Capitolul 12 METODE I TEHNICI MODERNE MOLECULAR - BIOLOGICE I APLICAIILE LOR

12. 1. RECOMBINAREA ADN - ului

Teoria stabilitaii genomului celular a fost zdruciunat n anul 1951, odat cu descoperirea elementelor transpozabile. Fenomenul destabilizrii genomului celular a rmas inexplicabil pn n momentul n care a fost posibil studiul moleculei de ADN. Concentrarea studiilor asupra ADN a fcut posibil injectarea genelor cu ajutorul virusurilor vectoare in celule, deschiznd perspectivele noii terapii cu gene (terapie genetic = Gene Targeting). Respectivele virusuri (vectoare de gene) cu aspect de ,,ace snt introduse intit prin ,,mpucare (shotgun) ntr-un numr foarte mare de ,,inte celulare, care includ linii foarte variate de organisme; Aceast metod a dus la o revoluie tehnico-tiinific a crei consecin a fost construirea de noi genotopuri, la toate tipurile de bacterii, plante, animale. Faptul c informaia genetic a organismelor vii se gsete acumulat pe helixul ADN, iar acest material genetic poate fi izolat iar cele dou lanuri ale dublului helix ADN separate i apoi fiecare din cele dou lanuri recombinate cu un alt lan de ADN strin complementar, d posibilitatea crerii de noi organisme, att n condiii naturale,ct i laborator. Procese naturale de recombinare ADN (recombinare genetic) Joac un rol foarte important n natur, reprezentnd un factor evolutiv; existena acestor procese se explic apariia unor noi specii. Procese artificiale de recombinare ADN (tehnologia ADN-ului recombinat) Se realizeaz n condiii de laborator, n vederea obinerii de noi variante de microorganisme i plante, printr-un numr de metode ce formeaz tehnologia genetic, cunoscute la nivel internaional sub numele de Genetic Engineering. Descrierea compoziiei i structurii spaiale a ADN de ctre J. D. Watson i Fr. Crick din anii 1953 au reprezentat cunotinele fundamentale care au stat ulterior la baza noilor direcii de cercetare, i anume a tehnologiei genetice. Prima reuit de recombinare a fost realizat n SUA n 1970. Aceste tehnici ncearc pe cale artificial combinatrea informaiei genetice (a genelor) de la dou organisme diferite, n vederea crerii unui organism nou cu proprietai prestabile (intite); organismele rezultate sunt organismele recombinate care formeaz astzi obiectul unor studii cu implicaii deosebite n dezvoltarea tiinific i economic pe scar internaional, cu mari perspective de viitor. Aceste tehnici de recombinare genetic stau la baza cercetrilor fundamentale i aplicare n biologia molecular, farmacologie i n medicina viitorului, n scopul ameliorrii diagnosticului i terapiei medicale ntr-un numr mare de boli. Aceste tehnici vor avea implicatii majore i n dezvoltarea agriculturii, n ceea ce privete crearea unur specii noi de plante cu o mare eficien economic.

12.1.1. Principiul recombinrii

Un proces natural de recombinare genetic exist la organismele eucariote (cu set diploid de cromozomi) n cursul meiozei (diviziune reducional). Meioza are loc n celulele germinale i duce la reducerea setului dublu de cromozomi (set diploid) n set haploid (simplu). n prima faz se produce un schimb de fragmente cromatidiene ntre cromozomi omologi (M/P=materni/paterni) alturai printr-un fenomen de ,,crossing-over, ceea ce reprezint un fenomen de recombinare genetic. 252

ntr-un organism diploid cu un anumit numr de perechi de cromozomi omologi i o singur pereche de cromozomi sexuali, fiecare cromozom n interfaz apare format din cte dou cromatide (iar fiecare cromatiod la rndul ei dintr-o molecul de ADN dublu helix). Prin ncruciarea cromatidelor (crossing-over) pe locul de ncruciare, lanurile duble ADN ale celor dou cromatide vor fi tiate, vor interschimba fragmente de ADN, iar apoi capetele tiate se vor lega altfel, rezultnd cromatide recombinate (molecule ADN recombinate). La cromozomii umani exist n medie dou-trei asemenea fenomene de crossing-over i interschimburi de fragmente ADN pe ambele cromatide ale unui cromozom. Aceste procese se produc att de exact, nct nu se pierde nici un nucleoid. Dup interschimburile ntre cromatidele cromozomilor omologi se produce separarea acestor cromozomi cu cromatidele interschimbate i mparirea lor ntre cele dou celule fiice. n faza a II-a a meiozei urmeaz separarea cromatidelor n patru celule germinative mature. Aceste patru celule pot conine: c1 = numai material matern c2 = numai material patern c2 i c3 = material cromatidian recombinat (rezultat din fenomenul de crossing-over) matern i patern.

12.1.2. Procese artificiale de recombinare ADN (Genetic Engineering)

Cu ani n urm era posibil doar cercetarea indirect a ADN-ului asupra produselor ARN i proteice, sau analiza genetic foarte laborioas asupra funciei genelor prin cercetarea aspectelor fenotipice ale organismelor mutante i ale progeniturii acestora. Tehnologia ADNului recombinat, care a aprut n jurul anilor 70, a revoluionat biochimia, oferind posibilitaile cele mai eficiente pentru analizarea i modificarea genelor (ADN) i proteinelor din organismele vii. Pe baza acestei tehnologii, astzi poate fi modificat ntr-un mod dinainte stabilit i intit bagajul genetic al organismelor. Tehnicile de recombinare ADN stau la baza progreselor biotehnologiei moderne, aceste tehnici viznd direct informaia genetic a organismelor, utilizarea acestor metode putnd duce n viitor la nfrngerea barierei ntre specii. Prin procedeele de inginerie genetic se poate obine, prin introducerea unei informaii genetice ntr-un organism, un organism cu priorieti noi (de exemplu, obinerea de noi soiuri de plante cu rezisten crescut i ageni duntori). Tehnologia ADN recombinant presupune urmtoarele etape: tierea lanurilor duble ADN n fragmente specifice, prin aciunea enzimelor de restricie, astfel nct s fie obinute n final fragmente ADN de lan unic; pe aceast cale, moleculele ADN cu greutate molecular nalta snt tiate n molecule cu greutate molecular mult mai mic. Concomitent cu ADN-ul de cercetat, vectorul (virusul) este supus i el aciunii acelorai enzime de restricie, pentru c, n final, pe ambele lanuri de acid nucleic (lan unic de cercetat i lan unic al vectorului), s se obin acelai tip de capete adezive: fragmentul de acid nucleic de cercetat, ct i cel al vectorului se leag covalent (n cursul unui process de circularizare) n prezena ADN-ligazelor introducerea, o data cu vectorul, a respectivului fragment de ADN selecionat i fixat pe vector n celula gazd (celula bacterian avirulent de Esch. coli K12) multiplicarea sincron, o data cu celula gazd, a vectorului i a fragmentului ADN strin ncorparat n genomul celulei gazd. Apar n consecin un numr mare de celule purttoare de copii identice de ADN recombinat. Acest process poart numele de clonare. n cadrul acestui proces, celula bacterian astfel ,,nou construit (cu ADN recombinat) reprezint celula cap de colon. 253

Construirea unui genom nou prin introducerea unei secvene ADN strine n genomul unei celule gazd (de exemplu, bacteria, organisme multicelulare) reprezint de fapt tehnica de inginerie genetic prin care se obin genomuri modificate ce pot fi ulterior exprimate (transcrise i translaionate) de ctre celula gazd, prin sinteza de noi proteine (caractere noi ctigate de celula gazd). Termenul Genetic Engineering este adesea folosit drept similar celui de recombinare ADN, din care rezult un nou genom (prin introducerea, n genomul unei celule, a unei secvene strine de ADN cu autorul vectorului), celula respectiv ctig caractere noi. Prin aceste metode genetice pot fi manipulate, modificate i interschimbate sau nou recombinate att secvenele codificatoare, ct i secvenele de control ale unei gene. Este posibil s se fac noi combinaii pentru secvenele de control ale unei gene i s se determine n acest fel exprimarea unei gene dorite, intr-o anumit celul. Astfel, prin alegerea unei anumite secvene de control, se poate reui exprimarea practice permanent a unei gene altminteri slab activ; n acest context proteinele, care n cantiti mari n calula nou construit. Pentru creterea acestei cantiti de proteine se utilizeaz de regul fragmente de ADNc (secvene codificatoare fr introni). Dac se urmrete introducerea i exprimarea unor gene eucariote n bacterii i drojdii, se folosesc tot fragmente ADNc deoarece aceste microorganisme nu snt capabile s ndeprteze prin fenomene de splicing din ARNm transcris secvenele de introni. Etapele metodei de inginerie genetic utilizat n vederea obinerii unei anumite proteine n cantitate mare snt urmtoarele: se pornete de la matricea ADN; se obine o copie de ADNc (n prezena reverstranscriptazei); se obine un lan dublu ADN; respectivul lan dublu ADN este clonat; fragmentul ADNc clonat este nglobat n vectorul de exprimare; fragmentul ADNc nglobat n vector este introdus n celula receptor o dat cu vectorul; n celula receptor se produce transcrierea i translaia fragmentului ADNc strain (introdus), obinndu-se n final sinteza proteinei dorite. Folosind aceast metod s-a reuit ca celulele bacteriene, drojdiile i celulele de memifere s fie aduse n starea de a produce cantiti mari de anumite proteine int. n acest fel devine posibil analiza proteinelor celulare, care, n mod normal se gsesc n organism n cantiti foarte mici (doar urme) i ar scpa astfel cercetrii. Proteinele sintetizate prin aceast metod i-au gsit utilizare n terapie i profilaxie. Pornindu-se de la aflarea expresiei anumitor gene s-a putut ajunge la descifrarea funciei unor proteine cu rol n procesele i diviziune celular, prin aceasta crendu-se bazele pentru cercetarea i gsirea cauzelor unor boli genetice.

12.1.3. Elemente de lucru utilizate n tehnologia ADN recombinat

Aceste elemente de lucru sunt reprezentate de: enzimele de restricie; ADN-ligazele; vectorii.

12.1. 3. 1. Enzimele de restricie Sunt endonucleaze de origine bacterian; ele cliveaz moleculele de ADN strain (de exemplu, ADN viral ptruns n respectica celul bacterian) fr a cliva ns ADN-ul bacterian propriu, deoarece ADN-ul bacterian poart un semn de recunoatere (un password ) care este reprezentat de nite situs-uri specifice metilate. Metilarea reprezint un mecanism de aprare al celulei bacteriene fa de propriile endonucleaze; ntr-o celul bacterian, un dublu 254

helix ADN nou-sintetizat i metilat numai pe un lan este recunoscut ca propriu de ctre celula bacterian, nefiind digerat de endonucleaze, iar n timp metilaze convertete treptat ADNhemimetilat n total metilat. Metilazele recunosc pe lanul ADN bacterian aceleai secvene ca i endonucleazele. Nucleazele bacteriene se clasific n: exonuleaze care se fixeaz pe molecula de ADN numai la captul ei; endonucleaze care nu se fixeaz la extermitile moleculei ADN, ci se fixeaz n interiorul moleculei de ADN, unde produc ruptura (tierea). n aceast categorie se ncadreaz i endonucleazele de restricie. Endonucleazele de restricie au aciuni secvenial-specific; se fixeaz pe o anumit secven nucleotidic, despicnd-o (clivare prin hidroloza legturii fosfodiesterice) ndeprtnd astfel respectivul segment dublu de ADN. Secvenele de baze recunoscute de ctre aceste enzime snt palindromice (aceleai, dar poziionate n sens invers pe cele dou fire ale dublului helix ADN), fiind citite de aceste enzime la fel pe cele dou lanuri i rezultnd un clivaj poziionat simetric pe ambele lanuri. Aceste endonucleaze se gsesc n numr mare la procariote. S-au descris enzimele de restricie I, II i III, dintre care: enzimele I i II recunosc secvenele specifice i se fixeaz pe acestea cu urmtoarele particularitai: enzimele I taie nespecific 100-1000 de perechi de baze, n afara regiunii specifice n direcia 5 3 pe lanul ADN; enzimele II au locul recunoatere, fixare i tiere (4-6 nucleoide) de obicei constant deci au specificitate de secven absolut, motiv pentru care snt preferate n studiile de recombinare ADN; enzimele III taie nespecific 20-30 de perechi de baz n direcia 5 3 pe lanul ADN. Endonuleozele de restricie sunt denumite dup microorganismele din care se izoleaz: enzime I Eco K i B (izolate din E. coli); enzime II Eci RI (izolate din E. coli); pot recunoate situs-urile int ale ADN ului palindronic, dar n prealabil trebuie s fie rupte perechile de baze care in unite cele dou lanuri complementare ADN Bam HI (izolate din Bacillus amilolichefaciens) Hpa I (izolate din Haemophilus parainfluenzae) Hin + III (izolate din Haemophilus influenzae) Enzima II au fost supranumite i, foarfeci moleculari; ele recunosc o secven de 4-6 nucleotide i pot tia cele dou lanuri ale helixului ADN, n mod: simetric, rezultnd capete drepte; asimetric, rezultnd capete coezive. Pn n prezent s-au purificat peste 90 de enzime de restricie. Un segment de ADN obinut prin aciunea unei enzime de restricie poate fi clivat main departe n segmente mai mici de ctre alte enzime de restricie. Structurile acestor fragmente finale pot servi drept, amprente (fingerprints) ale unei molecule de ADN. Cromozomii compleci care conin sute de milioane de bace pot fi astfel secionai i apoi cartai stabilindu-li-se harta genelor, prin folosirea enzimelor de restricie. Prin enzimele de restricie s-a descris i un grup special de enzime care au fost numite izoschizomeri; acestea recunosc aceleai secvene nucleotidice, dei fiecare taie asemenea secvene localizate, ns n poziii diferite pe respectivul lan ADN. Descrierea enzimelor endonucleaze de restricie a fcut posibil revoluia tiinific biologic i dezvoltarea tehnologiei ADN recombinat (modificri intite n structiura genelor i proteinelor i analiza acestora bazat pe enzimologia acizilor nucleici). 12.1. 3. 2. ADN-ligazele (polinucleoid-ligazele)

255

ADN-ligazele nu pot lega dou lanuri unice de ADN, ci doar dou lanuri ADN ce aparin aceleiai molecule ADN duble helix. Aceste enzime catalizeaz formarea unei legturi fosfodiesterice ntre gruparea 3-OH a unei extermiti a unui lan ADN i gruparea 5-fosfat de la extermitatea celuilalt lan. Procesul de legare (linkare) mediat de ADN-ligaze este esenial pentru sinteza normal a ADN, procesul de reparare a ADN, procesul de recombinare genetic.. 12.1.3.3. Vectorii Se deosebesc dou categorii majore de vectori: A. Vectori de expresie; B. Vectorispeciali. Vectorii de expresie Vectorii folosii pentru sinteza unor cantiti mari de proteine: - plasmide: factorul F, factorul R, factorul Col; - bacteriofagi: fagul ; 80; fagul - cosmide (fragmente de * + plasmid ) - fragemide (+plasmid) - secvene de inserie (SI) 0,8-1,4 kb. Vectori de transcriere (pentru sinteza ARN): - plasmid + promotor (SP6) - plasmid +2 promotori (SP6 T7) Vectori speciali: - retrovirusuri - retrovirus+plasmid Ti A. Vectori de expresie a1). Vectori folosii pentru sinteza unor cantitai mari de proteine. Plasmidele Reprezint o clas major de elemente genetice mobile. Sunt prezente att celulele procariote (bacterii), ct i la eucariote. La procariote sunt molecule de ADN dublu helix circular din dimensiuni de la dou la cteva sute de kilobaze; reprezint material genetic extracromozomial (cromozomi accesorii). Spre diferen de ADN-ul cromozomial, esenial pentru supravieuirea celulei, ADN-ul extracromozomial poate disparea la un moment dat din celul, fr ca absena acestuia s afecteze viaa celulara. n unele celule pot exista simultan 1*20 copii ale unei plasmide. n celula bacterian, genomul celular este reprezentat de materialul genetic cromozomial genetic cromozomial i extracromozomial (inconstant). Greutatea molecular a unui plasmid variaz ntre 1,5-200 x 10 6 daltoni (5% din greutatea cromozomial). Un plasmid este constituit dintr-un segment format din una sau mai multe gene, care imprim o proprietate sau mai multe proprieti celulei bacteriene (de exemplu, rezisten sau multirezisten la antibiotice);un segment care asigur transferul plasmidic de la o celul la alta (factor de transfer). n 1976, plasmidele erau definite de Novick drept ,,repliconi stabili motenii n stare extracromozomial, capabili a se replica independent de cromozom. n 1981, Dhillon i Colob. propun pentru plasmide termenul de ,,repliconi accesori (neeseniali), dar astzi se tie c aceti repliconi joac un rol important n procesele de selecie i de adaptare a celulelor bacteriene, ca rspuns la modificarile din mediul extern. Plasmidele s-au dovedit a fi unelte foarte valoroase n cercetarile efectuate n scopul aprofundrii unor procese fundamentale de biologie molecular (replicarea ADN, incompatibilitatea). 256

Astzi plasmidele sunt considerate ,,entiti fundamentale ale celulei bacteriene, reprezentnd o parte vital a pool-ului de gene, determinnd potenialul de adaptare al celulei gazd la condiiile de mediu. Prin ctigarea plasmidelor, celulele bacteriene au fost nzestrate cu noi ci enzimatice n cursul evoluiei. Zestrea plasmidic este un atribut de tulpin (i nu de specie). Plasmidele pot fi: neintegrate, libere n citoplasma celulei. Se mai numesc i autonome (de exemplu, factorii de bacteriocinogenie ColE1 colE8, Col I, Col V). aceste plasmide de replica autonom, asincron i mai frecvent dect ADN-ul cromozomial; n acest caz exist 10-20 de copii per celul; integrate (epizomi), inserate n cromozomul bacterian (de exemplu, factori de bacteriocinogenie pentru sinteza piocinelor). De replica concomitent cu ADN cromozomial i exist n una-dou copii per celul. n 1972, Clowes delimita dou grupe majore de gene plasmidice (plasmid-borngenes): agregate, exclusiv de origine extracromozomial; au potenial de rspndire foarte larg a anumitor caractere printe bacterii; s-au dezvoltat primele, din ele derivnd apoi cointegratele. Snt sisteme economice pentru conservarea anumitor mesaje genetice care se transmit masei de celule dar n caz de nevoie, n cursul procesului de adaptare la noi condiii de mediu. Una sau mai multe plasmide (neconjugative, de exemplu factorul Col) se transmit 100% de la o celul la alta cu ajutorul factorul F (plasmid conjugativ); n cazul tratamentului celulei receptor cu un factor curing (acridin oranj etc.) se pierde doar factorul F, dar rmn factorii Col (linkaj reversibil). cointegrate reprezint elemente genetice compuse din doi sau mai muli repliconi aezai ntr-o continuitate liniar, n care fiecare replicon i pstreaz independena fizic a replicrii deoarece fiecare replicon are propriul su replicator (de exemplu, cointegratul F. ColV. ColB. trp.cys.) Cointegratele sunt sisteme funcionale mai eficiente dect cele ale agregatelor din punct de vedere al transferului i stabilitii caracterelor linkate. n raport cu caracterele fenotipice exprimate, se cunosc pn n prezent urmtoarele tipuri de plasmide: de rezisten la agenii microbieni; de rezisten la raze u.v. (codific enzime care intervin n mecanismele de reparare a ADN celular); pentru sinteza bacteriocinelor; pentru sinteza agenilor antitumorali: de exemplu, agrocina 84 (sintetizat de tulpina bacterian de Agrobacterium radiobacter) cu aciune bactericid asupra bacteriei abrobacter tumefaciens (agent de colonizare, adeziune, hemolizine, enterotoxine, factori chelatori de ioni de fier); codificatoare de enzime ale unor ci metabolice, fixate de azot (de exemplu, la tulpini de Klebsiella), degradarea camforului, toluenului (tulpina de Pseudomonas); plasmide ,,criptice ale unor caractere somatice (nu au putut fi nc indetinficate). Factorul F Este plasmidul care induce conjugarea la bacterii. Acest fenomen presupune un transfer de material genetic de la celula donoare, la celula receptoare, prin intermediul factorului F (factor plasmidic-vector), numit i factor de fertilitate. Celula donoare conine factorul F liber n citoplasm este notat F+, sau inclus n cromozomi (Hfr); celula receptoare (F-) este celula care primete factorul F. Reiese de aici c trasnferul de material genetic este polarizat de la celula F+ sau Hfr ctre celula F-, ncepnd de la captul 5 al ADN-ului. 257

Factorul Col Reprezint plasmidul responsabil de sinteza colicinelor (bacteriocine produse de tulpinile bacteriene de Escherichia coli). n general bacteriocinele sunt principii actici sintetizate de bacterii, cu aciune bactericid asupra unor bacterii din aceeai specie, specii inrudite dar i foarte ndeprtate. Bacteriocinele se subdivid n dou categorii: necorpusculare (nonparticulare) cu greutate molecular mica, de natur chimic enzimatic, analogi adenin-nucleozidici, proteic dau de natur complex glicoproteic. corpuscular (particular) cu greutate molecular mare, prezentnd aspecte omologe cu diferite, componente fagice defective (capete goale de fagi, structuri de cozi goale sau pline, cozi fagice incomplete umplute cu un lan scurt de ADN). Printre bacteriocinele cele mai studiate i mai bine cunoscute astzi se numr colocinele i cloacina DF13. Producerea de bacteriocine se datoreaz prezenei plasmidului de bacteriocinogenie n respectivea celul bacterian. Plasmidul (factor genetic responsabil de sinteza de bacteriocin) poate fi: nonintegrat (replicon accesoriu), liber n citoplasm; de exemplu, factorii Col E1, E2, E3, E6, EI, EV,i ColDf 13; integrat n cromozom; de exempli, factorul pentru sinteza aeruginocinelor,colicinelor I-2, V- K94, i piocinelor. Plasmidele nonintegrate se subdivid n: nonconjugate: se transmit numai cu ajutorul factorului F sau al unui fag transductant, au o greutate molecular joas, ntre (4,2-8) x 10 8 megadaltoni prezint un numr mic de greutate molecular joas, de obicei n numr mare de copii (15-60) per ADN cromozomial (de exemplu, factorii Col E1, E1a, E2, E3, E7, A, K, CloDF13); conjugative: se transmit singure prin conjugare, au greutate molecular (4080)x10 6 megadaltoni, au un numr, mare de gene funcionale (100-200), de obicei prezente n 1-2 copii per celul (de exemplu, factorii Col, Col Ib, Col IB, Col I, Col V). Structura plasmidelor Col nonintegrate conjugative i nonconjugative a fost studiat cu ajutorul endonucleozelor de restricie; acest studiu a demonstrat c ambele tipuri de plasmide conin n structura lor: un grup de gene (cluster) ,,rep esenial pentru replicarea autonom; locus-ul de origine pentru replicarea plasmidului este prezent ntr-un punct pe aceast zon; o gen responsabil de sinteza proteinei (colicin); o gen responsabil pentru sinteza proteinei de imunitate (evideniat la plasmidele Col E1, E2, E3, CloDf13). Plasmidele conjugative posed n plus: un extra grup (extracluster) de gene (G T) implicate transfer. Acest grup de gene conine circa 20% din SADN-ul plasmidic. n general, celulele bacteriocinogene sunt immune la propria bacteriocin datorit prezenei de imunitate mai sus mentionate. Ruperea acestei imuniti se produce doar n prezena unei concentraii foarte nalte de bacteriocin, acest fenomen purtnd numele de fenomenul de rupere a imunitii (break-down immunity). Exist ns i cazuri particulare n care unele bacteriocine (welchicinele) sunt active chiar i pe celulele productoare (n acest caz explicaia fiind absena genei de imunitate pe plasmidul de bacteriocinogenie). n funcie de interrelaiile de factorul Col cu ali factori plasmidiali din celula bacterian, s-au descris: agregate; de exemplu linkajele: F. ColE2 i Col Ib. Col E1, n ultimul agregat factorul Col Ib jucnd rol de factor de transfer. Aceste aggregate au origine exclusiv extracromozomial i posed un potenial foarte nalt de rspndire a proprietii de bacteriogenie n populaia bacterian; 258

cointegrate; de exemplu, combinaia F. Col V. trp.cys. Se pare c proprietatea de colicinogenie este mai rar rspndit la tulpinile bacteriene de origine uman, dar este prevalent n flora apelor menajere i n populaia de enterobacterii de la animalele domestice. Cu referire special la rolul plasmidelor de bacteriocinogenie n organismul uman i animal, trebuie menionate urmtoarele: factorul Col v codific sinteza unui sistem de chelare (fixate, legare i transport) al fierului din mediul extern, de ctre celula bacterian, ducnd astfel la creterea virulenei bacteriilor. n acest sens, sistemul aerobactinei este considerat astzi un mijloc crucial de supravieuire i proliferare a celulelor bacteriene invasive; factorul Col V confer tulpinilor bacteriene capacitate de supravieuire n ser in vitro, crescnd rezistena acestora la efectul bactericid al serului; factorul Col confer capacitatea de adeziune celulelor bacteriene pe epiteliul intestinal (atribut al virulenei celulei bacteriene); la tulpinile de Esch. coli enterale autohtone, factorul Col are rol protector determinnd producerea de colocine cu aciune ndreptat mpotriva unor bacterii enterale patogene (de exemplu, Shigella), ngreunndu-le acestora implantarea; n culturi celulare s-a remarcat o aciune de inactivare a toxinei tulpinilor de E coli enterotoxigene de ctre colicina sintetizat de alte tulpini de Myzobacterium smegmatis are o aciune citocid asupra celulelor eucariote tumorale (inhib creterea celulelor tumorale umane,animale), dar rmne fr efect asupra celulelor normale din aceeai specie (datorit selectivitii de membran) prezint agrocina (bacteriocin); tulpinile bacteriene de Agrobacterium radiobacter produc bacteriocina agrocin 84, capabil s omoare tulpina bacterian Agrobacteruim tumefaciens (purttoare de plasmid Ti), care determin o stare canceroas (boala cocoului) la plante dicitiledonate. Se presupune c structuri nucleozidice analogigrocinei 84 cu aciuni citocid pe celulele canceroase ar fi mai rspndite n natur dect se cunoate astzi; plasmidele Col sunt considerate a fi entiti fundamentale pentru multe celule bacteriene inndu-se cont de faptul c sunt implicate n multe activiti celulare.Pe baza cunotinelor actuale despre plasmidele Col se poate aprecia c acestea reprezint o parte vital din poolul de gene al speciilor bacteriene. Cele dou posibiliti de linkaj al plasmidelor de bacteriocinogenie (system aggregate i cointegrate) pot fi considerate aspecte particulare ale potenialului de adaptare n cursul evoluiei. Gradele diferite de complexitate prezente de diferitele sisteme de bacteriocinogenie pot imprima i explica potenialul de adaptabilitate al celulei gazd la condiiile permanent n schimbare din: - datele acumulate pna n prezent pledeaz pentru o strns relaie filogenetic ntre plasmidele de bacteriocinogenie (factorul Col), pe de o parte i factorii plasmidiali F i R, pe de alt parte; - prezena i similaritatea genelor ,,kill i ,,de imunitate n plasmide de bacteriocinogenie i fagi pledeaza pentru o strns interrelaie n cursul evoluiei ntre aceti determinani genetici; - fenomenul de bacteriocinogenie este considerat a fi un split-phenotype al rspunsului celular SOS la ageni inductori (raze u.v., mitomicina C, acid nalidixic). Genele celulare rec A i lex A posed o capacitate complex de a regla diferite rspunsuri celulare SOS, incluznd aici i fenomenul de bacteriocinogenie, n scopul asigurrii supravieuirii i adaptrii celulare la condiiile de mediu extern. A fost dovedit rolul multiplu de copii plasmidice autonome/integrate per celul; - datele prezente sugereaz c fenomenul de bacteriocinogenie semnific o cale enzimatic specific cstigat n cursul evoluiei; - studiul fenomenului de bacteriocinogenie a permis aprofundarea unor aspecte fundamentale de biologie molecular (replicarea ADN-ului plasmidic, controlul replicrii, 259

fenomenul de incompatibilitate plasmidial, interrelaiile evolutive ntre celula gazd i factorul Col). Factorul R Fenomenul de rezisten la drog a fost descris de ctre Ehrlich n perioada anilor19101913. Rezistena celulelor bacteriene la antibiotice prezint dou aspecte: rezistena natural proprietate intrinsec a speciei, stabil, de natur cromozomial; rezistena dobndit caracter ctigat n urma unei terapii cu antibiotice (prin ctigarea de plasmid R, mutaie, sau n urma unui process de recombinare). Plasmidele R (factori de rezisten multipl la antibiotice) au fost descries att la germeni gram-pozitivi ct i gram-negativi. Au fost semnalate ntia oar n Japonia, bacilii Gram negative (Akiba,1959). Factorii R sunt molecule de ADN, dublu catenar formnd anse nchise covalent autonome n citoplasma celular bacterian. Au sisteme proprii de replicare i pot exista n mai multe copii. Posed unul sau mai muli determinani de rezisten (markeri). Se pot transfera: vertical la descendeni (ereditate extracromozomial) orizontal ntre specii. Acest ADN plasmadial codific sinteza de proteine (enzime) prin intermediul unui ARNm. Factorii R sunt: - conjugativi (autotransferabili), au greutate molecular de 20 x 10 6 2000 x 106 daltoni, sunt alctuii din trei secvene nucleotidice cointegrate, i anume: factorul RTF (factor de transfer de rezisten similar factorului F) care iniiaz transferul plasmidului de la celula donoare la celula receptoare; factorul codificator al autoreplicrii plasmidului (replicator); determinanii de rezisten la antibiotice de la 1 pna la 20 de markeri. Cu ct plastidele sunt mai mari, cu att replicarea lor se produce mai lent (I -2 copii/celul). - nonconjugativi (netransferabili), posed un ADN circular, fr factorul RTF, coninnd numai replicatorul i determinanii de rezisten. Au greutatea molecular de 0,5x10 6 pn la 5,5x106 daltoni, codific rezistena la unul-dou antibiotice, replicarea este mai rapid pe generaie, se formeaz uor copii multiple. Transferul plasmidelor R se face ntre celulele bacteriene, depind barierele de specie, gen i chiar de familie. Se realizeaz prin mecanisme de: - transfer clasic (conjugarea la bacili gram negativi, transducie la stafilococi i transformare) - recombinare (pe baza omologiei ADN gazd-ADN strin) prin crossing-over la nivelul cromozomului bacterian. Acest fenomen de recombinare este foarte rar. Plasmidele R pot fi pierdute: - spontan; se pot pierde unul sau mai muli markeri de rezisten, de exemplu prin conservarea tulpinilor bacteriene la +4 C cteva luni.; - sub influena unor factori fizici (raze u.v.), chimici (acridinoranj, acriflavin). Reasortarea plasmidelor R (din punct de vedere al numrului, proprietilor si sediului markerilor) se realizeaz prin elemente transpozabile tip transpozomi. Transpozomii sunt elemente genetice mobile ce poart gene determinate de rezisten la antibiotice; ei se pot exciza dintr-un ADN i autoinsera n altul (ntr-un plasmid sau cromozom). Se pot integra n situs-uri diferite, pe aceeai molecul de ADN. Prin mecanismele lor de translocare (cromozom-plasmid, plasmid-cromozom) determin un schimb larg de determinanii R intre specii.

260

Au fost descrii transpozomi care codific rezistena la - lactamine (penicilina, ampicilina), la trimetoprim/sulfametoxozol, neomicin/kanamicin, gentamicin/tobramicin, eritomicin etc. Unii trenspozomi au dimensiuni foarte mari, codificnd rezistena la un numr foarte mare de antibiotice. Referitor la circuitul plasmidelor R n natur trebuie menionat c flora intestinal comensal i saproft (oportunist patogen) la om i la animale este izvorul natural de bacili gram-negativi; la nivelul acestor germeni microbieni are loc cel mai important schimb de plasmide R ntre specii. Mecanismele de rearanjare a markerilor de rezisten plasmidici i transferul plasmidic explic formarea rapid a rezervorului de bacterii multi-rezistente. Epidemiile apar atunci cnd aceste plasmide R cu markeri multipli de rezisten ajung la bacterii nalt patogene i cu nalt contagiozitate. Rspndirea plasmidelor R este favorizat de utilizarea necontrolat i abuziv a antibioticelor, condiii ce determin selectarea i vehicularea n cadrul infeciilor intraspitaliceti a unor tulpini bacteriene cu un spectru foarte larg de antibiorezisten, ce creeaz mari dificulti terapeutice. Bacteriofagii Sunt virusuri care infecteaz bacteriile. Se fixeaz pe membrana celulei bacteriene, unde i abandoneaz nveliul proteic, injectndu-i materialul genetic n celula bacterian. Virusurile mprumut aparatul metabolismului celular bacterian, pentru propria replicare, sunt deci parazii obligatorii ai celulelor, multiplicndu-se pe socoteala acestora. In natur, virusurile apar n general drept parazii obligatorii ai organismelor i celulelor vii (bacterii, plante, animale, celule umane). Materialul genetic ai virusurilor const din ADN sau ARN, n form liniar sau circular nchis. Materialul genetic viral, dup injectare n celula bacterian, poate evolua pe una din cele dou ci: - poate fi integrat n genomul bacterian (cale lizogen) - poate trece imediat la multiplicare folosind aparatul enzimatic de sintez al celulei bacteriene gazd (receptoare). Noii fagi sintetizai prin acest ciclu litic" ,n urma lizei celulare, sunt eliberai n mediul extern, de unde ptrund i paraziteaz alte celule bacteriene.

Fagul
Este foarte bine studiat i utilizat ca vector. Cu ajutorul sistemului proteic reglator este capabil s aleag ntre cele dou posibiliti de evoluie mai sus prezentate. Alegerea cii de multiplicare este determinat de starea de nutriie i sntate a celulei receptor (gazd). Gazda fagului este celula bacterian de E. coli.; genomul acestui fag este reprezentat de un lan dublu ADN. Din ADN-ul fagului poate fi ndeprtat o cantitate de 40% fr ca funciile vitale ale acestui fag s fie evident influenate. Datorit acestui aspect este posibil ca n fagul s poat fi introdus ADN strin. Membrana proteic a fagului are o capacitate limitat de acceptare de ADN, deci cantitatea de ADN strin ce poate fi nglobat este limitat. Dup introducerea ADN strin prin membrana proteic fagului se poate trece la injectarea acestui fag (n care este nglobat ADN-ul strin) n celulele bacteriene de E coli. Bacteriofagii au un sistem propriu de transport pentru fragmentele ADN strine care pot fi astfel introduse pe cale natural i multiplicate n celula gazd. Fagii lizogeni pot media (ca i factorii plasmidici F) schimburi de gene. Astfel fagul (ADN) se poate insera pe cromozomul celulei de E coli ntre genele gal i bio. Cnd se formeaz virionii progeni, excizia nu este totdeauna precis, n acelai loc. n unul din 10 5 virioni, ADN-ul fagului conine fie operonul gal, fie operonul bio. Infecia cu asemenea fagi se numete gal sau 261

 bio; ea introduce genele celulei bacteriene de E coli, alturi de genele fagului ntr-o nou celul infectat de respectivul fag. Fagul 80 Este nrudit cu fagul; se insera lng operonul trp i poate purta gena trp de la o celul infectat la alta. Fagul Se insera n orice loc pe cromozomul celulei de E. coli; transport totdeauna un fragment din acest cromozom. Aceti fagi transductori (ca i factorul plasmidic F) sunt elemente genetice mobile care declaneaz interschimbul ntre genele bacteriene, accelernd n acest fel evoluia bacterian. Cosmide Sunt plasmide n care a fost introdus un anumit fragment de ADN din fagul . Cosmidele sunt mbrcate n membrana proteic a acestui fag. Prin infecie fagic (ptrunderea fagului n celul), cosmidul este injectat n respectiva celul gazd. n celula gazd, cosmidul se replic apoi ca un plasmid. Fagemide Reprezint o nou clas de vectori n care o parte din genomul unui fag cu lan unic ADN (de exemplu_ M13) este combinat cu un plasmid ADN. Fagemidul se multiplic n celula gazd ca un plasmid cu lan dublu ADN. Dac n momentul introducerii fagului se injecteaz n celula gazd i un fag helper, atunci famegidul se multiplic ca un fag cu lan unic ADN. Secvene de inserie (SI) Sunt elemente transpozabile. Transpoziia este fenomenul prin care copii (elemente transpozabile) ale unor secvene specifice de ADN dmtr-un genom, se deplaseaz de-a lungul aceluiai lan de ADN sau pe cel al altui genom, avnd capacitatea de a se insera pe unul sau mai multe situs-uri specifice. S-au descris dou tipuri de elemente transpozabile: secvene de inserie (SI) cu dimensiuni de 0,8-1,4 kilobaze (kilobaza (kb)=1000 perechi de baze); transpozonii (Tn) cu dimensiuni de 3-20 kb (numii i gene sritoare). 2) Vectorii de transcriere. Reprezint o clas special a vectorilor de expresie. Se folosesc pentru sinteza ARN. Prototipul acestor vectori de transcriere este format dintr-un plasmid n care a fost nglobat un fag, promotor (SP6) sau chiar doi fagi promotori (fagii SP6 i T7). Vectorul format din plasmid cu un fag promotor ( SP6) Acest vector poart numele de SP6. Celula gazd pentru SP6 este celula bacterian de Salmonella typhimurium; promotorul SP6 reprezint secvena start ADN de unde pornete transcrierea (deci sinteza ARNm-ului). n spatele promotorului SP6 se gsete o zon format dintr-un numr de secvene nucleotidice (zona MC S= muItiple cloning site), care ofer mai multe locuri de tiere pentru multe enzime de restricie (Fig. 140). 262

Fig. 140 - Vector format din plasmid i fag promotor SP6. Este de menionat c zona MCS reprezint poriunea din sistemul vector unde pot fi nglobate de plasmid noi fragmente de ADN. Dup tierea zonei MCS n dou, de ctre o enzim de restricie, i nglobarea unui fragment de ADN dublu lan (fragment ADN sau ADNc) n mijlocul zonei MCS (fig.134), zona MCS este tiat din nou de ctre alte enzime ADNc de restricie, vectorul linearizndu-se (fig.141).

Fig. 141 - Tierea zonei MCS i nglobarea unui nou fragment ADN

Fig. 142 - Vector linearizat De obicei ADN-ul nglobat este cel care urmeaz a fi transcris n ARN. Transcrierea cu ajutorul unui singur fag promotor este unidirecional. Vectorul format dintr-un plasmid i doi fagi promotori (SP6 i T7). Acest sistem cu doi promotori este vector bidirecional, deoarece cei doi promotori dirijeaz transcrierea n sensuri opuse (fig. 143 i fig. 144).

Fig. 143 - Vector format dintr-un plasmid i doi fagi promotori

263

Fig. 144 - Tierea cu ajutorul enzimelor de restricie a celor dou zone MCS i transcrierea n sens opus a celor dou lanuri ADN cu ajutorul fagilor SP6 i T7 Pentru utilizarea acestui sistem de transcriere bidirecional se aleg dou enzime diferite de restricie; aceste dou enzime acioneaz pe situs-uri diferite pe zona MCS, dup tierea prealabil a acestei zone n dou segmente ntre care a fost nglobat noul segment ADN. Astfel prima enzim taie primul fragment MCS ntre fagul SP6 i ADN-ul nglobat, iar a doua enzim taie al doilea fragment MCS ntre fagul T7 i ADN-ul nglobat. Promotorii SP6 i T7 sunt astfel orientai nct primul s conduc transcrierea unui lan din ADN dublu-lan nglobat ntr-un sens iar al doilea promotor, transcrierea celuilalt lan ADN (al aceluiai ADN dublu lan nou-nglobat) n sens opus (fig. 145). Acest sistem vector cu doi promotori care acioneaz n dou sensuri opuse, permind transcrierea concomitent a celor dou lanuri a ADN (dublu-lan) nou-nglobat, se numete vector bidirecional. Fig. 145 Tietura I Vector linearizat. Utilizarea sistemului pentru

SP6

transcrierea unuia din lanurile ADN nglobate. Alegerea vectorilor Se face dup mrimea fragmentului ADN care urmeaz a fi nglobat ntr-o celul. Lungimea fragmentului ADN sau ARN se stabilete dup numrul de perechi de baze: 1 kb (kilobaz) = 1000 baze (sau 500 perechi de baze); 1 mb (megabaze) = 1 milion de baze (sau 500 000 perechi de baze). Cosmidele se folosesc drept vehicule pentru fragmente foarte mari de ADN (de 30-45 kb). n ultima vreme s-au putut construi cosmide-vectori n care s-au putut ngloba fragmente mari de ADN de 100 kb - 1 mb, de pild vectori YAC (yeast artificial chromosome), numii i minicromozomi. Un vector tip YAC se comport n celulele de drojdii ca un cromozom care se dubleaz nainte de diviziunea celular, iar, n cursul acestei diviziuni, i mparte materialul ADN ntre cele dou celule fiice. Aceste cosmide ajut la studiul poziiei genelor pe harta genetic a cromozomului sau pe fragmente lungi de ADN. Vectorii de expresie reprezint vectori construii anume care conin n structura lor multe secvente de control optim pentru transcrierea i translaia genelor. Fiecare fragment de ADNc strin care va fi nglobat de ctre vector se va fixa pe acest vector tocmai n apropierea acestei secvene de control (cu rol de promotor); aceasta secven de control (promotor) va porni apoi transcrierea secventei ADNc strain inglobat. S-au construit un numar mare de vectori de expresie care s fie propice pentru diferite tipuri de celule. Secvenele de control nu sunt 264

aceleai pentru diferitele tipuri de celule. Vectorii de expresie trebuie selectionai pentru fiecare tip de celul n care urmeaz a fi introdus o gena strain pentru a se obtine sinteza unei anumite proteine. Astfel, prin alegerea unor vectori de expresie adecvai, s-a reuit introducerea unor fragmente ADNc strin (de la eucariote) n celula bacterian i sinteza ulterioar a urmatoarelor proteine: - insulina; - eritropoetina; - factorul VIII de coagulare; - somatotropina; - activator de plasminogen; - vaccinuri pentru boli bacteriene i virale; - anticorpi monoclonali; - factori imunologici (factori de necroza a tumorilor, interferon, interleukine); - hiradin (antitrombotic); pn de curnd principiul activ se extragea direct din rme. B. Vectori speciali b1. Retrovirusurile Sunt virusuri ARN cu o treapt ADN n replicare (de exemplu: HIV, VISNA). Multe retrovirusuri sunt oncogene, putADN determina formarea unor tumori in organismul gazda (virusul sarcomului Rous, virusul leucemiei aviare). Retrovirusurile ARN au capacitatea ca, o dat patrunse n organismul celulei gazd s declaneze, n prezena reverstranscriptazei, o transcriere invers, adic de la ARN spre ADN, determinnd astfel sinteza unui ADN dublu lant (dup paltern-ul respectivului ARN viral). Acest ADN dublu lan se integreaz apoi n cromozomul celulei gazd (uman sau animal). Celula poart n acest fel, integrat n cromozomul ei, informaia pentru sinteza virusului ARN, care este declansat ns doar n anumite condiii. Retrovirusurile sunt mai mici decat celelalte virusuri; spre deosebire de virusurile ADN, ele nu ucid (nu lezeaza) celulele pe care le contamineaz, motiv pentru care ele sunt folosite astzi drept vectori n tehnicile de inginerie genetic i de terapie genetic, n scopul transferului unor gene strine n celula int. n aceste cazuri, retrovirusurile joac rolul unor carcase pentru transportul respectivelor gene strine ctre o anumit celul int. A fost imaginat o metod eficace de prelucrare prealabil a retrovirusului vector (Richard Mulligan de la Massachusetts Institute of Technology USA), prin care se elimin n prealabil un numr de gene virale, iar segmentul de virus rmas este combinat apoi cu gene care urmeaz a fi injectate intit ntr-o anumit celul. n acest fel, virusul, lipsit de majoritatea genelor sale, devine inofensiv, deposedat de capacitatea lui infecioasa, dar vector de o gena (de gene) nou, pe care a fixat-o i pe care o introduce n celula int (mecanismul de transductie); injectat n celula inta, prin mecanismul de transcriere inversa, retrovirusul vector declanseaz actiunea reverstranscriptazei care determin sinteza ADN-ului corespunzator (replic a ARN-ului vector + gena fixat). Aceasta replic ADN se integreaz n cromozomul celulei gazd, conferind celulei gazd o noua proprietate corespunzatoare noii gene fixate. Retrovirusurile reprezint astazi uneltele (vectorii) cele mai utilizate n ingineria genetic pentru transportul de gene ctre genomul unei celule tint. b 2. Retrovirusuri i plasmidul Ti 265

Plasmidele Ti se gscsc n bacteriile Agrobacterium tumefaciens din sol. Prin infectarea unor leziuni ale plantelor cu aceast bacterie, plasmidele Ti ajunse n celulele vegetale determin apariia unei tumori. Deci plasmidele Ti au efect tumorigen. Prin utilizarea unui vector special, format dintr-un retrovirus i un plasmid Ti, acesta din urm, prin prelucrarea prealabila, pierde capacitatea de a mai produce tumori i pstreaz doar rolul de vector de gene ctre o celul int. Procesul de transfectie si vectori speciali n biologia moleculara, introducerea unui ADN strin (gene) n celulele organismelor superioare (plante, mamifere) poart numele de tranfecie. Introducerea acestor gene strine n organismul plantelor sau mamiferelor (animale, om) se face cu ajutorul unor vectori speciali: plasmide Ti i retrovirasuri. Dintre aceti vectori, retrovirusurile reprezint astazi uneltele (vectorii) cele mai larg utilizate n ingineria genetic i terapia genic, prin transport de gene ctre genomul unor celule int. Introducerea acestor gene strine n celule se mai poate face cu ajutorul particulelor de metal nobil (experiene balistice biologice), dar aceste metode produc leziuni grave celulei. Alt metod const n supunerea celulei unui cmp electric (electroporare), tratament prin care respectivele celule devin capabile (permeabile) s accepte macromoleculele din exterior. Se mai utilizeaz razele laser care produc orificii foarte fine n peretele celular rigid (la plante) prin care se injecteaz apoi molecula de ADN strin.

12.2. HIBRIDAREA
Este o tehnica de recombinare de acizi nucleici, care vizeaza construirea unei molecule de acid nucleic dublu lant din doua lanturi unice, separate, pe baza complementaritatii bazelor azotate. Imperecherea de baze complementare se poate face intre: ADN - ADN ADN-ARN ARN-ARN Totdeauna hibridizarea are loc intre doua lanturi unice de acid nucleic. Hibridizarea se foloseste ori de cate ori se urmareste identificarea secventelor nucleotidice pe un acid nucleic (secventa tinta).

12.2.1. Principiu
Se analizeaza o secventa de acid nucleic unic lant (secventa tinta). Analiza acestei secvente necunoscute se face fata de o sonda genetica (proba de acid nucleic) marcata (radioactive sau prin alte metode) cu o secventa de baze cunoscute. Daca sonda si secventa tinta sunt total sau partial complementare din punct de vedere al secventelor de baze nucleotidice, se formeaza o molecula hibrid de acid nucleic in care se identified secventele nucleotidice pe secventa tinta, in raport cu bazele (complementare) de pe secventa nucleotidica cunoscuta a sondei genetice. Pentru lucru, ADN dublu lant trebuie intai denaturat (supus actiunii caldurii sau substantelor chimice alcaline) pentru a fi disociat in lanturi unice. Lantul unic va reprezenta apoi substratul pe care se va efectua hibridizarea cu sonda genetica.

12.2. 2. Denaturarea
266

Dupa cum s-a aratat, pentru analiza si identificarea secventelor nucleotidice ale unui acid nucleic tinta, acesta trebuie intai adus la forma de lanturi unice prin denaturare. Denaturarea reprezinta modificarea structurii acidului nucleic prin tratament cu caldura (temperatura de 100"C) sau substante chimice, sau supunerea in mediu alcalin (pH>l 1). Folosind aceste metode se realizeaza desfacerea legaturii de hidrogen dintre bazele complementare. a). Denaturarea prin caldura Reprezinta taierea lantului dublu ADN cu ajutorul temperaturii inalte. Punctul de topire reprezinta temperatura la care 50% din respectivul acid nucleic dublu lant disociaza in unic lant. Acest punct de topire poate fi influentat de: o zona bogata in guanina-citozina, care cere totdeauna o temperatura mai inalta, deoarece aceste baze se leaga prin trei punti de hidrogen, in timp ce bazele adeninatimina se leaga doar prin doua punti de hidrogen; concentratia in NaCl a solutiei; o concentrate scazuta de NaCl determina destabilizarea moleculei de acid nucleic, aceasta necesitADN o temperatura de topire mai scazuta; concentratia cationilor. b). Denaturarea chimica Se face prin adaos de substante denaturante (formamida, uree) care determina scaderea punctului de topire.

12.2.3. Renaturarea (annealing/reannealing)

Reprezinta o hibridizare. Prin scaderea temperaturii sau a pH-ului este favorizata refacerea gaturilor intre bazele complementare de pe cele doua lanturi unice de ADN - ARN sau ARN - ADN. Reactiile de renaturare se produc de regula la temperaturi care corespund unei iferente de 20-30 C fata de temperatura punctului de topire al dublului lant de acid nucleic. iaca temperatura insa scade brusc, lanturile raman separate. Cantitatea de acid nucleic unic lant, care prin renaturarea trece in dublu lant, depinde de: concentratia moleculara a acidului nucleic din solutie; lungimea moleculei de acid nucleic; zona bogata n guanina-citozina; concentratia n NaCl; concentraia de formamida.

12.2.4. Factorul stringent

Este un important factor de hibridizare. Reprezint intensitatea reactiei de hibridizare. Dac dou lanuri unice de acid nucleic sunt pe toat lungimea lor formate din baze implementare, iar conditiile de reacie sunt favorabile, stringenta (intensitatea) reaciei de ambinare este foarte puternic. Dac pe cele dou lanuri de acid nucleic exist doar zone pariale cu baze complementare, stringent este mai scazut (aceast situaie apare n special atunci cADN cele dou lanuri de acid nucleic provin din dou organisme diferite).

12.2.5. Tipuri de hibridri

a. Hibridare Blotting: a.1. Southern Blotting (ADN Blotting) 267

a.2. Norhern Blotting (ARN Blotting) a.3. Western Blotting (Protein blotting) a.4. Dot Blotting a.5.Slot Blotting b. Hibridizare in situ; c. Hibridizare Colonial. a. Hibridizare Blotting Este o tehnic special prin care acidul nucleic int (de cercetat) este axtras din materialul de cercetat prin nclzire la 100 grade C i rcire la ghea i apoi depus pe o membran(de nitroceluloz sau filtru de nylon) i fixat. Hibridarea acestui acid nucleic necunoscut are loc direct pe filtru cu ajutorul sondei genetice (acid nucleic cunoscut i marcat). Noiunea de "Blot" reprezint fitrul+acidul nucleic fixat(imobilizat). Aciunea de "Blotting" reprezint trecerea acidului nucleic pe filtru. Exist mai multe variante de hibridare Blotting i anume: a.1. Southern Blotting A fost imaginat de Southern n 1975.Evideniaz secvenele specifice ale unor fragmente de ADN separate prin gelelectroforez. Etapele reaciei: - se extrage ADN dintr-un produs patologic lichid(ser sanguin care conine acid nucleic viral) sau solid(celule,esuturi); - ADN este tiat cu enzime de restricie; - fragmente de ADN(de circa 1000 perechi de baze)snt supuse electroforezei i separate n funcie de greutatea lor molecular; - fragmentele ADN obinute n gel snt supuse denaturrii; - trecerea fragmentelor de lan unic ADN de pe gelul sensibil(de nitroceluloz) care fixeaz aceste fragmente de ADN. Pentru transferul respectivelor fragmente de ADN de pe gel pe fitru se folosesc diferite metode,dintre care una este cea prin transfer capilar (Fig.146). Gelul (2) este pus pe hrtie de fitru (1) umed(care a absorbit prin capilaritatea lichid din vasul cu soluie tampon); peste gel (2) se pune alt hrtie de filtru (3) uscat, care se ngreuneaz prin aplicare,deasupra ei,a unei lame de sticl (4) i a unei greuti (5). Curentul de lichid care rezult din soluia tampon i care se formeaz prin capilaritate,de la hrtia de fitru umed spre cea uscat,acioneaz i scoate prin splare moleculele ADN din gel i le trage ctre i pe hrtia de fitru superioar (4). Fragmentele de lan unic ADN fixate pe hrtia de fitru superioar prin aciunea cldurii snt tratate(hibridizate) cu sonde genetice ADN sau ARN (marcate radioactiv). Hibridizarea se realizeaz prin incubarea hrtiei de fitru (3) ntr-o soluie care conine sonda genetic radioactiv (de exemplu, ADN marcat cu 32P); molecula-hibrid realizat va fi evideniat prin metoda autoradiografic sub form de benzi. Utilizarea practic a variantei Southern Blotting Gelul (2) este pus pe hrtie de fitru (1) umed(care a absorbit prin capilaritatea lichid din vasul cu soluie tampon); peste gel (2) se pune alt hrtie de filtru (3) uscat, care se ngreuneaz prin aplicare,deasupra ei,a unei lame de sticl (4) i a unei greuti (5). Curentul de lichid care rezult din soluia tampon i care se formeaz prin capilaritate,de la hrtia de fitru umed spre cea uscat,acioneaz i scoate prin splare moleculele ADN din gel i le trage ctre i pe hrtia de fitru superioar (4). Fragmentele de lan unic ADN fixate pe hrtia de fitru superioar prin aciunea cldurii snt tratate(hibridizate) cu sonde genetice ADN sau ARN (marcate radioactiv). Hibridizarea se realizeaz prin incubarea hrtiei de fitru (3) ntr-o 268

soluie care conine sonda genetic radioactiv (de exemplu, ADN marcat cu 32P); moleculahibrid realizat va fi evideniat prin metoda autoradiografic sub form de benzi.

269

Fig. 146 - Hibridarea Southern Blotting Utilizarea practic a variantei Southern Blotting Prin apariia unei mutaii n genomul celulelor germinative (modificarea unei baze), care se motenete, respectiv ADN modificat, dac va fi supus aciunii enzimelor de restricie,va prezenta una din urmtoarele dou ipostaze posibile: - lanul ADN rmne netiat,deoarece enzimele de restricie nu mai recunosc situs-ul specific; - din contr, poate apare un nou situs specific de tiere pentru aceste enzime. n acest al doilea caz, pot aprea n consecin noi tipare de fragmente ADN; acest fragment a fost numit "polimorfism de lungime al fragmentelor de restricie" (RFLP). Studiul acestor fragmente i a diferenei dintre ele, cu ajutorul metodei Southern Blotting,a putut aduce noi informaii n cercetrile efectuate asupra unor boli genetice i n medicina judiciar. Astfel s-a putut demonstra c: - la germenii univitelini, aceste tipare RFLP snt complet identice; - la rude, aceleai tipare RFLP snt n mare parte identice; - n boli genetice se evideniaz prezena unor gene defecte (pe baza unor fragmente ADN cu un tipar individual); - prezena unor modificri genetice n cazul unor procese tumorale; - pe baza tiparelor RFLP s-au putut clasifica microorganismele (virusuri i bacterii) - n medicina judiciar, pe baza pattern-urilor RFLP (ADN minisatelite=fragmente hipervariabile din genom, care nu snt transcriptibile) se poate face determinarea paternitaii. De asemenea, pe baza acelorai pattern-uri RFLP se pot face identificri de persoane n criminalistic, prin studiul unor probe de snge sau sperm; ADN de origine uman i cel provenind de la cimpanzeu i goril snt omologate n proporie de 97%(diferena const n cromozomul X). Speciile de cimpanzeii sunt mult mai copiate de om dect alte specii de maimua. n Africa de Sud a fost studiat originea speciei Quagga (Equus quagga), care a disprut n 1883, i pe baza studiilor filogenetice s-a stabilit c aceasta reprezint forma originar a tuturor speciilor de zebr; Studiul genelor pentru globin la primate (responsabile pentru sinteza proteinei hemoglobin) a demonstrat c aceste gene snt localizate la un loc,ntr-un cluster pe cromozomii umani 11 i 16. Dimensiunea acestor clusteri este asemntoare la om, goril i gibon. a. 2. Northern Blotting Aceast variant a hibridizrii Blot pune n eviden secvene specifice ale unor fragmente ARN departe prin gelelectroforez. Etapele reaciei sunt: - ARN este extras din materialul de cercetat; - ARN este pus n prezena substanei denaturatei (glicoxal dimetilsulfoxid formaidehid sau metilmercur); - ARN este supus separrii electroforetice; - transferul moleculelor ARN pe filtru (nylon sau mitriceluloz); - hibridizarea ARN de pe filtru cu o sond genetic ARN sau ADN; - evidenierea moleculei hibrid construite. Aplicaii practice ale variantei Northen Blotting - determinarea ribotipurilor tulpinilor bacteriene (n studii genetice, epidemiologice). - n epidemiologie, reprezint o motod foarte modern i util de cercetare pentru determinarea filiaiei cazurilor n epidemii, aceast metod fiind mult mai sensibil dect determinarea hizotipurilor de tulpini. Astfel, n actuala a VII -a pandemie de horel, cu ajutorul metodei de ribotipare s-a putut demonstra c profilul genetic al tulpinilor de Vibrio cholerae biotip eltor, prezente n Asia i Europa, este n mai mult de 70% din cazuri 270

identic. a. 3. Western Blotting (tehnica immunoassay) Aceast variant a hibridizrii Blot nu reprezint o reacie de hibridizare propriu-zis (anume construirea unei molecule ADN dublu lan din dou lanuri separate de ADN). Aceast variant folosete doar principiul reaciei de hibridizare, i anume desfaurarea substratului de cercetat pe gel de electroforez i apoi trecerea acestuia pe o membran de nitroceluloz,unde este apoi cuplat i evideniat prin intermediul unor grupri chimice complementare.n acest caz de Western Blotting, substratul de cercetat nu este reprezentat de un acid nucleic ci de o protein. Reacia folosete la evidenierea unor cantiti foarte mici de proteine prezente n lichidele sau celulele unui organism, prin cuplarea acestora cu anticorpi specifici corespunztori (marcai). Etapele reaciei sunt urmtoarele: - proteina este supus electroforezei n gel SDS*-policrilamid; - transferul spoturilor proteice (antigene) pe membrana de nitroceluloz; - adaos de anticorpi specifici marcari (cu enzime sau radionuclizi); - splarea anticorpilor rmai nefixai; - aplicarea deasupra membranei de nitroceluloz a unui film fotografic; - expunere i developare; - citirea prin autoradiografie a benzilor de protein cu ajutorul anticorpilor specifici marcai i fixai. Avantajul metodei este acela de a pune n evidena prezena unei anumite proteine, dintro mixtur complex.Aceast metod este folosit pentru clonarea genelor. a. 4. Dot Blotting Se execut pe o plac de plexiglas cu godeuri rotunde (fig.147). Este necesar extracia prealabil a acidului nucleic din probele de cercetatare(ser,extracte celulare sau tisulare. Proba de acid nucleic extras se depune ntr-unul din godeurile rotunde ale plcii de plexiglas.n fiecare godeu se depune alt prob de acid nucleic,n total pe o plac depunnduse attea probe cte godeuri are placa. Apoi respectiva plac se acoper cu hrtie de filtru, care absoarbe aventualele probe de acid nucleic prezent. Nu se face nici o separare electroforetic; probele de acid nucleic de pe hrtia de filtru snt supuse apoi denaturrii (prin nclzire la 100 gradeC i rcire la ghea). Apoi probele de acid nucleic denaturat de pe filtru snt hibridizate cu sonde genetice. Fig. 147 - Tehnica Dot Bloptting a. 5. Slot Blotting Se execut pe o plac de plexiglas cu godeuri de form dreptunghiular (Schlitz-uri = tieturi sau Slot-uri). Principiul metodei este identic cu cel de la Dot Blotting. Aceste ultime dou variante de hibridizare se folosesc atunci cnd se lucreaz deodat cu un numr foarte mare de probe patologice nefracionate (probe de ser, extract celulare 271

sau tisulare).

12.2.6. Hibridizare in situ

Se efectueaz direct pe celule i esuturi. n cazul hibridizrii Blotting este necesar extracia prealabil a acidului nucleic din proba de cercetat; prin aceast extracie, se pierde ns informaia asupra sediului exact al respectivului acid nucleic (ADN sau ARN) din anumite structuri celulare. Aceast informaie se poate obine numai cu ajutorul hibridizrii in situ.Prin aceast ultim metod se poate realiza evaluarea exact a distribuiei anumitor secvene ADN sau ARN direct in situ simultan cu determinri calitative i semicantitative. Se folosesc fragmente de esuturi, amprente de celule, culturi celulare (prelucrate, aplicative i fixate pe lame obiective). Fixarea se face cu xilol, etanol (100% i apoi 70%). Lama obiectiv cu celule fixate corespunde filtrului cu acid nucleic legat prin hibridizare Blotting. Reacia de denaturare i hibridizare se face pe lama obiectiv i anume: dup depunerea probei pe lama obiectiv, pentru denaturarea probei se folosete o nclzire puternic sau tratarea cu proteaze i digitonin, ultima slbind i desfcnd citoscheletul i rezultnd molecula int de acid nucleic unic.Lama cu prob pentru denaturarea se acoper cu o plac, realizndu-se o camer umed. Dup denaturare, lama se spal (pentru ndeprtarea particulelor nelegate) i abia apoi urmeaz hibridizarea cu sonda (ADN sau ARN) marcat; n cazul reuitei hibridizrii, secvenele int din acidul nucleic de cercetat (din esuturi) snt evideniate la autoradiografie (prin cuplare cu secvenele de acid nucleic complementare din probele marcate cu biotin). Biotina din sond a fost fixat de un necleotid cu uracil; acest uracil se va mperechea n lanul de acid nucleic int cu o adenin;dup ce se produce aceast reacie de hibridizare, se face o splare cu o soluie tampon,care ndeparteaz moleculele nelegate de acid nucleic din prob. Marcarea cu biotin este evideniat ulterior prin diferite variante de lucru (vezi "Sonde genetice.Marcarea"). Aplicaiile practice in situ sunt: evidenierea i localizarea diferiilor ageni infecioi n diferite celule i esuturi ale organismului: virusul hepatitei virale tip B, HIV, virusul Epstein-Barr, virusul cito-megaliei, virusul herpes simplex, virusul papilloma; cercetarea relaiilor virus-procese oncogene (de exemplu, relaia virusul hepatitei virale tip B-carcinom hepatic); diagnosticul pre- i postnatal n boli genetice; localizarea genelor defecte pe cromozom (de exemplu, n fibroza chistic, distrofia muscular Duchenne); identificarea anormalitilor cromozomiale (de exemplu: trisomia 21, sindromul Langdon Down, sindromul Turner); stabilirea sexului la embrion; cercetarea tiparelor de expresie genetic (stabilirea momentului activrii anumitor gene); stabilirea hrii genetice cromozomiale (stabilirea relativ a locus-ului fiecrei gene pe cromozom); hibridarea colonial. Pe plci cu medii de cultur se nsmneaz colonii bacteriene din dou tipuri de clone: o clon bacterian de origine(cu plasmid); o clon bacterian cu ADN int (cu plasmid+ fragmente de ADN int). Prin replica plating se obine copii ale acestor colonii din cele dou clone pe un filtru de nitroceluloz. Aceste copii de clone bacteriene (de pe fitru) sunt supuse lizei pentru a se obine ADN. ADN este supus denaturrii pentru obinerea lanurilor unice de ADN. Lanul unic ADN este supus hibridizrii cu probele ADN cunoscut i marcat radioactiv. 272

Dup fixarea probelor ADN radioactive(fixarea complementar)pe lanul unic de ADN int (de cercetat) se procedeaz la evidenierea autoradiografic a marcrii pe un film Roentgen. Prin compararea imaginii radiografice se identific i se difereniaz clonele bacteriene care conin fragmente de ADN int fa de clonele bacteriene de origine. Clonele bacteriene care poart ADN int recombinant (plasmid + ADN int) vor fi multiplicate mai departe (sincron se vor multiplica i fragmentele de ADN straniu).

12.2.7. Importana reaciei de hibridare pentru medicin i biologie

Aceast reacie a pus bazele unui numr de tehnici care au ajutat la progresul cercetrii biologice fundamentale,ct i la progresul diagnosticului medical ntr-un numr de boli. Astfel s-a reuit: stabilirea concentraiei anumitor secvene ADN sau ARN ntr-o mixtur de secvene; determinarea numrului de copii dintr-o anumit secven prezent ntr-un dovedirea gradului de nrudire ntre diferite organisme n raport cu numrul de secvene ADN identice; stabilirea activitii genelor pentru care s-au pus n eviden moleculele de ARNm corespunztoare; evidenierea secvenelor specifice ADN i ARN n material biologic de cercetat (snge, celule, esuturi); evidenierea acidului nucleic viral; n serul sanguin LCR, n vederea elucidrii diagnosticului unor infecii virale cronice: evidenierea acidului nucleic viral n aceste produse semnific prezena particulei virale n organismul respectiv. Evidenierea prezenei acidului nucleic viral direct n produsele patologice (ser, LCR) sau n materialul citologic reprezint o posibilitate de diagnostic rapid i precoce, n vederea instituirii a unei terapii de urgen n special la persoanele bolnave de SIDA sau la cele imunosupresate (terapeutic) n urma unor transplante de organe. n aceste cazuri diagnosticul serologic de obicei nu poate fi de ajutor deoarece pozitivarea serului n cazul infeciei cu HIV se produce abia dup cteva sptmni de infecie, iar n cazul imunosupresailor dup cteva luni sau chiar deloc; evidenierea prezeniei virale n tumori de origine viral; studiul efectuat asupra produsului de transcriere (ARNm) a unor secvene ADN celulare glucogene nevirale a ajutat la complectarea i aprofundarea diagnosticului de tumor. Astfel o reacie de tip imunohistochimic a putut pune n eviden un produs de transcriere (ARNm) specific de esut (de exemplu, prezena unui anumit ARNm corespunztor unei munoglobuline prezente n caz de limfoane maligne sau prezena unui anumit ARNm hormonal n anumite tumori neuroendocrine. Aceast metod reprezint o unealt foarte eficient pentru cercetarea activitii genelor oncogene prin evidenierea indirect imunohistochimic a produselor lor de translaie (ARNm corespunztor); diagnosticul pre- i postnatal al bolilor ereditare (la femei care doresc copii sau la care se pune problema ntreruperii sarcinii); determinarea defectelor metabolice; utilizarea metodelor ce folosesc sonde genetice pentru diagnosticarea infeciilor virale ale arborilor fructiferi (cu o precizie de diagnostic pentru o cantitatea de antigen de 2x10 nanograme); aplicaii n epidemiologia molecular n vederea depistrii unor noi markeri genetici (de exemplu, robotip, pulsotip); se precizeaz ca n viitor metoda hibridizrii s ofere posibiliti pentru elucidarea mecanismelor de reglare a activitii genelor. 273

12. 3. SONDE GENETICE

Cu ajutorul enzimelor de restricie, astzi se pot izola, teoretic, toate genele tuturor organismelor vii, n vederea obinerii unei bnci de gene (le vivant mondial). Principiul hibridizrii n vitro a dou ADN-uri complementare st la baza metodei care folosete sondele moleculare(coduri de ADN cunoscute asociate cu un marker). Cu ajutorul unor asemenea sonde, la un individ dintr-o anumit specie se pot repera codurile complementare pe care sonda "le lumineaz" prin procesul de hibridizare molecular. Cu ajutorul ADN-polimerazelor s-a reuit i amplificarea ulterioar a acestor fragmente de ADN bine determinate i deci clonarea genelor pentru a face i mai uoar (mai sensibil) reperea lor. Astzi,graie sondelor genetice, etichetarea, reperarea i cartografierea genelor au devenit operaii de rutin n marile laboratoare din lume, ceea ce va asigura n viitor progresul rapid al alctuirii hrilor cromozomiale complete ale genomului uman. Sondele genetice (probe de acid nucleic tip ADN sau ARN marcate) reprezint unealta esenial de lucru n metoda de hibridizare pentru analiza secvenelor nucleotidice din secvenele "int" ale ADN-ului de cercetat (genele). Aceste sonde genetice (proba de ADN sau ARN) sunt marcate (radioactiv sau nonradioactiv) pe un singur nucleotid (cu o secven de baze cunoscute). n prezent sondele genetice pentru cercetare i diagnostic se pot comADNa i cumpra de la casele productoare. Sondele genetice se prepar prin aceleai metode de hibridizare utilizate i pentru secvenierea (sequencing) acidului nucleic, i anume prin metodele Blot (Western Blot,Southern Blot) i metoda hibridizrii in situ. A. Prepararea probelor de acid nucleic(sonde genetice) pentru reaciile de hibridizare Sondele genetice pot fi: probe de ADN i probe de ARN. a. Prepararea probelor de ADN: a.1. Din fragmente ADN dublu lan clonate (n vederea obinerii ulterioare de sonde genetice). Aceste fragmente se obin prin ncorporarea de fragmente da ADN genomic(tiate cu ajutorul enzimelor de restricie) sau de fragmente ADNc (sintetizate cu ajutorul reverstranscriptazei dup modelul unei matriceARNm) ntr-un vector i prin introducerea lor, o dat cu acest vector (recombinant), ntr-o celul gazd, unde vectorul se multiplic rezultnd n final o cantitate mare de ADN clonat. Pentru hibridizri snt n special de preferat fragmentele ADNc clonat, deoarece reprezint secvene de ADN fr introni i fr alt secven care ar putea reaciona nespecific. Moleculele ADNc sunt, iniial, unic lan, dar prin diferite metode sunt transformate n ADN dublu lan i apoi introduse n vectori i multiplicate o dat cu acetia n celula gazd. n acest caz, ntr-o molecul final de ADNc dublu lan doar un lan conine secvene corespunztoare moleculei matri ARNm, iar cellalt lan ADNc reprezint secvenele complementare respectivului lan matri ARNm. Probele ADN dublu lan pot fi ulterior marcate n vederea obinerii sondelor genetice (vezi Marcarea sondelor genetice). a.2. Sub forma de oligonucleotide ADN unic lan prin sinteza chimic n "maini de gene". n aceste maini se pot realiza concomitent sinteza i marcarea sondelor genetice. Aceste oligonucleotide ADN-unic lan reprezint baza material pentru: sonde genetice; sinteza de gene; primeri pentru reacii polimerazice n lan. 274

b.Prepararea probelor ARN (sonde genetice) b.1. n " maini de gene":ca i probele ADN unic lan. b.2. Prin metoda de transcriere in vitro cu ajutorul vectorilor de transcriere. Aceast metod de transcriere in vitro (sinteza ARNm dup o matri ADN) se realizeaz cu ajutorul vectorilor de transcriere unudurecionali i bidirecionali, n vederea obinerii de probe ARN lan unic (sond genetic), care se utilizeaz ulterior n reaciile de hibridare.Prin aceast metod, ADN este transcris n afara celulei, n ARN, ARN-ul respectiv putnd fi marcat direct n cursul sintezei. Vectorii de transcriere (clas aparte a vectorilor de expresie), nu se folosesc cai ceilali vectori de expresie pentru sinteza de proteine, ci pentru sinteza de ARN. Vectorii de transcriere sunt formai dintr-un plasmid ADN, n care au fost nglobai un fag promotor (SP6) sau doi fagi promotori (SP6 i T7). n cazul vectorilor cu un fag promotor (SP6), transcrierea in vitro va fi unidirecional, iar n cazul vectorilor cu doi fagi promotori, bidirecional. Promotorul reprezint secvene de ADN de unde ncepe procesul de transcriere, deci sinteza ARNm. b.2.1. Transcrierea unidirecional cu ajutorul SP6 Dup nglobarea n sistemul SP6, ADN-ul strin este cel care urmeaz a fi transcris n ARN. Dup linearizare se adaug n mediu SP6-ARN-polimeraza i patru ribonucleotide (dintre care trei nucleotide marcate i unul nemarcat).ARN- polimeraza se va lega de promotorul SP6 pornind transcrierea genelor n direcia SP6>fragment MCS>fragment ADN nou nglobat (fig. 148). Va fi transcris unul din cele dou lanuri de ADN nou nglobat. n sintez, ARN-polimeraza va folosi ribonucleotidele marcate i nemarcate, pentru formarea unei molecule ARNm conform matriei ADN.

Fig. 148 - Transcrierea unidirecional cu ajutorul SP6 Avnd n vedere c transcrierea ncepe la nivelul promotorului SP6 i se termin la locul de tiere a enzimei de restricie, nseamn c prin utilizarea diferitelor enzime de restricie se poate prestabili lungimea lanului transcris i se pot obine lanuri ARNm transcrise de lungimi prestabilite. b.2.2.Transcrierea bidirecional cu ajutorul vectorului bidirecional cu doi promotori ( SP6 i T7). Vectorul bidirecional este format din ADN plasmidic , SP6, zona MCS i T7 (vezi fig. 137). Cei doi promotori dirijeaj transcrierea n dou sensuri opuse. Prin introducerea i nglobarea ntr-un vector de transcriere bidirecional a unui dublu lan ADN (de exemplu, ADNc ntre dou segmente de MCS i dup linearizarea vectorului), se poate stabili de la nceput care din cele dou lanuri ADNc va fi transcris n ARN. Fiecare din cele dou polimeraze necesare pentru transcrierea respectivului lan ARN i anume, SP6 ARN polimeraza i T7 - ARN polimeraza , se leag specific doar de promotorul corespunztor. Dup linearizare, n funcie de enzima de restricie folosit, ct i de ARN-polimeraza utilizat 275

pentru transcriere, se va sintetiza ARN sau ARN antisens. ntr-un dublu helix ADN: - un lan ADN este complementar cu ARNm de origine utilizat pentru sinteza ADNc; - al doilea lan conine aceleai secvene de nucleotide ca i ARNm de origine. Prin transcrierea: primului lan ADN, rezult ARN sens identic i cu acelai sens ca i ARNm de origine; celui de-al doilea lan ADN, rezult ARNm antisens = complementar fa de ARNm de origine: Acest ARN antisens se mai notweaz ARNc (complementar) i are sensul invers dect ARNm sens (normal). Probele de ARN obinute n maini de gene ct i prin metoda transcrierii cu ajutorul vectorilor fagici, pot fi marcate direct n soluia de sintez cu ajutorul nucleotidelor marcate (vezi Marcarea). Probele de lan unic ARN astfel obinute i marcate se utilizeaz ulterior n reacii de hibridare, ca sonde genetice. B. Marcarea Se face pe un sungur nucleotid, cu o substan care l face vizibil din punct de vedere biochimic sau imunohistochimic. a. Marcarea radioactiv Se face cu radioizotopi 3H,35S, 125I, 32P.La alegerea izotopului trebuie inut cont de timpul de njumtire (timp necesar pentru ca substana radioactiv s se descompun n proporie de 50%). Astfel, timpul de njumtire pentru : 3 H este de 12,35 ani; 35 S este de 87,4 ani; 125 I este de 60 de zile; 32 P este de 14,3 zile. Atomul radioactiv introdus n prob prin dezintegrare va emite radiaii care vor fi evideniate la autoradiografie (impresionarea plcii Roentgen la iluminarea cu radiaii u.v.). Timpul de expunere a filmului la u.v. va fi diferit n funcie de izotopul folosit: - pentru hibridarea Blotting se folosete proba marcat cu 32P; - pentru hibridarea in situ se folosete proba marcat cu 3H. n ultima vreme exist tendina ca substanele radioactive s fie abADNonate din cauza efectului lor nociv asupra organismului i nlocuirea lor cu substane neradioactive. b. Marcarea neradioactiv Se face n dou etape: Etapa I marcarea probelor cu biotin (cel mai frecvent), bromdeoxiuridin, digoxigenin. Etapa II probele marcate sunt evideniate prin intermediul legrii markerului de avidin (glicoprotein din ou)/streptovidin (sintetizat din ciuperca Streptomyces avidinii) i anticorpi antimarker (de exemplu, antibiotina) marcai cu fluorocrom. Etapa I Markerul (biotina) se leag printr-un lan de legare numit spacer de baza uracil din nucleotid. Acest bra de legare va uura i legarea ulterioar a biotinei de proteinele avidin/streptovidin, n etapa II. n mod normal uracilul se nglobeaz numai n ARN, nu i n ADN, dar n condiii de laborator, prin intermediul spacer-ului de la biotin se pot realiza dou tipuri de legturi: - legtura cu nucleozidul natural; - legtura cu nucleozidul artificial. De exemplu: Bio UTP; Biotin spacer uracil zahr trifosfat 276

Bio dUTP; Biotin spacer uracil zahr trifosfat. Pentru aceste structuri se folosesc n laborator trifosfaii nucleozidelor. ATP-ul din nucleotidele ADN este transportor de energie pentru metabolismul celular. Att Bio UTP, ct i Bio dUTP sunt derivate biotinate ale dezoxiuridin trifosfstului i , respectiv ribouridin trifosfatului i vor fi nglobate n locul dezoxitimidin trifosfatului i, respecti n ARN, n locul rbouridin trifosfatului. n momentul hibridrii cu segmente ADN int, nucleotidele cu uracil se mperecheaz, pe lanul complementar de ADN ca i pe lanul ARN, tot cu un nucleotid cu adenin. Etapa a II-a Probele de mai sus biotinate se evideniaz prin legarea biotinei de avidin/streptovidin sau anticorpi antibiotin marcai cu fluorocrom.Biotina prezint o mare afinitate pentru avidin. Legtura bitin + avidin este foarte puternic i aproape ireversibil. Din cauza unor reacii nespecifice se prefer streptovividina n locul avidinei. n final, pentru a se evidenia prezena complexului molecular hibrid biotin avidin/streptovidin, acesta este marcat prin diferite metode. C. nglobarea nucleotidelor marcate n sonda genetic Se realizeaz prin: a. Metode enzimatice b. Metode chimice. a. Metode enzimatice nglobarea nucleotidelor marcate radioactiv sau neradioactiv se face cu ajutorul unei reacii enzimatice, n prezena ionilor de Mg++. I. Nick - translaia Cea mai folosit metod pentru marcarea sondelor este Nick-translaia (translaia prin tiere). n aceast metod se folosesc dou enzime: ADN-aza I i ADN polimeraza I. ADN- aza I este o enzim de restricie extras din pancreas de bou; ea taie legturile fosfodiesterice de ADN unic sau dublu lan; nu atac ARN i acioneaz n prezena ionilor de Mg++ i Mn++ (fig. 149).

Fig. 149 - Acinea ADN- azei I pe dublul lan ADN m prezena ionilor de Mg++ i Mn++ ADN- polimeraza I (polimeraza Kornberg) este izolat din E. coli, are aciune polimerazic 5' > 3', fixeaz nucleotidul ADN la captul liber 3' (mai scurt) al moleculei ADN parial dublu lan, n funcie de complementaritatea fa de nucleotidele de pe lanul matri corespunztor (fig. 150). ADN polimeraza I are i o aciune exonucleazic n ambele sensuri: 5 ' > 3' i 3' > 5' ; aceast aciune apare doar cnd n cursul sintezei unui ADN sunt introduse nucleotide false (fig. 151).

277

Fig. 150 - Aciunea 5 ' > 3' polimerazic a ADN- polimeraza I

Fig. 151 - Aciunea exonucleazic n ambele sensuri ale ADN polimerazei I. Astfel, dup ncorporarea nucleotidelor marcate, dublul lan ADN este denaturat (cele dou lanuri sunt separate); se vor obine fragmente de lanuri unice ADN marcate de diferite lungimi i cu diferite secvene de baze (sonde genetice) (fig.152). Fig. 152 - Schema Nick translaiei (dup Hermaun , 1991). II. Oligomarcare (RADNom Priming, RADNom Priming Oligolabelling,FeinbergVogelstein Technik) Spre diferena de nicktranslatie, in oligomarcare se folosesc drept matrie lanturi unice de ADN rezultate dintr-o denaturare prealabila a unui lan ADN. Se folosete enzima Klenow Polimeraza care reprezinta un fragment de ADNpolimeraza. Klenow Polimeraza poseda activitate 5 3, si 3- 5 exonucleazica (dar nu prezinta activitate 5- 3 exonucleazica). Se mai utilizeaz un amestec de hexanucleotide (oligonucleotide sintetizate cu ajutorul unei maini de gene ); ele sunt structuri formate fiecare sir cate sase nucleoide care contin practic toate combinaiile de secvene nucleotidice posibile, reprezentate de nucleotide ADN marcate (.) ct i nemarcate (o), aflate de obicei in proporie de la 1 la 3.

278

Numele metodei de RADNom Priming deriv de la utilizarea drept primeri a hexanucleotidelor cu secvene ntampltoare (randomized primer). III. Marcare terminala a lanturilor ADN (Endlabelling). Pot fi marcate capetele 3 si 5 ale moleculei ADN i ARN. Spre diferena de primele doua metode (1 i 2), prin care sunt marcate moleculele de ADN probe (sonde genetice), n aceasta a treia metoda marcare se face numai la capetele moleculei ADN-proba rezultata ;de aceea, sensibilitatea moleculei de ADN rezultata prin aceast metoda este mult mai mic.Acest tip de marcare se efectueaza atat pe ADN unic lan ct i dublu lan.Exista mai multe metode de marcare terminal. Marcarea terminal 3 a ADN:se face cu ajutorul enzimei transferaza terminala*. Aceast enzim, n cazul de fa, catalizeaz fixarea nucleotidului pe capatul 3-OH liber al moleculei ADN unic (sau dublu lan). Enzima nu are nevoie de nici o matria; va rezulta deci un ADN lan unic cu un capat 3-OH liber (i respectiv un ADN cu un capat format dintrun lan 3-OH care atrna n afara). n aceasta metoda se folosete doar un singur nucleotide ADN marcat (de exemplu, cu biotina): dezoxiribouridinbiotinat (Bio-dUTP). Acest Bio-dUTP este legat prin aciunea transferezei terminale de capetele 3-OH ale unei molecule ADN dublu lan, deci pe fiecare din cele dou lanturi, la capetele 3-OH formnd o coada cu acelai nucleotide pe ambele lanturi ale dublului lan ADN (dar la capetele opuse). Lungimea acestei cozi este dependenta de concentraia cationilor de Co++si de concentraia nucleotidelor. Cu ajutorul enzimei transferaza terminala se poate,de asemenea, ataa, unei molecule dublu lan ADN , o coada cu nucleotide nemarcate,care conin toata timina.Dupa denaturarea i hibridicarea unei asemenea probe marcate, aceast coada cu timina poate fi evideniat indirect prin fixarea, n cursul hibridizarii, a unei cozi cu adenina marcata cu biotin ape lanul ADN proba (adenine se va fixa prin complementaritate pe coada de timina). n cazul acestei hibridizari, lanul cu coada de timina reprezinta secvena inta, iar cel cu coada de adenine, secvena proba.. b) Metode chimice Reprezinta o marcare directa a acidului nucleic. 1. Marcarea cu fotobiotin. Un asemenea tip de marcare este bazat pe legarea biotinei printr-un bra de legare chimic, de acidul nucleic, pe o grupare chimica activate in prezena luminii (iluminare foarte scurta). Se formeaza o legatura stabile ntre biotina i acidul nucleic (lan unic sau dublu). 2. Marcarea cu acridin oraj. Prin cuplarea ntre acridinester i acidul nucleic se produce o legatur de chemoluminiscenta care elibereaz lumina.

12.4. CLONAREA ADN ului

Clona bacteriana reprezinta un grup de celule bacteriene identice din punct de vedere genetic, care provin dintr-o singur celula bacterian.Clonarea se poate realiza prin ncorporarea (printr-o tehnic de recombinare ADN) a unui fragment de ADN strin ntr-un vector care ulterior este introdus i multiplicat ntr-o celula gazd. n biologia molecular, clonarea semnific obinerea unei culture de celule dintr-o celul unic, astfel ncat sa se obin populaie uniforma din punct de vedere genetic. ================================================================== 279

*Dezoximetil-nucleotid-terminal-transferaza; aceast enzim se folosete i n experiene de clonare pentru obinerea capetelor franjurate ale fragmentelor ADN

A. Etapele principale ale metodei de clonare Sunt urmatoarele: extragerea unui fragment ADN, prin taierea ADN genomic, cu ajutorul enzimelor de restricie; introducerea fragmentului ADN ntr-un vector; introducerea vectorului recombinant (plasmid care a nglobat fragmentu ADN strin) n celula gazd; selectarea celulelor bacteriene care conin vectorul recombinant. Clonarea ADN se recomADN atunci cADN este necesar izolarea i multiplicarea unui segment de ADN (dintr-un genom). n majoritatea experimentelor de clonare, se folosesc celule bacteriene de E.coli. 1.Extragerea unui fragment ADN. Se lucreaza pe celule de Esch.coli.Se folosesc enzime de restricie de tip sticky* i un plasmid care poarta doua gene (markeri de rezistena la doua antibiotice: ampicilina i tetraciclina). n scopul eficienei de clonare: a) pentru a mpiedica circularizarea vectorului ADN strin, trebuie ndepartate gruprile fosfat de la extremitaile 5 ale moleculei deschise de ADN a vectorului, cu ajutorul fosfatzei alcaline.n acest fel, vectorul nu se va mai circulariza. Fosfataza alcalina se obine din celule de Esch.coli sau celule de intestine de oaie; b) pentru a permeabiliza membrane celulei bacteriene la respectivul plasmid vector, celula bacteriana trebuie tratata cu soluie CaCl2 pentru a devenit compententa; c) avnd in vedere faptul ca celulele bacteriene poseda sisteme care protejeaz celula de ptrunderea unui ADN strin, se folosesc pentru clonari celule bacteriene mutante (celule cu system de aprare mult diminuat). 2.Introducerea vectorului recombinant in celula gazda (competenta) Acest fenomen reprezinta procesul de trasformare. n soluia nutritive n care se gsesc celulele bacteriene, sincron cu multiplicarea celulelor bacteriene, se produce i multiplicarea vectorilor recombinanti incorporate. innd cont de faptul c att plasmidul ct i fragmentele ADN au locuri (situs-uri) de tiere complementare, atunci cnd vectorul deschis i segmnetul ADN strin vor veni in contact, din zonele sticky, se vor lipi i va rezulta lanul ADN recombinant (fragmentul ADN a devenit inclus in vector). De obicei, pe plasmidul iniial care poarta rezistena la antibiotice (tetra i ampicilina) se incorporeaza fragmentul ADN strin pe locul unuia din cei doi markeri, eliminADN markerul respective(de obicei se elimina gena tetra i ramane cea pentru ampicilina in momentul taierii lanului ADN de atre enzimele de restricie. 3.Testarea celulor bacteriene supuse procesului de transformare. Aceasta testare se face cu scopul de a controla daca celula bacteriana a incorporate respectivul plasmid recombinant. n acest sens, bacteriile transformate (cele care au primit vector+ADN) se testeaza pe un mediu de cultura cu ampicilina; vor supravieui numai acele celule bacteriene care au catigat rezistena la ampicilina, prin acceptarea plasmidului recombinant, purtatorde gena pentru ampicilina (rezistena la ampicilina). Din aceste bacterii cu vectori recombinant, nsmnate pe mediu de cultura cu ampicilina vor crete colonii bacteriene, din care fiecare va reprezenta o clon. 4. Selectarea celulelor bacteriene purttoare de vector recombinant. 280

Selectarea acestor celule purttoare de plasmid cu ADN strin ncorporate i diferenierea lor de celule (clone) fr ADN strin se face prin nsmnare, prin replica plating, a coloniilor bacteriene pe un mediu cu tetraciclina; pe acest mediu vor supravieui doar clonele care nu conin nici un fragment de ADN strin (celule rezistente la tetraciclina). Tip sticky=enzime care taie cele dou lanuri ale helixului dna n mod franjurat datorit faptului ca i-au pastrat gena purtatoare de aceasta rezisten (este vorba de plasmidul gol fr ADN strin ataat), n timp ce clonele care au pierdut gena de rezistena la tetra (n momentul legrii plasmidului de ADN STRIN), prin formarea unui plasmid recombinant, nu cresc pe acest mediu. Abia din acest moment se poate studia mai departe clona care conine fragmentul ADN dorit, printr-o tehnic de hibridizare speciala, i anume prin hidibridizare colonial. B. Biblioteca genomica ADN (secvene de exoni+introni) Dac genomul unui organism este secionat cu enzime de restricie, iar diferite fragmente de ADN sunt clonate (n celule bacteriene), se va obine un numar de clone corespunzADN diferitelor amestecuri (vector plasmidic+segment ADN). Totalitatea acestor clone rezultate din genomul unui organism iniial reprezint biblioteca genomica ADN. Acest mod de clonare, care duce la formarea unei biblioteci genomice ADN prin tierea genomului (cu ajutorul enzimelor de restricie) potrivit principiului ntamplrii i prin unirea fragmentelor rezultate, reprezinta tehnica mpucarii (shotgun). Clona ADN genomica a unuia i aceluiai organism este totdeauna identical i independena de tipul celular, deoarece toate celulele aceluiai organism posed o nzestrare genetic identical.Din aceasta biblioteca se obin secvene ADN necesare pentru tehnica de hibridizare; acestea vor fi folosite drept secvene ADN cu rol complementar (cu secvene ADN cunoscute), in vederea identificarii unor fragmente ADN noi, necunoscute, a caror secvene nucleotidice trebuie cercetare i identificate. Clonele genomice ADN vor conine atat secvene de introni, ct i exoni, corespunztoare genomului celulei respective de origine. Clonele din biblioteca genomica ADN se folosesc pentru: - cercetarea structurii complete a genelor; - cercetarea structurii exonilor i intronilor; - cercetarea secvenelor reglatoare. C. Biblioteca ADNc (ADN copie dupa matria de ARNm matur) Reprezint doar o informaie pur format numai din secvene de exoni.Spre diferena de biblioteca genomica ADN, care rezult din clonarea de fragmente ADNc se sintetizeaz artificial n laborator, pe o molecula de ARNm matur, drept copie complementar (n prezena enzimei reverstranscriptaza). Produsul aciunii acestei enzime va fi o molecula mixta (hibrid): ARNm-ADNc. Din acest hibrid, lanul dublu ADNc se va forma din acest lan unic ADNc, prin doua posibiliti: n prezenta ADN-polimerazei (Klenow= ADN-polimeraza I extrasa din celula de Esch.coli); n vectori; vectorii recombinai(vector+ lan unic ADNc) vor determina ulterior formarea de clone bacteriene ADNc. n timp ce clonele de ADN genomic sunt identice pentru toate celulele aceluiai organism, clonele ADNc sunt diferite pentru diferitele tipuri de celule ale aceluiai organism.n fiecare tip de celule, aceluiai tip de ADN genomic i corespund alte gene active (exoni), ceea ce nseamn ca n fiecare tip de celule poate apare un alt tip de ARNm matur, astfel ncat, aceluiai organism, biblioteca ADNc rezultata variaza de la un tip celular la altul. Clonele din biblioteca ADNc se folosesc n special n scopul analizei directe a secvenelor de baze care codifica un anumit aminoacid sau produsul proteuc final (codificat de respectivul fragment ADNc). Secvena clonelor ADNc este studiat n special prin experimentele de hibridizare.

281

Astzi, n terapia bolilor tumorale se intrevede posibilitatea identificarii i distrugerii tintite a anumitor molecule ARNm, care induc translaia informaiei pentru sinteza unor substane oncogene. Cu ajutorul experientelor de clonare s-a reuit citirea de secvene de ADN de pe lanul ADN al genomului unui organism.Pasul urmator l reprezint obinerea unor modificariale acestor segvente ADN, cu ajutorul unor tehnici de inginerie genetic (procese artificiale de recombinare ADN), ct i introducerea acestor segmente astfel modificate de ADN n celule sau organisme, unde aceste modificri urmeaza a se exprima.

12. 5. Reacia de polimerizare n lan (PCR)

A fost numit de Lederberg, n 1993, instrumental pentru democratizarea biologiei molecular.Aceast reacie d posibilitatea ca dintr-o mixture de ADN s poata fi pescuit o singura moleculara de ADN, i aceasta sa fie ulterior amplificata enzimatic, cu mijloace tehnice relative simple. Spectrul de aplicabilitate al PCR este foarte larg: de la medicina judiciara, diagnosticarea bolilor genetice pn la vanarea i identificarea de noi virusuri i studii de ecologie i arheologie (studiul ADN-ului) din fosile. PCR este folosit pentru cercetarea unor cantiti foarte mici de ADN dintr-un produs biologic. Avantajele acestei reacii sunt urmatoarele: fiind foarte sensibil, reacia poate pune n evidenta chiar i prezena unei singure molecule de ADN, in probele de cercetat (produs biologic), deoarece reacia ofera posibilitate multiplicarii (clonarii) ADN-ULUI chiar i in afara celulei vii; reacia permite chiar i multiplicarea unei singure secvene de ADN. Astzi exista masini automate (Thermai Cycler) pentru realizarea unor asemenea reacii repetate; o multiplicare suficienta de secvene de ADN este reprezentata de minimum 25 de cicluri de multiplicare; ntr-o masina automata se desfaoara 30 de cicluri ntr-un interval de 4 ore. A. Principiul reaciei. Se folosete drept matria un ADN monocatenar. n condiii de laborator n vitro, pe acest lan unic de ADN se poate sintetiza un lan complementar cu ajutorul ADN-polimerazei i n prezenta unui oligonucleotid (15-20 nucleotide) primer (armorsa). Pentru a porni sinteza noului lan ADN pe un lan ADN matria, ADN-polimeraza necesit prezenta pe matria a unui oligonucleotid primer cu capatul 3-OH liber; la acest capt urmeaza a se fixa nucleptidele ADN care vor forma noul lan. B. Efectuarea reaciei PCR poate porni de la punctul a sau b. a. ADN genomic dublu lan (de cercetat) izolat din celule i tiat n fragmente cu ajutorul enzimelor de restricie corespunztoare; b. Lan unic de ADNc, sintetizat n prealabil prin trascriere inverse a ARNm. La capatul 3 al lanului ADNc se ataeaza o coada de nucleotide-guanina cu ajutorul enzimei trasferaza terminala.Urmeaza desfaurarea PCR cu doi primeri diferii utilizai simultan, cte unul corespunzator pentru fiecare lan ADN (rezultat din ADN-ul dublu lan denaturant). Dintre cei doi primeri, primul primer este nucleotide-timina, al doilea primer este nucleotide-citozina. Etapele reaciei; denaturarea ADN-ului genomic (izolat din celule) dublu lan sau ADNc (sintetizat cu ajutorul unei molecule de ARNm) la temperature nalta (95 grade C).Acest ADN conine secvene care urmeaza a fi multiplicate (amplificate); dupa scderea temperaturii se adaug primerul n exces. n aceste condiii fixarea primerului pe ADN-ul unic lan reprezint un proces de hibridizare ce are loc la 282

temperature sczuta (36-65 grade C). Primerul delimiteaza capatul iniial al fiecarei din cele doua secvene ADN unic lan (rezultate din denaturarea ADN-ului dublu lan) de multiplicat. Adaosul de primer se face n exces, pentru a se obine o hibridizare primer lan unic de ADN i nu o hibridizarea ntre lanurile unice de ADN rezultate din denaturare. reacia de sinteza a noului lan ADN cu ajutorul ADN-polimerazei, n prezenta celor 4 tipuri de nucleotide ADN (adenine/timin/guanine/citidin deoxi-nucleozid trifosfat) pornind de la locul de fixare a primerului. ADN-polimeraza se leag de capatul 3 al primerului i sintetizeaz noul lan n direcia 5->3, folosind drept matria segmentul ADN lan unic de amplificat.Primerul va fi ncorporate n noul lan de ADN format.n acest fel lanul de ADN este dublat i, o data cu acesta, un ciclu de PCR este terminat. ncepe un nou ciclu cu denaturarea de aceasta dat a ADN-ului dublu lan nou sintetizat (n treapta anterior anterioara); mai departe, acest nou ciclu si acest ADN nou-sintetizat (prin sinteza mijlocita de ADN-polimeraza); cu fiecare nou ciclu ( de denaturare/sintez a ADN-ului) va fi dublata cantitatea de ADN rezultata din ciclul anterior. Pentru sesizarea eventualelor erori sau neajunsuri ale reaciei PCR, se recomand; - repetarea de mai multe ori a respectivei reacii pentru aceeai prob; - reacia PCR sa fie nsoit, de fiecare dat, de controale negative. C. Polimeraza utilizat n PCR. n anii 1980, se folosea ADN-polimeraza Klenow (fragment de ADN-polimeraza I de la e. coli); fiind termolabila, aceast enzima a fost apoi nlocuit cu o ADN-polimeraza ternostabil, izolat de la o bacterie termifila Thermus acquaticus. Aceasta ADN-polimeraza a fost numit Taq-polimeraza. Taq-polimeraza este stabila pn la 95 grade C. La fiecare nou ciclu al PCR se adaug Taq-polimeraza proaspt.Optimum de activitate al acestei enzime este la 75-80 grade C; aceast activitate scade cu 50% la 60 grade C i cu 90% la 37 grade C. Dac pentru PCR denaturarea ADN-ului se face la 95 grade C, noul adios de Taqpolimeraza declaneaza de fiecare dat ciclu urmtor de sinteza ADN. n acest fel, se poate efectua reacia n care toi reactivii se pun de la nceput n recipient I pn la sfaritul reaciei nu mai trebuie adaugate noi cantiti. Utilizarea Taq-polimeraza a fcut posibil automatizarea totala a acestei produceri n mainile Thermal Cyclers. n condiii normale, cu ajutorul Taq-polimerazei se pot efectua consecutive 40 de cicluri PCR, obinndu-se o amplificare ADN de ordinal 10 la puterea 6-10 la puterea 7. Dac se urmarete o amplificare ADN mai mare dect cea corespunzatoare la 40 de cicluri PCR, trebuie nceputa o noua serie de cicluri, cu ajutorul ADN-ului amplificat, obinut i diluat de 1000-10000 de ori. n acest fel, cu ajutorul a doua serii cte 40 de cicluri PCR, se poate obine o amplificare de 109 a cantitaii de ADN. Pentru o multiplicare sufienta de secvene ADN sunt necesare 2530 de cicluri de reacii automatizate, care se efectueaz, dupa cum am mai artat, n aproximativ 4 ore. D. Amplicabilitatea practica a PCR-ului. Produsele ADN obinute prin PCR sunt separate electroforetic n funcie de dimensiuni, sub forma de benzi, n gelul de electroforeza, iar apoi benzile sunt fcute vizibile, n lumina U.V. prin tratarea prealabil a gelului cu etidiumbromid. Apoi se realizeaza hibridizarea ADN-ului cu sonde genetice specifice prin metoda Souther Blotting. PCR are un spectru de aplicabilitate foarte larg. a) n diagnosticul medical. n acest scop. ADN-ul extrage din celule proaspat lizate i din celule fixate i inglobate n parafina. ADN-ul astfel extras este supus reaciei polimerazei n lan i apoi analizat cu ajutorul sondelor genetice prin reacia de hibridizare. PCR este utilizat n: diagnosticul bolilor 283

ereditare (fibroza chistica, anemia Cooley, distrofia musculara Duchenne, fenilcetonuria). Diagnosticul bolilor ereditare, graie PCR-ului, se poate face i prenatal, n ft, prin determinarea ADN-ului din celulele trofoblastice; prin aceasta metoda se poate face determinarea prenatal pentru sexul copilului i se poate pune i diagnosticul unei eventuale boli genetice. n urma recoltarii de lichid amniotic este supus determinarii cu ajutorul PCRului sau al anticorpilor monoclonali, n acest fel fiind posibila determinarea de defecte genetice cromozomiale, metabolice (enzimopatii). diagnosticul bolilor infecioase. Diagnosticul infeciei HIV cu ajutorul PCR-ului se poate face n stadiile prococe ale infeciei, prin identificarea prezentei acidului nucleic viral n snge (i anume acidul nucleic viral fixat n genomul celulei limfocitare umane), atunci cnd toate celelalte reacii serologice sunt nca negative.PCR poate da un rezultat precoce pozitiv chiar i n prezena unei singure celule infectate cu HIV ( din materialul de cercetat ). Introducerea diagnosticului rapid al infeciei HIV prin PCR este astazi absolut necesara n practic, n special n investigarea donatorilor de snge i de organe. Pentru diagnosticarea infeciei HIV ntr-o encefalita declanat de acest virus, nu este necesara o proba de esut cerebral, ci este suficienta doar o proba de LCR. n general, pentru un diagnostic prin PCR, recoltarea de probe reprezinta un stres minim pentru bolnav; n acest caz se folosesc drept probe; spalatura bucala (cu celule epiteliale), epitelii de fir de par, probe uscate de snge. PCR mai este utilizat n diagnosticul urmatoarelor boli infecioase: hepatita virala, infecia cu virus herpes simplex, virus Epstein-Barr,virus papollima, Mycobacterium tbc., Pneumocistis carinii, Neisseria meningitides, Clostridium difficile. Recent, cu ajutorul reaciei PCR au fost efectuate studii genetice asupra tulpinei de Vibro cholerae grup 0139 (izolata pentru ntaia oara, pe glob, n 1992-1993, n Bengal), reuind sa se demonstreze ca aceast tulpina ar reprezenta rezultatul unor modificri genetice suferite de tulpina Vibrio cholerae grup 01 biotip eltor, prin deletia, de pe ADN-ul cromozomial, a unui segment de 22 kb, concomitant cu inseria unui segment nou de 35 kb. PCR este utilizat i n identificarea unor germeni microbieni ramai pn astzi necultivabili, de exemplu n boala Whipple. Boala Whipple a fost semnalat pentru ntia oara n anul 1907; este primul exemplu din partologia uman n care s-a emis ipoteza prezenei posibile a unei bacterii necultivabile, imposibil de identificat prin posibilitaile clasice cunoscute. S-au postulat apoi i alte boli de etiologie posibil microbiana fara a fi nsa posibil evidenierea prezenei unor microorganisme, probabil microbian fr a fi nsa posibil evidenierea vizual, n aceste cazuri fiind necesare alte metode dect cultivarea pe medii de cultura, pentru detectarea i identificarea agenilor patogeni. Noile metode i au rdcinile n filogenetica moleculara. Boala whipple se manifesta clinic prin astralgii migratorii, febra, dureri abdominale, diaree, pierderi n greutate, apariia n ganglionii mezenterici de infiltrate macrofagice proeminente, depozite de grasime. b. n medicina judiciar PRR este folosit pentru evidenierea identitii unui fir de prsau a unei cantiti foarte mici de snge sau sperm. Astzi PCR poate fi folosit n combinaie cu metoda fingerprinting n aceleai scopuri. c. n studii ecologice Cu ajutorul PCR s-a reuit evidenierea unui numr de microorganisme n probe de pmnt i ap; au fost analizate microorganisme care pn astzi nu au putut fi cultivate pe medii de cultur, ct i microorganisme de sol care au suferit n timp modificri genetice. d. n arheologie PCR a fost utilizat pn n prezent i pentru analiza ADN provenit din mumii egiptene vechi de mai bine de 2400 de ani.

284

12. 6. SECVENIEREA ADN- ului

Analiza structurii ADN a nceput o dat cu anii '70, cu ajutorul metodei de secveniere ADN i de analiz a secvenelor nucleotidice din aceste structuri. Acest studiu a fost posibil datorit folosirii enzimelor de restricie (endonucleaze), care pot tia moleculele de ADN n fragmente de cteva sute pn la cteva mii de perechi de baze. Aceste fragmente obinute pot fi apoi separate electroforetic i analizate. La Los Angeles i la Heidelberg exist n prezent bnci de date n care au fost strnse toate secvenele ADN cunoscute pn n prezent. Genomul multor virusuri a fost total secveniat. n 1995 a fost terminat secvenierea complet a primului genom bacterian, cel de Haemophilus influenzae, urmat la scurt timp de cel de Mycoplasma genitalium. Curnd vor fi terminate i secvenierile complete ale genomurilor bacteriene Escherichia coli, Bacillus subtilis, Methanobacterium thermoautotrophicum. La drojdii (drojdia de bere Saccharomyces cerevisiae), a fost secveniat pentru prima dat un cromozom, i anume cromozomul III, dovedindu-se c conine 315 357 perechi de nucleotide i 200 de gene; la aceast analiz s-a lucrat trei ani n 35 de laboratoare din lume. Cu ajutorul acestei proceduri s-au obinut informaii i asupra materialului genetic inclus n cele 23 de perechi de cromozomi umani, i anume: - locul relativ al genelor pe cromozomi; - identificarea unuio numr de gene; - cauzele unor boli genetice. n prezent este n curs de desfurare proiectul de cercetare asupra genomului uman, genom care conine circa trei miliarde de perechi de bze (50 000 100 000 de gene). Astzi se tie c doar 3 % din genomul uman reprezint gene funcionale (exoni), restul de 97 % din genom reprezint doar balast genetic a crui semnificaie este nc necunoscut. A. Principiu Secvenierea ADN (sequencing) nseamn tierea lanului ADN n secvene i analiza ulterioar a secvenelor de baze nucleotidice din aceste fragmente. Prin descifrarea acestor secvene de baze se poate ajunge la delimitarea genelor i la stabilirea secvenelor de aminoacizi codificate de o singur gen. Ca urmare, analiza secvenial a ADN-ului i, indirect, cea a proteinelor corespunztoare pot furniza date cu privire la conformaia proteinei, funciei proteice, nrudirii dintre proteine, ct i asupra bolilor produse prin mutaii. Secvenierea ADN este o variant a tehnicii de recombinare ADN cu ajutorul creia se poate stabili secvena de baze din molecula ADN. Condiia de baza pentru realizarea acestei secvenieri este prezena unui numr suficient de copii ale moleculei de ADN. Acest lucru se poate realiza prin clonarea ADN sau prin metoda PCR. B. Metode Pentru secveniere se folosesc dou metode: a. Metoda enzimatic; tehnica Sanger (Chain Termination Tehnique). b. Metoda chimic; tehnica Maxam- Gilbert ( de obicei combinat cu metoda Sanger). a. Metoda enzimatic Tehnica Sanger Principiu: se determin secvenele de baze nucleotidice pe copia de acid nucleic i prin complementaritate se deduce secvena de baze de pe lanul de acid nucleic de origine. Etapele reaciei: lantul dublu de acid nucleic (AN) aste adus la forma de AN unic lan; 285

pe lanul unic AN se fixeaz un primer (molecul starter sau amors). Acest primer ste un oligonucleotid scurt, preparat semiautomat prin tiere, cu ajutorul enzimelor de restricie, a unui fragment ARN. Primerul este stfel selectat nct captul 3' s se potriveasc prin complementaritate, ntr-un punct, pe lanul ADN de cercetat. Acest primer este nglobat ntr-un vector sau secven cunoscut; are loc sinteza lanului ADN complementar (dup modelul matriei AN) n prezena celor patru dezoxinucleotid trifosfai (dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dintre care unul este marcat, a unui didezoxinucleotid trifosfat (ddNTP) i a ADN-polimerazei I sau reverstranscriptazei; sinteza lanului ADN se va opri acolo unde n locul unui dNTP se va ngloba un ddNTP corespunztor. n acest punct se va opri reacia polimerazei. Aceast reacie de sintez a ADN-ului se va desfura n patru variante, n fiecare din variante fiind marcat altul din cele patru dNTP-uri; cele patru molecule de ADN dublu lan obinute sunt denaturatze prin cldur; lanul de acid nucleic nou sintetizat cu un nucleotid marcat este separat prin gel elecroforez; n locul marcrii radioactive, fiecare baz este colorat cu alt substan fluorescent. Apoi se face citirea bazelor colorate de pe gelul de electroforez prin autoradiografie. b. Metoda chimic Tehnica Maxam-Gilbert Spre deosebire de tehnica Sanger, unde determinarea secvenelor se face pe lanul copie, prin tehnica Maxam-Gilbert determinarea secvenelor se face pe lanul de acid nucleic de origine. Tehica se bazeaz pe o modificare chimicaunei baze i o tiere specific la nivelul altei baze (de exemplu adenina), de pe molecula ADN. Aceste reacii au loc pe lanul ADN originar. n ultimii ani, n S.U.A. n laboratoarele de Genetic ale Universitii Berkeley, s-au realizat aparate automate pentru citirea secvenelor de baze nucleotidice din acizii nucleici cu viteza de 7 000 8 000 secvene de baze pe zi.

12.7. FINGERPRINTING GENOMIC (amprente de ADN)

a. Principiu Pe baza analizelor de secveniere a ADN-ului, s-a demonstrat c fiecare individ este caracterizat printr-un fingerprinting genomic (un pattern individual al regiunilor hipervariabile din ADN-ul genomic, i anume de pe zona ADN- urilor minisatelizate). Genomul uman conine trei miliarde de perechi de nucleotide, dintre care: 70 % reprezint secvene unice identice la toi indivizii; 30 % reprezint secvene repetitive, i anume: nalt repetitive 7 10 %; aceeai secven de 300 perechi de nucleotide se repet de 30 000 1 milion de ori dispersat, pe toat lungimea genomului; gene structurale pentru sinteza de ARNt, ARNr i histone; zona spacer ce conine gene criptice (silenioase); ADN-uri satelite nalt repetitive, netranscriptibilr, necodificatoare de proteine. 20 30 % moderat repetitive, fiecare secven cu cteva sute pn la 6 000 de perechi de nucleotide se repet n 20 30 000 de copii. b.Tehnica RFLP Cu ajutorul acestei tehnici se pun n eviden zonele de ADN variabil de la individ la individ. Aceste tipare de fragmente de ADN individual sunt reprezentate de o amprent RFLP specifc ( polimorfismul de lungime al fragmentelor de restricie).

286

Pentru determinarea acestor tipare individuale, se izoleaz ADN-ul genomic din celulele unui organism (diferite esuturi, rdcini ale firului de pr, snge, saliv, sperm). Tehnica RFLP cuprinde urmtoarele etape: - ADN-ul extras este supus aciunii enzimelor de restricie; - Fragmentele de ADN (dublu catenar) sunt supuse migrrii bidimensionale ntr-un gel denaturat (coninnd un agent chimic denaturat ca ureea, concentraie 5 %); - Benzile de ADN unic lan obinute n gel sunt supuse colorrii cu etidiumbromid; - Benzile ADN sunt vizualizate prin transiluminare la u.v. Aceast tehnic evideniaz att prezena/asena fragmentelor de restricie, ct i polimorfismul de lungime al respectivelor fragmente. Determinarea RFLP pentru organismele eucariote, inclusiv omul, are semnificaie, n mod deosebit, n cazul urmririi transmiterii la descendeni, a informaiei genetice parentale (prin compararea fringerprint- urilor ntre generaii). n cazul examinrii singulare ( a informaiei genetice per individ), se prefer metoda Southern Blotting a crei capacitate discriminatorie este considerat mai bun. c.Tehnica AFLP Aceast tehnic ce combin principiul analizei RFLP cu cel al reaciei PCR nalt specific, detecteaz numai prezena sau absena fragmentelor de restricie, dar nu face i analiza polimorfismului de lungime a fragmentelor. Tehnica este considerat astzi metoda universal pentru determinarea prezenei/absenei unei anumite amprente de ADN n orice surs de origine bacterian, vegetal, animal sau uman. d.Aplicaii ale metodei amprentelor ADN n medicina judiciar: n criminalistic; urmrirea criminalului poate fi condus n funcie de urmele gsite: amprente individuale prezente n resturi de piele, pr, snge, sperm. Dac materialul genetic se afl n cantitate foarte mic, se recurge la PCR pentru amplificarea cantitii de ADN; diagnosticul paternitii; avnd n vedere c variaiile de ADN- urile minisatelite se motenesc dup legile mendeliene, metoda amprentelor ADN este util pentru dovedirea unei nrudiri (amprenta genetic difer de la individ la individ, se potrivete n mare parte la rude i este identic la gemenii univitelini); n medicina clinic n boli genetice; n analiza de likage i determinarea instabilitii genetice; n oncologie; pentru diagnosticul midificrilor genetice din celulele tumorale de la persoane cu carcinom mamar (se prepar i se compar amprente de ADN din celulele tumorale/elemente figurate sanguine cu condiia ca n proba de snge s nu existe celule modificate oncogen; urmrirea epidimiologic a circulaiei agenilor infecioi pentru determinarea patternurilor RFLP la virusuri i tulpini bacteriene; stabilirea interrelailor virale i bacteriene pe baz de amprente ADN, n vederea ncadrrii taxonomice a unor noi ageni infecioi; prin introducerea tehnicii de fracionare a segmentelor de restricie i separrii acestora n gel cu gradient denaturat, se va putea, n viitor, msura frecvena mutaiilor n genomul uman,se va putea analiza instabilitatea genomului i a relaiei acestuia cu senescena i neoplazia, se vor putea realiza analize de linkage i cartare de noi gene implicate n boli genetice; n biologie - stabilirea paternitii unor psri de prad ale cror ou au fost clocite de prini adoptivi; - stabilirea de relaii genetice ntre diferite specii pe baza structurii ADN-ului, acest criteriu fiind superior celui al sistematizrii de pn n prezent, efectuat pe baz simplelor caractere morfologice; - stabilirea polimorfismului genetic n interiorul aceleiai specii (de exemplu, heterozigoii); 287

pe baza existenei RFLP-urilor au fost amplificate i analizate secvene nucleotidice din fragmente ADN provenite de la specii disprute; n arheologie - s-a analizat ADN-ul provenit de la mumii egiptene vechi de mai bine de 2400 de ani (prin clonare i secvenierea unor fragmente ADN de circa 3400 de baze).

288