Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de fungi

Aspecte clinice, izolarea i identificarea (prelevarea probelor, examenul

microscopic direct, nsmnarea pe medii de cultur)
Micozele sau infeciile fungice

Aspecte clinice
Polimorfe
Diversitateaspeciilorafectatesia localizarilor
Micozelesuntsuspectatedeseoridupaeseculaltor
terapii
Colectarea probelor
Prelevare probe: biopsie tisular, aspiraie, raclare se evit pe ct posibil
utilizarea tampoanelor
Tehnici aseptice n obinerea tuturor probelor decontaminarea zonelor
adiacente de piele sau mucoas (nu este recomandat pentru dermatofii)
Trimiterea prelevatelor ctre laborator n cel mai scurt timp posibil evitarea
deshidratrii !
Procedurile invazive trebuie aplicate cnd este cazul, n favoarea pacientului
bronhoscopie, lavaj alveolar, cateterizare, biopsie, aspiraie
Procesarea prelevatelor imediat dup recepia n laborator (cele umede)
EXAMENUL MICROSCOPIC DIRECT
Scuame, fragmente unghiale: calcofluor, KOH
Fire de pr:
n cazul firelor de pr, se pot observa hife i artrospori rezultai prin
fragmentarea hifelor. Localizarea acestor elemente dermatofitice care
invadeaz tija pilar, ofer indicii privind etiologia afeciunii
3 tipuri de parazitare: endo-ectotrix, endotrix i favic
tipul endo-ectotrix-artrosporii rezultai n urma fragmentrii filamentelor
miceliene apar att n interiorul, ct i la exteriorul firului de pr; deosebim
subtipuri de parazitare, n funcie de diametrul i numrul sporilor:
- subtipul microsporic(spori cu diametrul de cca. 2m, extrem de numeroi,
formnd un manon compact i bine evideniat n jurul tijei pilare -ntlnit la M.
audouinii, M. canis, rar la M. ferrugineum);
-subtipul microid (spori cu diametrul de cca. 2m, formnd un manon mai
puin dens; ntlnit la T. erinaceii T. mentagrophytes);
-subtipul megasporic(spori mai mari n diametru, msurnd cca. 4-5 m i
formnd un manon nentrerupt; ntlnit la T. equinumi T. verrucosum).
tipul endotrix, la care artrosporii rezultai prin segmentarea filamentelor
miceliene din interiorul tijei pilare, vor determina fragmentarea firului de pr;
n aceste fragmente de mici dimensiuni sunt observabili la microscop numeroi
spori de form rotund care nlocuiesc practic medulara pilar. Acest mod de
parazitare se ntlnete la T. tonsurans, T. Violaceum i T. Soudanense
tipul favic, la care filamentele miceliene intrapilare sunt numeroase i
formeaz adevrate galerii n interiorul firului de pr, galerii ce devin vizibile
microscopic sub forma unor benzi de culoare brun, cu traiect rectiliniu, uneori
cu ramificare dicotomic; se ntlnete la T. schoenleinii.
Aspergillus
filamente5-10 um
septate, dichotomicramificate
MEDII DE CULTIVARE
Medii neselective: Suport creterea majoritii speciilor fungice i bacteriene
contaminante i patogene: Sabouraud Dextrose Agar; Potato Dextrose agar;
Brain Heart Infusion agar; Cornmeal agar
Medii selective: Conin antibiotice selective pentru inhibarea dezvoltrii
contaminanilor bacterieni sau fungici: Brain Heart Infusion cu cloramfenicol i
gentamicin, Agar Mycobiotic sau Mycosel (cicloheximid)
Medii difereniale: Includ suplimente de cretere sau reageni ce permit
mbuntirea dezvoltrii anumitor fungi sau detecteaz unii produi
metabolici: Trichophyton Agars, Niger seed agar, Mediul Christensen (testarea
ureazei), mediile cromogene (ChromAgar Candida, Candiselect4, Chromogenic
Candida Agar)
SABOURAUD DEXTROSE AGAR
AVANTAJE
A sporulare mbuntit
B permite creterea majoritii fungilor
DEZAVANTAJE
A -dezvoltarea contaminanilor bacterieni
B -dezvoltarea contaminanilor fungici
C -cretere slab a unor fungi pretenioi metabolic
CORNMEAL AGAR (Agar cu fin de porumb)
AVANTAJE
Apermite o bun difereniere a levurilor
B accentueaz producia de pigment
DEZAVANTAJE
A creterea contaminanilor bacterieni
B creterea contaminanilor fungici
BHI cu antibiotice (Infuzie cord-creier cu antibiotice)
AVANTAJE
A inhib creterea contaminanilor fungici i bacterieni
B permite dezvoltarea fazei filamentoase la fungii dimorfici
DEZAVANTAJE
A -inhib Nocardia asteroides
B inhib unele tulpini de Cryptococcus neoformans
C inhibit faza levuric a fungilor dimorfici
PDA (Agar cu extract de cartof glucozat)
AVANTAJE
A permite o bun dezvoltare pentru majoritatea fungilor
B mbuntete sporularea
DEZAVANTAJE
A nu inhib dezvoltarea bacteriilor
B nerecomandat ca mediu de izolare
Aditivi pentru mediile de izolare a fungilor
Gentamicin ( 50 g/ml) + cloramphenicol (50 g/ml)
Ciprofloxacin (5 g/ml)
Cycloheximid (0.5 mg/ml)
Snge defibrinat de berbec (10%)
Utilizarea cycloheximidei
Previne mascarea fungilor cu cretere lent de ctre coloniile speciilor cu
dezvoltare rapid
Inhib dezvoltarea unor specii cunoscute ca patogene
Permite izolarea speciilor de fungi dimorfici cu cretere lent
Obligatoriu se va folosi n paralel i un mediu fr cycloheximid
Cycloheximida---Fungi inhibai:
Aspergillus fumigatus
Cryptococcus neoformans
Pseudallescheria boydii
Candida krusei
Trichosporon species
Utilizarea plcilor Petri
Suprafa larg pentru izolarea coloniilor
Aerarea culturilor este mbuntit
Faciliteaz pregtirea preparatelor microscopice
Contaminare destul de frecvent
Mai puin sigur de manipulat n laborator
Deshidratare frecvent dac grosimea mediului nu este adecvat
Utilizarea eprubetelor pentru cultivare
Deshidratare redus ??
Suprafa redus pt izolarea coloniilor individuale
Dac dopul este fest, culturi neviable
Manipulare mai sigur n laborator
Mai dificil de pregtit preparatele din culturi
Incubarea culturilor:30C este optim i recomandat
Umiditatea relativ trebuie s fie mare
30-40 ml mediu per plac
Protecie cu parafilm
Tuburile trebuie meninute orizontal 30-45 min
Colorani pentru preparatele microscopice:Lactophenolcotton blue
Lactophenolaniline blue
Tehnici de examinare microscopic a fungilor din culturi:
Examenul microscopic al fragmentelor de colonii fungice urmrete:
-Aspectul hifelor septate sau nu
-aspectul miceliului difuz, gros, colorat, incolor
-Prezena i tipul sporilor sexuai zigospori, ascospori
-Prezena corpilor fructificani asexuai (tipul i aspectul sistemului sporal,
aranjarea (mbinarea) conidioforilor i a sporangioforilor, forma, culoarea,
mrimea i eventuala septare a sporului)
-prezena i tipul unor structuri particulare: rizoizi, stoloni, scleroi.

Tehnici folosite pentru studiul morfologiei microscopice a fungilor obinui n
urma nsmnrii prelevatelor :
-Levuri frotiuri (colorate Gram, cu albastru de metilen, etc) sau preparate
extemporanee ntre lam i lamel cu tu de India sau lactofenol i albastru de
anilin
-Fungi filamentoi -preparate extemporanee cu lactofenol i albastru de anilin,
preparate cu band adeziv sau preparate obinute prin cultivarea pe lam

Preparatul extemporaneu cu lactofenol i albastru de anilin (levuri)
-Este o metod rar utilizat pentru studierea morfologiei levurilor
-Este expeditiv
-Se examineaz la microscop x10, x20, x40, x100
-se pune o cantitate redus, astfel nct densitatea suspensiei obinute s fie
mic
-Se preleveaz cu ajutorul unui ac sau a unei microspatule un fragment de
dimensiuni milimetrice din colonia de examinat
-Se etaleaz n pictura de lactofenol de pe lam i se dilacereaz cu micri
fine miceliul, utiliznd 2 ace
-se acoper cu o lamel curat, se nclzete uor la flacr pentru a obine un
film ct mai fin de lactofenol i eliminarea bulelor de gaz
-se examineaz la microscop la x10, x20, x40, x100

Preparatul extemporaneu cu band adeziv
-Se prelev structurile fungice de la nivelul coloniilor cu ajutorul unui fragment
de band adeziv transparent (tip scotch), cu care se amprenteaz marginea
coloniei
-fragmentul de band adeziv se lipete pe o lam cu o pictur de lactofenol
Pentru coloniile care sporuleaz intens (Aspergillus spp., Penicilium spp., etc) se
recomand pregtirea a 2-3 preparate cu banda adeziv din acelai loc: prima
va fixa sporii, iar urmtoarele vor recolta conidioforii (se surprind toate
aspectele utile ncadrrii taxonomice).

Lutarea preparatelor extemporanee
-Este necesar pentru a evita evaporarea lichidului de montare
-suprafeele lamei i lamelei pe care se aplic substanele de etanare, trebuie
s fie perfect uscate i curate
-Substanele folosite la etanare nu trebuie s reacioneze cu lichidul de
montare, s fie impermeabile, elastice, persistente i s adere de suprafaa
sticlei
-acestea sunt: -rinile naturale (colofoniul, guma arabic, erlacul, balsamul de
Canada), lacul pentru unghii, Cimentul Thorner (Glyceel), amestecul de cear
galben de albine i colofoniu, amestecul de colofoniu i lanolin (60%
respectiv 40%)

Identificarea fungilor filamentoi
Fungi hialini septai
hife septate, uneori pigmentate in vitro, niciodat in vivo
nmulire asexuat prin spori externi CONIDII
Conidiile sunt produse la nivelul unor hife specializate, cu morfologie
particular CORPI FRUCTIFICANI sau CONIDIOFORI
Celulele productoare de conidii FIALIDE
------Preparatul cu band adeziv (tip scotch)
------Preparatul cu band adeziv (varianta modificat)
Aspergillus:
Morfostructural, fungii acestui gen se caracterizeaz prin prezena unor
formaiuni de fructificare cu aspect particular, cunoscute sub denumirea de
capete aspergilare
Conidioforii sunt lungi i se termin cu o vezicul de diferite forme
Pe vezicul se prind unul sau dou rnduri de celule conidiogene alungite
n funcie de numrul rndurilor de celule conidiogene, capetele aspergilare
pot fi uniseriate (un singur rnd de celule conidiogene fialidele) sau biseriate
(dou rnduri de celule conidiogene metule + fialide).
Speciile genului Aspergillus pot fi uniseriate (prezint doar capete aspergilare
uniseriate), uni-biseriate (prezint n aceeai cultur att capete aspergilare
uniseriate, ct i biseriate) sau biseriate (prezint doar capete aspergilare
biseriate).
Aceste fialide produc i elibereaz prin strangulare- conidiile dispuse sub
form de lanuri
Specii uniseriate de interes medical
A. clavatus, A. glaucus, A. restrictus, A. fumigatus
Specii uni-biseriate de interes medical
A. niger, A. candidus, A. ochraceus, A. flavus
Specii biseriate de interes medical
A. versicolor, A. nidulans,A. ustus, A. Terreus

Fusarium
peste 100 specii de fungi fitopatogeni sau saprobioi n sol.
Coloniile au cretere rapid, atingnd un diametru de peste 7 cm n 10 zile
(PDA).
Textura coloniilor este lnoas, iar culoarea aversului i reversului variaz n
limite largi: alb, roz, crem, galben, purpurie, roie, brun, albastr sau
albastr-verzuie.
Microscopic se observ hife hialine, septate, care dau natere din loc n loc
unor conidiofori aciculari, terminai cu fialide productoare de conidii.
Conidiile sunt de dou tipuri: macroconidiilungi, cu 2-5 septe, fusiforme sau
curbate sub form de pstaiei microconidiiscurte, uni-sau bicelulare,
elipsoidale, sferice, clavate sau reniforme, dispuse n grmezi (solidarizate ntr-
o mas gelatinoas) sau lanuri scurte.

Paecilomyces
aproximativ 40 specii de fungi saprobioi n mediul ambiant, pe substraturi
vegetale n descompunere.
Unele dintre acestea (P. javanicus, P. lilacinus, P. marquandii, P. variotii) au
fost ocazional semnalate n infecii la om, n general la pacieni
imunocompromii.
Unele specii sunt termotolerante dezvoltndu-se la 37C (P. lilacinus) , 40C (P.
Variotii) sau termofile (P. crustaceus), la 45C.
Coloniile au aspect catifelat sau pulverulent, cretere rapid, culoare alb,
orange-pal, crem, roz, violet-deschis sau galben-brun.
Celulele conidiogene (fialidele) iau natere la nivelul unor conidiofori
ramificai sau nu, cu lungime variabil n funcie de specie (50-600 m). Ele sunt
alungite, dilatate la baz i se ngusteaz treptat spre apex
Conidiile sunt unicelulare, hialine sau uor pigmentate, netede sau echinulate,
au diverse forme (ovoidale, fusiforme, cilindrice) i sunt dispuse sub form de
lanuri divergente.
Ca i la Penicillium, conidioforii se ramific sub form de verticil (emergena
elementelor de fructificare a fialidelor, de la acelai nivel al axului care le
poart (similar unui penson)

Penicillium
Peste 700 de specii ubicuitare, al cror habitat este reprezentat de sol. De aici,
ele contamineaz aerul, apa i implicit suprafeele din diverse ncperi.
Majoritatea au abilitatea de a se dezvolta pe substraturi nutritive vegetale pe
care le degradeaz sau crora le induc un anumit grad de toxicitate prin
elaborarea micotoxinelor.
Coloniile sunt uor de recunoscut: cretere rapid ( ajung la maturitate n
cteva 5-7 zile), culoare alb la nceput, apoi verzuie, albastr-verzuie, rar gri
sau roiatic, aspect catifelat, pufos sau granular
Coloniile unor specii pot produce un pigment de culoare glbuie, purpurie sau
roie-brun, difuzibil n mediu
Microscopic, se remarc conidioforii neramificai sau ramificai sub form de
verticil, avnd un rnd de fialide plasat terminal.
Fialidele dau natere unor lanuri de conidii unicelulare, sferice, elipsoidale,
fusiforme sau cilindrice, n general hialine, de 2-4 m diametru.
Acest ansamblu structural format din conidioforul ramificat sau nu, fialide i
lanurile de conidii poart numele de penicil.
Penicilul poate fi monoverticilat, biverticilat sau terverticilat, in functie de
gradul de ramificare al conidioforului.
Scopulariopsis
Coloniile se dezvolt rapid pe medii uzuale ,au aspect catifelat sau
pulverulent, iar culoarea variaz n funcie de specie, de la alb, crem, cafeniu,
lamaro-sepia, brun sau chiar negru.
Microscopic, celule conidiogene cu baza dilatat, grupate adeseori cte 2-4 i
conidii produse n lanuri (conidiogenez de tip anelidic) ,de form sub sferic,
ovoidal, cu baza truncat,hialine sau pigmentate n brun-deschis.


Diagnosticul infeciilor produse de dermatofii
Stadiile imperfecte(asexuate)ale dermatofiilor, numite i forme anamorfe,
sunt grupate n 3 genuri Epidermophyton, Microsporum i Trichophyton, n
timp ce stadiile perfecte (sexuate) cunoscute i ca forme teleomorfe, sunt
incluse n genul Arthroderma.

Micozele sau infectiile fungice



Aspectele clinice ale dermatofitozelor
Polimorfe
Diversitatea speciilor afectate si a localizarilor
Colectarea probelor
Prelevare probe: raclarese evit pe ct posibil utilizarea tampoanelor
Tehnicile aseptice n obinerea tuturor probelor (decontaminarea zonelor
adiacente de piele sau mucoas) nu sunt recomandate pentru dermatofii
Trimiterea prelevatelor ctre laborator n cel mai scurt timp posibilevitarea
deshidratrii!
Procesarea prelevatelor imediat dup recepia n laborator (cele umede)
Lumina Woods -+ doar pentru M. Canis 50%


Incubarea culturilor:
30C este optim i recomandat
Umiditatea relativ trebuie s fie mare
30-40 ml mediu per plac
Protecie cu parafilm
Tuburile trebuie meninute orizontal 30-45 min

Medii de cultur specifice dermatofiilor:
DermatophyteTest Medium(DTM) reprezintun mediu solid selectiv utilizat n
micologia medical.
Are ca baz agar Sabouraud dextroz cu adaos de cicloheximid pentru a
inhiba contaminanii saprofii, antibiotice pentru inhibarea bacteriilor i un
indicator de pH, rou fenol.
Indicatorul de pH este util n identificarea fungilor dermatofii, care utilizeaz
nitrogenul din substrat pentru metabolismul propriu, rezultnd produi alcalini
i determinnd modificarea culorii mediului n rou.
Fungii tipici saprofii utilizeaz carbohidraii din mediu rezultnd produi acizi,
fr modificarea culorii mediului.
D.T.M. agar baz ajut la izolarea i identificarea timpurie a membrilor din
speciile Microsporum i Trichophyton prin schimbarea culorii mediului n rou
(ATENIE LA REZULTATE FALS POZITIVE!!!!).
Speciile cu cretere rapid pot modifica complet culoarea mediului, n interval
de 3 zile, n timp ce speciile cu cretere lent vor avea nevoie de mai mult timp
pentru a modifica culoarea.
Unii saprofii, levuri i bacterii pot schimba n rou culoarea mediului,dar pot fi
uor deosebii prin caracteristicile de morfologie cultural.
Clasificarea complet a dermatofiilor depinde de observaiile microscopice
coroborate cu testele biochimice i serologice.
Mycobiotic Agar este un excelent mediu baz la care se adaug ageni
antifungici, cicloheximid i cloramfenicol pentru a se studia efectul acestora
pe fungi. Acest mediu se dovedete util n izolarea dermatofiilor i a altor fungi
patogeni din specimene clinice.
Microsporum canisyorkshire terrier prezinta sensibilitate crescuta (foarte
greu de tratat, uneori imposibil!!!)

EXAMENUL MICROSCOPIC DIRECT
Fire de pr
n cazul firelor de pr, se pot observa hife i artrosporirezultai prin
fragmentarea hifelor. Localizarea acestor elemente dermatofiticecare
invadeaz tija pilar, ofer indicii privind etiologia afeciunii
3 tipuri de parazitare: endo-ectotrix, endotrix i favic
tipul endo-ectotrix - artrosporii rezultai n urma fragmentrii filamentelor
miceliene apar att n interiorul, ct i la exteriorul firului de pr; deosebim
subtipuri de parazitare, n funcie de diametrul i numrul sporilor: subtipul
microsporic (spori cu diametrul de cca. 2m, extrem de numeroi, formnd un
manon compact i bine evideniat n jurul tijei pilare - ntlnit la M. audouinii,
M. canis, rar la M. ferrugineum); subtipul microid (spori cu diametrul de cca.
2m, formnd un manon mai puin dens; ntlnit la T. erinacei i T.
mentagrophytes); subtipul megasporic (spori mai mari n diametru, msurnd
cca. 4-5 m i formnd un manon nentrerupt; ntlnit la T. equinum i T.
verrucosum).

Microsporum canis
Aspectul microscopic
Sunt prezente hife septate, macroconidii i microconidii;
Macroconidiile sunt numeroase, cu aspect de fus cu o poriune recurbat la
apex, cu un perete celular gros, coninnd de la 6 la 15 celule;
Microconidiile sunt unicelulare, cu aspect piriform i rar prezente.
Aspectul macroscopic
Rata de cretere este rapid iar coloniile sunt plate uor reliefate, textura este
de la fin la lnoas iar diametrul variaz de la 3 la 9 cm dup incubare pe
Sabourauddextroz agar timp de 7 zile la 25C;
Culoarea coloniilor de la suprafa este alb, glbuie iar reversul variaz de la
galben la galben-orange,ocazional pal.

Microsporum gypseum
Reprezint un agent cauzal ocazional, localizat la nivelul scalpului sau pielii
glabraten infeciile la om.
Firele de pr afectate nu prezint fluorescen atunci cnd sunt examinate cu
lampa Wood.
O varietate mare de animale pot fi infectate sau pot servi ca vectori ai
fungului.
Morfologia microscopic a Microsporumgypseum:acesta prezint
macroconidii abundente, simetrice, elipsoide, cu perete subire i separate n 4-
6 celule.
Aspect microscopic
Hife septate, macroconidii i microconidii prezente;
Macroconidiile sunt abundente, elipsoide pn la fuziforme i simetrice ca
form, rotunjite la capete, cu peretele subire, coninnd 3-6 celule
Microconidiile sunt moderate ca numr, localizate lng hife i sunt sub form
de bt de baseball.
Cultura de Microsporum gypseum pe mediu mycobiotic are aspect plat,
granular, cu o culoare deschisa de scorioar. Rata de cretere este rapid iar
textura coloniilor variaz de la pudrat la granular, iar culoarea este bej sau
maro scorioar, iar reversul este galben sau brun-rocat.
Trichophyton mentagrophytes
aspecte clinice la om
Principalele rezervoare naturale ale varietilor ce afecteaz omul, sunt
anumite mamifere mici, cum ar fi roztoarele, aricii i iepurii, dei numeroase
alte specii de animale pot fi infectate.
Cnd infecteaz oamenii, izolatele ce provin de la animale, precum speciile
deT. mentagrophytesvar. mentagrophytes,sunt frecvent asociate cu leziuni
inflamatorii ale scalpului, pielii glabrate, a unghiilor i zona brbii.
Aspecte microscopice
Se pot gsi frecvent hife spiralate;
Microconidiile sunt de la rotunde la piriforme, unicelulare, apar grupate sau
pe lng hife nedifereniate, numeroase de cele mai multe ori, mai rare n
preparatele provenite din probele de la om;
Macroconidiile sunt de cele mai multe ori absente, dar dac sunt prezente, au
pereii netezi i subiri, sub form de bt de baseball, multi-septatei solitare.
Aspecte macroscopice
Rata de cretere este moderat rapid iar textura izolatelor clinice de la om
sunt fine spre pulverulente n timp ce izolatele clinice de la animale sunt
granulare; culoarea coloniei este alb spre roz, iar reversul este galben, maro
sau brun-rocat.