Universitatea “ Al. I.

Cuza” , Iaşi

Facultatea de Biologie

Plasmide şi vectori de clonaj

Disciplina de studiu:
Genetică moleculară umană
Student:
Anul de studiu: I Master
 Introducere

Clonarea este procesul de obţinere a unui grup de celule sau organisme identice din
punct de vedere genetic dintr-un singur predecesor (o celulă/un organism). De asemenea
clonarea mai poate fi definită ca fiind procesul de obţinere a mai multor copii identice a unui
fragment de ADN sau a unei gene prin utilizarea tehnologiei ADN-ului recombinant (Brown şi
colab., 2003).
În vederea realizării clonării este esenţială parcurgerea următoarelor etape de bază:
I. Fragmentul de ADN destinat clonării se obţine în urma acţiunii unor endonucleaze de
restricţie (=enzime).
II. Fragmentul de ADN de interes obţinut este legat apoi de alte molecule de ADN care
servesc drept vectori (Cseke şi colab., 2016). Un vector de clonaj este un construct de ADN (de
exemplu un plasmid, un genom viral modificat sau un cromosom artificial) capabil să transporte
o genă sau un fragment de ADN în interiorul unor celule în vederea clonării lor (Brown şi colab.,
2003).
III. Molecula de ADN recombinant rezultată este transferată în celula gazdă în care se va
replica şi va produce numeroase copii identice numite clone. Pe măsură ce şi celulele gazdă se
multiplică, molecula de ADN recombinant se va găsi şi în celulele fiice, toate conţinând secvenţa
de ADN clonată.
IV. Fragmentul de ADN clonat poate fi recuperat din celulele gazdă în vederea purificării
şi analizei sale prin diferite metode (Cseke şi colab., 2016).

1. Vectorii de clonaj

Un vector este un agent capabil să transfere secvenţe de ADN de interes dintr-o celulă în
interiorul unei alte celule (Windelspecht, 2007).
Escherichia coli este principala gazdă pentru manipularea de ADN în vederea clonării
sale, din acest motiv cei mai mulţi vectori sunt reprezentaţi de plasmide sau virusuri care pot
supravieţui în această bacterie sau bacterii similare. Numeroşi vectori au origini de replicare
bacteriene şi gene pentru rezistenţa la antibiotice.
1.1. Clasificarea vectorilor de clonaj
Vectorii utilizaţi în ingeneria genetică pot fi:
 vectori bacterieni (=plasmidele): de exemplu pBR322, pSC101, pUC 18/19;
 vectori de la drojdii: de exemplu Yep, YRp, Ycp, Yip;
 vectori de la virusuri: de exemplu vectorii fagului λ, vectorii fagului M13;
 cosmide;
 cromosomii artificiali;
 vectori de la animale;
2
  vectori de la plante (Clark şi Pazdernik, 2015).
În continuare vor fi descrise pe scurt o serie de vectori de clonaj.
a) Plasmidele reprezintă materialul genetic accesoriu de la bacterii, într-o celulă putând
exista mai multe copii (10-200 copii) (Windelspecht, 2007). Plasmidele conferă
microorganismelor care le conţin o serie de proprietăţi: abilitatea de conjugare, rezistenţa la
antibiotice, degradarea substanţelor xenobiotice şi producerea de substanţe ce neutralizează
toxinele (Harisha, 2007). Plasmidele vor fi descrise în detaliu în capitolul următor.
b) Bacteriofagii utilizaţi ca vectori au genomul viral modificat astfel încât fragmente mari
de ADN neviral să poată fi incluse în structura virusului. Deşi iniţial molecula de ADN introdusă
în E. coli este liniară, ea devine circulară cu ajutorul ADN-ligazei. Replicarea acestei molecule de
ADN în celula gazdă are loc doar când aceasta este circulară. Expresia genelor λ asigură sinteza
proteinelor care formează capsida virală. Fiecare capsidă va fi asamblată cu un singur genom
viral. După asamblarea fagilor, celulele de E. coli explodează şi permit eliberarea acestora.
Pentru a putea studia ADN-ul de la bacteriofagi fără a distruge întreaga cultură de bacterii
E.coli, cercetătorii elimină una sau mai multe gene esenţiale pentru împachetarea fagilor.
c) Cosmidele sunt vectori care conţin regiuni specifice numite cos. Fragmentul de ADN
de interes este inserat după îndepărtarea secvenţelor de ADN dintre regiunile cos ale
cosmidului. Constructul obţinut este împachetat într-o particulă produsă de un fag helper,
produsul final, fiind introdus în E.coli.
d) Cromosomii artificiali conţin cele mai mari fragmente de ADN (150-2000kb). În
cercetările de biotehnologie sunt utilizate următoarele tipuri de cromosomi artificiali:
 cromosomi artificiali de la drojdii (YACs- 2000 kb);
 cromosomi artificiali de la bacterii (BACs);
 cromosomi artificiali ai bacteriofagului P1 (PACs).
Genele de dimensiuni mai mici sunt studiate cu ajutorul plasmidelor în timp ce genele
mai mari cu ajutorul bacteriofagilor, cosmidelor sau cromosomilor artificiali (Clark şi Pazdernik,
2015).
1.2. Caracteristicile vectorilor de clonaj
Majoritatea vectorilor prezintă o serie de caracteristici esenţiale pentru utilizarea lor în
ingineria genetică printre care:
 vectorul este uşor de manipulat o dată ce a fost izolat datorită dimensiunilor sale
mici;
 vectorul este transferat uşor de la o celulă la alta (în general prin transformare);
 vectorul este izolat din celula gazdă uşor;
 vectorul este identificat şi selectat eficient;
 numărul de copii al vectorului este crescut→ se obţin cantităţi mari de ADN;
 prezenţa zonelor de restricţie multiple permite inserţia de ADN clonat.
Majoritatea plasmidelor întrunesc primele 3 însuşiri (Clark şi Pazdernik, 2015).

3
 2. Plasmidele

Un plasmid este o moleculă circulară de ADN care se replică independent de

cromosomul celulei bacteriene (Castilho şi colab., 2008). Plasmidele deşi conţin mai puţin
material genetic în comparaţie cu cromosomul bacterian, ele au fost mai intens studiate de
către biochimişti şi geneticieni, fiind considerate un instrument indispensabil pentru ingineria
genetică.
Primele experimente de inginerie genetică au fost realizate la începuturile anilor 1970
când fragmente de ADN de origine animală sau vegetală au fost introduse în plasmidele
bacteriene. Încă de la primele experimente cercetătorii au manifestat interes în studiul acestor
vectori şi există o serie de motive care să explice acest lucru.
a) Cele mai importante proprietăţi ale bacteriilor sunt codificate de plasmide în
comparaţie cu cromosomul bacterian. De exemplu, plasmidele codifică o serie de enzime care
permit bacteriei genului Rhizobium să transforme azotul atmosferic în NH 3 la plantele
leguminoase. Un alt exemplu ar fi producţia de toxine dintre cele mai nocive codificată de
plasmidele din bacteriile patogene. De asemenea plasmidele conţin gene care conferă unei
bacterii patogene rezistenţă la antibioticele consumate de om în scopul combaterii infecţiei.
b) Studiul plasmidelor a permis geneticienilor să înţeleagă modul de funcţionare al
genelor şi mecanismul lor de reglare. Plasmide de conjugare pot fi transferate de la o bacterie la
alta şi mai mult decât atât prin intermediul lor poate avea loc şi transferul de gene ale
cromosomului bacterian între celule. Geneticienii au utilizat plasmidele de conjugare pentru
localizarea poziţiei a mai multor gene din cromosomul bacterian. Scopul a fost identificarea
cauzei activării unor gene iniţial silenţioase care ulterior devin capabile să codifice proteine.
c) Un alt avantaj al descoperirii plasmidelor a fost posibilitatea de producere a unei
cantităţi mari de proteine cu ajutorul bacteriilor care conţin plasmidul modificat. Acest lucru a
fost posibil şi datorită faptului că de pe medii de cultură ieftine se pot izola un număr crescut de
bacterii. Plasmidele modificate au permis sinteza unor compuşi precum insulina, interferonii şi
hormonii de creştere (Michelson şi Bannister, 1984).
2.1. Clasificarea plasmidelor
Plasmidele diferă între ele prin mărime, structură, număr de copii, modul de replicare şi
abilitatea de transfer în diferite bacterii.
Criteriile de clasificare a plasmidelor sunt următoarele:
 după structură şi capacitatea de replicare în plasmide mici (aproximativ 10 gene şi
20 de copii/celulă) şi plasmide mari (circa 100 de gene şi 1-2 copii/celule); ambele
tipuri de plasmide sunt des întâlnite la tulpinile de E.coli izolate de la oameni sau
animale (Michelson şi Bannister, 1984);
 pe baza caracterelor codificate de genele plasmidului (Tabel 1);

4
  pe baza caracterelor fenotipice în plasmide criptice;
 pe baza prezenţei sau absenţei a „tra” sau genei de transfer în plasmide de
conjugare şi plasmide de non-conjugare.
Tabel 1. Clasificare plasmide în funcţie de caracterele codificate
Tip de plasmid Gena codificată Caracteristica, codificată de genă
Plasmide R RP4 pentru Pseudomonas,Rbk rezistenţă la antibiotice
pentru E.coli şi celelalte
bacterii
Plasmide F F pentru E.coli conjugarea= transferul de material
genetic
Plasmide Col gene pentru colicină sinteza de toxine care pot ucide
bacterii
Plasmide de degradare TOL pentru Pseudomonas sinteza de toluen
putida
Plasmide pentru Ti pentru Agrobacterium inducerea tumorilor („crown gall”)
virulenţă tumefaciens la plante
Alte plasmide sunt următoarele: plasmidele Ent (codifică producerea de enterotoxine);
plasmidele R6 (pentru rezistenţa la metalele grele); plasmidele Com (conţin gene pentru
metabolismul camforului); plasmidele de degradare/catabolice găsite la Pseudomonas şi
bacteriile înrudite (permit bacteriilor gazdă să metabolizeze compuşi aromatici complecşi ca
xilenii, naftalina sau diferite pesticide); plasmidele de virulenţă (oferă patogenitate bacteriei
gazdă deoarece codifică producerea de toxine sau alţi factori de virulenţă).
Multe tipuri de plasmide pot fi prezente la aceeaşi bacterie. Pentru a putea coexista
plasmidele diferite într-o singură celulă ele trebuie să fie compatibile unele cu celelalte. În caz
contrar, plasmidele incompatibile vor fi eliminate în timpul diviziunii bacteriei (Tripathi, 2010).
2.2 Proprietăţile generale ale plasmidelor
Plasmidele sunt de regulă molecule circulare de ADN, deşi uneori pot fi lineare sau
alcătuite din ARN. Pot exista într-o singură copie sau mai multe/celulă. Se multiplică doar în
interiorul celulei gazdă. Replicarea plasmidului se realizează separat de replicarea
cromosomului bacterian în celula gazdă. Plasmidele conţin gene care reglează propriul lor ciclu
de viaţă, altele conţin gene care afectează proprietăţile celulei gazdă (Clark, 2005). Plasmidele
se pot transfera singure în celula gazdă prin procesul de conjugare sau pot contribui la
transferul altor plasmide din celule sau chiar a cromosomului din celula gazdă. Ele pot fi
eliminate din celulă fără a afecta proprietăţile acesteia. Unele plasmide conţin gene pentru
rezistenţa la antibiotice sau metale grele sau pentru utilizarea compuşilor complecşi ai
carbonului (Tauro şi colab., 1986).
În continuare vor fi descrise 2 proprietăţi ale plasmidelor mai detaliat.
a) Conjugarea

5
 Primul plasmid descoperit la bacterii a fost plasmidul F (plasmid de fertilitate). El a fost
izolat din tulpina K-12 de la E.coli . Descoperirea acestui plasmid a fost posibilă deoarece acesta
este capabil să transfere gene între tulpinile de la această bacterie. Transferul de plasmide sau
a unei porţiuni din genom de la celula donor (F +) la celula recipient (F-) se numeşte conjugare
(Fig. 1).

Fig.1. Conjugarea la bacterii (http://www.acuz.net/html/img7314.jpg)

Plasmidul F conţine gene care codifică sinteza pilinei, proteină care intră în structura
pililor de sex (= prelungiri filamentoase cu structură tubulară în număr de 1-10/celulă
bacteriană) care fac legătura cu celulele lipsite de plasmidul F. Prin intermediul pilului sexual
sunt transferate copii ale plasmidului F de la o celulă la alta.
Descoperirea acestui plasmid a făcut posibilă identificarea unor tulpini de E.coli Hfr
(frecvenţă înaltă de recombinare) la care plasmidul F este legat direct de cromosom. Datorită
acestui fapt uneori s-a putut transfera o copie a întregului cromosom bacterian de la o celulă la
alta, acest proces durând 100 de minute. De regulă pilul sexual care lega celula donor de celula
recipient se rupea înainte de transferul unei copii complete a cromosomului (Michelson şi
Bannister, 1984).
b) Rezistenţa la antibiotice
Bacteriile pot manifesta rezistenţă la anumite antibiotice datorită prezenţei unor
plasmide de rezistenţă la antibiotice (plasmidele R). Datorită acestei proprietăţi a fost posibilă
rezolvarea unei probleme legate de clonare şi anume cunoaşterea regiunii de ADN ce urmează
fi clonată în celula gazdă. S-a constatat astfel că tulpinile bacteriene sensibile la un anumit
antibiotic şi care au preluat plasmidul R ce conţine o genă pentru rezistenţa la acel antibiotic,
vor creşte pe mediul de cultură cu acel medicament (Windelspecht, 2007). Gena conţinută de
plasmid codifică enzime care asigură acetilarea sau fosforilarea antiobioticelor astfel încât
acestea nu mai sunt toxice sau nu mai pot pătrunde în celula bacteriană.
Epidemia de febră tifoidă declanşată de o tulpină de Salmonella typhi în Mexic (anii
1972-1973) a ilustrat rezistenţa manifestată de către pacienţi la antibioticul administrat pentru

6
tratarea bolii (cloramfenicol) datorită plasmidului R existent la această bacterie. Drept urmare
10.000 de oameni au fost afectaţi (Michelson şi Bannister, 1984).
2.3. Caracteristicile esenţiale ale unui plasmid utilizat ca vector de clonare
Plasmidele sunt utilizate în ingineria genetică în procesele de clonare moleculară ca
vectori de gene. Pentru a putea funcţiona ca vectori de clonare plasmidele trebuie să posede
următoarele caracteristici:
 o origine de replicare pentru replicarea eficientă a plasmidelor astfel încât să se
poată obţine sute de copii/celulă;
 o genă de selecţie care asigură de regulă rezistenţă la un antibiotic ceea ce permite
selecţia clonelor care conţin plasmidul;
 o regiune de clonare multiplă care poate fi îndepărtată cu ajutorul enzimelor de
restricţie, fapt ce permite inserţia genei de interes;
 un promotor viral care să asigure transcrierea genei de interes în celulele eucariote.
După clonarea genei de interes în plasmid, are loc transferul acestuia în celula
bacteriană gazdă, de regulă la E.coli prin procesul de transformare bacteriană (Castilho şi colab.,
2008).
2.4 Proprietăţile generale ale vehiculelor de clonaj pSC101 şi pBR322
2.4.1 Plasmidul pBR322
În ingineria genetică plasmidele naturale au fost supuse unor modificări majore pentru
producerea de vectori cu proprietăţile dorite. Un important plasmid în istoria manipulării
genelor este pBR322 care a fost obţinut de Francisco Bolivar şi colaboratorii săi. Primul raport
privind utilizarea acestuia datează din anul 1977.
Acest plasmid a fost un vehicul de clonaj foarte popular, el fiind constituit din ADN ce
provine de la 3 plasmide naturale diferite:
 gena ampR (pentru rezistenţă la ampicilină) provine de la plasmidul R1= un plasmid tipic
pentru rezistenţa la antibiotice care se întâlneşte la populaţiile netransformate de E.coli;
 gena tetR (pentru rezistenţa la tetraciclină) provine de la plasmidul R6-5;
 originea replicării de la pBR322 care controlează multiplicarea vectorului în celulele
gazdă provine de la plasmidul pMB1 (plasmidul pMB1 este strâns corelat cu plasmidul
ColE1 care asigură producerea de colicină) (Brown, 2015).
Plasmidul pBR322 (Fig. 2) are toate caracteristicile esenţiale unui vector de clonare: masă
moleculară mică, gene pentru rezistenţă la antibiotice (ampicilină şi tetraciclină), o origine de
replicare (ori) şi o serie de regiuni de recunoaştere a endonucleazei de restricţie (Nicholl, 2008).

7
 Fig. 2 Plasmidul pBR322 (http://oxfordgenetics.com/images/stories/virtuemart/product/og589_pbr322.png)
Cercetătorii au mai identificat şi alte avantaje ale acestui plasmid ca vector de clonaj
ideal.
a) Dimensiunile vectorului de 4361 pb.
b) Folosirea genelor pentru rezistenţa la antibiotice ca markeri de selecţie pentru
celulele care conţin plasmidul. De asemenea aceste gene conţin regiuni de restricţie unice care
pot fi utilizate în experimentele de clonare. Inserţia unui fragment de ADN în pBR322 după
acţiunea enzimei de restricţie PstI, PvuI sau ScaI inactivează genele amp R, iar inserţia prin
folosirea unei enzime din cele 8 endonucleaze de restricţie (în special BamHI şi HindIII)
inactivează genele tetR.
c) În celulele de E.coli transformate pot exista în general 15 copii ale pBR322/celulă.
Acest număr poate creşte între 1000-3000 copii/celulă prin replicarea plasmidelor în prezenţa
unui inhibitor al sintezei proteice precum cloramfenicolul. Prin urmare o cultură de E.coli
asigură o producţie crescute de molecule recombinante de pBR322 (Brown, 2015).
Utilizarea frecventă a plasmidelor ca vehicule de clonaj a fost posibilă datorită
plasmidului pBR322. Astfel că noi plasmide vectori pot fi obţinute prin restructurarea a
diferitelor părţi din acest plasmid. Acest lucru implică inserţia sau eliminarea unui fragment de
ADN pentru schimbarea proprietăţilor vectorului. O variantă a pBR322 este plasmidul pAT153
care se obţine prin eliminarea a 2 fragmente de ADN din plasmidul de origine cu ajutorul
enzimei de restricţie HaeII. Avantajele noului plasmid obţinut în comparaţie cu cel de origine:
număr de copii/celulă de 3 ori mai mare şi conţinutul biologic important (Nicholl, 2008). Un alt
plasmid pBR327 s-a obţinut prin îndepărtarea unui segment de 1083 pb din pBR322. Acest lucru
nu a afectat genele ampR şi tetR, dar a modificat capacitatea de replicare şi conjugare a noului
plasmid (Brown, 2015).

8
 2.4.2. Plasmidul pSC101
Acest plasmid se găseşte la E.coli şi a fost primul vehicul de clonaj utilizat cu succes
pentru clonarea ADN-ului de la eucariote. În celule se găsesc aproximativ 1-2 copii de Psc101
(Fig.3) (Glover, 2013).

Fig. 3 Plasmidul pSC101 (http://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/0/9/1464.ashx)

Avantajele plasmidului pSC101 constă în prezenţa unei gene pentru rezistenţa la

tetraciclină, dimensiune (9 kb) şi originea în plasmidul de conjugare R6-5 (Newton, 2014).
pSC101 conţine o singură regiune EcoRI unde ADN de interes poate să fie inserat fără
să afecteze procesul de replicare sau rezistenţa la antibiotice ale plasmidului (Glover, 2013).
Boyer şi Cohen au lucrat cu bacteria E.coli în experimentele de clonare, folosind o
tulpină rezistentă la tetraciclină şi alta rezistentă la kanamicină. În experimentele lor, Boyer şi
Cohen au utilizat plasmidul pSC101. pSC101 a fost unul dintre cele mai simple plasmide
obţinute deoarece conţine doar 2 gene: una pentru replicare şi alta pentru rezistenţa la
tetraciclină. Cei 2 cercetători au inserat în acest plasmid o a 3-a genă care codifică rezistenţa la
kanamicină. Plasmidul pSC101 astfel modificat a fost introdus în bacteriile de E.coli . Boyer şi
Cohen au descoperit în urma acestui lucru că unele bacterii de pe mediul de cultură erau
rezistente la tetraciclină, iar altele la kanamicină şi restul la ambele antibiotice (acest lucru nu
se întâmplă în mod natural la E.coli, ceea ce indică faptul că obţinerea formelor recombinante
ale bacteriei determină apariţia de proprietăţi noi).
Boyer şi Cohen au reuşit nu numai să producă o moleculă de ADN recombinant ci şi să
introducă această moleculă în celule noi astfel încât în aceste celule să se poată obţine multiple
clone ale materialui genetic inserat. Cu această descoperire a început dezvoltarea tehnologiei
ADN recombinant (Newton, 2014).

9
 3. Purificarea ADN plasmidial

Înainte de clonarea unui fragment de ADN plasmidial se recomandă purificarea

acestuia. Acest lucru este extrem de important deoarece după un experiment se poate verifica
dacă plasmidul conţine fragmentul de ADN de interes destinat clonării. Tehnica aleasă pentru
purificarea ADN plasmidial depinde de numeroşi factori precum cât de pur trebuie să fie ADN-
ul, ce cantitate de ADN este necesară şi numărul de probe de care este nevoie pentru a izola
plasmidul din celule.
Procedura purificării ADN-ului plasmidial (Fig. 4) cuprinde următoarele etape de bază:
a) Creşterea pe un mediu de cultură specific a unei colonii de celule de la o singură
tulpină de bacterii care conţine plasmidul;
b) Recoltarea celulelor obţinute;
c) Liza celulelor care poate fi de 2 tipuri: liza alcalină cu SDS (sulfat de sodiu dodecil) sau
liza prin fierbere (Lodge şi colab., 2007). Aceasta este o etapă critică deoarece poate fi afectat
dramatic randamentul de refacere a plasmidului. Cantitatea de ADN plasmidial din lizatul
obţinut depinde direct proporţional de cantitatea de bacterii lizate în timpul acestei proceduri
(Liu, 2009).
d) Îndepărtarea tuturor componentelor celulare cu excepţia acizilor nucleici;
e) Precipitarea cu etanol în scopul izolării acizilor nucleici;
f) În anumite situaţii este esenţială şi separarea ADN plasmidial de alţi acizi nucleici (ARN
sau ADN cromosomal) prin centrifugare într-un gradient de clorură de cesiu în prezenţa
bromurii de etidiu (=tehnică utilizată de regulă pentru purificarea ADN cromosomal).

Fig. 4 Procedura purificării ADN plasmidial (https://www.acgtinc.com/image/pageInsert/plasmid_dna_purification.jpg)

10
 Una dintre cele mai simple şi sigure tehnici pentru purificarea ADN plasmidial este liza
alcalină. Această tehnică poate fi utilizată ca o metodă rapidă de izolare de ADN plasmidial în
experimentele analitice sau pentru obţinerea unei cantităţi mari de ADN pur pentru clonare
(Lodge şi colab., 2007).
Liza alcalină se realizează cu SDS care are rolul de a solubiliza fosfolipidele şi proteinele
componente ale membranei celulare ceea ce duce la fragmentarea bacteriei şi eliberarea
componentelor celulare (Liu, 2009). Înainte de aplicarea tehnicii se verifică dacă nu există alţi
acizi nucleici pe lângă ADN plasmidial.
Lizatul obţinut este trecut printr-o coloană de ioni de schimb. Această coloană se leagă
doar de acizii nucleici astfel încât proteinele şi carbohidraţii pot fi îndepărtaţi. Produsul rezultat
după îndepărtarea proteinelor şi hidraţilor de carbon este spălat cu o soluţie tampon 1M
pentru înlăturarea oricărei urme de ARN şi apoi este eluat. În lichidul de eluţie se va regăsi doar
ADN plasmidial.
Procedura purificării ADN plasmidial prin liză alcalină se realizează pe un volum mic de
celule (1,5 ml) şi presupune parcurgerea următoarelor etape:
a) O singură colonie este selectată de pe plăcile cu agar şi inoculată pe un mediu de
creştere cu antibiotice specifice, ea fiind lăsată să crească peste noapte.
b) Bacteriile sunt recoltate din cultură prin centrifugare.
c) Se adaugă o soluţie tampon bacteriilor izolate din cultură.
d) Apoi are loc liza celulelor bacteriene cu ajutorul unei soluţii ce conţine NaOH şi un
detergent (SDS). ADN se denaturează la pH alcalin. Soluţia devine vâscosă pe măsură ce
bacteriile sunt lizate şi ADN-ul este eliberat.
e) Suspensia obţinută este neutralizată cu o soluţie de acetat de potasiu 5M care are
rolul de a fragmenta celulele, inclusiv a membranei.
f) Impurităţile astfel rezultate sunt îndepărtate prin centrifugare în vederea obţinerii
unui lizat pur care conţine în principal ADN plasmidial, ARN şi proteine. În această etapă este
eliminat şi cromosomul bacterian care este adesea legat de membrana celulară. Deşi ADN
plasmidial este adesea puternic contaminat cu ARN (de la ribozomi în principal), ARN-ul nu
interferă în procesele următoare de manipulare a ADN-ului şi mai mult decât atât ajută la
precipitarea ADN-ului (Lodge şi colab., 2007).

4. Vectori cu selecţie directă

Selecţia directă a celulelor transformate care conţin plasmidul recombinant reduce

numărul de teste necesare pentru identificarea clonei dorite. Selecţia directă a clonelor cu ADN
de interes este utilizată în numeroase protocoale tehnice precum clonarea ADNc.
4 vectori reprezentaţi de plasmide permit selecţia directă a clonelor cu ADN de interes
(Tabel 2).

11
 Tabel 2. Vectori cu selecţie directă
Plasmid Dimensiune Markeri genetici
pKY228 11,0 kb ApR
9
pKN80 15,8 kb ApR
pUR2 2,6 kb ApR
pTR262 5,0 kb imunitate λ
operator lac
R
Ap = rezistenţă la ampicilină
4.1. Plasmidul pKY2289
În anul 1980, Okazaki şi colaboratorii săi au descris un plasmid (pKY2289) obţinut prin
inserţia transposonului (= fragment de ADN care se poate insera singur într-o altă regiune din
genom) ApR Tn3 în plasmidul ColE1. Celulele care conţin acest plasmid formează colonii pe
medii de cultură cu mitomicina C (=antibiotic antitumoral) deoarece este indusă sinteza
colicinei E1. În acest caz, celulele nu se pot apăra de efectul inhibitor al colicinei sintetizate.
Plasmidul cu inserţia de ADN în structura genei pentru colicina E1 în regiunile EcoRI şi SmaI nu
mai poate asigura sinteza directă de colicină. Ca urmare a acestui fapt, celulele cu plasmidul
pKY2289 formează colonii de dimensiuni normale pe mediile cu mitomicina C.
4.2. Plasmidul pKN80
Acest plasmid prezintă un fragment de ADN al fagului Mu care codifică funcţia de
distrugere a unor bacterii. Plasmidul se poate replica normal la tulpinile lizogenice, dar prezenţa
lui poate fi letală la tulpinile nelizogenice. Inserţia de ADN în regiunile HpaI sau HindIII
inactivează gena letală şi permite dezvoltarea normală a coloniilor nelizogenice cu plasmidul
pKN80. Pe baza acestui criteriu are loc selecţia directă a clonelor cu aceste inserţii.
4.3. Plasmidul pUR2
Celulele care conţin doar plasmidul pUR2 formează colonii albastre, iar cele care conţin
inserţii de ADN în regiunile unice EcoRI, BamHI sau HindIII ale aceluiaşi plasmid, formează
colonii albe.
4.4. Plasmidul pTR262
Plasmidul pTR262 permite identificarea clonelor de celule care sunt rezistente la
tetraciclină după inserţia unui fragment de ADN în acesta. Acest plasmid a fost obţinut prin
înlocuirea fragmentului PstI-EcoRI a pBR322 cu un fragment de ADN al fagului λ. Fagul λ conţine
gena represoare cI şi promotorul λ intacte. Prezenţa proteinei cI codificată de gena cu acelaşi
nume duce la represia genei Tet la pTR262. Celulele care conţin plasmidul pTR262 sunt imune la
infecţia cu fagul λ datorită proteinei cI.
Inserţia unui fragment de ADN în regiunile HindIII sau BclI ale plasmidului inhibă
expresia genei cI. Astfel în celule nu se mai sintetizează proteina cI ceea ce are ca efect expresia

12
genei Tet pentru rezistenţa la tetraciclină. Creşterea celulelor pe medii cu tetraciclină permite
selecţia directă a clonelor (Williamson, 2012).
Concluzii

Utilizarea vectorilor în ingineria genetică permite înţelegerea de către cercetători a

modului de funcţionare a genelor şi mai mult decât atât reprezintă un instrument de bază în
procesele de clonare moleculară.

Bibliografie

1. Brown, S.M., Hay, J.G., Ostrer, H. (2003), Essentials of Medical Genomics, John Wiley &
Sons INC Publication, p. 254.
2. Brown, T.A. (2015), Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, John Wiley & Sons,
Nr. 2, pp. 94-95.
3. Castilho, L.R., Moraes, Â.A., Augusto, E.F.P., Butller, M. (2008), Animal Cell Technology:
From Biopharmaceuticals to Gene Therapy, Taylor & Francis Group, pp. 493-494.
4. Clark, D.P. (2005), Molecular Biology: Understanding the Genetic Revolution, Academic
Press, p. 427.
5. Clark, D.P., Pazdernik, N.J. (2015), Biotechnology: Academic Cell, Academic Cell
Publications, Nr. 2, pp. 77-81.
6. Cseke, L.J., Kirakosyan, A., Kaufman, P.B., Westfall, M.V. (2016), Handbook of Molecular
and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Nr.3, p. 30.
7. Glover, D.M. (2013), Genetic Engineering Cloning DNA, Springer Science & Business
Media, p. 18.
8. Harisha, S. (2007), Biotechnology Procedures and Experimental Handbook, Infinity
Science Press LLC, p. 419.
9. Liu, D. (2009), Handbook of Acid Nucleic Purification, CRC Press, pp. 137-139.
10. Lodge, J., Lund., P., Minchin, S. (2007), Gene Cloning: Principles and Applications,
Garland Science, pp. 45-47.
11. Michelson, A.M., Bannister, J.V. (1984), Life Chemistry Reports, Harwood Academic
Publishers GmbH, Vol. 2, Nr.4, pp. 301-315.
12. Newton, D.E. (2014), GMO Food: A Reference Handbook, ABC CLIO, pp. 19-20.
13. Nicholl, D.S.T. (2008), An Introduction to Genetic Engineering, Cambridge University
Press, Nr.3, pp. 67-69.
14. Tauro, P., Kapoor, K.K., Yodav, K.S. (1986), An Introduction to Microbiology, New Age
International, p. 247.
15. Tripathy, G. (2010), Cellular and Biochemical Science, I.K. International Pvt Ltd, p. 815.
16. Williamson, R. (2012), Genetic Engineering 3, Academic Press, pp. 19-22.
13
17. Windelspecht, M. (2007), Genetics 101, Greenwood Press, pp. 83-84, 199.

14