MICROPROPAGAREA - ALTERNATIVĂ BIOTEHNOLOGICĂ DE CONSERVARE ȘI PERPETUARE A UNOR GENOTIPURI

VALOROASE (SPECII DE INTERES)

Înmulţirea “in vitro” a plantelor poartă numele de micropropagare sau

micromultiplicare şi reprezintă o modalitate artificială de multiplicare vegetativă.

• Înmulţirea vegetativă sau apomixia se bazează pe capacitatea de regenerare a

plantelor, fapt care reflectă o mare autonomie a celulelor şi ţesuturilor vegetale
comparativ cu organismele animale.

• Această autonomie a părţilor plantei se bazează pe totipotenţa celulei vegetale. În

afara organismului, aproape fiecare celulă vegetală, în condiţiile asigurării mediului
corespunzător, este capabilă de diviziune şi creştere.

• Această metodă neconvenţională permite obţinerea într-un timp scurt a unui număr
mare de copii conforme cu planta donatoare (clonare).

• Înmulţirea prin microexplante (organe, ţesuturi, celule), cultivate pe medii nutritive

adecvate asigură atât multiplicarea clonală a plantelor cu calităţi deosebite, rezultate
din lucrările de selecţie şi ameliorare, cât şi răspândirea în cultură a noilor genotipuri
create, concomitent cu posibilitatea stocării şi conservării acestora.
 Importanţa utilizării tehnicii de înmulţire a plantelor prin culturi de ţesuturi decurge din
avantajele pe care le prezintă această metodă neconvenţională:

1. propagarea rapidă şi în masă a unor soiuri;

2. prezervarea sau conservarea materialului genetic de la genotipuri valoroase pe durată
nelimitată;
3. realizarea şi menţinerea de plante libere de viroze;
4. posibilitatea de a iniţia culturi pe tot parcursul anului, cu explante provenite din câmp sau
sere;
5. scurtarea perioadei de ameliorare a soiurilor, de pildă la speciile lemnoase de la 10-15 ani
la 2-3 ani;
6. creşterea vitezei de propagare comparativ cu metoda clasică;
7. economisirea forţei de muncă şi reducerea spaţiilor de producţie.
 Micropropagarea prezintă numeroase aplicații biotehnologice cu importanță deosebită,
dintre care amintim :

•  propagarea în masă a plantelor rare sau de elită;

•  obținerea de calus, rădăcini sau lăstari cu potențial de producere a unor metaboliți;
•  obținerea de vitrocolecții de germoplasmă aparținând plantelor protejate;
•  creșterea facultății germinative a semințelor cu germinație redusă in vivo;
•  producerea de plante transgenice prin inserarea de ADN exogen;
•  obținerea de variabilitate genetică;
•  studii privind mutageneza
Etapele succesive ale micropropagării sunt:

Stadiul I – pregătirea plantelor donatoare de explante, ele sunt crescute în condiţii

speciale, în spaţii protejate,la temperatura de 25 ˚C;

Stadiul II- iniţierea culturii în condiţii aseptice;

Stadiul III- multiplicarea şi propagarea “in vitro”;

Stadiul IV- transplantarea plantelor neoformate “in vitro” la condiţiile mediului septic,
respectiv în ghivece.
.
TEHNICI DE MICROPROPAGARE
 REGENERAREA IN VITRO
• In vitro” se prefigurează două alternative ale derulării ciclului ontogenetic: una
presupune reinstalarea programului ontogenetic complet, prin iniţierea
embriogenezei somatice, iar cealaltă se bazează pe “reconstrucţia” plantelor întregi
prin iniţierea organogenezei.
• Regenerarea “in vitro” se poate desfăşura în mod direct la nivelul explantului sau
indirect la nivelul calusului. Regenerarea indirectă cuprinde două etape:
calusogeneza sau dediferenţierea explantului şi rediferenţierea prin organogeneză
sau embriogeneză somatică.
• Ambele căi de dezvoltare “in vitro” sunt în esenţă consecinţa reprogramării modelului
expresiei genice. Reorientarea celulelor explantului spre aceste programe ale
dezvoltării, cu alte cuvinte “achiziţionarea stării embriogene sau organogene este
intim legată de declanşarea unui lanţ de procese definite prin termenii de
competenţă, inducţie, determinare (Ammirato, 1985). Dobândirea acestei stări nu este
atât consecinţa condiţiilor specifice de cultivare “in vitro”, cât mai ales efectul excizării
ţesutului, care urmează să fie cultivat. Izolarea fiziologică sau fizică a explantului este
premiza declanşării organogenezei sau embriogenezei somatice.
• În sens larg, competenţa celulară este capacitatea celulelor de a-şi manifesta
totipotenţa. Diversitatea manifestărilor “in vitro” este concretizată fie prin exprimarea
imediată a acestei capacităţi, fie mai tardiv sau niciodată.
• Principalele procese sunt: dediferenţierea celulară, menţinerea stării dediferenţiate
(menţinerea calusului sau suspensiei celulare) pe timp nedefinit şi rediferenţierea
celulară prin organogeneză sau embriogeneză).

• Procesul de dediferenţiere, care are loc la nivelul explantului, începe imediat după
izolarea ţesutului şi debutează cu o accelerare a diviziunii celulare şi revenirea la
stadiul embrionar a tuturor celulelor specializate, chiar şi a celora cu un înalt grad de
specializare, cum ar fi cele de colenchim sau de sclerenchim (în curs de diferenţiere).
Prin dediferenţiere celulară redăm procesul în care celulele explantelor de
provenienţe extrem de diferite - epidermă, ţesut conductor, ţesut palisadic,
parenchim, raze medulare etc., plasate pe mediul de cultură, îşi pierd diferenţierea şi
redevin celule meristematice, capabile de diviziuni repetate.

• Calusul, în fapt, reprezintă o masă de celule care şi-au pierdut diferenţierea şi se

divid intens şi anarhic, asigurând acumularea de biomasă proaspătă.

• Calusul dezvoltat este foarte heterogen, prezentând variaţii în ceea ce priveşte forma,
mărimea, gradul de vacuolizare, conţinutul citoplasmatic al celulelor componente. În
ciuda creşterii dezorganizate a calusului, la nivelul acestuia apar zone cu un grad
special de organizare, precum centrii activi ai activităţii meristematice sau
meristemoizii, cât şi primordiile organelor vegetative.

.
 INIŢIEREA CULTURILOR DE CALUS

Initierea culturilor “in

vitro” Selectarea liniilor celulare morfogene la nivelul culturilor de
Tipul explantului + calus
mediul de cultura

Iitierea
calusului Calus rizogen

Calus caulogen

Calus nonmorfogen

Calus embriogen

Subcultivarea calusului
CALUS OBŢINUT DIN FRAGMENTE FOLIARE
CULTURĂ DE CALUS
LINII CELULARE MORFOGENE LA NIVELUL CALUSULUI
STADII INCIPIENTE ALE ORGANOGENEZEI
PROGRAMELE MORFOGENETICE „ IN VITRO”
 PROGRAMELE MORFOGENETICE

Organogeneza în culturi in vitro este un proces extrem de complex, care constă în generarea
de rădăcini - fenomen numit rizogeneză și / sau tulpini - fenomen numit caulogeneză.
• Aptitudinea organogenetică a cormofitoinoculilor este înscrisă în programul genetic al
celulelor. Formarea de organe poate avea loc direct din celulele explantului (organogeneză
directă) sau din masa de calus care a luat naștere prin dediferențierea celulelor explantului
(organogeneză indirectă).
• Culturile în care se induce organogeneza sunt folosite ca sisteme model pentru a determina
evenimentele cauzale prin care sunt produse rădăcinile respectiv tulpinile.
• Într-un astfel de model, procesul de organogeneză este împărțit în câteva faze conform
schemei următoare:
ORGANOGENEZA IN VITRO
 Rizogeneza (neoformarea de rădăcini) reprezintă formarea structurilor monopolare la nivelul
oricărui explant, indiferent de tipul organului din care provine. Aceste organe monopolare
apar neregulat şi la nivelul calusului şi prezintă o structură asemănătoare cu cea a
rădăcinii normale.

• Acest proces depinde într-un grad foarte important de originea explantului (specia, vârsta
plantei donor, genotipul), natura și mărimea acestuia, starea fiziologică a celulelor din
explant.

• Totodată și fitohormonii (mai ales auxinele endogene și exogene) au un rol extrem de

important în exprimarea acestui caracter. Un efect cert asupra rizogenezei exercită și
regimul de lumină și anume: o intensitate slabă a acesteia, sau expunerea pentru scurt
timp la lumină (600 lucși mai puțin de o oră /zi) stimulează procesul de rizogeneză.

• Temperatura optimă inducerii acestui proces este apreciată la 25° C. Uneori însă, se recomandă
practicarea unei alternanțe între o temperatură scăzută (5 - 15° C) și una ridicată (23 - 25° C), în
prezența luminii, a unei auxine, și a unui mediu bogat în glucide
RIZOGENEZA “IN VITRO”
• In vitro neoformarea de mugurași, caulogeneza, respectiv formarea de centrii vegetativi, este
esențială atunci când se urmărește multiplicarea sau reconstituirea unei plante.
• Primordiile caulinare apar dintr-o singură celulă sau dintr-un grup mic de celule şi
sunt localizate la periferia explantului sau a masei de calus, pe cănd cele radiculare
apar în profunzimea ţesutului.
• Inducerea caulogenezei la nivelul inoculilor cultivați in vitro poate fi realizată ușor, fără
producerea de calus, prin prelevarea explantelor de la frunzele plantelor, aptitudinea
caulogenă nefiind localizată strict într-un strat celular sau celule specifice. În mod practic,
caulogeneza e provocată artificial, prin folosirea citochininelor în detrimentul auxinelor .
CAULOGENEZA VIA CALUS
CAULOGENEZA VIA CALUS
 EMBRIOGENEZA SOMATICĂ

• Embriogeneza somatică reprezintă cea mai complexă cale de regenerare şi constă în

dezvoltarea structurilor bipolare, pornindu-se de la orice celulă somatică.
• Formarea embrionilor somatici se datorează diviziunii repetate a celulelor somatice, care se
organizează morfo-structural după modelul embrionului zigotic.
• Embriogeneza reprezintă apariţia de novo a unei plante întregi (cu rădăcină, tulpină şi
frunze), într-o succesiune de polarizări, structurări şi organizare (stadiul globular,
cordiform, torpedo, cotiledonar). Embriogeneza somatică constituie o modalitate de
sporire a randamentului în micromultiplicarea plantelor.
• Apariția embrionilor somatici, poate avea loc direct pe explant, derivând direct din țesuturile
inoculate in vitro (embriogeneză directă), sau mai frecvent din calusurile formate pe explantul
inițial (embriogeneză indirectă).
• Diferența dintre cele două tipuri de dezvoltare este că embriogeneza directă rezultă din
celule pro-embriogene determinate, iar cea indirectă necesită dediferențierea celulelor cu
funcții specializate, proliferarea calusului și inducerea celulelor embriogene.
 Studiile au condus la stabilirea a patru faze de diferențiere embrionară și anume:

• 1. faza de creștere izodiametrică - caracterizată printr-o diviziune neorientată a

celulelor, când se ajunge la stadiul globular, formațiune de celule nepolarizate;
• 2. imprimarea treptată a caracterului de polaritate - fază în care se produce o
distribuție polară a esterazelor (reacție evidențiată pe cale histochimică) și care se
afirmă - cu predilecție - la locul de formare al cotiledoanelor (stadiul globular
polarizat).
• 3. faza de polaritate progresivă - diviziunile celulare sunt orientate; se formează
cotiledoanele și apexul rădăcinii iar, mai apoi, se demarchează meristemul apical al
tulpinii, (stadiul cordiform și de torpedo).
• 4. faza de creștere bipolară - treptat, meristemele apicale, radicular și caulinar se
constituie și sunt apte de a intra în diviziune (faza cotiledonară).
EMBRIOGENEZA SOMATICĂ
Etapele embriogenezei somatice
Embriogeneza somatică: (a) cluster cu embrioni somatici; (b) stadiul
globular; (c) stadiul cordiform; (d) stadiul torpedo; (e) stadiul
cotiledonar; (f) embrion matur
 În culturile de calus cât și în cea de celule, studiile anatomice și histologice, au evidențiat
prezența a două categorii de celule:

• 1. primă categorie o constituie celulele mari, posedând o vacuolă mare (în suspensiile
celulare, celulele sunt liber dispersate în mediu); acest tip de celule este lipsit de potențial
embriogenic;
• 2. cel de al doilea tip de celule se caracterizează prin talie mică, conținut bogat în citoplasmă
densă, aceste celule sunt, adeseori grupate în aglomerări, sub formă de noduli. Ele sunt
capabile să formeze embrioni, în centre numite mase proembrionare sau noduli embriogeni.

S-a constatat că nodulii embriogeni conțin două tipuri de celule și anume:

• a) celule centrale, cu o unică vacuolă mare, cu nuclei mici și compacți, cu nucleoli abia
colorați, cu ribozomi puțini, cu rare profile de reticul endoplasmatic, cu un număr redus de
amiloplaste.
• b) celule meristematice aflate la periferia nodulilor embriogeni, care în contrast cu celulele
situate în centrul nodulului, au vacuole puține și mici iar nucleii sunt mari, difuz colorați și
conțin câte un nucleol puternic reliefat; citoplasma prezintă o mare diversitate de ribozomi și
numeroase profile de reticuli endoplasmatici. În acest tip de celule se găsesc proeminente
depozite de amidon .
 FACTORII DE MEDIU IMPLICAŢI ÎN DECLANŞAREA PROGRAMELOR
MORFOGENETICE

• Diversitatea programelor morfogenetice exprimate in vitro se bazează pe o succesiune de

reacții din partea celulelor componente ale explantului, sub acțiunea coordonată și ritmică a
factorilor inductivi.
• Debutul oricărui program morfogenetic presupune reorientarea celulelor spre noi căi de
dezvoltare și este condiționat atât de nivelul reactivității celulare (factori interni), cât și de
utilizarea unor stimuli inductivi adecvați. Cea de a doua categorie cuprinde factorii externi de
mediu, a căror intervenție se reflectă asupra proceselor biochimice și fiziologice, declanșate la
nivelul celulelor cultivate.
• Armonizarea factorilor exogeni, fizici și chimici, cu starea fiziologică a explantelor, cu
conținutul hormonal endogen, condiționează declanșarea reacțiilor morfogenetice in vitro. .
• În condițiile cultivării explantelor vegetale pe medii nutritive, substratul trebuie să asigure
celulelor aportul de nutrienți și fitohormoni de care țesuturile plantei mamă sunt tributare.
Explantele își mențin vitalitatea, celulele își reiau activitatea și se multiplică numai în cazul în
care sunt satisfăcute cerințele minimale, capabile să asigure supraviețuirea și reluarea
funcțiilor vitale. Avem în vedere o serie de factori exogeni: lumina (natura ei, intensitatea,
fotoperioada), temperatura, umiditatea, gradul de aerare.
• Manifestarea potenţialului organogen sau embriogen în cultură este fundamental
legată de genotipul plantei donatoare de explant. De pildă, la Triticum aestivum, din
23 de genotipuri testate, doar 16 au fost capabile să regenereze.
• Diferenţe semnificative referitoare la reacţiile morfogenetice sunt înregistrate în
funcţie de originea explantului; de regulă, ţesuturile vegetative tinere sunt mai
reactive decât cele mature.
• Permanenta preocupare pentru optimizarea mediilor de cultură a condus, în decursul
timpului, la elaborarea şi testarea a peste 2000 de reţete (George şi colab., 1988),
numai pentru inducerea embriogenezei somatice. Cele mai utilizate medii nutritive,
atât pentru embriogeneza somatică, cât şi pentru organogeneză sunt mediul
Gamborg (1968) şi Murashige-Skoog (1962).
• Componentele de bază ale oricărui mediu de cultură sunt sărurile minerale, sursa de
carbon, vitaminele, regulatorii de creştere şi suplimentele organice. Nota de
particularitate a fiecărui mediu în parte este corelată cu necesităţile nutritive, funcţie
de specie şi de tipul explantului cultivat “in vitro” (celule, ţesuturi sau organe) şi se
reflectă în variaţia concentraţiei unor componente de bază. De pildă, mediul B 5
(Gamborg) diferă de mediul MS (Murashige-Skoog) prin concentraţia mult mai
scăzută în săruri.
• Cea mai importantă categorie de substanţe conţinute în mediul de cultură, din punct
de vedere al implicării în controlul morfogenezei o constituie regulatorii de creştere
(Kohlenbach, 1977). Auxinele induc diviziunea celulară şi stimulează rizogeneza.
Principalele auxine sunt: acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4 D), acidul indolilacetic
(AIA), acidul naftilacetic (ANA), acidul 2,4-5 triclorfenoxiacetic (2,4,5 T).
• Citochininele sunt derivaţi ai adeninei şi au rol în caulogeneză. Cele mai frecvente
citochinine sunt: chinetina (K), benziladenina (BA), zeatina, izopenteniladenina (IPA),
benzilaminopurina (BAP).
• Programele morfogenetice se află în strânsă corelație cu balanța hormonală.
• În majoritatea situațiilor nu atât concentrația fitohormonilor este importantă cât, mai ales
raportul dintre auxină și citochinină. Auxina poate inhiba acumularea de citochinină, iar
citochinina poate inhiba unele activități ale auxinei, astfel încât în condiții de cultură in vitro
procesul de creștere al țesuturilor vegetale este afectat în mod decisiv de raportul dintre
auxină și citochinină din mediul de cultură.
 Mediul bazal Gamborg Mediul bazal Murashige- Skoog

Macronutrienţi mg/L Macronutrienţi mg/L

(NH4)2SO4 134 NH4·NO3 1650
KNO3 2528 KNO3 1900
CaCl2·2H2O 150 CaCl2·2H2O 440
MgSO4·7H 2O 250 MgSO4·7H 2O 370
NaH2PO4·H2O 150 KH2PO4 170
Na 2EDTA 37.30 Na 2EDTA 37.30
FeSO4·7H2O 27.80 FeSO4·7H2O 27.80
Micronutrienţi Micronutrienţi
H3BO3 3.0 H3BO3 6.20
MnSO4·H2O 10.0 MnSO4·H2O 22.30
ZnSO4·7H2O 2.0 ZnSO4·7H2O 8.60
KI 0.75 KI 0.83
Na2MoO4·2H2O 0.25 Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4 5H2O 0.025 CuSO4 5H2O 0.025
CoCl 2 ·6H2O 0.025 CoCl 2 ·6H2O 0.025
Substanţe organice Substanţe organice
mio-inositol 100.0 mio-inositol 100.0
acid nicotinic 1.0 acid nicotinic 0.5
piridoxina·HCl 1.0 piridoxina·HCl 0.5
thiamina·HCl 10.0 thiamina·HCl 10.0
sucroza 20,000 sucroza 30,000

pH 5.5 pH 5.7–5.8
 În tehnicile de micropropagare practicate în scop productiv sau în vederea conservării şi
transmiterii calităţilor specifice ale unui anumit genotip se preferă ca material iniţial,
explante cu o anumită organizare tisulară: explante meristematice, muguri sau
minibutaşi. Utilizarea explantelor meristematice asigură cel mai înalt grad de stabilitate
genetică în descendenţă.
Valoarea mare a culturii de meristeme constă în:
1. asigurarea uniformităţii genetice a materialului săditor generat in vitro - altfel spus,
valoarea constă în aceea că se pot obţine rapid clone;
2. eliminarea agenţilor fito şi zoopatogeni din cultura iniţială;
3. creşterea coeficientului de multiplicare, în cel mai scurt timp, a unui individ vegetal;
4. obţinerea unui material săditor juvenilizat, imposibil de realizat prin metodele tradiţionale
de înmulţire vegetativă;
5. crioprezervarea (conservarea prin frig) a inoculilor meristematici, pentru o lungă
perioadă de timp, într-o anumită fază de dezvoltare, pentru a avea un stoc permanent
care să asigure necesarul de material săditor (solicitat pe piaţă) - conservarea
germoplasmei în bănci de gene.
• Metodele criobiologice de prezervare a materialului generativ "in vitro" se bazează pe
conservarea la temperaturi foarte scăzute (-196 0 C - temperatura azotului lichid). În
aceste condiţii se asigură reducerea aproape la limita viului, a tuturor funcţiilor
metabolice.
• Tehnicile de crioconservare presupun utilizarea unor substanţe crioprotectoare, cu rol în
prevenirea daunelor cauzate de infectarea bruscă a celulelor Astfel de substanţe sunt
dimetilsulfoxidul (DMSO) şi glicerolul.
 EXPLANT MERISTEMATIC

Domul meristematic

Explant
meristematic
Apex caulinar
Primordiu foliar

Mugure axilar
 Micropropagarea la Agave sp.
(A) Prelevarea explantelor meristematice. (B) Inducerea
caulogenezei (C) Faza de multiplicare a lastarilor (D) I Plante
regenerate in vitro (E) Adaptarea plantelor ex vitro
• Embriogeneza somatică constituie o altă modalitate de sporire a randamentului în
micromultiplicarea plantelor.

• Lutz şi colaboratorii, 1985 apreciază că într-un mililitru de mediu se găsesc

aproximativ 2x106 celule, din care se pot obţine aproximativ 5000 de embrioni
somatici, după 14 zile de cultivare a celulelor pe un mediu lipsit de fitohormoni..
După generarea lor, embrionii somatici pot fi menţinuţi aproximativ 20 de săptămâni,
până la semănarea acestora în teren.

• Semănarea embrionilor somatici se face în momentul în care ei sunt suficient de

buine dezvoltaţi pentru a începe viaţa auxotrofă. Redenbaugh şi colaboratorii, 1984
au elaborat o metodă de încapsulare a embrionilor prin încorporarea lor într-o matrice
de gel (alginat de natriu), urmată de tratamentul cu o soluţie de CaCl 2 pentru
solidificarea matricei.

• În 1985, Gebbart a pus la punct un procedeu de încapsulare a embrionilor somatici în

polimeri biodegradabili.
 Capsule de alginat de calciu în
interiorul carora se aflla inclusi embrioni
somatici de Daucus carota, aflati în stadiul
de torpedo
 Germinarea in vitro a
embrionilor somatici de Daucus
carota încapsulati în gel de
alginat
Producerea seminţelor sintetice la Vanilla planifolia
 Stocarea materialului vegetal obţinut „in vitro”

• Băncile de stocare şi conservare a germoplasmei conţin în colecţii: polen, seminţe, organe sau
fragmente de organe.Materialul vegetal poate fi conservat pe o perioadă mai scurtă, prin
cultivarea inoculilor în regim de creştere lentă şi prin subcultivări periodice, la intervale de luni,
sau poate fi păstrat la temperaturi coborâte ( 4-5 0 C) câteva luni, fără repicare. Există şi bănci de
gene de lungă durată, cu stocarea materialului vegetal în azot lichid (- 196 0C).

• În general, toate metodele de conservare „in vitro” presupun o diminuare sau o stopare
temporară a proceselor vitale.

• Metoda crioconservării are la bază oprirea prin îngheţ a funcţionalităţii celulare, făcând imposibilă
realizarea schimburilor dintre celule şi mediu.
• O altă metodă se bazează pe deshidratarea gradată a materialului vegetal, prin scoaterea apei
din celule, administrându-se din exterior substanţe osmotic active.

• O altă metodă de stopare a dezvoltării inoculilor constă în producerea în vasele de cultură a unor
condiţii de hipoxie, prin înlocuirea parţială sau totală a oxigenului cu azot sau prin scăderea
presiunii atmosferice (hipobarie). Adeseori se practică tratamente combinate, în regim de
creştere lentă, la temperaturi pozitive sau negative, plus hipoxie şi deshidratare.
• Toate metodele de conservare vizează menţinerea genotipurilor valoroase pe o perioadă mai
scurtă sau mai lungă de timp, precum şi regenerarea de plante după stocare, plante care pot fi
aclimatizate la un regim normal de viaţă.
• Prima tentativă de conservare a celulelor la temperaturi foarte coborâte a fost raportată în 1968
la Linum usitatissimum , la temperatura de - 50˚C, cu o rată de supravieţuire de 14%. Această
temperatură nu este cea mai adecvată pentru conservare pe termen lung (Merymann, Williams,
1982).
• Cu timpul s-a acordat o deosebită atenţie pregătirii celulelor pentru crioconservare, în special prin
administrarea unor substanţe crioprotectoare. S-a constatat o strânsă dependenţă între starea
fiziologică şi ontogenetică a materialului conservat şi rata supravieţuirii celulelor.
• Celulele din faza lag târzie sau faza exponenţială timpurie au cea mai mare toleranţă la îngheţ,
deci implicit o rată sporită a supravieţuirii
• Celulele se recolteză în faza exponenţială de creştere şi se cultivă într-un mediu suplimentat cu
manitol 6% sau sorbitol 6-15%. Aplicarea substanţelor crioprotectoare este esenţială pentru
asigurarea supravieţuirii celulelor prin îngheţ.
• Tratamentul termic al celulelor se face gradat, ajungându-se la temperatura de –196 0 C, după ce
în prealabil celulele au fost transferate în ampule de polipropilenă. Materialul vegetal stocat pe
termen nelimitat poate fi reutilizat, prilej cu care se face testul viabilităţii celulelor.
• Testul viabilităţii se poate realiza cu diacetat de fluoresceină, caz în care celulele viabile sunt
detectate la microscopul cu lampă UV, dezvoltând fluorescenţă, sau cu 2, 3, 5 - clorură de
trifeniltetrazoliu, caz în care celulele viabile se colorează în roşu..