• 1.

IMPLICAŢII TEORETICE ŞI APLICATIVE ALE CULTURILOR IN VITRO

• - posibilitatea utilizării lor pentru multiplicarea unor soiuri sau chiar indivizi, cu calităţi productive de
excepţie.
• Primele încercări - Morel - 1963 la specii de Cymbidium (orhidee)
• - necesităţile horticulturii au impus folosirea pe scară largă a acestei metode şi aici s-au obţinut
cele mai multe şi valoroase rezultate.
• - culturile de meristeme radiculare, caulinare sau din muguri axilari, urmată de regenerare - s-au
obţinut plante identice cu planta donatoare - adică multiplicarea masivă a unui anumit individ
valoros.
• - metoda s-a extins şi asupra altor specii ornamentale: Begonia, Chrysanthemum, Gerbera.
• - in prezent există cca 200 specii la care se poate asigura multiplicarea şi propagarea prin metoda
culturilor in vitro.
• - metoda permite obţinerea într-un ritm cât mai rapid, la un preţ cât mai scăzut a unor copii
conforme cu planta donatoare (clonarea), deci menţinerea calităţilor genotipului supus
micromultiplicării, parametrii imposibil de atins prin metodele tradiţionale.
• La pomii fructiferi introducerea unui nou soi în cultură, prin practicile tradiţionale, presupunea o
durată de câţiva ani, în timp ce prin micropropagare se realizează o scurtare considerabilă a
perioadei de formare a unui stoc de plante (Morel, 1962).
• - prin metodele clasice de înmulţire vegetativă există neajunsul de a vehicula din planta donatoare
de material de inmulţire, către planta nou formată o serie de boli, astfel încât planta nou formată
este chiar de la inceputul vieţii tarată de prezenţa germenilor fitopatogeni. Tehnica culturilor de
meristeme, în scopul devirozării a fost pusă la punct, încă din 1962 de către Morel şi Martin.
• - haploidia - cultura de antere, polen, ovule. Pe această cale se pot produce plante
haploide şi ulterior, prin diploidizarea lor, se obţin indivizi perfect homozigoţi (linii
izogene) - sunt rezultate la cartof, tutun, orez.
• Plantele haploide se obţin fie pornindu-se de la cultura de polen, fie de la cea de
antere.

• - prin culturile in vitro, se constată o revigorare a cercetărilor ce au ca scop obţinerea

de mutante cu certe valori practice. In timp s-au obţinut şi selecţionat mutante
deosebit de valoroase la cartof (caracterizate prin rezistenţa la atacul cu Phytophtora
infestans), la sfecla de zahăr (cu rezistenţa la atacul unor virusuri), mutante auxotrofe
(cele ce nu se pot dezvolta pe medii minimale).
• O direcţie relativ recentă dar deosebit de promiţătoare şi modernă totodată, este
aceea a crioconservării (cunoscută şi sub numele de crioprezervare).
• Unele linii celulare sau chiar indivizi, care prezintă valoare (fie teoretică, fie
aplicativă), nu pot fi păstrate un timp prea lung ca atare şi nici nu pot fi stocate în
stadiul de sămânţă. Fiind foarte utile pentru bancile de gene şi indispensabile pentru
iniţierea unor investigaţii ulterioare, ele sunt conservate ca atare, prin menţinerea la
temperaturi scăzute. La ora actuală sunt puse la punct metode pentru
crioprezervarea protoplaştilor, celulelor sau meristemelor.
Tentativele de manipulare a materialului genetic - obţinerea de noi genotipuri, -
transferarea unor gene de la un individ la altul, cei doi indivizi aparţinând la aceeaşi
specie, la specii diferite din acelaşi gen sau chiar la genuri diferite.

Pentru ca scopul sa fie atins se impun doua condiţii şi anume:

•-gena ce urmează a fi transferată trebuie să poată fi integrată în genotipul gazdei;
•-gena transferată şi integrată în noul genotip trebuie să fie functională, adică să fie aptă
de a asigura transcripţia şi translaţia informaţiei pe care o conţine.

•In contextul acestui proces un rol de prim ordin îi revine vectorului. In majoritatea
cazurilor, drept vectori genici s-au utilizat plasmidele Ti, din Agrobacterium tumefaciens
sau virusul mozaicului tutunului.
• Cu utilitate practică imediată este tentativa de a asigura producerea substanţelor
biologic active, în special din categoria metaboliţilor secundari, prin metoda culturilor
in vitro.

- plantele - izvor de produşi alcaloidici, terpenici, glicozidici, vitamine, hormoni,

produşi cu largă utilizare în farmacie, cosmetică sau pur şi simplu în alimentaţie.
In cazul plantelor intacte, acumularea unor astfel de substanţe este asigurată de
prezenţa unor ţesuturi sau organe specializate. De pildă, chinina se acumulează în
scoarţa plantelor (din specii de Cinchona).
In cazul culturii de celule sau ţesuturi in vitro acest lucru nu mai este posibil. In plus,
prin cultura in vitro, cu timpul celulele îşi pierd capacitatea biosintetică pe care o
etalau în cazul individului integral. Pe de altă parte însă, în cazul culturii in vitro se
poate exercita o presiune selectivă eficientă, succesiunea generaţiilor fiind mult mai
rapidă (comparativ cu succesiunea indivizilor in vivo). Se cunosc deja exemple în
care, prin selecţie, s-au obţinut cantităţi suficient de mari de substanţe utile
(comparabile, ca preţ de cost, cu cele din vivo).
• In acest sens putem cita producerea de acid rosmarinic şi antrachinona (Zenk şi
colab, 1975- 1977). In Japonia se produce ubiquinona, medicament folosit în
tratamentul bolilor de inimă, prin cultivarea unor linii celulare de Nicotiana tabacum, în
bioreactoare de mare capacitate (Ikuta şi colab, 1976).

• Un alt aspect, deosebit de promiţător, al culturilor in vitro îl constituie realizarea

biotransformării unor compuşi cu utilitate practică. Spre exemplu, s-a asigurat obţinerea
metil-digoxinei din metil-digitoxina, prin hidroxilare, în culturi de Digitalis lanata
(Reinhard şi Alferman, 1980).

Culturile in vitro prezintă un mare interes şi deosebită importanţă pentru biologia

teoretică.
• De la cercetările din acest domeniu se aşteaptă elucidarea unor aspecte privind
procesele fiziologo-biochimice la nivel celular, diviziunea celulară, diferenţierea
celulară, rolul fitohormonilor, totipotenţa celulară.
• Prin investigaţii asupra protoplaştilor se aşteaptă elucidarea unor probleme vizând
formarea pereţilor celulari.
1.1 CONDITIILE DE LUCRU, SUBSTANTELE SI APARATURA NECESARE PENTRU
INITIEREA CULTURILOR IN VITRO

•In vitro, tradus ad literam, înseamna în sticlă.

Orice cultură artificială de organe, ţesuturi sau celule, realizată în condiţii de asepsie
totală, pe medii nutritive adecvate, în vase de sticlă (cutii Petri, baloane Erlenmeyer),
reprezintă o cultură in vitro.

•cultura de organe, ţesuturi sau celule nu se poate realiza decât in vitro (cu toate
condiţiile menţionate), fapt pentru care expresia cultura de celule in vitro este o sinonimie.

•Asigurarea asepsiei totale se impune ca o condiţie obligatorie deoarece atât explantele,

cât şi mediul nutritiv, sunt surse şi condiţii propice dezvoltării bacteriilor, virusurilor,
ciupercilor.

•sursa de material vegetal, din care se vor preleva eşantioane, pentru experimente, cât şi
recipientele de sticlă - sterilizare.
Operaţiuni:

a. Pregătirea sticlăriei şi a instrumentarului

•- toate tipurile de recipiente din sticlă: vasele cu capacitate de 1-2 l sunt necesare in
prepararea mediilor de cultură; flacoanele Erlenmeyer de diferite capacităţi (50, 100, 150,
200, 500 ml) servesc ca recipiente de cultură - spălare şi uscare în etuvă. Flacoanele
astfel pregătite vor fi obturate cu dopuri de vată, înfăşurate cu tifon.

In tehnicile de culturi in vitro se lucrează cu

•instrumentar de tip chirurgical: pense, bisturie,
spatule - sterilizate prin autoclavare înainte de folosire.
• b. Prepararea mediului de cultură şi sterilizarea prin autoclavare

• - repartizarea mediului în vasele de cultură imediat după preparare şi sterilizarea

(autoclavarea) în respectivele vase.

• - sau sterilizarea mediului ca atare, concomitent sau succesiv cu a vaselor, în care va fi

repartizat ulterior, în boxa cu flux laminar.

• - sau sterilizarea mediului, repartizarea în vasele de cultură, si apoi, resterilizarea.

• - prin sterilizări repetate se provoacă alterări calitative ale vitaminelor, fitohormonilor şi

chiar ale glucidelor folosite în compoziţia mediului.
• c. Prelevarea şi sterilizarea explantelor

Sterilizarea explantelor se efectuează, de obicei cu agenţi chimici de tipul hipocloritului

de sodiu sau calciu (soluţie 3%-4%).
 Durata tratamentului variază în funcţie de specia luată în studiu sau de originea
explantului (epiderma, mezofil, ţesut palisadic).
 se recomandă obţinerea de plante sterilizate, prin germinarea de seminţe sterilizate
în hipoclorit de sodiu de concentraţie 4% timp de 10-12 minute, pe hârtie de filtru, de
asemenea sterilizată, plasată în flacoane Erlenmeyer sau cutii Petri.
 Plantulele - plasate ca atare pe mediul de cultură, sau de la caz la caz, pot fi separate
în hipocotil şi cotiledoane, pot servi pentru obţinerea oricărui tip de explant.

 Daca explantul nu este steril (infecţia fungică, bacteriană sau virală fiind adânc
penetrată în organismul vegetal sau în întreaga samânţă) sterilizarea nu mai are nici
un efect.
 Pentru obţinerea de calus liber de infecţii există şi în aceste cazuri o cale şi anume -
utilizarea explantelor din vârful meristematic de creştere al tulpinii. In funcţie de tipul
de dezinfectant folosit, tipul de tratament, originea explantului şi mediul de cultură
utilizat, se poate vorbi despre o rată de calusare şi o rată de supravieţuire a calusului.
 Modalităţi de asigurare a asepsiei explantelor

Nr. crt. Tipul explantului Pretratament Sterilizare Postratament

1. Seminţe Etanol(96%) 10sec Ca(OCl)10%10-20 min spălare de 3ori cu apă distilată sterilă

2. Fructe Etanol(96%) 10sec. NaOCl 3% spălare cu apă distilată sterilă

3. Tulpină Etanol(96%) 10 sec. NaOCl 3%5-30 min. spălare cu apă distilată sterilă

4. Organe de depozitare spălare cu apă de robinet NaOCl3%10-30min. spălare cu apă distilată sterilă

5. Frunze Etanol(96%) HgCl2 O,1%1 min. spălare de mai multe ori cu apă distilată
• Sterilizarea propriu-zisă, atât a instrumentarului şi recipientelor, cât şi a mediului, se
efectuează la autoclav - autoclavare, la o temperatură de 120°C şi o presiune de o
atmosferă, timp de 20-25 min.

• Se poate efectua şi o tindalizare, adică o sterilizare discontinuă (fracţionată), mai ales

pentru mediile agarizate. In acest caz mediile sunt "topite" de 3 ori consecutiv, la
temperatura de 100° C, pe baie de apă. După fiecare etapă de fierbere, mediile
ramân 24 de ore la temperatura camerei pentru a permite germinarea sporilor
eventualelor microorganisme care au supravieţuit sau au suprainfectat mediul.

• Sunt şi procedee prin care sterilizarea se obţine prin filtrare. In aceste cazuri,
substanţele termolabile (în special fitohormonii), sunt sterilizate prin filtre bacteriene.

• Este indicat ca sticlăria în care va fi plasat mediul de cultură, pipetele pensetele,

ansele, spatulele să fie presterilizate, fie prin autoclavare la 120-130° C, timp de 20-
30 minute, fie prin menţinerea în etuvă, la 180°C timp de o oră. Toate se pot păstra în
casolete sau tuburi metalice.
• d. Plasarea explantelor sterilizate pe mediul de cultură, în boxa cu aer steril în
flux laminar

• Lucrul propriu-zis (transferul explantelor, subcultivarea calusului, extragerea de probe

pentru analiza) se efectuează în boxa sterilă (boxa în care se asigură aflux de aer,
sub presiune, trecut în prealabil prin filtre microbiene) - boxă cu aer în flux laminar.

• Este indicat să se iradieze boxa (din timp în timp şi mai ales înainte de a se lucra) cu
o lampă UV timp de 20-30 min.

• Un alt aparat, utilizat în cazul culturilor pe mediu lichid, este agitatorul rotativ sau
liniar, care se caracterizează prin mişcări oscilatorii (în plan orizontal sau în plan
elipsoidal) cu frecvenţa de 115-120 rot./ min.
• 1.2.PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA

Reactivii utilizaţi:

1. apa se recomandă să fie dublu distilată;

2. sărurile minerale trebuie să fie cu un inalt grad de puritate. Uneori este indicată
recristalizarea hormonilor de creştere. Spre exemplu, acizii naftalenacetic şi 2,4-D
(diclorfenoxiacetic), sunt purificaţi şi decoloraţi cu charcoal, apoi sunt recristalizaţi din
soluţie de etanol.
3. hidrolizatul de cazeină este un supliment organic utilizat, în concentraţie de 0,05-0,2 %
4. aminoacizii nu sunt necesari în mod obligatoriu.
5. Restul ingredientelor, din mediul de cultură (macronutrienţi, micronutrienţi, vitamine),
se utilizează după cum urmează:
 Pentru mediul B5 (mediul de bază, stabilit de Gamborg în 1968) se prepară soluţii stoc, de micronutrienţi, în
următoarele cantităţi:

Micronutrienţi mg/100 ml H2O

MnSO4 H2O 1000
H2BO3 300
ZnSO4 7H2O 200
Na2MoO4 25
CuSO4 5H2O 2,5
CoCl2 6H2O 2,5

Toate cantităţile precizate, cântărite la balanţa analitică, se dizolvă, în ordine, în 100 ml apă distilată.
Soluţia stoc astfel preparată se păstrează în flacon de culoare închisă, bine închis, la frigider.

Vitaminele, se pregătesc asemenea micronutrienţilor, în urmatoarele cantităţi:

Vitamina mg/100 ml apă distilată
Acid nicotinic 100
Thiamina HCl 1000
Piridoxina HCl 100
Totul se păstrează la frigider.

Clorura de calciu (CaCl22H2O) se prepară separat, în cantitate de 15 g/100 ml apă distilată.

Iodura de potasiu (KI), în cantitate de 75 mg/100 ml apă distilată se prepară, de asemenea separat.
• Soluţia stoc de 2,4D (diclorfenoxiacetic) se prepară astfel: se dizolvă 50 mg 2,4 D în 2-5 ml
etanol, încălzindu-se uşor şi diluându-se cu apa distilată, până ce se atinge volumul de 100
ml. Se stochează la frigider.

Prepararea mediului Gamborg:

In 500 ml apă distilată, se dizolvă în ordine:
• NaH2PO4 H2O 150 mg
• KNO3 2500
• (NH4)2SO4 134
• MgSO4 7H2O 250
• Sucroza 20-25 g
• - câte 1 ml din soluţiile stoc de clorură de calciu, iodură de potasiu, micronutrienţi, vitamine şi
2 ml din soluţia stoc de 2,4 D şi 5 ml din soluţia stoc de FeEDTA (ferric
ethylendiamintetraacetic acid).
• Se completează cu apa distilată, în balon cotat, până la 1000 ml. Se reglează pH-ul la
valoarea de 5,5 (cu soluţii de KOH 0,2 N sau HCl 0,2 N). Se adaugă 6-8 g agar şi se
autoclavează, conform precizărilor anteriare.
• Atât mediul Gamborg, cât şi cele de altă formulă (MS, White, Erikson) poate fi modificat, în
funcţie de scopul cercetării, prin variaţii ale concentraţiei fitohormonilor (2,4 D, IAA, NAA,
BAP).
 Pentru prepararea mediului MS (Murashige-Skoog) se procedează astfel:

Micronutrienţi mg/100 ml
H2BO3 620
MnSO44H2O 2230
ZnSO44H2O 860
Na2MoO42 H2O 25
CuSO45 H2O 2,5
CoCL26 H2O 2.5

Toate celelalte soluţii stoc se prepară după formula folosită în cazul mediului B5
Macroelementele se adaugă astfel:
NH4NO3 1200 mg/l
KNO3 1900 mg/l
MgSO4 7H2O 370 mg/l
KH2PO4 170 mg/l
FeEDTA 40 mg/l
Sucroza 30 g/l

Din soluţiile stoc de clorură de calciu, iodură de potasiu, vitamine,

micronutrienţi se ia câte 1 ml iar din soluţia stoc de 2,4 D 2 ml. Se execută
aceleaşi operaţiuni, în aceeaşi succesiune, ca pentru pregătirea mediului
Gamborg. Se ajustează pH-ul la 5,8.
 Pentru pregătirea mediului Erikson, urmându-se aceleaşi reguli de preparare,
se vor lua următoarele cantităţi de substanţe:

NH4NO3 1200 mg/l

KNO3 1900 mg/l
MgSO4 7H2O 370 mg/l
KH2PO4 340 mg/l
FeEDTA 40 mg/l
Sucroza 30 g/l

Din soluţiile stoc de micronutrienţi, vitamine, iodură de potasiu se adaugă câte

un mililitru, iar din soluţia stoc de clorură de calciu 2 ml. Din soluţia de 2,4 D se
adaugă l ml. Se ajustează pH-ul la 5,8.
 PREGATIREA MATERIALULUI VEGETAL

Germinarea seminţelor în condiţii aseptice

- se introduc seminţele în alcool etilic 70%, pe un agitator (shaker), timp de 2 min.

- se îndepărtează alcoolul şi se introduce hipoclorit de sodiu, 2-3%
- se menţine flaconul pe agitator, timp de 10-20 minute
- se îndeparteaza seminţele care plutesc (deoarece, - sunt goale şi, deci, nu vor germina).
In cazul în care se presupune că seminţele sunt puternic infectate se poate repeta tratamentul cu
hipoclorit.

- spălarea seminţelor cu apă distilată sterilă

- seminţele se dispersează pe hârtie de filtru, îmbibată cu apă distilată, într-o cutie Petri sau un flacon
Erlenmeyer, totul autoclavat în prealabil. Este bine ca vasul Petri să fie ermetic închis cu pelicula de
parafilm (germinarea seminţelor poate fi asigurată pe vată, în eprubete, închise cu parafilm). Cele mai
multe seminţe germinează bine în condiţii de întuneric, la temperatura de 23-25°C.

Se utilizeaza mai puţine seminţe per flacon, deoarece dacă o singură sămânţă este infectată, se va
transmite infecţia tuturor celorlalte din vasul respectiv.
Când seminţele au germinat, plantutele rezultate pot fi utilizate ca atare, sau se pot
fragmenta, utilizând hipocotilul, cotiledoanele.

Alteori, pentru inducerea calusului se pot utiliza explante, din plante crescute în
condiţii naturale: porţiuni din rădăcină, tulpină, ramuri, muguri, frunze, flori.
•Explantele se vor trata cu alcool etilic 70%, timp de 1-3 minute, apoi se vor spăla de 2-3
ori cu apă distilată sterilă.
•Dacă este vorba de rădăcini, tuberculi, bulbi, după imersare în alcool etilic, se
recomandă tratarea cu hipoclorit de sodiu, timp de 15-20 minute.

• Se recomandă tratarea, atât în cazul seminţelor cât şi în cazul explantelor, doar cu

hipoclorit de sodiu 3% timp de 15 - 25 minute (in funcţie de mărimea seminţelor sau
a explantelor).