PREPARATE MICROSCOPICE.

COLORAȚII

Preparate microscopice folosite in bacteriologie:

I. Preparatul nativ (denumiri sinonime: preparat între lamă și lamelă = proaspăt = umed =
necolorat):
- folosit frecvent în:
• parazitologie – mai ales pentru examene coproparazitologice;
• micologie – mai ales pentru examinarea fragmentelor de fanere (unghii, păr);
- folosit rar în bacteriologie.
Tehnica
- se pune o mică cantitate din produsul patologic pe o lamă sterilă: se pune ca atare dacă
este lichid / dizolvat intr-un diluent daca este solid (se pune inițial o picătură de ser fiziologic
steril și apoi o mică cantitate de produs solid); se amestecă pentru omogenizare în cazul
produselor solide, fără a întinde amestecul pe lamă;
- se aplică peste amestec o lamelă de sticlă cu o latură pe lamă, apoi se înclină la 45° și
se lasă să cadă ușor peste preparat;
• dacă cantitatea de lichid este prea mare, se contaminează mediul din jur;
• dacă cantitatea de lichid de pe lamă este prea mică, apar bule de aer sub lamelă care
împiedică examinarea microscopică;
- se examinează microscopic uscat:
• se folosesc obiectivele mici de x10, x20, x40;
• obiectivul este ridicat la o anumita distanta de preparat
• condensatorul se află la o mică distanță sub preparat.
II. Frotiul (preparat fixat/permanent):
- se foloseste frecvent în bacteriologie, dar și în parazitologie și micologie.
Tehnica – parcurge 3 etape:
1. Etalarea frotiului (întinderea frotiului) - se descriu mai multe variante tehnice:
a) frotiu din produs lichid (produs patologic lichid sau cultură bacteriană în mediu lichid):
- se pune pe o lamă sterilă o picătură de produs lichid (cu pipeta sau ansa buclă sterilă,
de plastic, de unică folosință);
- se întinde produsul pe lamă, cu ansa buclă, prin mișcări circulare, într-un strat cât mai
subțire (lamele trebuie să fie degresate pentru ca tehnica de întidere să fie eficientă);
b) frotiu din produs solid (produs patologic solid sau cultură pe mediu solid):
- se pune pe o lamă sterila degresată o mică cantitate de ser fiziologic steril, peste care
se adaugă o mică cantitate de produs; se amestecă cu ansa buclă pentru omogenizare;
- se întinde amestecul cu ansa buclă prin mișcări circulare ântr-un strat cât mai subțire;
c) frotiu din grunji de puroi (puroi cu cruste, foarte dur):
- se pun grunjii de puroi în mijlocul unei lame sterile;
- se adaugă deasupra o altă lamă căreia i se imprimă o mișcare de translație ușoară
față de prima; prin separarea lamelor se obțin 2 frotiuri;
d) frotiu din amprenta de țesut/organ:
- se aplică cu pensa sterilă un fragment de țesut în centrul lamei sterile, apoi se aruncă;
amprenta rămasă pe lamă reprezinta frotiul.
Observații: un frotiu corect întins trebuie să aibă următoarele caracteristici:
- să fie rotund sau ovalar (este posibil dacă lama a fost bine degresată);
- să fie omogen;
- să fie transparent;
- să nu atingă marginile lamei.
2. Uscarea frotiului: se lasă frotiul pe masă, acoperit parțial cu capacul unei plăci Petri.
3. Fixarea frotiului – se poate face în 2 moduri:
a) prin caldură:
- folosită pe scară largă fiind ieftină, rapidă și accesibilă oricărui laborator;
- constă în trecerea frotiului cu fața inferioară de 2-3 ori prin flacara becului Bunsen (prin
flacăra de gaz);
- se testează prin atingerea frotiului de tegumentul părții dorsale a mâinii stângi; dacă se
obține o senzație de arsură suportabilă, fixarea este suficientă;

1 / LP 1  M
 • o fixare prea intensă carbonizează frotiul care devine nefolosibil;
• o fixare insuficientă duce la spălarea frotiului de pe lamă în momentul colorării;
b) cu substanțe chimice: se folosește rar, pentru produse patologice care sunt deteriorate
de căldură.
Frotiurile sunt ulterior colorate.

Colorații – 3 categorii folosite în bacteriologie:

I. Colorații simple - se folosește un singur colorant - se observă morfologia bacteriilor, nu
și tinctorialitatea lor (tinctorialitate = afinitatea față de diverși coloranți.
Colorația cu albastru de metilen:
• tehnica:
- se pune lama cu frotiul fixat pe un suport de lame;
- se toarnă albastru de metilen 1% pe suprafața frotiului;
- se lasă 1-2 minute;
- se varsă colorantul;
- se spală lama cu apă de robinet ;
- se lasă să se usuce pe un stativ;
- se examinează microscopic - se observă că toate elementele vizibile pe frotiu sunt
colorate în albastru;
• avantaje:
- este foarte rapidă și accesibilă;
- are valoare mai ales în 2 situații clinice:
* pentru diferențierea rapidă a unei bacterii (de ex. stafilococ alb) de o levură (de
ex. Candida) care au creștere asemănătoare pe medii de cultură;
* pentru o mai bună observare a germenilor din genul Neisseria (meningococii în
LCR și gonococii în secrețiile vaginale/uretrale).
II. Colorații diferențiale
- folosesc 2 sau mai mulți coloranți;
- permit observarea morfologiei dar și a tinctorialității bacteriilor.
a) Colorația Gram:
- este principala colorație folosită în bacteriologie;
- tehnica are 4 etape:
1. colorarea:
• se pune o lamă cu un frotiu fixat pe un suport de lame ;
• se acoperă frotiul cu soluție de violet de gențiană 1%;
• se lasă 1-2 minute;
2. mordansarea (fixarea colorantului):
• se toarnă peste frotiu soluție Lugol (conține iod);
• se lasă 2-4 minute;
3. decolorarea:
• se toarnă peste frotiu un amestec decolorant alcool-acetonă 3:1 până când lichidul
care curge de pe lamă devine incolor;
• imediat se spală frotiul cu apă de robinet;
4. recolorarea:
• se pune lama din nou pe suport;
• se acoperă frotiul cu soluție de fucsină bazică 1% diluată extemporaneu (chiar în
momentul utilizării) 1/10 cu apă distilată;
• se lasă 1-2 minute;
• se spală frotiul cu apă de robinet;
• se lasă să se usuce pe un stativ de lame;
• se examinează microscopic;
 bacteriile Gram pozitive = violet
 bacteriile Gram negative = roșu pal;
- mecanismul colorației:
• în prima etapa toate bacteriile se colorează violet;
• soluția Lugol conține iod care are capacitatea de a se lega atât de peptidoglicanul
din peretele bacterian cât și de violetul de gențiana jucând un rol de mordant (= fixator de
colorant).
2 / LP 1  M
 • bacteriile Gram pozitive: au perete celular bogat în peptidoglicani (până la 80%) ce
va forma multiple legături cu violetul de gențiană, stabilizate și de mordant; prin adăugarea
amestecului alcool-acetonă, legăturile nu se destabilizează și bacteriile răman violet până
la finalul colorației;
• bacteriile Gram negative: au un perete celular subțire cu puțin peptidoglican (5-20%
din grosimea peretelui), se decolorează și se recolorează în roșu cu fucsină în etapa finală.
b) Coloratia Ziehl-Neelson
- se utilizează în suspiciunea de tuberculoză;
- este o colorație în 3 timpi:
1. colorarea:
• se pune lama cu frotiul fixat pe un suport de lame;
• se acoperă frotiul cu soluție de fucsină bazică 1%;
• se încălzește lama pe dedesubt cu o flacară, în mod repetat, până la emisia de vapori
din colorant (nu trebuie să fiarbă colorantul); când începe emisia de vapori, se așteaptă până
nu mai ies vapori, se reia apoi procedura în același mod până la 10 minute;
• se lasă lama cu frotiul să se răcească după 10 minute;
2. decolorarea:
• se toarnă peste frotiu un amestec decolorant acid-alcool, până când lichidul care
curge de pe lamă devine incolor;
• se spală lama cu apă de robinet;
3. recolorarea:
• se așează din nou lama pe suport;
• se acoperă frotiul cu soluție de albastru de metilen 1%;
• se lasă 1-2 minute;
• se spală frotiul cu apa de robinet;
• se lasă să se usuce într-un stativ pentru lame;
 bacteriile acido-alcoolo-rezistente se colorează în roșu;
 restul elementelor de pe frotiu se colorează în albastru;
- bacilii acido-alcoolo-rezistenti (BAAR) sunt agenții tuberculozei de obicei, făcând parte
din genul Mycobacterium.
III. Colorații speciale
- sunt utilizate pentru componente bacteriene greu colorabile datorită densității crescute a
conținutului și permeabilității scăzute a învelișurilor:
a) Colorații pentru capsulă:
• colorația cu tuș de China – colorează în negru;
• colorația rosu Kongo – colorează în roșu;
* observație: capsula bacteriană este vizibilă și pe frotiurile colorate cu colorații diferențiale
/ simple dar apare necolorată, refringent[, în jurul corpului bacterian colorat; ex.: stafilococ
violet și capsula incoloră în jur, bacil gram negativ roșu și capsula incoloră în jur.
b) Colorații pentru spori bacterieni:
• colorația cu verde malahit: sporii apar colorați în verde și corpul bacterian în roșu; sporii
sunt vizibili și pe frotiuri colorate cu colorații simple / diferențiale dar incolori, refringenți;
c) Colorații pentru cili:
• impregnarea argentică.
Examinarea microscopica a preparatelor
Preparatele native se examinează microscopic uscat.
Frotiurile se examinează microscopic cu imersie:
- se pune in mijlocul preparatului o picătură de ulei de imersie (exemplu - ulei de cedru);
- se ridică condensatorul la maximum, lipit de fața inferioară a preparatului;
- se folosesc obiective de imersie (x90, x100, x120), coborâte până în picătura de ulei ;
- se recomandă, ca și în cazul frotiurilor, să se practice inițial o examinare uscată, pentru a
alege un câmp microscopic mai sugestiv, pe care se va utiliza apoi examinarea cu imersie;
a) examinarea microscopică a frotiului efectuat din produsul biologic recoltat de la pacient
(examinare microscopică directă) permite observarea:
- rețea de fibrină: este normală în preparat;
- celule epiteliale: este normal să fie prezente;
- leucocite – pot fi: limfocite sau PMN:

3 / LP 1  M
 • dacă sunt multe PMN, sugerează o infecție bacteriană; numărul mare de leucocite
în raport cu celulele epiteliale sugerează prezența unui proces inflamator;
• dacă sunt multe limfocite - sugerează o infecție virală sau tuberculoză.
- hematii: nu întotdeauna au semnificație, pot apărea datorită manevrei;
- bacterii din flora normală a zonei sau agenți etiologici ai unor infecții (bacterii, levuri);
b) examinarea microscopica a frotiurilor din culturi bacteriene: pe frotiuri sunt vizibile doar
bacteriile – se poate verifica puritatea culturilor bacteriene obținute (dacă sunt pure sau
mixte).

4 / LP 1  M