TRANSFORMAREA GENETICA A TRESTIEI DE ZAHAR

MEDIATA DE Agrobacterium tumefaciens: OBTINEREA DE

PLANTE TRANSGENICE, EXPRESIA PROTEINELOR CU
VALOARE AGRONOMICA SI INDUSTRIALA

Realizat de:
Burueana Cristina Liliana
Ilie Geanina
Ilie Oana

Cuprins
Introducere
Tulpina bacteriana si plasmidele
Transformarea genetica a trestiei de zahar
Rezultate si discutii
Concluzii
Bibliografie

Introducere
Trestia de zahar cultura importanta pentru multe tari din intraga lume
Investitia in incercarile de inmultire - cea mai buna abordare pentru maximizarea productiei
de trestie de zahar.
Inmultirea trestiei de zahar poate beneficia foarte mult de utilizarea metodelor
neconventionale
Ingineria genetica poate scurta nu numai perioada de timp si reduce costurile pentru a
produce o linie de productie imbunatatita de trestie de zahar
De asemenea, in genomul de trestie de
zahar
noi
trasaturi
agronomice
importante ce sunt absente in mod
natural in germoplasma acestei specii,
cum ar fi: rezistenta la daunatori si
erbicide. In cateva culturi, rezistenta la
atacul fungic a fost sporita prin
exprimarea proteinelor anti-fungice din
plantele transgenice

 Prin inginerie genetica, creste calitatea

plantei ca materie bruta pentru productia
de zahar sau /si a altor sub-produse.
In plus, capacitatea inalta de producere de
biomasa si cerintele agronomice scazute,
face trestia de zahar un candidat excelent
pentru a fi utilizata ca bioreactor in sinteza
de noi produse pentru aplicatii medicale si
industriale.
Ca aplicatie interesanta, a fost aprobata expresarea levan-zaharazei de la Acetobacter
diazotrophicus (LsdA) in plantele transgenice.

Aceasta enzima actioneaza asupra

sucrozei, rezultand cantitati mari de 1Kestoza o fructo-oligo-zaharida
(FOS) ce este utilizata in scop
comercial pentru alimentatia sanatoasa
atat a oamenilor cat si a animalelor.

 Agrobacterium tumefaciens, a fost utilizat pe scara larga, ca mijloc pentru

transformarea genetica a plantelor dicotiledonate, ulterior el fiind folosit si la
monocotiledonate.

Avantajele transformarii genetice mediata

de Agrobacterium:
- numarul mai mic de copii transgenice;
- mai putine probleme in instabilitatea
genelor.

Materiale si metode
Pentru obtinerea unei culturi
aseptice de trestie de zahar s-au
folosit explantele

Ja60-5 si

B4362 in mediul de cultura MS

(Murashige i Skoog).

Compozitia mediilor de cultura pentru transformarea genetica a trestiei de zahar,

mediata de Agrobacterium cu ajutorul tulpinilor Ja60-5 SI B4362

Pentru testele de transformare genetica, au fost luate sectiuni de ax de la

cultivatele de trestie de zahar cultivate pe camp, mai vechi de 6 luni, si sterilizate
prin imersarea intr-o solutie de 1,5% NaClO (acid hipo-cloros), timp de 20 de
minute.
Sensibilitatea explantelor meristematice
Ja60-5 si B4362 obtinute in vitro si
crescute in camp, la diferite concentratii
de

PPT

si

hygromicina,

fost

determinata pe timpul diferitelor faze de

cultura.

`Tulpina bacteriana si plasmidele

S-a utilizat tulpina At2260 de Agrobacterium tumefaciens .
Bacteria a fost crescuta pe mediu de cultura YEB, suplimentat cu rifampicina (50
mg/L), carbenicilina (50mg/L), ampicilina (100mg/L), streptomycina (100mg/L) si
spectinomycina (100mg/L).
Pentru stabilirea protocolului transformarii directe a fost utilizata plasmida pGT
GUSBAR ce poarta genele A uid si bar .
Plasmidele suplimentare au fost construite
pentru

expresia

levan-zaharazei

de

la

Acetobacter dazotrophicus (LsdA) (pHES82 si

pHES83) si co-expresia gluconazei si Ap24
(pHGA58)

sau

chitinaza

si

gluconaza

(pHGA59).
Plasmidele au fost introduse in A. tumefaciens
prin protocolul transformarii directe.

Transformarea genetica a trestiei de zahar

Efectul antioxiantilor (Ao) din trestia de zahar
asupra viabilitatii celulare a meristemului si
cresterii Agrobacterium, au fost studiate la
diferite intervale de incubare.
Conditiile optime ale culturii de calus, s-a stabilit in prezenta compusilor acidul
ascorbic (15 mg/l), cisteina (40 mg/l) si azotatul de argint (2mg/l).
A. tumefaciens care adaposteste plasmida binara pGT GUSBAR a fost crescut pe
mediu YEB.
Celulele au fost colectate prin centrifugare si
resuspendate in volumul initial de P+5,
mediu suplimentat cu antioxidanti (LP+5Ao).

Diagrama descrierii procedurii care permite transformarea genetica a doua soiuri de trestie
de zahar cultivate in scop comercial

 Calusurile PPT- rezistente au fost taiate si subcultivate in fiecare luna pe mediu P+5 Sel
timp de 3 luni. Rezistenta la PPT a calusurilor mici a fost confirmata de catre metoda cu
clorofenol rosu.
Calusurile capabile sa creasca in mediul care contine PPT produce un halo galben dupa
24 de ore de incubare. Regenerarea a fost efecuata pe mediu P+ conform procedurii
standard.

 Studiile asupra plantelor transgenice cultivate in sera au fost realizate prin cresterea
acestora in ghivece.
Aplicarea erbicidului BASTA in 2,5 g/L solutie a fost realizata prin pulverizare timp de
60 de zile dupa plantare.
Rezistenta a fost evaluata din punct de vedere calitativ. Plante care nu au avut de
suferit la nivel foliar, datorita toxicitatii au fost cele cultivate in camp.

La final, s-a realizat analiza

Southern

blot

Sambrook

descrisa
Fritsh

de

(1989),

folosind ca sonda un fragment de

ADN de 1,2 kb care este marcat
cu 32 P cu un sistem de primoGene (Promega).

 Rezultate obtinute:
- analiza explantelor meristematice de trestie de zahar izolate in vitro sau
cultivate in teren este de obicei insotita de necroza tisulara destul de mare;
- aceste simptome sunt indepartate in timpul interactiunii tesut - A.
tumefaciens mai ales in explantele cultivate in teren;
- in scopul reducerii necrozei, explantele de Ja60-5 i B4362 au fost tratate cu
o combinatie de compusi antioxidanti;
- viabilitatea celulara a fost evaluata cu metoda de colorare albastru de
Evans;
- meristemele trestiei de zahar au raspuns pozitiv la acest tratament cu o
reducere semnificanta a necrozei si moartea calusului. Amestecul de
antioxidanti acid ascorbic, cisteina, si azotat de argint nu au afectat nici
cresterea Agrobacterium nici calitatea calusului trestiei de zahar.

Rezultate si discutii
o A fost studiat efectul inhibitor al PPT asupra esuturilor meristematice n diferite
faze de cultur.
o Att meristemelor de la plantele cultivate in vitro, ct i celor provenite de la
plantele cultivate pe teren, le-a fost stopat creterea i apoi au murit, la
adugarea unei cantiti de 4 mg/l PPT.

o S-a demonstrat c cea mai bun

concentraie de PPT pentru selecie
este de 4 mg/l i c este foarte
important utilizarea acestui agent
selectiv doar 10 zile de co-cultur.

o Aplicarea seleciei cu PPT imediat dup co-cultivare, a determinat o reducere a

activitii GUS n a aptea zi, de 29-5 puncte (locuri, spoturi) pentru Ja60-5,
respectiv 40-14 puncte pentru B4362, din cauza reducerii activitii celulare;
o Pe de alt parte, ncorporarea PPT n mediul de cultur la a 14-a zi dup cocultivare a avut ca rezultat o mbuntire a activitii GUS de la 3 la 26 puncte
pentru Ja60-5, respectiv de la 7 la 49 puncte pentru B4362 ;
o Aceste rezultate, pot fi explicate prin prezena ntr-o proporie foarte mare,
celule transformate n explant.

Tabelul 1. Influena seleciei cu PPT asupra eficienei de transformare a activitii GUS n

Ja60-5 i B4362 cultivate n momente diferite cu un agent de selecie

de

o Cele mai multe colonii de celule recuperate dup

prima lun de selecie cu PPT au proliferat
atunci cnd au fost subcultivate pe un mediu
selectiv proaspt.
o Plantele au fost regenerate cu uurin atunci
cnd esuturile rezistente au fost transferate pe
un mediu de regenerare fr PPT.

o Un numr mare dintre aceste plante au fost

rezistente la erbicidul BASTA n condiii de
ser. Analiza de Southern blot pe plantele
rezistente la erbicidul BASTA a confirmat
integrarea transgenic.

o Protocolul anterior a fost utilizat pentru a ob ine plante transgenice de B4362,

transformate cu construciile genetice pHCA58 i pHCG59;
o Calusurile rezistente la PPT derivate din infec ie, au dat na tere la plante n mediul de
regenerare;
o Numrul de calusuri rezistente i numrul total de plante regenerate folosind pHCG59 a
fost mai mare n comparaie cu cele la care s-a folosit pHCA58.
o Toate plantele obinute utiliznd plasmida pHCA58 (151 plante) i plasmida pHCG59
(227 plante) au fost adaptate pentru condi iile de ser, iar la nl imea de 50 cm au fost
transferate n condiii de cmp;
o n plus, 12 plante netransformate au fost folosite ca martori.

Tabelul 3. Eficiena de transformare n B4362 a trestiei de zahr cu dou combinaii de gene

antifungice

o Higromicina a fost raportat ca un agent selectiv eficient

pentru speciile de monocotiledonate;
o A fost necesar o concentraie de 120 mg/l de antibiotic
pentru a inhiba dezvoltarea meristematic a trestiei de
zahr, n timpul formrii de calus;

o Transformarea a avut loc folosindu-se plasmidele pliES82 i

pliES83:

o Celulele transformate formeaz calusuri separate clar de esutul necrozat.

o n etapa de regenerare higromicina, n cantitate de 30 mg/l a fost suficient pentru a distruge
esutul netransformat.
o Plantele rezistente la higromicin au fost transferate n sere i transgenele au fost detectate prin
PCR.
o Plasmidele pliES82 i pliES83 au fost concepute pentru expresia enzimei i localizarea n
apoplast i vacuol, respectiv cu scopul de a converti trestia de zahr ntr-o surs de
fructooligozaharide.

Concluzii
Dificultile n transferul de gene mediat de A. tumefaciens
la monocotiledonate este legat de rata de supravieuire
slab a celulelor int;
Prin utilizarea unui pretratament antinecrotic asupra
explantelor meristematice au fost realizate randamente
bune de transformare cu o tulpin obinuit de A.
tumefaciens, un vector binar genetic convenional, i fr
utilizarea inductorilor chimici (acetosiringone).

Bibliografie

Ariel D. Arencibia PhD, 2000 - Plant Genetic Engineering Towards the

Third Millennium, Editura Elsevier, Amsterdam, Lausanne, New York,
Oxford, Shannon, Singapore, Tokyo

Va multumim pentru
atentie!