MODELAREA SI CONTROLUL PROCESELOR FERMENTATIVE

FERMENTATIA

Procesul de creştere a microorganismelor pe medii de cultură, cu scopul de a biosintetiza diverşi produşi,

poarta denumirea de fermentaţie. Procesul de creştere a microorganismelor reprezintă rezultatul
interacţiunii dintre celula individuală şi mediul de cultură. Bacteriile anaerobe îşi procurã energia
necesarã proceselor de sintezã , care asigurã nutriţia, înmulţirea, mişcarea, prin scindarea şi
modificarea substanţelor organice din mediul lor de viaţã, în principal glucoza şi alte zaharide.
Aplicarea legilor termodinamicii, cineticii şi ale transferului de masa, impuls şi energie
demonstrează că mediul de cultură, prin compoziţie, temperatura, pH, presiune şi concentraţii de
substrat, afectează direct creşterea microorganismelor şi performanţa elaborării produselor utile.
Microorganismele sunt înzestrate genetic cu un mecanism care reglează producerea metaboliţilor, la un
nivel care să le satisfacă propriile necesităţi. Procesul de fermentaţie este procesul de baza din
tehnologiile de biosinteza pentru obţinerea antibioticelor, vitaminelor, hormonilor, alcoolilor, proteinelor, a
produselor destinate agriculturii, culturilor de celule, fabricarea brânzeturilor prin fermentaţia laptelui,
fabricarea berii şi a vinului.
Pentru fermentaţia alcoolică se utilizează diferite specii de drojdii specifice substratului
folosit. Astfel, pentru fermentaţia hexozelor se utilizează Saccharomyces cerevisiae, iar pentru
pentoze sau lactoză Kluyveromyces fragilis şi Candida sp. În condiţii optime, după aproximativ 120
de ore s-a obţinut o concentraţie a alcoolului etilic în mediu de 11,5 %. Pentru optimizarea procesului
de fermentaţie este necesar să se obţină, prin modificări genetice, o tulpină care să producă în exces un
anumit compus necesar omului, compus care să poată fi separat, purificat şi comercializat.Cu tulpini
selecţionate de drojdie, după luni de fermentaţie pot fi atinse concentraţii duble. Agenţii tipici ai
fermentaţiei alcoolice sunt drojdiile genului Saccharomyces care pot sa producă prin fermentarea
glucidelor alcool etilic cu tãrie superioarã valorii de 8°.

Dinamica fermentaţiei alcoolice

In condiţii industriale , fermentaţia alcoolica utilizeazã substraturi naturale bogate în glucide

fermentescibile . Factorii a cãror contribuţie este importantã pentru viteza de fermentare si
transformarea glucidelor în produsi primari si secundari poti fi împãrţiţi în factori fizico-chimici
(care depind de compoziţia mediului supus fermentãrii şi de condiţiile de mediu) şi factori
biologici(dependenţi de microagenţii fermentãrii).
Factorii fizici şi chimici care infulenţeazã procesul de fermentatie alcoolicã sunt : pH-ul,
presiunea osmotic, RH-ul, umiditatea, temperatura.
1)pH-ul mediului
Capacitatea de adapatare la modifcari survenite in mediul de cultura , fac posibila dezvoltarea
drojdiilor in limite largi de pH, astfel, daca un mediu este mai acid decat valoarea optima pentru
crestere, in celula se activeaza enzimele decarboxilaze iar cu cat pH este mai bazic decat valoarea
optima , se activeaza dezaminazele.Datorita acesti adaptabilitati , produsele rezultante din
aminoacizi realizeazã neutralizarea si sunt considerate un sistem tampon asupra efectului nociv al
pH-ului, însa odata cu epuizarea stocului de aminoacizi,actiunea pH-ului duce la moartea
celulelor prin modificarea schimburilor osmotice intre celula si mediu.Variaţia pH-ului
intracelular este foarte importanta in reglarea glicolizei si a respiratiei celulelor de drojdie.
Drojdia Saccharomyces cerevisiae se dezvolta optim atunci cand valoarea pH-ului se afla intre
4,5-5,8 , desi acestea sunt mai active la valori ale pH-ului cuprinse intre 7-7,5 inmultirea
drojdiilor fiind rapida.In practica ,dezvoltarea drojdiilor se realizeaza in mediu acid.
Conţinutul de alcool si compozitia mediului sunt factori ce pot influenta domeniul de pH
in care este realizata multplicarea drojdiei astfel, intr-un mediu de fermentare ce contine 4,5%
alcool drojdiile pot actiona pana la un pH de 1,8, în timp ce la un continut de 5,5-6% alcool ,
valoarea minima a pH-ului suportat de drojdii este de 2,3.
Daca se mareste pH-ul, activitatea enzimelor creste, enzime ce participa la formarea
poliglucidelor, solubile in acizi.In procesul de fabricare a drojdiei, valoarea pH-ului se scade pana
la valori de aproxiamtiv 4, fiind urmãritã in primele faze de multiplicare(faza I si II) o acumulare
de biomasa celulara activa.Odata cu cresterea numarului de faze de multiplicare, se creste si
numarul pH-ului pana la o valoare de 5,5.
Acidul lactic este utilizat in corectarea pH-ului in industria drojdiei,acesta fiind cel mai
benefic celulelor de drojdie ,acidiferea cu acesta ducand la obtinerea unei drojdii cu putere de
crestere de 10 minute, biomasa de 32g*dm-3 si o activitate maltazaica de 304 U.A.
2)Efectul presiunii osmotice
Pentru conditii optime de dezvoltare a drojdiilor, este important ca mediul in care se afla sa aibe o
presiune osmotica cat mai apropriata de cea din interiorul celulei.O schimbare brusca a presiunii
osmotice a mediului duce la dereglarea functiilor compensatroare de adaptare a mebranei
citoplasmatice si poate duce chiar la lezari ale peretelui celular, fapt ce poate conduce la moartea
fiziologica a celulei.Intr-un mediu cu presiune osmotica ridicata, celulele sunt obligate sa
realizeze in interiorul lor o contrapresiune osmotica echivalenta, permitand trecerea in mediu a
unei proportii corespunzatoare de apa.In momentul in care celulele se gasesc in medii cu presiune
osmotica mai micã decat cea a continutului vacuolelor (in apa ) din aceeasi necesitate de a realiza
o contrapresiune osmotica , permite patrunderea de apa din mediul exterior.Odata cu marirea
concentratiei in substante incepe sa se produca franarea proceselor biochimice ale celulei iar la un
anumit nivel se instaureaza socul osmotic.
3)RH-ul mediului
In reactia de oxidoreducere drojdiile au diferite grade de sensibilitate,iar printre substantele ce
ajuta la mentinerea unui potential redus de oxidoreducere ,se numara acidul ascorbic, glucidele
reducatoare si substante ce contin grupele –SH.Intr-un sistem biologic exista atat substante
oxidante cat si substante reducatoare,astfel incat valoarea potentialului de oxidoreducere depinde
strict de raportul dintre cele doua si in plus, depinde si de tensiunea de oxigen si valoarea pH-
ului.Modificarea rH-ului modifca metabolismul celular,iar in cazul unor valori limita, este oprita
cresterea.
4)Umiditatea
Celula de drojdie este dependenta de apa,nu numai prin prisma faptului ca reprezinta
principalul constituient din punct de vedere cantitativ(reprezinta aprox 80% din greutatea
celulelor vii) ci si pentru ca are urmatoarele functii:
-este reactant chimic present in celula, participa la reactiile de hidroliza;
-actioneaza ca solvent pentru metabolitii intracelulari
-are o functie structural in mentinerea formei si dimensiunilor celulei impuse de presiunea
hidrostatica ce ia nastere in interiorul celulei.
Apa este implicatã direct in procesul de formare a citoplasmei, celula de drojdie depinzand in mod
direct de starea sa. Daca umiditatea scade, viteza de metabolism scade, enzimele devin
inactive iar celulele de drojdie trec in stare de anabioza.
Mare parte din drojdii nu se pot dezvolta decat in medii cu un indice de activitate al apei mai mare
de 0,90, insa exista si drojdii osmotolerante , ce rezista la presiuni osmotic mai ridicate,
corespunzatoare unui aw=0,60 .

5)Temperatura

Temperatura reprezinta din punct de vedere al procesului de biosinteza desfasurat la scara

industriala,unul dintre cei mai importanti parametrii fizici,cu implicatii mari in optimizarea
procesului.Daca temperatura sufera variatii si randamentul de transformare a substratului in
produsul dorit va suferi modificari,dar de asemenea are efect si asupra compozitiei biomasei
obtinute.Drojdia Saccharomyces cerevisiae face parte din grupul mezofil,a cārei temperaturã
optimā variaza de la 26 pana la 36 grade Celsius(drojdia cu cea mai buna putere de crestere se
obtine la o temperature de 30 grade Celsius).Daca se modifca temperatura optima doar cu
 cateva grade va fi infulenţat nu numai randamentul dar si compozitia biochimica a celulei de
drojdie.Temperatura procesului de cultivare se afla in stricta legatura cu continutul in lipide
din compozitia membranelor celulare,astfel, mebrana drojdiilor psihrofile contine in cantitati
mai mare acizi grasi polinesaturati, membrana drojdiilor termofile, acizi grasi monosaturati,
iar cele mezofile contin acizi mono si polinesaturati. Mediul in care este tinut celula de
drojdie este foarte important,iar datorita faptului ca celula de drojdie poate suporta temperaturi
foarte scazute(spre 0 absolut),poate rezista mai bine intr-un mediu uscat decat intr-un mediu
umed.De asemenea, odata cu scaderea temperaturii sub 0grade Celsius, viteza de metabolism
scade.La temperaturi mici, apar pierderi de apa intracelulara,iar drojdiile trec in stare latent de
viata, stare in care metabolismul se desfasoara foarte lent si pot ramane viabile pe o perioada
lunga de timp.Pentru a putea fi pastrate pe o perioada nedeterminata, drojdiile pot fi congelate,
activitatea celulei oprindu-se.De asemenea s-a aratat ca inghetarile si dezghetarile repetate duc
la moartea celulelor de drojdie,rezultate ce au fost confirmate de Baum, in urma unei analize
efectuate pe o cultura pura de Saccharomyces cerevisae. Drojdia obtinuta la temperaturi
cuprinse intre 25-30 grade Celsius este mai bogata in fosfor si azot, in timp ce la temperature
ridicate calitatea productiei scade datorita posibilitatii de multiplicare a microbiotei
bacteriene si a drojdiilor atipice.Randamentul scade datorita microorganismelor ce
contamineaza substratul destinat drojdiei si il consuma. Se poate obtine insa drojdie si la
temperaturi mai ridicate (>30 grade Celsius), cu ajutorul acumulari in celula de drojdie a
terahalozei,temperature maxima de acumulare a trehalozei fiind realizata la temperature de 40
grade Celsius.La temperature mai ridicate procesul de multiplicare al drojdiei a fost redus
considerabil si a fost observata scaderea glicogenului. Odata cu cresterea temperaturii de
cultivare ,randamentul in drojdie este redus,datorita scaderii in umiditate si totodata viteza de
acumulare a alcoolului este si ea afectata de aceasta crestere.

Factori biologici

Intre anii 1885-1887 Ed Buchner a demonstrat ca fermentatia alcoolica se datoreaza enzimelor

elaborate din celula de drojdie.Procesul de fermentatie decurge activ in momentul in care celulele
de drojdie se afla in faza exponentiala sau la inceputul fazei stationare de crestere, in timp ce
drojdiile autolizate, isi pierd proprietatiile fermentative datorita hidrolizei proteninelor
intracelulare si inactivarii enzimelor.

Cele mai importante enzime sunt dehidrogenazele, glicerat-aldehid-dehidorgenaza si

alcool dehidrogenaza .

Viteza de fermentare

Proprietate ce depinde de numarul de cellule, viteza fiind direct proportional cu numarul

de cellule.Termenul de viteza se refera la continutul de alcool format la 1m3 lichid in u.t.
Spectrul de fermentare al glucidelor

Este cunoscut faptul ca drojdiile fermenteaza un numar limitat de glucide ,rezultă alcool
etilic si CO2 in conditii anaerobe.In afara acestor glucide fermentescibilie mai pot fi utilizate
substraturi naturale ce contin poliglucide cum ar fi amidonul sau celuloza.

Efect Pasteur

Fenomen ce apare atunci cand mediul de fermentare este puternic aerat,datorita acestui
effect putand fi vizibila conversia fermentatiei in respiratie,deoarece in prezenta oxigenului,
oxidarea are loc pana la produsi finali(CO2 si H2O), iar cantitatea de energie este mult mai mare.
In figura 1 sunt indicati pasii procesului de transformare a biomasei in etanol prin
fermentatie alcoolica.Conversia zaharurilor in etanol este foarte eficienta , aprox 90% din
zaharurile fermentabile fiind convertite in etanol

Schema producere etanol din fermentatie alcoolica

. Caracterizarea produşilor principali şi secundari obţinuţi în fermentaţia alcoolică

Fermentatia alcoolica este un proces anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt
metabolizate prin reacţii de oxido-reducere sub acţiunea echipamentului enzimatic al drojdiei in
produşii principali (alcool etilic si CO2) iar ca produşi secundari: alcooli superiori, acizi, aldehide
s.aAlcoolul etilic este un metabolit primar care poate fi obţinut prin fermentaţia zahărului sau a unor
polizaharide care sunt transformate enzimatic la zahăr.Conversia prin fermentare în mediu acid a
glucidelor, catalizată de enzimele din drojdii se desfăşoară în cinci etape principale:

1. Transformarea diferitelor tipuri de glucide în esteri ai glucozei şi formarea

esterului fructo-furanozo-1,6-difosfat. Este etapa în care se consumă energie
prin reacţia de transformare a ATP-ului în ADP.
2. Formarea triozelor –aldehidă fosfoglicerică şi fosfodioxiacetonă.
3. Transformarea triozelor până la formarea de acid piruvic. Energia eliberată prin
procesul de oxido-reducere este înmagazinată prin fosforilare de substrat.
4. Decarboxilarea acidului piruvic şi formarea de aldehidă acetică.
5. Aldehida acetică se reduce devenind acceptor de hidrogen şi se formează
alcoolul etilic.
Reacţia globală a fermentaţiei alcoolice în mediu acid este:

C6 H12O6 + 2 ADP + 2P → 2C2 H 5OH + 2CO2 + 2 ATP

În fermentaţia alcoolică rezultă o diversitate de produşi secundari. De exemplu, în vinuri

au fost identificate prin cromatografie 300-500 de substanţe diferite. Majoritatea lor rezultă prin
procesul de fermentaţie, iar celelalte sunt dependente de compoziţia mediului.

În urma analizei culturii de Saccharomyces cerevisiae Hansen au fost identificaţi prin

cromatografie o serie de produşi secundari. Dintre aceştia pot fi enumeraţi următorii:

- glicerol: 3g/100g glucoză fermentată;

- aldehida acetică: 2,2 mg∙dm-3;

- acid acetic: 86∙mg∙dm-3;

Analiza procesului de creştere drojdii

 Drojdiile sunt microorganisme eucariote unicelulare saprofite sau parazite, din clasa
ascomicetelor, utilizate în industria fermentativă, în industria de biosinteză, în scopul obţinerii
proteinelor furajere. Cele mai multe specii sunt folosite pentru obţinerea alcoolului etilic, berii,
vinului, pâinii, enzimelor şi a numeroaselor altor preparate alimentare.Fermentaţia alcoolică este un
proces întâlnit la numeroase microorganisme, dar care produc prin fermentare cantităţi mai reduse de
alcool etilic comparativ cu drojdiile. Pentru fermentaţia alcoolică se utilizează diferite specii de drojdii
specifice substratului folosit. Astfel, pentru fermentaţia hexozelor se utilizează Saccharomyces
cerevisiae( prin fermentarea glucidelor rezultã alcool etilic de 8°), iar pentru pentoze sau lactoză
Kluyveromyces fragilis şi Candida sp. În condiţii optime, după aproximativ 120 de ore s-a obţinut o
concentraţie a alcoolului etilic în mediu de 11,5 %. Pentru optimizarea procesului de fermentaţie este
necesar să se obţină, prin modificări genetice, o tulpină care să producă în exces un anumit compus necesar
omului, compus care să poată fi separat, purificat şi comercializat.Cu tulpini selecţionate de drojdie, după
luni de fermentaţie pot fi atinse concentraţii duble. Mai pot produce alcool etilic bacteriile: Bacillus
macerans, CI. acetonaetilicus, Zymomonas dar ele nu sunt considerate agenţi tipici .

Pentru a putea fi folosite în practica drojdiile genului Saccharomyces sunt studiate si

selecţionate în funcţie de unele proprietăţi care le recomandă pentru utilizarea industrială, cum ar
fi: puterea alcooligenă; alcoolorezistenţa; capacitatea de floculare şi pulverulenţta; osmotoleranţta;
frigofilia; caracterul killer.

Fermentaţia alcoolică în condiţii industriale foloseşte substraturi naturale bogate în zahar

fermentescibil, iar viteza de fermentare şi transformare a glucidelor în produşi primari şi secundari
este dependentă de numeroşi factori care pot fi împărţiţi în două mari categorii: factori biologici,
dependenţi de microagenţii fermentării, şi factori fizico-chimici, dependenţi de compoziţia
mediului supus fermentării şi condiţiile mediului ambiant.

1. Selecţia şi caracterizarea tulpinilor de microorganisme utilizate în fermentaţia

alcoolică

1.1. Caracterizarea drojdiilor din genul Saccharomyces

În vederea utilizării în practică a drojdiilor genului Saccharomyces acestea au fost caracterizate

şi selecţionate în funcţie de unele proprietăţi care le recomandă utilizării lor pe scară industrială.
 Puterea alcooligenă. Această proprietate se referă la concentraţia mare de alcool care se poate
acumula, când în mediu există un exces de zahăr. Drojdiile sunt sensibile la creşterea concentraţiei în
alcool. Spre deosebire de drojdiile cu putere alcooligenă slabă din genul Kloeckera, Torulopsis, care sunt
inhibate la o concentraţie alcoolică de 4-6o, drojdiile din genul Saccharomyces (Saccharomyces
cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomyces cerevisiae - cerevisiae) au o putere alcooligenă mare şi
continuă fermentaţia până se acumulează 16-18o alcool.

Alcoolorezistenţa. Reprezintă capacitatea drojdiei de a continua fermentaţia la o creştere a

concentraţiei de alcool şi de a porni fermentaţia în prezenţa a 8% alcool.

Sulfitorezistenţa. Este definită ca fiind capacitatea drojdiilor de vin, respectiv a drojdiilor din
genul Saccharomyces, de a produce fermentaţia alcoolică în prezenţa unor concentraţii de 200-5000 mg
SO2∙dm-3 pot influenţa negativ activitatea altor drojdii din must neadaptate (peliculare sau oxidative) ca
urmare a scăderii potenţialului de oxidoreducere.

Putem presupune că rezistenţa la SO2 se datorează şi capacităţii drojdiilor din genul

Saccharomyces de a excreta aldehidă acetică ce poate lega SO2 ,care astfel îşi poate reduce efectul
levuristatic.

Capacitatea de floculare şi pulverulenţa. Aceste proprietăţi se datorează structurii

peretelui celular şi a modificării de pH şi rH din timpul fermentaţiei. Drojdiile floculante
formează asociaţii ce se depun mai uşor, în timp ce drojdiile pulverulente se menţin mai mult timp
în suspensie şi produc o fermentaţie mai avansată. Astfel, pentru drojdiile de şampanie s-a urmărit
ca acestea să se depună uşor în gâtul sticlei, iar prin operaţia de degorjare să se separeu
sedimentul, obţinându-se o şampanie limpede.

Osmotoleranţa. Această proprietate se referă la capacitatea drojdiilor de a produce

fermentaţia în mediu cu o concentraţie crescută de zahăr. Este recomandată drojdiilor utilizate la
obţinerea spirtului de melasă cu un randament superior în alcool etilic.

Frigofilia. Reprezintă adaptarea drojdiilor de a produce fermentaţia la temperaturi mai

scăzute de 10-15oC. În acest fel sunt evitate fermentaţiile secundare, iar în vin sunt acumulate mai
multe substanţe de aromă.
 Caracterul killer. Acesta este întâlnit la unele drojdii capabile de a sintetiza intracelular o
toxină cu efect inhibitor asupra altor drojdii sensibile. De exemplu, în selecţionarea drojdiilor de
vin, culturile care au caracter k dau randamente superioare deoarece în cursul fermentaţiei are loc
o autoselecţie naturală.

Dinamica multiplicării

Procesul multiplicării populaţiei de drojdii cuprinde mai multe faze :

1. Faza de latenţă (lag)

– dureazã între momentul introducerii germenului în mediul de cultură (inoculare)

si momentul în care celulele acestuia încep să se multiplice(de nivelul a câteva ore)
– nr. bacteriilor din inocul rămân neschimbate cultura nu este vizibilă la microscop
– bacteriile acumulează în celulă metaboliţi esenţiali, sisteme enzimatice necesare creşterii
– perioadă de adaptare la noile condiţii de cultivare (de viaţă) mediu
nutritiv, temperatură, pH, aeraţie, timp cu atât mai scurt cu cât noul mediu este mai apropiat
de cel vechi ;
– transvazarea inoculului care poate provenii dintr-o cultură aflată în curs de multiplicare
dintr-un mediu nutritiv cu aceeaşi compoziţie sau m ediu nutritiv cu altă compoziţie.In primul
caz , cultura îşi păstrează ritmul rapid de dezvoltare şi are loc transvazarea inoculului în
intermediar pentru obţinerea unor cantităţi mai mari de inocul, în timp ce în al doilea caz
intervine o perioadă de adaptare şi o creştere neevidentă de la început.

2.Faza de multiplicare exponenţială (creştere logaritmică)

– accelerare a ritmului de creştere

– multiplicarea se produce cu o viteză progresivă mărită
– diviziunile sunt sincronizate, nr. celulelor se dublează brusc, la intervale de timp
regulate în progresie geometrică
– creştere exponenţială , timp de 2-3 ore, dupã care tendinţa de multiplicare rapidă scade
progresiv prin epuizarea substanţelor nutritive
– acumularea de produse de catabolism cu efect inhibitor
- perioada de post-lag, spre sfârşitul fazei de multiplicare logaritmică cu încetinirea,
desincronizarea creşterii populaţiei, amorsate biosintezele în culturi continui.
3.Faza staţionară maximă
– numărul celulelor viabile este maxim, rămâne constant timp de ore la câteva zile
– epuizarea substanţelor nutritive
– acumularea unor produşi toxici
– celulele nu se mai multiplică
4. Faza de declin

– scăderea progresivă a numărului celulelor viabile

– celule bătrâne
– fenomene de involuţie
– în unele cazuri fenomene de autoliză