





9
Despre autori
Autorii sunt cadre didactice la Disciplina de Biochimie,
Facultatea de Medicină, UMF „Carol Davila” Bucureşti
Valeriu Atanasiu: Profesor universitar, Şef al Disciplinei de Biochimie, absolvent
al Facultăţii de Chimie, Doctor în Chimie – 1984
Maria Mohora: Profesor universitar, absolventă a Facultăţii de Chimie, Doctor în
Chimie – 1993
Beatrice Carmen Dogaru: Asistent universitar, absolventă a Facultăţii de Medicină
Cristian Dinu Dogaru : Asistent universitar, absolvent al Facultăţii de Medicină
Carmen Duţă: Şef de lucrări, absolventă a Facultăţii de Chimie, secţia Biochimie,
Doctor în Medicină – 2002
Marilena Gîlcă: Conferenţiar universitar , absolventă a Facultăţii de Medicină,
Doctor în Medicină – 2002
Laura Elena Gaman: Şef de lucrări, absolventă a Facultăţii de Chimie, Doctor în
Farmacie – 2006
Corina Muscurel: Şef de lucrări, absolventă a Facultăţii de Medicină, Doctor în
Medicină – 2002
Irina Stoian: Conferenţiar universitar, absolventă a Facultăţii de Chimie, Doctor în
Medicină – 2005
Bogdana Vîrgolici: Şef de lucrări, absolventă a Facultăţii de Medicină, Doctor în
Medicină – 2003
Elena Torac: Asistent Universitar, absolventă a Facultăţii de Chimie - 2006
Luiza Rădulescu: Asistent universitar, absolventă a Facultăţii de Medicină - 2009
Daniela Lixandru: Şef de lucrări FMAM, absolventă a Facultăţii de Biologie, secţia
Biochimie, Doctor în Medicină – 2011

Valeriu Atanasiu Maria Mohora

10
 (coordonatori)

Beatrice Carmen Dogaru Carmen Duţă

Bogdana Vîrgolici Laura Elena Gaman
Corina Muscurel Elena Torac
Gîlcă Marilena Luiza Rădulescu
Irina Stoian Daniela Lixandru

BIOCHIMIE MEDICALĂ

– GHID PENTRU LUCRĂRI PRACTICE –

Ediţia a 3-a, revizuită

11
Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României
Biochimie medicală: ghid pentru lucrări practice / Valeriu Atanasiu, Maria Mohora (coord.),
Beatrice Carmen Dogaru, ... – Ed. a 2-a, rev. – Bucureşti: Editura NICULESCU, 2012
Bibliogr.
ISBN 978-973-748-655-4

I. Atanasiu, Valeriu (coord.)

II. Mohora, Maria (coord.)
III. Dogaru, Beatrice Carmen

577.1 :61 (075.8)

© Valeriu Atanasiu (coord.), Maria Mohora (coord.) şi colectiv

Editura NICULESCU, 2012

Adresa: Bd. Regiei 6D
060204 – Bucureşti, România
Comenzi: (+40)21-312.97.82
Fax: (+40)21-312.97.83
E-mail: editura@niculescu.ro
Internet: www.niculescu.ro

12
Tipărit în România

ISBN 978-973-748-655-4

Toate drepturile rezervate. Nicio parte a acestei cărţi nu poate fi reprodusă sau transmisă sub nicio formă şi prin niciun mijloc, electronic sau
mecanic, inclusiv prin fotocopiere, înregistrare sau prin orice sistem de stocare şi accesare a datelor, fără permisiunea Editurii NICULESCU.
Orice nerespectare a acestor prevederi conduce în mod automat la răspunderea penală faţă de legile naţionale şi internaţionale privind proprietatea
intelectuală.

Prefaţă

Acest manual de laborator de biochimie medicală este destinat

studenţilor din anul I ai Facultăţii de Medicină şi studenţilor din anii III, IV
şi V care urmează cursul opţional de Biochimie clinică.
Manualul cuprinde atât metode fundamentale de analiză calitativă şi
cantitativă – volumetrie, spectrofotometrie, electroforeză, cromatografie,
imunochimie – cât şi metode de identificare şi dozare a componenţilor normali
şi patologici din sânge, urină, suc gastric, lichid cefalorahidian. Manualul
conţine de asemenea date privind metabolismul calciului, fosforului şi
magneziului, fierului şi cuprului.
Fiecare capitol cuprinde, pe lângă tehnicile de lucru necesare, date
teoretice de biochimie şi biochimie patologică legate de parametrul studiat,
care completează noţiunile predate la curs. Aceste date sunt utile studenţilor
pentru interpretarea rezultatelor obţinute în cadrul activităţii experimentale
şi înţelegerea rolului investigaţiilor biochimice în stabilirea diagnosticului şi
urmărirea evoluţiei bolilor.

Autorii
13
14
 CUPRINS
I. Soluţii .................................................................................................................. 9
1. Concentraţia soluţiilor: Valeriu Atanasiu ......................................................... 9
2. pH-ul soluţiilor şi sisteme tampon: Valeriu Atanasiu..................................... 20

II. Tehnici utilizate în laboratorul de biochimie ............................................... 34

1. Volumetria: Valeriu Atanasiu ......................................................................... 34
2. Cromatografia: Valeriu Atanasiu, Laura Elena Gaman ................................. 47
3. Electroforeza: Elena Torac, Luiza Rădulescu ................................................ 55
4. Spectroscopia moleculară: Maria Mohora, Daniela Lixandru ....................... 65

III. Noţiuni de calcul statistic al erorii unei metode de analiză biochimică:

Maria Mohora ............................................................................................ 89

IV. Însuşirile principalelor clase de compuşi biochimici ................................... 94

1. Acizii nucleici: Carmen Duţă ......................................................................... 94
2. Glucidele: Valeriu Atanasiu ......................................................................... 118
3. Lipidele: Maria Mohora ............................................................................... 132
4. Aminoacizii: Valeriu Atanasiu ..................................................................... 137
5. Proteinele: Maria Mohora ............................................................................ 146
6. Enzimele: Marilena Gâlcă ........................................................................... 157

V. Metabolismul energetic: Laura Elena Gaman, Corina Muscurel ................. 173

VI. Analiza biochimică a sângelui ..................................................................... 177

1. Consideraţii generale: Beatrice Dogaru ....................................................... 177
2. Enzimele plasmatice: Bogdana Vârgolici, Marilena Gâlcă ......................... 184

15
 3. Compuşi minerali: Irina Stoian .................................................................... 211
4. Compuşi glucidici: Corina Muscurel ........................................................... 229
5. Compuşi lipidici: Maria Mohora, Bogdana Vîrgolici .................................. 235
6. Proteine plasmatice: Beatrice Dogaru .......................................................... 248
7. Compuşi azotaţi: Beatrice Dogaru ............................................................... 257

VII. Analiza urinii: Beatrice Dogaru .................................................................. 272

VIII. Analiza biochimică a lichidului cefalorahidian (LCR):

Beatrice Dogaru ....................................................................................... 296

IX. Analiza biochimică a sucului gastric: Beatrice Dogaru.............................. 300

X. Investigarea biochimică a sistemului endocrin: Bogdana Vârgolici,

Corina Muscurel ...................................................................................... 306

XI. Aplicaţii clinice: Bogdana Vîrgolici .............................................................. 310

Bibliografie .......................................................................................................... 331

16
 I. SOLUŢII

1. Concentraţia soluţiilor

Soluţiile se definesc ca amestecuri omogene formate din două sau mai multe
substanţe care nu interacţionează chimic şi alcătuiesc o singură fază. În laboratoarele
de biochimie se folosesc curent soluţiile lichide, care sunt formate din două
componente şi anume dizolvantul (solventul) şi una sau mai multe substanţe
dizolvate (solvaţii). Concentraţia unei soluţii reprezintă cantitatea de substanţă
dizolvată într-un anumit volum sau masă de soluţie. Modalităţile de exprimare a
concentraţiilor soluţiilor sunt:
A. Concentraţia procentuală sau empirică
B. Concentraţia molară sau molaritate
C. Concentraţia normală sau normalitate
D. Titrul unei soluţii

A. Concentraţia procentuală (c%)

a. Concentraţia procentuală masică (c% w/w)

Reprezintă cantitatea de substanţă exprimată în grame care se află în 100 g
soluţie. Pentru a se evita confuzia acestui tip de concentraţie procentuală cu cele ce
vor fi descrise în continuare, se preferă şi se recomandă specificarea modului în care
aceasta a fost preparată sau calculată. Astfel, în situaţia de mai sus raportul w/w
reprezintă prescurtarea specificaţiei tipului de concentraţie procentuală, şi anume
procente de masă sau masă /masă (w/w).
Exemplu: o soluţie apoasă de glucoză 1% (w/w) se obţine prin dizolvarea unui
gram de glucoză în 99 g apă, adică cele 100 g soluţie conţin 1 g glucoză.

b. Concentraţia procentuală de volum ( c% v/v )

Acest mod de exprimare a concentraţiei se foloseşte frecvent în cazul
dizolvării substanţelor lichide sau gazoase şi reprezintă numărul de centimetri cubi
de substanţă dizolvată în 100 cm3 de soluţie.
Exemplu: o soluţie de aldehidă formică 2% (v/v) conţine 2 cm3 aldehidă
formică şi 98 cm3 apă.

c. Concentraţia procentuală (c% w/v)

Este un alt mod de a exprima concentraţia procentuală extrem de mult utilizat
în biochimie şi reprezintă grame de substanţă dizolvate în 100 cm3 soluţie.
Exemplu: o soluţie de proteină 8,5% (w/v) conţine 8,5 g proteine în 100 ml
soluţie.

17
 d. Concentraţia %0 (exprimată la mie)
Poate fi în mod asemănător exprimată în %0 w/w, caz în care aceasta
reprezintă numărul de grame de substanţă dizolvată în 1000 g de soluţie.
%0 w/v când reprezintă numărul de grame de substanţă dizolvată în 1000 cm3
de soluţie.
%0 v/v când reprezintă numărul de cm3 dizolvaţi în 1000 cm3 de soluţie.
Exemplu: serul fiziologic este o soluţie NaCl 9 %o w/v şi se obţine din 9 g
NaCl peste care se adaugă apă (sub agitare) până se obţin 1000 cm3 soluţie.

B. Concentraţia molară sau molaritatea (m)

Această modalitate de exprimare a concentraţiei soluţiilor reprezintă numărul

de moli de substanţă dizolvată într-un litru de soluţie. De obicei soluţiile molare se
notează cu simbolul m sau M care însoţesc cifra ce arată concentraţia respectivă.

Exemple:
- o soluţie de NaCl 2m conţine 2 moli NaCl, adică 117 g NaCl la litru de
soluţie.
- o soluţie de H2SO4 0,1 m conţine 0,1 moli H2SO4, adică 9,8 g H2SO4 la litru
de soluţie.
Calculul numărului de moli dintr-o soluţie se realizează prin împărţirea
masei de substanţă la valoarea masei molare: = m/M. Calculul concentraţiei
molare a unei soluţii va ţine cont de numărul de moli () de substanţă dizolvată, ce
se găsesc într-un anumit volum (V) de soluţie:
ν( moli )............................V (mililitri)
m...........................................1000ml
m =  x 1000/V
Soluţia va avea molaritatea m. De reţinut că soluţiile molare pot fi: 1 M, 2M
(bimolare), multiplumolare sau decimolare (0,1 M) centimolare (0,01M), milimolare
(0,001 M), etc.

C. Concentraţia normală sau normalitatea

Reprezintă numărul de echivalenţi gram de substanţă dizolvată într-un litru

de soluţie. Soluţiile ale căror concentraţii se exprimă prin normalitate se numesc
soluţii normale şi se notează cu simbolurile n sau N care însoţesc cifra ce indică
concentraţia respectivă. Cunoscând cantitatea în grame (w) dintr-o substanţă
dizolvată într-un litru de soluţie, se poate calcula normalitatea soluţiei respective
astfel:
n = w/E (echivalenţi x l-1)
în care: E reprezintă echivalentul gram al substanţei dizolvate

18
 Calculul concentraţiei normale a unei soluţii va ţine cont de numărul de
echivalenţi gram de substanţa dizolvată (a) ce se găsesc într-un anumit volum (V) de
soluţie, astfel:
a (echivalenţi gram).....................................V (ml soluţie)
n....................................................................1000 ml soluţie

n = a x 1000/ V
Normalitatea soluţiei va fi n.
Exemple:
- pentru a prepara o soluţie de H2SO4 1 n se calculează mai întâi echivalentul
gram al H2SO4:
Eg H2SO4 = 98,08/2 = 49,04 g
astfel 1000 cm3 de soluţie H2SO4 1 n conţine 49,04 g H2SO4, adică un
echivalent gram de H2SO4, iar o soluţie de H2SO4 0,2 N conţine la 1000 cm3 soluţie
0,2 x 49,04 g H2SO4, adică 0,2 echivalenţi gram H2SO4. În general, cantitatea de
substanţă (w) exprimată în grame care trebuie dizolvată într-un litru de soluţie pentru
a obţine o anumită normalitate se calculează înmulţind echivalentul gram (E) cu
normalitatea (n):
W=Exn
Deci, cunoscând echivalentul-gram al unei substanţe se pot prepara soluţii
de orice normalitate, calculând câte grame de substanţă trebuie dizolvată la 1000 cm3
soluţie de normalitate dorită. Adeseori nu este necesar să se prepare un litru de soluţie
de o anumită normalitate, ci un volum mai mic sau mai mare de un litru. În acest caz
cantitatea de substanţă (w) care trebuie dizolvată într-un anumit volum de soluţie (V)
cu normalitate (n) se calculează înmulţind echivalentul gram (E) cu normalitatea (n)
şi volumul (V) exprimat în litri.
Exemplu: pentru a prepara 500 cm3 soluţie de NaCl 0,3 n se calculează
cantitatea de NaCl exprimată în grame (W NaCl) astfel:
ENaCl = 58,5 /1 =58,5 g
V =0,5 l

n = 0,3
WNaCl = 58,5 x 0,3 x 0,5 = 8,775 g

Deci, la 8,775 g NaCl se va adăuga apă (sub agitare) până la volumul de 500
cm3.
Utilizarea soluţiilor normale în volumetrie se bazează pe faptul că soluţiile
de aceeaşi normalitate reacţioneaza în volume egale, deoarece conţin dizolvate
substanţe în cantităţi echivalente.
Exemplu: 10 cm3 soluţie de NaOH 2n neutralizează exact 10 cm3 soluţie
HCl 2n.
Concentraţia unor constituenţi solubili din diferite fluide biologice (sânge,
salivă, lichid cefalorahidian, urină, etc.) se exprimă fie în grame/litru sau
19
subdiviziuni ale acesteia fie în echivalenţi/litru sau subdiviziuni ale acesteia. De
exemplu concentraţia cationilor Na+, K+, Ca2+, Mg2+ în sânge se exprimă în
grame/litru cât şi în miliechivalenţi/litru.
Între cele două moduri de exprimare există relaţia:
mE/l = mg/l/E
+
Astfel, pentru Na : mE/l = mg Na /l/23
pentru Ca2+: mE/l = mg Ca2+/l/20

D. Titrul unei soluţii

Reprezintă cantitatea de substanţă exprimată în grame care se găseşte

dizolvată într-un cm3 de soluţie. Titrul unei soluţii se notează cu litera T. Pornind de
la definiţia titrului rezultă relaţia:
T=W /1000=m x M /1000 = n x E /1000
unde: W= cantitatea de substanţă dizolvată în 1000 cm3 soluţie
m = molaritatea soluţiei
M = masa molară a substanţei dizolvate
n = normalitatea soluţiei
E = echivalentul-gram al substanţei dizolvate

Exemple:
Titrul soluţiei ce conţine 4 g NaOH la 1000 cm3 soluţie este:
T = 4/1000 = 0,004 g/ml
Titrul soluţiei de KOH 2m este: T = 2 x 56 /1000 = 0,112 g/ml
Titrul unei soluţii de HCl 2n se calculează conform următorului raţionament:
1000 cm3 soluţie HCl 2n conţin dizolvate ......73g HCl
1 cm3 soluţie HCl 2n conţine dizolvat ............T g HCl
T = 73/1000 = 0,073 g/ml
Transformarea unui mod de exprimare a concentraţiei în altul se poate face
folosind relaţia care exprimă titrul, relaţie din care rezultă:
W = m x M = n x E = 1000 T
molaritatea: m = W /M = 1000 T / M
normalitatea: n = W /E = 1000T / E
Cunoscând că W reprezintă cantitatea de substanţă exprimată în grame
dizolvată în 1000 cm3 de soluţie, cu densitatea , concentraţia procentuală se
calculează astfel:
c% ( W/V ) = W /10 = 100 T
c% ( w/W ) = W /10 x 1/
Exemplu: dacă se consideră o soluţie de H2SO4 0,1n (M H2SO4 = 98 g) se pot
calcula:

1.Titrul: T = n x E /1000 = 0,1 x 0,049 = 0,0049 g H2SO4/cm3 soluţie

20
2.Cantitatea de substanţă dizolvată: W = 1000T = 4,9 g H2SO4/1000 cm3 soluţie
3.Concentraţia molară: m = W/M = 4,9/98 = 0,5 moli H2SO4/1000 cm3 soluţie
4.Concentraţia procentuală:
c% (W/V) = W /10 = 4,9 /10 = 0,49 g H2SO4/100 cm3 soluţie
c% (W/W) = W/10 x 1/ = 4,9/10 x1/ = 0,49 x 1/ g H2SO4/100 g soluţie

Substanţe etalon - soluţii etalon

Substanţe etalon sau standard sunt considerate substanţele din care prin
cântărire, dizolvare şi aducere la un volum dat de soluţie se obţin soluţii cu titru
exact.
O substanţă etalon trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
- să fie suficient de pură;
- să aibă formula chimică bine definită, compoziţia să fie unitară şi stabilă
în condiţiile de lucru (să nu se carbonateze, să nu se oxideze, să nu absoarbă apă, să
nu piardă apa de cristalizare)
- să fie suficient de stabilă în solventul care se utilizează (de regulă apa
distilată);
- să aibă masa moleculară relativ mare, asfel încât eroarea de cântărire să fie
cât mai mică.
Exemple de substanţe etalon: dicromatul de potasiu (K2Cr2O7), acidul oxalic
(C2O4H2), carbonatul de sodiu (Na2CO3), clorura de potasiu (KCl), acidul benzoic
(C6H5 -COOH), etc. Substanţele etalon se utilizează în următoarele scopuri:
- pentru obţinerea directă prin simpla cântărire şi dizolvare a soluţiilor care
se folosesc în volumetrie; aceste soluţii se numesc soluţii etalon sau standard primare
(exemplu soluţia de K2Cr2O7, AgNO3, etc.).
- pentru determinarea exactă a concentraţiei unor soluţii ce urmează a fi
folosite în diferite determinări volumetrice. Această operaţie se numeşte
standardizare. Soluţiile ale căror concentraţii se determină prin standardizare se
numesc soluţii etalon sau standard secundare. De exemplu, o soluţie de hidroxid de
potasiu este o soluţie etalon (standard) secundar, deorece concentraţia sa exactă se
stabileşte cu ajutorul unei soluţii etalon primar de acid benzoic sau acid oxalic.
Soluţiile etalon sau exacte, reprezintă acele soluţii al căror titru este egal cu
titrul exact sau titrul teoretic, rezultat din calcul:
Tr = Tt = n x E /1000

Soluţii aproximative sau reale

Substanţele ce îndeplinesc condiţiile de substanţe etalon primar sunt relativ

puţine. Majoritatea substanţelor neîndeplinind aceste condiţii sunt folosite pentru
prepararea unor soluţii care nu au o concentraţie exactă. Aceste soluţii se numesc
soluţii aproximative sau reale. Ca exemplu de soluţii aproximative pot fi menţionate:

21
soluţiile de acid clorhidric, acid sulfuric, acid azotic, hidroxid de sodiu, hidroxid de
potasiu, permanganat de potasiu, etc. Soluţiile aproximative sau reale pot fi folosite
totuşi în analiza volumetrică la fel ca şi soluţiile etalon primare, cu condiţia de a fi
standardizate în prealabil. Prin standardizare se stabileşte concentraţia exactă,
respectiv titrul teoretic al acestor soluţii.
Factorul de corecţie
Pentru ca o soluţie aproximativă să poată fi folosită în analiza volumetrică
este necesar să se determine factorul de corecţie. Acesta reprezintă o valoare
numerică cu ajutorul căreia se poate transforma un volum de soluţie aproximativă
într-un volum de soluţie exactă. Factorul de corecţie se notează de obicei cu
simbolul F sau f şi reprezintă numărul de cm3 de soluţie de normalitate exactă care
corespunde la 1 cm3 de soluţie aproximativă. Altfel spus, factorul de corecţie
reprezintă raportul între titrul real şi titrul teoretic (exact) al unei soluţii.
Exemplu: considerând o soluţie aproximativă de NaOH 0,1 n al cărui titru
real ete Tr = 0,0042 g/cm3. Deoarece soluţia aproximativă de NaOH 0,1 n este mai
concentrată rezultă că 1 cm3 din soluţia aproximativă
(Tr = 0,0042 g/cm ) corespunde unui volum mai mare de soluţie exactă
3

(Tt = 0,0040 g/cm3). Factorul se calculează astfel:

F = Tr / Tt = 0,0042/0,0040 = 1,0500
Deci 1 cm de soluţie aproximativă de NaOH 0,1n corespund la
3

l,05 cm3 de soluţie exactă de NaOH 0,1n. De menţionat că în cazul soluţiilor etalon
care au titrul real egal cu titrul teoretic factorul de corecţie are valoarea 1,000.
Factorul de corecţie al unei soluţii aproximative se determină experimental prin
operaţia denumită titrare.
Cu ajutorul factorului de corecţie se poate efectua:
- transformarea unui volum de soluţie aproximativă (V r) într-un volum de
soluţie exactă (Ve), folosind relaţia:
Ve = F x V r
- calcularea titrului real (Tr) sau a concentraţiei reale a unei soluţii
aproximative pe baza relaţiei:
Tr = F x T t
Aplicând legea echivalenţilor chimici (substanţele simple şi compuse
participă la reacţiile chimice în numar egal de echivalenţi) pentru cazul a două
soluţii, o soluţie etalon şi o soluţie reală, de aceeaşi concentraţie, rezultă egalitatea:
Vr x F = Ve x Fe
Dacă factorul soluţiei etalon (Fe) are valoarea 1,000 rezultă că:
F = V e /Vr
Deci practic factorul de corecţie se calculează din raportul volumelor exact
măsurate a două soluţii, una etalon (Ve) şi una aproximativă (Vr), care au aceeaşi
normalitate.

22
 Pentru dozările volumetrice cu soluţii aproximative este recomandat ca
factorul de corecţie să aibă valorile cuprinse în intervalul: 0,900< F <1,1000. Factorul
se calculează de obicei cu patru zecimale. Dacă F>1,000 soluţia aproximativă este
mai concentrată decât soluţia exactă. În acest caz titrul real al soluţiei aproximative
este mai mare decât titrul teoretic. Dacă F < 1,000 soluţia aproximativă este mai
diluată decât soluţia exactă şi titrul său real este mai mic decât titrul teoretic.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Experienţa 1: Prepararea soluţiilor cu diverse concentraţii prin amestecare

Un caz des întâlnit în laboratorul de biochimie este cel în care trebuie
preparată o soluţie de o anumită concentraţie prin amestecarea a două sau mai multe
soluţii ale aceleeaşi substanţe, dar de concentraţii diferite. În acest caz este bine să
folosim regula amestecurilor sau regula dreptunghiului. Astfel, pentru a prepara din
două soluţii A şi B de concentraţii diferite a şi b o soluţie C de concentraţie c se
amestecă din soluţiile A şi B cantităţile dA şi dB exprimate în grame sau litri.
Se poate scrie astfel egalitatea: a x dA + b x dB = c(dA + dB)
de unde: dA(a - c) = dB(c - b) şi asfel se obţine: dA/dB = c - b/a - c, care
este expresia matematică a regulei dreptunghiului.
Conform regulei dreptunghiului cantităţile de soluţii ce se amestecă sunt
invers proporţionale cu valorile absolute ale diferenţelor dintre concentraţiile lor şi
concetraţia soluţiei finale obţinută după amestecare. Practic expresia stabilită mai sus
prin calcul matematic poate fi uşor găsită cu regula dreptunghiului astfel: se
construieşte un dreptunghi trasându-se cele doua diagonale; în colţurile din stânga se
trec cifrele ce reprezintă concentraţiile soluţiilor ce urmează a se amesteca (a şi b) astfel
încât cea mai mare să fie sus. La intersecţia celor două diagonale se trece concentraţia
c care trebuie obţinută în final. În colţurile din dreapta se trec cantităţile (masele sau
volumele) de soluţii ce se amestecă dA şi dB care se obţin scăzând cifra cea mai mică
din cea mai mare de-a lungul diagonalei dreptunghiului.

a c-b în care: dA =c-b

dB = a-c
dA +dB = a-b
c

a-c
b
De exemplu: pentru a obţine o soluţie de KOH 10% folosind soluţii de KOH
30% şi respectiv 2% se trasează dreptunghiul (dreapta) şi prin urmare este necesar
să se amestece 8 g soluţie KOH 30% cu 20 g soluţie KOH 2% pentru a prepara 28 g
soluţie KOH 10 %.

23
 30 10 - 2 = 8

10

2 30 - 10 = 20

Folosind aceleaşi soluţii de KOH se vor prepara soluţii de 15% şi 20%.

Experienta 2: Cântărirea la balanţă analitică şi prepararea soluţiilor cu

diverse concentraţii
Prepararea soluţiilor folosite în analiza cantitativă presupune folosirea
balanţei. În principiu, cântărirea la balanţă se face comparând masa substanţei de
cântărit cu masa unor etaloane sau greutăţi. În funcţie de soluţia ce trebuie preparată,
pot fi folosite următoarele tipuri de balanţe, care diferă prin precizia lor:
a) balanţe tehnice, a căror limită a preciziei este de ordinul gramelor
b) balanţe analitice, a căror limită a preciziei este de ordinul 10-4–10-6 g.
a) Balanţa tehnică este alcătuită dintr-o pârghie cu braţe egale care se sprijină prin
intermediu unui „cuţit” din oţel sau este prinsă pe o coloană centrală de susţinere. Pârghia
este prevăzută la mijloc cu un ac indicator care poate oscila în dreptul unei scale gradate.
La capetele pârghiei se află suspendate două platane. Este prevăzută cu dispozitiv de
oprire şi de reglare a orizontalităţii.
b) Balanţa analitică este introdusă de obicei într-o cutie de sticlă prevăzută cu
uşi laterale. În figura de mai jos este redată schema componentelor balanţei analitice.

Componentele balanţei analitice:

1- pârghia balanţei 5- scala gradată (-10, +10)

2- axul central 6- dispozitiv de oprire a balanţei
3- platane 7- buton de manevrare a disp. de
4- ac indicator oprire
24
 8- buton de reglare a punctului
zero
9- ecran de sticlă mată
10- sistem optic
11- placă suport
12- mase etalonate sub
formă de inele
13- suport pentru
masele etalonate
14- dispozitiv de
manevrare a maselor
etalonate

25
 Balanţa analitică este un instrument cu ajutorul căruia se efectuează cântărirea
precisă, foarte exactă, necesară în analiza cantitativă, respectiv în analiza
volumetrică. Este construită pe principiul pârghiilor şi poate fi prevăzută cu
amortizor, care după un număr mic de oscilaţii opreste acul indicator în dreptul unei
diviziuni de pe scala gradată.
Folosirea corectă a balanţei analitice necesită respectarea cu stricteţe a
următoarelor reguli de cântărire:
-balanţa analitică trebuie să fie perfect curată, fără urme de praf.
-deschiderea şi închiderea balanţei se fac încet, fără manipulări bruşte,
evitându-se orice şocuri.
-substanţele de cântărit se aşază pe platanul din stânga al balanţei, iar
greutăţile etalonate pe cel din dreapta (diferind după tipul balanţei).
-balanţa analitică trebuie să fie „oprită” în timpul încărcării sau descărcării
sale
-cântărirea se face cu uşile balanţei închise.
-înaintea cântăririi trebuie să se stabilească şi să se verifice „punctul zero”
al balanţei.
-masele etalonate de ordinul gramelor se păstrează în cutii speciale (după
caz).
-masele etalonate se manipulează numai cu o pensetă (gramele) şi cu ajutorul
dispozitivului de manevrare a maselor etalonate (zecimile şi sutimile de gram).
-toate cântăririle necesare în efectuarea unei anumite analize de laborator se
efectuează la aceeaşi balanţă analitică.

Etapele cântăririi

Pentru a prepara soluţii de diferite concentraţii se calculează cantitatea de

substanţă ce urmează a fi dizolvată. Această cantitate se cântăreşte la balanţa tehnică
în cazul preparării de soluţii aproximative sau la balanţa analitică în cazul preparării
de soluţii etalon de concentraţii exacte.
Cântărirea la balanţa analitică cuprinde următoarelor etape:
-balanţa analitică se conectează la sursa de curent se aprinde becul care
luminează scala gradată în dreptul căreia oscilează un ac indicator;
-se deschide uşor balanţa şi se reglează "punctul zero", acul indicator
trebuind să se oprească în dreptul diviziunii zero de pe scala gradată;
-substanţa de cântărit se aşează pe platanul din stânga al balanţei (de obicei);
-pe platanul din dreapta se pun mase etalonate de ordinul gramelor şi se
adaugă apoi mase etalonate sub formă de inele (decigrame sau centigrame) până
când se ajunge la echilibrare adică deschizând uşor balanţa, acul indicator se opreşte
în dreptul unei diviziuni de pe scala gradată (miligrame şi zecimi de miligrame).
De exemplu, dacă pe platan au fost puse mase etalonate în valoare de 7
grame, dacă masele etalonate sub formă de inele au valoare de 5 decigrame şi
26
respectiv 8 centigrame, iar dacă acul indicator s-a oprit pe scala gradată la diviziunea
+ 7,5 mg, rezultă că masa cântărită este:
7+ 0,5 + 0,08 + 0,0075 = 7,5875 g
În cazul în care acul indicator se opreşte în partea negativă a scalei gradate,
atunci valoarea miligramelor şi a zecimilor de miligram se scade din valoarea
maselor folosite la echilibrare.De exemplu, în cazul de mai sus rezultatul cântăririi
va fi:
7 + 0,5 + 0,08 - 0,0075 = 7,5725 g
Se recomandă efectuarea cântăririi astfel încât acul indicator să devieze în
partea pozitivă a scalei. După terminarea cântăririi, balanţa se descarcă prin scoaterea
maselor etalonate în ordinea descrescândă a valorii lor. Se verifică „punctul zero” al
balanţei şi se întrerupe alimentarea cu curent electric.

Dizolvarea substanţelor
Substanţa cântărită la balanţa analitică sau la balanţa tehnică, se aduce în
soluţie efectuându-se următoarele operaţii:
-sticla de ceas sau fiola cu substanţă cântărită se ţine deasupra unui pahar
Berzelius în care substanţa se trece cantitativ (cu ajutorul apei distilate dintr-un
stropitor);
-se agită uşor prin mişcări circulare ale paharului sau cu o baghetă de sticlă,
până la completa dizolvare a substanţei;
-cu ajutorul unei pâlnii, lichidul se transvazează într-un balon cotat, în cazul
preparării soluţiilor etalon sau într-un cilindru gradat, în cazul preparării soluţiilor
aproximative;
-se spală de câteva ori paharul cu apă distilată, volumele de spălare trecându-
se în balonul cotat sau cilindrul gradat;
-se îndepărtează pâlnia şi cu ajutorul stropitorului se adaugă apă distilată
până la cota balonului sau până la o anumită diviziune a cilindrului;
-soluţia din balonul cotat se omogenizează prin mişcări de răsturnare, după
închiderea prealabilă cu un dop rodat, soluţia din cilindru gradat se omogenizează cu
ajutorul unei baghete de sticlă;
-soluţiile obţinute se transvazează în sticle de reactivi adecvate, perfect
curate şi uscate.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ:
Se vor prepara următoarele soluţii:
a. 50 ml de soluţie NaCl de concentraţia serului fiziologic (0,9% W/V).
b. 20 ml de soluţie de acid oxalic 0,5 m.
c. 20 ml soluţie de acid sulfuric 0,2 n folosind o soluţie de acid sulfuric 1m.

27
 2. pH-ul SOLUŢIILOR şi SISTEME TAMPON

Toate soluţiile, inclusiv cele biologice (umori) au printre caracteristicile lor

şi pe aceea de-a fi acide, bazice sau neutre. Se ştie că aciditatea este datorată ionilor
H+ (mai corect H3O+) în timp ce bazicitatea este datorată ionilor HO-. Pentru a
exprima aciditatea sau bazicitatea soluţiilor se pot utiliza unităţile de concentraţie
cunoscute (de exemplu concentraţia molară M). Frecvent apar însă situaţii, mai ales
la concentraţii foarte mici ale H+ sau HO- când astfel de exprimare este greoaie (de
exemplu 0,000001 M). Se poate însă exprima aciditatea, bazicitatea sau neutralitatea
soluţiilor într-un mod mult mai simplu, respectiv printr-o scară a numerelor de la 0
la 14, dacă se utilizează mărimea notată pH şi definită drept „logaritmul zecimal cu
semn schimbat al concentraţiei ionilor de H+”:
pH = -log [H+]
Exprimarea prin mărimea pH atât a acidităţii, neutralităţii cât şi a bazicităţii
soluţiilor este posibilă în virtutea relaţiei existente între H3O+ şi HO- în cazul apei şi
anume:
[H3O+] [HO-] = K w
Kw este o constantă numită produsul ionic al apei. Valoarea ei a fost stabilită
prin măsurători ale conductibilităţii curentului (datorată ionilor H+ şi HO-) de către
apa lipsită complet de impurităţi la 25 oC; are valoarea de 10-14 reflectând disocierea
infinitezimală a apei. Aceasta înseamnă că în apă [H+] = [HO-] = 10-7 M. Se mai
deduce şi că [HO-] = 10-14/[H+].
Dacă se redă concentraţia [HO-] prin mărimea pOH = - log [HO-], între pH
şi pOH există relaţia:
pH + pOH = - log Kw = 14
De unde:
pH = 14 – pOH
relaţie în baza căreia se exprimă prin intermediul pH-ului şi bazicitatea soluţiilor.
Pe baza acestor definiţii şi considerente se poate concluziona:
- soluţiile acide au pH < 7 şi pH-ul scade când aciditatea creşte. Soluţiile
puternic acide au pH aproape de 0.
- soluţiile bazice au pH > 7 şi pH-ul creşte când bazicitatea creşte. Soluţiile
puternic bazice au pH aproape de 14.
- soluţiile neutre au pH = 7 (concentraţia H+ este egală cu concentraţia HO-)
Valorile normale ale pH-ului diverselor lichide biologice sunt date în tabelul
următor:

Lichidul pH
plasma sanguină 7,3
lichidul interstitial 7,4
sucul gastric 1,2-3
sucul pancreatic 7,8-8

28
 Saliva 6,3-6,8
Urina 5-8

Se observă că unele lichide au valori fixe ale pH-ului în timp ce la altele pH-ul
(considerat normal) se situează între o valoare minimă şi una maximă care, în cazul
urinei este de trei unităţi de pH. Altă observaţie importantă este că majoritatea
lichidelor biologice din organismul uman au pH-ul normal în apropierea (sau în
jurul) neutralităţii.
pH-ul lichidelor biologice are un rol covârşitor pentru, practic, toate reacţiile
chimice şi activităţile fiziologice ale ţesuturilor şi organismului în totalitatea lui.

Determinarea pH-ului unei soluţii

Cele mai utilizate metode pentru determinarea pH-ului unei soluţii sunt:
1. metoda colorimetrică
2. metoda electrometrică
1. Metoda colorimetrică
Metoda colorimetrică se bazează pe modificarea, în funcţie de pH, a culorii
unor substanţe denumite indicatori de pH sau indicatori de neutralizare (acido-
bazici). Pentru ca o substanţă organică să poată fi folosită ca indicator de pH trebuie
să îndeplinească următoarele condiţii:
-să-şi schimbe culoarea în mod reversibil, adică modificarea de pH însoţită
de schimbarea culorii să se petreacă atât la creşterea acestuia cât şi la scăderea lui,
-schimbarea culorii să fie sesizabilă la concentraţii foarte mici (sensibilitate)
-să fie solubilă
-să fie stabilă în mediul de lucru

Schimbarea culorii indicatorilor în funcţie de pH este interpretată astfel:

a. Teoria ionică; consideră că moleculele neionizate de indicator au altă
culoare decât ionii rezultaţi, deci schimbarea de culoare corespunde modificării
gradului lor de ionizare, care este, evident, dependent de pH. Dependenţa de pH ţine
de faptul că indicatorii sunt acizi slabi sau baze slabe.
Sunt posibile situaţiile:
1. H-Ind (culoare în mediu acid) H++Ind- (culoare în mediu bazic)

2. Ind-OH (culoare în mediu bazic) HO-+ Ind+ (culoare în

mediu acid)
Schimbarea culorii nu se produce neapărat la trecerea de la pH acid la pH
bazic (sau invers), ea poate avea loc într-un interval de pH în mediul acid sau bazic.
b. Teoria cromoforică, explică schimbarea de culoare printr-o schimbare
structurală a indicatorului, generată de modificarea pH-ului mediului. Celor două

29
structuri chimice diferite le corespund spectre de absorbţie diferite, deci culori
diferite.
Astfel în cazul indicatorului metil orange (sarea de sodiu a acidului p-dimetil-
amino-azobenzen p-sulfonic), virarea culorii se datorează unei modificări structurale
de tipul:

Forma azoidă (culoare galbenă, Forma chinoidă (culoare roşie,

în mediu alcalin) în mediu acid)
În cazul fenolftaleinei forma incoloră, trece la o anumită valoare a pH-ului alcalin
în forma chinoidă roşie:

Intervalul de viraj al unui indicator redă limitele de pH în interiorul cărora se

observă o schimbare netă de culoare ce poartă denumirea de viraj.
Considerând indicatorul drept un acid slab, ca şi în primul caz de la teoria
ionică, schimbarea de culoare nu are loc brusc ci apare la un anumit grad de
transformare (~10%) a formei iniţiale a indicatorului şi este sesizabilă de
către ochi până la un alt grad de transformare (~90%). Culoarea soluţiei
depinde deci în orice moment de raportul celor două forme ale indicatorului.
Fiecare indicator este caracterizat printr-o constantă de echilibru KHInd care
(omiţând, ca de obicei, apa din ecuaţia de echilibru) ia forma:
 
[H 3O ][Ind ]
K H ind 
[H ]
Ind

 [H ]
[H3O ]  K H Ind  Ind  K H Ind  90/9  K H Ind  10
[Ind ]

deci pH  pK
H Ind-1

Iar pentru limita superioară a zonei de viraj

[H3O+] = KHInd x 9/90 = KHInd x 0,1 = K HInd x 10 -1
30
 pH = pK HInd + 1
Putem concluziona că se va percepe schimbarea culorii indicatorului numai
când pH-ul mediului va fi cu o unitate mai mic sau mai mare decât pKHind, adică în
limita a două unităţi de pH. Dintre factorii care influenţează domeniul de viraj se pot
menţiona natura, concentraţia şi gradul de ionizare al indicatorului, temperatura,
natura solventului, etc. Principalii indicatori acido/bazici cu intervalele lor de viraj
sunt redate în tabel. Unii indicatori sunt unicolori, alţii bicolori sau tricolori. Prin
amestecarea unor indicatori în anumite proporţii se realizează diverse intervale de
viraj mai înguste, deci mai precise (indicatori micşti) sau intervale de viraj mai largi,
pe aproape întreaga scală a pH-ului (indicatori universali).

pH 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Acid picric
Rosu de crezol
2,4 dinitrofenol
Metilorange
Roşu de metil
Albastru de
bromtimol
Turnesol
Roşu de fenol
Fenolftaleina
Galben de
alizarina
Acid
trinitrobenzoic
pH 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Tabelul I.2.1 Intervalele de viraj ale unor indicatori

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Experienţa nr. 1. Determinarea experimentală a pH-ului unei soluţii prin me-

toda colorimetrică. Se prepară următoarele soluţii:
A. soluţie KH2PO4 de concentraţie 0,06 M
B. soluţie Na2HPO4 de concentraţie 0,06 M
În eprubete separate se amestecă soluţiile A şi B în proporţiile indicate mai
jos. Se pregătesc trei seturi identice de câte cinci eprubete. Se obţine astfel în fiecare
eprubetă o soluţie cu un anumit pH. În fiecare din cele cinci eprubete ale primului
set se adaugă câte o picătură de roşu de metil (soluţie alcoolică 2% 0{W/v}). Se
notează culoarea fiecărei eprubete în tabel:

31
 Culoarea
Soluţia A Soluţia B
Eprubeta Roşu de Albastru de
(ml) (ml) Fenolftaleina
metil bromtimol
0,5 4,5 1
2 3 2
3 2 3
4 1 4
4,5 0,5 5

Se repetă experimentul pentru o altă serie de cinci eprubete, adăugându-se

în fiecare câte o picătură de albastru de bromtimol (soluţie alcoolică 1%0{W/v}). Se
notează culoarea fiecărei eprubete în tabel. In cele cinci eprubete din setul 3 se
adaugă câte o picătură de fenolftaleină (soluţie alcoolică 1%0{W/v}). Se va constata
că virajul fiecarui indicator începe şi se termină la valori de pH, riguros determinate,
specifice.

Experienţa 2. Determinarea pH-ului unei soluţii folosind hârtia indicatoare de

pH
Una dintre alternativele simple, rapide şi cu o scară largă de aplicabilitate
pentru determinarea orientativă a pH-ului, o constituie utilizarea hârtiei indicatoare
de pH. Hârtia indicatoare de pH se prezintă sub formă de benzi înguste de hârtie
impregnate cu amestecuri de indicatori, care în contact cu soluţia al cărei pH se
determină, îşi modifică culoarea. Nuanţa obţinută se compară cu o scală etalon de
culori pe care sunt indicate valori corespunzătoare de pH.
În funcţie de domeniul de pH pe care-l acoperă, hârtiile indicatoare sunt:
-cu macrodiviziuni, ce cuprinde întreg domeniul de pH (0-14), indicând
valoarea pH-ului din unitate în unitate.
-cu microdiviziuni, care cuprinde numai anumite domenii de pH (de exemplu
pH=1-4, pH=5-8, pH=8-10, etc.); indicând valoarea pH-ului cu o aproximaţie de +
0,2 unităţi de pH, acest tip de hârtie indicatoare prezentând, deci, o precizie mult mai
mare.

Mod de lucru
Se utilizează soluţiile A şi B de la experienţa 1. Din acestea se prepară un
singur set de cinci soluţii utilizând aceleaşi volume. Se măsoară cu hârtie indicatoare
pH-ul în fiecare eprubetă. Se notează pH-ul determinat.

Soluţia A (ml) Soluţia B (ml) Eprubeta pH-ul determinat

0,5 4,5 1
32
 2 3 2
3 2 3
4 1 4
4,5 0,5 5

Pe o porţiune mică de hârtie indicatoare (tăiată cu o foarfecă din banda de

hârtie indicatoare), ţinută cu o pensetă de un colţ, se pune cu o pipetă (sau o baghetă
de sticlă) o picătură din soluţia a cărei pH urmează a fi determinat. Se lasă în contact
soluţia al cărei pH trebuie determinat cu hârtia indicatoare timp de câteva secunde
după care se compară culoarea porţiunii de hârtie cu culorile etalon indicate pe scala
de pH. Se citeşte valoarea pH-ului respectiv şi se notează în tabel. Valorile de pH
determinate ar trebui să corespundă, în ordine, următoarelor valori de pH: 5,8, 6,5,
7, 7,5, 8,0.
Dacă se diluează cu apă distilată soluţiile conţinute în eprubetele respective şi
se determină pH-ul, se obţin practic, aceleaşi valori ca pentru probele nediluate.
Prin procedeul descris mai sus se determina pH-ul următoarelor lichide
biologice: ser sanguin (bovin), urină, lapte, salivă. Se întocmeşte un tabel şi se com-
pletează valorile de pH determinate:

pH
Proba
determinat Valori normale
ser sanguin 7,3-7,4
urină 5-8
lapte 6,5-6,7
salivă 6,3-6.8

2. Metoda electrometrică
Această metodă se bazează pe relaţia de directă proporţionalitate ce există
între pH-ul unei soluţii şi diferenţa de potenţial (E) care se stabileşte într-o pilă
construită dintr-un electrod standard de sticlă (Eo) şi un alt electrod introdus în soluţia
de analizat. Această dependenţă poate fi scrisă şi sub forma:
0 RT 
EE  ln [H ]
F

Unde: Eo = potenţialul standard al electrodului de sticlă, R = constanta gazelor,

T = temperatura absolută, F = constanta Faraday. Înlocuind constantele cu valorile
lor şi trecând de la logaritm natural la logaritm zecimal se obţine ecuaţia:
E = - 0,059 log [H+] = 0,059 pH
Asemenea determinări de pH se efectuează cu aparate deosebit de sensibile,
denumite pH-metre, care indică direct valoarea pH-ului, ce apare afişată direct pe un
ecran sau pe o scală gradată, cu o precizie de ordinul sutimilor de unităţi de pH.

33
Putem spune astfel că pH-metrul este de fapt un milivoltmetru capabil de a măsura
tensiunea electromotoare între doi electrozi conectaţi la aparat. Scala acestuia este
de obicei gradată direct în unităţi de pH.
Electrodul de sticlă este prezentat schematic în figură. Realizează contactul cu
soluţia de analizat, prin intermediul unei membrane de sticlă de o compoziţie
specială. La nivelul acesteia se creează un potenţial electrochimic datorită diferenţei
între concentraţia de ioni hidroniu din soluţia din interiorul electrodului şi cea din
soluţia al cărui pH se determină.

Figura I.2.1. Electrod de sticlă

pH-metrul
Există mai multe variante constructive de pH-metre în funcţie de scopul
urmărit (laborator, industrial, etc). În principiu, orice pH-metru este alcătuit din
aparatul de măsură propriu-zis şi electrozi. Electrozii specifici măsurătorilor de pH
sunt electrodul de referinţă şi respectiv electrodul de sticlă. Există electrozi care
cuprind atât electrodul de sticlă cât şi pe cel de referinţă. Acest electrod, denumit
electrod "combinaţie", este destinat măsurării pH-ului unor probe cu volum redus
sau în incinte greu accesibile. Rezultatul măsurătorii se exprimă în unitati de pH, cu
o precizie cuprinsă între 0,1 şi 0,01 unităţi de pH. Calibrarea aparatului se face în
raport cu soluţii etalon (cu pH cunoscut).

Mod de lucru
1. Se porneşte aparatul (butonul roşu). Comutatorul "OPERATION" se
poziţionează în dreptul diviziunii 0).
2. Se ridică atent electrodul de sticlă cu ajutorul şurubului montat la suport.
Paharul Berzelius este îndepărtat prin mişcare de rotaţie.
3. Fiecare electrod este spălat cu apă distilată.
4. Ambii electrozi se introduc în paharul cu soluţia al cărei pH îl determinăm
astfel încât să nu atingă pereţii paharului.
5. Comutatorul „OPERATION” se poziţionează în zona de pH (alcalin 6-14
sau acid 0-8) în funcţie de pH-ul presupus al soluţiei. Pe scala gradată, pH-urile
alcaline se citesc de la stânga la dreapta şi pH-urile acide se citesc de la dreapta la
stânga. La citirea pH-ului se aşteaptă 1-2 minute până la stabilizarea acului indicator.

34
 6. După citire comutatorul „OPERATION” se poziţionează în dreptul diviziu-
nii 0. Se opreşte aparatul.
7. Se scot electrozii din soluţia de analizat şi se spală cu apă distilată. Electrodul
de sticlă se reintroduce în apă iar electrodul de referinţă în soluţie saturată de KCl.

Sisteme tampon şi capacitate de tamponare

Aşa cum s-a menţionat mai înainte pH-ul este esenţial în desfăşurarea practic
a tuturor proceselor în organismele vii. Menţinerea lui la o valoare fixă (de exemplu
în plasmă), în condiţiile în care intră şi ies în permanenţă compuşi cu caracter acid
sau bazic nu ar fi posibilă fără existenţa unor modalităţi de anihilare a exceselor de
ioni de H+ sau HO-, respectiv a ceea ce denumim sisteme tampon. Consideraţii
similare se pot face şi pentru fluidele biologice care au limite minime şi maxime ale
valorile normale de pH.
Sistemele tampon care acţionează în organism sunt multiple incluzând de
exemplu şi proteinele şi aminoacizii. Multe dintre aceste sisteme sunt utilizate şi în
laborator. În cele ce urmează nu se includ proteinele şi aminoacizii ca sisteme
tampon (această capacitate a lor este prezentată la proprietăţile generale ale
proteinelor şi aminoacizilor).
Sunt sisteme tampon soluţiile care conţin două componente: una capabilă să
cedeze protoni şi cealaltă capabilă să accepte protoni. Sistemele tampon cele mai
uzuale constau dintr-un amestec al unui acid slab şi o sare a sa (acid acetic-acetat de
sodiu, acid carbonic-carbonat de sodiu dar şi fosfat monosodic-fosfat disodic, etc.)
sau dintr-o bază slabă şi o sare a sa (hidroxid de amoniu-acetat de amoniu, hidroxid
de amoniu-clorură de amoniu). Se observă că, în toate cazurile, cele două
componente au un ion comun.
În principiu, acţiunea de „tamponare” (menţinerea constantă a pH-ului)
exercitată de către un sistem tampon se realizează astfel:
-prin adăugarea unui acid în anumite proporţii, baza corespunzătoare,
respectiv anionii, aflaţi în soluţia tampon, formează cu ionii H+ un acid care este slab
disociat, în acest mod, se neutralizează efectul acidului adăugat, pH-ul soluţiei
rămânând practic neschimbat. Prin adăugarea unei baze în anumite proporţii, ionii
H+ ai acidului care se găsesc în soluţia tampon formează cu ionii HO- molecule de
apă puţin disociate, astfel, se neutralizează efectul bazei adăugate prin formarea de
apă, pH-ul soluţiei rămânând nemodificat.
Exemplul 1
Dacă considerăm soluţia tampon acid acetic-acetat de sodiu, mult utilizată în
laboratoarele de biochimie şi ţinem cont că în soluţia respectivă au loc următoarele
procese de disociere:
 
CH 3  COOH  CH 3  COO  H

 
CH 3  COONa  CH 3  COO  Na

35
 Aplicând legea acţiunii maselor la disocierea acidului acetic, la echilibru se
obţine relaţia:
 
[CH 3  COO ] [H ]
K
[CH 3  COOH]

Din care rezultă valoarea concentraţiei ionilor de hidrogen [H+]:

 [CH 3  COOH]
[H ]  K  
[CH 3  COO ]
Aceasta poate fi interpretată astfel: concentraţia ionilor de
H+ din soluţie este dată de raportul dintre concentraţia moleculelor de acid acetic
nedisociate şi concentraţia anionilor de acetat. Dacă se adaugă soluţiei tampon, un
acid oarecare (de exemplu HCl), ionii H+ puşi în libertate prin disocierea acestui acid
vor reacţiona imediat cu anionii acetat, după reacţia:
 
CH 3  COO  H  CH 3  COOH
Astfel se formează molecule nedisociate de acid acetic care este un acid slab.
In acest fel se justifică restabilirea echilibrului perturbat prin adăugarea de acid tare,
iar concentraţia ionilor de H+ rămâne practic nemodificată. Dacă soluţiei tampon
considerată anterior i se adaugă o cantitate mică dintr-o bază (NaOH), procesele
chimice care se produc sunt analoage. Ionii HO- rezultaţi prin disocierea bazei vor
reacţiona imediat cu rezerve de molecule de acid acetic existente în soluţie. Deci,
prin acest proces scade concentraţia H+ şi se perturbă echilibrul de ionizare al
acidului acetic. Pentru refacerea echilibrului se va disocia o nouă cantitate de acid
acetic pană când va fi satisfăcută constanta lui de ionizare. Efectul final, al adăugării
hidroxidului de sodiu, constă în, scăderea concentraţiei acidului acetic nedisociat şi
o creştere a concentraţiei ionilor acetat (ionii de Na+ adăugaţi se consideră că nu
produc nici un fel de efect, iar apa rezultată din reacţie este în cantitate neglijabilă
faţă de cantitatea totală de apă în soluţie). In acest mod, valoarea pH-ului nu se
modifică. Procesele chimice ce se produc la adăugarea de bază (NaOH) peste soluţia
tampon (acetat), pot fi schematizate prin ecuaţiile reacţiilor chimice următoare:
 
CH 3  COOH  CH 3  COO  H
 
CH 3  COO  Na  CH 3  COONa
Se consideră că hidroliza acetatului de sodiu format este numai parţială şi astfel
concentraţia ionilor HO- rezultaţi din hidroliză conform reacţiilor:
CH 3  COONa  HOH  CH 3  COOH  NaOH
este mai mică decât cea provenită din adăugarea iniţială a hidroxidului de sodiu. De
asemenea se poate aprecia că acidul acetic neionizat funcţionează ca un rezervor
static de ioni de H+, ce pot fi folosiţi în eventualitatea adăugării unei baze; iar sarea

36
(acetatul de sodiu) este un rezervor static de anioni (acetat) ce pot fi folosiţi la
adăugarea unui acid. Deci acţiunea unui astfel de tampon poate fi rezumată astfel:
-la mărirea acidităţii soluţiei anionul sării aflat în amestecul tampon, formează
cu ionii H+, un acid slab disociat.
-la mărirea bazicităţii soluţiei, ionul H+ al acidului aflat în soluţia tampon
formează cu ionul HO- apă, puţin disociată.
Formarea combinaţiilor acestora puţin disociate fac ca aciditatea sau
bazicitatea să rămână aproape neschimbată.
Exemplul 2
Considerăm soluţia tampon formată dintr-o bază slabă şi o sare a sa (NH3 şi
NH4Cl):
La adăugarea de HCl, peste soluţia tampon are loc procesul chimic reprezentat
prin ecuaţia reacţiei următoare:
NH 3  HCl  NH 4 Cl
Se observă că pentru fiecare echivalent de HCl (respectiv H+) adăugat va
apărea un echivalent de NH4Cl care hidrolizează astfel:
NH 4 Cl  HOH  NH 4 OH
Dar aceasta se produce numai parţial şi astfel concentraţia de H+ rezultată prin
hidroliza va fi cu mult mai mică decat cea iniţială şi provenită din HCl. La adăugarea
de bază (NaOH) au loc transformările chimice:
NH 4 Cl  NaOH  NH 3  NaCl  HOH
Deci pentru fiecare echivalent de NaOH, respectiv HO- adăugat, apare un
echivalent de NH3 care fiind o bază slabă va disocia mult mai puţin decât un
echivalent de NaOH.
În concluzie soluţiile tampon de ambele tipuri amintite anterior au un
component care poate consuma (interacţiona cu) cea mai mare parte de ion H+,
respectiv HO-, proveniţi din afară, astfel că la introducerea acestor ioni în cantităţi
apreciabile, pH-ul soluţiei tampon se modifică relativ puţin.

Capacitatea tampon

Fiecare sistem tampon are un pH propriu care depinde de natura

componentelor şi de concentraţiile acestora. În vederea calculării pH-ului soluţiilor
tampon şi a demonstrării cantitative a comportării acestor sisteme, se consideră
cazurile generale de soluţii tampon acid slab-sare a acidului slab (HA-MA) şi bază
slabă-sare a bazei slabe (BOH-BX).
Acidul slab disociază astfel:
 
HA  H A
Aplicând legea echilibrului chimic obţinem:

37
  
[H ][A ]  [HA]
K HA  ; [H ]  K HA 
[HA] [A ]

Totuşi disocierea va fi mult împiedicată de prezenţa sării MA care este

practic total disociată:
 
MA  M A
Aceasta va retrograda disocierea acidului MA prin ionii A-. De aceea, fără o
eroare prea mare vom putea considera că într-un amestec de acid şi sarea sa, practic,
sarea este complet disociată iar HA este în formă nedisociată. Deci [A-] = [MA] si
[HA]nedisociat = [HA]total. Astfel rezultă că:
 [HA] C
[H ]  K HA   K HA acid
[A ] C sare

adică:

pH = -log KHA + log Csare - log Cacid

C sare
pH = pKHA + log Csare - log Cacid = pKHA + log
C acid

Această ultimă relaţie se numeşte ecuaţia Henderson-Hasselbach. Din această

relaţie se observă că pH-ul este cel mai bine menţinut constant de o soluţie tampon
care conţine acidul si sarea sa în cantităţi echivalente si al cărui pH este egal cu pKHA.

Exemplu:
Dacă se prepară o soluţie tampon cu pH = 5 se va folosi un acid cu K HA =
10-5, amestecul echimolecular al acidului si al sării sale de sodiu dă amestecul
tampon dorit. Prin schimbarea raportului lor molar se pot prepara o serie de soluţii
tampon cu orice interval de pH, cuprins între pH-ul acidului pur si pH-ul sării.
Practic, raportul acid/sare poate varia intre 1/10 si 10/1 preparându-se un mare număr
de amestecuri tampon, pentru un domeniu de 2 unităţi de pH între pKHA + 1 si pKHA –
1. Deci soluţiile tampon de acid acetic a cărui constantă de disociere este KHA = 1,86 x
10-5 sau pK = 4,7 sunt de obicei cuprinse în domeniul pH = 3,7 – 5,7.
În cazul bazei slabe BOH şi a sării sale, BX, concentraţia ionilor HO- este
dată de relaţia:
 [BOH]
[HO ]  K BOH 
[B ]
Printr-un calcul şi rationament analog celui amintit anterior, se obţine:

38
 C bază
pH = 14 - pKBOH + log
C sare
De reţinut că, la un amestec tampon care conţine un acid slab şi o sare a sa,
pH-ul nu depinde practic de temperatură, însă pH-ul unei soluţii care conţine un
amestec format dintr-o bază slabă şi sarea sa, variază în mod apreciabil cu temperatura
deoarece mărimea KW (produsul ionic al apei), variază mult cu temperatura.
Nici diluarea nu are influenţă remarcabilă asupra valorii pH-ului, deoarece
volumul total V (este acelaşi) se simplifică în expresia concentraţiei ionilor H+:
C
 moli acid/V moli acid
[H ]  K HA  K HA  K HA acid
moli sare/V moli sare C
sare
În schimb, prin diluare scade capacitatea de tamponare a amestecului sau
indicele de tamponare care se defineşte prin puterea de-a micşora schimbările pH-
ului şi are expresia:
dA dB
j 
dpH dpH
unde j = indicele de tamponare (capacitate de tamponare)
dA = adaosul de acid
dB = adaosul de bază
dpH = variaţia pH-ului la adaosul de acid sau bază
În organismele animale, principalele sisteme tampon ce acţionează sunt
următoarele:
- bicarbonat-acid carbonic (NaHCO3-H2CO3) în plasmă şi respectiv, KHCO3-
H2CO3 în eritrocite
- fosfat bibazic-fosfat monobazic de Na în plasmă şi de K în eritrocite
- hemoglobinat alcalin-oxihemoglobină (KHbO2- HHbO2)
- proteinat alcalin-proteină (proteinat de Na – proteină-H)

Exemple de sisteme tampon:

SISTEMUL TAMPON Limitele de pH
KH2PO4-Na2HPO4 5,2-8
Acid acetic-acetat de sodiu 3,6-5,6
Glicocol-HCl 1,1-3,7
Citrat-HCl 1,1-5
Glicocol-NaOH 8,6-13,1
Citrat-NaOH 5-12,4
Veronal sodic-HCl 6,8-9,6
Tris (hidroximetil) aminometan-HCl 7,2-9

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ
39
Evidenţierea proprietăţilor soluţiilor tampon
1. pH-ul nu depinde de concentraţiile absolute ale componenţilor
tamponului ci numai de raportul lor, de aceea diluarea tamponului nu modifică pH-
ul sistemului tampon.
Reactivi:
1. soluţie acid acetic 1 m
2. soluţie acetat de sodiu 1 m
Mod de lucru:
Într-un cilindru gradat se pregăteşte un tampon acid acetic-acetat de sodiu prin
amestecarea a 10 ml acid acetic 1 m cu 45 ml acetat de sodiu 1 m. Se ia o cantitate
mică din acest tampon şi i se determină pH-ul cu ajutorul hârtiei indicatoare de pH.
O parte din acest tampon este apoi diluat într-un cilindru gradat cu capacitatea de 50
ml, prin amestecarea a 25 ml tampon cu 25 ml apă distilată. Se determină apoi pH-
ul tamponului diluat. Se va constata că diluarea nu a determinat modificarea pH-ului.
2. Capacitatea tampon este funcţie de concentraţiile componenţilor (Csare +
Cacid) si prin diluare tamponul se opune cu o eficienţă redusă la variaţiile de pH.
Reactivi:
1. Soluţie de acid acetic 1 m
2. Soluţie acetat de sodiu1 m
3. Soluţie indicatoare de fenolftaleină 0,1%
4. Soluţie de NaOH 0,1 m
Mod de lucru:
Se prepară un tampon acid acetic-acetat de sodiu prin amestecarea a 10 ml
acid acetic 1 m cu 45 ml acetat de sodiu 1 m. O parte din tampon se diluează într-un
cilindru gradat cu volumul de 50 ml, prin amestecarea a 25 ml tampon cu 25 ml apă
distilată. Pentru măsurarea capacităţii tampon a celor două sisteme, cel iniţial si cel
diluat, se procedează în felul următor:
Se pipetează în două baloane câte 10 ml din fiecare tampon, se adaugă apoi
câte 2-3 picături de soluţie de fenolftaleină. Se va constata că soluţiile rămân
incolore, deci pH<8,2
Se măsoară apoi volumele de soluţie de NaOH 0,1 m necesare pentru a
deplasa pH-ul celor două soluţii tampon până la o valoare puţin mai mare decât 8,2
când fenolftaleina virează spre roşu.
Se va constata că soluţia tampon mai concentrată are o capacitate tampon mai
mare, opunându-se mai mult modificărilor de pH decât tamponul diluat.

40
 II. TEHNICI UTILIZATE ÎN LABORATORUL
DE BIOCHIMIE

1. VOLUMETRIA

Măsurarea volumelor
Măsurarea cu exactitate a volumelor de reactivi şi cântărirea reprezintă
operaţiile cele mai importante în metodologia preparării soluţiilor, pe larg utilizate
în laboratoarele de biochimie. Pentru măsurarea volumelor se utilizează diferite
tipuri de vase din sticlă, sau din materiale plastice inerte, riguros etalonate. Pentru
măsurarea exactă a volumelor este necesar să se lucreze la temperatura la care s-a
făcut etalonarea vaselor respective (de regulă la 20oC).
Baloanele cotate sunt vase de sticlă cu fund plat şi gât alungit pe care se află
un semn circular denumit „cotă”. Acest semn indică capacitatea balonului cotat,
respectiv limita până la care trebuie să se umple balonul. Pe corpul baloanelor se află
înscrisă capacitatea şi temperatura la care s-a făcut calibrarea. Baloanele cotate au
diferite capacităţi: 10, 20, 50, 100, 1000, 2000 cm3 şi sunt prevăzute cu dopuri rodate
pentru închidere. Umplerea baloanelor cotate cu soluţie se face până la „cotă” astfel
încât meniscul lichidului să fie tangent la cota înscrisă pe balon.
Cilindrii gradaţi au capacitatea cuprinsă între 5 şi 2000 cm3. Aceştia se
folosesc numai pentru măsurători aproximative de volum, având o precizie mai mică
decât baloanele cotate. Volumul de lichid se măsoară la diviziunea de pe cilindru
care marchează acest volum, astfel încât meniscul lichidului să fie tangent la
diviziunea respectivă.
Pipetele sunt tuburi de sticlă efilate la partea inferioară şi sunt utilizate
pentru măsurarea exactă a volumelor mici de soluţie. După forma şi modul de
gradare sunt cunoscute pipete cu bulă şi pipete gradate. Pipetele cu bulă prezintă o
dilataţie a tubului de sticlă (bulă) pe care sunt înscrise volumul şi temperatura de
calibrare. Acestea sunt folosite pentru măsurarea unor volume fixe de lichid şi nu
prezintă gradaţii intermediare. Pipetele cu bulă au capacităţi cuprinse între 5 şi 100
cm3. Pipetele gradate au avantajul măsurării unor volume de lichid şi mai mici decât
cel înscris pe pipetă. Ele sunt gradate în cm3 şi fracţiuni de cm3, permiţând asfel
măsurarea unor volume intermediare. Pipetele gradate au, de obicei, capacităţi mici
cuprinse între 1 şi 25 cm3.
Biuretele sunt tuburi de sticlă cu ajutorul cărora se măsoară exact volumele
de soluţii utilizate ca reactivi în analiza volumetrică. Biuretele sunt prevăzute la
partea inferioară efilată cu un dispozitiv de scurgere, respectiv de închidere. Acest
dispozitiv poate fi un tub de cauciuc prevăzut cu o clemă sau cu un robinet din sticlă,
care permite reglarea scurgerii lichidului din biuretă. În funcţie de capacitatea lor,
biuretele pot fi:
- macrobiurete, cu capacităţi de 25, 50 şi 100 cm3 gradate în fracţiuni de cm3;
- microbiurete, cu capacităţi de 1 sau 2 cm3 gradate în sutimi de cm3.
Măsurarea volumului de lichid cu biureta implică următoarele operaţii:
41
 - se fixează biureta în poziţie verticală cu ajutorul unui stativ şi a unor cleme;
- se umple cu lichid pe la partea superioară (deschisă) astfel încât să fie
depăşită diviziunea zero sau o altă gradaţie considerată;
- cu ajutorul clemei sau robinetului de sticlă se evacuează aerul din partea
inferioară a biuretei;
- se lasă lichidul să se scurgă prin picurare până când meniscul inferior al
lichidului devine tangent la diviziunea zero sau la altă diviziune considerată în cazul
lichidelor incolore; iar pentru cele colorate până când meniscul superior devine
tangent la gradaţia respectivă;
- măsurarea volumelor cu ajutorul biuretei se face prin scurgerea lichidului
cu viteză mică, treptat şi în picături, astfel încât erorile datorate aderenţei lichidului
la pereţii biuretei să fie minime.

Erori posibile la măsurarea volumelor

Eroarea de picurare
Apare în determinările volumetrice prin adăugarea unei picături de reactiv
în exces la sfârşitul titrării.
Eroarea de scurgere
La scurgerea unei soluţii printr-un tub, în funcţie de tensiunea superficială,
densitate, vâscozitate şi viteza de scurgere a lichidului, o anumită cantitate de soluţie
aderă pe suprafaţa interioară a tubului. Aceasta „eroare de scurgere” apare în cazul
măsurării volumelor cu pipete sau cu biurete.
Eroarea de citire
Modul de citire a tandemului menisc-gradaţie are o mare importanţă. În acest
sens pot interveni două erori de citire care trebuie evitate pentru a nu afecta precizia
rezultatelor. Prima este eroarea de paralaxă, care se produce în cazul în care la citirea
gradaţiei, ochiul observatorului este situat deasupra sau sub orizontala tangentă la
menisc. Pentru evitarea erorii de paralaxă, ochiul trebuie să se afle pe orizontala
tangentă la menisc sau dacă biureta are gradaţii circulare, partea din faţă a gradaţiei
trebuie să se suprapună peste partea din spate a acesteia. A doua eroare de citire se
poate produce din cauza fenomenului de refracţie a luminii la suprafaţa lichidului.
Eroarea de temperatură
Apare atunci când măsurarea de volum se face la o temperatură diferită celei
la care s-a făcut etalonarea (de obicei 20oC).

Pipeta automată
Pipeta automată este un instrument de mare precizie, folosit în prezent la
măsurarea în laborator a volumelor (figura II.1.1).

42
 Figura II.1.1. Pipeta automată

Corpul pipetei prezintă la un capăt un piston şi la celălalt un dispozitiv de care

se pot ataşa „vârfuri” de unică folosinţă. Pipeta automată se foloseşte utilizănd o
singură mână, astfel încât degetul mare să poată acţiona pistonul, iar vârful pipetei să
poată fi introdus în soluţia de interes. Pentru aspirare se apasă pistonul pipetei până la
primul obstacol, se introduce vârful în lichid şi se eliberează pistonul. Pentru eliberarea
lichidului se apasă complet pe piston, depăşind primul obstacol. Îndepărtarea vârfurilor
se poate face automat, evitându-se astfel atingerea directă a acestora. Capacitatea
pipetelor poate varia de la fracţiuni de l până la 10 ml. Există pipete automate cu
capacitate fixă (de ex. 50 l), dar marea majoritate au capacitate reglabilă într-un
anumit domeniu, volumul aspirat putând fi fixat de utilizator, iar valoarea respectivă
fiind afişată pe corpul pipetei.
Faţă de pipetele clasice prezintă avantaje deosebite, care o fac indispensabilă
într-un laborator modern:
a) aspirarea lichidului şi stabilirea volumului se face eliminând erorile ce pot
apare în cazul pipetelor obişnuite: de temperatură, de scurgere, de paralaxă.
b) folosirea vârfurilor de unică folosinţă elimină posibilitatea de
impurificare a reactivilor şi probelor şi face posibilă manipularea mult mai uşoară a
substanţelor nocive sau a probelor biologic active (suspensii virale, bacteriene). În
acelaşi timp, în laboratoarele ce utilizează culturi celulare este de neînlocuit,
deoarece vârfurile sunt sterile - element esenţial într-un astfel de laborator.
c) simplifică considerabil pipetarea volumelor mici de probă
d) scade timpul necesar experimentului. În anumite cazuri se pot folosi pipete
automate cu până la zece vârfuri care practic pot "automatiza" determinările într-un
laborator.

Analiza volumetrică
Volumetria sau titrimetria este o metodă chimică de analiză cantitativă care,
datorită simplităţii, rapidităţii şi preciziei este larg folosită în diferite laboratoare.
Una din operaţiile principale în analiza volumetrică este titrarea. Prin titrare
se înţelege adăugarea treptată a soluţiei de reactiv de concentraţie cunoscută (soluţie
titrată) peste soluţia de analizat, până la punctul de echivalenţă. Punctul de
echivalenţă se evidenţiază cu ajutorul indicatorilor chimici de titrare, substanţe care,
la punctul de echivalenţă îşi modifică vizibil una din proprietăţile caracteristice (de
exemplu culoarea). Punctul de echivalenţă corespunde situaţiei în care reacţia
43
chimică dintre component de dozat - reactiv din soluţia titrată, este completă.
Volumul soluţiei de concentraţie cunoscută se măsoară cu ajutorul biuretei. Înainte
de a se efectua titrarea se notează diviziunea V1 corespunzătoare până la nivelul
căreia se află soluţia titrată în biuretă. După titrare se notează corespunzător
diviziunea V2 până la care ajunge nivelul soluţiei în biuretă. Diferenţa (V 2 - V1)
reprezintă volumul în cm3 al reactivului folosit la titrare.
Reacţiile apte de a fi utilizate pentru dozări volumetrice trebuie să fie rapide,
complete şi sfârşitul lor să poată fi uşor şi precis de determinat. După tipul de reacţie
care stă la baza titrării se deosebesc analize volumetrice bazate pe următoarele tipuri
de reacţii de:
A. neutralizare;
B. precipitare (de exemplu argentometria);
C. oxidoreducere (de exemplu manganometrie, iodometrie, etc.);
D. formare a combinaţiilor puţin disociate (de exemplu mercurimetria);
E. de formare a complecşilor (complexometria).

A. Analiza volumetrică bazată pe reacţii de neutralizare

Acizii pot fi determinaţi prin titrarea soluţiilor respective cu o soluţie de bază

de o concentraţie cunoscută. Între acidul (AH) şi baza (HO-) are loc reacţia de
neutralizare:
AH + HO-  A- + H2O

Bazele (B), la rândul lor, pot fi dozate prin titrare cu o soluţie de acid (H3O+).
În acest caz reacţia de neutralizare este:

B + H3O+  BH+ + H2O

Din volumul de soluţie titrată de acid, respectiv de bază, folosit pentru

neutralizare se calculează cantităţile de substanţă din probele analizate. Sfârşitul
titrărilor, corespunzând momentului când cantităţile de acid şi de bază care au
interacţionat sunt echivalente, poate fi recunoscut prin urmărirea variaţiei pH-ului
soluţiei în cursul titrării.
Curbele de titrare ale acizilor cu baze şi ale bazelor cu acizi
În cursul neutralizării unui acid cu o bază sau a unei baze cu un acid, pH-ul
soluţiei se modifică foarte mult şi într-un ritm diferit de la un moment la altul al titrării.
Reprezentările grafice ale variaţiei pH-ului soluţiei în funcţie de cantitatea de reactiv
adăugat (acid sau bază) se numesc curbe de titrare. Aceste curbe au forme
caracteristice pentru diversele forme de reacţii de neutralizare.

Procesele reprezentate cu ajutorul curbelor de titrare se împart în:

a) neutralizarea acizilor monobazici şi a bazelor monoacide
b) neutralizarea acizilor polibazici şi a bazelor poliacide
44
 a) Neutralizarea acizilor monobazici şi a bazelor monoacide
Se disting următoarele situaţii: neutralizarea acizilor tari cu baze tari sau
invers, neutralizarea acizilor slabi cu baze tari sau invers, neutralizarea bazelor tari
cu acizi tari sau invers, neutralizarea acizilor slabi cu baze slabe sau invers. Fiecăruia
din aceste opt situaţii îi sunt caracteristice următoarele patru etape în procesul titrării:
- etapa iniţială;
- etapa până la echivalenţă;
- la echivalenţă;
- etapa după echivalenţă.
Curbele de titrare în aceste situaţii au forme caracteristice, corespunzătoare
diferitelor tipuri de reacţii de neutralizare ce le reprezintă.
Pentru înţelegerea proceselor chimice ce au loc în timpul titrării se consideră
că se neutralizează 100 ml soluţie de acid clorhidric 0,1 N cu o soluţie de hidroxid
de sodiu 0,1N. Deoarece acidul clorhidric este un acid tare, în soluţie este complet
ionizat, astfel încât concentraţia ionilor H3O+ este egală cu concentraţia totală a sa.
În tabelul II.1.1 sunt prezentate unele din etapele titrării.

Tabelul II.1.1 . Neutralizarea a 100 ml HCl 0,1N

cu o soluţie de NaOH 0,1N
NaOH 0,1 N HCl [H3O+] pH
adăugat (ml) (ml) (echivalenţi/l)
0 100 10-1 1
50 50 5 x 10-2 1,3
90 10 10-2 2
-3
99 1 10 3
99,9 0,1 10-4 4
100 0 10-7 7
-10
100,1 0,1 10 10

Înainte ca tot acidul să fie neutralizat, pH-ul este mai mic decât 7, în
momentul când s-au adăugat 100 ml NaOH 0,1N acidul este neutralizat în totalitate
şi pH-ul soluţiei este 7. Dacă se mai adaugă soluţie de NaOH soluţia devine alcalină,
are pH-ul mai mare decât 7. Prin înscrierea acestor date într-un sistem de axe de
coordonate, trecându-se pe abscisă volumul de bază adăugat iar pe ordonată pH-ul
soluţiei se obţine curba de titrare a HCl 0,1 N cu NaOH 0,1 N (figura II.1.2).

45
 Figura II.1.2. Curba de titrare a HCl 0,1N cu NaOH 0,1N
Din examinarea acestei curbe şi a tabelului, reiese că la începutul titrării pH-
ul creşte foarte încet la adăugarea bazei. Astfel, pH-ul soluţiei creşte de la 1 la 2 când
s-au adăugat 90 ml NaOH; creşte la 3 când s-au adăugat 99 ml NaOH şi la valoarea
4 când s-au adăugat încă 0,9 ml NaOH. În sfârşit ultima porţiune de bază de 0,1 ml
care neutralizează complet acidul, determină o creştere bruscă a pH-ului de la 4 la 7.
Dacă se adăuga NaOH în exces, pentru 0,1 ml soluţie pH-ul creşte de la 7 la 10.
De subliniat faptul că pH-ul soluţiei în timpul titrării nu variază uniform cu
volumul de bază adăugat. La începutul titrării au loc variaţii mici de pH pentru
volume mari de bază, pe când în apropierea punctului de echivalenţă au loc variaţii
foarte mari de pH pentru volume foarte mici de bază adăugate. Pentru 0,2 ml NaOH
pH-ul variază de la 4 la 10. Această modificare bruscă a pH-ului în jurul punctului
de echivalenţă se numeşte „salt de pH”. Forma acestei curbe este caracteristică titrării
acizilor tari cu baze tari sau invers. Deoarece în cazul examinat mai înainte, în jurul
punctului de echivalenţă pH-ul face un salt de la 4 la 10 se pot utiliza ca indicatori
de neutralizare oricare din următorii indicatori: roşu de metil, fenolftaleină,
metiloranj sau orice alt indicator cu zonă de viraj cuprinsă în acest interval.
b) Neutralizarea acizilor polibazici şi a bazelor poliacide
Calcularea concentraţiei ionilor H3O+ la neutralizarea acizilor polibazici
HnA şi a bazelor poliacide B(OH)n este un proces mai complex. În figura II.1.3 se
redă grafic curba de neutralizare a unui acid bibazic (1) şi a unei baze biacide (2).

46
 Figura II.1.3. Curba de neutralizare a unui acid bibazic (1)
Fig. II.1.3 (1) Curba de neutralizare a unui acid bibazic
(2) Curba de neutralizare a unei baze biacide

Pentru un acid polibazic (ex. H3PO4) curba de titrare are aspectul din figura
II.1.4, în care se pot observa cele 3 salturi de pH la punctele de echivalenţă.

Figura II.1.4. Curba de titrare a acidului fosforic

Fig.II.1.4. Curba de titrare pentru acid fosforic

Punctul de echivalenţă la neutralizarea acizilor sau bazelor se poate stabili

în două moduri:
-vizual, cu ajutorul indicatorilor de neutralizare;
-instrumental, folosind anumite proprietăţi ale soluţiei ca potenţial,
conductibilitate, indice de refracţie, etc. măsurate cu ajutorul aparatelor
corespunzătoare.
După parametrul măsurat şi aparatul folosit metoda de analiză poate fi
potenţiometrică, conductometrică, refractometrică.
ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Experienţa nr. 1. Dozarea acidului clorhidric (acid tare)

47
 Un volum bine determinat din soluţia de acid clorhidric de analizat se
titrează cu o soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 N utilizându-se ca indicator de
neutralizare metiloranj.

Mod de lucru:
Într-un balon de titrare se introduc 10 ml soluţie de analizat şi 2-3 picături
din soluţia de metiloranj. Se adaugă din biuretă în porţiuni mici soluţia de NaOH 0,1
N până la virajul indicatorului de la roşu la portocaliu. Se notează volumul de soluţie
de bază utilizat la titrare (v).
Prin calcul se pot stabili:
a) cantitatea de HCl în proba analizată;
Notând cu v1 volumul de soluţie de acid clorhidric luat ca probă şi daca acesta
a fost neutralizat cu un volum v2 de soluţie de bază, cantităţile de acid şi de bază
cuprinse în aceste volume sunt echivalente.
1 ml NaOH 0,1 N ………1 ml HCl 0,1 N……………36,5x 0,1/1000 g HCl
v2 ml NaOH 0,1 N …… v2 ml HCl 0,1 N……… v2 x 36,5 x 0,1/1000 g HCl
b) concentraţia normală (normalitatea) a soluţiei de HCl.
Relaţia ce există între volumele şi normalităţile a două soluţii ce reacţionează
complet este: v1/v2 = N2/N1. În cazul experimentului de mai sus se cunosc v1, v2 şi
N2 şi se calculează N1:
N1 = v2 x 0,1/ 10

Experienţa nr.2. Dozarea amoniacului în soluţie apoasă (bază slabă)

Deoarece amoniacul este o bază slabă echilibrul reacţiei sale de ionizare:
NH3 + HOH NH4+ + HO-
este deplasat spre stânga, astfel că în soluţie apoasă doar o mică cantitate de amoniac
este ionizată, cea mai mare parte fiind dizolvată fizic în apă. La titrarea unei soluţii
apoase de amoniac cu un acid tare neutralizarea de către acid a ionilor HO- din mediu
deplasează la dreapta echilibrul reacţiei de mai sus, antrenând ionizarea progresivă
a întregii cantităţi de amoniac dizolvat.
Deoarece amoniacul este o bază volatilă pentru a împiedica pierderile de
amoniac în timpul titrării se practică o titrare indirectă. Un anumit volum din soluţia
de amoniac de dozat se adaugă peste un volum în exces, măsurat, dintr-o soluţie
titrată de acid tare (clorhidric sau sulfuric); acidul fiind în exces toată cantitatea de
amoniac din soluţie este transformată prin neutralizare în sarea respectivă de amoniu
(clorură sau sulfat). Cantitatea de acid tare rămasă în mediu se titrează direct cu o
bază tare (NaOH) de concentraţie cunoscută. Diferenţa între cantitatea de acid
adăugată iniţial şi cea aflată prin titrare reprezintă cantitatea de acid tare de
normalitate cunoscută necesară neutralizării amoniacului din proba analizată.
Indicatorul folosit în această titrare indirectă este roşul de metil, care are
zona de viraj între 4,4 şi 6,2, deoarece la punctul de echivalenţă soluţia cuprinde pe
lângă sare nehidrolizată - provenită din neutralizarea acidului tare cu baza tare- şi o
sare de amoniu hidrolizabilă, cu o reacţie acidă.
48
 Mod de lucru:
Într-un balon de titrare se introduc 10 ml soluţie de acid sulfuric 0,05 N; 5
ml soluţie de amoniac de dozat şi 1-2 picături de soluţie de roşu de metil. Dacă într-
adevar acidul sulfuric este în exces soluţia trebuie să se coloreze în roşu (pH < 4,4).
Se titrează apoi excesul de acid sulfuric cu o soluţie de NaOH 0,05 N până la virajul
indicatorului de la roşu la portocaliu. Se notează volumul de NaOH folosit la titrare
(v). Soluţiile de acid sulfuric şi hidroxid de sodiu având aceeaşi normalitate, v ml de
NaOH 0,05 N au neutralizat vml de H2SO4 0,05 N şi deci amoniacul din proba de
analizat a fost neutralizat de (10 - v) ml H2SO4 0,05 N.
Se calculează cantitatea de amoniac din proba analizată, şi normalitatea solu-
ţiei de amoniac.

Experienţa nr. 3. Dozarea acidului clorhidric în sucul gastric.

Este descrisă la analiza biochimică a sucului gastric.

B. Analiza volumetrică bazată pe reacţii de precipitare

Pentru înţelegerea condiţiilor de echilibru care există în soluţiile ce conduc

la formarea de precipitate, cât şi pentru explicarea factorilor care favorizează
dizolvarea precipitatelor se definesc drept „sisteme heterogene” acelea care sunt
constituite dintr-o fază solidă şi o fază lichidă, adică dintr-o soluţie şi un precipitat.
Sărurile greu solubile (de ex. AgCl) se comportă în soluţie ca orice electrolit,
adică prin dizolvarea în apă, disociază în ionii corespunzători. Concentraţiile
soluţiilor saturate sunt o măsură a solubilităţii substanţelor.
Solubilitatea reprezintă cantitatea maximă de substanţă ce poate fi dizolvată
într-o anumită cantitate de solvent la o temperatură dată.
Echilibrul fazei solide cu soluţia se atinge numai la starea de saturare. Acest
proces dinamic dintre faza solidă a unei sări de tip MA şi ionii din soluţie saturată se
exprimă astfel:
 
MA  M A
(fază solidă) (soluţie saturată)
Reversibilitatea acestei reacţii se poate verifica experimental, deoarece la
echilibru cantitatea de substanţă solidă care se dizolvă este egală cu cantitatea de
substanţă solidă care se formează prin interacţia ionilor M+ şi A-, sau cu alte cuvinte
viteza de dizolvare este egală cu viteza de precipitare.
Aplicând reacţiei precedente legea echilibrului chimic se obţine următoarea
expresie:
 
[M ][A ]
K
[MA]
Concentraţia fazei solide [MA] se menţine practic constantă în timp astfel
că ea se poate îngloba în constanta de echilibru, obţinându-se relaţia:
[M+] [A-] = k [MA] = Ps ,
unde Ps reprezintă produsul de solubilitate al substanţei respective.
49
 Constanta Ps se defineşte deci ca produsul concentraţiilor tuturor ionilor unei
sări dintr-o soluţie saturată, la o temperatură dată. Când substanţa care se disociază
este formată din ioni cu valenţe diferite, expresia produsului de solubilitate se complică
deoarece prin dizolvarea unei molecule de tip MnAm se formează n cationi Mm+ şi m
anioni An-, echilibrul fiind reprezentat prin:
MnAm  n [Mm+] + m [An-]
Iar expresia produsului de solubilitate este:
Ps = [Mm+]n x [An-]m
Orice precipitare începe din momentul când concentraţiile ionilor unui
electrolit din soluţie devin mai mari decât produsul de solubilitate respectiv.
Precipitarea încetează în momentul când relaţia corespunzătoare produsului de
solubilitate este din nou satisfăcută. Nici o precipitare nu este absolut completă şi
deci produsul de solubilitate Ps are o valoare bine definită pentru orice electolit greu
solubil; cu alte cuvinte, o parte mai mare sau mai mică de ioni vor rămâne în soluţie
alături de precipitat. Deseori concentraţiile ionilor rămaşi în soluţie sunt atât de mici
încât nu-şi manifestă anumite însuşiri: în astfel de cazuri precipitarea se consideră
practic completă. În mod curent un anumit ion se consideră complet precipitat dintr-
o soluţie, dacă concentraţia lui este mai mică decât 10-5 ioni g / litru.
În general, dacă se cunoaşte solubilitatea „S” a unui electrolit se poate
calcula produsul de solubilitate Ps al acestuia şi invers. Pentru exemplificare se iau
în discuţie câteva tipuri de electroliţi greu solubili, frecvent întâlniţi în analiza
chimică şi biochimică. Electroliţii de tipul:
 
MA  M A
x x
(MA  M A )
(faza solidă) (faza saturată)

Din această categorie de electroliţi greu solubili, fac parte:

-AgX (unde X = Cl-, Br-, I-, CN-, SCN-)
-MCO3 (unde M2+ = Ca2+, Sr2+, Ba2+)
-MC2O4 (unde M2+ = Ca2+, Sr2+, Ba2+)
-MSO4 (unde M2+ = Ca2+, Sr2+, Ba2+, Pb2+)
-MCrO4 (unde M2+ = Ca2+, Sr2+, Ba2+, Hg2+)
-MS (unde M2+ = Co2+, Ni2+, Hg2+, Cu2+)
-MPO4 (unde M3+ = Fe3+, Cr3+, Al3+)
Produsul de solubilitate se calculează cu expresia cunoscută; iar concen-
traţiile celor doi ioni din soluţie care sunt egale între ele şi egale cu concentraţia
electrolitului din soluţie reprezintă chiar solubilitatea substanţei dizolvate „S”
(solubilitate molară):
S = [M+] = [A-]
Ţinând cont de expresia de mai sus se poate deduce că:
Ps = [M+]2 = [A-]2 = S2 iar

S = [M+] = [A-] = Ps
50
 Pentru înţelegerea deplină a corelaţiei dintre solubilitate (S) şi produsul de
solubilitate (Ps), funcţie de natura electrolitului greu solubil, în tabelul 1 se prezintă
câteva exemple de compuşi greu solubili pe care-i formează argintul şi plumbul, de
tip MA:

AgCl AgBr AgI PbSO4 PbCrO4 PbS

S (moli/l) ~10-5 ~10-7 ~10-9 ~10-4 ~10-7 ~10-15
Ps ~10-10 ~10-14 ~10-18 ~10-8 ~10-14 ~10-30

Din compararea acestor date, rezultă în mod evident că PbSO4 şi AgCl sunt
compuşi mai solubili decât PbCrO4 sau AgBr, iar compuşii cei mai greu solubili sunt
AgI şi PbS.
Factorii care influenţează o precipitare completă sunt: ionul comun, pH, sol-
ventul, temperatura, timpul de precipitare, lumina, presiunea, etc.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Analiza volumetrică bazată pe reacţii de oxidoreducere

Calculul echivalentului gram (Eg) în reacţiile de oxidoreducere

În reacţiile de oxidoreducere, în care au loc schimburi de electroni, Eg se
defineşte în raport cu reacţiile de oxidoreducere la care participă hidrogenul:

oxidant
1. oxidare: H2 - 2e- 2H+
reducator
2. reducere: 2H+ + 2e- H2

Eg al unui oxidant este cantitatea de substanţă care transformă un atom gram

de hidrogen într-un ion gram de hidrogen prin acceptarea unui electron gram.
Analog, Eg al unui reducător este cantitatea de substanţă care transformă un
ion gram de hidrogen într-un atom gram de hidrogen prin cedarea unui electron
gram.
Deci:
Mox (red)
Eg ox(red) =
număr de electroni acceptaţi (cedaţi)

Iodometria

Iodometria cuprinde totalitatea metodelor de analiză volumetrică bazate pe

reacţii de oxidoreducere la care participă iodul. Iodul poate funcţiona ca oxidant: (I2
51
+ 2 e- 2 I -) sau ca reducător (2I- - 2 e-  I2). Deci prin metoda iodometrica se pot
doza oxidanţi şi reducători.

Experienţa nr. 1. Dozarea unei soluţii de iod

Soluţia de iod de analizat este titrată cu o soluţie de tiosulfat de sodiu, în
prezenţa amidonului ca indicator:
I2 + 2 Na2S2O3 2 NaI + Na2S4O6
tetrationat de sodiu
2 Io + 2 e- 2 I-
2 S2O3 + 2 e- S4O62-
Mod de lucru:
Într-un balon de titrare se introduc 10 ml de soluţie de iod şi se spală pereţii
vasului cu un jet de apă distilată. Se titrează cu o soluţie de tiosulfat de sodiu 0,05 N
până la galben deschis. Se adaugă amidon. Soluţia se colorează albastru. Se continuă
titrarea cu tiosulfat până la dispariţia coloraţiei albastre. Se notează volumul total de
soluţie de tiosulfat de sodiu folosit la titrare.
Calcul:
După metodele cunoscute se calculează N, C% şi T soluţiei de iod.
M
EgI2   127g
2
Experienţa nr. 2. Dozarea unei soluţii de glucoză
În mediu alcalin glucoza este oxidată la gluconat de sodiu de către iodul
molecular, după următoarele reacţii:
I2 + 2 NaOH  NaI + NaIO + H2O
hipoiodit de Na
R-CHO + NaIO  R-COOH + NaI
R-COOH +NaOH  R-COONa + H2O
Reacţia globală este:
R-CHO + I2 + 3 NaOH  R-COONa + 2 NaI + 2 H2O

După acidulare cu acid sulfuric, se titrează excesul de iod cu Na2S2O3

(tiosulfat de sodiu) având loc următoarele reacţii:

NaI + NaIO + H2SO4  Na2SO4 + I2 + H2O

I2 + 2 Na2S2O3  2 NaI + Na2S4O6
tiosulfat de sodiu tetrationat de sodiu

Mod de lucru:
Într-un balon de titrare se introduc 10 ml soluţie de glucoză de dozat. Se
adaugă apoi 10 ml soluţie I2 0,05 N şi 5 ml soluţie NaOH 1 N. Se lasă 5 minute după

52
care se adaugă 5 ml soluţie H2SO4 1 N. Se asteaptă din nou 5 minute. Se titrează
excesul de iod cu o soluţie de tiosulfat de sodiu 0,05 N în prezenţa amidonului ca
indicator.
Se notează volumul de soluţie de tiosulfat de sodiu folosit la titrare şi se
calculează cantitatea de glucoză cuprinsă în proba de analizat şi concentraţia
empirică (%0) a soluţiei de glucoză.

53
 2. CROMATOGRAFIA

Cromatografia este o metodă identificare, purificare si dozare a compuşilor,

bazata pe separarea intre doua faze, una stationara (care poate fi solida sau lichida)
si una mobila (care poate fi un gaz sau un lichid).
Ea a fost inventata in 1906 de catre cercetatorul rus Mikhail Tsvet in timpul
cercetarii sale asupra clorofilei din plante. Abia dupa aproximativ 25 ani
cromatografia a fost recunoscuta ca tehnica si de ceilalti cercetatori si a inceput sa se
dezvolte.
Tehnicile cromatografice operează pe baza diferenţelor între masa moleculară,
încărcarea electrică, conformaţia, solubilitatea compuşilor sau proprietăţile lor de
afinitate, utilizând ca suport de separare un mediu potrivit, cu proprietăţi
caracteristice.
Datorită marii sale puteri de rezoluţie cromatografia se utilizează la obţinerea
substanţelor foarte pure justificând certificatul de calitate de "substanţă
cromatografic pură”. Un alt mare avantaj al cromatografiei este sensibilitatea sa
deosebită, prin analiza cromatografică putându-se detecta cantităţi infime de
substanţe până la ordinul nanogramelor.
Tehnicile cromatografice diferă în funcţie de scopul urmărit. Când se doreşte
izolarea şi purificarea unor compuşi se preferă separarea cromatografică pe coloană,
în timp ce separările în scop analitic se realizează pe strat subţire, în una sau două
dimensiuni.

Clasificarea metodelor cromatografice

Tehnicile cromatografice se pot clasifica în funcţie de tipul fazei mobile

folosite.

1. faza mobilă este un gaz - vom avea gaz cromatografie

2. faza mobilă este un lichid - vom avea lichid cromatografie.
3. faza mobilă este un lichid care este adus aproape de temperatura
critica (si din acest motiv nu se poate spune clar daca faza mobila
este gaz sau lichid) – vom avea cromatografia fluidelor supercritice
(SFC).

Gaz cromatografia (GC)

Se aplică compuşilor organici volatili sau care prin derivatizare se pot

transforma în compuşi volatili. Dacă faza staţionară (depusă pe o coloană capilară)
este un lichid vom avea gaz-lichid cromatografie sau, dacă faza staţionară este un
solid vom avea gaz-solid cromatografie.
Este foarte mult folosit în laboratoarele de criminalistică pentru analiza
urmelor de sânge, urmelor de droguri din sânge, rezidurilor provenite de la explozivi,

54
etc dar şi a compuşilor volatili din plante, a monozaharidelor, principiilor active din
medicamente, etc.

Lichid cromatografia (LC)

1. Cromatografia pe coloană

Este una din tehnicile de separare cele mai utilizate în biochimie. Această
metodă permite, de exemplu, separarea proteinelor în funcţie de mărimea
macromoleculelor. Obţinerea proteinelor în stare pură este necesară pentru
elucidarea structurii lor tridimensionale a proprietăţilor şi a mecanismului lor de
acţiune. Proba supusă separării este trecută printr-o coloana cromatografică ce
conţine un gel (în cazul cromatografiei de excludere), un material anorganic
absorbant (în cazul cromatografiei de adsorbţie) sau o răşină schimbătoare de ioni
(în cazul cromatografiei de schimb ionic).
Principiul separării pentru fiecare dintre variante este descris, pe scurt, în cele
ce urmează.

Cromatografia de excludere moleculară (gel-filtrarea) se bazează pe

diferenţele între dimensiunile moleculelor din amestec. Gelul cu care este umplută
coloana se comportă ca o "sită moleculară" care permite o deplasare diferenţiată a
moleculelor prin gel, în funcţie de mărimea lor. În lichidul care părăseşte coloana (în
eluat) apar întâi moleculele cu dimensiuni mari şi doar mai târziu cele cu dimensiuni
mici.

Figura II. 2.1. Separarea moleculelor prin cromatografie de excludere

moleculară

55
Figura II.2.2. Separarea moleculelor prin cromatografie cu schimbatori de ioni

Moleculele mici pot difuza în lichidul din interiorul particulelor de gel şi astfel
eluţia lor de pe coloană este încetinită, moleculele mari nu pot pătrunde în particulele
gelului şi deci se vor deplasa odată cu lichidul de eluţie printre particulele gelului
(figura II.2.1).

Cromatografia pe schimbători de ioni se bazează pe stabilirea unor legături

ionice între sarcinile electrice ale moleculelor ionizate din amestecul de separat şi
sarcinile electrice de semn contrar ale răşinii schimbătoare de ioni cu care este
umplută coloana. Sub acţiunea unui eluant ce conţine un ion cu afinitate mai mare
pentru grupele încărcate ale coloanei, legăturile ionice dintre răşină şi componenţii
amestecului de analizat se desfac. Cu cât numărul de legături ionice dintre un compus
şi răşina schimbătoare de ioni este mai mare cu atât şi numărul de ioni competitivi
din lichidul cu care se face eluţia trebuie să fie mai mare.
Separarea diferenţiată de pe coloană a componentelor amestecului se poate
realiza nu numai prin modificarea progresivă a concentraţiei ionice a lichidului de
eluţie dar şi prin modificările de pH ale acestui lichid. Modificările de pH vor reduce
numărul de sarcini electrice ale componenţilor probei şi, în final, vor anula legăturile
ionice cu coloana. Componentele eliberate vor fi antrenate de pe coloană cu lichidul
de eluţie şi vor fi colectate pe rând în eluat.
Este o tehnica utilizata adesea pentru purificarea proteinelor si analiza apei.
Cromatografia de înaltă performanţă în fază lichidă (HPLC) este un procedeu
modern de separare care prezintă o mare putere de rezoluţie şi reproductibilitate. În
acest tip de cromatografie o soluţie care conţine un amestec de compuşi ce urmează
a fi identificaţi sau purificaţi este trecut printr-o coloană umplută cu granule de
diametru mic ale unei răşini insolubile. Cu cât granulele sunt mai mici şi mai strâns
împachetate cu atât rezoluţia acestei tehnici este mai mare. Materialul ce umple
coloana cromatografică este atât de dens, încât pentru a depăşi rezistenţa la curgere,
soluţia trebuie pompată prin coloana cromatografică sub presiune mare. În acest scop
sunt utilizate pompe precise de presiune mare, conducte şi coloane din metal, spre
deosebire de celelalte tehnici în care materialele folosite pentru coloane şi conducte

56
sunt plasticul şi sticla.
Principiile separărilor cromatografice în HPLC sunt aceleaşi ca şi în
tehnicile clasice, insa , daca faza mobila are aceeasi compozitie pe tot parcursul
determinarii se spune ca separarea se face in regim izocrat, iar daca faza mobila are
o compozitie ce se schimba pe parcursul analizei se spune ca separarea se face in
gradient. Daca faza stationara este mai polara decat faza mobila atunci vom avea
cromatografie cu faza normala, iar daca faza mobila este mai polara decat faza
stationara vom avea cromatografie cu faza inversa.
Avantajele acestei tehnici:
- coloana pentru HPLC poate fi refolosita fara a fi reumputa si regenerata ca
in cromatografia cu coloane deschise
- o foarte buna rezolutie si reproductibilitate
- parametrii ce pot afecta eficienta analizei pot fi controlati continuu
- viteza in analiza
- utilizarea unor cantitati foarte mici de proba
Cromatografia de afinitate folosită la purificarea compuşilor biochimici. De
exemplu proteinele au o mare afinitate pentru substratele lor, grupări prostetice,
receptori membranari, inhibitori specifici necovalenţi şi anticorpi specifici. Aceşti
compuşi cu mare afinitate pot fi ataşaţi covalent de o răşină insolubilă şi utilizaţi
pentru a purifica o anumită proteină în coloana cromatografică. Într-un amestec de
componenţi eluaţi prin răşina, proteina de interes va fi întârziată selectiv şi astfel
separată.

2. Cromatografia pe strat subţire

Separarea pe strat subţire este comparabilă în multe privinţe cu cea pe hârtie,

dar permite folosirea unei game variate de solvenţi. Astfel, analiza va putea fi
realizată prin folosirea unei faze stationare, dispuse pe o placa speciala, pe care au
loc separari prin procese de adsorbţie, schimb de ioni, partiţie sau cernere
moleculară. Tehnica este foarte rapidă şi în mai puţin de o oră se pot realiza
numeroase separări. Compuşii sunt detectabili la o concentraţie mai mică decât pe
hârtie, căci spoturile sunt mai concentrate.
Stratul subţire. Se folosesc plăci pentru cromatografie pe strat subţire cu
utilizare directă care se dovedesc a fi mai uşor de folosit decât cele realizate în
laborator. Plăcile, cu suporturile dorite, sunt furnizate de firme specializate.

57
 Aplicarea probelor. Soluţia care conţine proba se introduce pe placă cu
ajutorul unui tub capilar. Pentru control pe marginile plăcii se pune o probă martor
cu compoziţie cunoscută având valori Rf într-un domeniu convenabil. Raportul
dintre distanţa parcursă de fiecare component al amestecului şi distanţa parcursă de
solvent este valoarea Rf a acelui component. Acest raport rămâne mai mult sau mai
puţin constant pentru un compus dat într-un anumit sistem solvent-suport, la o
temperatură şi un pH dat. Valoarea Rf este dependentă de coeficientul de partiţie 
al fiecărui compus. Coeficientul de partiţie este definit ca raportul dintre concentraţia
acelui compus în faza staţionară şi concentraţia aceluiaşi compus în faza mobilă, la
echilibru.

Figura II.2.3. Cromatografie pe strat subtire;

Tanc cromatografic

Figura II.2.4. Cromatografie pe strat subtire

58
 Developarea. Este necesar ca atmosfera din cuva de separare să fie perfect
saturată, dacă nu valorile lui Rf pot varia de la o cuvă la alta. Pentru aceasta este
preferabil să se utilizeze o cuvă mică şi să se aplice pe pereţii săi hârtie îmbibată cu
solvent.
Vizualizare şi evaluare. Placa developată se usucă în aer. Unele combinaţii
incolore se pot vizualiza prin fluorescenţă în UV. În altă variantă compuşii pot fi
evidenţiaţi şi prin diverşi reactivi corozivi şi la temperaturi ridicate ceea ce, în mod
obişnuit, nu este posibil în cromatografia pe hârtie.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Experiementul nr. 1. Separarea unui amestec de aminoacizi prin

cromatografie pe strat subtire
Materiale necesare:
1. Aparat pentru cromatografie – vas paralelipipedic, de sticlă, de dimensiuni
25/14/7 cm (h/L/l)
2. Placă de sticlă (capac) (15/10 cm) (L/l)
3. Placă cromatografică
4. Faza mobila alcatuita din butanol:izopropanol:acid acetic glacial
5. Soluţii etalon de aminoacizi individuali (0,01 M, în soluţii apoase sau
alcoolice)
6. Amestec de aminoacizi (proba de analizat) (concentraţia aminoacizilor din
amestec este aproximativ egală cu a celor din soluţiile etalon.
7. Ninhidrină 0,2 % (în etanol 96o sau în acetonă) – soluţie revelator
8. Etuva (t ~ 80-100oC)
Aminoacizii folosiţi ca etalon depind de compoziţia calitativă a probei de
analizat. Proba de analizat poate fi (la alegere):
P1 – Leu (sau Ile) + Pro + Lys (sau Arg)
P2 – Phe + Ala + Cys

Mod de lucru
Se introduce butanolul în aparatul de cromatografie astfel încât să formeze un
strat înalt de 2 cm, la partea inferioară a vasului. Pe lăţimea benzii cromatografice se
trasează cu creionul o linie “start”, la o distanţă de 3 cm de marginea inferioară a
hârtiei de filtru. (se evită atingerea hârtiei cu mâna liberă. Se lucrează cu mănuşi
chirurgicale; aminoacizii din transpiraţia de pe mâini pot genera artefacte). Pe linia
de “start” trasată, în poziţii marcate cu creionul, la distanţe de 2 cm, atât faţă de
muchiile benzii cât şi între ei, se aplică soluţiile aminoacizilor etalon (ex. Phe, Ala,
respectiv Cys) şi proba de analizat (de exemplu P2).

59
 Aplicarea soluţiilor se realizează cu micropipete, pata umedă realizată la o
aplicare nu trebuie să depăşească 0,5 cm în diametru. Dacă se doreşte “concentrarea
aplicării”, se usucă pata rezultată după prima aplicare şi apoi se repetă aplicarea
(astfel diametrul “aplicării” rămâne constant).
Se usucă plăcuţa în etuvă (sau în curent de aer cald) şi se introduce apoi în
aparatul de cromatografie astfel ca marginea ei inferioară să fie imersată ~1 cm în
faza mobila. Se astupă etanş aparatul cu placa de sticlă (capacul) pe care s-a fixat
prin aderenţă o hârtie de filtru obişnuită, umezită (prin pulverizare) cu apă distilată.
Se menţine plăcuţa cromatografică in aparat pană când faza mobil parcurge
ascendent aproape toata lungimea ei (aproximativ 2 ore la temperatură constantă).
Prin migrarea fazei mobile aminoacizii din amestec sunt antrenaţi şi separaţi.
Experimentul nr. 2 Separarea unui amestec de compuşi de mase moleculare
diferite, prin cromatografie de excludere moleculară (prin gel filtrare pe coloană)
Materiale necesare
1. Coloana cromatografică 1,5 x 30 cm
2. Sephadex G-75 (6 g % în NaCl 0,15 M sau în apă distilată) care reprezintă
materialul "suport" cu care se umple coloana
3. Soluţie NaCl 0,15 M pentru eluţie (varianta I de lucru)
4. Apă distilată pentru eluţie (varianta II de lucru)
5. Rezervor pentru eluant (eluent)
6. Vată de sticlă
7. Eprubete de sticlă pentru colectarea fracţionată a "eluantului"
8. Proba de analizat, la alegere:
Varianta I de lucru: 3 ml amestec de citocrom c (3 g %o) (roşu), cromat de
potasiu (2 g %o) (galben) şi Blue-Dextran (2 g %o) (albastru)
Varianta II de lucru: 3 ml soluţie de albumină 1%, precipitată cu (NH4)2SO4,
la saturaţie
9. Dispozitiv metalic pentru susţinerea coloanei şi a rezervorului pentru
diluant
10. Reactivi pentru identificarea în eluat a proteinei şi a ionilor sulfat, în
cazul variantei II: ninhidrină 0,2 g % şi BaCl2 5 g %

60
 Mod de lucru
Se îmbibă gelul prin introducerea sephadex-ului (~50 g) într-un exces de apă,
apoi se diluează corespunzător pentru obţinerea suspensiei de gel. Se fixează un strat
de vată de sticlă la partea inferioară a coloanei, deasupra tubului capilar de scurgere.
Se umple coloana cu suspensia de gel. Se conectează rezervorul cu lichidul de eluţie
şi se spală coloana (se echilibrează cu lichidul de eluţie), timp de 10-12 ore. Se
îndepărtează lichidul de deasupra gelului şi se introduce proba de analizat astfel ca
ea să se dispună deasupra gelului în coloană; se deschide robinetul de scurgere a
coloanei pentru ca proba să pătrundă în gel. Se iniţiază eluţia coloanei încărcate cu
proba de analizat; se stabileşte cu ajutorul unui cronometru viteza de eluţie dorită (de
ex. 60 ml/h) şi se colectează volume succesive (fracţiuni) de eluat, de 6-10 ml, în
eprubete separate. Se determină chimic sau fizico-chimic conţinutul fiecărei fracţiuni
recoltate.
Rezultate şi interpretare
In cazul variantei I de lucru se observă chiar de pe coloană separarea a trei
regiuni de culori diferite (albastru, roşu, galben) care progresează diferit spre capătul
inferior al coloanei.
Conform principiului cromatografiei de excludere moleculară, compusul cu
masa moleculară cea mai mare (Blue-Dextranul) "migrează" primul de pe coloană
(şi este cules în fracţiunile iniţiale) iar cromatul de potasiu, cu masa moleculară cea
mai mică, este "cules" ultimul (apare în fracţiunile finale).
In cazul variantei II de lucru, proteina (albumina) apare în primele 3-5
eprubete, pe când ionii sulfat apar în ultimele (6-10). Ionii sulfat, cu masa moleculară
mică pot pătrunde în interiorul particulelor de gel şi deci viteza lor de migrare în
coloană este încetinită.
Din primele eprubete dau reacţie pozitivă (coloraţie violet, la cald) la tratare
cu ninhidrină şi rezultat negativ la tratare cu BaCl2 (nu precipită BaSO4).
Cu ultimele fracţii colectate de pe coloană, reacţiile de recunoaştere sunt
inversate: probă pozitivă pentru prezenţa anionilor sulfat şi probă negativă pentru
proteină.

61
 3. ELECTROFOREZA

Molecule de dimensiuni relativ mari, precum proteinele, lipidele şi acizii

nucleici, pot fi separate cu ajutorul tehnicii electroforetice. Electroforeza este o
tehnică cu o utilizare de peste 50 de ani ce a venit în întâmpinarea cercetătorilor
pentru a-i ajuta în experimente ce cuprind purificarea proteinelor, determinarea
greutăţii masei moleculare, identificarea punctului izoelectric, determinarea
activităţii enzimelor, etc.
Aşadar, această tehnică are aplicabilitate nu numai în cercetare cât şi în
medicină, ea fiind utilizată în clinică pentru separarea fracţiilor proteice şi lipidice
din materiale biologice (sânge, urină, lichid cefalorahidian, lacrimi, salivă, ţesuturi)
cu scopul de a completa tablourile clinice a diverselor afecţiuni (hepatice, infecţii
virale, hemofilii, screloză multiplă, diabet, etc) .

Principiul metodei

Electroforeza este o tehnică în care biomoleculele migrează în câmp electric,

având drept rezultat separarea acestora în funcţie de sarcina lor electrică, masa
moleculară şi raza particulelor. Pentru a realiza o electroforeză calitativă trebuie
luată în considerare o serie de factori: viteza de migrare a moleculei (v), intensitatea
câmpului electric în care migrează moleculele (E), încărcarea electrică a moleculelor
(z), forţa de frecare a moleculelor, vâscozitatea mediului (η), etc. Viteza de migrare
a unei molecule în câmp electric depinde de intensitatea câmpului electric (E) în care
migrează, sarcina electrică a particulei (q) şi coeficientul de frecare (f):
𝑞𝐸
v=
𝑓
Forţa electrică, qE, va orienta moleculele încărcate electric către electrodul de
sarcină opusă. Coeficientul de frecare depinde de masa şi forma moleculei ce
migrează. Pe lângă aceşti doi factori este luată în calcul şi vâscozitatea mediului,
deoarece în funcţie de aceasta se stabileşte tipul de suport utilizat pentru migrare
(solid, semisolid sau lichid).
Migrarea moleculelor va avea loc într-un singur sens, fie către anod (+), fie
către catod (-). Particulele încărcate pozitiv migrează către polul opus şi se numesc
CATIONI, iar particulele încărcate negativ poartă denumirea de ANIONI. Cu cât
încărcarea electrică este mai mare cu atât migrarea va fi mai rapidă. Viteza de
migrare este influenţată şi de dimensiunea particulelor, astfel încât particulele mici
se vor deplasa mult mai repede comparativ cu particulele medii şi mari. Moleculele
cu masă mai mare sunt accelerate mai lent în câmpul electric comparativ cu cele
mici, la aceeaşi încărcare electrică. (Fig. II.3.1)

62
 Figura II.3.1. Migrarea anionilor şi cationilor în câmp electric

Componentele unui sistem de electroforeză şi etapele preliminarii

electroforezei.

Pentru a efectua o electroforeză sunt necesare: un suport pe care vor fi

aplicate probele, un sistem tampon, amestecul sau probele ce urmează să fie supuse
migrării şi o sursă de curent. Fiecare componentă trebuie selectată atent în funcţie
de scopul experimentului. Pentru a putea urmări zona de migrare este nevoie de un
colorant sau „tracer” introdus în probele ce urmează să fie supuse electroforezei.
Colorantul are menirea de a migra cu o viteză mai mare faţă de componentele
macromoleculare ale probei, indicând momentul stopării electroforezei. In funcţie
de tipul probei sunt mai multe clase de coloranţi, astfel pentru acizi nucleici se
folosesc: bromura de etidium, SYBR Green, pentru proteine: coloraţie cu argint,
albastru de bromfenol, verde de metilen, etc. Pe lângă colorant în probele ce conţin
proteine se pot introduce agenţi denaturanţi. Detergenţii (dodecil sulfat de sodiu-
SDS, NP-40, Triton X-100) au rolul de a rupe interacţiile hidrofobe, agenţii
reducători precum β-mercaptoetanol şi DTT (ditiotreitol) intervin pe legăturile
sulfurice inter- si intramoleculare, urea, tiourea şi guanidina distrug legăturile de
hidrogen şi interacţiile hidrofobe atât între proteine cât şi la nivelul structurii
secundare a acestora. Dacă proteinele nu sunt supuse solubilizării există riscul ca
acestea să formeze agregate, precipitând.
Sistemul tampon este ales în funcţie de natura moleculelor. De exemplu,
proteinele bazice se vor separa eficient la un pH acid şi invers. Insă există şi excepţii
şi anume două proteine de aceeaşi dimensiune, dar cu puncte izoelectrice diferite, se
vor separa cam la toate valorile de pH. La efectuarea electroforezei se va ţine cont
de tăria ionică a sistemului tampon, care trebuie să fie optimă nemodificând
conţinutul probei şi oferind o capacitate de tamponare suficientă. Cu cât tăria ionică
este mai mare, cu atât va fi mai mică rezistenţa electrică, iar curentul transportat va
fi mult mai mare, fapt ce va duce la supraîncălzirea sistemului precedată de
denaturarea probelor. La aparatele de electroforeză se poate integra un sistem de
răcire cu scopul de a disipa uniform excesul de căldură. Acest proces va avea drept
efect formarea unor benzi netede, crescând calitatea separării. O soluţie tampon cu o
tărie ionică mică va permite o migrare rapidă, însă cu o calitate inferioară.
63
 Câmpul electric este furnizat de un generator de curent continuu, cu un
interval optim al voltajului cuprins intre 5-8 volti/cm. Denaturarea probelor şi
evaporarea sistemului tampon apar la un voltaj ce depăseşte 10 V/cm.
La alegerea suportului pentru electroforeză se ia în considerare şi tipul probei
ce urmează să fie separată sau purificată. Pentru separarea proteinelor şi lipidelor
plasmatice şi/sau urinare, dar şi pentru cuantificarea hemoglobinelor sunt folosite
geluri preturnate, marcate corespunzător. In cercetare suportul este ales de cel ce
întocmeşte protocolul de lucru, electroforeza fiind de cele mai multe ori precedată
de alte tehnici precum imunoblotare.
Unul dintre cele mai ieftine şi uşor de utilizat suporturi este hârtia de filtru.
Cel mai mare dezavantaj pe care acesta îl prezintă este acurateţea mică, având
proprietatea de a absorbi moleculele ce urmează să fie separate. Pe lângă acest
inconvenient, mai există şi o limitare a utilizării sale fiind propusă pentru separarea
compuşilor cu molecule mici (aminoacizi, peptide şi proteine cu masă moleculară
mică). Hârtia de filtru este încadrată în categoria de suport solid alături de acetatul
de celuloză. Acetatul de celuloză oferă o separare mult mai bună comparativ cu
hârtia de filtru şi pentru că este extrem de util în identificarea gamapatiilor şi
separarea hemoglobinelor, a fost adaptat şi transformat în suport semisolid,
comercializat sub formă de membrane.
Gelurile reprezintă o formă de suport semisolid, fiind folosite atât în clinică,
cât şi în cercetare. In această clasă sunt încadrate gelurile de amidon, agaroză,
poliacrilamidă. Gelurile spre deosebire de suportul solid (hârtia de filtru) sau cel
lichid au avantajul de a fi adaptate în funcţie de necesităţile cercetătorului. Fiecare
gel se comportă precum o „sită moleculară”, având scopul de a separa moleculele
mari de cele medii şi mici, iar „ochiurile” acestei site pot fi mărite sau micşorate în
funcţie de amestecul ce urmează să fie separat. Pe lângă dimensiunile moleculelor,
fundamentală este şi sarcina acestora. Pentru a asigura o încărcare electrică netă,
lucru ce va uşura migrarea moleculelor într-un singur sens, proteinele vor fi
denaturate prin adăugarea unor substanţe cu rol de destabilizatori structurali.
Gelul de agaroză este un polimer constituit din galactoza, utilizat în
biochimie, biologie moleculară şi clinică la separarea biomoleculelor. Proteinele pot
fi separate pe baza punctului izoelectric pe gel de agaroză de tip IEF (isoelectric
focusing), iar acizii nucleici sunt separaţi în funcţie de lungimea fragmentelor. In
clinică sunt utilizate geluri preturnate de agaroză, pe care pot fi aplicate până la 30
de probe de la pacienţi diferiţi. Sensibilitatea electroforezei pe gel de agaroză este
relativ mare, de aproximativ 94%. Pentru separarea fragmentelor de acizi nucleici
cel mai indicat gel este cel de agaroză.

64
 Figura II.3.2. Gel de agaroză preturnat pentru electroforeza proteinelor
plasmatice

Figura II.3.3. Reprezentarea fracţiilor proteice serice umane (valori

normale)
Gelul de amidon este un gel uşor de procurat, având costuri mici, însă prezintă
un dezavantaj si anume este necesară o degazare prealabilă pentru a creşte calitatea
gelurilor. Este utilizat doar pentru separarea proteinelor.
Gelul de poliacrilamidă este unul din cele mai utilizate suporturi de
electroforeză. Este extrem de important pentru cercetare fiind inclus în tehnica
PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis). Este folosit la separarea proteinelor
pentru a determina masa moleculară a acestora. Pentru a putea stabili greutatea unei
proteine, exprimată în Da (daltoni), este introdus o dată cu probele, un standard
numit marker de greutate. Markerul de greutate cuprinde proteine cu masă
moleculară cunoscută cu rol de „riglă” moleculară în determinarea maselor
moleculare a compuşilor separaţi. (Fig. II.3.4)

Figura II.3.4. Marker de greutate cu diferite proteine (MM=mass molecular

exprimată in kDa)
Pe lângă aceste suporturi sunt menţionate în literatură şi suportul lichid sau
sistemele tampon ce pot fi utilizate la separare electroforetică. Acest tip de suport
este întâlnit la separarea fragmentelor de ADN care depăşesc 107 perechi de baze în

65
metoda PEGE ( pulsed-field gel electrophoresis) sau electroforeză în câmp
pulsatoriu.
Tehnici electroforetice
Clasificarea tehnicilor electroforetice este destul de amplă, tinându-se cont
de o multitudine de factori, însă noile metode de clasificare se raportează doar la
două mari clase de metode şi anume electroforeza în gel şi la electroforeza capilară.

A. Electroforeza în gel foloseşte, în general, volume de ordinul

microlitrilor. Probele traversează un suport din gel prin care trece un curent electric.
Migrarea electroforetică este oprită până la parcurgerea totală a gelului de către
amestecul introdus în aparat. In urma migrării se evidenţiază benzi ce indică prezenţa
biomoleculelor, fiind luată în considerare distanţa de la locul aplicării probei până la
staţionarea fragmentului numit timp de migrare (dm). Timpul de migrare al fiecărui
component se poate compara cu un standard.
In acestă clasă sunt încadrate: SDS-PAGE, IEF, electroforeza 2D,
izotachoforeza.
1) SDS-PAGE (sodium dodecilum suplhate- polyacrylamide gel
electrophoresis) sau electroforeza pe gel de poliacrilamidă.

La această tehnică este introdus detergentul anionic, dodecil sulfat de sodiu

(SDS), în gel, în tamponul de migrare cât şi în probe. SDS încarcă negativ
moleculelor proteice, cantitatea de SDS, necesară denaturării unui gram de proteine,
fiind de aproximativ 1,4 g. După introducerea acestui detergent anionic, fracţiile
proteice vor migra într-un singur sens şi anume către anod (+). Tehnica poate fi
realizată atât vertical cât şi orizontal, în funcţie de aparat.

Figura II.3.5. Destabilizarea structurii proteice cu ajutorul SDS-ului

Gelul de poliacrilamidă este format din 2 geluri: unul cu ochiurile reţelei mai
mari - gelul de concentrare, iar altul cu porii mai mici - gelul de separare. Pentru a
forma aceste geluri sunt necesare două separatoare din sticlă („spacere”) ce vor fi
prinse într-un suport cu rolul de a constitui o cavitate. Gelul de separare, a cărui
densitate este mai mare, va fi turnat primul în această cavitate, urmând după
polimerizarea acestuia să fie turnat cel de al doilea gel. In compoziţia gelului de
separare intră un sistem tampon fosfat cu un pH de 8.8, SDS 10%, amestec
acrilamidă/bisacrilamidă de cel puţin 8%, persulfat de amoniu şi TEMED. Fiecare
ingredient are un rol bine determinat în formarea „sitei moleculare” amintită anterior.
66
Monomerul de acrilamidă polimerizează permiţând formarea unor „ochiuri”, iar
dimensiunea acestor ochiuri este reglată cu ajutorul agentului de reticulare N,N’-
metilenbisacrilamida. O concentraţie mare de bisacrilamidă va crea ochiuri mici,
gelul căpătând o rezistenţă mare. Persulfatul de amoniu (sau de potasiu) este
considerat iniţiator în polimerizare şi alături de catalizatorul TEMED (N,N,N’N,’-
tetrametiletilendiamina) asigură formarea unui gel uniform. Gelul de concentrare
este turnat ulterior polimerizării celui de separare şi are un conţinut mai mic în
acrilamidă/bisacriamidă doar de 4%, iar tamponul fosfat are un pH mai mic decât cel
anterior (6.8). După oprirea migrării acest gel este îndepărtat şi aruncat.

Figura II.3.6. Formarea reţelei în gelul de poliacrilamidă

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Experienţa nr. 1. Separarea unor probe, ce conţin proteine serice umane,

prin electroforeza verticală

Materiale necesare:
1. Gel de poliacrilamida preparat
2. Tampon migrare glicina-SDS pH=7.4
3. Tuburi Eppendorf cu probe, ţinute pe gheaţă (probele sunt suspendate într-o
soluţie ce conţine mercaptoetanol, tiouree, albastru de bromfenol, glicerol,
SDS)
4. Soluţie de colorare pe bază de Coomasie Brilliant Blue
5. Soluţie de decolorare pe bază de acid acetic glacial şi etanol
6. Sursă de curent
7. Tancul de migrare
8. Micropipetă cu vârfuri de unică folosinţă, mănuşi

67
 Mod de lucru
Gelul, care are ataşat un „pieptene” necesar formării godeurilor, prins în
suport va fi scos din acesta şi introdus în compartimentul prevăzut cu electrozi. Se
pot lucra două geluri concomitent sau unul singur. In cazul introducerii unui singur
gel există o placă de plastic destinată înlocuirii celui de al doilea gel. In sistemul de
prindere, prevăzut cu electrozi, se vor introduce gelul cu „pieptenele” spre interior şi
paralel placa de plastic formând o cavitate care nu este etanşă. Acest suport este
introdus în tancul de migrare astfel încât să se potrivească capacul ce va închide
sistemul. Se scoate „pieptenele” şi uşor se adaugă sistem tampon de migrare până în
momentul în care gelul este acoperit cu lichid (lichidul trebuie să pătrundă şi în
spaţiile formate de pieptene, în godeuri). Cu ajutorul pipetei la care s-a ataşat vârful,
se prelevează un volum (10 μl) de probă şi cu atenţie se va elibera lichidul în primul
godeu. Se va proceda astfel cu toate probele până la epuizarea tuturor godeurilor.
După pipetarea probelor, în gel se va observa o delimitare de culoare albastră,
indicator că probele rămân în spaţiile destinate lor. Se închide sistemul şi se cuplează
la sursa de curent. Se selectează programul care are două etape, curentul fiind ajustat
pentru ambele tipuri de geluri (etapa 1- 20-30 min la intensitate constantă de 20 mA,
etapa 2- 40-60 min la 180 V). După ce programul s-a finalizat, se opreşte sursa, se
scoate gelul din tanc şi se desprind usor cele două gemuleţe ce cuprind gelul. Gelul
de concentrare este îndepărtat, se marchează un colţ în gelul de separare pentru a şti
care este prima proba aplicată şi se cufundă gelul în soluţia de colorare pentru 20 de
minute. După această etapă se scoate gelul de culoare albastră şi se introduce în
soluţia de decolorare unde va fi lăsat 12 ore sau chiar peste noapte. După acest
interval de timp se vor observa benzile proteinelor ce au migrat.

Figura II.3.7. Gel de poliacrilamidă cu 8 probe de proteine serice (1-8) şi

martor (M)
2) IEF (isoelectric focusing) sau focalizarea izoelectrică.

Această tehnică presupune separarea amfionilor (zwiterionilor) pe bază

punctelor izoelectrice (pI). Compuşii migrează în câmp electric folosind gradientul
de pH şi se opresc când pH-ul este egal cu pI. Această tehnică este utilizată în
medicina legală şi la teste de paternitate.

68
 3) Electroforeza 2D

Este destinată separării complexelor proteice şi urmăreşte migrarea în

funcţie de pI şi de dimensiunea biomoleculelor. Are o rezoluţie crescută deoarece
sunt practic două metode de electroforeză în gel. Prima oară se efectuează IEF, după
care se roteşte gelul cu 90o şi se intocmeşte SDS-PAGE, permiţând o separare net
superioară celorlalte două electroforeze în gel.

4) Izotachoforeza

In această metodă particulele migrează cu aceeaşi viteza într-un sistem

tampon discontinuu. Separarea se realizează pe bază mobilităţilor electroforetice. In
cadrul sistemului se găsesc doi electroliţi, unul de dirijare „leading” şi unul de
captare „trailing” a ionilor. Probele ionizate migrează cu aceeaşi viteza între
electrolitul de dirijare şi cel de captare, iar substanţele a căror mobilitate este mare
vor fi direcţionate către electrolitul „leading” şi cele cu mobilitate mică vor fi atrase
de electrolitul „trailing”. Izotachoforeza este aplicată în industrie (în controlul
poluării, depistării ionilor anorganici, detergenţilor în apă potabilă).

A. Electroforeză capilară este o metodă nouă, cu aplicabilitate mult mai

largă şi o sensibilitate mult crescută faţă de electroforeza în gel. Prezintă multe
avantaje şi anume: se folosesc volume mult mai mici faţă de electroforeza în gel,
capilarul prin care sunt pompate probele poate fi reutilizat după ce au fost efectuate
calibrările, există posibilitatea constituirii unei baze de date, timpul prelucrării
probelor şi rezultatelor este mult mai mic şi bineînţeles calitatea electroforegramelor
este mult superioară. Diferenţe atât calitative cât şi cantitative fac din electroforeza
capilară o alternativă viabilă la electroforeza clasică.

Ca şi principiu electroforeza capilară se aseamănă cu HPLC (high

performance liquid chromatography) şi GC-MS (gas cromatografia cuplată cu
spectrofotometrie de masă), existând un capilar prin care toţi compuşii parcurg
aceeasi distanţă într-un timp real, numit timp de migrare (tm). In loc de clasicele benzi
apar „picuri” ce reprezintă compuşii care au fost separaţi. Prezintă şi această tehnică
dezavantaje si anume faptul că aparatul are un cost ridicat fiind greu accesibil unui
laborator modest, însă un astfel de instrument poate fi folosit pe scară largă pentru
detectarea narcoticelor in urină, teste de dopaj, analiză calitativă si cantitativă a
diverselor alimente, industria cosmetică, biochimie, etc.

69
 Figura II.3.8. Separare cu ajutorul electroforezei capilare

Electroforeza este o metodă des utilizată în toate laboratoarele. De cele mai

multe ori ea este o etapă dintr-un experiment vast în care sunt incluse şi metode prin
care sunt analizate fracţiile separate (blotare, spectrofotometrie de masă,
cromatografie). Frecvent, benzile de interes sunt transferate pe un suport
(nitroceluloză) unde vor reacţiona cu un agent marcat chemiluminescent,
colorimetric sau fluorescent, proces numit blotare (blotting). Sunt trei tipuri de
blotare:
1) Southern Blot este destinată fragmentelor de ADN ce reacţionează cu un
compus radioactiv (32P) sau chemiluminescent. La această procedură
fragmentele de ADN supuse analizei vor fi secţionate cu ajutorul unei
enzime de restricţie şi separate prin electroforeză în gel de agaroză.
Fragmentele rezultate vor fi transferate pe o membrană specială. Pe
membrană vor fi imprimate aceleaşi benzi ce apar şi pe gel. Datorită folosirii
unor compuşi radioactivi la acest tip de analiză, benzile vor fi uşor de
detectat în domeniul razelor X. Southern Blot se foloseşte pentru detecţia
fragmentelor de restricţie, care pot fi plasmide sau clone bacteriofage.
2) Northern Blot este tehnica utilizată pentru detectarea secvenţelor specifice
de ARN folosind o probă marcată de ADN. Tehnica presupune separarea
ARN-ului în gel de agaroză. După migrare, benzile vor fi transferate pe
membrană şi apoi vor fi incubate cu o probă de ADN monocatenar. In urma
incubării se vor forma perechi de baze pe ADN ce sunt complementare cu
secvenţa de ARN supusă analizei. Rezultă o moleculă alcătuită din două
catene diferite, una de ARN şi una de ADN complementar. Datorită marcării
ADN-ului vizualizarea se poate realiza cu uşurinţă în domeniul ultraviolet.
3) Western Blot este o metodă de cuantificare a proteinelor, ce se efectuează
după migrarea electroforetică a fracţiilor proteice, în gel de poliacrilamidă.
Suportul, pe care sunt transferate benzile, este tratat cu anticorpi marcaţi ce
reacţionează cu proteine specifice (util în screeningul HIV-ului in sânge).
Detecţia benzilor se realizează colorimetric, fluorescent şi
chemiluminescent.

70
 4. SPECTROSCOPIA MOLECULARĂ

Metodele optice de analiză au la bază interacţiunea radiaţiei

electromagnetice cu substanţa. Ele se utilizează pentru identificarea, dozarea
sau stabilirea formulelor moleculare ale diferitelor componente biochimice din
ţesuturi şi lichide biologice. Aceste metode folosesc radiaţii care la trecerea
prin substanţă provoacă fenomene de absorbţie, emisie, difuzie, difracţie a
căror intensitate poate fi măsurată şi corelată cu parametrul urmărit. În cele
ce urmează vom descrie metodele spectrale bazate pe fenomene de absorbţie şi
emisie a luminii de către atomi şi molecule.

4.1. Radiaţia electromagnetică şi interacţiunea ei cu substanţa

Caracteristicile radiaţiei electromagnetice

Radiaţia electromagnetică este caracterizată prin lungimea de undă (λ) şi
frecvenţa -1
. Cele
trei mărimi sunt corelate astfel:
8

m/s)
Radiaţia electromagnetică se repartizează în diverse domenii spectrale (tabelul
1), fiecare domeniu spectral corespunzând la unul sau mai multe tipuri de tranziţii
electronice sau moleculare. Lumina obişnuită (policromică), vizibilă cu ochiul liber
(λ= 400-750 nm), poate fi descompusă prin diferite procedee (prisme, reţele de
difracţie) în radiaţii luminoase cu lungimi de undă diferite cărora le corespund
anumite culori.
Radiaţia compusă dintr-o singură lungime de undă sau dintr-un domeniu
foarte îngust de lungimi de undă izolat din spectru, poartă denumirea de radiaţie
monocromatică.

Domeniul Lungimea de undă Energia radiaţiei Tipul tranziţiilor

(cm) (alte unităţi) (eV)
Radiaţii  10-10 0,01Å
1,24 × 106 Nucleare
10-9
Radiaţii X 10-8 1Å 1,24 × 104 Electroni din straturile
10-7 1 nm 1,24 × 103 K, L
Ultraviolet 10-6 10 nm Electroni din straturi
îndepărtat 100 Å 124 intermediare
(de vid)
Ultraviolet 10-5 4-7 nm
apropiat 400-750 nm 3,1-1,6 Electroni de valenţă
Vizibil

71
Infraroşu 10-4 1 μm Vibraţii moleculare
apropiat 10-3 Vibraţii şi rotaţii
10-2 1,24 moleculare
mediu 0,124

îndepărtat
Microunde 10-1 1 mm Rotaţii moleculare şi
1,24 × 10-3-
10 rezonanţă electronică de
-3,7 × 10-6
spin
Unde radio 102 1m Rezonanţă magnetică
< 3,7 ×10-6
103 nucleară

Tabelul II.4.1. Domenii spectrale

Majoritatea substanţelor chimice prezintă proprietatea de a absorbi selectiv

toată lumina incidentă cu excepţia aceleia pe care o percepe ochiul. De exemplu, o

soluţie apare colorată în roşu deoarece absoarbe radiaţiile albastre cu lungimi de
undă mai mici şi în consecinţă, va transmite numai radiaţia roşie cu lungimea de
undă cuprinsă între 620 şi 760 nm.
In tabelul II.4.2 este dată relaţia dintre valorile lungimilor de undă ale
diferitelor radiaţii luminoase şi culoarea caracteristică acestora.

λ(nm) Domeniul spectral Culoare Culoare complementară

180-400 UV Invizibilă -
400-440 vizibil Violet Galben-verde
440-500 vizibil Albastru Galben
500-580 vizibil Verde Roşu
580-600 vizibil Galben Albastru
600-620 vizibil Portocaliu Albastru-Violet
620-760 vizibil Roşu Verde-albastru
760-2000 IR Invizibilă -

Tabelul II.4.2. Domeniul optic al spectrului electromagnetic

Tranziţii cuantice

Modificarea stării unui sistem cuantic (atom sau moleculă) prin absorbţie
sau emisie de energie se numeşte tranziţie cuantică. Dacă energia schimbată de
sistemul cuantic cu mediul se prezintă sub formă de radiaţie electromagnetică,
tranziţia respectivă este radiativă. Există însă şi posibilitatea transferului de energie
fără intervenţia radiaţiei (prin ciocniri cu molecule, ioni, electroni liberi). În astfel de
72
cazuri avem de-a face cu tranziţii neradiative. În figura nr. 1 sunt reprezentate
schematic câteva tipuri de tranziţii şi fenomene optice corespunzătoare. În cazul (a)
sistemul trece din starea fundamentală, cu energia E0, într-o stare excitată, cu energia
E1, tranziţia respectivă fiind neradiativă. Starea excitată are o durată de viaţă foarte
scurtă, sistemul revenind în starea iniţială prin eliberarea excedentului de energie sub
formă de radiaţie electromagnetică. Frecvenţa radiaţiei emise este direct
proporţională cu diferenţa de energie dintre cele 2 nivele şi constituie o caracteristică
a atomului sau moleculei respective:

E = E1 – E0 = hν

Pe de altă parte, intensitatea radiaţiei depinde de numărul atomilor sau

moleculelor substanţei de analizat, ceea ce face posibilă determinarea cantitativă.
Acest tip de tranziţie stă la baza spectrometriei de emisie.

Figura II.4.1. Tranziţii cuantice.

(a) emisie; (b) absorbţie; (c) fluorescenţă

Cazul (b) din figura precedentă corespunde fenomenului de absorbţie a

radiaţiei. Tranziţia radiativă aduce sistemul într-o stare excitată, iar revenirea pe
nivelul iniţial se realizează prin tranziţie neradiativă. Absorbţia este condiţionată de
următoarea relaţie între frecvenţa radiaţiei şi diferenţa de energie a nivelelor:

ν=E/h
unde: h = constanta lui Plank

Consecinţa acestor fenomene este atenuarea intensităţii radiaţiei incidente.

In cazul (c) excitarea se realizează prin tranziţie radiativă, frecvenţa ν , fiind
caracteristică speciei respective. Urmează o tranziţie neradiativă către nivelul
intermediar E2. De aici se revine la nivelul iniţial prin emisie de radiaţie cu frecvenţa
ν2 < ν , denumită radiaţie de fluorescenţă. Metoda de analiză respectivă se numeşte
fluorimetrie.
Absorbţia sau emisia de radiaţii electromagnetice permite atât determinări
cantitative cât şi calitative. Lungimea de undă sau frecvenţa radiaţiei conţine

73
informaţia cu caracter calitativ, iar intensitatea reprezintă informaţia cu caracter
cantitativ.

Tipuri de spectre

Reprezentarea grafică a cantităţii de energie absorbită sau emisă de un sistem

în funcţie de lungimea de undă a radiaţiei electromagnetice, poartă numele de
spectru. Dacă radiaţia provine de la atomi sau molecule excitate se obţine un spectru
de emisie. Spectrul obţinut prin măsurarea intensităţii radiaţiei după ce aceasta a
traversat substanţa este un spectru de absorbţie.
Orice absorbţie este înregistrată în spectru printr-un maxim caracterizat prin
poziţia (λ corespunzătoare absorbţiei maxime), forma (baza curbei), şi înălţimea
curbei, primele două fiind caracteristici calitative, iar ultima cantitativă, Fig.II.4.2.

Absorbanta
Amax

Amax
2

max 
Figura II.4.2 Caracteristicile unei curbe de absorbţie.
(Selectivitatea spectrului este cu atât mai mare cu cât baza este mai îngustă, iar
gradul de informare creşte cu numărul benzilor de absorbţie)

Spectrele de absorbţie pot fi:

a) Spectre atomice. Spectrele atomice sunt spectre de linii, radiaţiile
caracteristice putând fi situate într-un domeniu spectral foarte larg, începând cu
raze X şi terminând cu lumina vizibilă (tabelul II.4.1). Aceste spectre se
utilizează mult în biochimie.

b) Spectre moleculare. În molecule electronii ocupă noi nivele de energie. În

plus, atomii în molecule pot să vibreze şi să se rotească în jurul axelor de legătură,
determinând apariţia subnivelelor de energie de rotaţie şi de vibraţie. Pentru un
anumit nivel electronic molecula poate avea diverse stări de vibraţie. Subnivelele
asociate fiecărui nivel vibraţional corespund diverselor valori ale energiei de rotaţie.
Corespunzător acestei distribuţii a nivelelor energetice există mai multe tipuri de
tranziţii moleculare:
Tranziţiile de rotaţie au loc între nivele foarte apropiate iar frecvenţa radiaţiei
corespunzătoare este mică, situându-se în domeniile infraroşu îndepărtat şi de
microunde. Spectrele de rotaţie sunt spectre de linii.
74
 Tranziţiile de vibraţie pot fi însoţite de modificarea stării de rotaţie a
moleculei. Ca urmare, liniile spectrale foarte apropiate se contopesc formând benzi
spectrale. Diferenţele între nivelele de variaţie fiind mai mari, radiaţiile
corespunzătoare sunt situate în domeniul infraroşu mediu sau apropiat.
Tranziţiile electronice sunt însoţite de modificări atât ale stării de vibraţie cât
şi ale stării de rotaţie. În urma suprapunerii liniilor spectrale corespunzătoare rezultă
benzi largi, situate în domeniul UV sau vizibil. Aceste benzi pot fi deplasate sub
influenţa unor factori structurali (prezenţa unor grupări în moleculă, poziţia acestora,
etc.) cât şi a unor factori de mediu (solventul). Grupările din molecula unei substanţe
(>C=O; >C=C<; -C≡N; >C=N-; etc.), care determină o creştere a absorbanţei
într-o parte distinctă a spectrului, se numesc grupări cromofore. Aceste grupări
determină culoarea substanţei. Conjugarea dublelor legături micşorează energia
necesară pentru tranziţia electronică, determinând astfel creşterea lungimii de undă
la care absoarbe cromoforul.
Moleculele pot absorbi sau emite radiaţii din domeniile ultraviolet, vizibil,
infraroşu şi de microunde (tabelul II.4.1). Pe măsură ce frecvenţa se
deplasează spre valori mai mari se observă trecerea de la spectru de linii la
spectre de benzi. Spectrele de benzi sunt mai puţin avantajoase din punct de
vedere al selectivităţii deoarece există posibilitatea suprapunerii benzilor
substanţei de determinat cu ale compuşilor însoţitori.

c) Spectre de rezonanţă electronică de spin (RES)

Existenţa momentului magnetic permanent la particulele cu spin şi sarcină,
aşa cum este electronul, face ca acestea să se comporte într-un câmp magnetic
exterior asemenea unui mic magnet. Într-un câmp magnetic exterior constant, un
electron necuplat poate exista într-o stare de energie inferioară corespunzătoare
orientării spinului paralel cu câmpul magnetic sau cea superioară corespunzătoare
orientării antiparalele. Pentru ca un electron să treacă din starea de energie joasă în
starea de energie înaltă, trebuie să absoarbă o cuantă corespunzătoare de energie
(pentru a produce rezonanţa).


unde:
h - constanta lui Planck
ν - frecvenţa radiaţiei
β - momentul magnetic al electronului
H - intensitatea câmpul magnetic
g - constantă (factor spectroscopic)

Din formula de mai sus rezultă că frecvenţa radiaţiei absorbite este funcţie
de momentul magnetic al electronului şi de câmpul magnetic aplicat. De obicei, se
menţine constantă frecvenţa undei cu care se iradiază proba (microunde) şi se

75
modifică câmpul magnetic aplicat până se obţine rezonanţa, materializată printr-un
maxim de absorbţie (figura II.4.3).

Figura II.4.3. Spectru RES în cazul interacţiei lecitină-colesterol. (1T = 1

Tesla = 10K Gauss)

Deoarece rar există mai mult de un electron necuplat într-o moleculă, un

spectru RES conţine mai puţin de zece linii. Spectrele RES pot fi utilizate
pentru studiul localizării spaţiale a atomilor în molecule, ca urmare a
înregistrării interacţiunilor electronului necuplat cu nucleele adiacente.
Deoarece numai moleculele ce conţin electroni necuplaţi dau spectre RES,
această metodă se pretează la studiul radicalilor liberi formaţi prin iradierea
produselor biologice, al metaloproteinelor în particular cele care conţin
molibden (de ex. xantin oxidaza), cupru (de ex.citocrom oxidaza) şi fier (de ex.
citocromii, feredoxina).

d) Spectre de rezonanţă magnetică nucleară (RMN)

Atomii care conţin un număr impar de protoni în nucleu, posedă un moment
magnetic propriu, putând interacţiona cu un câmp magnetic. O radiaţie cu energie
corespunzătoare (din regiunea undelor radio a spectrului electromagnetic), absorbită
de un nucleu cu număr impar de protoni, aşezat într-un câmp magnetic omogen,
schimbă starea de joasă energie cu spinul nuclear aliniat paralel cu câmpul, cu o stare
de energie înaltă cu spinul nuclear aliniat antiparalel cu câmpul, producând rezonanţa
magnetică nucleară (RMN). În studiile biochimice se utilizează izotopii:
hidrogenului 1H (rezonanţa magnetică de proton), 13C, 15N, 19F, 31P, 23Na 40Ca.
Frecvenţa radiaţiei absorbite pentru producerea RMN depinde de natura izotopului
şi de mărimea câmpului magnetic aplicat. O undă radio cu frecvenţa de 40 MHz este
utilizată pentru obţinerea rezonanţei nucleului 1H.
Spectrul RMN este reprezentarea grafică a energiei absorbite de un nucleu cu
număr impar de protoni funcţie de intensitatea câmpului magnetic (Figura 6). Ca şi
spectrele RES, spectrele RMN sunt utilizate în studiul structurilor moleculelor
organice simple. Spectroscopia RMN reprezintă o modalitate de determinare a
naturii, numărului şi a localizării relative a diferiţilor atomi în molecule, în principal
a hidrogenului. Spre deosebire de spectrele UV şi IR, care evidenţiază anumite
76
grupări funcţionale dintr-o moleculă, RMN evidenţiază influenţa întregului schelet
molecular.
Imagistica prin RMN foloseşte fenomenul rezonanţei magnetice nucleare
pentru a crea o imagine a distribuţiei protonilor în organism. Tehnica constă în
redarea imaginii unor structuri anatomice prin traducerea în semnale optice a
intensităţii semnalelor de radiofrecvenţă emise în anumite condiţii de nucleii atomici
aparţinând respectivelor structuri anatomice. Deoarece utilizează radiaţii
neionizante, imagistica prin RMN se înscrie în categoria metodelor de explorare
“neinvazive”, deci lipsite de nocivitate. Structurile anatomice analizate sunt
“stimulate” pentru a produce ele însele semnale utilizabile în realizarea unei imagini.
Formarea imaginii implică participarea nucleelor atomice din mediul investigat şi nu
a straturilor electronice ale atomilor (ca în tehnicile de radiodiagnostic).

4.2. Spectrofotometria de absorbţie moleculară în vizibil şi în ultraviolet

Legile absorbţiei radiaţiilor

Un fascicul de lumină monocromatică de intensitate Io, care traversează o soluţie
omogenă aflată într-o cuvă transparentă, îşi diminuă intensitatea (It < Io). Diminuarea
intensităţii fasciculului este determinată de fenomenele de absorbţie şi reflexie care au
loc la interacţiunea cu substanţa (figura II.4.4).

Figura II.4.4. Absorbţia luminii de către o soluţie omogenă

Legea lui Lambert. Intensitatea unui fascicul de lumină monocromatică, care

traversează un mediu absorbant, scade exponenţial cu creşterea grosimii stratului
absorbant (l).

- k1l
It = Io e

Legea lui Beer. Intensitatea unui fascicul de lumină monocromatică, care

traversează un mediu absorbant scade exponenţial cu creşterea concentraţiei
mediului absorbant (c).
77
 - k2c
It = Io e

Legea Lambert-Beer rezultă din combinarea celor două legi:

-k c l
It = Io e

Transmitanţa (T) este o mărime care exprimă procentual proporţia de radiaţie

care traversează stratul absorbant:

T = It/ Io × 100

Proporţia de radiaţie absorbită de mediu este numită absorbanţă (A) sau

extincţie (E) şi se exprimă astfel:

E = ln Io/It = k l c

unde k este coeficientul de absorbţie. Extincţia şi transmitanţa sunt mărimi

adimensionale. Legea Lambert-Beer se respectă în domeniul concentraţiilor mici,
deci în cazul substanţelor diluate. În acest caz, dacă l este constant, dependenţa
absorbanţei de concentraţie se înscrie pe o linie dreaptă care trece prin origine.
Coeficientul molar de extincţie este o mărime caracteristică substanţei şi
reprezintă extincţia unei soluţii cu concentraţie 1 M şi o grosime a stratului absorbant
de 1 cm. Coeficientul molar de extincţie se exprimă în litru / mol × cm.
Coeficientul specific de extincţie se foloseşte când nu se cunoaşte masa
moleculară a compusului de analizat (de ex. un amestec de proteine şi acizi nucleici)
şi reprezintă absorbanţa unei soluţii cu concentraţia de 10 g/litru şi o grosime a
stratului absorbant de 1 cm.

Spectrofotometrul
Spectrofotometrele sunt aparate cu ajutorul cărora se poate măsura extincţia
unei soluţii la o anumită lungime de undă. Prin repetarea acestei măsurători într-un
anumit domeniu spectral (de exemplu în domeniul vizibil al spectrului) se poate trasa
spectrul de absorbţie al substanţei. În figura II.4.7 este prezentat spectrul
hemoglobinei şi al deoxihemoglobinei. Principalele componente ale unui
spectrofotometru sunt prezentate în figura II.4.5.

78
 Figura II.4.5. Principalele componente ale unui spectrofotometru

Sursa de lumină este de obicei o lampă de tungsten pentru domeniul vizibil şi

o lampă de hidrogen sau deuteriu pentru ultraviolet.
Monocromatoarele sunt sisteme optice care separă un fascicul alcătuit din
radiaţii cu lungimi de undă diferite în fascicule cu o singură lungime de undă. În
cazul regiunii vizibile a spectrului, monocromatoarele separă un fascicul de lumină
policromatică (albă) în fascicule monocromatice. Monocromatoarele pot fi prisme
optice (din sticlă pentru domeniul vizibil şi din cuarţ sau silica pentru domeniul UV)
sau reţele de difracţie. Monocromatoarele cu reţea de difracţie sunt mai avantajoase
din punct de vedere al selectivităţii, ele putând separa benzi de lungimi de undă mult
mai înguste decât prismele. Reţeaua de difracţie este o placă transparentă pe care s-
au gravat la distanţe egale linii paralele, opace. Fanta de ieşire permite trecerea spre
receptor a unei radiaţii monocromatice.
Celulele fotoelectrice sunt dispozitive care generează o diferenţă de potenţial
sub influenţa unei radiaţii electromagnetice. Funcţionarea oricărui spectrofotometru
are la bază interacţiunea radiaţiei transmise cu o celulă fotoelectrică. Tensiunea
generată este direct proporţională cu intensitatea radiaţiei. Elementul de bază al unei
celule fotoelectrice este reprezentat de un material semiconductor introdus într-o
incintă vidată, care în urma excitării emite o cantitate de electroni proporţională cu
intensitatea radiaţiei absorbite. Electronii emişi sunt atraşi de un electrod pozitiv
formându-se un curent electric. Acest semnal este măsurat şi intensitatea sa poate fi
citită pe scala de extincţie a aparatului. Tuburile fotomultiplicatoare sunt mult mai
sensibile decât celulele fotoelectrice. Aceste dispozitive conţin o incintă vidată în
interiorul căreia se află mai mulţi electrozi: fotocatodul, anodul şi un număr mare de
electrozi suplimentari, care au rolul de a amplifica semnalul electric prin intermediul
emisiei de electroni secundari.
Cuvele utilizate frecvent sunt din sticlă sau plastic. Aceste cuve nu pot fi
utilizate sub 310 nm deoarece absorbanţa sticlei sau plasticului este crescută în
domeniul ultraviolet. Pentru determinări spectrofotometrice în ultraviolet se
utilizează cuve şi medii optice din cuarţ. Cuvele utilizate frecvent au o grosime a
stratului absorbant de 1 cm şi necesită 2,5 - 3,0 cm3 de probă pentru o citire corectă.
Spectrofotometrele posedă cel puţin două scale: o scală liniară pentru
transmitanţă şi o scală logaritmică pentru extincţie.
79
 În figura II.4.6 se arată spectrofotometrul Spekol cu echipament EK1 sau EK5
pentru citirea extincţiilor.

EK5

e 600-850 nm 0
f
350-620 nm
g
d 100
1 c
a 0 b

Figura II.4.6 Spectrofotometrul Spekol cu echipament EK1 sau EK5

pentru citirea extincţiilor
a.Butonul pentru pornirea aparatului; b.Selector pentru lungimea de undă;
c.Clapă obturatoare; d.Semifantă utilizată când valorile transmisiei sunt foarte
apropiate de 100; e.Suport pentru cuve; f.Pârghia pentru selectarea receptorului
sensibil din domeniul lungimilor de undă utilizat; g.Buton de sensibilitate (se
foloseşte în cazul Spekol 10 pentru reglarea punctului 0 şi pentru mărirea
sensibilităţii aparatului).

Modul de lucru cu aparatul Spekol

Se porneşte sursa. Se pun cuvele în suport. Se selectează lungimea de undă

citirea. In prima operaţie facem să-i corespundă intensităţii luminii incidente Io

transmisia 0. Cu celula închisă (butonul c din stânga jos comutat pe 0) se face zeroul
(acul galvanometrului se reglează la diviziunea 0 pe scala de jos corespunzăotare
transmisiei, cu ajutorul butonului de reglare 0 din dreapta sus). Se introduce apoi în
echipamentul EK5 o cuvă ce conţine solventul pur sau reactivii, cu excepţia
substanţei de analizat, numită cuvă blanc sau cuvă martor, dupa care se deschide
celula fotoelectrică prin comutarea butonului c din stânga jos pe 1. Se reglează din
butonul de reglare 100 din dreapta jos, transmitanţa 100, ceea ce corespunde la o
extincţie egală cu 0 (acul galvanometrului se reglează la diviziunea 100 pe scala de
jos, corespunzăotare transmisiei, cu ajutorul butonului de reglare 100 din dreapta
jos). Se închide celula. Intr-o cuvă identică cu prima se pune soluţia colorată, a cărei
extincţie dorim s-o citim şi o introducem în echipamentul EK5. Se deschide celula.
80
Deviaţia acului galvanometrului, citită pe scala de sus (scala extincţiei, gradată între
0 - 2) ne dă extincţia.

Tipuri de spectrofotometre
Pe lângă spectrofotometrul “clasic” există mai multe tipuri de
spectrofotometre:
Spectrofotometrul cu dublu fascicul. Radiaţia incidentă străbate alternativ
proba şi mediul de referinţă. Nu mai este necesară calibrarea periodică, ca în cazul
spectrofotometrelor obişnuite (monofascicul), ceea ce duce la creşterea preciziei.
Spectrofotometrul “la temperaturi joase”. Prin coborârea temperaturii probei
(cu azot lichid), viteza termică a moleculelor absorbante scade (scade agitaţia
termică), având loc o modificare a coeficientului molar de extincţie. Se modifică
spectrele de rotaţie şi de vibraţie moleculară, maximele de absorbţie devin mai
înguste, rezultând o creştere a preciziei determinării.
Spectrofotometrul de reflexie. Măsoară radiaţia absorbită când radiaţia
incidentă este reflectată de către probă. Este folosit în cazul determinării extincţiei
suspensiilor celulare, prea opace pentru a putea fi folosit un spectrofotometru
obişnuit. Suprafaţa etalon de reflexie este oxidul de magneziu.
Spectrofotometrul cu multifascicul, determină simultan extincţii la două
lungimi de undă caracteristice substanţei respective.
Spectrofotometrul cu microscală, măsoară direct intensitatea radiaţiei
reflectate de probă, determinându-se indirect intensitatea radiaţiei refractate
(absorbite), a cărei valoare depinde de natura probei.

Utilizarea spectrofotometrului în vederea dozării substanţelor

Pentru ca o substanţă să poată fi dozată prin spectrofotometrie de absorbţie

este necesar să-i fie cunoscut spectrul de absorbţie. O substanţă colorată prezintă cel
puţin un maxim de absorbţie în domeniul vizibil. Lungimea de undă a radiaţiei
absorbite în această regiune spectrală se numeşte lungime de undă caracteristică de
absorbţie. Această valoare este o caracteristică specifică substanţei respective şi este
utilizată în procesul de dozare a acesteia.
Colorimetria este o aplicaţie a spectrofotometriei de absorbţie în domeniul
vizibil al spectrului. Dozarea unei substanţe care nu prezintă coeficient de extincţie
semnificativ în domeniul vizibil este posibilă după cuplarea acesteia cu un reactiv
colorat.
În determinarea concentraţiei soluţiilor pe baza reacţiei de culoare, există mai
multe posibilităţi:
1) substanţa cercetată are culoare proprie;
2) substanţa formează cu un reactiv o combinaţie colorată;
3) substanţa eliberează o substanţă colorată prin adăugarea reactivului;
4) substanţa de analizat distruge o substanţă colorată în soluţie.
Metodele bazate pe reacţii de culoare trebuie să îndeplinească condiţiile:
81
 1) culoarea să depindă numai de substanţa de analizat (specificitate);
2) culoarea să fie stabilă în timp;
3) legea lui Lambert-Beer să fie respectată;
4) măsurarea intensităţii culorii să se facă la λmax.
În vederea stabilirii concentraţiei unei soluţii a substanţei de interes se trasează
mai întâi o curbă etalon. Curba etalon reprezintă dependenţa extincţiei de
concentraţie la lungimea de undă caracteristică de absorbţie. Practic, se citesc
extincţiile unor soluţii de concentraţii diferite ale substanţei de interes şi se reprezintă
grafic E λ m a x = f(c). In domeniul de concentraţii în care se respectă legea Lambert-
Beer această dependenţă este liniară. Curba etalon va fi utilizată pentru dozarea
oricărei soluţii a substanţei de interes în domeniul respectiv de concentraţie.
Citirea extincţiei unei soluţii se face întotdeauna faţă de o soluţie de referinţă
numită soluţie blanc. În operaţia de etalonare a spectrofotometrului extincţia acestei
soluţii se impune a fi zero. Odată etalonat faţă de un blanc, spectrofotometrul poate
fi utilizat pentru citirea extincţiei numai la acea lungime de undă. La schimbarea
lungimii de undă este necesară reetalonarea aparatului. Soluţia blanc conţine
solventul şi toţi ceilalţi reactivi implicaţi în determinare în afară de substanţa de
interes. În majoritatea cazurilor soluţia blanc conţine numai apă distilată.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

a) Dozarea compusului de interes cu ajutorul unei curbe de etalonare

Se prepară soluţii de concentraţie cunoscută a substanţei de analizat, exact în
condiţiile în care se va lucra cu probele de analizat. Conţinutul unei cuve trebuie să
fie omogen, să nu prezinte turbiditate sau bule de aer. Se va evita atingerea
suprafeţelor optice ale cuvelor. Se citesc extincţiile faţă de o cuvă blanc. Se
reprezintă grafic pe hârtie milimetrică curba de etalonare, trecând pe ordonată
extincţiile iar pe abscisă concentraţia. In cazul în care se lucrează corect se obţine o
dreaptă care trece prin origine. Pentru aflarea concentraţiei unei probe (rezultatul
unei analize), se raportează extincţia acesteia la curba de etalonare. Se poate calcula
şi un factor al curbei de etalonare după formula: f = Ci/Ei. Concentraţia probei
necunoscute va fi: Cx = Ex f.

Mod de lucru
Ne propunem sa trasăm o curbă de etalonare care să servească la dozarea
fosforului anorganic seric, prin metoda Briggs. Ionul fosfat formează în prezenţa
molibdatului de amoniu şi în mediul acid o combinaţie complexă, care sub influenţa
reducătoare a hidrochinonei şi a sulfitului de sodiu trece în albastru de molibden.
Intensitatea culorii albastre este proporţională cu concentraţia fosforului anorganic.
Curba de etalonare se trasează astfel:

82
 Eprubetă
Reactivi 1 2 3 4 5 6 7
Soluţie fosfat
etalon (0,01 1 2,5 5,0 7,5 10 12,5 0
mg/ml) în ml
Reactiv
1 1 1 1 1 1 1
molibdat (ml)
Soluţie
hidrochinonă 1 1 1 1 1 1 1
(ml)
Soluţie sulfit de
1 1 1 1 1 1 1
Na (ml)
Apă distilată
16 14,5 12,0 9,5 7,0 4,5 17
(ml)
Concentraţia 0,01 0,025 0,050 0,075 0,100 0,125
blanc
(mg P/proba) C1 C2 C3 C4 C5 C6
Extincţia E1 E2 E3 E4 E5 E6

Citirile se fac la λ = 660 nm după 30 minute de incubare.

Se reprezintă grafic extincţia (ordonată) în funcţie de concentraţie (abscisă)
pe hârtie milimetrică. Pentru calcularea rezultatului unei analize se raportează
extincţia la curba de etalonare şi se află concentraţia:

Ex

Cx c

Factorul curbei de etalonare se poate calcula după formula:

f = (C1 + C2 + C3 + C4 + C5 + C6) / (E1 + E2 + E3 + E4 + E5 + E6)
Concentraţia necunoscută se calculează după formula:
Cx = Ex × f

b) Dozarea compusului de interes folosind un standard

Este o metodă simplificată care derivă din cea anterioară. Standardul
(etalonul) reprezintă o soluţie de concentraţie cunoscută a substanţei de interes.
Determinarea se face cu acurateţe numai în cazul în care concentraţia standardului
se încadrează în domeniul de liniaritate al dependenţei E = f(c).

83
 Se citesc extincţiile:
B = blancului: conţine toţi reactivii şi apa distilată, în volum egal cu cel al
probei de analizat şi al standardului;
P = probei de analizat: conţine reactivi şi materialul de analizat;
S = standardul (etalonul): conţine reactivii şi soluţia standard (etalon);
A = conţine numai materialul de analizat fără reactivii de culoare şi este
necesar doar când materialul de analizat este colorat.
Dacă se citesc extincţiile faţă de o cuvă cu apă distilată avem:
EP corectată = EP – EA – EB
ES corectată = ES – EB
Notăm cu Cp concentraţia probei şi cu Cs concentraţia standardului.
Aplicând legea Lambert-Beer, obţinem:
Cp / Cs = Ep corectat / Es corectat
Cp = Cs (Ep corectat / Es corectat)
In cazul în care se citesc extincţiile probei şi a standardului faţă de blanc:
Cp = Cs (Ep / Es)

Proprietăţile spectrale ale hemoglobinei

Hemoglobina este o proteină heminică care absoarbe în vizibil (datorită
grupării heminice) şi în ultraviolet (datorită globinei). Hemoglobina prezintă
maxime de absorbţie, unul la 430 nm, altele în jur de 555 nm.
Maximele de absorbţie se deplasează la combinarea hemoglobinei cu oxigenul,
culoarea sângelui trecând de la roşu închis la roşu deschis. La deoxigenare se
inversează procesul, ceea ce explică diferenţa de culoare între sângele venos şi cel
arterial. Spectrul de absorbţie al hemoglobinei se modifică la legarea oxigenului.
În hemoglobină şi oxihemoglobină fierul este în forma Fe2+. Dacă fierul este
oxidat cu un agent oxidant (fericianură de K) la Fe3+, hemoglobina se transformă în
methemoglobină, care nu se poate combina cu O2 sau cu CO. În general sângele
uman conţine cca 1% methemoglobină, acest procent putând creşte la ingestia de
medicamente. Spectrul methemoglobinei depinde de pH-ul mediului.

84
 Figura II. 4.7. Spectrul de absorbţie al hemoglobinei şi al deoxihemoglobinei

Hemoglobina se combină de 200 de ori mai uşor cu CO decât cu O2, formând

carboxihemoglobina. În cazul intoxicaţiei cu CO scade hemoglobina disponibilă pentru
transportul O2, producându-se anoxia tisulară. Spectrul de absorbţie al carboxihemoglo-
binei este suficient de diferit de cel al hemoglobinei, pentru a putea fi folosit în medicina
legală la stabilirea deceselor prin intoxicare cu CO (tabelul II.5.3).

Maxime de absorbţie(nm)
Hemoglobina 430 555
Oxihemoglobina 413 541 577
Carboxihemoglobina 418 535 570
Methemoglobina 406 500 630

Tabelul nr. II.4.3. Maximele de absorbţie pentru diferite tipuri de hemoglobine

1. Trasarea curbei de absorbţie în domeniul vizibil pentru Hb oxigenată.

Se prepară o probă ce conţine 0,014 g hemoglobină sau 0,1 ml sânge în 20 ml
soluţie amoniac de concentraţie 0,4 %. Soluţia obţinută este introdusă în cuva
spectrofotometrului (nivelul lichidului din cuvă va fi la aproximativ 2/3 din
înălţimea cuvei). După etalonarea aparatului
500nm, se introduce cuva cu probă. Se fixează lungimea de undă la 450 nm. Se
citeşte extincţia la lungimi de undă crescătoare între 450 şi 610 nm. Se
reprezintă grafic valorile lui E în funcţie de lungimea de undă.

2. Trasarea curbei de absorbţie în domeniul vizibil pentru methemoglobină

Se iau 3 ml din proba de soluţie de hemoglobină la care se adaugă 1ml
soluţie fericianură de potasiu 5%. Se face etalonarea la 500 nm cu 3 ml apă distilată

85
şi 1 ml fericianură de potasiu. Se citesc extincţiile la lungimi de undă între 400-700
nm (din 10 în 10 nm). Se trasează graficul E = f (λ).

3. Curba de etalonare pentru hemoglobină.

Se prepară mai multe soluţii etalon corespunzătoare unor concentraţii
cunoscute de hemoglobină (10,5; 11,5; 12,5; 13,5; 14,5 g Hb/100 ml apă distilată).
Se face o diluţie 1/200 a probelor. Se etalonează spectrofotometrul faţă de apă
distilată la λ = 546 nm. Se măsoară absorbanţele acestor soluţii la λ = 546 nm. Se
trasează graficul.(figura II.5.8).
0.5
E
0.4

0.3

0.2

0.1

0
10.5 12.25 14 15.75
conc Hb (g/100ml)
Figura nr. II.4.8. Curba de etalonare pentru hemoglobină

4. Dozarea hemoglobinei folosind curba de etalonare.

Se pipetează 0,25 ml sânge din “proba de dozat” într-o eprubetă şi se adaugă
4,75 ml soluţie de NH3 de concentraţie 0,4 %. După agitare, se iau din această
eprubetă 0,5 ml şi se trec într-o eprubetă care conţine 4,5 ml amoniac 0,4 %.
Amoniacul împiedică oxidarea Fe2+ la Fe3+. Prin diluţie cu soluţie de amoniac eritro-
citele se sparg şi hemoglobina din ele trece în soluţie. Se citeşte E la λ = 540 nm faţă
de amoniac şi se interpolează valoarea obţinută pe graficul ce reprezintă curba de
etalonare pentru hemoglobină. Concentraţia normală a Hb în sânge este: 14-15 g
Hb/100 ml sânge.

Proprietăţile spectrale ale coenzimelor piridinice

In stare liberă coenzimele piridinice NAD+ şi NADH au spectre asemănătoare

cu NADP+ şi NADPH. Spectrul formelor oxidate diferă sensibil de spectrul formelor
reduse. Formele oxidate şi reduse ale coenzimelor piridinice absorb puternic în
ultraviolet (260 nm), datorită nucleului adeninic (figura II.5.9).

86
 Figura II.4.9. Spectrul de absorbţie al NAD+ şi NADH. Absorbanţele
sunt citite pentru o soluţie de 44 mg/ litru, într-o cuvă cu grosimea de 1 cm.
NADP+ şi NAPH au spectre asemănătoare cu NAD+ şi respectiv NADH.

La reducerea NAD+ şi NADP+ apare un nou maxim de absorbţie la 340 nm.

Creşterea absorbţiei la 340 nm reflectă reducerea nucleului aromatic al piridinei din
partea nicotinamidei. Creşterea sau descreşterea absorbţiei la 340 nm este folosită
pentru a urmări cinetica reacţiei catalizate de dehidrogenazele piridin dependente
(lactat dehidrogenaza, alcool dehidrogenaza, etc.).

4.3 Spectrometria de fluorescenţă şi fosforescenţă moleculară

Noţiuni de bază
Fenomenele de luminescenţă cuprind o gamă foarte largă de manifestări
naturale, vizibile şi invizibile ochiului omenesc. Din punct de vedere fizic, există
acelaşi mecanism în producerea fluorescenţei chininei, chemiluminescenţei
leucocitelor fagocitate şi a bioluminescenţei licuriciului. Acest mecanism fizic
constă în excitarea electronilor din atomii şi moleculele unor substanţe şi eliberarea
energiei absorbite sub formă de lumină. Spre deosebire de lumina “caldă”, produsă
prin arderea combustibililor, luminescenţa este o lumină “rece”, care nu distruge
substraturile unde este formată. Toate fenomenele de luminescenţă au sufixul
“scenţă”, deşi incandescenţa nu face parte din această categorie.
Fotoluminescenţa cuprinde fluorescenţa şi fosforescenţa, ambele
fenomene constând în emisia de radiaţii de către o moleculă, în urma unui fenomen
de absorbţie. Excitarea se face cu radiaţii de o energie mai mare, folosind, de
exemplu, radiaţii din domeniul UV al spectrului iar emisia are loc de obicei în
domeniul vizibil. Fluorescenţa este fenomenul prin care o moleculă excitată prin
absorbţia unei radiaţii cu energie mare, după pierderea neradiativă de energie, emite
o radiaţie cu energia mai mică decât a radiaţiei absorbite. Fosforescenţa reprezintă

87
capacitatea unor molecule de a suferi un fenomen de emisie întârziată. Fosforescenţa
se produce la o lungime de undă mai mare decât fluorescenţa şi poate contribui la
identificarea structurii unor compuşi.
Termoluminescenţa apare în urma expunerii la energia termică a unor
substanţe aflate în stare excitată.
Electroluminescenţa sau catodluminescenţa rezultă ca urmare a excitării
ce are loc prin câmpuri electromagnetice intense.
Radioluminescenţa se produce prin contactul radiaţiilor ionizante emise de
izotopi radioactivi cu ecrane acoperite cu straturi de sulfuri metalice (ZnS, BaS) sau
prin reacţie cu amestecuri de scintilaţie.
Imunofluorescenţa (IF) – unul dintre reactanţi (antigenul sau anticorpul de
cercetat) trebuie să constituie o parte dintr-o structură biologică, celulă sau ţesut,
reactivul marcat cu fluorocrom relevând reacţia Ag-Ac.
Imunofluorescenţa se poate realiza direct sau indirect:
 IF directă reprezintă aplicarea Ac fluorescent peste preparatul
conţinând Ag
 IF indirectă, denumită şi tehnica sandwich, vizualizează reacţia Ag-
Ac prin aplicarea unui conjugat fluorescent anti-Ac.
Substanţele fluorescente cele mai folosite sunt fluoresceina (fluorescenţă
galben-verzuie; λmax = 520nm) şi rodamina (fluorescenţă roşie-portocalie; λmax =
620nm) cu derivaţii lor.
Fluorescenţa apare în general pentru molecule aromatice şi heterociclice sau
care conţin mai multe duble legături conjugate, având electroni delocalizaţi care pot
fi trecuţi în stări excitate de singlet cu energie mică. Măsurările de fluorescenţă
depind de numeroşi factori experimentali ca de exemplu:
 pH-ul influenţează fluorescenţa prin modificarea structurii anumitor
molecule în urma unor fenomene de disociere sau protonare
 temperatura → scăderea temperaturii determină o creştere a
intensităţii fluorescenţei
 oxigenul molecular dizolvat precum şi unii ioni metalici pot
determina fenomenul de stingere a fluorescenţei
 un substituent care delocalizează electronii π, ca de exemplu
grupările –NH2, -OH, -F, -OCH3, cresc fluorescenţa prin creşterea
probabilităţii tranziţiei între satrae de singlet cu energia cea mai
mică şi starea fundamentală
 grupările atrăgătoare de electroni (-Cl, Br, -I, -NO2 sau-COOH)
descresc sau sting fluorescenţa
 formarea chelaţilor cu ionii metalici determină apariţia fenomenului
de fluorescenţă deoarece creşte rigiditatea moleculei şi micşorează
vibraţiile interne
Aparatele în care separarea radiaţiilor excitatoare şi de fluorescenţă se face
cu ajutorul unor monocromatoare se numesc spectrofluorimetre sau florimetre.
Schema unui florimetru fotoelectric monofascicul cu filtre este prezentată în figura
88
II.4.10. Sursa de radiaţii constă dintr-o lampă cu vapori de mercur sau o lampă cu
xenon (emit intens în domeniul UV). Primul filtru permite trecerea unor radiaţii
excitatoare de anumite lungimi de undă, iar cel de-al doilea a radiaţiei de
fluorescenţă. Semnalul produs de detector este amplificat sau acţionează direct
sistemul de evaluare, care este un instrument de măsură.
Această schemă este asemănătoare cu a unui spectrofotometru, însă în cazul
florimetrului detectorul este rotit cu 90ºC faţă de direcţia radiaţiei incidente, iar al
doilea sistem de separare a radiaţiilor este plasat înaintea detectorului.

Figura II.4.10. Schema unui florimetru fotoelectric monofascicul cu

filtre
A = Sursa de radiaţii; B = Celulă ce conţine proba de analizat; C =
Fotocelulă; D=Instrument de măsură

Un fosforimetru este asemănător cu un fluorimetru însă are în plus un

dispozitiv optic care permite alternativ excitarea probei la anumite intervale de timp,
excitări urmate de măsurarea radiaţiei de fosforoscenţa.

4.4. Chemiluminescenţa şi bioluminescenţa

Noţiuni de bază
Chemiluminescenţa (CL) şi bioluminescenţa (BL) sunt fenomene naturale
sau provocate, în care absorbţia energiei produsă pe cale chimică determină formarea
unor molecule excitate (notate cu un asterix în dreapta sus) ca apoi energia să fie
eliberată. Emisia de lumină în CL respectă Legea lui Planck, conform căreia:
E = hυ
unde υ = frecvenţa = c/λ (c = viteza luminii; λ = lungimea de undă; h =
constanta lui Plank; E = diferenţa de energie dintre nivelele stării electronice
fundamentale şi cele excitate).
Astfel, reacţiile chimice producătoare de CL sau BL se pot schematiza:
A + B → C* → C + hυ

89
în care două substanţe A şi B reacţionează pentru a forma intermediar un produs în
stare excitată (C*), ca apoi acesta să treacă în acelaşi prosus neexcitat (C) sau în altul
(D), energia chimică fiind astfel eliberată ca lumină CL cu energia hυ. O altă
trăsătura esenţială a CL este durata emisiei, aceasta putând varia de la fracţiuni de
secundă la jumătate de oră.
Reacţiile de chemiluminescenţa pot fi grupate în trei categorii:
1) reacţii de chemiluminescenţă – sunt reacţiile chimice care utilizează compuşi
sintetici implicând specii puternic oxidante. De exemplu: bis (2,4,6 –triclorofenil)
oxalat sau TCPO în reacţie cu H2O2 produce un intermediar, -1,2-dioxetandiona- ,
care nu emite deloc lumină, dar, în schimb reacţionează cu un alt compus, denumit
florofor (de exemplu: 9,10-difenilantracen (DPA), formând un produs excitat care
emite rapid lumina)
2) reacţii de bioluminescenţă – sunt reacţiile emiţătoare de lumină care rezultă din
organismele vii, cum este licuriciul şi meduza
3) reacţii de electrochemiluminescenţă – sunt reacţiile emiţătoare de lumină care au
loc sub influenţa curentului electric.
Deoarece CL şi BL sunt fenomene frecvente în natură şi mai ales în
organismele vii, numeroase aplicaţii ale acestor tehnici au fost legate de studiul unor
procese biologice. CL este strâns legată de producerea, descompunerea şi chiar
simpla prezenţă a H2O2 în mediu. De aceea, orice reacţie care poate fi cuplată cu
producerea sau descompunerea H2O2 poate servi la determinarea prin CL a altor
compuşi. Reacţia catalizată de xantin oxidaza (XO) în prezenţă de Fe3+ şi a unui
agent complexant (EDTA) produce peroxidarea lipidelor microzomiale din ficat.
Procesul de peroxidare este inhibat de enzima superoxiddismutaza (SOD), sugerând
implicarea în reacţia a anionului superoxid şi a oxigenului singlet. Procesul de
peroxidare cuprinde o perioadă de iniţiere, în cursul căreia se formează radicalii
iniţiatori R. şi ROO., urmată de o a doua, o reacţie în lanţ, în care peroxizii formaţi
se propagă în structurile învecinate. În final, urmează o a treia perioadă caracterizată
prin descompunerea peroxizilor în aldehide şi cetone. Compuşi carbonilici (aldehide
şi cetone) rezultaţi din descompunerea peroxizilor lipidice (de exmplu:
malondialdehida=MDA) sunt în stare triplet sau singlet şi emit CL în regiunea 420-
450nm. De asemenea, autooxidarea acizilor graşi polinesaturaţi (AGPN) este o sursă
efectivă de CL şi este corelată liniar cu gradul de nesaturare al AGPN.
CL observată în omogenatele de ficat este crescută la animalele expuse la
agenţi hepatotoxici, care cresc conţinutul în peroxizi lipidici şi scade prin
administarea preventivă de antiozidanţi precum vitamina E şi glutation. Hepatocitele
ce au un conţinut scăzut în glutation redus prezintă o CL mai mare şi o acumulare
mai mare de MDA, CL şi formarea de glutation oxidat fiind astfel corelate direct
proporţional.
Determinările pe bază de BL folosesc următoarele principii:
 măsurarea directă a reactanţilor, cum sunt: ATP, FMN, NADH
 reacţii cuplate, în care reacţia luminescentă este indicator pentru
altă(e) reacţie(i)
90
 Determinările de ATP intracelular pot fi folosite pentru evaluarea viabilităţii
hematiilor, leucocitelor, trombocitelor, spermatozoizilor, etc. Măsurarea pierderii de
ATP dintr-o suspensie de celule permite monitorizarea imunodializei, proceselor de
coagulare, transplant, etc. Deasemenea, posibilitatea determinărilor unor compuşi
cuplaţi cu măsurarea ATP permite efectuarea unor analize pentru depistarea unor
boli congenitale la noii născuţi.
Faptul că un proces de chemiluminescenţă este propria sursă de radiaţie face
ca instrumentele de analiză, numite chemiluminometre, să fie foarte simple. Astfel,
un chemiluminometru nu necesită sursă de excitare (cum este cazul fluorescenţei şi
fosforescenţei), nu necesită monocromator şi adesea nici filtru. Schema unui
chemiluminometru este redată în figura II.4. 11.

Figura II.4.11 Reprezentarea schematică a unui chemiluminometru

A = Sistem de introducere a probei şi reactivilor; B = celula de
reacţie; C = detector; D = Sistem de achiziţie şi prelucrare a semnalelor; E =
Display

Chemiluminescenţa luminolului şi lucigeninei

Luminolul (C8H7N3O2; 5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona; LM) este o
substanţă care prezintă proprietăţi de chemiluminescenţă fiind larg utilizat în reacţia
care generează 3-aminoftalat (3-APA). Oxidantul cel mai utilizat este H2O2, emisia
radiaţiei de chemiluminescenţă a 3-APA fiind aproape instantanee şi scade la
aproximativ 50% dupa 8 secunde, atât intensitatea iniţială cât şi viteza de scădere a
acesteia fiind dependente de conţinutul de cupru.
Lucigenina (azotat de bis-N-metilacridina; LG) prezinta o emisie verde care
trece în albastru-verzui şi în final în albastru când este oxidată in mediu alcalin.
“Respiratory burst” (puseul oxidativ sau puseul respirator) este
caracterizat printr-o rapidă creştere în consumul de către celulă a radicalilor de
oxigen şi generarea din oxigenul molecular a radicalilor liberi de oxigen toxici.
Puseul oxidativ implică acţiunea unui grup de enzime cunoscute ca
91
nicotinamidadenindifosfat oxidaze (NADPH-oxidaze; NOX), enzime aflate în
citoplasma şi membrana fagozomului. Principalul efect al acestui grup de enzime
este acela de a converti oxigenul molecular în anionul superoxid (O2-), o specie înalt
oxidativă care are doi electroni neîmperechiaţi, fiecare electron fiind capabil de a
reacţiona cu un alt electron fapt ce duce la formarea unui alt radical liber, radicalul
hidroperoxid (H2O2).
Determinarea intensităţii puseului oxidativ granulocitar se poate realiza in
vitro prin chemiluminometrie cu luminol/lucigenină în urma stimulării cu PMA
(phorbol 12-myristate 13-acetate) sau OZ (zimozan opsonizat). PMA este un analog
structural al diacilglicerolului care fosforilează direct proteinkinaza C (PKC)
activând-o, fapt ce duce în final la activarea NADPH-oxidazelor şi producerea unei
mari cantităţi de ROS. Activarea NADPH oxidazelor realizată de PMA are loc pe
partea citosolică a membranei plasmatice urmând ca ulterior sa aibă loc translocarea
pe faţa mitocondrială. PMA induce activarea oxidazelor fapt ce pare legat de
eliberarea extracelulară a metaboliţilor ROS. Aceste concluzii au fost trase în urma
experimentelor ce detectează radicalul superoxid şi peroxidul de hidrogen format
extracelular utilizând molecule ce nu pot străbate membrana neutrofilelor şi ca
urmare detectează doar ROS extracelular. Luminolul detectează ROS intra şi
extracelular însă producţia este strict dependentă de activitatea peroxidazică a
mieloperoxidazei (MPO). Lucigenina din contră detectează numai superoxidul
format extracelular.
De asemenea ROS pot fi generaţi şi în urma stimulării cu zimozan opsonizat
(ZOP) care după fagocitoză va activa NADPH oxidazele via PKC. Zimozanul este
preparat din peretele celulei bacteriane şi este alcătuit dintr-un complex de proteine
carbohidrate. După opsonizare cu anticorpii şi factorii sistemului complement, care
vor fi recunoscuţi de receptorii prezenţi pe suprafaţa PMN, în urma fagocitozei are
loc activarea NADPH oxidazelor via PKC.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Puseul respirator
Celulele mononucleare sunt izolate prin centrifugare în gradient de densitate
pe Ficoll-PaqueTM Plus (1.0077g/mL). După centrifugare la 600g timp de 30 de
minute celulele sunt colectate, spălate de două ori în PBS (Dulbecco’s Phosphate
Buffered Saline), centrifugate la 200g timp de 10 minute celulele şi numărate.
Numărarea celulelor şi stabilirea viabilităţii celulare se realizează prin
colorarea cu Trypan Blue. Celulele vii nu încorporează Trypan Blue şi apar
birefringente la microscop, în timp ce celulele moarte se colorează în albastru. Pentru
determinarea numărului total de celule se foloseşte camera de numărare Burker-
Turk (hemacitometru), care se umple, prin capilaritate, cu suspensia celulară diluată
corespunzător cu Trypan Blue. Hemacitometrul este alcătuit din două camere,
fiecare dintre acestea fiind împărţită în 9 pătrate de 1mm. Deasupra acestora se
suprapune o lamelă de 0.1mm înălţime astfel încât volumul total deasupra fiecărui
92
pătrat este de 0.1mm3 sau 10-4cm3. Ştiind că 1cm2 este aproximativ egal cu 1mL,
concentraţia de celule per mL va fi reprezentată de media numărătorilor din fiecare
pătrat inmulţită cu 104.
Formulele folosite pentru determinarea concentraţiei celulare, a numărului de
celule şi a viabilităţii celulare sunt următoarele:
 concentraţia celulară = numărul mediu de celule x factorul de diluţie x 104
 numărul total de celule = concentraţia celulară x volumul de suspensie
celulară
 viabilitate % = numărul de celule vii/numărul total de celule x 100
După numărare, celulele mononucleare izolate sunt folosite pentru
determinarea puseului respirator într-o concentraţie de 0.25x106/mL. Citirea
unităţilor relative de chemiluminescenţă (RLU) se realizează după adăugarea de
LM/LG (0,143µmol/L) şi după stimularea cu PMA (concentraţie finală 5,4µmol/L)
sau OZ (concentraţie finală 0,83g/L).

93
 III. NOŢIUNI DE CALCUL STATISTIC AL ERORII
UNEI METODE DE ANALIZĂ BIOCHIMICĂ

Un proces analitic de măsură se desfăşoară în condiţii reale, condiţii în care

este supus permanent şi în toate etapele unor surse de perturbaţii. Sursele de
perturbaţii ce acţionează în procesul de analiză se pot clasifica în 3 mari categorii.
a) Surse de perturbaţii generale, legate de caracterul discret al materiei şi
energiei, de agitaţia termică a particulelor de materie, precum şi de
consecinţele principiului incertitudinii.
b) Surse de perturbaţii legate de condiţiile concrete în care operează sistemul
analitic. In cadrul acestor surse de perturbaţii intră vibraţiile, fluctuaţiile de
temperatură, umiditatea, iluminarea, alimentarea cu energie.
c) Surse de perturbaţii cauzate de imperfecţiuni ale sistemului analitic de măsură
şi ale modului de conducere a procesului de analiză. In această categorie de
surse de perturbaţii intră: manifestarea fenomenelor de interferenţă, calibrările
eronate, contaminarea probei de analizat.

Ca urmare a acţiunii perturbaţiilor, rezultatele măsurătorilor analitice şi apoi

rezultatele de analiză propriu-zise vor fi însoţite întotdeauna de erori. O eroare este
prin definiţie (1) diferenţa dintre valoarea măsurată şi valoarea adevărată sau (2)
incertitudinea estimată în executarea experienţei exprimată în termeni de mărimi
statistice.
Erorile sunt desemnate ca fiind erori întâmplătoare, erori sistematice şi erori
nepermise.
Erorile întâmplătoare sunt întâlnite când o măsurătoare este repetată şi
valorile obţinute nu corespund în mod exact. Motivele pentru care apar nepotriviri
între diferitele măsurători individuale trebuie să fie aceleaşi care determină şi
nepotrivirile între acestea şi valoarea adevărată. Erorile întâmplătoare sunt
experimentale sau accidentale şi includ erori de judecată şi erori rezultate din
condiţiile experimentale, sau din aplicarea unui procedeu impropriu pentru
măsurare.
Prin eroare sistematică se înţelege în analiza chimică eroarea care are un
caracter constant, adică distorsionează rezultatele determinărilor într-un singur sens,
cu o valoare constantă faţă de conţinutul adevărat. Erorile sistematice pot avea
diverse origini, putând fi rezultatul uneia sau mai multor cauze ce acţionează
concomitent. De exemplu ele pot apare ca urmare a folosirii incorecte a
instrumentelor de măsură incluse în sistem, datorită unei calibrări incorecte, folosirii
unor reactivi de puritate necorespunzătoare.
Erorile nepermise sunt erorile ce pot fi evitate, rezultând din citiri greşite la
aparate sau la balanţe, din lipsa condiţiilor experimentale corespunzătoare sau din
calcule incorecte.
Strâns legat de erorile de determinare s-au introdus şi se folosesc în practica
analitică noţiunile de precizie şi exactitate.
94
 Exactitatea este un criteriu de măsură a abaterii valorii măsurate de la valoarea
adevărată. Aceasta presupune cunoaşterea valorii exacte sau adevărate, ceea ce nu
este întotdeauna posibil deoarece implică posedarea unui etalon studiat pentru
comparaţie.
Precizia este un criteriu de măsurare a reproductibilităţii măsurătorii. Dacă
diferenţa între măsurătorile repetate este mare, precizia este mică. O precizie bună
nu înseamnă şi ca măsurătoarea este exactă, deoarece este posibil să se facă mereu
aceeaşi greşeală.
Incertitudinea este o expresie a extinderii unei erori într-o măsurătoare şi se
determină statistic sau prin propagarea erorilor estimate. O "valoare adevărată" a
unei mărimi măsurată experimental nu este cunoscută niciodată. Valoarea raportată
(care este adeseori media unei serii de măsurători) este considerată „cea mai bună
valoare“. Raportând această valoare „cea mai bună“ este util să se estimeze erorile
exprimate ca incetitudine prin semnul +. In acest fel se dau limitele în care se
presupune că se află valoarea reală. De exemplu, se consideră o soluţie de HCl
0,1106 + 0,0007 M. Soluţia nu conţine mai mult de 0,1113 şi mai puţin de 0,1099
moli de HCl per litru. Valoarea cea mai bună este 0,1106 M iar incertitudinea este +
0,0007 M.
In continuarea sunt prezentate procedee matematice pentru estimarea şi
raportarea marimii erorilor întilnite în alizele chimice.
Media este valoarea numerică obţinută prin împărţirea sumei unei serii de
măsurători identice la numărul rezultatelor individuale din serie:

Unde xi = măsurătoarea individuală, n = numărul total de măsurători

Abaterea medie este media abaterilor de la media aritmetică fără a ţine seama
de semn. Abaterea medie, d este calculată cu relaţia:

Unde xi - x este valorea absolută a abaterii numărului xi faţă de media aritmetică.

Abaterea standard, S poate fi obţinută din abaterile de la media aritmetică cu
ajutorul ecuaţiei:

Abaterea standard, σ, într-o formă statistică mai precisă este dată de ecuaţia:

95
 Această ecuaţie implică necesitatea executării unui număr mare de
determinări. Deoarece în practică se execută un număr relativ mic de măsurători, se
utilizează abaterea standard exprimată prin σ. Abaterea standard este preferabilă
abaterii medii deoarece este interpretabilă în mod statistic. In mod normal se poate
presupune că cu cât este mai mare numărul de măsurători pentru o probă dată cu atât
creşte certitudinea că media acestor numere corespunde rezultatului adevărat. Prin
urmare este de dorit să se efectueze un număr cât mai mare de determinări. Totuşi
există o limită practică dată fie de metoda de măsurare, fie de cantitatea de probă
oferită pentru analiză. Se pune problema care dintre măsurătorile efectuate trebuie
acceptată şi care trebuie respinsă. Alegerea acestora depinde de gradul de exactitate
cerut în cadrul analizei respective.
Abateria medie. După ce se obţine o abatere medie pentru o serie de
măsurători, datele se testează după cum urmează. Dacă o măsurătoare deviază de la
medie mai mult decât 4 d poate fi exclusă din media originală. Acest test se utilizează
numai când numărul măsurătorilor este mai mare decât 3.
Abaterea standard dacă mai multe măsurători sunt făcute pe o singură probă,
rezultatele se vor aprecia de o curbă de distribuţie normală (Gauss) în care frecvenţa
de răspândire a măsurătorilor este funcţie de valoarea măsurătorilor (figura III.1).

Figura III.1. Distribuţia ideală a valorilor măsurate faţă de medie

(Curba Gauss)

Conform curbei de distribuţie o măsurătoare se înscrie în domeniul +σ faţă de

medie cu o probabilitate de 68,26 %, în domeniul +2σ cu o probabilitate de 95,46 %
şi în domeniul +3σ faţă de medie cu o probabilitate de 99,7 %.
In mod normal când se utilitzează abaterea standard drept criteriu pentru
respingerea unei măsurători se foloseşte 3σ. Dacă valoarea unei măsurători oarecare
cade în afara acestui domeniu, aceasta poate fi respinsă. Testele de respingere 4d şi

96
3σ sunt dependente de numărul total de determinări. Dacă sunt suficiente date se
poate arăta că cele două teste de respingere sunt echivalente.
Distributia t Dacă s-au efectuat destule măsurători ale unei mărimi se va
obţine o distribuţie similară curbei Gauss. Deoarece în majoritatea determinărilor nu
este posibilă executarea unui număr mare de măsurători rezultatul provine din media
calculată care poate fi diferită de media distribuţiei. Distribuţia t prevede limitele în
care o medie va corespunde cu media distribuţiei.
Pentru a evalua limitele de certitudine se determina deviaţia standard a
măsurătorilor şi se obţine o valoare a lui t din tabel la un nivel de probabilitate dat.
Limitele pentru un anumit nivel de certitudine sunt apoi calculate prin formula:

unde t se obţine din tabel, σ este deviaţia standard şi n este numărul de măsurători
efectuate pe o anumită probă.

Tabel cu valorile lui t pentru anumite nivele de probabilitate:

Nr. de Nivel de certitudine

măsurători 80% 90% 95% 99%
3 1,89 2,92 4,3 9,92
4 1,64 2,35 3,8 5,84
5 1,53 2,13 2,78 4
6 1,48 2,02 2,57 4,03
7 1,44 1,94 2,45 3,71
8 1,42 1,90 2,36 3,5
9 1,40 1,86 2,31 3,36
10 1,38 1,83 2,26 3,25

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Calculul statistic va fi aplicat pentru determinarea clorului conform

metodologiei prezentate la volumetrie. Fiecare student va determina clorul din
eşantionul primit. La sfârşit fiecare grupă de studenţi va alcătui un tabel pe
baza căruia se vor prezenta rezultatele.

Nr. mg Cl /100 ml ser Xi - X (XI – X)2

1 X1 X1 - X (X1 – X)2
2 X2 X2 - X (X2 – X)2
3 X3 X3 - X (X3 – X)2
… … … …
10 X10 X10 - X (X10 – X)2
97
 Cu datele de tabel se vor calcula pe rând :
1. Deviaţia medie

Se va prezenta valoarea clorului în ser sub forma mg Cl /100 ml ser = x + 4 d

Valorile găsite experimental care nu intră în acest domeniul pot fi eliminate.

2. Deviaţia standard

Se va prezenta valoarea clorului în ser sub forma mg Cl /100 ml ser = x + 3 σ

Valorile găsite experimental care nu intră în acest domeniul pot fi eliminate.

3. Distribuţia t

Pentru diferite nivele de probabilitate se scoate valoarea lui t din tabel şi se

calculează nivelul de certitudine. Rezultatul se prezinta sub forma:

mg Cl /100 ml ser =

Se vor lua valorile lui t pentru nivelele de certitudine 90 %, 95 % şi 99 %. In

final se poate face o comparaţie între valorile obţinute pe baza celor trei metode
statistice.

98
 IV. ÎNSUŞIRILE PRINCIPALELOR CLASE DE COMPUŞI BIOCHIMICI

1. ACIZII NUCLEICI

Noţiuni teoretice

Acizii nucleici sunt produşi de policondensare a unor unităţi numite

nucleotide ce se află în celulele tuturor organismelor vii unde îndeplinesc roluri
importante în stocarea, transmiterea şi exprimarea informaţiei genetice. Molecula de
ADN conţine informaţia genetică cu privire la biosinteza proteinelor, exprimarea
acesteia realizându-se prin parcurgerea a două procese: transcrierea, respectiv
rescrierea unor părţi din molecula ADN-ului sub forma unui ARNm şi traducerea,
în cursul căreia mesajul genetic, ajuns sub formă de ARNm în citoplasmă, este
exprimat într-o secvenţă caracteristică unei proteine. Prin traducere, succesiunea de
triplete = codoni (grup de trei nucleotide) ce alcătuieşte ARN-ul mesager este tradusă
sub forma unui lanţ de aminoacizi, fiecărui codon corespunzându-i un aminoacid.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Tehnici generale:
1. Izolarea ADN
Există numeroase metode de izolare a ADN din materiale biologice. Toate
presupun liza celulei, urmată de deproteinizare şi recuperarea ADN-ului.
Diferenţele dintre metode vizează gradul de deproteinizare şi masa moleculară
a ADN-ului obţinut.
Ţesutul mărunţit şi îngheţat în azot lichid pentru a se obţine fragmente ce pot
fi rapid digerate enzimatic, este plasat într-o soluţie de proteinază K şi dodecil sulfat
de sodiu până când majoritatea proteinelor celulare sunt degradate (dacă se
intenţioneză obţinerea ADN din ficat trebuie în prealabil îndepărtată vezica biliară
care conţine mari cantităţi de enzime degradative). Digeratul este deproteinizat prin
extracţii succesive cu fenol/cloroform/alcool izoamilic, după care ADN-ul este
recuperat prin precipitare cu etanol, uscat şi resuspendat în tampon.
Pentru a minimaliza activitatea nucleazelor endogene este esenţială izolarea
rapidă, tăierea şi îngheţarea ţesutului.

Mod de lucru
a. Imediat după excizia ţesutului acesta este mărunţit şi îngheţat în azot lichid, după
care se adaugă 1,2 ml tampon de digestie (100 mM NaCl, 10 mM Tris.Cl pH 8, 25
mM EDTA pH 8, 0,5 % dodecil sulfat de sodiu, 0,1 mg/ml proteinază K) pentru
fiecare 100 mg ţesut;
b. Probele sunt incubate la 50oC pentru 12-18 ore în eprubete închise perfect;
c. Acizii nucleici sunt extraşi cu un volum egal de fenol/cloroform/alcool izoamilic
(25:24:1);
99
d. Amestecul este centrifugat 10 min. la 1700 x g;
e. Faza superioară apoasă este transferată într-un alt tub şi se adaugă un volum de
acetat de amoniu 7,5 M egal cu jumătate din volumul probei şi 2 volume de etanol
100%. ADN-ul precipită imediat şi este recuperat prin centrifugare la 1700 x g timp
de 2 min.;
f. Precipitatul este spălat cu etanol 70%, după care este lăsat să se usuce la aer;
g. ADN-ul obţinut este resuspendat în tampon TE (10 mM Tris.Cl pH 7,4, EDTA
1mM pH 8) până la dizolvare; pentru a ajuta acest proces ADN-ul poate fi agitat
încet la temperatura camerei sau la 65oC câteva ore;
h. ARN-ul rezidual poate fi eliminat, dacă este cazul, prin adăugarea de 0,1% dodecil
sulfat de sodiu şi 1 mg/ml RN-ază şi incubare la 37oC timp de 1 oră, urmată de
extracţie organică şi precipitare cu etanol aşa cum s-a descris mai sus.
i. ADN-ul obţinut se păstrează la 4oC.
Se obţin aproximativ 2 mg ADN dintr-un gram de ţesut, cu o lungime de
minimum 100 kb.
2. Izolarea ARN-ului
Dificultatea în izolarea ARN constă în aceea că majoritatea ribonucleazelor
sunt foarte stabile şi active şi nu necesită prezenţa cofactorilor. De aceea primul pas
în izolarea ARN constă în liza celulei într-un mediu care duce la denaturarea
acestora.
Ţesutul este omogenizat într-o soluţie denaturantă ce conţine 4 M guanidiniu
tiocianat. La homogenat se adaugă acetat de sodiu 2 M pH 4, fenol şi
cloroform/alcool izoamilic. Amestecul rezultat este centrifugat, ARN-ul fiind situat
în faza apoasă superioară. ADN-ul rămâne în faza organică, în timp ce proteinele
sunt situate în interfază. După precipitarea cu izopropanol, ARN-ul este redizolvat
în soluţie denaturantă, reprecipitat cu izopropanol şi spălat cu etanol 75%.
Etape:
a. 100 mg ţesut se omogenizează într-un omogenizator de sticlă cu 1 ml soluţie
denaturantă (guanidiniu tiocianat 4 M, citrat de sodiu 25 mM pH 7, 0,1 M 2-
mercaptoetanol, 0,5% lauroil sarcozină); guanidiniu tiocianatul este cel mai utilizat
denaturant proteic, liza celulelor având loc aproape instantaneu;
b. Se adaugă 0,1 ml acetat de sodiu 2 M pH 4 şi se amestecă prin răsturnare. Se
adaugă apoi 1 ml fenol saturat cu apă şi se amestecă bine, după care se adaugă 0,2
ml cloroform/alcool izoamilic 49:1 şi se incubează 15 min. la 0-4oC;
c. Se centrifughează 20 min. la 9000 rpm (10 000 x g) la 4oC. Faza apoasă se tranferă
într-o altă eprubetă de centrifugă; proteinele şi fragmentele mici de ADN (50 baze-
10 kb) se găsesc în faza organică iar fragmentele mai mari de ADN în intrefază;
d. ARN se precipită prin adăugarea a 1ml izopropanol 100%; probele sunt ţinute la
-20oC 30 min. şi centrifugate 10 min. la 10 000 x g şi 4oC, aruncându-se
supernatantul. Dacă se urmăreşte izolarea ARN din ţesuturi bogate în glicogen, de
ex. ficatul, după precipitarea cu izopropanol, se spală glicogenul cu LiCl 4 M,
operaţie urmată de centrifugarea 10 min. la 5000 x g şi dizolvarea ARN-ului obţinut
în soluţie denaturantă. În continuare este urmat protocolul iniţial.
100
e. ARN obţinut este dizolvat în soluţie denaturantă şi este transferat într-o eprubetă
de centrifugă;
f. Prin adăugarea de izopropanol 100% ARN-ul este precipitat la -20oC, timp de 30
min. şi este apoi centrifugat la 10 000 x g, 10 min., la 4oC aruncându-se
supernatantul;
g. Se resuspendă ARN-ul în etanol 75%, se agită şi se lasă la temperatura camerei
10-15 min. pentru a dizolva eventualele urme de guanidiniu ce ar putea contamina
produsul;
h. Se centrifugheză 5 min. la 10 000 x g şi se aruncă supernatantul; ARN-ul se usucă
la vid 5-15 min.( uscarea nu trebuie să fie completă pentru a se evita micşorarea
solubilităţii acestuia);
i. ARN-ul obţinut se dizolvă în apă sau 0,5% dodecil sulfat de sodiu tratate cu
dietilpirocarbonat (pentru a inhiba RN-azele) şi se păstrează la -20oC.
Prin această metodă se obţine intreaga gamă de molecule de ARN, inclusiv
cele mici (4S şi 5S). Cantitatea obţinuta variază funcţie de ţesutul din care s-a izolat,
respectiv 100 - 150 μg din 100 mg muşchi şi până la 800 μg din 100 mg ficat.
Raportul A260/A280 pentru ARN-ul izolat este în acest caz >1,8.

3. Identificarea ADN-ului

Principiul metodei: când ADN-ul este tratat cu difenilamină în mediu acid se

formează un compus colorat albastru ce are un maxim de absorbţie situat la 595
nm. În mediu acid 2-dezoxiriboza (în forma aciclică) este convertită la β-
hidroxilevulin-aldehidă, extrem de reactivă, care cu difenilamina formează un compus
colorat. Numai dezoxiriboza nucleotidelor purinice poate da această reacţie,
concentraţia obţinută exprimând deci jumătate din cantitatea de ADN prezent.

Mod de lucru
Intr-o eprubetă se măsoară 1 ml soluţie ADN peste care se adaugă 2 ml soluţie
de difenilamină. Se încălzeşte pe baia de apă la fierbere 10 minute.
Prezenţa ADN se evidenţiază prin apariţia unei culori albastre; intensitatea
culorii este proporţională cu cantitatea de ADN din probă.

4. Identificarea ARN-ului

Principiul metodei: în mediu puternic acid şi prin încălzire riboza formează

furfural; acesta formează cu orcinolul un complex colorat verde, care absoarbe la
665 nm.

Mod de lucru
Intr-o eprubetă se măsoară 0,2 ml soluţie ARN care se diluează la 1,5 ml cu
ser fiziologic. Se adaugă 1,5 ml orcinol şi se încălzeşte amestecul de reacţie pe baia

101
de apă la fierbere timp de 20 minute. Apariţia unei culori verzi evidenţiază prezenţa
ARN-ului iar intensitatea culorii este proporţională cu cantitatea de ARN din probă.

5. Identificarea componentelor structurale ale acizilor nucleici

Prin hidroliză în mediu acid, acizii nucleici extraşi pun în libertate

componentele lor structurale, şi anume: baze azotate, pentoze şi acid ortofosforic. Se
vor efectua reacţii de identificare specifice pentru fiecare dintre aceste componente
structurale.

a. Identificarea bazelor azotate purinice

Principiul metodei: bazele purinice în prezenţa ionilor de Ag+ precipită

ca săruri de argint de culoare brună.

Mod de lucru
Într-o eprubetă se introduc 1-2 ml hidrolizat peste care se adaugă 0,5-1 ml
soluţie de AgNO3. Apariţia precipitatului brun indică prezenţa bazelor purinice.

b. Identificarea pentozelor
Se efectuează după procedeele descrise anterior.

c. Identificarea acidului fosforic

Principiul metodei: acidul fosforic reacţionează cu molibdatul de amoniu în

prezenţă de hidroxilamină cu formarea unui compus colorat în albastru (amestec de
oxizi de molibden [Mo2O5. 6 MoO3]).

Mod de lucru
La 0,5-1 ml hidrolizat de acizi nucleici se adaugă 1 ml hidroxilamină şi 0,5 ml
soluţie de molibdat de amoniu (în H2SO4). Se omogenizează bine (eventual se
încălzeşte) şi după 2-3 minute se adaugă 0,5 ml soluţie NaOH 16%.Apariţia unei
culori albastre indică prezenţa acidului ortofosforic.

6. Determinarea cantitativă a ADN şi ARN

a. Spectroscopie de absorbţie
Acizii nucleici absorb puternic în domeniul UV al spectrului, datorită dublelor
legături conjugate ale nucleelor purinice şi pirimidinice. Ei prezintă un maxim
de aborbţie situat la 260 nm şi un minim la 230 nm.

102
 Absorbţia probei este măsurată la diferite lungimi de undă pentru a determina
puritatea şi concentraţia acizilor nucleici. Măsurătorile la 260 nm sunt precise pentru
preparate relativ pure ce conţin mg de acizi nucleici. Citirile nu pot face distincţie
între ADN şi ARN. Raportul A260/A280 poate fi utilizat ca indicator al purităţii acizilor
nucleici. Proteinele de exemplu, absorb la 280 nm ceea ce va reduce raportul
A260/A280. Absorbţia la 325 nm indică prezenţa unor impurităţi în soluţie sau faptul
că cuvele sunt murdare, în timp ce contaminanţii ce conţin legături peptidice sau
nucleee aromatice (fenol, uree, etc.) absorb la 230 nm.
O absorbţie la 260 nm de 1,0 indică 50 mg ADN dublu catenar/ml,~37 mg
ADN monocatenar/ml, sau ~40 mg ARN monocatenar/ml.
A260/A280 egal cu 1,8 - 1,9 şi respectiv 1,9 - 2,0 indică preparate foarte pure
de ADN, respectiv ARN. Contaminanţii care absorb la 280 nm (respectiv proteinele)
scad acest raport.
Un preparat foarte pur de ADN are următoarele valori ale absorbţiei la cele 4
lungimi de undă:

Lungime de undă (nm) Absorbanţă A260/A280 Concentraţie

(mg/ml)
325 0,01 - -
280 0,28 - -
260 0,56 2,0 28
230 0,30 - -

b. Detecţia ADN-ului utilizând fluorocromul H33258

Determinările fluorimetrice sunt mai simple şi mult mai sensibile decât
măsurătorile spectrofotometrice. Depistând cantităţi de ng, fluorocromul H 33258
are afinitate mică pentru ARN şi poate fi utilizat la fel de bine pentru omogenate
celulare sau pentru preparate purificate de ADN. Excitaţia se face la lungimea de
undă de 365 nm iar cea de emisie este de 450-460 nm. Fluorocromul este foarte
sensibil la schimbări în structura ADN, legându-se preferenţial la regiunile bogate în
adenină şi timină.

c. Detecţia ADN şi ARN cu ajutorul fluorescenţei bromurii de etidiu

Bromura de etidiu este mai puţin dependentă de schimbările în compoziţia

ADN decât fuorocromul H 33258 şi mai puţin sensibilă. Ea poate detecta totuşi
cantităţi de ng ADN, dar se leagă în egală măsură şi la ARN. Lungimea de undă la
care are loc excitaţia este de 302 nm sau 546 nm iar cea de emisie de 590 nm. Cu
ajutorul ei se poate estima foarte rapid concentraţia de ADN dintr-o probă. Atât
proba cât şi cantităţi crescătoare de ADN pur (standarde) se amestecă cu 4 ml dintr-
o soluţie 1 mg/ml bromură de etidiu. Pe un plastic plasat pe un transiluminator UV

103
se picură una lângă alta aceeaşi cantitate din soluţiile de ADN pur (standardele) şi
cea de analizat. După fotografiere se estimează concentraţia de ADN din probă prin
compararea cu fluorescenţa standardelor.

7. Denaturarea termică a ADN-ului

Prin încălzirea lentă a unei soluţii dublu catenare absorbţia acesteia la 260 nm
suferă variaţii puţin importante până când se atinge o anumită valoare numită
“temperatură mijlocie de tranziţie” (Tm). După această temperatură absorbanţa creşte
rapid pentru a atinge o valoare maximă, care nu se va modifica chiar dacă
temperatura continuă să crească. La Tm legăturile de hidrogen între perechile de baze
de pe catenele opuse se rup şi cele două catene ale ADN se separă. Dacă soluţia este
răcită lent cele două catene se recombină şi curba de răcire se suprapune perfect peste
curba de încălzire. Dacă, însă, ADN-ul este răcit brusc, cele două catene se
recombină parţial şi aleatoriu iar curba absorbanţei este mult diferită de cea de
denaturare.

Fig. IV.1. Denaturarea termică a ADN-ului

ADN-urile extrase din surse diferite se deosebesc prin raportul A+T/G+C
care poate fi mai mic decât 1, egal cu 1 sau mai mare decât 1. Cu cât un ADN dat
are un conţinut mai mare de G+C cu atât curba sa de denaturare termică este mai
deplasată spre dreapta. Explicaţia denaturării la temperaturi mai ridicate a ADN-
urilor cu conţinut mai mare de G+C rezidă în asocierea acestor două baze prin trei
legături de hidrogen faţă de două în cazul asocierii A cu T.

104
Fig. IV.2. Reprezentarea denaturării ADN în funcţie de conţinutul în G şi C

Reprezentând grafic valorile T m ale diferitelor ADN-uri în funcţie de

conţinutul G+C se obţine o dreaptă. Dreapta serveşte în continuare pentru obţinerea
pe baza valorii Tm determinate a conţinutului G+C la ADN-uri cu compoziţie
necunoscută.

Fig. IV.3 Reprezentarea grafică a Tm pentru diferite ADN-uri în funcţie de

conţinutul în G şi C

Prin denaturea termică a ADN-lui scade şi vâscozitatea soluţiei ca urmare a

transformarii dublei elice într-o structură dezorganizată.

Mod de lucru
Se introduc în vâscozimetru 8 ml soluţie de “ADN pentru denaturare”. Se
măsoară (repetând de 3-4 ori) timpul necesar scurgerii soluţiei între cele două repere.
Alţi 8 ml din aceeaşi soluţie se introduc într-o eprubetă cu dop rodat. Această eprubetă
se introduce într-un vas cu apă care se încălzeşte încet şi apoi se fierbe timp de 10
minute. După aceasta, conţinutul eprubetei se introduce rapid într-un vas cu apă rece
unde se ţine 5 minute şi se trece apoi în vâscozimetru procedându-se ca în cazul ADN
nedenaturat. Se compară timpul obţinut cu cel anterior.

105
 Tehnici speciale

1. Purificarea şi concentrarea ADN-ului din soluţii apoase

Aceste tehnici sunt utile atunci când proteine sau alte molecule solubile
trebuie eliminate sau atunci când soluţiile de ADN necesită concentrarea.
Extracţia cu fenol şi precipitarea cu etanol a ADN se pretează bine pentru
volume mici de probă.
ADN-ul de purificat aflat în soluţie este mai întâi extras cu un amestec de
fenol/cloroform/alcool izoamilic 25:24:1 pentru a îndepărta proteinele contaminante,
după care este precipitat cu etanol 100%. ADN-ul precipitat este spălat cu etanol
70% pentru a îndepărta sărurile şi moleculele organice mici şi este resuspendat în
tampon TE până la concentraţia dorită. Dacă moleculele de ADN sunt foarte mici
(<200 baze) se utilizează în această etapă etanol 95%.
Concentrarea ADN utilizând 2-butanol se utilizează atunci când avem volume
mari de soluţii ce conţin ADN, dar acestea sunt foarte diluate; în paralel cu
concentrarea soluţiei creşte şi concentraţia de săruri, ceea ce va face necesară
reprecipitarea ADN-ului şi resuspendarea acestuia.
Îndepărtarea resturilor de fenol, cloroform sau butanol se poate face prin
extracţie cu eter, urmată de evaporarea acestuia;
Purificarea ADN cu ajutorul “paturilor de sticlă”
În prezenţa unor concentraţii mari de NaI, ADN se leagă de mici particule
de sticlă aflate în suspensie. Suspensia se spală apoi pentru a îndepărta proteinele,
ARN-ul, solvenţii organici contaminanţi precum şi NaI, după care ADN-ul este eluat
cu apă sau tampon TE timp de 2-3 min. la 45oC. Dezavantajul acestei metode este că
se recuperează doar 50-75% din produsul iniţial. Metoda este utilizată optim pentru
fragmente de ADN mai mari de 500 bp, în timp ce fragmentele de 3-5 kb rămân
fixate pe sticlă.
Pentru diverse aplicaţii de biologie moleculară, ADN-ul utilizat trebuie să
fie foarte pur. O metodă foarte eficientă şi rapidă este cromatografia pe răşini
schimbătoare de anioni. Acizii nucleici încărcaţi negativ, sunt trecuţi pe o coloană
ce conţine o răşină schimbătoare de anioni având un număr mare de grupări încărcate
pozitiv de care se vor leaga acizii nucleici. Probele sunt dizolvate în tampoane cu pH
aproape neutru şi cu tărie ionică moderată. Spălarea ulterioară a coloanei cu
tampoane adecvate îndepărtează impurităţile conţinute în probă, obţinându-se astfel
preparate deosebit de pure.
Alta variantă de purificare a probelor este gel filtrarea. În acest caz
moleculele mari de acizi nucleici trec cu uşurinţă prin gel în timp ce moleculele
contaminante (ARNs mici şi oligonucleotidele) sunt reţinute.

2. Separarea diverselor fragmente de ADN

106
 a. Electroforeza în gel de agaroză
Este o metodă simplă şi eficientă pentru separarea, identificarea şi purificarea
fragmentelor de ADN ce conţin între 0,5-25 kb.
Tehnica parcurge trei etape:
1. prepararea unui gel cu un conţinut adecvat de agaroză având în vedere
fragmentele ce urmează să fie separate
2. încărcarea probelor şi migrarea la un voltaj şi un timp optime separării
3. colorarea gelului şi, sau dacă bromura de etidiu a fost inclusă în gel,
vizualizarea în lumină UV. Moleculele de ADN expuse unui câmp electric migrează
spre anod datorită sarcinilor negative ale grupărilor lor fosfat. Viteza de migrare este
limitată de forţele de frecare impuse de gel. În timp ce sarcina şi/sau mărimea pot
afecta viteza cu care macromoleculele traversează gelul, raportul sarcină/masă este
acelaşi pentru molecule de ADN de diferite lungimi. De aceea, mărimea moleculei
va fi cea care determină viteza cu care aceasta migrează, determinând o separare
foarte bună a amestecurilor de ADN cu diferite lungimi.

Mod de lucru
Se prepară volumul necesar de tampon TAE (40 mM Tris acetat, 2 mM
Na2EDTA, pH 8,5) sau TBE (89 mM Tris, 89 mM acid boric, 2 mM EDTA, pH 8,0)
pentru a umple tancul de electroforeză şi a prepara gelul. În general gelurile au un
conţinut de 0,8-1,5 % agaroză şi o grosime de 0,5-1,0 cm. Dizolvarea agarozei se
face la cald şi cu agitare, după care gelul se răceşte la 55oC înainte de a fi turnat.
Alegerea concentraţiei de agaroză se face funcţie de mărimea fragmentelor de ADN
ce urmează a fi separate:

Agaroză (%) Lungimea fragmentelor liniare de ADN (kb) ce

pot fi separate gmentelor de ADN liniare (kb)

0,5 30-1
0,7 12-0,8
1,0 10-0,5
1,2 7-0,4
1,5 3-0,2

Gelul se toarnă pe o placă de sticlă plasată într-o platformă închisă (astfel încât
să nu curgă), nu înainte de a se aplica pieptenele care va forma în gel orificii egale
în care se vor aplica probele. Pentru a facilita vizualizarea migrării fragmentelor de
μg/ml).
După ce gelul s-a răcit, se plasează în cuva de electroforeză şi se acoperă cu tampon
de electroforeză. Probele se vor prepara în acelaşi tampon cu cel folosit la migrare şi
se vor aplica în godeurile obţinute cu ajutorul pieptenului cu o micropipetă, cu grijă
pentru a împiedica amestecarea lor. Mărimea probei aplicate depinde evident de
mărimea godeului şi variază între 5 - 200 ng dacă este vorba de un singur fragment
107
de ADN sau între 0,1-10 g dacă proba conţine mai multe fragmente de diferite
mărimi.
Obligatoriu la fiecare migrare într-unul dintre godeuri se aplică un marker de
greutate moleculară pentru ADN, adică un amestec de fragmente de ADN, având
greutăţi moleculare cunoscute, obţinute cu ajutorul enzimelor de restricţie dintr-un
bacteriofag  sau, pentru fragmente mai mici, din plasmidul pBR322.

Pentru analize mai rapide (calitative) se folosesc de obicei mini- sau

midigeluri, care au şi avantajul folosirii unei cantităţi mai mici de ADN. În general
pentru aceste geluri se foloseşte un voltaj de 10 V/cm, o concentraţie de 0,5-1,0 %
agaroză şi tampon TAE, deşi se epuizează mai repede decât tamponul TBE. Dacă se
doreşte însă separarea unor fragmente mai mari de ADN se vor folosi geluri cu un
conţinut mai mic de agaroză şi un voltaj de 1V/cm, pentru că moleculele migrează
cu atât mai repede cu cât voltajul este mai mare.

b. Puls- field electroforeza

Este modalitatea cea mai utilizată pentru separarea unor fragmente de ADN mai
lungi de 25 kb, până la 2000 kb. În cazul electroforezei în gel, moleculele mai mici pot
trece uşor prin majoritatea porilor gelului, în timp ce moleculele mai mari trebuie să
“se subţieze” sau să-şi schimbe conformaţia, deplasându-se astfel mai încet.
Mobilitatea moleculei este deci dependentă de numărul de pori care pot fi traversaţi cu
uşurinţă, proces care poate fi numit “cernere”. Moleculele mai mari decât o anumită
dimensiune trebuie să se “subţieze” chiar şi la trecerea prin porii mai mari, drept pentru
care ele migrează cu aceeaşi viteză, numită “mobilitate limită”. Pentru gelurile
obişnuite de agaroză vorbim de mobilitatea limită pentru molecule care au 20-40 kb.
Separarea acestor molecule se poate însă realiza prin schimbarea orientării câmpului
electric sau mai bine prin modificarea unghiului câmpului electric. Pentru a trece
printr-un por al gelului molecula este obligată să capete o conformaţie extinsă (proces
care poate dura între milisecunde şi minute, depinzând de mărimea moleculei), dar
odată extinsă ea va putea traversa cu uşurinţă şi alţi pori. Dacă această moleculă este
108
însă obligată să-şi schimbe direcţia prin schimbarea orientării câmpului sau a unghiului
de aplicare a câmpului, ea va fi obligată să-şi schimbe mai întâi conformaţia astfel încât
să poată să se deplaseze pe noua direcţie. Cu cât molecula este mai mare cu atât îi va
trebui mai mult timp pentru a-şi schimba conformaţia. Aceste diferenţe de timp sunt
cele care vor determina în final separarea moleculelor. De exemplu, chiar dacă
molecule de 100 kb şi 200 kb migrează cu viteze comparabile în condiţii obişnuite, de
fiecare dată când se schimbă direcţia câmpului molecula de 100 kb va fi mai rapidă
decât cea de 200 kb.

c. Electroforeza în gel de poliacrilamidă

Poate fi folosită cu succes pentru separarea fragmentelor de acizi nucleici

având mase moleculare mici. În particular, micile fragmente de ADN având <500 bp
care se separă relativ greu pe un gel de agaroză pot fi uşor separate pe un gel de
poliacrilamidă. În funcţie de mărimea porilor gelului (3,5%-20% poliacrilamidă) se
pot separa fragmente între 10 şi 1000 bp. Concentraţia de poliacrilamidă care oferă
rezoluţia maximă pentru separarea fragmentelor de ADN s-a stabilit empiric:

Acrilamidă (%) Mărimea fragmentelor

separate (bp)
3,5 100-1000
5,0 100-500
8,0 60-400
12,0 50-200
20,0 5-100
Avantajele utilizării gelului de poliacrilamidă constau din faptul că pot fi
analizate cantităţi mici de ADN (1 μg) iar fracţiunile separate nu conţin materiale
contaminante care ar putea interfera cu enzimele utilizate la clonare, secvenţializare
sau marcarea ADN-ului.

Mod de lucru
Se asamblează plăcile de sticlă având grijă deosebită la sigilarea acestora
(pentru a nu se pierde gelul). Se prepară gelul având concentraţia dorită de acrilamidă
(funcţie de mărimea fragmentelor ce urmează a fi separate) şi se degazează
amestecul sub vid timp de câteva minute. Se toarnă gelul între plăci, se inserează
pieptenele adecvat şi se lasă să polimerizeze minim 30 minute, la temperatura
camerei. După polimerizare se scoate pieptenele, se spală godeurile cu apă distilată,
se umple tancul de electroforeză cu tampon şi se fixează gelul la aparat. Se aplică
probele şi markerii de greutate moleculară, migrarea făcându-se la cca. 5V/cm cu
grijă pentru a evita supraîncălzirea gelului (într-o asemenea situaţie probele din
centru vor migra mai rapid). Când separarea este considerată încheiată, gelul se
detaşează din aparat, se despart cele două plăci de sticlă cu grijă astfel încât să
rămână ataşat de una dintre ele şi se introduce într-o soluţie de bromură de etidiu 0,5
109
mg/ml după care fragmentele de ADN separate se pot vizualiza (şi eventual
fotografia) în lumină UV.

3. Izolarea şi purificarea fragmentelor de ADN separate prin electroforeză pe

agaroză sau poliacrilamidă

a. Electroeluţia se poate aplica pentru fragmente de 50-20.000 pb. Porţiunea

de gel care conţine fragmentul dorit este tăiată sub lumină UV şi plasată într-un tub
de dializă umplut cu tampon de migrare (TAE). Tubul este plasat apoi într-o cuvă de
electroforeză orizontală la aprox. 2V/cm suficient timp pentru ca ADN-ul să "iasă
din gel". Tamponul din tubul de dializă este aspirat cu grijă cu o pipetă Pasteur şi
este supus apoi operaţiilor de concentrare.
b. Izolarea fragmentelor de ADN utilizând agaroză având punctul de topire
scăzut este o metodă foarte comodă de separare a fragmentelor de ADN. După
separarea acestor fragmente, se decupează cu grijă fragmentul de dorit, agaroză este
"topită" prin încălzire la 65oC şi ADN-ul este extras cu fenol. O variantă şi mai
-agarază pentru digestia agarozei, urmată de
precipitarea cu etanol a aligozaharidelor.
c. Electroforeza pe hîrtie NA-45 este adecvată pentru fragmente mici de ADN
(<2000 bp). Electroforeza (pe gel de agaroză ce conţine şi bromură de etidiu) decurge
normal până în momentul în care separarea fragmentului de interes de ceilalţi
contaminanţi este realizată. Se opreşte temporar migrarea şi se practică două tăieturi
în gel, deasupra şi sub fragmentul de interes, după care în aceste tăieturi se introduc
bucăţele de hârtie NA-45. Se continuă electroforeza în aceleaşi condiţii până când
ADN-ul de interes a migrat pe hârtie. De pe hârtie ADN-ul se eluează cu un tampon
adecvat la 70oC, se extrage cu fenol/cloroform/alcool izoamilic şi se precipită cu
etanol.

4. Analiza secvenţei ADN prin Southern blotting şi hibridare

Southern blotting este o tehnică de transfer a fragmentelor de ADN de pe gel

pe o membrană suport. Transferul sau tratamentele ulterioare duc la imobilizarea
fragmentelor de ADN, asfel încât membrana reprezintă o reproducere fidelă a
gelului.
Etape:
a. Electroforeza amestecului de fragmente ADN pe gel de agaroză alături de
markeri adecvaţi de greutate;
b. Gelul este imersat într-o soluţie de HCl 0,25 M sau NaOH 0,4 M în funcţie
de membrana de transfer utilizată (nitroceluloză sau nylon) şi de tamponul utilizat
la transfer. Această etapă duce la depurinarea fragmentelor de ADN, ducând în final
la denaturarea dublului helix. Urmează neutralizarea gelului la pH<9 (dacă pH-ul
este mai mare de 9, ADN-ul nu se va lega de membrana de nitroceluloză);

110
 c. Transferul propriu-zis se realizează prin capilaritate cu ajutorul unui tampon
cu forţă ionică mare (3 M NaCl, 0,3 M citrat de sodiu, pH 7,0) (dacă este o membrană
de nitroceluloză sau nylon) sau cu o soluţie 0,4 M NaOH (dacă este o membrană de
nylon încărcată pozitiv).
Gelul se plasează pe o hîrtie de filtru Whatman îmbibată cu tamponul de
transfer şi imersată în vasul rezervor. Peste el se plasează membrana, un teanc de
şerveţele absorbante şi o greutate suficientă pentru a asigura un contact bun între gel
şi membrană. Transferul se realizează peste noapte. Dacă se foloseşte o soluţie
alcalină pentru transfer, timpul necesar este de numai 2 ore. Hîrtiile absorbante "trag"
odată cu soluţia din gel şi fragmentele de ADN care se vor fixa de membrană. Se
dezmembrează piramida de transfer şi se spală membrana pentru îndepărtarea
eventualelor fragmente de agaroză şi a excesului de sare sau pentru a neutraliza
membrana (în cazul folosirii soluţiilor alcaline).

d. Imobilizarea ADN-ului se face prin expunerea membranelor de nylon la

lumina UV (254 nm), când se realizează legarea covalentă încrucişată a ADN-ului
de membrană, sau încălzirea sub vid, la 80oC a membranelor de nitroceluloză,
legându-se astfel necovalent ADN-ul de membrană. Dacă avem însă o membrană de
nylon încărcată pozitiv nu mai sunt necesare aceste tratamente.

111
 Southern blotting se poate realiza şi în direcţia inversă, adică membrana să
fie plasată sub gel (downward capillary transfer).

În cazul gelurilor de poliacrilamidă transferul prin capilaritate nu

funcţionează din cauza dimensiunilor mici ale porilor gelului, difuzia ADN-ului
neputând avea loc. Se apelează în acest caz la "electroblotting transfer". După ce
migrarea fragmentelor de ADN a avut loc, peste gel se aplică o hârtie de filtru
umectată cu tampon de electroforeză (se evită astfel ruperea gelului) şi se
construieşte similar ca în cazul gelului de agaroză "piramida de transfer". Această
piramidă este plasată apoi într-o cuvă specială (electroblotter) şi are loc transferul
electric al ADN la 30 V timp de 4 ore într-o incintă răcită. Dacă gelul a fost
nedenaturant, membrana se poate denatura prin plasarea timp de 10 minute, cu ADN
în sus, pe hârtii Whatman îmbibate cu NaOH 0,4 M.
Membranele obţinute se pot păstra uscate între hârtii Whatman câteva luni
sau pe termen mai lung într-un desicator la 4oC.
Hibridizarea este o metodă de analiză prin care o catenă de ADN sau o
moleculă de ARN având o secvenţă nucleotidică bine cunoscută (proba) se
împerechează cu o altă moleculă de ADN sau ARN ce conţine o secvenţă
complementară (ţinta), stabilitatea hibridului obţinut depinzând de numărul de baze
care se împerechează. Experimental această analiză foloseşte o probă marcată
radioactiv cu 32P sau 35S şi un ADN ţintă care a fost imobilizat pe o membrană.
Metoda este deosebit de sensibilă permiţând detecţia unei unice copii a unei gene
într-un genom şi detectarea unei molecule de ADN recombinant în coloniile
bacteriene. Un experiment de acest tip are loc în trei etape:
- incubarea membranei cu o soluţie de preincubare ce conţine agenţi care
blochează situsurile de legare nespecifice ale ADN, în acest fel reducând hibridarea
nespecifică;
- incubarea timp de 24 ore a membranei cu proba radioactivă, permiţând
astfel legarea probei la secvenţele ţintă din ADN-ul imobilizat; în această etapă proba
se leagă nu numai la secvenţele ce au 100% complementaritate cu ea ci şi la secvenţe
uşor necomplementare;
- membrana este spălată pentru a îndepărta toate moleculele de probă legate
mai puţin puternic, astfel încât vor rămâne numai cele legate de secvenţe
complementare;
Membranele se pot utiliza de mai multe ori pentru hibridare, după extracţia
hibridului de pe ele cu deosebite precauţiuni, având în vedere faptul că legăturile
112
între ADN şi membrană sunt covalente (excepţie în cazul membranelor de
nitroceluloză, unde sunt hidrofobe) în timp ce legăturile ADN-probă sunt legături de
hidrogen. Tratamentul aplicat membranelor depinde de cât de tare se leagă proba de
ţintă, deci de conţinutul de GC al probei şi de numărul de perechi de baze care se
formează.
5. Determinarea secvenţei ADN-ului
Tehnicile de secvenţiere se bazează pe fragmentarea şi electroforeza în geluri de
poliacrilamidă denaturante a fragmentelor rezultate, urmată de identificarea
acestora. Gelurile de secvenţiere pot separa oligonucleotide monocatenare cu
lungime de 500 baze ce diferă doar printr-un singur dezoxinucleotid. Practic,
pentru o regiune ce urmează a fi secvenţiată se generează un set de
oligonucleotide monocatenare marcate, având un capăt identic şi diferind la
celălalt cu câte un dezoxinucleotid. Cheia acestui proces este generarea prin
patru reacţii chimice sau enzimatice a tuturor oligonucleotidelor care se termină
la capătul variabil cu A, T, G sau C. Produşii ologonucleotidici ai celor 4 reacţii
se separă apoi într-un gel de poliacrilamidă funcţie de mărimea lor şi secvenţa
ADN-ului este citită direct de pe gel după autoradiografia acestuia. Procesul
este însă limitat de lungimea fragmentului a cărui secvenţă urmărim să o
identificăm, în sensul că fragmente mai mari de 300-500 nucleotide trebuie
tăiate în fragmente mai mici cu ajutorul enzimelor exonucleaza III sau nucleaza
Bal 31.
Există 2 tehnici de determinare a unei secvenţe oligonucleotidice: metoda
enzimatică (a didezoxinucleotidelor) = metoda Sanger şi metoda chimică = metoda
Maxam şi Gilbert.

113
 Metoda Sanger utilizează o ADN polimerază pentru a sintetiza o copie
complementară a template-ului monocatenar. Ea se bazează pe abilitatea ADN
polimerazei de a utiliza 2',3'-didezoxi-nucleozid trifosfaţi (ddNTP) ca
substrate. Atunci când un ddNTP este încorporat la capătul 3' al lanţului aflat
în creştere, elongarea se va termina la G, C, T sau A pentru că primerul nu
mai are gruparea 3'-OH. Experimentul se realizează în 4 probe distincte care
diferă între ele exclusiv prin natura ddNTP utilizat. Raportul ddNTP:dNTP
este astfel ajustat în fiecare reacţie încât lanţul în elongare se va termina în
dreptul fiecărei bazei complementare din template care corespunde ddNTP
adăugat. În acest fel fiecare dintre cele 4 probe va conţine o populaţie de
catene având acelaşi capăt 5' şi un capăt variabil 3' corespunzător unui

ddNTP specific.

Sanger a utilizat pentru această reacţie o ADN polimerază I în care este

exclusă regiunea cu activitate 5'-->3' exonucleazică, numită fragmentul Klenow, un
oligonucleotid sintetic (primer) care se poate lega la capătul 3' a regiunii ce urmează
a fi secventializată şi amestecul de dNTP (dintre care unul este marcat radioactiv) +
unul dintre ddNTP. În aceste condiţii primerul se va elonga şi marca până când
ddNTP-ul va fi inclus în catenă, moment în care elongarea nu mai are loc. Într-o
reacţie următoare peste fiecare dintre cele 4 probe se adaugă concentraţii mari de

114
dNTP astfel încât lanţurile care nu s-au terminat prin încorporarea ddNTP se vor
elonga, obţinându-se fragmente ADN cu mase moleculare mari, care nu vor migra,
ulterior, la electroforeza.
Conform acestei proceduri lungimea fragmentelor obţinute este controlată de
raportul ddNTP:dNTP, fiind mai scurte cu cât raportul este mai mare. Citirea
secvenţei se face după autoradiografia gelului, de jos în sus, pe direcţia 5'-3'.

115
116
 În metoda Maxam-Gilbert cele 4 seturi de dezoxinucleotide sunt generate prin
tratamentul oligonucleotidului 3' sau 5' marcat acţiunii unui agent chimic care distruge
selectiv una dintre baze. Se foloseşte hidrazina (pentru T+C), dimetil sulfatul (pentru
G) acidul formic (pentru G+A) şi NaCl (în prezenţa acesteia numai C reacţionează cu
hidrazina) pentru a modifica bazele din moleculă şi piperidina pentru a desface ADN-
ul în dreptul acestor baze şi a le elimina. Cele 4 seturi de oligopeptide se separă apoi
electroforetic şi după autoradiografia gelului se citeşte direct secvenţa acestuia
ţinându-se cont de faptul ca fragmentelor obţinute vor fi mai scurte cu o bază, tocmai
cea pe care am eliminat-o specific (cea haşurată în desen).
Întrucât nucleotidul terminal 5' nu poate fi identificat (se distruge) se recurge la
secvenţializarea paralelă a catenei complementare, după marcarea acesteia.
Marcarea catenelor ADN se poate face şi cu 35S, sau, pentru evitarea iradierii
se poate folosi ca metodă de detecţie chemiluminescenţa sau fluorescenţa. În cazul
chemiluminescenţei se foloseşte un primer biotinilat, fragmentele biotinilate separate
prin electroforeză fiind transferate şi legate încrucişat pe o membrana de nylon.
Produşii sunt detectaţi utilizînd streptavidină, fosfataza alcalină biotinilată şi ca
substrat pentru fosfatază, dioxietan.
Streptavidina leagă încrucişat produşii biotinilaţi de fosfataza alcalină
biotinilată, imobilizând astfel fosfataza. În urma defosforilării sub acţiunea fosfatazei
alcaline dioxietanul emite lumină care poate fi detectată autoradiografic. Tehnica
chemiluminescentă permite identificarea fragmentelor separate prin metoda chimică.
Metoda fluorescentă utilizează marcarea primerului cu un compus fluorescent legat
covalent diferit pentru cele 4 probe sau ataşarea la un anumit ddNTP a unei molecule
care prezintă fluorescenţă la o anumită lungime de undă. În cazul al doilea cele 4 probe
sunt reunite după efectuarea replicării. Electroforeza amestecului duce la apariţia a
numeroase benzi electroforetice, fiecare cu un spectru de fluorescenţă caracteristic
capătului său 3' terminal, a căror succesiune indică succesiunea nucleotidelor în catena
ADN. Sistemul de detecţie ete automatizat şi permite secvenţializarea unor fragmente
de ADN într-un ritm de ~10.000 perechi de baze/zi.

117
 Secvenţializarea ARN se face, cel mai adesea după sinteza ADNc, catalizată
de revers transcriptază, urmată de amplificarea acestuia prin PCR (reacţia
polimerazică în lanţ) şi recurge la ambele tehnici decrise pentru ADN.
Reacţia polimerazică în lanţ (PCR) necesită o moleculă/fragment de ADN ce
urmează a fi amplificat, o pereche de oligonucleotide primeri (20-30 nucleotide) ce
flanchează fragmentul de amplificat, o ADN polimerază termostabilă şi cei 4 dNTP.
ADN polimeraza (Taq polimeraza) este capabilă să acţioneze la temperaturi de 75-
85 oC şi se extrage din Thermus aquaticus.
Primeri se adaugă în exces faţă de ADN-ul de amplificat. Ei hibridează la cele
două catene de ADN şi sunt orientaţi cu capetele lor 3' unul către celălalt astfel încât
să se sintetizeze catena complementară fragmentului cuprins între ei (Taq polimeraza
catalizează creşterea noilor catene în direcţia 5'-3') Un ciclu de sinteză (constând în:
separarea celor două catene de ADN prin denaturare termică, cuplarea primerilor şi
elongarea acestora) duce la obţinerea de fragmente cu lungimi variabile care, la fel ca
şi catena parentală, pot hibrida cu primerii într-un ciclu ulterior. Al doilea ciclu
produce două catene care împreună pot forma un produs dublu catenar având exact
lungimea fragmentului de amplificat. Fiecare catenă este complementară cu unul
dintre primeri şi de aceea poate participa ca template în ciclurile următoare. Cantitatea
de produs se dublează la fiecare ciclu, acumulându-se exponenţial astfel încât după 30
cicluri avem o amplificare de 228 ori a catenei iniţiale.

118
 În cazul ARN-ului amplificarea are loc după sinteza unui ADNc catalizată de
revers transcriptază.
Avantajul major al metodei constă în posibilitatea utilizării unei singure
molecule a cărei secvenţă este necunoscută. Specificitatea se asigură prin
alegerea primerilor şi stabilirea riguroasă a condiţiilor de lucru (temperatura
de cuplare, concentraţia de săruri, tamponul folosit). Tehnica se practică în
aparate automate, programându-se numărul de cicluri şi parametrii fiecarei
etape în parte (separarea celor 2 catene, cuplarea primerilor şi elongarea
acestora).
PCR este folosită în diagnosticarea prenatală a unor boli genetice, detectarea
polimorfismului alelei, detectarea infecţiilor virale, trierea suspecţilor şi identificarea
celui vinovat în medicina legală.
6. Tehnologia ADN recombinant
Se referă la metodologia obţinerii de ADN recombinant, adică de realizarea
in vitro a unor molecule de acid dezoxiribonucleic prin îmbinarea fragmentelor de
ADN din specii biologice diferite sau chiar a fragmentelor de ADN de la aceeaşi
specie biologică, aranjate însă artificial, în aşa fel încât elementele genetice
dobândesc o structură aparte.
Tehnologia ADN recombinant nu este sinonimă cu ingineria genetică, care
include toate procedeele efectuate in vitro cu gene, cromozomi şi uneori celule
întregi în scopul ”construirii” unei structuri genetice cu proprietăţi ereditare
premeditate.
Schema generală a tehnologiei ADN recombinant presupune existenţa unui
vehicul sau vector în care se va introduce un ADN străin (pasager), după care ADN
recombinant obţinut se introduce în celule receptoare adecvate pentru multiplicare.
Introducerea într-o celulă a unei singure gene sau a mai multor gene noi, în
speranţa că ele se vor exprima şi menţine, nu este posibilă. Odată ajunse în celule
aceste gene vor fi imediat distruse de către DNA-zele celulare în fragmente, iar
informaţia genetică pe care o conţin va fi total pierdută. Ca operaţia să reuşească este
nevoie ca genele noi – purtătoare ale informaţiilor genetice pe care dorim să le
dobândească un organism dat, să fie ”sudate” de o moleculă de ADN care are
proprietatea de a fi acceptată de celule şi, în plus, să aibă şi capacitatea de a se
automultiplica în celulele respective.
Inserţia fragmentului de ADN străin în vehicul trebuie realizată încât
funcţiile esenţiale ale vehiculului, necesare replicării lui, să nu fie modificate. Pentru
a se putea replica, un vector are nevoie de două elemente principale: o regiune
echivalentă cu regiunea ori care să fie recunoscută de o proteină cu rol de iniţiator
şi să conţină gena pentru această proteină în aceeaşi moleculă. În plus un vector
trebuie să fie uşor de purificat, să existe în cantităţi suficiente pentru experimentare,
să posede markeri genetici asociaţi moleculei lor, bine caracterizaţi, care să permită
o uşoară selecţionare a celulelor purtătoare a acestor vectori şi să posede un număr

119
limitat de situsuri pentru enzimele de restricţie, care să ofere posibilitatea scindării
specifice a vectorului, în scopul ataşării de el a unor fragmente noi de ADN.
a. Vectorul

SV 40, adenovirusul sau alte virusuri. Plasmidele sunt molecule mici de ADN
circular, extracromozomial, care se găsesc în copii multiple per celulă şi au
capacitatea de propagare proprie, ca atare sau împreună cu orice genă legată de ele.
Astfel de plasmide sunt pM B9, pBR313, pBR322 şi pSC101. Aceste plasmide au
caracteristica comună de a fi transferate cu o frecvenţă foarte scăzută accidental sau
printr-un proces pasiv, ceea ce conferă un grad crescut de protecţie biologică pentru
experimentele de tehnologie a ADN recombinant.
Plasmida pBR322, construită de Boyer şi colab (1977), cea mai frecvent
folosită pentru construirea de ADN recombinanţi, are masa moleculară de 2,6 x 106
Da şi prezintă doi markeri selectivi care marchează rezistenţa la ampicilină şi
tetraciclină.

Bacteriofagul λ este unul din numeroşii fagi care cresc în bacteria E.Coli.
Particulele de bacteriofag mature conţin în interiorul lor un ADN bicatenar liniar
(cromozomal) care are aprox 48 000 perechi de baze şi are particularitatea de a avea
capete coezive. Replicarea fagului are nevoie de gazda sa (E.Coli) nu numai ca
furnizoare de energie sau de unele componente dar şi pentru o serie de funcţii
120
catalitice. Această caracteristică oferă o siguranţă biologică mare, fagul scăpat în
mediul înconjurător neavând capacitatea de a se replica singur, faţă de o plasmidă
care poate propaga nedefinit ADN străin încorporat, deoarece se replică independent.
b. ADN de interes (pasagerul)
ADN de interes se obţine prin fragmentarea unei molecule de ADN
conţinând gena de interes cu enzime de restricţie, prin reverstranscriere folosind ca
matriţă un ARNm care dirijează sinteza unei anumite proteine sau prin sinteza
chimică.
c. Deschiderea vectorului
Deschiderea vectorului pentru a se introduce ADN străin se face cu ajutorul
aceleiaşi enzime de restricţie cu care s-a izolat ADN de interes, astfel încât cele două
molecule de ADN vor avea capete cu secvenţe nucleotidice complementare coezive
(sticky ends). Dacă enzimele de restricţie realizează capete tocite (blunt ends),
ataşarea ADN de interes la vector se poate face numai dacă se construiesc artificial
capete coezive. Scindarea vectorului trebuie însă făcută cu grijă pentru ca funcţia de
autoreplicare să nu fie afectată.
d. Legarea pasagerului la vector
Legăturile de hidrogen între capetele coezive ale vectorului şi ADN de
interes care se formează în urma amestecării lor, nu sunt suficient de puternice ca să
confere moleculei hibride stabilitate faţă de condiţiile fiziologice din celulă.
”Sudarea” acestor capete se face cu ajutorul ADN ligazelor care catalizează formarea
unor legături covalente fosfodiesterice. Se obţine astfel o moleculă de ADN
recombinat. Plasarea ADN de interes în poziţia corectă în vector faţă de elementele
genetice ale unui operon este obligatorie. Transcrierea şi traducerea ADN de interes
poate fi realizată numai dacă, plasat în vector, ordinea secvenţelor nucleotidelor sale
este în concordanţă cu sensul transcrierii şi ocupă o poziţie în aval de promotorul,
operatorul şi o genă structurală a unui operon adecvat.

121
e. Introducerea şi exprimarea ADN recombinant în celule
Odată ce construirea ADN recombinant a fost realizată, acesta este introdus în
celulele receptoare adecvate pentru multiplicare. Dacă vectorul este o plasmidă sau
bacteriofagul λ, gazda va fi o tulpină bacteriană (E.Coli, în principal). Introducerea
ADN recombinant în celulele receptoare se face prin fenomenul de transformare.
Acest fenomen a fost observat prima oară de Griffith (1929) şi lămurit la nivel
molecular printr-o experienţă crucială de către Avery şi colaboratorii (1944). Ceea ce
este esenţial pentru fenomenul de transformare este faptul că proprietăţile noi câştigate
în acest mod rămân stabile de-a lungul generaţiilor, oferindu-se astfel posibilitatea
multiplicării după dorinţă a informaţiei genetice noi introduse.
Transformarea este fenomenul prin care celulele aflate în stare de
”competenţă” reuşesc să accepte ireversibil molecule de ADN izolate de la alte
celule şi să dobândească prin aceasta proprietăţi noi. Într-o cultură de bacterii
receptoare nu toate celulele sunt susceptibile de a capta ADN. Starea de competenţă
este condiţionată de o serie de factori, printre care amintim anumite faze ale ciclului
de diviziune celulară, specia bacteriană, etapa fiziologică de creştere, mediul de
122
cultură. Tratarea celulelor cu Ca2+, de exemplu, determină creşterea substanţială a
numărului de celule aflate în stare de competenţă.
f. Clonarea ADN recombinant
Pătrunderea ADN recombinant în celule se face în general cu o eficienţă
scăzută. De obicei, celulele transformate sunt produse de captarea unei singure
molecule de ADN recombinant. Din acest motiv celulele formează câte o colonie
specifică, ce se deosebeşte de alte colonii generate de alte specii moleculare de ADN.
Recunoaşterea celulelor transformate de ADN recombinant se bazează în principal
pe unele proprietăţi ale vectorului sau, în anumite cazuri, chiar pe cele ale ADN de
interes.
Vectorul, de exemplu (posedând markeri genetici specifici, cum ar fi
rezistenţa la anumite antibiotice), conferă numai celulelor transformate (cele în care
a intrat ADN recombinant) posibilitatea să crească în prezenţa antibioticelor
respective. Pe această bază se pot selecţiona şi clona transformanţii obţinuţi.
Pasagerul poate servi şi el la clonarea ADN recombinant. Astfel,
introducerea genei β-galactozidazei ca pasager într-un vector conferă acestuia unele
caracteristici proprii acestei enzime. Coloniile generate de ADN recombinant
conţinând β-galacto-zidază devin albastre, spre deosebire de celelalte colonii care nu
conţin enzima şi care sunt albe.
Este suficient să se izoleze o singură colonie pentru a propaga apoi după
dorinţă celulele respective, pentru a produce ADN recombinant sau produsul pe care
îl sintetizează acest ADN artificial.
Tehnologia ADN recombinant a inaugurat era intervenţiei umane asupra
patrimoniului ereditar al organismelor. Realizările şi perspectivele tehnologiei ADN
recombinant pot fi grupate în două categorii principale: una de ordin fundamental şi
a doua de ordin practic. Cele de ordin fundamental permit printre altele:
 cunoaşterea modului de organizare a genelor în cromozomi;
 stabilirea hărţilor genetice a unor organisme;
 studiul fizic şi chimic al unor gene, studiul mecanismului de
exprimare şi reglare a unor gene;
 stabilirea zonei moleculare a unor ADN virali responsabili de
inducerea unor tumori.

Cele de ordin practic constau în:

 obţinerea de organisme microbiene noi, capabile de a sintetiza un
produs medical sau alimentar de mare interes, prin inserţia în
genomul micoorganismului a genelor specifice;
 posibilitatea transformării celulelor somatice, pentru a corecta
defecte genetice cum sunt anemia, fenilcetonuria, diabetul, etc.

123
 Principalele perspective care se conturează în utilizarea tehnologiei ADN
recombinant sunt următoarele: producţia de hormoni, antigene, anticorpi, enzime,
reactivi de diagnosticare, precum şi posibilitatea de a preveni şi vindeca anumite
maladii ereditare sau cancerul. Astfel se vor putea introduce prin intermediul unor
vectori adecvaţi la indivizii afectaţi, genele necesare sintezei componentelor care
lipsesc.

124
 2. GLUCIDELE
Glucidele sunt compuşi polihidroxicarbonilici, constituiţi din C, H şi O.
În funcţie de complexitatea lor glucidele se împart în:
- monozaharide, compuşi nehidrolizabili care pot fi aldoze sau cetoze iar
după numărul de atomi de C sunt trioze, tetroze, pentoze, hexoze, etc.
- oligozaharide, la hidroliză eliberează un număr mic de molecule de
monozaharide (2-10)
- polizaharide, la hidroliză eliberează un număr foarte mare de molecule de
monozaharide
Legăturile între moleculele de monozaharide în oligozaharide şi polizaharide
sunt de tip eteric.
Glucidele au o mare varietate de proprietăţi multe dintre acestea
constituind modalităţi de identificare sau dozare a lor. Cele mai importante sunt
prezentate în continuare.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ
1. Identificarea şi reacţii generale ale monozaharidelor
a. Reacţia cu baze tari
Principiu: prin tratarea monozaharidelor cu baze tari (alcalii concentrate)
acestea se descompun cu formarea de raşini brune.
Reactivi:
1. Soluţie de monozaharid (ex. glucoză)
2. Soluţie NaOH 10%
Modul de lucru
La 2-3 ml soluţie de monozaharid se adaugă câteva picături de soluţie NaOH
10%. Se încălzeşte eprubeta pe baie de apă câteva minute. Se va observa colorarea
soluţiei din eprubetă în galben brun. Produsul de reacţie miroase plăcut a caramel.
b. Testul Molisch
Principiu: diferitele oze (pentoze, hexoze) prin tratare cu acid sulfuric concentrat,
formează furfurol sau hidroximetilfurfurol, care condensându-se cu -naftol formează
un compus colorat roşu-violet. Reacţia este foarte sensibilă şi decurge astfel:

Reactivi:
1. Soluţie de glucoză (sau fructoză) 2%
2. Soluţie de -naftol 5% în alcool etilic (reactiv Molisch)
3. H2SO4 concentrat

125
 Modul de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 2-3 cm3 soluţie de glucoză, se adaugă 2-3 picături
de reactiv Molisch (-naftol), se adaugă 1-2 cm3 de H2SO4 concentrat prelins pe
peretele eprubetei, astfel încât cele două straturi formate să nu se amestece. La limita
de separare între straturi apare un inel roşu-violet care indică prezenţa ozei.

c. Reacţii de reducere

Gruparea carbonil din aldoze poate fi oxidată uşor la grupare carboxil; aceste
monozaharide pot deci reduce o serie de reactivi formându-se produşi cu însuşiri
specifice.

Testul Fehling

Principiu: în mediu alcalin, la cald, ozele reduc ionii Cu2+ din reactivul Fehling
la Cu cu formare de oxid cupros (Cu2O) care este un precipitat de culoare roşie-
+

cărămizie.
Reactivul Fehling se obţine astfel:

Hidroxidul cupric se dizolvă în soluţie de tartrat de Na şi K formând o

combinaţie complexă, colorată în albastru intens.
În prezenţa aldozelor reactivul Fehling eliberează treptat hidroxidul cupric
care este redus la oxid cupros. În paralel aldozele se oxidează la acizii aldonici
corespunzători:

Reactivi:
126
 1. Reactiv Fehling:
Soluţia I: 40 g CuSO4 x 5 H2O se dizolvă în apă distilată, se adaugă 2 cm3 de H2SO4
şi se completează la 1000 cm3 cu apă distilată.
Soluţia II: 346 g tartrat de Na şi K (sare Seignette) şi 140 g NaOH se dizolvă în apă
distilată şi se completează la 1000 cm3.
În momentul folosirii, cele două soluţii (I şi II) se amestecă, în volume egale.
Rolul tartratului de Na şi K este de a menţine în soluţie hidroxidul cupric format.
2. Soluţie de glucoză 2%

Modul de lucru
Într-o eprubetă se prepară reactivul Fehling, măsurându-se câte 1 cm3 din
soluţia I şi din soluţia II. Se încălzeşte până la fierbere şi se adaugă un volum egal
de soluţie de glucoză. Se continuă fierberea.
Se constată apariţia unui precipitat roşu-cărămiziu de Cu2O, format sub
acţiunea reducătoare a glucozei.
În general, cantitatea de precipitat şi intensitatea culorii sunt proporţionale
cu concentraţia glucozei. Reacţia Fehling este utilizată la identificarea şi dozarea
glucozei în fluidele biologice.

Testul Benedict

Principiu:
Acest test este o modificare a testului Fehling şi prezintă avantajul unei
sensibilităţi şi stabilităţi a produsului de reacţie mai ridicate.

Reactivi:
1. Soluţie de glucoză 2% (sau alt glucid reducător)
2. Reactiv Benedict: cuprinde 17,3 g CuSO4 . 5 H2O; 173 g citrat de sodiu şi
100 g Na2CO3 dizolvate în 1000 ml soluţie

Modul de lucru
Peste câteva picături din soluţia de glucoză se adaugă 2-3 ml de reactiv
Benedict. Se încălzeşte amestecul. Se observă apariţia unui precipitat verde, galben
sau roşu după cantitatea de monozaharid reducător din probă.

Testul Tollens (al oglinzii de argint)

Principiu: Monozaharidele reducătoare interacţionează cu o soluţie alcalină de
hidroxid diaminoargentic (azotat de argint amoniacal). Argintul din azotat (sub
formă de Ag+) este redus la argint metalic care aderă la peretele vasului sau se
depune. Reacţiile ce se produc sunt:

2 AgNO3 + 2 NaOH  Ag2O + 2 NaNO3 +H2O

Ag2O + 4 NH3 + H2O  2 [Ag(NH3)2]OH
127
 2 [Ag(NH3)2]OH + R-CHO  2 Ag + 4 NH3 + R-COOH + H2O

Reactivi:
1. Soluţie de monozaharid reducător
2. Reactiv Tollens: Acest reactiv se obţine adăugând la 100 ml soluţie de
AgNO3, de concentraţie 0,1 N 5 ml de NaOH 2N şi 20 ml soluţie NH3 2N.

Modul de lucru
Într-o eprubetă se introduc 2-3 ml soluţie de glucid, peste care se adaugă un
volum egal de reactiv Tollens. Se încălzeşte într-o baie de apă câteva minute. Pe
peretele eprubetei se observă apariţia unui strat fin de argint (oglindă de argint) sau se
obţine un precipitat brun de argint fin divizat.

Reacţia cu acidul picric

Principiu: aldozele, în mediu alcalin, reduc acidul picric la acid picramic:

Reactivi:
1. Soluţie de monozaharid reducător
2. Soluţie acid picric
Modul de lucru
Într-o eprubetă se introduc 2-3 ml soluţie monozaharid, se adaugă apoi câteva
picături de acid picric. Acidul picric, colorat în galben, se transformă în acid
picramic colorat în roşu-portocaliu.

2. Reacţiile specifice pentru unele categorii de monozaharide

a. Testul Bial (reacţia cu orcinol)

Principiu: Pentozele formează cu orcinolul (5-metil-rezorcina) în mediu de
acid clorhidric concentrat (reactiv Bial) produşi coloraţi în verde. Mai întîi pentozele
sub acţiunea HCl, la cald, se deshidratează transformându-se în furfurol; apoi,
furfurolul se condensează cu orcinolul, în prezenţa clorurii ferice, formând un
compus colorat:

128
 În aceleaşi condiţii, hexozele formează hidroximetilfurfurol; acesta pierde prin
hidroliză o moleculă de acid formic, transformându-se în acid levulinic care
nu reacţionează cu orcinolul:

Reactivi:
1. Soluţie de arabinoză 1%
2. Soluţie de glucoză 1%
3. Reactiv Bial: acest reactiv se obţine din 0,3 g orcinol care se dizolvă în HCl
concentrat peste care se adaugă 0,25 cm3 soluţie FeCl3 10%. Se aduce la 100 cm3 cu
HCl concentrat

Modul de lucru
Într-o eprubetă se introduc 2-3 ml reactiv Bial; se încălzeşte la fierbere, se
adaugă 5-6 picături soluţie de arabinoză şi se continuă încălzirea. Pentozele
(arabinoza) dau reacţie pozitivă, constatându-se apariţia unei culori verzi. Reacţia
pentozelor cu orcinolul este utilizată şi pentru dozarea colorimetrică a pentozelor, iar
prin intermediul acestora a acizilor nucleici. Utilizând glucoza în loc de arabinoză,
reacţia nu se produce.

b. Reacţia de condensare cu fenilhidrazina

Fenilhidrazonele
Prin tratarea monozaharidelor cu fenilhidrazină în soluţie alcoolică sau
acetică, la rece se formează fenilhidrazone. Fenilhidrazona D-glucozei, apare
în trei forme izomere, ca urmare a mutarotaţiei:

129
Formazanii
Cu soluţii reci de săruri de diazoniu, fenilhidrazonele aldozelor formează
difenil-formazani, cristale de culoare roşie:

Această reacţie este utilizată în tehnica histochimică. Reacţia este utilizată şi

pentru identificarea aldozelor. Fenilhidrazonele cetozelor nu formează
formazani.

Osazonele
Cu exces de fenilhidrazină, la cald, monozaharidele formează mai întîi
fenilhidrazonele; acestea reacţionează mai departe cu fenilhidrazina formând
osazone, conform reacţiilor:

Cetozele formează deasemenea osazone (prin intermediul fenilhidrazonelor).

Glucoza, manoza şi fructoza formează aceeaşi osazonă, respectiv cristale galbene
aciculare. Cristalele osazonelor altor monozaharide sunt diferite; pe baza
caracteristicilor acestora se pot recunoaşte diversele monozaharide.

Mod de lucru
În două eprubete se introduc separat câte 2-3 cm3 soluţie de glucoză (1%) şi
respectiv de fructoză (1%). Se adaugă câte 1 ml soluţie saturată de NaCl, 0,3 g
fenilhidrazină şi 0,5 ml acid acetic glacial. Eprubetele se menţin aproximativ 30
130
minute pe o baie de apă la fierbere. După răcirea soluţiei, cristalele se examinează la
microscopul optic. Glucosazona şi fructosazona se prezintă sub formă de cristale
aciculare identice, deoarece glucoza şi fructoza sunt monozaharide epimere.

c. Testul Seliwanoff
Principiu: cetozele reacţionează cu rezorcina (1,3 dihidroxibenzen), la
încălzire cu soluţie HCl şi formează compuşi coloraţi în roşu intens. Aldozele
nu dau aceasta reacţie.

Reactivi:
1. Soluţie de fructoză 1%
2. Soluţie de glucoză 1%
3. Soluţie de rezorcină 0,5% în HCl 20% (reactiv Seliwanoff)

Modul de lucru
Se introduc în două eprubete câte 1-2 ml reactiv Seliwanoff după care în prima
se introduc 1-2 ml soluţie de fructoză, iar în a doua 1-2 ml soluţie de glucoză.
Se încălzeşte conţinutul eprubetelor pe baie de apă la fierbere. Reacţia este
pozitivă pentru fructoză şi se evidenţiază prin apariţia culorii roşii. În cazul
soluţiei de glucoză coloraţia roşie nu apare.

d. Testul acidului mucic

Principiu: acest test este specific pentru galactoză. Prin oxidarea galactozei cu
HNO3 se formează acidul mucic, greu solubil; acidul mucic este un acid zaharic.
Reacţia ce se produce este următoarea:

131
 Reactivi:
1. Soluţie de galactoză 1%
2. Soluţie acid azotic concentrat
Modul de lucru
Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie de galactoză şi 1 ml soluţie acid azotic
concentrat. Se încălzeşte în baia de apă până la fierbere. După răcirea
soluţiei, se observă separarea cristalelor de acid mucic, care pot fi identificate
la microscop.

e. Activitatea optică a monozaharidelor

Monozaharidele cuprind în structura lor atomi de carbon asimetrici, în
consecinţă, rotesc planul luminii polarizate fiind, după caz, dextrogire (+) sau
levogire (-).
Activitatea optică a unei substanţe se exprimă prin mărimea cunoscută sub
denumirea de rotaţie specifică, notată cu [ ].
Rotaţia specifică se defineşte ca fiind unghiul cu care este deviat planul
luminii polarizate, când aceasta străbate un strat cu grosimea de 1 dm al unei soluţii
cu concentraţia de 1 g/ml. Sunt bine cunoscute rotaţiile specifice pentru diferite
monozaharide. De exemplu rotaţia specifică pentru amestecul de anomeri şi al
glucozei este [ ] = + 52,5 o, iar în cazul fructozei este [ ] = - 92 o.
Pe baza cunoaşterii rotaţiilor specifice, se pot determina cantităţile de
monozaharide cuprinse în diferite probe.
Activitatea optică a diferitelor soluţii se măsoară cu ajutorul unui dispozitiv
numit polarimetru.
Concentraţia unei soluţii (exprimată în g/100 ml) se calculează cu ajutorul
relaţiei:

unde: -  = unghiul măsurat

- l = lungimea tubului polarimetrului (în dm)
- [] = rotaţia specifică

3. Identificarea şi reacţii generale ale dizaharidelor

Dintre oligozaharide, maximă importanţă au dizaharidele care pot fi

reducătoare şi nereducătoare.

a. Reacţia Fehling
132
 Principiu: dizaharidele cu caracter reducător prezintă proprietatea de a reduce
la cald reactivul Fehling, formând un precipitat roşu-cărămiziu, de oxid cupros.

Reactivi:
1. Reactiv Fehling (vezi monozaharide, soluţiile 1 şi 2)
2. Soluţie de lactoză 1%
3. Soluţie de maltoză 1%
4. Soluţie de zaharoză 1%

Mod de lucru
Se introduc în trei eprubete câte 1 ml soluţie1 şi câte 1 ml soluţie 2. Se
încălzeşte continutul eprubetelor până la fierbere. În prima eprubetă se adaugă un
volum egal de lactoză, în a doua un volum egal din soluţia de maltoză, în a treia un
volum egal din soluţia de zaharoză. După aceasta se continuă fierberea.
În primele două eprubete apare un precipitat roşu-cărămiziu de Cu2O,
deoarece cele două monozaharide au caracter reducător; în cea de-a treia, reacţia nu
se produce deoarece zaharoza nu are nici o grupare carbonil de tip aldehidic care să
reducă reactivul Fehling.
Dacă zaharoza este hidrolizată glucoza care se eliberează reduce reactivul
Fehling în timp ce fructoza dă reacţia Seliwanoff. Hidroliza se face astfel: într-o
eprubetă se introduc 10 ml soluţie de zaharoză şi două picături de acid sulfuric
concentrat; se încălzeşte uşor pe o baie de apă, apoi se răceşte. Se împarte volumul
obţinut în două eprubete şi se efectuează reacţiile.

b. Formarea de osazone
Principiu: Dizaharidele cu caracter reducător reacţionează cu fenilhidrazina în
prezenţa acidului acetic, la cald, formând osazonele respective. Cristalele osazonelor
sunt caracteristice diferitelor tipuri de dizaharide. Aceste caracteristici se stabilesc
prin examinarea la microscop a cristalelor. Zaharoza nu dă această reacţie.
Activitate experimentală:
Reactivii şi modul de lucru sunt prezentate la monozaharide

c. Inversia zaharozei
Principiu: Prin hidroliza enzimatică sau cu acizi minerali a zaharozei, care este
dextrogiră rezultă glucoză cu  = +66,5 şi fructoză cu  = -92,5. Hidrolizatul
va fi deci levogir.

Reactivi:
1. Soluţie zaharoză
2. Soluţie HCl concentrat
3. Soluţie NH3 concentrat
133
 Mod de lucru
În două baloane de câte 100 ml, se introduc câte 10 g zaharoză şi câte 70 ml
apă. Se agită până la dizolvarea completă a cristalelor de zaharoză. Într-unul din
baloane se completează volumul la 100 ml. În celălalt balon se introduc 5 ml HCl
concentrat şi este ţinut 15 min într-o baie de apă caldă la 70-80oC.După răcire se
neutralizează soluţia folosind câteva picături de amoniac concentrat. Se verifică pH-
ul cu hârtia indicatoare. Se completează apoi volumul la 100 ml cu apă. Se masoară
la polarimetru activităţile optice ale celor două soluţii (de zaharoză si respectiv de
zaharoză hidrolizată). Cunoscându-se concentraţiile în g% ale celor două soluţii se
vor calcula rotaţiile specifice cu ajutorul relaţiei:
-  = unghiul măsurat
- l = 2 dm
- y = 10 g
Se vor compara valorile obţinute cu cele teoretice.

4. Identificarea şi reacţii generale ale polizaharidelor (amidonului şi

glicogenului)

Atât amidonul cât şi glicogenul sunt insolubili în apă rece, iar la cald formează
soluţii coloidale, opalescente.

a. Reacţia de culoare cu iodul

Principiu:
În prezenţa iodului soluţia de amidon se colorează în albastru, culoare care
dispare la cald şi reapare la rece; această comportare se datorează faptului că iodul nu
reacţionează cu amidonul ci este doar adsorbit de miceliile hidratate ale amilozei.
Glicogenul în prezenţa iodului se colorează în roşu-brun (unele specii moleculare ale
glicogenului nu se colorează cu iodul).

Reactivi:
1. Soluţie de iod in iodură de potasiu: 1g iod metalic si 2 g KI se dizolvă în
apă distilată şi se aduc la 100 cm3.
2. Soluţie de amidon 1%
3. Soluţie de glicogen 1%

Mod de lucru
Într-o eprubetă se introduc 2 ml soluţie de amidon, iar in altă eprubetă 2 ml
soluţie de glicogen. În fiecare din cele două eprubete se adaugă 2-3 picături de soluţie
de iod. Soluţia de amidon se colorează albastru, pe când soluţia de glicogen se
134
colorează în roşu-brun. Prin încălzire soluţia de amidon se decolorează, dar culoarea
reapare după răcirea soluţiei.

b. Hidroliza amidonului şi identificarea compuşilor rezultaţi

Principiu:
Amidonul, în prezenţa acizilor minerali tari este hidrolizat până la glucoză. Pe
parcursul reacţiei de hidroliză se formează produşi intermediari cu mase moleculare
tot mai mici, numiţi dextrine. Aceste dextrine dau culori caracteristice în prezenţa
iodului, astfel: amilodextrinele sunt violete, eritrodextrinele sunt roşii,
flavodextrinele sunt galbene. Dacă reacţia de hidroliză a amidonului este totală,
atunci proprietatea soluţiei de a se colora în albastru dispare; în schimb, apare
proprietatea reducătoare a glucozei, care se poate pune în evidenţă prin reacţia
Fehling.

Reactivi:
1. Soluţie de amidon 1%
2. HCl concentrat
3. Soluţie de iod în KI
4. Soluţie de NaOH 10%
5. Reactiv Fehling (I şi II)

Mod de lucru
Într-o eprubetă se introduc 10 ml soluţie de amidon. Se adaugă 1 ml HCl
concentrat. Se încălzeşte până la fierbere şi se menţine 10-15 min. În timpul fierberii
se colectează probe de câte 1 ml hidrolizat şi se răcesc sub jet de apă. În probele
colectate se adaugă 1-2 picături soluţie de iod. La începutul experimentului soluţia
de amidon dă cu iodul culoarea albastră. Pe măsură ce hidroliza avansează se observă
schimbarea culorii mai întâi în violet, apoi în roşu, galben, incolor. Efectuarea
testului Fehling în ultima probă indică prezenţa glucozei (apare precipitatul roşu-
cărămiziu de Cu2O).

135
 3. LIPIDELE

Lipidele sunt compuşi chimici, insolubili în apă dar solubili în solvenţi

organici nepolari (acetonă, alcool, cloroform sau eteri). Lipidele se clasifică în lipide
simple care conţin numai C, H şi O şi lipide complexe, care conţin pe lângă C, H şi
O şi/sau P, N, S. Steroizii şi vitaminele care au solubilităţi asemănătoare cu lipidele
se numesc derivaţi lipidici. Cele mai simple lipide sunt acizii graşi.

Indici de caracterizare a lipidelor

Analiza chimică completă a unei grăsimi, necesită determinarea unor indici

care reflectă anumite proprietăţi ale acestora. Aceşti indici reprezintă valori
numerice pe baza cărora se pot obţine date referitoare la natura acizilor graşi
care intră în structura grăsimilor, la gradul lor de nesaturare, la gradul de
peroxidare precum şi la alte proprietăţi fizico-chimice.

1. Indicele de saponificare
Saponificarea gliceridelor constituie procesul chimic de hidroliză a acestora
în mediu puternic alcalin, proces prin care legătura ester este scindată cu punerea în
libertate de glicerol şi săruri ale acizilor graşi (săpunuri). Indicele de saponificare
(Is) reprezintă cantitatea în mg de KOH necesară pentru saponificarea unui gram de
grăsime. Cunoaşterea indicelui de saponificare permite aprecieri asupra masei
moleculare medii a acizilor graşi constituenţi ai unor gliceride, valoarea indicelui de
saponificare fiind invers proporţională cu masa moleculară a acizilor graşi respectivi.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Determinarea indicelui de saponificare a unei grăsimi (ulei)

Reactivi
1. Grăsime sau ulei (tristearină, ulei de soia sau porumb).
2. Solvent (etanol şi eter în volume egale).
3. Soluţie alcoolică de KOH 0,5 N.
4. Soluţie de HCl 0,5N.
5. Soluţie de fenolftaleină 1% în alcool etilic.

Modul de lucru
Intr-un pahar Erlenmeyer la care se poate adapta un refrigerent cu reflux se
introduce un gram de ulei dizolvat în 3 ml solvent. Se adaugă 25 ml soluţie alcoolică
de KOH 0,5 N. Se fixează refrigerentul, se introduce balonul într-o baie de apă aflată
la fierbere unde se menţine 30 minute din momentul în care conţinutul începe să

136
fiarbă. După acest interval, în care s-a petrecut reacţia de saponificare, se scoate
refrigerentul şi se introduc 2-3 picături de fenolftaleină. Apare o coloraţie roşie-
violetă. Excesul de KOH se titrează cu o soluţie de HCl 0,5 N până la dispariţia
culorii roşu-violet. In paralel, se efectuează în aceleaşi condiţii determinarea unei
probe martor care nu conţine ulei.
Calcul. Ştiind că 1 ml din soluţia de HCl 0,5 N este echivalent cu (0,056x0,5)g
KOH, indicele de saponificare este dat de relaţia:
Is = (Vm - Vp) x 0,5 x 0,056 x 103 mg KOH / 1 g grăsime
unde: Vm reprezintă ml HCl 0,5N folosiţi pentru titrarea probei martor; Vp
reprezintă ml HCl 0,5 N folosiţi pentru titrarea probei de grăsime; (Vm - Vp)
reprezintă ml HCl 0,5 N corespunzători volumului de KOH 0,5 N consumat la
saponificarea probei de grăsime.

2. Indicele de iod

Halogenii se adiţionează la dublele legături ale acizilor graşi nesaturaţi

constituenţi ai grăsimii.
Indicele de iod (Ii) reprezintă cantitatea în grame de iod care se adiţionează la
100g grăsime. Valoarea indicelui de iod furnizează informaţii asupra gradului de
nesaturare al unei grăsimi, respectiv asupra proporţiei de acizi graşi nesaturaţi care
intră în structura acesteia.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Determinarea indicelui de iod al unei grăsimi (ulei).

Monobromura de iod (BrI) reacţionează la întuneric cu grăsimea. După

adăugarea de KI în mediul de reacţie, se dozează excesul de I2 prin titrarea cu
Na2S2O3:

CH CH + BrI CH CH
Br I
BrI  KI 
 I 2  KBr

I 2  2 Na2S2O3 
 2 NaI  Na2S4O6

Reactivi:
1. Ulei de analizat.
2. Tetraclorură de carbon.
3. Soluţie Hanus care cuprinde 13,2 ml I2 şi 3 ml Br2 în 100 ml acid acetic
glacial.

137
 4. Soluţie de KI 2g %.
5. Soluţie de Na2S2O3 0,05 N.
6. Soluţie de amidon 1g %.
Mod de lucru
Se pregăteşte o probă martor: într-un balon de titrare se introduc 3 ml soluţie
Hanus, 1 ml CCl4, 10 ml soluţie KI. Iodul cuprins în soluţie este titrat cu soluţie de
Na2S2O3 în prezenţă de amidon ca indicator (adăugat în momentul în care soluţia s-
a colorat în galben). Se notează cu Vm volumul de tiosulfat folosit la titrare.
Intr-un alt balon se pregăteşte proba propriu-zisă. Se introduc 20 mg ulei (două
picături), 1 ml CCl4 şi 3 ml soluţie Hanus. Se agită şi se lasă la întuneric 20-30
minute, timp în care iodul se adiţionează la legăturile etilenice. Se adaugă apoi 10
ml soluţie KI şi excesul de iod este titrat cu soluţie de Na2S2O3 în prezenţă de amidon.
Volumul folosit la titrare se notează cu Vp.
Calcul. Ştiind că 1 ml din soluţia de Na2S2O3 0,05N este echivalent cu 0,00635
g iod, indicele de iod este dat de relaţia:
Ii = (Vm - Vp) x 0,00635 x 100/0,02 g I2 / 100 g grăsime

3.Indicele de peroxidare

Grăsimile care conţin acizi graşi nesaturaţi, cu mai mult de două duble legături
în moleculă, prin învechire sau expunere la lumină, aer, ioni metalici, suferă o
degradare peroxidativă care le alterează gustul şi mirosul (râncezire). Procesul este
iniţiat de un radical liber, gruparea cea mai vulnerabilă la un atac radicalic fiind
gruparea metilen din vecinătatea dublelor legături:

. -HX .
CH CH CH2 CH CH + X CH CH CH CH CH
fragment dintr-un rest radical liber radical liber
de acid polietilenic initiator

+ O2 .
CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH
rest peroxidic .
O O
+ alt fragment dintr-un
rest de acid

CH CH CH CH CH
peroxid
O OH

Reacţia se propagă în lanţ. Peroxizii formaţi exercită acţiuni oxidante,

degradative asupra resturilor de acizi graşi, rezultând acizi inferiori, aldehide, cetone.
Peroxidarea in vivo este implicată în procesele inflamatorii, patogeneza cancerului,
ateroscleroza, îmbătrânire, etc.
138
 ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

a. Determinarea indicelui de peroxidare a unei grăsimi (ulei):

Peroxizii cuprinşi într-o grăsime oxidează, în mediul acid, ionii I- la I2.

KI + CH3COOH  HI + CH3COOK
R-OOH + 2 HI  I2 + R-OH + H2O
Iodul rezultat din reacţia de mai sus este titrat cu o soluţie de tiosulfat de
sodiu:
I2 + 2 Na2S2O3  2 NaI + Na2S4O6
Volumul de soluţie de tiosulfat folosit la titrare este proporţional cu cantitatea
de peroxizi cuprinşi în grăsime. Cantitatea de peroxizi (în miliechivalenţi) dintr-
un kilogram de grăsime este indicele de peroxid al acelei grăsimi.

Reactivi:
1. Ulei de analizat.
2. Amestec de trei părţi acid acetic glacial şi două părţi cloroform.
3. Soluţie de KI 10 g %.
4. Soluţie de Na2S2O3 0,1 N.
5. Soluţie de amidon 1 g %.

Modul de lucru
Într-un balon de titrare se pipetează 5,4 ml ulei rânced (echivalent cu 5 g) şi
10 ml amestec de acid acetic-cloroform. Se agită pentru a favoriza dizolvarea uleiului
în cloroform. Se adaugă apoi 0,5 ml soluţie de iodură. Se lasă în repaus cca. 1 minut,
după care se adaugă 50 ml apă. Se titrează iodul eliberat cu soluţie de Na 2S2O3 0,1
N. Amidonul se adaugă în cursul titrării, atunci când concentraţia iodului s-a redus.
Sfârşitul titrării corespunde momentului în care întreaga cantitate de iod a fost
consumată (dispare coloraţia albastră a fazei apoase şi cea violetă a stratului
cloroformic).
Calcul. Indicele de peroxid se exprimă în miliechivalenţi de peroxid cuprinşi
în 1000 g grăsime. Ştiindu-se că 1 ml soluţie de tiosulfat de Na 0,1 corespunde la 0,1
miliechivalenţi de peroxid, indicele de peroxid al uleiului analizat este dat de relaţia:
n x 0,1 x 1000/5 = miliechivalenţi de peroxid / Kg grăsime

b. Determinarea peroxizilor lipidici în sânge

În medii biologice, substratul cel mai favorabil peroxidării îl constituie acizii
graşi polinesaturaţi (acid linoleic, linolenic, arahidonic), componenţi importanţi ai
membranelor celulare şi subcelulare şi care în sânge se află în lipoproteine.
Peroxidarea este un proces complex, produşii de peroxidare fiind instabili. Din
cauza instabilităţii, problema determinării lor nu a fost nici până în prezent rezolvată

139
satisfăcător. Determinarea lor directă se poate face prin: chemiluminiscenţă,
spectrometrie de masă, colorimetrie. Metoda cea mai accesibilă este cea
colorimetrică folosită pentru determinarea produsului final de peroxidare,
malondialdehida (MDA).

Principiul metodei.
Produsul de descompunere al peroxizilor lipidici, MDA formează cu acidul
tiobarbituric un compus colorat în roz.

Reactivi.
1.Soluţie acid tricloracetic (TCA), 50%.
2.Acid tiobarbituric 0,67 g în 100 ml TCA 20%.

Mod de lucru
Sângele se recoltează pe heparină sau citrat de sodiu. Se pipetează într-o
eprubetă 2ml sânge peste care se adaugă 2ml apă. Se agită, se îngheaţă şi se
dezgheaţă de două ori. Se adaugă 2ml TCA 50%. Se amestecă cu bagheta de sticlă
şi se centrifughează 15 minute la 6000 rpm. Se iau două eprubete în care se pipetează:

P B
Supernatant 2ml -
Amestec (2 ml H2O + 2 ml TCA 20%) - 2ml
Acid tiobarbituric 2ml 2ml

Eprubetele acoperite cu o pâlnie mică de sticlă se menţin timp de 20 minute

într-o baie de apă la 100oC. Se răcesc eprubetele sub jet de apă. După răcire se
adaugă 4 ml n-butanol şi se agită de mai multe ori cu atenţie. Se citeşte extincţia în
faza organică la 530 nm.

Calcul:
Coeficientul molar de extincţie al MDA este 1,54x105 moli/l.
nmoli MDA/ml ser = Ep x 39
Valori normale: 3-6 nmoli/ml.

140
 4. AMINOACIZII

Aminoacizii sunt compuşi chimici ce prezintă în structura lor o grupare

amino (bazică) şi o grupare carboxil (acidă). Un număr de 20 de aminoacizi sunt
numiţi naturali aceştia fiind codificaţi genetic şi intrând în mod constant în structura
proteinelor.
Cele mai reprezentative proprietăţi fizice şi chimice ale aminoacizilor sunt
datorate existenţei stării dublu ionizate (amfion):

a. Structură cristalină Datorită formei bipolare aminoacizii au structură

cristalină. Cristalele aminoacizilor sunt alcătuite din reţele de ioni bipolari şi prin
aceasta se aseamănă cu sărurile formate din reţele de ioni.
b. Punctele de topire au valori ridicate (cca 200 oC) comparativ cu substanţele
organice. Comportarea aminoacizilor este asemănătoare cu cea a sărurilor şi se
evidenţiază prin procesul de eliberare a ionilor bipolari, în momentul dizolvării. În
soluţii apoase aminoacizii se află prioritar sub formă de amfioni.
c. Solubilitatea. Fiind substanţe polare, aminoacizii se dizolvă, unii mai mult,
alţii mai puţin în solvenţi polari (apă, alcool etilic) şi sunt insolubili în solvenţi
nepolari ca benzenul, eterul, etc.
d. Caracterul amfoter. Prin intermediul grupărilor acide sau bazice,
aminoacizii vor putea reacţiona atât cu bazele cât şi cu acizii, formând săruri care
sunt mult mai solubile decât aminoacizii din care provin.
La modul cel mai general, caracterul amfoter se poate evidenţia prin reacţiile
următoare:

Aceste reacţii arată că gruparea bazică (COO-) acceptă protoni, iar gruparea
acidă (NH3+) cedează protoni şi că în funcţie de pH-ul mediului amfionul se poate
transforma în cation sau anion într-o anumită proporţie. La pH-uri puternic acide,
practic toţi amfionii trec sub formă de cationi, iar la pH-uri alcaline, sub formă de
anioni.
Pentru fiecare aminoacid este caracteristică o anumită valoare a pH-ului,
numit punct izoelectric (pI) la care grupările acidă şi bazică sunt ionizate în egală
141
măsură sau, altfel spus, numărul sarcinilor pozitive este egal cu cel al sarcinilor
negative.
La punctul izoelectric, aminoacidul respectiv va prezenta solubilitatea cea mai
mică şi nu va migra în câmp electric.
La pH- uri diferite de pI, aminoacizii vor migra în câmp electric:
- când pH < pI, aminoacizii se află sub formă de cationi şi migrează la catod,
- când pH> pI, aminoacizii se află sub formă de anioni şi migrează la anod
După cum se va vedea mai departe, această proprietatea aminoacizilor de a
migra în câmp electric este utilizată pentru analiza calitativă şi cantitativă a acestor
substanţe prin tehnica numită electroforeză.
e. Efectul de sistem tampon. Este maxim în regiunea de pH care corespunde
semineutralizării aminoacizilor cu acizi sau cu baze.
Din reacţiile scrise mai înainte se poate constata că la adăugarea de acid (in
cantităţi limitate), pH-ul soluţiei nu scade semnificativ deoarece protonii sunt
acceptaţi de grupările bazice –COO- care se transformă în grupări –COOH neionizate
(reacţia 1 de mai sus), corespunzător la adăugarea de bază, pH-ul soluţiei nu creşte
datorită neutralizării ionilor HO- de către grupările acide NH3+ (reacţia 2).
Unele din proprietăţile fizice şi electrochimice menţionate mai sus vor fi
ilustrate în experienţele care urmează, altele dintre ele sunt descrise în capitolele
referitoare la cromatografie şi electroforeză.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

1. Proprietăţi generale ce decurg din structura amfionică a aminoacizilor

a. Solubilitatea aminoacizilor în acizi şi baze

Se utilizează aminoacizi mai puţin solubili în apă cum sunt cisteina sau tirozina.
Modificarea pH-ului mediului, în care aceşti aminoacizi se găsesc sub formă de
suspensie, prin adăugare de HCl sau NaOH, duce la solubilizarea lor ca urmare a
formării clorhidraţilor sau a sărurilor de sodiu, mai solubile decât aminoacizii.
Mod de lucru
În două eprubete se pun câte 1-2 ml suspensie de cisteină (în prealabil agitată).
Într-una din eprubete se adaugă picătură cu picătură soluţie de HCl 10 %, până la
dizolvarea cristalelor, când aminoacidul este transformat în clorhidrat; în a doua
eprubetă se adaugă, în acelaşi mod soluţie de NaOH 10 %. Se observă dizolvarea
cristalelor ca urmare a formării sării de sodiu a aminoacidului.
b. Capacitatea tampon a aminoacizilor
În trei eprubete (A, B, C) se introduc câte 5 ml soluţie de acid glutamic 0,5 g %.
în alte trei eprubete (A1, B1, C1) se pipetează câte 5 ml apă. În toate eprubetele se
adaugă câte 2 picături de indicator universal (care virează continuu de la roşu la
albastru violet între pH 4 şi pH 9).
142
 În eprubetele A şi A1 se introduc 1-2 picături de soluţie de HCl 0,01 N iar în
eprubetele B şi B1 se adaugă 1-2 picături de soluţie NaOH 0,01 N. În perechea de
eprubete C şi C1 nu se adaugă nimic.
După culoarea pe care o ia indicatorul se stabileşte cum s-a modificat pH-ul
apei şi pH-ul soluţiei de aminoacid, după adăugare de acid sau de bază, prin
comparaţie cu o scară de tampoane colorate, potrivit pH-ului fiecăruia, cu ajutorul
aceluiaşi indicator.
Aminoacizii, fiind compuşi cu funcţie mixtă vor da o serie de reacţii chimice
specifice grupării carboxilice, altele specifice grupării aminice, precum şi reacţii
datorate existenţei ambelor grupări în aceeaşi moleculă. Aceste reacţii sunt generale
pentru toţi aminoacizii.
În funcţie de natura radicalului, specific pentru fiecare aminoacid, vor exista
şi reacţii chimice particulare pentru diverşi aminoacizi sau grupe de aminoacizi.
Aceste reacţii sunt numeroase: unele de interes teoretic, care se întâlnesc în
cadrul proceselor metabolice, altele de interes mai mult practic, fiind utilizate pentru
analiza cantitativă şi calitativă a aminoacizilor şi proteinelor.
Cu ajutorul acestor reacţii obţinem date importante privind chimia proteinelor:
- identificarea şi analiza aminoacizilor din hidrolizatele proteice,
- identificarea reziduurilor de aminoacizi din proteinele native, responsabili de
activitatea biologică acestora etc.

2. Reacţii generale de identificare ale aminoacizilor

a. Reacţia cu ninhidrina
Aminoacizii formează cu ninhidrina (hidratul tricetohidrindenului) un compus
colorat în albastru–violet. Fac excepţie prolina şi hidroxiprolina care dau un compus
galben, respectiv portocaliu.
Reacţia se desfăşoară în mai multe etape.
Ninhidrina este un agent de oxidare care determină decarboxilarea oxidativă
a -aminoacidului, cu producerea de CO2, NH3 şi a unei aldehide care conţine un
atom de carbon mai puţin decât aminoacidul:

Ninhidrina redusă, împreună cu cea oxidată şi cu amoniacul eliberat

formează un compus de culoarea albastru violet:
143
 Reacţia este foarte sensibilă şi poate fi utilizată pentru estimarea cantitativă
a unor cantităţi foarte mici de aminoacizi. Această reacţie este dată şi de peptidele
având o grupare -aminică liberă.

Mod de lucru
La 1 ml soluţie de alanină se adaugă 1 ml soluţie de ninhidrină 0,1 g%. Se
încălzeşte până la fierbere 1-2 minute. Apare o coloraţie albastu-violet.
b. Formarea de săruri complexe
Aminoacizii formează cu ionii metalelor tranziţionale (Cu, Cr, Co, Mn) săruri
complexe colorate (chelaţi), pe baza electronilor neparticipanţi de la azot.
Complexul glicocolului cu ionii Cu2+ are structura:

Mod de lucru. La 1-2 ml soluţie de glicocol se adaugă câteva picături de

CuSO4 şi 1 ml soluţie de NaOH 10 g %. Apare o coloraţie albastră.

c. Dezaminarea cu acid azotos

Aminoacizii se dezaminează relativ uşor prin reacţia lor cu acidul azotos.
Acesta din urmă se obţine în mediu de reacţie dintr-o sare a sa şi acid acetic. Au loc
reacţiile:

Din reacţie se observă că pentru fiecare moleculă de aminoacid se

eliberează o moleculă de azot. Determinând volumul de azot se poate stabili
numărul de grupări aminice reactante.
Reacţia poate fi utilizată pentru identificare dar şi pentru analiza cantitativă a
aminoacizilor inclusiv pentru determinarea grupelor amino libere din proteine; analiza
cantitativă se face cu metoda volumetrică Van Slyke.
Mod de lucru
144
 La 1-2 ml soluţie de glicocol se adaugă un volum egal de soluţie NaNO2 (5 g %)
şi 1-2 ml soluţie de acid acetic 2 N. Se constată că are loc o degajare de gaz (azot).

3.Reacţii speciale ale unor aminoacizi

Pe lângă reacţiile generale datorate grupărilor NH2 şi COOH existente în
moleculele tuturor aminoacizilor aceştia vor prezenta şi reacţii specifice datorate
anumitor grupări existente în radicalul legat la C .
Aceste reacţii sunt extrem de utile atât pentru identificarea aminoacizilor cât
şi pentru determinarea cantitativă a anumitor grupări sau rezidii de aminoacizi dintr-
o catenă polipeptidică.
Identificarea şi determinarea cantitativă a diverselor rezidii de aminoacizi
dintr-o catenă pot da relaţii importante în ceea ce priveşte structura şi proprietăţile
biologice ale diverselor proteine.

a. Reacţia xantoproteică
Aminoacizii cu caracter aromatic pot fi nitraţi prin încălzire cu HNO 3
concentrat, transformându-se în nitroderivaţii corespunzători, de culoare galbenă.
Prin alcalinizare, nitroderivaţii trec în formele tautomere acinitro care, datorită
structurilor chinoide, sunt coloraţi mai intens.
Reacţia xantoproteică este dată cel mai uşor de tirozină şi mai greu de
fenilalanină, triptofan sau histidină. Cu tirozina reacţia decurge astfel:

Mod de lucru
Într-o eprubetă se iau 1-2 ml soluţie de tirozină şi se tratează cu cca 1 ml HNO3
concentrat. Se încălzeşte la fierbere până apare o coloraţie galbenă. După răcire se
alcalinizează cu soluţie de NaOH 10 %. Coloraţia se intensifică.

b. Reacţia Pauli (cuplare cu sărurile de diazoniu)

Aminoacizii cu caracter aromatic (tirozina, histidina) se cuplează cu acidul
diazobenzensulfonic dând naştere la compuşi azoici coloraţi. Acidul diazobenzen-
sulfonic se obţine prin tratarea acidului sulfanilic cu acid azotos. Acesta se obţine în
mediu de reacţie prin tratarea unei sări a lui cu un acid. Au loc următoarele reacţii:
NaNO2 + HCl  HNO2 + NaCl

145
 Mod de lucru
La 2 ml soluţie clorhidrică de acid sulfanilic (0,5 g%) se adaugă 1 ml soluţie
de NaNO2 0,5 g %. Se agită şi după 1-2 minute se adaugă 1-2 ml soluţie de tirozină
şi se alcalinizează cu soluţie de Na2CO3 10 g %. Apare o coloraţie roşie.
c. Reacţia triptofanului cu aldehidele
Triptofanul se condensează în mediu acid cu aldehidele dând compuşi
coloraţi, potrivit reacţiei:

Ca aldehidă pot fi utilizate: formaldehida (CH2O), acidul glioxilic (HCOO-

CHO), aldehida cinamică (C6H5-CH-CH-CHO) sau p–dimetil-amino-benzaldehida
(CH3)2N-C6H4-CHO). În funcţie de aldehida utilizată se obţin compuşi coloraţi
specific.

d. Reacţia Hopkins-Cole
Triptofanul tratat cu acid glioxilic, în mediu acid, formează un compus de
culoare violet.

Mod de lucru
La 1-2 ml soluţie de triptofan se adaugă un volum egal de acid acetic glacial
(care cuprinde acid glioxilic ca impuritate). Se agită. Se adaugă pe pereţii eprubetei
1-2 ml H2SO4 concentrat. La limita de separaţie a celor două straturi apare un inel
violet.

146
 e. Reacţia Sakaguchi
–
naftolul în prezenţa de NaBrO (obţinut prin tratarea a 100 ml soluţie de NaOH 5 g
% cu 2 g de brom). Se dezvoltă o coloraţie roşie.

f. Recunoaşterea aminoacizilor cu sulf

Prin încălzire în mediu puternic alcalin, sulful din tioaminoacizi (cisteină,
cistină, metionină) este eliberat sub formă de ioni S2- care sunt identificaţi ca sulfură
de plumb. Cu cisteina reacţia decurge astfel:

Cistina dă această reacţie după o prealabilă reducere.

Mod de lucru
La 1-2 ml soluţie de cisteină se adaugă un volum egal de NaOH 10 g % şi 1 ml
soluţie de Pb (CH3COO)2. Se fierbe câteva minute. Apare un precipitat negru–brun de
PbS.

4. Analiza cantitativă a aminoacizilor

Analiza cantitativă în clasa aminoacizilor urmăreşte, pe de o parte,
determinarea conţinutului acestora în proteine sau alţi compuşi, iar pe de altă parte,
separarea, identificarea şi dozarea fiecăruia dintre aminoacizii aflaţi în amestec.
Pentru separarea, identificarea şi dozarea aminoacizilor din amestecuri
(hidrolizate proteice, lichide biologice) se folosesc metode cromatografice şi
electroforetice.
Una dintre metodele utilizate pentru determinarea cantităţii totale de amino-
acizi dintr-un amestec este „formoltitrarea”.

Formoltitrarea aminoacizilor (metoda Sörensen)

147
 Aminoacizii sunt acizi foarte slabi sau baze foarte slabe şi nu pot fi dozaţi prin
titrare directă, deoarece la punctele de echivalenţă nu au loc variaţii ale pH-ului
suficient de pronunţate care să permită virajul brusc al indicatorului de neutralizare.
Prin tratarea aminoacidului cu formaldehidă gruparea aminică este blocată şi se
obţine un derivat cu caracter acid:

Acest compus are un pKa = 5 şi poate fi titrat cu NaOH în prezenţa

fenolftaleinei ca indicator:

Deoarece sarea obţinută este hidrolizabilă, se împiedică hidroliza prin

adăugarea unui exces de hidroxid de sodiu corespunzător unui pH de aproximativ 9.
În acest scop proba se titrează până la virajul fenolftaleinei la roşu intens, identic cu
culoarea unui martor ce conţine un volum cunoscut de NaOH, volum ce urmează să
fie scăzut din volumul folosit la titrare.
Formoltitrarea este utilizată pentru dozarea aminoacizilor din lichidele
biologice sau soluţii de aminoacizi, precum şi pentru dozarea aminoacizilor totali din
proteine (care au fost în prealabil hidrolizate).
Reactivi
1. Soluţie de glicocol de dozat.
2. Soluţie de formaldehidă 40 g % (neutralizată cu soluţie de NaOH în prezenţa
fenolftaleinei)
3. Soluţie de NaOH 0,05 N
4. Soluţie alcoolică de fenolftaleină 1 g %.

Mod de lucru
Se prepară un martor de culoare astfel: într-un balon de titrare se introduc 5
ml soluţie de formaldehidă, 5 ml apă, 3 picături de indicator şi se titrează cu soluţie
de NaOH 0,05 N până la virajul roşu intens al fenolftaleinei. (pH aproximativ 9).
Într-un balon de tritrare se introduc 5 ml soluţie de glicocol de analizat, 3
picături de indicator şi picătură cu picătură soluţie de NaOH până la virajul
fenolftaleinei în roz. Nu se măsoară acest volum. Se adaugă apoi 5 ml soluţie de
formaldehidă. Amestecul se decolorează prin scăderea pH-ului. Se titrează apoi cu
soluţie de NaOH 0,05 N până la o coloraţie roşu intens, asemănătoare cu a martorului
de culoare.

148
 Calcul
Din volumul de soluţie de NaOH folosit la titrarea probei (n2) se scade
volumul folosit la titrarea martorului (n1):
1 ml NaOH 0,05 N corespund la 75 x 0,05/1000 = 0,00375 g
0,00375 x (n2 – n1) x 20 = g glicocol/100 ml

149
 5. PROTEINELE

Proteinele sunt substanţe macromoleculare constituite din resturi de amino-

acizi reuniţi prin legături peptidice:
R1 O R3 O Rn

CH NH C CH NH C CH
+ -
H3 N C CH NH C CH NH COO
aminoacid O R2 O R4 aminoacid
N-terminal C-terminal
lanþ polipeptidic

Lanţurile polipeptidice prezintă o diversitate infinită în ceea ce priveşte

natura, numărul şi secvenţa resturilor de aminoacizi fapt care dă seama de
specificitate de organ, de specie a proteinelor.

1. Proprietăţile electrochimice ale proteinelor

Proteinele sunt amfioni macromoleculari. Grupările acide şi bazice care

conferă proteinelor caracter amfoter sunt: grupările -NH3+ şi -COO- ale resturilor N-
terminale şi, respectiv, C-terminale precum şi grupările acide sau bazice ale resturilor
aminoacizilor monoamino-dicarboxilici (acid aspartic, acid glutamic) şi
diaminocarboxilici (lizina, arginina):
NH CH CO NH CH CO NH CH CO NH CH CO

CH 2 CH 2 (CH2 )4 (CH2 )3
- +
COO CH 2 NH 3 NH
-
COO C NH 2
+
Asp Glu Liz Arg NH 2
Sarcina electrică netă a unei molecule proteice depinde de pH–ul soluţiei.
La pH-uri net acide toate grupările –COO- şi -NH2 sunt protonate: moleculele
proteinelor sunt cationi. La pH-uri net alcaline toate grupările –COOH şi -NH3+
cedează protoni, deci moleculele proteinelor sunt anioni. În forma cationică sau
anionică, moleculele vor migra în câmp electric, proprietate utilizată în metodele
electroforetice de separare, identificare şi dozare a proteinelor.
Pentru fiecare proteină se defineşte un anume pH la care poliamfionii
cuprind un număr egal de sarcini (+) şi de sarcini (-). Acesta este pH-ul izoelectric
sau punctul izoelectric (pI). La pI solubilitatea proteinelor este minimă. Urmărirea
solubilităţii proteinelor în soluţii tampon cu diferite pH-uri este folosită pentru
determinarea punctelor izoelectrice ale acestora.
Proteinele în soluţie, ca şi aminoacizii, exercită efecte tampon care însă se
manifestă cu intensitate relativ egală de-a lungul unor scări mai largi de pH.
Proprietăţile electrochimice amintite sunt ilustrate în experienţele
următoare.
150
 ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

a. Determinarea pH-ul izoelectric al cazeinei

În 6 eprubete se introduc câte 5 ml tampon de acid acetic-acetat de sodiu 0,1

M cu pH-uri cuprinse între 3,5 şi 5,4. În fiecare eprubetă se pipetează câte 1 ml
soluţie de cazeină. Se agită. După 5-10 minute se examinează abundenţa
precipitatului în diversele eprubete. pH-ul la care solubilitatea cazeinei este minimă
corespunde tocmai pH-ului izoelectric al acestei proteine.

b. Capacitatea tampon a proteinelor

Se repetă experienţa descrisă la aminoacizi utilizându-se în locul soluţiei de

acid glutamic, o soluţie de gelatină.

2. Reacţii de culoare ale proteinelor

Proteinele dau diverse reacţii care permit identificarea lor. Unele dintre
acestea sunt comune tuturor proteinelor, cum sunt reacţia biuretului şi reacţia cu
ninhidrină. Alte reacţii sunt datorate unor grupări din resturile aminoacizilor, cum
sunt grupările guanidinice, fenolice, tiolice, nuclee heterociclice, aromatice.
Intensitatea acestor reacţii de culoare variază de la o proteină la alta, după natura şi
abundenţa grupărilor reactive cuprinse în proteina cercetată.

a. Reacţia biuretului

La această reacţie, una dintre cele mai specifice reacţii de identificare a

proteinelor, participă grupările peptidice (-CO-NH) prin care sunt reunite resturile
aminoacizilor în orice lanţ polipeptidic. În mediu puternic alcalin, ionii Cu2+ sunt
chelaţi, fiecare, cu patru astfel de grupări, rezultând compuşi coloraţi în violet:

Deoarece biuretul (H2N-CO-NH-CO-NH2) în aceleaşi condiţii formează un

complex cupric colorat, reacţia a căpătat denumirea de reacţia biuretului.

Modul de lucru
151
 La 1-2 ml soluţie de proteină (ovalbumină) se adaugă un volum egal din
reactivul biuret. Apare o coloraţie albastru-violet. (Reactivul biuret se prepară în
felul următor: 1,5 g CuSO4, 5 H2O şi 6 g sare Seingnette se dizolvă în cca 500 ml
apă. Se adaugă apoi, sub agitare, 300 ml NaOH 10 g %. Se completează volumul
soluţiei la 1.000 ml cu apă).

b. Reacţia cu ninhidrina

Proteinele dau cu ninhidrina coloraţii albastru-violet ca şi aminoacizii, datorită

prezenţei în moleculele lor, sau eliberării după hidroliză, a grupărilor –CH(NH2) –
COOH.
Mecanismul reacţiei şi modul de lucru sunt descrise la capitolul privind
aminoacizii. Se va efectua reacţia utilizându-se o soluţie de ovalbumină.

c. Reacţiile de culoare ale proteinelor datorate radicalilor fixaţi la C .

În funcţie de aminoacizii constitutivi, proteinele vor da reacţiile de culoare,

caracteristice acestora: reacţia xantoproteica, reacţia Pauli, Sakaguchi, Hopkins-
Cole, reacţia pentru grupările tiolice. Se vor efectua aceste reacţii utilizându-se în
locul diverşilor aminoacizi, o soluţie de ovalbumină.

3. Reacţii chimice pentru identificarea aminoacizilor N-terminali şi C-

terminali din lanţurile polipeptidice.

Analiza proteinelor implică, în primul rând, determinarea structurii primare

definită prin numărul, felul şi ordinea de legare (succesiunea) aminoacizilor
din lanţul polipeptidic.
Înaintea secvenţializării unei proteine punţile disulfidice trebuie să fie
reduse cu mercaptoetanol (sau alţi reactivi) iar grupările –SH sunt alchilate (prin
tratare cu acid iodoacetic) pentru a împiedica refacerea punţilor disulfidice.
Metodele utilizate în acest scop au fost automatizate iar numărul
polipeptidelor şi proteinelor a căror structură primară a fost elucidată este în
continuă creştere.
În principiu, pentru determinarea structurii primare a unei polipeptide se
efectuează iniţial o hidroliză enzimatică specifică, în urma căreia se obţin peptide
mici, cărora li se determină secvenţa de aminoacizi. Această din urmă operaţie are la
bază o serie de reacţii chimice specifice pentru grupele -NH2 sau –COOH pe care le
conţin aminoacizii terminali ai lanţurilor polipeptidice. În cele ce urmează vom arăta
unele din reacţiile chimice cel mai des utilizate în acest scop.

Identificarea aminoacizilor N-terminali

152
 Există trei tehnici majore de secvenţializare a proteinelor începând cu
capătul N-terminal. Acestea sunt Sanger (cu dinitrofluorbenzen), clorura de dansil
şi Edman.
Numărul de lanţuri polipeptidice dintr-o proteină poate fi determinat în
acelaşi timp prin analiza aminoacidului N-terminal. Apariţia a 2 sau mai mulţi
aminoacizi N-terminali indică prezenţa a 2 sau mai multor lanţuri
polipeptidice.

Reacţia cu dinitrofluorbenzen (reacţia Sanger)

Gruparea aminică liberă a unui aminoacid formează în mediu alcalin cu

dinitrofluorbenzenul (DNFB), dinitrofenil derivaţi de culoare galbenă, rezistenţi la
hidroliza acidă.
Aminoacidul N-terminal al unui lanţ peptidic va da aceeaşi reacţie şi se va
obţine derivatul 2,4 dinitrofenil al peptidei respective. Prin hidroliza acidă (cu HCl
6 N) a acestui derivat vor fi hidrolizate toate legăturile peptidice ale lanţului şi, ca
urmare, hidrolizatul va conţine toate reziduurile catenei peptidice sub formă de
aminoacizi liberi cu excepţia celui N-terminal care va exista sub formă de 2,4-
dinitrofenil-aminoacid. Acesta poate fi uşor separat şi identificat prin metoda
cromatografică.

Reacţia cu clorura de dansil

Clorura de dansil reacţionează în mediu alcalin cu aminoacidul N-terminal
cu care formează un derivat (aminoacid dansilat) care poate fi detectat prin
fluorescenţă. Avantajul acestei metode este sensibilitatea extrem de mare.
Reacţia Edman
Reacţia Edman (cu fenilizotiocianat) este metoda de cea mai largă
utilizare. Ea se bazează pe proprietatea fenilizotiocianatului de a reacţiona,
cantitativ, în mediu bazic, cu gruparea aminică liberă a unei peptide şi de a forma
derivatul feniltiocarbamoil al peptidei respective. Avantajul acestei metode este că,
după ce aminoacidul N-terminal este marcat la fel ca şi în celelalte tehnici, restul
polipeptidului rămâne intact, ceea ce permite repetarea reacţiilor şi determinarea
secvenţei aminoacizilor dinspre capătul N-terminal spre cel C-terminal.
Prin tratarea cu acizi anhidrii, reziduul N–terminal se eliberează şi se
ciclizează formându-se derivatul fenitiohidantoinic al aminoacidului N-terminal,
care poate fi separat şi identificat prin metode cromatografice.
Tehnica Edman a fost automatizată pentru creşterea eficienţei şi vitezei de
secvenţializare a polipeptidelor. Dezavantajul acestei tehnici este că nu permite

153
secvenţializarea unor lanţuri polipeptidice mai lungi de aproximativ 50 de
aminoacizi. Din acest motiv lanţurile polipeptidice mai lungi sunt hidrolizate
enzimatic sub acţiunea unor endopeptidaze specifice şi transformate în polipeptide
cu lungime dorită care sunt separate cromatografic şi ulterior analizate.
Tehnica Edman se bazează pe următoarele reacţii:
+ -
N C S + H3N CH CO NH CH CO NH CH COO
R1 R2 Rn
fenilizotiocianat aminoacid N-terminal
lanþ polipeptidic
S
-
NH C NH CH CO NH CH CO NH CH COO
R1 R2 Rn
feniltiocarbamilpeptid
O R1
C CH
+ -
+ H3 N CH CO NH CH CO NH CH COO
N NH
C R2 R3 Rn
S aminoacid N-terminal
feniltiohidantoina lanþ polipeptidic

Identificarea aminoacizilor C-terminali

Reacţia de reducere cu borohidrură de litiu (LiBH4)

Gruparea carboxil a unui aminoacid C-terminal dintr-o catenă peptidică poate

fi redusă, în mediu anhidru de către borohidrura de litiu, cu formarea -amino-
alcoolului corespunzător.
COOH CH2 OH
LiAlH 4
H2 N C H H2 N C H

R R

Hidrolizatul unei peptide reduse la aminoacidul C-terminal, va cuprinde

alături de aminoacizi liberi, o moleculă de -aminoalcool corespunzătoare
aminoacidului C-terminal, care poate fi identificat prin metode cromatografice.

Reacţia cu hidrazina (hidrazinoliza)

154
 Prin tratarea unui lanţ polipeptidic cu hidrazina timp de 20-100 ore, la
temperatură de 90oC, aceasta va cliva toate legăturile peptidice, transformând toate
reziduurile de aminoacizi în aminoacid–hidrazide, cu excepţia celui C-terminal care
va fi eliberat ca acid liber, uşor de identificat prin metode cromatografice.
+ -
H3 N CH CO NH CH CO NH CH COO + (n-1) NH2 -NH2
R1 R2 Rn

+ -
(n-1) H3 N CH CO NH NH 2 + H2 N CH COO
R Rn
aminoacil-hidrazide aminoacid C-terminal

4. Precipitarea proteinelor

Stabilitatea unei proteine în soluţie este condiţionată de repartiţia şi proporţia

grupărilor polare hidrofile şi a grupărilor apolare hidrofobe, deci de structura
proteinei. Datorită grupelor hidrofile, moleculele apei se aşază în jurul moleculelor
proteice determinând hidratarea lor. Deoarece interacţiunea dintre grupele polare ale
proteinei şi moleculele de apă este mai mare decât cea dintre moleculele proteice
învecinate se produce de fapt solubilizarea acestora.
Ori de câte ori intervine din afară un factor care fie că îndepărtează apa ce
hidratează proteinele, fie că modifică structura proteinelor, acestea vor fi
precipitate. În funcţie de natura factorului precipitarea poate să fie reversibilă sau
ireversibilă.
În cele ce urmează vor fi descrise reacţiile de precipitare a proteinelor
precum şi importanţa practică a acestor operaţiuni.

a. Salifierea proteinelor

Sărurile neutre (Na2SO4, NaCl, MgSO4, (NH4)2SO4) în concentraţii mari scad

solubilitatea proteinelor, determinând precipitarea lor. Acest proces se datorează
“deshidratării” moleculelor proteice de către ionii salini care, prin numărul lor mare
şi prin afinitatea accentuată pentru apă, îndepărtează o cantitate atât de mare de apă
de pe suprafaţa moleculelor, încât apa rămasă devine insuficientă pentru menţinerea
lor în soluţie şi acestea precipită.
Precipitarea proteinelor prin salifiere este reversibilă. La diluarea cu apă
precipitatul se redizolvă, semn că nu s-a produs alterarea structurii. Deci salifierea
nu denaturează proteinele, acestea îşi păstrează acţiunile biologice specifice,
catalitice, hormonale sau de alt fel.
Deoarece fiecare proteină precipită la o concentraţie salină determinată este
posibil în principiu ca dintr-un amestec complex de proteine să se îndepărteze pe
rând fiecare component, adăugând cantităţi variabile de săruri neutre. Astfel
155
albuminile precipită când soluţiile care le cuprind sunt saturate cu (NH4)2SO4, pe
când globulinele se separă la semisaturarea acestora cu (NH4)2SO4.
Separarea prin precipitare nu este eficace decât în cazul proteinelor ce
prezintă o solubilitate mult diferită . În general nu se obţin proteine pure şi sunt
necesare alte metode de purificare (dializa, filtrare prin gel) care sunt descrise în
capitolele de cromatografie şi electroforeză.

Mod de lucru
La 5-6 ml soluţie de ovalbumină se adaugă în porţiuni mici cristale de
(NH4)2SO4. La saturaţie apare un precipitat abundent. O porţiune din suspensia
obţinută se diluează cu apă. Se observă dizolvarea precipitatului. Cealaltă porţiune
de precipitat este păstrată pentru efectuarea experienţei de dializă.

b. Dializa unei suspensii de ovalbumină

Dializa este metoda de îndepărtare a substanţelor micromoleculare dintr-un

amestec prin difuziunea lor printr-o membrană semipermeabilă, sub acţiunea unui
gradient de concentraţie. Proteinele, având greutăţi moleculare mari şi dimensiuni
mari nu pot străbate porii membranelor semipermeabile şi pot fi purificate, prin
dializa, de electroliţi şi de alte substanţe cu moleculă mică.
Astfel, pentru a putea fi folosite, albuminele separate prin salifiere aşa cum
s-a arătat în experienţa anterioară, este necesar să se îndepărteze sulfatul de amoniu
reţinut în precipitat. Acest lucru se realizează prin dializă, aşa cum se arată în
experienţa următoare.
Mod de lucru
O porţiune din suspensia de ovalbumină obţinută în experienţa anterioară se
introduce într-un dializor cu membrană de celofan. Se introduce dializorul într-un
pahar Berzelius care conţine apă distilată, având grijă ca lichidul din interiorul
dializorului să fie la acelaşi nivel cu apa din pahar. După 10-15 minute se analizează
lichidul din paharul Berzelius. Ionii SO42- care au dializat, se recunosc prin reacţia
cu BaCl2 în care se formează un precipitat alb de BaSO4 :

(NH4)2SO4 + BaCl2  BaSO4 + 2 NH4Cl

Cu o altă porţiune din lichid se efectuează reacţia biuretului. Se constată că

reacţia este negativă, dovadă că moleculele proteice nu au dializat.

c. Filtrarea prin gel

Este o metodă de separare a substanţelor dintr-un amestec prin trecerea lor

printr-un un strat de gel (vezi cromatografia de excludere moleculară).

156
 d. Separarea şi desalifierea albuminei serice

Serul conţine proteine (albumine şi globuline) precum şi o serie de compuşi

cu molecule mici. Pentru separarea albuminelor, un volum de ser uman proaspăt (5
ml) se tratează cu un volum egal (5 ml) de soluţie saturată de sulfat de amoniu.
Amestecul obţinut este semisaturat cu sulfat de amoniu, deci vor precipita
globulinele. Acestea se îndepărtează prin centrifugare, iar o porţiune (3 ml) din
supernatantul conţinând albumine, sulfat de amoniu şi alte molecule mici se aplică
într-o coloană de 17,5/2,5 cm umplută cu Sephadex G-25. Substanţele se eluează cu
apă distilată la un debit de 25 ml pe oră. Se recoltează 6-8 fracţiuni a câte 10 ml.
Albumina se eluează în fracţiunile 2-4, iar sulfatul de amoniu în fracţiunile
6-8. Folosind reacţia biuretului şi reacţia pentru identificarea anionului SO42-
(descrise anterior) se poate verifica eficienţa separării şi purificării prin metodele
folosite.

e. Precipitarea proteinelor cu solvenţi organici

Acţiunea precipitantă a solvenţilor organici se datorează în principal

micşorării constantei dielectrice a soluţiilor proteice în urma adăugării solvenţilor.
Se ştie că soluţiile apoase având o constantă dielectrică mare, micşorează forţa
de atracţie dintre sarcinile opuse ale moleculelor învecinate, aşa încât acestea se pot
păstra în soluţie. Adăugând solvenţi organici cu constantă dielectrică mică (eter,
etanol, metanol) constanta dielectrică a mediului scade, forţa de atracţie dintre
moleculele proteice creşte şi acestea pot să se unească, formând un precipitat.
Acţiunea solvenţilor organici este determinată de configuraţia electrică
caracteristică pentru fiecare tip de proteină şi de aceea precipitarea cu solvenţi
decurge diferit faţă de precipitarea cu săruri neutre a căror acţiune depinde de factori
mai puţin caracteristici, cum sunt dimensiunile şi forma moleculei.
Solvenţii organici intervin direct şi în procesele de solubilizare, intrând în
competiţie cu proteinele pentru moleculele de apă, determinând deshidratarea şi
precipitarea lor.
Deoarece solvenţii organici au în general tendinţa de a denatura proteinele,
toate operaţiunile de precipitare se efectuează la temperaturi scăzute.
Pe măsură ce scade temperatura, solubilitatea proteinelor în prezenţa
solvenţilor organici se micşorează considerabil, fapt ce determină atât micşorarea
cantităţii de solvent necesar pentru precipitare, cât şi atenuarea acţiunii sale
denaturate.

Mod de lucru
La 2-3 ml soluţie de ovalbumină se adaugă 2-3 volume de alcool etilic.
Proteina precipită.

157
 f. Precipitarea proteinelor cu diverşi agenţi denaturanţi

Proteinele sunt precipitate din soluţiile lor de către o serie de agenţi

denaturanţi cum sunt:
 acizii organici: acid picric, acidsulfosalicilic, acid tricloracetic, acid
fosfowolframic;
 acizi anorganici sau organici concentraţi: acid azotic, acid acetic;
 sărurile metalelor grele (CuSO4, AgNO3, HgCl2, Pb(CH3COO)2).
Mecanismul de precipitare a proteinelor diferă de la un grup de agenţi la altul.
Fiecare agent având un mod propriu de acţiune. Pentru o aceeaşi proteină pot rezulta
diferiţi produşi de denaturare corespunzători agentului folosit.

g. Precipitarea proteinelor cu acizi organici

În mediu acid proteinele se găsesc sub formă de cationi şi în aceste condiţii

sunt precipitate de unii acizi organici cu care formează săruri greu solubile.
Aceste reacţii de precipitare sunt frecvent utilizate în tehnicile de analiză
biochimică. Astfel, în majoritatea dozărilor compuşilor neproteici din ser se
procedează la îndepărtarea proteinelor prin precipitarea lor cu acid tricloracetic sau
acid fosfowolframic, pentru recunoaşterea şi dozarea proteinelor din urinile
patologice se utilizează acidul sulfosalicilic respectiv acidul picric (sub forma
reactivului Esbach).
Mod de lucru
În trei eprubete se introduc câte 2-3 ml soluţie de ovalbumină şi câteva picături
de HCl 10 %. În prima eprubetă se adaugă, picătură cu picătură, soluţie saturată de
acid picric; în a doua, soluţie de acid sulfosalicilic 20 g % şi în a treia eprubetă, soluţie
de acid tricloracetic 10 g %. Se examinează precipitatele obţinute.

h. Precipitarea proteinelor de către ionii metalelor grele.

Ionii metalici (Cu2+, Ag+, Hg2+, Pb+) formează cu proteinele săruri greu
solubile.
Mod de lucru
În patru eprubete se introduc câte 2 ml soluţie de ovalbumină. În prima epru-
betă se adaugă soluţie de Pb (CH3COO)2 2 g %; în a doua, soluţie de HgCl2 2 g %;
în a treia, soluţie de CuSO4 2 g % iar în a patra eprubetă soluţie de AgNO3 1 g %. Se
examinează precipitatele obţinute.

i. Precipitarea proteinelor cu acizi concentraţi

158
 Acizii acetic şi azotic concentraţi precipită diverse proteine din soluţiile lor,
în urma denaturării acestora.
Mod de lucru
În două eprubete se iau câte 2 ml soluţie de ovalbumină. Într-una din ele se
adaugă 1 ml acid acetic glacial, iar în cealaltă 1 ml HNO3 concentrat. Se formează
precipitate albe abundente.

5. Denaturarea proteinelor

Denaturarea proteinelor presupune dezorganizarea conformaţiei native a

macromoleculei, ca urmare a ruperii legăturilor dintre catenele polipeptidice şi
deplierii acestora sub acţiunea diverşilor agenţi fizici (căldură, radiaţii X sau
ultraviolete, agitare, ultrasonare) sau chimici (acizi concentraţi, alcalii, săruri). Prin
denaturare structura primară a proteinelor nu este alterată. Proteinele denaturate au
proprietăţile fizico-chimice şi biologice modificate:
 pierderea capacităţii de cristalizare (la proteinele cristalizabile);
 apariţia unor grupări chimice. În urma deplierii catenelor, grupările active,
care în proteina nativă erau inaccesibile pentru reacţii, devin accesibile. De aceea
proteinele denaturate dau reacţii de culoare mai intense sau uneori prezintă reacţii
caracteristice pentru anumite grupări funcţionale inexistente în proteina nativă.
Astfel apariţia grupelor –SH, capabile de a reacţiona cu nitroprusiatul de sodiu,
indică denaturarea proteinei respective;
 scăderea solubilităţii proteinei. Aceasta se observă uşor în apropierea pI la
care proteinele denaturate precipită. Micşorarea solubilităţii este determinată de
apariţia grupărilor apolare hidrofobe la suprafaţa moleculei, în urma deplierii
catenelor;
 modificarea proprietăţilor optice (activitatea optică, absorbţia în UV)
 modificarea vâscozităţii şi presiunii osmotice;
 modificarea proprietăţilor electroforetice;
 schimbarea capacităţii de a absorbi molecule mici (coloranţi, ioni, lipide)
 creşterea sensibilităţii la acţiunea enzimelor;
 pierderea specificităţii biologice.
Toate aceste aspecte ale denaturării pot fi explicate prin faptul că, în funcţie
de caracterul agentului denaturant, catenele polipeptidice devenite libere pot rămâne
desfăşurate sau se pot replia cu formarea unei structuri foarte apropiate de cea nativă,
sau pot forma o structură nouă, diferită de cea nativă.
În experienţa descrisă mai departe se denaturează ovalbumina prin încălzire.
Dacă pH-ul soluţiei este apropiat de pI proteina denaturată floculează. În soluţii mai
acide sau mai alcaline decât pI proteina denaturată este solubilă.

Mod de lucru
În trei eprubete A, B, C, se pipetează câte 3 ml soluţie de ovalbumină. În
eprubeta A se introduce 1 ml tampon acid acetic/acetat de sodiu cu pH 4,7 (pI-ul
159
ovalbuminei). în eprubeta B se introduce 1 ml soluţie de HCl 0,05 N iar în eprubeta
C, 1 ml soluţie de NaOH 0,05 N. Toate trei eprubetele sunt ţinute într-o baie de apă
la fierbere 5 minute. Se observă precipitarea proteinei în eprubeta A. După răcire se
adaugă în eprubetele B şi C câte 3 ml tampon acid-acetic/acetat de sodiu cu pH 4,7.
În ambele eprubete proteina denaturată floculează.
Dozarea proteinelor totale într-un produs se poate face prin metode
colorimetrice bazate pe reacţii de culoare specifice pentru proteine (de exemplu,
reacţia biuretului).

160
 6. ENZIMELE

A. Viteza reacţiilor catalizate de enzime. Ecuaţia Michaelis-Menten

Enzimele sunt proteine ce catalizează reacţiile chimice din organismele vii,

determinând creşterea vitezei cu care aceste reacţii se apropie de echilibru. Un
catalizator adevărat determină creşterea vitezei reacţiei chimice, el nesuferind nici o
schimbare în cursul acestui proces. Enzima, pe parcursul etapelor intermediare ale
reacţiei, formeaza complexe cu molecula ce urmează a fi transformată, dar numai
temporar, la sfârşitul reacţiei enzima fiind regenerată în forma ei originală, iar
produsul reacţiei fiind eliberat. O altă caracteristică a enzimelor şi a catalizatorilor,
în general, este că acestea nu modifică constanta de echilibru a reacţiei, ci doar
determină creşterea vitezei la care reacţia se apropie de echilibru. Deci, un catalizator
este responsabil de creşterea vitezei, dar nu de modificarea proprietăţilor
termodinamice ale sistemului cu care interacţionează. In sistemele biologice, un
catalizator este necesar deoarece la temperatura şi pH-ul organismului uman reacţiile
nu ar decurge la o viteză suficientă pentru a întreţine activitatea musculară rapidă,
generarea impulsului nervos şi toate celelalte procese necesare pentru întreţinerea
vieţii. Enzimele sunt cele care accelerează reacţiile prin factori de cel puţin 106,
având o putere catalitică imensă. De exemplu, chiar şi o reacţie simpla ca hidratarea
CO2 este catalizată de o enzimă numită anhidraza carbonică. Transferul CO2 de la
ţesuturi în sânge şi apoi la alveole ar fi mai puţin complet în absenţa acestei enzime,
reacţia catalizată fiind de 107 ori mai rapidă decât cea necatalizată.
Din moment ce enzimele modifică viteza reacţiilor chimice, este important de
a înţelege relaţiile şi termenii utilizaţi pentru măsurarea şi exprimarea vitezelor de
reacţie.

Noţiuni de cinetică chimică

Cinetica reprezintă un studiu al vitezei de transformare a stării iniţiale a

reactanţilor şi produşilor în starea finală a acestora. Reacţiile chimice pot fi
clasificate pe baze cinetice prin ordinul de reacţie; astfel există reacţii de ordinul
zero, reacţii de ordinul întîi, doi şi trei, depinzând de modul în care viteza de reacţie
este influenţată de concentraţia reactanţilor în anumite condiţii date.
Reacţiile de ordinul întîi sunt acelea care se desfăşoară cu o viteză direct
proporţională cu concentraţia unuia dintre reactanţi. Cel mai simplu exemplu este cel
al vitezei reacţiei AP (P = produsul reacţiei), care este direct proporţională cu
concentraţia lui A. Viteza de reacţie în orice moment, t, este dată de o ecuaţie de
viteză de ordinul întîi:
v = -d[A]/dt = k[A]

161
unde [A] = concentraţia molară a lui A şi -d[A]/dt = viteza cu care scade concentraţia
lui A. Constanta de proporţionalitate k se numeste constanta de viteză şi în acest caz
are ca dimensiuni reciproca timpului, deci s-1.
Reacţiile de ordinul doi sunt acelea în care viteza este proporţională cu
produsul concentraţiilor a doi reactanţi sau cu puterea a doua a concentraţiei unui
singur reactant. Cel mai simplu exemplu este reacţia: A + BP.
Viteza de reacţie este dată de ecuaţia de viteză de ordinul doi:
v = -d[A]/dt = k[A][B]
Daca reacţia are forma 2AP, ecuaţia de viteză este:
v = -d[A]/dt = k[A]2.
Constantele de viteză ale reacţiilor de ordinul doi au ca dimensiuni
M-1s-1.
Reacţiile de ordinul zero sunt acelea la care viteza este independentă de
concentraţiile reactanţilor, v = k. Dispariţia reactantului sau apariţia produsului are
loc la o viteză constantă. Condiţiile pentru reacţiile de ordin zero apar doar în
reacţiile catalizate, în care concentraţia reactanţilor este suficient de mare pentru a
satura toate situsurile catalitice. In aceste condiţii catalizatorul funcţionează la viteza
maximă şi toate situsurile catalitice sunt ocupate. In concluzie, adăugarea unei
cantităţi suplimentare de reactant nu ar determina creşterea vitezei.

Cinetica reacţiilor catalizate enzimatic

Principiile generale ale cineticii reacţiilor chimice se aplică şi la reacţiile

catalizate de enzime, dar acestea au în plus o trăsătură proprie, care nu se întâlneşte
la reacţiile neenzimatice şi anume saturarea cu substrat.

1. Determinarea vitezei unei reacţii enzimatice

Fie o reacţie catalizată enzimatic SP. S = substratul reacţiei.

Pentru această reacţie v = -d[S]/dt = d[P]/dt. Deci, viteza reacţiei poate fi
măsurată prin determinarea cantităţii de substrat care este transformat în unitatea de
timp sau prin determinarea cantităţii de produs rezultat în unitatea de timp.
In general, viteza unei reacţii enzimatice creşte proporţional numai în cursul
primelor minute de reacţie, după care scade, rămâne constantă sau creşte
neproporţional. Aceste abateri pot fi datorate scăderii gradului de saturaţie a enzimei
în substrat, deplasării echilibrului de reacţie, instabilităţii enzimei, inhibiţiei prin
produs final etc. Pentru aceste motive se recomandă determinarea vitezei iniţiale a
reacţiei (viteza măsurată atunci când o cantitate foarte mică de substrat a reacţionat)
din curba ce redă variaţia cantităţii de substrat sau de produs în timp (figura IV.6.1.).

162
 Figura IV.6.1: Viteza iniţială a reacţiei este determinată din panta curbei
cinetice la începutul reacţiei
Viteza iniţială creşte cu creşterea concentraţiei substratului (S1-S4), dar atinge o
valoare limită caracteristică fiecărei enzime.

v0 = (d[P]/dt)t=0 = (-d[S]/dt)t=0

În consecinţă, viteza iniţială va reprezenta tangenta în punctul iniţial al uneia

din cele două curbe de mai sus.

2. Saturarea cu substrat

Viteza iniţială a unei reacţii enzimatice este dependentă de concentraţia

substratului (fig.1). La creşterea concentraţiei substratului viteza iniţială creşte până
când enzima devine complet saturată cu substrat. Reprezentând vitezele iniţiale
determinate anterior în funcţie de concentraţiile substratului utilizate la determinarea
lor se obţine o curbă în formă de hiperbolă (figura IV. 6.2).

V0

Vmax

Vmax
2

KM [S]
Fig. IV.6.2: Reprezentarea grafică a ecuaţiei Michaelis-Menten

La o concentraţie mică de substrat, viteza iniţială de reacţie este aproape

proporţională cu concentraţia substratului şi reacţia este aproximativ de ordinul întîi în
163
raport cu substratul. Totuşi, odată cu creşterea concentraţiei substratului, viteza iniţială
creşte mai puţin, astfel încât nu mai este proporţională cu concentraţia substratului; în
această zonă, reacţia este de un ordin mixt. Crescând în continuare concentraţia
substratului, viteza de reacţie devine absolut independentă de concentraţia substratului
şi atinge asimptotic o valoare constantă. Pe acest interval de concentraţie de substrat
reacţia este de ordinul zero în raport cu substratul, iar enzima este saturată cu substratul
său. Toate enzimele prezintă efectul de saturare, dar ele diferă semnificativ cu privire
la concentraţia de substrat care îl produce. Efectul de saturare a condus, cu ani în urmă,
pe unii cercetători la ipoteza că enzima şi substratul reacţionează reversibil pentru a
forma un complex enzimă-substrat (ES), ca o etapă esenţială a reacţiei catalizate. A
fost propus astfel un model simplu, care explică aceste caracteristici cinetice:

Ecuaţia care explică datele cinetice din fig.2 se numeşte ecuaţia Michaelis-
Menten şi reprezintă relaţia dintre viteza unei reacţii enzimatice şi concentraţia
substratului pentru o anumită concentraţie de enzimă:

vmax [ S ]
v0 
K M  [S ]

unde:
v0 = viteza iniţială a reacţiei enzimatice la o concentraţie oarecare de substrat
Vmax = viteza maximă, viteza la concentraţii de substrat la care enzima e saturată cu
substrat
KM = constanta Michaelis-Menten
[S] = concentraţia substratului
Din ecuaţia Michaelis-Menten rezultă că valoarea KM este numeric egală cu
concentraţia substratului la care viteza reacţiei este jumătate din viteza maximă.
1 1 v [S ]
Daca v0  vmax , înseamnă că vmax  max , de unde KM = [S].
2 2 K M  [S ]
Valorile lui KM şi Vmax variază foarte mult de la o enzimă la alta şi pot fi
determinate dintr-o serie de experimente simple, în care viteza iniţială de reacţie se
măsoară la diferite concentraţii iniţiale de substrat, concentraţia enzimei păstrându-
se constantă. Pentru calculul lui KM şi Vmax se preferă transformarea ecuaţiei
Michaelis-Menten într-o ecuaţie liniară de tipul
y = ax + b.

1 KM 1 1
 
v0 vmax [ S ] vmax

164
 Această reprezentare se numeşte Lineweaver-Burk (figura IV.6.3). Astfel
dacă se înscrie într-un sistem de coordonate inversul vitezei unei reacţii enzimatice
(1/vo) în funcţie de inversul concentraţiei substratului (1/[S]) se obţine o dreaptă a
cărei ordonată la origine este 1/vmax, a cărei pantă este KM/Vmax şi care interceptează
axa 1/[S] la -1/KM:

1/v0

1/vmax

-1/KM
1/[S]

Fig. IV.6.3: Reprezentarea Lineweaver-Burk

Constanta Michaelis a unei enzime este o caracteristică importantă şi utilă,

reflectând afinitatea fiecărei enzime pentru fiecare substrat al său. Astfel, această
caracteristică e fundamentală nu numai pentru formularea matematică a cineticii
enzimatice, dar este şi un indice util pentru analiza unor mecanisme de reglare
enzimatică.

3. Semnificaţia fiziologică a KM

Conceptul de KM ar putea fi perceput ca neavând o semnificaţie fiziologică sau

clinică. Această idee este însă falsă. Cunoaşterea valorilor KM ale diverselor enzime
pentru fiecare din substraturile lor e foarte importantă în laboratorul clinic. De
exemplu, în termeni de control fiziologic al metabolismului glucozei, natura a creat
două hexokinaze, una cu un KM mare (afinitate mică pentru substrat) şi una cu un KM
mic pentru glucoză. Ele contribuie împreună la menţinerea nivelelor staţionare de
glucoză în sânge.
Un alt exemplu îl reprezintă sensibilitatea neobişnuită a asiaticilor la băuturile
alcoolice, sensibilitate ce are baze biochimice. Anumitor chinezi şi japonezi le este
necesar mult mai puţin etanol pentru producerea vasodilataţiei ce determină
îmbujorarea şi tahicardia decât europenilor. Efectele fiziologice provin din
acetaldehida generată de alcool dehidrogenaza din ficat.
CH 3  CH 2  OH 
 CH 3  CHO
AD

În mod normal, acetaldehida formată este înlăturată de către o altă enzimă şi

anume aldehid dehidrogenaza mitocondrială, care o converteşte la acetat. La anumite
persoane de origine mongoloida forma normală a aldehid dehidrogenazei
mitocondriale lipseşte. Această formă are un KM redus pentru acetaldehidă. La aceste

165
persoane, doar forma citosolică a acestei enzime este prezentă şi are un KM mare
(afinitate mică).
Unele tipuri de leucemie animală şi umană pot fi oprite din dezvoltare prin
administrarea intravenoasă a enzimei asparaginază, care catalizează reacţia:
Asparagina + H2O  Aspartat + NH4+
Acest rezultat conduce la concluzia că asparagina prezentă în sânge este o
substanţă esenţială pentru creşterea celulelor albe maligne; asparaginaza introdusă
intravenos produce hidroliza asparaginei la aspartat, care nu mai poate satisface
nevoia de asparagină. Cautând surse de asparaginază, s-a descoperit că nu toate
asparaginazele sunt eficiente în vindecarea leucemiei. Motivul este următorul:
asparaginazele din diverse surse diferă între ele foarte mult prin K M-ul pentru
asparagină. Deoarece concentraţia asparaginei în sânge este foarte mică,
administrarea asparaginazei de la o altă specie este eficientă terapeutic numai dacă
valoarea KM este destul de scazută pentru a hidroliza rapid asparagina, la concentraţia
ei mică din sânge.

4. Influenţa concentraţiei enzimei asupra vitezei de reacţie

Este important de notat că deşi ecuaţia Michaelis-Menten pare că nu conţine

concentraţia enzimei, aceasta este de fapt conţinută în termenul
vmax = k2[E0] ([E0] = concentraţia iniţială a enzimei).
Dacă se variază concentraţia enzimei, mentinând constantă concentraţia
substratului, relaţia Michaelis-Menten devine:
vo = k [Eo]
În concluzie, viteza iniţială a unei reacţii enzimatice este proporţională cu
concentraţia enzimei.

5. Metode de determinare a activităţii enzimatice

Activitatea unei enzime este măsurată de viteza reacţiei pe care o catalizează.

După cum s-a menţionat la punctul 1, viteza reacţiei se măsoară prin determinarea
cantităţii de substrat care este transformat în unitatea de timp sau prin determinarea
cantităţii de produs rezultat în unitatea de timp, recomandându-se determinarea
vitezei iniţiale a reacţiei. Viteza unei reacţii enzimatice se exprimă în unităţi
enzimatice (U). Unitatea enzimatică este definită ca acea "cantitate de activitate"
care catalizează transformarea unui micromol de substrat într-un minut şi în conditii
standard.

Fig IV.6.4: Viteza iniţială a unei

166reacţii enzimatice la diverse con-
centraţii de enzimă în condiţii sa-
turante de substrat.
 Viteza iniţială a unei reacţii enzimatice este dependentă de cantitatea de
substrat prezent şi de cantitatea de enzimă prezentă. Determinările de viteză iniţială
şi deci, a activităţii unei enzime, se fac de obicei în condiţii în care concentraţia
substratului este suficient de mare (condiţii saturante) pentru ca viteza reacţiei să fie
determinată numai de cantitatea de enzimă (fig IV.6.4). Viteza iniţială se dublează
când concentraţia enzimei se dublează.
Se poate observa că la concentraţii mici de enzimă echilibrul este atins mai
greu decât la concentraţii mari, deci tangenta se poate trasa cu mai multă acurateţe
şi calculul activităţii enzimatice se realizează cu mai multă acurateţe.
Metodele de măsurare a activităţii enzimatice sunt de două feluri: continue şi
discontinue. Principiul care stă la baza metodelor continue este următorul: enzima şi
substratul sunt amestecaţi şi este urmărită continuu o funcţie dependentă de
concentraţia produsului sau substratului (de exemplu, absorbanţa). In cazul
metodelor discontinue se recoltează probe din amestecul de reacţie, la diferite
intervale de timp, se stopează reacţia enzimatică şi se dozează cantitativ
componentul consumat sau eliberat în cursul reacţiei. Principalele tipuri de modele
de determinare a activităţii unei enzime sunt:
a) Metode spectrofotometrice
In unele reacţii enzimatice sunt înregistrate modificările proprietăţilor
spectrale ale reactanţilor sau produşilor de reacţie, modificări ce apar de obicei în
ultraviolet sau în regiunea vizibilă a spectrului lor de absorbţie şi care pot fi puse în
evidenţă şi măsurate cantitativ la concentraţii foarte mici de substanţă.
Deoarece este foarte puţin probabil ca substratul şi produsul reacţiei
enzimatice studiate să aibă spectru identic se alege o lungime de undă la care
transformarea unuia în celălalt este însoţită de modificarea absorbţiei. De exemplu,
coenzimele piridinice au un maxim de absorbţie la 260 nm, iar în stare redusă
prezintă un maxim de absorbţie la 340 nm. Astfel, viteza poate fi măsurată prin
determinarea creşterii sau scăderii valorii extincţiei la 340 nm.

b) Metode fluorimetrice
Deorece enzimele flavinice au o puternică fluorescenţă în starea oxidată şi
pierd fluorescenţa prin reducere, se poate urmări fluorimetric viteza procesului redox
catalizat de flavinenzime.
167
 c) Metode titrimetrice
Când în cursul reacţiilor enzimatice se formează sau se consumă acizi sau baze
şi când se formează un acid sau o bază mai tare decât substratul, viteza acestor
procese poate fi urmărită titrimetric.

d) Metode polarimetrice
Acest tip de metode se bazează pe studierea direcţiei şi unghiului de rotaţie a
planului luminii polarizate în cazul substratelor optic active. Ele se aplică în
următoarele cazuri:
- substratul este optic activ, produsul reacţiei este optic inactiv
- substratul reacţiei este inactiv din punct de vdere optic, produsul este optic activ
- atât substratul cât şi produsul reacţiei enzimatice sunt optic active, dar rotaţiile lor
specifice sunt diferite.
Viteza reacţiei enzimatice este urmărită prin modificarea în timp a rotaţiei
specifice optice.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

1. Influenţa concentraţiei enzimei asupra vitezei de reacţie; determinarea

activităţii ureazei
În vederea punerii în evidenţă a proportionalităţii directe între viteza reacţiei
enzimatice şi concentraţia de enzimă se urmăreşte viteza reacţiei de hidroliză a ureei
sub acţiunea ureazei, incubându-se o cantitate constantă (relativ mare) de substrat cu
cantităţi variabile de enzimă. Metoda de determinare a activităţii enzimatice a
ureazei este o metodă titrimetrică de tip discontinu.
Ureaza catalizează reacţia de hidroliză a ureei în amoniac şi bioxid de carbon:
H2N- CO - NH2 + H2O  CO2 + 2NH3

Principiul metodei
O soluţie de uree într-un tampon cu pH 7 este incubată cu enzima. După un
interval de timp (15 minute) reacţia enzimatică este blocată prin inhibarea enzimei
cu ioni Hg2+ (care se combină cu grupările -SH din enzimă). Se măsoară apoi
cantitatea de amoniac prin titrare cu o soluţie de acid clorhidric.
Reactivi necesari
1. Soluţie de uree 1 M
2. Tampon de fosfat monopotasic şi fosfat disodic 0,025M, pH 7
3. Soluţie de HCl 0,05 N
4. Soluţie de roşu de metil
5. Soluţie de HgCl2 0,05 g%
6. Soluţie urează
Mod de lucru
În baloane de titrare se pregătesc martorul şi probele:

168
 Tampon Soluţie de uree 1M H2O Soluţie enzimă
Martor 4 ml 2 ml 4 ml -
P1 4 ml 2 ml 3 ml 1 ml
P2 4 ml 2 ml 2 ml 2 ml
P3 4 ml 2 ml 1 ml 3 ml

Probele (P1, P2, P3) sunt lăsate la temperatura camerei 15 minute. La sfârşitul
acestui interval se adaugă în fiecare eprubetă-probă câte 5 picături de soluţie HgCl2
pentru a opri reacţia enzimatică. Toate probele, inclusiv martorul, sunt titrate cu
soluţie de HCl 0,05 N în prezenţă de roşu de metil ca indicator. Volumul folosit la
titrarea martorului (Vm) se scade din volumele folosite la titrarea probelor şi aceste
diferenţe se notează cu V1, V2, şi V3.

Calcul
Viteza reacţiei se exprimă prin numărul de moli de uree hidrolizată într-un
minut.
1 mol HCl 0,05 N este echivalent cu 0,00085 g NH3 (17x 0,05)/1000 şi
respectiv cu 0,0015 g uree. Plecându-se de la greutatea moleculară a ureei de 60,05
rezultă că 0,0015 g uree corespund la 25 moli de uree. Prin urmare se poate stabili
corespondenţa dintre volumul de soluţie de HCl 0,05 N utilizat la titrarea
amoniacului şi cantitatea de uree, în moli, hidrolizată sub acţiunea ureazei.
1 ml HCl 0,05 N ............. 25  moli uree
Se va calcula pentru cele trei probe (P1, P2, P3) cantitatea de uree hidrolizată
în moli, pe minut. Datele obţinute sunt înscrise într-un grafic: micro moli uree
hidrolizată/min = f(ml soluţie enzimă). Obţinerea unei drepte demonstrează că în
condiţiile date, viteza reacţiei este proporţională cu cantitatea de enzimă.

2. Determinarea constantei Michaelis a ureazei

În experienţa descrisă mai departe se măsoară viteza de hidroliză a ureei în

prezenţa unei cantităţi date de enzimă, dar cu concentraţii variabile de substrat.

Mod de lucru
Tampon Enzima H2O Uree
martor 4 ml 2 ml 4 ml -
P1 4 ml 2 ml 3 ml 1 ml 0.1M
P2 4 ml 2 ml 2 ml 2 ml 0.1M
P3 4 ml 2 ml 1 ml 3 ml 0.1M
P4 4 ml 2 ml 0 ml 4 ml 0.2M
169
 Probele sunt lăsate 15 minute la temperatura camerei după care reacţia
enzimatică este oprită prin adăugarea a câte 5 picături soluţie HgCl2. Fiecare probă
este titrată cu HCl 0,05 N în prezenţă de roşu de metil. Volumul folosit la titrarea
martorului este scăzut din volumele de bază utilizate pentru titrarea fiecărei probe.
Se calculează pentru fiecare probă cantitatea de uree în probă şi inversul ei
(1/[S]) şi cantitatea de uree hidrolizată per minut şi inversul acestei valori (1/v).
Valorile 1/v şi 1/[S] sunt înscrise într-un grafic de tip Lineweaver-Burk. Se
calculează KM.

B. Determinarea activităţii enzimatice şi efectul diverşilor factori asupra acesteia

Activitatea unei enzime este măsurată de viteza reacţiei pe care o catalizează.

Viteza reacţiei se măsoară prin determinarea cantităţii de substrat care este
transformat în unitatea de timp sau prin determinarea cantităţii de produs rezultat în
unitatea de timp, recomandându-se determinarea vitezei iniţiale a reacţiei (viteza
măsurată atunci când o cantitate foarte mică de substrat a reacţionat). Viteza unei
reacţii enzimatice se exprimă în unităţi enzimatice (U). Unitatea enzimatică este
definită ca acea cantitate de enzimă care catalizează transformarea unui micromol de
substrat într-un minut şi în condiţii standard.
Măsurătorile de viteză iniţială şi deci, a activităţii unei enzime, se fac de obicei
în condiţii în care concentraţia substratului este suficient de mare (condiţii saturante)
pentru ca viteza reacţiei să fie determinată numai de cantitatea de enzimă.
Viteza reacţiilor enzimatice este influenţată nu numai de concentraţia
substratului şi cea a enzimei, ci şi de o serie de factori fizici sau chimici, în special
de pH-ul mediului, de temperatură şi de prezenţa în sistem a unor activatori sau
inhibitori ai enzimei.

Efectul diverşilor factori asupra activităţii enzimatice

1. Efectul pH-ului asupra activităţii enzimatice

Activitatea catalitică a enzimelor este afectată de variaţiile concentraţiei

ionilor de hidrogen din mediu. Pentru fiecare enzimă se poate stabili un pH sau un
interval de pH la care viteza reacţiei enzimatice este maximă, denumit pH optim de
acţiune.

170
 Activitatea enzimei scade repede de o parte şi de alta a pH-ului optim, curba
pH-activitate având, în general, formă de clopot (figura IV.6. 5). Ea poate varia însă
considerabil de la o enzimă la alta. Multe enzime au pH-ul optim situat în jurul
neutralităţii, variind chiar între 5,0 şi 9,0, dar unele acţionează optim în regiuni mai
acide (pH-ul optim al pepsinei este de cca 2) sau mai alcaline (fosfataza alcalină are
pH-ul optim de 9).

Figura IV. 6. 5: Dependenţa

pH-activitate.

Forma curbelor pH-activitate este determinată de:

- denaturarea enzimei la pH-ul mare sau mic.
- alterările frecvente în starea încărcată a enzimei şi/sau a substratului.
pH-ul poate afecta activitatea unei enzime prin modificarea sarcinii la nivelul
restului aminoacidic implicat în fixarea substratului sau cataliză. De exemplu, să
considerăm o enzimă încărcată negativ (Enz-) reacţionând cu un substrat încărcat
pozitiv (SH+):
Enz- + SH+  EnzSH
La pH mic, enzima se protonează şi pierde sarcina ei negativă:
Enz- + H+  EnzH
La pH mare, SH+ ionizează şi îşi pierde sarcina pozitivă:
SH+  S + H-
Din moment ce, prin definiţie, singurele forme ce vor interacţiona sunt SH +
şi Enz-, valorile extreme de pH vor micşora concentraţia efectivă a Enz - şi SH+,
determinând astfel micşorarea vitezei de reacţie. Doar în interiorul clopotului
(fig. IV.6.1) Enz şi S se găsesc în starea ionică corespunzătoare, iar concentraţiile
maxime ale Enz şi S corect încărcate corespund vârfului clopotului.
In concluzie, variaţiile moderate de pH influenţează reacţiile enzimatice prin
modificarea stării de ionizare a moleculelor proteice şi/sau a moleculelor de substrat
şi, în consecinţă, a afinităţii enzimelor pentru substrat.
In afara acestor asupra vitezei reacţiilor enzimatice, variaţiile extreme de pH
influenţează structura proteinei, care prin denaturare îşi pierde activitatea catalitică.

2. Efectul temperaturii asupra activităţii enzimatice

171
 O reacţie chimică de tipul S  P are loc deoarece o anumită parte din
populaţia de molecule S, în orice moment dat, posedă suficientă energie pentru a
atinge o starea activată, numită stare de tranziţie (S*), în care probabilitatea ca o
legătură chimică să se formeze sau să se distrugă, dând naştere produsului P este
foarte mare. Această stare de tranziţie se află în vârful barierei de energie care separă
reactanţii de produşi (figura IV.6.6).
S*

G*
Energia
S
libera P
Sensul reacţiei

Figura IV. 6. 6: Starea de tranziţie într-o reacţie chimică

Energia liberă de activare, notată G* este egală cu diferenţa dintre energia
liberă a stării de tranziţie şi a substratului.
G* = GS* - GS
Viteza de reacţie este proporţională cu concentraţia lui S*, care este în
echilibru cu S.
S  S

 [S ]
ΔG   RTln
[S]
G  G 
[S  ]  
Deci,  e RT şi [ S  ]  [ S ]e RT
[S ]
G 
kT 
Dar, v  cst[ S ]  [ S ]e RT
h
unde k = constanta lui Boltzmann
h = constanta lui Planck
T = temperatura
R = constanta universală a gazelor.
Drept urmare, viteza unei reacţii chimice poate fi accelerată în două moduri
generale: prin creşterea temperaturii sau prin adăugarea de catalizatori. Creşterea
temperaturii produce creşterea mişcării şi energiei termice, creşterea numărului de
molecule capabile să intre în starea de tranziţie şi în acest fel, accelerează viteza
reacţiei chimice. In multe reacţii, viteza de reacţie este aproape dublată prin creşterea
temperaturii cu 10oC.
Enzimele, acţionând ca biocatalizatori, accelerează reacţiile prin scăderea
barierei de activare, deci a G. în prezenţa enzimei, energia stării de tranziţie este

172
mai mică decât în absenţa enzimei. In plus, aşa cum se întâmplă la majoritatea
reacţiilor chimice, viteza reacţiei catalizate de enzime creşte cu temperatura pe
intervalul de temperatură în care enzima este stabilă şi îşi păstrează întreaga
activitate.
Orice reacţie catalizată enzimatic are o temperatură optimă (fig. IV.6.7). Peste
această temperatură activitatea enzimatică scade brusc deoarece intervine
denaturarea termică.
Deşi majoritatea enzimelor sunt inactivate peste 55-60oC, unele sunt destul de
stabile şi îşi păstrează activitatea la temperaturi mult mai mari (enzimele diferitelor
specii de bacterii termofile).

Figura IV.6.7: Dependenţa activitate-temperatură

3. Efectul inhibitorilor asupra vitezei reacţiei enzimatice

Inhibitorii sunt efectori care introduşi în amestecul de reacţie provoacă

scăderea vitezei cu care aceasta decurge. Există multe tipuri de inhibitori, clasificarea
lor fiind funcţie de mecanismul lor de acţiune. O categorie aparte de inhibitori sunt
inhibitorii ireversibili.
Un inhibitor ireversibil se leagă, de cele mai multe ori, printr-o legătură de tip
covalent cu un rest de aminoacid din constituţia enzimei, esenţial pentru activitatea
biologică a acesteia formând un compus stabil şi inactiv.
O categorie mai importantă de inhibitori este cea a inhibitorilor reversibili, ce
pot fi: competitivi, incompetitivi şi necompetitivi.

a. Inhibitorii competitivi - în general substanţe înrudite structural cu substratul

- se combină cu enzima la nivelul aceluiaşi situs activ ca şi substratul, formând
complexe EI inactive.
E + S  ES  E + P
E + I  EI
În prezenţa inhibitorului concentraţia complexului activ ES, care determină
viteza reacţiei, depinde de raportul dintre concentraţia substratului şi a inhibitorului.
La concentraţii mari de inhibitor este favorizată formarea complexului inactiv EI, iar
la concentraţii mari de substrat formarea complexului ES. La aceeaşi concentraţie a
inhibitorului, pe măsură ce creşte concentraţia substratului se măreşte continuu
173
concentraţia complexului ES, prin deplasarea echilibrului E + S  ES spre dreapta
şi a echilibrului E + I  EI spre stânga. Mărind continuu concentraţia substratului
se va atinge o valoare la care toate moleculele EI s-au descompus şi întreaga cantitate
de enzimă se află sub formă de complex activ ES. Reacţia se desfăşoară acum cu
viteză maximă, viteză egală cu viteza maximă a reacţiei în absenţa inhibitorului.
b. Inhibitorii incompetitivi nu se combină cu enzima liberă şi nu afectează
reacţia acesteia cu substratul. Ei se combină cu complexul enzimă-substrat ES pentru
a da un complex inactiv enzimă-substrat-inhibitor, care nu mai poate conduce la o
reacţie ulterioară, de formare a produsului obişnuit:
ES + I  ESI.
Inhibiţia incompetitivă este rară în reacţiile cu un singur substrat, dar comună
la reacţiile cu două substrate.
c. Inhibitorii necompetitivi se pot combina fie cu enzima liberă, fie cu
complexul enzimă-substrat, interferând cu acţiunea ambelor. Ei se leagă de enzimă
în alt loc decât cel activ, adesea modificând enzima, astfel încât complexul ES nu se
mai formează cu viteză normală, iar odată format, complexul ES nu se mai
descompune cu viteză normală pentru a forma produşii de reacţie.
E + I  EI
ES + I  ESI
Complexele EI şi ESI sunt inactive, astfel că viteza reacţiei depinde numai de
concentraţia lui ES. La o concentraţie dată a inhibitorului, mărindu-se concentraţia
substratului, inhibitorul nu poate fi deplasat din complexele EI sau ESI, astfel că
viteza maximă a reacţiei va fi mai mică în prezenţa inhibitorului decât în absenţa lui.

4. Efectul ionilor asupra activităţii enzimatice

Un alt factor de care depinde activitatea catalitică a enzimelor este prezenţa

anumitor ioni în mediul de reacţie. In general, acţiunile cationilor sunt relativ
specifice, unele enzime manifestând o necesitate strictă pentru un anumit cation sau
un grup retrâns de cationi. Efectele activatoare ale anionilor asupra reacţiilor
enzimatice sunt mai greu de studiat şi au de multe ori un caracter nespecific. Pe de
altă parte, anionii pot influenţa viteza reacţiilor enzimatice prin schimbări ale
proprietăţilor fizico-chimice ale enzimei ca solubilitate, mobilitate electroforetică.
Se cunosc însă şi cazuri tipice de activare a enzimelor de către anioni, cum este cazul
-amilazei de origine animală care este activată de ionul Cl-.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Efectul pH-ului, al temperaturii şi al ionilor asupra activităţii enzimatice vor

fi ilustrate în lucrarea de faţă urmărindu-se variaţiile de activitate a amilazei salivare
la diverse temperaturi, la diferite pH-uri şi în prezenţa sau absenţa ionilor activatori.
Amilazele sunt glicozidaze larg răspândite în natură care catalizează hidroliza
amidonului şi glicogenului. Amilaza care acţionează în tubul digestiv al omului este
174
alfa-amilaza cu specificitate pentru legăturile alfa-1,4 glicozidice din interiorul
lanţurilor amilozice pe care le scindează în fragmente din ce în ce mai mici.
Produsele intermediare obţinute în urma acţiunii alfa-amilazei asupra glicoge-
nului sunt denumite dextrine. Acestea dau cu iodul diverse coloraţii în funcţie de
greutăţile lor moleculare: albastră (amilodextrine), roşie (eritrodextrine), galbenă
(flavodextrine). Dextrinele cu greutăţi moleculare mai mici nu mai dau nici o
coloraţie cu iodul (acrodextrine).
Experienţa: Determinarea activităţii amilazei salivare

Principiul metodei
Se incubează enzima cu o soluţie de amidon şi se măsoară timpul în care acesta
este hidrolizat până la produşi care nu mai dau coloraţii cu iodul (punctul acromic).
Activitatea enzimei este invers proporţională cu timpul în care se atinge punctul
acromic.

Reactivi necesari:
1. soluţie de amidon 1 g %.
2. soluţie de NaCl 1 g %
3. tampon fosfat 0,05 M, pH 6,8.
4. tampon fosfat 0,05 M, pH 5,5.
5. tampon fosfat 0,05 M, pH 8.
6. soluţie diluată de iod.
7. soluţie de enzimă (sol de alfa-amilază salivară).

a) Determinarea activităţii amilazei în condiţii optime (temperatură 38oC, pH

6.8 şi în prezenţa de NaCl).
Se pregăteşte o serie de 10-15 eprubete care conţin câte 1 ml soluţie de iod.
Într-o altă eprubetă (probă) se pipetează 2.5 ml soluţie de amidon, 1 ml soluţie de
NaCl şi 1 ml tampon pH 6,8. Se ţine eprubeta într-un termostat la 38oC timp de 5
min. Se adaugă apoi 0.5 ml soluţie de enzimă şi se notează exact acest moment. La
intervale de câte 1 minut de la adăugarea enzimei în probă se scot cite 2 picături din
amestecul de reacţie şi se introduc în câte o eprubetă care cuprinde soluţia de iod. Se
urmăreste variaţia culorii şi se notează momentul în care s-a atins punctul acromic
(cca 10 min).
b) Determinarea activităţii amilazei la 25oC şi la 65oC.
Se repetă experienţa precedentă la o temperatură de 25oC (se va utiliza un
termostat).
c) Determinarea activităţii amilazei la pH 5.7 şi pH 8.
Se repetă experienţa de la punctul „a” utilizând un tampon cu pH 5.7 şi unul
cu pH 8.
d) Determinarea activităţii amilazei în absenţa ionilor Cl-
Se repetă experienţa de la punctul „a” cu deosebirea că în locul soluţiei de
NaCl se pipetează 1 ml apă.
175
 Se compară activitatea enzimei (timpii necesari pentru atingerea punctului
acromic) în diversele situaţii.

176
 V. METABOLISMUL ENERGETIC

Functionarea celulei este conditionata de consumul permanent de energie.

In organism energia este furnizata prin arderea principiilor alimentare in
proportii diferite in functie de aportul alimentar. Mitocondria constituie principalul
producator de energie la nivelul celulelor aerobe.

Structura mitocondriei:
a) Membrana externa
 delimiteaza mitocondria de citosol
 este permeabila pentru molecule cu greutate mai mica de 10 Kda
 contine enzime: fosfolipaza A2, acil-CoA sintetaza, carnitin-acil-transfe-
razaI
b) Membrana interna
 delimiteaza matrixul mitocondrial
 este pliata sub forma de criste
 este permeabila doar pentru gaze si molecule mici, fara sarcina electrica
 prezinta sisteme de transport intre matrix si spatiul intermembranar
 contine enzime: succinat-dehidrogenaza, carnitin-acil-transferaza II,
translocaza, citocromul P450
c) Matrixul mitocondrial
 contine enzime necesare proceselor metabolice
 prezinta ADN mitocondrial si sistemul necesar replicarii si transcrierii
acestui ADN
 contine enzime: majoritatea enzimelor ciclului Krebs, sistemul
multienzimatic al piruvat-dehidrogenazei, enzimele -oxidarii acizilor grasi,
enzimele cetogenezei
ADNmitocondrial a fost identificat in 1963, iar secventializarea sa a fost realizata in
1981. Contine 16568 perechi de baze organizate in 37 gene:
 13 gene codifica proteine care sunt componente ale lantului respirator, din
care 7 apartin complexului I, 1 apartine complexului III, 3 sunt din
complexul IV si 2 sunt componente ale complexului V. Se observa ca
ADMmt nu codifica subunitati ale complexului II al lantului respirator,
acestea fiind codificate doar la nivel nuclear
 22 gene codifica ARNt
 2 gene codifica ARNr

177
 Figura V.1 Lantul respirator mitocondrial

La om, ADNmt este transmis doar pe linie maternă. Rata de apariţie a mutaţiilor
la nivelul ADNmt este de 10 ori mai crescută decât în ADNnuclear, datorită unor
particularităţi ale ADNmt (de ex: absenţa histonelor, slaba reprezentare a sistemelor
de reparare a leziunilor, prezenţa speciilor reactive de oxigen asociate lanţului
respirator). Mutaţiile care apar în ADNmt sunt punctiforme. Dacă procentul de
ADNmt normal este insuficient pentru funcţionarea lanţului respirator, atunci vor
apare semne de disfuncţionalitate în structura respectivă.

Procese metabolice mitocondriale

1. -oxidarea acizilor grasi

Enzimele implicate în transportul şi metabolismul acizilor graşi în
mitocondrie sunt codificate de ADNnuclear.
Translocarea acizilor graşi activaţi din citoplasmă în mitocondrie necesită
sistemul de transport transmembranar al carnitinei:
 carnitin acil transferaza I situata in membrana externa mitocondriala
 carnitina
 carnitin acil transferaza II situata in membrana interna mitocondriala
 translocaza situata in membrana interna mitocondriala
Prin acest sistem transportor acil~SCoA ajunge in matrixul mitocondrial
unde are loc -oxidarea propriu-zisa. Echivalentii reducatori sunt preluati de lantul
respirator.

Disfunctiile pot avea mai multe cauze:

 deficit de carnitina
178
  deficit de CAT
 deficit de acil-CoA dehidrogenaza specifica acizilor grasi cu lant mediu.

2. Decarboxilarea oxidativa a piruvatului si ciclul Krebs

SE formeaza o cantitate mica de energie, iar echivalentii reducatori intra in
lantul respirator.
Anumite afectiuni pot fi determinate de anticorpi antimitocondriali specifici
fata de componente cheie ale unor sisteme enzimatice mitocondriale: piruvat-
dehidrogenaza, -cetoglutarat dehidrogenaza.
3. Cetogeneza
4. Lantul respirator
Componentele sale sunt codificate atat de ADNnuclear cat si de ADNmt (ex:
succinat-dehidrogenaza este codificata de ADNnuclear, componentele citocromului
c sunt codificate atat la nivel nuclear, cat si mitocondrial

Patologii mitocondriale

In categoria bolilor mitocondriale intra aproximativ 15 boli cu afectare

multisistemica din care enumeram: sindromul Kearns-Sayre, MERRF (epilepsia
mioclonica cu fibre rosii rugoase), MELAS (miopatie, encefalopatie, acidoza lactic
si episoade stroke-like), boala Leigh, boala Alpers, sindromul Pearson. Aceste
efectiuni reprezinta un grup heterogen atat din punct de vedere clinic, secundar
afectarii atat a sistemului nervos central cu regres psiho-motor, crize epileptic,
tulburari senzoriale, cat si la nivelul sistemului nervos periferic, dar si a altor organe,
cum ar fi rinichiul si cordul, etc.
Investigarea biochimica in scopul depistarii bolilor lantului respirator
presupune analiza:
- lactatului si piruvatului in plasma si LCR
- alaninei, glicinei, prolinei, tirozinei in plasma si LCR
- intermediarilor ciclului Krebs, etilmalonatului, 3-metil-gluconatului,
acizilor dicarboxilici in urina
- acil carnitinelor in plasma

Astfel, cresterea concentratiei de lactat va fi asociata cu defecte in lantul

respirator, deoarece: defectele in lantul respirator vor duce la acumularea de NADH
in matrixul mitocondrial si scaderea abilitatii de a metabolize piruvatul, iar excesul
de piruvat va fi redus la lactat. Va creste astfel raportul lactat/piruvat in citosol si
raportul hidroxibutirat/acetoacetat in matrixul mitocondrial.

ACTIVITATE EXPERIMENTALǍ

Principiul metodei
179
 Lactatul se oxideaza la piruvat si H2O2 in prezenta lactat oxidazei (LO).
Reactia dintre apa oxigenata, 4-aminofenazona (4-AP) si 4-clorofenol, in prezenta
peroxidazei, va duce la formarea unui compus chinonic (rosu). Intensitatea culorii
va fi proportionala cu concentratia de lactat in proba.

Mod de lucru

Se incubeaza 10 min la temperature camerei si se citesc absorbantele probei

si standardului, fata de blank, la 505nm.

Calcul:

Valori normale: 4,5-19,8 mg/dl.

180
 VI. ANALIZA BIOCHIMICĂ A SÂNGELUI

1. CONSIDERAŢII GENERALE

Sângele este un ţesut mezenchimal format din celule proprii suspendate în

componenta fluidă care asigură circulaţia. Elementele celulare sunt grupate în
diferite serii de celule diferenţiate care se deosebesc prin origine, morfologie şi
funcţii: eritrocite, leucocite, trombocite. Aceste celule, în strânsă legătură cu plasma
sanguină îndeplinesc funcţii de transport al gazelor, de apărare celulară şi umorală,
de coagulare (hemostază). Împreună cu sistemul nervos, sângele conectează toate
organele corpului într-o unitate a cărei activitate complexă şi interdependentă se
exprimă şi prin variaţia compoziţiei chimice a plasmei. Orice modificare a
componenţilor sângelui, celulari sau plasmatici, reprezintă o tulburare a echilibrului
dintre funcţiile tuturor organelor, o modificare patologică, ce este denumită boală.
Majoritatea bolilor interne evoluează cu modificări sanguine ce pot fi puse în
evidenţă prin analize fizice sau chimice de laborator.
Sângele îndeplineşte funcţia fundamentală de reglare şi păstrare constantă a
parametrilor fizico-chimici ai mediului intern, asigură homeostazia mediului în care
se desfăşoară activitatea celulară. Această homeostazie este caracterizată prin trei
constante de bază ale organismului: izoionia, izotonia şi izotermia, care la omul
sănătos formează izostructura mediului intern. Izostructura sângelui face posibilă
desfăşurarea proceselor fiziologice ale tuturor organelor şi ţesuturilor.
În afara lichidului sanguin ca lichid circulant, se mai găsesc în organismul
omului lichidul intercelular şi cel intracelular. Între aceste trei lichide cu structură
chimică deosebită au loc permanente schimburi de apă şi substanţe prin care se
menţine constantă compoziţia mediului intern. Proprietăţile constante ale sângelui
sunt asigurate prin mecanisme de reglare fizico-chimice şi fiziologice prompte,
perfectate continuu în timpul evoluţiei filogenetice. Modificările determinate de
diferite cauze afectează funcţia unor sisteme celulare sensibile şi invers, dereglările
activităţii organelor duc la perturbări sanguine. Diagnosticul clinic beneficiază de
analizarea compoziţiei lichidului sanguin deoarece, în majoritatea cazurilor, stările
patologice sunt reflectate şi de modificări ale constantelor umorale, prin rolul său de
transportor, sângele reflectând dinamica diverşilor compuşi din organism.
Analiza biochimică a sângelui se poate efectua în sânge venos, arterial sau
capilar, în sânge total, plasmă sau ser, prezentând avantajul unei prelevări a produsului
biologic în condiţii relativ puţin stresante pentru pacient. Tehnica de recoltare variază în
funcţie de metoda analitică practicată, precum şi de natura componentului studiat.
Opţiunea între sângele venos sau arterial, plasmă sau ser este determinată atât de
diferenţa între compoziţia chimică a acestora, cât şi de accesibilitatea la componentul
chimic de analizat. Se poate folosi pentru dozarea unui component sânge total sau ser,
daca acesta se găseşte în aceeaşi concentraţie în ser şi eritrocite (ex. dozarea glucozei sau
ureei). Este preferat serul pentru separarea electroforetică a proteinelor sau pentru testele
de disproteinemie deoarece se evită interferenţa fibrinogenului. De asemenea, prin
181
folosirea serului se evită şi erorile datorate prezenţei anticoagulanţilor. Apar însă şi
dezavantaje: hemoliza determinată de timpul lung de contact hematii-ser până la
definitivarea coagulării, ce produce interferenţe cu metodele curente spectrofotometrice
de analiză, precum şi eliberarea unor cantităţi mari de potasiu şi fosfatază acidă din
eritrocite şi trombocite. De aceea, pentru dozarea acestor componente se recomandă
folosirea plasmei.
Utilizarea plasmei prezintă avantajul obţinerii imediate a acesteia prin centrifu-
garea sângelui total, fără a aştepta producerea coagulării sângelui. Majoritatea investiga-
ţiilor biochimice se practică pe sânge venos. Diferenţa majoră între sângele venos şi
arterial este gradul de saturare cu oxigen a hemoglobinei.
Pentru dozarea glicemiei se recomandă sângele capilar recoltat din pulpa
degetului sau din lobul urechii, din cauza diferenţei arterio-venoase şi faptului că
glicemia din sângele arterial nu este influenţată de tulburări în utilizarea glucozei. În
mod normal glicemia din sângele arterial (capilar) are valori cu circa 5 mg/dl mai
mari faţă de sângele venos, diferenţă neglijabilă, dar care devine importantă în cazul
testelor de toleranţă la glucoza. Având în vedere concentraţia glucozei foarte
apropiată în eritrocit şi plasmă, glicemia poate fi dozată în plasmă sau sânge total.
Factori cu deosebită importanţă în obţinerea unor rezultate biochimice obiective
sunt: alegerea momentului optim pentru recoltarea probelor, pregătirea pacientului
pentru analiza cerută, alegerea tehnicii de recoltare a sângelui, transportul şi conservarea
probelor până la efectuarea propriu-zisă a determinărilor, pregătirea probelor pentru
analiză. În vederea minimizării factorilor de eroare cu răsunet asupra corectitudinii
rezultatelor analizelor biochimice, au fost stabilite condiţii standard de recoltare pentru
fiecare parametru biochimic individual. Este obligatorie luarea în considerare şi a unor
factori nepatologici care pot influenţa la un moment dat compoziţia sângelui: dieta,
medicaţia, efortul fizic, oboseala fizică sau psihică, temperatura ambiantă, poziţia
corpului.
Pentru majoritatea analizelor biochimice se recomandă recoltarea sângelui
dimineaţa, înaintea micului dejun (a jeun) sau la 6 ore după ultima masă, fără exces
de grăsimi sau zaharuri. Restricţia de apă nu este absolută.
Dieta influenţează concentraţia unor componenţi din sânge. Un regim alimen-
tar bogat în nucleoproteine (carne), creşte nivelul acidului uric. Un prânz bogat în
lipide produce o creştere a turbidităţii serului datorată prezenţei chilomicronilor ce
interferă în analizele bazate pe determinări de turbiditate. Proteinemia creşte într-o
alimentaţie hipersodată şi scade în regimul desodat. Carenţa prelungită în vitamine
şi proteine duce deseori la scăderea proteinelor serice.
Pentru dozarea glicemiei şi aplicarea testelor de toleranţă la glucoză, cel
puţin cu trei zile înaintea recoltării sângelui, bolnavul trebuie să primească o dietă
cu un conţinut normal de glucide (150-250 g glucide/zi).
Există puţine componente sanguine a căror determinare este independentă
de regimul alimentar (creatinina, enzime, acid lactic, etc.). De asemenea, recoltarea
sângelui nu este considerată obligatoriu a fi efectuată a jeun pentru dozarea calciului,
ureei, creatininei, acidului uric, a unor enzime şi a proteinelor serice.
182
 Sunt foarte utile informaţiile asupra variaţiilor diurne ale diferiţilor constituenţi
plasmatici, ca cele ale glucozei, colesterolului, fierului, corticosteroizilor de care trebuie
ţinut cont la programarea recoltării probelor de sânge.
Schimbarea poziţiei corpului de la clino- la ortostatism, temperatura
mediului ambiant sau efortul fizic modifică compoziţia chimică a plasmei, prin
mărirea volumului sanguin sau numai al plasmei. Volumul sângelui circulant creşte
prin golirea depozitelor de sânge, aşa cum sunt sinusurile splinei. Efortul fizic creşte
nivelul potasiului, al proteinelor totale, al creatininei şi al unor enzime în plasma. În
stare de şoc, odată cu scăderea tensiunii arteriale, are loc şi o scădere importantă a
volumului sanguin circulant, în special al plasmei.
Medicaţia bolnavului influenţează foarte mult rezultatele examenului biochi-
mic al sângelui. Se consideră că medicamentele modifică rezultatele prin mecanisme
fizice, chimice sau farmacologice. Efectul farmacologic poate fi primar, când
acţionează direct substanţa activă medicamentoasă şi secundar, când interferă prin
metaboliţii săi. De exemplu, alopurinolul, inhibitor al xantinoxidazei, micşorează
concentraţia acidului uric în sânge şi măreşte concentraţia xantinei şi hipoxantinei.
Administrarea de estrogeni produce o creştere a capacităţii de legare a proteinelor, a
ceruloplasminei, transferinei, tiroglobulinei, producând rezultate fals crescute ale
cupremiei, sideremiei sau tiroxinemiei. Medicamentele care au structura chimică
asemănătoare cu structura componentei chimice pe care o dozăm, interferă direct în
reacţia de dozare. Astfel, administrarea de fier în complexe organo-metalice sau iod
interferă cu determinările sideremiei sau ale tiroglobulinei. Datorită faptului că
interferenţele medicamentoase pot avea uneori efecte imprevizibile asupra rezultatelor
determinărilor biochimice, recoltarea sângelui se face înaintea administrării
medicaţiei, de câte ori acest lucru este posibil.

Recoltarea sângelui
Recoltarea sângelui venos se face prin puncţia venei mediane la plica
cotului, din vena radială la nivelul articulaţiei pumnului la adult sau din venele
jugulare sau fontanelă la sugar, cu ajutorul unei seringi curate, uscate şi sterile, sau
de unică folosinţă. Înaintea puncţionării se fixează un garou deasupra cotului sau
locului de unde va fi recoltat sângele şi se dezinfectează tegumentul cu alcool 70%.
Garoul trebuie să comprime numai vasele superficiale, iar prelungirea fixării garoului
trebuie evitată deoarece se instalează staza venoasă care produce hemoconcentraţie, prin
trecerea apei din plasmă în spaţiul intercelular. Staza venoasă prelungită măreşte
considerabil nivelul proteinelor totale din ser.
Tuburile în care se recoltează sângele trebuie să fie curate chimic şi uscate,
urmele de detergenţi interferând cu unele determinări, iar urmele de apă favorizând
hemoliza. În prezent, sunt tot mai des folosite tuburi sterile vidate de unica folosinţă
(sistem Vacutainer). Pentru dozarea sideremiei acul trebuie să fie din platină, sau din
oţel inoxidabil de unică folosinţă.
După aspirarea sângelui în seringă, se îndepărtează garoul, se scoate acul şi
imediat se comprimă vena puncţionată cu un tampon de vată îmbibată în alcool
183
sanitar. Repartizarea sângelui în tuburi se face fără a mai fi trecut prin ac, pentru a
preveni fenomenul de hemoliză.
Recoltarea sângelui se poate face şi direct prin ac fără seringă, situaţie în
care se păstrează garoul fixat şi se pompează sângele prin închiderea ritmică a
pumnului.
Tot pentru a preveni hemoliza, se preferă pentru recoltarea probelor tuburile
de sticlă (eprubete sau tuburi de centrifugă). În tuburile din material plastic coagulul
aderă puternic de pereţi, se detaşează greu, serul se separă târziu şi se produce cu
uşurinţă hemoliza. Detaşarea cheagului de pereţii tuburilor se face cu ajutorul unei
baghete subţiri din sticlă, rotunjită la capăt, fără agitarea intensă a conţinutului
eprubetei.
Serul se recoltează cu uşurinţă dacă compusul chimic pe care îl dozăm ne
permite să lăsăm sângele 20-30 minute la temperatura camerei pentru coagulare şi
retracţia cheagului. Ulterior serul se decantează în eprubete curate de centrifugă şi
se centrifughează la 3000-3500 rpm timp de 5-10 minute pentru sedimentarea
urmelor de eritrocite.
Recoltarea sângelui arterial se efectuează prin puncţionarea arterei femurale
în condiţii speciale şi numai atunci când este necesară determinarea presiunii gazelor
din sânge. Pentru determinările curente din sângele arterial se foloseşte sânge capilar
care are practic compoziţie identică cu cel arterial. Sângele capilar se diferenţiază de
sângele venos prin valoarea pH-ului (arterial 7,4 şi venos 7,35) precum şi prin
conţinutul în dioxid de carbon, oxigen şi glucoză. Locurile de elecţie pentru
recoltarea sângelui capilar sunt pulpa degetului şi lobul urechii la adult, călcâiul şi
talpa piciorului la nou-născuţi. Această recoltare se practică în special pentru
metodele micro- şi ultramicroanalitice.
Tegumentul se dezinfectează cu un tampon de vată îmbibat în alcool etilic
70% şi se lasă să se evapore. Pentru a obţine un flux de sânge mai intens, se încălzesc
degetele în apă caldă sau cu comprese calde uscate, sau se masează uşor. Se
puncţionează cu un ac de seringă steril. Se şterge prima picătură cu vată şi se lasă să
se formeze o nouă picătură suficient de mare. Nu se comprimă ţesuturile pentru a
evita contaminarea cu lichid interstiţial. Sângele din picătură poate fi preluat în tuburi
capilare din sticlă sau material plastic.
Pentru a obţine sânge total sau plasmă, se tratează sângele arterial sau venos
cu un anticoagulant. Modalitatea de folosire a anticoagulantului este diferită în
funcţie de solubilitatea lui. Dacă este solubil în apă se foloseşte sub formă de
substanţă uscată introdus în tubul de recoltare peste care se recoltează sângele şi se
amestecă uşor cu anticoagulantul. În cazul heparinei sau oxalatului, se spală tubul cu
o soluţie de anticoagulant şi se usucă la o temperatură astfel aleasă încât să fie evitată
descompunerea substanţei. Se alege anticoagulantul care nu interferă chimic cu
componentul sanguin ce ne interesează. Se ţine seama de diluţia produsă prin
folosirea soluţiilor de anticoagulanţi. Substanţele cu acţiune anticoagulantă cel mai
frecvent folosite sunt: oxalatul (de sodiu, potasiu, litiu, amoniu), heparina (sare de
sodiu, potasiu, litiu), citratul de sodiu, EDTA disodic.
184
 Oxalatul. Sărurile stabile ale acidului oxalic fixează calciul sub formă de sare
insolubilă împiedicând astfel coagularea sângelui. Se introduc 1-2 mg/ml sânge. De
exemplu pentru recoltarea a 15 ml sânge se utilizează 0,1 ml dintr-o soluţie de oxalat
30g/dl în apă bidistilată. Volumul de soluţie necesar este introdus în tuburile de
recoltare şi evaporat la 37-80oC; la temperaturi înalte oxalatul se transformă în
carbonat care nu are acţiune anticoagulantă. Pentru determinările de electroliţi nu se
folosesc oxalatul de sodiu sau de potasiu, înlocuindu-se cu oxalat de litiu sau amoniu.
Heparina este cel mai indicat anticoagulant, interferă cel mai puţin cu
determinările din sânge, nu modifică compoziţia plasmei, fiind ea însăşi un
component fiziologic al majorităţii ţesuturilor, inclusiv al sângelui. Are acţiune
anticoagulantă prin intensificarea acţiunii antitrombinei III de care se leagă, aceasta
din urmă inhibând acţiunea trombinei asupra fibrinogenului şi implicit coagularea
sângelui. Poate fi folosită ca heparinat de sodiu, potasiu, litiu sau amoniu, sub formă
de soluţie sau substanţa uscată. Solubilitatea în apă a heparinei este foarte mare,
astfel încât difuzează cu uşurinţă în sânge, chiar în lipsa agitării. Se utilizează 20
U.I./ml sânge sau 0,1 ml/2 ml sânge dintr-o soluţie de 60 mg/20 ml apă bidistilată.
Se pot spăla seringa şi tuburile cu o soluţie de heparină şi eventual se evaporă la
37oC. Prezintă dezavantajul unei acţiuni temporare. Pentru determinări de electroliţi
se folosesc sărurile de litiu sau amoniu. Heparinatul de amoniu nu este indicat pentru
dozările de uree, de amoniac, iar sarea de litiu nu este indicată pentru dozări de
fosfatază alcalină.
Citratul de sodiu este folosit pentru dozări de fibrinogen, probe de coagulare
şi viteza de sedimentare a hematiilor. Este suficientă o cantitate de 5 mg/ml sânge
sau o parte soluţie citrat 3,8 g/dl la 9 părţi sânge.
EDTA acţionează ca agent chelator al calciului. Se foloseşte în mod deosebit
în hematologie, întrucât conservă integritatea celulelor sanguine. Poate fi folosit ca
sare de sodiu sau potasiu, ultima fiind foarte solubilă în apă. Nu este indicat pentru
dozarea azotului rezidual, pentru calciu, sodiu, potasiu. Inhibă fosfataza alcalină şi
activează fosfataza acidă. Este indicat pentru dozarea fibrinogenului şi a
metaboliţilor acestuia.
Fluorura de sodiu poate fi folosită ca anticoagulant (6-10 mg/ml sânge). Nu
este indicată pentru determinarea electroliţilor, enzimelor sau dozarea ureei cu
urează (inhibă această enzimă).
Opţiunea pentru un anticoagulant sau altul este condiţionată de cunoaşterea
tuturor factorilor de eroare introduşi prin utilizarea anticoagulantului. Sângele
recoltat pe anticoagulant se centrifughează imediat timp de 5-10 minute la 3000-
3500 rpm pentru a separa plasma. Plasma se separă de celule în timp scurt.
Plasma reprezintă partea fluidă a ţesutului sanguin în care sunt suspendate
celulele sângelui. Serul este plasmă defibrinată. Prin coagulare fibrinogenul se
transformă în fibrină insolubilă, în care se fixează celulele, formând cheagul sanguin.
Aspectul normal al plasmei sau serului este al unui lichid transparent uşor gălbui (datorită
concentraţiilor fiziologice de bilirubină). În funcţie de diferite stări fiziologice sau
patologice, aspectul normal al plasmei şi serului se modifică. Transparenţa serului şi a
185
plasmei scad de la uşor tulbure până la alb lăptos în cazul plasmei lipemice. Culoarea
galben-intens a plasmei este proporţională cu bilirubinemia şi variază de la galben intens
la brun cu reflexe verzi. Bilirubina în concentraţii mari interferă cu toate determinările
colorimetrice, mai ales cu cele care implică măsurători în domeniul albastru al spectrului
(400-500 nm), cu unele metode de dozare a colesterolului şi a proteinelor plasmatice.
Culoarea roşie, cu nuanţe şi intensităţi diferite este dată de prezenţa în concentraţii
diferite a hemoglobinei, rezultat al hemolizei, precum şi de procesele de transformare a
hemoglobinei în contact cu aerul sau vapori de substanţe chimice din mediul ambiant (
acizi, oxidanţi, etc.). Hemoliza falsifică rezultatele dozărilor de enzime şi dozarea
potasiului care se găseşte în concentraţii mari în eritrocite. Hemoglobina interferă direct
cu reactivul diazo în cazul dozării bilirubinemiei cu acest reactiv.

Transportul şi conservarea sângelui

Sângele recoltat în recipiente de sticlă sau material plastic se lasă în stativ 5-
10 minute şi apoi se transportă în laborator fără a agita recipientele. Înaintea
recoltării fiecare recipient este etichetat cu numele pacientului şi analiza solicitată.
Pentru obţinerea plasmei, sângele total este imediat centrifugat 5-10 minute la 3000-
3500 rpm, o centrifugare insuficientă lăsând în suspensie leucocite, care produc
modificări ale compoziţiei plasmei prin glicoliza. Serul se decantează de pe cheagul
sanguin şi se centrifughează în aceleaşi condiţii. Serul şi plasma se separă de celule
cât mai rapid. Pentru dozarea gazelor din sânge şi determinarea pH-ului recoltarea
se face sub parafină sau se astupă eprubetele imediat în mod etanş. În contact cu
aerul se degajă dioxid de carbon şi pH-ul sângelui creşte. Se acordă atenţie deosebită
probelor recoltate în recipiente din polietilenă sau polipropilenă care sunt permeabile
la vapori de apă, dioxid de carbon şi oxigen. Pereţii tuburilor absorb proteine, iod,
coloranţi, cupru, etc., modificând compoziţia sângelui. Erorile introduse prin
folosirea acestor recipiente sunt cu atât mai importante cu cât suprafaţa lor este în
mare exces faţă de volumul sângelui, aşa cum se constată la tuburile capilare folosite
în recoltare pentru microanalize.
Stabilitatea componentelor sângelui este foarte diferită, dar întotdeauna mai
mică în sângele total decât în ser sau plasma separate de celule, mai mică la
temperatura camerei decât la frigider. De aceea, ideal este să se determine
componentele care sunt de interes, în cel mai scurt timp de la recoltare (ex. pentru
dozările de amoniac, corpi cetonici, acizi graşi liberi, enzime). Dacă dozările
enzimatice nu pot fi efectuate imediat, se congelează serul sau plasma (niciodată
sângele total), în această stare enzimele fiind stabile până la 24 ore.
Dozarea fosforului organic şi a clorului se fac în primele două ore de la recoltare.
Glucoza din sânge suferă variaţii rapide de concentraţie în urma glicolizei
celulelor sanguine, descrescând cu 75% pe oră în sângele total sau serul hemolizat. În
serul separat de celule şi nehemolizat glucoza este stabilă la 25oC până la 8 ore şi la
4oC 72 ore. Dacă se tratează sângele cu fluorură, glucoza este stabilă 24 ore la
temperatura camerei. La temperatura camerei metabolismul eritrocitelor continuă

186
producând scăderea concentraţiei glucozei, pH-ului, precum şi creşterea acidului
lactic.
Sângele recoltat pentru dozarea bilirubinei trebuie protejat de acţiunea luminii,
serul sau plasma conservându-se la întuneric, în recipiente înfăşurate în hârtie neagră.
Conservarea sângelui la frigider mai mult de 24 ore nu este recomandabilă
deoarece se produce hemoliza. Congelarea serului stabilizează componentele până
la 7-8 zile. După decongelare serul sau plasma se agită în vederea omogenizării.

187
 2. ENZIMELE PLASMATICE

Noţiuni introductive
În 1954 s-a stabilit prima corelaţie între activitatea enzimatică şi boală (GOT
şi infarct).
a. Clasificarea enzimelor plasmatice
Enzimele prezente în plasmă pot fi încadrate în două categorii:
 enzime plasmatice funcţionale (au substratul în plasmă);
 enzime plasmatice nefuncţionale (nu au substratul în plasmă; ele reprezintă
majoritatea enzimelor).
Enzimele plasmatice funcţionale sunt constant prezente în plasmă, locul lor
normal de acţiune, unde au de îndeplinit o funcţie fiziologică bine definită. Printre
ele se numără:
- lecitin-colesterol-acil transferaza, enzimă ce catalizează esterificarea
colesterolului prin transferul unui grup acil de pe lecitină;
- enzimele şi proenzimele coagulării şi fibrinolizei;
- pseudocolinesteraza - enzima având ca substrat derivaţi de acil-colină;
- ceruloplasmina - oxidaza conţinând cupru.
Majoritatea acestor enzime sunt sintetizate de ficat, care le secretă activ în
plasmă, unde se găsesc în concentraţii mari. Modificarea activităţii acestor enzime
funcţionale în plasmă, de obicei în sensul scăderii, este expresia unei sinteze proteice
defectuoase în ficat şi traduce o suferinţă hepatică gravă. Absenţa acestor enzime în
plasmă se poate datora unei erori genetice moştenite, ca în cazul bolii Wilson
(degenerescenţa hepato-lenticulară) caracterizată printr-o deficienţă a
ceruloplasminei. Absenţa genetică a pseudocolinesterazei are ca rezultat
sensibilitatea subiecţilor respectivi la unele anestezice din clasa acetilcolinei.
Enzimele plasmatice nefuncţionale nu au de îndeplinit nici un rol în plasmă.
În condiţii fiziologice, ele ajung în plasmă în concentraţii foarte mici, ca urmare a
turn-overului celular (diviziune, moarte celulară). La rândul lor, ele sunt clasificate
în:
a-enzime ale secreţiilor exocrine
b-enzime intracelulare, numite şi enzime de leziune
a) Enzimele secreţiilor exocrine (lipaza, amilaza, tripsina pancreatică,
fosfataza acidă prostatică şi fosfataza alcalină biliară) pot prezenta scăderi în plasmă
în situaţia în care organul secretor este atrofiat sau pot prezenta creşteri în cazul:
obstruării căilor excretoare, a unor modificări de permeabilitate a membranei
celulelor producătoare sau a unei sinteze şi excreţii crescute.
b) Enzimele intracelulare: lactat dehidrogenaza (LDH), transaminazele
(GOT, GPT), creatin kinaza (CK) acţionează exclusiv la nivelul ţesuturilor, ca
instrumente de realizare a metabolismului celular. Enzimele ies din celule şi trec în
plasmă în urma acţiunii factorilor patogeni infecţioşi (virali şi bacterieni) şi a
toxicelor chimice sau ca o consecinţă a ischemiei şi traumatismelor tisulare.

188
 b. Exprimarea activităţii enzimelor
Măsurarea concentraţiei enzimei este prea dificilă datorită valorilor ei foarte
mici. Se măsoară, de fapt, activitatea catalitică a enzimei.
UI (o unitate internaţională) reprezintă activitatea enzimatică prin care se
asigură conversia unui mol substrat într-un minut, în condiţii standard de pH,
temperatură, prezenţa cofactorilor etc.
Valoarea normală a activităţii enzimatice reprezintă echilibrul între rata
sintezei şi eliberării în plasmă (pe de o parte) şi clearance-ul ei din circulaţie (pe de
altă parte).

c. Clearance-ul enzimelor plasmatice se realizează:

- pe cale urinară (amilaza serică)
- pe cale biliară (fosfataza alcalină, ceruloplasmina, gamaglutamil-
transpeptidaza, 5’-nucleotidaza)
- prin sistemul reticulo-endotelial (enzimele sunt îndepărtate prin fagocitoză
sau sunt inactivate prin mecanism neelucidat).

d. Timpul de înjumătăţire (T1/2) a enzimelor plasmatice

Enzimele intracelulare au o viaţă medie scurtă în ser, de ordinul zecilor de
ore. T1/2 trebuie cunoscut pentru aprecierea momentului recoltării probei de sânge.
De exemplu, în infarct se cer: CK, GOT, LDH în funcţie de timpul scurs de la debutul
durerii.

e. Variaţiile fiziologice ale activităţii enzimatice se înregistrează în funcţie de:

- vârstă (fosfataza alcalină are valori mai mari la copii faţă de adulţi)
- sex (CK are valoare mai mare la bărbat pentru că are musculatura scheletică
mai dezvoltată decât la femeie)
- rasă (CK este mai mare la negri faţă de albi)
- activitate fizică (repausul la pat pentru 2-3 zile scade activitatea CK cu 20%).
f. Valorile crescute ale activităţii enzimatice plasmatice apar în condiţii de:
- leziune celulară (leziune ischemică, virală, toxice etc.)
- turn-over celular crescut (proliferare celulară crescută în neoplazii)
- inducţie enzimatică (sărurile biliare au efect inductor asupra fosfatazei
alcaline)
- obstrucţie de duct excretor (pentru enzimele secreţiilor exocrine)
- scădere a clearance-ului enzimei.
Gradul creşterii activităţii enzimatice este funcţie de:
- localizarea intracelulară a enzimei
Majoritatea enzimelor sunt uniloculare, fiind situate numai în citoplasma
celulară sau în formaţiuni subcelulare (glutamat dehidrogenaza în mitocondrii,
catalaza în peroxizomi, fosfataza acidă în lizozomi). Puţine enzime sunt biloculare,
fiind situate şi în citoplasmă şi în mitocondrie (GOT, malat-dehidrogenaza, izocitrat-
dehidrogenaza)
189
 Cunoaşterea localizării enzimelor este importantă pentru că în procesul de
citoliză enzimele citoplasmatice sunt primele care trec în plasmă, în timp ce ieşirea
enzimelor din mitocondrii sau din alte organite subcelulare se produce numai în
cazul unei acţiuni drastice şi prelungite a factorului patogen.
- permeabilitatea membranară
- gradul de vascularizaţie al ţesutului lezat
De exemplu, musculatura striată se imobilizează atunci când este lezată, iar
circulaţia sanguină şi limfatică se reduce mult, pe când miocardul continuă să se
contracte şi atunci când prezintă leziuni. Aşa se poate explica faptul că leziuni relativ
reduse ale miocardului, în caz de infarct, produc modificări mai exprimate ale
enzimelor în ser decât leziunile traumatice ale musculaturii scheletice.
- numărul celulelor lezate, gradul de afectare al lor, viteza producerii
leziunii
Atenţie! Nu există corelaţie între gradul (severitatea) leziunii şi activitatea
enzimatică. Această corelare se poate exprima doar în măsura în care după acţiunea
acută a factorului patogen celula îşi menţine potenţialul de refacere, leziunea fiind
reversibilă. Dacă acţiunea factorului patogen se prelungeşte sau este atât de severă
încât nu mai permite reversibilitatea proceselor induse, insuficienţa metabolică a
ţesutului lezat se instalează ireversibil, afectând sinteza proteică şi implicit pe cea
enzimatică. Ca urmare, în insuficienţele cronice, concentraţia enzimelor
intracelulare plasmatice nu mai suferă modificări semnificative, ea menţinându-se,
în general, într-un domeniu echivoc, uşor peste limita normală a valorii.
Creşterile nespecifice ale activităţii enzimatice sunt determinate de:
- insuficienţa circulatorie
- medicamente, care pot induce sinteze enzimatice (de exemplu,
gamaglutamil-transpeptidaza este indusă de fenobarbital şi anticonvulsivante)
- injecţia intramusculară poate creşte CK
- clearance scăzut (de exemplu, în macroamilazemie, amilaza serică
formează complexe cu imunoglobulinele şi nu mai poate filtra renal)
Valorile scăzute ale activitaţii enzimatice apar în condiţii de:
-sinteză scăzută (insuficienţă de organ)
-deficite congenitale
-clearance crescut (apare rar)

Semnificaţia clinică a activităţii enzimatice

a. Determinarea activităţii unor enzime organospecifice.
Aceste enzime sunt prezente exclusiv într-un ţesut şi creşterea lor în plasmă
indică organul lezat. De exemplu, ornitin-carbamil transferaza este enzimă strict
hepatică şi creşterea ei în plasmă indică fără dubiu o suferinţă hepatică. Enzimele
organospecifice sunt restrânse numeric. De obicei aceeaşi enzimă este situată în
diferite ţesuturi, de unde şi dificultatea localizării leziunii. De aceea, se recurge la
metodele de mai jos.

190
 b. Determinarea unui spectru larg de activităţi enzimatice şi aprecierea
raportului lor cantitativ
De exemplu, o activitate crescută a fosfatazei alcaline poate sugera o afecţiune
hepatică sau osoasă; dacă aceasta este însoţită de o valoare crescută a -glutamil-
transpeptidazei şi a 5’-nucleotidazei, afecţiunea este hepatică. Ca alt exemplu, GOT
şi GPT sunt situate şi în cord şi în ficat, dar, în general, valoarea raportului GOT/GPT
creşte în afecţiunile cardiace şi scade în afecţiunile hepatice.
c. Determinarea activităţii izoenzimelor.
Izoenzimele sunt separate prin variate metode: electroforeza, stabilitatea la
acţiunea unor agenţi denaturanţi (căldura), sensibilitatea la inhibitori. De exemplu, o
activitate crescută a LDH poate sugera o afecţiune cardiacă, musculară sau hepatică.
Dacă LDH total este crescut pe seama izoenzimei LDH1, atunci afecţiunea este
cardiacă.

Concluzie
Importanţa cunoaşterii valorii activităţii enzimatice plasmatice constă în:
- depistarea şi localizarea ţesutului lezat
- depistarea existenţei unei proliferări celulare
- monitorizarea tratamentului sau a progresiunii bolii
Informaţii practice pentru o bună determinare şi interpretare a activităţii
enzimatice serice
a. Hemoliza falsifică în mare măsură determinările de LDH, GOT şi, într-o
măsură mai redusă, determinările de GPT, CK, gamaglutamil-transpeptidaza şi
fosfataza acidă
b. Modul de conservare a serului până la efectuarea determinărilor de enzime
este important. Amilaza, lipaza, gamaglutamil-transpeptidaza îşi păstrează nealterată
activitatea catalitică timp de 7 zile, atât la 4oC, cât şi la temperatura camerei.
Fosfataza alcalină îşi păstrează neafectată activitatea doar la 4oC. Fosfataza acidă se
inactivează extrem de rapid şi determinările trebuie efectuate imediat după recoltare.
c. Uneori este necesară excluderea unor artefacte. Lactatul seric crescut
determină rezultate fals scăzute ale GPT, iar cetoacidoza diabetică determină
rezultate fals crescute ale amilazei serice.

1. Fosfataza alcalină

Fosfataza alcalină reprezintă un termen generic pentru un grup de enzime

care au proprietatea de a hidroliza monoesteri organici ai fosfatului, la pH alcalin
(pH=10). Reacţia generală este:

191
 Enzima necesită Mg2+ ca activator şi este inhibată de Ca2+ şi de fosfat
anorganic. Rolul fiziologic şi substratul enzimei nu se cunosc.

Localizare
Enzima se găseşte în orice ţesut, dar ţesuturile bogate în fosfatază alcalină
sunt: osul (osteoblastele), ficatul (tractul hepato-biliar), placenta şi intestinul.
Enzima este situată pe suprafaţa membranei celulare, are timpul de înjumătăţire de
7 zile şi clearance-ul ei este probabil hepatic.
Activitatea enzimatică plasmatică este reprezentată de: fracţiunea hepatică
(30-50%), osoasă (50-70%), intestinală (0-20%). Identificarea izoenzimelor
fosfatazei alcaline întâmpină încă probleme de sensibilitate şi precizie de execuţie.
Se consideră că determinarea lor este improprie analizei clinice uzuale.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Dozarea fosfatazei alcaline după metoda McComb şi Bowers

Principiu
Fosfataza alcalină din probă hidrolizează p-nitrofenilfosfatul în prezenţa
ionilor de magneziu, la pH 10,2, cu producerea de p-nitrofenol şi fosfat. P-
nitrofenolul, în mediu alcalin, are o culoare galbenă, fotometrabilă la 405 nm. Rata
de formare a p-nitrofenolului este direct proporţională cu cantitatea fosfatazei
alcaline din probă.
Se lucrează pe ser proaspăt, nehemolizat. Se poate utiliza şi plasmă
heparinizată. Anticoagulantele ca: EDTA, citrat şi oxalat nu trebuie utilizate pentru
că inhibă activitatea enzimatică. Fosfataza alcalină din ser este stabilă 4-5 zile la
temperatura medie de 40C.
Reactivi necesari
1. Tampon 120 ml. Conţine tampon dietanolamină-succinat, la pH 10,2,
aspartat de magneziu, conservanţi şi surfactanţi nereactivi
2. Substrat 490 l. Substratul este p-nitrofenilfosfatul ca sare bisodică
Mod de lucru
Se prepară un amestec din substrat şi tampon, utilizând cantităţile de mai sus
Amestec (preîncăzit la 370C) 3ml
Ser 0,05 ml
Se aşteaptă un minut, după care se citeşte absorbanţa la 405 nm pentru 2-3
minute. Se stabileşte valoarea medie a variaţiei absorbanţei (A/min), valoare ce va
fi utilizată în calcul. Dacă valoarea A/min este mai mare de 0,270 se repetă testul
pe o probă diluată în soluţie salină. Testul este liniar până la 850 UI / l.

Calcul

192
 O UI corespunde unei activităţi enzimatice care transforma un mol de p-
nitrofenol la fiecare minut, în condiţiile specificate. Valoarea se calculează după
următoarea formulă:

1000 : converteşte ml la l
A/min : variaţia absorbanţei / minut
vt : volumul total intrat în reacţie, în ml
1000 : converteşte nmoli la moli
l : drumul optic în cm
18750 : coeficientul molar de extincţie a p-nitrofenolului la 405 nm
vp : volumul probei, în ml
Când determinarea se efectuează după procedeul de mai sus, utilizând un
drum optic de 1 cm, formula de calcul de reduce la: UI/l = A/min x 3253

Valori normale (la 370C)

Adulţi: 27-275 UI/l
Copii sub 1 an: 220-820 UI/l
Copii între 1 şi 10 ani: 150-550 UI/l
Adolescenţi între 10 şi 15 ani: 170-850 UI/l
Creşteri fiziologice ale activităţii fosfatazei alcaline se înregistrează:
- în copilărie şi pubertate, când există o creştere osoasă rapidă
- în trimestrul III al sarcinii, când activitatea fosfatazei alcaline este de 2 ori
mai mare decât valoarea de la adult şi revine la normal la 3 săptămâni postpartum
- după vârsta de 60 ani, (boala Paget subclinică)
Semnificaţia clinică a activitaţii crescute a fosfatazei alcaline
a. Boli hepatobiliare
Fosfataza alcalină este enzima sindromului de colestază prin obstrucţie biliară,
având două cauze majore: calculul de coledoc şi cancerul de cap de pancreas. O
creştere marcată a fosfatazei alcaline plasmatice (de 3-4 ori) şi durabilă este
caracteristică icterului colestatic, prin obstrucţie biliară. În acest caz, originea biliară
a fosfatazei alcaline (sărurile biliare au rol de inductori enzimatici) este susţinută de
valorile crescute ale 5’-nucleotidazei şi gamaglutamil-transpeptidazei.

b. Boli osoase
Fosfataza alcalină reflectă activitatea osteoblastelor. Măsurarea activităţii
fosfatazei alcaline trebuie însoţită de un bilanţ fosfocalcic complet, seric şi urinar.
Valori crescute se întâlnesc în: regenerarea osoasă după fracturi, rahitismul prin
carenţa vitaminei D etc.
c. Cancer

193
 Ţesutul canceros poate secreta două tipuri de fosfataze: oncofetale, secretate
direct de tumoră, şi cele secretate de ţesutul invadat de metastaze.
O fosfatază alcalină oncofetală este izoenzima Reagan, identică cu cea
placentară, secretată de tumori canceroase pulmonare sau ale aparatului genital
feminin.
Fosfataza alcalină are valori crescute şi în metastazele hepatice sau osoase.
Pentru diferenţierea lor se foloseşte -glutamil-transpeptidaza, care are origine
hepatică.

2. Fosfataza acidă

Termenul de fosfatază acidă este folosit pentru o familie de enzime care

reacţionează ca esteraze (de exemplu, asupra p-nitrofenilfosfatului). pH-ul optim
este de 5, de unde denumirea improprie de fosfatază acidă.
Localizare
În prostată se găseşte izoenzima prostatică a fosfatazei acide. Alte ţesuturi
(ficat, splină, os, trombocite, eritrocite) au concentraţie mică de fosfatază acidă.
Fosfataza acidă prostatică este sintetizată de prostată şi apoi este excretată, urmând
traseul duct prostatic, uretră. În condiţii fiziologice, valorile sanguine ale enzimei
sunt foarte mici.
Determinarea activităţii fosfatazei acide în laborator
Se determină p-nitrofenolul eliberat din substrat în prezenţa şi în absenţa
tartratului de sodiu. Activitatea inhibată de tartrat corespunde activitaţii fosfatazei
acide cu origine prostatică.
Recoltarea probei pentru determinarea activităţii fosfatazei acide
Determinarea activităţii enzimatice se face imediat după recoltarea probei
deoarece fosfataza acidă prostatică este instabilă. Heparina inhibă activitatea
enzimatică, de aceea se foloseşte sânge coagulat. Nu se utilizează probe hemolizate.
Este indicat ca proba de sânge să fie recoltată anterior efectuării tuşeului rectal.
Semnificaţia clinică
Fosfataza acidă prostatică are valori crescute în unele forme localizate de
cancer prostatic (la 5-20% din bolnavi) şi în majoritatea formelor metastatice de
carcinom prostatic (la 60-75% din bolnavi).
De obicei, determinările de fosfatază acidă prostatică sunt însoţite de
determinarea antigenului specific prostatic în ser. Acest antigen, descoperit în 1987,
este un peptid alcătuit din 237 aminoacizi, este sintetizat de epiteliul prostatic şi este
secretat în lichidul seminal. El are activitate proteolitică. Recent s-au găsit şi alte
localizări ale antigenului specific prostatic.
Fosfataza acidă prostatică şi antigenul specific prostatic sunt markeri
biochimici pentru cancerul de prostată. Valorile lor sunt crescute şi în caz de
hipertrofie benignă de prostată, prostatită şi după cateterism în investigaţii urologice.
De aceea, aceşti doi markeri nu sunt suficient de sensibili şi specifici pentru

194
screeningul cancerului de prostată. Aplicaţia lor majoră este în urmărirea evoluţiei
bolii şi pentru monitorizarea terapiei.

3. Amilaza serică

Amilaza serică este o -endoamilază care catalizează degradarea hidrolitică a

amidonului. Ea acţionează asupra legăturilor -1,4 glicozidice, cu formare de
oligozaharide reducătoare (dextrine), maltoză şi glucoză, care sunt compuşi
necolorabili cu iodul.
Localizare
Enzima se găseşte în: pancreas, glande salivare, ficat, intestin subţire, rinichi,
trompe uterine şi tumori (carcinom pulmonar, esofagian, ovarian, de sân).
Există 2 clase de izoenzime:
- izoenzima P (secretată de pancreas), care reprezintă 40% din amilaza serică
totală
- izoenzima S (secretată de diverse ţesuturi, în special de glandele salivare),
care reprezintă 60% din amilaza serică totală
Timpul de înjumătăţire (T1/2) este de 48 ore. Amilaza serică creşte în primele
24 ore de la debutul unei pancreatite, se menţine crescută 3 zile şi revine la normal
în 3-5 zile.
Enzima filtrează renal pentru că are masă moleculară mică (45000). În cazul
macroamilazemiei, amilaza nu mai filtrează renal pentru că formează
macromolecule cu imunoglobulinele, înregistrându-se astfel valori fals crescute ale
amilazei serice.
În pancreatita acută, valorile crescute ale amilazei urinare se menţin 7 zile
(mai mult decât ale celei serice) datorită unui defect tubular, reversibil, care
împiedică reabsorbţia amilazei urinare.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

a. Determinarea activităţii amilazei serice prin metoda cromogenă

La capătul reducător al maltoheptozei se fixează p-nitrofenolul. În urma

hidrolizelor enzimatice se eliberează p-nitrofenolul galben, care dă viteza de colorare
la 410 nm, proporţională cu activitatea enzimatică.

195
 b. Determinarea activităţii amilazei serice prin metoda Wohlgemuth

Principiu
Se incubează o cantitate dată de amidon cu diluţii progresive de ser pentru a
se stabili diluţia serului care mai cuprinde suficientă enzimă pentru a hidroliza
amidonul (în condiţiile date) până la dextrine necolorabile cu iodul. Activitatea
enzimei se exprimă în unităţi convenţionale Wohlgemuth, o unitate de amilază fiind
acea cantitate de enzimă care degradează un mg amidon în 30 nimute, la 370C, până
la dextrine necolorabile cu iodul.

Reactivi
1. Soluţie de clorură de sodiu izotonică 0,85% (ser fiziologic)
2. Soluţie de amidon 0,1%
3. Soluţie de iod 0,1N

Mod de lucru
În 10 eprubete numerotate se fac diluţii de ser cu ser fiziologic de la 1/1 la
1/512 în felul următor:
- în prima eprubetă se pipetează 2 ml ser, iar în următoarele câte 1 ml ser
fiziologic;
- din prima eprubetă se reia 1 ml ser, se introduce în a doua şi se agită;
- se reia 1 ml de amestec din eprubeta a doua, se introduce în a treia, se agită şi
se repetă operaţia până la ultima eprubetă, din care se reia 1 ml de amestec şi se aruncă.
Se realizează astfel diluţii succesive ca în tabelul următor:

Nr eprubetei 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Diluţia serului 1/1 1 /2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512
Activitate 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024
amilazică
exprimată în UW

Se adaugă în fiecare eprubetă câte 2 ml amidon 0,1 % şi se agită. Toate

eprubetele se menţin timp de 30 minute la temperatura de 370C. Se răcesc sub apă
curentă, apoi se adugă în fiecare eprubetă câte 3 picături soluţie de iod 0,1N şi se
agită.
Coloraţia soluţiilor din eprubete reflectă gradul de hidroliză al amidonului:
cele colorate în albastru conţin amidon nehidrolizat, cele colorate în violet
amilodextrine, cele colorate în roşu eritrodextrine, iar cele incolore sau slab gălbui
conţin acrodextrinne şi maltoză.
Calcul

196
 Dacă culoarea albastră apare de exemplu în eprubeta nr.5 calculul se va face
pe baza diluţiei din eprubeta nr.4 care conţine cantitatea minimă de enzimă necesară
hidrolizei totale sau parţiale a întregii cantităţi de amidon.
O unitate Wohlgemuth reprezintă cantitatea de amilază care hidrolizează 1 mg
amidon în 30 minute, la 370C. Activitatea amilazică a serului exprimată în unităţi
Wohlgemuth (U.W.) se află împărţind cantitatea în mg de amidon conţinută în
fiecare eprubetă la valoarea diluţiei. Astfel, deoarece în fiecare eprubetă se găsesc
câte 2 mg amidon (2 mg soluţie 0,1% conţin 2 mg amidon), iar în eprubeta nr.4
diluţia este 1/8, activitatea amilazică va corespunde la:
2
U .W .   16
1/ 8
Observaţie. Amilaza urinară se determină după aceeaşi tehnică.
Valori normale: în ser 16-32 U.W.;
în urină 8-64 U.W.

Semnificaţie clinică
a. Pancreatita acută. O valoare a amilazei serice mai mare de 3 ori decât
valoarea normală are o specificitate crescută pentru diagnosticul de pancreatită acută.
În pancreatita acută amilaza serică poate creşte până la de 40 ori valoarea normală.
Atenţie! - valoarea maximă a amilazei serice şi rata ei de scădere nu se corelează cu
severitatea sau cu prognosticul bolii.

Există pancreatite cu amilazemie normală în următoarele condiţii:

- recoltarea probei de sânge s-a efectuat la mai mult de trei zile de la debutul
bolii (nu s-a ţinut seama de timpul de înjumătăţire al amilazei serice)
- pancreatita cronică este surprinsă în puseu acut
- hipertrigliceridemie
b. Alte boli (când valoarea amilazei serice este peste valoarea normală, dar
mai mică decât triplul valorii normale)
- boli acute abdominale: ulcer peptic perforat, colecistită acută, ocluzie
intestinală, traumatism abdominal, sarcină ectopică ruptă
- boli ale glandelor salivare: oreion, calculi, după sialografie
- spasm al sfincterului Oddi, după administrarea de morfină
- o disfuncţie glomerulară
- cetoacidoza diabetică (reacţie fals pozitivă, când există condiţii favorabile
hidrolizei acide, cu afectarea determinării activităţii amilazei serice în laborator)
- macroamilazemia
Valori scăzute ale amilazei serice se înregistrează la sugari

4. Lipaza serică

Lipaza are origine pancreatică şi hidrolizează esteri ai glicerolului în

prezenţa unei proteine cu masa moleculară de 10000 (colipaza) şi a sărurilor biliare
197
de concentraţie slabă (altfel devin inhibitori). Lipaza reacţionează numai în mediu
heterogen asupra substratului emulsionat, de aceea este dificil de a măsura activitatea
enzimatică în laborator. Totuşi, astăzi sunt disponibile noi metode de determinare
(chiar automatizate), având o bună sensibilitate.
Localizare
Lipaza are localizare preponderent pancreatică. Se mai poate găsi în:
mucoasa gastrică şi intestinală, leucocite, adipocite.
Timpul de înjumătăţire este mai mare decât cel al amilazei serice, valorile
serice crescute persistând 14 zile. Enzima are clearance urinar.
Metode de determinare a activităţii enzimatice în laborator
Metoda uzuală (turbidimetrică) utilizează un substrat nu prea bine definit (o
emulsie de trioleină în tampon Tris de pH 9,2) cu diverşi activatori şi stabilizatori
(dezoxicolat de concentraţie corespunzătoare, ioni de calciu şi clor, colipază extrasă
din pancreas de porc). Se măsoară, la 340 nm şi 30oC, viteza de scădere a turbidităţii
emulsiei de trigliceride, care este proporţională cu activitatea lipazei pancreatice.
Rezultatul nu se poate exprima în submultipli de katal pentru că substratul nu este
bine definit (se utilizează unitaţi arbitrare dependente de condiţiile de lucru). Valorile
de trei ori mai mari decât nivelul de bază au semnificaţie semiologică.

Metoda enzimatică (necomercializată încă şi scumpă) are drept reacţii:

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

În scop didactic se prezintă următorul experiment pentru studiul activităţii

lipazei. Se utilizează 3 eprubete, numerotate de la 1 la 3. În ficare se pun: 5 ml lapte,
7 ml carbonat de sodiu M/10 (are rolul de a forma un mediu alcalin). În eprubetele 2
şi 3 se adaugă soluţie 3% de săruri biliare. În toate eprubetele se pune indicator
fenolftaleina (6 picături).

198
 Într-o eprubetă curată se pipetează 3 ml de soluţie de lipază 5%, care se
încălzeşte la becul Bunsen până la fierbere, câteva secunde. Se răceşte sub jet de apă
şi 1 ml din conţinut se transferă în eprubeta 2. În eprubetele 1 şi 3 se pune câte 1 ml
de lipază nefiartă. Se agită conţinutul eprubetelor, se lasă în stativ şi se observă din
când în când. Se completează tabelul de mai jos, cronometrând timpul necesar în
care, în fiecare eprubetă, conţinutul să treacă de la roz la alb:

Conţinut lapte, Na2CO3, Timpul necesar trecerii de

fenolftaleină,la care se adaugă: la roz la alb
1 lipaza
2 lipaza fiartă şi săruri biliare
3 lipaza şi săruri biliare

În urma efectuării experimentului, se poate răspunde la următoarele întrebări:

 Ce modificări chimice, înregistrate prin virarea culorii fenolftaleinei, au loc?
 Care este produsul final de digestie a laptelui responsabil pentru această
modificare?
 Care parte a experimentului demonstrează că lipaza este o enzimă?
 Ce rol joacă sărurile biliare în reacţia care are loc?
 Rezultatele obţinute demonstrează că lipaza acţionează pe grăsimile sau
proteinele din lapte?
Semnificaţie clinică
Nivelele crescute ale lipazei serice se înregistrează in pancreatitele acute şi în
puseele acute ale unei pancreatite cronice. Aceste valori sunt mai persistente decât
cele ale amilazei, deci ajută la punerea retrospectivă a diagnosticului de pancreatită.
Valori normale ale lipazei serice, însoţite de amilazemie crescută, apar în afecţiuni
extrapancreatice: leziuni ale glandelor salivare, oreion, sarcina extrauterină,
macroamilazemie, cetoacdoză diabetică.

5. Colinesteraza serică

Organismul dispune de enzime capabile să producă hidroliza esterilor

colinei cu diverşi acizi organici. Un grup al acestor enzime este localizat
predominant în eritrocite şi în ţesutul nervos, având activitate specifică asupra
acetilcolinei; denumirea enzimelor este de acetilcolinesteraze. Celălalt grup de
enzime este sintetizat de ficat, apoi secretat în plasmă şi are specificitate largă,
hidrolizând esteri variaţi (acetilcolina, butiril-colina, benzoil-colina, succinil-colina).
Denumirea enzimelor din acest grup este de colinesteraze serice nespecifice sau
pseudocolinesteraze.
Există numeroase tehnici de determinare a activităţii colinesterazelor serice.
Unele sunt bazate pe modificările de pH datorate eliberării acizilor din esterii colinei,
fie pe determinări colorimetrice sau spectrofotometrice ale substratului supus
hidrolizei.
199
 ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Determinarea activităţii colinesterazei serice prin metoda volumetrică

Principiul metodei: determinarea activităţii se bazează pe proprietatea enzimei

de a hidroliza acetilcolina la colină şi acid acetic.

CH3-COO-CH2-CH2-N+(CH3)3+H2O  CH3COOH+HO-CH2CH2-N+(CH3)3

Acidul pus în libertate se dozează volumetric, prin titrare cu hidroxid de sodiu

de normalitate cunoscută.

Mod de lucru
În două eprubete se iau câte 1 ml soluţie acetilcolină. În eprubeta probă se
pipetează 1 ml ser de analizat şi se incubează la 370C, timp de 30 minute. În eprubeta
martor se pipetează 1 ml ser inactivat (nu necesită incubarea). În ambele eprubete se
adaugă 3-4 picături de fenolftaleină şi se titrează cu NaOH N/100 până la apariţia
unei coloraţii slab roz.

Calcul
Se scade numărul de ml de NaOH N/100 folosiţi la titrarea martorului din
numărul de ml folosiţi la titrarea probei.
Valori normale: 2-4 ml NaOH 0,01N/ml ser.

Semnificaţie clinică
Pseudocolinesteraza dă indicaţii privind capacitatea proteosintetică a ficatului.
Valori crescute ale activităţii enzimatice se înregistrează în perioada de
vindecare a unei hepatite şi în sindromul nefrotic, când are loc o exagerare a funcţiei
proteosintetice a ficatului. Pentru hepatologie este important de ştiut că în caz de
afectare a ficatului la obezi, hiperlipemici sau hipertiroidieni, scăderea
pseudocolinesterazei porneşte de la un nivel iniţial mai ridicat.
Valori scăzute ale activitaţii enzimatice se înregistrează în boli de ficat
(hepatită cronică, ciroză). Urmărirea variaţiei activităţii enzimatice are valoare
diagnostică şi pentru urmărirea eficacităţii terapiei. Creşterea valorii în cursul
terapiei hepatitei indică un prognostic favorabil, în timp ce scăderea progresivă a
valorii denotă evoluţia spre atrofie hepatică.
Valori scăzute ale activităţii enzimatice se înregistrează şi în ingestia sau
absorbţia prin tegumente de anticolinesteraze (insecticide organofosforice), în
prezenţa de variante anormale ereditare ale colinesterazei, care au o activitate
biologică scăzută.
Sensibilitatea la suxametoniu

200
 Suxametoniul (succinil-colina, „scolina”) este un relaxant muscular, care este
metabolizat prin hidroliza de către colinesteraza serică, scăzându-i astfel durata de
acţiune. Administrarea de suxametoniu la un pacient cu activitate scăzută a
colinesterazei (de obicei datorită existenţei unei variante genetice anormale) este
urmată de o perioadă îndelungată de apnee. Asemenea pacienţi necesită ventilaţie
suportivă după operaţie. Pentru demonstrarea prezenţei unei variante genetice
anormale se determină şi numărul la dibucaină (valoarea normală este de 80% şi
reprezintă procentul cu care a fost inhibată activitatea colinesterazei în prezenţa
dibucainei). Pentru formele homozigote, activitatea colinesterazei serice este foarte
mult scăzută, iar procentul cu care este inhibată de către dibucaină este mai mic de
20%. Formele heterozigote au activitatea colinesterazei serice uşor scăzută şi număr
intermediar la dibucaină. Raţionamentul utilizării inhibiţiei la dibucaină constă în:
- o activitate serică scăzută a colinesterazei însoţită de numărul la dibucaină
normal sugerează o sinteză hepatică defectuoasă
- o activitate serică foarte scăzută a colinesterazei însoţită de numărul la dibu-
caină scăzut indică existenţa unei gene anormale pentru colinesterază
Identificarea pacienţilor susceptibili la suxametoniu şi a rudelor lor este
importantă pentru a aprecia riscul utilizării anestezicelor la aceştia.

6. Transaminazele

Transaminazele sunt enzime implicate în metabolizarea aminoacizilor (atât în

degradarea cât şi în biosinteza lor). Prin reacţia de transaminare are loc transferul
gruparii amino de pe un aminoacid oarecare pe - cetoglutarat (-KG), cu obţinerea
de glutamat (Glu) şi -cetoacizi (are loc canalizarea azotului din aminoacizi spre
Glu). Glutamatul este rezervorul - depozitul de azot din aminoacizi şi este unicul
substrat al dezaminării oxidative, din care rezultă amoniac, iar -cetoacizii formaţi
sunt oxidaţi în ciclul Krebs, constituind o sursă de energie.
Reacţia generală catalizată de transaminaze este:

Exemple:

201
În care:

GPT=glutamat-piruvat-aminotransferaza=ALAT=alanină-aminotransferaza
GOT=glutamat-oxaloacetat-aminotransferaza=ASAT=aspartat-aminotransferaza
Transaminazele au drept coenzimă piridoxal-5-fosfatul din vitamina B6. În
deficitul de vitamină B6 nivelul reacţiilor de transaminare scade (cu 66%) şi
deasemenea activitatea plasmatică a acestei enzime (ex. hepatita alcoolică-creşterile
sunt mai mici în alte hepatite).
Localizare
Concentraţia GPT e mai scăzută decât cea a GOT în toate ţesuturile, cu
excepţia ficatului.
GOT GPT
Localizare tisulară Inimă, ficat, musculatură striată Ficat, musculatură
(localizari principale) sistem striată, miocard,
nervos, rinichi, pancreas, hematii, rinichi, pancreas
plămâni (localizări secundare)
Localizare celulară Enzimă biloculară (40% în Enzimă uniloculară
mitocondrii, 60% în citoplasmă) (doar în citoplasmă)
Mecanismele Necroză (moartea celulară) Creşterea
creşterii activităţii permeabilităţii
plasmatice membranei celulare
Semnificaţia Leziuni severe Leziuni uşoare (când
creşterii în ser nu se asociază cu o
creştere a GOT)
T1/2 17h 47 h
Valori normale < 45 UI/l < 27 UI/l

Valori patologice ale transaminazelor serice

Creşterile GPT au în general aceleaşi cauze ca şi creşterea GOT. Transa-
minazele serice prezintă variaţii fiziologice de maxim 10 u.i./zi la aceeaşi persoană.
Raportul De Ritis
Raportul De Ritis este raporul între activitatea GOT/activitatea GPT
Valori normale: 1,3 (variază între 0,7-1,4 în funcţie de metodologie)
Valori patologice

202
 În cazul necrozei se eliberează enzime mitocondriale (ex. GOT) şi în
consecinţă raportul De Ritis va fi crescut; de exemplu în infarctul miocardic acut,
hepatita cronică activă, medicamentele hepatotoxice.
În cazul bolilor inflamatorii are loc o creştere a permeabilităţii membranei
celulare cu eliberarea enzimelor citoplasmatice şi deci raportul De Ritis va fi scăzut
de exemplu în hepatita infecţioasă.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Dozarea transaminazelor serice

Există mai multe metode de determinare a transminazelor serice
A. metoda cu 2,4 -dinitrofenilhidrazină (metodă spectrofotometrică)
B. metoda cu lactatdehidrogenază, respectiv malatdehidrogenază (metodă
spectrofotometrică). În prezent este din ce în ce mai utilizată cea de-a două metodă,
fiind mult mai rapidă şi mai specifică.

A. Metoda cu 2,4-dinitrofenilhidrazină
Principiu.
Prin tratarea cu 2,4 dinitrofenilhidrazină în soluţie alcalină a amestecului de
incubare se formează fenilhidrazonele acizilor -cetoglutaric şi piruvic colorate în
roşu-cărămiziu. Pentru a nu interfera în măsurarea activităţii enzimelor prin creşterea
concentraţiei produşilor de reacţie, -cetoglutaratul se adaugă în cantităţi mici, iar
măsurarea colorimetrică se face la lungime de undă mare (500-550 nm) unde
fenilhidrazona acidului -cetoglutaric absoarbe slab.
Reactivi necesari:
1. Substrat GOT 1,50 g K2HPO4, 0,20 g KH2PO4, 0,039g -cetoglutarat de
sodiu (sau 0,030g acid -cetoglutaric) şi 1,57 aspartat de sodiu (sau 1,32 g acid
aspartic) se dizolvă în aproximativ 80 ml apă. Se aduce pH-ul la 7,4 cu NaOH 0,4 N
apoi se completează volumul la100 ml cu apă bidistilată.
2. Substrat GPT 1,50 g K2HPO4, 0,20 g KH2PO4, 0,030g acid -cetoglutaric
(sau 0,039 g -cetoglutarat de sodiu) şi 1,768 g alanină se dizolvă în aproximativ 80
ml apă, se aduce la pH 7,4 cu NaOH 0,4 N apoi se completează la 100 ml apă
bidistilată.
3. Soluţie 2,4 dinitrofenilhidrazină 1 mM în HCl 2M: se dizolvă 20 mg
dinitrofenilhidrazină în 20 ml HCl, şi se completează cu 100 ml apă distilată.
4. Soluţie NaOH piruvat de sodiu 2 ml ( 22 mg % ml în apă distilată).
5. Soluţie NaOH 0,4 N ( 16 g/100 ml apă distilată).

Tehnica
Se lucrează cu ser nehemolizat făcâdu-se pentru fiecare set de analiză câte o
probă, un blanc şi un standard de piruvat de sodiu.
GOT GPT
Reactivi (ml) P S B P S B
203
 Substrat GOT 0,5 0,5 0,5 - - -
Substrat GPT - - - 0,5 0,5 0,5
Ser 0,1 - - 0,1 - -
Soluţie piruvat - 0,1 - - 0,1 -

Se incubează 60 min. probele GOT şi 30 min. probele GPT la 37 oC apoi se

adaugă:
H2O - - 0,1 - - 0,1
2,4 DNFH 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Se amestecă, se lasă la temperatura camerei 20 min. apoi se adaugă câte 5 ml

NaOH, 0,4 N în fiecare eprubetă, se agită şi după 5 min. se citesc exţincţiile probei
(Ep) şi ale standardului (Es) faţă de blancul corespunztor la 546 nm. Dacă extincţiile
sunt peste 0,26 pentru GOT şi peste 0,375 pentru GPT se diluează 0,1 ml ser şi 0,9
ml NaCl 0,95 şi se va multiplica cu 10.
Calcul
Se calculează concentraţia piruvatului rezultat din reacţie pentru fiecare
enzima M/min/l, ţinând seama de concentraţia substratului (0,2 M/0,1 ml) volumul
de ser luat în lucru şi timpul de incubare, astfel:

Pentru GOT:

Pentru GPT:

M/min/l mU/ml M/min/l mU/ml

GOT sau GPT GOT GOT GPT GPT
2 2 1 56 24
4 3 2 58 25
6 5 2,5 60 26
8 6 3 62 27
10 7 4 64 29
12 9 4,5 66 30
14 11 5 68 31
16 13 6 70 33
18 15 7 72 34
20 17 7,5 74 35
22 19 8 76 36
24 21 9 78 37
26 23 9,5 80 38
204
 28 25 10 82 39
30 27 11 84 40
32 29 12 86 42
34 31 13 88 44
36 33 14 90 46
38 35 15 92 48
40 37 16 94 50
42 39 17 96 52
44 41 18 98 54
46 44 19 100 56
48 47 20 102 60
50 51 21 - -
52 55 22 - -
54 60 23 - -

Pentru a avea activitatea enzimatică reală (dată numai de fenil-butazona

produsului de reacţie) exprimată în MU/ml s-au calculat tabelele de corecţie realizate
pe baza unei curbe de calibrare cu o soluţie de piruvat fie, mai exact, pe baza metodei
enzimatice de referinţă care măsoară activitatea transaminazică reală prin măsurarea
transformării NADH în NAD+ în prezenţa enzimelor indicatoare malat
dehidrogenază pentru GOT şi lactat hidrogenază pentru GPT.
Corespondenţa dintre valorile reale ale activităţii transaminazice exprimate în
mU/ml şi valorile obţinute prin tehnica cu 2,4 dinitrofenil-hidrazină în M /min/l
sunt în tabelul de mai sus.

Valorile normale
GOT până la 47 mU/ml şi GPT până la 25 mU/ml (valorile normale variază
în funcţie de temperatura la care se efectuează dozarea).

B. Metoda cu malatdehidrogenază (pentru GOT)

Principiu
Se utilizează reacţiile:
Asp + -KG  OAA + Glu

OAA+NADH+H+ MDH
 Malat + NAD+

Viteza descreşterii absorbţiei NADH la 340 sau 366 nm este direct

proporţională cu activitatea GOT conţinută în proba de sânge .
Reactivi
1. Reactivul 1, reactivul enzimatic, conţine tampon TRIS (pH=7,8) 80 mol/l
205
 L-aspartat 240nmol/l
MDH 600 U/l
NADH 0,18nmol/l
2. Reactivul 2 conţine -cetoglutarat 12 nmol /l

Tehnică
Se lucrează pe ser, plasmă heparinizată sau plasmă cu EDTA. Se evită
hemoliza care poate conduce la rezultate fals crescute. Se pipetează într-o eprubetă
următoarele: ser 0,4 ml, reactiv 1 sau 2 ml din reactivul enzimatic. Se agită şi se
incubează 5 min. la temperatura de 30 oC, apoi se adaugă reactivul 2 (care conţine
cel de-al doilea substrat al GOT) 0,5 ml. Se agită şi se citeşte absorbanţa la 340 nm
după 1 minut (se notează cu E1). Apoi se citesc din nou după exact încă 1 min (se
notează cu E2).

Calcul
Se multiplică diferenţa E = E2-E1 cu următorul factor în funcţie de
lungimea de undă la care s-au citit absorbanţele:

A 340nm 366nm
Factor multiplicare F 1151 2132

Activitatea serică GOT = (E2-E1) x F U/l

Valori normale: Barbaţi: 27-45 U/ l
Femei: 22-35 U/l

C. Metoda cu lactat dehidrogenază (pentru GPT )

Principiu: se utilizează reacţiile:

Ala + -KG  
GPT
Pyr +Glu

Pyr + NADH + H+  lactat + NAD+

Viteza descreşterii absorbţiei NADH la 340 nm este direct proporţională cu
activitatea GPT conţinută în probe de sânge.

Reactivi
1. Reactivul 1 -reactivul enzimatic- conţine tampon TRIS (pH =7,5) 100 mmol/l
L- alanina 500
LDH > 1200
NADH 0,18 nmol/l
2. Reactivul 2 conţine -cetoglutarat 15 nmol/l

206
 Tehnica
Se lucrează cu ser, plasmă heparinizată sau plasmă cu EDTA. Se evită
hemoliza care poate conduce la rezultate false crescute. Se adaugă într-o eprubetă
următorele cantităţi: 0,4 ml ser, reactiv 1 sau 2 ml. din reactivul enzimatic Se agită
şi se incubează 5 min. la 30 oC, după care se pipetează în aceeaşi eprubetă 0,5 ml. de
reactiv 2. Se agită, se citesc absorbanţele la 340 sau 366 nm după 1 min (E1) şi după
2 min (E2).

Calcul
Se multiplică diferenţa E2-E1 cu un factor a cărui valoare e dependentă de
lungimea de undă la care s-a făcut determinarea.
A 340nm 366nm
Factor multiplicare F 1151 2132

Activitatea serică GPT = (E2-E1) x F U/1

Valori normale:
Bărbaţi: 6-21 U/l
Femei: 4-17U/l

Observaţii
Când se analizează seruri cu activităţi serice foarte crescute ale transamina-
zelor absorbanţa iniţială este foarte joasă deoarece o mare parte de NADH se va
consuma înainte de a realiza prima citire la 1 min . În această situaţie se va relua
tehnica folosind ser diluat 1-10 (0,1 ser la 0,9 ml ser fiziologic) iar rezultatul se va
multiplica cu 10.

7. -Glutamiltraspeptidaza

-Glutamiltraspeptidaza (GT) este o enzimă implicată în transferul unităţilor

de -glutamil de pe -glutamilpeptide pe aminoacizi sau alte peptide cu moleculă
mică.În majoritatea sistemelor biologice donorul de -glutamil este glutationul,
reacţia generală catalizată de către GT fiind următoarea:
GT
Glutation + aminoacid  glutamilpeptid + L-cisteinilglicină
Funcţiile fiziologice specifice ale GT nu sunt clar precizate. Totuşi, este
recunoscută implicarea ei în următoarele procese: sinteza proteinelor şi a peptidelor,
reglarea concentraţiilor tisulare de glutation, transportul aminoacizilor prin
membranele celulare.

Localizare
GT este localizată în ficat, căi biliare, pancreas, intestine, rinichi, prostată şi
creier.Enzima circulantă este exclusiv de origine hepato-biliară.

207
 În hepatocite şi, mai ales, în celulele care tapetează canaliculele biliare,
enzima se găseşte aproape exclusiv la nivelul membranei celulare. GT este supusă
inducţiei hepatice microzomale la fenobarbital şi alcool, fapt care sugerează şi o
localizare extramembranară a enzimei (în reticulul endoplasmic neted din celulele
parenchimului hepatic, la nivelul căruia s-a detectat dealtfel o activitate crescută de
GT în cazul subiecţilor alcoolici sau care consumatori cronici de somnifere
barbiturice ).

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Determinarea GT în ser

Principiu
GT din proba de analizat catalizează transferul unei unităţi de -glutamil de
pe -glutamil-p-nitroanilina pe glicilglicină rezultând p-nitroanilină, care este un
compus cromogen cu maxim de absorbţie la 405nm (substratul, -glutamil-p-
nitroanilina, nu absoarbe la această lungime de undă)
-Glu-p-nitroanilina + Gly-Gly  p-nitroanilina + -Glu-Gly-Gly
Reactivi:
1. reactiv de culoare (-glutamil-p-nitroanilina 3,28mmol/l)
2. solvent (tampon pH 8,1:TRIS 223mmol/l, glicilglicina 223mmol/l)

Mod de lucru
Se amestecă in raport volumic 1:1 reactivul de culoare cu solventul. Din acest
amestec se pipetează 5ml intr-o eprubeta, se aduce la temperatura de 25C (30 sau
37 C ) şi se adaugă 0,5ml ser de analizat. Se amestecă bine şi după aproximativ 1
minut se citeşte extincţia la 405 nm faţă de apă.Se repetă citirea extincţiei după exact
1,2 si 3 minute. Se calculează media variaţiei extincţiei pe minut (E/min).

Calcul
Activitate GT = E/min x F (U.I./l)
Valoarea factorului F este 1158.
Dacă E/min este mai mare de 0,25 se repetă determinarea după ce se diluează
serul cu 20ml ser fiziologic.În această situaţie se va multiplica rezultatul final cu 5
(factorul de diluţie a serului).

Valori normale
Variază în funcţie de temperatura de lucru
25 C 30C 37C
Femei 4-18 U/l 5-25 U/l 7-32 U/l
Bărbaţi 6-28 U/l 8-38 U/l 11-50 U/l

Valori patologice
208
 Activitatea GT este crescută în colestază, hepatopatii, alcoolism, pancreatită,
cancer de prostată, tratament cu fenobarbital.

Observaţii
Determinarea activităţii serice a GT este utilă pentru diferenţierea cauzelor
creşterii activităţii serice a fosfatazei alcaline (cauză hepatică sau osoasă). GT nu
există în oase, deci creşterea activităţii ei asociată cu creşterea activităţii fosfatazei
alcaline indică originea hepatică a fosfatazei alcaline.
GT constituie un marker de boală hepatobiliară la adolescenţi (la care
fosfataza alcalină este crescută fiziologic şi nu mai poate fi folosită pentru
investigarea stării ficatului).
GT este folosită pentru a diagnostica alcoolismul cronic şi în mod special
ocult. Alcoolul induce activitatea enzimatică microzomală şi consecutiv creşterea
nivelului seric al activităţii GT.Acesta revine în limite normale după 2-3 săptămâni
de la oprirea consumului de alcool.

8. Lactatdehidrogenaza

Lactatdehidrogenaza (LDH) este o enzimă citoplasmatică participantă la

glicoliza anaerobă; catalizează următoarea reacţie reversibilă.

Piruvat + NADH + H+ . Lactat + NAD+

Enzima are o structură cuaternară tetrameră alcătuită din două tipuri de

monomeri H (heart) şi M (muscle). Prin combinarea în diferite proporţii a acestora
rezultă 5 izoenzime:

Izoenzima LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5

Structura H4 H3M H2M2 HM3 M4

Izoenzimele diferă prin sensibilitatea la căldură, la diferiţi inhibitori şi prin

mobilitatea lor electroforetică.
Fracţiunile LDH1 şi LDH2 rezistă la o încălzire la 55-60OC fără o pierdere
însemnată a activităţii, pe când LDH3, LDH4 şi LDH5 se inactivează rapid, aceasta
reprezentând şi o metodă simplă de diferenţiere.
Electroforeza izoenzimelor LDH este delicată şi relativ puţin practicată; după
migrarea pe acetat de celuloză sau gel de agaroză se foloseşte la revelare fluorescentă
NADH sau cuplarea transformării NAD+NADH cu cea a unui colorant adecvat.
LDH se complexează cu imunoglobulinele şi apar benzi atipice la
electroforeză. LDH complexate cu IgA sau cu IgG migrează de obicei între LDH3 şi
LDH4, iar acest complex macromolecular nu are semnificaţii clinice patologice
specifice.

209
 Diferenţierea izoenzimelor LDH se poate efectua şi prin cromatografie pe
coloană DEAE-celuloză sau prin filtrare în gel de Sephadex, fracţiunile LDH1 şi
LDH2 adsorbindu-se selectiv pe aceste medii.
LDH1 are o afinitate particulară pentru -hidroxibutirat, mai mare decât
pentru lactat. Din acest motiv LDH1 este desemnată uneori în literatură sub
denumirea de -hidroxibutiratdehidrogenază (HBDH).

Izoenzime Origine Proporţie Creştere

LDH1 Inimă, hematii, rinichi
(cortexul renal), sistem
reticuloendotelial
LDH2 Hematii, inimă, sistem
reticuloendotelial,
rinichi, plămâni
LDH3 Pămâni, placentă, sistem
nervos, rinichi, limfocite,
splină
LDH4 Musculatură striată, ficat,
rinichi, pancreas, sistem
nervos, placentă
LDH5 Ficat, musculatură
striată, rinichi, pancreas
20-30% Infarct miocardic acut,
anemie hemolitică, anemie
megaloblastică, infarct
renal acut
20-35% La fel ca LDH1
10-25% Trombembolism
pulmonar, pneumonie în
extindere, limfocitoză,
pancreatită acută, cancer
5-10% Necroză sau inflamaţie
hepatică, leziuni ale
musculaturii striate
5-10% La fel ca LDH4

La adult LDH1, LDH2, LDH3 sunt prezente în serul normal, inimă şi absente
în ficat, LDH4 şi LDH5 sunt prezente în ficat, absente în inimă şi sub formă de
urme în ser.
Plasma nou-născuţilor sau obţinută din sângele ombilical conţine cantităţi
mari de LDH şi toate cele 5 izoenzime sunt în proporţii uniform distribuite.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

a. Determinarea activităţii LDH totale serice

Principiu. Se utilizează reacţia
Piruvat + NADH + H+  Lactat +NAD+
Viteza oxidării NADH este direct proporţională cu activitatea LDH. Dacă
determinarea se face la pH 7,5 se măsoară reacţia de transformare a piruvatului în
lactat. La pH 9 predomină transformarea lactatului în piruvat.

Reactivi
1. Soluţie I: se dizolvă 8 mg NADH în 200 ml tampon trietanolamină 50 mM EDTA
50 mM pH=7,5. Se prepară soluţie proaspătă.
210
2. Soluţia II: 4 părţi tampon etanolamină-EDTA 50 mM şi o parte soluţie piruvat 30
mM

Tehnică
Se urmăreşte realizarea următoarelor concentraţii finale: NADH 0,428 mM,
piruvat 0,860 mM, tampon trietanolamină 50 mM-EDTA 5 mM, pH=9, 25oC,
lungimea de undă 340 sau 360 nm, cuva de 1 cm. Pentru aceasta se incubează în
cuva spectrofotometrului timp de 5 mni. 0,5 ml soluţie I cu 0,1 ml ser. Se controlează
extincţia timp de 1 minut apoi se declanşează reacţia enzimatică adăugând 0,1 ml.
soluţie II. Se măsoară variaţia de extincţie 0,5-2 minute şi se calculează variaţia
extincţiei pe minut. Cunoscându-se coeficientul de extincţie molar al NADH-ului,
volumul soluţiei de analizat (0,1 ml) şi volumul amestecului final (0,7 ml) se poate
calcula activitatea în unităţi internaţionale (mU/ml).

Calcul
Pentru 340 nm.:
Activitatea LDH (UI) este dată de: E / min x 1125 M/min/l
Valori normale: 120-240 UI/l

a. Diferenţierea izoenzimelor LDH prin acţiunea temperaturii

Pe lângă determinarea LDH totale (pe ser neîncălzit) se execută o altă
determinarea, de această dată pe serul încălzit timp de 60 min la 60 oC. Valori de
peste 80% ale LDH termostabile (LDH1 + LDH2) sugerează un infarct miocardic.

9. Creatinkinaza

Creatinkinaza este o enzima implicată în metabolismul energetic, participănd la

menţinerea unui raport optim ADP/ATP în celule. În condiţiile unui exces de ATP,
creatinkinaza conduce la înmagazinarea energia legăturilor macroergice din ATP sub
formă de creatin-fosfat, iar în condiţiile unui deficit de ATP, eliberează energia
înmagazinată în creatin-fosfat pentru a sintetiza rapid ATP-ul necesar celulei (ex. fibra
musculară în contracţie). Creatinkinaza are 3 izoenzime: CK-MM, CK-MB şi CK-BB.

Caracterizarea izoenzimelor creatinkinazei

IZOENZIMA LOCALIZARE CREŞTERE

CK-MM - muşchi striaţi, miocard, creier, - distrofii musculare, infarct
tiroidă (reprezintă miocardic, tumori ale
95-100% din activitatea serică sistemului nervos central
normală)

211
 CK-MB - miocard (reprezintă 0-5% din - infarct miocardic
activitatea serică normală)
CK-BB - creier, tub digestiv, uter, - infarct cerebral, intestinal,
rinichi, plămâni (în condiţii de insuficienţă renală
sănătate nu există în ser)

Distribuţia izoenzimelor în diferite organe

Izoenzima Muşchi Miocard Creier Tub Uter Rinich Prostată

striaţi digesti i
v
CK-MM 96- 60- 0-10% 0-3% 2-20% 8-10% 3-9%
100% 78%
CK-MB 0-4% 22- - 0-2% 3-20% - 4-40%
40%
CK-BB - - 90- 95% 60- 90- 56-93%
100% 95% 92%

Dozarea creatinkinazei

Principiul dozării: Activitatea creatinkinazei serice este direct proporţională

cu viteza creşterii absorbţiei la 340nm a NADPH rezultat în urma punerii în contact
a serului cu un amestec de reacţie format din ADP, glucoză, hexokinază şi glucozo-
6-fosfat dehidrogenaza. Reacţiile care au loc în cursul dozării sunt următoarele

Creatin-fosfat + ADP 

CK
creatina + ATP

ATP + glucoză  

Hexokinaza
ADP + gluozo-6-fosfat

Glucozo 6  fosfataza
Glucozo-6-fosfat + NADP+       6-fosfo-gluconolactonă +NADPH + H+

Valorile normale: 5-40 u/l la bărbaţi şi 5-30 u/l la femei

Observaţii
1. Deşi creierul conţine cantităţi mari de CK-BB, serul nu conţine CK-BB de
origine nervoasă deoarece masa moleculară a acestei izoenzime (M = 80.000 D) nu
îi permite să treacă bariera hematoencefalică. Această izoenzimă apare totuşi în ser
când există leziuni întinse nervoase, cu lezarea barierei hematoencefalice.
Deasemenea, la valorile serice scăzute ale acestei izoenzime mai participă şi alţi
factori: t1/2 scăzut (1-5 ore), cantitatea mică de enzimă din ţesuturi, tipul metodei de
212
dozare (cele mai multe metode de dozare folosesc anticorpi anti-M care recunosc
numai izoenzimele care conţin lanţuri M (CK-MB şi CK-MM) ).
2. În caz de hemoliză in vitro apar valorile fals crescute ale creatinkinazei serice.
Hematiile lizate eliberează enzimele intracelulare: glucozo-6-fosfat dehidrogenaza
(activitatea şuntului pentozelor este relativ ridicată în hematii), hexokinaza, glucoza
şi ADP amplificând ritmul sintetizării NADPH.
3. În unele cazuri de cancer pulmonar, infarct cerebral sau insuficienţă renală
stadiul terminal pot să apară valori fals crescute ale activităţii izoenzimei CK-MB.
În cancerul pulmonar şi în infarctul cerebral se eliberează în circulaţia sangvină
cantităţi mari de CK-BB ca urmare a proceselor citolitice care au loc la nivelul masei
tumorale şi respectiv în zona infarctizată ( CK-BB este principala izoenzimă a CK
existentă în plămâni şi rinichi). Ulterior poate avea loc în ser un transfer de subunităţi
între izoenzime, conform reacţiei:

CK-BB + CK-MM  2 CK-MB

Rezultă izoenzima CK-MB „atipică” fals crescută.

213
 3. COMPUŞI MINERALI

Mineralele îndeplinesc în organism roluri esenţiale pentru menţinerea

funcţionalităţii acestuia. După cantitatea prezentă în organism se pot împărţi în
macrominerale (ex. Na, K, Ca, Mg, P, Cl) şi oligominerale (ex. Fe, Cu, Zn, Mo, Co,
Se, F, etc.).
Funcţiile elementelor minerale sunt determinate, în parte, de sarcinile lor elec-
trice, mobilitatea şi afinitatea lor faţă de diverşi liganzi biologici. Aceste considerente
funcţionale pot împărţi elementele minerale în trei grupe.
Elementele din prima grupă (Na, K) se leagă relativ slab de liganzii încărcaţi
negativ şi pot traversa mebranele celulare fără impedimente majore. Ele sunt folosite
de organism ca transportori de sarcină electrică (conduc impulsurile electrice de-a
lungul nervilor, etc.).
Cele din a doua grupă (Mg, Ca) formează complexe cu stabilitate medie cu
enzime, acizi nucleici şi alţi liganzi biologici. Ele acţionează ca „triggeri” biologici
modulând sau/şi controlând funcţia acestor molecule (Ca controlează relaxarea şi
contracţia musculară).
A treia grupă (Fe, Zn, Cu, etc.) formează complexe puternice şi sunt compo-
nente funcţionale integrale ale enzimelor.
Elementele minerale pot determina modificări patologice datorită deficienţei
sau excesului. Deficienţa poate fi determinată de aport dietar insuficient, malab-
sorbţie în bolile diareice cronice, rezecţie chirurgicală a intestinului subţire sau prin
formarea complexelor cu componenţii dietari care sunt greu absorbiţi (ex. Zn şi
fitaţi). Deficienţa poate apare şi ca urmare a pierderilor excesive prin urină, suc pan-
creatic sau alte secreţii exocrine sau prin perturbări ale balanţei metabolice produse
de interacţii antagoniste sau sinergiste dintre metale (ex. Cantităţi mari de Ca
descresc absorbţia Zn şi conduc la deficienţă; excesul de Zn determină deficienţa de
Cu). Criteriile de recunoaştere a deficienţei includ descreşterea cantităţii de metal în
sângele total, păr, ser, schimbări în activitatea metaloenzimelor, însoţite sau nu de
simptome caracteristice.
Efectele toxice sunt dependente de forma chimică şi cantitatea ingerată, calea
de pătrundere în organism, moleculele biologice de care se leagă metalul, distribuţia
tisulară, concentraţia obţinută şi nivelul excreţiei. Mecanismele toxicităţii includ in-
hibarea anumitor enzime prin legare de resturi aminoacidice esenţiale pentru funcţio-
nalitatea lor, alterarea funcţiei şi structurii acizilor nucleici, influenţe în sinteza
proteică, efecte asupra permeabilităţii membranare şi altele.

A. Macrominerale
214
 1. Sodiul

Disribuţie şi roluri în organism

Aproximativ 40% din conţinutul total al sodiului în organism se găseşte în
oase dar această fracţiune nu participă semnificativ la procesele fiziologice. Restul
sodiului este localizat principal în fluidele extracelulare.
Compoziţia electrolitică a plasmei diferă foarte puţin de cea a fluidelor inter-
stiţiale datorită efectului Gibbs-Donnan determinat de proteinele anionice plasmatice
(concentraţia cationilor este crescută iar cea a anionilor este scăzută cu câteva
procente în plasmă faţă de fluidele interstiţiale).
Din raţiuni practice compoziţia electrolitică a plasmei este considerată repre-
zentativă penru întregul compartiment extracelular.
Distribuţia asimetrică a sodiului relativă la membrana celulară este menţinută
prin cheltuirea unei mari cantităţi de energie (derivată din metabolismul celular)
necesară constant pentru a pompa sodiul împotriva gradientului electrochimic.
Principalul rol al Na+ în organism decurge din diferenţa mare între concen-
traţia intracelulară şi extracelulară a acestui cation, el răspunzând de mai mult de
90% din osmolalitatea extracelulară. Orice modificare a concentraţiei sale în unul
din sectoarele hidroosmolare ale organismului se însoţeşte de o deplasare
corespuzătoare de apă (apa traversează rapid membranele celulare pentru a disipa un
eventual gradient osmotic care ar duce la ruperea membranei celulare).
Gradientul de concentraţie al Na+ stă la baza propagării impulsului nervos, al
absorbţiei tubulare renale al unor electroliţi sau a absorbţiei intestinale a unor sub-
stanţe nutritive.
O altă funcţie a Na+ este prezenţa sa în molecula unor baze tampon care parti-
cipă la menţinerea echilibrului acido-bazic al organismului.

Metabolismul sodiului
Metabolismul sodiului şi apei sunt strâns legate între ele. Conţinutul în sodiu
al organismului depinde de balanţa dintre aportul dietar şi excreţia renală. În condiţii
fiziologice pierderile extrarenale de sodiu sunt neglijabile. Excreţia renală de sodiu
este reglată în funcţie de aportul dietar.
Sodiul este absorbit (împreună cu apă) la nivelul intestinului. În intestinul
subţire Na+ este cotransportat cu Cl- sau substanţe nutritive (glucoza), în ileonul
terminal este cotransportat cu sărurile biliare iar în colon este absorbit via canale de
Na+ şi prin mecanismele electroneurale de la nivelul intestinului subţire.
Excreţia renală de Na+ este reglată prin mecanisme multiple. Creşterea sau
scăderea concentraţiei de Na+ produce schimbări corespunzătoare ale volumului
sanguin. Receptorii localizaţi în atrii, arterele centrale şi aparatul juxtaglomerular
răspund la schimbările înregistrate în presiunea locală.
215
 Sistemul renină-angiotensină-aldosteron stimulează reabsorbţia Na+ şi a
apei.
În condiţiile unei creşteri a concentraţiei Na+ sistemul renină-angiotensină
nu mai operează şi, în plus, sunt eliberate peptide natriuretice care cresc viteza
filtrării glomerulare şi inhibă reabsorbţia Na+. Prostaglandinele şi kininele secretate
în rinichi reduc deasemenea reabsorbţia Na+.
Valori normale şi modificări patologice
Valori normale pentru natriemie sunt cuprinse între 310-350 mg% ser (139-
145 mEg/l).
O creştere a concentraţiei de Na conduce la edeme; nu este considerată în
mod obişnuit ca o boală electrolitică ci ca făcând parte din patologia unor boli ca
ciroza, sindromul nefrotic sau insuficienţa cardiacă.
Scăderile de concentraţie sunt însoţite aproape întotdeauna de depleţie de
apă. Se întâlnesc în vomismente, diaree, insuficienţe corticosuprarenale, abuz de
diuretice.
Dozarea Na
O metodă foarte folosită în laboratorul clinic a fost flamfotometria. Excitarea
în flacără a atomului de Na este urmată de emisia unei radiaţii cu lungime de undă
caracteristică a cărei intensitate este direct proporţională cu concentraţia atomilor din
probă.
În prezent mai comodă este folosirea electrozilor ion selectivi care măsoară
modificarea potenţialului în funcţie de concentraţia ionilor de Na+.
2. Potasiul
Potasiul este principalul cation intracelular. Transportul activ mediat de Na+,
K /ATP-aza din membranele celulare menţin o concentraţie celulară de 160 mmol/l,
+

de 40 de ori mai mică decât concentraţia extracelulară. Este un determinant major al

volumului celular şi al osmolalităţii organismului.
Potasiul este, în acelaşi timp, un cofactor important al proceselor metabolice.
Chiar dacă este foarte mică, concentraţia extracelulară a potasiului influenţează
procesele neuromusculare. Raportul dintre potasiul intra- şi extracelular este
determinantul major al potenţialului de membrană în ţesuturile excitabile.
Cu excepţia dezechilibrelor acido-bazice concentraţia intra- şi extracelulară
a potasiului se modifică în aceeaşi direcţie.
Raportul dintre potasiul plasmatic şi cel intracelular este influenţat de
echilibrul acido-bazic şi de hormoni. Acidoza tinde să determine eliminarea K din
celule iar alcaloza pătrunderea lui. Insulina şi catecolaminele prin receptorii
-adrenergici stimulează pătrunderea K în celule iar agoniştii -adrenergici o
împiedică.
Excreţia potasiului se face în principal prin urină şi este influenţată de
concentraţia potasiului, aldosteron şi echilibrul acido-bazic.

216
 Valorile normale pentru potasiul plasmatic sunt cuprinse între 3,5-5 mEq/l.
Dozarea potasiului în ser se face folosind aceleaşi metode ca la dozarea
sodiului (flamfotometrie şi electrozi ion selectivi).

3. Clorul

Clorul este principalul anion din lichidele extracelulare. Circulaţia şi rolul său
se corelează cu cele ale Na+.
Clorul din alimente este absorbit aproape în totalitate, mai ales în ileon.
Eliminările de Cl se fac aproape integral prin rinichi (Cl- este principalul
anion al urinii). Numai 1-2% din cantitatea ingerată se elimină prin fecale. Cantităţile
eliminate variază în raport cu necesităţile impuse de menţinerea unui bilanţ echilibrat
al Cl-.
Alături de Na+ clorul este implicat în reglarea distribuţiei apei în organism,
în menţinerea echilibrului osmotic şi reglarea echilibrului acido-bazic. Este singurul
anion care intră în eritrocite (prin schimb cu HCO3- - fenomenul de membrană
Hamburger).
Concentraţia plasmatică este în medie 96-106 mEq/l.
Hipocloremiile însoţesc variate tulburări ale echilibrului acido-bazic şi
electrolitic. Ele sunt determinate de: insuficienţe renale cronice şi acute, administrări
îndelungate de diuretice, vomă (pierderi de suc gastric).
Hipercloremiile însoţesc acidozele metabolice, hipernatremiile, boala
Addison, diabetul insipid.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ
Dozarea clorului în ser
Principiu: ionii de Cl- sunt titraţi cu Hg(NO3)2 în prezenţa difenilcarbazonei.
2Cl- + Hg(NO3)2 -> HgCl2 + 2NO3-
Excesul de mercur va reacţiona cu difenilcarbazona formând un compus violet.
Mod de lucru
În două pahare Erlenmeyer (P şi S) se pipetează:
P S
Apă distilată 5 ml 5 ml
Standard KCl 0,1 N - 0,5 ml
Ser 0,5 ml
Difenilcarbazonă 10 picături 10 picături
Se titrează cu HgNO3 0,01 N până la virajul culorii soluţiei în violet şi se
notează volumele folosite cu Vp şi Vs.

Calcul:
217
 mg Cl % = [(Vp x 3,55) / Vs] x 100

4. Calciul

Distributie şi roluri în organism

Un organism adult normal conţine 1-2 kg de calciu, din care mai mult de
98% se găseşte în oase. Calciul mineral osos aflat la suprafaţă este în echilibru cu
fluidul extracelular, dar numai o mică fracţie (0,5%) este interschimbabil.
Calciul plasmatic, remarcabil constant în condiţii fiziologice (8,8-10,4
mg%) este compus din trei fracţii:
 calciul ionic liber (4,8 mg%) - fracţia activă biologic;
 calciul legat de proteine (în special de albumină);
 calciul complexat, în special cu acizi organici (difuzabil).
Calciul ionic liber este supus unui riguros control hormonal şi influenţează
multe funcţii celulare.
În interiorul celulelor concentraţia calciului liber este foarte mică (0,1
mmol/l), gradientul între concentraţia plasmatică şi cea intracelulară fiind de10000:1
Organitele celulare responsabile de depozitarea unor mici fracţiuni mobilizabile de
calciu sunt mitocondria şi reticulul endoplasmatic.
În afara unui rol structural (scheletul osos) calciul reglează procese
biochimice importante. Acestea includ excitabilitatea neuromusculară, coagularea,
procese secretorii, integritatea membranară şi transportul membranar, modularea
activităţii unor enzime, secreţia unor hormoni şi neurotransmiţători, acţiunea
intracelulară a unor hormoni.
Metabolismul calciului şi reglarea lui
Cea mai mare parte a calciului este absorbită la nivelul intestinului subţire.
Este implicat atât un transport activ cât şi o difuzie limitată. Amândouă procesele
sunt influenţate de vitamina D prin metaboliţii săi.
Calciul plasmatic provine din absorbţia la nivel intestinal cât şi din resorbţia
osului. Formarea şi resorbtia osului sunt strâns echilibrate, în condiţii fiziologice
normale cantităţile de calciu eliberate şi preluate de os fiind perfect egale.
Calciul plasmatic poate fi secretat în tractul gastrointestinal şi eliminat prin
fecale, excretat prin urină sau pierdut prin transpiraţie.
Cantitatea de calciu endogen eliminată prin fecale zilnic este constantă şi nu
variază în funcţie de calciul ingerat sau absorbit. Cantitatea de calciu eliminată prin
urină este reglată hormonal (la nivelul reabsorbţiei) şi depinde de cantitatea de calciu
absorbită intestinal.
Calcemia este reglată riguros prin parathormon şi calcitriol. Un alt hormon
implicat în reglarea metabolismului calciului este calcitonina.
Parathormonul, sintetizat de glanda paratiroidă, este un hormon peptidic (hi-
drosolubil) şi are ca mesager secund AMPc. El influenţează metabolismul calciului

218
(şi al fosforului) la nivel renal, osos şi, indirect, la nivel intestinal. Acţiunile para-
thormonului sunt:
 la nivel renal stimularea reabsorbţiei calciului şi eliminarea fosfaţilor;
 la nivel osos stimularea resorbţiei osului, deci eliberarea calciului şi fosfaţilor;
 prin acţiunea sa în formarea calcitriolului se poate spune că, indirect, stimulează
absorbţia intestinală a calciului.
Calcitriolul (1,25(OH)2-D3) este sintetizat din vitamina D3 sub acţiunea
hidroxilazelor hepatice şi renale.
D3
ficat 25-hidroxilaza
25(OH)D3
rinichi 1--hidroxilaza
1,25(OH)2D3 (calcitriol)

1--hidroxilaza renală este stimulată de parathormon.

Calcitriolul este un hormon steroid care acţionează la nivel intestinal, renal
şi osos. Acţiunile calcitriolului sunt:
 la nivelul intestinului stimulează absorbţia calciului şi fosfaţilor;
 la nivel ţesutului osos stimulează resorbţia osului (acţiune sinergică cu a
parathormonului);
 la nivel renal stimulează reabsorbţia calciului şi fosfaţilor.
Calcitonina, hormon peptidic, spre deosebire de parathormon şi calcitriol,
are acţiune hipocalcemiantă. Absenţa calcitoninei (ex. extirparea tiroidei) nu
produce modificări în metabolismul calciului şi fosfatului la oameni.

Valori normale şi modificari patologice

Calcemia este cuprinsă între 8,8-10,4 mg% (2,2-2,6 mmol/l)
Hipocalcemiile se pot întâlni în hipoparatiroidism sau deficienţa de vitamina
D. Simptomele hipoparatiroidismului includ iritabilitate neuromusculară care
determină crampe musculare şi tetanie. Deficienţa severă rezultă în paralizia tetanică
a musculaturii respiratorii, laringospasm, convulsii severe şi moarte.
Hipovitaminoza D conduce le rahitism la copii şi osteomalacie la adulţi.
Hipercalcemia este întâlnită în hiperparatirodismul primar (adenom paratiroi-
dian, hiperplazia glandei sau secreţia ectopică a hormonului) sau secundar (deobicei o
consecinţă a insuficienţei renale care conduce la imposibilitatea sintezei calcitriolului,
deci la absorbţia intestinală scăzută a calciului şi fosfaţilor care va determina
stimularea secreţiei de parathormon).
ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

a. Dozarea calciului prin metoda volumetrică (complexometrică)

Principiul metodei: ionii de calciu reacţionează iniţial cu un indicator
complexometric denumit murexid cu care formează o combinaţie complexă de culoare
roşie purpurie. Prin titrare în mediu alcalin cu o soluţie de EDTA (sarea de sodiu a
219
acidului etilendiaminotetraacetic) murexidul este decomplexat iar ionii de calciu
formează complexul Ca-EDTA care este incolor (stabilitatea complexului Ca-EDTA
este mai mare decât a complexului Ca-murexid). Sfârşitul reacţiei este indicat prin
virarea culorii de la roşu purpuriu (complex Ca-murexid) la violet (culoarea
murexidului liber).
Ca2+ + M  Ca - M (roşu purpuriu)
Ca - M + EDTA  Ca - EDTA (incolor) + M (violet)

Modul de lucru
În două pahare Erlenmayer martor (M) şi probă (P) se introduc:
M P
ser - 2 ml
apă bidistilată 52 ml 50 ml
NaOH 9 M 0,4 ml 0,4 ml
murexid 1 picătură 1 picătură
Se titrează cu EDTA 0,01 M până la virajul soluţiei de la roz la violet şi se
notează cu Vm şi Vp volumele folosite.
Calcul: mg Ca% = (Vp - Vm) x 0,2 x 50

b. Dozarea calciului prin metoda spectrofotometrică

Principiu: în mediu alcalin ionii de calciu formează un complex violet cu o-
crezolftaleina cu absorbţie la 570 nm.
Mod de lucru
În trei eprubete P (probă), S (standard), B (blank) se pipetează:

P S B
ser 2,5 ml - -
standard 10 mg% - 2,5 ml -
apă - - 2,5 ml
reactiv de culoare 1 ml 1 ml 1 ml

Reactivul de culoare se prepară amestecând înainte de efectuarea determinării

volume egale de tampon 1-amino-2 metil-2-propanol 3,5 M şi soluţie cromoforă care
conţine 150 mmol/l o-crezolftaleină 6,7 mmol/l 8-hidroxi-chinoleină şi 25 mmol/l
acid clorhidric. Dupa 25 minute se citeşte absorbţia la 570 nm.
Calcul: mg Ca% = (Ep/Es) x 10
Calciul ionic
Metoda directă de determinare a calciului ionic plasmatic este electrodul ion
selectiv.
În absenţa acestuia valoarea concentraţiei calciului ionic plasmatic se poate
aproxima cunoscând concentraţia proteinelor plasmatice şi stiind că aproximativ
50% din calciu este legat de proteine.

220
 % Ca legat de proteine = 0,8 x concentraţia albuminei (g/l) + 0,2 x
concentraţia globulinelor (g/l) + 3
O corecţie simplificată este uneori folosită pentru a indica dacă calcemia este
normală în cazul în care proteinemia este scăzută. Corecţia constă în adăugarea a 1
mg/dl la calciul plasmatic pentru fiecare g/dl cu care albumina serică este sub 4 g/dl.

5. Fosforul

Fosforul este un component major al osului şi al tuturor celorlalte ţesuturi şi,

într-o anumită măsură, se poate spune că este implicat în toate procesele metabolice.
Cantitatea totală de fosfor dintr-un organism adult este de aproximativ 1 kg din care
aproximativ 85% se găseşte în oase. Rolul funcţional al fosforului este legat de
prezenţa sa în proteine, glucide, lipide şi acizi nucleici. Compuşii bogaţi în fosfor
joacă un rol important în producerea, înmagazinarea şi eliberarea de energie (AMP,
ADP, ATP). Un alt rol al fosfaţilor este participarea lor în echilibrul acido-bazic al
organismului. În plasmă cea mai mare parte a fosforului se găseşte sub formă de
fosfat anorganic în concentraţii cuprinse între 2,8-4 mg% (0,9-1,3 mmol/l). Numai
12% din fosforul plasmatic este legat de proteine. NaHPO4- şi HPO42- sunt
aproximativ 75% iar H2PO4- este aproximativ 10% din fosforul total. Speciile
prezente şi concentraţia lor depind de pH şi alţi factori şi prin convenţie fosfatemia
se exprimă în mgP%.
Fosfatemia este reglată de aceiaşi hormoni care reglează şi metabolismul
calciului: parathormonul, calcitonina şi calcitriolul.
Valori normale şi modificări patologice
Fosfatemia este cuprinsă între 2,8-4 mg% (0,9-1,3 mmol/l).
Ea este crescută la copii şi femei după menopauză. Nu există simptome directe
asociate cu hiper-fosfatemia. Când nivelurile crescute sunt menţinute o perioadă mai
îndelungată pot apare depuneri ectopice de fosfat calcic. Depunerile ectopice de
acest fel pot fi întâlnite în insuficienţa renală (cu hipercalcemie severă) şi în
intoxicaţiile cu vit. D. Hipofosfatemia conduce la rahitism la copii şi osteomalacie
la adulţi. Hipofosfatemia determină niveluri scăzute de 2,3 DPG şi ATP în eritrocite
care alterează disocierea oxihemoglobinei şi în consecinţă poate apare o hipoxie
tisulară. Anemia hemolitică se produce datorită scăderii elasticităţii hematiilor.
Deficitul grav de fosfaţi se manifestă clinic prin parestezii, hiperreflexie, stare de
slăbiciune şi hiperventilaţie.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Dozarea fosfaţilor în ser

Principiul metodei: ionii fosfat reacţionează în mediu alcalin şi în prezenţa
unui reducător cu molibdatul de amoniu formând un complex de culoare albastră.
Mod de lucru: în trei eprubete se pipetează:

221
 proba sandard martor
soluţie reducătoare (hidroxil 1 ml 1 ml 1 ml
amină 0,3 M în H2SO4)
apă distilată 2 ml 2 ml 2,1 ml
molibdat de amoniu 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Ser 0,1 ml - -
standard 4 mgP% - 0,1 ml -
Se lasă în repaus 2 minute şi apoi se adaugă în fiecare eprubetă 0,5 ml NaOH
4m. După 5 minute se citesc extincţiile Ep, Es, Em la 700 nm faţă de apă distilată.
Calcul: mgP% = [(Ep - Em)/(Es - Em)] x 4

6. Magneziul

Majoritatea conţinutului în magneziu al organismului (~70%) se găseşte în

oase, 1% este în fluidele extracelulare iar restul (~30%) este intracelular.
În plasmă 60-70% din magneziu este liber (difuzabil) iar restul se găseşte
legat de proteine, în special de albumină.
Magneziul este cel mai abundent cation divalent intracelular. În celulă, o
parte a magneziului este liberă şi este în echilibru cu partea legată, în special de ATP.
Modificările concentraţiei magneziului intracelular pot determina modificări ale
ATP şi invers. Magneziul activează numeroase enzime şi este important pentru toate
procesele metabolice.
Magneziul are roluri şi în permeabilitatea membranei (în special a celei
mitocondriale) ca şi în excitabilitatea neuromusculară.
În ceea ce priveste excitabilitatea neuromusculară relaţia dintre Ca şi Mg
determina efecte sinergice (când ambele concentraţii se modifică în acelaşi sens) sau
antagonice (când unul dintre elemente creşte iar celălalt scade).
Intracelular Mg prezinta relaţii funcţionale cu potasiul şi fosforul. Depleţia
intracelulară a unuia dintre cele trei elemente conduce, în general, şi la depleţia
celorlalte (expulzarea celorlalte ajută celula în menţinerea unei compoziţii
procentuale normale). Răspunsul somatic la depleţia unui element intracelular major
este atrofia celulară, o balanţă azotată negativă, anorexie şi pierderea netă a celorlalte
două elemente majore.
Absorbţia magneziului se face în jejun şi ileon şi este redusă în avitaminoza
D.
Excreţia se face predominant prin urină.

Valori normale şi modificări patologice

Magnezemia este cuprinsă între 2-3 mg% (0,8-1,2 mmol/l), din care
aproximativ 1,4 mg% (0,6 mmol/l) este fracţiunea nelegată, difuzabilă.
Depleţia magneziului (ca şi a celorlalte elemente intracelulare majore) poate
există chiar dacă valorile serice sunt normale. Definirea unui deficit se face
considerând raportul element mineral/azot din ţesuturi. Cum acesta este în general
222
dificil de obţinut, determinările serice rămân singurele care pot detecta hipo sau
hipermagnezemia.
Simptomele caracteristice ale deficienţei de magneziu sunt paresteziile,
crampele musculare, iritabilitate şi confuzie mentală. Deficienţa de magneziu este
însoţită de hipocalcemie şi aproape jumătate din pacienţii hipomagnezici sunt şi
hipokalemici. Când deficienţa de magneziu se asociază cu deficienţă de K apar
aritmii cardiace, tulburări de conducere, fibrilaţie ventriculara şi, în ultimă instanţă
chiar stop cardiac.
Hipomagnezemia poate fi determinată de tulburări gastrointestinale
(malabsorbţie, steatoree), dereglări endocrine (hiperaldosteronism, hipo şi
hiperparatirodism, hipertiroidism, cetoacidoză diabetică, dereglări ale secreţiei de
vasopresina), alcoolism, creşteri ale excreţiei renale datorită împiedicării
reabsorbţiei tubulare (diuretice).
Hipermagnezemia se întâlneşte mai rar clinic. Ea este frecventă în faza
terminală a afecţiunilor renale.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Dozarea Mg în ser
Principiul metodei: în mediu alcalin ionii de Mg din ser reacţionează cu
colorantul galben de titan cu care formează un complex roşu-portocaliu stabilizat cu
alcool polivinilic.

Mod de lucru
Într-o eprubetă se introduc 2 ml ser şi 2 ml soluţie acid triclor acetic. Se agită
şi după 10 min se centrifughează la 3 000 rotaţii/min. După centrifugare se pipetează.
P S B
supernatant ser 2 ml - -
soluţie standard Mg 2 mg% - 2 ml -
Apă - - 2 ml
stabilizator 1 ml 1 ml 1 ml
galben de titan 0,05% 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
NaOH 4N 1 ml 1 ml 1 ml
După 30 min se citesc extincţiile la 560 nm.

B. Oligoelemente

1. Fierul

Fierul este implicat într-un spectru larg de procese biochimice, fiind esenţial
pentru viaţă. Un organism adult conţine 4-5 g de fier din care aproximativ 70% se
găseşte legat de porfirine, 20-29 % în feritină şi hemosiderină (forme în care este
stocat fierul intracelular), iar restul (mai puţin de 1%) în circulaţie (figura VI.3.1).
223
 Figura. VI.3.1. Distribuţia fierului în organism

Absorbţia fierului
Absorbţia fierului se face predominant în duoden şi jejun.
În alimente majoritatea fierului se găseşte sub formă de Fe3+. Fierul din
proteinele din carne este mult mai uşor absorbit decât din celelalte alimente deoarece
hemul din mioglobină şi hemoglobină este transferat pasiv în enterocit unde este
eliberat de către hem-oxigenază. Transportul Fe2+ din enterocit în sânge este realizat
de un transportor transmembranar de Fe2+ care acţionează concertat cu o feroxidază
ce conţine Cu2+. Fierul din alte alimente este, de obicei, complexat (de fitaţi sau alţi
liganzi) şi mult mai greu de absorbit. Pentru a putea fi absorbit fierul neheminic este
eliberat din complexele alimentare, în stomac, de către HCl, urmând ca în intestin să
fie redus la Fe2+. Această reducere este favorizată în intestin de vitamina C şi de către
o reductază membranară omoloagă cu cit b 561. Rezecţia stomacului va descreşte
absorbţia fierului deoarece descreşte cantitatea de acid clorhidric.
Fierul absorbit poate fi depozitat în formă de feritină (Fe3+-apoferitină) în
celulele intestinale sau transportat spre ţesuturi de către transferină în condiţii
normale. În general, când necesarul de fier al organismului este scăzut fierul proaspăt
absorbit este depozitat sub formă de feritină în celulele intestinale şi va fi eliminat
odată cu ele când acestea vor fi exfoliate.

Transport şi depozitare
Aşa cum reiese din figura VI.3.2 transportul fierului de la mucoasa intestinală spre
organele de depozit şi spre organele producătoare de hemoproteine se face cu ajutorul
224
transferinei. Transferina (β-globulină) este o glicoproteină care în mod normal poate lega
doi atomi de Fe3+ pe moleculă. Fierul legat de transferină este captat mult mai rapid de
către elementele seriei eritrocitare din măduvă decât de alte celule din organism. Acest
mod de transport asigură dirijarea preferenţială a fierului către celulele producătoare de
Hb şi împiedică difuzarea anarhică a atomilor de fier în ţesuturi.
De altfel, fierul liber, nefixat de transferină este toxic. În condiţii fiziologice
numai 20-45% din capacitatea totală de legare a fierului (CTL) este folosită.

Figura VI.3.2. Circuitul fierului în organism

Celulele au pe suprafaţa lor receptori pentru transferină. Legarea transferinei
de receptor este urmată de internalizarea complexului ligand-receptor. pH-ul acid al
lizozomului favorizează eliberarea fierului. Apotransferina legată de receptor va fi
eliberată apoi în plasmă unde complexul receptor-proteină va fi disociat.
Hematiile, după 120 zile, sunt captate de către celulele specializate din
sistemul reticulo-endotelial (în special în splină) şi degradate. Prin scindarea hemului
se formează bilirubină şi Fe2+. O parte din hematiile îmbătrânite se lizează în capilare
eliberând hemoglobina, care este preluată de haptoglobine, o familie de proteine
plasmatice care leagă hemoglobina sau hemul liber. În interiorul celulei fierul este
depozitat sub formă de feritină şi hemosiderină. Fierul stimulează sinteza

225
apoferitinei. În timp feritina este digerată de lizozom şi catabolizată la hemosiderină,
un amestec nespecific de proteine parţial degradate, lipide şi fier.
Atât feritina cât şi hemosiderina se găsesc în cantităţi mari în macrofagele
hepatice, splină şi măduvă osoasă. Feritina este prezentă de asemenea în celulele
intestinale şi în plasmă. Deoarece feritina plasmatică este în echilibru cu feritina din
sistemul reticuloendotelial, nivelul feritinei plasmatice poate fi folosit pentru
estimarea fierului stocat în organism.

Eliminarea fierului din organism

Datorită reutilizării fierului se formează un circuit intern al acestuia, elimi-
nările în condiţii fiziologice fiind reduse (figura nr. 2). Cantităţi mici de fier se pierd
prin exfolierea celulelor intestinale şi urme de fier sunt excretate prin bilă şi urină.
Reglarea balanţei fierului se face la nivelul absorbţiei deoarece capacitatea de
eliminare a fierului este limitată. Reglarea absorbţiei se face prin cantitatea de fier
depozitată (în special în celulele intestinale) şi prin viteza eritropoiezei. Creşterea
eritropoiezei este asociată cu o creştere a numărului de receptori pentru transferină de
pe celulele eritroide, iar această creştere în mod direct influenţează absorbţia fierului.

Valori normale şi modificări patologice

Sideremia este cuprinsă între 70-120 g% (9-31 moli/l). De cele mai ulte
ori când sunt suspectate modificări ale metabolismului fierului pe lângă sideremie
sunt determinate şi transferina (200-400 mg/dl), CTLFe (250-410 g%), saturaţia
transferinei = raportul siderimie/CTL Fe (20-45%), feritina serică (20-300 ng/ml).
Sideremia scade în anemii feriprive, malabsorbţie, pierderi de fier determinate de
eliminarea crescută a fierului (fiziologică-menstruaţie şi sarcină - sau nefiziologică -
cel mai des la nivelul tractului gastrointestinal: ulcer peptic, gastrite,
adenocarcinomul colonului, cancer gastric). Rezultatele obţinute în laborator depind
de momentul în care se fac analizele, deficienţa de fier progresând în trepte. Iniţial
este consumat fierul din rezerve şi se găseşte o valoare scăzută a feritinei. În etapa a
doua, când rezervele sunt epuizate, CTL Fe a transferinei creşte dar saturaţia ei scade.
Eritrocitele circulante devin microcitare şi hipocromice.
Creşterea concentraţiei de fier în organism este urmată de o creştere a
sideremiei, feritinei şi o scădere a CTLFe.
Supraîncărcarea cu fier se întâlneşte în hemosideroze sau hemocromatoze.
Creşterea concentraţiei fierului în organele de depozit poate conduce la insuficienţă
cardiacă, ciroze, diabet, pigmentarea pielii.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Dozarea Fe
Principiu: fierul este eliberat din transferină în tampon acetat la pH = 4,8 şi
redus la Fe2+ de acidul ascorbic. Fe2+ reacţionează cu 3-(2-piridil)-5,6-bis [2(5-acid
furilsulfonic)]-1,2,4 triazina - Feren.S rezultând un complex albastru cu =593 nm.
226
 Mod de lucru
Blanc Blanc Standard Probă
reactivi probă
Apa distilată 0,2 ml - - -
Ser - 0,2 ml - 0,2 ml
Standard (100 μg %) - - 0,2 ml -
Soluţie 1 - 1 ml - -
Soluţie 2 1 ml 1 ml 1 ml

Soluţia 1 conţine acid ascorbic 10 mM şi tiouree 66 mM în tampon acetat 1,4 M pH

4,8. Soluţia 2 conţine 4,4 mM Feren S dizolvat în soluţia 1.
Cele 4 eprubete se agită şi se lasă la temperatura camerei 5 minute. Se citeşte
absorbţia pentru eprubeta blanc probă (EPB) faţă de apa distilată şi absorbanţa probei
(EP) şi a standardului (ES) faţă de blancul reactivilor.
Calcul: % mg Fe = [(EP - EPB) / ES] x 100

2. Cuprul

Conţinutul total al cuprului în organism este de aproximativ 100-150 mg.

Cuprul se depozitează în ficat, rinichi, inimă şi creier. În plasmă 90% din cupru se
găseşte în ceruloplasmină şi 10% în albumină. 60% din cuprul eritrocitelor este
încorporat în SOD (superoxidismutaza). În organism rolul cuprului este de a fi
centrul activ al multor oxidoreductaze: CuZn SOD, lizil oxidaza, citocrom c oxidaza,
ceruloplasmina, tirozinaza, dopamin-hidroxilaza, etc.

Metabolismul cuprului
Absorbţia cuprului se face la nivelul stomacului şi al intestinului subţire.
Absorbţia intestinală este un proces mediat de un transportor saturabil. Zincul şi
cadmiul inhibă absorbţia intestinală a cuprului. În plasmă, ceruloplasmina este
proteina cu cel mai ridicat conţinut în cupru. Fiecare moleculă de ceruloplasmină
leagă 6 atomi de cupru. Restul cuprului plasmatic este legat de albumină sau
complexat de histidină. Cuprul care intră în celule provine majoritar din cel legat de
albumină sau histidină dar poate proveni şi din ceruloplasmină. Este important de
specificat că spre deosebire de transferină, ceruloplasmina nu pătrunde în celule
pentru a elibera cuprul. Calea principală de excreţie a cuprului din organism este
bila. Excreţia urinară a cuprului este neglijabilă în condiţii normale.

Valori normale şi modificări patologice

Cuprul plasmatic este cuprins între 100-200 μg% (16-31 μmol/l),
ceruloplasmina 25-43 mg% (1,7-2,9 μmol/l).

227
 Creşteri ale concentraţiei cuprului plasmatic se întâlnesc în infarctul
miocardic acut, leucemii, infecţii, ciroze hepatice, hemocromatoza. Consecinţele
creşterii sunt necunoscute.
Scăderile apar în sindromul nefrotic şi boala Wilson. Boala Wilson
(degenerarea hepatolenticulară) este o boală autozomal recesivă caracterizată de
acumularea cuprului. Expresia biochimică a bolii este o reducere a sintezei de
ceruloplasmină, acumularea iniţială a Cu în ficat şi diminuarea excreţiei biliare. În
timp se dezvoltă anemie hemolitică şi sindroame neurologice datorită acumulării
cuprului în creier. Un sindrom clinic frecvent întâlnit este inelul Keyser-Fleisher
(inel verde în jurul corneei datorat depunerii de cupru).

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Metoda de determinare a Cu seric

Cuprul eliberat din proteine prin denaturarea acestora cu guanidină
hidroclorică, formează un complex colorat cu 2,9-dimetil-4,7-difenil-1,10
fenantrolina disulfonată care absoarbe la 485 nm.

Mod de lucru
P S B
ser 0,2 ml - -
standard Cu (1 mg %) - 0,2 ml -
apă - - 0,2 ml
soluţie guanidină cu acid ascorbic 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
reactiv de culoare în TRIS 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

După 5 minute se citeşte absorbţia la 485 nm.

Calcul: % mg Cu = EP / ES x 1

3. Zincul

Zincul este cofactor pentru un număr mare de enzime implicate în aproape

toate căile metabolice, este component al factorilor de transcriere (zinc „fingers”),
este implicat în neurotransmitere şi în activitatea unor hormoni (insulina).
Absorbţia zincului se face în intestinul subţire şi este diminuată de fibre,
fitaţi, fosfaţi, Ca şi Cu şi crescută în prezenţa aminoacizilor şi peptidelor. Excreţia
zincului se face principal prin secreţiile pancreatice şi intestinale. Aproape 99% din
Zn total al organismului se găseşte în celule, restul fiind în plasmă şi în fluidele
extracelulare. Aproximativ 4/5 din Zn circulant se găseşte în eritrocite. Din Zn seric
aproximativ 70% este legat de albumină restul de 2macroglobulină şi de
aminoacizi.
Valori normale şi modificări patologice

228
 Zincul seric este cuprins între 50-150 μg%. Concentraţii mai mici de 8
μmol/l indică deficienţa de Zn. Nivelurile limită trebuie interpretate luând în
considerare concentraţia albuminei serice şi a unei proteine de fază acută (ex.
Proteina C-reactivă). În răspunsul de fază acută nivelurile transferinei,
ceruloplasminei şi albuminei se modifică şi în acelaşi timp apare o redistribuire între
plasmă şi ţesuturi a oligoelementelor ducând la scăderea concentraţiei lor plasmatice.
Nivelurile Zn seric descresc când cantitatea ingerată sau absorbită este
scăzută (enterite) sau când pierderile urinare sunt excesive (sindromul nefrotic,
ciroza hepatică sau alte condiţii care conduc la hipoalbunemie: stările catabolice din
şocuri, arsuri, intervenţii chirurgicale sau anemiile hemolitice şi cu eritrocite în
formă de seceră). În deficienţe de Zn ţesuturile care au un „turnover” ridicat sunt
primele afectate: pielea, celulele mucoasei gastrointestinale, condrocitele şi
timocitele). Manifestările dermatologice (hipercheratinizarea, acrodermatita şi
alopecia) pot fi o consecinţă a deficitului de Zn. Defectele imunologice ale
limfocitelor T sunt tipice.
Creşteri ale concentraţiei de Zn se constată în urma inhalării vaporilor cu Zn,
administrării orale sau intravenoase (deseori întâlnită la pacienţii hemodializaţi).
Excesul de Zn poate determina febră, leucocitoză, salivare excesivă, dureri de cap şi
tulburări ale sistemului nervos central.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Dozarea Zn în ser
Zn prezent în probă formează un complex colorat cu 5-Br-PAPS (2-(5-bromo-
2-piridilazo)-5-(N-propil-N-sulfopropilamino)-fenol) din reactiv complex care
absoarbe la 560 nm.

Mod de lucru:
P S B
Ser 0,5 ml - -
Standard Zn (200 g %) - 0,5 ml -
Apă - - 0,5 ml
Deproteinizant 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

Se centrifughează 10 min la 10 000 turaţii şi apoi se pipetează:

P S B
Supernatant 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Reactiv de culoare 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml

229
 Se incubează 5 min la 25oC şi apoi se măsoară extincţia standard a probei faţă
de blancul reactivilor la 560 nm.
Calcul: Zn μg% = [(EP - EB) / (ES - EB)] x concentraţia standardului

230
 4. COMPUŞI GLUCIDICI

1. REGLAREA GLICEMIEI

Menţinerea glicemiei în limite normale (65-110 mg/dl) este rezultatul acţiunii

convergente a unor factori metabolici şi hormonali. Principalii hormoni cu rol în
reglarea glicemiei sunt:
- insulina cu rol hipoglicemiant
- glucagonul, adrenalina, cortizolul şi somatotroplul cu rol hiperglicemiant
Insulina favorizează toate căile de utilizare a glucozei în muşchi, ficat, ţesut
adipos prin stimularea glicolizei, glicogenogenezei şi inhibarea gluconeogenezei
hepatice.
Glucagonul are acţiuni metabolice opuse insulinei, stimulând glicogenoliza şi
gluconeogeneza în ficat şi ţesutul adipos.
Adrenalina:
- prin intermediul receptorilor β2 de la nivelul musculaturii scheletice
stimulează glicogenoliza
- la nivel hepatic stimulează glicogenoliza şi gluconeogeneza furnizând
glucoză ţesurilor extrahepatice (în special creierului)
- la nivelul ţesutului adipos, prin intermediul receptorilor β1 stimulează
lipoliza cu eliberare de glicerol utilizat în gluconeogeneză
- prin intermediul receptorilor α2 pancreatici inhibă secreţia de insulină
Cortizolul stimulează la nivel hepatic gluconeogeneza prin aport crescut de
aminoacizi din muşchi şi de glicerol din ţesutul adipos, precum şi prin inducţia unor
enzime gluconeogenetice. Glucoza este parţial depozitată ca glicogen, parţial trece
în sânge. Efluxul glucozei are un efect hiperglicemiant fiind corelat şi cu o captare
redusă a glucozei în muşchi şi ţesut adipos.
Hormonul de creştere scade utilizarea periferică a glucozei, inhibă glicoliza şi
stimulează gluconeogeneza hepatică.
În condiţiile absenţei aportului exogen glucidic, menţinerea glicemiei este
asigurată prin:
- glicogenoliză (care se intensifică după câteva ore de post alimentar, dar
glicogenul hepatic se epuizează în circa 15 ore)
- gluconeogeneză (care este intensificată odată cu epuizarea rezervelor de
glicogen)
2. Modificări patologice ale glicemiei
Hiperglicemie (glicemie > 120 mg/dl )
Poate apare:
- asociată hipersecreţiei de glucocorticoizi, catecolamine sau hormoni
tiroidieni
- în timpul sarcinii
231
 - secundar administrării unor medicamente: cortizonice, unele diuretice,
glucoza concentrată
Clinic, hiperglicemia se asociază diabetului zaharat.
Diabetul zaharat este de două tipuri:
 IDDM = insulin dependent diabetes mellitus
 NIDDM = non-insulin dependent diabetes mellitus
Hipoglicemie (glicemie < 50 mg/dl asociată cu manifestări clinice)
Poate fi asociată:
- tumorilor hipersecretante de insulină (insulinom pancreatic)
- secundar administrării unor medicamente: insulină, antidiabetice orale,
alcool, salicilaţi

3. Investigarea parametrilor metabolismului glucidic

a) Glicemie a jeune
Glicemia se dozează din sângele recoltat dimineaţa, după aproximativ 12 ore
de post alimentar; pentru a preveni glicoliza în sângele recoltat se recomandă
folosirea ca anticoagulant a florurii de sodiu (0,1 g/ml sânge)
Valorile normale ale glicemiei sunt cuprinse între 65 şi 110 mg/dl. Obţinerea
unor valori mai mari de 120 mg/dl necesită efectuarea unor test suplimentare.
b) Test de toleranţă la glucoză
Se dozează glicemia a jeune, apoi se administrează 75 g glucoză dizolvată
în 300 ml apă şi se determină glicemia din 30 în 30 de minute pe timp de 2 ore.
Valori normale: glicemia a jeune şi glicemia la 2 ore sub 120 mg/dl, iar celelelalte
valori ale glicemiei pe parcursul testului să nu depaşească 200 mg/dl.
c) Hemoglobina glicozilată
Glucidele pot reacţiona cu grupări amino din hemoglobină, formând
hemoglobine glicozilate. Forma majoritară este HbA1c rezultată în reacţia dintre
gruparea carbonil şi gruparea amino a valinei terminale din lanţurile . Reacţia este
ireversibilă, decurge neenzimatic şi având în vedere durata de viaţă medie a
hematiilor, valoarea HbA1c reflectă glicemia medie a pacientului pe o perioadă de
4-6 săptamâni. Este influenţată de turnover-ul eritrocitelor şi de existenţa unor
hemoglobine patologice.
Valoare normală: 5-6 % din Hb totală.
d) Fructozamina serică
Este o investigaţie mult mai simplă şi ieftină decât determinarea hemo-
globinei glicozilate; este influenţată de turnoverul albuminei. Se dozează atât
fructozamina, cât şi raportul fructozamină/albumină.
Valori normale: fructozamina = 2,4-3,4 mmol/l,
fructozamină/albumină = 54-86 mol/g
Alţi parametrii care pot aduce informaţii asupra metabolismului glucidic sunt
insulina, pH-ul sanguin, ureea, creatinina. La aceştia se adaugă dozarea peptidului C
seric, care se formează în cursul transformării proinsulinei în insulină şi se foloseşte
232
pentru estimarea concentraţiei insulinei în cazul prezenţei anticorpilor anti-insulină,
precum şi dozările urinare de glucoză, albumină, corpi cetonici.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

a) Dozarea glucozei în ser prin metoda colorimetrică cu orto-toluidină

Principiu: În mediu acid şi la cald, gruparea carbonil a glucozei reacţionează
cu gruparea amino a orto-toluidinei, rezultând o bază Schiff care are maximul de
absorbţie la λ = 630nm:

Reactivi:
1. Acid tricloracetic 3%
2. Reactiv orto-toluidină (1,5g tiouree, 60ml orto-toluidină se dizolvă în 1000ml acid
acetic glacial)
3. Soluţie standard de glucoză 10mg/100ml (se dizolvă 10mg glucoză pură, anhidră
în 100ml soluţie saturată de acid benzoic)

Modul de lucru
Într-o eprubetă de centrifugă se pipetează 0,1 ml sânge şi 1,9 ml acid
tricloracetic; se agită, apoi se centrifughează 5 minute la 3000 turaţii/minut. Se
pregătesc trei eprubete: P(proba), M(martor), B(blank) în care se pipetează:
P S B
Supernatant 1 ml - -
Soluţie standard glucoză - 1 ml -
Apă distilată - - 1 ml
Reactiv o-toluidină 5 ml 5 ml 5 ml
Eprubetele se ţin în baia de apă la fierbere 10 minute, apoi se răcesc la jet de
apă rece. Se citesc extincţiile probei şi standardului faţă de blanc la λ=630nm.

Calcul:
mg glucoză/100ml sânge = EP/Es x 200

b. Dozarea glucozei în ser prin metoda enzimatică cu hexokinază

233
 Principiu:
Se determină cantitatea de NADPH+H+ care rezultă în cursul transformării
glucozei în 6-fosfogluconat.
hexokinaza
Glucoza +ATP glucozo-6-fosfat +ADP

G6PDH
Glucozo-6-fosfat + NADP+ 6-fosfogluconat + NADPH+H+

Se măsoară extincţia NADPH-ului format la λ = 340nm.

Reactivi:
1. Soluţie tampon, pH 7,5 (trietanolamină 0,3 M şi MgSO4 4 mM)
2. Soluţie NADP 12mM
3. Soluţie ATP 16Mm
4. Amestec enzimatic, soluţie stoc: (1 ml soluţie hexokinază 1mg/ml se amestecă cu
1ml soluţie glucozo 6-fosfat dehidrogenază 2mg/ml)
5. Acid percloric 0,33 M
6. Acid benzoic 0,2 %
7. Amestec de reacţie (1ml tampon + 40 μl NADP + 40 μl ATP + 10 μl amestec
enzimatic)
8. Soluţie standard glucoză 1000 mg/100ml (2 g glucoză se dizolvă în 200 ml acid
benzoic 0,2%)

Modul de lucru
În două eprubete de centrifugă (probă şi martor) se pipetează:
P M
Sânge 0,05 ml -
Acid percloric 0,5 ml 0,5 ml
Apă distilată - 0,05 ml
Se centrifughează 1 minut la 3000 turaţii şi apoi se pipetează în alte două
eprubete:
P M
Supernatant 0,125 ml 0,125 ml
Amestec de reacţie 1,25 ml 1,25 ml
Se agită şi se lasă eprubetele timp de 20 minute la 250C, apoi se citesc
extincţiile probei şi martorului la λ = 340 nm faţă de un blank reprezentat de apă
distilată. Extincţia martorului trebuie să fie zero sau aproape zero.

Calcul:
mg glucoză/100ml sânge = (EP-EM) x F

234
 Valoarea coeficientului F se stabileşte folosind o soluţie standard de glucoză
1000 mg/100ml şi acid benzoic 0,2 %. Se fac patru determinări, iar F este media
aritmetică a celor patru valori obţinute.
1 2 3 4
Soluţie standard glucoză 50 ml 40 ml 20 ml 10 ml
Acid benzoic 0,2% 50 ml 60 ml 80 ml 90 ml
Cantitatea de glucoză (mg/100ml) 500 400 200 100
Din fiecare eprubetă se iau câte 0,1 ml, se adaugă câte 1 ml amestec de
reacţie, se lasă eprubetele 20 minute la 250C, apoi se citesc extincţiile faţă de apă
distilată la λ = 340 nm. Se calculează pentru fiecare coeficientul FI după formula:
mg glucoză/100ml=Ei x FI,iar F=(F1+F2+F3+F4)/4

c. Determinarea HbA1c prin metoda colorimetrică

Prin încălzire în mediu de acid sulfuric şi arsenat, glucoza din Hb glicozilată
formează hidroximetil-furfural. Acesta reacţionează cu acidul tiobarbituric formând un
compus colorat a cărui extincţie se citeşte la λ = 443 nm:

Reactivi:
1. Hemolizat
- sângele recoltat pe anticoagulant este centrifugat
-
se înlătură supernatantul
- sedimentul este diluat de 4 ori cu apă distilată şi se lasă 1 oră la temperatura camerei
2. Amestec acid sulfuric-arsenat (acid sulfuric 0,6 M, arsenat disodic 0,01M)
3. Acid tricloracetic 40 %
4. Acid tiobarbituric(TBA 0,025 M în NaOH 0,01 M)

Modul de lucru
În două eprubete (proba şi martor) se pipetează:
P M
Hemolizat 750 μl -
Apă distilată - 750 μl
Acid sulfuric-arsenat 375 l 375 l

235
 Eprubetele se ţin 1 oră pe baie de apă la fierbere. Apoi se răcesc la 400C şi se
adaugă câte 375 μl TCA în fiecare eprubetă (TCA se adaugă picătură cu picătură şi
se amestecă continuu). Se filtrează:
P M
Filtrat 500 l 500 l
TBA 150 l 150 l
Se incubează 40 minute la 40 C, apoi se răcesc la 200C şi se citesc extincţiile
0

la λ = 443 nm.

Calcul:
Hb glicozilată (mM) = (Ep-EM) / le
în care: EP, EM = extincţiile probei, martorului
e = coeficient de extincţie molară (1,24 mM-1 x cm-1)
l = lungimea drumului optic prin cuvă (cm)
Se dozează şi Hb totală şi se calculează HbA1c ca procent din Hb totală.

d. Determinarea HbA1c prin metoda cromatografică

Principiu: Hemoglobinele din hemolizat sunt reţinute pe o coloană cromato-
grafică ce conţine răşina schimbătoare de cationi. După eliminarea fracţiunilor
HbA1a+b, este eluată HbA1c şi este dozată spectofotometric la λ = 415 nm.
Reactivii şi modul de lucru sunt specifice firmelor producătoare. Metoda
cromatografică prezintă mai multe avantaje: este mai rapidă, permite separarea doar
a fracţiunii de HbA1C, iar rezultatul se exprimă direct în procente faţă de Hb totală.

236
 5. COMPUŞI LIPIDICI

Plasma vehiculează cantităţi importante de lipide care suferă oscilaţii ample

în raport cu diverşi factori nutriţionali, metabolici sau hormonali.
Analiza lipidelor plasmatice se efectuează în două moduri:
 dozarea lipidelor totale şi a lipidelor ca specii moleculare (trigliceride,
fosfolipide, colesterol, acizi graşi liberi), prin reacţii specifice, sau prin
extracţii cu solvenţi selectivi şi dozarea fiecărei fracţiuni.
 separarea fracţiunilor lipoproteice prin electroforeză şi stabilirea
proporţiilor în care se află diversele fracţiuni (lipidograma).
Lipidele plasmatice suferă variaţii diurne foarte pronunţate şi din aceste
motive momentul recoltării sângelui este foarte important. Se consideră că analizele
efectuate după 12-14 ore de la ultima masă au cea mai bună valoare diagnostică. La
un subiect normal epurarea sângelui de chilomicroni este cvasicompletă după acest
interval, iar trigliceridele prezente în ser în acest moment sunt numai de origine
endogenă: ele provin prin sinteză hepatică şi sunt transportate sub formă de pre-  -
lipoproteine. Concentraţiile colesterolului şi fosfolipidelor suferă variaţii diurne mai
puţin accentuate. Acizii graşi liberi au timpi de înjumatăţire extraordinar de mici şi
în 24 ore suferă fluctuaţii foarte ample în funcţie de diverşi factori.
Fosfolipidele sunt lipide cu caracter amfipatic, componente principale ale
membranelor celulare. Circulă în sânge în formă de lipoproteine. Trigliceridele sunt
esteri ai glicerolului cu acizi graşi. Sunt lipide hidrofobe care se depozitează în ţesutul
adipos.Trigliceridele exogene, din alimente, ajung în plasmă în formă de chilomicroni.
Cele endogene, sintetizate în ficat sunt exportate în plasmă în formă de VLDL.
Concentraţia lipidelor totale şi a fracţiunilor lipidice la un adult sănătos sunt indicate
în tabelul următor:

Fracţiunea lipidică mg/100 ml

Lipide totale 600 - 700
Trigliceride 50 - 150
Colesterol total 150 - 220
Colesterol liber 40 - 50
Fosfolipide totale 160 - 260
Acizi graşi liberi 5 - 25

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ:

1. Dozarea lipidelor totale în ser prin metoda colorimetrică a lui Zöllner şi

Kirsch
Determinarea lipidelor totale în ser este utilizată ca un test de triere (screening)
pentru a depista dislipidemiile.
Principiu: Serul este tratat la cald cu acid sulfuric concentrat, după care se
adaugă un amestec de vanilină şi acid fosforic. Se admite că în prezenţa acidului
237
sulfuric concentrat, la cald, diversele categorii de lipide suferă oxidări degradative
cu formare de cetone care se condensează cu vanilina dând naştere la compuşi
coloraţi violet. Lipidele serice sunt calculate în comparaţie cu un standard
cuprinzând o cantitate cunoscută de trioleină.
Reactivi:
1. Acid sulfuric concentrat (d=1,84).
2. Reactiv de culoare vanilino-fosforic cuprinzând acid fosforic 11,9 M şi
vanilină 0,008 M.
3. Standard de trioleină, 500 mg/100 ml, în cloroform.
CHO
H3CO

vanilinã
OH
Mod de lucru: în două eprubete cu dop rodat, probă şi standard se pipetează:
Probă Standard
Ser 0,1 ml -
Soluţie de trioleină - 0,1 ml
H2SO4 concentrat 2 ml 2 ml
Se agită. Eprubetele astupate sunt ţinute 10 minute într-o baie de apă în
fierbere, după care sunt lăsate să se răcească la temperatura camerei. Se pregătesc
apoi trei eprubete în care se introduc:
Probă Standard Blank
Amestec ser + H2SO4 0,2 ml - -
Amestec trioleină + H2SO4 - 0,2 ml -
H2SO4 concentrat - - 0,2 ml
Reactiv vanilino-fosforic 4 ml 4 ml 4 ml
Se amestecă şi eprubetele sunt lăsate 30-40 minute la temperatura camerei
(sau 10 minute la 370). Se măsoară extincţia probei şi a standardului faţă de blank la
530 nm.
Calcul: Dacă Ep şi Es sunt extincţiile probei şi a standardului:
mg lipide totale / 100 ml ser = Ep/Es x 500
Valori normale: 600-700 mg / 100 ml ser.
Variaţii patologice: Valori mai mari de 800-1000 mg/100 ml ser indică o
situaţie patologică şi în aceste cazuri se impune o analiză a diverselor fracţiuni
lipidice şi lipoproteice pentru a stabili patogenia acestor dereglări. Hiperlipidemia
este prezentă în toate hiperlipoproteinemiile primare sau secundare. Hipolipidemia
este un simptom al necrozei hepatice avansate, al hipertiroidismului, al stărilor de
malabsorbţie.

2. Dozarea fosfolipidelor serice

Principiu: fosfolipidele sunt precipitate împreună cu proteinele prin tratarea
serului cu acid tricloracetic. Substanţele organice din precipitat sunt mineralizate
238
prin fierbere cu acid percloric (HClO4) şi acid azotic. Ionii fosforici din soluţie sunt
transformaţi în albastru de molibden prin tratare cu molibdat de amoniu şi reducerea
complexului fosfomolibdenic cu acid 1-amino-2-hidroxi-4-naftalen sulfonic (reactiv
Fiske-Subbarow). Intensitatea coloraţiei obţinute se măsoară fotometric şi se
compară cu cea dată de o soluţie standard de fosfaţi.
Reactivi:
1. Soluţie de acid tricloracetic 10 g % (pentru precipitare)
2. Soluţie de acid tricloracetic 5 g % (pentru spălarea precipitatului)
3. Soluţie de molibdat de amoniu 5 g %
4. Reactiv Fiske-Subbarow. Se prepară prin dizolvarea a 0,2 g acid 1-amino-
2-naftol-4-sulfonic, 1,2 g Na2SO3 şi 1,2 g NaHSO3 în 100 ml apa.
5. Soluţie standard de KH2PO4 0,004 mg P/ml. Se prepară o soluţie stock,
0,4394 g KH2PO4 /100 ml care este diluată 1:250 în momentul întrebuinţării.
6. Acid percloric 60% (d = 1,53)
7. Acid azotic fumans
Mod de lucru: toate operaţiunile: precipitarea, digestia acidă (mineralizarea)
şi dezvoltarea culorii se efectuează în eprubete de centrifugă. Într-o eprubetă (proba)
se pipetează 0,2 ml ser şi 3 ml apă şi se lasă în repaus 10 minute. Se centrifughează
la 2-3000 rmp timp de 5 minute. Se aruncă supernatantul clar şi sedimentul este
spălat cu 5 ml soluţie de acid tricloracetic 5% prin agitare puternică până când
precipitatul se detaşează de pe fundul eprubetei şi dispersează în soluţie. Se
centrifughează şi se aruncă supernatantul. Eprubeta conţinând precipitatul este ţinută
cu gura în jos, lipită pe o bucată de hârtie de filtru, timp de 5-10 minute.
În continuare peste precipitatul tricloracetic se introduc 0,5 ml acid percloric,
2 perle de sticlă (cu diametru de 2-3 mm) şi 3 picături de acid azotic fumans. Se
încălzeşte la flacără mică (sub nişă) până când conţinutul eprubetei s-a clarificat (cca
10 minute). Din acest moment se mai continuă încălzirea încă 5 minute pentru a se
asigura îndepărtarea oxizilor de azot. Se lasă eprubeta să se răcească la temperatura
camerei. Pentru dezvoltarea culorii, alături de probă, din această etapă se introduce
în lucru un standard. Se pipetează:

Probă Standard
Apă distilată 5 ml -
Soluţie standard de fosfat - 5 ml

Acid percloric 0,4 ml 0,4 ml

Molibdat de amoniu 0,5 ml 0,5 ml
Reactiv Fiske-Subbarow 0,2 ml 0,2 ml

Se amestecă; se lasă în repaus 10-15 minute. Se citesc extincţiile faţă de apă

distilată la 640 nm.
Calcul: Dacă Ep şi Es sunt extincţiile probei şi respectiv a standardului:
mg P din fosfolipide / 100 ml ser = Ep/Es x 10
Dacă se înmulţeşte fosforul lipidic cu factorul de conversie 25 se poate
obţine concentraţia fosfolipidelor serice:
239
 mg fosfolipide / 100 ml ser = fosfor lipidic x 25
Valori normale: 6,5 – 10 mg P lipidic / 100 ml ser, sau
160 – 260 mg fosfolipide / 100 ml ser
Variaţii patologice. Fosfolipidele serice suferă modificări moderate în
diverse hiperlipoproteinemii. Sunt însă crescute substanţial în obstrucţia biliară
extra- şi intrahepatică, împreună cu colesterolul. Fosfolipidele au acţiune
detergentă puternică şi serul care cuprinde un exces de fosfolipide ramâne clar
chiar atunci când trigliceridemia este foarte crescută.

3.Dozarea trigliceridelor (TG) serice prin metoda enzimatică

Trigliceridemia este un parametru biochimic cu o mare valoare diagnostică,
care poate fi estimată pe baza relaţiei:
Trigliceridemia = Lipide totale – (Colesterol + Fosfolipide).
Valorile obţinute în acest fel sunt aproximative, dar permit totuşi o apreciere
a gradului dislipidemiei. Trigliceridele se pot determina prin metoda cromatografică:
cromatografia în strat subţire, cromatografia gaz-lichid, cromatografia pe coloană
sau prin metoda enzimatică.
Principiul metodei enzimatice:
Glicerolul eliberat prin hidroliza trigliceridelor catalizată de
lipoproteinlipază este fosforilat de către glicerol kinază şi apoi oxidat sub acţiunea
glicerol-fosfat-oxidazei dând naştere la H2O2. Sub influenţa catalitică a peroxidazei,
H2O2 rezultată ca produs secundar în urma oxidării glicerol-fosfatului, formează în
prezenţa reactivului Trinder (4-clorofenol şi 4-aminofenazonă) un compus colorat în
roşu-purpuriu (chinonimină). Intensitatea culorii este proporţională cu concentraţia
trigliceridelor.
Lipoproteinlipaza
Trigliceride + H2O Glicerol + Acizi grasi
Glicerol + ATP Glicerolkinaza Glicerol-3-P + ADP
Glicerolfosfat oxidaza
Glicerol-3-P + O2 Dihidroxiaceton-P + H2O2
2H2O2 + 4-clorfenol + 4-aminofenazonã Peroxidaza Derivat chinoniminic + 4H 2O
(culoare rosie)

Reactivi necesari:
R1: Soluţie tampon (pH = 7,2) şi 4-clorfenol;
R2: Soluţie care conţine lipoproteinlipază, glicerolkinază, glicerolfosfat
oxidază, peroxidază, 4-aminofenazonă şi ATP.
Reactiv enzimatic: R1 + R2.
Modul de lucru
În 3 eprubete se pun:
Proba Standard Blanc

240
 Ser 0,5 ml - -
Standard (200 mg/dl) - 0,5 ml -
Apă 1 ml 1 ml 1,5 ml
Se preincubează 3 min la 37C, după care se adaugă reactivul enzimatic.
Reactiv enzimatic 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml
se incubează 5 minute la 37C
Se citesc extincţiile la 500 nm faţă de blanc.
EP
mg  TG / dl  ser   200
ES
Valori normale: < 150 mg/dl
Suspect: 150 ≥ c < 200 mg/dlC
Crescut: > 200 mg/dl

4.Colesterolul seric
Colesterolul seric cuprinde o fracţiune liberă (22-30 %) şi una esterificată
(70-78%). Colesterolul esterificat se găseşte în miezul particulelor lipoproteice, în
timp ce colesterolul liber este localizat la periferia acestora. Proporţia de colesterol
esterificat a lipoproteinelor descreşte în ordinea: LDL>HDL>IDL>VLDL,
succesiune ce este valabilă şi în cazul proporţiei de colesterol total.
Dozarea colesterolului plasmatic este o analiză uzuală care se practică
sistematic la persoanele trecute de 40 de ani, în paralel cu alte determinări (ureea
serică, glicemia, uricemia, trigliceridemia, testele de disproteinemie).
Colesterolul seric are o dublă origine:
- exogenă/alimentară - proporţia de colesterol care se absoarbe depinde de
cantitatea de colesterol ingerată şi de conţinutul de trigliceride al dietei, acestea
favorizând absorbţia colesterolului.
- endogenă - se referă la colesterolul sintetizat de novo în organism plecând
de la acetil-CoA (aproximativ 1-2g/zi); sediul principal al sintezei de colesterol este
ficatul (colesterolul mai este produs în: intestin glandele corticosuprarenale, ovare,
testicule, piele, aortă).

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Dozarea colesterolului prin metoda enzimatică Trinder

Principiu: vezi la dozarea HDL-colesterolului
Valori normale:150-220 mg/100ml sau 2,5-6,8 mM
Valorile normale ale colesterolului total variază în funcţie de vârstă şi sex.
După vârsta de 40 ani colesterolemia creşte cu 0,04 mM/an (15 mg/100ml/an) la
barbaţi şi cu 0,025 mM/an (10 mg/100ml/an) la femeie.

Vârstă Colesterol total (mg/100ml )

0 - 19 ani 210 - 230
241
 20 -29 ani 120 - 240
30 - 39 ani 140 - 270
40 - 49 ani 150 - 310
50 - 59 ani 160 - 330
Valori patologice.
a. Hipercolesterolemii
-primare: există creşteri marcate în hiperlipoproteinemiile tip IIa, IIb şi
creşteri moderate în celelalte hiperlipoproteinemii.
-secundare: diabet zaharat (scade viteza de catabolizare a colesterolului),
hipotiroidism, icter obstructiv (creşte în special colesterolul esterificat datorită
împiedicării eliminării prin bilă), pancreatita acută şi cronică, nefroza lipoidică
(datorită pierderilor urinare de proteine are loc creşterea compensatorie a sintezei
hepatice globale de proteine, inclusiv apo B100, cu creşterea producţiei de VLDL,
LDL), afecţiuni hepatice, gută
b. Hipocolesterolemii
-primare: abetalipoproteinemia (vezi “Lipoproteine”),
hipobetalipoproteinemia, boala Tangier
-secundare: hipertiroidism (creşte catabolizarea colesterolului), sindrom de
malabsorbţie (scade absorbţia colesterolului la nivelul tubului digestiv, infecţii
severe cu stări hipercatabolice, necroze hepatice avansate (scade în special
colesterolul esterificat deoarece sediul principal al sintezei de novo şi al
colesterolului esterificat este ficatul).
Hipocolesterolemia se asociază cu un risc scăzut aterogen. Totuşi poate să
prezinte alte inconveniente, cum ar fi tendinţa crescută, evidenţiată statistic, de a
dezvolta tulburări de personalitate (stări depresive cu tendinţe suicidare,
agresivitate, comportamente riscante).

5. Lipoproteine serice

Lipoproteinele reprezintă forma de transport a lipidelor în circulaţia

sangvină şi limfatică. Clasificarea lipoproteinelor se face în funcţie de densitatea lor
sau de mobilitatea electroforetică. În ordinea creşterii densităţii lor acestea sunt:
chilomicronii (CH), lipoproteinele cu densitate foarte mică (VLDL), lipoproteinele
cu densitate mică (LDL), lipoproteinele cu densitate mare (HDL). Densitatea
lipoproteinelor este direct proporţională cu conţinutul lor în proteine (vezi tabelul
următor).

CH VLDL LDL HDL

Densitate (g/ml) <0,95 0,95-1,006 1,006-1,063 1,063-1,210
Diametru (Å) 750-120000 280-750 200-250 100-150
Conc. plasmatică (mg/dl) 100 - 250 130 - 200 210 - 400 50- 130
Proteine % 2 9 21 33
Colesterol liber % 2 7 8 7

242
Colesterol esterificat % 6 15 38 23
Trigliceride % 83 50 10 8
Fosfolipide % 7 18 22 29
Apoproteina caracteristică B48 B100 B100 A

În funcţie de mobilitatea electroforetică lipoproteinele se clasifică în: pre-

lipoproteine (corespunzătoare VLDL), lipoproteine (corespunzătoare LDL),
-lipoproteine (corespunzătoare HDL).
Determinarea diferitelor fracţiuni lipoproteice serice este importantă în
evaluarea riscului dezvoltării unor afecţiuni cardiovasculare. Este indicat să se
realizeze un bilanţ lipoproteic în următoarele situaţii: naştere, semne clinice de
tezaurismoză lipidică (xantelasme, xantoame cutanate sau tendinoase), accidente
cardiovasculare (infarct, arterită, HTA, insuficienţă vasculară cerebrală), boli
metabolice (diabet, gută, obezitate, alcoolism cronic), antecedente heredo-colaterale
de accidente vasculare.
Bilanţul lipoproteic se efectuează pe sângele recoltat de la subiectul
respectiv după minim 10 h repaus alimentar absolut şi cuprinde următoarele etape:
 dozarea colesterolului total şi a trigliceridelor; dacă acestea au valori
modificate se parcurg şi următoarele două etape;
 dozarea HDL-colesterolului şi a apolipoproteinelor A şi B;
 electroforeza lipoproteinelor.
Fracţionarea lipoproteinelor, ultima analiză care se practică în cadrul
bilanţului lipoproteic, cuprinde doi timpi:
1) precipitarea fracţionată a blocului VLDL-LDL şi recuperarea HDL din
supernatant
2) electroforeza lipoproteinelor (se realizează la pH = 8,6 cu hârtie de filtru
Whatman nr.1, acetat de celuloză, gel de agaroză sau gel de poliacrilamidă;
developarea electroforegramei se face fie cu ajutorul unui colorant cu afinitate pentru
partea lipidică a lipoproteinelor, de exemplu negru de Sudan, fie cu un reactiv
specific fiecărui component lipidic al lipoproteinelor).
Precipitarea fracţionată a blocului VLDL-LDL se realizează cu
concanavalină sau cu polianioni. Concanavalina este o proteină care fixează specific
componenta glucidică a blocului VLDL-LDL, precipitându-l. Polianionii
(polietilenglicol, heparină + MnCl2, sulfat de dextran + MnCl2, fosfowolframic +
MgCl2) precipită specific VLDL şi LDL lăsând HDL în soluţie, în supernatant.
Această metodă permite dozarea HDL-colesterolului şi apoi calcularea
LDL-colesterolului , pe baza formulei lui Friedewald:
LDL-colesterol = colesterol total - TG/5 - HDL-colesterol
ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Dozarea HDL-colesterolului prin metoda enzimatică Trinder

Principiu: serul sau plasma sunt tratate cu acid fosfowolframic + MgCl 2 în
vederea precipitării selective a blocului VLDL-LDL. Se centrifughează proba, iar
supernatantul obţinut, care conţine HDL-colesterol, se tratează cu colesterolesterază,

243
colesteroloxidază, peroxidază, reactiv Trinder. H2O2 rezultată din reacţiile catalizate
de primele două enzime oxidează reactivul Trinder în prezenţa peroxidazei la un
compus colorat care se dozează spectrofotometric.

Reactivi: se folosesc chituri Sera-Pak care conţin:

1. Reactiv de precipitare (conţine acid fosfowolframic 7g/l şi MgCl2 39mmol/l
2. Soluţie 1 (conţine reactivul Trinder : 4-aminofenazonă şi fenol)
3. Soluţie 2 (conţine colesterolesterază, colesteroloxidază, peroxidază şi reactivul
de culoare Trinder)
4. Soluţie 3: se amestecă 1 volum de soluţie 1 cu 1 volum de soluţie 2 şi rezultă
o soluţie cu compoziţia următoare: tampon fosfat 100 mM (pH = 7,7),
colesterol-oxidaza > 80u/l, colesterolesteraza > 140u/l, peroxidaza >500u/l,
fenol 10 mM, 4-aminofenazona 0,5 mM, ferocianura de potasiu 12 M, colat
de sodiu 3 mM, surfactanţi 6,4 g/l
5. Standard cu concentraţia HDL-colesterol de 50 mg/dl (1,29 mmol/l).
Mod de lucru: se amestecă proba (ser sau plasmă) cu reactivul de precipitare în
raport 1:1. Se centrifughează la 1500g minim 10 minute şi se separă supernatantul. Se
pipetează în trei eprubete (proba, standard, blanc) următoarele cantităţi:
Proba Standard Blanc
Supernatant 0,1ml - -
Standard - 0,1ml -
Soluţie 3 2,5ml 2,5ml 2,5ml
Apa distilată - - 0,1ml
Se amestecă bine şi se incubează 5 minute la 37ºC sau se lasă 20
minute la temperatura camerei. Se citesc extincţiile la 510 nm (500-530 nm).
Calcul: dacă Ep este extincţia probei şi Es a standardului :
mg HDL-colesterol/100 ml = Ep/Es x 50 x 2
Sau: mmol HDL-colesterol/l = Ep/Es x 1, 29 x 2, unde 2 este factorul de diluţie.
Valorile normale variază în funcţie de vârstă:
vârstă (ani) bărbaţi femei
5 - 14 37 - 74 36 - 73
15 - 39 30 - 63 33 - 82
40 - 44 27 - 67 34 - 88
45 - 54 30 - 63 34 - 92
>55 30 - 78 35 - 98
Din studiile epidemiologice reiese că valorile HDL-colesterolului mai mici
de 35 mg/dl (0,90 mmol/l) pentru bărbaţi şi 45 mg/dl (1,16 mmol/l) pentru femei
sunt asociate cu risc crescut de boală coronariană. Valori peste 55 mg/dl (1,42
mmol/l) pentru bărbaţi şi 65mg/dl (1,68 mmol/l) pentru femei sunt asociate cu o
incidenţă scăzută a bolilor coronariene.
Observaţii:
HDL-colesterolul reprezintă fracţiunea de "colesterol benefic", fiind un
factor antiaterogen (transportă colesterolul de la ţesuturile periferice la ficat pentru
catabolizare şi excreţie). Nivelul seric mai crescut la femei decât la bărbaţi poate fi
244
una dintre cauzele frecvenţei mai mari a aterosclerozei la bărbaţi comparativ cu
femeile. Acurateţea metodei de dozare a HDL-colesterolului e importantă deoarece
o eroare în plus de 10 mg/100 ml poate dubla riscul estimat pentru dezvoltarea unei
boli cardiace coronariene. LDL-colesterolul reprezintă fracţiunea de "colesterol
malefic", fiind un factor pro-aterogen (transportă colestrolul de la ficat spre ţesuturile
periferice, favorizând supraîncărcarea acestora cu colesterol). Receptorii pentru LDL
din ţesuturile extrahepatice funcţionează maximal la o concentraţie a LDL-
colesterolului de numai 25 mg/100ml, care este mult mai mică decât valoarea
fiziologică (150-190 mg/100ml). Această caracteristică a receptorilor LDL explică
incidenţa crescută a aterosclerozei la om.
În condiţii fiziologice raportul LDL-colesterol/HDL-colesterol are valoarea de
2,9 la femei şi 3,3 la bărbaţi. Riscul dezvoltării unei boli cardiace coronariene creşte
semnificativ dacă valoarea acestui raport depăşeşte 3,5 la femei şi 3,8 la bărbaţi.

Electroforeza lipoproteinelor

Separarea electroforetică a lipoproteinelor se bazează pe sarcina electrică

diferită a acestora, care este dependentă de raportul proteine/lipide. Lipidograma este
interpretată vizual, observându-se natura şi intensitatea benzilor, sau cu ajutorul unui
integrator se trasează curba de variaţie a densităţii optice a lamei. Fracţiunile
lipoproteice cuprinse într-o lipidogramă sunt, în ordinea crescătoare a vitezei de
migrare, următoarele:
- chilomicronii, care rămân la origine întrucât aceste particule nu migrează în
câmp electric
- pre-β-lipoproteinele, corespund lipoproteinelor cu densitate mică (VLDL)
- β -lipoproteinele, corespund lipoproteinelor cu densitate mică
-  -lipoproteinele, corespund lipoproteinelor cu densitate mare
La o persoană sănătoasă, după 12-14 ore de post alimentar, chilomicronii sunt
absenţi şi banda pre este îngustă şi foarte slabă.
Electroforeza pe acetat de celuloză este imprecisă şi realizează doar o separare
în două zone: , corespunzând pentru HDL şi β corespunzând pentru VLDL şi
LDL. Electroforeza pe gel de agaroză permite o separare mai bună între VLDL şi
LDL, dar tehnica este mai delicată. De asemenea, face posibilă identificarea unor
lipoproteine anormale (ex.: LPx - indicator de colestază). Elecroforeza pe gel de
poliacrilamidă este metoda ideală pentru determinarea tipului de
hiperlipoproteinemie. Se realizează doar în laboratoarele specializate. Are
următoarele avantaje: 1) realizează o separare netă între VLDL şi LDL; 2) poate
pune în evidenţă LPa, o lipoproteină anormală caracteristică plăcilor de aterom, care
migrează între LDL şi VLDL; 3) evidenţiază IDL.
Lipidograma normală este reprezentată de următoarea distribuţie: CH –
0%, pre- 10-19%,  52 - 59% şi  25 - 35%.
Modificări patologice ale lipidogramei. Modificarea concentraţiei lipidelor
plasmatice sau a raporturilor dintre diversele fracţiuni lipoproteice poartă denumirea
de dislipidemie sau dislipoproteinemie. Variaţiile concentraţiei lipidelor în afara
limitelor fiziologice pot fi în sensul creşterii (hiperlipoproteinemii) sau în sensul
scăderii (hipolipoproteinemii). Atât hiperlipoproteinemiile cât şi hipoproteinemiile
245
 pot fi primare (determinate de factori genetici) sau secudare (apar în contextul altor
boli). Cele mai frecvente sunt hiperlipoproteinemiile. În funcţie de mecanismul
producerii lor, deosebim două tipuri:
1) hiperlipoproteinemii produse prin defect de catabolizare
2) hiperlipoproteinemii produse prin sinteza crescută.
În practică, diferenţierea acestor două tipuri implică studii de cinetică cu
lipoproteine marcate cu izotopi radioactivi, sau mai simplu, dozarea activităţii
plasmatice a enzimelor secretate de ficat (LCAT, PsCE, fXII), metodă care nu
asigură un diagnostic de certitudine, dar poate orienta asupra mecanismului
patogenic al hiperlipoproteinemiei respective.
Hiperlipoproteinemiile genetice se clasifică după Fredrickson în şase tipuri,
în funcţie de tipul fracţiunii lipoproteice modificate (tabelul VI. 5.1).

LP Lipide
Tip Denumire Cauze
crescute crescute
TG +++ Hipertrigliceridemie 1. deficit de LPL
I CH
C+ exogenă (AR) 2. deficit de apo CII
C+++ Hipercolesterolemia deficit al receptorilor
IIa LDL TG normale familială (AD) apoB100-apoE în ficat şi
ţesuturile extrahepatice
C+++ Hiperlipemie mixtă accelerarea sintezei de
VLDL şi
IIb TG+ familială VLDL, inclusiv a apoB100
LDL
(AD)
C++ Disbetalipoproteinemie 1. deficit de apoE
TG++ (AR) 2. apoE anormalaE2/E2
III IDL
3. deficit de lipază
hepatică
TG+++ Hipertrigliceridemie creşte sinteza de VLDL
IV VLDL
C+ endogenă (AD)
CH şi TG+++ Hipertrigliceridemie 1) apo CIII anormală
V
VLDL C+ mixtă (AR) 2) apoE anormală (E4/E4)

Tabelul nr. VI.5.1. Tipuri de hiperlipoproteinemii

(AD = autozomal dominantă, AR = autozomal recesivă)
O modalitate simplă de evidenţiere a unei hipertrigliceridemii marcate este
testul ecremării: plasma păstrată la 40C timp de 12-24 h devine tulbure (semn de
hipertrigliceridemie endogenă VLDL crescute) şi/sau capătă un “guleraş” cremos
(semn de hipertrigliceridemie exogenă: CH crescuţi).

Tipul de hiperlipoproteinemie Guleraş cremos Plasmă subiacentă

I + normală
IIa – clară
IIb – clară sau uşor tulbure
III +/– tulbure (frecvent opalescentă)

246
 IV – tulbure (lactescentă)
V + tulbure (lactescentă)

Există o multitudine de condiţii patologice care se pot asocia cu hiperlipo-

proteinemii (vezi tabelul următor).

Tipul Boli asociate cu hiperlipoproteinemii

I diabet zaharat
porfirie acută intermitentă, hepatopatie obstructivă, hipotiroidism,
IIa
insuficienţă renală
IIb hipotiroidism, sindrom Cushing, sindrom nefrotic, disgamaglobulinemii
III hipotiroidism, lupus eritematos sistemic (LES)
IV diabet zaharat, obezitate, uremie, LES, tratament estrogenic
V diabet zaharat, hipotiroidism, sindrom nefrotic, disgamaglobulinemii

Hipolipoproteinemiile sunt mult mai puţin răspândite.

Abetalipoproteinemia familială se asociază cu absenţa lipoproteinelor care
contin apoB100 sau apoB48 (VLDL, LDL, CH) datorită unui deficit genetic de sinteză
a apolipoproteinei B. Boala se transmite autozomal recesiv.
Hipoalfalipoproteinemia familiala se asociază cu o scădere medie a HDL;
are transmitere autozomal dominantă; defectul molecular nu este încă precizat.
Boala Tangier se asociază cu scădere marcată a HDL şi concentraţii extrem
de reduse de apoproteine AI şi AII.
Deficitul familial de LCAT se asociază cu o scădere importantă a
concentraţiei plasmatice a HDL; deşi nivelul colesterolului total poate fi crescut,
concentraţia plasmatică a colesterolului esterificat este mult scăzută. Se transmite
autozomal dominant.
Investigaţiile de rutină ale metabolismului lipidic includ determinările, în
plasmă, ale:
1. Colesterolului total
2. HDL colesterolului (HDL-C)
3. Trigliceridelor
LDL-colesterolul (LDL-C) se determină conform formulei Friedewald
(valabilă pentru trigliceridemie 400 mg/dl).
TG
LDL  C  colesteroltotal  HDLC  , totul exprimat în mg/dl.
5
Lipidograma pentru caracterizarea anomaliilor lipoproteinelor este indicată
la un număr redus de pacienţi.
Cunoaşterea “trepiedului” diagnostic (colesterol total, HDL-C, trigliceride)
pentru profilul lipidic are importanţă pentru cunoaşterea riscului de boală
cardiovasculară a pacientului.
Concentraţia plasmatică a colesterolului este influenţată de:

247
 1. Factori genetici : 60-70% din colesterol este endogen
2. Dietă: grăsimile bogate în AG saturaţi (unt, frişcă), grăsimi animale
cresc colesterolemia, în timp ce grăsimile cu AG polisaturaţi (peşte, ulei
vegetal) scad colesterolemia
3. Sex: La femei, colesterolemia totală este mai mică, în timp ce, valoarea
HDL-C este mai mare, din cauza estrogenilor. Astfel, femeile sunt
protejate de bolile cardiovasculare (cu excepţia celor care au anomalii
anatomice vasculare) până la menopauză. Diferenţele colesterolemiei
între femei şi bărbaţi dispar după menopauză.
4. Vârstă: în ţările civilizate, colesterolul plasmatic total creşte cu vârsta,
probabil legat de dietă.
5. Exerciţiu fizic: atunci când este regulat, tinde să crească HDL
colesterolul plasmatic şi să scadă uşor colesterolul total plasmatic.

Factorii care influenţează HDL-C plasmatic:

Factorii care cresc HDL-C Factorii care scad HDL-C
1. estrogenii 1. androgenii
2. consumul moderat de alcool 2. fumatul
3. efortul fizic zilnic 3. sedentarismul

Concentraţia plasmatică a trigliceridelor variază cu vârsta, sexul şi dieta.

Cantităţile mari de alcool şi dieta bogată în hidraţi de carbon cresc trigliceridemia.
În plus, există şi o variaţie foarte mare între indivizi, ceea ce face dificilă
interpretarea unui singur rezultat.
Hiperlipidemii primare sunt legate de modificările ereditare, metabolice.
Hiperlipidemii secundare
Mai puţin de 2% dintre hiperlipidemii sunt secundare altor afecţiuni.
Cauzele principale ale hiperlipidemiei secundare şi modificările biochimice
caracteristice sunt redate în tabelul următor:

Afecţiunea Colesterol TG HDL-C

Diabet zaharat N sau   
Obezitate N sau   
Alcoolism N  
Hipotiroidism  N sau  N
Insuficieţa renală N sau   
cronică
Colestaza  N N
Sdm nefrotic   

248
 6. PROTEINE PLASMATICE

Introducere
Plasma umană cuprinde între 6-8 g proteine la 100 ml. Proteinele plasmatice
constituie un amestec heterogen de componenţi, cu greutăţi moleculare variind între
70 - 1500 kdal.
Utilizându-se diverse metode, proteinele plasmatice au fost separate în
fracţiuni mai mult sau mai puţin omogene, în funcţie de rezoluţia metodei utilizate.
Cel mai vechi procedeu de separare, aplicat proteinelor plasmatice sau serice, este
salifierea, precipitarea proteinelor din soluţii prin adăugarea de cantităţi mari de
săruri neutre: (NH4)2SO4, MgSO4, NaCl, Na2SO4. Prin adăugare de sulfat de amoniu
se deosebesc două fracţiuni majore: globulinele care precipită când concentraţia în
sulfat de amoniu a soluţiei care le cuprinde a atins semisaturaţia şi albumina care
precipită când soluţia este saturată cu sulfat de amoniu.
Prin aplicarea unor metode mai fine de separare s-au individualizat în plasmă
până la 35 fracţiuni proteice iar din aceste fracţiuni puţine sunt omogene din punct
de vedere fizico-chimic.
Funcţiile proteinelor plasmatice
1. Proteinele plasmatice, prin presiunea coloid-osmotică (presiunea oncotică)
pe care o exercită (24-30 mm Hg) participă la reglarea distribuţiei lichidelor între
spaţiul intra- şi extracelular. Albumina este responsabilă de circa 80% din această
funcţie, datorită faptului că este cea mai abundentă proteină plasmatică şi are cea mai
mică masă moleculară. Scăderea concentraţiei albuminei, apărută în diferite stări
patologice, are drept efect invadarea spaţiului extracelular cu apă (edem).
2. Datorită caracterului lor amfoter proteinele plasmatice exercită efecte tam-
pon şi contribuie, alături de celelalte sisteme, la menţinerea pH-ului sanguin în
limitele fiziologice.
3. Proteinele plasmatice vehiculează diverse substanţe: ioni metalici, lipide,
hormoni, vitamine liposolubile, bilirubină, medicamente, etc.
4. Plasma conţine proteine specializate pentru iniţierea şi desfăşurarea pro-
ceselor de coagulare şi fibrinoliză (fibrinogen, protrombină, alţi factori ai coagulării,
plasminogen, etc.).
5. Unele fracţiuni proteice cuprind anticorpi şi alţi factori necesari reacţiilor
imunologice prin care organismul se apără împotriva macromoleculelor străine.
6. Proteinele plasmatice, în special albumina, pot fi utilizate ca sursă de azot
pentru ţesuturi. În mod normal rolul nutritiv al acestora este redus, dar creşte când
aportul de proteine este insuficient sau când raţia cuprinde proteine de calitate
inferioară. În inaniţie sau subnutriţia proteică se constată pe lângă o reducere masivă
a proteinelor tisulare şi o diminuare a proteinelor plasmatice.
Investigarea clinică a proteinelor plasmatice cuprinde următoarele analize:
 dozarea proteinelor totale în ser;
 dozarea fibrinogenului în plasmă;
 separarea proteinelor serice prin electroforeză;
249
  teste de disproteinemie.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Dozarea proteinelor totale (metoda colorimetrică bazată pe reacţia biuretului)

Principiu. În soluţie alcalină grupările peptidice ale proteinelor plasmatice

complexează ionii cuprici din reactivul biuret, dând naştere unui compus colorat,
intensitatea coloraţiei fiind proporţională cu cantitatea de proteine. În această
metodă, alături de proteine se dozează şi peptidele mai mici prezente în ser.
Interpretare. Proteinele plasmatice fiind heterogene se pot produce variaţii
independente ale diverşilor componenţi, sau diversele fracţiuni proteice pot suferi
modificări în sensuri opuse, astfel încât cantitatea totală de proteine să nu sufere mari
modificări. În general, creşterea albuminemiei şi scăderea globulinemiei sunt situaţii
rar întâlnite. Sunt însă frecvente situaţiile opuse, de scădere a concentraţiei albuminei
sau creştere a concentraţiei unor fracţiuni globulinice. Starea de hidratare a
organismului influenţează valorile concentraţiei proteinelor totale în ser prin
modificarea volumului sanguin. Deshidratarea poate simula o hiperproteinemie, în
timp ce hiperhidratarea determină o falsă hipoproteinemie. În cazurile incerte se re-
comandă coroborarea rezultatului proteinemiei cu valoarea hematocritului (raportul
între volumul celulelor sanguine şi volumul sanguin).
Hipoproteinemiile sunt cauzate de pierderi de proteine prin:
 rinichi: pot fi eliminate cantităţi mari de proteine, în special albumina, în afec-
ţiuni ca: sindrom nefrotic, glomerulonefrite, infecţii acute sau cronice, tulburări
circulatorii, intoxicaţii;
 tubul digestiv: enteropatii diverse (colite, enterite, fistule);
 piele: arsuri şi inflamaţii exudative severe.
Hipoproteinemia se mai întâlneşte în stările de subnutriţie, tulburări ale
digestiei şi absorbţiei aminoacizilor. De asemenea, diminuarea capacităţii
funcţionale a ficatului, sediul sintezei albuminei şi a unor globuline, determină
hipoproteinemia. Sarcina şi lactaţia sunt situaţii fiziologice care pot determina
hipoproteinemie.
Globulinele plasmatice se modifică în general în sensul creşterii concentraţiei
lor, fiind mai puţin întâlnite scăderi ale globulinemiei. Hipoglobulinemia poate însoţi
hipoalbuminemia consecutivă subnutriţiei. De asemenea a fost descrisă o boală genetică
caracterizată printr-un defect al sintezei gamaglobulinelor (agamaglobulinemie).
Hiperproteinemiile sunt datorate în special creşterii globulinelor şi se
întâlnesc în inflamaţiile cronice, infecţii, viroze. Sunt foarte accentuate în
plasmocitom şi în macroglobulinemia Waldenstrőm, prin dezvoltarea malignă a unor
linii celulare sanguine secretante de globuline.

Separarea electroforetică a proteinelor serice

250
 Principiu. Prin electroforeză se înţelege transportul particulelor încărcate
electric sub acţiunea câmpului electric continuu. Viteza cu care se deplasează o
particulă într-un câmp electric depinde de o serie de factori ca: densitatea de sarcină
electrică la suprafaţa particulei (care este funcţie de mărimea sarcinii şi de volumul
particulei), densitatea particulei, gradientul de potenţial (dat de raportul dintre diferenţa
de potenţial dintre electrozi şi distanţa dintre aceştia), forţa ionică a mediului,
vâscozitatea mediului, temperatura. Dacă este supusă electroforezei o soluţie
heterogenă, diversele tipuri de particule din soluţie vor parcurge în acelaşi timp (şi în
condiţii identice) distanţe diferite, corespunzător sarcinii şi mărimii fiecăreia.
Proteinele, fiind compuse din resturi aminoacidice vor prezenta la un anumit
pH, diferit de punctul izoelectric, o sarcină electrică netă, pozitivă sau negativă,
determinată de suma algebrică a sarcinilor electrice ale catenelor ataşate ale fiecărui
aminoacid component (ionizarea capetelor N- şi C-terminale având o influenţă
redusă), ceea ce va determina migrarea în câmp electric continuu spre polul
corespunzător. Astfel, la valori ale pH-ului mediului sub punctul izoelectric proteina
va fi încărcată pozitiv şi va migra spre catod, iar la valori ale pH-ului mediului peste
punctul izoelectric, proteina va fi încărcată negativ şi va migra spre anod. Datorită
acestei proprietăţi este posibilă separarea proteinelor din amestecuri complexe (cum
este cazul serului uman), utilizând metoda electroforetică.
În funcţie de mediul în care are loc migrarea moleculelor proteice, s-au
realizat două metode: electroforeza liberă şi electroforeza de zonă. Electroforeza
liberă se desfăşoară în interiorul unei faze lichide şi se realizează cu ajutorul unui
aparat de tip Tiselius. Electroforeza de zonă (practicată actual) foloseşte o fază solidă
sau semisolidă pentru migrarea particulelor proteice (hârtie de filtru, geluri diverse).
Electroforeza proteinelor serice se efectuează în mod standardizat la pH
alcalin 8,6, pH la care amfionii macromoleculari proteici poartă o încărcătură netă
negativă şi se vor deplasa dinspre catod către anod. Vizualizarea benzilor rezultate în
urma migrării diferitelor proteine se face cu ajutorul coloranţilor ce au afinitate pentru
proteine. Prin această metodă în mod normal sunt obţinute 5 (6) benzi bine definite:
albumina, alfa1-globuline, alfa2-globuline, beta-globuline (fracţie ce în cazul anumitor
tehnici este subdivizată în beta1-globuline şi beta2-globuline) şi gama-globuline.
Benzile colorate sunt eluate apoi individual cu o soluţie de NaOH şi ulterior se măsoară
extincţia fiecărui eluat. Se calculează în procente ponderea fiecărei fracţii şi ulterior se
face raportarea la concentraţia proteinelor totale serice determinată separat.

251
 Figura VI.6.1. Electroforegrama proteinelor plasmatice
şi valorile normale ale acestora (%).

Valori de referinţă obţinute în urma electroforezei proteinelor serice:

Fracţiune Valoare electroforetică (%) Valoare absolută

(g/dl)
Albumină 50 - 59 3,5 - 5
Alfa1-globuline 3-5 0,1 - 0,3
Alfa2-globuline 7-9 0,6 - 1
Beta-globuline 11 - 14 0,7 - 1,1
Gama-globuline 16 - 20 0,8 - 1,6
Proteine serice totale 100 6-8

Interpretarea modificărilor patologice ale electroforegramei.

1. Modificări ale intensităţii relative a unor benzi cu dispoziţie normală.

Scăderea intensităţii benzilor corespunzătoare albuminei şi gama-globulinelor
coroborată cu o intensificare a benzii alfa2 sugerează proteinurie selectivă ca cea
observată în sindromul nefrotic. Concentraţia albuminei trebuie să scadă cu cel puţin
o treime faţa de nivelul normal pentru ca scăderea intensităţii benzii corespunzătoare
să fie evidentă pe electroforeză.
O intensificare atât a benzii alfa1 (alfa1-antitripsina şi alfa1-glicoproteina
acidă) cât şi a benzii alfa2 (haptoglobina) sugerează o reacţie de fază acută. O creştere
numai a componentelor alfa1 poate fi observată în hepatita cronică şi în reacţii de
fază acută însoţite de hemoliză, ca şi în timpul terapiei cu estrogeni sau al gravidităţii.
În boli în care sunt prezente vasculita (precum poliartrita reumatoidă) sau complexe

252
imune circulante, poate exista o intensificare predominantă a benzii alfa2.
Intensificarea benzii beta (beta1) sugerează fie anemie feriprivă (creşterea
transferinemiei), fie niveluri crescute de estrogeni. Fuziunea sau interferenţa
benzilor beta şi gama sugerează o creştere a IgA întâlnită în ciroze, infecţii
respiratorii sau ale pielii şi poliartrita reumatoidă. Intensificarea benzii gama
sugerează o creştere policlonală a gamaglobulinelor asociată cu reacţii imune, boli
inflamatorii cronice, boli hepatice sau neoplasme diseminate. Hipergamaglobu-
linemia oligoclonală este uneori observată în hepatita cronică agresivă sau infecţii
virale cronice. Estomparea sau absenţa benzii gama sugerează un deficit imun (ex.
agamaglobulinemia).
2. Benzi multiple, absente sau cu mobilitate anormală. Pot fi observate în cazul
unor variante genetice ale unor proteine serice cum ar fi deplasarea haptoglobinei în
regiunea alfa1 sau a transferinei în regiunea beta2. O bandă îngustă, bine individualizată,
apărută în zona gama sugerează hipergamaglobulinemie monoclonală
(paraproteinemie). Creşterea mobilităţii albuminei survine când ea leagă penicilină
sau salicilaţi ori cantităţi mai mari decât normal de bilirubină sau acizi graşi.
Scăderea mobilităţii alfa1-antitripsinei survine când aceasta leagă compuşi tiolici sau
proteine Bence-Jones.
3. Apariţia unei benzi anormale. Creşterea concentraţiei unei proteine aflată
normal la niveluri foarte scăzute poate să atingă valori atât de mari încât aceasta să
devină vizibilă ca o linie pe electroforegramă. De exemplu, o bandă foarte îngustă,
de mică intensitate poate să apară între albumină şi regiunea alfa1 ca rezultat al
creşterii de sute de ori a concentraţiei alfa-fetoproteinei secretată de anumite tumori.
În mod similar, o creştere importantă a proteinei C reactive într-o reacţie severă de
fază acută poate genera o bandă individualizată de mică intensitate în regiunea gama,
sau o creştere a lizozimului în leucemia monocitară poate genera o bandă în regiunea
post-gama.
Fiecare din aceste modificări faţă de tiparul electroforetic normal poate fi
investigată suplimentar prin determinarea imunochimică a proteinelor individuale
implicate.

Teste de disproteinemie

Testele de disproteinemie mai sunt denumite şi teste (probe) hepatice, teste

de labilitate serică, sau teste de floculare. În organismul uman există un echilibru
dinamic între proteinele plasmatice şi cele aflate în celelalte compartimente, existând
posibilitatea apariţiei unor modificări sub acţiunea unor factori diverşi, fiziologici sau
patologici. Există mecanisme fine de reglare, remaniere şi degradare a proteinelor
prin care sunt asigurate calitatea şi cantitatea constante ale acestor constituenţi
plasmatici. Tabloul normal al proteinelor plasmatice depinde atât de cantitatea totală
de proteine cât şi de anumite raporturi cantitative între diferitele fracţiuni ale
acestora. Existenţa unor raporturi cantitative bine determinate între diferitele fracţiuni
proteice asigură stabilitatea coloidală a serului. Moleculele de albumină, de
253
dimensiuni mici, sferice şi puternic hidrofile, contribuie cel mai mult la stabilitatea
solului plasmatic. O micşorare a albuminemiei, asociată frecvent cu o creştere
compensatoare a globulinemiei, determină o labilizare a serului şi creează
posibilitatea floculării proteinelor în condiţii în care serul normal este stabil.
Totodată, labilitatea coloidală a serului poate fi determinată de creşterea unor
fracţiuni globulinice, fără ca albuminemia să fie semnificativ modificată.
Testele de disproteinemie sunt metode simple şi rapide de investigare în
laborator a echilibrului proteic, bazate pe precipitarea proteinelor plasmatice, în
urma adăugării de diverşi agenţi precipitanţi.
Disproteinemiile reprezintă modificări ale raporturilor cantitative dintre
diferitele fracţiuni ale proteinelor plasmatice. Deoarece ficatul este sediul sintezei şi
catabolismului majorităţii proteinelor serice, testele de disproteinemie sunt considerate a
fi în principal indicatori ai funcţiei hepatice, de unde şi una dintre denumirile acestora.
Totuşi, există şi o serie de afecţiuni nehepatice, în care se produc dezechilibre între
diferitele fracţiuni proteice plasmatice, care au printre consecinţe şi pozitivarea unor teste
de disproteinemie.
Prin compararea rezultatelor testelor de disproteinemie cu profilul
electroforetic al proteinelor plasmatice în cadrul diferitelor afecţiuni, au fost stabilite
corelaţii pozitive între anumite tipuri de raporturi electroforetice între proteinele
plasmatice şi pozitivarea corespunzătoare a unor teste de disproteinemie.
Aceste teste, deşi au o valoare orientativă pentru stabilirea unui diagnostic
clinic, sunt încă foarte utilizate datorită simplităţii, rapidităţii şi reproductibilităţii
lor. Semnificaţia este considerabil accentuată prin includerea lor în seturi de analize
de laborator corespunzător alese, interpretarea fiind făcută obligatoriu în funcţie de
contextul clinic. Valoarea testelor de disproteinemie este redusă dacă acestea nu se
efectuează pe seruri proaspăt recoltate, nehemolizate, clare, fără opalescenţă.
Testele care s-au impus în practica laboratorului clinic sunt testul Takata în
care este utilizată clorura mercurică drept agent precipitant, testul MacLagan cu
timol şi testul Kunkel cu sulfat de zinc.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

1. Testul Takata (nefelometric)

Principiu. Clorura mercurică (HgCl2) adăugată la un ser diluat cu o soluţie de
clorură şi carbonat de sodiu determină apariţia unei opalescenţe a cărei intensitate
depinde de scăderea raportului albumine/globuline. Gradul de opalescenţă se măsoară
fotometric şi se exprimă în unităţi de transmisie procentuală. Serurile normale tratate
cu clorură mercurică prezintă opalescenţă slabă (transmisii T = 100 - 80%). Reducerea
transmisiei la mai puţin de 80% indică pozitivarea testului. Rezultatele sunt
consemnate ca negative (T = 100 - 80%), slab pozitive (T =80 - 70%), pozitive (T =
70 - 50%) şi intens pozitive (T < 50%). Pozitivarea acestui test indică o creştere a
fracţiunilor globulinelor în raport cu albumina.

254
 Interpretare. Pozitivarea testului Takata indică cel mai frecvent o afecţiune
hepatică (ex. hepatita cronică, ciroza hepatică). În lipsa unei afecţiuni hepatice, poate
sugera un diagnostic de pneumonie, poliartrită, endocardită, pielonefrită,
tuberculoză.

2. Testul MacLagan
Principiu. Dacă unei soluţii de timol i se adaugă o cantitate mică de ser,
apare opalescenţă în urma formării unui complex timol-globuline-lipide.
Turbiditatea probei se măsoară fotometric şi se compară cu turbiditatea unei
suspensii standard de sulfat de bariu. Serurile normale produc turbiditate redusă. În
condiţii patologice, serurile cu un conţinut ridicat în globuline din fracţiile beta şi
gama prezintă turbiditate accentuată.
Interpretare. Serurile normale dau turbidităţi echivalente cu 1 - 4 unităţi
MacLagan. Testul este considerat slab pozitiv între 5 - 10 unităţi MacLagan şi net
pozitiv pentru valori mai mari de 10 unităţi.
Testul este sensibil pentru leziuni hepatocelulare (ex. hepatite acute virale,
toxice) şi permite diferenţierea de icterul prin obstrucţie. De asemenea, testul poate fi
pozitiv şi în boli nehepatice asociate cu hiperglobulinemie.

3. Testul Kunkel
Principiu. Serurile care cuprind cantităţi crescute de gama globuline devin
opalescente în prezenţa ionilor Zn2+ la pH 7,5. Turbiditatea rezultată este măsurată
spectrofotometric, iar extincţia obţinută este interpolată pe curba de etalonare cu sulfat
de bariu (vezi testul MacLagan), rezultatele exprimându-se în unităţi MacLagan.
Valorile normale (test Kunkel negativ) sunt cuprinse între 2 - 8 unităţi. Serurile
hiperlipemice dau rezultate fals pozitive.
Interpretare. Testul Kunkel este mult mai sensibil decât testul MacLagan în
ceea ce priveşte o creştere a fracţiunii gama globulinelor serice. Acest test se
pozitivează în cazul bolilor hepatice cronice (ex. hepatita cronică, ciroza hepatică).
De asemenea, testul prezintă avantajul de a da valori negative sau joase în icterul
obstructiv extrahepatic.

Fibrinogenul

Fibrinogenul este o proteină plasmatică cu masa moleculară 330 - 340 kdal

şi pH izoelectric 5,3. Mobilitatea electroforetică este beta - gama. Este factorul
plasmatic I al coagulării.
Fibrinogenul este precursorul fibrinei, proteină insolubilă, care formează
cheagul sanguin. Transformarea fibrinogenului în fibrină are loc prin detaşarea
hidrolitică a două peptide (fibrinopeptidul A cu 16 resturi de aminoacizi şi
fibrinopeptidul B cu 14 resturi de aminoacizi) sub acţiunea catalitică a trombinei,
aceasta din urmă rezultând din protrombină, sub acţiunea ionilor Ca 2+ şi a altor
factori ai coagulării. Moleculele de fibrină solubilă (monomeri) se asociază în număr
255
mare, dând naştere fibrinei insolubile, care formează un gel. Sub acţiunea factorului
XIII (factorul stabilizator al fibrinei), fibrina polimerică este stabilizată prin
realizarea de legături covalente încrucişate între lanţuri. Urmează apoi sinereza
(retracţia) cheagului (cu participarea trombosteninei plachetare) şi excluderea serului
din ochiurile reţelei de fibrină.
Concentraţia plasmatică a fibrinogenului este cuprinsă în mod normal între 200 -
400 mg/dl (2 - 4 g/l). Faţă de aceste valori de referinţă, în practica medicală pot fi întâlnite
hiperfibrinogenemii, hipofibrinogenemii şi afibrinogenemia.
Hiperfibrinogenemia este consecinţă a proceselor inflamatorii acute (ex.
pneumonii, tuberculoza, septicemii şi alte boli infecţioase, reumatism articular acut
şi alte boli reumatismale, traumatisme, intervenţii chirurgicale), neoplaziilor,
afecţiunilor coronariene. Fibrinogenul face parte din grupul proteinelor plasmatice
de fază acută şi creşteri peste valorile de referinţă sunt corelate cu creşterea vitezei
de sedimentare a hematiilor.
Hipofibrinogenemiile sunt semnalate în afecţiuni hepatice grave (ex. atrofia
galbenă acută, ciroza hepatică, hepatite acute toxice) când funcţia biosintetică a ficatului
este sever compromisă, în inaniţie şi afecţiuni care determină scăderea absorbţiei
intestinale a aminoacizilor. Dozarea fibrinogenului prezintă un interes deosebit în
obstetrică. Desprinderea prematură a placentei sau moartea fătului în uter determină
trecerea în plasma maternă a unor cantităţi mari de substanţe care accelerează
transformarea fibrinogenului în fibrină. După o primă fază de hipercoagulabilitate
(coagulare intravasculară diseminată), în urma scăderii drastice a fibrinogenemiei la
valori de 50 - 70 mg/dl apare pericolul unor hemoragii severe prin hipocoagulabilitate
sanguină.
Afibrinogenemia este o afecţiune genetică având transmitere recesivă,
caracterizată prin deficitul biosintezei acestui factor al coagulării.
Principiul metodei de dozare. Se recoltează sângele pe anticoagulant şi se
separă plasma prin centrifugare. Plasmei diluate cu ser fiziologic i se adaugă
trombină sau ioni Ca2+ (în exces, pentru a depăşi cantitatea de anticoagulant) pentru
transformarea fibrinogenului în fibrină insolubilă. Se separă precipitatul de fibrină,
se spală cu ser fiziologic şi apoi se dizolvă în mediu alcalin. În soluţia obţinută se
dozează fibrina prin reacţia de culoare cu reactiv biuret. Se măsoară absorbanţa
coloraţiei obţinute şi se compară cu aceea a unei soluţii standard de proteine.

256
 7. COMPUŞI AZOTAŢI

Ureea

Ureea reprezintă termenul final al catabolismului azotului proteic. Este forma

de detoxifiere şi eliminare a amoniacului rezultat în finalul proceselor de dezaminare-
transaminare ale aminoacizilor. După cum este cunoscut, numai o cantitate extrem de
mică de amoniac este transportată în sânge în formă liberă, fapt reflectat de
concentraţia plasmatică redusă (10 - 20 micrograme/dl). Cea mai mare parte este
vehiculată sub formă de glutamină care se obţine din acid glutamic şi amoniac în
prezenţa glutamin-sintetazei, enzimă ubicuitară (reacţia necesită ATP). Ficatul şi
rinichiul captează glutamina din sânge şi deoarece dispun în mod specific de
glutaminază, aceasta catalizează hidroliza ireversibilă a glutaminei, cu formare de acid
glutamic şi amoniac. Amoniacul astfel format în celulele tubulare renale, difuzează
prin membrană la polul urinar al acestor celule şi, acceptând protoni, se transformă în
ioni amoniu NH4+, care sunt eliminaţi, contribuind în acest fel la menţinerea rezervei
alcaline a plasmei.
Amoniacul eliberat din glutamină în ficat, la care se adaugă amoniacul adus
de sângele portal de la intestin este transformat în uree printr-un lanţ ciclic de reacţii
(ciclul ureogenetic Krebs-Hanseleit). Sinteza ureei implică un consum important de
energie obţinuta din hidroliza ATP (echivalentul a patru legături macroergice per
mol de uree). Justificarea acestui important consum energetic este reprezentată de
toxicitatea mare a amoniacului pentru toate tipurile celulare şi în special pentru
celulele nervoase, ureea fiind un compus cu toxicitate redusă şi în plus, datorita
hidrosolubilităţii, poate fi transportat în cantităţi relativ mari în sânge, în formă
liberă, pentru a fi eliminată pe cale renală.
Valorile de referinţă pentru concentraţia plasmatică a ureei sunt de 20 - 40 mg/dl
(pentru metoda cu diacetilmonoximă este acceptată valoare maximă 53 mg/dl) sau 7 -
18 mg/dl azot ureic. Ureea este o substanţă fără prag de eliminare renală, astfel încât
toată cantitatea sintetizată de către ficat este excretată în condiţiile unei funcţii renale
normale. Eliminările zilnice de uree sunt de 20 - 35 g.
Modificări ale concentraţiei plasmatice normale a ureei pot fi consecinţa fie a
scăderii sintezei hepatice, fie a afectării excreţiei renale. Creşteri ale concentraţiei
plasmatice a ureei pot surveni în: afecţiuni renale însoţite de retenţie azotată, stări
febrile (prin hipercatabolism proteic), arsuri, ingestie crescută de proteine (tranzitor).
Scăderi ale concentraţiei ureei pot fi consecinţa alterării funcţiei hepatice de sinteză
(necroza hepatică toxică, atrofia acută galbenă) sau unor deficienţe genetice ale
enzimelor cheie ale ciclului ureogenetic (carbamilfosfat-sintetaza, OCT, arginaza).

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

257
 Dozarea ureei în ser

1. Metoda Berthelot (clasică, cu urează).

Principiu. Ureea din ser este hidrolizată sub acţiunea ureazei la amoniac şi
dioxid de carbon. Amoniacul eliberat formează cu fenolul şi hipocloritul de sodiu p-
chinonclorimina, care reacţionează cu încă o moleculă de fenol, formând indofenolul
de culoare albastră, fotometrabil.

OH
-
O O
-
HO
NH4+ + 5 NaOCl + + 5 NaCl + 5 H 2O
N
fenol indofenol

2. Metoda cu diacetilmonoximă (standardizată)

Principiu. Ureea condensează în mediu acid cu diacetilmonoxima în
prezenţa clorurii ferice şi a tiosemicarbazidei, rezultând un complex colorat roşu,
fotometrabil.

Reactivi
1. Ser diluat 1:10
2. Standard uree
3. Reactiv combinat [H2SO4 1M, H3PO4 4M, FeCl3 1,8mM, tiosemicarbazidă
0,66mM]
4. Diacetilmonoximă 59,5mM

Modul de lucru
În 3 eprubete se pun:
Proba Standard Blanc
Ser diluat 1:10 0,1 ml - -
Standard uree - 0,1 ml -
(50 mg/dl)
Apă distilată - - 0,1 ml
Reactiv combinat 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml
Diacetilmonoximă 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Se ţin 8 min pe baia de apă la fierbere, după care se răcesc
sub jet de apă 3-5 min. Se citesc extincţiile la 520 nm faţă
de blanc

Calcul: Uree (mg/dl) = EP/ES x 50

3. Dozare enzimatică cinetică în UV (kit Medicarom)

258
 Principiu. Ureea este hidrolizată în prezenţa ureazei şi a apei, obţinându-se
amoniac şi dioxid de carbon. Amoniacul se combină cu alfa-cetoglutarat şi NADH
în prezenţa glutamat dehidrogenazei, rezultând L-glutamat şi NAD.
Valori de referinţă: 10 - 50 mg/dl (1,7 - 8,3 mmol/dl) în ser şi 20 - 35 g/24
ore (333 - 583 mmol/24 ore) în urină. Testul este linear până la 200 mg/dl în ser şi
până la 200 mg/l în urină.

Creatina şi creatinina

Creatina este sintetizată în rinichi, ficat şi pancreas şi apoi este transportată

de către sânge la muşchi şi creier, unde este fosforilată de către creatinkinază
(CK) la fosfocreatină, compus macroergic ce constituie o rezervă energetică
utilizabilă în timpul contracţiei musculare şi pentru menţinerea activităţii
cerebrale. Raportul creatină/fosfocreatină creşte în cursul activităţii
musculare prin utilizarea fosfocreatinei ca sursă de fosfat macroergic. În
perioadele de repaus muscular, raportul scade prin refacerea fosfocreatinei.
NH2 NH~PO3H2
CPK
HN C + ATP HN C + ADP
N CH2 COOH N CH2 COOH
CH3 Creatinã CH3 Creatin fosfat
NH2 NH CO
HN C HN C
N CH2 COOH N CH2
H2O CH3 Creatininã
CH3 Creatinã

O parte din creatina şi fosfocreatina din muşchi se transformă spontan în

creatinină (1 - 2% zilnic). Creatinina provine numai din metabolismul muscular şi
cantitatea formată depinde numai de masa musculară totală, fiind componentul
azotat al sângelui cel mai puţin variabil. Valorile de referinţă pentru concentraţia
creatininei în ser sunt 0,6 - 1,2 mg/dl (53 - 106 micromol/l) la bărbaţi şi 0,5 - 1,1
mg/dl (44 - 97 micromol/l) la femei.
Creatinina este un component excretat exclusiv pe cale renală prin filtrare
glomerulară şi în insuficienţele renale creşterea creatininei serice precede creşterea
azotului neproteic total. Eliminările renale de creatinină constituie de asemenea o
modalitate de menţinere la nivel constant a rezervelor de grupări metil din organism.
În distrofiile musculare, prin intensificarea catabolismului muscular, nivelul
creatininei serice creşte în etapa acută, pentru ca ulterior acesta să scadă prin
distrugerea masei musculare.
Determinările de creatinină serică şi urinară sunt folosite în vederea calculării
clearance-ului de creatinină. Acesta este un indicator al ratei de filtrare glomerulară,
în funcţie de care poate fi apreciată funcţia renală.

259
 ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Dozarea creatininei serice

Poate fi efectuată printr-o metodă clasică spectrofotometrică (metoda Jaffé)
sau prin cromatografie de înaltă performanţă în fază lichidă (HPLC), metodă ce
asigură o mare specificitate.
Principiu. Proteinele serice sunt precipitate cu acid picric şi supernatantul clar
obţinut după îndepărtarea precipitatului, prin alcalinizare cu NaOH dezvoltă o
coloraţie roşie fotometrabilă. Coloraţia roşie este datorată unui complex dintre acidul
picric şi creatinină (reacţia Jaffé):

O2N O2 N O -
NH CO NH C O
+
NaOH -. + Na
NO2 + HN C N O H2N C
N CH2 N CH
O2 N OH CH3 O2N O CH3
Acid picric Creatininã

Reactivi
1. Filtrat
2. Standard creatinină
3. Acid picric 1,2g/dl
4. NaOH 5g/dl
5. Apă distilată

Modul de lucru
În 3 eprubete se pun:
Proba Standard Blanc
Filtrat 2,5 ml - -
Standard creatinină - 0,5 ml -
260
 (2 mg/dl)
Acid picric 1,2g/dl - 2 ml 2 ml
NaOH 5g/dl 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Apă distilată 1 ml 1 ml 1,5 ml
Se agită şi se lasă 10-15 min, agitând din când în când.
Se citesc extincţiile la 520 nm faţă de blanc
Calcul: Creatinina (mg/dl) = EP/ES x 2

Bilirubina
Bilirubina este catabolitul hemului din hemoglobină şi alte hemoproteine.
Catabolismul hemoglobinei eritrocitare începe odată cu ruperea membranelor celulare
îmbătrânite (durata medie de viaţă a eritrocitelor este de 120 zile). Corespunzător
celulelor ce se distrug, la un om adult se degradează zilnic aproximativ 6 g
hemoglobină, formându-se 250 - 350 mg bilirubină. Hemoglobina eliberată în plasmă
este fagocitată de macrofagele sistemului reticulo-endotelial, în special ale ficatului,
splinei şi ganglionilor limfatici, sediile principale ale catabolismului.
Catabolismul hemului începe înainte de desprinderea acestuia de componenta
proteică şi constă în deschiderea pe cale oxidativă a inelului porfirinic. Procesul
oxidativ implică atomul de carbon alfa metinic şi atomii de carbon alfa din nucleele
pirolice I şi II, asupra cărora acţionează hemoxigenaza microzomială, necesitând
oxigen molecular, NADPH şi citocrom P450. Rezultă ca intermediar alfa-hidroxi-
hemina.
Sub acţiunea în continuare a oxigenului, nucleul porfirinic este scindat, chiar şi
neenzimatic, atomul de carbon metinic fiind oxidat la CO, iar atomii de carbon alfa
din nucleele pirolice I şi II sunt oxidaţi la grupări carbonil. Compusul aciclic oxidat
al hemului, ce este încă legat de globină, se numeşte verdoglobină. Prin desprinderea
fierului şi a globinei este obţinut în continuare un compus tetrapirolic liniar,
biliverdina (pigment verde).
Ulterior, biliverdina este redusă sub acţiunea biliverdin- reductazei la bilirubină,
pigment galben, liposolubil. Globina este hidrolizată la aminoacizi, iar fierul este
transportat sub formă de transferină la locurile de depozit.
Transformarea hemului în bilirubină la nivelul macrofagelor tegumentare
poate fi observată cu uşurinţă urmărind evoluţia coloraţiei hematoamelor de la roşu
către violaceu (desaturarea Hb în oxigen), apoi spre verzui (formare de biliverdină)
şi apoi galben (bilirubină).

261
 M V M P P M M V
SRO
NADP+
O N CH N CH 2 N CH O
N
H H H H
Biliverdin Bilirubinã
reductazã

NADPH M V M P P M M V

O N CH N CH N CH O
N
H H H
Biliverdinã

M V
NADP+
CO
HC CH
NADPH
M N M
Fe3+
N Fe2+ N
Hemoxigenaza Fe-ATP-azã
P N V
HC CH NADPH Citocrom
P450 reductaza

P M
Reticul endoplasmic
Hem
Degradarea hemului la bilirubinã

262
 Bilirubina astfel formată circulă în sânge, fiind transportată la ficat, sub
forma unui complex solubil bilirubină-albumină. Albumina serică are mai multe
locuri de legare a bilirubinei, în situsul principal fiind esenţiala prezenţa unui rest
de Lys. Legarea bilirubinei este influenţată de pH şi este limitată (cca. 25 mg).
Dacă bilirubina produsă în alte ţesuturi decât ficatul depăşeşte capacitatea de
transport, ea difuzează în ţesuturi. Legarea bilirubinei de albumină poate fi inhibată
competitiv de: sulfamide, unele antiinflamatoare, substanţe de contrast utilizate în
colangiografie, acizi graşi liberi în cantităţi mari. Deşi bilirubina este legată destul
de puternic de albumină, ea poate fi extrasă cu uşurinţă din sânge de către ficat.
Albumina transportoare rămâne în plasmă după pătrunderea bilirubinei în
hepatocite. Bilirubina traversează membrana hepatocitului sub formă ionizată,
printr-un proces de difuziune facilitată, proces care este inhibat competitiv de
analogi structurali ai bilirubinei, aflaţi sub formă de dianioni.
În hepatocit bilirubina este complexată de două proteine citoplasmatice, Y
(ligandina) şi Z, pentru a se evita ieşirea ei din hepatocite sau pătrunderea în organitele
celulare (fiind demonstrată inhibarea respiraţiei mitocondriale). La nivel hepatic are
loc conjugarea bilirubinei cu acidul glucuronic sub acţiunea UDP-glucuronil
transferazelor. Bilirubina conjugată include bilirubin-monoglucuronid, care
predomină în ficat, şi bilirubin-diglucuronid, preponderent în lichidul biliar. Împreună
reprezintă bilirubina conjugată. Activitatea UDP-glucuronil transferazelor este indusă
de unele medicamente (ex. fenobarbitalul).

HOOC C6H7 O CO CO O C6H7 COOH

CH 2 CH 2
Transferazã M V M CH 2 CH 2 M M V
Bilirubinã + 2 Acid UDP-
glucuronic
2 UDP O N CH N CH 2 N CH N O
H H H H
Bilirubin - diglucuronid
Conjugarea bilirubinei cu acid glucuronic

Bilirubina conjugată este transportată activ în canaliculele biliare. Mecanis-

mul de transport este limitativ, deoarece capacitatea de transport este depăşită de
capacitatea de conjugare. Din canaliculele biliare, bilirubina conjugată este deversată
împreună cu bila în căile biliare principale şi de aici în intestin, unde au loc ultimele
etape ale degradării hemului. În ileonul terminal şi în intestinul gros, resturile de acid
glucuronic sunt îndepărtate sub acţiunea unor enzime produse de către flora
bacteriană intestinală, beta-glucuronidaze, iar bilirubina este supusă în continuare
unor reduceri succesive catalizate de reductaze cu aceeaşi origine.

263
Captarea hepatică, glucuronoconjugarea şi excreţia activă a bilirubinei conjugate
(REN=reticul endoplasmatic neted, ABC/TA=sistem acceptor de bilirubină
conjugată şi transport activ transmembranar)

Bilirubinã conjugatã

Acid glucuronic

Bilirubinã
+4H
M V M P P M M V

+4H
HO N CH 2 N CH 2 N CH 2 OH
N
H H H H
Mezobilirubinogen
M V M P P M M V

-2H
HO N CH 2 N CH 2 N CH 2 OH
N
H H H H
M E M P P M M E
Stercobilinogen

HO
-2H
N CH 2 N CH N CH 2 N OH
H H H
Urobilinã IX  M V M P P M M V

HO N CH 2 N CH N CH 2 OH
N
H H H
Stercobilinã
Reducerea bilirubinei

264
 Primul compus obţinut prin reducere este necolorat (datorită absenţei unei
conjugări electronice pe suprafaţa moleculei, respectiv a absenţei conjugării dublelor
legături din structură) şi poartă numele de mezobilirubinogen, care se reduce în
continuare, la un alt compus incolor, urobilinogen . O mică parte a acestuia este redusă
în continuare la stercobilinogen, de asemenea incolor. Stercobilinogenul şi în mică parte
urobilinogenul sunt eliminaţi prin fecale. În contact cu aerul sunt oxidaţi la compuşi
coloraţi denumiţi stercobilină şi respectiv urobilină.
Cea mai mare parte a urobilinogenului este reabsorbită din intestin şi ajunsă
prin circulaţia portală la ficat (circuit entero-hepatic) este reexcretată prin bilă. O
mică parte din urobilinogenul reabsorbit scapă prin venele suprahepatice în circulaţia
sistemică şi este excretat pe cale renală, în urină (0-4 mg/24 ore). Absenţa
urobilinogenului în fecale şi urină indică obstrucţia completă a canalului biliar.
Bilirubina serică este reprezentată în mod normal majoritar de bilirubina
neconjugată, vehiculată de serumalbumină. La adult, concentraţia acesteia are valori
de 0,2 - 0,7 mg/dl (max. 12 micromol/l). Bilirubina conjugată, chiar dacă poate apare
în ser, nu depăşeşte în mod normal 0,1 - 0,4 mg/dl (max. 7 micromol/l). Împreună, cele
două forme constituie bilirubina serică totală cu valori de referinţă de 1,1 - 1,2 mg/dl
(3,5 - 19 micromol/l).

Metabolismul bilirubinei şi soarta

pigmenţilor biliari în tractul digestiv
La naştere, datorită imaturităţii
sistemului de conjugare şi transport
canalicular, bilirubinemia este mai ridicată
decât la adult, cuprinzând atât bilirubină
neconjugată, cât şi conjugată.
Nu se cunosc cazuri de scădere marcată
a bilirubinemiei sub limita inferioară. În
schimb, sunt frecvente cazurile depăşirii
limitei superioare, caz în care bilirubina
difuzează din sânge în ţesuturi, producând
colorarea intensă în galben a pielii şi
mucoaselor (sindrom icteric). Icterul se
manifestă clinic atunci când bilirubinemia depăşeşte 2,5 mg/dl.
Hiperbilirubinemiile pot fi clasificate în trei tipuri:
I. Hiperbilirubinemii cu bilirubină predominant neconjugată (de retenţie):
a)Icterul neonatal (fiziologic al nou-născutului) are drept cauză hemoliza accentuată,
corelată cu imaturitatea ficatului de a prelua, conjuga şi excreta bilirubina.
Bilirubinemia poate depăşi 20 mg/dl, iar bilirubina neconjugată poate traversa
bariera hemato-encefalică, producând encefalopatia toxică (kernicter); b)
Sindroamele Crigler-Najjar tip I şi II reprezintă defecte ereditare cu transmitere
autosomal recesivă, respectiv dominantă în sinteza UDP-glucuronil transferazelor;
265
c) Boala Gilbert include un grup heterogen de afecţiuni cauzate de captarea
defectuoasă a bilirubinei de către ficat şi activităţii reduse a UDP-glucuronil
transferazelor; d) Hiperbilirubinemia toxică este secundară intoxicaţiilor ce
afectează ficatul (cloroform, CCl4, etc.); e) Icterul hemolitic, produs prin creşterea
hemolizei (distrucţii masive ale eritrocitelor), are drept consecinţe, doar în primele
stadii ale sale, creşterea numai a bilirubinemiei neconjugate şi anemia hemolitică,
celulele hepatice fiind încă normale şi căile biliare libere.
II. Hiperbilirubinemii cu bilirubină predominant conjugată (de regurgitare): a)
Icterul colestatic (obstructiv sau „mecanic”) are drept cauză acumularea bilirubinei
conjugate în sânge şi difuzarea ei în ţesuturi, ca urmare a blocării parţiale sau totale
a drenării canalelor biliare. Mai frecvent blocarea se produce prin formare de calculi
biliari (litiază biliară), tumori sau consecutiv inflamaţiei (ca de exemplu, în hepatitele
virale colestatice). Dacă obstrucţia este totală, scaunul este decolorat, prin absenţa
urobilinogenului; b) Icterul idiopatic cronic (sindromul Dubin-Johnson) este un
defect genetic ce interesează structurile implicate în transportul bilirubinei conjugate
din hepatocite în capilarele biliare; c) Sindromul Rotor este o variantă a sindromului
precedent.
În colestazele prelungite, bilirubina conjugată poate forma un complex
ireversibil cu albumina serică datorită unei legături covalente amidice dintre
radicalul propionil al bilirubinei şi gruparea epsilon-amino a unui rest de lizină din
albumină. Acest tip de bilirubină se numeşte bilirubina delta (biliproteina) şi nu se
excretă prin rinichi. Aceasta are un timp de injumătăţire de 15-20 zile, de aceea
rămâne detectabilă în ser până la câteva săptămâni după eliberarea căii biliare sau în
timpul convalescenţei după boli hepatocelulare cu componentă colestatică.
III. Hiperbilirubinemii mixte: a) Icterele hepatocelulare apar ca o consecinţă
a unor suferinţe hepatice diverse (hepatite acute virale, pusee evolutive ale
hepatitelor cronice, ciroze hepatice), fiind afectate captarea, glucuronoconjugarea,
precum şi excreţia bilirubinei; b) Icterul hemolitic se produce în boli de diverse
etiologii, caracterizate prin distrugere importantă, în timp relativ scurt a unui număr
mare de hematii, aşa cum s-a menţionat anterior. În stadiile avansate ale hemolizei
însă, cresc atât bilirubinemia neconjugată cât şi cea conjugată deoarece se produce o
anemie hemolitică importantă care va avea drept consecinţă hipoxia hepatocitelor cu
afectarea vitală a acestora. Astfel, icterul care la început a fost pur hemolitic va
căpăta o patogenie mixtă prin adăugarea factorului hepatocelular.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Dozarea bilirubinei în ser (metoda Van den Bergh)

Principiu. Bilirubina prin cuplare cu acidul diazobenzensulfonic formează un
compus azoic colorat roşu. Bilirubina conjugată, hidrosolubilă, reacţionează rapid cu
reactivul diazo şi de aceea, acestei forme a bilirubinei i se spune şi bilirubină directă,
respectiv reacţia fiind denumită directă sau rapidă. Bilirubina neconjugată, vehiculată de
albumină, reacţionează încet cu reactivul diazo, sau reacţionează rapid după
266
deproteinizare. Acestei forme a bilirubinei i se mai spune şi indirectă, respectiv reacţia
fiind denumită indirectă sau lentă. În laboratoarele clinice se practică dozarea bilirubinei
totale şi a celei directe, concentraţia celei neconjugate fiind calculată prin diferenţă.

Reactivi:
1. Alcool metilic
2. Ser diluat 1:10
3. Standard bilirubină
4. Apă distilată
5. Reactiv diazo

Modul de lucru
În 3 eprubete se pun:
Proba Standard Blanc
Alcool metilic 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml
Ser diluat 1:10 2 ml - -
Standard bilirubină - 2 ml -
(0,2 mg/dl)
Apă distilată - - 2 ml
Reactiv diazo 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Se agită şi se lasă să reacţioneze 15 minute.
Se citesc extincţiile la 530nm faţă de blanc.
Calcul: Bilirubina (mg/dl) = EP/ES x 10 x 0,2

Acidul uric

La om, acidul uric (2,6,8 trihidroxipurina) reprezintă produsul final de

catabolism al nucleozidelor cu baze azotate purinice, adenozina şi guanozina.
Purinele rezultate din catabolismul acizilor nucleici proveniţi din dietă sunt
transformate direct în acid uric. Totuşi, majoritatea acidului uric excretat urinar
provine din degradarea acizilor nucleici endogeni. Reutilizarea bazelor purinice,
cunoscută drept „calea de salvare a purinelor”, presupune fosforibozilarea bazelor
libere şi conduce la resinteza nucleozid-monofosfaţilor. La primatele inferioare şi
alte mamifere, etapa finală a catabolismului bazelor purinice o constituie formarea
din acid uric a alantoinei sub acţiunea uricazei. La om aproximativ 75% din
cantitatea de acid uric sintetizată este excretată pe cale urinară; din restul, cea mai
mare parte este secretată în tractul gastro-intestinal unde, sub acţiunea enzimelor
bacteriene, este degradată la alantoină şi compuşi înrudiţi.
În excreţia acidului uric intervin procesele renale de filtrare glomerulară,
reabsorbţie la nivelul tubilor contorţi proximali, secreţie urmată de reabsorbţie în
tubii distali. Excreţia urinară netă reprezintă 6-12% din cantitatea filtrată glomerular.

267
 Proprietăţile fizico-chimice ale acidului uric determină concentraţiile
acestuia în sânge, la nivel tisular precum şi renal. Acidul uric posedă două grupări
funcţionale cu caracter acid, una cu pKa=5,75 şi alta cu pKa=10,3. Acest fapt
determină existenţa acidului uric în plasmă şi lichidele interstiţiale ca sare
monosodică, iar în urină predominant în forma acidă. Acidul uric este o substanţă
uşor oxidabilă şi datorită capacităţii sale de a capta radicali liberi derivaţi din oxigen
este considerat factor protector faţă de agresiunea oxidativă.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ
Dozarea acidului uric în ser
1. Metoda cu acid fosfowolframic. Acidul uric reduce acidul fosfowolframic la
compuşi coloraţi albastru, fotometrabili.
2. Metoda Trinder (enzimatică cu uricaza). Enzima oxidează acidul uric şi dă naştere
ca produs secundar la H2O2. Concentraţia de H2O2 se determină prin Metoda Trinder.
H2O2 sub acţiunea peroxidazei dă naştere la oxigen născând. În prezenţa oxigenului
reactivii de culoare (2,4-DCPS şi 4-aminoantipirina) dau naştere unui compus colorat
în roşu-purpuriu (chinonimina).
268
 Reactivi
1. Ser
2. Standard acid uric
3. Reactiv enzimatic
4. Apă distilată
Modul de lucru
În 3 eprubete se pun:
Proba Standard Blanc
Ser 0,4 ml - -
Standard acid uric (6 mg/dl) - 0,4 ml -
Apă distilată 2 ml 2 ml 2,4 ml
Se preincubează 3 min la 37C, după care se adaugă reactivul lăsând eprubeta
în termostat
Reactiv enzimatic 2 ml 2 ml 2 ml
Se lasă 10 minute la 37C După răcire se
citesc extincţiile la 520nm faţă de blanc.
Calcul: Acid uric (mg/dl) = EP/ES x 6

Valori de referinţă:
3,4 – 7 mg/dl la bărbaţi
2,5 – 6 mg/dl la femei

Interpretarea rezultatelor. Hiperuricemiile pot fi primare, determinate de defecte

metabolice ereditare şi secundare, consecutive altor afecţiuni. Dintre hiperuricemiile
primare cele mai cunoscute sunt guta si sindromul Lesch-Nyhan.
Guta metabolică primară este cauzată de o sinteză crescută a acidului uric
datorată unei dereglări a sintezei nucleozidelor şi nucleotidelor purinice. Se manifestă
prin depunerea de cristale de urat de sodiu la nivelul articulaţiilor ce determină o reacţie
inflamatorie dureroasă (artropatia gutoasă). Depunerea acestor cristale la nivel renal
determină litiază urică. În ţesuturile moi se acumulează conglomerate cristaline de urat de
sodiu (tofi gutoşi). Sindromul Lesch-Nyhan este determinat de deficienţa totală a
hipoxantin-guanin fosforibozil transferazei, enzima cheie în calea de reutilizare a
purinelor, manifestându-se prin hiperuricemie severă, agresivitate, tendinţă la automu-
tilare, deficit mental.
Hiperuricemiile secundare se datorează fie unor afecţiuni ce determină în mod
secundar hiperproducţie de acid uric (glicogenoza tip I - boala von Gierke, neoplazii,
leucemii, arsuri, iradieri), fie unei excreţii renale defectuoase (insuficienţă renală cronică,
glomerulonefrită cronică, uropatie obstructivă, etc.).
Hipouricemia (< 2mg/dl) este mai rar constatată, putând fi consecinţa unor
afecţiuni hepatice grave, reabsorbţiei renale deficitare, xantinuriei ereditare.

269
270
 VII. ANALIZA URINII

Introducere

Funcţia de ansamblu a rinichiului este reprezentată de menţinerea

constantelor mediului intern al organismului, constante care sunt supuse în mod
continuu modificărilor determinate de procesele metabolice şi aportul exogen de
alimente, apă, săruri minerale, etc. Prin urina pe care o formează, rinichii
îndeplinesc un rol important în reglarea metabolismului apei şi electroliţilor,
menţinerea echilibrului acido-bazic, eliminarea produşilor finali ai metabolismului
general, precum şi a substanţelor toxice din organism. Aceste funcţii sunt realizate
de către rinichi prin trei procese fundamentale: filtrare glomerulară, reabsorbţie
selectivă tubulară, secreţie activă tubulară.
În urma procesului de ultrafiltrare glomerulară se obţine urina primară, care
se deosebeşte de compoziţia plasmei prin lipsa proteinelor şi a lipidelor.
Urina finală se formează din urina primară, în timpul trecerii acesteia prin
sistemul tubular al nefronilor, prin secreţie activă, reabsorbţie selectivă, acidifiere,
diluţie sau concentrare.
Unitatea morfo-funcţională a rinichiului, în care se formează urina este
nefronul.
Irigarea cu sânge a rinichilor este de aproximativ 1500 litri pe zi (900 - 1200
ml pe minut), iar cantitatea de urină finală este de numai 800 - 1500 ml pe zi (0,5 -
1 ml pe minut).
În condiţii normale, la nivelul rinichiului este elaborată o urină ce reflectă
starea fiziologică a organismului. Urina este un lichid biologic de excreţie, cu
compoziţie complexă. În condiţii fiziologice, proprietăţile fizico-chimice şi
compoziţia urinii variază în funcţie de cantitatea şi felul alimentaţiei. Alterarea
funcţiilor renale se traduce prin incapacitatea rinichilor de a păstra homeostazia
mediului intern. În aceste condiţii, pot fi modificate proprietăţile fizico-chimice ale
urinii, apărând diferite substanţe cu semnificaţie patologică. Acesta este motivul
pentru care examenul de laborator al urinii constituie o investigaţie fundamentală
pentru diagnosticul afecţiunilor renale sau extrarenale. PrÎntr-un examen complet al
urinii şi printr-o interpretare judicioasă a rezultatelor acestuia în corelaţie cu valorile
concentraţiilor sanguine ale constituenţilor urmăriţi, se poate pune un diagnostic
corect.
Examenul de laborator al urinii include examenul macroscopic, microscopic
şi fizico-chimic.
În cadrul analizelor de laborator efectuate pentru urină se vor urmări
investigaţiile cerute în cazul examenului sumar de urină care implică, pe lângă
examenul macroscopic şi microscopic, cercetarea calitativă a unor componente care
apar în urină în condiţii patologice.

271
 Compoziţia normală a urinii la adult:
Substanţe Concentraţia Oligoelemente Concentraţia
azotate (g/l) (mg/l)
Uree 15 - 35 Aluminiu 0,03 - 0,07
Acid uric 0,5 - 1 Plumb 0,007 - 0,015
Creatină urme Bor 6 - 14
Creatinină 0,75 - 2 Brom 2 - 3,5
Indican 0,006 Iod 0,75
Acid hipuric 0,5 Fluor 0,2 - 1
Aminoacizi 0,7 - 1,6 Cobalt 0,002
Amoniac 0,4 - 1,3 Cupru 0,001 - 0,004
Proteine 0,02 - 0,03 Litiu 0,4
Urocrom 0,5 Mangan 0,007 - 0,015
Glutation urme Nichel 0,1 - 0,18
Baze purinice 0,2 - 0,5 Zinc 0,15 - 0,5
Alantoină 0,07 - 0,12 Staniu 0,007 - 0,015
Catecolamine 0,08 Arsen 0,005
Derivaţi 0,2 Concentraţia
Ioni minerali
imidazolici (g/l)
Glicociamină 0,009 - 0,05 Na+ 3-5
Fenoli 0,12 - 0,18 K+ 1,6 - 3
Substanţe reducă- 0,35 - 1
toare totale (expri- Ca2+ 0,15 - 0,3
mate ca glucoză)
Histamină 0,0001 Mg2+ 0,1 - 0,2
Colină 0,0007 - 0,007 Cl- 4,6 - 9,2
Acid glucuronic 0,3 mg/l HPO42- 1 - 1,5
Azot total 0,13 - 0,45 /kgc SO42- 1,8 - 2,5

Substanţe organice neazotate Concentraţia (mg/l)

Glucoză 100 - 300
Lipide 6
Acizi organici, din care: 700 - 800
- Acid citric 450 - 750
- Acid lactic 70
- Acid oxalic 25 -70
- Acid succinic 1,2 – 8
- Acid malic urme
- Acid alfa-cetoglutaric urme
Corpi cetonici 7 - 15 max. 35 mg (acetonă)

272
 În ceea ce priveşte determinarea cantitativă a anumitor componenţi urinari
anorganici (sodiu, potasiu, calciu, clor, etc.) sau organici (proteine, glucide, acid uric,
etc.), metodele de dozare sunt, în principiu, aceleaşi cu cele ale constituenţilor
respectivi din sânge. În cazul în care se urmăreşte cantitatea unui anumit component
urinar, dozarea trebuie făcută în urina colectată timp de 24 ore, întrucât excreţia unor
constituenţi este supusă unui ritm circadian. Dozările diferiţilor constituenţi urinari se
efectuează după o diluţie convenabilă a urinii şi dacă este cazul, după o prealabilă
deproteinizare.
Recoltarea şi conservarea urinii se efectuează imediat după emisie, în vase
de sticlă ce ulterior vor fi acoperite, spălate cu o soluţie de carbonat de sodiu şi apoi
clătite bine cu apă distilată.
Pentru examenul sumar al urinii se foloseşte prima urină de dimineaţă, urină
ce prezintă concentraţia maximă. Pentru examenul cantitativ se foloseşte urina
colectată timp de 24 ore. Colectarea se face în următorul mod: după golirea vezicii
urinare de dimineaţă, se colectează toate emisiile urinare timp de 24 ore, inclusiv
urina din dimineaţa următoare (care este recoltată separat). Este importantă
determinarea volumului total, deoarece toate determinările cantitative vor fi
raportate la acesta.
Este recomandabil ca urina să fie examinată imediat după emisie, sau cel
mult după 2-3 ore de la recoltare. În caz contrar, se impune conservarea urinii, fie
prin congelare imediată sub -20oC, fie prin adăugarea unor substanţe conservante
care să nu modifice rezultatele examenului fizico-chimic, precum timol 10% în
izopropanol (5 ml pentru urina colectată timp de 24 ore), metil-4-hidroxibenzoat (1,5
g/l), toluen, cloroform, xilen.
Pentru identificarea glucidelor, urina trebuie să fie proaspătă şi recoltată la cel
puţin 48 ore după ce subiectului în cauză nu i s-a mai administrat nici un fel de
medicaţie. Pentru dozarea catecolaminelor şi a steroizilor se adaugă 5 ml HCl 10N la
urina din 24 ore (17-cetosteroizii nu pot fi determinaţi în urina conservată cu timol-
izopropanol). Pentru dozarea porfirinelor, se recomandă recoltarea urinii în sticle
brune şi determinarea imediat după recoltare (la urina din 24 ore se adaugă 5 g carbonat
de sodiu). Pentru dozarea electroliţilor, precum şi a altor componente urinare
(aminoacizi, proteine, creatinină, etc.), se recomandă conservarea cu timol. Pentru
conservarea elementelor morfologice ale sedimentului urinar, se recomandă adăugarea
de formaldehidă 40% (1 ml în 10 ml urină). Pentru examenul bacteriologic nu se
adaugă conservanţi, recoltarea făcându-se în mod steril.
Observaţii. Flora saprofită (bacterii şi ciuperci) acţionează asupra majorităţii
componenţilor urinari, cu excepţia electroliţilor, degradându-i. Din această cauză,
conservarea necorespunzătoare sau timp îndelungat a urinii poate duce la rezultate
eronate. Datorită slabei solubilităţi a toluenului, timolului şi a sărurilor organice de
mercur, nu se ating concentraţii bacteriostatice şi fungistatice eficiente. Pentru
creşterea eficienţei, toluenul se amestecă cu izopropanol, substanţă ce îi măreşte
solubilitatea.
Examenul macroscopic
273
 Volumul. Cantitatea de urină colectată timp de 24 ore este măsurată cu un
cilindru gradat. În condiţii normale, diureza medie la bărbaţi este de 1500 ml, iar la
femei de 1200 ml, dintre care 3/4 sunt eliminate diurn. Diureza în clinostatism este
mai mare decât în ortostatism. În condiţii fiziologice, volumul urinar din 24 ore
depinde de ingestia de lichide, alimentaţie, temperatura ambiantă, greutate corporală,
stare emoţională. Ingestia de cafea, ceai, băuturi alcoolice are efect diuretic.
Modificările diurezei se referă la:
- volumul de urină eliminat în 24 ore: poliurie, oligurie, anurie;
- ritmul eliminării: nicturie, opsiurie.
Poliuria reprezintă producerea unei cantităţi de urină ce depăşeşte 2 litri în
24 ore. Poate surveni în condiţii fiziologice (frig, umezeală, emoţii, consum excesiv
de lichide sau cafea), raportul nictemeral rămânând nemodificat, sau în condiţii
patologice (diabet insipid sau zaharat, hipertiroidie, administrare de diuretice, boli
renale, etc.). Nicturia este caracteristică pentru poliuriile de cauză renală.
Oliguria înseamnă producerea unei cantităţi de urină mai mică de 1 litru în
24 ore. În condiţii fiziologice, ingestia de cantităţi mici de lichide, pierderea excesivă
de apă prin transpiraţie sunt însoţite de oligurie. Aceasta poate însoţi însă şi anumite
afecţiuni (insuficienţă cardiacă, vărsături, diaree, hemoragii, şoc, hipotiroidism,
litiază renală).
Anuria reprezintă incapacitatea aproape totală a rinichiului de a produce
urină (se elimină totuşi cca. 150 ml pe 24 ore). Printre cauzele ce pot determina
anurie menţionăm: afecţiuni nefrotoxice, intervenţii chirurgicale pe abdomen, sondaj
uretral, după extracţii dentare.

Aspectul. Urina normală la emisie este limpede, transparentă. Aspectul poate

varia în funcţie de timpul trecut de la emisie, temperatura mediului ambiant, tehnicile
de conservare. La o examinare făcută după câteva ore, apare o suspensie sau un depozit
floconos (nubecula) compus din celule descuamate din tractul urinar, iar la femei şi
din celule ale epiteliului vaginal.
În cazul urinilor alcaline sau neutre, aspectul imediat după emisie poate fi
tulbure, datorită fosfaţilor de calciu şi magneziu. La temperaturi scăzute, urina se
tulbură din cauza cristalizării acidului uric şi a uratului acid de sodiu. Conservată
defectuos, urina formează depozite de carbonat calcic şi fosfat amoniaco-magnezian.
Pentru a diferenţia modificările patologice ale aspectului urinii de modificări
ce depind de factorii de mai sus se folosesc următoarele modalităţi:
- într-o eprubetă, 5-6 ml urină de analizat se încălzesc la flacără; dacă opalescenţa
dispare, aceasta a fost cauzată de prezenţa cristalelor de acid uric, uraţi şi oxalaţi;
- într-o altă eprubetă, 5-6 ml urină sunt acidifiaţi cu 1 ml acid acetic 10%; dispariţia
opalescenţei indică existenţa unei concentraţii mari de fosfaţi şi carbonaţi.
Modificări patologice ale aspectului urinii sunt întâlnite în afecţiuni renale şi
ale căilor excretoare renale şi sunt datorate prezenţei elementelor figurate ale sângelui

274
(hematii, leucocite), mucusului şi diferiţilor cilindri. Modificările de aspect datorate
acestor cauze nu dispar prin cele două experienţe prezentate anterior.
Analiza unei urini tulburi, cu excepţia determinării reacţiei, se efectuează
numai după ce urina a fost limpezită.
Există însă şi afecţiuni renale ca de exemplu insuficienţa renală cronică în
stadiul poliuric, în care urina este foarte limpede, ca apa, transparentă şi fără
sediment.
Culoarea. Urina normală este de culoare galben-deschis până la galben-
roşcat, datorită pigmenţilor pe care îi conţine: urocromi, urobilină, porfirină, indoxil.
Fiziologic, urina poate prezenta modificări şi anume:
- urina nocturnă sau cea acidă sunt mai intens colorate faţă de cea diurnă sau
alcalină;
- după ingestia de diferite alimente sau medicamente poate deveni roşie
(sfeclă, varză roşie, rubarbă, aspirină), verde-albastră (albastru de metilen), galben-
intens (furazolidon), brun-neagră (tanin).
Schimbări ale coloraţiei urinii pot fi atribuite şi diferitelor afecţiuni renale
sau extrarenale:
- galben-portocaliu în boli febrile acute sau după transpiraţii abundente;
- galben-deschis în diabet insipid, scleroză renală, insuficienţă renală cu
poliurie, după administrare de diuretice;
- roşu în hematurie, hemoglobinurie, porfirinurie;
- cenuşie în methemoglobinemii, intoxicaţii cu fenoli;
- brun în sindroame icterice;
- verde-roşiatic până la verde-negru în nefrite acute hemoragice;
- negru în alcaptonurie.
Mirosul. Urina normală are un miros caracteristic, produs de acizii volatili
sau substanţele urinoide. Mirosul poate fi accentuat în cazul urinilor concentrate,
dezagreabil după aport alimentar de sparanghel, usturoi, hrean. Modificările
patologice ale mirosului urinii pot fi:
- miros amoniacal în boli infecţioase sau tumorale renale sau ale căilor
excretoare;
- miros putrid în infecţii cu floră anaerobă;
- miros de mere verzi în diabet zaharat.
Consistenţa. Urina normală are consistenţa unei soluţii slab saline. În
condiţii patologice urina poate prezenta modificări şi anume:
- urina ce conţine cantităţi mari de albumină are spumă persistentă;
- urina ce conţine leucocite în cantitate mare (puroi) este vâscoasă şi filantă.

Examenul microscopic al sedimentului urinar

Examenul microscopic se efectuează pe sedimentul urinar obţinut după

centrifugare (5 minute la 2000 rpm), în special când este bănuită prezenţa cilindrilor,
sau prin sedimentare spontană într-un pahar conic, timp de câteva ore.
275
 Pentru un examen microscopic obişnuit, excluzând urograma, metodele Addis
şi Hamburger, sunt necesare: microscop, lame de sticlă, lamele, pipete Pasteur.
Tehnica. După centrifugare se decantează supernatantul clar şi cu o pipetă
Pasteur se aspiră o cantitate mică din sediment, depunându-se o picătură pe lama de
microscopie. Aceasta se cercetează la microscop după aplicarea unei lamele din
sticlă, iniţial cu ajutorul unui obiectiv mic (5x) pentru orientare şi după ce se prinde
în câmpul vizual o zonă mai bogată în elemente se continuă examinarea cu un
obiectiv mai mare (10x) pentru observarea detaliilor de structură.
Sedimentele urinare pot fi clasificate în sedimente organizate şi neorganizate.
Sedimentele organizate. Se deosebesc de cele neorganizate prin insolubilitatea
lor la creşterea temperaturii sau acidifiere, fiind formate din următoarele grupe:
- elemente celulare;
- cilindri;
- cilindroizi;
- pseudocilindri;
- filamente urinare;
- secreţii ale glandelor genitale;
- celule neoplazice;
- paraziţi.

Elementele celulare sunt reprezentate de:

1. Celulele epiteliale. Acestea pot proveni din rinichi, căile urinare şi organele
genitale externe.
Celulele renale sunt puţin mai mari decât leucocitele, de care sunt relativ greu
de diferenţiat. Sunt rotunde sau ovale, cu citoplasma granulată şi nucleu rotund sau
oval. Prezenţa lor în sediment, alături de cilindrii epiteliali sau granuloşi, indică un
proces patologic la nivelul tubilor renali.
Celulele epiteliale ale căilor urinare sunt normal absente sau prezente în număr
mic. Când apar în număr mare şi sunt aglomerate, pot indica un proces inflamator al
căilor urinare joase. Au aspect poligonal, rotund, caudat, în formă de rachetă de tenis,
ovoidal sau cilindric, în funcţie de regiunea specifică din care provin: straturile
superficiale au celule pavimentoase (poligonale sau rotunde, cu nucleu voluminos),
straturile intermediare au celule caudate sau rachetiforme, iar straturile profunde au
celule ovoidale sau alungite.

2. Leucocitele au formă sferică, granulată, diametrul de 8 - 12 microni şi nucleu

unic sau polilobat. Sunt recunoscute cu uşurinţă în urinile acide sau acidifiate cu o
picătură de acid acetic 5%. În urinile alcaline, leucocitele pot fi mai mari, balonizate
sau dezintegrate, putând fi uşor confundate cu celulele renale; diferenţierea se face cu
soluţie Lugol, ce colorează leucocitele în brun, iar celulele epiteliale în galben deschis.
În cazul leucocitelor dezintegrate (urină veche), acidul acetic sau încălzirea la flacără
nu dizolvă sedimentul galben-cenuşiu format de acestea, diferenţiindu-le astfel de
sedimentul produs prin precipitarea fosfaţilor. În urina normală numărul leucocitelor
276
este foarte redus. Leucocituria este evidentă în: afecţiuni renale (pielonefrite), afecţiuni
ale căilor urinare (pielite, cistite, uretrite), afecţiuni extrarenale (apendicită,
metroanexită). Nu există proporţionalitate între numărul leucocitelor din sediment şi
gravitatea leziunilor. În cazul leucocituriei este important de stabilit dacă aceasta
provine din parenchimul renal sau din căile urinare excretoare. În acest sens, se
consideră că celulele Sternheimer-Malbin sunt patognomonice leziunilor
parenchimatoase renale, în special determinate de pielonefrită. Aceste celule sunt
leucocite ce au suferit modificări în tubii renali, fiind celule rotunde, cu nucleu sferic,
palid şi prezentând în citoplasmă mici granulaţii şi vacuole cu mişcare browniană.

3. Hematiile nu se observă în mod normal la examenul sedimentului. Folosind

metodele speciale Addis-Hamburger, pot fi totuşi descoperite şi în urina normală. În
sedimentul proaspăt al urinilor patologice, hematiile apar ca discuri biconcave, cu
dublu contur. Hematiile din urină trebuie diferenţiate de levuri şi sferule de grăsime.
Levurile sunt de mărimi diferite, ovalare, fără coloraţie gălbuie; acidul acetic 5%
dizolvă hematiile, dar nu modifică levurile. Sferulele de grăsime sunt intens
refringente, de regulă incolore, de mărimi de asemenea inegale; eterul şi cloroformul
le dizolvă rapid, dar afectează târziu hematiile, numai după distrugerea membranei
acestora. Hematurii pot fi întâlnite în:
- eforturi fizice mari;
- afecţiuni extrarenale: diateze hemoragice (hemofilie, leucemie, trombopenie,
scorbut, boli hepatice), boli de sânge (anemii drepanocitare, boala Hodgkin, poliglobulii),
după administrare de medicamente (cantaridă, sulfamide, etc.);
- afecţiuni renale: sindroame nefrotice pure (intensitate foarte mică),
glomerulonefrite cronice, nefroangioscleroză, pielite, uretrite, cistite (intensitate
redusă), glomerulonefrite acute, litiază renală, tumori maligne renale sau vezicale în
care intensitatea hematuriei este mare.
Prin studiul atent al morfologiei hematiilor din sediment poate fi precizată
originea hematuriei şi implicit sediul procesului patologic. Când hematiile provin
din nefroni, ele sunt decolorate, deformate, cu contur şters şi însoţite de proteinurie,
cilindrurie şi, patognomonic, de cilindri hematici. Când hematiile provin din căile
urinare, îşi păstrează forma şi culoarea, cu condiţia unei examinări rapide după
emisie, iar urina să aibă o concentraţie medie. De regulă, intensitatea hematuriei este
direct proporţională cu gravitatea leziunilor renale ce o determină.

Cilindrii
Cilindrii hialini. Proteinele plasmatice care străbat bariera glomerulară lezată
precipită în tubii uriniferi. Formaţiunile proteice, care sunt adevărate mulaje ale tubilor
distali şi colectori şi care apar în sedimentul urinar, poartă denumirea de cilindri hialini.
Ei se prezintă ca nişte benzi transparente şi omogene. Cilindrii hialini se evidenţiază în
nefropatiile însoţite de proteinurie, bolile febrile, eforturi mari.
Cilindrii hematici se formează în hematuriile de cauză renală (glomerulonefrite
acute).
277
 Cilindrii leucocitari reprezintă o aglutinare de leucocite şi pun în evidenţă un
proces inflamator al parenchimului renal (pielonefrite cronice).
Cilindrii epiteliali se formează prin agregarea celulelor epiteliului tubular
descuamate.
Cilindrii granuloşi provin din dezintegrarea elementelor celulare care au fost
incluse în cilindrii hialini. Prezenţa lor indică nefropatii acute sau cronice decompensate.
Cilindrii grăsoşi se formează prin aglomerarea granulelor de grăsime produse
în procesul de degenerare a ţesuturilor renale. Picături de grăsime se pot depune pe
cilindrii hialini sau granuloşi. Apar în glomerulonefroze şi în intoxicaţii cu fosfor şi
arsen.
Cilindrii ciroşi sunt omogeni şi spre deosebire de cilindrii hialini au un luciu mat,
asemănător cerii. Au compoziţie incertă. Prezenţa lor în sedimentul urinar indică un
prognostic grav (stadii terminale ale insuficienţei renale cronice).

Sedimentul urinar organizat:

1. hematii; 2. leucocite;
3. celule epiteliale în rachetă
4. epitelii plate; 5. celule renale;
6. leucocite cu degenerescenţă
grasă; 7. cilindroid; 8. cilindrii
hialini; 9. cilindrii granuloşi;
10. cilindrii hialini cu epitelii;
11. cilindrii hialini cu leucocite; 12
cilindrii leucocitari; 13. levuri; 14.
spermatozoizi ; 15. cilindrii
hematici; 16. cilindrii ciroşi

Cilindroizii sunt formaţi din precipitate de mucus din tubii colectori, au formă
alungită şi subţire, uneori prezintă striaţii longitudinale şi extremitate filamentoasă,
deseori bifidă. Nu au semnificaţie patologică.

Pseudocilindrii sunt aglomerări de hemoglobină sau conglomerate de uraţi,

fosfaţi sau bacterii. Pseudocilindrii de uraţi sau fosfaţi sunt formaţi din granulaţii foarte
fine, strălucitoare, fiind solubili în acid acetic sau acizi minerali. Nu prezintă semnificaţie
patologică. Pseudocilindrii de acid uric au culoare roşie-brună, fiind solubili în acid
clorhidric. Pseudocilindrii bacterieni sunt formaţi din bacterii, deosebindu-se de cilindrii
granuloşi prin coloraţie cu albastru de metilen. Apar în pielonefrite. Psudocilindrii

278
hemoglobinici au culoare brună datorată methemoglobinei, fiind întâlniţi în
hemoglobinurii.

Determinarea cantitativă a elementelor urinare este efectuată prin două

metode: metoda Addis şi metoda Hamburger.
Metoda Addis utilizează pentru determinarea elementelor urina recoltată timp
de 24 ore în două etape: între orele 8-20 şi 20-8 cu măsurarea exactă a volumelor
respective. La femei se recomandă ca recoltarea să se facă cu ajutorul unei sonde.
Regimul alimentar al pacientului este normal, cu excepţia limitării timp de 24 ore a
lichidelor ingerate.

Valori normale:
Elementul patologic Adulţi Copii
Eritrocite max. 500.000 max. 450.000
Leucocite 1.000.000 - 1.800.000 9.000 - 720.000
Cilindri max. 5.000 max. 6.500

Prin metoda Hamburger exprimarea numărului de elemente patologice se face

pe minut prin raportare la debitul urinar.
Valori normale:
- cilindri: 1-2 elemente, max. 7;
- eritrocite: 100 - 1.000; (la femei în perioada menstruală max. 10.000);
- leucocite: 1.000 - 5.000.

Sedimente neorganizate.
Sedimentul neorganizat este format din depuneri de diverse substanţe, aflate în
mod normal sau patologic în urină, sub formă cristalină sau amorfă. Sedimentarea
acestora este în funcţie de pH-ul urinar. De aceea examinarea se face separat pe o probă
de urină acidă şi o probă de urină alcalinizată. Alt grup este constituit din sedimentele
rare, întâlnite exclusiv în situaţii patologice.

Sedimentul din urina acidă.

1. Uraţii. Dacă urina este lăsată în repaus şi se formează un sediment abundent
roşu-cărămiziu, iar pH-ul este acid, acest sediment este format din uraţi. Predomină
uratul de sodiu, în cantitate mai mică uratul de potasiu, calciu, magneziu. O singură
sare a acidului uric, uratul de amoniu, precipită în urina alcalină. Temperatura
scăzută favorizează depunerea uraţilor. La încălzire, sedimentul format dispare,
urina limpezindu-se. Prin adăugarea de NaOH sau KOH 10%, uraţii se dizolvă
instantaneu. Daca sedimentul nu s-a dizolvat în totalitate, el conţine în afară de uraţi
şi alte săruri, precum şi elemente figurate sau mucus. La microscop uraţii au forma
unor granulaţii intens colorate.

279
 2. Acidul uric. Se prezintă sub forma unui nisip galben, cafeniu sau auriu,
cristalele având forme foarte variate. Cel mai des au formă de plăci rombice, cu colţurile
teşite. După adăugarea unei soluţii de KOH 10%, cristalele de acid uric se dizolvă şi,
dacă se adaugă HCl conc., reprecipită sub forma unor cristale foarte fine, rombice şi slab
colorate. În litiaza renală, cristalele au formă lanceolată şi aderă unul de altul. Cristalele
de acid uric pot fi obţinute şi în urina normală şi transparentă, prin adăugare de HCl şi
scăderea temperaturii, apărând de culoare brun închis, sub formă de cuie sau snopi.
3. Oxalatul de calciu. Cristalele sale au formă caracteristică octaedrică, fiind foarte
refringente. Formarea acestora este influenţată de alimentaţie, şi dacă sunt însoţite de
cristale de acid oxalic, pot sugera existenţa unui calcul renal.
4. Fosfatul secundar de calciu. Cristalele au formă penată, aglutinându-se în
rozete, având părţile ascuţite spre interior şi pe cele late spre periferie.
5. Acidul hipuric. Se întâlneşte foarte rar, cristalele având formă rombică,
izolate sau grupate. Acidul hipuric poate fi găsit în urină în cantitate mare în urma
consumului de fructe ca afinele, acid salicilic, acid benzoic.
6. Sulfatul de calciu. Şi aceste cristale apar rareori şi numai în urini foarte
acide. Au formă de ace lungi şi subţiri, incolore, sau de rozete, întâlnindu-se în urina
pacienţilor ce au consumat cantităţi mari de ape sulfuroase.

Sedimentul din urina alcalină.

1. Fosfaţii amorfi (de calciu şi de magneziu). Au aspect de grăunţe mici,
incolore. Adesea formează o peliculă la suprafaţa urinii. Se dizolvă uşor prin
acidifiere şi nu se solubilizează prin încălzire.
2. Fosfatul amoniaco-magnezian. Cristalele apar în urină alături de fosfaţii
amorfi, ca nişte prisme incolore, triunghiulare, pătrate sau hexagonale. Se deosebesc
de cristalele de oxalat de calciu prin faptul că se dizolvă uşor prin adăugarea de acizi
slabi (acid acetic).
3. Uratul de amoniu. Cristalizează sub forma unor sfere galben-brune, intens
colorate.
4. Fosfatul neutru de calciu. Cristalizează sub formă de plăci mari, rombic-
alungite. Se dizolvă uşor în acid acetic.
5. Carbonatul de calciu. Apare rareori în urină, ca mici sfere, ataşate unele de
altele, în grupuri de 4-6 elemente. La adăugarea de HCl se produce dizolvarea rapidă
a cristalelor, cu eliminare de dioxid de carbon.

Sedimentul urinar neorganizat:

1. acid uric
2. urat de amoniu
3. acid hipuric
4. oxalat de calciu

280
 Sedimentul urinar neorganizat:

1. fosfat amoniaco-magnezian
2. fosfat de magneziu
3. fosfat de calciu
4. sulfat de calciu
5. carbonat de calciu
6. fosfaţi feroşi

Sedimente rare, patologice

1. Cistina apare şi cristalizează în urină într-o boală ereditară – cistinuria -
caracterizată prin urină tulbure, gălbui-verde, cu reacţie de multe ori alcalină.
2. Xantina apare foarte rar, cristalele semănând cu cele de acid uric.
3. Leucina şi tirozina apar în urină în leziuni grave hepatice, în scarlatină,
precum şi în alte boli infecţioase.
4. Cristale de acizi graşi pot apare în boli ereditare numite chilurii. De asemenea,
pot apare în modificări degenerative ale epiteliului tubular (nefroze).
5. Colesterolul apare foarte rar şi însoţeşte lipidele în degenerescenţa grasă a
rinichiului.
În urinile patologice mai pot fi identificate bilirubina, hematoidina, indigoul,
fenil-glucozanul sau melanina, fiecare dintre acestea fiind markerul unei situaţii
patologice caracteristice.

Sedimentul urinar neorganizat:

1. colesterol
2. tirozină
3. leucină
4. cistină

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ
281
 Examenul fizico-chimic al urinii

1. Densitatea urinii. Este mai mare decât a apei şi este determinată de totalitatea
substanţelor dizolvate în urină (30 - 70 g/l). Densitatea urinii normale variază între
1,015 - 1,025 şi se măsoară la urina colectată timp de 24 ore. Densitatea urinară reflectă
capacitatea de concentrare a nefronilor, determinările de densitate fiind probe rapide
de detectare a suferinţelor renale.
Măsurarea densităţii urinare se efectuează cu ajutorul unui dispozitiv numit
urodensimetru.

2. Reacţia urinii. În mod normal urina are o reacţie acidă, pH-ul său fiind
aproximativ 6. Aciditatea urinii este determinată în cea mai mare măsură de fosfatul
primar de sodiu NaH2PO4, care se află în exces faţa de plasmă. Rinichiul este irigat
de sânge cu pH=7,4 şi formează urină cu pH aproximativ 6. Această modificare de
pH se realizează, în cea mai mare măsură, prin modificarea proporţiei dintre fosfaţii
primari şi cei secundari. Astfel, în plasmă, raportul HPO42-/H2PO4- = 4/1, iar în urină
acest raport este inversat în favoarea fosfatului primar, ajungând la proporţia 1/9. În
acest mod, prin eliminarea pe cale urinară de echivalenţi acizi, rinichiul contribuie
la menţinerea rezervei alcaline a plasmei.
În mod normal pH-ul urinar variază între 5,8 şi 7,4 (variaţii extreme 4,8 - 8).
În condiţii fiziologice pH-ul urinar variază în funcţie de alimentaţie: într-o
alimentaţie strict carnată urina este acidă, iar în cea strict vegetariană este uşor
alcalină. Administrarea de bicarbonaţi, sau tratamentele cu ape minerale
bicarbonatate, produc alcalinizarea urinii. Valoarea pH-ului este supusă unui ritm
circadian. Urina cea mai acidă este emisă noaptea şi cea mai puţin acidă (uneori
alcalină) dimineaţa. Prin păstrare timp mai îndelungat, urina poate deveni alcalină,
ca urmare a descompunerii bacteriene a ureei în amoniac.

3. Aciditatea totală (de titrare) a urinii. Reprezintă totalitatea componenţilor

acizi, ionizaţi sau neionizaţi, care sunt titraţi de către baze. Se exprimă prin numărul
de mililitri de soluţie NaOH 0,1N necesari titrării urinii colectate timp de 24 ore, în
prezenţa fenolftaleinei ca indicator. Valorile normale oscilează între 200 - 500 ml,
cu o medie de 350 ml. Aciditatea totală măsoară de fapt cantitatea de bază necesară
deplasării pH-ului urinii (acid de cele mai multe ori), până la o valoare de
aproximativ 8,5 ce reprezintă pH-ul de viraj al indicatorului. Ar fi preferabil ca
titrarea să se facă până la pH=7,4, pH-ul mediului intern, când s-ar obţine exact
cantitatea de protoni excretaţi prin urină în scopul menţinerii echilibrului acido-
bazic.

4. Amoniacul urinar. Prin urină, se elimină în mod normal o cantitate foarte

mică de amoniac, sub formă de săruri de amoniu (30 - 50 mg/24 ore). Excreţia de
282
amoniac contribuie şi ea la funcţia renală de conservare a rezervei alcaline a sângelui.
Amoniacul format sub acţiunea glutaminazei II renale, difuzează prin membrana
celulelor tubulare, ajungând în lumenul tubular, unde acceptă protoni,
transformându-se în ioni amoniu NH4+, care nu mai pot reveni în celulă, fiind
excretaţi.
Concentraţia amoniacului urinar, împreună cu aciditatea totală a urinii,
constituie un indicator al echilibrului acido-bazic al organismului, în condiţii de
integritate morfofuncţională renală.
Excreţia de amoniac este semnificativ crescută în acidoza diabetică, în care
acizii acetoacetic şi beta-hidroxibutiric sunt neutralizaţi în parte şi de amoniac.
Principiul de dozare (metoda Berthelot). Amoniacul formează cu fenolul şi
hipocloritul de sodiu în mediu alcalin, indofenol colorat în albastru. Reacţia este
catalizată de către nitroprusiatul de sodiu.

5. Ureea. Reprezintă produsul final al metabolismului azotului proteic şi este

cel mai abundent component organic din urină (20 - 35 g/24 ore). Cantitatea de uree
eliminată în urină depinde atât de ritmul sintezei sale hepatice, cât şi de capacitatea
excretorie a rinichiului. Ureea este o substanţă fără prag renal de eliminare, de aceea,
toată cantitatea sintetizată este excretată în condiţiile unei bune funcţionalităţi renale,
asigurându-se astfel una din funcţiile importante de detoxifiere.
În absenţa unei suferinţe renale, eliminarea de uree este crescută în stările
febrile sau alte stări hipercatabolice, când proteinele tisulare degradate în scop
energogen, furnizează secundar amoniac, ce este transformat în uree. În bolile
hepatice în care capacitatea funcţională a hepatocitelor este grav afectată, producţia
şi eliminarea de uree sunt scăzute. De asemenea, în acidoza diabetică, prin utilizarea
unor cantităţi mari de amoniac la neutralizarea corpilor cetonici acizi, scad sinteza şi
excreţia de uree. Suferinţele renale determină şi ele scăderea excreţiei urinare de
uree, însoţită însă de creşterea concentraţiei sale plasmatice. Dozările de uree în
urină, luate izolat, au o semnificaţie clinică redusă.
În mod clasic, dozarea ureei urinare se efectua prin metoda gaz-volumetrică
Kowarski, ce utiliza un dispozitiv special (ureometru) şi se baza pe reacţia ureei cu
hipobromitul de sodiu în mediu alcalin, cu degajare de azot. Volumul de azot degajat
şi determinat cu ajutorul ureometrului este proporţional cu concentraţia de uree din
proba de urina luată în lucru.
Actual, dozarea ureei din urină se bazează pe metodele descrise la determinarea
acestui component în sânge, ca de exemplu: metoda cu diacetilmonoximă sau metoda
enzimatică. În vederea folosirii acestor metode este necesară o diluţie a urinii de la
1:20 la 1:15, factor de diluţie cu care se înmulţeşte rezultatul obţinut. Exprimarea
rezultatelor se face în grame la volumul urinar din 24 ore.

283
 6. Acidul uric. Este produsul de catabolism al bazelor purinice, adenina şi
guanina, care sunt constituente ale acizilor nucleici şi ale unor nucleotide libere.
Acidul uric rezultă atât prin degradarea purinelor proprii organismului (acid uric
endogen) cât şi a celor ingerate din alimentaţie (acid uric exogen).Excreţia zilnică de
acid uric este de 0,2 - 0,8 g, variind într-o măsură importantă cu natura dietei.
Excreţia de acid uric este crescută după ingerarea unor alimente bogate în purine
(muşchi, ficat, rinichi), sau în stările în care se degradează cantităţi mari de
nucleoproteine (leucemii, arsuri, iradieri cu raze X sau gama). În guta metabolică
primară se sintetizează „de novo” cantităţi considerabile de acid uric, crescând în
acelaşi timp eliminările urinare. În afecţiunile renale, excreţia de acid uric poate
scade ca urmare a unei eliminări defectuoase.
În urină acidul uric se află în cea mai mare parte sub formă de uraţi. Prin
acidifierea urinii precipită uratul acid de sodiu. Cantitatea de acid uric, ca şi pH-ul urinar,
sunt factori importanţi în procesul formării calculilor renali.
Principiul dozării prin metoda colorimetrică. Acidul uric reduce reactivul
fosfowolframic, în mediu alcalin, la albastru de wolfram; intensitatea coloraţiei este
proporţională cu concentraţia acidului uric.
Principiul dozării prin metoda volumetrică. Acidul uric prezent în urină
predominant ca monourat de sodiu mai solubil este precipitat în prezenţa unui exces
de ioni NH4+ ca urat de amoniu. Acesta din urmă este separat prin filtrare, descompus
cu acid acetic şi ulterior acidul uric este titrat cu o soluţie de iod, în prezenţa
amidonului drept indicator. Iodul oxidează acidul uric la uree şi aloxan.

7. Creatinina şi clearance-ul creatininei endogene. Creatinina este catabolitul

creatinei. În mod normal, producţia de creatinină este constantă, depinzând numai
de mărimea masei musculare. Cantitatea de creatinină excretată în 24 ore pentru 1
kg greutate corporală este constantă la un individ (coeficient de creatinină). La
bărbaţi excreţia de creatinină este de 14 - 26 mg/kgc/24 ore (124 - 230
micromoli/kgc/24 ore), în timp ce la femei aceasta este de 11 - 20 mg/kgc/24 ore (97
- 177 micromoli/kgc/24 ore). Eliminările de creatinină tind să scadă odată cu
înaintarea în vârstă.
Determinările de creatinină urinară luate izolat au o semnificaţie clinică redusă.
Interesul pentru această dozare rezidă însă în faptul că acest component este excretat
la nivel renal numai prin procesul de filtrare glomerulară, fiind demonstrate ca
neglijabile influenţele reabsorbţiei din urina primară şi a secreţiei tubulare. Datorită
acestui fapt, creatinina este un component sanguin, eliminabil numai pe cale renală, ce
este adecvat pentru determinările ratei de filtrare glomerulară (clearance renal).
Prin clearance, sau coeficient de epurare renală se înţelege debitul de sânge
sau plasmă care este epurat de un component datorită funcţiei renale. Clearance-ul
este exprimat în ml/minut şi este dat de relaţia:

284
 U
C V 
P
unde C este clearance-ul în ml/minut, V este debitul urinar în ml/minut, P este
concentraţia plasmatică a componentului studiat, iar U este concentraţia urinară a
aceluiaşi component. Concentraţiile pot fi exprimate în orice unităţi de măsură, cu
condiţia ca aceeaşi unitate să fie folosită atât pentru concentraţia sanguină, cât şi
pentru cea urinară. Clearance-ul creatininei endogene măsoară viteza de filtrare
glomerulară şi are valori normale de:
97 - 137 ml/minut la sexul masculin;
88 - 128 ml/minut la sexul feminin; la ambele sexe are tendinţa de scădere
odată cu vârsta (cca. 6,5 ml/minut la fiecare 10 ani).
Utilitatea determinărilor de clearance pentru componenţii plasmatici ce se
elimină urinar constă în posibilitatea - în urma comparării valorii obţinute cu valoarea
clearance-ului creatininei endogene - determinării mecanismului predominant în
eliminarea renală a substanţei. Dacă valoarea este mai mare decât clearance-ul
creatininei, predomină secreţia tubulară, şi invers, la valori mai mici, procesul
predominant este reabsorbţia tubulară.
Pe de altă parte, determinările clearance-ului creatininei la pacienţi cu
afecţiuni renale oferă informaţii despre starea funcţională a nefronilor, întrucât
valoarea acestui parametru este direct proporţională cu numărul de nefroni
funcţionali. Urmărirea scăderii clearance-ului creatininei are astfel o importantă
valoare prognostică asupra gradului suferinţei renale.

Tehnica determinării clearance-ului creatininei endogene

Sunt necesare dozarea creatininei în ser şi într-o probă de urină recoltată într-
un interval de timp limitat (o oră). Pentru a elimina erorile de recoltare, se recoltează
două probe de urină şi dozarea se repetă. În timpul recoltărilor pentru clearance
pacientul trebuie să rămână în clinostatism şi să nu consume alimente sau lichide.
Dimineaţa, după golirea vezicii urinare, pacientul va ingera 250 ml lichid (ceai
diluat, neîndulcit) pentru a fi asigurată o diureză de circa 2 ml pe minut. După o oră
se recoltează urina, golindu-se complet vezica urinară, iar volumul este măsurat şi
exprimat în ml. În acelaşi timp se recoltează şi o probă de sânge. După încă o oră, se
goleşte din nou vezica şi urina este recoltată separat, măsurându-se de asemenea
volumul. Se dozează creatinina în ser şi în cele 2 probe de urină. Se calculează
clearance-ul separat pentru cele doua etape, utilizând formula:

Clearance = mg creatinină în 100 ml urină/mg creatinină în 100 ml ser x volumul

urinar (în ml).
Se face apoi media celor 2 valori.

8. Compuşi urinari cu semnificaţie patologică.

În diverse stări patologice, unii compuşi prezenţi în mod normal în cantităţi
mici se pot excreta prin urină în cantităţi considerabile. De asemenea, unele
285
modificări ale funcţiei renale determină trecerea în urină a unor componenţi sanguini
care nu se elimină în mod normal pe această cale. Prezenţa acestor substanţe, precum
şi excreţia altora în cantităţi crescute, în urină, au o semnificaţie clinică deosebită.
Compuşii urinari cu semnificaţie patologică sunt: proteinele, glucidele, corpii
cetonici, pigmenţii sanguini, pigmenţii biliari, acizii şi sărurile biliare.
a) Proteinele în urină. În condiţii normale, prin urină se elimină aproximativ
20-30 mg/24 ore şi în această concentraţie ele nu pot fi decelate prin reacţiile uzuale
de identificare. Apariţia proteinelor în urină în cantităţi mai mari constituie o stare
patologică cunoscută sub denumirea de proteinurie sau albuminurie. Proteinele care
sunt de origine plasmatică, apar în urină, în primul rând, în diverse afecţiuni renale
ca o consecinţă a modificării capacităţii de filtrare a membranelor glomerulare.
Albuminele, care au mase moleculare mici, trec prin aceste membrane cu mai multă
uşurinţă decât globulinele şi de aceea în cele mai multe cazuri de proteinurie, raportul
albumină/globuline în urină este mult mai ridicat decât în sânge. Proteinuriile de
diverse grade sunt caracteristice afecţiunilor renale: glomerulonefrita, nefroza,
nefroscleroza. În afara cauzelor strict renale, proteinuria poate surveni şi în diverse
alte maladii care induc tulburări circulatorii la nivel renal (boli de inimă, stări febrile,
ascită).
Pe lângă proteinuriile constituite din proteine plasmatice normale, se cunosc
şi stări patologice în care apar, în urină, proteine ce nu sunt prezente în sânge în mod
normal, denumite de aceea paraproteine, şi a căror identificare este utilă pentru
stabilirea diagnosticului. De exemplu, în mielomul multiplu se elimină un grup de
proteine cu mase moleculare relativ mici, care au proprietatea de a precipita foarte
uşor la temperaturi de 40-60oC şi de a fi solubile la temperaturi de 95-100oC,
denumite proteine termosolubile sau proteine Bence-Jones. Aceste proteine sunt
constituite din lanţurile polipeptidice uşoare (L) ale imunoglobulinelor (cel mai
frecvent ale IgG) şi reflectă o dereglare proliferativă a sistemului imun al
organismului.

Identificarea proteinelor în urină

Procedeele utilizate se bazează pe denaturarea şi modificarea solubilităţii lor.
1. Proba cu acid sulfosalicilic. La 1 ml urină se adaugă câteva picături soluţie
de acid sulfosalicilic (10 g la 100 ml). Formarea unui precipitat alb indică prezenţa
proteinelor.
2. Proba cu acid tricloracetic. La 4-5 ml urină se adaugă 1 ml soluţie de acid
tricloracetic 10%. În prezenţa proteinelor se formează un precipitat alb.
3. Proba cu acid azotic (Heller). La 2 ml acid azotic concentrat se adaugă,
prelingându-se încet pe pereţii eprubetei, 1-2 ml urină. În prezenţa proteinelor se
formează un inel alb la suprafaţa de contact a celor două lichide.
4. Proba de coagulare. Într-o eprubetă se introduc 4-5 ml urină şi se încălzeşte
la fierbere. Un precipitat format în aceste condiţii poate fi datorat proteinelor sau
fosfaţilor. Se adaugă apoi 3-4 picături de acid acetic diluat. Precipitatul datorat

286
fosfaţilor se dizolvă. Trebuie evitată adăugarea unui exces de acid deoarece şi
precipitatul de proteine se poate dizolva în mediu mai acid.
5. Identificarea proteinelor Bence-Jones. 10 ml urină filtrată sunt încălziţi la
60oC pe baie de apă. Apariţia unui precipitat alb ce se resolubilizează la 100oC indică
prezenţa proteinelor termosolubile Bence-Jones. La adăugarea unei soluţii de HCl
12,5% aceste proteine coagulează.

Dozarea proteinelor în urină.

Metoda Esbach. Proteinele urinare sunt precipitate cu reactiv Esbach într-un
tub etalonat, confecţionat din sticlă (albuminometru). Înălţimea stratului de
precipitat după 24 ore este proporţională cu cantitatea de proteine. Reactivul Esbach
este o soluţie apoasă ce cuprinde 10 g acid picric şi 20 g acid citric în 1000 ml apă
distilată.
Metoda colorimetrică cu reactivul biuret. Prin tratarea cu reactiv biuret a
precipitatului format din proteinele urinare şi acid percloric, rezultă un complex
solubil de culoare albastru-violet a cărei intensitate este proporţională cu cantitatea
de proteine.
b) Glucidele în urină. Urina nu cuprinde în mod normal glucide decelabile prin
metodele uzuale de identificare. Eliminarea lor prin urină este denumită, în termeni
generali, meliturie. Termenii glucozurie (uneori glicozurie), fructozurie, galactozurie,
pentozurie se referă la excreţia unui anumit monozaharid (glucoză, fructoză, galactoză)
sau a unui grup de glucide (pentoze).
Singurul monozaharid care există în cantităţi apreciabile în sânge este glucoza
şi aceasta nu apare în mod normal în urină deoarece este reabsorbită complet din
filtratul glomerular. Celelalte glucide, dacă apar eventual în sânge, sunt eliminate
imediat prin urină deoarece tubii renali nu posedă mecanisme pentru reabsorbţia lor.
Glucozuria. Capacitatea tubilor renali de a reabsorbi glucoza din filtratul
glomerular este de 250-350 ml/minut şi această capacitate este superioară aceleia
căreia rinichiul trebuie să-i facă faţă când glicemia este normală (cca. 1 g la 1000 ml).
Apariţia glucozei în urină depinde atât de nivelul glicemiei cât şi de integritatea
funcţională a rinichiului. Creşterea glicemiei peste valori de 1,6-1,7 g la 1000 ml are
drept consecinţă excreţia renală a glucozei, denumită glucozurie hiperglicemică,
deoarece capacitatea tubulară de reabsorbţie este depăşită şi glucoza trece în urină.
Acesta este cazul glucozuriei ce survine în diabetul zaharat, hipertiroidism sau chiar
după ingestia unor cantităţi mari de glucide. Pe de altă parte, în unele afecţiuni renale
(glomerulonefrite, nefroze) se produce glucozurie fără ca glicemia să depăşească
valorile normale, această glucozurie fiind denumită glucozurie normoglicemică.
Aceasta este rezultatul unei reabsorbţii incomplete a glucozei din filtratul glomerular.
Se cunoaşte însă şi o afecţiune ereditară, glucozuria renală, caracterizată prin
glucozurie la valori normale ale glicemiei produsă din cauza scăderii pragului renal de
eliminare a glucozei.
Fructozuria. În mod normal, fructoza este transformată în glucoză la nivel
hepatic, de aceea depăşirea capacităţii hepatice de conversie a fructozei are drept
287
consecinţă eliminarea prin urină a acesteia, adică fructozuria. Fructozuria se poate
produce de exemplu, ca urmare a ingestiei unor cantităţi mari de fructoză, deoarece
mecanismul hepatic de conversie este limitativ. Se cunoaşte totodată şi o afecţiune
ereditară caracterizată prin eliminarea constantă a fructozei pe cale renală, denumită
fructozurie esenţială, cauzată de absenţa sau deficienţa fosfofructokinazei hepatice. De
asemenea, la pacienţii cu diabet zaharat, fructozuria însoţeşte întotdeauna glucozuria.
Pentozuria. Se referă la eliminarea pentozelor prin urină. Pentozuria alimen-
tară se produce după ingestia excesivă de alimente bogate în pentoze, în special
fructe ca: cireşe, struguri, prune, etc. În acest caz, se elimină cantităţi mici de D-
riboză, L-arabinoză, L-xiloză. Maladia metabolică ereditară denumită pentozurie
esenţială se caracterizează prin eliminarea renală a unei anumite pentoze, L-xiluloza.
Aceasta se explică prin absenţa sau deficienţa în ficatul pacienţilor pentozurici a unei
enzime din ciclul glucuronatului şi anume a xilitol-dehidrogenazei NADP
dependentă, care participă la conversia L-xilulozei în D-xiluloză, împreună cu o
xilitol-dehidrogenază NAD dependentă.
Galactozuria. Eliminarea galactozei prin urină se poate produce într-o
afecţiune ereditară manifestată încă din primele zile de viaţă ale copilului. Această
boală constă în incapacitatea organismului de a converti galactoza în glucoză şi este
denumită galactozemie. Laptele, alimentul sugarului, conţine lactoză care în intestin
este hidrolizată la glucoză şi galactoză. Din cauza incapacităţii organismului de a
transforma galactoza în glucoză, concentraţia galactozo-1-fosfatului şi a galactozei în
sânge cresc, determinând galactozuria. Defectul metabolic primar constă în absenţa
din ficat a enzimei galactozo-1-fosfat-uridil-transferazei care catalizează transfor-
marea galactozo-1-fosfatului cu ajutorul UDP-glucozei, în glucozo-1-fosfat şi UDP-
galactoză. Această reacţie este o etapă în secvenţa transformărilor prin care galactoza
este transformată în glucoză. Galactozemia şi galactozuria produse prin defectul
metabolic primar al galactozo-1-fosfat-uridil-transferazei sunt cunoscute în practica
medicală drept galactozemie clasică pentru a se face diferenţa de un alt tip de
galactozemie, produs prin deficienţa enzimatică a galactokinazei, de asemenea
cauzatoare de galactozurie. Acest deficit enzimatic determină reducerea galactozei la
galactitol manifestată clinic prin apariţia cataractei. Deficienţa de galactozo-1-fosfa-
turidil-transferază este însă o afecţiune mai gravă pentru că determină acumularea de
galactozo-1-fosfat şi implicit sechestrarea fosfatului sub această formă.

Identificarea glucidelor în urină.

Monozaharidele au proprietăţi reducătoare şi multe din reacţiile lor de
recunoaştere sau dozare se bazează pe reducerea unor complexe metalice. Pentru
unele glucide sau grupuri de glucide se cunosc şi reacţii specifice. Deoarece urina
cuprinde şi substanţe reducătoare neglucidice acestea sunt îndepărtate în prealabil
prin precipitarea lor cu reactiv Courtonne (soluţie de acetat de plumb 30 g la 100
ml), prin adăugarea la 9 volume de urină a unui volum de reactiv. Se agită şi se
filtrează. Ulterior se va utiliza filtratul, numit şi urină defecată.

288
 Proba Fehling (pentru toate glucidele reducătoare). La 2-3 ml urină se adaugă
un volum egal de reactiv Fehling. Se încălzeşte. În prezenţa glucidelor se obţine un
precipitat roşu-cărămiziu de oxid cupros.
Proba Benedict (pentru toate glucidele reducătoare). La 2-3 ml reactiv
Benedict se adaugă câteva picături de urină. Se încălzeşte. În prezenţa glucidelor
apare un precipitat verde, galben sau roşu, în funcţie de cantitatea de glucide
existentă în urină.
Proba Seliwanoff (pentru fructoză). La 2-3 ml reactiv Seliwanoff se adaugă
câteva picături de urină. Se încălzeşte. În prezenţa fructozei apare o coloraţie roşie.
Proba Bial (pentru pentoze). La 4-5 ml reactiv Bial se adaugă 2-3 ml urină
defecată. Se încălzeşte. În prezenţa pentozelor apare o coloraţie verde.
Proba acidului mucic (pentru galactoză). Într-un pahar Berzelius cu capacitate de
150-200 ml se introduc 50 ml urină şi 12 ml acid azotic concentrat. Se încălzeşte pe baie
de apă până la reducerea volumului la aproximativ 10 ml. După răcire se adaugă 10 ml
apă şi se lasă peste noapte. Dacă urina cuprinde galactoză (sau lactoză) se formează acid
mucic, care fiind puţin solubil se separă sub forma unui precipitat cristalin.

Dozarea glucozei în urină (metoda Ionescu-Matiu).

Principiu. Metoda se bazează pe reducerea fericianurii de potasiu la
ferocianură. O soluţie standard de fericianură de potasiu este titrată cu urină
cuprinzând glucoză, în prezenţa acidului picric drept indicator. Sfârşitul titrării este
stabilit prin reducerea acidului picric la acid picramic, colorat în roşu, la adăugarea
unui mic exces de glucoză.

c) Corpii cetonici în urină. Corpii cetonici: acidul acetoacetic, acetona şi

acidul beta-hidroxibutiric sunt compuşi rezultaţi în urma procesului de cetogeneză
desfăşurat în ficat şi utilizaţi apoi, în scop energetic, de către ţesuturile extrahepatice.
Substanţa primară este acidul acetoacetic, celelalte două substanţe rezultând din
acesta prin reducere, respectiv decarboxilare. În condiţii normale, cetonemia este
mică, iar în urină aceşti compuşi se găsesc numai în urme (3 - 6 mg/24 ore). În
anumite stări patologice, corpii cetonici pot fi produşi în cantităţi crescute: acidoză,
diabet zaharat, inaniţie prelungită. Ca urmare a intensificării catabolismului acizilor
graşi survenită în aceste situaţii, o mare cantitate de acetil-CoA va fi deviată spre
cetogeneză. Dacă cetonemia depăşeşte capacitatea ţesuturilor extrahepatice de a
utiliza corpii cetonici (>70 mg/dl), aceştia vor fi eliminaţi pe cale urinară, cetonuria
putând depăşi 20 - 30 mg/24 ore.
Identificarea corpilor cetonici în urină. Urina diabeticilor conţine cei trei
corpi cetonici în diferite proporţii. Acidul acetoacetic este relativ instabil şi se
decarboxilează spontan la acetonă. Această transformare poate fi accelerată în cursul
tratamentelor chimice la care este supusă urina. De aceea, unele reacţii pentru
acetonă sunt comune cu cele pentru acidul acetoacetic (reacţia cu nitroprusiat). Pe
de altă parte, alte reacţii sunt specifice fie pentru acetonă (reacţia iodoformului), fie

289
pentru acidul acetoacetic (reacţia cu clorură ferică). Pentru acidul beta-hidroxibutiric
nu sunt disponibile reacţii simple de recunoaştere.
Proba Legal. Acetona şi acidul acetoacetic formează cu nitroprusiatul de
sodiu complexe colorate în roşu. Reacţia este mai sensibilă pentru acetonă. În 3 - 4
ml urină se adaugă câteva picături de soluţie proaspătă de nitroprusiat de sodiu (5
g%) şi 2 ml NaOH 2N. Apare o coloraţie brună care după acidifiere cu acid acetic
trece în roşu carmin. Coloraţia brună iniţială este dată şi de alţi componenţi urinari
(creatinina), dar coloraţia roşie este specifică pentru corpii cetonici.
Proba Rothera. Se bazează ca şi proba Legal pe formarea de săruri complexe
colorate la tratarea urinii cu nitroprusiat. Această probă este de 100 de ori mai
sensibilă pentru acidul acetoacetic. La 5 - 6 ml urină se adaugă sulfat de amoniu solid
până la saturaţie. Se adaugă câteva picături de amoniac concentrat şi 5 picături
soluţie de nitroprusiat. La cald apare o coloraţie roşu-violet.
Proba iodoformului. Este specifică pentru acetonă. După tratarea urinii cu iod
în mediu alcalin apare un precipitat galben de iodoform şi se simte mirosul său
caracteristic. La 3 - 4 ml urină se adaugă 1 ml soluţie Lugol şi câteva picături de
NaOH 2N. În prezenţa acetonei se va simţi mirosul de iodoform şi eventual acesta
se va separa sub forma unui precipitat galben.
Proba Gerhardt. Este specifică pentru acidul acetoacetic şi se bazează pe
formarea unei sări complexe colorate între ionii Fe3+ şi forma enolică a acidului
acetoacetic. La 4 - 5 ml urină se adaugă picătură cu picătură soluţie de FeCl3 4,5%
până nu se mai formează precipitat de fosfat feric. În prezenţa acidului acetoacetic
supernatantul se colorează în roşu-rubiniu.

d) Pigmenţi sanguini în urină. În anumite stări patologice urina poate

cuprinde hematii (hematurie) sau numai hemoglobină (hemoglobinurie). Hematuria
apare în diferite afecţiuni ce interesează rinichiul la nivel glomerular sau căile urinare
inferioare, în timp ce hemoglobinuria apare în special în cazul unei distrugeri intense
a hematiilor (hemoliză). Hemoglobina apare în urină când hemoglobinemia
depăşeşte 60 - 150 mg/dl. La examenul sedimentului urinar nu se observă în acest
caz structuri eritrocitare.
Identificarea hemoglobinei în urină. Hemoglobina şi derivaţii ei au
proprietatea de a cataliza reacţiile de oxidare a unor compuşi de către apa oxigenată
(acţiune pseudoperoxidazică). În prezenţa hemoglobinei apa oxigenată se
descompune, eliberând oxigen capabil să oxideze diferite substanţe (benzidina,
fenolftaleina, piramidonul în soluţie alcoolică); în urma oxidării oricare din aceste
substanţe îşi modifică culoarea.
Proba cu benzidină (Adler). Benzidina este oxidată de apa oxigenată, sub
acţiunea catalitică a hemoglobinei, la albastru de benzidină. Într-o eprubetă se introduc
câteva cristale de benzidină şi 3 ml acid acetic glacial (sau soluţie saturată de benzidină
în acid acetic). Se agită şi apoi se adaugă 2 - 3 ml urină şi 1 - 2 ml soluţie de apă
oxigenată 3%. În prezenţa pigmenţilor sanguini apare iniţial o coloraţie verde care
virează în albastru prin oxidarea benzidinei.
290
 Proba cu fenolftaleină (Kastle-Mayer). Leucoderivatul fenolftaleinei este
oxidat de către apa oxigenată, în prezenţa Hb drept catalizator la fenolftaleină,
colorată în roşu. La 3 - 4 ml urină se adaugă 1 ml reactiv Kastle-Mayer (format din
KOH, fenolftaleină şi Zn pulbere) şi 1 ml soluţie apă oxigenată 3%. În prezenţa
pigmenţilor sanguini apare o coloraţie roşie.

e) Pigmenţii biliari în urină. Pigmenţii biliari sunt cataboliţi ai nucleului

porfinic din hemoglobină. În mod normal, în sânge există numai bilirubină liberă,
neconjugată, care circulă legată de albumină. Datorită dimensiunilor mari, acest
complex nu filtrează prin capilarele glomerulare, deci bilirubina este absentă în urina
normală. De asemenea, bilirubina nu apare în urină în stările patologice în care este
crescută numai concentraţia în sânge a bilirubinei neconjugate (icter hemolitic). În
icterul prin obstrucţie, precum şi în stadiile avansate ale icterului determinat de
leziuni hepatice apare în sânge bilirubina conjugată, care este excretată pe cale
renală. Urina normală cuprinde cantităţi mici de bilinogeni, urobilinogen (0-4 mg în
urina pe 24 ore). Eliminarea urinară de urobilinogen este mult crescută în icterul
hemolitic, deoarece ficatul nu poate metaboliza cantităţile mari de urobilinogen ce
se formează prin degradarea unei cantităţi anormal de mari de bilirubină. De
asemenea urobilinogenuria este totdeauna crescută în insuficienţele hepatice şi de
multe ori precede hiperbilirubinemia. În icterul prin obstrucţie excreţia de
urobilinogen este scăzută şi eventual dacă obstruarea canalelor biliare este completă,
urobilinogenul este absent în urină. Imediat după emisie, urina nu cuprinde biline
(urobilină). Aceşti compuşi rezultă prin oxidarea spontană a bilinogenilor, astfel
încât reacţiile de identificare pot fi fals negative atunci când sunt efectuate pe urină
foarte proaspătă.
Identificarea bilirubinei în urină. Sub acţiunea agenţilor oxidanţi (acid azotic
conc., FeCl3), bilirubina se oxidează la compuşi coloraţi de la verde la roşu.
Proba cu acid azotic (Gmelin). Peste 5 ml HNO3 conc. se suprapun cu grijă
prin scurgere pe pereţii eprubetei 5 ml urină. La suprafaţa de contact a celor două
lichide apar inele colorate în verde, albastru, violet, roşu. Această probă mai poate fi
efectuată şi astfel: se filtrează circa 5 ml urină pe un filtru fin. În conul din hârtie de
filtru se pune o picătură de HNO3 conc. Se observă apariţia inelelor colorate pe hârtia
de filtru.
Proba cu clorură ferică (Fouchet). Pe o placă de porţelan se amestecă 1 - 2
picături urină cu 1 - 2 picături reactiv Fouchet (1 g FeCl3 în 100 ml acid tricloracetic
25%). În prezenţa bilirubinei apare o coloraţie verde.
Identificarea urobilinogenului (reacţia Ehrlich). Bilinogenii în mediu acid
se condensează cu p-dimetil-aminobenzaldehidă, dând un compus colorat în roşu,
uşor solubil în cloroform. Reacţia este caracteristică pentru derivaţii bilanului. La 3
ml urină proaspătă se adaugă 3 ml reactiv Ehrlich (0,7 g p-dimetil-
aminobenzaldehidă se dizolvă în 150 ml HCl concentrat şi apoi se aduce cu apă la
250 ml) şi, picătură cu picătură, soluţie saturată de acetat de sodiu până la virajul
indicatorului roşu de Congo. Se adaugă 3 ml cloroform şi se agită. Se observă
291
coloraţia roşie a stratului de cloroform. Cu urina normală reacţia este foarte slab
pozitivă. Urobilinogenuria este crescută în icterul hemolitic şi în insuficienţele
hepatice.
Identificarea urobilinei (reacţia Schlesinger). Urobilina formează cu ionii
Zn2+ un complex ce prezintă fluorescenţă verde. La un volum de circa 5 ml urină se
adaugă un volum egal de reactiv Schlesinger (obţinut prin suspendarea a 10 g acetat
de zinc în 100 ml alcool etilic 16%). Se filtrează. Se observă fluorescenţa verde a
filtratului în lumină UV sau chiar la lumina zilei. Urina normală dă o reacţie foarte
slab pozitivă.

f) Acizii şi sărurile biliare în urină. Acizii biliari sunt sintetizaţi în ficat din
colesterol. Principalii acizi biliari din lichidul biliar sunt acidul colic şi acidul
chenodezoxicolic. La nivel hepatic, acizii biliari sunt conjugaţi cu glicocol sau
taurină, după care sunt secretaţi în canaliculele biliare, ajungând cu bila în intestin.
În ileonul proximal, acizii biliari prin proprietăţile lor tensioactive puternice
emulsionează lipidele alimentare, activează lipaza pancreatică, asigurând astfel
absorbţia lipidelor. În ileonul terminal, după hidroliza legăturii amidice cu glicocolul
sau taurina şi unele remanieri structurale (pierderea grupării -OH din C7), acizii
biliari sunt reabsorbiţi pe cale portală şi ajung din nou în ficat, unde sunt reconjugaţi
şi excretaţi în bilă (circuitul entero-hepatic al acizilor biliari). O cantitate de
aproximativ 10% scapă reabsorbţiei şi se elimină prin fecale. Această pierdere netă
de acizi biliari reprezintă o cale de eliminare din organism a nucleului steroidic al
colesterolului. Concentraţia plasmatică a acizilor biliari este scăzută (0,2 - 0,3 mg/dl)
şi de aceea eliminările pe cale renală vor fi reduse. Acizii biliari apar în urină în
sindroamele de retenţie biliară, în obstrucţia căilor biliare sau în hepatite (când scade
capacitatea de conjugare), însoţind de obicei eliminarea de bilirubină.

Identificarea sărurilor biliare în urină.

Proba Hay. Se bazează pe proprietatea acestor substanţe de a scade
tensiunea superficială a lichidelor care le cuprind. Într-o eprubetă se introduc 10 - 15
ml urină şi la suprafaţa ei se presară o cantitate mică de pulbere de sulf. În cazul
urinii normale, sulful se menţine la suprafaţa lichidului, în timp ce în cazul urinii
conţinând săruri biliare în cantitate mare, care scad tensiunea superficială a
lichidului, pulberea cade la fundul eprubetei cu o viteză direct proporţională cu
concentraţia sărurilor biliare. O serie de substanţe aflate în mod accidental în urină
(alcool, acid salicilic) pot în mod fals să pozitiveze reacţia.
Proba Pettenkofer. Este o reacţie de culoare pe care acizii biliari o dau cu
furfurolul. Acesta rezultă în mediul de reacţie prin acţiunea acidului sulfuric
concentrat asupra zaharozei. La 2 - 3 ml urină se adaugă 2 - 3 picături soluţie de
zaharoză 5%. Se pipetează cu grijă pe pereţii eprubetei 2 - 3 ml H2SO4 concentrat,

292
în aşa fel încât să se obţină două straturi distincte. În prezenţa acizilor biliari, la limita
de separaţie a celor 2 straturi se formează un inel colorat în roşu.
g) Teste rapide pentru identificarea compuşilor patologici urinari. Acestea
sunt în prezent tot mai frecvent utilizate în laboratoarele clinice. Kit-urile conţin
benzi înguste din material plastic ce au dispuse pe suprafaţă, înspre unul din capete,
pastile impregnate cu reactivi specifici pentru diferiţi compuşi. În general,
identificările se bazează pe principiile enumerate anterior. După imersarea benzii în
urină, se compară culoarea dobândită de fiecare pastilă cu un etalon (ce însoţeşte
obligatoriu kit-ul), la intervale de timp bine definite, pentru a permite desfăşurarea
optimă a fiecărei reacţii. Prin compararea vizuală este posibilă o estimare
semicantitativă a prezenţei compuşilor patologici. Dacă modificările de culoare ale
benzilor sunt interpretate cu ajutorul unui analizor dedicat, sunt obţinute valori ale
concentraţiilor fiecărui compus analizat.

293
 VIII. ANALIZA BIOCHIMICĂ
A LICHIDULUI CEFALORAHIDIAN (LCR)

Introducere
Lichidul cefalorahidian este un ultrafiltrat al plasmei prin plexurile coroide
şi unele porţiuni ale ependimului ventricular. Ocupă spaţiul dintre piamater şi
arahnoida.
Procesul de formare al LCR nu este un simplu fenomen fizic de filtrare la
nivelul barierei hematoencefalice, ci implică şi mecanisme active de secreţie şi
reabsorbţie la nivelul celulelor plexului coroid. Aceasta se observă comparând
compoziţia chimică a LCR cu aceea a plasmei:

Component LCR (mg/dl) Plasmă (mg/dl)

Na+ 325 325
K+ 10 20
Ca2+ 5 10
Mg2+ 3 3
Cl- 449 360
HCO3- 40 60
HPO42- 2 1
SO42- 0,5 1
Proteine 30 7000
Uree 24 30
Acid uric 0,5 - 2,6 4
Glucide 72 90
Bilirubină 0,2 0,8
Acizi organici urme urme

Recoltarea lichidului cefalorahidian se poate face prin puncţie lombară,

suboccipitală sau ventriculară, în funcţie de contextul clinic, în eprubete perfect
curate, sterile sau în tuburi vidate, special destinate acestui scop. După recoltare, sunt
pregătite în primul rând probe pentru examenul microbiologic şi citologic (culturi şi
respectiv frotiuri), care necesită un produs steril, urmând ca restul eşantionului
recoltat să fie utilizat pentru examenul fizico-chimic.

Caracteristici fizice
Culoare. Lichidul cefalorahidian normal este un lichid incolor. În unele
condiţii patologice el poate fi colorat în galben sau verzui (xantocromic). Această
culoare se datorează prezenţei bilirubinei sau biliverdinei (accident vascular
hemoragic tardiv, meningită tuberculoasă). LCR poate fi hemoragic datorită
prezenţei sângelui rezultat în urma înţepării accidentale a unui vas sanguin (după

294
primele picături de culoare roşie lichidul devine incolor, iar în eprubetă sângele
coagulează), sau a unui accident vascular cerebral hemoragic (lichidul rămâne pe
toată durata puncţiei omogen hemoragic, iar în eprubetă sângele nu coagulează).
Transparenţa. În mod normal LCR este transparent şi limpede (ca apa de
stâncă). Poate deveni opalescent în cazul prezenţei în cantitate mare a leucocitelor,
albuminei sau datorită prezenţei microorganismelor. Devine tulbure în meningitele
purulente.
Volumul. În mod normal la adult volumul total al LCR este de 100 - 200 ml.
Densitatea relativă, în condiţii fiziologice, este 1,004 - 1,009. Poate creşte
în unele procese patologice. Densitatea este determinată cu ajutorul unor areometre
de foarte mici dimensiuni.
Presiunea LCR determinată în poziţia aşezat este de 35 - 40 cm H2O pentru
subiecţii de toate vârstele. În decubit lateral presiunea variază cu vârsta, fiind mai
mică la nou-născuţi şi copii decât la adulţi. În condiţii patologice (meningită
purulentă sau tuberculoasă) presiunea LCR poate fi crescută.
Reacţia. pH-ul lichidului cefalorahidian este slab alcalin, aproximativ egal
cu cel al sângelui.

Examenul chimic al LCR

Un număr redus de componenţi ai lichidului cefalorahidian prezintă
importanţă pentru diagnostic. Dintre aceştia, cel mai frecvent se dozează proteinele
(inclusiv electroforeza), glucoza, clorurile, se cercetează calitativ prezenţa
triptofanului (meningita tuberculoasă) şi a acetonei (coma diabetică acido-cetozică),
se determină permeabilitatea faţă de nitraţi şi pot fi efectuate determinări de activităţi
enzimatice. Toate determinările chimice se efectuează numai pe LCR centrifugat.
În legătură cu modificarea compoziţiei LCR trebuie subliniat faptul că nu
poate fi stabilit un diagnostic clinic numai pe baza rezultatelor furnizate de examenul
chimic deoarece un LCR normal nu exclude o afecţiune organică a sistemului nervos
central (SNC), iar pe de altă parte o compoziţie anormală a LCR nu este totdeauna
consecinţa unei alterări primare a SNC putând fi determinată de o boală sistemică
fără interesarea directă a sistemului nervos.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

Identificarea proteinelor

Reacţia Pandy
Principiu. Lichidul cefalorahidian devine opalescent după adăugarea unei
soluţii saturate de fenol, atunci când concentraţia proteinelor depăşeşte valoarea
normală.
Interpretare. LCR normal rămâne clar sau devine foarte uşor opalescent.
Apariţia unei opalescenţe intense cu aspect lăptos sau de precipitat indică o reacţie a
295
cărei intensitate se apreciază ca slab pozitivă (+), pozitivă (++) sau intens pozitivă
(+++). Reacţii slab pozitive sau pozitive sunt întâlnite în meningite virale, encefalite,
abces cerebral, sifilis cu determinare nervoasă, boli infecţioase cu reacţii meningeale.
Reacţii intens pozitive sunt întâlnite în meningita tuberculoasă sau în meningite
bacteriene purulente. O reacţie Pandy negativă nu exclude totuşi existenţa unor
leziuni cerebrale, deoarece unele dintre acestea (în unele encefalite sau tumori) pot
evolua fără creşteri ale proteinorahiei (concentraţia proteinelor în LCR).

Reacţia Nonne-Appelt
Principiu. Globulinele aflate în exces în LCR precipită în prezenţa unei
soluţii saturate de sulfat de amoniu.
Interpretare. LCR normal rămâne clar sau devine uşor opalescent. Apariţia
unei opalescenţe nete sau a unui precipitat alb indică o reacţie pozitivă. Pozitivarea
testului Nonne-Appelt se produce îndeosebi în meningitele cronice luetice, în care
există creşteri ale globulinelor de 1-4 g/l.

Determinarea cantitativă a proteinelor totale (metoda biuretului)

Principiu. Proteinele din LCR sunt precipitate cu acid percloric iar
precipitatul este dizolvat în reactiv biuret cu care produce o coloraţie albastră,
fotometrabilă.
Valori normale: max. 40 mg/dl.

Determinarea cantitativă a albuminei (reacţia Heller).

Principiu. Albumina din LCR produce cu acidul nitric-nitros (reactiv Heller)
un precipitat care poate fi evaluat cantitativ prin diluţii progresive. Experimental s-a
stabilit că apariţia unui precipitat exact la 3 minute după adăugarea reactivului arată
prezenţa în proba de analizat a unei cantităţi de 3,3 mg proteine/dl.
Interpretare. Cantitatea de albumină din LCR de analizat exprimată în mg/dl
se calculează înmulţind diluţia respectivă cu 3,3. Valori normale: max. 20 mg/dl.
Dozarea glucozei în LCR
Principiu. Glucoza în prezenţa o-toluidinei în mediu de acid acetic produce la
cald o coloraţie verde, fotometrabilă la 630 nm.
Valori normale: 50 - 85 mg/dl
Interpretare. Hiperglicorahia este întâlnită în afecţiuni ale sistemului nervos
central neînsoţite de hiperglicemie (encefalite, tumori, hemoragii cerebro-
meningeale, abcese cerebrale), precum şi în afecţiuni ce nu interesează SNC, dar sunt
însoţite de hiperglicemie (diabet zaharat, infecţii generale, boli eruptive). Valori
scăzute (hipoglicorahie) pot fi prezente în meningita tuberculoasa.

Dozarea clorurilor

296
 Principiu. Clorurile din LCR sunt dozate prin metoda argentometrică,
tratând cu o soluţie de azotat de argint în exces şi titrând excesul cu sulfocianură de
potasiu, în prezenţă de alaun drept indicator.
Valori normale: 410 - 470 mg/dl. Creşteri ale clorurorahiei pot surveni în
glomerulonefrite cronice cu insuficienţă renală în stadiul uremic, iar valori scăzute
în meningite acute tuberculoase.
Observaţie. Glicorahia şi clorurorahia prezintă interes practic în diagnosticul
diferenţial dintre meningita virală (în care au valori normale) şi meningita
tuberculoasă (în care prezintă valori mai scăzute). Normalizarea valorilor este un
indiciu important în evoluţia favorabilă a pacientului tratat cu tuberculostatice.

Identificarea triptofanului
Principiu. Triptofanul tratat cu oxalat de magneziu în mediu acid dezvoltă o
coloraţie violet. Reacţia este specific pozitivă în meningita tuberculoasă.

Identificarea acetonei
Principiu. Acetona reacţionează cu aldehida salicilică în prezenţa hidroxi-
dului de potasiu, dezvoltând o coloraţie roşu-portocalie. Reacţia este utilizată pentru
diagnosticarea comei diabetice acido-cetozice.

Permeabilitatea la nitraţi
Reacţia este utilizată pentru studiul alterării permeabilităţii meningeale, prin
determinarea cantităţii de nitraţi ce au trecut în LCR după administrarea pe cale orală
cu trei ore înaintea prelevării probei a 1 g azotat de sodiu la 30 kg corp, dizolvat în
apă (200 ml).
Principiu. Nitraţii reacţionează cu difenilamina în prezenţa acidului sulfuric,
dezvoltând coloraţie albastră.

297
 IX. ANALIZA BIOCHIMICĂ A SUCULUI GASTRIC

Introducere
Sucul gastric este un amestec al secreţiilor mai multor tipuri de celule
aparţinând mucoasei gastrice (celule ale glandelor cardiale, fundice sau oxintice şi
antropilorice), secreţiilor epiteliului de acoperire, la acestea adăugându-se
transudatul seric compus din apă, electroliţi şi mici cantităţi de proteine serice care
difuzează în lumenul gastric.
In 24 de ore se secretă în medie 1200-1500 ml suc gastric, secreţia gastrică
fiind influenţată de alimentaţie, vârstă (este maximă la 20-30 de ani şi scade cu
avansarea în vârstă datorită unui proces de atrofiere progresivă a mucoasei), precum
şi de alţi factori diverşi. Totodată secreţia gastrică este maximă în perioadele
digestive şi minimă în cele interdigestive.
Sucul gastric este un lichid incolor, opalescent sau clar, izoton cu plasma, cu
pH între 0,9-1,2 şi cu densitate între 1,001-1,010. Este compus din 99,4% apă şi 0,6%
substanţe anorganice şi organice.
În zona glandelor fundice se elaborează secreţia primară acidă numită şi
secreţia parietală, care este de fapt o soluţie apoasă de acid clorhidric.
În zona antropilorică se elaborează secreţia primară alcalină numită şi
secreţia neparietală, care este în realitate un amestec de proteine, mucus, ioni de
sodiu (Na+), potasiu (K+), calciu (Ca2+), clor (Cl), bicarbonat (HCO3-).
Secreţia alcalină are rolul de a reduce aciditatea gastrică prin neutralizare şi
diluţie. Sucul gastric rezultă deci în principal, din amestecul celor două secreţii:
parietală şi neparietală, iar componentele majore sunt reprezentate de:
a) Acidul clorhidric, după cum s-a precizat, este secretat activ de către
celulele parietale ale glandelor gastrice. Se găseşte parţial în stare liberă, parţial
combinat cu proteine. Intervine în procesul digestiv prin: activarea enzimelor
proteolitice gastrice prin favorizarea transformării zimogenilor în forma activă;
denaturează proteinele alimentare, proces care favorizează acţiunea enzimelor
proteolitice; face posibilă absorbţia fierului alimentar (preponderent Fe3+) prin
transformarea acestuia în Fe2+ (forma de absorbţie); împiedică multiplicarea
microorganismelor, asigurând prin aceasta antisepsia mediului gastric.
În prezent sunt vehiculate două teorii ce explică producerea protonilor ce vor
fi expulzaţi în lumenul gastric, unde ating concentraţii de 150 - 170 mEq/l. Prima
teorie explică generarea de protoni prin reacţia de ionizare a apei, urmată de
pomparea activă a acestora la polul luminal al celulelor parietale. Ionii HO - rămaşi
în celulă vor fi neutralizaţi de către protoni rezultaţi în urma disocierii acidului
carbonic rezultat din acţiunea anhidrazei carbonice. Sursa de CO2 este reprezentată
de metabolismul propriu al celulei parietale (în cazul unei secreţii moderate de HCl),
la care se adaugă CO2 difuzat în celulă din sânge (in cazul secreţiei maximale). Cea
de a doua ipoteză este cea redox care susţine că protonii rezultă în urma unui proces

298
de oxido-reducere extramitocondrial, la care participă o flavoproteină şi citocromul
c.
Clorul este de asemenea secretat activ de câtre celulele parietale la polul
luminal al acestora, prin intermediul unei ATP-aze Na+-K+ -dependentă. Secreţia de
ioni de clor este menţinută şi în condiţiile sistării secreţiei de protoni. Sursa de ioni
de clor în celula parietală este reprezentată de un proces de difuzie pasivă a acestora
la polul sanguin.
b) Ionii de sodiu sunt secretaţi la nivelul celulelor glandelor fundice antrale
şi cardiale, atingând concentraţii de 80 - 140 mEq/l în condiţiile secreţiei bazale,
scăzând până la 10 mEq/l în timpul secreţiei maximale, datorită schimbului acestor
ioni cu protonii expulzaţi.
c) Ionii de potasiu se găsesc în concentraţie mai mare decât cea plasmatică
(10 - 20 mEq/l), provenind atât din secreţia parietală, cât şi din cea neparietală.
d) Apa (2 - 3 litri / 24 ore) provine în parte din metabolismul celular, cea
mai importantă cantitate fiind de origine interstiţială.
e) Mucusul gastric are rolul de a proteja celulele epiteliale şi este secretat de
către celule specializate ale glandelor fundice, cardiale şi pilorice, precum şi de către
celulele epiteliale. Secreţia este stimulată în primul rând de către prostaglandine
sintetizate la acest nivel. Mucusul este constituit din glicoproteine şi
mucopolizaharide şi formează la suprafaţa celulelor epiteliale gastrice un strat
aderent, vâscos de 0,5 - 2,5 mm.
f) Enzimele aflate în sucul gastric sunt pepsina, gastricsina, catepsina ce
provin dintr-un zimogen comun - pepsinogen, lipaza gastrică, gelatinaza,
labfermentul, anhidraza carbonică şi lizozimul. Pepsina este principala enzimă
proteolitică digestivă, cu masa moleculară 35 kdal şi pH optim de acţiune 2, având
activitate de tip endopeptidazic. Activitatea proteolitică scade dramatic la pH gastric
peste 4. Pepsina este rezultatul unei modalităţi specifice de activare a pepsinogenului
în condiţii de pH foarte acid, secreţia zimogenului fiind stimulată de o secreţie
crescută de HCl şi inhibată de către prostaglandinele PGE2 şi PGI2. Gastricsina şi
catepsina sunt rezultatul altor modele de activare a pepsinogenului, având pH-uri
optime de acţiune mai ridicate decât pepsina.
Lipaza gastrică este activă în special la sugari, având un pH optim de acţiune
de 5,5. Gelatinaza acţionează asupra gelatinei din ţesuturile conjunctive, având
acţiune specifică şi mult accentuată în comparaţie cu pepsina. Labfermentul
acţionează asupra cazeinei din lapte pe care o transformă în paracazeină ce precipită
în prezenţa ionilor de calciu, fiind favorizată acţiunea asupra acesteia a altor enzime
proteolitice. Lizozimul acţionează asupra mucopolizaharidelor; se găseşte în mod
normal în concentraţii foarte mici, dar acestea cresc foarte mult la pacienţii cu ulcer
gastric.
Anhidraza carbonică ajunge în sucul gastric în urma descuamării celulare,
în special a celulelor parietale.

299
 g) Factorul intrinsec este o glicoproteină, secretată de celulele parietale, ce
formează cu vitamina B12 un complex, formă sub care această vitamină este absorbită
la nivel intestinal.

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

a) Identificarea acidului clorhidric

Principiu. Acidul clorhidric liber din sucul gastric formează cu reactivul
Gunzburg un produs de culoare roşie intensă.

b) Dozarea acidităţii sucului gastric

Principiu. În stomac acidul clorhidric există sub două forme: acid clorhidric
liber („aciditate liberă”) şi acid clorhidric combinat cu proteine sub forma de
clorhidraţi proteici („aciditate combinată”). Suma acestora constituie aciditatea
gastrică totală.
Aciditatea sucului gastric se determină prin titrare cu soluţie de NaOH 0,1N
în prezenţa indicatorului Topffer-Linossier.

Mod de lucru
La 3 ml suc gastric se adaugă 1-2 picături de indicator (coloraţie roşie). Se
titrează cu NaOH, până la virarea culorii în portocaliu şi se notează volumul utilizat
(v1). Se continuă titrarea, până la virarea culorii în galben pai şi apoi în roz persistent
(v2).
- v1 este echivalent cu aciditatea liberă
- v2 este echivalent cu aciditatea combinată
- v1 + v2 este echivalent cu aciditatea totală
Calcul. Rezultatul se exprimă în „unităţi clinice”, sau în grame de HCl/1000
ml suc gastric. Unităţile clinice reprezintă numărul de mililitri de NaOH 0,1N
utilizaţi pentru neutralizarea a 100 ml suc gastric. 1 ml NaOH 0,1N corespunde la
36,5 x 10-4 g HCl.
Valori normale:
În unităţi clinice: - aciditate liberă: 15 unităţi clinice
(Javorski);
- aciditate combinată: 25 unităţi clinice;
- aciditate totală: 40 unităţi clinice.
În g/l: - aciditate liberă: 0,9 - 1 g/l;
- aciditate combinată: 1 - 2,5 g/l;
- aciditate totală: 2,5 - 3,5 g/l.
Observaţii: recoltarea sucului gastric pentru determinarea acidităţii gastrice se
face:
a) prin recoltare simplă, într-un interval de timp limitat, a jeun, cu un tub de
calibru mare, sau cu o sondă subţire permanentă;
300
 b) după 60 minute de la administrarea unui prânz de probă, de exemplu
prânzul Boas: 35 g pâine albă şi 400 - 500 ml ceai îndulcit;
c) după injectare de histamină (proba cu histamină): se evacuează lichidul
de staza, după care se injectează subcutanat 0,5 - 1 mg histamină. Timp de 1 - 2 ore
se recoltează suc gastric prin aspiraţie cu o seringă, la diferite intervale de timp: în
prima oră la 10 minute, iar în a doua oră la 15 minute. Rezultate similare se obţin
prin stimularea secreţiei gastrice cu gastrină, pentagastrină, insulină.
- s-a demonstrat recent că dozarea acidului clorhidric liber prin această
metodă nu dă rezultate riguros exacte, deoarece acidul clorhidric combinat are o
tendinţă accentuată de disociere hidrolitică, favorizată tocmai prin titrare. Datorită
acestui fapt este corect ca prin aciditate liberă să se înţeleagă aciditatea potenţială a
sucului gastric, adică acidul clorhidric liber la care se adaugă o parte a acidităţii
combinate, cea care s-a disociat hidrolitic în timpul titrării.
- în accepţiunea actuală, noţiunile de aciditate liberă şi concentraţia HCl
(mEq/l) sunt valori arbitrare, fără semnificaţie fiziologică, deşi sunt încă frecvent
utilizate; în prezent sunt preferate exprimările în mEq H+/l (activitate totală a
protonilor), sau în mEq H+/h (secreţie acida, ceea ce reprezintă debitul de acid
clorhidric).
- în ultimul timp, măsurarea secreţiei acide se face prin titrare cu NaOH
0,05N în prezenţa de roşu neutru (0,15% roşu neutru în alcool etilic 80%) ca
indicator; culoarea roşu-oranj indicând sfârşitul titrării. Exprimarea se face direct în
ioni-gram de H+.

Interpretare. Valori crescute (hiperaciditate) se constată în: ulcer duodenal,

stenoze pilorice de diferite etiologii, sindrom Zollinger-Ellison şi sindromul Verner-
Morrison, ulcer peptic, anastomoze porto-cave. Valori scăzute (hipo- sau
anaciditate) se constată în: cancer gastric, anemie pernicioasă, ulcer gastric, afecţiuni
cronice ale colecistului, glucagonom, stări de subnutriţie, boala Addison, boli febrile
acute.

c) Determinarea activităţii pepsinei.

Principiu. Activitatea pepsinei gastrice este direct proporţională cu cantitatea
de proteină hidrolizată într-un interval de timp dat şi este dependentă de o aciditate
gastrică normala.
Interpretare. Dacă în prima eprubetă hidroliza ovalbuminei s-a terminat în trei
ore, activitatea pepsinei în mediul acid gastric este normală. Dacă hidroliza nu s-a
efectuat decât în a doua eprubetă, aciditatea gastrică este deficitară. Dacă hidroliza
nu este completă în nici o eprubetă, există un deficit de activitate enzimatică.

d) Identificarea acidului lactic.

Reacţia Uffelmann
301
 Reactiv: la 20 ml soluţie apoasă de fenol 4% se adaugă 1-2 picături dintr-o
soluţie de FeCl3 30% extemporaneu; culoarea reactivului este albastru-violet.
Se pipetează într-o eprubetă 5 ml reactiv Uffelmann, peste care se adaugă 1
ml suc gastric de cercetat. În prezenţa acidului lactic din sucul gastric, culoarea
albastru-violet trece în galben.
Reacţia Berg
Reactiv: 3 picături soluţie FeCl3 30% şi 3 picături HCl concentrat în 100 ml
apă b.d.; soluţia este colorată galben deschis.
Se pipetează într-o eprubetă 8-10 ml reactiv Berg, peste care se adaugă 1-1,5
ml suc gastric de cercetat. Se compară culoarea obţinută cu cea a reactivului.
Prezenţa acidului lactic determină apariţia unei coloraţii galben intens, datorată
lactatului de fier. Posibila apariţie a unei culori roşu-portocaliu este datorată unui
exces de tiocianat conţinut în saliva înghiţită.

e) Dozarea acidului lactic (metoda Boas).

Principiu. Acidul lactic separat prin extracţie din sucul gastric deproteinizat
este titrat cu o soluţie de NaOH 0,1N în prezenţa fenolftaleinei ca indicator.
Interpretare. Sucul gastric normal conţine cantităţi extrem de mici de acid
lactic, practic neglijabile. În afecţiuni însoţite de hipo- sau anaciditate şi sub influenţa
fenomenului de stază, se produce fermentaţia chimului gastric cu producere de acid
lactic. Concentraţia acidului lactic în sucul gastric este crescută în cancer gastric,
stenoze pilorice, anemia pernicioasă.

f) Identificarea sângelui (reacţia Kastle-Mayer).

Se pipetează într-o eprubetă 2 ml suc gastric nefiltrat; se fierbe cu atenţie în
scopul inactivării oxidazelor leucocitare. Se răceşte la curent de apă. Se adaugă 2 ml
amestec acid acetic/alcool (preparat din 2 ml acid acetic glacial şi 100 ml alcool etilic
95o), 0,5 ml reactiv Kastle-Mayer (preparat prin dizolvarea în 50 ml apă distilată a
10 g KOH şi 1 g fenolftaleină, soluţie ce este redusă cu 5 g Zn pulbere la fierbere şi
ulterior filtrata) şi 2-3 picaturi apă oxigenată 3%. Apariţia unei culori roşii indică
prezenţa sângelui.
Observaţii. În cursul tubajului trebuie evitată lezarea mucoasei gastrice,
pentru a nu avea o reacţie fals pozitivă. Reacţia poate fi pozitivă şi în cazul lezării
foselor nazale, sau a hemoragiei gingivale. În scopul evitării rezultatelor eronate, se
recomandă cercetarea hemoragiilor oculte în materiile fecale.
Interpretare. Afecţiunile în care poate apare sânge în sucul gastric sunt:
ulcer gastric şi duodenal, cancer gastric, insuficienţa renală cu uremie, ciroza
hepatică, telangiectazia ereditară (boala Rendu-Osler), tromboza venei porte şi a
venei splenice, precum şi după tratament cu: anticoagulante, ACTH, antiinfla-
matoare steroidiene sau nesteroidiene.

g) Identificarea pigmenţilor biliari.

302
 Prezenţa lichidului biliar în sucul gastric determină colorarea acestuia în verde
în cazul prezenţei acidului clorhidric liber, sau în galben, în absenţa acestuia.
Evidenţierea pigmenţilor biliari cu mare sensibilitate se poate face utilizând reacţia
Grimbert. Prezenţa acestora în sucul gastric indică un reflux biliar, ce poate apare la
pacienţi operaţi de ulcer peptic, determinând o gastrită alcalină.

303
 X. INVESTIGAREA BIOCHIMICĂ
A SISTEMULUI ENDOCRIN

Evaluarea funcţiei endocrine se realizează prin una sau prin asocierile

următoarelor determinări:
- concentraţia plasmatică a hormonului;
- excreţia urinară a hormonului sau a metaboliţilor lui;
- rata de secreţie a hormonului în circulaţie;
- rezerva hormonală şi reglarea hormonală, ambele prin teste dinamice;
- concentraţia receptorilor hormonali;
- efectele selective ale acţiunii hormonului pe ţesuturile ţintă.

1. Măsurarea concentraţiilor plasmatice hormonale

- hormonii steroizi şi tiroidieni au valori plasmatice între 1nmol/l şi 1mol/l
- hormonii peptidici au valori plasmatice între 1pmol/l şi 0,1 nmol/l
- dozarea hormonală se face prin tehnici moderne chimice, cromatografice,
radioimunologice
- ţine cont de secreţia pulsatilă a unor hormoni (ex. LH, testosteron), de
fluctuaţiile predictibile diurne (ex. cortisolul) sau lunare (ex. valorile gonadotrofi-
nelor, progesteronului şi estradiolului se interpretează în funcţie de faza ciclului
menstrual)
- pentru hormonii care necesită transportor plasmatic (steroizi, tiroidieni),
concentraţiile plasmatice libere reflectă cel mai bine funcţia endocrină, dar uzual se
determină valoarea hormonului plasmatic total (liber şi legat). Când există fluctuaţii
plasmatice ale proteinei transportoare, concentraţia ei trebuie determinată alături de
cea ale hormonului total;
- în populaţia sănătoasă, intervalul concentraţiilor plasmatice hormonale este
foarte larg. De aceea, este bine să se facă determinări de hormoni pereche (testosteron
şi LH, tiroxina şi TSH); de exemplu, când testosteronul este la limita inferioară a
normalului şi se însoţeşte de LH crescut este vorba de insuficienţă testiculară, dar dacă
LH de însoţire este normal, funcţia testiculară se consideră normală.

2. Măsurarea concentraţiilor urinare ale hormonilor şi ale metaboliţilor acestora

Pentru hormonii cu secreţie fluctuantă (ex. cortisolul), determinările urinare
hormonale prezintă avantaje faţă de valoarea obţinută pe o probă izolată de sânge.
Determinarea se face pe proba de urină colectată în ultimele 24 de ore, estimându-se
mai precis funcţia cortexului adrenal faţă de cazul în care se măsoară cortisolul
plasmatic pe o probă izolată de sânge.
Dezavantajele determinărilor hormonale urinare faţă de cele plasmatice
constau în:
- valorile urinare hormonale pot fi modificate de medicaţie;
304
 - eliminarea hormonală urinară depinde de funcţia renală; de aceea, se face
raportare la creatinina urinară;
- există hormoni care se secretă prin bilă (T3, T4), deci valoarea urinară nu
poate fi interpretată;
- există hormoni cu origini tisulare diferite, dar care au un metabolit urinar
comun; de ex., 17-cetosteroizii urinari derivă din androgenii adrenali şi gonadali; de
aceea, măsurarea lor are valoare redusă în aprecierea producţiei androgenice
testiculare.

Acidul vanil-mandelic urinar (AVM)

Acidul vanil-mandelic (acid 3-metoxi-4-hidroxi-mandelic) este produsul final
de metabolizare al catecolaminelor, generat sub acţiunea combinată a enzimelor
catecol-O-metil transferaza (COMT) şi monoaminoxidaza (MAO). Dozarea AVM
urinar este laborioasă şi nu de mare acurateţe. Astăzi, se preferă dozarea
metanefrinelor urinare (compuşi intermediari de metabolizare a catecolaminelor) sau
dozarea catecolaminelor plasmatice. Astfel, pentru diagnosticul de feocromocitom,
se determină normetanefrina şi metanefrina prin metode radioimunologice, pe urina
de 24 de ore sau pe o probă de urină recoltată la o oră după golirea vezicii urinare şi
repaus la pat.
Valori normale AVM: 1-7 mg/24 ore pentru adulţi şi copii peste 7 ani.
Exprimarea AVM sub formă de coeficient de eliminare este mult mai corectă,
concentraţia acestuia raportându-se la excreţia de creatinină.
AVM este un marker pentru două tipuri de tumori:
- neuroblastom, cu originea în celulele sistemului nervos simpatic şi
reprezintă una dintre cele mai frecvente tumori maligne ale copilului de vârsta mică;
valoarea AVM este ridicată pentru 70% dintre cazurile cu neuroblastom;
- feocromocitom, tumoră de medulosuprarenală, de obicei benignă şi care se
caracterizează clinic prin episoade de: hipertensiune, palpitaţii, transpiraţii, cefalee.

ACTIVITATEA EXPERIMENTALĂ

Dozarea acidului vanil-mandelic

Principiu: Se analizează urina colectată pe 24h (eventual conservată cu HCl

sau acid acetic glacial). In prealabil se extrage acidul vanil-mandelic (VMA) după
cum urmează: VMA este absorbit pe o coloană cu răşină schimbătoare de ioni. După
ce compuşii interferenţi au fost îndepărtaţi prin spălare, VMA este eluat. VMA astfel
extras se determină spectrofotometric (formează un compus colorat în roşu cu p-
nitroanilina diazotată).

Reactivi necesari:
p-nitroanilina diazotată
305
 Standard acid vanil mandeliv (concentratie 10 mg/L)

Modul de lucru
Proba Standard Martor
Urină [extract] 2 ml - -
Standard VMA 2 ml -
Apă 2 ml 2 ml 4 ml
p-nitroanilină diazotată 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml
Apă 2 ml 2 ml 2 ml

Se agită, se incubeaza 5 minute la temperatura camerei. Se citesc extincţiile la 520nm

faţă de martor.

Calcul: VMA (mg/L)= Ep/Es x 10

VMA (mg/24 h) = VMA (mg/L) x vol urinar in 24 h

Hormonii tiroidieni
Glanda tiroida secretă în principal tiroxină (T4) şi mai puţină triiodotironina
(T3); în ţesuturile periferice se sintetizează cantităţi mai mari de T3 din T4. În sânge, T4
circulă în cea mai mare parte legat de proteine (TBG- tyroxine binding globulin,
TBPA-tyroxine binding prealbumin). Albumina transportă 10% din T4 şi 30% din T3.
Metoda imunoenzimatică tip ELISA oferă avantajul dozării unor concentraţii
mici de hormon şi utilizarea unei cantităţi foarte mici de probă.

Principiu:
Serul este incubat cu anticorpi anti-T4 fixati pe un suport solid. După o
perioadă de incubare, se îndepartează excesul de antigen cu o soluţie de spălare. Se
adaugă al doilea anticorp anti-T4 marcat enzimatic. Se adaugă substratul enzimei şi
se formează un produs colorat, a cărui absorbanţă este proporţională cu concentraţia
de T4 din probă.
Calcularea concentraţiei de T4 din probă se realizează pe o curbă standard care
este trasată folosind standarde de concentraţii cunoscute de T4.

Reactivi necesari:
Suport solid cu anticorpi anti-T4 ataşaţi
Anticorpi anti T4 marcaţi cu o enzimă
Substratul enzimei
Solutie de spălare
Soluţie stop pentru reacţia enzimă-substrat
Standarde T4 de concentraţii cunoscute

Valori normale: T4 total = 4-12μg/dl (70-140 nmol/litru)

306
 Free T4 = 9-20 pmol/litru
T3 = 80-220 ng/dl

Hipertiroidia se caracterizează prin creşterea T3, T4 şi scăderea TSH.

Hipotiroidia se caracterizează prin scăderea T3, T4 şi creşterea TSH.
În condiţiile deficitului tiroidian şi global (în tot organismul) de iod,
tireoglobulina conţine un procent mare de monoiodtirozină. Cu cât este mai mare
procentul de monoiodtirozină, cu atât este mai mare proporţia de T 3 produsă de
glanda tiroidă. Pentru că hormonul T3 are efecte metabolice mai intense decât T4,
sinteza crescută de T3 este o măsură de adaptare a organismului la deficitul de iod.
Pe perioada sarcinii, concentraţia proteinei transportoare de hormoni tiroidieni
(TBG) este crescută. Tabelul de mai jos relevă că hiperfuncţia tiroidiană este
demonstrată de valori plasmatice crescute ale hormonului liber asociate cu
concentraţii scăzute ale hormonului hipotalamic de reglare (TSH scăzut).

T3 total T4 total TSH TBG T4 liber

Persoană
[nmol/l] [nmol/l] [mU/l] [mg/l] [pmol/l]
Gravidă cu funcţie
> normal > normal normal > normal normal
tiroidiană normală
Gravidă cu funcţie
> normal > normal < normal > normal > normal
tiroidiană crescută

307
 CAPITOLUL XI. APLICAŢII CLINICE

ENZIME PLASMATICE

1. Faceţi corespondenţa dintre afecţiune şi activitatea enzimatică modificată:

Afecţiuni:
1. pancreatită acută cu debut în urmă cu 36 ore
2. pancreatită acută cu debut în urmă cu 5 zile
3. infarct miocardic cu debut în urmă cu 8 ore
4. infarct miocardic cu debut în urmă cu 7 zile
5. colestază (staza sărurilor biliare) din cauza unui calcul biliar
6. hepatită acută virală A
7. hepatită cronică cu virus B.
Activitatea enzimatică:
a. CK-MB cu activitate dublă
b. amilaza serică de patru ori valoarea normală
c. TGO de 5 ori valoarea normală
d. LDH de doua ori peste valoarea normală
e. lipaza serică de două ori peste valoarea normală
f. TGO de peste o suta de ori valoarea normală
g. fosfataza alcalină de peste trei ori valoarea normală.

2. Se ştie că HVA se vindecă în totalitate, în timp ce HVB este o boală cronică.

Activitatea transaminazelor determinată la doi pacienţi, la 15 zile după debutul
fiecărei hepatite, relevă valorile 2000 UI/L şi respectiv 200UI/L.
Faceţi corespondenţa dintre diferitele tipuri de hepatite virale (hepatita virală
A-HVA şi hepatita virală B-HVB) şi activitatea transaminazelor.
De ce gradul creşterii activităţii enzimatice este diferit în cele două
afecţiuni?
Se poate corela gradul creşterii cu severitatea bolii?

3.Un pacient este adus la camera de gardă pentru dureri abdominale acute, care se
încadrează în tabloul clinic al pancreatitei acute. Durerea abdominală a debutat în
urmă cu 3-4 zile. La determinarea amilazei serice se determină o valoare normală.
Se poate exclude diagnosticul de pancreatită acută?
Dacă nu, ce alte determinări ar fi utile pentru diagnosticul de pancreatită
acută?

4. Un pacient vine pentru dureri toracice, puternice, cu debut în urmă cu 2 ore. Se

suspicionează un infarct miocardic acut (IMA). Diagnosticul de IMA se bazează pe

308
trei elemente: tabloul clinic (durere), modificări biologice (activitatea crescută a
enzimelor cardiace), modificări ale electrocardiogramei.
Activitatea căror enzime trebuie determinată atunci cand se suspicionează
IMA?
La ce interval de timp de la debutul durerii trebuie cerută activitatea
enzimelor cardiace?

5. Alegeţi cuvintele din paranteză (colestază, copil, de peste trei ori valoarea
normală, GGT), astfel încat afirmaţiile următoare să fie corecte:
La............,o activitate crescută a fosfatazei alcaline, de două ori faţă de
valoarea normală a adultului, înseamnă o valoare fiziologică. In obstrucţia canalului
coledoc, se produce ............., cu cresteri ........................... a fosfatazei alcaline. La
un pacient la care activitatea fosfatazei alcaline este crescută, pentru a diferenţia o
afecţiune hepatică, de una osoasă, se cere activitatea.............

METABOLISMUL CALCIULUI

1. Investigarea pacientílor cu hipocalcemie are ca etape, următoarele:

-se determină albuminemia pentru a exclude falsa hipocalcemie (calciul total scade
cu 0,8 mg/dL la fiecare scădere a albuminemiei cu 1g/dl)
-se determină magnezemia
-se fac teste ale funcţiei renale pentru a face diagnostic diferenţial între posibilele
cauze, după cum urmează:

Diagnostic de hipoparatiroidism Deficit de vitamină D3

sau insuficienţă renală cronică
Hipocalcemie cu hiperfosfatemie Hipocalcemie cu hipofosfatemie
PTH are valori mici plasmatice PTH are valori mari plasmatice

Explicati tabelul pe baza efectelor hormonilor pe ţesuturile ţintă.

2. Citiţi descrierea proteinelor osteocalcina şi calbindina, definiţiile osteoporozei şi
osteomalaciei şi răspundeţi la întrebarea: Monitorizarea concentraţiei de
osteocalcină poate fi utilă în determinarea raspunsului la tratamentul osteoporozei?
Osteocalcina
-este sintetizată de osteoblaste şi este considerată marker al formării osoase
-este proteina majoră non-colagenică din structura osoasă
-are o formă circulantă, ce reprezintă aproximativ 10-25% din osteocalcina ce
părăseşte osul şi filtrează renal
-sinteza ei este stimulată de vitaminaD3

309
-este carboxilată la resturile de acid glutamic, sub acţiunea vitaminei K, căpătand
astfel afinitate pentru calciu şi hidroxiapatită, întărind structura osoasă
-este implicata in reglarea glucozei sangvine, in secretia de insulina, si in modelarea
tesutului adipos
-se determină prin metoda imunometrică
Osteocalcina serica este crescuta in hiperparatiroidism si scazută în
hipoparatiroidism şi în diabetul zaharat tip 2.
Calbindina D28k
-proteină de legare a calciului şi a a calciuATP-azei , prezentă în celula intestinală,
a cărei sinteză este stimulată de vitamina D3
3. Se ştie că tratamentul osteoporozei constă în: dietă cu alimente bogate în calciu,
dietă lacto-vegetariană, calcitonină (spray nazal sau formă injectabilă), efort fizic
zilnic.
Ce importanţă are dieta lacto-vegetariană? Ce efecte are calcitonina?
4. O femeie cu varsta de 30 ani, este adusă la medic pentru lipotimie (leşin), survenită
după o stare conflictuală, anxietate. Examenul clinic relevă hiperexcitabilitate
neuromusculară. Care este cauza acestei hiperexcitabilităţi neuromusculare şi care
este tratamentul recomandat?

METABOLISMUL FIERULUI

310
1. Doi pacienţi cu anemie feriprivă, cu aceleaşi valori pentru hemoglobină şi
sideremie, au diagnostice diferite. Stabiliţi diagnosticele presupuse pe baza CTLFe.

Pacient 1 2
Date clinice Tanar, cu hemoroizi Varstnic, cu dureri
sangeranzi cronice , epigastrice
Hemoglobina (N= 14-16 g/dL) 9 g/dL) 9 g/dL)
Frotiu Hematii mici, hipocrome Hematii mici,
hipocrome
Sideremia (N=70-120 μg/dL) 45 μg/dL 45 μg/dL
Feritina serica Sub normal Sub normal
CTLFe (N= 250-410 μg/dL) 450 200
Diagnostic prezumptiv

2. Cunoscand valorile normale (HbCO 4-8% din Hb totală şi MetHb 1%), faceti
asocierile:
Simptome: 1dureri de cap, ameţeli ;2 probleme respiratorii
Analiză sange:a) HbCO 32%;b) MetHb 28%
Context: x)sugar, hidratat cu apă de fantană; y) şedere în încăpere, cu sobe,
cu ardere incompletă
Remediu: A)Vitamina C si alte substante reducatoare;B) Oxigen, pe mască,
debit mare
3. Completaţi posibilele valori ale Sideremiei (mică/mare) şi CTLFe (mică/mare) în
următoarele contexte clinice: a)femeie cu menstruaţii abundente, b)copil cu
talasemie majoră, tratat cu transfuzii de sange şi c) pacient cu cancer gastric
COMPUŞI GLUCIDICI
1. La un control medical, de rutină, glicemiile a jeun, determinate la trei pacienţi
sunt:85 mg/dl pentru subiectul 1, 118 mg/dl pentru subiectul 2 şi 156 mg/dl pentru
subiectul 3. Cum interpretaţi aceste valori?
2. Sunteţi medic urgentist. La camera de gardă vă sunt aduşi, în acelaş timp, doi
pacienţi diabetici, în comă. Asistenta medicală le verifică glicemia pe glucometru şi
valorile sunt de 50mmol/L şi respectiv 1.6 mmol/L. Transformaţi valorile glicemiei
în mg/dl. Pe care pacient il trataţi primul şi de ce?

3. Ţesuturile glucodependente (insulinoindependente) sunt..........

4. Ţesuturile glucoindependente (insulinodependente) sunt...................

5. Valoarea HbA1c reflectă glicemiile pe ultimele..........luni.

6. Valoarea fructozaminei reflectă glicemia pe ultimele..........săptămani.

311
Se ştie că rezistenţa la insulină înseamnă hiperinsulinemie cu hiperglicemie sau
euglicemie (normoglicemie)

7. Pe ficat, efectele rezistenţei la insulină sunt:…………………………

8. Pe muşchiul scheletic, efectele rezistenţei la insulină sunt: …………………

………

9. Pe ţesutul adipos, efectele rezistenţei la insulină sunt:…………………………

10. O valoare de 6.5-7% a HbA1c , la un pacient diabetic, reflectă un control

glicemic.....(bun/rau)

11. O valoare de 10% a HbA1c , la un pacient diabetic, reflectă un control

glicemic..... (bun/rau)

COMPUŞI LIPIDICI

1. Calculaţi concentraţia LDL-C la un pacient care are colesterolemie totală

275 mg/dl, TG=200 mg/dl şi HDL-C 35 mg/dl.
2. Pacientul cu analizele de mai sus este consumator cronic de alcool şi este
sedentar. Acest stil de viaţă poate influenţa valorile de mai sus? Pacientul are risc de
boală cardiovasculară?
3. Un bărbat în varstă de 40 ani, consumator cronic de etanol, are o dietă bogată
în lipide ce include un aport de 500 mg colesterol/zi. Profilul sangvin lipidic al
pacientului este:
 Colesterol total 300 mg/dl
 HDL-C 30 mg/dl
 Trigliceride 275 mg/dl
a.Menţionaţi alimente bogate în colestrol.
b.Cum consideraţi aportul de colesterol la această persoană?
c.Pacientul ţine o dietă hipolipidică şi are un aport zilnic de colesterol de 200
mg/zi. După 3 luni de dietă, colesterolemia scade la 250 mg/dl. De ce nu a
scăzut colesterolemia mai mult?
d.Care este efectul alcoolului pe profilul sangvin lipidic?
e.Calculaţi LDL-colesterolul. Ce tratament medicamentos recomandaţi?

312
 Completaţi tabelul, după exemplu:
Fracţiune Origine Destinaţie Staţie Apolipoproteine Rol în
finală prezente transportul
Chilomicroni enterocit muşchi, ficat Apo B48 şi trigliceridelor
ţesut ApoC, apoE de exogene
adipos pe HDL
VLDL
LDL
HDL

PROTEINE PLASMATICE

1. Care este valoarea albuminelor serice în următoarele afecţiuni: deshidratare,

malnutriţie, sindrom nefrotic, insuficienţă hepatică cronică?Argumentaţi.
2. În bolile cronice hepatice există o permeabilitate crescută a mucoasei intestinale
şi antigenele absorbite din lumenul intestinal trec din circulaţia portală direct în
circulaţia sistemică. Existenţa acestor modificări poate explica valorile mari de
gama-globuline, caracteristice bolilor cronice hepatice?
3. Interpretati diferite electroforegrame:

313
ACIDUL URIC

1. Enumeraţi cateva alimente bogate în nucleotide purinice.

2. Enumeraţi factorii care favorizează precipitarea cristalelor de urat.
3. De ce consumul de alcool este interzis în gută?
4. Care dintre următoarele analize pune diagnosticul de gută cu certitudine?
a. hiperuricemia
b. cristalele de urat monosodic evidenţiate la microscopul cu lumină
polarizată, la analiza lichidului articular
c. tumefacţia unui picior
d. calculii renali bogaţi în urat
5. Pacient cunoscut cu diagnosticul de gută, în varstă de 61 ani, după o cină festivă,
îmbelşugată de sărbători, se trezeşte cu piciorul stang tumefiat şi cu dureri articulare
metatarsofalangiene. Analiza sangelui relevă o valoare de 11mg/dl .
a.Ce a precipitat noul episod de gută?
b. Menţionaţi posibilele cauze ale hiperuricemiei din gută.
c.Tratamentul gutei.

UREE ŞI CREATININĂ

Ureea şi creatinina fac parte din analizele uzuale, folosite pentru estimarea funcţiei
renale. Nu folosiţi termenul de uremie pentru concentraţia ureei în sange. Uremia
reflectă dezechilibrele metabolice din insuficienţa renală cronică (mai puţin de 30%
din nefroni sunt funcţionali).

314
1. Pentru aceeaşi valoare a creatininei, de 1,4 mg/dL, faceţi asocierile între contextul
clinic şi funcţia renală şi apoi comentaţi.
Context clinic: x) Femeie în varsta de 70 ani, 45 Kg(subponderală), cu masă
musculară redusă şi y) barbat în varsta de 35 ani, sportiv, cu masa musculară bine
reprezentată
Funcţie renală: a)normală şi b)deficitară (insuficienţa renală cronică)
2. Un pacient, cunoscut cu afecţiune cronică hepatică (ciroză), cu valori uzuale ale
ureei plasmatice în jur de 18 mg/dL (N=20-40mg dL), face o hemoragie digestivă,
cu apariţia ulterioară a simptomelor intoxicaţiei cu amoniac (encefalopatia portală).
a) De ce un pacient cu afecţiune cronică hepatică (ciroză) are de obicei, ureea sub
normal?
b) De ce hemoragia digestivă a precipitat intoxicaţia cu amoniac la acest pacient
c) Vitamina K este ineficientă la acest pacient şi trebuie să se administreze plasmă.
De ce?
d) Pe baza acestui caz, enumeraţi sursele de amoniac din organismul uman.
3. Un pacient are ureea plasmatică 60 mg/dL (N20-40mg/dL), iar altul are ureea
plasmatică 300mg/dL. Menţionaţi cauzele valorilor modificate.
4. Un pacient are ureea plasmatică 180 mg/dL şi creatinina 2,3 mg/dL. Ce afecţiune
are?

SUMAR URINĂ

Completaţi ultimul rand cu posibilul diagnostic. Densitatea urinară a fost omisă.

Glucoză Glucoză Glucoză Glucoză Glucoză
absent absent prezent absent absent
Proteine Proteine Proteine Proteine Proteine
absente absente absente absente prezente
Corpi cetonici Corpi cetonici Corpi cetonici Corpi cetonici Corpi cetonici
absenţi absenţi prezenti absenţi absenţi
Urobilinogen Urobilinogen Urobilinogen Urobilinogen Urobilinogen
normal normal normal crescut normal
Bilirubina Bilirubina Bilirubina Bilirubina Bilirubina
absent absent absent prezenta absent
Leucocite Leucocite Leucocite Leucocite Leucocite
absent absent absent absent prezente
Nitriţi absent Nitriţi absent Nitriţi absent Nitriţi absent Nitriţi
Eritrocite Eritrocite Eritrocite Eritrocite prezenţi
absent prezente absente absente Eritrocite
pH 5,5 pH 6 pH 5 pH 5 absente
pH 8

BIOCHIMIA SISTEMULUI ENDOCRIN

315
1.Menţionaţi hormonii care se pot administra pe cale orală. De ce trebuie
administrată insulina sub formă injectabilă?
2.O femeie în varstă de 21 ani se prezintă la medic pentru o stare de nervozitate
crescută şi apetit crescut. Testul de sarcină este pozitiv. Se pune problema dacă
pacienta are o hiperfuncţie a glandei tiroide. Cum credeţi că vor fi modificate
următoarele date de laborator în cele două situaţii posibile: gravidă cu hipertiroidism
sau gravidă cu funcţie normală a glandei tiroide. Trebuie să ţineţi cont de faptul că
sarcina (caracterizată prin concentraţii crescute de hormoni sexuali feminini)
determină valori crescute de TBG (tiroid binding globulin).

Persoană T3 total T4 total TSH TBG T4 liber

nmol/L nmol/L mU/L mg/L pmol/L
Gravidă, cu
funcţie tiroidiană
normală
Gravidă, cu
funcţie tiroidiană
crescută

3. Scrieţi reacţia de formare a dihidrotestosteronului (DHT) pornind de la testosteron.

Un medicament pentru hipertrofia benignă de prostată are ca principiu inhibarea
enzimei din această reacţie. Denumiţi enzima. Explicaţi de ce DHT are efecte
metabolice mai importante decat testosteronul, deşi concentraţia plasmatică de DHT
este mai mică decat cea a testosteronului.
4. Anticoncepţionalele luate zilnic determină concentraţii plasmatice crescute de
estrogeni şi progestine. Ţinand cont de axa hipotalamo-hipofizară controlată de
hormonii sexuali feminini, explicaţi mecanismul de acţiune al acestor medicamente.
5. Cunoscand efectele fiziologice ale cortisolului, menţionaţi modificările
metabolice din hipercortizolism.

Efecte Condiţii hipercortizolism

fiziologice
În cadrul metabolismului glucidic
În cadrul metabolismului lipidic
În cadrul metabolismului proteic
Pe sistem imunitar

6. Hiperplazia adrenală congenitală ( creşterea numărului de celule din zona

reticulată a corticosuprarenalei) se datorează, în 95% din cazuri, deficitului de 21
hidroxilază din sinteza cortisolului. Menţionaţi efectele acestui deficit enzimatic

316
asupra nivelelor plasmatice ale androgenilor, ale ACTH-ului precum şi asupra
nivelelor 17-cetosteroizilor urinari. Care credeţi că este tratamentul bolii?
7. Consecinţele deficitului geoclimatic de iod sunt tot mai rare astăzi datorită
tratamentului profilactic cu iodură de potasiu. Explicaţi de ce în condiţiile unui
deficit de iod sau în condiţiile unei capacităţi scăzute a glandei tiroide de a concentra
iodul, sinteza tiroidiană de T3 este crescută faţă de T4
8. Ca epidemiolog, sunteţi solicitat într-o localitate mică, în care numărul cazurilor
de hipertiroidism a crescut mult în ultimele 6 luni. Majoritatea pacienţilor sunt de
sex masculin şi au varsta între 15-35 ani. Ei au simptome tipice de hipertiroidism
(scădere în greutate, intoleranţă la căldură, transpiraţii, tremurături), iar analizele de
laborator indică valori crescute de T3, T4 şi un nivel scăzut de TSH, iar testul
activităţii biologice in vivo (captarea de iod radioactiv) arată o glandă tiroidiană
nefuncţională. În urma evaluării statistice pe baza chestionarelor, pacienţii consumă
cantităţi mai mari de hamburgări decat populaţia neafectată. Odată cu cercetarea
cărnii de vită utilizate la prepararea de hamburgări, se constată că ea se obţine din
tocarea muşchilor gatului animalului sacrificat şi că 10% din greutatea ei este dată
de glanda tiroidă. Schimbarea procedeului de preparare a cărnii tocate face ca
tireotoxicoza să dispară. În cazul de mai sus, enzimele digestive (pepsina, tripsina)
au rolul de a elibera formele active ale hormonilor tiroidieni din tireoglobulină. Ce
efecte ar avea asupra sănătăţii noastre ingestia de carne de origine animală odată cu
ţesut hipotalamic sau hipofizar, sau adrenal sau pancreatic?

TEST 1

1. La o persoana sanatoasa, valoarea glucozei in urina este……………, pentru ca, la

nivelul nefronului, glucoza………..
2. La o persoana sanatoasa, valoarea proteinelor in urina este……………, pentru ca
, la nivelul nefronului, proteinele………………………………………..
3. Cetonuria este pozitiva in urmatoarele afectiuni ………………………………
4. Bilirubinuria este pozitiva in urmatoarele afectiuni……………………………….
5. Urobilinogenul este format in ………………….., 90% este absorbit
in…………..si 10% intra in colon, unde este transformat in…………………….,
care da culoarea scaunului.
6. Bilirubina care poate fi prezenta in urina este intotdeauna bilirubina……………,
iar un test rapid pentru confirmarea prezentei ei in urina consta in…………………
7. Formele calciului in plasma sunt………………………..
8. O valoare de 58mg/dl pentru urea plasmatica (normal 20-40mg/dl), poate
semnifica ………………………………….
9. O valoare de 1.4 mg/dl a creatininemiei la o femeie (normal 0.5-1mg/dl ) semnifica
urmatoarea afectiune……………….
10. Pentru o persoana cu suspiciune de anemie feripriva ce cer urmatoarele analize
de laborator (enumerati 4 analize de sange)………........................................

317
11. Guta este o boala …………………………………., iar diagnosticul se pune pe
baza analizei……………………………..
12. Aportul de carne trebuie sa fie redus in guta pentru ca………………………..,
alcoolul trebuie interzis pentru ca …………………………………………,iar
medicamentul utilizat este …………….. care actioneaza ca……………………
13. Anticorpii sunt formati de celulele……………………………
14. Alimentele bogate in fier sunt………………………………………………iar
factorii care favorizeaza absorbtia fierului sunt………………………..
15. Hormonii care cresc calcemia sunt……………………………………. iar
tesuturile lor tinta sunt……………………………………………
16. Acidul Vanil mandelic se determina in ………………(urina sau sange), la
pacientii…………………………………………
17. Rolurile proteinelor plasmatice sunt(scrieti cel putin 3)…………………………
18. Pentru evaluarea profilului lipidic la un pacient se cer analizele sangvine (in nr
de 3)…………………………………… si LDL se calculeaza………………..
19. Chilomicronii se formeaza in ………………… si transporta ……………
20. LDL transporta colesterolul ”………………” pentru ca…………………….
21. HDL transporta colesterolul ”………………” pentru ca …………………..
22. Albuminemia mica este prezenta in ( afectiunea)……………………………….
23. Dieta si tratamentul recomandat in osteoporeza este…………….. ………pentru
ca ……………………….
24. Glicemia normala este 65-110 mg/dl. O valoare de 50 mg/dl pentru glicemia a
jeun (fasting plasma glucose) semnifica…………………………………, o valoare
de 115 mg/dl poate reflecta ……………………
25. Cum puneti diagnosticul de diabet zaharat?….. …………………………….

TEST 2

1. Proteinuria poate semnifica urmatoarea afectiune……………………….......

2. Glucozuria cu hiperglicemie semnifica urmatoarea afectiune……………….
3. Prezenta sangelui in scaun sau urina (microhematurie) are la baza reactia de
oxidare cu apa oxigenata, iar hemoglobina din proba are rol de ……………....
4. In icterul posthepatic, cu obstructie totala de coledoc, Bdirecta reprezinta…..%
din bilirubina totala, in urina urobilinogenul este………….., iar bilirubina urinara
este……………, iar stercobilinogenul din scaun este………….. In consecinta, urina
are culoarea ………….., iar scaunul are culoarea…………………………
5. In icterul hepatic, Bdirecta reprezinta……………….% din bilirubina totala, in
urina urobilinogenul este………….., iar bilirubina urinara este……………, iar
stercobilinogenul din scaun este. …………………..
6. Corpii cetonici sunt formati in……………………, si reprezinta ”colacul de
salvare” pentru………………………………………
7. Corpii cetonici sunt prezenti in urina in diabetul zaharat tip…………

318
8. Electroforeza proteinelor , la un pacient cu ciroza hepatica, releva albuminemie
……….. (mica/mare) si gama globulinemie ………….………..(mica/mare). Ureea
plasmatica la acest pacient este………..………..(mica/mare).
9. Creatininemia de 3mg/dl (normal 0,5-1,2 mg/dl) asociata cu uree 80mg/dl (normal
20-40mg/dl) semnifica afectiunea………………………………….
10. Creatininemia de 0.9mg/dl (normal 0,5-1,2 mg/dl) asociata cu uree 60mg/dl
(normal 20-40mg/dl) poate semnifica ………………………………….
11. Alcaloza respiratorie se asociaza cu manifestari de tetanie pentru ca fractiunea
calciului liber (ionic) ……………(scade/ creste), in timp ce fractiunea legata de
albumina……………(scade/ creste). Prima masura terapeutica este
…………………………………………………………………………………
12. Valoarea feritinei serice reflecta concentratia fierului in …………………...
13. Proteina transportoare de fier in sange se numeste ………… si are o saturatie in
fier de…....................
14. 17 cetosteroizii urinari cu valoare peste normal semnifica ………………….
(afectiunile) la un barbat, iar la o femeie ……………………………….. (afectiunea)
15. VLDL se formeaza in…………………, sunt hidrolizate de enzima
….............................. din capilarele tisulare si transporta ………………………
16. Un pacient are HDL 45 mg/dl (normal >40mg/dl) si cholesterol total 180mg/dl
(recomandat <200mg/dl), iar trigliceridele 1oo mg/dl(normal 50mg/dl). Cat este
LDL la acest pacient………………. si daca are risc de boala cardiovascu-
lara…………(da/nu)
17. Factorii care cresc HDL sunt……………………………………………, iar cei
care scad HDL sunt…………………………………………………………………..
18. Glicemia normala este 65-115 mg/dl. O valoare de 45 mg/dl semnifica………,
o valoare a jeun de 149 mg/dl semnifica………………………, iar o valoare a jeun
de 119mg/dl semnifica……………………..
19. HbA1c (normal sub 5.2%) reflecta …………………………………… , iar
valoarea de 6,8% reflecta un diabet …………………..(echilibrat/ dezechilibrat), iar
valoarea de 12% reflecta un diabet …………………..(echilibrat/ dezechilibrat)
20. Acidul uric reprezinta……………………………………………………., are
valori mari in afectiunea ereditara………………………………., iar factorii care
favorizeaza precipitarea lui sunt…………………………………………………….
21. Alfa1 antitripsina are rol de…………………………………., haptoglobina are
rol de……………………………………………., ceruloplasmina are rol de
…………………………………………….., iar fibrinogenul are valori mari
in……………………………………………………..

RĂSPUNSURI

ENZIME PLASMATICE
319
1. 1b,2e,3a,4d,5g,6f,7c
2. În HVA se înregistrează valori de peste 2000 UI/L ale transaminazelor, iar în
HVB creşterile nu sunt aşa de spectaculoase (200UI/L).
Gradul creşterii activităţii enzimatice este diferit în cele două afecţiuni,
pentru că, în HVA, virusul A agresează brusc toate hepatocitele (presupuse
sănătoase), care vor descărca multe enzime de leziune (TGO, TGP). În hepatita
cronică, numărul hepatocitelor sănătoase este mai mic, agresiunea nu este brutală
pe toate celulele hepatice, aşa că transaminazele eliberate de hepatocite nu au
valori spectaculoase.
NU se poate corela gradul creşterii cu severitatea bolii.
3. Nu se poate exclude pancreatita acută ţinand cont de timpul de înjumătăţire al
amilazei serice.
Amilaza urinară are valori peste normal timp de 7 zile de la debutul pancreatitei,
iar lipaza serică ajută la diagnosticul retrospectiv al acestei afecţiuni (are valori
peste normal timp de 14 zile de la debutul pancreatitei).

4. La suspiciunea de IMA se cer: CK totală cu izoenzima C (ca marker de primă

linie în diagnosticul de IMA) şi LDH total cu izoenzima LDH1, pentru diagnosticul
retrospectiv de IMA. Activitatea TGO se foloseşte din ce în ce mai puţin, deoarece
mioglobina şi troponinele cardiace sunt markeri de IMA cu sensibilitate şi
specificitate mare. Raportul CK-MB/CKt *100 trebuie să fie >5% pentru
diagnosticul de IMA.
Este important să se cunoască timpul de înjumătăţire al enzimelor cardiace.
La 2 ore de la debutul IMA, enzimele cardiace nu au avut timp să crească.
Pacientul este reţinut în spital şi se fac determinări ale enzimelor cardiace, în
dinamică (repetate la 8 ore), începand de la 4-6 ore de la debutul presupusului
infarct miocardic.

5. La copil, o activitate crescută a fosfatazei alcaline, de două ori faţă de valoarea

normală a adultului, înseamnă o valoare fiziologică. In obstrucţia canalului
coledoc, se produce colestază, cu cresteri de peste trei ori valoarea normală a
fosfatazei alcaline. La un pacient la care activitatea fosfatazei alcaline este
crescută, pentru a diferenţia o afecţiune hepatică, de una osoasă, se cere activitatea
GGT.

METABOLISMUL CALCIULUI
1. Vezi curs
2. Da, monitorizarea concentraţiei serice de osteocalcină poate fi utilă în
determinarea raspunsului la tratamentul osteoporozei.
3. Dieta lacto-vegetariană determină un pH urinar alcalin, cu pierderi minime de
calciu. Dieta bogată în proteine de origine animală (ex.carnea) determină un pH

320
urinar acid, care favorizează pierderile de calciu. Calcitonina favorizează fixarea
calciului în oase.
4. Evenimentele, în succesiune, sunt: anxietate→hiperventilaţie la stress→alcaloză
respiratorie→creşte pH sanguin.
pH-ul crescut al sangelui determină creşterea anionilor plasmatici, inclusiv al
numărului de sarcini negative de pe albumină, avand drept consecinţă legarea
calciului ionic liber; scăderea fracţiunii calciului ionic liber este urmată de
hiperexcitabilitate neuromusculară.
METABOLISMUL FIERULUI
1.
Pacient 1 2
Diagnostic prezumptiv Hemoragie Cancer gastric
(hemoroizi
sangeranzi)
2. 1ayB şi 2bxA
3. a) sideremie mică, CTLFe mare; b) sideremie mare, CTLFe mica; c)sideremie
mică, CTLFe mică

COMPUŞI GLUCIDICI

1. Glicemie normală, glicemie a jeun anormală, diabet zaharat

2. 900mg/dl şi respectiv 28,8 mg/dl. Pacientul cu hipoglicemie va fi tratat primul,

pentru că celula nervoasă este foarte vulnerabilă la deficitul de glucoză.

3. Celula nervoasă, cristalinul, hematia

4. Muşchiul scheletic, miocardul, ţesutul adipos, ficatul

5. Ultimele 3-4 luni

6. Ultimele 3 saptamani

7. Se intensifică gluconeogeneza, cu creşterea glicemiei; scade exportul de VLDL,

cu încărcare grasă a ficatului

8. Scade patrunderea glucozei în muschi, apar depozite de trigliceride în muşchi

9. Scade patrunderea glucozei în ţesutul adipos, are loc lipoliza, cu creşterea AG în

sange
321
10. Bun

11. Rău

COMPUŞI LIPIDICI

4. 200 mg/dl
5. Consumul cronic de alcool determină hipertrigliceridemie, iar sedentarismul
scade HDL-C. Da, are risc de boală cardiovaculară.
a. grăsimile bogate în AG saturaţi (unt, frişcă), grăsimi
b.Foarte mare.Aportul de colesterol la o persoană sănătoasă trebuie să fie
<300 mg/zi, iar la o persoană cu risc de boală cardiovasculară, trebuie să fie <200
mg/zi .
c. Factorii genetici sunt importanţi, 60-70% din colesterol este endogen.
d.Alcoolul consumat în exces determină hipertrigliceridemie.
e.LDL-col 215 mg/dl. De administrează inhibitori de HMG-CoA reductază
pentru scăderea colesterolului şi fibraţi pentru scăderea trigliceridelor.
Fracţiune Origine Destinaţi Staţie Apolipoprotein Rol în
e finală e transportul
prezente
Chilomicron enteroci muşchi, ficat Apo B48 şi trigliceridelor
i t ţesut ApoC, apoE de exogene
adipos pe HDL
VLDL ficat muşchi, Sange, Apo B100 şi Trigliceridelo
ţesut devin apo C şi apoE r endogene
adipos IDL
LDL IDL, Ţesuturi, ţesutur Apo B100 şi Colesterolului
sange ficat i apoE malefic
HDL ficat ţesuturi ficat Apo A, apoC, Colesterolului
apo E bun

PROTEINE PLASMATICE

1. În deshidratare- valori fals crescute, deoarece volumul circulator este redus.

Malnutriţie- valori scăzute datorită unei sinteze scăzute sau datorită prezenţei
unei stări hipercatabolice proteice, cu consum de albumine
Sindrom nefrotic-valori scăzute datorită pierderilor renale
Insuficienţă hepatică cronică- valoare scăzută datorită sintezei scăzute
2. Da. Antigenele absorbite din intestin, şuntând ficatul ajung în circulaţia
sistemică şi generează un răspuns imun, cu creşterea -globulinelor.
322
3)1. normal; 2 inflamaţie acută;3inflamaţie acută sau sindrom nefrotic; 4.sindrom
nefrotic; 5 inflamaţie cronică, ciroză, boli de colagen; 6 idem 5, cu creştere mai
pronunţată a gama globulinelor; 7ciroză, sau boli granulomatoase sau boli de
colagen; 8 ciroză; 9 deficit de alfa-1 antitripsină cu creştere blandă de gama
globuline, sugerand o boală cronică concomitentă; 10 la fel ca la 5, cu creştere
mare de gama globuline si suprapunere de reacţie inflamatorie acută; 11
hipogamaglobulinemia;12 mielom sau macroglobulinemia Waldenstrom sau
gamopatie monoclonală

ACID URIC

1. Alimente bogate în nucleotide purinice: carnea (mai ales carnea de vanat),

produsele de patiserie pe bază de drojdie
2. pH acid şi temperatura scăzută
3. Alcoolul creşte acidul lactic care inhibă secreţia de acid uric
4. b
5. a. Excesul de carne (bogată în purine) şi alcool
b. guta este, în principal, o boală metabolică ereditară, cu modificări enzimatice
care conduc la exces de acid uric
c. dieta saracă în carne şi alcoolul interzis, iar ca medicaţie se administrează
Allopurinolul (inhibitor competitiv al xantin-oxidazei) şi Colchicina.

323
UREE ŞI CREATININĂ
1. xb şi ya
a. Ureea se sintetizează în ficat, iar în ciroză, capacitatea de sinteză hepatică este
afectată.
b. Sangele ajuns în tubul digestiv este transformat de enzimele florei intestinale,
fiind o sursă de amoniac. Amoniacul, în concentraţie mare este transformat
insuficient de ficatul bolnav.
c. Vitamina K este ineficientă la acest pacient pentru că ea activează factorii
coagulării II, VII, IX şi X. Factorii nu mai pot fi sintetizaţi de ficatul bolnav.
Trebuie să se administreze plasmă, care are aceşti factori ai coagulării.
d. Sursele de amoniac din organismul uman sunt: proteinele, aminoacizii, flora
intestinală.
3. Ureea 60 mg/dL poate semnifica: deshidratare, aport crescut de carne, febră,
hemoragie digestivă; ureea 300 mg/dL semnifică insuficienţă renală cronică
4. Pacientul are insuficienţă renală cronică.

SUMAR URINĂ
Normal Hematurie Diabet Hepatita Infecţie urinară
zaharat
dezechilibrat

BIOCHIMIA SISTEMULUI ENDOCRIN

1. Hormonii lipidici se pot administra pe cale orală. Insulina este un hormon
peptidic, care este degradat de enzimele digestive.
2.
Persoană T3 total T4 total TSH TBG T4
nmol/L nmol/L mU/L mg/L liber
pmol/L
Gravidă, cu funcţie ↑ ↑ N ↑ N
tiroidiană normală
Gravidă, cu funcţie ↑ ↑ ↓ ↑ ↑
tiroidiană crescută
3. 5-alfa reductaza. Afinitatea receptorilor pentru DHT este mai mare decat pentru
testosteron. 4.Anticoncepţionalele luate zilnic determină concentraţii plasmatice
crescute de estrogeni şi progestine. Prin mecanism feed-back, valorile lor mari,
inhibă secreţia hipofizară de FSH şi LH şi secretia hipotalamică de gonadotropin
releasing hormon. În absenţa peak-ului de creştere al LH , nu mai are loc ovulaţia.
5. Vezi curs
6. Deficitul de cortisol determină prin buclă feed-back o concentraţie mare de
ACTH, care va creşte sinteza de androgeni din zona reticulată. Fetiţele cu deficitul
enzimatic vor avea pseudohermafroditism, iar baietii vor avea pubertate precoce. 17-

324
cetosteroizii urinari vor avea valori mari. Tratamentul constă în administrarea de
cortisol.
7. T3 are iod mai puţin decat T4 şi are efecte biologice mai puternice
8. Hormonii cu structură lipidică se absorb pe cale digestivă.

TEST1

1. Zero/se reabsoarbe total

2. Zero/nu
3. Diabet zaharat tip1, etilism cronic
4. Icter hepatic si posthepatic
5. Intestin/ficat/stercobilinogen
6. Conjugata (directa)/ agitarea probei de urina, cu aparitia spumei galbene
7. Ionic 50%, legat de albumina si legat de anioni
8. Deshidratare, aport crescut de carne, febră, hemoragie
9. Insuficienta renală cronică
10. Hemograma completa, sideremia, feritina serică, CTLFe
11. Metabolică, ereditară/lichidului articular sinovial, la microscopul cu lumină
polarizată
12.Carnea este bogată în purine/alcoolul creşte concentraţia de acid lactic care inhibă
secreţia de acid uric/alopurinolul/ inhibitor competitiv
13. Limfocit B
14. Carnea (viscerele)/ acidul clorhidric, vitamina C
15. PTH, Vit D3/osul, intestinului
16. Urină/ hipertensivi cu varste extreme
17. Transport/ apărare imună/coagulare
18. Colesterol, LDL-colesterolul/ trigliceridele, iar LDL se calculează: colesterol
total-HDL-TG/5 mg/dL
19. Enterocit/ transporta trigliceride exogene
20. Rău/ există un raport de proporţionalitate inversă între concentraţia plasmatică
LDL şi numărul receptorilor pentru LDL; La om, valoarea LDL determina număr
mic de receptori, avand drept consecintá nepreluarea LDL din sânge, cu oxidarea lui
ulterioară. LDL oxidat este preluat de macrofage, care devin celule spumoase, din
peretele vascular (preambulul aterosclerozei)
21. Bun/ preia colesterolul în exces din ţesuturi şi pereţii vasculari şi îl transportă
către organul de eliminare, ficatul
22. Albuminemia mica este prezenta în ciroza (sinteza scăzută) sau in afecţiunile în
care se pierd albumine
23. Dieta lactovegetariană/ calcitonina/ dieta trebuie sa asigure un pH urinar alcalin
24. Hipoglicemie/ glicemie a jeun anormală (se face testul de toleranţă la glucoză)
25. Dacă două glicemii a jeun au valoarea peste 126 mg/dL

325
TEST 2
1. Glomerulară, renală
2. Diabet zaharat
3.Catalizator
4. >50% din bilirubina totala/zero/intens prezenta/ zero. Neagra (coca cola)/alba
5. 25-50% din bilirubina totala/prezent/ prezenta/scazut in primele
6. Ficat/ SNC
7. Diabet zaharat tip I
8. Mica/mare/ mica
9. IRC
10. Deshidratare, aport crescut de carne, febră, hemoragie
11. Scade/creste/se pune pacientul sa respire intr-o punga
12. Depozite
13. Transferina/ 25-40%
14. Afectiune de corticosuprarenala şi testiculară, la barbat şi afecţiune de
corticosuprarenală, la femeie
15. Ficat/lipoprotein-lipaza/trigliceride endogene
16. 115mg/dl/nu
17. Estrogenii, sportul zilnic, alcoolul consumat moderat cresc HDL/androgenii,
sedentarismul, fumatul scad HDL
18. Hipoglicemie/diabet zaharat/glicemie a jeun anormala (posibil intoleranta la
glucoza)
19. Valoare normală/echilibrat/ dezechilibrat|
20. Produsul de catabolism al nucleotidelor purinice/gută/pH acid şi temperatura
scăzută
21. Antielastază/a lega Hb liberă din circulaţie/transportă cuprul/inflamaţiile cronice

326
 BIBLIOGRAFIE

1. Biochimie Medicală – Veronica Dinu, Eugen Truţia, Elena-Popa Cristea,

Aurora Popescu; Editura Medicală, Bucureşti, 2002
2. Biochimie clinică Implicaţii practice – Minodora Dobreanu, Ediţia a II-a,
Editura medicală, 2010.
3. Biochimie clinică, metode de laborator – Denisa Mihele, Maria Pavlovici;
Editura Medicală, Bucureşti, 1996
4. Biochemistry – L. Stryer, Stanford University, Third Edition (pag 44-48)
5. Biochemistry and Molecular biology – W. Elliot & D. Elliot, Oxford
University Press, Fourth Edition (pag 71-75)
6. Electroforeza – A.T. Andrews; Editura tehnică, Bucureşti, 1996
7. Introduction to Spectroscopy – D.L. Pavia, G.M. Lampman, G.S. Kriz;
Brooks/Cole Pub Co, 2000
8. Analiză Instrumentală – Andrei Florin Dăneţ, Editura Universităţii din
Bucureşti, 2010
9. Tehnici Instrumentale Avansate – Iulia Gabriela David, Vasile David,
Editura Universităţii din Bucureşti, 2010
10. Chromatography: Concepts and Contrasts – James M. Miller; Wiley-
Interscience, 2002
11. Biochimie medicală – V. Atanasiu, Editura Universitară „Carol Davila”
Bucureşti, 2010
12. Biochimie medicală – Maria Mohora, Editura Niculescu, Bucureşti, 2010
13. Cell Biology LabFax, editată de G.B. Dealtry şi D. Rickwood Bios
Scientific Publishers Blackwell Scientific Publications, 1992 (pag 13-18)
14. Biomarkeri Tumorali în diagnosticul malignităţii – Relaţia lor cu
malignitatea. De la deziderate la posibilităţi şi limite – Nicolai Z. Bruja,
Editura Academiei Române, Bucureşti, 2010
327