Tema 5.

TEHNICI DE IZOLARE I CONSERVARE A CULTURILOR PURE

5.1 IZOLAREA CULTURILOR PURE DE MICROORGANISME
mbuntirea permanent a lotului de microorganisme din care s se selecioneze tulpini cu
performane deosebite, utile n procesele microbiologice industriale, impune izolarea din medii
naturale a mai multor culturi reprezentative, care trebuie meninute i studiate n laborator sub
form de culturi pure.
Tehnicile de izolare a microorganismelor, indiferent de natura lor, presupun operaii de
prelevare a probelor biologice din medii naturale, inoculare n medii de cultur specifice, i dup
cultivare n condiii optime, izolarea i studiul coloniilor izolate, replicare pentru obinerea de
culturi pure.
Mediile eterogene din microbiota crora se preleveaz de obicei probele biologice sunt
reprezentate de diverse biotopuri naturale (produse alimentare, sol, aer, ape. !umrul de probe
care se analizeaz variaz n general n funcie de obiectivul urmrit, densitatea posibil a
microorganismelor de izolat n mediul analizat i variaia densitii celulelor n habitatul respectiv n
funcie de condiiile de mediu.
"rin cultur pur se nelege biomasa de celule rezultate prin reproducere dintr#o
singur celul aflat ntr#un mediu nutritiv steril cu volum limitat. $stfel, o cultura pur este
format din celule aparin%nd unei singure specii sau unei singure tulpini.
n funcie de principiul realizrii lor, metodele de izolare a culturilor pure pot fi clasificate n
dou grupe mari i anume&
- metode bazate pe principiul separrii fizico-mecanic a celulelor;
- metode biologice
'a r%ndul lor fiecare din aceste dou grupe cuprinde metode generale, care se preteaz a fi
utilizate pentru izolarea ma(oritii microorganismelor, sau metode de izolare specifice pentru
un anumit grup, sau un microorganism individual.
Procedee fizice de izolare a culurilor !ure
). Meode !ri" r#$!%"dire & sunt larg folosite deoarece sunt uor de e*ecutat, av%nd ca principiu
rsp%ndirea celulelor, aflate n populaii eterogene n medii naturale, prin diluare n medii
lichide sau rsp%ndire mecanic pe suprafaa mediilor sterile solidificate.
1. Metoda Koch se bazeaz pe rsp%ndirea microorganismelor recoltate din medii naturale
ntr#un mediu nutritiv i fi*area distanat a celulelor n urma solidificrii mediului cu
formare prin multiplicare de colonii izolate ntre ele.
Metoda este folosit n special pentru izolarea culturilor pure de drod!!. Mediul de
rsp%ndire este mustul de mal cu gelatin, repartizat c%te +,cm
-
n - eprubete, fluidificat i
meninut la -.#/,01. 2in proba aleas pentru izolare se recolteaz celulele cu o ans, care
apoi este trecut succesiv n cele - eprubete. 2up inoculare i uniformizare, coninutul
fiecrei eprubete se repartizeaz n c%te o plac "etri, iar prin solidificarea mediului celulele care
rm%n fi*ate n gel vor forma prin multiplicare colonii izolate.
n funcie de densitatea celulelor recoltate iniial, n placa a +#a sau a -#a pot e*ista colonii
izolate (la o distan de cca. + cm, iar dup studiul caracterelor microscopice ale coloniilor
reprezentative se face repicarea n eprubete cu slant agar obin%ndu#se culturi pure (fig. 3.
4ig. 3. Te'"ica de izolare a culurilor !ure !ri" r#$!%"dire ()eoda
*oc'+
Caracere colo"iale
5acteriile se cultiv pe mediul de cultur general bulionul de carne lichid sau solidificat cu
agar#agar.
'a cultivarea pe bulion de carne cu agar dintr#o celul de bacterie, prin reproducere prin
sciziune ia natere o colonie care devine vizibil cu ochiul liber dup +/#/6 h.
5acteriile formeaz colonii cu urmtoarele aspecte&
t!" S #$mooth % &eted '(c!o$)
t!" R #ro(*h % r(*o$+ a$"r(+ c(tat)
t!" M #a$"ect m(co!d).
n seciune coloniile bacteriene prezint profil lenticular, crateriform, triunghiular iar
perimetrul coloniilor poate fi circular, dantelat sau cu ramificaii rizoidale (fig. +.
1uloarea coloniilor bacteriene poate fi alb, alb#crem, galben#auriu, oran(#rou, albastru.
'a cultivare pe medii nutritive lichide bacteriile pot da tulburare, sediment n cazul
bacteriilor anaerobe sau facultativ anaerobe sau formeaz la suprafaa lichidelor voal caracteristic,
fragil sau cutat, gelatinos n cazul bacteriilor aerobe.
$ceste caractere macroscopice servesc la identificarea bacteriilor.
,i-. .. Caracerile colo"iale ale )icroor-a"i$)elor
2. Metode $car!,!cate. n plci "etri sterile se repartizeaz mediul de cultur adecvat
(5ulion de carne agarizat #51$ sau must de mal agar i zat MM$. 1u a(utorul ans ei se
recolteaz celule din mediul natural, apoi cu ansa ncrcat cu celule se traseaz striuri diferite pe
suprafaa mediului solidificat, astfel nc%t prin drumul c%t mai sinuos parcurs de fir, ntr#o zon
a plcii celulele s rm%n ataate de mediu i prin termostatare /6#7+ ore s se dezvolte i s
formeze colonii izolate. 8e realizeaz apoi studiul morfologic al coloniilor reprezentative i culturile
care intereseaz sunt repicate n eprubete cu mediu steril obin%ndu#se astfel culturi pure (fig.
-, /.
4ig. -. O/0i"erea culurilor !ure !ri" r#$!%"dire !e $u!rafa0a )ediului cu -eloz#
4ig. 1. Meoda $carifica# de izolare a culurilor !ure
-. Metoda .& $tr!!. 8e aplic n cazul contaminrii cu microorganisme strine a culturilor pure n
timpul conservrii acestora. 9ste similar cu metoda scarificat, n schimb drept mediu de
rsp%ndire se folosete mediul nclinat din +#- eprubete, n care se realizeaz transferul succesiv de
celule, prin trasarea de striuri la suprafaa mediului.
/. Metoda Dr!*a'$0!. n trei plci "etri sterile se toarn mediu nutritiv cu agar (stratul de mediu s fie
de ,,.#3 cm grosime i se las s se solidifice. 2up meninerea plcilor n termostat 3#+ ore pentru
zv%ntarea suprafeei mediului, n prima plac cu o pipet se scurge o pictur din suspensia n care
se afl microorganismele i cu $"at ( 'a Dr! * a' $0 ! aceasta se rsp%ndete uniform pe suprafaa
mediului. 1elulele ataate de spatul sunt apoi rsp%ndite prin aceeai tehnic n urmtoarele +
plci "etri, realiz%nd astfel rsp%ndirea celulelor pe suprafaa mediului. "rin termostatare are
loc dezvoltarea de colonii izolate din care prin repicare n eprubet cu slant#agar se pot obine culturi
pure.
5. Metoda de r1$"2&d!re .& "'1c!+ se aplic n special pentru izolarea culturilor pure de
mucegai. : cantitate redus din proba biologic cu microbiot eterogen, din care urmeaz s se
realizeze izolarea, se introduce ntr#o eprubet cu mediu agarizat fluidificat i temperat la /+01. 2up
omogenizare coninutul eprubetei se repartizeaz ntr#o plac "etri. $poi, n aceeai eprubet se
adaug mediu nutritiv steril, pentru antrenarea eventualilor spori sau fragmente hifale rmase ataate
de pereii eprubetei, i coninutul se repartizeaz ntr#o alt plac "etri steril, operaia continu%nd
de -#. ori. n ultimele plci pot aprea colonii perfect izolate sau chiar o colonie unic, din care
prin repicare pe slant#agar se obine cultura pur.
II. Meodele de diluare presupun diluarea probei n ser fiziologic
steril prin tehnica diluiilor decimale, astfel nc%t numrul de celule ntr#o micropictur din ultima
diluie s fie redus.
Metoda Lindner este folosit pentru izolarea culturilor pure de dro(dii, este o metod precis
deoarece se realizeaz sub control microscopic. 2up realizarea de diluii corespunztoare, nc%t
ntr#o pictur s se afle o singur celul, cu a(utorul unei penie topografice se plaseaz ; picturi
pe suprafaa unei lamele sterile. 'amela se plaseaz, cu picturile n (os, pe o lam cu
e*cavaie i se studiaz la microscop fiecare pictur. 8e marcheaz apoi pictura care conine
o singur celula aparin%nd dro(diei ce intereseaz, apoi se desprinde lamela i cu a(utorul
unei benzi sterile de h%rtie se absoarbe pictura marcat. 5anda se introduce apoi ntr#o
eprubet cu must de mal lichid, iar prin termostatare se asigur condiii de multiplicare a
celulei, care prin reproducere va da o cultur pur.
Metoda Naumov este o metod specific pentru izolarea culturilor pure de mucegai. 2in proba
biologic se recolteaz cu ansa o cantitate redus de substrat, ce conine celule specifice ale
mucegaiului de izolat (spori, filamente hifale, care apoi se dilueaz n ap steril.
2intr#o diluie convenabil se aplic distanat micropicturi pe capacul interior al unei plci "etri,
peste care se adaug n picturi mediu agariz fluidificat (/+#/.01, i dup +# - zile de
termostatare la +.#+601, odat cu apariia vizibil a miceliului, se selecteaz, din pictura cu
colonie unic, cultura pur dorit.
: alt metod, care se preteaz cel mai bine pentru izolarea culturilor pure de mucegai, const n
inundarea suprafeei mediului solidificat (MM$, n plci "etri cu apro*imativ + cm
-
dintr#o
suspensie diluat de spori, care se menine n contact cu mediul c%teva minute, apoi se scurge
din plac. 8porii fungici care au rmas n contact cu mediul vor forma colonii izolate, din care
dup studiul caracterelor morfologice, prin repicare n eprubete cu slant#agar, se vor izola culturi
pure.
zolarea culturilor pure cu a!utorul micromanipulatorului. "rin intermediul
manipulatorului (aparat prevzut cu tuburi capilare pot fi izolate celulele dorite aflate n
preparate microscopice. <tilizarea micromanipulatorului este de asemenea util pentru recoltarea
de ascospori din celule ascogene i n studii de inginerie genetic (con(ugare, fusiune
protoplati.
Izolarea culurilor !ure !ri" )eode /iolo-ice
Metodele de izolare se bazeaz pe proprietile i particularitile fiziologice specifice ale
microorganismelor ce urmeaz a fi izolate, prin care se difereniaz net de microorganismele
nsoitoare aflate n microbiota eterogen din acelai biotop.
Metoda "urri asigur separarea microorganismelor n funcie de necesarul de o*igen
pentru desfurarea funciilor vitale (tipul respirator. 2up inoculare i omogenizare n
mediu cu agar (fluidificat i temperat la /+#/.01 mediul se transfer ntr#un tub de
sticl (,,6=+. cm i se solidific n poziie vertical form%nd un tub de mediu drept. 2rept
medii de cultur se recomand utilizarea de medii speciale (carne#ficat#agar,
tripticaz#glucoz#e*tract de dro(die, care conin glucoz. "entru inoculare se poate utiliza i
tehnica de rsp%ndire a celulelor, n strii, n profunzimea tubului de gel (fig...
a /
4ig. 5 2 Dez3olarea )icroor-a"i$)elor 4" fu"c0ie de !ariculari#0ile fiziolo-ice (i!ul
re$!iraor+5 / 2 Te'"ica de i"oculare a )icroor-a"i$)elor 4" )a$a de )ediu cu -eloz#
"rin termostatare, n funcie de accesul o*igenului din aer, separarea microorganismelor se
realizeaz n mod natural (dup tipul respirator (fig..&
3 m!croor*a&!$me'e aero4e 3 'a $("ra,a5a med!('(! dre"t6
3 m!croor*a&!$me'e ,ac('tat!7 a&aero4e 3 "e toat1 .&1'5!mea t(4('(! de med!(6
3 m!croor*a&!$me'e m!croaero,!'e % "e ('t!ma 89- d!& .&1'5!mea med!('(!.
3 m!croor*a&!$me'e $tr!ct a&aero4e 3 "e ma! m('t de :9- d!& .&1'5!mea t(4('(!.
2. #olosirea mediilor selective, medii cu o compoziie care favorizeaz dezvoltarea unui
grup restr%ns de microorganisme aparin%nd aceluiai gen sau aceleiai specii. 2e cele mai multe
ori, selectivitatea mediului este asigurat prin utilizarea unor substane chimice cu efect inhibitor
asupra populaiei eterogene din care trebuie separat microorganismul dorit. 2e e*emplu, pentru
izolarea streptomicetelor (ageni utilizai pentru obinerea n condiii industriale a unor antibiotice i
enzime, bacterii filamentoase, prezente n concentraie mare n sol n populaii microbiene
abundente i e*trem de diverse, selectivitatea mediilor se poate asigura prin una din urmtoarele
metodele&
> utilizarea unor medii de cultur selective, care s conin surse de carbon i azot
preferate, medii pe care streptomicetele s se dezvolte foarte bine comparativ cu eubacteriile
i fungii. n acest caz, mediile recomandate sunt acelea care conin am!do& ;! *'!cero' drept
surse de carbon, ar*!&!&1 $a( a<ota5! ca surse de azot. 1ombinaia amidon#azotat este
foarte favorabil pentru izolarea streptomicetelor, deoarece acestea asimileaz foarte bine
azotatul comparativ cu alte bacterii?
> folosirea unor substane selective cu efect antifungic (actidion .,# 3,, @g=cm
#-
?
pimaricin A nistatin 3,#3. @m=cm
#-
, sau antibacterian (polimi*in .@g=cm
#-
?
penicilin 3@g=cm
#-
. $stfel, mediul cu amidon# cazein i rifamicin (.,@g=cm
#-
poate
fi utilizat cu succes pentru izolarea unui numr mare de tulpini de $treptom%ces diastaticus,
cu efect inhibitor asupra altor microorganisme. 2e asemenea prin adugarea de roz bengal
(-.@g=cm
#-
, n mediul cu amidon#cazein#azotat, a fost inhibat creterea bacteriilor,
ncetinit dezvoltarea fungilor, iar streptomicetele s#au dezvoltat normal.
&. 'ermorezistena diferit a principalelor forme sub care pot e*ista microorganismele poate
reprezenta de asemenea un criteriu de separare a bacteriilor sporulate. $stfel, "acillus subtilis
agent utilizat n procese industriale de biosintez a enzimelor de tipul amilazelor i
proteazelor, poate fi separat din microbiota eterogen a diverselor biotopuri naturale (sol,ap, f%n,
produse alimentare prin pasteurizarea probelor la 6,01B3, minute, c%nd sunt distruse toate formele
vegetative ale microorganismelor, precum i sporii, n timp ce endosporii bacteriilor rezisteni la
pasteurizare, sunt izolai i n condiii favorabile de mediu dau natere la culturi pure.
/. <n alt procedeu de izolare pe baza proprietilor fiziologice specifice const n cultivarea
(n condiii restrictive de mediu, prin stabilirea unor regimuri de pC i temperatur optime
pentru dezvoltarea unui singur microorganism sau a unui grup restr%ns de microorganisme i
defavorabile pentru celelalte microorganisme nsoitoare prezente n acelai biotop.
6ERI,ICAREA PURIT78II CULTURILOR PURE IZOLATE
Derificarea puritii culturilor izolate prin una din tehnicile descrise se face analiz%nd
caracterele morfologice prin studiul urmtoarelor caractere&
> macroscopice (culturale # prin inoculri pe mediu nutritiv solidificat n plci "etri, c%nd
prin controlul vizual al culturii se urmrete uniformitatea creterii i prezena
indicatorilor morfologici caracteristici speciei izolate?
> microscopice # n preparate microscopice se apreciaz puritatea culturii pe baza
cunotinelor referitoare la morfologia celulelor i unele particulariti specifice privind
structuri de reproducere.
Tulpinile izolate n numr mare din medii naturale sunt iniial pstrate n laborator sub
denumirea de izolate i dup ce sunt studiate din punct de vedere morfologic i fiziologic capt
identitate i sunt definite ca tulpini ce aparin unor specii i genuri distincte.
1ea mai simpl i sigur metod de verificare a puritii culturii izolate const n
recoltarea celulelor, realizarea unei suspensii n ser fiziologic steril, diluarea suspensiei i
inoculare n mediu nutritiv cu agar, n plci "etri. 2up termostatare corespunztoare se
studiaz coloniile dezvoltate n plac i se verific dac indicatorii morfologici coincid cu cei ai
culturii iniiale. n cazul confirmrii puritii cultura se repic n cel puin + e*emplare i se
conserv n condiii corespunztoare care s asigure meninerea viabilitii, puritii i stabilitii.
CONSER6AREA CULTURILOR PURE
8tabilitatea microorganismelor utilizate n scopuri tiinifice i practice se poate realiza prin
conservarea n timp a strii de viabilitate (a caracteristicilor morfologice i biochimice ale
microorganismelor n culturi pure, utiliz%nd metode diverse de conservare bazate pe
ncetinirea proceselor metabolice ale celulelor vii.
Microorganismele i conserv caracterele fiziologice, n perioade de timp variabile, n
funcie de& specie? calitatea mediului? metoda de conservare? gradul de deshidratare a
mediului? perioada dup care este necesar repicarea culturii pe mediu proaspt i obinerea de
subculturi n condiii care s evite contaminarea.
2intre tehnicile aplicate pentru conservarea culturilor pure de microorganisme
menionm&
- repicarea periodic la intervale scurte de timp;
- privarea culturilor de accesul o)igenului;
- meninerea culturilor la temperaturi sczute;
- pstrarea celulelor (n medii cu umiditate redus.
Metodele de conservare aplicate, specifice fiecrui microorganism, trebuie s permit
meninerea viabilitii i a potenialului productiv pe o perioad ndelungat. )ndiferent de
metoda aplicat cultura supus conservrii trebuie s fie pur din punct de vedere genetic.
$legerea metodei cea mai adecvat de conservare se face n funcie de tulpinile ce urmeaz
a fi conservate, mi(loacele tehnice disponibile i investiiile necesare. 'iteratura de specialitate
ofer date privind cele mai adecvate metode de conservare a principalelor grupe de microorganisme
i n particular pentru genurile i speciile cu importan industrial.
$precierea viabilitii celulelor conservate prin diverse metode se realizeaz dup
reactivarea acestora prin cultivare pe medii de cultur bogate din punct de vedere nutritiv i
aprecierea cantitativ sau uneori calitativ a prezenei celulelor viabile.
1ontrolul presupune stabilirea procentului de celule care i#au meninut viabilitatea
dup o perioad de conservare prin metoda aleas, n raport cu numrul total de celule supuse
conservrii.
"rocentul de celule afectate prin conservare, care nu i#au pierdut viabilitatea dar suferit
modificri ale proprietilor biochimice se calculeaz prin diferena dintre numrul de celule care s#au
dezvoltat n mediu nutritiv bogat i numrul de celule care au crescut pe mediu sintetic (minimal.