TEHNICI IN VITRO PE CULTURI CELULARE

Scop: Inlocuirea testarilor pe animale cu teste in

vitro pe linii celulare

Substante sau materiale de

testat
 DE CE TESTĂRI IN VITRO PE LINII
CELULARE?

-Liniile celulare sunt relativ uşor de menţinut

-Celulele aderente sunt uşor de manipulat (pasage multiple)

 IPOTEZA DE LUCRU

Scopul experimentului in vitro pe culturi de fibroblaști

- determinarea citotoxicităţii, prin teste in vitro, a unei linii

celulare de fibroblaşti umani de provenienţă dermică (Human
Dermal Fibroblasts, adult (HDFa)), puse în contact cu diferite
tipuri de materiale sub formă de pulberi, suspensii, verificate la
intervale de 24 h de la cultivarea celulelor, timp de 5 zile.

(prin determinarea viabilităţii şi observarea

morfologiei celulare după expunerea la agent a
culturilor de celule).
 MATERIALE ŞI METODE
LABORATORUL DE CULTURI CELULARE AL UNIVERSITĂŢII ”APOLLONIA” DIN IAŞI

Centrifugă, Baie de apă ultrasonică, Frigider

Etuvă, Incubator, Butelie CO2, Hotă cu flux laminar, Pompă de vid, Lampă UV
 MATERIALE ŞI METODE
LABORATORUL DE CULTURI CELULARE AL UNIVERSITĂŢII ”APOLLONIA” DIN IAŞI

Invertoscop cu cameră foto, soft calculator

ETAPE DE LUCRU
1. PREPARARE MEDIU DE CULTURA - PROCEDURA DE LUCRU
2. DEZGHETAREA LINIEI CELULARE DE FIBROBLAŞTI – PROCEDURA DE
LUCRU
3. CULTIVAREA FIBROBLAŞTILOR - PROCEDURA DE LUCRU
4. SCHIMBAREA MEDIULUI DE CULTURĂ - PROCEDURA DE LUCRU
5. TRIPSINIZARE, PASAJUL CELULELOR - PROCEDURA DE LUCRU
6. INTRODUCERE NANOMATERIALE IN CULTURA - PROCEDURA DE LUCRU
7. SCHIMBARE MEDIU DE CULTURA - PROCEDURA DE LUCRU
8. COLORARE, NUMĂRAREA CELULELOR, DETERMINAREA VIABILITĂŢII -
PROCEDURA DE LUCRU

SR EN ISO Evaluarea biologică a dispozitivelor medicale.

10993-5:2009 Partea 5: Teste pentru citotoxicitate in vitro
1. PREPARARE MEDIU DE CULTURĂ
1. Mediu DMEM
2. Fetal bovin serum
3. Penicilină şi Streptomicină
4. Aminoacizi neesenţiali
5. PBS
1. se dilueaza 25 ml PBS concentrat cu apa
autoclavata pana la 250ml in flaconul de 500 ml
2. se adauga fetal bovin serum – 10 procente din
mediu de cultura
3. se adauga mediu DMEM pana la 400 ml
4. se adauga 4 ml solutie de penicilina cu
streptomicina concentrate
5. se adauga 4 ml de aminoacizi neesentiali
concentrate
Din flaconul cu mediul preparat se distribuie in 2
flacoane mai mici care se pun in baia de apa
incalzita la 37 C, timp de 5 minute, mediul ramas se
pune la frigider la 40C.
2. DEZGHETAREA LINIEI CELULARE DE FIBROBLAŞTI

1. se adauga 5ml mediu de cultura intr-un

tub de centrifuga
2. proba se dezgheata in baia de apa pana
raman cateva cristale de gheata la suprafata
3. continutul probei se introduce in cei 5 ml
mediu pregatit
RECIPIENTE CU AZOT – DEPOZITARE
CELULE

RECIPIENTE CU AZOT – PREGATIRE

CELULE PENTRU CULTURA
 3. CULTIVAREA FIBROBLAŞTILOR

1. proba cu mediul se centrifugheaza 5 min/1000 rotatii/min

2. dupa centrifugare se aspira supernatantul
3. se adauga 1 ml mediu, se omogenizeaza, si se introduce intr-un
flacon de 25ml, in care s-au introdus 5 ml mediu proaspat
4. se analizeaza la microcop
5. se introduce la incubator
 4. PASAJUL CELULELOR

1. aspirarea mediului din flaconul cu cultura celulara

2. spalarea culturii din flacon cu PBS, 8 ml, cateva secunde
3. aspirare PBS din flaconul cu cultura
4. se adauga tripsina, 1 ml
5. flaconul cu tripsina se pune la incubator, se verifica dupa 2,3
minute, daca celulele nu s-au detasat se mai lasa la incubator
pana la 5 minute
6. intre timp se pregateste mediul cald, incalzit in baia de apa la
37
7.peste flaconul cu cultura si tripsina se adauga 5 ml mediu cald,
omogenizam, dupa care flaconul se pune la centrifugat 5 min, la
1000 rotatii/min.
8. dupa centrifugare este eliminat supernatantul cu ajutorul
pompei de vid
9. se dauga 5 ml mediu in flaconul cu sedimentul ramas, se
omogenizeaza
10. continutul este distribuit intr-un flacon sau mai multe, in
care s-a introdus 5 ml mediu
11. se analizeaza la miscroscop, se noteaza data, mediul, cultura,
pasajul, se pune la incubator
 5.INTRODUCERE MATERIALE ÎN CULTURĂ
6. SCHIMBARE MEDIU DE CULTURĂ
100 µl/ml
100 µg/ml - 3 concentratii/proba
 7. REZULTATE
COLORARE, NUMĂRAREA CELULELOR, DETERMINAREA DENSITĂŢII ŞI A
VIABILITĂŢII
Viabilitatea celulelor în cultură – Test excludere cu
albastru-tripan (20μl suspensie celulară+ 20 μl soluţie
albastru-tripan) şi calculată prin raportarea numărului
de celule vii la numărul total de celule.

Nr.cel vii/ Total celule

(vii si moarte) x 100 = %
Celulele care sunt prea aglomerate,
Citotoxicitatea provoacă inhibarea creșterii
confluenta peste 100% - culoarea este
celulare
spre galben-maronie, datorita
- celulele gigant, celule multinucleate, au
modificarii pH ului, a unui
aspect accidental granular, vacuole în
metasbolism intens. Pasajul celulelor
citoplasmă sau nucleu
se realizeaza cand acestea au deposit
procentul de 60%.

La microscop, celulele moarte sunt vizibile prin

faptul ca dispare membrana, floteaza si nu mai
au citoplasma. Daca celulele au proliferat, si
sunt prea multe moarte, se inlocuieste mdiul, de
obicei la 2-3 zile.
PASAJUL CELULELOR

PB 1

PB 2

După tripsinizare
 IMPLANT ŞI BIOOS
SCHIMBARE MEDIU DE CULTURĂ

MARTOR IMPLANT

1 2 3
BIOOS
 REZULTATE
DETERMINAREA VIABILITĂŢII
 ARCURI ORTODONTICE

Nitinol 3M Niti GAC Beta 3 Titanium 3M

 MATERIALE L1A, LC4, CSPAT, CSP
SCHIMBARE MEDIU DE CULTURĂ

MARTOR
MARTOR

L1A LC4
CSP
CSP

CSPAT CSPAT
 MARTOR, L1A – NECITOTOXIC
CSP – USOR CITOTOXIC
LCP – SEVER CITOTOXIC
CSPAT - TOXIC