Tema: Mediile nutritive utilizate pentru cultivarea algelor.

Prepararea mediilor nutritive lichide şi solide. Sterilizarea

mediilor de cultură.
Un mediu de cultură reprezintă un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie să asigure
microorganismelor cantitatea necesară de apă, sursa de carbon, de azot, săruri minerale, deci care
să le furnizeze substanţele şi energia necesare în procesele de creştere, reproducere şi întreţinerea
funcţiilor vitale.
Actualmente se cunosc numeroase medii nutritive utilizate la cultivarea algelor.
Mediile nutritive pot fi clasificate după trei criterii principale:
După consistenţă - lichide, semisolide, solide;
Compoziţia chimică - naturale, sintetice, semisintetice;
Frecvenţa şi scopul utilizării în laborator - uzuale şi speciale.
Mediile nutritive recomandate pentru cultivarea artificială a algelor sunt variate (unele
reţete de medii nutritive sunt prezentate în Anexa nr.1). Selectarea mediilor nutritive depinde de
specificul obiectului cultivat şi de scopul cultivării. Mediile nutritive pot fi lichide şi solide
(agarizat). Mediile lichide se utilizează pentru obţinerea biomasei algelor şi pentru cercetările
morfologice, citologice, fiziologo-biochimice etc. Mediile solide sunt utilizate pentru păstrarea
colecţiilor algale (muzeu).
Una dintre cele mai esenţiale aspecte ale tehnologiilor de cultivare a algelor este
asigurarea cu elemente necesare nutriţiei minerale. Pentru sinteza substanţelor biologic active în
biomasa algelor este necesar ca acestea să fie asigurate cu macro- şi microelemente. Majoritatea
algelor au nevoie de azot pentru sinteza proteinelor. Pentru creşterea eficientă a algelor mediile
nutritive trebuie să conţină şi P, K, Mg, S. Calciul, de exemplu, este necesar doar în concentraţii
reduse. Printre elementele ce sunt necesare pentru cultivarea algelor cianofite se enumeră şi
natriul, care face parte din grupa macroelementelor esenţiale.
O importanţă mare o au şi microelementele, care se manifestă deseori în calitate de
factori limitativi ai creşterii celulelor algale. Sunt necesare în cantităţi mici, dar au o importanţă
deosebită pentru cultivare, deoarece intră în componenţa multor fermenţi. În categoria lor pot fi
incluse 10 cele mai importante elemente: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Si, Mo, Cl, V, Co. Din punct de
vedere fiziologic, pot fi divizate în trei categorii în funcţie de necesitate:
1) pentru fotosinteză - Mn, Fe, Cl, Zn şi V;
2) pentru metabolismul azotului - Mo, B, Co, Fe;
3) pentru alte funcţii metabolice - Mn, В, Co, Cu, Si.

Lucrare practică. Prepararea mediilor nutritive lichide şi solide

Materiale necesare pentru efectuarea lucrării practice: reagenţi chimici, cutii Petri,
etanol, pipete, ansă, spatula Drigalski, balanţă electronică cu precizie de 0,1 g, PH-MetruADVA,
pahare Berzelius, eprubete sterile cu dop, baloane Erlenmeyer cu dop, bec de gaz sau spirtieră,
autoclav, lampă UV.
Mersul lucrării:
Prepararea mediilor nutritive este o etapă importantă a procesului de cultivare a algelor.
Metodele clasice de preparare a mediilor nutritive lichide pentru cultivarea algelor includ
următoarele etape:
1. Selectarea şi utilizarea reactivelor chimice (ce sunt destinate pentru analize) indicate în
recetă;
2. Cântărirea şi adăugarea reactivelor în mediul nutritiv în ordinea indicată în recetă;
3. Fiecare sare se adaugă în mediul nutritiv după dizolvarea sării precedente;
4. Sărurile de Fe se dizolvă separat în volume mici de apă fiartă, după care se răcesc şi se
adaugă în mediul nutritiv sterilizat;
1
 5. În mediul nutritiv sterilizat şi răcit se adaugă soluţia sterilizată de microelemente;
6. Pentru omiterea sedimentării mediilor nutritive, componentele mediului se recomandă
a fi pregătite separat în volume mici. Soluţiile trebuie sterilizate şi după răcire ele se combină,
fiind adăugat volumul necesar de apă;
7. După necesitate, se ajustează pH-ul cu ajutorul soluţiilor speciale.
Prepararea mediilor nutritive solide
Mediile nutritive solide tipice se pregătesc din cele lichide adăugându-se agar-agar 15 g/l.
Concentraţiile mici de 7-10 g/l de agar se utilizează pentru obţinerea mediilor nutritive
semisolide.
Agar-agarul denumit şi geloză este un extract de alge roşii din genul Gelidium şi
Gracilaria, recoltate în mările Japoniei sau ale Noii Zeelande. Agarul are proprietăţi absorbante.
Păstrat în apă, nu se solubilizează. Prin absorbţia apei îşi măreşte volumul de 16-17 ori. Se
dizolvă în apă la temperaturi mai mari de 90°C şi se transformă în gel prin răcire la temperatura
de 45°C.
Mersul lucrării:
1. Se pregăteşte mediul nutritiv conform indicaţiilor descrise la pregătirea mediilor de
cultură lichide;
2. În mediul nutritiv lichid se adaugă agar-agar 15 g/l.
3. Mediul se încălzeşte până la fierbere pentru dizolvarea agarului.
4. Mediul obţinut se introduce în recipientul de cultivare (cutia Petri) şi se răceşte.
5. După solidificare mediul nutritiv este utilizat pentru cultivare.
Sterilizarea mediilor nutritive
Sterilizarea mediilor nutritive este operaţiunea de distrugere a microorganismelor
prezente într-un mediu nutritiv. Există mai multe metode de sterilizare:
1. Metode fizice - căldura, radiaţia ultravioletă, filtrarea, ultrasunetul;
2. Metode chimice - substanţe antiseptice etc.
Mediile lichide se sterilizează, de regulă, prin autoclavare (la temperatura de 121°C timp
de 20 min.). Autoclavarea reprezintă sterilizarea cu vapori de apă sub presiune. Este cel mai
frecvent utilizată în practică (pentru obţinerea culturilor bacteriologic curate), este o sterilizare
completă şi sigură. Vaporii de apă supuşi presiunii rezultă cu temperaturii de peste 100°C.
Astfel, la 0,5 atmosfere temperatura este de 115°C; la 1 atmosferă temperatura este de 121°C; la
1,5 atmosfere - de 127 °C, la 2 atmosfere - de 135°C.
Sterilizarea cu ajutorul lămpii ultraviolete
Acest tip de sterilizare este pe larg utilizat, însă radiaţia ultravioletă este periculoasă
pentru sănătatea omului (în special pentru ochi), astfel că trebuie să excludem contactul razelor
cu corpul uman. În procesul funcţionării lămpilor se elimină ozon, care la fel este toxic pentru
om. Razele ultraviolete la 260 nm au efect letal asupra microorganismelor. Razele ultraviolete nu
pătrund prin sticla obişnuită, de aceea pentru sterilizarea mediilor nutritive lichide cu volum
mare se recomandă utilizarea lămpilor rezistente la apă pentru administrarea lor subacvatică.
Sterilizarea mediilor nutritive solide
Pentru sterilizarea mediilor nutritive solide, ca şi în cazul mediilor lichide, de regulă, se
utilizează autoclavarea (15 minute la 121°C). La utilizarea cutiilor Petri agarul se repartizează
uniform pe vasul steril cu instrumente sterile, după care se răceşte. Pentru evitarea infectării,
volumul agarului nu trebuie să depăşească jumătate din volumul vasului Petri.

Sarcini de lucru:
1. Formulaţi concluzii din 5-6 fraze în baza materialului studiat.
În urma studierei temei teoretice am acumulat numeroase cunoștințe cu privire la: mediile
nutritive utilizate pentru cultivarea algelor, prepararea, prepararea mediilor nutritive lichide şi
solide, sterilizarea mediilor de cultură. Una din cele mai importante caracteristici a unui mediu
nutritiv este asigurarea acestuia cu macro- și microelemente cum ar fi :K, P, Mg, S Ca (în
cantități reduse), azot pentru cultivarea cianofitelor, etc. În dependență de obiectul specific

2
cultivat și scopul cultivării acestora mediile pot fi clasificate în mai multe categorii: lichide-
obţinerea biomasei algelor şi pentru cercetările morfologice, citologice, fiziologo-biochimice,
solide- pentru păstrarea colecțiilor algale, semisolide (după consistență), natura, sintetice,
semisintetice (compoziția chimică), etc. De asemenea o etapă importantă în prelucrarea mediilor
nutritive reprezinta sterilizarea acestora- distrugerea microorganismelor din componenta
acestuia. Mediile lichide de regula se stirilizeaza prin autoclavare- cu vaporti de apă sub presiune
și cu ajutorul lampii ultraviolete; cele solide de regulă se stirilizează doar prin autoclavare.
Consider că informațoa obținută în urma studierii temelor teoretice ne va fi de mare ajutor la
aplicarea acestora în practica, în timpul preparării mediilor lichide și solide.

2. Explicaţi importanţa mediilor nutritive în asigurarea algelor cu substanţe nutritive.

După cum am menționat anterior, selectarea mediilor nutritive depinde de specificul
algelor cultivate și scopul cultivării acestora, astfel mediile lichide se utilizează pentru
obţinerea biomasei algelor şi pentru cercetările morfologice, citologice, fiziologo-
biochimice etc., mediile solide sunt utilizate pentru păstrarea colecţiilor algale (muzeu).
Microelementele din componența mediilor se manifesta deseori ca factori limitativi ai
creșterii acestora. Astfel în dependență de microelementele din mediu acesta îndeplinește
diferite funcții fiziologice cum ar fi:fotosinteza, metabolizmul azotului și alte funcții
metabolice.
3. Prepară (în laborator) mediul nutritiv lichid Zarrouk pentru cultivarea speciei Spirulina
platense conform indicaţiilor metodice, anexa 1.
4. Prepară (în laborator) mediul nutritiv agarizat Drew pentru cultivarea speciilor de
cianoprocariote azotfixatoare conform indicaţiilor metodice, anexa 1.

Tema: Obţinerea în culturi a unor specii de alge

După colectarea probelor de alge din natură (din bazinele acvatice sau a algelor din sol)
urmează etape de lucru în ce priveşte realizarea culturilor de laborator, care sunt: culturi brute -
dense; culturi monoalgale; culturi pure („axenice”), lipsite de bacterii, ciuperci sau protozoare;
culturi intensive.
Obţinerea culturilor brute
Culturile brute reprezintă prima etapă de cultivare a algelor în laborator; în esenţă, ele
sunt reprezentate de probe (fragmente) preluate dintr-o biocenoză naturală şi transferate în
condiţii de laborator. Aici, proba respectivă poate fi divizată în mai multe părţi, la fiecare fiind
apoi adăugate anumite substanţe nutritive sau chiar medii complete. Ulterior, aceste culturi brute,
care, de regulă, conţin mai multe specii (dar nu toate speciile existente iniţial în algocenoza
respectivă), servesc drept sursă pentru izolarea unor specii de alge ce urmează să devină „culturi
monoalgale”.
Obţinerea culturilor monoalgale
Probele care conţin o singură specie de alge reprezintă o etapă importantă în obţinerea
culturilor de laborator. Ele constituie rezultatul separării dintr-o „policultura” a unei singure
specii de alge. Pentru obţinerea culturilor algologice curate, trebuie să cunoaştem informaţia
despre ciclul lor de viaţă, despre structura şi reproducerea celulelor.
Se cunosc mai multe procedee de divizare a algelor în monocultură - metode bazate pe
utilizarea mediilor nutritive agarizate şi lichide.
Utilizarea agarului solid este frecvent aplicat în practica de obţinere a monoculturilor
algale. Concentraţia agarului variază în limitele 0,8-2%, unele alge pot creşte pe agar cu
concentraţii de 0,3-0,6%. Mediile agarizate permit apariţia şi dezvoltarea masivă a ciupercilor,
care însă pot fi înlăturate prin filtrarea inoculului şi a substanţelor organice. Dacă se observă
creşterea masivă a ciupercilor, atunci aceste vase nu trebuie deschise, ci îndepărtate si sterilizate.

3
Mediile agarizate permit obţinerea monoculturilor algale pe o perioadă de la câteva zile până la o
lună.
În cutia Petri se introduce mediul nutritiv agarizat (1,6-1,8% agar), la suprafaţa mediului
solid se introduce 0,2-0,3 ml de apă distilată sterilizată (în funcţie de mărimea cutiei Petri) ce se
distribuie cu ajutorul spatulei sterile.
Trebuie ca în 1,5-2 zile apa să se îmbibe în mediu nutritiv. După administrarea apei în
cutiile Petri se adaugă o cantitate redusă de suspensie algală, ceaşca se închide şi se expune la
lumină.
Peste 2-3 săptămâni la suprafaţa agarului încep să apară colonii de alge. Printre ele, de
regulă la marginile cutiei, pot fi găsite colonii cu o singură specie. Aceste colonii vor fi inoculate
pe mediu nutritiv agarizat proaspăt.
Obţinerea monoculturilor din culturi brute dense
Această metodă are ca scop obţinerea monoculturilor algale la utilizarea atât a mediilor
solide, cât şi a celor lichide. Ea poate fi utilizată, în special, pentru obţinerea culturilor algologice
pure de alge edafice sau aerofile.
Probele de alge colectate din natură (în cazul când algele formează cruste „înflorirea
solului”) se expun în apa distilată sterilizată. O porţiune mică se microscopiază şi se determină,
în funcţie de parametrii morfologici, care alge predomină. După aceasta selectăm specia ce ne
interesează. Probele se spală bine (de 4–5 ori cu apă distilată) pentru înlăturarea primară a
particulelor solide şi a altor alge, dar şi a bacteriilor alipite crustei. Apoi algele sunt expuse din
nou în apă distilată, fiind supuse procedurii de centrifugare pentru separarea secundară de unele
bacterii şi nevertebrate. După centrifugare probele se utilizează pentru inoculare.
Obţinerea culturilor algale pure (axenice)
Pentru stabilirea activităţii algelor trebuie să avem culturi algale pure din punct de vedere
bacteriologic. Ideea despre culturi bacteriologic pure a fost înaintată de Koch şi Pasteur. De
menţionat că obţinerea culturilor algale pure se realizează nu dintr-o celulă, ci din populaţie
algală, care la cultivarea îndelungată sau la schimbarea condiţiilor de cultivare pot suferi unele
modificări ce pot contribui la schimbarea proprietăţilor culturii algale. De aceea, trebuie să
stimulăm obţinerea tulpinilor sau a clonelor selectate dintr-o celulă.
Culturile algale pure sunt preferate în cazul cultivării algelor pentru obţinerea biomasei
utilizate în alimentaţia umană, ca sursă medicamentoasă şi în cadrul cercetărilor ştiinţifice. În
cele ce urmează vom descrie unele modalităţi de obţinere a culturilor algale pure.

Lucrare practică. Pregătirea inoculului algal şi metodica de inoculare pe medii

nutritive lichide şi solide
Inocularea culturii de alge dintr-un mediu lichid în alt mediu lichid proaspăt se realizează
prin adăugarea unui volum mic de cultură inoculată, numită inocul, la un mediu nutritiv proaspăt
pregătit.
Materiale necesare pentru efectuarea lucrării de laborator: culturi de alge crescute în
baloane Erlenmeyer, culturi de alge crescute în cutii Petri, pinsete, pipete, ansă, ace de preparare.
Mersul lucrării:
Inocularea în cutia Petri pe mediu agarizat sterilizat se va efectua astfel:
1. Coloniile în formă de crustă se vor dispersa cu ajutorul pensetei sterile în bucăţi mai
mici şi mai mari.
2. Bucăţile mai mari se aranjează în formă de cerc la suprafaţa mediului agarizat la
distanţa de 1 cm de marginea cutiei Petri formând prima circumferinţă, iar bucăţile mici se
aranjează la fel în formă de cerc la suprafaţa mediului agarizat formând a două circumferinţă
(fig. 1).
3. În mijlocul celei de a doua circumferinţe se expune o porţiune mică de crustă. Probele
inoculate se expun în cultivator la iluminare continuă şi temperatura necesară.

4
 Fig. 1. Inocularea algelor colectate pe mediu agarizat
4. Inocularea probelor în mediu lichid sterilizat se efectuează în baloane Erlenmayer cu
volum de 100 ml, volumul mediului lichid fiind de 50 ml.
5. Se administrează 40 mg de inocul pregătit, probele se agită puţin şi se expun la
iluminare continuă şi temperatura necesară.
6. Pentru o mai bună iluminare şi schimb de gaze, volumul culturii din balonul
Erlenmeyer trebuie să fie astfel încât grosimea stratului lichid să nu depăşească 3 cm.
După ce se obţine o creştere masivă a biomasei probele se microscopiază, se selectează
specia predominantă şi se expune din nou pe mediu nutritiv. Etapele se repetă până la obţinerea
unei culturi monoalgale.
Sarcini de lucru:
1. Formulaţi concluzii din 4-5 fraze în baza materialului studiat.
În urma colectării preparatelor din bazinele acvatice sau din sol, de regulă examinatorii
au ca scop obținerea unor culturi: brute, monoalgale și pure. Culturile brute de regulă
sunt cele luate direct dintr-o biocenza naturală și transferate în condiții de laborator.
Acestea pot conține mai multe specii de alge. Culturile monoalgale sunt cele care conțin
o singură specie și se pot obține în urmatorul mod:metode bazate pe utilizazare mediilor
nutritive agarizate și lichide. Culturile pure (axenice) obținute dintr-o populație algală
care la cultivarea îndelungată sau la schimbarea condiţiilor de cultivare pot suferi unele
modificări ce pot contribui la schimbarea proprietăţilor culturii algale.
2. Enumeraţi etapele de lucru privind obţinerea în culturi a unor specii de alge.
 probele acumulate din natura și divizate, cu obținerea culturilor brute.
 Prin utilizarea mediiilor agarizate și lichide se obțin culturile monoalgale.
 Obținerea monoculturilor din culturi brute dense: Probele de alge colectate din
natură (în cazul când algele formează cruste „înflorirea solului”) se expun în apa
distilată sterilizată. O porţiune mică se microscopiază şi se determină, în funcţie
de parametrii morfologici, care alge predomină. După aceasta selectăm specia ce
ne interesează. Probele se spală bine (de 4–5 ori cu apă distilată) pentru
înlăturarea primară a particulelor solide şi a altor alge, dar şi a bacteriilor alipite
crustei. Apoi algele sunt expuse din nou în apă distilată, fiind supuse procedurii
de centrifugare pentru separarea secundară de unele bacterii şi nevertebrate. După
centrifugare probele se utilizează pentru inoculare.
 Prin cultivarea populațiilor algale pe o perioadă îndelungată, sau la schimbarea
condițiilor de cultivare, acestea suferă modificări care contribuie la modificarea
proprietăților culturilor algale.
Rezultatele obținute:

5
3. Efectuaţi (în laborator) inocularea pe medii nutritive lichide a unei culturi de alge.
4. Efectuaţi (în laborator) inocularea pe medii nutritive solide a unei culturi de alge.
5. De prezentat imagini (foto) cu mediile de cultură inoculate personal în laborator.
Anexa 1
Mediul nutritiv Zarrouk
Ingredientul Cantitatea, g/l
NaHCO3 16,8
NaNO3 2,5
К2НРО4*3Н2О 0,5
K2SO4 1
NaCl 1
MgSО4*7H2О 0,2
CaCl2*6H2О 0,04
FeSO4 0,01
EDTA 0,08
Soluţie de microelemente 4 ml
рн 9,5
Soluţie de microelemente pentru mediul nutritiv Zarrouk
Ingredientul Cantitatea, g/l
H3BO3 2,86
MnCl2*4H2О 1,13
ZnSО4*7Н2О 0,222
NaMoO4*5H2O 0,39
Co(NО3)2*6H2О 0,049
CuSО4*5H2О 0,079

Mediul nutritiv Drew

Ingredientul Cantitatea, g/l
K2HPO4 0,2
MgSO4*7H2O 0,2
CaCl2 Urme
FeCl3 Urme
Mediu cu extract din sol
Ingredientul Cantitatea, g/l
K2HPO4 0,02
6
 MgSO4*7H2O 0,02
Extract de sol 100 ml
Apă distilată 900ml

Extractul de sol se prepară prin dizolvarea a 1 kg sol de grădină în 1l apă distilară, se

agită şi se lasă pe 30 minute, după care se filtrează şi se utilizează.