, serotipurile A, B, E, F provoac botulismul la om. Toxina este
termolabil i poate fi distrus prin fierbere 20 minute.
CLOSTRIDIUM TETANII
Morfologie: bacili Gram pozitivi, lungi i groi 8 0.8-1.2 m / 3-9m cu
capete rotunjite, sporulai, mobili . Sporul este subterminal, deformant.
Produce diferite enzime proteolitice: peptidaze, gelatinaz. Nu fermenteaz
glucidele. Produce hemolizin.
Patogenitatea bacilului este determinat de toxina sa. Toxina tetanic este o
exotoxin, cu dou componente. Tetanolizina hemolizin, i tetanospasmina
care, fixat la nivelul receptorilor gangliozidici de la nivelul neuronilor SNC,
blocheaz eliberarea inhibitorilor mediatorilor chimici, cu contractur muscular.
Diagnosticul de laborator const n nsmnarea produsului patologic ( ca
atare sau inactivat la 80 0C 30 min), pe geloz snge, n anaerobioz, 4-5 zile. Se
observ producerea fenomenului de migrare i hemoliza.

Fig. XIV.1. a.Actinomyces


(www.geocites.com)

b.Propionilbacterium

Fig. XIV.2.a Fusobacterium

b.Peptostreptococcus

Fig. XIV.3. Clostridium tetani (www.geocites.com)

infeciilor produse
Capitolul
de treponeme
XV
i leptospire
Diagnosticul de laborator al
GENUL TREPONEMA cuprinde trei specii patogene pentru om:
T.pallidum, T.pertenue i T. Carateum.
Treponema pallidum include bacterii spiralate, subiri ( 5-15 m lungime
i 0.2 m diametru), cu spire regulate, la distan de aproximativ 1m ntre ele.
Prezint micri active, n jurul axei, de pendulare, de progresie i de flexie.

Fig. XV.1. Treponema- imagine de microscopie electronica ( e-Medicine


Syphillis)
Treponemele nu se coloreaz n coloraia Gram , ci doar prin metoda de
impregnare argentic sau cu fluorocromi. La examinarea n cmp ntunecat ,
treponemele apar albe, refringente, strlucitoare.
Treponemele patogene nu sunt cultivabile pe medii artificiale, ci doar pe
testicul de iepure. Treponema Reiter, o treponema saprofit nrudit antigenic cu T.
pallidum, este cultivabil in vitro n condiii de anaerobioz.
Structura antigenic.este complex.Principalele antigene sunt:
- cardiolipina antigen de natur fosfolipidic, prezent la toate treponemele
( patogene i nepatogene), precum i n unele esuturi animale sau umane.
- Antigene proteice , comune tuturor treponemelor utilizate n RFC
- Antigene ale corpului bacterian, foarte specifice, caracteristice
treponemelor patogene.
- Antigene de suprafa, determin apariia de anticorpi ce reacioneaz n
RIF.
Patogenitate: sifilisul
Sifilisul este o boal specific omului. Transmiterea se face
- pe calea sexual,
- prin transfuzii sau manipulare de produse patologice contaminate
- transmitere de la mam la ft

Diagnosticul de laborator

Detectia directa a Treponemei pallidum prin microscopia in camp


intunecat sau imunofluorescenta directa este indicata cand sunt prezente leziuni, n
special n sifilisul primar. Treponemele nu se coloreaz n coloraiile uzuale.

Cultivarea pe medii artificiale nu este posibila.

Diagnosticul serologic este cel mai folosit, fiind indicat n special n


sifilisul secundar i teriar
Microscopia in camp intunecat / Imunofluorescenta directa
Examenul microscopic in camp intunecat se recomanda pentru
serozitatea din leziunile de sancru
Imunofluorescenta directa este utila pentru leziuni bucale si anale
Produsul patologic este reprezentat de serozitatea din sancru sau celule
lezionale obtinute prin raclaj viguros al leziunii.
La examinarea n cmp ntunecat , treponemele apar albe, re fringente,
strlucitoare. ( Fig XV.1 )

Fig XV.2 Aspectul treponemelor la examenul microscopic n cmp ntunecat


(K.Tomae)
Avantaje:
Sunt primele care dau rezultate pozitive, inainte de pozitivarea testelor
serologice
se obtin rezultate in timp scurt.
Dezavantaje
microscopia in camp intunecat necesita examinarea imediata si un
medic cu experienta in microscopie.
Imunofluorescenta necesita reactivi relativi scumpi, microscop cu
lampa UV si medic cu experienta in microscopia pentru IF

Rezultate fals negative se pot obtine daca pacientul a inceput


tratamentul cu antibiotice pe cale generala
Diagnosticul serologic
este indicat in sifilisul secundar, metodele serologice fiind unicele
metode de diagnostic de laborator in sifilisul latent si tertiar
exista doua tipuri de teste serologice:
a. care folosesc antigenul cardiolipina ( non-treponemice) : VDRL,
RPR-carbon
b. Care folosesc antigene treponemice specifice: TPHA, FTA-abs.
( fluorescent treponemal antibody absorption), imunoenzimatic ELISA, si teste
rapide imunocromatografice, TPPA ( Treponema pallidum particle agglutination)
Teste non-treponemice
teste de screening
rapide si simple din punct de vedere tehnic
VDRL este util pentru LCR
Utile ce indicator de reinfectie
Pot fi efectuate cantitativ, urmarind scaderea titrului ca urmare a unui
tratament adecvat
Dezavantaje:
apar la 1-4 saptamani dupa aparitia sancrului
dau rezultate fals pozitive in boli virale, parazitare ( malarie), lepra,
autoimune ( LES, tiroidita), sarcina, hepatite cronice, neoplasme in stadiu avansat
rezultate fals negative in pana la 40% din cazuri in sifilisul primar si
25% din cazuri in sifilisul secundar
Teste treponemice
Testele care utilizeaz antigene extrase de la treponemele patogene
sunt teste specifice. Acestea sunt folosite ca teste de confirmare, ori de cate ori
VDRL sau RPR sunt pozitive
TPHA si FTA-abs sunt foarte sensibile si reprezinta testele de electie
Dezavantaje:
Reactii incrucisate cu treponematozele non-veneriene ( pinta, pianul ),
boli tropicale
Nu pot fi folosite in testarea LCR
Nu pot fi folosite in monitorizarea raspunsului la tratament sau
aprecierea reinfectiei
PCR ( reactia de amplificare a genomului) este disponibila in anumite centre
specializare.

In sifilisul congenital
La nou nascutii cu sifilis congenital sau suspiciune de sifilis congenital, se
recolteaza LCR inainte de inceperea tratamentului. Pot exista semnele clinice
( malformatii congenitale, hepatomegalie, splenomegalie).
La mam se efectueaza teste serologice : VDRL sau RPR si TPHA sau FTAabs.
La copil se efectueaz
- testele serologice : VDRL sau RPR si TPHA sau FTA-abs.
- Examenul LCR pentru prezenta treponemelor si a anticorpilor ( VDRL sau
RPR).
RPR carbon
Principiu
RPR ( rapid plasma reagin) este o reacie de aglutinare ntre antigenele
reprezentate cardiolipina adsorbit pe suprafaa unor particule de carbon i
anticorpii anticardiolopinici reaginele din serul bolnavilor de sifilis.
Tehnica testului calitativ
Sngele se recolteaz, pe nemncate, prin puncie venoas, n vacuum fr
anticoagulant. Se separ serul care trebuie s fie limpede, serurile lipemice sau
hemolizate nefiind adecvate. Serurile se pot pstra prin congelare la minus 20O C.
Se folosesc plcue de carton plastifiat, de unic utilizare, ce au imprimate
cercuri cu diametrul de 18 mm.
Se utilizeaz obligatoriu un ser control pozitiv i un ser control negativ.
n momentul efecturii testului serurile i reactivii trebuie s fie la
temperatura camerei.
n fiecare cercule se pipeteaz, cu vrfuri separate sau cu pipetele de
unic utilizare din trus, cte 50 l ser n fiecare cercule : ser control pozitiv, ser
control negativ i serurile de cercetat. Se disperseaz fiecare ser pe ntreaga
suprafa a cerculeului.
Suspensia antigenic se omogenizeaz prin agitarea 10-15 secunde a
sticluei-dispenser. Cu sticlua n poziie vertical se depune cte o pictur de
antigen n fiecare cercule, peste ser.
Se agit prin micri rotative, cu rotatorul automat la 100 rpm sau
manual, timp de 8 minute. ( Fig. XV.3.)

Fig.XV.3. Executarea reaciei RPR- carbon

Citirea rezultatelor se face strict dup oprirea rotaiei.


Rezultat pozitiv: aglutinare prezent, n orice grad. Minim, moderat,
sau marcat, intens. Serul se clarific i se observ grunjii de culoare neagr.
Rezultat negativ: lipsa aglutinrii, cu prezenei undei de antigen. ( Fig.
XV.4.)

++++

+++

++

Negativ

Fig. XV.4.: Modelul de interpretare a reaciei RPR- carbon


Toate serurile pozitive trebuiesc testate printr-o metod alternativ.

Testul cantitativ
Pentru fiecare ser de testat se folosete un ir de 5 cerculee.
Se pregtesc serurile de cercetat n diluii binare: 1.2, 1:4, 1.8, 1:16.
Se pipeteaz cte 50l ser nediluat i serurile dilute n cte un cercule. n
continuare se procedeaz similar cu testul calitativ.
Citirea i interpretarea: Ultima diluie de ser la cere se mai observ
aglutinare d titrul reaciei. De exemplu Reacie pozitiv, diluia 1.4
TPHA (Treponema pallidum haemagglutination)
TPHA este o reacie de hemaglutinare pasiv (indirect) folosit pentru
depistarea anticorpilor ndreptai mpotriva antigenelor specifice ale
treponemelor patogene.
Principiu:
Hematii aviare pe suprafaa crora au fost adsorbite antigene de
Treponema pallidum ( sua Nichols) sunt suspendate ntr-un diluent care
mpiedic aglutinarea nespecific.
Hematiile astfel sensibilizate, puse n contact cu serul unui pacient ce
posed anticorpii corespunztori, vor aglutina. Reacia poate fi efectuat
calitativ sau cantitativ.
Tehnica testului calitativ ( exemplu)
Pentru fiecare ser de testat se folosete un ir de 4 godeuri.
Se utilizeaz obligatoriu un ser control pozitiv i un ser control negativ.
1.Pentru fiecare ser se pipeteaz diluent: 25l n godeurile 1,3 i 4 i
100l n godeul 2.
2. Se adaug 25l ser n godeul 1, se amestec i se transfer 25l n
godeul 2; se amestec i se transfer cte 25l n godeurile 3 i 4. Se amestec
i
se arunc 25l din godeurile
3 i 4. Se realizeaz astfel diluii de ser de 1:20
3. Se adaug 75 l suspensie hematii de control ( nesensibilizate ) n
godeul 3 i 75 l suspensie hematii sensibilizate ( hematii test) n godeul 4.
4. Se amestec prin lovire uoar sau prin folosire unui agitator mecanic
30 sec.

5. Se acoper placa i se incubeaz la temperatura camerei timp de 1 h,


nemicat.
6. Se citete reacia.
Tehnica testului cantitativ
Pentru fiecare ser de testat se folosete un ir de 8 godeuri.
Se realizeaz diluii binare de ser, ultima fiind de 1:80
Citirea rezultatelor: ( Fig. 4 )

Fig.XV.5. TPHA aspectul martorilor i schema de interpretare a


rezultatelor
( dup K.Tomae)
- : buton de hematii
+/- : buton de hematii cu centrul gol

1+ : pelicul nconjurat de un inel gros de hematii


2+ : pelicul nconjurat de un inel subire de hematii
3+ : pelicul omogen ce acoper parial fundul godeului
4+ : pelicul omogen de celule, ce acoper tot fundul godeului
Interpretare:
Rezultatul pozitiv ( 1-4+) , indic prezena anticorpilor specifici
antitreponemici, semnificnd o infecie actual sau n antecedente.
Rezultatul negativ indic absena anticorpilor , semnificaia fiind, n
funcie de rezultatul VDRL, fie absena infeciei, fie o infecie foarte recent.
Rezultatele +/- sunt considerate fie ca negative, fie rezultate la limit,
corespunztoare unui stadiu precoce sau ca anticorpi reziduali n sifilisul tratat .
Este indicat s se repete testarea .
Erorile pot fi date de : reactivi necorespunztori, seruri hemolizate,
rezultate necorespunztoare la martorii pozitivi i negativi, erori de tehnic.
LEPTOSPIRA
Genul Leptospira cuprinde bacilli subiri (6 - 12 mm lungime i 0,1
mm diametru), spiralai, cu una sau ambele extremiti flectate n form de crlig.
Nu se coloreaz n coloraia Gram, ci doar prin metode speciale ( cu fluorocromi,
prin impregnare argentic), similar cu treponemele. Sunt bacterii aerobe.

A.
B.
Fig.XV.6. Leptospira: A. Imagine de microscopie electronic, B. impregnare
argentic
(Dup Dr. P. PEROLAT Institut Pasteur Paris)

Leptospira interrogans, cu serotipurile L.icterohemoragiae, L. canicola, L,pomona


i L.autumnalis este patogen pentru om i animale, iar Leptospira biflexa este
specie saprofit.
Leptospiroza este o antropozoonoz, omul infectndu-se fie direct prin contactul cu
animale bolnave (
roztoare, cini, bovine) sau
purttoare, fie indirect prin intermediul apelor dulci sau solului contaminat cu urin
de la aceste animale.
La om, infecia poate evolua sub mai multe forme clinice:
Forma benign, anicteric, pseudogripal, n 80% din cazuri
Boala Weil, sau forma ictero-hemoragic, cu tablou septicemic iniial urmat
de icter
( afectare hepatic), hemoragii difuze i insufucien renal.
Forma pulmonar
Forma cardiac
Forma neurologic
Diagnosticul de laborator n leptospiroz pote fi fcut prin urmtoarele metode:
a. Identificarea leptospirelor n fluide biologice: urin, snge, LCR. Urina
este cea mai recomandat leptospirele fiind prezente dup prima sptmn pe toat
durata bolii. n snge sunt prezebte doar n prima sptmn, iar n LCR n prima i
a doua sptmn.
Examenul microscopic n cmp ntunecat este puin sensibil i poate da rezultate
fals pozitive.
Flurescena direct este mai sensibil i mai specific, dar nu reprezint o metod
de rutin pentru majoritatea laboratoarelor.
Cultura este metoda cea mai recomandat, leptospirele putnd fi izolate in vitro pe
medii speciale: Tween 80 cu albumin, Fletcher, etc. Leptospirele sunt
microorganisme cu cretere lent culturile fiind incubate la 28-30 0 C timp de 6
sptmni.
b. diagnosticul serologic pune n eviden anticorpii anti-leptospira prin
reacia de aglutinare MAT ( microscopic agglutination test) sau ELISA. Reaciile
serologice se pozitiveaz dup 8-12 zile . Un titru al anticorpilor de cel puin 1:800
la prima determinare sau creterea n dinamic de 4X a titrului n convalescen
fa de prima determinare sunt sugestive pentru diagnostic.
c. Diagnosticul poate fi fcut i prin metode de biologie molecular - PCR dar de
asemenea nu reprezint o metod curent pentru majoritatea laboratoarelor.
.

Capitolul XVI

DIAGNOSTICUL INFECIILOR PRODUSE DE CHLAMYDIA I


MYCOPLASMA
Genul Chlamydia
Genul Chlamydia cuprinde bacterii Gram-negative cu parazitism intracelular
obligatoriu i care au un ciclu de multiplicare unic ntre microorganisme.
Chlamydiile se multiplic n citoplasma celulelor gazd, producnd incluziuni
caracteristice , vizibile la microscopul optic.

Fig. XVI.1. Celule epiteliale cu incluziuni specifice C.trachomatis (dup Atlas


Ronald M)
Speciile importante pentru om sunt: Chlamydia trachomatis i Chlamydia
pneumoniae. Chlamydia psitacii este o specie patogen pentru psri i animale.
C. trachomatis
Patogenitate
1.
C. trachomatis, serotipurile A - C, determin trachoma,
keratoconjunctivit cronic, contagioas endemic n Asia i Africa Complicatia
redutabil este pierderea total a vederii.
2.
C. trachomatis, serotipurile D - K, sunt responsabile de infecii cu
transmitere pe cale sexual, n special la tineri. n 20% - 40% din cazuri, infecia
coexist cu gonorea.
Chlamydia determin la femei cervicit, uretrit sau rectit iar la brbai uretrit sau
rectit. Perioada de incubaie este de 1-3 sptmni. Infeciile urogenitale sunt de
multe ori asimptomatice (50%dintre brbai- 70% dintre femei).
La adulii activi sexual, aceste serotipuri de C. Trachomatis pot determina
conjunctivita acut cu incluziuni ( secreie mucopurulent, keratit) , bacteria find
transmis prin autoinoculare sau dup contacte sexuale orale.
La gravidele cu infecie genital cu Chlamydia trachomatis, este
posibil transmiterea vertical ( de la mam la ft ) n timpul expulziei, n 50-70%

din cazuri. Nou nscutul poate dezvolta conjunctivit, cel mai frecvent, cu secreie
purulent, la 5-12 zile dup natere. Ca urmare a colonizrii faringelui, poate
dezvolta o pneumonie tardiv, n 10% din cazuri.
C. Trachomatis serotipurile L1, L2, i L3, determin limfogranulomatoza
venerian (LGV) sau boala Nicolas - Favre, boal sistemic cu punct de plecare
genital ce se ntlnete n zonele tropicale din Africa, Asia, America se Sud.
Diagnosticul de laborator
Produsele patologice sunt recoltate de la nivelul mucoasei conjunctivale,
cervicale sau uretrale, cu tampoane sterile, prin raclare uoar care s permit
antrenare de celule epiteliale (deoarece Chlamydia este un microorganism
intracelular, probele trebuie s fie bogate n celule epiteliale din zona infectat). Tot
n infeciile genitale se mai pot recolta: urin, sperm, secreii purulente. Pentru C.
Pneumoniae pot fi secreii faringian, nazal, sput , iar n suspiciunea de LGV:
aspirat ganglionar, puroi .
Examenul microscopic
Frotiurile efectuate din produsul patologic pot fi colorate prin metode
speciale: metoda cu lugol, coloraia Machiavello, coloraia Gimenez. Se urmrete
prezena leucocitelor, semn al inflamaiei i a celulelor epiteliale . Incluziunile se
evideniaz ca aglomerri intracitoplasmatice de material , colorat diastinct de
restul celulei (rou n coloraiile Gimenez i Machiavello, brun n coloraia cu
lugol)
Imunofluorescena direct sau indirect pune n eviden incluziunile
intracitoplasmatice i corpusculii elementari. Sensibilitatea metodei este de pn la
80%, iar specificitatea de 99%. Necesit reactivi relativi scumpi, microscop cu
lamp UV i personal specializat n examinarea pentru IF. Este ns o metod de
diagnostic de elecie.
Cultivarea nu este o metod de rutin. Chlamydiile cresc dificil, numai pe
medii celulare ( HeLa, McCoy, Hep-2). Metoda este scump, laborioas, i se obin
multe rezultate fals negative ( sensibilitatea metodei este preciat la 50%-90% de
diferii autori)
Diagnosticul imunologic
Detectarea antigenelor de Chlamydia n produsele patologice se poate face
prin mai multe metode : teste rapide imunocromatografice, (fig.2), ELISA, PCR.
Produsele patologice sunt recoltate cu tampoane sterile, prin raclare uoar care s
permit antrenare de celule epiteliale, apoi se introduc n tuburi cu medii speciale.
Dup descrcarea produsului i eventual centrifugare, supernatantul este folosit
pentru detectarea antigenelor prin metodele amintite.

Fig. Fig. XVI.2. Determinarea antigenelor de Chlamydia din produs patologic


(schem)
Diagnosticul serologic
Evidenierea anticorpilor IgG anti-Chlamydia trachomatis n serul
pacienilor, prin diferite metode, dintre care cea mai utilizat n prezent este
ELISA. Sensibilitatea este de 60%, specificittatea de 99% . Esta o metod
accesibil ca pre i tehnic. Un titru de 1:64 este sugestiv pentru infecie, iar
creerea titrului n dinamic confirm aceasta.
Sensibilitatea la antibiotice
Antibiograma nu se efectueaz de regul.
Antibioticele cele mai eficiente sunt cele cu o bun penetrabilitate
intracelular: tetracicline, macrolide, fluorochinolone de generaia a doua i a treia
i rifampicine.
Chlamydia posed rezisten natural la beta-lamine i glicopepetide.
Chlamydia pneumoniae
Chlamydia pneumoniae determin infecii respiratorii: faringite, bronite,
pneumonie, sinuzite.
Diagnosticul serologic
Evidenierea anticorpilor IgG anti-C. Pneumoniae n serul pacienilor,
prin diferite metode, dintre care cea mai utilizat n este ELISA.

Aproape 50% dintre aduli au anticorpi anti- C. Pneumoniae.


Tratamentul se face cu Tetraciclin sau Eritromicin, 10-14 zile.
Genul Mycoplasma
Genul Mycoplasma face parte din clasa Mollicutes ( cu membran moale).
Organisme procariote, de dimensiuni foarte mici: 150-250 nm, au un genom mic,
dar care conine att ADN ct i ARN, o membran celular deformabil ce conine
steroli i sunt complet lipsite de perete celular.

Fig. XVI.3. Mycoplasma imagine de microscopie electronic ( K.Todar)


Speciile cele mai importante n patologia uman sunt:
Mycoplasma pneumoniae, care produce infecii respiratorii
Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium i Ureaplasma
urealyticum, care determin infecii genitale.
M. pneumoniae este aerob, n timp ce celelalte specii sunt aerobe facultativ
anaerobe. Se coloreaz greu n coloraia Gram ( Gram negative) .
Cresc in vitro pe medii de cultur acelulare, dar sunt bacterii pretenioase.
Formeaz colonii caracteristice cu aspect de ou ochiuri.
M. pneumoniae se transmite pe cale aerogen, prin picturi Pflugge,
infeciile fiind mai frecvente toamna i iarna. Majoritatea cazurilor sunt infecii ale
cilor respiratorii superioare i doar n 5-10% din cazuri infecia progreseaz spre
traheobronit sau pneumonie, de obicei autolimitate.
Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium i Ureaplasma
urealyticum se transmit pe cale sexual.
Manifestrile clinice n infeciile genitale la femei sunt:
secreie veginal anormal
simptome de boal inflamatorie pelvic
stare febril post-partum sau post-abortum
La brbai infecia se manifest ca uretrit non-gonococic:
secreie uretral

disurie ( arsur, usturime la urinat)


dureri la nivelul prostatei
frisoane, febr

Diagnosticul de laborator
Examenul microscopic nu este sugestiv, deoarece mycoplasmele sunt foarte
mici i se coloreaz greu sau nu se coloreaz n coloraia Gram
Cultivarea este puin utilizat n diagnosticul de rutin deoarece
Mycoplasmele sunt bacterii fastidioase i cresc ncet pe mediile de cultur.
Diagnosticul serologic este cel mai accesibil
testul aglutininelor la rece; reacia este nespecific i n plus, numai
50% dintre bolnavi dezvolt hemaglutinine la rece
reacia de fixare a complementului pentru anticorpi anti M.
pneumoniae. Este mai specific i o cretere de 4X a titrului anticorpilor ntre
debutul bolii i convalescen precizeaz diagnosticul
ELISA pentru IgM i IgG anti- M. Pneumoniae. Specificitatea i
sensibilitatea sint de 98-99%. Este testul cel mai indicat n prezent.
Alte metode mai rar folosite sunt: Imunofluorescena direct, ELISA pentru
depistarea antigenelor n sput, RIA, i recent PCR.
n infeciile genitale, Mycoplasmele sunt depistate mai ales prin culturi ale
secreiilor uretral sau vaginal i prin teste imunologice.
Cultivarea se face pe medii speciale: bulion cu extracte de cord bovin i ser
de cal, urmat de trecere pe geloz mbogit cu aceleai elemente. Ureaplasma
crete de obicei n 2-3 zile, iar Mycoplasma hominis ntr-o sptmn. Mycoplasma
genitalium necesit pentru cretere 1-2 luni. Coloniile sunt foarte mici, cu centrul
dens i marginile clare, aspect caracteristc de ou ochiuri.
Diagnosticul imunologic este disponibil n prezent.
Tratament
n infeciile tractului respirator superior tratamentul cu antibiotice nu este
necesar.
n pneumonie, dei este autolimitat, se recomand antibioterapia, n scopul
reducerii duratei bolii i scderii riscului pentru contacii cu bolnavul.
- Antibioticele de elecie sunt macrolidele, tetraciclinele, fluorochinolone
numai la adulii cu pneumonie din comuniti; sunt contraindicate la copii i
gravide.
n infeciile genitale Tetraciclina i Doxiciclina sunt antibiotice de elecie,
ele avnd o bun aciune i pe Chlamydia trachomatis. La gravide se recomand

Capitolul XVII
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR GENITALE
Flora normal a tractului genital feminine
Flora vulvar prezint o flor asemntoare cu a regiunii perineale.
Cantitativ i calitativ este n strns legtur cu igiena local a fiecrei persoane.
Flora vaginal este mai specific i influenat de statusul hormonal i de
activitatea sexual.
- n copilrie, pn la instalarea ciclului menstrual i n post-menopauz , n vagin
sunt prezente numeroase specii de bacterii aerobe i anaerobe.
- n perioada de activitate a funciei ovariene, sub influena estrogenilor, are loc o
modificare radical a florei normale vaginale. Depozitele abundente de glicogen
din celulele epiteliale ale mucoasei vaginale favorizeaz dezvoltarea genului
Lactobacillus (fig. XVII.1), ce utilizeaz acest substrat nutritive i produc acid
lactic, cu scderea pH vaginal . PH de 3,8-4,5 este nefavorabil altor specii
bacteriene, saprofite sau patogene. Levurile (Candida) pot supravieui, n numr
limitat n aceste condiii.
Colul uterin, n zona exocolului are o flor asemntoare florei vaginale, dar
n zona de tranziie flora se reduce numeric. Mucusul cervical, prin substanele
antimicrobiene pe care le conine: lizozim, lactoferin i imunoglobuline, are un rol
de barier mpotriva ptrunderii microorganismelor .
Uterul i trompele uterine sunt sterile.
Infecii ale regiunii vulvare se manifest de obicei prin: prurit , senzatie de arsura
sau iritatie;
Infecii specifice.
Sifilisul primar: leziunea specific ancrul dur : ulceraie cu margini bine
delimitate, baza indurat, prezentnd o serozitate clar. Leziunea este nedureroas,
nepruriginoas i se nsoete de obicei de adenopatie inghinal . n sifilisul
secundar, pe mucoasa vulvar pot apare leziuni papuloase: condiloame.
Diagnosticul se face prin examen microscopic n cmp ntunecat al unui preparat
proaspt ntre lam i lamel efectuat din serozitatea din ancru. Se indic i testele
serologice ( VDRL, TPHA), care pot fi negative dac boala se afl la debut, dar se
recomand repetarea acestora dup 2 spt., o lun.
Candidoza vulvar nsoete de obicei candidoza vaginal ( vulvovaginita
candidozic). Doagnosticul de laborator se bazeaz pe
- examenul microscopic al frotiurilor efectuate din secreie i
- culturi pe mediul Sabouraud cu Cloramfenicol
Infecia cu Trichomonas vaginalis nsoete infecia vaginal. Diagnosticul
se face prin

examen microscopic al unui preparat proaspt ntre lam i lamel


din secreia vaginal i
examinarea frotiurilor colorate A.M. i Gram din secreie.

Vulvita herpetic determinat de Herpes simplex tip 2, caracterizat prin


prezena unor vezicule aglomerate pe o zon eritematoas, nsoite de durere, arsur
sau prurit, evolueaz apoi spre ulceraie i crustificare.
Condilomatoza venerian ( condiloma acuminata), determinat de HPV tip
6 i 11, caracterizat prin leziuni maculo-papuloasede mrime i form variate.
Moluscum contagiosum determinat de Poxvirus se caracterizeaz prin
leziuni papuloase.
Infeciile nespecifice pot avea diferite etiologii ( streptococie, stafilococice,
etc.), iar zona cutanat a vulvei poate fi sediul unor infecii tip piodermite:
foliculite, furuncule.
Diagnosticul este bacteriologic i se face prin cultivarea probelor recoltate de
la nivelul zonei afectate.
Bartolinitele infecii localizate la nivelul glandelor Bartholin- pot fi determinate
de Neisseria gonorhoeae, C. Trachomatis, Uraplasma urealyticum sau de flor
nespecific aerob sau i anaerob, n special abcesele glandelor Bartholin.
Diagnosticul bacteriologic se bazeaz pe culturi aerobe i anaerobe efectuate din
puroiul eliminat spontan sau dup incizie glandei abcedate, recoltat cu tampon
steril. Cu tampon separat se recolteaz pentru frotiu.
Vaginita inflamaie acut sau cronic a mucoasei vaginale. Se nsoete de multe
ori de afectarea mucoasei vulvare ( vulvo-vaginit) Orice modificare a secretiei
vaginale normale poate sugera diagnosticul de vaginita. De obicei secretia devine
abundenta, isi modifica culoarea (poate fi galbena, verzuie, sau alba pastoasa),
consistenta (vascoasa, sau apoasa) si capt un miros neplacut.
Se asociaz dispareunia (durere la contactul sexual) si uneori disurie, polakiurie
Cele mai frecvente sunt: vaginitele nespecifice numite i vaginoze
bacteriene, vaginitele cu Trichomonas vaginalis i cu Candida Albicans
Vaginozele bacteriene reprezint jumtate din totalul vaginitelor. Sunt
produse de diferite bacterii aerobe: Gardnerella vaginalis ( cocobacil Gramvariabil); streptococi de grup A, B; Staphylococcus aureus; bacili Gram-negativi:
Escherichia coli, Klebsiella; anaerobe (Bacteroides, Prevotella, Mobiluncus,
Peptostreptococcus) i Mycoplasma hominis.
Majoritatea femeilor cu vaginoze bacteriene sunt active sexual, raporturile
sexuale i introducerea diferitelor obiecte n vagin reprezentnd factori de risc n
apariia VB. Condiia major este reprezentat ns de modificarea florei normale
vaginale, dispariia lactobalililor i ruperea echilibrului florei endogene.

Vaginozele bacteriene sunt frecvente la gravide i tratarea acestora contribuie


la reducerea riscului unei nateri premature.
n aproximativ 50% din cazuri vaginozele bacteriene sunt asimptomatice. n
celelalte cazuri, secreia vaginal este abundent, omogen, gri-albicioas sau
glbuie, urt mirositoare , aderent la mucoasa vaginal i nsoit de prurit. Iritaia
mucoasei vulvare este de obicei absent.
Se pot complica cu boal inflamatorie pelvic.
Pentru diagnostic, se recolteaz cu valva i cu un tampon steril secreie
vaginal pentru efectuarea de frotiuri. Pe frotiuri se observ leucocite n numr
moderat sau mare i celule epiteliale vaginale cu conturul marcat de bacterii aderate
la suprafaa lor clue cells. ( peste 20% din celulele epiteliale prezente pe frotiu).
Cu alt tampon steril se recolteaz secreie pentru culturi aerobe i anaerobe.
PH-ul vaginal este mai mare de 4,5.
Tratarea secreiei cu soluie KOH 10% determin degajarea unui miros
pronunat de pete.
Tratamentul antibiotic se face de obicei cu metronidazol i clindamicin, pe
cale general sau n preparate topice. Acestea din urm pot avea ns efecte
decundare: iritaie, senzaie de arsur, stinging
Vaginita cu Trichomonas vaginalis este simptomatic n majoritatea
cazurilor.
Mucoasa vulvar i vaginal apar roii, edemaiate. Secreia vaginal este
abundent, cu aspect omogen, galben-verzui sau gri, aerat, cu miros neplcut. Se
pot observa puncte hemoragice i ulceraii la nivelul mucoasei vaginale i
exocervicale.
Diagnosticul de laborator : pH vaginal este peste 5, iar din secreia vaginal
recoltat cu valva sau cu tamponul se efectueaz preparat proaspt ntre lam i
lamel, n ser fiziologic la 370 C i frotiuri colorate A.M. i Gram. Preparatul
proaspt este deosebit de important deoarece se observ paraziii vii, mobili. Pe
frotiuri se observ un numr mare de leucocite , parazitul T. vaginalis i se
urmrete prezena eventual a altor microorganisme cu transmitere sexual. Dei
localizarea cea mai frecvent a parazitului este mucoasa vaginal, el poate afecta i
endocolul, uretra, glandele Bartholin i Skene.
Vulvovaginita candidozic Speciile de candida: C albicans, C tropicalis,
and C glabrata, care populeaz n mod normal vaginul n numr mic, se multiplic
excesiv n anumite condiii ( antibioterapie general, diabet, sarcin,
imunospupresoare), dar infecia candidozic poate fi transmis i pe cale sexual.
Candidoza vaginal se manifest prin prurit intens (simptomul cel mai
frecvent), arsur, chiar durere. Mucoasa este roie, edemaiat, i se acoper cu o

secreie albibicioas, pstoas sau granuloas. Pot fi prezente eroziuni sau papule.
Leucorea este uneori abundent, alb-glbuie, vscoas.
Diagnosticul de laborator: pH vaginal acid, din secreia vaginal se
efectueaz frotiuri colorate A.M. sau Gram .
Cu tamponul steril se recolteaz secreie pentru cultura pe mediul Sabouraud
cu cloramfenicol.
Cervicitele
La nivelul exocolului uterin, epiteliul pavimentos este asmntor celui
vaginal, iar infecia cu Trichomonas vaginalis i Candida poate evolua i la acest
nivel. De asemenea, ancrul dur se poate localiza la nivelul exocolului. HPV
determin infecii la acest nivel la 1% dintre femei.
La nivelul endocolului, unde epiteliul mucoasei este cilindric , se localizeaz
infecii cu Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis serotipurile D-K, Herpex
simplex tip 2 .
Secreia endocervical normal este clar, uor mucoid, mai vscoas n
perioada progesteronic a ciclului luteal. n cervicite secreia devine mai
abundent, muco-purulent. Dup ndeprtarea secreiilor stagnante la nivelul
exocolului, se recolteaz din endocol, prin introducerea pe o distan de 1-2 cm, a
dou tampoane: unul pentru efectuarea de frotiuri i unul pentru cultur. Pentru
testele imunologice (de ex. ELISA pt antigene C.trachomatis, HSV ) se recolteaz
tampoane separate ce vor fi introduse n tuburi cu medii speciale.
Pe frotiurile colorate Gram i Giemsa sau o coloraie special pentru
Chlamydia ( Gimenez) se urmrete prezena reaciei inflamatorii i a gonococilor ,
a levurilor sau a incluziunilor intraepiteliale specifice C.trachomatis.
Endometritele acute survin de obicei post-abortum sau post-partum i se manifest
prin febr, dureri hipogastrice, scurgeri vaginale purulente sau lohii cu aspect
purulent. Bacteriile ce determin endometrite sunt aerobe i anaerobe, cel mai
frecvent izolate fiind de origine endogen, vaginal: Streptococul de grup B, D, A
sau alte grupe, enterobacteriacee, Gardnerella vaginalis, anaerobi: Streptococi
anaerobi, Bacteroides fragillis, Clostridium perfringens, sau Mycoplasma hominis .
Culturile se fac ntotdeauna aerobe i anaerobe. n caz de satre febril
prelungit se recolteaz i hemoculturi, deoarece bacteriemia este o complicaie
destul de frecvent a endometritelor .

Fig. XVII.1: Celul epitelial vaginal superficial i lactobacili


(www.medlineplus.gov)

Fig. XVII.2.Aspect de vaginoz bacterian: clue-cells, leucocite, flor


polimorf (www.medlineplus.gov)

Fig. XVII.3. Aspect de vaginit cu Trichomonas vaginalis ( indicat de


sgeat) (www.medlineplus.gov)

Capitolul XVIII
DIAGNOSTICUL INFECIILOR PRODUSE DE LEVURI
(CANDIDA)
Ciupercile levuriforme sunt un grup heterogen de ciuperci, formate dintro singur celul ( celula levuric), eucariot, de form sferic, ovalar, sau, mai
rar , neregulat.
Ele se nmulesc n general prin nmugurire ( formarea de blastoconidii sau
muguri), form de reproducere asexuat i se mai numesc fungi imperfecti.
Sporii asexuai ai levurilor sunt blastospori ( blastoconidii) celule sferice sau
ovalare izolate, formate prin nmugurirea levurilor i care se separ de celula
mam.
Unele levuri dezvolt pseudo-filamente ( pseudohiphae): lanuri de celule
levurice alungite, rezultate din formarea blastoconidiilor din unul n altul, n
linie, fr separarea complet a celulelor. ntre celule nu exist ns legturi
stabile spre deosebire de fungii filamentoi, ai cror micelii sunt ramificaii ce
constituie o unitate fiziologic.
Alte levuri pot dezolta filamente adevrate ( hiphae) : fig.1 : Candida ciuperc dimorfic: celule levurice (C) i forme filamentoase (D)

Fig. XVIII. 1 : Candida - ciuperc dimorfic: celule levurice (C) i forme


filamentoase (D) ( www.mycologyadelaide.edu.au)
Genul Candida ( specia tip: C. Albicans)
Genul aparine familiei Cryptococaceae, din Deuteromycete ( fungi imperfecti)
Gen heterogen, caracterizat prin celule globuloase, ovalare sau elongate sau
blastospori ( blastoconidii) care se reproduc prin nmugurire lateral.
Majoritatea speciilor formeaz pseudohiphae.
Deoarece Candida spp. poate fi prezent n probele biologice ca rezultat al
contaminrii din mediu, multiplicrii din produsul respectiv ( dac este pstrat

prea mult timp) sau unei infecii reale, recoltarea i manipularea corect a
probelor este esenial n obinerea unui diagnostic de laborator corect. De
exemplu, cteva celule de Candida prezente ntr-o sput lsat la temperatura
camerei se pot nmuli rapid, dnd impresia unei infecii candidozice.
Levurile se coloreaz n albastru nchis, fiind foarte evidente n coloraia A.M.,
i n violet intens n coloraia Gram. Candida prezint celulele levurice de 3-4
m, de obicei prezentnd nmugurire unic. Pseudohifele au 5-10 m, au
capetele subiate i rmn ataate. Hifele adevrate dac sunt prezente au perei
paraleli i sunt septate. Dac pe frotiurile din produsele patologice se observ
sub form de pseudohife sau cuiburi de blastoconidii, este o indicaie a faptului
c modul lor de via nu mai este saprofit ci parazit .

Fig XVIII 2: Candida: aspecte morfologice a = albicans, t=tropicalis, k=krusei,


l=lusitaniae, g=glabrata, p=parapsilosis; chl=chlamydospor
(dupa Campbell et al.)
Culturile pentru ciuperci se fac pe medii speciale, cum ar fi Sabouraud
(Sabouraud dextrose agar), pentru produsele normal sterile sau Sabouraud cu
cloramfenicol (Sabouraud cu cloramfenicol i cicloheximid) , Sabouraud cu
CCG i NaCl (Sabouraud cu cloramfenicol, gentamicin i cicloheximid), sau
OGY- agar pentru produsele plurimicrobiene. Incubarea se face la 28-30O C
timp de 5-10 zile.
Coloniile sunt albe, cremoase, mari i se dezvolt la 28-30O C dup
48-72h ( maxim 5 zile). ( fig. 3 )

Fig. XVIII .3 : Colonii de candida albicans pe mediul OGY-agar


n candidozele cutanate diagnosticul se pune pe
examenul microscopic al scuamelor, prin efectuarea unui preparat
umed, n glicerin neutr sau n lichid de disociere KOH 30% (se observ celule
levurice, celule levurice nmugurite i pseudofilamente)
cultivarea pe mediu Sabouraud sau alte medii speciale pentru fungi.
Candidozele genitourinare
-Examenul microscopic al sedimentului urinar evideniaz leucocite,
eventual hematii, celule levurice nmugurite, cuiburi de blastoconidii
i
pseudofilamente.
-Urocultura pe mediu Sabouraud.
- pH vaginal este acid; din secreia vaginal se efectueaz frotiuri colorate
albastru de metilen sau Gram. Pe frotiu se evideniaz celule epiteliale vaginale,
leucocite, celule levurice, celule levurice nmugurite i pseudofilamente
- Cu tamponul steril se recolteaz secreie vaginal pentru cultura pe mediul
Sabouraud .

Candidoze ale tractului respirator


Examenul microscopic al sputei pe frotiurilor din colorate albastru de
metilen sau Gram pun n eviden leucocite, celule levurice, celule levurice
nmugurite i pseudofilamente .
Culturile din sput pe medii speciale: Sabouraud, OGY-agar etc.
Endoscopia cu sau fr biopsie este util pentru a deosebi infecia de
colonizare.
Identificarea de specie
a. Caractere morfologice: specii ale genului Candida pot fi identificate pe
baza caracterelor morfologice , testul de germinare: filamentele sunt produse din
celulele levurice dup 2-3 h de la incubare. ( Figura 2)
b. Teste biochimice:
CHROMagar Candida permite identificarea prezumptive a unor specii
de Candida folosind reacii de culoare n medii specializate.
o
API20C i API 32C sunt galerii miniaturizate i automatizate de reacii
biochimice ( asimilarea unor substrate ) ce determin profile biochimice pe baza
crora se pot identifica mai multe specii de levuri.
o

Antifungigrama
Testarea sensibilitii la antifungice (antifungigrama) poate fi efectuat prin
metoda difuziei,
E-test sau
metoda diluiilor ( microdiluiilor).
Metoda difuzimetric, conform NCCLS, folosete ca mediu de cultur
geloza RPMI, inoculul standard de 0.5 Mc Farland i discuri cu substane
antifungice ( Amfotericina B 10g, Ketoconazol 15 g , Itraconazol 8 g,
Fluconazol 25 g, Voriconazol 1.0 g, 5-Fluorocitozin 1 i 10 g.
E-test folosete benzi impregnate cu substane antifungice n concentraii
descresctoare, putndu-se determina i CMI. Mediul de cultur indicat este geloza
RPMI cu glucoz. ( fig.4 )
Metoda diluiilor este folosit pentru determinarea CMI, iar mediul folosit
este bulionul RPMI . Exist truse comerciale pentru antifungigrame prin metoda
microdiluiilor ( fig.5)

Fig. XVII.4.Celule levurice nmugurite ( aspect indicat de sgeat)

Fig. XVIII 5 Determinarea sensibilitaii la Fluconazol prin E-test i prin metoda


difuziei

Fig. XVIII 6

Antifungigrama prin metoda microdiluiilor (Fungitest)

Capitolul XIX
DIAGNOSTICUL INFECIEI CU TRICHOMONAS VAGINALIS
Parazitul Trichomonas vaginalis este un protozoar urogenital, mobil, care
exist numai sub forma vegetativ, neavnd forme de rezisten.
T. vaginalis este piriform, cu lungimea de 18-26 m, uneori putnd ajunge la
30 m. Nucleul este mare i poziionat anterior. Citoplasma este granular. Posed
patru flageli anteriori liberi i un flagel recurent ce se gsete pe marginea unei
membrane ondulante. n zona median prezint un axostil puternic, ce menine
forma celulei. ( fig. Fig.XIX.1.)

Fig.XIX.1. Schema structurii parazitului Trichomonas vaginalis


Transmiterea este direct, prin contact sexual n majoritatea cazurilor. Rar,
infecia poate fi transmis prin intermediul obiectelor de toalet sau lenjeriei
murdare cu secreii genitale infectate, sau de la mam la nou-nscut n timpul
travaliului.
La femei determin vaginit i uretrit, infecia fiind simptomatic n
majoritatea cazurilor. Pot fi afectate i endocolul, uretra, glandele Bartholin i
Skene.
La brbai produce uretrit i prostatit, n general asimptomatice .
La femei secreia vaginal este abundent, cu aspect omogen, galben-verzui
sau gri, aerat, cu miros neplcut. Se pot observa puncte hemoragice i ulceraii la
nivelul mucoasei vaginale i exocervicale.

Diagnosticul de laborator :
1. Metoda de diagnostic de elecie este examenul microscopic al unui
preparat proaspt ntre lam i lamel, n ser fiziologic la 37 0 C din secreia
vaginal recoltat cu valva n primele zile postmenstrual. Pe acest preparat se
observ paraziii vii, care se recunosc uor dup form, dimensiuni i micrile vii.
2. Tot din secreia vaginal recoltat cu valva sau cu tamponul se efectueaz
i frotiuri colorate albastru de metilen, Gram sau Giemsa. Pe frotiuri se observ un
numr mare de leucocite , parazitul T. vaginalis i se urmrete prezena eventual
a altor microorganisme cu transmitere sexual.

Fig.XIX.2. T.vaginalis. Coloraie Geimsa ( www.geocites.com)


3. Cnd examenul microscopic direct sau frotiul nu au fost concludente, se
pot face culturi pe mediul Loeffler, turnat nclinat n tuburi . Incubaia este de 2472h, dup care cultura se verific microscopic, ntre lam i lamel. Dac dup 72h
parazitii mobili nu se evideniaz microscopic, cultura este negativ.

Capitolul XX

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE


1. Microscopia optic: examenul citologic
Examenul citologic evideniaz efectele citopatice caracteristice produse
de unele virusuri n celulele infectate: balonizarea celulei, formarea de sinciii,
prezena de vacuole, incluziunile celulare. Incluziunile celulare: incluziuni
intranucleare Cowdry tip A, nconjurate de un halou clar i marginaia cromatinei,
datorate infeciei cu HSV ( virusul Herpes simplex), corpii Babes-Negri ( virusul
rabic), incluziuni cu aspect de ochi de bufni ( virusul citomegalic).
2. Microscopia electronic nu este o metod de rutin n diagnosticul de laborator,
dar este folosit n cercetare i evideniaz morfologia particulelor virale
3. Cultivarea virusurilor se poate face pe culturi celulare, ou de gin embrionat
i animale de laborator.
Culturile celulare pot fi:
culturi primare, obinute din esuturi animale disociate cu tripsin
sau colagenaz. Celulele sunt meninute ntr-un mediu artificial cu
ser bovin i factori de cretere, fie n mediu lichid ( limfocite), fie n
monostrat, adsorbite pe pereii eprubetelor ( fibroblati, celule
epiteliale). Exemple: celule de rinichi de maimu.
culturi secundare se obin din culturile primare, disociate cu tripsin
i transferate n alt mediu.
culturi de celule diplode sunt culturi formate din celule capabile de
a se divide i de a fi transferate de un numr mare dar finit de ori,
dup care mbtrnesc i mor. Exemplu: celule diploide fetale umane
linii celulare sunt formate din celule tumorale sau imortalizate prin
procedee chimice, i care se divid de un numr infinit de ori, fr a
prezenta semne de mbtrnire. Exemple: He-La, Hep-2.
Detectarea i identificarea unor virusuri se face, dup inocularea culturilor
celulare cu produsul patologic recoltat de la bolnav, prin apariia efectelor
citopatice.
Cuantificarea virusurilor din produs poate fi fcut prin TCD50 titrul ce
produce efecte citopatice n 50% din celulele din cultur.
3. Detectarea proteinelor virale
poate fi fcut prin electroforez,
imunohistochimie, sau detectarea antigenelor virale n produsul patologic sau
snge prin ELISA, imunofluorescen, Westtern-blot.
4. Detectarea acizilor nucleici virali poate fi fcut prin metode de biologie
molecular ca: hibridizare in situ,imunoblotting, PCR. PCR este metoda
prin care ADN sau ARN viral este recunoscut cu ajutorul primerilor specifici
( secvene complementare) i amplificat cu ajutorul enzimei polimeraza, astfel
nct produsul de amplificare este apoi uor de identificat prin electroforez n
gel sau ELISA.

5. Metode serologice. Identificarea anticorpilor antivirali n serul pacientului este


dovada rspunsului imun umoral fa de infecie. Apariia anticorpilor n ser
poart numele de seroconversie. Primii anticorpi care apar n rspunsul imun
primar sunt de clas Ig M, detectarea acestora indicnd astfel o infecie recent.
De asemenea, creterea de 4X a titrului anticorpilor de clas IgG semnific o
infecie curent.
Cele mai utilizate metode folosite n prezent sunt:
testele rapide imunohistochimice,
ELISA ( metoda imunoenzimatic)
reacia de hemaglutinare (HA) i hemaglutinoinhibare (HAI),
latex-aglutinare
imunofluorescena indirect
reacia de seroneutralizare
RIA ( radioimunoassay)

DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU HERPESVIRUSURI


Virusurile herpetice sunt foarte rspndite i pn n prezent, au fost
identificate opt specii de herpesvirusuri umane i un numr de aproximativ 100 de
specii la animale. Au un caracter comun important: stabilesc infecii latente dup
prima ptrundere n organismul gazdei.
Virusurile herpetice umane sunt grupate n 3 subfamilii:
1. Alpha herpesvirinae
Genul Herpes simplex virus
- Virus herpetic uman tip 1 ( HSV-1)
- Virus herpetic uman tip 2 ( HSV-2)
Aceste virusuri produc : primoinfecia herpetic i herpesul recidivant.
Cea mai frecvent localizare a leziunilor este cea cutanat, dar mai pot fi:
gingivo-stomatite, faringite, keratoconjunctivite, encefalite.
Herpesul genital primar. Se caracterizeaz prin eziuni foarte dureroase de
vulvo-vaginit, care pot invada i colul uterin. La brbat infecia este mai puin
sever.
La nou nscut poate determina o encefalit mortal. Este determinat n general de
HSV-2 transmis la natere de la mama infectat.
Recurena ( recidiva) este favorizat de factori care produc depresia
tranzitorie a imunitii celulare, fiind incriminai stressul, infeciile, menstruaia,
alimentaia, unele medicamente.

Reactivarea infeciei latente determin apariia erupiei herpetice, cu acelai


aspect (papul, vezicul, pustul i apoi vindecare pn la restitutio ad integrum) i
pe acelai teritoriu cutanat sau mucos ca i localizarea primar.
Genul Varicellovirus, (sau Virus herpetic uman 3)
- virusul Varicella-Zoster (VZV)
Virusul Varicela-Zoster determin ca prim infecie varicela ( vrsatul de
vnt). Infecia latent are loc n ganglionii nervoi senzitiv. Reactivarea determin
zona zoster, manifestat durere i erupie n teritoriul dermatomului
( dermatoamelor) corespunztoare.
Dup vindecarea varicelei, virusul se cantoneaz n ganglionii nervoi
senzitivi, i dup perioade relativ lungi, se reactiveaz, determinnd zona zoster.
Subfamilia alphaherpesvirinae se caracterizeaz prin: ciclu de replicare scurt,
producerea de infecii latente n ganglionii senzitivi (spinali) i producerea unor
efecte citopatice de tip litic n culturile celulare.
2. Beta herpes virinae
- Genul Citomegalovirus, specia Citomegalovirus uman
- Virus herpetic uman tip 6
- Virus herpetic uman tip 7
Subfamilia beta herpesvirinae se caracterizeaz prin ciclu de replicare lung,
efect de mrire a volumului celulelor infectatei meninerea latenei n leucocitele
circulante, din rinichi, glandele exocrine i alte esuturi.
3. Gamma herpesvirinae cu genurile:
- Lymphocryptovirus cu specia Virus Epstein-Barr
- Virus herpetic uman tip 8, cunoscut i ca herpesvirus asociat
sarcomului Kaposi
Virusurile din subfamilia gamma herpesvirinae sunt specifice pentru limfocitele
B i T i dau infecii latente n esutul limfoid.
Mononucleoza infecioas este o boal acut specific uman. Se transmite
prin contactul cu saliva unei persoane infectate ( se mai numete i boala
srutului).
Manifestrile clinice cele mai importante sunt: adenopatii, splenomegalie i
modificri hematologice.

Metode de diagnostic de laborator n infeciile cu virusurile herpetice


1. Microscopia electronic. Virusul poate fi vizualizat direct n lichidul din
vezicule , recoltat de la nivelul leziunilor ( HSV, VZV)

Fig. XX.1. Virusul Varicella-Zoster V.herpetic tip 3) dupa F. Fenner


2. Examenul histopatologic evideniaz celule multinucleate gigante, sinciii,
incluziuni celulare Cowdry tip A.
3. Imunofluorescena. Preparate microscopice realizate din celulele infectate
( recoltate din leziuni sau culturi celulare) sunt tratate cu anticorpi
monoclonali cuplai cu fluorocromi. ( HSV, VZV, CMV)
4. Culturi celulare. Produsele patologice sunt lichidul din vezicule i celule
obinute prin raclaj de la baza leziunilor. Efectele citopatice apar dup
intervale de timp diferite: 2 zile ( HSV) sau 1 sptmn ( VZV). Pentru
CMV efectele citopatice apar tardiv, dup 3 sptmni sau nu apar deloc.
5. Diagnosticul serologic.
n primoinfecia herpetic anticorpii de clas IgM arat infecia recent, iar cei
de clas IgG expunere n antecedente. Este util n infecia cu VZV, CMV, EBV i
HHV-6. Pentru HSV este important ca testele folosite s detecteze anticorpii
specifici de tip: anti glicoproteina G a HSV1 ( gG1) sau a HSV2 ( gG2). Acesti
anticorpi sunt detectabili n ser dup minim 2 sptmni maxim 3 luni de la
infecie. Pentru EBV se identific IgM i IgG anti-VCA ( capsida viral ) i antiEBNA ( nucleoproteine).
n infeciile recurente serologia nu este foarte util. IgM de obicei sunt abseni,
iar IgG trebuie s prezinte o cretere n dinamic a titrului pentru fi semnificativ.
6. Metode de biologie molecular: PCR evideniaz cu o specificitate i
sensibilitate de peste 99% att ADN viral ct i ARN-m viral. Pot fi folosite
pentru HSV, VZV, CMV, HHV-8. Detecteaz genomul latent i virionul
infecios. Prezena ARN-m semnific replicarea viral activ.

Diagnostic de laborator n mononucleoza infecioas


1. Diagnostic hematologic
Mononucleoza se caracterizeaz printr-o important reacie leucocitar,
numrul de leucocite avriind ntre 8 000 i 20 000/mm 3 , n care ponderea
monocitelor poate ajunge la 97%, caracteristice, mari, cu citoplasma i
nucleul cu aspect vacuolizat. Se asociaz scderea valorilor hemoglobinei
i a numrului de trombocite
2. Diagnostic serologic
Testele serologice reprezint metoda de elecie pentru diagnosticul
infeciei primare. La pacienii cu simptomatologie sugestiv pentru
mononucleoz i testul Paul- Bunnell pozitiv nu mai face necesar nici o
testare suplimentar.
Truse pentru reacia de hemaglutinare, RFC sau E.L.I.S.A. pun n
eviden anticorpii heterofili Paul-Bunnell.

Capitolul XXI
DIAGNOSTICUL HEPATITELOR VIRALE
Virusurile hepatitice sunt virusuri cu structuri diferite care se caracterizeaz
prin tropism pentru celula hepatic, fiind denumite: Virusul hepatitei A, B, C, D,
E, F, G, etc.
Exist i alte virusuri care afecteaz n mod secundar ficatul ( virusuri
facultativ hepatotrope): enterovirusuri, herpesvirusuri, flavivirusuri, etc.
Virusurile hepatitei A, E i F se transmit enteral
VIRUSUL HEPATITEI A ( HAV)
Clasificat ca Enterovirus tip 72, n prezent este considerat prototipul genului
heparnavirus, din familia Picornaviridae. Virus ARN, cu dimensiuni de 27-32
nm, form sferic, simetrie eicosaedric, nenvelit. Exist un singur serotip.
Transmiterea este pe cale fecal-oral.
Diagnosticul etiologic se pune de obicei prin evidenierea anticorpilor antiHAV de tip IgM, care atest infecia recent. Anticorpii anti HAV de clas igG
persist n ser ani de zile, artnd o infecie HAV n antecedente.
Virusul ca atare, sau Ag HAVpoate fi demonstrat n materiile fecale i snge
2 sptmni nainte i o sptmn dup instalarea icterului.

Fig. XXI.1. Dinamica anticorpilor n infectia cu Virusul hepatitei A

VIRUSUL HEPATITEI B ( HBV)


HBV face parte din genul hepadna virus, fiind un virus ADN, nvelit. Se
prezint la microscopul electronic sub trei forme morfologice:
- virusul complet sau particula Dane, cu form sferic i dimensiuni de 42nm,
cu o anvelop glico-lipo-proteic ce prezint la suprafa Ag HBs ( hepatitis
B surface antigen).
- Particule globulare cu diametru de 22 nm, i
- Particule filamentoase cu grosimea de 22 nm, alctuite exclusiv din Ag HBs.

Fig.XXI.2. Aspecte morfologice ale Virusului hepatitei B- imagine de microscopie


electronic ( Jawets, Melnick & Adelberg)
Nucleocapsida, dup ndeprtarea anvelopei, prezint Ag HBc ( antigenul
central, sau core antigen). Prin clivarea ( liza parial) a Ag HBc, rezult antigenul
Hbe.
Transmiterea se face pe cale parenteral, sexual i vertical, de la mam la nou
nscut.
Diagnosticul etiologic se pune prin evidenierea markerilor serologici ( antigene i
anticorpi), a cror succesiune indic i faza evolutiv a bolii.
- Ag HBs apare nc din perioada de incubaie i ar trebui s dispar la 3 - 6
luni de la infecie . Persistena Ag HBs peste 6 luni indic hepatita
cronic B
- Ag Hbe indic replicarea activ a virusului n hepatocit i are un pronostic
defavorabil
- Ag HBs nu poate fi detectat n ser.
- Anticorpii anti HBc, sunt primii anticorpi care apar. IgM anti HBc indic o
infecie recent, activ. IgG anti HBc pot persista mult vreme dup
vindecare, demonstrnd trecerea prin boal.
- Anticorpii anti Hbe apar la sfritul perioadei acute a bolii, i mpreun cu
dispariia Ag Hbe, arat evoluia favorabil, spre vindecare.
- Anticorpii anti Hbs apar tardiv, la 4-6 luni. Arat vindecarea ( simultan cu
dispariia AgHBs), persistnd toat viaa.

Fig.XXI.3. Dinamica anticorpilor n infecia cu Virusul hepatitei B

Fig.XXI.4. Dinamica anticorpilor n hepatita cronic B


VIRUSUL HEPATITEI C
VIRUS ARN din familia Flaviviridae.
Se transmite predominent parenteral i pe cale sexual.
Diagnosticul de laborator se face pe baza evidenierii n serul bolnavilor a
Ac anti HCV, cel mai utilizate fiind testele rapide imunocromatografice, metoda
ELISA i chemiluminiscena. Anticorpii IgM anti-HCV semnific infecia recent.

Fig.XXI.5. Test rapid imunocromatografic pentru Ac anti-HCV


Depistarea ARN-VHC i cuantificarea prin msurarea ncrcrii virale se
face prin biologie molecular.: tehnica PCR

Virusul hepatitei D ( delta)


Este un virus incomplet ( viroid), format dintr-o molecul foarte mic de
ADN circular. Pentru a deveni infecios are nevoie de nvelirea n Ag HBs.( deci
prezena acestui antigen n serul bolnavului)
Transmiterea se face pe cale parenteral
Coinfecia HBV+HDV determin o evoluie grav a hepatitei.
Infecia D la un purttor de Ag HBs ( superinfecia) crete riscul cronicizrii.

Capitolul XXII
DIAGNOSTICUL INFECTIEI HIV
Posibilitile actuale de diagnostic includ:
Detecia direct i indirect a virusului HIV
- Izolarea i cultivarea virusului
- PCR
- Hibridizarea in situ
- ELISA pentru antigenul p24
- Imunofluorescena indirecta
Detecia anticorpilor anti HIV
- Teste rapide imunocromatografice
- ELISA pentru detecia anticorpilor
- Imunofluorescena indirect
- Immunoblotting ( Western-Blot)
Detecia anticorpilor specifici se poate realiza doar dup 6-8 sptmni de la
contactul infectant, moment n care se produce seroconversia apariia n serul
pacientului a anticorpilor anti-HIV.
Viremia dureaz n majoritatea cazurilor pn cu o sptmn naintea
apariiei anticorpilor.
In perioada de fereastr imunologic, virusul este prezent n sngele celui
infectat, acesta putnd transmite infecia pe cile enunate mai sus, dar nu poate fi
diagnosticat prin metode serologice.
Testele standard pentru diagnosticul infeciei HIV sunt testele serologice
pentru detecia anticorpilor anti-HIV1 i HIV2, teste care n prezent au o foarte
bun sensibilitatea i specificitate: fie prin metoda ELISA (indirect, competitiv,
sandwich), fie teste rapide imunocromatografice.
Testul standard de confirmare a infeciei HIV este Western-Blot, folosit
pentru soluionarea rezultatelor incerte obinute prin metodele precedente.

Fig. XXII.1. Posibilitati de diagnostic serologic in HIV prin metoda ELISA

Fig.XXII: 2. Test rapid imunocromatografic pentru Ac anti HIV1 si HIV2

Fig.XXII:3. Teste ELISA de generaia a IV-a

Fig.XXII.4. Rezultatele unor teste Western-Blot


Testele pentru antigene i detecia virusului
Antigenele (antigenului p24) pot fi detectate n fazele timpurii ale infeciei HIV,
nainte de apariia anticorpilor, precum i n fazele finale ale infeciei. n faza latent
nu pot fi detectate, datorit formrii complexelor Ag-Ac
Prezena virusului n snge poate fi demonstrat prin metoda PCR pentru ADN proviral i RT- PCR pentru ARN viral .
Izolarea virusului poate fi fcut n culturi de celule ( limfocitele pacientului
cultivate mpreun cu celule din snge periferic proaspt de la donatori sntoi) sau
pe linii celulare de limfom T. Cultivarea virusului este o metod scump, laborioas,
folosit numai n cercetare.
Diagnosticul serologic al infeciei HIV la nou-nscuii din mame
infectate HIV nu poate fi stabilit prin teste uzuale. Anticorpii se transmit
transplacentar de la mam la ft i persist n sngele nou-nscutului pn la 18
luni. Determinarea AND sau ARN viral sau a anticorpilor Ig A anti-HIV, care nu
traverseaz placenta reprezint metode de diagnostic utile pentru copiii pn la 18
luni.

Testele cu valoare prognostic cele mai sugestive sunt


1. Prezena antigenelor HIV;
2. Numrarul de limfocite CD4 ofer indicii despre stadiul bolii;
3. Neopterina
4. 2-microglobulina
5. ncrcarea viral - testul cu cea mai mare valoare prognostic i de
monitorizare a terapiei; se determin ARN viral prin metoda RT-PCR
cantitativ

Bibliografie selectiv
1. Ballows, A., Haissler W. J., Herrmann, K., Isenberg H.D., Shadomy H.G.,
Manual of Clinical Microbiology, Fifth Edition, American Society of
Microbiology, Washington, D.C., 1992
2. Barousse MM, Van Der Pol BJ, Fortenberry D, et al: Vaginal yeast
colonisation, prevalence of vaginitis, and associated local immunity in
adolescents. Sex Transm Infect 2004 Feb; 80(1): 48-53
3. Barbeyrac B -Universit Victor Sgalen, Bordeaux 2, Centre National de
Rfrence des Infections Chlamydia- Chalmydia. Cours de bacteriologie
medicale, 2003
4. Buiuc, D. Microbiologie Medical , Ed. Didactic i Pedagogic, Bucureti
1992
5. Buiuc D., Negu M., Tratat de Microbiologie Clinic, Ed. Medical,
Bucureti, 1999
6. Callahan DB, Weinberg M, Gunn RA: Bacterial vaginosis in pregnancy:
diagnosis and treatment practices of physicians in San Diego, California,
1999. Sex Transm Dis 2003 Aug; 30(8): 645-9
7. Crstina D, Sac IC, Sac N, Laza-Stanca V, Tifrea D, Slavcovici A,
Sac F. E-test, diluii n mediu solid i tehnica difuzimetric n aprecierea
rezistenei stafilocilor la bata-lactami. Bacteriologia, Virusologia,
Parazitologia, Epidemiologia, 2001, vol.46 nr.4, 213-218.
8. Codi I., Israil A., Balotescu C., Popa M., Testarea rezistenei la antibiotice:
standard NCCLS sau CA-FM ? Comunicare , Reuniunea anual de
microbiologie, Timioara, 2003.
9. Hammill HA: Normal vaginal flora in relation to vaginitis. Obstet Gynecol
Clin North Am 1989 Jun; 16(2): 329-36
10. Jawetz, Melnick , Adelberg Medical microbiology, Lange Ed. 1991.
11. Lenette E., Ballows A., Manual of Clinical microbiology, Am. Society of
Microbiology, Washington D.C., 1993.
12. Murray P.R., Kobayashi G.S., Pfaller, M.A., Rosenthal K., Medical
Microbiology, Second Edition, 1994, Mosby-Year Book Inc., Missouri
13. Popa C. E-Test o nou metod pentru testarea rezistenei la substane
antimicrobiene. Bacteriologia, virusologia, parazitologia, epidemiologia,
vol.44, nr.1-2, 1999, p.127-130.
14. Popa, M.I. Diagnosticul de laborator n microbiologie, Ed. INFOMEDICA,
Bucureti, 2004
15. Sobel JD, Chaim W, Nagappan V, Leaman D: Treatment of vaginitis caused
by Candida glabrata: use of topical boric acid and flucytosine. Am J Obstet
Gynecol 2003 Nov; 189(5): 1297-300

16. Valenti W.M. AIDS 25 zears later: monitorizing HIV testing. AIDS Read.
2006 Sept: 16 (9). 461-3.
17. Weber B, Orazi B, Rainieri A, Thorstensson R, Burgisser P Multicenter
evaluation of a new 4th generation HIV screening assaz Elecsys HIV combi.
Clin Lab. 2006: 52( 9-109: 463-73.