CULTURA DE PROTOPLATI I HIBRIDAREA SOMATIC

III

Cuprins
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Cultura de protoplati Tehnologia culturilor de protoplati Etape ale cultivrii protoplatilor Aplicaii la plantele floricole Hibridarea somatic Aplicaii ale hibridrii celulare Concluzie Bibliografie

Cultura de protoplati
Protoplatii sunt celule somatice nude lipsite de membrane pectocelulozice rigide (perete celular) care au capacitatea de a fuziona, de a se divide n continuare i de a da natere la noi plante.

Cultura de protoplati Scurt istoric

Primele ncercri de obinere a protoplatilor din esuturile vegetale au fost fcute de Klercker (1892) care a elaborat metoda mecanic de separare a celulelor prin plasmolizare total i microdisecia membranelor. Aceast metod era ns traumatizant i puin eficient. Mai trziu, n 1960, Cocking n Anglia, Otsuki i Takebe (1969) n Japonia au elaborat metoda enzimatic de producere a protoplatilor, metod n care se folosesc enzime extrase din microorganisme ce diger peretele rigid al celulelor vegetale.

Cultura de protoplati
Protoplatii pot fi izolai din toate organele i esuturile plantelor, mai ales din mezofilul frunzelor, esuturi epidermale, rdcini i nodoziti ale rdcinilor, muguri, petale, gruncioare de polen n curs de germinare, fructe, semine i din esuturi cultivate in vitro. Materialul cel mai utilizat este reprezentat de frunze de la care se ia epiderm inferioar prin jupuire sau printr-un tratament enzimatic. Mai recent, au nceput s fie utilizate fragmente de calus, izolate din culturi de esuturi in vitro.

Tehnologia culturilor de protoplati

Tehnologia culturilor de protoplati necesit cunoatera i stpnirea complet a diferitelor etape care pornesc de la explantul donor pn la planta regenerat: 1.obinerea de protoplati viabili; 2.regenerarea pereilor celulari; 3.inierea diviziunilor celulare; 4.meninerea diviziunilor pn la obinerea microcalusurilor; 5.regenerarea plantelor din aceste calusuri.

3 4 5

Etape ale cultivrii protoplatilor

1. Izolarea protoplatilor
- metoda mecanic (presupune tierea esutului vegetal plasmolizat n prealabil, n fii subiri i microdisecia membranelor). -metoda enzimatic - se folosesc trei categorii de enzime: pectinaze, celuloze i hemiceluloze care sunt introduse n esuturi prin metoda infiltraiei in vacuum. Izolarea protoplatilor din mediul de incubaie se face prin 2-3 centrifugri la viteze reduse, timp de 7 10 minute (asigurnd sedimentarea lor), dup care urmeaz splarea restului de enzime cu soluie de zaharoz (15-20 %) i NaCl.

Etape ale cultivrii protoplatilor

2. Purificarea Obinerea unor suspensii celulare pure, necontaminate cu resturi de celule distruse sau perei celulari nedigerai. Purificarea se realizeaz prin centrifugri i resuspendri succesive n soluia cu stabilizator osmotic.

Etape ale cultivrii protoplatilor

3. Incubarea

Timpul de incubare variaz n funcie de natura i vrsta materialului biologic iniial utilizat pentru izolare. Protoplatii n stare purificat sunt trecui n alte medii lichide. Mediul de cultur este foarte complet, bogat n sruri minerale, vitamine, substane stimulatoare de cretere, asigurnd regenerarea unui nou perete celular.

Aplicaii la plantele floricole

Protoplatii sunt celule vegetale folosite pentru manipularea materialului genetic. Pot fi utilizai pentru fuzionare i hibridare somatic, pentru transformare cu AND exogen, pentru transferul de cromozomi, nuclee i diverse organite celulare, pentru studiul virozelor vegetale, pentru elucidarea modului de aciune al agenilor patogeni bacterieni i fungici. Aceast tehnic permite: 1. cercetri aprofundate asupra funcionrii celulei; 2. aplicarea de tratamente mutagene la celule izolate; 3. obinerea unor plante rezistente la bacterii, ciuperci i chiar duntori; 4. permite manipulri genetice ca introducerea sau substituirea de gene.

Aplicaii la plantele floricole

Nicotiana sp

Digitalis lanata

L. corniculatus

Helianthus annuus

D. purpurea

Ipomoea batatas

Lolium multiflorum

Hibridarea somatic
Const n fuzionarea (contopirea) a doi sau mai muli protoplati i refacerea unei noi celule care conine material genetic (nuclee, cromozomi, organite citoplasmatice) provenit din celule care aparin aceleiai specii sau la specii diferite (fr a recurge la hibridarea sexuat).

Hibridarea somatic
8%

Datura innoxia

11 %

Lilium longiflorum

S-a constatat c protoplatii izolai enzimatic sunt capabili s fuzioneze spontan, dar cu o frecven relativ mic (8% la Datura innoxia i 11 % la Lilium longiflorum), deoarece sunt ncrcai cu sarcin electric negativ.

Hibridarea somatic
Keller i Melchers (1973) au elaborat prima metod eficient de inducere a fuzionrii protoplatilor prin neutralizarea sarcinilor electrice, folosind ioni de Ca++ i K+ cu sarcin electric pozitiv (CaCl2, KH2PO4), la temperatura de 370 C i pH alcalin (9,5-10,5). Zimmermann (1981) a elaborat o metod mai modern n care fuziunea protoplatilor este indus ntr-un cmp electric alternativ discontinuu, aceasta realizndu-se ntr-un procent de 80 -100%, cu o eficien mult mai mare dect prin tratamentul cu polietilenglicon, deoarece nu afecteaz viabilitatea protoplatilor.

Hibridarea somatic
n urma fuzionrii protopltilor se formeaz produi de fuziune homocariotici (n cadrul celulelor ce aparin aceleiai specii) i heterocariotici (n cazul fuzionrii celulelor ce aparin la dou specii diferite). Hibridarea somatic ntre dou specii diferite const din urmtoarele faze: 1. preluarea materialului iniial folosind esuturi de meristem foliar; 2. izolarea celulelor prin tratamente enzimatice; 3. obinerea de protoplati i fuzionarea lor pn la realizarea heterocarionului; 4. nceperea diviziunilor mitotice; 5. formarea calusului; 6. obinerea plantelor prin culturi de calus selecionat; 7. regenerarea plantelor ntregi transplantate la sol.

Hibridarea somatic
1
2 Pectinaz Celulaze Hemicelulaze 3

7
5 6

Aplicaii ale hibridrii celulare

1. Obinerea de variatii somaclonale
n cazul hibridrii de protoplati, prin combinarea genotipurilor de la speciile incompatibile apropiate sau ndeprtate din punct de vedere taxonomic, se obin varaii somaclonale din care pot fi selecionate noi forme valoroase sub aspect genetic, utilizate ca material iniial n lucrri de ameliorare.

Aplicaii ale hibridrii celulare

2. Obinerea de hibrizi celulari (cibrizi) Cnd fuziunea de hibrizi de protoplati este urmat de o recombinare genetic, se poate realiza o hibridare att a nucleilor, ct i a organitelor citoplasmatice (cloroplaste, mitocondrii). Dac unul dintre nuclei este eliminat n cursul divizunilor succesive, se obin hibrizi citoplasmatici numii cibrizi n care apar, cel mai frecvent, recombinri mitocondriale.

Gru

Orz

Tomate

Cartofi

Vicia Cibrizi

Petunia

Aplicaii ale hibridrii celulare

3. Transferul de material genetic n protoplasti

Transferul direct de gene, prin hibridare somatic se poate realiza n faza de protoplast, protejat la exterior numai de membrana plasmatic (plasmalema). Includerea n protoplaste a unor microorganisme, virusuri, organite, macromolecule exogene se poate realiza pe 3 ci: endocitoz, fuzionarea membranelor, transfer prin intermediul lipozomilor.

Aplicaii ale hibridrii celulare

4. Mrirea rezistenei plantelor la factorii chimici sau fizici (toxine, erbicide) i la factori abiotici (ger, secet, salinitatea solului) ger toxine

secet
erbicide

salinitatea solului Tehnicile de inginerie genetic, molecular i celular pot contribui la crearea unor noi forme adaptate la stresul biotic i osmotic, prin cercetri care vizeaz funcionarea sistemelor enzimatice, reglarea i transferul informaiei genetice de la formele rezistente la cele sensibile.

Aplicaii ale hibridrii celulare

5. Ameliorarea planelor i crearea de soiuri noi

Transferul unor caractere de la speciile slbatice la cele cultivate asigur mrirea rezistenei plantelor hibride, att la factori patogeni, ct i la factori abiotici, inclusiv pesticide. Cercetrile actuale ce se efectueaz prin culturi de protoplati vizeaz numeroase aspecte: introducerea de gene responsabile de fixarea azotului atmosferic, de sinteza de noi pigmeni, de rezistena la frig, secet, poluare etc.

Concluzie

Hibridarea somatic este o metod relativ simpl spre deosebire de ADN recombinat. Utilizarea aceste metode cu scop de a mri variabilitatea plentelor inclusiv rezistena fa de factorii abiotici i biotici duc la obinerea de rezultate promitoare. Astfel hibridarea somatic poate fi utilizat pe larg n direcia ameliorrii plantelor

Bibliografie
1. http://ru.scribd.com/doc/106171300/Cultura-Protoplasti

Mulumesc pentru atenie