MICROSCOPIE

Curs 4
2023
 Microscopia electronica cu baleiaj

Primul microscop electronic de baleiaj (SEM, Scanning Electron Microscope)

a fost construit in 1935 de catre Max Knoll, la scurt timp dupa realizarea
primului TEM. In primele studii rezolutia era limitata la ~100 µm datorita
faptului ca nu se foloseau lentilecondensor pentru a micsora dimensiunea
laterala a fasciculului de electroni pe proba.

Spre deosebire de TEM, unde fasciculul de electroni la tensiune înaltă

formează imaginea specimenului, microscopul electronic cu scanare (SEM)
produce imagini prin detecţia electronilor secundari, cu energie scăzută, emisii
de pe suprafaţa specimenului datorită excitării acestuia de către raza
principală de electroni.

Microscopul cu scanare de electroni (SEM) se bazează pe aceleaşi principii

ca şi microscopul optic, cu singura deosebire că „sursa de lumina” este în
acest caz un fascicul de electroni, iar lentilele nu sunt optice, ci
electromagnetice.
Baleierea fasciculului se realizeaza cu ajutorul unui sistem de deflexie
incorporat in lentila-obiectiv. Fasciculul este baleiat pe suprafata probei linie cu
linie astfel incat spotul sa acopere o arie dreptunghiulara selectata.

Electronii emisi in urma interactiei fasciculului incident cu materialul probei sunt

colectati de detector, formand un curent electric care constituie unul dintre
semnalele utile in SEM.

Dupa o amplificare prealabila, semnalul util este folosit pentru a se reconstrui

imaginea suprafetei, printr-o corelatie punct cu punct intre punctele de pe aria
baleiata si punctele imaginii finale proiectate pe mediul de afisare.

Astfel, marirea in cazul unui SEM este data de raportul dintre dimensiunea
liniara a imaginii finale si dimensiunea liniara a ariei baleiate pe suprafata
probei.

Aria de baleiere poate fi variata intrun interval extrem de larg, astfel ca marirea
data de un SEM este cuprinsa de obicei intre 20× si 1.000.000×. Rezolutia unui
SEM depinde de diametrul fasciculului de electroni care baleiaza suprafata si
de volumul de interactie al fasciculului cu materialul probei.
 Pregatirea probelor pentru SEM

- Recoltarea probelor – probele pot fi de dimensiuni mai mari decat la TEM

(pot avea pana la 1 cm2).
- Fixarea si deshidratarea este asemanatoare cu cea realizata la pregatirea
probelor pentru TEM. Fixarea materialul se prelungeste in glutaraldehida (sau
in amestec de glutaraldehida si paraformaldehida) pana la 2 ore. Dupa
deshidratarea in alcool etilic absolut probele se trec in doua bai de acetona
anhidra.
 - Uscarea la punctul critic al dioxidului de carbon cu
uscătorul în punctul critic EMS 850 – este necesara
pentru prezervarea detalilor structurale ale probei
analizate. Uscarea la aer poate cauza deformari
acentuate ale suprafetelor materialelor biologice
cauzate, in principal, de tensiunea supeficiala a
apei. Utilizand uscarea la punctul critic al dioxidului
de carbon aceasta tensiune superficiala este redusa
aproape la 0.
- .
In momentul atingerii punctului critic (31,10C la o presiune de 1250 psi) CO2
lichid trece direct in faza gazoasa, iar eliminarea acestuia din probe, odata cu
scaderea presiunii se realizeaza cu pastrarea intacta a structurilor existente
- Metalizarea probelor uscate cu metalizorul EMS 550X este necesara pentru
observarea acestora in camera de vid a SEM. Metalizarea se realizeaza fie cu
aur fie cu aur-paladiu. Stratul de metal depus are grosimea de 30-60 angstromi
(functie de detaliile ce se doresc a fi observate).
Millingtonia hortensis, fam. Bignoniaceae

Bhattacharya et all, 2020

Imagini SEM obținute pe material uscat la puncul critic al CO2 – fără și după fixare cu
tetraoxid de osmiu

Imagini SEM obținute pe material uscat cu hexamethyldisilazan – fără și după fixare

cu tetraoxid de osmiu
Imagini SEM obținute pe material uscat în aer– fără și după fixare cu tetraoxid de
osmiu
Uscator la puncul critic al
CO2

Hexamethyldisilazan

Uscare în aer
Colorarea manuala a unei imagini cu eritrocite folosind MountainsMap® SEM software

Thierry Thomasset,
Université Technologique de Compiègne.
Imaginea SEM a unui cheag de sânge – hematii+rețeaua de fibrin
This award-winning SEM image of an ant was taken
by Stefan Eberhard of Complex Carbohydrate
Research Ctr, Univ of Georgia.
Cap de paianjen
Macadamia Lace Bug (Family Tingidate)
Ulonemia decoris. Research: Craig Maddox –
NSW Department Primary Industry.
Capul unei albine
Ploșnița de pat (Cimex lectularius)
Pollen from a variety of common plants including
the sunflower, primrose and lily, Dartmouth
Electron Microscope Facility
Passiflora edulis, polen, Louisa
Howard - Dartmouth College EM
Facility
Hibiscus Pollen
by Frans Holthuysen
Ipomoea kahloiae.
pollen, by César Adrián González Martínez
Taraxacum officinale pollen grain
Malva sylvestris pollen grain
Pollen grains, Cucumis sativus
Pollen grain (Zea mays)
Pollen grain (Pinus sp)
Adonis vernalis
Adonis vernalis – frunza matura, epiderma superioara
Adonis vernalis – sectiuni transversale prin antera staminei
Adonis vernalis – sectiuni transversale prin antera staminei (se observa
granule de polen si stratul mecanic din peretele anterei)
Ardisia crenata –
sectiuni transversale prin frunza
Ardisia crenata – sectiuni transversale prin nodulii din frunza (se observa
bacterii simbiotice)
Dryas octopetala
Primula halleri
Oxytropis halleri 
Iarba șarpelui
(Echium vulgare)
Iarba șarpelui (Echium vulgare)
Perovskia atriplicifolia 
(Russian Sage)
Perovskia atriplicifolia 
(Russian Sage)
Rosa rubiginosa
Rosa agrestis
Drosera rotundifolia
Drosera rotundifolia
Drosera rotundifolia
Drosera spatulata
Fulg de zăpada
observat la Low
Temperature
Scanning Electron
Microscope (LT-SEM)

Temperatura: -170
Grade Celsius

Agricultural Research
Service,
U. S. Department of
Agriculture