LUCRAREA 1

Identificarea eficientei de sterilizare a incintelor si suprafetelor

utilizand diferite tehnici de sterilizare

Metode de sterilizare şi dezinfecţie

Sterilizarea reprezintă procedeul de distrugere completă a tuturor microorganismelor, fie în stare

vegetativă, fie în stare sporulentă.
Metodele de sterilizare sunt multiple şi anume:
Metode fizice:
-metode termice, umede şi uscate;
-filtrarea;
-centrifugarea;
-radiaţiile ultraviolete;
-ultrasunete;
Metode chimice:
- cu agenţi chimici.

1.5.1.Metode fizice de sterilizare

Sterilizarea termică constă în degradarea materialului biologic până la carbonizare. Sub acţiunea
căldurii sunt distruse formele vegetative la temperaturi de 50-60ºC timp de 30 minute sau la 70-75ºC
timp de 10 minute.

1.5.1.1. Sterilizarea termică uscată

Incinerarea constă în arderea produselor ce nu pot fi reutilizate (vată, tifoane, materiale de plastic
şi altele care sunt infestate şi care reprezintă un pericol), până la carbonizare la peste 450ºC, în
cuptoare (crematorii).
Incălzirea la incandescenţă este utilizată pentru sterilizarea ansei înainte şi după utilizare şi
constă în încălzirea cu becul de gaz sau cu o lampă cu alcool a firului de platină până la incandescenţă.
Flambarea constă în trecerea rapidă prin flacară a unui obiect din sticlă (pipeta, gâtul flacoanelor
sau eprubetelor, lame, spatule, flacoanelor) în scopul distrugerii microorganismelor.
Sterilizarea în etuvă la cald se aplică pentru sterilizarea sticlăriei de laborator (eprubete, pahare,
cutii Petrii, pipete, baloane de sticlă, dopuri de vată) care a fost ulterior spălată şi uscată.
Se recomandă ca sticlăria să se împacheteze în hârtie pentru a se evita contaminarea ulterioară.
Sterilizarea se realizează prin menţinerea sticlăriei la 180 ºC timp de 2 ore. După două ore se întrerupe
încălzirea şi se lasă ca aceasta să se răcească lent evitându-se astfel spargerea ei. După sterilizarea
sticlăria se depozitează în spaţii special amenajate, curate.
 1.5.1.2.Sterilizarea umedă la cald

Acest tip de sterilizare are o eficienţă mai ridicată distrugând microorganismele la o temperatură
mai scăzută în comparaţie cu sterilizarea termică uscată, printr-o putere de penetrare mai mare, prin
denaturarea proteinelor.
Fierberea se utilizează pentru sterilizarea seringilor, a manşoanelor şi tuburilor din cauciuc şi a
instrumentelor metalice. Se realizează în apă distilată prin fierbere timp de 30 minute. Prin fierbere se
distrug formele vegetative ale bacteriilor, virusurilor şi unii spori(tetanos). Pentru a se ridica punctul
de fierbere al apei şi pentru a se evita depunerea de săruri pe suprafaţa materialelor şi ruginirea
acestora se adaugă soluţie de borax cu concentraţia 4-5%.

Sterilizarea cu vapori de apă sub presiune

Acest tip de sterilizare se realizează în autoclav, în atmosferă de vapori de apă sub presiune şi la
temperatură. Această sterilizare realizează distrugerea completă a tuturor microorganismelor şi a
sporilor. Cu ajutorul autoclavei se sterilizează mediile solide şi lichide în care au fost crescute
microorganismele, apa distilată, mediile de cultură.
De reţinut este faptul că nu se introduc simultan în autoclavă medii şi materiale care urmează a fi
utilizate pentru viitoarele însămânţări cu medii şi materiale care au fost utilizate în analizele
microbiologice anterioare. În funcţie de presiunea de lucru sterilizarea se realizează la temperaturi
diferite astfel:
-0,5 atm, se atinge temperatura de 115ºC, timpul de sterilizare 30 minute;
-1,0 atm, se atinge temperatura de 121ºC, timpul de sterilizare 20 minute;
-2,0 atm, se atinge temperatura de 134ºC, timpul de sterilizare 15 minute.
În tabelul 1 sunt prezentate unele durate, temperaturi şi presiuni de sterilizare pentru diferite medii
de cultură, alte obiecte şi soluţii utilizate în microbiologie.

Tabelul 1. Temperatura, presiunea şi timpul necesar pentru sterilizarea unor medii.

Material sterilizat Temperatura (ºC) Presiunea (atm) Timpul (minute)
Sticlărie curată 121 1 20
Apă, ser fiziologic 121 1 20
Parafină 121 1 20
Săruri minerale 121 1 20
Medii nutritive 121 1 15-20
curente (geloză,
bulion)
Lapte degresat 115 0,7 15
Medii termolabile 110 0,5 20
Glucoza în soluţie 110 0,5 20

Eficienţa sterilizării este evidenţiată utilizând indicatori de sterilizare, benzi de hârtie imprimate
special, a căror coloraţie virează în condiţii sterile. Deasemenea controlul sterilizării se poate face prin
utilizarea unui martor care conţine doar mediu care se incubează în aceleaşi condiţii cu proba. Dacă pe
martor nu apar modificări de culoare şi consistenţă atunci sterilizarea s-a realizat corect.
Sterilizarea cu vapori la 100 ºC se realizează cu ajutorul autoclavei dar la presiune de 1 atm,
această metodă se aplică pentru sterilizarea produselor ce nu suportă temperaturi mai mari de 100 ºC.
 Pasteurizarea este o metodă de sterilizare blândă care nu alterează vitaminele, enzimele şi
proteinele. Acest procedeu se realizează la temperatură ridicate, 65 ºC, timp de 30 minute, la 80-90 ºC
timp de 1-2 minute sau la 91-95 ºC timp de câteva secunde şi care constă în distrugerea formelor
vegetative ale germenilor patogeni. Produsele se păstrează închise ermetic la 4 ºC până în momentul
folosirii pentru a se evita germinarea sporilor.
Tidalizarea reprezintă o pasteurizare repetată de 3 ori la intervale de 24 h, este o metodă de
sterilizare completă. Se utilizează pentru sterilizarea produselor sau mediilor de cultură care conţin
glucide, gelatină, lapte şi altele care se degradează la temperaturi mai mari. În intervalul dintre două
pasteurizări succesive, produsele se păstrează la temperatura camerei, când sporii rămaşi se dezvoltă
la forme vegetative care sunt apoi distruse la viitoarea sterilizare.

1.5.1.3 Sterilizarea prin filtrare

Sterilizarea prin filtrarea reprezintă o metodă care se aplică la sterilizarea produselor care nu pot fi
sterilizate pe altă cale şi anume soluţii de vitamine, ser sanguin, oligoelemente şi altele. Această
metodă constă în trecerea unei soluţii printr-un material poros şi reţinerea microorganismelor în
spaţiile acestuia prin fenomene de capilaritate, fenomene superficiale şi adsorbţie. Procesul de filtrare
depinde de proprietăţile soluţiilor care se filtrează (pH, vâscozitate, temperatură, tăria ionică) dar şi de
proprietăţile materialului poros (dimensiune pori, sarcina electrică). Pentru realizarea filtrării trebuie
să existe o diferenţă de presiune între feţele filtrului,aceasta se obţine prin ataşarea sistemului la o
trompă de vid.
Filtrele cele mai utilizate sunt:
Filtrele Seitz (Figura 1) sunt filtre din plăci de azbest care se fixează într-o armătură metalică care
este prevăzută cu o pâlnie şi care se montează prin intermediul unui dop de cauciuc la un balon
Kitasato. Vasul Kitasato este pus în legătură cu o pompă de vid. Filtrul trebuie să fie steril şi se
umezeşte cu apă distilată sterilă înainte de utilizare. Lichidul filtrat trece în balonul de sticlă iar
virusurile sau bacteriile rămân pe filtru.
FiltreleSeitz pot fi :
-filtre pentru bacterii de tip EK1, care reţin bacteriile şi lasă să treacă virusurile;
-filtre pentru virusuri de tip EK2, care reţin virusurile de dimensiuni mari.
Filtrele de sticlă(Schott) sunt filtre constituite dintr-o placă de sticlă poroasă, fixată într-o pâlnie
de sticlă termorezistentă,care funcţionează după acelaşi principiu cu filtrele Seitz. Pentru utilizare
filtrele trebuie sterilizate şi spălate cu mari cantităţi de apă distilată, sterilă. În funcţie de dimensiunea
porilor filtrele pot fi:
-filtre cu pori mari, de tip G (Gross-mare), notate (G1-G5), care reţin microorganisme de tip
bacterii şi drojdii;
-filtre cu pori medii, de tip M (Mittel-mijlociu), care reţin microorganisme de tip bacterii cu
dimensiuni medii şi viruşi cu dimensiuni mai mari;
-filtre cu pori fini, de tip F (Fein-fin), care reţin virusuri.
Avantajele folosirii filtrelor din sticlă:
-permit trecere unor volume mari de lichide;
-nu modifică compoziţia filtratului;
-se curăţă şi se sterilizează uşor;
-sunt rezistente la factori fizici şi chimici;
-se regenerează periodic, menţinându-se în H2SO4 concentrat timp de 24 ore după care se trece
succesiv 1 litru de KMnO4 1‰, 1 litru de acid oxalic 1% şi 3 litri de apă distilată.
 Membranele filtrante polimerice (Figura 2) sunt filtre de unică folosinţă constituite din mase
plastice, esteri celulozici şi altele. În funcţie de domeniul de utilizare membranele sunt:
-pentru viruşi, cu diametrul porilor φ=0,025μm;
-pentru bacterii, cu diametrul porilor φ=0,22μm;
-pentru drojdii, cu diametrul porilor φ=0,45μm.
Avantajele utilizării acestui sistem de filtrare sunt similare cu cele ale utilizării filtrelor de sticlă,
cu menţiunea că membranele filtrante nu se regenerează, sunt de unică folosinţă;

1.5.1.4. Sterilizarea cu radiaţii

Sterilizarea cu radiaţii presupune utilizarea radiaţiilor de tip UV, gama şi ultrasunete.

Sterilizarea cu raze UV
Aceasta este o metodă completă de sterilizare care distruge atât formele vegetative cât şi pe cele în
formă de spori. Radiaţiile UV cu lungimea de undă cuprinsă între 2537-2800 Å sunt absorbite de
ADN-ul celulelor şi determină sinteza unor proteine cu efect mutagen sau blochează replicarea cu
efect letal. Există şi bacterii rezistente la UV.
Radiaţiile cu lungimea de undă cuprinsă între 136-4000 Å şi energie joasă sunt utilizate pentru
sterilizarea mediilor transparente precum aerul şi a suprafeţelor plane.

Sterilizarea cu radiaţii γ (gama)

Aceasta este o metodă completă de sterilizare care distruge atât formele vegetative cât şi pe cele în
formă de spori. Radiaţiile gama cu lungimea de undă cuprinsă între 0,005 şi 1,4 Å cu energie şi viteză
mare produc ionizări ale substratelor iradiate care determină moartea acestora. Această metodă este
utilizată pentru sterilizarea obiectelor din maerial plastic cu unică utilizare (tuburi de cateter, pense,
seringi, pipete, anse, tuburi etc.).

Sterilizare cu ultrasunete (US)

Undele cu frecvenţa υ ≥20KHz, obţinute în urma trecerii unui curent electric alternativ de înaltă
frecvenţă printr-un cristal de cuarţ determină dezintegrarea pereţilor celulari bacterieni şi dispersia
conţinutului celular în mediu (cavitaţie). Acest procedeu se foloseşte pentru sterilizarea sucurilor din
fructe, mustului, laptelui, vaccinurilor, produselor farmaceutice etc.

1.5.2.Metode chimice de sterilizare

Agenţii chimici de sterilizare au proprietatea de a inhiba creşterea microorganismelor
(microbiostatic) - antisepticele, sau de a distruge microorganismele (microbiocid) – dezinfectantele,
cu care vin în contact. Efectele agenţilor chimici asupra microorganismelor depind de natura,
concentraţia şi timpul de acţiune.

1.5.2.1. Antisepticele distrug doar formele vegetative nu şi sporii. Substanţele chimice au

concentraţii mici, se pot aplica direct pe ţesuturile vii şi nu trebuie să fie toxice, caustice şi iritante.
Dintre antisepticele cele mai des utilizate amintim:
-acid boric, soluţie, concentraţie 3-4%, antiseptic al mucoaselor;
-alcool etilic, soluţie, concentraţie 70%, antiseptic al tegumentelor;
-azotat de argint, soluţie, concentraţie 1%, antiseptic al mucoasei conjunctive;
-hipoclorit de sodiu, soluţie, concentraţie 0,5%clor activ, antiseptic al plăgilor;
-iodul, soluţie alcoolică, concentraţie 1-5%, antiseptic al tegumentelor;
-apa oxigenată, soluţie, concentraţie 3%, antiseptic al plăgilor;
-permanganatul de potasiu, soluţie, concentraţie 0,1‰, antiseptic al mucoaselor;
-hexaclorofen, soluţie, concentraţie 1%, antiseptic al tegumentelor şi mucoaselor;
-detergenţi cationici (săruri de amoniu) soluţie, concentraţie 1% în săpun, antiseptic al
tegumentelor şi plăgilor;
-detergenţi anionici şi săpunuri de Na+ şi K+, agenţi de spălare manuală.

1.5.2.2. Dezinfectantele sunt substanţe care au toxicitate ridicată, care distrug atât
microorganismele cât şi tesuturile vii şi care pot fi aplicate numai pe suprafeţe nevii pentru distrugerea
agenţilor patogeni.
Un dezinfectant trebuie să îndeplinească anumite condiţii şi anume:
-să acţioneze asupra unui număr mare de agenţi patogeni;
-să producă inactivitate ireversibilă a germenilor în condiţiile mediului;
-să fie puţin toxic pentru om şi animale;
-să fie stabil şi să-şi păstreze calităţile cât mai mult timp;
-să fie ieftin şi uşor de manevrat.

Substanţe dezinfectante:
-mertiolatul de sodiu soluţie 1/2000, utilizat pentru dezinfecţia mânilor, a instrumentelor
contaminante şi a obiectelor din piele şi de cauciuc;
-formol -aldehida formică, soluţie 40% în apă utilizat pentru conservarea prepartelor biologice,
soluţie 5% în apă dezinfectant al instrumentelor şi suprafeţelor de lucru;
-alcool etilic-soluţie 96%;
-amestec sulfocromic100g bicromat de potasiu/2L apă distilată şi 1L H2SO4 tehnic;
-fenolul, soluţie, concentraţie 3-5%, dezinfectant al suprafetelor;
-crezolii, soluţie, concentraţie 5% în apă fierbinte;
-varul cloros, 1 kg var cloros/10L apă, dezinfectant al suprafeţelor;
-cloraminele, 25% clor activ, dezinfectant al grupurilor sanitare;
-permanganat de potasiu, soluţie 1‰, 1-5000. 1/10000;
 -acid sulfuric, soluţie, concentraţie 5%, dezinfectant al podelelor;
-acid clorhidric, se utilizează pentru sterilizarea unor piei de animale moarte, a grupurilor sanitare;
-acidul azotic, soluţie 2% la 40ºC distruge germenii sporulaţi;
-hidroxidul de sodiu, soluţie, concentraţie 1-3%, dezinfectant mobilier;
-clorul gazos, concentraţie 2-3mg/L, dezinfectant al apei potabile;
-clorura mercurică, soluţie, concentraţie 1%, dezinfectant al preparatelor proaspete şi al
suprafeţelor de lucru;
-hipoclorit de sodiu, soluţie, concentraţie 25% clor.

1.5.2.3. Sterilizarea cu ajutorul gazelor

Pentru sterilizarea cu ajutorul gazelorseutilizează agenţi alchilaţi de tip formol şi oxid de etilenă.
Acest procedeu de sterilizare este utilizat pentru sterilizarea materialelor din plastic de unică folosinţă
sau a încăperilor contaminate. Sterilizarea camerelor se face prin vaporizare formolului diluat în 2-4
părţi cu apă, cu ajutorul autoclavei.Încăperile trebuie să fie perfect închise ermetic, procedura durează
6-8 ore, după care încăperile trebuie să fie bine aerisite.

TEHNICI DE CONTROL AL GRADULUI DE IGIENĂ DINTR-UN LABORATOR DE

MICROBIOLOGIE

În vederea identificării gradului de igienă dintr-un laborator de microbiologie se fac numeroase

teste periodice. Cele mai importante sunt: controlul microbiologic al suprafeţelor de lucru (test de
sanitaţie) şi determinarea microflorei din spaţiile de lucru.

1.4.1. Controlul microbiologic al suprafeţelor de lucru (test de sanitaţie)

Prelevarea probelor se face de pe pereţii interiori ai incintei bacteriologice şi suprafaţa de lucru,
înainte de începerea lucrului. Testul de sanitaţie se efectueaza în fiecare zi.

Materiale necesare (pentru o probă):

-şablon cu latura de 5 cm, sterilizat;
-tampoane de vată hidrofobă sub forma cilindrică cu dimensiuni de 2-2,5cm x 0,5-1cm, aşezate în
cutii Petri şi sterilizate prin autoclavare;
-câte o eprubetă cu: ser (apă) peptonat steril 1‰, sterilă,
-două plăci Petri sterile;
-pipete gradate sterile(1, 2 şi 10ml);
-pense sterile.

Modalitate de prelevare probă:

Înainte de folosire se umezeşte tamponul de vată într-un ml de ser fiziologic steril 1% într-o
eprubetă.
Se şterge o suprafaţă de 25 cm2 (interiorul şablonului), trecând tamponul în trei direcţii diferite (a
doua perpendiculară pe prima şi a treia oblic pe amândouă, în diagonală), concomitent cu rotirea
tamponului.
Se introduce tamponul în eprubeta iniţială, peste care se adaugă 9 ml ser peptonat. După un repaus
de 10-15 minute se face o agitare puternică pentru omogenizarea concentraţiei bacteriene, obţinându-
se suspensia brută de lucru. Agitarea se realizează prin lovirea energică a eprubetei de palmă de 30-40
de ori.

Însămânţarea şi incubarea probelor

Determinarea numărului de germeni/cm2
Din suspensia brută de lucru se mai execută o diluţie în apa peptonată sterilă şi rezultă o diluţie de
10 . Ambele probe se vor incorpora în geloza nutritivă topită şi răcită la 45-500C.
-1

Se incubează 48 ore la 370C.

Examinarea probelor şi interpretarea rezultatelor

Se fac după 48, respectiv 72 de ore de la însămânţare.
Determinarea numărului de germeni/cm2.
Se ţine cont că 1 ml din suspensia brută însămânţată conţine a 10-a parte din germenii recoltaţi de
pe o suprafaţă de 25cm2, iar 1 ml diluţie decimală 10-1 conţine a 100-a parte. Se raportează media
coloniilor dezvoltate pe ambele plăci la 1cm2 suprafaţă:

(Nr. germenisuspensie brutăx10)+(Nr. germenidilutie decimalăx100) =germeni/cm2.

2x suprafaţă şablon

Calculul numărului de colonii (germeni)

Se numără coloniile care s-au dezvoltat atât la suprafaţă cât şi în interiorul gelozei, (cu ochiul
liber sau prin lupa). Cutiile care conţin mai mult de 300 de colonii nu se iau în calcul.

Numărul de bacterii mezofile =

 (nd ) ; [UFC/cm3]
NV
Unde: n= numărul de colonii care s-au dezvoltat într-o cutie Petri;
d= inversul diluţiei probei însămânţate;
N= numărul de cutii Petri luate în calcul;
V= volumul de probă luat în lucru, în cm3;
UFC= unităţi formatoare de colonii.

1.4.2. Determinarea microaeroflorei din spaţiile de lucru

Determinarea microflorei din spaţiile de lucru se efectuează săptămânal şi reprezintă un indicator

al potenţialului infecţiilor aerogene din spaţiile de lucru.
Materiale necesare:
-două plăci Petri sterile, dintre care una reprezintă proba martor;
-mediu geloză nutritivă sterilă, topită şi răcită la 45C.

Mod de lucru:
În cele două plăci Petri, se toarnă geloză nutritivă sterilă, topită şi răcită la 45C.
Determinarea se face în perioada de maximă activitate (în timpul testului de prezumţie).
În fiecare încăpere din laboratorul de microbiologie, se utilizează câte două plăci Petri cu mediu
geloză nutritivă sterilă, una din plăci, reprezentând proba martor. Se notează plăcile din fiecare
încăpere. Placa Petri care este lăsată ca martor se acoperă imediat cu capacul. Cealaltă placă Petri se
lasă descoperită pentru a expune geloza nutritivă germenilor din aer. Perioada de expunere este de 15
minute.

Incubarea:
Incubarea celor două plăci se face la termostat, la 37C, timp de 24h, după care se mai ţin 24h la
temperatura camerei.
Determinarea numărului de germeni din aer se stabileşte prin numărarea coloniilor crescute pe
suprafaţa gelozei nutritive.

Interpretare:
-nu se admite prezenţa coloniilor.
Dacă după 48h, se constată dezvoltarea coloniilor pe geloză nutritivă, se face dezinfecţia totală, în
laborator şi se repetă testul.