A SE LUA IN CALCUL CA ACESTEA SUNT PENTRU ANUMITI

PROFI, MULTE NU SE REGASESC IN SUBIECTELE PROPRIU ZISE. De

exemplu, eu am dat practicul cu Eugen Radu si am avut doua subiecte de scrie
si de identificat ceva la ME. Subiectele de scriu erau PCR si ceva cu
hibridizarea in situ parca. Deci success :)))))

Subiecte Vechi
1. Puterea de rezolutie a MO
 Puterea de rezolutie a unui system optic se refera la capacitatea acestuia
de a distinge doua puncta diferite la distante mici
 Ochiul uman este principalul system optic fiind format dintr-un system de
lentile (cornee si cristalin) si un receptor (retina)
 Asemenea ochiului, MO este un system optic cu lentile, care foloseste
lumina artificiala si sistemul respective pentru a mari o imagine
 In timp ce puterea de rezolutie a ochiului uman este de 100 microni, cea a
MO este mai puternica, de 0.2 microni
 Rezoluția microscopului optic depinde de:
o Lungimea de undă a luminii (lambda) folosite pentru examinare
o Caracteristicile optice ale obiectivului utilizat
o Indicele de refracție al mediului dintre preparat și obiectiv

2. Componente MO
 Componentele MO sunt:
o Ocular
o Revolver
o Obiectiv
o Microviza
o Macroviza
o Portlama
o Sursa lumina
o Condenser
o Dispozitiv de deplasare a lamei
3. Metode de fixare MO
  Fixarea reprezinta procesul prin care se pastreaza arhitectura
tesuturilor si a celulei in afara organismului si de prevenire a
descompunerii, putrefactiei, sau a autolizei celulare
 Asigura conservarea rapida, dar omoara celulele
 Fixarea poate fi:
o Fizica- prin inghetare (inghetare rapida.vitrificare cu N lichid la
-190o C)
o Chimica: cu formaldehida (MO) sau glutaraldehida, tetraoxid de
osmiu (pt. observarea membranei) sau aldehide si agenti oxidanti
(ME)
6. Principiul si rolul fixarii
 Fixarea reprezinta procesul prin care se pastreaza arhitectura
tesuturilor si a celulei in afara organismului si de prevenire a
descompunerii, putrefactiei, sau a autolizei celulare
 Asigura conservarea rapida, dar omoara celulele
 Fixarea poate fi:
o Fizica- prin inghetare (inghetare rapida.vitrificare cu N lichid la
-190o C)
o Chimica: cu formaldehida (MO) sau glutaraldehida, tetraoxid de
osmiu (pt. observarea membranei) sau aldehide si agenti oxidanti
(ME)
8. Coloratia HE
H&E: Este cea mai frecvent utilizată colorație histologică; oferă informații
despre organizarea tisulară și morfologia celulelor, dar nu evidențiază
componente biochimice specifice.
• Hemalaunul este un colorant bazic, deci se va lega de un substrat
bazofil, de natură acidă – ex. acizi nucleici; nucleul celular va fi colorat
în violet, datorită legării hemalaunului de ADN;
• Eozina este un colorant acid, deci se va lega de un substrat acidofil, de
natură bazică; citoplasma conține o proporție mare de proteine bazice
(au resturi de aminoacizi cu grupări funcționale bazice – ex. Lys), deci se
va colora de regulă în roz-roșu, prin legarea eozinei la aceste proteine
• În cărțile/publicațiile în limba engleză, veți întâlni denumirea „colorație
hematoxilină-eozină”; aceasta denotă aceeași colorație și este folosită
aceeași abreviere (HE sau H&E); hematoxilina este precursorul care
trece printr-o serie de reacții chimice în urma cărora rezultă hemalaunul
9. Coloratia HE cu albastru de metilen
H&E: Este cea mai frecvent utilizată colorație histologică; oferă informații
despre organizarea tisulară și morfologia celulelor, dar nu evidențiază
componente biochimice specifice.
• Hemalaunul este un colorant bazic, deci se va lega de un substrat
bazofil, de natură acidă – ex. acizi nucleici; nucleul celular va fi colorat
în violet, datorită legării hemalaunului de ADN;
• Eozina este un colorant acid, deci se va lega de un substrat acidofil, de
natură bazică; citoplasma conține o proporție mare de proteine bazice
(au resturi de aminoacizi cu grupări funcționale bazice – ex. Lys), deci se
va colora de regulă în roz-roșu, prin legarea eozinei la aceste proteine
• În cărțile/publicațiile în limba engleză, veți întâlni denumirea „colorație
hematoxilină-eozină”; aceasta denotă aceeași colorație și este folosită
aceeași abreviere (HE sau H&E); hematoxilina este precursorul care
trece printr-o serie de reacții chimice în urma cărora rezultă hemalaunul
• Exista si coloratii care se leaga specific de o categorie de substante sau
tesuturi
• Pt. evidentierea fibrelor de t. conj.:
• Fibre de collagen:
• Apar albastre (HE cu albastru de metilen)
12. Metode speciale pentru evidentierea tesutului nervos
 In MO putem folosi coloranti pentru a evidentia diferite structure sau
celule
 Cand vorbim despre tesutul nervos, putem lua in calcul coloratia Nissl
care este un colorant basic care evidentiaza RER și grupuri de ribozomi
liberi din citoplasma corpului neuronal
 De asemenea , se poate lua in calcul impregnarea argentica, care pe langa
faptul ca da o coloratie brun-neagra fibrelor reticulare si a membranei
bazale a celulelor epiteliale, are rolul si de a scoate in evidenta
prelungirile neuronale
13. Metacromazia
 Reprezinta proprietatea de a se colora diferit in raport cu colorantul
utilizat sau cu tesuturile din jur
 Principiul de baza este existent unor grupari functionale plasate regulat
la o distanta destul de mica una de alta
  Colorantul se dispune ordonat si foarte aproape molecula de molecula
permitand reasezarea elevtronilor la alte nivele energetice si absorbtia
de alte lungimi de unda din spectrul vizibil
 Exemplu de colorant: albastru de toluidine
15. Tehnica de realizare a frotiului sangvin
 Frotiul este un preparat microscopic care se realizeaza prin etalarea
materialului biologic pe lame portobiect.
 Aceste preparate se efectueaza din sange, din urina, din celule provenite
din descuamari epiteliale etc.
 Este o metoda des utilizata in biologia celulara
 Se recolteaza cea de a doua picatura de sange aparuta dupa punctionare,
pe parte centrala a unei lame portobiect degresata, se acopera cu o lamella
si se examineaza imediat la microscop
 Rezultate: hematiile apar colorate galben-verzui, asezate in fasii,
leucocitele apar ca celule mai mari decat eritrocitele, mai rare, si mai
stralucitoare
16. Celula EK- organizare generala
 Celula EK este formata din trei componente principale:
o Membrana plasmatica
o Citoplasma
o Nucleu
 Membrana plasmatica (Plasmalena) are la randul ei trei componente
o Glicocalixul
o Bistratul fosfolipidic
o Citoscheletul membranar
 Citoplasma are doua componente:
o Citosolul (mediu de dispersie)
o Organitele (faza dispersata)
 Nucleul este format din
o Anvelopa nucleara, un dublu strat fosfolipidic ce prezinta pori
o Un interspatiu intre cele doua membrane
o Cromatina (heterocromatina si eucromatina)
o Nucleol (unul sau mai multi, depinde de stare nucleului si de fazele
ciclului cellular)
17. Org. delim. de endomb. Enumerare + rol
  Nucleu: contine informatia genetica, controleaza principalele functii
metabolice, are rol in exprimarea proteica
 Reticulul endoplasmic (neted: rol in metabolismul lipidic, rezervor de
Ca2+ si detoxifiere celulara; rugos: rol in biosinteza si prelucrare proteica)
 Aparatul Golgi: sortare, marcare si impachetare proteica
 Mitocondria: sinteza ATP, lantul respirator
 Lizozomi: digestie intracelulara, degradeaza molecule si resturi de
organite
 Peroxizomi: reactii antioxidante
 Vezicule: transport
 Autofagozomi: eliminare resturi organite, molecule, etc
18. Org. nedelim. de endomb. Enumerare + rol
 Ribozomi: sinteza proteica
 Proteazomi: digestia proteinelor citosolice
 Citoschelet: mentine/modifica forma celulara, geneza fortei mecanice, a
miscarii, transport intracelular
 Centru cellular: formeaza fusul de diviziune
 Incluziuni citoplasmatice:
o Lipidice:
 Adipocit alb: protective si termogeneza
 Adipocit brun: regiunea interscapulara si inghinal
o Melanina: colorare
o Lipofuscina: imbatranire celulara, a fost linkata cu Alzheimer
o Hemosiderina: reziduu nedigerabil in urma distrugerii hematiilor
o Pigmenti biliary: pathologic
o Glicogen: in effort si inteza intense
19 .Ultrastructura mitocondriei
 Organit delimitat de endomb.
 Prezinta:
o Membrana mitocondriala externa
o Interspatiu
o Membrana mitocondriala interna, falduara, cu rol in cresterea
suprafetei active si in formarea cristelor mitocondriale
o Matricea mitocondriala
22. Culturi de celule, etape si intretinere
 Este prima si cea mai simpla metoda de a studia un proces cellular sau
de a testa un produs terapeutic
 Este cea mai frecventa metoda de lucru in vitro
 Celulele normale vor creste intr-un recipient de cultura (placa Petri,
flask de cultura) pana cand vor ocupa tot spatiul, apoi vor muri si cultura
va fi pierduta
 De aceea, inainte de umplerea vasului, o parte din celule vor fi mutate
intr-un vas nou (pasate)
 O cultura de celule normale poate fi folosita doar de un numar limitat
de pasaje, dupa care se constata ca oricum celulele nu mai cresc- devin
sensecente
 Celulele tumorale pot creste unele peste altele daca sunt mentinute mult
timp in acelasi vas
 De asemenea, pot fi mentinute în cultură un numar mai mare de pasaje
decat cele normale

23. Labirintul bazal

 Reprezinta o specializare membrana de pol bazal, alaturi de jonctiunile
celula-matrice extracelulara
 Falduri de membrană bazală, bogată în Na+/K+ ATPază, între care se
regăsesc numeroase mitocondrii
 - Îl regăsim în celule din ductele secretorii ale glandelor salivare,
glandele sudoripare, nefron

24. Specializari de mb. apicala – cili, microvilli, stereocili

 Microscopia electronica de baleiaj cat si cea de transmisie se pot folosi
pentru a evidentia specializarile de membrana apicala
 Anumite celule, cum ar fi cele epiteliale, pot prezenta diferențe între
suprafața care privește spre o cavitate/lumen (numită apicală) și cea
opusă (bazală), separată de o membrană bazală de țesutul conjunctiv
subiacent
 Cele trei specializari de membrana apicala sunt cilii, microvilii si
stereocilii
  Cilii:
o au diametrul de 0.25 microni si sunt ancorati de citoschelet prin
microtubuli
o prezinta central axonemal formata din un dublet central de
microtubuli si 9 periferice
o legatura intre cele periferice si cel central se face prin actiunea unei
proteina, vizibila la MET, numita NEXINA
o lor li se asociaza DINEINA si KINEZINA cu rol in miscarea lor
o se gasesc in principal in mucoasa uterina si epiteliul olfactiv

 Stereocili:
o Proiecții apicale permanente, structurate pe filamente de actină
o Mai lungi ca microvilii
o Inegali ca dimensiuni
o Imobili
o Forme specializate de microvili din epiteliul auditiv care
detecteaza vibratia sonora
 Microvilii:
o Sunt extensii permanente, digitiforme, abundente la celulele
epiteliale implicate in absorbtie
o In enterocite sunt ~1000 / celula si cresc supra. activ. de 10-20x

25. Jonctiuni de atasare

 Structuri membranare cu rol în adezivitatea celulelor în cadrul unui ţesut
 Observabile doar la MET
 Clasificare după funcție:
o strânse (ocluzive)
o de ataşare (aderente)
 Între celule (celulă-celulă)
 Între celule și matricea extracelulară (celulă-matrice)
o de comunicare (comunicante)
 Zonula Adherens (filamente de actina)
 Macula Adherens/Desmozomi (filamente intermediare)
 Hemidesmozomul (filamente intermediare)
 Jonctiunea focala (actina si integrina)
  Jonctiuni Nexus GAP (6 monomeri de conexina formand conexonul, o
jonctiune poate avea mai mult de 100 de conexoni)
o *cele din paranteze sunt porteinele transmembranare linker

26. Electroforeza- principiu

 Metodă de separare a compusilor incarcati electric in camp electric
 Sarcina electrică a acizilor nucleici este (-), iar separarea lor se face în
funcţie dimensiunea fragmentului analizat, dată practic de nr. de perechi
de baze care îl formează (bp sau kilo bp – kbp)
 Vizualizarea se face prin adăugarea unei substanțe fluorescente care
se leagă de AND-dublu catenar
 Electroforeza SDS-PAGE (sodium dodecil sulfonat- poliacrilamida gel
electroforeza) se realizeaza cu gelul de poliacrilamida tratat cu diferite
substante stabilizatoare, se adauga Solutia tampon in cuva de
electroforeza si se contecteaza la doi electrozi si se introduce current in
Solutia tampon
28. Hibdridizarea in situ- principiu
 Metodă prin care se detectează localizarea unei gene/secvenţă
cunoscută ADN pe cromozomi
 Principiu: se folosesc sonde marcate fluorescent (secvențe scurte de
ADN complementare unei părți din secvența țintă)
 Utilitate: Se folosește pentru diagnosticul unor modificări deja
cunoscute din literatură ca fiind asociate unor boli

29. Animale transgenice- definitie

 Animale de laborator în care se introduc din viața intrauterină, în toate
celulele embrionare, gene umane mutate pentru a studia rolul acestora în
patologie
 Ce informatii poate oferi un model animal?
o date legate de absorbția, distribuția în organism, excreția unei
substanțe
o toxicitate tisulară a unui produs biologic activ, evaluată pe secțiuni
histologice/anatomopatologice
 o răspunsul unui parametru biologic la un anumit tratament (de
exemplu: durată de supraviețuire, scăderea nivelului seric al
anumitor lipide, micșorarea volumului unei tumori)
19. Videomicroscopia
 Reprezinta procesul prin care se achizitioneaza imagini la interval stabilit
de timp
 Se obtin imagini in contrast de faza sau fluorescente
 Exmplu de aplicare: migrarea kertaniocitelor inainte si dupa iradierea cu
raze UV

31. Imunofluorescenta
 Este o metoda de studio in biologia celulara prin care anutmite celule sunt
marcate cu anticorpi specifici (eventuali monoclonali, care recunosc un
singur epitop antigenic) la care se adauga molecule fluorescente, numite
fluorocromi
 Este o metoda de biologie celulara bazata pe anticorpi, alaturi de
imunohistochimie si imunoelectronomicroscopie
 Principiul metodei: anticorpii sunt cuplati cu un system de detectie
(molecule fluorescente; vizualizare in microscopia de fluorescent)

33. Citometria in flux- definitie

• CF măsoara si ulterior analizeaza anumite proprietati fizice si chimice ale
unor celule pe masura ce acestea trec individual, in flux, prin dreptul unui
fascicul laser.
• Avantajul principal al CF: capacitatea de analiza a unui numar
relativ mare de parametri (20) pentru un număr mare/foarte mare de
particule (106), intr-un timp relativ scurt (zeci de secunde – minute).
• La trecerea prin dreptul razei laser, lumina este dispersata de particule in
toate directiile în functie de indicele de refractie dintre particula si
mediu, de marimea particulei, complexitatea particulei (ex. in cazul
celulelor - canalele membranare si granule citoplasmatice).
• Lumina dispersata anterior, la un unghi mic, de 0,5-10° fata de directia
fasciculului laser (FS, FSC - „forward scatter”, FALS (Forward-Angle
 Light Scatter)) este proportionala (dar nu direct) cu patratul razei
particulei.
• Lumina dispersata la un unghi mare, (în general de 90°) (SS, SSC, SSc –
„side scatter”) este proportionala cu rugozitatea suprafetei particulei si
cu complexitatea structurii interne a particulei (granularitatea sa).

34. Mediul de cultura- componente

 Celulele normale vor crește într-un recipient de cultură (placă Petri, flask
de cultură) până vor ocupa tot spațiul. Apoi vor muri și cultura va fi
pierdută.
 De aceea, înainte de umplerea vasului, o parte din celule vor fi mutate
într-un vas nou (pasate).
 cultură de celule normale va putea fi folosită doar un număr limitat de
pasaje, după care se constată că oricum celulele nu mai cresc - devin
senescente.
35. Western Blot – definitie
 Este o metoda de identificare bazata pe anticorpi
 Metoda prin care se identifică o proteină de o anumită masă
moleculară, separată prin SDS PAGE dintr-un amestec, folosind un
anticorp specific

38. Mitoza – etape

 Profaza
 Prometafaza
 Anafaza
 Telofaza
 Citochineza

39. Meioza- definitie

 Meioza este tipul de diviziune celulară care permite formarea
celulelor reproducătoare.
 Ea se desfășoară în organele reproducătoare, în celulele germinale, și se
finalizează cu formarea celulelor reproducătoare asexuate (spori) sau
sexuate (gameți).
  Meioza se desfășoară în două faze: o primă fază reducțională (meioza I),
urmată de o fază ecvațională (sau ecuațională, meioza II).

40. Ultrastructura anvelopei nucleare

 Este prezenta in timpul interfazei, dispare cand celula intra in diviziune
 Prezinta:
o Membrana nucleara externa
o Spatiul perinuclear
o Membrana nucleara interna
 In mb. nc. ext. se observa pori care permit pasajul diferitelor molecule de
marimi mici ante si retrograde in nucleu
 Membrana interna este sustinuta de lamina nucleara, formata din filament
intermediare
 Membrana nucleara externa se continua cu tubii reticulului endoplasmic
rugos, astfel proteinele ce ies din nucleu patrund in RER pentru a fi
prelucrate, de aici merg catre reteaua Golgi unde sunt glicozilate si
marcate cu ajutorul enzimei glucozo 6-fosfataza
 Lamina nucleara este formata din filament intermediare (lamine A, B, C)
si proteine associate membranei nucleare interne

41. Nucleolul- functie, componente

 Este un oragnit nedelimitat de endomembrane
 Este vizibil si la MO si la ME
 1 nucleu poate avea mai multi nucleoli
 Au aspect heterogen, electronodens
 Are 3 zone:
o Centrul fibrilar cu gene pentru ARNr
o Zona dens fibrilara in care ADN-ul este transcris la ARN
o Regiunea granulara in care se afla subunitatile ribozomale mica si
mare
 Functie: biosinteza ribozomilor

42. Cromatina- definitie, tipuri

  Principalul constituent al nucleului – complex de ADN cu proteine
histonice și non-histonice
 Este de doua tipuri:
o Eucromatina: (electronotrasparenta/clara si transcrisa)
o Heterocromatina (electronodensa si netranscrisa)
 Facultativa
 Constitutiva

43. Ciclul celular

 Ciclul celular este perioada din viața unei celule de la formare pană la
finalul diviziunii celulare
 Are 2 etape:
o INTERFAZA
o DIVIZIUNEA (mitoză, meioză)
 Este o etapă în cadrul ciclului celular, alături de diviziunea celulară, de la
formarea noii celule la inițierea diviziunii.
 Este formată din trei faze:
o G1 – fază de creștere și reorganizare
 G0 – fază de repaus, stagnare
o S – faza de dublare a ADNului, în vederea unei noi diviziuni
o G2 – fază de pregătire a diviziunii celulare
 Meioza are mai multe etape:
o Profaza
o Prometafaza
o Metafaza
o Anafaza
o Telofaza
o Citochineza

Subiecte noi
1. Tipuri de MO si utilitatea lor
 Exista trei tipuri principale de MO:
o MO cu camp luminos (A)
o MO cu contrast de faza (B)
o MO cu fluorescent (C)
  A:
o Preparatele sunt fixate si colorate pentru a mari contrastul
o Se pot obtine imagini policrome sau monochrome
(metacromazie)
o Culoarea vine de la colorant care absoarbe toate lungimile de unda
(λ lambda) cu exceptia celei care ii da culoarea
o Lumina neabsorbita ajunge la ochi
o Rol:
 Studii calitative si cantitative asupra unei game largi de
probe
 Sensibilitate ridicata
 Evidentierea substantelor optic active din proba
 B:
o Pentru examenul celulelor si organismelor vii fara a realiza fixarea
si colorarea acestora
 C:
o Se realizeaza pentru examinarea celulelor fixate si nefixate (vii) in
care DIFERITE COMPONENTE CELULARE au fost marcate su
substante fluorescente numite FLUOROCROMI
o Ei absorb lumina de o anumita λ (excitatie)si emit alt alumina la o
λ superioara (emisie)
o Lumina poate veni de la un laser (monocrom) sau de la o lampa
(policroma)
o Preparatele se studiaza in intuneric pentru a se detecta mai usor
emisia luminii

2. Recoltarea
 Reprezinta prima etapa in obtinerea unui preparata microscopic
(permanent sau nu)
 Este de mai multe tipuri:
o Biopsie: pe tesut viu
o Necropsie: post mortem
o Fragmente de tesut recoltate endoscopic
o Punctie cu ac gros
o Punctie cu ac aspirator
o Excizie sectiune de piele
 Etape:
 o Se realizeaza intraoperator
o Se excizeaza in fixator
o Se trimite la laboratorul de anatomopatologie
o Se scriu datele pacientului si ce proba este
o Se decupeaza (1x1 cm)

3. Colorarea – definitie, scopuri si etape

 Colorarea reprezinta o etapa prin care se urmareste cresterea contrastului
intre diferitele componente celulare/tisulare prin capacitatea moleculelor
de lega diferentiat coloranti
 Colorantii sunt in principal de doua tipuri:
o Acizi: se leaga de un substrat acidofil, deci subst. bazice (sarcini +)
o Bazici: se leaga de un substrat bazofiil, deci subst. acide (sarcini -)
 Exemplu: coloratia HE (Hemalaun eozina/hematoxilin eozina) formata
din doua componente :
o Hemalaunul, colorant basic, de culoare violet, se va lega de
substante acide
o Eozina: colorant acid, de culoare roz-rosie, se va lega de substante
bazice
 NB: hematoxilina este precursoul care trece printr-o serie de
reactii chimice in urma carora rezulta hemalaunul
 Exista si coloratii care se leaga specific de o categorie de substante sau
tesuturi
o Pt. evidentierea fibrelor de t. conj.:
 Fibre de collagen:
 Albastre (HE cu albastru de metilen)
 Rosii (coloratia Van Gieson)
 Verzi (coloratia Masson)
 Fibre elastice:
 Brun-roscate (orceina)
 Fibre reticulare:
 Brun-negre (impregnare argentica)

o Pentru lipide:
 Sudan, deoarece in HE s-au spalat in solventii organici
 OsO4, lipidele apar negre
 o Pentru glicoproteine:
 Coloratia PAS (periodic acid Schiff) apare rosu-purpuriu
o Cu impregnare argentica se evidentiaza si:
 Membrana bazal a celulelor epiteliale
 Prelungirile celulelor nervoase

Colorație Rezultate

Hemalaun- Nuclei – violet

eozină
Citoplasma – roz-roșu

Hemalaun- Nuclei – albastru închis

eozină cu
Citoplasma – albastru-cenușiu
albastru de
metilen Fibre de colagen – albastru intens

Azan Nuclei – roșu intens

Citoplasma – roșu
Fibre de colagen – albastre

Orceină Fibre elastice – brun-roșcat

Impregnar Membrana bazală (celule epiteliale); fibre reticulare; prelungiri

e argentică nervoase – brun-negru

Sudan Lipide – de obicei roșu-portocaliu

PAS Polizaharide, glicoproteine – roșu purpuriu

(periodic
acid Schiff)

4. Metacromazie
 Reprezinta proprietatea de a se colora diferit in raport cu colorantul
utilizat sau cu tesuturile din jur
  Principiul de baza este existent unor grupari functionale plasate regulat la
o distanta destul de mica una de alta
 Colorantul se dispune ordonat si foarte aproape molecula de molecula
permitand reasezarea elevtronilor la alte nivele energetice si absorbtia de
alte lungimi de unda din spectrul vizibil
 Exemplu de colorant: albastru de toluidine

5. Fixare: obiective si substante utilizate:

 Fixarea reprezinta procesul prin care se pastreaza arhitectura tesuturilor
si a celulei in afara organismului si de prevenire a descompunerii,
putrefactiei, sau a autolizei celulare
 Asigura conservarea rapida, dar omoara celulele
 Fixarea poate fi:
o Fizica- prin inghetare (inghetare rapida.vitrificare cu N lichid la
-190o C)
o Chimica: cu formaldehida (MO) sau glutaraldehida, tetraoxid de
osmiu (pt. observarea membranei) sau aldehide si agenti oxidanti
(ME)
6. Metoda frotiurilor
 Frotiul este un preparat microscopic care se realizeaza prin etalarea
materialului biologic pe lame portobiect.
 Aceste preparate se efectueaza din sange, din urina, din celule provenite
din descuamari epiteliale etc.
 Este o metoda des utilizata in biologia celulara
 Se recolteaza cea de a doua picatura de sange aparuta dupa punctionare,
pe parte centrala a unei lame portobiect degresata, se acopera cu o lamella
si se examineaza imediat la microscop
 Rezultate: hematiile apar colorate galben-verzui, asezate in fasii,
leucocitele apar ca celule mai mari decat eritrocitele, mai rare, si mai
stralucitoare

7. MO cu contrast de faza
 Este folosit pentru examinarea celulelor vii si organismelor mici vii, fara
fixare si colorare
  Microscopul foloseste un principiu de constructie care creste micile
diferente de refractie existente in zone diferite ale celulei
 Aceasta diferenta este perceptibila de ochiul uman, aparand un contrast
vizibil intre diferite zone

8. Pregatirea preparatului pentru MET

 Recoltare:
o Biopsie
o Culture celulare
 Fixare:
o obligatoriu pt. ME doar celule moarte
o trebuie facuta rapid
o Fizica:
 Inghetare rapida/vitrificare (N lichid -190o C)
o Chimica:
 Glutaraldehida
 Tetraoxid de osmiu OsO4 pt. membranele celulare
 Aldehide si agenti oxidanti
 Includere:
o Materie solida, pentru sectiuni subtiri (50-100 nm) a.i. e- sa o
poata strabate
o Este precedata de o deshidratare cu solutii alcoolice de
concentratii crescande (50-100%) pentru a permite materialului
de includere (o rasina hidrofoba epoxidica) sa fie patruns de e-
 Sectionare:
o Ultramicrotom (sectiuni de 0.04-0.1 microni)
 Contrastarea:
o Este echivalenta colorarii in MO pt. a diferentia componentele
preparatului
o Se face cu saruri de metale grele (acetat de uranil, citrate de
plumb) care se leaga de anumite componente
 Imaginile la ME apar in ALB, NEGRU SI NUANTE DE GRI
 Moleculele care leaga nuclei grei se numesc electronodense si apar
intunecate, iar cele care nu leaga nuclei grei se numesc
electronotransparente si apar in alb sau in nuante de gri
9. Tehnica de inghetare-fracturare
 Permite vizualizarea suprafetelor prin clivajul anumitor structure (de ex.
Membrane celulare)
 Se ingheata celula, intr-o camera vidata este lovita cu un cutit, celula se
fractureaza in zonele hidrofobe (adica unde nu s-a format gheata),
urmand a se realiza un mulaj metallic de Au/C sau Pt/C al suprafetei, si
ulterior a se face o replica a suprafetei
 Se examineaza la MET

10. Impregnari metalice

 Principiul de baza este utilizarea unui precipitat de metal redus, dupa ce
se leaga in forma ionica pe diferitele elemente din tesuturi, evidentiind
structuri care in mod normal nu se coloreaza
 Cele mai folosite sunt impregnarile cu saruri de Ag, Au, Os si Hg)
 Impregnarea argentica este folosita pentru evidentierea elementelor din
tesutul epitelial sau conjunctiv si in studierea sistemului nervos
(structurile vizate apar brun-negre)

11. Etapele realizarii unu preparat microscopic permanent – enumerare

 Recoltare
 Fixare
 Includere
 Sectionare
 Colorare
 Montare
 Etichetare

12. Coloratia Van Gieson

 Este o coloratie tricroma formata din hematoxilina ferica, acid picric si
fucsina
  Fiecare are o afinitate diferita pentru diferite componente celulare
 In urma colorarii se observa:
o Nucleii sunt colorati in negru
o Citoplasma este colorata in galben
o Fibrele de collagen sunt colorate in rosu intens

13. Clasificarea colorantilor

 Colorantii se pot clasifica in functie de mai multe trasaturi caracteristici,
cea mai vasta clasificare este cea in functie de caracterul lor:
o Coloranti acizi, se vor lega de substraturi acidofile, deci substante
bazice
o Colorantii bazici se vor lega de substraturi bazofile, deci substante
acide
 Exista si coloratii care se leaga specific de o categorie de substante sau
tesuturi
o Pt. evidentierea fibrelor de t. conj.:
 Fibre de collagen:
 Albastre (HE cu albastru de metilen)
 Rosii (coloratia Van Gieson)
 Verzi (coloratia Masson)
 Fibre elastice:
 Brun-roscate (orceina)
 Fibre reticulare:
 Brun-negre (impregnare argentica)

o Pentru lipide:
 Sudan, deoarece in HE s-au spalat in solventii organici
 OsO4, lipidele apar negre
o Pentru glicoproteine:
 Coloratia PAS (periodic acid Schiff) apare rosu-purpuriu
o Cu impregnare argentica se evidentiaza si:
 Membrana bazal a celulelor epiteliale
 Prelungirile celulelor nervoase
14. MO – principiu, componente
 Foloseste lumina artificiala; trece prin obiectul examinat
  Strabate un system de lentile pentru a obtine o imagine marita a
respectivului obiect
 Imaginea rezultata va fi virtuala, rasturnata si mai mare
 Componentele MO sunt:
o Ocular
o Revolver
o Obiectiv
o Microviza
o Macroviza
o Portlama
o Sursa lumina
o Condenser
o Dispozitiv de deplasare a lamei
 P marire= P marire ocular x P marire obiectiv
o oc-10 x ob-100 → ~1000 x
 4x→lupa pt. localizare
 10x→orientare
 20-40x→diagnostic histologic
 60-100x→diagnostic citologic
 Putere de rezolutie ~0.2 microni (fata de 100 microni ochiul uman)

15. Tipuri de tehnici bazate pe folosirea anticorpilor

 Microscopie
o Imunohistochimie IHC
o Imunofluorescenta IF
o Imunoelectronomicroscopie IEM
 Citometrie in flux
o FACS fluorescence activated cell sorting
o MACS magnetic activated cell sorting
 Metode de cercetare si diagnostic
o IHC
o Determinarea grupelor de sange ABO
o Teste ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
o Western Blot
16. Tehnica PCR
 Folosita pt. obtinerea unui numar de copii ale unei gene, sufficient de
mare cat sa lege o molecula de marcaj fluorescenta
 Secventa genei trebuia cunoscuta de dinainte pt. a putea folosi PCR,
deoarece reactia de multiplicare este initiate de primeri – oligonucleotide
sintetizate pe comanda, de la caz la caz, adaugate in mediul de reactive
 Etape:
 Denaturare la 95◦ C (desfacerea lanturilor nucleotidice)
 Introducerea ADN polimerazei termostabile si a primerilor
nucleotidici
 Annealing la 55-65◦ C
 Extensia reactiei la 72◦ C, prin care ADN polimeraza incepe
completarea cu nucleotide
 Dupa aceste etape, se reia ciclul
 Vizualizarea rezulatului PCR este vizualizat prin electroforeza
 Aplicatii practice ale PCR:
o Identificarea unei mutatii
o Identificarea unei alele modificate
o Detectarea de ADN viral/bacterian pentru
 Diagnosticul unei infectii
 Evaluarea eficacitatii unei terapii
 Rezultatul reactiei PCR este:
o Cantitativ: nr. de copii ale genei detectate
o Calitativ: detectarea unei deletii/aditii (pt. vizualizarea rezultatului
se face electroforeza)

17. Imunomarcarea directa si indirecta

 Imunomarcarea include toate tehnicile ce utilizeaza anticorpi marcati
pentru localizarea antigenelor corespondente
 In preparate tisulare:
o Criosectiuni
o Sesctiuni incluse in parafina
 In culture celulare
 In alte probe biologice (de ex. Sange)
 Imunofluorescenta directa se foloseste pentru examinarea celulelor
vii/fixate folosind anticorpi marcati cu fluorocromi
  IFD detecteaza Ag/Ac intr-o singura etapa, atunci cand serul marcat cu
Ac fluorescent e adaugat direct la prep. microscopic
 Imunoflurescenta indirecta; IFID este de circa 10 ori mai sensibila
comparative cu IFD, detecteaza autoAc circulanti, in 2 etape:
o Se adauga la prep. o dilutie de ser pentru a fi analizat sau imunoser
specific pt identificarea Ag in preparat
o Se adauga la preparat o solutiede Ac mracati specific pt Ig serice
adaugate in prima etapa

18. Evolutia unei culturi de celule

 Este prima si cea mai simpla metoda de a studia un proces cellular sau
de a testa un produs therapeutic
 Este cea mai frecventa metoda de lucru in vitro
 Celulele normale vor creste intr-un recipient de cultura (placa Petri,
flask de cultura) pana cand vor ocupa tot spatiul, apoi vor muri si cultura
va fi pierduta
 De aceea, inainte de umplerea vasului, o parte din celule vor fi mutate
intr-un vas nou (pasate)
 O cultura de celule normale poate fi folosita doar de un numar limitat
de pasaje, dupa care se constata ca oricum celulele nu mai cresc- devin
sensecente
 Celulele tumorale pot creste unele peste altele daca sunt mentinute mult
timp in acelasi vas
 De asemenea, pot fi mentinute în cultură un numar mai mare de pasaje
decat cele normale

20. Studiile in vivo – definitie, avantje, limite

 Este o metoda de studio in care se studiaza un raspuns celular obtinut
intr-un model animal
 Avantaje:
o rezultatele obtinute sunt cele mai concludente posibil pentru ceea
ce se intamplă in organismul uman
  Limite:
o extrapolarea la organismul uman depinde de similitudinea
modelului animal cu organismul uman; in plus, sunt prezente
toate interferentele din partea altor populatii celulare din
vecinatate sau de la distanta

21. Studiile in situ – definitie, avantaje, limite

 Reprezinta procesul prin care populatia celulara/organul tinta este
pastrat in organism, sunt modulate influenţe metabolice, nervoase,
endocrine samd, la nivel local
 Avantaje:
o Se pot studia/modula procese la nivel cellular ale
tesutului/organului de studio
 Limite:
o Nu ofera o imagine completa a unui process tisular care poate fi
influentat de stimuli variati in vivo

22. Citometrie in flux (CF) – principiu, utilitate

• CF măsoara si ulterior analizeaza anumite proprietati fizice si chimice ale
unor celule pe masura ce acestea trec individual, in flux, prin dreptul unui
fascicul laser.
• Avantajul principal al CF: capacitatea de analiza a unui numar relativ
mare de parametri (20) pentru un număr mare/foarte mare de particule
(106), intr-un timp relativ scurt (zeci de secunde – minute).
• La trecerea prin dreptul razei laser, lumina este dispersata de particule in
toate directiile în functie de indic ele de refractie dintre particula si
mediu, de marimea particulei, complexitatea particulei (ex. in cazul
celulelor - canalele membranare si granule citoplasmatice).
• Lumina dispersata anterior, la un unghi mic, de 0,5-10° fata de directia
fasciculului laser (FS, FSC - „forward scatter”, FALS (Forward-Angle
Light Scatter)) este proportionala (dar nu direct) cu patratul razei
particulei.
• Lumina dispersata la un unghi mare, (în general de 90°) (SS, SSC, SSc –
„side scatter”) este proportionala cu rugozitatea suprafetei particulei si
cu complexitatea structurii interne a particulei (granularitatea sa).