1.

INTRODUCERE

“În domeniul observaţiei, hazardul nu

favorizeazå decât minţile pregătite”
- L. Pasteur

Existenţa lumii microbiene a r ămas necunoscut ă până la inventarea microscopului la

începutul secolului al XVII-lea. Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723), savant olandez, a
fost primul care a observat cu ajutorul unui “microscop” rudimentar fabricat de el însuşi,
particulele invizibile cu ochiul liber: sfere, bastonaşe, spirili.
Microorganismele au fost descoperite în sec. al XIX-lea şi clasificate în regnul
vegetal. Haeckel (1866) propune crearea regnului Protista, alături de cel animal şi vegetal.
Astfel, el regrupeaz ă organismele unicelulare sau pluricelulare care nu formeaz ă ţesuturi
diferenţiate în: alge, ciuperci, protozoare şi bacterii.
În 1978, fiinţele vii au fost clasificate în 5 regnuri, dup ă Whittaker şi Margulis:
(Prokaryotae, Protoctista, Fungi, Plantae şi Animalia), urmând ca , odat ă cu dezvoltarea
biologiei moleculare, C. Woese să propună, în 1990, o nou ă clasificare în trei “domenii”:
Archaea, Bacteria şi Eucarya.
Microbiologia este ştiinţa care se ocup ă cu studiul microorganismelor, fiin ţe
unicelulare sau multicelulare microscopice. Aceast ă ştiinţă biologică este scindată în mai
multe specialităţi: micologie, bacteriologie, virologie, algologie, protozoologie.

1
 2. LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE - GENERALIT ĂŢI

Laboratorul de microbiologie trebuie s ă cuprindă două compartimente:

- o sală de pregătire a mediilor şi obiectelor de lucru şi de decontaminare,
conţinând mese, un autoclav, o etuv ă, un congelator şi un frigider (care va fi utilizat şi
pentru păstrarea tulpinilor microbiene). Tot aici se poate stoca sticl ăria, mediile de cultură
precum şi reactivii.
- o sală de lucrări propriu-zise, de manipulare a culturilor microbiene, la ad ăpost de
curenţii de aer, dotat ă cu mese cu suprafa ţă netedă, rezistentă, impermeabilă, cu conducte
de gaz şi prize electrice, un sistem de vid şi de aer comprimat şi o hotă sterilizabilă, cu
radiaţii ultraviolete (eventual o hot ă cu flux laminar). În măsura în care este posibil, în
legătură cu aceast ă sală, ar trebui să existe anexe prev ăzute cu termostate la diferite
temperaturi ( 250C, 300C, 370C, 440C, 550C).
Manipulările de culturi microbiene sau de produse susceptibile s ă conţină
microorganisme se efectueaz ă ţinând cont de unele tehnici particulare prin care s ă se evite
cele două tipuri de contaminare:
1. contaminarea culturii sau a produsului ce trebuie analizat datorit ă personalului sau
mediului inconjurător;
2. contaminarea personalului sau a mediului înconjurător de către microorganismele
studiate.
In laboratorul de microbiologie, opera ţia de bază este transferul de microorganisme
dintr-un recipient în altul, lucrare ce se execut ă în zona steril ă de protec ţie din jurul flăcării
becului de gaz.
Sticlăria cel mai des utilizat ă în laboratorul de microbiologie const ă în eprubete de
diferite dimensiuni, flacoane Erlenmeyer, pl ăci Petri, pipete Pasteur şi pipete gradate. În
ultima perioadă sunt din ce în ce mai mult utilizate recipientele şi pipetele din plastic, de
unică folosinţă. Pentru prelevarea şi inocularea culturilor se utilizeaz ă ansa sau firul
metalic, fabricate din nicrom. Ustensilele de etalare permit repartizarea uniform ă a inoculului
pe suprafaţa mediilor solidificate şi pot fi fabricate prin îndoirea unui tub sau a unei baghete
din sticlă. În afara acestor ustensile curente de lucru, mai pot fi întrebuinţate o serie de alte
instrumente, în funcţie de opera ţia efectuată.
Laboratorul de microbiologie trebuie s ă aibă în dotare urm ătoarele aparate şi
echipamente:

2
• robinet cu apă caldă şi rece, de preferinţă acţionat cu piciorul;
• hotă cu flux laminar sau ni şă sterilizabilă, indispensabilă lucrărilor de
microbiologie
• bec de gaz tip Bunsen pentru lucrul în zona steril ă din jurul flăcării cu con albastru
şi pentru sterilizarea ansei
• etuvă pentru sterilizarea sticl ăriei
• termostat bacteriologic pentru incubarea culturilor
• autoclav pentru sterilizarea mediilor de cultur ă şi pentru decontaminarea obiectelor
• baie de apă termostatată
• frigidere pentru conservarea mediilor şi a culturilor
• balan ţe
• pH-metru
• microscoape

3
 3. TEHNICI DE STERILIZARE A OBIECTELOR ÎN LABORATORUL DE
MICROBIOLOGIE

Distrugerea microorganismelor sau sterilizarea este indispensabil ă pentru pregătirea

materialului de lucru şi a mediilor de cultură.
Un produs este considerat steril c ând nu mai con ţine forme de microorganisme ce
pot fi revitalizate. Există mai multe procedee de sterilizare care corespund diferitelor tipuri
de materiale ce trebuie tratate. În laboratorul de microbiologie de analize de rutin ă, căldura
reprezintă modalitatea de sterilizare cea mai întrebuinţată.

STERILIZAREA PRIN CĂLDURĂ

Căldura “umedă” Sterilizarea prin căldură “umedă” se efectueaz ă în autoclavul

cu aburi prin procedeul de autoclavare.
Principiu: În atmosfera de vapori de ap ă sub presiune, toate bacteriile (inclusiv formele
sporulate) sunt omor âte după 20 minute la 121 0C. Aceasta este metoda cea mai eficient ă de
sterilizare.
Autoclavul permite:
- pregătirea materialului (medii de cultur ă, diferite obiecte) în vederea utilizării în
laborator, prin distrugerea microorganismelor;
- decontaminarea materialelor dup ă folosirea în laborator (cel puţin 30 minute la
121 C). Microorganismele din produsele patologice, e şantioanele de apă şi produse
0

alimentare analizate, din culturile microbiene de laborator etc, trebuie neap ărat distruse.
Aceste dou ă operaţii ar trebui efectuate de preferin ţă în două autoclave diferite sau,
cel puţin,în mod separat.
Timpul de sterilizare
Duratele de sterilizare sunt date doar pentru obiecte, medii de cultur ă sau alte
substan ţe ce trebuie sterilizate în autoclav pentru analizele de rutin ă.

Materialul Temperatura (0C) Presiunea (barr) Timp (minute)

4
 sterilizat
Sticlărie curată 121 1 20
Apă , ser fiziologic 121 1 20
Parafină 121 1 20
Săruri minerale 121 1 20
Medii curente (bulion 121 1 15 - 20
nutritiv, geloză
nutritivă)
Lapte degresat 115 0,7 15
Medii conţinând 110 0,5 20
substan ţe termolabile
(ex. glucide)
Glucoză în soluţie 110 0,5 20

Controlul eficienţei sterilizării prin autoclavare este realizat adesea cu ajutorul unor
indicatori de sterilizare cum sunt h ârtiile indicatoare: sunt comercializate benzi de h ârtie
special imprimate pentru a vira culoarea dac ă au fost îndeplinite condiţiile de sterilizare.

Pasteurizarea
Sterilizarea trebuie să fie deosebită de pasteurizare, care reprezint ă doar un procedeu
de conservare utilizat în industria alimentară. Pasteurizarea const ă în tratarea produsului la o
temperatură în domeniul 56 0C - 850C, o durat ă variabilă de la câteva minute până la o or ă,
în mediu umed, în funcţie de produs.
În aceste condi ţii, majoritatea celulelor vegetative bacteriene sunt distruse, dar nu şi
formele sporulate.

Tyndalizarea
Tyndalizarea const ă în 2 - 3 pasteurizari repetate, alternate cu perioade în care proba
este menţinută în condiţii favorabile pentru germinarea endosporilor bacterieni, care devin
vulnerabili trecând în stare vegetativ ă şi sunt distru şi prin pasteurizare. Tyndalizearea se
poate realiza în baie de ap ă, de exemplu, în următoarele condi ţii: încălzire la 560C (până la
800C) timp de 1 oră, 3 - 7 zile consecutiv, cu un interval de 24 de ore.
Tyndalizarea se poate folosi pentru distrugerea microorganismelor în mediile ce
conţin substanţe termolabile.

Căldura “uscată”

5
 Sterilizarea prin căldură “uscată” se efectuează în sterilizatoarele cu aer cald (etuve).
Căldura “uscat ă” nu poate distruge bacteriile şi în special sporii bacterieni, dec ât la o
temperatură mai ridicată ca în cazul c ăldurii “umede”. Tratamentul pentru sterilizare cu
căldură “uscată” este de 4 ore la 140 0C sau 1 or ă la 1800C.
Un alt procedeu de sterilizare prin c ăldură “uscată” este flambarea, care se
efectueaz ă în flacăra becului de gaz pentru: extremitatea firului ansei, exteriorul pipetelor,
gâtul eprubetelor şi al flacoanelor.

ALTE PROCEDEE DE STERILIZARE

Sterilizarea prin filtrare

Filtrarea constă în trecerea unui produs lichid printr-un perete poros sau o membran ă
care reţine bacteriile. Se pot utiliza filtre de portelan (Chamberland), de sticl ă poroasă sau
membrane tip “Millipore”, cu pori de diferite dimensiuni.

Sterilizarea prin gaze toxice

Oxidul de etilen, de exemplu, este foarte utilizat pentru sterilizarea materialului
medico-chirurgical, a materialelor din plastic numite “sterile, de unic ă folosinţă” din
industrie.

Sterilizarea cu ajutorul radia ţiilor

Radiaţiile ultraviolete - sunt radiaţii cu utilizare curentă în laboratorul de
microbiologie; ele sunt bactericide, dar nu distrug sporii bacterieni. Acest tip de radia ţii
acţionează în mod direct şi au putere de penetra ţie scăzută (câţiva milimetri). Lămpile
“germicide” al căror efect se bazeaz ă pe acţiunea radiaţiilor UV cu lungimea de und ă de
254 nm sunt utilizate :
- pentru sterilizarea apei
- pentru sterilizarea incintelor şi a aerului ambiant

Radiaţiile gamma
Radiaţiile gamma fac parte din categoria radia ţiilor ionizante şi au un efect puternic
microbicid. Sunt dificil de produs şi de utilizat şi foarte periculoase datorit ă efectelor pe care
le au asupra materiei vii.
6
 Acest tip de radia ţii poate fi utilizat în sterilizarea materialului medical şi
microbiologic de folosin ţă unică sau pentru sterilizarea unor de şeuri.

3.1. PREGĂTIREA ŞI STERILIZAREA STICL ĂRIEI ÎN LABORATORUL DE

MICROBIOLOGIE

Pregătirea şi sterilizarea materialului în vederea utilizării în laboratorul de

microbiologie este o opera ţie deosebit de important ă deoarece exactitatea rezultatelor precum
şi reuşita desfăşurării proceselor microbiologice depind în mare măsură de rigurozitatea cu
care se efectueaz ă.
Principalele operaţii de pregătire a sticlăriei de laborator sunt:
- spălarea
- uscarea
- executarea dopurilor şi ambalarea - recipientele pot fi preg ătite cu dop din vat ă
hidrofobă pentru a nu p ăstra umezeala dup ă autoclavare. Din ce în ce mai folosite sunt
dopurile din celuloză comprimată (comercializate), sterilizabile pană la 2000C. Pentru
înlocuirea eprubetelor cu dop de vat ă, în scopul p ăstrării optime a culturilor, se pot utiliza
tuburi prevăzute cu capsule care se monteaz ă prin înşurubare.

Pentru evitarea contaminării mediilor de cultură utilizate în analiza microbiologic ă

sau în obţinerea culturilor microbiologice, sticlăria de laborator trebuie ambalată şi
sterilizată corespunzător. Sterilizarea se efectueaz ă la etuvă (sau pupinel), iar materialele
supuse acestei opera ţii trebuie să fie curate şi împachetate în hârtie sau a şezate în conteinere
metalice închise. Sterilizarea uscat ă se poate aplica pentru articole din sticl ă (plăci Petri,
baloane, pipete, eprubete), obiecte din por ţelan, instrumentar metalic fără suduri în cositor,
pulberi uscate etc. Aerul fiind slab conducător de căldură, sterilizatorul trebuie să
uniformizeze temperatura şi să asigure p ătrunderea aerului fierbinte în obiectele de
sterilizat. În calcularea timpului de sterilizare uscată trebuie avute în vedere urm ătoarele
etape:
• perioada de încălzire la temperatura de sterilizare, socotit ă în general o or ă;
• perioada de men ţinere a temperaturii de sterilizare;

• perioada de răcire în care scăderea temperaturii trebuie realizată treptat pentru

evitarea spargerii obiectelor de sticl ă prin şoc termic, aprox. 2 ore.
În practică se procedeaz ă la alegerea unei temperaturi de sterilizare de 180 o C şi a

7
unei durate de o or ă. Din exces de pruden ţă se practică sterilizări la temperaturi mai ridicate
sau de durate mai mari. În unele cazuri aceast ă practică este dăunătoare deoarece, de
exemplu, vata ordinar ă - la durate şi temperaturi mari de sterilizare uscat ă - eliberează
gudroane ce pot inhiba cre şterea microbiană.

Materiale utilizate:
- pipete;
- plăci Petri;
- eprubete;
- flacoane Erlenmayer;
- vată hidrofobă;
- tifon;
- hârtie ambalaj;
- etuvă.

Mod de lucru:
Se execut ă dopuri de vat ă hidrofobă pentru eprubete, astfel încât să poată fi extrase
uşor în timpul inoculării, iar densitatea materialului s ă asigure sterilitatea. Eprubetele se
introduc in co şul de sârmă şi se acoperă cu hârtie.
Pipetele se astup ă la partea opus ă vârfului, cu un dop subţire de vată care să
reţină microorganismele ce ar putea p ătrunde în pipetă pe la partea superioar ă. Pipetele se
ambaleaz ă într-o fâşie de hârtie care se r ăsuceşte în jurul tubului de sticl ă, începând de la
vârf.
Plăcile Petri se ambaleaz ă în hârtie de ambalaj, în funcţie de num ărul necesar.
Flacoanele Erlenmayer pentru medii de cultur ă se astup ă cu dop de vat ă înfăşurat în
tifon.
Toată sticlăria se sterilizează 1 oră la 180 oC la etuvă, timp socotit din momentul
atingerii temperaturii. După această perioadă etuva se opre şte şi se aşteaptă răcirea
materialului.

4. EXAMENUL MICROSCOPIC AL MICROORGANISMELOR

Studiul morfologiei microbiene nu poate fi conceput f ără utilizarea microscopului;

examenul microscopic joac ă un rol important în studiul şi identificarea germenilor, precum
şi în determinarea num ărului acestora.
8
 100 µm
domeniul microscopiei
optice celule epiteliale
10 µm globule roşii din sânge

bacterii tipice
1 µm domeniul
microscopiei
micoplasme electronice
100 nm
virusuri

10 nm (100 Α)
proteine

1 nm (10Α) aminoacizi

atomi
0,1 nm (1 Α)

MICROSCOPUL OPTIC

Microscopul optic se compune dintr-un stativ pe care sunt montate un sistem de

transmisie optică, o platin ă port-obiect şi un sistem de iluminare.

Sistemul de transmisie optică

9
 Ocularele au puterea de m ărire de 5x, 7x, 10x, 15x, 20x şi chiar 30x. În
lucrările curente cele mai des folosite sunt cele 7x şi 10x. Ocularele au rolul de a m ări
imaginea preparatului, dar şi de a aplatiza şi lumina câmpul optic.
Obiectivele reprezintă un sistem optic bine centrat, constituit din una sau mai multe
lentile destinate a forma o imagine real ă a obiectului. Puterea lor de m ărire este invers
proporţională cu distanţa focală, adică cu distanţa dintre obiect şi lentila pe care se
formează imaginea. Calitatea esential ă a obiectivelor este puterea lor de rezolu ţie. Aceasta la
rândul ei depinde de m ărimea deschiderii unghiului pe care îl face conul de raze care intr ă în
lentilă precum şi de indicele de refrac ţie al mediului dintre obiect şi lentilă. Obiectivele sunt
fixate prin înşurubare pe un revolver port-obiectiv care permite selec ţionarea rapidă a unuia
din ele, prin simpla rotire. Gama de obiective necesare în microbiologie se compune din trei
obiective cu puterea de m ărire de 10x, 20x, 40x şi un obiectiv cu imersie cu grosismentul
90x. Acest obiectiv se folose şte în cazul în care obiectul ce trebuie examinat este mai mic sau
dacă este necesar a se observa am ănunte foarte fine. La obiectivul cu imersie este necesar a
se interpune între obiect şi lentila frontală a obiectivului un lichid transparent (ulei de cedru,
ulei de parafină, balsam de Canada etc).

Sistemul de iluminare se compune din surs ă luminoasă şi dintr-un condensator.

Condensatorul este o pies ă care se găseşte imediat sub platina microscopului şi care
are rolul nu atât de a strânge (condensa) razele luminoase venite de la sursa de lumin ă, cât
de a m ări secţiunea conului de lumin ă pentru o mai bun ă claritate a imaginii.

Sistemul de reglare Deplasarea platinei port-obiect sau a sistemului optic se

efectueaz ă cu ajutorul unei cremaliere, prin intermediul a dou ă butoane: unul mare care d ă o
mişcare amplă şi rapidă (viza macrometrică) şi altul mic, pentru reglajul fin ( viza
micrometrică).

Modul de utilizare a microscopului

Preparatul este plasat pe platina microscopului, av ând grijă să fie bine fixat în
dispozitivul de prindere. Este selectat obiectivul; în general, un examen debuteaz ă cu
utilizarea obiectivului cel mai mic. În practică, se utilizează obiectivul 10x, apoi 20x pentru
un preparat necunoscut sau pentru drojdii şi mucegaiuri şi obiectivul 40x pentru bacterii. Se
reglează distan ţa lentilei obiectivului faţă de preparat prin mi şcarea vizei macrometrice şi a

10
celei micrometrice. (Obiectivele au o distan ţă de reglare care descre şte cu puterea lor).
Căutarea imaginii este apoi efectuat ă prin manevrarea butonului care ac ţionează cremaliera,
iar după fixarea imaginii se face o nou ă reglare a acesteia.
Curăţarea sistemului optic se efectuează regulat cu xylol şi nu cu alcool etilic.
Reglarea intensităţii luminii condensatorului se face ţinând seama de puterea de
mărire a obiectivelor; cu cât aceasta este mai mare, cu at ât poziţia condensatorului este mai
ridicată.

EXAMENUL PREPARATELOR ÎN STARE PROASP ĂTĂ

Acest tip de operatie const ă în examinarea unui microorganism într-un mediu lichid
între lamă şi lamelă.

4.1. STUDIUL MICROSCOPIC AL CULTURILOR DE DROJDII

Drojdiile reprezintă un grup taxonomic complex şi heterogen de microorganisme

unicelulare eucariote, care se înmulţesc prin înmugurire, ca form ă generală de reproducere
şi în mod particular prin ascospori. Una din propriet ăţile cele mai importante ale drojdiilor
este aceea de a fermenta o serie de zaharuri, în condi ţii de anaerobioz ă, cu formare de alcool
etilic, dioxid de carbon şi compuşi secundari, care dau aroma caracteristic ă produselor
fermentate, proprietate foarte mult utilizată în industria alimentar ă. Drojdiile au o
compozi ţie chimică valoroasă şi, după cultivare în condiţii de aerare sunt utilizate ca surs ă
de proteine cu denumirea de SCP (single cell protein) în alimentaţia omului şi a animalelor.
Celula de drojdie are în mod obi şnuit formă sferică, ovală, cilindrică, apiculat ă, sau
formă de sticlă, cu dimensiuni medii de 4 - 14 µm. Forma şi dimensiunea celulei sunt
caractere de specie şi pot fi influenţate de starea fiziologic ă şi de condi ţiile de cultivare.

Principiul metodei: Pentru evidenţierea caracterelor morfologice şi structurale ale drojdiilor

se folosesc preparate microscopice în stare proasp ătă, studiate la microscop cu obiectivele
10x, 20x, 40x.

Materiale utilizate:
- ca materiale biologice se vor utiliza o tulpin ă de Saccharomyces cerevisiae şi o

11
 tulpină de Candida utilis , cultivate pe mediu cu extract de mal ţ-agar.
- lame de microscop;
- lamele de microscop
- microscop;
- pipete sterile;
- ansă;
- eprubete sterile;
- albastru de metilen;
- alcool etilic 95 %;
- apă distilată 100 ml;
- sticluţă picurătoare.

Mod de lucru
a) Prepararea colorantului -solu ţie albastru de metilen
Se cântăresc 0,3 g albastru de metilen, peste care se adaug ă 30 ml alcool etilic 95 %.
După dizolvarea colorantului în alcool se adaug ă 100 ml apă distilată.

b) Eviden ţierea caracterelor morfologice

De pe suprafa ţa mediului de cultur ă se recoltează cu ansa o por ţiune din cultura de
drojdie care se amestec ă într-o eprubetă cu câţiva ml apă. Din suspensia de celule se depune
pe lama microscopic ă o picătură cu diametrul de ~ 0,7 cm, în zona central ă, cu ajutorul unei
pipete. Se acoper ă preparatul cu o lamel ă curată, evitându-se formarea de bule de aer. Se
examineaz ă la microscop cu obiectivele de 10x, 20x şi 40x, reţinându-se forma celulei,
prezenţa nucleilor, prezen ţa celulelor înmugurite.

c) Evidenţierea celulelor autolizate

O suspensie de celule de drojdie se amestec ă în volume egale cu o solu ţie de albastru
de metilen diluat şi după 3-5 minute se execut ă un preparat umed: celulele autolizate vor
apare intens colorate in albastru, comparativ cu celulele vii, necolorate. Într-un câmp
microscopic se vor determina num ărul total de celule şi separat, celulele autolizate, f ăcându-
se raportul acestora.

12
 4.2. STUDIUL MICROSCOPIC AL CULTURILOR DE MUCEGAI

Mucegaiurile (sau fungii filamentoşi) includ microorganisme de tip eucariot,

monocelulare sau pluricelulare, cu nutri ţie de tip absorbtiv, diferen ţiate din punct de vedere
morfologic şi care se reproduc prin spori sexua ţi sau asexua ţi. Corpul mucegaiurilor const ă
din celule filamentoase, ramificate, numite hife, care formeaz ă miceliul. Mucegaiurile pot fi
monocelulare, când se dezvoltă sub forma unei celule uriaşe cu ramificaţii (miceliu
coenocitic) sau pluricelulare, caz în care miceliul este septat prin pere ţi despărţitori (miceliu
necoenocitic). Aparatul reproduc ător este reprezentat de hifele reproduc ătoare purtătoare de
spori sexuaţi sau asexua ţi.

Principiul metodei: Pentru evidenţierea caracterelor morfologice şi structurale -hife

vegetative şi aparat reproduc ător - se efectueaz ă un preparat proasp ăt între lamă şi lamelă
sau un preparat în lactofenol, prin tehnica benzii adezive.

Materiale utilizate:
- culturi de Aspergillus niger şi Penicillium sp.în plăci Petri ;
- lame microscopice;
- lamele microscopice;
- microscop;
- pipete sterile;
- ansă;
- lactofenol;
- bandă adezivă transparentă.

Mod de lucru:
Se efectuează un preparat umed între lamă şi lamelă, în felul următor: din cultura în
plăci Petri se recolteaz ă cu ajutorul firului metalic, din partea marginal ă a coloniei şi f ără a
deranja structura iniţială a miceliului, o mică porţiune, care se desprinde u şor într-o
picătură de apă sterilă sau lactofenol de pe lama microscopic ă. Se aşează lamela evitând
formarea în preparat a bulelor de gaz şi se face studiul cu obiectivele 10x, 20x şi 40x. Pentru
menţinerea cât mai exactă a structurii aparatului reproduc ător, se poate aşeza uşor banda cu
partea adezivă peste cultura de mucegai din placa Petri, apoi se pune peste pic ătura de
lactofenol de pe lama microscopic ă. Se examineaz ă cu acelea şi obiective. Pentru cele dou ă
13
tulpini fungice se observ ă forma hifelor, prezenţa septurilor hifale, prezen ţa conidiforilor cu
organele de fructifica ţie specifice genurilor Aspergillus şi Penicillum .

4.3. EVIDENŢIEREA MICROSCOPICĂ A BACTERIILOR

Bacteriile sunt microorganisme monocelulare de tip procariot, cu un cromozom unic,

cu dimensiuni medii între 0,5 - 8 µm, care se înmulţesc asexuat prin sciziune binar ă,
izomorfă. Bacteriile au un rol major în natur ă în transformarea compu şilor organici în
compu şi anorganici simpli, prin procesul de mineralizare a materiei organice nevii,
contribuind la realizarea circuitelor unor elemente chimice de importan ţă vitală: carbon,
azot, sulf, fosfor ş.a. În procesele industriale, bacteriile sunt utilizate drept culturi starter în
unele procese fermentative din industria alimentar ă (fabricarea produselor lactate, în
panificaţie, la conservarea materiilor prime vegetale), la ob ţinerea de enzime, proteine,
aminoacizi, acizi organici, solven ţi, antibiotice, îngrăşăminte biologice, insecticide ,
vitamine, hormoni etc.

Principiul metodei: metoda se bazeaz ă pe efectuarea preparatului proasp ăt între lamă şi

lamelă din culturi bacteriene ob ţinute din Bacillus subtilis şi Lactobacillus sp .

Materiale utilizate:
- cultură în slanturi de Bacillus subtilis;
- cultură de Lactobacillus in mediu lichid (mediul MRS);
- lame microscop;
- lamele;
- ansă;
- apă distilată.

Mod de lucru:
Pe lama microscopic ă se pune o pic ătură de apă sterilă cu diametrul de 0,7 -1 cm.
Cu v ârful firului metalic se recoltează steril, la flacăra de gaz, o por ţiune dintr-o cultur ă de
Bacillus subtilis pe agar nutritiv, în eprubete. Cultura se omogenizeaz ă într-o picătură de
apă, apoi se ia o lamel ă curată , se sprijin ă pe lamă la un unghi de 45 o , se deplaseaz ă până
când lamela devine tangent ă la picătură şi se lasă să cadă peste aceasta: lichidul în exces

14
se absoarbe cu o h ârtie de filtru. Un preparat bun nu trebuie s ă prezinte bule de aer; acestea
pot determina aglomer ări de celule şi împiedică o bună observare a propriet ăţilor.
Pentru executarea preparatului din culturile lichide de Lactobacillus , se recolteaz ă din
proba omogenizat ă cu o pipet ă din care se lasă să cadă pe lamă o picătură, care se acoper ă
apoi cu lamela.
Se observă cu obiectivele 20x şi 40x. Se vor urm ări: în ambele cazuri- forma
celulelor, eventual formarea de lanţuri de bacili; prezen ţa sporilor bacterieni în cazul
preparatului cu Bacillus subtilis.

EXAMENUL PREPARATELOR BACTERIENE ÎN STARE USCATĂ

Efectuarea unui preparat în stare uscat ă sau frotiu const ă în etalarea probei de studiat
urmată de o uscare, de o fixare şi, eventual, de o colorare. Frotiurile sunt realizate frecvent
pentru bacterii sau pentru produse care con ţin bacterii, rareori pentru alte microorganisme.

4.4. TEHNICA DE EXECUTARE A PREPARATELOR USCATE. COLORATIA

GRAM

În anul 1884 Christian Gram a constatat c ă bacteriile reacţionează diferit în urma

aceleiaşi tehnici de colorare şi pune bazele metodei diferen ţiale de colorare ce îi poartă
numele , prin care bacteriile sunt împărţite in două mari grupe : Gram - pozitive şi Gram -
negative. Aceast ă afinitate tinctorială diferită faţă de coloran ţi este datorat ă structurii
deosebite a peretelui celular la cele dou ă categorii de bacterii : bacteriile Gram - pozitive se
colorează în violet prin aceast ă tehnică, în timp ce bacteriile Gram - negative primesc
culoarea roz sau ro şie a colorantului secundar utilizat. Peretele celular al bacteriilor Gram -
pozitive const ă într-un strat unitar şi omogen de peptidoglican, cu grosimea de 20 - 80 nm. În
contrast, peretele celular al bacteriilor Gram - negative este mai complex, format dintr-un
strat de peptidoglican de 1 -3 nm înconjurat de o membran ă externă de 7 - 8 nm.

15
Principiul metodei: Colorarea diferenţiată a celulelor în funcţie de structura peretelui
celular, prin metoda Gram, are la baz ă o tehnică în mai multe etape. În prima etapă, celulele
sunt colorate cu colorantul bazic cristal-violet, utilizat drept colorant primar. Cea de a doua
etapă cuprinde tratamentul cu o solutie de I 2 / KI, cu rol de mordant, care m ăreşte interacţia
dintre colorant şi componentele celulei. A treia etap ă este reprezentat ă de spălarea cu
alcool-acetonă, unde se diferen ţiază cele două tipuri de bacterii ; cele Gram pozitive re ţin
cristalul violet, în timp ce bacteriile Gram - negative pierd colorantul primar şi devin
incolore. În final, acestea din urm ă sunt colorate cu un alt colorant, secundar, cum este
safranina sau fuxina. În acest mod, cele dou ă categorii de bacterii r ămân colorate diferit,
putând fi diferen ţiate în funcţie de structura peretelui lor celular.

Materiale utilizate:
- cultură bacteriană;
- violet de genţiana;
- fenol cristalizat;
- iod;
- iodură de potasiu;
- alcool;
- acetonă;
- fuxină sau safranină
- ulei de imersie;
- lame de sticl ă;
- balanţă;
- pipete;
- baloane cotate;
- sticluţe picurătoare.

Mod de lucru:

A. Prepararea soluţiilor

1. Violet de genţiana:
- violet de gen ţiana……… 1 g
- fenol cristalizat…………5 g
- alcool etilic 96 %………10 ml
- apă distilată…………..100 ml
16
 Se triturează cristalele în mojar, se adaug ă câteva picături de glicerină şi treptat,
alcoolul, până devine ca o past ă, şi apoi cantitatea de ap ă. Se păstrează 48 ore, dup ă care
se filtrează şi se foloseşte la colorarea dup ă Gram.

2. Soluţie de Lugol:
- iod metalic………………1 g
- iodură de potasiu………. 2 g
- apă distilată…………..300 ml
Se dizolvă iodura de potasiu în 5 ml apă, se adaug ă cristalele de iod şi se dizolv ă,
apoi se adaug ă restul de apă până la 300 ml.

3. Fuxina Ziehl:
- fuxină bazică……………1 g
- fenol cristalizat…………5 g
- alcool etilic 96%………10 ml
- apă distilată………….100 ml
Se triturează cristalele în mojar, se amestec ă cu câteva picături de glicerin ă, se
adaugă alcoolul treptat, p ână se formeaz ă ca o past ă şi se adaug ă apă distilată. Se filtrează
după un repaos de 48 ore. Pentru solu ţia diluată se face un amestec cu ap ă distilată în
proporţie de 1/10.

B. Etapele de obţinere a frotiurilor colorate sunt următoarele:

• Pregătirea lamei: Lama perfect curat ă se sterilizează prin treceri consecutive ale
ambelor feţe prin flacăra becului de gaz şi se lasă să se răcească pe stativ, în
poziţie înclinată.
• Etalarea suspensiei de celule: Preparatul se realizeaz ă în picătură de apă sterilă în
care se suspend ă celulele recoltate cu firul de inoculare. Suspensia de celule se
întinde prin deplasarea firului ansei tangent cu lama, într-un strat uniform. Preparatul
de pe lama pe care s-a f ăcut etalarea şi uniformizarea materialului biologic poart ă
numele de frotiu.
• Uscarea frotiului: După uniformizare, frotiul se aşează pe stativul de uscare sau se
menţine în curentul de aer cald, la distan ţă de flacăra becului de gaz, pentru a se
produce evaporarea lichidului şi ataşarea celulelor bacteriene de suprafa ţa lamei.
• Fixarea frotiului const ă în omor ârea şi aderarea la lam ă a celulelor microbiene.

17
 Fixarea prin căldură se face trec ând frotiul uscat de trei ori, cu o mi şcare lentă,
prin flacăra becului de gaz, cu fa ţa opusă celei pe care se afl ă preparatul.

C. Tehnica de colorare constă în următoarele:

• Frotiul uscat şi fixat se acoper ă cu violet de gen ţiana, care se men ţine 1-2 minute,
după care se scurge şi se clăteşte cu ap ă.
• Frotiul se acoper ă cu solutie Lugol, cu rol de mordant, timp de 1 minut; se scurge şi
se clăteşte cu apă;
• Spălarea frotiului în 2-3 rânduri, cu picături din amestecul de alcool-acetonă (3/1);
• Frotiul se spală cu apă în jet subţire şi se colorează cu o soluţie de fuxină diluată
(1/10), care se men ţine pe preparat 1-2 minute, se scurge excesul de colorant, se
spală cu apă;
• Uscarea frotiului şi examinarea preparatului cu obiectiv de imersie.
Celulele Gram pozitive [G(+)] vor apare colorate în violet, celulele Gram negative,
[ G(-)], în roşu.

4.5. DETERMINAREA DIMENSIUNII CELULELOR CU AJUTORUL SCALEI

MICROMETRICE

Principiul metodei:
Măsurarea diametrului celulelor, sporilor sau hifelor poate fi efectuat ă utilizând un
sistem ocular-obiectiv prev ăzut cu un micrometru ocular şi un micrometru obiectiv.
Micrometrul ocular este o pl ăcuţă rotundă din sticlă foarte clară, pe care este
gravat ă o scară micrometrică. Acesta se introduce în tubul ocularului microscopic, cu fa ţa în
jos, după deşurubarea lentilei superioare.
Scara micrometrică este divizat ă în 50 de diviziuni egale notate de la 0 - 50, din 10 în
10. Valoarea unei diviziuni a sc ării micrometrice variază de la microscop la microscop, dar
şi în funcţie de obiectivul folosit la examinare. De aceea este necesar ca aceste valori s ă fie
determinate pentru fiecare microscop în parte şi, la acelaşi microscop, pentru fiecare
combinaţie ocular - obiectiv.
Etalonarea se face cu ajutorul unei lame speciale numit ă micrometru obiectiv sau
lamă micrometrică, pe care este de asemenea gravat ă sau fotografiat ă o scar ă lungă de 1

18
mm şi divizată în 100 p ărţi. Spre deosebire de scara micrometric ă a ocularului, valoarea
unei diviziuni de pe lama micrometric ă este cunoscut ă, fiind egală cu 1 / 100 dintr-un
milimetru, adică cu 10 micrometri. Deci intervalul dintre două diviziuni de pe lama
micrometrică este egal cu 10 micrometri.

Materiale utilizate:
- micrometru obiectiv (0,01 mm);
- micrometru ocular;
- microscop;
- culturi de drojdii şi mucegaiuri;
- lame microscopice;
- lamele microscopice;
- ac de inoculare.

Mod de lucru:
Etalonarea scării micrometrice
Se aşează lama cu micrometrul obiectiv pe platina microscopului şi se introduce
ocularul micrometric în ocularul st âng al microscopului, cu fa ţa in jos. Se prinde în c âmpul
microscopului scara micrometric ă a obiectivului (cu linii groase) şi se pune la punct p ână ce
apare foarte clar vizibil ă. Se caută să se suprapun ă cele două scări micrometrice aflate
acum în câmpul microscopului (aceea cu linii groase şi mai mari fiind scara obiectivului şi
aceea cu linii mai mici şi subţiri, scara ocularului). Se rote şte ocularul cu scara micrometric ă
astfel încât să se suprapună exact peste scara obiectivului. Se caut ă câte diviziuni ale
micrometrului obiectiv sunt acoperite exact de diviziunile micrometrului ocular. Practic se
procedeaz ă astfel: se caut ă prima diviziune a scării obiectivului, care se suprapune exact
peste una din liniile subţiri ale scării oculare. Se num ără a câta diviziune a micrometrului
ocular se suprapune din nou exact peste o diviziune a micrometrului obiectiv.
Pentru stabilirea valorii unui interval dintre dou ă diviziuni ale ocularului micrometric
(care se mai numeşte şi indice sau coeficient micrometric), se calculeaz ă astfel: dacă o
diviziune a obiectivului micrometric este egal ă cu 0,01 mm, atunci fiecare diviziune a
micrometrului ocular va fi egal ă cu 0,01/ nr de diviziuni dup ă care se suprapun.
Etalonarea micrometrului ocular se va face pentru obiectivele 20x şi 40x, astfel: dac ă
n gradaţii de pe ocular corespund la una sau p grada ţii de pe obiectiv, o singur ă gradaţie de

19
pe ocular va avea valoarea 0,01/q sau (p/q) ⋅ 10-2 mm.
Prin acelaşi procedeu se determin ă indicele micrometric al fiecărui microscop, pentru
toate combinatiile ocular-obiectiv, care se scriu apoi pe o list ă ce se aşează în interior, pe
uşa cutiei microscopului.
Pentru măsurarea dimensiunilor celulei se va a şeza preparatul microscopic proasp ăt
între lamă şi lamelă, pe platina microscopului şi suport, se va pozi ţiona astfel încât să
poată fi determinat numărul de gradaţii de pe ocular, corespunz ător diametrului mare şi
diametrului mic, rotindu-se ocularul şi dispozitivul de pozi ţionare al platinei-port obiect.
Cunoscându-se valoarea unei diviziuni {(p/q) ⋅ 10-2} şi numărul de diviziuni citite pe
scală, se va determina valoarea dimensiunii celulei: (n ⋅ p/q)⋅ 10-2 mm.

5. PREPARAREA ŞI STERILIZAREA MEDIILOR DE CULTUR Ă

Un mediu de cultur ă reprezintă un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie s ă

asigure microorganismelor cantitatea necesar ă de apă, sursa de carbon, de azot, s ăruri
minerale, factori de creştere, deci care să le furnizeze substan ţele şi energia necesare în
procesele de cre ştere, reproducere şi întreţinerea funcţiilor vitale.
Mediul de cultur ă trebuie să îndeplineasc ă următoarele condiţii:
• să corespund ă din punct de vedere nutritiv,
• să aibă o concentra ţie a substantelor dizolvate care s ă nu influenţeze negativ
schimburile osmotice ale celulei
• să nu conţină substan ţe toxice,
• să aibă un anumit pH
• să fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel încât să se dezvolte numai celulele
introduse prin inocul.
Mediile de cultur ă se folosesc în practica de laborator sau în practica industrial ă şi
sunt foarte diferenţiate în funcţie de scopul urm ărit. În tehnica de laborator mediile se
folosesc pentru izolarea din mediul natural a diferitelor microorganisme, pentru ob ţinerea de
culturi pure, pentru întreţinerea culturilor selec ţionate. În scopuri industriale, mediile de
cultură sunt utilizate pentru obţinere de biomas ă sau a unor compu şi de natură microbiană.

20
 După scopul utilizării lor, mediile de cultur ă se împart în:
* medii de cultur ă generale care asigur ă dezvoltarea unui mare num ăr de specii

* medii de cultură selective care permit dezvoltarea unui num ăr restrâns de

microorganisme
* medii de cultur ă de diferenţiere care permit separarea speciilor în funcţie de anumite
caractere biochimice
* medii de îmbogăţire destinate separ ării şi cultivării unor microorganisme
pretenţioase din punct de vedere nutritiv sau care se afl ă în număr redus
* medii de conservare
* medii de cultur ă industriale

Din punct de vedere al compozi ţiei chimice, mediile de cultur ă se împart în 3

categorii:
* medii naturale (empirice) de origine animal ă sau vegetal ă, cu o compozi ţie chimică
nedefinită în mod exact;

* medii sintetice: acestea sunt solu ţii de substanţe chimice pure în apă distilată, cu o
compozi ţie perfect determinat ă;

* medii semi-sintetice: sunt constituite din produse chimice bine definite, dar şi din
produse de origine natural ă (cu compoziţie cunoscut ă).

Constituenţii principali ai mediilor de cultur ă sunt:

1. Extracte de carne şi macerate
Aceste produse, comercializate în formă concentrat ă sub denumirea de “extracte de
carne”, conţin în principal proteine pu ţin hidrolizate, glucide, s ăruri minerale, vitamine
hidrosolubile. Compozi ţia lor variază în funcţie de carnea utilizat ă pentru preparare.
2. Extracte de drojdie
Aceste extracte, comercializate sub form ă deshidratată, sunt preparate din drojdia de
bere, fiind utilizate ca sursă de aminoacizi şi de vitamine hidrosolubile (vitamine din
complexul B).
3. Peptone şi hidrolizate
Peptonele reprezint ă un amestec de compu şi solubili în apă care provin în urma
acţiunii enzimelor asupra materialului proteic. Pot fi: pepton ă pepsică din carne, pepton ă

21
tripsică din cazeină (cu conţinut crescut în triptofan), peptonă pancreatică de cazein ă,
peptonă tripsică de carne, pepton ă papainică de soia, peptone compuse.
Hidrolizatele sunt peptone ob ţinute în urma acţiunii compuşilor anorganici asupra
proteinelor (acid clorhidric de ex.). Cel mai des întrebuinţat este hidrolizatul acid de cazein ă,
conţinând aminoacizii constitutivi ai cazeinei din lapte.
4. Agar-agarul sau geloza
Agar-agarul denumit şi geloză este un extract de alge ro şii (Rhodophyceae) din genul
Gelidium şi Gracilaria, recoltate în mările Japoniei sau ale Noii Zeelande. Se dizolv ă în apă
la o temperatur ă în jur de 900C şi se solidifică sub 450C, fiind utilizat pentru solidificarea
mediilor de cultură. Nu este degradat de microorganismele obi şnuite. Este comercializat în
forma sa iniţială deshidratată, numit “agar fibre” (foarte impur), sub form ă de paiete (mai
puţin impur), sau sub form ă de pulbere.

Numeroase firme sunt specializate în producerea şi comercializarea mediilor de

cultură de laborator (firma Difco, Merck, Biokar, Oxoid).
Mediile fermentative sunt medii de cultur ă industriale destinate producerii unor
cantităţi mari de celule sau produ şi de metabolism. În compozitia acestor medii intr ă ca
surse de carbon: melasa, produs secundar rezultat la fabricarea zah ărului şi care con ţine 45 -
55% zaharoză, diferite tipuri de făinuri, cereale boabe, zer bogat în lactoză, tărâţe etc.
Dintre sursele de azot cel mai des folosite sunt: f ăinurile proteice de soia, sulfatul de amoniu,
ureea, îngrăşământul complex. Ca săruri minerale se adaug ă fosfaţi, sulfaţi, cloruri etc.
Pentru cultivarea microorganismelor care necesit ă factori de creştere, se adaug ă extract de
porumb (obţinut prin concentrarea apelor rezultate la înmuierea porumbului, bogat in
aminoacizi, vitamine, acid lactic, microelemente), extract de drojdie, extract din radicele de
malţ şi germeni de gr âu şi porumb.

5.1. PREPARAREA MEDIILOR DE CULTUR Ă PENTRU ÎNTRETINEREA

BACTERIILOR, DROJDIILOR ŞI MUCEGAIURILOR

Materiale utilizate:
- balanţă cu precizie de 0,1 g;
- pahare Berzelius;
- sită azbest;
22
 - agar nutritiv pulbere;
- mediu de cultur ă extract de mal ţ - agar pulbere;
- mediu extract de cartof-dextroz ă-agar pulbere;
- eprubete cu dop, sterile;
- pipete de 10 ml;
- flacoane Erlenmayer;
- bec de gaz;
- autoclav cu gaze.

Mod de lucru:
Conform indicaţiilor de pe flacoanele con ţinând mediile de cultur ă pulverulente, se
vor cântări cantităţile necesare pentru a ob ţine câte 1 litru din fiecare tip de mediu de
cultură pentru eprubete şi câte 300 ml mediu pentru baloanele Erlenmayer. În cazul în care
nu există medii deshidratate, procurate de la firme specializate, mediile se vor prepara prin
cântărirea componentelor pentru volumul final dorit.
Mediul de cultur ă se aduce la fierbere în paharele Berzelius de 1 l, p ână la completa
dizolvare a agarului, apoi se repartizeaz ă câte 10 ml în eprubete sterile, prev ăzute cu dop de
vată, care se a şează în co şuri de sârmă şi se acoper ă cu hârtie. În mediu se determin ă pH-
ul şi, dacă este necesar, se ajusteaz ă la valoarea dorit ă. Mediile cu agar nu trebuie s ă fie
aduse la un pH mai mic de 6, deoarece agarul este par ţial hidrolizat în timpul sterilizării la
pH acid şi nu se mai solidific ă la răcire. Când sunt necesare astfel de medii, pH-ul trebuie
ajustat după sterilizare.
Baloanele Erlenmayer se astup ă cu dop de vat ă învelit în tifon, se leag ă la gură cu
hârtie şi sfoară. Coşurile şi baloanele Erlenmayer se introduc în autoclavul cu gaze, iar
sterilizarea se face conform instructiunilor afi şate langă aparat.
Se închide capacul autoclavului, se verific ă nivelul apei în vasul de nivel, se aprinde
gazul şi se aşteaptă apariţia jetului de abur viu care este eliminat prin purj ă.
După 10-15 minute de purjare se închide robinetul purjei, iar presiunea indicat ă de
manometru va urca p ână la valoarea 1, unde va fi men ţinută timp de 20 min. prin
micşorarea flăcării.
Între presiune şi temperatura din autoclav exist ă o corelaţie, aşa cum se prezint ă în
tabelul următor:

23
 Temperatura în grade Presiunea Presiunea
Celsius în kg/m3 în atmosfere
100 0,00 0,00
105 0,20 0,20
110 0,43 0,42
112 0,55 0,50
115 0,69 0,67
120 0,99 0,96
121 1,00 1,00
122 1,33 1,29
128 1,55 1,50
130 1,72 1,65
135 2,16 2,09
140 2,65 2,56

După acest interval se opre şte gazul, se a şteaptă scăderea presiunii pe manometru, se
deschide purja şi după 5 minute se poate deschide capacul autoclavei.
În general, mediile de cultur ă trebuie să ofere o suprafaţă de dezvoltare suficientă
pentru microorganisme. De aceea , dup ă sterilizare tuburile cu mediu se înclină pentru ca să
rămână cu o suprafaţă mare de cre ştere. Înclinarea se face prin sprijinirea eprubetelor pe o
baghetă suficient de groas ă, ţinând seama ca mediul negelificat s ă nu ude dopul de vat ă, ci
să se oprească la 2 - 3 cm de acesta. Prin r ăcire, vaporii ce ies din mediul cald, se
condenseaz ă pe pereţii mai reci ai eprubetelor şi cad sub form ă de picături pe mediu,
adunându-se pe fundul eprubetei. Din aceast ă cauză, eprubetele cu mediul r ăcit nu se
aşează în poziţie orizontală, ci verticală, in coşuri de sârmă. Acestea se acoper ă apoi cu o
hârtie şi se leagă cu sfoară.
Pentru a nu prepara în fiecare zi medii, sau, dac ă este nevoie de mai multe feluri de
medii în acelaşi timp, acestea se preg ătesc o dat ă şi apoi se depoziteaz ă pentru păstrare.
Sticlele cu medii se etichetează, notându-se tipul mediului şi data prepar ării. Pentru evitarea
uscării se recomand ă păstrarea mediilor nutritive în frigider.

24
6. ÎNSĂMÂNŢAREA CULTURILOR DE BACTERII, DROJDII ŞI MUCEGAIURI

Principiul metodei:
Microorganismele pot fi cultivate pe medii de cultur ă în plăci Petri sau în tuburi, at ât
pentru studiul lor, pentru conservarea lor prin refrigerare, c ât şi pentru obţinerea culturilor
stoc şi de lucru, în diversele procese biotehnologice. Opera ţia de trecere a unei culturi dintr-
un vas de cultur ă în altul se nume şte repicare sau trecere, iar fragmentul de cultur ă ce se
trece pe alt mediu se nume şte inoculum.

În jurul flăcării becului de gaz există o zonă sterilă cu diametrul de

aproximativ 20 cm, în lipsa curenţilor de aer. Toate manipulările care necesită
deschiderea recipientelor sterile sau conţinând culturi trebuie efectuate în această
zonă de protecţie.

6.1. ÎNSĂMÂNŢAREA ÎN TUBURI

Materiale utilizate:
- culturi de Bacillus subtilis pe agar nutritiv;
- culturi de Saccahromyces cerevisiae pe mediul extract de mal ţ - agar;
- culturi de Monascus purpureus , Aspergillus niger şi Penicillium pe mediul extract de
cartof - dextroză - agar;
- fir de inoculare;
- bec de gaz;
- eprubete cu mediu sterilizat şi înclinat (nutrient-agar, extract de mal ţ-agar, extract de
cartof-dextroză-agar);
- termostat la 30 oC;
- lampă bactericidă.

25
Mod de lucru:
Însămânţarea cu ansa
Se şterge suprafa ţa din interiorul nişei de lucru cu un tampon îmbibat cu alcool 95%.
Se aprinde lampa bactericid ă şi se lasă 15 minute pentru sterilizarea incintei de lucru. Se
spală mâinile cu să pun, apoi se clătesc cu alcool. Se aprinde becul de gaz şi se regleaz ă
flacăra, care trebuie s ă aibă conul de culoare albastr ă.
Se ţine eprubeta în care există cultura ce trebuie repicat ă cu mâna stângă, în poziţie
oblică sau chiar orizontal ă. În mâna dreapt ă se ţine acul de repicat. Acesta se arde în flacăra
becului de gaz, ţinându-l în poziţie verticală pentru ca flac ăra să cuprindă o porţiune cât
mai mare din el. Se ţine în flacără până ce mai mult de jum ătate din ac se înro şeşte, apoi
se plimbă de 2 -3 ori şi restul acului p ână la mâner, în flacără.
După aceea se apropie gura eprubetei de flac ără şi, cu degetul mic de la m âna
dreapt ă îndoit, se trage afar ă dopul de vat ă din gura eprubetei, apuc ându-l de cap ătul rămas
afară. Nu i se d ă drumul dopului pe mas ă sub nici un motiv, ci se ţine tot timpul în m ână.
Se trece gura eprubetei de 2 -3 ori prin flac ără. Se introduce acul fierbinte în eprubet ă şi se
răceşte, nu în cultură, ci alături, pe o por ţiune de agar f ără cultură. Se ia apoi o foarte
mică porţiune (de 1 - 2 mm) din cultur ă pe vârful acului (se alege por ţiunea cea mai tipic ă
şi mai curată a culturii respective).
Se scoate acul din eprubet ă, se arde din nou gura eprubetei şi se astupă cu dopul de
vată din mâna dreapt ă. Se lasă jos eprubeta şi se ia, tot cu m âna stângă, o altă eprubetă cu
mediu steril.
Acul de repicat cu fragmentul de cultur ă, se ţine mai departe în mâna dreapt ă
ferindu-l acum de flac ără. Se procedeaz ă cu eprubeta a doua la fel cum s-a procedat cu
prima, adică: se ţine în poziţie orizontală sau putin oblic ă în m âna stângă, se scoate dopul
cu degetul cel mic de la m âna dreapt ă îndoit, ţinându-se tot timpul opera ţiei de repicare în
mână. Se trece gura eprubetei prin flac ără, se introduce acul de repicare cu fragmentul de
cultură, atingând u şor mediul (în centrul eprubetei), până ce bucăţica de cultur ă rămâne
pe mediu. Uneori este bine ca fragmentul de cultur ă să fie puţin afundat în mediu, pentru a
face un contact mai str âns cu el.
Se scoate acul de repicat din eprubet ă, se arde din nou gura eprubetei şi se astupă cu
dopul din mâna dreaptă. Se trece şi capătul dopului care a fost ţinut cu mâna prin flacără,
dar foarte rapid.
Se arde din nou acul în flacără pană la roşu. Această operaţie este absolut necesar ă
şi trebuie făcută cu r ă bdare, pentru a se evita infectarea mediilor urm ătoare. După arderea

26
acului se ia din nou eprubeta cu cultura ce trebuie repicat ă şi se repet ă operaţia de repicare
cu o alt ă eprubetă sterilă.
Toate mişcările descrise mai sus, din care const ă operaţia de repicare, trebuie
executate destul de repede pentru a nu permite infectarea mediilor sterile din eprubete. Ele
trebuie făcute cu o oarecare ritmicitate şi nu prelungite prea mult. De asemenea trebuie
respectate o serie de indica ţii, care la prima vedere par minore, dar de care depinde foarte
mult reuşita unei repicări.
Astfel, trebuie avute în vedere:
-ţinerea eprubetei în poziţie orizontal ă în timpul repicării pentru a evita căderea sporilor de
ciuperci şi bacterii din atmosfer ă pe mediu;
-ţinerea acului de repicat în poziţie verticală în flacără şi nu orizontal, pentru ca arderea s ă
se facă pe o por ţiune cât mai mare;
-scoaterea dopului de vat ă cu degetul mic al m âinii drepte şi ţinerea lui tot timpul în mână,
pentru a-l feri de contamin ări secundare;
-arderea gurii eprubetei la scoaterea şi introducerea dopului de vat ă, deoarece pe marginile
exterioare ale eprubetei pot exista germeni de infec ţie secundar ă.
După dezvoltarea culturii se observ ă aspectul , culoarea, tipul coloniilor, precum şi
eventuala prezen ţă a contaminării cu alte microorganisme.

Însămânţarea cu pipeta Pasteur sau cu pipeta gradat ă

Pentru pregătirea pipetei Pasteur, se ia un tub de sticl ă obişnuită, cu diametrul
exterior de 6 mm şi cel interior de 4 mm, care se taie la o lungime de 25 cm, se rotunjesc
marginile la flacără, se astup ă cu dopuri de vat ă, se ambaleaz ă şi se sterilizează. În
momentul utilizării, partea mediană a tubului se men ţine în vârful conului albastru al
flăcării, se roteşte uşor şi, când sticla s-a înmuiat, se îndepărtează din flacără şi se
efilează după lungimea dorită. După solidificare, se separ ă în cele dou ă jumătăţi cu care
se poate lucra.
Însămânţarea cu pipeta se practic ă atunci când se doreşte recoltarea unui inocul
lichid. Pipeta se trece rapid prin flac ără, iar pipeta Pasteur se sparge în dreptul mijlocului
efilat. Din tubul ce con ţine cultura se prelevează câteva picături sau un volum determinat de
inocul, care se pipetează în mediul proasp ăt, steril.
Culturile se termostatează timpul necesar dezvolt ării fiecărui tip de microorganism.

27
 6.2. ÎNSĂMÂNŢAREA ÎN PLĂCI PETRI

Materiale utilizate:
- plăci Petri sterile

- medii de cultur ă pentru bacterii, drojdii, mucegaiuri, acelea şi ca în cazul

însămânţării în tuburi
- culturi de bacterii, drojdii, mucegaiuri
- pipete sterile
- apă sterilă

- fir de inoculare
- bec de gaz
- termostat

Mod de lucru
Mediul de cultur ă steril se topeşte pe baie de ap ă, după care se r ăceşte la 470C şi se
repartizează în mod aseptic în plăcile Petri, pentru evitarea unui condens prea mare pe
capacul pl ăcii. Se lasă mediul să se solidifice la temperatura camerei. Pentru economie de
spaţiu şi pentru evitarea form ării unui condens prea abundent, pl ăcile se pot a şeza una peste
alta, dacă este posibil.
Se agită tubul conţinând suspensia de celule în apă sterilă şi se recolteaz ă cu pipeta
aproximativ 2 ml din cultur ă, care se introduc în placa Petri, pe suprafa ţa mediului nutritiv.
Se repartizează omogen, pe toat ă suprafaţa, se scurge excesul de lichid şi se termostateaz ă
la temperatura convenabil ă.
Însămânţarea mediului de cultur ă din plăcile Petri se poate face de asemenea, prin
încorporarea suspensiei de celule, astfel: se pipeteaz ă în placa steril ă, goală, 1 ml din
suspensia de celule, după care se toarnă mediul topit şi răcit la 45 - 47 0C şi se
omogenizeaz ă pentru repartizarea uniform ă a celulelor din cultur ă. Se lasă să se solidifice
şi se incubeaz ă.

28
 7. STUDIUL CARACTERELOR COLONIILOR DE BACTERII, DROJDII ŞI
MUCEGAIURI

1. Caractere morfocoloniale ale bacteriilor

a. Culturi pe medii gelozate în plăci Petri
Se vor examina coloniile bacteriene care s-au dezvoltat pe suprafa ţa mediului
solidificat în perioada care a trecut de la lucrarea anterioar ă, avându-se în vedere
următoarele caractere:

Mărimea coloniilor: - colonii mici < 1 mm

- colonii medii 1,5 p ână la 3 mm

- colonii mari 3 mm
2. Forma coloniei: - punctiform ă (a), circulară (b), filamentoasă (c , neregulat ă (d),
rhizoidă (e), fusiformă (f).

a b c

d e f

3. Profilul coloniei: - plat (a), crescut (b), convex (c , pulvinat (d), umbonat(e).

29
 a b c

d e
4. Marginea: - uniform ă (a), ondulată (b), lobată (c , erodat ă (d), filamentoasă
(e), buclată (f).

a b c

d e f

5. Transparen ţa: - colonii transparente

- colonii translucide
- colonii opace.
6. Suprafaţa: - colonii lise (uneori str ălucitoare)
- colonii rugoase
- colonii mucoide

30
 7. Consistenţa - nu poate fi apreciat ă cel mai adesea dec ât în urma prelev ării de
probe:
- colonii grase, cremoase, care dau u şor suspensii omogene

- colonii uscate
- colonii mucoide (filante), care dau greu suspensii omogene.
8. Pigmenta ţia: - coloniile sunt cel mai adesea de culoare crem. O culoare diferit ă
este datorat ă unor pigmen ţi, care sunt uneori solubili în mediul de cultur ă şi care nu apar
decât la o temperatur ă determinată.

În final, coloniile bacteriene pot apar ţine unuia din urm ătoarele tipuri:
Tipul 1. Colonii S ( engl.” Smooth” = neted, lucios)
- margini regulate, uneori semi-bombate
- suprafaţă netedă

- consistenţă cremoas ă

suspensie omogen ă

Tipul 2. Colonii R (engl. “Rough” = rugos, aspru, zb ârcit)

- margini adesea neregulate
- suprafaţă rugoas ă

- consistenţă uscată

suspensie heterogen ă

Tipul 3. Colonii M (cu consistenţă mucoidă)

- margine uniformă, regulată
- colonii bombate
- suprafaţă netedă, strălucitoare

- consistenţă filantă

suspensie heterogen ă
corespund adesea bacteriilor capsulate Gram negative
(Klebsiella, Enterobacter etc )

31
 b. Culturi în medii lichide în tuburi
Dacă s-a realizat o cultur ă într-un bulion nutritiv în tuburi, după o incubare de 48 ore
se pot eviden ţia urmatoarele caractere:
1. Turbiditatea: - tulburare mai mult sau mai pu ţin intensă a mediului
2. Formarea unei pelicule: - în cazul bacteriilor aerobe apare la suprafa ţa mediului o
masă de celule care formeaz ă un voal
3. Formare de depozit: în cazul bacteriilor anaerobe se formeaz ă un sediment pe
fundul tubului, mai mult sau mai pu ţin abundent, colorat sau nu.

2. Caractere morfocoloniale ale drojdiilor

- se va observa forma şi profilul coloniei, diametrul acesteia, aspectul (de obicei
cremos), suprafaţa (lucioasă sau mată), culoarea ( în general alb-crem).

3. Caractere morfocoloniale ale mucegaiurilor

Vor fi determinate următoarele caractere coloniale:
- diametrul coloniei dup ă un timp cunoscut
- culoarea coloniei şi modificarea acesteia în timp
- culoarea reversului coloniei
- textura suprafeţei coloniei: pufoas ă, pâsloasă
- eventual prezenţa picăturilor de “transpira ţie”pe miceliul aerian
- mirosul

8. DETERMINAREA VITEZEI DE CREŞTERE A COLONIILOR DE MUCEGAI

Dezvoltarea mucegaiurilor are loc destul de rapid în condiţii favorabile, astfel că în

interval de 2 - 3 zile pe mediu nutritiv se formeaz ă colonii vizibile, care cresc în diametru. În
cazul mucegaiurilor inferioare caracterizate prin miceliu coenocitic, neseptat, coloniile se
dezvoltă rapid, sunt extinse, cu tendin ţa de a ocupa tot spa ţiul disponibil, av ând aspect
pâslos şi culori alb, bej, cenu şiu, brun. Mucegaiurile superioare caracterizate prin miceliu
septat formează colonii cu cre ştere radiară limitată şi culori ce diferă de la alb la galben,
brun, verde, portocaliu, albastru.

Principiul metodei:

32
 Viteza de creştere a mucegaiurilor se poate determina prin cultivarea acestora în plăci
Petri, prin înţepare central ă şi măsurarea zilnică a diametrului coloniei, pân ă la invadarea
completă a suprafeţei plăcii. Pentru microorganismele cercetate , apari ţia sporilor coincide
cu colorarea zonei respective, începând cu centrul coloniei.

Materiale utilizate:
- plăci Petri sterile;
- ansă microbiologică;
- mediu de cultur ă: extract de malţ - agar în flacoane Erlenmayer;
- soluţie acid lactic 5 %, steril ă;
- hârtie indicatoare de pH;
- material biologic -cultura în slanturi de Pencillum, Aspergillus sau alt mucegai
- baie de apă termostată;
- bec de gaz.

Mod de lucru:
Mediul de cultur ă se topeşte pe baia de ap ă, apoi se termostateaz ă la 45 oC. Se
adaugă soluţia sterilă de acid lactic p ână când pH-ul devine 3,5, valoare la care este
inhibată dezvoltarea bacteriilor, dar nu şi a mucegaiurilor.
Se toarnă 15-20 ml mediu de cultur ă în fiecare placă Petri şi se lasă la temperatura
camerei pentru solidificare.
Cu vârful acului de inoculare, se recolteaz ă o mică porţiune din cultur ă sporulată
din eprubeta cu cultura de mucegai şi se însămânţează prin înţepare în partea centrala a
plăcii, cu mare aten ţie pentru a nu se r ăspândi sporii pe suprafa ţa mediului de cultur ă. Cutia
se va închide cu band ă adezivă şi se termostatează la temperatura camerei, m ăsurându-se
zilnic diametrul coloniei.
Se determină viteza de cre ştere, Vcreştere, după formula:
Vcreştere = diametrul maxim al coloniei / nr.zile (ore)

9. ESTIMAREA DENSITĂŢII POPULATIILOR MICROBIENE

33
 Numărarea microorganismelor se execută în mod frecvent în laboratorul de
microbiologie, în vederea aprecierii stadiului de multiplicare a celulelor din diferite culturi
folosite în industrie sau pentru determinarea gradului de contaminare a unor produse, în
special alimentare. Pentru a asigura o num ărare rapidă şi în acelaşi timp precisă, ţinând
cont că încărcătura microbiană a diferitelor produse şi culturi poate să fie foarte ridicată, se
recomand ă în prima etapă să se efectueze diluări ale produsului supus analizei
microbiologice.

TEHNICA OBŢINERII DILUŢIILOR DECIMALE

După recoltare, la omogenizarea probelor destinate analizei microbiologice, se

recomand ă ca raportul între produs şi diluant să fie de 1:10, ob ţinându-se astfel prima
diluţie (diluţie 10-1). Pentru efectuarea urm ătoarelor diluţii decimale, cu o pipet ă sterilă,
se barbotează lichidul pentru omogenizare , se recolteaz ă 1 ml din dilu ţia I şi se scurge
lichidul în altă eprubetă cu 9 ml ser fiziologic steril, ob ţinându-se dilu ţia a II-a (diluţie 10-2)
şi se continuă procedeul până la obţinerea diluţiei necesare. Gradul de diluare este
condi ţionat de num ărul presupus de microorganisme din proba de analizat; cu c ât numărul
este mai mare, cu at ât se fac mai multe dilu ţii. Pentru majoritatea produselor sunt suficiente
4 - 8 dilu ţii succesive.
Când se face num ărarea celulelor dintr-o anumită diluţie considerată
corespunz ătoare, numărul obţinut se multiplică cu coeficientul de dilu ţie “k”, pentru a
obţine numărul de celule existent în produsul ini ţial (pentru d I, k = 10, pentru d II, k = 100
etc).
Pentru evitarea erorilor se recomand ă omogenizarea con ţinutului eprubetelor în care
s-a făcut diluarea fie prin rotirea eprubetei între palme, fie, cu ajutorul pipetei sterile, prin
barbotare, înainte de recoltarea volumului de 1 ml destinat urm ătoarei diluţii. Se iau toate
măsurile de precauţie pentru a evita contaminarea cu microorganisme din mediul ambiant,
lucrând în zona de protec ţie din jurul flăcării becului de gaz şi respectând regulile de
manipulare.

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
34
 Suspensie iniţială 1: 10 1 : 100 1 : 1000 1 : 10000

După efectuarea diluţiilor decimale, numărarea microorganismelor se poate realiza

prin metode directe, cu ajutorul camerelor de num ărare sau prin metode indirecte.

9.1. ESTIMAREA DENSITĂŢII POPULAŢIILOR MICROBIENE CU AJUTORUL

CAMEREI THOMA

Estimarea densităţii populaţiilor microbiene cu ajutorul camerei Thoma este o

metodă directă de numărare a celulelor, rapidă şi uşor de efectuat, cu utiliz ări în stabilirea
dinamicii de acumulare a celulelor microbiene într-un mediu de cultur ă, în scopul urm ăririi
formării de biomasă, de obţinere a unui inocul sau în diferitele procese fermentative. Metoda
prezintă dezavantajul c ă nu deosebe şte celulele vii de cele moarte, este greu de aplicat
pentru bacterii de dimensiuni mici, necesit ă suspensii celulare destul de dese şi nu este foarte
exactă.

Principiul metodei: Camerele de num ărat reprezintă lame de sticlă prevăzute cu trei
platforme, din care platforma centrală este denivelat ă faţă de celelalte dou ă cu 0,10 mm.
Camera Thoma prezint ă o reţea cu suprafa ţa de 1 mm 2, divizată în 400 microcelule
elementare, num ărătoarea făcându-se în grupuri de 16 microcelule.

lamela

35
 1/10 mm

lama Thoma

1/20 mm

1/20 mm

Materiale utilizate:
- suspensii de celule de drojdie şi spori de muceagi în apă;
- lamele;
- camera Thoma;
- pipete sterile.
- microscop.

Mod de lucru:
Se execut ă un preparat umed, plas ând suspensia de celule pe suprafa ţa reţelei. Se
36
aşează lamela, care, sprijinindu-se pe cele dou ă platforme laterale, va delimita înălţimea
stratului de lichid, egal ă cu adâncimea camerei (0,1 mm). Preparatul astfel obţinut se
fixează cu cleme de platina microscopului şi se caut ă imaginea reţelei. In câmpul
microscopic , prin deplasarea platinei se pot aduce grupe de c âte 16 microcelule elementare
şi se face numărarea celulelor de drojdii. Se exclud de la num ărare celulele care se afl ă cu
mai mult de jumătate din suprafa ţa celulei în exteriorul careului de 4 x 4. Se fac num ărări
din mai multe câmpuri microscopice (minimum 5) şi se calculeaz ă numărul mediu de celule
dintr-o microcelulă. Cunoscând suprafaţa unei microcelule şi volumul său (

1 1
V = ⋅ mm
3
), în funcţie de diluţia folosită la numărare, se poate calcula num ărul de
400 10

celule prezente într-un cm3 lichid de analizat,

cu formula:

N = n x 4000 x 1000 x k
în care:
n = numărul mediu de celule pe microcelul ă;
4000 = volumul microcelulei, în cm3;
1000 = factor de transformare în cm3;
k = coeficientul de dilu ţie.

9.2. ESTIMAREA NUM ĂRULUI DE CELULE MICROBIENE PRIN METODA

CULTURALĂ

Principiul metodei:
Metoda culturală Koch const ă în însămânţarea unui volum cunoscut din suspensia
de celule în / sau pe medii de cultur ă solidificate în plăci Petri şi, după o perioad ă de
incubare, se face num ăratoarea coloniilor consider ând c ă fiecare colonie este rezultat ă prin
multiplicarea unei singure celule. Metoda cultiv ării în plăci este foarte adesea folosită pentru
determinarea num ărului de microorganisme vii dintr-un produs şi permite, în acelaşi timp, o
analiză calitativă prin studiul caracterelor morfologice ale coloniilor dezvoltate. De obicei se
utilizează diluţiile decimale ale produsului de analizat.
Rezultatul se exprima in UFC (unit ăţi formatoare de colonii), deoarece pot exista mai
multe celule aglomerate care formeaz ă o colonie, iar în cazul mucegaiurilor exist ă fragmente
37
multicelulare de hife; în plus, există destule celule izolate care nu formeaz ă colonii. Se vor
alege plăcile care con ţin între 30 şi 300 colonii.

1 ml 1 ml 1 ml

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

1 10-1 10-2 10-3

Materiale utilizate:
- mediu de cultur ă: agar nutritiv sterilizat în flacoane Erlenmayer de 500 ml;
- plăci Petri sterile;
- pipete sterile;
- eprubete cu c âte 9 ml apă sterilă;
- probe de ap ă din diferite surse;
- baie de ap ă la 45 oC;
- termostat la 37 oC;
- dispozitiv de num ărat colonii.

Mod de lucru:
Mediul de cultur ă conţinut în balonul Erlenmayer se pune la topit pe baie de ap ă.
După fluidificarea completă, se termostateaza, tot pe baie de ap ă la 45 oC.
Folosind pipeta steril ă, se pregătesc câte 3 diluţii din probele de ap ă şi apoi se
recoltează câte 1 cm3 din aceste dilu ţii şI, prin desfacerea pl ăcii Petri sterile, se las ă să

38
treacă numai pipeta şi se scurge con ţinutul.
Peste volumul de suspensie se toarn ă mediul de cultur ă steril la 42-45 oC şi, imediat,
prin rotirea în plan orizontal a pl ăcii, se face omogenizarea cu mediul şi se lasă în repaos
pentru solidificarea mediului şi fixarea celulelor. Se recomand ă ca din aceea şi diluţie s ă se
facă însămânţari în câte două plăci paralele.
Plăcile cu mediile însămânţate se introduc în termostat, reglat la temperatura de 37
o
C, pentru dezvoltarea microorganismelor. Num ărarea coloniilor se va face dup ă 72 ore.
Pentru numărare se aleg pl ăcile în care num ărul de colonii este cuprins între 30 - 300, acolo
unde este posibil. În cazul în care coloniile sunt dese, pentru a înlesni numărătoarea, placa
Petri se inverseaz ă şi se aşează pe numărătorul de colonii TITRIPLAQUE.
La metoda culturii, toate opera ţiunile se execut ă cu multă aten ţie evitându-se orice
sursă de infectare cu microorganisme str ăine, care, ajung ând în placă ar influenţa rezultatul
analizei.
Numărul de unit ăţi formatoare de colonii este dat de formula:

UFC/ml = Nr. colonii x coeficientul de diluţie

9.3. DETERMINAREA NUM ĂRULUI DE MICROORGANISME ÎN MEDII

LICHIDE

Această metodă se bazează pe efectuarea de dilu ţii cu care este însămânţat mediul
de cultură lichid. Diluţiile se efectuează din 10 în 10, pornind de la suspensia ini ţială pentru
care se determin ă numărul de germeni.
Mediul de cultur ă ales convenabil este repartizat steril c âte 9 ml în fiecare tub. Serii
de 3 sau 5 tuburi vor fi însămânţate cu câte 1 mililitru din suspensia ini ţială, apoi din
diluţiile decimale în ordine descresc ătoare a densităţii celulelor (fiecare nouă serie
antrenează un nou factor 10 de dilu ţie). După incubare se procedeaz ă la citirea rezultatelor,
consider ându-se pozitive tuburile în care este vizibil ă creşterea (sau este vizibil ă o activitate
biologică: virajul unui indicator de pH, degajare de gaz sau altele) şi negative celelalte.

Pentru fiecare serie de culturi provenite din aceea şi diluţie, se numără tuburile
pozitive, care pot fi:

39
 1. - 0, 1 sau 2 pentru 2 tuburi;
2. - 0, 1, 2 sau 3 pentru 3 tuburi;
3. - 0, 1, 2, 3, 4 sau 5 pentru 5 tuburi.

Se compune astfel un num ăr caracteristic, format din cifrele corespunz ătoare pentru
trei diluţii succesive (pentru cazul 2), prima dilu ţie utilizată fiind cea mai concentrat ă.
Numărul este alcătuit din trei cifre şi anume: prima cifr ă reprezintă numărul de eprubete
din ultima diluţie în care s-a observat cre şterea în toate eprubetele însământate, următoarele
două cifre reprezintă numărul de eprubete pozitive din următoarele două diluţii
succesive. Interpretarea acestui test se bazeaz ă pe date statistice. Tabelele elaborate dau
pentru fiecare număr caracteristic, numărul de celule cel mai probabil dintr-un mililitru din
tubul corespunz ător primei cifre din num ărul caracteristic.
Numărul de microorganisme dintr-un gram sau mililitru din produsul ini ţial se
calculeaz ă înmulţind numărul din tabel (corespunz ător cifrei caracteristice) cu coeficientul
de diluţie corespunzător primei cifre din caracteristică.
Concentraţia iniţială se calculeaz ă ţinând cont de dilu ţiile efectuate. De exemplu,
pentru numărul caracteristic 210 (care înseamn ă 2 tuburi pozitive pentru cea mai mare
densitate de celule, un tub pozitiv pentru cea medie şi toate tuburile negative pentru
densitatea cea mai mic ă), în tabel corespunde num ărul cel mai probabil de celule 1,5 / ml,
care se va înmulţi cu coeficientul de dilu ţie. Dacă, de exemplu, dilu ţia a fost 10 -2, au fost
iniţial 150 celule / ml.

În tabelul următor (numit tabelul lui Mac Grady) se prezint ă relaţia între numărul
caracteristic corespunz ător pentru trei tuburi însămânţate şi numărul cel mai probabil de
celule:

40
 Număr Număr de Număr Număr de Număr Număr de
caracter celule caracter celule caracter celule
istic istic istic

000 0,0 201 1,4 302 6,5

001 0,3 202 2,0 310 4,5

010 0,3 210 1,5 311 7,5

011 0,6 211 2,0 312 11,5

020 0,6 212 3,0 313 16,0

100 0,4 220 2,0 320 9,5

101 0,7 221 3,0 321 15,0

102 1,1 222 3,5 322 20,0

110 0,7 223 4,0 323 30,0

111 1,1 230 3,0 330 25,0

120 1,1 231 3,5 331 45,0

121 1,5 232 4,0 332 110,0

130 1,6 300 2,5 333 140,0

200 0,9 301 4,0

DETERMINAREA BACTERIILOR COLIFORME DINTR-UN PRODUS

ALIMENTAR

Pentru a reflecta calitatea microbiologic ă a produselor alimentare în timpul

fabricaţiei, în timpul conserv ării, cât şi pentru a asigura protec ţia faţă de microorganismele

41
patogene transmisibile prin alimente, se efectueaz ă analize microbiologice în scopul de a
garanta siguran ţa igienei pentru consum.
Bacteriile coliforme fac parte din categoria microorganismelor indicatori igienico-
sanitari, fiind bacterii Gram negative nesporulate, aerobe sau facultativ anaerobe, ce pot s ă
se înmulţească în prezen ţa sărurilor biliare, capabile de a fermenta lactoza cu producere de
gaze.

Principiul metodei: Metoda pentru determinarea bacteriilor coliforme include teste

prezumptive şi de confirmare, bazate pe capacitatea bacteriilor coliforme de a fermenta
lactoza cu producere de acid lactic, CO 2 şi H2, în timp de 48 ore la 37 0C.
Testul prezumptiv const ă în inocularea probei în mediul nutritiv de îmbogăţire cu
lactoză, favorabil atât coliformilor cât şi altor bacterii capabile s ă folosească lactoza drept
sursă de carbon. Aprecierea probelor pozitive se face fie în funcţie de acumularea de gaze în
tubul Durham (plutitor), fie ca urmare a modific ării pH-ului datorită acumul ării de acizi.
Testul de confirmare const ă din inocularea culturilor din eprubetele pozitive ale
testului prezumptiv, pe medii selective care inhib ă dezvoltarea bacteriilor însoţitoare şi
evidenţiază bacteriile coliforme.

Materiale utilizate:
- proba de analizat (ap ă, carne tocat ă, produse lactate etc)

- eprubete în care a fost introdus tubul Durham

- bec de gaz
- termostat
- stativ pentru eprubete
- mediul pentru testul prezumptiv: bulion lactozat - pepton ă ………..10g
- NaCl……………..5g
- extract de carne….3g
- lactoză …………..5g

- apă dist. ……….1000ml

sau mediu Mac Conkey (conform cataloagelor de medii de

cultură)

42
 - mediu pentru testul de confirmare - bulion bil ă lactoză verde briliant (BLBV) sau

- bulion E.C. (conform cataloagelor)

Mod de lucru: Mediile lichide de cultur ă se introduc în eprubetele ce con ţin tuburile
Durham răsturnate, astfel încât să nu rămână aer în acestea, în volum de aproximativ 10
ml, în funcţie de grosimea eprubetei. Se sterilizeaz ă prin autoclavare, dup ă indicaţiile de pe
flaconul cu mediu deshidratat.
Din proba de analizat şi din diluţii decimale succesive se inoculeaz ă câte 1 ml în
câte 3 eprubete cu mediu pentru testul prezumptiv (ce con ţin tuburile Durham inversate) şi
se incubează 24 - 48 ore la 37 0C, după care se citesc rezultatele, conform tabelului de mai
sus. Se consider ă pozitive eprubetele în care se înregistrează tulburarea mediului de cultur ă,
acumulare de gaz în plutitor (mai mult de 1/3 din volum) şi, unde este cazul, virarea
indicatorului de pH.
Pentru testul de confirmare, din eprubetele pozitive se recolteaz ă câte o ansă (fir cu
buclă) şi se face inocularea în mediul pentru confirmare. Se termostateaz ă 48 ore la 37 0C, se
citesc rezultatele.
După înmulţirea numărului citit în tabel cu factorul de dilu ţie, se obţine numărul cel
mai probabil de coliformi /g sau ml prob ă de analizat ( MPN = most probable number).

10. METODE DE IZOLARE ŞI OBTINERE A CULTURILOR PURE

Cultura pură reprezintă o masă de celule rezultate prin reproducere dintr-o singur ă
celulă aflată într-un mediu nutritiv steril. Cultura pur ă este considerat ă şi colonia care se
formează ca rezultat al izol ării unei celule sau a unei unit ăţi formatoare de colonie, atunci

43
când aceasta este localizat ă pe un mediu nutritiv solid.
În practica de laborator se cunosc numeroase metode prin care se poate realiza
separarea unei singure celule din microbiota heterogen ă a mediilor naturale. Aceste tehnici
permit izolarea unui germen dat plecând de la medii complexe, separarea unor germeni
diferiţi dintr-un amestec, purificarea unei su şe contaminate, precum şi efectuarea studiului
calitativ şi cantitativ al florei unui produs, (de exemplu un produs alimentar). Scopul final
este obţinerea de tulpini pure care pot fi astfel identificate, studiate şi eventual num ărate.

A.Metode prin răspândire - se folosesc pe scar ă largă, fiind uşor de executat,

având ca principiu r ăspandirea celulelor din mediile naturale unde acestea se afl ă în număr
mare.

Metode scarificate sau în strii

În placa Petri se repartizeaz ă un mediu de cultur ă solidificat şi, cu firul metalic se
recoltează celule din mediul natural şi se execută trasări pe suprafata mediului, astfel încât
diversele celule să rămână distanţate între ele. Prin termostatare 48 - 72 ore, din colonia
care corespunde microorganismului ce trebuie izolat, se execut ă o repicare în eprubete cu
mediu solid înclinat (eprubete cu slant - agar) şi astfel se obţine o cultur ă pură.
O tehnică similară foloseşte drept suprafa ţă de răspândire mediul înclinat din 2 -3
eprubete, prin transferul de celule din mediul natural, prin realizarea de striuri, în mod
succesiv.
Aceste dou ă metode se folosesc şi în cazul în care o cultur ă pură este contaminată
cu microorganisme str ăine în perioada de p ăstrare şi trebuie salvată.

B. Metode prin diluare În cazul acestor metode, în prima etap ă, din mediul natural
se execut ă diluţii decimale în ser fiziologic steril, astfel încât numărul de celule să fie
relativ redus, permi ţând obţinerea de colonii izolate pe suprafa ţa mediului de cultur ă. O
metodă simplificată pentru separarea sporilor fungici const ă în inundarea suprafe ţei plăcii
Petri din diluţia convenabil ă. Sporii care au r ămas ataşaţi de mediu vor da colonii izolate. În
general, mucegaiurile nu ridic ă probleme la izolare, deoarece cresc sub form ă de colonii
mari pe diferite substraturi, iar pentru ob ţinerea în cultură pură se face repicarea de spori
situaţi în centrul coloniei.

Metoda de izolare cu ajutorul micromanipulatorului - este o metod ă precisă şi se

44
realizează cu ajutorul unui aparat prev ăzut cu tuburi capilare cu care se poate face selec ţia
celulelor dorite din preparate studiate la microscop. Cu ajutorul micromanipulatorului se
poate face recoltarea de ascospori din celule ascogene şi este folosit în cercetarea genetic ă, în
dirijarea proceselor de fuziune a protopla ştilor, pentru conjugare ş.a.

Metode biologice de obţinere a culturilor pure - sunt foarte diverse şi se bazează

pe proprietăţile fiziologice ale microorganismelor de izolat care permit diferen ţierea clară a
acestora de restul microorganismelor însoţitoare din acelaşi biotop. Prin metode biologice
pot fi selectate bacteriile sporogene din medii naturale, pe baza termorezisten ţei deosebite a
endosporilor. Numeroase metode de izolare se bazeaz ă pe introducerea în mediile de cultur ă
a unor substan ţe chimice cu rol de inhibitor asupra microorganismelor de care trebuie
separat ă cultura dorită.

10.1. IZOLAREA MICROORGANISMELOR DIN SOL DE GR ĂDINĂ

Principiul metodei: când o celula microbian ă ajunge pe un mediu favorabil de cultur ă,

aceasta se multiplic ă formând o colonie: din coloniile suficient de separate şi distanţate se
pot izola culturi pure.

Materiale utilizate:
- plăci Petri
- pipete sterile
- probe de sol de gr ădină
- tuburi cu ser fiziologic steril sau apă sterilă
- penicilină
- fir de inoculare
- termostat
- bec de gaz

- baie de apă
- mediu de cultur ă - agar nutritiv

Mod de lucru:
Repartizarea mediului de cultur ă în plăcile Petri:
- se lichefiaz ă conţinutul unui flacon cu mediu gelozat într-o baie de ap ă la fierbere, se
45
răceşte la 470C ± 20C, apoi se toarn ă conţinutul în plăcile Petri .sterile ţinând seama de
următoarele precauţii:
• se şterge cu grij ă flaconul la scoaterea din baia de ap ă
• se îndeparteaz ă dopul în zona steril ă a fl ăcării şi se flambeaz ă gâtul vasului pentru
distrugerea microorganismelor
• în timpul cât se toarnă mediul, se deschid pl ăcile Petri în imediata apropiere a
flăcării; nu se atinge placa cu flaconul
• după introducerea mediului, placa Petri se închide rapid
• se repartizează geloza prin agitare u şoară, dacă este cazul
• se lasă plăcile pe o suprafa ţă plană pentru solidificarea mediului
• dacă se lucrează cu mai multe plăci, este avantajos s ă se aşeze acestea unele peste
altele, evitându-se răcirea bruscă şi deci formarea în cantitate prea mare a condensului.
A. Tehnica striurilor
Izolările se efectueaz ă în plăci Petri, prin trasarea de striuri în una din urm ătoarele
forme:

a)

b)

c)

46
 d)

Pentru însămânţarea plăcilor se va utiliza o dilu ţie din sol de gr ădină.

B. Tehnica dilu ţiilor Din proba de cercetat se efectueaz ă diluţii în apă sterilă sau ser
fiziologic, în tuburi ce con ţin câte 9 ml. Prima dilu ţie se efectueaz ă prin pipetarea unui
mililitru de probă (sau prin cântărirea unui gram) în primul tub - aceasta reprezint ă diluţia 1
/ 10 ; dilu ţia a doua reprezent ând 1 / 100 se efectueaz ă prin pipetarea şi amestecarea a 1 ml
din diluţia 1 /10 în alt tub cu 9 ml ser fiziologic şi aşa mai departe. Din fiecare dilu ţie
efectuat ă se pipetează câte 2 ml pe suprafa ţa mediului repartizat în plăcile Petri, începând
cu cea mai mare dilu ţie. Se incubeaz ă plăcile la 370C timp de 48 de ore, dup ă care se
examineaz ă şi se izolează colonia care intereseaz ă, cu vârful firului metalic.

10.2. IZOLAREA GERMENILOR DIN AER

Se deschid total pl ăcile conţinând mediul de cultur ă solidificat, timp de câteva

minute, agitându-se lent şi expunându-le în curent de aer. Timpul de expunere a pl ăcilor
poate varia pentru câteva plăci. Se termostatează timp de 48 ore sau mai mult şi se
examineaz ă coloniile apărute.
10.3. IZOLAREA GERMENILOR REZISTENŢI LA ANTIBIOTICE

Mediul de cultur ă se va suplimenta cu c âte o picătură pentru fiecare plac ă, dintr-o

soluţie obţinută dintr-un antibiotic cump ărat din comerţ (de ex. penicilin ă), după care se
însămânţează fie prin inundare, fie prin încorporarea probei în geloză.

10.4. IZOLAREA BACTERIILOR SPORULATE AEROBE

Diluţia din proba de sol va fi încălzită timp de 2 minute pe baie de ap ă la fierbere

47
(fierberea distruge formele nesporulate), dup ă care se inoculeaz ă mediul de cultur ă.

Pentru toate cazurile se vor recunoa şte coloniile de bacterii, drojdii sau mucegaiuri.
Se va nota aspectul coloniilor (rotunde sau neregulate, bombate sau plate, netede sau nu,
strălucitoare sau mate, colorate sau nu, transparente sau nu). Cele mai reprezentative colonii
se vor examina la microscop, determin ându-se tipul microorganismului, forma, aparatul
reproducător în cazul mucegaiurilor.

11. METODE DE CONSERVARE A MICROORGANISMELOR

Microorganismele aflate în studiu cât şi cele care prezint ă unele proprietăţi

remarcabile trebuie păstrate în colecţii de cul turi, denumite micoteci. Dintre tehnicile
aplicate pentru conservarea culturilor pure, tehnici bazate pe prelungirea fazei sta ţionare şi
evitarea etapei de declin,cele mai importante sunt urm ătoarele:
Repicarea periodică prin transfer de celule din eprubeta con ţinând cultura pur ă,
în care mediul este epuizat, în eprubeta cu mediu nutritiv steril, proasp ăt, cu compozi ţie
similară. Intervalul de repicare este dependent de natura culturii, compozi ţia mediului şi
temperatura de păstrare. Acest procedeu necesit ă un mare volum de munc ă, prezintă risc de

48
contaminare şi este greu de realizat atunci c ând numărul de culturi de întreţinut este mare.

Prelungirea intervalului între două repicări prin scăderea vitezei de metabolism a

celulelor şi deci evitarea stării de declin ce poate duce la autosterilizare, se poate realiza prin
mai multe procedee:

Menţinerea culturilor la temperaturi scăzute, în condiţii de refrigerare sau

congelare. În acest caz, de exemplu, culturile de fungi p ăstrate la 50C se transfer ă anual, în
timp ce dacă păstrarea se face la 16 0C, repicarea va avea loc la un interval de 6 luni.

Desicarea poate fi realizat ă în laborator la o pompă de vid, culturile fiind plasate în

fiole speciale, care sunt apoi închise la flacără. Metoda desic ării are la bază reducerea
umidităţii mediului, care conduce la trecerea celulelor în starea de anabioz ă, ce poate fi
menţinută timp îndelungat f ără a se produce modific ări intracelulare, ireversibile.

Liofilizarea constă într-o congelare urmat ă de o sublimare. Prin acest procedeu se

prelungeşte considerabil intervalul de conservare a culturilor, f ără să se producă modificări
ale proprietăţilor lor fiziologice. Liofilizarea se realizeaz ă în aparate speciale numite
liofilizatoare, culturile fiind suspensionate în lichide protectoare (de obicei un coloid hidrofil
cum este laptele, glicerol 10%, gelatină, ser etc) şi introduse în fiole speciale.

11.1. REVITALIZAREA PREPARATELOR DESICATE SAU LIOFILIZATE

Materiale utilizate:
- culturi desicate sau liofilizate
- ansa cu bucl ă
- pipete sterile
- bec de gaz
- dopuri sterile pentru fiolele cu culturile desicate sau liofilizate
- lichid de revifiere: - extract de drojdie…….5g
- glucoză ……………..5g
- apă distilată ……….1000ml
- mediu de cultur ă în eprubete

49
Mod de lucru: Se încălzeşte gâtul fiolei ce con ţine cultura desicat ă sau liofilizată, la vârful
flăcării de gaz. Cu o pipet ă sterilă se lasă să cadă câteva picături de apă sterilă rece pe
gâtul încins al fiolei, care se va cr ăpa; vârful se desprinde u şor cu o bucat ă de vată sterilă,
se mai arde o dat ă marginea fiolei în flacără, după care se introduce dopul ţinut în mâna
dreapt ă. Cu o altă pipetă sterilă se ia un mic volum din lichidul de revifiere sau ap ă sterilă
şi se pipeteaz ă uşor peste con ţinutul fiolei. Se agită cu grijă şi se lasă în repaos jum ătate
de oră la temperatura camerei sau în termostat. Dup ă acest interval, în zona steril ă a flăcării
se deschide dopul fiolei, se arde g âtul acesteia în flacără şi se recoltează din cultura
liofilizată un mic volum, cu ajutorul ansei. Se însămânţează mediul de cultur ă din eprubet ă
şi se incubeaz ă la temperatura optimă de creştere. După dezvoltarea microorganismului, se
observă aspectul culturii şi eventualele modificări morfologice.

12. INFLUENŢA FACTORILOR DE MEDIU ASUPRA CREŞTERII

MICROORGANISMELOR

Având o mas ă redusă, celula microbian ă este puternic influen ţată de condi ţiile
mediului ambiant şi reacţionează foarte rapid la diferi ţi factori, cum sunt: temperatura,
umiditatea relativă, concentraţia de oxigen, compoziţia chimică, concentraţia
substratului şi pH-ul mediului de cultură, radiaţiile etc, fie prin adaptare, fie prin
dispariţie.

Influenţa temperaturii asupra creşterii microorganismelor

Temperatura are o mare influen ţă asupra proceselor fiziologice ale celulei deoarece
stimulează sau inhibă activitatea echipamentului lor enzimatic. Diferitele specii microbiene
se caracterizează prin anumite temperaturi numite cardinale: - temperatura minimă
(temperatura la care mai poate avea loc cre şterea, iar sub aceasta valoare cre şterea este
50
oprită); temperatura optimă (temperatura la care viteza specific ă de creştere este maximă)
şi temperatura maximă (la care creşterea este încă posibilă, dar prin depăşirea acesteia
efectul devine letal).

12.1. INFLUENŢA TEMPERATURII DE CULTIVARE ASUPRA VITEZEI DE

CREŞTERE A MUCEGAIURILOR

Principiul metodei: În funcţie de temperatura de cultivare, pe acela şi mediu de cultur ă,

mucegaiurile prezintă viteze diferite de creştere, deci diametrele coloniilor vor avea m ărimi
diferite.

Materiale utilizate:
- cultura de mucegai ( Monascus purpureus)
- plăci Petri
- ac de inoculare
- bec de gaz
- termostate la diferite temperaturi
- autoclav
- mediul de cultur ă - extract de cartof - dextroz ă - agar
Mod de lucru: Mediul de cultur ă repartizat în flacoane Erlenmeyer se sterilizeaz ă prin
autoclavare la 121 oC, timp de 20 minute, apoi se toarn ă câte 15 - 20 ml în pl ăci Petri sterile
şi se lasă la temperatura camerei s ă se solidifice. Seturi de c âte trei plăci se însămânţează
prin înţepare central ă din cultura de Monascus, având grijă să nu se împrăştie sporii de pe
firul acului de inoculare pe suprafa ţa mediului. Din cele nou ă plăci astfel însămânţate, trei
vor fi incubate la temperatura de 40 oC, trei la 30 oC şi trei la frigider, la 4-5 oC. După o
săptămână de dezvoltare a tulpinii fungice, se vor m ăsura diametrele coloniilor pentru cele
trei temperaturi, făcându-se media aritmetic ă a celor trei valori şi se va determina viteza
orară de creştere.

12.2. DETERMINAREA BACTERIILOR PSIHROFILE

Principiul metodei: Metoda se bazează pe cultivarea bacteriilor pe mediu nutritiv şi

incubarea plăcilor la temperatura de 100C, timp de 7 zile, condi ţii care favorizează
51
dezvoltarea bacteriilor psihrofile.

Materiale utilizate:
- proba de analizat
- plăci Petri
- pipete gradate sterile
- bec de gaz
- termostat
- mediu de cultur ă: agar nutritiv

Mod de lucru: Se face omogenizarea probei de analizat şi se efectuează diluţiile decimale.

Din diluţii se recoltează aseptic câte 1 ml care se introduce în două plăci Petri (probe duble)
şi deasupra se repartizeaz ă mediul nutritiv sterilizat şi răcit la 450C, făcându-se o
uniformizare rapidă. După solidificarea mediului de cultur ă în plăcile Petri, acestea se
menţin inversate în frigider şi după 7 zile se face analiza calitativ ă şi cantitativă a culturilor.
Se calculează numărul de celule din pl ăcile ce conţin între 30 şi 300 colonii şi, în
funcţie de diluţia folosită, se calculeaz ă numărul de bacterii psihrofile dintr-un gram sau
dintr-un mililitru de probă.

13. ESTIMAREA CREŞTERII MICROBIENE ÎN CULTURĂ DISCONTINUĂ

În condiţii favorabile de viaţă, în prezenţa mediului nutritiv,

microorganismele reacţionează rapid şI are loc creşterea, proces prin care
are loc mărirea coordonată a tuturor componentelor celulei, rezultată prin
adăugarea de substanţă nou formată prin biosinteză. Dacă
microorgamismul este coenocitic, creşterea înseamnă dezvoltarea celulei
unice, dar nu şI sporirea numărului de celule. În cazul microorganismelor
care se reproduc prin înmugurire sau prin sciziune binară, dezvoltarea
conduce la mărirea numărului de celule.
Creşterea microbiană este studiat ă prin analizarea curbei de cre ştere a culturii ( în
medii lichide), în sistem discontinuu, în şarje - “batch” (în timpul incub ării nu se introduce
mediu proaspăt şi nu se extrag produşi şi din această cauză concentraţia substratului
scade, iar cea a produ şilor de metabolism cre şte). Creşterea microorganismelor care se
reproduc prin sciziune binar ă poate fi reprezentat ă grafic prin logaritmul num ărului de
52
celule în funcţie de timp.

Timpul de generaţie ( ϑ) = durata unui ciclu de cre ştere sau timpul necesar pentru ca
populaţia să se dubleze.

Viteza specifică de creştere (µ) = numărul de generaţii în unitatea de timp.

ϑ=t/n şi µ=n/t unde n = numărul de generaţii

Curba de cre ştere va avea şase faze:

1. faza de lag sau faza de laten ţă în care µ = 0

2. faza de accelerare a cre şterii în care viteza specific ă de creştere µ este crescătoare

3. faza exponen ţială de creştere (µ este constant şi maxim)

4. faza de încetinire a cre şterii (µ este descresc ător)

5. faza staţionară (µ = 0)

6. faza de declin

lg N

1 2 3 4 5 6
timp

53
Materiale utilizate:
- cultura de Saccharomyces cerevisiae
- camera Thoma
- lamele
- bec de gaz
- termostat
- mediu de cultur ă - must de mal ţ sau melasă
- eprubete cu ap ă
- apă distilată
- pipete gradate sterile
- eprubete

Mod de lucru: Mediul de cultur ă (200 ml / flacon Erlenmeyer) şi eprubetele con ţinând
aproximativ 10 ml ap ă se sterilizează în autoclav, timp de 20 minute la 121 0C. Cultura de
drojdie din eprubet ă, pe mediu solidificat (extract de mal ţ - agar) este suspensionat ă în apă
sterilă , din care se inoculeaz ă 1 ml în mediul din flaconul Erlenmeyer, cu ajutorul pipetei
gradate, în zona de protec ţie a becului de gaz. Cultura se incubeaz ă la 300C, recoltându-se
probe, în mod aseptic, cu ajutorul pipetelor sterile (cate 2 ml), la intervale de c âte 3 ore (sau
la intervalul posibil). Recoltarea probelor se va face numai dup ă omogenizarea culturii prin
agitare în scopul ob ţinerii unei suspensii c ât mai uniforme de celule. Probele se examineaz ă
la microscop, determin ându-se numărul de celule direct din prob ă sau din diluţia decimală,
dacă este cazul. Analiza probelor va fi efectuat ă, pe cât posibil, imediat dup ă recoltare,
evitându-se păstrarea probelor pentru num ărarea ulterioară. Concomitent cu determinarea
numărului de celule, se va nota şi valoarea pH.
Se va trasa curba de cre ştere corespunzatoare num ărului de celule de drojdie dintr-un
mililitru de cultură (ţinându-se seama de diluţia efectuată), în funcţie de timp,
completându-se următorul tabel:

Durata de
dezvoltare
(ore)
Diluţia

54
 probei
Număr de
celule/ ml
pH

Pe parcursul experimentului se vor nota eventualele observa ţii (debutul fermentatiei,

aspectul culturii, apariţia unei eventuale infec ţii etc).

14. METABOLISMUL MICROBIAN

14.1. EVIDENŢIEREA METABOLISMULUI GLUCIDIC AL

MICROOGANISMELOR

Glucidele (monozaharide, dizaharide, polizaharide) pot fi degradate de bacterii

urmând una din cele dou ă căi principale: oxidarea ( în aerobioză) sau fermenta ţia (în
anaerobioz ă).
Principiul metodei: Metoda se bazeaz ă pe virarea culorii unui indicator de pH datorit ă
metabolizării zahărului de către tulpina bacterian ă.

Materiale utilizate:
- cultura bacterian ă
- eprubete cu dop de vat ă
- ac de inoculare
- bec de gaz
- baie de ap ă la fierbere

55
 - parafină sterilă
- mediul de cultur ă: (se va utiliza mediul Hugh - Leifson)
- peptonă…………………..2g
- extract de drojdie…………1g
- NaCl………………………5g
- K2HPO4…………………..0,2g
- albastru de bromtimol…….0,08g
- agar-agar………………….2,5g
- zahărul adăugat…………..10
- apă distilată…………….1000ml
- termostat
- autoclav

Mod de lucru: Mediul de cultur ă repartizat câte 10 ml în eprubete, se sterilizeaz ă separat

de zahărul ce trebuie testat, la 121 oC timp de 20 minute. Dac ă mediul a fost preparat mai
înainte, se regenereaz ă prin topire într-o baie de apă la fierbere, se adaug ă zahărul ce trebuie
testat, după care se solidific ă. Se inoculeaz ă tuburile prin înţepare în profunzime, pân ă la
baza mediului din cultura de studiat. Pentru fiecare zah ăr se vor realiza c âte două tuburi, din
care unul se va acoperi cu un strat de ulei de parafin ă sterilă (5 mm înălţime).
Tuburile se vor incuba la 30 sau 37 oC timp de 48 ore sau mai mult, dup ă care se va
observa modificarea culorii mediului de cultur ă (care a avut iniţial culoarea verde), exist ând
următoarele posibilităţi;

A. Culoare galben ă în ambele tuburi (cu sau f ără ulei):

• fermentarea zahărului

B. Culoare galben ă (în suprafaţă) în tubul fără ulei:

• oxidarea zah ărului
Fermentarea unui zah ăr poate fi însoţită de o degajare de gaz.

C. Culoare verde în ambele tuburi (cu sau f ără ulei):

• zahărul nu a fost metabolizat

D. Culoare albastr ă în tubul fără ulei şi verde în tubul cu ulei:

• alcalinizare datorat ă utilizării peptonei

56
 MICROORGANISME PRODUCĂTOARE DE ENZIME HIDROLITICE

14.2. EVIDENŢIEREA MICROORGANISMELOR PRODUC ĂTOARE DE ENZIME

AMILOLITICE

Principalele enzime microbiene care hidrolizeaz ă amidonul sunt α-amilaza, β-amilaza

şi glucoamilaza, enzime extracelulare produse de bacterii, mucegaiuri şi de drojdii. Bacteriile
din genul Bacillus ( B. subtillis, B. licheniformis, B. macerans, B. stearothermophillus ) sunt
producătoare de amilaze active la 50-60 oC, termostabile şi folosite pentru obţinerea
amilazelor industriale. Alte specii de Bacillus cum sunt: B. cereus, B. megaterium, B.
polymixa sunt producătoare de β-amilază, enzimă zaharogen ă, care prin hidroliza
legăturilor glucozidice elibereaz ă molecule de maltoz ă.
Mucegaiurile produc mai ales α-amilaza şi glucoamilaza ( Aspergillus, Mucor şi
Rhizopus), deosebindu-se prin raportul între aceste dou ă enzime sintetizate. Dintre drojdii,
cei mai importanţi din acest punct de vedere sunt reprezentan ţii genurilor Saccharomycopsis ,
Tricosporon, Candida .

Principiul metodei: evidenţierea enzimelor amilolitice produse de c ătre coloniile

microbiene poate fi efectuat ă utilizând un mediu de cultur ă solidificat, conţinând amidon.
Sub acţiunea amilazelor ce difuzeaz ă în gelul de agar, amidonul este scindat hidrolitic şi, în
urma adaosului de solutie Lugol (I 2 / KI), zona din jurul coloniilor produc ătoare nu se mai
colorează în brun. Valoarea raportului între diametrul zonei de hidroliză şi diametrul
coloniei sau indicele amilolitic, este o m ăsură a cantităţii de enzimă produsă de
microorganismul testat.

Materiale utilizate:
- cultura microbiană
- plăci Petri
- mediul de cultur ă: - extract de drojdie ………….. 4g
- amidon solubil …………… 10 g
- K2HPO4 ………………….. 1g,

57
 - Mg SO4.7H2O ………….. 0,5 g
- agar-agar ………………. 20 g
- apă distilată …………..1000 ml
- I2
- KI
- ac de inoculare
- termostat
- lampă bactericidă
- bec de gaz
- autoclav

Mod de lucru: Mediul se sterilizeaz ă în autoclav timp de 30 minute, la 120 oC, după care se
toarnă în cutii Petri şi se lasă să se solidifice. Plăcile sunt apoi însămânţate prin înţepare
centrală sau din dilu ţii decimale ale microorganismului de testat.Termostatarea se face timp
de 72 ore pentru bacterii şi 5 zile pentru mucegaiuri. Pentru determinarea diametrului zonei
de liză a amidonului, peste mediul din pl ăci se toarn ă solutie Lugol şi se măsoară diametrul
coloniei şi cel al zonei r ămase necolorate. Se calculează indicele amilolitic astfel:

zona de hidroliz ă a amidonului

colonie

diametrul zonei de liză a amidonului

IA=
diametrul coloniei

14.3. EVIDENŢIEREA MICROORGANISMELOR PRODUC ĂTOARE DE ENZIME

CELULOZOLITICE

Celuloza este polizaharidul de structur ă cu cea mai mare r ăspândire în lumea

vegetal ă, putând fi hidrolizată de enzimele celulozolitice produse de bacterii şi mucegaiuri.
58
Hidroliza general ă a celulozei are loc dup ă schema:

celuloz ă

endoglucanaze (C1-celulaz ă)

lanţuri β 1-4 glucanice (insolubile)

endo 1-4 glucanaze

celodextrine; cel-oligoglucide

exo β1-4 glucanaze

celobioz ă

celobiaza

glucoză

Dintre bacteriile care produc enzime celulozolitice fac parte bacterii cu forme spiralate
aparţinând genurilor: Cytofaga, Cellvibrio, Cellulomonas . Mucegaiurile cu activitate
celulozolitică superioară sunt : Fusarium, Mucor, Trichoderma, Aspergillus, Rhizopus .

Principiul metodei: În cazul în care microorganismul testat produce enzime celulozolitice

extracelulare, acestea difuzeaz ă în mediul de cultur ă şi produc o clarificare a agarului în
jurul coloniilor active.

59
Materiale utilizate:
- cultura microbiană (Trichoderma viridae)
- plăci Petri
- ac de inoculare
- mediul de cultur ă: - celuloză pudră …………2,5g
- peptonă…………………0,5g
- K2HPO4…………………0,2g
- MgSO4 .7H2O…………….0,2g
- K2CO3……………………0,4g
- CaCl2……………………..0,02g
- FeSO4.7H2O……………0,02g
- NaCl…………………….0,02g
- agar-agar………………..15g
- apă distilată…………….1000ml
Autoclavare 20 minute, 121 oC
- termostat
- lampă bactericidă
- bec de gaz
- autoclav

Mod de lucru: Mediul de cultur ă se sterilizează în flacoane Erlenmeyer de 500 ml, la 121 oC
timp de 20 minute, apoi se repartizeaz ă câte 15 - 20ml în cutii Petri şi se lasă să se
solidifice. Însămânţarea se face fie prin înţeparea central ă a suprafeţei mediului , fie din
diluţii decimale ale culturii de analizat. Termostatarea va avea loc la 30 oC, timp de 2 - 3 zile
pentru tulpina de Trichoderma viridae sau o durat ă corespunzatoare în cazul utilizării altor
tulpini.
Dacă microorganismul testat produce enzime cu ac ţiune celulozolitică, acestea
determină clarificarea mediului de cultur ă în jurul coloniei datorit ă procesului de hidroliz ă a
celulozei incorporate. Se va calcula indicele celulozolitic al tulpinii studiate, ca fiind raportul
dintre diametrul zonei de liz ă şi diametrul coloniei:

diametrul zonei de hidroliz ă a celulozei

IC=
diametrul coloniei

60
 14.4. EVIDENŢIEREA MICROORGANISMELOR PRODUC ĂTOARE DE ENZIME
PROTEOLITICE

Proteinele constituie unul din substratele nutritive pentru microorganisme. Ele nu sunt
direct asimilabile, datorită mărimii moleculei lor şi, de aceea, trebuie degradate în peptide cu
masă mai mică şi apoi în aminoacizi, cu ajutorul enzimelor extracelulare. Proteinele
conţinute în materia organic ă nevie, care se acumuleaz ă în sol şi ape, prin moartea plantelor,
animalelor, microorganismelor, pot fi hidrolizate sub ac ţiunea proteazelor extracelulare
produse de către bacterii şi mucegaiuri -agen ţi ai putrefacţiilor (degradarea proteinelor de
origine animal ă) şi ai putrezirii (degradarea proteinelor de origine vegetal ă). Spre deosebire
de bacterii şi mucegaiuri, drojdiile nu pot folosi proteinele din mediu în procesul de nutri ţie
deoarece ele con ţin proteaze intracelulare, care nu se pot elibera în mediul extern dec ât prin
dezintegrarea învelişurilor celulare sau moarte prin autoliz ă.
Proteazele sunt produse de un num ăr de bacterii ale genului Bacillus, Streptomyces,
Proteus , Clostridium, Pseudomonas şi de mucegaiuri din genul Aspergillus, Rhizopus,
Penicillium , Mucor.

A. Hidroliza cazeinei

Principiul metodei: Coloniile producătoare de enzime proteolitice determină în jurul lor

o zonă clară de liză a cazeinei din mediul de cultur ă.

Materiale utilizate:
- cutii Petri
- cultura microbiană ( Bacillus subtilis)
- ac de inoculare
- bec de gaz
- termostat
- autoclav
- mediu de cultur ă - cazeină ………………2,5g
- Ca(OH)2…………… 0,15g
- CaCL2……………….0,05g
- agar-agar……………15g
61
 - apă distilată ………1000ml

Mod de lucru: Mediul de cultur ă se repartizează câte 200 ml în flacoane Erlenmeyer de

500 ml şI se sterilizează prin autoclavare la 121 oC timp de 20 minute, apoi se toarn ă câte
15 - 20 ml în plăcile Petri şi se lasă să se solidifice. Însămânţarea plăcilor se efectueaz ă
din cultura de lucru prin înţepare central ă sau din dilu ţii decimale şi se incubează la 30oC,
timp de 48 -72 ore. Se m ăsoară diametrul zonei în care se observ ă dispariţia turbidităţii
mediului de cultur ă ca urmare a hidrolizei cazeinei, precum şi diametrul coloniei şi se face
raportul acestora pentru a se determina indicele proteolitic:

diametrul zonei de hidroliz ă a cazeinei

IP =
diametrul coloniei

B. Hidroliza gelatinei

Principiul metodei: Microorganismele produc ătoare de proteaze extracelulare pot hidroliza

gelatina din mediul de cultur ă, care îşi pierde astfel proprietatea de a se solidifica la
temperaturi scăzute.

Materiale utilizate:
- cultura microbiană ( Bacillus subtilis)
- eprubete cu mediul de cultur ă conţinând gelatină
- ac de inoculare
- bec de gaz
- termostat
- frigider
- autoclav
- mediul de cultur ă: - peptonă de carne………….5g
- extract de carne……………3g
- gelatină……………………120g
- apă distilată ………………1000ml

Mod de lucru: Mediul de cultur ă se repartizează câte 10 mililitri în tuburi prevăzute cu dop
62
de vată şi se sterilizează în autoclav, timp de 20 minute la 121 oC. După solidificarea
mediului nutritiv (păstrat peste noapte în apă rece), tuburile se inoculeaz ă prin înţepare
centrală cu tulpina bacterian ă cercetată, apoi se incubeaz ă la 37oC timp de 48 ore. Dup ă
acest interval, culturile se plaseaz ă aproximativ o or ă la +4oC, pentru solidificarea gelatinei
în cazul în care nu a fost hidrolizat ă. Dacă tulpina a prezentat activitate proteolitic ă, mediul
de cultură rămâne lichid după păstrarea în frigider.

14.5. EVIDENŢIEREA MICROORGANISMELOR PRODUC ĂTOARE DE ENZIME

LIPOLITICE

Lipidele prezente în materia nevie, de origine vegetal ă şi animală, care ajung în

habitaturi naturale, precum şi cele conţinute în materii prime sau produse alimentare pot
suferi transformări sub acţiunea microorganismelor produc ătoare de lipaze extracelulare.
Lipidele nu pot fi asimilate dec ât după hidroliza lor în prezenţa enzimelor specifice, numite
în general lipaze, dar, grupate totu şi în funcţie de tipul substratului pe care îl degradează în
trei categorii: esteraze, lipaze şi lecitinaze.
Lipazele sunt sintetizate de numeroase microorganisme: mucegaiuri (genul Rhizopus,
Mucor, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Geotrichum ş.a.) şi drojdii ale genului Candida.
Cu microorganisme selec ţionate se pot ob ţine preparate enzimatice cu activitate
lipazică ce pot fi utilizate la fabricarea brânzeturilor pentru dezvoltarea aromei, în
terapeutică împreună cu lipaza pancreatic ă pentru îmbunătăţirea digestiei, precum şi în
industria detergen ţilor.

Principiul metodei: Lipazele din grupa esterazelor hidrolizeaz ă compuşii denumiţi

“TWEEN”, care sunt esteri ai sorbitolului cu acizii gra şi cu lanţ lung. În tehnicile calitative
cele mai utilizate, aceşti esteri solubili în apă sunt încorporati într-o geloză nutritivă
conţinând CaCl2. Acizii graşi eliberaţi sub acţiunea lipazelor reacţionează cu CaCl2 şi
formează săruri insolubile de calciu care provoac ă opacifierea mediului în jurul coloniilor
producătoare de esteraze.

Materiale utilizate:
- cultura microbiană cu activitate lipolitică
- cutii Petri

63
- ac de inoculare
- bec de gaz
- termostat
- mediul de cultur ă: - agar nutritiv

Mod de lucru: se sterilizează mediul de cultur ă în flacoane Erlenmeyer de 500 ml şi,

separat, o solu ţie 1% de Tween 20, 40, 60 sau 80 şi o soluţie 1% CaCl2, în regim de 121 oC /
20 minute. În plăcile Petri sterile se introduc c âte 2 ml din solu ţia de Tween şi 0,5 ml din
soluţia de CaCl2. Peste acestea se toarn ă rapid 15 - 20 ml din agarul nutritiv, se
omogenizeaz ă prin rotirea în ambele sensuri a pl ăcilor şi se lasă să se solidifice. Mediul se
însămânţează prin înţepare centrală din cultura de cercetat şi se termostatează la
temperatura optimă de dezvoltare a microorganismului, timpul necesar. Microorganismele cu
activitate tween-esterazic ă determină apariţia în jurul coloniilor a zonelor opace. Se
calculeaz ă indicele lipolitic după formula:

diametrul zonei de hidroliz ă a esterului

IP =
diametrul coloniei

64
 14.6. STUDIUL EFECTULUI ANTIBIOTICELOR ASUPRA
MICROORGANISMELOR

EFECTUAREA ANTIBIOGRAMEI PRIN METODA DISCURILOR

Antibioticele sunt substan ţe a căror acţiune antibacterian ă se exprimă astfel:

• prin inhibarea multiplic ării bacteriilor - efect bacteriostatic

• prin distrugerea bacteriilor - efect bactericid

Evidenţierea acţiunii bacteriostatice a unor antibiotice prin metoda discurilor

Principiul metodei: Când un antibiotic este plasat pe suprafa ţa unui mediu de cultur ă
gelozat, în cutii Petri, acesta difuzează după un gradient de concentra ţie. Bacteria
însămânţată nu se va dezvolta la concentra ţii ale antibioticului superioare unei m ărimi
numită C.M.I. (concentraţie minimă de inhibiţie). În jurul discurilor de h ârtie impregnate cu
antibioticul respectiv se vor observa zone concentrice de inhibi ţie, al căror diametru este
dependent de sensibilitatea mai mare sau mai mic ă a tulpinii testate fa ţă de acest antibiotic.

Materiale utilizate:
- cultura bacterian ă
- cutii Petri
- discuri de hârtie impregnate cu diferite antibiotice (discurile au un diametru de
aproximativ 0,6 cm şi sunt inscripţionate cu denumirea prescurtată a antibioticului respectiv;
concentraţia de antibiotic este men ţionată de obicei de firma produc ătoare pe ambalaj).
- eprubete cu ap ă sterilă
- pipete sterile de 5 ml
- bec de gaz
- termostat
- mediul de cultur ă: agar nutritiv

65
Mod de lucru: Se sterilizează mediul de cultur ă şI eprubetele cu ap ă prin autoclavare
20 minute la 121 oC, apoi se toarn ă în pl ăcile Petri şi se lasă să se solidifice. Se preg ăteşte
inoculul prin obţinerea unei suspensii de celule bacteriene în apă sterilă, astfel încât
concentraţia acestuia s ă fie de 2 -3 x 106 UFC/ml. Această concentraţie bacteriană
trebuie să permită obţinerea de colonii confluente pe suprafa ţa mediului de cultur ă. De
asemenea, este indicat ca inoculul s ă provină dintr-o cultură bacteriană veche de 24 ore,
aflată în faza staţionară. Însămânţarea mediului de cultur ă din plăcile Petri se realizeaz ă
prin “inundarea” întregii suprafeţe cu 2 -4 ml din dilu ţia obţinută din cultura bacterian ă, iar
excesul de lichid se scurge prin aspirare cu o pipet ă Pasteur. Se aplic ă apoi discurile de testat
fie cu ajutorul distribuitorului automatic, fie cu o pens ă (sterilizată prin flambare), în mod
aseptic, apăsând uşor pe discuri pentru a asigura aderen ţa la mediu. Acest din urm ă
procedeu este tot mai rar întrebuinţat. Incubarea are loc 16 - 18 ore la 37 oC.
Se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară influenţa diferitelor
antibiotice asupra tulpinii bacteriene testate, men ţionându-se cel mai eficient antibiotic
precum şi cel cu ac ţiunea cea mai slab ă.

Antibiotic 2
Antibiotic 3

Antibiotic 4

Antibiotic 5
Antibiotic 1

66
 15. BIOSINTEZA PE CALE MICROBIAN Ă A UNOR COMPUŞI DE INTERES
INDUSTRIAL

Microbiologia industrială a devenit o parte important ă a microbiologiei, având ca

domeniu de studiu utilizarea microorganismelor în scopul producerii de metaboli ţi de interes
industrial, farmaceutic, agricol, pentru conservarea mediului etc.
Produşii de origine microbian ă sunt clasificaţi în metaboliţi primari şi secundari.
Metaboli ţii primari sunt reprezentaţi de compuşii aflaţi în legătură cu sinteza
componentelor celulei microbiene, produ şi cel mai adesea în faza de cre ştere exponenţială
sau trofofaza. Aceştia includ aminoacizi, nucleotide, enzime, produ şi finali de fermentaţie
cum sunt etanolul sau acizii organici.
Metaboli ţii secundari se acumuleaz ă în mediul de cultur ă în idiofază, adică în
perioada urm ătoare fazei de cre ştere exponentiale; ace ştia sunt compu şi care nu au leg ătură
directă cu creşterea şi sinteza de material celular. Din aceast ă categorie fac parte cele mai
multe antibiotice, micotoxine şi coloranţi microbieni.

Curba de creştere

metaboliţi metaboliţi
primari secundari

timp

Principalii metaboliţi microbieni de interes industrial şi biotehnologic sunt prezentaţi

în tabelul următor:

SUBSTANŢE MICROORGANISME

67
 Produse industriale
Etanol (din glucoz ă) Saccharomyces cerevisiae
Etanol (din lactoz ă) Kluyveromyces fragilis
Aceton ă şi butanol Clostridium acetobutylicum
2,3 - butandiol Enterobacter, Serratia
Enzime Aspergillus, Bacillus, Mucor, Trichoderma
Produse agricole
Gibereline Gibberella fujikuroi
Insecticide microbiene Bacillus thuringiensis
Aditivi alimentari
Aminoacizi Corynebacterium glutamicum
Acizi organici Aspergillus niger
Nucleotide Corynebacterium glutamicum
Vitamine Ashbya, Eremothecium, Blakeslea
Polizaharide Xanthomonas
Produse medicale
Antibiotice Penicillium, Streptomyces, Bacillus
Alcaloizi Claviceps purpurea
Insulină, hormon uman de cre ştere, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae
somatostatină, interferon şi altele prin inginerie genetic ă
Combustibili
Hidrogen Microorganisme fotosintetice
Metan Methanobacterium
Etanol Zymomonas, Thermoanaerobacter

Microorganismele utilizate în aplicaţiile industriale sunt cultivate fie în tuburi, în

flacoane agitate, în fermentatoare, cu agitare sau static, în medii lichide în submers sau pe
medii solide (fermentaţie pe suport solid). Mediile de cultur ă utilizate trebuie să aibă un
preţ de cost cât mai mic, de aceea sunt reprezentate de materii prime, produse, subproduse şi
deseuri ale industriei agroalimentare, constituind sursa de carbon, de azot , factorii de
creştere, care pot fi suplimentate cu s ăruri minerale.

15.1. OBŢINEREA DE BIOMASĂ DIN FUNGI

68
Materiale utilizate:
- cultură de Pleurotus ostreatus sau alt microorganism ce poate fi utilizat în acest
scop
- flacoane Erlenmeyer de 1500 ml
- ac de inoculare
- tuburi cu apă sterilă
- bec de gaz
- termostat
- mediu de cultur ă: boabe de gr âu

Mod de lucru: În flacoanele Erlenmeyer se c ântăresc câte 100 g de boabe de gr âu curate şi

se adaug ă 100 ml ap ă de robinet. Mediul se sterilizeaz ă 30 minute la 121 0C, iar după răcire
se însămânţează cu cultura de Pleurotus ostreatus obţinută prin suspensionarea celulelor
dintr-un tub în ser fiziologic sau ap ă sterilă. Se omogenizeaz ă cultura şi se termostatează la
temperatura camerei, timp de 2 - 3 s ăptămâni, notându-se data la care cultura a invadat
suprafata mediului şi efectuându-se cântăriri ale flaconului din 3 in 3 zile, pentru
determinarea pierderii masice datorate evaporării , respiraţiei şi metabolizarii substratului.
Ciuperca cultivat ă este comestibil ă, (ea face parte din categoria ciupercilor superioare, cu
pălărie) iar produsul brut obţinut ar putea fi prelucrat şi utilizat ca aditiv în industria
alimentară pentru valoarea sa nutritiv ă ridicată, gust şi aroma caracteristic ă.

15.2. OBŢINEREA DE ENZIME PECTOLITICE DIN ASPERGILLUS NIGER

Substan ţele pectice sunt constituen ţi fiziologici universali ai vegetalelor, alc ătuind
lamela mijlocie care formează legătura dintre celule. Tesuturile parenchimatoase sunt
deosebit de bogate în substan ţe pectice: acizi pectinici, acizi pectici şi protopectine. Acizii
pectinici sunt heteropolizaharide constituite în principal din acizi D-galacturonici, în
majoritate sub formă de ester metilic, un iţi prin legături α-1,4. Acizii pectici sunt acizi
poligalacturonici neesterificaţi insolubili in apă. Protopectinele, insolubile în apă, stau la
originea substanţelor pectice, pe care le eliberează prin hidroliză.
Enzimele care ac ţionează asupra substan ţelor pectice se pot încadra în două grupe:
enzime depolimerizante şi enzime saponifiante. Enzimele pectolitice saponifiante sunt
esteraze înalt specifice catalizând demetoxilarea pectinelor prin scindarea leg ăturilor esterice
69
dintre grupele -COOH şi alcoolul metilic din lanturile poligalacturonice. Ele se numesc
pectin-metil-esteraze sau pectin-esteraze fiind notate PME sau PE. Enzimele pectolitice
depolimerizante catalizeaz ă depolimerizarea pectinei.
Preparatele enzimatice comerciale se ob ţin prin cultivarea tulpinilor selec ţionate de
microorganisme (de obicei Aspergillus niger) pe medii de cultur ă formate din tărâţe de
grâu, tăiţei de sfecl ă de zahăr, morcovi, melasă, tescovină de mere etc.
După dezvoltarea microorganismului şi biosinteza enzimelor, mediile de cultur ă sunt
prelucrate după tehnicile cunoscute ob ţinându-se preparate enzimatice pectolitice purificate
sub formă de lichid concentrat sau sub form ă solidă.
Preparatele enzimatice pectolitice de origine microbian ă sunt utilizate în industria
sucurilor de fructe, conservelor de legume, vinurilor, produselor zaharoase.

Materiale utilizate:
- tulpina de Aspergillus niger producătoare de enzime pectolitice
- flacoane Erlenmeyer de 1500 ml
- ac de inoculare
- apă sterilă
- mediu de cultur ă: tăraţe de grau cu umiditate de 40 - 50%
- bec de gaz
- termostat
Mod de lucru: Se prepară mediul de cultur ă conţinand tărâţe de gr âu şi apă de robinet
(50% umiditate) şi se repartizeaz ă câte 100 g în fiecare flacon, dup ă care se sterilizeaz ă la
1210C, timp de 60 minute. Se inoculeaz ă cu 10 ml suspensie de spori de Aspergillus niger
obţinută prin raclarea culturii dintr-un tub de cultur ă în 10 ml ap ă sterilă. Mediul nutritiv se
omogenizeaz ă foarte bine şi se incubeaz ă la 300C, timp de 5 zile, cu agitare din 24 în 24 de
ore. După dezvoltarea complet ă şi sporularea culturii, se efectueaz ă o extracţie 1: 3 în ap ă
de robinet, în care se adaug ă şi câteva picături de Tween pentru umectarea sporilor şi
optimizarea extracţiei şi se lasă la temperatura camerei 2 ore. Se filtreaz ă mai întâi grosier,
apoi pe filtru EK şi se poate supune opera ţiei de concentrare.
Preparatul enzimatic brut se prezint ă ca un lichid transparent, de culoare brun ă,
având, o înc ărcătura relativ ridicată de conidiospori de Aspergillus niger, care poate fi
înlăturată prin trecerea pe filtru EK, din azbest.

70
 15.3. OBŢINEREA PIGMENTILOR MICROBIENI

BIOSINTEZA OREZULUI ROŞU FERMENTAT CU MONASCUS PURPUREUS

Mucegaiul Monascus purpureus, utilizat de secole în ţările din Orient pentru

prepararea unor mâncăruri tradiţionale, reprezint ă în prezent o nou ă sursă de obţinere a
unui aditiv de culoare pentru industria alimentar ă, farmaceutică şi cosmetică, şi în ţările
Europei şi Americii. Acest microorganism produce prin cultivare în medii lichide sau prin
fermentare pe suport solid cel putin 6 pigmen ţi, dintre care 2 galbeni (ankaflavina şi
monascina), 2 oranj (rubropunctatina şi monascorubrina) şi 2 roşii (rubropunctamina şi
monascorubramina), în funcţie de natura sursei de carbon şi azot şi de condi ţiile de
cultivare. Totodat ă, acest microorganism sintetizeaz ă o serie de enzime hidrolitice ( în special
amilaze), care degradeaz ă componen ţii mediului de cultur ă şi poate fermenta o serie de
glucide, fapt pentru care este folosit în Orient la obţinerea vinului de orez.

Materiale utilizate:
- tulpina de Monascus purpureus
- flacoane Erlenmeyer de 1500 ml
- ac de inoculare
- eprubete cu ap ă sterilă
- bec de gaz
- termostat
- mediu de cultur ă: orez boabe sau m ăcinat

Mod de lucru: Mediul de cultur ă se repartizează câte 100 g în fiecare flacon Erlenmeyer şi
se sterilizează prin autoclavare la 121 0C, timp de 30 minute. Dup ă răcire, mediul este
însămânţat cu o suspensie de conidiospori de Monascus purpureus obţinuţi prin raclarea
culturii din tub în apă sterilă. Se agită energic conţinutul flacoanelor, aceast ă operaţie
repetându-se zilnic până la încheierea biosintezei. Termostatarea va avea loc la întuneric, la
300C, timp de 3 s ăptămani. Se va nota intervalul dup ă care are loc apari ţia hifelor, colorarea
mediului de cultur ă în oranj sau ro şu şi se vor c ântări flacoanele la fiecare 3 zile pentru
evidenţierea scăderii în greutate ca urmare a evapor ării, consumului de substrat şi a
respiraţiei celulare. Dup ă încheierea procesului de sintez ă a pigmenţilor, aceştia vor fi
extraşi din mediul de cultur ă în etanol, put ându-se trasa spectrul în vizibil.
71
 16. INFLUENŢA RADIAŢIILOR UV ASUPRA MICROORGANISMELOR

16.1. POSIBILITATEA INDUCERII MUTAGENEZEI ÎN CELULA MICROBIANĂ

Radiaţiile ultraviolete cu lungimea de und ă de 254 nm pot avea efecte letale asupra
celulei microbiene, în funcţie de doză şi de starea microorganismelor. Ele sunt puternic
absorbite de bazele azotate, determin ând asupra acestora efecte chimice const ând în formarea
de pirimidine legate covalent (dimeri de pirimidin ă), în principal de timin ă adiacent ă în
lanţul polinucleotidic. Aceşti dimeri cauzează o distorsiune în helixul de ADN, dar cele mai
multe modificări pot fi reparate prin procese de fotoreactivare, prin excizie, recombinare sau
reparare SOS. Dac ă doza de radia ţii este subletal ă, informaţia genetică se transmite eronat
şi se pot ob ţine tulpini mutante, cu caractere diferite de cele ale tulpinei parentale. La nivel
molecular, mutaţiile reprezintă alterări ale secven ţei de baze din structura ADN. În practica
biotehnologică, acest aspect este utilizat pentru ob ţinerea de mutante cu potential productiv
ridicat, cultivate pentru biosinteza unor compu şi de interes industrial.

Principiul metodei: Radiaţiile ultraviolete fac parte din categoria agen ţilor mutageni fizici,
care determină, pe lângă moartea unor celule, m ărirea ratei de apariţie a mutaţiilor, care,

72
oricum s-ar fi produs şi spontan, dar în intervale de timp mult mai mari. Acţiunea radiaţiilor
UV poate fi evidenţiată prin determinarea numărului de celule viabile dup ă expunerea la
acest tip de factori fizici, faţă de un martor neiradiat.

Materiale utilizate:
- lampă germicidă (cu λ = 254 nm)

- cultura microbiană
- stativ
- cronometru
- pipete sterile
- plăci Petri
- termostat
- mediu de cultur ă - se va utiliza mediul adecvat tulpinii cu care se lucreaz ă. Pentru
determinarea numărului de bacterii viabile se va utiliza agar nutritiv, pentru drojdii sau
mucegaiuri - extract de mal ţ - agar. Pentru eviden ţierea tulpinilor mutante se va alege un
mediu special, în funcţie de caracterul care se dore şte a fi selecţionat, de exemplu: indice
amilolitic, proteolitic etc, crescut (vezi lucr ările anterioare), producţie de pigmenţi,
proprietatea de rezisten ţă la un anumit antibiotic ş.a.

Mod de lucru: Mediul de cultur ă sterilizat în prealabil se fluidific ă pe baie de ap ă, după

care se repartizeaz ă în plăci şi se lasă să se solidifice. Însămânţarea plăcilor se face dintr-o
diluţie corespunzătoare, în ser fiziologic sau ap ă sterilă, astfel încât să poată fi determinat
numărul de colonii ap ărute după termostatare, în cazul probei neiradiate. În cazul probelor
ce vor fi expuse ac ţiunii radiaţiilor UV, trebuie să se ţină seama că diluţia va fi din ce în ce
mai mică, mergând, unde se poate, pân ă la pipetarea direct ă din inocul. Pentru iradierea
probelor, se fixează stativul sub lampa germicid ă, la o distan ţă de aproximativ 20 cm, şi se
sterilizează nişa timp de 15 minute prin aprinderea l ămpii.

Pentru efectuarea iradierilor, pl ăcile Petri însămânţate şi deschise vor fi plasate pe

stativ, pornindu-se cronometrul concomitent cu aprinderea l ămpii. Atenţie! Înainte de
pornirea lămpii bactericide, se va închide ni şa cu ajutorul ecranului protector mobil. Nu se
introduce mâna în nişă în timp ce lampa de ultraviolete este în funcţiune!

73
 Timpii de expunere a culturilor din pl ăci la acţiunea radiaţiilor UV sunt cuprin şi
între 30 secunde şi câteva minute, în funcţie de tulpina cu care se lucreaz ă. Imediat dup ă
iradiere, plăcile se închid cu capacul, se noteaz ă timpul de expunere, se ambaleaz ă în h ârtie
neagr ă (pentru evitarea repara ţiilor prin fotoreactivare) şi se introduc în termostat, l ăsându-
se durata necesar ă dezvoltării coloniilor. După acest interval se num ără coloniile apărute în
fiecare placă, ţinându-se seama de coeficientul de dilu ţie.

Pentru fiecare timp de iradiere trebuie efectuate c âte trei plăci, în scopul exprim ării
rezultatelor ca medie a trei determin ări. Viabilitatea celulelor expuse iradierii se va calcula
după formula:

nr. colonii din plac ă x coeficientul de diluţie

Viabilitatea = x 100
nr. colonii din placa martor (neiradiat ă) x coeficientul de diluţie

Se va completa urm ătorul tabel:

Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
probă
Timp de 0 10 30 60 90 120 150 180 210 240
iradiere
(sec)
Nr.
celule/ml
Viabi-
litate (%)

În cazul în care se dore şte izolarea de tulpini mutante cu caractere fenotipice

modificate faţă de tulpina parental ă, se va utiliza un mediu de cultur ă convenabil, care s ă
permită selecţionarea uşoară şi rapidă a coloniilor mutante. Acestea vor fi însămânţate în
tuburi, pe mediu înclinat, urmând ca tulpinile selec ţionate să fie testate prin cultivare în
submers sau suprafa ţă din punct de vedere al biosintezei metaboli ţilor utili. De exemplu, pot
fi izolate tulpini bacteriene sau fungice produc ătoare de amilaze, proteaze, celulaze, lipaze,
coloranţi microbieni, rezistente la ac ţiunea unor factori de mediu etc.

74
 DESFĂŞURAREA ACTIVITĂŢII ŢI PROTECŢIA MUNCII
ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Microbiologia este o disciplină care necesită ordine, metodă, rigoare şi o

curăţenie impecabilă în timpul lucrului.

În laboratorul de microbiologie trebuie respectate o serie de reguli de igien ă, f ără de

care nu pot fi aplicate metodele de lucru specifice acestei discipline, exist ând totodată
pericolul contaminării propriei persoane, a celor din jur, precum şi a materialelor care se
manipuleaz ă.

Numărul microorganismelor din încă peri variază de la câteva sute / m3, în încăperi
foarte curate, f ără mişcări de aer, p ână la zeci de mii în încăperi neîntreţinute igienic. Este
cunoscut faptul că majoritatea microorganismelor din aer provin de pe sol, din depozitele de
materie organică şi ajung în aer odată cu particulele de praf. O alt ă categorie sunt
microorganismele expulzate de pe mucoasele aparatului respirator prin tuse, str ănut, vorbire
şi chiar în timpul respiraţiei.
Pentu desf ăşurarea unei activit ăti normale de lucru în laboratoarele de microbiologie
se vor respecta urm ătoarele reguli:

* întreţinerea în perfectă stare de curăţenie a încăperilor (pardoseal ă, pereţi, plafon şi

geamuri), combaterea insectelor şi a mucegaiului;

* îndepărtarea de pe mesele de lucru şi din încăpere a tuturor obiectelor inutile;

75
* întreţinerea în perfectă stare de cur ăţenie a aparaturii, mobilierului şi meselor de
lucru;
* ştergerea meselor de lucru cu un dezinfectant înainte de începerea lucrului;
* evitarea formării curenţilor de aer în încăperile de lucru;

* iradierea cu raze ultraviolete a atmosferei şi suprafeţelor de lucru înainte de

începerea activit ăţii
* întreţinerea în perfectă stare de cur ăţenie a mâinilor, îmbrăcămintei şi
încălţămintei persoanelor care lucreaz ă în laborator.

De aceea, în laboratorul de microbiologie :

• purtaţi un halat de laborator dintr-un material neinflamabil, în stare bună, curat şi

dintr-o singură culoare; lăsaţi-vă hainele în vestiar sau în spaţiul special amenajat;
după terminarea lucrărilor, halatul va fi p ăstrat în locuri speciale;
• protejaţi-vă şuviţele lungi de p ăr, purtaţi unghiile curate şi tăiate scurt;
• spălaţi-vă mainile cu apă cald ă şi săpun (de preferinţă lichid sau pudr ă, cu acţiune
bactericidă) şi ştergeţi-le pe un prosop de h ârtie de folosinţă unică înainte şi după
manipularea microbiologic ă;
• după utilizarea sticlăriei cu care aţi manipulat microorganismele, aceasta trebuie
depozitat ă separat în vederea autoclav ării;
ESTE INTERZISĂ ARUNCAREA OBIECTELOR CARE AU FOST ÎN CONTACT
CU MICROBII LA COŞUL DE GUNOI !
• nu mâncaţi, nu beţi şi nu fumaţi în incinta laboratorului;
• nu depozita ţi alimentele personale în frigiderul laboratorului;
• nu vorbiţi, nu strănutaţi şi nu tuşiţi în timpul însămânţărilor ;
În practica de laborator, principalele accidente pot apare la:
- mâini - tăieturi sau inţepături cu pipete Pasteur sau cu cioburi de sticl ă; arsuri ale
degetelor în timpul lucrului în zona steril ă din jurul flăcării de la becul de gaz; arsuri
cu amestec sulfocromic;
- ochi - prin proiectarea cioburilor de sticl ă sau a unor stropi de ap ă fierbinte sau
substanţe chimice în timpul lucrului;
- gură - ingerarea de produ şi toxici (reactivi) sau de culturi microbiene; acest tip

76
de accidente este foarte rar, deoarece pipetele sunt prev ăzute cu un dop de vat ă la
capăt;
- nas - inhalarea unei dispersii de germeni (aerosoli infec ţioşi), din cauza
practicilor greşite de însămânţare sau când un tub de cultur ă microbiană se sparge:
acest tip de accidente poate fi evitat prin purtarea unei m ăşti sterile din hârtie.

77