UNIVERSITATEA TRANSILVANIA BRAOV

FACULTATEA DE ALIMENTAIE I TURISM

MICROBIOLOGIE ALIMENTARA LUCRRI PRACTICE

Dr. Puchianu Gheorghe Medic Primar Veterinar Doctor n tiine Medicale Veterinare

Dr. Drghici Emilia Medic Veterinar Cercettor tiinific

2010

Condiiile pentru funcionarea laboratoarelor supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor

Funcionarea laboratoarelor n care se desfoar activiti supuse autorizrii sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor este condiionat de autorizarea acestora de ctre autoritile competente. Categoriile de laboratoare supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor, sunt: laboratoarele de referin: pentru sigurana alimentelor, organizate n cadrul Institutului de Igien i Sntate Public Veterinar; alte laboratoare naionale de referin desemnate prin ordin al preedintelui Autoritii Naionale Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor; laboratoare sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene, respectiv al municipiului Bucureti, organizate n cadrul direciilor sanitar-veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene, respectiv a municipiului Bucureti; laboratoare sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor organizate n cadrul unitilor de nvmnt medical veterinar superior de stat, desemnate de autoritatea competent s efectueze anumite analize sau examene n cadrul controlului oficial; laboratoare organizate n cadrul institutelor de cercetare de stat n care se desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor; laboratoarele private sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor, care includ:laboratoare sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor particulare ori organizate n uniti private n care se desfoar activiti sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor;laboratoare organizate n uniti n care se desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor, cunoscute sub denumirea de laboratoare uzinale; laboratoare sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor organizate n cadrul unitilor de nvmnt medical veterinar superior privat, desemnate de autoritatea competent s efectueze anumite analize sau examene n cadrul controlului oficial; laboratoare organizate n cadrul institutelor de cercetare private n care se desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor. Laboratoarele naionale de referin sunt autoriti centrale pentru domeniile de competen autorizate, iar laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene, respectiv al municipiului Bucureti, sunt autoriti judeene n domeniu. Acestea funcioneaz sub coordonarea tehnic i operaional a Serviciului de coordonare tehnic a institutelor de referin i a laboratoarelor sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor din cadrul Autoritii Naionale Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor. Laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor de supraveghere i diagnostic din structura institutelor veterinare centrale sunt autoriti centrale pentru domeniul lor de competen i funcioneaz sub coordonarea tehnic, controlul i supravegherea Serviciului de coordonare tehnic a institutelor de referin i a laboratoarelor sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor din cadrul Autoritii Naionale Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor. Laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene, respectiv al municipiului Bucureti, sunt autoriti judeene pentru domeniile lor de competen i funcioneaz n cadrul direciilor sanitar-veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene i a municipiului

Bucureti, sub coordonarea tehnic a laboratoarelor din cadrul institutelor veterinare centrale i coordonarea operaional prin Serviciul de coordonare tehnic a institutelor de referin i a laboratoarelor sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor din cadrul Autoritii Naionale Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor. Laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor organizate n cadrul unitilor de nvmnt medical veterinar superior de stat i privat nu au statutul de autoriti n domeniu i funcioneaz sub supravegherea tehnic a institutelor veterinare centrale. Laboratoarele organizate n cadrul institutelor de cercetare de stat i private n care se desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor nu sunt autoriti n domeniu i funcioneaz sub supravegherea tehnic a institutelor veterinare centrale. Celelalte laboratoare private n care se desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor nu sunt autoriti n domeniu i funcioneaz sub supravegherea tehnic a direciilor sanitar-veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene i a municipiului Bucureti, prin laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene, respectiv al municipiului Bucureti. Buletinele de analiz emise de laboratoarele autorizate Laboratoarele naionale de Referin i Laboratoarele sanitare veterinare Judeene, precum i cele emise de laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor organizate n cadrul unitilor de nvmnt medical veterinar superior de stat i privat autorizate au caracter oficial. Activitile pentru care se autorizeaz laboratoarele n care se desfoar activiti supuse autorizrii sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor, menionate n domeniul siguranei alimentare sunt urmtoarele: 1. laborator de microbiologia alimentelor i a hranei pentru animale - cu profilurile: a) microbiologia produselor i subproduselor animaliere i de origine animal; b) microbiologia produselor de origine nonanimal; c) microbiologia hranei pentru animale i apei; 2. laborator de analize fizico-chimice ale alimentelor i hranei pentru animale - cu profilurile: a) analize fizico-chimice ale produselor i subproduselor animaliere i de origine animal; b) analize fizico-chimice ale produselor de origine nonanimal; c) analize fizico-chimice ale hranei pentru animale; 3. laborator pentru controlul radioactivitii i detecia alimentelor iradiate - cu profilurile: a) controlul radioactivitii; b) detecia alimentelor iradiate; 4. laborator pentru controlul reziduurilor - cu profilurile: a) control reziduuri la animale vii; b) control reziduuri la produse animaliere i de origine animal; c) control reziduuri din ap i hran pentru animale; d) control reziduuri la produse de origine nonanimal.

Condiii pe care trebuie s le ndeplineasc un laborator Condiii de amplasare - trebuie s includ: referine generale privind distanele, structura terenului i nivelul apei freatice, existena cilor de acces adecvate, a unei suprafee de teren de rezerv sau tampon pentru eventuala extindere. Amplasarea cldirilor destinate laboratoarelor se face astfel nct: distana fa de cldirile nvecinate i drumurile publice s fie astfel proiectat nct s asigure respectarea prevederilor legale privind protecia mediului, sigurana cldirilor, sntatea public i sntatea animalelor; structura terenului i nivelul apelor freatice s permit amplasarea construciei n conformitate cu reglementrile n vigoare; s aib ci de acces proprii adecvate scopului de activitate. Condiii pentru construcie 1. Condiiile pentru construcie trebuie s includ: natura i calitatea materialelor de construcie, a fundaiei, a pavimentelor, a suprafeelor interioare, a uilor i ferestrelor, a acoperiului i a echipamentelor de iluminare, ventilaie i protecie antiseismic. 2. Construcia realizat trebuie s fie rezistent, s aib spaiu suficient pentru desfurarea proceselor de lucru i s asigure condiiile pentru aplicarea msurilor de igienizare, realizarea confortului termic i condiiile tehnice de funcionare a echipamentelor. 3. Materialele de construcie trebuie s fie netoxice, impermeabile, netede, rezistente la uzur i coroziune i s se poat cura uor. Nu se accept folosirea materialelor absorbante, poroase, greu de curat. 4. Pavimentele i pereii interiori trebuie construii din materiale netoxice, rezistente la ageni fizici i chimici, impermeabile, neputrezibile i netede, nct s permit igienizarea uoar i eficient a acestora, protecia termic i protecia fonic. 5. Tavanele din spaiile de lucru trebuie construite din materiale netoxice, rezistente la ageni fizici i chimici, impermeabile, neputrezibile i netede, nct s permit igienizarea uoar i eficient a acestora, protecia termic i protecia fonic, i s fie situate la o nlime corespunztoare, adecvat specificului activitii. 6. Instalaiile electrice trebuie astfel proiectate i instalate nct s respecte reglementrile n vigoare cu privire la energia consumat, protecia mediului, a sntii publice i sntii animalelor. 7. Corpurile de iluminat trebuie astfel amplasate nct s asigure iluminatul adecvat specific activitii. 8. Uile i ferestrele trebuie confecionate din materiale netoxice, rezistente la ageni fizici i chimici, impermeabile, neputrezibile i netede, nct s permit igienizarea uoar i eficient a acestora, protecia termic, protecia fonic, adecvate specificului activitii. 9. Acoperiul trebuie s fie construit din materiale rezistente i impermeabile. 10. Ventilaia se asigur n toate spaiile de lucru i administrative prin mijloace adecvate, prin sisteme generale i/sau autonome de climatizare, cu excepia spaiilor speciale n care se realizeaz activiti ce necesit presiune negativ sau alte mijloace de biosecuritate. Condiii privind utilitile 1. Condiiile privind utilitile trebuie s includ: aprovizionarea cu ap potabil i utilitar, alimentarea cu energie electric, asigurarea condiiilor de microclimat, gestionarea i neutralizarea deeurilor, sistemul de canalizare, aprovizionarea cu gaze naturale, protecia mediului i condiii de biosecuritate. 2. Laboratorul trebuie s se aprovizioneze numai cu ap potabil n cantiti suficiente pentru necesitile pe flux i pentru procesul de igienizare. Apa potabil trebuie s provin fie din reeaua de aprovizionare a municipiului sau localitii, fie din surs proprie.

3. n cazul n care unitatea/instituia posed staie de clorinare proprie, se prelev obligatoriu probe de ap din conducta de aducie a apei, ap neclorinat i dup clorinare, pentru a se urmri eficiena operaiei de clorinare a apei. 4. Apa potabil trebuie distribuit n toat reeaua sub presiune adecvat i continu i n cantiti suficiente pentru acoperirea tuturor necesitilor de funcionare a instituiei. 5. Trebuie s se asigure att ap rece, ct i ap cald. Apa cald este furnizat dintr-o instalaie central pentru nclzirea i distribuirea apei calde sau de la instalaii pariale. 6. Nu se admite utilizarea apei nepotabile n procesul de igienizare a spaiilor de lucru i a cilor de acces. 7. Conductele de ap trebuie s fie precis identificate. Trebuie s existe o delimitare separat a fluxului de ap potabil fa de cel de ap nepotabil, prin sistem separat de conducte. 8. n vederea prevenirii contaminrii spaiilor de lucru, conductele interioare vor fi identificate vizibil prin culori diferite, i anume: conducte pentru apa potabil verde; conducte pentru apa nepotabil - negru; conducte de canalizare - negru; conducte de nclzire - rou; conducte de gaze naturale - galben. 9. Alimentarea cu energie electric trebuie s se realizeze din linia de joas tensiune de 380/220 V i surs proprie, n caz de avarie. Pentru aparatura cu risc de electrocutare trebuie asigurat centura de mpmntare, n conformitate cu prevederile legale. 10. Instalaii pentru asigurarea parametrilor de microclimat n spaiile de lucru, astfel: instalaii de captare i evacuare a unor factori nocivi din spaiile de lucru; instalaii pentru meninerea parametrilor de temperatur n spaiile de lucru sau n cele n care este amplasat aparatura de lucru, n special aparatura de nalt precizie; 11. Grupurile sociale trebuie dimensionate n funcie de personalul care activeaz n laboratoare, dotate cu instalaie de ap rece i cald, duuri i vestiare. 12. Pentru managementul deeurilor rezultate din activitile ce au loc n cadrul laboratoarelor sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene trebuie s se respecte reglementrile n vigoare, precum i procedura general intern privind gestionarea deeurilor. Avnd n vedere profilul de activitate al laboratorului i amplasamentul acestuia, materialul patologic i deeurile rezultate n urma activitilor din laborator trebuie denaturate i inactivate prin mijloace adecvate, dup care acestea sunt preluate de o unitate specializat. 13. Laboratorul trebuie s fie prevzut cu o reea de canalizare corespunztoare, racordat la reeaua de canalizare a localitii/oraului sau la un sistem propriu de evacuare. 14. Apele uzate provenite din laborator trebuie tratate pentru a se preveni diseminarea oricrui factor de risc. De-a lungul prii externe a sistemului de canalizare trebuie amplasate guri de vizitare, pentru curenia curent sau pentru deblocare n caz de accidente. Acestea nu trebuie s constituie un pericol de contaminare pentru spaiile de lucru sau pentru zonele nvecinate. 15. Incinta de utilitate a instituiei trebuie s fie betonat sau asfaltat i prevzut cu sistem de canalizare corespunztor. 16. Construcia i incintele trebuie s respecte condiiile de mediu.

Examenul bacteriologic

Examenul bacteriologic presupune izolarea, cultivarea si identificarea germenilor bacterieni din diferite alimente suspecte de contaminare. Fata de examenul microscopic, care permite decelarea prezentei agentului etiologic, metodele bacteriologice complexe permit, pe lnga izolare si cercetarea diferitelor insusiri biologice care-l caracterizeaza. Faptul are o deosebita importanta si din punct de vedere epidemiologic, prin aceste examene evitindu-se, de exemplu darea in consum a unor produse animaliere care pot provoca la om infectii sau toxiinfectii, uneori cu evolutie grava. Este suficient sa se aminteasca pericolul pe care-l prezinta, mai ales carnea animalelor sacrificate de necesitate, la care intreruperea procesului patologic, prin sacrificare, face ca modificarile organoleptice si organice sa nu trezeasca suspiciune la examinare. Un examen bacteriologic insa poate pune in evidenta agentii unei salmoneloze, leptospirozei, antraxului etc. toate transmisibile la om. Examenul bacteriologic da adesea si indicii referitoare la sursa de infectie si permite deci, eliminarea ei. Tehnica samnarii - ca tehnici de insamintare pot fi aplicate mai multe procedee:
a) Cu pipeta Pasteur. Se cauterizeaza suprafafa probei cu o spatula incalzita, se extrage cu ajutorul unei pipete Pasteur, flambata si ea si racita, o cantitate de lichid organic din profunzime si se insaminteaza nti pe mediul lichid (bulion), iar apoi pe mediul solid (agar inclinat, agar cu singe, agar ou ser etc.). La inchiderea si deschiderea tuburilor se iau toate masurile de asigurare a sterilitatii, flambnd gura lor imediat dupa deschidere si inainte de inchidere. b) Cu ajutorul acului de insamintare drept. Se cauterizeaza suprafaa produsului alimentar si se sterilizeaza acul prin incalzire la rosu (tija se trece si ea de 3 ori prin flacara), iar dupa racire se inteapa prin suprafaa cauterizata, facnd cteva miscari spre interior. Se scoate acul din si se face insamntarea prin clatirea acestuia in mediul lichid. Fara a se flamba, acul se introduce apoi in tubul cu mediul solid, facndu-se pe suprafaa acestuia miscari in zig-zag, incepnd de la baza mediului spre partea superioara, sau se clateste acul in lichidul de condensare, dupa care se umecteaza intreaga suprafaa a mediului cu acest lichid, prin inclinari repetate. Dupa fiecare proba, acul se sterilizeaza prin inrosire la flacara. c) Cu poriuni de aliment. Cnd alimentul a fost recoltat in conditii de sterilitate (mai ales in cazul animalelor mici) se poate recurge la secionarea unor bucai cu ajutorul unor instrumente sterile, iar cu una din suprafeele sectiunii se disperseaza materialul patologic pe suprafaa unei placi cu mediu. In unele laboratoare aceasta tehnica este folosita aproape in exclusivitate. d) Prin introducerea direct, in mediu a portiunilor de aliment. Metoda se foloseste mai rar, in special cind se banuieste saracia in germeni a materialului patologic. Recoltarea si manipularea acestuia trebuie sa se faca in conditii de sterilitate perfecte.

Ca principiu general, se va evita deschiderea probelor alimentare sau secionarea tesuturilor inainte de recoltarea materialului pentru examenul bacteriologic. Tehnica transplantarilor. Are ca scop fie izolarea din culturile mixte a diferitilor germeni in stare pura, fie meninerea lor in timp, in conditii de laborator (tulpini de colectie). Din culturile pe medii lichide, transplantarea se face cu pipeta Pasteur sau cu ansa de insamintare. In primul caz, se recolteaza o cantitate arbitrara (cteva picaturi) din cultura veche, care apoi se insamnteaza in mediul proaspat. In cel de al doilea, se introduce ansa flambata si racita in cultura veche, dupa care se face insamntarea pe mediile proaspete (inti in mediul lichid si apoi in mediul solid, daca este cazul). Din culturile pe medii solide, transplantarea se face cu ansa, raclnd o cantitate foarte redusa de cultura, care apoi se depune pe mediile proaspete.

In timpul insamntarilor de orice natura, este necesar sa se aiba in vedere cteva reguli general valabile: nsmnrile se execut n boxe sterile sau n hote speciale care permit sterilizarea periodic i nu permit formarea de cureni de aer n timpul lucrului; n timpul operaiunilor de nsmnare se evit pe ct posibil conversaia i orice micare de prisos n jurul operatorului; ansa cu care se execut nsmnarea nu trebuie s fie atins de nici un obiect nesteril (mn, halat, mas de lucru, etc.); nsmnrile se vor executa ct mai repede, cu scopul de a reduce la minim contactul materialului de nsmnat cu atmosfera ambiant; n timpul ct recipientele sau tuburile de cultur, sterile sau nsmnate sunt deschise, vor fi inute n poziie nclinat ct mai aproape de flacr pentru a evita contaminarea cu germeni sau spori din atmosfer; imediat dup nsmnare se face notarea tuburilor cu creioane speciale fr a se omite data nsmnrii.

Mediile de culture folosite pentru izolarea diferitelor tipuri de bacterii Pentru a pune un diagnostic bacteriologic corect, sigur si prompt, folosirea unor medii de cultivare corespunzatoare este de o importanta hotrtoare. Cunoscndu-se insusirile germenilor cautati, conditiile lor optime de dezvoltare, bacteriologul trebuie sa foloseasca mediile cele mai eficiente si indicate de izolare, in funcie de specia microorganismului in cauza. Un mediu de cultura trebuie sa asigure substratul nutritiv pentru cresterea si multiplicarea microbilor, sa aibe un pH care sa permita desfasurarea normala a proceselor metabolice microbiene (in general 7,27,4), sa asigure condiiile de aerobioza sau anaerobioza, sa fie pastrate in recipiente care sa impiedice contaminarea cu alti microbi si sa fie usor de manevrat. In general, microbii patogeni se dezvolta optim la temperature corpului speciei de la care sunt izolati. Sunt insa si specii microbiene care prefera temperaturi mai joase ( ex. leptospirele se multiplica la 2830C). Mediile de cultura se pot imparti in doua categorii: medii uzuale (obinuite) - pe care se dezvolta majoritatea germenilor patogeni. Ele pot fi: pentru bacterii aerobe; pentru bacterii anaerobe; medii speciale, destinate izolarii, cultivarii si cercetarii insusirilor biologice ale anumitor specii de germeni. Ele mai pot fi sistematizate n medii: de izolare, de imbogatire, selective, diferentiale ; mediile speciale de izolare - favorizeaza dezvoltarea anumitor germeni, care nu se pot cultiva de la inceput pe mediile obisnuite, ei necesitnd anumite condiii speciale sau anumii ,,factori de plecare". Mediile de imbogire sunt folosite pentru cazurile in care in produsul patologic de examinat se bnuieste o cantitate mica de germeni patogeni si un numar mare de germeni din flora de asociaie. Astfel de medii sint mediul KaufmannMuller (pentru enterobacteriaceae), mediul Chapman (pentru stafilococi patogeni). Mediile selective favorizeaza, prin compoziia lor chimica, dezvoltarea anumitor germeni. Astfel sint mediul WilsonBlair si Drigalski (pentru salmonele), mediul IstratiMeitert (pentru Escherichia, Shigella, Salmonella), mediile Czapek, Sabouraud (pentru ciuperci). Mediile difereniale permit cresterea difereniata a unor specii microbiene sau pun in evidena anumite particularitati metabolice cu semnificaie diagnostic. Ele evideniaza anumite procese biochimice caracteristice metabolismului anumitor specii de bacterii, permitnd in acest fel identificarea lor (fenomene proteolitice, zaharolitice, oxidoreductoare etc.). Includerea in componena acestor medii a unor substane indicatoare sau revelatoare este menita sa faca vizibil procesul respectiv.
A. B.

Dupa starea lor fizica mediile se pot imparti in: solide, semisolide, lichide.

Dupa compozitie pot fi: medii simple si complexe. Exista si medii ,,sintetice" bazate pe componente cunoscute din punctul de vedere al structurii lor chimice. In comparatie cu bulionul, agarul sau alte medii ale caror componente nu sunt identificate chimic in totalitate, mediile sintetice au avantajul ca permit anumite determinari capabile sa ofere relatii asupra metabolismului bacterian (prin dozarea inainte si dupa cultivare a diferitelor componente se poate cunoaste ce anume a fost consumat in cursul multiplicarii si in ce cantitate). Dintre cele mai frecvent folosite medii de cultura sunt :

Apa peptonata - este unul din cele mai simple medii de cultura, dar care are largi utilizari, in special cnd i se adauga zaharuri, in vederea determinarii spectrului zaharolitic al diferitelor specii de bacterii. Se prepara din: - apa distilata - peptona - NaCl 100,0 ml 1,0 g 0,5 g

Se ajusteaza pH-ul la 7,27,4, se incalzete 15 minute la 115C pentru precipitare, se filtreaza prin hrtie de filtru si se sterilizeaza din nou !a autoclav. Cnd se adauga zaharurile, acestea se pun in proportie de 1% in balonane separate, se adauga albastru de bromtimol (12 ml la 1 litru de mediu) ca indicator si se sterilizeaza prin tindalizare 30 de minute, 3 zile consecutiv. Soluia de albastru de bromtimol folosita in acest scop se prepara din: 1 g albastru de bromtimol + 25 ml NaOH n/10 + 475 ml apa distilata. Bulionul de carne se prepara mai ales din came de bovine i cabaline, mai rar din cea de pasare. Muschii se curaa de aponevroze, tendoane, fascii si grasime, se taie bucati mici, sau se toaca la masina de tocat came. La 500 g tocatura, se adauga 1000 ml apa de robinet, se tine 24 de ore la rece, pentru macerare, apoi se fierbe 30 minute, se decanteaza i se stoarce, iar lichidul obtinut se filtreaza prin mai multe straturi de tifon si se completeaza cu apa la volumul iniial. Se incalzeste la 8090C si se adauga peptona 10 g si NaCl 5 g la 1000 ml lichid. Se ajusteaza pH-ul cu o solutie de NaOH n :1 (la 7,27,6) prin metoda colorimetrica. Se incalzeste la autoclav la 115C timp de 15 minute. Incalzirea in prezenta NaOH produce o precipitare abundenta, ceea ce impune o filtrare prin hirtie de filtru. Apoi se face repartizarea in tuburi, in cantitate de cca 5 ml, in sticle sau baloane, care se astupa cu dopuri de vata si se sterilizeaza 30 minute la auitoclav la 115C. Pentru repartizare se pot folosi pipete de 2550 ml, dar cel mai practic este sa se folosesca dispozitive speciale constnd din vase cu tubulura inferioara sau plnii suspendate, prevazute cu un tub de cauciuc si clem. In unele laboratoare exista dispozitive automatizate care asigura un debit constant, reglabil (aa numitele turntoare de medii). Bulionul astfel preparat are un aspect asemanator cu untdelemnul si trebuie sa fie perfect limpede. Pastrarea lui se poate face vreme indelungata in vase bine inchise, in incaperi reci si la adapost de lumina. La ora actuala, este din ce in ce mai raspindita folosirea extractelor de carne care sint livrate in stare deshidratata, purificata si standardizata, ceea ce asigura obinerea unor medii de o calitate superioara (extractele Merck, Oxoid etc.). Agarul nutritiv (geloza) este un mediu solid obtinut prin adaugarea la bulionul de carne a agarului (fibre sau pulvis). Acesta nu are nici un rol nutritiv, dar determina solidificarea mediului. La 1 litru de bulion, se calculeaza 30 g agar fibre sau 25 g agar pulvis, care se topeste apoi prin incalzire la 115C, timp de 15 minute la autoclav. Se filtreaza prin vata, in autoclavul cu capacul deschis (pentru a evita solidificarea pe parcursul filtrarii). Se repartizeaza in eprubete sau alte recipiente unde urmeaza a fi pastrat. Se astupa cu dopuri de vata, se sterilizeaza 20 de minute la 120C dupa care eprubetele se pun in pziie inclinata pentru solidificare.

Pastrarea se poate face in flacoane inchise etans pentru a evita pierderea apei, dar in general este bine sa nu se prepare sarje prea mari pentru a dispune de mediu ct mai proaspat. Examenul caracterelor culturale Dezvoltarea germenilor bacterieni pe mediile de cultura ia aspecte diferite in functie de specia in cauza, mediul folosit si uneori condiiile de cultivare. Pentru unele specii, o serie de caractere culturale reprezinta particularitati deosebit de pretioase pentru identificarea lor. In mediile lichide, in aprecierea dezvoltarii bacteriilor se au in vedere turbiditatea, depozitul si formatiunile de suprafaa.

Turbiditatea - poate fi pronuntata, discreta sau poate sa lipseasca. Depozitul - ia nastere prin depunerea la fundul tubului a germenilor care s-au dezvoltat in mediu. El poate fi discret sau abundent, granular, vscos sau pulverulent, omogenizabil sau neomogenizabil prin agitare, aderent sau nu la fundul tubului. Suprafata - mediului poate oferi aspectul unei membrane de grosimi variabile, rugoasa, granulara, incretita sau neteda, sau al unui inel de grosimi variabile la suprafata lichidului.

Pe mediile solide, germenii constituie, prin multiplicare, aglomerri cunoscute sub numele de colonii, vizibile cu ochiul liber sau cu lupa. In aprecierea lor, se au in vedere: dimensiunile, forma in ansamblu, profilul, suprafata, marginile, culoarea, opacitatea, consistenta, emulsionabilitatea. Sub aspectul dimensiunii, coloniile pot fi de talie variabila, pina la ciiva milimetri diametru. Forma poate fi circulara, ovalara, radiata sau neregulata;

Profilul (in seciune prezumtiva) poate avea un aspect plat, convex, concav, ombilicat, mamelonat sau papiliform;

Suprafata poate fi neteda, aspra, granulara, lucioasa sau mata; Marginile pot fi uniforme, neregulate sau cu prelungiri;

Culoarea coloniilor este diferita in funcie de prezenta si natura pigmentului pe care eventual il conin (alb, galben, verde, rosu, portocaliu etc.); Sub raportul opacitatii, coloniile pot fi translucide sau opace, intre ele existind grade intermediare; Consistenta este si ea variabila: untoasa, viscoasa, uleioasa, grun-joasa, friabila, filanta, ea determinind cel mai adesea si gradul de aderenta la suprafaa mediului. In timp ce coloniile de consistent untoasa i granulara se desprind cu usurinta, cele visooase adera, determinind o dificultate in desprinderea lor;

Emulsionabilitatea poate fi usoara sau dificila si face ca suspensiile care se practica sa fie omogene sau neuniforme. Citeva exemple in acest sens, pot fi edificatoare. In medii lichide: mediul poate fi tulbure omogen (salmonele, stafilococi);

mediul poate fi tulbure cu un inel pe perete la limita superioara a mediului (E.

coli);

mediul poate fi clar, insa la fund prezinta un depozit grunjos sau nisipos (streptococi); mediul poate fi clar, cu un depozit floconos si aderent la fundul tubului (bacilul

antraxului); mediul prezinta un val subtire la suprafaa (vibrionul holeric); mediul prezinta o membrana uscata la suprafata (Bacillus subtilis); mediul prezinta o membrana groasa, rugoasa, plisata la suprafaa, restul lichidului raminnd limpede (M. tuberculosis); mediul este colorat in verdealbastrui (b.piocianic). Pe medii solide:

E. coli da colonii rotunde cu margini si suprafee netede de 35 mm diametru, de culoare alba-laptoasa, lucioase; Pasteurella da, de regula, colonii mici, abia vizibile, transparente, uneori usor albastrui, aderente la mediu; antraxului da colonii cu suprafata aspra si cu margini avind prelungiri laterale, efilate, care privite cu lupa, au aspectul unor ondulaii ale firelor de par; stafilococii dau colonii rotunde, bombate, cu margini si suprafee netede, unele din ele pigmentate in alb, auriu sau citrin; streptococii dau colonii mici bombate; b. tuberculozei umane produce colonii rugoase, uscate, cu mar gini neregulate.

Bacteriile anaerobe ofera i ele aspecte variabile in functie de mediul folosit in cultivarea lor.

In cazul mediilor lichide, in general, se produce o tulburare uniforma cu sau fara producie de gaze, vizibile sub forma unor bule fie in intimitatea lui, fie la suprafata.

In cazul mediilor semisolide (geloza Veillon) se pot forma doua tipuri de colonii, in functie de difuzibilitatea germenilor in mediu, insusire legata de prezenta mobilitatii . Bacteriile mobile ( Cl. tetani ) produc colonii pufoase de aspect sferoid , in timp ce cele imobile ( Cl. perfringens ) produc colonii de aspect lenticular , de talie variabila Examinarea caracterelor metabolice (biochimice) ale germenilor bacterieni

Au o importan deosebit pentru confirmarea datelor furnizate n urma examinrilor morfo culturale. Ele se bazeaz pe anumite particulariti metabolice ale bacteriilor care sunt variabile n funcie de specia microbian sau chiar de tulpin i au la baz existena unui echipament enzimatic diferit care le confer capacitatea de a aciona asupra unor substane coninute n mediu sau de a elabora n cursul multiplicrii lor anumite substane noi identificabile prin diverse reacii chimice. Reacii de punere n eviden a capacitii zaharolitice fermentarea zaharurilor se datoreaz elaborrii de ctre germeni a unor enzime capabile s scindeze glucidele cu formare de aldehide, acizi i gaze (dioxid de carbon, hidrogen, metan). Ea se determin prin folosirea unor medii de cultur lichide sau solide la care se adaug diferite zaharuri i un indicator care s releve transformrile biochimice care survin deobicei consecutive modificrii pH-lui mediului. Substanele hidrocarbonate care se folosesc cel mai frecvent n acest scop sunt:

1. dizaharide maltoza, lactoza, zaharoza sau sucroza; 2. trizaharide rafinoza; 3. pentoze arabinoza, xiloza, ramnoza; 4. hexoze glucoza, fructoza, manoza, galactoza; 5. polizaharide inulina, amidonul, glicogenul; 6. glicozide salicina, esculina; 7. polialcoli ; 8. alcooli trivaleni (glicerina); tetravaleni (aritrina); pentavaleni hexavaleni (manita, dulcita, sorbita, inozita). (adonita);

Dintre mediile de cultur lichide cel mai frecvent se utilizeaz apa peptonat n care se dizolv n proporie de 1% substana hidrocarbonat ce urmeaz a se identifica i o soluie indicatoare (albastru de bromtimol, tinctur de turnesol, rou neutru). Mediul se repartizeaz de preferin n tuburi de reacie tip Wasermann. n mediul zaharat, nsmnarea tulpinii bacteriene de cercetat se soldeaz cu virarea culorii mediului n caz c s-a produs fermentarea sau cu pstrarea culorii iniiale dac aceasta nu s-a produs. Modificare culorii mediului are loc n timpul incubaiei la 37C dup o perioad variabil n funcie de rapiditatea cu care fenomenele fermentative au loc. La unele specii aceasta se produce dup cteva ore n timp ce la altele este nevoie de o incubaie mai ndelungat de cteva zile sau chiar sptmni. Mediile solide folisite pentru a evidenia capacitatea fermentativ a bacteriilor au nglobate n ele zaharul respectiv i un indicator care relev prin virarea culorii prezena procesului de fermentare, astfel: Partea dreapt

galben - glucoz pozitiv (fermenteaz glucoza) Rou sau nescimbat - glucoz negativ (nu fermenteaz glucoza) Negru - formare de hidrogen sulfurat (H2S) Bule de gaz sau spargerea agarului formare de gaz din glucoz

Partea nclinat

Galben lactoz zaharuri sunt folosite)

i/sau

zaharoz

pozitiv

(unul

sau

ambele

Rou sau neschimbat - lactoz i zaharoz negativ (nici un zahar nu este folosit

Reacii de punere n eviden a existenei fermentilor active fa de substanele proteice i aminoacizi i existena unor produi rezultai din dezintegrarea substanelor proteice. Testul de hemoliz se folosete pentru a determina capacitatea de a hemoliza globulele roii aparinnd unor specii variate (cal, oaie, bovine, cobia, iepure, om). nsuirea este prezent numai la anumite specii bacteriene i este de cele mai mute

ori legat de patogenitatea acestora. Capacitatea hemolizant este prezent n diferite grade la unele tulpini de E. coli, streptococci, stafilococi, listerii, Cl. Perfringens, etc. Hemliza poate fi de tip alfa care se caracterizeaz prin producerea n dreptul i n jurul coloniei a unei decolorri mai mult sau mai pui ntinse nsoit de o nverzire a mediului (datorit modificrilor chimice de oxidare ale hemoglobinei effect viridans) i beta care se caracterizeaz numai prin decolorarea mediului din dreptul i din jurul coloniei i denot o liz total a globulelor roii di zona respectiv. Tulpinile care pe medii cu snge nu au nici un fel de aciune asupra globulelor roii se numesc anhemolitice sau de tip gamma i caracterizeaz de regul germenii lipsii de patogenitate att n condiii experimentale ct i naturale. Pentru stabilirea capacitii hemolitice, nsmnarea se face la suprafa n plci Petri pe mediu ce conine snge defibrinat de diferite specii n proprie de 5%. Citirea se face dup o incubaie de 24 ore la 37C Testul indolului indolul rezult din dezintegrarea triptofanului. Tehnica efectuarii frotiurilor Frotiul este un preparat expeditiv, efectuat din diferite produse patologice (organe, lichide patologice etc.), sau din culturi ale diferitilor germeni, care permite punerea in evidenta a formatiunilor celulare i cerecetarea nsuirilor lor morfologice si tinctoriale. Tehnica efectuarii frotiurilor difer n funcie de materialul din care se face i de natura germenilor in cauz. Din lichide frotiurile se realizeaza prin intinderea materialului respectiv intr-un strat subtire, cu ajutorul unei anse bacteriologice sau a unei lame lefuite pe lame de microscop obinuite. Pelicula de material patologic este recomandabil sa fie cit mai fina i sa aibe o intindere mai redusa decat marginile lamei de microscop. Dac este vorba de frotiuri ce se practica din culturi, in cazul mediior lichide frotiul se face cu ansa bacteriologica, sau cu pipeta Pasteur, din mediul de cultura, iar in cazul mediilor solide se face prelevarea cu ansa bacteriologica a unei cantitati reduse de cultura care se emulsioneaz bine intr-o picatura de apa distilata, pusa in prealabil pe o lama de microscop bine degresata si apoi se intinde suspensia in strat subtire. In cazul culturilor in medii solidificate in pozitie vertical (de exemplu geloza Veillon) se recurge la o pipeta Pasteur la care se adapteaza un tub de cauciuc, in asa fel ca el sa permita manipularea pipetei in profunzimea mediului sub control vizual. Materialul microbian se recolteaza prin aspirarea coloniilor izolate, care se gasesc in diferite puncte ale mediului. Din organe, frotiul se poate realiza in mod diferit in functie de natura acestora. Cel mai frecvent se face prin aplicarea unei lame de microscop pe suprafafa de sectiune a probei de examinat, in acest fel raminind o impresiune corespunzatoare formei suprafetei atinse (metoda amprenta). Este bine ca pe aceeasi lama sa se practice mai multe amprente, pentru a se putea examina frotiurile mai subtiri ( ultimile amprente sunt intotdeauna mai fine). Se poate recurge, de asemenea, la glisarea unei portiuni de organ, tiat geometric, pe suprafaa unei lame de microscop, avndu-se grij de a nu se atinge marginile lamei. Si n acest caz se prefera frotiurile cit mai fine.

Uneori, frotiurile se executa prin strivirea intre doua lame (in cazul unor leziuni de tip nodular. In acest scop, se depune o formatiune nodulara suspecta pe o lama si cu o a doua se strivete prin compresiune. Frotiurile astfel obtinute se fixeaza dupa uscare la flacara i se coloreaza. Fixarea este necesara pentru a realiza o buna aderenta a materialului patologic pe lama si implicit evitarea desprinderii de catre solutiile colorante a materialului de examinat pe de o parte si inactivarea germenilor etalati pe de alta. Fixarea se poate obtine prin mijloace termice sau chimice. Fixarea termica presupune trecerea frotiului uscat de 34 ori prin flacara unui bec de gaz sau a unei lampi cu alcool, avnd grija ca lama sa fie orientata spre flacara cu partea opusa celei pe care s-a etalat materialul. Viteza de trecere este moderata, in asa fel ca in final temperatura lamei sa fie in jur de 60C. Fixarea termica se poate face si prin flambare, punnd pe frotiu citeva picaturi de alcool etilic, metilic sau alcool-acetona (din bateria de colorare Gram) si dindu-li-se foc imediat dupa scurgerea excesului de alcool. Fixarea chimica se realizeaza prin folosirea unor substane fixatoare (alcool etilic, amestec de alcool etilic, eter si alcool metilic). Acestea se pun in cantitate suficienta pentru a acoperi pelicula de material de pe lama si se lasa pna la evaporarea totala. Trebuie mentionat ca unii coloranti (de exemplu soluia Giemsa din metoda cu acelasi nume) au si capacitatea de a fixa frotiurile, asa incit in acest caz nu mai este necesara fixarea prealabila. Dupa fixarea si racirea frotiului urmeaza colorarea, care este bine sa se faca ct mai curnd dupa efectuarea frotiurilor.

Metode de colorare i examinarea microscopic a frotiurilor Metodele cele mai importante de colorare pentru examenul bacteriologic Prin colorare se pot stabili unele particularii morfologice ale germenilor (dimensiuni, forma, afinitati tinctoriale) ca si relaiile cu esuturile n care se afla, facilitindu-se in acest fel precizarea diagnosticului. Metodele de colorare sunt diverse si se aplica in mod diferentiat, in funcie de scopul urmarit. Exista metode care se aplica n mod curent si metode speciale, mai pretentioase si aplicate numai in anumite situatii. Coloratia Gram se foloseste pentru diferentierea germenilor Gram pozitivi de cei Gram negativi din frotiurile efectuate din diferite tesuturi sau din culturi microbiene. Este o metoda de baza in practica bacteriologica. Ea consta in:

colorare cu solute de violet de Gentiana 1% timp de 1 minut varsarea colorantului de pe lama tratarea frotiului cu solutie Lugol timp de 2 minute decolarea cu amestec de alcool-acetona pna cul ce se scurge de pe lama nu mai este colorat spalare cu apa de robinet recolorare cu fucsina diluata 1/10 timp de 2030 secunde spalare cu apa de robinet uscare

cind

ameste-

 examinarea la microscop. Germenii Gram pozitivi vor aparea colorati in albastru-violet iar cei Gram negativi in rosu. Aceasta diferenta de colorare rezulta din faptul ca germenii Gram pozitivi fixeaza violetul de Gentiana in asa fel incit prin tratarea cu solutia de alcool-acetona nu se decoloreaza, in timp ce cei Gram negativi se decoloreaza si apar ca urmare colorari in rosu cu cel de al doi-lea colorant (fucsina diluata). Sporii bacterieni apar sub forma de vacuole. Coloratia cu albastru de metilen (Loffler) - se foloseste pentru punerea in evidenta a germenilor intr-un material patologic, fara a-i diferentia sub raportul afinitatii lor tinctoriale. In acest scop se acopera frotiul fixat cu o solutie de albastru de metilen 3% i, dupa 2 5 minute, se spala cu apa, se usuca, se examineaza. Germenii vor aparea colorati in albastru, uniform. Metoda permite si observarea unor particularitati morfologice cum ar fi prezenta capsulei si sporului. Capsula se coloreaza in roz-pal, iar sporul apare sub forma unei vacuole. Coloraia ZiehlNeelsen - se foloseste pentru punerea in evidenta a germenilor acidorezistenti, care nu se coloreaza prin metodele obisnuite (mai ales micobacteriile):

acoperirea frotiului, in prealabil fixat la flacara, cu soluie de fucsina Ziehl incalzirea la flacara pna la aparitia vaporilor si mentinerea prin incalziri repetate timp de 510 minute (se va avea grija ca soluia coloranta sa nu fiarba si sa se completeze in caz c s-a evaporat de pe anumite portiuni de frotiu) varsarea colorantului decolorarea cu o solutie de acid sulfuric 1/4 sau acetic 1/3, timp de cca 2 minute spalare cu apa tratare cu alcool absolut timp de 5 minute spalare cu apa recolorare cu solutie de albastru de metilen 1% timp de 23 minute spalare cu apa uscare si examinare cu imersie. La examenul frotiurilor, germenii se pot prezenta colorai in rou (acidorezistenti) sau in albastru (neacidorezistenti). Primii fixeaza fucsina Ziehl si nu se decoloreaza sub aciunea acidului, in timp ce ceilali se decoloreaza sub influenza tratarii cu acid. Acidorezistenta rezida in structura chimica particulara a peretelui celular al germenilor, in sensul ca in cazul acidorezistenilor acesta fiind bogat in substane lipoide impiedica patrunderea acidului decolorant ca dealtfel si a coloranilor (fucsina patrunde datorita concentraiei ridicate si a caldurii). Pentru acest motiv, germenii acidorezistenti nu sunt colorabili prin metode obisnuite.

Alte metode de colorare: Coloratia Koster - se foloseste pentru colorarea brucelelor Metoda Koslovski - se foloseste pentru colorarea brucelelor; Metoda TribondeauFontana - s e foloseste pentru colorarea lepto spirelor Pentru colorarea capsulei bacteriene coloraia Giemsa, metoda de colorare negativa a capsulei cu tus de China, etc.; Pentru colorarea sporilor: Metoda Moller, Metoda Pooman, Metoda cu verde de

malahit

Pentru colorarea cililor - Metoda CasaresGill Determinarea bacteriilor din genul Salmonella Metoda stabilete prezena sau absena unei ncrcturi bacteriene din genul Salmonella n produsele cercetate, acestea fiind un pericol pentru sntatea consumatorului n cazul consumului de alimente contaminate. Metoda se aplic urmtoarelor produse: -

Lapte crud Lapte praf Produse lactate praf pentru copii Produse lactate acide (iaurt, smntn fermentat, lapte btut, kefir, sana) Iaurt cu fructe Smntn dulce pentru fric i fric btut Brnzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (ca, telemea proaspt) Brnzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (ca, telemea proaspt) Brnz proaspt din zer Brnz maturat n saramur din lapte pasteurizat Brnz maturat n saramur din lapte nepasteurizat Brnz fermentat cu past tare (svaier), semitare (moeciu), moale (Camembert, taga, nasal) Brnzeturi cu past filat (cacavaluri), afumate i neafumate Brnzeturi fermentate Unt Margarin de consum Margarin cu lapte ngheat, torturi de ngheat Praf de ngheat Lapte concentrat cu zahr creme vegetal (nlocuitori de fric) Carne tocat i semipreparate din carne tocat (hamburger, past de mititei, crnai proaspei etc.) Preparate din carne srate i/sau afumate Mezeluri (prospturi, salamuri semiafumate) Mncruri gtite congelate i mncruri gtite, servite calde Preparate din carne, mixte sau simple, gata pregtite, care se consum reci, fr alt prelucrare (piftii, pateuri din carne i organe, biftec) Produse crude (niel, cacava pane) Pete proaspt, decapitat i eviscerat Produse semiconservate (marinate reci, marinate calde nepasteurizate, marinate calde pasteurizate, produse din icre i din lapi) Icre srate Salat de icre cu adaos de ulei Pete srat Pete srat cu ceap Pete afumat la cald, pete afumat la rece Preparate culinare din pete Ou umplute, salate cu maionez Gelatin alimentar

Prjituri cu crem Torturi cu diferite creme, fric, fructe Maionez Pulberi de maionez (nlocuitori de maionez) Vegetale congelate Vegetale deshidratate Prafuri de budinci i creme deshidratate, nlocuitori de fric Paste finoase (macaroane, fidea) Paste finoase cu umplutur (ciuperci, carne brnz) Condimente i amestecuri Buturi rcoritoare i sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile Pulberi pentru sucuri Ape minerale i carbogazoase, ghia artificial Bere nepasteurizat, filtrat i nefiltrat Bere pasteurizat Finuri alimentare altele dect finuri pentru panificaie (fin de orez, orezin, fosfarin) Produse de panificaie cu umpluturi Derivate din cereale tratate termic (fulgi de porumb, orez, produse expandate) Biscuii uscai i biscuii glazurai Biscuii, pateuri Fursecuri, napolitane cu diferite creme Cacao, pudr, ciocolat tablete, ciocolat cu adaos, bomboane fine i extrafine de ciocolat Ciocolat umplut cu crem Specialiti din ciocolat umplute cu crem gras sau de tip fondant Bomboane altele dect ciocolat Jeleuri, rahat, gemuri, erbeturi, dulceuri, fructe confiate Arome alimentare naturale sau sintetice Emulsie pentru buturi rcoritoare Concentrate alimentare (supe, cuburi de carne) Oet alimentar Ceai (plant) Bor Cafea crud prjit i instant Melanj din ou praf Produse din gru germinat Fructe de mare refrigerate Pepsin (pulbere n maestec cu sare) sandviciuri, mncruri tip fast-food.

Documente de referin: - ISO 17025/2001 - SR EN 12824/2001 - ISO 6887/96 ISO 7218

Principiul metodei: Germenii din genul Salmonella pot fi prezeni n numr mic i sunt deseori nsoii de un numr mult mai mare de alte microorganisme din familia Enterobacteriaceae sau din alte familii. n

consecin este necesar mbogirea selectiv n plus deseori este necesar prembogirea pentru a evidenia acei germeni Salmonella care au fost supui alterrii. Aparatur i sticlrie folosit Termostat 35oC; 37o +-0,5oC; 42oC microbian
-

aparat electric pentru dezvoltarea

Etuv 160 180oC - asigur sterilizarea cu cldur uscat a obiectelor de sticl, porelan, hrtie, vat, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 3060 minute Autoclav - realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultur, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute
-

Lamp U.V. - radiaii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului ncperilor i a suprafeelor de lucru Balan analitic - balan electronic cu reglare automat funcie de temperatura camerei
-

Sterilizator electric pentru instrumente

Stomacher 1000 ml, pungi de material plastic pentru stomacher, turmix tip Atomix de nalt turaie (15-20.000 7/min), cu cupe sterilizabile
-

Baie de ap reglabil la temperatur 35oC sau 37oC, 45oC, 55oC i 70oC Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm Pipete gradate sterile de 1 ml+- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml Aparat pentru sterilizare uscat sau umed ISO 7218 Etuv ventilat prin convecie reglabil la 37oC i la 55oC pH metru cu compensare de temperatur cu exactitate 0,1 uniti de pH la 25o C Anse bacteriologice cu bucla cu diam de 3 mm din platin-iridiu sau nichel-crom Eprubete de 16 x 160 mm sterile Flacoane pentru medii de cultur Eprubete cu diam de 8/160 mm Pipete cu scurgere total cu capacitate nominal de 1 ml i 10 ml Mojar cu pistil, sterile Eprubete gradate Baloane erlenmayer cu capacitatea de 90, 150 i 250 ml

Eantionarea - este important ca laboratorul s primeasc un eantion cu adevrat reprezentativ, nealterat sau modificat n timpul transportului sau depozitrii n corelaie cu standardul internaional specific al produsului. Reguli de procedur

Modul de analiz, acceptare i nregistrare a comenzilor eantioanele trebuie s fie etichetatei iar procesul verbal de prelevare probe s conin urmtoarele date:produsul recoltat, examenul cerut, locul prelevrii, ziua i data prelevrii, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevrii, cine a prelevat proba. Pentru a obine o cultur pur de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlrii) s fie steril. Sticlria ntrebuinat este sterilizat la etuv la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute. Pregtirea eantionului pentru analiz. Eantionul se pregtete conform standardului internaional specific al produsului respective: lapte materie prim i produse lactate se cntresc 25 g eantion ntr-un balon Erlenmayer steril peste care se adaug 225 ml mediu de prembogire (APT), lapte praf, zer dulce i lactoz se cntresc 25 g eantion ntr-un balon erlenmayer steril peste care se adaug 225 g mediu de prembogire, brnza i brnza topit se cntresc 25 g prob ntr-un mojar steril, se mojareaz, se transfer ntr-un balon steril, peste care se adaug 225 ml mediu de prembogire, untul se cntresc 25 g eantion ntr-un balon erlenmayer steril, se nclzete ntr-o baie de ap la 45oC peste care se adaug 225 ml mediu de prembogire. Alimentul cu consisten solid se mrunete n buci mici nainte de mojarare. Din proba de analizat se introduc n mojar 25 g. Se mojareaz, se transfer ntr-un balon erlenmayer steril peste care se adaug 225 ml mediu de prembogire (ATP)

Aciuni i/sau msuri preventive Protecia personalului -

Obligatorie purtarea halatului Folosirea lampei de U.V. (nainte i dup nsmnare) Folosirea hotei de nsmnare Pipetele sunt prevzute cu dop de vat nehidrofil pentru a preveni aspirarea accidental a eantionului Flambarea ansei se face nti la baza flcrii i apoi la vrf pentru a mpiedica rspndirea germenilor Dezinfecia suprafeelor de lucru cu soluii dezinfectante

Protecia mijloacelor de ncercare i/sau msurare Modul de lucru

Sticlria steril se pstreaz n dulapuri speciale Sticlria steril se folosete maxim 6 zile Executarea periodic a serviciilor de ntreinere i curire zilnic a aparaturii Verificarea i nregistrarea temperaturii din ncperea de lucru

Pregtirea eantionului pentru analiz - se efectueaz conform standardului internaional pentru produsul de analizat. nsmnare i incubare 1. Faza de prembogire neselectiv.

Se cntresc 25 g produs ntr-un balon erlenmayer steril peste care se adug 225 ml mediu APT . Se incubeaz la temperatura de 35o 37oC timp de 16-20 h. 2. Faza de mbogire selectiv Din cultura obinut conform 10.3.1. se trec 0,1 ml n 10 ml mediu RV i 10 ml ntr-un flacon ce conine 100 ml mediu SC. Se incubeaz cele dou medii nsmnate dup cum urmeaz:.
a) mediul RV nsmnat la temperatura de 42oC timp de 24 h b) mediul SC nsmnat la temperatura de 35o 37oC (conform acordului)timp de 48 h

3. Izolare i identificare. Din cultura obinut n mediu RV dup 24 h de incubare cu o ans bacteriologic se nsmneaz suprafaa primului mediu de nsmnare selectiv (ARFVB) n cutii Petri sterile. Se procedeaz la fel cu cel de-al doilea mediu de izolare selectiv (AMC) folosindu-se o alt prelevare cu ansa bacteriologic i cutii Petri sterile de dimensiuni adecvate.Se incubeaz cele dou medii selective nsmnate la temperatur de 35o 37oC timp de 24 h. Din cultura obinut n mediu SC, dup 48 h incubare se repet operaiunile descrise mai sus.Dup 24 h incubare n ambele situaii se examineaz cutiile pentru a cerceta prezena coloniilor caracteristic de Salmonella. Interpretare

Coloniile caracteristice de Salmonella dezvoltate pe mediu ARFVB provoac virarea culorii mediului de la roz la rou. Dac dezvoltarea este slab sau nu se evideniaz coloniile caracteristice de Salmonella cutiile Petri nsmnate se incubeaz n continuare la temperatura de 35o 37oC (conform acordului) timp de 18-24 h.Se reexamineaz cutiile Petri pentru a cerceta prezena coloniilor caracteristice de Salmonella. Test de confirmare

Pentru confirmare, din fiecare cutie Petri din fiecare din cele dou medii selective se recolteaz cte 5 colonii considerate caracteristice sau suspecte. Dac se gsete o cutie cu mai puin de 5 colonii caracteristice sau suspecte, se rein toate coloniile caracteristice sau suspecte.Se striaz coloniile selecionate pe suprafaa agarului nutritiv din cutii Petri n prealabil uscate astfel nct s se obin o dezvoltare de colonii bine izolate. Se incubeaz cutiile astfel nsmnate la temperatura de 35o 37oC, timp de 18-24 h. Pentru conformrile biochimice i serologice se utilizeaz culturi pure. Confirmri biochimice Cu ajutorul ansei efilate se nsmneaz mediile indicate de la pn la cu fiecare din culturile obinute din coloniile reinute 1. Agar TSI Se nsmneaz coloana agarului TSI prin striere, iar panta prin trasare. Se incubeaz la temperatura de 35o 37oC timp de 24 h. Se interpreteaz modificrile care se produc n mediu n modul urmtor: Baza mediului galben glucoz pozitiv (fermentarea glucozei) - roie sau nemodificat glucoz negativ (lipsa fermentrii glucozei) - neagr formare de hidrogen sulfurat - bule de gaz sau fisuri-formare de gaz din glucoz Panta mediului galben lactoz i/sau zaharoz pozitiv - roie sau nemodificat lactoz i zaharoz negativ (neutilizarea lactozei i a zaharozei

Culturile tipice de Salmonella corespund unei pante alcaline (roie) cu formare de gaz i a unei baze acide (galben) cu formarea (90% din cazuri) hidrogenului sulfurat (nnegrirea agarului. Atunci cnd se izoleaz o Salmonella lactoz pozitiv panta agarului TSI este galben, n consecin o confirmare preliminar a culturilor de Salmonella nu trebuie s se bazeze doar pe rezultatele obinute pe agarul TSI. 2. Agar cu uree. Se nsmneaz panta agarului n striuri. Se incubeaz la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h i se examineaz din cnd n cnd. n cazul reaciei pozitive descompunerea ureei produce degajarea amoniacului, fcnd s vireze rou de fenol la roz apoi la rou nchis Reacia este deseori vizibil dup 2 pn la 4 h. 3. Mediu pentru decarboxilarea L-lizinei Se nsmneaz mediul lichid sub suprafa. Se incubeaz la 35o sau 37oC timp de 24 h. O culoare violet aprut dup incubare indic o reacie pozitiv. O culoare galben indic o reacie negativ. 4. Evidenierea betagalactozidazei Se disperseaz o ans din colonia suspect ntr-o eprubet ce conine 0,25 ml soluie salin, se adaug o pictur de toluen i se agit eprubeta. Se introduce eprubeta n baie de ap reglat la 35o sau 37oC (conform acordului) i se las s stea cteva minute. Se adaug 0,25 ml Reactiv pentru evidenierea betagalactozidazei i se amestec. Se reintroduc eprubetele n baia de ap la 35o sau 37oC (conform acordului) i se las 24 examinndu-le din timp n timp. O culoare galben indic o reacie pozitiv, deseori reacia este vizibil n 20 minute. n cazul folosirii discurilor de hrtie gata preparate se respect instruciunile fabricantului. 5. Mediu pentru reacia VP Se disperseaz o ans din colonia suspect ntr-o eprubet coninnd 0,2 ml VP, se incubeaz la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. Dup incubare se adaug 2 picturi din soluia de creatin, 3 picturi din soluia alcoolic de l-naftol i apoi 2 picturi din soluia de hidroxid de potasiu agitnd dup adugarea fiecrui reactiv. Formarea unei coloraii roz pn la rou aprins ntr-un interval de 15 minute indic o reacie pozitiv 6. Mediu pentru evidenierea indolului Se nsmneaz o eprubet ce conine 5 ml mediu tripton-triptofan cu colonia suspect Se incubeaz la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. Dup incubare se adaug 1 ml reactiv Kovacs. Formarea unui inel rou indic o reacie pozitiv. Formarea unui inel galben brun indic o reacie negativ.

Test1)

Reacie pozitiv sau negativ

Procentajul nsmnrilor de Salmonella care prezint reacia2)

Glucoz,TSI (formare de acid) Glucoz, TSI (formare de gaz) Lactoz, TSI Zaharoz, TSI Hidrigen Sulfurat, TSI Descompunerea ureei Decarboxilarea lizinei Evidenierea betagalactozidazei Reacia Voges Prostkauer Evidenierea Indolului

pozitiv + pozitiv + negativ negativ pozitiv + negativ pozitiv + negativ negativ negativ -

100 99,93) 99,24) 99,5 91,6 99,0 94,65) 98,54) 100 98,9

2) Aceste procentaje indic doar faptul c toate speciile de Salmonella nu dau reacii pozitive sau negative. Acest procentaj poate varia de la o ar la alta i de la un produs la altul 3) Salmonella typhi este anaerogen (nu produce gaze n anaerobioz) 4) Germeni Salmonella din subgenul 3(arizona) dau reacie lactoz pozitiv sau negativ, dar sunt betagalactozidaz pozitiv. Germenii Salmonella din subgenul 2 dau reacie lactoz negativ, dar dau reacia betagalactozidaz pozitiv. Pentru studiul speciilor poate fi util efectuarea unor teste biochimice suplimentare. 5) Salmonella paratyphi A este negativ

Confirmare serologic Cercetarea prezenei antigenelor O Vi sau H de Salmonella se efectueaz prin aglutinare pe lam cu seruri adecvate din colonii pure i dup eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. Eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. Se depune pe o lam de sticl curat o pictur de soluie salin, se disperseaz n aceast pictur o fraciune din colonia de testat aa fel nct s se obin o suspensie omogen i tulbure prin micarea lamei timp de 30-60 secunde. Dac bacteriile se adun n grmezi, tulpina este considerat autoaglutinabil i nu mai trebuie supus examinrilor ulterioare. Examinarea se face cu ajutorul unei lupe pe fond negru Evidenierea antigenelor O. Dintr-o colonie pur cunoscut ca neaglutinabil se procedeaz ca mai sus, dar n locul soluiei saline se folosete o pictur de antiser O. Dac se produce aglutinarea reacia este considerat pozitiv. Se utilizeaz serurile poli i monovalente unul dup altul. Evidenierea antigenelor Vi. Se procedeaz ca mai sus utiliznd o pictur de antiser Vi. Dac se produce aglutinarea reacia este pozitiv. Evidenierea antigenelor H. Se nsmneaz un agar nutritiv semisolid cu o colinie pur neautoaglutinabil, se incubeaz la 35o 37oC timp de 24 h, se utilizeaz aceast cultur pentru examenul antigenelor H procedmd ca mai sus, dar folosind o pictur antiser H.Dac se produce aglutinarea reacia este considerat pozitiv. Interpretarea reaciilor biochimice i serologice

Tabelul prezint interpretrarea testelor de confirmare pe colonii selecionate. Reacii biochimice tipice Autoaglutinare nu Reacii serologice antigene O, Vi sau H pozitive toate reaciile negative neefectuate tipice lipsa reaciilor tipice da nu antigene O,Vi sau H pozitive toate reaciile negative lipsa reaciilor tipice nu nu sunt considerate ca fiind Salmonella ar putea fi Salmonella Interpretare tulpini considerate ca fiind Salmonella

tipice

nu

Confirmare definitiv Tulpinile considerate ca fiind Salmonella sau c ar putea fi Salmonella (a se vedea tabelul 2) se trimit la Institurul de Igien i Sntate Public Veterinar pentru identificarea germenilor din genul Salmonella, pentru determinarea definitiv a serotipului. Aceast expediere trebuie nsoit de toate informaiile disponibile referitoare la tulpin (tulpini). Exprimarea rezultatelor n funcie de rezultatele interpretrii se indic prezena sau absena germenilor din genul Salmonella n x grame de prob de analizat.

LIMITELE DE NCREDRE PENTRU ESTIMRI DE NUMERE MICI

Numr de microorganisme 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Limite de ncredere la nivelul de 95% Inferioar Superioar <1 <1 <1 1 2 2 2 3 4 4 5 6 7 7 8 2 4 5 6 9 10 12 13 14 16 18 19 20 21 23

Diagrama modului de lucru

Apa peptonata tamponata la

Preimbogatire

Incubare (9,2) timp de 18 h +/- 2 h la 370 C +/10 C

0,1 ml cultura + 10 ml bullion RVS Incubare timp de 24 h +/- 3 h la 41,50 C +/- 10 C

Imbogatire selectiva

se

1 ml cultura + 10ml bullion MKTTNn Incubare timp de 24 h +/- 3 h la 370 C

Izolare

Mediu XLD si al doilea agar la alegere Incubare timp de 24 h +/- 3 h la 370 C +/10 C

De pe fiecare placa se testeaza o colonie caracteristica . Daca rezultatul e negativ se testeaza alte 4 colonii

Confirmare

Agar nutritive Incubare timp de 24 h +/- 3 h la 370 C +/- 10 C

Confirmare biochimica Exprimare

Confirmare serologica

DETERMINAREANUMRULUI TOTAL DE GERMENI AEROBI DIN PRODUSELE ALIMENTARE (NTG)

Stabilete prezena sau absena de microorganisme aerobe n produsele alimentare cercetate prin metoda numrrii coloniilor la temperatura de 30o C. n vederea stoprii vinderii produsului, acestea fiind un pericol pentru sntatea consumatorului n caz de contaminare. Metoda se aplic urmtoarelor produse: Lapte crud Lapte pentru consum, Lapte UHT Lapte praf Produse lactate praf pentru copii Smntn dulce pentru fric i fric btut Lapte concentrat cu zahr Carne zvntat, refrigerat, congelat i organe de pasre Mncruri gtite congelate i mncruri gtite, servite calde Preparate din carne, mixte sau simple, gata pregtite, care se consum reci, fr alt prelucrare (piftii, pateuri din carne i organe, biftec) - Pete proaspt, decapitat i eviscerat - Prjituri cu crem - Maionez - Prafuri de budinci i creme deshidratate, nlocuitori de fric - Buturi rcoritoare i sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile - Pulberi pentru sucuri - Finuri alimentare altele dect finuri pentru panificaie (fin de orez, orezin, fosfarin) - Specialiti din ciocolat umplute cu crem gras sau de tip fondant - Specialiti din ciocolat umplute cu crem gras sau de tip fondant - Concentrate alimentare (supe, cuburi de carne) - Ceai (plant) - Melanj din ou praf - Produse din gru germinat - Fructe de mare refrigerate - sandviciuri, mncruri tip fast-food - furaje pentru animale STAS-uri folosite pentru produsele enumerate mai sus sunt urmtoarele: -

ISO 17025/2001 SR ISO 4833/91 ISO 707 ISO 8261 (pentru lapte i produse lactate) ISO 7218/85 STAS 2356 1982 (pentru produse carnate) SR ISO 6887/96 STAS 11499 1981 (pentru produse zaharoase) SR ISO 8924 1995 (pentru recipiente nchise)

Principiul metodei -nsmnarea n profunzime a unui mediu solid turnat n dou cutii Petri cu o cantitate determinat de eantion pentru analiz dac produsul care se examineaz este lichid sau cu o cantitate determinat de suspensie mam n cazul altor produse. n aceleai condiii se face nsmnarea diluiilor decimale din eantionul de analizat sau suspensia mam (iniial).

nsmnarea se face prin nglobare n mediul de cultur solid fie a unei cantiti cunoscute din proba de lucru reprezentat prin gram sau a unei serii de diluii decimale n cutii Petri prin ncorporare dup solidificarea mediului. Incubarea cutiilor Petri se realizeaz timp de 72 de ore la temperatura de 30 oC, n condiii de aerobioz Aparatur i sticlrie

Termostat 30o +-0,5oC aparat electric pentru dezvoltarea microbian Etuv 160 180oC - asigur sterilizarea cu cldur uscat a obiectelor de sticl, porelan, hrtie, vat, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 3060 minute Autoclav - realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultur, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute Lamp U.V. - radiaii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului ncperilor i a suprafeelor de lucru Balan analitic - balan electronic cu reglare automat funcie de temperatura camerei Sterilizator electric pentru instrumente Baie de ap reglabil la 45oC Cutii Petri sterile din sticl cu diametrul de 90-100 mm Pipete gradate sterile de 1 ml+- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml Pipete cu scurgere total de 1 ml Baghete de sticl sterile pH metro cu compensare de temperatur cu exactitate 0,1 uniti de pH la 25o C Baloane cu capacitatea de 150 mlpn la 500 ml pentru sterilizarea i pstrarea mediilor de cultur Mojar cu pistil, sterile Material curent n laboratorul de microbilogie Aparat de numrare a coloniilor cu sistem de iluminare

Eantionarea - trebuie s se efectueze conform standardului internaional specific al produsului respectiv Se prepar attea diluii de lucru nct ntr-o cutie Petri s se obin cel mult 300 de colonii. Pentru a se evita lezarea microorganismelor datorit schimbrilor brute de temperatur, soluia de diluare trebuie s alb aproximativ aceeai temperatur cu proba, dac nu exist alte prescripii. Reguli de procedur

Pentru a obine o cultur pur de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlrii) s fie steril. Sticlria ntrebuinat este sterilizat la etuv la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121 oC timp de 30 minute. Pregtirea materialului de sterilizat: splarea i sterilizarea sticlriei se face respectnd urmtoarele reguli: Splarea sticlriei cu ap cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de ap, dup care splarea cu ap distilat; Punerea de dopuri de vat cu tifon, nvelirea cu hrtie a gtului eprubetelor sau baloanelor; Introducerea n etuv pentru 30 de minute la 121oC Pregtirea eantionului pentru analiz - Se prepar attea diluii de lucru nct ntr-o cutie Petri s se obin cel mult 300 de colonii. Pentru a se evita lezarea microorganismelor datorit schimbrilor brute de temperatur, soluia de diluare

trebuie s alb aproximativ aceeai temperatur cu proba, dac nu exist alte prescripii.
1. Lapte i produse lactate se agit energic eantionul de analizat pentru a

asigura o repartizare uniform a microorganismelor rsturnnd rapid de 25 de ori recipientul cu eantion. Trebuie evitat formarea spumei iar cea format trebuie dispersat. Intervalul dintre omogenizarea eantionului i prelevarea probei necesare analizei nu trebuie s depeasc 3 minute.
2. Lapte praf, zer dulce se amestec direct coninutul recipientului nchis, prin

agitri i rsturnri repetate..Se cntresc 10 g eantion ntr-un vas de sticl i se rstoarn praful n sticl cu soluia de diluare (90 ml de soluie adecvat la 45+-1oC n baie de ap). Se menin flacoanele n baia de ap timp de 5 minute agitnd din cnd n cnd. Se obine astfel o diluie de 10-1.
3. Alimentul cu consisten semisolid se omogenizeaz ca atare . Alimentul cu

consisten solid se mrunete n buci mici dup care se mojareaz. Din proba de analizat se introduc n mojar 1g/10g + cantitatea egal de nisip steril. Se tritureaz adugndu-se treptat lichid de diluie de 9 ori mai mare dect eantionul. Modul de lucru Pregtirea eantionului pentru analiz i a diluiei iniiale Cu o nou pipet steril se introduce 1 ml din soluia iniial ntr-o eprubet care conine 9 ml de soluie diluare steril. Pipeta se schimb pentru fiecare diluie. Diluii decimale urmtoare - prin operaia de diluie n tuburile cu diluii se vor obine cantitile de prob ilustrate n tabel, din care reiese c ntre dou diluii consecutive, diferena de concentraie este de 10 ori (diluii decimale): Nr. tub 1 2 3 4 Diluia Cantitate (g) sau volum (ml) Sau Din proba iniial pe ml diluie xx) 10-1 Sau 10-2 Sau 10-3 Sau 10-4 1/10 x) 0,1 1/100 0,01 1/1000 0,001 1/10000 0,0001

x) n cazul produselor solide sau semi-solide aceast diluie se afl n recipientul omogenizatorului sau n mojar;

xx) n cazul nsmnrii a 1 ml produse lichide sau 1 g produse solide sau semi-solide (10 ml diluie 10-1) aceast cantitate se noteaz cu 10-0. nsmnare i incubare
1. Se iau dou cutii Petri n care se introduce cu o pipet steril cte 1 ml eantion de

analizat dac produsul este lichid sau cte 1 ml din diluie iniial a produselor solide i semi-solide. Pe fiecare cutie se noteaz numrul probei, diluia i data.Se iau alte dou cutii Petri sterile. Cu o nou pipet steril se introduce n fiecare cutie cte 1

ml din prima diluie decimal a eantionului de analizat (10 -1), dac produsul este lichid sau cte 1 ml din prima diluie decimal a suspensiei iniiale (10 -2) n cazul altor produse. Se repet aceste operaii cu diluiile urmtoare folosind cte o nou pipet steril pentru fiecare diluie decimal.
2. Se toarn n fiecare cutie Petri n care s-a depus inoculul cca 15 ml mediu agar

nutritiv sau geloz alb la 45+-1oC. Timpul care se scurge ntre sfritul preparrii diluiei iniiale (sau a diluiei 10-1 n cazul unui produs lichid) i momentul n care diluiile vin n contact cu mediul de cultur nu trebuie s depeasc 15 minute. Se amestec cu grij inoculul cu mediul de cultur i se las s se solidifice punnd cutiile Petri pe o suprafa rece i orizontal.
3. Dup solidificarea complet i numai n cazul n care se bnuiete c eantionul de

analizat conine microorganisme ale cror colonii ar putea invada suprafaa mediilor, se toarn pe suprafaa mediului nsmnat 4 ml geloz alb la 45oC. Se las s se solidifice aa cum s-a descris mai sus. Aceast operaie, dac a fost efectuat trebuie menionat n buletinul de analiz.
4. Se incubeaz cutiile Petri cu capacul n jos. Nu trebuie puse mai mult de 6 cutii una

peste alta. Incubarea se face la 30+-1oC timp de 72+-2 de ore. Interpretarea

Dup expirarea perioadei de incubare specificat la punctul 10.4.4. se procedeaz la numrarea coloniilor din fiecare cutie Petri care conine cel mult 300 de colonii. Calculul Se rein cutiile care conin de la 15 la 300 de colonii la nivelul a dou diluii succesive. Exprimarea rezultatelor

Pentru numrtoare se utilizeaz cutiile ce conin cel mult 300 de colonii i cel puin 15 colonii. Numrul de microorganisme pe ml sau gram de produs, N, se calculeaz, ca medie ponderat cu urmtoarea formul:

C N = -----------------------(n1 + 0,1 n2) x d

unde;

C suma coloniilor numrate n toate cutiile reinute

n1 numrul cutiilor reinute la prima diluie n2 - numrul cutiilor reinute la adoua diluie d factorul de diluie corespunztor primei diluii

Rezultatele calculate se rotunjesc la dou cifre semnificative. Ca rezultat se ia numrul de microorganisme pe ml sau pe gram de eantion exprimat printr-un numr cuprins ntre 1,0 i 9,9 x 10x unde x este puterea atribuit lui 10.

Exemplu: O numrtoare de microorganisme obinute la 30oC a dat urmtoarele rezultate.

-

la prima diluie reinut 10-2: 168 i 215 colonii la a doua diluie reinut 10-3: 14 i 25 de colonii C 168 + 215 + 14+ 25 422

N = ----------------------------------= _________________ =________=19.162 (n1 + 0,1 n2 + 0,01 n3) x d [2+(0,1x2)+(0,01x 2)]x10-2 0,022

Se rotunjete la dou cifre semnificative adic 19.000 sau 1,9 x 10 -4 microorganisme pe ml sau pe gram de produs. Estimarea numerelor mici - dac cele dou cutii la nivelul eantionului de analizat (produse lichide) sau al diluiei iniiale (alte produse) conin mai puin de 15 colonii se face media aritmetic, ,m, a coloniilor numrate n cele dou cutii. Rezultatul se d sub forma: - numr de microorganisme estimat pe ml NE = m(produse lichide) numr de microorganisme estimat pe gram: NE = m x d-1 (alte produse), n care d este factorul de diluie al diluiei iniiale.

Nici o colonie - dac cele dou cutii corespunztoare eantionului de analizat (produse lichide) sau diluiei iniiale (alte produse) nu conin nici o colonie rezultatul se d sub forma: mai mic dect limita minim admis, raportndu-ne la prevederile legislaiei n vigoare ( ex. Pentru laptele materie prim Directiva UE nr. 92/46 prevede limita de 100.000 UFC uniti formatoare de colonii)

Fidelitate - din considerente de ordin exclusiv statistic, n 95% din cazuri limitele de ncredre ale acestei metode variaz de la 12% la 37%. n practic se pot costata variaii i mai mari mai ales ntre rezultatele obinute de microbiologi diferii-

Limitele de ncredere pentru estimrile de numere mici de microorganisme sunt indicate n tabelul A1.

LIMITELE DE NCREDRE PENTRU ESTIMRI DE NUMERE MICI Numr de microorganisme 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Limite de ncredere la nivelul de 95% Inferioar Superioar <1 <1 <1 1 2 2 2 3 4 4 5 6 7 7 8 2 4 5 6 9 10 12 13 14 16 18 19 20 21 23

DETERMINAREA STAFILOCOCULUI (AUREUS) COAGULAZ POZITIV DIN PRODUSELE ALIMENTARE

Metoda stabilete prezena sau absena unei ncrcturi bacteriene stafilococ (aureus) coagulaz pozitiv n produsele alimentare cercetate. Metoda se aplic urmtoarelor produse: Lapte crud Lapte praf Produse lactate praf pentru copii Produse lactate acide (iaurt, smntn fermentat, lapte btut, kefir, sana) Iaurt cu fructe Smntn dulce pentru fric i fric btut

Brnzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (ca, telemea proaspt) Brnzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (ca, telemea proaspt) Brnz proaspt din zer Brnz maturat n saramur din lapte pasteurizat Brnz maturat n saramur din lapte nepasteurizat Brnz fermentat cu past tare (svaier), semitare (moeciu), moale (Camembert, taga, nasal) Brnzeturi cu past filat (cacavaluri), afumate i neafumate Brnzeturi fermentate Unt Margarin de consum Margarin cu lapte ngheat, torturi de ngheat Praf de ngheat Lapte concentrat cu zahr creme vegetal (nlocuitori de fric) Carne tocat i semipreparate din carne tocat (hamburger, past de mititei, crnai proaspei etc.) Preparate din carne srate i/sau afumate Mezeluri (prospturi, salamuri semiafumate) Mncruri gtite congelate i mncruri gtite, servite calde Preparate din carne, mixte sau simple, gata pregtite, care se consum reci, fr alt prelucrare (piftii, pateuri din carne i organe, biftec) Produse crude (niel, cacava pane) Pete proaspt, decapitat i eviscerat Produse semiconservate (marinate reci, marinate calde nepasteurizate, marinate calde pasteurizate, produse din icre i din lapi) Icre srate Salat de icre cu adaos de ulei Pete srat Pete srat cu ceap Pete afumat la cald, pete afumat la rece Preparate culinare din pete Ou umplute, salate cu maionez Gelatin alimentar Prjituri cu crem Torturi cu diferite creme, fric, fructe Maionez Pulberi de maionez (nlocuitori de maionez) Vegetale congelate Vegetale deshidratate Prafuri de budinci i creme deshidratate, nlocuitori de fric Paste finoase (macaroane, fidea) Paste finoase cu umplutur (ciuperci, carne brnz) Condimente i amestecuri Buturi rcoritoare i sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile Pulberi pentru sucuri Ape minerale i carbogazoase, ghia artificial Bere nepasteurizat, filtrat i nefiltrat Bere pasteurizat

Finuri alimentare altele dect finuri pentru panificaie (fin de orez, orezin, fosfarin) Produse de panificaie cu umpluturi Derivate din cereale tratate termic (fulgi de porumb, orez, produse expandate) Biscuii uscai i biscuii glazurai Biscuii, pateuri Fursecuri, napolitane cu diferite creme Cacao, pudr, ciocolat tablete, ciocolat cu adaos, bomboane fine i extrafine de ciocolat Ciocolat umplut cu crem Specialiti din ciocolat umplute cu crem gras sau de tip fondant Bomboane altele dect ciocolat Jeleuri, rahat, gemuri, erbeturi, dulceuri, fructe confiate Arome alimentare naturale sau sintetice Emulsie pentru buturi rcoritoare Concentrate alimentare (supe, cuburi de carne) Oet alimentar Ceai (plant) Bor Cafea crud prjit i instant Melanj din ou praf Produse din gru germinat Fructe de mare refrigerate Pepsin (pulbere n maestec cu sare) sandviciuri, mncruri tip fast-food

Documente de referin STAS-uri folosite pentru produsele enumerate la punctul anterior sunt urmtoarele: ISO 17025/2001 ISO 5541/1 1986 (pentru produse lactate i derivate) STAS 6349/4 1980 (pentru produse lactate) ISO 707 ISO 8261 (pentru lapte i produse lactate) ISO 4832 1992 (pentru produse carnate) STAS 2356 1982 (pentru produse carnate) SR ISO 6887/96 STAS 11499 1981 (pentru produse zaharoase) SR ISO 8924 1995 (pentru recipiente nchise)

Principiul metodei nsmnare n suprafaa unui mediu selectiv solid, turnat n dou serii de plci Petri cu o cantitate determinat din eantionul de analizat dac produsul este lichid sau din suspensia mam n cazul altor produse. n aceleai condiii se nsmneaz i diluiile decimale obinute din eantionul de analizat sau din suspensia mam n prealabil nsmnate ntr-un mediu de mbogire (chapman lichid); Incubarea acestor plci timp de 24 - 48 de h la 35oC sau 37oC; Calculul numrului de stafilococcus aureus pe ml sau pe gram de eantion pornind de la numrul de colonii caracteristice i/sau necaracteristice care se obin n plcile alese,

la nivelurile de diluie care dau rezultate semnificative i care se confirm prin proba coagulazei. SOLUII DE DILUARE I MEDII DE CULTUR Soluii de diluare de utilizare general Soluie salin steril Soluii de utilizare special bulion hipersalin cu manit i indicator (chapman lichid) agar hipersalin cu manit i indicator (chapman solid) plasm citratat de om sau de iepure bulion de inim de creier Repartizarea, sterilizarea i pstrarea soluiilor de diluare Se repartizeaz soluiile de diluare pentru diluiile iniiale n flacoane sau sticle iar pentru diluiie urmtoare n eprubete sau sticle. Cantitile trebuie astfel repartizate, astfel nct dup sterilizare fiecare flacon sau sticl s conin 90 ml soluie de diluare sau un multiplu de 9 ml. Eprubetele, flacoanele sau sticlele trebuie nchise cu dopuri. Sterilizarea trebuie fcut n autoclav la 121+-1oC timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Dac soluiile de diluare nu sunt folosite imediat, ele trebuie pstrate la ntuneric ntre 05oC maxim o lun pentru evitarea oricrei modificri a volumului sau compoziiei lor. Medii de cultur Bulion hipersalin cu manit i indicator (chapman lichid) Agar hipersalin cu manit i indicator (chapman solid) Plasm citratat de om sau de iepure Bulion de inim de creier Aparatur i sticlrie pentru sterilizarea cu cldur uscat sau cu cldur umed (ISO 7218)

Termostat 35oC; 37o +-0,5oC aparat electric pentru dezvoltarea microbian Etuv 160 180oC - asigur sterilizarea cu cldur uscat a obiectelor de sticl, porelan, hrtie, vat, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute Autoclav - realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultur, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute Lamp U.V. - radiaii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului ncperilor i a suprafeelor de lucru Balan analitic - balan electronic cureglare automat funcie de temperatura camerei Sterilizator electric pentru instrumente Baie de ap reglabil sau echipament similar reglabil la 45+-0,5oC Baie de ap reglabil sau echipament similar reglabil la 50+-0,5oC Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm Pipete gradate sterile de 1 ml+- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml

Baghete de etalare din sticl (tip cros de hochei) cu diametrul de 3,5 ml i lungimea de 20 cm ndoite n unghi drept la cca 3 cm de una din extremiti, extremitile tiate trebuie s fie rotunjite la cald, sterile. pH metru cu compensare de temperatur cu exactitate 0,1 uniti de pH la 25o C Eprubete de 18/180 mm i flacoane pentru cultur cu capacitatea de 125-300 ml pentru sterilizarea i pstrarea mediilor de cultur Eprubete cu diametrul de 10 ml x 75 ml necesare pentru determinarea coagulazei Pipete cu scurgere total cu capacitate nominal de 1 ml i 10 ml Mojar cu pistil, steril Perle de sticl cu diametrul de cca 6 mm Flacoane cu capacitatea de 90, 150 i 250 ml Pipete etalonate special pentru uz bacteriologic cu capacitate nominal de 1 ml cu diviziuni de 0,1 ml i al cror orificiu de scurgere are un diametru de 2-3 ml Etuv sau incubator ventilat () (care permite uscarea mediului gelozat turnat n plci) reglabil() la 50+-1oC

EANTIONARE Eantionarea se efectueaz conform standardului specific al produsului de analizat. Dac nu exist standard specific se recomand ca prile interesate s se pun de acord asupra acestui subiect. Eantioanele sunt etichetate, cuprinznd: produsul recoltat, examenul cerut, locul prelevrii, ziua i data prelevrii, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevrii, cine a prelevat. Eantionul se pregtete conform standardului internaional specific al produsului respective: Lapte crud i produse lactate se agit energic eantionul de analizat pentru a asigura o repartizare uniform a microorganismelor rsturnnd rapid de 25 de ori recipientul cu eantion. Trebuie evitat formarea spumei iar cea format trebuie dispersat. Intervalul dintre omogenizarea eantionului i prelevarea probei necesare analizei nu trebuie s depeasc 3 minute; Lapte praf, zer dulce i lactoz se amestec direct coninutul recipientului nchis, prin agitri i rsturnri repetate..Se cntresc 10 g eantion ntr-un vas de sticl i se rstoarn praful n sticla cu soluia de diluare (90 ml de soluie adecvat la 45+1oC n baie de ap). Se menin flacoanele n baia de ap timp de 5 minute agitnd din cnd n cnd. Se obine astfel o diluie de 10-1; Brnza i brnza topit se folosesc 10 g prob ntr-o capsul cu o cantitate mic de soluie de diluare i se omogenizeaz cu pistilul. Se adaug restul de diluare pn la ntregul volum de 90 ml soluie de diluare. Se obine astfel diluia 10-1; Untul se pune recipientul cu eantion ntr-o baie de ap la 45oC. Se agit pentru a uura topirea i se menine pn la topirea complet. Se agit i cu o pipet nclzit la cca 45oC se introduc 10 ml ntr-un flacon care conine 90 ml soluie de diluie. Se agit de fiecare dat naintea transferului urmtor. Se obine diluie de 101 . Pentru obinerea diluiilor se poate lucra alternativ numai cu faz apoas; Alimentele cu consisten semisolid se omogenizeaz ca atare; Alimentele cu consisten solid se mrunete n buci mici nainte de mojarare. Din proba de analizat se introduc n mojar 1g/10g + cantitatea egal de nisip steril. Se tritureaz adugndu-se treptat lichid de diluie de 9 ori mai mare dect eantionul.

Aciuni i/sau msuri preventive

Pentru a obine o cultur pur de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlrii) s fie steril. Sticlria ntrebuinat este sterilizat la etuv la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute. Pregtirea materialului de sterilizat: -

Splarea sticlriei cu ap cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de ap, dup care splarea cu ap distilat; Punerea de dopuri de vat cu tifon, nvelirea cu hrtie a gtului eprubetelor sau baloanelor; Introducerea n etuv pentru 30 de minute la 121oC.

Protecia personalului: Obligatorie purtarea halatului, Folosirea lampei de U.V. (nainte i dup nsmnare), Folosirea hotei de nsmnare

Metodologia de lucru nsmnare i incubare

Din produsul omogenizat i din fiecare diluie se nsmneaz cte 1 ml n cte o eprubet cu 10 ml chapman lichid.n cazul celorlalte produse din suspensia mam se nsmneaz cte 10 ml n cte o eprubet cu 10 ml chapman lichid. Se incubeaz eprubetele nsmnate cu mediu de mbogire timp de 24 48 h la temperatura de 35o 37oC. Din fiecare eprubet n care au aprut semne de dezvoltare microbien prin virarea culorii mediului de mbogire se fac treceri pe suprafaa unui mediu selectiv (chapman solid) turnat n plci Petri sterile prin strierea cu ajutorul unei anse de nsmnare. Plcile Petri astfel nsmnate se incubeaz la 35o 37oC timp de 24 48 h.
Interpretarea Se controleaz plcile Petri nsmnate i din cele unde s-au dezvoltat colonii caracteristice i/sau necaracteristice, se rein plcile care conin ntre 15 i 150 colonii caracteristice i/sau necaracteristice. Din fiecare plac Petri se aleg pentru confirmare cte 5 colonii caracteristice i/sau necaracteristice dup caz.

Test de confirmare (proba coagulazei) Cu ajutorul unei anse bacteriologice sterile se preleveaz o parte din fiecare colonie selecionat i se nsmneaz ntr-o eprubet cu bulion de inim creier. Se incubeaz la 35 o sau 37oC timp de 20 24 h. Se adaug n mod steril cte 0,1 ml din fiecare cultur la cte 0,3 ml plasm de iepure n eprubete sterile cu diametru de 10 x 75 ml i se incubeaz la 35 o sau 37oC. Se examineaz coagularea plasmei dup 4 6 h. Se consider c reacia coagulazei este pozitiv cnd coagulul ocup mai mult de trei ptrimi din volumul ocupat iniial de lichid. Pentru control se adaug 0,1 ml bulion de inim creier steril la cantitatea recomandat de plasm de iepure (0,3ml) i se incubeaz fr nsmnare. Pentru ca reacia s fie valabil plasma din eprubeta martor nu trebuie s prezinte semne de coagulare. Calculul

Dac cel puin 80% din coloniile selecionate sunt coagulaz pozitiv se ia ca numr de stafilococcus (aureus) numrul prezumtiv dat de numrtoarea fcut conform punctului 10.5. n toate celelalte cazuri numrul se calculeaz pornind de la numrul de stafilococcus aureus prezumtiv (punctul 10.5.) care sunt coagulaz pozitiv (punctul 10.6.). Cutiile care conin ntre 15 i 150 colonii caracteristice i/sau necaracteristice pentru dou diluii consecutive numrul de stafilococcus aureus pentru fiecare diluie se calculeaz aa cum se indic la punctul 10.7.1. i 10.7.2. i se face media aritmetic a celor dou valori obinute exceptnd cazul cnd raportul dintre valoarea cea mai mare i valoarea cea mai mic este peste 2; n acest caz se reine ca rezultat valoarea cea mai mic.

EXPRIMAREA REZULTATELOR Cu rezultatele obinute n cele dou serii de cutii sau cu cele dou diluii consecutive se calculeaz numrul mediu de stafilococcus aureus.Se adun mediile de stafilococcus aureus obinute din coloniile caracteristice i/sau necaracteristice, lund n considerare pentru fiecare factorul de diluie. Nu se rein dect dou cifre semnificative procednd dup cum urmeaz: dac numrul este mai mic de 100 se rotunjete la cel mai apropiat multiplu de 5 dac numrul este mai mare de 100 i se termin cu 5, se rotunjete la cel mai apropiat multiplu de 20 - dac numrul este mai mare de 100 i nu se termin cu 5, se rotunjete la cel mai apropiat multiplu 10 Pentru a se obine numrul de stafilococcus aureus pe gram de produs dup caz se multiplic aceast valoare cu inversul volumului inoculului i apoi cu inversul ratei de diluie a eantionului de analizat Rezultatul se exprim printr-un numr cuprins ntre 1,0 i 9,9 multiplicat cu 10 n, unde n este puterea corespunztoare. Pentru estimarea numerelor mici se face o medie din numrul coloniilor confirmate caracteristice i necaracteristice i se rotunjete la numrul ntreg urmtor cel mai apropiat. Dac pentru cutiile nsmnate cu eantion de analizat ( produs lichid) sau suspensie mam (alte produse) numrul mediu al coloniilor confirmate calculat conform punctului 11.1. este mai mic de 15 rezultatul se d sub forma

a) pentru prdusele lichide - mai puin de 15 x ne Stafilococcus aureus pe ml, unde ne este inversul volumului de inocul: ne = : ______1_______ Volum de inocul

b) pentru celelalte produse: - mai puin de 15 x Ne Stafilococcus aureus pe gram unde

Ne=

_____1_______ x ____________1___________ Volum de inocul diluia eantionului de analizat

c) pentru estimarea numerelor mici n produsele lichide: m x ne Stafilococcus aureus pe ml unde m este numrul de colonii confirmate d) pentru estimarea numerelor mici n celelalte produse: m x Ne Stafilococcus aureus pe gram unde m este numrul mediu de colonii comfirmate.

DETERMINAREA LISTERIEI MONOCYTOGENES DIN PRODUSELE ALIMENTARE Metoda stabilete prezena sau absena unei ncrcturi bacteriene cu L. monocytogenes n produsele alimentare. Metoda se aplic urmtoarelor produse: Lapte pentru consum Lapte praf Produse lactate praf pentru copii Smntn dulce pentru fric i fric btut Brnzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (ca, telemea proaspt) Brnzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (ca, telemea proaspt) Brnz proaspt din zer Brnz maturat n saramur din lapte pasteurizat Brnz maturat n saramur din lapte nepasteurizat Brnz fermentat cu past tare (svaier), semitare (moeciu), moale (Camembert, taga, nasal) Brnzeturi cu past filat (cacavaluri), afumate i neafumate Brnzeturi fermentate Margarin cu lapte Lapte concentrat cu zahr creme vegetal (nlocuitori de fric) Carne tocat i semipreparate din carne tocat (hamburger, past de mititei, crnai proaspei etc.) Preparate din carne srate i/sau afumate Mezeluri (prospturi, salamuri semiafumate) Mncruri gtite congelate i mncruri gtite, servite calde Preparate din carne, mixte sau simple, gata pregtite, care se consum reci, fr alt prelucrare (piftii, pateuri din carne i organe, biftec) Produse crude (niel, cacava pane) Prjituri cu crem Torturi cu diferite creme, fric, fructe Concentrate alimentare (supe, cuburi de carne)

Fructe de mare refrigerate Pepsin (pulbere n maestec cu sare) sandviciuri, mncruri tip fast-food

Listeria moncytogenes este bacterie gram pozitiv cu form de bastona scurt nesporogen cu mobilitate prin rostogolire la 25oC betahemolitic i care d testul camp pozitiv pentru S. aureus pe agarul cu snge de oaie, catalaz pozitiv, oxidaz pozitiv,ER/VP pozitiv, bilesculin pozitiv, fermenteaz glocuza i rahnoza, nu fermenteaz xiloza i manita, nu reduce nitratul.. Documente de referin STAS-uri folosite pentru produsele enumerate la punctul anterior sunt urmtoarele: ISO17025/2001 ISO 5541/1 1986 (pentru produse lactate i derivate) STAS 6349/4 1980 (pentru produse lactate) ISO 707 ISO 8261 (pentru lapte i produse lactate) ISO 4832 1992 (pentru produse carnate) STAS 2356 1982 (pentru produse carnate) SR ISO 6887/96 STAS 11499 1981 (pentru produse zaharoase) SR ISO 8924 1995 (pentru recipiente nchise)

Principiul metodei nsmnarea unei cantiti de eantion determinat 25 ml (produs) 25 g (alte produse) Identificarea L.monocytogenes necesit patru faze succesive de lucru. Izolarea L. monocytogenes din produsele alimentare este destul de dificil din cauza microorganismelor competitive prezente n numr mare.

Faza de prembogire selectiv - nsmnarea unei cantiti din eantion pe un mediu lichid de prembogire i incubarea acestuia la temperatura de 35oC timp de 48 h.(mediu demifraser). Faza de izolare selectiv - Din mediu de prembogire se striaz pe dou medii solide selective (agar Oxford i agar Palcam, turnat n plci Petri sterile) se incubeaz la 35oC timp de 24 48 h. Faza de mbogire selectiv - Din cultura cu mediu demifraser se inoculeaz 0,1 ml n 10 ml mediu lichid fraser. Tuburile inoculate se incubeaz la 35oC timp de 48 h. Faza de izolare selectiv - Din cultura pe mediu fraser cu ansa bacteriologic se nsmneaz pe dou medii de izolare selectiv (agar Oxford i agar Palcam) turnate n plci Petri sterile, se incubeaz la 35oC timp de 24 - 48 h.

Soluii de utilizare special i medii de cultur folosite Soluii de utilizare special agar moale peroxid de hidrogen 3% sol. 1% dihidroclorur de tetrametilenparafenilendiamin benzi livrate de Cantacuzino

mediu cu glucoz, manit, xiloz i rhamnoz mediu Klarc MR/VP mediu cu bil esculin reactiv Griess mediu pentru testul camp Medii de cultur Bulion demifraser (mediu de baz + supliment) Bulion fraser (mediu de baz + supliment) Agar oxford. (mediu de baz + supliment) Agar palcam (mediu de baz + supliment)

Sterilizarea mediilor de cultur trebuie fcut n autoclav la 121+-1oC timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Dac mediile de cultur nu sunt folosite imediat, ele trebuie pstrate la ntuneric ntre 0-5oC maxim 7 zile pentru evitarea oricrei modificri a volumului sau compoziiei lor. Echipamente de ncercare i mijloace de msurare utilizate

Termostat 35o +-0,5oC (LP 116 / 3622) aparat electric pentru dezvoltarea microbian Etuv 160 180oC (SP 125G 0220/90 /3620) asigur sterilizarea cu cldur uscat a obiectelor de sticl, porelan, hrtie, vat, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute

Autoclav (17148 / 3802) - realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultur, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute Lamp - radiaii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului ncperilor i a suprafeelor de lucru Balan analitic - balan electronic cu reglare automat funcie de temperatura camerei Sterilizator electric pentru instrumentar Baie de ap reglabil la temperatur mai mare de 100oC sau reglabil la 45oC Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm Pipete gradate sterile de 1 ml+- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml pH metru - cu compensare de temperatur cu exactitate 0,1 uniti de pH la 25o C Flacoane cu capacitatea de 250 ml pentru sterilizarea i pstrarea mediilor de cultur Eprubete de 16 x 160 mm sterile Pipete cu scurgere total cu capacitate nominal de 1 ml i 10 ml Mojar cu pistil, sterile

Pentru a obine o cultur pur de germeni de L. monocytogenes este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlrii) s fie steril. Sticlria ntrebuinat este sterilizat la etuv la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute. Pregtirea materialului de sterilizat:splarea i sterilizarea sticlriei

Splarea sticlriei cu ap cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de ap, dup care splarea cu ap distilat Punerea de dopuri de vat cu tifon, nvelirea cu hrtie a gtului eprubetelor sau baloanelor Introducerea n etuv pentru 30 de minute la 121oC

Eantionare - eantioanele sunt etichetate, cuprinznd: produsul recoltat, examenul cerut; locul prelevrii; ziua i data prelevrii; data de valabilitate; sigiliul; martorii prelevrii; cine a prelevat. Lapte i produse lactate se agit energic eantionul de analizat pentru a asigura o repartizare uniform a microorganismelor rsturnnd rapid de 25 de ori recipientul cu eantion. Trebuie evitat formarea spumei iar cea format trebuie dispersat. Intervalul dintre omogenizarea eantionului i prelevarea probei necesare analizei nu trebuie s depeasc 3 minute. Lapte praf, zer dulce se amestec direct coninutul recipientului nchis, prin agitri i rsturnri repetate. Se cntresc 25 g eantion ntr-un vas de sticl i se rstoarn praful n flaconul cu mediu de prembogire Se menin flacoanele n baia de ap timp de 5 minute agitnd din cnd n cnd. Brnza i brnza topit se folosesc 25 g prob ntr-un mojar cu pistil steril. Se transfer proba ntr-un flacon steril peste care se adaug mediu de prembogire lichid Omogenizare prin mojarare Alimentul cu consisten semisolid se omogenizeaz ca atare. Alimentul cu consisten solid se mrunete n buci mici nainte de mojarare. Din proba de analizat se introduc n mojar 25g/10g + cantitatea egal de nisip steril. Se tritureaz, se transfer ntr-un flacon steril peste care se adaug mediu de prembogire. Aciuni i/sau msuri preventive Protecia personalului - Obligatorie purtarea halatului - Folosirea lampei de U.V. (nainte i dup nsmnare) - Folosirea hotei de nsmnare - Pipetele sunt prevzute cu dop de vat nehidrofil pentru a preveni aspirarea accidental a eantionului - Flambarea ansei se face nti la baza flcrii i apoi la vrf pentru a mpiedica rspndirea germenilor - Dezinfecia suprafeelor de lucru cu soluii dezinfectante Protecia mijloacelor de ncercare i/sau msurare - Sticlria steril se pstreaz n dulapuri speciale - Sticlria steril se folosete maxim 6 zile - Executarea periodic a serviciilor de ntreinere i curire zilnic a aparaturii - Verificarea i nregistrarea temperaturii din ncperea de lucru Verificarea strii de funcionare i confirmarea metrologic a mijloacelor de msurare - Verificarea de dou ori pe zi a temperaturii termostatelor - Teste privind efectuarea corect a sterilizrii: fizico-chimice microbiologice (stearotest i test Subtilis)

Controlul indirect al sterilizrii controlul sterilitii materialelor de laborator Termostatarea 24-48 ore a mediilor de cultur gata pregtite Tulpinile de referin pentru medii de cultur din ziua respectiv

Modul de lucru Pregtirea eantionului pentru analiz .Cu instrumente sterile, se recolteaz 25 ml din eantion n cazul produselor lichide i 25 g din eantionele semisolide i solide n mojare cu pistil sterile, se tritureaz, dup care se introduc n flacoane sterile nsmnare i incubare . 1. Cu instrumente sterile, se recolteaz 25 ml ntr-un flacon steril peste care se adaug 225 ml mediu de prembogire n cazul eantionului lichid i 25 g din eantioanele semisolide i solide n mojare cu pistil sterile, se tritureaz, dup care se introduc n flacoane sterile peste care se adaug 225 ml mediu de prembogire (demifraser).Se termostateaz la 35oC timp de 24 h. 2. Din cultura obinut se striaz cu o ans bacteriologic steril, pe medii selective agar Oxford i Palcam turnate n cutii Petri sterile. Se incubeaz timp 48 h la temperatura de 35oC. 3. Din cultura obinut se inoculeaz 0,1 ml n 10 ml mediu de mbogire Fraser, se incubeaz la 35oC timp de 48 h. 4. Din cultura obinut se striaz cu o ans bacteriologic steril pe medii selective agar Oxford i Palcam, se incubeaz la 35oC timp de 48 h.

Interpretarea - Dup incubare, cutiile Petri nsmnate la punctul 10.4.4.,se examineaz i se rein cele n care s-au dezvoltat colonii suspecte de L. monocytogenes. Test de confirmare - Culturile obinute pe suprafaa agarului Oxford i Palcam(Se rein 5 colonii specifice sau suspecte), suspecte ca fiind L.monocytogenes, se transplanteaz pe bulion i agar nutritiv, se incubeaz la 35oC timp de 24 h dup care se supun urmtoarelor teste: 1. Mobilitate - Examen microscopic- ntre lam i lamel; Examen cultural n agar moale (dezvoltare sub form de umbrel la 25oC) 2. Reacia catalazei - O ans de cultur se introduce ntr-o pictur de peroxid de hidrogen 3% depus pe o lam de sticl. Apariia imediat a bulelor de gaze se interpreteaz ca reacie pozitiv i este specific pentru L. monocytogenes. 3. Testul hemolizei - Pe agar cu snge se striaz o ans bacteriologic din cultura obinut la punctul 10.6., se incubeaz la 35 oC timp de 24 h. Dup care se examineaz placa Petri observndu-se hemoliz beta. 4. Fermentarea hidrailor de carbon (glucoz, manit, xiloz i rhamnoz) n eprubetele cu zaharurile mai sus menionate, cu o pipet steril se introduc cte 0,1 ml din cultura obinut n bulion nutritiv. Se termostateaz la 35oC timp de 24 h dup care examineaz. Reacia este pozitiv la glucoz i rhamnoz; reacia este negativ la manit i xiloz. 5. Reacia MR/VP- se folosete mediu Clarc i reacia este pozitiv 6. Reacia reducerii nitratului n nitrit negativ 7. Testul CAMP - Pe suprafaa agarului cu snge de oaie turnat n cutii Petri se striaz n linie dreapt pe tot diametrul cutiei cultur de 24 h de Stafilococcus aureus i R.eqvila distan de 3-4 cm una de alta i pe ct se paote linii paralele. Tulpinile de testat se striaz pe suprafaa agarului perpendicular pe primele dou strii n aa fel ca striile culturilor de testat s se opreasc la 2-3

mm de acestea. Rspunsul caracteristic pentru fiecare specie este pozitiv la Stafilocococus aureus i pozitiv sau negativ la R.eqvi, dup incubare de 24 h la 35oC

Exprimarea rezultatelor

Testul biochimic

L. monoc ytogen es + + + + -

L. ivanovi i + + + + -

L. innocu a + V + + -

L. welsh imerii + + V + + -

L. seelige ri + + + + -

L. grayi

L.mur rayi

Producerea de acid din:

D-glucoz D-xiloz D-manitol D-rhamnoz maltoz

+ + + + +

+ + V + + +

Ptoducere de :

catalaz H2S/TSI H2S/benzi de acetat de plumb betahemoliz

+ + + + + + +/-

+ + + + + +

+ + + + -

+ + + + -

+ + + + + + -

+ + + -

+ + + + -

Hidroliza esculinei Hidroliza hipuratului Hidroliza ureei Reducerea nitrailot Reacia Voges-Prostkauer Reacia Roului de metil CAMP-S.aureus CAMP-R.eqvi

n funcie de rezultatele interpretrii se indic prezena sau absena germenilor din genul Listeria monocytogenes n x grame de prob de analizat. Repetabilitate Diferena absolut dintre dou rezultate ale analizelor individuale, obinute cu ajutorul aceleeai metode, pe un material identic supus analizei, n acelai laborator, de ctre acelai operator, utiliznd aceeai aparatur, ntr-un scurt interval de timp nu trebuie s depeasc 30% din rezultatul cel mai mic.

***) Cnd condiiile de repetabilitate nu sunt ndeplinite n 5% sau mai mult din cazuri, se recomand a se cuta sursele posibile de eroare. A se vedea n ISO 5725, definiia repetabilitii.

SCHEMA MODULUI DE LUCRU

Prob de analizat, 25g +

mediu de mbogire primar (DEMIFRASER), 225ml incubare la 30oC timp de 24+-2 h

0,1ml cultur n 10 ml FRASER

striere pe agar OXFORD striere pe agar PALCAM

incubare la 35o 37oC timp de 48+-2 h

striere pe agar OXFORD striere pe agar PALCAM

confirmare

DETECTAREA SPECIILOR TERMOTOLERANTE DE CAMPYLOBACTER Bacteriile din genul Campylobacter sunt microorganisme care formeaz colonii tipice pe mediile solide, selective la 42oC, dintr-o cantitate dat de produs i care manifest caracteristicile de mobilitate i proprietile biochimice specifice. Procedura stabilete prezena sau absena unei ncrcturi bacteriene din genul Campylobacter n produsele cercetate. Metoda se aplic urmtoarelor produse: - Lapte crud - Carne de pasre Documente de referin: - SR ISO 10272/2000 - ISO 707 - SR ISO 6887/96 Principiul metodei: Pentru detectarea speciilor termotolerante de Campylobacter se cer urmtoarele faze: mbogire n mediu lichid - nsmanarea probei luate n lucru n mediu lichid (bulion Preston) i incubare la 42oC timp de 18 h. Izolare i identificare - din culturile obinute se face nsmanarea mediului selectiv solid (Agar Karmali) i incubare la 42oC timp de 24-72 h. Confirmare - efectuare de teste biochimice i serologice adecvate. Soluii de diluare i medii de cultur folosite: Soluii de utilizare special: Bulion Brucella; Agar Columbia cu sange; Agar TSI. Medii de cultur - Bulion Preston; Agar Karmali. Sterilizarea trebuie fcut n autoclav la 121+-1oC timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Dac soluiile de diluare nu sunt folosite imediat, ele trebuie pstrate la ntuneric ntre 0-5oC maxim 7 zile pentru evitarea oricrei modificri a volumului sau compoziiei lor. Echipamente de ncercare i mijloace de msurare

Termostat - reglabil la 42oC Etuv 160 180oC - asigur sterilizarea cu cldur uscat a obiectelor de sticl, porelan, hrtie, vat, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute

Autoclav - realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultur, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute Lamp U.V. - radiaii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului ncperilor i a suprafeelor de lucru Balan analitic - balan electronic cu reglare automat funcie de temperatura camerei Sterilizator electric pentru instrumente Ans buclat din paltin-iridiu sau nichel-crom cu diametrul de 3 mm Pipete gradate sterile cu scurgere total de 1 ml, de 10 ml i pipete Pasteur Lup cu putere de mrire de 3x pH metru cu compensare de temperatur cu exactitate 0,1 uniti de pH la 25o C Microscop Recipiente n principal eprubete de 16 mm x 160 mm i de 9 mm x 180 mm, eprubete pentru hemoliz de 13 mm x 75 mm, sticle cu capace metalice netoxice i/sau flacoane prevzute cu dopuri de bumbac, care s permit circulaia gazelor pentru a se realiza atmosfera microaerob necesar. Cutii petri de sticl sau de material plastic cu diametrul de 90 mm i 100 mm Mojar cu pistil, sterile Eeantionare - este important ca laboratorul s primeasc un eantion cu adevrat reprezentativ Reguli de procedur pentru determinarea germenilor din genul campylobacter Modul de analiz, acceptare i nregistrare a comenzilor este conform Manualului de Calitate LM 02 Eantioanele sunt etichetate, cuprinznd; produsul recoltat, examenul cerut, locul prelevrii, zua i data prelevrii, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevrii, cine a prelevat. Pentru a obine o cultur pur de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlrii) s fie steril. Sticlria ntrebuinat este sterilizat la etuv la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute. Pregtirea materialului de sterilizat: Splarea sticlriei cu ap cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de ap, dup care splarea cu ap distilat - Punerea de dopuri de vat cu tifon, mpachetarea cu hrtie a gtului eprubetelor sau baloanelor - Introducerea n etuv pentru 30 de minute la 121oC Omogenizare prin mojarare - alimentul cu consisten lichid se omogenizeaz ca atare. Alimentul cu consisten solid se mrunete n buci mici nainte de mojarare. Din proba de analizat se introduc n mojar 1g/10g + cantitatea egal de nisip steril. Se tritureaz adugnduse treptat lichid de diluie de 9 ori mai mare dect eantionul. Aciuni i/sau msuri preventive Protecia personalului - Obligatorie purtarea halatului - Folosirea lampei de U.V. (nainte i dup nsmnare) - Folosirea hotei de nsmnare - Pipetele sunt prevzute cu dop de vat nehidrofil pentru a preveni aspirarea accidental a eantionului

Flambarea ansei se face nti la baza flcrii i apoi la vrf pentru a mpiedica rspndirea germenilor Dezinfecia suprafeelor de lucru cu soluii dezinfectante Protecia mijloacelor de ncercare i/sau msurare Sticlria steril se pstreaz n dulapuri speciale Sticlria steril se folosete maxim 6 zile Executarea periodic a serviciilor de ntreinere i curire zilnic a aparaturii Verificarea i nregistrarea temperaturii din ncperea de lucru

DIAGRAMA MODULUI DE LUCRU

Prob de testat x g sau x ml

9 x bulion Preston

mbogire Incubare n atmosfer microaerob, la 42oC timp de 18 h

striere

agar Karmali Incubare n atmosfer microaerob, la 42oC timp de 24 h.........72 h (pan la 5 zile dac este necesar) 5 colonii caracteristice teste suplimentare exprimare rezultate

Factorii care influeneaz fidelitatea metodei sunt urmtorii: Tipul de aparatur pentru omogenizare

Durata omogenizrii Mediu lichid de mbogire

Pregtirea eantionului pentru analiz Se efectueaz conform standardului internaional pentru produsul de analizat. Dac nu exist standard internaional de produs se recomand ca prile interesate s se pun de acord asupra subiectului.
1. nsmnare i incubare

2. Faza de mbogire Pentru a prepara suspensia iniial se adaug o poriune din eantionul de examinat (mas sau volum) n 9 ml mediu de mbogire, bulion Preston pentru a obine un raport de 1/10 (mas/volum sau volum/volum) ntre produsul de examinat i mediu. Suspensia obinut, se incubeaz la 42oC, ntr-o atmosfer microaerob timp de 18 h. 3. Izolare i Identificare Din cultura obinut prin mbogire n bulion Preston, dup 18 h incubare, cu o ans bacteriologic se nsmaneaz, prin striere suprafaa agarului Karmali, din dou cutii Petri. Cutiile Petri nsmanate, se incubeaz n atmosfer microaerob la 42oC timp de 24 h, 48 h sau chiar 3 pan la 5 zile, dup care se examineaz cutiile Petri n vederea detectrii prezenei coloniilor tipice de Campylobacter termotolerant. 4. Interpretare Pe mediul agar Karmali coloniile tipice sunt plate asemntoare unor picturi alungite. 5. Test de confirmare Alegerea coloniilor pentru confirmare Pentru confirmare se aleg, din toate cutiile Petri inoculate cate 5 colonii tipice i/sau suspecte.Dac ntr-o cutie Petri sunt mai puin de 5 colonii tipice i/sau suspecte, se iau toate pentru confirmare. Examinarea caracterelor morfologice i de mobilitate o Din fiecare cutie Petri se utilizeaz cate o colonie perfect izolat pentru realizarea unui frotiu colorat Gram. o Se ia o colonie din cele 5 alese i se omogenizeaz ntr-un 1 ml bulion Brucella. o Se examineaz la microscop morfologia i mobilitatea fiecrei colonii selectate. o Pentru examinrile ulterioare, se rein suspensiile n care se evideniaz bacili Gram negativi, curbai cu o micare n spiral, de tirbuon, caracteristic. Studiu morfologic Din suspensiile selectate se fac strieri cu ansa pe agar Columbia cu sange pentru a obine colonii bine izolate. Cutiile Petri inoculate se incubeaz n atmosfer microaerob, la 42 oC, timp de 24 h i se utilizeaz pentru testele biochimice, culturile pure. Cretere la 25oC Din cutiile Petri cu agar Columbia cu sange se ia cate o colonie i se descarc ntr-un tub de bulion Brucella, se incubeaz la 25oC, n atmosfer microaerob timp de dou pan la cinci zile.Dup incubare se examineaz prezena sau absena creterii. Confirmri biochimice

o Detectarea oxidazei Cu o ans bacteriologic sau cu o baghet de sticl se ia o poriune dintr-o colonie bine izolat, din fiecare cutie Petri i se descarc pe o hartie de filtru mbibat cu reactiv pentru oxidaz. Apariia n 10 sec a unei culori mov, violet sau albastru nchis indic o reacie pozitiv. Cand se utilizeaz chituri de testare provenite din comer, se respect instruciunile productorului. Pentru confirmarea rezultatelor pozitive sau negative se utilizeaz tulpini martor. o Agar TSI Din fiecare colonie selectat se face inocularea agarului cu ansa. Se neap cu ansa, partea drept a agarului, pe toat lungimea sa, apoi se descarc, prin striere, pe partea nclinat a acestuia. Se incubeaz n atmosfer microaerob la 42oC, timp de 24 h i chiar 5 zile, dac este necesar. Interpretarea reaciilor se face n felul urmtor:

Partea dreapt galben Rou sau neschimbat Negru Bule de gaz sau spargerea agarului glucoz pozitiv (fermenteaz glucoza) glucoz negativ (nu fermenteaz glucoza) formare de hidrogen sulfurat (H2S) formare de gaz din glucoz

Partea nclinat Galben lactoz i/sau zaharoz pozitiv (unul sau ambele zaharuri sunt folosite) Rou sau neschimbat lactoz i zaharoz negativ (nici un zahar nu este folosit o Detectarea catalazei Din culturile obinute pe agar TSI se omogenizeaz cu ansa, ntr-o pictur de soluie de peroxid de hidrogen depus pe o lam microscopic n stare curat. Apariia n 30 sec., a bulelor de gaz indic reacie pozitiv. o Detectarea sensibilitii la acid nalidixic i cefalotin Se inoculeaz cu ansa, coloniile selectate, n bulion Brucella, pan cand se realizeaz o suspensie cu densitatea de 0,5 pe scara Mac-Farland. Suspensia realizat se dilueaz 1 : 10 cu bulion Brucella. Se inund cu suspensia diluat suprafaa agarului Mueller-Hinton cu 5% sange dintr-o cutie Petri. Se las n contact 5 min, dup care se nltur suspensia n exces.

Se usuc suprafaa mediului din cutii, prin meninere n etuv, la 37 oC, timp de 24 h.Pe suprafaa agarului uscat se aplic un disc cu acid nalidixic i un altul cu cefalotin. Se incubeaz ntr-o atmosfer microaerob la 37oC timp de 24 h. Interpretarea creterii bacteriene se face n felul urmtor; -cretere realizat n contact cu discul se consider rezisten; -prezena unei zone de o anumit mrime, unde se observ inhibarea creterii, se consider sensibilitate.

o Detectarea hidrolizei hipuratului Coloniile selectate de pe agar Columbia cu sange se inoculeaz cu o ans ntr-un tub Waserman (de hemoliz) 0,4 ml soluie de hipurat de sodiu. Se agit tubul uor i se incubeaz ntr-o baie de ap la 37oC timp de 24 h. Se adaug foarte uor 0,2 ml soluie de ninhidrin pe suprafaa soluiei de hipurat de sodiu. Nu se agit. Se incubeaz n baie de ap la 37oC timp de 10 min. Reacia este pozitiv atunci cand apare culoarea violet nchis. Culoarea violet deschis sau lipsa modificrii culorii indic reacie negativ. Eexprimarea rezultatelor - n funcie de rezultatele interpretrii se indic prezena sau absena germenilor din genul Campylobacter termotolerant n x grame de prob de analizat

DETERMINARE DE ESCHERICHIA COLI O157 H7 DIN CARNEA DE BOVIN Scop - Procedura stabilete prezena sau absena unei ncrcturi bacteriene coliforme n produsele cercetate. Aceast procedur cuprinde directive generale pentru determinarea numrului de uniti formatoare de colonii (UFC) de microorganisme prin metoda numrrii coloniilor la 30 o C. Metoda se aplic urmtoarelor produse: - Carne de vit i produse din carne care conin carne de vit Documente de referin STAS-uri folosite pentru produsele enumerate la punctul anterior sunt urmtoarele: - ISO17025/2001 - SR ISO 16654/99 - ISO 707 - ISO 4832 1992 (pentru produse carnate) - STAS 2356 1982 (pentru produse carnate) - SR ISO 6887/96 Simboluri i prescurtri

- BBLV +n Bulion EC cu novobiocin - MCS Agar MacConkey cu sorbitol - Ap peptonat cu sorbitol - ABT sorbitol Principiul metodei

nsmnarea a unei cantiti de 25 g de produs n 225 ml bulion EC cu novobiocin. Incubare la 35oC timp de 24 h. Din cultura cu bulion de mbogire se efectueaz diluii decimale de la 10 -1 pn la 105 .Din ultimele dou diluii se striaz cu ansa bacteriologic pe suprafaa unui mediu selectiv (agar Mac Conkey cu sorbitol) turnat n plci Petri sterile.Incubare la 35oC timp de 24 h. Identificare. 5 colonii cu aspect caracteristic din fiecare prob, dezvoltate pe suprafaa agarului MacConkey se nsmneaz fiecare colonie n urmtoarele medii: - Bulion nutritiv - Bulion EC n eprubete cu tub de fermentaie - Ap peptonat cu sorbitol i ABT cu sorbitol - Ap peptonat cu celobioz i ABT celobioz - Agar nutritiv nclinat - Agar TSI - Agar cu lizin i fier (LIA) - Agar cu citrat (SIMON) - Agar nutritiv moale n coloan sau SIM - Agar Levine Incubare la 35oC timp de 24 h. Citirea rezultatelor la testele executate. Executarea reaciei betagalactozidazei cu cultura dezvoltat pe agarul nclinat. Executarea reaciei de seroaglutinare pe lam cu cultura dezvoltat pe suprafaa agarului nclnat cu serul anti O157 i separat cu serul anti H7. Stimularea mobilitii n cazul seroaglutinrii negative cu antiserul H7. Soluii de utilizare special -

Bulion nutritiv Bulion EC n eprubete cu tub de fermentaie Ap peptonat cu sorbitol i ABT cu sorbitol Ap peptonat cu celobioz i ABT celobioz Agar nutritiv nclinat Agar TSI Agar cu lizin i fier (LIA) Agar cu citrat (SIMON) Agar nutritiv moale n coloan sau SIM Agar Levine Ser aglutinant O157 Ser aglutinat H7

Repartizarea, sterilizarea i pstrarea soluiilor de diluare i mediilor de cultur

Se repartizeaz soluiile de diluare pentru diluiile iniiale n flacoane sau sticle iar pentru diluiie urmtoare n eprubete sau sticle. Cantitile trebuie astfel repartizate astfel nct dup sterilizare fiecare flecon sau sticl s conin 90 ml soluie de diluare sau un multiplu de 9 ml. Eprubetele, flacoanele sau sticlele trebuie nchise cu dopuri. Sterilizarea trebuie fcut n autoclav la 121+-1oC timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Dac soluiile de diluare nu sunt folosite imediat, ele trebuie pstrate la ntuneric ntre 05oC maxim o lun pentru evitarea oricrei modificri a volumului sau compoziiei lor. Medii de cultur Bulion EC modificat cu novobiocin Agar MacConkey cu sorbitol (BCIG) Agar Levine Agar cu sorbitol rou de fenol i 4-metylunbelliferyl-beta-de-glucuronoid(PRS MUG) Echipamente de ncercare i mijloace de msurare o o o o
o o

o
o o o o

o o
o

o o o

o o o Eantioanele sunt etichetate, cuprinznd; produsul recoltat, examenul cerut , locul prelevrii, ziua i data prelevrii, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevrii, cine a prelevat Pentru a obine o cultur pur de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlrii) s fie steril. Sticlria ntrebuinat este sterilizat la etuv la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute. Pregtirea materialului de sterilizat:

Termostat 30o +-0,5oC aparat electric pentru dezvoltarea microbian Etuv 160 180oC - asigur sterilizarea cu cldur uscat a obiectelor de sticl, porelan, hrtie, vat, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute Autoclav - realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultur, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121 oC timp de 20-30 minute Lamp U.V. - radiaii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului ncperilor i a suprafeelor de lucru Balan analitic - balan electronic cu reglare automat funcie de temperatura camerei Stomacher - dispozitiv de mrunire, tocare i omogenizare Baie de ap reglabil la temperatur mai mare de 100oC sau reglabil la 45oC Cutii Petri sterile cu diametrul de 100x15 mm;150x15 mm; 60x15 mm Pipete automate cu vrfuri de plastic sterile pentru o singur folosire, calibrate pentru a repartiza 100 microlitri Anse bacteriologice din nichel-crom pH metru cu compensare de temperatur cu exactitate 0,1 uniti de pH la 25o C Alte materiale ce se folosesc curent n laboratoarele de microbiologie (lame microscopice de sticl, eprubete i pipete gradate de diferite capaciti, etc) Pungi de plastic sterile pentru stomacher sau baloane erlenmayer cu gura larg de 300 sau 500ml Tuburi Durham cu dimensiuni corespunztoare pentru utilizare n eprubete de 16 x 160 mm Pipete cu scurgere total cu capacitate nominal de 1 ml i 10 ml Mojar cu pistil, sterile

Splarea sticlriei cu ap cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de ap, dup care splarea cu ap distilat - Punerea de dopuri de vat cu tifon, nvelirea cu hrtie a gtului eprubetelor sau baloanelor - Introducerea n etuv pentru 30 de minute la 121oC Pregtirea eantionului pentru analiz Eantionul se pregtete conform standardului internaional specific al produsului respectiv Pentru a se evita lezarea microorganismelor datorit schimbrilor brute de temperatur, mediu de mbogire selectiv trebuie s aib aproximativ aceeai temperatur cu proba, dac nu exist alte prescripii. Protecia personalului Obligatorie purtarea halatului Folosirea lampei de U.V. (nainte i dup nsmnare) Folosirea hotei de nsmnare Pipetele sunt prevzute cu dop de vat nehidrofil pentru a preveni aspirarea accidental a eantionului Flambarea ansei se face nti la baza flcrii i apoi la vrf pentru a mpiedica rspndirea germenilor Dezinfecia suprafeelor de lucru cu soluii dezinfectante

Modul de lucru o nsmnare i incubare 1. mbogire selectiv. - Se cntrete 25g din eantion, se mrunete i se omogenizeaz cu ajutorul stomacherului peste care se adaug 225 ml bulion m EC + n. Se incubeaz la 35oC timp de 24 h. 2. Obinerea de colonii izolate: Din cultura obinut se fac diluii n ser fiziologic: de la 10-1 pn la 10-5. Din ultimele dou diluii se striaz cte 0,1 ml pe suprafaa agarului MacConkey cu sorbitol (BCIG) turnat n plci Petri sterile. Se incubeaz la 35oC timp de 24 h 3. Din plcile cu BCIG se iau 5 colonii suspecte (colonii albe) ca fiind colonii de E. coli O157H7 i se striaz pe suprafaa mediului PRS-MUG turnat n plci Petri sterile, se incubeaz plcile timp 24 h la temperatura de 35oC. 4. Identificare. Cele 5 colonii cu aspect caracteristic din fiecare plac Petri se nsmneaz fiecare pe urmtoarele medii:bulion nutritiv-indol pozitiv; bulion EC n eprubete cu tub de fermentaie-dezvoltare de gaze; ap peptonat cu sorbitol i ABT-sorbitol negativ; ap peptonat cu celobioz i ABT-celobioz negativ; agar nutritiv nclinat-R.beta-galactoxidaz pozitiv; agar TSI-galben H2 S-negativ; agar cu lizin i fier (LIA)-lizin decarboxilaz pozitiv; agar cu citrat (SIMON)-negativ; agar nutritiv moale n coloan sau SIM-mobilitate pozitiv; agar Levine-colinii caracteristice 5. Incubare la 35oC timp de 24 h. 6. Citirea rezultatelor; executarea reaciei beta galactozidazei cu cultura dezvoltat pe agarul nclinat; executarea reaciilor de seroaglutinare pe lam cu cultura dezvoltat pe suprafaa agarului nclinat i serul anti O157 i separat cu serul anti H7. Stimularea mobilitii n cazul seroaglutinrii negative cu antiserul H7. 7. Interpretarea - Rspunsul caracteristic la testele biochimice i seroaglutinarea pozitiv cu antiserurile O157 H7 demonstreaz prezena E. coli O157 H7 n 25 g produs examinat. n cazul c toate testele sunt caracteristice pentru E. coli O157 H7 , iar seroaglutinarea cu serul H7 este negativ i dup operaiunea de stimulare a

mobilitii se va concluziona c n 25 g produs s-a decelat prezana E. coli O 157 imobil. Exprimarea rezultatelor - n funcie de rezultatele interpretrii se indic prezena sau absena a Escherichiei coli O157 H7 n x grame de prob de analizat. Repetabilitate - Diferena absolut dintre dou rezultate ale analizelor individuale, obinute cu ajutorul aceleeai metode, pe un material identic supus analizei, n acelai laborator, de ctre acelai operator, utiliznd aceeai aparatur, ntr-un scurt interval de timp nu trebuie s depeasc 30% din rezultatul cel mai mic. Cnd condiiile de repetabilitate nu sunt ndeplinite n 5% sau mai mult din cazuri, se recomand a se cuta sursele posibile de eroare. A se vedea n ISO 5725, definiia repetabilitii. Testul Caracterul coloniilor pe: Folosirea citratului Aspectul pe: Lizin decarboxilaz Fermentarea celobiozei Producerea de betagalacto-xidaz Mediul folosit EMB (Levine) Agar cu citrat (Simons) Agar TSI LIA sau Moeller Ap triptonat + celobioz Agar nclinat + BCIG Reacia caracteristic pentru E. coli O157 H7 colonii de mrime medie, violet-maronii cu luciu metalic negativ coloan i pant galbene, H2S-negativ pozitiv negativ negativ