1

1.3.Concepia actual despre citologie Citologia este o ramur a tiinelor biologice, care studiaz structurile funcionale i fenomenele biologice generale comune tuturor celulelor, evideniind legile generale de desfurare a proceselor vitale la nivelul celular i molecular de organizare. Manifestndu-se ca o tiin integrativ, ea folosete noiuni de morfologie, biochimie molecular i celular, fiziolgie celular i genetic molecular. Ultimul deceniu se remarc prin intensificarea studierii nivelului molecular al proceselor celulare. Celula este considerat ,astfel, un microcosmos, n care structurile i funciile interacioneaz armonios, fiind determinate i reglate genetic, nct s se realizeze o eficacitate maxim. Dezvoltarea biologiei celulare i moleculare se datoreaz pe de o parte perfecionrii tehnicilor de studiere a celulei, iar pe de alt parte progreselor teoretice (conceptuale). 1.4.1.Tehnicile de studiere a celulei. Sunt reprezentate de tehnici de microscopie (optic sau electronic) i de tehnici de cercetare ( fizice, biochimice, debiologie celular i molecular , etc). 1.4.1. Tehnicile de microscopie optic i electronic Microscopia optic folosete fotonii pentru realizarea imaginilor, asigurnd mriri de 1500-3000 de ori (n mod obinuit de 1400 ori), cu o putere de rezoluie de 0,2 micrometrii (m). (Fig.1.1)

Fig.1.1 Formarea imaginii n microscopul optic 1.Sursa de lumin; 2.Dispozitiv de uniformizare i dozare a luminii;3.Condensor;4.Preparat;5.Lentil obictiv;6.Imagine format n obiectiv;7.Lentil ocular;8.Imagine final. Microscopia n contrast de faz, permite examinarea celulelor vii. Utilizeaz: microscoape cu interferen, pentru aprecierea cantitativ a masei unor componente tisulare; - microscoape cu interferen difereniat, pentru studierea suprafeei celulelor. Microscopia de fluorescen evideniaz moleculele cu fluorescen natural ( vitamina A, catecolaminele) sau fluorescena indus. Se folosete n imunohistochimie pentru detectarea reaciei antigen-anticorp. Microscopia cu ultraviolete folosete lumina ultraviolet pentru detectarea unor amino acizi sau a acizilor nucleici. Microscopia cu lumin polarizat pentru studierea formaiunilor cristaline. Microscopul confocal Permite obinerea de imagini tridimensionale ale structurilor din preparatele histologice. Principiul de funcionare este asemntor cu cel al microscopului de fluorescen. Sursa de lumin este reprezentat de un laser a crei raz trece printr-o diafragm cu deschidere punctiform, dup care este reflectat de o oglind mobil spre lentila obiectiv. Preparatul este situat la nivelul distanei focale a obiectivului. In urma aciunii razei laser asupra preparatului, acesta emite un fascicul de lumin (eventual fluorescent) care este colectat de lentila obiectiv i dirijat spre diafragma punctiform a detectorului , situat confocal ( n focarul lentilei obiectiv, opus focarului n care este situat preparatul), rezultnd o imagine final, care este captat de un detector (similar ocularului). Razele luminoase emise de formaiuni situate n alte planuri nu vor fi captate de detector, nct se obine o imagine foarte"curat", neestompat de imagini ale obiectelor situate proximal sau

distal fa de planul focal. Prin deplasarea n plan vertical a focarului lentilei obiectiv, se pot obine imagini ale unor planuri succesive, ca profunzime, realiznd "seciuni optice", fr a fi nevoie de o resecionare a preparatului. Imaginile planurilor succesive sunt stocate n memoria unui computer, care le "ansambleaz" obinnd o imagine tridimensional a preparatului examinat. Microscopul confocal permite examinatorului s obin "tomografia" unei structuri histologice, fiind folosit pentru studirea citoscheletului, a dispunerii cromozomilor n nucleu,etc. Dac este dotat cu lumin flurescent se pot obine imagini confocale fluorescente. Microscopul electronic se bazeaz pe utilizarea fluxurilor de electroni pentru realizarea imaginilor, permind obinerea unor grosismente teoretice mai puternice de 10.000 de ori dect n microscopia optic. Se ajunge la o putere de rezoluie egal cu 0,1 nanometri (nm).Exist dou tipuri principale de microscoape electronice: - microscopul electronic de transmisie i microscopul electronic de baleaj (scanning).(Fig.1.2) Fig.1.2 Formarea imaginii n microscopul electronic 1-Catod; 2-Anod; 3-Lentila (bobina)condensator;4-Preparatul; 5Lentila (bobina) obiectiv; 6-Imaginea primar; 7-Lentila (bobina) de proiecie; 8Imagine final. Microscopul electronic de transmisie (Transmission electron microscope - TEM) poate fi: - convenional (CTEM), cnd diferena de potenial ajunge pn la 100.000 voli; sau - de nalt voltaj (HVEM), cnd diferena de potenial ajunga la 800.000 voli. Componentele eseniale ale unui microscop electronic de transmisie sunt: Catodul sau sursa de electroni, reprezentat de un filament de tungsten nclzit. Anodul, care relizeaz diferena de potenial. Un sistem de electromagnei, care acioneaz ca nite lentile condensator, lentile-obiectiv i lentile de proiecie. Un suport pentru preparat sau portobiect, reprezentat de o gril metalic fin pe care se fixeaz seciunea de esut, inclus n mas plastic. Un ecran pe care se capteaz imaginea. Un dispozitiv de fotografiere a imaginii. Puterea de rezoluie este de 2 Angstromi(), n practic ajungndu-se la 1,2 nanometri. Fig.1.3 Formarea imaginii la microscopul de baleaj (scanning) 1-Catod; 2-Anod; 3-Lentil (bobin) condensator; 4-Bobin de scanare; 5Preparat; 5'-Detector de electroni; 6-Amplificator electronic; 7-Ecran de proiecie;8-Imagine final. Ca fixatori se folosesc glutaralaldehida, pentru constiutieni proteici i tetraoxidul de osmiu pentru lipide i fosfolipide. Se realizeaz seciuni de ordinul nanometrilor cu ajutorul unor ultramicrotoame, nzestrate cu cuite de diamant. Ultraseciunile sunt incluse n mase plastice i ntise pe grile de cupru. Pentru realizarea contrastului ntre diferite ultrastructuri se folosesc substane precum citratul de plumb i acetatul de uranil. La examinare se observ c structurile cu densitate mare disperseaz (mprtie) electronii, aprnd de culoare nchis, n timp ce structurile cu densitate mic, care permit trecerea electronilor far a-i devia apar clare. n cazul microscoapelor electronice de nalt voltaj ( HVEM ), diferena de potenial atinge un milion de voli. Electronii pot ptrunde prin

celule ntregi sau preparate de civa microni (cca. 2 microni). Se obine o imagine detaliat a organizrii tridimensionale, permindu-se vizualizarea texturii celulare interne i a unor detalii de structur, cum arfi de exemplu elemntele citoscheletului. Microscopul electronic de scanning (Scanning electron microscope SEM ) se carcterizeaz prin faptul c electronii nu trec prin preparatul studiat, ci mtur (terg) suprafaa acestuia, nct se va obine o imagine tridimensional a accidentelor de suprafa. Puterea de rezoluie este de cca. 100 Angstromi. Cnd electronii folosii de TEM sau SEM bombardeaz preparatul se produc radiaii X cu lungimi de und caracteristice elementelor lovite de electroni. Prin analiza acestor raze X cu aparate adecvate se pot obine estimri calitative i cantitative foarte exacte asupra elementelor cu numrul atomic mai mare de 12. 1.4.2.Tehnici fizice .biochimice,de biologie celular i molecular Tehnici fizice: - Fracionarea celulei prin centrifugare difereniat permite obinerea n stare pur a unor componente celulare, precum complexul Golgi, aparatul mitotic, ribozomi, etc. O contribuie deosebit la perfecionare acestei tehnici a adus-o G.Em.Palade care a pus la punct centrifugarea n gel de sucroz. - Criofracturarea permite despicarea membranelor celulare ngheate, la nivelul planului median al bistratului lipidic. - Autoradiografia localizeaz materialul radioactiv din esut. - Historadiografia realizeaz o microradiografie cu raze X a unui preparat histologic. - Difracia razelor X, care a permis descifrarea structurii spaiale a proteinelor i a acizilor nucleici. - Difracia i dispersia de neutroni, prin care s-a descifrat organizarea molecular a cromatinei. - Rezonana magnetic nuclear de nalt rezoluie, ce se utilizeaz pentru studierea interaciunilor moleculare n membranele biologice. - Rezonana magnetic n impulsuri, folosit la studiul permeabilitii membranelor pentru ap i ioni. - Rezonana electronic de spin, ce folosete ca markeri specifici substane cu electroni impari care se ataeaz i evideniaz molecule de ADN, de proteine,etc. - Spectrofluorometria,ce permite studierea vscozitii membranelor, difuziunea, rotaia proteinelor. Tehnici biochimice n biologia molecular se utilizeaz: - Electroforeza n gel de poliacrilamid, pentru studiiul proteinelor i acizilor nucleici. - Marcrile bazate pe fotoafinitate a unor pri din moleculelele integrate n structuri celulare. - Reconstituiri de structuri i funcii celulare din componentele purificate. - Imunocitochimia evideniaz reaciile dintre antigen i anticorp. Tehnici complexe de biologie celular i molecular Sunt reprezentate de: - Tehnica ADN-ului recombinat. - Producerea de anticorpi monoclonali cu ajutorul hibridoamelor, ce a permis descifrarea mecanismelor care regleaz exprimarea genei. - Sinteza artificial a genelor. - Manipulri de gene, etc. 1.5. Progrese conceptuale. Progresele teoretice sau conceptuale au permis mbogirea, dezvoltarea i aprofundarea cunotiinelor de biologie celular i molecular. Sunt reprezentate de: - Analiza i sinteza informaiilor obinute de morfologia celular, biochimia i biofizica celular, fiziologia celular, genetica molecular, imunologia celular i molecular, virusologie,etc. n acest concept se manifest dou tendine opuse: una de acentuare a sintezei i alta de extindere a sferei de sintez.

- Molecularizarea informaiilor , care const n descifrarea structurilor i funciilor pn la nivel molecular. Acest fapt a dus la schimbarea denumirii acestei ramuri a tiinelor biologice din "citologie general" n "biologie celular" i apoi n "biologie celular i molecular". - Integrarea informaiilor obinute prin toate metodele i de la toate nivelele ntr-un tot unitar, nct biologia celular i molecular studiaz n mod complex i complet aspectele morfofuncionale ale celululelor, observabile la microscopul optic, ultrastructurile relevate de microscopul electronic, organizarea i fiziologia molecular, realiznd o imagine exhaustiv a nivelului celular de organizare a materiei vii. 2. CELULA CA SISTEM BIOLOGIC Prin sistem biologic se nelege un ansamblu de elemente (componente) interconectate ntro formaiune complex, relativ stabil, formaiune care se comport ca un ntreg, cu proprieti i funcii distincte cantitativ i calitativ de proprietile elementelor componente. Exist sisteme lipsite de via (abiotice), precum particulele subatomice, atomii, moleculele i sisteme dotate cu via ( biotice )cum ar fi celulele, esuturile, organele, organismul, populaia, biocenoza i biosfera. Celula (cellula) este primul sistem biologic care manifest cea mai important caracteristic a materiei vii - capacitatea de auto reproducere. Formele de "via molecular", identificate pn n prezent, ca "prionii" (microorganisme patogene, formate din particule proteice, far acizi nucleici) i virusurile (microorganisme ce conin acizi nucleici i proteine) sunt capabile s se reproduc numai n interiorul celulei. Celula, ca sistem, prezint urmtoarele caracteristici: Este un sistem deschis, pentru c are n permanen schimburi de energie i substan cu mediul extracelular. Are un caracter istoric, aprnd la un anumit moment al evuluiei materiei vii i putnd s dispar, atunci cnd materia vie i va produce o alt form mai eficient de organizare dect celula. Are caracter informaional, deoarece recepioneaz, acumuleaz, prelucreaz i transmite informaii cu ajutorul codului genetic. Prezint trei categorii de programe, legate de capacitile sale structurale i funcionale: aprogramul " pentru sine", ce asigur autoconservarea celulei ( de expl. n culturile de celule); bprograme ale sistemelor componente, ca de exemplu programele organitelor sau ale complexelor moleculare; i c- programe superioare care asigur existena sistemelor superioare ( esut, organ, organism). Echilibrul dinamic, ce se manifest printr-o "pendulare" continu, fa de o stare morfofuncional optim, stabil. Autoreglarea sau "feed back"-ul, prin care i controleaz procesele interne, n funcie de relaiile cu mediul prin mecanisme de tip cibernetic. Heterogenitatea intern este nsuirea de a fi alctuit din elemente componente mai mult sau mai puin diferite ( de expl. mitocondrii, ribozomi, microfilamente, microtubului,etc.) Integralitatea, prin care celula ca sistem, nu se reduce la suma nsuirilor elementelor componente, ci prezint nsuiri noi (structurale i funcionale) pe care nu le au aceste elemente considerate izolat. Aceast nuire permite desfurarea funciilor biologice fundamentale: metabolismul, reproducerea, adaptarea, meninerea strii de stabilitatea difereniat,etc. Pe baza acestor caracteristici, concepia actual despre celul o definete ca fiind: unitatea elementar a lumii vii, produs al evoluiei, cu structur complex, n relaie de autonomie i echilibru dinamic cu mediul nconjurtor, avnd ca proprieti eseniale metabolismul, autoreproducerea, creterea i dezvoltarea. 2.1. Arhetipurile celulare Exist dou arhetipuri (arhetip = model primar, dup G.E.Palade) celulare: procariotele (procariot =prenucleat, fr nucleu distinct) i eucariotele (eukariot= cu nucleu distinct). 2.1.1. Procariotele Sunt reprezentate, n principal, de bacterii i de algele albastre verzi (denumite i cianobacterii). Ele sunt mai mici (1-10 m) dect celulele eucariote i lipsite de membrane intracelulare. Organitele celulare sunt puine ( numai ribozomi) sau absente. Nucleul nu apare distinct, genomul (totalitatea genelor) nefiind separat de citoplasm. Prezint un cromozom unic, dispus n citoplasm i reprezentat de un AND circular neconjugat cu proteine. ARN-ul i proteinele sunt sintetizate n acelai compartiment, n citoplasm.

Nu au aparat mitotic, deoarece se nmulesc prin sciziparitate. i realizeaz locomoia prin flageli simpli. Au metabolism aerob sau anaerob. Sunt delimitate de o membran plasmatic, ce trimite prelungiri endocelulare, denumite mezozomi, dublat la exterior de un perete celular. Nu prezint citoschelet, nu au cureni citoplasmatici, iar endocitoza i exocitoza sunt absente. De obicei sunt monocelulare. 2.1.2.Eucariotele Sunt reprezentate de protiste, fungi, plante i animale. Au dimesiuni mai mari (5-100 m) dect procariotele. Prezint un sistem complicat de membrane intracelulare, care delimiteaz unele componenete intracelulare (nucleul) i unele organite (mitocondriile, reticulul endoplasmic,complexul Golgi,etc). Au un nucleu distinct, n care este situat genomul, ce cuprinde mai muli cromozomi. Molecula de AND este foarte lung i conjugat cu proteine. ARN-ul este sintetizat i procesat n nucleu, n timp ce proteinele sunt sintetizate n citoplasm. Au citoschelet compus din proteine filamentoase, cureni citoplasmatici i desfoar procese de endocitoz i exocitoz. Prezint aparat mitotic.Se divid prin mitoz i meioz. 2.2 Morfologia general a celulelor eucariote Dimensiunile celulelor eucariote sunt extrem de variate. Ele se exprim n urmtoarele uniti de msur: micrometrul, nanometrul i angstromul. Unitile de msur folosite n morfologia microscopic Denumire Micrometrul ( = micronul ) Nanometrul Angstrom Simbol m ( ) nm A Valoare 1 m =0,001 mm = 10 6 m 1 nm = 0,001 m = 10-9 m 1A=0.1nm=10-4um=10-10m

Limita practic de rezoluie a ochiului uman este de cca. 0,1 mm, a microscopului optic de 0,2m, iar a celui electronic de 2 angstromi( ). Pentru fiecare categorie de celule, dimensiunile sunt relativ constante, indiferent de specie sau mrimea organului. Diferenele de greutate a aceluiai organ la specii diferite sunt generate de numrul de celule pe care l conin i nu de volumul celulelor. De exemplu, nefrocitele i celulele musculare cardiace au dimensiuni apropiate la hominide, ecvine i canide. Limitele de rezoluie in morfologie A. Cu ochiul liber B. Cu microscopul optic 0,1 milimetri (mm) 0,2 micrometri sau microni ( sau m) Ovocitul de pasre Ovocitul uman Amoeba Celule, Hematii, Neuroni Nuclei Mitocondrii Bacterii, etc Ribozomi, Virusuri, Organite celulaere Macromolecule molecule

C. cu microscopul electronic

2 Angstromi () sau 0,2 nanometri (nm)

* Prin rezoluie se nelege distana minim dintre dou puncte n care acestea pot fi percepute ca imagini seperate

Fig.2.1.Diagrama unitilor de lungime Dimensiunile medii ale diametrului celulelor se ncadreaz ntre 10-30 m, dar n organismul animalelor exist i celule mai mici, precum: neuronii din stratul molecular al scoarei cerebrale ( de cca.4-4 m), eritrocitele (5-7 m), precum i celule ce ajung la dimesiuni foarte mari, un exemplu constituindu-l ovulul ce atinge un diametru de 150-200 m la mamifere, 3,5 cm la psri i 10 cm la stru. Neuronii motori din coarnele ventrale ale mduvei spinrii au un corp ce atinge un diametru de 200 m, iar dac se iau n considerare i prelungirile ajung la o lungime de 1-1,5 m sau mai mult, n funcie de talia animalului. Fibra muscular striat are un diametru de ordinul micronilor, dar lungimea este foarte variat, de la 1 la 12 cm. Volumul celulelor variaz n limite foarte largi de la 200 la15000 micrometri cubi (m3), menndu-se constant pentru un anumit tip de celul, independent de mrimea organului, aspect cunoscut sub denumirea de "legea constanei volumului". Vrsta i funcia determin variaii n mrimea celulelor. Se observ o reducere a volumului celular n cursul embriogenezei timpurii, n cursul mbtrnirii i o cretere volumetric n timpul dezvoltrii postnatale. Se stabilete un raport nucleo/citoplasmatic optim, un raport al suprafeei celulei fa de volum i un raport ntre metabolism i volumul celulei. Masa (greutatea) unei celule este de aproximativ 10-12 g, iar cea a unui ovocit uman de 10 -8 g.

Fig.2.2. Forma celulelor 1-Ovula; 2-Hematie de mamifer; 3-Eritrocit de pasre; 4-Neutrofil de mamifer; 5Spermatozoid; 6-Celule poliedrice;7-Celule pavimentoase; 8-Celule cubice; 9-Leiocit; 10-Neuron piramidal; 11-Neuron piriform; 12-Celul mezenchimal; 13-Fibroblast;14-Melanocit,15-Adipocit alb; 16-Histiocit; 17-Celul prismatic cu platou striat; 18-Celul caliciform. Forma celulelor, inial sferic se modific n cursul diferenierii i maturrii celulelor. Forma celulelor este controlat att de factori externi ca presiunea i vscozitatea mediului, ct i de factori interni ca activitatea funcional, vrsta, vscozitatea citoplasmei, structura intern i caracteristicile suprafeei.(Fig.2.2 ) Forma celulelor se adapteaz la funcie, respectndu-se o lege general a biologiei, conform creia se obine maximum de randament funcional cu minimum de cheltuieli materiale i energetice.Astfel,celulele contractile sunt fuziforme sau cilindrice, iar celulele specializate n conductibilitate prezint numeroase prelungiri. Numrul celulelor este extrem de mare, ajungnd la ordinul de milioane de miliarde (1014). Celulele sanguine reprezint populaia cea mai numeroas, reprezentat de mai multe zeci de miliarde. Numrul hepatocitelor i al neuronilor este de circa 100 de miliarde, iar cel al nevrogliilor este de aproximativ 10 ori mai mare dect numrul neuronilor. Durata vieii celulei sau ciclul celular reprezint intervalul de la apariia unei celule pn i termin propria sa diviziune. Variaz de la 10-20 minute pn la 109 minute. Celulele bacteriene triesc cteva zeci de minute, celulele epiteliale 1-2 zile, hematiile 127 zile, iar unele celule musculare i nervoase toat viaa individului. La om, n fiecare secund au loc peste 4 milioane de diviziuni celulare, ntr-o zi au loc cca. 350 bilioane diviziuni, iar ntr-un an 1014 diviziuni, numr egal practic cu numrul total al celulelor ce alctuiesc corpul omului adult. 2.3. Compartimentarea celulelor eucariote Celula eucariot prezint trei componenete principale: membrana, nucleul i citoplasma. (Fig.2.3) Membrana poate fi situtat la periferie, realiznd pe de o parte delimitarea celulei de mediul extracelular, sau poate fi dispus n citoplasm, unde formeaz un sistem de membrane intracelulare cu o suprafa deosebit de activ biologic, de 10-20 ori mai mare dect cea a membranei periferice.

Fig.2.3. Schema unei celule eucariote ideale 1-Membrana celular;2-Nucleul; 3Citoplasm; 4-Lizozom primar; 5Poliribozomi liberi; 6-Reticul endoplasmic rugos; 7-Reticul endoplasmic neted; 8Complex Golgi; 9-Microfilamente; 10-Microtubuli; 11Centrioli; 12-Corpuscul bazal; 13-Microvili; 14-Cil; 15Fagozom; 16-Peroxizom; 17-Caveol acoperit; 19-Nucleoli; 20eterocromatin; 21Cistern perinuclear; 22-Por nuclear; 23Mitocondrie; 24-Corp rezidual; 25-Granule de secreie; 26-Pictur de lipide; 27Granule de glicogen; 28-Pseudopode. Membranele intracelulare, endomembranele sau citomembranele difer ntre ele prin structur, compoziie chimic i funcie. Ele mpart celula n dou compartimente: compartimentul matriceal sau plasmatic "P" i compartimentul intracisternal sau "E". Exist i un compartiment secundar sau de tip "C", reprezentat de matricea mitocondrial i a cloroplastelor. Totodat endomembranele delimiteaz nucleul i unele organite celulare (lizozomii, reticulul endoplasmic,complexul Golgi). Exist i organite nedelimitate de membrane (ribozomii,centriolii, corpusculii bazali, microfilamentele, filamentele intermediare i microtubulii). 3. Membranele celulare Membranele celulare (membrana celullaris) sunt structuri moleculare complexe care marcheaz limita celulei sau a unui teritoriu intracelular. Exist trei categorii principale de membrane celulare: 1.Membrana plasmatic sau plasmalema, ce confer individualitate celulei i particip la interaciunile dintre celule sau la cele cu mediul extracelular. 2.Citomembranele sau endomembranele, reprezentate de membrana nucleului, membranele reticulului endoplasmic, membranele complexului Golgi, membranele mitocondriilor, lizozomilor i peroxizomilor. 3. Membranele speciale reprezentate de membranele tecilor de mielin i de membranele discurilor din segmentul extern al celulelor vizuale din retin. 3.1 Organizarea molecular a membranelor n evoluia cunotiinelor despre organizarea molecular a membranelor se disting mai multe modele: iniial, paucimolecular, unit, mozaicul fluid i modelul actual. Fig.3.1 Modelul paucimolecular. 1-Bistratul lipidic; 2-Stratul proteic extern; 3-Stratul proteic intern. Modelul iniial (elaborat de OVERTON n 1895) a sugerat prezena lipidelor n membranele celulare, observnd c solvenii organici difuzeaz mai rapid prin membrane dect n ap. Lipidele din membrane sunt dispuse n strat dublu ( n bistrat ), pentru c suprafaa filmului lipidic din hematii este dubl fa de suprafaa acestora. ( dup GRTER i GRENDEL 1925 ) Modelul paucimolecular a fost elaborat ( n 1930 de DANIELLI i DAVSON ) , dup msurarea tensiunii

superficiale a membranelor celulare, cnd au gsit aproximativ o din/cm2 , fa de 5 dine ct reieea din calcule. Asfel, ei au dedus c bistratul lipidic (stratul lipidic dublu) este tapetat pe ambele fee de straturi de proteine, care reduc tensiunea superficial. Totodat au demonstrat experimental acest fapt, adugnd proteine, ce au produs reducerea tensiunii superficiale. Tot ei au elaborat modelul paucimolecular (paucus = puin numeros), dup care membranele celulare au un centru lipoid "lamina intermedia", ( format din fosfolipide, dispuse n strat dublu, cu capetele polare orientate spre exterior ), tapetat cu proteine, care formeaz o lamin extern i alta intern.(Fig.3.1) Modelul "UNIT" a fost elaborat ( de ROBERTSON, ntre 1958-1960 ), dup cercetri efectuate la microscopul electronic ( cu grosisment de 100.000), efectuate pe membrana tecii de mielin. Dup acest model, membranele celulare au o ultrastructur trilaminar, prezentnd dou benzi dense (de 2,5 nm), ce delimiteaz ntre ele o band clar ( de 3 nm), format dintr-un ax lipidic hidrofob. Acest model confirm modele anterioare i le dezvolt, adugnd dou noi concepte: universalitatea bistratului lipidic i - asimetria chimic, dup care glucidele sunt ataate numai pe faa extern, lipsind pe faa intern. Modelul este incomplet pentru c ignor dinamismul moleculelor componente.(Fig.3.2). Fig.3.2 Organizarea molecular a membranei periferice Modelul"mozaicului fluid", (elaborat de SINGER i NICOLSON n 1972 ) susine c moleculele componente ( de lipide i de protide) se mic n mod ntmpltor n bistratul lipidic. Cercetrile ulterioare au artat c micrile moleculelor sunt controlate de citoschelet i sunt limitate la anumite poriuni ale suprafeei membranei. Exist i zone ale feei externe a bistratului lipidic neacoperite de proteine. Modelul actual susine c: - bistratul lipidic este asimetric, fluid i reprezint axul ntregului edificiu molecular al membranelor; - pe feele hidrofile, proteinele sunt distribuite asimetric, n aranjamente caracteristice.

3.2. Ultrastructura membranei periferice

10

Membrana periferic are trei componente ultrastructurale: plasmalema, glicolema,citoscheletul membranei. Membrana periferic a celulei eucariote Componenta intern 20 nm Puin dens la fluxul de elecroni Conine: Galactoza Galactozamina Manoza, Fucoza, Glucoza Glucozamina, Acidul sialic Conine: Gruprile polare hidrofile ale fosfolipidelor Proteine extriseci Conine: Fosfolipide 70% Colesterol-25% Glicolipide-5% Conine: Gruprile polare hidrofile ale fosfolipidelor Proteine extrinseci Conine: Actin Anchirin Spectrin Proteina benzii 4-1

Glicolema (50 nm)

Componenta extern Lamina externa

30 nm 2,5 nm

Mai dens la fluxul de electroni Band dens la fluxul de elecroni Band clar la fluxul de electroni Band dens la fluxul de electroni

Membrana celular periferic

Plasmalema (7- 8 nm)

Lamina intermedia Lamina interna

3 nm

2,5 nm

Citoscheletul membranei

5-9 nm

3.2.1. Plasmalema Plasmalema (plasmalemma) reprezint structura de baz a tuturor membranelor celulare ( periferice sau endomembrane), fiind alctuit din bistratul lipidic asociat cu proteine. Are o grosime de cca. 7,5 nm. La un grosisment redus (de 10.000 ori ) apare ca o linie unic elecronodens. La o mrire de 100.000 ori, dac planul seciunii a czut perpendicular pe membran, plasmalema prezint un aspect caracteristic, trilaminar, cu dou benzi dense (de 2,5 nm), separate de o band clar ( de 3 nm). Endomembranele au ,n general, acelai aspect electronomicroscopic, respectnd modelul unit. (Fig.3.3)

11

Banda luminoas, clar (lamina intermedia) corespunde radicalilor de acizi grai hidrofobi din fosfolipidele bistratului, iar benzile dense (lamina externa et interna) cuprind gruprile polare hidrofile ale fosfolipidelor i parial proteinele asociate membranei. Fig.3.3 Componentele membranei celulare periferice I-Glicolema; IIPlasmalema; IIICitoscheletul membranei Compoziia chimic a plasmalemei cuprinde: lipide complexe, proteine i glucide. LIPIDELE sunt coninute n bistratul lipidic, fiind reprezentate de fosfolipide (70%), colesterol (25%) i glicolipide (5%).

Fig.3.4. Tendina de organizare a moleculelor de fosfolipide A-Monostrat; B,C- Micelii 1-Lauri de acizi grai; 2-Grup polar; 3-Ap; 4-Aer Fosfolipidele i glicolipidele sunt molecule complexe cu caracter amfofil (=amfipatice=bimodale), prezentnd un "cap" hidrofil (sau grupare polar) i o "coad"hidrofob, ce cuprinde fragmente de acizi grai esterificai.Ele au tendina de a se organiza n pelicule sau micelii , deoarece cozile trebuie s se dispun n afara contactului cu apa.Meninerea moleculelor n pelicule sau micelii se realizeaz prin legturi hidrofobe ce nu implic cheltuieli de energie. n cazul fosfolipidelor i glicolipidelor din membran, forma cea mai stabil a miceliilor este reprezentat de stratul lipidic dublu n care gruprile polare sunt dispuse la exterior n contact cu apa, iar lanul de acizi grai se afl la interior. Asfel, se formeaz un bistrat sau continuum lipidic. Fosfolipidele din plasmalem sunt reprezentate de fosfogliceride (ca de exemplu: fosfatidilcolin, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinozitolul) i de sfingolipide ( dintre care cea mai rspdit este sfingomielina. Molecula de fosfatidilcolin, denumit i lecitin, are aspectul unui "cui", n care "capul" (alctuit din radicali de colin i fosfat) este hidrofil, poart sarcini electrice i este numit grup polar. Radicalii de acizi grai sunt hidrofobi i formeaz segmentul apolar al moleculei.

12

Glicolipidele pot fi simple ( de expl. cerebrozidele) sau complexe (de expl.gangliozidele). Au asarcin electric negativ. Gangliozidele conin unul sau mai multi radicali de acid sialic (numit i acid N-acetilneuraminic sau NANA) care le confer sarcin electric negativ. ncrctura electric negativ a suprafeelor celulare este conferit n mare parte de gruprile polare ale fosfolipidelor, ale glicoproteinelor sulfatate i ndeosebi de radicalii carboxilici ai acidului sialic. Colesterolul se gsete n proporie mai mare n membranele la care predomin funcia de barier, dar scade n membranele intracelulare. Exist o asimetrie n dispunerea lipidelor n bistratul membranei eritrocitare. Astfel,glicolipidele se gsesc numai n stratul extern, la nivelul cruia este abundent i colesterolul. n stratul intern al bistratului lipidic sunt mai frecveni acizii grai nesaturai, n timp ce n stratul extern se ntlnesc n proporie mai mare acizii grai saturai cu lanuri lungi. Lipidele sunt repartizate neuniform pe suprafaa membranei celulare, putndu-se grupa n "petice" sau "calote", cu implicaii funcionale speciale, ndeplinind rol de receptori. Fluiditatea lipidelor. La temperatura corpului, toate lipidele din membran se gsesc n stare fluid. Ele pot executa dou tipuri de micri: 1- micri n interiorul unei molecule, precum micri ale atomilor de carbon n lanurile de acizi grai i n gruparea polar; 2-micri ale ntregii molecule, ce pot fi: - de translaie sau de difuziune lateral; - de rotaie n jurul axei longitudinale a moleculei i cmicri de difuziune transversal (flip-flop).(Fig.3.5)

Fig.3.5.Micrile lipidelor n bistrat 1-Gruparea hidrofil; 2-Gruparea hidrofob; 3-Difuziune lateral; 4-Rotaie; 5-Flip-flop;6-Flexie. Moleculele de lipide se deplaseaz mai uor prin micri laterale n acelai strat i trec foarte greudintr-un strat n altul. Unele lipide (expl. cardiolipina) sunt capabile, n prezena ionilor de calciu, s se detaeze din straturile lipidice i s se dispun n form hexagonal, n cilindri de lipide, care delimiteaz canale, ce permit schimburi selective prin bistratul lipidic. PROTEINELE plasmalemei formeaz dou straturi asimetrice, ce tapeteaz bistratul lipidic sau pot traversa bistratul lipidic, unde execut micri de translaie (difuziune lateral) i de rotaie. (Fig.3.6). Prin electroforez n gel de poliacrilamid au fost identificate 15 proteine majore, cu greuti moleculare ntre 15.000-250.000 daltoni. Trei din aceste proteine (spectrina, glicoforina i proteina benzii 3) ocup mai mult de 60% din greutatea proteinelor membranare. Fig.3.6.Formarea porilor hidrofili 1-Lipide - grupri hihrofobe; 2-Lipide - grupri hidrofile; 3-Proteine;4-Por hidrofil.

13

S-au identificat dou grupuri de proteine ( prin metode de cogelare-fracionare i fracionare purificare ): -a) proteine transmembranare (intriseci sau integrale), cuprinse n bistratul lipidic ca nite cuburi de ghea, legate hidrofil i hidrofob de lipide. Se extrag foarte greu i servesc ca dispozitive de recepie-transducie. -b) proteine membranare periferice (sau extrinseci), situate de o parte i de alta a bistratului lipidic, de care se ataeaz prin slabe legturi hidrofile.(Fig.3.7)

Fig.3.7. Dispunerea proteinelor n plasmalem 1-Bistratul lipidic; 2- Proteine extrinseci externe; 3-Proteine extrinseci interne; 4-Proteine intriseci transmembranare Proteinele extrinseci sunt distribuite pe o fa sau alta a bistratului lipidic i i se leag de capatele hidrofile ale lipidelor. Sunt mai numeroase pe fa intern unde particip la realizarea citoscheletului membranei celulare. Proteinele de pe faa extern a bistratului lipidic sunt glicoproteine i se prelungesc pe distane mai scurte sau mai lungi n glicolem, atand pe lanul lor polipeptidic fragmente de oligozaharide. Compoziia, ordinea moleculelor i dispunerea lanurilor de de oligozaharide fa de proteinele transmembranare determin specificitatea funcional i identitatea fiecrui tip de celule. 3.2.2. Glicolema sau glicocalixul Glucidele plasmalemei sunt reprezentate de hexoze, hexozamine i acid sialic. Fragmentele de acid sialic ocup ntotdeuna extremitile periferice ale lanurilor de oligozaharide i confer sarcin electric negativ suprafeei celulelor eucariote.(Fig.3.8) Fig.3.8. Organizarea glicocalixului A-Glicocalix; B-Bistratul lipidic. 1-Rest glucidic; 2-Glicolipid; 3-Glicoprotein adsorbit; 4-Protein transmembranar Lanurile de oligozaharide sunt ancorate pe versantul extern al plasmalemei, formnd un nveli al

14

suprafeei celulare, numit glicocalix (nveli dulce) sau glicolem. Nu exist o delimitare net ntre glicocalix i substana vie din spaiul extracelular, cunoscut sub numele de matrice extracelular. Glicolema sau glicocalixul (glicocalyx) este o componenta extern, de natur glicoproteic a membranei celulare periferice (cu grosimea medie de 50 nm) . Glicocalixul prezint dou zone: - o zon intern, denumit i nveli de suprafa, mai puin dens, (cu grosimea de 20 nm) i o zon extern mai dens ( cu grosimea de 30 nm). Grosimea glicocalixului apare variat. Este mult redus la celulele n culturi; - subiat (pna la 20-30 nm), cnd ocup spaiul dintre celulele nvecinate; - crescut (pn la 50 nm) la celulele libere sau pe polul apical al celulelor intestinale. Din punct de vedere chimic, glicocalixul este alctuit dintr-o estur delicat de de lanuri proteice, pe care sunt ancorate fragmente de glucide. Dintre monozaharide, n glicoproteinele i glicolipidele de la nivelul membranelor i din glicocalix, cele mai importante sunt: galactoza, galactozamina, manoza,fucoza, glucoza, glucozamina i acidul sialic. Raportul strns, de continuitate, dintre glicolem i plasmalem se datoreaz glicolipidelor i glicoproteinelor componente, nveliul de suprafa devennd parte integrant a membranei celulare. Glicocalixul confer individualitate biochimic celulei, comportndu-se ca o "carte de identitate a celulei", datorit numeroaselor variante moleculare pe care le realizeaz cu ajutorul monozaharidelor componenete. Intre moleculele membranei, oligozaharidele induc o variabilitate periferic pronunat, n contrast cu varibilitatea redus a lanului polipeptidc. Astfel, trei aminoacizi diferii pot da natere la ase tripeptide, n timp ce trei monozaharide pot genera 1056 trizaharide diferite. Funciile glicocalixului sunt : Particip, alturi de matricea extracelular, la realizarea adezivitii intercelulare; Asigur specificitatea i individualitatea biochimic tipului de celule.Astfel grupele sanguine sunt determinate de gruprile glucidice terminale aflate pe glicoproteinele i glicolipidele din membrana eritrocitelor. Conine gruprile glucidice ale proteinelor-receptori din membran, dar i ale unor proteine implicate n fenomenele de transport. Depoziteaz ionii de calciu (Ca2+)datorit sarcinilor elctrice negative i intervine n controlul schimburilor ionice transmembranare. Particip la transmiterea informaiei despre celul. Astfel, unele celule din ficat i din splin recunosc cu ajutorul receptorilor de membran glicoproteinele i glicolipidele de pe suprafaa eritrocitelor uzate, care au pierdut acidul sialic i prezint descoperit galactoza, ce ocup penultimul loc din lan. Galactoza este recunoscut de receptorii macrofagelor din ficat (celulele Kupffer), nct hematiile uzate sau mbtrnite sunt imobilizate, fagocitate i lizate. 3.2.3. Citoscheletul Citoscheletul (cytoscheleton) membranei celulare este o reea de proteine extrinseci (cu grosimea de 5-9 nm), situate pe faa intern a membranei periferice. Citosheletul este legat de plasmalem prin intermediul captului intern al proteinelor transmembranare, iar spre interiorul celulei se continu cu citoscheletul din matricea citoplasmatic. La microscopul electronic, citoscheletul membranei apare ca o reea de microfilamente proteice orientate neregulat, n nodurile reelei fiind prezente proteine globulare. (Fig.3.9) Datele referitoare la citoscheletul mebranei au fost obinute n urma cercetrilor efectuate pe membranele globulelor roii, ulterior fiind considerate valabile i pentru membranele altor tipuri de celule. n membrana hematiilor, citoscheletul nglobeaz circa 60% din masa proteinelor ntregii membrane. Principalele tipuri de proteine citoscheletale sunt: spectrina,anchirina, actina,glicoforina i o protein care n cursul electroforezei n gel de poliacrilamid migreaz n banda 4-1. Mai sunt prezente i alte proteine neidentificate, ce au mase moleculare diferite. Prin extragerea spectrinei i actinei, citoscheletul membranei se dezintegreaz, piezndu-i forma i structura. Spectrina (sau tectina) este proteina care predomin n citoschelet. Moleculele solitare de spectrin sunt foarte flexibile. Apare sub forma a doi dimeri (unul de 240.000daltoni i altul de 220.000 daltoni). Dimerii de spectrin au o form de bastona cu o lungime de 100 nm i o grosime de 5 nm. Ei se pot lega cap la cap formnd tetrameri, hexameri, octameri.

15

Fig.3.9.Schema citoscheletului membranei A-Complexul spectrin, anchirin, protein integral; B-Complexul spectrin, actin,proteina benzii 4-1; 1-Protein transmembranar; 2-Anchirin; 3Filamente scurte de actin; 4Proteina benzii 4-1; 5Spectrin. . Anchirina (nectina sau sindeina) este un polipeptid, cu form sferic sau piramidal ce leag spectrina la captul citoplasmatic al proteinei benzii 4,1. Are o greuate molecular de 200.000 daltoni,. Intr-o hematie de la om exist cca. 120.000 de molecule de anchirin, ntr-un neutrofil - 600.000, ntr-un trombocit - 3.000, iar ntr-un fibroblast - 30.000. Actina se gsete sub forma de mici fragmente de actin fibrilar, ce conin 13 monomeri. Lungimea fragmentelor de actin variaz n funcie de numrul moleculelor de spectrin pe care le leag prin capetele lor, fapt ce poate explica plasticitatea citoscheletului membranei, in vivo i aspectul lax al acestuia la microscopul electronic. Proteina benzii 4-1 are aspect globular ( cu diametru de 6 nm) . Laturile ochiurilor din reeaua citoscheletului membranar sunt alctuite din dimeri de spectrin, iar nodurile reelei (complexele joncionale) sunt formate din dou tipuri de complexe moleculare: - un complex ce conine spectrin, anchirin i o protein transmembranar, ce realizeaz legtura cu membrana plasmatic; - i un alt complex format din spectrin, actin, proteina benzii 4-1 i adducin, prezent n nodurile propiu zise ale reelei. Proteinele citoscheletului membranei, mpreun cu lipidele i proteinele de pe faa intern a plasmalemei prezint numeroi radicali hidrofili electronegativi, nct ncrctura electric negativ este mai puternic dect pe faa extern. Totodat, n citoscheletul membranei, se gsesc unele proteine cu locusuri de legare a calciului, denumite calmoduline, ce joac un rol important n reglarea proceselor intracelulare. Legturile dintre diferitele tipuri de proteine din citoschelet sunt realizate prin procese de fosforilare, n care intervine o protein reglatoare, gelsolina, dependent de calciu. Citoscheletul confer membranei: -1) elasticitate, prin dispunerea n reea a proteinelor; i -2) rezisten, prin complexele proteice de la nivelul nodurilor. 3.3.Diferenieri de suprafaa ale membranei celulare periferice. Sunt neregulariti ale citoplasmei periferice, cu caracter tranzitoriu sau permanent, delimitate de membran. Diferenieri ale membranei celulare periferice Invaginri Diferenieri tranzitorii Cripte Canalicule intracelulare Pseudopode

Filiforme Digitiforme Vluri Membrane ondulante Platou striat Margine n perie

Expansiuni sau procese

Procese lamelare Microviloziti

Diferenieri

16

permanente

Expansiuni

Cili Flageli

Diferenierile tranzitorii apar i dispar n raport cu anumite momente funcionale ale celulei, avnd aspectul unor nvaginri (invaginatio

Fig.3.10. Difereneri ale membranei celulare 1-Capilar sanguin; 2-Neutrofile; 3-Pseudopod; 4-Nucleu de histiocit; 5-Vluri ondulante; 6Macrofag cu vluri; 7-Enterocit;8 -Microvili; 9-Glicocalix; 10-Lumenul nefronului; 11Margine n perie; 12-Celul prismatic ciliat; 13-Cili; 14-Axonema; 15_Corpuscul bazal; 16-Rdcina cilului; 17-Seciune transversal prin tija cilului; 18-microtubuli centrali i periferici; 19-Stereocili pe celule epiteliale din epididim; 20-Flagelul spermatozoidului cellularis) ale plasmalemei (n endocitoz), sau al unor expansiuni (processus celularis), cum ar fi pseudopodele sau vlurile ondulante, prin care se realizeaz deplasarea celulelor. Pseudopodele (processus amoeboideus) sunt expansiuni cu form de conuri (processus filiformis) sau degete (processus digitiformis), cu ajutorul crora leucocitele ader de suporturi, deplasndu-se n timpul diapedezei. Ele conin organite celulare, precum mitocondrii, ribozomi, lizozomi. Vlurile i membranele ondulante (processus lamellosus) sunt expansiuni lamelare, foarte mobile, ce se formeaz n mediul lichid. Nu conin organite i nu ader la suporturi. Apar n urma unor modificri ale tensiunii superficiale i se ntlnesc la histiocitele implicate n fagocitoz.

17

Expansiunile permanente sunt reprezentate de microvili, cili i flagel.

Fig.3.11.Dispunerea microfilamentelor n microvilul intestinal 1-Microvili;2-Microfilamente de actin; 3Microfilamente de miozin; 4-Zonula adherens. Microvilii (microvillus, i ) sunt expansiuni cilindrice, delimitate de membrana polului apical (apex cellularis).Ele intervin n procesele de absorbie prin mrirea suprafeei de contact a celulei cu substanele ce vor fi absorbite i prin concentrarea unui numr mare de receptori. Pot fi dispuse grupat sau solitar. Microvilii solitari sunt inegali, cu forme i dimensiuni variabile, distanate unele de altele, formnd marginea n perie ( de expl.la nefrocite, din tubii contori ai nefronului). Platoul striat cuprinde numeroi microvili (300-3000/enterocit) uniformi ca lungime (0,60,8m) i diametru (200 nm), mbracati n glicocalix. Plasmalema microvililor conine ATP-az i un numr mare de transportori. Citoplasma microvililor cuprinde n zona central microfilamente (10-40) de actin, dispuse paralel cu axul lung al microvilului.(Fig.3.11) Microfilamentele de actin se inser cu un capt pe plasmalema polului apical al microvilului, iar la polul bazal al acestuia se termin ntr-o reea perpendicular de filamente de actin i miozin, denumit buton terminal, ce are rolul de a menine poziia microvilului. Mnunchiul de microfilamente din microvil este legat de plasmalem, din loc n loc,printr-o protein, denumit fimbrin. Aceste legturi formeaz o scar, n spiral, de-a lungul microvilului.

18

Fig.3.12.Cili- aspect, structur i ultrastructur A-Epiteliu pseudostratificat prismatic cilat; B-Celule prismatice ciliate,polul apical;C-Seciune transversal prin cil. Cilii (cilium,a) pot fi mobili (sau vibratili) i rigizi (sau stereocili). Cilii mobili (kinetocilii) sunt prezeni la polul apical al celulelor epiteliale din mucoasa aparatului respirator sau a oviductului. Au o lungime de 5-15 m, o grosime de 0,2 m. unt formai din trei poriuni: - tija sau poriunea liber, -corpusculul bazal i rdcina. Tija (pars extracellularis) conine o matrice electrono -dens, plasat la periferie i un complex filamentos axial (sau axonema)(filamentum axiale), format din 10 perechi de tubuli longitudinali: -o pereche central (microtubulus centralis) i - nou perechi periferice (diplomicrotubulus periphericus), dispuse n jurul perechii centrale. Corpusculul bazal (corpusculum basale) are un aspect cilindric i cuprinde n structura sa nou dublete sau triplete (triplomicrotubulus) periferice de microtubuli, lipsndu-i perechea central. Coordoneaz micarea cililor.(Fig.3.12) Rdcina (radix basalis) cilului este format din dubletele sau tripletele periferice ale corpusculului bazal care ajung n citoplasma polului apical al celulei ciliate. Are rolul de a ancora cilul n citoplasm, prezint proprieti contractile i particip la conducerea stimulilor recepionai de poriunea liber. Stereocilii sunt cili rigizi, n structura crora lipsete perechea de microtubuli centrali, avnd numai cele nou dublete periferice. Se ntlnesc pe polul apical al celulelor din epiteliul epididimului.

19

Flagelul (flagellum) are n axonem o pereche central i nou perechi periferice de microtubuli. Este prezent n alctuirea spermatozoidului. (microtubulus centralis) i - nou perechi periferice (diplomicrotubulus periphericus), dispuse n jurul perechii centrale. Corpusculul bazal (corpusculum basale) are un aspect cilindric i cuprinde n structura sa nou dublete sau triplete (triplomicrotubulus) periferice de microtubuli, lipsndu-i perechea central. Coordoneaz micarea cililor.(Fig.3.12) Rdcina (radix basalis) cilului este format din dubletele sau tripletele periferice ale corpusculului bazal care ajung n citoplasma polului apical al celulei ciliate. Are rolul de a ancora cilul n citoplasm, prezint proprieti contractile i particip la conducerea stimulilor recepionai de poriunea liber. Stereocilii sunt cili rigizi, n structura crora lipsete perechea de microtubuli centrali, avnd numai cele nou dublete periferice. Se ntlnesc pe polul apical al celulelor din epiteliul epididimului. Flagelul (flagellum) are n axonem o pereche central i nou perechi periferice de microtubuli. Este prezent n alctuirea spermatozoidului. 3.4. Jonciunile celulare Jonciunile celulare (junctio intercellulares) sunt structuri stabile prin care plasmalemele celulelor interacioneaz specific. Tipuri de jonciuni celulare A. Jonciuni simple Spaii intercelulare Jonciuni denticulate Jonciuni digitiforme Jonciuni de adezivitate B.Jonciuni complexe C. Complexe joncionale Fig.3.13.Tipuri de jonciuni celulare A-Jonciuni impermeabile zonula occludens; B-Desmozomi n band - zonula adherens; C-Desmozomi n pat - macula adherens; D-Jonciuni permeabile -gap. In raport cu structura lor, se descriu jonciuni simple, jonciuni complexe i complexe joncionale (jonctio intercellularis complex). n cazul jonciunilor simple (junctio intercelluaris simplex), ntre plasmaleme exist un spaiu (de cel puin 30 nm) prin care pot trece toate tipurile de molecule existente n mediul intercelular. Dup aspectul lor, jonciunile simple sunt de trei feluri : - spaii intercelulare, - jonciuni intercelulare denticulate (junctio intercellularis denticulata), i - jonciuni intercelulare digitiforme (junctio intercelluaris digitiformes). n raport cu funciile lor , se disting trei categorii de jonciuni complexe: -de adezivitate, impermeabile i -de comunicare.(Fig.3.13) Jonciuni impermeabile Jonciuni de comunicare Desmozomi n pat Desmozomi n band Hemidesmozomi Jonciuni focale

20

3.4.1.Jonciunile de adezivitate sau dezmozomii. Desmozomii (desmosoma) sunt jonciuni ce confer o mare rezisten mecanic unor esuturi i organe, solicitate n acest sens . Se prezint sub trei forme, toate ntlnite n esuturile epiteliale: 1-desmozomi n pat; 2-desmozomi n band; 3-hemidesmozomi. Desmozomii n pat (macula adherens) .Se mai numesc i desmozomi n "spot", n "nit", sau macula adherens (macula = pat, n limba latin). Sunt prezeni mai ales n esuturile epiteliale de acoperire. n alctuirea lor intr urmtoarele componente: 1- plasmalemele adiacente, dispuse paralel, la o distan de 25-30 nm; 2-un material proteic, intercelular dens la fluxul de electroni, cu aspect filamentos, bisectat de o densificare central,bogat n glucide i calciu; 3-densificri intracelulare, n form de disc, ataate de plasmalele joncionate; 4-dispozitive de legtur sau linkeri, reprezentai de microfilamente, ce se detaeaz din materialul dens intercelular, strbat plasmalemele i apoi discurile intracelulare, pentru a se ancora la microfilamentele citoscheletului; 5-elemente citoscheletale, respectiv microfilamente de actin sau filamente intermediare de cheratin, care se numesc tonfilamente.(Fig.3.14)

Fig.3.14 Desmozom n patschem 1Plasmalemele adiacente; 2- Spaiu i material intercelular; 3-Discuri intracelulare; 4-Linkeri; 5-

Tonofilamente.

Desmozomii n band (zonula adherens) sau n panglic (zonula=panglic, n latin) sunt prezeni la polul apical al celulelor epiteliale i la nivelul segmentelor transversale ale discurilor intercalare cardiace. Prezint o structur asemntoare cu cea a desmozomilor n pat, cu urmtoarele deosebiri: -spaiul intercelular, de 15-25 nm este mai srac n material electronodens; -densificrile intracelulare, de pe faa intern a plasmalemelor joncionate, nu au form de disc, ci de band sau panglic. (Fig.3.15) Hemidesmozomii (sau semidesmozomii) (hemidesmosoma) reprezint o variant a desmozomilor n pat, prin care se leag celulele epiteliale de membranele bazale. Prezint numai

21

jumtate din structura desmozomului n pat, n sensul c, pe frotul citoplasmatic al plasmalemei exist un disc, care se leag de membrana bazal prin filamente.

Fig.3.15. Schema desmozomilor n band (zonula adherens) A-Densificri intracelulare n band; b-Spaiul intracelular. 3.4.2.Jonciunile impermeabile Sunt dispuse n panglic, fapt pentru care se mai numesc zonula occludens ( sau jonciuni strnse). Se caracterizeaz prin obliterarea spaiului intercelular, deoarece membranele adiacente se apropie complet sau se sudeaz pentru a forma structuri pentalaminate sau heptalaminate. La realizarea acestor jonciuni particip proteine transmembranare, care se dispun n iruri gemene pentru a construi dispozitive ce se conecteaz "n fermoar" pe feele externe ale membranelor adiacente. Pe feele interne , proteinele transmembranare sunt "ancorate" prin intermediul unor microfilamente la citoscheletul matricei.

22

Fig.3.16.Schema jonciunilor impermeabile A-,B-Plasmalemele adiacente; C-Proteine transmembranare; D-Spaiu intercelular; E-Enterocit; F-Citoscheletul matricei. Aceste jonciuni mpiedic scurgerea fluidelor printre celule, inclusiv a micromoleculelor, care sunt obligate s treac prin celul. Sunt ntlnite la poriunile apicale ale celulelor care delimiteaz lumenul intestinului. Astfel, glucoza este pompat activ din lumenul intestinal n celul prin suprafaa polului apical, dup care trece n snge prin difuziune facilitat mediat de transportorii situai n zonele bazo-laterale ale plasmalemei, pe care o polarizeaz funcional ntr-un domeniuapical i altul latero-bazal.Totodat, jonciunile strnse mpiedic Retrodifuziunea glucozei din spaiul intercelular n lumenul intestinului.(Fig.3.16). Jonciunile strnse au aspecte diferite, n funcie de esutul epitelial n care sunt prezente. Astfel, jonciunile strnse de la polul apical al celulelor din tubul contort proximal al nefronului au o rezisten relativ sczut, fiind formate numai din unul sau dou iruri de proteine transmembranare. La nivelul celulelor epiteliale din mucoasa vezicii urinare, jonciunile strnse conin ase sau mai multe iruri de proteine transmembranare, nct se realizeaz o jonciune puternic, extrem de greu de traversat. La nivelul barierei hematoencefalice, jonciunile strnse existente ntre celulele endoteliale ale vaselor din encefal realizeaz o protecie eficient pentru esutul nervos, permind ns trecerea glucozei (principala surs de energie) din snge n creier i trecerea, n sens invers a bioxidului de carbon, rezultat din respiraia celulelor nervoase. Jonciunile celulare strnse se caracterizeaz prin: -flexibilitate i siguran; - formarea unor bariere chimice i fizice intercelulare; - conferirea unei polariti a celulelor angajate n jonciuni; -apariia de timpuriu, ntre celulele embrionare, iniial sub form de macule, care se extind treptat, lund form de zonule. Jonciunile focale reprezint o variant a jonciunilor strnse, n care membrana celulei se apropie de substratul de adezivitate pn la 10-15 nm. Pe faa extracelular a membranei sunt prezente filamente glicoproteice de fibronectin, iar pe faa intracelular se aglomereaz fascicule de microfilamente de actin i vinculin, care se leag de plasmalem prin intermediul unor densificri adiacente membranei. ntre filamentele de fibronectin i microfilamentele de actin i vinculin se realizeaz dispozitive transmembranare de legtur (de 8-20 nm), denumite fibronexuri.

23

3.4.3.Jonciunile de comunicare Permit trecerea unor molecule mici dintr-o celul n alta i sunt de de dou tipuri: jonciunile permeabile i sinapsele. Jonciunile permeabile, de tip gap, nexus sau macula comunicans sunt realizate prin structuri proteice, denumite conexoni, ce strbat plasmalema, proeminnd de o parte i de alta a bistraturilor lipidice ale membranelor adiacente. Sunt rspndite n diferite tipuri de esuturi, reprezentnd principala cale de comunicare intercelular. Permit schimburi rapide de molecule, fcnd posibil o cooperare metabolic eficient.Spaiul intercelular (spatium intercellulare) este foarte ngust (2-4nm). n momentul realizrii jonciunii permeabile, conexonii din cele dou plasmaleme se aeaz cap la cap, formnd canale directe de comunicare ntre citoplasmele celor dou celule, fr deschideri n spaiul intercelular.(fig.3.18).

Fig.3.17Schema jonciunii permeabile (gap) 1-Plasmalemele adiacente; 2-Spaiu intercelular; 3-Conexoni; 4-Canale intercelulare.

Fig.3.18.Diagrama schimburilor moleculare prin jonciunile gap. Un conexon are o form de prism hexagonal cu diametrul de 7-8 nm i este alctuit din 6 subuniti proteice (oligomeri). Subunitile delimiteaz un canal hidrofil cu diametrul reglabil. Ionii de calciu intracelular (Ca2+) modific diametrul canalului, controlnd astfel comunicarea intercelular. Canalul hidrofil al jonciunii gap permite trecerea dintr-o celul n alta a ionilor i a unor molecule cu greutate sub 1.000-1500 daltoni, precum: glucide, aminoacizi, nucleotide, hormoni, vitamine,etc. Nu pot s treac macromoleculele (proteine, acizi nucleici, etc.), dar sunt de 10.000 ori mai permeabile pentru ionii metalici dect restul suprafeei membranei. n culturile de celule, jonciunile de tip gap se organizeaz foarte rapid, din proteinele existente n plasmalem, care se grupeaz n conexoni. Ele permit schimbul unor molecule de mrimi medii, ca nucleotizii.

24

Jonciunile gap sunt necesare mai ale n situaiile n care celulele trebuie s acioneze simultan, n grup, cum este cazul celulelor embrionare, pe cale de difereniere sau ntre celulele musculare (cardiace i netede), nervoase i endocrine. 3.4.4.Complexele joncionale Cuprind jonciuni strnse spre frontul luminal i desmozomi spre frontul latero-bazal. Sunt ntlnite, mai ales, ntre celulele din epiteliile intestinale i renale. n complexele joncionale sunt prezente toate tipurile de legturi intercelulare necesare pentru ndeplinirea funciilor specifice esuturilor respective.(fig.3.19)

Fig.3.19. Complexe joncionale n epiteliul intestinului subire. A-Micvrovili;B-Jonciuni impermeabile; C-Desmozomi n band; D-Desmozomi n pat; E-Filamente din citoschelet; F-Jonciuni permeabile; G-Hemidesmozomi; H-Mebrana bazal.

25

3.5. Receptorii din membrane Receptorii din membrane sunt dispozitive moleculare proteice intramembranare, cu ajutorul crora se intercepteaz semnalele, ce sosesc pe cale nervoas sau umoral. Receptorii din membrane Liganzi = mesageri extracelulari (de ordinul I) Mediatori chimici locali Receptori pentru: Mediatori chimici locali Hormoni hidrofili (insulina,glucagonul,etc) Hormoni A. Receptori pentru substane endogene Hormoni hidrofobi (Hormoni steroizi sexuali) Acetil colina Adrenalina Noradrenalina Dopamina, serotonina GABA= Acidul gama aminobutiric Acidul aspartic Antigene endogene Anticorpi Componentele complementului Adenovirusuri Mixovirusuri Antigene nonslef Toxine microbiene Lectine,etc

Denumire

Neurotransmittori

Subst. imunogene B. Receptori pentru substane exogene Virusuri Antigene non self Toxine microbiene Lectine, etc

Toate substanele care se leag de receptori i moduleaz (modific) funcia celular se numesc liganzi. Liganzii sunt substane, produse de celule specializate, care acioneaz n mod specific asupra unui grup de celule "int", producnd-le modificri ale activitii . Ei sunt denumii i mesageri extracelulari sau mesageri de ordinul I, cei mai cunoscui fiind hormonii i neurotransmitorii. Liganzii acioneaz n cantitate foarte mic (10-8 M), iar receptorii i leag cu o constant de afinitate mare (K=108 litri/mol). Exist dou mari categorii de receptori n membrane: receptori pentru substane endogene i receptori pentru substane exogene. 3.5.1. Receptorii pentru substane endogene Se cunosc mai multe categorii de molecule semnal (de liganzi) de natur endogen (produse de organism): 1-mediatori chimici locali; 2-hormoni; 3-neurotransmitori; 4-substane imunogene. Mediatorii chimici locali sunt secretai de unele tipuri de celule i acioneaz numai asupra celulelor din imediata lor vecintate. Ei sunt rapid captai i distrui.(Fig.3.20). Hormonii sunt substane endogene produse de celulele glandelor endocrine. Pe cale sanguin, ajung la celulele int din diferite organe, acionnd la distane mari de locul de producere. Neurotransmitorii sunt substane endogene produse de neuroni i eliberate la nivelul sinapselor chimice. Ei acioneaz numai asupra neuronilor agajai n sinaps. Hormonii i neurotransmitorii sunt considerai mesageri de ordinul I. Hormonii au o compoziie chimic variat, putnd fi substane steroide (hormonii sexuali) sau polipeptide ( ca de expl. hormonii pancreatici i tiroidieni). Hormonii steroizi ptrund n celul, traversnd bistratul lipidic, pe cnd cei polipeptidici se cupleaz cu receptorii specifici din membran, acionnd de la acest nivel. Substanele imunogene sunt reprezentate de : -antigene endogene; - anticorpi; componentele complementului. Receptorii pentru neurotransmitori sunt situai n membrana postsinaptic a celulelor nervoase, n membrana celulelor musculare sau a altor celule efectoare. Ei recepioneaz

26

acetilcolina, noradrenalina, dopamina, serotonina, adrenalina, histamina, acidul gama-aminobutiric, acidul aspartic, encefalina,etc.

Fig.3.20. Molecule semnal endogene. Receptorii pentru hormoni au o localizare diferit n celul, n funcie de tipul hormonului, hidrofil sau hidrofob. Hormonii hidrofili (insulina, glucagonul, adrenalina, hormonii hipofizari, parathormonul,etc.) se ataeaz de receptorii din membrana periferic, transmind celulei informaia necesar pentru a-i modula activitatea. Dintre receptorii hidrofili, cei mai bine studiai sunt receptorii pentru insulin din membrana hepatocitelor i adipocitelor. Ei au o mas molecular de 300.000 daltoni, iar n membrana unei celule exist circa 10.000 receptori pentru insulin. Hormonii hidrofobi (steroizi i tiroidieni) traverseaz membrana celulei int i se leag de receptorii membranelor intracelulare. Receptorii pentru substanele imunogene sunt de trei feluri: 1-pentru antigene endogene; 2- pentru anticorpi; 3- pentru complement. Receptorii pentru antigene endogene sunt mai numeroi pe membrana limfocitelor T, sunt codificai genetic i au capacitatea s recunoasc structurile moleculare "self" (proprii organismului respectiv).Ei pot fi prezeni i n membrana unor celule neimunogene (expl. n membrana enterocitelor.) Receptorii pentru anticorpi sunt receptori Fc, pentru fraciunea cristalizabil a imunoglobulinei G. Ei sunt prezeni n membrana celulelor din sistemul fagocitelor mononucleare. n membrana bazofilelor i mastocitelor se gsesc receptori pentru imunoglobulina E. Receptorii pentru complement leag cea de a treia component a complementului de suprafaa celulei, fiind caracteristici celulelor din sistemul fagocitelor mononucleare. 3.5.2.Receptorii pentru substane exogene Sunt receptori pentru: - virusuri, capabili s recunoasc adenovirusuri, mixovirusuri,etc.; - antigene nonself (strine de organism); sunt prezeni pe suprafaa limfocitelor B i au o structur molecular asemntoare imunoglobulinelor.Aceti receptori determin transformarea blastic a limfocitelor B, dup contactul cu antigenul. - toxine microbiene. Sunt prezeni n membrana celulelor imunocompetente. - lectine. Lectinele sunt substane proteice sau glicoproteice, extrase din esuturi vegetale sau animale, capabile s formeze puni ntre glicoproteinele membranare.

3.5.3.Mecanismul de aciune al receptorilor.

27

Receptorii din membranele de suprafa sunt activai n majoritatea cazurilor de molecule semnal (liganzi) hidrofile. Moleculele semnal hidrofile nu pot strbate membrana celular dect dup ce se leag de receptorii specifici. Sub influena diferiilor liganzi se produc modificri metabolice n celulele int. Ataarea liganzilor de receptori se realizeaz prin legturi hidrofobe i legturi de hidrogen ( ca de exemplu legarea insulinei de receptori ). Legturile sunt labile i strict dependente de concentraia liganzilor din mediul extracelular. Efectele aciunii complexului ligand-receptor asupra celulelor constau n: modificri structurale ale membranei celulare i modificri funcionale ale membranelor. Modificrile structurale ale membranei celulare se manifest prin redistribuirea receptorilor, rspndii la ntmplare nainte de interaciunea ligand receptor. Dup contactul ligand-receptor, receptorii se grupeaz la suprafaa membranei n zone delimitate sau "plaje".(Fig.3.21) Acest lucru se poate realiza datorit fluiditii bistratului lipidic, nct mai multe molecule de ligand pot aciona asupra mai multor receptori nvecinai. Astfel n limfocitele B, lectinele pot induce formarea unor agregate receptor-ligand de dimensiuni mari, denumite cupole, unde se declaneaz un proces de endocitoz. Fig. 3.21.

Redistribuirea receptorilor din membrana celular Modificrile funcionale ale membranelor constau n: 1- Modificri de permeabilitate a membranei, caracteristice pentru liganzi de tipul neurotransmitorilor. n acest sens, acetilcolina se leag de receptorii din membranele postsinaptice ale fibrelor musculare, determinnd creterea permeabilitii membranei pentru ionii din mediul extracelular. 2- Inducerea de endocitoz, care se produce cnd ligandul este o substan endogen, vehiculat pe cale umoral. 3- Ptrunderea din mediul extracelular a unor ioni cu funcie de mesageri de ordinul II. Astfel, ionii de calciu ptrund n celul dup ce neurotransmitorii se leag de receptorii din membranele post sinaptice ale jonciunii neuromusculare. 4- Activarea unor enzime din membrana celular. Se produce cnd liganzii sunt hormoni hidrofili. Asfel se activeaz adenilat ciclaza ce va cataliza sinteza, pe faa intern a membranei, a adenozin 3' - 5' monofosfatului ciclic (AMP-c) sau va determina fosforilarea proteinelor celulare. Activarea adenilat ciclazei se realizeaz cu ajutorul unor proteine reglatoare.(Fig.3.22) Dup activarea adenilat ciclazei, n citosol crete cantitatea de AMP-c (considerat mesager de ordinul II) , amplificndu-se semnalul hormonal. Totodat se activeaz i o proteinkinaz care controleaz fosforilarea mai multor molecule proteice, stimulnd procesele metabolice din celul. Sinteza de AMP-c poate fi blocat de unele prostaglandine care acioneaz prin inhibarea aciunii adenilat ciclazei. n unele maladii este implicat, n mod direct disfuncia receptorilor din membran. Astfel, n "miasthenia gravis" este inactivat receptorul pentru acetilcolin de la nivelul plcii neuromusculare, iar n hipercolesterolemia genetic sunt abseni sau nefuncionali receptorii pentru colesterol.

28

Fig.3.22. Activarea unor enzime din membrana celular Exist afeciuni ale receptorilor care constau n blocarea funciei autoimune prin autoanticorpi antireceptori. Asfel, autoanticorpii pentru receptorii de insulin pot aciona ca insulinomimetici (activnd receptorii) sau ca blocani ai acestora (n diabetul insulinorezistent). Autoanticorpii care stimuleaz receptorii dopaminei pot constitui cauze ale scizofreniei, iar imunoautoanticorpii beta adrenergici sunt implicai n afeciunile asmatice. n procesul de mbtrnire i n unele boli neuropsihice (la om) s-a observat o modificare a densitii receptorilor. 3.6.Schimburile prin membran Prin membrana celular se efectueaz schimbul de substane, fie prin traversarea diferitelor structuri ale acesteia, sau pe calea transportului n mas, cu ajutorul veziculelor, furnizate de membrana celular. Bistratul lipidic funcioneaz ca o barier de difuziune pentru ap i alte molecule hidrofile, n timp ce moleculele liposolubile, oxigenul i bioxidul de carbon l trec cu uurin. 3.6.1.Transportul transmembranar Realizeaz schimburile de molecule mici i ioni (de unde i denumirea de microtransport) ntre celul i mediul extracelular. ndeplinete urmtoarele funcii: Preia din mediul extracelular o serie de combustibili metabolici necesari meninerii vieii celulei i activitilor ei metabolice; Elimin n mediul extracelular compui fiziologici necesari organismului (substane secretate), precum i substane toxice toxice , rezultate din activitatea celulei; Regleaz volumul celulelor; Asigur meninerea ph-ului intracelular i compoziia ionic la valori ct mai favorabile desfurarii activitii metabolice celularte; Produce diferene de concentraii (gradiente ionice), care permit desfurarea unor activiti biologice complexe, cum snt excitabilitatea nervului i a muchiului. Preia din mediul extracelular o serie de combustibili metabolici necesari meninerii vieii celulei i activitilor ei metabolice; Elimin n mediul extracelular compui fiziologici necesari organismului (substane secretate), precum i substane toxice toxice , rezultate din activitatea celulei; Regleaz volumul celulelor; Asigur meninerea ph-ului intracelular i compoziia ionic la valori ct mai favorabile desfurarii activitii metabolice celularte; Produce diferene de concentraii (gradiente ionice), care permit desfurarea unor activiti biologice complexe, cum snt excitabilitatea nervului i a muchiului.

Transportul prin membrane

29

Denumire

Modaliti Difuziune simpl

Mecanisme Pori Canale moleculare transmembranare Crui proteici moleculari Pompa de Na+- K+ Pompa de Ca 2+ Pompare molecular Fagocitoza Pinocitoza fr receptori Pinocitoza mediat de receptori Transcitoza distributiv Transcitoza conectiv

A.Transport pasiv Difuziune facilitat Transport prin pompe ionice B. Transport activ Transport cuplat Translocare de grup Endocitoza C. Transportul n mas Exocitoza Transcitoza

n funcie de mecanismele care intervin n micarea moleculelor prin membrana celular se deosebesc dou forme de transport : a-transportul activ i b- transportul pasiv. (Fig.3.23). 3.6.11.Transportul pasiv Realizeaz trecerea moleculelor mici n sensul gradientului de concentraie, iar a ionilor n sensul gradientului electrochimic. Se face fr consum de energie, fiind independent de metabolismul celular. Exist dou modaliti de realizare a transportului pasiv prin: difuziune simpl i prin difuziune facilitat. Transportul pasiv prin difuziune simpl. Se face lent, ntruct restructurarea permanent a membranelor biologice este o dificultate pentru difuziune.Este supus legilor difuziunii i osmozei, fiind dependent numai de fore fizice.

Fig.3.23. Transportul transmembranar. 1-Bistrat lipidic;2-Proteine transmembranare; 3-Molecule transportate;4-Difuziune simpl;5-Difuziune facilitat; 6-Transport activ; 7-Sensul gradientului electrochimic. Moleculele mici liposolubile difuzeaz prin bistratul lipidic, iar cele hidrosolubile trec prin orificii mici canale sau pori hidrofili situati n bistrat, delimitai de proteine transmembranare. Canalele transmemebranare au un diametru de 1 nm, fiind specializate i selective. Vasopresina stimuleaz transportul prin canale i pori mrindu-le diametrul pn la 2-3 nm. (Fig.3.24)

30

Fig.3.24. Transportul prin canale i pori. 1-Por; 2-Bistrat lipidic; 3-Proteine transmembranare; 4-Ion. Transportul prin difuziune faciliat. Este mult mai rapid (de cca.100.000 ori) dect cel prin difuziune simpl, permind trecerea prin membran a unor substane greu solubile n lipide i cu o mas molecular relativ mare. Se ntlnete frecvent la hepatocite,unde, n acest mod, se transport glucoza,aminoacizi,etc.(Fig.3.25.) Fig.3.25.Tranportori de tip canal i cru. 1-Bistrat lipidic; 2-Canal; 3- Cru sau tranportor mobil. Se realizeaz cu ajutorul unor molecule proteice din compoziia membranei cu rol de crui. Astfel, pe membrana hepatocitului exist 800.000 de crui, iar fiecare cru transport 100 molecule de glucoz pe secund. Transportul prin difuziune facilitat se efectueaz n sensul gradientului de concentraie i duce la echilibrarea concentraiilor pe ambele fee ale membranei, ns viteza de transport este direct proporional cu concentraia lor. n raport cu numrul speciilor transportate exist transport uniport, simport i antiport. (Fig.3.26.) Fig.3.26. Tipuri de transport, n funcie de sens i numrul speciilor transportate 1-Bistrat lipidic; 2-Protein transportor; 3-Molecule transportate; 4-Uniport: 5Sinport;6-Antiport.

3.6.1.2.Transportul activ Se realizeaz mpotriva gradientelor de concentraie sau a gradientelor electrochimice, producnd o cretere a concentraiei pe o fa a membranei. Solicit cheltuial de energie, care este furnizat de metabolismul celular, fiind metabolic dependent. Unele celule nalt difereniate (fibre musculare, neuroni) i procur energia necesar transportului pe cale aerob, prin producere de ATP. Hematiile i produc moleculele de ATP necesare pentru transport prin glicoliz. Exist mai multe tipuri de transport activ, n funcie de modul n care este folosit energia: 1-Tranportul activ prin pompe ionice, n care proteinele ce efectuiaz transportul folosesc direct energia din ATP, avnd proprieti ATP-azice ( de descompunere a ATP-ului). 2-Trasportul cuplat (sau cotransportul), n care se folosete energia gradientelor ionice, substanele de transportat (glucide, aminoacizi) fiind cuplate cu unii ioni (Na+). 3-Translocarea de grup, ntlnit la unele bacterii, care folosesc ca surs de energie fosfoenolpiruvatul. Transportul prin pompe ionice.

31

Pompele ionice sunt protein-enzime din compoziia plasmalemei care transport ionii ntr-o direcie termodinamic nefavorabil, mpotriva gradientului electrochimic sau de concentraie. n organism se cunosc pompe transportoare pentru ioni sau cationi,existnd pompe pentru un singur ion (Ca2+sau Mg2+) sau pentru doi ioni (pompa de Na+i K+). Pompa de Na+ - K+ este ce a mai bine cunoscut.(Fig.3.27) Fig.3.27. Organizarea molecular a pompei ionice de Na+ - K+ 1Plasmalema; ,-Proteine transmembranare

n condiii normale, ionul de potasiu (K+) se gsete ntr-o concentraie mai mare (de cca. 15 ori)intracelular, n timp ce ionul de sodiu (Na+) are o concentraie mai mare extracelular. Gradientele ionice (diferenele de concentraii) sunt meninute printr-un sistem special de transport, denumit pompa de Na+-K+. Pompa de Na+-K+ a fost studiat pe membranele hematiilor, unde s-a constatat o deplasare concomitent a Na+ extracelular (spre o concentraie mai mare), iar a K+ intracelular (tot spre o concentraie mai mare), contrar gradientelor de concentraie. Energia necesar acestui transport se obine prin hidroliza ATP-ului, care este realizat de ctre o enzim din plasmalem, denumit Na+K+-ATP-az, deoarece acioneaz numai n prezena ionilor de Na+,K+ i a unei concentraii favorabile de Mg2+. Aceast enzim este o glicoprotein mare, un tetramer cu o greutate molecular de 270.000 daltoni.

Fig.3.28.Transportul cuplat prin pompare molecular.

32

Pompa de Ca2+ sau Ca2+-ATP-aza asigur transportul ionilor de Ca2+ prin sistemul de membrane ale reticulului endoplasmic din fibrele musculare. Exist i pompe pentru anioni, precum pompa de clor (Cl-) din celulele parietale ale glandelor gastrice sau pompa de iod (I-) din tiroid. Transportul cuplat (sau mecanismul de pompare molecular) utilizeaz, pentru transportul unor molecule (glucoz, aminoacizi), energia care rezult din micarea Na+ mpotiva gradientului de concentraie i al gradientului electric. Aceast energie poate fi folosit pentru introducerea n celul a unor substane nutritive. (Fig.3.28). Glucoza este pompat din mediul extracelular n celule (enterocite sau nefrocite) odat cu ionii de Na + cu ajutorul unei uniti proteice de transport. Dup ptrunderea n celul, glucoza se decupleaz de ionii de Na+ , care sunt pompai n afara celulei printr-o Na+-K+-ATP-az. 3.6.2. Transportul n mas Este procesul prin care celulele preiau din mediul extracelular particule de natur diferit, prin formarea de vezicule pe seama membranei celulare. n funcie de direcia n care se deplaseaz veziculele deosebim trei tipuri de transport n mas: 1-exocitoza; 2-endocitoza; i 3-transcitoza. 3.6.2.1. Exocitoza Exocitoza este procesul prin care celulele i descarc n mediul extracelular produsele secretate sau alte materiale pemtru export. Produsele pentru export se colecteaz n vezicule intracitoplasmatice (vesicula cytoplasmatica, care se deplaseaz dinspre complexul Golgi spre membrana celular, fie n mod spontan, fie dup stimularea celulei de ctre unii factori secretagogi (hormoni, neurotransmitori, factori de eliberare). Deschiderea veziculelor i eliminarea coninutului n spaiul extracelular se datorete contraciei microfilamentelor, n prezena moleculelor de ATP , de AMP-c ia ionilor de Ca2+.n celulele exocrine, exocitoza este limitat la domeniul apical (luminal) al plasmalemei.

Fig.3.29.Transportul prin vezicule (n mas). A-Endocitoza; B-Exocitoza; C-Transcitoza. 1-Plasmalema; 2-Fagozom; 3-Lizozom primar; 4-Lizozom secundar;5-Vezicule de secreie; 6-Vezicule de transport. Exocitoza este prezent i la nivelul sinapselor, unde veziculele ce conin mediatori chimici (acetilcolin, noradrenalin) fuzioneaz cu membrana presinaptic. Mediatorii sunt eliberai n spaiul sinaptic, dup care se leag de receptorii specifici din membrana postsinaptic, producnd depolarizarea ei i transmiterea influxului nervos. 3.6.2.2. Endocitoza Endocitoza este procesul prin care celulele preiau din mediul extracelular molecule mari ( cu greutate molecular mai mare de 10.000 daltoni), prin intermediul unor vezicule, care se formeaz din membrana celular. n acest fel se poate realiza nutriia celulei, purificarea mediului extracelular i unele procese de aprare imunitar. Dup natura materialului endocitat i dup modaliatea de ingestie se disting dou tipuri de endocitoz: 1-fagocitoza (de la grecescul phagein = a mnca) sau endocitoza de molecule i particule solide,microorganisme (bacteriene sau virale), macromolecule alterate, detritus celular, celule ntregi,

33

etc. nensoite de fluid; 2- pinocitoza ( de la grecescul pinein = a bea) sau endocitoza de fluid, ce conine molecule sau particule. 3.6.2.2.1.Fagocitoza n condiii normale i patologice, pot participa la fagocitoz un mare numr de tipuri celulare, denumite generic fagocite. n funcie de mrimea particulelor pe care sunt capabile s le nglobeze, se disting microfage, care nglobeaz numai particule mici (exemplu neutrofilele) i macrofage, care nglobeaz particule mari, existnd macrofage mobile ( monocitele circulante) sau macrofage fixe (histiocitele din esutul conjunctiv, celulele Kupffer din ficat, celulele capilarelor sinusoide din splin, unele celule din mduva osoas hematogen, din limfonoduri, din pulmon,etc.). Fagocitele prezint pe suprafaa membranei regiuni specializate purttoare de receptori, cu ajutorul crora recunosc ceea ce este "self" (macromoleculele proprii organismului) de ceea ce este ""non self", adic macromoleculele strine de organism, denumite generic antigen. Dintre macromoleculele self, receptorii pentru fagocitoz rercunosc ceea ce este sntos de ceea ce este alterat ( self alterat: celule degenerate, celule maligne, celule mbtrnite, resturi tisulare). n unele situaii patologice, receptorii celulelor ce intervin n fagocitoz pierd capacitatea de a diferenia self-ul de non-self , acionnd, asfel, mpotriva proteinelor din organismul propriu i determinnd apariia reaciilor autoimune, care pot genera o serie de entiti patologice. Recunoaterea antigenilor n organism este nlesnit de prezena n mediul extracelular a unor proteine, denumite opsonine. Opsoninele sunt proteine extracelulare care mediaz i faciliteaz legtura ntre receptorii membranei fagocitelor i antigenele ce vor fi fagocitate, formnd complexe antigen-opsonine. Se cunosc mai multe tipuri de receptori ai complexelor antigen-opsonin, precum: - receptorii Fc, care leag de suprafaa membranei antigenele opsonizate cu imunoglobuline G ( Ig G), dup ce au recunoscut fraciunea cristalizabil (Fc) a imunoglobulinei G.; - receptorii C3, care reconosc i fixeaz antigenii opsonizai cu cel de al treilea component al complementului. n membrana fagocitelor, n afar de receptoriii pentru complexe opsonizate, s-au mai descris receptori nespecifici care recunosc i fixeaz selful alterat, reprezentat de resturi celulare sau celule maligne. Fagocitoza se desfoara n patru etape:chemotaxia,opsonizarea, ingestia i digestia. Chemotaxia este proprietatea unei celule mobile (n cazul de fa a neutrofilelor) de a se deplasa prin esuturi ctre particule int, ca rspuns la diveri stimulli dup ce inta a fost recunoscut. Semnalele chemotactice sunt reprezentate de: substane bacteriene (proteine, lipide), proteine serice, componente ale complementului (15 proteine serice, care amplific rspusul imun), produse ale limfocitelor (limfokine), factori eliberai de neutrofile.

Fig.3.30. Opsonizarea i fagocitarea. Opsonizarea const n acoperirea bacteriilor sensibilizate de anticorpi pentru a fi fagocitate. Principalele opsonine sunt anticorpii, n special imunoglobuline (Ig1, Ig3) i componente ale

34

complementului (C3, C5). Fraciunea cristalizabil (Fc) a imunoglobulinei G este recunoscut de receptorii Fc de pe suprafaa neutrofilelor. (Fig.3.30) Ingestia microorganismelor are loc dup ce acestea au fost opsonizate. Complexul antigenopsonine este recunoscut de receptorii de la suprafaa fagocitelor i legat de membrana celular, determinnd activarea receptorilor. n urma activrii receptorilor, actina din citoscheletul membranei,se contract, determinnd emiterea de pseudopode. Pseudopodele nconjoar strns particula i n acest fel se realizeaz interaciuni receptor- particul pe toat suprafaa ei. Mecanismul de fixare a particulei de membrana psedupodelor este comparat cu nchiderea unui fermoar. Extremitile pseudopodelor nconjoar particula i formeaz o vezicul, denumit fagozom. (Fig.3.30.) n citoplasm, fagozomul se unete cu un lizozom , formndu-se un fagolizozom, n care hidrolazele acide vor aciona asupra particulei strine, producnd digestia acesteia. n cazul neutrofilellor, contopirea granulelor azurofile primare (a lizozomilor) cu fagozomul i eliberarea coninutului lor n fagolizozom (sau vezicula digestiv) se manifest prin dispariia granulelor din citoplasm,fenomen cunoscut ca degranularea neutrofilelor.

Fig.3.31.Mecanismele fagocitozei ; A-Mecanisme moleculare; Realizarea fagozomilor. 1-ImunoglobulinaG; 2-Receptor inactiv; 3-Receptor activat; 4-Protein contractil din citoschelet; 5-Pseudopode; 6-Fagozom Digestia intracelular a particulelor fagocitate are loc n lizozomi i se produce prin: -sisteme dependente de oxigen, mediate de enzime (mieloperoxidaz, superoxidismutaz); i - prin sisteme independente de oxigen ,ce presupun aciunea lizozimului, a lactoferinei,etc..

3.6.2.2.2.Pinocitoza

35

Pinocitoza sau endocitoza particulelor n faz fluid reprezint procesul de transport n mas a unei cantiti variabile de fluid tisular, mpreun cu particulele pe care le conine, prin intermediul unor vezicule (vezicula pinocitocica), denumite pinozomi. Se ntlnete la toate tipurile de celule, aprnd ca o modaliatate mportant prin care celulele capteaz din lichidul intercelular substanele necesare metabolismului lor. Se deosebesc dou forme de pinocitoz n funcie de mecanismele care intervin n procesul de preluare a sustanelor: - pinocitoza far receptori i - pinocitoza mediat de receptori. Pinocitoza fr receptori este endocitoza cea mai frecvent ntlnit la acele celule din organism, care folosesc pentru transport suprafee mari nespecializate din membrana plasmatic.. Preluarea substanelor cu ajutorul veziculelor se face fr o legare prealabil a lor de membrana celular prin receptori. Pinocitoza se desfoar n mai multe etape: 1-Contactul particulelor din fluidul tisular produce activarea unor puncte de pe suprafaa celulei , denumite situsuri anionice. Acest proces induce agregarea microfilamentelor din citoscheletul membranei, producnd creterea flexibilitii membranei celulare. 2-Membrana celular se invagineaz formnd cripte sau canale intracelulare (invaginatio cellularis), n care intr lichid extracelular, mpreun cu particulele prezente n el. 3-Membranele din vecintatea extremitii profunde a canalului se alipesc,fuzioneaz i apar pinozomii (vesicula pinocytotica), vezicule ce se desprind de canal i sunt antrenate de curenii intracitoplasmatic. 4-Pinozomii fuzioneaz cu lizozomii, formnd pinolizozomii, n care enzimele lizozomale produc digestia materialelor preluate din exteriorul celulei. n funcie de mrimea particulelor nglobate prin pinocitoz se distinge o micropinocitoz i omacropinocitoz. Macropinocitoza este modalitatea de transport a unor particule mari vizibile la microscopul optic. Poate fi studiat prin injectarea in vivo de colorani vitali, care se fixeaz de proteinele serice. Complexele formate din proteine serice i coloranii vitali coloidali sunt introduse n citoplasm mpreun cu mici cantiti de lichid extracelular, fiind utilizate ca indicator de recunoatere a celulelor care manifest proprietate de pinocitoz la nivelul organelor i esuturilor. Micropinocitoza reprezint modalitatea de transport a moleculelor mici cu ajutorul veziculelor , vizibile numai la microscopul electronic. Urmrindu-se soarta veziculelor pinocitate, s-a observat c acestea pot: 1- rmne n citoplasm, unde fuzioneaz cu lizozomii, n care sunt digerate, iar dup ce i-au descrcat coninutul, membranele lizozomale sunt reintegrate n membrana celular; 2- traversa citoplasma fr a fuziona cu lizozomii, descrcndu-i coninutul pe cealalt fa a citoplasmei. Pinocitoza mediat de receptori. Se mai numete i pinocitoz absorbtiv, selectiv sau concentrativ. Este modalitatea de preluare din mediul extracelular a unor materiale diferite, prin folosirea unor zone specializate ale membranei celulare, prevzute cu receptori. Receptorii recunosc i leag de membran particule diferite. Fiind mobili receptorii se grupeaz la nivelul unor zone specializate ale membranei celulare, care se invagineaz formnd caveolele (vesicula superficialis s. caveola) acoperite, deoarece sunt acoperite pe versantul citoplasmatic de o reea de microfilamente, formate dintr-o protein, denumit clatrin. Reeua de clatrin stabilizeaz poziia receptorilor i menin caveolele n comunicare cu mediul extracelular. (Fig.3.32.) Caveolele acoperite care fixeaz complexele particul-receptor (sau ligand-receptor) sunt nglobate rapid mpreun cu o cantitate mic de fluid extracelular sub form de vezicule care pot s-i pstreze mantaua de clatrin pe faa lor extern (vezicule acoperite) sau microfilamentele de clatrin se desprind la nivelul membranei, n acest caz aprnd vezicule netede sau receptozomi. Particulele nglobate prin pinocitoza mediat de receptori pot fi degradate n lizozomi sau n unele cazuri, receptozomii traverseaz citoplasma fr s interacioneze cu lizozomii, fiind eliminate pe cealalt fa a celulelor.

36

Fig.3.32. Pinocitoza mediat de receptori. 1-Plasmalema; 2-Receptori mobili;3-Ligand; 4-Complex ligand receptor; 5-Caveol acoperit cu clatrin; 6-receptozom ; 7-Nucleu; 8-Complex Golgi; 9-Lizozom. Spre deosebire de pinocitoza fr receptori, n care concentraia substanelor n veziculele endocitate este aceeai ca n lichidul extracelular, n veziculele acoperite , ce apar n pinocitoza mediat de receptori, concentraia substanlelor este mult mai mare dect n lichidul extracelular, datorit capacitii receptorilor de a lega selectiv un numr mare de particule. Implicaii patologice. Pinocitoza mediat de receptori este o modalitate folosit pentru preluarea din lichidul extracelular i din snge a colesterolului, o lipoprotein cu densitate mic. n situaii normale, celulele prevzute cu receptori pentru proteine cu densitate mic preiau colesterolul din mediul extracelular. Lipsa acestor receptori, ntlnit n unele deficiene genetice, face imposibil preluarea moleculelor de colesterol din snge, determinnd o cretere a concentraiei acestuia (hipercolesterolemie) i apariia de plci aterosclerotice n peretele vascular.

37

Fig.3.33. Schematizarea modalitilor de transport prin celula endotelial. (dup SIMIONESCU-1981) 3.6.2.3.Transcitoza Transcitoza sau citopemsis reprezint o form aparte a transportului prin vezicule, prin care se realizeaz transportul macromoleculelor prin celule endoteliului capilar. A fost studiat de Palade (1953), care a observat, cu ajutorul microscopului electronic, vezicule ce traverseaz celulele endoteliale, realiznd schimburi ntre plasm i lichidul interstiial.(Fig.3.33) Transportul veziculelor pinocitate se poate realiza prin dou modaliti: 1-transcitoza distributiv, n care trecerea se face sub forma unor iruri de vezicule intracitoplasmatice, ce se ntind de la faa luminal la faa bazal, fr a ajunge n contact cu lizozomii; i 2-transcitoza conectiv, n care transportul se face prin canale ce se formeaz fie prin fiziunea veziculelor, fie prin invaginarea plasmalemelor. 4. NUCLEUL Nucleul (lat. nucleus i gr. karion = smbure) (nucleus) este o component esenial caracteristic celulelor eucariote. ndeplinete ca funcii principale: -stocarea informaiei genetice n ADN-ul nuclear , reglarea i controlul tuturor activitilor celulare. n organismele animale, exist i celule anucleate (hematiile, trombocitele), care sunt incapabile s sintetizeze proteine, activitiile lor metabolice fiind foarte restrnse. Componentele nucleului Denumire A. Membrana nuclear ( nveliul nuclear) Componente Membrana nuclear extern Cisterna perinuclear Formaiuni ultrastructurale Complexul por: Anulus extern Anulus intern Granul central 8 granule proteice periferice 8 conuri de proteine fibrilare Matricea fibrilar (granule i matrixin ) Lamina dens intern Complexul lamina por Componenta fibrilar a nucleolului Eucromatina Heterocromatina Filamente de 5 nm grosime/30-40 nm lungime

Membrana nuclear intern Scheletul nuclear B. Nucleoplasma Fraciune labil Cromatina C. Nucleolul Componenta filamentar

38

Componenta granular Componenta amorf Cromozomial

Precursori ribozomiali Cromatina perinucleolar Cromatina intranucleolar

Nucleul a fost descoperit de FONTANA, n 1831, care a observat o formaiune ovoid n celulele epidermice. Ulterior, BROWN (1833) a fost primul care a enunat conceptul de celul nucleat, ca unitate structural, care intr n alctuirea plantelor, concept ce a fost extins i la alcturiea corpului animalelor. n alctuirea nucleului intr: nucleolema sau membrana nuclear, nucleoplasma (matricea sau sucul nuclear), nucleolii i cromatina sau cromozomii. Nucleul reprezint centrul de comand, control i de coordonare a celulei eucariote, funcionnd ca un computer chimic prevzut cu un program (ADN-ul) i o memorie (ARN-ul). n calitate de centru informaional al celulei, nucleul coordoneaz toate reaciile chimice legate de desfurarea proceselor vitale, contrlnd att sinteza proteinelor enzime din celul, ct i sinteza proteinelor de structur. (Fig.4.1.)

Fig.4.1. Rolul nucleului n circulaia informaiei genetice n celula eucariot. Nucleul conine genomul (totalitatea genelor) celulei, format dintr-un numr precis de gene. O gen este o secven de nucleotide (500-1500), care determin o secven de aminoacizi, mpreun cu elementele de control (un promotor, o secven lider i un terminator. La animalele domestice, gena ocup un loc specific n molecula de ADN care ntr n compoziia cromozomului. ntr-o celul uman, lungimea total a moleculelor de ADN este de cca. 1,6 m coninnd un potenial informaional imens, estimat la aproximativ 9 X 1011 bii, ce corespunde informaiilor cuprinse ntr-o bibliotec cu 180.000 volume (considerndu-se c un cuvnt este evaluat n medie la 36 bii, iar n fiecare volum se gsesc 150.000 cuvinte). Totodat nucleul conine echipamentul enzimatic necesar pentru: repararea genomului, replicarea sa, transcrierea mesajului n ARN i prelucrarea ARN-ului ( n ARN mesager, ARN de transfer i ARN ribozomal.

39

Fig.4.2. Forme de nuclei 1-Veziculos (n neuron); 2-Multilobat (neutrofil); 3,11-Bilobat (eozinofil, pseudoeozinofil de pasre); 4-Aplatizat (adipocit); 5-Reniform (monocit); 6-Ovoidal (eritrocit); 7-Discoidal (celula caliciform); 8-Alungit (leiocit); 9,10-Sferoidal sau ovoidal (limfocit)

4.1. Caracterele morfologice ale nucleului Rspndire. Majorittea celulelor organismului prezint nucleu. Exist i excepii (hematiile,celulele cristaliniene, trombocitele), care reprezint stadii finale, n evoluia unui tip celular, cu existen limitat n timp, stadii specializate la funcii pasive. Celulele fr nucleu nu pot crete i nu se mai divid.

Forma nucleilor este foarte variat,indicnd, de regul, pe cea a celulei. Nucleul apare: sferic-ovoidal (nucleus sphericus- ovoideus), n celulele izodiametrice (sferice,cubice,poliedrice);alungit (bacilliformis,fusiformis), n celulele fusiforme (musculare) sau columnare (prismatice); turtit,aplatizat (planus) n celulele pavimentoase (endoteliale),n adipocite, n celulele caliciforme; lobat (segmentalis s. moniliformis)), n celulele care trebuie s se modeleze rapid.(Fig.4.2.)

40

Forma nucleului este influenat de activitatea celulei. Devine neregulat n celulele foarte active. n acest mod se produce o cretere a suprafeei prin care se realizeaz schimburile dintre nucleu i citoplasm. Totodat nucleul prezint o oarecare plasticitate (deformabilitate) care i permite ca, n anumite condiii spaiale intracelulare, s i modifice forma. Asfel, n monocite nucleul apare reniform (nucleus reniformis), dei celula este sferic, deformarea datorndu-se prezenei centriolului. Poziia. n cele mai multe cazuri, nucleul ocup o poziie central, strategic pentru rolul de coordonator al activitii celulare. Totodat exist numeroase excepii, n care nucleul ocup o poziie: excentric, n adipocite (celule care acumuleaz grsimi n citoplasm); medio-bazal, n celulele secretoare din pancreas sau parotid; bazal, n secretoare de mucus, n celulele caliciforme. n general n celulele secretoare.(Fig.4.3.) Numr. Ca regul general, o celul prezint un nucleu. Excepiile sunt ns numeroase.

Fig.4.3. Poziia nucleului n diferite celule. 1-Central; 2-Periferic; 3-Mediobazal; 4,5-Bazal.

Astfel, hepatocitele sunt binucleate n proporie de 7-8%, osteoclastele au 30-40 nuclei, iar fibra muscular striat (rabdocitul) prezint ntre 20-40 nuclei pentru fiecare centimetru. n condiii patologice, mai muli nuclei apar n:- celulele gigante Langhans (prezente n tuberculoz, au cva zeci de nuclei, dispui la periferia celulei, n coroan sau potcoav); -celulele gigante de corp strin, care apar n cazul ptrunderii n organism a unor particule strine, nedigerabile de ctre celule; - celulele tumorale. Multinuclearitatea se produce n dou moduri: 1- prin multiplicare nuclear repetat (cariokinez), fr diviziunea citoplasmei (citodierez),rezultnd un plasmodiu; 2-prin fuzionarea mai multor celule mononucleate, rezultnd un sinciiu (cum este cazul osteoclastelor, rabdocitelor,celulelor Langhans,etc.)

Fig.4.4. Variaia dimensiunilor nucleului n funcie de gradul de poliploidie Dimensiunile nucleului. Variaz n limite mai strnse (ntre 5-15) dect dimensiunile celulelor, diversitatea dimensiunilor celulelor din organismul animal realizndu-se pe baza variaiei de volum a citoplasmelor. Msurarea dimensiunilor nucleului se numete cariometrie i reprezint un domeniu de mare interes pentru biologia i patologia celular. Nucleii prezint variaii dimensionale funcionale i patologice. Variaiile funcionale ale dimensiunilor nucleului sunt n legtur cu: Vrsta, nucleul fiind mai mare n celula tnr, dect n celula mbtrnit, n cazul aceluiai tip celular; Bioritmul, existnd diferene de volum de pn la 20%, ntre zi i noapte, la hepatocite,neuroni, nefrocite,etc.; Gradul de poliploidie (numrul de seturi cromozomale prezente n nucleu). Cu ct gradul de poliploidie este mai mare cu att nucleul este mai mare. Astfel, nucleii megacariocitelor sunt mult

41

mai voluminoi dect cei a hepatocitelor. Din acest punct de vedere n hepatocite se pot ntlni : 1 nuclei mici (cu diametru de 10 m), diploizi (2n), ntlnii la cca.80% din hepatocite; 2 - nuclei medii (cu diametru de 15 m); - tetraploizi (4 n), ntlnii la 16% din hepatocite i uneori octaploizi. S-a constatat c suprafaa nuclear crete proporional cu gradul de poliploidie, fapt ce explic nmugurirea nucleilor poliploizi. n patologie, variaii ale dimensiunilor nucleului se ntlnesc n toxicoze, n boala de iradiere i n cancer. n celulele neoplazice, nucleii apar de talie mare, cu morfologie extrem de variat n acelai cmp microscopic, putnd prezenta uneori aspect monstruos.+ ntre volumul nucleului i volumul citoplasmei se stabilete un raport nucleo-citoplasmatic (N/C), a crei valoare variaz n limite foarte largi (1/3 - 1/20), de obicei situndu-se ntre 1/7 - 1/10. Atunci cnd volumul citoplasmei crete mai mult dect volumul nucleului, raportul N/C va fi refcut fie prin diviziune celular, fie printr-o cretere a volumului nuclear. n cazul n care volumul nu poate fi refcut, funcionarea normal a celulei este perturbat. n condiii patologice, raportul N/C poate fi complet modificat, ajungndu-se la inversarea raportului, n celulele tumorale. Vscozitatea nucleoplasmei este mai mic dect a citoplasmei, excepie fcnd ovocitul. Greutatea specific a nucleului este influenat de coninutul n ap i de starea fiziologic a celulei, descrescnd n urmtoarea ordine: nucleol, cromatin, nucleoplasm. Ph-ul nuclear este uor alcalin (7,4-7,5). Totodat, n nucleu se realizeaz diferene de potenial ntre membrana nuclear (cu sarcini electrice negative) i nucleoli sau cromozomi, ce au sarcini electrice pozitive. Componentele nucleului sunt: membrana nuclear, nucleoplasma,cromatina i nucleolul. 4.2. Membrana nuclear Membrana nuclear (nucleolema sau carioteca) (nucleolemma s. karyoteca) este o structur lipoproteic, cu o grosime de civa zeci de nanometri, caracteristic eucariotelor care mparte celula n dou compartimente: - nucleul ce conine genomul, structurile implicate n transcripie i n prelucrarea produsului transcriptic; - citoplasma ce cuprinde organitele celulare. n celulele vii, apare ca o pelicul fin, cu indice de refracie i densitate mai mare dect restul nucleului. n celulele fixate, se coloreaz bazofil, iar vizibilitatea cromatic se datorete condensrii i coagulrii unor componente ale carioplasmei care se depoziteaz pe faa intern a membranei. La microscopul electronic, nucleolema apare format din dou foie (una intern i alta extern), fiecare trilaminat, lipoproteic, groase de 60-100 , separate printr-un spaiu perinuclear sau cisterna perinuclear, de 150 300 , plin cu o substan amorf.

42

Fig.4.5.Membrana (MN) nuclear - reprezentare tridimesional 1-MN i relaiile sale cu reticulul endoplasmic (RE); 2-MN, la microscopul electronic, cu grosisment redus; 3-Trilaminaritatea celor dou MN; 4-Organizarea molecular a MN; 5-Ultrastructura MN . a-Nucleul; b-Membrana nuclear; c-Citoplasma; d-Por; e-Reticul endoplasmic; f-ribozomi. Membrana nuclear extern (membrana nuclearis externa) prezint o fa citoplasmatic, ornat cu ribozomi, are un contur mai flexibil i zone active de formare a veziculelor. Membrana nuclear intern (mebrana nuclearis interna) este lipsit de ribozomi i ader fie la nucleoplasm, care poate diferenia o lamin dens, fie la cromatin. Cisterna perinuclear (cisterna nucleolemmae) apare ca un spaiu tridimensional, aflat n continuitate cu spaiul reticulului endoplasmatic. n acest spaiu s-au pus n eviden proteine, enzime.Ca2+.(Fig.4.5) Nucleolema sau nveliul nuclear este ntrerupt (fenestrat) de orificii circulare, denumite pori circulari, la nivelul crora cele dou membrane se afl n raporturi de continuitate. Numrul de pori de pe o unitate de suprafa este legat de intensitatea schimburilor nucleo-citoplasmatice. Asfel, la celulele n cretere pot exista 10 pori/m2. Se ntlnesc variaii n numrul, frecvena i distribuia porilor de la un tip de nucleu la altul. Porii sunt n fapt "porile" folosite de macromolecule i de ansamblurile macromoleculare (proteine, ARN m, subuniti ribozomale,etc.) pentru a intra sau iei din nucleu. (Fig.4.6)

Fig.4.6. Structura porului nuclear. Porul (porus nuclearis) mpreun cu structurile adiacente formeaz complexul porului. Complexul por (complexus pori) cuprinde: a - dou inele sau anuli , asezate pe ambele fee ale porului (nuclear i citoplasmatic), fiecare inel (anulus pori) fiind compus din granule proteice sferoide cu diametrul de 10-25 nm, care sunt dispuse n form de octagon; b - opt conuri, orientate dinspre peretele porului ctre lumenul su, considerate a fi agregate de fibrile; c - o particul central, n form de granul sau bastona, inconstant prezent; d - pachete de filamente nucleoplasmatice de 4-8 nm, care se inser cu oextremitate de inelul intern, iar cu cealalt extremitate se prinde pe formaiuni intra nucleare (eventual pe nucleol). Dup unii autori, diferitele structuri care apar n centrul porului (diafragma porului, granula central, filamentele) par a fi mai curnd materiale surprinse n timpul trecerii prin por dect structuri pemanente.

43

Fig.4.7.Schema complexului por. 1-MN extern; 2-MN-intern;3-Spaiu cisternal; 4-Filament intern; 5-Formaiune conic; 6-Granulanulus extern; 7-Granul-anulus intern; 8-Granul central. Funciile membranei nucleare sunt: 1 - delimiteaz coninutul nucleului de cel al citoplasmei;2 - regleaz schimburile dintre nucleu i citoplasm; 3 - formeaz membranele reticulului endoplasmic, reprezentnd rezerva de citomembrane n celule care se divid rapid; 4 - menine i stabilizeaz cromatina, care se ataeaz de faa sa intern; 5 - rol mecanic n susinerea organitelor, acestea fiind legate de faa sa extern prin fibrile de 18 nm.(Fig.4.8.) Fig.4.8. Diagrama cilor de translocare a matrialului din nucleu (A) n citoplasm (B). 1-Transport prin microvezicule; 2-Transport transmembranar3-Transport combinat; 4-Translocare prin pori; 5-Extruzare prin delimitarea unor saci din nveliul nuclear.

4.3.Nucleoplasma Nucleoplasma, matricea nuclear sau sucul nuclear (nucleoplasma) reprezint acea parte a nucleului, aparent lipsit de structuri (la microscopul optic i la cel electronic,de grosisment redus). La nivelul molecular apare structurat, nct denumirea de suc nuclear apare impropie, fiind mai adecvat denumirea de matrice nuclear. Nucleoplasma se prezint ca un mediu de natur proteic care n care "plutesc" nucleolii i cromatina. Are rol esenial n organizarea nucleului, determinndu-i forma, n sinteza de ADN i ARN, n medierea semnalelor hormonale (ale steroizilor).Conine diverse enzime, ce intervin n glicoliza anaerob i n realizarea unor legturi macroergice.

44

Matricea nuclear cuprinde dou componente: matricea nuclear propiu-zis i fraciunea labil a matricei. Matricea nuclear propiu-zis sau scheletul nuclear reprezint echivalentul citoscheletului la nivel nuclear,fiind format dintr-o reea de proteine stabile cu greutatea molecular mare.Se poate izola dup extragerea cromatinei i nucleolului. Este format din trei componente: matricea fibrilar, componentele fibrilare (nemembranoase) ale nveliului nuclear i componenta fibrilar a nucleolului. Matricea fibrilar apare ca o reea de fibrile intranucleare, ntins n toat masa nucleului. Este format din granule sau particule matriceale, electronodense, cu diametru de 15-20 nm i din fibrile matriceale (sau matrixin), cu diametru de 5 nm,dispuse n pachete. Matricea fibrilar conine proteine (20% din totalul proteinelor nucleare), ADN (1,2%), ARN (0,5%) i fosfolipide, n cantitate redus. Lipsesc proteinenele histonice, n timp ce proteinele nonhistonice ocup 18,2%, predominnd cele acide. Componentele fibrilare (nemembranoase) ale nveliului nuclear sunt o form specializat a citoscheletului nuclear,fiind reprezentate de lamina dens intern (sau lamina fibrosa) i de complexul por. Lamina dens intern este situat pe faa nuclear a membranei interne a nveliului nuclear. Are aspectul unei reele de fibrile legate pe de o parte la reeaua matricei nucleare i pe de alt parte la componentele fibrilare ale complexului por. Complexul por este format din structuri inelare (matricea anular sau anulii), din granule centrale i din filamente radiare. Lamina dens intern mpreun cu complexul por formeaz o component a scheletului nuclear, denumit complex lamina-por. Acest complex conine 2-3% din totalul proteinelor din nucleu (95% din ele fiind nehistonice, predominent acide). Pe faa intern a complexului lamina-por a fost identificat o nucleozid trifosfataz, implicat n transportul ARN ctre citoplasm. Componenta fibrilar nucleolar (matricea nucleolilor) este reprezentat de o reea de filamente ce ocup aria ce corespunde prii fibroase i prii granuloase din nucleol.Este format din polipeptide asemntoare celor din scheletul nuclear i are rol de suport pentru depozitarea granulelor ribozomale. Funciile matricei nucleare sunt: 1- menine forma nucleului i stabilitatea acestuia n interfaz; 2-asigur flexibilitatea nucleului, fapt ce permite realizarea unor modificri structurale legate de organizarea cromatinei, replicarea ADN, transcripia i transportul intranuclear de ARN; 3contractilitatea, independent de ATP, dar influenat de ionii bivaleni (Ca2+,Mg2+) ce permite realizarea unor variaii ale volumlui nuclear; 4- suport pentru depozitarea granulelor ribozomale. 4.4. Cromatina Cromatina nu este o substan chimic, ci o noiune biologic, fiind reprezentat de materialul intranuclear care se evideniaz cu colorani bazici. Este forma de existen a cromozomilor n interfaz , n celula aflat ntre dou diviziuni. Cromatina i cromozomii sunt dou forme de organizare ale unuia i aceluiai material genetic (ADN-ul). Compoziia chimic a cromatinei cuprinde ADN, proteine histonice, mici cantiti de ARN i proteine nehistonice. Cantitatea de ADN din nucleu este constant pentru o anumit specie i reprezint genomul speciei respective. Este dat de numrul i dimensiunile moleculelor de AND. Histonele sunt proteine bazice, prezente numai n genomul eucariotelor. n funcie de coninutul n arginin i lizin exist cinci tipuri de histone, denumite H1, H2A, H2B, H3, H4. La rndul su fiecare tip prezint mai multe subtipuri. Histonele prezint mai multe particulariti: 1- au mas molecular mic; 2- sunt puternic bazice, datorit coninutului mare (10-20%) de aminoacizi bazici (lizine i arginine); 3- sunt purttoare de sarcini electrice pozitive, care le permit s se lege de sarcinile negative ale gruprilor fosfat din ADN; 4-sunt proteine cu evoluie filogenetic molecular definitiv. Histonele ndeplinesc un rol major n mpachetarea ADN-ului n nucleu, n realizarea organizrii supramoleculare a ADN-ului sub form de nucleozomi. n cursul ciclului celular, histonele sufer o serie de modificri chimice ( acetilri,fosforilri, metilri). n spermatozoid, histonele sunt nlocuite de protamine. Protaminele au o greutate molecular foarte mic (4200 daltoni), o lungime medie de numai 33 aminoacizi i sunt foarte bazice, coninnd mult arginin. nlocuirea histonelor are loc n timpul trecerii de la spermatid la spermatozoid, permind realizarea unui nalt grad de condensare i compactare a cromatinei, pentru mpachetarea ADN-ului ntr-un volum foarte mic, cum este cel al capului spermatozoidului. Fig.4.9. Aspecte ale cromatinei nucleare I. La microscopul optic: 1-Cruste; 2-Granule; 3-Nevuri; 4-Nucleu hipercromatic;

45

5-Nucleu hipocromatic. II. La microscopul electronic: 1- Cromatin periferic; 2-Cromatin insular; 3Cromatina asociat nucleolui; 4-Nucleol; 5-Membran nuclear; 6-Spaiu perinuclear; 7-Pori.

Aspectele histologice ale cromatinei. Datorit coninutului bogat n ADN,complexat cu histone, cromatina se coloreaz ntens cu colorani bazici (hematoxilin,albastru de tripan), putnd prezenta aspecte variate: granule, grmezi neregulate, reele de filamente, corpusculi cromocentrici (sau cariozomi). Aspectul morfologic al cromatinei este asemntor n nucleii aparinnd aceluiai tip celular, dar variaz n funcie de tipul celular i de stadiul funcional,fiind un criteriu important pentru identificarea celulelor la microscopul optic. 4.4.1. Eucromatina Eucromatina (euchromatinum) reprezint cromatina funcional, activ, purttoare de gene structurale, pe care se face transcripia mesajului genetic. Poate fi de dou feluri: 1- eucromatin activ, pecare transcripia se efectueaz continuu, asigurndu-se defurarea normal a vieii celulei; 2- eucromatin permisiv , potenial activ, devenindactiv n momentul n care acioneaz semnale specific modulatoare (de exemplu: hormonii). Reglarea conformaiei genetice se realizeaz pe eucromatin, prin intervenia unor ageni biochimici, n principal proteine nehistonice, ce pot aciona ca represori sau derepresori, modulnd transcriptibilitatea materialului genetic activ i nu structura acestuia. Raportul dintre eucromatin i heterocromatin se exprim funcional prin raportul dintre transcriptibil i netranscriptibil, permind, n fapt, realizarea relaiei dintre genotip i fenotip. Astfel, prin genotip se nelege totalitatea materialului genetic cuprins n cromatina interfazic, deci eucromatina mpreun cu heterocromatina. Fenotipul reprezint expresia unei pri din genotip, care a fost transcris din eucromatin n interfaz, totalitatea trsturilor (nsuirilor morfologice,fiziologice,etc.) exprimate din noianul de informaii nscrise n genotip. 4.4.2. Heterocromatina Heterocromatina (heterochromatinum) este cromatina condensat, netranscriptibil, inactiv metabolic.Exist dou tipuri de heterocromatin: constitutiv i facultativ. Heterocromatina constitutiv este genetic inactiv, lipsit de gene structurale. Pe ea nu se face transcripie niciodat, rmnd ntotdeuna condensat n interfaz. Conine ADN repetitiv sau satelit, un ADN n care anumite secvene nucleotidice sunt repetate de un numr foarte mare de ori.

46

La mamifere, ADN-ul repetitiv reprezint 15% din cantitatea total de ADN. Exist dou tipuri de ADN repetitiv:1- ADN nalt repetitiv (10%), n care secvenele se repet de sute de mii de ori; 2-ADN mediu repetitiv (5 %), n care secvenele se repet de 100 ori, de 1000 ori sau de zeci de mii de ori. Pe cromozomii omologi (care formeaz o pereche), heterocromatina constitutiv se localizeaz identic, de regul, n imediata vecintate a centromerului, putnd fi detectat prin tehnica de bandare a cromozomilor. Rolul heterocromatinei constitutive este incomplet elucidat, atribuindu-se o semnificaie de "protecie" sau de "suport", sugerndu-se ipoteza c ea determin specificitatea centromeric, respectiv poziia centromerului n cromozomi. Heterocromatina facultativ este o cromatin condensat, care conine gene structurale represate (inactive) pe care nu se face transcripia. Pe aceste gene, transcripia s-a efectuat sau nu ntr-o perioad anterioar, sau se va putea efectua, dac se transform n eucromatin, sub influena unui agent derepresor. Astfel, transformarea unei pri din heterocromatina autozomal n eucromatin determin sinteza de imunoglobuline i transformarea limfoblastic a limfocitelor. n funcie de cromozomi n care se gsete, heterocromatina poate fi: 1-autozomal (autosoma), prezent n perechile de cromozomi autozomi, sub forma poriunilor condensate, heterocromatice, ce conin lanuri de gene, inactive transcripional; 2-gonozomal (gonosoma), prezent numai n cromozomii ce determin sexul , reprezentat de cromatina X, la femel i de corpusculul Y, la mascul.

Fig.4.10. Aspectele cromatinei X 1-Satelit nucleolar; 2-Drumstick; 3-Corpuscul cromocentric Cromatina X sau corpusculul Barr a fost descris de M.L.BARR i de E.G.BERTRAM n 1949, n neuronii din nucleul nervului hipoglos la pisic. Este folosit ca marker genetic pentru recunoaterea sexului genetic. In mod normal este prezent numai n nucleii celulelor somatice ale femelelor sub forma unui corpuscul cromatidian, denumit corpuscul Barr. Acesta reprezint condensarea interfazic a unuia din cei doi gonozomi X. Prin condensare, eucromatina se transform n heterocromatin facultativ inactiv. n situaia n care ambii gonozomi X ar fi activi (transcripionabili), n celulele femelei ar trebui s existe o cantitate dubl de enzime, controlate de genele situate pe cromozomul X. Cromatina X este prezent i detectabil la toate femelele mamiferelor, cu excepia femelei de opussum (mamifer marsupial), unde este prezent la ambele sexe. Lipsete la toi masculii normali. Corpusculul Barr are un diametru de cca. 1m i poate prezenta forme diferite: plan-convex, convex-concav, biconvex, triunghiular. Poziia sa variaz dup tipul celular, aprnd situtat adiacent membranei nucleare interne ( n celulele epidermale i ale epiteliului mucoasei bucale) sau ataat nucleolului (n unii neuroni). n neutrofilele femelelor este prezent o formaiune echivalent corpusculului Barr, denumit, dup aspectul su "b de tob" (drumstick), format dintr-un cap cu diametrul de 1,5m, ataat printr-un filament cromatic extrem de subire la unul din lobii nucleului. Frecvena drumstick-ului est de 7/500 neutrofile, sau chiar mai mult. Cromatina Y sau corpusculul F se poate observa n nucleii celulelor provenite de la masculii normali, examinate n lumin ultraviolet, dup colorare cu fluorocrom. Are aspectul unui corpuscul intens fluorescent. A fost descpoperit de PEARSON, n 1970 i reprezint expresia citologic a cromozomului Y. La indivizii ce prezint doi cromozomi Y se observ doi corpusculi F. n acest mod se pot diagnostica unele anomalii cromozomiale (trisomia XXY) la masculi, care predispun la un comportament dur, nrit. 4.4.3. Cromozomii

47

Cromozomii (Chromosoma) sunt structuri celulare cu numr, forme i mrimi caracteristice pentru fiecare specie. Ei devin vizibili la microscopul optic n celulele care se pregtesc pentru diviziune sub forma unor filamente lungi, cu mare afinitate pentru colorani bazici, de unde i trag denumirea, croma nsemnnd n limba greac culoare, iar soma - corp. (Fig.4.11.) n funcie de posibilitile de a fi observai la microscopul optic, cromozomii pot fi clasificai n : - cromozomi interfazici, necondensai i neobservabili la microscop; -cromozomi mitotici, uor observabili la microscop, mai ales n cursul metafazei i de aceea denumii cromozomi metafazici. Structura cromozomilor metafazici cuprinde: cromatidele, centromerul, kinetocorii, constriciile secundare i sateliii. Cromatidele (chromatidea) sunt cele dou jumti longitudinale, genetic identice ce formeaz fiecare cromozom metafazic. Fiecare cromatid corespunde unei molecule de ADN.

Fig.4.11. Cromozomi interfazici i cromozomi mitotici Extremitile terminale ale cromatidelor se numesc telomere (telomerus) i sunt absolut necesare pentru structura i funcionarea normal a cromozomilor, deoarece previn fuziunea i menin o anumit ordine a cromozomilor interfazici n interiorul nucleului prin ataarea lor la membrana nuclear intern. Centromerul (centromerus ) sau constricia primar este regiunea cea mai ngust din lungimea cromozomului, unde cele dou cromatide se unesc. Centromerul este slab colorat sau acromatic, avnd un coninut sczut de ADN. n vecintatea centromerului se gsete heterocromatina constitutiv. Cei mai muli cromozomi sunt monocentrici ( cromosoma monocentricum), prezentnd un singur centromer. n cazul unor anomalii cromozomiale apar cromozomi dicentrici ( cromosoma dicentricum) sau policentrici (cromosoma polycentricum). Kinetocorii (kinetocorus, i) sunt n numr de doi pentru un cromozom i reprezint locul prin care fiecare cromatid se ataeaz de microtubulii fusului de diviziune. La microscopul electronic un kinetocor are forma unui oval cu dimensiunile de 5/25 nm. (fig.4.12.)

48

Fig.4.12.Ultrastructura cromozomului 1-Centromer; 2-Cromatide; 3-Cromoneme; 4-Cromomere. Constriciile secundare sunt zone ale cromozomilor ce nu rein colorantul bazic. Servesc drept criteriu morfologic de indiviudalizare a cromozomilor. n comparaie cu constriciile primare, la nivelul costriciilor secundare nuse produc deviaii angulare ale segmentelor pe care le unesc. Unele din zonele de constricie secundar sunt legate de formarea nucleolilor i se numesc zone nucleolare sau organizatori nucleolari. iar cromozomii care particip la formarea nucleolilor sunt denumii cromozomi nucleolari (chromosoma nucleolare). Satelitul (satelles chromosomalis) este un corpuscul sferic, cu diametrul egal cu al cromozomului sau mai mic, ataat de restul cromozomului printr-un filament (filum satellitis) subire de cromatin de lungime variabil. Cromozomii ce prezint satelit se numesc SAT-cromozomi (chromosoma satellitiferum). n funcie de poziia centromerului, cromozomii se clasific n: 1-telocentrici (chromosoma telocentricum), la care centromerul este situat la o extremitate a cromozomului,lipsindu-i braele scurte; 2-acrocentrici (chromosoma acrocentricum), cu brae scurte abia vizibile, centromerul fiind situat n apropierea extremitii cromozomului;3-submetacentrici (chromosoma submetacentricum), la care centromerul este situat n apropierea mijlocului lungimii cromozomului, prezentnd un bra scurt i un bra lung; 4- metacentrici (chromosoma metacentricum), cu braele aproximativ egale, centromerul fiind situat la mijlocul lungimii cromozomului.

Fig.4.13. Schema unui cromozom.Tipuri de cromozomi. 1-Centromer: 2-Constricie secundar; 3-Satelit;

49

a-Cromozom telocentric; b-Cromozom acrocentric; c-Cromozom submetacentric;d-Cromozom metacentric. Dimensiunile cromozomilor sunt cuprinse ntre 1,5-10 m, lungime i 0,2-2 m diametru, putndu-se ntlni cromozomi gigani i cromozomi pitici. Numrul cromozomilor apare constant pentru aceiai specie, existnd: 60 cromozomi la bovine, 54 la ovine, 38 la suine, 64 la cabaline, 63 la catr, 38 la felide, 78 la canide i 46 la primate. Celulele sexuale sau gameii sunt haploide (haplos= simplu), coninnd un singur set de cromozomi, notat cu "n",fa de celulele somatice care sunt diploide (diplos=dublu) i conin dou seturi (2n) de cromozomi (un set matern i altul patern). Fiecare cromozom dintr-un set are n setul opus un cromozom complementar, identic structurat morfologic i genetic, alctuind o pereche de cromozomi omologi. Asfel, taurinele prezint 58 cromozomi autozomi (29 perechi) i 2 cromozomi de sex ( heterocromozomi sau gonozomi). Taurinele femele au n celulele somatice doi cromozomi X, ,iar formula cromozomial este 60,XX. Masculii taurinelor au formula cromozomial 60,XY i prezint n celulele somatice un cromozom X i altul Y. n formula cromozomial, prima cifr indic numrul total de cromozomi, dup virgul fiind indicai cromozomii de sex (gonozomii). La taurine, fiecare din cele 29 perechi de cromozomi autosomi este format din 2 cromozomi omologi, cu aceiai morfologie i dispunere a genelor. Heterocromozomii ( gonozomii) nu sunt omologi. La taur, diferena de form ntre cromozomul X i cel Y este evident, cromozomul Y fiind un cromozom submetacentric mic. La vaci, cei doi cromozomi X submetacentrici nu sunt omologi, deoarece numai unul este activ genetic, iar cellalt este inactiv, rmne condensat n interfaz i formeaz cromatina sexual (corpusculul Barr). Diferenierea celor doi cromozomi X n unul activ i altul inert genetic se face ntr-un stadiu precoce al dezvoltrii embrionare. Compoziia chimic a cromozomilor include ADN, proteine (histonice i nonhistonice) i o cantitate redus de ARN. Histonele sunt proteine cu greutate molecular redus (10.000- 20.000 dal), cu coninut mare (10-20%) de aminoacizi bazici (lizin i arginin), purttori de sarcini electrice pozitive, ce le permite s se lege de sarcinile negative ale gruprilor fosfat din ADN. La eucariote exist cinci clase de histone, ce difer dup coninutul lor n lizin i arginin: H1, H2A, H2B, H3 i H4.. n timp ce histonele H2A, H2B, H3 i H4 sunt cele mai constante din punct de vedere al secvenei aminoacizilor la diverse specii, histonele H1 prezint o variabilitate a secvenelor. Proteinele nonhistonice sunt de foarte multe tipuri, de la proteine ce intr n structura cromozomilor sau care se leag de ADN, intervenind n exprimarea genelor i pn la proteine enzime ce intervin n sinteza de ADN i ARN sau n scindarea lor. Proteinele ce intervin n reglarea exprimrii genelor sunt rare, aprnd ntr-un exemplar la 3000 de nucleozomi. Exist, ns i proteine nehistonice mult mai abundente, precum grupul de proteine cu mobilitate mare (HMG-higt mobility group), care fiind mici i cu multe sarcini electrice migreaz rapid n cursul electroforezei. Din acest grup, proteinele HMG14 i HMG17 se gsesc n toate celulele de la mamifere, legndu-se de nucleozomii asociai cu genele active. ARN-ul se gsete n cantitate redus n cromozomi, fiind reprezentat de ARN-ul nascent, care se formeaz pe matria de ADN n procesul de transcriere. 4.4.3.1. Cariotipul Cariotipul este reprezentat de totalitatea caracterelor morfologice (numr, mrime, form, poziia centromerului, constriciile ) ale cromozomilordintr-o celul diploid. Grafic poate fi prezentat printr-o "hart" numit cario- sau idiogram, n care perechile de cromozomi omologi sunt aezai n ordinea descrescnd a lungimii. Cromozomii sexuali sunt cromozomi X submetacentrici i cromozomul Y, submetacentric mic. Cariotipul unei specii se obine prin fotografierea cromozomilor metafazici, obinui din metafazele limfocitelor din culturi, stimulate s se divid cu fitohemaglutinine i blocate n metafaz prin adaus de colchicin, un alcaloid ce mpiedic asamblarea fusului de diviziune. Din fotografiile obinute se decupeaz cromozomii i se aranjeaz n cariotip, putndu-se identifica grupele de cromozomi, fra a se putea preciza cu certitudine perechea. Identificarea fiecrei perechi se face prin folosirea tehnicilor de bandare, tehnici care permit punerea n eviden a unor benzi transversale de-a lungul cromozomilor, benzi care sunt caracteristice pentru fiecare cromozom. Se folosesc dou categorii de tehnici de bandare: 1- tehnici cu fluorescen prin care se obin benzile "Q" ( de la quinacrin) fluorescente; 2 -tehnici bazate pe tratarea cromozomilor cu diferii ageni fizici i chimici, urmate de coloraia Giemsa prin care se evideniaz trei feluri de benzi : benzile G (Giemsa), care apar intens colorate i corespund benzilor fluorescente Q; -benzile R

50

(reverse band), cu o dispunere invers benzilor G, nct benzile R intens colorate, corespund benzilor G palide;- benzile C, apar numai n regiunea centromerului sau n apropiere ei i corespund localizrii heterocromatinei constitutive. Determinarea cariotipului are o mare importan n practica medical, pentru: a-diagnosticul unor boli congenitale, precum trisomia perechiii 21, care produce boala Down (idioia mongoloid); bsfatul genetic i dirijarea mperecherilor la animale; c-aprecierea statusului genetic la populaiile cu mare risc genetic; d-diagnosticul diferenial al unor anomalii sexuale, cu determinare genetic, precum sindromul Turner (XO, n loc de XX), ce produce sterilitate, ovare vestigiale i sindromul Kleinfelter (XXX, n loc de XY), ce se manifest prin testicule atrofiate, sterilitate, ginecomastie; ediagnosticul unor boli ale sngelui, precum leucemia mieloid, unde apare un cromozom marker anormal (cromozomul Ph-Philadelphia); f - pentru diagnosticul de paternitate, prin msurarea lungimii cromozomului Y, care trebuie s fie aceiai la ft ca i la presupusul tat; g- pentru diagnosticul diferenial ntre unele tumori benigne i alte maligne, ce modific cariotipul. De asemenea stabilirea locusului pe care l ocup ogen ntr-un cromozom permite realizarea hrilor cromozomiale, un domeniu de cercetare de mare actualitate. 4.4.3.2. Organizarea molecular i supramolecular a cromozomilor la eucariote. La microcopul electronic, cromozomii metafazici apar ca nite gheme de cromatin, nfurate foarte neregulat. Fiecare cromatid conine o singur molecul de ADN ce se organizeaz sub forma unei fibre de cromatin, cu grosimea de 10 nm, foarte sinuoas, mpachetat compact, prezentnd zone de eucromatin i heterocromatin. mpachetarea ADN-ului i a histonelor n cromozom este absolut necesar pentru ca o molecul de AND co greutate molecular de 61010 daltoni i o lungime de 3 cm s ncap ntr-un cromozom lung de 5 m ( 0,0005 cm). mpachetarea se facecu ajutoul nucleozomilor, care sunt uniti fundamentale repetitive de organizare a complexului AND -histone, deci a cromatinei. (Fig.4.14).

Fig.4.14.Modaliti de plicaturare a fibrei de cromatin n cromozom 1-Plicaturare transversal; 2-Plicaturare longiutdinal; 3-Plicaturare combinat; 4-Structur cuaternar. 4.4.3.3. Nucleozomii Conceptul de nucleozom a fost elaborat de KRNBERG, n anii 1975-1977. Un nucleozom este un octamer histonic de forma unui cilindru scurt , cu un diametru de 11 nm i o nlime de 5,5 nm, pe care duplexul de AND l nconjoar de dou ori.(Fig.4.15.)

51

Fig.4.15.Alctuirea nucleozomului

Fig.4.16.Poziia histonei H1

Octamerul histonic este format din opt molecule de histone, cte dou molecule de H2A, H2B, H3 i H4. Tetramerul de histone - (H3)2 i (H4)2 - bogate n arginin formeaz miezul nucleozomului i determin nfurarea duplexului de ADN. Cei doi dimeri de histone bogate n lizin, - (H2A)2 i (H2B)2 - sunt ataai miezului nucleozomului. Nucleozomul nu conine proteine nonhistonice. Histona H1 nu intr n structura nucleozomului, fiind siutat lateral de acesta, n contact cu intrarea sau ieirea ADN-ului din nucleozom. Histona H1 se leag de ADN-ul linker prin fore ionice, prezentnd o poriune C (carboxil) terminal, legat direct de ADN i o poriune N (amino-), ce nu se ataeaz de ADN, dar ofer locusuri de legare pentru proteinele nehistonice HMG1 i HMG2. Histona H1 este implicat n spiralizarea Fibrei de cromatin.(Fig.4.16). Molecula de ADN este continu de-a lungul cromozomului, prezetnd poriuni nfurate pe nucleozomi i poriuni ce fac legtura dintre doi nucleozomi succesivi, denumite ADN-linker sau internucleozomic. De ADN-ul linker se leag o molecul de histon H1, amplasat ntre doi nucleozomi. Se realizeaz, asfel, o niruire a nucleozomilor unul dup altul, ca mrgele pe a, formndu-se filamentul subire de cromatin, cu diametrul de 11 nm, care se poate observa la microscopul electronic, numai dac cromatina este "ntins" n mod artificial. n celula vie, fibra de cromatin are un diametru de 30 nm, rsucit ntr-o structur helicoidal (un solenoid sau o bobin) cu pasul elicei de 11 nm. La fiecare tur de spir se inser ase nucleozomi. Rata de mperechere a ADN-ului pe nucleozom este de circa 10/1. aproximativ 60 nm de ADN fiind nfurai pe un cilindru nucleozomic nalt de 5,5 nm. Apoi, dispunerea nucleozomilor sub form de bobin (solenoid) cu diametru de 30 nm permite realizarea unui raport de mpachetare de cca. 50/1. Eucromatina corespunde filamentului de cromatin de 10 nm, iar heterocromatina corespunde solenoidului (bobinei) de 30 nm.(Fig.4.17)

52

Fig.4.17.Formarea filamentului subire de cromatin A-Histona H1; B-Nucleozom; C-Filamentul de cromatin; 1-Poriunea globular a histonei. mpachetarea duplexului de ADN pe nucleozom i a nucleozomilor n fibra de cromatin de 30 nm ar permite ca ntr-un cromozom ipotetic de 1 mm lungime, s ncap un ADN lung de 3 cm. La rndul ei, fibra de cromatin de 30 nm se pliaz formnd bucle de mrimi variabile, ce permite s se reduc lungimea "firului" de ADN de la 1 mm la 100 m. Pentru a "ncape" n cei 5 m lungime ai unui cromozom metafazic sunt necesare nc dou ordine de condensare a cromatinei, care se realizeaz probabil prin mpachetarea elicoidal a buclelor de cromatin, nct aglomerarea lor n anumite zone determin apariia benzilor vizibile n cromozomul metafazic. Se pare c superspiralizarea solenoidului se realizeaz cu ajutorul unor proteine nehistonice. Astfel, fosforilarea proteinelor nehistonice ar declana superspiralizarea solenoidului, n momentul trecerii de la G2 la mitoz, iar defosforilarea lor ar induce despiralizarea, n momentul trecerii de la mitoz la G1. Alturi de histone, n procesele de mpachetare a nucleozomilor n fibra de cromatin, ntervine ionul de Mg2+.(Fig.4.18.)

Fig.4.18.Structura fibrei de cromatin de 30 nm (A) i nucleozomului (B). 1- Miezul histonic; 2- ADN linker. In timpul diviziunii celulare, condensa-rea cromatinei corespunde mpachet-rii compacte n spaiu a fibrei de cromatin de 30 nm, odat cu realizarea structurii cromozomului metafazic. (Fig.4.19.) S-a calculat c, ADN-ul nfurat pe un nucleozom este prea scurt pentru a corespunde unei gene structurale, nct nu exist o concordan ntre o gen, ca unitate de informaie genetic i un nucleozom, ca unitate de mpachetare a ADN-ului.

53

Gena este format din aproximativ 1000 perechi de nucleotide (perechi de baze), n timp ce ADN-ul nfurat pe un nucleozom are 200 perechi de baze. Unele gene de la eucariote apar discontinui, prezentnd secvenele din ADN care codific aminoacizi (exoni), separate ntre ele prin secvene de ADN care nu codific aminoacizi (introni).(fig. 4.19)

Fig.4.19.Eucromatina i heterocromatina 1-ADN linker 1+2Eucromatin; 3-Solenoid de 30 nm - heterocromatin

Fig.4.20.Etapele realizrii structurilor cromozomilor eucariotici A-Duplex de ADN; B-Filament de cromatin; C-Fibra de cromatin; D-Bucle de cromatin; E-Band condensat; F-Cromozom n metafaz.

Exist mai multe ipoteze asupra mecanismului prin care genele structurale din ADN-ul nfurat pe nucleozom sunt activate pentru transcripie. Cea mai larg acceptat ipotez (emis n 1982) susine c activarea genelor se face ca urmare a interveniei proteinelor nehistonice HMG14 i HMG17, care fie c nlocuiesc proteinele HMG1 i HMG2 de pe locurile lor de legare pe histona H1,fie c nlocuiesc nsi histona H1 de pe ADN-ul linker internucleozomic.(Fig.4.20.) In acest fel, regiunile din filamentul nucleozomic n care intervin proteinele HMG14 i HMG17 i vor modifica conformaia biochimic, devenind regiuni active transcripional. 4.5. Nucleolul

54

Nucleolul (nucleolus) este o component intranuclear, cu aspect corpuscular (corpusculum nucleare), prezent n interfaz, a crei funcie principal const n biogeneza ribozomilor (cu excepia ribozomilor mitocondriali. Ocup o poziie cheie n circuitul intracelular al informaiei, fiind sediul unui considerabil trafic de molecule. n el se desfoar principalele procese care au loc n nucleu (replicare, transcripie, transport), jucnd rolul unui intermediar ntre cromozomi i citoplasm. Este prezent (vizibil sau nu ) n toate celulele eucariote. Nu exist nucleu fr nucleol, iar celulele care i perd nucleolii nu mai sunt viabile. n timpul diviziunii celulare se dezintegreaz i reapare dup terminarea acesteia. n structurarea nucleolului, un rol deosebit revineorganizatorilor nucleolari, prezeni n unii cromozomi, adiacent constriciei secundare. Dei a fost observat nc din 1836 de ctre VALENTIN, ca o granul dens n interiorul nucleului, rolul su a fost dezlegat mult mai trziu, abia n 1960, precizndu-se rolul esenial pe care l are n biogeneza ribozomilor. Examinat la microscopul prezint un aspect omogen, puternic bazofil, bine delimitat. Prin impregnri argentice, au fost evideniate dou componente n structura nucleolului: 1-nucleolonema (nucleolonema), o formaiune filamentoas, rsucit ca un ghem; i 2- o component astructurat sau amorf (pars amorpha). Nu este delimitat de o membran. n celulele vii, examinate n contrast de faz, nucleolul apare ca un corpuscul puternic refringent, datorit coninutului redus de ap, heterogen i cu contur neregulat. Numrul nucleolilor. n nucleii celulelor somatice exist, n mod obinuit doi nucleoli, cte unul pentru ,fiecare set cromozomial. Numrul nucleolilor crete n raport direct cu gradul de poliploidie. Astfel, n hepatocite exist 2 nucleoli, n celulele diploide, 4 n cele tetraploide i 8 n cele octaploide. Dimesiunile nucleolilor sunt ntre 1-2 m, ocupnd circa 30% din volumul nucleului. Ele variaz n funcie de implicarea celulelor n sinteza de proteine. Celulele care sintetizeaz cantiti mari de proteine (neuronii, celulele embrionare, limfocitele stimulate antigenic) au nevoie de muli ribozomi,ceea ce face ca nucleolii s aib dimensiuni mari. n celule n care sinteza de proteine este redus (n spermatozoizi), nucleolii au dimensiuni mai mici. Nucleolul apare hipertrofiat n anabolism, n perioada de difereniere embrionar i se reduce n catabolism i n inaniie. Raportul nucleolo / nuclear. Numrul i volumul nucleolilor depind de starea funcional a celulei. Cu ct celula este mai activ n sinteza proteinelor, cu att raportul nucleolo/nuclear este mai mare. Acest raport este folosit drept criteriu pentru aprecierea vrstei celulelor. Astfel celula tnr prezint un nucleu mare eucromatic, cu un nucleol mare, cu o citoplasm redus i bazofil, iar o celul adult prezint un nucleu mai mic, hipercrom, cu nucleoli mici i o citoplasm abundent.

Fig.4.21. Forma i poziia nucleolului A-Forma: 1-Sferoidal-ovoidal; 2Discoidal; 3-Triunghiular; 4-Neregulat. B-Poziia: 1-Alipit membranei nucleolare; 2-Central; 3-Excentric. Forma nucleolilor. Nucleolii prezint, de cele mai multe ori, o form sferic-ovoidal, care pe msura mbtrnirii celulei devine neregulat. Densitatea nucleolilor este mare (1,35), nucleolul fiind cea mai dens structur din celul, datorit concentraiei ridicate n substan uscat i a cantitii foarte mici de ap. Dispunerea nucleolilor n nucleu este n majoritatea cazurilor central sau paracentral, putnd varia n raport cu mometul funcional. S-au observat i descris micri ale nucleolului n interiorul nucleului i stabilirea unor contacte cu nveliul nuclear, localizare eficient pentru descrcarea de material biologic n citoplasm. 4.5.1. Ultrastructura nucleolului Ultrastructura nucleolului evideniaz patru componente n alctuirea nucleolului: componenta filamentar (pars filamentosa), componenta granular (pars granulosa), componenta cromozomial (pars cromosoma) i componenta astructurat (pars amorpha).

55

Componenta filamentar cuprinde filamente de 5nm grosime i 30-40nm lungime, dispuse n pachete ntretiate, formnd o reea. Conine ADN-ul pe care se sintetizeaz ARN-ul ribozomal i produsul primar al acestei sinteze (ARN de 45 S). (Fig.4.22.) Componenta granular este domi-nant, fiindalctuit din granule cu diametru de 15-20 nm, asemntoare, dar nu identice cu ribozomii citoplasma-tici. Aceste granule reprezint precursorii ribozomilor. Componenta cromozomial, dispus la periferia nucleolului (cromatina perinucleolar) sau avansnd spre interiorul nucleolului sub form de benzi (cromatin intranucleolar) este alctuit din filamente de 10 nm.

Fig.4.22.Ultrastructura nucleolului. 1-Componenta filamentar; 2-Componenta granular; 3-Componenta cromozomial; 4-Componenta astructurat.

Componenta astructurat apare omogen i cu densitate medie la fluxul de electroni. Umple spaiul dintre granule i fibre, fiind considerat, de unii autori, cariolimf, iar de ali autori un gen de matrice pentru celelalte componente nucleolare. Cele patru componente nucleolare se pot distinge n acelai nucleol numai n cazuri rare. Raporturile cantitative i topografice dintre ele variaz n funcie de tipul celulei i de momentul funcional al acesteia. Asfel, n hepatocitul uman, componentei filamentoase i revine 15 %, celei granulare 70%, iar componentei cromozomiale 5% din volumul nucleolului. n celulele active, componenetele nucleolare pot segrega, dnd natere unui corpuscul nucleolar (corpusculum nucleare). Nucleolul nu conine membrane i nu este delimitat de membrane.Componenta filamentoas i ce granular se pot asocia formnd benzi ce apar, la microscopul optic, ca nucleolem. iar poriunea periferic a componentei cromozomiale corespunde cromatinei asociate nucleolului. n funcie de criteriile ultrastructurale, exist mai multe tipuri de nucleoli: nucleoli reticulari, cei mai comuni, cu cele patru componente distincte; nucleoli compaci, n care nu se disting componentele, ntlnii la cteva tipuri celulare, ca de exemplu la limfocite; nucleoli inelari, n care copmponenetele filamentoas i granular formeaz un inel periferic, care nconjoar o lacun central. Compoziia chimic a nucleolului variaz n funcie de tipul celular i de momentul funcional, principalele componente chimice fiind: ADN-ul (3 %), ARN-ul (7%) i proteinele (90% din greutatea uscat). La aceasta se mai adaug cantiti mici foarte mici de lipide i minerale (magneziu, calciu, zinc, cobalt, etc.). ADN-ul din nucleol este reprezentat de organizatorii nucleolari ce ptrund ca nite bucle de ADN n nucleol. ARN-ul din nucleol este n principal ARN ribozomal aflat n diverse faza de maturare. Se presupune c nucleolul este o staie intermediar obligatorie n tranzitul spre citoplasm al ARN-ului mesager i al celui de transfer.n nucleol exist diferite tipuri de ARN, ce difer dup coeficentul lor de

56

sedimentare (exprimat n uniti Svedberg), precum ARN 45 S, ARN 41 S, ARN 20 S, ARN 28 S, ARN 32 S. Aceste tipuri corespund diferitelor etape de maturare a ARN-lui. Proteinele nucleolare provin din citoplasm i sunt repezentate n cea mai mare parte de enzime implicate n sinteza i maturarea ARN r (ribozomal), precum ARN-polimeraza-ADN dependent (sau ARN-polimeraza I), convertaza, metilaza,etc. Bazofilia nucleolului reprezint principala sa caracteristic, vizibil la microscopul optic i se datorete coninutului relativ mare de ARN i AND. 4.5.2.Biogeneza nucleolilor Nucleolul este vizibil numai n interfaz,disprnd n profaz i reaprnd n interfaz. Un rol esenial n biogeneza nucleolului i revine organizatorului nucleolar,care este o zon cromozomial distinct, slab colarabil (heteropicnoz negativ), situat n vecintatea constriciei secundare, avnd un grad mai redus de nfurare a fibrei de cromatin. Numrul cromozomilor care prezint organizatori nucleolari este limitat i variabil n funcie de specie. La hominide exist cinci perechi de cromozomi autuzomi, purttori de organizatori nucleolari (perechile 13, 14, 15,21 i 22 ). (Fig.4.23.) La microscopul optic, organizatorii nucleolari corespund cromatinei asociat nucleolului, ce poate fi evideniat prin reacia Feulgen, aprnd colorat rou-violaceu. La microscopul electronic, organizatorii nucleolari corespund componentei cromozomiale, iar funcional cu ADN r (genele care codific ARN r) ce cuprinde cistronii responsabili de transcripia ARN r.

Fig.4.23. Organizatorii nucleolari. 1-nveliul nuclear; 2-Nucleol; 3Cromozomi cu oranizatori nucleolari; 4Bucle de cromatin cu gene pentru ARN r.

Ipotezele clasice privind biogeneza nucleolului susin: a- continuitatea sau persistena nucleolului n cursul diviziunii celulare sub form de granule sau filamente fine (denumite corpusculi nucleolari), ataate de cromozomi, mpreun cu care se repartizeaz n celulele fiice, dup care sunt asamblai de organizatorii nucleolari; b-formarea de novo, deoarece materialul nucleolar se dezintegreaz complet n cursul mitozei, fr a fi incorporat n noii nucleoli. Concepia actual a realizat un compromis raional din punct de vedere molecular, ntre ipotezele clasice (a continuitii i a formrii de novo), n sensul c componeneta cromozomal respect continuitatea, iar celelalte componente (filamentoas, granular i amorf) sunt neoformate rapid n faza G1 a ciclului celular, cnd cistronii sunt reactivai pentru transcripie. 4.5.3. Funciile nucleolului Nucleolul ndeplinete funcii legate de: - sinteza ARN r i biogeneza ribozomilor; -reglarea sintezei de ARN r; - transferul ARNm i ARNs n citoplasm; pregtirea mitozei. n sinteza de ARNr, ADN-ul nucleolar joac rolul de matri, reprezentnd organizatorul nucleolar. ADN nucleolar conine cistroni, denumii ADNr, responsabili pentru transcripia ARNr, separai ntre ei prin segmente de spaiere i terminare, formate din ADN care nu codific. ADNr este transcris prin intervenia ARN-polimerazei I, rezultnd un ARN de 45 S care reprezint precursorul ARN-ribozomal. n nucleolii hepatocitelor se sintetizeaz 1000 de molecule de ARN-45S pe minut. O parte din molecula de ARN de 45 S este ndeprtat de o endonucleaz i apare un ARN de 41 S, care prin intervenia unei convertaze este scindat n ARN de 20 S i ARN de 32 S. (Fig.4.24.)

57

Fig.4.24.Rolul nucleolului n sinteza de ARNr i n biogeneza ribozomilor

ARN-ul de 20 S sufer intervenia unei metilaze, care ndeprteaz un fragment molecular, transformndu-se n forma matur de 18 S. ARN-ul de 18 S prsete nucleolul i se combin cu proteine venite din citoplasm, dup care este trecut n citoplasm prin porii membranei nucleare sub form de particule ribonucleoproteice, care reprezint subunitatea ribozomal mic de 40 S, ce apare n citoplasm la 30 minute de la nceperea sintezei. ARN-ul de 32 S este i el metilat i se transform n forma matur de ARN de 28 S, dup ce a pierdut un fragment din molecul. ARN-ul de 28 S mpreun cu ARN-ul de 5 S ( de origine nuclear, dar extranucleolar) i cu proteine formeaz o particul ribonucleoproteic, care reprezint subunitatea ribozomal mare (de 60 S). Subunitatea ribozomal mare trece prin porii nveliului nuclear, aprnd n citoplasm la o or de la debutul sintezei. Cele dou subuniti ribozomale se ataeaz de ARNm, n momentul nceperii sintezei de proteine, formnd ribozomii. Fibrilele din componenta filamentoas sunt filamente de ARN de 45 S, iar granulele din componenta granular sunt subuniti ribozomale mari.

58

Biogeneza ribozomilor Etape Copierea cistronilor ADNr Prelucrarea ARN 45 S Prelucrarea ARN 41S Prelucrare ARN 20 S Prelucrare ARN 32 S Prelucrare ARN 18 S Prelucrare ARN 28 S

Intervin: ARN-polimeraza I Endonucleaza Convertaze Metilaze Metilaze Proteine ribozomale Proteine ribozomale

Rezultat Sinteza de ARN 45 S ARN 41 S ARN 20 S ARN 32 S ARN 18 S ARN 28 S Subunitatea ribozomala mica 40 S Subunitatea ribozomala mare 60 S

Reglarea sintezei de ARNr n nucleol se realizeaz printr-un mecanism de feed-back. Existea unui exces de ribozomii acioneaz ca inhibitor al genelor ADN r, care determin sinteza de ARNr. Invers, distrugerea ribozomilor va declana ncetarea inhibiiei i creterea sintezei de ARNr, cu formarea de noi ribozomi. Transferul de ARN mesager (ARN m), deci a mesajului genetic i de ARN de transport (ARN t) din nucleu n citoplasm nu poate avea loc dect n prezena unui nucleol funcional, fapt demonstrat experimental rpin distrugerea selectiv anucleolului cu un fascicul laser. Se crede c nucleolul joac rolul de staie intermediar n tranzitul ARN m-ului i ARN t-ului spre citoplasm. Pregtirea i desfurarea mitozei nu pote avea loc fr prezena nucleolului n interfaz. Distrugerea acestuia produce blocarea celulei n faza G2, care precede mitoza. 4.5.4. Implicarea nucleolului n citopatologie. Aspectul nucleolului poate fi folosit pentru recunoaterea celulelor canceroase. n celulele canceroase, nucleolul prezint modificri de volum,numr i form, care sunt o consecin a malignizrii i nu cauza acesteia. Hipertrofia nucleolar apare ca o caracteristic aproape constant n celulele neoplazice (canceroase),iar creterea numrului de nucleoli i neregularitile de form sunt relativ frcvente. Hipertrofia nucleolar nu este acompaniat i de o hipertrofie proporional a nucleului nct valoarea raportului nucleolo-nuclear este mai ridicat n celulele neoplazice fa de cele normale (depind valoarea de 1/3). Gradul de hipertrofie a nucleolului reflect capacitatea proliferativ a celulei fiind proporional cu gradul de malignitate a tumorii. Numrul nucleolilor este mai mare n celulele maligne dect n celulele normale, fiind uneori proporional cu gradul de malignitate a tumorii. Asfel, n unele adenocarcinoame din ovar, au putut fi observati 24 nucleoli ntr-o celul. Forma nucleolilor este neregulat n celulele maligne, ea putnd varia de la o celul la alta n cadrul aceleiai tumori.

5.CITOPLASMA

59

Citoplasma (cytoplasma) reprezint acea component a celulei situat ntre plasmalem i nucleolem. Cuprinde n volumul su : - o matrice citoplamatic ( hialoplasm sau citoplasma fundamental) ce corespunde prii din citoplasm, care nu este cuprins n compartimentele delimitate de membranele intracelulare; - organite celulare sau intracitoplasmatice (organellae cytoplasmaticae); i - incluziuni (inclusiones cytoplasmaticae) celulare. 5.1. Matricea citoplasmatic Matricea citoplasmatic (matrix cytoplasmae) se prezint ca un mediu intern al celulei n care sunt "gzduite" organitele celulare. O lung perioad de timp s-a considerat c matricea citoplasmatic este omogen, nestructurat (amorf), fapt pentru care a fost denumit hialoplasm.

Fig.5.1. Ultrastructura citoplasmei 1-Membrana celular; 2-Citoscheletul membranei; 3- Microtubuli; 4-Microtrabecule; Mitocondrie; 6-Reticul endoplasmic rugos; 7-Polizomi; 8-Fibre de stress; 9-Ribozomi.

5-

Ultrastructura citoplasmei Denumire Componente Ultrastructuri Observatii

60

I.Citoscheletul matriceal A.Matricea citoplasmatica II. Citosolul

a.Microfilamentele b.Microfilamentele intermediare c.Microtrabecule d.Microtubuli Citoplama astructurata 1.Microfilamentele de actina

Faza solid Faza fluid Contin:actina, tropomiozina, troponinele (T,C,I) Contin:molecule de miozina Contin: si tubuline, dinein Au : membrana externa, membrana interna cu criste, compartiment extern, matrice mitocondrial Au: subunitate mica de 40S, subunitate mare de 60s Reticul endoplasmatic rugos Reticul endoplsamatic neted Compus din: microvezicule, cisterne golgiene si macrovezicule Contin: hidrolaze acide Contin: uratoxidaza si catalaza Conin : proteine, lipide, glucide,vitamine, minerale Conin : granule de zimogen, granule de mucigen, hormoni,etc. lipofuscina, hemofuscina -carotenoizi, melanici, cu nucleu tetrazolic -praf, pulberi,caroten

I. Organitele miscarii celulare II. Organitele energetice

2.Microfilamentele de miozina 3.Microtubulii Mitocondriile

a.Ribozomi B.Organite citoplasmatice III. Organitele de sinteza b.Reticulul endoplasmatic c.Complexul Golgi IV. Organitele de digestie I.Incluziuni cu substante de rezerva II.Incluziuni cu produsi de elaborare III. Incluziuni cu produsi de dezasimilatie IV. Incluziuni cu pigmenti 1.Lizozomi 2.Peroxizomi (glioxizomi) Vezicule delimitate de endomembrane

C.Incluziuni citoplasmatice

Pigmenti cromolipoizi 1.Pigmenti endogeni 2.Pigmenti exogeni

La microscopul optic apare astructurat, cu grade diferite de acidofilie sau bazofilie. n celula vie prezint vscoelasticitate, aprnd mai frecvent cu aspect de gel dect de sol, n funcie de echilibrul dinamic dintre procesele de polimerizare i depolimerizare, echilibru determinat de momentul funcional al celulei, de condiiile mediului intracelular si extracelular. Cu ajutorul microscopiei electronice (de transmisie i de nalt voltaj) s-a observat, n hialoplasm, citoscheletul matriceal, format din microfilamente i microtubuli, precum i dintr-o reea de microtrabecule.n acest fel matricea citoplasmatic, prezint dou faze sau componente: -o component (faz) fluid,denumit citosol, ce conine ap, aminoacizi,enzime,electrolii, ioni i gaze; o component (faz) solid, polimerizat, sub forma unei reele bogat n proteine structurale i n enzime.(Fig.5.1.) Matricea citoplasmatic ndeplinete mai multe roluri: - menine forma celulei i o adapteaz la necesitile funcionale ale celulei prin componentele citoscheletului; - este sediul de desfurare a unor procese metabolice, precum glicoliza, gluconeogeneza, glicogenoliza, glicogenogeneza, biosinteza acizilor grai, a nucleotidelor, etc.; - conine sau depoziteaz glicogen (n ficat i muchi), lipide (n corticosuprarenal), ioni, pigmeni, ribozomi liberi, 15% din ARN-ul celular (sub form de ARN mesager i ARN de transport); adpostete organitele celulare i incluziunile citoplasmatice. Organitele citoplasmatice au diferite mrimi, unele de ordinul micrometrilor, fiind observabile la microscopul optic (complexul Golgi, mitocondriile, centrul celular,ergastoplasma) iar altele sunt mai

61

mici, de ordinul nanometrilor, putnd fii observate numai la microscopul electronic (ribozomii, lizozomii, peroxizomii, reticulul endoplasmic neted i rugos, microtubulii i microfilamentele). Unele organite sunt delimitate de membrane (complexul Golgi, mitocondriile, peroxozomii, lizozomii, reticulul endoplasmic), n timp ce altele sunt lipsite de membrane (ribozomii, centriolii, microtubulii i microfilamentele). Organitele delimitate conin n structura membranelor unele enzime caracteristice, denumite enzime marker, ce pot fi evideniate prin metode histochimice. De exemplu, mitocondria se caracterizeaz prin prezena monoaminoxidazei, citocromoxidazei i a enzimelor ciclului Krebs.Lizozomii au ca enzime marker fosfataza acid i aril sulfataza, peroxizomii au catalaza i urat oxidaza, iar reticulul endoplasmic glucozo-6-fosfataza. Membranele ce aparin reticulului endoplasmic, complexului Golgi i nveliului nuclear se afl n continuitate structural i funcional, formnd un sistem al endomembranelor. Acest sistem poate stabili conexiuni temporare cu unele organite ca mitocondriile, peroxizomii, unele vacuole i cu membrana periferic. Organitele celulare ndeplinesc diferite funcii: 1- micarea intracelular (microfilamentele, microtubulii, centriolii); 2- deplasarea celulei n mediu extracelular (cilii i flagelul); 3- producerea de energie (mitocondriile); 4-digestia intracelulular (lizozomii, peroxizomii); 5-dezintoxicare (reticulul endoplasmic neted, peroxizomii); 6- sinteza de molecule necesare celulei sau destinate exportului (ribozomii, reticulul endoplasmic rugos i neted, compexul Golgi); 7- unele funcii speciale n celulele musculare (miofilamentele), n celulele epiteliale (tonofilamentele), n celulele nervoase (neurofilamentele) i nevroglice (gliofilamentele). 5.2.Citoscheletul Citoscleletul (cytoskeleton) este o reea n spaiu (tridimensional) de filamente proteice i microtubuli care strbat ntreaga matrice citoplasmatic, ntretindu-se n toate direciile. Citoscheletul ndeplinete funcii variate: - menine forma celulei i o adapteaz la necesitile funcionale; - particip la realizarea micrilor celulei; - ia parte la formarea citoscheletului membranei;- interacioneaz cu nucleul i cu organitele celulare (mitocondriile,veziculele sinaptice), participnd la meninerea lor n poziie i la deplasarea lor n celul (mitocondriile i lizozomii efectund o micare saltatorie); - interacioneaz cu macromoleculele din citosol, evideniindu-se enzime glicolitice legate de filamentele de actin; - particip la transportul proteinelor n lungul axonului. Citoscheletul se modific n celulele maligne. Astfel, fibroblastele transformate malign i pierd fibrele de stress din citoschelet i devin sferice. n compunerea citoscheletului intr microfilamentele, microtubulii, microfilamentele intermediare i microtrabeculele. 5.2.1. Microfilamentele i microtubulii Microfilamentele (microfilamentum, a) sunt componente ale citoscheletului, prezente n citoplasma tuturor celulelor, aprnd mai abundente n celulele care prezint micri de deplasare n esuturi sau micri active intracitoplasmatice. Au lungimi variate i un diametru de 5-7 nm, putnd apare izolate sau grupate. Sunt orientate pe direcii diferite i formate din molecule proteice, n special din actin i miozin, asemntoare celor din celulele musculare. Microtubulii (microtubulus,i) sunt componente ale citoscheletului cu aspect cilindric, cu diametrul cuprins ntre 20-30 nm, formai prin polimerizarea unor molecule proteice, denumite tubuline. Pot apare grupai sau izolai. Microfilamentele i microtubulii sunt ultrastructuri cu caracter dinamic, deoarece procesele de polimerizare i depolimerizare se desfoar concomitent i continuu. Ele se asambleaz i dezasambleaz rapid n celul, n citoplasm existnd un depozit permanent de monomeri de actin i de dimeri de tubulin. Microtubulii i microfilamentele prezint polaritate, nct polimerizarea i depolimerizarea se desfoar cu viteze diferite la cele dou extremiti. La extremitatea pozitiv (notat cu +), viteza polimerizrii este mult mai mare dect cea a depolimerizrii, nct microfilamentul sau microtubulul se alungete. La extremitatea negativ (notat cu -), viteza de depolimerizare este mai mare, determinnd scurtarea. Pentru o anumit concentraie de monomeri liberi n citosol, microfilamentul sau microtubulul se afl ntr-o stare de echilibru, n care la extremitatea negativ se pierd molecule, iar la extremitatea pozitiv se ataeaz molecule. n acest fel, un grup de molecule ataate la captul pozitiv (+), se deplaseaz de-a lungul filamentului sau microtubulului, de la extremitatea pozitiv spre extremitatea negativ. (Fig.5.2.)

62

n cazul cnd se protejeaz captul negativ (-) i se mpiedic depolimerizarea, se produce creterea n lungime. Din acest motiv, microtubulii liberi au captul negativ inserat n centrul celular sau n corpusculii bazali. Fig.5.2.

Polilerizarea i depolimerizarea microtubulului. Dinamismul citosheletului este influenat foarte mult de cationii bivaleni. Astfel, modificarea concentraiei ionilor de calciu ( Ca2+) induce polimerizarea sau depolimerizarea microtubulilor i regleaz interaciunile dintre actin i miozin. Ionul de calciu i exercit efectele sale prin intermediul unor proteine ce leag calciul, ca de exemplul calmodulina, o protein format din 148 aminoacizi, cu secvene de aminoacizi asemntoare cu troponina C. Calmodulina a fost detectat n toate celulele animale i vegetale, nct este considerat a fi un receptor intracelular pentru calciu. De asemenea unele proteine ca profilina,vilina, gelsolina, filamina, alfa-actinina, fibrina, miozina influeneaz polimerizarea i depolimerizarea microfilamentelor de actin. n polimerizarea i depolimerizarea microtubulilor intervin proteinele tau ( ) i proteinele asociate microtubulilor. Un alt factor care moduleaz dinamismul citoscheletului l reprezint nucleotidele. Astfel, adenozin monofosfatul ciclic (AMPc) favorizeaz polimerizarea citoscheletului i determin aglomerarea microfilamentelor i a microtubulilor, modificnd forma i mobilitatea celulelor. 5.2.2.Microfilementele intermediare Microfilamentele intermediare au fost descrise i investigate intens dup anul 1978. Sunt denumite astfel, deoarece au diametrul de 10 nm, cuprins ntre cel al microfilamentelor de actin (6 nm) i cel al microtubulilor (25 nm). La microscopul electronic apar sub forma unor filamente rectilinii sau uor curbate, prezente n endoplasm, la periferia celulei (n desmozomi sau n prelungiri). Sunt structuri mult mai stabile dect filamentele de actin i dect microtubulii, nct odat asamblate nu se mai depoliomerizeaz. Sunt formate din molecule filiforme de proteine. Polimerizarea lor se face prin alturarea i mpletirea monomerilor, ca ntr-o frghie i nu prin niruirea monomerilor. Rezult astfel, structuri rezistente, ce pot fi ntrite la nevoie i prin legturi covalente ntre subuniti. Proteinele ce alctuiesc filamentele intermediare variaz dup tipul de celul n care apar i dup specie. n compoziia unui filament intermediar pot intra mai multe polipeptide diferite, cu greuti moleculare ce variaz n limite largi. n funcie de proteinele componenete, exist urmtoarele tipuri de filamente intermediare: filamentele de cheratin sau tonofilamentele, caracteristice pentru celula epitelial, formate din proteine (citokeratine) asemntoare keratinei din pr i ongloane; -neurofilamentele, caracteristice neuronului, prin asociere cu microtubulii strucutreaz neurofibrilele ce au un diametru de 1-2 m; filamentele de vimentin, caracteristice celulelor de origine mezodermic (fibroblaste, condroblaste, macrofage, celule endoteliale, leiocite, astrocite, celulele Sertoli).(Fig.5.3.)

63

Fig.5.3. Tonofilamentele A-Aspect la microscopul optic; B-Aspect la electronomicroscop: 1-Material fibrilar; 2-Material granular. Aplicaii medicale. Identificarea tipului de filament intermediar cu ajutorul anticorpilor monoclonali, marcai prin fluorescen sau cuplai cu o enzim capabil s coloreze, permite diagnosticarea tumorilor maligne, deoarece: carcinoamele au filamente de cheratin, sarcoamele de vimentin, iar rabdomiosarcoamele de desmin. Glioamele au filamente gliale, iar neuroblastoamele au neurofilamente. 5.2.3.Microtrabeculele. Microtrabeculele au fost descrise n celule examinate prin microscopie electronic de voltaj supranalt, la mriri de 300.000 ori. Sunt structuri fibrilare mai subiri de 4-6 nm, dect microfilamentele. Microtrabeculele formeaz o reea ce strbate ntreaga citoplasm, nterconectnd microfilamentele,microtubulii, practic toate componentele subcelulare prezente n celula animal. Pot fi considerate ca fiind expresia fenomenului de gelificare, dei uneori se contest realitatea lor biologic, fiind considerate un artefact. Microtrabeculele menin poziia n spaiul intracelular a citoscheletului i organitelor,fiind considerate suportul matricii biostructurate. De reeaua microtrabecular se leag enzimele din citosol, asigurndu-se trecerea substratului de la o enzim la alta n mod coordonat. n ochiurile reelei se gsete ap i ioni , nct microtrabeculele protejeaz celula n cazul fluctuailor coninutului n ap. Atunci cnd apa ptrunde n celul, spaiile se dilat, n timp ce n cazul deshidratrii celulei, spaiile se contract. Un alt rol al reelei de microtrabecule constp n micarea intracelular a granulelor de pigment. 5.3.Organitele micrii celulare Organitele micrii celulare sunt: -microfilamentele de actin, microfilamentele de miozin i microtubulii. 5.3.1.Microfilamentele de actin Microfilamentele de actin sunt formate din molecule de actin i au diametrul de 6 nm. La eucariote, actina ocup 10% din totalul proteinelor din celulele nemusculare. n citoplasm, moleculele de actin se pot gsi fie sub form monomeric ( actin globular sau actin G), fie sub form polimerizat, filamentoas ( actin filamentoas sau actin F). Microfilamentele de actin (denumite, pe scurt , filamente) se formeaz prin polimerizarea actinei globulare. Un filament cuprinde dou lanuri de actin nfurate unul n jurul celuilalt, formnd dublu helix rsucit spre dreapta avnd pasul spiralei de 70-80 nm.Fiecare molecul de actin din microfilament este capabil s lege cte un cap al moleculei de miozin. n celulele eucariote, cu excepia celulelor musculare, microfilementele se pot gsi izolate sau grupate n mnunchuri, dispuse la periferia citoplasmei, imediat sub plasmalem, formnd fibrele de stress n cazul celulelor n culturi sau intnd n structura inelelor contractile. Inelul contractil poate fi: tranzitoriu, cnd apare n telofaza diviziunii celulare indirecte, producnd strangularea citoplasmei i separarea celulelor fiice; - permanent, ca de exemplu n zona apical a celulelor epiteliale, unde formeaz dezmozomul n band. Mnunchiuri de filamente de actin exist i n microvili, n stereocili, n prelungirile filiforme temporare ale celulelor din culturi. n alte tipuri de celule dect cele musculare, microfilamentele de actin ndeplinesc att un rol structural sau de susinere, formnd suportul prelungirilor (al microvililor, ct i un rol dinamic n realizarea micrilor bazate pe mecanismul actin-miozin. Exist un echilibru dinamic ntre filamentele de actin i monomerii de actin din citoplasm, ntre polimerizare i depolimerizarea actinei, echilibru ce joac un rol esenial n micrile celulare. Polimerizarea actinei este nsoit de o cretere a vscozitii citoplasmei, iar depolimerizarea se asociaz cu scderea vscozitii.Ambele procese joac un rol principal n trecerea de la starea de gel la cea de sol a citoplasmei. Polimerizarea actinei este inhibat de unele substane (citocalazine) secretate de mucegaiuri, producndu-se oprirea micrii de locomoie ameboidal. n celulele musculare, moleculele de actin mpreun cu proteinele reglatoare formeaz miofilamentele subiri (miofilamentum tenue) din sarcomere. Astfel, pe toat lungimea miofilamentului

64

de actin se gsete o protein tropomiozina, pe care se nir 7 monomeri de actin. Tropomiozina are att un rol structural, ntrind flilamentul subire, ct i un rol funcional n realizarea contraciei. Din loc n loc, de-a lungul filamentului de actin se gsete o alt protein, troponina, care este un complex de trei polipetide - troponinele T,I i C.Troponina T este strns ataat de tropomiozin, troponina C leag ionii de calciu, iar troponina I inhib interaciunea actinmiozin. Tropomiozina are att un rol structural, participnd la structurarea filamentului subire, ct i un rol funcional mediind reglarea contraciei. (Fig.5.4). Filamentele subiri se gsesc numai n miofibrilele din muchii scheletici i muchiul cardiac unde sunt dispuse ordonat, paralel cu filamentele groase de miozin. i n alte tipuri de celule dect cele musculare au fost evideniate proteine reglatoare ale interaciunii actin-miozin,asemntoare tropomiozinei, dar acestea sunt mai scurte, permind ataarea a numai 6 monomeri de actin, n loc de 7 cum apare n celulele musculare. n celulele nemusculare, nu a fost bine precizat existena troponinelor T i I, dar au fost identificate proteine reglatoare, asemnotare troponinei C, carer leag ionii de calciu i au fost denumite proteine modulatorii sau calmoduline. n afara proteinelor reglatoare amintite (tropomiozina,troponinele i calmodulina), n celule se mai pot gsi i alte proteine reglatoare ce se leag de actin, ca: -filamina, prezent mai abundent n leiocite; -spectrina, ce se gsete n citoscheletul membranei celulare.

65

Fig.5.4. Organizarea molecular a filamentului subire de actin

5.3.2.Microfilamentele de miozin

66

Formate prin polimerizarea proteinelor denumite miozine, miofilamentele de miozin au un diametru de 10 nm. Miozinele se gsesc n cantitate mai mic dect actinele n toate celulele eucariote, cu excepia celulelor musculare. Fig.5.5. Moleculele de miozin i formarea filamentului gros. 1-Coad; 2-Cap; 3-Punte transversal. Molecula de miozin are aspectul unui bastona lung (160 nm/2nm) i subire (coada),prevzut la una din extremiti cu o regiune globular (capul). Capul moleculei de miozin(4-5 nm/15-20 nm) este bipartit (iar molecula este bicefal), fiind alctuit din dou subuniti sau lobi. Polimerizarea se produce prin agregarea cozilor moleculelor de miozin, n timp ce capetele rmn la exterior. n acest fel, mio- filamentul de miozin prezint o zon "nud" (neted) la mijloc, unde se gsesc cozile i dou zone mai groase la extremiti n care proemin de jur mprejurul filamentului capetele globulare ale miozinelor.(fig.5.5.) n alte celule dect cele musculare, filamentele de miozin sunt agregate mici, labile greu observabile, formate prin polimerizarea a 10-20 molecule. n celulele musculare, polimerizeaz cteva sute de molecule de miozin (200-500), formnd miofilamente groase (myofilamentum crassum) cu diametrul de 10-20 nm, ce se dispun paralel cu filamentele subiri de actin.Miofilamentele sunt dispuse ntr-o reea hexagonal, la un miofilament gros revenind 6 miofilamente subiri.

67

Fig.5.6. Reprezentarea schematic a moleculei de miozin LMM - L meromiozin; HMM - H meromiozin; S1 - Subfragmentul 1; S2 - Subfragmentul 2. Alctuirea moleculei de miozin cuprinde dou lanuri polipeptidice grele, fiecare cu greutate de cca. 200 kilodaltoni i patru lanuri uoare cu greuti de 15-20 kilodaltoni. Lanurile grele se ntind pe toat lungimea moleculei, n timp ce lanurile uoare sunt localizate la capul moleculei de miozin, cte dou pentru fiecare lob. Fiecare lan greu are dou poriuni: - o poriune alungit alfa helicoidal (coada) i un cap globular. Poriunile alungite ale lanurilor grele sunt rsucite n spiral, pe cndcapetele globulare rmn separate. De fiecare cap sau lob se leag cte o pereche de lanuri uoare. Pentru studierea alctuirii moleculei de miozin s-a efectuat proteoliza moleculei cu ajutorul tripsinei. Din molecula de miozin se formeaz dou fragmente, denumite meromiozine: - o meromiozin uoar, L meromiozina (de la light = uor n englez) i o meromiozin grea, H meromiozina (de la heavy = greu). L meromiozina (LMM) are aspectul unui bastona cu lungimea de 80 nm i grosimea de 2 nm, este lipsit de activitate ATP-azic i nu interacioneaz cu actina. H meromiozina (HMM) are o poriune linear de 60 nm, care se termin cu o poriune globular de 20/5 nm. Sub aciunea papainei, HMM poate fi scindat n dou subuniti, subfragmentul 1 i subfragmentul 2. Subfragmentul 1(S -1) are o greutate de 120 KD i corespunde poriunii globulare a H meromiozinei, prezint activitate ATP-azic i poate interaciona cu actina. Subfragmentul 2 (S - 2) are o greutate milecular de 60 KD, i lipsete activitatea ATP-azic i capacitaea de a interaciona cu actina. n ntregul ei, poriunea liniar a moleculei de miozin este format din L meromiozin i subfragmentul 2 al H meromiozinei, iar capul moleculei de miozin este reprezentat de subfragmentul 1 al H meromiozinei. 5.3.2.1.Funciile microfilamentelor de actin i miozin. Microfilamentele de actin i miozin sunt implicate att n micrile celulare de locomoie (deplasarea fibroblastelor n culturi, micarea ameboidal prin emiterea de pseudopode, micrile morfogenetice din embrion), ct i n micrile intracitoplasmatice (migrarea granulelor de secreie, a

68

granulelor pigmentare, deplasarea organitelor celulare, mobilitatea microvililor). Participarea microfilamentelor n aceste fenomene celulare este influenat de concentraia n citosol a ionilor de calciu, a moleculeor de ATP i de AMP-ciclic, de ph, etc. n celulele musculare, actina i miozina intr n alctuirea unor ultrastructuri stabile, denumite microfilamente sau miofilamente (myofilamentum) de actin i de miozin. Miofilamentele se dispun ordonat, n sensul lungimii, paralele ntre ele i formeaz miofibrilele, cu un diametru de 1-2 m. Un miofilament de actin este alctuit din 600 molecule de actin, n timp ce un miofilament de miozin conine numai 200 molecule de miozin. Cea mai precis organizare i dispunerea a moleculeor de actin i miozin se ntlnete n miofilamentele i miofibrilele muchiului striat (scheletic i cardiac), care sunt orientate paralel cu axul mare al fibrei musculare. (Fig.5.7.) n rabdocit (fibra muscular scheletic) exist cca. 1000 miofibrile ,dispuse n pachete longitudinale (colonete Leydig), ce apar pe seciune transversal sub forma unor grupri de 30-50 miofibrile ( cmpurile Cohnheim). La microscopul optic, miofibrilele apar striate,prezentnd o succesiune alternant de benzi sau discuri. O band A (stria A), denumit i disc ntunecat, de 1,5 nm, anizotrop (discus anizotropicus) n lumin polarizat, ntunecat n contrast de faz, mai intens colorabil, alterneaz cu o band clar (stria I) de 0.8 nm, izotrop (discus isotropicus) n lumin polarizat, clar n contrast de faz, mai slab colorabil.

Fig.5.7.Organizarea dispozitivului contractil n fibra muscular striat Discul ntunecat (banda A) este transversat prin mijlocul lui de zon clar (zona lucida s. stria H) care este strbtut de o linie ntunecat, numit linia M (linea M) sau mesofragm (mesophragma).

69

Discul clar (banda I) este i el traversat de o linie intunecat, denumit linia Z (linea Z), telofragm (telophragma) sau stria AMICI, ce se prelungete transversal, de o parte i de alta, n toate miofibrilele dintr-un rabdocit. n unele fibre musculare mai intens solicitate, discurile clare (I) pot fi traversate, n plus, i de o fina linie accesorie, linia N. ntre dou telofragme (strii Amici sau linii Z) sucesive se delimiteaz un sarcomer sau un miomer (myomerrum), care reprezint unitatea fundamental de structur i funcie a miofibrilei. Un sarcomer are o lungime de 2,5 m i cuprinde un disc ntunecat ( o band A) i cele dou jumti de benzi clare (I) adiacente. ntr-o mifobril se gsesc cteva zeci de mii de sarcomere aezate cap la cap. De exemplu, ntr-un rabdocit cu lungimea de 5 cm sunt 20.000 de sarcomere, nct 20.000 x 2,5 m = 50.000 = 5 cm.

Fig.5.8. Organizarea ultrastructurilor din banda M a.Seciune transversal b. Reprezentare tridimensionala, FG-filament gros de miozin;FM-filamente M ale citoscheletului endosarcometric enodsarcomeric; PM-puni M Ultrastructura sarcomerului a fost investigat prin studii de microscopie electronic nc din anul 1953, reprezentnd primele aplicaii ale electronomicroscopiei n biologie. S-a constatat c filamentele groase, de miozin (cu diametrul de 15 nm i lungimea de 1,6 nm) sunt dispuse n mijlocul sarcomerului n zona ocupat de discul ntunecat ( banda A) n timp ce la nivelul discului clar (banda I) se gsesc numai filamente subiri, de actin (cu diametrul de 6 nm i lungimea de 1nm), care pornesc de o parte i de alta a benzii Z i ptrund n discul ntunecat (A) pn n apropierea zonei H, n care se gsesc numai filamente groase. n restul discului ntunecat (A) se produce o interdigitare a filamentelor groase i subiri, nct pe o seciune transversal la acest nivel, ficare filament gros are n jurul su 6 filamente subiri, realizndu-se un model hexagonal. (Fig.5.8.) Pe suprafaa filamentelor groase proemin capetele moleculelor de miozin sub forma unor puni transversale. Pe imaginile electronomicroscopice, punile transversale apar ca proeminene laterale, perpendiculare pe axa filamentelor groase, extinse spre filamentele subiri pe care tind s le ating. S-au numrat 200-220 puni transversale pentru un filament gros, dispuse regulat urmnd un traiect spiralat de-a lungul filamentului. Punile transversale conin HMM (H meromiozin) ce are activitate ATP-azic i interacioneaz cu actina.(Fig.5.9) Fig.5.9. Dispunerea punilor transversale la nivelul filamentului

70

5.3.2.2. Micri celulare bazate

pe sistemul actin-miozin

Pe baza sistemului molecular actin-miozin se realizaez mai multe categorii de micri celulare: -micrile din timpul contraciei musculare; -micarea de locomoie ameboidal; - micrile din microvili; i curenii citoplasmatici. Interaciunile actin-miozin se desfoar dup acelai mecanism molecular att n celulele musculare, ct i n cele nemusculare: Ele se stabilesc ntre filamentele subiri de actin i capete globulare ale moleculelor de miozin din punile tranversale. Micarea se produce prin alunecarea filamentelor de actin i miozin, unul peste altul. Pentru aceasta se desface puntea dintre miozin i actin i se restabilete puntea cu monomerul urmtor din filamentul de actin, antrennd deplasarea filamentului. Energia necesar este furnizat de hidroliza ATP-ului, iar deplasarea se face dup mecaniosmul "roii cu clichei" de la ceasornicele mecanice.Relaxarea se produce prin desfacerea simultan a tuturor punilor dintre filamentele de actin i miozin, ceea ce permite glisarea filamentelor.(fig.5.10).

Fig.5.10. Schema modului de aciune a punilor transversale. a-n relaxare; b-La nceputul contraciei; c-detaarea de filamentul de actin; d-Reataarea pe monomerul urmtor de actin; 1,2,3,4,5,6,7-Monomeri de actin. 5.3.2.2.1. Contracia fibrelor musculare striate Contracia muscular reprezint forma cea mai perfecionat de micare bazat pe sistemul actinmiozin. Se produce prin alunecarea (glisarea) filamentelor de actin printre cele de miozin, fr a se modifica lungimile lor. Mecanismul glisrii a fost propus de HUXLEY n 1954 i apoi demonstrat experimental. Ca rezultat al glisrii se scurteaz lungimea sarcomerului, iar prin nsumarea scurtrii tuturor sarcomerelor se ajunge la scurtarea fibrei musculare n ntregul ei. De exemplu, o scurtare a sarcomerului de la 2,5 la 2 m (deci cu 20%), nsumat pentru 20.000de sarcomere produce o scurtare de la 5 cm la 4 cm. n timpul contraciei, discul ntunecat (banda A) nu se modific, scurtndu-se doar discul clar (banda I) (fig.5.11.)

71

Fig.5.11. Aspectul sarcomerului a-n muchiul contractat; b- n muchiul relaxat; c-n muchiul ntins. Glisarea se datoreaz faptului c fiecare cap al moleculelor de miozin "pete" n lungul filamentului de actin, de pe un monomer pe urmtorul "trgnd" filamentul de actin pas cu pas. Contracia muchiului scheletic se declaneaz n momentul n care excitarea nervului motor al muchiului determin apariia unui potenial de aciune n sarcolem ( plasmalema fibrei musculare striate), la nivelul jonciunii neuromusculare. Semnalul electric se transmite rapid n jurul fiecrei miofibrile prin tubii transveri (T) ce se ntind de la sarcolem la miofibril. n acest fel, semnalul electric ajunge la reticulul sarcoplamic ( o form specific a reticulului endoplasmic n fibra muscular), producnd eliberarea din cisternele reticulului n citosol, a unei cantiti mari de ioni de calciu ( Ca2+), ce se afl stocai n lumenul cisternelor. Creterea brusc a concentraiei de ioni de calciu declaneaz contracia miofibrilei, datorit efectului pe care Ca2+ l produc asupra troponinei i tropomiozinei, proteine asociate cu actina n filamentul subire. n repaus, tropomiozina se interpune ntre actin i capul miozinei, blocnd interaciunea dintre ele. Troponina C leag ionul de calciu i prin aceasta modific poziia tropomiozinei, fcnd posibil interaciunea actinei cu miozina. (Fig.5.12).

Fig.5.12. Relaiile actin- miozin- tropomiozin a - n repaus; b- n activitate; 1- miozina; 2- actina; 3 tropomiozina

72

n momentul n care capul miozinei atinge actina este eliberat ADP i gruparea fostfat, ceia ce determin o flexare a capului miozinei care trage de filamentul de actin, rezultnd glisarea filamentului i contracia muscular. Dup acest moment, de capul miozinei se leag o molecul de ATP, producndu-se desprinderea miozinei de actin.Miozina hidrolizeaz ATP-ul n ADP i gruparea fosfat, iar capul miozinei i recapt conformaia iniial, dup capul se repet. Micrile de "pire" a capetelor de miozin (din filamentele groase) n lungul filamentelor subiri (de actin) sunt efectuate de ctre fiecare molecul i de ctre fiecare lob al capului. n acest fel, ntr-un muchi n contracie, la un moment dat exist capete ale moleculelor de miozin care sunt ataate de actin, iar altele sunt detaate. ntr-o contracie rapid, fiecare din cele 500 capete de miozin ale unui filament gros parcurge ciclul de 5 ori ntr-o secund. Dup terminarea contraciei, ionii de calciu sunt recaptai n cisternele reticulului sarcoplasmic printr-o enzim (Ca2+ - ATP - az), ceea ce produce relaxarea muchiului. Pe lng actin i miozin, n miofibrile se mai gsesc proteine accesorii cu rolstructural. Astfel, n stria Z, se gsesc proteine (-actina i desmina) ce ancoreaz filamentele de actin i aliniaz miofibrilele adiacente, asigurnd contracia sincronizat a miofibrilelor. Alte proteine accesorii ndeplinesc un rol funcional mediind efectul pe care Ca2+ l are n contracia muscular. n muchiul cardiac, filamentele de actin i miozin prezint o dispunere asemntoare cu din muchiul scheletic, fiind evidente striaiile. Muchiul neted este lipsit de striaii, iar filamentele de miozin i de actin nu formeaz miofibrile, nefiind dispuse strict ordonat ca n muchii striai, dei, n general, sunt orintate paralel cu axul lung al celulei. Miozina din celulele musculare netede (leiocite) se deosebete de cea din fibrele musculare striate (rabdocite) prin dou caractere: 1-activitatea ATP-azic este de zece ori mai mic, fiind mult mai direct legat de ionii de calciu; 2- n leiocite, miozina poate interaciona cu actina numai dac lanuriile uoare sunt fosforilate.

Fig.5.14. Diagrama activrii kinazei 1-Calmodulina; 2-Ioni de calciu; 3-Complexul Ca2+ - calmodulin; 4- Kinaz inactiv; 5-Kinaz activat. Fosforilarea i defosforilarea lanurilor uoare ale miozinei din leiocit sunt efectuate de enzime specifice. Astfel. enzima de fosforilare se numete kinaza lanurilor uoare i este activat de complexul Ca2+- calmodulin. Kinaza activat fosforileaz lanurile uoare din molecula de miozin, permind interaciunea cu actina. (Fig.5.14.) Kinaza miozinei poate fi activat de influxul de Ca2+, rezultat n urma excitrii sistemului neurovegetativ, dar i prin AMP-ul cicclic al crui nivel n celul este legat de hormoni. n acest fel contracia muchiului neted poate fi produs prin aciune nervoas sau hormonal. Contracia muchiului neted este mai lent deoarece i activarea miozinei prin sistemul calmodulinei este lent. n muchiul striat, unde se realizeaz o contracie rapid este prezent o form specializat a calmodulinei, troponina C. n toate celulele nemusculare, miozina se aseamn cu cea din muchiul neted prin faptul c activarea ei (dobndirea capacitii de a se lega de actin) depinde de fosforilarea lanurilor uoare. care la rndul ei este stimulat de complexul Ca2+-calmodulin.Fosforilarea induce asamblarea miozinei n agregate mici bipolare, formate din 10-20 molecule de miozin, legate prin cozile lor. Aceste agregate pot produce deplasarea filamentelor de actin prin mecanismul interaciunii actin-miozin. Contracia complexului acto-miozinic produce trecerea citoplasmei n starea de gel, iar relaxarea determin trecerea n stare fluid, cum se ntmpl n micarea ameboidal i n motilitatea microvililor. (Fig.5.15.)

73

Fig.5.15. Agregarea miozinei n celulele nemusculare. 1-Molecule de miozin; 2-Agregate moleculare. Alte micri bazate pe sistemul actin-miozin sunt micarea ameboidal, micrile din microvili i curenii citoplasmatici.

5.3.2.2.2. Micarea de locomoie ameboidal Micarea de locomoie ameboidal prezint o importan deosebit pentru organisme, deoarece prin acest mecanism leucocitele ies din vasele sanguine i se deplaseaz la locul infeciilor, iar fibroblastele se deplaseaz pe suprafaa rnilor depunnd colagen, cu rol n formarea cicatricei.

74

Fig.5.16.Micarea ameboidal a fibroblastelor. 1-Nucleu; 2-Coad; 3-Ondulaii de suprafa; 4-Microvrfuri; 5-Lamelipode; 6-Plci de adeziune; 7,8-Extensie; 9-Adeziune; 10-Contracie. n cazul animalelor domestice, emiterea de pseudopode mici se ntlnete la deplasarea leucocitelor, care se face lent. Fibroblastul emite pe direcia micrii prelungiri lite, lamelipode, care formeaz o muchie de naintare. Procesul de emitere a acestor prelungiri este continuu, unele prelungiri adernd la substrat prin una din feele lor cu plci de adeziune, n timp ce alte prelungiri, desprinse de pe faa opus, se rentorc spre corpul celulei, formnd ondulaii de suprafa. Pe msur ce are loc naintarea celulei, rmne o coad n interiorul creia se gsesc fibre de retracie, iar din aceast coad se desprind fragmente pe care celula le las n urm. La micarea fibroblastelor se produc treceri succesive i reversibile ale citoplasmei din starea de gel n cea de sol, ajungndu-se la o vitez de 40 nm/or. Micarea ameboidal nu se face la ntmplare, fibroblastele manifestnd o preferin pentru suprafeele pe care pot adera. Este posibil ca prelungirile subiri, epii observai pe lamelipode s acioneze ca nite antene de exploatare a suprafeei. Forma suprafeei influeneaz micarea ameboidal, fibroblastele migrnd pe direcia curburii minime ( n sensul lungimii cilindrului de sticl). (Fig.5.16) Emiterea pseudopodelor i deplasarea celulei se face spre un stimul chimic, fenomen cunoscut sub denumirea de chemotactism.S-a dovedit c leucocitele sunt atrase de molecule "atractante" eliberate n focarul inflamator. Aceste molecule produc metilarea unor grupri carboxil din proteinele din membran. Dac metilarea este blocat, chemotactismul este inhibat. 5.3.2.2.3. Micrile din microvili n alctuirea unui microvil (microvillus) exist filamente de actin (cca.40), dispuse longitudinal i paralele ntre ele, avnd toate aceeai polaritate. O extremitate a filamentelor ajunge al vrful microvilului, ntr-o regiune amorf, cu o compoziie chimic insuficient precizat, ce ancoreaz filamentele de membran. Extremitatea opus ajunge la polul bazal al microvilului, terminndu-se ntr-o reea perpendicular de filamente de actin, denumit buton terminal, ce conine i miozin, avnd rolul de a menine n poziie microvilul. Mnunchiul de filamente din microvil este legat, din loc n loc, ntre ele i cu plasmalema prin fimbrin, ce realizeaz o "scar " n spiral n lungul microvilului. (Fig.5.16.)

75

Fig.5.16.Diagrama ultrastructurii microvililor

Polaritatea filamentelor de actin din microvil este similar cu a filamentelor subiri din sarcomer, producnd scurtarea ritmic a microvililor i mpingerea substanelor absorbite spre interiorul celulei. (Fig.5.18.)

Fig.5.19.Polaritatea filamentelor de actin A - n microvil B n sarcomer

5.3.2.2.4. Curenii citoplasmatici Curenii citoplasmatici sunt micri ce realizeaz o deplasare a organitelor i componenetelor n interiorul celulei. Se manifest sub form de: 1 - scurgere a citoplasmei fluidifiate n prelungirile celulere n timpul micrii ameboidale; 2 - micare saltatorie a organitelor, n care pe filamentele de actin situate la periferia celulei se deplaseaz filamente de miozin pe care sunt ancorate organite celulare; 3 -cicloza, o micare n jurul nucleului, vizibil n celule vegetale sau n algele verzi unicelulare. Curenii citoplasmatici sunt caracteristici celulelor eucariote vii, disprnd odat cu moartea acestora. Transportul axoplasmatic din neuroni reprezint o form specializat de cureni citoplasmatici n care intervin microtubulii. 5.3.3. Microtubulii i micrile bazate pe sistemul microtubul - dinein 5.3.3.1. Microtubulii

76

Microtubulii (microtubulus, i) sunt formaiuni rectiliniii cu lungimi variabile (pn la civa micrometri) i cu un diametru mediu de 25 nm. Pot apare grupai sau singulari n citoplasm. Peretele microtubulului este format din 13 iruri lineare, drepte sau spiralate, formate din molecule proteice globulare, cu diametru de 5nm, cu o greutate molecular de 50-60 Kdal., denumite tubuline. Tubulinele polimerizeaz rezultnd dimeri de tubulin, alctuii dintr-o alfa-tubulin i o betatubulin, legate prin interaciuni necovalente i dispuse alternant n peretele microtubulului. n peretele microtubulilor, dimerii de tubuline formeaz protofilamente sau protofibrile (protofibrila) cu diametrul de 5 nm. n protofibrile, dimerii formeaz se dispun n aa fel, nct alfatubulina de la un dimer de leag de beta-tubulina de la de la dimerul din rndul vecin. Protofibrilele, n numr de 13 se dispun sub forma unui cilindru, structurnd un microtubul cu diametrul de 25 nm constant n toate cazurile.Energia necesar asamblrii microtubulilor este furnizat de moleculele de guanizin-trifosfat (G.T.P.) i nu de cele de A.T.P. Microtubulii prezint polaritate, adaugarea de dimeri, avnd lo intensitate mai mare la captul pozitiv, producndu-se creterea, n n timp ce la captul opus (negativ) predomin pierdera de dimeri, avnd loc scurtarea. Exist un echilibru dinamic ntre microtubuli i dimerii de tubulin din citosol. Polimerizarea se petrece spontan la temperatura de 370 C, n timp ce depolimerizarea are loc la 00 . Cationii bivaleni de calciu i magneziu n concentraie mic (micromolar) sunt necesari pentru polimerizare, care este mult accelerat n prezena proteinelor asociate microtubulilor (MPAs), care pot fi: - proteine cu greutate molecular mare (HMW = Hight Molecular Weight ) i proteine tau (). De asemenea, calmodulina controleaz procesul de asamblare - dezasamblare, iar colchicina, un alcaloid blocheaz polimerizarea tubulinelor, prin legarea unei molecule de colchicin de un dimer de tubulin. Pe aceast proprietate se bazeaz folosirea colchicinei la blocarea metafazelor n culturile de celule, pentru studierea cromozomilor. Unele medicamente,folosite ca citostatice (vinblastina, vincristina) distrug fusul de diviziune i oar celulelele maligne, care se divid intens.

Fig.5.20.Formarea protofibrilelor din dimeri de tubulin i asamblarea unui microtubul A.Seciune transversal prin microtubul 1-Alfa-tubulin; 2-Beta-tubulin; 3-Dimer; 4-Asamblare; 5- Blocarea asamblrii prin colchicin; 6-Protofibril; 7-Dezasamblare. n celul, microtubulii ndeplinesc att un rol structural, ct i un rol dinamic. Rolul strucutural const n: 1- meninerea formei celulelor i a prelungirilor sale (axon,dentrite, cili, flageli); 2-determinarea i pstrarea dispunerii spaiale a organitelor; 3- organizarea citosheletului, determinnd distribuia filamentelor intermediare n celul; 4- dispunerea filamentelor de actin, ce structureaz inelul contractil, ntre cei doi poli ai celulei; 5- formarea unor "schele temporare" pe care celula s-i dispun unele componente, ca de exemplu n cursul spermatogenezei, cnd microtubulii formeaz o "schel" n spiral pe care se sprijin mitocondriile. Rolul dinamic const n: 1- particip la realizarea micrilor celulare ce au la baz mecanismul microtubul-dinein, precum micarea cililor i flagelilor; 2- asigur o serie de micri intracitoplasmatice, precum micarea granulelor de melanin n melanocite; 4- asigur transportul

77

unor molecule i substane; 5- realizeaz transportul axonal rapid (200 nm/ 24 ore) i lent (24 nm/ 24ore); 5- particip la eliberarea proteinelor i lipoproteinelor sintetizate n hepatocite. n citoplasm, microtubulii sunt prezeni n alctuirea unor structuri stabile, cum sunt centriolii, fusul de diviziune, cilii i flagelii. 5.3.3.2. Centriolii Centriolul (centriolum) este o structur microtubular stabil ce intr n componena centrului celular ( cytocentrum). n majoritatea celulelor, centrul celular este situat juxta nuclear, n apropierea complexullui Golgi i conine unul sau doi centrioli, ce sunt nconjurai de o zon citoplamatic clar, denumit material pericentriolar. Centrul celular lipsete n celulele nalt specializate (eritrocit, rabdocit, neuron), iar cnd este prezent coordoneaz mobilitatea celular n timpul diviziunii. (Fig.5.20.)

Fig.5.21.Aspectul centrului celular la microscopul optic A- n intercinez; B- n timpul diviziunii. La microscopul electronic, fiecare centriol apare ca o structur cilindric (n lungimre de 0,5 m i cu diametrul de 0,11 m), dispus perpendicular pe congenerul su. Fiecare centriol este format din 9 triplete (triplomicrotubulus) de microtubuli, notai de la interior spre exterior cu A,B,C i mbrcai ntr-o mas de substan dens. Centrul cilindrului este lipsit de microtubuli, realizndu-se o structur de tipul "9+0", diferit de structura axonemei cililor i flagelului, care este de tipul "9+2". (Fig.5.22)

78

Fig.5.22.Ultrastructura centriolilor 1-Triplet de microtubuli Centrul celular (sau centrozomul ) joac rolul de organizator al microtubulilor, datorit faptului c materialul pericentriolar format din proteine i ARN, determin polimerizarea tubulinelor i asamblarea microtubulilor, care au captul negativ ( - ) n materialul pericentriolar din centrazom, n timp ce captul pozitiv ( + ) dispus distal prezint o cretere intens. Datorit funciei sale de organizator temporar, spaial i vectorial al microtubulilor, centrul celular este implicat n toate procesele n care acetia apar ca organizatori ai citoscheletului. Centrul celular intervine i n direcionarea micrilor de locomoie ameboidal ( a fibroblastelor i leucocitelor), situndu-se naintea nucleului pe direcia micarii celulelor.Tot odat, centrul celular particip i definirea polaritii celulei, dispunndu-se ca i complexul Golgi, apical fa de nucleu n celulele epiteliale. 5.3.3.3. Fusul de diviziune Fusul de diviziune (fusus mitoticus) este o structur intra celular, format din microtubuli (microtubuli fusalis) ce realizeaz o legtur ntre centriolii care se despart i migraz la cei doi poli ai celulei, n timpul diviziunii celulare. n interfaz, centrozomul este situat n vecintatea nucleului i din el pleac microtubuli n toat citoplasma. n timpul fazei "S" a ciclului celular ncepe dublarea centrului celular prin separarea centriolilor, n vecintatea fiecruia din centriolii vechi producndu-se asamblarea unui centriol, nou perpendicular pe cel vechi. Concomitent cu deplasarea spre polii celulei a centrilor celulari, microtubulii formeaz filamente ce se dispun sub forma unui fus de diviziune.Fiecare filament este alctuit din circa 100 microtubuli i proteinele asociate lor.ntre microtubuli din fus i moleculele de tubulin din citosol se stabilete un echilibru dinamic.(Fig.5.22)

Fig.5.22.Participarea microtubulilor la formarea fusului de diviziune 3-Centrioli; 2-Microtubuli;3-Fibrele fusului de diviziune; 4-Cromozomi.

79

5.3.3.4. Cilii i flagelul Cilii (cilium,a) i flagelul (flagellum) sunt expansiuni celulare permanente, formate din citoplasm i membran celular, dispuse la polul apical al celulei. n structura lor, microtubulii sunt prezeni, n axul citoplasmatic ciliar, denumit axonem (axonema), fiind dispui ordonat, paraleli ntre ei i cu axul longiutudinal al formaiunii. La baza fiecrei axoneme se afl cte un corpuscul bazal (corpusculum basale), ce are organizarea unui centriol. Cilii pot fi vibratili ( sau kinetocili) i nevibratili (sau stereocili). La cilii vibratili (din mucoasa traheal, nasal), axonema este format din doi microtubuli axiali, nconjurai, la periferie de nou dublete de microtubuli. Fiecare dublet cuprinde un microtubul complet sau subfibra A, format din 13 protofilamente i un microtubul incomplet sau subfibra B, format din 10 sau 11protofilamente. Tubulinele alfa () i beta () ce formeaz subfibra A sunt diferite de tubulinele omoloage din subfibra B.

Fig.5.24. Ultrastructura cililor De la fiecare subfibr A pornesc nspre subfibra B din dubletul vecin dou brae simetrice n form de clete formate din molecule de dinein, care este o protein-enzim bogat n ATP-az. Braele de dinein sunt dispuse n lungul microtubulului la intervale regulate de 24 nm. La intervale mai mari de 24 nm exist, din loc n loc, la o distan de 86,5 nm legturi elastice, formate dintr-o alt protein, denumit nexin. De la subfibra A pleac spre centrul axonemei cte un bra de legtur (sau spi), ce se termin printr-o poriune globular, n vecintatea tecii interne ce nconjoar cei doi microtubuli centrali.(Fig.5.25). Flagelul (flagellum), de obicei, unul singur pentru fiecare celul (expl. la spermatozoid) prezint o structur asemntoare cu a cilului, dar mai complex. Axonema sa este structurat dup tipul "9+2", prezentnd n jurul su o coroan de mitocondrii ce a asigur ATP-ul necesar micrii. Cilii nevibratili sau stereocilii ( de exempl. cei din epididim i din urechea intern) au aceiai structur ca i cilii mobili, cu deosebirea c lipsesc cei doi microtubuli centrali din axonem. Micrile celulare ce au la baz sistemul microtubul-dinein sunt pe deoparte micrile caracteristice cililor i flagelilor, iar pe de alt parte sunt micrile cromozomilor din cursul diviziunii celulare.

80

Fig.5.25.Seciune transversal prin axonema unui cil A - Subfibra A.; B - Subfibra B. a-Brae de dinein; b-Legturi de nexin; c-Spi; d-Teaca intern; e-Microtubuli centrali; fTija cilului; g-Rdcina cilului. Micarea cililor i flagelilor se realizeaz prin alunecarea unui dublet periferic n raport cu dubletul vecin lui.Alunecarea depinde de legarea ciclic a dineinei subfibrei A dintr-un dublet de subfibra B a dubletului vecin, nct braele de dinein "pesc " de-a lungul dubletelor, producnd energia necesar btilor cilului sau a flagelului.Se realizeaz astfel glisarea dubletelor unul peste altuli ncovierea cilului i flagelului. Dineina prezint o funcie similar cu a miozinei, prezentnd activitate ATP-azic, nct prin scindarea ATP-ului furnizeaz energia necesar micrii. ATP-ul provine din glicoliz i difuzeaz prin citoplasm n axonema cililor, pe cnd, n flageli, ATP-ul este generat de mitocondriile ce nconjoar axonema. Legturile radiare (spiele) dintre teaca intern i dubletele periferice, precum i teaca intern au rolul de a controla activitatea braelor de dinein, nct s se produc o und coerent de micri de la baz spre vrf. Astfel cilii au micri ciclice n doi timpi (btaie - revenire), ce dureaz 0,1-0,2 secunde, n timp ce flagelul are o micare ondulatorie sinusoidal sau elicoidal.(Fig.5.26).

81

Fig.5.26. Schema micrii flagelului (A) i a cililor. a-Btaie; b-Revenire n condiii patologice, pot aprea tulburri funcionale ale cililor datorit unor anomalii localizate fie la nivelul corpuisculului bazal (centriol incomplet), fie la nivelul axonemei (complexe tubulare supranumerare, sau cu aranjament dezorganizat) ,fie n pri componente ale cilului. De asemenea, absena dineinei produce sindromul cililor imobili (o boal genetic), care se caracterizeaz prin infecii respiratorii cronice (datorit incapacitii cililor de a curii cile respiratorii sau prin sterilitate (spermatozoizii fiind imobili). 5.4.Mitocondriile - organite generatoare de energie

Mitocondriile (mitochondrion gr.= filament,granul) sunt organite specializate n producerea de energie necesar activitii celulelor eucariote, comportndu-se ca nite centrale energetice, in care energia este eliberat prin oxidarea unor substrate i transformat n energie chimic (ATP) prin procesul de fosforilare oxidativ. Sunt fabricile de energie ale celulei. Mitocondriile sunt prezente n toate tipurile de celule cu excepia eritrocitului adult, n care lipsesc. Au fost observate la microscopul optic n a II-a jumtate a secolului XIX de ctre ALTMAN1890, prin coloraie cu verde Janus i de BENDA-1897, care afolosit coloraia cu hematoxilin feric Regaud. Enzimele marker pentru mitocondrii sunt: monoaminoxidaza, citrocromoxidaza i enzimele ciclului Krebs. Numrul mitocondriilor difer de la o celul la alta n funcie de intensitatea activitii acestora, fiind mai mare n celulele mai active. Astfel, n hepatocite exist 1000-3000 de mitocondrii n citosol, n nefrocite-300, n spematozoizi 20-24, n timp ce n eritrocite lipsesc.Numrul mitocondriilor este mai redus n celulele cu activitate metabolic redus. Poziia mitocondriilor n celul este diferit.Ele pot fi rspdite, reletiv uniform, n ntreaga citoplasm ( de expl. n hepatocit) sau localizate n celul, n locurile unde ATP-ul este necesar n cantitate mai mare. Astfel: - n muchiul scheletic, mitocondriile sunt dispuse ntre miofibrile; -n spermatozoid, sunt aranjate helicoidal n jurul axonemei flagelului; - n neuroni, n regiunea sinaptic; - n panceasul endocrin, mitocondriile sunt alturate reticulului endoplasmic rugos, genernd ATP-ul necesar biosintezei proteinelor. Mitocondriile se concentreaz la polii activi ai celulelor polarizate funcional: - la polul bazal, n nefrocite; - la polul apical, n enterocite;- perinuclear, n momentele de intens activitate de sintez, dup care se rspdesc n citoplasm. Mitocondriile i schimb mereu poziia, putndu-se altura temporar unor organite aflate n intens activitate, n special reticulului endoplasmic. 5.4.1.Morfologie,structur i ultrastructur Dimensiunile mitocondriilor sunt variabile de la o celul la alta, ajungnd pn la 7 m lungime i 0,5 m grosime. n general, cu ct o celul este mai activ, cu att mitocondriile sunt mai mari. n celule aflate n repaus, dimesiunile sunt mai mici. La microscopul optic, mitocondria se poate prezenta sub trei aspecte:-granule ( granulum mitochondriale),mitocondrii individualizate , diseminate n citoplasm; -granule nirate ca nite mrgele pe a (condriomite)i filamente (filamentum mitochondriale) sau virgule (condrioconi ) (Fig.5.27).

82

Fig.5.27. Mitocondriile A. Aspecte la microscopul optic: 1-Condrioconte; 2-Bastonae Heidenhein; 3-Mitocondrii; 4-Condriomite; 5-Condrioconi, localizai bipolar. B.Aspecte la microscopul electronic: 6-Organizarea spaial a mitocondriei; 7-Ultrastructura membranelor; 8-Aspecte ale cristelor; 9-Ultrastructura cristelor; 10-Seciune transversal printr-o crist. Ultrastructura mitocondriilor a fost elucidat de PALADE i SJSTRAND-1952, pe seciuni de ficat examinate electronomicroscopic. n ultrastructura mitocondriei intr dou membrane (membrana mitochondrialis), cu grosimea de 6 nm fiecare, ce delimiteaz dou compartimente.Membrana extern (membrana mitochondrialis externa) este neted, n timp ce membrana intern (membrana mitocondrialis interna) dei urmrete conturul celei externe prezint din loc n loc pliuri sau invaginri denumite criste (latinescul crista= creast) mitocondriale cu grosimea de 25 nm, de forme variate. Numrul, dispoziia i dimensiunea cristelor variaz n raport cu tipul activitii metabolice i necesitile energetice ale celulei. Numrul cristelor este mai mare atunci cnd activitatea celulelor este mai intens. Cristele mitocondriale au forme variate, putnd aprea lamelate sau septate (sub form de foie sau septe) i tubulare ( t ubulus),sub form de cilindri sau veziculare (vesicula). Cristele pot fi orientate perpendicular sau paralel cu axul longitudinal al mitocondriei. Ele pot fi rectilinii,ramificate sau ncruciate n reea, compartimentnd matricea mitocondriei. (Fig.5.28). Fig.5.28.Ultrastructura mitocondriei 1-Crist; 2-ADN-mitocondrial;3-F1-ATP-az; 4-Membrana extern; 5-Membrana intern;6-Spaiul intermembranar; 7-Ribozomi; 8Incluziuni; 9-Matrice; 10-Particul elementar(F1): a-piesa bazal,bpiesa intermediar,c-piesa superioar.

83

ntre cele dou membrane (extern i intern) se delimiteaz un compartiment extern (spatium intermembranosum) de 7-8nm. Membrana intern delimiteaz un compartiment intern sau matricea mitocondrial (matrix mitochondrialis). La nivelul membranei interne, prin tehnici adecvate (coloraie negativ cu acid fosfotungtic, pentru a obine un contrast mai mare la microscopul electronic) s-au evideniat subuniti de membran sau particule elementare (particule F1) (particula elementaria s. spherula s.sphaerula membrane). O particul elementar apare ca o proeminen de 10 nm, format din trei piese: bazal, intermediar i superioar. Particulele elementare conin o enzim, F1 - ATP-az, ce face parte din complexul enzimatic ce particip la sinteza ATP-ului.(Fig.5.29) Membrana mitocondrial intern este mai puin permeabil dect membrana mitocondrial extern, comportndu-se ca unfel de barier ntre matricea mitocondrial i restul mitocondriei. Prin ea trec spre spaiul intern: -ioni de calciu (Ca 2+) i magneziu (Mg2+), necesari activitii enzimelor cuprinse n matricea mitocondrial; - molecule de ADP i ATP, necesare desfurrii procesului de fosforilare activ; -acizi grai i unii aminoacizi (glutamatul i apartatul). Transportul prin membran a acestor produi se realizeaz cu ajutorul unor proteine din membran,care servesc ca transportori sau crui (translocazele i permeazele).

Fig.5.29. Organizarea particulelor elementare 1-Factorul de cuplare; 2-Citocromi; 3-Succinat dehidrogenaza.

5.4.2. Matricea

mitocondrial.

Matricea mitocondrial conine enzime, vitamine (B,A,C), acizi nucleici (ADN i ARN), ioni ( K+, Na+, Ca 2+, Mg2+) i granule de glicogen, lipide, riboproteine (ribozomi). Enzimele matricei aparin la urmtoarele sisteme: -sistemul enzimatic al ciclului acidului citric (Krebs); - sistemul enzimatic al beta oxidrii acizilor grai; -sistemul enzimatic de fosforilare oxidativ; enzime care intervin n sinteze specifice; -enzime proteolitice. Acizii nucleici mitocondriali sunt reprezentai de ARN ribozomal, ARN mesager, ARN de transfer i ADN. Molecula de ADN mitocondrial (cu lungimea de 20m) este circular, asemntoare cu cea a procariotelor. Replicarea ADN-ului mitocondrial nu se produce sincron cu replicarea ADNului nuclear i nici n mod continuu. Sinteza ADN-ului mitocondrial se produce mai lent dect n cazul ADN-ului nuclear i independent de acesta. ADN-ul mitocondrial este sintetizat independent n matricea mitocondrial,fapt demonstrat prin evidenierea n matrice a enzimei care catalizeaz biosinteza ADN-ului, enzim denumit ADN-polimeraza. Ribozomii mitocondriali au diametrul de 15 nm i sunt asemntori celor de la procariote, de tip 70 S, cu cele dou subuniti: mare, de 50S i mic, de 30S. Mitocondria are autonomie genetic parial, ntruct posed un cromosom (cromosoma mitochondrialis) ce conine programul genetic (ADN-ul mitocondrial), i este capabil s-i sintetizeze singur, fr ajutorul nucleului unele protein-enzime (datorit nzestrrii cu ribozomi proprii, ce biosintetizeaz proteine).Codul genetic folosit de mitocondrie difer parial de codul genetic nuclear. 5.4.3.Procesele metabolice mitocondriale Aparin pe de o parte metabolismului energetic, iar pe de alt parte metabolismului sintetetic. Mitocondria este sediul metabolismului celular aerob, dependent de oxigen, care include: 1ciclul acidului citric (KREBS); 2- oxidarea acizilor grai i 3-fosforilarea oxidativ. Prin aceste procese, n mitocondrii se produce ntreaga cantitate de energie (sub form de ATP) necesar creterii,funcionrii i vieii celulei, nct mitocondriile se comport ca nite centrale energetice celulare. ntr-un caz ipotetic, n care celulele animale ar fi lipsite de mitocondrii, producerea de energie ar depinde de glicoliza anaerob, n care fiecare molecul de glucoz genereaz dou molecule de

84

ATP. n realitate, n mitocondrii, metabolismul glucozei este complet, oxidarea mergnd pn la CO2 i H2O, nct fiecare molecul de glucoz produce 36 molecule de ATP.Prin hidroliza ATP-ului se elibereaz o cantitate important de energie (8.000-10.000 Kcal/mol) necesar proceselor metabolice. n cazul acizilor grai, acetia trec din citosol n matricea mitocondrial, unde intr n ciclul beta-oxidrii,pierznd n mod repetat cte doi atomi de carbon de la captul carboxil i rezultnd o molecul de acetil-coenzim A. Totodat, n urma glicolizei ce are loc n citosol,rezult dou molecule de piruvat, care n matricea mitocondrial este convertit de ctre complexul piruvat dehidrogenaz n acetil coenzima A. Acetil coenzima A, rezultat din acizii grai sau din glucoz intr n ciclul acidului citric (ciclul KREBS), ce are loc n matricea mitocondrial.La acest nivel cu ajutorul oxigenului molecular, produs de respiraia celular, au loc oxidri n urma crora rezult energie ce este folosit pentru sinteza de ATP, de ctre complexul ATP- sintetazei, prezent n membrana mitocondrial intern. Celulele dispun de depozite de lipide (trigliceride) n esutul adipos i de glucide (glicogen), n ficat i muchi, prin care se asigur o surs continu de piruvat. Participarea mitocondriilor la efectuarea unor procese metabolice este posibil datorit existenei unui mozaic complex de enzime,localizate n diferite structuri mitocondriale, precum membrana extern, membrana intern cu criste i particule elementare, compartimentul extern (sau spaiul intermembranar) i compartimentul intern (sau matricea mitocondrial).Astfel, enzimele care intervin n ciclul acidului citric i n beta -oxidarea acizilor grai sunt localizate n membrana extern i n matricea mitocondriilor.Enzimele i ali factori care particip la procesul de fosforilare oxidativ (generatoare de ATP) sunt localizate n membrana intern,respectiv n criste.n particulele elementare ale membranei interne se afl localizat enzima denumit factorul de cuplare F1, care posed activitate ATP-azic i catalizeaz ultima etap a formrii ATP-ului. Procesele metabolice biosintetice pot avea loc, datorit faptului c mitocondriile conin ADN, ARN, ribozomi i toate enzimele necesare exprimrii genelor mitocondriale.n mitocondrii se desfoar unele etape din sinteza hemului i a hormonilor steroizi, ca de exemplu n celulele interstiiale din ovar i testicul, n corticosuprarenal. Structura chimic a mitocondriilor cuprinde 65-70% proteine (din care 30% structurale i 70% enzime), 25-28% lipide (fosfolipide, lecitine, trigliceride, cardiolipin), 0,5% ARN, AND (n cantitate mic),glucide,ioni,ap i uneori vitaminac. ntr-o mitocondrie, toate proteinele, ca i toate lipidele sunt n locuite la aproximativ 20 de zile, nct mitocondria se renoiete continuu, iar cnd iese din funcie, este ndeprtat prin autofagie cu ajutorul lizozomilor. 5.4.4. Originea mitocondriilor n celul, noile mitocondrii apar prin condrodierez (clivaj,despicare), nct dintr-o mitocondrie funcional rezult dou organite asemntoare. Se menioneaz i posibilitatea de formare a mitocondriilor din molecule proteice i lipidice sintetizate n celul sau din alte citomembrane, n special din cele ale reticulului endoplasmic. n filogenez, primele mitocondrii au aprut n celulele animale prin transformarea unor bacterii care, odat ptrunse n celul animal i-au pierdut virulena, i-au structurat o a doua membran (membrana mitocondrial extern), i-au adoptata metabolismul la celula gazd, devenind un organit endo-simbiont. Mitocondria,ca i bacteriile prezint o molecul de AND circular, iar unele enzime sunt prezente att n bacterii, ct i n mitocondrii. 5.4.5. Funciile mitocondriilor Mitocondriile ndeplinesc un rol esenial n metabolismul energetic al celulelor vii, producnd energia necesar desfurrii oricrei activiti celulare (diviziune,difereniere,secreie, contracie muscular, transmitere nervoas).Energia este generat prin aciunea enzimelor oxido-reductorii mitocondriale i prin procesul fosforilrii active sub forma molecelor macroergice de ATP.Enzima denumit ATP-az, scindeaz molecule de ATP i elibereaz energia pe care acestea o conin. n cursul desfurrii reaciilor enzimatice oxidative i ale cuplrii oxidrii cu fosforilarea, mitocondria sufer o serie de modificri de form i strucutur, ce formeaz un ciclu fiziologic de umflare contracie. n acest ciclu, membrana extern rmne nemodificat, n timp ce membrana intern permite micri ale apei i ionilor cu ajutorul translocatorilor specifici. (Fig.5.30) Fig.5.30. Ciclu fiziologic de balonare-contracie al mitocondriei.

85

1-Mitocondrie nemodificat; 2-Mitocondrie condensat; 3-Mitocondrie balonat. n stare de contracie,datorit proteinelor contractile pe care le conine, mitocondria i micoreaz mult volumul, spaiul intermembranar se reduce, iar cristele mitocondriale se taseaz, organitul, n totalitatea sa, aprnd electronodens. n starea de balonare, mitocondria acumuleaz o cantitate mrit de ap, i mrete volumul, se sterg cresteler mitocondriale, iar cele dou membrane ajung n contact una cu cealalt. Aceste modificri pot fi fiziologice i reversibile. Balonarea se datorete pe de o parte modificrii raportului ATP/ADP de la suprafaa extern a mitocondriei, ct i datorit acumulrii peste normal a unor ioni. 5.5.Organitele de sintez i secreie ale celulei Sunt reprezentate de ribozomi,reticulul endoplasmic i complexul Golgi. 5.5.1. Ribozomii Ribozomii (ribosoma) sau granulele Palade sunt organite celulare intracitoplasmatice prezente n toate celulele cu excepia eritrocitelor . (Fig.5.31).

Fig.5.31. Ribozomii - aspect, ultrastructur i biogenez: 1-Ribozomi liberi;2-Ribozomi ataai la RE;3-Poliribozomi;4-Subunitate mic; 5-Subunitate mare;6-Ribozom funcional;7-Dimer;8-Protein ribozomal structural; 9-ARN ribozomal dublu elicoidal;10-ARN ribozomal monocatenar;11-Nucleu; 12-Nucleol;13-Ribozom;14-citoplasm,15-membran celular. Ribozomii pot fi liberi n citoplasm , solitari sau grupai sub form de poliribozomi (polyribosoma). De asemenea,se pot ataa de membranele reticulului endoplasmatic (structurnd reticulul endoplasmic granular) sau de faa extern a membranei nucleare. Numrul ribozomilor variaz n funcie de tipul celulei i de momentele funcionale ale acesteia , fiind foarte mare i ataai reticulului endoplasmic n celulele care sintetizeaz proteine de export (celulele acinoase, limfocit i plasmocit). n celulele care secret hormoni steroizi (din glandele suprarenale , din gonade ) numrul este foarte mic, ribozomii aprnd liberi, n citoplasm (Fig.5.32). Diametrul ribozomilor este de 15-30nm, avnd aspectul unor granule sferice, cu constana de sedimentare de 80S la eucariote i de 70S (uniti Svedberg) la procariote.

86

Fig.5.32.Aspecte ale ribozomilor examinai cu microscopul optic 1-Ergastoplasm; 2-Corpusculi Nissl; 3-Grupri bazofile n celulele secretorii din glanda mamar; 4-Corpi Berg n hepatocit. Organizarea ultrastructural. La eucariote, un ribozom este format din dou subuniti inegale, ca dimensiuni asimetrice: a) o subunitate mare (cu diametrul de aproximativ 30nm), de form sferoidal, cu constan de sedimentare de 60S. ; b) o subunitate mic, alungit, cu o constant de sedimentare de 40S.(Fig.5.33).

Fig.5.33.Schema ribozomilor i a formelor lor de organizare 1-Subunitatea mic; 2-Subunitatea mare; 3-Ribozomi; 4-Dimer; 5-Poliribozomi. Ribozomul de la procariote este asemntor cu ribozomul mitocondrial de la eucariote, avnd o constant de sedimentare de 70S, cu o subunitate mic, de 30S i o subunitate mare, de 50S. Cele dou subuniti ribozomale sunt separate atunci cnd nu particip la sinteza de proteine sau cnd, n citoplasm, concentraia ionilor de magneziu (Mg2+) scade sub 10-3 sau n prezena unor inhibitori ai sintezei de proteine ca puromicina sau etionina. Atunci, cnd concentraia ionilor de magneziu crete peste 10-3 se produce agregarea ribozomilor n grupuri denumite polimeri (di, tri, tetra) care nu au o funcie special n celul. Odat cu revenirea la normal a concentraiei ionilor de magneziu n citoplasm se produce desfacerea polimerilor i individualizarea ribozomilor. n cursul proceselor de biosintez a proteinelor mai muli ribozomi se dispun de-a lungul unei molecule de ARN mesager (ARNm), formnd cu un poliribozom (polirybozoma), sau un polizom. ARNm se amplaseaz n spaiul dintre cele dou subuniti ale ribozomului i introduce mesajul genetic n secvena de aminoacizi a proteinelor ce se sintetizeaz. Numrul de ribozomi ce se grupeaz variaz n funcie de mrimea moleculei proteice ce urmeaz a fi sintetizat, fiind necesari 100 ribozomi pentru o molecul de colagen i de 5 ribozomi pentru o molecul de globin din hemoglobin. Molecula de ARN mesager are forma unui filament sinuos, gros de 2nm, ce nir ribozomii, precum mrgelele pe a, trecnd prin fiecare ribozom, printre subunitatea mic i cea mare. Dup ce proteina a fost sintetizat, lanul poliribozomal se rupe, iar ribozomii se disperseaz n citoplasm. Compoziia chimic a ribozomilor cuprinde ARN ribozomal (ARNr) i proteine n pri aproximativ egale, cantiti mici de ap i diferii ioni metalici (de magneziu i calciu).

87

Fig.5.34. Proteine de structur (1) i ARN ribozomal (2) Molecula de ARN ribozomal prezint segmente bicatenare elicoidale, dispuse la suprafaa subunitilor ribozomale, ce alterneaz cu segmente monocatenare nespiralate, dispuse n interiorul subunitilor, unde sunt situate i proteinele ribozomale. Prin coninutul lor n ARNr, ribozomi confer bazofilia celulelor. (Fig.5.34). n subunitatea mare de 60S sunt prezente 3 specii de ARNr (de 5,8S, de 28S i de 5S), n timp ce, subunitatea mic conine numai o singur specie de ARNr (de 18S). n moleculele de ARNr, bazele apar asimetrice, fiind reprezentate de baze purinice (guanin i adenin) mai abundente i de baze pirimidinice (uracil i citozin). Proteinele ribozomale sunt legate mai strns sau mai lax de ARNr i ndeplinesc un rol structural, unele intervenind n asamblarea unitilor ribozomale, iar altele sunt implicate n realizarea funciilor specifice ribozomilor. Proteinele ribozomale sunt bogate n radicali specifici de tipul argininei i lizinei n subunitatea mare existnd 45 proteine i n subunitatea mic 33 proteine (Fig.5.35).

Fig.5.35. Diagrama componentelor ribozomului la eucariote. 1-Ribozom; 2-Subunitate ribozomal mic; 3-Subunitate ribozomal mare. Biogeneza ribozomilor ncepe n nucleol, la nivelul moleculelor de AND nucleolar din componenta cromozomal, unde pe o poriune a cromozomului denumit organizator nuclear se gsesc genele pentru producerea ARNr. Iniial se produce un precursor al ARNr cu constant de 45S ce se localizeaz n componenta fibrilar a nucleolului. O parte din ARNr 45S d natere la ARNr 28S i ARNr 18S, care trece n componenta granular a nucleolului, iar cealalt parte de ARN 41S se transform sub aciunea exonucleazelor n ARNr 28S i ARNr 20S (din care rezult rapid un ARNr 18S). ARNr 28S i ARNr 18S, mpreun cu o parte din proteinele ribozomale venite n nucleu din citoplasm, migreaz separat n citoplasm prin porii membranei nucleare. ARNr 58S se sintetizeaz n afara nucleolului n nucleoplasm dup tiparul ADN-ului, iar ARNr 5S i ARNr 5,8S migreaz n citoplasm ataai de molecula de ARNr 28S. Odat trecute n citoplasm, cele dou subuniti, nc imature se matureaz foarte repede, se asambleaz i se asociaz cu proteine citoplasmatice specifice ribozomului, structurnd n final ribozomii.

88

Funcia ribozomilor const n sinteza proteinelor. Ribozomii ataai membranelor reticulului endoplasmic sintetizeaz proteinele de export (enzime, hormoni, anticorpi, tropocolageni- ca n cazul celulelor seroase din pancreas, limfocitelor, plasmocitelor i fibroblastelor), n timp ce poliribozomii liberi neataai sintetizeaz proteine de structur (ce se consum n diviziune i cretere, n nlocuirea organitelor uzate), precum i unele proteine speciale (proteine contractile, proteinele din mioglobin i hemoglobin). 5.5.2.RETICULUL ENDOPLASMIC Reticulul endoplasmic (reticulum endoplasmaticum s.cytoplasmaticum) este un organit intracelular implicat n activitile de sintez i secreie celular, format dintr-un complex de membrane intracelulare ce delimiteaz un sistem de canalicule (tuburi, cisterne) care strbat ntreaga citoploasm a celulei eucariote. Este prezent n toate tipurile de celule, cu excepia eritrocitului adult. (Fig.5.36).

Fig.5.36. Reticulul endoplasmatic - aspect i organizare tridimensional. 1-Reticul endoplasmic rugos; 2-Reticul endoplasmic neted; 3-Organizare tridimensional a REN; 4-Ergastoplasm n celula seroas din pancreas; 5Nissl n neuron.

Corpusculii

A fost observat n secolul trecut la microscopul optic sub forma unor granulaii bazofile n neuron (unde formeaz substana tigroid sau corpusculii Nissl), n hepatocit (sub forma unor zone sferice, corpii Berg) i n pancreas (unde formeaz o zon bazofil cu striaii longitudinale numit ergastoplasm). Reticulul endoplasmic este mai bine reprezentat n celulele active n sinteze (de proteine, de glucide, de lipide) i foarte dezvoltat n celulele secretorii exo- i endocrine. n interiorul celulei este situat cu precdere n zona intern i mijlocie a citoplasmei, ce formeaz endoplasma (endoplasma) i mai puin n zona extern. Este separat de plasmalem printr-un strat subire de ectoplasm, ce conine infrastructurile fibrilare ale citoscheletului. Contactul cu plasmalema sau continuitatea membranei reticulului cu plasmalema este extrem de rar i poate fi considerat accidental (sau artefacte datorit preparrii). Ultrastructura reticulului endoplasmic cuprinde saci (sacculus), cisterne (cisterna) , tubi (tubulus) i vezicule anastomozate ntre ele i delimitate de o endomembran groas de 6 nm, cu

89

organizare molecular , comun tuturor membranelor interne. Lumenul formaiunilor reticulului endoplasmic variaz ntre 25-500 nm, n raport de momentul funcional al celulei, iar coninutul lor poate apare la M.E. clar sau ntunecat, mai des omogen i amorf dect heterogen. Unele poriuni ale reticulului endoplasmic prezint ribozomi ataai de endomembrane i poart numele de reticul endoplasmic rugos (RER) sau granulos (reticulum endoplasmaticum granulosum), n timp ce alte poriuni sunt lipsite de ribozomi i formeaz reticulul endoplasmic neted (REN) (reticulum endoplasmaticum nongranulosum). Membrana REN se continu cu membrana RER, dar n RER predomin cisternele, pe cnd n REN sunt mai frecvente tuburile i canalele interconectate n reea. Membrana RER se continu cu foia extern a nveliului nuclear, iar lumenul RER comunic cu spaiul perinuclear. REN se ntinde spre periferia celulei fr a atinge plasmalema. Cele dou poriuni ale reticulului endoplasmic, rugos i neted, prezint interconexiuni morfologice i funcionale. Reticulul endoplasmic rugos prezint pe faa extern a endomembranei sale ribozomi individualizai sau grupai n poliribozomi. Ribozomii se leag de membranele reticulului prin subunitatea mare, care este strbtut de un canal ce se deschide n lumenul reticulului i prin care trec lanurile polipeptidice, ce se formeaz n ribozomi. Legarea ribozomilor se face cu ajutorul unor glicoproteine transmembranare denumite riboforine (I i II). Ribozomii ataai confer o puternic bazofilie celulei respective. R.E.R. prezint o mare plasticitate i o mare putere de adoptare n raport cu vrsta sau starea funcional a celulei. n situaii patologice ale celulei se observ mari variaii morfologice ale organitului, precum: fragmentri, dilatri, acumulri de materiale n cisterne i vezicule, proliferri ale formaiunilor reticulului. R.E.R. este specializat n sinteza proteinelor. Reticulul endoplasmic neted (R.E.N.) nu prezint ribozomi pe membrana sa limitant. Este alctuit mai mult din formaiuni tubulare cu diametrul de 30nm, ce comunic prin canale de legtur cu R.E.R. Este prezent n citoplasma tuturor celulelor, dar mai puin reprezentat cantitativ dect cel rugos. REN apare mai dezvoltat n celulele care: - sintetizeaza hormoni steroizi (glandele suprarenale, celulele interstitiale din ovar si testicul); - produc glucide n cantitate mare (hepatocite, celule musculare); - formeaza pigment (melanoblaste) si - elaboreaz acid clorhidric (parietale din glandele fundice). n celula musculara, REN se numeste reticul sarcoplasmic prezentnd un aspect morfologic si functional particular si ndeplinind un rol esential n cuplarea excitatiei cu contractia. n celulele pigmentare ale retinei, REN apare si sub forma unor corpi nucleoizi, biconvexi, PAS pozitivi cu rol n procesele de fotoreceptie. Compoziia chimica a reticulului endoplasmic a fost studiat dupa centrifugarea diferentiata a omogenatului celular, cnd s-au obtinut microzomii. Microzomii nu sunt organite celulare, ci fractiuni subcelulare, ce cuprind portiuni de reticul endoplasmic,membrane golgiene i fragmente de membrane celulare. Se pot obtine i separa microzomii rugosi si netezi, atunci cnd se desprind ribozomii de RER. n microzomi se pastreaza orientarea membranei reticulului endoplasmic din celula, prezentnd o fata externa, ce corespunde fetei citoplasmatice a reticulului endoplasmic, iar continutul lor este identic cu cel din lumenul reticulului endoplasmic. In compozitia chimica a reticulului endoplasmic intra proteine (60%) si lipide (40%). O parte din proteine sunt incluse n structurile organitului (proteine structurale), iar alta parte sunt proteine de export (hormoni, enzime). Dintre lipide, predomina fosfolipidele, lecitinele si cefalinele, iar colesterolul este n cantitate mica (mai ales n RER). Acizii grasi din fosfolipide sunt foarte nesaturati, ceea ce confera o mare fluiditate membranei reticulului endoplasmic. Enzima marker pentru reticulul endoplasmic este glucozo-6-fosfataza, dar n membranele reticulului endoplasmic se mai gasesc si alte enzime legate de transferul de electroni, precum si enzime hidrolitice sau de dezaminare. Originea reticulului endoplasmic este nca discutabila, el parnd sa se formeze fie din membranele nucleare, fie de novo prin sinteza macromoleculelor caracteristice n membrane si asamblarea lor. Membranele reticulului endoplasmic se rennoiesc cu viteze diferite de la un segment la altul (unele dupa 40-60 de ore, iar altele dupa 16 zile). Functiile comune ale reticulului endoplasmic sunt: 1) RE realizeaza un vast sistem microcirculator intracitoplasmatic, prin care sunt vehiculate n permanent substante n toata citoplasma sau n alte structuri cu care RE comunica (precum complexul golgian sau spatiul perinuclear). 2) RE formeaza un suport intracitoplasmatic att pentru celelalte organite, ct si pentru mentinerea formei celulei.

90

3) RE participa prin citomembranele sale, dotate cu permeabilitate selectiva, la realizarea unor schimburi active ntre continutul formatiunilor componente si citosol.

Fig.5.37 Participarea RER la sinteza proteinelor Functiile specifice difera la RER la REN. Reticulul endoplasmic rugos (RER) are ca functie de baza sinteza proteinelor de export, dar si sinteza proteinelor de membrana destinate diferitelor membrane ale organitelor si plasmalemei. Astfel, RER apare foarte bine dezvoltat n: a) celulele seroase ale pancreasului exocrin ce secreta enzime digestive; b) n plasmocitele ce sintetizeaza imunoglobuline; c) n hepatocite care produc albumine si alte proteine serice; d) n neuroni, unde ndeplineste rolul unei fabrici de membrane, care produce si ntretine o suprafata mare de membrane, datorita prelungirilor. n general, RER este fabrica de membrane a celulei eucariote. (Fig.5.37) Reticulul endoplasmic neted ndeplineste mai multe functii specifice n celule: 1) participa la sinteza hormonilor steroizi (n celulele corticosuprarenalei, precum si n celulele glandei interstitiale din ovar si testicul; 2) participa la metabolismul glucidelor, intervin att n glicogeneza (n hepatocite), ct si n glicogenolliza (prin glucozo-6-fosfataza pe care o contine); 3) intervine n metabolismul lipidelor, participnd la sinteza unor lipoproteine (trigliceride sau complexe lipoproteice). Astfel, n celulele intestinale, REN este foarte dezvoltat i sintetizeaza trigliceride (din substante absorbite), ce pot fi evidentiate n REN sub forma de chilimicroni (picaturi de grasime); 4) intervine n procesele de detoxifiere, prin metabolizarea unor substante toxice endo- si extracelulare, datorita enzimelor localizate n citomembranele sale (de exemplu, metabolizeaza sarurile biliare, hormonii steroizi, colesterolul, hemoglobina, precum si unele medicamente); 5) participa la realizarea contractiei musculare, conducnd, prin sistemul tubilor transversi, excitatia de la suprafata plasmalemei la miofilamentele contractile; 6) intervine n biosinteza acidului clorhidric n celulele parietale ale glandelor fundice; 7) participa la fotoreceptie, n celulele pigmentare din retina. 5.5.3.complexul golgi Complexul Golgi (complexus golgiensis s. apparatus reticulatus internus) este un organit celular comun, prezent n toate tipurile de celule, cu exceptia hematiei adulte. A fost descoperit n 1898 de catre Camillo Golgi, n neuronii piriformi din cerebel. La microscopul optic, n celula proaspata poate fi evidentiat prin colorare cu rosu neutru, iar n celula fixata prin impregnare cu saruri de metale grele (osmiu, argint etc.), aparnd sub forma unei retele, formata din canalicule anastomozate, vacuole de diverse marimi sau bastonase (dictiozomi). (Fig.5.38)

91

Fig.5.38 - Aparatul Golgi - aspecte la microscopul optic 1 - Retea perinucleara; 2 - Vezicule; 3 - Ramificat printre granule de secretie (a); 4 - Retea terminata n crlig n celulele foliculului tiroidian; 5 - Coarda rasucita; 6 - Imagine Golgi negativa. Pozitia complexului Golgi n celula variaza dupa tipul si activitatea celulei. Astfel, n neuroni este dispus perinuclear, pe cnd n celulele secretorii exocrine (de exemplu n celulele acinilor serosi din pancreas) ocupa o pozitie supranucleara, fiind situat ntre nucleu si polul apical al celulei. n celulele cu dubla polaritate functionala (exemplu celula tiroidiana si adamantoblastul), complexul Golgi se deplaseaza frecvent ntre cei doi poli, n functie de activitatea metabolica predominanta a unuia sau altuia. n celule, complexul Golgi se poate gasi n mai multe exemplare distincte. Organizarea ultrastructurala a complexului Golgi cuprinde trei elemente componente: a) pachete de saci turtiti sau cisterne asezate n stiva; b) microvezicule si c) macrovezicule. Aceste elemente componente sunt delimitate de endomembrane (citomembrane), groase de 6-8 nm, netede, fara ribozomi atasati de suprafetele lor. Sacii sau cisternele golgiene sunt polarizate morfologic si functional, prezentnd: a) o fata cis sau proximala sau convexa sau imatura, formatoare, n strnsa relatie cu RER. (Fig.5.39)

Fig.5.39 - Complexul Golgi - ultrastructura si relatii cu alte componente celulare

92

b) o fata trans sau distala, concava sau matura, ndreptata catre membrana celulara, unde se formeaza veziculele de secretie. Membrana sacilor si veziculelor este mai subtire (6 nm, ca la RE) pe fata CIS si mai groasa (10 nm, ca la plasmalema), pe fata TRANS, tranzitia de la un tip de membrana la altul fac^andu-se la nivelul cisternelor. Structurile complexului Golgi se gsesc n micare continu, n sensul migrarii lor de la fata imatura spre fata de maturare a organitului, nct microveziculele vor forma sacii Golgieni, iar din acestia vor lua nastere macroveziculele si apoi veziculele secretorii. Microveziculele (sau veziculele de transfer) (vesicula) sunt cavitati sferoidale (de 20-80 nm), delimitate de o membrana de 6 nm, sunt dispuse de obicei pe fata imatura CIS sau se gsesc ntre RER si sacii Golgieni. Se formeaza prin gtuirea capetelor dilatate ale RER, de care se desprind pierzndu-si ribozomii de pe fata externa. Unele dintre microvezicule prezinta o membrana mai groasa dect a primilor saci golgieni si sunt pozitive la reactia pentru fosfataza acida, nct sunt interpretate a fi lizozomi primari formati n complexul GERL (Golgi - endoplasmic reticulum lysosome). Restul microveziculelor fuzioneaza, formnd astfel noi saci golgieni. (Fig.5.40) Cisternele (sacii) golgieni (sacculus lamelliformis) formeaza componenta major a complexului Golgi, avnd un aspect de saci turtii, usor curbati si dispusi paralel unii fata de altii si separati ntre ei prin spatii regulate de 20-30 nm. Fiecare sac (cisterna) se aseamana cu o farfurie, avnd regiunea centrala mai subtire (1-7 nm) si periferia mai groasa. Numarul sacilor este variat (ntre 3-12) putnd sa ajunga n unele celule secretorii pna la 20. Extremitatile laterale ale sacilor pot prezenta pori sau prelungiri care sa anastomozeze sacii ntre ei sau sa-i lege de RE.

Fig.5.40. Formarea veziculelor de transfer Macroveziculele sunt cavitati sferoidale sau ovoidale, cu diametrul ntre 200-600 nm, delimitate de o citomembrana groasa (8 nm), cu un continut amorf sau granular-heterogen, cu material mai condensat si inegal la fluxul de electroni. Ele sunt situate de obicei pe fata de maturare TRANS - a complexului Golgi si sunt interpretate ca fiind vacuole de secretie sau corpi de condensare a produsului secretat de celula. Macroveziculele se formeaza din dilatatiile laterale ale sacilor golgieni, de care se desprind si se individualizeaza. Numarul veziculelor de secretie difera de la un tip de celula la altul, fiind mai numeroase n faza de maxima activitate a celulelor secretorii exocrine si endocrine. Compozitia chimica a complexului Golgi contine 60% proteine de structura si protein-enzime si 40% fosfolipide si colesterol. Enzimele marker pentru complexul Golgi sunt: a) tiaminpirofosfataza (TPP), localizata mai ales n interiorul sacilor golgieni de pe fata trans; b) nucleoziddifosfataza (NDP) prezenta n interiorul sacilor golgieni intermediari si c) unele glicoziltransferaze. Totodata complexul Golgi este bogat n sulfatotransferaza, care intervine activ n sulfatarea polizaharidelor. De asemenea mai contine: citocrom-reductaza (ca si RE) 5-nucleotidaza (ca si membrana plasmatica), adenilat ciclaza, fosfataza acida (n veziculele sistemului GERL), ubiquinona, vitamina A si vitamina K.

93

Originea complexului Golgi. Structurile complexului Golgi se formeaza din membranele preexistente ale sacilor golgieni. Nucleul controleaza sinteza proteinelor specifice din endomembrane si deci indirect influenteaza formarea complexului Golgi. Functiile complexului Golgi sunt multiple, fiind reprezentate de: 1) Functii legate de procesul de secreie intracelular, aparatul Golgi fiind implicat n: a) concentrarea produsilor sintetizati n RE; b) prelucrarea produsilor sintetizati n RE prin procese biochimice; c) sinteza de noi componente; d) stocarea si segregarea produsilor de secretie; e) ambalarea produsilor sub forma de vezicule; f) livrarea produsilor spre plasmalema. Produsul de secretie elaborat n RE ajunge la formatiunile golgiene prin microvezicule ce se detaseaza din capetele reticulului endoplasmic rugos, functionnd ca o naveta (suveica) cu frecvente deplasari dusntors ntre RE si sacii golgieni. (Fig.5.41).

Fig.5.41 - Functiile complexului Golgi 2) Fabricarea de endomembrane pentru veziculele secretorii si din acestea mai departe pentru plasmalema. n acest mod, membrana veziculelor de secretie se ncorporeaza n plasmalema, compensnd astfel pierderile de plasmalema prin endocitoza. Complexul Golgi participa la reciclarea (reutilizarea) membranelor veziculelor secretoare, ale veziculelor sinaptice si ale veziculelor de endocitoza. Prin acest proces, unele componente ale plasmalemei ca receptori, enzime sau unele molecule informationale din mediul extracelular (hormoni peptidici, cotecolamine) sunt introduse n celula pe calea complexului Golgi, unde sunt modificate (glicozilate, sulfatate, fosforilate) sau reparate. n acest mod, complexul Golgi ndeplineste rolul de a fi principala statie de rennoire a endomembranelor si a plasmalemei. Actiunea unor virusuri sau transformarea maligna a celulelor poate altera fluxul membranelor, att n ceea ce priveste conexiunile dintre formatiunile delimitate de endomembrane, ct si n ceea ce priveste manifestarile functionale ale acestora. 3) Sinteza complexelor hidratilor de carbon. Complexul Golgi participa la sinteza glicoproteinelor prin faptul ca n structurile golgiene componenta primita de la RER se uneste cu moleculele de hidrati de carbon, cu ajutorul unor enzime aflate n organit (transferaze, glucozaminidaze). n complexul Golgi se desavrseste procesul de glicozilare a glicoproteinelor. Glicoproteinele sintetizate pot ramne intracelular ca enzime lizozomale sau pot forma continutul veziculelor secretorii, care prin exocitoza ajung extracelular. 4) Formarea proteoglicanilor sulfatati (condroitin sulfatatilor) si a glicoproteinelor sulfatate (mucina) se realizeaza prin procesul enzimatic de sulfatare a glicoproteinelor cu ajutorul sulfotransferazei golgiene.

94

5) Maturarea lipoproteinelor si a albuminelor. Lipidele sintetizate la nivelul reticulului endoplasmic neted sunt transportate la complexul Golgian, unde are loc procesul de maturare si complexare cu proteinele. 6) Formarea lizozomilor primari are loc pe fata cis - imatura - sub forma unor microvezicule pozitive pentru fosfataza acida. Enzimele lizozomale sintetizate n RER sunt transportate si mpachetate fie n sistemul GERL, fie n vezicule de condensare. 7) Formarea acrozomului. n spermiogeneza, complexul Golgi ocupa o pozitie supranucleara, si modifica forma si realizeaza acrozomul, care elibereaza enzime litice la contactul cu ovulul. 5.5.4.Ciclul secretor Ciclul secretor sau procesul secretor reprezinta o succesiune de etape pe care le parcurg proteinele de export din momentul sintezei si pna la eliberarea lor n mediul extracelular. Se descriu cinci etape obligatorii:

Fig.5.42. Desfasurarea ciclului secretor 1. Sinteza si segregarea proteinelor de export la nivelul RER. Initial proteinele sunt sintetizate pe polizomii neatasati membranelor RE, formati din ribozomi dispusi de-a lungul unei molecule de ARNm la distante de 100 nucleotide. ntr-un polizom, fiecare ribozom sintetizeaza independent cte un lant polipeptidic, care este adapostit n tunelul subunitatii ribozomale mari. Atunci cnd lantul polipeptidic a atind un anumit stadiu de formare, ribozomii se ataseaza de membrana reticulului endoplasmic ntr-o anumita pozitie care recunoaste o secventa specifica fiecarei proteine, denumita secventa semnal, situata pe capatul terminal amino al peptidei care ia nastere. Acest semnal este interceptat de proteine specifice din membrana reticulului (denumite riboforine). n momentul atasarii polizomilor se formeaza un orificiu n membranele RER, n continuarea celui din subunitatea ribozomala mare. Prin acest tunel trec n spatiul endoplasmic lanturile polipeptidice nou-formate. (Fig.5.42) 2. Transportul intracelular al proteinelor prin formatiunile reticulului endoplasmic rugos la complexul Golgi se realizeaza cu ajutorul microveziculelor, care sunt ncarcate cu proteine sintetizate de polizomi si se ndreapta spre sacii golgieni. 3. Condensarea si maturarea proteinelor n structurile golgiene. Procesul de maturare sau condensare (cu durata de circa 1 ora) desavrseste conformatia cuaternara a proteinelor, realiznduse prin interactiunea proteinelor cu un peptidoglican sulfatat sintetizat n complexul Golgi. Din aceasta interactiune se formeaza agregate osmotic inactive nsotite de eliberarea unor molecule de apa din proteinele nou formate (deci de o concentrare a lor).

95

4. Depozitarea intracelulara se face sub forma veziculelor secretorii, care ramn un timp n citoplasma, dupa care sunt trecute n ectoplasma si mai departe n mediul extracelular, sub actiunea unor hormoni sau neurotransmitatori. 5. Exocitoza este procesul prin care veziculele secretorii sunt trecute n mediul extracelular. Este influentat de concentratia intracelulara a ionilor de calciu, de prezenta moleculelor de ATP si AMP-ciclic care provoaca contractia microfilamentelor care determina deschiderea veziculelor si eliminarea continutului n spatiul extracelular. Prin exocitoza sunt eliberati din celula: hormonii, enzime, imunoglobuline, lipoproteine, neurotransmitatori, constituenti ai serului si laptelui, componente ale membranei celulare, glicocalixului sau alti produsi sintetizati n reticulul endoplasmic si condensati n complexul Golgi. Prin acelasi mecanism al exocitozei sunt eliminati si unii produsi terminali, metabolic inerti, nefolositori sau daunatori pentru celula. 5.6. ORGANITELE DIGESTIEI INTRACELULARE Digestia intracelular cuprinde totalitatea fenomenelor care produc degradarea biochimic a moleculelor ptrunse n citoplasm prin endocitoz, a unor organite uzate, a unor fragmente de celul sau structuri celulare. La procesul de digestie intracelular particip dou tipuri de organite: lizozomii i peroxizomii. 5.61. Lizozomii Lizozomii (lysosoma) sunt organite celulare de form sferic sau ovoidal (de 0,2 - 1 nm diametru), prezeni n citoplasma tuturor celulelor animale, cu excepia hematiilor adulte. Lizozomii au fost descoperii n 1950, de ctre DE DUVE prin tehnici de fracionare celular, ca particule ce sedimenteaz ntre mitocondrii i microzomi i conin enzime hidrolitice cu pH optim de aciune acid. Organizarea lor ultrastructural a fost descris de ctre NOVIKOFF n 1956. Au mai fost denumii corpi litici, saci de sinucidere sau stomacul celulei. Organizarea ultrastructural a lizozomilor cuprinde o membran lizozomal i matricea lizozomal (Fig 5.43).

Fig. 5.43. Schema imaginii electronooptice a lizozomilor 1- Membran lizozomal; 2- Matrice lizozomal. Membrana lizozomal delimiteaz lizozomii, prezentnd o structur comun endomembranelor, lipoproteic, mozaicat, cu o grosime medie de 6-8 nm. Membrana lizozomal poate fi dubl sau unic, prevzut la exterior cu mici prelungiri numite spiculi. Ea acioneaz ca o barier ntre enzimele digestive i citosol, mpiedicnd ptrunderea acestor hidrolaze n matricea citoplasmatic. Hormonii glucocorticoizi (cortizon, cortizol) i colchicina activeaz ca stabilizatori ai membranei lizozomale, n timp ce vitaminele A, E, radiaiile X i ultraviolete, endotoxinele, hormonii steroizi sexuali (testosteron, progesteron), dezoxicorticosteronul, ocul osmotic, hipoxia, anoxia etc. acioneaz ca destabilizatori ai membranei. Matricea lizozomal prezint aspecte diferite la microscopul electronic, putnd aprea omogen, fin granular sau heterogen nct se recunosc dou tipuri majore de lizozomi: primari i secundari. Lizozomii primari sunt de talie mic i au matricea omogen sau fin granular fiind dotat cu un set incomplet de hidrolaze acide. Sunt lizozomi tineri, cu o via scurt (de 24-48 ore), neangajai nc n activitile de digestie intracelular. Coninutul enzimatic variaz n raport cu specia, starea funcional i tipul celulei. Astfel, lizozomii primari ai polimorfonuclearelor neutrofile (microfage mobile) conin o mare cantitate de neuroaminidaz, care distruge membrana bacteriilor; - lizozomii macrofagelor conin multe fosfataze acide. Lizozomii secundari sunt heterogeni, coninnd n matrice structuri granulare i membranoase i desfurnd activiti enzimatice digestive. Au o via mai lung (de la cteva zile la cteva

96

sptmni), talia mai mare i un set enzimatic complet. Se formeaz din fuziunea lizozomilor primari, cu veziculele de endocitoz ce conin substane fagocitate, endocitate sau degradate din celule. n funcie de modul n care s-au format, exist mai multe tipuri de fagozomi secundari: heterofagolizozomi (heterophagosoma s. phagolysosoma), autofagolizozomi (autophagosoma), crinofagolizozomi, corpusculi reziduali (corpusculum residuale) i corpi multiveziculari (corpus multivesiculare). Organizarea chimic a lizozomilor cuprinde un numr mare de hidrolaze acide (peste 50 enzime), care pot degrada orice component a celulei: acizi nucleici (prin ribonucleaz acid), proteinele (prin colagenaz, catepsin), glicogenul (prin alfa-glicozidaz), mucopolizaharidele (prin alfa-monozidaz). Enzimele lizozomale sunt active numai la pH acid (4-6).

Fig. 5.44. Coninutul enzimatic lizozomal i aciunile sale Enzimele marker pentru identificarea lizozomilor pe seciuni de esuturi sunt fosfataza acid i arilsulfataza, iar n timpul fracionrii celulare: fosfataza acid, catepsina C, N-acetil-betaglucozaminidaza. Niciodat un lizozom nu conine ntreg setul de enzime hidrolitice, nct heterogenitatea lizozomilor este dat att de numrul, ct i de concentraia unor enzime din matrice i membrana lizozomal. Cea mai mare parte a enzimelor e localizat n matricea lizozomal, existnd ns enzime localizate numai pe membrana lizozomal, ct i enzime cu dubl localizare n matrice i n membran. (Fig. 5.44) n afar de hidrolaze acide, lizozomii mai conin conponente de origine extra sau intracelular, supuse digestiei i aflate n diferite stadii de degradare. Datorit acestui aspect pentru identificarea lizozomilor trebuie avute n vedere enzimele marker, att la examinarea la microscopul electronic, ct i la examinarea prin fracionare celular. Lizozomii pot fi comparai cu nite saci de sinucidere ce conin enzime (hidrolaze acide) care sunt eliberate n mediul intracelular, fie prin modificarea membranei lizozomale de ctre diferii ageni toxici, chimici sau fizici (ca de exemplu: temperaturi foarte joase, raze ultraviolete, vitamina K), fie de ctre detergeni care rup membrana. Odat eliberate n citoplasm enzimele produc liza celulei. Eliberarea poate avea loc i n mod normal n timpul unor fenomene de involuie fiziologic (ca n evoluia uterin post partum, n glanda mamar n perioada de post-lactaie).

97

Fig.5.43. Lizozomi primari i formarea lizozomilor secundari 1- Lzozom primar: a-membran, b- halou, c-matrice; 2- Corp multivezicular; 3- Fagozom; 4- Heterolizozom (heterofagolizozom); 5- Hetero lizozom cu material digerat; 6- Corp rezidual; 7- Mitocondrie; 8- Autofagozom; 9- Membrana nuclear. Ph-ul optim (acid) pentru activitatea enzimelor lizozomale este asigurat de membrana lizozomilor care conine o protein ce grupeaz ionii de hidrogen n lumenul lizozomilor folosind energia rezultat din hidroliza ATP. Alturi de enzimele hidrolitice acide, n lizozomi se mai gsesc n cantiti reduse lipide i proteine de structur, iar n proporii foarte reduse glicolipide, flavine, acid hialuronic. n funcie de natura (substratul) materialului asupra cruia acioneaz lizozomii exist trei tipuri de digestie lizozomal: a) heterofagia, cnd lizozomii acioneaz asupra materialelor exogene nglobate prin endocitoz; b) autofagia, cnd lizozomii acioneaz asupra propriilor constitueni citoplasmatici (exemplu: organite degenerate), segregai n focare de citoliz; c) crinofagia, cnd lizozomii diger unele materiale de secreie celular. (Fig. 5.45). n heterofagie se diger intracelular, cu ajutorul lizozomilor substanele nutritive, bacteriile, virusurile introduse prin endocitoz (fagocitoz, pinocitoz). n urma proceselor de endocitoz se formeaz: fagozomi (phagosoma) (sau heterofagozomi), n cazul fagocitozei, pinozomi n procesul de pinocitoz fr receptori i receptozomi n pinocitoza mediat de receptori. (Fig.5.46)

98

Fig. 5.46. Schem privind participarea lizozomilor la procesul de digestie intracelular Fagozomii, pinozomii i receptozomii sunt antrenai prin micrile din citoplasm, ctre interiorul celulei. Spre ei se ndreapt chimiotactil lizozomii primari i prin fuzionare, rezult o singur vacuol, denumit lizozom-secundar sau heterolizozom sau heterolizom. n interiorul lizozomilor secundari, enzimele hidrolitice lizozomale produc digestia n funcie de complexitatea materialului endocitat. Ca urmare a aciunii enzimelor lizozomale se obin produi de digestie micromoleculari (aminoacizi, nucleotide, hidrai de carbon, lipide) ce vor traversa membrana lizozomal, ajungnd n citoplasm, unde sunt folosite ca materie prim pentru procesele biosintetice sau ca surs de energie. Pe msur ce produii de digestie prsesc lizozomul secundar, acesta i micoreaz volumul, producndu-se simultan o invaginare a membranei lizozomale cu formarea unor vezicule (ca la pinocitoz), care vor fi i ele digerate. Prezena acestor vezicule mici n interiorul unui lizozom secundari d aspectul de corp multivezicular (corpus multiveziculare), observabill electro-microscopic. AUTOFAGIA este procesul de digestie intracelular, cu ajutorul enzimelor lizozomale, a organitelor celulare epuizate sau uzate. n acest mod, mitocondriile uzate, peroxizomii, poriuni uzate de reticul endoplasmic sunt iniial nconjurate cu o membran, denumit nveli de izolare provenit din reticulul endoplasmic sau din aparatul Golgi. Se formeaz astfel vezicule (autofagozomi) sau vacuole autofagice, ce conin materialul intracelular ce trebuie ndeprtat. Autofagozomii fuzioneaz cu lizozomii primari, rezultnd lizozomi secundari n care se produce digestia materialelor incluse. O parte din produsele rezultate din digestie sunt eliberate n citoplasm pentru a fi reutilizate, iar ceea ce rmne formeaz corpii reziduali. Prin autofagie, lizozomii asigur rennoirea (turn-over-ul) componentelor citoplasmei, deoarece mitocondriile au o via de circa 12 zile, peroxizomii de 2-3 zile,

99

iar ribozomii de 10 zile. n ficat se distrug mai mult de un miliard de mitocondrii pe un gram de esut ntr-o or. Procesele de autofagie sunt accelerate: a) n inaniie cnd se remarc o cretere a numrului de vacuole autofagice (de exemplu n ficat) sau b) n inactivitate ( n muchi). De asemenea, se intensific funcia de autofagie n timpul morfogenezei ori de cte ori are loc involuia unor esuturi. n unele situaii, enzimele lizozomale sunt deversate n afara celulei, producnd efecte litice, prin acest mecanism osteoclastele digernd esutul osos. CRINOFAGIA reprezint un aspect particular de autofagie observat n celulele secretorii exocrine i endocrine, prin care lizozomii intervin n reglarea cantitii de produi de secreie ai celulei. n cazul n care n celul se acumuleaz un surplus de vezicule secretorii, care nu ajung s fie exocitate, acest surplus va fi digerat cu ajutorul lizozomilor primari care vor fuziona cu veziculele secretorii, formnd crinofagolizozomii. Moleculele mici rezultate n urma digestiei sunt trecute n citosol unde sunt reutilizate (Fig. 5.47).

Fig.5.47. Participarea lizozomilor la crinofagie 1-Hormon sintetizat pe ribozom; 2Segregare i transport prin R.E.; 3-Vezicule Golgi cu hormon; 5- Vezicule de secreie; 6- Fuzionarea veziculei cu lizozomul. Digestia n heterolizozomi i n autolizozomi este incomplet, unele materiale nefiind digerabile. Lizozomii care, dei i-au terminat funcia digestiv, conin nc resturi nedigerabile se numesc lizozomi teriari, telolizomi sau corpi reziduali i vor fi eliminai n cea mai mare parte prin procesul de exocitoz. n cazul celulelor care nu se divid (neuronii, celulele musculare) corpii reziduali se pot ntlni n celulele n vrst, formnd granule de lipofuscin. n corpii reziduali se mai pot ntlni: figuri mielinice, ce reprezint produi de degradare a fosfolipidelor, pigmeni hemoglobinici sub forma granulelor de hemosiderin, substane injectate. Biogeneza lizozomilor ncepe n reticulul endoplasmic rugos, unde sunt sintetizate proteinele componente (structurale i enzimatice) ale lizozomilor. Microveziculele formate n RER i care transport hidrolazele acide pot fi mpachetate n sistemul GERL (scurtcircuitnd structurile golgiene) sau n veziculele de condensare. (Fig. 5.48) Fig.5.48. Formarea lizozomilor 1- Complexul Golgi; 2-Reticul endoplasmic neted; 3Reticul endoplasmic granular; 4- Vezicul autofagic; 6Vezicul de fagocitoz; 7- Corp dens; 8- Corp multivezicular; 9- Endocitoz; 10-Exocitoz Implicarea lizozomilor n patologie Lizozomii pot fi implicai ntr-o serie de procese patologice determinate de diverse substane (medicamente, toxine microbiene), introduse n celul prin endocitoz, sau de unele boli congenitale. Sunt descrise n aceste condiii modificri ale structurii i funciei lizozomilor precum: a) alterri morfologice i funcionale (creteri n volum, intensificarea sau reducerea funciei datorit acumulrii n exces a substanelor toxice endocitate); b)

100

alterri ale activitii, prin activarea sau inhibarea mai multor hidrolaze acide; c) alterri ale stabilitii membranei, cu eliberarea enzimelor lizozomale n citoplasm sau extracelular, provocnd distrugerea matricei esuturilor. Astfel, vitamina K i expunerea prelungit la soare produc ruperea membranelor lizozomale cu distrugerea celulelor epidermice. Unele bacterii vii (bacilul turbeculozei, al leprei) sau toxoplasma (un protozoor parazit) inhib fuziunea lizozomilor primari cu veziculele de endocitoz, permind acestor microorganisme s distrug celulele care le-au fagocitat. Uneori fuziunea lizozomilor primari cu veziculele endocitate are loc prematur, nainte ca membrana plasmatic s fi nchis complet vezicula, nct coninutul enzimatic lizozomal este eliminat n spaiul extracelular, producnd inflamaii (exemplu: n reumatism, n artrita gutoas), afeciuni n care se folosete colchicina, care inhib fuziunea lizozomilor cu veziculele de endocitoz, mpiedicnd trecerea enzimelor lizozomale n mediul extracelular. n mucolipidoza II (sau boala cu celule I), enzimele lizozomale sunt lipsite de semnalul de recunoatere (manoz-6-P) i din acest motiv sunt eliminate i nu mai pot fi recaptate, nefiind recunoscute. Lipsa unei enzime din setul de hidrolaze acide se datoreaz unui defect genetic i determin apariia bolilor de depozit, denumite i tezaurimoze lizozomice, care se manifest prin acumularea, n lizozomii deficieni, a substanelor ce nu pot fi digerate din lipsa unei enzimei sau mai multor enzime. Astfel se acumuleaz lipide sau poliozide nedigerate, care, n final, ocup celula i compromit funcia ei, afectnd organe precum creierul, ficatul, splina. n ultimii ani se folosete terapia lizozomotropic, care const n administrarea unor medicamente legate de un vehicul transportor. Lizozomii desfac legtura dintre medicament i vehiculul transportor, medicamentul trecnd n citoplasma celulei bolnave, n timp ce transportorul este digerat. n orice necroz celular se distrug i lizozomii nct trec n snge unele enzime, care permit precizarea diagnosticului (exemplu n necroz hepatic sau miocardic). 5.6.2. PEROXIZOMII Peroxizomii (peroxysoma) sunt organite celulare comune i permanente, care se caracterizeaz printr-un bogat coninut n peroxidaze, enzime care catalizeaz reacia de formare (oxidaza) i de descompunere (catalaza) a peroxidului de hidrogen (sau a apei oxigenate H2O2). Au fost observai la microscopul electronic n 1954, n rinichi de ctre RHODIN i denumii microbodies. Mai trziu, DE DUVE i colaboratorii, n urma unor cercetri de fracionare a hepatocitului, le-au considerat ca organite distincte, ce au ca enzime marker: uratoxidaza, catalaza i D-aminoacidoxidaza. n celulele din cotiledoanele plantelor au fost descrii sub denumirea de glioxizomi, deoarece conin glioxilat i particip la transformarea lipidelor n carbohidrai. Denumirea de glioxizomi este acceptat i n cazul celulelor animale, pentru acei peroxizomi care, pe lng alte enzime peroxizomale, mai conin cel puin dou enzime ale ciclului glioxilat (malat-sintetaza sau izocitrat-liaza). Forma, dimensiuni i numr. Peroxizomii au o form sferic sau oval, uneori neregulat cu prelungiri. Au dimensiuni de 0,5 - 1 nm, variabile de la o celul la alta. n funcie de talia lor se deosebesc dou categorii de peroxizomi: macroperoxizomi, cu diametrul de o,5 - 1,5 nm i microperoxizomi, cu diametrul de 0,1 - 0,4 nm. Numrul peroxizomilor apare diferit de la un tip de celul la altul, iar n aceeai celul, n funcie de momentul ei de activitate. n unele celule (exemplu celula hepatic), numrul peroxizomilor depete cu mult pe cel al lizozomilor. Fig.5. 49. Organizarea ultrastructural a peroxizomului 1- Reticul endoplasmatic rugos; 2- Reticul endoplasmatic neted; 2- Mitocondrie; 4- Peroxizom: a- membran, bmatrice, c- cristaloid Organizarea ultrastructural a peroxizomilor cuprinde: o endomembran, de 6,5 - 8 nm grosime i o matrice fin granular, mai dens la fluxul de electroni dect matricea lizozomal. La unii peroxizomi, n matrice se observ o zon central dens, numit miez sau cristaloid, care la un grosisment puternic apare format dintr-un mnunchi de tubuli paraleli i deni la fluxul de

101

electroni, care pe seciune transversal dau imaginea unui fagure de miere. La unii peroxizomi se mai observ n matrice prezena unei plci marginale, cu aspect de regiune dens, ngroat la periferie, cu funcie nc neelucidat. Cristaloidul nu apare dect la unele specii i conine uratoxidaza. (Fig. 5. 49) Endomembrana peroxizomal, dei prezint o compoziie asemntoare cu a membranei reticulului endoplasmic, difer de aceasta prin unele polipeptide i enzime din structura sa. S-a putut observa, n unele cazuri att o continuitate ntre membrana microperoxizomilor i a reticulului endoplasmic neted, dar i o continuitate a membranei de la un peroxizom la altul, formnd un reticul peroxizomal, diferit de reticulul endoplasmic. Biogeneza peroxizomilor se poate realiza direct din reticulul endoplasmic prin dilatarea i desprinderea unor pri terminale ale cisternelor, care sunt pozitive pentru catalaz. Mai frecvent, peroxizomii se formeaz prin reticulul endoplasmic - complexul Golgi, unele enzime peroxizomale sintetizndu-se n reticulul endoplasmic rugos, iar altele (catalaza, uricaza) n ribozomii liberi, dup care sunt dirijate spre peroxizomi direct prin citosol. n compoziia chimic a peroxizomilor sunt prezente proteine, lipide i enzime speciale, precum: catalaza (33% din proteinele peroxizomale, enzim marker), uratoxidaza (uricaza), enzimele ciclului glioxilat, D-aminoacidoxidaza. Aceste enzime difer ca numr i specificitate de la un peroxizom la altul. Astfel, peroxizomii renali nu conin sistemul enzimatic al beta-oxidrii. Funciile peroxizomilor sunt : 1. Intervin n metabolismul peroxidului de hidrogen, ntr-o prim etap n producerea acestuia, cu ajutorul oxidazelor, care folosesc oxigenul molecular pentru oxidarea unor substraturi variate, producnd peroxidul de hidrogen ( H2O2 ), un produs toxic pentru celule. n etapa urmtoare, peroxidul de hidrogen este descompus, cu ajutorul catalazei, n oxigen i ap. 2. Intervin n metabolismul acizilor nucleici deoarece prin uratoxidaz, particip la degradarea purinelor (adenina i guanina). 3. Particip la reglarea metabolismului glucozei, prin enzima denumit alfahidroxiacidoxidaza, care catalizeaz oxidarea lactatului la piruvat. Prin alfa-hidroxiacid-oxidaza i Damino-acidoxidaza (sau aminotransferaza), peroxizomii particip i la procesul de gluconeogenez (prin care se sintetizeaz glucoz pe seama unor precursori neglucidici). Cu ajutorul acestor enzime se realizeaz transferul ireversibil al gruprilor amino de la unii aminoacizi (leucina, fenilalanina) formndu-se n acest fel alfa-cetoacizii care reprezint substratul pentru gluconeogenez. 4. Particip la beta-oxidarea acizilor grai, mprind aceast funcie cu mitocondria, fiind ns mai puin activi, nct numai 1/4 - 1/5 din totalul oxidrii acizilor grai are loc n peroxizomi. Caracteristic apare faptul c peroxizomii oxideaz acizii grai, cu lan lung de atomi de carbon pn cnd lanul s-a scurtat la 6 atomi de carbon, dup care oxidarea este realizat de mitocondrii. 5. Produc acetil coenzima A i reduc NAD+ la NADH, ambele substane fiind utilizate de mitocondrie pentru producerea de ATP. 6. Particip la detoxificarea unor molecule deoarece membrana peroxizomilor este foarte permeabil pentru ioni i moleculele cu greutate molecular mic. Astfel, jumtate din etanolul consumat este oxidat n acetaldehid. 7. Sintetizeaz plasmalogenii (substane asemntoare cu fosfolipidele), care intr n proporie de 10% n componena unor membrane. 8. Produc cldur, intervenind n termogenez. Astfel numrul lor e crescut n esutul adipos brun. Implicaii medicale. Peroxizomii sunt afectai n unele boli congenitale, fie prin absena catalazei ( acatalasemie), fie prin reducere numeric i alterarea coninutului enzimatic, n sindromul cerebro-hepato-renal (Zellwegar). Este descris o reducere a funciei de oxidare a acizilor grai cu lan lung de atomi de carbon n adreno-leuco-distrofii, boli genetice letale caracterizate prin distrugerea progresiv a substanei albe din creier i a corticosuprarenalei. S-a observat o relaie ntre peroxizomi i cancer, peroxizomii lipsind total n tumorile cu proliferare rapid. Peroxizomii cresc numeric i n dimensiuni n unele infecii virale (exemplu, n hepatit) sau dup administrarea de medicamente ce scad lipemia. Hipertiroidia determin o proliferare hepatic a peroxizomilor i n consecin o cretere remarcabil a activitii catalazei i a beta-oxidrii acizilor grai cu lan lung de atomi de carbon.

5.7.Incluziunile celulare

102

Incluziunile (sau pseudoincluziile) celulare, sau citoplasmice (inclusiones cytoplasmicae) sunt formaiuni prezente n matricea citoplasmatic n care pot fi depozitai temporar sau definitiv diferii produi ai metabolismului. Aceste depuneri, denumite incluziuni pot conine: a) substane de rezerv (proteine, glucide, lipide, vitamine, minerale, cristale i cristaloizi); b) produi de elaborare (granule de zimogen, granule de mucus, de pigment, hormoni); c) produi de dezasimilaie (pigmentul lipofuscinic). Proteinele se depoziteaz ca substane de rezerv n fibrele musculare, hepatocite i n vitelusul oului, putndu-se prezenta ca granule fine sau mase omogene. Se pot evidenia prin reacia MILLON (cnd apar roii), prin reacia xantoproteic ( cnd apar galbene) i prin impregnri argentice (cnd apar brune). (Fig.5.50) Lipidele se prezint sub forma unor picturi sferice de diferite mrimi. Ele se evideniaz n seciuni, obinute la criostat, unde se pot colora n galben (cu Sudan III), n rou (cu SARLACH), n negru (cu Sudan negru). Lipidele sunt frecvente n: hepatocite (n cantiti diferite n funcie de diverse stri fiziologice i patologice); - n celulele productoare de hormoni steroizi din corticosuprarenal, ovar, corp galben, testicul, unde formeaz substratul n steroidogenez. n lipocitele din esutul adipos alb, lipidele formeaz o bul mare, ce ocup aproape n ntregime celula, pe cnd, n esutul adipos brun apar forme de picturi mici, dispersate n citoplasm.

Fig.5.50. Incluziuni celulare 1- Granule; 2-Bocuri; 3- Depozite perinucleare; 4Granule de cherato-hialin i eleidin (n celulele epiteliale); 5- Mucopoliozide neutre (n glandele uterine); 6- Mucopoliozide acide n celulele cervixului); 7- Adipocit alb; 8-9 Vezicule cu lipide (n celula luteinic); 10-Cristale Reinke ( n celula Leydig, din testicul); 11- Granule de zimogen (n celulele seroase); 12-Hemoglobin (n hematie);13Melanin (n melanocite); 14- Vitamina C; 15- Cristale de colesterol

103

Glucidele se depoziteaz sub form de glicogen, n special n hepatocite i n fibrele musculare. Histochimic se evideniaz prin metoda PAS (periodic acid SCHIFF) sau prin colorare cu carmin BEST, cnd apar sub form de rou violaceu, grupate n grmezi sau plaje. La electronomicroscop, glicogenul poate apare: a) sub form de particule mari, neregulate sau n form de rozet cu diametrul de 150 nm (particule alfa); b) cu aspect de particule mici, cu form de bastonae lungi de 20 - 30 nm (particule beta). n unele boli de depozit sau n diabet, glucidele pot apare i n nucleu. Incluziuni citoplasmatice Denumire Incluziuni cu substante de rezerv Incluziuni cu produsi de elaborare Conin : proteine,lipide, glucide,vitamine, minerale hormoni,granule de zimogen, granule de mucigen, vezicule de secreie, etc. a.Carotenoizi : lipocromi, luiteina, caroten protidele (iodopsina, rodopsina, caroten-albumina) ; b.Cromolipozi (de dezasimilaie): lipofuscina, hemofuscina ; Incluziuni cu pigmenti endogeni c.melanici : melanina d. cu nucleu tetrazolic : hemoglobina, mioglobina, hemosiderina ; Particule de crbune (n antracoz) ; Particule de fier (n sideroz) ; Particule de siliciu (n sideroz)

Pigmenti exogeni

Vitaminele se pot evidenia n epitelii prin fluorescen natural (vitamina A), sau prin impregnaie argentic (metoda Cater) n corticosuprarenal, gonade, hepatocite i fibre musculare. Incluziile minerale de fier, cupru, potasiu, calciu se prezint cu aspect de granule, ce pot fi evideniate prin metode citochimice specifice. Incluziile cristaloide sunt prezente n citoplasma celulelor interstiiale din testicul sub forma cristalelor REINKE, fine, polimorfe. Produii de elaborare apar sub forma unor incluzii diferite precum: granulele de zimogen (la polul apical al celulelor seroase din pancreas); granulele de mucigen (la polul apical al celulelor mucoase i n celulele caliciforme); hormonii (n celulele glandelor endocrine); pigmeni (melanina n melanocite). Aceste incluzii se evideniaz prin diferite metode histochimice: cu rou Magenta (zimogenul), cu mucicarmin (mucusul) sau prin colorare natural proprie n cazul pigmenilor. Pigmenii pot fi de origine endogen sau exogen. Pigmenii endogeni sunt reprezentai de: carotenoizi, cromolipoizi, pigmeni melanici i pigmeni cu nucleu tetrazolic. Carotenoizii sunt de obicei asociai cu lipidele i sunt reprezentai de: lipocrom (pigmentul esutului adipos, la cabaline), luteina (n celulele corpului galben din ovarul mamiferelor), carotenproteidele (carotenalbumine, iodopsina i rodopsina din celulele cu conuri i bastona din retin). Cromolipoizii sunt: pigmeni de culoare brun sau neagr (lipofuscina), rezultai n urma dezasimilaiei n neuroni, hepatocite, zona reticular a corticosuprarenalei, miocard, celulele interstiiale Leydig, sau hemofuscina ntlnit n focare hemoragice. Pigmenii melanici sunt de culori diferite: neagr, brun sau galben. Cel mai cunoscut este melanina, prezent n melanocitele pielii, coroidei, proceselor ciliare, irisului i stratului pigmentar din retin. Pigmenii cu nucleu tetrazolic sunt reprezentai de: hemoglobin (n eritrocite), mioglobina (n muchi), hemosiderina (n celulele sistemului macrofagic monocitar din mduva hematogen, ficat, pulmoni). Pigmenii de origine exogen provin din mediul extern i sunt ncorporai prin aer sau prin furaje, producnd impregnarea esuturilor crora le imprim devieri de la coloraia natural specific. Astfel, impregnarea cu particule de praf (crbune) produce antracoza, cu localizri mai frecvente n pulmoni la carnasiere, n limfocentrul bronic, la rumegtoare i n mucoasa duodenal la psri; impregnarea cu pulberi de fier produce sideroza cu localizare predominant pulmonar; impregnarea cu pulberi de siliciu (nisip) produce silicoza, frecvent la ovinele ce pasc pe terenuri cu nisipuri foarte

104

fine; furajele bogate n caroten (exemplu morcovul) imprim o coloraie glbuie esuturilor la suine i la psri datorit carotenilor din vitelus. 6. Reproducerea celulara Reproducerea celular este fenomenul prin care se asigur continuitatea n timp a celulelor i const n esen n faptul c dintr-o celul se obin dou celule. Acest proces are loc n cursul diviziunii celulare, care devine posibil numai dup ce a avut loc o reproducere biochimic sau molecular, care necesit att materiale nutritive i energie, ct i informaie genetic. Reproducerea biochimic se produce n cel puin 4 faze: 1) acumularea de substane anorganice; 2) sinteza enzimatic a unor substane organice simple (aminoacizi, monozaharide etc.); 3) sinteza proteinelor i 4) sinteza (sau replicarea) ADN-ului, care este esenial pentru declanarea diviziunii. n cursul reproducerii biochimice are loc dublarea masei celulare, duplicarea componentelor i se produce un complex de evenimente ce se succed ciclic, realizndu-se un ciclu celular. 6.1. Ciclul celular Ciclul celular(cyclus cellularis) sau ciclul de via al unei celule este perioada de timp cuprins ntre momentul apariiei unei celule i momentul terminrii propriei diviziuni. Ciclul vieii celulare cuprinde dou mari perioade sau faze: a) diviziunea celular (notat cu M de la mitoz) (periodus mitoticus) i b) interfaza sau intercineza (periodus intermitoticus), perioada dintre dou diviziuni succesive sau perioada ce precede diviziunea. Mult timp s-a considerat n mod greit c n interfaz (n perioada situat n afara diviziunii) celula se odihnete. Prin folosirea metodelor biologiei celulare, s-a observat c interfaza este perioada din viaa celulei cu maxim activitate metabolic, deoarece n cursul ei se produce sinteza ADN-ului, ARN-ului i a proteinelor din celul. Etapele ciclului celular Faze Interfaza Perioada sintetic (S) Perioda Postsintetica (G2) Punct de restricie (R2) Mitoza Profaza Prometafaza Metafaza Anafaza Telofaza Perioade Perioada presintetic (G1) Puncte de restricie Punct de restricie (R 1)

n timp ce sinteza ARN i a proteinelor are loc n toat interfaza, sinteza ADN are loc numai ntr-o anumit perioad, numit perioada sintetic (i notat cu S) care este precedat de o perioad presintetic (notat cu G1) i succedat de o perioad postsintetic (notat cu G2). Un ciclu celular complet (cu durata de circa 16 ore) cuprinde patru perioade: 1) G1 (intervallum ambiguum s.postmitoticum))- intervalul de timp de 5 ore de la sfritul mitozei pn la nceputul sintezei de ADN; 2) S - perioada sintezei de AND( synthesis genomica) de circa 7 ore; 3) G2 (intervallum premitoticum) - intervalul de timp de la sfritul sintezei de ADN i nceputul diviziunii de circa 3 ore i 4) M - diviziunea celular de circa 1 or. La celulele eucariote ciclul celular dureaz 10-25 ore. Durata lui variaz n funcie de specie, tip celular i chiar de la o celul la alta n cadrul aceluiai esut. Dintre perioadele ciclului, perioada G1 are durata cea mai variabil, putnd s difere, la unele celule, n timp ce perioada S sau G2 este cea mai constant pentru un anumit tip celular. Astfel exist celule care se divid foarte rapid, parcurgnd ciclul n 8 ore, n timp ce altele se divid mai rar, avnd ciclul de 100 zile sau mai mult. (Fig.6.1)

105

Fig.6.1. Diagrama ciclului celular G0_- Perioada de repaus G1 Peroada presintetic S perioada sintetic G2 Perioada postsintetic

Exist dou momente denumite puncte de restricie a cror depire permite parcurgerea etapelor urmtoare. Primul i cel mai important punct de restricie este ntre perioadele G1 i S1, iar cel de-al doilea este ntre perioadele G2 i M. ntr-o populaie de celule, momentul depirii punctului de restricie (punctul R) difer de la o celul la alta, nct nu toate celulele parcurg n acelai timp etapele ciclului celular, gsindu-se n diferite etape. Datorit acestui aspect populaiile celulare sunt asincrome. Nu se cunoate precis care este factorul care determin trecerea unei celule de mamifer dincolo de punctul R. Practic se consider c depirea punctului de restricie G1/S depinde de realizarea unei concentraii prag a unei proteine instabile, denumit proteina U de la unstable. ntr-o celul, proteina U poate trece pragul concentraiei numai cnd este sintetizat rapid. n momentul realizrii pragului de concentraie, proteina U determin nceperea replicrii ADN i n consecin trecerea celulei din faza G1 n S. Inhibarea sintezei proteinelor i n mod implicit a sintezei proteinei U poate explica prelungirea fazei G1. Existena punctului de restricie G1/S constituie o rezerv de supravieuire a celulei, care n condiii vitrege, sintetizeaz n primul rnd proteine de ntreinere, iar sinteza proteinei U va fi redus, nct dei celula nu se divide, ea rmne vie pentru perioade lungi de timp, chiar i n condiii de inaniie sever. n condiii n care celula este lipsit de aport nutritiv n alte perioade ale ciclului celular, ea nu va supravieui. n acest mod, punctul de restricie G1/S apare ca un punct de odihn sigur pentru celulele care din cauza condiiilor de cretere sau interaciunilor cu alte celule trebuie s-i opreasc diviziunile. Celulele care se afl oprite n aceast stare stabil se afl n faza G0 a ciclului celular. Un alt punct de restricie se afl la sfritul perioadei G2. Inhibarea sintezei proteinelor n aceast faz mpiedic intrarea celulei n diviziune. Se consider c la sfritul perioadei G2 este activat o proteinkinaz solubil, care catalizeaz fosforilarea proteinelor din membrana nuclear i a histonelor H1. Fosforilarea proteinelor din membrana nuclear induce dezasamblarea nveliului nuclear, iar fosforilarea histonelor H1 produce condensarea cromozomilor, fenomen caracteristic diviziunii. n raport cu modul n care parcurg ciclul celular, se disting trei categorii de celule: I - Celulele care i-au pierdut capacitatea de a se divide, dup parturiie, fiind oprite n faza G1, ca de exemplu: neuronii, celulele musculare. II - Celulele care au o capacitate sczut de a se divide (hepatocitele, unele celule endocrine), dar care n condiii speciale se pot divide rapid. Astfel, hepatocitele se divid rapid dup hepatectomie, refcnd celulele pierdute. III - Celulele care se divid rapid, ca de exemplu celulele mduvei osoase hematogene, din epiderm, din epiteliul mucoasei intestinale, celulele liniei germinative spermatogene. Aceste celule se pot gsi n esuturi n dou compartimente (grupe) celulare: a) un compartiment proliferativ, ce cuprinde celulele care se divid rapid i b) un compartiment neproliferativ, ce cuprind celule care nu se divid dect n anumite condiii. Astfel, se petrec fenomenele n esuturile n care o parte din celulele materne se pierd n mod fiziologic, ca de exemplu celulele din epiteliul mucoasei intestinale, care se

106

descuameaz dup 3-5 zile; hematiile care se distrug dup 120 zile de via. Pierderile de celule mature sunt compensate prin trecerea constant a unor celule de rezerv, numite i celule surs, sau celule stem, aflate n faza G0, din compartimentul neproliferator n compartimentul proliferator. Trecerea din faza G0 se face sub aciunea unor stimuli specifici, reprezentai de substanele mitogene, adic de cele ce induc mitoza, precum: eritropoietina, factorii de cretere ai unor celule (ai nervilor, ai fibroblastelor), poliamina (exemplu putrescina), hormoni (estrogeni). Pot aciona ns i factori tisulari, cum sunt chalonele (peptide sau glicoproteine), care inhib diviziunile celulare. Tip Diviziunea direct (amitoza) Modalitati Inmugurire Clivaj Sciziparitate Mitoza (Diviziunea nereducional) Faze Etape Stadii

Profaza Prometafaza Metafaza Anafaza Telofaza Profaza I Meioza I (reductional)

Leptonema Zigonema Pachinema Diplonema Diachineza

Diviziunea indirect

Meioza (Diviziunea reducional) Interfaza Meioza II (nereducional)

Prometafaza I Metafaza I Anafaza I Telofaza I Profaza II Prometafaza II Metafaza II Anafaza II Telofaza II

6.2. Diviziunea celular Diviziunea celular (divisio cellularis) este acea perioad a ciclului celular n care se realizeaz distribuirea materialului genetic la cele dou celule fiice. Exist dou modaliti de realizare a diviziunii celulare: a) diviziunea direct (sau amitoza) i b) diviziunea indirect, care poate fi de dou feluri: mitoz sau meioz. 6.2.1.Diviziunea Diviziunea direct (amitosis) reprezint forma reproducere celular, organismelor unicelulare. apare fie n procesele de fie n condiii patologice n tumorale. Se caracterizeaz prin lipsa mitotic, iar materialul inegal distribuit, putnduerori n distribuie. Cele mai modaliti de diviziune nmugurirea, sciziparitatea, (Fig.6.2.) direct sau amitoza inferioar de caracteristic La metazoare regenerare, unele procese aparatului genetic este se produce frecvente direct sunt: clivajul.

107

Fig.6.2. Diviziunea direct - amitoza 6.2.2.Diviziunea indirect Se caracterizeaz prin procese mai complexe, ce constau n modificri sincrone n citoplasm (cytokinesis) i nucleu (nucleokinesis), ce realizeaz o distribuire egal a materialului genetic la celulele fiice. Exist dou tipuri de diviziune indirect: a) mitoza sau diviziunea ecuaional, ntlnit la celulele somatice i produce celule diploide; b) meioza sau diviziunea reducional, ntlnit numai la celulele gametogene i produc celule haploide.

108

Fig. 6.3. Mitoza 1- Centrul celular; 2- Spirem; 3- fusul de diviziune;4- Cromozom; 5-Plac metafazic; 6- Inel contractil

109

6.2.2.1.Mitoza Mitosa (mitosis) are o durat total de circa 60 minute la om i se desfoar n patru faze: a) profaza (prophasis), mpreun cu o faz intermediar - prometafaza (30 minute sau 50% din durata total); b) metafaza (metaphsis) (8 minute sau 13,4%); c) anafaza (anaphasis) (4 minute sau 6,6%); d) telofaza (telophasis)(18 minute sau 30%). Profaza Se remarc printr-o serie de fenomene caracteristice, ce se desfoar att n citoplasm, ct i n nucleu. (Fig.6.3.) n citoplasm: 1) Devine vizibil cel de-al II-lea centru celular (centrozom), dublarea centriolilor realizndu-se prin asamblarea unui centriol nou (centriolum filiale), din depozitul de tubuline al citoplasmei. Polimerizarea tubulinelor are loc ncepnd din faza S. 2) Separarea i ndeprtarea centriolilor centrosomului spre polul celulei, ntre ei realiznduse un fus de diviziune (fusus mitoticus), format din filamente structurate pe seama microtubulilor. n nucleu: 1) dispare nucleolul; 2) se condenseaz cromatina nuclear sub forma unui spirem (sau ghem) (glomus), iniial compact (glomus compactum) i apoi lax (glomus dispersum) din care se desprind cromozomii sub form de bastonae. n nucleol - componenta amorf se desprinde i se amestec cu sucul nuclear, iar restul structurii se ataeaz pe fragmentele cromozomilor SAT. n prometafaz: 1) dispare nucleolema (membrana nuclear) prin aciunea proteinkinazei solubile (coninute n lizozomi) care produce fosforilarea proteinelor din membran; 2) cromozomii ncep s interacioneze cu fibrele fusului de diviziune. Ei execut micri oscilatorii agitate, iar datorit contraciei tubulinei, cromozomii se deplaseaz spre mijlocul fusului de diviziune. Viteza lor de deplasare variaz de la un cromozom la altul, ultimul ajungnd cromozomul X. n metafaz: 1) Cromozomii sunt dispui la nivelul ecuatorului fusului(equator fusi) de diviziune, cu axul lor lung perpendicular pe axul fusului, realiznd o plac metafazic (lamina equatorialis). 2) n placa metafazic, cromozomii se despic (cliveaz) longitudinal, nct cele dou cromatide surori se despart. n urma acestei clivri longitudinale se dubleaz numrul de cromozomi (exemplu la taurine, din 60 rezult 120 cromozomi monocromatidici), iar materialul genetic se distribuie n mod egal la celulele fiice. Fiecare din fibrele fusului de diviziune este alctuit dintr-un mnunchi de circa 100 microtubuli i proteinele asociate lor. n structura fusului de diviziune (fusus mirtoticus) se disting dou categorii de fibre, n funcie de modul lor de ancorare la capete: a) fibre polare (centrozom-centrozom) (microtubulus continuus), cele mai numeroase, dispuse de la un pol la altul; b) fibre cinetocorice (centrozom-kenetocor) sau fibre de jumtate de fus (microtubulus chromosomaticus), ancorate cu un capt pe centrozom i cu cellalt pe cinetocorii cromatidelor (cte doi pentru fiecare centromer al unui cromozom). Fibrele cinetocorice sunt alctuite din mnunchiuri de microtubuli ce radiaz n direcie opus de pe cea cinetocori ai fiecrui cromozom. Ele servesc la aezarea cromozomilor n placa metafazic, avnd capetele pozitive (+) blocate n cinetocori, iar capetele negative (-) libere. (Fig.6.4.)

Fig.6.4. Schema fusului de diviziune A-nceputul metafazei; B Sfritul metafazei 1- Centrozom; 2- Cromozom; 3- Fibr polar; 4- Fibr cinetocoric

110

Dac fusul este distrus nu se mai produce diviziunea celular, pe acest fapt bazndu-se utilizarea unor medicamente citostatice (ca vinblastina sau vincristina). Anafaza Se caracterizeaz prin deplasarea cromatidelor devenite cromozomii fii spre cei doi poli ai celulei. Deplasarea spre polii celulei este rezultatul a dou evenimente independente: a) micarea spre poli a fibrelor cinetocorice prin depolimerizarea capetelor libere (negative) ale microtubulilor i antrenarea cu ele a cromatidelor ataate; b) alungirea prin polimerizare la captul pozitiv (+) a fibrelor polare, producndu-se distanarea celor doi poli. Alunecarea fibrelor polare are la baz sistemul motil microtubul-dinein. Telofaza ncepe n momentul n care cele dou grupe cromozomiale au ajuns la cei doi poli celulari i fuzioneaz aparent formnd cte un spirem. n jurul spiremului se reface nveliul nuclear prin defosforilarea proteinelor laminare. Totodat se refac nucleolii, datorit aciunii cromozomilor SAT, iar nucleul i recapt structura din interfaz, cromatina lundu-i aspectul de reea i granule. Clivarea citoplasmei la nivelul plcii ecuatoriale, n cursul fenomenului denumit citodierez sau citokinez (cytokinesis), ncepe prin apariia unui an pe suprafaa celulei (constrictio cytoplasmatica), datorit activitii unui inel contractil, prezent sub plasmalem. Inelul contractil (anulus equatorialis) este format dintr-un mnunchi de filamente de actin, ce ncepe s fie asamblat nc de la nceputul anafazei. Inelul i micoreaz diametrul prin depolimerizarea filamentelor sale, necesitnd prezena ionilor de calciu. Suprafaa total a celor dou celule fiice este mai mare dect a celulei mam, fapt ce necesit o biogenez de plasmalem. Se constat c biogeneza plasmalemei ncepe naintea diviziunii, observndu-se prin microscopia de baleaj c pe msur ce celula trece din faza G1 n faza S i apoi n faza G2, suprafaa ei devine din ce n ce mai proas prezentnd microviloziti care reprezint rezerva de membran necesar pentru nvelirea celulelor fiice, ce au foarte puini microvili. n urma mitozei, dintr-o celul mam rezult dou celule fiice avnd aceeai cantitate de ADN i acelai numr de cromozomi ca i celula mam. Gradul de asemnare al celulelor fiice cu celula mam permite s se disting patru forme de mitoz: homotipic, heterotipic, asimetric i de ntinerire. n mitoza homotipic ( sau homoplastic ) celulele fiice sunt asemntoare ntre ele i cu celula mam. Este ntlnit la celulele nedifereniate (foarte tinere). n mitoza heterotipic ( sau heteroplastic ), celulele fiice sunt asemntoare ntre ele, dar sunt mai mature, mai difereniate dect celula mam, fapt pentru care se mai numete i mitoz de difereniere. n mitoza asimetric ( homo-heteroplastic ), una din celulele fiice seamn cu celula mam, iar cealalt este diferit. n mitoza de ntinerire (sau de dedifereniere), celula mam d natere la celule mai tinere (active), cu potenialiti biologice caracteristice formelor tinere (active) ale celulei mam. Se ntlnete la limfocit, care prin diviziune d natere la dou limfoblaste. Factorii care determin mitozele sunt nc insuficient precizai. Mitoza apare ca o faz obligatorie a ciclului celular ( n situaia n care s-au depit punctele de restricie) i ca o consecin a dublrii masei i componentelor celulei, fiind declanai de o serie de factori ce pot fi ncadrai n trei grupe: a) factori generali, ca: temperatura, lumina, hormonii (tiroidieni, hipofizari), vitamine; b) factori intracelulari, ca: modificarea raportului nucleo-citoplasmatic i nucleolo-nuclear (ca i cum volumul crescut al citoplasmei nu ar mai putea fi controlat de nucleu, fcnd necesar diviziunea celulei); c) factori intercelulari, precum raportul care trebuie s existe, n fiecare esut, ntre celulele uzate i cele care se divid. Sunt cei mai importani n cazul n care un grup de celule moare, se declaneaz diviziunea unui alt grup de celule printr-un mecanism de retro-aciune (feed-back), nct raportul ntre cele trei categorii de celule s rmn aproximativ acelai.

6.2.2.2. Meioza

111

Meioza (meyosis s. cyclus meioticus) se caracterizeaz prin faptul c reduce la jumtate numrul de cromozomi ( deci materialul genetic), nct plecndu-se de la celule diploide, se ajunge la celule haploide, care conin numai cte un cromozom din fiecare pereche de omologi i

Fig.6.5. Comparaie ntre mitoz i meioz

112

numai un cromozom de sex. Este prezent n procesul de maturare al gameilor. Permite ca, prin procesul fecundrii, din dou celule haploide s rezulte o celul diploid, din care se poate dezvolta n mod normal ntregul organism (Fig.6.5). Meioza este alctuit din dou diviziuni indirecte care se succed fr ca ntre ele s se mai produc sinteza de ADN. Prima diviziune se numete meioza I i este reducional, n timp ce a doua diviziune se numete meioza II i este nereducional, aprnd ca o mitoz homoplastic. Meioza I apare mai complicat, cu o profaz specific n care se petrec fenomene caracteristice. Poate dura zile, luni i ani de zile (n funcie de specie), iar profaza este foarte lung, ocupnd 90% din aceast durat. Astfel, ovocitele primare rmn n profaza I pn la pubertate, iar spermatogoniile intr n meioz numai la pubertate. Profaza I (prophasis I) cuprinde 5 faze (etape, stadii) succesive: leptonema, zigonema, pachinema, diplonema i diachinezis. 1) n leptonem (leptonema), se produce condensarea cromatinei, nct cromozomii devin vizibili cu aspect de filamente lungi, cu diametrul neuniform. Ei se ataeaz cu ambele capete de nveliul nuclear la nivelul unor structuri denumite plci de ataare . Fiecare cromozom deci este duplicat i format din 2 cromatide surori, intim ataate una de alta nct n lungul cromozomului se formeaz o lam proteic, denumit ax. (Fig.6.6).

Fig. 6.6. Modificarea cromozomilor n profaza I a meiozei - schem A- Interfaz; B-Leptoten; C-zigoten; D-Pahiten; E- Diploten i daicinezis A, b, c, d - cromatide 2) n zigonem (zygonema), caracteristic este fenomenul de sinaps sau conjugarea (conjugatio) cromozomilor, care const n faptul c, cromozomii omologi (chromosoma homologum) ( din aceeai pereche), unul din setul matern i altul din setul patern se apropie i se alipesc, dar nu funzioneaz. Cromozomii omologi sunt legai unul de altul printr-o reea proteic, denumit complex sinaptolemal (complexus synaptonematicus), ce se ntinde pe ntreaga lungime a cromozomilor, ancorndu-se la cele dou capete de nveliul nuclear. Complexul sinaptolemal realizeaz alinierea perfect a celor doi cromozomi, nct genele alele s fie situate fa n fa. (Fig.6.7.)

113

Fig.6.7. Structura complexului sinaptolemal din cromozomul bivalent 1- Modul de recombinare; 2- Element central; 3-Elemente laterale; a-b i c-d cromatide surori.

3) n pachinem (pachynema), cromozomii sunt mai condensai. Pachinema ncepe n momentul n care sinapsa (synapsis) este complet i are drept caracteristic fenomenul de crossing-over (decussatio), ce const n ruperea unei cromatide materne i a unei cromatide paterne n acelai punct din lungimea cromozomului i sudarea ncruciat a fragmentelor, nct un fragment situat iniial pe un cromozom patern ajunge pe cromozomul matern i invers. Fiecare pereche de cromozomi omologi este denumit cromozom bivalent (chromosoma bivalens) sau tetrad (chromosoma tetravalens), deoarece fiecare cromozom omolog este clivat n dou cromatide surori, nct ntr-o pereche exist patru cromatide. (Fig.6.8)

Fig.6.8. Schema tetradei i a fenomenului de crossing-over

114

1- Centromere; 2- Chiasma; a-b i c-d cromatide surori

Prin schimbul de fragmente ntre cromozomi omologi se realizeaz un schimb de gene, cu un rol extrem de important n ereditate, nct gametul unui individ va avea n final gene ce provin de la cromozomul patern, ct i gene ce provin de la cromozomul matern. n acest fel, un cromozom bivalent, va cuprinde tot patru cromatide, din care una este patern pur, alta matern pur, iar cele dou cromatide ntre care s-a efectuat schimbul de material genetic sunt mixte. Acest schimb de gene ntre cromozomii omologi (chromosoma homologicum), denumit i recombinare genetic sau fenomen de crossing-over este universal i are importan foarte mare n transmiterea caracterelor ereditare. Fig.-6.9. Comparaie ntre mecanismele alinierii i separarii cromozomilor n meioza I i meioza II 4) n diplonem (diplonema), cromozomii rezultai dup crossing over (cromosoma meioticum) ncep s se despart (s realizeze desinapsa ). Ei rmn, ns, legai n punctele numite chiasme, n care s-a produs crossing-overul. La ovocite, diplonema poate dura luni sau ani de zile, deoarece cromozomii se decondenseaz i ncepe sinteza de ARN. 5) n diachinesis (diakinesis), nceteaz sinteza ARN-ului, cromozomii se condenseaz, se ngroa i se detaeaz de nveliul nuclear. Fiecare cromozom bivalent conine patru cromatide, din care cromatidele surori sunt unite la nivelul centromerilor, iar cele nesurori, mixte, ntre care s-a produs crossing-overul sunt unite la nivelul chiasmelor. n concluzie, n profaza I au loc trei importante fenomene caracteristice: 1) condensarea cromozomilor; 2) conjugarea sau sinapsa ( n zigonem ) i 3) schimbul de gene ntre cromatidele nesurori (sau crossing-overul ). n prometafaza I ( prometaphasis I ) se produce dispariia nveliului nuclear i formarea fusului de diviziune. n metafaza I ( metaphasis I ) cromozomii se ataeaz de fibrele fusului de diviziune i formeaz placa metafazic .

115

n anafaza I ( anaphasis I ) se produce deplasarea cte unui cromozom ntreg (bicromatidic,cu dou cromatide) din fiecare cromozom bivalent ctre un pol al celulei, pe cnd cellalt cromozom, tot bicromatidic, se deplaseaz spre polul opus. Diferena esenial fa de anafaza din mitoz const n faptul c nu se despart i nu migreaz separat cromatidele fiecrui cromozom, ele rmnnd legate la nivelul centromerului. (Fig.6.9) Fig.6.10. Diagrama meiozei

Meioza II se realizeaz ca o mitoz obinuit, avnd cele patru faze: profaza II cu prometafaza II (prometaphasis II), metafaza II (metaphasis II), anafaza II (anaphasis), telofaza II

116

(telophasis) . n metafaza II se despart cromatidele fiecrui cromozom, dup care are loc deplasarea lor spre polii celulei, n timpul anafazei II. (Fig.6.10) n concluzie, n cursul diviziunii reducionale (a meiozei), celula se divide de 2 ori, n timp ce cromozomii se divid (desprindu-i cromatidele) numai o singur dat, n timpul metafazei II. 6.3.BAZELE MOLECULARE ALE REPRODUCERII CELULARE Bazele moleculare ale reproducerii celulare se refer la trei fenomene eseniale: 1) replicarea ADN; 2) transcrierea mesajului genetic i 3) traducerea mesajului genetic n biosinteza proteinelor. 6.3.1. Structura i replicarea ADN Acidul deoxiribonucleic (ADN) constituie materialul genetic al tuturor vieuitoarelor, care au n compoziia lor acest acid nucleic. Replicarea (sau duplicarea sau autoreplicarea) ADN-ului cromozomial i distribuirea lui n mod egal n celulele fiice formeaz baza mecanismelor moleculare de transmitere a informaiei genetice. Replicarea ADN este procesul molecular prin care se realizeaz o copiere fidel a moleculelor de ADN (a secvenelor de nucleotide) n timpul duplicrii cromozomilor. Dublarea cantitii de ADN are loc n cursul biosintezei de ADN n faza S a ciclului celular, biosintez care se numete replicare. Structura ADN-ului ADN-ul este o macromolecul, compus din dou lanuri de nucleotide foarte lungi, rsucite unul n jurul celuilalt ntr-o structur dublu-elicoidal (numit dublu-helix sau duplex de ADN). Fiecare lan are: a) o parte constant (ce poate fi asemnat cu coloana vertebral) format din dezoxiriboze, situate pe latura extern i legate prin puni diesterice i b) o parte variabil, reprezentat de secvena bazelor. Bazele sunt situate pe latura intern (ntre lanuri) i sunt reprezentate de dou baze purinice (adenina A i guanina G) i dou baze pirimidinice (timina T i citozina C) (fig.6.11). Fiecare lan este polarizat, deoarece la un capt prezint hidroxilul 5 liber, iar la captul opus hidroxilul 3 liber. n mod convenional se consider c secvena n lan este scris de la 5 spre 3, aa cum n proteine secvena este scris n direcia aminocarboxil. Cele dou lanuri sunt antiparalele, avnd direcia legturilor fosfo-diesterice opus, pe unul este de la 5 la 3, iar pe lanul pereche de la 3 la 5. Cele dou lanuri polinucleotidice sunt meninute mpreun prin legturi de hidrogen ntre baze, existnd dou legturi ntre adenin i timin i trei ntre guanin i citozin. Fig.6.11. Structura ADN-ului Aranjarea bazelor n perechi este specific, nct adenina este legat, n pereche, ntotdeauna cu timina, iar guanina cu citozina. Aceast specificitate este determinat de factori spaiali (sterici) i de legturile de hidrogen. Astfel, diametrul constant al duplexului de ADN (de 2 nm) face ca spaiul dintre cele dou lanuri s fie de 1,1 nm, att ct ocup o

117

baz pirimidinic aranjat n pereche cu o baz purinic. Dou baze purinice ar ocupa prea mult spaiu, iar dou baze pirimidinice prea puin. Pasul helixului este de 3,4 nm i reprezint intervalul la care se repet structura helicoidal. Pe aceast distan se afl zece nucleotide, deci 10 perechi de baze. Numrul de perechi de baze dintr-o molecul de ADN variaz de la cteva mii pn la cteva milioane ( de exemplu, la E. colli molecula de ADN cuprinde 3,4 milioane perechi de baze). Pe un lan polinucleotidic, considerat izolat, secvena bazelor nu este expus nici unei restricii; dar pe lanul pereche secvena va fi strict determinat de specificitatea aranjrii bazelor n perechi, nct lanurile sunt complementare. Astfel, un lan este complementul celuilalt, la secvena GCTAG corespunznd pe lanul opus secvena CGATC. Complementaritatea lanurilor polinucleotidice a permis lui WATSON i CRICK (1953), descoperitorii structurilor n dublu helix a ADN-ului, s sugereze mecanismul replicrii i al transmiterii informaiei genetice. Astfel fiecare lan acioneaz ca o matri pentru formarea unui lan nou complementar cu el nsui. n acest fel se poate replica ADN-ul (dubla cantitate de ADN), iar pentru c molecula de ADN funcioneaz ca matri pentru propria sa formare, procesul a fost denumit autoreplicare. (fig. 6.12). Fig.6.12. Autoreplicarea AND-ului n biologia molecular prin matri se nelege o macromolecul ce prezint o suprafa de legare cu o anumit configuraie spaial. Pe fiecare loc de matri se poate lega n mod specific un singur fel de monomer, cel care are o configuraie complementar cu a matriei (fig. 124). Replicarea ADN-ului Replicarea ADN-ului prezint urmtoarele caracteristici: 1) este semiconservativ, nct n fiecare molecul de ADN nou format, unul din lanuri provine din molecula mam (iniial); 2) ncepe ntotdeauna n acelai punct numit origine, din care pleac pe fiecare lan cte o furculi de replicare, ce reprezint locul n care se produce simultan dezrsucirea ADN-ului parental i n care din dou lanuri se formeaz patru lanuri polinucleotidice. Replicarea ADN-ului ncepe odat cu dezrsucirea celor dou lanuri polinucleotidice din dublul helix al ADN parental. Dezrsucirea este favorizat de ruperea unuia din cele dou lanuri la nivelul coloanei vertebrale de riboz-fosfat, la distan de circa 30 de furculia de replicare, cu ajutorul unei enzime. n continuare dezrsucirea este uurat de unele proteine specifice de dezrsucire, care se leag una dup alta de ADN monocatenar, mpiedicnd rsucirea lui. Concomitent cu dezrsucirea, pe fiecare din cele dou lanuri polinucleotidice se sintetizeaz un lan nou (o replic) cu secven complementar de nucleotide. Astfel pe fiecare din lanurile parentale este sintetizat un ADN nou sub form de fragmente mici (fragmente OKAZAKI) de circa 1000 nucleotide. n procesul sintezei ADN-ului intervin urmtoarele enzime: 1. ARN-polimeraza, ce sintetizeaz cte un fragment scurt de ARN (de circa 100 nucleotide) pe fiecare din lanurile de ADN parental ce servete ca matri. Rezult astfel un primer de ARN, necesar pentru nceperea sintezei propriu-zise de ADN cu ajutorul polimerazelor.(Fig. 6.13)

118

Fig.6.13. Reprezentarea schematic a biosintezei de ADN 2. ADN-polimerazele denumite ADN-polimeraza I, II i III n ordinea descoperirii lor la E coli, catalizeaz polimerizarea deoxiribonucleotidelor. 3. ADN-ligaza, ce leag cte dou capete ale unor fragmente de ADN ce fac parte dintr-un duplex, prin formarea unor legturi fosfo-diesterice ntre cele dou capete (unul cu OH n 3, iar cellalt cu un fosfat la 5). Se nchid astfel discontinuitile (sprturile) din ADN. Reacia este endergonic, energia fiind donat de ctre ATP. 4. ADN-topoizomerazele ( I i II ) scindeaz reversibil dublexul de ADN, permind astfel rotaia i ndeprtarea tensiunii acumulate n timpul dezrsucirii lanurilor polinucleotidice. Mecanismul molecular al biosintezei (replicrii) de ADN cuprinde urmtoarele etape: 1) desprinderea (desperecherea) lanurilor de ADN din molecula parental; 2) sintetizarea, pe fiecare lan, prin aciunea ARN-polimerazei, a cte unui primer de ARN; 3) sintetizarea, n continuarea primerului, a lanurilor de ADN complementare matriei, cu ajutorul ADN-polimerazei; 4) fragmentele OKAZAKI - se formeaz n direcia 5 - 3 pe ambele lanuri; 5) excizia fragmentului de ARN sub aciunea ARN-polimerazei I nct pe msur ce se ndeprteaz cte un ribonucleotid, se adaug imediat dezoxiribonucleotidul corespunztor; 6) legarea fragmentelor de ADN nou formate prin aciunea ADN-ligazei. 6.3.1.1. Particularitile replicrii la eucariote Diferenele care exist ntre replicarea de la procariote i cea de la eucariote se datoresc complexitii organizrii cromatinei la eucariote, unde ADN-ul este complexat cu histone n nucleozomi, care se succed la intervale de circa 200 perechi baze n lungul ADN, nct fragmentele de ADN nou formate (OKAZAKI) sunt mai mici ca la procariote avnd 100-200 nucleotide, iar primerul de ARN numai 10-20 nucleotide. Viteza replicrii la eucariote este de 10 ori mai mic dect la procariote (de exemplu se replic 50 nucleotide pe secund fa de 500 la procariote). Astfel pentru ntreaga replicare a unui cromozom uman, o singur furculi de replicare ar avea nevoie de 800 de ore, depind de circa 10 ori perioada S a ciclului celular.

Fig.6.14. Replicarea ADN-ului la eucariote 1- Puncte de origine; 2- Furculie de replicare; 3- Bule de replicare Pentru a se putea ncadra n faza S, replicarea ncepe pe fiecare cromozom n mai multe puncte de origine (circa 100 pentru fiecare cromozom uman). Pentru fiecare punct de origine apar dou furculie de replicare, ce se deplaseaz pe direcii opuse n lungul cromozomului genernd nite structuri denumite bule de replicare (fig. 6.14). Originile furculielor de replicare apar n grupe (de 20-80) situate toate ntr-o anumit zon. Fiecare grup se numete unitate de replicare (sau replicon). Repliconii se activeaz treptat n faza S a ciclului, zonele de heterocromatin fiind ultimele activate. Furculiele de replicare se deplaseaz cu aceeai vitez n tot cursul fazei S. Cnd ajung s se ntlneasc pe tot cromozomul, replicarea se termin, iar cei doi cromozomi se despart. Replicarea ADN-ului se produce paralel cu sinteza de histone, care are loc numai n faza S a ciclului celular. Odat sintetizate i asamblate n nucleozomi, histonele nu mai prsesc ADN-ul de care s-au legat nct miezurile nucleozomilor vechi trec numai pe unul din duplexuri, n timp ce pe cellalt duplex de ADN se leag numai de miezurile nucleozomilor noi sintetizai. Implicaiile i aplicaiile medicale ale replicrii ADN-ului constau n: a) apariia mutaiilor; b) sinteza reparatoare a ADN-lui i c) inhibarea sintezei de ADN. Apariia mutaiilor este rezultatul unor greeli care apar n procesul de replicare a ADN-ului. Un anumit nivel de apariie a mutaiilor (de obicei sczut) a fost necesar i util n evoluia speciilor, dar atunci cnd depesc acest nivel fac imposibil supravieuirea celulei, majoritatea mutaiilor fiind duntoare. Din aceast cauz celulele au numeroase sisteme enzimatice de reparare a erorilor care

119

pot apare n ADN spontan sau induse de ageni mutageni (fizici sau chimici). Mecanismele reparatorii sunt eficace, nct o mutaie spontan apare la un milion de replicri ale genelor. Pot s apar mutaii punctiforme (prin nlocuirea unui singur nucleotid) sau mutaii mari complexe, ca: deleii (lipsa unor secvene din ADN), inserii (secvene n plus de nucleotide). Frecvena mutaiilor poate crete foarte mult n urma aciunii unor substane, denumite mutagene, precum: a) unele substane chimice (ce modific direct bazele din ADN), agenii alchilani (care fixeaz radicalii metil, etil etc.) actiflavinele, cofeina; b) radiaiile ultraviolete; c) radiaiile ionizante (ce produc ruperea unuia sau a ambelor lanuri de ADN, pierderi de baze, modificri ale bazelor). Unii din aceti ageni pot fi folosii n terapia cancerului, ntruct celulele maligne sunt mai sensibile la aciunea lor (ca de exemplu, unii ageni alchilani, radiaiile ionizante). Sinteza reparatorie a ADN-lui se produce ntr-o anumit perioad de timp, nct exist posibilitatea (n cazul celulelor care prolifereaz foarte rapid) ca s nceap un nou ciclu de replicare nainte ca reparaia s fie complet. n acest fel, celulele care prolifereaz foarte rapid sunt foarte sensibile la radiaii, fapt ce permite folosirea radiaiilor ionizante n tratamentul cancerelor. Inhibarea sintezei de ADN este produs de o serie de substane chimice, care pot fi folosite n practica medical curent - ca substane antimicrobiene, antivirale i antitumorale (citostatice). Astfel: acidul nalidixic, un antibiotic, inhib biosinteza ADN-ului; acidul fosfonoacetic, un agent antiviral, inhib selectiv ADN-polimerazele virale i din celula gazd. Unele substane antitumorale (arabinozilcitozina, arabinoziladenina) inhib sinteza de ADN, iar altele (neocarcinostatina - o protein format din 109 aminoacizi) produc rupturi n molecula de ADN. 6.3.2.Transcrierea mesajului genetic n exprimarea informaiei genetice (a mesajului genetic) exist dou etape: 1) transcrierea (copierea) informaiei din ADN n ARN i 2) traducerea informaiei coninut n ARN n sinteza de proteine. Sub form prescurtat transmiterea informaiei genetice este cuprins n dogma central a biologiei moleculare care se exprim n formula: autoreplicare ADN transcriere ARN traducere proteine Astfel, genele din ADN determin sinteza de proteine de ctre celul, dar nu ADN-ul este matricea pe care se sintetizeaz proteinele, ci moleculele de ARN (Fig. 6.15). Moleculele de ARN care poart informaia genetic necesar pentru biosinteza proteinelor se numesc ARN mesager (ARN-m). ARN-ul mesager Conceptul de ARN mesager (ARN-m) a fost introdus n biologia molecular n 1961 de ctre JACOB i MONOD care au presupus existena unui ARN care este sintetizat i degradat foarte rapid, ce servete ca mesager al genei (aflat n nucleu), transfernd informaia de la nucleu la sediul sintezei proteinelor (ribozomi) - aflai n citoplasm. ARN mesager este o molecul sintetizat pe matria de ADN, avnd o secven a bazelor complementar ADN-matri. Pentru fiecare gen se sintetizeaz cte o molecul de ARN-m, care va servi la rndul ei ca matri pentru sinteza proteinei codificat de gena respectiv.

120

Fig. 6.15. Reprezentarea schematic a transmiterii informaiei genetice n celul, pe lng ARN-ul mesager, mai exist nc dou categorii de ARN, implicate direct n biosinteza proteinelor: ARN-l de transfer i ARN-ul ribozomal. ARN-ul de transfer (ARNt) transport aminoacizii activai la ribozomi, unde se realizeaz formarea legturilor polipeptidice n secvena dictat de matria de ARNm. ARN-ul ribozomal (ARNr) intr n componena ribozomilor, fr a i se cunoate precis rolul lui n biosinteza proteinelor. 6.3.3.1. Mecanismul molecular al biosintezei de ARN ARN-ul este o macromolecul lung format din ribonucleotide legate prin legturi 3-5 fosfodiesterice. Numrul de nucleotide variaz ntre 75 (n ARNt) i cteva mii (n ARNm). Toate tipurile de ARN sunt biosintetizate printr-un mecanism molecular asemntor, sinteza de ARN pe matri de ADN fiind catalizat de enzima denumit ARN-polimeraz-ADN-dependent (transcriptaz). Pentru realizarea sintezei de ARN sunt necesare urmtoarele elemente: 1) matria de ADN dublu helicoidal; 2) precursori activai, ca ribonucleozid-trifosfai (ATP, GTP, UTP, CTP); 3) ioni de magneziu sau alte metale bivalente. Sinteza de ARN se aseamn cu sinteza de ADN prin: a) direcia de sintez (de la 5 la 3, care este antiparalel lanului de ADN); b) mecanismul de alungire, care produce eliberarea de acid pirofosforic (din ribonucleozid-trifosfat), ce este hidrolizat, eliberndu-se energie. Diferenele ntre biosinteza de ARN i biosinteza de ADN constau n: 1) conservarea integral a matriei de ADN n procesul de sintez de ARN (n timp ce n sinteza de ADN matria este semiconservat); 2) ARN-polimeraza nu necesit un primer; 3) ARN-polimeraza nu desfoar activitate nucleazic. La eucariote, exist mai multe ARN-polimeraze, nct cele din clasa A produc ARNr, cele din clasa B produc ARNm, iar cele din clasa C produc ARNt. n timpul procesului de transcriere se parcurg mai multe etape dup cum urmeaz:

121

1) Legarea ARN-polimerazei de matria de ADN n regiunile promotoare care sunt recunoscute n mod specific, producndu-se dezrsuciri locale ale helixului. 2) Iniierea formrii lanului de ARN prin formarea primei legturi diesterice la nivelul regiunii dezrsucite. 3) Alungirea lanului de ARN se face n direcia de la 3 la 5 a matriei de ADN, n timp ce lanul de ARN crete n direcia 5 la 3. Matria de ADN transcris i reia conformaia dublu helicoidal, n timp ce poriunea urmtoare se dezrsucete. 4) terminarea lanului de ARN are loc n momentul n care pe matria de ADN se recunosc unele puncte de terminare, cu ajutorul unei proteine specifice. 5) maturarea sau prelucrarea are loc numai dup desprinderea de pe matri de ADN i este suferit numai de unele molecule de ARN. Maturarea const n: a) clivarea (ruperea) lanului de ARN (de 45 S) n lanuri mai mici (de 28 S i 18 S); b) metilarea unor grupri OH din riboz sau din bazele purinice i pirimidinice. La eucariote, trecerea ARNm din nucleu n citoplasm se face prin porii nucleeari sub forma unor precursori ribozomali. S-a demonstrat c, pentru fiecare gen (care are dou lanuri ADN), numai unul din cele dou lanuri de ADN este copiat, nct o gen codific o singur protein. Aplicaiile medicale legate de transcrierea mesajului genetic constau n folosirea unor inhibitori i a transcrierii n combaterea unor infecii microbiene sau virale. Astfel, rifampicina (extras din Streptomyces) i rifampicina (un derivat semisintetic) inhib n mod specific iniierea sintezei de ARNm. Actinomicina D inhib n mod specific transcrierea fr a inhiba replicarea ADN sau biosinteza proteinelor. 6.3.3.Traducerea mesajului genetic n biosinteza proteinelor n conformitate cu dogma central a biologiei moleculare, informaia genetic stocat sub forma secvenei de baze n ADN este transcris (copiat) n secvena de baze din ARNm i apoi este tradus (concretizat) n secvena ( dispunerea ) aminoacizilor din proteine. ntruct n acizii nucleici exist numai patru baze azotate diferite, iar n proteine exist 20 aminoacizi diferii, apare necesitatea existenei unui cod genetic (o form cifrat) care s permit legarea n proteine a acestor aminoacizi. Codul genetic reprezint, astfel, relaia care exist ntre secvena bazelor n ADN (sau n ARNm) i secvena aminoacizilor n proteine. El cuprinde 64 secvene (grupuri) de cte 3 nucleotide denumite codoni, care determin legarea unui aminoacid ntr-o protein, jucnd rolul unor cuvinte n traducerea informaiei genetice n sinteza proteinelor. Astfel, codonul U-U-U determin legarea fenilalaninei ntr-o protein. Codul genetic prezint urmtoarele caracteristici: a) este degenerat, deoarece legarea unui aminoacid (specificarea lui) ntr-o protein este determinat de mai muli codoni; b) prezint 3 codoni nonsens, care nu specific (leag) nici un acid, ci determin terminarea lanului polipeptidic; c) este universal, fiind acelai n toate celulele de la bacterii pn la om. Sinteza unei molecule de protein, prin asamblarea aminoacizilor, se face la nivelul ribozomilor, unde se citete informaia genetic de pe ARNm, participnd i o serie de proteine solubile, precum i aminoacizi activai legai de ARNt ce prezint: 1) un loc de punct de legare a aminoacidului i 2) un loc de recunoatere a matriei de ARNm, reprezentat de o secven de 3 baze, denumit anticodon. Anticodonul de pe ARNt recunoate secvena complementar de 3 baze din codonul de pe ARNm permind legarea specific a aminoacidului de matri. Pentru un aminoacid (din cei 20 existeni n proteine) pot exista mai multe molecule diferite de ARNt, legat de faptul c mai muli codoni pot specifica (lega) mai muli aminoacizi. (Fig. 6.16)

122

Fig.6.16. Schema moleculei de ARN t Moleculele de ARNt prezint: a) patru regiuni cu baze complementare dispuse n dublu helix, denumite tulpini (tulpina acceptor, tulpina D, tulpina T i tulpina anticodon) i b) 4 regiuni fr baze complementare denumite bucle (o bucl anticodon, o bucl D, o bucl T i o bucl variabil).(Fig. 6.16) Datorit apariiei structurii de dublu helix la nivelul tulpinilor, molecula de ARNt are o dispunere spaial n forma literei L, cu dou brae: a) un bra lung ce cuprinde tulpinile T i acceptor. Regiunile dublu helicoidale sunt perpendiculare una pe alta i conin fiecare cte 10 perechi de baze, ce corespund la o tur de dublu helix. Formarea regiunilor de dublu helix asigur moleculei o mare stabilitate, iar buclele ce proemin pot interaciona specific cu alte grupri de atomi. Astfel, anticodonul este situat la captul braului lung din L, iar aminoacidul este legat la captul braului scurt din L.

Rolul ARNt este de a lega specific aminoacizii liberi din citoplasm i de a-i transporta n ribozomi, permind legarea lor n lanul polipeptidic n secvena dictat de ARNm. (Fig.6.17)

123

Fig.6. 17. Aspectul tridimensional al moleculei de ARN-t Legarea aminoacidului de ARNt este catalizat de o enzim, denumit aminoacil-ARN-sintetaz existnd cte o enzim specific pentru fiecare din cei 20 aminoacizi, care poate lega aminoacidul de ARNt diferii. Aminoacidul ARNt-sintetaza catalizeaz dou reacii succesive: 1) activeaz aminoacidul legndu-l de AMP, formnd un compus intermediar, denumit aminoaciladenilat (aminoacil~AMP), care rmne legat de enzim pn ntlnete o molecul de ARNt specific pentru aminoacidul respectiv; AA + ATP = AA ~ AMP + ADP 2) transfer aminoacidul pe ARNt formnd complexul ARNt ncrcat ( aminoacil-ARNt ). Energia legturii macroergice din complexul aminoacil-ARNt poate fi utilizat ulterior n ribozomi pentru formarea legturii macroergice; AA~AMP + ARN t = AA~ ARN t + AMP Molecula de ARNt prezint la toate vieuitoarele o structur asemntoare, perfect adaptat funciei sale, fiind o molecul universal ca i codul genetic. Acidul ribonucleic ribozomal (ARNr) este reprezentat de mai multe specii cu constante de sedimentare diferite. ARNr este sintetizat n nucleu i intr n constituia celor dou subuniti ribozomale: a) subunitatea mic (40 S) i b) subunitatea mare (60 S), care se angreneaz, n citoplasm, cu subunitatea mic, realiznd ribozomul. 6.3.3.1.Mecanismul molecular al biosintezei proteinelor Formarea legturilor peptidice ntre aminoacizii care compun proteina are loc n ribozom, sinteza lanului polipeptidic avnd loc n direcia aminocarboxil. Ribozomul devine funcional numai atunci cnd are loc asocierea celor dou subuniti. (Fig. 6.18)

124

Fig.6.18. Schema sintezei proteinelor n celula eucariot Mecanismul sintezei de proteine, mai bine studiat la E.coli, este acelai n toate celulele i cuprinde trei faze: 1) faza de iniiere, 2) faza de elongare i 3) faza de terminare (la fel ca i la sinteza de ADN i de ARN). Faza de iniiere ncepe odat cu formarea compusului formil-metionil-ARNt prin legarea metioninei de un ARNt specific i prin blocarea gruprii amino prin formilare. n continuare se formeaz Complexul de iniiere 30 S la care particip formil-metionil-ARNt, subunitatea mic 30 S, ARNm i unele proteine solubile din citosol, denumite factori de iniiere (IF1, IF2, IF3), precum i GTP. Subunitatea mic (30 S) se leag de ARNm pe un loc specific situat la circa 10 nucleotide de la captul 5 al ARNm (factorul IF3 intervenind n aceast legare). Biosinteza proteinelor la procariote Faze A.Iniiere Timpi Formarea compusului formil metionil - ARNt 1.Inseria unui AA-ARNt B. Elongare 2.Formarea legturii peptidice Fenomene - se leag metionina de ARNt -se blochez gruparea amino prin formilare -se formeaz complexul de iniiere -pe locul A se inser un AA ~ ARNt -se transfer formil metionina de pe locul P pe gruparea aminoacil ~ ARNt de pe locul A -pe locul P rmne un ARNt descrcat -pe locul A se gsete un dipeptidil ~ ARNt -ARNt desccat prse locul P -dipeptidil ~ ARNt se mut de pe locu lA pe locul P -ARNm se deplaseaz spre captul 3! -n dreptul locusului A, pe ARNm apare un codon nonsens

3.Translocarea C. Terminare Terminarea sintezei lanului polipeptidic

De complexul 30 S se leag apoi subunitatea mare (50 S) a ribozomului, folosind pentru legare energia rezultat din hidroliza GTP-ului. S-a format astfel, complexul de iniiere (70 S), n care

125

pe ribozom exist dou locuri de legare: a) un loc P (de la peptidil) care este ocupat de formil-metionil-ARNt i b) un loc A (de la aminoacid) neocupat n complexul de iniiere. Faza de elongare se realizeaz n trei timpi (subfaze): a) inseria unui aminoacid; b) formarea legturii peptidice i c) translocarea. Inseria const n legarea pe locul A din ribozom a unui aminoacid-ARNt, ce corespunde codonului din ARNm, aflat n dreptul locului A. Codonul din ARNm este recunoscut de anticodonul ce transport aminoacidul cerut (specificat) de cele trei nucleotide ale codonului (din ARNm). Pentru inserie sunt necesare: o molecul de GTP i o protein din citosol numit primul factor al elongrii. n urma inseriei a rezultat un complex n care pe locul P se afl formilmetionil-ARNt-ul, iar pe locul A se afl un aminoacil-ARNt. Formarea legturii peptidice se produce cu ajutorul unei enzime denumit peptidil transferaz, existent n subunitatea 50 S a ribozomului, prin transferul formilmetioninei (de pe locul P) pe gruparea amino din animoacil-ARNt (aflat pe locul A). n urma formrii legturii peptidice pe locul P rmne un ARNt descrcat, n timp ce pe locul A se gsete un dipeptidil-ARNt. Translocarea cuprinde trei fenomene: a) ARNt descrcat prsete locul P; b) dipeptidil-ARNt se mut (transloc) de pe locul A pe locul P i c) ARNm se deplaseaz cu trei nucleotide spre captul 3. Datorit acestui fapt, codonul urmtor de pe ARNm este pregtit pentru a fi citit de ctre anticodonul unui nou aminoacid-ARNt corespunztor. Translocarea necesit hidroliza celei de-a treia molecule de GTP i intervenia celui de al treilea factor al elongrii, denumit translocaz. Odat ncheiat translocarea, ciclul elongrii se poate repeta, fiindc locul A a devenit vacant, iar n dreptul su se afl un alt codon, care poate fi recunoscut de aminoacidul ce prezint anticodonul complementar. n acest fel un alt aminoacid este legat n locul polipeptidic (P), iar mesajul genetic nscris n ARNm este citit de ctre anticodonii de pe ARNt i tradus n formarea unei legturi peptidice ntre aminoacizi n conformitate cu secvena dictat (specificat) de codoni. Faza de terminare a sintezei lanului polipeptidic se declaneaz n momentul cnd la sfritul fazei de elongare, n dreptul locului A din ribozom ajunge unul dintre cei trei codoni nonsens (UAA, UGA i UAG); n citoplasma celulelor normale nu se gsesc molecule de ARN cu anticodoni camplementari acestor codoni. Dar aceti codoni nonsens sunt recunoscui de o protein, denumit factor de eliberare (existnd doi factori de eliberare RF1 i RF2). Factorii de eliberare se leag de locul A i determin hidroliza legturii dintre polipeptid i ARNt de pe locul P, elibernd lanul polipeptidic terminat care prsete ribozomul. n continuare, ribozomul se disociaz n cele dou subuniti, care se desprind de ARNm, iar ARNt-ul este pus n libertate. Compoziia lanului polipeptidic sintetizat de un ribozom este determinat n mod exclusiv de ARNm i nu de felul ribozomului. n acest mod, aceiai ribozomi pot sintetiza lanuri polipeptidice diferite n funcie de matria de ARNm pe care sunt legai. 6.3.3.2.Particulariti ale biosintezei proteinelor la eucariote La eucariote, sinteza proteinelor are loc n ribozomii 80 S din citosol, iar iniierea sintezei lanului polipeptidic se face prin metionil-ARNt care nu este formilat ca la bacterii. Factorii de iniiere sunt mai numeroi i mai compleci la eucariote, ei controlnd viteza sintezei proteinelor. Viteza cu care se sintetizeaz proteinele este foarte mare, att datorit elongrii foarte rapide, ct i datorit faptului c o molecul~a de ARNm este tradus simultan de mai muli ribozomi. Grupul de ribozomi legat de o molecul de ARNm se numete poliribozom sau polizom. ntr-un polizom ribozomii sunt dispui la distane de circa 100 nucleotide unul de altul i fiecare ribozom sintetizeaz cte un

lan polipeptidic. (Fig. 6.19)

126

Fig.6. 19. Schema poliribozomului la eucariote 1- Subunitate mic; 2- Subunitate mare; 3- ARN m; 5-nceperea sintezei; 6- Terminarea sintezei lanului polipeptidic. n lanul polipeptidic, aminoacizii sunt legai n mod strict n ordinea (secvena) codificat de gen, nct codul genetic (limbajul bazelor nucleotidice din ADN i ARNm) este tradus n ordonarea (aezarea) aminoacizilor din molecula de protein. Numrul de lanuri polipeptidice care pot fi sintetizate pe o molecul de ARNm este diferit la procariote, de eucariote. Astfel, la eucariote pe fiecare molecul de ARNm se sintetizeaz un singur lan polipeptidic, n timp ce la procariote o molecul de ARNm sintetizeaz mai multe lanuri polipeptidice. Poriunea din ARNm care codific un lan polipeptidic se numete cistron i ncepe cu un codon de iniiere (unde se leag ribozomii) i se termin cu un codon nonsens. La eucariote ARNm este ntotdeauna monocistronic, pe cnd la bacterii este de obicei policistronic. Prin adugarea sau prin delecia (nlturarea) unei baze din ARNm apar mutaii, deoarece din acel punct de vedere citirea codonilor este greit, defazat fa de mesajul original, rezultnd alte cuvinte. La eucariote unele gene apar discontinui. Pn n prezent gena este definit ca o regiune a cromozomului (ca un fragment de ADN) care este copiat (transcris) ntr-o molecul de ARNm, iar aceasta este tradus ntr-un lan polipeptidic. La eucariote secvenele de ADN (denumite exoni) care codific aminoacizii sunt separate prin segmente de ADN (denumite introni) care nu codific. Din moleculele de ARNm precursor (ce apare prin transcrierea genei) sunt ndeprtate poriunile ce corespund intronilor, fragmentele rmase fiind legate cap la cap printr-un proces de ndire (splicing) ce se pot produce n nucleu n cursul maturrii ARNm. (Fig.6.20)

Fig. 6.20. Schema procesului de splicing a ARN-ului mesager i la eucariote exist posibilitatea ca unele secvene de ADN s produc cel puin dou molecule diferite de ARNm, datorit unor variaii n fenomenul de ndire. De asemenea, nu toate genele codific proteine. Influenarea biosintezei proteinelor cu ajutorul unor antibiotice sau prin aciunea unor toxine st la baza unor aplicaii sau implicaii medicale. Aplicaii medicale n practica medical sunt folosite antibiotice care inhib biosinteza proteinelor, acionnd pe subunitatea mic sau mare i pe ribozomi de tipuri diferite (70 S sau 80 S). Streptomicina i tetraciclinele acioneaz pe subunitatea 30 S, producnd citirea greit a ARNm (streptomicina) sau blocnd legarea aminoacil-ARNt pe locul A din ribozomi (tetraciclinele). Cloramfenicolul i ciclohexinida acioneaz pe subunitatea mare, blocnd activitatea peptidil transferazei. Eritromicina acioneaz pe subunitatea mare (50 S) a ribozomului procariotic, mpiedicnd translocarea. Puromicina acioneaz pe ambele tipuri de ribozomi producnd terminarea prematur a sintezei lanului polipeptidic. Unele toxine microbiene inhib biosinteza proteinelor la eucariote. Astfel, toxina difteric produs de Corynebacterium dyphteriae, blocheaz faza de elongare la eucariote, inactivnd translocaza.

127

7.Diferentierea si evolutia celulelor Diferenierea celular este procesul biologic, n care, pornindu-se de la o singur celul, se constituie tipuri celulare stabile, deosebite morfofuncional ntre ele. n biologie, diferenierea este un proces esenial, de el depinznd nsi apariia i existena organismelor individuale. Prin difereniere se realizeaz: 1) reproducerea, n urma creia se formeaz noi indivizi ntr-o specie; 2) creterea i dezvoltarea organismelor; 3) regenerarea celulelor sau a esuturilor lezate sau uzate; 4) evoluia speciilor i adaptarea organismelor la mediu. Diferenierea celular are caracter universal n lumea vie, fiind prezent la toate speciile de plante sau animale. Nefiind limitat n timp, diferenierea celular se desfoar pe tot parcursul vieii individului, din momentul concepiei i pn n momentul morii organismului. Intensitatea i amploarea diferenierii sunt variabile n timpul diverselor perioade ale vieii organismului, nregistrnd o intensitate maxim n embriogenez. La mamifere, diferenierea celular are un caracter ireversibil, nct nici o celul difereniat nu-i mai poate redobndi caracterele embrionare. 7.1.Mecanismele diferenierii celulare La mamifere, diferenierea celular debuteaz n momentul fecundrii, cnd se formeaz zigotul. Att zigotul, ct i celulele rezultate din primele diviziuni se pot diferenia n oricare din tipurile celulare funcionale ale adultului. Aceste celule care au potenial maxim de difereniere sunt denumite celule totipotente sau pluripotente i se caracterizeaz din punct de vedere genetic c au toate genele active (derepresate) nct accept orice mesaj genetic, putnd urma orice traseu evolutiv. Ele se pot integra n oricare din regiunile unui embrion avansat, la care soarta celulelor este definitiv, genernd structuri specializate n funcie de indicaia primit de la regiunea suport. O serie de factori extracelulari denumii factori determinani, oblig fiecare celul pluripotent s aleag un anumit traseu evolutiv, transformndu-se n celule determinate ( direcionate ). Determinarea reduce progresiv numrul de tipuri celulare specializate care pot lua natere din celule embrionare. Astfel, celulele pluripotente pot genera prin difereniere toate tipurile de celule adulte, dar mai trziu, odat cu apari,tia celor trei foie embrionare, din fiecare foi rezult un numr limitat de celule, ca de exemplu: celule nervoase din ectoderm; celule conjunctive, musculare din mezoderm etc. Dei cantitativ i calitativ genotipul celulelor pluripotente i determinate este identic, determinarea i diferenierea celular represeaz (inactiveaz) un numr variabil de gene, mereu altele n funcie de tipul de celule specializate. Cu ct vrsta embrionului este mai avansat, numrul genelor represate este mai mare, iar starea de celul determinat este ireversibil la mamifere. Factorii care impun alegerea unui anumit parcurs i deci diferenierea spre un anumit tip de celul specializat se numesc inductori. Inductorii acioneaz asupra unor celule int, iar aciunea lor este posibil numai dac celulele int devin permisive, n urma primirii unor mesaje sau influene directoare.

Etapele diferenierii celulelor Etap Iniial Determinrii Apariia celulelor permisive Denumirea celulei Celula totipotent (pluripotent) Celule determinate (direcionate) Celule stem multipoten -iale Exemple Zigotul i primele 8-16 blastomere Celule foielor embrionare Celule mezenchi male Hemohistio blast Hemocitoblast Celule multipoten -iale limfoide Celule multipoten -iale mieloide Caracteristici Toate genele sunt active (derepresate) Au gene active i gene inactive (represate) Sunt permisive Crete numrul genelor represate Crete numrul genelor represate Asupra lor acionez: Factori determinani Factori inductori Factori inductori

Apariia celulelor progeni-toare

Celule stem direcionate (formatoare de colonii)

Factori inductori

128

Apariia celuleor precursoare Apariia celulelor specializate

Celule tinere (blati) Celulele mature

Proeritro-blast Mieloblast Monoblast Limfoblast Neuroni, celule musculare, eritrocite, leucocite

Crete numrul genelor represate Numrul de gene active este caracteristic fiecrui tip celular

Factori inductori

Permisivitatea apare ca urmare a unor modificri genetice i structurale ce au loc la nivelul membranei celulare, modificri determinate de aciunea unui alt inductor anterior. Se remarc faptul c permisivitatea pentru un anumit inductor este limitat n timp. Diferenierea celular se realizeaz prin intervenia unui grup heterogen de factori inductori, care iniial acioneaz asupra unei populaii de celule pluripotente, iar mai apoi, asupra unor celule determinate (direcionate). Astfel, n ontogenez numrul determinrilor succesive coincide cu numrul inductorilor. n urma aciunii inductorilor i determinrii rezult celulele STEM, celule de origine, din care vor lua natere anumite tipuri de celule specializate. Astfel, celulele stem din mduva osoas hematogen sunt capt de serie pentru hematii, leucocite i trombocite, iar celulele nedifereniarte din epiteliu sunt capt de serie pentru diverse tipuri de epitelii. n organismul adult nu mai exist celule pluripotente, dar fiecare esut i fiecare organ mai are nc rezerve de celule stem incomplet difereniate (excepie fcnd esutul nervos i muscular cardiac). Aceste celule stem i pot continua programul de difereniere, putnd reface celulele specializate adulte, lezate sau uzate. La mamifere, celula difereniat i pstreaz aceeai cantitate de ADN ca i celula pluripotent, iar caracterele generale ale celulelor difereniate sunt expresia fnotipic a numrului de gene nerepresate din genotip. Diferenierea celular se realizeaz n dou etape: a) o etap a diferenierii intracelular i b) o etap a diferenierii intercelular. n etapa diferenierii intracelulare, n interiorul celulei se produc modificri structurale succesive care determin apariia formei i structurilor specifice celulei difereniate, ca de exemplu modificarea formei spermatogoniei i apariia flagelului. n etapa diferenierii intercelulare, modificrile structurale suferite de un grup restrns de celule dintr-o populaie mai mare determin apariia unor diferene ntre caracterele celulelor iniiale i caracterele celulelor provenite din celulele iniiale. Sub raport biochimic, diferenierea s-a realizat n momentul n care n celul s-a acumulat o substan specific, de regul o protein cu funcie enzimatic, ca de exemplu hemoglobina n hematii, actina i miozina n celulele musculare. Ca rezultat al diferenierii celulare apar funcii specifice fiecrui tip celular constituit, precum contractilitatea celulelor musculare, mobilitatea spermatozoidului, transportul de oxigen i bioxid de carbon. 7.2. Caracteristicile celulelor difereniate Caracterele celulelor difereniate sunt reprezentate de: 1) Specializarea funcional, care reprezint principalul obiectiv al diferenierii celulare, fr a se contrapune cooperrii cu alte tipuri celulare. 2) Morfologia (forma i structura) celulelor difereniate este specific n sensul dezvoltrii mai accentuate a organitelor celulare necesare ndeplinirii funciilor specifice. Astfel, reticulul endoplasmic rugos i complexul Golgi sunt foarte dezvoltate n celulele implicate n sinteza de proteine, iar aparatul de contracie, respectiv filamentele de actin i miozin, apare foarte dezvoltat n celulele musculare. 3) Compoziia chimic apare specific, datorit acumulrii unor proteine specifice sau datorit desfurrii unor activiti enzimatice specifice. 4) Adezivitatea pe substrat, care permite formarea esuturilor i organelor. 5) Interrelaia cu alte celule sau jonciunea, prin care se realizeaz solidarizarea ntre ele n cadrul unui esut. Prin jonciunile permeabile, de tip gap pot trece anumite molecule cu rol n reglarea funcional, permind funcionarea sincron a celulelor din esuturi. 6) Inhibiia capacitii de diviziune. Celulele difereniate sunt greu divizibile sau indivizibile (ca neuronul, hematia, celula muscular cardiac etc). Celulele difereniate divizibile i pot regla ritmul de

129

diviziune n funcie de necesiti (ca n cazul hepatocitelor). Capacitatea de diviziune este mai ntrziat sau inhibat n cazul celulelor cu grad de specializare avansat. De asemenea, n cazul unor esuturi n care celulele specializate au o durat de via foarte scurt, ca urmare a solicitrilor func,tionale intense (exemplu n epiteliu interstiial) se ntlnesc celule tinere, incomplet difereniate, capabile s se divid pentru refacerea populaiei de celule adulte specializate, epuizate. 7) Inhibiia de contact, care apare atunci cnd densitatea celulelor atinge un anumit grad ntr-un esut (ca, de exemplu n regenerarea epiteliilor dup lezionare) sau n culturile de celule. Prin aceast proprietate celulele sunt oprite din migrare i proliferare. Celule specializate 7.3. Caracteristicele celulelor nedifereniate Denumirea celulelor Specializarea funcional Eritrocite Transport de oxigen i dioxid de carbon Miocite Contracie Enterocite Absorbie i metabolism Celule caliciforme Sintez de substane mucoase Exocrinocitele pancreatice Sintez i secreie de enzime Endocrinocitele pancreatice Sintez de hormoni pancreatici Endocrinocitele din gonade Sintez de hormoni steroizi Nefrocitele Transport de ioni Neuroni Generare i conducere de impulsuri nervoase Macrofage Digestie intracelular Celulele nedifereniate prezint urmtoarele caracteristici. 1) Nu au funcii specifice, celulele nedifereniate pot ndeplini un singur rol, acela de a genera diverse tipuri de celule specializate n urma determinrilor succesive. 2) Nu au structuri specifice, toate celulele nedifereniate sau parial difereniate sunt asemntoare prezentnd: nucleul mare, eucromatic, citoplasma redus cantitativ, slab bazofil datorit numrului sczut de ribozomi. 3) Nu au compoziii chimice specifice. 4) Prezint adezivitate pe substrat, nct atunci cnd vin n contact se recunosc, ader i formeaz esuturi sau organe. 5) Joncionarea cu alte celule se poate realiza prin jonciuni de tip gap, cu un diametrul mai mic dect n cazul celulelor difereniate. Aceste jonciuni prezint un mare dinamism desfcndu-se i refcndu-se cu rapiditate. 6) Prezint o mare capacitate de diviziune, ceea ce permite unui numr redus de molecule inductoare care acioneaz iniial asupra unui numr foarte mic de celule s genereze un numr mare de celule. 7) Prezint inhibiie de contact, ca i n cazul celulelor difereniate. n momentul n care iau contact cu alte tipuri de celule, celulele nedifereniate se opresc din migrare, putnd s realizeze esuturi i organe. Celulele mature pot suferi fenomenul de modulaie i de metaplazie. Modulaia este fenomenul prin care n celulele mature, n anumite condiii fiziologice sau patologice, pot s apar modificri structurale i funcionale, minore i pasagere, reversibile, care le fac s semene cu celula tnr din care au provenit. Astfel, fibrocitele se pot transforma n fibroblaste n culturile de celule, datorit condiiilor de mediu. Metaplazia este fenomenul de transformare a unei celule difereniat ntr-o celul difereniat de alt tip. Metaplazia apare exclusiv la esutul epitelial i conjunctiv. 7.4.mbtrnirea i moartea celulelor n viaa sa, celula parcurge urmtoarele stadii (sau faze): 1) un stadiu de funcionare normal; 2) mbtrnirea (sau senescena); 3) agonia; 4) moartea celular. Celule mbtrnite sufer o serie de modificri morfologice precum: a) scderea volumului celular; b) scderea ritmului mitotic i creterea procentului de celule moarte, ntr-o populaie de celule; c) modificri ale nuceului i d) modificri ale citoplasmei.

130

Fig.7.1. Modificri ale nucleului n timpul nbtrnirii i morii celulelor 1-Picnoza; 2- Cariorexis; 3- Carioliz Modificrile nucleului sunt reprezentate de: a) picnoza nuclear, care const n retractarea i condensarea nucleilor, colorare intens (hipercromie) i dispariia detaliilor de structur; b) cariorexis sau fragmentarea nucleului; c) carioliza sau dispariia (dizolvarea) nucleului. Modificrile citoplasmei constau n: scderea bazofiliei, vacuolizarea citoplasmei, acumularea de pigmeni de uzur i lipide ca urmare a scindrii moleculelor lipoproteice. (Fig.7.1) n celulele n agonie se observ: a) modificri nucleare asemntoare celor ntlnite n celulele mbtrnite; b) modificri ale organitelor citoplasmatice, cu eliberare de fosfolipide i formarea de figuri mielinice; c) modificarea strii coloidale a citoplasmei (fluidificare sau gelificare) i modificri ale curenilor citoplasmatici. Ipotezele i teoriile privind mbtrnirea i moartea celulelor se pot grupa n dou categorii: a) o teorie a erorilor i b) o teorie a morii programate a celulelor. Teoria erorilor consider c senescena celular (mbtrnirea) este o consecin a acumulrii defectelor genetice n urma aciunii radiaiilor, agenilor mutageni sau radicallor liberi din mediu asupra ADN-ului sau asupra diferitelor etape din transcrierea i traducerea informaiei genetice. Rezultatul acestei aciuni este producerea unor erori n sinteza unor proteine i n funcionalitatea lor. O variant a teoriei erorilor o reprezint teoria invaziei virale care consider senescena celular ca fiiind o consecin a ncorporrii ADN-ului viral n genomul celulei. Prin teoria erorilor nu se poate explica ns variabilitatea duratei de via a diferitelor tipuri de celule. Teoria morii programate, recent elaborat, susine c fiecare tip de celul are nscris n programul genetic o anumit durat de via, dup care celula moare. Aceast teorie este sprijinit de rezultatele experimentale obinute de HAYFLICK (1986), care, n culturi de celule, a observat c fibroblastele provenite din esutul embrionar se divid de 50 de ori, n timp ce la fibroblastele provenite de la persoane de diferite vrste, numrul diviziunilor scade treptat cu vrsta. Dac culturile de celule sunt ngheate mai muli ani, la dezgheare, culturile se divid exact de attea ori, ca i celulele de aceeai generaie nengheate. Descifrarea mecanismului programrii morii n celulele normale poate oferi cheia vindecrii cancerului i prelungirea vieii. mbtrnirea celular apare ca un proces cu semnificaii structurale i funcionale variate pentru diferitele tipuri de celule existente n organism. Astfel, celulele cu ritm rapid de diviziune au un proces de mbtrnire cu un mecanism de producere diferit fa de unele celule nedivizibile. Orice tip celular difereniat divizibil parcurge n cursul viaii organismului un numr precis de diviziuni programate genetic, nct mbtrnirea poate s se traduc prin scderea ritmului sau chiar oprirea complet a procesului de diviziune. n cazul celulelor nedivizibile n cursul vieii organismului (neuronul, celulele musculare) mbtrnirea se traduce prin acumularea de macromolecule cu proprieti diferite de cele iniiale sau prin acumularea de substane nedegradabile (ca lipofuscin etc.). ntre senescena celular i mbtrnirea organismului ntreg este o mare diferen, organismul animal fiind format din mai multe sisteme. Astfel mbtrnirea organismului este rezultatul mbtrnirii fiecrui sistem n parte i mai ales rezultatul mbtrnirii moleculelor, celulelor, esuturilor i organelor, fiecare dintre acestea mbtrnind ntr-un mod specific, diferit. Moartea celulei Studierea mecanismelor i a cauzelor care produc moartea celulei constiuie obiectul de studiu al tanatologiei celulare.

131

Moartea celulei se produce instantaneu, nct post mortem se poate observa: a) retractarea pseudopodelor i adoptarea unei forme sferice; b) o colorare difuz a nucleului i citoplasmei cu colorani vitali; c) balonarea i dispariia mitocondrilor; d) picnoz, cariorexis i carioliz nuclear. Aceste modificri sunt rezultatul eliberrii enzimelor din lizozomii alterai, ca urmare a ncetrii circulaiei sanguine i constituie un semn cert al morii organismului animal. Sunt descrise trei tipuri de moarte a celulelor: moartea celular programat, apoptoza i necroza. Moartea celular programat sau oncoza const n autodistrugerea celului prin activarea unui program genetic propriu i specific. Se ntlnete n cursul dezvoltrii ontogenetice embriofoetale, pe parcursul dezvoltrii sau funcionrii unor organe (de exemplu: in- voluia glandei mamare, la ncheierea unui ciclu de lactaie sau involuia uerului la ncetarea strii de gestaie. Apoptoza este o moarte celular lent, care intervine dup primirea unor semnale intrinseci i se realizeaz prin mecanisme proprii. Prin acest tip de moarte celular, organismul se elibereaz de anumite celule care nu-i mai sunt utile (celule lezate, celule n exces, celule cu ADN-ul modificat i nereparat, etc) n producerea apoptozei se pot distinge patru stadii evulutive : un stadiu molecular, un stadiu de contractare, un stadiu de clivaj i un stadiu de fagocitoz. n stadiul molecular sau de preangajare apar modificri ale membranei i citoplasmei care i permit celulei s recepioneze semnale (de obicei chimice: AMP-c, inozitol trifosfatul, ioni de calciu, etc), ce produc modificarea permeabilitii membranelor celulare, dispariia microvililor , dispariia jonciunilor i pierderea contactului cu celulele adiacente. Ca o consecin a acestor fenomene se produce activarea unor gene de liz sau gene letale (protooncogene c-fos, c-myc, antioncogena P 53). Aceste gene induc sinteza de macromolecule efectoare sau activatoare ale apoptozei (proteina de stress hsp 70, catepsina D etc.) Celulele prsesc angrenajul tisular, citosolul se condenseaz, plasmalema prezint invaginaii adnci, iar n nucleu apare o hipercromatoz marginal, datorit dispunerii periferice a eucromatinei nucleare. n acest stadiu ribozomii i mitocondriile nu sunt modificate,iar celula este nc capabil s elimine colranii vitali n stadiul urmtor, de clivaj n corpi apoptotici, cisternele reticulului endoplasmic i unii saci golgieni se vacuolizeaz, iar fibra de cromatin este fragmentat, sub aciunea unor endonucleaze, dependente de calciu i sensibile la zinc. Apar corpii apototici cu aspectul fragmente celulare delimitate de plamalem i coninnd citosol, organite i oligonucleozomi. Stadiul de fagocitoz i de eliminare a corpilor apoptotici este de scurt durat, deoarece corpii apoptotici sunt recunoscui imediat de lectine i receptorii macrofagelor i eliminai prin fagocitoz. Citonecroza sau necroza sau necrobioza este o moarte celular violent. Se produce sub o aciune patogen intens ce depsete posibitile de adaptare ale celulei i cuprinde un numr mai mare de celule. ntr-o prim faz celula se tumefiaz, apoi lizozomii elibereaz hidrolazele acide, nct celulele se lizeaz n totalitate,genernd o reacie inflamatorie n teritorillie nvecinate. Nucleul trece prin modificri profunde (picnoz, carirexis i carioliz).Celulele necrozate i mresc volumul, contrar fa de ceea ce se ntmpl n apoptoz.

7.5. Recunoaterea celular Celula posed capacitatea de a se recunoate unele pe altele n mod specific. Astfel, dac un embrion de gin este disociat n celule independente, prin tratament cu tripsin, dup cteva ore celulele aflate n suspensie se agreg (se grupeaz) din nou. Dac se amestec celule ectodermice i mezodermice, iniial se formeaz un conglomerat sferic, dar dup 1-2 zile, celulele se separ dup tip, cele mezodermice dispunndu-se la interior, iar cele ectodermice la exterior. Fenomenul se datoreaz glicoproteinelor prezente n membrana citoplasmatic, care formeaz molecule specifice, capabile s transmit informaia genetic. n cultur fenomenul recunoaterii celulare se manifest n cazul celulelor normale prin inhibiia de contact nct contactul cu peretele lateral al vasului i cu celulele vecine ofer celulei informaia necesar pentru oprirea diviziunii. Inhibiia de contact este absent n cazul celulelor maligne i a unor celule transformate, care apar spontan n culturile de celule normale. Pierderea inhibiiei de contact nu este ns un criteriu suficient pentru a defini o celul malign sau o celul transformat. Astfel n 1960, AUB a descoperit c celulele maligne i transformate au un plus nc o proprietate care le deosebete de celulele normale, ele fiind aglutinate de lectine (sau fit - hemaglutinine) care sunt proteine vegetale ce se leag de glicolipidele i glicoproteinele din membranele celulelor transformate i tumorale.

132

7.6.ONCOGENELE Oncogenele sunt o categorie de gene, care pot s determine transformarea unei celule normale ntr-o celul canceroas. Sunt considerate o form mutant a unei gene normale (protooncogen) implicat n creterea i diviziunea celulelor. Modificrile de membran ale celulelor maligne se datoresc modificrilor intervenite n exprimarea unor gene, care determin compoziia i proprietile membranei celulare periferice, ceeace face ca celulele maligne s aib o capacitate de cretere autonom, ele reproducndu-se i prolifernd independent de mecanismele normale de reglare. Un model al genezei cancerelor (cancerogenezei) propus de HUEBNER i TODARO (1969) susine c n toate celulele normale exist un virus integrat n cromozomi (un provirus). La un moment dat se produce activarea uneia din genele virale (denumit oncogen) care codific proteine ce pot s transforme o celul normal ntr-o celul malign. S-a constatat c, n cromozomii umani, exist gene care au secvene foarte asemntoare cu oncogenele virusurilor cu ARN (denumite v-oncogene). Astzi se tie c nu oncogenele celulare provin din cele virale (deci nu sunt virusuri integrate), ci dimpotriv virusurile au preluat din celulele normale aceste gene. Oncogenele celulare au fost denumite i proto-oncogene i se pare c s-au conservat, n evoluie, un timp foarte ndelungat, ndeplinind funcii foarte importante. Pn n prezent nu se cunoate ce rol au n celula normal i nici ce este modificat, atunci cnd se produce cancerul, determinnd perturbri n exprimarea oncogenelor. n cancer s-au descris modificri ale cromozomilor ca ruperi de cromozomi i transferuri ale fragmentelor pe ali cromozomi, oncogenele fiind localizate tocmai n locul n care se rup cromozomii sau n fragmentele translocate. Sunt cunoscute 18 proto-oncogene, care se pot clasifica n dou clase: a) myc i b) ras. Oncogenele myc intervin n codificarea proteinelor nucleare, regleaz transcrierea i induc transcrierea unor gene eseniale, critice pentru proliferarea celular. Oncogenele ras codific o serie de proteine ce se localizeaz n citoplasm i determin modificri de form, de adezivitate i de recepionare a unor semnale de cretere. Se pare c o celul devine transformat malign ntruct secret n exces un factor stimulator al creterii celulare, care printr-un mecanism autocin suprastimuleaz nsi creterea celulei care l-a produs. Date recente par a indica c o singur oncogen nu poate produce cancer, fiind necesar colaborarea mai multor oncogene care intr n activitate n fiecare din etapele carcicogenezei. Cunoscndu-se mecanismele moleculare ale malignizrii se pot identifica punctele unde aceasta va putea fi ntrerupt nct se sper c biologia molecular va contribui la adoptarea unei adevrate terapii a cancerelor.

8.MATRICEA EXTRACELULAR Matricea extracelular sau intercelular este mediul n care triesc i i desfoar activitatea diferitele tipuri de celule ale organismelor pluricelulare. n acest mod, celulele se afl n contact cu o reea de macromolecule, denumit matricea extracelular, care ocup spaiul intercelular continundu-se cu glicocalixul. Matricea extracelular

133 Componente Membrana bazal Ultrastructuri A.Lamina bazal (lamina lucida + lamina reticularis) B. Lamina reticular Fibre de colagen Fibre intercelulare Fibre elastice (oxitalanice, de elaunin) Fibre de reticulin Compoziie molecular colagen IV proteoglicani (perlecan) fibronectin laminin colagen fibrilar (I, II, III ) colageni asociai fibrilelor ( IX, XII) elastina fibrilina elaunina colagen III - Glicozaminaglicani: acidul hialuronic,condroitin sulfaii, keratan sulfaii,heparina - Proteoglicanii : agrecan,sindecan, betaglican) - Glicoproteinele structurale : fibronectina,laminina,condronectina, uvomorulina, glicoproteina 115 ap, ioni, micromolecule de proteine

Substan fundamental Lichid tisular

astructurat astrucuturat

Matricea extracelular este compus dintr-o mare diversitate de molecule de proteine i de poliglucide,care sunt asamblate ntr-o reea, ce menine strnse raporturi cu suprafaa celulelor, care le sintetizeaz.Este bogat n polimeri fibrilari, n special de colagen, care rezist mai mult dect celulele la diferite solicitri mecanice. Exist mari diferene n cantitatea, tipul de molecule i modul de organizare a matricei extracelulare, fiecare form de organizare fiind adaptat la solicitrile funcionale ale esutului.Astfel,matricea extracelular se calcific n esutul osos i n dini, este transparent n cornee.n esutul conjunctiv, matricea este mai abundent dect n alte tipuri de esuturi, nct celulele apar relativ mai rare. Matricea extracelular particip la realizarea unor structuri specializate precum: membranele bazale, cartilagiile i tendoanele. iar mpreun cu depunerea cristalelor de fosfat de calciu particip la formarea oaselor i dinilor. Funciile matricei extracelulare sunt multiple: a) stabilizeaz structura fizic a esuturilor; b) lubrefiaz, amortizeaz ocurile mecanice i asigur elasticitatea esuturilor i organelor; c) asigur i controleaz adezivitatea celular, acionnd ca un clei intercelular universal; d) influeneaz i controleaz creterea, diferenierea, proliferarea i migrarea celulelor; e) ndeplinete un rol metabolic activ. n alctuirea matricei extracelulare intr trei componente: a) membrana bazal; b) fibrele intercelulare (colagene, elastice i reticulare) i c) substana fundamental a matricei. 8.1.Membrana bazal Membrana bazal (membrana basalis) sau lamina bazal este o structur special situat sub celulele epiteliale (pe care le separ de esutul conjunctiv subiacent) sau n jurul unor celule individuale (musculare, adipoase, celula Schwann). n histologia clasic, termenul de membran bazal a fost atribuit structurilor alctuite dintr-o lam fin polizaharidic, ce ndeplinea rolul de a cimenta baza epiteliilor i care se asociaz cu o tram reticular fin, n contact cu esutul conjunctiv. Lama poliglucidic a fost evideniat selectiv prin impregnri cu sruri de argint sau prin reacia PAS cnd se coloreaz n rou purpuriu. Epiteliile n marea lor majoritate, prezint membrane bazale de form lamelar, cu o grosime de ordinul zecilor de nanometri (40-120, n epiderm, epiteliul cilor respiratorii, glandele exocrine). Membrane bazale mai groase (de civa micrometri) sunt prezente la nivelul epiteliilor corneei (anterior i posterior), cristalinului. n alte cazuri, ca n epiteliul vezicii urinare, existena membranei bazale a fost pus la ndoial n histologia clasic, grosimea ei fiind sub puterea de rezoluie a microscopului optic. n glomerulul renal (n foia visceral a capsulei Browmann) sau n epiteliul alveolar, membrana bazal este singura care se interpune ntre epiteliul respectiv i endoteliul capilarelor sanguine, acionnd ca un filtru foarte selectiv. (Fig.8.1)

134

Fig.8.1.Ultrastructura membranei bazale 1- Nucleu; 2- Citoplasm; 3-Plasmalem; 4- Membrana bazal; 5- Fibre conjunctive; 6.Lamina lucida; 7- Lamina densa; 8- Lamina reticularis; 9- Colagen La microscopul electronic, membrana bazal se prezint ca o structur matriceal fin care se interpune ntre esuturile epiteliale i esutul conjunctiv subiacent. Membrana bazal prezint n alctuirea sa trei structuri lamelare suprapuse: 1) lamina lucid (lamina lucida), cu grosime de 10 nm, adiacent plasmalemei bazale a celulelor epiteliale, omogen i traversat de rare filamente fine; 2) o lamin dens (lamina densa s.basalis), cu grosime de 20-30 nm format din filamente fine, abundente, cuprinse ntr-o matrice amorf, dens i 3) o lamin reticulat (lamina fibroreticularis), care face trecerea la matricea esutului consjunctiv. Membrana bazal este produs, prin secreie, de ctre celulele ce se sprijin pe ea i se leag prin dispozitive joncionale speciale de adezivitate, denumite hemidesmozomi. n epiteliul stratificat pavimentos cornificat al epidermului, lamina basalis este ancorat de esutul conjunctiv subiacent prin fibrile de ancorare (anchoring fibrils), formate colagen VII. Compoziia chimic a membranelor bazale variaz de la un esut la altul, de la o regiune la alta a aceleiai lamine i cuprinde: colagen (de tipul IV ), proteoglicani (precum un mare heparan sulfat, denumit perlecan), fibronectin, entactina i laminina. Laminina este una din primele proteine ale matricei extracelulare, sintetizat de celulele embrionare. n stadiile timpuriii ale structurrii, lamina bazal este format dintr-o reea de laminin, colagenul IV lipsind sau fiind redus cantitativ.

135

Fig.8.2. Componentele membranei bazale Laminina este o macromolecul (850.000 daltoni), complex flexibil, format din trei lanuri polipeptidice foarte lungi, legate ntre ele prin legturi disulfidice i dispuse n fom de cruce asimetric. Are mai multe domenii funcionale care leag colagenul IV, heparan sulfatul, entactina, iar unul sau mai multe domenii se leag de unele de pe suprafaa celulei proteine receptori. Asemntor colagenului IV, moleculele de laminin pot forma, in vitro, o reea prin stabilirea de interaciuni ntre capetele braelor moleculei de laminin. Entactina, o molecul proteic cu aspect de halter, se leag strns de braul scurt al fiecrei molecul de laminin. totodat entactina se mai leag de colagenul IV, jucnd rolul unei punii de legtur ntre colagenul IV i reeua de laminin din membrana bazal. Funciile membranei bazale sunt multiple i complexe: 1) Acioneaz ca un filtru semipermeabil selectiv, reglnd trecerea macromoleculelor (exemplu, din snge n urin, la nivelul glomerulilor renali). Heparan sulfatul joac un rol mportant n realizarea acestei funcii, nct atunci cnd lanurile de glicozaminoglicani sunt distruse enzimatic, funcia de filtru selectiv este distrus. (Fig. 8.2) 2) Acioneaz ca o barier celular n epitelii, oprind trecerea fibroblastelor,nct acestea nu ajung n contact direct cu celulele epiteliale, dar permite trecerea macrofagelor, limfocitelor i a prelungirilor nervoase. 3) Particip la regenerarea esuturilor lezionate (epitelii, muchi, nervi), funcionnd ca un suport pentru deplasarea celulelor n cursul regenerrii esuturilor epiteliale, a jonciunilor neuromusculare. n cazul jonciunii neuromusculare, membrana bazal care nconjoar celula muscular prezint o poriune joncional care se interpune ntre terminaiile neuronului motor i plasmalema celulei musculare. Aceast poriune joncional joac un rol central n refacerea sinapsei dup lezarea nervului sau a muchiului.Astfel, membrana bazal joncional ghideaz terminaiile nervoase motorii i controleaz localizarea receptorilor pentru acetilcolin n plasmalem celulei musculare. n extractele obinute din membrana bazal joncional s-a identificat o nou protein matriceal, denumit agrin, care adaugat la culturile de celule musculare, iniaz apariia de structuri sinaptice n plasmalem. Agrina este produs nu numai de neuronii motori i pare a avea rolul n configurarea ansamblului de receptori i de alte macromolecule postsinaptice. 4) Particip la recunoaterea intercelular i la ghidarea celulelor, n timpul dezvoltarii embrionului. Astfel, s-a observat c mutaia unei gene care codific o protein asemntoare lamininei perturb cile pe care unele celule mezodermice i axoni nervoi se deplaseaz pe memebrana bazal ce susine epidermul.

136

5) Membranele bazale sunt capabile s: induc diferenierea celular, s determine polaritatea celular, s influeneze metabolismul celular, s organizeze proteinele din membrana plasmatic adiacent i s constituie o cale specific pentru migrarea celulelor. 8.2. Fibrele intercelulare Fibrele intercelulare sunt reprezentate de: a) fibrele de colagen; b) fibrele elastice cu varianta lor fibrele oxitalanice i c) fibrele de reticulin. 8.2.1. Fibrele de colagen Fibrele de colagen (Fibrae collagenosae) sunt alctuite din proteine fibroase (sau scleroproteine), constituite din molecule de colagen, care reprezint aproximativ 25-30% din totalul proteinelor din organism. Molecula de colagen are o lungime de 300 nm i un diametru de 1,5 nm, fiind format din trei lanuri polipeptidice numite lanuri alfa, rsucite n triplu helix. Configuraia de triplu helix a moleculei de colagen este stabilizat prin puni de hidrogen i legturi bisulfidice, realizate ntre cele trei lanuri, din care dou lanuri alfa 1 (1) sunt asemntoare ntre ele prin frecvena aminoacizilor, dar difer de cel de al treilea lan, denumit lan alfa 2 (2). Lanurile alfa pot fi de 25 tipuri diferite, fiecare fiind codificat de cte o gen proprie. Un lan conine 1000 radicali de aminoacizi, este rsucit n helix spre dreapta, pe fiecare tur existnd o triplet de aminoaci ( glicin -prolin -hidroxiprolin). Prolina are o form sferic, stabilizeaz conformaia helicoidal n fiecare lan .Glicina, cel mai mic aminoacid din lan (avnd numai un atom de hidrogen n lan) permite mpacetarea strns a celor trei lanuri pentru a forma n final triplu helixul de colagen. Genele care codific lanurile sunt foarte mari, ajungnd la o lungime de 44 Kilobaze i conin n jur de 50 exoni. Multi exoni au o lungime de 54 (sau un multiplu de 54) de nucleotide, ceea ce sugereaz c colagenii iau natere prin multiple duplicaii ale unei gene primordiale ce conine 54 nucleotide i codific tripleta Gly-X-Y (glicin-prolin-hidroxiprolin).

Fig.8.3. Schema moleculei de colagen IV A-Domeniu necolagenic 1 (globulus); B- Domeniu necolagenic 2; C- Fragment 7 S; D-Segment major; E- Zona mobil a moleculei. Exist 25 lanuri care pot fi asamblate n mai mult de 10.000 tipuri de molecule de colagen, dintre care numai 15 sunt mai bine cunoscute. Principalele tipuri de colagen din esutul conjuctiv sunt colagenul de tip I, II, III,IV, V i XI (Fig.8.3). Colagenul de tip I, fibrilar, este cel mai comun,fiind principalul colagen din piele, tendoane, oase i capsule. Prezint o structur molecular tipic, n triplu helix (Fig.8.4). Colagenii de tip IV i VII formeaz reele (network-forming collagens).Moleculele de colagen IV formeaz o estur care ocup o parte important din membrana bazal. Moleculele de colgen de tip VII formeaz dimeri, care ntr n structura fibrilelor de ancorare (anchoring fibrils), mai abundente n piele i care ajut la ancorarea membranei bazale a epidermului la esutul conjunctiv subiacent. Colagenii de tip IX i XII, denumii colageni asociai fibrilelor (fibril-associated collagens) acoper suprafaa acestora i particip la legarea fibrilelor att ntre ele, ct i de ali componeni ai matricei extracelulare.

137

Fig.8.4. Lanurile polipeptidice ale moleculei de colagen Colagenul de tip I, II i III polimerizeaz sub form de fibrile de colagen i organizeaz colagenul fibrilar care intr n alctuirea fibrelor de colagen i reticulin. Colagenul de tip IV i V nu formeaz fibrile, fiind colagen afibrilar i intrnd n structura membranelor bazale i nvelitorilor fetale. n mediul extracelular, moleculele de colagen polimerizeaz, formnd microfibrile de colagen (microfibrilla colagenoidea), cu diametrul de 10-300 nm, lungi de mai multe sute de microni, observabile n electronomicrografii. Fiecare microfibril de colagen prezint o alternan regulat de benzi clare i ntunecate, ce se succed cu o periodicitate de 67 nm, datorit dispunerii ordonate a moleculelor. n microfibrile, moleculele de colagen (sau tropocolagen) sunt dispuse paralel ntre ele i n scar, aprnd astfel, de-a lungul microfibrilei, zone lacunare (gap) de 35 nm ce alterneaz regulat cu zone de suprapunere. Zonele sau benzile lacunare apar negre la microscopul electronic, deoarece au mai muli radicali liberi care fixeaz mai uor colorantul negativ. Mrimea gap-ului este astfel aranjat, nct se repet dup 5 molecule de colagen. (Fig.8.5)

Fig.8.5. Dispunerea microfibrilelor n fibra de colagen Microfibrilele de colagen se leag ntre ele, prin interaciuni covalente transversale, ce se stabilesc ntre radicalii de lizin din moleculele constituiente, formnd fibrilele de colagen (fibrilla colagenosa), groase de 0,2 - 0,5 m. Dac legturile transversale sunt inhibate, rezistena la ntindere este foarte redus, iar formaiunile colagenoase din piele,tendoane i vase devin fragile, rupndu-se. n unele structuri (tendonul Ahile), legturile transversale sunt foarte dese, asigurnd o foarte mare rezisten la intindere. Fibrilele au diametre variate i se organizeaz diferit. n pielea mamiferelor se dispun n reele pentru a rezista la traciuni pe mai multe direcii.n tendoane, se dispun n benzi parale, orientate n axul major al tensiunii. n osul matur i n cornee, se dispun n lamele,iar fibrlele dintr-o lamel sunt paralele ntre ele, dar perpendiculare pe cele din lamela nvecinat. Celulele conjunctive regla mrimea i dispunerea fibrilelor de colagen, prin ghidarea dispunerii moleculelor de colagen dup secreie n strns asociere cu plasmalemma. n plus, organizarea spaial a fibrilelor de colagen este influenat i de interaciunile cu alte molecule din matricea extracelular. Astfel, molecule de colagen de tip IX i XII sunt produse de nsui celule conjunctive locale i devin colageni asociai fibrilelor. Colagenii asociai fibrilelor difer de colagenii fibrilari prin mai multe particulariti: - au structura triplu helicoidal ntrerupt de unul sau dou domenii nonhelicoidale, ceea ce le confer mai mult flexibilitate; - rein propeptidele dup secreie; - nu se grupeaz pentru a forma fibrile;- se leag periodic de suprafaa fibrilelor din colagenii fibrilar. Astfel, colagenul de tip IX se leag de colagenul II,

138

coninut n cartilagii, cornee i corpul vitros.Clagenul de tip XII se leag de colagenul I din tendoane i din alte esuturi. Colagenii asociai fibrilelor au rolul s medieze att interaciunile fibrelor ntre ele, ct i cu alte molecule din matrice, jucnd un rol deosebit n dispunere fibrilelor. Un numr variabil de fibrile de colagen se asociaz i formeaz fibre de colagen(fibra collagenosa), cu grosimi ntre 1 i 20 m. La rndul lor, fibrele sunt unite ntre ele prin ca hexoze, care confer o reacie PAS-pozitiv fibrelor de colagen. Fibrele de colagen sunt cilindrice lungi i sinuoase cu capete care se pierd n matricea extracelular. Sunt denumite i fibre albe i nu se anastomozeaz ntre ele, dar se pot grupa n benzi, n unele esuturi conjunctive. Sunt foarte rezistente i apar birefringente la microscopul de polarizare. Fiind acidofile se coloreaz n roz cu eozina, n albastru prin coloraia tricromic Mallory i n verde cu coloraia tricromic Masson. Pot fi degradate sub aciunea colagenazei, care elibereaz molecula de tropocolagen la un anumit nivel i mparte triplul helix n dou fragmente inegale, unul reprezentnd 75% din molecul, iar cellalt 25%. Numai n cazuri rare se reueste s separe unul de altul cele trei lanuri ale moleculei de colagen. Formarea (geneza) fibrelor de colagen Colagenul este produs (sintetizat i secretat) de ctre fibroblaste (n esuturile conjunctive), condroblaste (n cartilaj), osteoblaste (n esuturile osos). Producerea colagenului are loc n dou etape: o etap intracelular i alta extracelular.(Fig.8.6)

Fig.8.6. Etapele producerii fibrei de colage

139

n etapa intracelular are loc:- copierea genelor (transcripia) care codific sinteza moleculelor de colagen; - traducerea mesajului genetic n sinteza lanurilor pro ; - hidroxilarea radicalilor de prolin i lizin, precum i glicozilarea radicalilor de hidroxilizin; - elaborarea lanurilor polipeptidice, formarea legturilor bisulfidice i asamblarea lanurilor polipeptidice cu formarea de triplu helix; - mpachetarea procolagenului n complexul Golgi i eliberarea acestuia n mediul extracelular. Lanturile polipeptidice de colagen sintetizate de ribozomii ataati membranele reticulului endoplasmic sunt injectate n lumenul acestuia ca precursori, denumii lanuri pro-. Aceti precursori prezint la ambele capete ( amino- i carboxil-) aminoacizi adiionali, denumii propeptide. Propeptidele ghideaz formarea intracelular a moleculeor de procolagen triplu rsucite, prevenind, totodat, apariia intracelular a unor fibrile mari,care ar putea fi nocive pentru celule. n lumenul RE, radicalii de prolin i lizin sunt hidroxilai, formnd hidroxiproline i hidroxilizine, iar unele hidroxilizine sunt glicozilate. Fiecare lan pro- se leag de alte dou lanuri prin puni de hidrogen, rezultnd o molecul triplu rsucit helicoidal, denumit procolagen. n etapa extracelular, procolagenul este transformat n molecule de colagen ( tropocolagen ) prin nlturarea enzimatic a propeptidelor (numai n cazul formelor de colagen fibrilar), dup care are loc polimerizarea moleculelor i formarea fibrilelor de colagen. n moleculele de colagen, gupurile hidroxil din hidroxiprolin i hidroxilizin au rolul s formeze legturi de hidrogen ntre lanuri, care stabilizeaz conformaia spaial de triplu helix i previn hidroxilarea prolinei, cum se ntmpl n deficiena de acid ascorbic (scorbut). nlocuirea (turnoverul) moleculelor de colagen are loc dup o perioad destul de lung, ce ajunge n os pn la 10 ani. Fibrilele de colagen se depun pe suprafaa celulei care le-a produs, ocupnd cu predilecie nfundrile plasmalemei, formate prin fuziunea veziculelor secretorii cu suprafaa celulei. Citoscheletul din citoplasma periferic influenteaz poziia, numrul i orientarea ansamblului de fibrile. 8.2.2.Fibrele elastice Fibrele elastice (fibrae elasticae) sau fibrele galbene sunt mai subiri dect cele de colagen avnd diametrul de numai 1 nm. Ele sunt monofibrilare, se ramific i se anastomozeaz formnd reele neregulate. Sunt de cel puin cinci ori mai extensibile dect o fibr de cauciuc de aceeai seciune transversal. Se pot colora electiv cu orcein ( n rou brun ntunecat ), cu rezorcin fuxin WEIGERT (n rou aprins), cu aldehidfuxin GMRI (n negru) i cu hematoxilin-eozin (cnd se coloreaz slab i inconstant). Sunt rezistente i extensibile (cu 100-200%), revenind la lungimea iniial, dup ce traciunea asupra lor a ncetat. Se gsesc n pereii vaselor sanguine, n pulmon, n piele i n esutul conjunctiv lax. Odat cu naintarea n vrst se rresc provocnd disfuncia organelor respective. Au o compoziie n amino-acizi asemntoare cu a fibrelor de colagen. Fibrele elastice sunt de trei feluri: oxitalanice, de elaunin i elastice propiu-zise.(Fig.8.7) Fig.8.7. Contracia i relaxarea moleculelor de elastin Componentul principal al fibelor elastice este elastina, o protein foarte hidrofil cu o lungime de circa 750 resturi (radicali) de amino acizi. Asemntor colagenului este bogat n prolin i glicin, dar spre deosebire de acesta nu este glicozilat i conine puin hidroxiprolin i hidroxilizin. La microscopul electronic, fibrele elastice prezint n centru o mas amorf, astructurat, ce conine elastina, nconjurat de o teac de microtubuli, orientat n axul longitudinal al fibrei i dispui n benzi. Microtubulii sunt formai din glicoproteine, apar primii n cursul elaborrii fibrei de ctre fibroblast i au rolul de a orienta depunerea elastinei n regiunea amorf central. Formarea (geneza) fibrelor elastice. Elastina este sintetizat ca precursor (proelastina) de ctre fibroblastele din piele i tendoane sau de ctre celulele musculare netede din pereii vaselor mari. Proelastina, o molecul globular cu masa de 70 kDa este eliminat n matricea extracelular, unde pe suprafaa membranei plasmatice

140

(n nfundturile acesteia) are loc polimerizarea n fibre elastice. Sub form nefibrilar, elastina este prezent n lamele elastice din pereii unor vase sanguine. Elastina conine doi amino acizi, desmosina i isodesmozina, fiind compus din dou tipuri de segmente scurte, care alterneaz dealungul lanurilor polipeptidice:- segmente hidrofobe, care i confer proprieti elasticitate i semente -helicoidale,bogate n alanin i lizin, care formeaz legturi transversale ntre moleculele adiacente. Fiecare segment este codificat de un exon separat. Elastina este rezistent la fierbere, la extracia cu acizi i baze diluate i la aciunea tripsinei. n schimb, este hidrolizat de o enzim, elastaza, secretat de pancreas. Moleculele de elastin, sinuoase i polimorfe, sunt legate ntre ele prin puni necovalente slabe, ca i prin puni covalente distanate, care permit reelei s fie elastic. n organism, elastina poate servi ca matrice pentru calcifiere, explicndu-se astfel formarea plcilor ateromatoase i calcifierea unor esuturi. Miezul de elastin este acoperit de o teac de microfibrile, care au un diametru de 10 nm. Microfibrilele sunt compuse dintr-un numr de glicoproteine, dintre care fibrilina pare a fi esenial pentru integritatea lor. Microfibrilele joac un rol important n asmblarea fibrelo elastice. Ele apar naintea elastinei n timpul dezvoltrii fibrelor elastice i formeaz o schel pe care se depun moleculele de elastin. Fibrele oxitalanice sunt o varietate de fibre elastice, foarte rezistente la acizi. Sunt mai groase i mai rigide dect fibrele elastice. Ele se pot colora cu coloranii fibrelor elastice (orceina, fucsina) numai dup o prealabil tratare cu acid peracetic, acid permanganic sau acid performic. Rezist la digestia cu elastaz, dar sunt degradate imediat prin tratare cu acid peracetic. Se gsesc n numr mare n ligamentele alveolo-dentare, dispersate printre fibrele de colagen i reticulin. Numrul lor crete n bolile paradoniului sau n chisturile radiculare dentare. O form aparte de fibre elasice sunt fibrele de elaunin, care se gsesc n jurul glandelor sudoripare i n derm. 8.2.3.Fibrele de reticulin Fibrele de reticulin se caracterizeaz printr-un diametru mai redus (ntre 0,5 i 2 m), aprnd foarte subiri. Nu sunt grupate n fascicule, dar sunt ramificate i formeaz reele, n mod frecvent. Pot fi observate n contrast de faz i n microscopul de polarizaie, dup colorare cu rou Sirius. Pe preparatele fixate, se coloreaz ca i cele de colagen (cu albastru de anilin). Fiind fibre argirofile, se pot evidenia n condiii bune cu sruri de argint. Datorit coninutului mai mare n glicoproteine, fibrele de reticulin sunt PAS-pozitive. Astfel, hexozele sunt n procent de 6-12% n fibrele de reticulin, fa de 1% n fibrele de colagen. Fibrele de reticulin conin, n principal, molecule de colagen de tip III, asociat cu glicoproteine, proteoglicani i alte tipuri de colagen. La microscopul electronic apar formate din fibrile groase de 35 nm, strns mpachetate i legate ntre ele prin puni de proteoglicani i glicoproteine. Fibrele de reticulin iau natere, ca i celelalte dou tipuri de fibre conjunctive, n fibroblaste, unde are loc sinteza de molecule de colagen tip III, ce vor fi exocitate i polimerizate extracelular. Sunt rspndite n: muchii netezei, n esuturile hematopoetice i limfopoetice (mduva osoas, splin i organele limfoide), n jurul capilarelor, n membranele bazale, n glandele endocrine, n ficat, n rinichi, iar,n condiii patologice, apar n esuturi dup lezionri.Diametru redus i dispunerea n reea lax i flexibil a fibrelor reticulare permite modificri de form i volum a unor organe,precum splina, ficatul, arteerele, musculatura uterin i intestinal. n cursul embriogenezei, n procesele inflamatorii i de cicatrizare, firbrele de reticulin pot fi nlocuite de fibre de colagen. 8.3Substana fundamental a matricei extracelulare. Substana fundamental (substantia fundamentalis), interfibrilar sau intercelular, apare amorf, incolor, transparent, omogen i vscoas. Din punct de vedere chimic, conine diferite molecule de glicozaminoglicani, de obicei legai covalent de o protein, formnd proteoglicani i proteine fibroase, care sunt de dou feluri: structurale (colagen, elastin) i glicoproteine structurale adezive (fibronectina i laminina).

8.3.1.Glicozaminoglicanii

141

Denumii, n trecut, mucopoliglucide sau mucopolizaharide, glicozaminoglicanii (GAG) sunt complexe poliglucidice neramificate, compuse din uniti repetitive de diglucide, n care unul din cele dou resturi de glucid care se repet este un aminoglucid ( N-acetil glucozamina sau N-acetilgalactozamina ).Cel de al doilea glucid este, de obicei un acid uronic (glucoronic sau iduronic).

Fig.8.8. Proteoglicani n monomer i n agregat 1-Miez proteic; 2-Heparan sulfat; Condroitin sulfat; 4Keratan sulfat;5-Proteine de legtur Glicozaminoglicanii sunt intens ncrcai negativ, din cauza gruprilor (terminaiilor) sulfat sau carboxil existente pe resturile de glucide. Dup radicalii de glucide, tipul de legturi ntre acestea, numrul i dispunerea gruprilor sulfat se disting mai multe tipuri principale de glicozaminoglicani:acidul hialuronic sau hialuranul;- condroitin sulfatul i dermatan sulfatul;- heparan sulfatul i heparina; -keratan sulfatul (Fig. 8.8). Lanurile de poliglucide sunt intens hidrofile i inflexibile, nct nu se pot plia n structuri globulare. De aceia, glicozaminoglicanii au o conformaie foarte extins, ocupnd un volum imens fa de masa lor, formnd geluri i la concentraii foarte mici. Sarcinile negative, foarte numeroase, atrag o mulime de cationi (Na+), sunt osmotic active i rein o mare cantitate de ap n matricea extracelular, fcnd-o turgescent, capabil s reziste la compresiuni, n contradicie cu fibrele de colagen care rezist la traciuni. Prin acest mecanism, matricea cartilajului articular poate rezista la presiuni de sute de atmosfere. n esutul conjunctiv, glicozaminoglicanii ocup mai puin de 10% din cantitatea de proteine fibroase. Dar, pentru c ei formeaz geluri hidratate "poroase", glicozaminoglicanii ocup mult din spaiul extracelular, oferind suport mecanic pentru esuturi i permind o rapid difuziune a moleculelor solubile n ap (nutrieni, metabolii, hormoni) sau deplasarea celulelor. n fibrele de colagen i elastice i sunt reprezentati de: acidul hialuronic (singurul nesulfatat), condroitin-sulfaii, heparan-sulfaii, keratan-sulfaii i heparina. Excepie fcnd acidul hialuronic, toi ceilali glicozaminoglicani se leag covalent de o protein formnd molecule de proteoglicani (PG), n care glicozaminoglicanii ocup 95%, iar proteinele 5%. n esutul conjunctiv, glicozaminoglicanii i proteoglicanii formeaz un gel foarte hidratat, rezistent la compresiuni, n care sunt cuprinse proteinele fibroase. (Fig.8.9) Acidul hialuronic ( sau hialuronanul sau hialuronatul ) este format dintr-o repetare secvenial a peste 25.000 de uniti diglucidice nesulfatate. Se gsete n cantiti variabile n toate esuturile, fiind mai abundent la embrionii timpurii. Este cea mai simpl form de glicozaminoglicani. Producerea acidului hialuronic se realizeaz direct pe suprafaa celulei, cu ajutorul unui complex de enzime, cuprinse n membrana plasmatic, nefiind nevoie de exocitoz. Fa de ceilali glicozaminoglicani, acidul hialuronic nu conine dizaharide sulfatate, secvenele sunt mai simple,iar lanurile mai scurte (mai puin de 300 resturi glucidice).

142

Acidul hialuronic ndeplinete multiple roluri: - asigur rezistena mecanic n esuturi i articulaii; - ocup spaiile libere n timpul dezvoltrii embrionare, permind modificarea formelor i structurilor ; - fiind produs de zona bazal a epiteliilor, sevete la crearea unui spaiu liber, n care celulele vor migra , ca n cazul formrii cordului, corneei etc. Cnd migrarea celulelor s-a ncheiat, excesul de hialuronan este degradat de hialuronidaz. Hialuronanul este produs n cantiti mari n timpul cicatrizrii leziunilor i constituie un lubrefiant al lichidului articular.ndeplinirea acestor roluri este condiionat de legarea hialuronanului de proteinele sau proteoglicanii din matricea extracelular sau de pe suprafaa celulelor. Unele din aceste molecule, denumite hialaderine prezint domenii omoloage pentru legare de acidul hialuronic, coninnd grupe de radicali aminoacizi, ncrcate pozitiv.

Fig.8.9.Relaiile proteoglicanilor cu acidul hialuronic. 8.3.2.Proteoglicanii Proteoglicanii (PG) sunt compui din lanuri de glicozaminoglicani legate covalent de un miez proteic. Ca i n cazul altor glicoproteine, lanul de polipeptide sau miezul proteic este sintetizat n reticulul endoplasmic rugos, iar lanurile de polizaharide sunt asamblate pe acesta n complexul Golgi. Proteoglicanii se deosebesc de celelalte glicoproteine prin felul, cantitatea i aranjamentul lanurilor de glucide. Apar foarte heterogeni, n ceea ce privete coninutul proteic, mrimea moleculei i numr, dar prezint o repetare a diglucidelor similare. Miezul proteic al unui proteoglican este de obicei o glicoprotein. n el, carbohidraii pot ocupa mai mult de 95% din greutatea sa, cel mai adesea avnd forma de lanuri lungi neramificate, cu 80 radicali de glucide. De obicei, proteoglicanii sunt mult mai mari dect glicoproteinele. Astfel, agrecanul care este o component major a cartilajului are o mas de 3 x 106 daltoni, peste 100 lanuri de GAG, cte unul

143

la fiecare 20 resturi de aminoacizi. Exist, ns i proteoglicani mici, cu 1-10 lanuri de GAG, ca de exemplu decorinul, care este secretat de fiboblaste i are numai un lan de GAG. n principiu, proteoglicanii au o heterogenitate fr limit. Greutatea molecular a miezului proteic variaz de la 10.000 la 600.000 daltoni, de el putndu-se ataa un mare numr i tipuri diferite de GAG. n plus, modelul de repetare a diglucidelor n fiecare GAG poate varia n funcie de gruprile SH, nct se obine o heterogenitate enorm, ce face dificil identificarea i clasificarea proteoglicanilor n funcie de glucidele lor. Secvena proteinelor din miezul proteic, determinat prin tehnici de ADN recombinat apare, de asemenea extrem de divers. Dei au fost identificate cteva familii mici, nu exist un aspect structural comun care s disting clar proteinele din miezul proteic de alte proteine, iar muli PG au unul sau mai multe domenii care sunt omoloage cu domeniile existente n alte proteine din matricea extracelular i din membran. Se consider (Hardungham, Fosang 1992) c proteoglicanii sunt un grup aparte de glicoproteine glicosilate, a cror funcii sunt mediate att de miezul proteic, ct i de lanurile de GAG. Funciile proteoglicanilor. Rolul PG nu poate fi limitat la meninerea hidratrii spaiului intercelular. Lanurile de GAG formeaz geluri cu pori de mrimi variate,nct servesc ca site selective ce regleaz traficul de molecule n funcie de mrime i ncrctura electric. Astfel, perlecanul, un PG heparan sulfat, joac acest rol n membrana bazal a glomerulului renal. PG intervin n comunicarea chimic dintre celule. Ei leag diferite molecule semnal produse de celule, ca de exemplu unii factori de cretere, modificndu-le activitatea. Astfel, factorul de cretere a fibroblastelor (FGF) se leag de lanurile de heparan sulfat ale PG, att n esuturi, ct i in vitro. Pentru unele celule aceast legare reprezint un pas necesar pentru activarea receptorilor de suprafa. n majoritatea cazurilor, moleculele semnal se leag de lanurile de GAG ale PG, existnd diferene ntre molecule: - factorul de transformare a creterii ( transforming growth factor =TGF ) se leag de miezul proteic al mai multor PG din matrice ( de decorin) ncetndu-i activitatea. PG se leag i regleaz activitatea proteazelor i a inhibitorilor de protease. Legarea de un PG controlez activitatea unei proteine prin urmtoarele mecanisme:- i limiteaz sfera de aciune, imobiliznd proteina la locul de producere; - i blocheaz activitatea; creaz un rezervor de proteine, n vederea unei eliberri ulterioare; - protezeaz o protein fa de o degradare proteolitic;- modific sau concentrez proteina pentru o mai eficient prezentare la receptorii de suprafa. Glicozaminoglicanii i proteoglicanii se asociaz pentru a forma complexe polimerice imense n matricea extracelular, Astfel, molecula de aggrecan ( un PG important din esutul cartilaginos) formeaz mpreun cu acidul hialuronic un complex mai mare dect o bacterie. Totodat GAG i PG se asociaz cu proteinele fibroase din matrice (cu colagenul),rezultnd structuri extrem de complexe. Dispunerea spaial a moleculelor de PG este intens determinat n esuturile vii. Exit i PG intracelulari. Astfel, serglycina este un constituient al veziculelor secretorii intracelulare, unde ajut la mpachetarea i stocarea moleculelor secretate. Ali PG sunt componenete integrate n membranele plasmatice, avnd miezul proteic inserat transversal n bistratul lipidic sau ataat la bistrat prin glicosil-fosfatidil-inozitol (GPI). Asfel, syndecanii au un miez proteic ce traverseaz membrana. De domeniul lor extracelular se leag un numr variabil de lanuri GAG (condroitin sulfat i heparan sulfat), n timp ce domeniul lor intracelular interacioneaz cu actina citoscheletului din cortexul celular. Sindecanii se gsesc pe suprafaa mai multor tipuri de celule (fibroblaste, celule epiteliale), unde ndeplinesc, alturi de integrine, rolul de receptori pentru colagen, fibronectin i alte proteine matriceale , de care ei se leag.Sindecanii se mai leag factorul de cretere a fibroblastelor (FGF), fiind prezeni n receptorii pentru FGF. Betaglicanul se leag de TGF- (factorul de transformare a creterii), fiind prezent n receptorii pentru TGF-. n acest mod, proteoglicanii din membranele plasmatice acioneaz ca i coreceptori care colaboreaz cu receptorii convenionali ai suprafeei celulare, att n legarea celulelor de matricea extracelular, ct i n iniierea rspunsului celular la factorii de cretere. Sindecanii sunt organizai n gel hidratat, nct lanul de GAG difuzeaz repede ntre celule, facilitnd migrarea celulelor i formarea prelungirilor celulare. Proteoglicanii se leag covalent de o parte i de alta a unui ax polipeptidic, denumit miez proteic, nct formeaz subuniti i complexe moleculare mari. Mai multe subuniti se leag necovalent pe un lung filament de acid hialuronic (AH) prin intermediul unor mici linkeri proteici, ajungnd la o mas de 105 Kdal i o lungime de ordinul micrometrilor. n majoritatea proteoglicanilor, miezul proteic este asociat cu dermatan-sulfatul,

144

condritin-sulfatul sau heparan-sulfatul. n unele cazuri proteoglicanii se pot lega unii de alii sau de alte macromolecule locale cum ar fi colagenul, elastina i fibronectina. La microscopul electronic, proteoglicanii pot fi evideniai cu ajutorul roului de ruteniu, care se leag selectiv la polimerii acizi i devin electronodeni dup combinarea lor cu oxidul de osmiu (OsO 4). Astfel proteoglicanii au fost identificai n glicocalix (sub form de filamente subiri de 3-5 nm), n matricea extracelular (sub form de granule mari de 20-50 nm) i n membranele bazale (sub form de granule mici de 10-20 nm). n concluzie, proteoglicanii ndeplinesc multiple roluri, dintre care subliniem : 1) particip la realizarea adezivitii celulare fa de matrice; 2) confer vsco-elasticitate i rezisten la presiune populaiilor celulare; 3) regleaz deplasarea moleculelor (mari i mici) prin spaiul interstiial; 4) modeleaz homeostazia tisular; 5) interacioneaz cu lipoproteinele sanguine. Sinteza glicozaminoglicanilor i proteoglicanilor se realizeaz n fibroblaste printr-un mecanism de sintez comun glicoproteinelor. Astfel componenta proteic se sintetizeaz la nivelul ribozomilor reticulului endoplasmic rugos (RER), unde ncepe i glicolizarea, care va fi completat n structurile golgiene, unde se desfoar i sulfatarea, dup care sunt eliminai n matricea extracelular. Dup o funcionare de 2-4 zile (pentru proteoglicani) ei sunt degradai de macrofage prin sistemul lor de hidrolaze acide lizozomale. 8.3.3.Glicoproteinele structurale Sunt formate dintr-un miez proteic la care se ataeaz glucide cu structur ramificat. n contrast cu PG, n glicoproteinele structurale (GS) predomin miezul proteic, iar glicoproteinele structurale nu conin poliglucide lineare formate din diglucide repetitive ce au glucozamine. Ele joac un rol important n funcionalitatea matricei extracelulare, cum ar fi relaiile intercelulare, adezivitatea celulelor. Sunt reprezentate de fibronectine (prezente n matricea tuturor tipurilor de esuturi conjunctive) i n cele mai multe membrane bazale, condronectine (prezente n matricea cartilaginoas) i laminine (prezente n membranele bazale). Fibronectina este o glicoprotein, cu o greutate medie de 222-240 kDa, compus din dou subuniti legate prin puni bisulfidice, n apropierea terminaiei carboxil. Fiecare subunitate prezint o serie de domenii funcionale distincte, desprite prin domenii polipetidice flexibile. (Fig.8.10) Fig.8.10. Adezivitatea celulelor la colagenul intercelular cu ajutorul fibronectinei i proteoglicanilor

145

Domeniile sunt constituite din mici module repetabile, codificate de codoni separai deoarece gena fibronectinei prezint multiple duplicaii ale exonilor, asemnndu-se cu genele colagenului. Un domeniu leag colagenul, altul heparina, iar altul se leag de diveri receptori specifici de pe suprafaa unor variate tipuri de celule.ndat ce un domeniu cu activitate de legare a fost identificat de receptori, secvena sa de aminoacizi determin sinteza unor peptide care i corespund. Aceste peptide sunt folosite pentru gsirea regiunii principale pentru legarea celulei, fiind identificat o secve specific de tripeptide (Arg-Gly-Asp sau RDG). Fiecare peptid foarte scurt conine secvena RDG i concur cu fibronectina pe situsul de legare al celulei, putnd s inhibe ataarea celulelor la fibronectin. Dac aceste peptide sunt prezente pe o suprafa solid, ele determin aderena celulelor la aceasta. Tipul principal de modul, numit repetiia fibronectinei de tip III (type III fibronectin repeat) are o lungime de circa 90 radicali de aminoacizi i se gsete de cel puin 15 ori n fiecare subunitate. Acest modul mai este ntlnit i n alte proteine matriceale, n unele proteine ale membranei plasmatice i citoplasmei. Exist mai multe forme ( izoforme ) de fibronectin:- fibronectina plasmatic, solubil,prezent n snge i alte lichide din corp, intervine n coagularea sngelui , n vindecarea rnilor i n fagocitoz; - fibronectina filamentoas, asamblat pe suprafaa celulelor i depozitat n matrice. Toate formele de fibronectin sunt codificate de o singur gen mare, lung de 50 kilobase i format din circa 50 exoni cu mrimi similare. Transcrierea AND-ului produce o singur molecul mare deARN, care pote fi sudat alternativ n trei regiuni n funcie de tipul de celul i de stadiu de dezvoltare. La om se produc 20 tipuri de ARN mesageri, fiecare fiind capabil s codifice cel puin o subunitate diferit de fibronectin. Sudarea alternativ permite celulei s produc tipul de fibronectin cel mai potrivit cu necesitile esutului. Astfel, formele de fibronectin produse n timpul dezvoltrii embrionare difer de cele ntlnite n fazele trzii. Dar dac cutisul adult este lezat se revine la fibrovectina embrionar. n vindecarea rnilor, fibronectina permite migrarea celulelor i proliferrile cerute de dezvoltare sau repararea esuturilor. Prin experiene de inginerie genetic,efectuate pe oareci, s-au inactivat genele fibronectinei, fapt ce a generat o serie de defecte morfologice ce au produs anomalii n dezvoltarea notocordului, somitelor, cordului, vaselor sanguine, tubului neural i anexelor extraembrionare. Fibronectina este produs de fibroblaste, de celulele endoteliale i n cantitate mai mic i de unele celule epiteliale i mediaz aderarea celulelor la colagen sau la alte componente ale matricei extracelulare, aciune la care pot contribui i alte molecule locale ca laminina, condronectina etc. Alte roluri ale fibronectinelor constau n: a) organizarea spaial a citoscheletului; b) intervenia lor n migrarea celulelor n cursul diferenierii embrionare, n fagocitoz, n hemostaz i n malignizarea celulelor (cnd lipsa lor favorizeaz malignizarea); c) pot nlocui unii factori de competen (ca de exemplu: factorul de cretere al fibroblastelor i al plachetelor sanguine, factorul de cretere epidermic). n timpul dezvoltrii embrionare, fibronectina ghideaz deplasarea celulelor, ajutnd celulele s se ataeze de matrice, fr s fie imobilizate n ea. Mai exist i alte tipuri de molecule adezive din matrice, care joac un rol n ghidarea celulelor n cursul deplasrilor morfogenetice. Astfel,este tenascina un complex glicoproteic cu ase lanuri polipeptidice, care se desprind dintr-un centru. Fiecare din lanuri este pliat i compus din diferite secvene scurte de aminoacizi, care se repet de mai multe ori. Pe fiecare lan se gsesc un numr de domenii funcionale distincte, din care unul se leag de suprafaa celulei prin syndecan ( un proteoglican transmemebranar), iar altul de fibronectin. Tenascina este mai abundent n matricea a esuturilor embrionare. Ea poate s favorizeze, sau s inhibe adeziunea celular, n funcie de tipul de celul i de medierea unor domenii proteice, jucnd un rol n ghidarea deplasrilor celulare. Laminina este o glicoprotein a membranelor bazale, fiind localizat n lamina rara, n imediata apropiere a celulelor epiteliale cu membrana bazal, mediind ataarea acestora de colagenul de tip IV al membranelor bazale. Nu prezint o specificitate absolut nct poate facilita i ataarea fibroblastelor la un substrat de sticl. Este compus din trei lanuri alfa (sau A) i un lan beta (sau B) ce formeaz o molecul foarte mare cu o greutate de 1 milion daltoni, ce posed locuri specifice de legare. (Fig.8.11)

146

Fig. 8.11. Laminina domenii structurale i funcionale A i B lanuri alfa i beta; Regiunile haurate sunt rezistente la proteaze. Condronectina este o glicoprotein seric ce mediaz specific ataarea condrocitelor de colagenul de tip II din cartilaj. Este sintetizat de condrocite. n matricea extracelular din aproape toate esuturile conjunctive s-a identificat glicoproteina 115 (necolagen), cu o greutate molecular de aproape 115.000, care este prezent n cantitate mai mare n vasele sanguine, n fibrele musculare netede, i n unele membrane bazale, avnd o funcie asemntoare fibronectinei i lamininei. La embrion, n faza de morul, se ntlnete o glicoprotein denumit uvomorulina implicat n adezivitatea celulelor embrionare. Ea a putut fi identificat i la adult n spaiul intercelular al epiteliului intestinal, n jurul domeniului laterobazal al celulelor. Uvomorulina este distribuit uniform la suprafaa celulelor maligne n carcinomul nedifereniat. Tot n matricea extracelular a unui tip de carcinom a fost izolat epinectina, o protein cu greutatea molecular de 70.000 daltoni. n serul sanguin, n afar de condronectin i fibronectin se mai ntlnesc i alte glicoproteine cu importan major n adezivitatea celulelor de colagen i n etalarea celulelor n vitro, ca de exemplu: factorul de etalare a fibroblatilor i a celulelor epiteliale, epibolina (ce favorizeaz etalarea celulelor epiteliale). Tot n matricea extracelular a esuturilor conjunctive este prezent i lichidul tisular care are o compoziie asemntoare plasmei sanguine, coninnd ap, molecule mici (inclusiv proteine) i diferii ioni (n special de sodiu i clor i mai puin magneziu, calciu i potasiu). Unele moleculele din matricea extracelular pot s regleze cantitatea altor molecule extracelulare. Astfel, fibronectina stimuleaz sinteza colagenului de ctre hepatocite n urma efectelor pe care fibronectina le are asupra fosforilrii proteinelor. La fel factorul de cretere epidermic, AMPul ciclic, vitamina A stimuleaz acumularea fibronectinei n diferite linii celulare. Refacerea (turnoverul) moleculelor matricei extracelulare este continu i prezint o mare importa pentru multe procese biologice. Se realizeaz un echilibru ntre degradare i resintez. Astfel, o degradare rapid se produce n timpul involuiei uterine post partum. Degradri localizate sunt necesare atunci cnd unele celule ( leucocitele) trec prin memebrana bazal n esuturi, iar celulele canceroase migreaz la distan, dnd metastaze. Componentele matricei sunt degradate prin enzime proteolitice care sunt produse i eliberate local de celule, precum:- unele metaloproteaze, ce depind de ionii de Ca2+ i de Zn2+, iar altele sunt proteaze serice. Ele coopereaz pentru a degrada proteinele matriceale (colagenul, laminina, fibronectina). Colagenaza (o proteaz seric) ore o specificitate restrns, modificnd integritatea matricei pe zone limitate i facilitnd migrarea celulelor. O important proteaz seric este un activator de tip plasminogen al urokinazei (urokinase-type plasminogen activator) (U-PA). Ea transform plasminogenul ntr-o proteaz activ plasmina, care degradeaz fibrina, fibronjectina i laminina. Degradarea componentelor matriceale este controlat strns prin mai multe mecanisme ca: secreia unor proteaze ca precursori inactivi;- activitatea proteazelor este limitat la anumite arii de inhibitori specifici; -inhibitorii sunt produi de celulele de la marginea ariilor cu degradri active, avnd

147

scopul de a conserva matricea neimplicat. Ei protejeaz de asemenea i proteinele de pe suprafaa celulelor, care sunt necesare pentru adeziune i migrare. Multe celulele au receptori de memebran care leag U-PA, limitnd aciunea acesteia la zonele unde este necesar. Astfel, un receptor pentru U-PA a fost detectat pe conul de cretere al neuronului, la marginea de naintare a leucocitelor i la unele tipuri de celule canceroase, care metastazeaz. 8.4. Integrinele sau receptorii celulari pentru matricea extracelular Integrinele sunt o familie de proteine transmembranare care leag colagenul, fibronectina i laminina. Spre deosebire de ali receptori de membran, integrinele prezint o constant de afinitate relativ joas (Ka =106 109 litri/ mol), permind celulelor s exploreze ambiana fr s se ataeze de matrice. Interginele sunt heterodimeri, compusi din dou subuniti ( i ) necovalente asociate cu glicoproteine transmembranare. Integrinele ndeplinesc un rol crucial pentru adeziunea i cooperarea celulelor cu matricea extracelular. n timp ce unele integrine leag numai o macromolecul din matrice (fibronectina sau laminina), altele pot lega mai multe. Astfel, o integrin prezent pe suprafaa fibroblastelor leag colagenul, fibronectina i laminina. Mai mult aceiai molecul de integrin, n diferite tipuri de celule, poate lega diferite molecule. O subfamilie de integrine recunoate i leag secvena de aminoacizi arginin-glicin-aspartat, care este prezent n fibronectin i n alte proteine matriceale.Se pare c unii factori celulari specifici interacioneaz cu integrinele i le moduleaz activitatea. Datorit prezenei a 3 sau 4 domenii de legare existente pe partea extracelular a catenei , legarea integrinelor depinde de unii cationi extracelulari bivaleni(Ca2+, Mg2+). La vertebrate, unele proteine matriceale pot fi recunoscute i ataate de mai multe integrine. Astfel, fibronectina este legat de 8 integrine, iar laminina de 5 fibronectine.Integrinele sunt foarte diverse, deoarece cei 20 heterodimeri pot forma 9 tipuri de subuniti i 14 tipuri de subuniti . Catenele 1 care formeaz dimeri cu cel puin 9 catene exist la aproape toate celuele de la vertebrate. Astfel, 5 1 este receptor pentru fibronectin, iar 6 1 leag laminina. Lanurile 2 care formeaz dimeri cu 3 tipuri de lanuri se gsesec pe suprafaa leucocitelor i joac un rol esenial n activarea lor. Astfel, integrina 1 2 este un factor asociat limfocitelor (LAF-1), iar integrina M 2 este asociat macrofagelor (Mac-1). Integrinele 2 mediaz n principal interaciunile dintre celule i mai puin pe cele dintre celul i matrice. Ele premit leucocitelor s se ataeze de endoteliul vascular i s-l traverseze. Integrinele funcioneaz ca linkeri transmembranari (sau integratori) care mediaz interaciunea dintre citoschelet i matricea extracelular. Cele mai multe intergine se leag de filamentele de actin, excepie fcnd integrina 6 4, existent n hemidesmozomi, care se leag de filamentele intermediare. n timpul atarii integrinei de un ligand extracelular, captul intracelular al catenei se leag la filamentele de actin din citoschelet. Ataarea transmembranar la citoschelet este o cerin important att pentru adeziunea celelelor la matrice, ct i pentru adeziunile intercelulare, deoarece n lipsa unei ancorri interne adeziunile sunt slabe, nerezistente, aa cum s-a observat n cazul unei integrine mutante far domeniu intracelular, obinut prin tehnici de AND recombinat. Integrinele mediaz, interaciuni transmembranare, ntre citoschelet i matricea extracelular jucnd un rol important n orientarea celulelor i matricei n esuturi. La rndul su, matricea extracelular poate influena organizarea citoscheletului, determinnd n fibroblastele transformate (cancer like) din culturi apariia intracelular a fibrelor de stres, prin organizarea filamentelor de actin i producerea unei cantiti mai reduse de fibronectin. Citoscheletul exercit fore care orienteaz moleculele matricei pe care celulele o produc, iar acestea influeneaz organizarea citoscheletului. Celulele reglez activitatea integrinelor pe care le produc. Astfel, integrinele celulelor sanguine trebuie s fie activate pentru a media adeziunea celular. Acest fapt permite celulelor sanguine s circule nestnjenite pn cnd sunt activate rapid de un stimul specific, deoarece integrinele lor nu trebuie sintetizate, ele existnd deja sub form inactiv. Trombocitele sunt activate de contactul cu peretele lezat al vasului sanguin sau de unele molecule semnal solubile. Acestea determin activarea integrinei 3 din membrana trombocitelor, nct aceasta recepioneaz i leag proteinele coagulrii, determinnd agregarea trombocitelor i formarea coagulilor. n mod asemntor, legarea de limfocitul T a unui antigen de suprafa specific blochez calea de semnalizare intracelular, ceea ce duce la o activare rapid, dar trectoare a integrinei (LFA -1). Integrina activat permite limfocitului T s adere puternic i pentru un timp suficient de lung

148

la celula int, pn de vine stimulat. Dup aceia integrina revine la starea sa inactiv, permind limfocitului T s se desprind. i alte evenimente intracelulare pot determina activarea integrinelor. Astfel, fosforilarea serinei de pe captul citoplasmatic a integrinei 1 , n timpul mitozei celulelor din culturi diminueaz capacitatea integrinei de a lega fibronectina, nct celulele i modific forma i se detaeaz de substrat. Moleculele matricei extracelulare influeneaz puternic comportaea celulelor n culturi, modificndu-le forma, micarea, metabolisnmul, dezvoltarea i diferite funcii. Integrinele mediaz multe din aceste evenimente. Asfel , integrinele de locul de contact cu matricea sau cu alt celul pot activa mai multe ci de semnalizare intracelular. ( pe cea a fosfolipid inozitolului, a tirozin kinazei,etc). Se produce,astfel un semnal complex pe faa intern a membranei, care determin intrarea in activitate a unor receptori intracelulari . n urma acestor evenimente, numai celulele ataate prin integrine la moleculele matricei extracelulare reacioneaz, decland o cascad de semnale care se traduc prin mnodificri n comportamentul celulelor i prin proliferri celulare. 9.Embriologia GENERAL Embriologia este disciplina biologic care se ocup cu studiul dezvoltrii ontogenetice a organismelor, din momentul producerii gameilori si pn n momentul parturitiei sau ecloziunii. Ontogeneza (ontogenesis) parcurge mai multe etape sau faze: 1) gametogeneza; 2) fecundaia; 3) segmentarea; 4) gastrularea; 5) histogeneza; 6) organogeneza si 7) creterea i dezvoltarea postnatal sau post eclozional. Etapele ontogenezei Perioade Gametogeneza ETAPE FAZE multiplicare cretere maturare apropiere penetrare amfimixie morul blastul gastrul Neurul

Fecundaia Dezvoltarea intramaternal (preeclozionala)

Embriogeneza (segmentaia) Histogeneza (formarea esuturilor) Organogeneza

Dezvoltarea postpartum (posteclozional)

Dezvoltarea fetal (preeclozional) Perinatal (perieclozional) Tineree Maturitate Imbtrnire

n cazul mamiferelor, unele din aceste faze sunt parcurse n organismul matern, alctuind dezvoltarea intrauterin, ce cuprinde: fecundaia, segmentarea, gastrularea, histogeneza i organogeneza. Dezvoltarea intrauterin (genesis praenatalis) se continu dupa actul parturiiei (parturitio), n afara organismului matern cu o perioada denumita extrauterin sau postnatal. n cazul psrilor, perioada dezvoltrii n organismul matern este nlocuit, aproape n totalitatea sa (exceptnd fecundatia) de perioada dezvoltrii n ou, iar dup ecloziune se continua cu o perioada posteclozionala.

149

Fig.9.1. Formarea i evoluia gameilor n cursul unei generaii 1- Ovul; 2-Spermatozoid; 3-Zigot; 4 Celule somatice; 5- Celul sexual primordial; 6- Gonocite; 7Ovogonii; 8- Ovocit I, 9- Ovocit II; 10- Globuli polari; 11- Ovocit matur; 12- Spermatogonii; 13Spermatocit I, 14- Spermatocit II; 15- Spermatid. Dezvoltarea intrauterin sau preeclozional se desfasoar n trei etape: 1) o perioada embrionar sau embriogeneza (embryogenesis), care ine pn la apariia celor trei foie embrionare i a anexelor embrionare; 2) o perioada de histogenez (histogenesis) i organogenez (organogenesis); 3) o perioada fetal (fetogenesis) - n care se continu dezvoltarea organelor pna la fatare (parturiio) sau ecloziune. Embriogeneza constituie obiectul de studiu al embriologiei generale, iar histogeneza, organogeneza i perioada fetal sunt studiate de embriologia special (ce va fi prezentat odat cu histologia esuturilor i organelor). 9.1. Gametogeneza Gametogeneza (gametogenesis) cuprinde ansamblul de transformari prin care trec celulele germinale primordiale (cellulae germinales promordial)sau gonocitele primordiale pna la stadiul de celula sexuala matura. (Fig.9.1) Procesul de gametogeneza parcurge trei perioade, asemanatoare la ambele sexe: 1) perioada germinativa (de multiplicare sau de nmultire); 2) perioada de crestere; si 3) perioada de maturare. Gametogeneza Perioade Perioada germinativ Spermatogeneza Spermatogonii (prfoase-A intermediare-I crustoase-B) Spermatocit primar I Speramatocit secundar II Spermatidie (faza Golgi faza cap faza acrozomic faza de maturare) Spermatozoid Ovogeneza Ovogonii Ovocit primar I Ovocit secundar II ( + polocit primar) Ovul (+polocit secundar)

Perioada de cretere

Perioada de maturare

150

9.1.1. Spermatogeneza Spermatogeneza (spermatogenesis) cuprinde totalitatea proceselor pe care le parcurg spermatogoniile (gonocite primordiale mascule) pn devin celule sexuale mature (spermatozoizi), apte pentru fecundaie. Se desfasoar la nivelul epiteliului seminal din tubii seminiferi ai testiculului. (Fig.9.2) 1) Perioada germinativ (de multiplicare sau de nmultire) este parcursa n timpul prepubertatii, cnd gonocitele primordiale se divid mitotic, genernd doua categorii de spermatogonii: a) unele mici, identice cu gonocitele primordiale; b) altele mai mari, spermatogoniile prafoase (de tip A) (spermatogonium A), care se vor divide mitotic, n mod repetat, trecnd spritr-un stadiu intermediar (spermatogonium intermedium) i genernd spermatogoniile crustoase (de tip B) (spermatogonium B), care vor continua linia seminala.

Fig. 9.2. Epiteliul tubului seminal 1-Spermatogonie; 2- Spermatocit I; 3- Spermatocit II, 4, 5, 6 Spermatide n evoluie; 7Spermatozoizi; 8- Celul Sertoli; 9 Membran bazal. 2) Perioada de cretere se declanseaz odat cu pubertatea i const n creterea (dublarea n volum) a spermatogoniilor, transformndu-se n spermatocite de ordinul I (spermatocytus primarius).

Fig.9.3. Spermatogeneza I-Perioada germinativ; II-Perioada de cretere; III-Perioda de maturare. 1-Gonocit; 2- Spermatogonii;3-Spermatocit I; 4-Spermatocit II; 5-Spermatide; 6-Spermatozoizi 3) Perioada de maturare se remarc prin faptul spermatocitul de ordinul I se divide reducional (meiotic) genernd doua spermatide de ordinul II (spermatocytus secundarius) (cu set haploid de cromozomi), care se divid imediat (n mod mitotic), rezultnd n final 4 spermatide dintr-un spermatocit de ordinul I sau dou spermatide dintr-un spermatocit de ordinul II. (Fig.9. 3) ca

151

Spermatidele (spermatidium,a) parcurg o metamorfoz celular, denumit spermiogeneza (spermiogenesis) , fiecare spermatid devenind un spermatozoid (spermatozoon s. spermium). Spermiogeneza are loc n cile genitale intratesticulare. Spermatida apare ca o celula poliedric, n citoplasma careia se gsete un nucleol situat central. Complexul Golgi i mitocondriile sunt dezvoltate, iar centrul celular este reprezentat de doi centrioli. Elementele reticulului endoplasmic neted sunt numeroase i asociate cu lipide. Enzimele hidrolitice sunt active. Transformarea spermatidei n spermatozoid, spermiogeneza, se realizeaz n patru perioade succesive: a) perioada Golgi; b) perioada cap; c) perioada acrozom; d) perioada de maturare. (Fig.9.4)

Fig. 9.4. Spermiogeneza 1-Nucleu; 2- Complex Golgi; 3- Mitocondrii; 4- Centrioli; 5- Vacuol acrozomal; 6- Gtul spermatozoidului; 7- Centriol proximal; 8- Poriunea proximal a centriolului distal; 9Piesa intermediar; 10- Poriunea distal a centriolului distal; 11 Piesa principal a cozii. a) n perioada Golgi: 1. - nucleul spermatidei se deplaseaz n sens axial, ctre un pol al celulei, se alungete i se aplatizeaz uor; 2. - complexul Golgi, cuprinznd n interiorul sau granule proacrozomice (granulum proacrosomaticum) i vezicule proacrozomiale (vezicula proacrosomatica), se deplaseaza, n cadrul citoplasmei, ctre polul anterior al nucleului; 3. - centriolii se despart, dispunndu-se unul lng polul caudal al nucleului (centriolul proximal), iar cellalt la o distan de 1-2 m (centriolul distal), de nucleu - de la el desprinzndu-se filamentul axial al viitoarei cozi. b) n perioada cap: 1. proacrozomul (proacrosoma) sau vezicula crozomal se detaeaz de complexul Golgi, se aplatizeaz i ia forma unui capion ce mbrac jumatatea anterioar a nucleului; 2. - complexul Golgi migreaz spre periferia citoplasmei; 3. - microtubulii din citoplasm se grupeaz ntre cei doi centrioli i structureaz filamentul axial, din care se va constitui viitoarea axonem a spermatozoidului. c) n perioada acrozomic: 1. - nucleul spermatidei se alungete, devenind ovoidal; 2. vezicula acrozomal se transform n acrozom i acoper jumtatea anterioar a nucleului; 3. nucleul devine compact, pierde o parte din ap, iar cromatina se condenseaz; 4. - citoplasma se deplaseaz spre polul posterior al nucleului; 5.-axonema crete n lungime, structurnd piesa de conjugare i piesa intermediar; 6.- centriolul distal se desparte ntr-o jumtate proximal, cu aspect discoidal, situat ntre piesa de conjugare i piesa intermediar, si o jumtate distal, cu aspect inelar, ce nconjoar axonema cozii, fiind situat ntre piesa intermediar i piesa principal. d) n perioada de maturare a spermiogenezei: 1. - jumtatea inelar a centriolului distal (denumit si inelul Jensen) se ndeprteaz, delimitnd lungimea piesei intermediare; 2. citoplasma spermatidei se reduce; 3. mitocondriile, n numr de 15-25, se dispun n helix (cu 14 ture), n jurul filamentului axial al cozii; 4. - se contureaz aspectul morfologic al spermatozoizilor maturi, care au capul nfundat n faldurile membranei apicale a celulelor de susinere (Sertoli); 5. - pe msur ce se realizeaz maturarea, spermatozoizii ncep s secrete hialuronidaza i se desprind de celulele de sustinere, devenind liberi. Nucleul spermatidei sufer o serie de modificri, precum:

152

condensarea cromatinei, formnd n stadiile iniiale fibre paralele cu axul lung al nucleului, fibre care mai trziu se grupeaz n lamele; membrana nuclear si mrete suprafaa, formnd falduri care sunt mai numeroase spre polul posterior (caudal) al nucleului, unde i porii membranei sunt mai numeroi; la polul anterior, cromatina nuclear ader la membrana nucleului, iar la polul posterior se dispune sub aspectul unui material filamentos ntre cutele membranei. Citoplasma spermatidei este mai hialin i conine ribozomi, lipide, glicogen i puine mitocondrii. Se realizeaz un trazit intens ntre nucleu i citoplasm.Odat cu maturarea complet se acumuleaz spre polul posterior al nucleului, sub forma unei picturi, denumit relicvat citoplasmatic (sau corp rezidual), ce va fi fagocitat de celule Sertoli. n viitorul spermatozoid, rmne numai o fin pelicul citoplasmatic acoperit de plasmalem. 9.1.1.1.Morfologia spermatozoidului Evideniat n 1667 la om, de Ham din Leyda i n 1679, la animale, de van Leeuwenhoek, spermatozoidul (spermatozoon s. spermium) este format din: cap i flagel (coad).

Fig. 9. 5. Structura i ultrastructura spermatozoidului la taurine A- Aspect la microscopul optic; B Aspecte electronomicroscopice. I Capul spermatozoidului; II Gtul; III Piesa intermediar; IV Piesa principal; V Peisa terminal. 1- Plasmalema; 2- Acrozom; 3Membrana nuclear; 4 Nucleu; 5Protuberane bazale; 6- Placa bazal; 7Capitelul; 8- Coloanele segmentate; 9- Centriolul proximal; 10-Mitocondrii; 11- Perechea central de microtubuli; 11- Perechile periferice de microtubuli; 13- Fibre dense.

Capul spermatozoidului

153

Capul (caput) prezint forme i dimensiuni diferite, n funcie de specie, aprnd ovalar (la hominide, armsar, taur, berbec, ap, vier) sau cu form de: par (la iepure i cine), secer (la coco i obolan), cu lungimi medii ntre 5 m (la bbat) i 9 m (la berbec), grosimile medii atingnd ntre 2-5 m. Nucleul spermatozoidului este nconjurat de un strat subire de citoplasm i de o plasmalem periferic foarte delicat. n componena capului intr: nucleul, acrozomul, capionul cefalic, perforatorul, protuberanele bazale i membrana periferic. Nucleul (nucleus) conine cromatina deshidratat i condensat, n care ADN-ul (43%) este strns combinat cu protamine bazice (57%). Ocup cea mai mare parte din capul spermatozoidului. Cromatina apare mai condensat la baza nucleului, granular n partea apexial i cu aspect clar, n regiunea ecuatorial. Cantitatea de cromatin reprezint o caracteristic de specie. Din cromatin se formeaz cromozomii autosomi i un heterozom. Deoarece spermatozoizii sunt celule haploide conin numai jumtate din numrul de cromozomi al unei specii ( n cromozomi ). Se accept c, aproximativ, jumtate din numrul total de spermatozoizi dintr-un testicul conin cromozomul sexual X, iar cealalt jumtate cromozomul Y.(Fig.9.5) Acrozomul este situat supranuclear, interpus ntre membran i nucleu, pe care l acoper pn n zona inelului ecuatorial. Se formez din complexul Golgi n timpul spermiogenezei. Cuprinde n structura sa: o membrana acrozomic intern (membrana acrosomatica interna),o membran acrozomic extern ( membrana acrosomatica externa) i o substana acrozomic (substantia crosomatica), n care se disting granulele acrozomice (granulum acrosomale). Este considerat un lizozom specializat ce conine multe enzime hidrolitice (ex: fosfataza acid, hialuronidaza) si o protein nrudit cu tripsina. Aceste enzime depolimerizeaz acidul hialuronic ce cimenteaz celulele foliculare din coroana radiat a ovocitului, dispersndu-le . Joac un rol hotrtor n fecundaie i fiind prezent la toate speciile de animale. Capionul cefalic reprezint o pelicul foarte fin de citoplasm condensat, ce se interpune ntre membrana periferic i acrozomul pe care l acoper. Conine glicoproteine. Perforatorul este situat ntre acrozom i membrana nuclerar, avnd rolul s perforeze plamalema ovocitului. Formez un canal n citoplasm, prin care se transfer coninutul nucleului spermatozoidului.

154

Structura i ultrastructura spermatozoidului Pari componente Structuri Nucleul Acrosomul CAP Capionul cefalic Perforatorul Waldeyer Protuberanele bazale Plasmalema Piesa de conjugare (gtul) placa bazal capitelul coloanele segmentare centriolul proximal dispozitivul fibrilar plasmalema jumtate proximal a centriolului distal axonema (filamentul axial) dispozitivul fibrilar teaca mitocondril jumtatea distal a centriolului distal -inelul axonema (filamentul axial) dispozitivul fibrilar teaca fibroas Piesa principal Piesa terminal plasmalema Filamentul axial plasmalema fibre circumfereniale + 2 coloane longitudinale Ultrastructuri vezicule nucleare saci nucleari Membran acrosomic intern Membran acrosomic extern Substan acrosomic Granule acrosomice citoplasma dintre plasmalem i acrozom ctoplasma dintre acrozom i membrana nuclear delimiteaz foseta de implantaie membrana periferic Observaii

FLAGEL

9 fibrile proteice dense

Piesa intermediar

Protuberanele bazale apar ca dou formaiuni osmiofile semicirculare, formate din citoplasm condensat, dispuse la polul caudal (bazal) al capului. Delimiteaz ntre ele fosa de implantare. Fosa de implantare (fosulla articularis) apare ca o escavaie redus ce servete pentru inseria extremitii proximale a filamentului axial al cozii spermatozoidului. Membrana periferic, trilaminat, foarte delicat i transparent, acoper capionul cefalic i acrozomul, delimitnd capul spermatozoidului. Prezint receptori specifici. Coada spermatozoidului sau flagelul Flagelul (flagellum) cuprinde (dupa Nomina Histologica 1994) urmtoarele parti: gtul, piesa intermediar, piesa principal i piesa terminal. a) Gtul spermatozoidului (pars conjungens) apare foarte scurt, circa 0,4 m, fiind delimitat ntre nucleu i jumtatea proximal a centriolului distal. Conine placa bazal, capitelul, coloanele segmentate, centriolul proximal, mitocondriile i dispozitivul fibrilar, fiind delimitat la periferie de o membran fin de natura lipoproteic. Este foarte fragil, rupndu-se deseori.

155

Placa bazal (patella basalis) este o lam fix de citoplasm osmiofil, dispus n fosa de implantare. Delimiteaz capul spermatozoidului de gt, interpunndu-se ntre membrana nuclear i capitel. Capitelul (capitulum) este segmentul proximal al complexului centriolar i reprezint zona de unire a bazelor coloanelor segmentate (basis columnaris), care vine n contact cu faa distal a plcii bazale. Coloanele segmentate sau striate (columna striata), sunt considerate ca fiind rdcinile axonemei flagelului. Apar formate din elemente proteice fibroase, cu o structur periodic (perioada este de 650 ). Sunt sintetizate n ribozomii spermatidei i polimerizate radial n jurul centriolului proximal. Dupa constituirea coloanelor segmentate, centriolul proximal devine centriol cinetic al cozii spermatozoidului. Centriolul proximal (centriolum proximale), situat sub capitel, prezint o forma de cilindru (cu o lungime de 500nm i un diametru de 250nm) i o nclinaie de 70, n raport cu axa lung a cozii. Are peretele format din 9 triplete (A,B,C) de microtubuli. Mitocondriile sunt alungite i dispuse n partea distal a gtului, nconjurnd dispozitivul fibrilar. Dispozitivul fibrilar este compus din 9 fibrile dense (aflate n continuarea coloanelor segmentare), care nconjoar un complex filamentos axial (axonema), alctuit din 10 perechi de microtubuli, din care o pereche este central, iar celelalte 9 perechi sunt dispuse periferic. (Fig. 9.6)

Fig.9.6. Seciuni transversale prin coada spermatozoidului A Piesa intermediar; B- piesa principal; C Piesa terminal. a- Filament axial; b Fibre externe; c Fibre satelit; d- Teaca mitocondrial; e-Teaca fibroas; f- coloane longitudinale; g Plasmalema. Spermatozoizii imaturi prezint la limita dintre piesa de comjugare i piesa inmtermediar o pictur citoplasmatic, care va fi fagocitat de celulele Sertoli pn la maturarea complet. b) Piesa intermediara (pars intermedia), cu lungimi variabile (5-10 m), este delimitat ntre cele dou jumati (proximal i distal) ale centriolului distal. Cuprinde n structura sa: 1. o membrana plasmatic periferic, ce prezint o margine inelar (annulus) - la limita cu piesa principal; 2. o pelicula de citoplasm, n care se gsesc particule mici ce formeaz rezerva de glicogen a spermatozoidului; 3. mitocondriile - dispuse helicoidal ntr-un filament dublu spiral (cu circa 25 de ture a 3-4 mitocondrii fiecare), ce formeaz o teac mitocondrial (vagina mitochondrialis); 4. fibre externe dense (fibra densa), groase si masive, n numar de nou, inegal dezvoltate i n contact cu fibrele satelite axolemei, plasate central; 5. filamentul axial (filamentum axiale s. axonema), compus din 9 dublete periferice (diplomicrotubulus periphericus) si o pereche de filamente centrale (microtubulus centralis). Piesa intermediar joac rolul de central energetic a spermatozoidului. c) Piesa principal apare de aproximativ 9 ori mai lung dect piesa intermediar. Cuprinde: 1. - filamentul axial (axonema), format din cele 10 perechi (9+1) de microtubuli ; 2. nou fibre dense (fibra densa) externe, groase; 3. - teaca fibroas (vagina fibrosa) format din fibre circumfereniale (costa fibrosa), care se prind prin capetele lor n dou coloane longitudinale (columna longitudinalis) ce reprezint ngrori ale tecii, diametral opuse; 4. - membrana plasmatic.

156 d) Piesa terminal (pars terminalis), cu o lungime de 3-4 m cuprinde numai membrana plasmatic i complexul filamentos axial (axonema), care si pierde aranjarea tipic a dubletelor. Ciclul spermatogenetic (spermatogenesis) are o durat variabil la diverse specii (13,5 zile la taur, 10,4 la berbec, 8 zile la vier), iar dintr-o spermatogonie rezult un numar variabil de spermatide (112 la oarece, 96 la hamster i 64 la taur i berbec). Desfurarea spermatogenezei este influenat de numeroi factori fizici, fiziologici, farmacologici, umorali. Astfel, temperatura ridicat, aplicat local sau n condiii generale produce oligospermie, iar razele X i gama atac spermatogoniile si cromozomii spermatidelor. Alimentaia deficitar n proteine sau vitamine (A, E), unii hormoni (FSH, LH) i sistemul nervos pot interveni, modificnd funcia spermatogenetic. Pentru a-si ndeplini functia de reproducere, spermatozoizii trebuie s prezinte: mobilitate, putere fecundant i vitalitate. Mobilitatea se datoreaz prezenei tubulilor n organizarea flagelului (cozii) spermatozoidului. Suprimarea mobilitaii mpiedic, n mod ireversibil fecundaia. Viteza de deplasare difer n funcie de specie, atingnd: 6-7 mm/minut la taur; 5-10 mm/minut la berbec; 4-6 mm/minut la armasar; 3-6 mm/minut la vier. Puterea fecundanta sau capacitatea vital (capacitaia) este o nsuire pe care spermatozoizii o dobndesc cnd ajung n cile genitale femele, dup o perioad de aclimatizare. Aceast nsuire se dobndete prin pierderea unei caliti antagoniste (decapacitaia) pe care spermatozoizii o folosesc ca protecie n drumul lor prin cile genitale mascule. Ea permite spermatozoidului s ptrund n ovul sau n mucoasa uterin. Vitalitatea este proprietatea spermatozoizilor de a-i pstra mobilitatea i puterea fecundant n condiii de conservare. 9.1.2. Ovogeneza Ovogeneza (ovogenesis) cuprinde complexul de transformri prin care trece ovogonia (celula germinativ iniial) pn devine ovul (ovocit) apt de fecundare. Se petrece n zona cortical a ovarului, n interiorul unor formaiuni histologice complexe, denumite foliculi ovarieni. n ovogenez sunt parcurse trei perioade: germinativ, de cretere i de maturare. 1. Perioada germinativ (de nmulire) se desfoar n timpul vieii embrionare, avnd ca punct de plecare ovogoniile din ovarul embrionar. n perioada embrio-fetal, n ovar se formeaz ntreaga rezerv de celule sexuale femele, pentru toat viaa (ce cuprinde circa 60.000 - 100.000 ovocite de ordinul I). Ovocitele de ordinul I (ovocytus primarius) rmn n stare de laten biologic (status quiescent) pn la pubertate, fiind blocate n profaza diviziunii meiotice (reducionale). 2. Perioada de cretere variaz foarte mult ca durat, ncepnd imediat dupa natere i ajungnd s se ntind pe ani de zile (exemplu: la hominide pn la 20-30 de ani). n cursul acestei perioade se produce i se acumuleaz vitelus. La psri, perioada de vitelogeneza cuprinde dou intervale: a) unul lung de circa 180 de zile, la gin, n care se realizeaz 5-10% din rezerv de vitelus i b) altul mai scurt, de circa 5 -12 zile, n care se sintetizeaz 90-95% din vitelus. Vitelogeneza const n formarea de plcue de vitelus n citoplasma ovociilor primari. Vitelusul este format din substane nutritive (glicogen, lipide, fosfolipide) care sunt produse n ficat (vitelus exogen) apoi sunt vehiculate de snge i pinocitate n ovocite prin microvilozitile care apar la suprafaa membranei acestor celule. 3. Perioada de maturare a ovocitelor ncepe la pubertatea animalului. Cuprinde cele dou diviziuni de maturare: a) prima diviziune, care este meiotic (reducionala), din ovocitul de ordinul I rezultnd dou celule inegale: una de talie mare (haploid) - ovocitul de ordinul II (ovocytus secundarius) i alta de talie mic - primul globul (polocytus primarius), ce se poate divide; b) a doua diviziune de maturare este mitotic, din ovocitul secundar (ovocit de ordinul II) rezultnd ovulul (ovocitul) matur i al doilea globul polar (polocytus secundarius). n acest fel, la sfritul perioadei de maturare, dintr-un ovocit primar, rezult un ovocit cu set haploid de cromozomi i trei globuli polari. (Fig. 9.7)

157

Fig.9.7. Ovogeneza 1- Ovogonie; 2- Ovocit I; 3Ovocit II; 4- Primul globul polar; 5- Spermatozoid; 6_ matur; 7- Globuli polari secundari.

Ovul

Dehiscena (ruperea) folicular i eliberarea ovocitelor are loc n momentul n care ovocitul primar (ovocitul de ordinul I) si formeaz fusul de diviziune, intrnd n prima diviziune de maturare (meiotica), nct pavilionul oviductului capteaz deja ovocitul secundar (ovocitul de ordinul II). Posibilitile de supravieuire ale ovocitului secundar (ovocitul de ordinul II) sunt de 24-48 de ore, iar a dou diviziune de maturare se finalizeaz numai dac a avut loc penetraia zonei pelucide de ctre spermatozoizi. n caz contrar, ovocitul secundar (de ordinul II) rmne blocat n metafaza celei de-a doua diviziuni de maturare. n momentul dehiscenei, ovocitul secundar (ovocitul de ordinul II) este nconjurat de ovolem, zona pelucida i coroana radiata. Ovolema (ovolema sau membrana vitelin) este o membrana citoplasmatic cu numeroi microvili. Zona pelucid (zona pellucida) este o zon mucopoliglucidic, traversat de microvili lungi ai celulelor foliculare, ce ajung la microvilii ovolemei. Coroana radiata (corona radiata) este format din 1-2 rnduri de celule foliculare. 9.1.2.1. Morfologia ovulei Ovula sau ovocitul matur (ovum) reprezint celula sexual femel matur, haploid, cu o form sferic i cu un diametru de pn la 200 m. Conine, pe lng materialul genetic inclus n cromozomi i material nutritiv necesar pentru perioada iniial de dezvoltare a embrionului. a) Nucleul celulei apare sferic, veziculos, nucleolat, cu cromatina fin granular, situat central sau excentric i delimitat de o membran dubl cu pori, n al cror lumen este prezent un material electronodens, ce intervine selectiv n reglarea tranzitului nucleo-citoplasmatic. Prin porii membranei nucleare trec n citoplasm granule electronodense de 350.(Fig.9. 8)

158

Fig. 9.8. Structura i ultrastructura ovocitului A- Aspect la microscopul optic; B- Aspect electronomicroscopic. 1- Citoplasma ovocitului; 2- Nucleu; 3- Reticul endoplasmic neted; 4- Reticul endoplasmic rugos; 5- Mitocondrii; 6- Plcue viteline; 7- Ovolema; 8-Zona pelucida; 9- Celule foliculare. b) Citoplasma ovulei (ovoplasma) este acidofil i fin granular. Conine, pe lng organitele comune, aglomerate n zona perinuclear, mult ARN liber i nucleul vitelin (Balbiani) (deuteroplasma s. vitellus), o formaiune ovoid format din mitocondrii, dictiozomi i lamele inelare. Mitocondriile alctuiesc o coroan perinuclear incomplet. La bovidee, mitocondriile au o prelungire n forma de glug, ce cuprinde n concavitatea ei o picatur lipidic. Cristele mitocondriale lipsesc n prelungire dar se menin n restul mitocondriei. (Fig.8.9) Fig. 8.9. Aspectul mitocondriei n ovocitul de la bovidee 1- Matrice mitocondrial; 2- Criste mitocondriale; 3- Prelungire n form de glug; 4- Pictur n form de lipide.

c) Complexul Golgi se extinde i n zona cortical a citoplasmei, unde este constituit din granule corticale, nconjurate de endomembrane. Granulele corticale particip la formarea lichidului perivitelin, ndeplinind un rol important n fecundaie. Complexul Golgi particip activ la concentrarea vitelusului i la sinteza lipidelor, procese n care sunt implicate i mitocondriile. Reticulul endoplasmic este de tip neted, cu elemente dispuse lax. Ribozomii sunt liberi sau ataai reticulului endoplasmic. De asemenea, sunt prezeni n citoplasm: lizozomi primari, corpi multiveziculari (ca urmare a pinocitozei intense) i numeroase granule (plcue de vitelus). d) Membrana vitelina a ovocitului ( ovolemma s.plamalemma) este de natura lipoproteic trilaminat i prezint numeroase prelungiri - sub forma de microviloziti fine, care se angreneaz cu prelungirile rare i groase ale celulelor foliculare. Se pare c formaiunile microviloase nu sunt permanente, apariia lor fiind legat de stadiul funcional al celulei. La nivelul membranei viteline se observ numeroase vezicule pinocitice, ceea ce demonstreaz schimbul intens de substane ce se efectueaz ntre celulele foliculare ale coroanei radiata i ovul. (Fig.9.10) Fig. 9.10. Relaia dintre ovocit i celulele foliculare 1- Prelungirile celulelor foliculare; 2- Microvilii ovocitului; 3- Zona pelucida; 4- Desmozomi; 5- Vezicule de pinocitoz

de vitelus pe i centrolecite.

Zona pelucida (zona pellucida) prezint un aspect striat, datorat microvilozitilor membranei viteline i ale celulelor foliculare, n care se realizeaz jonciuni celulare de tipul zonulei adherens. Capacitatea vital a gametului femel difer, n raport cu specia i se menine: 10 ore la iap, 20 ore la vac, 5 ore la oaie, 12 ore la scroaf i 6 ore la iepuroaic. Clasificarea ovocitelor se face n funcie de cantitatea care o conin, existnd urmtoarele tipuri: oligolecite, lecite, telolecite

159

Ovulele oligolecite conin vitelus n cantitate mic, iar segmentaia lor este total i inegal. Sunt prezente la cefalocordate (la amfioxus)si la mamifere. (Fig.9.11)

9.11. Tipuri de ovocite A- Ovocit oligolecit; B- Ovocit centrolecit; C- Ovocit mezolecit (lecit); D-Ovocit telolecit; 1-Disc germinativ; 2- Latebr Purkinje; 3- Vitelus nutritiv. Ovulele lecite sau mezolecite se ntlnesc la batracieni i cuprind mai mult vitelus dect cele oligolecite. Vitelusul se aglomereaz la polul vitelin sau vegetativ al celulei, n timp ce polul vitelin al celulei este srac n vitelus i conine nucleul. Segmentaia este total, rezultnd blastomere inegale. Ovulele telolecite sunt caracteristice petilor, reptilelor i psarilor. Vitelusul, n cantitate mare, ocup aproape ntreaga mas a ovulei, n timp ce nucleul (sau vezicula germinativ) mpreun cu o cantitate redus de citoplasm formeaza discul germinativ. Segmentaia este parial i discoidal interesnd numai Ovulele centrolecite sunt caracteristice artropodelor. Vitelusul nutritiv ocupa centrul ovulei, n timp ce vitelusul formativ (hialoplasma) formeaz un strat periferic subire. Segmentaia intereseaz numai vitelusul formativ, aprnd de tip superficial.

160

9.2.FECUNDAIA Fecundatia este un proces biologic complex, format dintr-o succesiune de fenomene interdependente prin care, cei doi gamei de sex opus (spermatozoidul i ovula) se contopesc i se asimileaz reciproc, rezultnd zigotul (sau oul), prima celula a unui viitor organism. Fazele fecundaiei Faze Faza de apropiere Faza de penetraie Faza de amfimixie Intervin: -fertilizina ( ginogamon) -antifertilizina (androgamon) -acrozina (=hialuronidaza) Se produce: -disociere celulelor foliculare Observaii: -este nespecific

-penetraia membranei pelucida -eliberarea polocitului secundar - ptrunderea spermatozoidului n ovula -rotaia capului spermatozoidului -formarea asterului spermatic -cariogamia -singamia -refacerea setului diploid determinarea sexului

- la homonide i roztoare penetraia este total

Fecundaia se realizeaz n trei faze succesive: de apropiere, de penetraie i de amfimixie. a) Faza de apropiere are loc datorit atraciei reciproce dintre cei doi gamei ntruct membrana pelucida a ovocitului conine o glicoprotein denumit fertilizin sau ginogamon, care reacioneaz cu o protein acid de pe suprafaa spermatozoizilor, denumit antifertilizin sau androgamon. n felul acesta se produce o reacie similar reaciei dintre antigen i anticorp. S-a demonstrat ca anticorpii IgG pot impiedica ataarea spermatozoizilor i penetrarea zonei pelucide (denumit i membran pelucida). Pot aprea autoanticorpi pentru zona pellucida care s genereze infecunditate. Spermatozoizii care au capacitate fecundant (capacitatio) produc disocierea celulelor foliculare din coroana radiata cu ajutorul hialuronidazei, deschiznd drumul spre membrana (zona) pelucida. La vac, oaie, capr disocierea are loc imediat dup ovulaie. Disocierea celulelor foliculare nu este specific, realizndu-se i sub aciunea enzimelor eliberate de spermatozoizii altor specii. Apropierea celor doi gameti are loc n treimea superioara oviductului. Ataarea spermatozoidului de zona pelulucida are loc n urma formrii unor legturi ntre o glicoprotein din membrana plamatic a spermatozoidului (o galactosyltransferaz) i receptorii pentru aceasta din zona pellucida .(Fig.9.12)

Fig. 9.12. Etapele realizrii fecundaiei A- Penetrarea zonei pelucide, a speiului perivitelin i a membranei viteline; B- Ptrunderea spermatozoidului n ovul; C- C-Formarea pronucleilor mascul i femel; D-Amfimixia; E- Metafaza primei diviziuni 1- Ovocitul; 2- Nucleul; 3Ovolema; 4- Spaiul perivitelin; 5- Zona pelucid cu spermatozoizi.

161

b) Faza de penetraie (penetratio spermii) const n ptrunderea ctorva spermatozoizi, numai din aceeai specie sau din specii foarte apropiate, ca de exemplu: cal-mgar. Spermatozoizii trec prin zona (membrana) pelucida i ajung n spaiul perivitelin (spatium perivitellinum), plin cu lichid perivitelin (liquor perivitellinus). n urma contactului dintre acrozom i membrana (zona) pelucida, se rupe membrana acrozomului (reactio acxrosomalis), eliberndu-se acrozina (sau hialuronidaza), ce produce o hidroliz localizat, realiznd un canal (via spermatica) tangenial la ovolem. Micrile spermatozoizilor (motus spermii) de traversare a zonei pelucide dureaz circa 5 minute. Ovocita reacioneaz la ptrunderea unui numr redus de spermatozoizi n zona pelucida, prin realizarea celei de-a doua diviziuni de maturare, rezultnd al doilea globul polar (polocitul secundar), celul care va fi eliminat i ovula, apt pentru fecundare. Dupa ce primii spermatozoizi au ptruns n zona pelucid se produce reacia zonei pelucide, adic: granulele corticale din ovocit i vars coninutul n spatiul perivitelin, ceea ce face ca din acest moment zona pelucida s devin impermeabil i rezistent fa de acrozina altor spermatozoizi. Impermeabilizarea se poate realiza lent, in circa 60 secunde (la vac, iap, oaie, scroaf, cea, hamster), sau rapid n1-2 secunde (la iepuroaic). n felul acesta se asigura fecundaia monospermic (monospermia) i se evit polispermia (polyspermia). Spermatozoizii cei mai viguroi se orienteaz spre orificiul membranei viteline prin care a fost expulzat cel de-al doilea globul polar. Numai un singur spermatozoid, denumit spermatozoid privilegiat ptrunde n ovul. La taurine, ovine, canide i leporide, n ovul ptrunde numai capul spermatozoidului, gtul i coada rmnnd n zona pelucida. La hominide i la unele roztoare ( oarece, cobai) penetraia este total. La mamifere, producerea contactului dintre cei doi gamei i realizarea fecundaiei depinde de supravieuirea spermatozoizilor, depui n cile genitale femele. Supravietuirea variaz n funcie de specie, fiind de: 44 ore la armsar, 25-30 ore la taur, 30-35 ore la berbec, 8 -12 ore la iepure. c) Faza de amfimixie sau concepie (conceptio) are loc dup ptrunderea spermatozoidului n ovul. n aceast faz se produc urmtoarele fenomene: 1. capul spermatozoidului migreaz spre centrul ovulului, unde se afla nucleul, suferind o rotaie de 180, nct acrozomul se orienteaz spre membrana vitelin, iar gtul spermatozoidului se orienteaz spre nucleul ovulului; 2. centriolul proximal se detaeaz de baza capului, formnd spermocentrul, iar citoplasma ovulei se condenseaz n jurul spermocentrului sub form de raze citoplasmatice, dnd natere la asterul spermatic (aster spermaticus); 3. capul spermatozoidului, respectiv nucleul, ncepe sa asimileze foarte repede citoplasma ovulei, crete n volum i devine pronucleu mascul (pronucleus masculinus); 4. nucleul ovulei sufer modificri infrastructurale i mai ales biochimice, transformndu-se n pronucleu femel(pronucleus femininus); 5. cei doi pronuclei se apropie reciproc, membranele lor vin n contact, se alipesc (realiznd cariogamia), se dizolv n acest punct i se formeaza o singur membran nuclear, n interiorul creia se asimileaz reciproc (realiznd singamia ) componentele infrastructurale i biochimice ale celor doi pronuclei, obinndu-se astfel o celula nou, zigotul (zygota s. conceptus) sau oul fertilizat (ovum fertilizatum s.spermovium). n timpul amfimixiei se reface setul diploid al zigotului, realizndu-se setul de cromozomi caracteristic speciei i stabilindu-se bazele ereditii ale noului organism. Se determin sexul i se declaneaz segmentaia. Durata total a fecundaiei variaz n funcie de specie, fiind n medie de 12-16 ore, la animalele domestice. Cel mai mare numr de ore (10-12 ore) este ocupat de fenomenele care au loc la nivelul pronucleilor. Exist unle specii de animale nevertebrate (albine,furnici, purici de plante) sau vertebrate (o specie de oprl, Lacerta saxatilis), la care dezvoltarea ovulei se poate produce fr a fi avut loc fecundaia, prin fenomenul de partenogenez. De asemenea, la unele specii de peti (la caras Carassius auratus gibelio), a fost observat fenomenul de pseudogamie sau ginogenez , o form de fecundaie incomplet, cnd nu se produce amfimixia, dei spermatozoidul ptrunde n ovul. Puii rezultai au motenit i unele caractere de la tai, ceea ce demonstrez influena substanelor din spermatozoizi asupra metabolismului i dezvoltrii oului,chiar i n cazul, n care nu s-a produs amfimixia. n patologia fecundaiei se ntlnesc aspecte precum: a) himerismul - cnd are loc o fecundaie dispermic: un spermatozoid face amfimixie cu nucleul ovulei, iar cellalt spermatozoid face amfimixie cu nucleul globulului polar, antrenndu-se ntr-o dezvoltare anarhic; b) aberaiile cromozomiale, datorate greelilor din meioz i mitoz, ce pot interesa att gonozomii, ct i autozomii, producndu-se diferite malformaii cromozomiale.

162

9.3. Segmentatia Prin segmentaie se nelege ansamblul diviziunilor pe care le urmeaz zigotul i n urma crora se realizeaz edificii pluricelulare. Se declaneaz la un interval variabil de timp dup fecundare (la circa 30 de ore la hominide).La sfritul ei embrionul este schiat, fiind constituit din primele dou foie embrionare. Se desfaoar n timp ce zigotul coboar prin oviduct n uter i cuprinde urmtoarele stadii embrionare: morula, blastula, gastrula i neurula. Ca model didactic pentru explicarea segmentaiei, se prezint segmentaia la amfioxus (de la grecescul amphi = dublu; oxys = ascuit), Branchiostoma lanceolatum, un cefalocordat. Este cea mai simpl segmentaie i prezint asemnri cu cea de la pasre i mamifere. 9.3.1.Segmentaia la amfioxus Amfioxus are ovul de tip oligolecit, care va realiza o segmentaie total holoblastic (fissio holoblastica s. fissio totalis) i inegal ( fissio inequalis) , parcurgnd fazele de: morul, blastul, gastrul i neurul. (Fig. 9.13)

Fig. 9.13. Segmentaia la amfioxus A- Zigot; E,C,D Apariia blastomerelor; E- Morula; F- Invaginarea blastulei; G- Formarea gastrulei. 1- Polul animal; 2- Polul vegetal; 9.3.1.1.. Faza de morula Faza de morul (morulatio) ncepe la cteva ore dup fecundare, cnd zigotul (zygota s. conceptus) sau celula ou intr n diviziune. Prima diviziune se realizeaz dup un plan vertical, meridional (planul fissionis meridionalis), rezultnd dou blastomere (blastomerus) egale, al cror volum total nu depsete volumul zigotului (a celulei ou). A doua diviziune este tot meridional (vertical), ns perpendicular pe planul primei diviziuni, rezultnd patru blastomere. A treia diviziune este transversal, planul de diviziune fiind paralel cu ecuatorul, dar situat supraecuatorial (planum fissionis tangentiale). Rezult opt blastomere inegale: patru blastomere mici, micromere (micromerus), n emisfera polului animal i patru blastomere mai mari, macromere (macromerus), situate n emisfera polului vegetativ. Prin diviziunile ulterioare, numrul blastomerelor crete n proporie geometric (16, 32, 64, 128) att n cazul micromerelor ct i n al macromerelor. Celulele rezultate n urma acestor diviziuni vor genera o formaiune sferoidal (spheroideum s. sphaeroideum), plin de celule cu aspect muriform, denumit morula (morula). Morula este mai mare, ca volum, dect celula ou din care s-a format. n cadrul ei, micromerele se dispun spre polul animal, iar macromerele spre polul vegetal al morulei. Se consider c, pn n stadiul de cteva (8-10) blastomere, toate celelele sunt omnipotente (cellula omnipotens) sau pluripotente (cellula pluripotents), avnd aceeai valoare n difereniere. n acest stadiu celulele sunt nedeterminate (cellula indetermniata) i indiferent de poziia lor, dac sunt

163

detaate i puse n condiii propice, evolueaz pn la sfritul dezvoltrii embrionare, putnd genernd un organism ntreg. 9.3.1.2. Faza de blastula (blastulatio)

Blastomerele din interiorul morulei ncep s produc un lichid blastocelic ce le mpinge la periferie, unde se dispun sub forma unui singur strat de celule, ce delimiteaz cavitatea blastocelic (cavum blastocystis). Rezult, astfel, stadiul monoblastic (blastocystis unilaminaris) sau blastula (blastula) s.blastocystis). Blastula sau blastocistul (blastocystis) cuprinde circa 128 blastomere, Este sferoidal i nu depsete, la amfiox, volumul iniial al zigotului. n cazul acestei formaiuni, micromerele au mai puin vitelus i formeaz peretele emisferei animale, iar macromerele sunt mai bogate n vitelus, alctuind peretele emisferei vegetale. n aceasta faz se produce determinarea (determinatio) prin poziie, blastomerele ocupnd prin diviziuni repetate, anumite poziii. Blastomerele vor evolua diferit,n funcie de factorii de mediu ambiant i n raport cu interrelatiile intercelulare. Aceasta faz este denumita i preludiul diferenierii, pentru ca, dup intrarea celulelor n faza de determinare, conform poziiilor i relaiilor intercelulare noi, n fiecare celul sau ntr-un grup de celule s nceap sinteze specifice. n acest fel sunt activate anumite protein-enzime, care vor iniia sinteza unei proteine specifice sau a unui anumit teritoriu morfogenetic din care fac parte celulele respective. 9.3.1.3. Faza de gastrul (gastrulatio)

Faza de gastrul (gastrulatio) se caracterizeaz printr-o proliferare intens, o cretere volumetric i prin deplasri morfogenetice (motus morphogenetici) ample de celule sau grupuri de celule, n urma crora rezult foiele embrionare (strata germinalia). Micromerele se divid mai rapid i alunec (immigratio) la suprafaa blastulei prin epibolie (epibolia), realiznd foia celular extern (epiblastus) sau ectoblastul (ectoblastus). Macromerele care conin vitelusul se divid mai puin intens i se invagineaz (invaginatio), prin embolie, realiznd foia intern (endoderma) sau endoblastul (endoblastus). Embolia const ntr-o invaginanare n cavitatea blastocelic a macromerelor. Cavitatea format n urma invaginrii se numete arhenteron i comunic cu exteriorul prin blastopor, care marcheaz extremitatea caudal a corpului viitorului animal, fiind delimitat de dou buze, una superioar, alta inferioar. Spre sfritul fazei are loc o alungire (elongatio) a gastrulei, n sensul axului antero-posterior. Factorii ce intervin n diferenierea i dezvoltarea embrionului. n evenimentele complexe ale diferenierii i dezvoltrii embrionare, un rol important, n afara controlului genetic permanent, l au influenele din mediul extracelular, interaciunea celulelor nvecinate, micarile celulare morfogenetice i adezivitatea celular. Astfel, accesibilitatea diferit la factorii din mediul extracelular, determin potenialiti evolutive diferite. Acioneaz un gradient de mediu, care se refer la faptul c lichidul extracelular este mai bogat n substane nutritive la periferia masei de celule, n timp ce n centrul masei de celule este mai srac n substante nutritive i mai bogat n produi de excreie ai celulelor. Interaciunile celulare cu rol inductiv apar foarte de timpuriu n embriogenez, nc din faza de 8 blastomere. n etapa de morul, celulele sunt cuplate electric, membranele celulare avnd o foarte mare permeabilitate ionic. Curentul electric realizeaz un cuplaj, chiar n absena jonciunilor specializate. ntr-o faz mai avansat, permeabilitatea pentru ioni scade foarte mult, rmnnd nealterate la nivelul jonciunilor de tip gap, care apar imediat dupa primele determinri. Micrile celulare (motus morphogenetici) sunt foarte intense n embriogenez, fiind determinate de factori greu de definit, asemntori, ca efect, cu factorii chimio-tactici pentru leucocite. Micrile celulare ncep n faza de gastrul i permit celulelor s ajung n contact cu un alt tip de celule cu care pot stabili interaciuni cu rol inductiv. Adezivitatea celular joac un rol deosebit n evenimentele complexe ale diferenierii i dezvoltrii embrionare, fiind mediat de molecule de proteine, denumite molecule de adezivitate (n limba engleza: cell adhesion molecules, prescurtat: CAM). Acestea aparin membranei celulare i matricei extracelulare. (Fig.9.14)

164

Fig.9.14. Regiunile blastocistului n funcie de prezena moleculelor adezivitii celulare (CAM) A-Regiuni cu N-CAM; B- Regiuni cu LCAM; C-Regiuni fr CAM. 1-Linia primitiv; 2- Ectoderm; 3- Sistem nervos; 4Notocord; 5- Somite;6- Cord; 7- Aparat urinar; 8-Muchi neted; 9- Endoderm; 10Tesuturi hematoformatoare. Moleculele adezivitii celulare activeaz selectiv n cursul desfurrii proceselor dinamice care au loc, modificnd comportamentul celulelor angajate n micari morfogenetice. Ele au fost identificate sau izolate prin metode ale imunologiei i au fost definite dup celulele pe care au fost depistate, astfel, existnd: molecule de adezivitate interneuronale ( N-CAM ), molecule ale adezivitatii celulelor hepatice ( L-CAM ) i molecule ale adezivitatii dintre neuron i nevroglie ( NG-CAM ). Ele sunt glicoproteine, iar N-CAM conin cantitti foarte mari de acid sialic. N-CAM, L-CAM si NG-CAM nu au specificitate ncruciat, deoarece nu se leag ntre ele pentru a media adezivitatea dintre celule. n funcie de repartiia moleculelor adezivitii celulare (CAM), embriologii au conceput hrti ce indic esuturile i structurile care se vor forma din fiecare regiune. Astfel, regiunile blastocistului care exprim N-CAM vor da natere plcii neurale, notocordului i somitelor, iar cele care exprim LCAM vor genera ectodermul non-neural i endodermul. Cu ajutorul metodelor de imunofluorescen s-a observat c 2/3 din suprafaa blastomerului este pozitiv pentru cele dou tipuri de molecule ale adezivitii. 9.3.1.4. Faza de neurul Faza de neurul (neurulatio) sau perioada iniial a anului neural (periodus sulci neuralis initialis) se caracterizeaz prin formarea din ectoblast, n mod succesiv a plcii neurale (lamina neuralis), a canalului i a tubului neural . Astfel, faza neurulrii marcheaz constituirea tubului nervos, dar, totodat i nceputul histogenezei, precum i a diferenierii primordiilor de organe. n aceast faz se petrec dou evenimente morfogenetice majore: a) formarea tubului neural si b) cordomezoblastului. a) Formarea tubului neural Micromerele ectoblastice din zona dorso-central a embrionului devin mai nalte dect ectoblastul, se ngroa, formndu-se placa sau lama neural (neuroectoblastul) orientat n axul longitudinal al embrionului.

Fig. 9.15. Neurulaia la Amfioxus Etape iniiale A,B,C Seciuni transversale 1-Ectoderm, 2-Endoderm, 3- Arhenteron, 4- an i tub neural; 5-Notocord; 6-Diverticuli mezoblastici.

165

Evenimente

Etape Placa neurala

Formaiuni specifice

Formaini terminale

Observaii: La psri i mamifere, n ectoblast, n aria pelucid apar: linia primar, nodulul anterior, prelungirea cefalic, semiluna gonocitar, nodulul posterior

Fomarea tubului neural (origine n ectoblast)

Jgheab neural

Creste neurale

Ganglionii nervoi Nervii Telencefal Diencefal Mezencefal Mielencefal Metencefal Mduva spinrii Coloana vertebral

Vezicula cerebral primar (encefalul) Tub neural Tubul neural Coarda dorsal Notocordul

La pasri si mamifere se dezvolt din ectoblastprelungirea cefalic Formarea Mezoblastul Somitele Miotoamele La psri i cordomezoprimar Nefrotomul Sclerotoa-mele mamifere se blastului Hipoblastul Hipoblastul dezvolt din (origine n (somatopleura ectoblast de pe endoblast) i splanchnolaturile liniei pleura) primitive i din prelungirea cefalic Celulele plcii neurale se divid n continuare cu mare intensitate, nct placa neural se ndoaie i se invagineaz puin, formnd jgheabul (sulcus neuralis) i canalul neural (canalis neuralis) cu forma literei U sau V (pe seciune transversal) delimitat de crestele neurale (crista neuralis). Ulterior, jgheabul neural se nchide prin apropierea i sudarea marginilor sale superioare, realizndu-se tubul neural (tubus neuralis) . Neurulaia la Amfioxus b) Formarea cordomezoblastului Se desfoar concomitent cu formarea tubului neural i const n formarea coardei dorsale i a mezoblastului primar. Coarda dorsal sau notocordul (notochorda) se formeaz n axul sagital dorsal al endoblastului prin diviziuni rapide i proliferri puternice, dup care se detaeaz de endoblast i se dispune ventral de tubul neural. Concomitent, paramedian se produce o ngroare a celor dou margini laterale ale jumtii dorsale a endoblastului, realizndu-se dou creste paramediane cu aspect triunghiular, care se vor detaa de endoblast i vor forma, pe ambele laturi, mezoblastul primar. Mezoblastul primar sau mesodermul paraaxial (mesoderma paraaxiale) se dezvolt, ptrunznd, pe fiecare parte, printre ectoblast i endoblast, constituind cea de-a treia foi embrionar, ce marcheaz apariia stadiului triblastic (tridermic), care ncheie embriogeneza, marcnd trecerea spre histogenez i organogenez.(fig.9.16)

166

Fig.9.16. Neurulaia la Amfioxus Etape finale A,B,C Seciuni transversale 1- Tub neural; 2- Coard dorsal; 3- Saci celomici; 4- Intestin; 5- Cavitate celomic; 6Splanchnopleura; 7- Somatopleura. Prin dezvoltarea mezoblastului, vor rezulta trei formaiuni (somitele, nefrotomul i hipoblastul) dispuse dorso-ventral i iniial legate ntre ele. Tot din mezoblast deriv i mezenchimul. Somitele(somiti) apar ca dou mase celulare, triunghiulare pe seciune transversal ce flancheaz lateral tubul neural i coarda dorsal. Ele se vor segmenta transversal, printr-un proces denumit metamerizare. Din somite se vor diferenia: a) miotoamele (myotomi),din partea dorsolateral a somitelor, formate din mioblati, care se vor transforma n fibre musculare; b) sclerotoamele (sclerotomi),din partea medial a somitelor, din care se vor dezvolta oasele. Nefrotomul (nephfrotomi) se segmenteaz transversal (se metamerizeaz) genernd primordiile (primordia) sau mugurii embrionari ai aparatului urinar. Hipoblastul nu se metamerizeaz, ci se delamineaz (delaminatio) (despic) longitudinal, genernd splanchnopleura i somatopleura, ce vor delimita cavitatea celomic primar (celoma s. coeloma) i vor da natere membranelor seroase ale cavitilor (pleura, peritoneul, pericardul). (Fig.9.16) Splanchnopleura (splanchnopleura) sau foia visceral va acoperi intestinul primitiv i toate organele ce se vor forma din el. Somatopleura (somatopleura) sau foia parietal va cptui ectoblastul care delimiteaz embrionul. Mezenchimul (mesenchyma) este un derivat mezoblastic ce se formeaz din celulele migrate de pe faa intern a somitelor i a splanchnopleurei. El va da natere: sngelui, esutului conjunctiv propriu-zis, sistemului macrofagic monocitar i muchilor netezi. Dup ncheierea stadiului de morul, n locul termenilor de ectoblast, endoblast i mezoblast, se vor folosi termenii de ectoderm, endoderm i mezoderm. Din foiele embrionare se vor diferenia esuturile, sistemele i aparatele organismului. Din ectoderm (ectoderma) se formeaz: epiderma, epiteliul mucoasei bucale i anale, sistemul nervos, hipofiza, epifiza, medulosuprarenala, epiteliul cornean i cristalinian, epiteliul senzorial auditiv, retina i epiteliul olfactiv. Se remarc apariia unor ngrori ectoblastice denumite placode: placoda olfactiv, placoda cristalinian i placoda auditiv. Placoda olfactiv (placoda olfactoria) difereniaz, prin evoluie, neuronii olfactivi i celulele de susinere din mucoasa olfactiv. Placoda cristalinului (placoda lentis) va genera cristalinul, iar din placoda auditiv (placoda otica)se va diferenia vezicula auditiv din care se va dezvolta labirintul membranos. Din mezoderm (mesoderma) se difereniaz: epiteliile rinichilor i gonadelor, mezoteliile cavitilor pleurale, pericardiace i peritoneale; endoteliile vaselor sanguine i limfatice; celulele corticosuprarenalei; celulele Leydig din testicul, celulele luteale ale ovarului; esuturile conjunctive, sistemul macrofagic monocitar; scheletul osos; sngele, muchii; vasele; aparatul urinar; unele poriuni ale aparatelor genitale. Din endoderm (endoderma) se difereniaz: epiteliile aparatului respirator (cu excepia mucoasei nazale); epiteliul tubului digestiv (exceptnd epiteliile cavitii bucale i canalului anal);

167

ficatul, pancreasul i vezica biliar; glandele tiroid i paratiroid; epiteliul cavitii timpanice i ale tubei auditive; timusul.

Histogeneza i organogeneza Foia embrionar Ectoderm esuturi Epidermul Epiteliul mucoasei bucale i nazale Epiteliul mucoasei anale Epiteliul cornean Epiteliul cristalinian Epiteliul senzorial auditiv esutul nervos Celulele sistemului macrofagic Celulele corticosuprarenalei Celulelor glandelor interstiiale Epiteliile renale Epiteliile gonadelor Mezotelii seroaselor Endoteliile vasculare esuturile conjunctive esutul sanguin esutul muscular Epiteliul cavitii timpanice Epiteliul tubei auditive Epiteliile tubului digestiv Epiteliile aparatului respirator Aparate sau sisteme Sistemul nervos Organe Hipofiza Medulosupra-renala Retina Placoda olfactiv Placoda cristalinian Placoda auditiv Oasele Muchii

Mezoderm

Scheletul Sistemul vascular Sistemul limfatic Aparatul urinar Segmente ale aparatelor genitale

Endoderm

Aparatul respirator Aparatul digestiv

Tiroida Paratiroida Ficat Pancreas Vezic biliar Timusul (parial)

9.3.2.SEGMENTAIA LA PSRI Datorit oului, care este de tip telolecit, segmentaia este meroblastic sau parial, iar dup aspectul su este polar sau discoidal. La psri, celula sexual femel matur (sau ovulul) este reprezentat numai de glbenu. Nucleul ovulei este situat la polul animal al glbenuului, fiind nconjurat de o cantitate redus de citoplasm activ (sau vitelus formativ) mpreun cu care alctuiete o formaiune discoidal, denumit discgerminativ (cicatricula) sau pat germinativ (nucleul Pander). Numai discul germinativ va intra n segmentaie. Restul ovoplasmei este format din vitelus alb formativ (ce conine granule mici, cu compoziie predominant proteic 43%) i din vitelus galben nutritiv, ce cuprinde granule mari, formate n principal din lipide i proteine, n cantitate mai redus (28%). Depunerea vitelusului ncepe de sub discul germinativ, cu un strat de vitelus alb care se prelungete spre centrul oului cu o formaiune cu aspect de limb de clopot, denumit latebra Purkinje. n afara acestui vitelus alb se se dispune un strat de vitelus galben, iar n continuare are loc o dispunere a celor dou tipuri de vitelus n straturi concentrice alternative. La periferie, oul este nvelit de o membran vitelin (de ovolem). (Fig.9.17) Fig.9.17. Oul la psri

168

1- Latebr; 2- Disc germinativ; 3- Membrana vitelin; 4- Vitelus galben; 5- Vitelus alb;; 6Albu dens; 7- alaze; 8- Albu fluid; 9- Albu dens; 10- Albu fluid, al treilea strat; 11- Membrana cochilier intern; 12- Membrana cochilier extern; 13- Camera cu aer; 14- Camera calcaroas; 15Cuticula. Fecundarea oulor are loc n poriunea iniial a oviductului sau pe suprafaa ovarului, nainte de a fi acoperit cu albu, membrane cochiliere i cochilie. Dup fecundare ovula (oul nefecundat) devine ou fecundat (ovum fertilisatum s. sperovium) sau zigot (zygota s. conceptus). nceputul segmentaiei este marcat de apariia unui an linear ce marcheaz planul de separare dintre cele dou celule fiice, plan ce cade perpendicular pe suprafaa discului germinativ, fr s-i ating marginile. Celulele rezultate sunt identice i de talie egal (diviziune homoplastic). A doua mitoz are anul i planul de separare dispuse perpendicular pe primul an. n cea de-a treia mitoz apar dou anuri verticale, ambele perpendiculare pe primul an. Este urmat de alte diviziuni verticale, rezultnd un singur strat de celule prismatice, reprezentnd ectoblastul. Formarea primelor dou blastomere are loc dup 30 de minute de la singamie, iar dup patru ore embrionul are 8 blastomere, ajungnd la 152 blastomere dup 7 ore. Segmentarea este sincron, deoarece toate diviziunile celulare se desfoar simultan. Intercineza este scurt, fr sintez de acizi nucleici, acetia existnd deja. n plus, vitelusul formativ este bogat n aminoacizi, enzime, glucide i lipide, asigurnd necesarul proceselor de multiplicare. Ectoblastul este desprit de vitelus printr-o cavitate plin de lichid, denumit cavitatea subgerminal sau de segmentare. Acest aspect (ectoblastul i cavitatea subgerminal) reprezint stadiul embrionar monoblastic (comparabil cu blastula de la amfiox), avnd la psri forma de disc, de unde i denumirea de discoblastul (sau de disc embrionar sau bnu). (Fig.9. 18)

Fig.9.18. Segmentaia zigotului la psri. A-Discul germinativ nesegmentat; B-Stadiul cu dou blastomere; C-Stadiul cu patru blastomere; D-Stadiul cu opt blastomere; F,G-Discoblastula.

Privit de sus, discul embrionar apare ca o suprafa relativ circular care prezint: 1) o zon mai transparent aria pelucid (area pellucida), situat uor excentric; i 2) o zon mai ntunecat aria opac (area opaca), ce nconjoar aria pelucid. n stadiul diblastic se formeaz endoblastul. Unele dintre celulele ectoblastice iau form cubic i migreaz la limita dintre ectoblast i cavitatea subgerminal. n continuare, aceste celule se multiplic i formeaz un strat continuu subectoblast, denumit hipoblast (hypoblastus), mprind cavitatea de segmentare n dou spaii, o cavitate blastocelic i o cavitate subgerminal propiuzis, delimitat ntre vitelus i hipoblast,umplut cu lichid blastocelic i particule de vitelus. Procesul de de separare a celulelor ce formeaz hipoblastul se numete delaminare (delaminatio), iar ectoblastul devine epiblast (epiblastus). Hipoblastul are un rol temporar, fiind nlocuit de endoblast (endoblastus). Celulele endoblastice imping celulele hipoblastice in aria extraembrionar, unde particip la formare peretelui vezicii ombilicale.(Fig.9.19) Stratul diblastic se realizeaz n intervalul de 24-48 de ore, ct dureaz parcurgerea oviductului, pn n momentul eliminarii oului din corpul psrii (pontei). Evoluia embrionului se oprete prin meninerea acestuia la 5-7C i continu prin incubaie la 38-39C, n condiii de umiditate, aerare i ntoarcere periodic.

169

Fig.9.19. Discoblastula la psri, nainte de nceperea gastrulaiei A, B- Discoblastule, aspecte dorsaleC,D,E Seciuni transversale 1-Aria opac;2- Aria clar (pelucida), 3- Nodul posterior;4- Ectoblast; 5- Endoblast;6- Cavitate subgerminal Procesele de multiplicare celular se reiau dup ase ore de la nceperea incubaiei,cnd ncepe perioada de gastrulare. Celulele epiblastice i cele ale hipoblastului realizeaz: micri de convergen (pentru a forma linia primitiv i nodulul caudal),migrri n profunzime (n cavitatea blastocelic i n aria extraembrionar), micri de deplasare lateral (pentru a forma mezoblastul). Gastrularea la psri cuprinde: formarea nodulului posterior, formarea liniei primitive cu nodulul anterior, formarea mezodermului, formarea notocordului i regresia liniei primitive. Dup 24 de ore de incubaie, discul embrionar (discus embryonicus) i modific forma, devenind oval (din rotund), apoi cu aspect piriform (cu lungimea de 3,5-5 mm), prezentnd o extremitate cefalic i o extremitate caudal, cu o proliferare ectoblastic, de form triunghiular, cu aspect ntunecat, denumit nodul caudal sau posterior. Aceast proliferare ectoblastic se prelungete pe linia median, n sens cranial, formnd linia primitiv (linea primitiva), care este parcurs n sens longitudinal de o depresiune ngust, denumit anul liniei primitive (sulcus primitivus). (Fig.9. 20) Extremitatea cefalic a liniei primitive se termin printr-o formaiune nodular denumit nodul cranial sau anterior (Hensen) (nodus primitivus), aprut datorit proliferrilor mai intense. n centrul nodulului anterior se observ o depresiune denumit foset primitiv (fovea primitiva). De la nodulul anterior, prin proliferri celulare, ia natere o formaiune prelungirea cefalic (processus cephalicus s.processus notochordalis) dirijat cranial, care va ptrunde sub forma unui deget de mnu ntre ectoblast i endoblast, fr a se atinge limita discului (plica limtans areae et sulcus limitans disci embryonici). Aceast prelungire va genera cordomezoblastul, respectiv coarda dorsal (notochorda) i mezoblastul (mesoderma embryonicum) anterior. (Fig.20)

170

Fig. 9.20. Aspecte evolutive ale ariei embrionare la psri 1- Vitelus; 2- Aria opac; 3-Aria pelucid; 4- Linia primar; 5- Nodul anterior; 6- Prelungire cefalic; 7- Semiluna gonocitar; 8- Creste neurale; 9- Plica limitant anterioar; 10- Nodul posterior. Spre deosebire de Amfioxus, unde mezoblastul are origine endodermic, la psri, mezoblastul se formeaz din ectoblast. (Fig.9. 21, 9.22 )

Fig. 9.21. Seciune transversal prin prelungirea cefalic a liniei primare la gin 1-Ectoblast; 2- Endoblast; 3-Mezoblast; 4-Prelungire cefalic Exist la psri dou focare de mezoblastogenez: a) la nivelul liniei primitive, unde are loc o proliferare celular care se ndreapt spre laturile discului embrionar (mesoderma paraaxiale) i, ptrunznd ntre ectoblast i endoblast, genereaz o parte a mezoblastului embrionar (mesoderma embryonicum ) i mezoblastul extraembrionar (mesoderma extraembryonicum); b) la nivelul prelungirii cefalice, de unde ia natere, aproape n totalitate mezoblastul ce invadeaz discul embrionar, genernd coarda dorsal i mezoblastul anterior (mesoderma capitis).

171

Fig.9.22. Seciuni transversale prin aria embrionar la psri A, B, C Etape succesive 1- Linia primar; Sanul liniei primare; 3- Ectoblast; 4- Endoblast; 5- Mezoblast Mezoblastul anterior, situat pe prile laterale ale coardei dorsale formeaz lamele mezodermale (mesoderma laterale) care vor evolua n somite, nefrotoame i lame laterale. Printr-un proces de clivaj, din lamele laterale apare cavitatea celomic (cavum celomicum) delimitat de: a) somatopleur, format din elementele celulare mezoblastice aflate n contact cu ectoblastul i de b) splanchnopleur, aflat n contact cu endoblastul. (Fig.9.23) Neurulaia se desfoar n mod asemntor cu cea de la amfiox. Ectoblastul situat la nivelul prelungirii cefalice (median i oral de nodul anterior), va genera prin ngrori proliferative, placa neural, anul neural, canalul (tubul) neural i crestele neurale. n partea anterioar a extremitii cefalice a discului embrionar, n aria extraembrionar vascular apare o formaiune cu aspect semilunar semiluna gonocitar sau conul germinativ, ce constituie locul de difereniere a celulelor gonocitare la psri.

Fig. 9.23. Stadii succesive de dezvoltare embrionar la psri Scheme ale seciunilor transversale 1- Ectoblast; 2- Endoblast; 3- Mezoblast; 4- Coarda dorsal; 5- an neural; 6- Somite; 7- Cavitate celomic; 8- Canal Wolf; 9- Somatopleura; 10- Splanchnopleura; 11- Aorta. La incheierea stadiului de neurul, embrionul capt forma literei C i se delimiteaz de sacul vitelin, de care va rmne ataat prin canalul vitelin. Formarea corpului embrionului se realizeaz n dou etape: n prima etap, tubul neural crete mai intens dect ectodermul i endodermul,aparnd un buzunar subencefalic i un proces cranial; n etapa a doua, capul i corpul embrionului se delimiteaz de zona extraembrionar, n ziua a IIIa de incubaie. 9.3.3.segmentaia la mamifere

172

Prezint particulariti generate de faptul c la mamifere oul este oligolecit. Segmentaia este total (ntreaga mas a oului intr n diviziune), subegal (rezultnd blastomere aproape egale ca mrime) i de tip asincron (mitozele se succed fr o anumit ordine n timp). Prezint trei perioade: 1) o perioad iniial, asemntoare cu segmentaia de la amfioxus; 2) o perioad specific mamiferelor i 3) o perioad asemntoare cu segmentaia la psri. Prima diviziune a oului duce la formarea unei celule voluminoase macromera (macromerus), cu aspect clar i a unei celule mici, micromera (micromerus), ntunecat, ambele ocupnd spaiul delimitat de zona pelucid. (Fig.9.24)

Fig.9.24. Segmentaia la mamifere A- Zigotul oligolecit; B- Stadiul cu dou blastomere; C- Stadiul cu trei blastomere; D- Stadiul cu patru blastomere; E- Formarea blastocistului. 1- Macromera; 2- Micromera; 3- Zona pelucida; 4-Trofoblast; 5- Buton embrionar. Macromera se divide naintea micromerei, rezultnd stadiul cu 3 blastomere (foarte scurt ca existen), pentru ca, imediat, unul din blastomerele clare (macromere) se divide, rezultnd stadiul de 4 blastomere, dintre care 3 sunt clare (macromere) i una este ntunecat (micromer). n continuare, ritmul de diviziune al blastomerelor devine cu totul neregulat, iar planurile de segmentaie nu sunt ordonate spaial, nct dispar i diferenele volumetrice ntre blastomerele clare i cele ntunecate. n final se edific morula (morula), alctuit dintr-un bloc compact de celulentunecate, cu contururi poligonale. Diferena fa de ceea ce se ntmpl la amfiox, const n aceea c micromerele i macromerele nu se polarizeaz la antipozi, nici n morul, nici n blastul. Astfel, micromerele se dispun periferic nvelind macromerele i genernd trofoblastul (trophoblastus), ce va servi la hrnirea embrionului pn la formarea placentei. Macromerele se dispun central, alctuind embrioblastul embrionar (embryoblastus s.massa cellularis interna) sau butonul embrionar. Toate transformrile desfurate pn n acest moment se petrec n spaiul delimitat de membrana pelucid, care se va subia treptat i va dispare definitiv. Prin dispariia membranei pelucide, trofoblastul ia contact intim cu membrana uterin, intervenind ulterior n nutriia embrionului. Celulele embrioblastului secret un lichid albuminos, care se acumuleaz ntr-o cavitate, denumit lecitocel, ce mpinge macromerele spre polul superior (animal). La acest pol, macromerele vor forma un mugure embrionar (nodus embryonicus s. massa embryonica), suspendat parc de trofoblast, asemntor unei picturi de ap condensat pe tavan. Aceast formaiune ce cuprinde trofoblastul (format din micromere dispuse periferic), lecitocelul i mugurele embrionar poart denumirea de blastocist (blastocystis s. blastula) i este analog blastulei de la amfiox, aprnd dup aproximativ 7 zile de la fecundaie. (Fig.9.25) Fig.9.25. Seciuni prin blastocistul de leporide A, B Etape evolutive

173

1- Buton embrionar; 2- Trofoblast; 3- Membrana pelucid; 4- Cavitatea vitelin; Blastocistul ajunge n cavitatea uterin i se fixeaz de mucoasa uterin prin procesul de nidaie (la om i la roztoare) sau implantaie (la restul animalelor). Concomitent cu nceputul nidaiei sau implantaiei ncep procesele de difereniere n butonul embrionar i n trofoblast. Din trofoblast se vor diferenia 2 straturi: a) un strat extern, sinciiotrofoblastul (sycytiotrophoblastus), alctuit din celule cu limite celulare slabe i cu o citoplasm mai ntunecat; i b) un strat intern, citotrofoblastul (cytotrophoblastus), format din celule cu limite distincte. Ca rezultat al diferenierilor ulterioare, din trofoblast se va forma componenta fetal a placentei, iar din butonul embrionar se vor diferenia cele trei foie embrionare: ectoblastul, endoblastul i mezoblastul. Gastrulaia La mamiferele placentare, gastrulaia se desfoar n dou etape: n prima etap se formeaz ectoblastul i endoblastul, iar n a doua mezoblastul. (Fig.9.26)

Fig. 9.26. Blastocist de leporide n timpul gastrulaiei 1-Trofoblast;2-Ectoblast; 3-Endoblast; 4- Cavitate vitelin Formarea ectoblastului i endoblastului. Din stratul unic de macromere prismatice care reprezint ectoblastul se difereniaz pe faa sa profund cteva celule mai intunecate. Acestea se vor nmuli i vor genera, similar cu ceea ce se ntmpl la psri, un al doilea strat, format din celule turtite, denumit endoblast. Apare, n acest fel, stadiul diblastic, care datorit aspectului su se mai numete i gastrodisc, sau pat embrionar. Odat ce endoblastul s-a format complet i cptuete ntreaga cavitate a a lecitocelului, n blocul de celule care formeaz buttonul embrionar se produce o clivare (delaminatio), aprnd un spaiu nou, cavitatea amniotic (cavum amnii).

174

9.27. Dezvoltarea endoblastului la leporide 1- Trofoblast; 2- Ectoblast; 3- Endoblast; 4- Cavitate vitelin. La suine,ovine, cervide i leporide, ectoblastul se formeaz din podeaua cavitii amniotice,disprd tavanul acesteia mpreun cu trofoblastul adiacent.Tavanul cavitii amniotice rmne intact la cobai, oarece, obolan, veveri, arici i liliac, unde formeaz ectoblastul, ce este acoperit n totalitate de trofoblast. La ecvine, taurine i carnivore, nu apare cavitate amniotic primar, iar ectoblastul se formeaz din celulele superficiale ale butonului embrionar.(Fig.9. 27) n stadiul incipient al gastrulaiei, cnd ectoblastul i endoblastul sunt complet formate, aria embrionar ( cmp embrionar sau zon embriogen ) are un aspect piriform, cu extremitatea caudal mai ascuit i cu cea cranial mai rotunjit. La extremitatea caudal, se realizeaz prin proliferare, o formaiune mai opac, denumit nodul posterior, ce se continu n sens cranial cu linia primitiv. La mijlocul ariei embrionare, linia primitiv prezint o dilataie, nodulul anterior (Hensen), dup care se continu spre extremitatea cefalic cu prelungirea cefalic. (Fig.9.28) De pe prile laterale ale liniei primitive, se desprind numeroase celule cu contur neregulat (stelat), ce vor forma mezoblastul (mesoblastus), ntre ectoblast i endoblast. Fig. 9.28. Aria embrionar la mamifere - aspecte dorsale evolutive 1-Aria embrionar; 2- Linia primitiv; 3- Nodul posterior; 4- Nodul anterior; 5- Prelungire cefalic. Mezoblastul embrionar prezint trei poriuni distincte: a) o poriune cefalic, nesegmentat; b) o poriune mijlocie, sau mezoblastul trunchiului; c) o poriune caudal, nesegmentat. Mezoblastul trunchiului cuprinde trei zone (regiuni) distincte: 1) o zon dorsal; 2) o zon intermediar; 3) o zon lateral. (Fig.9.29) 1) Zona dorsal se va fragmenta transversal, genernd somitele (somiti). Fiecare somit prezint, la rndul ei, trei poriuni: 1) miotomul (myotomus), poriunea medio-dorsal din care vor lua natere mioblatii i ulterior muchii; 2) sclerotomul (sclerotomus), poriunea medio-ventral, din care se desprind celulele mezenchimale, care migreaz n jurul tubului neural, structurnd mezenchimul (mesenchyma); 3) dermatomul (dermatomus), poriunea lateral a somitei care va genera dermul (dermis) i hipodermul. 2) Zona intermediar (zona nefrogen) (mesoderma intermedium) se segmenteaz transversal n veziculele nefrogene ale pronefrosului, ale mezonefrosului i ale metanefrosului.

175

Fig. 9.29. Gastrulaia la mamifere stadiu avansat. Seciuni transversale A (a a) naintea nodulului anterior; B (b b ) Prin nodulul anterior; C (c c) Prin linia primitiv 1- Ectoblast; 2- Endoblast; 3- Mezoblast; 4- Nodul anterior; 5- Linia primitiv; 6-an primitiv. 3) Zona lateral a mezoblastului (mesoderma laterale) se cliveaz, dnd splanchnopleura i somatopleura, ntre care se delimiteaz celomul primitiv embrionar (cavum coelomicum) . Concomitent acestor transformri, embrionul ia aspect tubular i apoi sufer o ncurbare, sub forma literei C, ale crei capete se apropie i nchid o parte din cavitatea blastocelic ce va deveni cavitate toraco-abdominal, iar ceea ce rmne din cavitatea blastocelic va forma extraembrionar, vezicula vitelin (ombilical) a embrionului. Odat realizate fenomenele de proliferare i difereniere, n dezvoltarea embrionului ncepe o nou etap, denumit histogenez i organogenez, iar embrionul i continu dezvoltarea devenind fetus (foetus). Cele trei foie embrionare i schimb denumirea n ectoderm, endoderm i mezoderm. 9.4.Anexele embrionare i fetale Sunt formaiuni morfologice cu rol n protecia, nutriia i epuraia embrionului i fetusului. Ele sunt o continuare n exteriorul embrionului a componentelor embrionare (ectoderm, endoderm i mezoderm), alctuind, n totalitatea lor, aria extraembrionar. Anexele embrionare i fetale (membranae fetales) sunt reprezentate de: a) vezicula vitelin (sau ombilical); b) alantoid; c) amnios; d) corion. 9.4.1. Vezicula vitelin (ombilical) Vezicula vitelin sau sacul vitelin (saccus vitellinus) este anex embrionar care deriv din endoderm, dup ce acesta nlocuiete hipoblastul. Este desprit de trofoblast prin lecitocel sau blastocel. Ocup o parte din spaiul cavitatii lecitocelice care, odat cu ncurbarea embrionului (sau a ariei embrionare) se mparte n dou compartimente: - un compartiment cuprins n corpul embrionului, reprezentnd intestinul primitiv (enteron primitivum) cptuit de endoderm; i - un compartiment mai spaios, situat extraembrionar, care va forma vezicula ombilical, cptuit de endodermul extraembrionar, ce delimiteaz cavitatea vitelin (cavum vitellinum). Comunic cu

176

intestinul embrionar prin canalul ombilical (vitelin) (ductus pedunculi vitellini), care strbate pedunculul vitelin (pedunculus vitellinus), de legtur cu embrionul i fetusul. Peretele vezicii viteline este format din dou straturi: unul intern, format de celulelele endodermale ( care au nlocuit hipoblastul) i altul extern format din splanchnopleur (din mezoderm extraembrionar). Aici celulele mezenchimale se se grupeaz i formeaz insule sanguine (hemato- i vasculo-formatoare). n etapa timpurie a embriogenezei ndeplinete rolul de organ vasculo i hematoformator, precum i de rezervor de substane nutritive, regresnd ulterior. 9.4.2. Amniosul Amniosul (amnion) se formeaz (amniogenesis) din ndoiturile ectodermului i ala somatopleurei care l cptuete, cute ce apar n urma coborrii embrionului n cavitatea lecitocelic. n acest mod se formeaz patru cute (plica limitans): anterioar, posterioar i dou laterale, care se vor suda n planul median, delimitnd o cavitate amniotic (cavum amnii) ntre ectodermul embrionar i foia amniotic realizat. n lichidul amniotic (liquor amnioticus) plutete embrionul i apoi fetusul cruia-i confer att mobilitate ct i protecie. (Fig.9.30) 9.4.3. Alantoida Este o anex format din endoderm i splanchnopleur. Se dezvolt (allantogenesis) din endodermul intestinului caudal, care prin proliferare i evaginare genereaz iniial un mugure alantoidian digitiform (processus allantoicus). Pe msur ce mugurele embrionar crete, se insinueaz i se interpune ntre amnios i vezicula ombilical, reducnd spaiul ocupat de cavitatea vitelin i antrennd cu el i splanchnopleura care ocup intestinul primitiv.

Fig.9.30. Formarea anexelor embrionare la psri 1- Ectoblast; 2- Endoblast; 3- Mezoblast; 4- Cavitate amniotic; 5- Alantoid; 6- Vezicul ombilical; 7- Vitelus; 8- Splanchnopleura; 9- Intestin primitiv; 10- Somatopleura. Alantoida rmne legat de locul de origine printr-un pedicul , strbtut de canalul urac (urachus),denumit i canal alantoidian (ductus allantoicus). n splanchnopleura, ce acoper endodermul se dezvolt o bogat reea vascular ce se va conecta la vasele viteline pe care le nlocuiete treptat, alctuind cea de-a doua circulaie fetal (circulaia alantoidian) ce cuprinde dou artere i dou vene alantoidiene. Cavitatea (vezicula) alantoidian (cavum allantoicum), plin cu lichid, este delimitat de dou foie: una intern, n contact cu amniosul (allantoamnion) i alta extern, n contact cu corionul (allantochorion). 9.4.5.Corionul

177

Cea mai extern anex (nvelitoare) din aria extraembrionar, corionul, provine din micromerele morulei. Dup dispariia membranei pelucide, acestea vor forma corionul primar (chorion primarium) sau procorionul sau trofoblastul. Pe suprafaa sa extern prezint viloziti (villi chorii primarii) ce sunt repartizate n diferite moduri, n funcie de specie. O vilozitate corial este constituit din: axul conjunctiv de esut lax i din trofoblastul care acoper axul conjunctiv. Trofoblastul este format din dou rnduri de celule, morfologic distincte: citotrofoblastul i sinciiotrofoblastul. Sinciiotrofoblastul (syncytiotrophoblastus), stratul extern, are o culoare mai nchis i numeroi nuclei dispersai ntr-o mas de citoplasm, fr limite celulare. Citoplasma are un aspect spumos, conine lipide, colesterol i mucopoliglucide i prezint un citoschelet filamentos. Are aspectul unui epiteliu cubic simplu, cu margine n perie. Examinat la microscopul electronic, marginea n perie prezint microviloziti dispuse la intervale de 8-20 nm. Microvilozitile nu sunt structuri rigide, prezentnd lungimi ce variaz ntre 1-2 m i un diametru de 150-250 nm. Nucleii sinciiotrofoblastului apar deseori grupai, polimorfi, prezentnd un nucleol excentric, cu citoplasma clar i cromatina granular, rspndit neuniform. Citotrofoblastul (cytotrophoblastus) (stratul intern sau stratul celular Langhans) cuprinde celule mari cu limite celulare distincte, cu nuclei veziculoi, cu nucleoli evideni, cu citoplasm clar, cu numeroase mitocondrii, reticul endoplasmic rugos, complex Golgi perinuclear, numeroase microvezicule i granule cu fier. La limita cu sinciiotrofoblastul prezint numeroi desmozomi. Membrana bazal a trofoblastului are un aspect neregulat, discontinuu i o grosime de 150 nm. Este desprit de polul bazal al celulelor citotrofoblastice printr-un spaiu de 25 nm, plin de o mas amorf cu o densitate electronic sczut. Axul conjunctiv al vilozitii coriale este format din esut conjunctiv embrionar, cu celule mezenchimatoase stelate. Cuprinde o arteriol care se capilarizeaz sub membrana bazal a epiteliului vilozitii. Din estura de capilare se desprinde o venul care va fi colectat de venele membranei coriale. Endoteliul acestora, extrem de fin, este nconjurat de fibre delicate, ce aparin esutului conjunctiv embrionar al axului vilozitii. 9.4.5.Particulariti ale anexelor embrionare i fetale la mamifere Vezicula vitelin are o dezvoltare redus, rolul su nutritiv limitndu-se la fazele timpurii ale embriogenezei, datorit faptului c ovulele mamiferelor sunt oligolecite. Dup atrofia veziculei viteline, se menine o formaiune vestigial, denumit diverticulul Meckel. Prezint o funcie vasculoformatoare i hematoformatoare timpurie. Astfel, celulele mezoblastice din peretele veziculei viteline vor forma insule vasculo i hemato-formatoare (insulele Wolff i Pander) (insulae sanguineae). Aici apar primele elemente figurate sanguine i reeaua extraembrinar de capilare, care se va conecta la circulaia sanguin intraembrionar. Circulaia vitelin a embrionilor, denumit i omfalomezenteric, va fi nlocuit treptat cu circulaia placentar, iar hematopoeza este preluat de ficat. Anexele embrionare si fetale Structuri Formaiuni specifice Sinciiotrofoblastul Viloziti coriale Citotrofoblastul Membrana bazal Alantoida Endoderm Cavitatea alantoidian Canalul urac Splanchnopleur Reea vascular Vezicula Endoderm Compartiment Canal ombilical(vitelin) ombilical intraembrionar (vitelin) Compartiment extraembrionar Amniosul Ectoderm Cavitate amniotic Cute amniotice Lichid amniotic La mamiferele cu schizamnios (primate, cobai, arici, liliac) vezicula ombilical este mai redus dect la mamiferele cu plectamnios (rumegtoare, carnivore, roztoare). Amniosul se formeaz foarte timpuriu. Modul de formare a amniosului difer n funcie de modul de implantare (nidaie). Formarea poate avea loc n dou moduri: prin plicaturare (plectamnios) i prin clivaie (schizamnios). Prin plicaturarea ectodermului se formeaz amniosul la leporide, Anexa Corion Origine n: Micromerele morulei

178

carnivore, suine i rumegtoare, unde nidaia este de tip central. La hominide i la alte specii de mamifere (cobai, arici,liliac,tatu),unde nidaia este de tip interstiial, formarea amniosului are loc n faza de embrion diblastic (gastrodisc) printr-un proces de clivaj orizontal al celulelor ectoblastului. Rndul superior va forma amniosul, iar spaiul dintre cele dou straturi de celule ectoblastice va genera cavitatea amniotic, n care se va acumula lichid amniotic. La mamiferele cu nidaie de tip excentric, ntr-o prim faz apare un scizamnios,care va fi nlocuit de un plectamnios. Lichidul amniotic, nghiit de fetus, este resorbit n intestin, ajunge n circulaia fetal alantoidian i, prin traversul placentei, n circulaia matern, dar nu ptrunde n cile respiratorii. Este mucilaginos, limpede i sporete cantitativ n prima parte a gestaiei. Acumularea de lichid amniotic este mai lent n a doua parte a gestaiei, cnd lichidul devine tulbure i conine pr, celule descuamate etc. n apropierea parturiiei este galben datorit meconiului format din luna a aptea de gestaie. Amniosul mamiferelor se dezvolt foarte mult, revenindu-i mai multe roluri: - de protecie a embrionului mpotriva ocurilor mecanice; - de lubrefiere a cilor de expulzare a fetusului i dec urirea a acestora de bacterii i micei; -rol trofic, fiind bogat n ap, sruri minerale, proteine;-rol metabolic ntervenind n glicogenez (la rumegtoare) i n lipogenez; -rol de depozit pentru produide dezasimilaie (acid uric,uree). Gradul de dezvoltare al amniosului, respectiv suprafaa i volumul de lichid amniotic (raportat la talia speciei) crete progresiv la marsupiale, la carnivore, la rumegtoare i la primate. La iap, amniosul ncepe s se formeze la 21 de zile, iar cantitatea de lichid ajunge la 3-7 litri, formnd a doua pung a apelor. La rumegtoare, la nivelul amniosului se descriu formaiuni, cu form neregulat, denumite plaje amnitotice cu rol neelucidat, (probabil glicogenogenetic).Plajele amniotice lipsesc la scroaf i cea, iar la iap i oaie sunt rar nrtlnite. La scroaf, lichidul amniotic, ajunge la 40-300ml, dar scade dup sptmna a 12-a de gestaie, iar la carnivore (cea i pisic) la parturiie rmn numai cteva picturi (8-30 ml). (Fig.9.31)

Fig. 9.31. Schema unui fetus de mamifer, mpreun cu anexele sale 1- Fetus; 2- Intestin primitiv; 3- Cordon ombilical; 4- Cavitate amniotic; 5- Alantoida; 6- Vezicula vitelin; 7- Corion; 8- Vilozitate corial. Alantoida prezint un grad de dezvoltare ce difer foarte mult n raport cu specia. Astfel, exist specii cu: a) alantoida redus la un diverticul n deget de mnu (la primate); b) alantocorion, n care alantoida apare ca o pung aplatizat, a crei fa intern acoper aproape n

179

totalitate amniosul ( la mamiferele aplacentare); c) amniocorionul, la care alantoida acoper numai parial amniosul, aceasta venind n contact cu corionul. Foia extern a alantoidei va cptui corionul pe o suprafa mai mare sau mai mic. La mamifere, alantoida prezint trei zone: 1) zona intraembrionar, din care se va forma vezica urinar; 2) zona mijlocie, din care va rezulta canalul urac, zona este cuprins n cordonul ombilical; 3) zona extraembrionar sau sacul alantoidian propriu-zis, interpus ntre amnios i corion. Lichidul alantoidian apare nainte ca rinichii fetali s devin funcionali. Este limpede, apos, brun glbui. Conine albumin, fructoz i uree, deoarece filtratul renal fetal ajunge n sacul alantoidian prin canalul urac. La vac, iap, oaie,capr i scroaf, se ntlnesc calculi alantoidieni (formai din detritusuri celulare, fosfat de calciu i mucoproteine)ceplutesc n lichidul alantoidian. La mamifere, reeaua vascular alantoidian (a doua circulaie embrionar) este mai dezvoltat dect la psri i particip la realizarea circulaiei placentare. La vrsta de 2 luni (la ecvine, taurine), circulaia vitelin este complet atrofiat i nlocuit de circulaia alantoidian. Din fuzionarea mezodermului extraembrionar ce acoper alantoida cu troblastul se formeaz corionul alantoidian ce gzduiete o reea vascular bogat ce asigur conexiunea ntre endometru maternal i reeua vascular alantoidian. Alantoida ndeplinete la mamifere mai multe roluri: -de rezervor de substane toxice i deeuri metabolice; - organizator al reelei vasculare embrio-fetale ce nlocuiete reeaua vascular vitelin; -furnizeaz mezenchim pentru axul vilozitilor coriale;- pregtete i lubrefiaz tractusul genital pentru parturiie; - particip la formarea cordonului ombilical. Cordonul ombilical face legtura dinte placent i fetus. La structurarea lui particip: vezica vitelin cu canalul ombilical, alantoida cu canalul alantoidian, peretele sacului amniotic adiacent zonei ombilicale, mezodermul extraembrionar (celule mezenchimale, substan fundamental mucoidgelatin Wharton), arterele i venele ombilicale. Lungimea cordonului ombilical este, n medie de 5060 cm la iap, 30-40 cm la bovine, 25 cm la scroaf, 8-12 cm la cea i pisic. La rumegtoare i cabaline n cordonul ombilical sunt prezente i fibre musculare netede, care produc vasoconstricie n momentul parturiiei. La iap, mugurele alantoidian apare la 21 de zile i ajunge n contact cu corionul la 55-60 de zile, cnd are reeaua vascular dezvoltat i nlocuiete circulaia vitelin (omfalo-mezenteric) pn la 70-80 de zile. Cantitatea de lichid alantoidian ajunge la 8-18 litri, fiind clar i constituit iniial din transsudat sanguin. n apropierea parturiiei, din cauza urinii fetale devine glbui murdar. La scroaf, alantoida lipsete n mare parte la nivelul zonei centrale, unde amniosul, venind n contact cu corionul, realizeaz un amniocorion. Cantitatea de lichid alantoidian crete (ajunge la 100-200 ml), pn la jumtatea gestaiei, dup care se resoarbe treptat, devenind de culoare brunmurdar i, la parturaie, rmnnd doar civa mililitri. La rumegtoare, alantocorionul se gsete pe cea mai mare parte a suprafeei, exceptnd zona central, unde predomin amniocorionul (ca la scroaf). La cea i pisic, alantoida separ complet amniosul de corion (alantocorion). Cantitatea de lichid alantoidian ajunge la 40-110 mililitri (la cea),iar la pisic este ntre 5-15 ml. Corionul la mamifere prezint viloziti coriale primare, cu aspect de formaiuni filiforme sau digitiforme orientate spre exterior. Concomitent cu vascularizarea i dezvoltarea alantoidei, vilozitile coriale primare se repartizeaz diferit, n raport cu specia, se vascularizeaz i ptrund n criptele mucoasei, devenind viloziti coriale secundare i participnd la constituirea placentei. Astfel, o vilozitate corial secundar este o prelungire a corionului ( trofoblast cu mezoderm extraembrionar) n care au ptruns vasele alantoidiene (n cazul alantocorionului) sau vasele viteline (n cazul omfalocorionului). Vilozitile coriale secundare pot fi rspndite: a) difuz, cu rspndire uniform complet (pe toat suprafaa), la iap sau incomplet (lipsind la capetele corionului), la scroaf; b) zonal, sub forma unui bru circular median, la carnivore; c) grupate n formaiuni denumite cotiledoane, la rumegtoare; d) discoidal, sub forma unei zone circulare la roztoare i primate. Vilozitile coriale lipsesc la marsupiale, care au un corion avilos i sunt denumite mamifere aplacentare. La iap, corionul este cptuit n ntregime de alantoid, dup 55-60 de zile, cnd apare i circulaia placentar. Complexul corio-alantoidian prezint cute care se pot desprinde, cad n lichidul alantoidian i constituie hipomamele. Corionul are un aspect catifelat, datorit vilozitilor fine (microcotiledoane), dispuse uniform pe toat suprafaa sa. La nivelul contactului corio-alantoidian pot apare depuneri de fosfat de calciu, denumite plci opace. La scroaf, sacul corial este iniial alungit-fusiform, (msurnd 15 mm la 17 zile) dup care se scurteaz (prin necroza extremitilor) i se dilat dup 20 de zile. Vilozitile lipsesc la capetele sacilor corionici.

180

La vac, sacul corial fusiform ajunge la 50-60 cm lungime. Vilozitile coriale se grupeaz n cotiledoane, dispuse pe 4 rnduri, fiind n numr de 80-120, n dreptul fiecrui corn uterin. n zona central a sacului, corionul nu este cptuit de alantoid, stabilindu-se un raport amnio-corial. n restul suprafeei uterine a corionului, raportul este alanto-corial. La extremitile sale, corionul este necrotic, ca i la scroaf. La oaie i capr, angrenarea vilozitilor coriale n criptele uterine are loc n a 44-a zi de gestaie. La cea i pisic, iniial corionul este acoperit n totalitate cu viloziti coriale primitive, dintre care se dezvolt numai cele cin zona circular central (reprezentnd 1/3 din suprafaa corionului). n totalitatea sa, corionul este cptuit de alantoid (alantocorion). 9.4.6.Particularitile anexelor embrionare la psri La psri, sacul vitelin (vezicula vitelin) are o importan mult mai mare dect la mamifere, deoarece ovula este de tip telolecit. Este prima anex embrionar care se organizeaz ( din ziua a treia de incubaie). n ziua a 5-a de incubaie, vitelusul coninut n vezicula ombilical este acoperit n ntregime de endodermul i mezodermul extraembrionar, nct peretele sacului vitelin este structurat din endoderm, membrana vitelin i mezoderm. n mezodermul sacului vitelin se formeaz insulele sanguino- i vasculo-formatoare (Wolff i Pander), din care iau natere celulele sanguine i vasele primei circulaii embrionare (circulaia omfalomezenteric). Aceast reea vascular transport substanele absorbite de ctre endodermul vitelin, care prezint viloziti. Rezorbia vitelusului continu i n primele zile dup ecloziune. Tot prin reeaua vascular se realizeaz transferul pasiv al anticorpilor maternali existeni n vitelus, precum i al unor proteine virale sau virusuri. Acest fapt permite transmiterea pe vertical (transembrionar) a unor infecii i vaccinarea in ovo , aplicat pentru imunoprofilaxia unor boli ( Boala Marek, bursita infecioas aviar). Sacul vitelin este complet dezvoltat dup 5-6 zile de incubaie i comunic cu intestinul embrionului prin canalul vitelin (ductus vitellinus), fr ca vitelusul s treac prin acest canal n intestin. Vestigiile canalului vitelin persist sub forma diverticulului vitelin ( diverticulum intestinale jejuni) sau a tubercului Meckel, care prezint o structur (cu patru tunici), asemntoare peretelui intestinal, i o populaie limfocitar i plasmocitar bogat, nct este considerat organ limfoid secundar. Sacul vitelin ndeplinete mai multe roluri, precum:-absorbia din vitelus a substanelor nutritive i plastice, necesare dezvoltarii embrionului pn la ecloziune; - organizeaz reeaua de capilare omfalomezenterice; - produce primele celule sanguine; - are funcie de aprare imun local i general. Amniosul se formeaz de timpuriu (din a doua zi de incubaie),prin plicaturare, fiind complet nchis n ziua a treia (la gin) sau a patra (la curc i la gsc) de incubaie. Peretele amniosului este format din dou straturi:- un strat intern, orientat ctre embrion, reprezentat de ectodermul extraembrionar i altul extern, reprezentat de mezodermul extraembrionar (respectiv de somatopleur), n care vor apare vase de snge i fibre musculare. Fibrele musculare genereaz contracii ritmice.Amniosul este desprit de corion printr-un spaiu denumit cavitate celomic extraembrionar (celoma extraembryonicum). Ectodermul amniosului secret lichidul amniotic (liquor amnioticus) care umple cavitate amniotic (cavum amnii). n acest lichid se acumuleaz urai, produi de rinichiul embrionar, fulgi i secreii ale glandelor din cavitatea bucal i tractusul respirator. Din ziua a 5-a de incubaie, lichidul amniotic este nghiit de pui. Amniosul i lichidul amniotic asigur: -protecia mecanic; libertate de micare pentru embrion; -nutriia embrionului cu albu, care este transferat din sacul cu albu (albumen) delimitat de corion ntr-un canal sero-amniotic i nghiit de embrion;-asigur necesarul de ap; detoxific embrionul de urai i sruri minerale; stimuleaz funciile de deglutiie i respiraie. Dup 11 zile de incubaie, amniosul ncepe s regreseze, se atrofiaz i dispare.

181

Fig.9.32. Schema unei seciuni prin oul de gin, la nceputul incubaiei 1-Camera cu aer;2- Amnios; 3- Alantoid; 4- Sacul vitelin; 5- Coaja calcaroas; 6- Membrana cochilier; 7- Albu; 8- Corion

Alantoida se formeaz ncepnd cu a 46 ore de incubaie, cnd mugurele endodermic alantoidian, detaat din zona caudo-ventral a intestinului prsete aria embrionar, devenind o vezicul (dup 72 ore de incubaie) plin cu lichid, ce comunic cu intestinul primitiv printr-un pedicul strbtut de canalul urac. Pe msur ce se dezvolt, vezicula alantoidian se insinueaz ntre sacul vitelin, amnios i corion, antrennd splanchnopleura i ocupnd ntreg celomul extraembrionar. nconjoar albuul pe care l cuprinde ntr-un sac. Din corion se formeaz un diverticul tubular care trece printre alantoid i sacul vitelin,devenind canal seroamniotic, prin care albuul este transferat n amnios i nghiit de pui. Mezodermul splanchnic al foiei externe, se sudeaz cu somatopleura corionului, realiznd membrana corioalantoidian , n care se dezvolt o reea vascular (dup 5-6 zile de incubaie), care se va lega de reeaua vitelin pe care o va nlocui treptat, realiznd circulaia alantoidian care se va racorda la circulaia embrionar Rolul alantoidei este foarte important n a doua jumtate a incubaiei cnd asigur: protecia embrionului prin lichidul alantoidian; consumarea albuului (rol nutritiv); excreia metaboliilor (prin canalul urac); respiraia (prin intermediul circulaiei alantocoriale, ncepnd cu ziua a 6-a). Corionul este anexa cea mai puin important la psri. Se formeaz de timpuriu, o dat cu amniosul, din partea extern a cutelor amniotice. Are origine ectodermic i parial mezodermic (din somatopleur). Este mpins de alantoid i ajunge n contact (dup 7-8 zile de incubaie) cu membranele cochiliere i cu alantoida, cnd somatopleura corionului se sudeaz cu splanchnopleura alantoidei, realiznd membrana corioalantoidian (alantocorionul). Membrana corioalantoidian asigur, ncepnd cu zillele 9-10 de incubaie, respiraia embrionului prin circulaia alantocorial i schimburile de ap ntre embrion i mediul exterior. n timpul incubaiei: - nutriia se face pe seama vitelusului coninut n vezicula ombilical i prin intermediul alantoidei (din sacul de albu); -respiraia se face prin intermediul vascularizaiei alantoidine direct din camera de aer; - excreia se face prin alantoid. Pe msur ce rezerva de vitelus este consumat, sacul vitelin se retracteaz i dispare, nchizndu-se ombilicul. n momentul ecloziunii puiul sparge cu ciocul resturile de alantoid, corionul, membranele cochiliere i coaja calcaroas.