Studiul morfologiei bacteriene

Coloratia simpla Coloratia Gram

 Examinarile

bacteriologice urmaresc evidentierea si identificarea bacteriilor din produse patologice. metodele folosite in acest scop, studiul caracterelor morfologice este o etapa foarte importanta.

 Dintre

 Bacteriile

avind dimensiuni de ordinul m, nu pot fi vazute cu ochiul liber, de aceea examinarea lor se efectueaza cu ajutorul microscopului.

Anthoni van Leeuwenhoek (1632-1723) a fost primul care a (1632studiat bacterii si alte microorganisme la microscop

microscopic se executa fie direct din produsele patologice (examen microscopic direct), fie din culturi pure.  Preparatele microscopice sint de 2 feluri:  - preparat nativ, cu germeni vii  - frotiu sau preparat colorat, cu germeni omoriti
 Examenul

microscopic da indicatii asupra prezentei microorganismelor in preparat si asupra proprietatilor morfotinctoriale:  - forma (bacili, coci, spirili)  - marimea  - mobilitatea ( in preparatul nativ )  - existenta eventuala a formatiunilor neobligatorii ( cili, capsula, spori)
 Examenul

-

asezarea in frotiu ( lant, ciorchine, diplo-, diplotetrade, etc)  - proprietatile tinctoriale ( colorabilitatea ) Examenul microscopic direct din produsele patologice permit in unele infectii stabilirea diagnosticului ( gonococ, bacil tuberculos, stafilococ ) si constituie o etapa esentiala in identificarea bacteriana.

Preparatul nativ ( cu germeni vii )

 Ex.

microscopic al preparatului nativ reprezinta examinarea directa intre lama si lamela a unei suspensii de germeni vii intrintr-o picatura de ser fiziologic, sau mediu de cultura lichid, precum si a produsului patologic (singe, sediment urinar, lcr).

 Examinarea

prep. nativ are implicatii restrinse si nu da informatii asupra tuturor proprietatilor morfologice ale bacteriilor, de aceea este obligatorie completarea lui cu examinarea preparatului colorat.

Examenul microscopic al unui preparat colorat (frotiu)

 Proprietatile

morfotinctoriale ale bacteriilor pot fi studiate mai detailat pe preparate fixate si colorate, cu germeni omoriti . Mai rar se folosesc coloratii vitale, spre ex. in reactia de umflare a capsulei .

Timpii de executie a preparatului colorat

pregatitori:  - etalarea = intinderea frotiului  - uscarea  - fixarea ( procedee fizice - prin incalzire si chimice: cu alcool metilic, etilic, alcool eter, acid acetic )
 Timpi

Fixarea
 Scopul

fixarii este multiplu:  - microorganismele sint omorite=preparat neinfectios  - preparatul adera mai bine de lama  - prin omorirea microorganismelor se mareste permeabilitatea peretelui celular si se produc modificari ale citoplasmei, care cresc afinitatea fata de coloranti = detalii fine de strucura

Coloratia
 Procedeu

fizicofizico-chimic complex, in care colorantii se combina cu constituenti celulari, facindu-i vizibili la microscop. facinduColorantul se absoarbe, apoi se dizolva si difuzeaza in continutul celular , unde are loc formarea unei combinatii stabile. Colorarea se executa de obicei prin acoperirea suprafetei frotiului fixat cu colorant, care se lasa sa actioneze un timp limitat, la cald sau la rece.

Tipuri de coloratii
 

Coloratia simpla, se executa cu un singur colorant Coloratia combinata, care se realizeaza prin actiunea succesiva sau simultana a mai multor coloranti, fiecare colorant actionind independent si fixindu-se pe anumite elemente fixindu- coloratii speciale: pentru formatiuni morfologice celulare si extracelulare: corpusculi, cili, spori, capsula

Coloratia simpla
-

frotiul fixat  - se acopera complet cu un singur colorant: albastru de metilen sau fuxina, timp de 1-2 min. 1 se spala cu apa si se usuca  in coloratia cu albastru de metilen toate elementele se coloreaza in albastru  in coloratia cu fuxina, toate elementele se coloreaza in rosu

Coloratia simpla
 Permite

stabilirea unor proprietati morfotinctoriale ca: forma si marimea microorganismelor, precum si existenta unor elemente celulare  Este utila in diagnosticul prin ex. microscopic direct din produsul patologic in gonoree, meningita cerebrospinala epidemica etc

Coloratii combinate: coloratia Gram

 Larg

utilizata in microbiologie, pentru ca deosebeste germenii gram pozitivi de cei gram negativi, orientind cercetarea in directia identificarii lor.

Hans Christian Gram (medic danez)

Coloratia Gram Tehnica de colorare

    

Frotiul fixat este acoperit cu violet de gentiana : 1-2 1min. (Se spal cu ap de la robinet ). Se acopera cu o solutie de lugol pentru mordansare, 2 min. (Se spal cu ap ). Decolorare cu alcool-acetona timp de 20 sec, pina nu alcoolse mai dizolva colorant. (Se spal cu ap ). Se recoloreaza cu fuxina diluata/ safranina , 2 min.( Se spala cu apa ) Se usuca frotiul si se examineaza cu imersie.

 Germenii

gram + rezista la decolorare si isi mentin culoarea albastru violet initiala; germenii gram se decoloreaza si se recoloreaza in rosu cu fuxina/safranina.

Coloratia Gram

 Diferenta

de comportament in coloratia Gram se explica prin structura si compozitia chimica diferita a peretelui celular la bacteriile gram+ si gram -.

Christian Gram recognized two different types of bacteria based on reaction to certain staining procedure.

Coloratia Gram permite constituirea urmatoarelor grupe de bacterii:

coci gram + : streptococi, stafilococi, pneumococi  - coci gram - : meningococ, gonococ  - bacili gram + : bacillus antracis ( bacilul carbunos), corynebacterium diphteriae ( bacilul difteric), listeria monocitogenes, clostridium botulinum ( bacilul botulinic), clostridium tetani ( bacilul tetanic)
-

gram - : E. Coli ( bacilul coli ), Klebsiella, Pseudomonas ( bacilul piocianic), Salmonella typhi ( bacilul tific )  Cococbacili gram - : haemophilus influenzae, bordetella pertusis, brucela
 Bacili

Coci Gram +, dispusi in gramezi

Coci Gram+, dispusi in lanturi

Bacili Gram -

Bacili Gram +

Coci Gram +

Cocobacili Gram +

Coci Gram + si Cococbacili Gram +

Frotiu lcr colorat Gram

Trusa comerciala pt coloratia Gram