• PRINCIPALELE TIPURI DE CULTURI IN VITRO

• Cultivarea ţesuturilor şi celulelor vegetale are la bază metode similare celor

din microbiologie.
• Primele culturi in vitro au fost cele în regim staţionar sau, altfel spus, culturile
statice, care sunt caracterizate prin utilizarea substratului nutritiv solid,
obţinut pe seama unor agenţi de gelificare ca: agarul, gelatina sau
silicagelul.
• Această modalitate de cultivare, de la începuturile dezvoltării tehnicilor in
vitro şi până astăzi, ramăne de bază, în investigaţiile experimentale, cu
toate că determină un caracter limitat al reacţiei explantului la factorii
inductivi ai mediului.
• Este vorba despre contactul redus al calusului sau al explantului cu
substratul nutritiv, având ca rezultat accesul diferenţiat al celulelor la
substanţele mediului de cultură.
• Alternativa pentru acest neajuns este cultivarea ţesuturilor şi celulelor
vegetale pe medii lichide, în regim de agitare continuă, sistem care asigură
utilizarea mai eficientă a nutrienţilor din mediu, schimburi gazoase mai
echilibrate.
• Suspensiile celulare sunt iniţiate prin utilizarea fragmentelor de calus friabil
şi cultivarea lor pe medii lichide.
exemplu de calus -
embrioni somatici regenerati
din calus
• Culturile celulare în suspensie sau suspensiile celulare reprezintă ansamblul
celulelor şi agregatelor celulare, care cresc într-un mediu nutritiv lichid, în condiţii de
agitare continuă.
• In timpul incubării, cantitatea materialului celular creşte şi ajunge la un punct de
maximă acumulare, moment în care este necesară subcultivarea sa. Astfel de culturi
pot fi propagate timp nelimitat, prin subcultivări periodice (7 zile).
• Exprimarea numărului de celule dintr-o suspensie celulară funcţie de durata incubării
poate fi reprezentată grafic prin modelul creşterii exponenţiale (Wilson şi Street,
1971), care cuprinde o fază lag, urmată de faza de creştere exponenţială, faza
creşterii liniare, faza accelerării negative a creşterii şi faza staţionară. Tehnica
generală de păstrare şi perpetuare a suspensiei celulare este subcultivarea în faza
staţionară. Perioada cuprinsă de la iniţierea culturii pană la atingerea fazei staţionare,
poate fi caracterizată prin: densitatea celulară iniţială, durata fazei lag şi rata de
creştere celulară. Densitatea iniţială a inoculului trebuie să fie cuprinsă între 0,5-2,5 x
105 celule/ ml mediu, valoare care creşte în timpul incubării culturilor ajungand la 1-4 x
106 celule/ ml mediu.
• Principalii indicatori ai creşterii unei suspensii celulare sunt estimaţi prin: numărarea
celulelor, determinarea volumului celular total (packed cell volume), greutatea
substanţei proaspete (cell fresh weight), greutatea subsanţei uscate (cell dry
weight) şi conţinutul de proteine.
Numărul celulelor
•Operaţia preliminară numărării celulelor este separarea lor din agragatele celulare. In acest scop
sunt tratate cu acid cromic 5-15% sau supuse unui tratament cu pectinază.
•Operaţia propriu-zisă de numărare se realizează cu ajutorul unei camere de numărat celule de tip
Fuchs-Rosenthal.

Volumul celular total

•Este determinat prin transferarea unui volum de suspensie celulară într-un tub conic gradat, de
centrifugă, de 15 ml şi centrifugarea la o turaţie de 2000 rot/min., timp de 5 minute. Se exprimă în ml
sediment celular/ ml mediu.

Greutatea substanţei proaspete

•Suspensiile celulare sunt filtrate prin sita de nylon, apoi celulele sunt spălate şi uscate la pompa de
vid, după care urmează cântărirea.

Greutatea substanţei uscate

•Suspensiile celulare sunt filtrate prin sita de nylon, apoi sunt menţinute la 60°C, timp de 12 ore.
Răcirea se execută într-un desicator, care conţine silicagel, după care materialul vegetal este
cântărit.
•Atât greutatea substanţei proaspete cât şi a celei uscate, sunt exprimate în raport cu unitatea de
volum şi la 106 celule.
Indicele mitotic

•Durata ciclului mitotic poate fi evaluată prin numărarea celulelor. Intervalul de timp, în care o populaţie
celulară îşi dublează numărul de celule, este considerat durata unei generaţii. Sincronizarea parţială sau
completă a diviziunilor celulare, în culturi de celule vegetale este necesară în scopul studierii metabolismului
celular, pentru determinarea lungimii ciclului mitotic total.
•Eriksson(1966) a elaborat o metodă bazată pe tratamentul suspensiilor celulare cu 5 aminouracil sau
hidroxiuree, ca agenţi sincronizatori ai culturii. Tratamentul cu aceste substanţe inhibitoare ale sintezei
ADN ului, se aplică în culturi în vârstă de o zi, obţinute din linii celulare subcultivate regulat şi durează 12-14
ore, funcţie de agentul sincronizator folosit.
•După tratament, celulele sunt spălate de două ori în mediul nutritiv proaspăt şi transferate în flacoane cu
mediu proaspăt. Se iau probe pentru fixare, în diferite intervale de timp de la aplicarea tratamentului. Se
foloseşte fixatorul Carnoy. Apoi se îndepărtează fixatorul prin centrifugare. Urmează hidroliza cu HCl 1N, la
60°C,timp de 5 minute. Celulele sunt centrifugate pentru îndepărtarea HCl şi sunt colorate cu orceină
lactopropionică (1g orceină în 100 ml dintr-un amestec în părţi egale de acid propionic/acid lactic.

•Pentru determinarea indicelui mitotic se numără minimum 1000 de celule pentru fiecare probă.
•IM = Nr.celulelor mitotice
Nr.total de celule analizate x 100
•Agentul sincronizator este eficace când produce un indice mitotic cel puţin dublu faţă de cel constatat la
martor.
• Tehnica culturii celulelor în suspensie presupune mai multe sisteme de culturi:
sistemul de agregate celulare pe agitator rotativ, sistemul închis de cultură
continuă, sistemul deschis de cultură continuă.

• 1.Sistemul de agragate celulare pe agitator rotativ se realizează prin transferul

calusului într-un mediu lichid, agitat continuu. In cazul acestui tip de cultură, cu volum fix
al mediului nutritiv, biomasa creşte prin diviziune celulară, astfel încât unele substanţe
nutritive, dar şi cantitatea de oxigen pot deveni factori limitativi ai culturii. De aceea se
impune subcultivarea periodică a suspensiilor celulare, la interval de 7 zile.

• 2.Sistemul închis de cultură continuă este sistemul în care componenţii nutritivi

necesari sunt suplimentaţi printr-un flux continuu de mediu proaspăt. Acest tip de sistem
se utilizează atât pentru obţinerea metaboliţilor primari cât şi a celor secundari.

• 3.Sistemul deschis de cultură continuă implică echilibrarea mediului nou introdus cu

recoltarea unui volum egal de cultură. In categoria sistemelor deschise intră
chemostatele, în care mediul nutritiv este introdus în doze calculate şi turbidistatele, in
care densitatea celulară este menţinută în anumite limite.
Tehnici ale clonării celulare

•Culturile celulare în suspensie se caracterizează, de obicei, printr-o mare heterogenitate atât

sub aspect morfologic, cât şi biochimic. Diversitatea genetică, reflectată în numărul şi morfologia
cromozomilor este un fenomen frecvent semnalat la nivelul culturilor celulare în suspensie. În
scopul obţinerii unor populaţii celulare omogene, care să prezinte stabilitate genetică, au fost
elaborate diferite tehnici prin care se cultivă celule izolate, a căror evoluţie ulterioară poate fi
mai bine controlată şi dirijată.

•1.Metoda suportului nutritiv (Hildebrandt ,1977) constă în plasarea celulelor izolate pe o hârtie
de filtru, plasată la rândul ei deasupra unei mase de calus, care acţionează ca o sursă de hrană.
Celula plasată pe hârtia de filtru se poate divide formând, după câteva săptămâni, o mică
colonie.

•2.Metoda culturii în picătură (Hildebrandt,1977) constă în cultivarea unei celule într-o picătură
de mediu lichid,înconjurată de ulei mineral, pe o lamă microscopică. Se pune câte o picătură de
ulei de parafină pe fiecare latură a picăturii de mediu, iar peste cele două picături de parafină se
aşează câte o lamelă sterilă. A treia lamelă este plasată peste mediul de cultură care conţine
celula şi face legătura între cele două lamele laterale. Celula creşte şi se divide în această
picătură de mediu. Parafina permite schimbul de oxigen şi împiedecă pierderea apei din mediu.
• 3.Metoda "plating-ului" a fost elaborată de Bergmann, în 1960 şi constă în
amestecarea unui mililitru dintr-o suspensie celulară cu 9 ml mediu nutritiv, ce conţine
0,5 % agar, la temperatura de 40°C. După amestec, cei 10 ml sunt trecuţi în vase
Petri.
După solidificarea mediului, evoluţia fiecărei celule din suspensia celulară poate fi
urmărită prin examinarea microscopică. De regulă coloniile celulare încep să se
formeze după aproximativ 1-2 săptămani de cultură. Plăcile Petri sunt incubate la
25°C şi întuneric. Declanşarea diviziunii celulare depinde în mare măsură de
densitatea celulelor etalate în vasele Petri. Densitatea minimă este de 1 x 10 3 celule/
ml.