ȘCOALA POSTLICEALĂ SANITARĂ

,,CAROL DAVILA,, - GALAȚI

REFERAT LA DISCIPLINA:

MICROBIOLOGIE

TEMA
COLORAȚIA GRAM

NEGRU CRISTINA
Asistenți Medicali
An I
 COLORATIA GRAM

1. SCOP

Instrucţiunea descrie operaţiunile necesare efectuarii coloratiei Gram din produsul

patologic si in culturi pe medii selective si neselective.

2. MOD DE LUCRU

Resurse necesare

Reactivi componenti ai trusei Gram :

 Solutie violet de gentiana : 1g violet de gentiana, 10ml etanol absolut, 2g

fenol cristalizat, 90 ml apa distilata
 Solutie lugol : 1g iod, 2g iodura de potasiu, 300ml apa distilata
 Amestec etanol-acetona : 3 parti etanol 96+ 1 parte acetona
 Solutie fuxina fenicata : 1g fixina bazica, 10ml etanol absolut, 5g fenol
cristalizat, 90ml apa distilata

Materiale : lame microscopie curate, microscop cu obiectiv imersie (90-100x), ulei

de imersie, solutie salina fiziologica, hartie de filtru, apa curenta.

Execuţia coloratiei Gram

Frotiu din produsul patologic: se roteşte tamponul pe suprafaţa lamei, nu se freacă

de lamă pentru a nu strica structura
celulelor

Frotiu din cultură : se depune o picătură de soluţie salină 0.85% pe lamă în care se
emulsionează o porţiune de colonie suspectă, fie cu ansa, fie cu un tampon (pe care
se poate executa ulterior reacţia Oxidazei).

Frotiurile se usucă la aer şi apoi se fixează la flacără (încălzire uşoară)

Coloraţia :

a). violet de genţiană 1min., spălare cu apă curgătoare

b). lugol 2min.

c). decolorare cu alcool-acetonă, secunde (frotiul devine roz)

d). spălare cu apă curgătoare

e). fuxină fenicată diluată 1/10 in apa distilata 1min.

f). spălare şi uscare

Examinare la microscop cu imersie :

a. Frotiu din produs patologic : (ex) Neisseria gonorrhoeae apare sub formă de
diplococi reniformi Gram negativi,extra- şi intra-PMN

b. Frotiu din cultură : (ex)Neisseria gonorrhoeae apare sub formă de coci reniformi
Gram negativ, în diplo, terade sau grămezi

Rezultatul examinarii se inregistreaza in Formularul inregistrare rezultate.

2.3. Controlul de calitate al coloratiei

Se execută un frotiu din amestec de culturi de 18 h de E.coli (sigur Gram negativ)

şi Staphylococcus aureus (sigur Gram pozitiv),

care se colorează în paralel cu frotiurile din produsul patologic sau culturile de

testat.
3. CRITERII DE ACCEPTARE / RESPINGERE

Coloraţia este validată numai în cazul în care frotiurile de control au aspectul

caracteristic : E.coli Gram negativ şi Staphylococcus aureus, Gram pozitiv
 Despre colorația GRAM

Colorația Gram este o colorație compusă folosită în microbiologie pentru

examenul microscopic al bacteriilor, care a permis clasificarea acestora în
funcție de afinitatea tinctorială a peretelui bacterian. Metoda a fost inventată de
bacteriologul danez Hans Christian Gram, în anul 1884.

Procedura se bazează pe reacția dintre peptidoglicani din pereții celulari ai unor

bacterii. Colorația Gram presupune colorarea bacteriilor, fixarea culorii cu un
mordant, decolorarea celulelor și aplicarea unui contracolor.

1. Colorația primară ( violet cristal ) se leagă de peptidoglican, colorând

celulele violet. Atât celulele gram-pozitive, cât și cele gram-negative au
peptidoglican în pereții lor celulari, așa că inițial, toate bacteriile colorează
violet.
2. Iodul Gram ( iod și iodură de potasiu) se aplică ca mordant sau
fixativ. Celulele Gram pozitive formează un complex cristal violet-iod.
3. Alcoolul sau acetona sunt folosite pentru a decolora celulele. Bacteriile
Gram-negative au mult mai puțin peptidoglican în pereții lor celulari, astfel
încât acest pas le face în esență incolore, în timp ce doar o parte din culoare
este îndepărtată din celulele gram-pozitive, care au mai mult peptidoglican
(60-90% din peretele celular). Peretele celular gros al celulelor gram-
pozitive este deshidratat prin etapa de decolorare, provocându-le să se
micșoreze și prinzând complexul colorat-iod în interior.
4. După etapa de decolorare, se aplică o contrapătă (de obicei safranină, dar
uneori fucsină) pentru a colora bacteriile în roz. Atât bacteriile gram-
pozitive, cât și cele gram-negative preiau pata roz, dar nu este vizibilă peste
violetul mai închis al bacteriilor gram-pozitive. Dacă procedura de colorare
este efectuată corect, bacteriile gram-pozitive vor fi violete, în timp ce
bacteriile gram-negative vor fi roz. Rezultatele colorației Gram sunt
vizualizate folosind microscopie cu lumină . Deoarece bacteriile sunt

1
 colorate, nu numai că este identificat grupul lor de colorație Gram, dar pot fi
observate forma , dimensiunea și modelul lor de aglomerare. Acest lucru
face din colorația Gram un instrument valoros de diagnostic pentru o clinică
sau un laborator medical. În timp ce pata poate să nu identifice cu siguranță
bacteriile, adesea știind dacă sunt gram-pozitive sau gram-negative este
suficient pentru a prescrie un antibiotic eficient.

Unele bacterii pot fi gram-variabile sau gram-nedeterminate. Cu toate acestea,

chiar și aceste informații pot fi utile în restrângerea identității bacteriene. Tehnica
este cea mai fiabilă atunci când culturile au mai puțin de 24 de ore. Deși poate fi
folosit pe culturi de bulion, cel mai bine este să le centrifugi mai întâi. Limitarea
principală a tehnicii este că dă rezultate eronate dacă se comit greșeli în
tehnică. Practică și abilități sunt necesare pentru a obține un rezultat de
încredere. De asemenea, un agent infecțios poate să nu fie bacterian. Agenții
patogeni eucarioți colorează gram negativ. Cu toate acestea, majoritatea celulelor
eucariote, cu excepția ciupercilor (inclusiv drojdia), nu reușesc să se lipească de
lamă în timpul procesului.

Pași

1. Puneți o picătură mică de probă bacteriană pe o lamă. Fixați cu căldură

bacteriile pe lamă trecând-o de trei ori prin flacăra unui arzător
Bunsen. Aplicarea prea multă căldură sau pentru prea mult timp poate topi
pereții celulelor bacteriilor, deformându-le forma și ducând la un rezultat
inexact. Dacă se aplică prea puțină căldură, bacteriile vor spăla lama în
timpul colorării.
2. Folosiți un picurător pentru a aplica pata primară (violet cristal) pe
diapozitiv și lăsați-o să stea timp de 1 minut. Clătiți ușor lama cu apă nu mai
mult de 5 secunde pentru a îndepărta petele în exces. Clătirea prea lungă
poate elimina prea multă culoare, în timp ce nu clătirea suficient de lungă
poate permite să rămână prea multă petă pe celulele gram-negative.
3. Folosiți un picurător pentru a aplica iod Gram pe lamă pentru a fixa cristalul
violet de peretele celular. Lasă-l să stea timp de 1 minut.
4. Clătiți lama cu alcool sau acetonă aproximativ 3 secunde, urmată imediat cu
o clătire ușoară cu apă. Celulele gram-negative își vor pierde culoarea, în
timp ce celulele gram-pozitive vor rămâne violete sau albastre. Cu toate
acestea, dacă decolorantul este lăsat prea mult timp, toate celulele își vor
pierde culoarea!

2
 5. Aplicați pata secundară, safranina, și lăsați-o să stea timp de 1 minut. Clătiți
ușor cu apă nu mai mult de 5 secunde. Celulele gram-negative ar trebui să
fie colorate în roșu sau roz, în timp ce celulele gram-pozitive vor apărea în
continuare violet sau albastru.
6. Vizualizați lama folosind un microscop compus. Poate fi necesară o mărire
de la 500x la 1000x pentru a distinge forma și aranjamentul celulei.

Nu toate bacteriile identificate prin colorația Gram sunt asociate cu boli, dar câteva
exemple importante includ:

 Coci gram-pozitivi (rotunzi): Staphylococcus aureus

 Coci gram-negativi:  Neisseria meningitidis
 Bacili Gram pozitivi (tije):  Bacillus anthracis
 Bacili Gram negativi:  Escherichia coli