C3-A - CULTURI IN VITRO

CERINŢELE NUTRITIVE ALE ŢESUTURILOR VEGETALE

CULTIVATE ÎN CONDIŢII ASEPTICE

Explantele vegetale pentru a putea trăi, după desprinderea de planta donator, au nevoie
de condiţii speciale de cultură, să fie protejate de agenţii patogeni (asepsie totală) şi să aibă
ca sursă de hrană o soluţie nutritivă complexă, formată din apă, săruri minerale, substanţe
organice şi fitohormoni.

Pentru menţinerea explantelor la suprafaţă şi pentru ca acestea să nu fie asfixiate,

mediul de cultură se solidifică cu un agent de solidificare.
Soluţia nutritivă complexă lichidă sau solidă se numeşte mediu de cultură sau
substrat de cultură. Acest mediu de cultură trebuie sa fie steril şi cu o compoziţie complexă
deoarece explantul nu are capacitate de a se hrăni autotrof, el trăieşte heterotrof pe baza
substanţelor existente în mediu.
În funcţie de scopul urmărit, evoluţia explantului poate fi dirijată prin modificarea
compoziţiei mediului, obţinându-se calus sau regenerarea de noi plante prin stimularea
organogenezei.
Compoziţia mediului de cultură este specifică pentru fiecare specie, soi şi fază de
dezvoltare, cerinţele fiind diferite şi în funcţie de explantul folosit, momentul de prelevare
şi zona din care s-a prelevat, chiar în cadrul aceluiaşi soi.

În prezent se cunosc şi se utilizează o serie de medii de cultură ce poartă numele celor

care le-au creat: White, Murashige-Skoog, Nitsch, Gamborg, Heller.
Heller

Compoziţia mediului s-a stabilit atât prin tatonări repetate cu diferite substanţe, cât şi prin
studii ale sevei brute şi elaborate la diferite specii, studii privind absorbţia şi desorbţia,
schimbul ionic care există între plantă şi mediul înconjurător.
Compoziţia chimică

A. Compuşii anorganici şi rolul lor

Apa

Sărurile anorganice

•Substanţele anorganice sunt introduse în mediu sub formă de săruri.

• Cele mai utilizate sunt: azotaţii, fosfaţii, clorurile şi sulfaţii de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Mo, Zn, Cu, Na, etc.
•Absorbţia elementelor din mediu se face sub formă de ioni; utilizarea uneia sau alteia din săruri este în funcţie de cerinţele fiecărei specii şi de faza de vegetaţie.

•În funcţie de cantitatea de elemente ce se foloseşte în mediu, elementele se împart în:

•-macroelemente - utilizate în concentraţii de ordinul milimolilor – C, O, H, N, K, Ca, P, S, Mg;

•-microelemente sau oligoelemente, utilizate în concentraţii de micromoli.

 Principalele medii de cultură utilizate în culturi
in vitro
Constituenţi Heller White Nitsch Murashige Gamborg
Skoog
Macroelemente mg/l
KCl 750 65 - - -
NaNO3 600 - - - -
MgSO4x 7H2O 250 720 185 370 250
NaH2PO4x H2O 125 16,5 - - 150
CaCl2x 2H2O 75 - - 440 150
CaCl2 - - 166 - -
KNO3 - 80 950 1900 2500
Na2SO4 - 200 - - -
(NH4)2SO4 - - - - 134
NH4NO3 - - 720 1650 -
KH2PO4 - - 68 170 -
Ca(NO3)2 x 4H2O - 300 - - -
Microelemente
FeSO4x 7H2O - - 27,8 27,8 27,8
Na2EDTA x 2H2O - - 37,3 37,3 -
MnSO4x H2O - - - - 10,0
MnSO4x 4H2O 0,01 7,0 25 22,3 -
KI 0,01 0,75 - 0,83 0,75
NiCl2x 6H2O 0,03 - - - -
CoCl2x 6H2O - - - 0,025 0,025
ZnSO4x 7H2O 1,0 3,0 10,0 8,6 2,0
CuSO4x 5H2O 0,03 - 0,025 0,025 0,025
H3BO3 1,0 1,5 10,0 6,2 3,0
FeCl3x 6H2O 1,0 - - - -
Na2MoO4x 2H2O - - 0,25 0,25 0,25
AlCl3 0,03 - - - -
Fe(SO4)3 - 2,5 - - -
Constituenţi
organici
Inozitol - - 100 100 100
Acid Nicotinic - 0,05 5 0,5 1,0
Piridoxină HCl - 0,01 0,5 0,5 1,0
Tiamină HCl - 0,01 0,5 0,1 10
Glicină - 3,0 2 2,0 -
Acid folic - - 0,5 - -
Biotină - - 0,05 - -
Zaharoză - 2% 2% 3% 2%
• B. Compuşii organici

 Sursele de carbon

• Viaţa in vitro este aproape în exclusivitate heterotrofă, în special în primele faze ale
existenţei, până la formarea unui număr suficient de mare de frunze pe fiecare
plantulă sau lăstar.
• Datorită acestei nutriţii heterotrofe mediul de cultură trebuie să conţină un compus
care să asigure carbonul organic necesar în metabolism.
• Principalele surse de carbon sunt glucidele. Acestea sunt substanţele cele mai
utilizate şi mai accesibile plantelor ca sursă energetică. Dozele pe litru sunt de cca. 2-
3% în funcţie de faza de vegetaţie şi tipul de explant folosit.
• Dintre glucide zaharoza răspunde cel mai bine cerinţelor culturilor in vitro.
 Aminoacizii
• Sunt utilizaţi ca surse de azot amoniacal disponibil imediat pentru celule şi ţesuturi,
fată de azotul organic care este mai greu accesibil.
• Se adaugă în mediu sub formă de compuşi simpli sau complecşi.
• Principalii aminoacizi utilizaţi sunt: glicina, asparagina, acidul aspargic, cisteina,
alanina, glutamina etc.

 Vitaminele
• Plantele spre deosebire de animale sunt capabile de sinteza vitaminelor, dar nu şi
ţesuturile cultivate in vitro. S-a demonstrat experimental ca in vitro ţesuturile şi
plantulele răspund favorabil la adaosul exogen de vitamine în cantităţi mici.
Majoritatea vitaminelor sunt termolabile, sunt distruse la temperaturi ridicate, uneori
cu ocazia autoclavării, dar s-a observat că şi substanţele reziduale au rol favorabil
asupra culturii.
• Principalele vitamine utilizate în mediile de cultură sunt:
• -tiamina (vitamina B1, aneurina), se foloseşte în concentraţii cuprinse între 0,1-10 mg/l; stimulează creşterea vegetativă, sporirea biomasei produsă in vitro;
• -piridoxina (vitamina B6), 0,1-1 mg/l; precursor a unor coenzime, catalizând reacţii de baza în metabolismul aminoacizilor;
• -riboflavina (vitamina B2), 0,1-1 mg/l, rezistentă la temperaturi ridicate (280°C); inhibitor al creşterii rădăcinilor, rol în metabolismul celular;
• -acidul pantotenic (vitamina B5), este mai puţin utilizat ca atare; pantotenatul de calciu se foloseşte în concentraţii cuprinse între 0,5-2,5 mg/l;
• -cobalamina (vitamina B12), este mai rar folosită, stimulează sinteza nucleoproteidelor;
• -acidul nicotinic (vitamina B3, niacina), 0,5-5 mg/l, rezistent la temperaturi ridicate (234-237oC); rol în metabolismul intermediar;
• -biotina (vitamina H), 0,1 mg/l; stimulează creşterea ţesuturilor meristematice şi proliferarea celulelor;
• -acidul folic, 0,01 mg/l; efect stimulator asupra creşterii ţesuturilor la lumină; la întuneric are efect toxic;
• -acidul para-aminobenzoic, 1 mg/l; stimulează biosinteza acidului pantotenic şi a biotinei;
• -acidul ascorbic (vitamina C), 1-100 mg/l, prin autoclavare se distruge în bună parte; este activator general al metabolismului celular;
• -vitamina E (tocoferolul), măreşte sensibilitatea celulelor la auxine;
• -inozitolul (mio-inozitolul, mezo-inozitolul, hexahidroxi-ciclohexan), 100-1000 mg/l; este considerat atât vitamină cât şi glucid; stimulează diviziunea celulară.
 Fitoregulatorii

• Fitohormonii, fitoregulatorii sau substanţele regulatoare de creştere sunt substanţe

organice utilizate în cantităţi mici cu rol de a stimula, inhiba sau controla procesele
fiziologice de creştere şi dezvoltare.
• Există fitohormoni endogeni, sintetizaţi de plante şi fitohormoni exogeni sau de
sinteză.
• Ţesuturile in vitro nu sunt capabile să-şi sintetizeze întreaga cantitate de care au
nevoie, fiind necesară adăugarea lor în mediul de cultură pentru a asigura o bună
creştere a explantelor.
• Cei mai folosiţi fitohormoni în culturile in vitro sunt auxinele, citochininele şi
giberelinele.
• Auxinele – sunt mult utilizate pentru reglarea proceselor de morfogeneză alături de
citochinine. Auxina naturală descoperită este AIA (acidul indolil-acetic) care se produce
şi prin sinteză pe cale industrială. Cele mai folosite auxine de sinteză sunt:
• -IBA (acidul 3 indolil butiric); ANA (acidul naftilacetic); 2,4D (acidul 2,4
diclorfenoxiacetic); ANOA (acidul beta naftoxiacetic).
• Acţiunea auxinelor este foarte complexă datorită intreacţiunii pe care o au cu alte
substanţe regulatoare şi intervenţiei asupra unor procese fiziologice.
• Rolul auxinelor poate fi redat astfel:
• -stimulează diviziunea celulară;
• - influenţează alungirea celulelor prin mărirea plasticităţii peretelui celular;
• -modifică permeabilitatea membranelor plasmatice pentru apă şi ioni;
• -rol important în dominanţa apicală;
• -inhibă formarea embrionilor somatici în suspensiile celulare;
• Auxinele sunt sintetizate în partea aeriană a plantelor în muguri, frunze, fructele tinere şi
bobocii florilor de unde circulă în toată planta. Cel mai mult se folosesc ANA şi 2,4D
care sunt mai stabile, nu se oxidează în prezenţa luminii. 2,4D este mult utilizată pentru
inducerea şi creşterea calusului şi pentru rizogeneză. La calus asigură friabilitate mare
uşurând separarea calusului pentru cultura de suspensii celulare şi în embriogeneza
somatică.
• Citochininele sunt substanţe ce se găsesc în cantităţi relativ ridicate în fructe,
seminţe, etc., iar ca structură au la bază adenina şi un nucleu purinic.
• Prima citochinină izolată a fost chinetina, experimentată cu succes la culturile in vitro.
La scurt timp s-a sintetizat benzil aminopurina (BAP). În prezent se folosesc pentru
culturile de ţesuturi patru citochinine dintre care două naturale (2 IP - isopentenyl
adenine şi zeatină) şi doua de sinteză (chinetina şi BAP - 6-benzylaminopurine).

• Efectul fiziologic al citochininelor constă în:

• -acţionează asupra diviziunii celulare alături de auxine;
• -stimulează formarea mugurilor adventivi şi din calus;
• -stimulează formarea lăstarilor laterali;
• -stimulează sinteza proteică;
• -inhibă formarea rădăcinilor.

• Biosinteza citochininelor endogene are loc în rădăcini şi în embrioni, iar migrarea

este dependentă de cea a glucidelor. Sunt substanţe termostabile suportând uşor
autoclavarea.
• Giberelinele sunt substanţe care acţionează la nivelul întregii plante şi nu asupra
celulei, cu rol în stimularea creşterii, înfloririi şi fructificării.
Cea mai utilizată giberelină este acidul giberelic (GA3) fiind şi cea mai activă.

Acţiunea fiziologică este următoarea:

-produce alungirea internodurilor tulpinale;
-stimulează creşterea frunzelor şi rădăcinilor.

Giberelinele sunt sintetizate în frunzele şi fructele tinere, în mugurii activi, în

embrioni şi vârful rădăcinilor, circulând în plante prin vasele liberiene.
Pentru meristeme giberelina este indispensabilă în vederea alungirii lor.
La alte tipuri de explante nu se recomandă giberelina deoarece inhibă dediferenţierea
celulară.
 Etilena a fost recunoscută ca fitoregulator mult mai târziu şi este utilizată puţin
în culturile in vitro.

Rolul fiziologic poate fi prezentat sintetic astfel:

•-exercită un control asupra creşterii permeabilităţii membranelor;
•-induce senescenţa ţesuturilor;
•-are rol în transportul auxinei;
•-se produce în cantităţi mai mari în ţesuturile şi celulele rănite;
•-inhibă extensia celulară.

Acidul abscisic este implicat în procesele de latenţă a mugurilor şi seminţelor.

Poate fi utilizat pentru:
•-inducerea latenţei embrionilor somatici;
•-inducerea latenţei seminţelor artificiale în vederea păstrării lor o perioadă mai lungă;
•-inhibarea creşterii ţesuturilor şi organelor pe timpul stocării;
•-are rol antagonist cu auxinele şi giberelinele.
 Agenţii de solidificare
Substratul nutritiv utilizat la culturile in vitro este de obicei semisolid sau solid,
utilizarea mediului lichid fiind limitată doar la unele experienţe şi la cultura de suspensii celulare.
Cel mai utilizat agent de solidificare este agarul obţinut din alge şi are următoarele caracteristici:
•-formează cu apa un gel care se topeşte la 100°C şi se solidifică la 45°C, rămânând solid în
condiţii normale de cultură;
•-nu este toxic pentru plante şi nu este asimilat de plante;
•-nu conţine elemente minerale care să afecteze echilibrul dintre ioni în mediul de cultură, faţă
de reţeta de mediu folosită;
•-nu reacţionează cu constituenţii mediului.
Cantitatea de agar utilizat la litru de mediu diferă în funcţie de consistenţa dorită, între
0,5-1%.
Cu rol similar în solidificarea mediului de cultură se mai folosesc:
•-agaroza are un înalt grad de purificare şi se foloseşte mai ales pentru cultura protoplaştilor şi
în prepararea gelului pentru electroforeză;
•-acidul alginic se foloseşte pentru cultura protoplaştilor, suspensiilor celulare şi pentru
încapsularea embrionilor somatici în vederea obţinerii seminţelor artificiale;
•-phytagelul (Gelrite) produce un gel limpede. Se foloseşte în concentraţii de 1,5-2,0 % şi se
gelifica la 27-31°C. Se utilizează mai ales la speciile care necesită un pH mai acid, asigurând
solidificarea mediului şi în aceste condiţii.
 Alte substanţe utilizate

•Adenina are rol regulator în mediul de cultură, favorizează formarea mugurilor adventivi,
stimulează creşterea şi alungirea apexurilor cât şi rata de multiplicare. Se pare că are o
acţiune sinergică cu a citochininelor putând fi un precursor al acestora. De regulă se
foloseşte sub formă de sulfat de adenină, în doză de 40-80 mg/l.

•Compuşii fenolici stimulează creşterea calusului, favorizează înrădăcinarea, creşterea

lăstarilor şi a ratei de multiplicare. Are o acţiune sinergică cu a auxinelor, în special cu
AIA. După unii autori are rol în prevenirea degradării auxinelor. Dintre compuşii fenolici
cel mai utilizat este fluoroglucinolul şi procaina.

•Floroglucinolul este mult utilizat în multiplicarea meristematică a pomilor şi

arborilor, se găseşte în seva brută, mai ales la măr.

•Procaina are rol în multiplicarea şi respiraţia celulelor, stimulează creşterea biomasei

explantelor, a conţinutului în pigmenţi, stimulează germinaţia seminţelor şi creşterea
plantelor. Dozele utilizate sunt cuprinse între 0,1-10 mg/l.
• Substanţele antioxidante se utilizează pentru prevenirea brunificărilor explantelor şi a
mediului, în special, la speciile ce conţin substanţe fenolice în cantităţi mari, evitând
oxidarea lor. Se folosesc fie ca soluţii în care se ţine materialul vegetal înaintea
prelevării explantelor, fie se adaugă în mediul de cultură. Dintre substanţele
antioxidante, cele mai folosite sunt: acidul ascorbic (50-100 mg/l), acidul citric (150
mg/l), cisteina HCl (100 mg/l).

• Polivinilpirolidona (PVP) este un poliamid utilizat pentru absorbţia şi blocarea

fenolilor, împiedicând astfel oxidarea lor cu brunificarea şi moartea explantului. Se
foloseşte în concentraţii de 250-1000 mg/l.

• Cărbunele activ este un cărbune vegetal, bine mărunţit ce se adaugă mediului, cu

scopul de a absorbi şi bloca substanţele toxice din mediu. Poate avea acţiune şi
asupra fitohormonilor (auxine), blocându-le parţial efectul, are acţiune de inhibare a
formării calusului, stimulează embriogeneza, favorizează formarea rădăcinilor.

• Uneori se mai pot folosi şi alte substanţe cu rol de a îmbunătăţii, de a completa

compoziţia mediului, cum sunt: laptele de cocos, sucul de tomate, sucuri de fructe.
Prezenţa acestora în mediul de cultură este facultativă.