Examinarea caracterelor de cultură și colonie ale fungilor

Identificarea unei tulponi de fungi dintr-o probă mixtă presupune parcurgerea

etapelor:
Izolarea și cultivarea m.o. în cultură pură;
Examinarea caracterelor de cultură și de colonie după însămânțarea pe diferite
medii de cultură;
Examenul microscopic;
Determinarea caracterelor biochimice prin însămânțare pe diferite medii de
cultură ce conțin diferite substanțe asupra cărora acționează m.o. prin intermediul
anumitor enzime din echipamentul lor enzimatic;
Testarea sensibilității la antibiotic (prin tehnica antifungigramei).
 Caractere de cultură evidențiate pe medii lichide

 Momentul apariției culturii, evidențiat prin creșterea turbidității mediului;

 Gradul de dezvoltare al culturii: intens sau slab;
 aspectul: omogen sau neomogen al culturii (în acest ultim caz cultura
poate prezenta flocoane sau precipitate);
 Formarea depozitului când se urmărește:
- intensitatea depozitului (abundant sau sărac);
- aspectul depozitului: granular, vâscos/flocular:;
 Formarea vălului (membranei) la interfața mediu-aer, când se urmăresc
următoarele caractere:
- grosimea membranei (subțire/groasă);
- aspectul membranei (netedă/încrețită);
- consistența (umedă/uscată);
- aderența la pereții tubului;
- rezistența la agitare/friabilitate.
 Caractere de cultură evidențiate pe medii solide

 Momentul apariției culturii;

 Gradul de dezvolatre al culturii-anumite specii de fungi filamentoși acoperă
întreaga suprafață a mediului de cultură din placă (Rhizopus sp.), alte specii
prezintă creșterea limitată la zona de inoculare (Apergillus ustus);
 Consistența culturii (culture uscate, pufoase, pulverulente, umede sau
prăfoase);
 Culoarea culturii, determinate de capacitatea de pigmentogeneză și de tipul
pigmenților: paracromopari (secretați și eliberați în mediu), cromofori (stocați
în citoplasmă), paracromofori (stocați la nivelul peretelui cellular sau a
structurilor extraparietale);
 Mirosul culturii.

Pentru caracterele de cultură se notează:

- dimensiunea coloniilor (colonii punctiforme, mici cu diametrul de 1-2mm,
mijlocii, mari);
- forma coloniilor: circulară/filamentoasă/neregulată, rizoidă/fuziformă;
- aspectul coloniei: întergi/ondulate/lobate/dințate/filamentoase/arborescente;
- profilul coloniei: plat/plat ridicat/convex/crateriform/umbonat;
- suprafața coloniei:netedă/ucată/umedă/încrețită/rugoasă;
- consistența coloniei:vâscoasă/mucoasă/uscată.
A. niger A. niger A. niger
cultură 24 ore cultură 48 ore - cultură 48 ore -
avers revers

Descriere microscopică:
Aversul coloniei:
- forma sferic-ovalară
- marginea dreaptă, ușor
neregulată
- profilul plat
- colonia este de culoare
A. niger neagră
A. niger
cultură 48 - aspectul coloniei este
cultură 48 ore
ore - avers pudros
- revers
Reversul coloniei:
- culoare gri închis, fără
pigment difuzat în mediu.
 Pentru izolarea levurilor, însămânţarea prelevatelor se face pe Agar
Sabouraud aditivat cu cloramfenicol. Acest mediu permite o bună
dezvoltare a levurilor şi supresează multiplicarea eventualelor bacterii
contaminante.

 Pentru levurile lipodependente ale genului Malassezia, cultivarea

prelevatelor se face fie pe Agarul Sabouraud cu cloramfenicol pe
suprafaţa căruia s-a etalat prin striere o fină peliculă de ulei de măsline
sterilizat prin autoclavare, fie pe medii speciale (Dixon, Leeming).

 Pe Agar Sabouraud cu cloramfenicol, culturile mixte apărute prin

asocierea a două sau mai multe specii de levuri sunt uneori dificil de
observat, de aceea ideal ar fi ca însămânţarea prelevatelor să se facă pe
un mediu diferenţial cromogen, care pe lângă discriminarea între speciile
levurice poate aduce informaţii esenţiale pentru identificarea agentului
etiologic. Se realizează astfel într-o singură etapă, atât izolarea, cât şi
identificarea levurii / levurilor incriminate.
 Pe mediile de izolare, levurile de interes medical se dezvoltă
în 24-72 ore de incubare. În funcţie de provenienţa
prelevatului se va face şi alegerea temperaturii de incubare.
Pentru prelevatele provenind din situsuri în care în mod
normal temperatura este identică cu cea a organismului, se
va alege temperatura de 37°C pentru incubare.

 În cazul celor provenind de la nivelul tegumentului sau

unghiilor, incubarea se va face atât la 37°C, cât şi la 30°C,
deoarece unele levuri cultivabile la 30°C dar necultivabile la
37°C, pot avea semnificaţie clinică fiind cauza unor micoze
superficiale.
 În cazul dermatofitozelor, se recomandă ca primocultura să
se efectueze în plăci Petri şi nu în tuburi, deoarece atât
însămânţarea cât şi manoperele ulterioare sunt mult
facilitate.

 Mediul de elecţie pentru izolarea dermatofiţilor este Agarul

Mycobiotic (Agar Sabouraud aditivat cu cloramfenicol şi
cicloheximidă); prezenţa cloramfenicolului suprimă
dezvoltarea bacteriilor care pot contamina prelevatul, iar
cicloheximida (Actidione) inhibă multiplicarea fungilor
contaminanţi, facilitând izolarea dermatofiţilor.

 Materialul patologic se însămânţează în mai multe puncte

pentru a creşte probabilitatea izolării dermatofiţilor şi a putea
acorda semnificaţie clinică tulpinii izolate.
 Cu cât numărul punctelor de însămânţare pozitivate este mai mare, cu atât
implicarea clinică a tulpinii izolate este mai sigură. Este posibilă şi
însămânţarea prin înglobarea prelevatului în mediul de cultură, însă
interpretarea semnificaţiei clinice devine mai dificilă. Incubarea se
realizează la 25°-30°C, timp de cca. 4 săptămâni.

 Când se suspicionează o infecţie cu T. verrucosum, plăcile se vor incuba

la 37°C (creştere accelerată). În cazul absenţei sporulării în primocultură,
tulpinile se pot pasa pe medii speciale care favorizează producerea
macroconidiilor şi pigmentogeneza: mediul Lactrimel (Borelli), PDA, agar
peptonă 3%. Se recomandă observarea culturilor de 2 ori / săptămână
pentru a surprinde în dinamică aspectele caracteristice coloniilor de
dermatofiţi.

 Importante din punct de vedere diagnostic sunt viteza de creştere,

caracterele morfologice macro- şi microscopice. La unele specii de
dermatofiţi apar aşa-numitele „formaţiuni ornamentale” care reprezintă de
fapt hife cu aspect modificat, al căror rol nu este încă elucidat: hife „în
rachetă” sau cu aspect de „tijă de bambus”, candelabre favice, hife
spiralate (vrile), celule osiforme (aspect de „ganteră”), organe nodulare,
hife pectinate.
 Tehnica de purificare a izolatelor levurice

După obţinerea primoculturii, se va verifica obligatoriu puritatea acesteia

deoarece contaminarea bacteriană este indezirabilă în acţiunea ulterioară
de identificare a speciei. În acest scop, se pregătesc fie preparate între
lamă şi lamelă, fie frotiuri colorate Gram care se examinează la microscop,
cu obiectivul de imersie. În cazul prezenţei bacteriilor, se recurge la
pasarea tulpinii în bulion Sabouraud aditivat cu acid clorhidric soluţie 1N.
După incubare şi reverificare prin coloraţia Gram, se epuizează 0,1 ml din
tubul cu numărul maxim de picături de HCl care a permis dezvoltarea
levurilor, pe suprafaţa unui Agar Sabouraud cu cloramfenicol în vederea
obţinerii coloniilor purificate.
Figura 1-Purificarea
izolatelor levurice –
metodologie de lucru
Bibliografie selectivă
1. Bazgan O (1999) - Diagnostic de laborator şi igiena alimentelor de origine animală; Ed. Moldogrup; Iaşi.
2. Buiuc D, Neguţ M (1999) - Tratat de microbiologie clinică; Ed. Medicală; Bucureşti.
3. Coman I, Mareş M (2000) - Micologie medicală aplicată; Ed. Junimea; Iaşi.
4. Constantinescu O (1974) - Metode şi tehnici în micologie; Ed. Ceres; Bucureşti.
5. Golăescu M (1997) - Diagnosticul şi tratamentul micozelor interne; Ed. Viaţa Medicală Românească; Bucureşti.
6. Grillot R (1996) - Les mycoses humaines démarche diagnostique; Elsevier; Paris.
7. Guého E, Midgley G, Guillot J (1996) - The genus Malassezia with description of four new species; Antonie van Leeuwenhoek;
69:337-355.
8. Hoog G S de, Guarro J, Gené J, Figueras M J (2000) - Atlas of clinical fungi; 2nd edition; Centraalbureau voor Schimmelcultures /
Universitat Rovira i Virgili.
9. Ribes J A, Vanover-Sams C L, Baker D J (2000) - Zygomycetes in Human Disease; Col Rev; 2(13):236-301.
10. Ribes J A, Vanover-Sams C L, Baker D J (2000)– Zygomycetes in Human Disease; Col Rev ; vol. 13(2): 236-301.
11. Mareș M (2007)-Tehnici de laborator în micologia medicală, Editura Pim, Iași.
12.Gheorghe I, Ditu LM, Mitache MM, Avram I-Manual de micologie aplicată, Ed. Universității Titu Maiorescu, Ed. Hamangiu,
București, 2019.