Proiect

PLASMIDE I VECTORI DE CLONAJ

Studenta: Ilie Oana

Facultatea de: Bioogie
Specializarea: Biotehnologii microbiene i
celulare

Cuprins
Introducere
I. Proprietile generale ale plasmidelor
1. Clasificarea plasmidelor
2. Principalele cate gorii de gene codificate de plasmide
3. Structura molecular a plasmidelor
4. Proprietile fundamentale ale plasmidelor
II. Proprietile generale ale vehiculelor de clonaj psc101 i pbr322
1. Proprietile generale ale vectorului de clonaj pbr322
2. Proprietile generale ale vectorului de clonaj psc101
Concluzii

Introducere

n prezent, plasmidele sunt definite ca fiind repliconi neeseniali, capabili s se

replice fizic independent de cromozom i transmii n form extracromosomal, pe
vertical (de la o generaie de indivizi la alta) sau pe orizontal (de la un individ la altul n
cadrul aceleiai generaii). n general, plasmidele reprezint un fenomen al lumii procariote.
Cu toate acestea, au fost descrise structuri genetice plasmidiale i la unele grupuri de
eucariote inferioare (drojdii, fungi, mucegaiuri) i chiar i la eucariote superioare
(plasmidele din mitocondrii i cloroplaste la unele specii vegetale) (Vassu Tatiana i colab.,
2001).
Exist cercettori care ncadreaz plasmidele n categoria organismelor acelulare.
n contrast cu aceast teorie, ali cercettori consider plasmidele ca nefiind organisme, ci
alturi de virusuri, transposoni i secvene de inserie, aceasta aparine unor specii
moleculare speciale, de elemente genetice mobile (P. Sykora, 1992 citat de Vassu Tatiana i
colab., 2001).

I. Proprietile generale ale plasmidelor

1. Clasificarea plasmidelor

Dup efectul plasmidelor asupra celulelor gazd, acestea au fost denumite i

clasificate astfel:
-

Plasmide F (factori de fertilitate);

Plasmide R (de rezisten la antibiotice);
Plasmide Col (colicinogene).

Pe baza criteriului de incompatibilitate (capacitatea plasmidelor de a exclude

alte plasmide de acelai tip de la coexisten n aceeai bacterie), plasmidele au fost
mprite n grupuri de incompatibilitate. La bacteriile Gram-negative au fost descrise peste
30 de grupuri de incompatibilitate (Moldoveanu Dumitru i colab., 2001).
Dup capacitatea lor de a media transferul de material genetic, prin conjugarea
celulelor bacteriene plasmidele pot fi:
a. Plasmide conjugative (conjugoni, factori de fertilitate, transferoni, factori de
sex).
Sunt transmisibile, infecioase i controleaz stabilirea n celula gazd a strii de
donator de material genetic i apariia pililor de sex, care permit transferul de material
genetic de la celula purttoare de plasmid (donator) la celule fr plasmid (receptor). Au
n structura lor gene de replicare autonom i gene care stimuleaz formarea cuplurilor de
ncruciare ntre bacterii. Plasmidele conjugative sunt:
-

plasmide de sex (F, Hfr, F);

plasmide Ent;
unele plasmide Col i R (Moldoveanu Dumitru i colab., 2001).

b. Plasmide neconjugative.
Din acest grup fac parte unele plasmide Col i R. Nu sunt autotransmisibile i deci
neinfecioase. Nu confer starea de donator de material genetic. Sunt lipsite de genele tra
(care asigur transferul prin conjugare a materialului genetic). Transferul lor se realizeaz
prin intermediul unui fag transductor, sau datorit prezenei concomitente n celula
bacterian a unei plasmide de sex.
o n funcie de capacitatea lor de integrare n cromosomul bacterian
plasmidele se mpart n dou categorii:
Plasmide cu funcii episomale (eng. episom = corp adugat).
Aceste plasmide pot exista alternativ n stare autonom (libere n citoplasm ), sau
integrate (ncorporate n cromosom). De exemplu, plasmidele de sex F i plasmida Col E1.
Plasmide incapabile de integrare n cromosomul celulei gazd.

De exempli, factorul Col i factorul F (un derivate al plasmidei F integrate, care a

ncorporat un fragment de cromosom bacterian) (Moldoveanu Dumitru i colab., 2001).

2. Principalele categorii de gene codificate de plasmide

Fiind repliconi fizic independeni, toate plasmidele poart gene implicate n
propria replicare, stabilitate i partiie. n afar de acestea, majoritatea genelor codificate
de plasmide confer caractere adaptative, avantajoase gazdelor bacteriene. Cele mai
frecvente categorii de gene purtate de plasmide sunt:
-

gene de rezisten la antibiotice

Plasmidele de rezisten au fost descoperite n Japonia n anii 50 i izolate clinice

de Shigella dysenteriae i s-a constatat c aceste gene nu erau plasate pe cromosomul

bacterian. Au fost denumite factori R. Folosirea abuziv i/sau incorect a antibioticelor au
determinat, pe de o parte rspndirea n populaiile de bacterii patogene a determinailor de
antibiorezisten, iar pe de alt parte, dezvoltarea unor mecanisme de antibiorezisten
extrem de eficiente.
n ceea ce privete originea genelor de antibiorezisten au fost emise dou ipoteze
majore:
a) genele de antibiorezisten existente n prezent n foarte multe bacterii
patogene ar avea originea n gene similare prezente n bacteriile ce produc
antibiotice (i care, de regul, sunt bacterii din sol); n aceast situaie se
presupune c ar fi avut loc evenimente de trasfer de gene pe orizontal ntre
bacterii din sol i bacterii patogene;
b) genele de antibiorezisten ar fi evoluat din gene house-keeping (de
exemplu: proteinele ce eflueaz tetraciclina ar putea s fi evoluat din proteinele
-

de transport al nutrienilor).
gene de toleran la metale grele (ioni mercurici, derivai organomercurici, nichel,

cobalt, plumb, cadmiu, bismut, antimoniu, zinc, argint);

gene ce codific factori de petogenitate i virulen;
gene de rezisten la ageni intercalani, radiaii UV, radiaii X, bacteriofagi,

bacteriocine;
gene ce codific bacteriocine;
gene ce codific antibiotice;
gene implicate n metabolismul opinelor (plasmidele Ti de la Agrobacterium);
gene ce codific capaciti metabolice deosebite, de exemplu folosirea unor

substane xenobiotice ca unic surs de carbon i energie la specii de Pseudomonas;

gene fixatoare de azot (genele nif de la Rhizobium i Bradirhizobium);
gene ce codific enzime proteolitice, amilolitice, etc;
5

gene ce codific transferul plasmidelor pe orizontal prin proces de conjugare

bacterian .

Deci n afar de genele implicate n propria replicare, stabilitate i partiie, plasmidele

mai pot purta i gene ce codific caractere unele eseniale, altele neeseniale pentru
bacteria gazd.
Caracterele eseniale reprezint ci metabolice centrale ale celulei bacteriene,
plasmidele purttoare fiind prezente la marea majoritate a izolatelor naturale ale unor
tulpini bacteriene (de exemplu, unele plasmide mari de la Agrobacterium tumefaciens,
Rhizobium leguminosarum).
Unele caractere neeseniale confer avantaje selective gazdelor purttoare,
permind supravieuirea acestora n anumite condiii de mediu. n aceast categorie intr
genele plasmidiale ce codific rezistena la antibiotice i tolerana la metale grele
(asemenea gene sunt prezente la multe tulpini de bacterii patogene). n absena
antibioticelor sau a metalelor grele ca factori de presiune selectiv, procesele de replicare,
meninere i partiie a plasmidelor reprezint un efort metabolic suplimentar pentru celulele
bacteriene. Ca urmare, n doar cteva pasaje, aceste plasmide sunt eliminate din populaia
bacterian prin subreplicare. Ele se menin doar ntr-o proporie sczut a populaiei
bacteriene, fapt ce ar putea fi considerat o economie metabolic la nivelul ntregii
populaii bacteriene.
Exist i aa-numite plasmide criptice, care nu par s ofere gazdei nici un
caracter avantajos, interesant este faptul c dei pot fi ncadrate n categoria selfish DNA
(ADN egoist), totui i aceste plasmide sunt meninute ntr-o anumit proporie din
populaiile bacterienene (Vassu Tatiana i colab., 2001).
n ansamblu, genomul bacterian se caracterizeaz printr-o intens circulaie pe
orizontal a genelor, ntre diveri indivizi bacterieni (H. Tschape, 1994 citat de Vassu
Tatiana i colab., 2001).
Aceast circulaie se desfoar prin trei procese centrale conjugare,
transformare i transducie dintre care plasmidele sunt implicate n primele dou.
Acest flux continuu de gene pare s fie o caracteristic definitorie a lumii
bacteriene i s fi contribuit esenial la extrema versatilitate metabolic a bacteriilor n
aproape toate mediile naturale (Vassu Tatiana i colab., 2001).

3. Structura molecular a plasmidelor

6

Plasmidele sunt molecule de ADN circulare, nchise covalent. Circularitatea este o

condiie esenial pentru suptavieuirea lor n celul. Dimensiunea plasmidelor este de
aproximativ 1-2 % din mrimea cromosomului i au un coninut n baze (G+C) diferit de
cromosom, datorit informaiei genetice diferite i accesorie. Greutatea molecular a
plasmidelor variaz ntre 1,5-150 106 dal. Plasmidele pot fi gsite n celulele bacteriene n
trei forme:
1. Forma I (CCC = eng. covalently closed circular) corespunde unei molecule
dublu catenare circulare, nchis covalent, dar care prezint torsiuni ce dau
moleculei aspectul de superhelice. Sub influena unor ageni chimici (bromura
de etidiu), forma de superhelice poate s treac n forma I inelar relaxat.
2. Forma II (eng. open circular duplex sau nicked circular duplex)
corespunde formei circulare deschise, avnd o caten nchis i una deschis.
3. Forma III (plasmide multimere sau oligomere). Plasmidele au n structura lor
mai mult dect un genom. Cnd moleculele plasmidiale sunt formate din
genomuri identice legate cap la cap, ele formeaz structuri numite concatenare
(oligomere concatenate). Cnd moleculele plasmidiale circulare nchise
superhelicale, sau cele circulare deschise, sunt nlnuite ca zalele unui lan,
formeaz structuri numite catenani (oligomere catenate).

Figura 1. Structura molecular a plasmidelor

(Moldoveanu Dumitru i colab., 2001)

Noile tehnici, cum ar fi electroforeza n cmp pulsatoriu, au permis detectarea

plasmidelor lineare, precum i a celor de dimensiuni mari. Conformaiile moleculare ale
ADN plasmidial pot fi evideniate prin ultracentrifugare n gradient de clorur de cesiu sau
prin electroforez n gel de agaroz, ele prezentnd mobiliti diferite: cel mai rapid
migreaz forma linear i ultima forma circular deschis (Moldoveanu Dumitru i colab.,
2001).

4. Proprietile fundamentale ale plasmidelor

Eliminarea plasmidelor.
Plasmidele pot fi eliminate spontan sau prin tratare cu anumite substan e ca
acriflavina, rifampicina, bromura de etidiu, ionii de cobalt, etc. Aceast proprietate nu
afecteaz viabilitatea celulei gazd.
Inhibarea fertilitii (fi+).
Unele plasmide R, cnd coexist cu plasmide F n aceeai celul donatoare de E.
Coli, nu modific activitatea de transfer a plasmidelor F. Alte plasmide R reduc func ia de
fertilitate a plasmidei F cu care coexist. Aceste plasmide R prezint funcia de inhibare a
fertilitii. Fertilitatea plasmidelor F se exprim prin faptul c ele sunt mutante spontane fin
O, deci nu pot produce unul din componentele represorului.
Excluderea de suprafa.
O plasmid prezent ntr-o bacterie produce anumite modificri ale suprafeei
celulare, ceea ce creeaz o barier fizic fa de ptrunderea unei plasmide identice.
Barierea este specific. De exemplu, n cazul bacteriilor F+, modificare mpiedic
ptrunderea unei plasmide F identice.
Fenomenul de incompatibilitate a plasmidelor.
Incompatibilitatea corespunde situaiei cnd dou plasmide omologe, dup
ptrunderea lor n celul, nu pot fi meninute stabil n aceeai bacterie, deoarece una o
exclude pe cealalt indiferent care este rezident i care este de suprainfecie. Fenomenul se
prezint ca un proces polarizat. n cazul cnd plasmide diferite ca structur pot coexista n
8

aceeai bacterie, ele sunt compatibile (Collins, 1977 citat de Moldoveanu Dumitru i colab.,
2001).
Pe baza acestui criteriu plasmidele au fost grupate n grupuri de incompatibilitate,
deoarece exist o mare omologie ntre plasmidele din acelai grup de incompatibilitate i o
foarte mic asemnare ntre plasmidele compatibile. Incompatibilitatea reprezint cel mai
adecvat criteriu de clasificare a plasmidelor. Un membru al unui grup de incompatibilitate
nu poate coexista ntr-o celul cu alt membru al aceluiai grup, dar poate coexista cu oricare
membru al unui grup de incompatibilitate (Moldoveanu Dumitru i colab., 2001).

II. Proprietile generale ale vehiculelor de clonaj psc101 i

pbr322
1. Proprietile generale ale vectorului de clonaj pbr322
Plasmidul pbr322 a fost unul dintre primii vectori EK2 de clonare multifunc ional
proiectai (acum 10 ani n urm) pentru clonarea eficient i selectarea moleculelor de ADN
recombinant din Escherichia coli.
Aceast molecul de ADN a fost folosit pe scar larg ca un vehicul de clonare
datorit simplitii i a disponibilitii secvenei sale de nucleotide. Utilizarea pe scar larg
a vectorului de clonare pbr322 a determinat numeroase studii asupra structurii moleculare i
a funciilor sale.
Aceste studii au relevat dou caracteristici care au afectat eficacitatea plasmidelor
ca vectori de clonare: instabilitatea plasmidelor n absena seleciei i lipsa unui sistem de
selecie direct pentru moleculele de ADN recombinant.
Mai muli vectori care se bazeaz pe vectorul pbr322 au fost construi i pentru a
depi aceste limitri i pentru a extinde versatilitatea vectorului de a gzdui n scopuri
speciale clonarea (Balbas P. i colab., 1986).

2. Proprietile generale ale vectorului de clonaj psc101

n ultimii ani, a existat un interes experimental considerabil pentru plasmida
psc101, care a fost folosit ca un vehicul de clonaj al ADN-ului, ca un model de replicon
9

pentru a investiga replicarea plasmidului ADN, sau ca un donator al genomului n studiul

rezistenei antibioticelor. nainte de transformare, acest plasmid a fost izolat de la
Escherichia Coli (Stanley N. Cohen i Annie C. Y. Chang, 1977).
Aceast plasmid prezint un numr mediu de copii (6-7) per echivalent
cromosomal i are o gen de rezisten la tetraciclin. ntreaga plasmid (9263 pb) a fost
secveniat.
Prin analize de deleii s-a constatat c regiunea replicativ a acestei plasmide
reprezint un fragment de 2,2 kpb ce este cuprins ntre situsurile a dou enzime de restric ie
Hinc II i Rsa I.
Aceast regiune replicativ are 3 zone majore:
1. regiunea par foarte important pentru stabilitate i afecteaz i numrul de
copii;
2. regiunea ori de la care pornete replicarea unidirecional i care confer
majoritatea situsurilor necesare pentru replicare i pentru incompatibilitate;
3. gena repA care este o gen specific plasmidial i codific o protein de
replicare.
Plasmidul pSc101, mpreun cu fagul P1 i cu o serie de alte plasmide apar in unei
clase de repliconi a cror replicare nu este realizat de ADN polimeraza. Aceti repliconi
codific o protein autoreglat (RepA) esenial pentru replicare i posed copii repetate
direct ale unei secvene ce este specific pentru fiecare plasmid i la care se ataeaz
proteina RepA.
Proteina RepA este alctuit din 316 aminoacizi i funcioneaz ca dimer.
Promotorul genei repA conine o secven parial omoloag cu repetri directe. Astfel,
RepA are specificitate de ataare i la propriul promotor autoreglndu-i propria exprimare.
n procesul prin care aceast protein controleaz replicarea plasmidei, RepA se ataeaz la
cele 3 secvene participnd la iniierea replicrii. Eficiena de legare a lui RepA la cele 3
secvene RS pare s moduleze numrul de copii plasmidiale.
Meninerea stabil a plasmidului pSC101 n celula bacterian presupune
intervenia mai multor clase de proteine: DnaA, DnaB, IHF, DnaC, DnaG, precum i
diverse componente proteice ale holoenzimei ADN polimeraza III (Vassu Tatiana i colab.,
2001).

10

Concluzii

1. Toate plasmidele poart gene implicate n propria replicare,

stabilitate i partiie.
2. Plasmidul pbr322 a fost unul dintre primii vectori de clonare
multifuncional proiectai pentru clonarea eficient i selectarea moleculelor
de ADN recombinant din Escherichia coli.
3. Plasmida psc101, care a fost folosit ca un vehicul de clonaj al
ADN-ului, ca un model de replicon pentru a investiga replicarea plasmidului
ADN, sau ca un donator al genomului n studiul rezistenei antibioticelor.
11

Bibliografie

1. Balbs P, Sobern X, Merino E, Zurita M, Lomeli H, Valle F, Flores N, Bolivar F.,

1986 - Plasmid vector pBR322 and its special-purpose derivatives--a review. Gene,
50(1-3): 3-40.
2. Moldoveanu Dumitru, Militaru Costin, Moldoveanu Iulia, 2001 Microbiologie i
inginerie genetic. Editura FIAT LUX, Bucureti, p. 125-157.
3. Stanley N. Cohen i Annie C. Y. Chang, 1977 Revised interpretation of the origin of
the pSC101 plasmid. J Bacteriol., 132(2): 734737.
4. Vassu Tatiana, Stoica Ileana, Csutak Ortansa, Muat Florin, 2001 Genetica
microorganismelor i inginerie genetic microbian. Note de curs i tehnici de
laborator. Editura Petrion, Bucureti, p.23-45.
12

13