MICROBIOLOGIA - STIINTA CARE SE OCUPA CU STUDIUL MICROORGANISMELOR

RELATIA DINTRE MICROORGANISM SI GAZDA – RASPUNSUL IMUN

PROFILAXIE – VACCINURI
TERAPIE – ANTIBIOTICE, SEROTERAPIE

RELATII MICROORGANISM –GAZDA

• simbioza (bacteriile saprofite- nepatogene)
• comensalism (bacterii saprofite conditionat patogene/ oportuniste - intre aceste bacterii si
gazda exista un echilibru care atunci cand se rupe determina patogenitatea acestora) E. coli
• parazitism obligatoriu (bacterii patogene- in relatie cu gada numai bacteria profita –
Shigella spp, Clostridium spp)
• parazitism facultativ (bacterii telurice - bacterii ce supravietuiesc libere in natura)
4 niveluri de biosecuritate in functie de microorganismele manipulate
BSL- 1
Agenți: nu produc în mod constant boli la persoanele sănătoase
prezintă o amenințare minimă pentru mediu și personal de laborator
Practici:
Bariere primare: microbii pot fi manipulați în aer liber, nu este necesar un echipament special
de izolare
Bariere secundare: este necesară chiuvetă deschisă pe bancă
BSL-2
Agenți: asociați cu boli umane, pericolul este prin leziuni percutanate, ingestie, expunere la
mucoase, prezintă un pericol pentru mediu
Practici:
Bariere primare: BSC de clasa I / II, dispozitive fizice de izolare utilizate pentru toate manipulările
agenților care provoacă stropi sau aerosoli de materiale infecțioase
Echipament individual de protecție: halat, mănuși, protecție pentru față
Bariere secundare: BSL1 Plus: autoclav disponibil
BSL-3
Agenți: sunt de origine locală sau exotică, asociați cu transmisie respiratorie și boli grave sau letale
Practici:
Bariere primare: BSC de clasa I / II, dispozitive fizice de izolare utilizate pentru toate manipulările
deschise ale agenților.
Echipament individual de protecție + protecție respiratorie
Bariere secundare: BSL-2 plus: separarea fizică de coridoarele de acces; acces la închidere automată, ușă
dublă, aer evacuat nerecirculat, flux negativ de aer în laborator
BSL-4
Agenți: au un potențial mare de infecție letală
Bariere primare: clasa III BSC
Bariere secundare: BSL-3 plus: clădire separată sau zonă
izolată, sisteme dedicate de alimentare și evacuare, vid și
sistem de decontaminare , alte cerințe

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR

BACTERIOLOGIC
• RECOLTARE PRODUS PATOLOGIC
• TRANSPORT
• EXAMEN MACROSCOPIC PRODUS PATOLOGIC
• EXAMEN MICROSCOPIC ( COLORATIA AM, GRAM, ZN)
• INSAMANTARE PE MEDII DE CULTURA
• IDENTIFICARE – ASPECT MICROSCOPIC, CARACTERE DE CULTURA , BIOCHIMICE ,
ANTIGENICE
• ANTIBIOGRAMA
SEROLOGIC
• RECOLTARE SANGE, DETECTARE/TITRARE ANTICORPI IN SERUL PACIENTULUI
IMUNOLOGIC
• TESTARE RASPUNSULUI IMUN AL GAZDEI: IDR PPD

Instrumente si materiale folosite in laborator

- Anse bacteriologice
- Pipeta gradata
- Pensa
- Tampon de recoltare
- Hemorecoltoare
- Recipient pt recoltare urina
- Recipiente recoltare sputa
- Coprorecoltor
- Placi Petri cu mediu de cultura

TESTE BIOCHIMICE

Studiu de caz: Barbat, 60 de ani, fara adapost. Simptome: tuse, febra, transpiratii nocturne, durere in
piept, in ultimele cateva zile sputa abundenta, vascoasa, aspect jeleu de coacaze. Istoric: tusea a aparut
acum o luna si simptomatologia s-a accentuat.
Imagine radiologica – torace – infiltrat lob drept cu o leziune cavitara
Diagnostic clinic: pneumonie
Diagnostic microbiologic:
 - Hemocultura
- Frotiu, cultura sputa
- Diagnostic diferential:
o Haemophilus influenzae
o Klebsiella pneumoniae – una dintre cele mai frercvente cauze de pneumonie la
persoanele fara adapost – sputa aspect jeleu de coacaze
o Legionella pneumophilia
o Staphylococcus aureus
o Streptococcus pneumoniae
o Mycobacterium tuberculosis – tuberculoza (prezenta leziunilor cavitare)
Bacteriile:
- Vegetative
- Sporulate
Sterilizarea
• procesul de distrugere/ îndepărtare a tuturor microorganismelor ( bacterii, fungi, spori, virusuri,etc),
• forme vegetative sau sporulate
• de pe suprafeţe / medii lichide /solide
• utilizand metode fizice şi chimice
Steril - absența totală a microorganismelor viabile, evaluată prin lipsa creșterii pe orice mediu de cultura
Dezinfecţia
• procesul de distrugere a formelor vegetative microbiene sau de inhibiţie a creşterii acestora pe suprafeţe
inerte
• metode fizice , chimice, vapori de gaz (etilen oxid)
Eficienţa utilizării dezinfectantilor influenţată:
• de natura obiectului
• cantitatea de material organic prezent (poate inactiva dezinfectantul)
• numărul de microorganisme contaminante
• tipul, concentraţia dezinfectantului
• durata şi temperatura expunerii la acesta
Dezinfectantii
• compuşi iritanți și toxici pentru organismul uman
• Utilizati pe suprafete inerte
Asepsia
• ansamblul procedurilor prin care se evită contaminarea mediului ambiant cu germeni microbieni şi se
menține sterilitatea țesuturilor, mediilor de cultură, medicamentelor injectabile
Antisepsia
• procedura de înlăturarea sau distrugere a formelor vegetative microbiene de pe tegumente,
mucoase,plăgi şi este realizată cu ajutorul substanțelor antiseptice
Antiseptice
• aplicate local pe mucoase/ țesuturi
• inhibă creșterea microorganismelor / le omoară, fără a avea acțiune sporicidă
Dezinfectanti
• nivel înalt: glutaraldehida [obiecte ce nu pot fi autoclavate (ex.
endoscopul utilizat în proceduri invazive)]
• nivel intermediar: alcool, componente pe bază de iod [obiectele în care
contaminarea cu spori nu este posibilă (laringoscop)]
• nivel scăzut: compuşi cuaternari de amoniu [obiecte care vin în contact
cu pacientul dar nu penetrează mucoasele sau ţesuturile sterile
(stetoscop, electrozii de electrocardiograf)]
1. Fenoli (acid fenic) – efect germicid inclusiv micobacterii si fungi; ineficienti asupra sportilor si
visururilor neanvalopate
Actiune asupra microorganismelor:
 denaturarea proteinelor şi distrugerea membranelor celulare
 utilizări limitate datorită proprietăților caustice și toxicității sale
 etalonul față de care se apreciază activitatea antimicrobiană a antisepticelor și dezinfectanților:
coeficientul fenolic
2. Formaldehida in solutie apoasa (formalina) 37%
 pentru stabilizare este adăugat metanolul 8-15%
 o concentraţie scăzută de formalină are activitate bacteriostatică
 o concentraţie de 20% are activitate bactericidă
3. Peroxid de hidrogen
 Agent oxidant in concentratie >3-25%
4. Etanol 70-95%
 Efect lent antimicrobian
 Ineficient asupra fungilor, activitatea creste prin asociere cu hipocloriti sau formol
 Dezorganizarea stratului lipidic membranar
5. Alcool izopropilic 90-95%
6. Iodofori – iod 2% solubilizat in solutie apoasa de alcool
 inactivează proteinele, acționează ca agent oxidant
 efect bactericid în soluție apoasă de alcool ce conține iodura de
 potasiu
7. Hipocloriti – clor, cloramina
 inctivează bacteriile prin oxidarea grupărilor sulfhidril
 dezinfectant pentru echipamente contaminate cu sânge, efect virucid (HIV, virusul hepatitei B)


Antiseptice
1. Iodofori (povidone-iodin)
 eliberare de iod liber care produce oxidare si distructie celulara
 durata scurta de actiune, inactivat de sange, puroi
 iritant tegumentar, poate produce reactii alergice
2. clorhexidina gluconat 2% si alcool izopropilic 70%
 dezorganizarea bistratului lipidic membranar
 rapid si cu durata lunga de actiune
 netoxic pentru piele si mucoase, inactivat de puroi
3. alcool izopropilic 70%
 denaturarea proteinelor cu efect bactericid ca urmare a lizei celulare;
  dezorganizarea bistratului lipidic membranar
4. hipermanganat de potasiu (acțiune la nivelul mucoaselor)
 oxidarea grupărilor chimice libere ale enzimelor (-SH)
5. peroxid de hidrogen soluție 3% (plăgi)
 agent oxidant
6. metale grele: săruri de mercur-mercuro-crom, săruri de argint – azotat de argint–colargol
 blocarea grupărilor chimice libere ale enzimelor (-SH) efect bactericid
7. derivați de acridină: rivanol
 alterare acizi nucleici
CALDURA UMEDA – denaturare proteine si modificarea acizilor nucleici
Autoclavare cu vapori sub presiune
• sterilizarea instrumentarului chirurgical (metalic)
• medii de cultură
• substanțelor în soluție
• uleiurilor cu conţinut ridicat de apă (20%).
• rata de distrugere a microorganismelor este influenţată de temperatură, durata autoclavării, fluxul de
vapori, mărimea şi dispunerea materialului în autoclav
Autoclavare cu vapori fluenţi - robinetul de vapori rămâne deschis şi temperatura atinsă în interiorul
autoclavului este de 1000 C
Eficienţa sterilizării - fiola ce conţine spori de Bacillus
stearothermophilus.
sterilizare corectă- organismul însamanțat pe un mediu de cultură nu va creşte
Avantaj
-nu corodează metalele (de ex. instrumente chirurgicale) si nu afectează suprafețele sticlei
Sterilizare fracționată, parțială
Tindalizarea (sterilizare fracționată)
• 3 zile succesiv timp de 60 min. la 65-750C, formele vegetative germinate din sporii prezenți vor fi
distruse
la a doua sau a treia încălzire
Fierberea (sterilizare parțială) timp de 30 min. la 1000C
• distruge bacteriile în formă vegetativă, fungii, virusurile dar nu și sporii
Pasteurizarea - încălzirea la temperaturi inferioare temperaturii de fierbere
• pasteurizare joasă: 30 min. la 62-650C
• medie: 15 min. la 71-750 C
• înaltă: 2-5 min. la 85-900C
• distruge formele vegetative dar nu și sporii bacterieni
• conservarea de scurtă durată a alimentelor (bere, lapte)

CALDURA USCATA – oxidarea/carbonizarea structurilor bacteriene

• mai puţin eficientă decât sterilizarea cu vapori sub presiune
• deoarece penetrarea şi difuzia căldurii este lentă
• perioada de timp necesară acestui proces este mai lungă
• temperatura aplicată este mai înaltă (timp de 1 oră la 1710C sau 2 ore la 160C, 16 ore la 121C
• Eficienta - spor test, Bacillus subtilis
Etuva (pupinel )
• dispozitiv cu pereți dubli
• în interiorul căruia se obține și se menține temperatura pentru sterilizare cu ajutorul unei rezistențe
electrice și a unui termostat
• uniformizarea temperaturii -sistem de ventilație. pot fi sterilizate : obiecte curate și ambalate, din sticlă,
porţelan dar și pulberile inerte termostabile
Sterilizarea ansei bacteriologice se face prin încălzirea firului ansei pană la incandescență, urmată de
trecerea portansei de câteva ori prin flacăra becului de gaz
Flambarea- trecerea prin flacara becului de gaz a obiectului care contine germeni microbieni ( gatul
eprubetei) , germenii sunt carbonizati
Lamele de sticla, curate , degresate , se sterilizeaza prin trecerea de cateva ori prin flacara , inainte de
efectuarea frotiurilor

STERILIZAREA PRIN FILTRARE

Filtrarea – trecerea unui fluid printr-un corp poros , filtru, ( prin aspiratie)
Microorganismele retinute mecanic si electrostatic in porii filtrului
Metoda utilizata :
• mediilor de cultura lichide
• Reactivi care nu pot fi sterilizati prin caldura
• Membrane filtrante- acetat de celuloza – porozitate 1- 0,025 μm
• Porozitate de 0,22 μm retine toate bacteriile
• Filtrare - presiune negativa
• decontaminare bacteriana si fungica a aerului
• BSL 2 – filtre HEPA ( Hight Efficiency Particulate Air Filters)
• Flux de aer vertical, unidirecțional, filtrat HEPA în zona de lucru
• Aerul de evacuare filtrat HEPA către cameră / evacuarea conectată la un sistem de extragere extern

STERILIZAREA PRIN ENERGIE RADIANTA

Radiaţiile ionizante gama (g) ionizează apa citoplasmatică cu formare de radicali hidroxil care au efect
letal asupra bacteriilor denatureaza proteinele şi acizii nucleici
Utilizare
• sterilizarea acelor, seringilor, liniilor de cateter și a mânușilor chirurgicale
• industria vaccinurilor
• prevenirea degradării alimentelor
Sterilizarea are loc concomitent cu împachetarea diferitelor articole, în absența căldurii.

Radiaţiile ultraviolete (UV) (neionizante)

• In moleculele de ADN se formează dimeri de timină, cu efect mutagem (cei intracatenari) sau care
blochează replicarea ADN-ului bacterian (cei intercatenari)
Utilizare
• în laboratoare/sali de operatie, au penetrabilitate slabă şi sunt absorbite de sticlă
Risc - potențialele leziuni la nivelul corneei și pielii
• Lampi UV - C / Sterilizatoare (bactericide) cu radiatie indirecta
• Principii de functionare : emit flux indirect de radiatii UV - C la lungime de unda = m253.7 nm, unde
edficacitatea este maxima , distrugand irevocabil bacterii, virusi,
mucegaiuri, fungi, si oricare alte microorganisme.
• Lampile sunt destinate in ridicarea si mentinerea nivelului de puritate microbiologica in salile de
operatie, laboratoare, farmacii, in industria alimentara, cosmetica, farmaceutica, spitale, hale de productie.

ETILEN OXID
gaz incolor solubil în apă şi un solvent organic comun utilizat pentru sterilizarea obiectelor termosensibile
procesul de sterilizare este relativ lent şi este influenţat de :
• concentraţia de gaz
• umiditatea relativă a obiectului de sterilizat
• timpul de expunere şi temperatura.
• Mecanismul de acţiune este prin alchilarea grupărilor terminale hidroxil, carboxil, amino, sulfhidril
• distruge ţesuturile viabile gazul trebuie să fie disipat înainte ca obiectul să fie folosit (în general 16 ore
sau mai mult)
• Eficienţa sterilizării este monitorizată cu testul de spori de Bacillus subtilis.

STERILIZATORUL CU OZON
• sterilizare bactericida in spitale
• sali de reanimare
• in unitatile de stocare a sangelui
• pentru sterilizarea aparatelor medicale
• in fabricile de medicamente
• in crescatoriile de animale
• in magaziile de stocare a alimentelor
• purificarea aerului in unitati economice
• locuri publice, mijloace de trasport
• prelucrarea apei reziduale din spitale, a apei industriale, menajere
• aparate casnice (vesela), sterilizarea fructelor si legumelor
• sterilizarea permanenta a filtrelor aparatelor de aer conditionat; utilizare cosmetica

Baie cu ultrasunete
Ultrasunetele produc ruperea structurilor bacteriene prin fenomenul de cavitaţie ( vibratii produse la
trecerea unui curent
electric alternativ printr-un cristal de cuart 20KH/sec) pe care-l produc la trecerea prin apa extra şi
intracelularădezintegrare
rapida a celulei bacteriene
 REGULI RECOLTARE- TRANSPORT PROBE

Probele recoltate
• cantitate suficientă- recipiente sterile
• reprezentative pentru procesul infectios al procesului bolii
• înainte de administrarea agenților antimicrobieni (ori de câte ori este posibil)
• când agenții patogeni sunt prezenți într-un număr mult mai mare (de exemplu, stadiul acut, puseu febril )
• cu o contaminare externă cât mai mică [ ex. colectarea de lichide corporale normal sterile (sânge sau
lichid cefalorahidian) prin
aspirarea percutanată trebuie să fie precedată de o decontaminare completă a pielii- se curate mecanic
pielea folosind germicide
prin frecare se incepe și spre exterior în cercuri mereu mărite, se repeta acesta tehnica de mai multe ori,
folosind de fiecare dată
un tampon nou)
• alcoolul (70%) este satisfăcător pentru piele (este nevoie de 2 minute de contact umed)
• iodul (tinctură de iod 2%) funcționează mai repede (1 minut)
Transportul probelor la laborator –imediat
• probele care conțin floră microbiană abundentă pastrate la 5 ° C (frigider) timp de câteva ore înainte de
cultivare dacă nu pot fi procesate imediat

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR

Membrane fibroase care la atingerea cu tamponul de exsudat faringian se vor rupe si vor
produce o sangerare abundenta – semn de disterie respiratorie (Corynebacterium diphteriae)
HIPERSENSIBILITATE DE TIP CELULAR - LT cu memorie
IDR PPD 0,1ml / 2UT/ 10UT cu citirea reactiei la 48-72 ore ( derivat proteic purificat de tuberculina)
•reacție întârziată a organismului care apare la 72 ore de la contactul cu antigenul
•LTh1 cu memorie sunt atrase la locul pătrunderii antigenului, unde secretă citokine
•care atrag mai multe LT și macrofage determinând apariția inflamației
• ulterior macrofagele distrug antigenul și organismul revine la normal
Un test cutanat pozitiv (j transversal al zonei indurate >/=10mm) arata faptul ca
pacientul a fost infectat cu agentul respectiv dar nu implica o boala actuala
Virajul tuberculinic (succesiunea a 2 testari cutanate prima negativa urmata de una
pozitiza) sugereaza infectia recenta sau chiar prezenta bolii manifeste

REACȚIA DE POLIMERIZARE ÎN LANT – PCR (Polymerase Chain Reaction)

• metodă rapidă de amplificare enzimatică a unui fragment specific de ADN.
(sintetiza unui număr mare de copii ale unui segment dintr-o moleculă de ADN)
Un anumit segment de acid nucleic este replicat în mod specific pornind de la doi primeri
oligonucleotidici care flanchează fragmentul respectiv de ADN.
Procesul are loc în cadrul unor cicluri repetitive:
a) Denaturare: 94 0 C, 1 min
b) Hibridizare primeri:55 0 C, 1min
c) Extensia primerilor: 72 0 C, 1 min cu ajutorul unei ADN polimeraze termostabile (Taq polimeraza),
folosind o matriţă ADN
• Primerii adăugaţi în exces faţă de ADN-ul ce trebuie amplificat, hibridizează pe catenele ADN pe baza
complementarităţii de secvenţă, câte un primer pe fiecare lanţ.
• Ciclurile succesive de amplificare vor dubla de fiecare dată cantitatea de AND sintetizată în ciclul
precedent, rezultând teoretic după 30 de cicluri o amplificare de aproximativ 270 milioane de ori a unui
segment de AND • În prima etapă a reacţiei de amplificare enzimatică se realizează un amestec ce
conţine: ADN, 2 primeri oligonucleotidici, Taq polimeraza, deoxiribonucleozid trifosfaţi (dNTPs),
tamponul de reacție

INSTRUMENTE UTILIZATE ÎN BIOLOGIA MOLECULARĂ

• ENZIME DE RESTRICȚIE RFLP (analiza lungimii fragmentelor de restricție)
Enzimele de restricție (endonucleazele de restricție) taie ADN-ul în fragmente. Aceste enzime sunt izolate
din bacteriile care le produc și pe care le folosesc în apărarea față de atacul viral, distrugând astfel AND
ul viral. Fiecare enzimă de restricție recunoaște și taie ADN-ul la nivelul unei secvențe specifice,
denumită situs de restricție.
• VECTORI
Vectorul reprezintă structura care poate introduce ADN într-o celulă.

Plasmidele bacteriene și virusurile pot fi utilizați ca vectori. Aceștia odată ajunși într-o celulă se replică
astfel încat genele inserate vor fi copiate pe măsură ce celula se divide.
• În cazul virusurilor ARN, de exemplu poliovirusul, acest proces necesită o etapă suplimentară de
transcriere inversă (RT) de la ARN la ADN complementar (ADNc)
• Sinteza catenei de ADN complementar poate fi făcută cu ajutorul unui primer ARN complementar
secvenţei ARN sau cu un oligo (dT) care hibridizează pe secvenţa poli (A) din capătul 3’al genomului, în
prezenţa unei revers transcriptaze (AMV).
• Reacţia se desfăşoară la 42 0C sau 500C timp de 30 minute şi este urmată de o reacţie obişnuită de PCR,
pornind de la cantitatea de ADN obţinută
• Evaluarea variaţiei genetice a tulpinilor de poliovirus, - analiza polimorfismului
fragmentelor de ADN provenite dintr-o regiune a genomului (RFLP), ce urmează revers transcrierii.
• Principiul metodei constă în evidenţierea unui situs de restricţie care a fost creat sau a fost suprimat
după apariţia unei mutaţii prin comparaţie cu numărul de situsuri corespunzătoare de restricţie ale
tulpinilor de referința in cazul de fata tulpinilor vaccinale Sabin.
• Enzimele de restricţie sunt endonucleaze (RsaI, DdeI, Hinf I) de origine bacteriană ce au proprietatea de
a tăia ADN dublu catenar la nivelul unor situsuri specifice
• Produşii de digestie se vizualizează în gel de agaroză 3% şi se evaluează în raport cu un marker de masă
moleculară şi o probă de ADN nelizat alături de lizate ale tulpinilor de referinţă. Practic după amplificare
şi digestie enzimatică, migrarea în gel de agaroză permite punerea în evidenţă a unei benzi suplimentare
sau a absenţei altei benzi prin comparaţie cu tulpina vaccinală
• Produşii RFLP sunt evidenţiaţi prin electroforeză în gel de agaroză 3%, în tampon TAE 1X, vizualizaţi
pe transiluminator în lumina UV. Profilurile obţinute în urma digestiei enzimatice sunt comparate cu cele
obţinute pentru tulpinile vaccinale,

qRT- PCR - tehnică utilizată pentru a cuantifica acidul nucleic (ADN / ARN) prezent într-o
probă, în timpul reacției PCR denumita PCR în timp real sau PCR cantitativă (q)
• Cantitatea de acid nucleic prezentă în probă este cuantificată folosind marker fluorescenti în loc de
vizualizare benzilor pe un gel la sfârșitul reacției PCR
• procesul este monitorizat în „timp real cu un spectrofluorometru care evidentieaza prezenta ADN dupa
fiecare ciclu de amplificare
• pe masura ce se amplifica ADN-ui, generarea de fluorescență este detectată cu o camera de tungsten sau
halogen în timpul fiecărui ciclu PCR
• semnalul detectat este trimis la computer după conversia în semnal digital care este afișat pe ecran
Marker fluorescent:
• SYBER green – nespecific
• Sonda Taqman- specific pentru secventa de identificat
• pe măsură ce numărul copiilor genetice crește în timpul reacției, crește și fluorescența, indicând
progresul reacției
• un prag de fluorescență (Threshold) este determinat în partea liniară a curbei, corespunzător fazei cu cea
mai bună eficiență de amplificare
SYBER GREEN – colorant care emite un semnal fluorescent proeminent atunci când se leagă nespecific
de AND

Metoda exploatează activitatea endonucleazei 5 ‘a Taq DNA polimerazei pentru a cliva o sondă
oligonucleotidică în timpul PCR, generând astfel un semnal detectabil
Taqman
• sondă de hidroliză care poartă un colorant, adesea fluoresceină (FAM) la capătul său 5 ’și un
tetrametilrhodamină de stingere (TAMRA), la capătul 3’ al oligonucleotidei
• În condiții normale, sonda rămâne înfășurată pe ea însăși, aducând colorantul de fluorescență lângă
stingător, care inhibă sau stinge semnalul fluorescent al colorantului.
• Oligonucleotida Taq polimerazei are o regiune omoloagă cu gena țintă și astfel, atunci când secvența
țintă este prezentă în amestec, se leagă de ADN-ul probei
• Pe măsură ce Taq polimeraza continua extensia, provoacă degradarea sondei prin activitatea de nuclează
la capătul 5 ’, iar fluoresceina este separată de stingător, ca urmare este generat semnal de fluorescență.
• Pe măsură ce această procedură continuă, în fiecare ciclu numărul de molecule de semnal crește,
determinând creșterea fluorescenței care este pozitiv legată de amplificarea țintei.

• Baseline (Linia de bază) este definită ca cicluri PCR în care

semnalul fluorescent sub limitele de detectare a instrumentului
• ΔRn - creștere a semnalului fluorescent la fiecare punct de timp
Valorile ΔRn sunt reprezentate grafic față de numărul ciclului
• Threshold (Pragul) este un nivel arbitrar de fluorescență ales pe
baza variabilității de bază. Un semnal detectat deasupra pragului
este considerat un semnal real care poate fi utilizat pentru a defini
ciclul de prag (Ct) pentru un eșantion
• Ct este definit ca numărul fracțional al ciclului PCR la care
fluorescența reportata este mai mare decât pragul.

DETERMINAREA SECVENŢEI ACIZILOR NUCLEICI

Secventierea prin PCR, integrată în sistemul automat cu fluorocromi permite secvenţierea directă a
produsului obţinut prin PCR, fără clonare prealabilă Principiul reacţiei constă în migrarea în gel de
poliacrilamidă a ADN-ului marcat cu 4 fluorocromi diferiţi
În funcţie de mărime, fragmentele de ADN sunt separate, traversează regiunea de la baza gelului, care
este supusă unui fascicul de laser care îl baleiază în mod continuu
Fluorocromii sunt excitaţi de laser, emiţând fiecare o lungime de undă detectată cu ajutorul unei camere
video cuplată la un spectrograf
Intensitatea emisiilor este colectată sub forma unor semnale electrice. Un program informatic cuplat la
secvenţiator, permite analiza automată şi transformarea datelor în secvenţe nucleotidice

INGINERIA GENETICĂ- tehnologia recombinării ADN

• tehnici și instrumente de purificare, amplificare, modificare și exprimare specifică a secvențelor genice
• elementele de baza ale ingineriei genetice sunt: clonarea și exprimarea vectorilor, amplificarea
secvențelor ADN, utilizarea enzimelor
de restricție care clivează ADN-ul reproductibil la nivelul anumitor secvențe, ADN-ligaza care leagă
fragmentul ADN la un vector clonat
• Clonarea și expresia vectorilor permite inserarea ADN-ului străin în el dar trebuie să fie capabil de
replicare normală în celula eucariotă
sau procariotă
• Vectorii plasmidieni sunt utilizați pentru fragmente ADN de pană la 20kb, bacteriofagii pentru
fragmente mai mari de 25kb si cosmid
vectorii combină cele două proprietăți ale plasmidelor și bacteriofagilor și sunt utilizați pentru fragmente
mai mari de 45 kb
• Clonarea ADN-ului presupune purificarea ADN-ului cromozomial din celule, virusuri sau plasmide sau
amplificarea selectivă a
secvențelor ADN prin reacția de polimerizare in lanț (PCR)
• Vectorul și ADN-ul străin sunt clivați cu ajutorul enzimelor de restricțe
• Cei mai multi vectori clonați au o secvență denumită loc: «multiple cloning site» ce poate fi digerată de
multe enzime de restricție
• Ligarea vectorilor cu moleculele de ADN generează o molecula recombinant ADN capabilă de
replicarea secvenței inserate
• ADN-ul recombinant poate fi introdus in celula care transcrie și translatează genele

VARIATII, ERORI IN MICROBIOLOGIA CLINICA

Variatii biologice
• Interindividuale, legate de varsta (copil , adolescent, adult, variatii ale microbiotei vaginale : la femeia
matura sexual, la menopauza )
• Intraindividuale , legate de alterarea temporara sau definitiva a mecanismelor de eliminare microbiana
Variatii preanalitice
• Fiziologice – diureza influenteaza bacteriuria; terapia antimicrobiana
• Prelevarea probelor ( alegerea probei, momentul recoltarii, modul de recoltare), etichetarea, conservarea,
transportul in laborator ,
intocmirea cererii de analiza
Variatii analitice – generate de examenul de laborator : materiale utilizate ( medii de cultura, reactivi,
instrumente), tehnica de
lucru, performante individuale ale personalului implicat
Variatii postanalitice – apar intre momentul obtinerii rezultattului de laborator si insusirea de catre medic,
erori de transcriere a datelor

PERFORMANTA TESTELOR DE LABORATOR

EFICACITATEA – prezenta bolii / starii de purtator
Testul solicitat – poate sa confirme sau sa infirme prezenta bolii / +/-
Relatii intre rezultatele testului solicitat si prezenta sau absenta bolii –performantele testului
SENSIBILITATEA – proportia pacientilor cu boala pe care testul ii identifica corect in populatia
investigata
Se= RP (real pozitiv)/ RP + FN ( fals negativ)
SPECIFICITATEA –proportia pacientilor fara boala pe care testul le identifica in mod corect in populatia
investigata
SP= RN ( real negativ)/ FP ( fals pozitiv) + RN
Proportia FN= FN/ RP + FN
Proportia FP= FP/FP + RN
Predictia pozitiva (PP) – masoara proportia pacientilor cu boala din totalul celor cu test pozitiv ; PP= RP/
RP+FP
Predictie negativa(PN) – masoara proportia persoanelor fara boala din totalul celor cu test negativ ; PN=
RN/ FN+RN
Eficacitatea (Ef) exprima proportia clasificarilor diagnostice corecte printr-un test dat Ef= RP +RN/ N ; N
= RP + FP + FN+ RN
Prevalenta (Pr) unei boli – fractiunea persoanelor din colectivitate care au aceasta boala
Pr= RP+ FN/ N

Recoltarea probelor – recipiente sterile, etichetarea probelor – nume pacient, prelevat, sursa , data si ora
prelevarii
Cerere de analiza : nume pacient, prelevat, sursa , data si ora prelevarii, examen solicitat , date necesare
interpretarii rezultatelor (date vaccinale)
Transportul la laborator – 4 0C ( majoritatea microbilor supravietuiesc cateva ore , multiplicarea
contaminatilor este oprita ); putine bacterii nu rezista la refrigerare : meningococul, gonococul,
Haemophilus influenzae
Medii de transport ; asigura supravietuirea microorganismelor prevenind desicarea, autoliza, variatii
de pH , oxidarea ( mediile Cary Blair, Amies , Stuart)

RECOLTARE PRODUS PATOLOGIC

sange venos 10 ml – adult, 3-5 ml copil
Pentru sistemul BACTEC
• recoltarea se face in recipientul de hemocultura (rășini) pe principiul sistemelor inchise cu vid
• utilizeaza tehnologia unica a senzorului fluorescent care permite monitorizarea automata si continua a
culturilor sangvine, avand ca rezultat o detectie rapida a specimenelor pozitive (CO2)

Secretie conjunctivala - utilizarea unui tampon umezit cu bulion din conjunctiva tarsiană superioară sau
inferioară

Exsudat faringian
• inainte sau dupa 4 ore de la toaleta cavitatii bucale sau ingestia de alimente sau lichide.
Tehnica de recoltare
• Se aseaza pacientul pe scaun cu fata spre sursa de lumina, gatul in usoara extensie si ceafa sprijinita de
spatar sau perete.
• Se deprima baza limbii cu apasatorul si, in timp ce pacientul pronunta vocala “a”, se sterg ferm cu
tamponul amigdalele si peretele posterior al faringelui, insistand asupra zonelor inflamate, ulcerate sau cu
depozite purulente; daca exista false membrane, acestea se desprind usor, tamponandu-se mucoasa
subiacent
• Atat la introducerea cat si la scoaterea tamponului, se evita atingerea bazei limbii si a palatului moale.
- Se introduce tamponul in tubul protector simplu sau prevazut cu mediu de transport (Amies sau Stuart),
care se eticheteaza corespunzator.

SPUTA 1-2 ml
 secretiile traheobronsice expectorate in cursul unui acces de tuse; contine prin contaminare secundara
si secretiile din cavitatea bucofaringiana si nazala
 se face din expectoratia de dimineata
 in prealabil bolnavul va efectua o gargara cu ser fiziologic steril sau cu apa fiarta si racita daca
recoltarea se face la domiciliu
 expectoratie indusa - aerosoli
 Raportul celule inflamatorii/celule malpighiene mai mic de 5 indica o proba nesatisfacatoare
(nepurulenta, avand contaminare oro-faringiana masiva)

URINA- 10-15 ml adulti

• prima urina de dimineata sau la cel putin 4 ore de la ultima mictiune
• inaintea inceperii tratamentului cu antibiotice;
• inaintea recoltarii probei se va face o toaleta locala riguroasa cu apa si sapun;
• proba va fi recoltata din jetul urinar mijlociu, fara a intrerupe fluxul, intr-un recipient
steril
• pentru recoltarea probei la sugari se va utiliza punga pediatrica • proba va fi
transportata cat mai repede la laborator (in 1-2 ore)

Cum interpretam rezultatele examenului de urina?

• Analiza caracteristicilor fizice si chimice ale urinei se face in laborator si implica, de obicei, trei etape:
• • Examen vizual – se evalueaza culoarea, claritatea, nebulozitatea si concentratia urinei
• • Test dipstick – se examineaza compozitia chimica a urinei cu ajutorul unei benzi de test
• • Examen microscopic – se analizeaza urina la microscop pentru a identifica bacterii, celule si parti de
celule
Examenul vizual
• Urina - de obicei lichid limpede Mirosul neobisnuit, nebulozitate
- pot indica problema
• Culoare rosu/maro- sange in urina
• Culoarea urinei -influentata de alimentele consumate ( sfecla poate colora urina in rosu)
Aciditatea (pH)
• Proteinele
• glucide
• Cetone.
• Bilirubina
• Dovezi ale infectiei ( prezenta nitritilor sau a esterazei leucocitare -infectie la nivelul tractului urinar

MATERII FECALE 5 ml scaun lichid; 3-5 cm3 scaunul format

Prelevarea din scaun emis spontan prelevarea se face cu spatula coprorecoltorului, vizand portiunile
lichide si, mai ales, cele mucoase si/sau sangvinolente, daca exista. Volumul recoltei trebuie sa fie de
minim

LCR
o lichid limpede, incolor, fără pigmentare
o produs în plexurile coroide ale ventriculelor creierului; 500-1200 ml/zi
o umple sistemul ventricular cerebral, canalul ependimar, spațiile subarahnoidiene cerebrale și medulare

PUNCȚIA LOMBARĂ
diagnostic /terapeutica efectuata - analiza biochimica, microbiologica si citologica sau mai rar pentru
ameliorarea presiunii intracraniene.
Indicații:
• suspiciune de meningită : febră, letargie, iritabilitate, cefalee, fotofobie, erupții cutanate, convulsii
• suspiciune de hemoragie subarahnoidiană
• suspiciune de alte boli ale sistemului nervos, ex: sindromul Guillain-Barre
• Inainte - efectuarea unui examen neurologic precum si examinarea fundului de ochi pentru a exclude un
sindrom de hipertensiune intracraniana
MATERIALE NECESARE
• Tinctură de iod / alcool -aseptizare tegumente
• Mănuşi sterile, echipament de protectie
• Trocar și seringi sterile
• Anestezic local : xilina, lidocaina
• Manometru Claude
• Ace sterile de puncţie rahidiană
• Pense sterile pentru scoaterea acului
• Eprubete sterile pentru recoltare LCR
1. Pacientul asezat in decubit lateral curbat (pozitie fetala) cu coapsele, genunchii si barbia flectate spre
piept pentru a deschide spatiile interlaminare
2. Se toaleteaza planurile tegumentare cu antiseptice în 3 rânduri, precum şi policele stâng al medicului;
acesta va repera spaţiul interspinos ales pentru puncţie intre vertebrele lombare L3/L4, L4/L5 sau L5/S1
3. Anestezie locală la nivelul locului de puncţie

1. Se realizeaza infiltrarea plan cu plan;patrunderea se face cu acul cu mandren perpendicular pe linia

mediana,in mijlocul spatiului interspinos
2. 2. Introducerea acului se va face progresiv prin ligamentul interspinos, ligamentele galbene şi
duramater, însoţită de retragerea periodică a mandrenului pentru a verifica poziţia acului
3. Scoaterea mandrenului, observând scurgerea primelor picături de LCR pe ac;
Recoltarea LCR se va face în eprubete sterile- 5-10 ml

 Se recolteaza cantitati de 5-10 ml LCR

 Recoltarea este invaziva si trebuie efectuata intr-o singura incercare.
 LCR este depozitat in 2-3 tuburi sterile (2 tuburi vor fi centrifugate iar din al treilea tub se vor realiza
testele biochimice si alte teste utile
 pentru a sugera etiologia); !!! daca LCR este franc purulent, examenul microscopic direct se face fara
centrifugare
 LCR trebuie sa fie prelucrat imediat.
 Daca LCR trebuie transportat, transportul trebuie sa se faca cat mai rapid si la o temperatura apropiata
de temperatura corpului uman ( in
 nici un caz la +4 °C; atat H.influenzae, N. meningitidis agenţi etiologici recunoscuţi ai meningitelor
bacteriene sunt distruşi prin refrigerare)
 Un alt motiv in favoarea unui transport si o prelucrare foarte rapida a LCR este reprezentat de studiul
citologic al produsului patologic si mai
 precis de numararea leucocitelor PMN care incep sa fie distruse in numar semnificativ inca din
primele 30-60 minute dupa recoltare.
o Aspect LCR ( normal/ modificat : xantocromic ( eritroite in LCR), purulent, fibrina

ANALIZA LCR

SECREȚIA PURULENTĂ
 Puroiul - exsudat conținând fibrina, leucocite, resturi celulare și microorganisme
 o poate apărea în țesuturi și organe (cutanate, țesut musculoscheletal, ganglioni, viscere,
cavități, pe suprafețele tisulare denudate prin arsuri, plăgi);
o colecțiile se pot deschide spontan prin fistule..
 Se recolteaza lichid purulent din zona infectata – cu un tampon steril
 exudat faringian,
 raclat lingual
 exudat nazal
 de la nivel ocular (sac conjunctival sau de unde se observa secretii)
 vagin / col uterin
 Recipientul colector se închide apoi ermetic
Materiale necesare prelevării
• trusă pentru efectuarea unui pansament (trusă de mică chirurgie) cu pense anatomice, chirurgicale,
hemostatice, foarfece, bisturiu, etc;
• material moale steril (tampoane, comprese, feşe);
• soluţii antiseptice pentru plagă şi tegument;
• mănuși sterile;
• soluţie sterilă de ser fiziologic, pentru spălarea plăgii;
• bandă adezivă (romplast);
• recipiente sterile pentru colectat produsul (tampon de exudat cu mediu de transport);
• tăviţă renală;
• Containere, saci pentru deșeuri medicale

TEHNICI DE CULTIVARE BACTERIANA

• Mediile de cultura- selectate
• pentru a asigura condițiile optime de creștere a agenților patogeni prezenti frecvent într-un anumit loc
sau tip de proba, medii simple, medii complexe
• în funcție de cerințle speciale de creștere a bacteriilor asociate cu un anumit tip de infecție sau
necesitatea de a selecta anumite bacterii patogene dintr-o populație mixtă de floră indigenă
Antibioticele sau substanțele chimice pot fi adăugate pentru a crea un mediu selectiv, cum ar fi acid
analidixic utilizat pentru a inhiba creșterea bacililor gram-negativi, permițând creșterea bacteriile gram-
pozitive
Încălzirea sângelui pentru a produce geloza chocolat și adăugarea de suplimente de vitamine creează un
mediu îmbogățit cu hemin (X) și factori V disponibili pentru izolarea Haemophilus și a altor bacterii
fastidioase.

REGULI PRIVIND ÎNSĂMANȚAREA MEDIILOR DE CULTURA LICHIDE , SOLIDE ,

SEMISOLIDE
Însămanțarea probelor cu respectarea regulilor de asepsie și antisepsie
După prelucrarea produsului patologic lichid se însămanțează mai întâi mediul de cultură lichid pentru a
reduce șansele de transfer din mediul solid în cazul în care acesta a fost contaminat
Frotiurile se colorează după ce toate mediile au fost însămanțate
Etichetarea corectă a mediul care trebuie însămanțat
Insămanțarea probelor cat mai mai repede din momentul în care proba a ajuns în laborator
Minimizați producția de aerosoli deschizând încet capacele mediului lichid, evitând agitarea puternică a
probei și evitândexpulzarea ultimei picături din pipetă

TEHNICA ASEPTICĂ
Sterilizarea ansei bacteriologice înainte și după utilizare prin aducerea firului ansei la incandescenta in
flara becului de gaz
Racirea firului ansei pe peretii eprubetei înainte de recoltarea produsului patologic în vederea însămanțarii
Nu se racește firul ansei prin mișcarea / fluturare în aer
Dacă bucla ansei este prea fierbinte crește riscul de aerosoli contaminați dar si de distrugere a
microorganismelor cu care vine în contact
Eprubetele cu produ patologic / tuburile cu mediu de cultura cu care se lucreaza se așează în poziție
vertical în stativ
Nu se așează capacele tubului pe masa de lucru

INSAMANTAREA MEDIILOR DE CULTURA SOLIDE – PACI PETRI

METODA PENTAGONULUI DESCHIS
 se descarca produsul patologic cu ansa/ tampon pe mediul de cultura , dupa
care cu ansa bacteriologica se descrie prima latura a pentagonului prin
trasarea unor linii subțiri ( striuri ) de insămanțare, paralele astfel încat
produsul să se intinda pe suprafața acestuia ( a se evita patrunderea ansei în
profunzimea mediului)
 se inchide placa Petri , se sterilizeaza ansa
 se deschide placa Petri , se raceste bucla ansei intr-o zonă a mediului curata
 se descrie a doua latură a pentagonului pornind de la latura inițiala
 se repetă procedura pană cand se ajunge la ultima latura a pentagonului care nu trebuie sa se uneasca
cu prima latura
INSĂMANȚAREA MEDIILOR DE CULTURĂ LICHIDE
- Tuburile cu dop de vata
- Gatul eprubetei se flambeaza dupa deschidere si înainte de
închidere – prevenirea contaminării
•Se înclină tubul u mediu lichid la 45 0 și se depune produsul de
însamanțat pe perete deasupra suprafeței lichidului la partea
inferioară, cand tubul revine la poziția inițiala , produsul
însămanțat se află în mediul de cultură
Însămanțarea în zig-zag a mediilor semisolide înclinate ( a) ( b,
c) pentru mediile semisolide cu parte dreaptă si inclinata -
înțeparea mediului urmată de însămanțarea în zig-zag a parții înclinate

TEHNICA ASEPTICĂ
Sterilizarea ansei bacteriologice metalice - înainte și după utilizare prin aducerea firului ansei la
incandescenta în flacăra becului de gaz ( inițial la baza flacării si ulterior se ridica ansa spre varful
flăcării, se flambeaza si portansa)
Racirea firului ansei pe peretii eprubetei înainte de recoltarea produsului patologic în vederea însămanțarii
Nu se racește firul ansei prin mișcarea / fluturare în aer
Dacă bucla ansei este prea , crește riscul de aerosoli contaminați dar si de distrugere a microorganismelor
cu care vine în contact
Eprubetele cu produs patologic / tuburile cu mediu de cultura cu care se lucreaza se așează în poziție
verticală în stativ
Se flambeaza gatul eprubetei dupa deschidere si la închiderea acesteia
Nu se așează capacele tubului pe masa de lucru

TEHNICA EFECTUĂRII FROTIULUI

• produs patologic
• bulion
• colonie bacteriana
1. Intinderea frotiului lama curate , degresata se pune cu ansa- o picatura de ser fiziologic in care se
descarca produsul/ colonia bacteriana recoltate cu ansa sterile), se omogenizeaza foarte bine
Daca se face frotiu din bulion nu este necesara picatura de ser fiziologic
2.Uscarea la temperature camerei ( aspect de pelicula foarte fina si subtire)
3. Fixarea – la cald - trecerea lamei cu partea opusa celei pe care se gaseste frotiul, pe deasupra flacarii
becului de gazed 2 , 3 ori ( 5-6 sec)
Aderarea preparatului la suprafata lamei , concomitant cu coagularea proteinelor dar cu pastrarea
structurii celulare a microorganismului studiat, cresterea afinitatii pentru coloranti

Coloratia cu Albastru de Metilen

1. Albastru de metilen 3-4 minute
2. Spalare cu apa de la robinet
3. Uscare la temperature camerei sau prin tamponare cu hartie de filtru

Coloratia Gram

 se acopera lama cu violet de gentiana ( proaspat filtrat, fara precipitate), 1-2 min
 se indeparteaza colorantul si lama se acopera cu lugol ( mordant) 3min
 se indeparteaza lugolul, se picura alcool acetona ( 3 parti alcool 960 si o parte acetona) 7 sec
 se acopera lama cu fuxina diluata extemporaneu 1/10 - 2 min
 se spala frotiul cu apa de la robinet si se usuca
PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA ARTIFICIALE
- Cantarire ingrediente
- Rehidratare la cald - apa distilata, apa deionizata
- Repartizarea mediului in tuburi
- Sterilizarea mediului – autoclavare 15 min 121 C
o Medii de cultura artificiale repartizate in eprubete / tuburi, - utilizate pentru multiplicare
o bacteriana / teste biochimice
- Lichid – bulion
- Semisolid – geloza ( portiune dreapta si inclinata, portiune dreapta)

TEHNICI DE CULTIVARE BACTERIANA

• Mediile de cultura- selectate
• pentru a asigura condițiile optime de creștere a agenților patogeni prezenti frecvent într-un anumit loc
sau tip de proba, medii simple, medii complexe
• în funcție de cerințele speciale de creștere a bacteriilor asociate cu un anumit tip de infecție sau
necesitatea de a selecta anumite bacterii patogene dintr-o populație mixtă de floră indigenă
• antibioticele sau substanțele chimice pot fi adăugate pentru a crea un mediu selectiv, cum ar fi acid
analidixic utilizat pentru a inhiba creșterea bacililor gram-negativi, permițând creșterea bacteriile
grampozitive
- Încălzirea sângelui pentru a produce geloza chocolat și adăugarea de suplimente de vitamine mediu
îmbogățit cu hemin (X) și factor V necesari pentru izolarea speciilor de Haemophilus și a altor
bacterii fastidioase

REGULI PRIVIND ÎNSĂMANȚAREA MEDIILOR DE CULTURA LICHIDE , SOLIDE ,

SEMISOLIDE
• Însămanțarea probelor cu respectarea regulilor de asepsie și antisepsie
• După prelucrarea produsului patologic lichid, se însămanțează mai întâi mediul de cultură lichid pentru
a reduce șansele de transfer din mediul solid în cazul în care acesta este contaminat
• Frotiurile se colorează după ce toate mediile au fost însămanțate
• Etichetarea corectă a mediul care trebuie însămanțat
• Insămanțarea probelor cat mai mai repede din momentul în care proba a ajuns în laborator
• Evitarea producerii de aerosoli prin agitarea probei sau deschiderea bruscă a capacelor recipientelor
cumediu lichid

INSAMANTAREA MEDIILOR DE CULTURA SOLIDE – PLACI PETRI

METODA PENTAGONULUI DESCHIS
- se descarca produsul patologic cu ansa/ tampon pe mediul de cultura , dupa care cu ansa bacteriologica
sterile, se descrie prima latura a pentagonului prin trasarea unor linii subțiri ( striuri ) de insămanțare,
paralele astfel încat produsul să se intinda pe suprafața mediului ( a se evita patrunderea ansei în
profunzimea mediului)
- se inchide placa Petri , se sterilizeaza ansa
- se deschide placa Petri , se raceste bucla ansei intr-o zonă a mediului curate
- se descrie a doua latură a pentagonului pornind de la latura inițiala
- se repetă procedura pană cand se ajunge la ultima latura a pentagonului care nu trebuie sa se uneasca cu
prima latura

INSAMANTAREA MEDIILOR DE CULTURA LICHIDE

- Tuburile cu dop de vata / capac cu filet
- Gatul eprubetei se flambeaza dupa deschidere si înainte de închidere
– prevenirea contaminării
•Se înclină tubul u mediu lichid la 45 0 și se depune produsul de însamanțat pe perete deasupra suprafeței
lichidului la partea inferioară, cand tubul revine la poziția inițiala , produsul însămanțat se află în mediul
de cultură

TEHNICA EXAMENULUI MICROSCOPIC AL BACTERIILOR

MICROSCOPUL
• Instrument optic – studiul microorganismelor, utilizat in scopul maririi imaginii obiectelor
supuse observatiei
• Grosismentul (g) microscopului = marimea imaginii/ marimea adevarata a obiectului
Tipuri de microscoape:
Fotonice
• microscop optic obisnuit
• microscoape speciale – ultramicroscop
• microscop cu contrast de faza
Electronice
Ionice – protonice
TEHNICA EXAMENULUI MICROSCOPIC AL BACTERIILOR
MICROSCOPIA FOTONICA
MICROSCOPUL
PARTE MECANICA :
• Picior
• Platina
• Tub – macro/microviza
PARTE OPTICA:
Sistemul de iluminare
• Sursa de lumina
• Condensator
• Diafragm
Partea propriu zisa:
Obiective uscate 10x, 20x, 40x, imersie, ulei de cedru, 100x
Oculare 5x. 7x, 10x , 15x

Examinarea unui preparat proaspat pentru studiul bacteriilor

• pe lama portobiect se depune o suspensie de germeni
• se acopera cu o lamela
• se aseaza pe platina microscopului , fixandu-se sub platina
• se examineaza cu condensatorul coborat cca 1,5 cm sub platina
• diafragmul semideschis si obiectiv 40x coborat pana aproape de lamela
• coborarea obiectivului se face privind lateral si rotind incet macroviza
• privind prin tubul microscopic, se roteste macroviza , pana cand apare campul microscopic cu germenii
mobili
Punerea la punct a campului se face cu microviza , regland lumina prin modificarea fantei
condensatorului
Miscarea bacteriilor se realizeaza in toate sensurile campului microscopic
Miscarea browniana este imprimata tuturor bacteriilor intr-un singur sens

ULTRAMICROSCOPIA
Examen microscopic pe fond intunecat- microscop obisnuit , sursa puternică de lumina , condensator cu
posibilitate de
diafragmare a luminozitatii, obiectiv 40x
• Preparatul de examinat este fixat pe un fond negru și prin iluminarea laterală a acestuia, particulele mici
din calea razelor
(germenii), vor deveni centre de reflexie ale luminii , particulele devenind luminoase si vizibile
• - pentru preparate native – evidențiere morfologie , moblitate ( treponeme , leptospire)
Microscopia cu contrast de fază
• Observarea obiectelor transparente care prezinta in structura variații de indice de refracție sau de
grosime
• Studiul structurilor microscopice native
Microscopia prin fluorescenta
Fluorescenta – aspect particular al fenomenului de luminescență (emisia luminoasa a unui corp , indusa
de o radiație externă)
Radiația externă , excitantă (UV/ lampa vapori Hg) este absorbită de atomii corpului de studiat
Revenirea la starea normala se face cu pierderea energiei acumulate sub forma de emisie luminoasă
Fluorescența – poate fi :
• Primară – proprie microorganismelor de examinat
• Secundară – consecutiv tratării substratului de cercetat cu fluorocromi
• Fluorocromii- compusi organici care emit lumina fluorescenta – alcalini( auramina , acridin oranj ,
tripaflavina), acizi ( fluoresceina, eozina) , neutri ( lizamin rhodamina)
 Frotiu cultura pura – Candida spp F
coloratie Gram

Frotiu cultura pura coloratie Gram – coci in Frotiu hemocultura

coloratie Gram – coci in tetrade si diplo
diplo si in lanturi

Frotiu secretie vaginala coloratie Gram cocobacili Gram negativi, capsulati

– Candida albicans

secretie vaginala Gram, celula epiteliala,

coci in diplo Gram pozitivi
LCR coloratie AM- coci diplo
intra si extraleucocitari

Frotiu secretie vaginala AM – cel epit, Candida albicans Frotiu serozitate șancru dur – Treponema pallidum
Boala – sifilis

Frotiu spută- colorație Ziehl Neelsen- bacilul Koch

(BK) acid alcoolo rezistenti (BAAR) roșii
pe fond albastru

Conditii impuse mediilor de cultura:

• nutritive(factori de crestere)
• sterile
• pH (7,2-7,6)
• umiditate favorabila multiplicarii germenilor
Clasificarea mediilor de cultura ( artificiale) :
• dupa starea de agregare: lichide (bulion), solide(geloza), semisolide(gelatina)
• dupa complexitatea ingredientelor : medii naturale(lapte, bila)
• medii artificiale(geloza, bulion)
• medii mixte(geloza-sange)
• dupa sursa ingredientelor : medii cu proteine animale(bulion sange)
• medii cu proteine vegetale(cartof, soia)
• medii sintetice si semisintetice( Lodder)
• dupa complexitatea ingredientelor: medii complexe- electiv(Loeffler)
• selectiv(Loewenstain)
• de imbogatire(Muller- Kauffman)
• diferential(AABTL)
• dupa scopul urmarit prin utilizarea lor: medii de transport(Carry- Blair)
 • medii de izolare(electiv, selectiv, de diferentiere)
• medii de identificare(TSI, MIU)
• medii de conservare(Loewenstein)
• dupa continutul in apa: umiditate obisnuita(normale); uscate(deshidratate) in scopul conservarii

MEDII DE CULTURA SIMPLE

Bulion
• Bulionul, mediu lichid conține macerat de carne de vita, peptonă și 0,5% NaCl;
• Apa peptonata
• Geloza simplă - prin gelificarea mediului simplu lichid cu 2%agar (un carbohidrat derivat din alge
roșii care se topește la 1000C și se gelifiază la 400C), se obține un mediu solid simplu care permite
fixarea bacteriilor la punctul de inoculare, permițand astfel obținerea coloniilor izolate

MEDII DE CULTURA COMPLEXE

• Medii simple + adaus de lichide organice ( sange, ser) sau zaharuri ( glucoza, lactoza) cultivare specii
pretentioase -
N. meningtidis, H. influenzae)
Mediul Selectiv: contine substante bacteriostatice ce inhiba dezvoltarea unei populatii microbiene
favorizand dezvoltarea unei anumite specii (BK)- m.Loewenstein prin verdele malachit inhiba flora de
asociatie, contine saruri minerale, amidon, ou, glicerina
Mediul Electiv:
m. Loeffler(contine ser coagulat de bou si bulion glucozat) pentru bacilul difteric; permite cresterea in 8-
12 ore a acestuia (celelalte bacterii cresc dupa 18-24 ore de incubare

MEDII DE CULTURA COMPLEXE

Mediul de imbogatire: functioneaza concomitent si ca mediu selectiv si ca mediu electiv.(Chapman solid -
clorura de sodiu, manita, rosu fenolpermite
diferențierea S aureus ( fermenteaza manita din mediu , coloniile si mediul devin galbene ) de S.
epidermidis ( nu fermenteaza) )
• Medii lichide de îmbogațire- medii care favorizează înmulțirea anumitor bacterii patogene inhiband
selectiv dezvoltarea florei de asociație
• M. OCST (ou, cistină, ser, telurit de potasiu) pentru Corynebacterium diphteriae
• M. hiperclorurat lichid Chapman - pentru diferențierea S. aureus de S. epidermidis
• m Muller – Kauffmannn- mediu cu selenit acid de sodiu, izolarea genului Salmonella
• m geloza – sange- evidentiaza fenomenul de hemoliza – sange defibrinat de berbec 5%
• Mediul diferential- Mediu solid ce contine unele substraturi (sange, zaharuri, indicatori de ph,) care sub
actiunea echipamentului enzimatic bacterian ,pot fi sau nu modificate vizibil.
• Ex.: AABTL(agar, albastru de brom timol ,lactoza) pentru Enterobacterii diferentiaza bacteriile lactozo
pozitive de cele lactozonegative, ADCL (Agar dezoxicolat citrat lactoză Hektoen enteric agar (lactoză,
sucroză, săruri biliare, sulfat feric de amoniu, tiosulfat de sodiu, albastru de brom timol, acid fucsic)
• m Stuart - transport
Medii de cultura complexe pt izolarea enterobacteriilor

BluEcoli™ urine biplate

•Mediul MacConkey cromagen pe o parte și geloza sânge pe altă parte
• se insamanteaza ambele placi cu proba de urină
• dacă organismul infectant este E coli, coloniile de pe partea cromogenă a
biplatului vor deveni albastre
Daca pe partea cu geloza sange : 105 UFC /ml urina – infecție urinară
MEDII PENTRU TESTE BIOCHIMICE
FERMENTARE ZAHARURI , PRODUCERE DE H2S
Mediul TSI (glucosa, lactoza , rosu fenol citrat feric); o
bază galbenă indică fermentarea glucozei, o
bază galbenă și o pantă indică atât fermentarea glucozei,
cât și lactoza, bulele din mediu arată
producția de gaz din glucoză, înnegrirea mediului indică
producția de hydrogen sulfurat

Testul Indol · Utilizat pentru a determina capacitatea unui organism

de a cliva aminoacidul triptofan în indol, amoniac și
acid piruvic. · Procedurile implică insamantarea unui mediu care
conține aminoacid triptofan · Dacă organismele au
enzima triptofanază, îndepărtarea grupei amino din triptofan
formează indol ·
Indolul este ușor detectat prin adăugarea de reactivi Kovacs și
apariția culorii roșu-cireș

Testul ureazei
Organismul testat este insamantat într-un bulion ce contine uree și
conține roșu de
fenol, un indicator de pH și are un pH de 6,8. La acest pH fenolul
roșu are culoarea
somon, când pH-ul crește peste 8,1 fenol roșu capătă o culoare roz
aprins

Testul utilizării citratului ca unică sursă de carbon

Koser’s citrate medium -indicatorul bromotimol se transformă din
verde în albastru ca urmare a reacției
alcaline pozitive

Testarea motilitatii bacteriilor

Bacteriile mobile „înoată” peste tot , mediul arată omogen
Bacteriile nemobile cresc numai pe traseul de insamantare

MEDII UTILIZATE PENTRU IDENTIFICAREA

STREPTOCOCILOR DE GRUP D
Testul Bilă-Esculin identifică organismele din grupa D. care au capacitatea de a crește
în prezența bilei și hidrolizează esculina în esculetină și glucoză. În prezența ionilor
ferici (prezenți în mediu) esculetina formează un complex negru.
De la stânga la dreapta: Enterococcus; Streptococcus bovis; tub neinsamantat (fără bacterii);
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus

TESTUL TOLERANȚEI LA 6,5% NaCl

Toleranta la NaCl distinge Enterococci de S. bovis se bazeaza pe
capacitatea Enterococilor de a crește în prezența 6,5% NaCl.
Turbiditatea vizibilă este dovada creșterii.

MEDII UTILIZATE PENTRU IZOLAREA Corynebacterium diphteriae

m Gundel-Tietz: (geloză sânge cisteina-telurit) ; teluritul inhibă

creșterea multor patogeni respiratori și bacili Gram negativi
Coloniile produse de biotipul gravis: col .j=1-2mm, plate,
margini crenelate, striații radiale, suprafața granulară, consistență
friabilă/semifriabilă, se emulsionează greu, negre cenușii/negre
cu margini transparente, când este bine dezvoltată aspect de
floare de margaretă- (izolat în formele grave)
m.Tinsdale: mediu selectivo-diferential (geloză, ser, cisteina,
telurit thiosulfat); H2S reacționează cu sărurile de telur, colonii
negre (nediferențiate ca morfologie pentru cele 3 tipuri, gravis,
mitis, intermedius) înconjurate de halou cafeniu brun
m. Pisu (geloza, ser cisteina, acetat de plumb); H2S+acetat de
Pb=SPb determină apariția unui halou cafeniu în jurul coloniilor
MEDII PENTRU CULTIVAREA BACTERIILOR ANAEROBE
• bulion cu acid thioglicolic (mediu lichid; la suprafata se adauga ulei de parafina)
• Tarozzi (mediu lichid, cu albus de ou; la suprafata se adauga ulei de parafina)
• Geloza Veillon (se obtin culturi in profunzimea mediului, realizate prin incorporare)
Tehnica Ott (se insamanteaza pe mediu solid, agenti reducatori si se sigileaza cu parafina) â
Mediu pentru cultivarea fungilor – Sabouraud ( geloza cu zaharuri de tip geloza 4% sau maltoză 4%+
antibiotic)