Sunteți pe pagina 1din 64

LUCRARI LABORATOR MICROBIOLOGIE GENERALA

L.1. Reguli de protecie a muncii n laboratorul de microbiologie; Microscopul. Utilizarea microscopului L.2. Studiul microbiologic al bacteriilor - Studiul bacteriilor prin colorare simpla L.3. Studiul microbiologic al bacteriilor - Studiul bacteriilor prin colorare difereniala L.4. Studiul microbiologic al drojdiilor (Saccharomyces, Pichia, Torulopsis) L.5. Studiul microbiologic al drojdiilor (Candida, Rhodotorula, Kloeckera) L.6. Studiul microbiologic al mucegaiurilor (Mucor, Rhizopus) L.7. Studiul microbiologic al mucegaiurilor (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus glaucus, Penicillium expansum) L.8. Studiul microbiologic al mucegaiurilor (Botrytis, Geotrichum, Alternaria, Fusarium, Cladosporium) L.9. Tehnici de izolare a culturilor pure L.10. Tehnici indirecte (culturale) de evaluare a numrului de microorganisme - Tehnica clasic de numrare prin cultivare pe medii dense L.11. Metoda direct de numrare a bacteriilor n preparate fixate i colorate - Metoda Breed L.12. Metode directe de numrare - Numrarea cu citometre de mediu asupra dezvoltrii L.13. Influena factorilor microorganismelor

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

REGULI DE PROTECIE A MUNCII N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE


ntr-un laborator de microbiologie trebuie respectate anumite reguli de ordine interioar, dup cum urmeaz: Este strict interzis accesul persoanelor strine n laborator; Intrarea n laborator i participarea la lucrrile practice se va face numai dup audierea i nsuirea regulilor de protecie a muncii (dovedit prin semntur pe un proces verbal); Intrarea n laboratorul de microbiologie necesit purtarea obligatorie a echipamentului de protecie (halat cu mneci lungi, mnui sterile, etc.). Se recomand ca echipamentul de protecie s fie pstrat separat de hainele utilizate n exterior; Nu se mnnc i nu se fumeaz n laborator. Manipulrile trebuiesc efectuate cu multa atenie, chiar dac nu se lucreaz cu microorganisme patogene. Culturile, preparatele microscopice umede, toate materialele care conin sau s-au aflat n contact cu microorganisme vii trebuie mnuite cu grija. n laboratorul de microbiologie, poate exista i pericolul generat de utilizarea tensiunii nalte, a radiaiilor ultraviolete i a altor radiaii. Radiaiile ultraviolete (=250-270 nm) sunt folosite pentru sterilizarea aerului i suprafeelor de lucru. iradierea se face timp de 15 min - 2 ore, n funcie de dimensiunea ncperii i gradul presupus de contaminare a aerului. n timpul funcionarii lmpii, nu este permis accesul personalului n ncpere dect cu ochelari de protecie i pentru scurta durata, deoarece razele ultraviolete ataca retina, iar in doze mari pot produce arsuri ale epidermei; Rnile i zgrieturile de pe mini trebuie s fie complet protejate de pansamente rezistente la apa i de mnui chirurgicale; S se evite pe ct posibil atingerea prului, innd cent ca nivelul de contaminare a acestuia este de aproximativ 1 milion/cm2. Persoanele cu pr lung este necesar s-l strng, pentru a evita accidentele, innd seama ca de obicei se lucreaz n. apropierea becului de gaz;
1

Cnd o cultura este pipetat din greeala pe bancul de lucru sau pe podea, nu va grbii s tergei locul respectiv, ci aplicai peste suspensia respectiva o soluie dezinfectanta, ateptai aproximativ 20 minute i abia apoi curai;
Laborator Microbiologie general|

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

Evacuarea rapid a coninutului pipetelor poate produce aerosoli. Aerosolii pot fi generai i la mnuirea firului sau ansei, i la ndeprtarea dopului de vata sau de cauciuc din eprubetele cu culturi i la deurubarea capacelor sticlelor cu culturi. n general, n munca din laboratorul de microbiologie se prefera micrile lente, negrbite; Utilizarea firului sau ansei necesit bune deprinderi la mnuirea acestora, pentru a se evita contaminarea aerului i a zonei de lucru. Firul i ansa trebuie s fie sterilizate nainte i dup utilizare, prin flambare la rou, n flacra unui bec Bunsen pe toata lungimea firului metalic. mprtierea materialului aderent se evita prin introducerea firului metalic n flacra, n mod gradat; Eprubetele cu culturi vor fi inute ntotdeauna n stativele pentru eprubete. Nu lsai niciodat eprubete sau pipete utilizate pe bancul de lucru. Placa Petri n care se numra microorganismele nu va fi privit ca fiind lipsita de risc, chiar dac inocularea ei s-a fcut dintr-un aliment bun pentru consum; Dopul de vat de la captul pipetei se afl acolo pentru a preveni contaminarea lichidului care trebuie pipetat i pentru a preveni infectarea utilizatorului. Pipetele folosite nu se vor lsa nici o data pe bancul de lucru. Ele se vor introduce ntr-un recipient coninnd soluie dezinfectant (bicromat de potasiu 5%). Lamele i lamelele se vor aeza dup utilizare n vase coninnd soluii dezinfectante, dup ce n prealabil lamelele au fost separate de lame cu ajutorul unei pensete; S se eticheteze corect culturile nainte de depozitarea lor la termostate sau n alte zone; Dup terminarea lucrului se va cura zona de lucru. Aceasta se va terge cu o soluie dezinfectanta (cloramina 6.5-3%, formol sau fenol 3-5%, HgCI2 0.1%). Minile se igienizeaz prin introducerea lor ntr-o substan antiseptic pentru cteva minute, apoi se spal cu ap cald si spun.

Laborator Microbiologie general|

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

MICROSCOPUL. UTILIZAREA MICROSCOPULUI


Microscopul este instrumentul cel mai utilizat i cel mai important n laboratorul de microbiologie. Cu ajutorul microscopului optic se realizeaz studiul morfologic al microorganismelor (bacterii, drojdii i mucegaiuri) i numrarea direct a acestora. Studiul virusurilor i a ultrastructurilor celulare necesita utilizarea microscopului electronic.

Reguli de utilizare a microscopului ntotdeauna microscopul se transport cu dou mini, o mn se aeaz la baza, iar cu cealalt se prinde coloana sau stlpul microscopului; Se aeaz cu atenie microscopul pe masa de lucru. n cazul unei micri violente sau dup un oc acesta se poate deregla; Nu se nclin niciodat microscopul, chiar dac exist aceast posibilitate. Cnd se utilizeaz obiectivul de imersie, prin inclinare, uleiul de cedru se rspndete pe msua microscopului; Pentru curare, ntotdeauna se folosete hrtie special pentru curarea lentilelor. Dac rezultatele nu sunt corespunztoare prin utilizarea hrtiei, se poate folosi o cantitate mic de benzen. Nu se va utiliza alcoolul sau alt produs care-poate determina desprinderea lentilelor; S se observe permanent diferenele dintre obiectivele folosite pentru studiul preparatelor microscopice umede i obiectivele de imersie (pentru studiul preparatelor microscopice colorate). Obiectivul de imersie este fragil, el trebuie utilizat cu foarte mult atenie; De fiecare data cnd se utilizeaz microscopul este necesar s se curee toate lentilele: ale obiectivului, ocularului i condensatorului; Se aeaz ntotdeauna n centrul optic al microscopului obiectivul cel mai mic i se coboar tubul ct este posibil; Se acoper microscopul dup utilizare cu un sistem de protecie;
1

Nu se vor ntreprinde niciodat reparaii. Acest lucru se realizeaz de ctre echipele specializate.

Laborator Microbiologie general|

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

Elementele microscopului Microscopul se compune dintr-un stativ portant, un sistem optic, o msu port-obiect i un sistem de iluminare. Sistemul optic i msua sunt mobile.

1 Oculare 2 Dispozitiv port-obiective 3 Obiective 4 Clema pentru fixarea preparatului 5 Msu urub macrometric pentru prinderea 6 imaginii

urub pentru deplasarea pe axa y urub micrometric pentru clarificarea 8 imaginii 9 urub pentru deplasarea pe axa x 10 Buton de pornire oprire 11 urub de ajustare a luminozitii 7 12 Lampa

Laborator Microbiologie general|

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

Ocularele Curent se utilizeaz oculare care au puterea de mrire de x8, x10, x12. Obiectivele Dispozitivul port-obiectiv permite selecionarea obiectivului dorit prin simpla rotaie. Obiectivele utilizate n microbiologie sunt n general obiective acromatice i dac este posibil plan-acromatice. Gama obiectivelor necesare au puterea de mrire de x10, x20, x40, iar obiectivele de imersie au puterea de mrire de x90, x100. Msua port-obiect Msua port-obiect reprezint un suport pentru lam. Deplasarea pe cele doua axe orizontale perpendiculare se realizeaz cu ajutorul unui urub situat lateral. Sistemul de iluminare Se compune dintr-o sursa de lumina i un condensator. Condensatoarele curente sunt dotate cu o diafragma. Sistemul de iluminare este independent sau ncorporat n microscop. Sistemul de deplasare a obiectivelor Se realizeaz cu un urub pentru micrile rapide i un alt urub pentru reglare micrometric. Distanta frontal, adic distanta ntre preparat i obiectiv, depinde de puterea de mrire a obiectivului. Puterea de mrire Puterea de rezoluie este capacitatea de separare a doua obiecte foarte apropiate. Puterea de mrire variaz de la 100-1200 corespunztor sistemului oculare obiectiv utilizat. Se calculeaz prin produsul dintre puterea de mrire a ocularului i a obiectivului.

Utilizarea microscopului Curarea cu ajutorul unei hrtii speciale a elementelor optice ale microscopului; Reglarea luminozitii; Fixarea preparatului pe msu cu ajutorul unei cleme. Partea preparatului care intereseaz se aeaz n centrul port-obiectului;
3

Obiectivul este selecionat: iniial se fixeaz obiectivul cu puterea de mrire cea mai mic (x10) pentru prinderea imaginii; Se coboar obiectivul la o distan de 0.5-1 cm de preparat cu ajutorul urubului
Laborator Microbiologie general|

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

macrometric; Pentru studiu se schimba obiectivul cu un altul cu putere de mrire superioar prin rotirea dispozitivului port obiective; Dup obinerea imaginii, se realizeaz clarificarea acesteia cu ajutorul urubului micrometric; n cazul utilizrii obiectivului de imersie, se depune o pictur de ulei de imersie n zona care intereseaz i se imerseaz obiectivul n aceasta zon; Dup utilizare, obiectivele de imersie trebuie sa fie curate cu benzen; Lamele examinate vor fi imediat ndeprtate pentru a se evita contaminarea.

Cauzele care duc la obinerea unor imagini necorespunztoare sunt: Executarea unor preparate necorespunztoare; Preparate care nu sunt centrate corespunztor; Elemente optice murdare; Obiective i oculare dereglate; Luminozitate reglat necorespunztor.

Laborator Microbiologie general|

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

STUDIUL BACTERIILOR
Definiie Bacteriile sunt microorganisme monocelulare de tip procariot cu un cromozom unic, care se nmulesc asexuat prin sciziune binar. Rspndire n sol - concentraia de celule poate ajunge la valori de 107-109/g att n straturile superficiale (bacterii aerobe), ct i n straturile de profunzime (bacterii anaerobe). din sol, bacteriile s-au adaptat s triasc n ape, unde concentraia de celule poate fi ntre 10/cm3 n apa de izvor, pn la valori de 1012/cm3, de exemplu, n ape fecalo-menajere. existena n aer a bacteriilor este temporar i prin intermediul curenilor de aer sunt rspndite la distane foarte mari. Din aer, sunt antrenate din nou n sol prin intermediul precipitaiilor atmosferice. fac parte din microbiota naturala a plantelor i animalelor Rol rol important n natur: n transformarea compuilor macromoleculari n compui simpli, prin mineralizarea materiei organice nevii, contribuind astfel la realizarea natural a circuitului unor elemente de importan vital: carbon, azot, sulf, fosfor, fier .a. n industria alimentar - culturi starter al proceselor fermentative bacteriile lactice sunt folosite la fabricarea produselor lactate, a brnzeturilor, n industria panificaiei, la conservarea legumelor, mslinelor, furajelor verzi etc. bacteriile propionice sunt utilizate la fabricarea brnzeturilor tip schwaitzer bacteriile acetice la fermentaia alcoolului etilic obinerea industrial a oetului. n biotehnologie se pot obine: enzime, proteine, aminoacizi, acid lactic, acid acetic, solveni (aceton, alcool izopropilic, alcool butilic); hormoni insulina produs de un mutant de Escherichia coli; ngrminte biologice Azotobacter; insecticide biologice Bacillus thuringiensis; antibiotice Streptomyces sp. vitamine de ex. vitamina B12 Propionibacterium shermani
1

Aspecte negative: n industria alimentar bacterii ageni de alterare a produselor alimentare (acrirea berii, vinului, putrefacia crnii .a.);
Laborator Microbiologie general|

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

bacterii patogene ingerare alimente contaminate toxiinfecii alimentare; bacterii patogene pot s paraziteze organismele vii dnd mbolnviri grave (tuberculoza, febra tifoid, dizenteria, sifilis, bruceloza, antrax, .a.), bacterioze la plante. Caractere morfologice Bacteriile prezint forme celulare foarte diversificate, dintre care forme de baz, monocelulare, precum i forme derivate ale acestora ce rezult n urma asocierii celulelor rezultate prin reproducere. Dintre formele de baz fac parte urmtoarele (Anexa 2): - forma sferic coccus sfera este perfect (micrococi), ovalar (enterococi), lanceolat (pneumococi) i reniform (gonococi); - forma bacilar cilindric drepte cu capete rotunjite (g. Enterobacter), cu capete retezate (g. Bacillus), fusiforme, mciucate (g. Corynebacterium), cu diametru variabil (g. Mycobacterium); - formele spiralate-elicoidale specifice bacteriilor patogene forma vibrio forma spirillum filamente rigide cu spire largi forma spirocheta filamente flexibile cu mai multe spire; - formele filamentoase specifice bacteriilor miceliene (actinomicete, chlamydobacterii etc.). Mediul de baz pentru cultivarea bacteriilor bulionul de carne lichid sau solidificat cu agar (BCA). Prin reproducere pe mediu nutritiv solidificat ia natere o colonie alctuit din biomasa de celule rezultate prin sciziune din celula unic: - colonii de tip S (smooth neted lucios) - colonii de tip R (rough rugos, aspru, zbrcit) - colonii de tip M la bacterii productoare de capsule, cu consisten gelatinoas, mucoid Coloniile de bacterii: pe medii solide culori de alb, alb-crem, galben-auriu, oranj-rou, albastru fluorescen pe medii nutritive lichide pot da tulburare i sediment bacteriile anaerobe formeaz voal caracteristic, fragil, cutat, gelatinos bacteriile aerobe. Caractere fiziologice generale bacteriile se dezvolt ntr-un domeniu larg de temperatura 10C i 90C; n raport cu oxigenul majoritatea bacteriilor sunt aerobe (ex. bacterii acetice), care cresc n semiaerobioz (ex. bacterii lactice), dar un grup restrns de bacterii sunt adaptate s creasc n strict anaerobioz (ex. genul Clostridium). pH=1-11 optim la valori acide pentru bacterii acidotolerante (bacterii acetice, lactice) sau la valori neutre pentru bacterii de putrefacie.
Laborator Microbiologie general|

Facultatea tiina i Ing a gineria Alimen ntelor

STUDIUL BACT S TERIILOR PRIN COLOR R RARE SIM MPL


Prepara atele micros scopice sunt de dou tipuri: A. B. Preparate umede pentru stu e udiul drojdii si a mu ilor ucegaiurilor r; Frotiuri (p preparate-u uscate) pe entru studiu bacteriilo ul or.

Coloranii utilizai n studiul bacteriilor au ca scop accentuare contrast prepara b a ea tul atelor (colorar simpl) sau n sco re opul identificrii (color rrile difer reniale). Colorare simpl prezint do etape: ea p ou 1. Obinerea fr O rotiurilor; 2. Colorarea simpl prop C priu-zis.

Etapele prelevrii probelor pe entru realiz zarea frotiu urilor sunt p prezentate n figura 1.

Figu 1. Etapele prelev probelo ura rii or


La aborator Micro obiologie gen neral|

Facultatea tiina i Ing a gineria Alimen ntelor

Obinere frotiurilo presupu ea or une etalare celulelo r de studia urmat de uscare de ea at, e, fixare i de colorar (Fig. 2) re

F R O T I U

1. Sterilizare lam m 2. Adugare ap diistilat A 3. Sterilizare ansa 4. Prelevare pro ob 5. Plasare prob pe lam P e 6. Etalare prob b 7. Uscare 8. Fixare 9. Rcire

Figura 2. Etap pele realiz frotiului rii i Etalarea este rea a alizat porn nind de la prelevare probele etap id a ea e, dentic cu cea utilizat pentru pre eparatele um mede n sta proasp are t. Pictura de suspe a ensie se etaleaz cu ajutorul fir rului metaliic steril ast tfel nct s se s obin o distribuie foarte fin omogen e , . Uscarea se efectueaz deasupra flcr unui bec de gaz pe a rii c entru a se e evita o nc lzire violent. Fixarea se realizea trecnd lama de 2-3 ori pri n flacra b az becului de g gaz, dup care se realiz zeaz rcir rea. Frotiul poate fi ana p alizat n con ntinuare su aceasta form sau colorat. ub
2

La aborator Micro obiologie gen neral|

Facultatea tiina i Ing a gineria Alimen ntelor

Se realiz zeaz prin acoperirea frotiurilor fixate cu c a teva pict de colo turi orant timp d 30 de sec 2 min (A), du care se realizeaz splarea (B) i zvn up e ntarea prep paratelor (C C).

Examen microscopic se efe nul ectueaz cu obiective de imer u ele rsie (x90, x x100). Coloranii utilizai frecvent sun albastru de metilen sau fucsi f nt: u n ina. Etapele realizrii colorrii sim c mple sunt pr rezentate n figura 3. n

C O L O R A R E S I M P L

1. Obinere frotiu e

2. A Adugare colo orant (fucsin )

3. Meninere collorant 1 min.

4. Splare c colorant

5. Zvntare preparat

6. Adugare ule de cedru . ei

Figu ura. 3 Etap pele realiz colorrii simple rii


3

La aborator Micro obiologie gen neral|

Bacteri iidinIA AURT

Iaurturile sunt fab bricate cu ajutorul la aptelui pas steurizat, in noculat cu dou bac u cterii termofile e: Lacto obacillus bu ulgaricus, agent de ac a cidifiere i a arom; Strep ptococcus th hermophilus formeaz aroma. s, Exist un sinergism ntre cele dou bac u m cterii; aces stea produc compui utili una pe c entru cealalt (activitate peptidazic de ctre prima bact terie, acid f formic prod de cea de a dus doua).

1.

L Lactobacil llus bulgar ricus

Sunt bacili a alungii, G Gram poz zitivi, nesporu ulai, imo obili, homoferment tativi, termofilli (temperat tura de dez zvoltare 45 C). Fermen nteaz gluc coza, lacto oza, fructoz i za cteoda galacto at oza cu prod ducere de acid lactic.

2.

S Streptococ ccus therm mophilus

Sunt c coci, Gra am pozitiv vi, nespor rulai, imobili, grupai n perechi cteodat n n i t lanuri. Fermen nteaz lacto oza, zaharoza, glucoz i za uneori g galactoza c formare de acid la cu e actic, tempera atura maxi ma de cre tere 50-52 2C.

Labo orator Microb biologie gene eral|

Bact teriidi inSM NTN N


Streptococcus cr S remoris

Smntna acid este fe S a ermentat de Streptoc d coccus crem moris. Sunt coci (l S lanuri de coci), G+, nesporula micro-aerofili, foar exigen din ai, rte i punct de vedere nutriional, cresc la tempera d a atura de + +10C, dar nu cres la sc tempera atura de 45C. Fermenteaz lactoza i maltoza. F i

Labo orator Microb biologie gene eral|

Bacteri B iidinB BOR


Lactobac L cillus delb brueckii

Sunt ba acili alung gii, Gram pozitivi, ne esporulai, imobili, homofermen ntativi, term mofili (tempera atura de de ezvoltare 45 5C). Lactoba acillus delbr rueckii ferm menteaz la actoza.

orator Microb biologie gene eral| Labo

Tema: STUDIUL BACTERIILOR PRIN COLORARE SIMPL Scopul: Formarea deprinderilor de manipulare a ustensilelor i aparaturii de laborator; Cunoaterea i utilizarea adecvat a noiunilor necesare identificrii bacteriilor

Bacterii din IAURT

Bacterii din SMNTN

Bacterii din BOR

NUME/PRENUME STUDENT

GRUPA Data Cadrul didactic

Facultatea tiina i Ing a gineria Alimen ntelor

STU UDIUL BA ACTERIILOR PR COL RIN LORARE DIFER E RENIAL L (G GRAM)


Prepara atele micros scopice sunt de dou tipuri: A. B. Prepa arate umed pentru studiul dr de u rojdiilor si a mucegaiu urilor; Frotiu (prepara uri ate-uscate) pentru st tudiul bacte eriilor.

Coloranii utilizai n studiul bacteriilor au ca scop accentuare contrast prepara b a ea tul atelor (colorar simpl) sau n sco re opul identificrii (color rrile difer reniale). Colorare Gram pe ea ermite diviz zarea bacte eriilor n do grupe: GRAM PO ou OZITIVE (G i G+) GRAM NEGATIVE (G-). Aceasta me E etoda se bazeaz p diferena structur i pe rii compoz ziiei perete celular la cele do elui ou grupe de bacterii Bazele m i. metodei au fost stabilite de bacteriologul danez Hans Christian Gr ram, n anu 1884. ul Colorare GRAM prezint do etape: ea p ou 1. Obinerea fr O rotiurilor; 2. Colorarea GRAM prop C G priu-zis.

Obinere frotiurilo presupu ea or une etalare celulelo r de studia urmat de uscare de ea at, e, fixare i de colorar re

Frotiul uscat i fix se acop u xat per cu cteva pictu de viole de genian sau cristal uri et violet, timp de 1 minut (A), apoi se cl m a tete cu ap (B). Se acoper a p apoi prepa ratul timp de cteva se e ecunde (30 sec) cu soluie Lu gol (iod n iodura de potasiu) care 0 n e joaca ro de morda (C); ol ant

A B C Frotiul este supus aciunii alcoolului etilic - 96 ( e s (D). Dup splarea p preparatulu cu ui ap (E), acesta se acoper cu al doile colorant (fucsina bazic) ca recolore e ea t are eaz celulele bacteriilor Gram neg e r gative (F).

Labo orator Microb biologie gene eral|

Facultatea tiina i Ing a gineria Alimen ntelor

D E F Dup splarea preparatulu cu ap (G) se r s p ui realizeaz zvntare a (H) i apoi studiere acestuia cu obiect de 90x imersat n ulei de ce dru. ea a tiv

G H n urma acestei metode de colorare bacteriile G vor ave culoarea roz-roie iar a m b Gea a e; bacteriile G+ se vor colora n violet. Prezent tarea schematic a colorrii Gr c ram se reg sete n f figura 1.
1. Obinere frotiu u

C O L O R A R E D I F E R E N I A L

2. Adugare colo 2 orant (violet de genian sau e cristal violet) Menin nere colorant 1 min. 3. A Adugare Lugol Me eninere 30 sec c. 4. S Splare cu alcoo ol

5. Splare cu ap

6. Adug gare colorant (fu ucsin) Menin nere colorant 1 min. 7. S Splare cu ap

8. Zv vntare preparat t

9. Adu ugare ulei de cedru

Figu ura. 1 Etap pele realiz colorrii GRAM rii


Labo orator Microb biologie gene eral|

Facultatea tiina i Ing a gineria Alimen ntelor

ANEXA A Et tapele colorrii GRAM c


Reactivi/P Prepa rat Frotiu fixat, necolorat Durat ta aplica are de Rea acii Aspec celule ct Celule fr e culoare i dificil de vizu ualizat bacteriile Att Gram pozitive ct ele Gram i ce negativ ve sunt colorat n violet te nchis. Ambele grupe de e bacteriii rmn colorat n violet te nchis. riile Gram Bacter rmn pozitiv e te colorat n violet nchis n timp ce Gram bacteriiile negativ ve devin incolor i dificil re de obs servat. Gram pozitiv ve (G+) Gram negative (G-)

Cristal viol let

1, apoi cltire cu ap e

bazici b Coloranii cu reacioneaz rcate grupe ncr gativ din pe erete neg mem mbran i citosol Iodul are efect e mor rdant i mr rete ata area spal s Solvenii colo orantul i iodu din ul celu ule. Colora antul difu uzeaz din celula bac cteriilor Gram G poz zitive mult mai lent dec ct n cazul celor c Gra am nega ative, dato orit compo oziiei chim mice i gro osimii peretelui celular Colorantul bazic se c fixe eaz de gru upele nc rcate negativ din v de amb bele tipuri celu ule. La bacteriile Gra am pozitive sunt ns puine grupe g libe de cristal violet ere v com mparativ cu cele Gra am negative care sun complet liber nt re

Soluie Lug gol

1, apoi e cltire cu ap

Alcool etilic 96

10-15, apoi cltire cu ap e

Fucsin, colorant contrast

de

apoi 1, cltire e cu ap, zvnta are n aer cald, studiu u cu obiect tiv de 90x imersat u n ulei de cedru

Celule le Gram pozitiv e rmn colorat n violet te nchis (culoarea ntului coloran primar ) n timp ce Gram celulel e devin colorate n sau rou roz rea (culoar coloran ntului de contras st)

Labo orator Microb biologie gene eral|

Bacillu ussub btilis


1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale). fo ormeaz pe Plate Coun Agar, dup 48h de c e nt p cultivare la 3 37C, coloni alb-crem, plate ii i neuniforme e.

2.

Caractere microscop C m pice bacterii cu forma de bastonae, G+, aerob mezofile n gener mobile. Sunt f b be, e ral ca aracterizai prin aptitudinea de spo orulare.

3.

Rspndire i rol R e sunt foarte r spndite n natur, n special n so i pe prod n s ol dusele vege etale.

La aborator Micro obiologie gen neral|

Bacteri B riidinO OET


Aceto obacter a aceti

Sunt bacili, G-, nesporulai, n ge S eneral mob aerobi. bili, Sunt ageni de fermen S ntare acetic, care e este de fap o oxidare incomple a pt e et etanolului. Caracteristic principa este pro C ca al oducerea de acid acet pornind de la etano e tic ol. Prin colorare Gram ele apar de culoare ro P ea ie. Sunt bacteri de contam S ii minare a pr roduselor a alcoolizate pe care le acidific. n industrie sunt utiliza pentru obinerea o n ate o oetului.

orator Microb biologie gene eral| Labo

Tema: STUDIUL MORFOLOGIC AL UNOR SPECII DE BACTERII PRIN COLORARE GRAM Scopul: Formarea deprinderilor de manipulare a ustensilelor i aparaturii de laborator; Cunoaterea i utilizarea adecvat a noiunilor necesare identificrii bacteriilor

Bacillus subtilis

Bacterii din OET

NUME/PRENUME STUDENT

GRUPA Data

Cadrul didactic

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

STUDIUL DROJDIILOR

Definiie Drojdiile reprezint un grup taxonomic complex i eterogen de microorganisme monocelulare de tip eucariot, care se nmulesc prin nmugurire, ca form general de reproducere i n mod particular prin ascospori formai pe cale asexuat i sexuat.

Importan/rol produc fermentarea glucidelor simple n anaerobioz cu formare de alcool etilic i dioxid de carbon fabricarea alcoolului, a vinului, berii i pinii. sunt utilizate ca surs de proteine n alimentaia uman, cu denumirea de SCP (single cell protein) sau n alimentaia animalelor. din biomasa de drojdie se obin: - extracte folosite ca aditivi alimentari; - vitamine hidrosolubile: B1, B2, PP, ergosterol; - enzime: - fructofuranozidaza i - galactozidaza; - prin hibridizri i inginerie genetic, din mutani ai speciei Saccharomyces cerevisiae s-a obinut interferonul. Rspndire n sol, celulele de drojdie se ntlnesc n straturile superficiale pn la adncimi de aproximativ 30 cm, n concentraii de 102- 2105/g. din sol, prin aciunea unor factori (fizici, mecanici, biologici), microorganismele se pot afla temporar n aer i s se rspndeasc la distane mari; din sol i aer drojdiile pot ajunge n ape i unele specii pot fi ntlnite chiar la adncimi de 4000 m. in microbiota epifita a plantelor. Caractere morfologice generale Exemple de genuri cu importan in industria alimentar: forma oval (elipsoidal) g. Saccharomyces; forma sferic g. Torulopsis; forma apiculat (de lmie) g. Kloeckera; forma cilindric g. Candida; forma de sticl g. Saccharomycodes.

Cultivarea celulelor de drojdie pe medii nutritive lichide:


Fermentare anaerobaa zahrului

Laborator Microbiologie general|

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

[1]. Tulburare mediu [2]. Producere spum [3]. Depunere sediment [4]. Limpezirea supernatantului Cultivarea celulelor de drojdie pe medii nutritive solide sau solidificate (de exemplu: must de mal cu agar)
nmugurire

succesiv

Coloniile de drojdii au aspect cremos lucioase sau mate alb-crem drojdii din g. Rhodotorula colonii rou-pastelat Colonia n seciune poate avea: un profil lenticular, semicircular sau triunghiular perimetrul circular, umbonat, cu margini ondulate Caractere fiziologice generale ale drojdiilor O proprietate important a unor drojdii cu utilizri n industria alimentar este aceea de a fermenta n condiii de anaerobioz glucide (hexoze, diglucie, triglucide) cu formare de alcool etilic i dioxid de carbon i produse secundare care dau aroma caracteristic produselor fermentate. n condiii de aerobioz, drojdiile asimileaz glucidele transformndu-le prin respiraie la CO2 i H2O, iar energia eliberat favorizeaz creterea i nmulirea celulelor. Celulele de drojdie, n funcie de condiiile de cultivare i vrst pot prezenta activitate metabolic difereniat concretizat prin trei stri n care se pot afla celulele i anume: starea de metabioz (activ), n care celulele au activitate metabolic maxim. n condiii favorabile de cultur, celulele cresc, se reproduc i acumuleaz intracelular substane de rezerv glicogen i trehaloz; starea de anabioz (latent), celulele i menin caracteristicile vitale, dar nu se pot nmuli. Aceast stare apare cnd substanele nutritive ale mediului sunt epuizate, iar celulele consum din substanele de rezerv intracelulare; starea de autoliz (moartea fiziologic). Se produce o solubilizare a compuilor intracelulari sub aciunea enzimelor proprii celulei.
2

Laborator Microbiologie general|

Sacch mycesc harom cerevis siae

1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale). Dup 3 zile de cultivare la 25C, for a rmeaz pe MEA (Malt Extract A Agar), co olonii de culoare alb-cr rem, conve exe, cu per rimetrul circ cular i sup prafaa lucio oas, av vnd diamet de 1 - 2 mm. trul

2.

Caractere microscop C m pice celule au form elipsoid ele ma dal, globoa as sau el lipsoidal alungit i p fi pot dis spuse singu ular, in pere echi sau lan nuri; se rep produc prin nmugurire iar mugurele poate f alipit de c n e, fi celula mam . 3. Rspndire i rol R e micro oflora epifit a fructelor dulci (strug guri, mere, p pere, prune, gutui, coac , cze, ag grie); este utilizat la: u fab bricarea spir rtului; la obinerea drojdiei comp o primate; n panificaie; la fabricarea unor sortime f u ente de bere e.

La aborator Micro obiologie gen neral|

Pichiamem a mbrana aefacie ens

1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale).

forme eaz, pe must de mal cu agar, colonii cu perimetrul slab lobat sau m t chiar ne eregulat, cu aspect ma rugos, de culoare a u at, e alb sau alb b-cenuie. 2. Caractere microscop C m pice

prezin celule alungite, cilin nt a ndrice, cu c capetele asc cuite sau ro otunjite disp puse n lanu sau aso uri ociaii, form mnd pseu udomicelii rezultate prin nmugurire multipo olar. Poate fo orma 1- 4 ascospori. a 3. Rspndire i rol R e micro oflora produs selor vegeta conserva prin mur ale ate rare; se de ezvolta pe lic chide slab alcoolice ( 7- 9 alcool) producnd oxidarea t a ), d total a alcool lului etilic; este agent de alterare a buturilor s a slab alcooliz zate (vin d masa, b de bere), pstrate in vase cu gol de aer. e u .

La aborator Micro obiologie gen neral|

Torulop T psisho olmii

1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale).

forme eaz pe mu de mal cu agar, du 3 zile d cultivate la 25C, co ust up de olonii albe, circulate, con nvexe, aplat tizate, cu su uprafaa luc cioas. 2. Caractere microscop C m pice celule sunt mic elipsoidale; ele ci, se rep produc prin nmugurire i apar izo e olate sau as sociate; forme eaz 1-4 ascospori, cu form s a c sferic pn la elipsoidal i p n perei netezi. 3. Rspndire i rol R e drojdi este pre ia ezent n saramura fazele in s n ncipiente de fermenta a are murtur rilor; a fost izolat din buturi rc t coritoare, de pe mslin verzi i fr e ne ructe citrice.

La aborator Micro obiologie gen neral|

Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL DROJDIILOR Scopul: Cunoaterea i utilizarea adecvat a noiunilor necesare identificrii drojdiilor

Saccharomyces cerevisiae

Pichia membranaefaciens

Torulopsis holmii

NUME/PRENUME STUDENT

GRUPA Data

Cadrul didactic

Candi idava alida(C Candid damyc coderm ma)

1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale).

coloniile dezvolta pe med solidific prezint un aspect mat, cuta de ate diu cat t at, culoare alb-cenuie sau uneor alb-crem. e ri 2. Caractere microscop C m pice

celule sunt de form elipso ele f oidal - alung git, cilindric cu extre c, emitile rotu unjite sau slab ascuite. b pot fo orma pseu udomiceliu, deoarece prin nmug gurire multi ipolar, cel lulele rmn alipite. a 3. Rspndire i rol R e face parte din microbiota ep p pifit a fructe i a uno legume; elor or n ca azuri rare, se ntlne ete n m microbiota s seminelor oleaginoas i se cerealie ere; este agent de alterare a vinurilor sllab alcoolic slab su ce, ulfitate, pro oduce defectul numit floa area vinului" "; produ uce alterri ale butur rilor rcorito oare i a p produselor conservate prin e murare.

La aborator Micro obiologie gen neral|

Rh hodoto orulag glutinis s

1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale).

forme eaz pe MEA (Malt Extract Aga dup 3 zile de c E ar), cultivare, co olonii convexe cu perimetrul circula cu supra e, ar, afaa lucioas sau aspe mucos, de culoare rou s ect pastelat. 2. Caractere microscop C m pice

celule au form elipsoidal i dimensiuni medii; reproduce ele l ; erea are loc prin c nmugur pe ntrea suprafa rire aga a; celule pot fi izo e olate sau asociate perechi. Unel tulpini p forma c a le pot celule alungite. . 3. Rspndire i rol R e este larg rspn l ndit pe sup prafaa fruct telor i legu umelor proas spt recolta ate; se ntlnete n microbiota epifit a frunzelor tulpinilor, a boabelo de a i or cereale, a mslinelo ; or poate produce ra alterri ale fructelor s legumelor e ar si r; poate produce alterri ale sucurilor insuficient pasteuriza de mere i e e ate cpuni.

La aborator Micro obiologie gen neral|

Klo oecker raapic culata a

1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale).

forme eaz pe ME (Malt Ext EA tract Agar) d dup 3 zile de cultivare la 25C, co e olonii de culoa alb-crem aproape semisferice cu margin circulare suprafaa lucioas. are m, e, ni i 2. Caractere microscop C m pice

celule au fie forma elipso ele fo oidal, fie a apiculat, d datorit mug gurilor term minali, mono sa bipolari, care se gse singuri sau perechi. au c esc s 3. Rspndire i rol R e a fost izolat de pe cpuni; afine, struguri, must d struguri, sucuri de c t de citrice i siropuri de fructe produ fermenta alcoolic a mustulu de struguri; uce aia c ui produ alterarea smochinelor, tomatelo i cireelor. uce a or

La aborator Micro obiologie gen neral|

Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL DROJDIILOR Scopul: Cunoaterea i utilizarea adecvat a noiunilor necesare identificrii drojdiilor

Candida mycoderma

Rhodotorula glutinis

Kloeckera apiculata

NUME/PRENUME STUDENT

GRUPA Data

Cadrul didactic

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

STUDIUL MUCEGAIURILOR
Definiie Mucegaiurile sunt microorganisme de tip eucariot, monocelulare sau pluricelulare, difereniate din punct de vedere morfologic i care se reproduc prin spori formai numai pe cale asexuat sau pe cale mixt (asexuat i sexuat).

Rspndire n sol, n special n stratul superficial al solului care le asigur condiii de cretere i supravieuire. din sol, sporii de mucegai sunt antrenai pe calea aerului la distane foarte mari. n aer, mucegaiurile sub form de spori sau hife vegetative pot supravieui un timp ndelungat. n ap prezena mucegaiurilor este ocazional sporii de mucegai se ntlnesc frecvent la suprafaa plantelor, n tractul digestiv, n special la ierbivore. n microbiota plantelor, pe suprafaa fructelor i legumelor. la om i animale mucegaiurile patogene produc un numr mai redus de mbolnviri, se dezvolt pe piele, unghii, pr. Rol rol important n natur: Prin activitatea lor de degradare a materiei organice vii, mucegaiurile particip la transformarea unor compui organici (celuloza, hemiceluloze, substane pectice, amidon, lipide) la compui mai simpli i sunt considerai ageni de putrezire. Mucegaiurile particip astfel la circuitul carbonului n natur i mbogesc solul n substane cu molecule mici care pot fi folosite de alte microorganisme sau de ctre plante. n industria alimentar, culturi fungice selecionate se pot folosi la fabricarea brnzeturilor tip Roqueforti, Camemberti sau la maturarea salamurilor crude. n biotehnologie se pot obine compui deosebit de valoroi: antibiotice: peniciline Penicillium chrysogenum, etc.; acizi organici (citric, lactic, gluconic, kojic, malic, fumaric); vitamine (B2, ergosterol provitamina D2); enzime (amilaze, proteaze, lipaze, celulaze etc.). mbogirea n proteine a finurilor vegetale ageni de depoluare a apelor reziduale obinere SCP
Laborator Microbiologie general|

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

Caractere morfologice Mucegaiurile se rspndesc n natur sub form de spori rezisteni la uscciune, form n care se menin n stare viabil ani de zile. Dac un astfel de spor ajunge pe suprafaa unui mediu favorabil pentru cretere, cu o cantitate suficient de ap liber care s-i permit absorbia substanelor nutritive, n primul stadiu care poate s dureze 3-4 ore, are loc absorbia apei i activizarea sistemelor enzimatice, apoi are loc germinarea celulei sporale i formarea tuburilor vegetative numite hife (lat. hypha) sau thal (thallus). Hifele cresc numai prin vrf i deci au o cretere apical dup care se ramific rezultnd miceliul. Hifele se extind pe suprafaa mediului, se diversific i ndeplinesc anumite funcii specializate. Hifele de extindere se pot dezvolta i n profunzimea mediului realiznd absorbia nutrienilor i au rol de susinere; Hifele de rspndire se pot dezvolta de-a lungul mediului sau aerian. La un anumit grad de dezvoltare a acestor hife vegetative se formeaz hifele reproductoare, generatoare de spori, difereniate n funcie de gen i specie. Totalitatea hifelor vegetative i reproductoare alctuiete miceliul. Dezvoltarea mucegaiurilor are loc destul de rapid n condiii favorabile; astfel n interval de 2-3 zile pe mediu nutritiv se formeaz colonii vizibile, difereniate. n cazul mucegaiurilor inferioare coloniile se dezvolt rapid, sunt extinse, cu tendina de a ocupa tot spaiul disponibil, au aspect pslos i culori, alb, bej, cenuiu, brun. Mucegaiurile superioare caracterizate formeaz colonii cu o cretere radial limitat i culori ce difer de la alb la galben, brun, verde, portocaliu, albastru, cu diferite nuane specifice n funcie de gen i specie. Caractere fiziologice generale sunt microorganisme aerobe deci necesit pentru cretere prezena oxigenului din aer sau a oxigenului dizolvat n mediul lichid. Un numr limitat de specii sunt microaerofile i pot produce mucegirea intern a untului i a oulor. se dezvolta n limite largi de pH (15-9), valoare optim n domeniu acid 5.5-6. microorganisme mezofile cu temperaturi optime de cretere la 25C, un numr restrns sunt termofile - cele patogene au temperatura optim la 37C, iar altele sunt adaptate la temperaturi sczute (0-3C). Majoritatea sunt inactivate la temperaturi de 80C; cei mai rezisteni spori sunt distrui la 88C/10 minute.
2

Laborator Microbiologie general|

Muco ormuc cedo

1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale) colonii dense, p sloase i o culoare ce variaz de la cenuiu-argintiu p la e e n

glbui; 2. Caractere microscop C m pice Spora angioforii lungi i neramifica de obicei perpen ai, ndiculari pe hifa vegetativ; Spora angii sferici i; Colum mela form cilindric piriform sau oval; ma , Colar se ob rul bserv prin ruperea sau solubilizar membra u rea anei sporan ngelui i eliber rarea sporilo or; Spora angiosporii oval-cilindrici, nete i hialini. ezi 3.

Rspndire i rol R e

se nt tlnete pe resturi vege etale i dejec cii. produ muceg uce irea cerealelor, pinii, a produsel lactate a lor acide, a cr i rnii prepara atelor de car rne.

orator Microb biologie gene eral| Labo

Rh hizopu usstolo onifer r

1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale) colonii extinse, cu un miceliu dens, psllos i culoar cenuie u u re

2.

Caractere microscop C m pice Stilos sporangele sferic, de culoare b e d brun - neagr la maturitate; Colum mela se emisferic, cu apofiza la c arg; Spora angiosporii elibera prin sparg ai gerea spora angelui sunt de form o t oval,

brun - n nchis. 3. Rspndire i rol R e n nat tur, n sol i pe produs vegetale; se ; altera area fructelo i legumelor depozita or ate; produ muceg uce irea produs selor alimentare i poate elabora m e micotoxine.

La aborator Micro obiologie gen neral|

Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL MUCEGAIURILOR Scopul: Cunoaterea mucegaiurilor i utilizarea adecvat a noiunilor necesare identificrii

Mucor mucedo

Rhizopus stolonifer

NUME/PRENUME STUDENT

GRUPA Data Cadrul didactic

Asperg A gillusn niger

1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale)

colonia se dezvo rapid, cu un mice catifelat de culoar alb sau albolt c eliu t, re u glbuie. Odat cu formarea co onidiosporilor, colonia capt un a aspect gran nular i culo oarea devine brun nchis - negru; revers coloniei poate fi inc sul color sau co olorat n galben-pal; ma arginile colo oniilor rmn albe sau sla glbui. a ab 2. Caractere microscop C m pice

Conid dioforii se dezvolta de obicei direc din substr d ct rat; Vezic cula este ma sferic sau globoa are, as; Fialid dele se dez zvolta radial pe ntreaga suprafaa lateral a veziculei i sunt a a dispuse n dou rnduri: e I. Fialidele primare sunt mai lungii dect cele secundare; p II. Fialidele secundare sunt mult m scurte. e mai Fialos sporii se de ezvolta basipetal, n lan nuri lungi, d fialidele secundare; au o din form sferic sau globoas. s g 3.

Rspndire i rol R e

se nt tlnete n sol, materii vegetale descomp n punere, mic croflora veg getal (tubercu rdcini, semine, fr uli, , ructe, cerea i produsele lor de prelucrare,d ale) depozite, piv vnie, sli de fabricaie. f tulpini seleciona se folos ate sesc industr pentru o rial obinerea de acizi orga anici: acid glu uconic, galic citric, fuma oxalic. c, aric,
orator Microb biologie gene eral| Labo

Aspergi illusor ryzae

1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale) colonia are culoa glbuie spre galben are s n-orange, br run-oliv; revers coloniei este incolor sul r.

2.

Caractere microscop C m pice Conid dioforii sun nali cu pe nt erei subiri i aspect ru ugos, sub ve ezicul. Capu conidial este sferic. ul e Vezic cula este sfe eric i prez zint pe 2/3 din suprafa aa Fialid dele sunt un niseriate. Un neori pot fi p prezente i f fialide secun ndare. Conid diosporii su elipsoida piriformi, sau globo la maturita unt ali, i ate

3.

Rspndire i rol R e

se po oate izola din sol, de pe resturi veg e getale, sem mine, n spe ecial de orez (lat. z oryzae - orez), mal fructe, pro oduse alimen ntare.

Labo orator Microb biologie gene eral|

As spergi illusgl laucus s

1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale) colonia are culoa verde g are lbui sau verde cenuie e; revers coloniei este slab colorat n n sul nuane galb ben-verzui, brun - roc la cat

margini. 2. Caractere microscop C m pice

Conid dioforii sun netezi, in nt ncolori, cu d diametrul ca se lrge are ete treptat spre vezicul de form oval. , Capu conidial este mare, sferic sau ov ul e s val. Fialid dele se form meaz direc pe vezicu la parte superioa Adeseo pe ct ul, ea ar. ori vezicul se pot form noi conid ma diofori scur i. Fialos sporii au fo orma elipsoidal sau pir riform. 3. Rspndire i rol R e

este rspndit n natura, fiind frecvent n r d ntlnit n sol l. Asper rgillus glau ucus este agent de mucegire al produs selor alimentare conserv vate prin us scare (cere eale, semin oleaginoa e ase, fructe uscate) sa cu adao de au os zahr (s sucuri, sirop puri, fructe confiate). c a fost izolat de pe pine, lapte concentra unt. t e rat,

Labo orator Microb biologie gene eral|

Pen nicilliu umexp pansum m

1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale) colonia are culoa verde-alb are bstrui, cu a aspect catife elat; revers este colo n brunsul orat -nchis sau portocaliu-b brun.

2.

Caractere microscop C m pice Conid dioforii au perei netez p zi. Prezin fialide fie cu form de fiol, fie cu form cilindric. nt f Forme eaz conid elipsoidale, cu perei netezi. dii

3.

Rspndire i rol R e

Penic cillium expan nsum este un mucega psihrofil (p ai poate crete la -6C; c e crete viguros la 0C). Se dezvolt optim la 28 e 8C. Tempe eratura max xim de dez zvoltare est de te 35C. Este prezentat n mod frecv n vent pe me i pere la care pro ere oduce putre ezirea brun. A fost izolat i de pe cpuni i tomate. t e Foarte rspndit pe alimente cum sunt c e e carnea i pr rodusele din carne. n Produ micotox uce xine de tipul patulinei i citrininei.

Labo orator Microb biologie gene eral|

Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL MUCEGAIURILOR Scopul: Cunoaterea mucegaiurilor i utilizarea adecvat a noiunilor necesare identificrii

Aspergillus niger

Aspergillus oryzae

Aspergillus glaucus

Penicillium expansum

NUME/PRENUME STUDENT

GRUPA Data Cadrul didactic

Botryt B tiscine erea

1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale)

forme eaz colonii extinse, floconoase. M Miceliul este iniial alb, d devine g dar gri-gri nchis pe msura fo p ormarii conidiilor. revers este de culoare gri. sul 2. Caractere microscop C m pice

Conid dioforii se formeaz din hifele aeriene, a diferite lungimi, fie au ecare purtnd terminal un mnunchi de ramuri scurte, avn capetele rotunjite. d n s nd Conid diile formate pe aceste ramuri scu sunt elip e e urte psoidale, ne etede i lung gi. 3. Rspndire i rol R e

Botryt cinerea se dezvolta n domenii de temper ytis s a raturi minim de -2 - .me -5C, maxime de 28-35C i optime la 22-25C, i ntr-un in e C , nterval de p de 2-8. pH este un mucega ntlnit n zonele te ai n emperate, p legume (roii) i f pe fructe (strugur mere, per cpuni ). ri, re, poate s produc putrezirea fructelor i legumelor n condiii de refrigera e a i i are. n toa amnele nso orite produc "botritiza ce area nobila" cu obiner de vinu de " rea uri calitate superioara din boabele stafidite. e
Labo orator Microb biologie gene eral|

Botrytiscinerea

Laborator Microbiologie general|

Geo otrichu umcan ndidum m

1.

Caractere macroscop C m pice (colon niale)

miceliul are culo oare alb-cre em, nlimi reduse i textura as semntoar cu re cea a drojdiilor. Pe MEA colon sunt ex e niile xtinse, au cu uloare alb aspect pu , ulverulent. revers necolorat s t 2. Caractere microscop C m pice

Prezint hife vegetative, ramificate dichotomi v ic, pe car se dez re zvolta perpend dicular hife reproduc toare, care nu se difereniaz de hifele vege e e etative. Hifele reproduc e ctoare se fragmentea la matur f az ritate aproa n ntreg ape gime, formnd arthrospo hialini, cilindrici sau elipsoidali, cu capete rotunjite. d ori c u , Arthr rosporii au tendina de aranjare n zig-za iar la m u e ag, maturitate d devin sferici. 3. Rspndire i rol R e

se de ezvolt la temperaturi optime de 25-30C i m o maxime de 3 35-38C. Crete slab la temperaturi sub 10C. t i este agentul de contaminat al produ a te uselor lactat al zemii de murtu al te, uri, drojdiei comprima ate. Produc putrezire acr, special a fructelor citrice (l ce ea n r mi, grapefru n timp depozita acestor Produce rncezirea untului i a altor gr uit), pul arii ra. e a simi alimentare. este contaminan frecvent al utilajelor d industria laptelui, m c nt a din a motiv pentru care a fost denumit "mu ucegaiul utila ajelor".
Labo orator Microb biologie gene eral|

Alt ternar riaalte ernata a

1.

Caractere coloniale C c miceliul este puf fos, are ini culoare alb murda ial ar-gri, iar ap devine b poi brun-

cenuie e. revers coloniei are culoare brun pn la negru. sul e 2. Aspect mic A croscopic

prezin hife sub nt biri, septate e. forme eaz lanuri de conidii (cca., 10 c conidii), ram mificate nere egulat, la ca aptul unor co onidiofori fo oarte scur care nu se pot dis i stinge. Con nidiile prezi int 2-3 se epturi longitud dinale, sunt piriforme i dispuse cu partea asc i u cuita elong gata, spre co onidiofor. 3. Rspndire i rol R e

se n ntlnete n microflora cerealelo semine n a or, elor oleagin noase proa aspt recoltat cnd prez te zena lor po oate fi considerat drep indice de prospeime ale acesto pt e ora.

Labo orator Microb biologie gene eral|

Fusa ariumgrami inearu um

1.

Caractere coloniale C c

Miceliul are asp pect pslos, dens, i se extinde rapid n p e placa. Culo oarea este roz z-cenuiu spre auriu-b s brun Reversul este colorat n portocaliu- brun cu nuane mai deschise spre c margine e. 2. Aspect mic A croscopic n pre eparat micr roscopic se pot observ va: macroco onidii, car se for re rmeaz pe conidiofo simpli sau e ori ram mificai, de obicei n mnunchi, fu o usiformi, cu 5 septuri. clamidos spori, care e-sunt mono sau pluricelulari, de obicei globoi, o e formai interca alar, de-a lu ungul hifelo sau la nivelul macro or oconidiilor; sunt net tezi sau rug goi, hialini sau de culoare brun p pal. 3.

Rspndire i rol R e

Se de ezvolta opti la 24-26 im 6C, la pH 6 6,7-7,2. Este rspndit n natura i este fitop patogen al g gramineelo (putrezire n or ea coroana la plante de gru, po a orumb). Se po oate ntlni si pe plant (mazre, cartofi, ba te , anane). Poate elabora micotoxine de tipul scir e m d rpene (zear ralenone).
Labo orator Microb biologie gene eral|

Clad dospori iumhe erbaru um

1.

Caractere coloniale C c colonii catifelate, netede uo ridate, de culoare oliv. or e revers de culoare brun oliv pn la neg s e p gru-bleumar (ca o pat de cerne rin t eal).

2.

Aspect mic A croscopic prezin hife sub nt biri, septate e. Conid dioforii su ramifica neregula ceea c le conf unt ai at, ce fer un as spect

dendritic. forme eaz conid elipsoid dii dale pn la cilindric ce, cu ex xtremiti uneori neregul late datorita cicatricilor mugurale. Conidiile sunt de obic neseptat dar cele mari a r cei te, pot prez zenta 1-2 se epturi transversale. 3. Rspndire i rol R e

se po oate dezvolt pn la un aw de 0. i ntr-un domeniu de tempera ta u .88 atura cuprins ntre -1-0C i 32C. C este un contamin u nant frecvent al produs selor alimen ntare, este ntlnit pe c came i produ din carn oua, legume proasp use ne, pete, alune, cereale. produ pete negre pe carn pstrat n condiii de refriger uce nea , i rare.

Labo orator Microb biologie gene eral|

Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL MUCEGAIURILOR Scopul: Cunoaterea mucegaiurilor i utilizarea adecvat a noiunilor necesare identificrii

Botrytis cinerea

Geotrichum candidum

Alternaria alternata

Fusarium graminearum

Cladosporium herbarum

NUME/PRENUME STUDENT

GRUPA Data Cadrul didactic

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

TEHNICI DE IZOLARE A CULTURILOR PURE


Tehnicile de izolare a microorganismelor, indiferent de natura lor, presupun operaii de prelevare a probelor biologice din medii naturale, inoculare n medii de cultur specifice i, dup cultivare n condiii optime, izolarea i studiul coloniilor izolate, repicare pentru obinerea de culturi pure.

Prin cultur pur se nelege biomasa de celule rezultate prin reproducere dintr-o singur celul aflat ntr-un mediu nutritiv steril cu volum limitat. Astfel, o cultur pur este format din celule aparinnd unei singure specii sau unei singure tulpini.
In funcie de principiul realizrii lor, metodele de izolare a culturilor pure pot fi clasificate n dou grupe mari, i anume: metode bazate pe principiul separrii fizico-mecanice a celulelor; metode biologice. La rndul lor, fiecare din aceste dou grupe cuprinde metode generale, care se preteaz a fi utilizate pentru izolarea majoritii microorganismelor, sau metode de izolare specifice pentru un anumit grup sau un microorganism individual. Procedee fizice de izolare a culturilor pure Metoda Koch Se bazeaz pe rspndirea microorganismelor recoltate din medii naturale ntr-un mediu nutritiv i fixarea distanat a celulelor n urma solidificm mediului cu formare prin multiplicare de colonii izolate ntre ele. Metoda este folosit n special pentru izolarea culturilor pure de drojdii. Mediul de rspndire este mustul de mal cu gelatin, repartizat cte 20cm3 n 3 eprubete, fluidificat i meninut la 35-40C. Din proba aleas pentru izolare se recolteaz celulele cu ajutorul unei anse, care apoi este trecut succesiv n cele 3 eprubete. Dup inoculare i uniformizare, coninutul fiecrei eprubete se repartizeaz n cte o plac Petri, iar prin solidificarea mediului celulele care rmn fixate n gel vor forma prin multiplicare colonii izolate. n funcie de densitatea celulelor recoltate iniial, n placa a 2 a sau a 3 a pot exista colonii izolate (la o distan de cca. 2 cm), iar dup studiul caracterelor microscopice ale coloniilor reprezentative se face repicarea n eprubete cu Malt Extract Agar, obinndu-se culturi pure (fig. 1).
1

Laborator Microbiologie general|

a gineria Alimen ntelor Facultatea tiina i Ing

Fig 1. Tehnic de izolare a culturilo pure g. ca e or Metoda scarificat n plci Petri sterile se repartiz P e zeaz mediul de cultur adecvat ( r (BCA sau M MMA) (fig. 2 2).

Fig. 2 Repartiz zare mediu d cultur a de adecvat Cu ajuto firului metalic se recolteaz celule din mediul nat orul m tural sau d culturi m din mixte (fig. 3), apoi cu firu ncrcat cu celule se traseaz striuri dife ul s ferite pe suprafaa med diului solidifica astfel nc prin drum ct mai sinuos par at, ct mul i rcurs de fir (Fig.4), ntr zon a plcii r-o celulele s rmn ataate de mediu i prin termo e ostatare 48-72 h s se dezvolte i s e formeze colonii izola ate.

La aborator Micro obiologie gen neral|

a gineria Alimen ntelor Facultatea tiina i Ing

Fig 3 Recoltar celulelo din cultur mixte g. rea or ri Se realiz zeaz apoi studiul morf s fologic al co oloniilor repr rezentative culturile c i care interes seaz sunt repicate n epru ubete cu me ediu steril, obinndu-s astfel cult pure (fig 5). o se turi g.

Fi 4 Trasar striuri pe suprafaa unui mediu solidificat ig. re e

Fig. 5 Obin nere de cult pure turi

La aborator Micro obiologie gen neral|

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

TEHNICI INDIRECTE (CULTURALE) DE EVALUARE A NUMRULUI DE MICROORGANISME


Tehnica clasic de numrare prin cultivare pe medii dense
Metoda culturala Koch

Metodologia de analiz presupune inoculare n masa mediului solidificat, cnd 1 cm3 din fiecare diluie se transfer cu cte o pipet steril n plci Petri sterile. Peste suspensia din fiecare plac se repartizeaz cte o eprubet de mediu de cultur specific, cu agar (10-15 cm3), fluidificat i temperat. Mediul se omogenizeaz cu suspensia din plac prin micri orizontale, circulare ale plcii. Dup solidificarea mediului, prin termostatare n condiii optime, se vor forma colonii att la suprafaa mediului ct i n profunzimea acestuia.

Acest mod de cultivare este cel mai favorabil pentru microorganismele facultativ anaerobe, dar i microorganismele aerobe le tolereaz destul de bine. n cazul microorganismelor anaerobe se recomand cultivarea n dublu strat, adic dup nglobarea celulelor n mediu i solidificare, primul strat de mediu se acoper cu nc un strat de mediu steril.
Laborator Microbiologie general|

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

Citirea i interpretarea rezultatelor Dup termostatarea n condiii optime, apariia vizibil a coloniilor va depinde de particularitile fiziologice ale microorganismelor cultivate i de condiiile de cultivare, de obicei dup 48-72 h de cultivare. n funcie de numrul de colonii evideniate n plcile din care s-a fcut numrarea n, se va calcula numrul de microorganisme pe gram sau cm 3 prob de analiz, cu formula:

N numrul de celule/cm3(g) prob; n suma numrului coloniilor din plcile din care se face numrarea; x1 numrul plcilor din prima diluie aleasa pentru numrare; x2 - numrul plcilor din a doua diluie aleasa pentru numrare; k coeficientul de diluie corespunztor primei diluii aleas pentru numrare; 0,1 coeficient care egaleaz diluiile.
Atenie!!! Numrarea se realizeaz din plcile Petri n care s-au dezvoltat ntre 25 250 de colonii

n cazul n care numrul de colonii pe plac este mare, n imposibilitatea repetrii analizei, pentru a nlesni numrarea fie se mparte placa n mai multe sectoare, se numr coloniile pe un sector i, n final, se nsumeaz coloniile pe ntreaga plac, fie se delimiteaz pe reversul mediului o suprafa de 1 cm2, care conine un numr mediu de microorganisme, se numr coloniile de pe aceast suprafa i, n final, se raporteaz la total suprafa mediul din plac.

Laborator Microbiologie general|

Tema: TEHNICI INDIRECTE MICROORGANISME

(CULTURALE)

DE

EVALUARE

NUMRULUI

DE

Scopul: Cunoaterea i utilizarea adecvat a noiunilor necesare evalurii numrului de microorganisme 1. Completai schema de lucru pentru realizarea diluiilor si inocularea probelor

2. nregistrai in tabelul de mai jos numrul de colonii/plac (in plcile selectate pentru numrare) Proba Nr. colonii/plac Diluia 1 2 3. Stabilii gradul de contaminare exprimat in uniti formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs: Proba 1 _______________ Proba 2 _______________

NUME/PRENUME STUDENT GRUPA Data

Cadrul didactic

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

METODA DIRECT DE NUMRARE A BACTERIILOR N PREPARATE FIXATE I COLORATE METODA BREED


Celulele de bacterii aflate ntr-un volum cunoscut de lichid se repartizeaz pe o suprafa limitat de frotiu, iar dup fixare i colorare simpl se stabilete numrul de celule prin examen microscopic direct. 2-6 cm (a).
2

Pe o lam de sticl degresat se contureaz cu markerul o suprafa Sd de

Se inverseaz lama i, central, cu ajutorul unei micropipete sterile, se plaseaz o pictur din suspensia de analizat cu un volum cunoscut Vp, egal cu 0.02-0.05 cm3 (b). Imediat cu ajutorul firului se repartizeaz cantitatea de prob ct mai uniform, pe ntreaga suprafa conturat.

Se realizeaz uscarea n curent de aer cald (c, d), fixarea (de preferat cu soluie de alcool 96%, timp de 20 min) (e), colorarea simpl (f), splarea (g) i uscarea.
1

Preparatul se studiaz apoi la microscop, cu obiectiv de imersie, avnd grij ca pictura de ulei de cedru s fie pus n momentul n care se face numrarea. Se numr celulele de bacterii din mai multe cmpuri microscopice (minimum 25; n=600-1000) aflate n diferite zone ale frotiului. Dup numrare; se
Laborator Microbiologie general|

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

calculeaz numrul mediu de celule pe cmp microscopic (x = numrul de cmpuri cercetate):

Pentru determinarea numrului de celule prezente ntr-un gram sau cm3 produs analizat este necesar s se cunoasc: gradul de diluie, volumul de suspensie folosit la obinerea frotiului, mrimea suprafeei delimitate pe care s-a realizat frotiul i suprafaa cmpului microscopic. Suprafaa cmpului microscopic Sc se determin cu ajutorul micrometrului obiectiv. Se nlocuiete preparatul analizat cu lama micrometrului obiectiv i, cu acelai obiectiv cu care s-a fcut numrarea, se msoar diametrul cmpului dc cu ajutorul scrii gradate (1 mm:100 diviziuni): unde: nd este numrul de diviziuni de pe scara micrometrului obiectiv care se cuprind exact n cmpul microscopic:

Numrul de cmpuri microscopice posibil de studiat pe suprafaa de frotiu delimitat - Nc se calculeaz cu formula:

Numrul de bacterii prezente ntr-un cm3 sau un g produs analizat se determin cu formula: n care: k este coeficientul de diluie.

Laborator Microbiologie general|

Tema: METODA DIRECT DE NUMRARE A BACTERIILOR N PREPARATE FIXATE I COLORATE - METODA BREED Scopul: Cunoaterea i utilizarea adecvat a noiunilor necesare evalurii numrului de microorganisme 1. nregistrai datele obinute n tabelul de mai jos:
Suprafaa delimitat, cm2 Volumul suspensiei de analizat, cm3 Numrul mediu de celule pe cmp microscopic:
x (numrul de cmpuri cercetate) n (nr. celulele de bacterii) x (numrul de cmpuri cercetate) n (nr. celulele de bacterii)

Sd = Vp =

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

dc = Sc =

Diametrul cmpului microscopic, mm Suprafaa cmpului microscopic, cm2

Numrul de cmpuri microscopice pe suprafaa de frotiu delimitat

Nc =

Numrul de bacterii prezente ntr-un ml sau un g

N=

NUME/PRENUME STUDENT GRUPA Data Cadrul didactic

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

METODE DIRECTE DE NUMRARE NUMRAREA CU CITOMETRE


Celulele de drojdii i sporii de mucegai se pot numra, prin examen microscopic direct, cu ajutorul citometrelor (camerelor de numrat) . Se cunosc mai multe tipuri de citometre: Thoma, Trk, Brker, Rosenthal, Goreaev .a., construite pe acelai principiu. Un citometru este o lam de sticl groas, prevzut cu trei platforme separate ntre ele prin rigole n sticl. Platforma central este denivelat fa de celelalte dou cu o nlime de 0,1- 0,2 mm (nscris pe fiecare camer). Pe platforma central este gravat o reea de linii perpendiculare, care delimiteaz o anumit suprafa divizat de ctre linii perpendiculare n microcelule de form ptratic (ptrele elementare). Diferenierea dintre tipurile de citometre const n mrimea variabil a suprafeei unui ptrel elementar, n cazul citometrului Thoma, suprafaa de 1 mm2 este divizat de ctre linii n 400 de ptrele elementare cu (Fig. 1) latura de 1/20 mm.

Fig. 1 Profilul i reeaua citometrului Thoma


1

Pentru numrare se plaseaz o pictur din suspensia de celule de analizat pe platforma central, n dreptul suprafeei delimitate. Peste suspensie se plaseaz o lamel care se sprijin pe cele dou platforme laterale i astfel ntre lamel i citometru se creeaz o pelicul de lichid cu nlime egal cu denivelarea platformei centrale (0,1 mm).
Laborator Microbiologie general|

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

Preparatul obinut se studiaz la microscop cu obiectiv cu grosisment x 40, cnd n cmpul microscopic poate fi vizualizat un grup de 16 ptrele elementare, din care se numr celulele a cror suprafa se afl mai mult de jumtate n interiorul careului de 4x4 ptrele elementare. Se fac numrri de celule din mai multe cmpuri microscopice (n = 100) i se calculeaz numrul mediu de celule pe un ptrel elementar. Suprafaa (S) de 1 mm2 este divizat de ctre linii n 400 de ptrele elementare cu latura de 1/20 mm. Suprafaa ptrelului elementar este:

nlimea platformei centrale:

Volumul ptrelului elementar:

Numrul mediu de celule pe un ptrel elementar: Numrul de celule prezente ntr-un cm3 de suspensie de analizat se determin cu formula:

n care: n - numrul mediu de celule pe un ptrel elementar; k - coeficient de diluie. n cazul bacteriilor, aceast metod este greu de aplicat, att din cauza dimensiunilor reduse ale celulelor ct i a faptului c de multe ori ele prezint mobilitate.

Laborator Microbiologie general|

Tema: METODE DIRECTE DE NUMRARE NUMRAREA CU CITOMETRE Scopul: Cunoaterea i utilizarea adecvat a noiunilor necesare evalurii numrului de microorganisme 1. Analizai profilul i reeaua citometrului Thoma

2. nregistrai datele obinute n tabelul de mai jos:


Suprafaa ptrelului elementar, mm 2 Spe =

nlimea platformei centrale, mm

h=

Volumul ptrelului elementar, cm 3

Vpe n (nr. celulele )

Numrul mediu de celule pe un ptrel elementar: x (numrul de cmpuri n (nr. x (numrul de cmpuri cercetate) celulele ) cercetate) 1 6 2 7 3 8 4 9 5 10 Numrul de celule prezente ntr-un cm3 de suspensie

N=

NUME/PRENUME STUDENT GRUPA Data Cadrul didactic

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

INFLUENA FACTORILOR DE MEDIU ASUPRA DEZVOLTRII MICROORGANISMELOR


n procesul de nutriie i deci n cel de dezvoltare a microorganismelor, acestea sunt supuse influenelor unor factori de mediu care condiioneaz activitatea microbian determinnd fie stimularea creterii i reproducerii, fie inhibarea activitii (inactivarea microorganismelor).

Procesele metabolice se desfoar n limite stricte de temperatura, specifice fiecrui microorganism. Factorul temperatur poate favoriza sau inhiba dezvoltarea microorganismelor, iar n anumite cazuri poate chiar determina moartea acestora.

Modul de lucru Pentru a testa influena temperaturii asupra dezvoltrii microorganismelor se folosesc dou microorganisme test (Bacillus subtilis i Saccharomyces cerevisiae), sub form de suspensie. Pentru fiecare microorganism luat n studiu, se iau cte trei plci Petri sterile. Cu o pipet steril se introduc n fiecare plac, cate 1 cm3 suspensie. n fiecare plac Petri se toarn apoi cca. 15 cm3 mediu de cultura (BCA bulion de carne cu agar, pentru Bacillus subtilis i MMA must de mal cu agar, pentru Saccharomyces cerevisiae) fluidificat i rcit la 455C. Mediile se repartizeaz uniform n plci prin rotirea acestora n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea. Pe capacul plcilor se noteaz numele probei, mediul utilizat i apoi se termostateaz la temperaturi de 4, 25, 37C, timp de 3 zile. Dup perioada de termostatare se va evalua creterea microorganismelor n fiecare plac i se va nota nivelul de cretere, n tabelul din fisa de lucru.

Pentru a aprecia dezvoltarea microorganismelor sau activitatea enzimelor este necesar s se cunoasc valoarea activitii apei.

Laborator Microbiologie general|

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor

Disponibilitatea apei dintr-un mediu de cultur pentru transferul de substane i reaciile chimice este exprimat prin activitatea apei (aw). Acest parametru ia valori de la 0 la 1. Prezena substanelor solubile n apa face ca activitatea apei pure s scad sub valoarea 1. Cu ct concentraia unei soluii este mai mare, cu att scderea valorii activitii apei este mai mare i vice-versa, ceea ce poate crea un soc osmotic.

Mod de lucru Pentru a testa influena temperaturii asupra dezvoltrii microorganismelor se folosesc dou microorganisme test, Bacillus subtilis i Saccharomyces cerevisiae, sub form de suspensie i medii de cultura cu concentraii diferite de sare (0%, 0.5%, 2% NaCl)/ diferite activiti ale aw. Pentru fiecare microorganism luat n studiu, se iau cte trei placi Petri sterile. Cu o pipet steril se introduc n fiecare plac, cate 1 cm3 suspensie. n fiecare plac Petri se toarn apoi cca. 15 cm3 mediu de cultura (BCA bulion de carne cu agar pentru Bacillus subtilis i MMA must de mal cu agar pentru Saccharomyces cerevisiae) fluidificat i rcit la 455C. Mediile se repartizeaz uniform n placi prin rotirea acestora n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea. Pe capacul plcilor se noteaz numele probei, mediul utilizat, concentraia de sare i apoi se termostateaz la temperatura de 25C timp de 3-5 zile plcile inoculate cu suspensie de Saccharomyces cerevisiae i temperatura de 37C, timp de 48 ore, plcile inoculate cu suspensie de Bacillus subtilis. Dup perioada de termostatare se va evalua creterea microorganismelor n fiecare plac i se va nota nivelul de cretere n tabelul din fisa de lucru.

Laborator Microbiologie general|

Tema: FACTORI MICROORGANISMELOR

CARE

INFLUENEAZ

DEZVOLTAREA

Scopul: nelegerea modului n care diveri factori influeneaz dezvoltarea microorganismelor 1. Influena temperaturii asupra dezvoltrii microorganismelor
Notai n tabel nivelul de cretere a microorganismelor dup termostatare la diferite temperaturi.
MICROORGANISM 4C Bacillus subtilis Saccharomyces cerevisiae
++ cretere maxim + cretere medie - cretere nul

TEMPERATURA 25C 37C

2. Influena activitii apei asupra dezvoltrii microorganismelor


Notai n tabel nivelul de cretere a microorganismelor dup inoculare pe medii de cultura cu concentraii diferite de NaCl si valori diferite ale activitii apei.
MICROORGANISM 0% Bacillus subtilis Saccharomyces cerevisiae
++ cretere maxim + cretere medie - cretere nul

Concentraie NaCl/aw 0,5%

2%

NUME/PRENUME STUDENT GRUPA Data

Cadrul didactic