Microscopia electronica

• In microscopia electronica, in locul fotonilor, imaginea este formata cu

ajutorul unui facicul de electroni accelerati si focalizati asupra tintei.
Detallile sunt realizate pornind de la comportamentul tintei, care poate sa
fie “electronoopaca” sau electronotransparenta”, oarecum similar cu
comportamentul optic in microscopia clasica.

TEM si SEM
• Prelevare proba
• Fixare (Glutardialdehida) pt. proteine
• Post-fixare (OsO4) – genereaza structuri electronoopace prin legarea
OsO4 la componentele hidrofobe ale lipidelor de membrana; lipide si
proteine
• Includerea - in rasina epoxidica (EPON) – asigura rigiditatea piesei
pentru…
sectionare (ultramicrotom, 40-100 nm grosime)
Prepararea probelor
• Criofixarea – racirea rapida a probei, de regula la temperatura azotului
lichid. Aceasta coserva specimenul prin racire instantanee in starea sa
“initiala” . Din aceasta procedura au derivat procedee de fixare aplicate si
in MO.
• Fixare - este un termen general care descrie proccesul de conservare
care previne deteriorarea ulterioara, astfel incat acesta sa conserve cat
mai mult din starea initiala. Fixarea pentru ME utilizeaza glutardialdehida
pentru reticularea proteinelor, si post-fixarea ci tetraoxid de osmiu, prin
care se fixeaza (si coloreaza) lipidele.
•
• Deshidratarea – indepartarea apei din probe. Se inlocuieste apa cu
solventi organici ca etanolul sau acetona, ca o etapa catre uscarea totala a
specimenelor SEM sau impregbnarea cu rasina urmata de incorporare,
pentru TEM.
• Includerea – infiltrarea tesutului cu o rasina cum este araldita sau LR
white, care polimerizeaza, formand un bloc rigidizat pentru a se sectiona.
• Sectionarea - are ca scop realizarea de sectiuni ultrafine din specimen.
Sectiunile trebuie sa fie semitransparente pentru electroni , intre 40 si
100 nm. Aceste sectiuni se realizeaza cu un iltramirotom, avand cutite de
sticla (mai ieftine) sau de diamant.
• Colorarea – foloseste metale grele (Pb sau U) amplificand in acest fel
contrastul; structurile biologice sunt initial “transparente” pentru
electroni , iar prin colorare se obtine o densitate mai mare fata de
electroni. Specimenele se pot colora inainte de incorporare sau duppa
sectionare, prin expunere la coloranti cu metale grele.
• Criofracturarea si crio-decapajul- o metoda de preparare utila in
special pentru examinarea membranelor lipidice si a proteinelor de
membrana. Piesele se fixeaza rapid prin criofixare, apoi sunt fracturate
prin utilizarea unui ultramicrotom la temperatura azotului lichid.
Suprafetele fracturate se “decapeaza” prin riicarea temperaturii la -95
grade, permitand sublimarea partiala a ghetii pentru a oferii detalii
microscopice.
•
• Se realizeaza apoi o umbrire prin acoperirea cu platina vaporizata (la un
unghi de 6o). Se aplica un strat de carbon, care se evapora perpendicular
pe suprafata, marind stabilitatea acoperirii. “Masca metalizata” se
degajeaza de resturile de material biologic, se depune pe grile si se
examineaza.
• In cazul SEM, examinarea poate fi facuta imediat dupa crio-fracturare si
decapaj.
• Acoperirrea prin pulverizare catodica - se poate depune un strat ultra-
fin de metal (electroconductor), printr0-un procedeu in vid inaintat.
Aceasta previne incarcarea probei (datorata incarcarii statice), iar la SEM
asigura o crestere a numarului de electroni detectabili, crescand astfel
raportul semnal/zgomot. Asemenea acoperiri se fac cu AU, Au/PD, Pt, Cr,
etc.
• Depunerea pe grile (de Au sau Cu)… sunt echivalentele “lamei” de la MO.
Servesc de “suport” in manipularea probelor.
• Contrastare: se poate utiliza tehnica metalizarii in vid, prin care pe
suprafata probelor se depun particule metalice sau/si de carbon, care
intensifica contrastul.