Lucrarea practica nr.

1
PREPARAREA MEDIILOR DE CULTUR UTILIZATE N PROCESELE
BIOTEHNOLOGICE
Mediul de cultur reprezint un complex de substane organice i anorganice ce constituie
suportul nutritiv sterilizat necesar cultivrii microorganismelor n afara niei lor ecologice naturale.
Un mediu de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
s fie nutritiv, s conin toate substanele necesare ntreinerii, dezvoltrii i multiplicrii
microorganismelor
s fie steril
s aib pH-ul optim microorganismului pe care dorim s-l cultivm
s satisfac aerofilia microorganismului cultivat
Mediile de cultur prezint o mare importan n procesele biotehnologice, ele influennd direct
reproductibilitatea i eficiena tehnologiei aplicate.
Ele permit studierea la nivel de laborator a particularitilor morfologice, fiziologice, genetice i
de biosintez a microorganismelor de cultivate.
Mediile de cultur utilizate n biotehnologie sunt diferite, avnd n compoziie elemente specifice
fiecarui tip de microorganism.
1. Clasificarea mediilor de cultur

Mediile de cultur pot fi clasificate n funcie de mai multe criterii.

a) Dup natura substanelor nutritive care intr n compoziia lor:
naturale
sintetice
b) Dup spectrul lor de activitate:
uzuale, pentru izolare i ntreinerea microorganismelor
selective, pentru selecia microorganismelor
c) Dup consisten:
lichide, pentru mbogirea culturilor microbiene, pentru studiul proprietilor biochimice i
modificrilor asupra substratul lichid
solide, pentru izolarea microorganismelor i pentru studiul caracterelor coloniilor
semisolide, favorizeaz migrarea microorganismelor n mediu pentru diferenierea ntre
specii
d) Dup tipul respirator al microorganismelor cultivate:
pentru microorganisme aerobe
pentru microorganisme anaerobe
e) Dup scopul i frecvena ntrebuinrii:
curente
de mbogire
de conservare
de identificare
de bioprocess
f) Dup de numrul ingredientelor pe care le conin i n funcie de scop:
minimale
complexe
g) n funcie de scara la care sunt folosite:
de laborator, sunt medii complete, relativ simple care permit obinerea unei biomase
microbiene corespunztoare
-1-

industriale, sunt medii ieftine, ce asigur necesitile nutriionale ale microorganismelor

cultivate i producerea compuilor dorii; utilizarea lor permite obinerea de produse finale la un pre
de cost convenabil
2. Compoziia mediilor de cultur
Mediile de cultur utilizate n biotehnologie conin n principal:
- surs de carbon i energie
- surs de azot
- oligoelemente
- microelemente
- factori de cretere (hormoni, steroizi)

Surse de carbon
n majoritatea proceselor biotehnologice, principala surs de carbon o constituie glucidele. n
mediile de cultur naturale, sursele de carbon sunt reprezentate de monoglucide (glucoz, fructoz) sau
diglucide (maltoz, zaharoz, lactoz), fie sub form de substane pure, fie furnizate de produse
agroalimentare ca melasa, siropul de glucoz, fina de porumb, zerul de lapte, deeuri celulozice.
Pentru obinerea unui mediu de cultur, sursa de carbon se prepar sub forma unei soluii de
concentraie cunoscut, astfel nct dup reunire cu celelalte componente ale mediului de cultur,
concentraia sursei de carbon n mediu s corespund valorii indicate n tehnologie.
Surse de azot
Sursa de azot necesar preparrii unui mediu de cultur este reprezentat fie de substane
organice sau anorganice simple ca amoniacul, ureea, sulfatul de amoniu, fosfatul de amoniu, fie de
produse naturale, ce conin aminoacizi sau proteine cum sunt fina de soia, peptona, extractul de carne,
extractul de porumb, extractul de drojdie.
Substana reprezentnd sursa de azot se cntrete la balana tehnic, se dizolv n cantitate
minim n ap, se sterilizeaz, iar dup rcire se amestec cu celelalte componente ale mediului de
cultur.
Oligoelemente i microelemente
Fosforul, potasiul, sodiul, sulful i magneziul sunt elemente de baz pentru microorganisme, fr
de care nu pot exista. Ele sunt furnizate din srurile minerale care se introduc n mediul de cultur.
Microelemente ca fier, cupru, cobalt, mangan, zinc i molibden sunt de asemenea eseniale, fiind
de regul prezente n mediu sub form de impuriti existente n alte ingrediente ale mediului.
Srurile minerale componente ale mediului de cultur se cntresc i se dizolv separat n ap,
apoi se reunesc i se sterilizeaz conform protocolului indicat n reeta de lucru.
3. Reguli generale de preparare a mediilor de cultur
n general, exist dou variante de preparare a mediilor de cultur:
a)
cntrirea i dizolvarea pe rnd a substanelor indicate n reet, ntr-o cantitate minim de ap,
completarea cu ap pn la volumul dorit i apoi sterilizarea mediului de cultur
b)
cntrirea, dizolvarea i sterilizarea separat a ingredientelor indicate n reeta de lucru, urmat
de reunirea lor n condiii aseptice
Cea de-a doua variant prezint avantajul c elimin eventuale interaciuni ce pot s apar ntre
diferite componente din mediu n timpul operaiei de sterilizare termic. De exemplu, n timpul
sterilizrii prin autoclavare a sursei de carbon, reprezentat de glucide i a sursei de azot, reprezentat de
aminoacizi, au loc reacii Maillard, cu formarea unor produi denumii melanoide care au efect
inhibitor asupra microorganismelor.
Pentru prepararea mediilor de cultur utilizate n biotehnologie, se parcurg urmtoarele operaii:
pregtirea i cntrirea ingredientelor
-2-

dizolvarea substanelor, de obicei la rece, ntr-o cantitate de ap distilat mai mic dect
volumul total de mediu preparat
verificarea i ajustarea pH-ului cu ajutorul unor soluii alcaline de NaOH sau NH 3, sau soluii
acide de HCl sau acid lactic, dup caz. Msurarea pH-ului se efectueaz cu ajutorul hrtiilor
indicatoare pH sau cu pH-metru
filtrarea, pe hrtie de filtru (daca este cazul)
completarea cu ap distilat la volumul final
topirea agarului, pentru mediile solide, prin fiebere 30 min sau autoclavare (0,5 atm)
repartizarea mediilor lichide, n recipiente de diverse capaciti, n funcie de necesiti
(eprubete, flacoane Erlenmeyer, sticle)
sterilizarea mediilor, de regul 15-20 min, la 1210C pentru mediile care nu conin glucide, iar
cele cu glucide 15-20 min, la 1150C, pentru a evita caramelizarea lor
controlul sterilitii mediilor, prin incubare timp de 24 ore, la temperatura la care urmez s
se incubeze mediul de cultur
adugarea eventualelor substanelor termosensibile sterilizate separat prin alte metode
stocarea mediilor, la 4-80C, nu mai mult de 4 sptmni
Exemple de medii de cultur
Bulion nutritiv
- Extract de carne
- Pepton
- Clorur de sodiu
- Ap distilat
pH=6-7, sterilizare 1200C, 20 min

0,3%
0,5%
0,5%
1000 ml

Geloz nutritiv
- Bulion nutritiv
1000 ml
- Agar
1,5-2,0%
pH=6-7, sterilizare 1200C, 20 min

Mediu YPG - solid

Glucoza
Peptona
Extract de drojdii
Agar
pH = 7

2%
2%
1%
2% ;

-3-

Lucrarea practica nr. 2

FERMENTAIA LACTIC
Prin fermentaie lactic se nelege procesul biologic prin care n urma degradrii unui mediu de
cultur rezult ca produs principal acidul lactic.
Fermentaia lactic are numeroase aplicaii practice n domenii diferite cum sunt:
industria alimentar, la conservarea crnii, petelui, legumelor, la prepararea erbetului i
dulceurilor, ca acidifiant pentru sucuri i siropuri, la prepararea laptelui acru, a iaurtului i a altor
produse lactate, la obinerea unor buturi din cereale i a unor specii de bere
zootehnie, la conservarea i nsilozarea nutreurilor
medicin, ca antiseptic
industria chimic, ca mordant la colorarea i imprimarea textilelor
n industria pielriei
Glucoza

Fructoza-difosfat
2 ATP

Acid 3-fosfogliceric
(2 molecule)

2 ADP

NADH2

2 ADP

Aldehida 3-fosfoglicerica
(2 molecule)
+

NAD

2 ATP

Piruvat

Lactat

Calea metabolic de formare a acidului lactic (glicoliza)

Principiul metodei
Materiile prime de natur amidonoas sau zaharoas din fermentatoare sunt nsmnate cu
culturi selecionate de Lactobacillus delbrueckii, pentru amidon, glucoz, melase, Lactobacillus
bulgaricus, pentru zer sau Lactobacillus plantarum, pentru leii bisulfitice. Dup 8-10 zile de incubare la
45-500C, 90-98% din materia prim este transformat n acid lactic. Pe msur ce se formeaz, acidul
lactic este neutralizat cu Ca(OH)2 astfel nct, produsul final obinut este lactatul de calciu. Acidul lactic
este separat din lactatul de calciu prin tratare cu H2SO4 formndu-se astfel CaSO4 care precipit i poate
fi separat prin filtrare. Soluia de acid lactic se concentreaz prin evaporare n vid pn la 50-80% din
volumul iniial, dup care se purific.
C6H12O6 2 CH3 CHOH COOH
glucoz
acid lactic (-hidroxipropionic)
2 CH3 CHOH COOH + CaCO3 (CH3 CHOH COO)2Ca + CO2 + H2O
acid lactic
lactat de calciu
(CH3 CHOH COO)2Ca + H2SO4 2 CH3 CHOH COOH + CaSO4
lactat de calciu
acid lactic
Prepararea inoculului
Bacteriile folosite pentru fermentaia lactic difer n funcie de materia prim utilizat i de
temperatura de incubare. Lactobacili folosii sunt rezisteni la aciditate i foarte activi n producerea
acidului lactic:
Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus casei
-4-

Lactobacillus delbrueckii
Lactobacillus leichamanni
Streptococcus lactis

Materiale necesare:
tulpini de bacterii lactice
ans, eprubete sterile, pipete sterile
ap distilat sau ser fiziologic sterile
bec de gaz
Mod de lucru:
Se introduc 5 ml de ap distilat sau ser fiziologic peste o cultur vegetativ de bacterii lactice,
se omogenizeaz bine. Suspensia obinut va fi folosit ca inocul pentru nsmnarea baloanelor cu
mediu de fermentaie
nainte de nsmnare se verific microscopic puritatea inoculului.
Fermentaia la flacoane
Procesul de fermentaie decurge cu rezultate bune ntr-un mediu cu materii amidonoase
zaharificate i cu aciditate mic (pH = 5,5).
Materii prime i materiale:
glucoz, (NH4)2HPO4, pepton, CaCO3
flacoane Erlenmeyer de 100 ml
pahare Berzelius de 500 ml
pipete sterile
cilindru gradat
hrtie de pH
termostat
Mod de lucru:
Se prepar 100 ml mediul de cultur cu urmtoarea compoziie:
glucoz
10%
(NH4)2HPO4
0,1%
pepton
0,5%
CaCO3
1%
pH = 5,5
Dup cntrire i dizolvare mediul se repartizez n flacoane Erlenmayer de 100 ml, cte 50
ml/flacon i se sterilizeaz la 1100C, 20 minute. Dup rcire, n fiecare flacon se adaug steril cte 2 ml
inocul de bacterii lactice pregtite anterior. Flacoanele se incubeaz 72 de ore la 420C.

1. Variaia parametrilor biochimici pe parcursul fermentaiei lactice

1.1. Determinarea consumului de glucoz pe parcursul fermentaiei lactice
Dezvoltarea microorganismelor este influenat de variaiile concentraiei de substrat. Din acest
motiv, n mediile de biosintez se determin i se urmrete pe tot parcursul bioprocesului, concentraia
sursei de carbon.
n cazul n care sursa de carbon a unui mediu de biosintez este constituit din glucide,
concentraia acestora se determin prin metoda Schoorl sau prin metoda Bertrand, bazate pe reacia
Fehling sau prin metoda enzimatic. Menionm c primele dou metode, nu ofer un grad de precizie
foarte ridicat, astfel nct, atunci cnd se dorete un control riguros al concentraiei sursei de carbon pe
parcursul bioprocesului, se aplic alte metode.
-5-

n probele colectate pe parcursul biosintezei, se determin concentraia glucozei, dup care se

traseaz curba de variaie a glucozei pe parcursul fermentaiei, nscriind pe abscis timpul de
fermentaie, iar pe ordonat concentraia n glucoz.
DETERMINAREA GLUCIDELOR REDUCTOARE PRIN METODA SCHOORL
Principiul metodei
n mediul alcalin, la cald, glucidele reductoare reduc complexul cuprotartric, format prin
amestecarea soluiilor Fehling I i Fehling II, pn la oxid cupros (Cu2O), precipitat rou crmiziu.
Gruparea aldehidic se oxideaz la carboxil.
Soluia de sulfat de cupru i sarea Seignette, n exces de hidroxid de sodiu, poart numele de
soluie Fehling. De obicei, aceasta se prepar n momentul ntrebuinrii prin amestecarea a dou soluii
de baz, n cantiti egale:
- soluia Fehling I, soluie cupric: CuSO4 x 5H2O
- soluia Fehling II, soluie bazic: NaOH + tartrat dublu de Na i K (sare Seignette)
CuSO4 + NaOH

Cu(OH)2 + Na2SO4

HO CH COOK

O CH COOK

Cu(OH)2 +

Cu

HO CH COONa
Tartrat de sodiu si potasiu
(Sare Seignette)

+ H 2O

O CH COONa
Complex cuprotartric
(Albastru inchis)

Complexul cuprotartric format oxideaz funciunea aldehidic a glucidului reductor (glucoza),

el reducndu-se la oxid cupros. Cantitatea de oxid cupros este proporional cu cantitatea de glucoz din
mediul de reacie.
O CH COOK
2 R CH O + 2 Cu
+ 2 H2O
Aldoza
O CH COONa
Complex cuprotartric
(albastru inchis)

HO CH COOK
R COOH + Cu2O + 2
Acid organic
HO CH COONa
Sare Seignette

n metoda Schoorl, restul de Cu(OH)2 care nu a fost redus se aciduleaz cu H 2SO4,

transformndu-se din nou n CuSO4 i I2 care se titreaz cu tiosulfat de sodiu.
Cu(OH)2+ H2SO4

CuSO4 + 2 H2O

2 CuSO4 + 2 KI
I2 + 2 Na2S2O3

K2SO4 + Cu2SO4 + I2
amidon

NaI + Na2S4O6

La titrare, se utilizeaz ca indicator o soluie de amidon care formeaz cu iodul un compus

colorat n albastru nchis. Dup titrare, soluia devine alb.
Reactivi necesari:
- soluie Fehling I
- soluie Fehling II
- soluie H2SO4 25%
- soluie KI 20%
- soluie amidon 1%
Mod de lucru:
-6-

Se preleveaz 10 ml din mediul de fermentaie i se filtreaz pe hrtie de filtru. Din proba filtrat
se iau n lucru dup cum urmeaz:
- n primele 48 de ore de fermentaie (glucoza variaz ntre 12-5%) 0,5 ml
- ntre 48-96 ore de fermentaie (glucoza variaz ntre 5-0%) 1 ml
ntr-un flacon Erlenmeyer de 500 ml, se pipeteaz 10 ml soluie Fehling I i 10 ml soluie
Fehling II, 20 ml ap distilat i 0,5 ml / 1 ml prob. Se nclzete la flacr potrivit, pe o sit de azbest,
astfel nct soluia s ajung la fierbere n aproximativ 3 minute, dup care se menine la fierbere 2
minute. Deasupra flaconului se aeaz o plnie se sticl pentru condensarea vaporilor de ap. Se rcete
cu ap curent, dup care adaug 10 ml soluie H2SO4 25% i 10 ml KI 20%.
Soluia obinut se titreaz sub agitare cu soluie de tiosulfat de sodiu 0,1N, pn cnd soluia
devine glbuie. Se adaug cteva picturi soluie amidon 1% i se continu titrarea pn ce culoarea
soluiei devine alb.
n paralel se realizeaz un martor folosind 20 ml ap distilat, 10 ml soluie Fehling I i 10 ml
soluie Fehling II. La martor nu este necesar fierberea. n continuare se lucreaz identic ca la prob.
Tabelul 6. Corespondena ntre concentraia glucidelor reductoare i volumul de tiosulfat
utilizat la titrare
ml Na2S2O3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

0,1ml Na2S2O3
0,31
0,31
0,32
0,32
0,32
0,32
0,32
0,32
0,34
0,34
0,33
0,34
0,34
0,35
0,35
0,35
0,35
0,35
0,36
0,36

Glucoz [mg]
3,2
6,3
9,4
12,6
15,9
19,2
22,4
25,6
28,9
32,3
35,7
39,0
42,4
45,8
49,3
52,8
56,3
58,9
63,3
66,9

Zahr invertit [mg]

3,2
6,4
9,7
13,0
16,4
19,8
23,2
26,5
29,9
33,4
36,8
40,3
43,8
47,3
50,8
54,3
58,0
61,8
65,5
69,4

Zaharoz [mg]
3,1
6,2
9,3
12,4
15,6
18,8
22,0
25,0
28,4
31,7
35,0
38,5
41,6
44,9
48,2
51,6
55,1
58,7
62,3
65,9

Calculul rezultatelor:
(N - n)* F = X ml Na2S2O3
unde: N = volumul de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit pentru titrarea martorului
n = volumul de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei
F = factorul soluiei de tiosulfat de sodiu 0,1N (0.9900)
Echivalena n susbstan reductoare din proba luat n lucru se gsete n tabelul 6.
1. Cnd se iau n lucru 0,5 ml:
Concentraie n glucoz (%) = mg glucoz (tabel) x 0,2
2. Cnd se iau n lucru 1 ml prob:
Concentraie n glucoz (%) = mg glucoz (tabel) x 0,1

-7-

n cazul n care sursa de carbon din mediu este reprezentat de un diglucid ca zaharoza, pentru
determinarea coninutului n glucide reductoare se aplic aceeai metod, cu deosebirea c se
efectuaez n prealabil o hidroliz a probei de analizat.
Pentru hidroliza diglucidelor se preleveaz din proba respectiv 5 ml, se dilueaz cu 20 ml ap
distilat, se adaug 5 ml HCl 10%. Amestecul se menine n ap fierbinte la 670C, timp de 5 minut i
apoi se rcete imediat n jet de ap rece. Se aduce amestecul la 50 ml cu ap distilat ntr-un balon
cotat. Din aceast soluie se iau cte 5 ml pentru dozarea glucozei n modul descris mai sus.

-8-

Lucrarea practica nr. 3

1.2. Variaia pH-ului pe parcursul biosintezei de acid lactic

Pe parcursul procesului de fermentaie pH-ul mediului variaz, determinarea lui fcndu-se cu
ajutorul hrtiei indicatoare de pH sau cu pH-metrul.
Pentru neutralizarea aciditii i pentru meninerea pH-ului n intervalul 5-5,5 (optim pentru
dezvoltarea bacteriilor lactice), pe msur ce se formeaz acid lactic, n mediul de fermentaie se adaug
CaCO3, Ca(OH)2 sau NH3. CaCO3 se poate aduga n mediu fie la nceputul fermentaiei, fie treptat, pe
parcurs.
n timpul fermentaiei se colecteaz probe la intervale regulate de timp. Dac pH-ul scade sub 4
(att fermentaiile cu bacterii, ct i cu drojdii), se fac corecii cu CaCO 3, soluii amoniacale (12,5%) sau
cu soluii de NaOH 40%.
n final, se traseaz curba de pH, nscriind pe abscis timpul de fermentaie, iar pe ordonat
valoarea pH-ului.

1.3. Determinarea concentraiei totale de acid lactic pe parcursul fermentaiei

Pe parcursul fermentaiei lactice exist permanent un amestec de acid lactic liber i lactat de
calciu. Pentru determinarea concentraiei n acid lactic total existent n mediul de cultur se determin
concentraia acidului lactic liber la care se adaug concentraia n acid lactic existent sub form de lactat
de calciu.
A. Determinarea acidului lactic liber n mediul de fermentaie
Principiul metodei
Acidul lactic formeaz n urma reaciei cu hidroxidul de sodiu, lactat de sodiu. Hidroxidul de
sodiu rmas neconsumat se determin titrimetric cu o soluie de acid clorhidric 0,1N, n prezen de
fenolftalein, ca indicator. Cantitatea de hidoxid de sodiu consumat n reacie este direct proporional
cu cantitatea de acid lactic din prob.
CH3 CHOH COOH + NaOH CH3 CHOH COONa + H2O
HCl + NaOH NaCl + H2O
Mod de lucru:
Proba de mediu se filtreaz pe hrtie band albastr. ntr-un flacon Erlenmeyer de 500 ml se
introduc 0,5 ml prob, 20 ml ap distilat i 50 ml NaOH 0,1N. Se astup flaconul cu dop rodat i se las
n repaus 30 de minute. Se titreaz n prezen de fenolftalein cu HCl 0,1N pn la decolorare. n
paralel, se face un martor, n aceleai condiii dar fr prob de acid lactic.
Calculul rezultatelor:
1ml NaOH 0,1N corespunde la 0,009008 g acid lactic

unde: Vm = volumul de HCl 0,1N folosit la titrarea martorului

Vp = volumul de HCl 0,1N folosit la titrarea probei
g = cantitatea de prob luat n lucru
f = facturul soluiei de HCl 0,1N
B. Determinarea lactatului de calciu n mediul de fermentaie
-9-

Principiul metodei
Metoda se bazeaz pe dozarea ionilor de calciu prin complexarea lor cu sarea disodic a acidului
etilendiaminotetraacetic (EDTA-Na2) sau complexon III, n prezen de murexid, ca indicator.
Complexul iniial, format ntre ionii de calciu i indicator, este colorat n roz-violet.
CH2 COO-Na+

+Na-OOC H2C

+ Ca2+

N CH2 CH2 N
O C H 2C
OH

CH2 C O
Complexon 3

OH

CH2 COO-Na+

+Na-OOC H2C
N CH2 CH2 N
O C H 2C
O

CH2 C O
O

Ca

Complexonat de calciu
Ionii de calciu rmai n mediul de reacie se titreaz cu soluie EDTA-Na2 formnd
complexonatul de calciu. n momentul apariiei n soluie a unui exces de complexon III, acesta va
reaciona cu complexul iniial, format ntre ionii de calciu i murexid, elibernd murexidul care
coloreaz soluia n albastru.
Reactivi necesari:
- soluie EDTA 0,05M (C10H14N2Na2O8 x 2H2O): 18,612 g EDTA disodic se dizolv n ap
distilat i se completeaz la 1000 ml
- soluie tampon amoniacal pH = 10: 5,4 g clorur de amoniu se dizolv n 50 ml ap distilat, se
adaug 35 ml NH3 25% i se completeaz cu ap distilat la 100 ml
- soluie sulfat de magneziu 0,05M (MgSO4 x 7H2O): se cntresc 1,23 g i se dizolv n 100 ml
ap distilat
- eriocrom negru T (C20H12N3O7SNa): 1 g eriocrom negru T se amestec cu 100 g NaCl
- proba de mediu: 20 ml lichid de fermentaie se trateaz un vrf de spatul de CaCO 3 i se las
30 de minute n repaus pentru neutralizare, apoi se filtreaz pe hrtie de filtru
Mod de lucru:
Din mediul filtrat se msoar un volum de lichid astfel nct cantitatea de lactat de calciu s fie
200 mg.
Pe parcursul fermentaiei, numrul de ml prob luai n lucru variaz astfel:
- 24 ore
n = 3 ml
- 72 ore
n = 2 ml
- 72-96 ore
n = 1 ml
ntr-un flacon Erlenmeyer de 500 ml (1) se introduc: n ml prob, 5 ml soluie tampon amoniacal
i 100 ml ap distilat.
ntr-un alt flacon Erlenmeyer de 500 ml (2) se introduc: 1 ml sulfat de magneziu 0,05M, un vrf
de spatul de eriocrom negru T. Se titreaz cu EDTA-Na2 0,05M pn la coloraie albastr.
Soluia obinut (denumit edetat de Na i Mg) din flaconul (2) se adaug n flaconul (1) ce
conine proba de titrat pentru observarea corect a virajului culorii (magneziul adugat intensific
culoarea fr s modifice rezultatul deoarece este titrat).
Soluia reunit se titreaz cu EDTA-Na2 0,05M pn la coloraia albastr, notndu-se volumul
total folosit.
- 10 -

Calculul rezultatelor:
Concentraia n lactat de calciu din mediul de fermentaie se calculeaz cu formula:
unde: A = volumul de EDTA cu care s-a
titrat
f = factorul soluiei de EDTA 0,05M
n = numrul de ml prob luai n lucru
Cantitatea de acid lactic existent n mediul de cultur sub form de lactat de calciu se calculeaz
conform urmtorului raionament:
218 g lactat de calciu 2 x 90 g acid lactic
b g lactat de calciu obinut Y g acid lactic
Y g acid lactic = 2 x 90 x b / 218
Concentraia de acid lactic sub form de lactat calculat pentru 1 ml prob luat n lucru se
calculeaz astfel:
C acid lactic sub form de lactat (%) = Y x 100

- 11 -

Lucrarea practica nr. 4

PRELUCRAREA MEDIULUI DE FERMENTAIE LACTICA
La sfritul procesului de fermentaie mediul se trateaz cu hidroxid de calciu, astfel nct,
produsul final s se gseasc n ntregime sub form de lactat de calciu. Suspensia obinut se filtreaz,
iar lichidul se trateaz cu acid sulfuric pn la reacie acid pentru descompunerea lactatului de calciu n
acid lactic i precipitat de sulfat de calciu. Dup filtrarea sulfatului de calciu, soluia diluat de acid
lactic se concentreaz.
Concentrarea se face prin evaporare n vid, la presiune sczut, pn la 1/5 din volumul iniial,
cnd concentraia de acid lactic este 50-80%. Produsul obinut, acidul lactic brut, denumit i acid lactic
uz tehnic, poate fi folosit fie ca atare n industrie, fie purificat.
Pentru purificarea acidului lactic se folosesc mai multe metode:
recristalizarea lactatului de calciu i tratarea ulterioar a acestuia cu acid sulfuric pentru
obinerea acidului lactic liber;
transformarea lactatului de calciu n lactat de Zn care cristalizeaz mai uor dect celelate
sruri ale acidului lactic. Lactatul de zinc se purific prin cristalizri repetate, apoi se trateaz cu
hidrogen sulfurat pentru precipitarea sulfurii de zinc. Soluia de acidul lactic se decoloreaz cu
crbune activ, se filtreaz i se concentreaz n vid;
esterificarea acidului lactic cu alcool metilic. Mediul se trateaz cu acid sulfuric i se menine
4-5 ore la cald. Precipitatul se ndeprteaz prin filtrare, iar excesul de alcool metilic prin distilare;
oxidarea acidului lactic cu diferii ageni oxidani (hipoclorit de sodiu, hipoclorit de calciu,
permanganat de potasiu, acid azotic, ap oxigenat, clor, ozon);
extragerea cu solveni (eter izopropilic);
trecerea unui curent de vapori de alcool metilic prin soluiile apoase de acid lactic; lactatul de
metil d natere prin hidroliz i distilare la acid lactic pur.
Mod de lucru:
Mediul de fermentaie obinut n laborator (100 ml), se trateaz cu 5 ml H 2SO4 concentrat, se las
timp de 30 minute pentru descompunere, dup care se filtreaz pe hrtie band albastr pentru
ndeprtarea sulfatul de calciu. Lichidul perfect limpede, coninnd aproximativ 10% acid lactic, se
concentreaz sub vid pn la 1/5 din volumul iniial. n final, se determin concentraia acidului lactic
obinut.
CALCULUL RANDAMENTULUI DE OBINERE A ACIDULUI LACTIC
Caracterizarea bioprocesului de obinere a acidului lactic prin fermentaie se realizeaz prin
calcularea mai multor randamente.
Pentru evidenierea gradului de utilizare a glucozei la sfritul fermentaiei, att pentru
dezvoltarea microorganismelor ct i pentru biosintez, se calculeaz randamentul de consum al
glucozei i randamentul de transformare a glucozei n acid lactic.
Pentru evaluarea bioprocesului la sfritul biosintezei se calculeaz randamentul de obinere a
acidului lactic.
a) Randamentul de consum al glucozei
Prin calculul acestui randament se obin informaii referitoare la proporia total n care a fost
consumat substratul pentru dezvoltarea microorganismelor i pentru producerea de acid lactic. Acesta nu
ofer ns informaii referitoare la gradul de transformare a glucozei n acid lactic.
cantitatea de glucoz consumat
=
x 100
- 12 -

cantitatea de glucoz iniial

b) Randamentul de transformare a glucozei n acid lactic
Acest calcul ofer informaii cu privire la specificitatea microorganismului productor i
capacitatea acestuia de a produce acid lactic i nu ali produi.
cantitatea de glucoz transformat n acid lactic
=

x 100
cantitatea de glucoz consumat

c) Randamentul de obinere a acidului lactic

Acesta intereseaz din punct de vedere tehnologic, ntruct ofer informaii globale referitoare la
desfurarea bioprocesului.
cantitatea de acid lactic obinut practic
=

x 100
cantitatea de acid lactic teoretic

Cantitatea de acid lactic obinut practic, se calculeaz n funcie de volumul final al mediului de
fermentaie.
Cantitatea teoretic de acid lactic se deduce din stoechiometria reaciei chimice de transformare a
glucozei, innd cont de cantitatea introdus la nceputul procesului de fermentaie.
Pentru o mai bun nelegere a randamentelor prezentate mai sus, se consider urmtorul
exemplu:
Exemplu:
Se consider urmtoarele concentraii i volume iniiale i finale:
volum iniial de fermentaie = 95 ml
volum final de fermentaie = 80 ml
concentraie iniial de glucoz = 9,0% (g/v)
concentraie de acid lactic = 3,5% (g/v)
concentraie de lactat de calciu = 4% (g/v)
concentraie final de glucoz = 0,3% (g/v)
S se calculeze randamentele de consum al glucozei, de transformare a glucozei n acid lactic i
cel de obinere a acidului lactic.
a) Randamentul de consum al glucozei
Cantitatea de glucoz iniial introdus n mediul de fermentaie se calculeaz astfel:
9 x 95 / 100 = 8,55 g glucoz iniial
cantitatea de glucoz consumat = cantitatea iniial de glucoz cantitatea final de glucoz
Cantitatea de glucoz rmas n mediu la sfritul fermentaie se calculeaz astfel:
0,3 x 80 / 100 = 0,24 g glucoz final
Cantitatea de glucoz consumat = 8,55 0,24 = 8,31 g glucoz comsumat
c = 8,31 / 8,55 x 100 = 97%
b) Randamentul de transformare a glucozei n acid lactic
- 13 -

Cantitatea de glucoz transformat n acid lactic se obine din calculul stoechiometric al reaciei
globale:
C6H12O6 2 CH3 CHOH COOH
glucoz
acid lactic
180
90
cantitatea total de
cantitatea de acid
cantitatea de acid lactic
=
+
acid lactic
lactic liber
din lactatul de calciu
Cantitatea de acid lactic aflat sub form de lactat de calciu se calculeaz din reacia:
2 CH3 CHOH COOH + CaCO3 (CH3 CHOH COO)2Ca + CO2 + H2O
acid lactic
lactat de calciu
90
218
Cantitatea de acid lactic aflat ca lactat de calciu se calculeaz astfel:
4 x 80 / 100 = 3,2 g lactat de calciu
218 g lactat de calciu 180 g acid lactic
3,2 g lactat de calciu .............. x g acid lactic
x = 3,2 x 180 / 218 = 2,64 g acid lactic din lactat de calciu
Cantitatea de acid lactic liber se calculeaz astfel:
3,5 x 80 / 100 = 2,8 g acid lactic liber
Cantitatea total de acid lactic = 2,8 + 2,64 = 5,44 g
Cantitatea de glucoz din care provine acidul lactic se calculeaz astfel:
180 g glucoz ..... 2 x 90 g acid lactic
y g glucoz ..... 5,44 g acid lactic
y = 180 x 5,44 / 180 = 5,44 g glucoz
tr = 5,44 / 8,3 x 100 = 65,5%
c) Randamentului de obinere a acidului lactic
Cantitatea de acid lactic teoretic ce ar fi trebuit obinut:
180 g glucoz ...... 2 x 90 g acid lactic
8,55 g glucoz ..... z g acid lactic
y = 180 x 8,55 / 180 = 8,55 g acid lactic teoretic
= 5,44 / 8,55 x 100 = 63%

- 14 -

Lucrarea practica nr. 5

FERMENTAIA ALCOOLIC
Fermentaia alcoolic are numeroase aplicaii practice n industrie:
fabricarea spirtului, a buturilor spirtoase;
fabricarea vinului, a berii;
fabricarea sucurilor de fructe;
n panificaie.
Etanolul se poate obine prin metode chimice sau prin fermentaia complet de ctre unele drojdii
a diferitelor substane hidrocarbonate, umat de distilarea i purificarea alcoolic.
Drojdiile au un echipament enzimatic foarte bogat, graie cruia, prin procese anaerobe de
fermentaie ii pot procura energia necesar reaciior metabolice vitale.
C6H12O6 2 CH3 CH2OH + 2 CO2
n realitate, mersul reaciei este mult mai complicat, formndu-se i numeroi compui secundari
de fermentaie.
nceputul fermentaiei corespunde perioadei de multiplicare a drojdiei n care consumul sursei de
carbon este de 2%, iar degajarea de dioxid de carbon este slab (fermentaie redus). Dup 20 de ore,
fermentaia este nsoit de degajare intens de dioxid de carbon, concentraia sursei de carbon scznd
de la 85%, la 15% (fermentaia principal). Urmeaz o perioad linitit, cu degajare slab de dioxid de
carbon, concentraia sursei de carbon ajungnd la 2% (fermentaia secundar). Formarea etanolului se
observ dup mai multe zile, n funcie de temperatur de incubare.
Prin procesul de fermentaie alcoolic, rezult o cantitate redus de energie, fapt confirmat i de
randamentul energetic sczut, realizat ntr-o unitate de timp. Pentru a obine aceeai cantitate de energie
rezultat prin respiraia unei molecule de glucoz, n fermentaia alcoolic sunt necesare 12 molecule de
glucoz. ntr-un proces mixt de descompunere a glucidelor pe cale anaerob i aerob, 98% din aceast
cantitate se folosete pentru fermentaie i numai 2% pentru respiraie.
Bilanul energetico-chimic al procesului de fermentaie alcoolic este:
C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 18 kcal
n biotehnologie se realizeaz o fermentaie dirijat cu tulpini selecionate, care dureaz 20-24 de
ore, aa cum se exemplific n continuare.
Materii prime i materiale necesare:
cultura stoc de Saccharomyces cerevisiae
eprubete sterile
bec de gaz
ans
mediu lichid de dezvoltare
Prepararea inoculului
Fermentaia alcolic poate fi produs de o serie de microorganisme:
Saccharomyces cerevisiae
Bacillus macerans
Sarcina ventriculi
Zymomonas mobilis
Erwinia amylovora
Thermoanaerobacter ethanolicus
-

- 15 -

n comparaie cu fermentaia alcoolic produs de drojdii, obinerea etanolului pe cale bacterian

este un proces mai avantajos deoarece bacteriile cresc mai rapid i au o rat de productivitate mult mai
mare.
Mod de lucru:
Se preleveaz cu ansa o cultur stoc de Saccharomyces cerevisiae i se colecteaz ntr-o eprubet
steril cu mediu lichid. Se incubeaz static, 24 ore, la 28 0C. Se obine astfel o suspensie omogen de
drojdii ce va constitui inoculul pentru fermentaia la nivel de laborator (flacoane).
Fermentaia la baloane
Se prepar 1.000 ml de mediu pentru multiplicarea drojdiilor cu urmtoarea compoziie:
Glucoz
15%
Extract
de
drojdie
0,4%
Pepton
0,4%
(NH4)2SO4
0,4%
KH2PO4
0,2%
Materii prime i materiale necesare:
flacoane Erlenmayer de 500 ml sterile
balan tehnic
spatule, pahare Berzelius (mensur)
cilindru gradat
baghet de sticl
pH-box
bec de gaz
autoclav
Mod de lucru:
Se cntresc i se dizolv pe rnd substanele componente ale mediului de cultur, se corecteaz
pH-ul la valoarea 4-5, se repartizeaz cte 250 ml n fiecare flacon Erlenmayer i se sterilizeaz prin
autoclavare la 1150C, 15 minute.
Fiecare flacon este nsmnat cu 10% inocul i se termostateaz la 280C, static, timp de 24-48 h.
Produsul rezultat conine n principal alcool etilic, n concentraie de 5-7% dar i cantiti mici de
produi secundari, ca acetaldehida, glicerina, acizi organici volatili i alcooli superiori.
1. Variaia parametrilor biochimici pe parcursul fermentaiei alcoolice
1.1. Determinarea variaiei sursei de carbon pe parcursul fermentaiei
Cnd se foloseete glucoza n mediul de fermentaie, determinarea consumului acesteia se face
prin metoda Schoorl, fr hidroliz prealabil. n general, n mediile de cultur pentru drojdii se
utilizeaz glucide fermentescibile ale cror concentraii variaz ntre 2 i 20%. Gradul de asimilare al
glucidelor depinde de concentraia lor n mediu, de cantitatea de biomas, de temperatur i pH.
Cantitatea de glucoz consumat se determin recoltnd probe din 4 n 4 ore.
6.3.1.2. Determinarea coninutului n alcool etilic n mediul de fermentaie
Mod de lucru:
Se msoar ntr-un cilindru gradat un litru de mediu de fermentaie, se introduce ntr-un balon de
2 litri, dup care se distil la 2/3 din cantitatea introdus, urmrindu-se ca temperatura n corpul coloanei
s creasc spre 1000C. Se msoar volumul distilat i se determin coninutul n alcool cu un
alcoolmetrul. Cantitatea de alcool se exprim procentual, cu ajutorul urmtoarei formule:
- 16 -

% alcool = (V x C) / 100 ( v/v)

unde: V = volumul de alcool distilat
C = concentraia de alcool determinat cu alcoolmetrul
Pentru o mai mare precizie, fraciunea distilat care conine acizi distilai se neutralizeaz cu
NaOH n prezen de fenolftalein i se redistil. Raportarea cantitii de alcool se face ca n primul caz.
2. Prelucrarea mediului de fermentaie alcoolic
n urma fermentaiei alcoolice se obine un produs ce conine alcool etilic i diferii produi
secundari. Alcoolul etilic se recupereaz din mediul de fermentaie prin distilare. n urma distilrii
simple se obine o soluie alcoolic avnd un coninut n alcool de 27-32%.
3. Calculul randamentului n alcool etilic
Randamentul de obinere a alcoolului etilic obinut la sfritul procesului de fermentaie, se
calculeaz astfel:
cantitatea de alcool etilic obinut practic
alcool =
x 100
cantitatea de alcool etilic obinut teoretic
Cantitatea de alcool etilic teoretic se deduce din stoechiometria reaciei chimice, innd seama de
cantitatea de glucoz pur iniial supus procesului de fermentaie:
C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2
180
46

(1)

Exemplu:
Se consider urmtoarele concentraii i volume iniiale i finale:
concentraie iniial de glucoz = 9,7% (g/v)
volum iniial mediu de fermentaie = 500 ml
concentraie final de alcool etilic = 5,2% (v/v)
volum final mediu de fermentaie = 495 ml
Cantitatea iniial de glucoz:
9,7 x 500 / 100 = 48,5 g glucoz iniial
Cantitatea de alcool etilic teoretic se calculeaz din ecuaia (1) astfel:
180 g glucoz . 92 g alcool etilic
48,5 g glucoz . X g alcool etilic
X = 92 x 48,5 / 180 = 24,7 g alcool etilic teoretic
Volumul de alcool etilic obinut practic:
5,2 x 495 / 100 = 25,74 ml alcool etilic practic
Masa alcoolului etilic din mediul de fermentaie se calculeaz cu formula:
m=xv
unde: m = masa (g)
= densitatea (g/ml); pentru alcoolul etilic 100% = 0,79 g/ml
v = volumul (ml)
Cantitatea de alcool etilic practic:
- 17 -

m alcool = 0,79 x 25,74 = 20,33 g alcool etilic practic

= 20,33 / 24,7 x 100 = 82,32%

- 18 -

Lucrarea practica nr. 6

OBINEREA ACIDULUI GLUCONIC
Acidul gluconic este un acid slab, biodegradabil (98% n 48 ore), nu este coroziv, volatil sau
toxic.
n natur, acidul gluconic se gsete n fructe, miere, ceai de kombucha si vin.
Se poate obine prin oxidarea glucozei sub aciunea glucoz-oxidazei, produs de fungi
(Aspergillus niger) sau a glucoz-dehidrogenazei, produs de bacterii (Gluconobacter). Fermentaia cu
Aspergillus niger dateaz de cteva decenii i este cea mai rentabil metod de obinerea acidului
gluconic.
Acidul gluconic i derivaii lui i gsesc aplicaii n numeroase industrii: alimentar,
farmaceutic, textil, a detergenilor i cea a produselor de igien.
n principal, este folosit ca aditiv alimentar (E574) pentru reglarea aciditatii produselor. El
imprim un gust proaspt, acidulat multor produse alimentare ca vinul, sucurile de fructe, etc.
Gluconatul de sodiu, datorit proprietii de chelatare a metalelor grele, superioar EDTA-ului,
i gsete aplicaii n domenii din cele mai variate: n metalugie, pentru prevenirea formrii i curarea
ruginii, n industria textil, pentru prevenirea formrii depunerilor de fier, n industria detergenilor,
pentru ndeprtarea depozitelor calcaroase de pe metale i alte suprafee. De asemenea, mai poate fi
folosit ca aditiv la cimentului reglnd procesul de maturare, crescndu-i duritatea, rezistena la ap, la
nghe i la crpare.
Gluconatul de calciu este folosit n terapia deficienelor de calciu, n nutriia animalelor, iar pe
cale injectabil, pentru tratarea malariei.
Gluconolactona se folosete ca acidifiant slab n panificaie, n procesarea crnii, n coagularea
proteinelor din soia, n industria produselor lactate, pentru creterea stabilitii la fierbere a laptelui i
pentru obinerea unor tipuri de brnzeturi.
Microorganismele utilizate frecvent pentru obinerea acidului gluconic sunt:
Fungi: - Aspergillus niger
- Penicillium chrysogenum
Bacterii: - Acetobacter aceti
- Acetobacter gluconicum
- Pseudomonas fluorescens
- Pseudomonas ovalis
Pentru obinerea acidului gluconic prin fermentaie se folosete ca materie prim glucoza. Ea este
oxidat incomplet sub aciunea glucozo-oxidazei elaborat de microorganismele din cultur.
Metabolizarea glucozei se realizeaz n culturi submerse aerate, sub presiune, randamente mari de
producie (90-95%) putnd fi obinute cu condiia neutralizrii acidului gluconic din mediu cu carbonat
de calciu sau hidroxid de sodiu. n aceste condiii, produsul final se obine sub form de gluconat de Ca
sau de Na, n funcie de natura substanei folosit pentru neutralizare.
Reacia global devine:
CH2OH (CHOH) 4 CHO
CH2OH CH (CHOH) 3 C O
glucoza
O
FAD
-D-gluconolactona
FADH2
glucozoxidaza + O2
H 2O
H2O2 + FAD
catalaza

CH2OH (CHOH) 4 COOH

H2O + 1/2 O2

- 19 -

acid D-gluconic

CH2OH (CHOH) 4 CHO + 1/2 O2

glucoza

2 CH2OH (CHOH) 4 COOH + CaCO3

acid gluconic

CH2OH (CHOH) 4 COOH

acid gluconic

[CH2OH (CHOH) 4 COO]2Ca + CO2 + H2O

gluconat de calciu

Prepararea inoculului de Aspergillus niger

Pentru nsmnarea mediului de fermentaie la nivel de laborator se folosete o suspensie de
microorganisme, dezvoltat pe mediu solid.
Mediul solid pentru obinerea conservului vegetativ are urmtoarea compoziie: must de mal
2%, agar 2%, pH=6,4. Mediul astfel preparat se repartizeaz n eprubete, se sterilizeaz la 110 0C, timp
de 30 de minute, se rcete pe o suprafa nclinat i se nsmneaz cu o suspensie de spori provenit
dintr-o cultur pur de Aspergillus niger. Incubarea se face la termostat, la 28-30 0C, timp de 7 zile,
pentru sporulare.
Fermentaia la baloane agitate
n scopul efecturii unei fermentaii gluconice n laborator, se pregtesc 300 ml mediu de cultur
cu urmtoarea compoziie:
glucoz (dextroz)
20%
carbonat de calciu
1%
azotat de sodiu
0,05%
sulfat de magneziu 0,0125%
fosfat monopotasic
0,01%
Soluia de glucoz mpreun cu srurile (fr carbonatul de calciu) se repartizeaz n 6 baloane
Erlenmayer de 100 ml, cte 50 ml/balon i apoi se sterilizeaz la 120 0C, timp de 30 de minute. Dup
sterilizarea i rcirea mediului, se adaug cte 0,5 g carbonat de calciu/balon, sterilizat separat n etuv
la 1800C, 2 ore.
Fiecare balon se nsmneaz cu 0,5% suspensie de spori preparat astfel: 5 ml ap distilat
steril se adaug peste cultura de Aspergillus niger dezvoltat pe solid.
Cultura se dezvolt la 28-300C sub agitare continua la 220 rpm, timp de 48 de ore. Dup aceast
perioad cultura trebuie s s fie pur, s prezinte un miceliu crenelar, cu hife distincte la microscop,
mpslite, dar nu aglomerate, iar pH-ul mediului trebuie s fie de aproximativ 6,0.
1. Determinarea coninutului de acid gluconic n mediul de fermentaie
Acidului gluconic se determin de fapt ca gluconat de calciu, aceasta fiind forma regsit la
sfritul procesului de fermentaie, dup care se calculeaz concentraia corespunztoare n acid
gluconic.
Principiul metodei
Metoda se bazeaz pe dozarea ionilor de calciu prin complexare cu sarea disodic a acidului
etilendiaminotetraacetic.
Mod de lucru:
Se filtreaz 5 ml mediu de fermentaie pe hrtie de filtru (band albastr).
Din filtrat se msoar un volum de lichid astfel nct cantitatea de lactat de calciu s fie 300 mg.
ntr-un flacon Erlenmeyer de 500 ml (1) se introduc: 1 ml prob, 5 ml soluie tampon amoniacal
i 100 ml ap distilat.
ntr-un alt flacon Erlenmeyer de 500 ml (2) se introduc: 1 ml sulfat de magneziu 0,05M, un vrf
de spatul de eriocrom negru T. Se titreaz cu EDTA-Na2 0,05M pn la coloraie albastr.

- 20 -

Soluia obinut (denumit edetat de Na i Mg) din flaconul (2) se adaug n flaconul (1) ce
conine proba de titrat pentru observarea corect a virajului culorii (magneziul adugat intensific
culoarea fr s modifice rezultatul deoarece este titrat).
Soluia reunit se titreaz cu EDTA-Na2 0,05M pn la coloraia albastr, notndu-se volumul
total folosit.
Calculul rezultatelor:
Concentraia n gluconat de calciu din mediul de fermentaie se calculeaz cu formula:

unde: A = volumul de EDTA cu care s-a titrat

f = factorul soluiei de EDTA 0,05M
n = numrul de ml prob luai n lucru
Cantitatea de acid gluconic existent n mediul de cultur sub form de gluconat de calciu se
calculeaz conform urmtorului raionament:
430 g gluconat de calciu 2 x 196 g acid gluconic
Y g gluconat de calciu obinut Z g acid gluconic
Z g acid gluconic = 2 x 196 x Y / 430
Concentraia de acid gluconic sub form de gluconat (%) = Z x 100
2. Prelucrarea mediului de fermentaie
Mediul de biosintez obinut n finalul fermentaiei gluconice se prelucreaz pentru izolarea
acidului gluconic format pe parcursul bioprocesului i calculul randamentului.
n scopul neutralizrii complete a acidului gluconic rezultat n urma oxidrii glucozei, se
procedeaz la tratarea mediului de fermentaie cu hidroxid de calciu (carbonat de calciu carbonat de
calciu sau carbonat de calciu.). Acesta se adaug cu o spatul, n proporie de 10% (10 g carbonat de
calciu sau hidroxid de calciu la 100 ml mediu). Pentru definitivarea reaciei de neutralizare se nclzete
amestecul la 60-700C, timp de 30 de minute, sub agitare continu. Dup neutralizare, amestecul de
reacie se filtreaz fierbinte, pe filtru rmnnd biomasa i excesul de carbonat de calciu rmas
nereacionat.
Soluia perfect limpede obinut dup filtrare se rcete pe baie de ghea, sub agitare continu,
timp de 1-2 ore pentru cristalizarea gluconatul de calciu din soluie. Suspensia obinut se filtreaz n
vederea separrii precipitatului. Turta de gluconat de calciu se esoreaz corespunztor, se usuc n etuv,
n curent de aer cald la 40-500C, timp de 4-5 ore, se cntrete i se calculeaz randamentul de obinere.

- 21 -

Lucrarea practica nr. 7

BIOREACTOARE
1. Bioreactorul discontinuu de tip Braun
1.1. Descrierea i operarea bioreactorului n sistem batch
Pentru obinerea produselor biotehnologice, la nivel micropilot se utilizeaz diverse tipuri de
bioreactoare, n funcie de tipul microorganismului utilizat, de natura produselor obinute i de
productivitatea urmrit.
Bioreactoarele, n funcie de modul de operare pot fi conduse n regim discontinuu, semicontinuu
sau continuu.
Bioreactorul BRAUN este un bioreactor cu funcionare discontinu (sistem batch), caracterizat
prin operarea n arje, ceea ce presupune ncrcarea reactanilor, iar dup un interval de timp determinat,
descrcarea produilor de reacie.
Acesta reprezint o construcie modular format din corpul bioreactorului i trei module de
automatizare (figura 5).
Corpul bioreactorului este alctuit din dou tronsoane: unul din sticl, reprezentat de vasul din
sticl i unul metalic reprezentat de capacul bioreactorului. Vasul din sticl are forma cilindric i o
capacitate total de 5 l (capacitate util de 4 l) este prevazut la partea superioar cu un capac metalic
format dintr-un disc solid de inox fixat de vasul din sticl cu ajutorul unui inel metalic.
Pe capac se gsesc montate dou buoane, unul pentru electrodul de pH i unul pentru cel de
oxigen si 6 racorduri: dou pentru introducerea inoculului i cte unul pentru evacuarea aerului, pentru
prelevarea probelor, pentru traductorul de temperatur i pentru intrarea aerului.

Bioreactorul BRAUN

Vasul de biosintez este de asemenea prevzut cu un condensator metalic, vertical, montat pe

capac, avnd rolul de a condensa vaporii de ap eliberai n timpul procesului de biosintez din mediul
de cultur sau care sunt antrenai de aerul ce iese permanent din bioreactor (n cazul fermentaiilor
aerobe). Picturile de ap sunt returnate n mediul de fermentaie evitndu-se astfel o eventual
concentrare a acestuia n timpul biosintezei. Condensatorul este prevzut cu o manta de nclzire-rcire,
utilizat numai pentru rcire, fiind cuplat permanent la o surs de ap rece.
Bioreactorul este prevazut cu un plonjon, dispozitiv cu ajutorul cruia se recolteaz probe din
mediul de fermentaie (prin creterea presiunii n vasul de biosintez). Plonjonul const ntr-o eav de
inox care intr prin capacul bioreactorului i ajunge pn la fundul vasului. Pentru o mai bun colectare
a probelor, plonjonul este curbat la partea inferioar.
Capacul bioreactorului mai este prevazut cu 4 racorduri de diametru mai mic, utilizate pentru
diverse adaosuri, cum ar fi: soluie acid sau bazic bazic, antispumant, componente de mediu.
Adaosurile se efectueaz cu ajutorul a trei pompe peristaltice, anexe bioreactorului i grupate
ntr-un modul de sine-stttor. Aceste pompe funcioneaz manual sau automat, fiind prevazute cu tuburi
speciale de silicon i vase de adaos sterilizabile. Principiul de funcionare al pompelor peristaltice se
bazeaz pe o micare de contracie i una de relaxare a tubului de silicon, ceea ce creeaz o diferen de
presiune care asigur deplasarea lichidului din vasul de adaos n bioreactor, prin tubul de silicon.
- 22 -

Bioreactorul este prevazut cu un rotametru, pentru masurarea debitului de aer furnizat de

compresor. Intre compresor i rotametru se interpune un filtru de aer prevzut cu vat de sticl
(prefiltrare aer); ntre rotametru i vasul de cultur este fixat un filtru Millipore sterilizabil, cu diametrul
porilor mai mic de 0,2 mm, care asigur sterilizarea aerului.
Pe capacul bioreactorului este montat i sistemul de agitare, format dinntr-un motor, un cuplaj
metalic de fixare i axul agitatorului. Turaia agitatorului variaz ntre 0-1200 rpm, la o capacitate a
vasului de 5 l. Cnd vasul de biosintez este nlocuit cu unul similar, dar de capacitate de 10 l, turaia
maxim este de 600 rpm.
1.2. Sistemul de automatizare i control al bioreactorului
a) Modulul de automatizare i control al agitrii
Bioprocesul poate fi condus la o turaie constant, care se fixeaz la nceput, potrivit
recomandrilor biotehnologului sau la o turaie variabil (n anumite perioade de timp). Turaia
agitatorului pe parcursul biosintezei poate fi programat pe panoul modulului.
b) Modulul de automatizare i control al parametrilor de proces: temperatur, pH, agitare,
concentraie de O2 i antispumant
Pe panoul acestui modul se programeaz parametrii de bioproces, urmnd ca acetia s fie
meninui la valoarea introdus iniial n memoria calculatorului.
c) Modulul de control i automatizare al pompelor peristaltice (pentru adaosul soluiilor
necesare coreciei pH-ului i soluii de nutrieni).
Acest modul cuprinde att cele trei pompe peristaltice ct i sistemul de automatizare aferent.
Cnd se intenioneaz adugarea automat a unei soluii, programarea pompei se realizeaz pe modulul
de automatizare i control. De exemplu, dac se dorete meninerea pH-ului la o anumit valoare, cnd
acesta se modific fa de valoarea prescris, pompa peristaltic se declaneaz automat adugnd n
mediu soluie acid sau bazic pentru corecie.
Operaiile necesare conectrii aparatului sunt urmatoarele:
pregtirea aparatului
calibrarea pompelor
dup autoclavarea vasului de cultur, conectarea electrozilor
reglarea parametrilor de masur i control
Caractensticile tehnice ale bioreactorului sunt urmatoarele:
capacitate total: 5 1
capacitate util: 4 1
debit aer furnizat: 0-240 1/h
temperatura de lucru: 20-600C
suprapresiune: 0,2-0,5 atm
presiune de sterilizare: 2 bar
temperatura de sterilizare: 1200C
turaie agitator: 0-1200 rpm
1.3. Pregatirea bioreactorului n vederea efecturii unei arje de biosintez
nainte de efectuarea unei arje de biosintez se procedeaz la sterilizarea bioreactorului i a
anexelor acestuia dup procedeul descris n continuare. Vasul bioreactorului se demonteaz i se
sterilizeaz gol n autoclav la 1200C, timp de 20 minute (o dat cu bioreactorul se sterilizeaz i filtrul de
aer). Dup rcire, vasul bioreactorului se umple cu mediu de cultur i se sterilizeaz in nou prin
autoclavare.
Dup rcire la 20-400C, corpul bioreactorului se aeaz pe masa de laborator asigurand un
montaj corespunzator unei bune funcionari, se fixeaz motorul i apoi se introduc electrozii de pH i de
oxigen.
- 23 -

Se inoculeaz mediul cu microorganismul specific, n conditii sterile i se fixeaz parametrii de

lucru (temperatur, debit de aer, pH, concentraie de oxigen).
La ncheierea procesului, se va decupla instalaia i se va proceda la descrcarea, splarea i
igienizarea utilajului.
Dup operaiile de splare i igienizare, vasul se va terge cu tifon uscat, apoi se vor cura toate
racordurile i se vor unge cu vaselin siliconic numai suprafeele de etanare, pregtind astfel vasul
pentru un nou experiment.
1.4. Controlul pH-ului n bioreactor
1.4.1. Noiuni generale
ntr-o soluie apoas, concentraia absolut a ionilor de hidrogen are valori mici i este incomod
de intrebuinat n practic. n anul 1909, S. Sorensen, a propus s se foloseasc pentru calculul
concentraiei ionior de hidrogen dintr-un mediu lichid, logaritmul zecimal cu semn schimbat numit
exponent de hidrogen sau pH. Astfel, pH-ul se poate defini:
pH = lg [H3O+] = lg (1 / [H3O+])
n mod analog se definete i exponentul ionilor de hidroxil:
pOH = lg [HO-] = lg (1 / [HO-])
O soluie de HCl 1N are o concentraie a ionilor de hidrogen de 1 ion g/l.
[H3O+] = 1 pH = lg l = 0
ntruct produsul ionic al apei este [H3O+] x [HO-] = 10-14,
[HO-] = 10-14 ion g/1
Pentru concentraia unei baze se poate raiona n mod analog.
Astfel, rezult c n solutii apoase, concentraia ionilor de hidrogen poate varia ntre 1 si 10 -14 ion
g/1.
Dac se logaritmeaz expresia produsului ionic al apei se obtine:
lg [H3O+] lg [HO-] = lg 10-14
pH + pOH = 14
Cu ajutorul acestei relaii se poate exprima aciditatea sau bazicitatea unei soluii apoase.
n concluzie, n soluiile apoase, pH-ul poate varia ntre 0 si 14. ntr-o soluie cu pH zero,
concentraia ionilor de hidrogen este 1, iar cea a ionilor hidroxil este 10 -14. Rezult astfel c soluia este
acid. n mod asemnator, cnd concentraia ionilor hidroxil este 1, pH-ul este 14, iar soluia este
bazic. n acest caz, concentraia ionilor de hidrogen este 10-14.
[H3O+] = 10-7 [HO-] = 10-7 pH = 7
Atunci cnd concentraia ionilor de hidrogen este egal cu cea a ionilor hidroxil, pH-ul este 7, iar
soluia este neutr.
Rezult c la valori de pH mai mari de 7 soluiile sunt bazice, iar dac pH-ul este mai mic de 7,
soluiile sunt acide. Cnd pH-ul crete cu o unitate, concentraia ionilor de hidrogen descrete de 10 ori.
La determinarea pH-ului un factor important l constituie temperatura de lucru. De pild, punctul
neutru scade o dat cu creterea temperaturii. n general, cnd nu se specific, masurarea pH-ului
soluiilor se face la 250C (temperatura ambiant).
Determinarea pH-ului n soluie se realizeaz cu hrtii indicatoare sau cu electrozi de pH.
1.4.2. Electrodul de pH-IngoId
Principiul de aciune
Determinarea pH-ului cu ajutorul electrozilor se realizeaz prin msurarea potenialului de
electrod al pilelor. Fora electromotoare a unei pile se datoreaz diferenelor de potenial aprute la
interfaa electrod-soluie. Aceast diferen de potenial se numete potential de electrod i apare
- 24 -

deoarece ionii metalici din soluie au un potenial diferit fa de cel al ionilor din metal, astfel c ntre
acetia se stabilete un echilibru.
ntruct potenialul unui singur electrod nu se poate determina se alege prin convenie un
electrod de referin, al crui potenial, se consider zero. Ca electrozi de comparaie se folosesc frecvent
electrodul de hidrogen, electrodul de calomel, etc.
n anul 1947, dr. Werner Ingold a introdus pe pia modelul electrozilor combinai, acetia fiind
utilizai astzi n toat lumea. n electrodul combinat, electrodul de sticl i cel de referin formeaz un
corp comun. Electrodul de referin nconjoar electrodul de sticl coaxial, iar electrolitul vine n contact
electric cu proba prin intermediul unei membrane.
Electrozii combinai sunt de obicei formai din electrozi de calomel sau de argint. n cazul
electrozilor sterilizabili, utilizai la msurarea pH-ului n bioreactoare, se folosete electrodul de argint.
Acesta se noteaz simbolic prin:
Ag / AgCl solid / KCl (soluie) sau HCl
Electrodul de argint const dintr-o plac de argint, n contact cu clorur de argint, n soluie de
acid clorhidric. La electrod au loc reacii inverse, mai nti de dizolvare a argintului solid i reacia lui cu
ionii de clor pentru a forma clorura de argint, insolubil, pentru ca apoi clorura de argint s se dizolve i
s reformeze argintul solid.
Ag Ag+ + eAg+ + Cl- AgCl
Reacia global devine: AgCl + e Ag + ClClorura de potasiu care nconjoar electrodul mpiedic creterea concentraiei ionilor de argint
la electrozi, care ar putea face electrodul mai pozitiv i l-ar polariza.
n biotehnologie, pH-ul constituie un parametru biochimic deosebit de important pentru
desfurarea diferitelor procese biologice, ceea ce impune controlul i corecia lui permanent la
valoarea indicat n tehnologie.

Electrodul de pH Ingold

Pstrarea electrodului
Pentru o bun funcionare, electrodul de pH nu se pstreaz n atmosfer uscat (n aer liber), ci
se menine permanent n soluia electrolitului de referin (KCl).
Dup o perioad lung de stocare, membrana de sticl trebuie reactivat cu acid fluorhidric
procedndu-se astfel: membrana electrodului se introduce 1 minut, ntr-o soluie concentrat de acid
fluorhidric, apoi se menine 12 ore n soluia stoc.
Calibrarea electrodului de pH aferent bioreactorului Braun
Electrodul de pH trebuie calibrat, nainte de a-l folosi ntr-un proces de fermentaie n bireactor.
Electrodul de pH Ingold utilizat pentru controlul pH-ului n bioreactor este sterilizabil (suport
sterilizare termic umed).

- 25 -

Calibrarea electrodului de pH se realizeaz la temperatura de fermentaie. Pentru calibrare, se

utilizeaz dou soluii tampon de pH cunoscut. n general, se folosesc o soluie acid cu pH=4,1 i o
soluie neutr cu pH=7.
Procedeul de calibrare a electrodului se realizeaz prin parcurgerea mai multor etape:
1. Se scoate electrodul din soluia de stocare i se spal cu ap distilat, cu ajutorul unei pisete;
2. Se introduce electrodul n soluia tampon de pH =4, se selecteaz canalul Calibrare, se
stabileste valoarea 4,1 pentru prima soluie tampon (BUF Z) i se confirm cu Enter. Sistemul de
automatizare nregistreaz aceast valoare ca fiind pH=4,1. Cnd valoarea nregistrat pe panou este 4,1
se confirm din nou cu Enter;
3. Se scoate electrodul din soluia tampon cu pH=4,1, se spal cu ap distilat i se introduce n
soluia cu pH=7. Se selecteaz pe canalul Calibrare funcia corespunzatoare celei de-a doua soluii
tampon (BUF S) i se confirm cu Enter. Sistemul de automatizare nregistreaz aceast valoare ca
fiind pH=7. Dac semnalul msurat i nregistrat pe panoul de comand este constant i egal cu 7, se
confirm din nou cu Enter;
4. Se selecteaz pe canalul Calibrare funcia corespunzatoare pantei (Slope). Cele dou puncte
nregistrate formeaz o dreapt a crei pant trebuie s aib o anumit valoare. n momentul selectrii
funciei Slope se introduce o valoare cuprins ntre 54-60 mV si se confirm cu Enter.
1.5. Msurarea concentraiei de oxigen din mediul de fermentaie
1.5.1. Noiuni generale
Relaia de echilibru ntre presiunea total i presiunea parial de oxigen este dat de legea lui
Henry:
pAG = pT x yAG = H x CAL (1)
unde: pAG = presiunea parial a componentului A n gaz
pT = presiunea total a gazului
yAG = fracia molar a componentului A n amestecul gazos
H = constanta lui Henry, care este funcie de temperatura de lucru i este tabelat
CAL = solubilitatea componentului gazos A n lichid, de asemenea tabelat n funcie de
temperatura de lucru
Din ecuaia (1), rezult c la creterea presiunii totale a gazului sau a concentraiei de oxigen n
amestecul gazos, n condiii de temperatur constant, solubilitatea componentului gazos n lichid crete
peste valoarea de echilibru ceea ce se concretizez, n final, printr-o intensificare a transferului de mas
dintre cele doua faze.
De multe ori, n procesele de fermentaie care necesit o aerare intens, se introduce aer
mbogit n oxigen pentru mbuntirea transferului de mas dintre cele dou faze.
1.5.2. Electrodul de oxigen
Concentraia oxigenului dizolvat n fermentatoare se msoar, n mod uzual, cu ajutorul unui
electrod de oxigen.
Exist dou tipuri constructive pentru un astfel de electrod:
1. electrozi galvanici
2. electrozi polarografici
La ambele tipuri, o membran permeabil pentru oxigen separ fluidul de fermentaie, de
electrodul de msur.
Principiul de aciune
- 26 -

Oxigenul difuzeaz prin membran la catod, unde reacioneaz i produce un curent electric ntre
anod i catod, proporional cu presiunea parial a oxigenului n mediul de fermentaie.

Schema transferului de oxigen din mediu la catodul electrodului de masur

n funcie de debitul de alimentare a mediului, de proprietile fizico-chimice ale lichidului i de

proporia de utilizare a oxigenului de ctre microorganisme, stratul de lichid ce nconjoar membrana de
msur a electrodului formeaz o interfa ntre electrodul solid i lichidul de msurat.
Dup cum rezult si din figura 7, eliberarea i transmiterea moleculelor de oxigen din mediu spre
catod se realizeaz prin procese de transfer de mas. ntruct nu exist o micare propriu-zis a fluidului
prin membran sau prin soluia de electrolit, ci exist o micare redus prin pelicula de lichid de la
interfaa membranei, n cazul operrii cu sonda electrodului oxigenul difuzeaz prin grosimea acestei
pelicule de lichid. Acest proces necesit o perioad mai lung de timp i este cunoscut sub denumirea de
timp de rspuns al electrolitului. Durata acestuia poate fi masurat prin transferarea rapid a sondei
dintr-un mediu saturat cu azot ntr-un saturat cu oxigen. Timpul de rspuns este definit ca timpul
necesar aparatului pentru a indica 63% din valoarea total a concentraiei de oxigen dizolvat n mediul
de masurat. Electrozii comercializai la ora actual au timpi de rspuns cuprini ntre 10-100 secunde.
Timpul de rspuns al electrodului de oxigen poate fi mbuntit prin urmatoarele aciuni:
- agitarea intens a lichidului n care se msoar concentraia de oxigen dizolvat
- micorarea grosimii peliculei de lichid de la suprafaa membranei
- micorarea catodului, deci a cantitii de oxigen consumat, prin utilizarea de microsonde
Ambele tipuri de electrozi, galvanic si polarografic, msoar, presiunea parial a oxigenului sau
tensiunea de oxigen n mediul de fermentaie i nu direct concentraia de oxigen dizolvat.
Pentru convertirea acestora n concentraie de oxigen dizolvat este necesar cunoaterea
solubilitii oxigenului n lichidul de msurat, la temperatura i presiunea la care au loc msurtorile.
Determinarea concentraiei de oxigen din mediile de fermentaie se realizeaz cu ajutorul unui
electrod tip Mettler Toledo. Acest se compune din:
a) Senzorul de baza Clark, polarografic, care const dintr-un electrod de lucru (catodul), un
electrod de numrare i unul de referin (anodul) i o membran permeabil pentru oxigen, care separ
electrodul, de mediul analizat.
b) Transmitorul, care se aplic la catod (tensiune de polarizare) i asigur un voltaj ntre 550 si
750 mV.
c) Moleculele de oxigen care migreaz prin membrana permeabil. Acestea sunt reduse la catod. n
acelai timp, la anod are loc un proces de oxidare, unde metalul anodic oxidat este transferat n electrolit.
Electrolitul nchide circuitul electric dintre anod si catod (conductivitate ionic).
Curentul produs de reacia descris la punctul c) este msurat de transmitor. Acest curent este
proporional cu presiunea parial de oxigen din mediul de cultur.
Operarea electrodului
Cand se lucreaz prima dat cu sistemul sau cnd senzorul a fost deconectat de la sursa de
tensiune pentru o durat mai mare de 5 sau 10 minute, acesta trebuie polarizat nainte de calibrare, prin
- 27 -

conectare la transmitorul de oxigen sau la un modul de polarizare Mettler. Senzorul este polarizat i
gata de operare dup 6 ore de polarizare. Mai puin de 6 ore vor fi suficiente dac senzorul a fost
deconectat numai pentru cteva minute.
Calibrarea electrodului
Electrodul trebuie recalibrat nainte de fiecare msuratoare. Dac senzorul lucreaz cu un
transmitor Mettler tip 170, este suficient numai o calibrare simpl ntr-un punct, ntr-un mediu saturat
cu oxigen sau ntr-o incint cu aer saturat n vapori de ap. Aducerea la zero nu este necesar.
Dac lucrul se desfaoar n condiii sterile, sistemul trebuie calibrat dup sterilizare, deoarece
temperatura poate modifica panta senzorului. Dup rcire, fermentatorul este aerat. La calibrare, dupa ce
semnalul s-a stabilizat, se ajusteaza potentiometric "panta" pentru a aduce pe ecran valoarea dorit.
Modificarea pantei poate atinge cteva procente cnd se utilizeaz un modul cu membrana nou.
Modificarea pantei este de obicei foarte mic.
Exemple:
Transmitor Mettler tip 170% aer; domeniu "mediu" valoare setat pe display la 100%
saturare aer;
Transmitor Mettler tip 170% O2, domeniu "mediu" valoare setat pe display la 20,9%
saturare O2;
Transmitor Mettler tip 170% O2 ppm, domeniu "mediu" valoare setat pe display la 11,25
mg O2/l apa la 10C si 1013 mbar/1 atm.
Dac senzorul lucreaz cu alte tipuri de transmitori Mettler trebuie efectuat o calibrare n 2
puncte. n mod particular, aceasta se recomand pentru msurtori la presiuni pariale de oxigen foarte
sczute.
n timpul calibrrii punctului zero, senzorul trebuie sa fie plasat ntr-un gel de punct zero sau ntrun alt mediu care nu conine oxigen (ex. 99,98% azot sau dioxid de carbon). Dac soluia analizat poate
fi eliberat complet de oxigen prin saturare cu azot sau dioxid de carbon, aceasta poate fi utilizat drept
etalon pentru calibrarea punctului zero. Dupa 10 minute citirea ar trebui sa fie stabil i punctul zero
poate fi setat. Calibrarea pantei poate fi efectuat n ap saturat cu aer sau ntr-o incinta cu aer saturat n
vapori de apa. Verificarea calibrrii se face periodic pentru validarea punctului zero, cu ajutorul unui
simulator de oxigen Mettler.
Intretinerea electrodului
nainte de fiecare calibrare se inspecteaz vizual membrana pentru a evidenia eventuale
deteriorri. Dac membrana este murdar, aceasta se terge cu atenie, utiliznd o bucat de crp moale,
fin. n funcie de natura mediului, electrolitul poate fi schimbat periodic. Acesta nu ar trebui utilizat mai
mult de 6 luni.
Modulul membranei trebuie schimbat cnd arat semne de mbtrnire sau dereglri cum ar fi:
- un timp de rspuns prea mare
- citiri zgomotoase sau eronate
- imposibilitatea de a fi calibrat
- distrugeri mecanice
Inspectarea electrodului
Se recomand msuratori periodice ale punctului zero pentru verificarea funcionrii corecte a
senzorului. Aceasta se poate face utiliznd gelul de zero sau gaze pure (99,98% azot sau dioxid de
carbon).
Dup 1 minut ntr-un mediu liber de oxigen senzorul ar trebui s afieze mai puin de 10% din
coninutul n oxigen al aerului i dup nc 10 minute, mai puin de 1% din valoarea dedus a oxigenului
din aer. Valori mai mari sugereaz o distrugere a electrolitului sau a membranei.
Pstrarea electrodului
- 28 -

Electrodul poate fi pstrat cteva luni, asigurndu-ne c este plin cu oxigen electrolitic i c
membrana este acoperit cu manonul de protecie. Pentru a evita polarizarea, senzorul poate fi pstrat la
un modul de depozitare Mettler.

- 29 -

Lucrarea practica nr. 8

PROCESE BIOTEHNOLOGICE LA NIVEL MICROPILOT
OBINEREA UNUI PREPARAT BIOLOGIC CU LACTOBACILLUS PLANTARUM
n ultimii ani s-a extins tot mai mult folosirea preparatelor biologice ca aditivi pentru stimularea
proceselor fermentative acido-lactice, favorabile din silozuri. Aceste preparate se obin cu ajutorul
bacteriilor acido-lactice i propionice, drojdiilor i enzimelor. Microorganismele au capacitatea de a se
multiplica foarte rapid rspndindu-se n toat masa silozului, cu producerea unei fermentaii acidolactice eficiente n procesul de conservare. n plus, n momentul consumrii acestor produse intervine i
un efect probiotic. Utilizarea acestor microorganisme se poate realiza fie prin administrarea direct n
hran, fie prin adaugare n nutre, nc de la nsilozare.
Obinerea biomasei de Lactobacillus plantarum la nivel micropilot presupune parcurgerea
urmtoarelor etape:
- prepararea inoculului laborator
- fermentaia micropilot
- prelucrarea mediului de fermentaie
- determinarea cantitativ a biomasei i caracterizarea fizico-chimic a produsului obinut
1.1. Obinerea culturii de Lactobacillus sp. n bioreactor
Culturile de Lactobacillus plantarum sunt obinute i prelucrate n funcie de materiile prime
utilizate i de temperatura la care se face fermentaia.
Prepararea inoculului de laborator
Materii prime si materiale:
- cultur stoc de Lactobacillus plantarum
- ans
- pipete sterile
- ser fiziologic steril
Compoziia mediului nutritiv utilizat pentru prepararea inoculului:
- glucoz
2%
- (NH4)HPO4
0,1%
- pepton
0,5%
- CaCO3
1% , pH = 5,5
Mod de lucru:
Se recolteaz cu ansa cultur de Lactobacillus plantarum i se nsmneaz 25 ml mediu de
cultur sterilizat. Se incubeaz la 400C, timp de 24 de ore, static, n condiii de anaerobioz.
Fermentaia n bioreactor
Materii prime si materiale:
- inocul de Lactobacillus plantarum
- pipete sterile
- bioreactor cu mediu lichid steril
Compoziia mediului nutritiv utilizat n bioreactor:
- glucoz
2%
- (NH4)HPO4
0,1%
- 30 -

pepton
CaCO3
pH = 5,5

0,1%
1%

Mod de lucru:
Se prepar 3000 ml mediu de cultur care se introduce n bioreactor. Se nchide etan
bioreactorul, se introduce n autoclav i se sterilizeaz la 120 0C, timp de 20 de minute. Dup rcire,
mediul astfel pregtit i sterilizat se inoculeaz cu inocul de laborator, iar apoi se fixeaz parametrii de
lucru la: 400C, pH=5,5, fr aerare, agitare 20 rpm, timp de 24 ore.
-

Pe parcursul i la sfritul fermentaiei se determin urmtorii parametrii:

D.O. la 570 nm - la 8, 16, 24 ore (se urmrete o cantitate ct mai mare de lactobacili pentru a
realiza conservarea furajelor)
aspectul microscopic i puritatea culturii
concentraia n glucoz prin metoda enzimatic
1.2. Prelucrarea mediului de fermentaie

Dup ncheierea procesului de fermentaie, prima operaiune n cadrul prelucrrii post-biosintez

este reprezentat de separarea biomasei acido-lactice din mediul lichid, prin centrifugare. Aceasta se
realizeaz cu ajutorul separatoarelor centrifugale de turaie mare (4000-5000 rpm). Dup centrifugare,
bimasa umed se usuc pn la greutate constant.
Materiale necesare:
- mediu de fermentaie obinut n bioreactor
- etuv, tvi de uscare
- centrifug
Mod de lucru:
Dup terminarea fermentaiei, mediul de cultur din bioreactor este msurat i apoi repartizat n
cuve de centrifug, tarate n prealabil. Centrifugarea se efectueaz la 4000 rpm, timp de 20 min, la rece.
La sfritul operaiei de centrifugare se cntrete i se colecteaz biomasa umed cu ajutorul
unei spatule, se aeaz n tvi de uscare i se usuc n etuv, la 105 0C, sub curent de aer. Se cntrete
cantitatea total de biomas uscat obinut, iar apoi se analizeaz din punct de vedere fizico-chimic, n
vederea caracterizrii preparatului obinut.

- 31 -