CULTURI IN VITRO

RĂSPUNSUL EXPLANTELOR ÎN CULTURĂ

- brunificarea explantelor - imersia explantelor într-o soluţie antioxidantă (soluţie de acid

ascorbic cu acid citric în proporţie de 0,5 % respectiv 0,05%), imediat după fasonarea
acestuia sau prin adiţia în mediul de cultură a unor substanţe adsorbante sau detoxificante,
cum ar fi cărbunele activ (1 până la 4 g/l) sau polivinilpirolidonă (5 până la 10g/l).
A. Explante cu structură rudimentară - muguri, apexuri caulinare, meristeme şi apexuri
florale

Explantele din această categorie pot fi cultivate prin două metode:

 Prima metodă constă în inducerea creşterii apicale prin adiţia în mediul de

cultură a fitohormonilor din clasa auxinelor şi/sau a giberelinelor, foarte rar se pot adăuga
şi citochinine, întotdeauna într-o doză foarte mică.
După iniţierea pe acest tip de mediu se observă apariţia unor formaţiuni
calusare la baza explantelor.
După formarea calusului - rol protector (asemeni calusului format la o rană) se
formează prima frunzuliţă, apoi prima rozetă de frunze şi mai târziu are loc elongarea
tulpinii (axului principal). Aceste etape morfogenice pot avea loc pe acelaşi tip de
mediu la unele specii ornamentale (crizanteme, garoafe) sau pe două medii
succesive, la speciile lemnoase. Primul mediu va iniţia creşterea, putând fi utilizat
ulterior şi pentru propagarea fragmentelor cu un nod (microbutăşire). Al doilea mediu,
îmbogăţit cu auxine (cel mai frecvent, acidul indolil acetic), serveşte ca mediu de
înrădăcinare (Actinidia, măr, numeroase specii lemnoase).
 A doua metodă constă în blocarea creşterii apexului caulinar favorizând regenerarea
şi dezvoltarea lăstarilor laterali (axilari), caz în care mediul de cultură este adiţionat cu
citochinină (de la 1 la 10mg/l).

Lăstarii regeneraţi pot fi izolaţi şi crescuţi pe mediu pentru creştere, fără hormoni sau cu
acid giberelic în concentraţie mică.
În unele cazuri este nevoie de al treilea mediu de cultură pentru înrădăcinarea lăstarilor,
mediu adiţionat în general cu auxine.
 B. Explante constituite din diferite tipuri de ţesut - fragmente de tulpină, frunze, flori şi
fructe

• Aceste explante sunt compuse din diferite celule asociate în ţesuturi fără o organizare
structurală, putând proveni din orice parte a sistemului vegetativ (tulpină, frunze, rădăcini)
sau generativ (ax floral, sepale, petale, stamine, polen, ovul, fruct).
•Celulele ce răspund la cultura in vitro trebuie să treacă prin procesul de dediferenţiere,
adică sa se întoarcă la stadiul de celule nediferenţiate.

• 1. Apare o formaţiune calusara cu rol protector. Celulele aflate în imediata apropiere

a mediului sunt primele ce încep să se dividă şi să se dediferenţieze.
Dacă celulele ce vin în contact cu mediul se brunifică, nu se mai formează calus şi deci
tot explantul moare.

• 2. Al doilea proces de organizare, mai puţin frecvent, este acela în cursul căruia celulele
se vor comporta ca un ou fertilizat, urmând etapele embriogenezei. Vom vorbi astfel de
embrioni sau embriogeneză somatică.
• În cursul dezvoltării se observă cum celulele se divid şi embrionii ajung în stadiul globular,
apoi apare simetrie între forme şi embrionul evoluează spre stadiul cordiform şi apoi într-un
embrion capabil să genereze o plantulă.

• Pentru celulele capabile să genereze embrioni somatici sunt suficiente două medii de
cultură. Primul asigură formarea embrionilor, putând servi şi ca mediu de micropropagare,
iar al doilea va induce germinarea embrionilor.

Embrioni somatici de citrice: a) în stadiul globular, b) în stadiul cordiform, c)

generând o plantulă
• Uneori sunt necesare mai multe subcultivări pe medii fără hormoni pentru a induce
germinarea embrionilor somatici şi creşterea plantulelor, în timpul acestor subcultivări
are loc diluţia fitohormonilor la nivel celular permiţând astfel dezvoltarea normală a
celulelor.

Embrioni somatici de morcov regeneraţi din calus

Inducerea calusului și regenerarea plantelor la macul persan (P. bracteatum).
(A) Calus maro strălucitor format din semințe după 8 săptămâni;
(B) regenerarea lăstarilor din calusul semințelor după 2 subculturi; (C) calus maro strălucitor format din
rădăcină după 8 săptămâni; (D) regenerarea lăstarilor din calusul rădăcinii după 5 subculturi; (E) calus maro
strălucitor format din hipocotil după 16 săptămâni; (F) regenerarea lăstarilor din hipocotil (calus) după 9
subculturi; (G) calus maro strălucitor format din cotiledon după 12 săptămâni; (H) regenerarea lăstarilor din
calusul cotiledonului după 8 subculturi. Totul a fost indus pe mediu MS care conține 1,0 mg/L 2,4-D, 0,1
mg/L kinetină și 15 mg/L acid ascorbic la 25 ◦C în întuneric. Regenerarea lăstarilor din calus a fost realizată
pe mediu MS care conține 0,5 mg/L BA și 1,0 mg/L NAA.
Calus - Inducerea și
regenerarea plantelor Zea mays
(A) Semințele pe mediul
germinativ al semințelor.
(B) Internoduri umflate.
(C)Internoduri divizate
longitudinal. (D) Internoduri
divizate pe calus
mediu de inducție.
(E–G) Regenerarea calusului
embriogen.
(E) Calus embriogen proliferat.
(F) Inducerea lăstarilor multipli de
la calus embriogen.
(G) Regenerarea plantelor.
(H–J) Calus organogen
regenerare.
(H) Calus organogen compact,
dur și uscat.
(I) Multiplu formarea lăstarilor din
calusul organogen.
(J) Lăstari multipli bine alungiți.
(G1și J1) Rădăcină bine stabilită.
(G2 și J2) Plantulă pe turbă și
perlit.
 Utilizarea explantelor diferenţiate este foarte avantajoasă deoarece sursa de
explante este nelimitată şi rata de multiplicare poate atinge valori considerabile.

În funcţie de răspuns, aceste explante prezintă unele dezavantaje la nivel

genetic.
În primul rând, celulele ce dau naştere noilor plantule sunt somatice şi există
probabilitatea ca celule mutante să genereze embrioni din care să ia naştere noi plante.

În al doilea rând, cea mai mare rată de inducere a embriogenezei somatice are
loc din calus, caz în care, datorită ritmului intens de diviziune celulară numeroase celule pot
prezenta modificări la nivel genetic (modificări cromozomale de tipul poliploidiei sau
aneuploidiei, sau modificări citoplasmatice).
• Prelevarea şi sterilizarea explantelor

Sterilizarea explantelor se efectuează, de obicei cu agenţi chimici de tipul hipocloritului

de sodiu sau calciu (soluţie 3%-4%).
 Durata tratamentului variază în funcţie de specia luată în studiu sau de originea
explantului (epiderma, mezofil, ţesut palisadic).
 se recomandă obţinerea de plante sterilizate, prin germinarea de seminţe sterilizate
în hipoclorit de sodiu de concentraţie 4% timp de 10-12 minute, pe hârtie de filtru, de
asemenea sterilizată, plasată în flacoane Erlenmeyer sau cutii Petri.
 Plantulele - plasate ca atare pe mediul de cultură, sau de la caz la caz, pot fi separate
în hipocotil şi cotiledoane, pot servi pentru obţinerea oricărui tip de explant.

 Daca explantul nu este steril (infecţia fungică, bacteriană sau virală fiind adânc
penetrată în organismul vegetal sau în întreaga samânţă) sterilizarea nu mai are
nici un efect.
 Pentru obţinerea de calus liber de infecţii există şi în aceste cazuri o cale şi anume -
utilizarea explantelor din vârful meristematic de creştere al tulpinii. In funcţie de tipul
de dezinfectant folosit, tipul de tratament, originea explantului şi mediul de cultură
utilizat, se poate vorbi despre o rată de calusare şi o rată de supravieţuire a calusului.
 Modalităţi de asigurare a asepsiei explantelor

Nr. crt. Tipul explantului Pretratament Sterilizare Postratament

1. Seminţe Etanol(96%) 10sec Ca(OCl)10%10-20 min spălare de 3ori cu apă distilată sterilă

2. Fructe Etanol(96%) 10sec. NaOCl 3% spălare cu apă distilată sterilă

3. Tulpină Etanol(96%) 10 sec. NaOCl 3%5-30 min. spălare cu apă distilată sterilă

4. Organe de depozitare spălare cu apă de robinet NaOCl3%10-30min. spălare cu apă distilată sterilă

5. Frunze Etanol(96%) HgCl2 O,1%1 min. spălare de mai multe ori cu apă distilată
• Sterilizarea propriu-zisă, atât a instrumentarului şi recipientelor, cât şi a mediului, se
efectuează la autoclav - autoclavare, la o temperatură de 120°C şi o presiune de o
atmosferă, timp de 20-25 min.

• Se poate efectua şi o tindalizare, adică o sterilizare discontinuă (fracţionată), mai ales

pentru mediile agarizate. In acest caz mediile sunt "topite" de 3 ori consecutiv, la
temperatura de 100° C, pe baie de apă. După fiecare etapă de fierbere, mediile
ramân 24 de ore la temperatura camerei pentru a permite germinarea sporilor
eventualelor microorganisme care au supravieţuit sau au suprainfectat mediul.

• Sunt şi procedee prin care sterilizarea se obţine prin filtrare. In aceste cazuri,
substanţele termolabile (în special fitohormonii), sunt sterilizate prin filtre bacteriene.

• Este indicat ca sticlăria în care va fi plasat mediul de cultură, pipetele pensetele,

ansele, spatulele să fie presterilizate, fie prin autoclavare la 120-130° C, timp de 20-
30 minute, fie prin menţinerea în etuvă, la 180°C timp de o oră. Toate se pot păstra în
casolete sau tuburi metalice.
• Plasarea explantelor sterilizate pe mediul de cultură, în boxa cu aer steril în flux
laminar

• Lucrul propriu-zis (transferul explantelor, subcultivarea calusului, extragerea de probe

pentru analiza) se efectuează în boxa sterilă (boxa în care se asigură aflux de aer,
sub presiune, trecut în prealabil prin filtre microbiene) - boxă cu aer în flux laminar.

• Este indicat să se iradieze boxa (din timp în timp şi mai ales înainte de a se lucra) cu
o lampă UV timp de 20-30 min.

• Un alt aparat, utilizat în cazul culturilor pe mediu lichid, este agitatorul rotativ sau
liniar, care se caracterizează prin mişcări oscilatorii (în plan orizontal sau în plan
elipsoidal) cu frecvenţa de 115-120 rot./ min.
 PREGATIREA MATERIALULUI VEGETAL

Germinarea seminţelor în condiţii aseptice

- se introduc seminţele în alcool etilic 70%, pe un agitator (shaker), timp de 2 min.

- se îndepărtează alcoolul şi se introduce hipoclorit de sodiu, 2-3%
- se menţine flaconul pe agitator, timp de 10-20 minute
- se îndeparteaza seminţele care plutesc (deoarece, - sunt goale şi, deci, nu vor germina).
In cazul în care se presupune că seminţele sunt puternic infectate se poate repeta tratamentul cu
hipoclorit.

- spălarea seminţelor cu apă distilată sterilă

- seminţele se dispersează pe hârtie de filtru, îmbibată cu apă distilată, într-o cutie Petri sau un flacon
Erlenmeyer, totul autoclavat în prealabil. Este bine ca vasul Petri să fie ermetic închis cu pelicula de
parafilm (germinarea seminţelor poate fi asigurată pe vată, în eprubete, închise cu parafilm). Cele mai
multe seminţe germinează bine în condiţii de întuneric, la temperatura de 23-25°C.

Se utilizeaza mai puţine seminţe per flacon, deoarece dacă o singură sămânţă este infectată, se va
transmite infecţia tuturor celorlalte din vasul respectiv.
 Când seminţele au germinat, plantutele rezultate pot fi utilizate ca atare, sau se pot
fragmenta, utilizând hipocotilul, cotiledoanele.

• Alteori, pentru inducerea calusului se pot utiliza explante, din plante crescute în
condiţii naturale: porţiuni din rădăcină, tulpină, ramuri, muguri, frunze, flori.
• Explantele se vor trata cu alcool etilic 70%, timp de 1-3 minute, apoi se vor spăla de 2-3
ori cu apă distilată sterilă.
• Dacă este vorba de rădăcini, tuberculi, bulbi, după imersare în alcool etilic, se recomandă
tratarea cu hipoclorit de sodiu, timp de 15-20 minute.

• Se recomandă tratarea, atât în cazul seminţelor cât şi în cazul explantelor, doar cu

hipoclorit de sodiu 3% timp de 15 - 25 minute (in funcţie de mărimea seminţelor sau
a explantelor).
• Nu se ştie nici în prezent care este modalitatea de a determina exact concentraţia şi
balanţa hormonală atunci când se apelează la fitoregulatori exogeni, dar pe de altă
parte, aceştia din urmă permit cercetătorilor manipularea materialului biologic în
sensul dorit.

• Aceste cercetări, ce sunt încă incomplete, sunt baza de la care s-a pornit în
realizarea multor aplicaţii practice, unele dintre ele fiind acum parte din procesul de
micropropagare ce a început să fie tot mai mult folosit.
CLZ - OBIECTIVE
• alegerea mediilor de cultură și a tipului de explant adecvate pentru
obținerea unei rate de micropropagare ridicată,
• stabilirea compoziției mediilor de cultură, a tipului de hormoni și a
concentrațiilor acestora,care să favorizeze obținerea de neoplantule,
creșterea și proliferarea lăstarilor in vitro,
• stabilirea compoziției mediilor de cultură, a tipului de hormoni și a
concentrațiilor acestora, care să favorizeze înrădăcinarea in vitro a
microlăstarilor,
• determinarea capacității de aclimatizare a vitroplantelor, după faza de
înrădăcinare in vitro