CULTURI CELULARE VEGETALE

• Biotehnologiile reprezintă totalitatea aplicațiilor tehnologice, care utilizează sisteme

biologice, organisme vii sau derivate ale acestora, în scopul producerii sau modificării
unui compus sau a unui proces biologic, pentru un anumit scop.

• Culturile de celule şi țesuturi vegetale ocupă un loc aparte în cadrul biotehnologiilor

moderne, având la bază noțiuni din domenii conexe precum: citologia, morfologia,
anatomia, fiziologia plantelor, biologie moleculară, dar includ și o serie de metode
specifice: inducerea formării calusului și regenerarea plantelor, embriogeneza
somatică, variația somaclonală, crioconservarea germoplasmei, producerea de
metaboliți secundari.

• Prin culturi de țesuturi și celule vegetale (in vitro), denumim generic, creșterea pe
medii sintetice, sterile, a unor fragmente vegetale (explante sau inoculi)
macroscopice (culturi de organe) sau microscopice (țesuturi, celule, protoplaşti).
 APLICAŢII PRACTICE ALE BIOTEHNOLOGIEI VEGETALE

Organe……………Ţesuturi……………… Celule ……..…………Protoplaşti

Regenerare

Micropropagare Metaboliti secundari Ingineria genetică

AMELIORAREA PLANTELOR
 MICROPROPAGAREA
ALTERNATIVĂ BIOTEHNOLOGICĂ DE CONSERVARE ȘI PERPETUARE A UNOR
GENOTIPURI VALOROASE (SPECII DE INTERES)
Înmulţirea “in vitro” a plantelor poartă numele de micropropagare sau
micromultiplicare şi reprezintă o modalitate artificială de multiplicare vegetativă.

• Înmulţirea vegetativă sau apomixia se bazează pe capacitatea de regenerare a

plantelor, fapt care reflectă o mare autonomie a celulelor şi ţesuturilor vegetale
comparativ cu organismele animale.

• Această autonomie a părţilor plantei se bazează pe totipotenţa celulei vegetale. În

afara organismului, aproape fiecare celulă vegetală, în condiţiile asigurării mediului
corespunzător, este capabilă de diviziune şi creştere.

• Această metodă neconvenţională permite obţinerea într-un timp scurt a unui număr
mare de copii conforme cu planta donatoare (clonare).

• Înmulţirea prin microexplante (organe, ţesuturi, celule), cultivate pe medii nutritive

adecvate asigură atât multiplicarea clonală a plantelor cu calităţi deosebite, rezultate
din lucrările de selecţie şi ameliorare, cât şi răspândirea în cultură a noilor genotipuri
create, concomitent cu posibilitatea stocării şi conservării acestora.
 Importanţa utilizării tehnicii de înmulţire a plantelor prin culturi de ţesuturi decurge din
avantajele pe care le prezintă această metodă neconvenţională:

1. propagarea rapidă şi în masă a unor soiuri;

2. prezervarea sau conservarea materialului genetic de la genotipuri valoroase pe durată
nelimitată;
3. realizarea şi menţinerea de plante libere de viroze;
4. posibilitatea de a iniţia culturi pe tot parcursul anului, cu explante provenite din câmp sau
sere;
5. scurtarea perioadei de ameliorare a soiurilor, de pildă la speciile lemnoase de la 10-15 ani
la 2-3 ani;
6. creşterea vitezei de propagare comparativ cu metoda clasică;
7. economisirea forţei de muncă şi reducerea spaţiilor de producţie.
 Micropropagarea prezintă numeroase aplicații biotehnologice cu importanță
deosebită, dintre care amintim :

• propagarea în masă a plantelor rare sau de elită;

• obținerea de calus, rădăcini sau lăstari cu potențial de producere a unor metaboliți;
• obținerea de vitrocolecții de germoplasmă aparținând plantelor protejate;
• creșterea facultății germinative a semințelor cu germinație redusă in vivo;
• producerea de plante transgenice prin inserarea de ADN exogen;
• obținerea de variabilitate genetică;
• studii privind mutageneza
Etapele succesive ale micropropagării sunt:

Stadiul I – pregătirea plantelor donatoare de explante, ele sunt crescute în condiţii

speciale, în spaţii protejate,la temperatura de 25 ˚C;

Stadiul II- iniţierea culturii în condiţii aseptice;

Stadiul III- multiplicarea şi propagarea “in vitro”;

Stadiul IV- transplantarea plantelor neoformate “in vitro” la condiţiile mediului septic,
respectiv în ghivece.
.
TEHNICI DE MICROPROPAGARE
 REGENERAREA IN VITRO
• In vitro” se prefigurează două alternative ale derulării ciclului ontogenetic: una
presupune reinstalarea programului ontogenetic complet, prin iniţierea
embriogenezei somatice, iar cealaltă se bazează pe “reconstrucţia” plantelor întregi
prin iniţierea organogenezei.
• Regenerarea “in vitro” se poate desfăşura în mod direct la nivelul explantului sau
indirect la nivelul calusului. Regenerarea indirectă cuprinde două etape:
calusogeneza sau dediferenţierea explantului şi rediferenţierea prin organogeneză
sau embriogeneză somatică.
• Ambele căi de dezvoltare “in vitro” sunt în esenţă consecinţa reprogramării modelului
expresiei genice. Reorientarea celulelor explantului spre aceste programe ale
dezvoltării, cu alte cuvinte “achiziţionarea stării embriogene sau organogene este
intim legată de declanşarea unui lanţ de procese definite prin termenii de
competenţă, inducţie, determinare (Ammirato, 1985). Dobândirea acestei stări nu
este atât consecinţa condiţiilor specifice de cultivare “in vitro”, cât mai ales efectul
excizării ţesutului, care urmează să fie cultivat. Izolarea fiziologică sau fizică a
explantului este premiza declanşării organogenezei sau embriogenezei somatice.
• În sens larg, competenţa celulară este capacitatea celulelor de a-şi manifesta
totipotenţa. Diversitatea manifestărilor “in vitro” este concretizată fie prin exprimarea
imediată a acestei capacităţi, fie mai tardiv sau niciodată.
• Principalele procese sunt: dediferenţierea celulară, menţinerea stării dediferenţiate
(menţinerea calusului sau suspensiei celulare) pe timp nedefinit şi rediferenţierea
celulară prin organogeneză sau embriogeneză).

• Procesul de dediferenţiere, care are loc la nivelul explantului, începe imediat după
izolarea ţesutului şi debutează cu o accelerare a diviziunii celulare şi revenirea la
stadiul embrionar a tuturor celulelor specializate, chiar şi a celora cu un înalt grad de
specializare, cum ar fi cele de colenchim sau de sclerenchim (în curs de diferenţiere).
Prin dediferenţiere celulară redăm procesul în care celulele explantelor de
provenienţe extrem de diferite - epidermă, ţesut conductorţesut palisadic, parenchim,
raze medulare etc., plasate pe mediul de cultură, îşi pierd diferenţierea şi redevin
celule meristematice, capabile de diviziuni repetate.

• Calusul, în fapt, reprezintă o masă de celule care şi-au pierdut diferenţierea şi se

divid intens şi anarhic, asigurând acumularea de biomasă proaspătă.

• Calusul dezvoltat este foarte heterogen, prezentând variaţii în ceea ce priveşte

forma, mărimea, gradul de vacuolizare, conţinutul citoplasmatic al celulelor
componente. În ciuda creşterii dezorganizate a calusului, la nivelul acestuia apar
zone cu un grad special de organizare, precum centrii activi ai activităţii
meristematice sau meristemoizii, cât şi primordiile organelor vegetative.

.
 INIŢIEREA CULTURILOR DE CALUS

Initierea culturilor “in

vitro” Selectarea liniilor celulare morfogene la nivelul culturilor de
Tipul explantului + calus
mediul de cultura

Iitierea
calusului Calus rizogen

Calus caulogen

Calus nonmorfogen

Calus embriogen

Subcultivarea calusului
CALUS OBŢINUT DIN FRAGMENTE FOLIARE
CULTURĂ DE CALUS
LINII CELULARE MORFOGENE LA NIVELUL CALUSULUI
STADII INCIPIENTE ALE ORGANOGENEZEI
PROGRAMELE MORFOGENETICE „ IN VITRO”
 PROGRAMELE MORFOGENETICE

Organogeneza în culturi in vitro este un proces extrem de complex, care constă în

generarea de rădăcini - fenomen numit rizogeneză și / sau tulpini - fenomen numit
caulogeneză.
• Aptitudinea organogenetică a cormofitoinoculilor este înscrisă în programul genetic al
celulelor. Formarea de organe poate avea loc direct din celulele explantului
(organogeneză directă) sau din masa de calus care a luat naștere prin
dediferențierea celulelor explantului (organogeneză indirectă).
• Culturile în care se induce organogeneza sunt folosite ca sisteme model pentru a
determina evenimentele cauzale prin care sunt produse rădăcinile respectiv tulpinile.
• Într-un astfel de model, procesul de organogeneză este împărțit în câteva faze
conform schemei următoare:
ORGANOGENEZA IN VITRO
 Rizogeneza (neoformarea de rădăcini) reprezintă formarea structurilor monopolare la
nivelul oricărui explant, indiferent de tipul organului din care provine. Aceste organe
monopolare apar neregulat şi la nivelul calusului şi prezintă o structură asemănătoare cu
cea a rădăcinii normale.

• Acest proces depinde într-un grad foarte important de originea explantului (specia, vârsta
plantei donor, genotipul), natura și mărimea acestuia, starea fiziologică a celulelor din
explant.

• Totodată și fitohormonii (mai ales auxinele endogene și exogene) au un rol extrem de

important în exprimarea acestui caracter. Un efect cert asupra rizogenezei exercită și
regimul de lumină și anume: o intensitate slabă a acesteia, sau expunerea pentru scurt
timp la lumină (600 lucși mai puțin de o oră /zi) stimulează procesul de rizogeneză.

• Temperatura optimă inducerii acestui proces este apreciată la 25° C. Uneori însă, se
recomandă practicarea unei alternanțe între o temperatură scăzută (5 - 15° C) și una
ridicată (23 - 25° C), în prezența luminii, a unei auxine, și a unui mediu bogat în glucide
RIZOGENEZA “IN VITRO”
• In vitro neoformarea de mugurași, caulogeneza, respectiv formarea de centrii
vegetativi, este esențială atunci când se urmărește multiplicarea sau reconstituirea
unei plante.
• Primordiile caulinare apar dintr-o singură celulă sau dintr-un grup mic de celule şi
sunt localizate la periferia explantului sau a masei de calus, pe cănd cele radiculare
apar în profunzimea ţesutului.
• Inducerea caulogenezei la nivelul inoculilor cultivați in vitro poate fi realizată ușor,
fără producerea de calus, prin prelevarea explantelor de la frunzele plantelor,
aptitudinea caulogenă nefiind localizată strict într-un strat celular sau celule specifice.
În mod practic, caulogeneza e provocată artificial, prin folosirea citochininelor în
detrimentul auxinelor .
CAULOGENEZA VIA CALUS
CAULOGENEZA VIA CALUS
 EMBRIOGENEZA SOMATICĂ

• Embriogeneza somatică reprezintă cea mai complexă cale de regenerare şi constă în

dezvoltarea structurilor bipolare, pornindu-se de la orice celulă somatică.
• Formarea embrionilor somatici se datorează diviziunii repetate a celulelor somatice,
care se organizează morfo-structural după modelul embrionului zigotic.
• Embriogeneza reprezintă apariţia de novo a unei plante întregi (cu rădăcină, tulpină şi
frunze), într-o succesiune de polarizări, structurări şi organizare (stadiul globular,
cordiform, torpedo, cotiledonar). Embriogeneza somatică constituie o modalitate de
sporire a randamentului în micromultiplicarea plantelor.
• Apariția embrionilor somatici, poate avea loc direct pe explant, derivând direct din
țesuturile inoculate in vitro (embriogeneză directă), sau mai frecvent din calusurile
formate pe explantul inițial (embriogeneză indirectă).
• Diferența dintre cele două tipuri de dezvoltare este că embriogeneza directă rezultă
din celule pro-embriogene determinate, iar cea indirectă necesită dediferențierea
celulelor cu funcții specializate, proliferarea calusului și inducerea celulelor
embriogene.
 Studiile au condus la stabilirea a patru faze de diferențiere embrionară și anume:

• 1. faza de creștere izodiametrică - caracterizată printr-o diviziune neorientată a

celulelor, când se ajunge la stadiul globular, formațiune de celule nepolarizate;
• 2. imprimarea treptată a caracterului de polaritate - fază în care se produce o
distribuție polară a esterazelor (reacție evidențiată pe cale histochimică) și care se
afirmă - cu predilecție - la locul de formare al cotiledoanelor (stadiul globular
polarizat).
• 3. faza de polaritate progresivă - diviziunile celulare sunt orientate; se formează
cotiledoanele și apexul rădăcinii iar, mai apoi, se demarchează meristemul apical al
tulpinii, (stadiul cordiform și de torpedo).
• 4. faza de creștere bipolară - treptat, meristemele apicale, radicular și caulinar se
constituie și sunt apte de a intra în diviziune (faza cotiledonară).
EMBRIOGENEZA SOMATICĂ
Etapele embriogenezei somatice
Embriogeneza somatică: (a) cluster cu embrioni somatici; (b) stadiul
globular; (c) stadiul cordiform; (d) stadiul torpedo; (e) stadiul
cotiledonar; (f) embrion matur
 În culturile de calus cât și în cea de celule, studiile anatomice și histologice, au
evidențiat prezența a două categorii de celule:

• 1. primă categorie o constituie celulele mari, posedând o vacuolă mare (în

suspensiile celulare, celulele sunt liber dispersate în mediu); acest tip de celule este
lipsit de potențial embriogenic;
• 2. cel de al doilea tip de celule se caracterizează prin talie mică, conținut bogat în
citoplasmă densă, aceste celule sunt, adeseori grupate în aglomerări, sub formă de
noduli. Ele sunt capabile să formeze embrioni, în centre numite mase proembrionare
sau noduli embriogeni.

S-a constatat că nodulii embriogeni conțin două tipuri de celule și anume:

• a) celule centrale, cu o unică vacuolă mare, cu nuclei mici și compacți, cu nucleoli
abia colorați, cu ribozomi puțini, cu rare profile de reticul endoplasmatic, cu un număr
redus de amiloplaste.
• b) celule meristematice aflate la periferia nodulilor embriogeni, care în contrast cu
celulele situate în centrul nodulului, au vacuole puține și mici iar nucleii sunt mari,
difuz colorați și conțin câte un nucleol puternic reliefat; citoplasma prezintă o mare
diversitate de ribozomi și numeroase profile de reticuli endoplasmatici. În acest tip de
celule se găsesc proeminente depozite de amidon .
 FACTORII DE MEDIU IMPLICAŢI ÎN DECLANŞAREA PROGRAMELOR
MORFOGENETICE

• Diversitatea programelor morfogenetice exprimate in vitro se bazează pe o

succesiune de reacții din partea celulelor componente ale explantului, sub acțiunea
coordonată și ritmică a factorilor inductivi.
• Debutul oricărui program morfogenetic presupune reorientarea celulelor spre noi căi
de dezvoltare și este condiționat atât de nivelul reactivității celulare (factori interni),
cât și de utilizarea unor stimuli inductivi adecvați. Cea de a doua categorie cuprinde
factorii externi de mediu, a căror intervenție se reflectă asupra proceselor
biochimice și fiziologice, declanșate la nivelul celulelor cultivate.
• Armonizarea factorilor exogeni, fizici și chimici, cu starea fiziologică a explantelor, cu
conținutul hormonal endogen, condiționează declanșarea reacțiilor morfogenetice in
vitro. .
• În condițiile cultivării explantelor vegetale pe medii nutritive, substratul trebuie să
asigure celulelor aportul de nutrienți și fitohormoni de care țesuturile plantei mamă
sunt tributare. Explantele își mențin vitalitatea, celulele își reiau activitatea și se
multiplică numai în cazul în care sunt satisfăcute cerințele minimale, capabile să
asigure supraviețuirea și reluarea funcțiilor vitale. Avem în vedere o serie de factori
exogeni: lumina (natura ei, intensitatea, fotoperioada), temperatura, umiditatea,
gradul de aerare.
• Manifestarea potenţialului organogen sau embriogen în cultură este fundamental
legată de genotipul plantei donatoare de explant. De pildă, la Triticum aestivum, din
23 de genotipuri testate, doar 16 au fost capabile să regenereze.
• Diferenţe semnificative referitoare la reacţiile morfogenetice sunt înregistrate în
funcţie de originea explantului; de regulă, ţesuturile vegetative tinere sunt mai
reactive decât cele mature.
• Permanenta preocupare pentru optimizarea mediilor de cultură a condus, în decursul
timpului, la elaborarea şi testarea a peste 2000 de reţete (George şi colab., 1988),
numai pentru inducerea embriogenezei somatice. Cele mai utilizate medii nutritive,
atât pentru embriogeneza somatică, cât şi pentru organogeneză sunt mediul
Gamborg (1968) şi Murashige-Skoog (1962).
• Componentele de bază ale oricărui mediu de cultură sunt sărurile minerale, sursa de
carbon, vitaminele, regulatorii de creştere şi suplimentele organice. Nota de
particularitate a fiecărui mediu în parte este corelată cu necesităţile nutritive, funcţie
de specie şi de tipul explantului cultivat “in vitro” (celule, ţesuturi sau organe) şi se
reflectă în variaţia concentraţiei unor componente de bază. De pildă, mediul B5
(Gamborg) diferă de mediul MS (Murashige-Skoog) prin concentraţia mult mai
scăzută în săruri.
• Cea mai importantă categorie de substanţe conţinute în mediul de cultură, din punct
de vedere al implicării în controlul morfogenezei o constituie regulatorii de creştere
(Kohlenbach, 1977). Auxinele induc diviziunea celulară şi stimulează rizogeneza.
Principalele auxine sunt: acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4 D), acidul indolilacetic
(AIA), acidul naftilacetic (ANA), acidul 2,4-5 triclorfenoxiacetic (2,4,5 T).
• Citochininele sunt derivaţi ai adeninei şi au rol în caulogeneză. Cele mai frecvente
citochinine sunt: chinetina (K), benziladenina (BA), zeatina, izopenteniladenina (IPA),
benzilaminopurina (BAP).
• Programele morfogenetice se află în strânsă corelație cu balanța hormonală.
• În majoritatea situațiilor nu atât concentrația fitohormonilor este importantă cât, mai
ales raportul dintre auxină și citochinină. Auxina poate inhiba acumularea de
citochinină, iar citochinina poate inhiba unele activități ale auxinei, astfel încât în
condiții de cultură in vitro procesul de creștere al țesuturilor vegetale este afectat în
mod decisiv de raportul dintre auxină și citochinină din mediul de cultură.
 Mediul bazal Gamborg Mediul bazal Murashige- Skoog

Macronutrienţi mg/L Macronutrienţi mg/L

(NH4)2SO4 134 NH4·NO3 1650
KNO3 2528 KNO3 1900
CaCl2·2H2O 150 CaCl2·2H2O 440
MgSO4·7H 2O 250 MgSO4·7H 2O 370
NaH2PO4·H2O 150 KH2PO4 170
Na 2EDTA 37.30 Na 2EDTA 37.30
FeSO4·7H2O 27.80 FeSO4·7H2O 27.80
Micronutrienţi Micronutrienţi
H3BO3 3.0 H3BO3 6.20
MnSO4·H2O 10.0 MnSO4·H2O 22.30
ZnSO4·7H2O 2.0 ZnSO4·7H2O 8.60
KI 0.75 KI 0.83
Na2MoO4·2H2O 0.25 Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4 5H2O 0.025 CuSO4 5H2O 0.025
CoCl 2 ·6H2O 0.025 CoCl 2 ·6H2O 0.025
Substanţe organice Substanţe organice
myo-Inositol 100.0 myo-Inositol 100.0
acid nicotinic 1.0 acid nicotinic 0.5
piridoxina·HCl 1.0 piridoxina·HCl 0.5
thiamina·HCl 10.0 thiamina·HCl 10.0
sucroza 20,000 sucroza 30,000

pH 5.5 pH 5.7–5.8
 În tehnicile de micropropagare practicate în scop productiv sau în vederea conservării şi
transmiterii calităţilor specifice ale unui anumit genotip se preferă ca material iniţial,
explante cu o anumită organizare tisulară: explante meristematice, muguri sau
minibutaşi. Utilizarea explantelor meristematice asigură cel mai înalt grad de stabilitate
genetică în descendenţă.
Valoarea mare a culturii de meristeme constă în:
1. asigurarea uniformităţii genetice a materialului săditor generat in vitro - altfel spus,
valoarea constă în aceea că se pot obţine rapid clone;
2. eliminarea agenţilor fito şi zoopatogeni din cultura iniţială;
3. creşterea coeficientului de multiplicare, în cel mai scurt timp, a unui individ vegetal;
4. obţinerea unui material săditor juvenilizat, imposibil de realizat prin metodele tradiţionale
de înmulţire vegetativă;
5. crioprezervarea (conservarea prin frig) a inoculilor meristematici, pentru o lungă
perioadă de timp, într-o anumită fază de dezvoltare, pentru a avea un stoc permanent
care să asigure necesarul de material săditor (solicitat pe piaţă) - conservarea
germoplasmei în bănci de gene.
• Metodele criobiologice de prezervare a materialului generativ "in vitro" se bazează pe
conservarea la temperaturi foarte scăzute (-1960 C - temperatura azotului lichid). În
aceste condiţii se asigură reducerea aproape la limita viului, a tuturor funcţiilor
metabolice.
• Tehnicile de crioconservare presupun utilizarea unor substanţe crioprotectoare, cu rol în
prevenirea daunelor cauzate de infectarea bruscă a celulelor Astfel de substanţe sunt
dimetilsulfoxidul (DMSO) şi glicerolul.
 EXPLANT MERISTEMATIC

Domul meristematic

Explant
meristematic
Apex caulinar
Primordiu foliar

Mugure axilar
 Micropropagarea la Agave sp.
(A) Prelevarea explantelor meristematice. (B) Inducerea caulogenezei (C) Faza de
multiplicare a lastarilor (D) I Plante regenerate in vitro (E) Adaptarea plantelor ex
vitro
• Embriogeneza somatică constituie o altă modalitate de sporire a randamentului în
micromultiplicarea plantelor.

• Lutz şi colaboratorii, 1985 apreciază că într-un mililitru de mediu se găsesc

aproximativ 2x106 celule, din care se pot obţine aproximativ 5000 de embrioni
somatici, după 14 zile de cultivare a celulelor pe un mediu lipsit de fitohormoni..
După generarea lor, embrionii somatici pot fi menţinuţi aproximativ 20 de săptămâni,
până la semănarea acestora în teren.

• Semănarea embrionilor somatici se face în momentul în care ei sunt suficient de

buine dezvoltaţi pentru a începe viaţa auxotrofă. Redenbaugh şi colaboratorii, 1984
au elaborat o metodă de încapsulare a embrionilor prin încorporarea lor într-o matrice
de gel (alginat de natriu), urmată de tratamentul cu o soluţie de CaCl2 pentru
solidificarea matricei.

• În 1985, Gebbart a pus la punct un procedeu de încapsulare a embrionilor somatici în

polimeri biodegradabili.
 Capsule de alginat de calciu în
interiorul carora se aflla inclusi embrioni
somatici de Daucus carota, aflati în stadiul
de torpedo
 Germinarea in vitro a
embrionilor somatici de Daucus
carota încapsulati în gel de
alginat
Producerea seminţelor sintetice la Vanilla planifolia
 Stocarea materialului vegetal obţinut „in vitro”

• Băncile de stocare şi conservare a germoplasmei conţin în colecţii: polen, seminţe, organe sau
fragmente de organe.Materialul vegetal poate fi conservat pe o perioadă mai scurtă, prin
cultivarea inoculilor în regim de creştere lentă şi prin subcultivări periodice, la intervale de luni,
sau poate fi păstrat la temperaturi coborâte ( 4-50 C) câteva luni, fără repicare. Există şi bănci de
gene de lungă durată, cu stocarea materialului vegetal în azot lichid (- 196 0C).

• În general, toate metodele de conservare „in vitro” presupun o diminuare sau o stopare temporară
a proceselor vitale.

• Metoda crioconservării are la bază oprirea prin îngheţ a funcţionalităţii celulare, făcând imposibilă
realizarea schimburilor dintre celule şi mediu.
• O altă metodă se bazează pe deshidratarea gradată a materialului vegetal, prin scoaterea apei
din celule, administrându-se din exterior substanţe osmotic active.

• O altă metodă de stopare a dezvoltării inoculilor constă în producerea în vasele de cultură a unor
condiţii de hipoxie, prin înlocuirea parţială sau totală a oxigenului cu azot sau prin scăderea
presiunii atmosferice (hipobarie). Adeseori se practică tratamente combinate, în regim de creştere
lentă, la temperaturi pozitive sau negative, plus hipoxie şi deshidratare.
• Toate metodele de conservare vizează menţinerea genotipurilor valoroase pe o perioadă mai
scurtă sau mai lungă de timp, precum şi regenerarea de plante după stocare, plante care pot fi
aclimatizate la un regim normal de viaţă.
• Prima tentativă de conservare a celulelor la temperaturi foarte coborâte a fost raportată în 1968 la
Linum usitatissimum , la temperatura de - 50˚C, cu o rată de supravieţuire de 14%. Această
temperatură nu este cea mai adecvată pentru conservare pe termen lung (Merymann, Williams,
1982).
• Cu timpul s-a acordat o deosebită atenţie pregătirii celulelor pentru crioconservare, în special prin
administrarea unor substanţe crioprotectoare. S-a constatat o strânsă dependenţă între starea
fiziologică şi ontogenetică a materialului conservat şi rata supravieţuirii celulelor.
• Celulele din faza lag târzie sau faza exponenţială timpurie au cea mai mare toleranţă la îngheţ,
deci implicit o rată sporită a supravieţuirii
• Celulele se recolteză în faza exponenţială de creştere şi se cultivă într-un mediu suplimentat cu
manitol 6% sau sorbitol 6-15%. Aplicarea substanţelor crioprotectoare este esenţială pentru
asigurarea supravieţuirii celulelor prin îngheţ.
• Tratamentul termic al celulelor se face gradat, ajungându-se la temperatura de –1960 C, după ce
în prealabil celulele au fost transferate în ampule de polipropilenă. Materialul vegetal stocat pe
termen nelimitat poate fi reutilizat, prilej cu care se face testul viabilităţii celulelor.
• Testul viabilităţii se poate realiza cu diacetat de fluoresceină, caz în care celulele viabile sunt
detectate la microscopul cu lampă UV, dezvoltând fluorescenţă, sau cu 2, 3, 5 - clorură de
trifeniltetrazoliu, caz în care celulele viabile se colorează în roşu..
ANDROGENEZA EXPERIMENTALĂ
Progresele spectaculoase realizate în domeniul geneticii microorganismelor sunt justificate în
mare măsură de natura haploidă a materialului experimental.

La plantele superioare- organisme diploide şi poliploide- studiile similare sunt confruntate cu

dificultăţi generate de fenomene precum dominanţa sau segregarea, probleme ale căror
soluţionare prin intermediul metodelor clasice implică investigaţii laborioase.

La început, haploizii obţinuţi la plantele superioare au fost apariţii spontane, urmări ale unor
anomalii care pot avea loc în timpul procesului de reproducere sexuată, sau ca rezultat al aplicării
unor procedee experimentale specifice.

În anul 1963, Yamada şi colaboratorii au semnalat pentru prima dată izolarea unui ţesut haploid
din culturi de antere la Tradescantia reflexa.

În 1964, Guha şi Maheshwari au descris formarea unor structuri embrionare la Datura innoxia, a
căror origine din polenul imatur a fost confirmată ulterior
În 1967, Bourgin şi Nitsch au obţinut primele plante haploide din antere de Nicotiana sylvestris şi
Nicotiana tabacum.

Actualmente, obţinerea haploizilor prin cultivarea anterelor se înregistrează la peste 150 de specii
aparţinând la 52 de genuri şi 23 de familii de dicotiledonate şi monocotiledonate :Asparagus
officinalis (Pelletier, 1972), Capsicum anuum (Wang, 1973), Beta vulgaris (Shao, 1979), Triticum
aestivum (Ouyang, 1973), Zea mays ( Ku, 1975, Nitsch, 1980).
Androgeneza experimentală presupune dezvoltarea partenogenetică a unui embrion, respectiv
plantă haploidă, dintr-un nucleu haploid al microsporului germinat sau granulei de polen.

Antere

Microspori

Androgeneza directă Androgeneză indirectă

Proembrion Calus

Embrion
Regenerare

Plante haploide Plante haploide

• Sub influenţa unor stimuli externi (mediul de cultură, temperatura, lumina) poate fi declanşată
androgeneza directă, care presupune o evoluţie particulară a nucleului haploid al microsporului şi
anume, prin diviziuni mitotice repetate devine embrioid, iar apoi plantă haploidă. În cazul
androgenezei indirecte, microsporul se divide repetat formând mai întâi calus, din care apoi, pe
calea regenerării, se obţin plantele haploide.
• La angiosperme, fiecare celulă mamă diploidă a ţesutului sporogen dă naştere prin meioză la o
tetradă de microspori haploizi, numiţi şi granule de polen. Evoluţia ulterioară a granulei de polen
reprezintă dezvoltarea gametofitului mascul.
• Microsporii rezultaţi din tetradele meiozei sunt uninucleaţi. În urma primei mitoze polinice
asimetrice se formează doi nuclei inegali: unul vegetativ mai mare şi altul generativ mai mic.
Microsporul tânăr se transformă în granulă de polen binucleată, formată de fapt din două celule:
una vegetativă şi alta generativă.
• Celula generativă se divide încă o dată ( a doua mitoză polinică) rezultând doi gameţi
masculi(nuclei spermatici), care vor participa la dubla fecundare: unul se uneşte cu oosfera, iar
celălalt cu nucleul secundar al sacului embrionar.
• În celula vegetativă, nucleul se măreşte, se acumulează amidon, au loc activităţi metabolice
intense şi se formează tubul polinic..
• “În vitro”, gametofitul mascul poate urma o altă evoluţie finalizată cu apariţia embrionilor haploizi
prin:diviziuni repetate ale celulei vegetative, în timp ce celula generativă avortează; diviziuni
repetate ale celulei generative, fără participarea celulei vegetative la formarea haploidului;
diviziuni simetrice ale nucleului microsporului cu formarea a doi nuclei, respectiv două celule
identice.
Reprezentarea schematică a dezvoltării polenului ” in vivo”
şi ” in vitro” (după Guha şi Maheshwari, 1971)
 Pentru inducerea unei devieri a programului normal de dezvoltare a gametofitului mascul există
trei metode: de cultivare a anterelor, inflorescenţelor şi polenului.

• Cultura de antere este metoda cea mai veche, introdusă de Guha şi Maheshwari, (în 1964) la
Datura innoxia, ulterior fiind aplicată şi altor specii de interes economic: orez, grâu (Hu, 1978),
secară (Wenzel, 1977), tutun (Sunderland, 1977). În cazul acestei metode, s-a elaborat un
protocol experimental care să asigure numai dezvoltarea polenului, fără ţesuturile somatice
înconjurătoare. Polenul se dezvoltă fie sub forma unor structuri organizate de tipul embrionilor (la
tutun, varză), fie sub forma unor mase neorganizate de celule (calus) ( la cereale).
• Cultura de inflorescenţe a fost pusă la punct de Wilson,(în 1977) pentru orz şi în general este
folosită în cazul speciilor cu flori mici, având periant redus.
• Cultura de polen datează din 1974, prin contribuţia lui Nitsch şi a fost aplicată la câteva specii
din familia Solanaceae. Ea implică o cultivare prealabilă a anterelor, pentru a impiedica
degenerarea polenului după izolare Polenul este reactiv în cultură numai în decursul unei scurte
perioade din dezvoltarea timpurie a anterelor. Această perioadă începe imediat după eliberarea
microsporilor din tetrade şi se sfârşeşte la scurt timp după prima diviziune mitotică, care iniţiază
formarea gametofitului mascul. În acest interval există un stadiu optim pentru fiecare specie sau
varietate.

Sunderland, (în 1980) clasifică speciile, funcţie de răspunsul polenului în cultură în 3 clase:
1. premitotică (cerealele)- au reacţia optimă înainte de prima diviziune mitotică;
2. mitotică (tutunul)- răspunsul optim este în timpul diviziunii mitotice;
3. postmitotică (Nicotiana sylvestris)- răspunsul optim este la încheierea diviziunii, o dată cu formarea
celulei generative.
Plantele haploide sunt pure genetic, la ele manifestându-se fenomenul de hemizigoţie, posedă
numai o doză de gene în genotip şi nu perechea de alele, de aceea există o corespondenţă
deplină între genotip şi fenotip. Pentru ameliorare, acest fapt este foarte important în realizarea
selecţiei tipului corespunzător de plantă la nivel haploid.

Prin diploidizarea haploizilor pot fi obţinute liniile izogene, care sunt homozigote pentru totalitatea
genelor. Caracteristica esenţială a plantelor dublu haploide constă în faptul că ele posedă gene
similare la aceiaşi loci din cromosomii omologi.
Descendenţa acestor linii, datorită homozigoţiei, este identică şi uniformă genetic şi este
menţinută prin autopolenizare. Importanţa utilizării liniilor dublu haploide în procesul de ameliorare
derivă din identitatea perechilor de alele, care controlează o anumită caracteristică, fapt care
asigură uniformitatea indivizilor în cadrul unei generaţii precum şi de la o generaţie la alta.

Metoda haploidiei şi, implicit, producerea liniilor izogene constituie baza obţinerii de noi soiuri.
Producerea liniilor izogene valoroase prin metoda androgenezei experimentale se realizează într-
un timp mult mai scurt decât prin metoda clasică, de pildă, la Nicotiana tabacum ciclul de obţinere
de noi soiuri prin utilizarea haploidiei este de 5 ani, în timp ce prin metoda clasică, este de 10-12
ani. Aceasta înseamnă o mărire a eficienţei procesului de ameliorare în condiţiile reducerii
substanţiale a cheltuielilor (suprafeţe reduse de teren, necesităţi reduse de forţă de muncă).

Liniile izogene obţinute la Solanum tuberosum sunt utilizate pentru ameliorarea unor caracteristici
cantitative: rezistenţa la boli şi dăunători, la îngheţ, forma tuberculilor.
 Cultivarea celulelor haploide reprezintă un sistem ideal pentru cercetările de mutageneză :
inducerea mutaţiilor la nivel haploid are un caracter mai controlat şi, totodată, permite izolarea
imediată a mutantelor.

Mutageneza la nivel haploid generează o mare variabilitate genetică, care în urma selecţiei
permite obţinerea unor plante mai productive, mai bine adaptate la mediu, rezistente la boli.

Prin metoda androgenezei experimentale se pot evidenţia rapid mutaţiile recesive şi pot fi induse
artificial mutante la nivel haploid. Posibilitatea izolării rapide a mutaţiilor recesive naturale sau
induse artificial reprezintă un avantaj al haploizilor, aceasta spre deosebire de plantele diploide, la
care mutaţiile recesive nu se manifestă decât în stare homozigotă.

Mutaţiile recesive sunt evidenţiate imediat la nivel haploid, ele pot fi aduse prin diploidizare în stare
homozigotă, la liniile izogene.
Un avantaj al plantelor haploide sau dublu haploide îl constituie faptul că acestea manifestă atât
trăsăturile recesive, cât şi dominante, şi ca atare pot fi uşor selectate.
.
Numeroase mutante biochimice au putut fi izolate la nivel haploid: mutante de tip auxotrof pentru
biotină, arginină, precum şi mutante rezistente la antibiotice, erbicide sau diferiţi factori de stres(
temperaturi scăzute sau ridicate, salinitate).

Inducerea şi detectarea la plantele de cultură a unor mutante rezistente sau tolerante la doze mai
mari de pesticide şi capabile să metabolizeze aceste substanţe chimice asigură obţinerea unor
genotipuri rezistente, evitându-se riscul distrugerii culturilor, în cazul administrării unor cantităţi
mai mari de pesticide. Capacitatea de metabolizare a substanţei active din pesticide constituie
premiza producerii unor recolte lipsite de substanţe remanente nocive pentru om şi animale.

Acumularea excesivă a sărurilor solubile (clorurile) constituie un factor limitativ pentru producţia
agricolă. Creşterea şi dezvoltarea plantelor este afectată de excesul de săruri din sol. Studiile de
mutageneză, efectuate pe culturi haploide de Nicotiana sylvestris au permis selectarea unor linii
celulare care tolerează NaCl, fiind capabile să creasă la o concentraţie de 1-50%. Liniile selectate
şi-au păstrat această proprietate după multe generaţii. În mod normal celulele tolerează
concentraţii de NaCl doar de 1 % .
 Antere

Microspori

Embriogeneză Calus haploid

Plante haploide Mutageneză fizică şi chimică

Dublarea cromosomilor Selecţie şi regenerare

Plante homozigote (linii izogene) Mutante

Factorii implicaţi în declanşarea androgenezei experimentale sunt:

• Genotipul plantei donatoare influenţează atât capacitatea anterelor de a produce calus, cât şi
capacitatea calusului de a regenera plante haploide. De pildă, la viţa de vie, Gresshoff a obţinut
calus haploid doar la 3 din cele 27 de soiuri testate. La diferite soiuri de Triticum aestivum s-au
înregistrat diferenţe în privinţa potenţialului androgenetic (Chu, 1973).

• Vârsta şi starea fiziologică a plantei donatoare se referă la stadiul de dezvoltare a polenului care
urmează a fi cultivat. Faza optimă de dezvoltare a microsporilor, necesară pentru inducerea
androgenezei este cuprinsă între stadiul de tetradă şi imediat după prima mitoză polinică. De
pildă, la cereale recoltarea anterelor în etapa de dezvoltare de microspori uninucleaţi asigură
răspunsurile androgenetice maxime.

• Mediul nutritiv, lumina şi temperatura afectează randamentul androgenezei directe şi indirecte.

În general se utilizează mediile White, Murashige-Skoog şi Nitsch, care conţin toate elementele
de bază necesare dezvoltării “in vitro”: macroelemente, microelemente, aminoacizi esenţiali,
vitamine, substanţe de creştere. Zaharoza, în concentraţie de 8% are efect inductiv asupra culturii
de antere de Brassica napus, Brassica campestris, B. oleracea, B. nigra. Alteori efectul inductiv
constă în utilizarea unei concentraţii de 17-20% zaharoză, urmată de reducerea concentraţiei la
10-13 %. Aminoacizi, ca glutamina, prolina, asparagina stimulează embriogeneza haploidă la orz,
grâu, porumb.
 Temperatura optimă de cultivare “in vitro” a polenului este de 27 ˚C. Microsporii izolaţi prezintă o
fotosensibilitate mai crecută decât a anterelor, de aceea în primele zile de cultură ei sunt ţinuţi la
întuneric. Schimbarea evoluţiei normale a microsporilor cu o evoluţie pe cale vegetativă poate fi
indusă prin tratarea anterelor cu diferiţi agenţi fizici sau chimici, care contribuie la sporirea
numărului de diniziuni simetrice ale microsporilor. Anterele sunt supuse şocurilor termice, fiind
păstrate timp de 24-48 de ore la temperatura de 3-5 ˚C.
Obţinerea plantelor diploide homozigote presupune tratamentul cu colchicină a plantelor haploide,
substanţă care blochează mitoza în metafază, prin inactivarea fusului de diviziune, ce are ca efect
dublarea numărului de comosomi.
Embriogeneza haploidă se referă nu numai la regenerarea “in vitro” a plantelor haploide din
culturi de microspori(antere), ci şi din ovule (ovare).
• Ginogeneza experimentală are un caracter mai limitat decât androgeneza, deoarece aceasta din
urmă presupune folosirea unui materialde start mult mai abundent, mai uniform ca mărime şi mai
uşor de manipulat.
• Dezvoltarea embrionilor haploizi din culturi de ovare, ovule, muguri florali a fost obţinută la
monocotiledonate şi dicotiledonate.
• Se cultivă de obicei sacul embrionar cu cei 8 nuclei şi fiecare celulă haploidă poate da naştere
unui embrion. Studii histologice privind ginogeneza experimentală au fost efectuate îndeosebi la
Helianthus anuus.
• La Oryza sativa, sinergidele au evoluat spre calea embriogenezei (He şi Yang, 1988), iar la
Allium tuberosum antipodele (Tian şi Yang, 1989).
 Factorii care influenţează ginogeneza sunt aceiaşi ca şi în cazul androgenezei:

• Genotipul plantei donatoare- diferenţe genotipice sub aspectul embriogenezei au fost semnalate
la Allium cepa şi Beta vulgaris;

• Stadiul de dezvoltare a celulelor gametofitului femel - la Helianthus anuus, recoltarea ovulelor s-a
efectuat cu 3-4 zile înainte de înflorire. la Beta vulgaris , ovulele de formă alungită au fost
adecvate pentru embriogeneză, iar cele sferice au degenerat. Sezonul recoltării influenţează
frecvenţa ginogenezei în culturi de ovule(ovare).

• Mediul de cultură şi condiţiile fizice – fitohormonii joacă un rol important în declanşarea

ginogenezei. De pildă, la Beta vulgaris s-a utilizat BAP (benzilaminopurină). Mediul de iniţiere a
culturii conţine zaharoză (10%). La Alium cepa , cultivarea ovulelor se realizează la 27 ˚ C şi la
lumină slabă. La Beta vulgaris, ovulele au fost cultivate 4-5 zile la temperatuă scăzută, iar la
Helianthus annuus, 24-48 de ore la temperatura de 4 ˚C.
 Quercus suber
a) Stadii ale dezvoltării staminelor b) Polenul în stadiu de tetradă şi apariţia
microsporilor izolaţi c) Microspori uninucleaţi d) Microspori uninucleaţi
(vacuolizaţi) e) Microspori binucleaţi
 Inducerea şi proliferarea embrionilor haploizi la (Quercus suber L.)
a) Quercus suber L. b) Ramuri cu stamine c)Cultivarea anterelor in vitro d)
Dezvoltarea embrionilor haploizi e) Stadii incipiente ale embriogenezei haploide f)
Proliferarea embrionilor haploizi
Inflorescente, muguri, antere si microspori de Olea europaea L.
a. tetrade ;
b.,c. microspori uninucleati- stadiu timpuriu;
d. microspori uninucleati- stadiu avansat;
e. granule de polen binucleate;
f. granule de polen matur.
 MANIPULAREA GENETICĂ “IN VITRO”

Manipularea genetică este o metodă a geneticii moleculare, care asigură transferul materialului
genetic de la o celulă (protoplast) la altă celulă (protoplast), excluzând procesul sexual.
1. Hibridarea somatică (hibridarea parasexuală)- se realizează prin
fuziunea completă a nucleilor şi citoplasmelor celor doi
protoplaşti.
2. Hibridarea citoplasmatică (cibridizarea)- presupune fuziunea
nucleului şi citoplsmei unui protoplast cu citoplasma altui
protoplast;
3. Transferul de nuclei, cromosomi, fragmente cromosomiale şi organite
( cloroplaste şi mitocondrii) la nivelul protoplaştilor.
4. Tehnica ADN-ului recombinant , care presupune utilizarea unui vector
(plasmidă sau virus), ce asigură transferul unor gene izolate din
plante, bacterii sau virusuri, la nivelul protoplaştilor vegetali.
 Hibridarea somatică şi avantajele utilizării ei în
ameliorarea plantelor

Această tehnică constă în fuziunea spontană sau indusă a unor tipuri diferite de celule din care
rezultă celule hibride.
La plante, hibridarea somatică n-a devenit posibilă decât după ce au fost elaborate metode
eficiente de obţinere a unui tip special de celule, şi anume protoplaştii- celule lipsite de
peretele celular rigid, pecto-celulozic. În jurul anului 1960 a fost elaborată metoda enzimatică
de izolare a protoplaştilor, prin utilizarea celulazei, pectinazei, macerozimului. În 1971,
cercetătorul francez J.P. Nitsch a obţinut primele plante regenerate la Nicotiana tabacum,
pornind de la culturi de protoplaşti.
Din punct de vedere genetic, protoplaştii prezintă o deosebită importanţă pentru:

• Înmulţirea vegetativă foarte rapidă a unor genotipuri valoroase; dintr-un gram de frunze verzi
se pot obţine 2 milioane de protoplaşti, identici din punct de vedere genetic.
• Obţinerea de hibrizi somatici între două sau mai multe specii îndepărtate din punct de
vedere filogenetic.
• Fuziunea protoplaştilor aparţinând aceleaşi specii duce la obţinerea unor forme cu grade
variate de ploidie, care pot fi utilizate direct în ameliorarea plantelor; este vorba despre
multiplicarea numărului de genomuri proprii, caracteristică autopoliploizilor.

• Transferul de gene sau cromosomi în protoplaşti, fapt care permite transferul rezistenţei la
boli şi dăunători de la speciile sălbatice la cele cultivate sau a genelor care determină sinteza
unor proteine animale în celulele vegetale, fapt cu profunde implicaţii în alimentaţia
umană.; în protoplaşti pot fi transferate cele mai diverse gene, responsabile de sinteza
aminoacizilor, vitaminelor, hormonilor, antibioticelor.

• Transferul cloroplastelor în protoplaştii proveniţi de la plantele cu un sistem fotosintetic

ineficient.
În concluzie, putem afirma că protoplaştii sunt cele mai eficiente sisteme celulare folosite în
manipularea genetică, care include hibridarea somatică, transferul de ADN nuclear şi
extranuclear.
 IZOLAREA SI CULTIVAREA PROTOPLASTILOR ȘI SUBPROTOPLAȘTILOR VEGETALI

• Etapele izolării protoplaștilor:

1. Alegerea țesutului care servește ca sursă de protoplaști, sterilizarea pentru plantele
crescute ex vitro (cele mai frecvente surse sunt: mezofilul, hipocotilele, cotiledoanele,
suspensiile celulare).
2. Plasmoliza- se bazează pe o soluție ce conține un stabilizator osmotic (manitol sau
sorbitol)
3. Tratamentul enzimatic-constă în incubarea materialului vegetal într-o soluție de macerare (
celulază, pectinază, macerozim, săruri de calciu, stabilizator osmotic).
4. Purificarea protoplaștilor- se bazează pe filtrare cu filtre de nylon sau metalice ( separarea
protoplaștilor de resturile nedigerate din amestecul enzimatic), apoi protoplaștii sunt spălați
de soluția de macerare prin centrifugări repetate și centrifugarea în gradient de zaharoză (
protoplaștii se vor separa la suprafața soluției)..
 5. Stabilirea numărului și a viabilității protoplaștilor.Numărarea se realizează cu ajutorul
hemocitometrului și se raportează la 1 g țesut. Pentru evidențierea viabilității se pot utiliza
coloranți vitali absorbiți de celulele viabile sau coloranți vitali absorbiți de celulele moarte.
Din prima categorie este diacetatul de fluoresceină, care este un compus nefluorecent care
pătrunde prin membrana plasmatică. Sub acțiunea esterazelor este descompus în
fluoresceină, un compus fluorescent care nu poate trece prin membrana intactă. Protoplaștii
viabili, analizați la microscop cu lumina UV vor prezenta o fluorescență verde, în contrast cu
protoplaștii neviabili. Din cea de a doua categorie fac parte fenosafranina sau albastru
Evans, compuși pentru care membrana celulară intactă nu este permeabilă.

Izolarea subprotoplaștilor reprezintă fragmente celulare înconjurate de plasmalemă, putând

fi izolate fie prin șoc osmotic urmat de izolare mecanică, fie prin centrifugare diferențiată la
turație mare, în gradient de zaharoză și manitol.
Se pot izola următoarele tipuri de subprotoplasti:
• Citoplaști- subprotoplaști bogați în citoplasmă și organite mici, dar lipsiți de nucleu
• Miniprotoplaști sau nucleoplaști- prezintă nucleul înconjurat de un strat subțire de
citoplasmă și membrana plasmatică
• Condrioplaști sau plastoplaști, ce conțin un strat subțire de citoplasmă și preponderent un
tip de organite: mitocondrii, respectiv plastide
• Vacuoplaști- prezintă vacuola înconjurată de un strat subțire de citoplasmă și plasmalema
 Sisteme de cultivare a protoplaștilor

• Cultivarea în mediul lichid- suspensia de protoplaști este pipetată sub formă de

micropicături.
• Cultivarea pe mediu solid- este o metodă mai avantajoasă deoarece se poate urmări cu
ușurință dezvoltarea coloniilor,iar agentul de gelificare este agaroza sau alginatul de sodiu.
• Cultura doică sau nurse culture- protoplaștii sunt cultivați într-o picătură de mediu lichid
separat printr-o membrană filtrantă sau hărtie de filtru de un mediu solid în care sunt
imobilizați protoplaștii.
Schema izolării protoplaştilor (după Cocking, 1960)
Protoplaşti de origine foliară la Echinacea purpurea
 Pentru înţelegerea avantajelor oferite de hibridarea somatică, reamintim unele dintre
caracteristicile esenţiale ale hibridării sexuate, precum şi impedimentele care decurg din
acestea:.
• Hibridarea sexuată asigură echilibrul dintre schimbările de ordin genetic limitând
variabilitatea individuală a descendenţei.
• La hibridarea sexuată iau parte gameţii, încrucişarea este simetrică, în sensul că gameţii
femeli şi masculi aduc o contribuţie egală în materialul genetic nuclear al descendenţei.
• În privinţa factorilor genetici citoplasmatici, aceştia se moştenesc uniparental, pe cale
maternă.
 Comparativ cu hibridarea sexuată, hibridarea somatică se realizează doar experimental şi
conferă hibridului unele avantaje, dintre care menţionăm:

• Obţinerea de hibrizi între indivizi care aparţin unor specii îndepărtate filogenetic,
asigurându-se depăşirea barierelor interspecifice.

• Obţinerea hibrizilor între specii, care se înmulţesc doar pe cale vegetativă.

• Obţinerea hibrizilor multiparentali, rezultaţi din fuziunea simultană a mai mult de două
celule.
• Fuziunea dintre celulele somatice poate apărea spontan “in vitro” şi “in vivo” sau poate fi
indusă în culturile de protoplaşti cu ajutorul diferiţilor agenţi de fuziune.
Cele trei faze succesive ale fuzionării protoplaştilor sunt:
• Aglutinarea- în timpul căreia plasmalemele celor doi protoplaşti vin în contact.
• Fuziunea plasmalemelor în mici areale localizate, care se extind treptat cu formarea unor
punţi citoplasmatice, stabilindu-se continuitatea între protoplaştii adiacenţi; amestecul
citoplasmatic este complet când fuzionează tonoplaştii.
• Formarea homo-sau heterocarionilor sferici.
În urma procesului de fuziune pot rezulta două categorii de celule multinucleate (policarioni):

• Homocarionii-sunt celule cu nuclei identici din punct de vedere genetic, proveniţi din acelaşi
tip de celule parentale; ei sunt de regulă produşii fuziunilor spontane intraspecifice.
• Heterocarionii- sunt celule cu nuclei diferiţi din punct de vedere genetic,rezultaţi din celule
parentale diferite; aceştia sunt consideraţi adevăraţii hibrizi.
 În cazul în care supravieţuiesc, în urma fuziunii nucleare, heterocarionii devin celule
mononucleate, adică sincarioni. Aceştia se pot menţine şi prolifera pe medii adecvate timp
îndelungat, formând calus, din care pe calea regenerării vor rezulta hibrizii vegetali. Analizele
citologice şi biochimice ale hibrizilor somatici au evidenţiat trei tipuri de hibrizi:

• Hibrizii simetrici- conţin genomurile nucleare ale ambilor parteneri de fuziune ( Helianthus
anuus x Helianthus giganteus).

• Hibrizii asimetrici- conţin în întregime genomul nuclear al unui părinte şi doar o parte din
genomul nuclear al celuilalt părinte. Această situaţie este datorată eliminării treptate a
cromosomilor, pe măsura ciclurilor celulare succesive (Brassica nigra x Brassica napus).

• Cibrizii- sunt hibrizii citoplasmatici, care conţin nucleul şi citoplasma unei celule şi
citoplasma anucleată a altei celule
Ei pot fi obţinuţi prin:
• fuziunea unui protoplast normal cu unul anucleat;
• fuziunea unui protoplast normal cu un protoplast care conţine un nucleu neviabil eliminarea
unuia dintre cei doi nuclei după formarea heterocarionului.
Izolarea, cultivarea şi fuziunea protoplaştilor foliari (după Bajaj,
1977)
Etapele hibridării somatice (după Carlson şi colab., !972)
Hibridarea intraspecifica la Solanum tuberosum
 Metode de inducere a fuziunii protoplaştilor

• Metoda mecanică se bazează pe utilizarea unor micropipete de perfuzie, prin intermediul

cărora protoplaştii sunt aduşi în contact direct şi pot fuziona. Această metodă a fost
elaborată de Mitchel (1937) şi aplicată la Glycine hispida şi Arachis hypogaea.
• Metoda chimică constă în utilizarea unor substanţe ca: nitratul de sodiu, polietilenglicolul,
ionii de Ca la un pH ridicat, substanţe deosebit de eficiente în procesul aglutinării
protoplaştilor şi formării produşilor de fuziune. Este o metodă larg utilizată începând din
1909, când Küster a obţinut homocarioni în urma fuziunii protoplaştilor de Allium cepa..
În 1972, Carlson a obţinut primele plante hibride pornind de la protoplaştii a două specii de
Nicotiana.
• Metoda imunologică, elaborată de Hartmann în 1973, se bazează pe aglutinarea
protoplaştilor cu ser de iepure, preparat pentru producerea de anticorpi.
 Fuziunea protoplaştilor a devenit în ultimele decenii o tehnică cu un potenţial deosebit
pentru biotehnologia plantelor superioare; totuşi, metodele clasice de fuziune, bazate pe
utilizarea agenţilor fusogeni chimici, rămân în mare parte nesatisfăcătoare.Aceste metode
supun protoplaştii unor condiţii necorespunzătoare din punct de vedere fiziologic( pH
alcalin, concentraţii crescute ale ionilor de Ca), care sunt toxice pentru produşii de fuziune.

Sincronizarea şi urmărirea desfăşurării întregului proces de fuziune sunt dificil de urmărit la

microscopul fotonic. Agenţii fusogeni de natură chimică interacţionează cu plasmalema într-
o manieră greu de controlat, afectând viabilitatea celulelor; randamentul procesului de
fuziune este scăzut, aproximativ 50 %.
• Senta şi colab. (1979), precum şi Zimmermann şi colab. (1981) au elaborat şi dezvoltat o
nouă tehnică de fuziune: electrofuziunea, care elimină multe din neajunsurile metodelor
chimice. Această metodă utilizează ca agent inductor câmpul electric şi constă din aducerea
protoplaştilor în contact intim, prin amplasarea acestora într-un câmp electric alternativ şi
administrarea unor pulsuri de curent direct, având amplitudine ridicată şi durată scurtă de
acţiune
• Tehnica electrofuziunii a fost aplicată celor mai diverse tipuri de celule: de la bacterii la
celulele umane, făcând posibilă fuziunea unor celule aparţinând unor genuri sau chiar
regnuri diferite.În comparaţie cu metodele chimice de fuziune, electrofuziunea presupune o
aparatură relativ simplă şi ieftină, întregul proces poate fi urmărit şi înregistrat prin filmare şi
fotografiere, la microscopul fotonic, fiind posibilă prestabilirea parametrilor optimi de
electrofuziune, precum şi a densităţii optime a suspensiei de protoplaşti pentru favorizarea
fuziunilor binare, terţiare sau multiple. Randamentul procesului de fuziune este cuprins între
60-80 %, uneori chiar 100 %.
Electrofuziunea a fost aplicată la un număr mare de specii: Avena sativa, Triticum aestivum,
Zea mays, Hordeum vulgare, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum.

În experimentele efectuate, viabilitatea produşilor de fuziune s-a reflectat în capacitatea de

regenerare a heterocarionilor, iniţial la planta test Nicotiana tabacum, ulterior şi la alte
specii de cultură de importanţă economică: Zea mays x Glycine max, Pisum sativum x
Glycine max, Hordeum vulgare x Daucus carota.
 Metode de selecţie a hibrizilor somatici
• Selecţia hibrizilor somatici poate avea loc în diferite faze:
• imediat după fuziune, înaintea apariţiei diviziunii;
• după diviziunea homo- sau heterocarionului;
• după apariţia calusului;
• după regenerarea hibrizilor somatici.

În fiecare din aceste faze pot fi aplicate metode diferite, funcţie de produşii de fuziune. În
prima fază, cea de homo- sau de heterocarion sunt efectuate analize electronomicroscopice
pentru evidenţierea cloroplastelor sau a diferitelor tipuri de heterocromatină.
Prezenţa sau absenţa unor organite citoplasmatice favorizează recunoaşterea trăsăturilor
parentale
În faza următoare, în cazul în care homo-sau heterocarionul a devenit sincarion, placa
metafazică în timpul mitozei va cuprinde cromosomii speciilor parentale, de aceea în această
fază se poate efectua cariotipul celulelor hibride.

După apariţia calusului se aplică atât metode de identificare a celulelor hibride, cât şi de
selecţie, prin utilizarea unor markeri biochimici: mutante rezistente la medicamente,
erbicide sau mutante nutriţionale auxotrofe pentru aminoacizi, vitamineÎn faza următoare,
în cazul în care homo-sau heterocarionul a devenit sincarion, placa metafazică în timpul
mitozei va cuprinde cromosomii speciilor parentale, de aceea în această fază se poate
efectua cariotipul celulelor hibride.

Selecţia şi regenerarea hibridului Nicotiana glauca x Nicotiana langsdorffii (Carlson, 1972) a

fost posibilă prin cultivarea celulelor hibride pe un mediu lipsit de fitohormoni. Protoplaştii
fiecăruia dintre părinţi nu pot creşte pe un mediu fără regulatori de creştere, de aceea s-au
selectat numai celulele fuzionate, care se pot dispensa de substanţele de creştere
respective.
• Selecţia şi regenerarea hibridului Nicotiana glauca x Nicotiana langsdorffii a fost posibilă
prin cultivarea celulelor hibride pe un mediu lipsit de fitohormoni. Protoplaştii fiecăruia
dintre părinţi nu pot creşte pe un mediu fără regulatori de creştere, de aceea s-au selectat
numai celulele fuzionate, care se pot dispensa de substanţele de creştere respective.

• În 1987, Davey şi Power au obţinut primii hibrizi gametosomatici intergenerici: Nicopetunia

prin electrofuziunea protoplaştilor izolaţi din tetradele polinice de Nicotiana tabacum cu
protoplaştii de Petunia inflata. Incapacitatea de regenerare a protoplaştilor izolaţi din
tetradele polinice a fost folosită ca metodă de selecţie pentru separarea hibrizilor.

• Un alt criteriu în selecţia hibrizilor are la bază faptul că anumiţi agenţi patogeni sau toxinele
lor provoacă o gamă largă de receptivitate la nivelul diferitelor plante. Toxinele produse de
Helmintosporium maydis distrug protoplaştii liniilor sensibile de Zea mays, în timp ce alte
linii sunt rezistente. Folosind linii rezistente la toxine se pot regenera plante imune la
respectivul patogen.
Modelarea genomului unui organism vegetal, prin introducerea uneia sau mai multor
gene străine este posibilă cu ajutorul unui complex de metode, care aparţin ingineriei
genetice şi au ca rezultat transformarea genetică a plantelor sau, altfel spus,
obţinerea plantelor transgenice

Aspectele practice ale tehnologiei ADN- ului recombinant reprezintă o etapă nouă în
cercetare, cea de “hibridare moleculară”, prin care sursele materialului genetic
transferat sunt nelimitate, depăşind cu mult posibilităţile oferite de hibridarea sexuată
sau somatică.

Transformarea genetică a plantelor presupune o serie de tehnici ale biologiei

moleculare, care vizează izolarea genelor, utilizarea unor vectori, caracterizarea
moleculară a plantelor transformate

Plantele transgenice sunt obţinute în urma experimentelor „in vitro” de transfer de

material genetic exogen: la nivelul lor se integrează în mod stabil secvenţe de ADN
provenite de la alte organisme, care le conferă anumite însuşi fenotipice noi sau
modificate.

Transferul de gene la plante a devenit posibil datorită descoperirii şi a utilizării

sistemului de transformare genetică prin intermediul bacteriilor din genul
Agrobacterium (A. tumefaciens şi A. rhizogenes).

Rezultatele cercetărilor din domeniul geneticii vegetale, se bazeaza în primul rând pe

folosirea plasmidelor Ti de la Agrobacterium tumefaciens.
 Particularităţile bacteriilor din genul Agrobacterium

A.tumefaciens şi A.rhizogenes sunt bacterii ce trăiesc în sol, ele fiind capabile de a

produce boli unor specii de plante dicotiledonate şi gimnosperme. S-a dovedit că
A.tumefaciens determină apariţia unor tumori de tip "crown gall" pe tulpinile rănite ale
unor plante (în special la nivelul coletului), în timp ce A.rhizogenes induce formarea
de rădăcini adventive (de tip "hairy") la nivelul ţesuturilor vegetale rănite.

Modificările morfogenetice determinate de infectarea plantelor cu tulpini de

A.tumefaciens sau A.rhizogenes se datorează transferului unor gene de origine
bacteriană în celulele vegetale.

Bacteriile din genul Agrobacterium prezintă un sistem genetic organizat care permite
introducerea de gene noi în celula vegetală, graţie prezenţei în celula lor a unei
plasmide Ti ("tumor inducing") sau Ri ("root inducing"), ce reprezintă factorul
determinant al producerii tumorilor, respectiv rădăcinilor anormale, la plante.

Transferul unei porţiuni din aceste plasmide în genomul celulei vegetale determină
modificări funcţionale, ce se concretizează prin apariţia fenomenului tumoral. Aceste
plasmide constituie, aşadar, un sistem organizat şi complex de transfer de informaţie
genetică naturală în celula vegetală.
Tumori “crown gall” la Medicago sativa
Tumori “crown gall” la Phaseolus vulgaris
Tumori “crown gall” la Juglans regia
Tumori “crown gall” la Euonymus sp.
Culturi “hairy roots” de Rehmannia glutinosa, obtinute din explante
foliare tratate cu Agrobacterium rhizogenes
În principiu, plasmidul Ti (un mic fragment circular de ADN necromosomal cu
replicare independentă faţă de cea a cromosomului) conţine mai multe regiuni, cu
funcţii distincte:
regiunea T-ADN (conţinând genele de tumorigeneză),
regiunea de virulenţă (genele vir), ambele fiind cele mai importante pentru procesul
de transformare a celulelor vegetale.
 Regiunea de virulenţă cuprinde gene esenţiale pentru transferul de ADN bacterian
în celulele vegetale, fără a fi însă ele însele transferate. Regiunea vir cuprinde un
segment de aproximativ 30-40 kb (în funcţie de tulpina bacteriană), fiind formată din
mai mult de 20 gene organizate în cel puţin 6 unităţi transcripţionale (operoni): virA (o
genă), virB (11 gene), virC (2 gene), virD (4 gene), virE (2 gene) şi virG (o genă).
Dintre aceste unităţi transcripţionale, virA, virB, virD şi virG sunt esenţiale pentru
transferul ADN-T, iar virC şi virE asigură o creştere a eficienţei transferului. Toţi aceşti
operoni sunt induşi în prezenţa celulelor vegetale rănite (care produc o serie de
compuşi fenolici cu rol inductor), funcţiile lor fiind următoarele:

• virA şi virG codifică proteine responsabile de recunoaşterea celulelor vegetale rănite

şi de inducerea celorlalte funcţii vir;

• - virC şi vir D codifică proteine ce asigură formarea unei copii de ADN-T

monocatenar, transferabil în celula vegetală;

• - virD şi virE codifică proteine ce formează un complex împreună cu ADN-T

ghidându-l spre nucleul celulei vegetale; ele se pare că sunt implicate şi în procesul
de integrare al ADN-T în genomul noii gazde;

• - virB codifică proteine care răspund de transportul complexului ADN-T-proteine prin

membrana plasmatică bacteriană.
 Exprimarea genelor localizate în regiunea de virulenţă a plasmidelor Ti este
inductibilă, fiind reglată de acţiunea unor factori din exterior. Experimental s-a
demonstrat că, sub acţiunea unor molecule semnal din exudatele plantelor sau la
nivelul rănilor produse la plante, are loc o puternică activare a acestor gene. Aceste
molecule semnal sunt compuşi fenolici, de tipul acetosiringonei sau a α-
hidroxiacetosiringonei.
Regiunea T-ADN reprezintă o porţiune din plasmida Ti (sau Ri) care este transferată
în celula vegetală, integrându-se stabil în genomul celular. Această regiune T-ADN(de
la ADN transferat) are aproximativ 20-25 kb lungime (în funcţie de tulpina bacteriană
gazdă) şi conţine toate genele (oncogenele) care transferate în celula vegetală vor
determina fenotipul caracteristic al celulelor transformate. Genele localizate pe T-
ADN determină două proprietăţi caracteristice pentru celulele vegetale tumorale:
creşterea pe medii de cultură în absenţa fitohormonilor; sinteza şi secreţia de opine,
substanţe specifice pentru aceste tipuri de celule.
• Nester şi colab. (1984) au reuşit identificarea şi cartarea a opt gene aflate la nivelul
T-ADN : gene implicate în codificarea sintezei de auxine, de citochinine, de opine.
• De remarcat că, T-ADN conţinut de toate plasmidele Ti naturale este flancat de scurte
secvenţe de nucleotide, de aproximativ 25 pb, repetate direct, esenţiale pentru
procesul de transfer în celulele vegetale. Analiza acestor secvenţe terminale a arătat
că acestea sunt conservate la diferitele tulpini de Agrobacterium, ele fiind
recunoscute de echipamentul enzimatic implicat în transferul ADN-T din celula
bacteriană în celula vegetală.

• În cazul plasmidelor Ri, analiza regiunii T-ADN a dovedit că aceasta conţine o serie
de gene, responsabile de fenotipul de tip "hairy" al ţesuturilor vegetale transformate.

• De remarcat că, genele ce se transferă în celulele vegetale sunt grupate la marginile

regiunii T-ADN. Astfel, în partea stângă a T-ADN sunt localizate genele rolA, B, C şi D
care sensibilizează celulele vegetale la acţiunea auxinelor. S-a dovedit că, la anumite
specii vegetale, simpla prezenţă a genelor rol, chiar în absenţa celorlalte gene din
ADN-T, determină apariţia fenotipului caracteristic ("hairy root").
 Mecanismul transferului T-ADN în celula vegetală
Mecanismul mobilizării şi transferului T-ADN din celula bacteriană în celula vegetală
a fost intens studiat în ultimii ani fiind clarificate multe dintre etapele acestui proces.
Cu toate acestea rămân de elucidat unele aspecte ale sale, mai ales cele ce au loc în
celula vegetală.

Primele etape ale interacţiunii dintre plante şi celulele de Agrobacterium sunt

următoarele:

• -celulele vegetale rănite eliberează o serie de compuşi fenolici (cum este

acetosiringona), aminoacizi sau glucide (acid D-galacturonic sau acid D-glucuronic),
care servesc drept chemoatractanţi pentru agrobacterii;
• - recunoaşterea celulelor rănite şi ataşarea bacteriilor la nivelul acestora ca urmare a
exprimării constitutive a genelor vir cromosomale, procesul fiind denumit colonizare
bacteriană;
• - inducerea funcţiilor vir plasmidiale şi începerea procesului de transfer al T-ADN.
• Procesul de transfer al T-ADN poate fi împărţit în două etape: una ce se desfăşoară
în celula bacteriană şi o alta ce are loc în celula vegetală
 Etapa bacteriană include toate evenimentele ce conduc la producerea şi exportul T-
ADN, începând cu activarea funcţiilor vir plasmidiale de către compuşii fenolici sau
glucidici eliberaţi din celulele vegetale rănite.

• Primele gene vir ce intră în acţiune sunt cele din operonii virA şi virG, fiind sintetizate
proteinele corespunzătoare, VirA şi VirG.

• Se pare că proteina VirA este produsă într-o formă inactivă ce este activată
(fosforilată) de inductorii vegetali (compuşii fenolici sau glucidici).

• La rândul său, proteina VirG este activată (fosforilată) de proteina VirA. Cele două
proteine interacţionează şi determină activarea celorlalţi operoni vir (virB, virC, virD,
virE).
• In esenţă, pentru ca T-ADN să fie transferat este necesară prezenţa secvenţelor
marginale de 25 pb (notate de obicei TL sau TR) şi, cel puţin în cazul unor anumite
plasmide Ti, existenţa unui element suplimentar localizat în afara T-ADN (în partea
dreaptă). Acest element stimulează procesul de transformare (are funcţie de
"enhancer").
• Excizia T-ADN este iniţiată de acţiunea combinată a proteinelor VirD1 şi VirD2,
codificate de operonul virD precum şi a proteinelor VirC1 şi VirC2, codificate de
operonul virC .
• Dintre aceste proteine, rolul cel mai important îl are proteina VirD2 care este o
endonuclează de restricţie (situs-specifică). Ea recunoaşte marginile T-ADN şi le
clivează (de obicei are loc mai întâi secţionarea uneia dintre catenele T-ADN la
nivelul marginii din dreapta) generând un segment de ADN monocatenar lung de
aproximativ 20kb, simultan având loc sinteza catenei lipsă.
• Proteina VirD2 rămâne ataşată la nivelul capătului 5' al T-ADN monocatenar
protejându-l, probabil, de acţiunea exonucleazelor. De asemenea, la T-ADN se
ataşează proteina VirE2), care nu numai că protejează segmentul monocatenar ci îl
şi converteşte la o formă corespunzătoare pentru transport
• Pentru a ajunge în nucleul celulei vegetale, complexul T-ADN-proteine trebuie să
traverseze cinci bariere majore: membrana plasmatică şi spaţiul periplasmic
bacterian, peretele celular vegetal, plasmalema celulei vegetale şi membrana
nucleară. In etapa transportului prin membrana plasmatică bacteriană sunt implicate
cele 11 gene ale operonului virB dar mecanismul exact al acestui proces nu este încă
elucidat. Rolul proteinelor este complex: pe de o parte, protejează T-ADN de atacul
exonucleazelor şi asigură transportul într-o formă corespunzătoare.

• Se pare că proteina bacteriană virE2 însoţeşte complexul virD2-T-ADN. La procesul

de translocare ar mai participa şi proteinele codificate de operonii suplimentari virF şi
virH al căror rol ar fi legat de direcţionarea complexului T-ADN spre nucleul celulei
vegetale şi de specificitatea de gazdă a tulpinilor bacteriene implicate în procesul de
transfer de ADN.

• Se consideră doar că, odată pătruns în citoplasma celulelor vegetale, complexul T

(ADN şi proteine) este preluat de proteinele vegetale şi transportat în nucleu, unde T-
ADN este integrat în genom
Tehnicile de transformare genetică cuprind mai multe etape:
1. Identificarea şi clonarea secvenţei codante a genei de interes de la un alt organism (
virus, bacterie, drojdie, plantă, celulă animală sau umană ). Metodele clasice se
bazează pe două strategii:
a. Fragmentarea ADN ului nuclear sau extranuclear cu ajutorul enzimelor de restricţie,
localizarea secvenţei de interes şi excizia ei din genom.
b. Identificarea ARN ului mesager specific pentru proteina de interes şi obţinerea unei
molecule de ADNc prin reverstranscripţie.

2. Realizarea unui construct genetic, care poate conţine gene marker de selecţie sau
gene raportoare.
3. Transferul genei în celula vegetală, prin metode directe sau indirecte de transfer.
4. Regenerarea plantelor transformate.
5. Multiplicarea şi analiza plantelor transgenice.
Reprezentarea unui construct genetic
(a)gena raportoare GUS şi markerul de selecţie
NPTII (rezistenţa la kanamicină)
(b) lăstari de tutun transgenic;
(c) plante de tutun transgenic;
(d) plantulă de tutun transgenic
 Transgeneza indirectă
Vectori de clonare pentru celula vegetală
Pentru realizarea transferului eficient de gene în celulele vegetale ţintă au fost
construiţi vectori de clonare specifici, de obicei derivaţi de la plasmidele Ti sau Ri sau
de la unele virusuri caracteristice unor specii vegetale.
Vectori plasmidiali
• Sistemul natural de transfer descris mai sus este impropriu pentru a fi utilizat, ca
atare, în scopul ameliorării plantelor. Pentru a putea fi aplicat, plasmidele Ti au fost
modificate drastic, prin eliminarea genelor ce determină producerea tumorilor, prin
menţinerea şi clonarea în alte plasmide, mai mici, doar a regiunilor marginale şi a
unor promotori ce sunt recunoscuţi de echipamentul de transcriere al celulelor
vegetale. De asemenea, între extremităţile T-ADN prelucrat, au fost introduse gene
marker specifice (nptII, gus, cat, gfp) sub controlul unor promotori corespunzători,
obţinându-se vectori de clonare foarte eficienţi.
• Pornindu-se de la constatarea că, pentru a se realiza transferul de material genetic în
celula vegetală este suficient să existe extremităţile de 25 pb ale T-ADN, au fost
făcute diferite încercări de înlocuire a genelor din interiorul T-ADN cu alte gene, de
provenienţă străină.
Vectori virali
• În ultimii ani, pentru obţinerea de plante transgenice au fost testaţi şi vectori derivaţi
de la diferite virusuri specifice plantelor. Printre cele mai studiate virusuri vegetale se
numără: virusul mozaicului conopidei (CaMV), virusul latent al maniocului (CLV),
virusul piticismului la grâu (WDV), virusul mozaicului galben al tomatelor (TGMV).
 Transgeneza directă
• Metoda chimică- se bazează pe utilizarea unor substanţe ca: poliaminele (
poliornitina, polilisina), dextran sulfatul, polietilenglicolul, care stimulează preluarea
ADN-ului de către protoplaşti. Principalul dezavantaj al acestei metode este efectul
toxic al acestor substanţe, reflectat în reducerea viabilităţii protoplaştilor.
• Electroporarea- este o metodă fizică care permite introducerea genelor în protoplaşti,
prin utilizarea unui câmp electric. Protoplaştii vegetali sunt suspendaţi într-o soluţie
ionică, ce conţine ADN. Aplicarea unor pulsuri de intensitate mare, prin intermediul
electrozilor produce o permeabilizare a plasmalemei, permiţând astfel pătrunderea
ADN-ului în celulă. Este o metodă frecvent utilizată în obţinerea plantelor transgenice
la cereale.
• Microinjecţiile cu ajutorul unor micropipete prin care ADN-ul este injectat direct în
protoplaşti sau celule, imobilizate pe un suport solid de agaroză.
• Bombardamentul cu microparticule- constă în utilizarea unor particule microscopice
de aur (microcarrieri) (1-3 μm), purtători ai fragmentelor de ADN. Particulele pătrund
prin peretele celulelor explantului eliberând ADN-ul care asigură transformarea
genetică a celulelor. Eficienţa acestei metode decurge din faptul că ţinta
bombardamentului cu microparticule o constituie explantele de tipul seminţelor,
embrionilor sau meristemelor.
Plantele transgenice de Triticum aestivum, Oryza sativa, Zea mays au fost obţinute
prin utilizarea acestei metode.
 Markeri genetici pentru selecţia şi caracterizarea celulelor vegetale transformate
Pentru a se putea evalua rapid transferul şi, mai ales, integrarea genelor clonate în
celulele vegetale, este absolut necesar ca, odată cu gena de interes, în celulele
vegetale să se integreze şi anumite gene marker specifice. In prezent, genele
utilizate drept markeri pentru celulele vegetale transformate sunt de două tipuri:
markeri de selecţie care asigură doar diferenţierea între celulele vegetale normale şi
cele modificate genetic şi markeri cuantificabili (gene raportoare) care permit şi
determinarea nivelului exprimării genelor clonate.
Dintre cele mai utilizate gene marker de selecţie pentru celulele vegetale
transformate menţionăm:
• gena pentru neomicin fosfotransferază (gena nptII ce determină rezistenţă la
kanamicină,
• gena pentru cloramfenicol-acetiltransferază (gena cat ce conferă rezistenţă la
cloramfenicol);
• gene care conferă rezistenţa la erbicide: gena bar, izolată de la bacteria
Streptomyces hygroscopicus şi gena pat, izolată de la S. viridochromogenes, ambele
codifică enzima fosfinotricinacetiltransferaza.

Gene raportoare :
• gena pentru luciferază (gena luc ce determină sinteza luciferazei care, în prezenţa
substratului specific, luciferina, produce lumină; plantele transgenice ce conţin o
asemenea genă au primit denumirea de plante "lampion"); gena pentru β-
glucuronidaza bacteriană (gena gus); gena pentru proteina cu fluorescenţă verde
(gena gfp = "green fluorescence protein").
• Selecţia celulelor vegetale transformate se poate realiza, fie prin cultivarea acestora
pe medii de cultură specifice ce conţin antibioticele corespunzătoare (kanamicină,
cloramfenicol, higromicină), prin teste histochimice aplicate celulelor vegetale (pentru
evidenţierea produsului genei luc) sau prin teste fluorimetrice (pentru produsul
genelor gus sau gfp).

.
Evidențierea markerului de selecție (gena raportoare luc -proteine
luminescente) la tutunul transgenic
lMarkeri de selecție ( proteine fluorescente) la Nicotiana tabacum (a) și
Arabidopsis thaliana(b)
Evidenţierea markerului de selecţie pentru proteina cu fluorescenţă
verde(GFP)
 Aplicaţii ale transgenezei plantelor

Speciile vegetale prezintă o mare diversitate genetică, iar cele sălbatice constituie un
mare rezervor genetic, din care se pot obţine gene importante din punct de vedere
practic.
Cercetările de inginerie genetică la plante prezintă o semnificaţie teoretică deosebită,
facilitând cunoaşterea modului de acţiune a genelor acestor organisme, a efectelor
fitohormonilor asupra dezvoltării plantelor, a mecanismelor de inactivare a genelor.
De asemenea, prin aplicarea tehnicilor de biologie moleculară se pot obţine informaţii
utile asupra particularităţilor genomului plantelor folosite în ameliorare, a localizării
unor gene de interes, a gradului de înrudire dintre diferite specii.

În ceea ce priveşte aplicaţiile practice, până în prezent au fost obţinute o serie de

rezultate semnificative, unele aplicate deja în practică aşa cum sunt:

- plante transgenice rezistente la viroze,

- plante transgenice rezistente la atacul unor dăunători,
- plante transgenice rezistente la erbicide,
- aplicaţii ale transgenezei în industria alimentară
- plante transgenice capabile să sintetizeze metaboliţi secundari în cantităţi crescute;
-plante transgenice producătoare de anticorpi
 1. Protecţia plantelor faţă de atacul insectelor
• Tehnologia ADN recombinant oferă în prezent posibilitatea obţinerii de noi insecticide
biologice care păstrează avantajele agenţilor biologici „clasici” de control având în
plus unele caracteristici noi.

• Obţinerea de plante rezistente la dăunători reprezintă poate domeniul cel mai

spectaculos al ingineriei genetice aplicate la plante, deoarece a permis regenerarea
de plante transgenice care conţin gene de origine bacteriană ce le asigura protecţie
faţă de anumite insecte dăunătoare. Aceasta asigură, pe de o parte, obţinerea de
recolte mai bogate şi, pe de altă parte, reducerea cheltuielilor fermierilor pentru
pesticide.

• In ultimii ani, au fost descoperite o serie de noi gene pentru rezistenţa la atacul
insectelor, transferabile la plante. Dintre acestea sunt de amintit: genele ce codifică
producerea δ-endotoxinei de la Bacillus thuringiensis; gene pentru sinteza unor
enzime sau a unor inhibitori enzimatici; gene de la plante ce codifică sinteza unor
lectine specifice; gene care determină inducerea sintezei unor compuşi vegetali de
tipul fitoalexinelor.
 a. Genele pentru δ-endotoxina de la Bacillus thuringiensis

În elaborarea metodologiei de clonare s-a pornit de la observaţia că există un grup de

bacterii Gram pozitive, aparţinând speciei Bacillus thuringiensis, care produc o toxină,
numită delta-endotoxina sau proteina cristal, capabilă să omoare o gamă foarte largă
de insecte (coleoptere, lepidoptere, diptere), în funcţie de tulpina bacteriană.

De mare interes este tulpina B.thuringiensis var. tenebrionis care sintetizează o δ-

endotoxină eficientă împotriva gândacului de Colorado. Genele implicate în sinteza
acestei proteine sunt localizate, la majoritatea tulpinilor bacteriene, pe plasmide de
dimensiuni mari (75 kb), producerea toxinei făcându-se în cursul sporulării.

De asemenea, s-a dovedit că proteina cristal (δ-endotoxina) este exprimată, în mod

normal, ca o pro-toxină inactivă, de dimensiuni mari, care suferă o prelucrare
proteolitică în intestinul insectei sensibile, devenind toxină activă. Aceasta recunoaşte
receptorii specifici de la nivelul celulelor intestinale şi blochează funcţiile acestor
celule, ceea ce conduce la moartea insectelor.
 Studiile asupra genelor ce codifică proteinele inhibitoare produse de B.thuringiensis
au condus la gruparea acestora în patru tipuri pe baza specificităţii de acţiune (de
tipul de insectă ţintă) şi a secvenţei de nucleotide:

• - genele cry de tipul I codifică proteine specifice pentru larvele de lepidoptere

• - genele cry de tipul II codifică proteine active asupra larvelor de diptere şi lepidoptere
• - genele cry de tipul III codifică proteine cu acţiune specifică asupra larvelor de
coleoptere
• - genele cry de tipul IV codifică proteine inhibitorii pentru larvele de diptere

Prima plantă transgenică obţinută care manisfestă rezistenţă la atacul insectelor

aparţine speciei Nicotiana tabacum.
Dată fiind semnificaţia practică a rezistenţei plantelor la insectele dăunătoare
cercetările au fost extinse şi la alte specii de plante, obţinându-se plante de Solanum
melongena rezistente la atacul unor coleoptere, Brassica sp. cu rezistenţă la anumite
specii de lepidoptere, porumb cu rezistenţă la Busseola fusca, precum şi o serie de
progrese la plante leguminoase
• Pe lângă δ endotoxina produsă de tulpini de B.thuringiensis, au mai fost identificate şi
alte specii de bacterii care produc proteine cu efect insecticid. Acesta este cazul unor
tulpini de Bacillus cereus care produc două proteine, VIP 1 şi VIP2 cu efect asupra
unor insecte, modul lor de acţiune fiind asemănător cu al δ endotoxinei.
b. Gene pentru sinteza unor enzime sau a unor inhibitori enzimatici cu efect
insecticid

Dintre enzimele care pot asigura protecţie plantelor transgenice faţă de atacul
insectelor, un loc aparte este ocupat de chitinaze, enzime care acţionează asupra
chitinei, component de bază al învelişurilor insectelor. Astfel, plantele transgenice de
tutun care exprimă gene pentru chitinază izolate de la insecte sau de la fasole
manifestă o rezistenţă crescută la lepidoptere.

O altă enzimă de origine bacteriană care manifestă acţiune insecticidă este

colesterol oxidaza. Spre exemplu, introducerea şi exprimarea genei cho A pentru
colesterol oxidază de la Streptomyces sp. în plante de tutun a condus la o rezistenţă
crescută a plantelor transgenice obţinute faţă de larve de Anthonomus grandis.
• O serie de gene ce codifică diferiţi inhibitori pentru serin-proteaze au fost izolate
din diferite surse (plante, microorganisme) şi clonate în diferite specii vegetale, cum
ar fi tutun, porumb etc; plantele transgenice obţinute au manifestat o rezistenţă
crescută faţă de diferite insecte dăunătoare comparativ cu plantele normale,
nemodificate genetic.
• Metabolismul glucidelor de la insecte reprezintă o altă ţintă pentru agenţii inhibitori
testaţi în numeroase studii. Astfel, au fost izolate şi caracterizate genele pentru diferiţi
inhibitori pentru α-amilază (de la grâu şi fasole).
• Lectinele vegetale reprezintă un grup special de glicoproteine care au funcţii
protectoare faţă de o serie de organisme dăunătoare. Studiile asupra acestor
glicoproteine au dovedit că acestea produc efecte puternice asupra dezvoltării unor
tipuri variate de insecte. Primul exemplu de plante transgenice ce conţin gene pentru
lectine nespecifice şi care manifestă toxicitate pentru dăunători este reprezentat de
plante tutun la nivelul cărora au fost clonate genele pentru lectina de la mazăre.
• Cu toate acestea, multe dintre lectinele vegetale au efect toxic şi asupra mamiferelor,
ceea ce limitează utilizarea lor ca agenţi de mărire a rezistenţei plantelor la dăunători.
 2. Gene de rezistenţă la fitopatogeni microbieni, virali şi la nematode
Aplicarea markerilor moleculari a permis izolarea a aproape 20 de gene de rezistenţă
(gene R) de la specii de plante bine caracterizate din punct de vedere genetic,
dovedindu-se că multe dintre ele sunt grupate la nivelul unor regiuni cromosomale
specifice (formează „clusteri”).

Eforturile cercetătorilor de a obţine sisteme de rezistenţă aplicabile la un număr cât

mai mare de specii vegetale nu se limitează doar la genele R ci includ şi
mecanismele sistemice de apărare pe care le declanşează infecţia cu un anumit
patogen („systemic acquired resistance” = SAR).

Au fost izolate şi caracterizate mai multe gene implicate în SAR, dintre care, gena
Npr1 care codifică un reglator transcripţional constituie o genă cheie în acest sistem.
Supraexprimarea acestei gene măreşte rezistenţa plantelor de Arabidopsis thaliana
sau de orez la o mare varietate de patogeni.

Alături de aceasta, o altă genă recent clonată, Pad4, izolată de la Arabidopsis

thaliana, se dovedeşte extrem de interesantă pentru dezvoltarea rezistenţei cu
spectru larg.: supraexprimarea genei respective în plante transgenice sporeşte şi
rezistenţa faţă de fitopatogeni.
3. Plante transgenice producătoare de vaccinuri comestibile sau de anticorpi
Progresele înregistrate în ultimii 10 ani în biologia moleculară şi în domeniul
imunologiei au permis o mai bună înţelegere a numeroase boli şi au condus la
dezvoltarea unor strategii noi pentru vaccinare. Una dintre direcţiile promiţătoare în
acest sens este obţinerea de plante transgenice în care să se exprime gene pentru
diferiţi antigeni. Proteinele antigenice derivate de la plantele transgenice elimină sau
previn unele boli la animale, iar în testele clinice în cazul oamenilor ele s-au dovedit a
fi sigure şi funcţionale. S-a dovedit că răspunsul imun al unui organism faţă de un
anumit patogen poate fi indus prin utilizarea unor polipeptide similare celor din
structura agenţilor etiologici.
In acest sens au fost elaborate tehnologii de obţinere a vaccinurilor subunitare care
au avantajul că elimină utilizarea de virusuri „vii” sau de microorganisme patogene
active, dar dezavantajul că sunt termosensibile şi foarte scumpe. Producerea unor
asemenea vaccinuri în plante elimină unele impedimente curente: preţul de cost ar fi
mic, se elimină riscul contaminării de patogeni animali, se asigură o stabilitate pentru
produsul obţinut, iar administrarea se poate face pe cale orală şi nu prin injectare.
Primele testări clinice ale unui vaccin produs de plante au fost realizate în 1998, prin
demonstrarea caracterului imunogen al unui antigen bacterian recombinat produs de
plante transgenice de cartof: administrarea „vaccinului” comestibil a condus la
inducerea unui răspuns imun la nivelul mucoaselor.
• Primele încercări de a obţine vaccinuri produse de plante datează din anul 1990 când
Curtiss şi Cardineau au determinat exprimarea unei proteine antigenice de la
Streptococcus mutans (proteina SpaA) după clonarea genei codificatoare în plante
de tutun. După incorporarea de ţesut vegetal transformat în dieta şoarecilor, s-a
obţinut un răspuns imun la nivelul mucoaselor faţă de proteina Spa A. Cercetări
ulterioare au permis exprimarea antigenului de suprafaţă de la virusul hepatitei B
în plante transgenice de tutun şi salată, a unei glicoproteine antigenice de la
virusul turbării în plante transgenice de tomate, a subunităţilor toxinei holerice în
plante transgenice de tutun sau cartof.
• Cele mai recente studii referitoare la vaccinurile „comestibile” produse de plante
transgenice ţin de stabilirea metodelor optime de administrare şi dozare, a tipului de
răspuns imun şi a duratei sale în cazul patogenilor de tipul Vibrio cholerae,
Pseudomonas aeruginosa, HIV.
• In paralel se realizează teste pe voluntari umani, pentru anumite tipuri de vaccinuri
produse de plante: vaccin antidiareic ce conţine o proteină sintetică derivară de la
subunitatea B a toxinei termolabile de E.coli, produs de plante de cartof transgenic;
vaccin oral obţinut din cartof care conţine antigenul de suprafaţă al virusului hepatitei
B (HbsAg); vaccin antidiareic (pentru formele de boală de origine virală).
 4. Plante transgenice tolerante sau rezistente la erbicide
Metodele convenţionale de combatere a buruienilor sunt mecanice, biologice şi chimice.
Utilizarea erbicidelor prezintă o serie de avantaje: au un spectru larg, migrează în sistemul
radicular, pot fi aplicate pe suprafeţe mari şi au acţiune rapidă.

Dezavantajele constau în toxicitatea lor, pot ajunge în pânza freatică, contaminând apa,
sunt remanente, au un impact negativ asupra ecosistemului subteran, pot genera rezistenţa
unor buruieni la erbicid prin utilizarea lui repetată.

Genele care codifica enzimele ce inactiveaza erbicidele si alti compusi cu efect dăunător, au
fost izolate dintr-o varietate de organisme procariote si eucariote.

Plantele transgenice obtinute sunt tolerante la erbicide ca: 2,4- dichlorophenoxyacetic acid,
bromoxynil (denumirea comerciala-Bactril), fosfinothricin (denumirea comercială-
Basta),glifosat (denumirea comercială - RoundUp).
De asemenea, au fost obtinute plante tolerante la erbicidele din clasa acidului benzoic
incluzând si dicamba.

Bacteria care metabolizeaza erbicidul dicamba este cunoscuta ,iar genele specifice,
responsabile pentru metabolizarea erbicidului pot fi izolate si folosite pentru a produce
plante rezistente la dicamba si pentru alte organisme.
Plantele transgenice rezistente la erbicide pot metaboliza anumite erbicide,
Fosfinotricinul sau glifosatul este un produs de sinteză similar cu o toxină produsă de
Streptomyces hygroscopicus. Pentru a preveni autotoxicitatea, acest microorganism
produce o enzimă : fosfinotricin N acetiltransferaza, care acetilează fosfinotricinul
într-un metabolit netoxic.
Ingineria genetică a folosit această genă pentru a obţine plante care să metabolizeze
erbicidul (soia transgenică rezistentă la glifosat).
 5. Aplicaţii ale transgenezei în industria alimentară
Valoarea nutritivă a alimentelor bogate în proteine depinde de conţinutul de
aminoacizi esenţiali, de exemplu porumbul şi alte cereale sunt deficitare în lisină şi
triptofan. Linia mutantă Opaque 2 a fost obţinută cu un conţinut de 32% lisină mai
mare decât liniile normale.
La leguminoase au fost obţinute plante transgenice cu un conţinut sporit de
metionină.
La orez, prin transgeneză a fost obţinut soiul Golden rice ( cu endosperm galben) cu
un conţinut ridicat de provitamina A. Au fost transferate genele implicate în biosinteza
provitaminei A de la Narcissus şi Erwinia.
Producerea unor edulcoranţi (îndulcitori) ca de exemplu taumatina (proteină dulce),
existentă în fructele arborelui Thaumatoccocus danielli a fost posibilă prin clonarea
genei responsabile de sinteza proteinei şi transferul ei la tutun.
În comercializarea fructelor şi legumelor, există probleme legate de coacerea
prematură şi de alterarea lor prin transport.
Genele care intervin prin activitatea lor în coacerea fructelor codifică unele enzime
ca celulaza şi poligalacturonaza. Se consideră că intervenind în expresia uneia sau
alteia dintre aceste gene, procesul coacerii poate fi întârziat. Au fost obţinute plante
transgenice la tomate, la care nivelul poligalacturonazei este scăzut, fapt care inhibă
coacerea lor.
Orez transgenic cu continut ridicat de β-caroten
 6. Plante transgenice fixatoare de azot
• Plantele superioare utilizează în dezvoltarea lor azotul furnizat fie pe cale biologică,
fie pe cale industrială. Sursa biologică de azot este asigurată de un grup restrâns de
microorganisme, care formează diverse tipuri de simbioză cu alte organisme. Cele
mai eficiente sunt simbiozele formatoare de nodozităţi, dintre leguminoase şi bacterii
din genul Rhizobium, care pot asigura necesităţile nutritive în azot ale plantelor.
• Bacteriile utilizează hidraţii de carbon de la plantă şi cedează acesteia azotul absorbit
sau fixat din aer într-o formă asimilabilă plantei. Procesul de fixare biologică a
azotului atmosferic este determinat de existenţa unui sistem enzimatic complex,
denumit nitrogenază, care catalizează producerea amoniului.

• Noile cercetări având drept scop ridicarea eficienţei simbiozelor existente, obţinerea
de noi simbioze sau transformarea speciilor cultivate, nefixatoare de azot (cereale şi
plante furajere) în specii fixatoare de azot au la bază tehnicile ADN-ului recombinant.
Sinteza sistemului enzimatic nitrogenazic este condiţionată de complexul de gene nif
(nitrogen fixation).
• Potrivit cercetărilor, există deosebiri între speciile bacteriene în ceea ce priveşte
modul de organizare a genelor nif. S-a încercat diversificarea tipurilor de
microorganisme fixatoare de azot, transferându-se genele nif la bacterii nefixatoare
de azot (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Klebsiella aerogenes), prin
intermediul plasmidelor.
 O altă direcţie de cercetare urmăreşte extinderea capacităţii de fixare a azotului la
plante neleguminoase, adică formarea nodozităţilor pe rădăcinile cerealelor. Practic
acest lucru este posibil prin:
• -încorporarea bacteriei Rhizobium sau a algelor unicelulare albastre-verzi în
citoplasma protoplaştilor şi transformarea lor în organite celulare permanente;
• - transferul genelor nif, înserate în plasmidele Ti, la nivelul culturilor de calus sau de
protoplaşti;
• - transferul genelor nif prin fuziunea protoplaştilor izolaţi din nodozităţi cu protoplaştii
proveniţi de la plante nefixatoare de azot.
• Cea mai mare suprafaţă cultivată cu OMG se află în SUA, aproximativ 42,8 mil ha,
reprezentând 63% din întreaga suprafaţă cultivată cu OMG pe plan mondial.
Pe locul doi se situează Argentina, cu o suprafaţă de aproximativ 14 mil. ha (21% din
total suprafaţă cultivată cu OMG), urmată de Canada cu 4,4 mil. ha (6%), Brazilia cu
3 mil. ha (aproximativ 5%), China cu 2,8 mil ha (4%).
• Restul suprafeţei, reprezentând 1% din total este cultivată de următoarele
ţări: Australia, Spania,Uruguay, România, Columbia, Honduras, Filipine, India,
Indonezia.
• Principalele specii de plante modificate genetic cultivate la nivel mondial: soia 61%,
porumb 23%, bumbac 11%, rapiţă 5%

• Soiurile modificate genetic testate şi înregistrate în Catalogul oficial al României

1 Cartof Rezistenţă la gândacul de Colorado

2 Soia toleranţă la glifosat

3 Sfeclă de zahăr toleranţă la glifosat

4 Porumb toleranţă la glifosat, rezistenţă la Ostrinia nubilalis

 Avantaje
1. Conservarea genofodului prin crearea băncilor de gene
2. Sporirea productivităţii agricole
3. Obţinerea de noi soiuri cu caracteristici utile din punct de vedere economic
4. Transgeneza la plante joacă un rol esenţial în cunoaşterea şi analiza genomului
vegetal, în controlul procesului de dezvoltare, în înţelegerea metabolismului
plantelor
Dezavantaje
1. Preţuri de cost ridicate
2. Scăderea resurselor genetice
3. Efectele neprognozabile ale introducerii noilor organisme transgenice în
mediul natural

Categorii de risc
1. Planta în sine
2. Fluxul de gene pe verticală
3. Transferul orizontal de gene
1. Risc toxicologic şi alergenic- datorate proteinelor de origine animală sau vegetală
Firma producătoare de seminţe Pioneer a încercat comercializarea de soia transgenică,
conţinând o genă de la nuca de cocos, producătoare de metionină, dar a constatat efectul
alergenic al acesteia, ceea ce a condus la retragerea ei de pe piaţă.

Cartofii transgenici, ce conţin o genă, care codifică o proteină cu efect insecticid, preluată
de la ghiocel s-au dovedit nocivi , în cazul utilizării lor ca hrană pentru animalele de
laborator

Atât pe plan internaţional cât şi naţional au fost elaborate o serie de documente legislative
care reglementează utilizarea organismelor modificate genetic pentru obţinerea de
alimente de uz uman, fiind unanim acceptată ideea etichetării obligatorii a produselor de
acest tip.

Se oferă consumatorului, în acest fel, posibilitatea de opţiune în vederea utilizării sau nu a

produselor obţinute din materii prime de origine transgenică. Spre exemplu, s-a aprobat
utilizarea plantelor de porumb transgenic ce conţin gena pentru proteina insecticidă Cry
(derivată de la B.thuringiensis) dar numai pentru hrana animalelor şi pentru prelucrare
industrială, nu şi pentru consumul uman deoarece există posibilitatea ca proteina
respectivă să fie alergenă.
De asemenea, pentru a elimina posibilitatea ca anumite substanţe produse de organismele
modificate genetic să producă alergii dar, în acelaşi timp să nu se excludă utilizarea
acestora, multe instituţii naţionale sau internaţionale iau măsuri pentru elaborarea de teste
rapide şi eficiente de identificare a posibililor compuşi alergeni sau dăunători.
2. Plantele modificate genetic, datorită combinaţiilor noi şi nenaturale pot căpăta un
avantaj competitiv faţă de flora naturală. Există posibilitatea ca însuşirile adiţionate
prin manipulare genetică să fie transmise rudelor sălbatice sau speciilor de origine,
determinînd răspândirea în natură a genelor străine.

Porumbul transgenic, care prezintă rezistenţa la pesticide se poate încrucişa cu

rudele sălbatice, din categoria buruienilor, rezultând hibrizi nedoriţi. Acest fenomen
este stimulat şi de faptul că polenul transgenic are o capacitate de fertilizare de 20 de
ori mai mare.
3. Cruciferele modificate genetic sintetizează enzime ( chitinaze, glucanaze) capabile să
distrugă peretele celular al ciupercilor patogene şi proteine care înhibă enzimele
digestive ale coleopterelor.S-a constatat un impact negativ al plantelor transgenice de
rapiţă asupra albinelor, care sunt principalii polenizatori.
Un alt risc este transferul genelor de rezistenţă la antibiotic de la planta transgenică
la alte organisme.
Retragerea de la comercializare a porumbului transgenic ( rezistent la glifosat, la
fluturele sfredelitor) a fost legată de posibilul transfer al genei de rezistenţă la
ampicilină de la plante la microbiota intestinală a organismului animal şi uman.
 VARIABILITATEA SOMACLONALĂ- SURSĂ DE VALORIFICARE A
POTENŢIALULUI REGENERATIV ŞI BIOPRODUCTIV « IN VITRO »
• Perpetuarea unui genotip pe parcursul creşterii şi dezvoltării “in vitro” depinde de procesele
obişnuite ale replicării cromosomilor şi ale diviziunii celulare. Abaterile şi neregularităţile ce pot
surveni în cadrul acestor procese constituie sursa variabilităţii şi, implicit, a evoluţiei genotipurilor.
• Ţesuturile şi celulele vegetale, ca şi cele animale, în condiţiile cultivării “in vitro” pot manifesta
alterări ale proceselor nucleare. În consecinţă, variabilitatea în astfel de populaţii celulare prezintă
aspecte distincte faţă de ipostaza integrată a acestora.
• Atât “in vivo”, cât şi “in vitro”, variabilitatea se manifestă prin alterări ale organizării structurale şi
funcţionale la nivelul diferitelor structuri purtătoare ale informaţiei genetice (gene, cromosomi).
• Principalul obstacol în tehnicile de micropropagare constituie instabilitatea genetică, care perturbă
caracterul clonal al plantelor obţinute prin regenerarea“in vitro". Variaţiile observate în culturile de
ţesuturi se pot datora modificărilor fiziologice induse de condiţiile de cultivare. Ele au un caracter
temporar, nu se transmit în descendenţă, fiind de natură epigenetică=. modificaţii,
• Culturile de ţesuturi etalează şi o variabilitate de natură genetică, al cărei determinism se
regăseşte în modificări la nivelul structurilor purtătoare ale informaţiei ereditare (gene,
cromosomi)= mutaţii. Variabilitatea genetică include variaţiile ireversibile, ereditare, ce se transmit
pe cale sexuată.
Variaţiile somaclonale sunt diferenţieri fenotipice de origine genetică şi epigenetică manifestate
la indivizii vegetali obţinuţi prin regenerare din culturi celulare din explante somatice.
• Variaţiile semnalate în cadrul culturilor “in vitro” au două surse principale: heterogenitatea
celulară preexistentă în explant şi apariţia de noi variaţii, induse de condiţiile cultivării “in
vitro”.
• Creşterea şi dezvoltarea normală a plantelor sunt însoţite la aproximativ 90% dintre angiosperme
de o anumită rată a variabilităţii ADN-ului nuclear. În consecinţă la majoritatea plantelor, ţesuturile
mature (scoarţa sau măduva) etalează un număr considerabil de variaţii ale constituenţilor
cromosomali ai celulelor.
• În meristemele apicale (radiculare sau caulinare), în care sinteza ADN-ului este urmată imediat de
cariochineză şi citochineză, celulele se menţin în marea lor majoritate în stare diploidă.
Cu toate acestea, în cursul diferenţierii celulare ulterioare, derivatele celulelor meristematice nu
se divid întotdeauna prin mitoze normale, ci pot suferi duplicări şi endoreduplicări ale ADN -ului.
Ca urmare, diversele grade de endoreduplicare se pot regăsi la nivelul celulelor somatice
diferenţiate, ce prezintă, astfel, diverse grade de poliploidie.
• Frecvenţa pronunţată a poliploidiei în celulele diferenţiate denotă că endopoliploidizarea celulelor
somatice este asociată cu diferenţierea şi funcţionalitatea celulară, intervenind în morfogeneză
prin creşterea volumului celulelor.
• Existenţa unei corelaţii între variaţia gradului de ploidie şi starea (meristematică sau diferenţiată) a
celulelor constituie o explicaţie pentru influenţa pe care tipul histologic şi originea explantului
utilizat o pot exercita asupra frecvenţei variabilităţii somaclonale. Astfel, utilizate ca sursă de
explante, ţesuturile nediferenţiate (cambiu, procambiu, uneori periciclu) generează o rată redusă a
variabilităţii, în timp ce ţesuturile diferenţiate (măduva, de exemplu) constituie premisa unei
variabilităţi sporite.
• În situaţii normale, variabiliatea genetică apărută în celulele somatice (poliploidia, aneuploidia)
rămâne nesemnificativă, deoarece celulele afectate nu se divid. În condiţiile cultivării “in vitro”,
însă, poate fi indusă diviziunea celulelor poliploide şi poate avea loc o rediferenţiere a cestora,
însoţită de exprimarea variabilităţii la nivelul întregii plante regenerate. De regulă, gradul de ploidie
a materialului vegetal iniţial, utilizat ca sursă de explante, exercită un rol hotărâtor în producerea
variaţiilor. Astfel, speciile poliploide manifestă, în urma regenerării “in vitro”, via calus, variaţii
numeric cromosomale mai frecvente comparativ cu speciile diploide..
• Producerea variabilităţii în culturile “in vitro” poate fi favorizată de condiţiile concrete ale cultivării :
prezenţa regulatorilor de creştere, numărul subcultivărilor. Literatura de specialitate menţionează
că adăugarea în mediul de cultură a unor substanţe, precum: acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4-D),
acidul naftilacetic (ANA) sau citokininele sintetice, are ca efect o sporire considerabilă a numărului
şi frecvenţei cu care se produc variaţiile numeric cromosomale în culturi. Kinetina pare să inducă
în mod selectiv diviziunea celulelor poliploide , iar concentraţiile ridicate de benziladenină (BA)
induc variaţii somaclonale evidente la Nicotiana tabacum.
• Pe de altă parte, subcultivările repetate “in vitro” duc la sporirea ratei variabilităţii somaclonale, în
special în cazul culturilor de calus, a suspensiilor celulare şi a culturilor monocelulare. În unele
cazuri, apariţia de variaţii în urma pasărilor succesive poate fi sau nu corelată cu pierderea
potenţialului regenerativ. La Daucus carota, în suspensii celulare, celulele rămân diploide,
totipotente şi nu manifestă variaţii numeric cromosomale, în timp ce în culturile de calus, celulele
sunt aneuploide şi pierd potenţialul regenerativ. Dimpotrivă, corelaţia mai sus amintită nu este
evidentă la Nicotiana tabacum, specie care etalează “in vitro” atât un ridicat potenţial regenerativ,
cât şi o pronunţată instabilitate genetică.
Deşi natura mecanismelor ce determină variabilitatea genetică este, în esenţă, similară “in vivo”
şi “in vitro”, incidenţa apariţiei variaţiilor este mult sporită “in vitro”, ca urmare a condiţiilor diferite
în care aceste mecanisme funcţionează
Manifestarea variabilităţii somaclonale este intim legată de mecanismele care o generează:
modificări ale gradului de ploidie (variaţii numeric cromosomale), modificări structural –
cromosomale, mutaţii genice, amplificare genică, modificări ale genelor extranucleare, activarea
elementelor transpozabile, metilarea ADN-ului.
• Modificarea gradului de ploidie constituie cea mai frecventă variaţie numeric cromosomală
constatată în culturile de celule şi ţesuturi şi la nivelul plantelor regenerate din acestea. În funcţie
de numărul cromosomilor afectaţi, în culturile “in vitro” apar două tipuri de variaţii numeric
cromosomale : poliploidia şi aneuploidia.
• Poliploidia apare în culturile de ţesuturi prin aceleaşi mecanisme ca şi “in vivo”(multiplicarea
seturilor proprii de cromosomi) dar şi ca produs al endopoliploidizării sau fuziunii nucleare.
• Poliploidia rezultă şi din formarea unui nucleu de restituţie (care apare în urma unei anomalii în
diviziunea mitotică) Migrarea cromosomilor spre unul din polii celulei şi formarea unui singur
nucleu are drept cauze: formarea anormală a fusului de diviziune şi apariţia unor cromosomi
retardatari în anafază, fuziunea fusurilor de diviziune în cursul diviziunilor sincrone din celulele
multinucleate, fuziunea nucleilor în interfază.
• Aneuploidia apare rar în mod spontan în natură, exceptând plantele hibride şi poliploizii de origine
recentă. În culturile “in vitro”, însă, aneuploidia apare mai frecvent, fiind cauzată de fragmentarea
nucleului (amitoză) şi formarea de celule multinucleate, cu nuclei de diferite dimensiuni.Alte cauze
ale aneuploidiei sunt formarea de fusuri de diviziune “aberante” şi formarea de cromosomi
dicentrici sau acentrici prin ruperi de cromosomi.
• Ruperea cromosomilor în culturile “in vitro” este un fenomen frecvent. O ipoteză privind rolul
heterocromatinei în producerea ruperilor cromosomale a fost propusă de Mc Coy şi colab.,(în
1982), şi care arată că regiunile cromosomale care se replică normal, în condiţiile cultivării “in
vitro” se vor replica mai târziu. Cromatidele pe punctul de a se separa sunt reţinute în acest
moment de vârf al replicării, producându-se un stress care ar putea determina ruperi (mai ales
între centromer şi regiunea care se replică târziu).
• Mc Clintock, 1984 a observat că introducerea unui cromosom rupt într-o celulă poate iniţia un ciclu
prin care cromosomul rupt s-ar replica şi în anafază, la situsul de rupere capetele cromosomului
fuzionează şi formează o punte între cei doi cromosomi ataşaţi, care sunt traşi spre polii opuşi.
Puntea se poate rupe , permiţând o reîncepere a procesului numit “ciclul rupere-fuziune-punte”.
În anumite condiţii cromosomii, care iniţial n-au fost implicaţi în ciclu, pot suferi aceleaşi procese.
• Ipoteza privind interrelaţia dintre perturbările ciclului celular şi variaţiile genetice induse “in vitro”
este susţinută şi de Phillips şi Kaeppler (1994). În culturile celulare, metilarea-demetilarea unor
secvenţe de ADN constituie unul din mecanismele implicate în activarea sau inactivarea unor
gene.
• În 1984, Orton a elaborat o listă a speciilor de interes economic şi comercial, în privinţa cărora
cercetările “in vitro” au sugerat posibile utilizări ale variabilităţii somaclonale în vederea ridicării
nivelului calitativ şi cantitativ al producţiei.
• Până în prezent, prin acest tip de cercetări au fost elaborate diverse modalităţi de ameliorare a
speciilor vegetale. Aceste modalităţi sunt deja aplicate, deşi nu la scară largă, în practicile de
cultivare a unor specii vegetale de importanţă agricolă sau farmaceutică.
INDUCEREA ŞI SELECŢIA MUTANTELOR ÎN CULTURILE DE CELULE
VEGETALE
 Culturile de celule şi ţesuturi vegetale oferă multe avantaje în cercetările de
mutageneză. Utilizarea tehnicilor „in vitro’’ prezintă următoarele avantaje:
• face posibilă aplicarea tratamentelor cu agenţi mutageni asupra unui număr foarte
mare de celule;
• oferă posibilitatea selectării celulelor tratate, în condiţii de mediu strict controlate;
• permite izolarea rapidă a unor mutante recesive, în condiţiile cultivării celulelor
haploide;
• materialul utilizat „in vitro” poate fi reprezentat de populaţii omogene de celule
vegetale, calus sau organe vegetale.
Mutaţiile sunt considerate reale doar dacă din liniile celulare selecţionate pot fi
regenerate plante capabile să transmită în descendenţă caracterul mutant.
Creşterea variabilităţii genetice „in vitro” poate fi realizată prin expunerea celulelor la
diferiţi agenţi mutageni fizici sau chimici. Agenţii mutageni fizici sunt radiaţiile UV, X,
gamma. Frecvenţa mutantelor depinde de cantitatea de radiaţii şi de condiţiile de
temperatură, lumină, oxigenare, umiditate, înainte, în timpul şi după tratamentul
aplicat. Agenţii mutageni chimici sunt etil- şi metilmetansulfonat (agenţi alchilanţi), 5
bromodeoxiuridina, 5 bromuracil, nitrosoguanidina. După expirarea timpului de
tratament, mediul de cultură suplimentat cu agenţi mutageni este înlocuit cu mediu
proaspăt, lipsit de agenţi mutageni. Selecţia mutantelor este realizată prin cultivarea
celulelor tratate, în condiţii speciale: concentraţii ridicate de metaboliţi, absenţa unor
nutrienţi sau hormoni, prezenţa unor agenţi stresanţi.
 Mutantele pot fi de trei tipuri:
• 1. Mutante auxotrofe- care necesită pentru creşterea lor „in vitro”, suplimentarea
mediului de cultură cu diferite componente chimice, pe care celulele nu le pot
sintetiza singure, cum ar fi: fitohormonii, aminoacizii, bazele azotate purinice şi
pirimidinice. Carlson, P. (1970) a obţinut mutante auxotrofe la haploizi de Nicotiana
tabacum. Tehnica a constat în încorporarea în ADN-ul celulelor de tip normal a
substanţei mutagene- 5 bromodeoxiuridina (5-BUDR), care a fost introdusă în mediul
de cultură. Celulele de tip normal se divid şi absorb 5-BUDR. Printr-o expunere
ulterioară la lumină, acestea sunt distruse. Mutantele auxotrofe nu au încorporat 5-
BUDR în ADN şi, ca urmare, supravieţuiesc şi la lumină. Prin suplimentarea mediului
nutritiv cu substanţe stimulatoare de creştere, se asigură condiţii pentru dezvoltarea
acestor mutante. Prin aplicarea acestei tehnici s-au putut obţine mutante care solicită
în mediu arginină, prolină, lizină. Importanţa acestor mutante rezidă din faptul că pot
manifesta o creştere substanţială a masei celulare pentru întreaga clonă,
dezvoltându-se pe medii suplimentate cu substanţe de creştere. Mutantele auxotrofe
permit studiul biosintezei diferiţilor metaboliţi secundari. La Zea mays s-au izolat
mutante auxotrofe pentru prolină, iar la Arabidopsis thaliana , mutante auxotrofe
pentru tiamină.
• 2. Mutante autotrofe- care sunt capabile să trăiască în medii deficitare în diferite
componente chimice, deoarece ele pot să le sintetizeze singure. Tipul normal,
„sălbatic” nu poate sintetiza aceşti compuşi, de aceea ei trebuie să intre în compoziţia
mediului de cultură. Mutante autotrofe au fost izolate la Acer pseudoplatanus şi
Daucus carota, mutante care îşi sintetizează singure auxinele necesare.
3. Mutante rezistente la diferite substanţe chimice sau la condiţii nefavorabile de
mediu (rezistente la antibiotice, pesticide, toxine, produse de ciuperci, concentraţii
mari de săruri). La Nicotiana tabacum s-au obţinut mutante rezistente la
streptomicină.
Un interes deosebit prezintă selecţia unor linii celulare rezistente la erbicide de tip
atrazin, picloram, 2,4 D.
Erbicidul 2,4 D, în concentraţii mari are acţiune letală asupra majorităţii
dicotiledonatelor. La Nicotiana sylvestris, folosindu-se suspensii celulare haploide, s-a
selectat o linie celulară rezistentă la o concentraţie foarte mare de 2,4 D, concentraţie
toxică pentru liniile celulare de tip normal. Se consideră că rezistenţa la erbicid s-ar
datora fie creşterii capacităţii liniilor rezistente de a metaboliza erbicidul, fie datorită
inactivării metabolice a erbicidului, ca urmare celulele vegetale nu sunt afectate de
acţiunea toxică. Cercetările au ca scop atât selectarea unor linii capabile să
degradeze pesticidele,erbicidele în mod special, până la metaboliţi primari, cât şi
detectarea unor linii la care mecanismele prelucrării pesticidelor sunt blocate.
Inducerea şi detectarea, la plantele de cultură a unor mutante rezistente sau
tolerante la doze mari de erbicide şi capabile să metabolizeze anumite substanţe
chimice apar ca cerinţe care se impun în practică. Detectarea unor mutante
înzestrate cu capacitatea de a metaboliza substanţele active din pesticide constituie
premiza producerii unor recolte mari şi reducerea uneia dintre principalele surse de
poluare a mediului ambiant.
• Numeroşi fungi şi bacterii sunt patogeni prin toxinele pe care le produc. Cea mai
recentă tehnică utilizată în vederea obţinerii plantelor rezistente la boli implică
selecţia unor linii celulare rezistente la toxine. S-au obţinut plante de Nicotiana
tabacum rezistente la atacul bacteriei Pseudomonas tabaci, plante de Zea mays
rezistente la toxina T, produsă de Helmintosporium maydis, plante de Solanum
tuberosum rezistente la Phythophtora infestans şi Fusarium oxisporum. Toate aceste
plante au fost regenerate din linii celulare care au supravieţuit în prezenţa toxinelor
extrase din agenţii patogeni, toxine incluse în mediul de cultură.
• Tehnicile „in vitro” pot fi utilizate şi pentru obţinerea unor linii celulare tolerante la
concentraţii ridicate de săruri, rezistente la temperaturi scăzute. Modul de lucru este
similar celui folosit în cazul selecţiei unor linii rezistente la boli :iniţierea unei culturi de
celule, aplicarea factorului stresant la un nivel considerat inhibitor, selecţia celulelor
care cresc şi se divid în aceste condiţii, regenerarea de plante din celulele mutante,
studierea plantelor regenerate şi a descendenţilor acestora, pentru a verifica
stabilitatea mutantelor.
OBŢINEREA METABOLIŢILOR SECUNDARI PRIN
METODA CULTURILOR “IN VITRO “
Initierea culturilor submerse (suspensii celulare)
Agitator pentru suspensii celulare
• În jurul anilor ’50 încep să se contureze primele încercări legate de elaborarea unui complex
metodologic aplicat culturilor de celule, în scopul valorificării potenţialului lor bioproductiv.
• Cultivarea celulelor vegetale , în scopul acumulării de biomasă- sursa principală de obţinere a
metaboliţilor secundari, a permis extinderea acestei metode la un număr mare de specii de
importanţă economică.
• Exploatarea chimico-farmaceutică a plantelor, prin aplicarea tehnicilor de cultivare “in vitro”,
asigură obţinerea la scară industrială a unor compuşi utili în industria alimentară (coloranţi,
indulcitori), chimică, farmaceutică (alcaloizi, glicozide cardiotonice.steroizi), cosmetică (pigmenţi,
uleiuri eterice).
• Metoda cultivării “in vitro”s-a diversificat şi a cunoscut o amplă dezvoltare, fiind aplicată
preponderent la plantele medicinale. Japonia şi Germania sunt cele mai implicate ţări în
dezvoltarea acestor biotehnologii.
• Acumularea biomasei vegetale “in vitro”, pe baza căreia sunt extraşi metaboliţii secundari, este
rezultatul multiplicării celulelor; cinetica multiplicării populaţiilor celulare presupune derularea
aceloraşi faze ca şi în cazul populaţiilor bacteriene.
• Cultivarea în regim industrial a celulelor vegetale, ca şi în cazul culturilor microbiene, se bazează
pe utilizarea unor sisteme de cultivare discontinue (mediul de cultură nu este reînnoit) sau
continue ( mediul de cultură se reînnoieşte continuu).
• Culturile discontinue sunt sisteme închise (batch-culture) de cultivare, în care multiplicarea
celulară se desfăşoară într.un volum fix de mediu. Într-un astfel de sistem, creşterea este limitată
la un volum fix de mediu, acumularea produşilor de metabolism putând deveni nefavorabilă
acestui proces.
• Rata de creştere a celulelor în unitatea de volum (r) este diferită în dinamica multiplicării
populaţiilor celulare ( aza de latenţă sau lag, faza de accelerare, faza de creştere exponenţială,
faza de încetinire, faza staţionară, faza de declin)
Dinamica multiplicarii celulelor in culturi submerse
• Faza de latenţă sau de lag ( engl. to lag = a întârzia ) sau de creştere 0 este cuprinsă între
momentul introducerii celulelor în mediu (momentul inoculării) şi momentul când acestea încep să
se multiplice. În cursul acestei faze, numărul celulelor din inocul rămâne neschimbat.

• Faza de multiplicare exponenţială sau de creştere logaritmică apare după o scurtă perioadă
de accelerare a ritmului de creştere, în care multiplicarea se produce cu o viteză progresiv mărită
şi se caracterizează prin ritm constant şi maxim ( r = maxim). Fiecare celulă se divide pentru a
forma două celule surori, fiecare, la rândul său se divide şi produce alte două celule noi, deci în
momentul fiecărei diviziuni populaţia se dublează.

• Faza de încetinire sau faza lineară corespunde perioadei în care concentraţia factorului limitant
al creşterii scade sub nivelul care asigură creşterea maximă. Orice factor a cărui lipsă din mediu
opreşte creşterea devine un dfactor limitant. Creşterea lineară este limitată şi este direct
proporţională cu timpul, adică aritmetică.

• Faza staţionară urmează perioadei de încetinire a ritmului de creştere, în care multiplicarea nu se

mai produce în progresie geometrică, ci într-un ritm care scade progresiv. În condiţiile în care
nutrienţii nu sunt reînnoiţi, rata de creştere scade progresiv, până când încetează complet, ca
urmare a epuizării nutrienţilor cât şi a acumulării produşilor toxici. În faza staţionară, rata de
creştere este 0, numărul celulelor viabile este maxim şi rămâne constant o perioadă de timp, a
cărei durată variază, funcţie de natura factorilor care limitează creşterea.
• Faza de declin şi moarte celulară se instalează atunci când populaţia celulară
descreşte numeric. Producerea metaboliţilor secundari în culturile celulare este în
strânsă dependenţă de utilizarea unui substrat nutritiv adecvat.

În consecinţă, cultivarea celulelor pe medii speciale, care asigură condiţii optime de

creştere permite producerea metaboliţilor secundari , de obicei în faza staţionară, când
mediul este sărăcit în componenţii lui nutriţionali.

Din aceste considerente, se practică sistemul culturilor duble: care presupune într-o primă
etapă producerea de biomasă într-un mediu adecvat pentru proliferarea celulelor (mediul
de creştere), iar în a doua etapă, transferarea celulelor pe un alt mediu, cel de biosinteză.

Zenk şi colaboratorii (1977) au iniţiat sistemul culturilor în două trepte, obţinând alcaloizi
indolici în suspensii celulare de Catharanthus roseus.
Aceeaşi strategie a fost utilizată mai târziu de Fujita (1982) în scopul obţinerii la scară
industrială a shikoninei, în suspensii celulare de Lythospermum erythrorhizon.

Cele mai frecvente modificări ale compoziţiei mediului de cultură în scopul biosintezei
metaboliţilor secundari sunt:
• 1.Reducerea sau eliminarea acidului 2,4 D (acidul 2,4- diclorfenoxiacetic) sau a altor
fitohormoni; nivelul ridicat al auxinelor din me-diul de cultură stimulează proliferarea
celulară, dar afectează biosinteza metaboliţilor secundari, de aceea auxinele sunt
adăugate în mediul de creştere, dar lipsesc din mediul de biosinteză;
• 2. Reducerea cantităţii de fosfaţi.
• 3. Creşterea cantităţii de zaharoză sau a altor carbohidraţi.
• În alte cazuri este posibilă utilizarea aceluiaşi mediu, atât pentru acumularea de biomasă, cât şi
pentru inducerea biosintezei. De exemplu, utilizarea mediului bazal MS cu o concentraţie ridicată
de zaharoză a permis atât multiplicarea celulară, cât şi biosinteza alcaloizilor în suspensii celulare
de Catharanthus roseus.

• Comparativ cu metoda tradiţională, care are la bază extracţia compuşilor utili din plantele de
cultură, metoda culturilor “in vitro” oferă posibilitatea obţinerii unor produşi naturali noi, pe care
planta întreagă nu-i sintetizează. De pildă, compusul rutacultin este obţinut exclusiv în culturile
celulare de Ruta graveolens , iar compusul tarenosid este sintetizat doar în culturile celulare de
Gardenia jasminoides. Condiţiile “in vitro” pot fi foarte diverse, astfel încât celulele pot să-şi
exprime un potenţial biosintetic inedit, pe care planta întreagă nu şi-l exprimă în condiţiile
ecologice normale.

• Un alt aspect, care conferă acestei metode neconvenţionale de valorificare a principiilor active un
avantaj în plus este posibilitatea obţinerii "in vitro"a unor compuşi naturali, în cantităţi mult mai
mari decât prin metodele clasice.
• Primele culturi celulare cu un înalt potenţial de biosinteză a metaboliţilor secundari au fost
obţinute la Daucus carota, caracterizată prin producerea de antociani , Beta vulgaris,
caracterizate prin productivitatea ridicată în betalaine, Morinda citrifolia, care produce
antrachinone. În cazul speciei Morinda citrifolia, productivitatea calusului în antrachinone este
superioară, (de peste 20 de ori) celei pe care o etalează rădăcina plantei intacte., S-a reuşit să se
izoleze mai multe linii celulare de Catharanthus roseus înalt producătoare de serpentină şi
ajmalicină, alcaloizii de bază pe care-I găsim în rădăcinile plantei intacte. Aceste linii celulare sunt
apte să producă 162 mg/l serpentină şi 164 mg/l ajmalicină.
• Explantele utilizate pentru iniţierea culturilor celulare sunt foarte heterogene sub aspectul
capacităţii de biosinteză a metaboliţilor secundari, heterogenitate care sporeşte în condiţiile
cultivării “in vitro”, fiind o consecinţă a variaţiilor genetice şi epigenetice, înregistrate mult mai
frecvent în această ipostază. În consecinţă, celulele şi agregatele celulare etalează o mare
variabilitate în producerea şi acumularea metaboliţilor secundari , sursă de selectare şi perpetuare
a unor linii celulare înalt producătoare.

• În majoritatea cazurilor, suspensiile celulare s-au dovedit incapabile de a produce metaboliţi

secundari în cantităţi comparabile cu cele produse în plantele intacte. Prin urmare, se impune o
reexaminare a conceptului de totipotenţă celulară, cu necesara disjuncţie pentru totipotenţa
biochimică şi totipotenţa morfologică. Există totuşi câteva exemple în care, printr-un screen-ing
adecvat la nivelul suspensiilor celulare, s-a reuşit să se obţină linii celulare înalt producătoare.
Este cazul speciilor Catharanthus roseus şi Digitalis lanata

• Selectarea unor linii celulare înalt producătoare de pigmenţi( berberina, shikonina, betalaina)
constă în izolarea sectoarelor intens colorate ale agregatelor celulare, urmată de cultivarea lor
separată, pe medii adecvate. În cazul compuşilor fără culoare, un criteriu al selectării îl reprezintă
reacţiile specifice ale celulelor sau aplicarea unor teste imunologice ale extractelor.

• Atât izolarea unor linii celulare înalt producătoare, cât şi perpetuarea nealterată a acestora
necesită efectuarea unor selecţii repetate. Yamamoto şi colaboratorii (1982) au efectuat 30 de
clonări consecutive ale agregatelor celulare cu conţinut mare de antociani, obţinând linii celulare
stabile la Euphorbia millii.
• Conservarea unor linii celulare înalt producătoare se realizează prin criostocare (conservare în
azot lichid).
• Pentru evitareea distrugerii biomasei prin metodele de extracţie, unii cercetători au elaborat un
procedeu de includere a celulelor într-un gel (alginat) sau fixarea în diverşi polimeri
(poliacrilamida, poliuretan), aşa numita metodă de imobilizare a celulelor.
• Brodelius şi colaboratorii (1979) au fost primii care au imobilizat celule de Catharantus roseus şi
Daucus carota în granule de alginat.
• Valorificarea potenţialului bioproductiv este limitată nu numai de instabilitatea genetică, dar şi de
lipsa proceselor regenerative, care în multe cazuri este semnificativă pentru biosinteza
metaboliţilor secundari. De pildă, la Mentha piperita, uleiurile esenţiale sunt stocate la suprafaţa
frunzelor, la Papaver somniferum, alcaloizii sunt acumulaţi în laticifere.

• Pe de altă parte, producerea unui metabolit presupune un echilibru între sinteză şi acumulare,
degradare. Aceste procese presupun o compartimentare spaţială şi temporală a expresiei genice.

• De pildă, producerea alcaloizilor chinolizidinici(lupanina) de către lupin se realizează "in vivo" în

frunze, apoi aceştia sunt transportaţi prin floem în celulele epidermice. “In vitro”, alcaloidul este
produs, dar este rapid degradat deoarece nu există celule epidermice care să-l acumuleze. Acest
exemplu ilustrează importanţa coordonării funcţiilor de sinteză, transport şi stocare desfăşurate" in
vivo". Este dificil de reprodus acest tip de coordonare “in vitro” fără intermediul unui proces de
diferenţiere celulară. Nu este de mirare că exemplele spectaculoase, cum ar fi producerea
shikoninei, berberinei, antocianilor, corespund situaţiei în care sinteza şi acumularea produşilor se
realizează în aceeaşi celulă.
Aloe vera Antrachinone Antimicrobian, antifungic, citotoxic

Capsicum annuum Capsaicina Antitumoral

Curcuma longa Curcumina Antitumoral, anti Alzheimer

Digitalis purpurea Digoxina, digitoxina Glicozide cardiotonice

Ephedra sinica Efedrina Stimulator al SNS

Ginkgo biloba Ginkgolide Antitumoral, anti Alzheimer

Glycyrrhiza glabra Glycirrhizin Antiviral, antimicrobian, antifungic,

anti HIV
Hypericum perforatum Hipericina Antidepresiv

Linum usitatissimum Phytoestrogen Antidiabetic

Momordica charantia Charantin, momordicin Hipoglicemiant

Panax ginseng Ginsenozide Antitumoral

Rosmarinus officinalis acidul caffeic , carnosic ,rosmarinic Antitumoral, antiinflamator

Taxus brevifolia Paclitaxel Antitumoral

Valorificarea metabolitilor secundari în culturi hairy roots
 CULTURILE „HAIRY –ROOTS”- ALTERNATIVĂ DE VALORIFICARE A METABOLIŢILOR SECUNDARI
• Este binecunoscut faptul că plantele reprezintă o bogată sursă de metaboliţi secundari cu valenţe
farmaceutice şi alimentare.
• Cercetările actuale reprezintă o dovadă a preocupărilor de a conserva şi valorifica în mod raţional
biodiversitatea. Biologia aplicată “in vitro” şi totodată, tehnologiile existente asigură obţinerea
metaboliţilor secundari pe căi neconvenţionale, prin micropropagare, culturi celulare, bioreactoare. Un
impediment major înregistrat în valorificarea metaboliţilor secundari în suspensii celulare cultivate în
bioreactoare este instabilitatea genetică a culturilor, care este corelată cu pierderea potenţialului
biosintetic.

Cultivarea rădăcinilor “in vitro” este semnalată, încă din 1934, prin studiile effectuate de White pe
rădăcini de tomate, referitoare la creşterea şi nutriţia minerală.
Începând cu 1980 s-a accentuat interesul pentru cultivarea rădăcinilor în scopul producerii de
metaboliţi secundari din următoarele motive:
• În suspensiile celulare aparţinând unor specii din fanilia Solanaceae, producţia de nicotină şi alcaloizi
tropanici este redusă, în schimb la nivelul regeneratelor radiculare , aceşti compuşi se regăsesc în
concentraţii foarte mari. Aceste rădăcini reprezintă sistemele experimentale folosite în studierea căilor
de biosinteză a alcaloizilor tropanici.
• Un alt motiv al sporirii interesului pentru cultivarea rădăcinilor este utilizarea vectorului plasmidial
pentru ingineria genetică. Plasmidul derivat din Agrobacterium rhizogenes cauzează boala numită
“hairy roots”.
• Infecţia cu Agrobacterium rhizogenes determină o proliferare a rădăcinilor adventive la locul de
infecţie. În plus, aceste rădăcini pot fi excizate din plantă şi se pot obţine clone “hairy roots”. Culturile
“hairy roots” se dezvoltă spectaculos, prezintă o densitate mare a perilor radiculari şi un mare
potenţial de producere a biomasei. Toate aceste argumente justifică valorificarea rădăcinilor în scopul
producerii metaboliţilor secundari specifici acestor organe.
• În timpul infecţiei, o copie a segmentului T-ADN din plasmidul Ri este integrată în genomul celulei
vegetale. Acest proces este mediat de genele vir localizate în plasmidul Ri. Exprimarea genelor vir
este determinată de compuşii hidroxiacetosiringon şi acetosiringon. Au fost identificate gene la nivelul
segmentului T-ADN din plasmidul Ri: rol A, rol B ,rol C, rol D implicate în apariţia culturilor “hairy
roots). La tutun, gena rol A este responsabilă de dezvoltarea rădăcinilor, în timp ce gena rol B este
implicată în inducerea rădăcinilor “hairy roots” . Culturile “hairy roots” rezultate în urma infecţiei cu
Agrobacterium rhizogenes prezintă un potenţial de creştere nelimitat pe medii fără fitohormoni .
• Culturile „hairy roots” pot produce o gamă foarte diversă de metaboliţi secundari: alcaloizi, cumarine,
naftochinone, taninuri, utilizaţi in industria farmaceutică şi chimică, ca şi în agricultură.
• O atenţie deosebită se acordă culturilor „hairy roots” aparţinând unor specii din familia Solanaceae, pentru
producerea alcaloizilor tropanici şi nicotinei. Au fost folosite peste 20 de clone „hairy roots” de Hyoscyamus
muticus pentru obţinerea hiosciaminei.
• Culturile „hairy roots” de Nicotiana tabacum şi Nicotiana rustica sunt valorificate pentru producerea nicotinei,
Pe lângă alcaloizii produşi de solanacee, alcaloizii indolici (ajmalicină şi catarantină) sunt produşi de rădăcinile
de Catharanthus roseus. În rădăcinile acestei plante s-a depistat şi vindolina, un monomer necesar pentru
biosinteza unui medicament antileucemic (vinlastina).
• Culturile „hairy roots” de Panax ginseng produc saponine şi steroizi, iar cele de Beta vulgaris produc betalaine.
 Pe lângă compuşii cu greutate moleculară mică, rădăcinile produc macromolecule de tipul mucilagiilor
şi proteinelor
• Planta medicinală Trichosanthes kirilowii este utilizată în medicina tradiţională chineză în tratamentul
diabetului. Principala substanţă responsabilă este un polipeptid (tip 1), o proteină care inactivează
ribozomii ( ribosome inactivating protein = RIP), numită trichosanthină.
Datorită potenţialului său farmaceutic, specia Trichosanthes kirilowii este cultivată “in vitro” prin
sistemul culturilor “hairy roots”, furnizănd această proteină ca agent antiviral şi în tratamentul HIV.

Ecdisteroizii sunt substanţe implicate în metamorfoza artropodelor. Izolarea acestor substanţe se

realizează în scopul utilizării lor ca insecticid, cât ca promotor al maturării viermelui de mătase. La
planta Ajuga reptans, aceşti compuşi au fost depistaţi în rădăcină. De aceea producerea acestor
substanţe “in vitro” se realizează prin aplicarea sistemului “hairy roots”.

• În medicina tradiţională chineză se utilizează rădăcinile uscate de Astragalus membranaceus, care

conţin substanţe de tipul astragalozidelor. Substanţele bioactive din plantă sunt saponinele şi
polizaharidele, substanţe diuretice, tonice.
Au fost extrase 8 astragalozide cunoscute şi 4 noi (glicozide triterpenice) din culturi “hairy roots” de
Astragalus membranaceus.
Plante (Ophiorrhiza liukiuensis, O. kuroiwai , O. pumila) de 5 saptamani cultivate “in
vitro” pe mediul agarizat MS;

Culturi “hairy roots” pe mediul lichid B5

Culturi “hairy roots” de Rehmannia glutinosa, obtinute din explante foliare tratate
cu Agrobacterium rhizogenes
Producerea artemisininei in culturi “hairy roots” de Artemisia annua
Dezvoltarea radacinilor adventive la Echinacea purpurea pe mediul MS (a,b)
a. Culturi submerse de radacini adventive de Echinacea purpurea, plasate pe un
agitator ;
b. Cultura de radacini adventive de 4 saptamani ;
c. Recoltarea radacinilor
Cultivarea radacinilor adventive de Echinacea purpurea, in bioreactoare de 5 l
Uscarea biomasei de Echinacea purpurea
 Producerea biotehnologică a
triptolidelor - Tripterygium wilfordii
 INTRODUCERE. TRIPTOLIDE

Triptolidele (C20H24O6 )sunt a diterpenoide epoxide care se găsesc în planta

Tripterygium wilfordii.

• Perioadă lungă de
creștere și maturare
• Cantitate mică de
Intervenția
metaboliți secundari
tehnicilor
biotehnologice

Formula structurală a triptolidelor

•Importanță medicala
•Agricultură

Tripterygium wilfordii
 Tripterygium wilfordii Tripterygium wilfordii
Tripterygium wilfordii
Tripterygium wilfordii
Tripterygium wilfordii
raspândire: E –ul și S-ul Chinei, Korea, Japonia și Taiwan.

.
Scleroză multiplă Apoptotic Lupus

Biopesticid
Anti-inflamator

Antireumatic
Antitumoral

Imunomodulator
Antiartritic

Tripterygium wilfordii, fam. Celastraceae

Miao et al ., 2013;
 Producerea biotehnologică a triptolidelor
1. Micropropagare

Sterilizare
Explant=lastari etanol
Mediu MS
(70%, v/v) 60 s +benzilaminopurine (BAP),
Clorură de mercur apa sterilă 0.1 mg/l acid α- naftalene
acetic ,3% (w/v) sucroză
A +0.4% (w/v) agar
Caulogeneza

trecere pe alt mediu (30 de zile )

B
Mediu MS

Rizogeneză
MS suplimentat
cu 20% sucrose 0.4% agar + acid indolil
butiric +charcoal=> rizogeneza
Flacoane cu mediu
Aclimatizare 30 ml mediu 3 zile întuneric
(Chen, 2009) + expunere la lumină
 2. Suspensie celulară2. Suspensie celulară
2. Suspensii celulare

Mediu PRL-4
Explant (2,4-D; 2 mg/l, (2 4 diclorfenoxiacetic)
lapte de cocos (100mg/ml)
agar (7 g/l), sucroză (20 g/l)

Triptolidele+ Wilforgine + Wilforine Calus copact (stanga) și friabil

(dreapta)
HPLC
+diclormetan-metanol
(49:1)
Mediu PRL-4
2,4-D (2 mg/l), kinetină (0.1 mg/l),
cazeină (250 mg/l),
sucroză (20 g/l)
25 ± 1 C intuneric
120 rpm

uscare/înghețare separare în funcție de agregate 100 ml subcultivare

100, 500, 2,000, and 5,000 µm 25 de zile
Zhu et al., 2014
 Pregătirea culturilor hairy roots pentru producerea de triptolide
Tratare 7 zile
Mediu + 2 elicitori +3 precursori
50 µM acid salicilic

50 µM jasmonat de metil
500 µM precursori acid nicotinic,
izoleucină, acid aspartic

HPLC uscare

www.researchgate.net Zhu et al., 2014

Zhu et al., 2014
 Activitatea biologic activă a triptolidelor împotriva celulelor
tumorale, fac ca acesta sa fie una dintre cele mai utilizate variante de
terapeutice naturale de origie vegetală împotriva cancerului. Datorită
acestui lucru industria farmaceutică apelează la tehnicile actuale ale
biotehnologiei.

În ceea ce privește materia primă de obținere a triptolidelor –

planta Tripterygium wilfordii, posedă o paletă larga de metaboliți
secundari de importanță medicală (aproximativ 350 cu efect
antitumoral,antireumatic, antiartritic, recent fiind dovedit ca acestea ar
avea efect și împotriva lupusului)

Zhu et al., 2014

 PRODUCEREA BIOTEHNOLOGICĂ A
PROTEINELOR RIP
Exploatarea trichosanthinei din Trichosanthes
kirilowii prin metode biotehnologice
 CE SUNT PROTEINELE RIP?
Proteinele RIP (Ribosome-inactivating proteins) formează o familie de toxine bine caracterizate, ce au fost izolate pentru prima dată cu peste un
secol în urmă și despre care s-a arătat că posedă proprietăți catalitice, inactivând în mod specific și ireversibil sinteza proteinelor în celulele
eucariote, prin alterarea ARN-ului ribozomal 28S, constituent al subunității ribozomale mari (60S).

Majoritatea proteinelor RIP sunt produse de plante ca mecanisme de apărare împotriva

prădătorilor (virali sau paraziți), cele mai cunoscute fiind ricinul, abrinul și saporinele.

Aceste proteine pot fi subdivizate în două clase distincte pe baza structurii lor
• Proteine RIP de Tip1;
 Proteine monomerice de aproximativ 30 kDa
 Posedă activitate enzimatică ARN N-glicozidazică
• Proteine RIP de Tip2;
 Sunt heterodimeri compuși dintr-un lanț A cu activitate ARN N-glicozidazică asociat unuia sau mai
multor lanțuri B de aproximativ 35 kDa prin punți disulfidice.
 Subunitatea B asigură translocarea prin membrana plasmatică, motiv pentru care proteinele de
acest tip sunt mai toxice.
Mecanism de inactivare:
 Trichosanthina și proprietățile sale
în tratarea HIV

Trichosanthina (TCS) este o proteină de 27 kDa extrasă din rădăcina plantei medicinale de origine asiatică, Trichosanthes
kirilowii, fam. Curcubitaceae și prezintă caracteristicile unei proteine RIP de tip 1.
Activitate antitumorală
TCS (acțiune abortivă, induce apoptoza celulară)

Activitate imunoreglatoare
Activitate anti-HIV
(inhibă integraza virusului imunodeficienței umane de tip 1, scade nivelul antigenului HIV-1 p24
din ser și crește procentul celulelor CD4+)

Trichosanthina inhibă în mod preferențial replicarea virusului imunodeficienței umane de tip 1 (HIV-1)

Mecanismul exact al activității anti-HIV a trichosanthinei nu este încă clar .

Inițial se considera că TCS este implicată în inactivarea ribozomilor celulei gazdă, ducând la inhibarea translației proteinelor virale și moartea celulelor gazdă.
Cu toate acestea, cu ajutorul tehnicilor recombinante, s-au produs RIP mutante și s-a putut constata că activitățile de inactivare a ribozomului și antivirale ar putea fi
separate.
 PRODUCEREA BIOTEHNOLOGICĂ A
TRICHOSANTHINEI
Date fiind considerabilele implicații medicinale ale trichosanthinei, de-a lungul timpului s-au stabilit diferite metode de a produce acest compus, cu
toate că există relativ puține studii în ceea ce privește producerea proteinelor de apărare.
Pe cale clasică:
- purificarea trichosanthinei naturale, direct din Trichosanthes kirilowii
o metodă cromatografică simplă de a izola TCS pură electroforetic prin care se pot purifica cantități de ordinul gramului într-o zi.

Prin biotehnologii:
- biosinteza TCS în culturi crown gall, plante de tutun transgenic, culturi de rădăcini transformate (hairy roots) și sisteme de tipul bioreactoarelor.
- trichosanthina s-a identificat și în extractele celulare de calus transformat rezultat din infecția cu Agrobacterium rhizogenes.

Biotehnologia producerii trichosanthinei din:

A. culturi crown gall de T. kirilowii (transformare cu A. tumefaciens

B. culturi de tip „hairy roots” de T. kirilowii

C. suspensii celulare pornind de la culturi de calus transformat cu A.

rhizogenes

Trichosanthina biosintetizată prezintă aceeași activitate ca cea izolată direct din plantă.
 BIOTEHNOLOGIA PRODUCERII
TRICHOSANTHINEI DIN CULTURI DE TIP „HAIRY
ROOTS” DE T. KIRILOWII
AVANTAJE
• Se dezvoltă rapid și fără adaosul de hormoni exogeni, cum este necesar în cazul culturilor de calus, și este ușor de manipulat.
• Transformarea celulelor vegetale cu Agrobacterium rhizogenes produce rădăcini caracterizate printr-un grad ridicat de ramificare și multe
vârfuri de rădăcini meristematice, ducând așadar la producerea unor cantități mari de biomasă.
• Acest tip de cultură este recunoscut a fi o bună sursă de metaboliți secundari (rădăcinile plantelor sintetizează și acumulează
macromolecule precum proteinele de stocare sau cele legate de apărare), deoarece prezintă rate de creștere ridicate și sunt mult mai
stabile din punct de vedere genetic decât acestea.
Cu toate acestea, există doar câteva rapoarte privind producerea de proteine prin culturi „hairy-roots”.

ETAPE: Transformarea și generarea culturilor de rădăcini

Semințele sterilizate Infecția cu A. rhizogenes (linia
Plantulele obținute au fost propagate în Culturile stoc au fost menținute pe
germinează pe mediu 15834), urmată de transferul
mediul MS pentru transformarea 1 lună mediu MS prin subcultivare la
bazal MS solidificat cu rădăcinilor adventice rezultate pe
ulterioară și menținute la 24°C într-o aproximativ 4 saptămâni în mediu
0.2% Gelrite în mediu MS suplimentat cu 250
cameră de creștere cu o fotoperioadă de proaspăt lipsit de antibiotic și crescute
întuneric. μg/ml carbenicilină, pentru
14 ore lumină – 10 ore întuneric. la 24°C în lumină continuă.
distrugerea bacteriei.
 BIOTEHNOLOGIA PRODUCERII
TRICHOSANTHINEI DIN CULTURI CROWN GALL
DE T. KIRILOWII
Pentru a sintetiza trichosanthină în acest mod, are loc transformarea plantulelor de T. kirilowii cu A. tumefaciens, ceea ce declanșează sinteza unor niveluri ridicale de
auxine, cytokinine, etillen și opine în planta gazdă, determinând inducerea apariției formațiunilor de tip Crown gall.

AVANTAJE:
• Culturile crown gall prezintă stabilitate, rată de creștere ridicată pe mediu lipsit de hormoni.
• Culturile de crown gall de T. kirilowii constituie o sursă excelentă de trichosanthină și își mențin proliferarea pe mediu MS lipsit de hormoni
pentru mai mult de 5 ani, păstrând aceeași rată de creștere și de producere a proteinei.
• Folosirea elicitorilor (extract de A. mellea) conferă un mod convenabil de a produce TCS.
• Culturile crown-gall s-au dovedit a fi un sistem low-cost stabil pentru producerea TCS.

ETAPE: Inducerea formațiunilor Crown gall

Germinare pe Fragmente de Țesutul Crown gall
Semințe de mediu MS cu 5cm infectate este transferat pe Mediu MS
2 săptămâni 1 lună 1 lună
T. kirilowii sucroză cu A. mediu MS fără proaspăt
sterilizate 30g/L, și agar tumefaciens hormoni cu 500 fără
0.7% (C58) mg/l carbenicilin hormoni
Obținerea culturilor crown gall și optimizarea procesului
• Pentru optimizarea condițiilor de cultură, fragmentele crown gall au fost inoculate pe 4 tipuri de mediu solid:
MS WP Gamborg B5 67-V
Din cele 4 medii a fost ales MS, și pentru acesta s-a stabilit doza de sucroză și azot precum și pH-ul de 5.7.
După o lună a fost analizată biomasa produsă (greutate proaspătă) și conținut de trichosanthină.
 BIOTEHNOLOGIA PRODUCERII
TRICHOSANTHINEI DIN CULTURI CROWN GALL
DE T. KIRILOWII

• Utilizarea elicitorilor fungici în secreția TCS

Elicitorii sunt molecule capabile de declanșarea răspunsurilor de apărare ce precede o posibilă infecție, prin imitarea
percepției unui patogen asupra plantei.
Pentru a testa posibilitatea ca un elicitor de origine fungică să determine secreția TCS în mediu, a fost pregătit un extract
de Armillaria mellea.
- Țesuturile crown gall au fost inoculate în mediu lichid MS fără hormoni (pH 5.7), cu sau fără elicitor (100ml/l) în flaoane
de 100 ml și cultivate la întuneric, fiind agitate la 80 rpm.
- Țesuturile și mediul au fost prelevate și analizate (biomasa și conținutul în TCS) din 2 în 2 zile, începând cu a 12-a zi.
- Rezultatele au arătat că elicitorul nu a afectat creșterea țesutului, iar în mediu s-a constatat prezența mai multor
proteine de 26 kDa decât în mediul lipsit de elicitor. S-a confirmat că aceasta este TCS, într-o concentrație de 0.5 µg/ml.
• Optimizarea creșterii la scală largă, în bioreactoare
- Pentru optimizarea condițiilor de creștere a coloniilor de crown gall la scală largă, acestea au fost cultivate în
bioreactoare de 5 l în diferite concentrații (20, 30, 40, 50 g/l) și diferite viteze de omogenizare (60, 80, 100, 120 rpm),
acesta constituind factorul critic.
- Culturile au fost prelevate și analizate pentru biomasă după 28 de zile.
- Rezultatele au arătat că o concentrație de 40mg/l a dat cel mai mult produs, iar viteza optimă e de 80 rpm.
 CONCLUZII ȘI PERSPECTIVE

• Proteinele RIP constituie o clasă importantă de proteine de apărare cu potențial terapeutic pentru om, iar culturile vegetale reprezintă un mod util
pentru a studia biosinteza acestora și posibile metode de producere.
• Trichosanthina conținută în rădăcinile de depozitare ale plantei Trichosanthes kirilowii constituie un potențial inhibitor al replicării virusului HIV-1 cu
toate că nu se cunoaște mecanismul exact de acțiune, motiv pentru care se studiază modul în care această proteină ar putea fi produsă.
• Printre metodele de producere a trichosanthinei se numără biosinteza acesteia în culturile crown gall, culturi „hairy roots, în sisteme de tipul
bioreactoarelor.
• Prin culturi „hairy-roots” se obțin doar cantități reduse de proteină RIP, constatându-se că producerea într-o cantitate ridicată a acesteia este corelată
cu inducerea creșterii secundare în rădăcini.
• Culturile de crown gall de T. kirilowii constituie o sursă excelentă de trichosanthină, metoda dovedindu-se a fi un sistem low-cost stabil pentru
producerea acesteia, iar prin folosirea elicitorilor se îmbunătățește randamentul de producere al trichosanthinei. În plus, această metoda ar prezenta
atât avantajele culturilor hairy-roots cât și a suspensiilor celulare, prezentând în același timp și slabilitate genetică și morfologie avantajoasă.
• Îmbunătățirea în viitor a cunoștințelor în ceea ce privește căile metabolice și mecanismele reglărilor sale ar putea conferi un pas important pentru
exploatarea potențialului biosintetic al biotehnologiilor de producere a TCS.