MICROORGANISME PRODUCATOARE DE ENZIME CELULOZOLITICE

Biomasa vegetală reprezintă sursa majoră de carbon în ecosistemele terestre

astfel că este firească presupunerea că multe dintre microorganismele care populează
aceste ecosisteme să fie capabile să degradeze aceste substrate, deci să sintetizeze enzime
de timpul celulazelor şi hemicelulazelor.
Celuloza este un polizaharid complex, care este componenta principală a ţesuturilor
vegetale și cel mai important compus cu carbon din sol și ape.
Celuloza este răspândită în materiile prime de origine vegetală (aproximativ 1/3) şi
în structura pereţilor celulari ai fungilor.
Biodegradearea celulozei pana la dioxid de carbon si apa se numeste celulozoliza si
este realizata de o mare varietate de microorganisme aerobe si anaerobe, apartind
bacteriilor si ciupercilor.Toate aceste microorganisme sintetizeaza si elimina extracelular
celulaza,un complex enzimatic constituit din mai multe componente.
Celuloza este un polimer neramificat de glucoză compus din unităţi de anhidro D-
glucoză unite prin legături 1,4-β-D-glucozidice. Aceste legături pot fi hidrolizate de către
enzimele celulozolitice. De obicei celuloza este foarte rezistentă la hidroliză datorită
gradului ridicat de cristalinitate, rezultatul unei conformaţi lineare (paralele) care permite
realizarea unor puternice legături de hidrogen între grupările OH ale lanţurilor paralele
vecine. In fibrele de celuloză regiunile cu structură înalt cristalină coexistă cu regiunile cu
structură amorfă iar cele cu un raport favorabil zonelor cristaline prezintă o rezistenţă
crescută la acţiunea enzimatică.
Celuloza, aşa cum se găseşte în natură este un homopolimer cu greutate
moleculară mare, insolubil şi adesea în asociere intimă cu lignina, hemiceluloza la nivelul
peretelui celular vegetal fapt ce o face puţin accesibilă degradării enzimatice (Robson şi
Chambliss, 1989).
Toate organismele care degradează celuloza cristalină secretă sisteme enzimatice
mai mult sau mai puţin complexe care sunt alcătuite din enzime cu diferite modalităţi de
acţiune, specificitate de substrat şi care acţionează de obicei sinergic pentru a hidroliza
celuloza.
Cel mai bine studiat sistem celulazic este cel de la fungi (de la Trichoderma
reesei), enzimele care îl alcătuiesc fiind grupate în trei categorii:
- exo-b-1,4-glucanaze sau celobiohidrolaze (EC 3.2.1.91.)
- endo-b-1,4-glucanaze sau endocelulaze (endoglucanaze)(EC 3.2.1.4.)
- b-glucozidaza sau celobiaza (EC 3.2.1.21.)
Aceste trei grupe de enzime acţionează sinergic ducând la hidroliza celulozei
cristaline. Endoglucanazele determină ruperea legăturilor interne ale lanţului de celuloză,
atacul făcându-se la întâmplare şi ducând la formarea de oligozaharide. Efectul direct al
acestui tip de enzime este fragmentarea lanţului de celuloză cuplat cu o creştere slabă a
cantităţii de zaharuri reducătoare eliberate. De obicei, în complexele celulozolitice sunt
cuprinse mai multe endoglucanaze care pot prezenta afinităţi diferite pentru celo-
oligozaharide cu lungimi variate. Spre deosebire de aceste, exoglucanazele
(celobiohidrolazele) acţionează la nivelul extremităţilor nereducătoare ale lanţului de
celuloză, eliberând glucoză sau celobioză (zaharuri reducătoare) în cantitate crescută,
lungimea lanţului celulozic nefiind modificată semnificativ.
Acţionând individual, atât endoglucanazele cât şi celobiohidrolazele pot degrada
regiuni restrânse ale lanţului celulozic (cele cu structură amorfă). Pentru a determina
hidroliza regiunilor cu structură cristalină este necesar ca în amestecul enzimatic să fie
prezente ambele tipuri de enzime.
In ceea ce priveşte β-glucozidazele, acestea determină hidroliza celobiozei în
două unităţi de glucoză. Deşi aceste enzime nu sunt propriu-zis celulaze, ele participă la
îmbunătăţirea randamentului degradării celulozei prin eliminarea inhibării prin feedback
a celulazelor realizată de obicei de celobioză (Robson şi Chambliss, 1989).
Utilizarea a numeroase substrate şi diverse tehnici de evidenţiere a activităţii
celulazice a dus la o comparare dificilă a sistemelor celulozolitice de la diferite
organisme. Mai mult, deoarece celulazele aflate în extracte brute prezintă o suprapunere
parţială a specificităţii de substrat, un studiu corect trebuie realizat în condiţiile purificării
acestor enzime. In ultima vreme au fost obţinute o serie de substrate celulozice care ar
putea fi folosite ca substrate mai mult sau mai puţin specifice pentru fiecare dintre
componentele sistemului celulazic (Wood şi Bhat, 1988). Cel mai utilizat procedeu de
determinare a activităţii enzimatice este măsurarea cantităţii de zaharuri reducătoare
eliberate în urma acţiunii enzimelor asupra substratului. Astfel, substratele celulozice cu
structură amorfă sau cele modificate chimic cum sunt celuloza-azur,
carboximetilceluloza(CMC), celuloza tratată cu acizi ("acid-swollen cellulose") sau
trinitrofenil-carboximetilceluloza (TNP-CMC) sunt degradate în mod semnificativ şi
specific de către endoglucanaze dar, în unele situaţii şi celobiohidrolazele le pot hidroliza
de şi cu o eficienţă mai mică. In cazul utilizării drept substrat a celulozei cu structură
cristalină de tipul Avicelului (celuloză microcristalină), bumbacului sau hârtiei de filtru,
pentru degradarea lor eficientă este necesar un sistem celulazic complet, care să conţină
atât endoglucanază cât şi celobiohidrolază. De obidei, pentru a determina prezenţa într-un
preparat enzimatic brut a ambelor tipuri de enzime se determină eliberarea de zaharuri
reducătoare în funcţie de substrat. Astfel, endoglucanazele cauzează o creştere rapidă a
fluidităţii (reducerea vâscozităţii) carboximetilcelulozei dar o eliberare scăzută de
zaharuri reducătoare. In contrast, celobiohidrolazele nu modifică fluiditatea substratului
dar conduce la eliberarea unei cantităţi mai mari de zaharuri reducătoare. Cu toate acestea
este dificil de precizat dacă o celulază este sau nu celobiohidrolază deoarece nu există un
substrat specific pentru aceasta. Deshpande şi colab., (1988) au arătat însă că hidroliza
unor compuşi cum ar fi metil-umbeliferil-celobiozid (MUC) sau p-nitrofenil-b-D-
celobiozid (pNPC) ar fi un indiciu al activităţii exo-b-1,4-glucanazice.
Există în prezent numeroase date referitoare la bacterii celulozolitice dar mulţi
autori consideră că bacteriile produc doar endoglucanaze şi nu un sistem celulazic
complet. Deşi cea mai acceptată teorie referitoare la modul de degradare a celulozei este
cea bazată pe rezultatele cercetărilor efectuate asupra fungilor şi care presupune că
hidroliza eficientă a substratelor celulozice se realizează în urma acţiunii sinergice a
endo- şi exoglucanazelor, ea nu este aplicată bacteriilor. La acestea, modelul de
degradare sugerat presupune că endoglucanazele care au ca substrat specific celo-
oligozaharidele cu lungimi variate pot determina hidroliza celulozei cristaline dacă ele se
află în concentraţie mare sau dacă se leagă de fibrele de celuloză sau sunt grupate în
imediata vecinătate a acestora ("celulosomi") (Robson şi Chambliss, 1989). Reuşita unor
laboratoare din lume de a izola şi caracteriza celobiohidrolaze de la bacterii vine să
contrazică în cazul speciilor respective teoria enunţată mai sus (Creuzet şi colab.,1983;
Mac Kenzie şi colab.,1984; Gardner şi colab., 1987; Beguin, 1990; Ruttersmith şi Daniel,
1991).
Celuloza ajunsă în sol şi în ape este transformată în timp, sub acţiunea
microorganismelor care produc enzime celulozolitice:
․ micromicete-agenţi ai putrezirii,
․ bacterii aerobe şi anaerobe.
Produşii intermediari de hidroliză sunt metabolizaţi în mod diferenţiat, în funcţie
de natura microorganismelor şi de prezenţa/absenţa oxigenului din aer.
Degradarea aerobă a celulozei se caracterizează prin formarea din celobioză sau
glucoză, în prima etapă, a hidroxiacizilor din care, prin oxidare, se eliberează CO2 şi
H2O.
Dintre bacteriile aerobe care asimilează celuloza fac parte bacterii cu forme
spiralate aparţinând genurilor: Cytofaga, Cellvibrio, Cellulomonas.
Importanţă industrială o au bacteriile din genul Cellulomonas, care pot fi cultivate
aerob pe deşeuri vegetale, pe hârtie ş.a., iar biomasa rezultată prin înmulţire este
valoroasă prin conţinutul ridicat în proteine (46,2%).
Dintre micromicete au activitate celulozolitică superioară specii ale genurilor:
Botryotinia, Fusarium, Mucor, Rhizopus, Trichoderma şi Tricothecium.
Tulpini selecţionate de micromicete ale genurilor Trichoderma şi Aspergillus sunt
bune producătoare de celulaze şi sunt folosite industrial ca surse de enzime.
Degradarea anaerobă a celulozei are loc permanent în sedimente şi în mâlul apelor, la
fermentarea compostului, în rumenul erbivorelor, în profunzimea solului, în soluri
inundate, lacuri termale.
În transformarea celulozei se pot distinge trei etape, în funcţie de natura produselor de
fermentaţie.
După hidroliza celulozei la compuşi simpli, sub acţiunea unei microbiote heterogene
alcătuite din bacterii anaerobe şi facultativ anaerobe din familiile Enterobacteriaceae,
Bacillaceae (genul Clostridium), se acumulează alcooli, acizi, CO2 şi H2.
Produsele rezultate în acest stadiu sunt folosite de bacteriile acetogene producătoare
de acid acetic pe cale anaerobă, în a doua etapă.
În etapa a treia, denumită metanogenă, sunt active bacteriile metanogene strict
anaerobe din genul Methanobacterium cu speciile M.ruminantium, M.formicicum,
M.mobilis, M.farkeri ş.a.
Bacteriile anaerobe pot folosi acidul acetic ca sursă energetică şi produc metan. Se
apreciază că 73% din metan rezultă din acidul acetic format în faza acetogenă.).
La bacterii celulazele extracelulare se cupleaza prin agregare si formeaza complexe
macromoleculare proteice numite celulosomi. Acestia sunt structuri caracteristice pentru
bacteriile celulozolitice, iar sinteza lor este determinata de activitatea a 14-18 gene. In
celulosomi enzimele se agrega pentru a putea actiona mai eficient iar prin ei se actioneaza
asupra fibrelor de celuloza. 
Uneori celulosomii formeaza niste structuri numite policelulosomi care se leaga de
fibrilele de celuloza si o degradeaza mai eficient. Ei se pot desprinde de pe celulele
bacteriene si de pe fibrele de celuloza, se pot disocia in celulosomi, iar acestia apoi in
enzime libere.
 Un celulosom este alcatuit din:
- o parte centrala numita proteina majora
- o parte neenzimatica, la suprafata , avand rol de organizare a agregatului si de legare
atat in celula bacteriana cat si de fibrila celulozica.
Activitatea celulosomiilor consta in:
- mentinerea celulazelor grupate, fara o difuzie si dilutie a lor in mediul extern,
- in mentinerea bacteriilor legate de fibrele de celuloza si astfel se asigura activitatea
biodegradativa a lor ,
- in asigurarea activitatii simultana in mai multe puncte de pe fibrele de celuloza
- si in mentinerea grupata a produsilor biodegratarii fara sa se piarda in mediul extern.
Degradarea enzimatica a celulozei determina producerea de zaharuri solubile precum
etanolul, acetona, butanolul, acidul acetic, acidul lactic si alti acizi organici.
Pentru o activitate mai eficienta microorganismele actioneaza in asociatii.
Exemple de asociatii sunt : Sporocytophaga myxococcoides si Flavobacterium;
Clostridium thermocellum si Clostridiumautotrophicum.
In cazul ciupercilor celulozolitice actioneaza mai multe sisteme enzimatice si anume:
exocelulazele, endoglucanazele,exoglucanazele, βglucodiazele,celobiooxidazele,
celobiohidrolazele, carboximeticelulazele, hidroxietilcelulazele, glucohidrolazele.
Activitatea microorganismelor celulozolitice este influentata de o serie de factori.
Astfel, in conditii de sol, pH-ul influenteaza direct favorizand activitatea fungilor, a
bacteriilor, iar la pH-ul alcalin a asociatiilor bacterii si fungii.
Activitatea celulozolitica este influentata si de prezenta azotului in substrat prin
stimularea acesteia.
Temperatura influenteaza activitatea microorganismelor celulozolitice ca si umiditatea,
compozitia amestecului de gaze si compozitia in lignina a tesuturilor vegetale si altor
glucide.
Degradarea celulozei de catre microorganisme are si o serie de aplicatii
biotehnologice ca: producerea de proteina, de biomasa furajera, de biopolimeri, de etanol,
de indulcitori alimentari, de antibiotice, de acizi, de aminoacizi, acetona, butanol sau
biogaz.
 Printre bacteriile considerate a avea sisteme celulazice complexe, tipice se numără
genurile Clostridium, Cellulomonas, Bacillus, Thermomonospora, Ruminococcus,
Bacteroides, Erwinia şi Acetobacter.
De asemenea, tulpini celulozilitice au fost identificate şi în cadrul altor genuri de
bacterii: Streptomyces, Rhizobium, Cellvibrio, Pseudomonas, Microbispora etc.
Acum aproximativ 200 de ani, genul Trichoderma a fost inclus ca taxon pentru a
denumi un grup special de fungi filamentoşi nou descoperit. Abia după 150 de ani, genul
Trichoderma a atras din nou atenţia c‚nd s-a observat, Ón cursul celui de-al doilea război
mondial, că specii aparţin‚nd acestui grup (T. viride) sunt capabile să degradeze celuloza.
Ulterior, Ón cadrul grupului au fost identificate mai multe specii (T. viride, T. reesei, T.
harzianum, T. koningii etc.), dintre care unele s-au dovedit a fi extrem de eficiente in
degradarea substraturilor celulozice, iar altele, prin compuşii produşi inhibă creşterea
unor fitopatogeni.
In ultimii ani, fungii filamentoşi din genul Trichoderma au fost supuşi unor studii
amănunţite atat in privinţa particularităţilor morfologice, fiziologice, biochimice sau
genetice cat mai ales pentru identificarea, purificarea şi utilizarea compuşilor de interes
economic. Din acest punct de vedere, se poate spune că fungii filamentoşi din genul
Trichoderma prezintă un interes biotehnologic deosebit, fiind elaborate pană in prezent
numeroase tehnologii de obţinere a unor substanţe biologic active sintetizate de aceştia.