UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚELE VIEȚII „REGELE MIHAI I” DIN

TIMIȘOARA

FACULTATEA DE BIOINGINERIA RESURSELOR ANIMALIERE

Izolarea și cultura protoplaștilor

Obținere, fuziune și cultură.

Proiect realizat de:

Bîzdîră Angela
Copil Miruna
Materia: Biotehnologii vegetale
Specializarea: Biotehnologii Agricole
Grupa: 344

1
 CUPRINS

➢ INTRODUCERE........................................3

➢ OBȚINEREA PROTOPLAȘTILOR...........4

➢ FUZIUNEA PROTOPLAȘTILOR..............5

➢ CULTURA PROTOPLAȘTILOR...............6

➢ BIBLIOGRAFIE..........................................7

2
 INTRODUCERE

Ce înseamnă termenul de protoplast?

Protoplast este un termen biologic ce definește acea

parte din celulă care poate fi plasmolizată și izolată, înlăturând
peretele celular prin procedee mecanice sau enzimatice.
Metodele enzimatice sunt cele mai folosite și permit izolarea
protoplaștilor, inclusiv din țesuturi formate din celule ce nu
plasmolizează ușor.

Mezofilul frunzei ( mai ales de la frunzele tinere) reprezintă cea mai

bună sursă pentru majoritatea speciilor, de asemenea se pot folosii
culturile de calus și suspensiile celulare.

3
 Scopul final al obținerii protoplaștilor îl
reprezintă fuziunea acestora sau hibridarea somatică. Fazele
hibdridării somatice:
1. Alegerea și cultivarea materialului vegetal;
2. Sterilizarea materialului vegetal (daca nu a fost cultivat in vitro)
3. Tratament enzimatic pentru obținerea protoplaștilor și purificarea;
4. Fuziunea, urmărită de selecția hibrizilor somatici;
5. Cultura protoplaștilor, regenerarea peretelui celular și inducerea
diviziunii celulare;
6. Regenerarea plantelor;
7. Verificarea produșilor de fuziune;
8. Testarea utilității în ameliorarea plantelor.

OBȚINEREA PROTOPLAȘTILOR
Protoplaștii se obțin prin tratamentul enzimatic a celulelor
mezofilului, calusurilor, suspensiilor celulare cu un amestec de
enzime. Dacă se alege suspensia celulară ca
material inițial pentru obținerea protoplaștilor,
atunci trebuie alese celule în faza exponențială
de creștere, pentru că are pereții celulari mai
subțiri. Tratamentul enzimatic ar trebui să fie
cât mai scurt și controlat, deoarece afectează
viabilitatea protoplastului, de asemena și temperatura, pH-ul,
condițiile de iluminare și viteza de agitare trebuie strict controlate
(efectuate în întuneric).
După obținerea lor, ei trebuie să fie purificați, proces realizat prin:
➢ Filtrare (oțel inoxidabil sau site de nylon);
➢ Centrifugare în soluție de zaharoză (sedimentarea protoplaștilor)

Uneori, sedimentarea este imposibilă prin centrifugare!

4
 FUZIUNEA PROTOPLAȘTILOR
Fuziunea protoplaștilor este un tip de modificare
genetică a plantelor prin care două specii distincte de plante sunt
fuzionate împreună pentru a forma o nouă plantă hibridă cu
caracteristicile amândurora. Fuziunea este în general indusă prin
incubarea în soluție foarte concentrată de PEG și cu un pH relativ
ridicat, pentru a înlătura sarcina negativă a protoplaștilor.
În urma fuziunii a doi protoplaști proveniți de la genotipuri sau specii
diferite, rezultă un heterocarion, iar dacă fuzionează doi protoplaști
asemănători, rezulta un homocarion.
Cea mai mare problemă în urma hibridării somatice este de a
selecta hibrizii somatici din populația de celule.
Hibridarea între doi protoplaști A și B va rezulta o populație care
conține protoplaști nefuzionați. Vom avea AA și BB-homocarioni, AB-
heterocarioni și diverși carioni multiplii.
Sunt posibile și hibridări somatice intergenerice, dar
sunt imposibil de obținut pe cale sexuată, iar cei
obținuți pe cale somatică sunt sterili.
Hibridarea somatică este interesantă din punct de
vedere al agriculturii, mai ales pentru plante
importante la care este posibilă regenerarea plantelor
întregi și funcționale din protoplaști.
EXEMPLE:

Brassica napus(rapiță) Medicago sativa(lucerna) Trifolim repens(trifoi alb)

5
 CULTURA PROTOPLAȘTILOR
Cultura protoplaștilor constă din mai multe procese diferite:
➢ Regenerarea pereților celulari;
➢ Diviziunea celulară;
➢ Formarea calusului;
➢ Diferențierea organelor și/sau embrionilor.
Prima diviziune are loc de obicei la 2-7 zile după izolarea
protoplaștilor. Un mediu de cultură folosit pentru cultura
protoplaștilor conține: stabilizatori osmotici, nutrienți
anorganici, surse de carbon, vitamine, azot organic și
fitohormoni.
Protoplaștii pot fi cultivați astfel:
1. Suspendați în strat subțire de mediu lichid in cutie Petri;
2. Pe mediu solid după tehnica lui Bergmann;
3. Crescuți în microîncăperi între plăci de sticlă;
4. În picături de mediu lichid plasate pe o cutie Petri;
5. În ,,culturi de îngrijire” ( mai ales când densitatea lor este mică);
6. În strat mediu(semi) lichid plasat pe mediu solid;
7. Cultura în grăunciori sau în discuri de agaroză.

CONDIȚII DE CULTURĂ:
• pH-ul mediului cuprins între 5,5 si 5,8;
• temperatura de cultivare între 22-28®C;
• lumina nu este un factor esențial, dar intensitatea ei nu trebuie să
depășească 2000lx;
• concentrația inițială a protoplaștillor 104-106/ml;

6
 BIBLIOGRAFIE

Ghid practic de culturi in vitro

Culturi in vitro și micropropagare- Marcel Danci
Google image
https://www.youtube.com/watch?v=utlKKvqxbWw&fbclid=IwAR3i5Z0
6CnFCvD6APGngMljURiJuU_wnY_AVpBQXqR9-iralsJCh0Gdh32Q