LP 3

Examenul microscopic în diagnosticul bacteriologic. Coloraţii utilizate în bacteriologie și

parazitologie (ex. coproparazitologic, amprenta anală si recunoașterea paraziților în sânge)

Obiective: La sfârşitul acestei lucrări practice studenţii trebuie:

1. Să identifice părţile unui microscop optic şi să il manipuleze corect în scopul efectuării
unui examen microscopic.
2. Să cunoască etapele efectuării unui preparat microscopic în laboratorul de
microbiologie (preparat umed, frotiu).
3. Sa cunoască tipurile de coloratii utilizate în microbiologie.
4. Să cunoască etapele coloraţiei Gram şi să interpreteze rezultatele controlului de
calitate al acesteia.
5. Să cunoască importanţa medicală a coloraţiei Gram.
6. Să descrie corect caracterele morfo-tinctoriale ale bacteriilor observate la examenul
microscopic al unui frotiu colorat.
7. Sa cunoască avantajele şi dezavantajele examenului microscopic.
8. Sa cunoască particularitatile ex. coproparazitologic.
9. Sa cunoască indicatiile efectuarii amprentei anale.
10. Sa cunoască particularitatile ex. parazitologic al sangelui.

1. Microscopul optic este format din:

⮚ o parte mecanică (talpa, braţul microscopului, suportul condensorilor, masa port
obiect);
⮚ sistemul optic (obiective, oculare);
⮚ sistem de iluminare.
Puterea de mărire a unui microscop = produsul dintre puterea de mărire a obiectivului, a
ocularului şi a capului binocular (pentru microscoapele binoculare).
▪ aprox. 1000X – examen cu obiectiv cu imersie

2. Preparate microscopice
a. Preparate microscopice umede – indicatii, tehnica, interpretare
- microscopia pe fond intunecat
b. Preparate microscopice colorate – principiu, indicatii
- frotiul – definitie: materialul microbian (produs patologic, cultură microbiană) etalat în
strat cât mai subţire şi uniform pe suprafaţa unei lame de microscop.
- etapele efectuarii unui frotiu (demonstratie practica efectuarea frotiu din
cultura pe mediu solid)
1. Etalarea.
2. Uscarea.
3. Fixarea

3. Tipuri de coloraţii:
⮚ simple: albastru de metilen
⮚ diferenţiale: Gram, Ziehl Neelsen
1
 ⮚ speciale (flageli, spori, incluzii)

4. Coloraţia Gram
Principiu: Peretele bacterian nu este colorabil, dar prin structura sa chimică condiţionează
colorabilitatea protoplastului în coloraţiile diferenţiale. Bacteriile Gram pozitive rezistă la
decolorarea cu amestecul alcool-acetonă şi rămân colorate violet, cele Gram negative se
decolorează si, pentru a fi observate, trebuie recolorate în roşu.

Etapele coloraţiei diferenţiale Gram (demonstratie practica):

● - Colorarea - violet de metil
● - Mordanţarea – solutie Lugol
● - Diferenţierea - amestec alcool acetonă
● - Recolorarea - soluţie de fucsină fenicată Ziehl diluată 1/10
Rezultat : bacterii gram pozitive = violet
bacterii gram negative = roşii
Controlul de calitate : - frotiul efectuat din produs patologic - leucocitele sunt întotdeauna roşii.
- frotiu martor
Surse de eroare: subdecolorarea, supradecolorarea
5. Importanţa medicală a coloraţiei Gram
● Prima etapă în identificarea bacteriilor
● Orientează antibioterapia de primă intenţie
● Permite alegerea celui mai adecvat mediu de cultură pentru însămânţare
Microscopia cu imersie – etape
6. Descrierea caracterelor microscopice ale bacteriilor:
- forma – coci, bacili, cocobacili
- variaţia formei- coci rotunzi, ovali, lanceolaţi, în boabă de cafea
- bacili cu capetele rotunde, cu capetele tăiate drept, cu capetele măciucate
- aşezarea: în grămezi neregulate, în lanţuri, în diplo, în litere chinezeşti
- mărime relativă: mic, mare
- afinitatea tinctorială
- prezenţa capsulei
- prezenţa sporului: marime: deformant, nedeformant
forma: oval, sferic
aşezare: central, terminal, subterminal
7. Avantajele examenului microscopic:
⮚ Permite o depistare rapida a microorganismelor;
⮚ Are un cost redus;
⮚ Este uşor de efectuat;
⮚ Orientează următoarele etape de diagnostic microbiologic;
⮚ Se pot evidenţia bacterii necultivabile sau care cresc lent;
⮚ Ofera informaţii semicantitative (1 bacterie/câmp ~ 10 5 UFC/ ml). Acestea sunt utile
în interpretarea rezultatelor (ex. examenul microscopic în diagnosticul infecțiilor cu

2
 condiționat patogeni), care pot fi si membrii ai florei normale, dar si, în anumite
condiții, agenți etiologici.
Dezavantajele examenului microscopic: - sensibilitate si specificitate reduse.
Sensibilitate: se referă la pragul de pozitivitate - o cultură sau un produs patologic cu ˂10 3
UFC/ml, va genera un rezultat fals negativ (microscopia poate evidentia bacterii peste 10 3
UFC/ml). Importanța in diagnostic: când tabloul clinico-epdeimiologic este sugestiv, dar
microscopia negativă, se urmărește mai departe cultura (cultivarea fiind mai sensibilă).
Specificitate: caracterele microscopice rar sunt suficiente pentru a defini specia (S.
penumoniae, C. diphteriae, C. tetani), ele fiind doar orientative (ducând la concluzia: gen
(Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clsotridium) sau doar familii (Enterobacteriaceae,
Pseudomonadaceae etc.).
8. Ex. coproparazitologic
- examenul parazitologic al materiilor fecale - metoda de diagnostic folosita pentru
evidentierea parazitilor (protozoare, helminti) cu localizare intestinala sau care se elimina prin
tubul digestiv.
- examenul microscopic:
▪ direct – preparat umed – in ser fiziologic sau solutie Lugol – detectarea protozoarelor
(trofozoizi si chisturi, ex. Giardia), oua de helminti (ex. Ascaris), sange, mucus. Studiul
mobilitatii si al morfologiei.
▪ preparatul in strat gros (metoda Kato-Miura) – detecteaza si identifica ouale de helminti
cu localizare intestinala (ex. Ascaris)
▪ preparat dupa concentrarea elementelor parazitare – pentru esantioane cu numar mic
de oua de helminti
a) concentrare prin flotare (solutii hipertone) – pentru oua usoare (ex. Taenia)
b) concentrare prin sedimentare (solutii hipotone) – pentru oua grele (ex. Ascaris)
▪ frotiu colorat – identificarea protozoarelor (trofozoizi si chisturi), oua helminti
- coloratie May-Grunwald-Giemsa, Ziehl-Neelsen
9. Amprenta anala - diagnosticul oxiurozei si teniazei cu Taenia saginata
-recoltare din pliurile anale cu ajutorul unei benzi adezive (celofan/scotch) si a unei
baghete de sticla
10. Examenul parazitologic al sangelui
- ex. direct -frotiu – colorat May-Grunwald-Giemsa – permite evidentierea
elementelor parazitare (dg. de specie) si a modificarilor hematiilor.
- picatura groasa - metoda de concentrare – dg. de specie dificil (parazitii apar
retractati)

Bibliografie:
1. D. Buiuc. Microbiologie medicala, 2003, pag. 32-38
2. S. Radulescu, Parazitologie medicala, 2001, pag. 29-33

In sala se gasesc:
▪ bateria pentru coloratia Gram
▪ lame de sticla curate
▪ ansa de platina, spirtiera
▪ cultura bacteriana pe mediu solid

3
▪ ser fiziologic steril, pipete sterile
▪ recipient cu dezinfectant
▪ frotiu martor Gram
▪ frotiuri din cultura (stafilococ, BGN, Bacillus spp) colorate Gram
▪ frotiu din sputa colorat Gram
▪ frotiu din sange colorat MGG