MICROSCOPIA ELECTRONICA

LP 3
BIOLOGIE CELULARA SI MOLECULARA
• In ME, in locul fotonilor, imaginea este formata
cu ajutorul unui fascicul de electroni accelerati
si focalizati asupra tintei.
• Detaliile sunt realizate pornind de la
comportamentul tintei, care poate sa fie
“electronoopaca” sau electronotransparenta”,
oarecum similar cu comportamentul optic in
microscopia clasica.
 TEM si SEM
Transmission electron microscopy / Scanning Electron Microscopy

• Microscopia electronica de transmisie (TEM)

utilizeaza un fascicul de electroni care a parcurs
specimenul, pentru a forma imaginea acestuia,
prin intermediul unui sistem de focalizare a
imaginii (obiectiv), analog celui din MO –
analizeaza structuri interioare
• Microscopia electronica de baleiaj (SEM)
formeaza imaginea prin detectarea si masurarea
electronilor reflectati/deviati de tinta/suprafata
specimenului – analizeaza suprafata probei
MICROSCOPUL
ELECTRONIC DE
TRANSMISE
MICROSCOPUL ELECTRONIC DE
BALEIAJ
 PREPARAREA PROBELOR PENTRU ME

• Criofixarea – racirea rapida a probei, de regula la

temperatura azotului lichid. Aceasta conserva specimenul
prin racire instantanee in starea sa “initiala”. Din aceasta
procedura au derivat procedee de fixare aplicate si in MO.
• Fixare - este un termen general care descrie procesul de
conservare care previne deteriorarea ulterioara, astfel incat
acesta sa conserve cat mai mult din starea initiala. Fixarea
pentru ME utilizeaza glutardialdehida pentru reticularea
proteinelor, si post-fixarea cu tetraoxid de osmiu, prin care se
fixeaza (si coloreaza) lipidele.
 Pregatire probe
• Prelevare proba
• Fixare (Glutardialdehida) pt. proteine
• Post-fixare (OsO4) – genereaza structuri
electronoopace prin legarea OsO4 la
componentele hidrofobe ale lipidelor de
membrana; lipide si proteine
• Includerea - in rasina epoxidica (EPON) – asigura
rigiditatea piesei pentru…
• sectionare (ultramicrotom, 40-100 nm grosime)
 PREPARAREA PROBELOR PENTRU ME
• Deshidratarea – indepartarea apei din probe. Se inlocuieste
apa cu solventi organici ca etanolul sau acetona, ca o etapa
catre uscarea totala a specimenelor SEM sau impregnarea cu
rasina urmata de incorporare, pentru TEM.
• Includerea – infiltrarea tesutului cu o rasina cum este araldita
sau eponul, care polimerizeaza, formand un bloc rigidizat
pentru a se sectiona.
• Sectionarea - are ca scop realizarea de sectiuni ultrafine din
specimen. Sectiunile trebuie sa fie semitransparente pentru
electroni , intre 40 si 100 nm. Aceste sectiuni se realizeaza cu un
ultramicrotom, avand cutite de sticla (mai ieftine) sau de
diamant.
 PREPARAREA PROBELOR PENTRU ME
• Colorarea – foloseste metale grele (Pb sau U) amplificand in acest
fel contrastul; structurile biologice sunt initial “transparente”
pentru electroni , iar prin colorare se obtine o densitate mai mare
fata de electroni. Specimenele se pot colora inainte de incorporare
sau dupa sectionare, prin expunere la coloranti cu metale grele.
• Criofracturarea si crio-decapajul - o metoda de preparare utila in
special pentru examinarea membranelor lipidice si a proteinelor
de membrana. Piesele se fixeaza rapid prin criofixare, apoi sunt
fracturate prin utilizarea unui ultramicrotom la temperatura
azotului lichid. Suprafetele fracturate se “decapeaza” prin
ridicarea temperaturii la -95 0C, permitand sublimarea partiala a
ghetii pentru a oferi detalii microscopice.
 PREPARAREA PROBELOR PENTRU ME
• Se realizeaza apoi o umbrire prin acoperirea cu platina vaporizata
(la un unghi de 6o). Se aplica un strat de carbon, care se evapora
perpendicular pe suprafata, marind stabilitatea acoperirii. “Masca
metalizata” se degajeaza de resturile de material biologic, se
depune pe grile si se examineaza.
• In cazul SEM, examinarea poate fi facuta imediat dupa
criofracturare si decapaj.
• Acoperirea prin pulverizare catodica - se poate depune un strat
ultra-fin de metal (electroconductor), printr-un procedeu in vid
inaintat. Aceasta previne incarcarea probei (datorata incarcarii
statice), iar la SEM asigura o crestere a numarului de electroni
detectabili, crescand astfel raportul semnal/zgomot. Asemenea
acoperiri se fac cu Au, Au/PD, Pt, Cr, etc.
Avantaje TEM
-Putere foarte mare de marire si rezolutie
-Aplicatii in domenii stiintifice, educationale si industriale
-Ofera informatii asupra structurii unui element

Dezavantaje TEM
-Aparat voluminos si scump
-Prepararea probei este laborioasa
-Operarea si analiza rezultatelor necesita training
-Probele analizate sunt limitate la cele care sunt
transparente pentru electroni
-Necesita o incapere speciala si mentenanta
-Imaginile sunt alb si negru
Aplicatii biologice ale TEM

-Medicina – instrument de diagnostic – in special in

cazul biopsiilor renale
-Tomografie celulara – vizualizare prin sectionare –
informatia este asamblata pentru a obtine o imagine
tridimensionala – se obtin detalii 3D ale structurilor
subcelulare
-Cercetare oncologica – permite studiul ultrastructurii
celulelor tumorale
-Toxicologie - permite studierea impactului poluarii din
mediu asupra diferitelor nivele de organizare biologica
Avantaje SEM
-Ofera detalii 3D si topografice
-Instrumentul este rapid
-Permit generarea datelor in forma electronica
-Majoritatea probelor SEM necesita o minima preparare

Dezavantaje SEM
-Aparat voluminos si scump
-Operarea si analiza rezultatelor necesita training
-Prepararea probei poate duce la producerea de artefacte
-Este limitata la probe solide
-Exista un risc de expunere la radiatii associate cu
electronii care sunt deviate de pe suprafata specimenului
Aplicatii biologice ale TEM

-Virusologie – investigatii ale structurii virusului

-Imagini 3D ale tesuturilor – ofera informatii legate de
organizarea celulara intr-o retea 3D – interactie celulara
-Ofera imagini 3D detaliate in cazul microorganismelor
si de asemenea, imagini anatomice ale insectelor,
viermilor, spori si alte structuri organice
Ultramicrotomul
Imagine generala a unei celule
Eucromatina Heterocromatina
Nucleol
Anvelopa nucleara
Por nuclear
Reticul endoplasmatic rugos

RER
Plasmocit, uman.
 Mitocondrii

Plasmocit Sobolan Plasmocit Uman

Pulmon Uman
 Aparatul Golgi

Maimuta

Plasmocit
uman
 Spatiul intercelular

Stratum spinosum (om) Sinapsa, cortex de Spatiul intercelular

Spatii intercelulare largite sobolan, Subst. de baza + colagen
Cu vezicule sinaptice Ligament, sobolan
 Jonctiune gap
(Cobai, urechea interna)

Tight junction
(jonctiune stransa)
(hepatocite, sobolan)

Interdigitatie si desmozom
Duoden de maimuta
 Caveole

Caveole
Caveole
(Sobolan, musculatura
(Cobai, urechea interna)
neteda a colonului)
Autoradiografia in ME

Receptori de acetilcolina
 Imagini SEM

Eritrocit (stanga), placheta (centru) si Limfocit B (dreapta)